(57)【要約】【課題】固定化される物質の量のばらつきが、公知の物質固定化剤よりも低減される新規な物質固定化剤並びにそれを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供すること。 【解決手段】物質固定化剤は、基体上に所望の物質を固定化するための物質固定化剤であり、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーを含む。光反応性基は、フルオロ置換芳香族アジド基又は芳香族ジアジリン基を１つ又は複数含む基である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上に所望の物質を固定化するための物質固定化剤であって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーを含み、前記光反応性基がフルオロ置換芳香族アジド基又は芳香族ジアジリン基を１つ又は複数含む基である、物質固定化剤。
【請求項２】
前記フルオロ置換芳香族アジド基を１つ又は複数含む基が、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基、4-アジド-3,5-ジフルオロフェニル基であり、前記芳香族ジアジリン基が4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル]フェニル基である、請求項１に記載の物質固定化剤。
【請求項３】
前記水溶性ポリマーが、ノニオン性ポリマー又は両イオン性ポリマーである請求項１又は２に記載の物質固定化剤。
【請求項４】
前記ノニオン性ポリマーが、ポリアルキレングリコール、又は、ポリアルキレングリコールを側鎖に有する重合単位を含むビニル系ポリマーである、請求項３に記載の物質固定化剤。
【請求項５】
前記ノニオン性ポリマーが、下記式[I]で表わされる構造を有する請求項３記載の物質固定化剤。
【化１】
2015025788.tif 000012
式[I]中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素又はメチル、ｍは３〜４０の整数、ｎは６０〜９７の整数、ｐは３〜１２の整数、Ｘは単結合、炭素数１〜４のアルキレン基（ただし、アルキレン基中の炭素が酸素又はカルボニル基に置き換わっていてもよい）、-CONH-R3-（R3は炭素数１〜４のアルキレン基）、又は-COO-R4-（R4は炭素数１〜４のアルキレン基）である。
【請求項６】
前記両性イオン性ポリマーが、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、又はイミダゾールベタイン基を側鎖に有する重合単位を含むビニル系ポリマーである、請求項３に記載の物質固定化剤。
【請求項７】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質、ウイルス、及び細胞並びにその一部からなる群から選ばれる請求項１〜６のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項８】
基体上に請求項１〜７のいずれか１項に記載の物質固定化剤が塗布された基体。
【請求項９】
前記物質固定剤により物質が固定化された請求項８に記載の基体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を基体上に固定化するための物質固定化剤、及び物質固定化剤が塗布された基体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、抗体又は抗原をプレート上に固定化した、免疫測定のためのイムノプレートや、核酸をチップ上に固定化したＤＮＡチップ等が広く用いられている。従来、基体上にタンパク質や核酸を固定化する方法の１つとして、物理吸着が広く用いられている。すなわち、例えばポリスチレンのような疎水性の基体と、基体上に固定化すべきタンパク質や核酸の水溶液とを接触させて放置することにより、物理吸着によってタンパク質や核酸が基体上に固定化される。
【０００３】
しかしながら、物理吸着を用いる方法では、基体と固定化物質との結合が弱く、物質を固定化した基体の安定性が不十分であるという問題がある。また、目的のタンパク質や核酸で被覆されなかった領域への非特異吸着を防止するために、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質（タンパク質を固定化する場合）や、サケ精子ＤＮＡ等のＤＮＡ（ＤＮＡを固定化する場合）でブロッキングすることが行われているが、ブロッキングによる非特異吸着の防止効果も必ずしも満足できるものではない。
【０００４】
また、基体上の官能基と、固定化すべきタンパク質や核酸の官能基とを共有結合させることにより基体上にタンパク質や核酸を固定化することも行われている。しかしながら、この方法では、用いる官能基が物質の活性部位の中又はその近傍にある場合には、固定化により物質の活性が失われてしまう。また、適当な官能基が存在しない場合には、この方法により固定化することができない。また、物理吸着の場合と同様、ブロッキングにより非特異吸着が防止されているが、その防止効果は必ずしも満足できるものではない。
【０００５】
本出願人は、この問題を解決すべく、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマーが分子全体として電気的に中性なポリマーから成る、物質固定化剤を発明し、特許を取得している（特許文献１及び特許文献２）。特許文献１及び特許文献２には、光反応性基として4-アジドフェニル基を用いることも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４６３０８１７号掲載公報
【特許文献２】特許第第４５０５５８１号掲載公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１及び特許文献２に記載された物質固定化剤は、任意の物質を共有結合により基板に固定化することができ、かつ、基板への非特異吸着が効果的に防止されるという優れた性質を有するが、物質の固定化量にばらつきがあり、このため、この物質固定化剤を用いて作製したマイクロアレイを用いてアッセイを行った場合、測定結果にばらつきが生じるという問題があることがわかった。
【０００８】
従って、本発明の目的は、固定化される物質の量のばらつきが、公知の物質固定化剤よりも低減される新規な物質固定化剤並びにそれを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは鋭意研究の結果、光反応性基として、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基のようなフルオロ置換芳香族アジド基を用いることにより、固定化される物質の量のばらつきを、特許文献１及び特許文献２に記載された公知の物質固定化剤を用いた場合よりも低減することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、基体上に所望の物質を固定化するための物質固定化剤であって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーを含み、前記光反応性基がフルオロ置換芳香族アジド基を又は芳香族ジアジリン基を１つ又は複数含む基である、物質固定化剤を提供する。また、本発明は、基体上に上記本発明の物質固定化剤が塗布された基体を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、公知の物質固定化剤よりも、物質の固定化量のばらつきが小さくなる新規な物質固定化剤が提供された。本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化してマイクロアレイを作製すると、物質の固定化量のばらつきが小さいので、このマイクロアレイを用いた測定結果のばらつきも小さくなり、測定結果の再現性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例において行った、自己抗原の光固定化の方法を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上記の通り、本発明の物質固定化剤は、１分子中に少なくとも２個のフルオロ置換芳香族アジド基又は芳香族ジアジリン基を有し、かつ、分子全体として電気的に中性なポリマーから成る。フルオロ置換芳香族アジド基としては、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基、4-アジド-3,5-ジフルオロフェニル基等が好ましく、特に、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基が好ましい。芳香族ジアジリン基としては、4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル]フェニル基が好ましい。フルオロ置換芳香族アジド基又は芳香族ジアジリン基は、光反応性基として機能する。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近のpH（pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を有さないか、又は有していても陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的に０になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が０になるか、又は０にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。
【００１４】
本発明の物質固定化剤は、水溶性であり、水に対する溶解度（水１００ｇに溶解するグラム数）は、好ましくは５以上である。
【００１５】
本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有するノニオン性水溶性ポリマー及び両イオン性ポリマーを好ましい例として挙げることができ、特にノニオン性水溶性ポリマーが好ましい。
【００１６】
ここで、「ノニオン性」とは、中性付近のpH（pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量（例えば、このような基の数が炭素数の１％以下）であることを意味する。
【００１７】
水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、３５０〜５００万程度であり、好ましくは、５００〜数１０万程度である。
【００１８】
ノニオン性水溶性ポリマーの好ましい例として、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、2-ビニルピリジン、4-ビニルピリジン、N-ビニルサクシンイミド、N-ビニルホルムアミド、N-ビニル-N-メチルホルムアミド、N-ビニルアセトアミド、N-ビニル-N-メチルアセトアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、n-プロピルシアノアクリレート、iso-プロピルシアノアクリレート、n-ブチルシアノアクリレート、iso-ブチルシアノアクリレート、tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、n-プロピルビニルエーテル、iso-プロピルビニルエーテル、n-ブチルビニルエーテル、iso-ブチルビニルエーテル、tert-ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類（カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいものはポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド（本明細書及び特許請求の範囲において、「（メタ）アクリル」は、「メタクリル」又は「アクリル」を意味する）及びポリ（グリシジル（メタ）アクリレート）であり、これらの中で特に好ましくは、ポリエチレングリコールである。特に、ノニオン性水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール／ポリアクリルアミド−光反応性アクリル酸アミド）共重合体又はポリエチレングリコール／ポリ（グリシジルメタクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体が好ましく、特に、ノニオン性水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体であるものが好ましい。
【００１９】
両性イオン性ポリマーとしては、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、又はイミダゾールベタイン基を側鎖に有する重合単位を含むビニル系ポリマーが好ましい。
【００２０】
上記した水溶性ポリマーは、１分子当り少なくとも２個の光反応性基である4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基のようなフルオロ置換芳香族アジド基（以下の記述において、特に断りがない限り、「光反応性基」は、フルオロ置換芳香族アジド基を意味する）を有する。水溶性ポリマー１分子当りの光反応性基の数は、２個以上であれば、特に限定されるものではないが、あまりに多すぎると、非特異吸着が増大する恐れがあるので、高分子を構成する炭素数（側鎖の炭素を含まない）の１０％以下が好ましく、さらに好ましくは７％以下である。光反応性基は、水溶性ポリマーに直接結合していてもよいが、任意のスペーサー構造を介して水溶性ポリマーに結合されていてもよく、通常、後者の方が製造が容易であり好ましい。後者の場合、スペーサー構造は、ポリマーの水溶性及び本発明の効果に悪影響を与えないものであれば、何ら限定されるものではなく、例えば炭素数１〜４のアルキレン基（ただし、アルキレン基中の炭素が酸素又はカルボニル基に置き換わっていてもよい）、-CONH-R3-Y-（R3は炭素数１〜４のアルキレン基、Yは単結合、-NHCO-又は-OCO-）、及び-COO-R4-Y（R4は炭素数１〜４のアルキレン基、Yは単結合、-NHCO-又は-OCO-）等を挙げることができる。
【００２１】
好ましいノニオン性水溶性ポリマーとして、下記式[I]で表わされる構造を有するものを挙げることができる。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
式[I]中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素又はメチル、ｍは３〜４０の整数、ｎは５０〜２００の整数、ｐは３〜１２の整数、Ｘは単結合、炭素数１〜４のアルキレン基（ただし、アルキレン基中の炭素が酸素又はカルボニル基に置き換わっていてもよい）、-CONH-R3-（R3は炭素数１〜４のアルキレン基）、又は-COO-R4-（R4は炭素数１〜４のアルキレン基）である。下記実施例では、上記式[I]中、Ｘが-CONHCH2CH2-（エチレン基側がNに結合）であるものを作製しており、望ましい結果が得られている。上記式[I]で表される構造を有するポリマーの中でも、下記実施例で作製した下記式[II]の構造のものを好ましい例として挙げることができる。
【００２４】
【化２】
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【００２５】
式[II]中、ｍは３〜４０の整数、ｎは５０〜２００の整数、ｐは３〜１２の整数を表す。下記実施例では、ｍが５、ｎが９５、ｐが６であるものを作製している。
【００２６】
好ましい両イオン性水溶性ポリマーとして、下記式[III]〜[V]で表される構造を有するものが挙げられる。
【００２７】
【化３】
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【００２８】
【化４】
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【００２９】
2015025788.tif 000007
【００３０】
式[III]〜[V]中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、ｍ及びｎは、それぞれ式[I]におけるＲ１、Ｒ２、Ｘ、ｍ及びｎと同義、ｑ及びｒは、互いに独立して１〜４の整数を表す。
【００３１】
水溶性ポリマーへの光反応性基の導入は、常法に基づき容易に行うことができる。例えば、官能基を有する水溶性ポリマーと、該官能基と反応する官能基を有するアジド化合物を反応させて、水溶性ポリマーにアジド基を結合させることができる。好ましいノニオン性水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを用いる場合、両末端にアミノ基やカルボキシル基を有するポリエチレングリコールが市販されているので、このような市販の官能基含有ポリエチレングリコールの官能基に、光反応性基含有化合物を反応させてポリエチレングリコールにアジド基を結合させることができる。あるいは、水溶性ポリマーが水溶性ビニル系高分子のように、モノマーの重合により形成されるものである場合には、水溶性ビニル系高分子の主な構成単位となるビニル系モノマーと、光反応性ビニル系モノマーとを共重合させることにより光反応性基を有する水溶性ポリマーを製造することもできる。この方法により得られる光反応性水溶性ビニル系高分子の好ましい例として、ポリ（（メタ）アクリルアミド−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体及びポリ（グリシジル（メタ）アクリレート−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体等を挙げることができ、これらを製造する方法は、下記実施例に具体的に記載されている。
【００３２】
本発明の物質固定化剤を用いて固定化される物質は、特に限定されないが、ポリペプチド（糖タンパク質及びリポタンパク質を包含する）、核酸、脂質、ウイルス並びに細胞（動物細胞、植物細胞、微生物細胞等)及びその構成要素（核、ミトコンドリア等の細胞内小器官、細胞膜や単位膜等の膜等を包含する）を例示することができる。本発明の物質固定化剤に光反応性基として用いられる4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基中のアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。
【００３３】
基体としては、少なくともその表面が、上記光反応性基と結合し得る物質から成るものであれば特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン等の有機物から成るものを例示することができる。ガラス板にシランカップリング剤をコーティングしたもの等も用いることができる。また、基体の形態は何ら限定されるものではなく、マイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のもの等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレートのウェル等も用いることができる。本発明の物質固定化剤は、これらのうち、特にマイクロアレイ用に適している。
【００３４】
本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、基体に固定化すべき物質と、本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の物質固定化剤の濃度（重量基準）は、特に限定されないが、通常、0.005％〜10%程度であり、好ましくは0.04〜1%程度である。また、固定化すべき物質の濃度（重量基準）は、通常、用いる物質固定化剤の１０倍ないし２００倍程度であり、好ましくは２０倍ないし１００倍程度である。
【００３５】
次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、１cm2当たり１ｍW〜100mW程度である。
【００３６】
光を照射することにより、ポリマー中の光反応性基がラジカルを生じ、ポリマーが基体及び固定化すべき物質の双方と共有結合する。その結果、固定化すべき物質がポリマーを介して基体に固定化される。光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。なお、本発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。
【００３７】
光が照射されなかった部分では、光反応性基が基体及び物質に結合しないので、洗浄すればポリマーも物質も除去される。従って、フォトマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで物質を固定化することができる。従って、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に物質を固定化することができるので、非常に有利である。
【００３８】
あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイクロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、DNAチップ等の作製に常用されており、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合、固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合にも固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層（それぞれ分離したスポット）の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。
【００３９】
本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定化した免疫測定用プレートの作製、ＤＮＡやＲＮＡを基板上に固定化した核酸チップ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなく、例えば、細胞全体やその構成要素の固定化等にも適用することができる。
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、全ての％は、特に断りがない限り質量％を意味する。
【００４１】
実施例１
１．  4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸(1)の合成
4-アミノ-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸を購入し、以下の通り、ジアゾ化反応により4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸(1)に変換した。すなわち、4-アミノ-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸(2.0 g, 9.57 mmol)をトリフルオロ酢酸(50mL)に溶解し、亜硝酸ナトリウム (1.32g, 19.1 mmol)を加え、得られた混合物を０℃の暗所で１時間撹拌した。次いで、反応混合物にアジ化ナトリウム(6.22g, 95.7 mmol)を５分間に亘ってゆっくりと加え、次に40mLのジエチルエーテルを直ちに加え、さらに２時間反応させた。反応後、水を加えて反応を終了させ、生成物をジエチルエーテルで抽出し、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムを加えてろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。収率は89%であった。
【００４２】
13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ 160.11, 145.66 -142.88 (m), 141.57-138.84 (m), 122.73 (m), 108.41 (m). 19F NMR (376MHz, CDCl3): δ -151.0 (m, 2F), -137.19 (m, 2F).
【００４３】
２．  2,5-ジオキソピロリジン-1-イル4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾエート(2)の合成
4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸(1) (1g, 4.25 mmol)、N-ヒドロキシスクシンアミド(489mg, 4.25 mmol)及びEDAC (1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、1.629g, 8.5 mmol )を15mLのジクロロメタンに溶解し、室温で一夜撹拌した。得られた混合物を水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させた。収率は79%であった。
【００４４】
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 2.92 (s, 4H). 13C NMR (100MHz, CDCl3): δ 168.56, 155.26 (m), 147.82-144.99 (m), 141.98-139.22 (m), 126.44, 101.99 (m), 25.67. 19F NMR (376MHz, CDCl3): δ -151.79 (m, 2F), -134.18 (m, 2F).
【００４５】
３．  N-(2-アクロリルアミノエチル)-4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンズアミド(4)の合成
N-(2-アミノエチル)アクリルアミド塩酸塩(3)は、公知の方法（文献名Mingtao Liang, I-Chun Lin, Michael R. Whittaker, Rodney F. Minchin, Michael J. Monteiro, and  Istvan Toth, ACS Nano, 4(1), 403-413(2010))によりBoc-アミノエチルアクリルアミドを合成し、その後の脱Boc反応は4MHClで行い、Ｎ−（２−アミノエチル）アクリルアミド塩酸塩を得た。N-(2-アミノエチル)アクリルアミド塩酸塩とN,N-ジイソプロピルエチルアミンとをジメチルホルムアミドに溶解した。2,5-ジオキソピロリジン-1-イル4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾエート(2)を分割してジメチルホルムアミドに溶解した。後の溶液を先の溶液にゆっくりと滴下し、室温で２４時間反応させた。反応終了後、得られた溶液を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水、次いで塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムとろ過して乾燥し、溶液を減圧下で蒸発させた。収率は66%であった。
【００４６】
1H NMR (400MHz, CDCl3):δ3.50 (q, 4H), 5.66 (dd, 1H, J = 6.4, 3.2), 6.21-6.23 (m, 2H). 19F NMR (376MHz, CDCl3): δ-150.79 (m, 2F), -141.35 (m, 2F)
【００４７】
４．  重合反応
N-(2-アクロリルアミノエチル)-4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンズアミド(4) (33.2mg, 0.1 mmol)にポリメタクリル-PEG (0.68g, 1.88 mmol)を加え、さらにアゾイソブチロニトリル(5.6 mg, 0.03 mmol)を加え、10mLのエタノール中に溶解した。溶液を２０分間アルゴンガスでパージし、反応混合物を６０℃のオイル槽中に１８〜２４時間置いた。得られた溶液を蒸発させてエタノールを除去し、２日間透析してポリマーを精製した。ガス浸透クロマトグラフィーを用いて得られたポリマーを特徴付けした。収率は2.7 g (78%)であった。このコポリマーを以下、「光反応性PEG」と呼ぶことがある。
【００４８】
合成した各化合物の19F NMRシフト(溶媒CDCl3)及びHR-質量分析の結果を下記表１に示す。
【００４９】
【表１】
2015025788.tif 000008
【００５０】
５．  自己抗原の光固定化
光固定化を図１に示すように行った。すなわち、光反応性PEG(50 mg/mL)とTween 20(商品名、５％）をリン酸緩衝液(PBS)中で混合し、プレート上にスピンコートした。ウイルス(1 mg/mL)を脱イオン水に溶解し、得られた水溶液を50nLずつマイクロアレイスポッター(MGII社製）でプレート上にスポットした。このようにしてマイクロアレイ化したプレートを紫外線ランプ(300-400 nm, ニッポ電機社製FL15BLB, 1.6 mW/cm2)で７分間照射した。最後に、このようにしてウイルスを固定化したプレートを、0.1% Tween-20（商品名）含有PBS(洗浄バッファー）ですすぎ、使用時まで-20℃で保存した。
【００５１】
実施例２  マイクロアレイアッセイ
血清をPBSで１００倍希釈した。ウイスル固定化プレートを、希釈血清(100μL）と共に、チャンバー内で２０分間、室温で振とうしながらインキュベートした。プレートを30mLの洗浄バッファーで３分間チャンバー内で洗浄した。HRP-結合抗ヒトIgG抗体(BSA(ウシ血清アルブミン）飽和PBSで１００倍希釈）をマイクロアレイプレートに載せ、プレートをチャンバー内で１時間、振とうしながらインキュベートした。最後に、基質溶液(ECL Advance Kit、商品名)をプレートに加え、３分間室温でインキュベートした。
【００５２】
測定された発光強度を、酵素免疫測定(EIA)の結果と対比して下記表２に示す。
【００５３】
【表２】
2015025788.tif 000009
【００５４】
実施例３、比較例１
光反応性PEG（実施例３）(50 mg/mL)又は光反応性PEG 中の4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル基が4-アジド-フェニル基になっているコポリマー（比較例１）を、プレート上にスピンコートした。抗ＩｇＥ抗体(1mg/mL)を水に溶解し、得られた水溶液を50nLずつマイクロアレイスポッター(MGII社製）でプレート上にスポットした。このようにしてマイクロアレイ化したプレートを紫外線ランプ(300-400 nm、ニッポ電機社製FL15BLB、 1.6 mW/cm2)で７分間照射した。このようにして抗ＩｇＥ抗体を固定化したプレート、ＩｇＥ(ELISA Kit、RC80-108-6（商品名、Bethyl Laboratories社製、17.5μg/mL) x280希釈(62.5ng/mL) 390μLを分注、 室温にて30分、振動(1次反応)、TBST 洗浄2回 (2分、10分)、TBS洗浄3回 (各2分)、 HRP標識抗IgE抗体(Kit) 125ng/mL (1mg/mL原液を8、000倍希釈)  500μLを分注。15分室温で振とうしながらインキュベートした。最後に、基質溶液(ECL Advance Kit、商品名)をプレートに加え、３分間室温でインキュベートした。測定された発光強度を、酵素免疫測定(EIA)の結果と対比して下記表３に示す。
【００５５】
【表３】
2015025788.tif 000010
【００５６】
表３から明らかなように、本発明の実施例３は、アジド基が結合しているベンゼン環上にフッ素が結合していない比較例１に比べて、変動係数が約１／４になり、本発明により、固定化される物質の量のばらつきが小さくなることが確認された。
【００５７】
実施例４、比較例２
実施例１で製造した水溶性ポリマー（実施例４）又は比較例１で製造したコポリマー（比較例２）を、それぞれエタノールに0.5 vol%の濃度で溶解した溶液を環状ポリオレフィン製(COC)基板上にスピンコートした。濃度5mg/mLのヒトIgGを1500倍にPBSで希釈し、3.3μg/mLの濃度の溶液をスポットした。風乾後、実施例１と同様な条件でUV照射した。
【００５８】
基板をTBST（Tween 20（商品名）含有Tris緩衝生理食塩液）で１０分間予備洗浄し、次いで、MilliQ水（商品名）で３回洗浄した。HRP標識抗体NA933V ECL （商品名、抗-ヒトIgGヒツジ抗体、2000倍、1% BSA-TBST希釈 で最終濃度0.28mg/mLに調整）を添加し、５分間振とう反応させた。次にTBST各1.5mLで３回洗浄（各1分間振とう）し、さらにTBST各1.5mLで３回洗浄（各1分間振とう）し、次いで、Lumigen（商品名、発光基質）を取扱説明書通りに添加、反応させた。反応後の基板をCCDカメラで撮影し、発光強度を測定した。結果を下記表４に示す。
【００５９】
【表４】
2015025788.tif 000011
【００６０】
表４から明らかなように、本発明の実施例４は、アジド基が結合しているベンゼン環上にフッ素が結合していない比較例２に比べて、変動係数が１／２になり、本発明により、固定化される物質の量のばらつきが小さくなることが確認された。
【図１】
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