(57)【要約】      （修正有）【課題】イネ科植物の病害抵抗性を誘導する新規な手段を提供する。【解決手段】伸長因子ＥＦ−Ｔｕの一部からなり、特定のアミノ酸配列を含み、かつ、２００個以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドであって、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチド、例えば下記のポリペプチドを、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤の有効成分とする：（ｃ）他の特定のアミノ酸配列の内の１７６〜２２５位のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｄ）他の特定のアミノ酸配列の内の１７６〜２２５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチド。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
伸長因子ＥＦ−Ｔｕの一部からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ、２００個以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドであって、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ＥＦ−Ｔｕが、アシドボラックス属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、又は、パントエア属に属する細菌に由来する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＥＦ−Ｔｕが、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１又は２に記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
１５０個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
１００個以下のアミノ酸残基からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
５０個以上のアミノ酸残基からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
下記（ｃ）又は（ｄ）に記載のポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド：
（ｃ）配列番号３の１７６〜２２５位のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号３の１７６〜２２５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列を有する領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有する領域との間に、２９〜３２個のアミノ酸残基を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性が高い、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有する、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤。
【請求項１１】
葉面散布又は根圏施用により植物に施用される、請求項１０に記載の病害抵抗性誘導剤。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを発現可能な形態で含むプラスミド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドが発現可能な形態で導入されたイネ科植物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項１０に記載の病害抵抗性誘導剤をイネ科植物に施用することを含む、イネ科植物の病害抵抗性を誘導する方法。
【請求項１６】
施用時のポリペプチドの濃度が１ｎＭから１０ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
イネ科植物が、イネ、コムギ、シバ、又はトウモロコシである、請求項１５又は１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ科植物の病害抵抗性を誘導するポリペプチド、それを含有する病害抵抗性誘導剤、及びイネ科植物の病害抵抗性を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の病害を防除する方法においては、植物病原菌に対する殺菌作用を有する化学物質や病原菌の感染機能を阻害する薬剤などを有効成分とする化学農薬が主として用いられている。しかしながら、このようなタイプの農薬は標的生物以外にも少なからず影響を及ぼすと考えられている。近年の食料品に対する消費者の安全意識の高まりとともに、化学合成農薬の不使用、使用量の低減、天然系農薬による病害防除技術が強く求められるようになってきている。
【０００３】
そのような時流の中で注目されているのが、植物本来の病害抵抗性を増強させる技術である。
【０００４】
植物が有する病原菌に対する抵抗性は、静的（受動的）抵抗性と動的（能動的）抵抗性に大別される。静的抵抗性とは、植物細胞壁の硬さや厚さ、ポリフェノール類の蓄積など、病原菌の感染を受ける前から植物が具備している物理的・化学的な性質による抵抗性を意味する。これに対し、動的抵抗性は、植物細胞または組織が外敵の攻撃やその予兆を察知して積極的に発動する一連の防御応答を意味する。高等植物の動的抵抗性反応としては、活性酸素の生成とそれに伴う過敏感細胞死、パピラの形成、病原菌に対して抗菌活性をもつファイトアレキシン（phytoalexin）合成系酵素をコードする遺伝子群の発現上昇、侵入菌の細胞壁を分解するキチナーゼやグルカナーゼ、あるいはその他のＰＲ（Pathogenesis-related）タンパク質の合成などがある（例えば非特許文献１）。
【０００５】
植物と非親和性関係の病原体、またはエリシターなどで植物を人為的に処理することによって植物組織に構築される、物理的・化学的な障壁に基づいた抵抗性を、誘導抵抗性と呼ぶ。この現象は、抵抗性誘導物質と呼ばれる特定の物質で植物を前処理することによって、植物が本来有する動的抵抗性が引き出された結果であるとみなすことができる。
【０００６】
植物病害を防除する手段として、殺菌剤を散布することによって直接病原体を攻撃する方法の他に、静的抵抗性および動的抵抗性を利用した病害防除方法も複数提案されており、その一部は農業で実用化されている。
【０００７】
動的抵抗性を利用した薬剤は植物抵抗性誘導剤と呼ばれる。殺菌剤など植物病原体に対して直接作用するタイプの農薬は、継続的に使用すると薬剤に対して抵抗性変異株が出現する場合が多い。これに対し植物抵抗性誘導剤は、直接病原菌に作用するのではなく、植物の抵抗性を誘導することで病害感染を防除することから、これまでにこのタイプの農薬の抵抗性変異株が出現した事例は認められていない。さらに、抵抗性誘導型農薬は生物に対する殺菌作用が少ないために、植物以外の生物を含めた環境への負荷は比較的少ないと考えられている。
【０００８】
植物抵抗性誘導剤としては、プロベナゾール(商品名：オリゼメート。明治製薬（株）)、ベンゾチアゾール系(BTH)のアシベンゾラルＳメチル（ASM、商品名：バイオン。シンジェンタ ジャパン（株））、チアジアゾールカルボキサミド系のチアニジル（商品名：ブイゲット。日本農薬（株））が販売されている。
【０００９】
また、病害抵抗性を誘導する天然物由来の物質としては多糖体分解物（例えば、特許文献１）、セレブロシド類（例えば、特許文献２）、ジャスモン酸（例えば、特許文献３）、キチンオリゴ糖（例えば、非特許文献２）、β-1,3-およびβ-1,6-グルカンオリゴ糖（例えば、非特許文献３）、胆汁酸（特許文献４）、ペプチドグリカン（非特許文献４）、リポポリサッカライド(非特許文献５)、各種アミノ酸（非特許文献６、特許文献５）等が知られている。発酵副生物（特許文献６）、微生物菌体を酸性溶液中で加熱処理することにより得られる抽出液（特許文献７、特許文献８）などが報告されている。
【００１０】
植物は微生物固有の分子パターン(Microbe-Associated Molecular Pattern; MAMPs）を認識し動的抵抗性を誘導する。その防御応答は特にPattern triggered immunity（PTI）と呼ばれている。代表的なMAMPsとして、細菌鞭毛成分のフラジェリン（非特許文献７）や糸状菌細胞壁を構成するキチン（非特許文献８）、βグルカン（非特許文献９）などが挙げられる。
【００１１】
MAMPsのうち、最も研究の進んでいるものの一つが伸長因子（elongation factor Tu：EF-Tu）である。EF-Tuは、シロイヌナズナやハクサイなどアブラナ科植物に限定してPTI を誘導するMAMPsであることが報告されている（非特許文献１０）。
【００１２】
一方、イネにはシロイヌナズナで活性部位として同定されたEF-TuのN 末端18残基（elf18）を認識する受容体（EF-Tu receptor：EFR）のオルソログが存在しないため、EF-Tuを認識して動的抵抗性を誘導することはないとされてきた（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平5-331016号公報
【特許文献２】特許第2846610号公報
【特許文献３】特開平11-29412号公報
【特許文献４】特開2006-219372公報
【特許文献５】WO2012/046758
【特許文献６】WO2013/065439
【特許文献７】WO2009/088074
【特許文献８】WO2011/087002
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】分子レベルから見た植物の耐病性−ポストゲノム時代の植物免疫研究−  島本功ら  秀潤社  ２００４
【非特許文献２】Yamada A. et. al., Biosci. Biotech. Biochem., 1993, 57(3):405-409
【非特許文献３】Yamaguchi, T. et. al., Plant Cell, 2000, 12:817-826
【非特許文献４】Gust, A.A. et. al., J. Biol. Chem., 2007, 282:32338-32348
【非特許文献５】Newman, M.A. et al., Plant J. 2002, 29:487-495
【非特許文献６】V Raj, S.N. et al., Phytoparasitica, 2004, 32:523-527
【非特許文献７】Meindl, T., et al., Plant Cell, 2000, 12:1783-1794
【非特許文献８】Miya, A., et al., PNAS, 2007, 104:19613-19618
【非特許文献９】Klarzynski, O., et al., Plant physiol., 2000, 124:1027-1038
【非特許文献１０】Zipfel, C., et al., Cell, 2006, 125:749-760
【非特許文献１１】Boller, T., and Felix, G., Annu Rev Plant Biol., 2009, 60:379-406
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、イネ科植物の病害抵抗性を誘導する新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、（１）植物病原性細菌および非病原性細菌に広く保存されているEF-Tu（elongation factor thermo unstable）にイネ科植物の病害抵抗性を誘導する活性があること、及び、（２）病原性細菌アシドボラックス・アベナエ（Acidovorax avenae）のEF-Tuの中央部分（176位から225位までの50残基付近）にその活性があること、を見出し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１７】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１８】
（１）伸長因子ＥＦ−Ｔｕの一部からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ、２００個以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドであって、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチド。
（２）ＥＦ−Ｔｕが、アシドボラックス属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、又は、パントエア属に属する細菌に由来する、前記ポリペプチド。
（３）ＥＦ−Ｔｕが、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、前記ポリペプチド：
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するタンパク質。
（４）１５０個以下のアミノ酸残基からなる、前記ポリペプチド。
（５）１００個以下のアミノ酸残基からなる、前記ポリペプチド。
（６）５０個以上のアミノ酸残基からなる、前記ポリペプチド。
（７）下記（ｃ）又は（ｄ）に記載のポリペプチドである、前記ポリペプチド：
（ｃ）配列番号３の１７６〜２２５位のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号３の１７６〜２２５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチド。
（８）配列番号１のアミノ酸配列を有する領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有する領域との間に、２９〜３２個のアミノ酸残基を有する、前記ポリペプチド。
（９）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性が高い、前記ポリペプチド。
（１０）前記ポリペプチドを含有する、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤。
（１１）葉面散布又は根圏施用により植物に施用される、前記病害抵抗性誘導剤。
（１２）前記ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
（１３）前記ポリヌクレオチドを発現可能な形態で含むプラスミド。
（１４）前記ポリヌクレオチドが発現可能な形態で導入されたイネ科植物。
（１５）前記ポリペプチド、又は病害抵抗性誘導剤をイネ科植物に施用することを含む、イネ科植物の病害抵抗性を誘導する方法。
（１６）施用時のポリペプチドの濃度が１ｎＭから１０ｍＭである、前記方法。
（１７）イネ科植物が、イネ、コムギ、シバ、又はトウモロコシである、前記方法。
【発明の効果】
【００１９】
殺菌剤のような植物病原菌に対して直接作用するタイプの農薬は、継続的な使用により薬剤に対する抵抗性変異株が出現することが多いが、本発明のポリペプチド、及びそれを
含む植物抵抗性誘導剤は、薬剤の抵抗性変異株が出現しにくく、長期間にわたる使用が可能である。
【００２０】
本発明のポリペプチド、及びそれを含む病害抵抗性誘導剤は、非病原性細菌を含む細菌に広く保存されているポリペプチドの一部を有効成分とするものであり、人間に対する安全性が高く、環境負荷も極めて低いと考えられる。また、植物が認識できる領域を200アミノ酸、好ましくは50アミノ酸程度にまで狭めることで、エシェリヒア・コリ（E. coli）やコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）などの細菌を用いた製造や、化学合成による製造を、容易かつ低コストで行うことが可能である。
【００２１】
既存の植物病害抵抗性誘導剤、例えば農薬登録がなされている植物病害抵抗性誘導剤や、アミノ酸のような病害抵抗性を誘導する天然物由来の物質と、本発明のポリペプチドとを混合使用することによって、防除効果を高めるか、又は既存の植物病害抵抗性誘導剤の使用量を低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】E. coliで発現させた全長EF-Tu-Aaのイネ培養細胞における活性酸素生成の誘導を示す図。
【図２】シロイヌナズナおよびイネ培養細胞のelf18-Aa、elf18-Ecそれぞれに対する応答を示す図。
【図３】シロイヌナズナ培養細胞とイネ培養細胞のEF-Tu-Aa認識部位の違いを示す図。
【図４】イネ細胞のEF-Tu-Aa認識部位を示す図。
【図５】各種細菌のEF-Tuの部分配列のアラインメントを示す図。各細菌の菌株、及びそれらの菌株のEF-Tuの部分配列を記載した配列表における配列番号は以下のとおりである。E. coli K12（配列番号６）、B. subtilis 168（配列番号７）、P. ananatis LMG5342（配列番号８）、C. glutamicum ATCC13032（配列番号９）、P. syringae pv. syringae B728a（配列番号１０）、P. syringae pv. tomato DC3000（配列番号１１）、A. avenae N1141（配列番号１２）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドは、因子EF-Tuの一部からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ、２００個以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドであって、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチドである。
【００２４】
本発明のポリペプチドが由来するEF-Tuは、イネ科植物の病害に対する抵抗性を誘導できるものであれば特に限定されないが、EF-Tuは細菌各種で高度に保存されており、エシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アシドボラックス（Acidovorax）属、バチルス（Bacillus）属、パントエア（Pantoea）属に属する細菌由来のEF-Tuが挙げられる。また、クレブシエラ（Klebsiella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アセトバクトー（Acetobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、エルビニア（Erwinia）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ペクトバクテリウム（Pectobacterium）属など、植物病原菌、非病原菌であるかにかかわずらず、それらの細菌のEF-Tuであってもよい。また、細菌以外の生物のEF-Tu、例えば高等植物のオルガネラ由来のEF-Tuであってもよい。
【００２５】
「細菌由来のEF-Tu」との文言は、その細菌から得たEF-Tuに限られず、その細菌が持つ
EF-Tuと同じアミノ酸配列を有するEF-Tuを意味する。
【００２６】
EF-Tuは、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有する限り、天然のEF-Tuのアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。このようなタンパク質を「バリアント」と記載する。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００２７】
EF-Tuとして具体的には、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するアシドボラックス・アベナエ（Acidovorax avenae）のEF-Tuが挙げられる。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、上記のようなEF-Tuの一部からなるものであり、配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び、配列番号２のアミノ酸配列を含む。配列番号１は、配列番号３の１７８位〜１８１位の配列に相当する。この配列は、各種細菌のEF-Tuで保存されている配列である。また、配列番号２は、配列番号３の２１３位〜２２５位の部位と、この部位に対応するアシドボラックス・アベナエ以外の細菌のEF-Tuの部位の共通配列である。EF-Tuの一部とは、EF-Tu又はそのバリアントのアミノ酸配列において、一部の連続したアミノ酸配列からなる領域をいう。
【００２９】
アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端からＸ番目を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。すなわち、上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、または付加などによってその位置は前後することがある。例えば、配列番号３の１７８位のアミノ酸残基（Ala）」とは、配列番号３における１７８位のアラニン残基に相当するアミノ酸残基を意味し、１７８位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から１７７番目のアミノ酸残基が「EF-Tuの１７８位のAla残基」であるものとする。また、１７８位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から１７９番目のアミノ酸残基が「EF-Tuの１７８位のAla残基」であるものとする。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、２００個以下、好ましくは１５０個以下、より好ましくは１００個以下のアミノ酸残基からなる。ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ、２００個以下のアミノ酸残基からなる限り、EF-Tuのどの領域に由来するものであってもよい。本発明のポリペプチドは、好ましくくは５０個以上のアミノ酸残基からなる。典型的には、本発明のポリペプチドは、５０アミノ酸残基からなる。
上記のようなEF-Tuの部分ペプチドは、全長EF-Tu、例えば配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性が高い。
【００３１】
また、本発明のポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる領域のC末端と、配列番号２のアミノ酸配列からなる領域のN末端との間に、２９〜３２個のアミノ酸残基を含むことが好ましく、３０個のアミノ酸残基を含むことがより好ましい。
【００３２】
本発明のポリペプチドの好ましい一例は、配列番号３の１７６〜２２５位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、他の例は、配列番号３の１７６〜２２５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有するポリペプチドである。「１若しくは数個」は、前記と同様である。
【００３３】
実施例に示されるように、アシドボラックス・アベナエのEF-Tuの活性部位は配列番号３の１７６〜２２５位の領域近傍に存在する。また、各種細菌のEF-Tuは、この領域に相当する領域、特に配列番号１及び２のアミノ酸配列を有する領域が保存されている。したがって、配列番号１及び２のアミノ酸配列を有するペプチド、特にEF-Tu又はそのバリアントの部分ペプチドは、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有すると考えられる。図５に、アシドボラックス・アベナエのEF-Tuの活性部位近傍のアミノ酸配列（配列番号１２。配列番号３の１７１位〜２２８位に相当する。）、及び、各種細菌のEF-Tuの相当する領域のアミノ酸配列（配列番号６〜１２）のアラインメントを示す。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、イネ科植物の免疫応答を誘導する活性を有する。「イネ科植物の免疫応答を誘導する活性」は、ポリペプチドをイネ科植物に施用することにより、イネ科植物の免疫応答が高まることを意味し、イネ科植物の動的抵抗性（能動的抵抗性）を誘導する活性と同義である。また、イネ科植物の免疫応答が誘導される結果、イネ科植物の病害抵抗性が誘導される。したがって、「免疫応答を誘導する活性」は、病害抵抗性を誘導する活性と言い換えることができる。イネ科植物の免疫応答を誘導する活性は、例えば、実施例に示すように、H2O2の生成を指標とした免疫反応の測定により、測定することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で適当なベクターに挿入し、得られた組換えベクターを適切な宿主に導入し、同ポリヌクレオチドを発現させることによって製造することができる。ポリヌクレオチドと適当なプロモーターを連結した断片をベクターに挿入してもよく、プロモーターを含む発現ベクターにポリヌクレオチドを挿入してもよい。
【００３６】
ポリヌクレオチドの塩基配列は、本発明のポリペプチドをコードする限り特に制限されないが、各アミノ酸のコドンは、イネ科植物における発現に適したコドンであることが好ましい。ポリヌクレオチドは、化学合成によって製造することができる。
【００３７】
ベクターとしては、宿主としてエシェリヒア・コリを用いる場合には当該細菌で自律複製できるプラスミドを挙げることができる。例えば、pUC19、pET、pGEMEX、pGEM-T等が使用可能である。
【００３８】
ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターは、特に制限されず、rpoHプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター等が挙げられる。
【００３９】
宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌等のグラム陰性細菌、グラム陽性細菌としてはバチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌等を用いることができる。その他、酵母、カビなどの細胞等を利用してもよい。
【００４０】
組換えベクターを導入された宿主を、プロモーターが機能する条件で培養することにより、本発明のポリペプチドが生成する。宿主又は培地からのポリペプチドの採取は、通常の遺伝子組換え技術を利用したタンパク質、ポリペプチドの生産と同様にして行うことができる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤、又はその有効成分として使用することができる。本発明において「イネ植物の病害抵抗性誘導剤」とは、病原菌に対するイネ科植物の動的抵抗性を誘導し、イネ科植物の病害を防除するための薬剤をいう。病害抵抗性の誘導には、病害抵抗性の増強も含まれる。病害抵抗性誘導剤は、一種のポリ
ペプチドを含んでいてもよく、任意の２種又はそれ以上のポリペプチドを含んでいてもよい。
【００４２】
イネ科植物病害抵抗性誘導剤は、本発明のポリペプチド以外に任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒、担体、pH調整剤、植物体への展着力を高めるための展着剤、植物への浸透性を高めるための界面活性剤等の成分、肥効を高めるためのミネラル等の肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、本発明の効果を損なわない限り、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
また、イネ科植物病害抵抗性誘導剤は、ポリペプチド以外の病害抵抗性誘導剤を含んでいてもよい。
【００４３】
本発明によるイネ科植物の病害抵抗性誘導剤の剤型は液剤、粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤等の何れの使用形態でも良く、施用の為の薬剤の形態、その使用形態、施用方法は特に限定されるものではない。
【００４４】
担体成分としては、例えば、本発明のイネ科植物の病害抵抗性誘導剤が底床添加剤又は固形剤である場合には、バーミキュライト、タルク、珪藻土、カオリン、炭酸カルシウム、クレー、水酸化カルシウム、白土、シリカゲル等の無機質や小麦粉、澱粉等の固体担体を用いることができる。また、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤が液剤である場合には、水、キシレン等の芳香族炭化水素類、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の液体担体を用いることができる。
【００４５】
また、使用に際して、固体状又は粉体状のイネ科植物の病害抵抗性誘導剤を、水、アルコール等の溶媒に溶解又は分散させてもよい。また、液状のイネ科植物の病害抵抗性誘導剤を、水、アルコール等の溶媒で希釈してもよい。
【００４６】
また、本発明の好ましい態様によれば、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤は病害防除剤として用いられるものである。そして、本発明の別の態様によれば、本発明によるイネ科植物の病害抵抗性誘導剤をイネ科植物に施用する、イネ科植物病害防除方法が提供される。
【００４７】
イネ科植物の病害抵抗性誘導剤におけるポリペプチドの含量は特に制限されず、後述の施用量に応じて適宜設定することができる。例えば、イネ科植物の病害抵抗性誘導剤におけるポリペプチドの含量は、病害抵抗性増強に有効な量が施用できる限り特に制限されないが、例えば、通常１ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１００μＭである。尚、この濃度は、植物病害抵抗性誘導剤が固形又は粉体状の場合は、使用時に溶液にしたときの濃度である。また、液状のイネ科植物の病害抵抗性誘導剤を使用時に希釈して用いる場合は、前記濃度は希釈後の濃度である。
【００４８】
本発明の病害抵抗性誘導剤の対象となる植物はイネ科に属する植物であり、イネ（Oryza sativa）、シバ（Zoysia属植物）、コムギ（Triticum属植物）、トウモロコシ（Zea mays）、オオムギ（Hordeum vulgare）、ライムギ（Secale cereale）、サトウキビ（Saccharum officinarum）などが挙げられる。品種には下記のものが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４９】
イネの品種としては、日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、あきたこまち、はえぬき、きらら３９７、キヌヒカリ、ほしのゆめ、つがるロマン、ななつぼし、ゆめあかり、あさひの夢、あいちのかおり、夢つくし、ササニシキ、コー・コー  ７号、コー・コー  ２３号、コー・コー  １０号、プレー  １、サンパートーン  １、カオドークマリ
１０５、ピサヌローク  １、ピサヌローク  ３、ピサヌローク  ６０−１、コー・コー
６、ナム・ルー、チャオ・ホー、シウ・メーチャン、Ｒ２５８、ラチサイル、ＩＲ
５、ペリタ１−１、シサダネ、シサンガルング、ＩＲ６４、シボゴ、コンデ、シヘラング、ドドカン、ダナウテムペ、シラタ、ＩＲ８、ＴＮ１、ウイダス、ＩＲ２０、ダナウガウング、ペタ、シアプス、メムベラモ等がある。
【００５０】
シバ品種としては、ヒメコウライシバ、ノシバ、センチピードグラス、バミューダグラス、ティフトンシバ、リビエラ、サンデビルII、ティフウェイ、バヒアグラス、セントオーガンスチングラスなどが挙げられる。
【００５１】
コムギ品種としては、小麦農林10号、ホクシン、農林61号、チクゴイズミ、春よ恋、さぬきの夢2000、シラネコムギ、きたもえ、もち姫、タクネコムギ、オーストラリア産スタンダードホワイト（ASW）、デュラム、プライムハード (PH)、ウエスタンホワイト (WW)、ダークノーザンスプリング (DNS)、カナダウエスタンレッドスプリング (CWRS)などが挙げられる。
【００５２】
トウモロコシ品種としては、ハニーバンタム、味来390、味来早生130、ピクニックコーン、ゴールドラッシュ、ピュアホワイト、あまいんです、ゆめのコーン、ゆめのコーン85、サンライズコーン、ウッディーコーン、シルバーハニーバンタム、スーパーハニーバンタム、ピーターコーン、ピーター610、ピーター早生1号、カキクケコーン、おひさまコーン、歩味ドリーム、どでかコーン優作、サラダコーン、スイートコーン味来390、キャンベラ86、キャンベラ90、スイート恵味(めぐみ)86、ルーシー90、Sweet歩味86、ゴールデンクロスバンタム、ポップコーン、黄八行うるきび(ロングフェロー)、黒もちきび、白もちきび、黄もちきび、などが挙げられる。
【００５３】
オオムギ品種としては、二条大麦、四条大麦、六条大麦、裸大麦、サチホゴールデンなどが挙げられる。
【００５４】
ライムギ品種としては、春香、春一番、キングライ麦、ライ太郎、Petkusなどが挙げられる。
【００５５】
サトウキビ品種としては、農林８号、農林９号、農林10号、農林11号、農林13号、農林15号、農林19号、農林20号、F161、KY96-189、KY96T-537などが挙げられる。
【００５６】
実施例に示すように、H2O2の生成を指標とした免疫反応の測定により、本発明のポリペプチドは、動的抵抗性を誘導することが示された。植物の動的抵抗性は病原菌に対して非特異的であることから、対象病害としては特に制限されない。例えば糸状菌、細菌、ウイルスを原因とする植物病害が含まれる。
【００５７】
イネの代表的な病害の例としてイネ白葉枯病、イネ炭疽病、イネ紋枯病、イネ苗立枯病、イネ葉鞘褐変病、イネばか苗病、イネ縞葉枯病、イネ黄化萎縮病などが挙げられる。
【００５８】
シバの病害の例としてはシバ萎縮病、シバモザイク病、シバ萎黄病、シバ麦角病、シバ白葉病、シバさび病、シバいもち病、シバ立枯病などが挙げられる。
【００５９】
コムギの病害としてはコムギ萎縮病、コムギ赤かび病、コムギ赤さび病、コムギ麦角病、コムギ葉枯病、コムギ斑点病、コムギいもち病、コムギ角斑病、コムギ黒点病、コムギ黒さび病、コムギ黄斑病、コムギ炭疽病、コムギ立枯病、コムギうどんこ病などが挙げられる。
【００６０】
トウモロコシの病害としては、トウモロコシすじ萎縮病、トウモロコシ黄化病、トウモロコシモザイク病、トウモロコシ赤かび病、トウモロコシごま葉枯病、トウモロコシ斑点病、トウモロコシ葉枯病、トウモロコシいもち病、トウモロコシ褐斑病、トウモロコシ紋枯病、トウモロコシ苗立枯病、トウモロコシ南方さび病、トウモロコシさび病などが挙げられる。
【００６１】
オオムギの病害としては、オオムギうどんこ病、オオムギ輪紋病、オオムギ条斑病、オオムギ立枯病、オオムギすす紋病、オオムギ雲形病、オオムギ小さび病、オオムギ黒変病、オオムギ黒点病などが挙げられる。
【００６２】
ライムギの病害としては、ライムギ黄葉病、ライムギ麦角病、ライムギ赤さび病、ライムギ斑点病、ライムギうどんこ病、ライムギ黒変病、ライムギ赤かび病、ライムギ条斑細菌病などが挙げられる。
【００６３】
サトウキビの病害としては、サトウキビモザイク病、サトウキビ赤すじ病、サトウキビ赤腐病、サトウキビ外皮病、サトウキビ白すじ病、サトウキビべと病、サトウキビわい化病、サトウキビ眼点病、サトウキビ擬似赤すじ病、サトウキビ褐条病、サトウキビ葉枯病、サトウキビ黒穂病、サトウキビ輪斑病、サトウキビさび病などが挙げられる。
【００６４】
また、本発明の植物病害防除法は、病害の予防を主な目的としており、病害が発生する時期に先駆けて使用することが好ましい。ただし、病害の発生後であってもその拡大を抑制したり、病害を減弱する効果は期待できる。
【００６５】
病害抵抗性誘導剤を、イネ科植物に施用することにより、上記のような病害に対する抵抗性を増強することができる。施用の方法は特に制限されず、その剤形および水田または畑の状態、農業従事者の事情に応じた方法で用いられ得る。例えば、植物の生長点のみならず、茎や葉をはじめとする植物体の一部又は全体に液剤や乳剤として散布、滴下あるいは塗布等することができる。またその他にも根圏への施用、例えば土壌への表面散布、潅注、土壌への混合、又は根への浸漬処理が挙げられる。これらの中では、根圏施用が好ましい。
【００６６】
本イネ科植物の病害抵抗性誘導剤のイネ科植物への投与については、その頻度は投与目的やイネ科植物個体の生育ステージ等により異なる。例えば、田植え前であれば苗床に施用することで幼病の病害を抑制できる。
【００６７】
イネ科植物病害抵抗性誘導剤の施用量は、有効成分の濃度、施用時期、施用回数、植物の種類、栽培密度、生育段階、施用方法等によっても異なり得る。葉面散布では、施用量は、ポリペプチドの量として、例えば、通常１ｎＭ〜１０ｍＭの溶液を５００〜１０００Ｌ／ヘクタール、好ましくは１０ｎＭ〜１００μＭの溶液を５００〜１０００Ｌ／ヘクタールである。また、イネ科植物病害抵抗性誘導剤を根圏に施用する場合も、施用量は上記の葉面散布と同様である。
ポリペプチドを含む病害抵抗性誘導剤と、ポリペプチド以外の病害抵抗性誘導剤は、別々にイネ科植物に施用してもよい。
【００６８】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現可能な形態でイネ科植物に導入することにより、病害抵抗性を獲得又は増強されたイネ科植物が得られる。
【００６９】
イネ科植物で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、ユビキチンプロモーター、ALSプロモーター等が挙げられる。
【００７０】
また、イネ科植物用の発現ベクターとしては、pRI 101-ON DNA、pPALS R-2等が挙げられる。
【００７１】
形質転換には通常用いられている方法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法等を、供試する宿主細胞に応じて用いればよい。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
（１）イネにおけるEF-Tuによる免疫応答誘導効果の検証
アシドボラックス・アベナエN1141株由来の全長EF-Tu（EF-Tu-Aa）をエシェリヒア・コリで発現させ、その発現タンパク質でイネ培養細胞を100nMの濃度で処理して免疫反応が誘導されるかを調べた。
アシドボラックス・アベナエN1141株は、独立行政法人  農業生物資源研究所遺伝資源センター  農業生物資源ジーンバンク（NIAS Genebank）（郵便番号305-8602 茨城県つくば市観音台2-1-2）にMAFF 301141の番号で保存されており、同ジーンバンクから入手することができる（http://www.gene.affrc.go.jp/databases-micro_search_detail.php?maff=301141）。
上記イネ培養細胞は、Baba, A. et al., Plant Cell Physiol., 1986, 27(3):463-471に記載の方法により、イネ（Oryza sativa L.）の種子から発芽させた芽生えから切り取った根の組織片を培養して得たカルスを液体培地に懸濁させることにより、取得したものである。
【００７３】
アシドボラックス・アベナエのEF-Tu（EF-Tu-a）のエシェリヒア・コリでの発現は、以下のようにして行った。
アシドボラックス・アベナエN1141株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４及び５に示すオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、PCRによりEF-Tu遺伝子を増幅した。増幅産物をpGEM-Tベクター（プロメガ）にクローニングし、プラスミドEF-Tu-a1/pGEX-Tを得た。このプラスミドをSalI及びBamHIで消化し、得られた断片をpGEX-6p-3ベクター（GE Healthcare）に挿入して、プラスミドEF-Tu-a1/pGEX-6p-3を得た。このプラスミドを保持するエシェリヒア・コリBL21(DE3)をLB培地で37℃、６時間培養し、IPTG添加によりEF-Tu-aタンパク質とGST（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）との融合タンパク質を発現させた。菌体を遠心分離により培地から回収し、PBS（pH7.3）で洗浄し、30mlのPBSに懸濁させた。菌体を超音波処理により破壊し、遠心分離により未破壊の菌体及び菌体破砕物を除去した。上清をグルタチオンセファロース4B（GE Healthcare）カラムに通し、GST融合タンパク質切断用プロテアーゼ（PreScission Protease, GE Healthcare）によりEF-Tu-aタンパク質を溶出させた。
【００７４】
イネ、及び、シロイヌナズナ培養細胞のタンパク質による処理は、Kadota et al., Ann. Phytopathol. Soc. Jpn., 2002, 62:425-428、及び、Che, F.S. et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:32347-32356に記載の方法により行った。イネ培養細胞（Oc系統）は、光照射下30℃で培養し、７日間毎日新鮮な培地で希釈した。シロイヌナズナ培養細胞（T87系統）は、光照射下22℃で培養し、７日間毎日新鮮な培地で希釈した。それらに試料（EF-Tu-aタンパク質）を終濃度100nMるように添加し、イネ培養細胞は30℃、シロイヌナズナ培養細胞は22℃で静置した。
【００７５】
免疫反応の指標として活性酸素（H2O2）を用い、これをルミノール法で定量した（Hirai, H. et al., J. Biol. Chem., 2011, 286(29):25519-25530）。活性酸素種の生成は病害応答のごく初期に起こり、それに続いて動的な防御応答が誘導される。活性酸素種は防御遺伝子の活性化に関わるセカンドメッセンジャーとして機能するばかりでなく、局部的
に発生した活性酸素はなんらかの移動性シグナルに変換され、植物に全身的な抵抗性を付与することが広く知られている（分子レベルから見た植物の耐病性−ポストゲノム時代の植物免疫研究−  島本功ら  秀潤社  ２００４）。
【００７６】
前記のようにして、全長のEF-Tu-Aaでイネ培養細胞を処理し、発生するH2O2を経時的（30分おき）に測定した。その結果、処理後30分からH2O2の発生が認められた（図１）。このことは、EF-Tuがイネの免疫応答を誘導することを示している。また活性酸素発生以外にも、病害抵抗性関連遺伝子の発現誘導やカロースの蓄積などの一連のPTI反応が誘導されたことから、EF-Tu-AaはイネのPTI誘導を引き起こすことが確認された。
【００７７】
（２）イネにおけるelf18の免疫応答誘導効果の検証
シロイヌナズナにおいては、細菌由来のEF-Tuは、N末端から18位までのアミノ酸（elf18）がシロイヌナズナ細胞膜に存在する受容体型キナーゼEFRに認識されることによって、免疫応答を誘導することが知られている（Zipfel, C., et al., Cell, 2006, 125:749-760）。そこで、A. avenae N1141菌株とE. coliのEF-Tuのアミノ酸配列情報からそれぞれ、elf18-Aaとelf18-Ecを作製し、それらでイネとシロイヌナズナの培養細胞を前記と同様にして処理し、H2O2の発生量を測定した。elf18-Aaは、A. avenaeのEF-Tu（EF-Tu-Aa）のN末端から18位までの配列を有するポリペプチドを、elf18-Ecはエシェリヒア・コリのEF-Tu（EF-Tu-Ec）のN末端から18位までの配列を有するポリペプチドを、各々表す。
【００７８】
結果を図２に示す。シロイヌナズナ培養細胞においてはelf18-Aaとelf18-Ec両方でH2O2発生活性が認められたのに対し、イネに培養細胞では、両ポリペプチド共に10-6 M の濃度まで、全くH2O2発生活性を示さなかった。これらのことから、イネはelf18 以外のEF-Tu配列を認識して免疫反応を誘導していることが示唆された。
【００７９】
（３）イネの免疫誘導効果に必要なEF-Tu領域の探索
イネにおけるEF-Tuの認識領域を探索するために、EF-Tu-Aaの様々なドメインで構成されるポリペプチドを大腸菌で作製し、それらでイネ培養細胞を前記と同様にして処理してH2O2の発生活性を測定した。
【００８０】
EF-Tu-AaのN末端側の1-200のアミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa1-200」、中間部分の101-300のアミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa101-300」、C末端部分の201-396のアミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa201-396」をそれぞれ大腸菌内で発現させ、精製、単離した。「A-B」のアミノ酸との表現は、N末端からA位のアミノ酸からB位のアミノ酸までのアミノ酸を表す。それらのポリペプチドでシロイヌナズナ培養細胞またはイネ培養細胞を処理しH2O2の発生を測定した。その結果、中間部分の「EF-Tu-Aa101-300」のみに活性酸素発生活性が認められた（図３）。このことから、イネにおいてはシロイヌナズナとは異なり、EF-Tuの中間部分が認識されてPTIが誘導されることが示された。また、EF-Tu-Aa101-300は、完全長EF-Tu-AaよりもPTI誘導活性が高いことが示された。
【００８１】
イネ培養細胞に認識されるアミノ酸配列をさらに絞り込むため、さらにEF-Tu-Aaの異なる部位に由来する部分ペプチドを作製し、PTI誘導活性を調べた。各種部分ペプチドのEF-Tu-Aaにおける位置を図４左図に示す。また、活性酸素発生活性を、図４右図に示す。151-250の100アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa151-250」や、176-225の50アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa176-225」ではH2O2の発生が認められたのに対し、181-220の40アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa181-220」、186-215の30アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa186-215」、191-210の20アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa191-210」、176-205の30アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa176-205」、196-225の30アミノ酸で構成される「EF-Tu-Aa196-225」では、H2O2の発生は全く認められなかった。このことから、EF-Tu-AaのPTI誘導の最小活性単位は176-225の50アミノ酸部位に含まれることが強く示された。また、176-225のアミ
ノ酸を含む部分ペプチド（EF-Tu-Aa101-300、EF-Tu-Aa151-250、EF-Tu-Aa176-225）は、完全長EF-Tu-AaよりもPTI誘導活性が高いことが確認された。
【００８２】
また、EF-Tu-Aa176-225は、シロイヌナズナに対してはPTI誘導活性を有していないことが確認された。このことからも、イネにおいてはこのEF-Tu-a196-225部位をEFRとは異なる受容体を介して認識していることが強く示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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