(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも一種のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体と結合するポリペプチドの提供。【解決手段】血液、血漿、又は血清試料中のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体の検出及び定量に用いるポリペプチド。更にＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体を多く含む試料を選抜し、薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる為の抗癌医薬組成物の使用。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも一種のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体と結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有する、抗癌医薬組成物を選抜するための、ポリペプチドの使用。
【請求項４】
人体から分離された血液、血漿、又は血清から前記抗癌医薬組成物を選抜する、請求項３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５】
前記抗癌医薬組成物は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体を少なくとも一種含む、請求項３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６】
前記抗癌医薬組成物は、ナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅能力を上昇させる、請求項５に記載のポリペプチドの使用。
【請求項７】
前記抗癌医薬組成物は、化学療法と相乗作用して薬剤抵抗性癌細胞の量を抑える、請求項５に記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する抗体。
【請求項９】
ナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅能力を上昇させる、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
化学療法と相乗作用して薬剤抵抗性を有する癌細胞の量を抑える、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、試料中のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体の量を検出する検出キット。
【請求項１２】
配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをプローブとし、試料中のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体の量を検出する検出方法。
【請求項１３】
酵素結合免疫吸着法、ウェスタンブロッティング、バイオチップ法、磁気ビーズ分離定量法、及び他のプローブ検出法からなる群から選択される少なくとも一種の方法で、試料中のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体を検出する、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
少なくとも以下の手順：
（ａ）前記ポリペプチドを容器中にコーティングする；
（ｂ）前記容器中の第一懸濁液を除去する；
（ｃ）適切な濃度の前記試料を前記容器中に投入する；
（ｄ）前記容器中の第二懸濁液を除去する；
（ｅ）第二抗体を投入する；
（ｆ）前記容器中の第三懸濁液を除去する；及び
（ｇ）前記容器中の前記第二抗体の量を検出する；
を含む請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記容器は９６ウェルプレートである、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記試料は人体から分離された血液、血漿、および血清からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１２に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌医薬組成物の選抜に用いるポリペプチド及びその応用に関するものであり、特にＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体の選抜に用いるポリペプチド及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は中後期ステージの癌の主要な治療方法である。一般的に、一定期間の化学療法を行った癌患者の大半の癌細胞は死滅するが、少数の破壊されていない癌細胞が残留し、その量はおよそ１０８〜１０９である。それら残留癌細胞は大量のＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、以下「ＡＢＣトランスポーター」と略す）を発現し、ＡＢＣトランスポーターは細胞膜まで運ばれ、細胞内の化学療法薬剤の除去を行う。即ち、残留癌細胞はＡＢＣトランスポーターを利用し癌細胞内の化学療法薬剤を細胞外へ輸送し、そのため化学療法薬剤は有効に残留癌細胞を攻撃することが出来ない。これが臨床上の癌細胞薬剤抵抗性であり、化学療法以外の方法で薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる方法が必要とされている。
【０００３】
非特許文献１で述べられた癌細胞薬剤抵抗性と関連するＡＢＣトランスポーターは、主に以下のサブファミリーを含む：
１．ＡＴＰ結合カセットタンパク質サブファミリーＢ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ）：例えばＡＢＣＢ１、多剤耐性タンパク質１（ｍｕｌｔｉ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ＭＤＲ１と略す）、浸透性糖タンパク質（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ぶ；またはＡＢＣＢ４（ＭＤＲ３とも呼ぶ）；これら以外にも例えばＡＢＣＢ１１、Ｐｇｐと同じファミリー（Ｓｉｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｐｇｐ）であるもの。
２．ＡＴＰ結合カセットタンパク質サブファミリーＣ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｃ）：例えばＡＢＣＣ１、多剤耐性関連タンパク質１（ｍｕｌｔｉ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，ＭＲＰ１と略す）とも呼ぶ；またはＡＢＣＣ２、多剤耐性関連タンパク質２（ｍｕｌｔｉ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２，ＭＲＰ２と略す）；ＡＢＣＣ３−６、ＡＢＣＣ１０−１１を含む可能性もある。
３．ＡＴＰ結合カセットタンパク質サブファミリーＧ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ）：例えばＡＢＣＧ２、ミトキサントロン耐性タンパク質（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＸＲと略す）、乳癌耐性タンパク質（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＣＲＰと略す）とも呼ぶ。
【０００４】
特許文献１では、薬剤抵抗性癌細胞の表面に存在する大量のＡＢＣトランスポーターを利用し、分子標的攻撃を行い、薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる方法が開示された。それは人工の方法でＡＢＣトランスポーター抗体を合成し、ＡＢＣトランスポーター抗体で細胞を死滅させる薬剤を運び、抗体分子標的薬とする。当該抗体分子標的薬はＡＢＣトランスポーター抗体を通じて薬剤抵抗性癌細胞と結合し、薬剤により薬剤抵抗性癌細胞の周辺で細胞を死滅させる。
【０００５】
しかし、直接的にＡＢＣトランスポーター抗体を合成する方法、若しくはＡＢＣトランスポーターを合成しＡＢＣトランスポーター抗体を選抜する方法で、ＡＢＣトランスポーター抗体／ＡＢＣトランスポーターの合成はフォールディングが正しく行われているかを考慮しなければならず、生産の際に考慮すべき要素が複雑かつ困難であり、コストの削減が難しい。また、従来の技術で合成するＡＢＣトランスポーター抗体は単一のＡＢＣトランスポーターしか認識出来ず、全種類の薬剤抵抗性癌細胞への適用は難しい。それに、従来の技術では、長期的に薬剤により薬剤抵抗性癌細胞を死滅させるには、体や腎臓への負担が小さくない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７７８５８１２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｒｋａｄｉ  Ｂ，  Ｈｏｍｏｌｙａ  Ｌ，  Ｓｚａｋaｃｓ  Ｇ，  Ｖaｒａｄｉ  Ａ．  Ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ＡＢＣＢ  ａｎｄ  ＡＢＣＧ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｈｅｍｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００６，  ８６（４）：１１７９−１２３６
【発明の概要】
【０００８】
従来の技術に欠点が存在するため、本発明はＡＢＣトランスポーター抗体の選抜に必要とする、構造が複雑なＡＢＣトランスポーターの代わりに、単純なプロセスで合成できるポリペプチドを提供する。
【０００９】
また、本発明は各種の異なる種類の薬剤抵抗性癌細胞に適用可能な、複数種のＡＢＣトランスポーター抗体を含む医薬組成物を選抜する複数種のポリペプチド及びそれらの組み合わせを提供する。
【００１０】
本発明は薬剤抵抗性癌細胞に対抗するため、体や腎臓に負担が小さい抗癌医薬組成物を提供するものでもある。
【００１１】
また、本発明はナチュラルキラー細胞が癌細胞を死滅させる能力を上昇させる抗癌医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は癌細胞の薬剤抵抗性を低減でき、化学療法と相乗作用して、薬剤抵抗性癌細胞の量を抑える抗癌医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一形態によると、下記配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。
【００１４】
なお、配列番号１〜７は、それぞれ、ＡＴＰ結合カセット輸送タンパク質配列からヒト白血球抗原と高い親和性を有する配列を選抜し、それにより設計したものであり、下記配列を有する。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
好ましくは、前記ポリペプチドは、少なくとも一種のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体と結合する。
【００１７】
また、本発明の一形態によると、抗癌医薬組成物の選抜に用いるポリペプチドが提供される。前記ポリペプチドは、配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
好ましくは、前記ポリペプチドは、人体から分離された血液、血漿、又は血清から抗癌医薬組成物を選抜するのに使用される。
【００１９】
好ましくは、前記抗癌医薬組成物は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体を少なくとも一種含む。
【００２０】
好ましくは、前記抗癌医薬組成物は、ナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅能力を上昇させる。
【００２１】
好ましくは、前記抗癌医薬組成物は、化学療法と相乗作用して薬剤抵抗性を有する癌細胞の量を抑える。
【００２２】
また、本発明の一形態によると、配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する抗体が提供される。当該抗体は、単離若しくは精製抗体又は人工抗体でありうる。
【００２３】
好ましくは、前記抗体は、ナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅能力を上昇させる。
【００２４】
好ましくは、前記抗体は、化学療法と相乗作用して、薬剤抵抗性を有する癌細胞の量を抑える。
【００２５】
また、本発明の一形態によると、試料中のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体の量を検出する検出キットが提供される。当該検出キットは、配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００２６】
また、本発明の一形態によると、配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをプローブとし、試料中のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体の量を検出する検出方法が提供される。
【００２７】
好ましくは、前記検出方法は、酵素結合免疫吸着法、ウェスタンブロッティング、バイオチップ法、磁気ビーズ分離定量法、及び他のプローブ検出法からなる群から選択される少なくとも一種の方法で、試料中ＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体を検出する。
【００２８】
好ましくは、前記検出方法は、少なくとも以下の手順を含む。
（ａ）前記ポリペプチドを容器中にコーティングする；
（ｂ）前記容器中の第一懸濁液を除去する；
（ｃ）適切な濃度の前記試料を前記容器中に投入する；
（ｄ）前記容器中の第二懸濁液を除去する；
（ｅ）第二抗体を投入する；
（ｆ）前記容器中の第三懸濁液を除去する；及び
（ｇ）前記容器中の前記第二抗体の量を検出する。
【００２９】
好ましくは、前記検出方法において、前記容器は９６ウェルプレートである。
【００３０】
好ましくは、前記検出方法において、前記試料は人体から分離された血液、血漿、又は血清からなる群から選択される少なくとも一種である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係るＡＢＣトランスポーター抗体の量を検出する検出方法の一実施形態を表すフローチャートである。
【図２】癌治療薬血漿の癌細胞の薬剤抵抗性に対する影響を表す棒グラフである。
【図３】癌治療薬血漿のナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅作用に対する影響を表す棒グラフである。
【図４】本発明に係るポリペプチドを利用してＡＢＣトランスポーター抗体を精製する方法の一実施形態を表すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
従来の技術に制限や欠点が存在するため、本発明は抗癌医薬組成物を選抜するポリペプチド及び応用方法を提供する。即ち、構成が簡単なポリペプチドを用いて、抗体を多く含む医薬組成物を選抜し、前記医薬組成物で薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる。
【００３３】
ナチュラルキラー細胞（通常はＣＤ３−ＣＤ５６＋サブセットのリンパ細胞と定義される）は人類の免疫システム上、癌細胞との対抗に重要であり、主に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣと略す）で癌細胞を死滅させる。詳しく言えば、癌細胞がＡＢＣトランスポーターを発現し（それにより薬剤抵抗性を持つ）体内又は外来のＡＢＣトランスポーター抗体と結合した時、ナチュラルキラー細胞表面のＣＤ１６分子（ＦｃｇＲIII；抗体定常部位（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の受容体，人類抗体の定常部位と特異結合する）はＡＢＣトランスポーター抗体の定常部位（例えばＩｇＧ抗体の定常部位）を認識し結合する。その後ナチュラルキラー細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こし、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）等のサイトカインを放出し薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる。
【００３４】
発明者らの長年の経験及び研究結果により、従来の技術のＡＢＣトランスポーターを分子標的とする利点を有したまま、構成が複雑な抗体／タンパク質が必要、及び、薬剤で死滅させる、という二つの欠点を除去し、より簡易で体に負担の小さい薬剤抵抗性癌細胞の死滅法が開発できると考えた。即ち、多くの種類のＡＢＣトランスポーター抗体を含む医薬組成物の選抜に用いる直鎖状ポリペプチド抗原を開発する。上記医薬組成物中のＡＢＣトランスポーター抗体は薬剤抵抗性癌細胞ＡＢＣトランスポーターと結合し、分子標的となる。さらに、ＡＢＣトランスポーター抗体はナチュラルキラー細胞のＡＤＣＣ作用を引き起こし、薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる。また、発明者は適切な直鎖状ポリペプチド抗原を設計することにより、選抜された医薬組成物のＡＢＣトランスポーター抗体は同時にＡＢＣトランスポーターを阻害することが出来、化学療法薬剤が細胞外へ輸送されることを止め、薬剤抵抗性を有する癌細胞の薬剤抵抗性を低減させると考える。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに制限されない。本発明の範囲内において当業者は各種の変更や修飾を行うこと可能であり、それらも本発明に包含される。
【００３６】
［実施例１］ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドの設計
バイオインフォマティクスを利用し、各種ＡＢＣトランスポーター（化学療法薬剤抵抗性を示すＡＢＣトランスポーター）配列から、ヒト白血球型抗原（Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡと略す；即ち人類のＭａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣと略す）と高い親和性を持つ配列を探し出す。この方法で探し出した直鎖状ポリペプチド配列は、ＡＢＣトランスポーターの表面に位置する可能性があり、ＡＢＣトランスポーターの代わりにＡＢＣトランスポーター抗体と特異結合する。
【００３７】
設計の改良及び実験による選抜を行った後、７種類の直鎖状ポリペプチド（ポリペプチドは一般的に２０〜５０個のアミノ酸により組成するが、それに限られない）を開発した。即ち、配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。上記７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチド若しくはそれらの組み合わせは、少なくとも一種のＡＢＣトランスポーター抗体と結合し、抗癌医薬組成物を選抜することが出来る。特に、上記７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチド若しくはそれらの組み合わせは、少なくとも一種の癌化学療法の薬剤抵抗性を引き起こすＡＢＣトランスポーターの抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）と構造が類似するため、化学療法の薬剤抵抗性を引き起こすＡＢＣトランスポーター抗体と結合でき、薬剤抵抗性癌細胞に対抗する抗癌医薬組成物を選抜することが出来る。
【００３８】
その中で、前記ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドと少なく一種のＡＢＣトランスポーター抗体の結合力は、リン酸緩衝塩類溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳと略す；ｐＨ  ７．４）と上記少なくとも一種のＡＢＣトランスポーター抗体の結合力より上回る。
【００３９】
［実施例２］ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドの合成
化学的方法で純度９５％以上のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドを合成する。ペプチド合成会社にＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドの合成を依頼してもよい。本願出願人は、Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（明欣生物科技有限公司）に上記７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドの合成を依頼している。
【００４０】
合成したＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドを６７％の酢酸に入れ（直鎖状ポリペプチド５ｍｇ／６７％酢酸１ｍＬ）、−２０℃で低温貯蔵する。
【００４１】
［実施例３］：抗癌医薬組成物の選抜
前記７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチド中の少なくとも一種を試料（例えば人体から分離した血液、血漿、又は血清の少なくとも一種）と混ぜ、試料中のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチド抗体複合体（以下はポリペプチド抗体複合体と略す）の量を検出した。ポリペプチド抗体複合体の量が多いものは、試料中にＡＢＣトランスポーター抗体を大量に含み、抗癌医薬組成物として使え、ナチュラルキラー細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を引き起こし、ＡＢＣトランスポーターを発現している薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる。
【００４２】
その中で、酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡと略す）又は他のポリペプチドをプローブとした検出法（例えばウェスタンブロッティング、バイオチップ法、磁気ビーズ分離定量法）を利用し、試料中のＡＢＣトランスポーター抗体の量を検出し、抗癌医薬組成物に適した試料、特に少なくとも一種の化学療法の薬剤抵抗性を引き起こすＡＢＣトランスポーターの抗体を含む抗癌医薬組成物を選抜する。以下では酵素結合免疫吸着法を例に挙げて詳しく説明する：
図１は、本発明に係る、ＡＢＣトランスポーター抗体の量を検出する検出方法の一実施形態を表すフローチャートである。図１によると、ＡＢＣトランスポーター抗体の量を検出する方法は少なくとも以下の手順を含む。
ステップＳ１：ポリペプチドを容器中にコーティングする；
ステップＳ２：容器中の第一懸濁液を除去する；
ステップＳ３：適切な濃度の試料を容器中に投入する；
ステップＳ４：容器中の第二懸濁液を除去する；
ステップＳ５：第二抗体を投入する；
ステップＳ６：容器中にある第三懸濁液を除去する；及び
ステップＳ７：容器中の第二抗体の量を検出する。
【００４３】
好ましい形態によると、ステップＳ１の容器は９６ウェルプレートである。ステップＳ１は９６ウェルプレートの第一ウェル及び第二ウェルに１００μＬのＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドを加え、第三ウェル及び第四ウェルに１００μＬの植物性タンパク質ポリペプチドを加え、４℃で８時間（又は一晩）コーティングする。
【００４４】
ここで、前記ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチド及び植物性タンパク質ポリペプチド分子は、すでにリン酸緩衝塩類溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳと略す；ｐＨ  ７．４）を用いて、５〜２０μｇ／ｍＬまで希釈している。また、前記ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドは配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを同じ比例で混合したものである。
【００４５】
ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドの第一ウェルは実験群、植物性ポリペプチドの第三ウェルは対照群、ＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドの第二ウェルは第一陰性対照群、植物性ポリペプチドの第四ウェルは第二陰性対照群である。
【００４６】
また、ステップＳ２は第一ウェル、第二ウェル、第三ウェル、第四ウェルの第一懸濁液を除去する。好ましくは、第一懸濁液を除去した後、リン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ  ７．４）で三回洗う。
【００４７】
さらに、ステップＳ３の試料として、人体から分離された血漿（血液、血清でもよいが、それらに限られない）を用いた。前記適切な濃度の試料として、血漿（又は血液、血清でもよいが、それに限らない）をリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ  ７．４）で１００〜２００倍希釈したものを用いた。ステップＳ３は、第一ウェル及び第三ウェルに前記適切な濃度の試料を１００μＬ加え、第二ウェル及び第四ウェルに酸緩衝塩類溶液（ｐＨ  ７．４）を１００μＬ加え、適切な温度で一定の時間作用させる。好ましくは、室温で２時間作用させる。
【００４８】
ステップＳ４は第一ウェル、第二ウェル、第三ウェル、第四ウェルの第二懸濁液を除去した。好ましくは、第二懸濁液を除去した後、リン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ  ７．４）で三回洗う。
【００４９】
ステップＳ５の第二抗体として、ヒトのＡＢＣトランスポーター抗体と特異結合する抗体（例えばウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体又はヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体）を用いる。ステップＳ５では、適切な量（例えば２００μＬ）及び濃度の第二抗体（例えばリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ  ７．４）で１００００倍希釈したもの）を加え、適切な温度で一定の時間作用させる。好ましくは、室温で２時間作用させる。
【００５０】
ステップＳ６は第一ウェル、第二ウェル、第三ウェル、第四ウェルの第三懸濁液を除去する。好ましくは、第三懸濁液を除去した後、リン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ  ７．４）で三〜五回洗う。
【００５１】
ステップＳ７の検出原理は、前記第二抗体のある酵素を利用し、ある化合物をある発色化合物に変換する。これにより前記第二抗体の含量は酵素の量及び色の濃さに比率し、色の濃さから第二抗体の量を推定できる。好適な場合、上記第二抗体の酵素は、テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢと略す）を青の化合物に転化する。或いは、ステップＳ７の検出原理は第二抗体にある蛍光物質を利用し、蛍光強度で第二抗体の量を推定する。
【００５２】
好ましい形態では、ステップＳ７の具体的手順は第一ウェル、第二ウェル、第三ウェル、第四ウェルに１００μＬ  ＴＭＢを加え、２０分間反応させた後に２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加え、反応を中止させる。測定波長４５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度（ＯＤ値）を測定し、特異的結合指数（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ，ＳＢＩと略す）を計算する。
ＳＢＩ＝（実験群の吸光度−第一陰性対照群の吸光度）／（対照群の吸光度−第二陰性対照群の吸光度）
ＳＢＩ値で試料（例えば人体から分離した血液、血漿、又は血清の少なくとも一種、しかしこれらに限らない）の選抜を行う場合、値が１．５以上のものは癌治療用の抗癌医薬組成物としてナチュラルキラー細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（即ちＡＤＣＣ）を引き起こすことができる。上述抗癌医薬組成物中、ＳＢＩ値が１．５を上回る血液は癌治療薬血液と呼ぶ；ＳＢＩ値が１．５を上回る血漿は癌治療薬血漿と呼ぶ；ＳＢＩ値が１．５を上回る血清は癌治療薬血清と呼ぶ。
【００５３】
［実施例４］抗癌医薬組成物効果実験
（１）化学療法薬剤抵抗性を有する癌細胞株の選抜
２４ウェルプレート中に濃度５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＭＣＦ−７乳癌細胞株を加える。１００ｎＭのミトキサントロン（即ちＭｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ、化学療法薬剤の一種；米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入可能、商品名はＭｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を加え一ヶ月間継代培養し、生き残った細胞がミトキサントロン薬剤抵抗性を有するＭＣＦ−７乳癌細胞である。
【００５４】
（２）抗癌医薬組成物の癌細胞薬剤抵抗性に対する影響
９６ウェルプレート中にミトキサントロン薬剤抵抗性を有するＭＣＦ−７乳癌細胞を加え、各ウェルに５０００個ずつ細胞を入れる。対照群中に１００ｎＭのミトキサントロン加えて培養する。実験群中に１００ｎＭのミトキサントロン及び５％の癌治療薬血漿（９５μＬの細胞液に５μＬ癌治療薬血漿加える）を加えて培養する。２４、４８、７２時間培養後、ＭＴＴ試験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）で検出し細胞の生存率を計算する。
【００５５】
図２は、癌治療薬血漿の、癌細胞の薬剤抵抗性に対する影響を表す棒グラフである。図２では、左側はミトキサントロンを加えた対照群、右側はミトキサントロン及び癌治療薬血漿を加え培養した実験群である。対照群細胞を１日間、２日間、３日間培養したところ、細胞量は、それぞれ６．４×１０３細胞／ウェル、９．４×１０３細胞／ウェル、１２．９×１０３細胞／ウェルに達した。実験群細胞を１日間、２日間、３日間培養したところ、細胞量は、それぞれ４．０×１０３細胞／ウェル、４．８×１０３細胞／ウェル、６．２×１０３細胞／ウェルに達し、同期間培養した対照群細胞と比べて有意な差があった（ｐ＜０．００１）。
【００５６】
図２より、癌治療薬血漿はミトキサントロン薬剤抵抗性を有するＭＣＦ−７乳癌細胞の成長を抑制し、抑制効果は作用時間とともに増加した。その中で、癌治療薬血漿で１日間作用させた後は３７．５％抑制、２日間作用させた後は４８．９％抑制、３日間作用させた後は５１．９％抑制されていた。
【００５７】
これにより、本発明の７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドで選抜した癌治療薬血漿は、高濃度のＡＢＣトランスポーター抗体を持ち、薬剤抵抗性癌細胞表面のＡＢＣトランスポーターと結合できるため、薬剤抵抗性癌細胞が化学療法薬剤を細胞外へ輸送することを阻害し、化学療法の効果を長期間発揮させられる。さらに、本発明の７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドで選抜した癌治療薬血漿を利用し選抜した抗癌医薬組成物は、癌細胞の薬剤抵抗性を低減でき、化学療法と相乗作用して、薬剤抵抗性癌細胞の量を有意に抑制する。
【００５８】
（３）抗癌医薬組成物の、ナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅作用に対する影響
９６ウェルプレート中にミトキサントロン薬剤抵抗性を有するＭＣＦ−７乳癌細胞を加え、各ウェルに５０００個ずつ細胞を入れる。対照群中各ウェルに２×１０４個のナチュラルキラー細胞を加える。実験群中各ウェルに２×１０４個のナチュラルキラー細胞及び５％の癌治療薬血漿（９５μＬの細胞液に５μＬ癌治療薬血漿加える）を加えて培養する。２４、４８、７２時間培養後、ＭＴＴ試験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）で検出しＭＣＦ−７乳癌細胞の生存率を計算する。
【００５９】
図３は、癌治療薬血漿の、ナチュラルキラー細胞の癌細胞を死滅させる作用に対する影響を表す棒グラフである。図３では、左側はナチュラルキラー細胞を加えた対照群、右側はナチュラルキラー細胞及び癌治療薬血漿を加え培養した実験群である。対照群細胞を１日間、２日間、３日間培養したところ、細胞量は、それぞれ４．５×１０３細胞／ウェル、５．９×１０３細胞／ウェル、８．５×１０３細胞／ウェルに達した。実験群細胞を１日間、２日間、３日間培養したところ、細胞量は、それぞれ３．１×１０３細胞／ウェル、３．５×１０３細胞／ウェル、５．０×１０３細胞／ウェルに達し、同期間培養した対照群細胞と比べて有意な差があった（ｐ＜０．００１）。
【００６０】
図３より、癌治療薬血漿はナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅効果を有意に上昇させ、効果は作用時間とともに増加した。その中で、癌治療薬血漿の作用による死滅効果は１日間作用させた後は３１．１％、２日間作用させた後は４０．７％、３日間作用させた後は４１．２％上昇した。
【００６１】
これにより、本発明の７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドで選抜した癌治療薬血漿は、高濃度のＡＢＣトランスポーター抗体を持ち、ナチュラルキラー細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を引き起こすことができるため、ナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅効果を上昇させ、大幅に薬剤抵抗性癌細胞の量を下げる。
【００６２】
本発明者らの長年の経験及び研究結果により、動物体内で本発明の医薬組成物を投薬する場合、化学療法ごとに１５０〜３００ｍＬ投薬することを勧める。
【００６３】
［実施例５］ＡＢＣトランスポーターの精製
図４は、本発明に係る、ポリペプチドを利用してＡＢＣトランスポーターを精製する方法の一実施形態を表すフローチャートである。図４によると、本発明に係る、ポリペプチドを利用してＡＢＣトランスポーターを精製する方法は、少なくとも以下の手順を含む。
ステップＳ１１：ポリペプチドを有する磁気ビーズを合成し、ポリペプチド磁気ビーズを作る；
ステップＳ１２：ポリペプチド磁気ビーズと試料を混合し、混合液を得る；
ステップＳ１３：上記混合液を磁気カラムに通す；
ステップＳ１４：緩衝液をカラムに投入し、ポリペプチド抗体複合体磁気ビーズ中のポリペプチド磁気ビーズ及びＡＢＣトランスポーターを分離する。
【００６４】
その中で、ステップＳ１１のポリペプチドは配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を有する。ステップＳ１１は磁気ビーズ会社に依頼してもよい。例えばＴａｉｗａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（台灣圓點奈米技術股ふん有限公司）に依頼する。
【００６５】
ステップＳ１２において、混合液はポリペプチド抗体複合体磁気ビーズを含む。
【００６６】
ステップＳ１３において、混合液中のポリペプチド抗体複合体磁気ビーズは磁力の影響を受けカラムに付着する。
【００６７】
ステップＳ１４において、緩衝液はポリペプチド磁気ビーズとＡＢＣトランスポーター抗体のリンクを破壊できるものを選ぶ。ステップＳ１１を磁気ビーズ会社に依頼した場合は適切な緩衝液が提供される。
【００６８】
この方法で精製したＡＢＣトランスポーター抗体は、ナチュラルキラー細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を引き起こせ、さらに抗癌薬剤又は抗癌医薬組成物の合成に利用できる。
【００６９】
上述により、本発明が提供する７種類のＡＢＣトランスポーター直鎖状ポリペプチドは、癌治療薬血液、癌治療薬血漿、癌治療薬血清の選抜、又はＡＢＣトランスポーター抗体などの抗癌医薬組成物の精製に利用できる。上述の抗癌医薬組成物はナチュラルキラー細胞の癌細胞死滅効果を全体的に上昇させ、また、薬剤抵抗性癌細胞の薬剤抵抗性も低減され、これにより化学療法薬剤は薬剤抵抗性癌細胞を死滅させる効果を得る。
【００７０】
本発明は抗癌医薬組成物の選抜に用いるポリペプチド、即ち配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列、又は配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも一のアミノ酸配列を含む２０〜５０個のアミノ酸により組成するポリペプチドを提案する。
【００７１】
また、配列番号１〜７のアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失または挿入し、派生した少なくとも一種類のＡＴＰ結合カセットトランスポーター抗体と結合できるポリペプチドも、本発明に包含される。
【００７２】
上述の実施例は本発明の好適な実施形態を示したにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。そのため、本発明の思想や範囲から逸脱しない範囲で様々な変更を施しても、本発明に包含される。
【符号の説明】
【００７３】
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１４  ステップ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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