(57)【要約】【課題】免疫系ボツリヌス毒素血清型Ａ活性アッセイに有用な細胞を提供すること。【解決手段】ＢｏＮＴ／Ａによる中毒になりやすい細胞を含む、樹立されたクローン細胞株であって、ここで、前記細胞は、３つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれら遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１．５倍の差を示し；前記遺伝子発現レベルはＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、およびＴＰＴＥからなる群より選択され；かつ、前記クローン細胞株は、約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む、樹立されたクローン細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢｏＮＴ／Ａによる中毒になりやすい細胞を含む、樹立されたクローン細胞株であって、ここで、
前記細胞は、３つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれら遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１．５倍の差を示し；
前記遺伝子発現レベルはＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、およびＴＰＴＥからなる群より選択され；かつ、
前記クローン細胞株は、約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む、
樹立されたクローン細胞株。
【請求項２】
前記細胞が、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれら遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも２．０倍の差を示すか、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞における発現レベルと比較して少なくとも３．０倍の差を示すか、または１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞における発現レベルと比較して少なくとも４．０倍の差を示す、請求項１に記載の樹立されたクローン細胞株。
【請求項３】
前記遺伝子発現レベルが前記細胞の分化の前、または前記細胞の分化の後に測定される、請求項１に記載の樹立されたクローン細胞株。
【請求項４】
前記樹立されたクローン細胞株由来の細胞が、少なくとも５回以上の細胞継代に渡って約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを示す、請求項１に記載の樹立されたクローン細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系ボツリヌス毒素血清型Ａ活性アッセイに有用な細胞に関する。
【０００２】
本出願は２００９年３月１３日に提出され、米国特許法第１１９条（ｅ）項によって、米国特許仮出願第６１／１６０，１９９号に対する優先権を主張し、全内容が引用により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書に開示されている配列は本明細書に添付された配列リストに含まれ、全内容が引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
神経伝達を阻害するボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴｓ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）などのクロストリジウム毒素の能力は、幅広い治療と美容の用途に活用されている。例えば、非特許文献１を参照のこと。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素は、ＢＯＴＯＸ（登録商標） （Ａｌｌｅｒｇａｎ， Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）， ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）、（Ｉｐｓｅｎ Ｌｔｄ．， Ｓｌｏｕｇｈ， Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＰＵＲＴＯＸ（登録商標） （Ｍｅｎｔｏｒ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）、ＸＥＯＭＩＮ（登録商標） （Ｍｅｒｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ＧｍｂＨ．， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標） （Ｍｅｄｙ−Ｔｏｘ， Ｉｎｃ．， Ｏｃｈａｎｇ−ｍｙｅｏｎ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）、ＢＴＸ−Ａ （Ｂｉｏｇｅｎ−ｔｅｃｈ Ｌｔｄ．， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）などのＢｏＮＴ／Ａ調製物およびＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）／ＮＥＵＲＯＢＬＯＣ（登録商標） （Ｓｏｌｓｔｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）などのＢｏＮＴ／Ｂ調製物を含む。一例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、現在、１つ以上の国において、以下の適応症：アカラシア、成人痙縮、肛門裂傷、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、痙性斜頸、本態性振戦、眉間の表情皺、運動過多性顔面線、頭痛、片側顔面けいれん、膀胱の亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス疾患、鼻唇褶の皺、痙攣性発声障害、斜視およびＶＩＩ脳神経障害などにおいて承認されている。
【０００５】
致死試験であるマウスＬＤ５０バイオアッセイは、製薬企業が用いる調製物の能力を発現させる「ゴールドスタンダード」試験として今でも変わっていない。例えば、非特許文献２を参照のこと。実際、医薬調製物のラベルの単位はマウスＬＤ５０の単位であり、かつ、統計的に有用なＬＤ５０データを得るのに必要な動物数は大きい。マウスＬＤ５０バイオアッセイの利点は軽鎖の酵素活性の計測のみを実施するインビトロアッセイなどのような一部の中毒過程だけの活性の計測ではなく、ボツリヌス毒素取込（例えば細胞表面の受容体に対する毒素結合、毒素受容体複合体の内在化、細胞質内への軽鎖の転座、基質の軽鎖切断）について必要なステップの全てを計測することである。数多くの動物群を使用することによって、残念ながら、マウスＬＤ５０バイオアッセイはＢｏＮＴ血清型が全く同じである測定可能なエンドポイント、および不正確である危険性の問題により多くの実験動物群を使用する高運転コスト、および特異性の欠如などの多くの欠点を有する。さらに、動物愛護団体は動物実験を削減させ、よりいっそう重要なことは製品を発売するためにはマウスＬＤ５０バイオアッセイを代替するように米国（ＦＤＡ／ＮＩＣＥＡＴＭ／ＩＣＣＶＡＭ）およびヨーロッパ（ＭＨＲＡおよびＥＤＱＭ）の規制当局、ならびにボツリヌス製剤を製造する製薬会社に圧力をかけている。規制当局はボツリヌス神経毒の力価試験へ３つの“Ｒ”（削減（Ｒｅｄｕｃｅ）、精製（Ｒｅｆｉｎｅ）、代替（Ｒｅｐｌａｃｅ））の原則を適用するように製薬会社を指導している。非特許文献３を参照のこと。近年、プロトコールを標準化し、かつ、アッセイ毎に使用する動物を減らしてより一定のデータを出すようなマウスＬＤ５０バイオアッセイを減らし、改良された方策がすでにとられている。
【０００６】
従って、ボツリヌス毒素取込に必要な全てのステップの完全性を評価できる、簡単で、信頼性があり、実証され、かつ、政府機関が承認したボツリヌス毒素活性アッセイが大変重要である。なぜなら、そのような動物を含まないアッセイは動物実験の必要性を低減し、このタイプでの動物を含むアッセイの欠点、コスト、および倫理問題を軽減するからである。Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌのコンパニオン特許出願である免疫系ボツリヌス毒素血清型Ａ活性アッセイ、特許文献１は、例えば、医薬および食品業界などの種々の業界に有用となるＢｏＮＴ／Ａ活性をアッセイする新規の組成物、細胞、および方法を提示する。そのような組成物、細胞、および方法では生きた動物または生きた動物由来の細胞を使用しないが、神経毒素作用、つまり、毒素の結合および細胞取込、細胞サイトゾル内への転座、およびプロテアーゼ活性などの全てのステップを評価することができる。
【０００７】
特許文献１で開示した方法の必要成分の一つは、低レベルのＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立された細胞株からの細胞の使用である。これは、市販されている医薬組成物内に含まれるＢｏＮＴ／Ａの量が大変低いからである。例えば、約４〜５ｎｇのＢｏＮＴ／Ａ複合体がＢＯＴＯＸ（登録商標）などの医薬組成物に含まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願第１２／４０３，５３１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ． Ｌｉｐｈａｍ， Ｃｏｓｍｅｔｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ （Ｓｌａｃｋ， Ｉｎｃ．， ２００４）
【非特許文献２】Ｓ． Ｓ． Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＪＡＭＡ ２８５： １０５９−１０７０ （２００１）
【非特許文献３】Ｄ． Ｓｔｒａｕｇｈａｎ， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ Ｒｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｔｙｐｅ Ａ， Ａｌｔｅｒｎ． Ｌａｂ． Ａｎｉｍ． ３４（３）： ３０５−３１３ （２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、試料中に非常に低い量の神経毒素がある場合、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む樹立された細胞株を特定して作製する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書は非常に低い量のＢｏＮＴ／Ａが存在する場合でのＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい新規の細胞および細胞組成物を提示し、これによりＢｏＮＴ／Ａを含めた市販されている医薬組成物がアッセイされる。
【００１２】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕ＢｏＮＴ／Ａによる中毒になりやすい細胞を含む、樹立されたクローン細胞株であって、ここで、
前記細胞は、３つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれら遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１．５倍の差を示し；
前記遺伝子発現レベルはＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、およびＴＰＴＥからなる群より選択され；かつ、
前記クローン細胞株は、約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む、
樹立されたクローン細胞株、
〔２〕前記細胞が、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれら遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも２．０倍の差を示すか、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞における発現レベルと比較して少なくとも３．０倍の差を示すか、または１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞における発現レベルと比較して少なくとも４．０倍の差を示す、〔１〕に記載の樹立されたクローン細胞株、
〔３〕前記遺伝子発現レベルが前記細胞の分化の前、または前記細胞の分化の後に測定される、〔１〕に記載の樹立されたクローン細胞株、
〔４〕前記樹立されたクローン細胞株由来の細胞が、少なくとも５回以上の細胞継代に渡って約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを示す、〔１〕に記載の樹立されたクローン細胞株
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、免疫系ボツリヌス毒素血清型Ａ活性アッセイに有用な細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は中枢と末梢神経における神経伝達物質放出およびクロストリジウム毒素の中毒についての現在のパラダイムの概略図を示す。図１Ａは中枢と末梢神経の神経伝達物質放出の放出機構の概略図を示す。放出プロセスは以下の２つのステップを含むものとして説明できる。１）神経伝達物質分子を含む小胞の小胞結合ＳＮＡＲＥ蛋白質が原形質膜に位置する膜結合ＳＮＡＲＥ蛋白質に関連する小胞ドッキング、および２）原形質膜と融合する小胞および神経伝達物質分子がエキソサイトーシスされた神経伝達物質放出。図１Ｂは、中枢と末梢神経における破傷風菌とボツリヌス毒素活性についての中毒機構の概略図を示す。この中毒プロセスは４つのステップを含むものとして説明できる。１）クロストリジウム毒素がクロストリジウムの受容体複合体と結合し中毒プロセスを開始する受容体結合、２）毒素結合後に毒素／受容体システム複合体を含む小胞が細胞内にエンドサイトーシスした複合体の内在化、３）小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル孔の形成、重鎖からのクロストリジウム毒素軽鎖の分離、軽鎖の放出等を含んだ多重事象が起こると考えられている軽鎖の転座、および４）クロストリジウム毒素の軽鎖がＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ、シンタキシンなどの標的ＳＮＡＲＥ基質の蛋白質分解を起こし、これにより小胞ドッキングおよび神経伝達物質放出を防止する酵素標的の改変。
【図１Ｂ】図１は中枢と末梢神経における神経伝達物質放出およびクロストリジウム毒素の中毒についての現在のパラダイムの概略図を示す。図１Ａは中枢と末梢神経の神経伝達物質放出の放出機構の概略図を示す。放出プロセスは以下の２つのステップを含むものとして説明できる。１）神経伝達物質分子を含む小胞の小胞結合ＳＮＡＲＥ蛋白質が原形質膜に位置する膜結合ＳＮＡＲＥ蛋白質に関連する小胞ドッキング、および２）原形質膜と融合する小胞および神経伝達物質分子がエキソサイトーシスされた神経伝達物質放出。図１Ｂは、中枢と末梢神経における破傷風菌とボツリヌス毒素活性についての中毒機構の概略図を示す。この中毒プロセスは４つのステップを含むものとして説明できる。１）クロストリジウム毒素がクロストリジウムの受容体複合体と結合し中毒プロセスを開始する受容体結合、２）毒素結合後に毒素／受容体システム複合体を含む小胞が細胞内にエンドサイトーシスした複合体の内在化、３）小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル孔の形成、重鎖からのクロストリジウム毒素軽鎖の分離、軽鎖の放出等を含んだ多重事象が起こると考えられている軽鎖の転座、および４）クロストリジウム毒素の軽鎖がＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ、シンタキシンなどの標的ＳＮＡＲＥ基質の蛋白質分解を起こし、これにより小胞ドッキングおよび神経伝達物質放出を防止する酵素標的の改変。
【図２Ａ】図２は、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０およびＨ１細胞株において４倍（Ｉｏｇ２（４）＝２）を超えるアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のボルケイノプロットを示す。図２Ａは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｃは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｄは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｅは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｆは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｇは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｈは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。各ドットはプローブセットを表す。破線は９５％信頼区間、ｐ≦０．０５を表す。また、２Ｄ６（ＡおよびＢ）と比較して、ＢＢ１０およびＨ１において過剰に発現した大部分の遺伝子はＰＡ（Ｃ）と比較して、ＢＢ１０、ならびにＰＡ（Ｄ）と比較して、Ｈ１、ならびに２Ｄ６（Ｅ）と比較して、ＰＡにおいて過剰に発現または過少に発現したが、いくつかは４倍未満の過剰の発現であり、および／または９５％信頼区間を超えない。
【図２Ｂ】図２は、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０およびＨ１細胞株において４倍（Ｉｏｇ２（４）＝２）を超えるアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のボルケイノプロットを示す。図２Ａは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｃは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｄは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｅは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｆは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｇは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｈは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。各ドットはプローブセットを表す。破線は９５％信頼区間、ｐ≦０．０５を表す。また、２Ｄ６（ＡおよびＢ）と比較して、ＢＢ１０およびＨ１において過剰に発現した大部分の遺伝子はＰＡ（Ｃ）と比較して、ＢＢ１０、ならびにＰＡ（Ｄ）と比較して、Ｈ１、ならびに２Ｄ６（Ｅ）と比較して、ＰＡにおいて過剰に発現または過少に発現したが、いくつかは４倍未満の過剰の発現であり、および／または９５％信頼区間を超えない。
【図２Ｃ】図２は、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０およびＨ１細胞株において４倍（Ｉｏｇ２（４）＝２）を超えるアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のボルケイノプロットを示す。図２Ａは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｃは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｄは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｅは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｆは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｇは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｈは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。各ドットはプローブセットを表す。破線は９５％信頼区間、ｐ≦０．０５を表す。また、２Ｄ６（ＡおよびＢ）と比較して、ＢＢ１０およびＨ１において過剰に発現した大部分の遺伝子はＰＡ（Ｃ）と比較して、ＢＢ１０、ならびにＰＡ（Ｄ）と比較して、Ｈ１、ならびに２Ｄ６（Ｅ）と比較して、ＰＡにおいて過剰に発現または過少に発現したが、いくつかは４倍未満の過剰の発現であり、および／または９５％信頼区間を超えない。
【図２Ｄ】図２は、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０およびＨ１細胞株において４倍（Ｉｏｇ２（４）＝２）を超えるアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のボルケイノプロットを示す。図２Ａは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｃは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｄは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｅは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｆは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｇは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｈは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。各ドットはプローブセットを表す。破線は９５％信頼区間、ｐ≦０．０５を表す。また、２Ｄ６（ＡおよびＢ）と比較して、ＢＢ１０およびＨ１において過剰に発現した大部分の遺伝子はＰＡ（Ｃ）と比較して、ＢＢ１０、ならびにＰＡ（Ｄ）と比較して、Ｈ１、ならびに２Ｄ６（Ｅ）と比較して、ＰＡにおいて過剰に発現または過少に発現したが、いくつかは４倍未満の過剰の発現であり、および／または９５％信頼区間を超えない。
【図２Ｅ】図２は、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０およびＨ１細胞株において４倍（Ｉｏｇ２（４）＝２）を超えるアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のボルケイノプロットを示す。図２Ａは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｃは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、ＢＢ１０細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｄは、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）と比較して、Ｈ１細胞株でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｅは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でアップレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｆは、２Ｄ６細胞株と比較して、ＢＢ１０細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｇは、２Ｄ６細胞株と比較して、Ｈ１細胞株でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｈは、２Ｄ６細胞株と比較して、親ＳｉＭａ細胞株（ＰＡ）でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。各ドットはプローブセットを表す。破線は９５％信頼区間、ｐ≦０．０５を表す。また、２Ｄ６（ＡおよびＢ）と比較して、ＢＢ１０およびＨ１において過剰に発現した大部分の遺伝子はＰＡ（Ｃ）と比較して、ＢＢ１０、ならびにＰＡ（Ｄ）と比較して、Ｈ１、ならびに２Ｄ６（Ｅ）と比較して、ＰＡにおいて過剰に発現または過少に発現したが、いくつかは４倍未満の過剰の発現であり、および／または９５％信頼区間を超えない。
【図３Ａ】図３は７．８ｎＭの抗体である２Ｅ２Ａ６、１Ｄ３Ｂ８、３C１Ａ５および２Ｃ９Ｂ１０、ならびに市販のＭＣ−６０５０とＭＣ−６０５３の正規化ＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲカーブを示す。図３Ａは、各抗体のオン・レートについて正規化データを示す。図３Ｂは、各抗体のオフ・レートについて正規化データを示す。
【図３Ｂ】図３は７．８ｎＭの抗体である２Ｅ２Ａ６、１Ｄ３Ｂ８、３C１Ａ５および２Ｃ９Ｂ１０、ならびに市販のＭＣ−６０５０とＭＣ−６０５３の正規化ＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲカーブを示す。図３Ａは、各抗体のオン・レートについて正規化データを示す。図３Ｂは、各抗体のオフ・レートについて正規化データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書はＢｏＮＴ／Ａを含む市販されている医薬組成物などのＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａ組成物のアッセイをすることができるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい新規の細胞および細胞組成物を提示する。Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌの免疫系ボツリヌス毒素血清型Ａ活性アッセイ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号などに開示された方法などの本明細書で開示する細胞および細胞組成物は試料中のピコモル量のＢｏＮＴ／Ａを検出することができる方法を実施するのに有用であり、全内容が引用により本明細書に組み込まれる。本細胞および細胞組成物、ならびにＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法での使用は動物毒性試験にニーズを減らすがＢｏＮＴ／Ａ中毒の複数のステップ、つまり結合および毒素の細胞取込、細胞サイトゾル内への転座、およびプロテアーゼ活性などのを解析に役立つ。以下に説明するように本明細書の新規の細胞および細胞組成物は、粗試料およびバルク試料ならびに高度に精製された２本鎖毒素および処方毒素製品を解析するアッセイで使用することができ、また、自動高速スループットアッセイ形式に適している。
【００１６】
従って、本明細書の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすいクローン細胞株由来の細胞を含む細胞組成物を提供する。
【００１７】
本明細書の他の態様は、本明細書で開示したクローン細胞株を使用してＢｏＮＴ／Ａ活性を検出する方法を提供する。
【００１８】
ボツリヌス菌、破傷風菌、クロストリジウム・バラティおよび酪酸菌が産生するクロストリジウム毒素はヒトおよび他の哺乳類への広い治療と美容処理に幅広く使われている。ボツリヌス菌株はヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／ＥおよびＢｏＮＴ／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１およびＢｏＮＴ／Ｄ）または土壌から分離（ＢｏＮＴ／Ｇ）におけるボツリヌス症の発生を調べて同定されているボツリヌス毒素（ＢｏＮＴｓ）の抗原性の異なる７つの血清型を産生する。７つボツリヌス毒素の血清型の全ては類似する構造と生物特性を有する一方で、例えば、薬理学的性質などの異種的な特性をも示す。対照的に、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は破傷風菌の統一された群により産生される。さらに、クロストリジウムの他の２つの種であるクロストリジウム・バラティおよび酪酸菌はＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｅに類似する毒素をそれぞれ産生する。
【００１９】
それぞれのクロストリジウム毒素は内因性クロストリジウムの毒素プロテアーゼなどの天然のプロテアーゼまたは環境中で産生される天然のプロテアーゼなどが原因で、後にジスルフィドループ内でタンパク質分解切断によって開裂する約１５０ｋＤａの単一鎖ポリペプチドとして翻訳される。この翻訳後プロセスは単一ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用によりまとめられている約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）と約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含む２本鎖分子を生じる。それぞれの成熟した２本鎖分子は機能的に異なる３つのドメインを含む。１）神経伝達物質放出装置のコアとなる成分を特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置する酵素ドメイン、２）細胞内小胞から標的細胞の細胞質内へのＬＣの放出を促進するＨＣ（ＨＮ）のアミノ末端半分以内に含有される転座ドメイン、および３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体に対する毒素の結合活性および結合特異性を決定するＨＣ（ＨＣ）のカルボキシ末端半分以内に認められる結合ドメイン。
【００２０】
これら３つの機能的ドメインの結合、転座および酵素活性は毒性に必要なものである。このプロセスに関する詳細は正確にはまだ明らかになっていないがクロストリジウム毒素がニューロンに入り神経伝達物質放出を阻害するという総合的な細胞中毒機構は血清型またはサブタイプに係らずに類似している。出願人は以下の記載により限定されることを望まないが中毒機構は少なくとも４つのステップを含むものとして説明できる。１）受容体結合、２）複合体の内在化、３）軽鎖の転座、および４）酵素標的の改変（図１）。クロストリジウム毒素のＨｃ結合ドメインが標的細胞の原形質膜表面に位置する毒素特異的な受容体システムに結合する場合にプロセスが開始される。受容体複合体の結合特異性はガングリオシドおよび個々のクロストリジウム毒素受容体複合体を明確に含むと考えられる蛋白質受容体の特定の組み合わせにより一部は達成されると考えられる。結合後、毒素／受容体複合体はエンドサイトーシスにより取り込まれ、かつ、取り込まれた小胞は特定の細胞内経路へ区分けされる。転座ステップは小胞コンポーネントの酸性化により起こされると考えられる。このプロセスは疎水性を増大させ、小孔形成を促進させ、毒素の重鎖と軽鎖の分離を促進させる重要なｐＨ依存性の構造再構成を開始すると思われる。分離後は細胞内小胞から神経伝達物質放出装置のコアとなる成分を特異的に標的とすると考えられるサイトゾルへ毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが放出される。このコアとなる蛋白質、小胞結合膜蛋白質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａシナプトソーム結合蛋白質（ＳＮＡＰ２５）およびシンタキシンは、神経終末でのシナプス小胞ドッキングおよび融合に必要であり、かつ、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子接着蛋白質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅはカルボキシル末端領域におけるＳＮＡＰ−２５を切断し、９または２６のアミノ酸断片をそれぞれ放出し、さらに、ＢｏＮＴ／Ｃ１はカルボキシル末端の近傍のＳＮＡＰ−２５を切断して８つのアミノ酸断片を放出する。ボツリヌス血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存されている中央部分に働き、かつ、ＶＡＭＰのアミノ酸末端部分をサイトゾルへ放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１はサイトゾルの膜表面の近傍の単一の部位でシンタキシンを切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的な蛋白質分解は、インビボでクロストリジウム毒素により起こる神経伝達物質放出のブロックに関係がある。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥ蛋白質標的は、さまざまな非神経細型におけるエキソサイトーシスに共通であり、神経細胞と同様にこのような細胞において軽鎖ペプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻害する。例えば、Ｙａｎｎ Ｈｕｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．、Ｈｏｗ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ａｎｄ Ｔｅｔａｎｕｓ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ Ｂｌｏｃｋ Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｒｅｌｅａｓｅ、８２（５） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ． ４２７−４４６ （２０００）； Ｋａｔｈｒｙｎ Ｔｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ａｎｄ Ｔｅｔａｎｕｓ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｔｉｌｉｔｙ、２７（１１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ５５２−５５８ （２００２）； Ｇｉｏｖａｎｎａ ＬａＩＩｉ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎｅｙ ｏｆ Ｔｅｔａｎｕｓ ａｎｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ、１１（９） Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３１−４３７ （２００３）を参照のこと。
【００２１】
本開示の態様は、樹立された細胞株からの細胞の一部を含む。本明細書において「細胞」は、ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ａを取り込む任意の真核細胞によるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい真核細胞を言う。細胞という用語はさまざまな生物由来、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、ヒトの細胞などの細胞を含む。それらはさまざまな細胞型、例えば、神経細型および非神経細型由来で異種細胞集団、組織または臓器からまたはその一部から分離できるものである。本明細書で使用されるとき、用語「樹立された細胞株」は、「死化細胞株」または「形質転換細胞株」と同意語とみなし、かつ、組織、細胞または臓器由来の細胞集団からの不明確な増殖について選択された細胞の細胞培養を言う。定義に従い、樹立された細胞株は一次細胞の細胞培養を除く。本明細書で使用されるとき、用語「一次細胞」は、新鮮組織または臓器から直接収集した細胞であり、不確定に増殖する可能性を持たない。樹立された細胞株は細胞の異種集団または細胞の均一集団を含むことができる。単細胞由来の樹立された細胞株はクローン細胞株と言う。樹立された細胞株はＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし、ＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒素／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質内へＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む全般的な細胞機構を行う細胞に必要な全ての成分を内因的に発現する細胞であってもよい。あるいは、樹立された細胞株は、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし、ＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒素／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質内へＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む全般的な細胞機構を行う細胞に必要な少なくとも１つの成分の外因性源から導入された細胞であってもよい。また、遺伝子改変細胞株において、そのような樹立された細胞株由来の細胞は、例えば、外因性ＦＧＦＲ２、外因性ＦＧＦＲ３、外因性ＳＶ２、外因性ＳＮＡＰ−２５またはこれらの組み合せを発現してもよい。本明細書で使用されるとき、用語「樹立された細胞株」または「クローン細胞株」は、親細胞株とも称される樹立された細胞株を含む細胞型の異種細胞集団から選択された細胞の細胞培養を言う。従って、非限定的な例として、Ａ６、Ａ７、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ｂ５、Ｂ１０、Ｃ５、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｄ７、Ｄ１１、Ｅ１１、Ｆ１０、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ８、Ｈ１０、１Ｅ３、２Ｂ９、２Ｅ４、３Ｂ８、３Ｄ５、３Ｇ１０、４Ｂ５、４Ｃ８、５Ｆ３、ＡＣ９、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、ＢＥ３、ＢＦ８、ＣＣ１１、ＣＤ６、ＣＥ６、ＣＧ８、ＣＧ１０、ＤＣ４、ＤＤ１０、ＤＥ７、ＹＦ５、およびＨ１ １．４クローン細胞株からの細胞はＳｉＭａ細胞株（または親ＳｉＭａ細胞株）ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４を含む異種細胞集団から選択された。
【００２２】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立されたクローン細胞株からの細胞を一部は含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞」、「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞」または「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立されたクローン細胞株からの細胞」は、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす、ＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒素／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質内へＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む全般的な細胞機構を行うことができる細胞を言う。定義に従い、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞は少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ａ受容体および少なくとも１つのＳＮＡＰ−２５を発現するか、発現するように改変されなければならない。ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞由来の細胞の非限定的な例は、Ａ６、Ａ７、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ｂ５、Ｂ１０、Ｃ５、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｄ７、Ｄ１１、Ｅ１１、Ｆ１０、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ８、Ｈ１０、１Ｅ３、２Ｂ９、２Ｄ２、２Ｄ６、２Ｅ４、３Ｂ８、３Ｄ５、３Ｇ１０、４Ｂ５、４Ｃ８、４Ｄ３、５Ｃ１０、５Ｆ３、ＡＣ９、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、ＢＥ３、ＢＦ８、ＣＣ１１、ＣＤ６、ＣＥ６、ＣＧ８、ＣＧ１０、ＤＣ４、ＤＤ１０、ＤＥ７、ＤＦ５、ＹＢ７、ＹＦ５およびＨ１ １．４クローン細胞株を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａを取り込む細胞」または「ＢｏＮＴ／Ａを取り込む樹立したクローン細胞株を含む細胞」は、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす、ＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合、神経毒素／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質内へＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む全般的な細胞機構を行うことができる細胞を言う。定義に従い、ＢｏＮＴ／Ａを取り込む細胞は少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ａ受容体および少なくとも１つのＳＮＡＰ−２５を発現するか発現するように改変されなければならない。ＢｏＮＴ／Ａを取り込む樹立したクローン細胞株由来の細胞の非限定的な例は、Ａ６、Ａ７、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、Ｂ５、Ｂ１０、Ｃ５、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｄ７、Ｄ１１、Ｅ１１、Ｆ１０、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ８、Ｈ１０、１Ｅ３、２Ｂ９、２Ｄ２、２Ｄ６、２Ｅ４、３Ｂ８、３Ｄ５、３Ｇ１０、４Ｂ５、４Ｃ８、４Ｄ３、５Ｃ１０、５Ｆ３、ＡＣ９、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、ＢＥ３、ＢＦ８、ＣＣ１１、ＣＤ６、ＣＥ６、ＣＧ８、ＣＧ１０、ＤＣ４、ＤＤ１０、ＤＥ７、ＤＦ５、ＹＢ７、ＹＦ５およびＨ１ １．４クローン細胞株を含む。ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞由来の細胞を含む細胞株およびＢｏＮＴ／Ａを取り込む細胞は「応答性細胞株」と言う。
【００２３】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすい細胞」、「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすい細胞」または「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞」は、例えば、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４などの親ＳｉＭａ細胞株を含む細胞と比較して、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行う程度が大きい細胞を言う。ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞の非限定的な例はＡ１０、Ｈ１、２Ｅ４、３Ｂ８、３Ｄ５、５Ｆ３、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、ＤＣ４またはＨ１ １．４クローン細胞株を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａをより取り込む細胞」または「ＢｏＮＴ／Ａをより取り込む樹立したクローン細胞株を含む細胞」は、例えば、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４などの親ＳｉＭａ細胞株を含む細胞と比較して、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行う程度が大きい細胞を言う。ＢｏＮＴ／Ａをより取り込む樹立したクローン細胞株由来の細胞の非限定的な例は、Ａ１０、Ｈ１、２Ｅ４、３Ｂ８、3Ｄ５、５Ｆ３、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、ＤＣ４またはＨ１ １．４クローン細胞株を含む。ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞またはＢｏＮＴ／Ａをより取り込む細胞を含む細胞株は「高反応性細胞株」と言う。
【００２４】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりにくい細胞」、「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりにくい細胞」または「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞」は、例えば、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４などの親ＳｉＭａ細胞株を含む細胞と比較して、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行う程度が小さい細胞を言う。ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞の非限定的な例は、Ａ７、Ｂ１０、Ｄ１１、Ｈ１０、２Ｄ２、２Ｄ６、４Ｄ３、５Ｃ１０、ＤＦ５またはＹＢ７クローン細胞株を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａをより取り込みしない細胞」または「ＢｏＮＴ／Ａをより取り込みしない樹立したクローン細胞株を含む細胞」は、例えば、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４などの親ＳｉＭａ細胞株を含む細胞と比較してＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行う程度が小さい細胞を言う。ＢｏＮＴ／Ａをより取り込みしない樹立したクローン細胞株由来の細胞の非限定的な例はＡ７、Ｂ１０、Ｄ１１、Ｈ１０、２Ｄ２、２Ｄ６、４Ｄ３、５Ｃ１０、ＤＦ５およびＹＢ７クローン細胞株を含む。ＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞またはＢｏＮＴ／Ａをより取り込みしない細胞を含む細胞株は「低反応性細胞株」と言う。
【００２５】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい細胞」、「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい細胞」または「ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞」は、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行うことができない細胞を言う。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａを取り込みできない細胞」または「ＢｏＮＴ／Ａを取り込みできない樹立したクローン細胞株を含む細胞」は、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行うことができない細胞を言う。ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい樹立したクローン細胞株由来の細胞またはＢｏＮＴ／Ａをより取り込みできない細胞を含む細胞株は「非反応性細胞株」と言う。
【００２６】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい。本実施形態の態様では、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下または約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａによる樹立したクローン細胞株由来の細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい。本実施形態の別の態様では、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下または約１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａによる樹立したクローン細胞株由来の細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい。更に別の態様では、約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下または約１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａによる樹立したクローン細胞株由来の細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい。更に別の態様では、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下または約０．１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａによる樹立したクローン細胞株由来の細胞はＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい。本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載された事項、数、パーセンテージまたは用語の値が特定された場合には、記載された事項、パーセンテージ、パラメータまたは用語の値のプラスまたはマイナス１０パーセントの範囲を言う。
【００２７】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は、ＢｏＮＴ／Ａを取り込みできる。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭまたは約１００ｐＭのＢｏＮＴ／Ａを取り込みできる。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下または約１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込む能力を持つ。更に別の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は、約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下または約１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込む能力を持つ。更に別の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下または約０．１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａを取り込む能力を持つ。別の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は、例えば、約０．０１ｐＭ〜約１００ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約７５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約２０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約１５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約１０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１００ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約７５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約２０ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１０ｐＭ、または約０．００１ｐＭ〜約５ｐＭのＢｏＮＴ／ＡからＢｏＮＴ／Ａを取り込める。
【００２８】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下または約１００ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、または約１０ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい。更に別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい。更に別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下、または約０．１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい。別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約０．０１ｐＭ〜約１００ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約７５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約２０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約１５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約１０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１００ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約７５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約２０ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１０ｐＭ、または約０．００１ｐＭ〜約５ｐＭのＢｏＮＴ／ＡからのＢｏＮＴ／Ａ中毒になりにくい。
【００２９】
本開示の態様では、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４などの親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞よりも安定しているＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「安定している」とは同様のアッセイ状態および同様のＢｏＮＴ／Ａ（または分子）が両方のアッセイで使用される、同様または類似した継代数において、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４などの親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞により示される相対的なＥＣ５０、感受性、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線の値と類似するＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０、感受性、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線を示す特定の継代数についての樹立したクローン細胞株由来の細胞を言う。
【００３０】
従って、一実施形態では、親ＳｉＭａ細胞株と比較して樹立したクローン細胞株由来の細胞はより安定している。本実施形態の一態様では、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４と比較して樹立したクローン細胞株由来の細胞はより安定している。本実施形態の別の局面では、親ＳｉＭａ細胞株と比較して樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、少なくとも５以上の継代、少なくとも１０以上の継代、少なくとも１５以上の継代、少なくとも２０以上の継代、少なくとも２５以上の継代、または少なくとも３０以上の継代についてより安定している。本実施形態の更に別の態様では、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４と比較して樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、少なくとも５以上の継代、少なくとも１０以上の継代、少なくとも１５以上の継代、少なくとも２０以上の継代、少なくとも２５以上の継代、または少なくとも３０以上の継代についてより安定している。
【００３１】
本開示の態様は、複数回の細胞継代に渡って安定しているＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「安定している」とは同様のアッセイ状態および同様のＢｏＮＴ／Ａ（または分子）が両方のアッセイで使用され、先行する継代からでなく同様の樹立したクローン細胞株由来の細胞により示される相対的なＥＣ５０、感受性、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線の値と類似するＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０、感受性、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線を示す特定の継代数についての樹立したクローン細胞株由来の細胞を言う。
【００３２】
本明細書において開示する樹立した細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡ってＢｏＮＴ／Ａ活性に対して一定した感受性を示すことができる。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ活性に対する感受性」は、無治療対照またはバックグラウンドシグナルで検出できるシグナル以上においてアッセイが一定して計測できる最小用量を言う。
【００３３】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、１００ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下、約０．１ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａである任意の所与の継代についてＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約０．０１ｐＭ〜約１００ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約７５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約２０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約１５ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約１０ｐＭ、約０．０１ｐＭ〜約５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１００ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約７５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約２０ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１５ｐＭ、約０．００１ｐＭ〜約１０ｐＭ、または約０．００１ｐＭ〜約５ｐＭのＢｏＮＴ／Ａである任意の所与の継代についてＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す。
【００３４】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代または５０以上の細胞継代について約１００ｐＭ以下、約７５ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約２５ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１５ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下または約１ｐＭ以下であるＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す。本実施形態の別の局面では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約１５〜約６０の継代、約２０〜約６０の継代、約２５〜約６０の継代、約３０〜約６０の継代、約３５〜約６０の継代、約４０〜約６０の継代、約４５〜約６０の継代、約５０〜約６０の継代、約１５〜約５０の継代、約２０〜約５０の継代、約２５〜約５０の継代、約３０〜約５０の継代、約３５〜約５０の継代、約４０〜約５０の継代、約１５〜約４０の継代、約２０〜約４０の継代、約２５〜約４０の継代、または約３０〜約４０の継代であり、約１００ｐＭ以下、約７５ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約２５ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１５ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下または約１ｐＭ以下であるＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す。
【００３５】
本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡ってＢｏＮＴ／Ａ取込、ＢｏＮＴ／Ａ活性またはＢｏＮＴ／Ａ中毒についての一貫性がある相対的な有効性を示す。本明細書で使用されるとき、用語「相対的な有効性」は、どの程度現在のアッセイ試験において検出されたＢｏＮＴ／Ａ活性について上漸近線がそのアッセイで使用されている標準物質、標準分子または標準継代数において検出されたＢｏＮＴ／Ａ活性についての上漸近線と比較できるのかを言う。本明細書で使用されるとき、用語「上漸近線についてのシグナル対ノイズ比」は、無治療対照またはバックグラウンドシグナルで検出できるシグナルで分割した検出の最大値でアッセイにおいて検出されたシグナルを言う。検出の最大値はシグナルの飽和が起こる前におけるシグナルのアッセイが一貫して測定ができる最高用量である。
【００３６】
従って、一実施形態では、本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡って明確に定義された上漸近線を示ことができ、かつ、アッセイにとって一貫して十分なシグナル対ノイズ比を維持することができる。本実施形態の態様では、本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、または５０以上の細胞継代でＢｏＮＴ／Ａ活性に関する上漸近線について、例えば、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１、または少なくとも６００：１のシグナル対ノイズ比を有さなければならない。本実施形態の別の態様では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約１５〜約６０の継代、約２０〜約６０の継代、約２５〜約６０の継代、約３０〜約６０の継代、約３５〜約６０の継代、約４０〜約６０の継代、約４５〜約６０の継代、約５０〜約６０の継代、約１５〜約５０の継代、約２０〜約５０の継代、約２５〜約５０の継代、約３０〜約５０の継代、約３５〜約５０の継代、約４０〜約５０の継代、約１５〜約４０の継代、約２０〜約４０の継代、約２５〜約４０の継代、約３０〜約４０の継代でＢｏＮＴ／Ａ活性に関する上漸近線について、例えば、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１、または少なくとも６００：１のシグナル対ノイズ比を有しなければならない。
【００３７】
本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡ってＢｏＮＴ／Ａ活性について明確に定義された用量応答曲線を示すことできる。本明細書で使用されるとき、用語「用量応答曲線」は、どの程度生データがかかるアッセイについての選択の統計モデルに適合するかを言う。非限定的な例として、４−パラメーターロジスティック適合表示のＳ字状曲線は、効力アッセイなどの酵素活性アッセイについての用量応答曲線である。別の非限定的な例として、単一部位飽和適合があるリガンド結合はリガンド／抗体結合アッセイについての用量応答曲線である。
【００３８】
従って、一実施形態では、本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡ってＢｏＮＴ／Ａ活性について明確に定義された用量応答曲線を示す。本実施形態の態様では、本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、または５０以上の細胞継代でＢｏＮＴ／Ａ活性について明確に定義された用量応答曲線を示す。本実施形態の別の態様では、本明細書において開示した樹立した細胞株由来の細胞は、例えば、約１５〜約６０の継代、約２０〜約６０の継代、約２５〜約６０の継代、約３０〜約６０の継代、約３５〜約６０の継代、約４０〜約６０の継代、約４５〜約６０の継代、約５０〜約６０の継代、約１５〜約５０の継代、約２０〜約５０の継代、約２５〜約５０の継代、約３０〜約５０の継代、約３５〜約５０の継代、約４０〜約５０の継代、約１５〜約４０の継代、約２０〜約４０の継代、約２５〜約４０の継代、または約３０〜約４０の継代で、ＢｏＮＴ／Ａ活性について明確に定義された用量応答曲線を示す。
【００３９】
本明細書において開示する樹立した細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡ってＢｏＮＴ／Ａ活性について一貫性がある相対的なＥＣ５０値を示すことができる。本明細書で使用されるとき、用語「相対的なＥＣ５０」または「相対的なＥＣ５０値」は、そのアッセイで使用されている標準物質、標準分子または標準継代数について計算したＥＣ５０に対して正規化したＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０値を言う。
【００４０】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、複数回の細胞継代に渡ってＢｏＮＴ／Ａ活性について一貫性がある相対的なＥＣ５０値を示す。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、または５０以上の細胞継代についてのＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０値について、例えば、約±１０％、約±２０％、約±３０％、約±４０％、約±５０％、約６０％、約７０％または約±７５％のＢｏＮＴ／Ａ活性の一貫性のある相対的なＥＣ５０値を示す。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、または５０以上の細胞継代についてのＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０値について、例えば、約±１０％〜約７５％、約±１０％〜約７０％、約±１０％〜約６０％、約±１０％〜約５０％、約±１０％〜約４０％、約±１０％〜約３０％または約±１０％〜約２０％のＢｏＮＴ／Ａ活性の相対的なＥＣ５０値を示す。
【００４１】
本開示の態様は、表５、６、７または８に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示すＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表５、６、７または８に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の差を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表５、６、７または８に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおける差を示す。更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、表５、６、７または８に記載の約５遺伝子から約１００遺伝子、約１０遺伝子から約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおける差を示す。表５、６、７および８に記載の対数比は、０．５８５が１．５倍の差のｌｏｇ２（１．５）、１が２倍の差のｌｏｇ２（２）、１．５８４が３倍の差のｌｏｇ２（３）、２が４倍の差のｌｏｇ２（４）、２．３２１が５倍の差のｌｏｇ２（５）、２．５８４が６倍の差のｌｏｇ２（６）、２．８０７が７倍の差のｌｏｇ２（７）、３が８倍の差のｌｏｇ２（８）、３．１６９が９倍の差のｌｏｇ２（９）、および３．３２１が１０倍の差のｌｏｇ２（１０）であるｌｏｇ２の値を表す。
【００４２】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表５または７に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、表５または７に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、例えば、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表５または７に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおける増加を示す。更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表５または７に記載の約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、約２５遺伝子〜約５０遺伝子の遺伝子発現レベルにおける増加を示す。
【００４３】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較してＡ２ＢＰ１、ＡＣＯ１、ＡＣＯＴ７、ＡＣＯＴ９、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＣＴＬ６Ｂ、ＡＤＲＢＫ２、ＡＧＰＳ、ＡＩＤＡ、ＡＫＡＰ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＡＭＯＴＬ１、ＡＮＡＰＣ７、ＡＮＫＲＤ１３Ａ、ＡＮＫＲＤ５４、ＡＮＫＳ１Ｂ、ＡＮＬＮ、ＡＮＰ３２Ｅ、ＡＮＸＡ６、ＡＰＡＦ１、ＡＰＢＢ２、ＡＰＯＯ、ＡＲＦ３、ＡＲＨＧＡＰ１１Ａ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＬ１３Ｂ、ＡＲＬ６、ＡＲＬ６ＩＰ１、ＡＳＣＬ１、ＡＳＦ１Ａ、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＳＸＬ３、ＡＴＡＤ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＲ、ＢＮＣ２、ＢＯＫ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ４、ＢＲＩ３ＢＰ、ＢＲＩＰ１、ＢＴＢＤ３、ＢＴＧ３、ＢＵＢ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＢＵＢ３、ＢＶＥＳ、Ｃ１０ＯＲＦ５８、Ｃ１０ＯＲＦ７８、Ｃ１１ＯＲＦ７５、Ｃ１２ＯＲＦ４８、Ｃ１２ＯＲＦ４９、Ｃ１４ＯＲＦ１０６、Ｃ１４ＯＲＦ１４３、Ｃ１５ＯＲＦ２３、Ｃ１５ＯＲＦ４２、Ｃ１８ＯＲＦ５４、Ｃ１ＯＲＦ１１２、Ｃ１ＯＲＦ１８３、Ｃ１ＯＲＦ４３、Ｃ１ＱＬ１、Ｃ２０ＯＲＦ１０８、Ｃ２０ＯＲＦ２０、Ｃ２０ＯＲＦ７、Ｃ２０ＯＲＦ７２、Ｃ２２ＯＲＦ２８、Ｃ２２ＯＲＦ２９、Ｃ２２ＯＲＦ３９、Ｃ３ＯＲＦ１４、Ｃ３ＯＲＦ７０、Ｃ４ＯＲＦ４６、Ｃ４ＯＲＦ４９、Ｃ５ＯＲＦ３２、Ｃ６ＯＲＦ１１５、Ｃ９ＯＲＦ１００、ＣＡＲＨＳＰ１、ＣＢＬＢ、ＣＢＷＤ１、ＣＢＸ５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＣＤＣ１１７、ＣＣＤＣ１５、ＣＣＤＣ２１、ＣＣＤＣ３、ＣＣＤＣ３４、ＣＣＤＣ５２、ＣＣＤＣ８６、ＣＣＤＣ９９、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＮＦ、ＣＣＮＹＬ１、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ９、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ４２ＥＰ４、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＤＣ５Ｌ、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ２、ＣＤＣＡ４、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ７、ＣＤＣＡ８、ＣＤＨ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＣＤＫ６、ＣＤＫＡＬ１、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＣＤＯ１、ＣＤＳ２、ＣＥＣＲ５、ＣＥＬＳＲ３、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＨ）、ＣＥＮＰＩ、ＣＥＮＰＪ、ＣＥＮＰＫ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮＰＭ、ＣＥＮＰＮ、ＣＥＮＰＯ、ＣＥＰ１３５、ＣＥＰ１５２、ＣＥＰ５５、ＣＥＰ７８、ＣＥＰ９７、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＨＤ６、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＲＮＡ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＨＳＴ１５、ＣＩＴ、ＣＫＡＰ２、ＣＫＡＰ２Ｌ、ＣＫＬＦ、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＬＤＮＤ１、ＣＬＳＴＮ２、ＣＭＴＭ７、ＣＮＮ３、ＣＮＯＴ４、ＣＮＰ、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ４、ＣＯＢＬＬ１、ＣＯＱ３、ＣＰＮＥ４、ＣＰＴ１Ａ、ＣＰＶＬ、ＣＲＩＳＰＬＤ１、ＣＲＴＡＣ１、ＣＲＹＢＧ３、ＣＲＹＺ、ＣＳＥ１ Ｌ、ＣＳＲＰ２、ＣＳＲＰ２ＢＰ、ＣＳＴＦ１、ＣＴＤＳＰＬ２、ＣＴＮＮＢＬ１、ＣＴＳＬ２、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＴＳＡ、ＤＡＣＴ１、ＤＡＺ１、ＤＢＦ４Ｂ、ＤＢＨ、ＤＣＬＲＥ１ Ｂ、ＤＣＰＳ、ＤＤＡＨ２、ＤＤＴ、ＤＥＫ、ＤＥＮＲ、ＤＥＰＤＣ１、ＤＥＰＤＣ１Ｂ、ＤＥＲＡ���ＤＧＣＲ１４、ＤＧＫＥ、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３５、ＤＩＡＰＨ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＫＦＺＰ４３４Ｌ１８７、ＤＬＥＵ２、ＤＬＧＡＰ５、ＤＬＬ３、ＤＬＸ６、ＤＮＡ２、ＤＮＭ３、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＯＣＫ１０、ＤＯＫ４、ＤＯＫ５、ＤＰＦ１、ＤＰＹＤ、ＤＰＹＳＬ３、ＤＲＡＭ１、ＤＲＧ１、ＤＳＣＣ１、ＤＳＮ１、ＤＴＬ、ＤＴＮＢＰ１、ＤＴＹＭＫ、ＤＶＬ２、ＤＹＮＬＴ３、ＤＹＲＫ４、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ８、ＥＡＦ２、ＥＢＦ１、ＥＣＴ２、ＥＦＮＡ５、ＥＦＮＢ２、ＥＬＡＶＬ４、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＥ１、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＭＩＬＩＮ３、ＥＭＬ１、ＥＮＣ１、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＥＰＯＲ、ＥＲＣＣ６Ｌ、ＥＳＣＯ２、ＥＳＦ１、ＥＳＰＬ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ１、ＥＸＯ１、ＥＸＯＣ５、ＥＸＯＳＣ６、ＥＸＰＨ５、ＥＺＨ２、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＡＭ１０５Ａ、ＦＡＭ１１０Ａ、ＦＡＭ１１４Ａ１、ＦＡＭ１１８Ａ、ＦＡＭ１２０Ｃ、ＦＡＭ１２９Ｂ、ＦＡＭ１３Ａ、ＦＡＭ１６２Ｂ、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＦＡＭ１９Ａ５、ＦＡＭ５４Ａ、ＦＡＭ６４Ａ、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＲＰ１、ＦＡＴ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＰ１、ＦＢＸＯ４３、ＦＢＸＯ５、ＦＥＮ１、ＦＧＦＲ２、ＦＨ、ＦＩＧＮＬ１、ＦＫＢＰ５、ＦＮＤＣ５、ＦＯＸＤ１、ＦＯＸＮ３、ＦＲＭＤ６、ＦＲＺＢ、ＦＳＴＬ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ８、Ｇ２Ｅ３、ＧＡＢＢＲ２、ＧＡＰ４３、ＧＡＰ４３、ＧＡＳ２Ｌ３、ＧＡＴＭ、ＧＥＭＩＮ４、ＧＦＰＴ２、ＧＦＲＡ１、ＧＦＲＡ２、ＧＧＣＸ、ＧＩＮＳ１、ＧＩＮＳ３、ＧＪＣ１、ＧＬＤＣ、ＧＭＮＮ、ＧＮＡＭ、ＧＮＡＳＡＳ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＮＧ４、ＧＰＡＭ、ＧＰＮ３、ＧＰＲ１２５、ＧＰＲ１６１、ＧＰＳＭ２、ＧＰＸ３、ＧＲＰ、ＧＳＧ２、ＧＳＳ、ＧＳＴＣＤ、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＧＸＹＬＴ１、Ｈ１Ｆ０、Ｈ２ＡＦＸ、ＨＡＴ１、ＨＡＵＳ６、ＨＤＡＣ８、ＨＥＧ１、ＨＥＳ６、ＨＧＦ、ＨＩＣ２、ＨＭＧ４Ｌ、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＨＭＧＢ３、ＨＭＧＸＢ４、ＨＭＭＲ、ＨＯＯＫ３、ＨＰＳ４、ＨＲＨ３、ＨＳ３ＳＴ２、ＨＳ６ＳＴ２、ＨＳＰＢ１１、ＨＴＡＴＳＦ１、ＩＤＨ２、ＩＦＩ２７Ｌ１、ＩＱＧＡＰ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＩＴＰＲＩＰ、ＪＡＲＩＤ２、ＫＣＮＧ３、ＫＣＮＪ８、ＫＣＮＮ１、ＫＣＴＤ１２、ＫＤＥＬＣ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＫＩＡＡ０１０１、ＫＩＡＡ０４０６、ＫＩＡＡ１２１１、ＫＩＡＡ１５２４、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ１４、ＫＩＦ１６Ｂ、ＫＩＦ１８Ａ、ＫＩＦ２３、ＫＩＦＣ１、ＫＬＦ７、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ５、ＫＮＴＣ１、ＫＰＮＡ２、ＬＢＨ、ＬＧＲ５、ＬＨＦＰＬ２、ＬＩＦＲ、ＬＩＧ３、ＬＭＦ２、ＬＭＮＢ１、ＬＯＣ１００１２７９８３、ＬＯＣ１００１２８８４４、ＬＯＣ１００２８８５５１、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ３４４５９５、ＬＯＣ４４０２８８、ＬＯＣ６４２５９７、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＬＲＦＮ２、ＬＲＲＣ１、ＬＳＭ４、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＧＥＨ１、ＭＡＮ１Ａ１、ＭＡＮ２Ａ１、ＭＡＯＡ、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰＫ１１、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫＡＰＫ３���ＭＡＳＴＬ、ＭＢＤ２、ＭＣＡＭ、ＭＣＭ１０、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＭＣＭ８、ＭＤＣ１、ＭＤＭ１、ＭＥＤ２０、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＭＥＬＫ、ＭＥＳＴ、ＭＦＡＰ２、ＭＧＡＴ５Ｂ、ＭＩＮＡ、ＭＫＩ６７、ＭＫＬ１、ＭＬＦ１ＩＰ、ＭＭＤ、ＭＮＳ１、ＭＰＨＯＳＰＨ９、ＭＰＰ５、ＭＰＰＥＤ２、ＭＲＣ２、ＭＲＰＬ３５、ＭＲＰＬ４９、ＭＲＳ２、ＭＳＮ、ＭＴＦ２、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＵＳ１、ＭＶＫ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＭＹＤ８８、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹ０６、ＭＹＳＴ１、ＮＡＡＡ、ＮＡＧＡ、ＮＡＮＰ、ＮＡＲＧ１、ＮＡＳＰ、ＮＡＴ１１、ＮＡＴ１３、ＮＣＡＰＤ３、ＮＣＡＰＧ、ＮＣＡＰＧ２、ＮＣＡＰＨ、ＮＣＡＰＨ２、ＮＤＮ、ＮＥＤＤ１、ＮＥＤＤ９、ＮＥＩＬ３、ＮＥＬＬ２、ＮＦＩＢ、ＮＯＣ４Ｌ、ＮＯＳ１、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲＧ３、ＮＲＭ、ＮＲＸＮ１、ＮＳＭＣＥ４Ａ、ＮＴＡＮ１、ＮＵＣＫＳ１、ＮＵＤＴ１、ＮＵＦ２、ＮＵＰ１０７、ＮＵＰ３７、ＮＵＰ４３、ＮＵＰ５０、ＮＵＰ９３、ＮＵＳＡＰ１、ＮＸＰＨ１、ＮＸＴ２、ＯＤＺ３、ＯＤＺ４、ＯＩＰ５、ＯＲＣ１Ｌ、ＯＲＣ６Ｌ、ＯＳＢＰＬ３、ＰＡＩＣＳ、ＰＡＮＫ２、ＰＡＲＰ３、ＰＡＳＫ、ＰＢＫ、ＰＣＤＨ１７、ＰＣＤＨ８、ＰＣＧＦ５、ＰＣＮＡ、ＰＤＣＬ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＬＩＭ５、ＰＤＲＧ１、ＰＥＧ３、ＰＥＬＩ２、ＰＥＬＯ、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ２６、ＰＦＫＦＢ３、ＰＧＡＭ５、ＰＧＭ２、ＰＨＦ１９、ＰＨＦ２０、ＰＨＦ２１Ｂ、ＰＨＦ５Ａ、ＰＨＬＰＰ１、ＰＨＹＨＩＰＬ、ＰＩ４ＫＡ、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＰＩＲ、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＣＬ２、ＰＬＤ５、ＰＬＥＫＨＦ２、ＰＬＫ２、ＰＬＫ４、ＰＬＳ３、ＰＬＸＮＡ２、ＰＬＸＮＡ４、ＰＬＸＮＢ２、ＰＭ２０Ｄ２、ＰＯＬＡ１、ＰＯＬＡ２、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＥ２、ＰＯＬＱ、ＰＯＳＴＮ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＡＴ、ＰＰＩＦ、ＰＰＩＬ５、ＰＰＭ１Ｆ、ＰＰＰ１Ｒ１３Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＰＰＰ３ＣＢ、ＰＲＩＭ１、ＰＲＩＭ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＰＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＳＭＡ７、ＰＳＭＣ３ＩＰ、ＰＳＭＤ５、ＰＳＭＤ９、ＰＳＲＣ１、ＰＴＥＲ、ＰＴＧＥＳ２、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＧＲ１、ＰＴＰＲＥ、ＰＴＰＲＧ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＴＧ１、ＰＶＲＬ３、ＰＸＭＰ４、ＰＸＮ、ＲＡＢ３５、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＡＤ１８、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＬＹ、ＲＡＮ、ＲＡＮＢＰ１、ＲＡＮＧＡＰ１、ＲＡＳＥＦ、ＲＢＢＰ７、ＲＢＢＰ９、ＲＢＬ１、ＲＢＰＭＳ、ＲＢＸ１、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＥＰ１、ＲＥＬＢ、ＲＥＬＬ１、ＲＥＸＯ２、ＲＦＣ１、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＲＧＭＡ、ＲＧＳ５、ＲＩＬＰＬ２、ＲＩＭＢＰ２、ＲＭＭ、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ２６、ＲＮＦ３４、ＲＰＡ１、ＲＰＰ３０、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＰ７Ａ、ＲＳＲＣ１、Ｓ１ＰＲ３、ＳＡＬＬ４、ＳＡＰ３０、ＳＡＳＳ６、ＳＢＦ２、ＳＣＤ５、ＳＣＭＬ１、ＳＣＭＬ２、ＳＤＣ１、ＳＥＣ２３Ａ、ＳＥＣ６１Ａ２、ＳＥＬＭ、ＳＥＭＡ６Ａ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＳＮ３、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＦＭ、ＳＦＲＰ１、ＳＧＯＬ２、ＳＨ３Ｄ１９、ＳＨＣＢＰ１、ＳＨＭＴ１、ＳＨＯＸ２、ＳＩＭ１、ＳＩＶＡ１、ＳＫＡ１、ＳＫＡ２、ＳＫ���３、ＳＫＰ２、ＳＬＣ２５Ａ１０、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ２Ａ４ＲＧ、ＳＬＣ２Ａ８、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣ８Ａ１、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＳＬＩＴ３、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＬＫ、ＳＬＭＯ２、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＣ２、ＳＭＣ４、ＳＭＣ６、ＳＭＯ、ＳＭＹＤ５、ＳＮＡＩ２、ＳＮＡＰ２９、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＮＲＰＤ３、ＳＮＸ１８、ＳＮＸ５、ＳＯＲＤ、ＳＯＸ４、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＳＰＯＣＫ１、ＳＰＳＢ４、ＳＲＧＡＰ１、ＳＲＲＤ、ＳＲＲＭ４、ＳＳＨ２、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴ８ＳＩＡ２、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴＡＲＤ４、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ１７Ａ、ＳＴＭＮ３、ＳＴＯＭ、ＳＴＯＮ２、ＳＴＲＡ６、ＳＵＳＤ５、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＶＩＰ、ＳＹＮ２、ＳＹＮＥ２、ＳＹＮＭ、ＳＹＴ１７、ＳＹＴＬ４、ＴＢＣ１Ｄ１、ＴＢＸ３、ＴＣＦ１９、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦＬ５、ＴＤＲＫＨ、ＴＥＡＤ３、ＴＥＳＣ、ＴＦＤＰ１、ＴＦＤＰ２、ＴＦＰＩ２、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＯＣ４、ＴＩＦＡ、ＴＩＭＰ３、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＭＣＣ３、ＴＭＥＭ１０７、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１５１Ｂ、ＴＭＥＭ１７０Ｂ、ＴＭＥＭ１７８、ＴＭＥＭ１９４Ａ、ＴＭＥＭ３８Ｂ、ＴＭＥＭ４８、ＴＭＥＭ５６、ＴＭＥＭ９８、ＴＭＰＯ、ＴＭＳＢ１５Ｂ、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＯＢ２、ＴＯＭＭ３４、ＴＰＢＧ、ＴＰＴＥ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ６８、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＰ１３、ＴＲＯＡＰ、ＴＳＨＺ３、ＴＳＰＡＮ１４、ＴＳＰＡＮ４、ＴＳＰＡＮ５、ＴＴＣ２８、ＴＴＣ９、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＴＵＢＢ、ＴＷＩＳＴ１、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＭＳ、ＴＹＲＯ３、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＣＫ１、ＵＣＰ２、ＵＦＤ１Ｌ、ＵＨＲＦ１、ＵＮＣ１１９Ｂ、ＵＮＧ、ＵＱＣＣ、ＵＳＰ１、ＵＳＰ４８、ＵＴＰ１８、ＶＡＰＢ、ＶＡＶ３、ＶＰＳ２９、ＶＳＴＭ２Ｌ、ＷＤＨＤ１、ＷＤＲ５１Ａ、ＷＤＲ５３、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ６７、ＷＥＥ１、ＷＥＥ１、ＷＨＳＣ１、ＷＲＡＰ５３、ＷＷＣ３、ＸＲＣＣ４、ＸＲＣＣ６、ＺＡＫ、ＺＦＨＸ４、ＺＦＰ８２、ＺＧＰＡＴ、ＺＮＦ２１５、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ２５３、ＺＮＦ２８０Ｂ、ＺＮＦ３６７、ＺＮＦ４３、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ５０３、ＺＮＦ５２１、ＺＮＦ５６０、ＺＮＦ６０８、ＺＮＦ６２６、ＺＮＦ６８１、ＺＮＦ７１、ＺＮＦ８２３、ＺＮＦ８
５、ＺＮＦ９２、ＺＮＦ９３および／またはＺＷＩＮＴから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００４４】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＣＯＴ９、ＡＬＣＡＭ、ＡＮＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＳＣＬ１、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＴＡＤ２、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＮＣ２、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ３、ＢＵＢ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、Ｃ１２ＯＲＦ４８、Ｃ１４ＯＲＦ１０６、Ｃ１５ＯＲＦ４２、Ｃ１８ＯＲＦ５４、Ｃ１ＯＲＦ１１２、Ｃ３ＯＲＦ７０、Ｃ４ＯＲＦ４９、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＣＤＣ３、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ２、ＣＤ９、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ２、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ８、ＣＤＫ２、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＩ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮＰＮ、ＣＥＰ５５、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＮＡ７、ＣＩＴ、ＣＫＡＰ２Ｌ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ４、ＣＰＶＬ、ＣＲＹＢＧ３、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＤＥＰＤＣ１、ＤＥＰＤＣ１Ｂ、ＤＩＡＰＨ３、ＤＬＧＡＰ５、ＤＮＡ２、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＰＹＳＬ３、ＤＳＣＣ１、ＤＳＮ１、ＤＴＬ、ＤＹＮＬＴ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ８、ＥＣＴ２、ＥＦＮＢ２、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＥ１、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＭＩＬＩＮ３、ＥＭＬ１、ＥＮＣ１、ＥＲＣＣ６Ｌ、ＥＳＣＯ２、ＥＳＰＬ１、ＥＴＶ１、ＥＸＯ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＡＭ１１４Ａ１、ＦＡＭ５４Ａ、ＦＡＭ６４Ａ、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＴ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＰ１、ＦＢＸＯ４３、ＦＧＦＲ２、ＦＮＤＣ５、ＦＯＸＤ１、ＦＲＭＤ６、ＦＲＺＢ、ＦＺＤ５、ＧＡＳ２Ｌ３、ＧＦＲＡ２、ＧＩＮＳ１、ＧＩＮＳ３、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＰ、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＨＧＦ、ＨＭＭＲ、ＨＳ３ＳＴ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＣＮＧ３、ＫＣＴＤ１２、ＫＤＥＬＣ２、ＫＩＡＡ０１０１、ＫＩＡＡ１５２４、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ１４、ＫＩＦ１８Ａ、ＫＩＦ２３、ＫＩＦＣ１、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ６４２５９７、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＣＭ５、ＭＥＬＫ、ＭＩＮＡ、ＭＫＩ６７、ＭＬＦ１ＩＰ、ＭＰＰＥＤ２、ＭＲＣ２、ＭＳＮ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＭＹ０６、ＮＣＡＰＧ、ＮＣＡＰＨ、ＮＤＮ、ＮＥＤＤ９、ＮＥＩＬ３、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲＸＮ１、ＮＵＦ２、ＮＵＳＡＰ１、ＯＩＰ５、ＯＲＣ１Ｌ、ＯＳＢＰＬ３、ＰＢＫ、ＰＣＧＦ５、ＰＤＥ５Ａ、ＰＥＧ３、ＰＥＬＯ、ＰＦＫＦＢ３、ＰＨＬＰＰ１、ＰＬＤ５、ＰＬＫ２、ＰＬＫ４、ＰＬＳ３、ＰＯＬＡ２、ＰＯＬＥ２、ＰＯＬＱ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＳＲＣ１、ＰＴＧＲ１、ＰＴＰＲＥ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＴＧ１、ＰＶＲＬ３、ＲＡＤ５１、ＲＢＬ１、ＲＢＰＭＳ、ＲＥＬＬ１、ＲＦＣ５、ＲＧＭＡ、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＲＲＭ２、Ｓ１ＰＲ３、ＳＧＯＬ２、ＳＨＣＢＰ１、ＳＨＯＸ２、ＳＩＭ１、ＳＫＡ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＭＣ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴＫ１７Ａ、ＳＵＳＤ５、ＳＹＮ２、ＳＹＮＭ、ＳＹＴ１７、ＴＣＦ１９、ＴＥＳＣ、ＴＦＤＰ２、ＴＦＰＩ２、ＴＩＭＰ３、ＴＬＥ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１７８、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＢＧ、ＴＰＴＥ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ６８、ＴＲＯＡＰ、ＴＷＩＳＴ１、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＨＲＦ１、ＷＤＨＤ１、ＷＤＲ５１Ａ、ＷＤＲ６７、ＷＥＥ１、ＺＦＰ８２、ＺＮＦ３６７、ＺＮＦ５２１および／またはＺＷＩＮＴから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００４５】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＬＣＡＭ、ＡＮＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＳＣＬ１、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＴＡＤ２、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＮＣ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、Ｃ１２ＯＲＦ４８、Ｃ１４ＯＲＦ１０６、Ｃ１８ＯＲＦ５４、Ｃ３ＯＲＦ７０、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＣＤＣ３、ＣＤ９、ＣＤＣ２、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＤＣＡ２、ＣＤＣＡ８、ＣＤＫ２、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＰ５５、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＮＡ７、ＣＫＡＰ２Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＲＹＢＧ３、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＤＥＰＤＣ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＬＧＡＰ５、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＴＬ、ＤＹＮＬＴ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ８、ＥＦＮＢ２、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＭＬ１、ＥＮＣ１、ＥＳＰＬ１、ＥＴＶ１、ＥＸＯ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ５４Ａ、ＦＡＭ６４Ａ、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＴ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＸＯ４３、ＦＧＦＲ２、ＦＺＤ５、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＰ、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＨＧＦ、ＨＭＭＲ、ＩＴＧＡ６、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＣＴＤ１２、ＫＤＥＬＣ２、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ１４、ＫＩＦ１８Ａ、ＫＩＦ２３、ＫＩＦＣ１、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＥＬＫ、ＭＩＮＡ、ＭＫＩ６７、ＭＳＮ、ＭＹＢＬ１、ＮＣＡＰＨ、ＮＤＮ、ＮＥＤＤ９、ＮＥＩＬ３、ＮＲＸＮ１、ＮＵＦ２、ＮＵＳＡＰ１、ＯＩＰ５、ＯＲＣ１Ｌ、ＯＳＢＰＬ３、ＰＢＫ、ＰＣＧＦ５、ＰＥＧ３、ＰＥＧ３、ＰＨＬＰＰ１、ＰＬＤ５、ＰＬＫ２、ＰＬＫ４、ＰＬＳ３、ＰＯＬＥ２、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＰＲＥ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＭ、ＲＢＰＭＳ、ＲＥＬＬ１、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＲＲＭ２、Ｓ１ＰＲ３、ＳＧＯＬ２、ＳＨＣＢＰ１、ＳＨＯＸ２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＭＣ６、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴＫ１７Ａ、ＳＹＴ１７、ＴＦＰＩ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１７８、ＴＰＢＧ、ＴＰＴＥ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ３６、ＴＷＩＳＴ１、ＵＢＥ３Ｂ、および／またはＺＮＦ３６７から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００４６】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＳＣＬ１、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＴＡＤ２、ＡＵＲＫＡ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＮＣ２、ＢＵＢ１、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ３、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＮＡ７、ＣＫＡＰ２Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＲＹＢＧ３、ＣＵＧＢＰ２、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＤＥＰＤＣ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＬＧＡＰ５、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＴＬ、ＤＹＮＬＴ３、Ｅ２Ｆ８、ＥＦＮＢ２、ＥＬＯＶＬ７、ＥＮＣ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＴ１、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＲＰ、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＨＭＭＲ、ＩＴＧＡ６、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＣＴＤ１２、ＫＤＥＬＣ２、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＥＬＫ、ＭＩＮＡ、ＭＫＩ６７、ＭＳＮ、ＭＹＢＬ１、ＮＤＮ、ＮＥＤＤ９、ＮＲＸＮ１、ＯＳＢＰＬ３、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＬＳ３、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＭ、ＲＢＰＭＳ、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＲＲＭ２、ＳＧＯＬ２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＴＫ１７Ａ、ＴＦＰＩ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１７８および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００４７】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＴＡＤ２、Ｃ１１ＯＲＦ８２、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ４、Ｃｙｃｌｉｎ Ａ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ７、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＥ１、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＫＩＡＡ１５２４、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＮＤＣ８０、ＮＤＮ、ＯＲＣ１Ｌ、ＰＬＳ３、ＰＲＩＭＡ１、ＲＡＤ５４Ｌ、ＲＢＬ１、ＲＢＰＭＳ、ＲＲＭ２、Ｓ１ＰＲ３、ＳＣＬＹ、ＳＬＣＩＡ３、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＦＤＰ１、ＴＦＰ１２、ＴＫ１、ＴＭＥＭ３５、ＴＴＫ、ＴＷＩＳＴ１、ＴＹＭＳ、ＴＹＫおよび／またはＺＷＩＮＴから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００４８】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＵＲＫＢ、ＢＩＲＣ５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１ Ｂ、ＣＤ９、ＤＬＧＡＰ３、ＤＹＮＬＴ３、ＥＮＣ１、ＦＢＬＮ１、ＦＯＸＭ１、ＧβＹ、ＧＮＡＭ、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＳＭ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＨＧＦ、ＩＴＧＡ６、ＪＮＫ、ＫＣＮＪ５、ＫＩＦ１８Ａ、ＫＩＴＬＧ、ＭＭＤ、ＭＳＮ、ＭＹＲＩＰ、ＮＥＫ２、ＮＲ３Ｃ１、ＮＸＰＨ１、ＯＳＢＰＬ３、ＰＫＭＹＴ１、ＰＴＰＲＭ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１ＡＰ１、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＭＣ６、ＳＮＡＩ２、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＳＨ２、ＳＴＫ１７Ａ、ＳＹＮＰＯ２、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰＴＥ、ＴＲＡＦ４、ＴＳＰＡＮ、ＴＳＰＡＮ４、ＵＢＥ３、ＵＢＥ３Ｂおよび／またはＶＡＶ３から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較してＡＬＣＡＭ、ＡＵＲＫＡ、ＣＨＥＫ、ＣＩＴ、ＣＳＲＰ２、Ｅ２Ｆ、ＥＣＴ２、ＥＦＮＢ２、ＥＲＫ、ＥＳＰＬ１、ＧＮＡＩ、ＧＰＲ１６１、ＨＭＭＲ、ＫＩＦ４Ａ、ＫＩＦ１４、ＫＩＦ１５、ＫＩＦ２２、ＫＩＦ２３、ＫＩＦＣ１、ＬＰＡＲ１、ＭＫ１６７、ＯＩＰ５、ＰＨＬＰＰ、ＰＰ１／ＰＰ２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＴＧ１、ＲＡＣＧＡＰ、ＲＢ、ＲＧＳ５、ＳＤＣ２および／またはＴＰＸ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００４９】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＳＣＬ１、ＨＥＳ６、ＭＡＰＫ、ＮＭＵ、ＰＥＧ３、ＰＴＰＲＫ、ＰＲＬＨＲ、ＰＴＰＲＫ、ＳＧＯＬ２、ＳＰＡＲＣおよび／またはＺＮＦ２１７から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＳＦ１Ｂ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＮＣＡＰＨ、ＰＢＫ、ＰＲＡＭＥ、ＳＭＣ２、ＵＨＲＦ１および／またはＶＲＫ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ｃ１４ＯＲＦ１０６、ＣＥＰ７２、ＫＩＦ２０Ａ、ＰＣＮＡ、ＰＥＸ１３、ＰＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＳＰＡＧ５、ＳＹＴＬ４、ＴＲＯＡＰおよび／またはＷＤＲ５１Ａから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＮＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＰＭ、ＢＵＢ１、ＣＣＤＣ９９、ＣＥＰ５５、ＣＫＡＰ２、ＤＲＡＭ、Ｅ２Ｆ８、ＰＬＸＮＡ２、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｓおよび／またはＷＤＨＤ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００５０】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＲＨＧＥＦ３、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＦＢＰ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＩＦ１１、ＰＦＫＦＢ３および／またはＰＬＫ４から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＲＨＧＥＦ３、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＦＢＰ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＩＦ１１、ＰＦＫＦＢ３および／またはＰＬＫ４から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＦＮＤＣ５、ＨＳＰＣ１５９、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＹＮ２および／またはＺＮＦ３６７から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＥＸＯ１、ＫＣＴＤ１２、ＭＹＯ６、ＰＨＥＢＬ１、ＳＨＣＢＰ１、ＴＰＢＧおよび／またはＴＵＢＢ６から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＴＧ３、ＧＡＢＲＡ５、ＴＲ１Ｐ１０および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＮＣ２、ＤＰＹＤ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＰＰＩＬ５および／またはＴＡＣＣ３から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００５１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、Ｃ３ＯＲＦ７０、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤ９、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＤＫ２、ＣＥＮＰＬ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＦＮＤＣ５、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＲ１７７、ＧＴＳＥ１、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＭＹ０６、ＭＹＲＩＰ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＧＲ１、ＰＴＰＲＫ、ＰＶＲＬ３、ＲＡＢ３２、ＲＢＰＭＳ、ＳＤＣ２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＭＥＭ１７８、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０、ＴＷＩＳＴ１および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＤＥＬＣ２、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１ Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＰＭＳ、ＲＮＦ１８２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ １７８および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比���して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００５２】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＣＤ９、ＣＤＫ２、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＣＭ１０、ＭＳＮ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３２、ＳＤＣ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０および／またはＴＷＩＳＴ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＬＰＡＲ１、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＴＰＲＫ、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＤＯＫ５、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００５３】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＰＹＤ、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＮＤＣ５、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＶＲＬ３、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＳＭＣ２、ＴＦＰ１２、ＴＭＥＭ１７８および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＰＹＤ、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＴＦＰＩ２および／またはＴＭＥＭ１７８から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＡＳＰ１、ＤＰＹＤ、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＰＬＫ２および／またはＴＦＰＩ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００５４】
また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ｃ３ＯＲＦ７０、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＰＲＳＳ１２、ＣＥＮＰＬ、ＧＰＲ１７７および／またはＰＴＧＲ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＭＡＢ２１Ｌ２および／またはＰＲＳＳ１２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００５５】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６または８に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６または８に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６または８に記載の遺伝子、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して減少を示す。さらに別の実施態様において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６または８に記載の約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、または約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおける減少を示す。
【００５６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＡＴＫ、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ８、ＡＢＲ、ＡＢＴＢ１、ＡＣＯＴ１、ＡＣＲＢＰ、ＡＣＲＶ１、ＡＣＹＰ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＭ、ＡＦＦ１、ＡＧＡＰ４、ＡＧＰＡＴ３、ＡＧＸＴ２Ｌ２、ＡＨI1、ＡＫＡＰ９、ＡＫＩＲＩＮ１、ＡＫＴ２、ＡＭＨ、ＡＮＫ２、ＡＮＫ３、ＡＮＫＨＤ１、ＡＮＫＲＤ１７、ＡＮＫＲＤ５０、ＡＮＫＳ１Ａ、ＡＱＰ１、ＡＲＦ１、ＡＲＨＧＡＰ１、ＡＲＨＧＡＰ２３、ＡＲＬ１７Ａ、ＡＳＡＭ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ１、ＡＴＰ８Ｂ２、ＡＴＰ９Ａ、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＨ２、ＢＬＺＦ１、ＢＰＴＦ、ＢＲＵＮＯＬ４、ＢＲＵＮＯＬ５、ＢＲＷＤ１、ＢＲＷＤ２、ＢＴＢＤ１８、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＺＲＡＰ１、Ｃ１４ＯＲＦ１５９、Ｃ１５ＯＲＦ２４、Ｃ１５ＯＲＦ５７、Ｃ１６ＯＲＦ５２、Ｃ１７ＯＲＦ２８、Ｃ１ＯＲＦ２１、Ｃ１ＯＲＦ２１、Ｃ１ＯＲＦ５０、Ｃ２１ＯＲＦ５７、Ｃ２１ＯＲＦ５９、Ｃ２１ＯＲＦ６６、Ｃ２ＣＤ２、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ２ＯＲＦ６０、Ｃ２ＯＲＦ６８、Ｃ３ＯＲＦ２３、Ｃ４ＯＲＦ４１、Ｃ５ＯＲＦ４２、Ｃ６ＯＲＦ１５４、Ｃ６ＯＲＦ５２、Ｃ７ＯＲＦ２８Ｂ、Ｃ７ＯＲＦ５４、Ｃ９ＯＲＦ１５０、Ｃ９ＯＲＦ６８、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＹ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＡＰＮ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＢＳ、ＣＣＤＣ１０４、ＣＣＤＣ５０、ＣＣＤＣ７６、ＣＤ１５１、ＣＤ１６３Ｌ１、ＣＤ３０２、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＳ１、ＣＦＣ１、ＣＨＤ５、ＣＬＣＮ３、ＣＬＤＮ１２、ＣＬＩＰ４、ＣＬＭＮ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＮＭ１、ＣＮＯＴ６Ｌ、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＰＡ、ＣＰＮＥ８、ＣＲＫＲＳ、ＣＲＴＣ１、ＣＲＹＧＳ、ＣＳＴＢ、ＣＴＳＫ、ＣＵＬ４Ａ、ＣＹＧＢ、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＴＬ１、Ｄ４Ｓ２３４Ｅ、ＤＣＬＫ１、ＤＣＴＤ、ＤＥＰＤＣ６、ＤＨＸ３６、ＤＩＰ２Ａ、ＤＩＳ３、ＤＫＦＺＰ５４７Ｇ１８３、ＤＮＡＪＣ２２、ＤＴＮＡ、ＤＴＷＤ１、ＤＵＳＰ１６、ＤＵＳＰ５、ＤＶＬ３、ＥＦＮＢ３、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＬＦＮ２、ＥＮＯＳＦ１、ＥＲＡＰ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＭＡＰ、ＥＴＦＤＨ、ＥＸＯＳＣ６、ＦＡＤＳ３、ＦＡＭ１２０ＡＯＳ、ＦＡＭ１５０Ｂ、ＦＡＭ１６５Ｂ、ＦＡＭ１８４Ｂ、ＦＡＭ３０Ａ、ＦＡＭ４６Ａ、ＦＡＭ６６Ｃ、ＦＡＴ４、ＦＢＲＳＬ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＤ５、ＦＧＦ１３、ＦＬＪ３３６３０、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＯ６、ＦＵＢＰ３、ＧＡＬ、ＧＡＬ、ＧＬＴ２５Ｄ２、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ８Ａ、ＧＰＲ１２３、ＧＰＸ７、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＰ２、ＧＲＭ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、Ｈ２ＡＦＹ、ＨＣＧ １７７６０１８、ＨＣＧ ２０２２３０４、ＨＣＮ４、ＨＥＡＴＲ１、ＨＥＬＱ、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＰＵＤ２、ＨＥＸＤＣ、ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＨＩＶＥＰ３、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＲ、ＨＰＣＡＬ１、ＨＰＣＡＬ４、ＨＳＰＤ１、ＩＥＲ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＮＴＵ、Ｊ��Ｙ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＡＴＮＢ１、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＳ２、ＫＣＴＤ１３、ＫＨＤＣ１、ＫＩＡＡ０１２５、ＫＩＡＡ１３７０、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＩＦ１Ａ、ＫＩＦ５Ｃ、ＫＩＦ５Ｃ、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＫＬＨＤＣ１、ＬＣＯＲＬ、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＯＣ１００１３００９７、ＬＯＣ１００１３０３６０、ＬＯＣ１００１３０５２２、ＬＯＣ１００２７２２２８、ＬＯＣ２８４４０８、ＬＯＣ３９９４９１、ＬＯＣ４０１３２０、ＬＯＣ６４１２９８、ＬＯＣ６４２８５２、ＬＯＣ９０１１０、ＬＯＣ９４４３１、ＬＯＮＲＦ２、ＬＲＰ２ＢＰ、ＬＲＲＣ３７Ａ２、ＬＲＲＦＩＰ１、ＬＴＢＰ３、ＬＹＰＬＡＬ１、ＬＹＲＭ５、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ７、ＭＡＰ９、ＭＣＭ３ＡＰ、ＭＣＭ３ＡＰＡＳ、ＭＣＴＰ１、ＭＥＯＸ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＦＳＤ４、ＭＧＡＴ４Ａ、ＭＬＸＩＰ、ＭＲＰＬ１、ＭＲＰＳ３３、ＭＳＴ１、ＭＵＣ２０、ＭＸＤ１、ＭＺＦ１、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰ１Ｌ３、ＮＢＰＦ１、ＮＢＰＦ１０、ＮＣＯＡ７、ＮＣＲＮＡ００１７１、ＮＣＲＮＡ００１８２、ＮＤＲＧ１、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＤＵＦＶ３、ＮＥＢＬ、ＮＥＬＦ、ＮＨＥＤＣ２、ＮＨＥＧ１、ＮＩＰＡＬ２、ＮＩＰＡＬ３、ＮＬＲＸ１、ＮＯＬ３、ＮＳＭＡＦ、ＮＵＤＴ１９、ＮＵＰ１５３、ＮＵＰ５４、ＯＬＦＭ３、ＯＲ７Ｄ２、ＯＳＢＰ、ＰＡＢＰＣ１Ｌ、ＰＡＢＰＣ４、ＰＡＣＲＧＬ、ＰＡＭ、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＱＲ６、ＰＡＲＰ１２、ＰＣＢＤ２、ＰＣＮＸＬ２、ＰＤＣＤ６、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤＩＡ２、ＰＧＡＰ１、ＰＨＦ１７、ＰＨＫＡ１、ＰＨＫＡ２、ＰＨＬＤＡ２、ＰＩＧＨ、ＰＩＯＮ、ＰＫＤ１、ＰＬＡ２Ｇ４Ｃ、ＰＬＣＢ４、ＰＬＥＫＨＨ１、ＰＬＰ２、ＰＬＲＧ１、ＰＬＸＮＣ１、ＰＮＣＫ、ＰＮＭＡ３、ＰＯＦＵＴ２、ＰＯＧＫ、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＰＡＰＤＣ１Ｂ、ＰＰＩＤ、ＰＰＩＥ、ＰＰＭ１Ｋ、ＰＰＰ１Ｒ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ、ＰＰＴ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＰＨ、ＰＳＭＢ７、ＰＴＣＤ１、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＧＳ１、ＰＴＮ、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＮ、ＲＡＢ１１ＦＩＰ３、ＲＡＢ６Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＧＡＧ４、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ８、ＲＨＢＤＬ１、ＲＨＯＱ、ＲＨＯＵ、ＲＬＦ、ＲＮＡＳＥＴ２、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１６５、ＲＮＦ２０７、ＲＮＦ４１、ＲＰＬ３７、ＲＳＬ１Ｄ１、ＲＵＮＤＣ３Ａ、Ｓ１００Ａ６、ＳＣＭＨ１、ＳＣＮ２Ａ、ＳＥＲＰ１、ＳＥＴＸ、ＳＦＲＳ１８、ＳＦＸＮ３、ＳＧＫ３、ＳＨ３ＢＰ５、ＳＨ３ＧＬ２、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＨＣ２、ＳＨＣ４、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＩＫ１、ＳＬＣ１２Ａ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ１Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ３８Ａ５、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＭＡＧＰ、ＳＭＡＰ２、ＳＮＣＡ、ＳＯＢＰ、ＳＯＲＣＳ１、ＳＯＲＬ１、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＩＲＥ２、ＳＰＯＣＫ２、ＳＲＲ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＳＴＡＲ、ＳＴＥＡＰ３、ＳＴＯＸ２、ＳＴＸ３、ＳＹＮＪ１、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ５、ＴＡＦ１０、ＴＡＮＣ２、ＴＣＥＡ１、ＴＨＢＳ２、ＴＨＳＤ４、ＴＩＭＰ１、ＴＭ２Ｄ１、ＴＭＥＭ１１１、ＴＭＥＭ１５１Ａ、ＴＭＥＭ１８４Ｃ、ＴＭＥＭ４１Ｂ、ＴＭＥＭ４３、ＴＭＥＭ５、ＴＭＥＭ５９Ｌ、ＴＭＩＥ、ＴＮＦＲＳＦ２５、Ｔ��ＦＲＳＦ２５、ＴＯＸ４、ＴＰ５３ＢＰ１、ＴＰＭ３、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ７３、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＴ１、ＴＳＲ１、ＴＴＣ１７、ＴＴＣ３、ＴＴＣ３９Ｃ、ＴＵＳＣ３、ＴＸＬＮＢ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＢＮ２、ＵＢＸＮ６、ＵＣＮ、ＵＧＰ２、ＵＮＣ８０、ＵＮＱ１８８７、ＵＳＰ３６、ＵＳＰＬ１、ＶＮ１Ｒ１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＶＰＳ５３、ＶＰＳ８、ＷＤＦＹ３、ＷＤＲ２７、ＷＤＲ８５、ＷＳＢ１、ＹＪＥＦＮ３、ＹＬＰＭ１、ＺＤＨＨＣ１１、ＺＥＲ１、ＺＧ１６Ｂ、ＺＮＦ２７５、ＺＮＦ４４０、ＺＮＦ５７３、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ７８５および／またはＺＮＦ８１4から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００５７】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ１、ＡＤＡＲＢ１、ＡＤＭ、ＡＮＫ２、ＡＱＰ１、ＡＳＡＭ、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ３ＯＲＦ２３、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＤ１６３Ｌ１、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＦＣ１、ＣＬＭＮ、ＣＰＮＥ８、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＤＮＡＪＣ２２、ＤＵＳＰ５、ＥＮＯＳＦ１、ＥＲＡＰ１、ＦＧＦ１３、ＦＯＸＯ６、ＧＡＬ、ＧＮＡＳ、ＧＰＸ７、ＧＲＩＡ２、ＧＲＭ５、ＨＣＧ １７７６０１８、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＩＬ１７Ｂ、ＫＩＡＡ０１２５、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＬＲＰ２ＢＰ、ＭＥＯＸ２、ＮＣＲＮＡ００１８２、ＮＤＲＧ１、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＩＰＡＬ２、ＮＵＤＴ１９、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＨＫＡ２、ＰＨＬＤＡ２、ＰＴＧＥＲ２、ＲＧＳ１１、Ｓ１００Ａ６、ＳＣＮ２Ａ、ＳＨＣ４、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ１Ａ６、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ３８Ａ５、ＳＯＲＣＳ１、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ５、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ１および／またはＴＭＥＭ１１１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００５８】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ１、ＡＤＡＲＢ１、ＡＮＫ２、ＡＱＰ１、Ｃ３ＯＲＦ２３、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＤ１６３Ｌ１、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＦＣ１、ＣＰＮＥ８、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＦＧＦ１３、ＦＯＸＯ６、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＡ２、ＧＲＭ５、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＩＬ１７Ｂ、ＫＩＡＡ０１２５、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＭＥＯＸ２、ＮＤＲＧ１、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＩＰＡＬ２、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＨＫＡ２、ＲＧＳ１１、ＳＣＮ２Ａ、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ３８Ａ５、ＳＹＴ１３および／またはＴＨＢＳ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００５９】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＱＰ１、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＤ１６３Ｌ１、ＣＤＣ４２ＥＰ１、ＣＦＣ１、ＣＰＮＥ８、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＦＧＦ１３、ＧＮＡＳ、ＧＲＩＡ２、ＧＲＭ５、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＩＬ１７Ｂ、ＫＩＡＡ０１２５、ＭＥＯＸ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＨＫＡ２、ＲＧＳ１１、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ３８Ａ５および／またはＳＹＴ１３から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００６０】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＮＸＡ２、ＡＱＰ１、ＡＲＨＧＡＰ９、ＣＤＨ１０、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＰＴ１、ＣＮＴＮ２、ＥＲＡＰ１および／またはＲＧＳ１１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＢＣＣ８、ＡＥＬＩＭ３、ＣＡＰ２、ＩＬ１７Ｂ、ＭＥＦ２Ａ、ＮＥＥＢＬ、ＰＨＣ、Ｓ１００Ａ６、ＳＬＣ１Ａ６、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８、ＳＹＴ１３および／またはＳＹＴＬ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＳＴＢ、ＧＰＣＲ、ＧＲＩＭ５、ＫＩＳＳＲ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＬＣ１Ａ２および／またはＴＨＢＳ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００６１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＲＢ１、ＡＤＭ、ＰＴＰＰＨおよび／またはＳＬＣＯ１Ａ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＮＧＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅおよび／またはＰＴＧＳ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤおよび／またはＯＳＣＡＲから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＡＬＹから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００６２】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＯＬ５Ａ１および／またはＭＩＣＡＬ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＯＬＦＭＬ２Ａおよび／またはＳＩＧＩＲＲから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＨＰＣＡＬ１および／またはＬＰＡＲ５から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＨＴＲ１Ｅおよび／またはＳＯＲＣＳ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００６３】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＮＫ２、ＣＰＮＥ８、ＣＲＥＢ５、ＩＬ１７Ｂ、ＫＩＡＡ０１２５、ＬＯＣ１００２８９１０９、ＬＯＣ１４４５７１、ＮＰＡＳ４、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＯＲＣＳ１、ＴＨＢＳ２および／またはＺＮＦ８１４から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００６４】
本開示の態様は、表９、１０、１１または１２に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示すＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本実施形態の態様では、表９、１０、１１または１２に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示すＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表９、１０、１１または１２に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の差を示す。さらに別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表９、１０、１１または１２に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して差を示す。本実施形態の更に別の様態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表９、１０、１１または１２に記載の約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおける差を示す。表９、１０、１１または１２に記載の対数比は、０．５８５が１．５倍の差のｌｏｇ２（１．５）、１が２倍の差のｌｏｇ２（２）、１．５８４が３倍の差のｌｏｇ２（３）、２が４倍の差のｌｏｇ２（４）、２．３２１が５倍の差のｌｏｇ２（５）、２．５８４が６倍の差のｌｏｇ２（６）、２．８０７が７倍の差のｌｏｇ２（７）、３が８倍の差のｌｏｇ２（８）、３．１６９が９倍の差のｌｏｇ２（９）および３．３２１が１０倍の差のｌｏｇ２（１０）であるｌｏ���２の値を表す。
【００６５】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、Ｃ３ＯＲＦ７０、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤ９、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＤＫ２、ＣＥＮＰＬ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＦＮＤＣ５、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＲ１７７、ＧＴＳＥ１、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＧＲ１、ＰＴＰＲＫ、ＰＶＲＬ３、ＲＡＢ３２、ＲＢＰＭＳ、ＳＤＣ２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＭＥＭ１７８、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０、ＴＷＩＳＴ１および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＤＥＬＣ２、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＰＭＳ、ＲＮＦ１８２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ１７８および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。
【００６６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表９および１１に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表９または１１に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表９または１１に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して増加を示す。さらに別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表９または１１に記載の約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、約２５遺伝子〜約５０遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して増加を示す。
【００６７】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＤＲＭ１、ＡＦＦ４、ＡＧＡＰ４、ＡＬＣＡＭ、ＡＮＡＰＣ７、ＡＮＫＲＤ１３Ｄ、ＡＮＫＲＤ２８、ＡＰＩ５、ＡＲＦ１、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＬ１７Ａ、ＡＳＣＬ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ３、ＡＴＦ７ＩＰ、Ｂ３ＧＡＬＮＴ２、ＢＡＳＰ１、ＢＬＣＡＰ、ＢＮＣ２、Ｃ１０ＯＲＦ５８、Ｃ１２ＯＲＦ４９、Ｃ１２ＯＲＦ５１、Ｃ１ＯＲＦ４３、Ｃ２０ＯＲＦ１１７、Ｃ２０ＯＲＦ７、ＣＡＤＭ１、ＣＡＤＰＳ、ＣＡＬＣＢ、ＣＡＰＮ１、ＣＡＰＲＩＮ２、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＮ２、ＣＢＷＤ１、ＣＣＤＣ１５０、ＣＣＤＣ３、ＣＤ９、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＦＤＰ１、ＣＨＲＮＡ７、ＣＩＡＰＩＮ１、ＣＬＡＳＰ２、ＣＮＯＴ７、ＣＰＶＬ、ＣＲＹＢＧ３、ＣＳＥ１Ｌ、ＣＴＴＮＢＰ２ＮＬ、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＣＴ１、ＤＡＺ１、ＤＢＨ、ＤＣＡＦ８、ＤＥＮＲ、ＤＨＸ３５、ＤＫＦＺＰ４３４Ｌ１８７、ＤＬＥＵ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＥＡＦ２、ＥＦＮＡ５、ＥＩＦ３Ｂ、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＬ１、ＥＭＬ４、ＥＮＣ１、ＥＶＬ、ＥＸＯＳＣ６、ＥＸＰＨ５、ＥＺＨ２、ＦＡＭ１７８Ａ、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＬＪ１０２１３、ＦＵＢＰ３、ＦＵＳ、ＦＺＤ５、ＧＡＰ４３、ＧＦＭ１、ＧＦＲＡ２、ＧＧＡ２、GNAI1、ＧＮＡＳ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＯＬＧＡ４、ＧＰＲ１２５、ＧＲＭ８、ＧＲＰ、ＧＳＰＴ１、ＧＳＳ、ＧＳＴＣＤ、ＧＵＬＰ１、ＨＡＵＳ２、ＨＥＧ１、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＤ４、ＩＤ２、ＩＤＨ３Ｂ、ＩＬ１Ａ、ＩＮＳＭ１、ＩＲＥＢ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ５、ＫＣＴＤ１２、ＫＤＥＬＣ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＫＩＡＡ０９０７、ＫＩＡＡ１２６７、ＫＩＦ１６Ｂ、ＫＬＣ１、ＫＬＨＬ１３、ＬＢＨ、ＬＭＯ４、ＬＯＣ１００１２８８４４、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ６４１２９８、ＬＯＣ６４７１９０、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＯＣ７２８１５３、ＬＲＰＰＲＣ、ＬＲＲＦＩＰ２、ＬＳＭ３、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＮ２Ａ１、ＭＡＯＡ、ＭＡＲＳ、ＭＤＮ１、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ２２、ＭＧＣ２４１０３、ＭＩＮＡ、ＭＫＬＮ１、ＭＬＥＣ、ＭＭＤ、ＭＯＲＦ４Ｌ２、ＭＰＺＬ１、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＭＲ９、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ６、Ｎ４ＢＰ２、ＮＡＡＡ、ＮＤＵＦＳ８、ＮＥＤＤ９、ＮＦＩＢ、ＮＫＴＲ、ＮＬＮ、ＮＯＳ１、ＮＲ２Ｃ１、ＮＵＦＩＰ２、ＮＵＰＬ１、ＯＳＢＰＬ３、ＰＡＰＤ４、ＰＣＢＰ２、ＰＣＤＨ９、ＰＣＧＦ５、ＰＣＮＸ、ＰＤＬＩＭ５、ＰＤＺＲＮ３、ＰＥＬＩ２、ＰＦＫＦＢ３、ＰＧＰ、ＰＨＦ２０、ＰＬＫ２、ＰＬＸＮＡ２、ＰＬＸＮＡ４、ＰＭ２０Ｄ２、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＱ、ＰＰＰ２Ｒ２Ａ、ＰＰＰ２Ｒ３Ｃ、ＰＲＤＸ２、ＰＳＭＡ７、ＰＳＭＥ４、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＫ２、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＲＥ、ＰＴＰＲＧ、ＱＫＩ、ＲＡＢ１２、ＲＡＢ３５、ＲＡＢ３ＧＡＰ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＬＧＡＰＡ１、ＲＡＮ、ＲＡＳＥＦ、ＲＢＬ１、ＲＤＨ１１、ＲＥＬＬ１、ＲＥＰＳ１、ＲＧＳ５、ＲＩＭＢＰ２、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ３４、ＲＮＰＥＰ���ＲＯＢＯ２、ＲＰＡＩＮ、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＲＤ１Ａ、Ｓ１ＰＲ３、ＳＡＬＬ４、ＳＢＮＯ１、ＳＣＡＲＢ２、ＳＤＨＡ、ＳＥＭＡ６Ａ、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＦ１、ＳＦＲＳ８、ＳＩＭ１、ＳＩＲＴ２、ＳＫＩＬ、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＣ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＸ５、ＳＯＸ２、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＧ９、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＳＰＯＮ１、ＳＲ１４０、ＳＳＢＰ２、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴＭＮ３、ＳＴＲＡ６、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＳＹＴＬ３、ＴＡＦ１５、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＤＧ、ＴＥＲＴ、ＴＦＰＩ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＯＣ４、ＴＩＭＰ３、ＴＬＥ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１７８、ＴＭＥＭ１８１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３６、ＴＳＨＺ３、ＴＸＮＲＤ１、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｏ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｚ、ＵＢＸＮ２Ａ、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ２５、ＵＳＰ３２、ＵＳＰ３４、ＶＰＳ２９、ＸＰＯ１、ＸＰＯ７、ＺＦＡＮＤ６、ＺＦＨＸ４、ＺＦＹＶＥ１６、ＺＧＰＡＴ、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ４５１、ＺＮＦ５０および／またはＺＮＦ６６４から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００６８】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＳＣＬ１、ＢＮＣ２、ＣＢＬＮ２、ＣＣＤＣ１５０、ＣＣＤＣ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＲＹＢＧ３、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＤＫＦＺＰ４３４Ｌ１８７、ＤＬＬ１、ＥＦＮＡ５、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＬ１、ＥＭＬ４、ＥＮＣ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＺＤ５、ＧＦＲＡ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＲＰ、ＩＤ２、ＩＴＧＡ６、ＫＣＴＤ１２、ＬＯＣ１００１２８８４４、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＧＣ２４１０３、ＭＳＮ、ＮＥＤＤ９、ＮＦＩＢ、ＯＳＢＰＬ３、ＰＡＰＤ４、ＰＣＤＨ９、ＰＤＺＲＮ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＱ、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＰＲＥ、ＰＴＰＲＧ、ＲＡＤ２３Ｂ、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＲＯＢＯ２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＧ９、ＳＲ１４０、ＴＦＰＩ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＰＢＧ、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３６および／またはＺＦＡＮＤ６から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００６９】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ６、ＣＢＬＮ２、ＣＣＤＣ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＲＹＢＧ３、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＬ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＲＰ、ＩＴＧＡ６、ＫＣＴＤ１２、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＧＣ２４１０３、ＰＣＤＨ９、ＰＬＫ２、ＰＯＬＱ、ＰＴＰＲＥ、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＲＯＢＯ２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＰＡＧ６、ＴＩＭＰ３および／またはＴＭＥＭ１３２Ｃから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００７０】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＢＬＮ２、ＣＣＤＣ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＲＹＢＧ３、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＧＮＢ４、ＧＲＰ、ＫＣＴＤ１２、ＬＵＭ、ＭＧＣ２４１０３、ＰＣＤＨ９、ＰＬＫ２、ＰＯＬＱ、ＰＴＰＲＥ、ＲＧＳ５、ＲＯＢＯ２、ＳＩＭ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＴＩＭＰ３および／またはＴＭＥＭ１３２Ｃから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００７１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して増加を示す。さらに別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に記載の約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、または約２５遺伝子〜約５０遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して増加を示す。
【００７２】
本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、Ｃ３ＯＲＦ７０、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤ９、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＤＫ２、ＣＥＮＰＬ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＦＮＤＣ５、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＲ１７７、ＧＴＳＥ１、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＧＲ１、ＰＴＰＲＫ、ＰＶＲＬ３、ＲＡＢ３２、ＲＢＰＭＳ、ＳＤＣ２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＭＥＭ１７８、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０、ＴＷＩＳＴ１および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＤＥＬＣ２、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＰＭＳ、ＲＮＦ１８２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ１７８および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００７３】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＣＤ９、ＣＤＫ２、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＣＭ１０、ＭＳＮ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３２、ＳＤＣ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０および／またはＴＷＩＳＴ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＬＰＡＲ１、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＴＰＲＫ、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＤＯＫ５、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００７４】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＰＹＤ、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＮＤＣ５、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＶＲＬ３、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＳＭＣ２、ＴＦＰ１２、ＴＭＥＭ１７８および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＰＹＤ、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＴＦＰＩ２および／またはＴＭＥＭ１７８から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＡＳＰ１、ＤＰＹＤ、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＰＬＫ２および／またはＴＦＰＩ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００７５】
また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ｃ３ＯＲＦ７０、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＰＲＳＳ１２、ＣＥＮＰＬ、ＧＰＲ１７７および／またはＰＴＧＲ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＭＡＢ２１Ｌ２および／またはＰＲＳＳ１２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００７６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１０または１２に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１０または１２に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１０または１２に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して減少を示す。別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１０または１２に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して減少を示す。更に別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１０または１２に記載の約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して減少を示す。
【００７７】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、１−Ｍａｒ、ＡＢＣＧ１、ＡＢＴＢ１、ＡＣＯＴ１、ＡＣＳＬ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＹＰ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＲＢ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＤ２、ＡＤＯ、ＡＦＦ３、ＡＫＡＰ１２、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＡＬＫＢＨ１、ＡＬＬＣ、ＡＭＮ１、ＡＮＫＨ、ＡＮＫＲＡ２、ＡＮＫＲＤ５０、ＡＮＸＡ５、ＡＰ３Ｂ２、ＡＲＭＣ１０、ＡＲＭＣＸ５、ＡＳＡＭ、ＡＳＢ１３、ＡＳＰＨＤ１、ＡＴＧ５、ＡＴＬ３、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｃ１、ＡＴＲＮＬ１、Ｂ３ＧＡＬＴＬ、ＢＡＣＥ１、ＢＡＣＥ２、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ７、ＢＣＡＰ２９、ＢＣＬ２、ＢＣＯＲＬ１、ＢＲＵＮＯＬ４、ＢＲＵＮＯＬ６、ＢＲＷＤ１、ＢＴＮ３Ａ３、Ｃ１０ＯＲＦ１０、Ｃ１０ＯＲＦ１０４、Ｃ１１ＯＲＦ５７、Ｃ１１ＯＲＦ７０、Ｃ１４ＯＲＦ１６７、Ｃ１５ＯＲＦ３９、Ｃ１６ＯＲＦ５２、Ｃ１７ＯＲＦ６９、Ｃ１８ＯＲＦ１８、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ１ＯＲＦ２１、Ｃ１ＯＲＦ２５、Ｃ１ＯＲＦ９７、Ｃ１ＲＬ、Ｃ２１ＯＲＦ５７、Ｃ２ＣＤ２、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ２ＯＲＦ６７、Ｃ２ＯＲＦ６８、Ｃ３ＯＲＦ２３、Ｃ４ＯＲＦ１２、Ｃ４ＯＲＦ３９、Ｃ４ＯＲＦ４１、Ｃ５ＯＲＦ４２、Ｃ６ＯＲＦ１２０、Ｃ９ＯＲＦ１５０、ＣＡＤＭ２、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＣＡＭＫ２Ｎ１、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＡＰＮ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＣＤＣ１２６、ＣＣＤＣ４０、ＣＣＤＣ５０、ＣＣＮＹ、ＣＤ２４８、ＣＤ３０２、ＣＤＣ２Ｌ６、ＣＤＣ３７Ｌ１、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＨ１２、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＳ１、ＣＦＣ１、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＣＬＣＮ３、ＣＬＤＮ１２、ＣＬＭＮ、ＣＬＮ８、ＣＮＧＡ３、ＣＮＮＭ１、ＣＮＯＴ６Ｌ、ＣＯＬ２７Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＸ１８、ＣＯＸ５Ｂ、ＣＲＹＧＤ、ＣＲＹＺＬ１、ＣＴＰＳ２、ＣＴＳＣ、ＣＹＢ５Ｒ２、ＣＹＧＢ、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｕ１、ＣＹＴＬ１、ＣＹＹＲ１、Ｄ４Ｓ２３４Ｅ、ＤＡＢ１、ＤＢＴ、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＬＫ１、ＤＣＴＤ、ＤＤＡＨ１、ＤＨＲＳＸ、ＤＩＳＰ１、ＤＫＦＺＰ４３４Ｉ０７１４、ＤＫＫ１、ＤＮＡＪＣ１２、ＤＮＡＪＣ２４、ＤＮＡＳＥ１Ｌ１、ＤＮＥＲ、ＤＯＰＥＹ２、ＤＲＡＭ２、ＤＳＣＡＭ、ＤＳＣＲ３、ＤＴＸ３Ｌ、ＤＵＳＰ１６、ＤＵＳＰ２２、ＥＣＥＬ１、ＥＣＨＤＣ３、ＥＥＦ１Ｄ、ＥＥＦ２Ｋ、ＥＦＥＭＰ２、ＥＦＮＢ３、ＥＭＩＤ１、ＥＮＯＸ２、ＥＲＡＰ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＴＦＤＨ、ＥＴＳ２、ＥＹＡ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＦＡＭ１６２Ｂ、ＦＡＭ１６５Ｂ、ＦＡＭ１７２Ａ、ＦＡＭ１７５Ａ、ＦＡＭ１９０Ａ、ＦＡＭ２６Ｆ、ＦＡＭ４６Ａ、ＦＡＭ４９Ａ、ＦＡＭ７１Ｅ１、ＦＡＭ７６Ａ、ＦＡＭ８５Ａ、ＦＢＸＬ５、ＦＢＸＷ７、ＦＣＲＬＢ、ＦＧＤ５、ＦＧＦ１、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＴＮ、ＦＬＪ１００３８、ＦＬＪ３５２２０、ＦＬＪ３５３９０、ＦＬＪ３７７９８、ＦＬＪ３９０５１、ＦＯＸＯ６、ＦＳＴＬ１、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬ、ＧＡＲＴ、ＧＡＳ５、ＧＤＰＤ５、ＧＬＣＥ、ＧＬＩ２、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ３、ＧＬＴ２５Ｄ２、ＧＮＡ１４、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２３、ＧＰＸ７、ＧＲＭ５、ＧＴＦ２Ｈ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、Ｈ２ＡＦＪ、ＨＣＧ １７７６０１８、ＨＤＡＣ４、ＨＥＢＰ２、ＨＥＬＱ、ＨＥＲＰＵＤ２、ＨＨＬＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＨＭＧＣＬＬ１、ＨＮＲＮＰＲ、ＨＰＣＡＬ１、ＨＰＤＬ、ＨＰＳ３、ＨＳＢＰ１Ｌ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＴＡＴＩＰ２、ＩＣＡＭ２、ＩＦＮＡＲ１、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ７、ＩＧＳＦ５、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ７、ＩＭＭＰ２Ｌ、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ１、ＩＴＧＢ１ＢＰ１、ＪＭＹ、ＪＲＫＬ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＣＭＦ１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ５、ＫＣＴＤ１８、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＳＲ、ＫＨＤＣ１、ＫＩＡＡ１１０９、ＫＩＡＡ１３２４、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＩＡＡ１８０４、ＫＩＲＲＥＬ３、ＫＬＨＤＣ１、ＫＲＣＣ１、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＩＦＲ、ＬＩＮＧＯ１、ＬＩＰＴ１、ＬＭＡＮ２Ｌ、ＬＭＣＤ１、ＬＯＣ１００１２９１９５、ＬＯＣ１００１２９８８４、ＬＯＣ１００１３０５２２、ＬＯＣ１００１３０８５６、ＬＯＣ１００１３２１６７、ＬＯＣ１００２１６４７９、ＬＯＣ１００２７２２１７、ＬＯＣ１００２８７０３９、ＬＯＣ１５１１４６、ＬＯＣ１５３６８２、ＬＯＣ２２０９３０、ＬＯＣ２５４１２８、ＬＯＣ２５５１６７、ＬＯＣ２８３５８８、ＬＯＣ２８５２８６、ＬＯＣ２８５５５０、ＬＯＣ２８５８７８、ＬＯＣ２８６０５２、ＬＯＣ３３９２９０、ＬＯＣ４０１３２１、ＬＯＣ６４５５１３、ＬＯＣ８０１５４、ＬＯＣ９０２４６、ＬＯＣ９３６２２、ＬＯＣ９４４３１、ＬＰＡＲ３、ＬＰＨＮ２、ＬＲＣＨ２、ＬＲＰ２ＢＰ、ＬＹＲＭ１、ＬＹＲＭ５、ＭＡＧＩ２、ＭＡＮＳＣ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ９、ＭＡＰＫＡＰ１、ＭＢＤ５、ＭＢＬＡＣ２、ＭＢＮＬ１、ＭＣＴＰ１、ＭＥＤ６、ＭＥＧＦ１１、ＭＥＯＸ２、ＭＥＴ、ＭＥＴＴ５Ｄ１、ＭＦＳＤ４、ＭＦＳＤ６、ＭＦＳＤ９、ＭＧＡＴ４Ａ、ＭＯＲＣ３、ＭＲＥＧ、ＭＲＰＳ１８Ｃ、ＭＲＰＳ３３、ＭＳＴ１、ＭＴＭＲ３、ＭＴＵＳ２、ＭＸＲＡ７、Ｎ４ＢＰ３、ＮＡＰ１Ｌ３、ＮＣＡＭ１、ＮＣＡＭ２、ＮＣＯＡ７、ＮＣＲＮＡ０００８１、ＮＣＲＮＡ００１１７、ＮＣＲＮＡ００１７１、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＤＵＦＶ３、ＮＥＡＴ１、ＮＥＢＬ、ＮＥＩＬ２、ＮＥＴＯ１、ＮＦＡＴＣ４、ＮＨＥＤＣ２、ＮＩＰＡＬ３、ＮＬＲＸ１、ＮＮＡＴ、ＮＯＴＣＨ４、ＮＰＷ、ＮＰＹ、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＴ５Ｅ、ＮＵＤＴ１９、ＮＵＤＴ６、ＯＧＦＲＬ１、ＯＬＦＭ３、ＯＭＡ１、ＯＰＲＭ１、ＯＰＴＮ、Ｐ４ＨＴＭ、ＰＡＢＰＣ４Ｌ、ＰＡＢＰＣ５、ＰＡＫ１、ＰＡＭ、ＰＡＰＯＬＧ、ＰＡＰＰＡ、ＰＢＸ１、ＰＣＤＨＢ１０、ＰＣＤＨＢ１６、ＰＣＮＸ、ＰＣＮＸＬ２、ＰＤＣＤ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ６、ＰＨＫＡ１、ＰＨＬＤＢ３、ＰＩＢＦ１、ＰＩＤ１、ＰＩＧＨ、ＰＩＧＰ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＷＩＬ２、ＰＫＮＯＸ１、ＰＫＮＯＸ２、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ、ＰＬＣＢ１、ＰＬＥＫＨＡ２、ＰＬＥＫＨＡ３、ＰＬＩＮ２、ＰＬＲＧ１、ＰＯＬＲ３ＧＬ、ＰＯＵ６Ｆ��、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＰＯＸ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＰＰＰ３ＣＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＭＴ２、ＰＲＰＨ、ＰＳＤ３、ＰＳＴＫ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＮ、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＮ２、ＰＴＰＲＲ、ＱＰＣＴ、ＲＡＢ４Ａ、ＲＡＢ６Ｂ、ＲＡＣ２、ＲＡＩ２、ＲＣＡＮ １、ＲＣＣ １、ＲＤＨ １３、ＲＦＰＬ１Ｓ、ＲＧ９ＭＴＤ２、ＲＧＡＧ４、ＲＨＢＤＤ１、ＲＨＢＤＦ２、ＲＨＯＵ、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ４１、ＲＮＬＳ、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３７、ＲＰＲＤ１Ａ、ＲＲＮ３、ＲＳＬ１Ｄ１、ＲＳＰＨ３、ＳＡＰ３０、ＳＡＶ１、ＳＣＧ５、ＳＣＮ５Ａ、ＳＥＲＴＡＤ４、ＳＧＭＳ１、ＳＨ３ＢＧＲ、ＳＨ３ＧＬ２、ＳＨ３ＫＢＰ１、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＩＡＥ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＩＫ１、ＳＩＫ３、ＳＩＸ２、ＳＬＣ１２Ａ７、ＳＬＣ１６Ａ１４、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬＣ２５Ａ１２、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ６Ａ１５、ＳＬＩＴ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＥＫ２、ＳＮＡＰ９１、ＳＮＣＡ、ＳＯＣＳ５、ＳＯＲＣＳ２、ＳＰＡＴＡ１７、ＳＰＡＴＡ７、ＳＰＩＮ３、ＳＰＩＮＴ１、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＯＣＫ２、ＳＰＲＥＤ１、ＳＳＰＮ、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＳＴＡＣ２、ＳＴＡＲ、ＳＴＥＡＰ３、ＳＴＯＸ２、ＳＴＸ１２、ＳＴＸＢＰ５Ｌ、ＳＵＣＬＧ２、ＳＹＮＪ１、ＳＹＮＰＲ、ＳＹＴ１３、ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１Ｂ、ＴＢＣ１Ｄ１２、ＴＢＣ１Ｄ１５、ＴＣＥＡＬ２、ＴＥＸ２６４、ＴＨＡＰ２、ＴＭ２Ｄ１、ＴＭＣＣ１、ＴＭＥＭ１８２、ＴＭＥＭ１８４Ｃ、ＴＭＥＭ１９６、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＴＭＥＭ５、ＴＭＥＭ５９Ｌ、ＴＭＥＭ６５、ＴＭＩＥ、ＴＮＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＳＦ４、ＴＯＸ、ＴＲＡＰＰＣ９、ＴＲＨＤＥ、ＴＲＩＭ６１、ＴＲＩＭ６９、ＴＳＰＡＮ７、ＴＳＰＡＮ９、ＴＴＣ２３、ＴＴＣ３９Ｃ、ＴＵＳＣ３、ＴＸＬＮＢ、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＣＮ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＴＰ２３、ＶＰＳ３７Ａ、ＶＳＴＭ２Ａ、ＷＡＳＦ３、ＷＤＦＹ３、ＷＤＴＣ１、ＸＰＲ１、ＸＹＬＴ１、ＺＢＴＢ４１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ、ＺＮＦ１４８、ＺＮＦ１８５、ＺＮＦ２２、ＺＮＦ２３、ＺＮＦ２５、ＺＮＦ２５０、ＺＮＦ２８０Ｄ、ＺＮＦ２８５Ａ、ＺＮＦ２９５、ＺＮＦ３４６、ＺＮＦ５２８、ＺＮＦ５８５Ａ、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ６４１、ＺＮＦ６６２、ＺＮＦ６７７および／またはＺＮＦ８６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００７８】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ１、ＡＤＡＲＢ１、ＡＳＡＭ、ＢＡＣＥ２、Ｃ１１ ＯＲＦ７０、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ３ＯＲＦ２３、ＣＡＤＭ２、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＦＣ１、ＣＮＧＡ３、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＤＳＣＡＭ、ＥＣＥＬ１、ＥＣＨＤＣ３、ＦＡＭ２６Ｆ、ＦＡＭ４９Ａ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１９、ＦＬＪ３９０５１、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬ、ＧＰＸ７、ＧＲＭ５、ＨＣＧ １７７６０１８、ＨＨＬＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＴＡＴＩＰ２、ＩＣＡＭ２、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１３ＲＡ２、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＱ５、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＲＣＣ１、ＬＭＣＤ１、ＬＯＣ１００２１６４７９、ＬＯＣ２５４１２８、ＬＯＣ３３９２９０、ＬＰＡＲ３、ＭＥＧＦ１１、ＭＥＯＸ２、ＮＣＡＭ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＡＴ１、ＮＮＡＴ、ＮＰＷ、ＮＰＹ、ＰＡＢＰＣ４Ｌ、ＰＡＰＰＡ、ＰＩＤ１、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＮ、ＰＴＰ４Ａ３、ＲＡＣ２、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＹＴ１３、ＴＣＥＡＬ２、ＴＨＡＰ２、ＴＭＩＥ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＲＨＤＥ、ＴＸＬＮＢおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００７９】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ１、ＡＳＡＭ、ＢＡＣＥ２、Ｃ１１ＯＲＦ７０、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ３ＯＲＦ２３、ＣＡＤＭ２、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＦＣ１、ＣＮＧＡ３、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＤＳＣＡＭ、ＥＣＥＬ１、ＥＣＨＤＣ３、ＦＧＦ１、ＦＧＦ１３、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬ、ＧＰＸ７、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＴＡＴＩＰ２、ＩＣＡＭ２、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ７、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＲＣＣ１、ＬＭＣＤ１、ＬＯＣ１００２１６４７９、ＬＯＣ２５４１２８、ＬＯＣ３３９２９０、ＬＰＡＲ３、ＭＥＯＸ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＡＴ１、ＮＮＡＴ、ＮＰＷ、ＮＰＹ、ＰＡＰＰＡ、ＰＩＤ１、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＲＡＭＥ、ＰＴＮ、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＹＴ１３、ＴＣＥＡＬ２、ＴＭＩＥ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＲＨＤＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００８０】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ｃ１１ＯＲＦ７０、ＣＡＤＭ２、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＮＧＡ３、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＤＳＣＡＭ、ＦＧＦ１３、ＦＵＣＡ２、ＧＡＬ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＴＡＴＩＰ２、ＩＣＡＭ２、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ７、ＬＭＣＤ１、ＬＯＣ１００２１６４７９、ＭＥＯＸ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＡＴ１、ＮＮＡＴ、ＮＰＷ、ＰＩＤ１、ＰＲＡＭＥ、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＹＴ１３、ＴＣＥＡＬ２、ＴＭＩＥ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００８１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表５および７に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示し、かつ、表９および１１に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表５または７に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示し、かつ、表９および１１に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表５または７に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の増加を示し、かつ、表９または１１に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表５または７に記載の、かつ、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表９または１１に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおける増加を示す。更に別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表５または７に記載の、かつ、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表９または１１に記載���、例えば、約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、または約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおける増加を示す。
【００８２】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＬＣＡＭ、ＡＮＡＰＣ７、ＡＲＦ１、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＬ１７Ａ、ＡＳＣＬ１、ＡＳＸＬ３、ＢＡＳＰ１、ＢＮＣ２、Ｃ１０ＯＲＦ５８、Ｃ１２ＯＲＦ４９、Ｃ１ＯＲＦ４３、Ｃ２０ＯＲＦ７、ＣＢＬＢ、ＣＢＷＤ１、ＣＣＤＣ３、ＣＤ９、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＨＲＮＡ７、ＣＰＶＬ、ＣＲＹＢＧ３、ＣＳＥ１Ｌ、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＣＴ１、ＤＡＺ１、ＤＢＨ、ＤＨＸ３５、ＤＫＦＺＰ４３４Ｌ１８７、ＤＬＥＵ２、ＤＬＬ３、ＥＡＦ２、ＥＦＮＡ５、ＥＩＦ３Ｃ、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＬ１、ＥＮＣ１、ＥＸＯＳＣ６、ＥＸＰＨ５、ＥＺＨ２、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＦＡＭ１９Ａ４、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＵＢＰ３、ＦＺＤ５、ＧＡＰ４３、ＧＦＲＡ２、ＧＮＡＭ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＰＲ１２５、ＧＲＰ、ＧＳＳ、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ５、ＫＣＴＤ１２、ＫＤＥＬＣ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＫＩＦ１６Ｂ、ＫＬＨＬ１３、ＬＢＨ、ＬＯＣ１００１２８８４４、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ６４１２９８、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＮ２Ａ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＭＤ、ＭＳＮ、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹ０６、ＮＡＡＡ、ＮＥＤＤ９、ＮＯＳ１、ＯＳＢＰＬ３、ＰＣＧＦ５、ＰＥＬＩ２、ＰＦＫＦＢ３、ＰＨＦ２０、ＰＬＫ２、ＰＬＳ３、ＰＬＸＮＡ２、ＰＬＸＮＡ４、ＰＭ２０Ｄ２、ＰＯＬＥ、ＰＳＭＡ７、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＰＲＥ、ＰＴＰＲＧ、ＲＡＢ３５、ＲＡＦ１、ＲＡＮ、ＲＡＳＥＦ、ＲＢＬ１、ＲＥＬＬ１、ＲＧＳ５、ＲＩＭＢＰ２、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ３４、Ｓ１ ＰＲ３、ＳＡＬＬ４、ＳＥＭＡ６Ａ、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＰＡＧ６、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴＭＮ３、ＳＴＲＡ６、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＦＰＩ２、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＯＣ４、ＴＩＭＰ３、ＴＬＥ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＭＥＭ１７８、ＴＰＢＧ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３６、ＴＳＨＺ３、ＴＸＮＲＤ１、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＥ２Ｖ１、ＶＰＳ２９、ＺＦＨＸ４、ＺＧＰＡＴ、ＺＮＦ２１７および／またはＺＮＦ５０３から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８３】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＳＣＬ１、ＢＮＣ２、ＣＣＤＣ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＲＹＢＧ３、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＥＦＮＡ５、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＬ１、ＥＮＣ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＦＺＤ５、ＧＦＲＡ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＲＰ、ＩＴＧＡ６、ＫＣＴＤ１２、ＬＯＣ１００１２８８４４、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＳＮ、ＮＥＤＤ９、ＯＳＢＰＬ３、ＰＬＫ２、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＰＲＥ、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＰＡＧ６、ＴＦＰＩ２、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＭ１３２Ｃ、ＴＰＢＧ、ＴＲＩＭ２９および／または ＴＲＩＭ３６から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８４】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＨＧＡＰ６、ＡＲＨＧＥＦ６、ＣＣＤＣ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＲＹＢＧ３、ＣＵＧＢＰ２、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＬ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＲＰ、ＩＴＧＡ６、ＫＣＴＤ１２、ＬＯＣ３４０１０９、ＬＵＭ、ＭＡＢ２１Ｌ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＰＬＫ２、ＰＴＰＲＥ、ＲＧＳ５、ＲＮＦ１８２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＰＡＧ６、ＴＩＭＰ３および／またはＴＭＥＭ１３２Ｃから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８５】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＣＤＣ３、ＣＨＲＮＡ７、ＣＲＹＢＧ３、ＣＸＣＲ４、ＤＡＺ１、ＥＸＰＨ５、ＦＡＭ７Ａ３、ＧＮＢ４、ＧＲＰ、ＫＣＴＤ１２、ＬＵＭ、ＰＬＫ２、ＰＴＰＲＥ、ＲＧＳ５、ＳＩＭ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＴＩＭＰ３および／またはＴＭＥＭ１３２Ｃから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＦ１、ＡＲＬ１７Ａ、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＣＤ９、ＣＵＧＢＰ２、ＥＡＦ２、ＥＩＦ３Ｃ、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＦＵＢＰ３、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＫＤＥＬＣ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＫＬＨＬ１３、ＬＯＣ６４１２９８、ＬＯＣ７２８０５２、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＭＹ０６、ＰＬＫ２、ＰＬＳ３、ＲＡＦ１、ＲＥＬＬ１、ＲＮＦ１８２、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ１７８、ＴＲＡ２Ａ、Ｕ２ＡＦ１および／またはＺＮＦ２１７から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８７】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ａ２ＢＰ１、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＦ１、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＣＤ９、ＣＵＧＢＰ２、ＥＩＦ３Ｃ、ＦＵＢＰ３、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＫＤＥＬＣ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＬＯＣ６４１２９８、ＬＯＣ７２８０５２、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＭＹ０６、ＰＬＫ２、ＰＬＳ３、ＲＥＬＬ１、ＲＮＦ１８２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＳＬＩＴＲＫ５、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ１７８、ＴＲＡ２Ａおよび／またはＺＮＦ２１７から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８８】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＳＣＬ１、ＣＵＧＢＰ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＬＯＣ７２８０５２、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＳＮ、ＰＬＫ２、ＲＮＦ１８２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＩＴＲＫ５および／またはＴＦＰＩ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００８９】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＰＬＫ２、ＲＮＦ１８２、ＳＩＭ１、ＳＬＣ４４Ａ５および／またはＳＬＩＴＲＫ５から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００９０】
本実施形態の更に別の様態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＧＮＢ４、ＰＬＫ２、ＳＩＭ１および／またはＳＬＩＴＲＫ５から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【００９１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６および８に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示し、かつ、表１０および１２に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６および８に記載した１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示し、かつ、表１０および１２に記載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表６または８に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の減少を示し、かつ、表１０または１２に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の減少を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１０または１２に記載の、例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して減少を示す。更に別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表６または８に記載の、かつ、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して表１０または１２に記載の、例えば、約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝���、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、または約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおける減少を示す。
【００９２】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＢＴＢ１、ＡＣＯＴ１、ＡＣＹＰ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＤＣＹ１、ＡＮＫＲＤ５０、ＡＳＡＭ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＢＡＣＥ１、ＢＲＵＮＯＬ４、ＢＲＷＤ１、ＢＴＮ３Ａ３、Ｃ１６ＯＲＦ５２、Ｃ１ＯＲＦ２１、Ｃ２１ＯＲＦ５７、Ｃ２ＣＤ２、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ３ＯＲＦ２３、Ｃ９ＯＲＦ１５０、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＡＰＮ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＤ３０２、ＣＤＨ１２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＳ１、ＣＦＣ１、ＣＬＣＮ３、ＣＬＤＮ１２、ＣＬＭＮ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＮＭ１、ＣＮＯＴ６Ｌ、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＹＧＢ、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、Ｄ４Ｓ２３４Ｅ、ＤＣＬＫ１、ＤＣＴＤ、ＤＵＳＰ１６、ＥＦＮＢ３、ＥＲＡＰ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＴＦＤＨ、ＦＡＭ１６２Ｂ、ＦＡＭ１６５Ｂ、ＦＡＭ４６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＤ５、ＦＧＦ１３、ＦＯＸＯ６、ＦＳＴＬ１、ＧＡＬ、ＧＬＴ２５Ｄ２、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２３、ＧＰＸ７、ＧＲＭ５、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＨＣＧ １７７６０１８、ＨＥＬＱ、ＨＥＲＰＵＤ２、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＨＮＲＮＰＲ、ＨＰＣＡＬ１、ＩＬ１０ＲＢ、ＪＭＹ、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＱ２、ＫＨＤＣ１、ＫＩＡＡ１５９８、ＫＬＨＤＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＩＦＲ、ＬＯＣ１００１３０５２２、ＬＯＣ９４４３１、ＬＲＰ２ＢＰ、ＬＹＲＭ５、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ９、ＭＣＴＰ１、ＭＥＯＸ２、ＭＦＳＤ４、ＭＧＡＴ４Ａ、ＭＲＰＳ３３、ＭＳＴ１、ＮＡＰ１Ｌ３、ＮＣＯＡ７、ＮＣＲＮＡ００１７１、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＤＵＦＶ３、ＮＥＢＬ、ＮＨＥＤＣ２、ＮＩＰＡＬ３、ＮＬＲＸ１、ＮＵＤＴ１９、ＯＬＦＭ３、ＰＡＭ、ＰＡＰＰＡ、ＰＣＮＸＬ２、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＨＫＡ１、ＰＩＧＨ、ＰＬＲＧ１、ＰＬＲＧ１、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＰＨ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＮ、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＢ６Ｂ、ＲＧＡＧ４、ＲＨＯＵ、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ４１、ＲＳＬ１Ｄ１、ＳＨ３ＧＬ２、ＳＨ３ＹＬ１、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＩＫ１、ＳＬＣ１２Ａ７、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＮＣＡ、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＯＣＫ２、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＳＴＡＲ、ＳＴＥＡＰ３、ＳＴＯＸ２、ＳＹＮＪ１、ＳＹＴ１３、ＴＭ２Ｄ１、ＴＭＥＭ１８４Ｃ、ＴＭＥＭ５、ＴＭＥＭ５９Ｌ、ＴＭＩＥ、ＴＴＣ３９Ｃ、ＴＵＳＣ３、ＴＸＬＮＢ、ＵＣＮ、ＷＤＦＹ３、ＷＤＦＹ３、ＺＮＦ６４１および／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９３】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ１、ＡＤＡＲＢ１、ＡＳＡＭ、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ３ＯＲＦ２３、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＦＣ１、ＣＮＧＡ３、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＦＧＦ１３、ＧＡＬ、ＧＰＸ７、ＧＲＭ５、ＨＣＧ １７７６０１８、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＫＣＮＭＡ１、ＫＩＡＡ１５９８、ＭＥＯＸ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＮ、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥ、ＴＸＬＮＢおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９４】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ１、ＡＳＡＭ、Ｃ２ＣＤ４Ａ、Ｃ３ＯＲＦ２３、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＦＣ１、ＣＮＧＡ３、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＦＧＦ１３、ＧＡＬ、ＧＰＸ７、ＫＩＡＡ１５９８、ＭＥＯＸ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＴＮ、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９５】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＡＰ２、ＣＡＲＴＰＴ、ＣＮＧＡ３、ＣＹＧＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＴＬ１、ＦＧＦ１３、ＧＡＬ、ＭＥＯＸ２、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＳＬＣ３５Ｆ３、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＡＰ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＮＧＡ３、ＦＡＭ１６２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＯＸＯ６、ＦＳＴＬ１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＨＤＣ１、ＬＩＦＲ、ＭＣＴＰ１、ＭＥＯＸ２、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＴＮ、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９７】
本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＡＰ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＮＧＡ３、ＦＧＦ１３、ＦＯＸＯ６、ＦＳＴＬ１、ＫＣＮＭＡ１、ＫＨＤＣ１、ＭＣＴＰ１、ＭＥＯＸ２、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＴＮ、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９８】
本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＮＧＡ３、ＦＧＦ１３、ＫＣＮＭＡ１、ＭＥＯＸ２、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＴＮ、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【００９９】
本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＮＧＡ３、ＦＧＦ１３、ＭＥＯＸ２、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＰＴＮ、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【０１００】
本実施形態の更に別の様態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＣＮＧＡ３、ＦＧＦ１３、ＭＥＯＸ２、ＳＹＴ１３、ＴＭＩＥおよび／またはＺＮＦ６６２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の減少を示す。
【０１０１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に掲載の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍または少なくとも８．０倍の差を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に記載の例えば、２以上の遺伝子、３以上の遺伝子、４以上の遺伝子、５以上の遺伝子、６以上の遺伝子、７以上の遺伝子、８以上の遺伝子、９以上の遺伝子、１０以上の遺伝子、２０以上の遺伝子、３０以上の遺伝子、４０以上の遺伝子、５０以上の遺伝子、６０以上の遺伝子、７０以上の遺伝子、８０以上の遺伝子、９０以上の遺伝子、または１００以上の遺伝子の発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して増加を示す。更に別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、表１４または１６に記載の、例えば、約５遺伝子〜約１００遺伝子、約１０遺伝子〜約１００遺伝子、約１５遺伝子〜約１００遺伝子、約２０遺伝子〜約１００遺伝子、約２５遺伝子〜約１００遺伝子、約５遺伝子〜約７５遺伝子、約１０遺伝子〜約７５遺伝子、約１５遺伝子〜約７５遺伝子、約２０遺伝子〜約７５遺伝子、約２５遺伝子〜約７５遺伝子、約５遺伝子〜約５０遺伝子、約１０遺伝子〜約５０遺伝子、約１５遺伝子〜約５０遺伝子、約２０遺伝子〜約５０遺伝子、約２５遺伝子〜約５０遺伝子の発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して増加を示す。
【０１０２】
実施形態において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、Ｃ３ＯＲＦ７０、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤ９、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＤＫ２、ＣＥＮＰＬ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＦＮＤＣ５、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＲ１７７、ＧＴＳＥ１、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＣＭ１０、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＭＹ０６、ＭＹＲＩＰ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＧＲ１、ＰＴＰＲＫ、ＰＶＲＬ３、ＲＡＢ３２、ＲＢＰＭＳ、ＳＤＣ２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＭＥＭ１７８、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０、ＴＷＩＳＴ１および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＳＰ１、ＢＶＥＳ、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＴＳＥ１、ＧＴＳＦ１、ＩＴＰＲＩＰ、ＫＤＥＬＣ２、ＬＯＣ７２８０５２、ＬＰＡＲ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＲＳＳ１２、ＰＴＰＲＫ、ＲＢＰＭＳ、ＲＮＦ１８２、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ１７８および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の差を示す。
【０１０３】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＣＤ９、ＣＤＫ２、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＣＭ１０、ＭＳＮ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３２、ＳＤＣ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０および／またはＴＷＩＳＴ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、GNAI1、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＬＰＡＲ１、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＴＰＲＫ、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＤＯＫ５、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２および／またはＴＰＴＥから選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【０１０４】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＡＣＯＴ９、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＰＹＤ、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＮＤＣ５、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＹ０６、ＭＹＲＩＰ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＶＲＬ３、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＳＭＣ２、ＴＦＰ１２、ＴＭＥＭ１７８および／またはＺＮＦ５２１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＰＹＤ、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＴＦＰＩ２および／またはＴＭＥＭ １７８から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＢＡＳＰ１、ＤＰＹＤ、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＰＬＫ２および／またはＴＦＰＩ２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【０１０５】
また他の実施形態において、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、Ｃ３ＯＲＦ７０、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＰＲＳＳ１２、ＣＥＮＰＬ、ＧＰＲ１７７および／またはＰＴＧＲ１から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルがにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、ＭＡＢ２１Ｌ２および／またはＰＲＳＳ１２から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、２Ｄ６細胞株と親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４の両方由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して少なくとも１．５倍の増加を示す。
【０１０６】
本開示の態様は親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞のＢｏＮＴ／Ａ活性でのＥＣ５０に比べてＢｏＮＴ／Ａ活性については、等価またはそれより低いＥＣ５０を示すＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４来の細胞のＢｏＮＴ／Ａ活性でのＥＣ５０に比べてＢｏＮＴ／Ａ活性については、等価またはそれより低いＥＣ５０を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４来の細胞のＢｏＮＴ／Ａ活性での ＥＣ５０に比べてＢｏＮＴ／Ａ活性については、等価のＥＣ５０を示す。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は、親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４来の細胞のＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０に比べてＢｏＮＴ／Ａ活性については、より低い、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％のＥＣ５０を示す。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４来の細胞のＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０に比べてＢｏＮＴ／Ａ活性についてはより低い、例えば、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％または少なくとも２００％のＥＣ５０を示す。さらに別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞は親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４来の細胞のＢｏＮＴ／Ａ活性の ＥＣ５０に比べてＢｏＮＴ／Ａ活性についてはより低い、例えば、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３２５％、少なくとも３５０％、少なくとも３７５％、少なくとも４００％、少なくとも４２５％、少なくとも４５０％、少なくとも４７５％、または少なくとも５００％のＥＣ５０を示す。本実施形態の更に別の様態では、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい樹立したクローン細胞株由来の細胞はＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０、例えば、１０ｐＭ以下、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３．０ｐＭ以下、２．９ｐＭ以下、２．８ｐＭ以下、２．７ｐＭ以下、２．６ｐＭ以下、２．５ｐＭ以下、２．４ｐＭ以下、２．３ｐＭ以下、２．２ｐＭ以下、２．１ｐＭ以下、２．０ｐＭ以下、１．９ｐＭ以下、１．８ｐＭ以下、１．７ｐＭ以下、１．６ｐＭ以下、１．５ｐＭ以下、１．４ｐＭ以下、１．３ｐＭ以下、１．２ｐＭ以下、１．１ｐＭ以下、１．０ｐＭ以下、０．９ｐＭ以下、０．８ｐＭ以下、０．７ｐＭ以下、０．６ｐＭ以下、０．５ｐＭ以下、０．４ｐＭ以下、０．３ｐＭ以下、０．２ｐＭ以下または０．１ｐＭ以下を示す。
【０１０７】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａを一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ」は、「ボツリヌス神経毒素血清型Ａ」または「Ａ型ボツリヌス神経毒素」と同意語とみなし、天然のＢｏＮＴ／Ａまたは天然に存在しないＢｏＮＴ／Ａの両方を言い、さらには約１５０ ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ神経毒素および結合性の非毒性結合蛋白質（ＮＡＰ）ならびに約１５０ ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ神経毒素のみを含むＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む。ＢｏＮＴ／Ａ複合体の非限定的な例は、例えば、９００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ複合体、５００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ複合体、３００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む。約１５０ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ神経毒素の非限定的な例は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４を含む。
【０１０８】
本明細書で使用されるとき、用語「天然のＢｏＮＴ／Ａ」は、限定するものではなく、翻訳後修飾から産生されたＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム、異なるスプライシングにより生成した転写物または自発突然変異、および、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ２サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ３サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ４サブタイプ、およびＢｏＮＴ／Ａ５サブタイプなどのＢｏＮＴ／Ａサブタイプを含む天然のプロセスにより調製されたＢｏＮＴ／Ａを言う。天然のＢｏＮＴ／Ａは、限定するものではなく、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のＢｏＮＴ／Ａの市販されている医薬組成物は、限定するものではなく、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）、（Ｉｐｓｅｎ Ｌｔｄ．、Ｓｌｏｕｇｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＰＵＲＴＯＸ（登録商標）（Ｍｅｎｔｏｒ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）、ＸＥＯＭＩＮ（登録商標）（Ｍｅｒｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＧｍｂＨ．、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）（Ｍｅｄｙ−Ｔｏｘ、Ｉｎｃ．、Ｏｃｈａｎｇ−ｍｙｅｏｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）、ＢＴＸ−Ａを含む。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、用語「天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生されたアミノ酸配列が変化したＢｏＮＴ／Ａ、およびインビトロでの化学合成により産生されたＢｏＮＴ／Ａを含むヒトの操作の支援で修飾された構造のＢｏＮＴ／Ａを言う。天然に存在しないＢｏＮＴ／Ａｓの非限定的な例は、例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（米国特許第７，２２３，５７７号）；Ｄｏｌｌｙ、Ｊ． Ｏ． ｅｔ ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許第７，４１９，６７６号）；Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（米国特許出願公開第２００４／０２２０３８６号）；Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ Ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ Ｆｏｒ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国特許出願公開第２００８／００９６２４８号）；Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ Ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００８／０１６１５４３号）；Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ Ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００８／０２４１８８１号）に記載されている。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。
【０１１０】
従って、一実施形態では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は天然のＢｏＮＴ／Ａからである。本実施形態の一態様では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性はＢｏＮＴ／ＡアイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａサブタイプからである。本実施形態の一態様では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のＢｏＮＴ／Ａからである。本実施形態の別の態様では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するＢｏＮＴ／Ａからである。本実施形態の別の態様では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性はＢＯＴＯＸ（登録商標）、ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）、ＰＵＲＴＯＸ（登録商標）、ＸＥＯＭＩＮ（登録商標）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）またはＢＴＸ−Ａからである。
【０１１１】
別の実施形態では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａからである。本実施形態の別の態様では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ変異体からである。本実施形態の別の態様では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と比べて１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ変異体からである。さらに別の実施形態では、検出されるＢｏＮＴ／Ａ活性は配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と比べて１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ変異体からである。
【０１１２】
本開示の態様はＳＮＡＰ−２５を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＳＮＡＰ−２５」は、天然のＳＮＡＰ−２５またはＢｏＮＴ／Ａにより優先的に切断されている天然には存在しないＳＮＡＰ−２５を言う。本明細書で使用されるとき、用語「優先的に切断されている」は、ＢｏＮＴ／Ａによる他の基質と比べて少なくとも１桁以上高いＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ基質の開裂速度を言う。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／ＡによるＢｏＮＴ／Ａ基質の開裂速度はＢｏＮＴ／Ａによる他の基質の開裂速度と比べて少なくとも２桁以上高い、少なくとも３桁以上高い、少なくとも４桁以上高い、または少なくとも５桁以上高い。
【０１１３】
本明細書で使用されるとき、用語「天然のＳＮＡＰ−２５」は、限定するものではなく、翻訳後修飾から産生されたＳＮＡＰ−２５アイソフォーム、異なるスプライシングにより生成した転写物または自発突然変異、およびＳＮＡＰ−２５サブタイプを含む天然のプロセスで産生されたＳＮＡＰ−２５を言う。天然のＳＮＡＰ−２５は、限定するものではなく、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４または配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しないＳＮＡＰ−２５」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生されたＳＮＡＰ−２５およびインビトロでの化学合成により産生されたＳＮＡＰ−２５を含むヒトの操作の支援で修飾された構造のSＮＡＰ−２５を言う。天然に存在しないＳＮＡＰ−２５の非限定的な例は、例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．、ＦＲＥＴ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許第７，３３２，５６７号）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ．、Ｌｉｐｏｈｉｌｉｃ Ｄｙｅ−ｂａｓｅｄ ＦＲＥＴ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許出願公開第２００８／０１６０５６１号）に記載されている。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。天然には存在しないＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加してもよい。
【０１１５】
従って、一実施形態では、ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の一態様では、ＳＮＡＰ−２５はＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプである。本実施形態の一態様では、天然のＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＳＮＡＰ−２５である。
【０１１６】
別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５は天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。さらに別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。
【０１１７】
ＳＮＡＰ−２５は内因性ＳＮＡＰ−２５または外因性ＳＮＡＰ−２５であってもよい。本明細書で使用されるとき、用語「内因性ＳＮＡＰ−２５」は、ＳＮＡＰ−２５の外部原因またはＳＮＡＰ−２５をコード化する遺伝物質の外部原因を必要とすることなく細胞がＳＮＡＰ−２５を固有に発現するように細胞のゲノム中に天然にコードされている細胞に天然に存在するＳＮＡＰ−２５を言う。内因性ＳＮＡＰ−２５の発現は細胞分化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。定義に従い、内因性ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５またはその変異体だけである。、例えば、以下の樹立された細胞株はＢＥ（２）−Ｍ１７、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃなどの内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、用語「外因性ＳＮＡＰ−２５」は、ＳＮＡＰ−２５の外部の原因またはヒトの操作によりＳＮＡＰ−２５をコード化する遺伝物質の外部原因を導入することで細胞内に発現するＳＮＡＰ−２５を言う。外因性ＳＮＡＰ−２５の発現は細胞分化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。非限定的な例として、樹立したクローン細胞株由来の細胞はＳＮＡＰ−２５コード配列の一時的または安定したトランスフェクションにより外因性ＳＮＡＰ−２５を発現できる。他の非限定的な例として、樹立したクローン細胞株由来の細胞はＳＮＡＰ−２５の蛋白質移入により外因性ＳＮＡＰ−２５を発現できる。外因性ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５またはその変異体でありまたは天然には存在しないＳＮＡＰ−２５またはその変異体である。
【０１１９】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株は内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の一態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４である。さらに別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５はＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプなどの天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＳＮＡＰ−２５である。
【０１２０】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の一態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。さらに別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作しＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプなどの天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の更に別の様態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。
【０１２１】
本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然では存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然では存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。さらに別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。
【０１２２】
ＢｏＮＴ／Ａ曝露後のＢｏＮＴ／Ａ基質の切断を検出するアッセイは、細胞が内因性または外因性ＳＮＡＰ−２５を発現するかを評価するに用いることができる。このアッセイにおいては、ＳＮＡＰ−２５切断産物の生成はＢｏＮＴ／Ａ曝露後にＳＮＡＰ−２５を発現する細胞で検出される。ウェスタンブロット法、ならびに十分に特性が明らかな試薬、条件およびプロトコールの非限定的な例は、限定するものではなく、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ； Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ、ａｎｄ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ ＪｏＩＩａ、ＣＡなどの業者から容易に利用可能である。ＳＮＡＰ−２５切断についてのこれらおよび類似のアッセイは内因性または外因性ＳＮＡＰ−２５を発現する細胞を同定するのに有用となる可能性があることが、理解される。
【０１２３】
非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ ＳＮＡＰ−２５−切断産物またはＳＮＡＰ−２５の切断型と非切断型の両方を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法はＢｏＮＴ／Ａ取込のアッセイに使用してもよい。このアッセイに有用なα−ＳＮＡＰ−２５抗体の例は、限定するものではなく、α−ＳＮＡＰ−２５ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＳＭＩ−８１ （Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ｍｏｕｓｅ α−ＳＮＡＰ−２５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｌ ７１．１ （Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｌ ７１．２ （Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＳＰ１２ （Ａｂcａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、α−ＳＮＡＰ−２５ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ （Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ （Ａｂcａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびα−ＳＮＡＰ−２５ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ Ｓ９６８４ （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む。
【０１２４】
本開示の態様はＢｏＮＴ／Ａ受容体を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ受容体」は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒反応を誘発するようにＢｏＮＴ／Ａと優先的に相互作用する天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体または天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体を言う。本明細書で使用されるとき、用語「優先的に相互作用する」は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体についてのＢｏＮＴ／Ａの平衡解離定数（ＫＤ）が他の受容体についてのＢｏＮＴ／Ａの場合よりも少なくとも１桁低いことを言う。平衡解離定数はＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａ受容体複合体などの構成要素分子へ可逆性に分離（解離）を行うＢｏＮＴ／Ａ−ＢｏＮＴ／Ａ受容体複合体の性質を測定する特定のタイプの平衡定数である。解離定数はＫＤ＝［Ｌ］［Ｒ］／［Ｃ］と定義される。ここで、［Ｌ］はＢｏＮＴ／Ａのモル濃度と等しく、［Ｒ］はＢｏＮＴ／Ａ受容体のモル濃度であり、かつ、［Ｃ］はＢｏＮＴ／Ａ−ＢｏＮＴ／Ａ受容体複合体のモル濃度で、さらに、すべての濃度は系が平衡状態にある場合の成分である。解離定数が小さくなるほど、ＢｏＮＴ／Ａがその受容体により強く結合し、またはＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ａ受容体間の結合親和性が高くなる。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体についてのＢｏＮＴ／Ａの解離定数は他の受容体についてのＢｏＮＴ／Ａと比べて少なくとも２桁低い、少なくとも３桁低い、少なくとも４桁低いまたは少なくとも５桁低い。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体と優先的に相互作用するＢｏＮＴ／Ａの結合親和性は、例えば、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ＮＭ以下の平衡解離定数であることができる。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体と優先的に相互作用するＢｏＮＴ／Ａの結合親和性は、例えば、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０nＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下の平衡解離定数であることができる。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ中毒反応を誘発する」は、ＢｏＮＴ／Ａと相互作用して神経毒素／受容体複合体を形成し、かつ、その後、その複合体を細胞質への内在化するＢｏＮＴ／Ａ受容体の能力を言う。
【０１２５】
本明細書で使用されるとき、用語「天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体」は、天然のプロセス、限定するものではなく、翻訳後修飾から産生されたＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォーム、異なるスプライシングにより生成した転写物または自発突然変異、およびＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプで産生されたＢｏＮＴ／Ａ受容体を言う。天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体は、限定するものではなく、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（米国特許出願公開第２００８／０００３２４０号）；Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（米国特許出願公開第２００８／０１８２７９９号）；Ｍｉｎ Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＳＶ２ ｉｓ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００６）； Ｓ． Ｍａｈｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ、Ｔｈｅ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２Ｃ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎｔｏ Ｐｈｒｅｎｉｃ Ｎｅｒｖｅｓ、５８０（８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２０１１−２０１４ （２００６）に記載されている線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、シナプス小胞糖タンパク質２（ＳＶ２）および複合体ガングリオシド様ＧＴ１ｂを含む。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。天然のＦＧＦＲ２は、限定するものではなく、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０または配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のＦＧＦＲ３は、限定するものではなく、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７または配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のＳＶ２は、限定するものではなく、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１または配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。
【０１２６】
本明細書で使用されるとき、用語「天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体変異体」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生されたＢｏＮＴ／Ａ受容体、および、化学合成により産生されたＢｏＮＴ／Ａ受容体を含むヒトの操作または設計の支援で産生したＢｏＮＴ／Ａ受容体を言う。天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体変異型の非限定的な例は保存的なＢｏＮＴ／Ａ受容体変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ａ受容体変異体、ＢｏＮＴ／Ａ受容体キメラ変異体および活性なＢｏＮＴ／Ａ受容体断片などを含む。
【０１２７】
本明細書で使用されるとき、用語「天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生されたＢｏＮＴ／Ａ受容体、および、インビトロでの化学合成により産生されたＢｏＮＴ／Ａ受容体を含む、ヒトの操作の支援で修飾された構造のＢｏＮＴ／Ａ受容体を言う。天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体の非限定的な例は、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（米国特許出願公開第２００８／０００３２４０号）；Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ（米国特許出願公開第２００８／０１８２７９９号）に記載されている。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０からの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含んでもよい。
【０１２８】
従って、一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体はＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２などの天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体である。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体はＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプである本実施形態の一態様では天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０の天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体である。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０との少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体である。
【０１２９】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は遺伝子改変ＦＧＦＲ２、遺伝子改変ＦＧＦＲ３、遺伝子改変ＳＶ２などの天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体である。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体である。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０と比べて１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体である。さらに別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０と比べて、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体である。
【０１３０】
ＢｏＮＴ／Ａ受容体は内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体であってもよい。本明細書で使用されるとき、用語「内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体」は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体の外部原因またはＢｏＮＴ／Ａ受容体をコード化する遺伝物質の外部原因を必要とすることなく細胞がＢｏＮＴ／Ａ受容体を固有に発現するするように細胞のゲノム中に天然にコードされている細胞に天然に存在するＢｏＮＴ／Ａ受容体を言う。内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体の発現は細胞分化またはプロモータ活性化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。例えば、以下の樹立したクローン細胞株はＢＥ（２）−Ｍ１７、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃなどの少なくとも１つの内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体またはそれらの天然の変異体だけである。
【０１３１】
本明細書で使用されるとき、用語「外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体」は、ＢｏＮＴ／Ａ受容体の外部の原因またはヒトの操作によりＢｏＮＴ／Ａ受容体をコード化する遺伝物質の外部原因を導入することで細胞内に発現するＢｏＮＴ／Ａ受容体を言う。外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体の発現は細胞分化またはプロモータ活性化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。非限定的な例として、樹立したクローン細胞株由来の細胞はＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２などのＢｏＮＴ／Ａ受容体をコード化するポリヌクレオチド分子の一時的または安定したトランスフェクションによる１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現できる。別の非限定的な例として、樹立したクローン細胞株由来の細胞はＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２などのＢｏＮＴ／Ａ受容体の蛋白質トランスフェクションによる１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現できる。外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体あるいはそれらの天然の変異体または天然では存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体あるいはそれらの天然では存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体であり得る。
【０１３２】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施形態の一態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体である。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０である。本実施形態のさらなる様態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体はＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプなどの天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体である。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞により発現した内因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体である。
【０１３３】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施形態の一態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０の天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。さらに別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作しＢｏＮＴ／Ａ受容体アイソフォームまたはＢｏＮＴ／Ａ受容体サブタイプなどの天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施形態の更に別の様態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。
【０１３４】
本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然では存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然では存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０と比べて、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。本実施施形態の更に別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０と比べて、例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、２０つ以上、３０つ以上、４０つ以上、５０つ以上または１００つ以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する。
【０１３５】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し外因性ＦＧＦＲ２、外因性ＦＧＦＲ３、外因性ＳＶ２またはそれらの組み合せを発現する。本実施形態の一態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然のＦＧＦＲ２、天然のＦＧＦＲ３、天然のＳＶ２またはそれらの組み合せを発現する。さらに別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然では存在しないＦＧＦＲ２、天然では存在しないＦＧＦＲ３、天然では存在しないＳＶ２またはそれらの組み合せを発現する。本実施形態の更に別の様態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作し天然のＦＧＦＲ２か天然では存在しないＦＧＦＲ２のいずれか、天然のＦＧＦＲ３か天然では存在しないＦＧＦＲ３のいずれか、天然のＳＶ２か天然では存在しないＳＶ２のいずれかまたはそれらの組み合せを発現する。
【０１３６】
１つ以上の内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞は毒素取込の直接および間接アッセイを含む定められた方法により同定することができる。ＢｏＮＴ／Ａ結合または取込特性を測定するアッセイは細胞がＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するかを評価するのに使用することができる。そのようなアッセイは、限定するものではなく、［１２５Ｉ］ＢｏＮＴ／Ａ、例えば、Ｎｏｒｉｋｏ Ｙｏｋｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｙｐｅ Ｃ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ、５７（１） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ２７２−２７７ （１９８９）； Ｎｏｒｉｋｏ Ｙｏｋｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｙｐｅ Ｃｌ、Ｄ ａｎｄ Ｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ、２９（２） Ｔｏｘｉｃｏｎ ２６１−２６４ （１９９１）；およびＴｅｉ−ｉｃｈｉ Ｎｉｓｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｙｐｅ Ｂ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ、２６９（１４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １０４９８−１０５０３ （１９９４）などの標識ＢｏＮＴ／Ａを用いた架橋アッセイを含む。他の非限定的なアッセイは標識または非標識抗体を用いてＢｏＮＴ／Ａ結合を検出する免疫細胞化学的アッセイを含み、例えば、Ａｔｓｕｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｙｐｅ Ｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｔｏｘｉｎ ｉｎｔｏ ＨＴ−２９ ｃｅｌｌｓ、３１９（２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３２７−３３３ （２００４）を参照し、さらには標識または非標識抗体を用いて結合毒素を検出する免疫沈降アッセイを含み、例えば、Ｙｕｋａｋｏ Ｆｕｊｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｙｐｅ Ｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ、１５０（Ｐｔ ５） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５２９−１５３８ （２００４）を参照する。これらのアッセイに有用な抗体は、限定するものではなく、ＢｏＮＴ／Ａに対して選択された抗体、例えば、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＳＶ２などのＢｏＮＴ／Ａ受容体に対して選択された抗体および／またはＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３、ＧＱ１ｂ、またはＧＴ１ｂなどのガングリオシドに対して選択された抗体を含む。抗体が標識されている場合、分子の結合は当業者に周知の技術を用いてウェスタンブロット法、抗体の細胞内の位置を直接顕微鏡下で観察する、洗浄工程の後の細胞または基質結合抗体の測定、フローサイトメトリ−、キャピラリー電気泳動などを含め���種々の方法で検出が可能である。抗体が非標識の場合、結合分子の間接的検出に標識二次抗体を用いてもよく、検出は標識抗体と同じように処理できる。ＢｏＮＴ／Ａ取込特性または特徴を測定するこれらと類似のアッセイは内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体発現する細胞を同定するのに有用である可能性があることが理解される。
【０１３７】
さらにＢｏＮＴ／Ａ処理後の分子の放出をモニターするアッセイは細胞が１つ以上の内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するかを評価するのに用いることができる。これらのアッセイでは分子放出の阻害がＢｏＮＴ／Ａ処理後にＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞に起こる。周知のアッセイは、例えば、［３Ｈ］ノルアドレナリンまたは［３Ｈ］ドーパミン分泌などの神経細胞からの放射能標識化カテコールアミン放出の阻害を測定をする方法を含む。参照文献の例はＡ Ｆａｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．破傷風毒素およびボツリヌス毒素ｔｙｐｅ Ｆに非感受性なカルシウム依存性小胞伝達物質放出の証拠Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８９３−９０２ （１９９９）およびＳａｒａ Ｓｔｉｇｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．ボツリヌス毒素のＣ１およびＥに対するカテコールアミン遊離の感受性は容易に遊離可能なプール内への小胞セットの選択的標的化を示唆する８５（２） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４０９−４２１ （２００３）または蛍光法を用いてカテコールアミン放出を測定する、などである。参照文献の例はＡｎｔｏｎ ｄｅ Ｐａｉｖａ ｅｔ ａｌ．エクトアクセプタに結合し、細胞内への伝達物質遊離を阻害する毒素誘導体により明らかにされるボツリヌス神経毒Ａの内在化における鎖間ジスルフィドまたはその関与するチオールの役割２６８（２８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０８３８−２０８４４ （１９９３）、Ｇａｒｙ Ｗ． Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．無処理および透過性クロム親和性細胞のボツリヌス毒素ＡまたはＢによる２５ｋＤａシナプトソーム会合蛋白質（ＳＮＡＰ‐２５）あるいはシナプトブレビン切断後の異なったエキソサイトーシス応答２３６（３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８７７−８８６ （１９９６）、およびＰａｔｒｉｃｋ Ｆｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．ボツリヌス神経毒Ｃ１は無傷ならびに透過性処理クロム親和性細胞においてシンタキシンとＳＮＡＰ‐２５を分解する、そのカテコールアミン放出妨害との関連３５（８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３０−２６３６ （１９９６）などである。他の非限定的な例は、垂体前葉細胞または卵巣細胞などの内分泌細胞からのホルモン放出の阻害を計測するアッセイを含む。分子の放出のこれらと類似のアッセイは内因性、外因性あるいはＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞を同定するのに有用である可能性があることが理解される。
【０１３８】
さらにＢｏＮＴ／Ａ曝露後のＢｏＮＴ／Ａ基質の切断を検出するアッセイは細胞が１つ以上の内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するかを評価するのに用いることができる。このアッセイにおいては、ＢｏＮＴ／Ａ基質切断産物の生成または無処理ＢｏＮＴ／Ａ基質の消失はＢｏＮＴ／Ａ処理後のＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞内で検出できる。ウェスタンブロット法、ならびに十分に特性が明らかな試薬、条件およびプロトコールの非限定的な例は、限定するものではなく、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ； Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ、ａｎｄ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ ＪｏＩＩａ、ＣＡなどの業者から容易に利用可能である。ＢｏＮＴ／Ａ基質切断についてのこれらおよび類似のアッセイは内因性または外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する細胞を同定するのに有用となる可能性があることが理解される。
【０１３９】
非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ ＳＮＡＰ−２５−切断産物またはＳＮＡＰ−２５の切断型と非切断型の両方を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法はＢｏＮＴ／Ａ取込のアッセイに使用できる可能性がある。このアッセイに有用なα−ＳＮＡＰ−２５抗体の例は、限定するものではなく、ＳＭＩ−８１ α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体 （Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、Ｃｌ ７１．１ α−ＳＮＡＰ−２５ マウスモノクローナル抗体（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃｌ ７１．２ α−ＳＮＡＰ−２５ マウスモノクローナル抗体（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳＰ１２ α−ＳＮＡＰ−２５ マウスモノクローナル抗体（Ａｂcａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、α−ＳＮＡＰ−２５ ウサギポリクローナル抗血清 （Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５ ウサギポリクローナル抗血清Ｓ９６８４ （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、およびα−ＳＮＡＰ−２５ ウサギポリクローナル抗血清（Ａｂcａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含む。
【０１４０】
本開示の態様は外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する遺伝子操作または組換え技術により作製される細胞を提示する。遺伝子操作または組換え技術により作製される外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体の発現に有用な細胞は外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現する場合も、発現しない場合もある神経細胞および非神経細胞を含む。そのような遺伝子操作と組換えられた細胞は構成的、組織特異的、細胞特異的、誘導プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたは両方の制御下で外因性ＳＮＡＰ−２５および１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するかもしれないことが理解される。外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性ＢｏＮＴ／Ａ受容体を発現するよう細胞が遺伝子操作され、かつ、組換えられＢｏＮＴ／Ａ中毒となりえる可能性がある限り細胞は有用であることがさらに理解される。
【０１４１】
ＢｏＮＴ／Ａが、例えば、ＳＮＡＰ−２５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２などのＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし、全体的細胞性機構を行う細胞に必要な成分をコード化する外因性ポリヌクレオチド分子を細胞に導入するのに有用な方法は、限定するものではなく、リン酸カルシウム媒介、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）‐デキストラン媒介、脂質媒介、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）‐媒介、ポリリジン媒介およびポリブレン媒介などの化学物質媒介送達法、さらに、バイオリスティック粒子送達法、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーションなどの物理的媒介送達法、およびレトロウイルス媒介トランスフェクションなどのウイルス媒介送達法を含む。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、ｐｐ． １６．１−１６．６２ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、ｅｄｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ． ３、３ｒｄ ｅｄ． ２００１）； Ａｌｅｓｓｉａ Ｃｏｌｏｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、２９（２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１４−３１８、３２０−３２２、３２４ （２０００）； Ｐｈｉｌｉｐ Ｗａｓｈｂｏｕｒｎｅ ＆ Ａ． Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｎｅｕｒｏｎｓ、１２（５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ５６６−５７３ （２００２）； ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ｐｐ ９．１６．４−９．１６．１１ （２０００）を参照。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。ポリヌクレオチド分子を細胞に導入する特定の方法の選択は、ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす全般的な細胞機構を行うのに細胞に必要な成分を一過性であるか、または安定的に含むかどうか一部依存することは、当業者は理解できる。ＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こす、全体的な細胞機構を行うのに細胞に必要な成分をコードするポリヌクレオチド分子の非限定的な例は配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８のＦＧＦＲ２ポリヌクレオチド分子、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１のＦＧＦＲ３ポリヌクレオチド分子、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４のＳＶ２ポリヌクレオチド分子、および配列番号１４５、配列番号１４６のＳＮＡＰ−２５ポリヌクレオチド分子である。
【０１４２】
化学物質媒介送達法は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ Ｊｏｒｄａｎ ＆ Ｆｌｏｒｉａｎ Ｗｏｒｍ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｈｅｒｅｎｔ ａｎｄ Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３３（２） Ｍｅｔｈｏｄｓ １３６−１４３ （２００４）； Ｃｈｕｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ、３３（２） Ｍｅｔｈｏｄｓ １４４−１５０ （２００４）に記載されており、当業者に周知である。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。そのような化学物質媒介送達法は標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）； Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ、（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ ＪｏＩＩａ、ＣＡ）； Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）； ＥｘＧｅｎ ５００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｉｎｃ．、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＭＤ）、およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ （Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を参照。
【０１４３】
物理的媒介送達法、例えば、Ｊｅｉｋｅ Ｅ． Ｂｉｅｗｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、７１ （１） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ６７−７５ （１９９７）； Ｊｏｈｎ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＆ Ｓａｒａｈ Ｃ． Ｒ． Ｌｕｍｍｉｓ、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ａｎｄ Ｄｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ ｔｏ Ｄｅｌｉｖｅｒ ＤＮＡ ａｎｄ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｙｅｓ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、３３（２） Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１−１２５ （２００４）； Ｍ． Ｇｏｌｚｉｏ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、３３（２） Ｍｅｔｈｏｄｓ １２６−１３５ （２００４）；およびＯｌｉｖｅｒ Ｇｒｅｓｃｈｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌｓ、３３（２） Ｍｅｔｈｏｄｓ １５１−１６３ （２００４）に記載されており、当業者に周知である。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。
【０１４４】
ウイルス媒介送達法、例えば、Ｃｈｏｏｉ Ｍ． Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ、２１（１２） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８９５−９１３ （２００２）； ｌｌｙａ Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−Ｂａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９３（２１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１３７１−１１３７７ （１９９６）； Ｒｏｌａｎｄ Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．、Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、２４６ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ３９１−４１１ （２００４）； Ａ． Ｈｕｓｅｒ ＆ Ｃ． Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｎｏｖｅｌ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ−Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、３（１） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ５３−６３ （２００３）； Ｔｉｚｉａｎａ Ｔｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ− ａｎｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−Ｂａｓｅｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、２８５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １４１−１４８ （２００４）； Ｍａｎｆｒｅｄ Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｈｅｒｍａｎｎ Ｂｕｊａｒｄ、Ｔｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（米国特許第５，４６４，７５８号）；Ｈｅｒｍａｎｎ Ｂｕｊａｒｄ＆Ｍａｎｆｒｅｄ Ｇｏｓｓｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（米国特許第５，８１４，６１８号）；Ｄａｖｉｄ Ｓ． Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｉｎｓｅｃｔ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｗｉｔｈ Ｓａｍｅ（米国特許第５，５１４，５７８号）；Ｄａｖｉｄ Ｓ． Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｉｎｓｅｃｔ Ｅｃｄｙｓｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（米国特許第６，２４５，５３１号）；Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｖｅｇｅｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｈａｖｉｎｇ Ｃ． Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｖｅｇｅｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｕｔａｔｅｄ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（米国特許第５，８７４，５３４号）に記載されており、当業者に周知である。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。そのようなウイルス媒介送達法���標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標） Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ） ａｎｄ ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標） Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ２５−０５４３ ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、（ＪｕＩ． １５、２００２）；およびＡＤＥＡＳＹ（商標） Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ ＪｏＩＩａ、ＣＡ） ａｎｄ ＡＤＥＡＳＹ（商標） Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ０６４００４ｆ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．を参照のこと。さらに、そのようなウイルス送達システムは標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＢＤ（商標） Ｔｅｔ−Ｏｆｆ ａｎｄ Ｔｅｔ−Ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ） ａｎｄ ＢＤ（商標） Ｔｅｔ−Ｏｆｆ ａｎｄ Ｔｅｔ−Ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ、ＰＴ３００１−１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、（Ｍａｒ． １４、２００３）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標） Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ） ａｎｄ ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標） Ｓｙｓｔｅｍ Ａ Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｄ、２５−０３１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、（Ｎｏｖ． ４、２００２）； ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標） Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ） ａｎｄ ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標） Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ２５−０５０１ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、（Ｄｅｃ． ８、２００３）；およびＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標） Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ ＪｏＩＩａ、ＣＡ）およびＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標） Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、０６４００５ｅである。
【０１４５】
上記のように、本明細書に記載されているＳＮＡＰ−２５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２などのＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全般的な細胞機構を行う細胞に必要外因性成分を細胞に導入することができる。細胞集団へ送達させる送達剤を有しており、そのような外因性成分の導入に有用なすべての方法は、方法が所与の細胞集団内の少なくとも５０％の細胞に本明細書に記載した外因性成分を導入する条件下では有用であることができる。従って、本実施形態の態様は少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の所与の細胞集団が本明細書に記載されているＳＮＡＰ−２５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＳＶ２などのＢｏＮＴ／ＡがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全般的な細胞機構を行う細胞に必要な外因性成分を含むような細胞集団を含むことができる。本明細書で使用されるとき、用語「送達剤」は、共有結合、非共有結合する剤または他の方法においてポリペプチドの細胞への導入に関連する剤の内在化を可能にして高める分子を言う。従って、用語「送達剤」は、限定するものではなく、蛋白質、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、ポリヌクレオチド分子、リポソーム、脂質、ウイルス、レトロウイルスであり、かつ、限定するものではないが、細胞膜、細胞質または核に共有結合または非共有結合した分子を輸送する細胞を含む。用語「送達剤」は、その機能が受容体媒介エンドサイトーシスを介し、かつ、受容体媒介エンドサイトーシスとは、独立している送達剤を含む機構により取り込まれる分子を含むことがさらに理解される。
【０１４６】
さらに送達剤は、例えば、化学結合または一般的に産生された融合蛋白質を用いてＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＳＶ２またはＳＮＡＰ−２５などの共有結合成分の細胞組込みを可能にし、高める薬剤であってもよい。送達剤と共有結合させる方法およびそのような薬剤を用いる方法は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎ Ｆ． Ｄｏｗｄｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ＷＯ ００／３４３０８； Ｇｅｒａｒｄ Ｃｈａｓｓａｉｎｇ ＆ Ａｌａｉｎ Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ Ｕｓｅｄ ａｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（米国特許第６，０８０，７２４号）；Ａｌａｎ Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ＴＡＴ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｏｉｅｒｔ（米国特許第５，６７４，９８０号）；Ａｌａｎ Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、ＴＡＴ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（米国特許第５，７４７，６４１号）；Ａｌａｎ Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、ＴＡＴ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許第５，８０４，６０４号）；Ｐｅｔｅｒ Ｆ． Ｊ． Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許第６，７３４，１６７号）；Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ Ｌｉｎ ＆ Ｊａｃｋ Ｊ． Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌｓ（米国特許第５，８０７，７４６号）；Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ Ｌｉｎ＆Ｊａｃｋ Ｊ． Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌｓ（米国特許第６，０４３，３３９号）；Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，２４８，５５８号）；Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，４３２，６８０号）；Ｊａｃｋ Ｊ． Ｈａｗｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ Ｃｅｌｌｓ（米国特許第６，４９５，５１８号）；Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，７８０，８４３号）；Ｊｏｎａ��ｈａｎ Ｂ． Ｒｏｔｈｂａｒｄ ＆ Ｐａｕｌ Ａ Ｗｅｎｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｃｒｏｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（米国特許第６，３０６，９９３号）；Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｂ． Ｒｏｔｈｂａｒｄ＆ Ｐａｕｌ Ａ Ｗｅｎｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｃｒｏｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（米国特許第６，４９５，６６３号）；およびＰａｍｅｌａ Ｂ． Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（米国特許第６，２８７，８１７号）に記載されている。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。
【０１４７】
さらに送達剤は、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＳＶ２ｃまたはＳＮＡＰ−２５などの非共有結合と関連する成分の細胞取入れを可能にし、高める薬剤であってもよい。共有結合の不存在下において機能する方法およびそのような薬剤を使用する方法は、例えば、Ｇｉｌｌｅｓ Ｄｉｖｉｔａ ｅｔ ａｌ、Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ（米国特許第６，８４１，５３５号）；Ｐｈｉｌｉｐ Ｌ Ｆｅｉｇｎｅｒ ａｎｄ Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｚｅｌｐｈａｔｉ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ（米国特許出願公開第２００３／０００８８１３号；およびＭｉｃｈａｅｌ Ｋａｒａｓ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（米国特許出願公開第２００４／０２０９７９７号）に記載されている。これらの各々は、全内容が、本明細書中に引用により組み込まれる。そのようなペプチド送達剤は、標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）； ＢＩＯ−ＰＯＲＴＥＲ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢＩＯ ＴＲＥＫ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ ＪｏＩＩａ、ＣＡ）およびＰＲＯ−ＪＥＣＴ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）である。
【０１４８】
本開示の様態は、以下のようにも記載できる。
１．ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む樹立したクローン細胞株。
２．親ＳｉＭａ細胞株から選択されたクローン細胞株である、上記１．の樹立したクローン細胞株．。
３．ＢｏＮＴ／Ａの約１００ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下または約０．１ｐＭ以下でＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞である、上記１．または２．の樹立したクローン細胞株。
４．ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性が細胞分化以前に計測される、上記１．または２．の樹立したクローン細胞株。
５．未分化の状態で、２Ｄ６細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表５からの遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の増加を示す細胞または、２Ｄ６細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表６の遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の減少を示す細胞である、上記２．の樹立したクローン細胞株。
６．分化した状態で、２Ｄ６細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表９からの遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の増加を示す細胞または、２Ｄ６細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表１０の遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の減少を示す細胞である、上記２．の樹立したクローン細胞株。
７．未分化の状態で、親ＳｉＭａ細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表７からの遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の増加を示す細胞または親ＳｉＭａ細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表８の遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の減少を示す細胞である、上記２．の樹立したクローン細胞株。
８．分化した状態で、親ＳｉＭａ細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表１１からの遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の増加を示す細胞または親ＳｉＭａ細胞株由来の１つの細胞中の１つ以上の遺伝子（表１２の遺伝子）の発現と比べて１つ以上の遺伝子の遺伝子発現が少なくとも１．５倍の減少を示す細胞である、上記２．の樹立したクローン細胞株。
９．約５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、５０以上の細胞継代、５５以上の細胞継代、６０以上の細胞継代について１００ｐＭ以下または２５ｐＭであるＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す細胞である、上記１．または２．の樹立したクローン細胞株。
１０．例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、５０以上の細胞継代、５５以上の細胞継代または６０以上の細胞継代で少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１のＢｏＮＴ／Ａ活性に関する上漸近線について明確に定義されたシグナル対ノイズ比を示す樹立したクローン細胞株由来の細胞である、上記１．または２．の樹立したクローン細胞株。
１１．ＢｏＮＴ／Ａの約１００ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下または約０．１ｐＭ以下でＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞である、親ＳｉＭａ細胞株から作製されたＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む樹立したクローン細胞株。
１２．親ＳｉＭａ細胞株から選択されたクローン細胞株であり、かつ、ＢｏＮＴ／Ａの約１００ｐＭ以下でＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含むクローン細胞株である、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む樹立したクローン細胞株。
１３．親ＳｉＭａ細胞株が親ＳｉＭａ細胞株ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４ＳｉＭａである、上記１２．の樹立したクローン細胞株。
１４．約５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、５０以上の細胞継代、５５以上の細胞継代、または６０以上の細胞継代について１００ｐＭ以下または２５ｐＭであるＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す細胞である、上記１２．の樹立したクローン細胞株。
１５．例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、５０以上の細胞継代、５５以上の細胞継代または６０以上の細胞継代で少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１のＢｏＮＴ／Ａ活性に関する上漸近線について明確に定義されたシグナル対ノイズ比を示す樹立したクローン細胞株由来の細胞である、上記１２．の樹立したクローン細胞株。
１６．ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性が細胞分化以前に計測される、上記１２．の樹立したクローン細胞株。
１７．２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが少なくとも１．５倍の差を示す細胞である、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＳＣＬ１、ＢＡＳＰ１、ＤＯＫ５、ＤＰＹＤ、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＴＳＦ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＳＮ、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＲＳＳ１２、ＲＮＦ１８２、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＰＡＲＣ、ＴＦＰＩ２、およびＴＰＴE群から選択した遺伝子発現レベルである、かつ、ＢｏＮＴ／Ａの約１００ｐＭ以下でＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含むクローン細胞株である、ＢｏＮＴ／Ａ中毒になりやすい細胞を含む樹立したクローン細胞株。
１８．２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが少なくとも２倍の差を示す細胞である、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが少なくとも３倍の差を示す細胞である、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが少なくとも４倍の差を示す細胞である、上記１７．の樹立したクローン細胞株。
１９．細胞の分化前または細胞の分化後に遺伝子発現レベルを計測される、上記１７．の樹立したクローン細胞株。
２０．約５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、５０以上の細胞継代、５５以上の細胞継代、または６０以上の細胞継代について１００ｐＭ以下または２５ｐＭであるＢｏＮＴ／Ａ活性において感受性を示す細胞である、上記１７．の樹立したクローン細胞株。
２１．例えば、５以上の細胞継代、１０以上の細胞継代、１５以上の細胞継代、２０以上の細胞継代、２５以上の細胞継代、３０以上の細胞継代、３５以上の細胞継代、４０以上の細胞継代、４５以上の細胞継代、５０以上の細胞継代、５５以上の細胞継代または６０以上の細胞継代で少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１のＢｏＮＴ／Ａ活性に関する上漸近線について明確に定義されたシグナル対ノイズ比を示す樹立したクローン細胞株由来の細胞である、上記１７番の樹立したクローン細胞株。
【実施例】
【０１４９】
実施例Ｉ ＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性細胞を含む細胞株のスクリーニング
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性または神経毒取り込み能力を有するクローン細胞を、樹立された親細胞株からどのようにして同定するかを説明する。
【０１５０】
１．クローン細胞株の単離
関連特許出願である、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号は、例えば、ＬＡ１−５５ｎ（ＥＣＡＣＣ ０６０４１２０３）、Ｎ１８（ＥＣＡＣＣ ８８１１２３０１）、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１３１）、ＰＣ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）、およびＳｉＭａ（ＤＳＭＺ ＡＣＣ １６４）を含む、開示された免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａ活性の検出方法を実施するために有用な複数の樹立された細胞株を同定した。ＳｉＭａ細胞株の解析を行っている間に、少なくとも５つの異なる細胞表現型を含んだ、この樹立された細胞株を構成する細胞が発見された。これら表現型の異なる細胞型のいずれか１つが、この細胞株のＢｏＮＴ／Ａ中毒への感受性に関与しているかどうかを決定するために、それぞれの表現型の異なる細胞型を単離する単一のコロニーを得るための２種類の異なる限界希釈スクリーニングが行われた。
【０１５１】
両方のスクリーニングにおいて、ＳｉＭａストック由来の好適な密度の細胞をＴ１７５コラーゲンＩＶをコーティングしたフラスコに入れた、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地中で生育させた。２度目の継代の後、細胞懸濁液を生産するために細胞をトリプシンで処理し、細胞濃度を決定した。この細胞懸濁液から約４．０ｘ１０６個の細胞を５０ｍＬのチューブに移し、１０ｍＬシリンジを用い、１８．５ゲージの針を通して強制的に排出することを繰り返すことにより、細胞を単一の細胞になるまで分離した。次に、この分離単一細胞懸濁液からの細胞を１５ｍＬの新しい成長培地を添加することによって０．２ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度まで希釈し、１０細胞／ｍＬの濃度になるように、この希釈液２．５μＬを５０ｍＬの新しい成長培地に添加した。この最終希釈ストックから、９６ウェルコラーゲンＩＶコーティングプレートのそれぞれのウェルに１００μＬの成長培地を添加し（最終的な平均密度は１細胞／ウェル）、この細胞を一定に保たれた３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で４週間生育させた。全部で１９個の９６ウェルプレートを解析のために用意した。コロニーの成長を評価するために、定期的にプレートを顕微鏡的に解析した。４週間後、成育中のコロニーを同定するためにそれぞれのウェルを顕微鏡的に解析し、同定されたそれぞれの成長中のコロニーについて、１００μＬの新しい成長培地をそれぞれのウェルに添加し、細胞を一定に保たれた３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で２週間生育させた。さらに２週間生育させた後、成長中の単一のコロニーをトリプシンで処理し、さらに培養を続けるために新しい９６ウェルプレートに移した。目視検査によってコロニーが約１，０００細胞まで生育したと判断した時点で細胞をトリプシンで処理し、それぞれの細胞懸濁液を２４ウェルコラーゲンＩＶコーティングプレートの新しいウェル中に移した。細胞を、必要に応じて２〜３日ごとに新しい成長培地で満たしながら、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた。培養が約６０％以上のコンフルエンスに達するまで細胞を生育させ、その時点で細胞をトリプシンで処理し、それぞれの細胞懸濁液を２５ｃｍ２のコラーゲンＩＶコーティングフラスコ中に移した。細胞を、必要に応じて２〜３日ごとに新しい成長培地で満たしながら、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた。フラスコ中の細胞が７０〜８０％コンフルエンスに達した時点でそれらを凍結させ、ＢｏＮＴ／Ａ中毒への感受性を決定するためにクローン細胞株を試験するまで、液体窒素中で保存した。両方のスクリーニングにおいて当初単離された１，８２４個のコロニーのうち１３０のクローン細胞株を生存能力および成長の特徴に基づいて選択し、続くスクリーニング過程のために拡大した。
【０１５２】
２．クローン細胞株からのＢｏＮＴ／Ａ複合体を用いたＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性細胞の一次スクリーニング
クローン細胞株由来の細胞がＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性かどうかを決定するための１つの方法は、それぞれのウェルにおける細胞数を均一化するためのＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生死判定アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）を用いた一次スクリーニングの実施と、その全文が引用により本明細書に組み込まれる、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号に記載されたようなＢｏＮＴ／Ａ活性を決定するための免疫を用いた方法であった。１つをＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイ用に、もう１つを細胞生死判定アッセイ用に、２つの個別の９６ウェルプレートを用意した。
【０１５３】
ＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイを行うために、単離したそれぞれのクローン細胞株からの細胞をポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のウェル中にプレーティングすることによってＢｏＮＴ／Ａを処理した細胞から、溶解物を調製した。ウェルに、最小必須培地、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標） Ｉ ｗｉｔｈ Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ、１ｘＢ２７ サプリメント、１ｘＮ２ サプリメント、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ（３０２−０１１−Ｍ００５、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む、０．１ｍＬの無血清培地を添加した。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で、成長停止および神経突起伸展などの標準的かつ慣習的な形態学的な基準によって評価される通りに細胞が分化するまで生育させた（およそ３日）。分化した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、１ｎＭのＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む新しい培地と交換した。２４時間インキュベートした後、成長培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを濯ぐことによって細胞を洗浄した。細胞の回収には、１ｘＰＢＳを吸引し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む３０μＬのリシスバッファーをそれぞれのウェルに添加し、５００ｒｐｍで回転している振とう機上で、プレートを３０分間、４℃でインキュベートすることにより細胞を溶解した。細胞残渣を沈殿させるためにプレートを４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、検出工程を行うために、上清を補足抗体でコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０１５４】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液を調製するために、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６（実施例ＶＩＩ）由来の腹水に含まれるα−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体を標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いて精製した。
【０１５５】
α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するためには、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、製造業者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）による説明書に従ってルテニウム（ｌｌ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン酸）ＮＨＳエステル標識試薬（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）と共役させた。共役反応は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ストック溶液を再構成した３０μＬの蒸留水を２００μＬの２ｍｇ／ｍＬα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体に添加し、反応液を暗所、室温で２時間インキュベートすることにより行った。標識した抗体を標準的なスピンカラムプロトコールを用いて精製し、標準的な比色タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。１リットル当たりのモルにおける濃度を決定するために、α−ＳＮＡＰ−２５抗体／ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）共役体の吸光度を吸光度計を用いて４５５ｎｍで測定した。検出抗体溶液は使用まで４℃で保存した。
【０１５６】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体を含むα−ＳＮＡＰ−２５固相担体を調製するために、およそ５μＬの適したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体溶液（１ｘＰＢＳ中に２０μｇ／ｍＬ）を９６ウェル ＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ プレートのそれぞれのウェルに添加し、溶液中の液体を蒸発させるために、生物学的に安全なキャビネット中で２〜３時間、溶液を風乾させる。補足抗体を共役させたウェルを密封し、使用まで４℃で保存した。
【０１５７】
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって、開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在を検出するために、α−ＳＮＡＰ−２５固相担体のウェルをその後、２％ Ａｍｅｒｓｈａｍ ブロッキング試薬（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）および１０％ヤギ血清（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を含むブロッキングバッファーを１５０μＬ添加し、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを吸引し、ＢｏＮＴ／Ａで処理した細胞由来の溶解物２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートのウェルを、細胞溶解物を吸引することによって３回洗浄し、それぞれのウェルを２００μＬの１ｘＰＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）で３回濯いだ。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中の２％ Ａｍｅｒｓｈａｍ ブロッキング試薬を含む５μｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液２５μＬをそれぞれのウェルに添加、密閉し、振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体をインキュベートした後、ウェルを２００μＬ １ｘＰＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）で３回洗浄した。洗浄した後に、１５０μＬの１ｘリードバッファー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をそれぞれのウェルに添加し、ＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００ Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてプレートを読み込んだ。生データをＥＣＬ ｉｍａｇｅｒを用いて回収した。
【０１５８】
発光細胞生死判定アッセイを行うために、単離したそれぞれのクローン細胞株由来の細胞をプレーティングし、上述の通りに分化させた。分化した細胞からの培地を、それぞれのウェルから吸引し、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）基質およびＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）バッファーを含む１００μＬの試薬混合液で製造業者の説明書に従って置き換えた。プレートをその後遮光し、オービタル振とう機上で２分間混合した。溶液を底部が透明な９６ウェル細胞プレートから白色照度計プレートに移し、１０分間インキュベートした後に照度計で計測した。
【０１５９】
これらの結果は、細胞生死判定の測定値が９，８３８〜１０，４２３，１８８の範囲であり、ＢｏＮＴ／Ａ活性シグナルが８４〜２７，２４２の範囲であったことを示した（表１）。加えて、生存と活性の比率は常に１：１ではなかったが、データを標準化するために細胞の生存に対するＢｏＮＴ／Ａ活性の比率を算出した。Ｈ１、Ａ７、Ａ１１、Ｆ１０、Ａ９、Ａ１０、およびＣ１１の７つのクローン細胞株は、約０．２ｘ１０−２以上の活性／生存比を示した（表１）。Ｈ３、Ｈ８、Ｅ１１、Ｈ１０、Ａ６、Ｃ５、Ｃ１２、Ｄ１１、およびＢ５の９つのクローン細胞株は、約０．１２５ｘ１０−２〜約０．１５０ｘ１０−２の活性／生存比を示した（表１）。Ｄ７およびＢ１０の２つの細胞株は、約０．１００ｘ１０−２の活性／生存比を示した（表１）。ＢｏＮＴ／Ａに対する用量反応曲線を生成するためのＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイを用いた二次スクリーニングを行うことによるさらなる試験のために、細胞生存およびＢｏＮＴ／Ａ活性シグナル測定値と共にこれらの活性／生存比に基づいて、これら１８つのクローン細胞株を選択した。
【表１−１】
2015077153.tif 000002
【表１−２】
2015077153.tif 000003
【０１６０】
ＢｏＮＴ／Ａに対する用量反応曲線を生成するためのＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイを行うために、単離したそれぞれの細胞株由来の細胞をポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレートに播種し、上述の通りに分化させた。さらなる試験のために選択した最初の１８つのクローン細胞株のうち８つのみが生存を維持し、残りの１０クローン細胞株は、再増殖に失敗し、失われた。分化した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、０．９ｐＭ、２．８ｐＭ、８．３ｐＭ、および２５ｐＭいずれかのＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む新しい培地で置換した。２４時間処理した後に細胞を洗浄し、ＳＮＡＰ−２５基質を開裂させるために、毒素を含まない、無血清培地中でさらに２日間インキュベートし、上述の通りに回収した。検出工程を行うために、上清を補足抗体でコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０１６１】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、およびα−ＳＮＡＰ−２５固相担体を上述の通りに調製した。ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ解析による、開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在の検出を上述の通りに行った。ＥＣＬ ｉｍａｇｅｒから得られた生データをその後、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ｖ．９．０に移し、４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ ｆｉｔを用いて用量反応曲線を定義した。データのプロッティングにおいては、使用された４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ関数に関する制約はなかった。画像レポートを、Ｒ２（相関係数）、ａ（データセットの最大値）、ｂ（傾き）、およびＸ０±ＳＥ（ＥＣ５０値±標準誤差）を用いた解析によって生成した。
【０１６２】
これらの結果は、親ＳｉＭａ細胞株を構成する細胞と比較した場合に、試験した８つのクローン細胞株のうち２つのみがＢｏＮＴ／Ａ中毒によりなりやすいことを示した（表２）。例えば、親ＳｉＭａ細胞株を構成する細胞は、２．２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａに対してＥＣ５０活性を示すが、Ｈ１およびＡ１０細胞株を構成する細胞は１．７６ｐＭ以下のＢｏＮＴ／Ａに対してＥＣ５０活性を示した。逆に、Ｈ１０およびＤ１１細胞株を構成する細胞は、５．０ｐＭ未満であるが、親ＳｉＭａ細胞株を構成する細胞で見られたよりも高いＢｏＮＴ／ＡへのＥＣ５０活性を示した。５．０ｐＭ未満（１００Ｕ／ｍＬ未満）のＢｏＮＴ／Ａに対するＥＣ５０活性を示すいずれのクローン細胞株も、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号に記載された、免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａ活性の測定方法において有用であることに注意されたい。
【表２】
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【０１６３】
３．処方されたＢｏＮＴ／Ａ医薬品を用いた、クローン細胞株からのＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性細胞の一次スクリーニング
クローン細胞株由来の細胞がＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性かどうかを決定する別の方法としては、ＢｏＮＴ／Ａに対する用量反応曲線を生成することによる一次スクリーニングの実施と、その全文が引用により本明細書に組み込まれる、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号に記載されたような、免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａ活性の測定方法によるＥＣ５０値の算出であった。
【０１６４】
最初に、単離された３５クローン細胞株のうち６つをＢｏＮＴ／Ａに対する完全な用量反応を用いて評価した。ＢｏＮＴ／Ａで処理した細胞からの溶解物を調製するために、６つのクローン細胞株由来の細胞をポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレートに播種し、６０μｇ／ｍＬのＧＴ１ｂを含む無血清培地を用いた以外は、セクション２で上述した通りに分化させた。３Ｄ８、ＹＢ８、１Ｄ４、２Ｄ６、１Ｅ１１、２Ｆ５のクローン細胞株を用いた。上記で同定したＨ１およびＨ１０クローン細胞株を親ＳｉＭａ細胞株と共に、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対して高い感受性をもつ細胞株の同定における参照として用いた。分化した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）、０．９８Ｕ／ｍＬ、１．９Ｕ／ｍＬ、３．９１Ｕ／ｍＬ、７．８１Ｕ／ｍＬ、１５．６Ｕ／ｍＬ、３１．３Ｕ／ｍＬ、６２．５Ｕ／ｍＬ、１２５Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、または５００Ｕ／ｍＬいずれかの処方されたＢｏＮＴ／Ａ医薬品を含む新しい培地で置換した。２４時間処理した後、細胞を洗浄し、ＳＮＡＰ−２５基質が開裂するように、毒素を含まない、無血清培地中でさらに２日間インキュベートした。細胞の回収には、１ｘＰＢＳを吸引し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリシスバッファー３０μＬをそれぞれのウェルに添加し、５００ｒｐｍで回転している振とう機上、４℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞を溶解した。細胞残渣を沈殿させるために、プレートを４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。タンパク質濃度を標準的な方法で決定した。免疫を用いた方法による検出工程を行うために、上清を補足抗体でコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０１６５】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、およびα−ＳＮＡＰ−２５固相担体をセクション２で上述した通りに調製した。ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ解析によるＳＮＡＰ−２５開裂産物の存在を検出を行い、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ｖ．１０を使用した以外はセクション２で上述した通りに、回収したデータを解析してＥＣ５０を算出した。
【０１６６】
これらの結果は、クローン細胞株Ｈ１を構成する細胞が親ＳｉＭａ細胞株よりもＢｏＮＴ／Ａにより感受性であることを示した（表３）。加えて結果は、クローン細胞株Ｈ１０、１Ｄ４、１Ｅ１１、２Ｄ６、２Ｆ５、３Ｄ８、およびＹＢ８を構成する全ての細胞が、親ＳｉＭａ細胞株よりもＢｏＮＴ／Ａに対する感受性が低いが、この全てが３０Ｕ／ｍＬよりも低いＢｏＮＴ／Ａ活性のＥＣ５０を有することを示した（表３）。ＢｏＮＴ／Ａに対して１００Ｕ／ｍＬ以下（５．０ｐＭ以下）のＥＣ５０活性を示したいずれのクローン細胞株もＥｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号で記載されたような免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａ活性の測定方法において有用であることに注目されたい。
【表３】
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【０１６７】
１０の異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａを用いたこの最初の一次スクリーニングにおいて、３種類の異なるＢｏＮＴ／Ａ濃度を用いる、短縮されたアッセイに有用な３種類の濃度を同定した。１つの濃度は漸近線の最小（８Ｕ／ｍＬ）よりもわずかに高く、１つの濃度はＥＣ５０（２５Ｕ／ｍＬ）に近く、もう１つの濃度は漸近線の最大（８０Ｕ／ｍＬ）の約８０％を示す。これらのその後の一次スクリーニングにおいて、単離された残りの２９のクローン細胞株を、細胞を０（未処理試料）、８Ｕ／ｍＬ、２５Ｕ／ｍＬ、または８０Ｕ／ｍＬいずれかの処方されたＢｏＮＴ／Ａ医薬品で処理する以外は、上述の通りに試験した。１Ｅ３、２Ｂ９、２Ｄ２、２Ｅ４、３Ｂ８、３Ｄ５、３Ｇ１０、４Ｂ５、４Ｃ８、４Ｄ３、５Ｃ１０、５Ｆ３、ＡＣ９、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、ＢＥ３、ＢＦ８、ＣＣ１１、ＣＤ６、ＣＥ６、ＣＧ８、ＣＧ１０、ＤＣ４、ＤＤ１０、ＤＥ７、ＤＦ５、ＹＢ７、およびＹＦ５のクローン細胞株を試験した。加えて、親ＳｉＭａをポジティブコントロールとして用いた。
【０１６８】
これらの結果は、クローン細胞株２Ｅ４、３Ｂ８、３Ｄ５、５Ｆ３、ＡＦ４、ＢＢ３、ＢＢ１０、およびＤＣ４を構成する全ての細胞が、親ＳｉＭａ細胞株よりもＢｏＮＴ／Ａに対してより感受性であることを示す（表４）。加えて、これらの結果はクローン細胞株１Ｅ３、２Ｂ９、３Ｇ１０、４Ｂ５、４Ｃ８、ＡＣ９、ＢＥ３、ＢＦ８、ＣＣ１１、ＣＤ６、ＣＥ６、ＣＧ８、ＣＧ１０、ＤＤ１０、ＤＥ７、およびＹＦ５を構成する全ての細胞が、親ＳｉＭａ細胞株と類似したＢｏＮＴ／Ａへの感受性を有することを示す（表４）。最後に、これらの結果はクローン細胞株２Ｄ２、４Ｄ３、５Ｃ１０、ＤＦ５、およびＹＢ７を構成する全ての細胞が親ＳｉＭａ細胞株よりもＢｏＮＴ／Ａに対する感受性が低いことを明らかにする（表４）。
【表４】
2015077153.tif 000006
【０１６９】
実施例ＩＩ クローン細胞株の安定性解析 以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒感受性または神経毒取り込み能力を有する、樹立されたクローン細胞株由来の細胞の安定性を、どのように解析したかを説明する。
【０１７０】
ＳｉＭａ細胞株の解析を行っている間に、ＢｏＮＴ／Ａに対する感受性の著しい減少に際して親ＳｉＭａ細胞株が不安定になることが明らかになった。例えば、１３回目の継代の前には、親ＳｉＭａ細胞株を構成する細胞の慣習的に示すＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０は５．０ｐＭよりも低かった。しかしながら、約１４回〜約２０回の継代の後、親ＳｉＭａ細胞を構成する細胞は、２５．０ｐＭを超えるＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０を慣習的に示した。ＳｉＭａ細胞株が少なくとも５つの異なる細胞型を含むために、天然においてはＳｉＭａ細胞株が異種性であることが、ＥＣ５０値のこの劇的な減少の一因として考えられる。時間経過と共に、これらの細胞型のうちの１つがその他の４つを排除するように培養中で過剰になる可能性がある。この過剰な細胞型のＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性が低いが、しかし完全には感受性を失っていない場合、その後この細胞型が細胞株中において優勢になるにつれて、この過剰になったＳｉＭａ細胞株におけるＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０が減少すると考えられる。従って、樹立されたクローン細胞株はこれら細胞型の１つのみに由来していることから、結果として、５．０ｐＭより低いＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０を維持することに関しては、クローン細胞株は増加した安定性を示すと考えられる。
【０１７１】
樹立されたクローン細胞株由来の細胞が、親ＳｉＭａ細胞株を構成する細胞と比較して上昇した安定性を示すかどうかを決定するために、免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａ活性の測定方法を用いて、クローン細胞株ＢＢ１０、Ｈ１、Ｈ１０、および親ＳｉＭａ細胞株における異なる継代回数でのＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０を決定した。分解した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）、０．９８Ｕ／ｍＬ、１．９Ｕ／ｍＬ、３．９１Ｕ／ｍＬ、７．８１Ｕ／ｍＬ、１５．６Ｕ／ｍＬ、３１．３Ｕ／ｍＬ、６２．５Ｕ／ｍＬ、１２５Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、または５００Ｕ／ｍＬをいずれかの処方されたＢｏＮＴ／Ａ医薬品を含む新しい培地で置換した。２４時間処理した後、細胞を洗浄し、ＳＮＡＰ−２５基質が開裂するように、毒素を含まない、無血清培地中でさらに２日間インキュベートし、上述の通りに回収した。検出工程を行うために、上清を補足抗体をコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０１７２】
同様に、セクション３に記載した通りに、α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、およびα−ＳＮＡＰ−２５補足抗体を含む固相担体を調製した。最後にＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＮＡＰ−２５開裂産物の存在の検出を行い、４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ ｆｉｔについてＰＬＡ ｖ．２を使用した以外はセクション２に上述した通りに回収したデータを解析し、ＥＣ５０を算出した。
【０１７３】
この安定性実験からの結果は、ＢＢ１０、Ｈ１およびＨ１０の全ての細胞株が、親ＳｉＭａ細胞株と比較して上昇した安定性を示したことを示した。例えば、親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞が約１４回〜約２０回の継代の後に５００Ｕ／ｍＬ（または２５ｐＭ）を超えるＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０を示すのに対し、ＢＢ１０、Ｈ１およびＨ１０細胞株を構成する全ての細胞は約３０回の継代の後でも１０Ｕ／ｍＬ（または０．５ｐＭ）よりも低いＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０を示した。
【０１７４】
実施例ＩＩＩ ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性細胞を含む細胞株の遺伝子発現プロファイル
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性または神経毒取り込み能力を有する、樹立されたクローン細胞株由来の細胞を、遺伝子発現プロファイリングによってどのように解析したかを説明する。
【０１７５】
ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性細胞におけるゲノム規模での遺伝子転写レベルの変化を測定するために、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用い、製造業者の説明書に従って、分化したおよび未分化段階のＨ１、ＢＢ１０、２Ｄ６および親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞における、遺伝子発現解析を行った。例えば、引用することによりその全文が本明細書に組み入れられる、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、７０２２３２、Ｒｅｖ．２（２００６）を参照のこと。
【０１７６】
これら細胞株について分化した細胞を調製するために、Ｈ１、ＢＢ１０、２Ｄ６、およびＳｉＭａ細胞株由来の好適な密度の細胞を、強化最小必須培地、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｘＢ２７ サプリメント、１ｘＮ２ サプリメント、および６０μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ（３０２−０１１−Ｍ００５、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む無血清培地５０ｍＬを入れた個別のＴ１７５組織培養フラスコに播種した。これらの細胞を、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で、成長停止および神経突起伸展などの標準的および慣習的な形態学的基準によって評価されるように細胞が分化し、８０％コンフルエンスに達するまでインキュベートした（およそ３日）。細胞をその後５０ｍＬの１ｘＰＢＳで洗浄し、トリプシンで５分間、室温で処理し、その後トリプシンを不活性化するために１５ｍＬの成長培地をフラスコに添加した。細胞懸濁液を５０ｍＬのチューブに移し、細胞を沈殿させるために２００ＲＣＦで５分間、室温で遠心分離した。沈殿した細胞を５０ｍＬの１ｘＰＢＳ中で洗浄し、細胞を沈殿させるために２００ＲＣＦで５分間、室温で遠心分離し、上清を除去した。沈殿した細胞を直ちに凍結し、使用まで−８０℃で保存した。
【０１７７】
これら細胞株の未分化な細胞を調製するために、Ｈ１、ＢＢ１０、２Ｄ６、およびＳｉＭａ細胞株由来の好適な密度の細胞を、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、および６０μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含む成長培地５０ｍＬを入れた個別のＴ１７５組織培養フラスコに播種した。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で細胞が８０％コンフルエンスに達するまでインキュベートした（およそ３日）。細胞をその後上述の通りに処理し、沈殿した細胞を直ちに凍結し、使用まで−８０℃で保存した。
【０１７８】
トータルＲＮＡを調製するために、ＲＮＡ分離キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、製造業者のプロトコールに従って、それぞれの細胞株の細胞を溶解し、トータルＲＮＡを単離、精製した。ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ ＤＮａｓｅ Ｉ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＤＮＡを消化した。ＲＮＡを分光光度計を用いて２６０ｎｍで定量し、分光光度計を用いたＡ２６０Ａ２８０比によって純度を評価した。ＲＮＡの品質をＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて評価した。抽出し、小分けしたトータルＲＮＡを直ちに液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
【０１７９】
遺伝子マイクロアレイチップ用のｃＤＮＡプローブを調製するために、ファーストストランドｃＤＮＡ合成反応においてはＴ７−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プロモータープライマーを用いて、約１〜１５μｇを逆転写した。ＲＮａｓｅ Ｈを介したセカンドストランドｃＤＮＡ合成の後に二本鎖ｃＤＮＡを精製し、続くインビトロ転写反応のためのテンプレートとして用いた。相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）増幅およびビオチン標識用のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼとビオチン化ヌクレオチドアナログ／リボヌクレオチドとの混合物の存在下で、インビトロ転写反応を行った。その後、ビオチン化ｃＲＮＡ標的を除去および断片化し、製造業者による説明書に従って、ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｒａｙに１７時間、６５℃でハイブリダイズさせた。例えば、引用することによりその全文が本明細書に組み入れられる、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、７０２２３２、Ｒｅｖ．２（２００６）を参照のこと。対照の細胞株と比較して、処理によって実質的にアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子発現の差を同定するためには、１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）を超える差を有意と考え、３回の解析において一貫して変化を示した遺伝子のみについて検討した（表５〜１２）。
【０１８０】
未分化段階におけるＨ１、ＢＢ１０および２Ｄ６細胞株について解析した発現プロファイリングは、２Ｄ６細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以上高いその発現レベルを有する１，３２３の遺伝子を同定したことを明らかにした（表５）。これらのうち、６８６の遺伝子が、２Ｄ６細胞株におけるこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において２倍（ｌｏｇ２１．０）以上高い発現レベルを示し、２３１の遺伝子が、２Ｄ６細胞株から決定されたこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては４倍（ｌｏｇ２２．０）以上高い発現レベルを示した。発現の減少に関しては、２Ｄ６細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以上低い発現レベルを有するとして、１，４３８の遺伝子を同定した（表６）。これらのうち、６６８の遺伝子が２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては２倍（ｌｏｇ２１．０）以下まで低下した発現レベルを示し、１０７の遺伝子が２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては４倍（ｌｏｇ２２．０）以下までに低下した発現レベルを示した。
【０１８１】
分化段階におけるＨ１、ＢＢ１０および２Ｄ６細胞株について解析した発現プロファイリングは、２Ｄ６細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以上の高い発現レベルを有するとして、２，５５６の遺伝子を同定したことを明らかにした（表７）。これらのうち、１，６３４の遺伝子が２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては２倍（ｌｏｇ２１．０）以上までの高い発現レベルを示し、かつ、６９６の遺伝子が２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては４倍（ｌｏｇ２２．０）以上まで高い発現レベルを示した。発現の減少に関しては、２Ｄ６細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以下までの低い発現レベルを有するとして２，０８７の遺伝子を同定した（表８）。これらのうち、１，２１５の遺伝子は２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては２倍（ｌｏｇ２１．０）以下までに低下した発現レベルを示し、２８０の遺伝子が２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては４倍（ｌｏｇ２２．０）以下までの低下した発現レベルを示した。
【０１８２】
未分化段階におけるＨ１、ＢＢ１０およびＳｉＭａ細胞株について解析した発現プロファイリングは、ＳｉＭａ親細胞株から得られた発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以上までの高い発現レベルを有する遺伝子として、１，２３２の遺伝子を同定したことを明らかにした（表９）。これらのうち、７６４の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において２倍（ｌｏｇ２１．０）以上までの高い発現レベルを示し、２２８の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において４倍（ｌｏｇ２２．０）以上までの高い発現レベルを示した。発現の減少に関しては、ＳｉＭａ親細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以下までの低い発現レベルを有する遺伝子として、１，２６５の遺伝子を同定した（表１０）。これらのうち、６４８の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において２倍（ｌｏｇ２１．０）以下までの低い発現レベルを示し、１８９の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株においては４倍（ｌｏｇ２２．０）以下までに低下した発現レベルを示した。
【０１８３】
分化段階におけるＨ１、ＢＢ１０およびＳｉＭａ細胞株について解析した発現プロファイリングは、ＳｉＭａ親細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以上の高い発現レベルを有する７５６の遺伝子を同定したことを明らかにした（表１１）。これらのうち、４７２の遺伝子が、ＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において２倍（ｌｏｇ２１．０）以上の高い発現レベルを示し、１５０の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において４倍（ｌｏｇ２２．０）以上の高い発現レベルを示した。発現の減少に関しては、ＳｉＭａ親細胞株から得られた遺伝子発現レベルと比較して、Ｈ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍（ｌｏｇ２０．５８）以下の低い発現レベルを有するとして９１２の遺伝子を同定した（表１２）。これらのうち、４１１の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において２倍（ｌｏｇ２１．０）以下の低い発現レベルを示し、１０８の遺伝子がＳｉＭａ親細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において４倍（ｌｏｇ２２．０）以下に低下した発現レベルを示した。
【０１８４】
実施例ＩＶ クローン細胞株の遺伝子発現プロファイルの経路解析
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性または神経毒取り込み能力を有する、樹立されたクローン細胞株由来のクローン細胞から得られた遺伝子発現プロファイルを、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に関連する生物学的なネットワークまたは経路を同定するためにどのように解析したかを説明する。
【０１８５】
非常に高いＢｏＮＴ／Ａ感受性を有する単一のクローン細胞株由来の２つの独立した細胞株であるＢＢ１０およびＨ１のＲＮＡ発現表現型を、関連する、非常に弱いＢｏＮＴ／Ａ感受性を有する単一のクローン細胞株２Ｄ６と比較して解析するために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を行った。解析は、ＢｏＮＴ／Ａ感受性細胞株の特定の遺伝子発現表現型を同定するために行った。ＢｏＮＴ／Ａの取り込みを増強する機能を有するタンパク質の予測するためおよび可能性を有するタンパク質を同定するために、結果をまた用いることができる。
【０１８６】
行ったＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓにより、ＩＰＡライブラリーからの遺伝子間における連結度に基づいたＢｏＮＴ／Ａ中毒への生物学的に関連しているネットワーク、および、上記で議論された発現プロファイリングから決定したような有意な変化を示す遺伝子を同定した。この解析については、これ以降プロファイル遺伝子と称する、２Ｄ６細胞株から決定したこれら遺伝子の発現レベルと比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において４倍（ｌｏｇ２２．０）以上に発現レベルが上昇したまたは低下した全ての遺伝子を、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に関連する既知のまたはＢｏＮＴ／Ａ中毒に関連すると予測される選択した遺伝子と共に用いた。特定のネットワーク上にマッピングしたプロファイル遺伝子の数をそのネット示されたネットワークにおける関連性の有意性を測定し、ワーク上にマッピングした遺伝子の総数で割った比によってランク付けした。ｐ−スコアを算出するために、プロファイル遺伝子およびネットワーク間の関連を示すフィッシャーの直接確率検定を用い、そのｐ−スコアに基づいたプロファイル遺伝子からの遺伝子をネットワークをランク付けするために用いた。ｐ−スコアはｐ値から生成した。ネットワーク中にｎ個の遺伝子があり、それらのうちのｆ個がプロファイル遺伝子である場合、ｐ値は、Ｇｌｏｂａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｔｗｏｒｋからランダムに選択されたｎ遺伝子のセット中においてｆ個以上のプロファイル遺伝子を見いだす確率を意味する。有意なｐ値が非常に低いため（例えば１ｘ１０−８）、ｐ−スコアはｐ値の構成要素として定義され、ｐ−スコア＝−ｌｏｇ １０（ｐ値）である。同定したネットワークを、分化の前または後のいずれかに１．５倍以上の異なる発現および０．００１以下のｐ値を有する、異なって発現した遺伝子に重ねた。
【０１８７】
ＩＰＡ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて、異なって発現したプロファイル遺伝子を２６のネットワークと関連させた。これらのうちの１９は１０以上のプロファイル遺伝子を含んだ（表１３）。これら１９のネットワークから、Ａ、ＢおよびＣと名付けた、３つの全体にわたるネットワーク群を同定した（表１３）。これら３群におけるネットワーク中には、重複している遺伝子があり、および３つ以上の遺伝子の発現が分化の後で上昇した。Ａ群の遺伝子には、ＢｏＮＴ／Ａへの受容体としてＢｏＮＴ／Ａ中毒の過程で機能することが示されているＦＧＦＲ２受容体、および：２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＮＸＡ２、ＡＱＰ１、ＡＲＨＧＡＰ９、ＣＤＨ１０、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＰＴ１、ＣＮＴＮ２、ＥＲＡＰ１、およびＲＧＳ１１；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＴＡＤ２、Ｃ１１ＯＲＦ８２、ＣＤＣ４５Ｌ、ＣＮＴＮ１、ＣＮＴＮ４、Ｃｙｃｌｉｎ Ａ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ７、ＥＬＯＶＬ７、ＥＭＥ１、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＫＩＡＡ１５２４、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＮＤＣ８０、ＮＤＮ、ＯＲＣ１Ｌ、ＰＬＳ３、ＰＲＩＭＡ１、ＲＡＤ５４Ｌ、ＲＢＬ１、ＲＢＰＭＳ、ＲＲＭ２、Ｓ１ＰＲ３、ＳＣＬＹ、ＳＬＣＩＡ３、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＦＤＰ１、ＴＦＰ１２、ＴＫ１、ＴＭＥＭ３５、ＴＴＫ、ＴＷＩＳＴ１、ＴＹＭＳ、ＴＹＫ、およびＺＷＩＮＴが含まれる。
【０１８８】
Ｂ群の遺伝子には、細胞培養実験においてＢｏＮＴ／Ａの取り込みを上昇することが示されているＮＧＦによって制御される受容体であるＥＧＦＲ、および：２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下の低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＢＣＣ８、ＡＥＬＩＭ３、ＣＡＰ２、ＩＬ１７Ｂ、ＭＥＦ２Ａ、ＮＥＥＢＬ、ＰＨＣ、Ｓ１００Ａ６、ＳＬＣ１Ａ６、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８、ＳＹＴ１３、およびＳＹＴＬ１；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＵＲＫＢ、ＢＩＲＣ５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＤ９、ＤＬＧＡＰ３、ＤＹＮＬＴ３、ＥＮＣ１、ＦＢＬＮ１、ＦＯＸＭ１、ＧβＹ、ＧＮＡＩ１、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＧＰＳＭ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＨＧＦ、ＩＴＧＡ６、ＪＮＫ、ＫＣＮＪ５、ＫＩＦ１８Ａ、ＫＩＴＬＧ、ＭＭＤ、ＭＳＮ、ＭＹＲＩＰ、ＮＥＫ２、ＮＲ３Ｃ１、ＮＸＰＨ１、ＯＳＢＰＬ３、ＰＫＭＹＴ１、ＰＴＰＲＭ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１ＡＰ１、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＭＣ６、ＳＮＡＩ２、ＳＮＣＡＩＰ、ＳＳＨ２、ＳＴＫ１７Ａ、ＳＹＮＰＯ２、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰＴＥ、ＴＲＡＦ４、ＴＳＰＡＮ、ＴＳＰＡＮ４、ＵＢＥ３、ＵＢＥ３Ｂ、およびＶＡＶ３が含まれる。
【０１８９】
Ｃ群の遺伝子には、ＢｏＮＴ／Ａの細胞内トラフィッキングにおいて機能する可能性のある、キネシンファミリーの多数の微小管モータータンパク質、および：２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下の低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＣＳＴＢ、ＧＰＣＲ、ＧＲＩＭ５、ＫＩＳＳＲ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＬＣ１Ａ２、およびＴＨＢＳ２；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＬＣＡＭ、ＡＵＲＫＡ、ＣＨＥＫ、ＣＩＴ、ＣＳＲＰ２、Ｅ２Ｆ、ＥＣＴ２、ＥＦＮＢ２、ＥＲＫ、ＥＳＰＬ１、ＧＮＡＩ、ＧＰＲ１６１、ＨＭＭＲ、ＫＩＦ４Ａ、ＫＩＦ１４、ＫＩＦ１５、ＫＩＦ２２、ＫＩＦ２３、ＫＩＦＣ１、ＬＰＡＲ１、ＭＫ１６７、ＯＩＰ５、ＰＨＬＰＰ、ＰＰ１／ＰＰ２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＴＧ１、ＲＡＣＧＡＰ、ＲＢ、ＲＧＳ５、ＳＤＣ２、およびＴＰＸ２が含まれる。
【０１９０】
同定した残りのネットワークは、その他のいずれのネットワークとも共通した遺伝子をもたなかった。ネットワーク３には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＤＡＲＢ１、ＡＤＭ、ＰＴＰＰＨ、およびＳＬＣＯ１Ａ２；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＳＣＬ１、ＨＥＳ６、ＭＡＰＫ、ＮＭＵ、ＰＥＧ３、ＰＴＰＲＫ、ＰＲＬＨＲ、ＰＴＰＲＫ、ＳＧＯＬ２、ＳＰＡＲＣ、およびＺＮＦ２１７が含まれる。ネットワーク６には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＣＮＧＡ３、ＨＩＳＴ１Ｈ３ＥおよびＰＴＧＳ１；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＳＦ１Ｂ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＮＣＡＰＨ、ＰＢＫ、ＰＲＡＭＥ、ＳＭＣ２、ＵＨＲＦ１、およびＶＲＫ１が含まれる。ネットワーク９には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤおよびＯＳＣＡＲ；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、Ｃ１４ＯＲＦ１０６、ＣＥＰ７２、ＫＩＦ２０Ａ、ＰＣＮＡ、ＰＥＸ１３、ＰＦＣ５、ＰＯＬＱ、ＳＰＡＧ５、ＳＹＴＬ４、ＴＲＯＡＰ、およびＷＤＲ５１Ａが含まれる。ネットワーク１２には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＮＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＳＰＭ、ＢＵＢ１、ＣＣＤＣ９９、ＣＥＰ５５、ＣＫＡＰ２、ＤＲＡＭ、Ｅ２Ｆ８、ＰＬＸＮＡ２、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｓ、およびＷＤＨＤ１が含まれる。ネットワーク１３には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子であるＣＡＬＹ；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＲＨＧＥＦ３、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＦＢＰ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＩＦ１１、ＰＦＫＦＢ３、およびＰＬＫ４が含まれる。ネットワーク１４には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＣＯＬ５Ａ１およびＭＩＣＡＬ２；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＦＮＤＣ５、ＨＳＰＣ１５９、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＳＬＩＴＲＫ５、ＳＹＮ２、およびＺＮＦ３６７が含まれる。ネットワーク１５には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＯＬＦＭＬ２ＡおよびＳＩＧＩＲＲ；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＥＸＯ１、ＫＣＴＤ１２、ＭＹＯ６、ＰＨＥＢＬ１、ＳＨＣＢＰ１、ＴＰＢＧ、およびＴＵＢＢ６が含まれる。ネットワーク１７には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＨＰＣＡＬ１およびＬＰＡＲ５；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＢＴＧ３、ＧＡＢＲＡ５、ＴＲ１Ｐ１０、およびＺＮＦ５２１が含まれる。ネットワーク１９には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＨＴＲ１ＥおよびＳＯＲＣＳ１；２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＢＮＣ２、ＤＰＹＤ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＰＰＩＬ５、およびＴＡＣＣ３が含まれる。
【表５−１】
2015077153.tif 000007
【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【０１９１】
実施例Ｖ クローン細胞株から得られた遺伝子発現プロファイルの経路解析
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性または神経毒取り込み能力を有する、樹立されたクローン細胞株由来のクローン細胞から得られた遺伝子発現プロファイルを、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に関連する生物学的なネットワークまたは経路を同定するためにどのように解析したかを説明する。
【０１９２】
２つの独立して得られた単一のクローン細胞株であり、ＢｏＮＴ／Ａ活性に対して非常に高い感受性を有するＢＢ１０およびＨ１、並びにより弱いＢｏＮＴ／Ａ活性感受性を有する単一のクローン細胞株である２Ｄ６のＲＮＡ発現表現型を解析するために、コンピューター解析を行った。結果は、本明細書において開示した方法の実施において有用である、ＳｉＭａ親細胞株から選択されるクローン細胞株の同定において有用であることを示す。
【０１９３】
ＢｏＮＴ／Ａ感受性細胞株に関連した特定の遺伝子発現表現型を同定するために、ＪＭＰ Ｇｅｎｏｍｉｃ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いてデータを解析した。ＪＭＰ Ｇｅｎｏｍｉｃ解析を行うために、「データ」および「実験計画」と指定したＳＡＳファイルを構築することによってＲＮＡ発現データをＪＭＰ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにインポートした。平均発現値における差を決定するための分散解析および分散の一元配置解析（一元配置ＡＮＯＶＡ）を含む、基礎的な発現ワークフローを行った。細胞株とそれぞれの細胞株の分化段階（分化したまたは分化していない）との間の差を決定するために、分散解析を用いた。４つ全ての細胞株の発現値を分化段階と無関係にペアワイズで比較し、２Ｄ６細胞株と比較してＨ１細胞株において、２Ｄ６細胞株と比較してＢＢ１０細胞株において、および２Ｄ６細胞株と比較してＳｉＭａ親細胞株（ＰＡ）において４倍以上高く過剰発現した遺伝子を同定した。説明された分散の割合におけるそれらの貢献度を明らかにするために、分散解析においては、試験における全ての因子を変量効果とみなした（全分散＝１００％）。分散の約半分、４６．９％は異なる細胞型間における差を示し、２６％は分化の前および後の差を示す。分散４．６％のみが分化したまたは未分化の細胞型間の差を示した。このことは、分化の後に異なって発現した遺伝子が、試験した全ての細胞型について類似したものであったことを意味し、細胞株間におけるＢｏＮＴ／Ａ感受性についての差は分化段階と無関係であることを示唆している。そのため、分化に無関係に、異なる細胞型間で異なる遺伝子について検討した。
【０１９４】
分散解析からの結果に基づいて、全ての細胞株の発現値を分化とは無関係にペアワイズで比較した（図２）。２Ｄ６細胞株と比較してＨ１細胞株において、および２Ｄ６細胞株と比較してＢＢ１０細胞株において、４倍以上過剰発現した遺伝子プローブのみを示した。ｘ軸に発現値（Ｌｏｇ２）、およびｙ軸にｐ値（−ｌｏｇ１０（ｐ値））として、遺伝子プローブをプロットした。赤色の破線は９５％信頼区間を示す。２Ｄ６細胞株（図2Ａ）と比較してＨ１細胞株において、および２Ｄ６細胞株と比較してＢＢ１０細胞株において４倍以上過剰発現した遺伝子プローブ（図２Ｂ）はまた、ＳｉＭａ親細胞株と比較してＢＢ１０細胞株において（ＰＡ、図２Ｃ）、ＳｉＭａ親細胞株と比較してＨ１細胞株において（図２Ｄ）、および２Ｄ６細胞株と比較してＳｉＭａ親細胞株において（図２Ｅ）過剰発現した遺伝子との間にも広く見られた。これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａ感受性がこれら遺伝子の発現の漸増に関したことを示唆する。この知見に基づいて、ＢｏＮＴ／Ａ感受性に対してより重要であると予想された、１つ以上の細胞株にわたって異なって発現した遺伝子プローブさえをも合理化しながら、２Ｄ６細胞株と比較してＳｉＭａ親細胞株におてもまた過剰発現した遺伝子プローブのみを含めることにより、多数の遺伝子プローブをさらに１１９まで絞った。そのため、ＪＭＰ Ｇｅｎｏｍｉｃ解析によっては、ＪＭＰプローブセットと指定された、１１９遺伝子プローブが同定された。
【０１９５】
ＪＭＰプローブセットのさらなる特徴づけのために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）にＪＭＰプローブセットをエクスポートした。この解析を用いて、ＩＰＡライブラリーおよびＪＭＰプローブセットに含まれる遺伝子間の連結度に基づいて、ＢｏＮＴ／Ａ中毒に生物学的に関連しているネットワークを同定した。示されたネットワークにおける関連性の有意性を測定し、特定のネットワーク上にマッピングされたＪＭＰプローブセット由来の遺伝子プローブの数をそのネットワーク上にマッピングした遺伝子の総数で割った比によってランク付けした。ｐ−スコアの算出にはフィッシャーの直接確率検定を用い、そのｐ−スコアに基づいて、ＪＭＰプローブセット由来の遺伝子をネットワークのランク付けに使用した。ｐ値からｐ−スコアを生成した。ネットワーク中にｎ個の遺伝子があり、それらのうちのｆ個がＪＭＰプローブセット由来の遺伝子プローブである場合、ｐ値は、Ｇｌｏｂａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｔｗｏｒｋからランダムに選択されたｎ遺伝子のセット中においてｆ個以上のＪＭＰプローブセット由来の遺伝子プローブを見いだす確率を意味する。有意なｐ値が非常に低いため（例えば１ｘ１０−８）、ｐ−スコアはｐ値の構成要素として定義され、ｐ−スコア＝−ｌｏｇ１０（ｐ値）である。同定したネットワークを、分化の前または後のいずれかに１．５倍以上の異なる発現および０．００１以下のｐ値を有する、異なって発現した遺伝子に重ねた。ＩＰＡ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて、ＪＭＰプローブセット由来の１１９の遺伝子プローブのうち、１１１をネットワーク上にマッピングした。８つのマッピングされなかったプローブの多くは古い命名によるプローブ、または既知の遺伝子産物をもたない遺伝子を示しているプローブのいずれかを示す。１１１の遺伝子プローブは、ｐ値カットオフを０．０５に設定した場合に、２Ｄ６細胞株と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において４．０倍を超えて異なって発現し、かつ、２Ｄ６細胞株と比較してＳｉＭａ親細胞株において４．０倍を超えて異なって発現した、７９の遺伝子に対応した（表１４）。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【０１９６】
ＩＰＡ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて、７９遺伝子のうちの７３を５つの異なるタンパク質ネットワーク上にマッピングした（表１５）。重複した遺伝子のマッピングに基づいて、７９の遺伝子のうち、アップレギュレートされた７３遺伝子が、ＡおよびＢと名付けた、２つの主要なタンパク質のネットワーク群に関連していると考えられた（表１５）。ネットワーク１、２および５がＡ群に属し、およびネットワーク３および４がＢ群に属す。同様に、ダウンレギュレートされた全ての遺伝子を、Ｃと名付けた１つのネットワークに関連づけた（表１５）。
Ａ群の遺伝子には、ＢｏＮＴ／Ａ中毒の過程においてＢｏＮＴ／Ａ受容体として機能することが示されたＦＧＦＲ２受容体、および：２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＥＦ３、ＡＳＣＬ１、ＢＡＲＤ１、ＣＤ９、ＣＤＫ２、ＣＳＲＰ２、ＣＴＳＬ２、ＤＩＡＰＨ３、ＤＯＫ５、ＤＹＮＬＴ３、ＥＭＩＬＩＮ２、ＥＴＶ１、ＦＢＬＮ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡＩ１、ＧＮＢ４、ＧＮＧ１１、ＧＮＧ１２、ＨＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＬＰＡＲ１、ＭＣＭ１０、ＭＳＮ、ＰＡＧ１、ＰＥＧ３、ＰＬＫ２、ＰＯＬＡ２、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３２、ＳＤＣ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ７Ａ２、ＳＭＣ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＣ２５、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＦＰＩ２、ＴＭＥＭ３５、ＴＮＦＡＩＰ８、ＴＰＴＥ、ＴＲＩＰ１０、およびＴＷＩＳＴ１が含まれる。
【０１９７】
Ｂ群の遺伝子は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＣＯＴ９、ＢＡＳＰ１、Ｃ１１ＯＲＦ７５、ＣＣＤＣ１０９Ｂ、ＣＤＣＡ７Ｌ、ＣＬＳＴＮ２、ＣＮＴＮ１、ＣＵＧＢＰ２、ＤＥＰＤＣ１、ＤＰＹＤ、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＦＮＤＣ５、ＧＴＳＥ１、ＭＡＯＡ、ＭＩＮＡ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＰＬＫ２、ＰＲＬＨＲ、ＰＶＲＬ３、ＲＢＰＭＳ、ＳＧＯＬ２、ＳＭＣ２、ＴＦＰ１２、ＴＭＥＭ１７８、およびＺＮＦ５２１である。
【０１９８】
Ｃ群の遺伝子は、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以下に低下した発現レベルを示す遺伝子である、ＡＮＫ２、ＣＰＮＥ８、ＣＲＥＢ５、ＩＬ１７Ｂ、ＫＩＡＡ０１２５、ＬＯＣ１００２８９１０９、ＬＯＣ１４４５７１、ＮＰＡＳ４、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＯＲＣＳ１、ＴＨＢＳ２、および／またはＺＮＦ８１４である。
【０１９９】
同定した残りのネットワークは、その他のいずれのネットワークとも共通した遺伝子をもたなかった。しかしながら、個別には、２Ｄ６細胞株由来の細胞におけるそれらの発現と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍以上に上昇した発現レベルを示す遺伝子としては、Ｃ３ＯＲＦ７０（ネットワーク６）、ＭＡＢ２１Ｌ２（ネットワーク７）、ＰＲＳＳ１２（ネットワーク８）、ＣＥＮＰＬ（ネットワーク９）、ＧＰＲ１７７（ネットワーク１０）、およびＰＴＧＲＩ（ネットワーク１１）があった。
【表７−１】
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【表７−２】
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【０２００】
プローブのリストが、２Ｄ６およびＳｉＭａ親細胞株の両方と比較してＨ１およびＢＢ１０細胞株において１．５倍を超えて異なって発現する遺伝子を反映する以外は、実施例Ｖと同様に、コンピューター解析を行った。ｐ値カットオフを０．０５に設定した場合、この解析によって、３６９の遺伝子に分類できる４３９の遺伝子プローブを同定した（表１６）。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【０２０１】
プローブが、２Ｄ６およびＳｉＭａ親細胞株の両方と比較してＨ１細胞株およびＢＢ１０細胞株において１．５倍を超えて異なって発現し、かつ、２Ｄ６細胞株と比較してＳｉＭａ親細胞株において１．５倍を超えて異なった発現する遺伝子を反映する以外は、実施例Ｖと同様に、コンピューター解析を行った。ｐ値カットオフを０．０５に設定した場合、この解析によって、７０の遺伝子に分類できる９４の遺伝子プローブを同定した（表１７）。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【０２０２】
実施例Ｖｌ 免疫を用いた、ピコモル量のＢｏＮＴ／Ａの検出方法
以下の実施例は、例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）、ＰＵＲＴＯＸ（登録商標）、ＸＥＯＭＩＮ（登録商標）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）、またはＢＴＸ−Ａなどの、ピコモル量のＢｏＮＴ／Ａ医薬品を検出することができる、免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａ活性の検出方法をどのように行うかについて説明する。
【０２０３】
１．ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、免疫を用いたＢｏＮＴ／Ａの検出方法
ＢｏＮＴ／Ａで処理した細胞からの溶解物を調製するために、樹立されたクローン細胞株由来のおよそ１５０，０００細胞を、最小必須培地、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｉ ｗｉｔｈ Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ、１ｘＢ２７ サプリメント、１ｘＮ２ サプリメント、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび６０μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂを含む無血清培地１００μＬを入れた９６ウェル組織培養ポリ−Ｄ−リジンプレートのウェルにプレーティングした。ＢＢ１０、Ｈ１、およびＳｉＭａ細胞株を用いた。これらの細胞を、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で、成長停止および神経突起伸展などの標準的および慣習的な形態学的な基準によって評価されるように細胞が分化するまでインキュベートした（およそ３日）。分化した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、１）ＳｉＭａ細胞株、０（未処理）、０．９８Ｕ／ｍＬ、１．９Ｕ／ｍＬ、３．９１Ｕ／ｍＬ、７．８１Ｕ／ｍＬ、１５．６Ｕ／ｍＬ、３１．３Ｕ／ｍＬ、６２．５Ｕ／ｍＬ、１２５Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、または５００Ｕ／ｍＬの塩化ナトリウムを含まない培地中に再構成したＢｏＮＴ／Ａ医薬品；２）ＢＢ１０、０（未処理）、０．４９Ｕ／ｍＬ、０．９８Ｕ／ｍＬ、１．９Ｕ／ｍＬ、３．９１Ｕ／ｍＬ、７．８１Ｕ／ｍＬ、１５．６Ｕ／ｍＬ、３１．３Ｕ／ｍＬ、６２．５Ｕ／ｍＬ、１２５Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ；３）Ｈ１、０（未処理）、０．３Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、３Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、２８Ｕ／ｍＬ、８３Ｕ／ｍＬ、および２５０Ｕ／ｍＬのうちの１つを含む、新しい培地で置換した。ＢｏＮＴ／Ａ医薬品が塩化ナトリウムを含むため、培養培地への塩化ナトリウムの添加は、細胞の生存に有害な高浸透圧培地を生じた。高浸透圧の問題を回避するために、最終濃度が２５ｐＭ ＢｏＮＴ／Ａ（５００Ｕ／ｍＬ）になるようにＢｏＮＴ／Ａ医薬品を再構成するために、塩化ナトリウムを加えずに作成した２００μＬのＭＥＭ培地を用いた。用いた最も高い濃度（２５ｐＭまたは５００Ｕ／ｍＬ）において存在する賦形剤の量が一致する希釈物を作成するために使用した培地中に塩化ナトリウムを添加することにより、全ての濃度について、用量反応曲線に沿ったマトリックスの一貫性が維持された。２４時間処理した後、細胞を洗浄し、毒素を加えずにさらに２日間インキュベートした。細胞を回収するために、１ｘＰＢＳを吸引し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣＩ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリシスバッファー７５μＬをそれぞれのウェルに添加することによって細胞を溶解し、プレートを５００ｒｐｍで回転している振とう機上、４℃で３０分間インキュベートした。細胞残渣を沈殿させるためにプレートを４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、検出工程を行うために上清を補足抗体をコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０２０４】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液を調製するために、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６（実施例ＶＩＩ）由来の腹水に含まれるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いて精製した。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をルテニウム（ｌｌ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン酸）ＮＨＳエステル標識試薬（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に、製造業者による説明書（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に従って共役させた。２００μＬの２ｍｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体にＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ストック溶液を再構成した蒸留水３０μＬを添加し、反応液を室温、暗所で２時間インキュベートすることによって共役反応を行った。標識した抗体を標準的なスピンカラムのプロトコールを用いて精製し、タンパク質濃度を標準的な比色タンパク質アッセイを用いて決定した。１リットル当たりのモル濃度を決定するために、α−ＳＮＡＰ−２５抗体／ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）共役体の吸光度を、分光光度計を用いて４５５ｎｍで測定した。検出抗体溶液を使用まで４℃で保存した。
【０２０５】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的な補足抗体を含む固相担体を調製するために、およそ１μＬのα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１ｘＰＢＳ中に４５μｇ／ｍＬ、７５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）を、９６ウェルＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のそれぞれのウェルに添加し、溶液中の液体を蒸発させるために、生物学的に安全なキャビネット中で２〜３時間風乾させ、プレートを密閉して使用まで４℃で保存した。乾燥させた、補足抗体が結合したウェルをその後、１ｘＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、２％ ＥＣＬブロッキング試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）、および１％ヤギ血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を含む１５０μＬのブロッキングバッファーを添加し、６００ｒｐｍで回転させながら、室温で２時間ブロッキングした。
【０２０６】
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ解析を用いてＳＮＡＰ−２５開裂産物の存在を検出するために、プレートのブロッキングバッファーを吸引し、ＢｏＮＴ／Ａで処理した細胞からの溶解物２５μＬをそれぞれのウェルに添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートのウェルを細胞溶解物を吸引することによって３回洗浄し、それぞれのウェルを２００μＬ １ｘＰＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）を用いて３回濯いだ。洗浄した後、１ｘＰＢＳに溶解した２％ Ａｍｅｒｓｈａｍブロッキング試薬、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）を含む２５μＬの５μｇ／ｍＬ α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液をそれぞれのウェルに添加し、プレートを密閉し、密閉したプレートを振とうさせながら、室温で１時間インキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体をインキュベートした後、２５０μＬ １ｘＰＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）を用いてウェルを３回洗浄した。洗浄した後、１５０μＬの１ｘリードバッファー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をそれぞれのウェルに添加し、プレートをＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００ Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて読み込んだ。生データをその後ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ｖ １０．０に移し、用量反応曲線を決定するために４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ ｆｉｔを用いた。データのプロッティングにおいては、使用された４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ関数に関する制約はなかった。画像レポートを、Ｒ２（相関係数）、ａ（データセットの最大値）、ｂ（傾き）、およびＸ０±ＳＥ（ＥＣ５０値±標準誤差）を用いた解析によって生成した。
【０２０７】
これらの結果は、親ＳｉＭａ細胞株を構成する細胞と比較してＢＢ１０およびＨ１クローン細胞株を構成する細胞が、平均してＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性がより高いことを示した。ＢＢ１０細胞株由来の細胞が示したＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０は７Ｕ／ｍＬであり、Ｈ１細胞株由来の細胞が示したＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０は８Ｕ／ｍＬであり、および親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞が示したＢｏＮＴ／Ａ活性に対するＥＣ５０は１３Ｕ／ｍＬであった。この方法は、引用することによりその全文が本明細書に組み入れられる、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ，ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号に記載されたような複合的な方法においてもまた、使用することができる。
【０２０８】
実施例ＶＩＩ
感受性クローン細胞株へのＢｏＮＴ／Ａ受容体ＤＮＡのトランスフェクションは、クローン細胞株のＢｏＮＴ／Ａの感受性をさらに改良する
以下の実施例はＢｏＮＴ／Ａ中毒に対する感受性をさらに改良するために、またはＢｏＮＴ／Ａ取り込み能力を改良するために、ＢｏＮＴ／Ａ受容体コードしているポリヌクレオチド分子を、どのようにクローン細胞株由来の細胞に導入したかを説明する。
【０２０９】
外因性のＢｏＮＴ／Ａ受容体を、樹立されたクローン細胞株を構成する細胞に導入するために、配列番号２５のＦＧＦＲ３をコードしている配列番号１３９のポリヌクレオチド分子を含む哺乳動物の発現コンストラクトを、陽イオン性脂質法によってＨ１クローン細胞株由来の細胞にトランスフェクションした。樹立されたクローン細胞株由来の好適な密度（約５ｘ１０６細胞）の細胞を５ｍＬの完全培養培地を加えた１００ｍｍ組織培養ディッシュにプレーティングし、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で、トランスフェクションに適した密度に細胞が達するまで生育させる。６０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む１．５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）血清使用量低減培地を添加することによって３ｍＬのトランスフェクション溶液を用意し、１．５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）血清使用量低減培地が２４μｇの配列番号２５のＦＧＦＲ３をコードしている発現コンストラクトを含むように、室温で５分間インキュベートする。このトランスフェクション混合液を室温でおよそ３０分間インキュベートする。細胞上の完全培地を３ｍＬのトランスフェクション溶液で置換し、細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でおよそ８時間インキュベートする。トランスフェクション培地を３ｍＬの新しい完全培養培地で置換し、細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でおよそ２４時間インキュベートする。培地を、トランスフェクションされた細胞を選抜するためにおよそ１ｍＭのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む３ｍＬの新しい完全培養培地を置換する。細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でおよそ１週間インキュベートし、古い培地を０．５ｍＭ Ｇ４１８を含む新しい完全培養培地で置換し、細胞を１ウェル当たり０．５細胞の密度で９６ウェルのコラーゲンＩＶコーティングプレートにプレーティングする。細胞の増殖および生存を顕微鏡的試験によってモニターし、約３週間後に約２０％のウェルにおいて単一のクローンが発現した。これらのクローンをさらに２週間生育させ、その後、１つのプレートをクローン細胞株を維持するため、もう一方をＢｏＮＴ／Ａ感受性を試験するための２つのプレートを用意するために、２４ウェルコラーゲンＩＶコーティングプレートに移した。
【０２１０】
ＢｏＮＴ／Ａ受容体を過剰発現しているクローン細胞株を含む細胞の感受性を決定するために、感受性を決定するためのウエスタンブロット解析を行い、ＥＣ５０値を決定するためにＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ＦＧＦＲ３を安定にトランスフェクションしたＨ１細胞について、全部で８つのクローンを試験した。
【０２１１】
ウエスタンブロット解析用の細胞溶解物を調製するために、クローン細胞株由来の細胞を最小必須培地、２ｍＭ ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）Ｉ ｗｉｔｈ Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ、１ｘＢ２７ サプリメント、１ｘＮ２ サプリメント、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２５μｇ／ｍＬ ＧＴ１ｂ（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む無血清培地を入れたポリ−Ｄ−リジンコーティング９６ウェルプレートの２つのウェルにプレーティングした。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で成長停止および神経突起伸展などの標準的および慣習的な形態学的な基準によって評価されるように細胞が分化するまでインキュベートした（およそ３日間）。分化した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理）、０．５ｎＭまたは０．２５ｎＭのいずれかのＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む新しい培地で置換した。６時間処理した後、細胞を洗浄し、毒素を加えずにさらに１８時間インキュベートした。インキュベーションした後、成長培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳでそれぞれのウェルを濯ぐことによって細胞を洗浄した。細胞を回収するために、１ｘＰＢＳを吸引し、４０μＬの２ｘＳＤＳローディングバッファーを添加してプレートをローディングバッファーで覆うように旋回させることによって細胞を溶解した。溶解物を新しい９６ウェルＰＣＲプレート（Ａｘｙｇｅｎ、ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ、ＣＡ）に移し、細胞を完全に溶解させ、タンパク質を変性させるためにプレートを９５℃で５分間加熱した。
【０２１２】
開裂していないＳＮＡＰ−２５基質および開裂したＳＮＡＰ−２５産物の両方の存在を検出するために、回収したそれぞれの試料の一部をウエスタンブロットによって解析した。この解析においては、変性、還元条件下で、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ １２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、回収した試料の１２μＬのアリコートをＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。「Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＋ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ＆ Ｃｏｏｌｅｒ」ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたウエスタンブロットにより、分離したタンパク質をゲルからニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上に移した。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭ ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパンジオール塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ 塩化ナトリウム、２．７ｍＭ 塩化カリウム）、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）、２％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％ 脱脂粉乳を含む溶液中で、ゆるやかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートすることにより、膜をブロッキングした。ブロッキングした膜を、１：５，０００に希釈したα−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を一次抗体として含む、ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）、２％ ＢＳＡ、および５％ 脱脂粉乳中、４℃で一晩インキュベートした。それぞれの細胞株における全てのＳＮＡＰ−２５発現を評価し、ＢｏＮＴ／Ａ処理後に開裂したＳＮＡＰ−２５のパーセンテージをＢｏＮＴ／Ａの取り込み量を評価するための指標とすることを可能にすることにより、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体は開裂していないＳＮＡＰ−２５基質およびＳＮＡＰ−２５開裂産物の両方を検出することができる。一次抗体でプロービングしたブロットをＴＢＳ、ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で３回、それぞれの回につき５分間洗浄した。１：１０，０００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼに共役したヤギポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリンＧ、重鎖および軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を二次抗体として含むＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）、２％ ＢＳＡ、および５％ 脱脂粉乳中で洗浄した膜を室温で２時間インキュベートした。二次抗体でプロービングしたブロットをＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で５回、それぞれの回につき５分間洗浄した。標識したＳＮＡＰ−２５産物のシグナルの検出においては、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｄｅ���ｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて可視化し、膜を画像化して開裂したＳＮＡＰ−２５産物のパーセンテージをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１０ 可変 Ｍｏｄｅ ＩｍａｇｅｒおよびＩｍａｇｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて定量した。ピクセルサイズの選択（１００〜２００ピクセル）およびＰＭＴ電圧設定（３５０〜６００、通常は４００）は、それぞれのブロットに依存する。完全なおよび開裂したＳＮＡＰ−２５産物に対応するバンドの体積をＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＴＬを用いて定量し、２つのＳＮＡＰ−２５のバンドの強度に基づいて、ＳＮＡＰ−２５の全量および開裂したＳＮＡＰ−２５のパーセンテージを算出した。
【０２１３】
高いパーセンテージのＳＮＡＰ−２５の開裂および高レベルの全ＳＮＡＰ２５を有したクローンＨ１ １．４をさらなる試験のために選択した。ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイおよび凍結ストック用に十分な細胞が生産されるかを確認するために、選択したクローンを最初に１０ｃｍ２ディッシュ中で、その後Ｔ１７５フラスコ中で生育させた。１ｘ１０６細胞と１ｍＬのＲｅｃｏｖｅｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ−ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１２６４８−０１０ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉａ）とを用いて凍結ストックを作成した。
【０２１４】
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ用の細胞溶解物を調製するために、Ｈ１クローン細胞株由来のおよびＦＧＦＲ３を過剰発現しているＨ１ １．４クローン細胞株由来のおよそ５０，０００細胞を上述の通りにプレーティングし、分化させた。分化した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し（未処理）、０．２７ｐＭ、０．８２ｐＭ、２．４７ｐＭ、７．４ｐＭ、２２．２ｐＭ、６６．６ｐＭ、または２００ｐＭいずれかのＢｏＮＴ／Ａ複合体を含む、新しい培地で置換した。６時間処理した後、細胞を洗浄し、毒素を加えずに一晩インキュベートした。２４時間処理した後、ＢｏＮＴ／Ａを含む培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳでそれぞれのウェルを濯ぐことによって細胞を洗浄した。洗浄した細胞を、新たに調製したＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００リシスバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、およびプロテアーゼ阻害剤）中で、絶えず撹拌しながら４℃で３０分間溶解することにより、回収した。残渣を沈殿させるために、溶解した細胞を４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【０２１５】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、およびＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的な補足抗体を含む固相担体を、実施例Ｖに記載したように調製した。ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて開裂ＳＮＡＰ−２５産物の存在を検出するために、実施例ＶＩに記載したようにプレートを処理し、データを回収して解析し、ＥＣ５０を算出した。Ｈ１ １．４細胞のＥＣ５０は約１．７ｐＭと推測され、Ｈ１細胞でのＥＣ５０が約８．７ｐＭであることと比較して、ＢｏＮＴ／Ａ取り込みについては、新たに作出したＨ１ １．４細胞株がＨ１細胞株よりも約５倍感受性が高いことを示している（同様の結果を示した２回の独立した実験の平均）。両方の細胞株におけるシグナルの最大値は同一であり、このことはＳＮＡＰ２５開裂に対して同様の効力を有することを意味している。感受性の上昇は特により低い濃度のＢｏＮＴ／Ａで顕著であり、０．２７ｐＭ濃度ではバックグラウンドに対して非常に粗いシグナルを生じるＨ１細胞と比較して、Ｈ１ １．４細胞はＢｏＮＴ／Ａに対して何倍も感受性が高い。ＦＧＦＲ３の過剰発現をα−ＦＧＦＲ３抗体ｓｃ−１２３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）を用いたウエスタンブロットによって確認した。
【０２１６】
実施例ＶＩＩＩ
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基に自由なカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合する、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の開発。
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができる、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体をどのように作成したかを説明する。
【０２１７】
１．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の生成。
ＳＮＡＰ−２５開裂産物に対するより高い特異性を有し、ＳＮＡＰ−２５開裂産物および／またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体へのより高い親和性を有する、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を開発した。加えて、ＦＤＡによって認可されたアッセイには、不変で、安定で、かつ、再生可能なα−ＳＮＡＰ−２５抗体源が好ましいため、モノクローナル抗体を単離するためのスクリーニングを行った。モノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体を開発するために、ＳＮＡＰ−２５抗原として、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有する１３残基ペプチドであるＣＤＳＮＫＴＲＩＤＥＡＮＱＣＯＯＨ（配列番号３８）を設計した。このペプチドは、柔軟なリンカー領域、および、カルボキシル化Ｃ末端グルタミン（配列番号３８）を有するヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号５）のＫＬＨおよびアミノ酸１８６〜１９７と共役するためのＮ末端システイン残基を含む。適切に選択した、エピトープ特異性の制御を提供する独特なペプチド配列に対するモノクローナル抗体の生成は、近縁のアイソフォームのプール間のタンパク質の特定の亜集団の同定を可能にする。Ｂｌａｓｔ検索により、このペプチドがＳＮＡＰ−２５のみに対して高い相同性を有し、かつ、神経細胞におけるその他のいずれのタンパク質ともほとんど交差反応しないことが明らかになった。疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可撓性のある領域、および好ましい二次構造、並びに続く特定の配向および選択したペプチド配列の表出を決定するためのコンピューターアルゴリズムを用いて、配列をまた、注意深く精査した。ペプチドを合成し、免疫原性を高めるために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共役させた。６匹のＢａｌｂ／ｃマウスをこのペプチドを用いて免疫し、約８週間における３回の免疫化の後、試験のためにマウスから採血した。血液を４℃で６０分間インキュベートすることによって凝固させた。細胞残渣を沈殿させるために、凝血塊を１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた血清試料を５０μＬに懸濁し、使用まで−２０℃で保存した。
【０２１８】
本明細書に開示されたその他のＳＮＡＰ−２５抗原に基づいた類似の方法が、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の開発に用いられる。例えば、配列番号４５のＳＮＡＰ−２５抗原を配列番号３８のＳＮＡＰ−２５抗原の代わりにＫＬＨに共役させることができる。別の実施例としては、配列番号３８のＳＮＡＰ−２５抗原由来のヒトＳＮＡＰ−２５の１８６〜１９７番目のアミノ酸を配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号１４７、または配列番号１４８で置換することができる。
【０２１９】
２．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在のスクリーニング。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在を決定するために、抽出したマウス血清を用いて、比較ＥＬＩＳＡおよび細胞を用いた開裂アッセイを行った。比較ＥＬＩＳＡ用に、配列番号４８のＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７、および配列番号４９のＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６の、２つの融合タンパク質を構築した。ＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７は、配列番号５の１３４〜１９７番目のアミノ酸を含むＳＮＡＰ−２５ペプチドにアミノ末端によって結合する、配列番号５０の天然にビオチン化した１６アミノ酸のＢｉｒＡペプチドを含む。ＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６は、配列番号５の１３４〜２０６番目のアミノ酸を含むＳＮＡＰ−２５ペプチドにアミノ末端によって結合する、配列番号５０の天然にビオチン化した１６アミノ酸のＢｉｒＡペプチドを含む。１０μｇ／ｍＬ濃度のＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７およびＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６のこれら２つの基質を１ｘＰＢＳ中に懸濁した。およそ１００μＬの適した基質溶液を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートすることにより、ＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７およびＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６を個別のプレート上にコーティングした。洗浄したプレートを、１：１０〜１：１００に希釈した免疫した６匹のマウス（マウス１、マウス２、マウス３、マウス４、マウス５、およびマウス６）のうちの１匹由来の抗体を含む血清を含む１ｘＴＢＳに含まれる０．５％ ＢＳＡ中で３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体でプロービングしたプレートを、２００μＬ ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回、それぞれの回につき５分間洗浄した。洗浄したプレートを、１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに共役したヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として含む１ｘＴＢＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体をプロービングしたプレートを、２００μＬ ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回洗浄した。標識したＳＮＡＰ−２５産物の発色の検出をＩｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いた発色の検出によって可視化した。ＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７でコーティングしたプレートでは黄色の発色が見られ、ＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６をコーティングしたプレートでは見られなかったことは、α−ＳＮＡＰ−２５抗体が主にＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を認識することを意味した。結果は、免疫化に用いられた６匹のマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３、およびマウス４）がより高い力価を有し、かつ、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対してより特異性が高いことを示した。
【０２２０】
これらの結果をＥＬＩＳＡ軽鎖活性アッセイを用いて確認した。およそ１００μＬの以下の基質溶液を添加することにより、９６ウェルＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を調製した。Ａ〜Ｃ列を、１２種類の異なる濃度のＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７、１００μＬでコーティングした；Ｄ〜Ｈ列を、１０μｇ／ｍＬのＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６、１００μＬでコーティングした。基質溶液を吸引し、２００μＬ ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回濯ぐことにより、プレートを洗浄した。ＢｏＮＴ／Ａインキュベーションバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％ ウシ胎仔血清、１０μＭ ＺｎＣｌ２、１０ｍＭ ジチオトレイトール）中、３７℃で２０分間、ＢｏＮＴ／Ａ希釈液を前もって還元し、１００μＬの前もって還元したＢｏＮＴ／Ａを基質をコーティングプレート上に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。ＢｏＮＴ／Ａインキュベーションバッファーを吸引し、２００μＬ ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのプレートを３回濯ぐことにより、ＢｏＮＴ／Ａで処理したプレートを洗浄した。洗浄したプレートを、１：１０〜１：１００に希釈した試験する抗体を含む血清を含む１ｘＴＢＳに溶解した０．５％ ＢＳＡ中、３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体でプロービングしたプレートを２００μＬ ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回、それぞれの回につき５分間洗浄した。洗浄したプレートを、１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに共役させたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として含む１ｘＴＢＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体でプロービングしたプレートを、２００μＬ ＴＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回洗浄した。標識したＳＮＡＰ−２５産物の発色の検出は、Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いた発色の検出の可視化によって行った。免疫化した全てのマウス（マウス１、マウス２、マウス３、マウス４、マウス５、およびマウス６）由来の抗体を含む血清を用いることにより、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物の存在に対応する黄色の発色がＢｏＮＴ／Ａで処理した試料においては見られたが、未処理の対照においては見られなかった。従って、比較ＥＬＩＳＡ解析は免疫化に用いたマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３、およびマウス４）がより高い力価を有し、かつ、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対してより高い特異性を有することを示した。
【０２２１】
細胞を用いた開裂アッセイ用に、好適な密度のＰＣ１２細胞を、３ｍＬの適した血清培地（表１）を入れた６０ｍｍ２の組織培養プレート中にプレーティングした。細胞を、細胞が適当な密度に達するまで、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた。室温で５分間インキュベートした１５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＩＮＥ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）血清使用量低減培地を、１０μｇのｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクト（配列番号５１）を含む２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）血清使用量低減培地に添加することにより、５００μＬのトランスフェクション溶液を調製した。ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトは、そのプロモーターエレメントが、配列番号５２のＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖をコードしているポリヌクレオチドに機能的に連結しているｐＱＢＩ−２５発現ベクター（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む。このトランスフェクション混合液を室温でおよそ２０分間インキュベートした。培地を新しい添加していない培地で置換し、５００μＬのトランスフェクション溶液を細胞に添加した。細胞をその後、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でおよそ６〜１８時間インキュベートした。実施例ＩＩに記載したように、細胞を洗浄し、回収した。開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部を、１：１，０００に希釈した抗体を含む血清を一次抗体として、および１：２０，０００に希釈したマウスα−ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として使用した以外は実施例ＩＩに記載したようにウエスタンブロットによって解析した。３匹のマウス（マウス２、マウス３、およびマウス４）由来の抗体を含む血清を用いて、ＢｏＮＴ／Ａで処理した試料においては、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物に対応する単一のバンドが検出されたが、未処理の対照においては検出されなかった。従って、細胞を用いた開裂アッセイは、免疫化に用いたマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３、およびマウス４）がより高い力価を有し、かつ、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対してより高い特性性を有することを示した。
【０２２２】
３．ハイブリドーマの作出。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体に選択的に結合することができるＳＮＡＰ−２５抗原を生産するハイブリドーマを作出するために、最終的な「追加」免疫化の３日間後に、マウス２から脾臓を摘出し、標準的なハイブリドーマプロトコールを用いて、脾臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３ Ａｇ８．６５３と融合させた。これらの細胞を５つの９６ウェルプレートにプレーティングし、ＨＡＴ培地を用いて雑種を選別した。融合後８〜１４日間以内に、ＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７およびＢＩＲＡ−ＨＩＳ ＴＡＧ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６ペプチドでコーティングした２枚の個別のプレートを用いた比較ＥＬＩＳＡにより、およそ４８０の親クローンの一次スクリーニングを行った。比較ＥＬＩＳＡは、開裂したＳＮＡＰ−２５１９７に特異的な抗体を生産するハイブリドーマを同定するための迅速なスクリーニングを提供した。上から１８のクローンを、上述の細胞を用いた開裂アッセイおよびＬＣ／Ａをトランスフェクションした細胞の免疫染色を用いたさらなるスクリーニングに用いた（表１８）。
【表１０】
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【０２２３】
クローン１Ｄ３、１Ｇ１０、２Ｅ２、３Ｃ１、３Ｃ３、および３Ｅ８によって生産された馴化培地がＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物とＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質との比１９７／２０６が少なくとも４：１である、好ましい結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んだことから、クローン１Ｄ３、１Ｇ１０、２Ｅ２、３Ｃ１、３Ｃ３、および３Ｅ８を限界希釈法によってさらにクローニングし、細胞を用いた開裂アッセイおよびＧＦＰ−ＬＣ／Ａを用いてトランスフェクションしたＰＣ１２細胞の免疫染色によってＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を検出した。同様に、クローン２Ｃ９、２Ｆ１１、３Ｇ２、４Ｄ１および４Ｇ６よって生産される馴化培地がＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質とＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物との比１９７／２０６が少なくとも１．５：１の好ましい結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んだことから、クローン２Ｃ９、２Ｆ１１、３Ｇ２、４Ｄ１および４Ｇ６を限界希釈法によってさらにクローニングし、細胞を用いた開裂アッセイを用いてＳＮＡＰ−２５２０６−開裂していない基質を検出した。比較ＥＬＩＳＡ、細胞を用いた開裂、および、それらの親和性および特異性を確認するための免疫染色を用いてこれら単一細胞由来のクローンを再度スクリーニングし、標準的な方法を用いて抗体のアイソタイプを分類した。クローン１Ｄ３Ｂ８（ＩｇＭ．ｋ）、１Ｇ１０Ａ１２（ｌｇＧ３．ｋ）、２Ｃ９Ｂ１０（ｌｇＧ３．ｋ）、２Ｅ２Ａ６（ｌｇＧ３．ｋ）、２Ｆ１１Ｂ６（ＩｇＭ．ｋ）、３Ｃ１Ａ５（ｌｇＧ２ａ．ｋ）、および３Ｃ３Ｅ２（ｌｇＧ２ａ．ｋ）から腹水を生産した。クローン３Ｅ８はクローニングの過程の最中に抗体生産を停止したため、それ以上評価することができなかった。
【０２２４】
４．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合特異性の評価。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合特異性を評価するために、細胞を用いた活性アッセイ、免疫細胞化学および免疫沈降によるＳＮＡＰ−２５開裂産物の検出において、クローン１Ｄ３Ｂ８、１Ｇ１０Ａ１２、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、２Ｆ１１Ｂ６、３Ｃ１Ａ５、および３Ｃ３Ｅ２由来の腹水を用いた。
【０２２５】
細胞を用いた活性アッセイ用に、ウエスタンブロット解析により、α−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水の、開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物を検出する能力を解析することによって結合特異性を決定した。好適な密度のＰＣ１２細胞を、３ｍＬの適した培地を入れた６０ｍｍ２組織培養プレート中にプレーティングし、細胞が適当な密度に達するまで３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させ、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクト（トランスフェクションしていない細胞）を含まないトランスフェクション溶液またはｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクト（トランスフェクションした細胞）を含むトランスフェクション溶液のいずれかを用いて上述した通りにトランスフェクションした。実施例Ｉに記載したように細胞を洗浄し、回収した。開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物両方の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部を、１：１００に希釈したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を含む腹水を一次抗体として、および１：２０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに共役したα−マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として使用した以外は実施例Ｉに記載したようにウエスタンブロットによって解析した。加えて、３種類の市販されているマウスα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を試験した。製造業者によると開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の両方を検出する、α−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＳＭＩ−８１（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、製造業者の推奨に従って１５，０００倍希釈で使用した。製造業者によると開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の両方を検出するα−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＭＣ−６０５０（Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ、ＮＶ）を、製造業者の推奨に従って１：１００希釈で使用した。製造業者によると開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物のみを検出するα−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＭＣ−６０５３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ、ＮＶ）を、製造業者の推奨に従って１：１００希釈で使用した。
【０２２６】
表１９は、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物のみを検出したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水を示す。細胞を用いた開裂アッセイは、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、および３Ｃ３Ｅ２から生産された腹水がＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較した場合に、この開裂産物を選択的に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成することを示した。市販の抗体であるＳＭＩ−８１はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質を検出したが、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物をわずかにしか認識しなかった（表１９）。驚くことに、市販の抗体であるＭＣ−６０５０はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質のみしか検出せず、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を認識しなかった（表１９）。さらに驚くことに、市販の抗体であるＭＣ−６０５０はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質のみしか認識せず、この抗体がＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を選択的に検出するという製造業者による広告にも関わらず、ＳＮＡＰ−２５−Ｉ９７開裂産物を認識しなかった（表１９）。従って、この解析は、１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、および３Ｃ３Ｅ２はＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への好適な選択性を示すが、１Ｇ１０Ａ１２および２Ｆ１１Ｂ６はそうではないことを示す。加えて、市販の抗体であるＳＭＩ−８１、ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３の全てがＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物の選択的な検出に失敗したことから、本明細書で開示した免疫を用いた方法には適さない。
【０２２７】
免疫細胞化学解析については、免疫染色によってα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水の、開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５−Ｉ９７産物を検出する能力を解析することにより、結合特異性を決定した。例えば、Ｅｓｔｅｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ、Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（９）：３２０８−３２１３（２００４）を参照のこと。好適な密度のＰＣ１２細胞をプレーティングし、生育させ、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトを含まないトランスフェクション溶液（トランスフェクションしていない細胞）またはｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトを含むトランスフェクション溶液（トランスフェクションした細胞）のいずれかを用いて、上述したようにトランスフェクションした。１ｘＰＢＳ中で細胞を洗浄し、５ｍＬのＰＡＦ中、室温で３０分間固定した。固定した細胞をリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、５ｍＬの１ｘＰＢＳに溶解した０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）中でインキュベートし、１ｘＰＢＳで洗浄し、５ｍＬのメタノール中、−２０℃で６分間透過処理を行った。透過処理を行った細胞を５ｍＬの１００ｍＭ グリシン中、室温で３０分間ブロッキングし、１ｘＰＢＳ中で洗浄し、１ｘＰＢＳに溶解した５ｍＬの０．５％ ＢＳＡ中、室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキングした細胞を１ｘＰＢＳ中で洗浄し、１：１０に希釈した試験するクローンハイブリドーマ細胞株由来の腹水を含む１ｘＰＢＳに溶解した０．５％ ＢＳＡ中、室温で２時間インキュベートした。一次抗体でプロービングした細胞を１ｘＰＢＳ中で３回、それぞれの回につき５分間洗浄した。洗浄した細胞を１：２００希釈したＡＬＥＸＡ（登録商標）ＦＬＵＯＲ５６８に共役したヤギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＧ、重鎖および軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を二次抗体として含む１ｘＰＢＳ中、室温で２時間インキュベートした。二次抗体でプロービングした細胞を１ｘＰＢＳ中で３回、それぞれの回につき５分間洗浄した。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）封入培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）にマウントし、カバーグラスを乗せることにより、顕微鏡実験用に洗浄した細胞を調製した。適したレーザーの設定を用いたＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡により、シグナル検出画像を得た。表１９は、ＳＮＡＰ−２５１９７−開裂産物を特異的に検出したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水を示す。免疫細胞化学解析は、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、および３Ｃ３Ｅ２由来の腹水は、ＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較した場合に、この開裂産物を主に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物に対して高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクロ��ナル抗体を合成することを示した。
【０２２８】
免疫沈降解析用に、精製されたα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体であるプロテインＡ（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の、開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５−Ｉ９７産物を沈殿させる能力を解析することにより、結合特異性を決定した。例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ８ Ｓｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｐｐ．３０９−３１１、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、上記、１９９８ａを参照のこと。好適な密度のＰＣ１２細胞をプレーティングし、生育させ、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ発現コンストラクトを含むトランスフェクション溶液（対照細胞；配列番号５３）またはｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトを含むトランスフェクション溶液（実験細胞）のいずれかを用いて、上述したようにトランスフェクションした。ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ発現コンストラクトは、そのプロモーターエレメントが配列番号５４のＧＦＰをコードしているポリヌクレオチドに機能的に連結している発現ベクターを含む。一晩インキュベートした後、成長培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳを用いてそれぞれのウェルを濯ぐことによって細胞を洗浄した。細胞を回収するために、ＰＢＳを吸引し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＤＴ、１０％ グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）および１ｘＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む免疫沈降リシスバッファーを添加し、４℃で一時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。細胞残渣を除去するために、溶解した細胞を３、０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を清潔なチューブに移し、タンパク質濃度がおよそ１ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。およそ５μｇの精製したモノクローナル抗体を０．５ｍＬの希釈した上清に添加し、４℃で２時間インキュベートした。一次抗体をインキュベートした後、およそ５０μＬの固定化プロテインＧ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を希釈した上清に添加し、４℃で１時間インキュベートした。０．５ｍＬの免疫沈降リシスバッファーを添加し、タンパク質Ｇを沈殿させるために３００ｘｇ、４℃で１分間遠心分離し、上清を移すことにより、インキュベートした上清を３回、それぞれの回につき３０分間洗浄した。洗浄した後、沈殿物を３０μＬの１ｘＳＤＳローディングバッファー中に再懸濁し、試料を９５℃まで５分間加熱した。開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質および開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の両方の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部を、１：１，０００に希釈したα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体血清（実施例ＩＶを参照）を一次抗体として用い、１：２０，０００に希釈したウサギα−ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ���ＩＬ）を二次抗体として用いた以外は実施例Ｉに記載したように、ウエスタンブロットによって解析した。表１９は免疫沈降解析によってＳＮＡＰ−２５１９７−開裂産物を特異的に沈降させたα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水を示す。免疫沈降解析は、クローン２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５由来の腹水が、ＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較した場合にこの開裂産物を主に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成することを示した。
【表１１】
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【０２２９】
５．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合親和性の評価。
ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物またはＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質のいずれかに対して高い結合特異性を示すα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合親和性を決定するために、結合親和性アッセイを、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭ５）センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたＢＩＡＣＯＲＥ ３０００装置上で行った。解析は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０を含むＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用い、２５℃、流速１０μＬ／分で行った。標準的なアミンカップリングを用い、ＣＭ５センサーチップの表面に配列番号５のアミノ酸１３４〜１９７（ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７）または配列番号５のアミノ酸１３４〜２０６（ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６）を含むＳＮＡＰ−２５ペプチドを共有結合させた。簡潔に説明すると、０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの混合液を７分間注入することによってＣＭ５チップを活性化し；その後ＳＮＡＰ−２５ペプチドを、２０分かけて流速１０μＬ／分で１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中に注入し；そして１Ｍ エタノールアミン塩酸塩、ｐＨ８．５を７分間注入することにより反応していないコハク酸イミドエステルをブロッキングした。チップ上の固定化量のＳＮＡＰ−２５１３４−１９７またはＳＮＡＰ−２５１３４−２０６は、反応単位で１００〜１５０の上昇（約０．１０〜０．１５ｎｇ／ｍｍ２）を反映した。結合時間を１０分、解離時間を２０分として、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、および３Ｃ３Ｅ２から生産した腹水または精製したモノクローナル抗体を含む抗体試料、並びに市販されているα−ＳＮＡＰ−２５抗体をＣＭ５チップの表面に流した。１０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を流速１５μＬ／分で１分間注入することにより、解析の間で表面を再生した。センサーグラム曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを用いて１：１の動的結合モデルにフィッティングさせた。
【０２３０】
結果は、２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５の両方が、ＳＮＡＰ−２５開裂していない基質よりも開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物に高い特異性を有することを示す（表２０）。ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３の結合親和性と比較した場合、これら市販の抗体と比べ、１Ｄ３Ｂ６はおよそ１０倍高いＳＮＡＰ−２５開裂産物に対する平衡解離定数を有した（表２０）。興味深いことに、これら市販の抗体と比べて、２Ｅ２Ａ６はわずかに低いＳＮＡＰ−２５開裂産物対する平衡解離定数のみを有した（０．４０５ｎＭ対０．４９７および０．５０８）（表２０）。これら市販のα−ＳＮＡＰ−２５抗体はいずれもＳＮＡＰ−２５開裂産物を選択的に認識せず（表１９）、それら選択性の達成に部分的には問題のある、０．５ｎＭよりも低い平衡解離定数を示した。同様に、ＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３の結合親和性と比較した場合、２Ｅ２Ａ６は少なくとも約１倍遅いオフレート／解離定数（６．７４ｘ１０−５対８．８２ｘ１０−４ｓ−１および１．１８ｘ１０−３ｓ−１）（表２０）を有した。このことはさらに、ＳＮＡＰ−２５開裂産物に対する選択的な結合を達成するには部分的に問題のある、約８．８２ｘ１０−４よりも低いオフレート／解離定数を示すことを示唆する。この結果は、５．７８ｘ１０−５ｓ−１のオフレート／解離定数を有した１Ｄ３Ｂ８の結果と一致する（表２０）。
【表１２】
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【０２３１】
６つの異なる抗体を比較するために、ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアからのプログラムを用いて、それぞれのオンレート（ｋａ）およびオフレート（ｋｄ）を標準化した。オンレートの比較用に、まず最初に再生部分および注入によるスパイク状のノイズを除去することによってデータを個々にトリミングし、その後０〜１００スケールに標準化した。オフレートの比較については、注入のストップ／トップポイントまでデータを標準化した。この解析は、２Ｃ９Ｂ１０がその他の抗体よりもかなり遅いオンレートを有し（図３Ａ）、ＭＣ−６０５３がその他の抗体よりかなり早いオフレート（解離）を有したことを示した（図３Ｂ）。ＭＣ−６０５３の早いオフレートは、洗浄の工程においてこの抗体が基質抗原への結合を維持することが難しいため、この抗体が本明細書において開示した方法においてはうまく機能しないことを示す。
【０２３２】
６．単離したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体からのエピトープのシークエンシング。 ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができる単離したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のエピトープを決定するために、ハイブリドーマ１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２由来のα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖をコードしているポリヌクレオチド分子のシークエンシングを行った。標準的なプロトコールを用いてそれぞれのハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、精製し、オリゴｄＴ抗センスプライマーまたは遺伝子特異的（マウスＩｇＧ１ ＣＨおよびカッパＣＬ）抗センスプライマーのいずれかを用いてｃＤＮＡへと逆転写した。抗体のアイソタイプを決定するために、ｃＤＮＡ生産後、マウスおよびヒト定常ドメイン特異的プライマーを用いてＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した。ｃＤＮＡからの可変ドメインを増幅するために、ＶＨおよびＶＬ縮重プライマーを用いた。５’ＲＡＣＥ用に、ホモポリマーｄＣＴＰテイルをｃＤＮＡの３’末端に付加した。その後、オリゴｄＧセンスプライマーおよび遺伝子特異的（ＣＨ／ＫＣ）抗センスプライマーを用いて重鎖および軽鎖を増幅した。シグナルペプチド、可変ドメインおよび定常ドメインの配列に含まれるＰＣＲ産物は抗センスプライマー次第であった。小断片を除去するためにＰＣＲ産物をゲルを用いて精製しそしてシークエンシング用に平滑またはＴＡベクターにクローニングした。それぞれの鎖につき、５つの個別のクローンをシークエンシングし、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖およびコンセンサス配列のアライメントを作成した。ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を決定する方法は、引用することによりそのそれぞれの全文が本明細書に組み入れられる、例えば、Ｒｏｇｅｒ Ａ． Ｓａｂｂａｄｉｎｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌｉｐｉｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ，米国特許第２００７／０２８１３２０号；およびＰｅｔｅｒ Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｔｙｐｅ Ａ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ａｓ Ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ， ６５（９） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ３７４３−３７５２，に記載される。加えて、抗体の可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖をシークエンシング、およびＣＤＲ領域を同定する、市販のサービスもまた使用できる。例えば、Ｆｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄを参照のこと。
【０２３３】
本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むポリヌクレオチド配列は以下の通りである：１Ｄ３Ｂ８ ＶＨ（配列番号７１）、２Ｃ９Ｂ１０ ＶＨ（配列番号７３）、２Ｅ２Ａ６ ＶＨ（配列番号７５）、３Ｃ１Ａ５ ＶＨ（配列番号７７）、３Ｃ３Ｅ２ ＶＨ変異体１（配列番号７９）、３Ｃ３Ｅ２ ＶＨ変異体２（配列番号８１）、３Ｃ３Ｅ２ ＶＨ変異体３（配列番号１４９）、１Ｄ３Ｂ８ ＶＬ（配列番号８３）、２Ｃ９Ｂ１０ ＶＬ（配列番号８５）、２Ｅ２Ａ６ ＶＬ（配列番号８７）、３Ｃ１Ａ５ ＶＬ（配列番号８９）、および３Ｃ３Ｅ２ ＶＬ（配列番号９１）。本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むアミノ酸配列は以下の通りである：１Ｄ３Ｂ８ ＶＨ（配列番号７２）、２Ｃ９Ｂ１０ ＶＨ（配列番号７４）、２Ｅ２Ａ６ ＶＨ（配列番号７６）、３Ｃ１Ａ５ ＶＨ（配列番号７８）、３Ｃ３Ｅ２ ＶＨ変異体１（配列番号８０）、３Ｃ３Ｅ２ ＶＨ変異体２（配列番号８２）；３Ｃ３Ｅ２ ＶＨ変異体２（配列番号１５０）、１Ｄ３Ｂ８ ＶＬ（配列番号８４）、２Ｃ９Ｂ１０ ＶＬ（配列番号８６）、２Ｅ２Ａ６ ＶＬ（配列番号８８）、３Ｃ１Ａ５ ＶＬ（配列番号９０）、および３Ｃ３Ｅ２ ＶＬ（配列番号９２）。ハイブリドーマ１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、および３Ｃ３Ｅ２から生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲドメインを含むアミノ酸配列を表２１に示す。
【表１３】
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【０２３４】
本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨＣＤＲドメイン変異体を含むアミノ酸配列の非限定的な例としては、１Ｄ３Ｂ８のＶＨＣＤＲ１変異体、配列番号１１８；２Ｃ９Ｂ１０のＶＨ ＣＤＲ１変異体、配列番号１１９、２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５ ＶＨ；３Ｃ１Ａ５ ＶＨおよび３Ｃ３Ｅ２変異体３のＶＨ ＣＤＲ１変異体、配列番号１２０；１Ｄ３Ｂ８および２Ｅ２Ａ６のＶＨＣＤＲ２変異体、配列番号１２１；２Ｃ９Ｂ１０および３Ｃ１Ａ５ ＶＨのＶＨ ＣＤＲ２変異体、配列番号１２２；３Ｃ１Ａ５ ＶＨおよび３Ｃ３Ｅ２変異体３のＶＨ ＣＤＲ２変異体、配列番号１２３；１Ｄ３Ｂ８および２Ｃ９Ｂ１０のＶＨＣＤＲ３変異体ＭＤＹ；２Ｅ２Ａ６および３Ｃ１Ａ５ ＶＨのＶＨ ＣＤＲ３変異体ＭＧＹ；および３Ｃ１Ａ５ ＶＨおよび３Ｃ３Ｅ２変異体３のＶＨＣＤＲ３変異体、配列番号１２４が挙げられる。本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＬＣＤＲドメイン変異体を含むアミノ酸配列の非限定的な例としては、１Ｄ３Ｂ８のＶＬ ＣＤＲ１変異体、配列番号１２５；２Ｃ９Ｂ１０のＶＬＣＤＲ１変異体、配列番号１２６；２Ｅ２Ａ６のＶＬ ＣＤＲ１変異体、配列番号１２７；３Ｃ１Ａ５のＶＬ ＣＤＲ１変異体、配列番号１２８；３Ｃ３Ｅ２のＶＬＣＤＲ１変異体、配列番号１２９；１Ｄ３Ｂ８のＶＬ ＣＤＲ２変異体ＫＶＳ；２Ｃ９Ｂ１０のＶＬ ＣＤＲ２変異体ＮＡＫ；２Ｅ２Ａ６のＶＬＣＤＲ２変異体ＬＶＳ；３Ｃ１Ａ５のＶＬ ＣＤＲ２変異体ＹＡＴ；および３Ｃ３Ｅ２のＶＬ ＣＤＲ２変異体ＹＡＳが挙げられる。
【０２３５】
実施例ＩＸ
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基に自由なカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の開発。
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体をどのように作成したかを説明する。
【０２３６】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物のＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を開発するために、ＳＮＡＰ−２５開裂産物抗原として１０残基のペプチドＣＧＧＧＲＩＤＥＡＮＱ（配列番号４６）を設計した。このペプチドは、ＫＬＨに共役するＮ末端システイン残基、ヒトＳＮＡＰ−２５の１９１〜１９７番目のアミノ酸（配列番号５）に連結したＧ−ｓｐａｃｅｒ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｐａｃｅｒ（ＧＧＧ）およびカルボキシル化Ｃ末端グルタミンを含む。Ｂｌａｓｔ検索により、このペプチドがＳＮＡＰ−２５のみに対して高い相同性を有し、神経細胞におけるその他のタンパク質とはほぼ交差反応しないことが明らかになった。疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可撓性のある領域、および好ましい二次構造、それに続く特定の配向、および選択したペプチド配列の表出を決定するために、コンピューターアルゴリズムを用いて、配列を注意深く精査した。免疫原性を高めるために、ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共役させた。動物を免疫する前に、細胞溶解物中に存在するタンパク質に対する免疫活性を有さない動物を同定するために、ウエスタンブロットにおいて候補細胞株由来の細胞溶解物に対してナイーブなウサギを最初にスクリーニングした。このペプチドを用いて、スクリーニングを行う前の２匹のウサギを免疫し、約８週間中３回の免疫化の後に、試験のためにウサギから採血した。血液を凝固させるために、４℃で６０分間インキュベートした。細胞残渣を沈殿させるために、凝血塊を１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた血清試料を５０μＬずつにわけ、使用まで−２０℃で保存した。
【０２３７】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物のＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を開発するために、本明細書において開示したその他のＳＮＡＰ−２５抗原に基づく同様の方法を用いた。例えば、配列番号４７のＳＮＡＰ−２５抗原を、配列番号４６のＳＮＡＰ−２５抗原の代わりにＫＬＨに共役させることができる。別の例として、配列番号３８のＳＮＡＰ−２５抗原由来のヒトＳＮＡＰ−２５の１９１〜１９７番目のアミノ酸を、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号４４で置換することができる。
【０２３８】
２．α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の存在のスクリーニング。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の存在を決定するために、実施例ＶＩＩＩに記載したように、抽出したウサギ血清を用いた比較ＥＬＩＳＡおよび細胞を用いた開裂アッセイを行った。両方のウサギから得られた血清は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を含んだ。α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体をＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３と表した。
【０２３９】
３．α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の精製。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を精製するために、ウサギ血清から得られたＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３抗体を配列番号４６のＳＮＡＰ−２５抗原を含むアフィニティカラムを用いて精製した。
【０２４０】
４．α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の結合特異性の評価。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の結合特異性を評価するために、精製したＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を、実施例ＶＩＩＩに記載したような開裂産物を検出するための細胞を用いた活性アッセイ、免疫細胞化学および免疫沈降に用いた。細胞を用いた開裂アッセイ、免疫細胞化学解析および免疫沈降解析の全ては、ＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体は開裂していないＳＮＡＰ−２５と交差反応しないことを示した。従って、ＮＴＰ２２およびＮＴＰ２３両方は、ＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較してこの開裂産物を主に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への高い結合特異性を有する。抗原に対する親和性は、実施例ＶＩＩＩに記載したように、ＳＰＲを用いてＢｉＡｃｏｒｅで決定することもできる。
【０２４１】
別段の指定のない限り、明細書および請求項で用いられた構成要素の量、分子量、反応条件などの特性などを表す全ての数は、「約」という用語により、全ての例において調節されることを理解されたい。従って、反対に指定のない限り、明細書および添付の請求項において示した数値パラメーターは、本発明によって得ることが目的とされる所望の性質に依存して多様になり得る、近似値である。少なくとも、請求項の範囲の等価物の原則の適用を限定する意図でなく、それぞれの数値パラメーターは、少なくとも報告された有効数字の数を考慮して、かつ、一般的な丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲において示している数値の範囲およびパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において示した数値は、できるだけ正確に報告した。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験した測定においてみられる標準誤差からどうしても生じる、特定の誤差を本質的に含む。
【０２４２】
別段の指定のない限り、本明細書においては、本発明を説明する文脈で（特に以下の請求項における文脈で）用いられる「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および類似の指示対象は単数および複数の両方を含むように解釈され、または文脈からそうでないことが明白である。本明細書における値の範囲の詳細は単に、その範囲内にあるそれぞれ別個の値を個別に言及する、簡潔な方法を提供する目的のためである。本明細書において別段の指定のない限り、それぞれの個別の値は、本明細書において個別に記載された通りに本明細書に組み込まれる。本明細書において別段の指定のない限り、本明細書において記載した全ての方法は任意の好適な方法によって実施することができ、またはそうでないことが文脈から明白である。本明細書において提供した、いずれのおよび全ての実施例、または例示的な言葉（例えば「など」）の使用は単に、本発明をより明確にする目的のためだけのものであり、請求項に記載しない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の実施において必須の、請求項に記載していないいずれの要素を示す言葉は、本明細書においては記載されていないと解釈されたい。
【０２４３】
本明細書で開示した発明の別の要素、または実施形態の分類は、限定としては解釈されない。それぞれの群のメンバーは個別に、またはその群のその他のメンバー若しくは本明細書に見られるその他の要素との任意の組み合わせにおいて記載され、および請求され得る。便宜上および／または特許権の理由から、ある群の１つ以上のメンバーが、群に含まれるまたは群から除かれてもよい。そのような任意の包含または除去が生じた場合には、本明細書はその群を変更した群に含まれると見なし、そのため、添付の請求項において用いた全てのマーカッシュ群について記載した詳細を満たす。
【０２４４】
発明者らに既知の本発明の実施における最適な方法を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書において記載した。当然のことながら、前述の明細書を読むことにより、これら記載した実施形態の変異型が当業者には明らかになるだろう。熟練した技術者は、それら変異型を適した形態として用いることを発明者らは予期し、本明細書に記載した方法以外の方法で本発明が実施されることを発明者らは意図する。従って、本発明は、適用法によって許可される通り、添付の請求項に記載した対象物の全ての変更および等価物を含む。さらに、本明細書において別段の指定のない限りまたは文脈からそうでないことが明らかでない限り、全ての可能な変異型における上述した要素のいずれの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【０２４５】
本明細書において開示した特定の実施形態は、「からなる」または「本質的にからなる」という言葉を使用する請求項においてはさらに限定され得る。請求項において用いられた場合、分野としてまたは補正に加えられたとしても、「からなる」という移行句は、その請求項において指定されていないいずれの要素、工程、または成分を除外する。「本質的にからなる」という移行句は、指定した材料または工程、並びに基本的なおよび新規の特徴に物質的に影響を及ぼさない材料または工程に、発明の範囲をに制限する。請求項に記載された本発明の実施形態は、本質的にまたは明確に記載され、本明細書において使用可能である。
【０２４６】
さらに、本明細書を通じて、参考文献として数多くの特許および発行された印刷物を引用した。上記で引用したそれぞれの参考文献および発行された印刷物は、個別のその全文が引用により本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
終わりに、本明細書で開示した本発明の実施形態は、本発明の原理を説明するものであることを理解されたい。用いられる可能性のあるその他の変更もまた、本発明の範囲に含まれる。従って、非限定的な一例として、本発明の別の形態が、本明細書の教えに従って用いられる可能性がある。従って、本発明は、示しおよび記載したように正確には限定されない。
【０２４８】
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０２４９】
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０２５０】
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【０２５１】
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【表２４】
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【表２５】
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【０２５２】
【表２６】
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【表２７】
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【０２５３】
【表２９】
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【表３０】
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【表３４】
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【表３５】
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【表４０】
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【０２５７】
【表４１】
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【表４３】
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【表４４】
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【表７７】
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【表７９】
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【０２７０】
【表８０】
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【表８１】
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【表８４】
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【表８７】
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【０２７３】
【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【０２７４】
【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【０２７５】
【表９５】
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【表９８】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０４】
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【表１０７】
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【０２８０】
【表１１０】
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【表１１３】
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【表１１４】
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【表１１５】
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【０２８２】
【表１１６】
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【表１１７】
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【表１１９】
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【表１２０】
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【表１２４】
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【表１２５】
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【表１２６】
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【表１２７】
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【０２８６】
【表１２８】
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【表１２９】
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【表１３０】
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【０２８７】
【表１３１】
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【表１３２】
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【表１３３】
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【０２８８】
【表１３４】
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【表１３５】
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【表１３６】
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【０２８９】
【表１３７】
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【表１３８】
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【表１３９】
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【０２９０】
【表１４０】
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【表１４１】
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【表１４２】
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【０２９１】
【表１４３】
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【表１４４】
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【表１４５】
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【０２９２】
【表１４６】
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【０２９３】
【表１４９】
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【表１５０】
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【表１５１】
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【表１５２】
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【表１５５】
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【表１５６】
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【表１５８】
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【表１５９】
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【表１６４】
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【表１６５】
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【表１６６】
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【０２９９】
【表１６７】
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【０３００】
【表１７０】
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【表１７１】
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【表１７２】
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【０３０１】
【表１７３】
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【表１８４】
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【０３０５】
【表１８５】
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【表１８６】
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【表１８７】
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【表１８９】
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【０３０７】
【表１９０】
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【表１９６】
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【０３０９】
【表１９７】
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【表１９９】
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【０３１０】
【表２００】
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【表２０１】
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【表２０２】
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【０３１１】
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【表２０６】
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【０３１３】
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【表２１１】
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【０３１４】
【表２１２】
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【表２１３】
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【表２１４】
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【０３１５】
【表２１５】
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【表２１６】
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【表２１７】
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【０３１６】
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【０３２０】
【表２３０】
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【表２３４】
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【表２３５】
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【０３２２】
【表２３６】
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【０３２３】
【表２３９】
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【表２４０】
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【表２４１】
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【０３２４】
【表２４２】
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【表２４３】
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【０３２５】
【表２４５】
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【表２４６】
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【表２４７】
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【０３２６】
【表２４８】
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【表２４９】
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【表２５０】
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【０３２７】
【表２５１】
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【表２５２】
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【表２５３】
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【０３２８】
【表２５４】
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【表２５５】
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【表２５６】
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【０３２９】
【表２５７】
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【表２５８】
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【表２５９】
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【０３３０】
【表２６０】
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【表２６１】
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【表２６２】
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【０３３１】
【表２６３】
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【表２６４】
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【表２６５】
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【０３３２】
【表２６６】
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【表２６７】
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【表２６８】
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【０３３３】
【表２６９】
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【表２７０】
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【表２７１】
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【０３３４】
【表２７２】
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【表２７３】
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【表２７４】
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【０３３５】
【表２７５】
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【表２７６】
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【表２７７】
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【０３３６】
【表２７８】
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【表２７９】
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【表２８０】
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【０３３７】
【表２８１】
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【表２８２】
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【表２８３】
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【０３３８】
【表２８４】
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【表２８５】
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【表２８６】
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【０３３９】
【表２８７】
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【表２８８】
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【表２８９】
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【０３４０】
【表２９０】
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【表２９１】
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【表２９２】
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【０３４１】
【表２９３】
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【表２９４】
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【表２９５】
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【０３４２】
【表２９６】
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【表２９７】
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【表２９８】
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【０３４３】
【表２９９】
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【表３００】
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【表３０１】
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【０３４４】
【表３０２】
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【表３０３】
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【表３０４】
2015077153.tif 000340
【０３４５】
【表３０５】
2015077153.tif 000341
【表３０６】
2015077153.tif 000342
【表３０７】
2015077153.tif 000343
【０３４６】
【表３０８】
2015077153.tif 000344
【表３０９】
2015077153.tif 000345
【表３１０】
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【図１Ａ】
2015077153.tif 000347
【図１Ｂ】
2015077153.tif 000348
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015077153.tif 000350
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2015077153.tif 000352
【図２Ｅ】
2015077153.tif 000353
【図３Ａ】
2015077153.tif 000354
【図３Ｂ】
2015077153.tif 000355
【配列表】
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