(57)【要約】【課題】  本発明は、脂質二重層で形成されるリポソームを用いてリポソームと相互作用をするペプチドの作製方法、及びその方法によって得られたリポソーム結合ペプチドを提供することを目的とする。【解決手段】  Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、中央部にリポソームの膜と結合するアミノ酸配列を有することを特徴とする、リポソーム結合ペプチドを提供する。また、リポソーム結合ペプチド作製用コンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；このコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてインビトロでcDNAディスプレイを作製するcDNAディスプレイ作製工程と；リポソーム作製工程と；リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、中央部にリポソームの膜と結合するアミノ酸配列を有することを特徴とする、10〜100アミノ酸から構成される、リポソーム結合ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドを構成するアミノ酸数は、25〜40であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものである、請求項１又は２に記載のリポソーム結合ペプチド。
配列表の配列番号１
Arg His Ser Lys Ser Leu Xaa Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号２
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Xaa Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile 
配列表の配列番号３
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser GlyIle Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
【請求項４】
前記配列番号１のペプチドが、配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム結合ペプチド。
配列表の配列番号４
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号５
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号６
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
【請求項５】
前記配列番号２のペプチドが、配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする、リポソーム結合ペプチド。
配列表の配列番号７
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Xaa Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
【請求項６】
５’側から３’側に向かって、プライマー領域１と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域と、プライマー領域２とを含む、リポソーム結合ペプチドの作製用コンストラクト。
【請求項７】
前記ランダム領域は、10〜100アミノ酸残基で構成され、Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、中央部にリポソームの膜と結合するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項６に記載のリポソーム結合ペプチド作製用コンストラクト。
【請求項８】
前記ランダム領域は、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７に記載のリポソーム結合ペプチド作製用コンストラクト。
【請求項９】
リポソーム結合ペプチドの作製方法であって、
請求項６〜８のいずれかに記載のコンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；
前記コンストラクト作製工程で作製されたコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてペプチド−リンカー−mRNA/cDNAをインビトロで作製するcDNAディスプレイ作製工程と；
所望の直径を有するリポソームを作製するリポソーム作製工程と；
前記cDNAディスプレイ作製工程で得られたcDNAディスプレイを前記リポソームと混合させ、リポソームと結合したcDNAディスプレイを回収し、リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；
を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法。
【請求項１０】
前記cDNAディスプレイ法は、（ａ１）請求項６〜10のいずれかに記載のコンストラクトから転写によってmRNAを調製するmRNA調製工程と；（ａ２）得られたmRNAをピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体である、リンカー−mRNA複合体を形成させる第１複合体形成工程と；（ａ３）翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させて、第２複合体である、ペプチド−リンカー−mRNA複合体を形成させる第２複合体形成工程と；（ａ４）前記第２複合体を磁性粒子に結合させる粒子結合工程と；（ａ５）前記磁性粒子に結合した第２複合体のmRNAを逆転写してcDNAを形成させ、第３複合体である、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAを形成させる第３複合体形成工程と；（ａ６）前記第３複合体形成工程で得られた第３複合体である、cDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させる第３複合体遊離工程と；（ａ７）前記遊離された第３複合体を、リポソームと結合させて選択する選択工程と、を備えることを特徴とする、請求項９に記載のリポソーム結合ペプチドの作製方法。
【請求項１１】
前記リポソーム作製工程は、（ｂ１）脂質の有機溶媒溶液を調製する脂質溶液調製工程と；（ｂ２）前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる脂質膜形成工程と；（ｂ３）前記脂質膜にグッド緩衝剤を加えてリポソーム溶液を作製するリポソーム溶液作製工程と；（ｂ４）前記リポソーム溶液に糖を含有するグッド緩衝剤を加えてリポソームを回収するリポソーム回収工程と；を備えることを特徴とする、請求項９又は10に記載のリポソーム結合ペプチドの作製方法。
【請求項１２】
前記選択工程は、（ｃ１）前記リポソームを含有するリポソーム溶液に、cDNAディスプレイ含有溶液を添加する添加工程と；（ｃ２）前記リポソームと前記cDNAディスプレイ溶液との混合液を遠心分離する遠心工程と；（ｃ３）前記リポソームに結合したcDNAディスプレイをリポソームごと回収する回収工程と、を備えることを特徴とする請求項９〜11のいずれかに記載のリポソーム結合ペプチドの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム結合ペプチド及びその作製方法に関する。より詳細には、リポソームに安定的に結合し膜に入り込むペプチドと、該ペプチドをインビトロ進化法によって作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質二重膜からなるリポソームは，1960年代に発見されて以来、広く注目を集めてきたが、生体成分の１つであるリン脂質を主成分としており生体適合性に優れること、毒性や抗原性が低いこと、調製が容易であること、脂溶性又は水溶性の種々の薬物を内包させられること等から、薬物送達系（以下、「DDS」ということがある。）の主要な技術の１つとなった。
【０００３】
リン脂質のみで構成される単純な組成のリポソームを静脈内投与すると、異物を貪食することにより生体防御に関与する細網内皮系（RES）に捕捉され、破壊されて速やかに排除される。このため、内包された薬物等が血中に漏れ出す等、血中での安定性や滞留性に乏しいという問題があった。
この問題を解決するために、リポソーム表面をポリエチレングリコール（PEG）で修飾する方法が開発され、そうした技術を使用したPEG表面修飾リポソームが、長期血中滞留型リポソームとして開発されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
こうしたPEG表面修飾リポソームは、薬物輸送のキャリアとして使用することができるため、そのPEGを抗体等のリンカーと結合させ、分子識別能を付与することが試みられてきた。
また、リポソーム表面を抗体で修飾する技術が開発され、利用されている（特表2004-512345号公報参照）。この方法では、リポソーム表面を抗体で修飾するために、あらかじめ抗体と反応性のある特殊なリン脂質を混ぜておき、このような混合物を用いてリポソームを調製し、抗体を結合させる方法が記載されている。
また、Protein Aをリポソームに共有結合させることによって、リポソームに抗体結合能を付与する方法も提案されている（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2004-512345号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. M. Allen, et al., Biophys. Acta, 1066 29-36(1991)
【非特許文献２】Lee D. Leserman, et al., Nature 288 (1980) pp. 602
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リポソームの血中での安定性や滞留性を改善するために、PEGでリポソームの表面を修飾してリンカーを結合させるには、高度な有機合成の技術が必要であり、かつ、実験操作も非常に高度かつ煩雑であった。そして、抗体のような生体分子を有機化学的に結合させると、こうした生体分子の機能を維持することが難しく、使用した生体分子の機能に影響が出ることもあった。すなわち、期待通りの機能を保ったまま抗体等の分子識別機能を有する分子をリポソームと結合させることは非常に難しいという問題があった。
また、上記のように、抗体と反応性のある特殊なリン脂質を使用する方法では、精製された抗体を準備しておくことが必須であり、リン脂質が結合する抗体分子の部位が予測できないという問題があった。このため、リポソームの結合部位によっては、抗体の活性が維持できないという場合も生じた。
【０００８】
さらにまた、プロテインAを利用する方法では、リポソームを構成するリン脂質に対して、Protein Aとの反応性をもたせる処理を施す必要があるため、そうした性質を持つリン脂質を使用せざるを得ないという問題があり、Protein Aの分子量は約57kDaと比較的大きいため、取り扱いが難しいという問題もあった。
このため、特殊なリン脂質を使用することなく、サイズを制御しながらリポソームを簡便な手法で作製する技術に対する強い社会的要請があった。また、リポソームを用いたスクリーニングを行うことにより、こうした手法で作製されたリポソームの表面修飾に使用できるペプチドを製造する技術を開発する技術についても、強い社会的要請があった。
一方で、リポソームをスクリーニング手段として使用するには、非常に多くの被験物質が必要となること、また、感度良く検出できる方法を確立することが難しいため、リポソームをスクリーニング手段とすることは、これまで行われてきていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、上記のような状況の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したものである。すなわち、本発明は、脂質二重層で形成されるリポソームを用いてリポソームと相互作用をするペプチドの作製方法、及びその方法によって得られたリポソーム結合ペプチドを提供することを目的とする。
【００１０】
Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、中央部にリポソームの膜と結合するアミノ酸配列を有することを特徴とする、10〜100アミノ酸から構成される、リポソーム結合ペプチドである。ここで、前記ペプチドを構成するアミノ酸数は、25〜40であることが好ましい。本明細書中において、リポソームの膜に「結合する」とは、リポソーム膜の表面に単純に結合するのではなく、上記の特定のアミノ酸配列の部分が、リポソームの膜に入り込むことをいう。
また、前記ペプチドは、下記の配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
配列表の配列番号１
Arg His Ser Lys Ser Leu Xaa Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号２
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Xaa Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile 
配列表の配列番号３
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser GlyIle Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
【００１１】
また、前記配列番号１のペプチドは、下記の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
配列表の配列番号４
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号５
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号６
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
【００１２】
さらに、前記配列番号２のペプチドが、下記の配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
配列表の配列番号７
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Xaa Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
【００１３】
本発明の別の実施態様は、５’側から３’側に向かって、プライマー領域１と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域と、プライマー領域２とを含む、リポソーム結合ペプチドの作製用コンストラクトである。
ここで、前記ランダム領域は、10〜100アミノ酸残基で構成され、Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、中央部にリポソームの膜と結合するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、前記ランダム領域は、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００１４】
本発明の更に別の実施態様は、リポソーム結合ペプチドの作製方法であって、前記コンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；前記コンストラクト作製工程で作製されたコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてペプチド−リンカー−mRNA/cDNAをインビトロで作製するcDNAディスプレイ作製工程と；所望の直径を有するリポソームを作製するリポソーム作製工程と；前記cDNAディスプレイ作製工程で得られたcDNAディスプレイを前記リポソームと混合させ、リポソームと結合したcDNAディスプレイを回収し、リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法である。
【００１５】
ここで、前記cDNAディスプレイ法は、IVV（mRNAディスプレイ）法のmRNAを逆転写したcDNA及びmRNAハイブリッドと新生タンパクとの結合体による、遺伝子型表現型対応付け技術をいう。具体的には、（ａ１）前記コンストラクトから転写によってmRNAを調製するmRNA調製工程と；（ａ２）得られたmRNAをピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体である、リンカー−mRNA複合体を形成させる第１複合体形成工程と；（ａ３）翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させて、第２複合体である、ペプチド−リンカー−mRNA複合体を形成させる第２複合体形成工程と；（ａ４）前記第２複合体を磁性粒子に結合させる粒子結合工程と；（ａ５）前記磁性粒子に結合した第２複合体のmRNAを逆転写してcDNAを形成させ、第３複合体である、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAを形成させる第３複合体形成工程と；（ａ６）前記第３複合体形成工程で得られた第３複合体である、cDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させる第３複合体遊離工程と；（ａ７）前記遊離された第３複合体を、リポソームを結合させて選択する選択工程と、を備えることが好ましい。
【００１６】
さらに、前記リポソーム作製工程は、（ｂ１）脂質の有機溶媒溶液を調製する脂質溶液調製工程と；（ｂ２）前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる脂質膜形成工程と；（ｂ３）前記脂質膜にグッド緩衝剤を加えてリポソーム溶液を作製するリポソーム溶液作製工程と；（ｂ４）前記リポソーム溶液に糖を含有するグッド緩衝剤を加えてリポソームを回収するリポソーム回収工程と；を備えることが好ましい。
【００１７】
前記リポソーム結合cDNAディスプレイ回収工程は、（ｃ１）前記リポソームを含有するリポソーム溶液に、cDNAディスプレイ含有溶液を添加する添加工程と；（ｃ２）前記リポソームと前記cDNAディスプレイ溶液との混合液を遠心分離する遠心工程と；（ｃ３）前記リポソームに結合したcDNAディスプレイをリポソームごと回収する回収工程と、を備えることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、リポソームと結合するリポソーム結合ペプチドが提供される。また、上記リポソーム結合ペプチドを、効率よく製造する方法を提供することができる。さらに、これらのリポソーム結合ペプチドを高い内包率で内包するリポソームを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、生体膜のモデルとなるリポソームの構造を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明のリポソーム結合ペプチドのスクリーニング方法を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明のリポソーム結合ペプチド作製用コンストラクトの構造を示す模式図である。
【００２０】
【図４】図４は、後述する方法で、37℃にて12時間インキュベートして形成したリポソーム溶液を顕微鏡観察像である。
【図５】図５は、ゼータサイザーによって形成されたリポソームのサイズを測定した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、リポソームによる選択法の実験手順を示す模式図である。
【図７】図７は、リポソームとcDNAディスプレイとを混合した後の遠心管の中の状態を示す模式図、及びその溶液を観察した顕微鏡観察像である。左側は遠心前、右側は遠心後の状態を示す。
【図８】図８には、インビトロ選択によってスクリーニングされたペプチド（クローン）のうち、収束が見られたアミノ酸配列を示す図である。
【００２１】
【図９】図９は、脂質膜とペプチドとの相互作用モデルを示す模式図である。
【図１０】図１０は、スクリーニングによって得られたペプチドA-1のアミノ酸配列と膜内侵入モデルとの関係を示す図である。
【図１１】図１１には、リポソームのみを共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した蛍光観察像、微分干渉像、およびそれらの重ね合わせ像を示す。
【図１２】図１２には、リポソームとスクリーニングによって得られたペプチド（100nM）とをインキュベートした後の状態を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した、蛍光観察像、微分干渉像、およびそれらの重ね合わせた像を示す。
【図１３】図１３は、リポソームとスクリーニングによって得られたペプチド（6nM）とをインキュベートした後の状態を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した、蛍光観察像及び微分干渉像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の第１の態様は、特定の配列を有するリポソーム結合ペプチドである。リポソームの一般的な構造を図１に示す。これらの中でも、Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、中央部にリポソームの膜と結合するアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。このリポソーム結合ペプチドを構成するアミノ酸配列の数は、10〜100であることが好ましく、25〜40であることが、操作性の点からさらに好ましい。
【００２３】
また、前記ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものであることが、リポソームとの結合活性の高さの点で好ましい。
配列表の配列番号１
Arg His Ser Lys Ser Leu Xaa Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号２
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Xaa Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile 
配列表の配列番号３
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser GlyIle Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
【００２４】
また、前記配列番号１のペプチドが、配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有するものであることが、リポソームとの結合活性の高さの点で好ましい。
配列表の配列番号４
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号５
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号６
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
【００２５】
さらにまた、前記配列番号２のペプチドが、下記の配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列を有するものであることが、リポソームとの結合活性の高さの点で好ましい。
配列表の配列番号７
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Xaa Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
【００２６】
本発明の第２の態様は、５’側から３’側に向かって、プライマー領域１と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域と、プライマー領域２とを含む、リポソーム結合ペプチドの作製用コンストラクトである。このコンストラクトは、上記ペプチドを後述するインビトロ進化法によって得るために使用するものである。
ここで、プライマー領域１及び２として使用するアミノ酸配列は、市販されている一般的なものを使用することができる。また、プロモーター領域としては、T7、SP6当業者を使用することができる。非翻訳領域としては、Ω配列等を使用することができる（図２参照）。
【００２７】
ここで、前記ランダム領域は、10〜100アミノ酸残基で構成される。リポソームの厚みは、リポソームを構成する脂肪酸中の炭素鎖数で定まるため、このアミノ酸残基の数を、リポソームを構成する脂質二重層の厚み（図１参照）によって、適宜増減させることが好ましい。ペプチドの長さを脂質二重層の厚みとマッチする長さとすることで、リポソームとの結合をより安定したものとすることができるからである。
そのアミノ酸組成は、極性かつ塩基性のアミノ酸がペプチドを構成するアミノ酸数の50〜70％、極性かつ無電荷のアミノ酸が15〜29％、疎水性アミノ酸が10〜20％、及び極性かつ酸性アミノ酸が１〜５％であることが、リポソーム結合活性の高いペプチドを、後述するインビトロスクリーニングによって取得する上で好ましい。前記ランダム領域が、30〜40アミノ酸残基で構成され、そのアミノ酸組成が、極性かつ塩基性のアミノ酸が60％、極性かつ無電荷のアミノ酸が23.2％、疎水性アミノ酸が15％、及び極性かつ酸性アミノ酸が1.8％であることが好ましい（図２参照）。
【００２８】
また、前記極性かつ無電荷のアミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン（Asn）及びグルタミン（Gln）であり、グリシン、セリン及びトレオニンが15％以上かつ、グリシンとセリンとが同量であることが、リポソーム結合活性の高いペプチドを、後述するインビトロスクリーニングによって取得する上でさらに好ましい。
また、前記疎水性ペプチドは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びプロリンであり、プロリンとロイシン、及びアラニンとバリンとがそれぞれ、等量で含まれることが、リポソーム結合活性の高いペプチドを、後述するインビトロスクリーニングによって取得する上で好ましい。
【００２９】
本発明の第３の実施態様は、リポソーム結合ペプチドの作製方法であって、前記のコンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；前記コンストラクト作製工程で作製されたコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてペプチド−リンカー−mRNA/cDNAをインビトロで作製するcDNAディスプレイ作製工程と；所望の直径を有するリポソームを作製するリポソーム作製工程と；前記cDNAディスプレイ作製工程で得られたcDNAディスプレイを前記リポソームと混合させ、リポソームと結合したcDNAディスプレイを回収し、リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法である。
【００３０】
このリポソーム結合ペプチドの作製方法を簡単に述べると、上記のコンストラクト作製工程で作製したコンストラクトを用いて106オーダーのcDNAを包含するcDNAライブラリ（ペプチド−リンカー−mRNA/cDNA複合体のライブラリ）を作製し、これをcDNAディスプレイ法を用いて、インビトロで選択する、というものである。
ここで、前記cDNAディスプレイ法は、図２に示すように、（ａ１）mRNA調製工程と；（ａ２）第１複合体形成工程と；（ａ３）第２複合体形成工程と；（ａ４）粒子結合工程と；（ａ５）第３複合体形成工程と；（ａ６）第３複合体遊離工程と；（ａ７）選択工程と、を備えている。
【００３１】
まず、（ａ１）mRNA調製工程では、前記のコンストラクトから転写によってmRNAを調製する。そして、（ａ２）第１複合体形成工程において、前記mRNA調製工程で得られたmRNAを、ピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体を形成させる。ここで形成される第１複合体は、上記の通り、リンカー−mRNA複合体である。次に、（ａ３）第２複合体形成工程において、翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させる。すなわち、この工程で形成される第２複合体は、ペプチド−リンカー−mRNA複合体である。
【００３２】
次いで、（ａ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られた第２複合体を、磁性粒子に結合させる。引き続き、（ａ５）第３複合体形成工程において、前記磁性粒子と結合した第２複合体のmRNAを逆転写し、cDNAを形成させる。このため、ここで形成される第３複合体は、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAとなる（以下、「cDNAディスプレイ」ということがある）。次に、（ａ６）複合体遊離工程において、前記第３複合体形成工程で得られたcDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させ、引き続き、（ａ７）選択工程において、前記遊離された第３複合体をリポソームと結合させて選択する。
【００３３】
無細胞翻訳系として、市販のキット、例えば、Retic Lysate IVT Kit（Ambion社製）を利用してもよい。このキットのプロトコルに従って、無細胞翻訳反応に使用される全ての試薬を穏やかに撹拌して遠心し、氷上に置く。反応液は、20〜50μLスケールとし、次のような順番で混合して調製し、反応させることができる。
上記のキットを使用する場合には、0.5〜1μLの20X Translation Mix minus-Met、0.5〜1μLの20X Translation Mix minus-Leu、及び15〜20μLのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッティングして混合する。
【００３４】
この混合液を25〜50μLのサンプル溶液中に添加し、反応液が所望の量、例えば、20〜30μLになるようにDEPC水を加える。そして、泡が立たないように再度丁寧に混合し、30℃にて20分間、翻訳反応をさせる。
上記翻訳反応後に、連結体Ａと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に15〜25μＬの２〜４Ｍの塩化カリウム、及び４〜８μLの0.5〜２Mの塩化マグネシウムを加え37℃にて30〜50分間反応させる。
【００３５】
上記の溶液中に80〜100pmol相当のcDNAディスプレイ分子がある場合、50〜70μLの量の磁性ビーズ、例えば、ダイナル社製のDynabead MyOne C1を加え、室温で、15〜30分間インキュベートし、リンカーのピューロマイシンに合成されたペプチドが付加された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド連結体）を磁性ビーズの表面にリンカー部分で結合させる。なお、蛍光分子が結合されているリンカーを使用すると、蛍光のリポソーム表面での局在を確認することができる。
【００３６】
次いで、例えば、ReverTra Ace（東洋紡製）を用いて、40〜44℃にて、30分間反応させ、この連結体に結合しているmRNAの逆転写を行い、cDNAが連結された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド−cDNA連結体）を得る。
引き続き、適当な酵素、例えば、RNase T1、を用いて、約35〜38℃にて、10分間反応させ、cDNAが連結された連結体（cDNAディスプレイ）を磁性ビーズから遊離させる。
ここで使用する蛍光分子としては、フルオレセイン、GFP等を挙げることができる。
【００３７】
前記リポソーム作製工程は、（ｂ１）脂質溶液調製工程と；（ｂ２）脂質膜形成工程と；（ｂ３）リポソーム溶液作製工程と；（ｂ４）リポソーム回収工程と；を備えている。
ここで、上記の（ｂ１）脂質溶液調製工程では、脂質の有機溶媒溶液を調製する。また、上記の（ｂ２）脂質膜形成工程では、前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる。上記の（ｂ３）リポソーム溶液作製工程では、前記脂質膜にグッド緩衝剤を加えてリポソーム溶液を作製する。上記の（ｂ４）リポソーム回収工程では、前記リポソーム溶液に糖を含有するグッド緩衝剤を加えてリポソームを回収する。
【００３８】
すなわち、上記の（ｂ１）脂質溶液調製工程で使用する脂質としては、例えば、1,2-ジドデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（以下、「DOPC」ということがある。）等を挙げることができる。光学顕微鏡でも観察することがきる、一枚の脂質二重層からなる巨大なリポソーム（以下、「ベシクル」ということがある。）を作製することができるため、DOPCを使用することが好ましい。
また、有機溶媒としては、ジクロルメタン、クロロホルム、四塩化炭素等の有機溶媒を挙げることができるが、クロロホルムを使用することが、作業の簡便さの点から好ましい。
【００３９】
リポソームに包含された溶液と、リポソームの外液との比重の違いを利用してリポソームを精製するために、異なる種類の糖を同じ濃度で含有するグッドの緩衝液を調製した。こうしたバッファーとしては、例えば、0.05〜0.2Mのスクロースを含有する10〜30mのMOPSバッファーと、0.05〜0.2Mのグルコースを含有する10〜30mMのMOPSバッファーとを調製してもよい。
30〜50μLのDOPC（AVT）を900〜1,000μLの有機溶媒、例えば、クロロホルム、に溶解させて、0.5〜2mMの脂質クロロホルム溶液を所望の量、例えば、0.75〜1.5mL調製する。
【００４０】
適当な大きさのガラスシャーレ、例えば、直径5cmのガラスシャーレを界面活性剤で洗浄して乾燥させる。このシャーレ中に、上記の脂質クロロホルム溶液を全量流し込み、シャーレ全体に広げる。
次いで、窒素ガスをシャーレ内に流し込み、有機溶媒を揮発させる。引き続き、真空ポンプをデシケータに接続し、この中に上記のシャーレを入れて一晩置く。
例えば、0.1Mのスクロースを含有する20mMのMOPSバッファーを20mL、脂質膜が撹拌されないように、このシャーレ内に静かに注ぐ。35〜39℃で２〜４時間静置して水和させ、リポソームを作製する。以下、リポソームを「ベシクル」ということがある。
【００４１】
リポソーム調製の際には、上記のように、例えば、約0.1Mのスクロースを含有する20mMのMOPSバッファー（pH 6.8〜7.2）を使用し、このバッファーが内包されているリポソームを作製する。このリポソーム含有溶液を１〜３mLとって、所望の容量、例えば、15mLの遠心管に入れ、ここに所望の量、例えば、約12mLの約0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファー（pH 6.8〜7.2）を加える。
リポソームが包含するバッファーよりも、リポソームの外液であるバッファーの比重の方が重いときは、リポソームを浮遊させて精製し、逆の場合には、遠心分離によって沈降させる。遠心によって沈降させる場合には、遠心管の底に集積したリポソームを、シリンジを用いて回収することができる。以上のようにして、光学顕微鏡で観察可能な、巨大一枚膜ベシクル(giant unilamellar vesicles、以下、「GUV」ということがある）を調製する。
【００４２】
次いで、（ｂ２）脂質膜形成工程では、前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる。上記のような脂質を、上記のような有機溶媒に所望の濃度、例えば、0.5〜2mMとなるように溶解させ、固相上に流して薄膜を形成させる。使用する固相としては、上記のような有機溶解を使用することからガラスシャーレが好ましい。こうした固相上に流した後に、例えば、窒素ガスを吹き付けると、形成される薄膜の厚みが一定になる。その後、薄膜を形成させた固相を終夜静置し、さらに乾燥させて、有機溶媒を完全に揮発させる。
【００４３】
次いで、（ｂ３）リポソーム溶液作製工程では、上記のようにして作製した脂質膜に、所望の濃度に調製した糖を含有するグッド緩衝剤を静かに加えて、所望の温度で所望の時間、静置し、リポソーム溶液を作製する。ここで、グッドの緩衝剤の中でも、モルホリノプロパンスルホン酸（以下、「MOPS」ということがある）を使用することが、調製及び保存が容易であることから好ましい。グッドの緩衝剤は、10〜50mMの濃度で使用することが、反応効率の点から好ましい。
【００４４】
また、ここで上記の緩衝剤に添加する等としては、スクロース、グルコース等を挙げることができる。こうした糖の含有量は、例えば、0.05〜0.2mMとすることが、リポソームの精製、リポソームとペプチドとの結合、及びリポソームとペプチドとの結合体の精製が容易であるために好ましい。
例えば、0.5〜2mMのDOPCのクロロホルム溶液を調製し、この溶液をガラスシャーレにまく。その後、窒素ガスを吹き付けて、シャーレの内壁に脂質が薄い膜を作るようにクロロホルムを除去する。その後、例えば、真空ポンプに連結したデシケータ中でさらに一晩乾燥させる。
【００４５】
次に、0.05〜0.2Mの糖を含む10〜50mMのグッドの緩衝剤に脂質膜を加えて、32〜40℃にて２〜５時間インキュベートして水和させ、リポソームを作製する。例えば、約0.05〜0.2Mのスクロースを含む約20mMのMOPSバッファー中に、上記のようにして作製した脂質膜を加えて、約35〜37℃で約２〜４時間インキュベートして水和させる。この方法で、直径0.01〜10μｍのリポソームを作製することができる。
引き続き、（ｂ４）リポソーム回収工程では、前記リポソーム溶液に糖を含有するグッドの緩衝剤を添加して、遠心によりリポソームを回収する。この工程で使用する糖としては、グルコース、スクロース等を挙げることができるが、グルコースを使用すると、リポソームを容易に沈降させることができるために好ましい。
【００４６】
リポソームの作製からこのリポソームに結合したcDNAをリポソームごと回収する工程を示した模式図を図６に示す。
上記のようにして作製したリポソーム溶液に、所望の濃度の糖を含有するグッドの緩衝剤を所望の量加えて遠心し、リポソームを回収する。例えば、0.05〜0.2mMのグルコースを含有する10〜50mMのMOPSを４〜６倍容加えて遠心する。この溶液を使用することにより、リポソーム内に封入されたスクロース含有MOPSの比重の方が、リポソーム外液であるグルコースを含有するMOPSの比重よりも大きくなるために、遠心するだけで、リポソームを沈降させることができる。沈降したリポソームについては、例えば、シリンジ等で回収することができる。
以上のようにして作製したリポソームは、再結合を起こさないように、遮光して、例えば、４℃にて使用時まで保存する。
【００４７】
次に、リポソーム結合cDNAディスプレイ回収工程は、（ｃ１）溶液添加工程と；（ｃ２）分離工程と；（ｃ３）回収工程とを備えている。（ｃ１）溶液添加工程では、前記リポソーム含有するリポソーム溶液に、cDNAディスプレイ含有溶液を添加する。引き続き、前記の（ｃ２）分離工程で、前記リポソームと前記cDNAディスプレイ溶液との混合液を、例えば、5,000ｘｇで５分間遠心して分離する。その後、前記の（ｃ３）回収工程で、前記リポソームに結合したcDNAディスプレイをリポソームごと回収する。
以上のようにして、リポソーム結合ペプチドを製造することができる。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）リポソーム結合ペプチド選択用コンストラクトの構築
図３に示す構造を有するコンストラクトの構築には、以下のものを使用した。
ランダム領域については、アルギニン含有量が多くかつストップコドンの出現確率が小さくなるように塩基のバランスを調整した配列に基づいて設計し、製造をジーンワールド（株）に委託した。
ランダム領域の5'側上流に、プライマー領域１、T7プロモーター配列、及びUTRを、また、3'側下流にヒスチジンタグ（HNtag）及びプライマー領域２を付加したDNAを常法によって合成し、PCRによって増幅させ、DNA精製カラムによって精製した。
【００４９】
（実施例２）cDNAディスプレイ法によるインビトロでの選択
（１）mRNAの合成
実施例１で作製したコンストラクトとT7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System（プロメガ（株）製）を用いて、添付のプロトコルに従って5〜30 pmol/μLのmRNAを合成した。
【００５０】
（２）連結体の形成（T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション酵素反応）
ライゲーション反応は、リンカー１に対して1.5倍のmRNAを加え、20μLのT4 RNAリガーゼバッファー（50mMのトリス塩酸、pH 7.5；10mMの塩化マグネシウム、10mMのDTT；1mMのATPを含む）中にて行なった。酵素を加える前にアニーリングするため、90℃で５分間アルミブロック上にて温めた、次に70℃で５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で10分間放置した後、氷上に置いた。
ここに、1μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（10 U/μL）及び1μLのT4 RNAリガーゼ（40 U/μL）（いずれもタカラバイオ（株）製）を加え、25℃で15分間、保持した。
【００５１】
（３）cDNAディスプレイ法によるスクリーニング
（３−１）無細胞翻訳系
無細胞翻訳系にはRetic Lysate IVT Kit（Ambion社製）を利用した。混合の方法等は、キットのプロトコルを参照して行った。無細胞翻訳反応に使用される全ての試薬を穏やかに撹拌して遠心した後、氷上に置いた。25μLスケールの反応液は次のような順番で混合して調製し、反応させた。
0.625μLの20X Translation Mix minus-Met、0.625μLの20X Translation Mix minus-Leu、及び17μLのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッティングし、混合した。
【００５２】
この混合液を36.5μLのサンプル溶液中に添加し、反応液が25μLになるようにDEPC水を加えた。そして、泡が立たないように再度丁寧に混合した。混合後30℃にて20分間、翻訳反応をさせた。
上記翻訳反応後に、連結体Ａと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に20μＬの3Ｍの塩化カリウム、及び6μLの1Mの塩化マグネシウムを加え37℃で40分間反応させた。
【００５３】
（３−２）ペプチドの精製
上記の溶液中に90pmol相当のcDNAディスプレイ分子がある場合、60μLの量の磁性ビーズ（ダイナル社製、Dynabead MyOne C1）を加え、室温で20分間インキュベートし、リンカーのピューロマイシンに合成されたペプチドが付加された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド連結体）を磁性ビーズの表面にリンカー部分で結合させた。なお、ここでは、蛍光分子（GFP）が結合されているリンカーを使用した。
次いで、ReverTra Ace（東洋紡製）を用いて、42℃、30分の条件で反応させ、この連結体に結合しているmRNAの逆転写を行い、cDNAが連結された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド−cDNA連結体）を得た。
引き続き、RNase T1を用いて、37℃、10分の条件で反応させ、cDNAが連結された連結体（cDNAディスプレイ）を磁性ビーズから遊離させた。
【００５４】
（実施例３）巨大一枚膜リポソームの作製
（１）リポソームの作製
本実施例では、光学顕微鏡で観察可能なGUVを調製した。0.1Mのスクロース含有20mMのMOPSバッファー及び0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファーを調製した。
40μLのDOPC（AVT）を960μLのクロロホルムに溶解させて、1mMの脂質クロロホルム溶液1mLを調製した。
【００５５】
直径5cmのガラスシャーレを界面活性剤で洗浄して乾燥させた。このシャーレ中に、上記の脂質クロロホルム溶液を全量（1mL）流し込み、シャーレ全体に広げた。
次いで、窒素ガスをシャーレ内に流し込み、クロロホルムを揮発させた。引き続き、油回転真空ポンプをデシケータに接続し、この中に上記のシャーレを入れ、一晩置いた。
0.1Mのスクロース含有20mMのMOPSバッファーを20ｍL、脂質膜が撹拌されないように、このシャーレ内に静かに注いだ。37℃で３時間静置して水和させ、リポソームを作製した。
【００５６】
（２）リポソームの回収
リポソーム調製の際に、上記のように0.1Mのスクロース含有20mMのMOPSバッファー（pH 7.0）を使用し、このバッファーが内包されているリポソームを作製した。このリポソーム含有溶液を2mLとって15mLの遠心管に入れ、ここに、12mLの0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファー（pH 7.0）を加えた。
リポソーム作製時と異なるバッファーを使用することで、リポソームの外液であるグルコース含有MOPSバッファーに比べて、リポソーム内液のスクロース含有MOPS溶液の比重の方が重くなるため、遠心分離により沈降させた。遠心管の底に集積したリポソームを、シリンジを用いて回収した。
【００５７】
得られたリポソームの大きさを、スケールバーとともに図８に示す。黒い矢印で示すものがリポソームである。また、ゼータサイザー（マルバーンインスタルメンツ社製、英国製）で形成されたリポソームの大きさを測定した。結果を図９に示す。
図９に示すように、このときの実験では、直径が１nm以下の非リポソームと、直径が100nmを越えるサイズのリポソームとが形成されたことが確認された。
その後の実験を繰り返し、直径が１〜10μmのリポソームが形成されることを確認した（不図示）。
【００５８】
（実施例４）結合ペプチドのスクリーニング
（１）作製したリポソームとペプチドとの結合性の確認
実施例３で作製したリポソーム溶液（0.1Mのスクロースを含有する20mMのMOPSバッファー（pH 7.0））を２mLとって15mLの遠心管に入れ、ここに実施例２で作製したcDNAディスプレイを含む溶液を0.1mL加えた。さらに、12mLの0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファー（pH 7.0）を加え、その後、5,000ｘｇで、25℃にて５分間遠心した。対照には、cDNAディスプレイを含まない溶液のみを加え、同様に遠心操作を行った。
【００５９】
図７に、遠心管の中のリポソーム、cDNAディスプレイ、cDNAが結合した状態のリポソームを示す模式図と顕微鏡で観察された像（図７の左側）及び遠心後の模式図と顕微鏡で観察された像（図７の右側）を示した。
リポソームに結合したcDNAディスプレイは、図７の左側及び右側の顕微鏡の下側の像に示すように、蛍光が観察された。これに対し、リポソームに結合していないcDNAディスプレイのみでは蛍光は観察されなかった。
【００６０】
（２）リポソーム結合ペプチドのスクリーニング−１
実施例２で得られたペプチドを、上記のようにリポソーム溶液を混合して、リポソームへの結合性を調べた結果、84個のペプチドが得られた。これらのうち、共通の配列を有する17個の配列を図８にまとめて示した。これら以外のペプチドの配列には共通するものが見られず、収束しなかった。
【００６１】
図８に示した通り、Aグループ（11個）のペプチドのアルギニンの含有量は37％、リジンを含めると47％であった。また、Bグループ（4個）のペプチドのアルギニンの含有量は43％でリジンを含めるとAグループと同様の47％であった。Cグループ（2個）のペプチドのアルギニンの含有量は30％でリジンを含めると43％となっており、いずれのグループに属するペプチドも、コンストラクト作製時のアルギニン含有量56％（リジンを含めると60％）よりも、これらの割合は低くなっていた。
【００６２】
これらのペプチドとリポソームの脂質二重層の結合様式を示す模式図を図９に示す。図９中、疎水性のアミノ酸は黒丸で、また、親水性のアミノ酸は白丸で示した。また、親水性かつ塩基性のアミノ酸は網かけで示した。これらのペプチドは、その中央付近に疎水性のアミノ酸配列があるため、この部分で脂質二重層と結合し、親水性のアミノ酸配列が脂質二重層の外液である水溶液と接する位置にあると考えられた。
A-1のペプチドのアミノ酸配列を見ると、枠をつけた11個の配列中７個が疎水性のアミノ酸である。このため、疎水性のアミノ酸によって膜内に進入していくモデルと一致した（図10参照）。
【００６３】
（３）リポソーム結合ペプチドのスクリーニング−２
実施例３で形成されたリポソームと実施例２で作製した蛍光標識ペプチドとを、ペプチドの終濃度100nM、25℃で３時間インキュベートした場合と、リポソームのみの場合を、それぞれ、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を図11及び12に示す。図中のスケールバーは２μmである。
この大きさのリポソームであっても、ペプチドとインキュベートした場合には、蛍光含観察され、ペプチドが結合していることが確認された。これに対し、リポソームのみでは蛍光は確認されなかった。
【００６４】
ペプチドの濃度を６μMに上げ、25℃で２時間インキュベートした場合でも、蛍光観察像より、ペプチドがリポソームに結合していることが示された。結果を図13に示す。
以上より、上記のコンストラクトを用いてインビトロ選択してスクリーニングを行うことにより、リポソームに結合するペプチドが得られたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
また、本発明は、医薬、診断薬、環境分析、食品分析、研究用バイオイメージング等の幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：リポソーム結合ペプチドA
配列番号２：リポソーム結合ペプチド（クローンA-1）
配列番号３：リポソーム結合ペプチド（クローンA-2）
配列番号４：リポソーム結合ペプチド（クローンA-3）
配列番号５：リポソーム結合ペプチドB
配列番号６：リポソーム結合ペプチド（クローンB-1）
配列番号７：リポソーム結合ペプチド（クローンB-2）
配列番号８：リポソーム結合ペプチド（クローンC）
【図１】
2015067578.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015067578.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015067578.tif 000012
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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