(57)【要約】【課題】初期段階等の糖尿病も高感度で検出でき、糖尿病に対する特異性が高く、かつ操作も簡便な、尿を検体とする糖尿病の検出技術を提供する。【解決手段】被験者から採取した尿を検体として用いる糖尿病の検出方法であって、前記検体は、精製処理を経ていない尿又は尿由来物であり、励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて前記検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光の強度を指標として、前記被験者における糖尿病の有無を検出することを特徴とする糖尿病の検出方法が提供される。前記検体として、尿そのもの又は尿の希釈物を用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した尿を検体として用いる糖尿病の検出方法であって、
前記検体は、精製処理を経ていない尿又は尿由来物であり、
励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて前記検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光の強度を指標として、前記被験者における糖尿病の有無を検出することを特徴とする糖尿病の検出方法。
【請求項２】
前記蛍光の強度は、励起波長よりも１０〜２５０ｎｍ大きい波長における蛍光の強度であることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病の検出方法。
【請求項３】
前記検体は、尿そのもの又は尿の希釈物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の糖尿病の検出方法。
【請求項４】
前記蛍光の強度を測定し、得られた測定値を基準値と比較することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の糖尿病の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病の検出方法に関する。本発明の糖尿病の検出方法は、糖尿病の有無を高感度、高特異性、かつ簡便に検出できるものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満，糖尿病，動脈硬化等の生活習慣病が増加している。このうち糖尿病は、知覚麻痺、失明、動脈硬化等との合併症を引き起こすことも多く、日常生活に多大な障害をもたらす病気として特に問題視されている。
【０００３】
糖尿病はインスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。糖尿病は１型と２型に分類される。１型糖尿病は、膵臓のランゲルハンス島が炎症を起こした結果、インスリン分泌能が低下又は枯渇してしまい、高血糖に至るものである。一方、２型糖尿病はそれ以外の原因によってインスリンの作用不足が起こり、高血糖に至るものである。この２型糖尿病は日本人の糖尿病の大部分を占めるものであり、特に問題視されている。
【０００４】
２型糖尿病の発病メカニズムはまだ不明の点があるが、主に環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために膵臓のインスリン分泌量が激増した結果、膵臓が疲労して逆にインスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。一方、逆に、インスリンの作用不足から生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられて肥満が進むこともあり、糖尿病はその発症メカニズムにおいて肥満と密接に関係している。また、２型糖尿病は発症初期に自覚症状がないことが多く、発見時にはかなり進行していて治療が困難となることもある。すなわち、２型糖尿病の予備軍は相当に多いと予想される。
【０００５】
現在、糖尿病の検出に用いられている臨床検査項目としては、尿糖、空腹時血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、血中インスリン値、血中・尿中Ｃ−ペプチド値（ＣＰＲ）などがある。その他、グルコースを経口摂取した後の血中グルコース濃度をモニターし、そのクリアランス能力をみる経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）も行われている。
【０００６】
また近年、医学領域において、糖化最終産物（Advanced glycation end products；以下、「ＡＧＥｓ」と称する）と呼ばれる物質が注目されており、様々な病気、疾患、老化等との関連性について研究されている。そして、慢性的な高血糖状態では循環血液中や組織でＡＧＥｓの生成が促進され、蓄積されることが知られている。ＡＧＥｓという名称は総称であり、ＡＧＥｓには種々の化合物が含まれる。代表的なＡＧＥｓとして、カルボキシメチルリジン（Nε-(carboxymethyl) lysine）、ペントシジン（Pentosidine）、ピラリン（Pyrraline）、クロスリン（Crossline）などが知られている。
【０００７】
ＡＧＥｓの測定技術としては、ＡＧＥｓが発する蛍光（主に、励起波長３７０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍ）を指標とする蛍光分析法、褐色変化を利用した吸光度測定法、化学発光法等が、簡易的な方法として知られている（例えば、特許文献１〜３）。その他、ＨＰＬＣやＧＣ／ＭＳによる精密な測定法も知られている（例えば、非特許文献１、特許文献４）。さらに、特定のＡＧＥｓに着目したＥＬＩＳＡによる測定法も開発されている（例えば、特許文献５〜７、非特許文献２，３）。
【０００８】
このうち蛍光測定法は、ＡＧＥｓの多くが蛍光を発することを利用したものである。ただし、蛍光を発しないＡＧＥｓも存在するので（例えば、ピラリン）、蛍光分析法は全てのＡＧＥｓを網羅したものではない。逆に、ＡＧＥｓ以外の蛍光物質も含めて測定していると考えられる。また、選択する励起波長と発光波長によって、検出できる蛍光物質が異なると考えられる。蛍光分析法は高感度かつ簡便であり、多数の試料を測定する場合に有用である。例えば、健康診断等において複数の尿や血清を測定試料とする場合に有用である。
【０００９】
糖尿病の検出を目的とした尿中ＡＧＥｓの蛍光分析に関する報告がある（例えば、非特許文献４，５）。ここで、尿検体を蛍光分析に供する場合には、除タンパク等の前処理を行うのが普通である。
例えば、非特許文献４に記載の技術では、前処理として尿検体を限外ろ過に供し、分子量１万以上の物質を除去してから蛍光分析を行っている。また非特許文献５に記載の技術では、前処理として尿検体をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による除タンパク処理に供している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−０９９８３８号公報
【特許文献２】特開２００１−０２１５４９号公報
【特許文献３】特開２００１−０５９８４３号公報
【特許文献４】特開平７−０９８３１７号公報
【特許文献５】特開２００４−３２３５１５号公報
【特許文献６】特開２００６−３１２６２１号公報
【特許文献７】特開２００１−０２１５５９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】MP DE LA MAZA et al., "Fluorescent serum and urinary advanced glycoxidation end-products in non-diabetic subjects", Biol Res. 2007;40(2):203-12.
【非特許文献２】N. Turk et al., "Urinary extraction of advanced glycation endoproducts in patients with type 2 diabetes and various stages of proteinuria", Diabetes Metab. 2004 Apr;30(2):187-92.
【非特許文献３】Takeuchi, M., et al., "Immunological evidence that non-carboxymethyllysine advanced glycation end-products are produced from short chain sugars and dicarbonyl compounds in vivo ", Mol Med. 2000 Feb;6(2):114-25.
【非特許文献４】Yanagisawa et al., "Specific Fluorescence Assay for Advanced Glycation End Products in Blood and Urine of Diabetic Patients", Metabolism. 1998 Nov;47(11):1348-53.
【非特許文献５】M. P. de la Maza et al., "Fluorescent advanced glycation end-products (ages) detected by spectro-photofluorimetry, as a screening tool to detect diabetic microvascular complications", Journal of Diabetes Mellitus. 2012 2(2):221-226.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記したように、２型糖尿病は発症初期に自覚症状がないことが多く、発見時にはかなり進行していて治療が困難となることも多い。そのため、糖尿病の検出を目的とした臨床検査においては、糖尿病の罹患の有無のみならず、通常は検出できないような初期段階の糖尿病の有無、糖尿病の将来の発症リスクの有無、いわゆる糖尿病予備軍であるか否か、等も検出したいという要望がある。一方、非糖尿病が偽陽性として検出されないよう、糖尿病に対する高い特異性が維持されていることも求められる。さらに、集団検診に容易に対応できるように、できるだけ簡便な操作で糖尿病の検出を行いたいという要望もある。そこで本発明は、初期段階等の糖尿病も高感度で検出でき、糖尿病に対する特異性が高く、かつ操作も簡便な糖尿病の検出技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した課題を解決すべく、本発明者らは、尿を検体として用いる糖尿病の高感度、高特異性、かつ簡便な検出技術について研究を進めた。その結果、尿を前処理せずにそのまま蛍光分析に供することによって、上記の課題を解決できることを見出した。すなわち、尿又は尿の希釈物をそのまま蛍光分析に供することによっても糖尿病の検出が可能であること、さらに、尿の前処理を行わないことにより、従来の方法では見逃されていた糖尿病も検出できることを見出した。さらに、前処理を行わない場合でも糖尿病に対する高い特異性は維持されており、糖尿病と非糖尿病の判別を高精度で行えることを見出した。
【００１４】
上記した知見に基づいて提供される本発明の１つの様相は、被験者から採取した尿を検体として用いる糖尿病の検出方法であって、前記検体は、精製処理を経ていない尿又は尿由来物であり、励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて前記検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光の強度を指標として、前記被験者における糖尿病の有無を検出することを特徴とする糖尿病の検出方法である。
【００１５】
本発明の糖尿病の検出方法は、精製処理を経ていない尿又は尿由来物を検体として用い、検体が発する特定の蛍光強度を指標とするものである。本発明によれば、糖尿病に対する高い特異性を維持しつつ、高感度かつ簡便に糖尿病を検出することができる。例えば、従来のような、前処理を経た尿検体を用いた蛍光分析では検出できない糖尿病も検出することができる。
【００１６】
ここで「精製処理」とは、採取した尿が有している含有物の組成を変化させるような処理を指す。例えば、一部の含有物を除去する処理や、一部の含有物を濃縮する処理は、当該精製処理に含まれる。例えば、一定以上の分子量を有する物質の除去（例えば、限外ろ過による濃縮・分画処理）、タンパク質やペプチドの除去（例えば、ＴＣＡによる除タンパク処理）、一部の荷電分子の除去（例えば、イオン交換体との接触）、各種クロマトグラフィーによる分画処理は、いずれも当該精製処理に含まれる。
一方、希釈操作は、尿全体を均一に薄めるのみであり、含有物の組成を変化させるものではないので、当該精製処理には含まれない。同様に、尿全体を均一に濃縮する操作も、当該精製処理には含まれない。尿全体に安定化剤等を添加する処理も、含有物の組成を変化させない限り当該精製処理に含まれない。
【００１７】
精製処理を経ていない「尿由来物」とは、尿そのものではないが、尿に由来し、かつ前記した精製処理を経ていない物を指す。当該尿由来物の代表例は、前記した尿の希釈物である。その他、尿の均一濃縮物も当該尿由来物に含まれる。
【００１８】
ここで「糖尿病の有無」とは、糖尿病の罹患の有無だけでなく、通常は検出困難な初期の糖尿病の有無、糖尿病の将来の発症リスクの有無、いわゆる糖尿病予備軍であるか否か、等も含む概念である。糖尿病の将来の発症リスクの有無とは、糖尿病を発症していない時点において、将来、糖尿病に罹患する可能性（危険性）の有無を指す。
【００１９】
なお、本発明で指標とする蛍光は、励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光である。この励起波長の範囲は、ＡＧＥｓの蛍光測定で従来から採用されている波長と重複している。ただし、本発明で指標とする当該蛍光はＡＧＥｓのみを反映したものではなく、他の蛍光物質、例えば、従来技術では前処理で除去されていた蛍光物質も含めた広い範囲をカバーしている。
【００２０】
好ましくは、前記蛍光の強度は、励起波長よりも１０〜２５０ｎｍ大きい波長における蛍光の強度である。
【００２１】
好ましくは、前記検体は、尿そのもの又は尿の希釈物である。
【００２２】
好ましくは、前記蛍光の強度を測定し、得られた測定値を基準値と比較する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、糖尿病に対する高い特異性を維持しつつ、高感度かつ簡便に糖尿病を検出することができる。例えば、従来のような、前処理を経た尿検体を用いた蛍光分析では検出できない糖尿病も検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（ａ）は糖尿病型と非糖尿病型を含む尿検体について蛍光強度を測定した結果を表すグラフ、（ｂ）はドットプロット図である。
【図２】尿中アルブミンと蛍光強度との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の糖尿病の検出方法は、被験者から採取した尿を検体として用いる糖尿病の検出方法であって、前記検体は、精製処理を経ていない尿又は尿由来物であり、励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて前記検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光の強度を指標として、前記被験者における糖尿病の有無を検出することを特徴とするものである。例えば、前記検体が発する前記蛍光強度を蛍光分析装置等で測定し、該測定値を基準値と比較し、その比較結果に基づいて糖尿病の有無を検出する。
【００２６】
本発明では、検体として「精製処理を経ていない尿又は尿由来物」を用いる。上述したように、精製処理とは、採取した尿が有している含有物の組成を変化させるような処理を指す。すなわち本発明では、限外ろ過や除タンパク等の前処理を経ていない尿又は尿由来物を用いる。
【００２７】
上述したように、精製処理を経ていない「尿由来物」とは、尿そのものではないが、尿に由来し、かつ前記した精製処理を経ていない物を指す。当該尿由来物の代表例は、尿の希釈物である。
【００２８】
好ましい実施形態では、検体として、尿そのもの又は尿の希釈物を用いる。尿そのものと尿の希釈物の使い分けは、例えば、検体が発する蛍光強度に応じて行うことができる。すなわち、尿の蛍光強度が高すぎる場合には、消光現象を回避するために尿を希釈することが好ましい。
尿の希釈に用いる希釈液としては、蛍光測定に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定はなく、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、各種の緩衝液、等を適宜用いることができる。希釈液のｐＨとしては、蛍光物質が安定に存在できるものであればよく、例えば、６．０〜８．０の範囲から選択することができる。希釈液におけるイオン種やイオン強度についても、蛍光物質が安定に存在できるものであればよい。例えば、タンパク質が変性しない程度のイオン種やイオン強度を選択すればよい。
また希釈液は、蛍光物質を含まないものであることが好ましい。
【００２９】
本発明では、励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光の強度を指標とする。上述したように、この励起波長の範囲は、ＡＧＥｓの蛍光測定で従来から採用されている波長と重複している。前記励起波長の範囲は、好ましくは２５０〜４５０ｎｍ、より好ましくは２８０〜４２０ｎｍｍ、さらに好ましくは２８０〜４００ｎｍ、特に好ましくは３００〜４００ｎｍである。
蛍光強度測定時の蛍光波長（発光波長）としては、蛍光を検出できる波長であれば特に限定はないが、励起波長よりも１０〜２５０ｎｍ大きい波長を選択することが好ましい。
具体例を挙げると、励起波長が２６０ｎｍの場合には、蛍光波長は２７０〜５１０ｎｍ、好ましくは３００〜３８０ｎｍ、より好ましくは３２０〜３７０ｎｍの範囲から選択することができる。
励起波長が３００ｎｍの場合には、蛍光波長は３１０〜５５０ｎｍ、好ましくは３５０〜５００ｎｍ、より好ましくは３６０〜４８０ｎｍの範囲から選択することができる。
励起波長が３４０ｎｍの場合には、蛍光波長は３５０〜５９０ｎｍ、好ましくは３８０〜５３０ｎｍ、より好ましくは３９０〜５２０ｎｍの範囲から選択することができる。
励起波長が３７０ｎｍの場合には、蛍光波長は３８０〜６２０ｎｍ、好ましくは４０００〜５５０ｎｍ、より好ましくは４２０〜５３０ｎｍの範囲から選択することができる。
励起波長が４００ｎｍの場合には、蛍光波長は４１０〜６５０ｎｍ、好ましくは４５００〜６００ｎｍ、より好ましくは４６０〜５８０ｎｍの範囲から選択することができる。
励起波長が４５０ｎｍの場合には、蛍光波長は４６０〜７００ｎｍ、好ましくは５０００〜６５０ｎｍ、より好ましくは５１０〜６３０ｎｍの範囲から選択することができる。
励起波長が５００ｎｍの場合には、蛍光波長は５１０〜７５０ｎｍ、好ましくは５５００〜７００ｎｍ、より好ましくは５６０〜６８０ｎｍの範囲から選択することができる。
【００３０】
さらに、ＡＧＥｓの蛍光測定で従来から採用されている「励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ」の組み合わせを採用してもよい。
【００３１】
本発明では、励起波長２５０〜５００ｎｍにおいて検体に含まれる蛍光物質が発する蛍光の強度を指標とするが、その具体的操作の代表例は、得られた蛍光強度値を基準値と比較することである。例えば、標準物質の蛍光強度を同時に測定し、当該測定値を基準値とすることができる。
より具体的には、例えば、安定な一定濃度の標準溶液を作製し、この標準溶液の蛍光強度を１００とした場合の相対値で検体の蛍光強度を表すことができる。
前記標準物質としては、公知の蛍光物質を用いることができる。当該蛍光物質は、上記の励起波長と発光波長で蛍光測定可能なものであれば特に限定されない。ＡＧＥｓである必要もない。複数の標準物質を用いてもよい。
標準物質となり得る蛍光物質の具体例としては、硫酸キニーネ、フルオレセインナトリウム、ローダミンＢなどが挙げられる。例えば、硫酸キニーネの０．１〜１ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液は安定であり、標準溶液として有用である。
【００３２】
その他、基準値がカットオフ値となるような標準物質を選択し、蛍光強度値が基準値以下の場合を非糖尿病、基準値を超える場合を糖尿病と判定することもできる。
また、段階希釈した標準物質を用いて検量線を作成してもよい。
【００３３】
本発明においては、尿を検体とする他の臨床マーカーと同様に、クレアチニン補正等の濃度補正をすることが好ましい。
尿中クレアチニンの測定方法としては、公知の方法をそのまま用いることができる。例えば、有機化学的測定法、紫外部吸収法、酵素的測定法、質量分析、などを用いることができる。このうち、紫外部吸収法は、尿又は尿の希釈物をそのまま測定試料とすることができ、簡便である。
クレアチニンによる補正以外では、尿の比重によって補正してもよい。
【００３４】
検体の蛍光強度の測定は、公知の蛍光分析装置を用いて行うことができる。例えば、分光蛍光光度計を用いることにより、検体の蛍光強度を測定することができる。また、蛍光マイクロプレートリーダーを用いることにより、マイクロプレートの各穴に入れた複数の検体の蛍光強度を同時に測定することができる。
【００３５】
さらに、マイクロデバイス（マイクロ流体デバイス、μＴＡＳ）を用いた微量分析技術を応用することもできる。例えば、試料導入部と、試料導入部に連通するマイクロ流路と、マイクロ流路に連通するとともに光学セルとして機能する検体収容部とを備えたマイクロデバイスを用意する。そして、試料導入部から検体（例えば、精製処理を経ていない尿希釈物）を導入し、マイクロ流路を経由して検体収容部に収容する。そして、検体収容部（光学セル）に収容された検体が発する蛍光強度を、蛍光分析装置で測定する。
このとき、マイクロデバイスとして検体収容部（光学セル）を２つ設けたものを採用し、一方の検体収容部を蛍光強度測定用、他方の検体収容部をクレアチニン濃度測定用として用いてもよい。この際のクレアチニン測定法としては、例えば、前記した紫外部測定法（２２０〜２５０ｎｍ）を用いることができる。
本発明にマイクロデバイスを適用することにより、微量の検体（測定試料）で蛍光測定を行うことが可能となる。さらに、光学セルの光路長（セルの厚み、液厚）を小さくすることにより、濃い尿であっても希釈を行わずに、尿そのものを測定試料とすることが可能となる。この際のセルの厚みとしては、例えば１００〜５００μｍ程度とすることができる。
【００３６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（１）血糖値及び血中ＨｂＡ１ｃ値との相関関係
血糖値と血中ＨｂＡ１ｃ値が分かっている成人男性１１４名の尿について、本発明による尿中の蛍光物質測定を行い、相関関係を調べた。なお、該１１４名の血糖値（ｍｇ／ｄＬ）の分布は、最小値８３、最大値２７１、平均値１１７．２５、標準偏差２７．０１６であった。また、血中ＨｂＡ１ｃ値（％）の分布は、最小値４．４、最大値９．９、平均値５．７０６、標準偏差１．０５６２であった。
【００３８】
尿をＰＢＳで１０〜２００倍に希釈し、蛍光測定用の検体（測定試料）を調製した。各測定試料２００μＬを前処理することなくそのまま蛍光測定用マイクロプレート（Greiner bio-one、762077）の各穴に入れ、マイクロプレートリーダー（Spectra Max Gemini EM; Molecular Devices, Sunnyvale, CA）にて蛍光強度（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）を測定した。別途、各尿検体について、Ｌタイプワコー  ＣＲＥ・Ｍ（和光純薬工業社）を用いてクレアチニン濃度を測定した。得られた蛍光強度値をクレアチニン濃度値で除し、補正された蛍光強度値（ＡＵ／ｇクレアチニン）を得た。
その結果、補正された蛍光強度値の分布は、最小値４６、最大値１２７６、平均値１９６．３３、標準偏差１５８．０６７であった。
【００３９】
ＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ社）により統計処理を行った。その結果、補正された蛍光強度値と血糖値とのPearsonの相関係数は０．２６０、有意確率（両側）は０．０５であった。また、補正された蛍光強度値と血中ＨｂＡ１ｃ値とのPearsonの相関係数は０．２８１、有意確率（両側）は０．０２であった。
以上より、尿の蛍光強度（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）は、血糖値及び血中ＨｂＡ１ｃ値と相関を有していた。
【００４０】
（２）蛍光強度による糖尿病と非糖尿病の判別
成人男性３９３名（糖尿病型２２名、非糖尿病型（健常人）３７１名）の尿を検体として用い、以下の測定を行った。なお、糖尿病型２２名の内訳は、
（ａ）糖尿病治療薬を使用している人：１５名
（ｂ）糖尿病治療薬を使用していないが空腹時血糖が１２６ｍｇ／ｄＬでＨｂＡ１ｃが６．１％以上の糖尿病診断基準を満たしている人：７名
であった。
【００４１】
尿をＰＢＳで１０〜２００倍に希釈し、蛍光測定用の検体（測定試料）を調製した。各測定試料２００μＬを前処理することなくそのまま蛍光測定用マイクロプレート（Greiner bio-one、762077）の各穴に入れ、マイクロプレートリーダー（Spectra Max Gemini EM; Molecular Devices, Sunnyvale, CA）にて蛍光強度（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）を測定した。
別途、各尿検体について、Ｌタイプワコー  ＣＲＥ・Ｍ（和光純薬工業社）を用いてクレアチニン濃度を測定した。得られた蛍光強度値をクレアチニン濃度値で除し、補正された蛍光強度値（ＡＵ／ｇクレアチニン）を得た。結果を図１（ａ），（ｂ）に示す。
【００４２】
補正された蛍光強度値（ＡＵ／ｇクレアチニン）の平均値±標準偏差は、非糖尿病型（３７１名）では１７１±１３２であった。一方、上記（ａ）の糖尿病型（１５名）では２６０±１８１、上記（ｂ）の糖尿病型（７名）では３４４±４１３、上記（ａ）（ｂ）を合わせて（２２名）２８７±２６９であった。
そして、非糖尿病型と糖尿病型（ａ）との間、非糖尿病型と糖尿病型（ｂ）との間、非糖尿病型と糖尿病型（ａ）及び（ｂ）との間、のいずれにおいても、補正された蛍光強度値に有意差（Ｐ＜０．０５）が認められた。
【００４３】
（３）励起波長と蛍光波長の検討
上記（２）の各検体について、励起波長を２６０〜５００ｎｍの範囲、蛍光波長を３００〜７００ｎｍの範囲で振って、蛍光強度（ＡＵ／ｇクレアチニン）を測定し、糖尿病群（２２例）と非糖尿病群（３７１例）での有意差検定を行った。結果を表１に示す。
すなわち、少なくとも励起波長２６０〜５００ｎｍの範囲で、蛍光強度に有意差が認められた（Ｐ＜０．０５、太字部分）。また蛍光波長については、少なくとも励起波長プラス２０ｎｍ程度の波長であれば、十分採用可能であった。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
（４）尿中アルブミンと蛍光強度の関係
上記（２）の各検体について尿中アルブミンを測定し、（Ｎ）２０ｍｇ／ｇクレアチニン以下（３５３例）、（Ｍｉ）２１〜２００ｍｇ／ｇクレアチニン（３６例、ミクロアルブミン尿）、（Ｍａ）２０１ｍｇ／ｇクレアチニン以上（４例、マクロアルブミン尿）、の３つの群に分けた。各群について、上記（２）で測定した蛍光強度（ＡＵ／ｇクレアチニン）を比較した。結果を図２に示す。
【００４６】
蛍光強度（ＡＵ／ｇクレアチニン）の平均値±標準偏差は、（Ｎ）では１７０±１４４、（Ｍｉ）では２２９±１２０、（Ｍａ）では３６１±２２３であった。そして、（Ｎ）と（Ｍｉ）との間、並びに、（Ｎ）と（Ｍａ）との間に有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。
このように、本発明の方法では、尿中アルブミンが高いほど、すなわち糖尿病の重症度が高いほど蛍光強度が高かった。本発明の方法によれば、重症度に応じた糖尿病の検出が可能であった。
【００４７】
なお、非特許文献４に記載の方法では、前処理として尿を限外ろ過に供しており、アルブミンは予め除去されている。そして、Ｎ群、Ｍｉ群、及びＭａ群の３群の間には有意差が認められない（例えば、Fig. 2B、Fig. 3）。この方法では、尿中アルブミンが検出されるような重症の糖尿病患者を見逃している可能性があり、重症度に応じた糖尿病の検出が困難であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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