(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍関連抗原に対する高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、それをコードする単離された核酸分子、前記ＴＣＲを発現するＴ細胞、及び、前記腫瘍関連抗原を発現する悪性細胞関連疾患の治療に使用する薬学的組成物の提供。【解決手段】腫瘍関連抗原、特にチロシナーゼに対して高い親和性を示す、ＴＣＲ又はＣＤＲ３領域等のＴＣＲの機能性部位をコードするそれらのフラグメント。更に、チロシナーゼ発現悪性細胞関連疾患、好ましくはメラノーマ、神経膠腫、膠芽細胞腫及び／又は外胚葉起源のまれな腫瘍を効果的に治療する、養子細胞療法に使用する薬学的組成物。【選択図】図２ａ
2015211682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原を認識するＴＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードし、
前記ＴＣＲのα鎖をコードする配列番号１の核酸配列、および／または、前記ＴＣＲのβ鎖をコードする配列番号２の核酸配列を有する核酸分子
または
前記各鎖のＣＤＲ３領域の外側におけるアミノ酸１〜１５個の１以上の付加もしくは欠失、および／または、アミノ酸１〜１５個の保存的置換により前記鎖が改変され、腫瘍抗原認識特性が維持もしくは向上される、前記α鎖または前記β鎖をコードする、それらの誘導体、
または
配列番号３もしくは４の核酸配列、または、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、腫瘍抗原を認識するＴＣＲのＣＤＲ３領域をコードする、それらのフラグメント、
または
１〜３個以下の連続するアミノ酸を超えない、アミノ酸１〜５個以下の１以上の付加および／または欠失、および／または、アミノ酸１〜６個の保存的置換により前記ＣＤＲ３領域が改変され、前記腫瘍抗原認識特性が維持もしくは向上される、前記フラグメントの誘導体。
【請求項２】
前記α鎖または前記β鎖をコードする配列の誘導体が、コドン最適化による配列番号１および２に由来し、
前記ＴＣＲのα鎖をコードする配列番号７の核酸配列、および／または、前記ＴＣＲのβ鎖をコードする配列番号８の核酸配列を含む、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記腫瘍抗原が、チロシナーゼである、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の１以上の核酸によりコードされる、または、配列番号５および／または６のアミノ酸配列を含む、ＴＣＲ、好ましくは可溶化ＴＣＲ。
【請求項５】
ａ）少なくとも一つのエピトープタグ、および
ｂ）請求項１から４のいずれか一項に記載の１以上のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列を含み、
前記エピトープタグが、下記ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される機能性ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質。
ｉ）前記α鎖および／または前記β鎖のＮ末端および／またはＣ末端に付加されたエピトープタグ、または、前記α鎖および／または前記β鎖配列の内側で、かつ前記ＣＤＲ３領域の外側に付加されたエピトープタグ
ｉｉ）前記α鎖および／または前記β鎖の定常領域に挿入されたエピトープタグ、および
ｉｉｉ）前記α鎖および／または前記β鎖の定常領域において、複数のアミノ酸を置換したエピトープタグ
【請求項６】
請求項４または５記載のＴＣＲ、または、請求項１記載の一つの前記ＣＤＲ３領域を含むＴＣＲを発現するＴ細胞。
【請求項７】
挿入された請求項１記載のＣＤＲ３領域を含む免疫グロブリン分子、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｅ）、ＴＣＲγ鎖／δ鎖。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか一項に記載の１以上の核酸、または、請求項４または５記載のＴＣＲをコードする核酸を含むベクター、好ましくはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または、遺伝子治療用の粒子および／またはベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターにより形質転換された細胞、好ましくはＰＢＬ。
【請求項１０】
請求項４または５記載のＴＣＲ、請求項６記載のＴ細胞、請求項７記載の免疫グロブリン分子、アンチカリン、ＴＣＲγ鎖／δ鎖、または、請求項９記載の細胞、および、薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物、好ましくは点滴または注射。
【請求項１１】
養子細胞療法に使用する薬剤の製造のための請求項１０記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１２】
前記薬剤が、患者の疾患、好ましくはＨＬＡ−Ａ２陽性患者の疾患、チロシナーゼ発現悪性細胞関連疾患、好ましくはメラノーマ、神経膠腫、膠芽細胞腫および／または外胚葉起源のまれな腫瘍（ｒａｒｅ  ｔｕｍｏｒｓ）の治療用である請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍関連抗原に対する高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、それをコードする単離された核酸分子、前記ＴＣＲを発現するＴ細胞、および、前記腫瘍関連抗原を発現する悪性細胞関連疾患の治療に使用する薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＣＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、２つのサブユニット、すなわち、α−サブユニットおよびβ−サブユニットからなる。これらは、一つのＮ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）領域、一つのＩｇ−定常（Ｃ）領域、膜貫通領域／細胞膜貫通領域、および、Ｃ末端に短い細胞質尾部を有する。前記ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の両方の前記可変領域は、３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有し、一方、前記β鎖の前記可変領域は、通常は抗原と接触しないためＣＤＲであるとは考えられていない、超可変の付加領域（ＨＶ４）を有する。
【０００３】
ＣＤＲ３は、処理抗原の認識を担う主要ＣＤＲであり、前記α鎖のＣＤＲ１は、抗原性ペプチドのＮ末端部に相互作用を示す。一方、前記β鎖のＣＤＲ１は、前記ペプチドのＣ末端部に相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣを認識すると考えられる。前記β鎖のＣＤＲ４は、抗原認識に関与すると考えられていないが、超抗原との相互作用を示す。前記ＴＣＲ領域の前記定常領域は、短い連結配列からなり、前記連結配列において、システイン残基が２つの鎖の間を連結するジスルフィド結合を形成する。
【０００４】
特定の抗原へのＴＣＲの親和性は、複数の治療アプローチに有益である。例えば、メラノーマ患者等のガン患者を、養子免疫療法の使用により、効果的に治療できる。
【０００５】
同種幹細胞移植（ＳＣＴ）において、リンパ球の前記養子免疫伝達について、悪性血液疾患を根絶する免疫系の能力が説明されている（Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。場合によっては、ＳＣＴが、腎細胞ガン（ＲＣＣ）等の充実性腫瘍を除去する機能を有することも明らかとなっている（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  ａｎｄ  Ｄｕｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ２００３）。ＳＣＴレシピエントでは、特異的Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで活性化し、その後、移植レシピエントにおける新たな造血系の発生により十分な量に増殖させなければならないため、悪性細胞の除去には数ヶ月から１年間もかかってしまう場合がある。また、前記ＳＣＴレシピエントにおける寛容が確立されるまでの期間（約６０日）の経過後、未刺激で未分離のリンパ球の伝達は、腫瘍細胞に対する免疫応答の発生を加速させてしまう。繰り返しになるが、腫瘍細胞を攻撃し得る特異的なリンパ球を活性化し、これを、移植された未選択群のリンパ球の中に存在する低頻度のリンパ球前駆細胞から増殖させなければならない。ＳＣＴ後の未選択のリンパ球群のドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）は、成長の遅い慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の除去には十分に機能するが、悪性細胞の生育が、免疫細胞の増殖能を上回るという事実により、急性白血病の根絶にはほとんど効果がない。免疫細胞が腫瘍細胞より増殖が遅いことによる増殖の差は、急速に進行する充実性腫瘍の免疫除去が効果的でないことにも影響を与えている。ＤＬＩにおいて、未選択の混合リンパ球群の使用についての第２の障害は、レシピエントの正常な細胞および組織を攻撃する能力を有するＴ細胞が移植されてしまった場合、罹患率および死亡率が高い移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こしてしまうことである。
【０００６】
近年の研究において、確定したペプチド特異性を有する選択されたＴ細胞の前記養子免疫伝達により、自家移植において、特に、患者に非骨髄破壊的療法（ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ）による前処理を施した場合、全身腫瘍組織量を大幅に減少させ得ることが説明されている（Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ２００３）。これにより、前記腫瘍患者にＳＣＴを行う必要性がなくなり、ＧＶＨＤの問題も回避される。
【０００７】
より急速に増殖する腫瘍を有する患者の治療に養子細胞療法（ＡＣＴ）の使用可能性を拡大するために、正常な組織に対する本格的な攻撃を避け、効果的に腫瘍細胞を攻撃するリガンド特異性が選択された、十分量のペプチド特異的エフェクターＴ細胞（ＣＤ４ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の両方）の移植が目標とされている。これらの細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで急速に大量に増殖させ、その後、ＡＣＴに使用される。また、このようなリガンド特異的Ｔ細胞の前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をクローニングし、レシピエント末梢血リンパ球、または十分に増殖でき、かつ、正常な宿主組織への攻撃能を有さない、確定した特異性を有する活性化Ｔ細胞のクローンのいずれかを使用し、活性化リンパ球におけるＴＣＲ導入遺伝子として発現できる。
【０００８】
例示として、レシピエントにより発現されないＭＨＣ分子に特異的な、増殖させた同種特異的Ｔ細胞クローン、または、サイトメガロウイルスもしくはエプスタイン−バーウイルス等のウイルスに特異的な増殖させたＴ細胞クローンを、遺伝子組換えＴＣＲのレシピエント細胞として使用できる。異なるＭＨＣペプチドリガンドを認識する遺伝子組換えＴＣＲベクター群を、ＣＤ４およびＣＤ８サブタイプの両方の前活性化Ｔ細胞を大量に増殖させるのに有効に使用できる。したがって、大量のエフェクターリンパ球を急速に調製でき、対応するＴＣＲリガンドを発現する腫瘍の患者に移植できる。これにより、腫瘍成長を抑制するのに必要な量の特異的Ｔ細胞を得る時間を省き、あるいは、急速に進行する腫瘍を、より効果的に根絶できる。
【０００９】
充実性腫瘍細胞と同様に、特異的Ｔ細胞が白血病およびリンパ腫を認識する決定因子は、多くの場合、自己のＭＨＣ分子により提示される過剰発現タンパク質由来の自己のペプチドである。このため、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の親和性が低い。自己免疫を避けるために、胸腺におけるリンパ球の増殖中に適用される負の選択により、親和性の高い受容体を有するＴ細胞が除外されてしまうためである。胸腺における増殖中に自己のＭＨＣ分子に対する負の選択がされていないリンパ球群から、前記Ｔ細胞を発生させれば、より効果的に腫瘍細胞を認識できる。
【００１０】
国際公開ＷＯ２００６／０３１２２１号パンフレット（特許文献１）は、腫瘍関連抗原に対するＴ細胞受容体、それをコードする核酸、前記Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含むベクターおよび細胞、ならびに、それらの使用方法に関連する。特に、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉおよびメラノーマ関連ｇｐ１００を提示する腫瘍細胞に対して、Ｔ細胞に特異性を授与するＴＣＲの形成能を有する、前記ＴＣＲのサブユニットが開示されている。
【００１１】
従来から、チロシナーゼを認識し、チロシナーゼに結合するＴＣＲについて記載された複数の科学文献および特許文献が存在する。Ｖｉｓｓｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９７）  ７２，  １１２２−１１２８（非特許文献１））では、複数のチロシナーゼ特異的ＴＣＲの親和性および特異性が記載され、メラノーマ患者の有効な治療法として、これらのＴＣＲの使用が提案されている。
【００１２】
Ｒｏｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）  １７０，  ２５８２−２５８９（非特許文献２）、および、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００５）  ６５，  １５７０−１５７６（非特許文献３））では、チロシナーゼ特異的ＴＣＲの特性が決定されている。
【００１３】
米国特許５，９０６，９３６号明細書（特許文献２）は、非ＭＨＣ拘束的標的細胞を殺傷し、それ以外の細胞を殺傷しない、特異的ＴＣＲ配列を含む細胞傷害性Ｔ細胞に関連する。
【００１４】
国際公開ＷＯ９７／３２６０３号パンフレット（特許文献３）は、非ヒトＴＣＲおよびヒトＨＬＡ拘束的腫瘍抗原に特異的なＴＣＲの製造方法に関連する。また、前記ＴＣＲ核酸および組換えＴ細胞、ならびに、複数の疾患の治療にＴＣＲ遺伝子組換えＴ細胞の投与について記載されている。
【００１５】
国際公開ＷＯ２００７／０６５９５７号パンフレット（特許文献４）には、抗原特異的ＴＣＲコードＲＮＡで形質転換されたエフェクターＴ細胞が記載されており、前記形質転換されたＴ細胞は、前記ＭＨＣ分子の複合体における前記抗原を認識し、前記抗原に結合する。腫瘍抗原として、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、チロシナーゼおよびサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）があげられている。
【００１６】
国際公開ＷＯ２００８／０３９８１８号パンフレット（特許文献５）には、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼ特異的ＴＣＲ配列が開示されており、ＣＤＲ２領域の置換により抗原認識性が向上することが記載されている。
【００１７】
上記従来技術のＴＣＲ配列は、全て自己または異種に由来し、同種異系には由来していない。
【００１８】
例えば、ＴＣＲ配列は、末梢血、またはＨＬＡ−Ａ２陽性メラノーマ患者の腫瘍浸潤性リンパ球由来のものである。このことは、これら全てのＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２自己拘束的ＴＣＲであること、または、ＨＬＡ−ＤＰ４拘束的、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的、もしくは両方の自己起源由来であることを意味している。代案として、国際公開ＷＯ９７／３２６０３号パンフレット（特許文献３）には、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子組換えマウス由来のＴＣＲが開示されている。この場合、前記配列は、異種系であり、前記従来技術の文献には、同種拘束的およびチロシナーゼ特異的ＴＣＲ配列は示されていない。
【００１９】
このため、腫瘍細胞上の特定のリガンドを認識可能な、高機能的な結合性ＴＣＲを有するＴ細胞を発生する手段を見出すことは、いまだに重要である。抗腫瘍機能を有する組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞の養子免疫伝達は、進行性腫瘍の患者の新たな治療法として有望であるが、種々の悪性腫瘍の治療に必要な特異的ＴＣＲを有する高結合性Ｔ細胞を同定することが重大なボトルネックとなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／０３１２２１号パンフレット
【特許文献２】米国特許５，９０６，９３６号明細書
【特許文献３】国際公開ＷＯ９７／３２６０３号パンフレット
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００７／０６５９５７号パンフレット
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００８／０３９８１８号パンフレット
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｖｉｓｓｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９７）  ７２，  １１２２−１１２８
【非特許文献２】Ｒｏｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２００３）  １７０，  ２５８２−２５８９
【非特許文献３】Ｒｏｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００５）  ６５，  １５７０−１５７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、本発明は、腫瘍関連抗原、特にチロシナーゼに対して高い親和性を示す、ＴＣＲまたはＣＤＲ３領域等のＴＣＲの機能性部位の提供を目的とする。さらに、本発明は、チロシナーゼ発現悪性細胞関連疾患、好ましくはメラノーマ、神経膠腫、膠芽細胞腫および／または外胚葉起源のまれな腫瘍を効果的に治療する、養子細胞療法に使用する薬学的組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
これらの目的は、独立請求項の主題により解決される。好ましい態様を従属請求項に示す。
【発明の効果】
【００２４】
メラノーマ関連抗原であるチロシナーゼに対する特異的ＴＣＲは、本発明者等により単離された。同種拘束的クローン由来のＴＣＲは、レシピエントのリンパ球における導入遺伝子としての発現後に、特定のペプチドおよび腫瘍細胞の認識性に優れていることが示された。したがって、ＴＣＲ、およびＣＤＲ３領域等のＴＣＲの機能性部位を同定し、複数の悪性腫瘍の治療に養子細胞療法（ＡＣＴ）への適用を見出した。
【００２５】
種々の腫瘍関連抗原に特異性を有するＴ細胞クローンは、長年にわたって多数報告されている（上記参照）。これらのＴＣＲのほとんどは、自己のＭＨＣ分子により拘束されてしまう。一方、ここで開示される前記ＴＣＲ配列は、同種拘束的であるが、特定のリガンドの認識において高い結合性を示す。本発明のＴＣＲは、自己ＭＨＣ拘束的でないため、共通する過剰発現自己タンパク質を介して腫瘍細胞を標的とするＭＨＣペプチドリガンドに対する相互作用のための高い構造的親和性を有する。実施例において要点を述べているように、本発明のＴＣＲは、同種異系のＨＬＡ−＊Ａ０２０１分子および抗原を共発現している、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナー由来の自己樹状細胞でのＣＤ８＊Ｔ細胞の刺激により発生させたＴ細胞クローンに由来する。この結果、本発明のＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ２陽性患者の治療に使用される。
【００２６】
より詳細には、腫瘍に対するＴ細胞応答は、過剰発現自己タンパク質に由来するペプチドを提示する自己ＭＨＣ分子に対しても起こってしまう場合がある。一般的に、自己ペプチド／自己ＭＨＣリガンドに高い結合性を有するＴ細胞は、自己免疫を避けるために、負の選択により除外される。残存する自己リガンドに特異的なＴ細胞における前記ＴＣＲの親和性は、通常低いが、腫瘍を効果的に根絶するには、高結合性Ｔ細胞が必要である。負の選択は自己ＭＨＣ分子に限定されるため、同種異系のＭＨＣ分子を認識するＴ細胞は、負の選択を受けない。一方、本発明において述べるように、同種異系のＭＨＣ分子によりペプチドが提示されれば、過剰発現自己タンパク質由来の共通する腫瘍関連リガンドに特異的な高結合性Ｔ細胞を得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１：ＤＣ刺激後の限界希釈培養から得られたクローンのスクリーニング。
【図２ａ】図２：クローンＴ５８とＩＶＳ−Ｂとの比較。図２ａ：メラノーマ細胞株に対する細胞傷害活性。
【図２ｂ】図２ｂ：多量体結合およびオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）の測定。図２ｃ：メラノーマ細胞株による刺激後のインターフェロン−γ分泌。図２ｄ：メラノーマ細胞株に対する細胞傷害活性。
【図３】図３：クローンＴ５８およびＩＶＳ−Ｂによる初期メラノーマ腫瘍細胞の認識。
【図４】図４：ＴＣＲレトロウイルス遺伝子伝達による抗原特異性の伝達。
【図５】図５：ＴＣＲレトルウイルス遺伝子伝達による、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼペプチド「ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ」に対するＴ５８およびＩＶＳ−Ｂの特異性の伝達。
【図６】図６：腫瘍細胞株および初期メラノーマ腫瘍細胞のチロシナーゼペプチド特異的ＣＴＬ認識。
【図７】図７：ＴＣＲ−Ｄ１１５およびＴＣＲ−Ｔ５８のレトルウイルス遺伝子伝達による、抗原特異性の伝達。
【図８】図８：ＴＣＲ−Ｄ１１５およびＴＣＲ−Ｔ５８のレトルウイルス遺伝子伝達による、抗原特異性の伝達。
【図９】図９：ＴＣＲ伝達が維持するサイトカインプロファイルの相違。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
第１の態様によれば、本発明は、腫瘍抗原を認識するＴＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードし、前記ＴＣＲのα鎖をコードする配列番号１の核酸配列、および／または、前記ＴＣＲのβ鎖をコードする配列番号２の核酸配列を有する核酸分子を提供する。
【００２９】
したがって、本発明のＴＣＲおよびそれをコードする核酸配列は、ここで定義される前記α鎖配列または前記β鎖配列の一方のみを含んでもよいし、さらなるα鎖またはβ鎖との組み合わせでもよいし、両方の鎖を含んでもよい。
【００３０】
核酸に関してここで使用される「核酸」という用語は、自然発生の核酸を参照する。前記自然発生の核酸は、前記両方の配列同士が直接接触しておらず、由来となる細胞の自然発生ゲノムにおいては、前記配列が直接接触している（５’末端の配列および３’末端の配列）。例えば、核酸は、制限されず、任意の長さの組換えＤＮＡ分子でもよく、通常、自然発生ゲノムにおける組換えＤＮＡ分子を除去または欠損する直接フランキング（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｆｌａｎｋｉｎｇ）が見出される核酸配列を含む。このため、核酸は、特に制限されず、ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡと同様に、他の配列から独立した分離分子（例えば、ｃＤＮＡ、または、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により製造されたゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡ、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルス）があげられる。加えて、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である、組換えＤＮＡ分子を含んでもよい。
【００３１】
また、ここで使用される「核酸」という用語は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ情報に基づくＤＮＡ合成により得られた配列等の、人工合成のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列も含む。
【００３２】
本発明の核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、好ましくはＴ細胞中で、ポリペプチドを発現できる限り、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはこれらの混合物を含んでもよい。本発明の核酸は、ＲＮＡが好ましく、より好ましくはＤＮＡである。
【００３３】
また、本発明は、前述の核酸分子の誘導体も含み、前述の配列番号１および２に関連し、前記配列は、付加、欠失および／または置換により改変され、前記腫瘍抗原認識特性が維持もしくは向上される。すなわち、少なくとも、前記腫瘍抗原認識特性が維持される。
【００３４】
より正確には、このような誘導体は、前記α鎖または前記β鎖をコードし、前記鎖は、前記各鎖のＣＤＲ３領域の外側におけるアミノ酸１〜１５個の１以上の付加もしくは欠失、および／または、アミノ酸１〜１５個の保存的置換により改変される。これに関連して、前記ＣＤＲ３領域は、改変されてもよいが、より少ない範囲がよい。これらの改良の定義は、後述のＣＤＲ３領域をコードするフラグメントの誘導体においても示す。
【００３５】
特に、全核酸配列における有用な改変は、コドン最適化およびエピトープタグの付加に関連し、詳細を、以下に説明する。このようなコドン最適化には、発現レベルの最適化、標的細胞に対する結合性の最適化、またはそれらの両方が含まれる。
【００３６】
一般的に、前記改変は、ＭＨＣとの関連で腫瘍関連抗原を認識するＴＣＲの一部を形成する、コードされたポリペプチドの親和性を減少または改変させないようにすべきであり、ガン細胞の破壊を促進し、好ましくは腫瘍または他の癌の状態の抑制を促進すべきである。
【００３７】
例えば、発現されるアミノ酸配列内に保存的置換により改変を行える。機能に影響を及ぼさないのであれば、ＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域に、これらの変異を行える。ただし、上記のように、前記ＣＤＲ３領域における付加および欠失（例えば、エピトープタグの付加等）は、行うべきではない。
【００３８】
「保存的アミノ酸置換」の概念は、当業者であれば理解でき、好ましくは、正電荷残基（Ｈ、ＫおよびＲ）をコードするコドンは、正電荷残基をコードするコドンで置換され、負電荷残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンは、負電荷残基をコードするコドンで置換され、中立極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹ）をコードするコドンは、中立極性残基をコードするコドンで置換され、中立非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＶおよびＷ）をコードするコドンは、中立非極性残基をコードするコドンで置換されることを意味する。これらの変異は、自発的に発生してもよいし、ランダム変異導入法により導入されてもよいし、定方向突然変異誘発法により導入されてもよい。これらの変異は、ガン細胞を破壊可能な高い結合性を有するＭＨＣに関連する抗腫瘍抗原を認識する、これらのポリペプチドの本質的な特性を破壊することなく行える。当業者であれば、変異アミノ酸および／またはそれをコードする核酸を、容易かつルーチンにスクリーニングし、これらの変異が、実質的にリガンド結合能を示すのか、破壊するのかを、公知の方法により決定できる。
【００３９】
更なる形態において、本発明は、腫瘍抗原を認識するＴＣＲのＣＤＲ３領域をコードし、配列番号３もしくは４の核酸配列、または、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前述の核酸分子のフラグメントを提供する。前記ＣＤＲ３領域における改変は、後述の検討事項に基づいて行える。
【００４０】
また、本発明は、１〜３個以下の連続するアミノ酸を超えない、アミノ酸１〜５個以下の１以上の付加および／または欠失、および／または、アミノ酸１〜６個の保存的置換により前記ＣＤＲ３領域が改変され、腫瘍抗原認識特性が維持もしくは向上される、誘導体を提供する。
【００４１】
より正確には、付加または欠失は、前記ＣＤＲ３領域においてアミノ酸１〜５個を付加または欠失する範囲で行えることを意味する。１回以上の付加または欠失を行う場合、付加または欠失されるアミノ酸の全数が、５個を超えないのがよい。また、より大きな付加／欠失を行うことにより、前記リガンド結合能が低下するため、一箇所での１回の付加または欠失は、１〜３個のアミノ酸の範囲、すなわち、連続するアミノ酸１〜３個のみであるのがよい。
【００４２】
前記ＴＣＲの前記α鎖または前記β鎖をコードする核酸分子の好ましい誘導体は、配列番号１および２の元の配列が、コドン最適化により改変されたものである。腫瘍抗原を認識するＴＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードする誘導体の好ましい例は、前記α鎖をコードする配列番号７の核酸配列、および、前記β鎖をコードする配列番号８の核酸配列である。
【００４３】
コドン最適化は、細胞系において外来遺伝子を最適に発現させる遺伝子技術である。最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドンの使用頻度、ならびに、望ましい配列モチーフおよび望ましくない配列モチーフの存在に依存する。コドン最適化は、アミノ酸配列を改変しないため、ここに記載されるように、保存的置換の定義には該当しない。
【００４４】
好ましい態様において、前記腫瘍抗原は、チロシナーゼである。チロシナーゼを発現する悪性腫瘍は、罹患率が高く、例えば、毎年世界中で、およそ１６０，０００人が新たにメラノーマと診断されている。ＷＨＯにより発行される報告書によれば、全世界で年間約４８，０００人が、メラノーマに関連して死亡している。このため、チロシナーゼは、腫瘍治療の標的となり得る適した腫瘍抗原である。
【００４５】
第２の形態において、本発明は、ＴＣＲを対象とし、好ましくは可溶性ＴＣＲであり、前述の核酸分子によりコードされるか、または、配列番号５および／または６のアミノ酸配列を含む。前記ＴＣＲは、下記ａ）およびｂ）を含み、機能性ＴＣＲα鎖および／または機能性ＴＣＲβ鎖の融合タンパク質の形状で存在することが好ましい。
ａ）少なくとも一つのエピトープタグ、および
ｂ）前述のＴＣＲ、または、前述の要約のような核酸分子によりコードされるＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列
前記エピトープタグは、下記ｉ）〜ｉｉｉ）から選択される。
ｉ）前記α鎖および／または前記β鎖のＮ末端および／またはＣ末端に付加されたエピトープタグ、または、前記α鎖および／または前記β鎖配列の内側で、かつ前記ＣＤＲ３領域の外側に付加されたエピトープタグ
ｉｉ）前記α鎖および／または前記β鎖の定常領域に挿入されたエピトープタグ、および
ｉｉｉ）前記α鎖および／または前記β鎖の定常領域において、複数のアミノ酸を置換したエピトープタグ
【００４６】
エピトープタグは、特異的抗体を発生させ得る、アミノ酸の短いストレッチである。複数の実施形態において、生体組織または培養細胞に添加されたタグ付加タンパク質を、特異的に同定でき、追跡できる。タグ付加分子の検出は、複数の異なる技術を使用し行える。このような技術は、例えば、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウェスタン）およびアフィニティークロマトグラフィーがあげられる。エピトープタグは、目的のタンパク質に既知エピトープ（抗体結合部位）を付加し、多くの場合、高い親和性を有する既知抗体への結合を提供する。これにより、生体組織または培養細胞に添加されたタグ付加タンパク質を、特異的に同定でき、追跡できる。
【００４７】
本発明に関連して、「機能性」Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質は、前記鎖が、エピトープタグを含む、および／または、付加されたタグを有し、前記融合において、少なくとも実質的に融合タンパク質の生物活性が維持されている、α鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質を意味してもよい。ＴＣＲの前記α鎖および／または前記β鎖の場合、このことは、生物学的機能、特に、前記ＴＣＲの特異的ペプチドＭＨＣ複合体に結合する機能、および／または、ペプチド活性化による機能性シグナル変換を発揮する、Ｔ細胞受容体（非修飾α鎖／β鎖、または、他の本発明の融合タンパク質α鎖および／またはβ鎖）の形成能が、両方の鎖に残存することを意味してもよい。
【００４８】
本発明によれば、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質は、前記エピトープタグが、６〜１５個、好ましくは９〜１１個のアミノ酸の鎖長を有するものが好ましい。
【００４９】
本発明によれば、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質は、間隔を空けて、または、直接相前後する、２つ以上のエピトープタグを含むのがより好ましい。前記融合タンパク質の具体例は、前記融合タンパク質が、その生物活性／活性（機能性）を維持する限り、例えば、２、３、４、５またはそれ以上のエピトープタグを含み得る。
【００５０】
本発明によれば、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質において、前記エピトープタグは、特に制限されず、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、または、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｔ７−タグ、ＨＡ（血球凝集素）−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓ−タグ、ＧＳＴ−タグもしくはＧＦＰ−タグ等の他の従来公知のタグから選択されることが好ましい。ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは、実在する分子由来のエピトープである。一方、ＦＬＡＧは、高い抗原性に設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許４，７０３，００４号明細書および米国特許４，８５１，３４１号明細書参照）。前記ｍｙｃタグは、その検出に高品質試薬を利用できるため、好ましく使用できる。当然のことながら、エピトープタグは、抗体による認識以外に、１以上の付加機能を有してもよい。これらのタグの配列は、文献に記載されており、当業者に周知である。
【００５１】
本発明によれば、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖および／またはβ鎖の融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、例えば、α−ＴＣＲ−鎖のＮ末端に付加された２つのｍｙｃ−タグ配列、および／または、前記２つのｍｙｃ−タグ配列に置換されたβ鎖の定常領域における突出ループ（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  ｌｏｏｐ）領域の１０個のアミノ酸から選択されてもよい。
【００５２】
本発明の実施形態において、本発明者は、Ｔ細胞受容体構造の複数の適切な部位に、ｍｙｃタンパク質（ｍｙｃ−タグ）の一部に相当するアミノ酸配列を挿入し、Ｔ細胞中に、この修飾された受容体を形質導入した（後述の実施例を参照）。前記ＴＣＲ構造にタグを導入することで、前記患者に前記タグ特異的抗体を投与することにより、前記修飾された細胞を激減できる。
【００５３】
機能性ＴＣＲ融合タンパク質を、ａ）少なくとも一つのエピトープ提供アミノ酸配列（エピトープタグ）、および、ｂ）前述のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列を含む融合タンパク質からなる群から選択される融合タンパク質を発現する宿主細胞群を選択する方法に使用してもよい。前記エピトープタグは、前記α鎖および／または前記β鎖のＮ末端および／またはＣ末端に付加されたエピトープタグ、または、前記α鎖および／または前記β鎖配列の内側で、かつ前記ＣＤＲ３領域の外側に付加されたエピトープタグ、前記α鎖および／または前記β鎖の定常領域に挿入されたエピトープタグ、および、前記α鎖および／または前記β鎖の定常領域において、複数のアミノ酸を置換したエピトープタグから選択される。ＴＣＲは、前記宿主細胞表面において、前述の少なくとも一つの融合タンパク質を含む。前記宿主細胞群の選択方法は、免疫学的に前記エピトープタグに結合する結合剤に、試料中の宿主細胞を接触する工程、および、前記結合に基づく前記宿主細胞の選択工程を含む。
【００５４】
また、本発明は、ここで定義したように、挿入されたＣＤＲ３領域（またはその誘導体）を含む免疫グロブリン分子、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｅ）、ＴＣＲγ鎖／δ鎖を提供する。
【００５５】
第３の形態において、本発明は、ここで定義したように、ＴＣＲ、または、前述のＣＤＲ３領域の１つを含むＴＣＲを発現するＴ細胞に関連する。
【００５６】
また、本発明は、前述の核酸分子を１つ以上含む、ベクター、好ましくはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または、遺伝子治療用の粒子および／またはベクターを提供する。
【００５７】
本発明に関連して、「ベクター」は、宿主細胞に形質導入される核酸分子を意味してもよく、その結果、形質転換宿主細胞が製造される。ベクターは、例えば、複製起点等の、宿主細胞において複製を可能にする核酸配列を含んでもよい。ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子および当業者にとって既知の他の遺伝要素も含んでよい。ベクターは、前記核酸を発現させる配列に操作可能に連結された、本発明の核酸を含む発現ベクターが好ましい。
【００５８】
第４の形態は、前述のベクターにより形質転換された細胞、好ましくは末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を提供する。単離されたＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローニング、および／または、ＰＢＭＣにおけるＴＣＲ導入遺伝子の発現は、Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．において記載されたような確立された方法により行える。
【００５９】
第５の形態において、本発明は、前述のＴＣＲ、Ｔ細胞または細胞（ＰＢＬ）、および、薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００６０】
本発明の活性成分は、許容されるキャリアまたはキャリア材料に混合された用量で、前記疾患を治療または少なくとも緩和し得る、薬学的組成物に使用されるのが好ましい。このような組成物は、前記活性成分および前記キャリアに加えて、従来公知の充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、およびその他の材料を含んでもよい。
【００６１】
「薬学的に許容される」という用語は、前記活性成分の生物活性の有効性を妨げない、無毒性材料を意味する。前記キャリアは、用法に応じて選択する。
【００６２】
前記薬学的組成物は、前記活性成分の活性を増進するか、前記処置を補う付加成分を含んでもよい。このような付加成分および／または因子は、相乗効果を果たすか、不都合または望ましくない効果を最小化することにより、前記薬学的組成物の一部としてもよい。
【００６３】
本発明の活性成分の剤形または調製技術、および、用法／投薬については、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ）」の最新版に記載されている。適切な用法は、非経口投与、例えば、筋肉内注射、皮下注射、骨髄内注射、髄腔内注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、結節内注射、腹腔内注射または腫瘍内注射である。前記静脈注射は、患者の治療に最も好ましい。
【００６４】
好ましい態様によれば、前記薬学的組成物は、点滴または注射である。
【００６５】
注射可能な組成物は、薬学的に許容される液体組成物であり、少なくとも一つの活性成分、例えば、ＴＣＲを発現するＴ細胞群（例えば、自己または治療対象の患者に対して同種異系）を増殖させる活性成分を含む。前記活性成分は、通常、生理学的に許容されるキャリアに溶解または懸濁させる。前記組成物は、１以上の非毒性補助物質、例えば、乳化剤、防腐剤およびｐＨ緩衝剤等を、少量付加的に含んでもよい。ここで開示する前記融合タンパク質とともに使用するのに有用な注射可能な組成物は、従来公知であり、適切な剤形は、当業者に周知である。
【００６６】
さらなる形態において、本発明は、養子免疫療法を必要とする患者の治療方法に関し、前記方法は、前記患者に前述の薬学的組成物を投与する工程を含む。治療対象の前記患者は、ＨＬＡ−Ａ２陽性患者群に属することが好ましい。
【００６７】
前記患者は、チロシナーゼ発現悪性細胞関連疾患、好ましくはメラノーマ、神経膠腫、膠芽細胞腫および／または外胚葉起源のまれな腫瘍を患っていることが好ましい。
【００６８】
以下、本発明を、添付の図面および実施例により説明する。以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然のことながら、本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【００６９】
図１：ＤＣ刺激後の限界希釈培養から得られたクローンのスクリーニング
Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡを発現している樹状細胞で刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで２ラウンドの刺激後、細胞を限界希釈によりクローニングした。１４〜２８日後、個々の培養ウェルにおいて十分に増殖したＴ細胞クローンを、光学顕微鏡で同定した。十分に増殖したクローンを取得し、２種類のメラノーマ標的細胞株に対する殺傷活性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより測定した。Ｍｅｌ−Ａ３７５細胞は、ＨＬＡ−Ａ２を発現するが、チロシナーゼを発現しない。Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現し、ＨＬＡ−Ａ２拘束的なチロシナーゼペプチド特異的Ｔ細胞により認識されるリガンドを形成し得る。Ｍｅｌ−Ａ３７５細胞がＴ細胞クローンにより認識される場合、前記クローンがアロ反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）であり、チロシナーゼペプチドと独立してＨＬＡ−Ａ２を認識することを意味する（すなわち、クローンＴ４１およびＴ４２）。前記Ｔ細胞がＭｅｌ−９３．０４Ａ１２細胞のみを認識する場合、前記Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドリガンドに対する特異性を有する（すなわち、Ｔ５８およびＴ４３）。種々のＴ細胞クローンによる特異的溶解の割合を、２種類の標的メラノーマ細胞株について示す（ｘ軸に表示）。矢印は、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２に強力な殺傷性を示すが、Ｍｅｌ−Ａ３７５には殺傷性を示さないクローンＴ５８を示す。このクローンを、強力な増殖能に基づいて、さらなる特性評価用に選択した。
【００７０】
図２：クローンＴ５８とＩＶＳ−Ｂとの比較
図２ａ：メラノーマ細胞株に対する細胞傷害活性
クローンＴ５８の殺傷能を、メラノーマ患者由来のクローンＩＶＳ−Ｂと比較した。比較の際、アミノ酸配列「ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ」の合成チロシナーゼペプチドを、ｘ軸に示す種々の濃度（Ｍ）でパルスしたＴ２細胞株を、標的細胞として使用する。％相対的溶解を、ｙ軸に示す。５０％相対的溶解に対応するペプチド濃度は、線の交差により示され、クローンＴ５８がクローンＩＶＳ−Ｂと比較して、実質的により低濃度でペプチドを認識できることを示す。
【００７１】
図２ｂ：多量体結合およびオフレートの測定
０時間における陽性細胞の割合を決定するために、２種類のクローンを、多量体とインキュベートした。両方のクローンとも、１００％の割合で前記細胞に多量体を結合した。多量体を洗い流し、前記クローンを、ＨＬＡ−Ａ２特異的抗体を含む培地でインキュベートした。多量体が細胞表面から放出された場合、前記多量体は前記抗体に捕捉され、前記細胞に再結合できない。１時間および２時間後における多量体−陽性細胞の割合を、再度分析した。
【００７２】
図２ｃ：メラノーマ細胞株による刺激後のインターフェロン−γ分泌
クローンＴ５８およびＩＶＳ−Ｂを、前記初期スクリーニング（図１に記載）に使用した２種類のメラノーマ細胞株と共培養し、２４時間後に、培養液中へのＩＦＮ−γの分泌を、標準的なＥＬＩＳＡにより評価した。ｎ．ｄ．は、不検出。データを、ｙ軸にｐｇ／ｍｌで表す。
【００７３】
図２ｄ：メラノーマ細胞株に対する細胞傷害活性
前記クローンについて、図１に記載したのと同様に、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、殺傷活性を比較した。データを、ｙ軸に特異的溶解割合として示す。
【００７４】
図３：クローンＴ５８およびＩＶＳ−Ｂによる初期メラノーマ腫瘍細胞の認識
（ａ）５０μｇ  ＨＬＡ−Ａ２  ｉｖｔ−ＲＮＡで形質転換した、ＨＬＡ−Ａ２−メラノーマ患者の初期腫瘍細胞（１２代継代）上のＨＬＡ−Ａ２表面発現、ならびに、確立したメラノーマ細胞株Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）およびＭｅｌ−Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）上のＨＬＡ−Ａ２表面発現を、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより測定した。各ヒストグラムは、染色された試料（塗りつぶした曲線）および対応するコントロール試料（空白の曲線）を示す。コントロール曲線は、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体で染色された、形質転換されていない初期腫瘍細胞（左のヒストグラム）、または、アイソタイプのコントロール抗体で染色されたメラノーマ細胞株を表す。ＲＮＡで形質転換した初期腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ２タンパク質の発現を、エレクトロポレーションから１０時間後に検出した。（ｂ）患者由来のＴ細胞クローン（ＩＶＳ−Ｂ）およびＴ細胞クローンＴ５８のＩＦＮ−γの分泌能、または、（ｃ）上記のメラノーマ細胞との共培養における放出パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した。
【００７５】
図４：ＴＣＲレトロウイルス遺伝子伝達による抗原特異性の伝達
（ａ）ヒトＴＣＲ欠損Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ７６９に、Ｔ細胞クローンＴ５８のＴＣＲを形質導入した。ＴＣＲ発現を、チロシナーゼペプチド特異的なＨＬＡ−多量体を使用して検出した。ＴＣＲ発現は、ＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入したＪｕｒｋａｔ７６細胞においてのみ検出され（右のヒストグラム）、形質導入していないＪｕｒｋａｔ７６細胞では、検出されなかった（左のヒストグラム）。（ｂ）健常ドナーのＰＢＬに、レトロウイルスによりＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入した。１０日後、形質導入していないＰＢＬおよびＴＣＲ形質導入ＰＢＬについて、特異的ＨＬＡ多量体を使用して、チロシナーゼＴＣＲ発現を分析した。染色する多量体をｘ軸に示し、染色するＣＤ８をｙ軸に示す。多量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、右上四分の一の位置に表示する。（ｃ）ＴＣＲ形質導入ＰＢＬの機能性を、標準的なＩＦＮ−γ放出アッセイを使用して測定した。段階的にチロシナーゼ３６９−３７７ペプチド（１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍ）を負荷したＴ２細胞を、標的細胞とし、標的細胞に対する固定化エフェクターと１：１の割合で使用した。形質導入していないＰＢＬをコントロールとしたところ、これは、チロシナーゼペプチド特異的ＩＦＮ−γ放出を示さなかった（データ示さず）。データは、形質導入していないＰＢＬコントロールによる分泌を差し引いた後のサイトカインｐｇ／ｍｌを示す。（ｄ）メラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ＋）、Ｍｅｌ−Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）、Ｍｅｌ−６２４．３８（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）およびＭｅｌ−９３．０４Ａ１２（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）との共培養におけるＩＦＮ−γ分泌能を、標準的なＩＦＮ−γ放出アッセイを使用し、Ｅ：Ｔ＝１：１で評価した（ｎ．ｄ．は、不検出）。
【００７６】
図５：ＴＣＲレトルウイルス遺伝子伝達による、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼペプチド「ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ」に対するＴ５８およびＩＶＳ−Ｂの特異性の伝達
（ａ）健常ドナーのＰＢＬに、前記患者由来のＴＣＲ−ＩＶＳ−Ｂまたは前記ＴＣＲ−Ｔ５８をレトロウイルスにより形質導入した。１１日後、形質導入していないＰＢＬおよびＴＣＲ形質導入ＰＢＬについて、チロシナーゼＴＣＲ発現を、特異的ＨＬＡ多量体を使用して分析した。染色する多量体をｘ軸に示し、染色するＣＤ８をｙ軸に示す。多量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、右上四分の一の位置に表示する。（ｂ）ＴＣＲ形質導入ＰＢＬの機能性を、標準的なＩＦＮ−γ放出アッセイを使用して測定した。段階的にチロシナーゼ３６９−３７７ペプチド（１０−１１Ｍ〜１０−５Ｍ）、または、１０−５Ｍの無関係のインフルエンザマトリックスタンパク質５８−６６を負荷したＴ２細胞を、標的細胞とし、標的細胞に対する固定化エフェクターと１：１の割合で使用した。形質導入していないＰＢＬをコントロールとしたところ、これは、チロシナーゼペプチド特異的ＩＦＮ−γ放出を示さなかった（データ示さず）。データは、形質導入していないＰＢＬコントロールによる分泌を差し引いた後のサイトカインｐｇ／ｍｌ（平均値＝３１８ｐｇ／ｍｌ；範囲＝２１９〜３６８ｐｇ／ｍｌ）を、比較可能な多量体＋細胞の調整値として示す。
【００７７】
図６：腫瘍細胞株および初期メラノーマ腫瘍細胞のチロシナーゼペプチド特異的ＣＴＬ認識
各列に、腫瘍細胞株群との共培養における、自己拘束的Ｄ１１５ＣＴＬおよび同種拘束的Ｔ５８ＣＴＬにより分泌されたＩＦＮ−γ量（ｐｇ／ｍｌ）を表す。左から右にかけて：ＭａＣａ１（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−）；ＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ＋）；Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６、ＰａｎｃＴｕ  １、ＭａＣａ１／Ａ２およびＵＴＳ  ＣＣ  １５８８（全てＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）；Ｍｅｌ−６２４．３８、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２、ＳＫ−Ｍｅｌ−２３、ＳＫ−Ｍｅｌ−２９およびＷＭ−２６６−４（全てＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）。Ｔ細胞は、刺激細胞以外はＣＴＬを使用する。前記ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−腫瘍細胞株Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６およびＭａＣａ１／Ａ２に、１０−５Ｍの無関係のｆｌｕペプチドまたは１０−５ＭのチロシナーゼペプチドＹＭＤを外部から負荷し、ＩＦＮ−γの分泌をＥＬＩＳＡにより測定し、ｐｇ／ｍｌで示した。
【００７８】
図７：ＴＣＲ−Ｄ１１５およびＴＣＲ−Ｔ５８のレトルウイルス遺伝子伝達による、抗原特異性の伝達
健常ドナーのＰＢＬに、ＴＣＲ−Ｄ１１５またはＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入した。腫瘍細胞株との共培養におけるＩＦＮ−γ放出により、認識の特異性を評価した。左から右にかけて：ＭａＣａ１（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−）；ＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ＋）；Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６、ＰａｎｃＴｕ  １、ＭａＣａ１／Ａ２およびＵＴＳ  ＣＣ  １５８８（全てＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）；Ｍｅｌ−６２４．３８、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２、ＳＫ−Ｍｅｌ−２３、ＳＫ−Ｍｅｌ−２９およびＷＭ−２６６−４（全てＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）。Ｔ細胞は、刺激細胞以外はＣＴＬを使用する。前記ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−腫瘍細胞株Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６およびＭａＣａ１／Ａ２に、１０−５Ｍの無関係のｆｌｕペプチドまたは１０−５ＭのチロシナーゼペプチドＹＭＤを外部から負荷し、ＩＦＮ−γの分泌をＥＬＩＳＡにより測定し、ｐｇ／ｍｌで示した。
【００７９】
図８：ＴＣＲ−Ｄ１１５およびＴＣＲ−Ｔ５８のレトルウイルス遺伝子伝達による、抗原特異性の伝達
（Ａ）健常ドナーのＰＢＬに、ＴＣＲ−Ｄ１１５またはＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入した。未分類のＴＣＲ形質導入ＰＢＬを、無関係のＢ７−ｐｐ６５およびＡ２−ｐｐ６５多量体、ならびに、特異的Ａ２−ｔｙｒ多量体を使用し、遺伝子組換えＴＣＲ発現から１０日後に分析した。形質導入していないＰＢＬは、多量体への結合を示さなかった（０．１％、データ示さず）。多量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、右上四分の一の位置に表示する。
（Ｂ）および（Ｃ）は、段階的にチロシナーゼペプチド（１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍ）を負荷したＴ２細胞を用いて、２：１の割合で刺激した、未分類のＴＣＲ形質導入ＰＢＬのＩＦＮ−γ放出を示す。（Ｂ）において、相対的ＩＦＮ−γ放出を％で表示し、（Ｃ）において、前記特異的なＩＦＮ−γ放出をｐｇ／ｍｌで表示する。（Ｄ）未分類のＴＣＲ形質導入ＰＢＬの機能性を、チロシナーゼペプチド（１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍ）を負荷した自己ＨＬＡ−Ａ２＋ＰＢＭＣを刺激細胞とし、２：１の割合で用いたＩＦＮ−γ放出により、測定した。形質導入していないＰＢＬ（▲）は、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ放出を示さなかった。（Ｅ）前記ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−腫瘍細胞株Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６およびＭａＣａ１／Ａ２に、１０−５Ｍの無関係のｆｌｕペプチド（ｆ）または１０−５Ｍのチロシナーゼ−ペプチドＹＭＤ（ｔ）を外部から負荷し、ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡにより測定し、ｐｇ／ｍｌで示した。（Ｆ）腫瘍細胞株との共培養におけるＩＦＮ−γ放出により、認識の特異性を評価した。左から右にかけて：ＭａＣａ１（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−）；ＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ＋）；Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６、ＰａｎｃＴｕ  １、ＭａＣａ１／Ａ２およびＵＴＳ  ＣＣ  １５８８（全てＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）；Ｍｅｌ−６２４．３８、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２、ＳＫ−Ｍｅｌ−２３、ＳＫ−Ｍｅｌ−２９およびＷＭ−２６６−４（全てＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）。Ｔ細胞は、刺激細胞以外はＣＴＬを使用する。
【００８０】
図９：ＴＣＲ伝達が維持するサイトカインプロファイルの相違
（Ａ−Ｄ）左側は、メラノーマ株Ｍｅｌ−Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）およびＭｅｌ−６２４．３８（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）との共培養における、ＴＣＲ形質導入ＰＢＬのサイトカイン放出を示す。右側は、段階的にチロシナーゼペプチド（１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍ）を負荷したＴ２細胞による刺激後の、対応するサイトカイン放出を示す。形質導入していないＰＢＬ（▲）は、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ放出を示さなかった。以下のサイトカインが検出された：ＩＦＮ−γ（Ａ）、ＩＬ−２（Ｂ）、ＴＮＦ−α（Ｃ）およびＭＩＰ−１β（Ｄ）。全４種類のサイトカイン分泌レベルは、同種拘束的ＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入したＰＢＬを使用した場合が、より高かった。Ｔ２細胞に対する応答において、形質導入していないＰＢＬが非常に高いレベルでＭＩＰ−１βを分泌したため、このサイトカインの前記ペプチド滴定は、評価できなかった。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２陰性健常ドナー由来の刺激性樹状細胞（ＤＣ）を調製した１、２。前記ＤＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたチロシナーゼおよびＨＬＡ−Ａ２の（ｉｖｔ）−ＲＮＡをエレクトロポレーションした成熟ＤＣを使用し、同種異系のＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子およびチロシナーゼタンパク質を共発現させたものである。これらのＤＣは、精製された自己ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激に使用した。新鮮に調製したＤＣにより、２ラウンドの刺激を行った。２ラウンドの刺激後、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ３６９−３７７ペプチド複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を、チロシナーゼ３６９−３７７／ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１多量体を使用して染色した３。ＣＤ８＋多量体＋細胞を、蛍光活性化セルソーティングにより単離した。ソートした細胞を、限界希釈培養でクローニングし、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼペプチド特異性を示す単離クローンを、抗原依存刺激の使用により増殖させた４。前記Ｔ細胞クローンＴ５８を、良好な機能的活性を有するクローンとして、初期スクリーニングにおいて同定した（図１）。
【００８２】
Ｔ５８は、ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１陰性ドナーから単離されたため、ｉｎ ｖｉｖｏで負の選択を受けない同種拘束的Ｔ細胞クローンである。前記Ｔ５８クローンの活性を、転移性メラノーマ患者から単離されたＩＶＳ−Ｂクローンと比較した５。このクローンは、クローンＴ５８のように、同じＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼペプチドリガンドを正確に認識するが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性患者の生体内で活性化されるため、自己拘束的である。患者由来のこのＴ細胞クローンは、生体内で胸腺における自己ペプチド／自己ＭＨＣ分子に対する負の選択を受ける、末梢レパートリーに利用されるＴ細胞の一種である。
【００８３】
クローンＴ５８とＩＶＳ−Ｂとの比較対照により、前記自己拘束的ＩＶＳ−Ｂクローンに対して、前記同種拘束的Ｔ５８クローンが優れた性質を有することが証明された。チロシナーゼ３６９−３７７認識における機能的Ｔ細胞の結合性を、段階的に外来ペプチドでパルスしたＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２細胞を標的細胞として使用し、５１Ｃｒ放出アッセイにより測定した。５０％相対的溶解に要する前記ペプチドの濃度を、半値溶解値と定義した６。前記同種拘束的Ｔ細胞クローンＴ５８は、クローンＩＶＳ−Ｂと比較して、ペプチドでパルスしたＴ２細胞により、実質的により少ないペプチドで活性化された（６．０×１０−１０Ｍ  ｖｓ．３．０×１０−８Ｍ）（図２ａ）。
【００８４】
構造的なＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド結合親和性の判断として、経時的な多量体結合の減少を測定した（すなわち、ＨＬＡ−多量体オフレート）。オフレートが遅いということは、ＴＣＲ−リガンド相互作用がより安定的であり、より高い構造的親和性を示す７。多量体との最初のインキュベートおよび洗浄の後に、放出された多量体の細胞への再結合を妨げるためのＨＬＡ−Ａ２特異的抗体の存在下、多量体を使用せずに、Ｔ細胞を１時間および２時間インキュベートした。前記メラノーマ患者由来のＴ細胞クローンＩＶＳ−Ｂは、中程度の多量体結合を示した。０時間で全細胞が多量体＋であり、１時間および２時間で細胞の約４０％が多量体を保持した（図２ｂ）。一方、クローンＴ５８のオフレートはより遅く、１時間で、クローンＩＶＳ−Ｂが４１％であるのに対し、７４％の陽性結合を示し、２時間後でも、より多量体＋細胞を有していた（５５％  ｖｓ．４０％）。
【００８５】
両方のＴ細胞クローンについて、ＩＦＮ−γ放出アッセイにより、機能および特異性を分析した（図２ｃ）。前記クローンを、ＨＬＡ−Ａ２分子を発現し且つチロシナーゼタンパク質の発現がそれぞれで異なる２種類のメラノーマ細胞株と共培養した。メラノーマ細胞Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２は、両方のタンパク質を共発現するが（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋）、Ｍｅｌ−Ａ３７５は、チロシナーゼタンパク質を発現せず（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−）、前記Ｔ細胞クローンに認識される前記ＭＨＣペプチドリガンドを発生しない。同種拘束的Ｔ細胞クローンＴ５８は、チロシナーゼ発現メラノーマ細胞株により、ＩＦＮ−γの分泌が高いレベルで誘導されたが、ＩＶＳ−Ｂ細胞では、わずかなサイトカイン分泌しか見られなかった（１，２３４ｐｇ／ｍｌ  ｖｓ．１０６ｐｇ／ｍｌ）。ＨＬＡ−Ａ２チロシナーゼリガンドを発現する腫瘍細胞の認識において、クローンＴ５８が非常に優れた機能を有することが証明された。予想したとおり、前記クローンにおいて、Ｍｅｌ−Ａ３７５細胞による刺激後、ＩＦＮ−γ分泌が検出されず、腫瘍細胞認識におけるＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼ発現に対する特異性が証明された。
【００８６】
同種拘束的クローンＴ５８の前記殺傷能も、５１Ｃｒ放出アッセイを使用し、クローンＩＶＳ−Ｂと比較した（図２ｄ）。クローンＴ５８が優れた機能を有することが改めて示された（７６％  ｖｓ．２４％特異的溶解）。
【００８７】
両方のクローンについて、初期メラノーマ細胞の認識能を評価した。初期ＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞を使用せずに、ＤＣと同様に、腫瘍細胞にＨＬＡ−Ａ２のｉｖｔ−ＲＮＡを導入した（図３ａ）。初期腫瘍細胞における放射線標識の高い自然放出を避けるために、ＩＦＮ−γ分泌およびパーフォリン放出を検出するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、機能を測定した。ＨＬＡ−Ａ２ＲＮＡを欠損する初期腫瘍細胞が認識されなかったため、初期腫瘍細胞の認識は、ＨＬＡ−Ａ２拘束的であることが示された。ＩＦＮ−γ分泌（図３ｂ）およびパーフォリン分泌（図３ｃ）による評価が示すように、前記患者の自己拘束的ＩＶＳ細胞はほとんど認識しないのに対して、同種拘束的Ｔ５８は良好に認識するという、強力な相違が確認された。
【００８８】
ＴＣＲによる同種拘束的Ｔ５８細胞の優れた機能的結合性を証明するために、クローンＴ５８のＴＣＲα鎖およびβ鎖について、別々の組換えレトロウイルスを作製した８。ヒトＴＣＲ欠損Ｊｕｒｋａｔ７６細胞９に、前記α鎖および前記β鎖レトロウイルスを共感染させ、遺伝子組換えＴＣＲの発現を、多量体染色により測定した。ＴＣＲ−Ｔ５８は、良好なレベルで発現し、前記それぞれのレトロウイルス上清が適切な品質であることが証明された（図４ａ）。つぎに、健常ＨＬＡ−Ａ２−ドナーの活性化末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に形質導入し、チロシナーゼ特異的ＴＣＲ発現用の多量体により分析した（図４ｂ）。低頻度にも関わらず、ＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入したＰＢＬは、段階的にチロシナーゼペプチドでパルスしたＴ２細胞による刺激で、多量のＩＦＮ−γを放出した（図４ｃ）。ＴＣＲ−Ｔ５８形質導入ＰＢＬは、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現するメラノーマ細胞株による刺激に対して、特異的に応答した（図４ｄ）。これにより、ＨＬＡ−Ａ２またはチロシナーゼを発現しなかった腫瘍細胞には応答せず、Ｔ５８による認識について、改めてＨＬＡ−Ａ２チロシナーゼリガンドの特異性が証明された。
【００８９】
ＩＶＳ−Ｂ細胞における前記ＴＣＲのα鎖およびβ鎖をコードする、２シストロン性（Ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のレトロウイルスベクターを調製し、活性化ＰＢＬへの形質導入に使用した。同時に、同じ活性化ＰＢＬを、ＴＣＲ−Ｔ５８における前記２本の鎖をコードする２シストロン性のレトロウイルスベクターで、形質導入した。対応する受容体を発現するＰＢＬを、ＣＤ８および多量体の共染色により同定したところ、陽性を示した細胞は少数であった（図５ａ）。低頻度にも関わらず、ＴＣＲ−Ｔ５８を形質導入したＰＢＬは、段階的にチロシナーゼペプチドでパルスしたＴ２細胞での刺激により、多量のＩＦＮ−γを放出した。ＴＣＲ−ＩＶＳ−Ｂを発現するＰＢＬは、ごく少量しかＩＦＮ−γを分泌しなかった。形質導入していないＰＢＬコントロール細胞では、チロシナーゼペプチド特異的サイトカイン分泌が検出されなかった。データは、形質導入していないＰＢＬコントロールによる分泌を差し引いた後のサイトカインｐｇ／ｍｌ（平均値＝３１８；範囲＝２１９〜３６８ｐｇ／ｍｌ）を示す（図５ｂ）。
【００９０】
表１に、ＴＣＲ−Ｔ５８の前記α鎖および前記β鎖における、ＶＪおよびＶＤＪの遺伝子断片の遺伝情報をそれぞれ示す。ＩＭＧＴに基づく前記ＣＤＲ３領域について、核酸配列およびアミノ酸配列を示す。全長ＶＪ領域および全長ＶＤＪ領域のコドン最適化配列をあわせて示す。
【００９１】
材料と方法
細胞株
前記ヒトメラノーマ細胞株Ｍｅｌ−Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ−；ＣＲＬ−１６１９、American  Type  Culture  Collection（ＡＴＣＣ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ＋、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｐ．Ｓｃｈｒｉｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｍｅｌ−６２４．３８１０（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ＋、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｍ．Ｃ．Ｐａｎｅｌｌｉ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＨＬＡ−Ａ２−、チロシナーゼ＋；ＭＴＢ−７２、ＡＴＣＣ）、前記リンパ細胞株Ｔ２（ＣＲＬ−１９９２、ＡＴＣＣ）、および、前記ヒトＴＣＲ欠損Ｊｕｒｋａｔ７６９Ｔ細胞株を、１２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【００９２】
前記ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束的チロシナーゼ３６９−３７７ペプチド特異的メラノーマ患者由来ＩＶＳ−Ｂ  Ｔ細胞クローンを培養した５。
【００９３】
チロシナーゼおよびＨＬＡ−Ａ２  ｉｖｔ−ＲＮＡの生産
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＤＭ８−ＨＬＡ−Ａ２、および、チロシナーゼｃＤＮＡを含むｐＺｅｏＳＶ２＋／ｈｕＴｙｒを直線化し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により、製造者の説明書に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ生産ための転写テンプレートとして使用した。
【００９４】
ＲＮＡでパルスしたＤＣによるＤｅ ｎｏｖｏＴ細胞刺激
健常ドナーの血液試料を、インフォームドコンセント、およびｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の承認を得た後に採取した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により単離した。ＰＢＬは、１．５％ヒト血清（ＤＣ培地）を添加した超低濃度エンドトキシン（ＶＬＥ）ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｌｒｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１５ｍｌに、７５ｃｍ２の培養フラスコあたり７．５×１０７個となるように再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。非接着細胞を、洗浄により注意深く除去した。成熟ＤＣを、接着した単球から調製し、前述のように、エレクトロポレーションによりｉｖｔ−ＲＮＡで形質転換した２。ＨＬＡ−Ａ２−ドナーのＤＣを、２４μｇ  チロシナーゼｉｖｔ−ＲＮＡおよび４８μｇ  ＨＬＡ−Ａ２  ｉｖｔ−ＲＮＡで、共形質転換した。その日のうちに、自己ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、市販キット（ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ｈｕｍａｎ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、製造者の説明書に従って、負の選択によりＰＢＬから濃縮した。共培養は、ＲＰＭＩ１６４０中の１×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ＲＮＡでパルスした１×１０５個のＤＣを添加することにより、２４穴プレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）におけるＤＣエレクトロポレーションから１０時間後に開始した。ＲＰＭＩ１６４０は、１０％熱不活性化ヒト血清、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  β−メルカプトエタノールおよび１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地（Ｔ細胞培地）とした。ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、０日目に添加し、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２日後に添加し、ついで、３日おきに添加した。ＩＬ−２の添加は、非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の減少を遅延させた４。２回目のＴ細胞刺激は、新たに調製したＲＮＡでパルスしたＤＣを使用し、７日後に行った。
【００９５】
ＨＬＡ−多量体の染色およびソーティング
ＲＮＡでパルスしたＤＣによるＣＤ８濃縮Ｔ細胞の２回目の刺激から７日後に、ＨＬＡ−Ａ２拘束的チロシナーゼ特異的Ｔ細胞を、ＰＥ標識化ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ｈｔｙｒ３６９−３７７ペプチド／ヒトβ２ｍ多量体１１、抗ＣＤ８−ＡＰＣ抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ：２μｇ／ｍｌ）による染色で検出した。ソーティングのため、５×１０６個以下の細胞を、０．５％ヒト血清含有ＰＢＳ  １００μｌにおいて、１２μｇの多量体とインキュベートした。ついで、添加から２５分後に、ＣＤ８−ＡＰＣ抗体を１／５０で添加した。染色細胞を２回洗浄した後、ソーティング用のＰＩを含む０．５％ヒト血清含有ＰＢＳに希釈した。刺激した培養あたり、合計２０〜５０×１０６個の細胞を、ソーティングのために染色した。ＰＩ陰性細胞を区別し、ＣＤ８＋多量体＋Ｔ細胞を、７０μｍノズルを備えるＦＡＣＳＡｒｉａ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、１５，０００ｅｖｅｎｔｓ／ｓの割合でソートした。
【００９６】
ＨＬＡ−多量体オフレートアッセイのため、多量体結合後、細胞を洗浄し、分離した多量体を捕捉し、Ｔ細胞への再結合を妨げるための飽和量のＢＢ７．２モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ）含有ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。試料を、１時間または２時間後、１％パラフォルムアルデヒド含有ＦＡＣＳバッファー中で固定し、フローサイトメトリーにより分析した７。
【００９７】
ペプチド特異的Ｔ細胞クローンの培養
多量体でソートしたＴ細胞を、限界希釈法によりクローニングした。クローンを、９６穴丸底プレート（ＴＰＰ）において、２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地に播種した。５０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を３日ごとに添加するとともに、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を７日ごとに添加した。Ｔ細胞クローンを、抗ＣＤ３抗体（０．１μｇ／ｍｌ；ＯＫＴ−３）により非特異的に刺激し、９６ウェルごとに、５人の関連のないドナーのプール由来の放射線（５０Ｇｙ）照射ＰＢＬからなる１×１０５個のフィーダー細胞、および、放射線（１５０Ｇｙ）を照射した１×１０４個のＥＢＶ形質転換同種異系Ｂ−ＬＣＬを、２週間ごとに供給した。増殖するＴ細胞を、２４穴プレート（ＴＰＰ）に移し、サイトカインを添加したＴ細胞培地１．５ｍｌで培養した。２４穴プレートの各ウェルあたり、１×１０６個の同種異系の放射線照射ＰＢＬ、および、１×１０５個の放射線照射ＥＢＶ形質転換同種異系Ｂ−ＬＣＬを、フィーダー細胞として添加した。クローン性を、ＴＣＲ−β鎖受容体分析により決定した１２。
【００９８】
Ｔ２細胞へのペプチド負荷
外来ペプチドのパルスのため、１×１０６個のＴ２細胞を、１０μｇ／ｍｌ  ヒトβ２−ミクログロブリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および、１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲のチロシナーゼペプチドＹＭＤ（チロシナーゼ３６９−３７７、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。１０−５Ｍ  インフルエンザペプチドＧＩＬ（インフルエンザマトリックスタンパク質５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＴＬ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ）でパルスしたＴ２細胞を、ネガティブコントロールとした。洗浄後、ペプチドを負荷したＴ２細胞を標的細胞とし、細胞傷害性またはＩＦＮ−γ放出アッセイに使用した。
【００９９】
ＩＦＮ−γ放出アッセイ
特異性の調査のため、Ｔ細胞クローン（１００μｌ中２×１０３個）を、代表的なメラノーマ細胞株、または、ペプチドでパルスしたＴ２細胞（１００μｌ中１×１０４個）と培養した。共培養から２４時間後、培養上清を収集し、ＯｐｔＥＩＡ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、標準的なＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１００】
細胞傷害性アッセイ
Ｔ細胞クローンの細胞傷害活性を、標準的な４ｈ  ５１−クロム放出アッセイにより分析した。メラノーマ細胞またはペプチドを負荷したＴ２細胞を、標的細胞として使用した。すなわち、１×１０６個の標的細胞を、１００μＣｉ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により、１〜１．５時間標識化した。Ｖ底９６穴組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の１２％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０  １００μｌ／ウェルにおいて、５１Ｃｒ標識化標的細胞を、Ｔ細胞と培養した。機能的結合性の決定のため、１×１０４個のＴ細胞に、滴定量のペプチドを負荷した、ペプチドでパルスしたＴ２細胞  １×１０３個を、Ｅ：Ｔを１０：１の割合で添加した。
【０１０１】
３７℃、４時間の共培養後、５０μｌの上清を回収し、γ線カウンターにより放射線を測定した。特異的溶解の割合を、１００×（実験による放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）として算出した。自然放出は、エフェクター細胞不在下での標的細胞の培養により評価したところ、概して１５％未満であった。相対的溶解の割合を算出するために、特異的溶解の最大割合を、１００％の参照値として設定し、この参照に対応させて換算値を算出した。半値溶解の決定のため、相対的溶解の割合をペプチド濃度に対してプロットした。５０％相対的溶解を横切る曲線におけるペプチド濃度を、半値溶解の値として採用した６。
【０１０２】
ＥＬＩＳＰＯＴ
抗体を予め被覆したＰＶＤＦプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｎａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、非特異的結合の防止のため、ＣＴＬ  Ｔｅｓｔ培地（登録商標、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）中、３７℃で２時間インキュベートした。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴのため、プレートを、ＩＦＮ−γ特異的捕捉抗体クローン１−Ｄ１Ｋにより予め被覆し、プレートを、パーフィリンＥＬＩＳＰＯＴのため、パーフィリン特異的捕捉抗体（クローンＰｆ−８０／１６４；Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ）により予め被覆した。刺激されたＴ細胞を、ＣＴＬ  Ｗａｓｈ（登録商標）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）で洗浄し、１×１０３個の応答Ｔ細胞を、ＣＴＬ  Ｔｅｓｔ（登録商標）培地１５０μｌ中、５×１０３個のメラノーマ細胞により刺激し、２４時間後、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにより、または４８時間後、パーフィリンＥＬＩＳＰＯＴにより評価した。ＰＢＳ／０．０１％  ＴｗｅｅｎおよびＰＢＳ単独で洗浄後、プレートを、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴのため、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を直接コンジュゲートした検出抗体（クローン７−Ｂ６−１；Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ）と、室温で２時間インキュベートした。また、プレートを、パーフィリンＥＬＩＳＰＯＴのため、ビオチン化検出抗体（クローンＰｆ−３４４；Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ）と、室温で２時間インキュベートし、ついで、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）と１時間インキュベートした。前記プレートを、再度洗浄し、ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ−ｐｌｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ）を添加した。スポットを、ｔｈｅ  ＡＩＤ  ｒｅａｄｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ＥＬＲ０３  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（ＡＩＤ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりカウントした。
【０１０３】
レトロウイルスベクターの構築、ウイルス上清の調製ならびにＪｕｒｋａｔ７６  Ｔ細胞およびＰＢＬへの形質導入
腫瘍特異的Ｔ細胞クローンのＴＣＲを同定するために、相補性決定領域（ＣＤＲ３）を含むＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の一部を、各定常領域プライマーを組み合わせたＴＣＲＶαおよびＴＣＲＶβプライマーセットを使用し、ＰＣＲにより増幅した１３。Ｔ細胞クローンＴ５８およびＩＶＳ−Ｂの前記ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子を、遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位で、レトロウイルスベクターＭＰ７１ＰＲＥ８にクローニングした。ヒトＴＣＲ−Ｔ５８の両方の鎖（Ｖα７、Ｖβ２３）およびＴＣＲ−ＩＶＳ−Ｂの両方の鎖（Ｖα３、Ｖβ１４）を、シングルのＴＣＲ遺伝子ベクター（ｓｉｎｇｌｅ−ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ）またはダブルのＴＣＲ遺伝子ベクター（ｄｏｕｂｌｅ−ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ）（ｐＭＰ７１−Ｔ５８αおよびｐＭＰ７１−Ｔ５８β、ｐＭＰ７１−ＩＶＳ−ＢαおよびｐＭＰ７１−ＩＶＳ−Ｂβ；ｐＭＰ７１−Ｔ５８β−Ｐ２Ａ−Ｔ５８αおよびｐＭＰ７１−ＩＶＳ−Ｂβ−Ｐ２Ａ−ＩＶＳ−Ｂα）として構築した。レトロウイルスベクタープラスミドを、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ  ｇａｇ／ｐｏｌおよびＭＬＶ−１０Ａ１  ｅｎｖ遺伝子をコードする発現プラスミドとともに、２９３Ｔ細胞に共形質転換し、それぞれ両種性ＭＬＶ偽型レトロウイルスを調製した１４。前記ヒトＴＣＲ欠損Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ７６およびＰＢＬに形質導入した１４。Ｊｕｒｋａｔ７６細胞（形質導入から５日後）およびＰＢＬ（形質導入から１０日後）を、ＰＥ標識化ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ｈｔｙｒ３６９−３７７ペプチド／ヒトβ２ｍ多量体、および、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体を使用して染色した。１３日目に、段階的にチロシナーゼ３６９−３７７ペプチド（１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍ）を負荷したＴ２細胞、または、１０−５Ｍのインフルエンザマトリックスタンパク質５８−６６ペプチドでパルスしたＴ２細胞、ならびに、腫瘍細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、Ｍｅｌ−Ａ３７５、Ｍｅｌ−６２４．３８およびＭｅｌ−９３．０４Ａ１２を、刺激細胞とし、Ｅ：Ｔ＝１：１の割合で使用し、ＩＦＮ−γ放出アッセイを行った。形質導入していないペプチド刺激ＰＢＬのコントロール値を、各ペプチド濃度における形質導入細胞の値から差し引き、ついで、全ＴＣＲ遺伝子組換え細胞について、比較可能な数値に調整した。
【０１０４】
Ｔ５８−ＴＣＲ分析
チロシナーゼ特異的クローンＴ５８のＴ細胞受容体分析のため、ＣＤＲ３領域を含むＴＣＲα鎖およびβ鎖の一部を、各ＴＣＲの定常領域プライマーを組み合わせたＴＣＲＶαおよびＴＣＲＶβプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。増幅産物をシークエンスし、ＩＭＧＴに基づいて指定した（表１；ＩＭＧＴ、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、http://imgt.cines.fr）。
【０１０５】
ＴＣＲ配列の修飾
ＴＣＲ  ｍＲＮＡの翻訳を促進するために、Ｔ５８−ＴＣＲ両鎖のＶＪ／ＶＤＬＪ領域のコドン最適化を行った（表１）。例えば、ｍｙｃ−タグ１５（特許出願番号：０６０１４６０６．５−１２１２）等の抗体タグ、または、例えば、ＣＤ２０エピトープ等の他の修飾は、任意の箇所、すなわち、除去抗体に認識され、ＴＣＲの機能性を妨げない、前記ＴＣＲα鎖のＮ末端に導入可能である。
【０１０６】
【表１】
2015211682.tif 000003
【０１０７】
ＴＣＲα鎖（ＶＪ領域）、ＴＣＲβ鎖（ＶＤＪ領域）およびＣＤＲ３の長さは、ＩＭＧＴ（ＩＭＧＴ、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、http://imgt.cines.fr）に基づいて指定した。
【０１０８】
［実施例２］
実施例１において、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子により提示されるチロシナーゼ由来のペプチド（すなわち、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、以下、ＹＭＤという）を特異的に認識する、２種類のＴ細胞クローンを比較するデータを提供した。前記Ｔ細胞クローンＴ５８は、同種拘束的であり、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナー由来のペプチド特異的Ｔ細胞クローンである。前記Ｔ細胞クローンＩＶＳ−Ｂは、転移性のメラノーマを患うＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性患者に由来する。このメラノーマは、チロシナーゼを発現する。
【０１０９】
本実施例においては、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性患者由来で、同じＹＭＤペプチドを認識するＴ細胞クローンの一種Ｄ１１５を含めて比較した。クローンＩＶＳ−Ｂとは対照的に、クローンＤ１１５は、健常者の血液由来の応答性Ｔ細胞を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発生させた。したがって、このＴ細胞クローンは、生体内の腫瘍環境（すなわち、メラノーマ）から、負の影響を受けるおそれは無い。
【０１１０】
図６に、新たなクローンＤ１１５および、本特許の主題であるクローンＴ５８の標的細胞認識のパターン比較を示す。明らかに示されるように、Ｄ１１５およびＴ５８の両方は、種々の腫瘍細胞株（ｘ軸および図中の凡例）との共培養後における、インターフェロン−γ分泌（ｙ軸）により検出された認識パターンが同じであることを示した。ＨＬＡ−Ａ２陰性であるがチロシナーゼを発現する腫瘍細胞、または、ＨＬＡ−Ａ２陽性であるがチロシナーゼ陰性の腫瘍細胞のどちらも、クローンは認識しなかった。一方、両方のＴ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼの両方が陽性である複数種類の腫瘍細胞株を認識した。この認識における前記ＹＭＤペプチドの役割は、チロシナーゼを発現せず、ＹＭＤペプチドを内部で処理し、提示のために、ＨＬＡ−Ａ２分子により細胞表面に輸送させるＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞が、合成ＹＭＤペプチドを担持でき、Ｄ１１５とＴ５８によりそれらを認識させるとの知見により示される。したがって、両方のクローンは、ＨＬＡ−Ａ２分子により提示される前記ＹＭＤペプチドに対して同じ特異性を示す。クローンＴ５８による認識効率は、インターフェロン−γ分泌のレベルが示すように、クローンＤ１１５よりはるかに優れている。このことは、例えば、Ｄ１１５ではメラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２９をほとんど認識しないのに対し、Ｔ５８では明確に認識することから分かる。
【０１１１】
クローンＤ１１５およびＴ５８の前記ＴＣＲを、活性化したレシピエントのリンパ球において、組換えタンパク質として発現させた（図７）。これらのＴＣＲ形質導入リンパ球について、同じ標的細胞群により改めて分析した際、元のＴ細胞クローンと同じ特異性パターンを示し、図６に示す結果から、ＴＣＲ認識が重要な役割を担っていることが証明された。図７において、クローンＴ５８の前記ＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現する前記メラノーマ腫瘍細胞株、および、ＹＭＤペプチドでパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍細胞の認識性に優れていることが、改めて証明された。
【０１１２】
図８Ａは、前記ＹＭＤペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２分子を含むＭＨＣ多量体に結合するＴ細胞を、約１１％含む形質導入群において、前記ＴＣＲ形質導入リンパ球が、比較可能なレベルで各組換えＴＣＲを発現していることを示す。このような結合は、ヒトサイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質由来の他のペプチドを提示するコントロール多量体では確認されていない。
【０１１３】
種々の濃度のＹＭＤペプチド（ｘ軸に示す）でパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性抗原提示細胞（すなわち、Ｔ２細胞）により、前記２群のＴＣＲ形質導入ＰＢＬを刺激した場合、ＴＣＲ−Ｔ５８を発現する細胞が、１００倍の低濃度のペプチドで、インターフェロン−γ（ｙ軸）を最大レベルの５０％放出するのが確認された。このペプチド感受性アッセイは、ＴＣＲ−Ｄ１１５と比較して、前記ＴＣＲ−Ｔ５８が高い機能的結合性を有することを示す（図８Ｂ）。
【０１１４】
この相違は、ＴＣＲ−Ｄ１１５形質導入リンパ球に対する、ＴＣＲ−Ｔ５８形質導入リンパ球で産生されるインターフェロン−γの最大レベルについての強力な相違により、さらに証明された。ＴＣＲ−Ｔ５８細胞の場合、前記最大値は、２４時間で５０００ｐｇ／ｍｌに達するが、ＴＣＲ−Ｄ１１５では、約２０００ｐｇ／ｍｌでしかない。また、２０００ｐｇ／ｍｌのインターフェロン−γを放出させるための、Ｔ２細胞により提示されるペプチド量は、ＴＣＲ−Ｔ５８形質導入リンパ球の場合、ＴＣＲ−Ｄ１１５形質導入リンパ球と比較して、１５，０００倍低い（図８Ｃ）。
【０１１５】
図８Ｄは、滴定量のＹＭＤペプチド（ｘ軸）でパルスした末梢血単核細胞を使用した場合の、他のペプチド感受性アッセイを示す。ＴＣＲ−Ｔ５８を発現するリンパ球により放出されるインターフェロン−γ量は、ＴＣＲ−Ｄ１１５と比較して改めて多かった。矢印は、ＴＣＲ−Ｄ１１５と比較してＴＣＲ−Ｔ５８に１０００倍少ないペプチドにより発生する、サイトカイン分泌の最初の検出を示す。
【０１１６】
図８Ｅおよび図８Ｆは、ペプチドでパルスした腫瘍細胞（図８Ｅ）、または、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現する腫瘍細胞株（図８Ｆ）に対する、前記形質導入されたリンパ球群の特異性を証明している。全ての場合において、ＴＣＲ−Ｄ１１５に対して、ＴＣＲ−Ｔ５８を発現するリンパ球による認識が優れている。
【０１１７】
前記優れたサイトカイン分泌は、インターフェロン−γには限られない。インターロイキン−２、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−１βの分泌レベルも、ＴＣＲ−Ｔ５８が優れている。このことは、腫瘍細胞またはペプチドでパルスしたＴ２細胞によるＴＣＲ形質導入リンパ球の刺激後に確認された（図９）。
【０１１８】
材料と方法
細胞株
前記ヒトメラノーマ細胞株Ｍｅｌ−Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ−；ＣＲＬ−１６１９、American  Type  Culture  Collection（ＡＴＣＣ））、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ＋、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｐ．Ｓｃｈｒｉｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｍｅｌ−６２４．３８１およびＳＫ−Ｍｅｌ−２３（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ＋、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｍ．Ｃ．Ｐａｎｅｌｌｉ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８（ＨＬＡ−Ａ２−、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ＋；ＭＴＢ−７２、ＡＴＣＣ）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２９（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ＋、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｐ．Ｒｉｅｂｅｒ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＷＭ−２６６−４（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ＋；ＣＲＬ−１６７６、ＡＴＣＣ）、および、ヒトメラノーマ（６〜１２代継代）の初期培養およびＭａＣａｌ（ＨＬＡ−Ａ２−、チロシナーゼ−、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｒ．Ｗａｎｋ、Ｍ．Ｄ．Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＭａＣａｌの安定型ＨＬＡ−Ａ＊０２０１形質転換体（ＭａＣａ１／Ａ２）（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ−、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｅ．Ｎｏｅｓｓｎｅｒ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ  Ｚｅｎｔｒｕｍ  Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＲＣＣ−２６２（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ−）、ＰａｎｃＴｕ１（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ−、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｐ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＬＭＵ  Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＵＴＳ  ＣＣ  １５８８（ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ−、ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｍ．Ｓｃｈｍｉｔｚ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、および、前記リンパ細胞株Ｔ２（ＣＲＬ−１９９２、ＡＴＣＣ）を、１２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【０１１９】
Ｔ２細胞、ＰＢＭＣおよび腫瘍細胞へのペプチドの負荷
外来ペプチドのパルスのため、１０μｇ／ｍｌ  ヒトβ２−ミクログロブリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、および、滴定量の範囲１０−５Ｍ〜１０−１１ＭのチロシナーゼペプチドＹＭＤ（チロシナーゼ３６９−３７７、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ）と、１×１０６個のＴ２細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。１０−５Ｍ  インフルエンザペプチドＧＩＬ（ｆｌｕ：インフルエンザマトリックスタンパク質５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＴＬ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ）でパルスしたＴ２細胞を、ネガティブコントロールとした。Ｔ２細胞と同様に、チロシナーゼペプチドを、滴定量の範囲１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍで、ＰＢＭＣに負荷した。Ｔ２細胞と同様に、１０−５Ｍのｆｌｕペプチドまたは１０−５ＭのチロシナーゼペプチドＹＭＤを、腫瘍細胞に負荷した。洗浄後、ペプチドを負荷したＴ２細胞、ＰＢＭＣまたは腫瘍細胞を刺激細胞とし、ＩＦＮ−γ放出アッセイに使用した。
【０１２０】
サイトカインアッセイ
特異性の調査のため、ＣＴＬ（１００μｌ中２×１０３個）を、前述の同様に、ペプチドでパルスまたは未パルスの種々の腫瘍細胞（１００μｌ中１×１０４個）と培養した。共培養から２４時間後、培養上清を回収し、ＯｐｔＥＩＡ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡにより評価した。データは、２度の測定により算出した対応する平均偏差とあわせて、平均値を示す。％相対的ＩＦＮ−γ放出の算出のため、最大ＩＦＮ−γ放出を１００％の参照値として設定し、この参照に対応させて、換算値を算出した。同時に複数のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−１β）を調査するために、腫瘍細胞、およびチロシナーゼペプチドでパルスまたは未パルスのＴ２細胞（１０−５Ｍ）とのＣＴＬの共培養上清におけるサイトカイン分泌を、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して測定した。
【０１２１】
レトロウイルスＴＣＲ遺伝子伝達
腫瘍特異的ＣＴＬのＴＣＲを同定するために、ＣＤＲ３をコードするＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の領域を、各定常領域プライマーを組み合わせたＴＣＲＶαおよびＴＣＲＶβプライマーセットを使用し３、ＰＣＲにより増幅した。ＣＴＬクローンＴ５８およびＤ１１５の前記ＴＣＲα鎖遺伝子および前記ＴＣＲβ鎖遺伝子の全長を、ｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲにより増幅した。プライマー配列は、依頼に応じて供給できる。ＴＣＲの両方の鎖の定常領域は、ＴＣＲの安定性を向上するマウスカウンターパート（ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）により改変した４。前記ＴＣＲ鎖を、２Ａペプチドリンカー（ＴＣＲβ−Ｐ２Ａ−ＴＣＲα）により連結し５、コドンを最適化し（Ｇｅｎｅａｒｔ）６、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位で、レトロウイルスＭＰ７１ＰＲＥにクローニングした５。レトロウイルスベクタープラスミドを、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ  ｇａｇ／ｐｏｌおよびＭＬＶ−１０Ａ１  ｅｎｖ遺伝子をコードする発現プラスミドとともに、２９３Ｔ細胞に共形質転換し、それぞれ両種性ＭＬＶ偽型レトロウイルスを調製した５。２回目の形質導入から１０日後、ＰＢＬを、ＰＥ標識化Ａ２−ｔｙｒ多量体およびＦＩＴＣ標識化ＣＤ８特異的抗体を使用して染色した。サイトメガロウイルスｐｐ６５由来のペプチドを提示する多量体を、コントロールとして使用した。ＰＥ標識化ＨＬＡ−Ｂ７  ｐｐ６５４１７−４２７（Ｂ７−ｐｐ６５）を、ＨＬＡコントロールとし、ＨＬＡ−Ａ２  ｐｐ６５４９５−５０３多量体を、ペプチド特異性コントロールとした。１５日目に、段階的にチロシナーゼペプチド（１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍ）を負荷したＴ２細胞または自己ＰＢＭＣ、ならびに、前記腫瘍細胞ＭａＣａ１、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、Ｍｅｌ−Ａ３７５、ＲＣＣ−２６、ＰａｎｃＴｕ  １、ＭａＣａ１／Ａ２、ＵＴＳ  ＣＣ  １５８８、Ｍｅｌ−６２４．３８、Ｍｅｌ−９３．０４Ａ１２、ＳＫ−Ｍｅｌ−２３、ＳＫ−Ｍｅｌ−２９およびＷＭ−２６６−４を、刺激細胞とし、Ｅ：Ｔ＝２：１の割合で使用し、ＩＦＮ−γ放出アッセイを行った。
【０１２２】
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１８．  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．Ａ．  （２００３）．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ−ｃｅｌｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：  ６６６−６７５．
１９．  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｍ．  Ｅ．，  Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｐ．  Ｆ．，  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｈｗｕ，  Ｐ．，  Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｓｈｅｒｒｙ，  Ｒ．，  Ｒｅｓｔｉｆｏ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｈｕｂｉｃｋｉ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｒａｆｆｅｌｄ，  Ｍ．，  Ｄｕｒａｙ，  Ｐ．，  Ｓｅｉｐｐ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｒｏｇｅｒｓ−Ｆｒｅｅｚｅｒ，  Ｌ．，  Ｍｏｒｔｏｎ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｍａｖｒｏｕｋａｋｉｓ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｗｈｉｔｅ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ａ．  （２００２）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｌｏｎａｌ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：８５０−８５４．
２０．  Ｅｎｇｅｌｓ，  Ｂ．，  Ｎｏｓｓｎｅｒ，  Ｅ．，  Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｂ．，  Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｔｈ．，  Ｓｃｈｅｎｄｅｌ，  Ｄ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｕｃｋｅｒｔ．  ２００５．  Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １６（７）：７９．９−８１０  
２１．  Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ  Ｌ，  Ｂａｒｒａｃｃｈｉｎｉ  ＫＣ，  Ｖｉｇｇｉａｎｏ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｌｌｅｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９５；５５：３１４９−３１５７．
２２．  Ｓｃｈｅｎｄｅｌ  ＤＪ，  Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ  Ｂ，  Ｏｂｅｒｎｅｄｅｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｉ．  ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３；１５１：４２０９−４２２０．
２３．  Ｓｔｅｉｎｌｅ  Ａ，  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｃ，  Ｊａｎｔｚｅｒ  Ｐ，  Ｓｃｈｅｎｄｅｌ  ＤＪ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｂ３５  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｈａｒｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌｌｙ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ａｌｌｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９５；１８１：５０３−５１３．
２４．  Ｃｏｈｅｎ  ＣＪ，  Ｚｈａｏ  Ｙ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ−ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＴＣＲ）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ＴＣＲ／ＣＤ３  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６；６６：８８７８−８８８６．
２５．  Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ  Ｍ，  Ｅｎｇｅｌｓ  Ｂ，  Ｍｅｙｅｒｈｕｂｅｒ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００８；８６：５７３−５８３．
２６．  Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ＫＢ，  Ｋｒａｍｅｒ  Ｄ，  Ｋｕｅｔｅｒ  ＥＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｄｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００６；１１９：１３５−１４５．
【図１】
2015211682.tif 000004
【図２ａ】
2015211682.tif 000005
【図２ｂ】
2015211682.tif 000006
【図３】
2015211682.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015211682.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【配列表】
2015211682000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月27日(2015.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の核酸分子によりコードされるα鎖および配列番号２の核酸分子によりコードされるβ鎖を含む、チロシナーゼペプチドを認識するＴＣＲ。
【請求項２】
α鎖およびβ鎖を含み、
前記α鎖またはβ鎖が、
前記各鎖のＣＤＲ３領域の外側におけるアミノ酸１〜１５個の１以上の付加もしくは欠失、および／または、アミノ酸１〜１５個の保存的置換により前記鎖が改変され、チロシナーゼペプチド認識特性が維持もしくは向上される、請求項１記載のα鎖またはβ鎖の誘導体、または
配列番号３もしくは４の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、または、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を含み、チロシナーゼペプチドを認識するＴＣＲのＣＤＲ３領域を含むそれらのフラグメント、または
１〜３個以下の連続するアミノ酸を超えない、アミノ酸１〜５個以下の１以上の付加および／または欠失、および／または、アミノ酸１〜６個の保存的置換により前記ＣＤＲ３領域が改変され、チロシナーゼペプチド認識特性が維持もしくは向上される、前記フラグメントの誘導体である、チロシナーゼペプチドを認識するＴＣＲ。
【請求項３】
前記α鎖または前記β鎖の誘導体をコードする配列が、コドン最適化による配列番号１および２に由来し、
配列番号７の核酸配列によりコードされる前記ＴＣＲのα鎖、および／または、配列番号８の核酸配列によりコードされる前記ＴＣＲのβ鎖を含む、請求項２記載のＴＣＲ。
【請求項４】
配列番号５および／または６のアミノ酸配列を含む、請求項２または３記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲが、可溶化ＴＣＲである、請求項４記載のＴＣＲ。
【請求項６】
配列番号１の核酸もしくはその誘導体をコードする核酸、またはそのフラグメントをコードする核酸もしくは前記フラグメントの誘導体をコードする核酸、および配列番号２の核酸もしくはその誘導体をコードする核酸、またはそのフラグメントをコードする核酸もしくは前記フラグメントの誘導体をコードする核酸を、宿主細胞に発現させる工程を含み、
前記α鎖またはβ鎖の誘導体は、前記各鎖のＣＤＲ３領域の外側におけるアミノ酸１〜１５個の１以上の付加もしくは欠失、および／または、アミノ酸１〜１５個の保存的置換により前記鎖が改変され、チロシナーゼペプチド認識特性が維持もしくは向上された前記α鎖またはβ鎖であり、
前記フラグメントが、チロシナーゼペプチドを認識するＴＣＲのＣＤＲ３領域を含み、配列番号３もしくは４の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、または、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を含み、
前記フラグメントの誘導体が、１〜３個以下の連続するアミノ酸を超えない、アミノ酸１〜５個以下の１以上の付加および／または欠失、および／または、アミノ酸１〜６個の保存的置換により改変され、チロシナーゼペプチド認識特性が維持もしくは向上されたＣＤＲ３領域を含み、
配列番号１の核酸分子によりコードされるα鎖もしくはα鎖の誘導体、またはそのフラグメントもしくはフラグメントの誘導体、および配列番号２の核酸配列によりコードされるβ鎖もしくはβ鎖の誘導体、またはフラグメントもしくはフラグメントの誘導体を含む請求項１または２記載のＴＣＲの生産方法。
【請求項７】
請求項１記載のα鎖をコードする核酸を含むベクターおよび請求項１記載のβ鎖をコードする核酸を含むベクターを含む、ベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または、遺伝子治療用の粒子および／またはベクターである、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターにより形質転換された、細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、ＰＢＬである、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＣＲおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
前記薬学的組成物が、点滴または注射である、請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の前記薬学的組成物を含む、養子細胞療法用薬剤。
【請求項１４】
チロシナーゼ発現悪性細胞関連疾患の治療用である、請求項１３記載の薬剤。
【請求項１５】
ＨＬＡ−Ａ２陽性患者の疾患の治療用である、請求項１３記載の薬剤。
【請求項１６】
メラノーマ、神経膠腫、膠芽細胞腫および／または外胚葉起源のまれな腫瘍（ｒａｒｅ  ｔｕｍｏｒｓ）の治療用である、請求項１４記載の薬剤。