(57)【要約】      （修正有）【課題】マルチプレックス化された核酸増幅反応における、適応性免疫受容体コードＤＮＡの、定量的高スループットシークエンシングの提供。【解決手段】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は免疫グロブリン（ＩＧ）をコードしている再構成されたリンパ球系細胞ＤＮＡを含有する、ＤＮＡ鋳型の異種性の１組を増幅するために典型的に使用されてもよいような、オリゴヌクレオチドプライマーの非常に高い異種性のセットのＤＮＡ増幅効率を標準化する組成物及び方法。【選択図】図１
2015171372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象の生体サンプル中の１種以上の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅する、オリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する組成物であって、前記組成物は、
複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドを含み、各合成鋳型オリゴヌクレオチドは、
（ａ）適応性免疫受容体の可変（Ｖ）領域をコードする遺伝子配列の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列又はその相補鎖を含むＶ配列領域であって、各Ｖ配列領域は、固有のＶ領域オリゴヌクレオチド配列を含む、Ｖ配列領域と、
（ｂ）適応性免疫受容体の連結（Ｊ）領域をコードする遺伝子配列ならびに隣接するイントロン配列の、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列又はその相補鎖を含むＪ配列領域であって、各Ｊ配列領域は、固有のＪ領域オリゴヌクレオチド配列を含む、Ｊ配列領域と、
（ｃ）何も含まないか、または第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を含む、Ｕ１配列と、
（ｄ）何も含まないか、または第２のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を含む、Ｕ２配列と、
（ｅ）対となる組み合わせとして、（ｉ）（ａ）の固有のＶ領域オリゴヌクレオチド配列と（ｉｉ）（ｂ）の固有のＪ領域オリゴヌクレオチド配列とを固有に識別する４〜２５個の連続するヌクレオチドの配列を含む、少なくとも１つのバーコード配列Ｂ１と、
（ｆ）少なくとも２個の連続するヌクレオチドを含む、少なくとも１種のランダムオリゴヌクレオチド配列Ｒと、
を含むオリゴヌクレオチド配列を有し、
前記組成物は、各固有のＶ領域オリゴヌクレオチド配列に対する少なくとも１種の合成鋳型オリゴヌクレオチドと、各固有のＪ領域オリゴヌクレオチド配列に対する少なくとも１種の合成鋳型オリゴヌクレオチドと、を含む、
組成物。
【請求項２】
前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチド中の各合成鋳型オリゴヌクレオチドが、等モル量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ランダムヌクレオチド配列Ｒの長さが２〜５０個の連続するヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドは、どちらが大きいにせよ、いくつかの少なくともａ個、又は少なくともｂ個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ａは前記対象における固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは前記対象における固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記複数の鋳型オリゴヌクレオチドが、少なくとも（ａ×ｂ）個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ａは、前記哺乳類対象における、固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは、前記哺乳類対象における、固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、前記組成物が、Ｖ領域をコードする遺伝子セグメントとＪ領域をコードする遺伝子セグメントの、すべての可能性のある組み合わせに対して、少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記適応性免疫受容体が、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ及びＩＧＬからなる群から選択される遺伝子座を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）のＶ配列が、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ又はＩＧＬ受容体のＶ領域ポリペプチドをコードし、（ｂ）のＪ配列が、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ又はＩＧＬ受容体のＪ領域ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
複数のａ’個の固有のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、複数のｂ’個の固有のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、を含む、１種以上の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅可能であり且つ前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドを増幅可能である１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ａ’が、１から前記哺乳類のゲノムにおけるＶ遺伝子セグメントの最大数までの範囲であり、ｂ’が、１から前記哺乳類のゲノムにおけるＪ遺伝子セグメントの最大数までの範囲である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳類対象由来の生体サンプル中の１種以上の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅可能である、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を決定する方法であって、前記方法は、
（ａ）複数の増幅された合成鋳型オリゴヌクレオチドを得るために、単一のマルチプレックスＰＣＲ反応において、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドを含む前記組成物を増幅することと、
（ｂ）前記複数を含む各固有の合成鋳型オリゴヌクレオチドに対して、（ｉ）合成鋳型オリゴヌクレオチド配列と（ｉｉ）前記合成鋳型オリゴヌクレオチド配列の発生頻度とを決定するために、前記複数の増幅された合成鋳型オリゴヌクレオチドを配列決定することと、
（ｃ）前記合成鋳型オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの発生頻度を、期待分布と比較することであって、前記合成鋳型オリゴヌクレオチド配列の前記発生頻度と前記期待分布との間の偏差が、前記１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を示す、比較することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記期待分布が、前記組成物を含む前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドの既定のモル比を決定することに基づくものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記既定のモル比が等モルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記期待分布が、各固有の合成鋳型オリゴヌクレオチドの頻度に基づいて決定され、前期頻度は、各固有のランダムオリゴヌクレオチド配列Ｒの頻度を定量することに基づいて決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記期待分布が、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅された前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドに対する均一な増幅レベルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記期待分布に対し不均一な増幅能を示す前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーの各メンバーに対して、前記１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーの前記オリゴヌクレオチドプライマーメンバーの相対的提示を調節することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
調節することが、
前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーの前記メンバーの前記相対的提示を増加させて、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正することを含むか、または、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーの前記メンバーの前記相対的提示を減少させて、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正することを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記期待分布に対して不均一な増幅能を示す前記１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーの各メンバーに対して、比例して増加又は減少した前記増幅された鋳型核酸分子の発生頻度を算出して、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
単一のマルチプレックスＰＣＲ増幅反応において増幅バイアスを補正して、哺乳類対象から得た生体サンプル中の複数種の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を定量する方法であって、
（ａ）前記サンプルを、請求項１３に記載の前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドと前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーとを含む組成物と接触させて、鋳型スパイクサンプルを生成することと、
（ｂ）前記Ｖセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーを含む前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、単一のマルチプレックスＰＣＲ反応において前記鋳型スパイクサンプルを増幅して、複数の増幅された合成鋳型オリゴヌクレオチド及び前記対象由来の複数の適応性免疫受容体をコードしている複数の増幅され再構成された核酸分子を得ることと、
（ｃ）前記複数の増幅された合成鋳型オリゴヌクレオチドを配列決定して、前記複数を含む各固有の合成鋳型オリゴヌクレオチドに対して、（ｉ）合成鋳型オリゴヌクレオチド配列と（ｉｉ）前記合成鋳型オリゴヌクレオチド配列の発生頻度とを決定することと、
（ｄ）複数種の適応性免疫受容体をコードしている前記対象由来の前記複数の増幅され再構成された核酸分子を配列決定して、各固有の再構成された核酸分子に対して、（ｉ）再構成された核酸分子配列と（ｉｉ）前記再構成された核酸分子配列の発生頻度とを決定することと、
（ｅ）前記合成鋳型オリゴヌクレオチドの前記発生頻度を、期待分布と比較することであって、前記期待分布が、前記組成物を含む前記複数の合成鋳型オリゴヌクレオチドの既定のモル比に基づくものであり、前記合成鋳型オリゴヌクレオチド配列の前記発生頻度と前記期待分布との間の偏差が、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を示す、比較することと、
（ｆ）１セットの合成鋳型オリゴヌクレオチド配列と、前記示された不均一な核酸増幅能を有する前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーの前記メンバーによって増幅され再構成された核酸分子配列に対して、１組の補正値を生成することであって、前記１組の補正値が、前記マルチプレックスＰＣＲ反応中の増幅バイアスを補正する、１組の補正値を生成することと、
（ｇ）前記再構成された核酸分子配列の前記発生頻度に前記１組の補正値を任意に適用して、前記マルチプレックスＰＣＲ反応における増幅バイアスを補正することと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年１１月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／７２６，４８９号、及び２０１２年５月８日に出願された米国特許仮出願第６１／６４４，２９４号の優先権を主張するものであり、その全開示が、全ての目的のために、その全体として、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、概ね、マルチプレックス化された核酸増幅反応における、適応性免疫受容体コードＤＮＡ（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び免疫グロブリン（ＩＧ）をコードしているＤＮＡ）の、定量的高スループットシークエンシングに関する。特に、本明細書で記述される組成物及び方法は、マルチプレックス化ＤＮＡ増幅法における特定のオリゴヌクレオチドプライマーの過剰活用及び／又は過少活用バイアスの結果として適応性免疫受容体コード配列の定量において生じ得る、望ましくない歪みを克服する。
【背景技術】
【０００３】
適応性免疫系は、多数の潜在的な病原を認識するために十分な多様性を有するＴ及びＢ細胞抗原受容体、すなわち適応性免疫受容体のレパートリーを、様々な方策を用い生成する。Ｔ細胞が様々ながん又は感染性生物に関連する多数の抗原を認識する能力は、ＴＣＲＡ遺伝子座からのα（アルファ）鎖とＴＣＲＢ遺伝子座のβ（ベータ）鎖とのヘテロダイマー、又はＴＣＲＧ遺伝子座からのγ（ガンマ）鎖とＴＣＲＤ遺伝子座からのδ（デルタ）鎖とのヘテロダイマーである、そのＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）によって与えられる。これらの鎖を構成するタンパク質は、リンパ球系細胞内において、ＴＣＲの広範な多様性を生成するために、固有の再構成機構を利用するＤＮＡによってコードされる。このマルチサブユニット型免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩタンパク質のいずれかによって提示されたペプチドと結合する。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合が、Ｔ細胞活性化における重要なイベントであり、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点の免疫シナプスにて発生する。
【０００４】
各ＴＣＲペプチドは、可変性の相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域を含む。αβ  Ｔ細胞の配列多様性は、α及びβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列によって主として決定され、多様性は、それぞれβ鎖遺伝子座の可変（Ｖβ）と、多様性（Ｄβ）と、連結（Ｊβ）遺伝子セグメントとの間、及びα鎖遺伝子座内の類似ＶαとＪα遺伝子セグメントとの間の組換えの結果として生じる。ＴＣＲ  α及びβ鎖遺伝子座内に多数のこのような遺伝子セグメントが存在することにより、多数の異なるＣＤＲ３配列がコードされる。ＣＤＲ３配列の多様性は、ＴＣＲ遺伝子再構成のプロセス中に、Ｖβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ及びＶα−Ｊα連結部において、ヌクレオチドが独立して挿入及び欠失されることによって更に増加する。本態様において、免疫適格性は、ＴＣＲの多様性に由来する。
【０００５】
γδ  ＴＣＲヘテロダイマーは、先天性免疫系と密接に相互作用する受容体をコードし、非ＨＬＡ依存様式において抗原を認識する、αβ  ＴＣＲとは異なる。ＴＣＲγδは、発生の早期に発現するものであり、解剖学的分布、固有の病原体及び低分子特異性、並びに広域スペクトルの先天性及び順応性細胞の相互作用が特定化されている。ＴＣＲγ  Ｖ及びＪセグメント発現のバイアスパターンが、個体発生過程の早期に確立される。したがって、成人組織中の多種多様なＴＣＲγレパートリーは、病原体及び毒性分子に対する環境曝露による刺激を受けて広く周辺に拡大した結果として生じる。
【０００６】
本明細書でＢ細胞受容体（ＢＣＲ）としても参照される免疫グロブリン（Ｉｇ又はＩＧ）は、４つのポリペプチド鎖、Ｈ２Ｌ２構造を形成するＩＧＨ遺伝子座からの２つの重鎖（Ｈ鎖）及びＩＧＫ又はＩＧＬ遺伝子座からの２つの軽鎖（Ｌ鎖）からなる、Ｂ細胞によって発現されたタンパク質である。Ｈ及びＬ鎖はそれぞれ、抗原認識に関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにＴＣＲと相似するフレームワーク領域及び定常領域を含有する。ＩｇのＨ鎖はまず、ＩＧＭ又はＩＧＤ定常領域エキソンのいずれかを用いて、膜結合アイソフォームとして発現されるが、抗原認識の後、定常領域は、ＩＧＧ、ＩＧＥ及びＩＧＡを含む種々の更なるアイソタイプへクラススイッチ可能である。ＴＣＲと同様に、個体内のナイーブＩｇの多様性は主に、超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）によって決定される。ＴＣＲＢと同様に、Ｈ鎖のＣＤＲ３ドメインは、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントが組み合わせて連結されることによって作製される。超可変ドメインの配列多様性は、Ｉｇ遺伝子再構成のプロセス中の、ＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨ及びＶＨ−ＪＨ連結部でのヌクレオチドの非依存性の付加及び欠失によって更に増加する。ＴＣＲとは異なり、Ｉｇ配列多様性は、ナイーブＢ細胞がまず抗原を認識した後に再構成されたＩＧ遺伝子中の体細胞超変異（ＳＨＭ）によって更に増加する。ＳＨＭのプロセスは、ＣＤＲ３に限定されず、したがって、フレームワーク領域、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに体細胞的に再構成されたＣＤＲ３において、生殖系列配列に対して変化を導入してもよい。
【０００７】
適応性免疫系が、固有のＴＣＲ又はＢＣＲを発現している細胞のクローン展開によって部分的に機能するので、各Ｔ細胞又はＢ細胞クローンの全存在量における変化を正確に測定することが、適応性免疫応答の動態を理解する上で重要である。例えば、健康なヒトは、数百万の固有の再構成されたＴＣＲβ鎖を有し、各ＴＣＲβ鎖は、健康な個体中のおよそ一兆個のＴ細胞の内、数百から数千のクローン性のＴ細胞中で保有されている。高スループットシークエンシングの進展を利用して、膨大なＴＣＲ及びＢＣＲレパートリーを特性化する、新しい分野の分子免疫学が近年出現している。再構成された適応性免疫受容体の遺伝子配列のシークエンシング、及び適応性免疫受容体クローン型の決定のための組成物及び方法は、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号及び国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号に記述され、すべて本明細書に参照により援用される。
【０００８】
これまでに、適応性免疫受容体をコードしている核酸を高スループットで定量的に配列決定するための様々な異なる方策が用いられており、これらの方策は、例えば、ＣＤＲ３−コード領域を増幅するために使用されるアプローチによるものと、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を配列決定することを選択するものとによって区別することができる。
【０００９】
ｍＲＮＡのスプライシングイベントにより、ＪセグメントとＣセグメントと間のイントロンが除去されることから、ｇＤＮＡを配列決定するよりもｍＲＮＡを配列決定する方が、より簡単な方法である可能性がある。これにより、Ｃ領域において共通の３’ＰＣＲプライマーを使用して、異なるＶ領域及びＪ領域を有する適応性免疫受容体（例えば、ＴＣＲ又はＩｇ）を増幅することができる。例えば、各ＴＣＲβに関して、１３個のＪセグメント全てが６０塩基対（ｂｐ）長より短い。したがって、スプライシングイベントによって、再構成されたＶＤＪ連結部の１００ｂｐ未満内に、（どのＶ及びＪ配列が使用されたかにかかわらず）ＴＣＲβ定常領域をコードしている同一のポリヌクレオチド配列がもたらされる。スプライシングされたｍＲＮＡは、次いで、ｍＲＮＡのポリＡテールに相補的なポリ−ｄＴプライマー、ランダム小プライマー（通常、六量体又はナノマー）又はＣ−セグメント特異的オリゴヌクレオチドを用いて、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写することができる。これにより、（ポリ−ｄＴ、ランダム六量体又はＣセグメント特異的オリゴのいずれにせよ、全てのｃＤＮＡが同一のオリゴヌクレオチドを提供されるので、）各再構成にて使用されたＶ及びＪセグメント、並びにＣＤＲ３の特定の配列に関する情報を得るために、配列決定され得る、ＴＣＲ  ｃＤＮＡの不偏のライブラリを産生するべきであるといえる。このようなシークエンシングは、単一の、ロングリードスパニングＣＤＲ３（「ロングリード」）技術を利用可能であり、又は代わりに断片化されたライブラリを用いる、より長い配列のショットガンアセンブリ、及びより高スループットのより短い配列リードを伴い得る。
【００１０】
ｍＲＮＡシークエンシングに基づく特定の再構成されたＴＣＲ（又はＩｇ）を発現するサンプル中の細胞数を定量するための努力にかかわらず、各細胞が潜在的に、異なる量のＴＣＲ  ｍＲＮＡを発現するので、解釈するのが難しい。例えば、インビトロにて活性化されたＴ細胞は、休眠Ｔ細胞よりも、細胞あたり１０〜１００倍多くｍＲＮＡを有する。これまでに、異なる機能状態のＴ細胞におけるＴＣＲ  ｍＲＮＡの相対量に関する非常に限定された情報のみが存在し、したがって、大量のｍＲＮＡの定量によって、各クローン性ＴＣＲ再構成を担架している細胞の数を、必ずしも正確に測定することができない。
【００１１】
一方、ほとんどのＴ細胞が、１つの生産的に再構成されたＴＣＲαと、１つの生産的に再構成されたＴＣＲβ遺伝子（又は２つの再構成されたＴＣＲγ及びＴＣＲδ）と、を有し、ほとんどのＢ細胞が、１つの生産的に再構成されたＩｇ重鎖遺伝子と、１つの生産的に再構成されたＩｇ軽鎖遺伝子（ＩＧＫ又はＩＧＬのいずれか）と、を有するので、ＴＣＲ又はＢＣＲをコードしているゲノムＤＮＡサンプルにおける定量は、サンプル中のＴ又はＢ細胞のそれぞれの数と直接相関すべきである。任意の１つ以上の適応性免疫受容体鎖をコードしているポリヌクレオチドのゲノムシークエンシングによって、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含有するサンプル中に存在する、多くの可能性のある再構成されたＣＤＲ３配列の全てを、等しい効率で増幅することができ、その後、定量的シークエンシングが行われ、相対的に多量のそれぞれの再構成されたＣＤＲ３クローン型の定量的測定が得られることが望ましい。
【００１２】
しかしながら、このようなアプローチには、マルチプレックスＰＣＲを用い再構成された各クローンに対し均等な増幅及びシークエンシング効率を簡単に達成できない場合があるという難点がある。例えば、ＴＣＲＢにて、各クローンが、５４個の可能性のある生殖系Ｖ領域コード遺伝子の内の１つと、１３個の可能性のあるＪ領域コード遺伝子の内の１つを利用する。多種多様な適応性免疫レパートリーを生成するため、Ｖ及びＪセグメントのＤＮＡ配列は必然的に多様である。この配列多様性により、全てのＶセグメント（又はＪセグメント）に、等しい親和性でアニールするであろう単一のユニバーサルプライマー配列を設計することが不可能となり、その中に含有される多数の異なる配列の正確な決定が、マルチプレックス化増幅と高スループットシークエンシングを同時に用いる、複数の分子種を定量する能力における技術的な限界によって妨げられる、複合ＤＮＡサンプルを産生させる。
【００１３】
１つ以上の要因によって、シークエンシングデータの出力と入力されるクローン型のコピー数との間の相関を歪める人為的な結果が生じる場合があり、これにより、非常に多種多様なＴＣＲβ遺伝子鋳型を集収してマルチプレックス化増幅することに基づきシークエンス方策により信頼できる定量的データを得る性能が損なわれる。これらの人為的な結果はしばしば、マルチプレックス化増幅工程における多種多様なプライマーの不等な利用の結果である。多種多様な増幅鋳型を利用するマルチプレックス化反応における１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーのこのようなバイアス化された利用が、１つ以上の、鋳型及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド塩基組成物中の差違、鋳型及び／又はプライマー長における差違、使用する特定のポリメラーゼ、増幅反応温度（例えば、アニーリング、伸長及び／又は変性温度）及び／又は他の因子（例えば、Ｋａｎａｇａｗａ，２００３  Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：３１７、Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：２０３９、Ｏｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔ．４：１８５、Ｂａｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：６８４、Ａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１２：Ｒ１８）による、示差的アニーリング速度則（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の関数として生じてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
複合鋳型ＤＮＡ集団のマルチプレックス化増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマーセットの特定の鋳型の増幅におけるバイアスによる、誤解を招く恐れのある個々の配列の過剰又は過少提示のような結果の歪みを回避するように、複合サンプル中の、適応性免疫受容体コードＤＮＡ配列の多様性の正確な定量を可能とするであろう、改善された組成物及び方法の必要性が明確に存在する。本明細書で記述された実施形態は、この必要性に取り組み、他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の再構成された核酸分子を含む生体サンプル中の１種以上の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化するための組成物であって、各適応性免疫受容体は、可変領域と、連結領域と、を含み、組成物は、一般式：５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含み、式中（ａ）Ｖは、適応性免疫受容体の可変（Ｖ）領域コード遺伝子配列の２０個以上１０００個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はその相補鎖相補鎖であり、各Ｖポリヌクレオチドは固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｂ）Ｊは、適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コード遺伝子配列の、１５個以上６００個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はその相補鎖であり、各Ｊポリヌクレオチドは固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｃ）Ｕ１は存在しないか、又は（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結され、５’に位置する第１のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列と、から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｄ）Ｕ２は存在しないか、又は（ｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結され、５’に位置する、第２のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列と、から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｅ）Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４はそれぞれ独立して、存在しないか、又はそれぞれ、３〜２５個の連続するヌクレオチドのバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドＢを含み、各Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４は、対となる組み合わせとして、（ｉ）（ａ）の固有のＶオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）（ｂ）の固有のＪオリゴヌクレオチド配列と、を固有に識別するオリゴヌクレオチド配列を含み、（ｆ）Ｒは存在しないか、又は（ａ）〜（ｅ）を欠いているオリゴヌクレオチド配列を含む、制限酵素認識部位を含み、（ｇ）複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、どちらが大きいにせよ、少なくともａ個の、又は少なくともｂ個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ａは対象中の固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは対象中の固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、組成物は、各固有のＶポリペプチドに対する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、各固有のＪポリヌクレオチドに対する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物。
【００１６】
１つの実施形態において、ａは１から対象の哺乳類ゲノムにおけるＶ遺伝子セグメントの最大数である。他の実施形態において、ｂは１から対象の哺乳類ゲノムにおけるＪ遺伝子セグメントの最大数である。他の実施形態において、ａは１又はｂは１である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、少なくとも（ａ×ｂ）個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ａは、対象哺乳動物における、固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは、対象哺乳動物における、固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、組成物は、Ｖ領域をコードする遺伝子セグメントと、Ｊ領域をコードする遺伝子セグメントの全ての可能性のある組み合わせに対する、少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、Ｊは、適応性免疫受容体のＪ領域コード遺伝子配列の定常領域を含む。
【００１８】
他の実施形態において、適応性免疫受容体は、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ及びＩＧＬからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、（ａ）のＶポリヌクレオチドは、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ又はＩＧＬ受容体Ｖ領域ポリペプチドをコードする。他の実施形態において、（ｂ）のＪポリヌクレオチドは、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＫ又はＩＧＬ受容体Ｊ領域ポリペプチドをコードする。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＶとＢ２との間に終止コドンがある。
【００２０】
１つの実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチド中の各鋳型オリゴヌクレオチドは、実質的に等モル量で存在する。他の実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、（１）Ｖ及びＪポリヌクレオチドが、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット４、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット５、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット６、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット７、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット８、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット９、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１０、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１２及びＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１３として、図５ａ〜５ｌに、６８個のＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにおいて示されるＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（２）Ｖ及びＪポリヌクレオチドが、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット４及びＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット５として図６ａ及び６ｂに、１４個のＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにおいて示されるＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（３）Ｖ及びＪポリヌクレオチドが、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット１、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット２、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット３、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット４、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット５、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット６、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット７、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット８及びＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット９として図７ａ〜７ｍにて、１２７個のＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにおいて示されるＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（４）配列番号３１５７〜４０１４において示されるような一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（５）配列番号４０１５〜４０８４において示されるような一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（６）配列番号４０８５〜５２００において示されるような一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列、（７）配列番号５５７９〜５８２１中で示されるような一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（８）配列番号５８２２〜６０６６において示されるような一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（９）配列番号６０６７〜６１９１において示されるような一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、から選択される、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、Ｖは、適応性免疫受容体のＶ領域コード遺伝子配列の、少なくとも３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０又は２１０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はその組成物である。他の実施形態において、Ｖは、適応性免疫受容体のＶ領域コード遺伝子配列の、９００、８００、７００、６００又は５００個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、又はその組成物である。
【００２２】
他の実施形態において、Ｊは、適応性免疫受容体のＪ領域コード遺伝子配列の、少なくとも１６〜３０、３１〜６０、６１〜９０、９１〜１２０又は１２０〜１５０個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、又はその組成物である。他の実施形態において、Ｊは、適応性免疫受容体のＪ領域コード遺伝子配列の、５００、４００、３００又は２００個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、又はその組成物である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、各鋳型オリゴヌクレオチドは、長さにして１０００、９００、８００、７００，６００、５００、４００、３００又は２００ヌクレオチド未満である。
【００２４】
他の実施形態において、組成物は、複数のａ’個の固有のＶ−セグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、複数のｂ’個の固有のＪ−セグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、を含む、１種以上の適応性免疫受容体をコードしている、再構成された核酸分子を増幅可能である１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ａ’は、１から哺乳類ゲノムにおけるＶ遺伝子セグメントの最大数であり、ｂ’は、１から哺乳類ゲノムにおけるＪ遺伝子セグメントの最大数である。１つの実施形態において、ａ’はａである。他の実施形態において、ｂ’はｂである。
【００２５】
また他の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーセット中の各Ｖセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、各Ｊセグメントオリゴヌクレオチドプライマーは、複数の鋳型オリゴヌクレオチド中の、少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成可能である。他の実施形態において、各Ｖセグメントオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つの適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、各Ｊセグメントオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つの適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
他の実施形態において、組成物は、各Ｖセグメントオリゴヌクレオチドプライマーが特異的にハイブリッド形成する一般式（Ｉ）のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、各Ｊセグメントオリゴヌクレオチドプライマーが特異的にハイブリッド形成する一般式（Ｉ）のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、を含む。
【００２７】
本発明は、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の再構成された核酸分子を含む生体サンプル中の１種以上の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅可能である、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間に生じ得る不均一な核酸増幅を決定する方法を含む。方法は、（ａ）複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドを得るために、マルチプレックスＰＣＲ反応において、本明細書で記述するような組成物を増幅する工程と、（ｂ）前記複数を含む各固有の鋳型オリゴヌクレオチドに対して、（ｉ）鋳型オリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記鋳型オリゴヌクレオチド配列の発生頻度とを決定するために、前記複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、（ｃ）前記鋳型オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの発生頻度を期待分布と比較する工程であって、前記期待分布は、前記組成物を含む、前記複数の鋳型オリゴヌクレオチドの既定のモル比に基づくものであり、前記鋳型オリゴヌクレオチド配列の前記発生頻度と、前記期待分布との間の偏差は、１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を示す、比較する工程と、を含む。
【００２８】
１つの実施形態において、既定のモル比は等モルである。他の実施形態において、期待分布は、前記１セットのオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅された前記１セットの鋳型オリゴヌクレオチドの均一増幅レベルを含む。また他の実施形態において、各増幅された鋳型核酸分子は、長さにして、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０又は７０ヌクレオチド未満である。
【００２９】
方法は、期待分布に対して不均一増幅能を示す１セットのオリゴヌクレオチドプライマーの各メンバーに対して、１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマー中のオリゴヌクレオチドプライマーメンバーの相対的提示を調節する工程を含む工程を含む。１つの実施形態において、調節する工程は、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーにおけるメンバーの相対的提示を増加させて、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正する工程を含む。他の実施形態において、調節する工程には、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーにおけるメンバーの相対的提示を減少させて、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正する工程を含む。
【００３０】
他の実施形態において、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｖ領域偽遺伝子若しくはオーファン、又はＪ領域偽遺伝子若しくはオーファンに対し特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。
【００３１】
方法はまた、期待分布に対し不均一な増幅能を示す１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーの各メンバーに対して、増幅された鋳型核酸分子の、比例して増加又は減少する発生頻度を算出する工程を含み、増幅は、前記メンバーによって増幅され、その算出によって、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正する工程を含む。
【００３２】
本発明は、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の再構成された核酸分子を含む生体サンプル中の１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている複数の再構成された核酸分子を定量する方法を含み、各適応性免疫受容体は、可変（Ｖ）領域と、連結（Ｊ）領域と、を含み、方法は、（Ａ）（１）対象哺乳動物のリンパ球系細胞を含む生体サンプル由来の再構成された核酸分子と、（２）固有のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドのそれぞれの既知の数が存在する、本明細書で記述されたような組成物と、（３）生体サンプル由来の１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅可能である、オリゴヌクレオチド増幅プライマーと、を含む、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、再構成された核酸分子を増幅する工程を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、プライマーセットは、（ａ）実質的に等モル量にて、それぞれ独立して、適応性免疫受容体のＶ領域ポリペプチドをコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド、又はその組成物に特異的にハイブリッド形成可能な、複数のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーであって、各Ｖセグメントプライマーは、少なくとも１つの機能的適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＶセグメントプライマーは、組成物中に存在する実質的に全ての機能的適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントに対し特異的にハイブリッド形成する、複数のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｂ）実質的に等モル量の、それぞれ独立して、適応性免疫受容体のＪ領域ポリペプチドをコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド、又はその組成物に特異的にハイブリッド形成可能である複数のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーであって、各Ｊセグメントプライマーは、少なくとも１つの機能的適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＪセグメントプライマーは、組成物中に存在する実質的に全ての機能的適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントに対し特異的にハイブリッド形成する、複数のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、を含む。
【００３４】
他の実施形態において、Ｖセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）多数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドを産生するための、組成物中の実質的に全ての鋳型オリゴヌクレオチドであって、前記多数の増幅された鋳型核酸分子は、組成物中の鋳型オリゴヌクレオチドの多様性を定量するのに十分である、実質的に全ての鋳型オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）多数の増幅され再構成されたＤＮＡ分子を産生するための、生体サンプル中の適応性免疫受容体をコードしている、実質的に全ての再構成された核酸分子であって、前記多数の増幅され再構成された核酸分子は、生体サンプル由来のＤＮＡにおける再構成された核酸分子の多様性を定量するのに十分である、実質的に全ての再構成された核酸分子と、の前記マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における増幅を促進可能である。
【００３５】
１つの実施形態において、複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチド中、及び複数の増幅され再構成された核酸分子中のそれぞれの増幅された核酸分子は、長さにして１０００ヌクレオチド未満であり、（Ｂ）（ｉ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含有する増幅された鋳型オリゴヌクレオチドの鋳型産物数と、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドバーコード配列を欠く増幅され再構成された核酸分子の再構成された産物数と、を定量するために、前記増幅された鋳型オリゴヌクレオチドと、前記増幅され再構成された核酸分子を定量的に配列決定する工程と、（Ｃ）（Ａ）（２）の固有のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドのそれぞれの既知の数によって、（Ｂ）（ｉ）の鋳型産物数を割ることによって、増幅率を算出する工程と、（Ｄ）サンプル中の固有の適応性免疫受容体をコードしている再構成核酸分子の数を定量するために、（Ｃ）にて算出した増幅率によって、（Ｂ）（ｉｉ）の再構成された産物数を割ることと、である。
【００３６】
他の実施形態において、サンプル中の固有の適応性免疫受容体をコードしている再構成核酸分子の定量された数は、サンプル中の固有のＢ細胞又は固有のＴ細胞ゲノム鋳型の数である。
【００３７】
本発明は、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の再構成された核酸分子を含む生体サンプルを得る工程と、前記サンプルを既知の量の、本明細書で記述したような組成物を含む鋳型オリゴヌクレオチドと接触させる工程と、マルチプレックスＰＣＲ反応において、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の鋳型オリゴヌクレオチド及び再構成された核酸分子を増幅して、複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチド及び複数の増幅され再構成された核酸分子を得る工程と、前記複数を含む各固有の鋳型オリゴヌクレオチドの、（ｉ）鋳型オリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記鋳型オリゴヌクレオチド配列の発生頻度と、を決定するために、前記複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、前記複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドの平均コピー数と、前記鋳型オリゴヌクレオチドの前記既知の量に基づいて、前記マルチプレックスＰＣＲ反応の平均増幅率を決定する工程と、を含む、マルチプレックスＰＣＲアッセイにおいて平均増幅率を算出する方法を含む。
【００３８】
方法はまた、前記複数を含む各固有の再構成された核酸分子の、ｉ）再構成された核酸分子配列と、ｉｉ）前記再構成された核酸分子配列の発生数と、を決定するために、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の前記複数の増幅され再構成された核酸分子を配列決定する工程と、前記マルチプレックスＰＣＲ反応に対する平均増幅率、及び前記再構成された核酸分子の発生数に基づいて、前記サンプル中のリンパ球系細胞の数を決定する工程、を含む。
【００３９】
他の実施形態において、方法は、前記増幅され再構成された核酸配列のそれぞれの発生数の和を生成する工程と、前記平均増幅率によって前記和を除すことと、を含む、前記サンプル中のリンパ球系細胞の数を決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、既知の量は、前記鋳型オリゴヌクレオチドそれぞれ１コピーである。１つの実施形態において、１００≦ａ≦５００である。他の実施形態において、１００≦ｂ≦５００である。
【００４０】
方法は、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の再構成された核酸分子を含む生体サンプル中の１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている、再構成された核酸分子を定量するために、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応における増幅バイアスを補正するために提供され、（ａ）前記サンプルを、本明細書で記述した組成物と接触させて、鋳型スパイクサンプルを生成する工程であって、前記鋳型及び前記再構成された核酸分子が、対応するＶ及びＪ領域配列を含む、接触させる工程と、（ｂ）マルチプレックスＰＣＲ反応において、前記鋳型スパイクサンプルを増幅して、複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドと、複数の適応性免疫受容体をコードしている複数の増幅され再構成された核酸分子を得る工程と、（ｃ）前記複数の増幅された鋳型オリゴヌクレオチドを配列決定して、前記複数を含む各固有の鋳型オリゴヌクレオチドの、（ｉ）鋳型オリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記鋳型オリゴヌクレオチド配列と、の発生頻度と、を決定する工程と、（ｄ）１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている前記複数の増幅され再構成された核酸分子を配列決定して、前記複数を含む前記複数の適応性免疫受容体をコードしている各固有の再構成した核酸分子の、（ｉ）再構成された核酸分子配列と、（ｉｉ）前記再構成された核酸分子配列と、の発生頻度と、（ｅ）前記鋳型オリゴヌクレオチド配列の発生頻度を、期待分布と比較する工程であって、前記期待分布が、前記組成物を含む前記複数の鋳型オリゴヌクレオチドの既定のモル比に基づくものであり、前記鋳型オリゴヌクレオチド配列の前記発生頻度と、前記期待分布との間の偏差が、１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を示す、比較する工程と、（ｆ）１セットの鋳型分子と、前記示された不均一な核酸増幅能を有する１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーの前記メンバーによって増幅され再構成された核酸分子配列に対して、１組の補正値を生成する工程であって、前記１組の補正値が、前記マルチプレックスＰＣＲ反応における増幅バイアスを補正する、生成する工程と、（ｇ）前記マルチプレックスＰＣＲ反応における増幅バイアスを補正するために、前記再構成された核酸分子配列の前記発生頻度に対して、前記１組の補正値を任意に適用することと、を含む。
【００４１】
本発明は、複数の鋳型オリゴヌクレオチドと、本明細書で記述したような１セットのオリゴヌクレオチドプライマーと、を含む、組成物を含む試薬と、対象哺乳動物のリンパ球系細胞由来の再構成された核酸分子を含む生体サンプル中の１種以上の適応性免疫受容体をコードしている再構成された核酸分子を増幅することが可能な１セットのオリゴヌクレオチドプライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を決定するための取扱説明書と、を含む、キットを含む。
【００４２】
他の実施形態において、キットは、不均一な核酸増幅能を有している１セットのオリゴヌクレオチドプライマーの１つ以上のメンバーを補正する取扱説明書を含む。
【００４３】
他の実施形態において、キットは、サンプル中の固有の適応性免疫受容体をコードしている再構成核酸分子の数を定量する取扱説明書を含む。
【００４４】
本明細書で記述した発明の実施形態のこれら及び他の態様が、以下の発明を実施するための形態と添付図面を参照して明らかとなるであろう。本明細書内で参照され及びかつ／又は出願データシート内で列記される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許発行物は、それぞれが個々に組み込まれるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の態様及び実施形態は、必要に応じて、改変可能であり、また更なる実施形態を提供するために、種々の特許、出願及び公報のコンセプトを利用する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点が、以下の記述及び付随する図面に関してよりよく理解されるようになるであろう。
【図１】適応性免疫受容体（ＴＣＲ又はＢＣＲ）をコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能である、オリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用する、例示の鋳型オリゴヌクレオチドの概要を示す図。Ｕ１、Ｕ２、ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド、Ｂ１〜４、バーコードオリゴヌクレオチド、Ｖ、可変領域オリゴヌクレオチド、Ｊ、連結領域オリゴヌクレオチド、Ｒ、制限酵素認識部位、Ｓ、任意終止コドン。
【図２】５２個のＰＣＲプライマー（配列番号：１７５３〜１８０４）の等モル（未調整）プールを用いて、標準化オリゴヌクレオチド鋳型組成物（配列番号：８７２〜１５６０にて示した鋳型の等モルプール）から増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）ＤＮＡシークエンサー上で定量的に配列決定した、個々のＴＣＲＢ  Ｖ遺伝子セグメント配列の増幅後の頻度を示すグラフ。不偏の頻度は０．０１８８と算出された。
【図３】ＴＣＲＢ  Ｖ領域特異的プライマーを用いた、鋳型オリゴヌクレオチドの交差増幅後の定量的シークエンシングの結果を示すグラフ。Ｙ軸は、標準化オリゴヌクレオチド鋳型組成物（配列番号：８７２〜１５６０にて示される鋳型の等モルプール）の増幅のための、同一のプライマーセットからの他のプライマーのモル濃度の２倍（２×）にて、各別々の増幅反応中に存在した個々の増幅プライマー（配列番号：１７５３〜１８０４）を示し、Ｘ軸は、記載されていないものの、データ点はＹ軸と同一の順番で表され、Ｘ軸は、定量的シークエンシングによって同定されるような、対応する増幅されたＶ遺伝子鋳型を表す。黒の四角は、全ての他のプライマーの等モル濃度に対して２倍で存在するそれぞれのプライマーによる増幅度に変化がないことを示し、白の四角は、増幅において１０倍の増加を示し、灰色の四角は、０〜１０倍の増幅の（グレースケール階調での）中程度を示す。白の四角の対角線は、所与のプライマーに対する２倍濃度が、ほとんどのプライマーのそれぞれの鋳型の増幅において、約１０倍の増加となったことを示す。非対角の白の四角は、相当しない鋳型を示し、それに対して特定のプライマーがアニールし、増幅可能であった。
【図４】プライマー利用バイアスに対する調節前の（黒棒、全てのＶ領域プライマーが、等モル濃度で存在する）、等モル濃度の、ＴＣＲＢ増幅プライマーセット（配列番号：１７５３〜１８０４）の全てのメンバーを用い、バイアスに対して補正するために、多数の個々のプライマー濃度を調節した後（灰色棒、非常に効率的なプライマーの濃度が減少し、効率が悪いプライマーの濃度が増加した、表６を参照のこと）、同一のプライマーセット（配列番号：１７５３〜１８０４）を用いて、標準化オリゴヌクレオチド鋳型組成物（配列番号：８７２〜１５６０にて示される鋳型の等モルプール）から増幅された個々のＴＣＲＢ  Ｖ遺伝子セグメント配列の増幅後の頻度を示すグラフ。増幅後の頻度は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）ＤＮＡシークエンサーにおける定量的シークエンシングによって決定された。
【図５ａ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｂ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｃ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｄ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｅ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｆ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｇ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｈ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｉ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｊ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｋ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図５ｌ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲＢ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用されるＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット（６８Ｖ＋１３Ｊ）を示す表。
【図６ａ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体γ（ＴＣＲＧ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット（１４Ｖ＋５Ｊ）を示す表。
【図６ｂ】１つ又は複数のヒトＴ細胞受容体γ（ＴＣＲＧ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット（１４Ｖ＋５Ｊ）を示す表。
【図７ａ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｂ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｃ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｄ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｅ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｆ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｇ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｈ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｉ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｊ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｋ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｌ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図７ｍ】１つ又は複数のヒト免疫グロブリン重（ＩＧＨ）鎖ポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する際に使用される、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’［Ｉ］の複数のオリゴヌクレオチド配列を含む、鋳型組成物に使用される、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット（１２７Ｖ＋９Ｊ）を示す表。
【図８】ＩＧＨ配列のマルチプレックス化ＰＣＲ増幅に加えられた鋳型組成物中での、各ＶＪ対に対する増幅率を算出し、次いで、全ての合成鋳型にわたって増幅率を平均化して、全ての合成鋳型分子にわたって倍配列カバレッジ（fold sequence coverage）を推定した結果を示すグラフ。
【図９】本明細書で記述したような合成鋳型組成物と増幅率を用い、天然のＤＮＡ鋳型の供給源として使用したＢ細胞の既知の数と比較して推定したＢ細胞数ののプロットを示すグラフ。
【図１０】１１１６個のＩＧＨ  ＶＪバイアス調節分子と、２４３個のＩＧＨ  ＤＪバイアス調節分子のそれぞれの、ＰＣＲ増幅前シークエンシング数を示すグラフ。
【図１１】相対的な増幅バイアスに対してグラフ化された合成ＴＣＲＢ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＢ−プライマー反復を示すグラフ。
【図１２】相対的増幅バイアスに対してグラフ化された、合成ＩＧＨ  ＶＪ鋳型の、ＩＧＨプライマー反復を示すグラフ。
【図１３】Ｖ遺伝子の２７個の合成ＩＧＨ  ＤＪ鋳型の相対的増幅バイアスを示すグラフ。
【図１４ａ】５５個の合成ＴＣＲＧ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＧ−プライマー反復を示すグラフ。相対的増幅バイアスが、化学的バイアス制御補正（図１４ａ）、化学的補正の第１の反復（図１４ｂ）、化学的補正の第２の反復（図１４ｃ）、及び化学的補正の最終反復（図１４ｄ）の前に、ＴＣＲＧ  ＶＪプライマーに関して、決定された。
【図１４ｂ】５５個の合成ＴＣＲＧ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＧ−プライマー反復を示すグラフ。相対的増幅バイアスが、化学的バイアス制御補正（図１４ａ）、化学的補正の第１の反復（図１４ｂ）、化学的補正の第２の反復（図１４ｃ）、及び化学的補正の最終反復（図１４ｄ）の前に、ＴＣＲＧ  ＶＪプライマーに関して、決定された。
【図１４ｃ】５５個の合成ＴＣＲＧ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＧ−プライマー反復を示すグラフ。相対的増幅バイアスが、化学的バイアス制御補正（図１４ａ）、化学的補正の第１の反復（図１４ｂ）、化学的補正の第２の反復（図１４ｃ）、及び化学的補正の最終反復（図１４ｄ）の前に、ＴＣＲＧ  ＶＪプライマーに関して、決定された。
【図１４ｄ】５５個の合成ＴＣＲＧ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＧ−プライマー反復を示すグラフ。相対的増幅バイアスが、化学的バイアス制御補正（図１４ａ）、化学的補正の第１の反復（図１４ｂ）、化学的補正の第２の反復（図１４ｃ）、及び化学的補正の最終反復（図１４ｄ）の前に、ＴＣＲＧ  ＶＪプライマーに関して、決定された。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、特定の実施形態において、本明細書で記述するように、免疫グロブリン（Ｉｇ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような、適応性免疫受容体をコードしている再構成された遺伝子の、大規模で構造的に多種多様な集団を確実に定量するために有用な組成物及び方法を提供する。これらの再構成された遺伝子は、ヒト対象を含む、対象のリンパ球系細胞又は生物源由来のＤＮＡを含有する生体サンプル中に存在してもよい。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「再構成された核酸分子」には、再構成された適応性免疫受容体をコードする配列を含む、リンパ球系細胞株から直接又は間接的に得られた、任意のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡが含まれ得る。
【００４８】
このような増幅産物の定量的高スループットシークエンシングの前に、適応性免疫受容体をコードしている再構成された遺伝子を含有する生体サンプル由来の、増幅され再構成されたＤＮＡ分子集団を生成するために、マルチプレックス化された核酸増幅反応において使用される、複合体オリゴヌクレオチドプライマーの標準化及び校正のための予想外に有益なアプローチが本明細書で開示される。再構成されたＴＣＲ及びＢＣＲ（ＩＧ）コードＤＮＡ配列のマルチプレックス化増幅及び高スループットシークエンシングは、例えば、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６（米国特許出願公開第２０１２／００５８９０２号），Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７（米国特許出願公開第２０１０／０３３０５７１号）、国際公開第２０１０／１５１４１６号、同第２０１１／１０６７３８号（国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号）、同第２０１２／０２７５０３号（国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．６１／５５０，３１１、及びＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．６１／５６９，１１８にて記述されており、したがって、これらの開示は参照により組み込まれており、本明細書で記述された実施形態にしたがった利用に適合し得る。
【００４９】
簡潔に言えば、非限定的な理論にしたがって、本発明の組成物及び方法は、マルチプレックス化核酸増幅の産物を配列決定することによって、ＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子の多様性を定量する現在の方法にて発生する場合がある不正確さを克服する。生体サンプル中に存在し得るＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子鋳型配列の膨大な多様性を収容するために、マルチプレックス化増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーセットは、広く多種多様な配列長とヌクレオチド組成（例えば、ＧＣ含量）を典型的に含む。その結果、所与の一式の増幅反応条件下において、異なるプライマーがアニールし、それらと相同的な鋳型配列の増幅を支持する効率が顕著に異なることになる場合があり、結果として、異なるプライマーが不均一に利用されることになり、異なる増幅産物の相対的な定量的提示において人工的なバイアスがもたらされる。
【００５０】
例えば、いくつかの非常に効率的なプライマーの相対的な過剰利用により、特定の増幅産物の過剰な提示がもたらされ、いくつかの他の低効率なプライマーの相対的な過少利用により、特定の他の増幅産物の過少な提示がもたらされる。増幅産物を配列決定することによって達成される、リンパ球系細胞ＤＮＡ含有サンプル中に存在する各鋳型種の相対量の定量的決定により、増幅前のサンプル中の異なる鋳型種の実際の相対的提示に関する誤解を招く可能性のある情報を産生する場合がある。パイロット試験において、例えば、ヒトリンパ球系細胞ＤＮＡ鋳型由来の全ての可能性のあるヒトＴＣＲＢ可変（Ｖ）領域遺伝子の配列を増幅することが可能であるように設計された１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、マルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲは、ＴＣＲＢ  Ｖ遺伝子セグメントを均一に増幅しなかったことが観察された。代わりに、いくつかのＶ遺伝子セグメントが相対的に過剰増幅され（総配列の〜１０％を表す）、他のＶ遺伝子セグメントが相対的に過少増幅された（総配列の約４×１０−３％を表す）、また例えば図２を参照のこと。
【００５１】
増幅プライマーの亜集団のこのような偏した利用の問題を克服するために、本開示は、最初に、オリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバーの増幅効率を標準化する鋳型組成物と方法を提供し、プライマーセットは、リンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプル中の、複数の適応性免疫受容体（ＴＣＲ又はＩｇ）をコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能である。鋳型組成物は、本明細書でより詳細に記述するように、一般式（Ｉ）の複数の多種多様な鋳型オリゴヌクレオチドを含む。
５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’    （Ｉ）
【００５２】
鋳型組成物は、構成要素である鋳型オリゴヌクレオチドからなり、鋳型オリゴヌクレオチドは個々の鋳型オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に関して多種多様である。個々の鋳型オリゴヌクレオチドはしたがって、多数の可能性のあるＴＣＲ又はＢＣＲ可変（Ｖ）及び連結（Ｊ）領域ポリヌクレオチド間で有意な配列変動性の作用として、ヌクレオチド配列において互いに相当異なってもよい。個々の鋳型オリゴヌクレオチド種の配列はまた、多種多様な複数の鋳型内の特定の鋳型に含まれる、Ｕ１、Ｕ２、Ｂ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４）及びＲオリゴヌクレオチドの配列差異の作用として、互いに異なってもよい。
【００５３】
特定の実施形態において、バーコードオリゴヌクレオチドＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４）は独立して、任意に、オリゴヌクレオチドバーコード配列を含んでもよく、バーコード配列は、特定の固有のＶオリゴヌクレオチド配列と、特定の固有のＪオリゴヌクレオチド配列の特定の対になった組み合わせを個別に同定するために選択される。バーコードオリゴヌクレオチドＢ１及びＢ４と、ユニバーサルアダプタの相対的な配置によって、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（登録商標）又はＧｅｎｅＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）−２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上の短い配列リードと、対となる末端シークエンシングによる、所与の固有鋳型オリゴヌクレオチドの増幅産物の迅速な同定及び定量を有利に行うことができる。とりわけ、これらの関連する実施形態によって、増幅産物中に存在するＶ及びＪ配列の特定の組み合わせを迅速に高スループットで決定することができ、それによって、サンプル中の再構成されたＴＣＲ又はＢＣＲコードＤＮＡを増幅することが可能なプライマーセット内に存在し得る、各Ｖ特異的プライマーと、各Ｊ特異的プライマーの相対的な増幅効率を特性化することができる。増幅産物のアイデンティティ及び／又は量の検証が、Ｂ２まで伸びる配列リードを任意に含む、より長い配列リードにより達成され得る。
【００５４】
利用に際して、複数の鋳型オリゴヌクレオチド中の各鋳型オリゴヌクレオチドが実質的に等モル量で存在し、特定の好ましい実施形態において、全オリゴヌクレオチドのモル濃度が、互いの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５パーセント以内である調製物を含む。本明細書で提供するような特定の他の好ましい実施形態において、鋳型オリゴヌクレオチドは、全オリゴヌクレオチドのモル濃度が、互いの一桁以内である時に、実質的に等モル量で存在するとみなされ、任意の所与の固有鋳型オリゴヌクレオチド種が有することができる最も高いモル濃度が、組成物中、最も低い濃度を有する固有鋳型オリゴヌクレオチド種が提示するモル濃度よりも、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４４０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００，９０、８０、７０、６０、５０、４０又は３０パーセント以下大きい調製物を含む。
【００５５】
同様に、本明細書で開示された特定の実施形態は、増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを企図し、そのセットにおいて、成分プライマーは、実質的に等モル量で提供されてもよい。また本明細書で記述されるように、特定の他の実施形態にしたがって、特定のプライマーが、等モル量、又は実質的に等モル量で存在しないように、プライマーセット中の１つ以上のプライマーの濃度が意図的に調節されてもよい。
【００５６】
好ましい実施形態において、本明細書で記述される鋳型組成物が、再構成されたＴＣＲ又はＩｇ遺伝子のマルチプレックス化増幅にて使用され得るＶセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーの複合体セットのような、オリゴヌクレオチドプライマーセット、例えば、本明細書で提供されたプライマーセット、又はＲｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６（米国特許出願公開第２０１２／００５８９０２号），Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７（米国特許出願公開第２０１０／０３３０５７１号）、国際公開第２０１０／１５１４１６号、同第２０１１／１０６７３８号（国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号）、同第２０１２／０２７５０３号（国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．６１／５５０，３１１、及びＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．６１／５６９，１１８等にて記述された任意のプライマーセットを特性化するために、核酸増幅（例えばＰＣＲ）鋳型として用いられてもよい。
【００５７】
好ましくは、本明細書で記述され、多種多様な配列と一般式（Ｉ）の一般構造を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含む、増幅効率を標準化する鋳型組成物における全ての鋳型は、実質的に同一の長さのオリゴヌクレオチドである。理論に束縛されるものではないが、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅反応において、鋳型ＤＮＡ長は、プライマーと、ヌクレオチド塩基の相補性を介した特異的、ヌクレオチド配列指向ハイブリッド形成によってプライマーがアニールする鋳型ＤＮＡ分子との間の相互作用の速度則に影響を与えることによって、オリゴヌクレオチドプライマーの増幅効率に影響を与え得る。一般的に、より長い鋳型は、相対的に短い鋳型よりも低い効率で作用すると見なされる。特定の実施形態において、本明細書で開示された、複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する鋳型組成物は、本明細書で提供したような、一般式（Ｉ）の複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含み、鋳型オリゴヌクレオチドは、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０又は１００ヌクレオチド以下（この間の全ての整数値を含む）の長さであり、同一の長さ、又は実質的に同一の長さである。
【００５８】
したがって、マルチプレックス化増幅の間、オリゴヌクレオチドプライマーの利用における望ましくないバイアスに対する潜在的な寄与を減少、除去又は最小化するために、本明細書で開示した好ましい実施形態は複数の鋳型オリゴヌクレオチドを利用してもよく、この場合、配列が多種多様な複数の鋳型オリゴヌクレオチド中の全ての鋳型オリゴヌクレオチドは、実質的に同一の長さである。複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、鋳型組成物中の全て（例えば、１００％）又はほとんど（例えば、５０％超）のこのようなオリゴヌクレオチドが、それぞれが正確に同数のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである時、実質的に同じ長さであってもよく、又は鋳型組成物中、１つ以上の鋳型オリゴヌクレオチドが、長さにして、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド以下だけ、互いに異なってもよい。本開示より、全ての鋳型オリゴヌクレオチドを、正確に同一の長さを有しない状況においても、本明細書で記述した組成物及び方法はまだ、１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を決定し、任意に補正するために使用されてもよい。
【００５９】
本明細書で開示した特定の実施形態にしたがって、（ｉ）本明細書で記述した鋳型組成物の各鋳型オリゴヌクレオチドが実質的に等モル量で提供され、（ｉｉ）複数の適応性免疫受容体をコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットが、実質的に等モル量で提供される複数のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーを含み、（ｉｉｉ）複数の適応性免疫受容体をコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットが、実質的に等モル量で提供される複数のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーを含み、（ｉｖ）増幅が所与の配列の開始鋳型の数と線形に比例する。
【００６０】
したがって、各鋳型の増幅産物の期待収率が算出され、１００％の理論的に均一な増幅レベル値を適宜割り当て可能である。増幅反応においてプライマーセットが鋳型オリゴヌクレオチドの配列を増幅させた後、異なる増幅産物の相対比間で観察される実質的な等価物からの統計学的に有意な偏差により、増幅の間のプライマー利用においてバイアス（すなわち不等な効率）が存在することが示される。言い換えると、得られる異なる増幅産物の相対量における定量的な差により、プライマーセット中の全てのプライマーが、それらの対応する鋳型を同等の効率で増幅したわけではないことが示される。特定の実施形態は、１００％超及び未満の理論収率に許容範囲を割り当てることを企図し、その結果、許容範囲内の任意の増幅レベル値が、実質的等価物として見なされ得る。
【００６１】
特定のこのような実施形態において、増幅産物収率の範囲は、産物収率が全て同一の桁内である（例えば、１０倍未満だけ異なる）時に、実質的に等価であると見なされてもよい。特定の他のこのような実施形態において、増幅産物収率の範囲は、産物収率が、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍又は３倍以下だけ互いに異なる時に、実質的に等価であると見なされてもよい。特定の他の実施形態において、許容可能な許容範囲内であると見なされてもよい産物収率は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、１００又は２００％だけ、算出された１００％収率より大きい又は小さくてもよい。
【００６２】
方法は、定量プロセスの一部として、既知の技術を用いて各増幅産物のヌクレオチド配列を決定することを伴うので、各固有の（配列によって定義されたような）産物の増幅に寄与するプライマー（類）が同定可能であり、プライマーセット中のそれらの（複数の）相対量が結果的に調節（例えば、統計学的に有意な方法で、増加又は減少）されてもよい。プライマーセット中の過剰に効率のよいプライマーの濃度を、他のプライマーの濃度に対して減少させることが可能であり、その結果、本明細書で記述した鋳型組成物中の鋳型のこのようなプライマーによる特定の増幅レベルは、理論的な均一増幅レベルを供給するか、又は許容可能な許容範囲内であるレベルを供給する、大部分のプライマーによって提供される増幅レベルと実質的に等価となる。プライマーセット中の効率が悪いプライマーの濃度を、他のプライマーの濃度に対して増加させることが可能であり、その結果、本明細書で記述した鋳型組成物中の鋳型のこのようなプライマーによる特定の増幅レベルは、理論的な均一増幅レベルを供給するか、又は許容可能な許容範囲内であるレベルを供給する、大部分のプライマーによって提供された増幅レベルと実質的に等価となる。
【００６３】
したがって、本明細書で記述するように、所与のＴＣＲ又はＩｇ鎖の完全なレパートリーのコード配列を増幅するように設計されるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する鋳型組成物、このようなプライマーセットのメンバー間の不均一な増幅効率（「不均一な増幅能」）を決定する方法、及びこのような不均一な増幅能を補正する方法が、本明細書で提供される。したがって本開示は、オリゴヌクレオチドプライマーセットを校正可能である基準として本明細書で記述される鋳型組成物を提供することによって、個々のプライマー濃度が、増幅産物の構造的に多種多様なアレイの実質的に均一な増幅を産生するために調節可能であるように、各鋳型オリゴヌクレオチドが実質的に等モル量で存在する特定の実施形態において、個々のプライマー効率におけるバイアスに関連する上記問題を有利に克服する。
【００６４】
本明細書で提供される組成物及び方法を用いて、個々のプライマーは、増幅反応中の（ｉ）互いに対して実質的に等モル量の全ての鋳型オリゴヌクレオチドの、（ｉｉ）互いに対して実質的に等モル量の全てのＶセグメントプライマーの、（ｉｉｉ）互いに対して実質的に等モル量の全てのＪセグメントプライマーの存在にかかわらず、均一増幅レベルに対して、特定の鋳型オリゴヌクレオチドの増幅増加（例えば、実質的に有意に多い）、又は増幅減少（例えば、実質的に有意に少ない）によって証明された、不均一な増幅促進によって、不均一な増幅能を有すると同定されてもよい。
【００６５】
次いで、このようなプライマーの相対濃度が均一増幅レベルに対する増幅の増加又は減少したレベルをそれぞれ補正するために、全てのプライマーが互いに対して実質的に等モル量で存在しないプライマーの改良された完全なセットを得るために増加又は減少され得る。次いで、プライマーセットは、均一増幅レベルにて、又は許容可能な許容範囲内で、本明細書で開示される鋳型組成物中の全ての配列を増幅するその能力に関して再試験されてもよい。
【００６６】
全ての鋳型オリゴヌクレオチドが、互いに実質的に等モル量で提供される、本明細書で開示した鋳型組成物を増幅するそれらの能力に関して改良プライマーセットを試験するプロセスは、全ての産物が、均一増幅レベルにて、又は許容可能な許容範囲内で増幅されるまで、反復して繰り返されてもよい。本明細書で開示される鋳型組成物を用いたこのようなプロセスによって、オリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率が標準化されてもよく、この場合、プライマーセットは、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプル中の、１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている生産的に再構成されたＤＮＡを増幅可能である。
【００６７】
更に、又はあるいは、本開示にしたがって、オリゴヌクレオチド増幅プライマーの任意の特定の対が、オリゴヌクレオチド増幅プライマーの大多数によって示される均一増幅レベルに対して、鋳型組成物の増幅の増加又は減少のような、不均一な増幅能を示すかどうか決定されてもよく、標準化調節因子を使用して、このような各増幅プライマー対によって促進される増幅産物の、それぞれ比例的に減少又は増加した発生頻度を算出することができる。したがって、特定の実施形態において、本発明の鋳型組成物は、１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーのメンバー間の不均一な核酸増幅能を補正する方法を提供する。
【００６８】
特定のこのような実施形態は、不均一な増幅イベントの結果として得られるデータの補正、校正、標準化、規格化等を有利に許容してもよい。したがって、本実施形態は、１つ以上の増幅プライマーの濃度を反復して調節したり、本明細書で記述した鋳型組成物を増幅する工程を繰り返したりする必要なく、オリゴヌクレオチドプライマーの偏った利用からもたらされるようなデータの不正確さを補正することができる。このようにして、有利な効率が得られ、増幅産物を定量的に配列決定する工程の繰り返しが避けられる。しかしながら、特定の他の企図された実施形態は、このような反復アプローチを使用してもよい。
【００６９】
したがって、本明細書で記述したように、オリゴヌクレオチドプライマーセットの個々のメンバー間の不均一な核酸増幅能（例えば、バイアス）を決定するために、このような鋳型組成物を用いる方法と共に、オリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する鋳型組成物が本明細書で提供される。オリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバー間のこのような不均一な核酸増幅能（例えば、バイアス）を補正する方法も本明細書で記述されている。これらの関連する実施形態は、本明細書で記述した特徴を有する増幅効率を標準化する鋳型組成物を用いて、望ましくない増幅バイアスを補正するために、複合体オリゴヌクレオチドプライマーセットを校正することによって得られる、以前は認識されていない利点を利用し、前述した方法論に関して、正確さを改善することにおいて利用され、その改善によって特定のクローン型ＴＣＲ及び／又はＩｇコードＤＮＡ配列が定量可能となるであろう。
【００７０】
また以上で言及し、本明細書の他の場所で記述したように、本開示の前に、サンプル中の実質的に全ての生産的に再構成された適応性免疫受容体遺伝子を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド増幅プライマーの複雑なセットを用いたマルチプレックス化増幅の後、（ｉ）対象由来のリンパ球系細胞ＤＮＡを含む生体サンプルにおいて、固有の配列を有する再構成された適応性免疫受容体コードＤＮＡ鋳型の実際の定量的分布と、（ｉｉ）このような鋳型の核酸増幅産物の相対的な提示との間に、不十分で見分けるのが困難な不一致が存在した。例えば、鋳型集団と増幅プライマーセット両方の異質性により、本明細書で示されたように、異なる増幅プライマーの増幅効率における差違が有意であることは一般的であり、増幅反応後に得られ、定量的に配列決定される増幅産物の相対比における実質的な歪みがもたらされる。
【００７１】
鋳型及びプライマー
特定の好ましい実施形態に従って、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプルの１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている、（特定の実施形態において、生産的に再構成されたＤＮＡを意味し得るが、特定の他の実施形態において、それに限定される必要がない）再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する鋳型組成物が提供され、鋳型組成物は、本明細書で提供したように、一般式（Ｉ）：
５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’    （Ｉ）
の複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチド中の各鋳型オリゴヌクレオチドは、実質的に等モル量で存在し、特定の実施形態において、以上で述べたように、各鋳型オリゴヌクレオチドは、等モル濃度にて、又はモル基準にて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は２００％以下だけ等モルから乖離したモル濃度で存在し、特定の他の実施形態において、全ての鋳型オリゴヌクレオチドが互いの桁内であるモル濃度にて存在する組成物を意味してもよい。複数の鋳型は、異なるヌクレオチド配列をそれぞれ有する、少なくとも１００、２００、３００、４００，５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００以上（これらの間の全ての整数値を含む）の別個のオリゴヌクレオチド種を含んでもよい。
【００７２】
本明細書で開示した鋳型組成物はしたがって、一般式
５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’    ［Ｉ］
の複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含み、式中、特定の好ましい実施形態にしたがって、簡単に、そして本明細書の他の場所にてより詳細に述べるように、
Ｖは、適応性免疫受容体の可変（Ｖ）領域コード遺伝子配列の２０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０又は２１０以上１０００、９００、８００、７００、６００又は５００個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、又はその組成物であり、それぞれの複数の鋳型オリゴヌクレオチド配列において、Ｖは固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、
Ｊは、適応性免疫受容体結合（Ｊ）領域コード遺伝子配列の１５〜３０、３１〜６０、６１〜９０、９１〜１２０又は１２０〜１５０以上６００、５００、４００、３００又は２００個以下の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、又はその組成物であり、それぞれの複数の鋳型オリゴヌクレオチド配列において、Ｊは固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、
Ｕ１及びＵ２はそれぞれ、存在しないか、又は独立して、（ｉ）ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結され５’に位置するシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列と、から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４はそれぞれ独立して、存在しないか、又はそれぞれ、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００個（これらの間の全ての整数値を含む）の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドＢを含み、各複数の鋳型オリゴヌクレオチド配列Ｂは、（ｉ）鋳型オリゴヌクレオチドの固有のＶオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）鋳型オリゴヌクレオチドの固有のＪオリゴヌクレオチド配列とを、固有に識別するか、又は対となる組み合わせとして識別する固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、
Ｒは存在しないか、又はＶ、Ｊ、Ｕ１、Ｕ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４のないオリゴヌクレオチド配列を含む、制限酵素認識部位を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、鋳型オリゴヌクレオチド組成物は、更なる非コード又はランダムオリゴヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、一般式Ｉ（５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’）中の成分間又は内の種々のセグメント内に挿入されてもよく、大きさにして種々の長さであってもよい。
【００７４】
１つの実施形態において、ａは１から対象の哺乳類ゲノムにおけるＶ遺伝子セグメントの最大数である。他の実施形態において、ｂは１から対象の哺乳類ゲノムにおけるＪ遺伝子セグメントの最大数である。他の実施形態において、ａが１であるか又はｂが１である。いくつかの実施形態において、ａはＴＣＲＡに対して１個のＶ遺伝子セグメント〜５４個のＶ遺伝子セグメント、ＴＣＲＢに対して１〜７６個のＶ遺伝子セグメント、ＴＣＲＧに対して１〜１５個のＶ遺伝子セグメント、ＴＣＲＤに対して１〜７個のＶ遺伝子セグメント、ＩＧＨに対して１〜１６５個のＶ遺伝子セグメント、ＩＧＫに対して１〜１１１個、又はＩＧＬに対して１〜７９個のＶ遺伝子セグメントの範囲であり得る。他の実施形態において、ｂは、ＴＣＲＡに対して１個のＪ遺伝子セグメント〜６１個のＪ遺伝子セグメント、ＴＣＲＢに対して１〜１４個のＪ遺伝子セグメント、ＴＣＲＧに対して１〜５個のＪ遺伝子セグメント、ＴＣＲＤに対して１〜４個の遺伝子セグメント、ＩＧＨに対して１〜９個のＪ遺伝子セグメント、ＩＧＫに対して１〜５個のＪ遺伝子セグメント、又はＩＧＬに対して１〜１１個のＪ遺伝子セグメントの範囲であり得る。
【００７５】
以下の表は、機能的Ｖ及びＪセグメントを含む、各ヒト適応性免疫受容体遺伝子座の、Ｖ遺伝子セグメント（ａ）とＪ遺伝子セグメント（ｂ）の数を列記している。
【００７６】
【表１】
2015171372.tif 000003
＊  総可変及び連結セグメント遺伝子
＊＊  少なくとも１つの機能的対立遺伝子を有する可変及び連結セグメント遺伝子
【００７７】
いくつかの実施形態において、Ｊポリヌクレオチドは、１５〜３０、３１〜６０、６１〜９０、９１〜１２０又は１２０〜１５０以上６００、５００、４００、３００又は２００個以下の、適応性免疫受容体のＪ定常領域の連続するヌクレオチド、又はその組成物を含む。
【００７８】
特定の実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、少なくとも（ａ×ｂ）個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、そこでａは対象中の、固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは対象中の、固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、組成物は、Ｖ領域をコードする遺伝子セグメントと、Ｊ領域をコードする遺伝子セグメントとの全ての可能性のある組み合わせの、少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドを含む。
【００７９】
本明細書で企図される発明はそのように限定する意図はないが、しかしながら、特定の実施形態において、実質的により少ない数の鋳型オリゴヌクレオチドが、有利に使用され得る。ａが、対象における固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂが、対象における固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数である、これらの関連する実施形態において、各固有のＶポリヌクレオチド配列と、各固有のＪポリヌクレオチド配列が、鋳型組成物中の少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチド中に存在する限り、その複数の鋳型オリゴヌクレオチドが含まれる固有のオリゴヌクレオチド配列の最小数は、ａ及びｂのいずれが大きいかによって決定されてもよい。したがって、特定の関連した実施形態にしたがって、鋳型組成物は、例えば一般式（Ｉ）にしたがった各固有のＶポリヌクレオチドのうちの単一の１種を含む、各固有のＶポリヌクレオチドに対する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、例えば一般式（Ｉ）にしたがった各固有のＪポリヌクレオチドのうちの単一の１種を含む、各固有のＪポリヌクレオチドに対する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、を含んでもよい。
【００８０】
特定の他の実施形態において、鋳型組成物は、少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドを含み、それに増幅プライマーセット中の各オリゴヌクレオチド増幅プライマーがアニール可能である。
【００８１】
すなわち、特定の実施形態において、鋳型組成物は、各Ｖセグメントオリゴヌクレオチドプライマーが特異的にハイブリッド形成可能な、一般式（Ｉ）のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、各Ｊセグメントオリゴヌクレオチドプライマーが特異的にハイブリッド形成可能な、一般式（Ｉ）のオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、を含む。
【００８２】
このような実施形態にしたがって、１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている、再構成されたＤＮＡを増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットは、複数のａ’個の固有Ｖセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、複数のｂ’個の固有Ｊセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、を含む。複数のａ’個のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ独立して、適応性免疫受容体のＶ領域ポリペプチドをコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド又はその相補鎖にアニールするか、特異的にハイブリッド形成することが可能であり、各Ｖセグメントプライマーは、少なくとも１つの適応性免疫Ｖ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。複数のｂ’個のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーはそれぞれ独立して、適応性免疫受容体のＪ領域ポリペプチドをコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド又はその相補鎖にアニールするか、特異的にハイブリッド形成することが可能であり、各Ｊセグメントプライマーには、少なくとも１つの適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列が含まれる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ａ’は（鋳型オリゴヌクレオチドに関して上記した）ａと同一である。他の実施形態において、ｂ’は（鋳型オリゴヌクレオチドに関して上記した）ｂと同一である。
【００８４】
したがって、特定の実施形態において、そしてまた本明細書の他の場所で議論するように、本発明の鋳型組成物は、発現されないものを含む、全ての再構成された適応性免疫受容体コード遺伝子配列を増幅するように設計される増幅プライマーとの増幅反応において使用されてもよく、一方で特定の他の実施形態において、鋳型組成物及び増幅プライマーは、発現されていない再構成された遺伝子（例えば、偽遺伝子、オーファン）の増幅産物を産生しないように設計されてもよい。したがって、特定の実施形態において、再構成された適応性免疫受容体コード遺伝子のサブセットのみが望ましくは増幅されてもよく、その結果、好適な増幅プライマーサブセットが、対象とする再構成されたＶ−Ｊ配列のみを増幅するように設計され、利用されてもよいことが理解されるであろう。これらの関連する実施形態において、鋳型組成物が、増幅プライマーセット中の各オリゴヌクレオチド増幅プライマーがアニール可能な少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドを含む限り、再構成されたＶ−Ｊ再構成配列の対象のサブセットのみを含む本明細書で記述された鋳型組成物を使用してもよい。したがって、鋳型組成物中の鋳型オリゴヌクレオチドの実際の数は、使用される増幅プライマーセットによって異なり、企図される実施形態においてかなり多様であってもよい。
【００８５】
例えば、特定の関連する実施形態において、鋳型組成物中、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、（１）ポリヌクレオチドＶ及びＪが、それぞれＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット４、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット５、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット６、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット７、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット８、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット９、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１０、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１２及ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１３として、図５ａ〜５ｌに示されるような、６８個のＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにおいて示される、ＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数オリゴヌクレオチド配列と、（２）ポリヌクレオチドＶ及びＪが、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット４、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット５として図６に示されるような、それぞれ１４個のＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにおいて示される、ＴＣＲＧ  Ｖ及びＪを有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、（３）ポリヌクレオチドＶ及びＪが、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット１、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット２、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット３、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット４、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット５、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット６、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット７、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット８及びＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット９として図７に示されるような、１２７個のＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにおいて示される、ＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列と、から選択される複数の一般式（Ｉ）の配列を有してもよい。
【００８６】
特定の実施形態において、Ｖは適応性免疫受容体のＶ領域の少なくとも１０〜７０の連続アミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補鎖であり、Ｊは適応性免疫受容体のＪ領域の少なくとも５〜３０の連続アミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補鎖であり、Ｕ１及びＵ２はそれぞれ、存在しないか、又は（ｉ）ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結され５’の位置にあるシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４はそれぞれ独立して、存在しないか、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含む、オリゴヌクレオチドＢを含み、複数のオリゴヌクレオチド配列Ｂのそれぞれにおいて、（ｉ）固有のＶオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）固有のＪオリゴヌクレオチド配列と、を対となる組み合わせとして、固有に識別する固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、Ｒは存在しないか、又はＶ、Ｊ、Ｕ１、Ｕ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４に該当しないオリゴヌクレオチド配列を含む、制限酵素認識部位を含む。特定の好ましい実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、少なくともａ又はｂ個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ここでａは対象内の固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは対象内の固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、各Ｖ領域をコードする遺伝子セグメントに対応する少なくとも１つのＶポリヌクレオチドと、各Ｊ領域をコードする遺伝子セグメントに対応する少なくとも１つのＪポリヌクレオチドを含むという条件で、組成物は、少なくともａ又はｂのいずれかが大きい固有の鋳型オリゴヌクレオチド配列を含む複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含む。
【００８７】
ＴＣＲ及びＩｇ遺伝子座の非再構成ゲノムＤＮＡ配列、及びこのような遺伝子座にて生産的に再構成されたＤＮＡ配列とそれらのコードされた産物を含み、またこれらの遺伝子座での疑似遺伝子を含み、更に関連するオーファンを含む、多数の適応性免疫受容体の可変（Ｖ）領域と連結（Ｊ）領域遺伝子配列が、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列として既知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号及び国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号を参照のこと。オリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化する、本明細書で提供された鋳型組成物中に含まれるべき鋳型オリゴヌクレオチドの設計及び産生のため、ＴＣＲ又はＩｇポリペプチド鎖をコードしている再構成されたＤＮＡを増幅させることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーセットの設計及び産生のため、本技術分野で既知のこれら及び他の配列が本開示にしたがって使用されてもよく、再構成されたＤＮＡは、リンパ球系細胞ＤＮＡを含む生体サンプル中に存在してもよい。
【００８８】
式（Ｉ）において、Ｖは、適応性免疫受容体（例えば、ＴＣＲ又はＢＣＲ）可変（Ｖ）領域遺伝子配列の、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００又は４５０以上１０００、９００、８００、７００、６００又は５００個以下の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチド配列又はその相補鎖であり、各複数のオリゴヌクレオチド配列Ｖは、固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。ヒト及び他の種のＴＣＲ及びＢＣＲ  Ｖ領域遺伝子に対するゲノム配列が既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋのような公的データベースから利用可能であり、Ｖ領域遺伝子配列は、発現され、再構成されたＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子の産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、またＶ領域遺伝子座において同定されている疑似遺伝子のポリヌクレオチド配列を含む。本明細書で開示された一般式（Ｉ）の鋳型内に組み込まれてもよい多種多様なＶポリヌクレオチド配列は、長さ、ヌクレオチド組成（例えば、ＧＣ含量）及び実際の直鎖ポリヌクレオチド配列において、非常に多様であり、例えば、特定の配列多様性を示す「ホットスポット」又は超可変領域を含むことが知られている。
【００８９】
一般式（Ｉ）のポリヌクレオチドＶ（又はその相補鎖）は、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバーが特異的にアニールする配列を含む。複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なプライマーセットが、例えばＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号等に記述されており、又は本明細書で記述されるように、特定のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲ  α、β、γ又はδ、又はＩｇＨ  μ、γ、δ、α又はε、又はＩｇＬ  κ又はλ）における各固有のＶ遺伝子、又は各Ｊ遺伝子に特異的にハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド配列を含むように設計されてもよい。例えば、例示の目的であり、限定ではないが、１つ又は複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー増幅セットのオリゴヌクレオチドプライマーは典型的に、１５、１６、１７、１８、１９、２０，２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の連続するヌクレオチド、又はそれ以上のヌクレオチド配列を含んでもよく、本明細書で提供したように、Ｖ又はＪポリヌクレオチドの１５、１６、１７、１８、１９、２０，２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の連続するヌクレオチドの相補配列に特異的にアニールしてもよい。特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドを含んでもよく、特定の実施形態において、プライマーは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個以下の連続するヌクレオチドの配列を含んでもよい。プライマーと、他の長さのプライアーアニール部位がまた、本明細書で開示したように、明示的に企図される。
【００９０】
一般式（Ｉ）の各ポリヌクレオチドＶの全ポリヌクレオチド配列は、各異なるＶ遺伝子からの連続するヌクレオチドから独占的になってもよいが、その必要はない。例えば、特定の実施形態にしたがって、本明細書で記述した鋳型組成物において、式（Ｉ）の各ポリヌクレオチドＶは、少なくとも、１つのＶ遺伝子中に見られ、プライマーセット内の単一のＶ領域プライマーが特異的にアニール可能な、固有のＶオリゴヌクレオチド配列を含む領域を有すればよい。したがって、式（Ｉ）のＶポリヌクレオチドは、任意の他の鋳型Ｖポリヌクレオチド中に含まれない、少なくとも１つの固有のＶオリゴヌクレオチド配列領域（プライマーアニール部位）が含まれる限り、（Ｖ疑似遺伝子配列を含む）天然に生じるＶ遺伝子配列の、全て又は任意の記述した部分（例えば、少なくとも１５、２０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０又は２１０個の連続するヌクレオチド、又はその間の任意の整数）を含んでもよい。
【００９１】
特定の実施形態において、特定のヌクレオチド配列が、鋳型Ｖ領域と、任意の天然に生じるＶ遺伝子との間で異なる場合であっても、本明細書で記述した鋳型組成物中に存在する複数のＶポリヌクレオチドが、既知の天然に生じるＶ遺伝子ヌクレオチド配列の全長をシミュレートする長さを有することが好ましい可能性がある。本明細書で記述した鋳型中のＶ領域長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０パーセント以下だけ、天然に生じるＶ遺伝子配列の長さと異なってもよい。
【００９２】
したがって、式（Ｉ）のＶポリヌクレオチドは特定の実施形態において、その開始コドンからそのＣＤＲ３コード領域までの典型的なＶ遺伝子の長さと同一か、又は同様な長さを有するヌクレオチド配列を含んでもよく、ＣＤＲ３領域をコードしているヌクレオチド配列を含んでもよいが、その必要はない。ＣＤＲ３コードヌクレオチド配列及び配列長は、かなり多様であってもよく、種々の異なるナンバリング方法（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９９  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ７：１３２、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｉｎ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７、また、例えば、Ｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：３２３、Ｓａａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８５：３２３）によって特性化されてきた。
【００９３】
簡潔に言えば、ＣＤＲ３領域は典型的には、Ｖセグメント中の（トリヌクレオチドコドンＴＧＹによってコードされた、Ｙ＝Ｔ又はＣ）高度に保存されたシステイン残基から、ＴＣＲのＪセグメント中の（ＴＴＹによってコードされた）高度に保存されたフェニルアラニン残基まで、又はＩＧＨ中の（ＴＧＧによってコードされた）高度に保存されたトリプトファンまで伸長しているポリペプチド部分に広がる。９０％を越える、ＴＣＲＢ遺伝子座中の、天然の生産的再構成は、２４〜５４ヌクレオチドの本基準によるＣＤＲ３コード長を有し、これは、９〜１７のコードされたアミノ酸に相当する。ここで開示した合成鋳型オリゴヌクレオチドのＣＤＲ３長は、任意の所与のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座に対して、天然に生じる再構成の９５％と同一の範囲に収まるべきである。したがって、例えば、複数のＴＣＲＢポリペプチドをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットの増幅効率を標準化するための本明細書で記述した鋳型組成物において、ＶポリヌクレオチドのＣＤＲ３コード部分が、その間の全ての整数を含む、２４〜５４ヌクレオチドの長さを有してもよい。上述したＣＤＲ３コード領域のナンバリング方法は、保存されているシステイン、フェニルアラニン及びトリプトファンコドンの位置を示し、これらのナンバリング方法はまた、これらの保存されたアミノ酸をコードしている１つ以上のコドンが、異なるアミノ酸をコードしているコドンと置換され得る疑似遺伝子にも適用されてもよい。これらの保存されたアミノ酸を使用しない疑似遺伝子に対して、ＣＤＲ３長は、保存された残基が、以上で引用した確立されたＣＤＲ３配列位置ナンバリング方法の１つに従って、置換を有しないと観察された対応する位置に対して定義されてもよい。
【００９４】
特定の実施形態において、本明細書で記述した鋳型組成物中に存在する複数のＶポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列が異なる場合であっても、既知の、天然に生じるＶ遺伝子配列の全ヌクレオチド組成物をシミュレートする、ヌクレオチド組成（例えば、ＧＣ含量の割合）を有することがまた好ましい。このような鋳型Ｖ領域ヌクレオチド組成は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０パーセント以下だけ、天然に生じるＶ遺伝子配列のヌクレオチド組成と異なってもよい。任意に、かつ特定の実施形態にしたがって、本明細書で記述した鋳型オリゴヌクレオチドのＶポリヌクレオチドは、一般式（Ｉ）のＶの３’末端で、又はその近くで終止コドンを含む。
【００９５】
式（Ｉ）にて、Ｊは、適応性免疫受容体結合（Ｊ）領域コード遺伝子配列の１５〜３０、３１〜６０、６１〜９０、９１〜１２０又は１２０〜１５０以上６００、５００、４００、３００又は２００個以下の連続するヌクレオチド、又はその相補鎖を含むポリヌクレオチドであり、複数のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれにおいて、Ｊは固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
一般式（Ｉ）のポリヌクレオチドＪ（又はその相補鎖）は、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバーが特異的にアニール可能な配列を含む。複数のＴＣＲ又はＢＣＲをコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なプライマーセットは、例えばＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号等に記述されており、また本明細書で記述されるように、特定のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座（例えばＴＣＲ  α、β、γ又はδ、又はＩｇＨ  μ、γ、δ、α又はε、又はＩｇＬ  κ又はλ）における各固有のＶ遺伝子と、又は各Ｊ遺伝子に特異的にハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチド配列を含むように設計され得る。
【００９７】
一般式（Ｉ）の各ポリヌクレオチドＪの全ポリヌクレオチド配列は、各別個のＪ遺伝子からの連続するヌクレオチドから独占的になってよいが、その必要はない。例えば、特定の実施形態にしたがって、本明細書で記述した鋳型組成物において、式（Ｉ）の各ポリヌクレオチドは、少なくとも、１つのＪ遺伝子中で見られ、プライマーセット中の単一のＶ領域プライマーが特異的にアニール可能な、固有のＪオリゴヌクレオチド配列を含む領域を有すればよい。したがって、式（Ｉ）のＶポリヌクレオチドは、任意の他の鋳型Ｊポリヌクレオチド中に含まれない少なくとも１つの固有のＶオリゴヌクレオチド配列領域（プライマーアニール部位）が含まれる限り、（Ｖ疑似配列を含む）天然に生じるＶ遺伝子配列の全ての、又は任意の規定された部位（例えば、少なくとも１５、２０、３０、６０，９０、１２０、１５０、１８０又は２１０個の、又はその間の任意の値の個数の連続するヌクレオチド）を含んでもよい。
【００９８】
特定の実施形態において、本明細書で記述した鋳型組成物中に存在する複数のＪポリヌクレオチドが、特定のヌクレオチド配列が、鋳型Ｊ領域と、任意の天然に生じるＪ遺伝子との間で異なる場合であっても、既知の天然に生じるＪ遺伝子ヌクレオチド配列の全長をシミュレートする長さを有することが好ましい可能性がある。本明細書で記述した鋳型におけるＪ領域長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０パーセント以下だけ、天然に生じるＪ遺伝子配列の長さと異なってもよい。
【００９９】
したがって、式（Ｉ）のＪポリヌクレオチドは、特定の実施形態において、典型的な天然に生じるＪ遺伝子の長さと同一か、又は同様である長さを有するヌクレオチド配列を含み、以上で議論したように、ＣＤＲ３領域をコードしているヌクレオチド配列を含んでもよいが、その必要はない。
【０１００】
ヒト及び他の種のＴＣＲ及びＢＣＲ  Ｊ領域遺伝子に対するゲノム配列が既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋのような公的データベースから利用可能であり、Ｊ領域遺伝子配列は、発現及び未発現の再構成されたＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子の産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ここで開示した一般式（Ｉ）の鋳型内に組み込まれ得る多種多様なＪポリヌクレオチド配列が、ヌクレオチド組成（例えば、ＧＣ含量）、実際の直鎖ポリヌクレオチド配列、及び長さにおいて非常に多様であってもよい。
【０１０１】
本明細書で記述した鋳型オリゴヌクレオチド及び／又はＶセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーの構築における使用のための、本明細書で記述したＶ及びＪ配列の代案が、各ＴＣＲ及びＩｇサブユニットの遺伝子のＶ及びＪコード領域に対する公開された遺伝子配列に関する技術分野での知識を用いて、本開示に基づいた当業者によって選択されてもよい。ヒト適応性免疫受容体配列に関する参照Ｇｅｎｂａｎｋ登録（Reference Genbank entries）として、ＴＣＲα：（ＴＣＲＡ／Ｄ）：ＮＣ＿００００１４．８（ｃｈｒ１４：２２０９００５７．．２３０２１０７５）、ＴＣＲβ：（ＴＣＲＢ）：ＮＣ＿０００００７．１３（ｃｈｒ７：１４１９９８８５１．．１４２５１０９７２）、ＴＣＲγ：（ＴＣＲＧ）：ＮＣ＿０００００７．１３（ｃｈｒ７：３８２７９６２５．．３８４０７６５６）、免疫グロブリン重鎖、ＩｇＨ（ＩＧＨ）：ＮＣ＿００００１４．８（ｃｈｒ１４：１０６０３２６１４．．１０７２８８０５１）、免疫グロブリン軽鎖−カッパ、ＩｇＬκ（ＩＧＫ）：ＮＣ＿０００００２．１１（ｃｈｒ２：８９１５６８７４．．９０２７４２３５）、及び免疫グロブリン軽鎖−ラムダ、ＩｇＬλ（ＩＧＬ）：ＮＣ＿００００２２．１０（ｃｈｒ２２：２２３８０４７４．．２３２６５０８５）が挙げられる。マウス適応性免疫受容体遺伝子座配列に対する参照Ｇｅｎｂａｎｋ登録としては、ＴＣＲβ：（ＴＣＲＢ）：ＮＣ＿００００７２．５（ｃｈｒ６：４０８４１２９５．．４１５０８３７０）、及び免疫グロブリン重鎖、ＩｇＨ  （ＩＧＨ）：ＮＣ＿００００７８．５（ｃｈｒ１２：１１４４９６９７９．．１１７２４８１６５）が挙げられる。
【０１０２】
鋳型及びプライマー設計解析及び標的部位選別の検討が、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェア及び／又はＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９〜４０２）、又は本技術分野で利用可能な他の同様のプログラムを用いて実施可能である。
【０１０３】
したがって、本開示に基づいて、かつこれらの既知の適応性免疫受容体遺伝子配列及びオリゴヌクレオチド設計法を考慮して、即席の鋳型オリゴヌクレオチドに包含するために、当業者が、それぞれ所与のＶ及びＪ遺伝子に対して固有であるオリゴヌクレオチド配列をそれぞれ独立して含有する、複数のＶ領域特異的及び、Ｊ領域特異的ポリヌクレオチド配列を設計可能である。同様に、本開示から、かつ既知の適応性免疫受容体配列を考慮して、当業者はまた、それぞれ所与のＶ及びＪ遺伝子に対して固有である、特定の配列にそれぞれ独立してアニール可能である複数のＶ領域特異的及びＪ領域特異的オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを設計可能でもあり、それによって複数のプライマーが、所与の適応性免疫受容体コード遺伝子座（例えば、ヒトＴＣＲ又はＩｇＨ遺伝子座）中の実質的に全てのＶ遺伝子と実質的に全てのＪ遺伝子を増幅可能である。このようなプライマーセットによって、（例えば、多重フォワード及びリバースプライマー対を用いて）マルチプレックス化されたＰＣＲにおいて、再構成されたＶ領域をコードする遺伝子セグメントによってコードされた第１の末端と、Ｊ領域をコードする遺伝子セグメントによってコードされた第２の末端とを有する増幅産物を生成することができる。
【０１０４】
典型的に、特定の実施形態において、本発明はそのように限定される意図はなく、ＣＤＲ３コード配列を含まない増幅産物を企図するが、このような増幅産物は、ＣＤＲ３コード配列を含んでもよい。プライマーは好ましくは、産物（アンプリコン）の配列決定によって、Ｖ遺伝子が再構成を受け、機能的適応性免疫受容体コード遺伝子を産する近位に、各遺伝子セグメント（ｉ）特定のＶ遺伝子、及び（ｉｉ）特定のＪ遺伝子に対して固有である配列に基づいて識別可能であるように、本明細書で記述したようなＶ及びＪ配列及び／又はＶ−Ｊバーコード（Ｂ）配列の十分な部分を有する増幅産物を産するように設計され得る。典型的に、好ましい実施形態において、ＰＣＲ増幅産物は、大きさにして６００塩基対未満であり、これは非限定理論にしたがって、非再構成適応性免疫受容体遺伝子からの増幅産物を除外するであろう。特定の他の好ましい実施形態において、増幅産物は、短い配列リードによって、配列の異なるアンプリコンの、迅速な高スループットの定量を有利に提供し得るように、大きさにおいて、５００、４００、３００、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０又は２０塩基対未満であろう。
【０１０５】
特定の好ましい実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、どちらが大きくても、少なくともａ又は少なくともｂ個の固有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ａは対象中の固有の適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、ｂは対象中の固有の適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントの数であり、組成物は、各固有のＶポリヌクレオチドの少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、各固有のＪポリヌクレオチドの少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、を含む。鋳型オリゴヌクレオチドが、Ｖポリヌクレオチドを含み、またＪポリヌクレオチドを含む一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有するので、鋳型組成物はしたがって、（ａ×ｂ）個より少ない固有のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよく、しかし少なくともａ又はｂ個のより多くの固有のオリゴヌクレオチド配列を含むであろうことが理解されるであろう。したがって、組成物は、各固有のＶポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの発生と、各固有のＪポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの発生とを収容してもよく、場合によっては、特定の固有のＶポリヌクレオチドの少なくとも１つの発生が、少なくとも１つの特定の固有のＪポリヌクレオチドの発生が見られ得る同一の鋳型オリゴヌクレオチド中で存在するであろう。したがって、例えば、「各固有のＶポリヌクレオチドの少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドと、各固有のＪポリヌクレオチドの少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチド」は、特定の例において、１つの固有のＶポリヌクレオチドと１つの固有のＪポリヌクレオチドが存在する単一の鋳型オリゴヌクレオチドを意味してもよい。
【０１０６】
本明細書の他の部分でまた開示するように、特定の他の好ましい実施形態において、鋳型組成物は、増幅プライマーセット中の各オリゴヌクレオチド増幅プライマーがアニール可能である、少なくとも１種の鋳型オリゴヌクレオチドを含む。したがって、組成物は、ａ又はｂ個より少ない固有配列を含んでもよく、例えば、増幅プライマーセットは、全ての可能なＶ及び／又はＪ配列に対する固有のプライマーを含まなくてもよい。
【０１０７】
特定の実施形態が、本明細書で提供したような、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプルの１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている生産的に再構成されたＤＮＡを増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマーの増幅効率を標準化する鋳型組成物を企図し、そこで鋳型組成物は、本明細書で記述したような、一般式５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｂ３−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含むことに留意されたい。これらの関連する実施形態にしたがって、そしてまた本明細書他の部分で記述するように、生産的に再構成されたＤＮＡを増幅可能な１セットのオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、Ｖ領域疑似遺伝子若しくはオーファン、又はＪ領域疑似遺伝子若しくはオーファンに対し特異的にハイブリッド形成する任意のオリゴヌクレオチドプライマーを除外してもよい。したがって、このような実施形態において、鋳型組成物は、固有のＶオリゴヌクレオチド配列及び／又は固有のＪオリゴヌクレオチド配列がそれぞれ、Ｖ領域疑似遺伝子若しくはオーファン、又はＪ領域疑似遺伝子若しくはオーファンに対して固有である配列である、一般式（Ｉ）の鋳型オリゴヌクレオチドを望ましく除外するであろう。
【０１０８】
８５８個の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む例示的なＴＣＲＢ鋳型組成物を、配列番号：３１５７〜４０１４にて配列リストに開示する。８７１の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む他の例示的なＴＣＲＢ鋳型組成物を、配列番号：１〜８７１にて配列リストに開示する。６８９個の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む他の例示的なＴＣＲＢ鋳型組成物を、配列番号：８７２〜１５６０にて配列リストに開示する。
【０１０９】
７０個の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む例示的なＴＣＲＧ鋳型組成物を、配列番号：４０１５〜４０８４にて配列リストに開示する。また、７０個の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む例示的なＴＣＲＧ鋳型組成物を、配列番号：１５６１〜１６３０にて配列リストに開示する。
【０１１０】
１１１６個の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む例示的なＩＧＨ鋳型組成物を、配列番号：４０８５〜５２００にて配列リストに開示する。また、１１１６個の別個の鋳型オリゴヌクレオチドを含む例示的なＩＧＨ鋳型組成物を、配列番号：１８０５〜２９２０にて配列リストに開示する。
【０１１１】
一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する本明細書で記述した鋳型オリゴヌクレオチドに包含する、Ｖ及びＪポリヌクレオチドの例示的なセットもまた本明細書で開示される。ＴＣＲＢに関して、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドＶ及びＪがそれぞれ、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット４、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット５、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット６、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット７、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット８、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット９、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１０、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１２及びＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１３のような、図５に示されるような、６８個のＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにて示されるＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有してもよい。
【０１１２】
ＴＣＲＧに関して、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドＶ及びＪがそれぞれ、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット４及びＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット５のような図６に示されるような１４個のＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにて示されるＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有してもよい。
【０１１３】
ＩＧＨに関して、複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドＶ及びＪがそれぞれ、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット１、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット２、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット３、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット４、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット５、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット６、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット７、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット８及びＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット９のような図７に示されるような１２７個のＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列番号の少なくとも１つのセットにて示されるＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列を有する、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有してもよい。
【０１１４】
プライマー
本開示にしたがって、オリゴヌクレオチドプライマーが、複数のＶセグメントプライマーと、複数のＪセグメントプライマーと、を含むオリゴヌクレオチドプライマー内で提供され、プライマーセットは、リンパ球系細胞ＤＮＡを含む生体サンプルの適応性免疫受容体をコードしている、再構成されたＤＮＡを増幅可能である。好適なプライマーセットが本技術分野で既知であり、本明細書で開示されており、例えばＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号等、又は表１にて示される。特定の実施形態において、プライマーセットは、サンプル中（疑似遺伝子を含む）各固有のＶ領域遺伝子の、固有のＶ領域配列に特異的にアニール可能な少なくとも１つのプライマーと、サンプル中各固有のＪ領域遺伝子の、固有のＪ領域配列に特異的にアニール可能な少なくとも１つのプライマーを含む、複数のＶ配列−特異的プライマーを含むように設計される。
【０１１５】
プライマーの設計は、既知のＴＣＲ及びＢＣＲゲノム配列の観点で、常用の方法論によって達成されてもよい。したがって、プライマーセットは好ましくは、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成の結果であり得る全ての可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせを増幅可能である。以下でまた記述するように、特定の実施形態は、１つ以上のＶプライマーが、２つ以上のＶ領域によって共有されてもよいが、全てのＶ領域に共通ではない「固有の」配列に特異的にアニール可能であり得、かつ／又は１つ以上のＪプライマーが、２つ以上のＪ領域によって共有されてもよいが、全てのＪ領域に共通ではない「固有の」配列に特異的にアニール可能であり得る、プライマーセットを企図する。
【０１１６】
特定の実施形態において、本明細書で記述した組成物及び方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的Ｖ又はＪセグメント（すなわち、Ｖ領域又はＪ領域ポリペプチドをコードしているゲノムポリヌクレオチドの部分）の１５ヌクレオチド長の連続配列と同一の、又は相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の核酸を含むか、又は核酸からなってもよい。より長いプライマー、例えば、標的Ｖ又はＪ領域領域コードポリヌクレオチドセグメントの連続配列と同一の配列、又は相補的な配列を有する約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５又は５０ヌクレオチド長のプライマーがまた、特定の実施形態において利用されるであろう。本明細書で記述されたオリゴヌクレオチドプライマーの全ての中程度の長さが、本明細書で使用のために企図される。当業者に認識され得るように、プライマーには、制限酵素認識部位、配列決定のためのアダプタ配列、バーコード配列等のような、追加配列（例えば、標的Ｖ又はＪ領域領域コードポリヌクレオチドセグメントと同一でないか、又は相補的でなくてよいヌクレオチド）を追加してもよい（例えば、表で提供されるプライマー配列及び本明細書で列記されている配列を参照のこと）。したがって、プライマーの長さは、特定の利用又は必要性に応じて、長さにして約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９５、１００ヌクレオチド以上より長くてもよい。
【０１１７】
特定の実施形態における利用のために、配列表にて示されるものを含む、ヌクレオチド配列が本明細書で提示されるオリゴヌクレオチドプラマーに対して、高度な配列同一性を共有してもよい、適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー変異体も企図される。したがって、これらの関連する実施形態において、適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書で開示された適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー配列に実質的に同一性を有してもよく、例えば、本明細書で記述した方法（例えば、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴ解析）を用いて、このようなオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書にて開示したオリゴヌクレオチドプライマー配列のような参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を含んでもよい。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、リーディングフレーム位置等を考慮することによって、適応性免疫受容体セグメントコードポリヌクレオチドにアニールする、オリゴヌクレオチドプライマー変異体の対応する能力を決定するために、適切に調節可能であることを認識するであろう。
【０１１８】
典型的に、オリゴヌクレオチドプライマー変異体は１つ以上の置換、付加、欠損及び／又は挿入を含有し、好ましくは、変異オリゴヌクレオチドのアニーリング能力は、本明細書で具体的に示されている適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー配列のそれに対して、実質的に劣らないであろう。
【０１１９】
表１は、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプル中のＴＣＲ  β−鎖（ＴＣＲＢ）をコードしている生産的に再構成されたＤＮＡを増幅可能であるオリゴヌクレオチドプライマーセットを、非限定例として示す。本プライマーセットにおいて、Ｊセグメントプライマーは、実質的な配列相同性を共有し、したがって、１つ以上の標的Ｊポリヌクレオチド配列の間でクロスプライムしてもよいが、Ｖセグメントプライマーは、ＶのＣＤＲ２領域内の標的配列に特異的にアニールするように設計され、したがって、各Ｖセグメントに固有である。しかしながら、密接に関連した標的遺伝子のファミリー内配列が同一である数個のＶプライマーの場合、例外が存在する（例えば、Ｖ６−２及びＶ６−３は、Ｖセグメントのコード配列を通してヌクレオチドレベルで同一であり、したがって、単一プライマー、ＴＲＢ２Ｖ６−２／３を有してもよい）。
【０１２０】
したがって、特定の実施形態において、鋳型組成物中の異なる鋳型オリゴヌクレオチドの数、及び／又はプライマーセット中の異なるオリゴヌクレオチドプライマーの数は、Ｖ及び／又はＪ配列中の特定の既知の類似性を利用するように、鋳型及び／又はプライマーを設計することによって、有利に減少し得る。したがって、これらの関連する実施形態において、本発明で記述する「固有の」オリゴヌクレオチド配列には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドによって共有される特定のＶポリヌクレオチド配列、及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドによって共有される特定のＪポリヌクレオチド配列が含まれてもよく、このような鋳型は、共有されたＶ及び／又はＪ配列以外によって、互いに配列が異なる。
【０１２１】
特定の本明細書で企図される実施形態にしたがって、全ての天然に生じるＶ及びＪ遺伝子の限定されたサブセットに対してのみ、不等なプライマー効率（例えば、不等なプライマー利用）からの結果であり得る１セットの増幅プライマーメンバー間の不均一な核酸増幅能のような、鋳型増幅バイアスを減少させる（例えば、統計学的に有意に減少させる）ことが有用であり得る。例えば、ワクチン内での特定の抗原に対してか、又は自己免疫疾患での組織に対してかのいずれにせよ、免疫応答に関与するＴＣＲ又はＢＣＲ免疫レパートリーの解析において、増殖性ＴＣＲ又はＩＧ再構成のみが対象であり得る。このような状況において、ＴＣＲ又はＢＣＲコードＤＮＡの増殖性再構成に寄与するそれらのＶ及びＪセグメントプライマーに対してのみ、不均一な核酸増幅能を識別し、補正し、疑似遺伝子及びオーファン（すなわち、他の染色体に二重化されたＴＣＲ又はＢＣＲ  Ｖ領域コードセグメント）の不均一増幅を補正するための努力を除外することができるので、経済的に有利であり得る。
【０１２２】
例えば、ヒトＩＧＨ遺伝子座において、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（Ｍ．−Ｐ．ＬｅＦｒａｎｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）は、１６５個のＶセグメント遺伝子に注釈を付け、そのうち２６が他の染色体上のオーファンであり、１３９個が染色体１４にてＩＧＨ遺伝子座の中にある。ＩＧＨ遺伝子座内の１３９個のＶセグメントのうち、５１個が少なくとも１つの機能的対立遺伝子を有し、一方６個が、高度に保存されたアミノ酸残基を少なくとも１つ欠いているＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）であり、８１個が疑似遺伝子である。疑似遺伝子には、Ｖセグメントコード配列内のインフレーム終止コドン、開始コドンとＣＤＲ３コード配列との間のフレームシフト、１つ以上の繰り返し配列の挿入、及び第１のエキソン又はＲＳＳのような重要な領域の欠損を含有するＶセグメントが含まれてもよい。疑似遺伝子及び／又はオーファンを特性化する時間と費用を回避しつつ、サンプルの機能的ＩＧＨ再構成を特性化するために、疑似配列に特異的な増幅プライマー及び鋳型オリゴヌクレオチドを合成又は校正せずとも、ＴＣＲ又はＢＣＲをコードするよう機能的再構成に加わるＶセグメントのみを含むように設計される、本明細書で記述される合成鋳型オリゴヌクレオチドを１サブセット利用することが企図される。したがって、とりわけ時間と費用に関して有利な効率が得られる。
【０１２３】
【表２−１】
2015171372.tif 000004
【０１２４】
【表２−２】
2015171372.tif 000005
【０１２５】
特定の実施形態において、本明細書で記述したようなＶセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーは、再構成された適応性免疫受容体遺伝子座（例えば、Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の配列上流の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の塩基対、好ましくはＶ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の配列上流の少なくとも約２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０の塩基対、及び特定の好ましい実施形態において、Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の配列上流の４０超の塩基対、及びＪ遺伝子ＲＳＳの下流の少なくとも１、２、３、４，５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の塩基対、好ましくはＪ遺伝子ＲＳＳの下流の少なくとも約２２、２４、２６、２８又は３０の塩基対、及び特定の好ましい実施形態において、Ｊ遺伝子ＲＳＳの下流の３０超の塩基対）において増幅産物を生じさせる、特定のＶ遺伝子と特定のＪ遺伝子の両方を固有に識別するために、再構成された適応性免疫受容体（ＴＣＲ又はＩｇ）の増幅産物の配列内に適切な情報が存在するよう、ヌクレオチド配列が含まれるように設計される。
【０１２６】
この特徴は、単にＶ及びＪセグメントに対する適切な大きさの産物の有無の検出のために増幅反応に主として依存する、ＴＣＲコード又はＩｇコード遺伝子配列の増幅に関して、本技術分野で記述されたオリゴヌクレオチドプライマーとは対立する（例えば、ＰＣＲ反応産物中に特定の大きさのアンプリコンが存在する場合、Ｖ又はＪセグメントの存在が示されるが、増幅されたＰＣＲ産物の配列を提供することはできず、したがって、スペクトラタイピングでは一般的である通り、その同一性を確認することができない）。
【０１２７】
オリゴヌクレオチド（例えばプライマー）は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２のジエチルホスホルアミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法のような方法による直接化学合成を含む、任意の好適な方法によって調製可能である。オリゴヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの複合体の合成方法の概説が、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５〜１８７にて提供される。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、用語「プライマー」は、好適な条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用させることのできるオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件には、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が、適切な緩衝液中、好適な温度にて、４つの異なるヌクレオシド三リン酸と伸長のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で誘導されるものが含まれる。
【０１２９】
プライマーは好ましくは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図する利用によって異なるが、典型的には６〜５０ヌクレオチド、又は特定の実施形態において、１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子の場合、一般的に、十分に安定的なハイブリッド複合体を鋳型と形成させるためには、より低温であることが要求される。プライマーには、鋳型核酸の実際の配列を反映させる必要はないが、鋳型にハイブリッド形成するために十分相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅のために好適なプライマーの設計は、本技術分野で既知であり、本明細書で引用した文献に記述されている。
【０１３０】
本明細書で記述したように、プライマーは、プライマーの検出又は固定化を許容する更なる特徴を組み込むことができるが、ＤＮＡ合成の開始点として作用するという、プライマーの基本的特性は変わらない。例えば、プライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するのではなく、増幅した産物のクローニング、検出又はシークエンシングを促進させる更なる核酸配列を５’末端に含有してもよい。本明細書では、ハイブリッド形成させるために鋳型に対して十分に相補的なプラマーの領域を、ハイブリッド形成領域と呼ぶ。
【０１３１】
本明細書で使用する際、プライマーは、十分に厳しい条件下での増幅反応中において使用される場合、プライマーが、主に標的核酸とハイブリッド形成するなら、標的配列に「特異的」である。典型的に、プライマーは、プライマーと標的からなる二本鎖の安定性が、プライマーと、サンプル中に見られる任意の他の配列との間に形成される二本鎖の安定性より大きい場合に、標的配列に対して特異的である。プライマーの特異性にはプライマーの塩条件及び塩基組成、ミスマッチの位置のような種々の因子が影響を与え得ること、並びに多くの場合、プライマーの特異性は、所定の実験により確認する必要があることを、当業者は認識するであろう。プライマーが、標的配列とのみ、安定的な二本鎖を形成可能な、ハイブリッド形成条件が選択可能である。したがって、好適な厳しい増幅条件下における標的特異的プライマーの利用によって、標的プライマー結合部位を含有するそれらの標的配列を選択的に増幅することができる。
【０１３２】
特定の実施形態において、本明細書で記述した方法で利用されるプライマーは、標的Ｖ又はＪセグメントの１５ヌクレオチド長の連続配列と同一の配列、又は相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の核酸を含むか、又はそれからなる。より長いプライマー、例えば、標的Ｖ又はＪセグメントの連続配列と同一の配列、又は相補的な配列を有する、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３６、３７、３８、３９、４０、４５又は５０ヌクレオチド長のプライマーがまた、特定の実施形態において利用されるであろう。上記プライマーの全ての中程度の長さが、本明細書で使用されるために企図される。当業者に認識され得るように、プライマーには、制限酵素認識部位、シークエンシングのためのアダプタ配列、バーコード配列等のような、追加配列（例えば、標的Ｖ及びＪセグメントと同一か、又は相補的ではないヌクレオチド）を追加してもよい（例えば、本明細書及び配列表で提供されたプライマー配列を参照のこと）。したがって、プライマーの長さは、特定の使用又は必要性に応じて、長さにして５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５ヌクレオチド以上のように、より長くてもよい。例えば、１つの実施形態において、フォワード及びリバースプライマーは両方とも、ＤＮＡシークエンサーと適合する、ユニバーサルフォワードプライマー配列で、５’末端で修飾される。
【０１３３】
特定の実施形態における利用のために、配列表にて示されるものを含むヌクレオチド配列が、本明細書で提示されるオリゴヌクレオチドプラマーに対して高度な配列同一性を共有してもよい、適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー変異体も企図される。したがって、これらの関連する実施形態において、適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書で開示された適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー配列に実質的に同一性を有してもよく、例えば、本明細書で記述した方法（例えば、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴ解析）を用いて、このようなオリゴヌクレオチドプライマー変異体は、本明細書にて開示したオリゴヌクレオチドプライマー配列のような参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を含んでもよい。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、リーディングフレーム位置等を考慮することによって、適応性免疫受容体セグメントコードポリヌクレオチドにアニールする、オリゴヌクレオチドプライマー変異体の対応する能力を決定するために、適切に調節可能であることを認識するであろう。
【０１３４】
典型的に、オリゴヌクレオチドプライマー変異体は１つ以上の置換、付加、欠損及び／又は挿入を含有し、好ましくは、変異オリゴヌクレオチドのアニーリング能力は、本明細書で具体的に示されている適応性免疫受容体のＶセグメント又はＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマー配列のそれに対して、実質的に劣らないであろう。本明細書の他の場所でまた言及されるように、好ましい実施形態において、適応性免疫受容体のＶセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＤＲ３に対するコード領域を含む、再構成されたＴＣＲ又はＩＧＨ配列を増幅可能であるように設計される。
【０１３５】
本明細書で企図される特定の実施形態にしたがって、本開示のマルチプレックスＰＣＲ法で使用されるプライマーは、非Ｔ又はＢ細胞配列の非特異的プライミングを防止するために、機能的にブロックされてもよい。例えば、プライマーは、米国特許出願公開第２０１０／０１６７３５３号にて記述されたように、化学修飾でブロックされてもよい。特定の本明細書で開示された実施形態にしたがって、本マルチプレックスＰＣＲ反応でのこのようなブロックされたプライマーの利用には、ＤＮＡ複製（すなわち、プライマー伸長）がブロックされる不活性配座（inactive configuration）と、ＤＮＡ複製が進む活性配座（activated configuration）とを有してもよいプライマーが関与する。プライマーの不活性配座は、プライマーが一本鎖である場合、あるいはプライマーが対象の標的ＤＮＡ配列に対し特異的にハイブリッド形成するものの、プライマーの３’末端又はその周辺に結合させる化学部位によってプライマー伸長がブロックされたままである場合に存在する。
【０１３６】
プライマーの活性化配座は、プライマーが対象の標的核酸配列にハイブリッド形成し、続いて３’ブロッキング基を除去するためのＲＮａｓｅ  Ｈ又は他の切断試薬によって作用し、それによって酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が、増幅反応中にプライマー伸長を触媒することができる時に存在する。理論に束縛されるものではないが、このようなプライマーのハイブリッド形成の速度則は、二次反応に近く、したがって、混合物中のＴ細胞又はＢ細胞遺伝子配列濃度の関数となると考えられる。ブロックされたプライマーでは、標的とハイブリッド形成させ、続いて切断した後にプライマー伸長を進行させる必要があることから、非特異的反応が最小化される。プライマーが、所望の標的配列と関連するが、結果として塩基対ミスマッチとなる１つ以上の非相補的ヌクレオチドを有する点で異なる配列と不正確にハイブリッド形成する場合、プライマーの切断は、特に切断部位又はその周辺にミスマッチが存在する場合に阻害される。増幅の適合度を改善するための本方策は、このような場所における誤ったプライミングの頻度を減少させ、反応の特異性を増加させる。当業者によって認識され得るように、反応条件、とりわけＲＮａｓｅ  Ｈの濃度、及び各サイクル中にハイブリッド形成及び伸長させる時間は、その真の標的配列と正しくハイブリッド形成する時の、プライマーの非常に効率的な切断と、不正確にアニールし得る鋳型配列との間でミスマッチが存在する時の、プライマーの切断の乏しさとの間における切断効率の差を最大化するように最適化することができる。
【０１３７】
米国特許第２０１０／０１６７３５３号に記述されるように、伸長を防止するために、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’末端に、又はその近くに配置可能な多数のブロッキング基が本技術分野で既知である。プライマー及び他のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’デオキシリボヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド残基、非ヌクレオチドの連結又はアルカンジオール修飾（米国特許第５，５５４，５１６号）の付加によって、ＤＮＡ合成の開始を予防、又は阻害するために、３’末端ヌクレオチドにて修飾されてもよい。プライマー伸長を阻害、又はブロックするために使用され得るアルカンジオール修飾はまた、Ｗｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（８）：２０６５）及びＡｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，０３１，０９１号）によって記述されてきた。好適なブロッキング基の更なる例としては、３’ヒドロキシル置換基（例えば、３’−リン酸塩、３’−三リン酸塩又は３−ヒドロキシプロピルのようなアルコールを有する３’−リン酸ジエステル）、２’，３’−環状リン酸塩、末端ＲＮＡ塩基の２’ヒドロキシル置換基（例えば、リン酸塩又はトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）又はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）等の立体的に嵩高な基）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの３’末端にて置換されたＴＩＰＳ及びＴＢＤＭＳのような２’−アルキルシリル基が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｉｋｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第１１／６８６，８９４号によって記述されている。嵩高な置換基がまた、プライマー伸長をブロックするために、オリゴヌクレオチドの３’−末端残基の塩基上に組み込まれてもよい。
【０１３８】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を阻害するために使用されるブロッキング基の上流（例えば、５’）に位置する切断ドメインを含んでもよい。例として、切断ドメインは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインであってもよく、切断ドメインは、単一ＲＮＡ残基を含むＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインであってもよく、又はオリゴヌクレオチドは、１つ以上の選択的なヌクレオシドでのＲＮＡ塩基の置換を含んでもよい。更なる例示的な切断ドメインが、米国特許第２０１０／０１６７３５３号に記述されている。
【０１３９】
したがって、マルチプレックスＰＣＲシステムは、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５個以上のフォワードプライマーを使用してもよく、各フォワードプライマーは、単独の機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖセグメント、又は機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖセグメントの小ファミリー、例えば、ＴＣＲ  Ｖβセグメントに相補的であり（例えば、表１、配列番号：１６４４〜１６９５にて示されるようなＴＣＲＢＶプライマーを参照のこと）、例えば、ＴＣＲ  Ｊβセグメント（例えば、表１、配列番号：１６３１〜１６４３中のＴＣＲＢＪプライマーを参照のこと）のようなＴＣＲ又はＩｇ  Ｊセグメントに特異的な、１３個のリバースプライマーを使用してもよい。他の実施形態において、マルチプレックスＰＣＲ反応は、それぞれ１つ以上の機能的ＴＣＲγ  Ｖセグメントに特異的な４個のフォワードプライマーと、それぞれ１つ以上のＴＣＲγ  Ｊセグメントに特異的な４個のリバースプライマーを使用してもよい。他の実施形態において、マルチプレックスＰＣＲ反応は、それぞれ１つ以上の機能的Ｖセグメントに特異的な８４個のフォワードプライマーと、それぞれ１つ以上のＪセグメントに特異的な６個のリバースプライマーを使用してもよい。
【０１４０】
熱サイクル条件は、当業者の方法にしたがってもよい。例えば、ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）熱サイクラー（Ｈｙｂａｉｄ，Ａｓｈｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いて、以下のサイクル条件が使用されてもよい。９５℃にて１５分間の１サイクル、９４℃にて３０秒間、５９℃で３０秒間及び７２℃で１分間の２５〜４０サイクル、続いて７２℃にて１０分間の１サイクル。当業者によって認識され得るように、熱サイクル条件は、例えば、アニーリング温度、アニーリング時間、サイクル数及び伸長時間を改善することによって最適化されてもよい。当業者によって認識され得るように、使用されるプライマー及び他のＰＣＲ試薬の量、並びにＰＣＲパラメータ（例えば、アニーリング温度、伸長時間及びサイクル数）は、所望のＰＣＲ増幅効率を達成するために最適化されてもよい。
【０１４１】
あるいは、本明細書でまた企図される特定の関連する実施形態において、「デジタルＰＣＲ」法が、標準曲線を必要とせずに、サンプル中の標的ゲノムの数を定量するために使用可能である。デジタルＰＣＲにおいて、単一サンプルに対するＰＣＲ反応は、各液滴が増幅するか（例えば、増幅産物の生成によって、マイクロセル又は液滴に少なくとも１種の鋳型分子が存在することを証明する）、又は増幅に失敗するか（所与のマイクロセル又は液滴に鋳型が存在しないことを証明する）のいずれかであるように、１００マイクロセル又は液滴よりも大きい程度で実施される。陽性のマイクロセルの数を単純に数えることによって、入力サンプルに存在する標的ゲノムの数を直接数えることが可能である。
【０１４２】
デジタルＰＣＲ法は典型的に、熱サイクル反応における各サイクルの後に測定される従来の定量的ＰＣＲシグナルとは違い、エンドポイントリードアウトを用いる（例えば、Ｐｅｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ  １１（１３）：２１５６、Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ  １１（１３）：２１６７、Ｔｅｗｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１０２５、２０１０  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７８、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：９２３６〜４１、Ｐｏｈｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｈ，２００４  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４（１）、４１〜７，２００４を参照のこと）。伝統的なＰＣＲと比較して、ｄＰＣＲは以下の利点を持つ。（１）参照又は標準に依存する必要がない。（２）所望の精度が、ＰＣＲ複製の総数を増加させることによって達成され得る。（３）阻害因子に対して耐性が高い。（４）複合体混合物を解析可能である。（５）サンプルに存在するコピー数に対して線形応答を提供し、コピー数における小さな変化も検出する。したがって、任意の本明細書に記述した組成物（例えば、鋳型組成物及び適応性免疫受容体遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドプライマーセット）と方法が、このようなデジタルＰＣＲ方法論、例えば、ＡＢＩ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｔｈｅ  ＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ｔｈｅ  ＱｕａｎｔａＬｉｆｅ（商標）ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）又はｔｈｅ  ＲａｉｎＤａｎｃｅ（商標）ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）での使用のために適合されてもよい。
【０１４３】
アダプタ
本明細書で記述された一般式（Ｉ）の鋳型オリゴヌクレオチドはまた、特定の実施形態において、第１（Ｕ１）及び第２の（Ｕ２）のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を含み、又はＵ１及びＵ２何れか、又は両方を欠いてもよい。Ｕ１はしたがって、存在しないか、又は（ｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第１のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結して５’に位置する第１の配列プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列と、から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよく、Ｕ２は存在しないか、又は（ｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結して５’に位置する第２の配列プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列から選択される配列と、を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【０１４４】
Ｕ１及び／又はＵ２は、例えば、ユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列及び／又はＨｉＳｅｑ（商標）又はＧｅｎｅＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）−２（ＧＡ−２）ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は計測、試薬及びソフトウェアの他の好適なシークエンシング一式のような、使用されている単一分子シークエンシング技術に特異的である、シークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。このようなプラットフォーム特異的アダプタ配列の包含により、ＨｉＳｅｑ（商標）又はＧＡ２又は等価物のような、ヌクレオチドシークエンシング方法論を用いて、一般式（Ｉ）の複数の異なる鋳型オリゴヌクレオチドを含む、本明細書で記述した鋳型組成物の直接定量的シークエンシングを行うことができる。したがって、この特徴により、鋳型組成物を定性的かつ定量的に特性化することができる。
【０１４５】
とりわけ、直接的には、鋳型組成物の全ての成分を配列決定する能力によって、複数の鋳型オリゴヌクレオチドにおける各鋳型オリゴヌクレオチドが、実質的に等モル量で存在することを検証することができる。例えば、本明細書で記述した１セットの鋳型オリゴヌクレオチドは、更にシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドを組み込むためのアダプタ配列が各鋳型の各末端に使用され得るように、両末端にユニバーサルアダプタ配列を有するよう生成することもできる。
【０１４６】
理論に束縛されるものではないが、成分鋳型オリゴヌクレオチドのそれぞれの鋳型成分における相対的提示が定量的に変わらないように、２サイクルだけの変性、アニーリング及び伸長において、５’（５’−プラットフォーム配列−ユニバーサルアダプタ−１配列−３’）及び３’（５’−プラットフォーム配列−ユニバーサルアダプタ−２配列−３’）オリゴヌクレオチドを用いて、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドをこのような修飾鋳型の末端上に加えてもよい。固有の識別子配列（例えば、本明細書で記述するように、それぞれ個々のＶ及びＪ領域と関連づけられ、識別する固有のＶ及びＢオリゴヌクレオチド配列を含むバーコード配列Ｂ）がアダプタ配列に近接して配置されるので、存在する各固有の鋳型配列の相対量の基準によって、鋳型集団を特性化するために、短い配列リードにて、定量的シークエンシングを行うことができる。
【０１４７】
このような直接定量的シークエンシングが、１つ以上の特定のオリゴヌクレオチドが、鋳型組成物の調製において、過剰提示又は過少提示されることを示す場合、全てのオリゴヌクレオチドが実質的に等モル量で存在する鋳型組成物を得るために、鋳型組成物の調節が行われてもよい。次いで、全てのオリゴヌクレオチドが実質的に等モル量で存在する鋳型組成物が、プライマーセットのメンバー間の不均一増幅能を決定及び補正するために本明細書で開示された方法において、増幅プライマーセットに対する校正標準として使用されてもよい。
【０１４８】
実施例にて記述し、配列表の例示的な鋳型配列（例えば、配列番号：１〜１６３０の５’及び３’末端）に含まれるアダプタ配列に加えて、本明細書で開示した鋳型の他の部分で見られる配列と異なる、アダプタオリゴヌクレオチド配列の選別を含む、ユニバーサルアダプタ配列として使用され得る他のオリゴヌクレオチド配列は、本開示の観点から見て、当業者に周知であろう。更なるアダプタ配列の非限定例を、表２で示し、配列番号：１７１０〜１７３１に示す。
【０１４９】
【表３】
2015171372.tif 000006
【０１５０】
バーコード
本明細書で記述するように、特定の実施形態は、全増幅産物を配列決定する必要なく、鋳型配列の、すなわち、鋳型の増幅に寄与する少なくとも１つのプライマーを明白に識別することができる、短いシグネチャー配列を含有する、鋳型オリゴヌクレオチド配列を設計することを企図する。一般式（Ｉ）の本明細書で記述した鋳型オリゴヌクレオチドにおいて、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４はそれぞれ独立して、存在しないか、又はそれぞれ、（その間の全ての整数値を含む）３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００，９００又は１０００個以上の連続するヌクレオチドのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドＢを含み、複数の鋳型オリゴヌクレオチド配列のそれぞれにおいて、Ｂが、対となる組み合わせとして、（ｉ）鋳型オリゴヌクレオチドの固有のＶオリゴヌクレオチド配列と、（ｉｉ）鋳型オリゴヌクレオチドの固有のＪオリゴヌクレオチド配列とを固有に識別する、固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
したがって、例えば、バーコード識別子配列を有する鋳型オリゴヌクレオチドは、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００，１００，９０、８０、７０、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０，１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４ヌクレオチド以下のバーコード配列リードのような、比較的短い増幅産物配列リードを許容してもよく、その後、鋳型設計の部分としてバーコードを有する鋳型内に組み込まれる関連するＶ及びＪ配列と、本バーコード配列情報を照合させる。本アプローチにより、複合プライマーセットにおける増幅バイアスに寄与するプライマーを識別するために、多数の増幅産物が、同時に部分的に、高スループット平行シークエンシングによって配列決定可能である。
【０１５２】
例示的なバーコードは、それぞれ、長さにして、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２ヌクレオチドのバーコードを提供するために、鋳型における各Ｖポリヌクレオチドを固有に識別する、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６ヌクレオチドの第１のバーコードオリゴヌクレオチドと、鋳型における各Ｊポリヌクレオチドを固有に識別する、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６ヌクレオチドの第２のバーコードオリゴヌクレオチドと、を含んでもよいが、これらの関連する実施形態はそのように制限される意図はない。バーコードオリゴヌクレオチドは、最短バーコード長が、異なる配列（例えば、Ｖ及びＪ配列）を有する２つ以上の鋳型オリゴヌクレオチドの所与のバーコード配列の発生が起きないようにして得られる限り、任意の長さのオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１５３】
したがって、異なるＶ−Ｊ配列対を固有に識別するために使用されるバーコード間のこのような冗長性を避けるために、最短バーコード長は、Ｘヌクレオチドであり、４ｘは非同一配列を有することに基づいて差異化される異なる鋳型種の数よりも大きい。例えば、配列番号：１〜８７１として本明細書で示される、１セットの８７１個の鋳型オリゴヌクレオチドに対する、最短バーコード長は、５ヌクレオチドであり、これは、１０２４個の（すなわち、８７１個より大きい）異なる、可能性のある疑似遺伝子配列の理論的総計を許容するであろう。実際、バーコードオリゴヌクレオチド配列リード長は、使用されるべきヌクレオチドシークエンシング装置の配列リード長の制限によってのみ制限されてもよい。特定の実施形態のために、鋳型オリゴヌクレオチドの個々の種を区別するであろう異なるバーコードオリゴヌクレオチドは、バーコードオリゴヌクレオチド配列中の特定の位置で一致するヌクレオチドの数を最大化するために整列する時、少なくとも２つのヌクレオチドの不一致（例えば、最小ハミング距離２）を有するべきである。
【０１５４】
好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）の鋳型組成物内に固有の配列を有する各異なる鋳型オリゴヌクレオチド種において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４は同一であろう。
【０１５５】
当業者は、その間の全ての整数値を含む、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、３００、５００個以上の連続するヌクレオチドの設計、合成、及びより大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造内への組み込みに周知であろう。オリゴヌクレオチドバーコード配列識別方策の設計及び実施の非限定例に関しては、例えば、ｄｅ  Ｃａｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ａｄｖ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：６３１０、Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３５（１９）：３３０、Ｒｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２９１を参照のこと。
【０１５６】
典型的には、バーコードは、それらが、天然では見られない位置で鋳型の中に配置され、すなわち、バーコードが隣接しておかれる配列付近に見られ得る天然に生じるオリゴヌクレオチド配列（例えば、Ｖ及び／又はＪ配列）とは異なるヌクレオチド配列を含む。このようなバーコード配列は、本明細書で記述した特定の実施形態にしたがって、一般式（Ｉ）の本明細書で開示される鋳型オリゴヌクレオチドの配列Ｂ１、Ｂ２及び／又はＢ３として含まれてもよい。したがって、一般式（Ｉ）の本明細書で記述される鋳型オリゴヌクレオチドのあるものは、特定の実施形態において、１つ、２つ又は３つ全てのバーコードＢ１、Ｂ２及びＢ３を含んでもよく、一方、特定の他の実施形態において、３つのうちいくつか又は全てのバーコードが存在しなくてもよい。特定の実施形態において、全てのバーコード配列は、同一又は同様のＧＣ含量を有するであろう（例えば、ただ２０％以下、又は１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０％以下だけ、ＧＣ含量が異なる）。
【０１５７】
特定の本明細書で開示された実施形態にしたがった鋳型組成物において、バーコード含有配列Ｂ（例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及び／又はＢ４）は、単一の対になったＶ−Ｊの組み合わせを固有に識別するオリゴヌクレオチド配列を含む。任意に、そして特定の実施形態において、バーコード含有配列Ｂはまた、各特定の対になったＶ−Ｊの組み合わせを固有に識別する特定のバーコード配列の上流及び／又は下流に位置する、ランダムヌクレオチド、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、２００，３００、５００個以上の連続するヌクレオチドのランダムポリヌクレオチド配列を含んでもよい。特定のバーコード配列の上流及び下流両方に存在する時に、ランダムヌクレオチド又はランダムポリヌクレオチド配列は、互いに独立し、すなわち、同一のヌクレオチド又は同一のポリヌクレオチド配列を含んでもよいが、その必要はない。
【０１５８】
制限酵素部位
本明細書で開示した特定の実施形態にしたがって、鋳型オリゴヌクレオチドは、Ｖ及びＪ配列間に位置し、鋳型オリゴヌクレオチド配列中の他の場所では発生しない、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）認識部位を含んでもよい。ＲＥ認識部位は、Ｖ領域配列を識別するバーコード部位に任意に隣接してもよい。ＲＥ部位は、鋳型を適切な制限酵素に接触させることによって、選択的にそれらを破壊するために利用され得る構造的特徴としての制限されることなく、任意の多数の目的のために含まれてもよい。例えば、鋳型オリゴヌクレオチドを、それらが意図的に、又は偶発的に導入された他の組成物から除去するために、好適なＲＥと接触させることによって、選択的に本鋳型オリゴヌクレオチドを分解することが望ましい場合がある。あるいは、ＲＥ部位は、鋳型組成物中の鋳型オリゴヌクレオチドのシークエンシングの過程で、かつ／又は制限酵素で切断するか、又はしないかにかかわらず、鋳型オリゴヌクレオチド配列内の位置配列マーカーとして、有益に利用されてもよい。例示的なＲＥ部位は、オリゴヌクレオチドモチーフＧＴＣＧＡＣであり、これは制限酵素Ｓａｌ  Ｉによって認識される。多数の更なる制限酵素及びそれらの対応するＲＥ認識部位配列が本技術分野で既知であり、市販されている（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。これらには、例えば、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）及びＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）が含まれる。当業者は、任意の種々のこのようなＲＥ認識部位が、本明細書で開示される鋳型オリゴヌクレオチドの特定の実施形態内に組み込まれてもよいことを理解するであろう。
【０１５９】
シークエンシング
シークエンシングは、種々の利用可能な高スループット単独分子シークエンシング装置及びシステムを用いて実施されてもよい。具体的なシークエンスシステムとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及び関連する装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、又は同様の能力を有する他のシステムのような、合成時解読（sequence-by-synthesis）システムが挙げられる。シークエンシングは、増幅されたＤＮＡ分子内の定義された領域にハイブリッド形成する、１セットのシークエンシングオリゴヌクレオチドを用いて達成される。シークエンシングオリゴヌクレオチドは、本開示に基づいて、かつ公的に利用可能なデータベースで見られる既知の適応性免疫受容体遺伝子配列の観点から見て、生成される配列によって、Ｖ及びＪコード遺伝子セグメントが固有に識別可能であるように設計される。例えばＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７、国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号又は国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号を参照のこと。例示的なＴＣＲＢ  Ｊ領域シークエンシングプライマーが、表３に示される。
【０１６０】
【表４】
2015171372.tif 000007
【０１６１】
用語「遺伝子」は、全て又は一部のＴＣＲ又はＩｇポリペプチド（例えば、ＣＤＲ３含有ポリペプチド）のようなポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コーディング領域「リーダー及びテーラー」並びに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）の前及び後の領域を含み、また制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、受容体結合部位等）を含んでもよく、また本明細書で記述したように、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）も含んでもよい。
【０１６２】
またポリヌクレオチドとして本明細書で呼ばれる、本実施形態の核酸は、ＲＮＡの形態、又はＤＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖である。本実施形態にしたがった利用のための、ＴＣＲ又は免疫グロブリン又はその領域（例えば、Ｖ領域、Ｄセグメント、Ｊ領域、Ｃ領域等）をコードするコード配列は、任意の所与のＴＣＲ又は免疫グロブリン遺伝子領域又はポリペプチドドメイン（例えば、Ｖ領域ドメイン、ＣＤＲ３ドメイン等）に関する本技術分野で既知のコード配列と同一であってもよく、又は異なるコード配列であってもよく、遺伝的コードの冗長性又は縮重の結果として、同一のＴＣＲ又は免疫グロブリン領域又はポリペプチドをコードする。
【０１６３】
特定の実施形態において、増幅された、Ｊ領域をコードする遺伝子セグメントは、それぞれ、ＲＳＳ部位に対して定義された位置に存在する、２、３、４、５、６、７、８、１０又は約１５、２０ヌクレオチド以上の固有配列定義識別子タグを有してもよい。例えば、４つの塩基タグが、ＲＳＳ部位から＋１１〜＋１４下流位置にて、増幅されたＴＣＲβ  ＣＤＲ３コード領域のＪβ領域コードセグメント中で使用され得る。しかしながら、これらの関連する実施形態は、そのように制限される必要はなく、また、Ｊ領域をコードする遺伝子セグメント中で検出され、ＲＳＳ部位に対するそれらの位置に基づいて定義されてもよい、他の相対的短いヌクレオチド配列定義識別子タグも企図される。これらは、異なる適応性免疫受容体コード遺伝子座間で様々であってもよい。
【０１６４】
組換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、１２＋／−１ｂｐ（「１２−シグナル」）又は２３＋／−１ｂｐ（「２３−シグナル」）のいずれかのスペーサーによって分離された、２つの保存された配列（ヘプタマー、５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’及びナノマー５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ−３’）からなる。多数のヌクレオチド位置が、ヘプタマーの位置１及び２でＣＡジヌクレオチドを含む組換えに対して重要であるとして特定されており、ヘプタマー位置３でのＣが、ナノマーの位置５、６、７でのＡヌクレオチドと同様、非常に好ましいものと示されてきた（Ｒａｍｓｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．１９９４、Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ．ａｌ．１９９４、Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ．ａｌ．１９８９）。その他のヌクレオチドの変異では、最小又は一貫性のない効果がもたらされる。より変動が大きくなるものの、スペーサーもまた組換えに大きな影響を与え、単一ヌクレオチド置換が、組換え効率に有意に影響を与えることが示されてきた（Ｆａｎｎｉｎｇ  ｅｔ．ａｌ．１９９６，Ｌａｒｉｊａｎｉ  ｅｔ．ａｌ  １９９９、Ｎａｄａｌ  ｅｔ．ａｌ．１９９８）。有意に異なる組換え効率を有するＲＳＳポリヌクレオチド配列を識別するための基準が記述されている（Ｒａｍｓｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ  １９９４、Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ．ａｌ．１９９４、Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ．ａｌ．１９８９及びＣｏｗｅｌｌ  ｅｔ．ａｌ．１９９４）。したがって、シークエンシングオリゴヌクレオチドは、ＲＳＳ部位の＋１１〜＋１４下流位置にて、増幅されたＪコード遺伝子セグメント内で、４つの塩基タグに隣接してハイブリッド形成してもよい。例えば、ＴＣＲＢに対するシークエンシングオリゴヌクレオチドは、この「タグ」のちょうど下流で見られる、コンセンサスヌクレオチドモチーフにアニールするように設計され、配列リードの最初の４つの塩基が、Ｊコード遺伝子セグメントを固有に識別するであろう（例えば、国際公開第２０１２／０２７５０３号参照）。
【０１６５】
Ｖセグメントの第２の保存されたシステインと、Ｊセグメントの保存されたフェニルアラニンとの間の、ＴＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチドとして定義される、ＴＣＲのＣＤＲ３−コード領域は、３５＋／−３ヌクレオチドである。したがって、特定の実施形態において、特定のＴＣＲ又はＩｇＨ  Ｊ領域（例えば、本明細書で記述したような、ＴＣＲ  Ｊβ、ＴＣＲ  Ｊγ又はＩｇＨ  ＪＨ）のＪセグメントタグから開始する、ＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーとＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ほぼ常に、５０塩基対リード中に完全なＶ−Ｄ−Ｊ連結を得ることができるであろう。Ｖセグメント中の保存されたシステインと、Ｊセグメント中の保存されたフェニルアラニンと間のヌクレオチドとして定義される、ＩｇＨ  ＣＤＲ３領域の平均長は、ＴＣＲβ遺伝子座におけるよりも抑制されないが、典型的には約１０〜約７０ヌクレオチドであるであろう。したがって、特定の実施形態において、ＩｇＨ  Ｊセグメントタグから開始する、ＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーとＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、１００塩基対リード中に完全なＶ−Ｄ−Ｊ連結を得ることができるであろう。
【０１６６】
不一致な鋳型配列上のポリヌクレオチド伸長にアニールするか、又はそれを支持するＰＣＲプライマーは、雑多なプライマーと呼ばれる。特定の実施形態において、ＴＣＲ及びＩｇ  ＪセグメントリバースＰＣＲプライマーは、マルチプレックスＰＣＲのコンテキストにおいて、雑多なプライミングを最小化するために、シークエンシングオリゴヌクレオチドとの重なりを最小化するように設計され得る。１つの実施形態において、ＴＣＲ及びＩｇ  Ｊセグメントリバースプライマーは、シークエンシングプライマーの最小の重なりを有して、コンセンサススプライス部位モチーフにアニールすることによって３’末端で固定されている。一般に、ＴＣＲ及びＩｇ  Ｖ及びＪセグメントプライマーは、既知の配列／プライマー設計及びデフォルトパラメータ下の解析プログラムを用いて、一貫したアニーリング温度でのＰＣＲにて動作するように選択されてもよい。
【０１６７】
シークエンシング反応のための、例示的なＩＧＨＪシークエンシングプライマーは、国際公開第２０１２／０２７５０３号にて記述されるように、保存されたＣＡＧ配列にわたって３つのヌクレオチドを伸長する。
サンプル
試験生体サンプルが得られる対象又は生物源は、ヒト又は非ヒト動物、又はトランスジェニック又はクローン化、又は（幹細胞の利用を介するものを含む）組織遺伝子操作を受けた生物であってもよい。本発明の特定の好ましい実施形態において、対象又は生物源は、血液又は固形がん又は他の悪性状態、又は自己免疫疾患、又は炎症状態を有することが既知であってよく、あるいは有するという又はリスク下にあるという疑いがあってよく、本発明の特定の好ましい実施形態において、対象又は生物源は、このような疾患のリスク又は存在がないことが既知であってもよい。
【０１６８】
特定の好ましい実施形態は、米国国立がん研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）のものような、又はＤｅＶｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）にて記述されたような、本技術分野で許容された臨床診断基準にしたがって、がんになる、又はがんにかかるリスクを有する、又はリスクであるとして診断された患者のような、ヒト対象である対象又は生物源を企図し、特定の実施形態が、このような基準によってがんを有する、がんになる、又はがんにかかるリスクがないことが既知であるヒト対象を企図する。
【０１６９】
特定の他の実施形態は、固体腫瘍及び／又は他のがんに関する前臨床モデルを含む、前臨床モデルとして本技術分野に既知であり得るこのような非ヒト対象を含む、非ヒト対象又は生物源、例えばマカク、チンパンジー、ゴリラ、ベルベット、オラウータン、オナガザル又は他の非ヒト霊長類を企図する。特定の他の実施形態は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモット又は他の動物である非ヒト対象を企図し、多くのこのような哺乳類が、血液又固形腫瘍及び／又は他のがんを含む、特定の疾患又は疾病に対する前臨床モデルとして本技術分野に対して既知の対象であり得る（例えば、Ｔａｌｍａｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：７９３、Ｋｅｒｂｅｌ，２００３  Ｃａｎｃ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１３４、Ｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｃａｎｃ．Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．２６：７３７、Ｃｅｓｐｅｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．８：３１８）。実施形態の範囲はそのように限定されることを意図しないが、対象又は生物源が非哺乳類脊椎動物、例えば他の高次脊椎動物、又は鳥類、両生類又はは虫類種、又は他の対象若しくは生物源であり得る他の実施形態も企図される。
【０１７０】
生体サンプルは、対象又は生物源からの、血液サンプル、生検標本、組織外植、器官培養、生体液又は他の組織又は細胞調整物を得ることによって提供されてもよい。好ましくは、サンプルには、例示の目的であり、制限ではないが、１つ以上のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子座にて再構成されたＤＮＡを含有してもよい、対象又は生物源のリンパ球系細胞由来のＤＮＡが含まれる。特定の実施形態において、試験生体サンプルは、例えば外科的切除、針生検、又は細胞の混合物を含有する試験生体サンプルを得るための他の手段によって、固形組織（例えば、固形腫瘍）から得られる。
【０１７１】
特定の実施形態において、任意の多数の確立された方法論にしたがってリンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞）を単離することが望ましく、そこで単離されたリンパ球系細胞は、それらが天然に生じる組織、周辺又は環境から除去又は分離されたものである。Ｂ細胞及びＴ細胞はしたがって、骨髄、胸腺、リンパ腺、リンパ節、末梢組織及び血液を含む様々な組織及び生体液サンプルからのような、生体サンプルから得られるが、末梢血液がもっとも入手しやすい。Ｂ及びＴ細胞の存在のために任意の末梢組織がサンプリングされてもよく、本明細書で記述された方法での使用が企図される。適応性免疫細胞が得られる組織及び生体液としては、皮膚、上皮組織、結腸、脾臓、粘膜分泌物、口腔粘膜、腸粘膜、膣粘膜又は膣分泌液、頸部組織、神経節、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、臍帯血、血清、漿膜液、血漿、リンパ、尿、腹水、胸膜液、心膜液、腹膜液、腹液、培養培地、条件培養培地、又は洗浄液が挙げられる。特定の実施形態において、適応性免疫細胞は、アフェレーシスサンプルから単離されてもよい。末梢血液サンプルは、対象から静脈切開によって得られる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配分離によって、当業者に既知の技術によって単離される。特定の実施形態において、全てのＰＢＭＣが解析に使用される。
【０１７２】
核酸抽出に際し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用い、本技術分野で既知の方法及び／又は市販のキットを用いて、細胞から全ゲノムＤＮＡを抽出することができる。単一ハプロイドゲノムのおよその重量は３ｐｇである。好ましくは、少なくとも１００，０００〜２００，０００の細胞、すなわち２倍体Ｔ又はＢ細胞からの約０．６〜１．２μｇのＤＮＡが解析に使用される。供給源としてＰＢＭＣを使用して、Ｔ細胞の数は、総細胞の約３０％であると推定可能である。Ｂ細胞の数はまた、ＰＢＭＣ調製物内の総細胞の約３０％であると推定可能である。
【０１７３】
Ｉｇ及びＴＣＲ遺伝子座は、多くの異なる可変（Ｖ）、多様（Ｄ）及び連結（Ｊ）遺伝子セグメントを含有し、早期リンパ分化の間、再構成プロセスにかけられる。Ｉｇ及びＴＣＲ  Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子配列が本技術分野で既知であり、ＧＥＮＢＡＮＫのような公的データベースにて利用可能である。Ｖ−Ｄ−Ｊ再構成は、Ｄ遺伝子セグメントの両側にてＶ遺伝子セグメントの下流と、Ｊ遺伝子セグメントの上流に位置する、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）にてＤＮＡを認識し、切断することによって、ＲＡＧ１及びＲＡＧ２タンパク質が重要な役割を果たす、リコンビナーゼ酵素複合体を介して仲介される。適切でないＲＳＳは、再構成を減少させ、又は完全に妨げる。組換えシグナル配列（ＲＳＳ）には、１２＋／−１ｂｐ（「１２−シグナル」）又は２３＋／−１ｂｐ（「２３−シグナル」）の何れかのスペーサーによって分離される、２つのコンセンサス配列（ヘプタマー、５’−ＣＡＣＡＧＴＧ−３’及びノナマー、５’−ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ−３’）を含む。Ｖセグメント及びＤセグメントの３’末端にて、ＲＳＳ配列はヘプタマー（ＣＡＣＡＧＴＧ）−スペーサー−ノナマー（ＡＣＡＡＡＡＡＣＣ）である。Ｊセグメント及びＤセグメントの５’末端にて、ＲＳＳ配列は、各特定の遺伝子セグメントのヘプタマー及びナノマー配列における実質的な配列変動を伴うノナマー（ＧＧＴＴＴＴＴＧＴ）−スペーサー−ヘプタマー（ＣＡＣＴＧＴＧ）である。
【０１７４】
多数のヌクレオチド位置が、ヘプタマーの位置１及び２でＣＡジヌクレオチドを含む組換えに対して重要であるとして特定されており、ヘプタマー位置３でのＣが、ナノマーの位置５、６、７でのＡヌクレオチドと同様、非常に好ましいものと示されてきた。（Ｒａｍｓｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．１９９４、Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ．ａｌ．１９９４、Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ．ａｌ．１９８９）。その他のヌクレオチドの変異では、最小又は一貫性のない効果がもたらされる。より変動が大きくなるが、スペーサーもまた組換えに大きな影響を与え、単一のヌクレオチド置換は、組換え効率に有意な影響を与えることが示されている（Ｆａｎｎｉｎｇ  ｅｔ．ａｌ．１９９６  Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７９：１，Ｌａｒｉｊａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．１９９９  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２７：２３０４、Ｎａｄｅｌ  ｅｔ．ａｌ  １９９８  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６０６８、Ｎａｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８７：１４９５）。基準が、有意に異なる組換え効率を有するＲＳＳポリヌクレオチド配列を識別するために記述されてきた（Ｒａｍｓｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ  １９９４  Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２２：１７８５、Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ．ａｌ．１９９４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４５２０、Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ．ａｌ．１９８９  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１０５３、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  ＰＬｏＳ  １（１）：Ｅ１）。
【０１７５】
Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）、ＴＣＲベータ（ＴＣＲＢ）及びＴＣＲデルタ（ＴＣＲＤ）遺伝子における再構成プロセスは一般に、ＤからＪ再構成で開始し、その後、ＶからＤ−Ｊ再構成があり、一方、直接のＶからＪ再構成は、Ｉｇカッパ（ＩｇＫ）、Ｉｇラムダ（ＩｇＬ）、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲＡ）及びＴＣＲガンマ（ＴＣＲＧ）遺伝子にて発生する。再構成されている遺伝子セグメント間の配列は一般に、ＴＣＲ切除円（excision circle）（ＴＲＥＣ）又はＢ細胞受容体切除円（ＢＲＥＣ）とも呼ばれる、環状切除産物の形状で検出される。
【０１７６】
Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの多くの異なる組み合わせが、いわゆるコンビナトリアルレパートリーを提示し、これは、Ｉｇ分子に関して〜２×１０６、ＴＣＲαβ分子に関して〜３×１０６、ＴＣＲγδ分子に関して〜５×１０３と推定される。Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの連結部位にて、ヌクレオチドの欠損及びランダム挿入が、再構成プロセスの間に発生し、結果として、非常に多種多様な連結領域となり、有意にＩｇ及びＴＣＲ分子の総レパートリーに寄与し、＞１０１２の可能性のあるアミノ酸配列であると推定される。
【０１７７】
成熟Ｂリンパ細胞は更に、胚中心における抗原認識に応じ、Ｉｇ分子を親和性成熟へ導くプロセスである体細胞超変異を介してＩｇレパートリーを拡張する。体細胞超変異プロセスは、ＩｇＨ及びＩｇ軽鎖遺伝子のＶ−（Ｄ−）Ｊエキソンに焦点をあて、主に単一ヌクレオチド変異を生成するが、時々ヌクレオチドの挿入又は欠損も生成する。体細胞変異したＩｇ遺伝子はまた、典型的に、成熟Ｂ細胞悪性病変にて発見される。
【０１７８】
本明細書で記述した特定の実施形態において、Ｖセグメント及びＪセグメントプライマーが、試験生体サンプル中の再構成されたＴＣＲ又はＢＣＲ  ＣＤＲ３−コードＤＮＡ領域を増幅するために、ＰＣＲ反応において使用されてもよく、各機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖ−コード遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含み、各機能的ＴＣＲ又はＩｇ  Ｊ−コード遺伝子セグメントは、Ｊ遺伝子ＲＳＳを含む。これらの関連する実施形態において、各増幅され再構成されたＤＮＡ分子は、（ｉ）少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以上の連続するヌクレオチドが、Ｖ遺伝子ＲＳＳに対して５’に位置して、ＴＣＲ又はＩｇ  Ｖコード遺伝子セグメントのセンス鎖の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００（その間の全ての整数値を含む）個以上の連続するヌクレオチドを含んでもよく、かつ／又は各増幅され再構成されたＤＮＡ分子は、（ｉｉ）少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個以上の連続するヌクレオチドがＪ遺伝子ＲＳＳに対して３’で位置して、ＴＣＲ又はＩｇ  Ｊコード遺伝子セグメントのセンス鎖の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００（その間の全ての整数値を含む）個以上の連続ヌクレチドを含んでもよい。
【０１７９】
増幅率決定
本明細書で記述したようなオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットの増幅効率を標準化する際の、本明細書で開示される鋳型組成物の利用に加えて、特定の他の実施形態は、サンプル中の再構成された適応性免疫受容体コード配列の数を推定する際の、増幅率を決定するための鋳型組成物の利用を企図する。これらの実施形態及び関連する実施形態において、適応性免疫受容体をコードしているＤＮＡがＤＮＡ再構成を受けた細胞を含む細胞の混合物中に存在するリンパ球系細胞を含む、リンパ球系細胞から得たＤＮＡサンプル中の適応性免疫受容体コード配列の数を定量するための使用が見られるが、サンプルは、このような再構成が起こらない細胞由来のＤＮＡも含有する（例えば、非リンパ細胞、未熟細胞、間葉細胞、がん細胞等）。
【０１８０】
対象中の適応性免疫受容体（例えば、ＴＣＲ又はＩｇ）の所与のクラスの異なるメンバーの総数が、包括的なＶ−Ｊ増幅プライマーセットを用いたマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲと、続く増幅産物の定量的シークエンシングによって推定され得る。再構成されたＴＣＲ及びＢＣＲ（ＩＧ）コードＤＮＡ配列のマルチプレックス化増幅及び高スループットシークエンシングが、例えば、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，４０９９、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．２：４７ｒａ６４、Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１１．０９．００１、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．３：９０ｒａ６１、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１３／２１７，１２６（ＵＳ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０１２／００５８９０２）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．１２／７９４，５０７（ＵＳ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０１０／０３３０５７１）、国際公開第２０１０／１５１４１６号、同第２０１１／１０６７３８号（国際出願ＵＳ２０１１／０２６３７３号）、同第２０１２／０２７５０３号（国際出願ＵＳ２０１１／０４９０１２号）、Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｎ．６１／５５０，３１１，及びＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．６１／５６９，１１８に記述されている。
【０１８１】
本方法論は典型的に、再構成されたＴＣＲ又はＩＧコードＤＮＡを欠く有核細胞を含有することも知られている、血液サンプル中に存在するリンパ球系細胞などのリンパ球系細胞の亜集団から、ＤＮＡをサンプリングすることを含む。本発明の組成物及び方法によって、このようなサンプル中の再構成されたＴＣＲ及びＩＧコードＤＮＡ分子の数の決定の際の正確さと精度を改善することができる。本明細書で記述するように、マルチプレックス化増幅プライマーセット中に存在するオリゴヌクレオチドプライマー間の相対的効率を評価するにあたり、例えば、本鋳型組成物でＤＮＡサンプルをスパイキングすることによって、増幅鋳型の内部標準が提供される。このようにして、既知の量で増幅反応に加えられる本人工的鋳型組成物の増幅産物を評価することによって、オリゴヌクレオチド増幅プライマーセットに対して増幅率（例えば、倍数、正規化、倍率又は幾何学的因子等）を決定することができ、次いでサンプル中の天然のＤＮＡ鋳型の数を算出するために使用することができる。
【０１８２】
他の例として、これらの関連する実施形態によって、持続的リンパ腫又は白血病細胞を含む、リンパ球系細胞及び非リンパ球系細胞の混合調製物から得たサンプル中の再構成されたＴＣＲ又はＩＧコードＤＮＡの定量的検出によって、リンパ腫又は白血病における微小残存病変（ＭＲＤ）の定量を行うことができる。先行技術方法は、サンプル中の細胞総数の割合として検出可能な悪性細胞の数としてＭＲＤを決定する。反対に、本発明の方法により、悪性細胞（例えば、特定のクローン型のような、ＴＣＲ又はＩｇ再構成を有するもの）が、全ての細胞の割合としてではなく、このような再構成された細胞の割合として定量可能であるように、再構成されたＴＣＲ又はＩＧコードＤＮＡを有するサンプル中の細胞の総数を推定することができる。非限定的な理論によって、ＭＲＤを有するか、有することが疑われる対象の臨床サンプル中の全ての再構成された細胞の提示は典型的に非常に弱いので、本発明の方法によって、シグナル対ノイズ比を増加させることによってこのような感受性を改善することを含む、ＭＲＤが検出可能な感受性を劇的に改善することができるであろう。
【０１８３】
したがって、特定の実施形態は、対象のリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生体サンプル中の１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている再構成されたＤＮＡ分子を定量する方法を提供し、各適応性免疫受容体は、可変領域と、連結領域と、を含む。簡潔に言えば、本方法は、
（Ａ）所与の適応性免疫受容体に対して、実質的に全てのＶ−Ｊコードの組み合わせを増幅可能な本明細書で記述したオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いたマルチプレックス化増幅反応において、増幅効率を標準化するための既知の量の本明細書で記述した鋳型組成物を加えたサンプルからのＤＮＡを増幅して、増幅産物を得る工程と、
（Ｂ）（ｉ）本明細書で記述した鋳型組成物の増幅産物であり、少なくとも１つのバーコードヌクレオチド配列を含有するので、識別可能であろう、鋳型増幅産物と、（ｉｉ）特異的Ｖ及びＪ配列を含有し、オリゴヌクレオチドバーコード配列を欠くが、識別可能であろう、サンプル中の再構成された適応性免疫受容体コードＤＮＡ配列の増幅産物と、を定量するために、（Ａ）の増幅産物を定量的に配列決定する工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）にて得た定量的情報に基づいて増幅率を算出する工程と、
（Ｄ）算出によって、サンプル中の固有の適応性免疫受容体コードＤＮＡ分子の数を決定するために、（Ｃ）の増幅率を使用する工程と、を含む。
【０１８４】
理論に束縛されるものではないが、これらの、関連する方法に従って、マルチプレックス化増幅反応中でサンプリングされた再構成されたＴＣＲ又はＩＧコードＤＮＡ分子の数が測定される。そのようにするために、配列カバレッジ値、例えば、各入力（鋳型）分子に対して決定される出力配列リードの数を決定し、存在する異なる鋳型オリゴヌクレオチドの全数にわたって平均化し、平均配列カバレッジ値を得る。（ｉ）所与の配列に対して得られるリード数を（ｉｉ）平均配列カバレッジ値によって割ることによって、増幅反応の開始時に鋳型として存在する再構成された分子の数が算出される。
【０１８５】
したがって、例えば、配列カバレッジ値を算出するために、既知の量の１セットの本明細書で開示した鋳型組成物の合成分子を各ＰＣＲ増幅に加え、合成鋳型は、式（Ｉ）５’Ｕ−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−（Ｂ３）−Ｊ−Ｂ４−Ｕ  ３’の基礎構造を有し、式中各Ｖは、ＴＣＲ又はＩＧ  Ｖ遺伝子配列と一致する配列を有する３００塩基対セグメントであり、ＪはＴＣＲ又はＩＧ  Ｊ遺伝子と一致する配列を有する１００塩基対セグメントである。Ｂ２は、各ＶＪ対を個別に識別し、また、（バーコード配列を欠くであろう）リンパＤＮＡサンプルによって与えられる天然に生じる生物学的鋳型ＤＮＡ分子の増幅産物と（バーコード配列を含有するであろう）合成ＤＮＡ鋳型の増幅産物とを区別する、固有のバーコードオリゴヌクレオチド配列である。本実施例において、式（Ｉ）は存在しない。ＰＣＲ増幅及びシークエンシング後、各配列決定された合成分子（すなわち、バーコード配列を含有する増幅産物）の数が数えられる。合成分子の配列カバレッジは、次いで、増幅反応をスパイクするために使用する開始合成鋳型分子の既知の数に基づいて算出される。
【０１８６】
例えば、（全ての可能性のあるＶＪ対を表している）それぞれ４〜５コピーの１１００個の固有合成鋳型オリゴヌクレオチド配列を含む、５０００個の合成、バーコード含有鋳型分子のプールを、増幅反応に加えてもよい。増幅産物が、合成鋳型分子と一致する５０，０００個の配列を含む場合、１０×の配列カバレッジ値が得られ、増幅率は１０である。サンプルから得たＤＮＡ中の自然ＶＤＪ−再構成鋳型分子の数を推定するために、次いで、自然鋳型の増幅産物（すなわち、任意のバーコード配列を欠く増幅産物）の数を増幅率にて除す。追加された精度によって、本例において、５０００個の合成分子が、全てのＶＪ対を表している１１００個の分子の複合プールであるので、ＶＪ対毎の増幅率が個々に算出可能である。次いで、増幅率は、全ての合成分子にわたって平均される（図８）。本方法の精度と堅牢性を図９に示し、詳細を実施例５にて以下に記述する。
【０１８７】
代替の実施形態において、１サブセットの合成鋳型分子の総プールの利用が異なることを除いて、本項目にて以上又は以下で記述するものと同一のものが、サンプルに１サブセットの別の鋳型分子の１コピー以下のサンプルを追加するという形で使用される。当業者に既知のポアソン統計法を適用して、プールの既知の特性（例えば、異なる配列の総数、及び鋳型分子の濃度）に基づいて加える鋳型の量を決定する。例えば、プール内に存在する１サブセット鋳型分子のそれぞれ平均１以下のコピーが存在するように、２００〜５００個の鋳型分子が増幅反応に加えられる。
【０１８８】
したがって、これらの実施形態において、方法は、（Ａ）（１）対象のリンパ細胞を含む生体サンプル由来のＤＮＡと、（２）既知の数の、固有のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドそれぞれが存在する請求項１に記述の鋳型組成物と、（３）生体サンプル由来のＤＮＡ中の、１種又は複数種の適応性免疫受容体をコードしている再構成されたＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチド増幅プライマーセットであって、プライマーセットが、（ａ）実質的に等モル量の、それぞれ独立して、少なくとも１つの、適応性免疫受容体のＶ領域ポリペプチドをコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド又はその相補鎖に特異的にハイブリッド形成可能な複数のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーであって、各Ｖセグメントプライマーが、少なくとも１つの機能的適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＶセグメントプライマーは、鋳型組成物中に存在する実質的に全ての機能的適応性免疫受容体のＶ領域をコードする遺伝子セグメントに対し特異的にハイブリッド形成する、複数のＶセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｂ）実質的に等モル量の、それぞれ独立して、少なくとも１つの、適応性免疫受容体のＪ領域ポリペプチドをコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド又はその相補鎖に特異的にハイブリッド形成可能な複数のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーであって、各Ｊセグメントプライマーが、少なくとも１つの機能的適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントに相補的である、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、複数のＪセグメントプライマーは、鋳型組成物中に存在する実質的に全ての機能的適応性免疫受容体のＪ領域をコードする遺伝子セグメントに特異的にハイブリッド形成し、Ｖセグメント及びＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーが、（ｉ）多数の増幅された鋳型ＤＮＡ分子を産生するために、鋳型組成物中の実質的に全ての鋳型オリゴヌクレオチドであって、前記多数の増幅した鋳型ＤＮＡ分子が、鋳型組成物中の鋳型オリゴヌクレオチドの多様性を定量するのに十分である、実質的に全ての鋳型オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）多数の増幅され再構成されたＤＮＡ分子を産生するために、生体サンプル中の適応性免疫受容体をコードしている実質的に全ての再構成されたＤＮＡ分子であって、前記多数の増幅され再構成されたＤＮＡ分子が、生体サンプル由来のＤＮＡ中、再構成されたＤＮＡ分子の多様性を定量するのに十分である、実質的に全ての再構成されたＤＮＡ分子と、の前記マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中の増幅を促進可能であり、多数の増幅した鋳型ＤＮＡ分子中、及び多数の増幅され再構成されたＤＮＡ分子中、各増幅されたＤＮＡ分子は、長さにして、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０又は７０ヌクレオチド未満である、複数のＪセグメントオリゴヌクレオチドプライマーと、を含む、ＤＮＡを増幅する工程と、
（Ｂ）（ｉ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコード配列を含有する、増幅された鋳型ＤＮＡ分子の鋳型産物数と、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドバーコード配列を欠く、増幅され再構成されたＤＮＡ分子の再構成産物数と、を定量するために、前記増幅された鋳型ＤＮＡのそれぞれと、前記増幅され再構成されたＤＮＡ分子のそれぞれの全て又は十分な部分を定量的に配列決定する工程と、
（Ｃ）（Ａ）（２）の固有のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドのそれぞれの既知の数によって、（Ｂ）（ｉ）の鋳型産物数を除することによって、増幅率を算出する工程と、
（Ｄ）サンプル中の固有の適応性免疫受容体コードＤＮＡ分子を定量するために、（Ｃ）で算出した増幅率によって、（Ｂ）（ｉｉ）の再構成された産物数を除する工程と、を含む。
【０１８９】
企図される実施形態は、上記方法に限定する意図はなく、本開示から、当業者は、使用し得る変形を理解するであろう。例えば、代替的なアプローチは、再構成されたリンパ球系細胞ＴＣＲ及び／又はＩＧコードＤＮＡ並びに非再構成ＤＮＡを含有するＤＮＡサンプルのマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲ増幅において、スパイクインした制御鋳型として、本明細書で記述した合成鋳型組成物を使用しなくてもよい。代わりに、１つのこのような代替にしたがって、Ｖ及びＪ増幅プライマーを用いる増幅反応に、異なる、高度に保存されたゲノム配列領域を増幅する、オリゴヌクレオチド増幅プライマーの既知のセットが加えられてもよい。これらのゲノム制御プライマーは、再構成されたＴＣＲ及び／又はＩＧコード配列を含有するかしないかに関わらず、ＤＮＡサンプル中に存在する全てのゲノムを増幅することができ、一方でＶ及びＪプライマーは、再構成されたＶＤＪ領域を有するゲノムからのみの産物を増幅することができる。これらの２つのクラスの増幅産物分子間の比によって、サンプル中のＢ細胞ゲノムの総数を推定することができる。
【０１９０】
本発明の特定の実施形態の実施は、特に反対のことを示さない限り、本技術分野内である微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学及び免疫学の技術における従来の方法を使用し、例示の目的でそのいくつかを以下に参照されたい。このような技術は、文献にて完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ，１９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  ＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００２）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００６）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００６）、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ  Ｅｄ．，２００６）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｄａｒｗｉｎ  Ｊ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．Ｐｈｉｎｎｅｙ，ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ  Ｅｄｓ．，２００８）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．Ｋｌｕｇ，ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ  Ｔ．Ｊｏｒｄａｎ  Ｅｄｓ．，２００１）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｅｖｉｎ  Ｄ．Ｂｕｎｔｉｎｇ  Ｅｄ．，２００８）Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｌｉｅ  Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ  Ｅｄ．，２００８）を参照のこと。
【０１９１】
特定の定義がない限り、本明細書で記述した分子生物学、解析化学、合成有機化学及び医薬品化学及び製薬化学に関連して利用される専門用語並びにそれらの実験手順及び技術は、本技術分野で既知であり、通常使用される。標準的な技術が、組換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、製剤、処方及び伝達、並びに患者の処置のために使用されてもよい。
【０１９２】
文脈が他に要求しない限り、本明細書及び請求項を通して、単語「含む（comprise）」、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」のようなその変形は、開放的で包括的な意味、すなわち「含むが、これらに限定されない」のように解釈されるものとする。「からなる」は、語句「からなる」に続くものが何であれ、含むが、典型的には、これらに限定されないことを意味する。「本質的に〜からなる」は、語句の後に列記された任意の要素を含み、列記された要素に関して本開示にて特定された活動又は作用を干渉しない、又はそれを与える他の要素に限定することを意味する。したがって、語句「本質的に〜からなる」は、列記された要素が必要であるか、必須であることを示すが、他の要素が要求されず、それらが列記された要素の活動又は作用に影響を与えるか与えないかに依存して存在してもよく、又は存在しなくてもよいことを示す。
【０１９３】
本明細書及び付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の方法を指さない限り、複数の言及を含む。本明細書で使用する際に、特定の実施形態において、数値に先行する場合、用語「約」又は「およそ」は、５％、６％、７％、８％又は９％の範囲のプラス又はマイナスの値を示す。他の実施形態において、数値に先行する場合、用語「約」又は「およそ」は、１０％、１１％、１２％、１３％又は１４％の範囲のプラス又はマイナスの値を示す。また他の実施形態において、数値に先行する場合、用語「約」又は「およそ」は、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％の範囲のプラス又はマイナスの値を示す。
【０１９４】
本明細書を通して、「１つの実施形態」又は「実施形態」又は「態様」の言及は、実施形態に関連して記述される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して、種々の場所において、語句「１つの実施形態において」又は「実施形態において」が出現した場合、必ずしも全て、同一の実施形態について言及しているわけではない。更に、特定の特徴、構造又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わされてもよい。
【実施例】
【０１９５】
実施例１：増幅プライマーバイアス制御を校正するための鋳型オリゴヌクレオチドの設計
本実施例及び以下の実施例において、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｒａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）にて記述された技術を含む、標準分子生物学及び生化学材料及び方法論を使用した。
【０１９６】
１セットの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型オリゴヌクレオチドが、特定の適応性免疫受容体（ＴＣＲ又はＢＣＲ）遺伝子座にて、全ての可能性のあるＶ／Ｊの組み合わせをシミュレートした対照鋳型として使用するために、校正標準として設計された。各ヒトＴＣＲ及びＢＣＲ遺伝子座に関して、リストをＲＳＳの既知のゲノムＶセグメント配列５’に適合させ、リストをＲＳＳの既知のゲノムＪセグメント３’に適合させた。ｄｓＤＮＡ鋳型のコード鎖配列が、５’から３’方向が、左から右に読まれる慣例にしたがって、解釈を簡単にするために本明細書で提示される。
【０１９７】
鋳型オリゴヌクレオチドの一般構造の略図を図１に示す。多数のコンテキストにおいて、各固有の鋳型オリゴヌクレオチドの同一性の交差検証にて使用するために、バーコードの第１の８ｂｐで鋳型のＶセグメントポリヌクレオチドを、バーコードの第２の８ｂｐでＪセグメントを固有に識別した各鋳型内に異なる１６ｂｐのバーコードオリゴヌクレオチド（Ｂ）を組み込んだ。このバーコードのコピーを、（Ｂ３）標準のＩｌｌｕｍｉｎａ又はＩｏｎプライマーを有する短い単独末端リードが、各鋳型オリゴヌクレオチド中のＶ及びＪ配列の固有の組み合わせの同一性を示すことができるように、外部アダプタ（Ｕ２）とＪセグメント配列（Ｊ）との間に、（Ｂ２）標準的なシークエンシング方策（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ−２又はＨｉＳｅｑ（商標）又はＭｉＳＥＱ（登録商標））が各鋳型オリゴヌクレオチド中のＶ及びＪ配列の固有の組み合わせを得るように、ＶセグメントとＪセグメントとの間に、（Ｂ３）短い対となった末端リードが、所望の場合、各鋳型オリゴヌクレオチド中のＶ及びＪ配列の固有の組み合わせの同一性を確認可能であるように、Ｖセグメントと他の外部アダプタ（Ｕ１）との間に、三重に組み込んだ。
【０１９８】
図１で示すように、鋳型オリゴヌクレオチド配列は、分子の末端で、シークエンシングプラットフォーム特異的短オリゴヌクレオチド配列を組み込むことが可能である、アダプタ配列（Ｕ１）から開始した。本実施例において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）アダプタを使用したが、本質的に任意の対のロバストＰＣＲプライマーが十分に均等に機能することに留意すべきである。例示的なアダプタとして、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａオリゴヌクレオチドに加えるＮｅｘｔｅｒａ（商標）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ａｄａｐｔｏｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
【０１９９】
（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ）  ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４７］
との適合性を維持するために、オリゴヌクレオチド配列ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ［配列番号：１７４６］が、Ｕ１（図１）のＶセグメント末端にて接続され、これは単一又は対となった末端Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングフローセルと適合した。
【０２００】
（３’〜）Ｕ１からの直下流が、バーコードオリゴヌクレオチドＡＣＡＣＡＣＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴ［配列番号：１７４８］の第１のコピー（Ｂ１）であった。次に、Ｖセグメントにて削られた固定数の塩基を有する天然のＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子再構成を模倣するために、Ｖセグメント配列の固定長を、鋳型セット中の全ての鋳型が天然のＲＳＳの前に所与の数の塩基で終了するように、鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込んだ。本実施例において、ゼロ塩基が、ＲＳＳの前にまず削られた。これらの配列の認識性を最大化するために、残余Ｖセグメント配列が開始コドンとインフレームであるように、次いで、全てのＶセグメントポリヌクレオチド配列をトリムして、ＲＳＳに隣接する部分コドンを除去した。多種多様なＶセグメント配列は、配列表中に表される例示的な鋳型オリゴヌクレオチドセットにおいて示されるものであり（例えば、配列番号：１〜８７１中のＴＣＲＢ鋳型オリゴヌクレオチドセットの式（Ｉ）配列内の１セットのＴＣＲＢ  Ｖセグメント、配列番号：８７２〜１５６０内のＴＣＲＢ鋳型オリゴヌクレオチドセットの式（Ｉ）配列内の異なる１セットのＴＣＲＢ  Ｖセグメント、配列番号：１５６１〜１６３０中のＴＣＲＧ鋳型オリゴヌクレオチドセットの式（Ｉ）配列内の１セットのＴＣＲＧ  Ｖセグメント）、単一の例示的なＶポリヌクレオチドは以下のようであった。
ＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＴＣＧＣＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧ［配列番号：１７４９］
【０２０１】
終止コドンＴＧＡを、鋳型オリゴヌクレオチド配列が、生体サンプルを汚染する現象において関連性があると考慮されないことを確かにするために、各鋳型オリゴヌクレオチド中のＶポリヌクレオチド配列の３’末端にてインフレームで組み込んだ。ＮＤＮが通常存在するＶセグメントとＪセグメントとの間の終止コドンより下流に、Ｖ／Ｊ識別子バーコード配列Ｂ２（配列番号：１７４８）の第２のコピーを挿入した。次に、Ｓａｌ１制限酵素認識部位（Ｒ）配列ＧＴＣＧＡＣを組み込み、この配列は、所望の場合、合成鋳型を特異的に破壊する能力を与える、又は合成配列を識別するために、情報マーカーとして利用するために、任意のＴＣＲＢ  Ｖ又はＪセグメントゲノム配列中に自然には存在しない配列であることに基づいて選択される。Ｂ３部位は、本バージョンの鋳型では空である。
Ｊポリヌクレオチド（Ｊ）を、Ｊ−Ｃイントロン内に伸長している本実施例において、天然の再構成を模倣するために、天然のＲＳＳ後の固定数の塩基から測定した、Ｊ遺伝子配列からの固定長の配列として組み込んだ。本実施例において、ゼロ塩基は、Ｊセグメントからの欠損した塩基であるが、他の鋳型オリゴヌクレオチド設計において、天然の範囲内に全Ｊセグメント長を維持する一方で、Ｖ−Ｊ連結にて、ＶＪバーコード（Ｂ２）の場所を空けるために、５ｂｐの欠損が使用された。例示的なＪポリヌクレオチドは、
ＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＡＣＡＧ［配列番号：１７５０］であった。
【０２０２】
Ｊセグメントポリヌクレオチドから下流が、Ｖ／Ｊバーコード識別子オリゴヌクレオチド（配列番号：１７４８）の第３のコピー（Ｂ４）であった。例示的な鋳型オリゴヌクレオチド配列は、分子の末端にて、プラットフォーム特異的配列を組み込むことが可能である、第２のアダプタ配列（Ｕ２）で終結した配列である。以上で記したように、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）−適合アダプタ（ＣＴＧＡＴＧＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＧＧＣ）［配列番号：１７５１］を、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングオリゴヌクレオチドに加えることができるように、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ａｄａｐｔｏｒ（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ）［配列番号：１７５２］と利用するために、Ｕ２のＪセグメント末端上で使用し、これは、単一又は対となった末端フローセルのいずれかと適合した。
【０２０３】
本開示にしたがった、例示的なＴＣＲＢ及びＴＣＲＧ鋳型オリゴヌクレオチドセットを調製し、配列番号：１〜１６３０にて示したヌクレオチド配列を有した。配列番号：１〜８７１及び１５６１〜１６３０にて示した配列を有する鋳型オリゴヌクレオチドのセットを、ｇＢｌｏｃｋｓ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ化学を用いて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって、本明細書で開示した配列設計情報に基づいて、カスタム合成した。配列番号：８７２〜１５６０にて示した配列を有する鋳型オリゴヌクレオチドのセットを、実施例２にて記述したＰＣＲタイリングアプローチによって生成した。
【０２０４】
ＴＣＲＢ鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号：１〜８７１）一般式（Ｉ）（Ｂ３は存在せず）の８７１個の鋳型オリゴヌクレオチドのセットを、ヒトＴＣＲＢ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を用いて設計した。
５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−（Ｂ３）−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’      （Ｉ）
【０２０５】
各鋳型オリゴヌクレオチドは、４９５塩基対のＤＮＡ分子からなった。センス鎖配列を配列番号：１〜８７１として表す。
【０２０６】
本鋳型セットの設計を描写している概略図を図１に示す。慣例によって、図は、５’から３’（左から右）方向でオリゴヌクレオチドの設計を描写する。「Ｖセグメント」は、適応性免疫受容体の可変（Ｖ）領域コード遺伝子配列、又はその相補鎖を表す。「Ｊセグメント」は、適応性免疫受容体連結（Ｊ）領域コード遺伝子配列、又はその相補鎖を表す。Ｕ１及びＵ２は、それぞれ、第１及び第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列に連結され５’に位置する、第１及び第２のシークエンシングプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を任意に更に含んでもよい、第１及び第２のユニバーサルアダプタオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｂ１、Ｂ２及びＢ４は、それぞれ、対となる組み合わせとして、（ｉ）固有のＶセグメント配列と、（ｉｉ）固有のＪセグメント配列とを固有に識別する固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドバーコード配列をそれぞれ含む、オリゴヌクレオチドバーコード配列を表し、本実施例において、Ｂ３は存在しなかった。
【０２０７】
Ｓは、Ｖの３’末端にてインフレームであるか、又はフレーム外であり得る任意の終止コドンを表す。Ｒは、任意の制限酵素認識部位を表す。配列番号：１〜８７１において、Ｕ１及びＵ２アダプタは、以上で記述したように、１９マーを含み（それぞれ配列番号：１７４６及び１７５１）、全ての（Ｖ＋Ｊ）識別バーコード（Ｂ）配列（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４）は長さにして１６ヌクレオチドであり、終止コドンＴＧＡとＳａｌ１制限酵素認識部位（ＧＴＣＧＡＣ）が含まれた。
【０２０８】
ＴＣＲＢ鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号：８７２〜１５６０）。一般式（Ｉ）にしたがって、Ｖ及びＪがそれぞれ、ヒトＴＣＲＢ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を含み、Ｕ１及びＵ２が独立して異なる制限酵素認識部位（Ｒ１及びＲ３）を含み、Ｂ１、Ｂ３及びＢ４が独立して存在しない、６８９個の鋳型オリゴヌクレオチドの第２のセットを、一般式（ＩＩ）に達するように設計し、
Ｒ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ２−Ｊ−Ｒ３（ＩＩ）
式中、Ｂ２が８−ヌクレオチドバーコード識別子（例えば、表７にて示されるようなバーコード配列）、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、制限酵素認識部位ＥｃｏＲ１（ＧＡＡＴＴＣ）、Ｓａｌ１（ＧＴＣＧＡＣ）及びＳｐｈ１（ＧＣＡＴＧＣ）であり、Ｖ及びＪはそれぞれ、本明細書で示したような、Ｖ領域及びＪ領域ポリヌクレオチドであった。各鋳型オリゴヌクレオチドは、２３９塩基対ＤＮＡ分子からなった。センス鎖配列を、配列番号：８７２〜１５６０として示す。
【０２０９】
ＴＣＲＧ鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号：１５６１〜１６３０）一般式（Ｉ）の７０個の鋳型オリゴヌクレオチドの第３のセットを、ヒトＴＣＲＧ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を用いて設計した。各鋳型オリゴヌクレオチドは、４９５塩基対のＤＮＡ分子からなった。センス鎖配列を、配列番号：１５６１〜１６３０として示す。ＴＣＲＧ鋳型の７０−オリゴヌクレオチドセット（配列番号：１５６１〜１６３０）に関する詳細が代表的であり、以下の通りであった。
【０２１０】
規定のゲノム配列に基づいて、ヒトＴＣＲＧ遺伝子座が、それぞれがＲＳＳ配列を有し、したがって再構成コンピテントとして見なされる、１４個のＶγセグメントを含有することが示された。これらの１４個のＶγセグメントは、発現されると知られている６つの遺伝子セグメントと、オープン−リーディングフレームを有するとして分類される３つのＶセグメントと、５つのＶ疑似遺伝子と、を含んだ。Ｖγ遺伝子セグメントは、５つのＪγ遺伝子セグメントに連結した。１４個のＶ及び５個のＪセグメントに対して全ての可能性のあるＶ＋Ｊ遺伝子の組み合わせを含めるために、７０（５×１４）個の鋳型を、全ての可能性のあるＶＪの組み合わせを表すために設計した。各鋳型は、一般式（Ｉ）（５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−（Ｂ３）−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’）（図１）に従い、９つのセクションである、１９塩基対（ｂｐ）のユニバーサルアダプタ（Ｕ１）と、Ｖ遺伝子とＪ遺伝子セグメントの各対になった組み合わせを固有に識別している１６ｐｂのヌクレオチドタグ（Ｂ１）と、３００ｂｐのＶ遺伝子特異的配列（Ｖ）と、３ｂｐの終止コドン（Ｓ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの他のコピー（Ｂ２）と、全ての分子によって共有された６ｂｐの連結タグ（Ｒ）と、１００ｂｐのＪ遺伝子特異的配列（Ｊ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの第３のコピー（Ｂ４）と、１９ｂｐのユニバーサルアダプタ配列（Ｕ２）と、を含み、Ｂ３は存在しなかった。
【０２１１】
７０個の鋳型（配列番号：１５６１〜１６３０）のそれぞれを、ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ１、Ｕ２）にアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（表４、配列番号：１７３２〜１７４５）を用いて個々に増幅した。
【０２１２】
【表５】
2015171372.tif 000008
【０２１３】
各増幅された鋳型オリゴヌクレオチド産物の得られた濃度を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（商標）キャピラリー電気泳動システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて定量した。バーコードＢ１を配列決定することによって決定したように、各７０個の可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせの発生頻度を表５に示す。７０個の増幅された鋳型オリゴヌクレオチド調製物を、標準濃度に正規化して、次いでプールした。
【０２１４】
全ての７０個の鋳型オリゴヌクレオチドが、実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨にしたがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。簡潔に言えば、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列をプールされた鋳型オリゴヌクレオチドに組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）アダプタ配列テールを有して設計した。次いで、７サイクルＰＣＲ反応を実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。次いで、ＰＣＲ反応産物混合物を、製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。最初の６０ｂｐのＰＣＲ反応産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２１５】
７０個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ１．４％を含有することが算出され、全ての種に対して１０倍頻度プラス又はマイナス（０．１４〜１４％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングにより、初期プール内の７０種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが均一に提示されないことが明らかになった。
【０２１６】
したがって、個々の鋳型オリゴヌクレオチドの濃度の調節と、定量的シークエンシング工程の反復が、各分子が、閾値許容濃度（０．１４〜１４％）内で存在するまで実施される。
【０２１７】
【表６】
2015171372.tif 000009
【０２１８】
実施例２：ＴＣＲＢ  Ｖ遺伝子増幅バイアスの検出
本実施例は、どのようにして、１セットの６８９個の一般式（Ｉ）のヒトＴＣＲＢ鋳型オリゴヌクレオチドが、ヒトＴＣＲＢ配列を増幅可能である１セットのオリゴヌクレオチドプライマー中の全ての可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせに対する、ハイブリッド形成標的を含有する鋳型セットをそれぞれ生成するために、５０〜９０ヌクレオチドの４つの一本鎖オリゴヌクレオチドを一緒にタイリングすることによってアセンブリしたかを記述する。次いで、鋳型オリゴヌクレオチドのセットを１セットのＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ増幅プライマーの相対増幅効率を特性化するために使用した。
【０２１９】
ヒトＴＣＲＢ鎖に対する全ての可能性のある生産的に再構成されたＶ及びＪの組み合わせを表しているポリヌクレオチド配列を含有する１セットのＴＣＲＢの６８９個の鋳型オリゴヌクレオチドを、標準ＰＣＲ反応において、４つの一本鎖ＤＮＡプライマーを一緒に「タイリング」することによって合成した。簡潔に言えば、２つの９０ｂｐの断片（１つが「フォワード」方向、他が「リバース」）を、各ＴＣＲＢ  Ｖ遺伝子セグメントに対して設計し、１つの９０ｂｐの断片（「リバース」方向）を、各ＴＣＲＢ  Ｊ遺伝子セグメントに対して設計し、５０ｂｐ（フォワード）のリンカー分子を、Ｖ及びＪ遺伝子断片を一緒に連結するために設計した。合計で、５２個のＶフォワード及び５２個のＶリバース、１３個のＪリバース、及び６８９個のリンカー分子が設計された。Ｖ遺伝子セグメントのそれぞれに対応する２つの９０ｂｐの断片（１フォワード、１リバース）が、３９ｂｐの相補的重複配列を有した。各Ｖリバース断片の一端が、５０ｂｐのリンカー分子と重なり合った２５ｂｐの相補配列を有した。各リンカー分子中の残りの２５ｂｐは、Ｊ分子の一端と相補的に重なり合った配列であった。分子は、相補的配列が、互いにアニールし、Ｔａｑポリメラーゼが結合し酵素的に分子を伸長する二本鎖ＤＮＡを形成するように設計された。
【０２２０】
タイル化した分子をアセンブルするための各ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ部品番号２０６１４５、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、１０％  Ｑ−溶液（ＱＩＡＧＥＮ）及び４つの一本鎖オリゴヌクレオチド配列（上述のように、２つのＴＣＲＢ  Ｖ、１つのＴＣＲＢ  Ｊ及びリンカー）を使用した。２つの外部分子（１つのＶフォワードと１つのＪリバース）を各１μＭの最終濃度で加え、一方、２つの内部分子（１つのＶリバースとフォワードリンカー）をそれぞれ、０．０１μＭの最終濃度で加えた。熱サイクラー条件は、９５℃、１５分間、続いて９４℃、３０秒間、５９℃、３０秒間及び７２℃、１分間の３５サイクル、続いて７２℃、１０分間の１サイクルであった。合成の後、分子を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（商標）キャピラリー電気泳動システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）によって定量し、各得られたバンドの濃度（ｎｇ／μｌ）を、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸソフトウェアを用いて算出した。
【０２２１】
６８９個のＴＣＲＢ鋳型オリゴヌクレオチドの得られたセットに対するヌクレオチド配列を配列番号：８７２〜１５６０にて示す。配列番号：８７２〜１５６０において、各異なるＶ領域配列を、表７で示すように、８つのヌクレオチドの固有のバーコード配列によって識別した。全ての６８９個の鋳型を、２５ｎｇ／μｌの標準濃度に正規化して、次いでプールした。得られたプールを、本明細書で記述したＴＣＲＢアッセイのために使用して、６８９−鋳型オリゴヌクレオチドセット（配列番号：８７２〜１５６０）の増幅の間のＴＣＲＢ増幅プライマーの偏した（不均一な）利用を検出した。
【０２２２】
６８９個の鋳型のそれぞれが、等モル濃度に実験的に可能な限り近い状態で、鋳型オリゴヌクレオチドプール中に存在し、プールは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプタ−適合配列（配列番号：１７５３〜１８０４、表６）及び１３個のＴＣＲＢ  Ｊ領域プライマー（配列番号：１６３１〜１６４３、表１）の等モル混合物を含んだ５２個のＴＣＲＢ  Ｖ領域プライマーの等モル混合物を使用したＴＣＲＢ増幅ＰＣＲ反応のための鋳型として使用された。６８９個の鋳型のプールのメンバーを、表１（配列番号：１６３１〜１６９５）中で示したような５２個のＴＣＲＢ  ＶβＦ（フォワード）プライマー（「ＶＦプール」）の等モルプールと、１３個のＴＣＲＢ  ＪβＲ（リバース）プライマー（「ＪＲプール」）の等モルプールを用いて増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（各５０μＬ）を、１．０μＭのＶＦプール（各固有ＴＣＲＢ  ＶβＦプライマー２２ｎＭ）、１．０μｍのＪＲプール（各固有ＴＣＲＢ  ＪβＲプライマー７７μＭ）、１μＭのＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ部品番号２０６１４５、Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、１０％  Ｑ−溶液（ＱＩＡＧＥＮ）及び１６ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）にて設定した。以下の熱サイクル条件を、Ｃ１００熱サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で使用した。９５℃、１５分間の１サイクル、９４℃、３０秒間、５９℃、３０秒間及び７２℃、１分間の２５〜４０サイクル、続いて７２℃、１０分間の１サイクル。１００万の再構成されたＴＣＲβ  ＣＤＲ３遺伝子座をサンプルするために、ＰＣＲの１２〜２０のウェルが各ライブラリに対して実施された。以上言及したように、Ｖ及びＪプライマーは、シークエンシングのためのＩｌｌｕｍｉｎａアダプタに対応し、適合したテールを含んだ。
【０２２３】
増幅産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳＥＱ（商標）シークエンサー上で定量的に配列決定した。各産物分子の６０塩基対領域を、Ｊ分子から開始する標準Ｊシークエンシングプライマー（表３）を用いて配列決定した。反応産物中の各ＴＣＲＢ配列の発生頻度を、図２で示し、それにより、全てのＴＣＲＢ配列が、同程度まで増幅されるのではないことが明らかであった。
【０２２４】
【表７−１】
2015171372.tif 000010
【０２２５】
【表７−２】
2015171372.tif 000011
【０２２６】
【表７−３】
2015171372.tif 000012
【０２２７】
【表７−４】
2015171372.tif 000013
【０２２８】
【表７−５】
2015171372.tif 000014
【０２２９】
【表７−６】
2015171372.tif 000015
【０２３０】
【表８−１】
2015171372.tif 000016
【０２３１】
【表８−２】
2015171372.tif 000017
【０２３２】
上述したように、図２を生成するために得たデータを用いて、交差増幅能力（プライマーが、アニーリング配列相補性に基づいて特に設計されたもの以外のＶ遺伝子セグメントを増幅する能力）を、特定のＶ遺伝子セグメントにアニールするように設計された各増幅プライマーに関して評価した。５２個の独立した増幅プライマープールを調製し、各プライマープールは、等モル濃度でプールされた表６の５２個のＴＣＲＢ  Ｖ領域プライマーのうち５１個、及び他の５１個のプライマーの２倍のモル濃度でプール中に存在する５２番目のＴＣＲＢ  Ｖ領域プライマーを有した。別の増幅プライマープールを、単一プライマーが、他のプライマーの２倍の濃度で存在する、５２個のＶプライマーのそれぞれに対して１つのプールが存在するように調製し、結果として５２個の固有プライマープールがもたらされた。次いで、それぞれの固有の増幅プライマープールの１つで、５２個の別個の増幅反応を設定し、各反応は、上述した６８９個のオリゴヌクレオチド（配列番号：８７２〜１５６０）のセットを使用した。鋳型オリゴヌクレオチドは、互いに対して等モル濃度で存在した。増幅及びシークエンシングを、上述した条件を用いて実施した。結果を図３にて示す。
【０２３３】
図３にて、黒の四角は、全ての他のプライマーの等モル濃度に対して２倍の濃度で存在する、それぞれの示されたＴＣＲＢ  Ｖ領域特異的プライマーでの増幅の程度において変化がないことを示し、白の四角は、増幅において、１０倍の増加を示し、灰色の四角は、０〜１０倍の中程度の増幅（グレースケール勾配）を示した。対角線は、所与のプライマーのモル濃度を２倍にすることにより、試験したほとんどのＴＣＲＢ  Ｖ領域プライマーの場合、特定のアニーリング標的配列を有するそれぞれの鋳型オリゴヌクレオチドの増幅において、約１０倍の増加となることを示した。非対角の白の四角は、特定のプライマーがアニールし増幅することができた、非対応鋳型を示した。
【０２３４】
１つ以上のプライマーが、許容可能な範囲の増幅能（例えば、指定均一増幅能範囲）より有意に大きいか、又は小さい増幅能を示した場合、更に個々のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度の調節と、鋳型増幅及び定量的シークエンシング工程の反復を、各種の産物分子が、増幅プライマーセット内のプライマー間の不均一増幅能の補正を示唆した所望の範囲内に存在するまで、実施した。
【０２３５】
したがって、プライマー濃度は、図２及び３にて明らかである、偏した増幅結果が、それぞれ非常に効率のよい、又は効率の悪い増幅プライマーの相対的存在を増加又は減少させることによって、感度を減少させ得るかどうかを判定するために、表６で示されるように調節された。調節されたプライマーセットを用いるマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲに関して、Ｖ遺伝子プライマー配列は同一（表６で報告された配列）のままであるが、各プライマーの相対濃度は、プライマーがその鋳型を過小増幅する場合（図３）、増加するか、又はプライマーがその鋳型を過剰増幅する場合（図３）、減少するかの何れかであった。次いで、増幅プライマーの調節した混合物をＰＣＲにおいて使用して、等モル量で、図２及び３個のデータを生成するために使用される、６８９個の鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号：８７２〜１５６０）のセットを含有する鋳型組成物を増幅した。
【０２３６】
増幅及び定量的シークエンシングを、上述のように実施し、結果を表４に示し、増幅プライマーの濃度が、表６に示したような濃度に調節された（灰色棒）後に各このような産物が得られた頻度と、全ての増幅プライマーが等モル濃度（黒棒）で存在した場合に、各示された増幅されたＶ領域配列含有産物が得られた頻度を比較する。
【０２３７】
更なるｈｓ−ＴＣＲＢプライマー配列が、配列番号．６１９２〜６２６４において見つけられる。
【０２３８】
実施例３：ＴＣＲ増幅オリゴヌクレオチドプライマーセットにおける不均一増幅能（ＰＣＲバイアス）の補正
多種多様なＴＣＲ増幅プライマーを、対象からのリンパ球系細胞ＤＮＡを含有する生体サンプル中の、再構成されたＴＣＲ  Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの全ての可能性のある組み合わせを増幅するように設計する。等モル濃度の多種多様な増幅プライマーを含有する調製物を、マルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲにおいて使用し、ＴＣＲ遺伝子座に対して全ての可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせを表している少なくとも１種の鋳型を有する式（Ｉ）にしたがって等モル濃度のＴＣＲ−特異的鋳型オリゴヌクレオチドを含む、多種多様な鋳型組成物を増幅する。増幅産物を定量的に配列決定し、各固有のＶ−Ｊ産物配列の発生頻度を、各Ｖ−Ｊの組み合わせを固有に識別する各１６ｂｐの分子バーコード配列（式（Ｉ）のＢ）の発生頻度から得る。
【０２３９】
ＴＣＲＧに対して、ＴＣＲＧ鋳型オリゴヌクレオチド（配列番号：１５６１〜１６３０）を、ＴＣＲＧ  Ｖ−及びＪ−特異的プライマー（配列番号：１７３２〜１７４５、表４）を用いて増幅する。それぞれ対となるＶプライマーから独立したＪプライマーを、８つのＴＣＲＧ  Ｖ遺伝子セグメント特異的プライマーのそれぞれを、５つのＪ遺伝子セグメント特異的プライマーのプールで別々に増幅することによって識別する。増幅産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォーム上で定量的に配列決定し、特定のＶ−Ｊの組み合わせを固有に識別する内部１６ｂｐのバーコード配列（Ｂ）の発生頻度によって、各Ｖ−Ｊ対を定量することができる。それぞれ対となるＪプライマーのＶプライマー独立性を、逆反応を実施することによって、すなわち、５つのＴＣＲＧ  Ｊ遺伝子セグメントプライマーのそれぞれを、８つのＶ遺伝子セグメント特異的プライマーのプールにて、別々に増幅することによって、識別する。
【０２４０】
ＴＣＲＧ  Ｖプライマー又はＪプライマーが公差増幅するかどうか（遺伝子セグメント特異的プライマーが、非特異的に増幅するかどうか、例えば、ＴＣＲＧ  Ｖ７セグメントを増幅するために、特異的に設計されたＶプライマーが、ＴＣＲＧ  Ｖ６とＴＣＲＧ  Ｖ７  Ｖ遺伝子セグメントの両方を増幅可能であるかどうか）を試験するために、独立したプライマープールが、等モル濃度の１つを除く全てのプライマーを含有するように生成され、次いで、外されたプラマーは、全ての他のプライマーのモル濃度の２倍で、プールに加えられる。次いで、それぞれ式（Ｉ）のＶ及びＪポリヌクレオチド中、ＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ遺伝子配列を用いて、本明細書で記述したように、一般式（Ｉ）の複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含む複数の鋳型組成物を増幅するためにプライマーを使用する。定量的シークエンシングによって、単一の増幅プライマーが、プライマーのプールに、全ての他のプライマーの濃度の２倍で存在する時に、増幅産物間で過剰提示する任意の１つ以上の鋳型を識別することができる。次いで、プライマー混合物を、１つ以上のプライマーの相対濃度を増加又は減少させるために調節し、許容可能な定量的許容範囲内の反復で増幅頻度を得る。そのようにして得た、調節されたプライマー混合物は、プライマーセットのメンバー間の不均一増幅能を減少させるために補正されたと見なされる。
【０２４１】
補正されたプライマー混合物が、対象のリンパ球系細胞由来の生体サンプル中の再構成されたＴＣＲ鋳型ＤＮＡを増幅するために使用される時に、不偏の増幅能を示すかどうかを判定するために、本明細書で記述したような、人工鋳型組成物が、同様の頻度で存在する全てのＶＪ対で、また特定のＶＪ対の相対的提示の種々の比で調製される。各タイプの鋳型調製物を、プライマーセットの特定のメンバー間の不均一増幅能を減少させるために補正された増幅プライマーセットの増幅鋳型として別に試験する。増幅産物の定量的配列決定により、鋳型調製物における特定の配列の相対的定量提示が、増幅産物間の特定の配列の相対的定量提示に反映されることが識別できる。
【０２４２】
上記反復プロセスの代替として、又はその後、定量的シークエンシングが行われる、このような反復増幅工程に加えて、増幅バイアスはまた、コンピュータ処理的に補正可能である。このコンピュータ処理的なアプローチによれば、合成鋳型組成物中の鋳型オリゴヌクレオチド配列の各種の開始頻度は既知である。ＰＣＲ増幅に続いて得られる増幅産物間のオリゴヌクレオチド配列のこれらの種のそれぞれの頻度を、定量的シークエンシングによって決定する。ＰＣＲ増幅前の鋳型オリゴヌクレオチド配列の相対頻度と、ＰＣＲ増幅後のそれらの頻度との間の差が、「ＰＣＲバイアス」である。この差は、例えば、種々の増幅プライマー間の異なる増幅効率の結果として、増幅の間に導入される増幅バイアスである。
【０２４３】
それぞれの既知の鋳型オリゴヌクレオチド配列に対して定量的に決定されるように、各プライマーのＰＣＲバイアスは、各増幅産物に対して観察された頻度が、鋳型組成物中のそれぞれの鋳型配列の実際の頻度を反映して補正される増幅バイアス（標準化）因子を算出するため使用される。増幅プライマーセットのＰＣＲバイアスが、１０倍以内であるように本鋳型組成物を用いて経験的に検出される場合、バイアスは、同一の増幅プライマーセットが、未知の組成物のＤＮＡサンプルを増幅するために使用される時に得られる増幅産物中でコンピュータ処理的に補正され得る。それによって、ＤＮＡサンプル中の鋳型種の定量時の精度を改善することができる。
【０２４４】
Ｖ及びＪプライマーを経験的に試験し、独立であると示されるので、増幅バイアス因子（amplification bias factor）は、各Ｖ種及び各Ｊ種に対して誘導可能であり、各ＶＪ種に対する増幅率は不要である。したがって、各Ｖ種及びＪ種に対する増幅バイアス因子が、本鋳型組成物を用いて誘導される。本発明の方法によって、ＰＣＲ増幅の前に、鋳型組成物中のＶ及びＪ遺伝子配列の頻度が既知である（又は、合成される際の鋳型組成物中の各鋳型オリゴヌクレオチド種の濃度の知識に基づいて算出可能である）。ＰＣＲ増幅後、定量的シークエンシングを使用して、増幅産物中の各Ｖ及びＪ遺伝子セグメント配列の頻度を検出する。各配列の、遺伝子セグメント頻度の差が、増幅バイアスである。
初期頻度／最終頻度＝増幅バイアス因子
【０２４５】
増幅バイアス因子が、Ｖ遺伝子セグメント毎に、かつＪ遺伝子セグメント毎に算出される。これらの増幅率は、算出されると、Ｖ及びＪ遺伝子の開始頻度が未知であるサンプルに適用可能である。
【０２４６】
各Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの開始頻度が未知である、（再構成された適応性免疫受容体コードＤＮＡを含有すると予想されるリンパ球系細胞由来のＤＮＡを含む生物源から得た複合ＤＮＡサンプル、又はこのような再構成を欠いている他の細胞由来のＤＮＡを更に含む複合ＤＮＡサンプルのような）混合鋳型集団において、本鋳型組成物を用いて特性化されたプライマーセットの算出された増幅率を、残余ＰＣＲ増幅バイアスを補正するために使用可能である。配列決定された増幅産物分子のそれぞれの種に対して、分子によって使用されるＶ及びＪ遺伝子を、配列類似性に基づいて決定する。増幅バイアスを補正するために、分子が配列決定された回数に、正確なＶ及びＪ増幅率の両方が掛けられる。得られた配列数は、コンピュータ処理的に「正規化された」セットである。
【０２４７】
実施例４：追加鋳型組成物の生成
追加鋳型組成物を、上述方法論にしたがって本質的に設計し、産生した。
【０２４８】
Ｖ及びＪポリヌクレオチド．ＴＣＲＢ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を、本明細書で記述した複数の鋳型オリゴヌクレオチドに包含するために生成し、それぞれ、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット４、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット５、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット６、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット７，ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット８、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット９、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１０、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１１、ＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１２及びＴＣＲＢ  Ｖ／Ｊセット１３として図５ａ〜５ｌに示すような、６８個のＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ配列番号のセットにて示す。
【０２４９】
ＴＣＲＧ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を、本明細書で記述した複数の鋳型オリゴヌクレオチドに包含するために生成し、それぞれ、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット１、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット２、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット３、ＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット４及びＴＣＲＧ  Ｖ／Ｊセット５として図６ａ〜６ｂにて示されるような、１４個のＴＣＲＧ  Ｖ及びＪ配列番号のセットにて示す。
【０２５０】
ＩＧＨ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を、本明細書で記述した複数の鋳型オリゴヌクレオチドに包含するために生成し、それぞれ、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット１、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット２、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット３、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット４、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット５、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット６、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット７、ＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット８及びＩＧＨ  Ｖ／Ｊセット９として図７ａ〜７ｍにて示されるような、１２７個のＩＧＨ  Ｖ及びＪ配列番号のセットにて示す。
【０２５１】
鋳型組成物．鋳型組成物を、ＴＣＲＢ増幅プライマーセットの増幅効率を標準化するために調製した。組成物は、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含んだ。８５８個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドを含むＴＣＲＢ鋳型組成物が、配列番号：３１５７〜４０１４にて、配列表で開示される。
【０２５２】
鋳型組成物を、ＴＣＲＧ増幅プライマーセットの増幅効率を標準化するために調製した。組成物は、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含んだ。７０個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドを含むＴＣＲＧ鋳型組成物が、配列番号：４０１５〜４０８４にて、配列表で開示される。
【０２５３】
鋳型組成物を、ＩＧＨ増幅プライマーセットの増幅効率を標準化するために調製した。組成物は、一般式（Ｉ）の複数のオリゴヌクレオチド配列を有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを含んだ。１１１６個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドを含むＩＧＨ鋳型組成物が、配列番号：４０８５〜５２００にて、配列表で開示される。１１１６個の鋳型オリゴヌクレオチドのセットを含むＩＧＨ鋳型組成物はまた、配列番号：１８０５〜２９２０にて、配列表で開示される。
【０２５４】
実施例５：増幅率を決定するための鋳型組成物の利用
本実施例は、Ｂ細胞及び線維芽細胞ＤＮＡを含有するＤＮＡサンプルのマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲ増幅における、「スパイク−イン」合成鋳型として、本明細書で記述した鋳型オリゴヌクレオチド組成物を用いた、複数のＩＧ分子をコードしている再構成されたＤＮＡ分子の定量を記述する。
【０２５５】
生物学的鋳型ＤＮＡ：８つの生体サンプルを、鋳型ＤＮＡの供給源として使用し、各生体サンプルは、同量の総ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）３００ｎｇを含有するが、（ｉ）Ｂ細胞から抽出されたＤＮＡの、（ｉｉ）ヒト線維芽細胞から抽出されたＤＮＡに対する比率が異なり、その細胞型はＩＧ及びＴＣＲコード遺伝子が再構成しない。サンプルは、０、０．０７、０．３、１、４、１８、７５又は３００ｎｇのＢ細胞ｇＤＮＡを含有し、線維芽細胞ｇＤＮＡは、各３００ｎｇのｇＤＮＡ調製物の残部を供給した。各サンプル４つの複製を作製した。
【０２５６】
合成鋳型ＤＮＡ：各ＰＣＲ反応（以下）に、１１１６個の合成ＩＧＨ鋳型オリゴヌクレオチド分子のプールを含むオリゴヌクレオチド鋳型組成物（配列番号：４０８５〜５２００）からの５０００個の分子（各配列の４〜５分子）を加えた。１セットの１１１６個の鋳型オリゴヌクレオチドを含むＩＧＨ鋳型組成物はまた、配列番号：１８０５〜２９２０として配列表で開示される。
【０２５７】
ＰＣＲ反応、ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｌｕｓ（商標）ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ部品番号２０６１５２、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ），１０％  Ｑ−溶液（ＱＩＡＧＥＮ）及び３００ｎｇの生物学的鋳型ＤＮＡ（上記）を使用した。プールした増幅プライマーを、最終反応が、２μＭの集合体フォワードプライマー濃度と、２μＭの集合体リバースプライマー濃度を有するように加えた。フォワードプライマー（配列番号：５２０１〜５２８６）は、３’末端にＩＧＨ  Ｖセグメントコード配列にアニールしたおよそ２０ｂｐのセグメントと、５’末端におよそ２０ｂｐのユニバーサルプライマーｐＧＥＸｆとを有する８６個のプライマーを含んだ。リバースプライマー（配列番号：５２８７〜５２９３）は、３’末端に、ＩＧＨ  Ｊセグメントコード配列にアニールするおよそ２０ｂｐのセグメントと、Ｊプライマーの５’末端がユニバーサルプライマーｐＧＥＸｒである、Ｊセグメント特異的プライマーの集合体を含んだ。以下の熱サイクル条件をＣ１００熱サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で使用した。９５℃、１０分間の１サイクル、９４℃、３０秒間、６３℃、３０秒間及び７２℃、１分間の３０サイクル、続く７２℃、１０分間の１サイクル。各反応は、４重で実施した。
【０２５８】
シークエンシングのために、また８ｂｐのタグと６ｂｐのヌクレオチドのランダムセットを含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプタ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、７サイクルＰＣＲ反応において、ＰＣＲ反応産物の末端に組み込んだ。ＰＣＲ試薬及び条件は、９５℃、５分間、続いて９５°、３０秒間、６８°、９０秒間及び７２°、３０秒間の７サイクルである熱サイクル条件を除いて、上記のようであった。熱サイクルに続いて、反応を１０分間７２°にて維持し、プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプタテーリングプライマー（配列番号：５３８７〜５５７８）であった。サンプルを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＰＥ＿ＲＤ２プライマーを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）上で配列決定した。
【０２５９】
結果．配列データが各サンプルに対して得られ、合成鋳型の増幅産物がバーコードオリゴヌクレオチド配列の存在によって識別された。各サンプルの、鋳型産物の数を、固有の合成鋳型オリゴヌクレオチド配列の数（１１１６）で除し、サンプル増幅率を得た。次いで、各サンプルの生物学的鋳型の増幅産物の総数を増幅率で除して、固有のＢ細胞ゲノム鋳型の数の推定としての、開始増幅反応における再構成された生物学的鋳型分子（例えば、ＶＤＪ遺伝子組み換え）の数を算出した。標準偏差を有する平均値が、Ｂ細胞の入力に基づいた再構成された生物学的鋳型分子の既知の数に対してプロットされた（図９）。図９において、ドットは平均増幅率を表し、棒は４つの複製の標準偏差を表す。（Ｂ細胞の数に対するプロキシ値として）ＶＪ−再構成されたＩＧコード分子の数を推定するために本明細書で記述したように算出した増幅率の利用により、少なくとも１００個のＢ細胞の入力に至るまで、既知のＢ細胞の数と一致した決定が得られた。推定された増幅率の値と、観察された増幅率は、非常に相関した（図９、Ｒ２＝０．９９８８）。
【０２６０】
実施例６：ＩｇＨ、ＩｇＬ及びＩｇＫバイアス制御鋳型
ＩｇＨ  ＶＪ鋳型オリゴヌクレオチド
１つの実施形態において、ＩｇＨ  ＶＪ鋳型オリゴヌクレオチドを生成し、解析した。一般式（Ｉ）の１セットの１１３４個の鋳型オリゴヌクレオチドを、ヒトＩｇＨ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を用いて設計した。各鋳型オリゴヌクレオチドは、４９５塩基対のＤＮＡ分子からなった。ＩｇＨ鋳型の１１３４−オリゴヌクレオチドセットに関する詳細は代表例であり、以下の通りであった。
【０２６１】
規定のゲノム配列に基づいて、ヒトＩｇＨ遺伝子座が、それぞれがＲＳＳ配列を有し、したがって再構成成分として見なされた１２６個のＶｈセグメントを含有することが示された。これらの１２６個のＶｈセグメントは、発現すると知られる５２個の遺伝子セグメントと、オープン−リーディングフレームを持つとして分類された５つのＶセグメントと、６９個のＶ疑似遺伝子と、を含んだ。Ｖｈ遺伝子セグメントは、９個のＪｈ遺伝子セグメントに連結した。１２６個のＶ及び９個のＪセグメントに対して、全ての可能性のあるＶ＋Ｊ遺伝子の組み合わせを含めるために、１１３４（９×１２６）個の鋳型を、全ての可能性のあるＶＪの組み合わせを提示して設計した。各鋳型は一般式（Ｉ）（５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’）（図１）に一致し、したがって９つのセクション、１９塩基対（ｂｐ）のユニバーサルアダプタ（Ｕ１）と、それぞれ対となったＶ遺伝子及びＪ遺伝子の組み合わせを固有に識別している１６ｂｐのヌクレオチドタグ（Ｂ１）と、３００ｂｐのＶ遺伝子特異的配列（Ｖ）と、３ｂｐの終止コドン（Ｓ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの他のコピー（Ｂ１２）と、全ての分子によって共有された６ｂｐの連結タグ（Ｒ）と、１００ｂｐのＪ遺伝子特異的配列（ＩＪ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの第３のコピー（Ｂ４）と、１９ｂｐユニバーサルアダプタ配列（Ｕ２）と、を含み、Ｂ３は存在しなかった。２つのＶセグメントが、他の２つのＶセグメントに同一のヌクレオチドであり、したがって規則的でなかった。これにより、１１３４から１１１６まで含まれるセグメントの数が減少した。１１１６個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドを含むＩＧＨ鋳型組成物が、配列番号：４０８５〜５２００にて、配列表で開示される。
【０２６２】
１１１６個の鋳型のそれぞれを、ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ１、Ｕ２）にアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを個々に用いて増幅した。これらのオリゴヌクレオチド配列は、任意のユニバーサルプライマーであり得る。本適用に対して、Ｎｅｘｔｅｒａとコードされたユニバーサルプライマーを使用した。
【０２６３】
【表９】
2015171372.tif 000018
【０２６４】
ユニバーサルプライマー配列は、本明細書で開示した任意のプライマー配列にアニールすることができる。ユニバーサルプライマー配列を含むＰＣＲプライマーの例を以下に示す。
【０２６５】
【表１０】
2015171372.tif 000019
【０２６６】
各増幅された鋳型オリゴヌクレオチド産物の得られた濃度を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（商標）キャピラリー電気泳動システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて定量した。１１１６個の増幅した鋳型オリゴヌクレオチド調製物を、標準濃度に正規化し、プールした。
【０２６７】
全ての１１１６個の鋳型オリゴヌクレオチドが、実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨にしたがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を、プールした鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端にＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプタ配列テールを有するように設計した。７サイクルＰＣＲ反応を次いで実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。ＰＣＲ反応産物混合物を次いで、製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応産物の最初の２９ｂｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２６８】
１１１６個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ〜０．０９％を含有することが算出され、全ての種に対してプラス又はマイナス１０倍頻度（０．００９％〜０．９％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングによって、初期プール内の１１１６種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが均一に提示されなかったことが明らかにされた。
【０２６９】
したがって、個々の鋳型オリゴヌクレオチドの濃度の調節と、定量的シークエンシング工程の反復を、各分子が、閾値許容濃度（０．００９〜０．９％）内に存在するまで実施した。
【０２７０】
ＩｇＨ  ＤＪ鋳型オリゴヌクレオチド
他の実施形態において、ＩｇＨ  ＤＪ鋳型オリゴヌクレオチドを生成し、解析した。一般式（Ｉ）の２４３個の１セットの鋳型オリゴヌクレオチオを、ヒトＩｇＨ  Ｄ及びＪポリヌクレオチド配列を用いて設計した。各鋳型オリゴヌクレオチドは、３８２塩基対のＤＮＡ分子からなった。ＩｇＨ  ＤＪ鋳型オリゴヌクレオチド配列を配列番号：５５７９〜５８２１中で示す。ＩｇＨ鋳型の２４３−オリゴヌクレオチドセットに関する詳細は代表例であり、以下の通りであった。
【０２７１】
規定のゲノム配列に基づいて、ヒトＩｇＨ遺伝子座が、２７個のＤｈセグメントを含有することが示された。２７個のＤｈ遺伝子セグメントが、９個のＪｈ遺伝子セグメントに連結した。２７個のＤ及び９個のＪセグメントに対する全ての可能性のあるＤ＋Ｊ遺伝子の組み合わせを含めるために、２４３（９×２７）個の鋳型を、全ての可能性のあるＤＪの組み合わせを提示するように設計した。各鋳型は、一般式（Ｉ）（５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’）（図１）に一致し、したがって、９つのセクション、すなわち、１９塩基対（ｂｐｈ）のユニバーサルアダプタ（Ｕ１）と、Ｄ遺伝子及びＪ遺伝子セグメントの各対となる組み合わせを固有に識別している１６ｂｐのヌクレオチドタグ（Ｂ１）と、を含んだ。しかしながら、これらの分子に関して、３００ｂｐのＶ遺伝子特異的配列（Ｖ）が、Ｄ遺伝子特異的配列の１８２ｂｐのセグメントで置換された。このセグメントは、エキソン及びイントロンのヌクレオチドセグメントの両方を含んだ。他の分子のように、これらは、３塩基対（ｂｐ）の終止コドン（Ｓ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの他のコピー（Ｂ２）と、全ての分子によって共有された６ｂｐの連結タグ（Ｒ）と、１００ｂｐのＪ遺伝子特異的配列（Ｊ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの第３のコピー（Ｂ４）と、１９ｂｐのユニバーサルアダプタ配列（Ｕ２）と、を含み、Ｂ３は存在しなかった。
【０２７２】
２４３個の鋳型（配列番号：５５７９〜５８２１）のそれぞれを、ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ１、Ｕ２、表８を参照のこと）にアニールするように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを個々に用いて増幅した。これらのオリゴヌクレオチド配列は、任意のユニバーサルプライマーであり得、本願では、Ｎｅｘｔｅｒａとコードされたユニバーサルプライマーを使用した。
【０２７３】
ユニバーサルアダプタ配列を有するＰＣＲプライマーの例を表１０にて示す。
【０２７４】
【表１１】
2015171372.tif 000020
【０２７５】
各増幅された鋳型オリゴヌクレオチド産物の得られた濃度を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（商標）キャピラリー電気泳動システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて定量した。２４３個の増幅された鋳型オリゴヌクレオチド調製物を、標準濃度に正規化して、プールした。
【０２７６】
全ての２４３個の鋳型オリゴヌクレオチドが実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を、プールした鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端としてのＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプタ配列テールを有するように設計した。７サイクルＰＣＲ反応を次いで実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。ＰＣＲ反応産物混合物を次いで、製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応産物の最初の２９ｂｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２７７】
２４３個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ〜０．４％を含有することが算出され、全ての種に対してプラス又はマイナス１０倍頻度（０．０４％〜０．４％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングによって、初期プール内の２４３種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが均一に提示されなかったことが明らかになった。
【０２７８】
したがって、個々の鋳型オリゴヌクレオチドの濃度の調節と、定量的シークエンシング工程の反復を、各分子が、閾値許容濃度（０．０４〜４．０％）内に存在するまで実施した。正規化に続いて、このセットを、１３５９個の鋳型のプールの１１１６個のＩｇＨ  ＶＪバイアス制御セットと組み合わせた。
【０２７９】
図１０は、１１１６個のＩＧＨ  ＶＪバイアス調節分子と、２４３個のＩＧＨ  ＤＪバイアス調節分子のそれぞれのＰＣＲ増幅前シークエンシング数の結果を示す。個々のバイアス調節分子はｘ−軸に沿っている。セットは、１３５９個のｇブロックの合計に対して、１１１６個のＩＧＨ  ＶＪバイアス調節分子及び２４３個のＩＧＨ  ＤＪバイアス調節分子を含む。Ｙ軸は、各個々のｇブロックの配列数である。この算出により、各ＶＪ対の増幅前提示の組成物の定量が提供される。このデータを使用して、プライマーによって導入される増幅バイアスを算出するための、サンプル前とＰＣＲ増幅後サンプルとの間の頻度における変化を推定する。
【０２８０】
ＩｇＬ  ＶＪ鋳型オリゴヌクレオチド
他の実施形態において、ＩｇＬ  ＶＪ鋳型オリゴヌクレオチドを生成し、解析した。一般式（Ｉ）の１セットの２４５個の鋳型オリゴヌクレオチドを、ヒトＩｇＬ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を用いて設計した。各鋳型オリゴヌクレオチドは、４９５塩基対のＤＮＡ分子からなった。ＩｇＬ鋳型オリゴヌクレオチドを、配列番号：５８２２〜６０６６として表す。ＩｇＬ鋳型の２４５−オリゴヌクレオチドセットに関する詳細は代表例であり、以下の通りであった。
【０２８１】
規定のゲノム配列に基づいて、ヒトＩｇＬ遺伝子座が、それぞれＲＳＳ配列を有し、したがって再構成コンピテントとして認識される、７５個のＶＬセグメントを含有することが示された。これらの３３個のＶＬセグメントが、発現すると知られる遺伝子セグメントと、オープン−リーディングフレームを有すると分類された５つのＶセグメントと、３７個のＶ疑似遺伝子と、を含んだ。ＶＬ遺伝子セグメントは、５つの６つのＪＬ遺伝子セグメントに連結した。３３個の機能的Ｖセグメント及び６個のＪセグメントに対する全ての可能性のある機能的で発現されるＶ＋Ｊ遺伝子の組み合わせを含めるために、２０４（６×３３）個の鋳型を、全ての可能性のある発現されるＶＪの組み合わせを提示するように設計した。加えて、２つのＶ疑似遺伝子が疑わしく、更なる１２（２×６）個のＶＪ鋳型が設計され、結果、合計２１６個となった。各鋳型は一般式（Ｉ）（５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’）（図１）に一致し、したがって９つのセクション、すなわち、１９塩基対（ｂｐ）のユニバーサルアダプタ（Ｕ１）と、それぞれ対となったＶ遺伝子及びＪ遺伝子セグメントの組み合わせを固有に識別している１６ｂｐのヌクレオチドタグ（Ｂ１）と、３００ｂｐのＶ遺伝子特異的配列（Ｖ）と、３ｂｐの終止コドン（Ｓ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの他のコピー（Ｂ１２）と、全ての分子によって共有された６ｂｐの連結タグ（Ｒ）と、１００ｂｐのＪ遺伝子特異的配列（ＩＪ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの第３のコピー（Ｂ４）と、１９ｂｐのユニバーサルアダプタ配列（Ｕ２）と、を含み、Ｂ３は存在しなかった。
【０２８２】
２１６個の鋳型のそれぞれを、ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ１、Ｕ２）にアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを個々に用いて増幅した。これらのオリゴヌクレオチド配列は、任意のユニバーサルプライマーであってもよく、本適用において、Ｎｅｘｔｅｒａとコードされるユニバーサルプライマーを使用した。
【０２８３】
各増幅された鋳型オリゴヌクレオチド産物の得られた濃度を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（商標）キャピラリー電気泳動システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて定量した。２１６個の増幅された鋳型オリゴヌクレオチド調製物を、標準濃度に正規化して、プールした。
【０２８４】
全ての２１６個の鋳型オリゴヌクレオチドが実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を、プールした鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端にＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプタ配列テールを有するように設計した。７サイクルＰＣＲ反応を次いで実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。ＰＣＲ反応産物混合物を次いで、製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応産物の最初の２９ｂｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２８５】
２１６個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ〜０．４６％を含有することが算出され、全ての種に対してプラス又はマイナス１０倍頻度（０．０４６％〜４．６％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングによって、初期プール内の２１６種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが、均一に提示されることが明らかになった。
【０２８６】
ＩｇＫ  ＶＪ鋳型オリゴヌクレオチド
１つの実施形態において、ＩｇＫ  ＶＪ鋳型オリゴヌクレオチドを生成し、解析した。一般式（Ｉ）の１セットの５６０個の鋳型オリゴヌクレオチドを、ヒトＩｇＫ  Ｖ及びＪポリヌクレオチド配列を用いて設計した。各鋳型オリゴヌクレオチドは、４９５塩基対のＤＮＡ分子からなった。ＩｇＫ鋳型オリゴヌクレオチドの例が、配列番号：６０６７〜６１９１において見つけられる。ＩｇＫ鋳型の５６０−オリゴヌクレオチドセットに関する詳細は代表例であり、以下の通りであった。
【０２８７】
規定のゲノム配列に基づいて、ヒトＩｇＫ遺伝子座が、それぞれＲＳＳ配列を有し、したがって再構成コンピテントとして見なされる、１１２個のＶｋセグメントを含有すると示された。これらの１１２個のＶｋセグメントが、発現すると知られる４６個の遺伝子セグメントと、オープンリーディングフレームを有すると分類された８個のＶセグメントと、５０個のＶ疑似遺伝子と、を含んだ。このＩｇＫに対して、発現したＩｇＫ  ＶＪ再構成のみを解析した。疑似遺伝子と分類された遺伝子と、オープンリーディングフレームは除外した。Ｖｋ遺伝子セグメントを５個のＪｋ遺伝子セグメントに連結した。これにより、２３０個のＶＪ遺伝子再構成（４６×５）が得られた。４６個の機能的Ｖ及び５個のＪセグメントに対する全ての可能性のある機能的Ｖ＋Ｊ遺伝子の組み合わせを含めるために、２３０（５×４６）個の鋳型を、全ての可能性のあるＶＪの組み合わせを提示するように設計した。各鋳型は一般式（Ｉ）（５’−Ｕ１−Ｂ１−Ｖ−Ｂ２−Ｒ−Ｊ−Ｂ４−Ｕ２−３’）（図１）に一致し、したがって９つのセクション、すなわち、１９塩基対（ｂｐ）のユニバーサルアダプタ（Ｕ１）と、それぞれ対となったＶ遺伝子及びＪ遺伝子セグメントの組み合わせを固有に識別している１６ｂｐのヌクレオチドタグ（Ｂ１）と、３００ｂｐのＶ遺伝子特異的配列（Ｖ）と、３ｂｐの終止コドン（Ｓ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの他のコピー（Ｂ１２）と、全ての分子によって共有される６ｂｐの連結タグ（Ｒ）と、１００ｂｐのＪ遺伝子特異的配列（ＩＪ）と、１６ｂｐのヌクレオチドタグの第３のコピー（Ｂ４）と、１９ｂｐのユニバーサルアダプタ配列（Ｕ２）と、を含み、Ｂ３は存在しなかった。
【０２８８】
２３０個の鋳型のそれぞれを、ユニバーサルアダプタ配列（Ｕ１、Ｕ２）にアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを個々に用いて増幅した。これらのオリゴヌクレオチド配列は、任意のユニバーサルプライマーであってもよく、本適用には、Ｎｅｘｔｅｒａとコードされるユニバーサルプライマーを使用した。
【０２８９】
各増幅された鋳型オリゴヌクレオチド産物の得られた濃度を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（商標）キャピラリー電気泳動システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて定量した。２３０個の増幅された鋳型オリゴヌクレオチド調製物を、標準濃度に正規化して、プールした。
【０２９０】
全ての２３０個の鋳型オリゴヌクレオチドが実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨にしたがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。簡潔に言えば、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を，プールした鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端であるＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプタ配列テールを有するように設計した。７サイクルＰＣＲ反応を次いで実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。ＰＣＲ反応産物混合物を次いで、製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応産物の最初の２９ｂｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２９１】
２３０個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ〜０．４％を含有することが算出され、全ての種に対してプラス又はマイナス１０倍頻度（４．０％〜０．０４％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングによって、初期プール内の２３０種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが、均一に提示されたことが明らかになった。
【０２９２】
実施例７：組み合わせアッセイ
ＩｇＨ  ＤＪ及びＩｇＨ  ＶＪの組み合わせアッセイ
いくつかの実施形態において、再構成されたＩｇＨ  ＶＤＪ  ＣＤＲ３鎖と、再構成されたＩｇＨ  ＤＪ鎖を共増幅及び配列決定することが望ましい。鋳型のプールを生成するために、ＩｇＨ  ＤＪ及びＩｇＨ  ＶＪ鋳型を用いて、組み合わせられたＩｇＨ  ＤＪ及びＩｇＨ  ＶＨアッセイを試験する。プールした時、最終プールは、１１１６個のＶＪ鋳型及び２４３個のＤＪ鋳型を含み、合計１３５９個の個々の鋳型となる。１１１６個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドを含むＩｇＨ  ＶＪ鋳型組成物が、配列番号：４０８５〜５２００にて配列表に開示される。ＩｇＨ  ＤＪ鋳型オリゴヌクレオチド配列を配列番号：５５７９〜５８２１に示される。
【０２９３】
全ての１３５９個の鋳型オリゴヌクレオチドが、実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を、プールした鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端にＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプタ配列テールを有するように設計した。７サイクルＰＣＲ反応を次いで実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。ＰＣＲ反応産物混合物を次いで、製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応産物の最初の２９ｂｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２９４】
１３５９個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ〜０．０７３％を含有することが算出され、全ての種に対してプラス又はマイナス１０倍頻度（０．７３％〜０．００７３％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングによって、初期プール内の１３５９種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが、均一に提示されたことが明らかになった。
【０２９５】
ＩｇＬ及びＩｇＫ組み合わせアッセイ
他の実施形態において、再構成したＩｇＬ及びＩｇＫと、再構成したＣＤＲ３鎖を共増幅及び配列決定することが所望される。鋳型のプールを生成するために、組み合わされたＩｇＬ及びＩｇＫアッセイ（ＩｇＬ及びＩｇＫ鋳型を組み合わせる）を試験する。プールした時、最終プールは、２１６個のＩｇＬ鋳型と２３０個のＩｇＫ鋳型を含み、合計４４６個の個々の鋳型となる。ＩｇＬ鋳型オリゴヌクレオチドを、配列番号：５８２２〜６０６６として示す。
【０２９６】
全ての４４６個の鋳型オリゴヌクレオチドが、実質的に等モル濃度で存在することを実証するために、プールを、製造業者の推奨にしたがって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（商標）シークエンシングプラットフォームを用いて配列決定した。簡潔に言えば、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチド配列を，プールした鋳型オリゴヌクレオチド内に組み込むために、テールしたプライマーを、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ１、Ｕ２）にアニールし、５’末端であるＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）アダプタ配列テールを有するように設計した。次いで、７サイクルＰＣＲ反応を実施して、鋳型オリゴヌクレオチドにＩｌｌｕｍｉｎａアダプタをアニールさせた。次いで、ＰＣＲ反応産物混合物を製造業者によって推奨された条件下においてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  ｂｅａｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応産物の最初の２９ｂｐを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳＥＱ（商標）シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて配列決定し、各１６ｂｐの分子バーコードタグ（Ｂ１）の頻度を評価することによって解析した。
【０２９７】
４４６個の異なる鋳型オリゴヌクレオチドのセットに対する実質的に等モルの調製物が、セットの各メンバーのおよそ〜０．０２２％を含有することが算出され、全ての種に対してプラス又はマイナス１０倍頻度（２．２％〜０．００２２％）の閾値許容範囲が所望された。定量的シークエンシングによって、初期プール内の４４６種のアダプタ修飾鋳型オリゴヌクレオチドが、均一に提示されたことが明らかになった。
【０２９８】
実施例８：ＩＧＨ増幅オリゴヌクレオチドプライマーセットにおける不均一増幅能（ＰＣＲバイアス）の補正
多種多様なＩｇＨ増幅プライマーを、対象からのリンパ球系細胞ＤＮＡを含有する生体サンプル中の、再構成されたＩｇＨ  Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの全ての可能性のある組み合わせを増幅するように設計した。等モル濃度の多種多様な増幅プライマーを含有する調製物をマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲにて使用して、ＩｇＨ遺伝子座に対して、全ての可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせを提示している少なくとも１種の鋳型で、等モル濃度の式（Ｉ）にしたがったＩｇＨ−特異的鋳型オリゴヌクレオチドを含む多種多様な鋳型組成物を増幅した。増幅産物を定量的に配列決定して、各固有のＶ−Ｊ産物配列の発生頻度を、各Ｖ−Ｊの組み合わせを固有に識別した各１６ｂｐの分子バーコード配列（式（Ｉ）中Ｂ）の発生頻度から得た。
【０２９９】
マルチプレックスＰＣＲ反応を、ＩＭＧＴコラボレーションによって注釈を付けたように、全ての可能性のあるＩｇＨ遺伝子座のＶ及びＪ遺伝子再構成を増幅するように設計した。Ｙｏｕｓｆｉ  Ｍｏｎｏｄ  Ｍ，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ，Ｃｈａｕｍｅ  Ｄ，Ｌｅｆｒａｎｃ．ＭＰ．ＩＭＧＴ／ＪｕｎｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖ−Ｊ  ａｎｄ  Ｖ−Ｄ−Ｊ  ＪＵＮＣＴＩＯＮｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４、２０（ｓｕｐｐｌ  １）：ｉ３７９〜ｉ３８５を参照のこと。遺伝子座は、１２６個の固有のＶ遺伝子と、５２個の機能性遺伝子と、機能に対して重要なアミノ酸を欠いている６個の推定オープン−リーディングフレームと、６９個の疑似遺伝子と、９個のＪ遺伝子と、６個の機能性及び３個の疑似遺伝子と、を含む。プライマーアニーリングのための標的配列は、いくつかのＶセグメントに対して同一であり、これによって、８６個の固有のフォワードプライマーで、１２６個の全てのＶセグメントを増幅することができる。同様に、７個の固有リバースプライマーが９個の全てのＪ遺伝子にアニールした。バイアス評価の基準として、１１１６個の鋳型のプールを、８６個のＶフォワードプライマー（ＶＦ；Ｖ遺伝子に特異的）の等モルプール及び７個のＪリバースプライマー（ＪＲ；Ｊ遺伝子に特異的）の等モルプールを用いて増幅した。
【０３００】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（各２５μＬ）を、２．０μＭのＶＦ、２．０μＭのＪＲプール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μＭのＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、１０％のＱ−溶液（ＱＩＡＧＥＮ）及び本発明者らの合成ＩｇＨレパートリー混合物からの２００，０００の標的分子にて設定した。以下の熱サイクル条件を、Ｃ１００熱サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において使用した。９５℃、６分間の１サイクル、９５℃、３０秒間、６４℃、１２０秒間及び７２℃、９０秒間の３１サイクル、続いて７２℃、３分間の１サイクル。全ての実験に対して、各ＰＣＲ条件を３回複製した。
【０３０１】
初期バイアス評価に続いて、全ての個々のプライマー増幅特性を定義するために実験を実施した。ＶＦ及びＪＲプライマーの特異性を決定するための、８６個の混合物を、全てのＪＲプライマーと共に単一のＶＦプライマーを含有して調製し、全てのＶＦプライマーと単一のＪＲプライマーを含有する７個の混合物を調製した。これらのプライマーセットを合成鋳型を増幅するために使用し、標的化Ｖ及びＪ遺伝子セグメントに対する各プライマーの特異性を測定し、オフターゲットプライミングの例を識別するために、得られたライブラリを配列決定した。滴定実験を、全ての他の等モルプライマーのコンテキスト内の、２倍及び４倍濃度の各個々のＶＦ又はＪＦ（例えば、２倍のＩｇＨＶ１−０１＋全ての他の等モルＶＦ及びＪＲプライマー）のプールを用いて実施して、観察された鋳型頻度にプライマー濃度を関連づける倍率を推定した。
【０３０２】
プライマー混合物最適化
プライマーを一つずつ滴定することによって誘導される倍率を用いて、代替的なプライマー混合物を、増幅バイアスを最小化するために、プライマーがムラのある濃度で組み合わせられるように開発した。次いで、修正されたプライマー混合物を使用して、鋳型プールを増幅し、残存性増幅バイアスを測定した。本プロセスを繰り返し、そのプライマーによって増幅された鋳型が、結果の前の回で過剰に、又は過少に提示されたかどうかに基づいて適切に各プライマー濃度を増加又は減少させる。本反復プロセスの各段階で、増幅バイアスの全体的な程度を、ダイナミックレンジ（最大バイアス／最小バイアス）のメトリックと、二乗和（ＳＳ、ログ（バイアス）値上で算出）を算出することで決定し、反復の間に最小の改善がなされるまで、プライマー濃度の調節プロセスを反復した。最終的な最適化プライマー混合物の堅牢性と、等モル鋳型入力からの偏差に対する倍率を評価するために、本発明者らは、シークエンシング出力における効果を決定するために、ＩｇＨ参照鋳型の非常にムラのある混合物を使用した。最終混合物は、等モル混合物よりも実質的に良好であった。
【０３０３】
実施例９：ＴＣＲＢ−増幅オリゴヌクレオチドプライマーセットにおける不均一増幅能（ＰＣＲバイアス）の補正
多種多様なＴＣＲＢ増幅プライマーを、対象からのリンパ球系ＤＮＡを含有する生体サンプル中の、再構成されたＴＣＲＢ  Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの全ての可能性のある組み合わせを増幅するように設計した。等モル濃度の多種多様な増幅プライマーを含有する調製物をマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲにて使用して、ＴＣＲＢ遺伝子座に対して、全ての可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせを提示している少なくとも１種の鋳型で、等モル濃度の式（Ｉ）にしたがったＴＣＲＢ−特異的鋳型オリゴヌクレオチドを含む多種多様な鋳型組成物を増幅した。増幅産物を定量的に配列決定して、各固有のＶ−Ｊ産物配列の発生頻度を、各Ｖ−Ｊの組み合わせを固有に識別した各１６ｂｐの分子バーコード配列（式（Ｉ）中Ｂ）の発生頻度から得た。
【０３０４】
マルチプレックスＰＣＲ反応を、ＩＭＧＴコラボレーションによって注釈を付けたように、全ての可能性のあるＴＣＲＢ遺伝子座のＶ及びＪ遺伝子再構成を増幅するように設計した。Ｙｏｕｓｆｉ  Ｍｏｎｏｄ  Ｍ，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ，Ｃｈａｕｍｅ  Ｄ，Ｌｅｆｒａｎｃ．ＭＰ．ＩＭＧＴ／ＪｕｎｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖ−Ｊ  ａｎｄ  Ｖ−Ｄ−Ｊ  ＪＵＮＣＴＩＯＮｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４、２０（ｓｕｐｐｌ  １）：ｉ３７９〜ｉ３８５を参照のこと。遺伝子座は、６７個の固有のＶ遺伝子を含む。プライマーアニーリングのための標的配列は、いくつかのＶセグメントに対して同一であり、これにより、６０個の固有のフォワードプライマーで、６７個の全てのＶセグメントを増幅することができる。Ｊ遺伝子座に関して、１３個の固有のリバースプライマーが１３個のＪ遺伝子にアニールした。バイアス評価評価の基準として、８６８個の鋳型のプールを、６０個のＶフォワードプライマー（ＶＦ；Ｖ遺伝子に特異的）の等モルプール及び１３個のＪリバースプライマー（ＪＲ；Ｊ遺伝子に特異的）の等モルプールを用いて増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（各２５μＬ）を、３．０μＭのＶＦ、３．０μＭのＪＲプール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μＭのＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、１０％のＱ−溶液（ＱＩＡＧＥＮ）及び本発明者らの合成ＴＣＲＢレパートリー混合物からの２００，０００の標的分子にて設定した。以下の熱サイクル条件を、Ｃ１００熱サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）において使用した。９５℃、５分間の１サイクル、９５℃、３０秒間、６２℃、９０秒間及び７２℃、９０秒間の３１サイクル、続いて７２℃、３分間の１サイクル。全ての実験に対して、各ＰＣＲ条件を３回複製した。
【０３０５】
初期バイアス評価に続いて、全ての個々のプライマー増幅特性を定義するために実験を実施した。本発明者らのＶＦ及びＪＲプライマーの特異性を決定するために、６０個の混合物を、全てのＪＲプライマーと共に単一のＶＦプライマーを含有して調製し、全てのＶＦプライマーと単一のＪＲプライマーを含有する１３個の混合物を調製した。これらのプライマーセットを合成鋳型を増幅するために使用し、標的化Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの各プライマーの特異性を測定し、オフターゲットプライミングの例を識別するために、得られたライブラリを配列決定した。滴定実験を、全ての他の等モルプライマーのコンテキスト内の、２倍及び４倍濃度の各個々のＶＦ又はＪＦ（例えば、２倍のＴＣＲＢＶ０７−６＋全ての他の等モルＶＦ及びＪＲプライマー）のプールを用いて実施し、これによって、発明者らは観察された鋳型頻度にプライマー濃度を関連づける倍率を推定することができた。
【０３０６】
プライマー混合物最適化
プライマーを一つずつ滴定することによって誘導される倍率を用いて、代替的なプライマー混合物を、増幅バイアスを最小化するために、プライマーがムラのある濃度で組み合わせられるように開発した。次いで、修正されたプライマー混合物を使用して、鋳型プールを増幅し、残存性増幅バイアスを測定した。本プロセスを反復し、そのプライマーによって増幅された鋳型が、結果の前の回で過剰に、又は過少に提示されたかどうかに基づいて適切に各プライマー濃度を増加又は減少させる。本反復プロセスの各段階で、増幅バイアスの全体的な程度を、ダイナミックレンジ（最大バイアス／最小バイアス）のメトリックと、二乗和（ＳＳ、ログ（バイアス）値上で算出）を算出することで決定し、反復の間に最小の改善がなされるまで、プライマー濃度の調節プロセスを反復した。最終混合物は、プライマーの等モル混合物よりも実質的に良好であった。
【０３０７】
図１１は、相対的な増幅バイアスに対してグラフ化された合成ＴＣＲＢ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＢ−プライマー反復を示す。相対的増幅バイアスを、化学的バイアス制御補正（等モルプライマー（黒色））前、化学的補正（最適化プライマー（暗灰色））後、及び化学的及びコンピュータ処理的補正後（コンピュータ処理的調節（明灰色）後）後に、８５８個の合成ＴＣＲＢ  ＶＪ鋳型に関して決定した。等モルプライマーは、２６４のダイナミックレンジ、０．８４１の四分位レンジ、及び１３２の二乗和（ログバイアス）を有した。最適化プライマーは、１４７のダイナミックレンジ、０．５８１の四分位レンジ、及び５０．７の二乗和（ログバイアス）を有した。補正したプライマー（コンピュータ処理的調節後）は、９０．８のダイナミックレンジ、０．２４８の四分位レンジ、及び１２．８の二乗和（ログバイアス）を有した。
【０３０８】
実施例１０：組み合わせたＩＧＨ  ＶＪ及びＤＪ−増幅オリゴヌクレオチドプライマーセットにおける不均一増幅能（ＰＣＲバイアス）の補正
多種多様なＩｇＨ増幅プライマーを、対象からのリンパ球系細胞ＤＮＡを含有する生体サンプル中の、再構成されたＩｇＨ  Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、及びＩｇＨ  Ｄ及びＪ遺伝子の全ての可能性のある組み合わせを増幅するように設計した。等モル濃度の多種多様な増幅プライマーを含有する調製物をマルチプレックス化マルチプレックスＰＣＲにて使用して、ＩｇＨ遺伝子座に対して、全ての可能性のあるＶ−Ｊの組み合わせと、ＩｇＨ遺伝子座に対して全ての可能性のあるＤ−Ｊ組み合わせとを提示している少なくとも１種の鋳型で、等モル濃度の式（Ｉ）にしたがったＩｇＨ−特異的鋳型オリゴヌクレオチドを含む多種多様な鋳型組成物を増幅した。増幅産物を定量的に配列決定して、各固有のＶ−Ｊ及びＤ−Ｊ産物配列の発生頻度を、各Ｖ−Ｊ及びＤ−Ｊ組み合わせを固有に識別する各１６ｂｐの分子バーコード配列（式（Ｉ）中Ｂ）の発生頻度から得た。
【０３０９】
マルチプレックスＰＣＲ反応を、ＩＭＧＴコラボレーションによって注釈を付けたように、全ての可能性のあるＩｇＨ遺伝子座のＶ及びＪ遺伝子再構成、及びＤ及びＪ遺伝子再構成を増幅するように設計した。遺伝子座は、１２６個の固有のＶ遺伝子と、５２個の機能性遺伝子と、６個の機能に対して重要なアミノ酸を欠いている推定オープン−リーディングフレームと、６９個の疑似遺伝子と、９個のＪ遺伝子と、６個の機能性及び３個の疑似遺伝子と、を含んだ。遺伝子座はまた、２７個の固有のＤ遺伝子を含んだ。プライマーアニーリングのための標的配列は、いくつかのＶセグメントに対して同一であり、これによって、８６個の固有のフォワードプライマーで、１２６個の全てのＶセグメントを増幅することができる。同様に、７個の固有リバースプライマーが９個の全てのＪ遺伝子にアニールした。Ｄ−Ｊアッセイに関して、プライマーを、再構成した−ＤＪステムにアニールするように設計した。Ｂ細胞発達の間、両方の対立遺伝子が、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間で再構成され、結果として２つの−ＤＪステムとなる。−ＤＪステムは、Ｊ遺伝子と、１つのＮ領域と、Ｄ遺伝子と、を含む。ＤＪ再構成に続いて、２つの対立遺伝子の１つＶ遺伝子が、−ＤＪステムにて再構成し、ＣＤＲ３遺伝子領域（ＶｎＤｎＪ）をコードする。−ＤＪステムを増幅するために、２７個の固有のプライマーを、Ｄ遺伝子エクキソンのイントロン領域上流における各特異的なＤ遺伝子にアニールするように設計した。これらのセグメントは、−ＤＪステム内に存在する一方で、Ｖから−ＤＪ組み換えの後、削除される。しかしながら、Ｊプライマーは再設計されず、ＤＪアッセイは、ＶＪアッセイと同一のＪプライマーを使用した。
【０３１０】
バイアス評価の基準として、１３５９個の鋳型のプールを、８６個のＶフォワードプライマー（ＶＦ；Ｖ遺伝子に特異的）、２７個のＤフォワードプライマー（ＤＦ；Ｄ遺伝子に特異的）の最適化（混合物２−１）プール、及び７個のＪリバースプライマー（ＪＲ；Ｊ遺伝子に特異的）の等モルプールを用いて増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（各２５μＬ）を、１．０μＭのＶＦ、１．０μＭのＤＦ及び２．０μＭのＪＲプール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×  ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｌｕｓ  ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、１０％のＱ−溶液（ＱＩＡＧＥＮ）及び本発明者らの合成ＩｇＨ  ＶＪ及びＤＪレパートリー混合物からの２００，０００の標的分子にて設定した。以下の熱サイクル条件を、Ｃ１００熱サイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において使用した。９５℃、６分間の１サイクル、９５℃、３０秒間、６４℃、１２０秒間及び７２℃、９０秒間の３１サイクル、続いて７２℃、３分間の１サイクル。全ての実験に対して、各ＰＣＲ条件を３回複製した。
【０３１１】
初期バイアス評価に続いて、全ての個々のプライマー増幅特性を定義するために実験を実施した。本発明者らのＤＦ及びＪＲプライマーの特異性を決定するための、２７個の混合物を、全てのＪＲプライマーと先に識別され最適化されたＶＦプールと共に単一のＤＦプライマーを含有して調製し、全てのＶＦ及びＤＦプライマーと単一のＪＲプライマーを含有する７個の混合物を調製した。合成鋳型を増幅するために、これらのプライマーセットを使用して、得られたライブラリを配列決定して、標的化Ｖ、Ｄ又はＪ遺伝子セグメントに対する各プライマーの特異性を測定し、オフターゲットプライミングの例を識別した。
【０３１２】
滴定実験を、全ての他のプライマー（ＶＦプライマーの最適化混合物を含む）のコンテキスト内の、２倍及び４倍濃度の各個々のＤＦ又はＪＦ（例えば、２倍のＩｇＨＤ２−０８＋全ての他の等モルＤＦ、最適ＶＦ混合物、及びＪＲプライマー）のプールを用いて実施して、観察された鋳型頻度にプライマー濃度を関連づける倍率を推定した。
【０３１３】
プライマー混合物最適化
交差増幅試験を用いて、ＤＦプライマーが、交差増幅されると識別された。１２個のＤＦプライマーを除去し、１５個のＤＦプライマーの最終的なプールを得た。プライマーを一つずつ滴定することによって誘導される倍率を用いて、代替的なプライマー混合物を、増幅バイアスを最小化するために、プライマーがムラのある濃度で組み合わせられるように開発した。次いで、修正されたプライマー混合物を使用して、鋳型プールを増幅し、残存性増幅バイアスを測定した。本プロセスを反復し、そのプライマーによって増幅された鋳型が、結果の前の回で過剰に、又は過少に提示されたかどうかに基づいて適切に各プライマー濃度を増加又は減少させる。本反復プロセスの各段階で、増幅バイアスの全体的な程度を、ダイナミックレンジ（最大バイアス／最小バイアス）のメトリックと、二乗和（ＳＳ、ログ（バイアス）値上で算出）を算出することで決定し、反復の間に最小の改善がなされるまで、プライマー濃度の調節プロセスを反復した。最終プライマー混合物は、等モルプライマー混合物よりも実質的に少ないプライマーバイアスを有する。
【０３１４】
図１２は、相対的増幅バイアスに対してグラフ化された、合成ＩＧＨ  ＶＪ鋳型の、ＩＧＨプライマー反復を示す。相対的増幅バイアスを、化学的バイアス制御補正（等モルプライマー（黒色））前、化学的補正（最適化プライマー（暗灰色））後、及び化学的及びコンピュータ処理的補正後（コンピュータ処理的調節（明灰色）後）に、１１１６個の合成ＩＧＨ  ＶＪ鋳型に関して決定した。等モルプライマーは、１１３０のダイナミックレンジ、０．９９１の四分位レンジ、及び２３３の二乗和（ログバイアス）を有した。最適化プライマーは、１２９のダイナミックレンジ、０．７３２の四分位レンジ、及び８８．２の二乗和（ログバイアス）を有した。コンピュータ処理的調節後のプライマーは、７６．９のダイナミックレンジ、０．５４５の四分位レンジ、及び３７．９の二乗和（ログバイアス）を有した。
【０３１５】
図１３は、Ｖ遺伝子の２７個の合成ＩＧＨ  ＤＪ鋳型の相対的増幅バイアスを示す。Ｖ遺伝子セグメントの相対的増幅バイアスは、３つのプライマー反復、１）化学的バイアス制御補正前（黒色）、２）化学的補正の第１の反復（白色）、及び３）化学的補正の第２の反復後（明灰色）において示される。
【０３１６】
実施例１１：ＴＣＲＧ  ＶＪプラマー反復
他の実施形態において、ＴＣＲＧ  ＶＪプライマーを、多重プライマー反復における、相対的増幅バイアスに関して試験した。図１４ａ〜ｄは、５５個の合成ＴＣＲＧ  ＶＪ鋳型のＴＣＲＧ−プライマー反復を示す。化学的バイアス制御補正（図１４ａ）、化学的補正の第１の反復（図１４ｂ）、化学的得補正の第２の反復（図１４ｃ）、及び化学的補正の最終反復（図１４ｄ）の前に、ＴＣＲＧ  ＶＪプライマーの相対的増幅バイアスが決定された。
【０３１７】
実施例１２：代替的なバイアス制御及びスパイクイン方法
他の実施形態において、代替的な方法が、増幅バイアスを決定するために使用され得る。方法の２つの主要な目標は以下の通りであった。（１）ＢＣＲ又はＴＣＲ遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ増幅において、増幅バイアスを除去すること、及び（２）開始鋳型において、Ｂ又はＴ細胞の分画を推定すること。
【０３１８】
方法は、Ｂ及び／又はＴ細胞を含むサンプルから抽出した、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む１セットの細胞で開始することを含む。細胞を含むサンプルにおいて、ＤＮＡは、本技術分野で標準の方法を用いて抽出される。
【０３１９】
抽出されたＤＮＡは、多数の部分に分割され、異なるＰＣＲウェルに入れられる。いくつかの実施形態において、１つのウェルを使用して容量を充満させるか、又は数千のウェルを使用可能である。１つの実施形態において、１８８個のウェルがＰＣＲのために使用される（２つの９６個のウェルプレート）。ウェルあたりのＴＣＲ又はＢＣＲ鋳型の数はまばらであり、同一のウェルの中に同一のクローン型からの多数の分子を有することはまれである。
【０３２０】
次いで、方法は、同一の複数のプライマーセットを用いて、各ウェルで別々に、ＤＮＡを増幅することを含む。本明細書で記述したプライマーセットを使用可能である。以上で記述したように、バーコーディング法が、同一のバーコード配列で、各ウェルの増幅された分子に適用される。例えば、各ウェルは、それ自身のバーコードを得る。
【０３２１】
次いで、分子が、十分な量の増幅されたＢＣＲ又はＴＣＲ配列で、高スループットシークエンシング装置上で配列決定され、配列によって使用したＶ及びＪ鎖、並びにバーコード配列を識別する。
【０３２２】
各ウェルは平均コピー数を有する。各クローン型は、ウェル中に一回現れ、平均に対するその鋳型の量が、Ｖ−Ｊの組み合わせに対するバイアスである。Ｖ及びＪバイアスが独立しているので、全てのＶ−Ｊの組み合わせが，バイアスを決定するために必要である。次いで、これらの相対的バイアスは、非常に過少又は過剰に増幅しているプライマーを再設計するか、又は増幅を増加又は減少させるために、プライマー濃度を滴定するかいずれかのために使用される。全プロセスが、新しいプライマーロットで繰り返され、バイアスを減少させるために継続して反復される。
【０３２３】
反復の任意のサイクルの後、１セットのコンピュータ処理的因子（相対的増幅率）が、バイアスを除去するために適用される。バイアスは、プライマーの変更及びコンピュータ処理的補正の両方（又はいずれか）によって減少させることができる。
【０３２４】
方法は、同様のアッセイからの有核細胞の画分を算定することを含む。各ウェルに対して、各クローン型を定義し、各クローンに対して、シークエンシングリードの数を決定する。いくつかの実施形態において、鋳型の数は、まばらである必要はない。各クローンに対するリード数を、上述のようにバイアス制御因子によって補正する。
【０３２５】
ヒストグラムが修正したリード数で作成され、グラフは１次モード（増幅率）を有する。本モードは、（第１の大きいピークの識別に基づいた）検査によって、又はフーリエ変換によって、又は他の既知の方法によって識別される。
【０３２６】
各ウェル中の補正されたリードの総数を、そのウェルに対する増幅率によって除す。これは、ウェル中に存在したＴＣＲ又はＢＣＲゲノム鋳型の推定値である。サンプルからのＢＣＲ又はＴＣＲの総数は、全てのウェルからの数の和である。各ウェル中のゲノムの総数は、ＰＣＲの前に測定される。これは、ＤＮＡを定量するために使用した、ナノドロップ又は他の既知の方法によって実施される。ＤＮＡの測定重量を、二本鎖ゲノムの重量（例えば、ヒトにおいて、〜６．２ピコグラム）で除する。
【０３２７】
サンプル中のＢ細胞又はＴ細胞の画分は、反応に加えた二本鎖ＤＮＡ分子の総数で除した、サンプル中のＢＣＲ又はＴＣＲの総数である。結果は、Ｔ細胞の小画分が再構成された両方の対立遺伝子を有するので、マイナーな補正を必要とする。本補正因子は、アルファベータＴ細胞に対しておよそ１５％、Ｂ細胞に対して１０％である。ガンマデルタＴ細胞に対して、ほぼ全ての細胞が、再構成された両方の対立遺伝子を有し、したがって補正は２の因子である。
【０３２８】
これらの更なる方法が、ＢＣＲ又はＴＣＲ遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ増幅における増幅バイアスを決定可能であり、開始鋳型中のＢ又はＴ細胞の画分を推定するために使用可能である。
【０３２９】
上述のさまざまな実施形態は組み合わされ、更なる実施形態を提供することが可能である。本明細書で引用する、かつ／又は明細書データシートに列記される全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許発行物が、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、種々の特許、出願及び公報の概念を利用し、更なる実施形態を産するために必要であれば、改変可能である。
【０３３０】
上の詳述を考慮して、これら及び他の変更が実施形態に実施可能である。一般に、以下の請求項において、使用する用語は、本明細書及び請求項にて開示した特定の実施形態に対して、請求項を限定するよう解釈されるべきでないが、このような請求項が権利がある等価の全範囲にそって全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、請求項は、本開示によって限定されない。
【０３３１】
情報配列リスト
【０３３２】
【表１２−１】
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【０３３３】
【表１２−２】
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【０３３４】
【表１２−３】
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【０３３５】
【表１２−４】
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【０３３６】
【表１２−５】
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【０３３７】
【表１２−６】
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【０３３８】
【表１２−７】
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【０３３９】
【表１２−８】
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【０３４０】
【表１２−９】
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【０３４１】
【表１２−１０】
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【０３４２】
【表１２−１１】
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【０３４３】
【表１２−１２】
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【０３４４】
【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【０３４６】
【表１２−１５】
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【０３４７】
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【０３４８】
【表１２−１７】
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【０３４９】
【表１２−１８】
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【０３５０】
【表１２−１９】
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【０３５１】
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【表１２−２１】
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【０３５３】
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【０３５５】
【表１２−２４】
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【０３５６】
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【０３５７】
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【０４１３】
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【０４７８】
【表１４−２３】
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【０４７９】
【表１４−２４】
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【０４８０】
【表１４−２５】
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【０４８１】
【表１４−２６】
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【０４８２】
【表１４−２７】
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【０４８３】
【表１４−２８】
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【０４８４】
【表１４−２９】
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【０４８５】
【表１４−３０】
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【０４８６】
【表１４−３１】
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【０４８７】
【表１４−３２】
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【０４８８】
【表１４−３３】
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【０４８９】
【表１４−３４】
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【０４９０】
【表１５−１】
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【０４９１】
【表１５−２】
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【０４９２】
【表１５−３】
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【０４９３】
【表１５−４】
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【０４９４】
【表１５−５】
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【０４９５】
【表１６】
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【０４９６】
【表１７−１】
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【０４９７】
【表１７−２】
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【０４９８】
【表１７−３】
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【０４９９】
【表１７−４】
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【０５００】
【表１７−５】
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【０５０１】
【表１７−６】
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【０５０２】
【表１７−７】
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【０５０３】
【表１７−８】
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【図２】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図５ｉ】
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【図５ｊ】
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【図５ｋ】
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【図５ｌ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【図７ｉ】
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【図７ｊ】
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【図７ｋ】
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【図７ｌ】
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【図７ｍ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１】
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【図３】
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