(57)【要約】【課題】より簡単な構成をもって、核酸増幅反応における反応液の昇温と降温の繰り返しを行える技術を提供する。【解決手段】マイクロチップ１は、第一反応槽５と、第二反応槽６と、両者を繋ぐ連結路７を有する。マイクロチップ１は、さらに光応答性又は熱応答性のガス発生フィルム８を有する。ガス発生フィルム８に光を照射してガスを発生させることにより、第一反応槽５と第二反応槽６にガスを供給し、反応槽内の反応液１０にガスによる圧力を付与する。ガスによる圧力で、反応液の一方の反応槽から他方の反応槽への移送を繰り返し、反応槽間で反応液１０を往復させる。第一反応槽５を９４℃〜９６℃程度、第二反応槽６を５５℃〜７５℃程度にそれぞれ維持し、核酸の変性工程とアニーリング工程／伸長工程とを繰り返す。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液の昇温と降温を繰り返す核酸の増幅方法であって、
所定温度に維持された高温領域と、前記高温領域の所定温度よりも低い所定温度に維持された低温領域を設定し、前記高温領域と前記低温領域との間で反応液を往復させて反応液の昇温と降温を繰り返すものであり、
光応答性又は熱応答性のガス発生剤から発生したガスによる圧力を前記反応液に付与し、一方の領域から他方の領域に前記反応液を移動させる工程を交互に繰り返すことにより、前記反応液を往復させることを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項２】
反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応をマイクロチップ内で行う核酸の増幅方法であって、
前記マイクロチップは、所定温度に維持される高温反応槽と、前記高温反応槽の所定温度よりも低い所定温度に維持される低温反応槽と、前記高温反応槽と前記低温反応槽を連結する連結路を有し、
各所定温度に維持された高温反応槽と低温反応槽との間で反応液を往復させて、反応液の昇温と降温を繰り返すものであり、
前記マイクロチップは、光応答性又は熱応答性のガス発生剤をさらに有し、
前記ガス発生剤から発生したガスを一方の反応槽に供給して前記反応液にガスによる圧力を付与し、他方の反応槽に前記反応液を移送する工程を交互に繰り返すことにより、前記反応液を往復させることを特徴とする核酸の増幅方法。
【請求項３】
前記連結路には、当該連結路と系外部とを連結する細管が設けられており、反応液の往復時において、当該細管への反応液の流入を阻止しつつ、当該細管からガスを逃がすことを特徴とする請求項２に記載の核酸の増幅方法。
【請求項４】
前記高温領域又は前記高温反応槽が維持される所定温度が９３℃〜９７℃であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項５】
前記低温領域又は前記低温反応槽が維持される所定温度が５５℃〜７５℃であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項６】
前記ガス発生剤は、アゾ又はアジド系ガス発生剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項７】
前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項８】
前記ガス発生剤は、フィルム状又はテープ状であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の核酸の増幅方法。
【請求項９】
反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応に用いられる核酸増幅用マイクロチップであって、
所定温度に維持される高温反応槽と、前記高温反応槽の所定温度よりも低い所定温度に維持される低温反応槽と、前記高温反応槽と前記低温反応槽を繋ぐ連結路と、光応答性又は熱応答性のガス発生剤を有し、
前記ガス発生剤から発生したガスを前記高温反応槽及び前記低温反応槽に供給可能であり、
一方の反応槽に前記ガスを供給して当該反応槽内の反応液に圧力を付与し、他方の反応槽に前記反応液を移送する工程を交互に繰り返して、前記反応液を往復させることが可能であることを特徴とする核酸増幅用マイクロチップ。
【請求項１０】
前記連結路には、当該連結路と系外部とを連結する細管が設けられており、反応液の往復時において、当該細管への反応液の流入を阻止しつつ、当該細管からガスを逃がすことが可能であることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅用マイクロチップ。
【請求項１１】
前記ガス発生剤は、各反応槽ごとに独立して設けられていることを特徴とする請求項９又は１０に記載の核酸増幅用マイクロチップ。
【請求項１２】
前記ガス発生剤は、アゾ又はアジド系ガス発生剤であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用マイクロチップ。
【請求項１３】
前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用マイクロチップ。
【請求項１４】
前記ガス発生剤は、フィルム状又はテープ状であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用マイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法、並びに、核酸増幅用マイクロチップに関する。本発明は、微量試料を用いた核酸増幅反応に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
微量の液体試料を取り扱うことができるマイクロチップが知られている。例えば、手で容易に取り扱い得る大きさの基板（チップ）内に、液体試料等を搬送するためのマイクロ流路が形成され、必要に応じて、試料の導入部、試薬類の保持部、反応槽等が設けられたマイクロチップやマイクロ流体デバイスが知られている（例えば、特許文献１，２）。
【０００３】
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法等の核酸増幅反応を、マイクロチップを用いて行うことができる。マイクロチップを用いることにより、微量の液体試料であっても核酸増幅反応を容易に行うことができる。
【０００４】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応は、核酸を変性（解離）させる変性工程、核酸同士をアニーリングさせるアニーリング工程、及び核酸を伸長させる伸長工程を繰り返す。一般に、変性工程は９４℃〜９６℃程度の高温で行われ、一方、アニーリング工程と伸長工程は、これよりも低い温度、例えば５５℃〜７５℃程度で行われる。したがって、核酸増幅反応においては、反応液を少なくとも２種類の温度に晒す工程を交互に繰り返すこととなる。すなわち、反応液の昇温と降温を繰り返すこととなる。
【０００５】
反応液の昇温と降温を繰り返すための方策としては、異なる所定温度に維持された複数の領域を設定し、これらの領域間で反応液を移動又は往復させることが挙げられる。この方策によれば、１つの反応槽を昇温および降温させるよりも短時間で所望の温度に反応液をさらすことができ、核酸増幅に必要な時間を短縮できる。
【０００６】
異なる温度領域の間で反応液を移動又は往復させる技術が知られている。例えば特許文献３には、ガラスキャピラリーからなる筒状の反応容器内に往復移動可能なピストンを設置し、当該ピストンを往復させることにより、反応容器内のＤＮＡ増幅用反応液を往復させるＤＮＡ増幅装置が開示されている。本装置では、反応液を３種の温度領域間で往復させることができる。また特許文献４には、マイクロ流体デバイスに形成されたジグザグ状の流路に反応液を一方向に流すことにより、異なる温度領域上を反応液が順次通過する構成が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１３２８７９号公報
【特許文献２】特開２０１２−２１５５３５号公報
【特許文献３】特開平７−３０３４６９号公報
【特許文献４】特開２００５−１９２５５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献３に記載の技術は、ピストンを用いて反応液を往復させるものであり、装置の構成が複雑である。また特許文献４に記載の技術においても、別途用意したマイクロシリンジポンプを用いて反応液を送液しており、簡単な構成とはいえない。
そこで本発明は、より簡単な構成をもって、核酸増幅反応における反応液の昇温と降温の繰り返しを行える技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸の増幅方法であって、所定温度に維持された高温領域と、前記高温領域の所定温度よりも低い所定温度に維持された低温領域を設定し、前記高温領域と前記低温領域との間で反応液を往復させて反応液の昇温と降温を繰り返すものであり、光応答性又は熱応答性のガス発生剤から発生したガスによる圧力を前記反応液に付与し、一方の領域から他方の領域に前記反応液を移動させる工程を交互に繰り返すことにより、前記反応液を往復させることを特徴とする核酸の増幅方法である。
【００１０】
本発明は、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸の増幅方法に係るものである。本発明の核酸の増幅方法では、互いに異なる所定温度に維持された高温領域と低温領域を設定し、これらの領域間で反応液を往復させて反応液の昇温と降温を繰り返す。
そして本発明では、反応液を往復させる際に、光応答性又は熱応答性のガス発生剤から発生したガスの圧力を利用する。すなわち、当該ガスの圧力を反応液に付与することにより、一方の領域から他方の領域に反応液を移動させる。
本発明では、光応答性又は熱応答性のガス発生剤から発生したガスの圧力を利用するので、より簡単な構成をもって反応液を往復させることができる。そのため、核酸の増幅反応を簡便かつ効率的に行うことができる。本発明の核酸の増幅方法は、微量試料を用いる核酸増幅反応に特に有用である。
【００１１】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応をマイクロチップ内で行う核酸の増幅方法であって、前記マイクロチップは、所定温度に維持される高温反応槽と、前記高温反応槽の所定温度よりも低い所定温度に維持される低温反応槽と、前記高温反応槽と前記低温反応槽を連結する連結路を有し、各所定温度に維持された高温反応槽と低温反応槽との間で反応液を往復させて、反応液の昇温と降温を繰り返すものであり、前記マイクロチップは、光応答性又は熱応答性のガス発生剤をさらに有し、前記ガス発生剤から発生したガスを一方の反応槽に供給して前記反応液にガスによる圧力を付与し、他方の反応槽に前記反応液を移送する工程を交互に繰り返すことにより、前記反応液を往復させることを特徴とする核酸の増幅方法である。
【００１２】
本発明の核酸の増幅方法は、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応をマイクロチップ内で行うものである。本発明では、当該マイクロチップが、互いに異なる所定温度に維持される高温反応槽と低温反応槽を有しており、これらの反応槽の間で反応液を往復させて反応液の昇温と降温を繰り返す。
そして本発明では、当該マイクロチップが光応答性又は熱応答性のガス発生剤を有しており、反応液を往復させる際に、当該ガス発生剤から発生したガスの圧力を利用する。すなわち、当該ガスの圧力を反応槽内の反応液に付与することにより、一方の反応槽から他方の反応槽に反応液を移動させる。
本発明では、マイクロチップにガス発生剤が備えられているので、マイクロチップを用いた核酸増幅反応を簡単な構成で実施することができる。例えば、別途のガス発生装置等を用意する必要がなく、システム全体の小型化、ディスポーザブル化、及びメンテナンス性の向上を実現することができる。
【００１３】
好ましくは、前記連結路には、当該連結路と系外部とを連結する細管が設けられており、反応液の往復時において、当該細管への反応液の流入を阻止しつつ、当該細管からガスを逃がす。
【００１４】
この好ましい様相では、反応槽間を繋ぐ連結路に細管が設けられている。そして、反応液の往復時において、当該細管からガスを逃がす構成を採用している。かかる構成により、反応液の移動がスムーズに行われる。
細管への反応液の流入を阻止しつつ細管からガスを逃がす構成は、例えば、ラプラス圧を利用した液体停止バルブ機構により実現することができる。当該機構は、例えば、特開２００８−６４７４８号公報、特開２００９−１２８０４９号公報、特開２００９−１６８４８７号公報に記載されている。
【００１５】
好ましくは、前記高温領域又は前記高温反応槽が維持される所定温度が９３℃〜９７℃である。
【００１６】
本様相は、高温領域又は高温反応槽で核酸の変性工程を行う態様を想定したものである。
【００１７】
好ましくは、前記低温領域又は前記低温反応槽が維持される所定温度が５５℃〜７５℃である。
【００１８】
本様相は、低温領域又は低温反応槽でアニーリング工程を行う態様を想定したものである。当該領域又は反応槽にて、アニーリング工程に加えて伸長工程を行うこともできる。
【００１９】
好ましくは、前記ガス発生剤は、アゾ又はアジド系ガス発生剤である。
【００２０】
好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。
【００２１】
好ましくは、前記ガス発生剤は、フィルム状又はテープ状である。
【００２２】
本発明の他の様相は、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応に用いられる核酸増幅用マイクロチップであって、所定温度に維持される高温反応槽と、前記高温反応槽の所定温度よりも低い所定温度に維持される低温反応槽と、前記高温反応槽と前記低温反応槽を繋ぐ連結路と、光応答性又は熱応答性のガス発生剤を有し、前記ガス発生剤から発生したガスを前記高温反応槽及び前記低温反応槽に供給可能であり、一方の反応槽に前記ガスを供給して当該反応槽内の反応液に圧力を付与し、他方の反応槽に前記反応液を移送する工程を交互に繰り返して、前記反応液を往復させることが可能であることを特徴とする核酸増幅用マイクロチップである。
【００２３】
本発明は、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応に用いられる核酸増幅用マイクロチップに係るものである。本発明のマイクロチップは、互いに異なる所定温度に維持される高温反応槽と低温反応槽を有しており、これらの反応槽の間で反応液を往復させることにより、反応液の昇温と降温を繰り返すことができる。
そして本発明のマイクロチップは、光応答性又は熱応答性のガス発生剤を有している。そして、ガス発生剤から発生したガスを高温反応槽及び低温反応槽に供給可能な構成とされており、反応槽内の反応液にガスによる圧力を付与し、反応液を移動させることができる。
本発明のマイクロチップはガス発生剤を有しているので、マイクロチップを用いた核酸増幅反応を簡単な構成で実施することができる。例えば、別途のガス発生装置等を用意する必要がなく、システム全体の小型化、ディスポーザブル化、メンテナンス性の向上を実現することができる。
【００２４】
好ましくは、前記連結路には、当該連結路と系外部とを連結する細管が設けられており、反応液の往復時において、当該細管への反応液の流入を阻止しつつ、当該細管からガスを逃がすことが可能である。
【００２５】
かかる構成により、反応液の移動がスムーズに行われる。細管への反応液の流入を阻止しつつ細管からガスを逃がす構成は、例えば、上記したラプラス圧を利用した液体停止バルブ機構により実現することができる。
【００２６】
好ましくは、前記ガス発生剤は、各反応槽ごとに独立して設けられている。
【００２７】
かかる構成により、各反応槽へのガス供給を効率的に行うことができる。
【００２８】
好ましくは、前記ガス発生剤は、アゾ又はアジド系ガス発生剤である。
【００２９】
好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。
【００３０】
好ましくは、前記ガス発生剤は、フィルム状又はテープ状である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の核酸の増幅方法によれば、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応を、より簡単な構成をもって行うことができる。特に、マイクロチップを用いる構成によれば、核酸増幅反応に必要なシステム全体の小型化、ディスポーザブル化、及びメンテナンス性の向上を実現することができる。
【００３２】
本発明の核酸増幅用マイクロチップについても同様であり、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応をより簡単な構成をもって行うことができる。さらに、システム全体の小型化、ディスポーザブル化、及びメンテナンス性の向上を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】（ａ）は本発明の第一実施形態に係るマイクロチップの反応槽を模式的に表す平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面図である。
【図２】反応槽とガス発生フィルムの構成の一例を表す断面図である。
【図３】反応槽とガス発生フィルムの構成の他の例を表す断面図である。
【図４】図１の反応槽間で反応液を往復させる方法を説明する説明図であり、（ａ）は反応液が第一反応槽に収容されている状態、（ｂ）は反応液が第一反応槽から第二反応槽に移動している状態、（ｃ）は反応液が第二反応槽に収容されている状態、（ｄ）は反応液が第二反応槽から第一反応槽に移動している状態、（ｅ）は反応液が第一反応槽に戻った状態を表す。
【図５】（ａ）は本発明の第二実施形態に係るマイクロチップの反応槽を模式的に表す平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ断面図である。
【図６】本発明の第二実施形態において、反応槽間で反応液を往復させる方法を説明する説明図であり、（ａ）は反応液が第一反応槽に収容されている状態、（ｂ）は反応液が第一反応槽から第二反応槽に移動している状態、（ｃ）は反応液が第二反応槽に収容されている状態、（ｄ）は反応液が第二反応槽から第一反応槽に移動している状態、（ｅ）は反応液が第一反応槽に戻った状態を表す。
【図７】図６（ｂ）及び図６（ｄ）の細管近傍の様子を拡大した説明図である。
【図８】本発明の第三実施形態に係るマイクロチップの反応槽を模式的に表す平面図である。
【図９】本発明の第四実施形態に係るマイクロチップの反応槽を模式的に表す平面図である。
【図１０】本発明の第二実施形態の変形例のマイクロチップの反応槽を模式的に表す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、発明の理解を容易にするために、各図面において、各部材の大きさや厚みについては一部誇張して描かれており、実際の大きさや比率等とは必ずしも一致しないことがある。また本発明がこれらの実施形態に限定されないことは当然である。
【００３５】
図１に示す本発明の第一実施形態に係るマイクロチップ（核酸増幅用マイクロチップ）１は、全体形状が板状であり、板状の基材２に保護部材３が積層された基本構造を有している。マイクロチップ１には、第一反応槽（高温領域、高温反応槽）５、第二反応槽（低温領域、低温反応槽）６、及び連結路７が形成されている。
平面視において、第一反応槽５と第二反応槽６は隣接しており、かつ連結路７によって両者が接続されている。
【００３６】
第一反応槽５と第二反応槽６は、いずれも反応液１０が導入かつ収容される密閉可能な部屋である。第一反応槽５と第二反応槽６は、基材２に形成された凹部と保護部材３とで囲まれた空間で構成されている。第一反応槽５と第二反応槽６のサイズ及び形状は、実質的に同じである。第一反応槽５と第二反応槽６の容積は、数〜数百ｍｍ3（μＬ）程度である。
第一反応槽５と第二反応槽６には、ガスを逃がすための機構（図示せず）が設けられている。当該機構は、後述する反応液１０の移動時にのみ作用するものである。
また、第一反応槽５と第二反応槽６は、いずれも外部のヒータによって加熱可能である。すなわち、外部のヒータを第一反応槽５あるいは第二反応槽６に接触させることにより、第一反応槽５と第二反応槽６を所定温度に維持することができる。
【００３７】
連結路７は、第一反応槽５と第二反応槽６とを連結する流路である。連結路７は、基材２に形成された直線状の溝と保護部材３とで囲まれた筒状の空間で構成されている。第一反応槽５と第二反応槽６とは、連結路７を介して連通している。マイクロチップ１に導入された核酸増幅用の反応液１０は、連結路７を介して第一反応槽５と第二反応槽６との間を往復可能である。
【００３８】
連結路７はいわゆるマイクロ流路で構成されている。マイクロ流路とは、流路を流れる液体に所謂マイクロ効果が発現する形状寸法に形成されている微細な流路をいう。具体的には、流路を流れる液体が、表面張力と毛細管現象との影響を強く受け、通常の寸法の流路を流れる液体とは異なる挙動を示す形状寸法に形成されている微細な流路である。マイクロ流路の内径は、一般に０．０２μｍ〜２ｍｍ程度である。
【００３９】
連結路７の壁面と反応液との親和性を最適にすると、反応液の移動がよりスムーズになる。連結路７の壁面と反応液との親和性が低いと反応液の移動が阻害されやすく、また、連結路７の壁面と反応液との親和性が高いと低いと毛細管現象により、意図しない反応液の移動が起こり好ましくない。例えば、反応液が水溶液である場合、連結路７の壁面の接触角は気温２３℃において４０〜６０°が好ましい。
【００４０】
マイクロチップ１は、さらにガス発生フィルム（ガス発生剤）８を有している。そして、ガス発生フィルム８から発生したガスが、第一反応槽５と第二反応槽６に供給可能な構成とされ、マイクロポンプが形成されている。ここでガス発生フィルム８は、光応答性又は熱応答性のガス発生剤で構成されている。そのため、ガス発生フィルム８に光や熱からなる外部刺激を与えることにより、ガスを発生させることができる。
【００４１】
ガス発生フィルム８から発生したガスを、第一反応槽５や第二反応槽６に供給可能な構成としては、例えば、図２、図３に示すものが挙げられる。なお図２、図３では第一反応槽５のみを示しているが、第二反応槽６についても全く同じ構成を採用することができる。
【００４２】
図２に示す構成では、ガス発生フィルム８が基材２の下側（裏面）に設けられている。また基材２の裏面にはガス供給口１２と、ガス供給口１２から第一反応槽５に至るガス供給用流路１３が設けられている。そしてガス発生フィルム８は、ガス供給口１２全体を塞ぐように、基材２の裏面に貼付されている。すなわち、ガス発生フィルム８の一方の面が、ガス供給用流路１３の内部に向かって露出している。
第一反応槽５にガスを供給する場合には、図２に示す状態で、例えば基材２の裏面側からガス発生フィルム８に向けて光源１６から光を照射する。または熱を与える。これによりガス発生フィルム８からガスが発生し、ガス供給口１２にガスが供給される。供給されたガスは、ガス供給用流路１３を通じて第一反応槽５内に導入される。
なお、ガス供給用流路１３の途中に逆止弁等の逆流防止手段１５が設けられている。逆流防止手段１５により、第一反応槽５からガス供給口１２に向かってガスや反応液１０が逆流することが防止される。
【００４３】
一方、図３に示す構成では、ガス発生フィルム８が第一反応槽５の上側に設けられている。詳細には、ガス発生フィルム８は基材２と保護部材３との間であって第一反応槽５に対応する位置に設けられており、第一反応槽５の天面を構成している。すなわちガス発生フィルム８の下面は、第一反応槽５の内部に向かって露出している。そのため、ガス発生フィルム８に光や熱からなる外部刺激を与えることにより、ガスを発生させ、第一反応槽５の内部にガスを供給することができる。なお、保護部材３を光透過性の材料で構成することにより、光源１６を用いてマイクロチップ１の上側から光を照射して、光をガス発生フィルム８に到達させることができる。
【００４４】
本実施形態のマイクロチップ１を用いて核酸増幅反応を行う手順について、図４（ａ）〜（ｅ）を参照しながら説明する。本実施形態はＰＣＲ法による核酸増幅反応を行うものであり、第一反応槽（高温反応槽）５で変性工程を行い、第二反応槽（低温反応槽）６でアニーリング工程と伸長工程を行う（２ステップ法）。また本実施形態では、第一反応槽５と第二反応槽６それぞれに、図２や図３に例示されるような、光応答性又は熱応答性のガス発生フィルム８を利用したガス供給機構（マイクロポンプ）が設けられている。図４（ａ）〜（ｅ）において、反応液１０にはハッチングを付している。
【００４５】
まず事前準備として、核酸増幅反応に必要な成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質等）を含む反応液１０を調製する。一方、外部のヒータを用いて、マイクロチップ１の第一反応槽５を９３℃〜９７℃、好ましくは９４℃〜９６℃、第二反応槽６を５５℃〜７５℃、好ましくは６６℃〜７０℃の各所定温度に維持しておく。
【００４６】
まず反応液１０を第一反応槽５に導入し、反応液１０の温度を昇温させる（図４（ａ））。そして、所定時間（例えば３０秒〜１分程度）そのまま置く（変性工程）。これにより、反応液１０が例えば９４℃〜９６℃の温度に晒され、鋳型ＤＮＡが変性（解離）する。
【００４７】
次に、第一反応槽５に対応するガス発生フィルム８に光を照射し、ガスを発生させる。これにより、発生したガスが第一反応槽５に供給され、反応液１０にガスによる圧力が付与される。すると、反応液１０が連結路７を通じて第二反応槽６に向かって移動を開始する（図４（ｂ））。そして、反応液１０が第二反応槽６に移送される（図４（ｃ））。
【００４８】
第二反応槽６への移送が完了すると（図４（ｃ））、反応液１０は第二反応槽６の維持温度である５５℃〜７５℃まで降温する。そのまま所定時間（例えば１〜２分間程度）置く（アニーリング工程および伸長工程）。これにより、アニーリングとそれに続くＤＮＡ合成反応が行われる。
【００４９】
次に、第二反応槽６に対応するガス発生フィルム８に光を照射し、ガスを発生させる。これにより、発生したガスが第二反応槽６に供給され、反応液１０にガスによる圧力が付与される。すると、反応液１０が連結路７を通じて第一反応槽５に向かって移動を開始する（図４（ｄ））。そして、反応液１０が第一反応槽５に移送される（図４（ｅ））。すなわち第一反応槽５に戻る。この昇温と降温の繰り返しが１サイクルとなる。
このサイクルを３０回程度繰り返すことにより、反応液１０中で核酸が増幅される。
【００５０】
続いて、本発明の第二実施形態について説明する。第二実施形態に係るマイクロチップ２１は、第一実施形態と同様に、全体形状が板状であり、板状の基材２に保護部材３が積層された基本構造を有している。そして、第一反応槽（高温領域、高温反応槽）５、第二反応槽（低温領域、低温反応槽）６、及び連結路７が形成されている。
第二実施形態に係るマイクロチップ２１では、図５に示すように、連結路７の途中に細管２２が設けられている。細管２２は、連結路７に直交する方向に分岐しており、連結路７と系外部を連結している。
【００５１】
細管２２は連結路７よりも細い。細管２２の流路面積は、連結路７を流れる液体がラプラス圧によって細管２２へ流入しない程度に形成されている。そのため細管２２により、ラプラス圧を利用した液体停止バルブ機構が働く構成となっている。すなわち、連結路７を通過する反応液１０は細管２２に流入しないが、ガスは細管２２を通じて系外部に逃げることができる。
具体的には、細管２２の流路面積は、連結路７の流路面積の１／２以下であることが好ましい。また細管２２の流路面積は、連結路７の流路面積の１／１０以上であることが好ましい。さらに具体的には、連結路７は、横断面矩形状である場合、高さ及び幅が１００μｍオーダーであってもよい。一方、細管２２は、断面矩形状である場合、高さ及び幅が１〜５０μｍ程度であってもよく、５〜２５μｍ程度であることが特に好ましい。連結路７の高さは、細管２２の高さの１〜１０倍程度であってもよく、１〜５倍程度であることが好ましい。
また、流路の横断面積に対する該横断面の辺周の比率で比較した場合、細管２２の当該比率が、連結路７の当該比率の２倍〜１０倍であることが好ましい。
細管２２が設けられている以外は、マイクロチップ１とマイクロチップ２１の構成は同じである。
【００５２】
第二実施形態のマイクロチップ２１を用いて核酸増幅反応を行う手順は、基本的に、第一実施形態のマイクロチップ１を用いる場合と同じである。
まず事前準備として、反応液１０の調製及び第一反応槽５と第二反応槽６の加熱を行っておく。
【００５３】
反応液１０を第一反応槽５に導入し、反応液１０の温度を昇温させる（図６（ａ））。そして、所定時間（例えば３０秒〜１分程度）そのまま置く（変性工程）。これにより、反応液１０が例えば９４℃〜９６℃の温度に晒され、鋳型ＤＮＡが変性（解離）する。
【００５４】
次に、第一反応槽５に対応するガス発生フィルム８に光を照射し、ガスを発生させる。これにより、反応液１０が連結路７を通じて第二反応槽６に向かって移動を開始する（図６（ｂ））。このとき、連結路７を流れる反応液１０は細管２２には流入せず、ガスのみが細管２２から逃げる。そのため、反応液１０はスムーズに移動することができる。さらに、移動の過程で反応液１０の一部が失われることはない。この過程における細管２２の近傍の様子は図７に示すとおりであり、反応液１０の気液界面が細管２２内に実質的に入り込まず、全ての反応液１０が第二反応槽６側へ移動する。
そして、反応液１０が第二反応槽６に移送される（図６（ｃ））。
【００５５】
第二反応槽６への移送が完了すると（図６（ｃ））、反応液１０は第二反応槽６の維持温度である５５℃〜７５℃まで降温する。そのまま所定時間（例えば１〜２分間程度）置く（アニーリング工程および伸長工程）。これにより、アニーリングとそれに続くＤＮＡ合成反応が行われる。
【００５６】
次に、第二反応槽６に対応するガス発生フィルム８に光を照射し、ガスを発生させる。これにより、反応液１０が連結路７を通じて第一反応槽５に向かって移動を開始する（図６（ｄ））。このときも、連結路７を流れる反応液１０は細管２２には流入せず、ガスのみが細管２２から逃げる（図７）。
そして、反応液１０が第一反応槽５に移送される（図６（ｅ））。以上が１サイクルとなる。
このサイクルを３０回程度繰り返すことにより、反応液１０中で核酸が増幅される。
【００５７】
上記した実施形態では、第一反応槽５と第二反応槽６を用いた２ステップの核酸増幅反応を行った。次に説明する第三実施形態では、第三反応槽２３をさらに設定し、３ステップの核酸増幅反応が可能な構成となっている。第三反応槽２３は、第一反応槽５や第二反応槽６とは異なる所定温度に設定される。
【００５８】
本実施形態では、図８に示すように、第一反応槽５と第二反応槽６と第三反応槽２３とが、この順番に連結路７ａ，７ｂを介して直列に連結されている。そして、第一反応槽５と第二反応槽６との間、並びに、第二反応槽６と第三反応槽２３との間で、反応液が往復可能である。第一反応槽５と第三反応槽２３との間でも、第二反応槽６を介して反応液が往復可能といえる。
第三反応槽２３の構成は、第一反応槽５や第二反応槽６の構成と同じである。例えば第三反応槽２３にも、図２，３に示すように、ガス発生フィルム８から発生したガスを供給可能である。
【００５９】
本実施形態でＰＣＲ法等の核酸増幅反応を行う場合は、例えば、第一反応槽５で変性工程（例えば９４℃〜９６℃）、第二反応槽６でアニーリング工程（例えば５５℃〜６５℃）、第三反応槽２３で伸長工程（例えば６０℃〜７５℃）を行うことができる。
【００６０】
反応液１０の移送についても、図４（ａ）〜（ｅ）に示すように行うことができる。すなわち、第一反応槽５で反応液を変性工程に供した後、第一反応槽５にガス発生フィルムから発生したガスを供給し、反応液を第二反応槽６に移送する。第二反応槽６で反応液をアニーリング工程に供した後、第二反応槽６にガス発生フィルムから発生したガスを供給し、反応液を第三反応槽２３に移送する。第三反応槽２３で反応液を伸長工程に供した後、第三反応槽２３にガス発生フィルムから発生したガスを供給し、反応液を、第二反応槽６を経由して第一反応槽５に移送する。これが１サイクルとなる。
なお、第三反応槽２３から第一反応槽５への移送時に第二反応槽６を経由することとなるが、反応液を速やかに移送させれば特に問題は生じない。
また第二反応槽６へガスを供給した場合における反応液の移動方向は、連結路７ａ，７ｂに流路の開閉機構を設けることにより、所望する方向のみに限定することができる。
【００６１】
第一反応槽５と第三反応槽２３のみに、すなわち両端の反応槽のみに、ガスを供給する構成としてもよい。この場合には、第一反応槽５にガスを供給することにより、反応液を第二反応槽６及び第三反応槽２３に移送することができる。同様に、第三反応槽２３にガスを供給することにより、反応液を第二反応槽６及び第一反応槽５に移送することができる。
【００６２】
本実施形態において第三反応槽２３は、第一反応槽５との関係では低温反応槽（低温領域）として機能し、第二反応槽６との関係では高温反応槽（高温領域）として機能する。
【００６３】
本実施形態においても、連結路７ａ，７ｂに、上記構成の細管２２を設けることができる。
【００６４】
第三実施形態の変形例として、図９に示すような構成も可能である。図９に示す第四実施形態では、第一反応槽５と第二反応槽６と第三反応槽２３とが、連結路７ａ，７ｂ，７ｃを介して環状に連結されている。そして一方向に反応液を移動させる（循環させる）ことで、上記の温度サイクルを実現する。例えば、反応液を第一反応槽５から第二反応槽６へ、第二反応槽６から第三反応槽２３へ、さらに第三反応槽２３から第一反応槽５へと一方向に流す。
本実施形態では、反応液が第一反応槽５から第二反応槽６へ移送され、さらに第三反応槽２３を経由して第一反応槽に戻ってくるから、反応液が第一反応槽５と第二反応槽６との間を往復していると言える。同様に、反応液は第二反応槽６と第三反応槽２３との間を往復しており、さらに、第一反応槽５と第三反応槽２３との間を往復していると言える。すなわち本実施形態では、反応液の往きと戻りの流路が別々となっている。
【００６５】
本実施形態においても、連結路７ａ，７ｂ，７ｃに、上記構成の細管２２を設けることができる。
【００６６】
なお、上記した各反応槽５，６，２３や連結路７，７ａ〜７ｃの形状を、角のないものとすることにより、反応液１０の移動をよりスムーズにすることができる。例えば上記した第二実施形態の場合は、図１０のような略Ｕ字型の形状であると、反応液が第一反応槽５や第二反応槽６の角部分に残ることなく、スムーズに移動できる。
【００６７】
以下、各部材を構成する材料等について説明する。
基材２は、例えば、樹脂、セラミックス、ガラス等により構成することができる。基材２を構成する樹脂としては、例えば、有機シロキサン化合物、ポリメタクリレート樹脂、環状ポリオレフィン樹脂などが挙げられる。有機シロキサン化合物の具体例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチル水素シロキサンなどが挙げられる。
【００６８】
保護部材３は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等の光透過性の材料で構成されている。
【００６９】
ガス発生フィルム（ガス発生剤）８を構成する材料の例としては、アゾ化合物、アジド化合物、ポリオキシアルキレン樹脂、などが挙げられる。
アゾ化合物の具体例としては、例えば、２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−メチルプロピル）−２−メチルプロピオンアミド］等が挙げられる。
アジド化合物としては、例えば、スルフォニルアジド基またはアジドメチル基を有する化合物が挙げられる。アジドメチル基を有する化合物の具体例としては、例えば、グリシジルアジドポリマー等が挙げられる。
さらに、国際公開第２００９／１１３５６６号に記載されているような、光酸発生剤（スルホン酸オニウム塩、ベンジルスルホン酸エステル、ハロゲン化イソシアヌレート、ビスアリールスルホニルジアゾメタン等）と酸刺激ガス発生剤（炭酸塩及び／又は重炭酸塩等）の組み合わせ、光塩基発生剤（コバルトアミン系錯体、カルバミン酸ｏ−ニトロベンジル、オキシムエステル、カルバモイルオキシイミノ基含有化合物等）と塩基増殖剤（Ｆｌｕ３、Ｆｌｕ４等）の組み合わせ、等を、ガス発生剤を構成する材料として用いることができる。
【００７０】
前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂と混合して用いることができる。好ましく用いられるバインダー樹脂の具体例としては、アクリル樹脂、グリシジルアジドポリマーなどが挙げられる。また、前記ガス発生剤は、光増感剤を含ませてもよい。好ましく用いられる光増感剤の具体例としては、ベンゾフェノン、ジエチルチオキサントン、アントラキノン、ベンゾイン、アクリジン誘導体などが挙げられる。
【００７１】
ガス発生フィルム８に光を照射するための光源の例としては、発光ダイオード（ＬＥＤ）からなる光源が挙げられる。光源の出力（ワット数）は、必要とするガス発生量や加熱時間に応じて適宜選択することができる。
【００７２】
上記した実施形態では、核酸増幅反応としてＰＣＲ法を例に説明した。しかし本発明はこれに限定されず、反応液の昇温と降温を繰り返す核酸増幅反応であれば、ＰＣＲ法以外にも適用できる。
【符号の説明】
【００７３】
１  マイクロチップ（核酸増幅用マイクロチップ）
５  第一反応槽（高温領域、高温反応槽）
６  第二反応槽（低温領域、低温反応槽）
７，７ａ〜７ｃ  連結路
８  ガス発生フィルム（ガス発生剤）
１０  反応液
２１  マイクロチップ（核酸増幅用マイクロチップ）
２２  細管
２３  第三反応槽（高温領域、高温反応槽、低温領域、低温反応槽）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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