(57)【要約】      （修正有）【課題】耐病性、耐乾性、耐塩性、光合成効率向上、及び分げつ数を増大を同時に付与する遺伝子の提供。【解決手段】（ａ）特定の核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、植物体において発現されると、該植物体に対して以下：（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大；の少なくとも１つの機能を付与するための核酸構築物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列； 
（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、
植物体において発現されると、該植物体に対して以下：（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大；の少なくとも１つの機能を付与するための核酸構築物。
【請求項２】
前記植物体に付与される機能は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大の５つすべてを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
配列番号１に示す核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
配列番号１に示す核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記核酸は単離されたものまたは天然の状態から加工されたものである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記核酸はｃＤＮＡである、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記核酸構築物は単離されたものである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項８】
さらに、プロモーター配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記プロモーター配列は、Ｎｏｓプロモーター、３５Ｓプロモーター、ユビキチンのプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに由来する、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
さらに、ターミネーター配列を含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記ターミネーター配列は、Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓのターミネーターからなる群より選択されるターミネーターに由来する、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
３５Ｓプロモーター配列およびＮｏｓターミネーター配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産するための核酸構築物を製造するための方法であって、
Ａ）
（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む核酸を提供する工程；ならびに
Ｂ）必要に応じて、プロモーターおよび／またはターミネーターを該核酸に作動可能に連結させる工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１５】
プロモーター配列をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ターミネーター配列をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸構築物を含む、植物。
【請求項１８】
前記植物が、イネ植物である、請求項１７に記載の植物。
【請求項１９】
（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の核酸構築物を提供する工程；および
ｂ）該核酸構築物を用いて植物体を形質転換する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能を植物体に付与または増強するためのキットであって、該キットは、
請求項１に記載の核酸構築物；
該核酸構築物を、該植物体に導入するための手段、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分野に関する。より詳細には、本発明は、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大を植物に付与する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大をそれぞれ付与する遺伝子は知られているが、同時にこれらを達成する遺伝子は知られていない。これについては、非特許文献１でも見られるように、達成されていないのが現実である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Petroni  K.,  et  al.,  Plant  Cell.  2012  Dec;24(12):4777-92.  doi:  10.1105/tpc.112.105734.  Epub  2012  Dec  28.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意研究開発を行った結果、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大を同時に付与する遺伝子を見出し、その遺伝子又は遺伝子産物を植物に導入することで、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大が付与または増強された植物の開発に資することを見出し、本発明を完成した（図１および２、表１を参照）。従来、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大を同時に付与する遺伝子は、知られていなかったことから、本発明は、従来技術では達成し得なかった格別な効果を奏するものである。
【０００５】
本発明は例えば以下を提供する。
【０００６】
（１）（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列； 
（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、
植物体において発現されると、該植物体に対して以下：（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大；の少なくとも１つの機能を付与するための核酸構築物。
（２）前記植物体に付与される機能は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大の５つすべてを含む、項目１に記載の核酸構築物。
（３）配列番号１に示す核酸配列を含む、項目１または２に記載の核酸構築物。
（４）配列番号１に示す核酸配列からなる、項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
（５）前記核酸は単離されたものまたは天然の状態から加工されたものである、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
（６）前記核酸はｃＤＮＡである、項目５に記載の核酸構築物。
（７）前記核酸構築物は単離されたものである、項目１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
（８）さらに、プロモーター配列を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
（９）前記プロモーター配列は、Ｎｏｓプロモーター、３５Ｓプロモーター、ユビキチンのプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに由来する、項目８に記載の核酸構築物。
（１０）さらに、ターミネーター配列を含む、項目８または９に記載の核酸構築物。
（１１）前記ターミネーター配列は、Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓのターミネーターからなる群より選択されるターミネーターに由来する、項目１０に記載の核酸構築物。
（１２）３５Ｓプロモーター配列およびＮｏｓターミネーター配列をさらに含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
（１３）（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産するための核酸構築物を製造するための方法であって、
Ａ）
（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む核酸を提供する工程；ならびに
Ｂ）必要に応じて、プロモーターおよび／またはターミネーターを該核酸に作動可能に連結させる工程
を包含する、方法。
（１４）項目１〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むベクター。
（１５）プロモーター配列をさらに含む、項目１４に記載のベクター。
（１６）ターミネーター配列をさらに含む、項目１４または１５に記載のベクター。
（１７）項目１〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物または項目１４〜１６のいずれか１項に記載のベクターを含む、植物。
（１８）前記植物が、イネ植物である、項目１７に記載の植物。
（１９）（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産する方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目１〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物または項目１４〜１６のいずれか１項に記載のベクターを提供する工程；および
ｂ）該核酸構築物を用いて植物体を形質転換する工程
を包含する、方法。
（２０）（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能を植物体に付与または増強するためのキットであって、該キットは、
項目１〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物または項目１４〜１６のいずれか１項に記載のベクター；
該核酸構築物を、該植物体に導入するための手段、
を備える、キット。
（Ａ１）（ａ）配列番号１に示す核酸配列、またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む核酸であって、該核酸は、植物体において発現されると、該植物体に対して以下：（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大；の少なくとも１つの機能を付与する、
核酸。
（Ａ２）前記植物体に付与される機能は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大の５つすべてを含む、項目Ａ１に記載の核酸。
（Ａ３）配列番号１に示す核酸配列を含む、項目Ａ１またはＡ２に記載の核酸。
（Ａ４）配列番号１に示す核酸配列からなる、項目Ａ１〜Ａ３のいずれかに記載の核酸。
（Ａ５）前記核酸は単離されたものまたは天然の状態から加工されたものである、項目Ａ１〜Ａ４のいずれかに記載の核酸。
（Ａ６）前記核酸はｃＤＮＡである、項目Ａ５に記載の核酸。
（Ａ７）項目Ａ１〜Ａ６いずれかに記載の核酸を含む、単離された核酸構築物。
（Ａ８）さらに、プロモーター配列を含む、項目Ａ７に記載の核酸構築物。
（Ａ９）前記プロモーター配列は、Ｎｏｓプロモーター、３５Ｓプロモーター、ユビキチンのプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに由来する、項目Ａ８に記載の核酸構築物。
（Ａ１０）さらに、ターミネーター配列を含む、項目Ａ７〜Ａ９のいずれかに記載の核酸構築物。
（Ａ１１）前記ターミネーター配列は、Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓのターミネーターからなる群より選択されるターミネーターに由来する、項目Ａ１０に記載の核酸構築物。
（Ａ１２）３５Ｓプロモーター配列およびＮｏｓターミネーター配列をさらに含む、項目Ａ７〜Ａ１１のいずれかに記載の核酸構築物。
（Ａ１３）（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産するための核酸構築物を製造するための方法であって、
Ａ）
（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；
（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む核酸を提供する工程；ならびに
Ｂ）必要に応じて、プロモーターおよび／またはターミネーターを外核酸に作動可能に連結させる工程
を包含する、方法。
（Ａ１４）項目Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の核酸または項目Ａ７〜Ａ１２のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
（Ａ１５）プロモーター配列をさらに含む、項目Ａ１４に記載のベクター。
（Ａ１６）ターミネーター配列をさらに含む、項目Ａ１４またはＡ１５に記載のベクター。
（Ａ１７）項目Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の核酸、項目Ａ７〜Ａ１２のいずれかに記載の核酸構築物またはＡ１４〜Ａ１６のいずれか１項に記載のベクターを含む、植物。
（Ａ１８）前記植物が、イネ植物である、項目Ａ１７に記載の植物。
（Ａ１９）（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産する方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の核酸、項目Ａ７〜Ａ１２のいずれかに記載の核酸構築物またはＡ１４〜Ａ１６のいずれか１項に記載のベクターを提供する工程；および
ｂ）該核酸を用いて植物体を形質転換する工程
を包含する、方法。
（Ａ２０）（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能を植物体に付与または増強するためのキットであって、該キットは、
項目Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の核酸、項目Ａ７〜Ａ１２のいずれかに記載の核酸構築物またはＡ１４〜Ａ１６のいずれか１項に記載のベクター；
該核酸を、該植物体に導入するための手段、
を備える、キット。
（Ａ２１）項目Ａ１〜Ａ６のいずれかに記載の核酸でコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０００７】
加えて、耐塩性や乾燥耐性などの非生物的ストレスや、光合成機能向上の機能に関わる遺伝子が、病害耐性と分げつ数の増大にも寄与し得ることは当該分野の技術水準に照らしても予想外であるといえ、本発明の遺伝子の顕著性はこの点でもさらに評価されるべきである。
【０００８】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大が同時に付与または増強された植物（例えば、作物等）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の遺伝子で形質転換したイネ（日本晴れ）を通常条件、高塩濃度条件、乾燥（干ばつ）条件で行った栽培した実験結果を示す。使用した系統は＃４および＃８であり、形質転換は、アグロバクテリウム法を用いて行った。各写真において、いずれも左からＥＶ（対照）系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃４系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃１８系統を示す。通常条件下以外の条件では、対照に比べて、ダメージの程度が低いことがわかる。バケツのイネにおいて、通常条件では、イネ育苗培養土（イセキＫＫ、愛媛）約３Ｌをバケツに加え、発芽したイネを植え、湛水状態で、１６時間・明、８時間・暗の条件下、約２６℃のグロースチャンバーで育成した。乾燥条件は、通常条件から水を排除した条件を使用し、高塩濃度は、通常条件において、２００mM  塩化ナトリウムに変更した条件を用いた。播種後28  日(4週）後に、バケツに移植し、15日間通常条件で栽培し、その後15日間通常条件を含め各条件で育成した。写真は、移植４３日後の写真である。無処理は影響なしであるが、乾燥条件および高塩濃度条件では  コントロールのEVは枯れている部分（黄褐色）が大きいことがわかる。
【図２】図２は、葉緑体の増加および光合成効率の増加を見た実験結果を示す。上段は、葉緑体の指標としてＳＰＡＤ値を調べた図を示し、下段は、光合成効率として光合成速度（μｍｏｌｍ−２ｓ−１）を調べた結果を示す。いずれも左からＥＶ（対照）系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃４系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃１８系統を示す。エラーバーは、３回の実験、各３個体、各個体３葉、一葉あたり３か所について測定し、葉を選び、その葉の３か所測定（一個体あたり合計９か所）その標準偏差を示す。図２の実験は、形質転換後２か月後のイネを用いた。ＳＰＡＤ値は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｍｅｔｅｒ  ＳＰＡＤ−５０２Ｐｌｕｓ（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。光合成速度は、Ｌｉ−６４００  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）で測定した。上段では、ＥＶ（対照）に比べ右２系統ではＳＰＡＤ値が上昇している（葉緑体が多い）ことがわかる。下段では、ＥＶ（対照）に比べ右２系統では光合成効率が上昇している（１０００ｌｕｘと５００ｌｕｘ条件下）ことがわかる。
【図３】図３はプラスミド構築およびＯｓＨＡＰ２Ｅの概略的なゲノム構造を示す。示されるのはＯｓＨＡＰ２Ｅの概略的なゲノム構造である。
【図４】図４は、プラスミドの概略的構造と、ＲＴ−ＰＣＲによるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびＯｓＨＡＰ２Ｅの発現のＰＣＲ検出を示す。（Ａ）は、プラスミドの概略的構造であり、（Ｂ）は、ＰＣＲによるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの発現実験結果、（Ｃ）は、ＯｓＨＡＰ２Ｅの発現のＲＴ−ＰＣＲ検出結果である。
【図５】図５は、イネいもち菌（Ｍ．  ｏｒｙｚａｅ）感染に対する抵抗性を示す結果である。Ｎ，日本晴：Ａ，あそみのり：Ｓ，戦捷（抵抗性品種）：ｐＢＩ１２１，トランスジェニック系統（ｐＢＩ１２１）：４および１８，トランスジェニック系統（ＨＡＰ２Ｅ）．Ｍ，モック：Ｉ，接種した。系統４及び８で病斑のサイズが他の系統より小さいので、抵抗性を示している。
【図６】図６は、イネいもち菌（Ｍ．  ｏｒｙｚａｅ）の増殖に対する病斑のサイズ（ｎ＝２０）を接種後７日目に測定した結果を示す。左から、日本晴、あそみのり、戦捷（抵抗性品種）、ｐＢＩ１２１、系統（４）、系統（８）を示す。系統４及び８で病斑のサイズが他の系統より小さいので、抵抗性品種「戦捷」と同等かそれ以上の抵抗性を示している。
【図７】図７は、イネ白葉枯れ病細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．  ｏｒｙｚａｅ）に対する抵抗性を示す。Ｎ，日本晴：Ａ，あそみのり（抵抗性品種）：Ｓ，戦捷：ｐＢＩ１２１，トランスジェニック系統（ｐＢＩ１２１）：４および１８，トランスジェニック系統（ＨＡＰ２Ｅ）．Ｍ，モック：Ｉ，接種したもの。系統４及び８で病斑のサイズが他の系統より小さいので、抵抗性を示している。
【図８】図８は、接種後８日目の病斑のサイズを示す。各品種において左が長さ、右が幅を示す。品種は、左から、日本晴、あそみのり（抵抗性品種）、戦捷、ｐＢＩ１２１、系統（４）、系統（８）を示す。系統４及び８で病斑のサイズが他の系統より小さいので、抵抗性を示している。さらに抵抗性品種「あそみのり」と同等かそれ以上の抵抗性を示している。
【図９】図９は、ＣＭＶに対する抵抗性を示す実験結果である。ＣＭＶ粒子を摂取し、接種後７日目に、接種葉より全量ＲＮＡを抽出し、ＣＭＶのプライマーをもとにしてＲＴ−ＰＣＲを実施した。その結果を示す。ＰＣＲの条件は９４℃で２分間、続いて、３０サイクルの増幅ステップ（９４℃、１分、５８℃で１分間、７２℃で１分間）であった。上から、ＣＭＶの発現、ＯｓＨＡＰ２Ｅの発現、アクチン遺伝子（Ａｃｔｉｎ）の発現、およびコントロールとしてｒＲＮＡを最下に示す。アクチン遺伝子はＲＴ−ＰＣＲ用のコントロールであり、ｒＲＮＡは鋳型に用いたＲＮＡを同量用いた指標とした。過剰発現系統＃４，５および１８の３系統を用いた。それぞれ３個体を供試した。左の４レーンはモック接種（日本晴れ、＃４，５および１８である。）である。次に、３個体ずつ過剰発現系統を日本晴れ、＃４，５および１８について示している。
【図１０】図１０は耐乾性および耐塩性についての発芽試験結果を示す。上段は、シャーレ培地におけるイネ種子の７日めの発芽状態を示し（左からコントロール、マンニトール刺激、ＮａＣｌを示す刺激の結果）、下段は発芽率を示す。１／２ＭＳ培地（通常のＭＳ培地の成分を半量にした培地）に、２００ｍＭマンニトールを加え水分含量を少なくした条件で耐乾性を２００ｍＭの塩化ナトリウムを加えて高塩濃度にした条件で耐塩性を試験した結果である。図１０下段は、発芽率について、左からコントロール、マンニトール刺激、ＮａＣｌ刺激の結果を示す。各グラフでは、左からＥＶ（コントロール）（遺伝子導入処理をしたが、導入遺伝子をもたない系統）、＃４および＃１８を示す。＃４および＃１８では、耐乾性、耐塩性が付与されたことがわかる。
【図１１】図１１は、発芽後７日目の草丈と根の長さを測定した結果を示す。各パネルにおいて、左からＥＶ（コントロール）（遺伝子導入処理をしたが、導入遺伝子をもたない系統）、＃４および＃１８を示す。左の２つのパネルは、コントロールであり、中央２つのパネルは万位トール刺激であり、右の２つのパネルはＮａＣｌ刺激を示す。各々のパネル中左側が草丈の長さ、右側が根の長さを示す。ＥＶより、＃４と１８の方が草丈、根の生育がよいことをもって耐乾性、耐塩性が付与されたと判断される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１２】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。
【００１３】
本明細書において、「ＨＡＰ２Ｅ」とは、イネで発見された遺伝子で、ＯｓＨＡＰ２Ｅ、ＯｓＮＦ−ＹＡ２とも呼ばれる。これは、「ＨＡＰ２  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＯＦ  ＣＣＡＡＴ−ＢＯＸ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＣＯＭＰＬＥＸ」（ＣＣＡＡＴボックス結合複合体のＨＡＰ２サブユニット）と呼ばれる遺伝子である。ｃＤＮＡアクセッション番号はＡＫ０７１５９５、ＡＫ０６２１３５等であるが、実施例ではＡＫ０７１５９５の情報（配列番号１、２）を用いているがこれに限定されない。これらのアクセッション番号で開示される情報については、本明細書でもこれらの情報を援用する。本明細書の目的で使用される場合は、本発明の遺伝子である「ＨＡＰ２Ｅ」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００１４】
既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。
【００１５】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。本発明において、ＨＡＰ２Ｅのフラグメントとは、タンパク質または核酸の場合、ＨＡＰ２Ｅの任意の領域を含むポリペプチドであり、本発明の目的を達成し得る限り天然のＨＡＰ２Ｅの生物学的機能を有していなくてもよい。
【００１６】
ＨＡＰ２Ｅの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＨＡＰ２Ｅの有する活性をいう。
【００１７】
ＨＡＰ２Ｅのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＨＡＰ２Ｅの有する活性をいう。
【００１８】
ここで、「ＨＡＰ２Ｅ」が有する活性とは、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、より好ましくは５つすべてをいう。
【００１９】
本明細書において「耐病性」とは、植物についていい、ある処理をしたとき（例えば遺伝子の導入）、通常の状態よりも少なくとも１つの病変に対して、抵抗性が上昇していることをいう。本発明について採用される判定方法について説明すると、病原体の接種（ここでは針による付傷接種を用いた）後に出現する病斑の大きさが、非形質転換体の感受性イネや、他の遺伝子の形質転換体イネと比較して、小さいものほど抵抗性の程度が強いと判断する。被験対象を非形質転換体の抵抗性品種と比べることもできる。この場合は既存の抵抗性品種と同等かあるいはそれ以上の強い抵抗性を示すと表現することができる。ウイルスの場合は、接種（カーボランダム粉末をふりかけ、ウイルス溶液をガラスべらでこすりつけ接種）後ウイルスＲＮＡの蓄積をＲＴ−ＰＣＲなどにより、定量することにより、同様に抵抗性付与の検定を行うことができる。その例示は、実施例に記載されている。
【００２０】
本明細書において「耐乾性」とは、植物についていい、ある処理をしたとき（例えば遺伝子の導入）、通常の状態よりも乾燥状態に対して、抵抗性が上昇していることをいう。本発明について採用される判定方法について説明すると、バケツを用い、灌水状態でイネを２８日間育成し、そのあと、水を排除し、１５日間育成する、この段階で、イネを調査し、枯死・葉枯れ・葉の湾曲などの症状の割合を調査する。非形質転換イネと比較して、これらの症状の割合が低いと耐乾性が付与されたと判断する。代替手法として、他の実験ではイネ種子を２００ｍＭマンニトール寒天培地（含まない培地より水分含量が少ない条件）上に播種し、発芽率、その後の生育状態を、マンニトールを含まない培地で育成した種子や、非形質転換体の種子と比較し、非形質転換体種子の発芽や生育状態と比較して、発芽率がより高い、生育状態がより良好であることをもって、耐乾性が付与されたと判断する。その例示は、実施例に記載されている。
【００２１】
本明細書において「耐塩性」とは、植物についていい、ある処理をしたとき（例えば遺伝子の導入）、通常の状態よりも塩濃度が高い状態に対して、抵抗性が上昇していることをいう。本発明について採用される判定方法について説明すると、バケツを用い、灌水状態でイネを３０日間育成し、そのあと、２００ｍＭ  の塩化ナトリウムを加えた水で１５日間育成する。この段階で、イネを調査し、枯死・葉枯れ・葉の湾曲などの症状の割合を調査する。非形質転換イネと比較して、これらの症状の割合が低いと耐乾性が付与されたと判断する。代替手法として、他の実験ではイネ種子を２００ｍＭ塩化ナトリウム含有寒天培地上に播種し、発芽率、その後の生育状態を、塩化ナトリウムを含まない培地で育成した種子や、非形質転換体の種子と比較し、非形質転換体種子の発芽や生育状態と比較して、発芽率がより高い、生育状態がより良好であることをもって、耐塩性が付与されたと判断する。その例示は、実施例に記載されている。
【００２２】
本明細書において「光合成効率向上」とは、植物についていい、ある処理をしたとき（例えば遺伝子の導入）、通常の状態よりも光合成の効率が上昇していることをいう。本発明について採用される判定方法について説明すると、単位面積あたりの葉緑体数をＳＰＡＤ値をもって単純に測定することが行われ、葉緑体数が多いことは、光合成効率も高いことが容易に予想できる。また、光合成効率については、ａｎ  Ｌｉ−６４００  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｌｉ−Ｃｏｒ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ，  Ｎｅｂｒａｓｋａ  ＵＳＡ）を用いて測定することができる。これらの測定値から光合成効率が、非形質転換体と比較して、値が高いと光合成効率が向上したと判断することができる。。その例示は、実施例に記載されている。
【００２３】
本明細書において「分げつ数増大」とは、植物についていい、ある処理をしたとき（例えば遺伝子の導入）、通常の状態よりも分げつ数が増加していることをいう。本発明において採用される判定方法について説明すると、イネをバケで育成し、およそ２か月後に分げつの数を目で数えることにより調査することができる。非形質転換体と比較して、分げつ数が多いと、増加したと判断できる。その例示は、実施例に記載されている。
【００２４】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００２５】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマ−をいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエ−ト結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデ−ト結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボ−スとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾ−ルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボ−スが２’−Ｏ−プロピルリボ−スで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボ−スが２’−メトキシエトキシリボ−スで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。
【００２６】
本明細書において「核酸分子」はまた、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００２７】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００２８】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００２９】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列しているが染色体外のものも遺伝形質を規定する限り遺伝子の範疇に入る。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。
【００３０】
本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」とは、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさす。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００３１】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくはイネ科植物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本発明の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
【００３２】
本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、１０、８、６、５、４、３、または２個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。１または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zolleret al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science.1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.）。欠失等がなされたポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD-Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO CO., LTD.)を使用できる。欠失等を導入した変異型ポリペプチドから、野生型と同様の活性のあるポリペプチドを選択することは、本明細書で実施例で例示されるような各種手法等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
【００３３】
本発明の一実施形態において「９０％以上」は、例えば、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositivesまたはIdentitiesとして数値化される。
【００３４】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium  citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。（１）洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる（例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、または（３）２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベーションし、次に約３７−５０℃で１×ＳＳＣでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は５０％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、５、１５、３０、６０、もしくは１２０分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubelet al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular Cloning2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford UniversityPress(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第3版、Vol.1，7.42-7.45  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関��、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本発明において使用されるポリペプチドには、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００３５】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.  J.  (1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.  J.  (1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.  (1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.  L.  et  al.  (1992).  The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.et  al.(1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.  T.  (1996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００３６】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００３７】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００３８】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC-IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST2.2.28（2013.4.2発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００３９】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエ−ト、ホスホルアミデ−ト、メチルホスホネ−ト、キラルメチルホスホネ−ト、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【００４１】
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予想される、別の種における遺伝子をいい、しばしば特定のアミノ酸配列が高度に保存されている領域が共通して見られる。このような特徴は、それらが進化的には同一祖先を有するものであり、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。対応する遺伝子は、同族遺伝子を包含する。対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある生物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその生物の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００４２】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００４３】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプタ−への結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００４４】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００４５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Kyte.  J  and  Doolittle,  R.  F.  J.  Mol.  Biol.  157(1):  105-132,  1982）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプタ−、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００４６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００４７】
タンパク質の改変においては、親水性指数もまた、考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００４８】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グル−プ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（truncated）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（allele）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（homolog）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ortholog）」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous  gene）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリ−を例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。また、システインプロテアーゼインヒビターである、ヒトのシスタチンＡと、イネのオリザシスタチンとを比較すると、標的となるプロテアーゼとの相互作用に重要と考えられる３箇所の短いアミノ酸モチ−フが保存されているだけで、他の部分のアミノ酸の共通性は非常に低い。しかし、両者はともにシスタチン遺伝子スーパーファミリーに属し、共通祖先遺伝子を持つとされていることから、単に全体的なアミノ酸の相同性に限らず、局所的に高い相同性を持つアミノ酸配列が共通して存在する場合も、オルソログたり得る。このように、オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。ＨＡＰ２Ｅについても、同様に改変体を生産することができ、これらも本発明において利用することができることが理解される。
【００５０】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Mark  Zoller  and  Michael  Smith，Methods  in  Enzymology，100,468-500（1983））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【００５１】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００５２】
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００５３】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼ−ション法などを組み合わせてもよい。
【００５４】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５５】
本明細書において、「遺伝子構築物」、「核酸構築物」または「遺伝子カセット」とは、交換可能に用いられ、遺伝子をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）と、これに必要に応じて作動可能に（すなわち、その核酸の発現を制御し得るように）連結された制御配列（例えば、プロモーター）とを含む核酸配列、ならびに、必要に応じて制御配列（例えば、プロモーター）と、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸分子をいう。このカセットまたは構築物は、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る遺伝子カセットまたは核酸構築物である。
【００５６】
そのような遺伝子構築物またはベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡなどの核酸分子を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel  F．A．et  al., （1988）、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  New  York,  NY;  Sambrook  J  et  al.,  (1987)  MolecularCloning:  A  Laboratory  Manual,  2nd Ed.  およびその第三版,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY,  別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００５７】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本発明において使用され得るベクターとしては、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができさえすれば、どのようなベクターでも使用され得る。
【００５８】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡなどの核酸分子を導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，  84，  1929（1978）］、酢酸リチウム法［J．Bacteriol．，  153,163（1983）］、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，75,  1929（1978）記載の方法が挙げられる。
【００５９】
本明細書において「ターミネーター」とは、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターとしては、ＮＯＳターミネーター、３５Ｓターミネーター等が挙げられるが、これに限定されない。本発明では、生物においてターミネーターの活性を示すものであれば、どのような配列でも使用することができる。
【００６０】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモ−タ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の中または下流にも存在し得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在するがそれに限定されず、それ以外にもプロモーターは存在する。好ましくは、本発明では、特異的に発現させるプロモーターが使用され得る。そのような特異的プロモーターとしては、貯蔵タンパク質における特異的な発現を駆動するプロモーターが好ましいがそれに限定されない。より好ましくは、本発明では、プロモーターは、３５Ｓプロモーター、トウモロコシ等のユビキチンのプロモーター等が使用され得るが、それに限定されない。
【００６１】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００６２】
本明細書において、核酸を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel  F．A．et  al., （1988），  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，  Wiley  New  York，  NY;  Sambrook  J.  et  al.,(1987)  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual，2nd  Ed.およびその3rd  ed．，  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY,  別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノ−ザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００６３】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、パ−ティクルガン（遺伝子銃）、リン酸カルシウム法、リポソ−ム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレ−ション法を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA，  84，  1929（1978）］、酢酸リチウム法［J．Bacteriol．，  153,  163（1983）］、Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA，75,   1929（1978）記載の方法が挙げられる。
【００６４】
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、遺伝子導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソ−スから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Effectene Transfection  Reagent  (cat.no.301425,Qiagen,CA),   TransFastTM  Transfection  Reagent  (E2431,Promega,WI),  TfxTM-20  Reagent(E2391,Promega,WI),   SuperFect  Transfection  Reagent  (301305,Qiagen,CA),  PolyFect  Transfection  Reagent  (301105,Qiagen,CA),   LipofectAMINE  2000   Reagent  (11668-019,  Invitrogen  corporation,   CA),   JetPEI(×4)conc.   (101-30,   Polyplus-transfection,  France)およびExGen  500(R0511,   Fermentas Inc.,   MD)などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６５】
本発明を植物において利用する場合、植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Nagel  et  al.  (1990)，  Microbiol.  Lett.,  67,  325）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物に適切な発現ベクターでエレクトロポレ−ションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをGelvinら(Gelvin  et  al.  Ed.  (1994)，  Plant  Molecular  Biology  Manual  (Kluwer  Academic  Press  Publishers)）に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、パ−ティクルガン法（Christou  et  al.  (1991)、Bio/Technology  9:957-962を参照のこと）ならびにポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）法（Datta  et  al.  (1990)，  Bio/Technology  8:  736-740を参照のこと）、エレクトロポレ−ション法（Shimamoto  et  al.(1989)、Nature、338:274-276;およびRhodesら(1989)、Science、240:204-207を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００６６】
本発明は、イネ植物において特に有用であることが示されているが、他の植物においても利用することができる。本発明において使用される分子生物学技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel  F.A.  et  al.  Ed.(1988)、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley、New  York、NY;Sambrook  J  et  al.(1987)Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual,2nd  Ed.およびその第3版,Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,Cold  Spring  Harbor,  NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【００６７】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【００６８】
形質転換を行う方法において、物理的手法には、パ−ティクルガン法、ポリエチレングリコ−ル法（ＰＥＧ法）、電子穿孔（エレクトロポレ−ション）法、マイクロインジェクション法がある。
【００６９】
本発明において、形質転換体では、目的とする核酸分子（導入遺伝子）は、染色体に導入されていても導入されていなくてもよい。好ましくは、目的とする核酸分子（導入遺伝子）は、染色体に導入されており、より好ましくは、２つの染色体の両方に導入されている。
【００７０】
本明細書において「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、イネ、タマネギ、タバコ、トマト、メロン、スイカ等が挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００７１】
本明細書において「生物体」（または、植物の場合「植物体」）とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むもの（または植物）をいい、代表的には、細胞構造、増殖（自己再生産）、成長、調節性、物質代謝、修復能力など種々の特性を有し、通常、核酸のつかさどる遺伝と、タンパク質のつかさどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、原核生物、真核生物（植物、動物など）などが包含される。好ましくは、本発明では、生物は、植物であり得る。本明細書では、好ましくは、そのような植物体は稔性であり得る。より好ましくは、そのような植物体は、種子を生産し得る。
【００７２】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子がある生物に組み込むことまたは組み込まれた生物（例えば、植物（イネ、タマネギなど）を含む）をいう。
【００７３】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本明細書に記載される１つ以上の特徴は任意に組み合わせて実施され得ることが理解される。
【００７４】
（核酸）
１つの局面において、本発明は、（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸であって、該核酸は、植物体において発現されると、該植物体に対して以下：（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大；の少なくとも１つの機能を付与する、核酸を提供する。
【００７５】
１つの実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１に示す核酸配列または配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、より好ましくは、本発明の核酸は、配列番号１に示す核酸配列からなる。
【００７６】
１つの実施形態では、本発明において、前記植物体に付与される機能は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大の少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さらに好ましくは５つすべてを含む。
【００７７】
１つの実施形態において、本発明の核酸は、天然の状態そのままのものは除外され、すなわち、単離されたものまたは天然の状態から加工されたものである。１つの実施形態では、本発明の核酸はｃＤＮＡである。
【００７８】
（核酸構築物）
他の局面において、本発明は、本発明の核酸を含む、単離された核酸構築物を提供する。本発明の核酸は、上記（核酸）の節において説明された任意の形態をとることができることが理解される。この核酸構築物は、植物体において発現されると、該植物体に対して以下：（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大；の少なくとも１つの機能、有利には少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さらに好ましくは５つすべてを付与するために用いられる。また、耐病性についてみると、菌類、細菌、およびウイルスの３種の異なる病原に対して抵抗性が付与されたことが実証されたことから、耐病性については、従来の遺伝子と比較しても顕著な効果を示すことが理解される。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明の核酸構築物は、プロモーター配列をさらに含む。例えば、このプロモーター配列としては、Ｎｏｓプロモーター、３５Ｓプロモーター、トウモロコシ等のユビキチンのプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用され得るプロモーター配列は、本発明の核酸の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節しうるものであれば、どのようなものでもよい。本発明の核酸構築物は、本発明の核酸とプロモーター配列との間にスペーサー配列を含んでいても、いなくてもよい。
【００８０】
他の実施形態において、本発明の核酸構築物は、ターミネーター配列をさらに含み得る。例えば、このターミネーター配列としては、Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓターミネーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用され得るターミネーター配列は、本発明の核酸の転写を終結しうるものであれば、どのようなものでもよい。本発明の核酸構築物は、本発明の核酸とプロモーター配列との間にスペーサー配列を含んでいても、いなくてもよい。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物は、３５Ｓプロモーター配列およびＮｏｓターミネーター配列をさらに含み得る。
【００８２】
（核酸構築物の製造方法）
別の局面において、本発明は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産するための核酸構築物を製造するための方法であって、Ａ）（ａ）配列番号１に示す核酸配列またはそれに対応するタンパク質をコードする核酸配列のフラグメントを含む、核酸配列；（ｂ）（ａ）の配列に対して１または数個の置換、付加または欠失を含む核酸配列；（ｃ）（ａ）の配列を有する核酸に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列；（ｄ）（ａ）の配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸を提供する工程；ならびにＢ）必要に応じて、プロモーターおよび／またはターミネーターを外核酸に作動可能に連結させる工程を包含する、方法を提供する。ここで核酸および核酸構築物は、上述の（核酸）および（核酸構築物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００８３】
（ベクター）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。ここで核酸および核酸構築物は、上述の（核酸）および（核酸構築物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００８４】
１つの実施形態において、本発明のベクターは、プロモーター配列をさらに含み得る。好ましくは、このプロモーター配列としては、Ｎｏｓプロモーター、３５Ｓプロモーター、トウモロコシ等のユビキチンのプロモーター等に由来する配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のベクターにおいて使用され得るプロモーター配列は、本発明の核酸の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節しうるものであれば、どのようなものでもよい。本発明のベクターは、本発明の核酸とプロモーター配列との間にスペーサー配列を含んでいても、いなくてもよい。
【００８５】
別の実施形態において、本発明のベクターは、ターミネーターをさらに含み得る。例え
ば、このターミネーター配列としては、Ｎｏｓターミネーター、３５Ｓターミネーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のベクターにおいて使用され得るターミネーター配列は、本発明の核酸の転写を終結しうるものであれば、どのようなものでもよい。本発明のベクターは、本発明の核酸とプロモーター配列との間にスペーサー配列を含んでいても、いなくてもよい。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明のベクター配列は、３５Ｓプロモーター配列およびＮｏｓターミネーター配列の両方を含み得る。ここで核酸および核酸構築物は、上述の（核酸）および（核酸構築物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００８７】
（形質転換体）
１つの局面において、本発明は、本発明の核酸または本発明の核酸構築物を含む、植物を提供する。本発明において提供される植物体は、例えば、イネ、タマネギ、タバコ、トマト、メロン、スイカ等の任意の植物のものであり得る。好ましくは、イネ、タマネギである。ここで核酸および核酸構築物は、上述の（核酸）および（核酸構築物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００８８】
（機能が付与または増強された植物体を生産する方法）
別の局面において、本発明は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能が付与または増強された植物体を生産する方法であって、該方法は、以下：ａ）本発明の核酸および／または本発明の核酸構築物を提供する工程；およびｂ）該核酸または核酸構築物を用いて植物体を形質転換する工程を包含する、方法を提供する。ここで核酸および核酸構築物は、上述の（核酸）および（核酸構築物）に記載される任意の形態が使用され得る。形質転換方法は、当該分野で公知の任意の手法を用いることができ、本明細書の他の箇所に説明されており、実施例において例示されている。形質転換体をさらに育成する方法もまた、当該分野で公知の任意の手法を用いることができ、本明細書の他の箇所に説明されており、実施例において例示されている。
【００８９】
（キット）
別の局面において、本発明は、（ｉ）耐病性；（ｉｉ）耐乾性；（ｉｉｉ）耐塩性；（ｉｖ）光合成効率向上；および（ｖ）分げつ数増大からなる群より選択される少なくとも1つの機能を植物体に付与または増強するためのキットであって、該キットは、本発明の核酸および／または本発明の核酸構築物；該核酸および／または核酸構築物を、該植物体に導入するための手段を備える、キットを提供する。
【００９０】
ここで、核酸を導入するための手段としては、任意の遺伝子導入手段が考えられ、例えば、ベクター、プラスミド、遺伝子銃を考慮することができる。このような手段としては、当該分野で公知の任意の手法を用いることができ、本明細書の他の箇所に説明されており、実施例において例示されている。
【００９１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００９２】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、物質、キットなどは、例外を除き、和光純薬、ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）などから市販されるものを用いた。
【００９４】
（実施例１：プラスミド構築および発現増加の確認）
（プラスミド構築）
本発明の実施のために、プロベナゾール  （ＰＢＺ）  誘導性遺伝子の一種であるＨＡＰ２Ｅ（配列番号１〜２）を用いたプラスミドを構築した。ＯｓＨＡＰ２Ｅの概略的なゲノム構造の構造を図３に示す。
【００９５】
（ベクターへの本遺伝子の配列導入、ＯｓＨＡＰ２Ｅ過剰発現トランスジェニック植物のプラスミド構築）
過剰発現させるため、ＰＣＲで本発明の遺伝子塩基配列（配列番号１）を増幅し、ベクターに導入した。
【００９６】
全長ＯｓＨＡＰ２Ｅをコードする９５４ｂｐのｃＤＮＡフラグメント（アクセッション番号ＡＫ０７１５９５）をイネｍＲＮＡから、それぞれＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ認識部位を含む追加の配列を有するプライマー対ＯｓＨＡＰ２Ｅ−ＯＲＦ−Ｆ−５′およびＯｓＨＡＰ２Ｅ−ＯＲＦ−Ｒ−３′を用いて増幅した。配列の情報は以下のとおりである。
ＯｓＨＡＰ２Ｅ−ＯＲＦ−Ｆ−５′：5′-CGGAATTCATGATAATGCTGTTGCAAG-3（配列番号３；ＯＲＦのＡＴＧがＥｃｏＲＩの隣である。）
ＯｓＨＡＰ２Ｅ−ＯＲＦ−Ｒ−３′：5′-CCACTAGTTCACCTCATGACGGGGAC-3′（配列番号４；ＯＲＦの終了コドンＴＧＡのマイナスＡＣＴがＳｐｅＩの隣である。）
増幅されたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｐＣＡＭＢＩＡ１３９０−３５Ｓにライゲートした。バイナリプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ−ＯｓＨＡＰ２Ｅを、９５４ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩフラグメントをｐＣＡＭＢＩＡ１３９０−３５ＳのＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ部位に導入することによって構築した。ｐＣＡＭＢＩＡ１３９０の全配列情報は、
http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1390/
から入手可能である。本実施例では、実際にはｐＣＡＭＢＩＡ１３９０のＭＣＳにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター配列を挿入した。
【００９７】
（プラスミド導入）
プラスミドのイネへの形質転換は、エレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入した。
【００９８】
上記プラスミドを、エレクトロポレーション法によってＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入した。アグロバクテリウムの系統は、ＥＨＡ１０５を用いた。このプラスミドを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムに形質転換した。エレクトロポーレーション装置はＧＥＮＥＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポー レーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌ スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。増殖させた形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＰ培地に播種して、一晩インキュベートし、この培養液と等量のグリセロールを入れてボルテックスミキサーで十分に混合し、−８０℃で使用時までストック溶液として保存した。
【００９９】
（２）アグロバクテリウムにプラスミドが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する。すなわち、アグロバクテリウムにプラスミドが導入されていることを、アルカリＳＤＳ法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
（３）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＯｓＨＡＰ２Ｅ導入イネを作出した。
【０１００】
データは示さないが、ＯｓＨＡＰ２Ｅ導入イネは、発現が増加することが確認されている。
【０１０１】
（実施例３：ＯｓＨＡＰ２Ｅを過剰発現するトランスジェニックイネの作製）
次に、本発明のＯｓＨＡＰ２Ｅを過剰発現するトランスジェニックイネを作製した。
【０１０２】
作製に使用したプラスミドの模式図を図４Ａに示す。
【０１０３】
また、ＲＴ−ＰＣＲによるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびＯｓＨＡＰ２Ｅの発現のＰＣＲ検出を図４Ｂおよび４Ｃに示す。２０のうち１０のトランスジェニック系統（２、３、４、５、６、８、９、１０、１４および１８）が、ＯｓＨＡＰ２Ｅを発現することが示された。なお、２０系統のトランスジェニックはそれぞれイネゲノムへ挿入された位置はランダムであると考えられる。
【０１０４】
（実施例４：  イネいもち病菌（M.  oryzae）感染による過剰発現系統の評価）
次に、本発明の効果を評価するため、M.  oryzae感染による過剰発現系統で評価を行った。
【０１０５】
図５に示すように、イネいもち病菌（M.  oryzae）感染に対する応答が本実施例では試験された。図５では、それぞれ、Ｎは日本晴を示し、Ａはあそみのりを示し、Ｓは戦捷を示し、ｐＢＩ１２１はトランスジェニック系統（ｐＢＩ１２１）を示し、４および１８はトランスジェニック系統（ＨＡＰ２Ｅ）を示し、Ｍはモックを示し、Ｉは接種した系統を示す。ＯｓＨＡＰ２Ｅを過剰発現するトランスジェニック系統を産生したことが確認された。
【０１０６】
本実施例では、Ｔ１植物を使用した。この植物は、形態的に非形質転換体となんら相違は見られなかった。
【０１０７】
また、図６に示すように、イネいもち病菌（M.  oryzae）による病斑サイズ  (n  =  20)を接種後7日目に測定した。図５に示すように、トランスジェニック系統  4  および18  におけるイネいもち病菌（M.  oryzae）病斑の長さおよび幅は有意に減少した。すなわち、これらの系統は、イネいもち病菌（M.  oryzae）による症状のレベルが著しく減少した。
【０１０８】
（実施例５：イネ白葉枯れ病細菌（X.  oryzae  pv.  oryzae）感染による過剰発現系統の評価）
次に、イネ白葉枯れ病細菌（X.  oryzae  pv.  oryzae）感染による過剰発現系統を用いて本発明の系を評価した。図７にその結果を示す。図７にはイネ白葉枯れ病細菌（X.  oryzae  pv.  oryzae）に対する応答の結果が示されている。Ｎは日本晴を示し、Ａはあそみのりを示し、Ｓは戦捷を示し、ｐＢＩ１２１はトランスジェニック系統（ｐＢＩ１２１）を示し、４および１８はトランスジェニック系統（ＨＡＰ２Ｅ）を示し、Ｍはモックを示し、Ｉは接種したものを示す。Ｔ１植物を使用したところ、この植物は低下したレベルの病斑のサイズを示した。
【０１０９】
次に、図８に示すように、接種後８日目の病斑のサイズと幅を評価した。図１１に示すように、トランスジェニック系統４および１８におけるイネ白葉枯れ病細菌（X.  oryzae  pv.  oryzae）病斑の長さおよび幅は有意に減少した。
【０１１０】
これらの実施例の結果から、これらの結果は、ＯｓＨＡＰ２Ｅが病害抵抗性に関与することを示す。
【０１１１】
本発明者らは、トランスジェニックイネ植物を用いて、プロベナゾール誘導性遺伝子であり、ＣＣＡＡＴ結合因子の一つでもある、イネｈｅｍｅアクチベータータンパク質遺伝子（ＯｓＨＡＰ２Ｅ）の特徴付けを行った。ＯｓＨＡＰ２Ｅを過剰発現するトランスジェニック系統由来の葉にM.  griseaまたはX.  oryzae  pv.  oryzaeを接種すると、病斑サイズは、非形質転換系統またはＧＵＳトランスジェニック系統であるｐＢＩ１２１におけるものよりも著しく小さく、抵抗性の品種である戦捷またはあそみのりのそれぞれにおけるものよりもさらに小さかった。これらの結果をまとめると、ＯｓＨＡＰ２Ｅがイネいもち病菌（M.  oryzae）およびイネ白葉枯れ病細菌（X.  oryzae  pv.  oryzae）に対する病害抵抗性に関与していることが示唆された。したがって、以下の実施例において、本発明の遺伝子で形質転換したイネ（日本晴）の高塩濃度条件、乾燥条件での抵抗性の実験を進めた。
【０１１２】
（実施例６：本発明の遺伝子で形質転換したイネ（日本晴れ）の高塩濃度条件、乾燥条件での抵抗性）
次に、上述の実施例で作製した、本発明の遺伝子で形質転換したイネ（日本晴）を通常条件、高塩濃度条件、乾燥条件で行った栽培した実験を行った。
【０１１３】
使用した系統は＃４および＃１８であり、形質転換は、アグロバクテリウム法を用いて行った。
【０１１４】
（育成条件）
バケツのイネにおいて、通常条件はイネ育苗培養土（イセキＫＫ、愛媛）３Ｌをバケツに加え、発芽したイネを植え、湛水状態で、１６時間・明、８時間・暗の条件下グロースチャンバーで育成した。であり、乾燥条件は、通常条件から水を排除した条件を使用し、高塩濃度は、通常条件において、２００ｍＭ塩化ナトリウムに変更した条件を用いた。播種後２８日（４週）後に、バケツに移植し、１５日間通常条件で栽培し、その後１５日間通常条件を含め各条件で育成した。
【０１１５】
（結果）
結果を図１に示す。各写真において、いずれも左からＥＶ（対照）系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃４系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃１８系統を示す。通常条件下以外の条件では、対照に比べて、ダメージの程度が低いことがわかる。写真は、移植１５日後の写真である。無処理は影響なしであるが、乾燥条件および高塩濃度条件ではコントロールのＥＶは枯れている部分（黄褐色）が大きいことがわかる。
【０１１６】
（実施例７：分げつ数に対する効果）
次に、本発明の遺伝子で形質転換したイネ（日本晴れ）の分げつ数への影響を確認した。
【０１１７】
分げつ数は実施例６等で示したものと同様に育成したイネをさらに通常条件、すなわち、イネ育苗培養土（イセキＫＫ、愛媛）３Ｌをバケツに加え、発芽したイネを植え、湛水状態で、１６時間・明、８時間・暗の条件下、約２６℃のグロースチャンバーで育成した。その後、約２か月（８週）後の個体についての調査した（３回実験、それぞれ３株使用）。結果を表１に示す。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
表１は、イネ分ゲツ数への影響を示す表である。分げつ数は育成したイネをさらに通常条件で育成し、約２か月（８週）後の個体についての調査（３回実験、それぞれ３株使用）の平均値を示す。本発明の過剰発現系統では多くなることがわかる。１５日間の処理による影響は無処理にくらべ分げつ数は減少するが、過剰発現株では減少するなりにも多い。数値は分げつ（個々の軸）の数で、本数である。括弧内の数値は対象（ＥＶ）を１．０にした場合に何倍になっているかを示した数値である。
【０１２０】
（実施例９：葉緑体の増加および光合成効率の増加）    次に、本実施例では、本発明の遺伝子で形質転換した日本晴イネを用いて、葉緑体の増加および光合成効率の増加を調べた。
【０１２１】
（手法）
形質転換の手法は、実施例１等と同様の条件を用いた。本実施例では形質転換後２か月後のイネを用いた。
【０１２２】
ＳＰＡＤ値は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｍｅｔｅｒ  ＳＰＡＤ−５０２Ｐｌｕｓ（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。光合成速度は、Ｌｉ−６４００  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）で測定した。
【０１２３】
（結果）
結果を図２に示す。上段は、葉緑体の指標としてＳＰＡＤ値を調べた図を示し、下段は、光合成効率として光合成速度（μｍｏｌｍ−２ｓ−１）を調べた結果を示す。いずれも左からＥＶ（対照）系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃４系統、ＯｓＨＡＰ２Ｅ＃１８系統を示す。エラーバーは、３回の実験、各３個体、各個体３葉、一葉あたり３か所について測定し、葉を選び、その葉の３か所測定（一個体あたり合計９か所）その標準偏差を示す。
【０１２４】
（実施例１０：ウイルス抵抗性および耐乾性、耐塩性の増加）
本実施例では、ウイルス抵抗性および耐乾性、耐塩性の増加を確認する実験を行った。
【０１２５】
（ウイルス抵抗性）
ＣＭＶに対する抵抗性をみるために、イネ葉にカーボランダムをふりかけ、ＣＭＶ粒子を含む溶液をチップで葉上に滴下し、ガラスべらでこすりつけ接種した。接種後７日目に、接種葉より全量ＲＮＡを抽出し、ＣＭＶのプライマーをもとにしてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１２６】
そのプライマー情報は以下のとおりである。
フォワード：CMV-R3-cDNA-F-5′  5′-CTGCCTCCTCGGACTTATCC-3′（配列番号５）
リバース：CMV-R3-cDNA-R-3′  5′-CTGAAACTAGCACGTTGTGC-3′（配列番号６）
ＰＣＲの条件は９４  ℃で２分間、続いて、３０サイクルの増幅ステップ  （９４  ℃、１分、５８℃で１分間、７２℃で１分間）であった。アクチン遺伝子はＲＴ−ＰＣＲ用のコントロールであり、ｒＲＮＡは鋳型に用いたＲＮＡを同量用いた指標とした。過剰発現系統＃４，５および１８の３系統を用いた。それぞれ３個体を供試した。
【０１２７】
結果を図９に示す。左の４レーンはモック（ｍｏｃｋ）接種である。これをＣＭＶの蓄積量（バンドの濃さ）はＮｂ（日本晴）がもっとも高く、過剰発現系統の３系統はいずれもＮｂより低（薄い）。ウイルスの蓄積量が少ないので、抵抗性が付与されたと判断される。
【０１２８】
（耐乾性および耐塩性についての発芽試験）
１／２ＭＳ培地（通常のＭＳ培地の成分を半量にした培地）に、２００ｍＭマンニトールを加え水分含量を少なくした条件で耐乾性を２００ｍＭの塩化ナトリウムを加えて高塩濃度にした条件で耐塩性を試験した。
【０１２９】
実験の様子（発芽状態）を図１０に示す（上段）。下段には発芽率を示す。図１０上段のシャーレは７日めの写真を示す。マンニトールやＮａＣｌでは、ｃｏｎｔｒｏｌ（ＥＶ，遺伝子導入処理をしたが、導入遺伝子をもたない系統）にくらべ＃４や＃１８では発芽率が高いので、耐乾性、耐塩性が付与されたことがわかる。
【０１３０】
また図１１には、発芽後７日目の草丈と根の長さを測定した結果を示す。各パネルにおいて、左からＥＶ（コントロール）（遺伝子導入処理をしたが、導入遺伝子をもたない系統）、＃４および＃１８を示す。左の２つのパネルは、コントロールであり、中央２つのパネルは万位トール刺激であり、右の２つのパネルはＮａＣｌ刺激を示す。各々のパネル中左側が草丈の長さ、右側が根の長さを示す。ＥＶより、＃４と１８の方が草丈、根の生育がよいことをもって耐乾性、耐塩性が付与されたと判断される。
【０１３１】
以上から、本発明の遺伝子は、ウイルス抵抗性を付与し、耐乾性、耐塩性をも付与し得ることが示される。
【０１３２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明により、耐病性・耐乾性・耐塩性・光合成効率向上・分げつ数増大が付与または増強された植物（例えば、作物等）が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号１：本発明の遺伝子HAP2Eの核酸配列全長
配列番号２：本発明の遺伝子HAP2Eのアミノ酸配列全長
配列番号３：OsHAP2E-ORF-F-5′：5′-CGGAATTCATGATAATGCTGTTGCAAG-3
配列番号４：OsHAP2E-ORF-R-3′：5′-CCACTAGTTCACCTCATGACGGGGAC-3′
配列番号５：CMV-R3-cDNA-F-5′   5′-CTGCCTCCTCGGACTTATCC-3′
配列番号６： CMV-R3-cDNA-R-3′5′-CTGAAACTAGCACGTTGTGC-3′
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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