(57)【要約】      （修正有）【課題】リジン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属の変異体作成【解決手段】アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、及びジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性より増加し、更にピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属微生物の変異体、及びそれを用いてＬ−リジンを生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン
酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性がそれぞれの
内在性活性と比較して増加した、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性と比較して
増加している、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン
酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コ
リネ型細菌群のａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａ
ｐＢ遺伝子およびｌｙｓＡ遺伝子の発現の増加によるものである、請求項１に記載のコリ
ネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のｐｙｃ遺伝子
の発現の増加によるものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記発現の増加は、前記微生物の内在性遺伝子に対応する外来対立遺伝子の１つ以上の
コピーを導入されることによるものである、請求項３または４に記載のコリネバクテリウ
ム属微生物。
【請求項６】
前記微生物は、受託番号ＫＦＣＣ１０８８１のコリネ型細菌群である、請求項５に記載
のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記ａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝
子、ｌｙｓＡ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、
２９、３０および３７のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のコリネバクテリウ
ム属微生物。
【請求項８】
前記導入は、それぞれ図２〜図６の切断地図を有するベクターをコリネ型細菌群に形質
転換することにより行われる、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記外来の対立遺伝子は、前記微生物の核ＤＮＡに挿入される、請求項５に記載のコリ
ネバクテリウム属微生物。
【請求項１０】
前記微生物は、受託番号ＫＣＣＭ１０７７０Ｐのコリネバクテリウムグルタミカム  Ｋ
ＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４である、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１１】
前記発現の増加は、各遺伝子に対する外来プロモーターの導入によってなされる、請求
項３〜１０のいずれか１項に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１２】
前記外来プロモーターは、配列番号４４〜５０のいずれかに示されるヌクレオチド配列
を有する、請求項１１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１３】
前記外来プロモーターは、配列番号４４に示されるヌクレオチド配列である、請求項１
２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１４】
前記外来プロモーターの導入は、図８〜図１３に示されるベクターの少なくとも一つを
コリネ型細菌群に導入することにより行われる、請求項１１に記載のコリネバクテリウム
属微生物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の微生物を培養する工程と、
前記微生物の細胞または細胞培養物からリジンを回収する工程段階とを含む、Ｌ−リジ
ンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アス
パラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒド
ロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopim
elate dicarboxylase）の活性が内在性活性より増加し、さらにピルビン酸カルボキシラ
ーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の変異体、並びにそれを
用いてＬ−リジンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、特にコリネバクテリウムグルタミカム(Cory
nebacterium glutamicum)は、Ｌ−アミノ酸の生産に多用されているグラム陽性の微生物
である。Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンは、動物飼料、医薬品および化粧品産業を含む種
々の産業に適用できる。これらの産業での使用に対して、Ｌ−リジンは、典型的にはコリ
ネバクテリウム属株を用いた発酵によって生成されている。
【０００３】
従来のリジン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属株およびＬ−リジン
生産方法が当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，７４６，８５５号には、ｌｙ
ｓＥ遺伝子（リジン排出キャリア遺伝子）が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子
、ｐｙｃ遺伝子およびｄａｐＢ遺伝子を含む群から選ばれた遺伝子がさらに導入されたコ
リネバクテリウム属株と、この株を培養してＬ−リジンを生産する方法が開示されている
。また、米国特許第６，２２１，６３６号には、Ｌ−リジンおよびＬ−トレオニンにより
フィードバックの阻害に実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配
列、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組み換
えＤＮＡを有するコリネ型細菌群が開示されている。
【０００４】
ところが、リジン生合成経路に関与する６種の酵素、すなわちアスパラギン酸アミノト
ランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテ
リウム属種（Corynebacterium spp.）については、開示されたことがない。また、これら
の６種酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加し
ているコリネバクテリウム属種についても開示されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、リジン生合成経路に関与する６種の酵素、すなわちアスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、お
よびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネ
バクテリウム属の株を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記６種の酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの
活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記微生物を用いてＬ−リジンを生産する方法を提供することに
ある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
技術的解決方法
上記目的を達成するために、本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ア
スパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピ
コリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカ
ルボキシラーゼの活性がそれぞれの内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の
株を提供する。
【０００９】
本発明の他の様相によれば、前記６種の酵素に加えて、さらにピルビン酸カルボキシラ
ーゼの活性が内在性活性より増加しているコリネバクテリウム属の株を提供する。
【００１０】
本発明の別の様相によれば、前記微生物を用いてＬ−リジンを生産する方法を提供する
。
【００１１】
本発明のコリネバクテリウム属株において、前記７種の酵素は、それらの内在性レベル
より高いレベルの活性を示す。本発明に係る前記増加した酵素の活性は、遺伝子コピー数
の増加、固有のプロモーターのより強力なプロモーターへの置換および人為的な変異によ
る酵素活性の増加を含む様々な要因に基づいている。より詳しくは、前記遺伝子コピー数
は、外来対立遺伝子の導入により、および／または内在性遺伝子の増幅によって増加でき
る。前記遺伝子プロモーターの置換の例には、下流の構造遺伝子を発現する強力な活性を
有する外来プロモーターの導入、および、内在遺伝子プロモーターでの置換によるものも
含まれる。遺伝子の増幅は、当該分野で周知の方法、例えば適切な条件の下で培養するな
どによって容易になされ得る。
【００１２】
本発明の一様相によれば、本発明のコリネ型細菌群は、その核ＤＮＡの内在性遺伝子の
ａｓｐＢ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子）、ｌｙｓＣ（
アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子）、ａｓｄ（アスパラギン酸セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）、ｄａｐＡ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼを
コードする遺伝子）、ｄａｐＢ（ジヒドロジピコリン酸リダクターゼをコードする遺伝子
）、およびｌｙｓＡ（ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）に加
えて、少なくとも１コピーのａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌ
ｙｓＡ遺伝子が存在することによって特徴付けられる。この様相の変形において、外来の
強力なプロモーターを、それぞれの構造遺伝子の開始コドンの上流に位置させることもで
きる。
【００１３】
本発明の他の様相によれば、本発明のコリネ型細菌群は、前記少なくとも１コピーのａ
ｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡ遺伝子と共に、その核Ｄ
ＮＡの内在性ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）遺伝子に加えて、少なくとも１コピ
ーのｐｙｃ遺伝子が存在することによって特徴付けられる。この様相の変形において、前
記６個それぞれの遺伝子の内在性プロモーターがそれぞれ外来の強力なプロモーターに取
り替えられると同時に、ｐｙｃ遺伝子の開始コドンの上流に外来の強力なプロモーターを
挿入する。
【００１４】
コリネバクテリウム属に属しているかぎり、前記遺伝子が導入される母株（mother str
ain）として任意のコリネ型細菌群を使用することができる。本発明に有用なコリネバク
テリウム属微生物の例には、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutami
cum)ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウムグルタミカム、コリネバクテリウムテルモ
アミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバ
クテリウムフラバム(Brevibacterium flavum)ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム
ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９、およびこ
れらに由来するＬ−アミノ酸生産の変異体または菌株、例えばコリネバクテリウムグルタ
ミカム  ＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１１００１が
含まれる。好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１である。
【００１５】
本発明のコリネバクテリウム属微生物において、ａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐ
Ａ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡおよびｐｙｃは、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２
９、３０および３７のヌクレオチド配列を有し、各々が固有のプロモーターおよび終止コ
ドンを含む。
【００１６】
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、それぞれ図２〜図６の切断地図を有するベク
ターｐＤＺ−２ａｓｐＢ、ｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄ、ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢ
、ｐＤＺ−２ｌｙｓＡおよびｐＤＺ−２ｐｙｃがコリネ型細菌群に形質転換されたもので
あってもよい。これらのベクターは、所定の順番で、または同時に導入することができる
。上述したように、外来プロモーターが前記遺伝子の開始コドンの上流にそれぞれ挿入さ
れたものであってもよい。前記微生物は、好ましくは、ａｓｐＢ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｄ
ａｐＡ、ｄａｐＢ、ｌｙｓＡおよびｐｙｃの追加のそれぞれのコピーを少なくとも１つそ
のゲノムＤＮＡ内に有している。別の実施形態或いはより好適な実施形態では、各遺伝子
の内在性プロモーターと開始コドンとの間に強力な外来プロモーターが挿入されている。
外来遺伝子のゲノムＤＮＡ内への挿入は、当該分野で周知の方法、例えば相同組み換えに
よって行われ得る。
【００１７】
受託番号ＫＣＣＭ１０７７０Ｐのコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１００
８−ＣＪ５が、本発明において特に有用である。本菌株は、コリネバクテリウムグルタミ
カム  ＫＦＣＣ−１０８８１に、それぞれ図２〜図５の切断地図を有するｐＤＺ−２ａｓ
ｐＢ、ｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄ、ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢおよびｐＤＺ−２ｌ
ｙｓＡを導入し、選択培地でその形質転換体を培養して、外来遺伝子のａｓｐＢ、ｌｙｓ
Ｃ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡをそれぞれの内因性対立遺伝子と相同組
み換えすることによって得ることができ、この株は、結果として２コピーのａｓｐＢ、ｌ
ｙｓＣ、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびｌｙｓＡをゲノムＤＮＡ内に有している。前
記菌株は、母菌株より高い効率でＬ−リジンを生産することができる。また、前記菌株に
、図６の切断地図を有するベクターｐＤＺ−２ｐｙｃをさらに導入し、ゲノムＤＮＡ内に
２コピーのｐｙｃを有するようにすることによって、Ｌ−リジンの生産効率をより高める
ことができる。
【００１８】
本発明の別の様相によれば、本発明は、個々の遺伝子について固有プロモーターと開始
コドンとの間に外来プロモーターを挿入することを含む、高収率でＬ−リジンを産生する
方法を提供する。
【００１９】
本発明の実施形態において、リジン生合成遺伝子の各プロモーターは、それぞれ外来の
強力なＣＪ７プロモーターに置換される。本発明において有用なＣＪ７プロモーターは、
コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）由来の配列番号
４４に示されるヌクレオチド配列を有する強力なプロモーターであって、本出願人によっ
て以前に開発されたものである（韓国特許第ＫＲ−０６２００９２号）。コリネバクテリ
ウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１のｌｙｓＣを発現させる場合、ＣＪ７プロモー
ターが内在性プロモーターを用いるときよりアスパラギン酸キナーゼの活性が約２倍増加
することを確認した。本明細書においては、ＣＪ７プロモーターを用いた実施例のみが提
供されているが、韓国特許第ＫＲ−０６２００９２号に開示された、コリネバクテリウム
アンモニアゲネス由来のそれぞれ配列番号４５〜５０に示されるヌクレオチド配列を有す
るＣＪ１〜ＣＪ６プロモーターが、ＣＪ７プロモーターと同一の方式でリジン生産菌株の
調製のために使用できることが理解されるべきである。よって、ＣＪ１〜ＣＪ６プロモー
ターは、ＣＪ７プロモーターと同様に、本発明に係る目的遺伝子の発現レベルを増加させ
るために有用な外来プロモーターの範囲に含まれる。
【００２０】
本発明の別の様相によれば、本発明は、本発明に係る微生物を培養して細胞内でＬ−リ
ジンを発現させるか、あるいは培地中にＬ−リジンを放出する工程と、前記細胞または培
地からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンの生産方法を提供する。
【００２１】
前記培養工程は下記にさらに詳しく説明する。
【００２２】
本発明に係るＬ−リジン生産方法における微生物については、上述したとおりである。
【００２３】
前記培養工程については、当該分野で周知の種々のプロセスの１つを使用できる。前記
コリネバクテリア属株は、例えば流加回分工程（fed batch process）または繰り返し流
加回分工程（repeated fed batch process）など、回分工程または連続工程で培養するこ
とができる。
【００２４】
培養に用いられる培地は、培養される株の要件を満たさなければならない。コリネバク
テリア属種に対する培養培地は周知である（例えば、Manual of Methods for General Ba
cteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C.,  USA, 1981）。培
養に有用な炭素源の例としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース
、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖類および炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマ
シ油、ココナッツ油などの油および脂質；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸など
の脂肪酸；グリセロール、エタノールなどのアルコール；および酢酸などの有機酸が含ま
れる。これらの物質は単独でまたは組み合わせて使用できる。本発明のバクテリアの培養
培地に有用な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、コーンスティ
ープソリッド（corn steep solid）、大豆粉、尿素、ならびに例えば硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど
の無機化合物が含まれ得る。このような窒素源は、単独でまたは組み合わせて使用するこ
とができる。培地中の窒素源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ニカリウム、
またはこれらのナトリウム含有塩を使用することができる。また、培養培地は、微生物の
成長に必要な成分として、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を必要とする。ま
た、アミノ酸およびビタミンなどの他の必要成分が培養培地に含まれる。また、これらの
成分それ自体の代わりに、その前駆体を使用することもできる。前述した成分は、培養過
程で培養物に回分式または連続式で微生物の培養物に添加できる。
【００２５】
培養物のｐＨは、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性
化合物、またはたとえばリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を用いて調整することがで
きる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加して気泡の生成を抑制す
ることができる。好気状態は、培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注
入することによって維持することができる。有機体を培養する間、培養培地は、２０℃〜
４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃の範囲で維持される。培養は、Ｌ−アミノ酸の生成量
が最大に得られるまで行い続ける。この点に関し、Ｌ−リジンの最大量を得るには、１０
〜１６０時間かかる。このアミノ酸は培養培地中に放出される場合もあるし、あるいは細
胞中にとどまる場合もある。
【００２６】
回収工程は、下記のとおり実施される。細胞または培養培地からＬ−リジンを回収する
方法は、当該分野で周知である。Ｌ−リジン回収方法の例としては、濾過、陰イオン交換
クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００２７】
有利な効果
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジ
ピコリン酸シンターゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼおよびジアミノピメリン酸デカ
ルボキシラーゼ、そしてさらにピルビン酸カルボキシラーゼの内在性活性よりも高い酵素
活性を有するので、Ｌ−リジン生産能を高収率で産生することができる。
【００２８】
よって、本発明のコリネバクテリウム属微生物の使用を特徴とする方法は、Ｌ−リジン
を高効率で生産するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子(nuclear-targeted gene)を挿入するためのベクターｐＤＺを示す図である。
【図２】図２はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ａｓｐＢを示す図である。
【図３】図３はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを示す図である。
【図４】図４はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを示す図である。
【図５】図５はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＡを示す図である。
【図６】図６はコリバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクターｐＤＺ−２ｐｙｃを示す図である。
【図７】図７はｐＤＺ−ＰＣＪ７ベクターを示す図である。
【図８】図８はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ａｓｐＢベクターを示す図である。
【図９】図９はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｌｙｓＣベクターを示す図である。
【図１０】図１０はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｄａｐＡベクターを示す図である。
【図１１】図１１はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｄａｐＢベクターを示す図である。
【図１２】図１２はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｌｙｓＡベクターを示す図である。
【図１３】図１３はｐＤＺ−ＰＣＪ７／ｐｙｃベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を例
示的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでは
ない。
【実施例】
【００３１】
［実施例１：核標的化遺伝子を挿入するためのベクター（ｐＤＺ）の構築およびこれを
用いた遺伝子の挿入］
本実施例では、大腸菌（E. coli）クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ 
Ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ ＃ Ｘ０６４０２）を
基本ベクターとして使用し、コリネバクテリウム属の染色体を運ぶための組み換えベクタ
ーｐＤＺを構築した。その製作過程は次のとおりである。
【００３２】
ｐＡＣＹＣ１７７ベクターをＡｃｕIおよびＢａｎI制限酵素で処理した後、クレノウ酵
素処理によって平滑末端化した。選別マーカーとして用いられる大腸菌由来のｌａｃＺ遺
伝子は、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の核ＤＮＡからＰＣＲによって自身のプロモーターを
含むように遺伝子増幅した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナー
ゼ処理によって５’末端のリン酸化および平滑化を行うことにより調製した。これらの２
種のＤＮＡ断片を互いにライゲーションして環状ＤＮＡ分子を得、この環状ＤＮＡ分子の
制限酵素部位ＢａｍＨＩに人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプ
ター配列を挿入し、コリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベクター
ｐＤＺを構築した。図１はコリネバクテリウム属内に核標的化遺伝子を挿入するためのベ
クターｐＤＺのマップを示す図である。
【００３３】
その後、コリネバクテリウム属の核ＤＮＡに目的の遺伝子を挿入した。このために、目
的遺伝子を連続的に２コピー含有しているｐＤＺベクターをＬ−リジン生産菌株としての
コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１にエレクトロポレーションによっ
て形質転換し（Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545による電気パルス法を
用いる）、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有した選別培地で、染色体上に目的の遺伝子
が挿入された形質転換体を相同性によってスクリーニングした。ベクターを用いた核ＤＮ
Ａへの成功的な遺伝子の挿入は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトシド）を含んだ固体培地で青色が出現することで示された。核に挿入
された１次菌株を栄養培地で振とう培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０−４か
ら１０−１０まで連続的に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。増殖し
た大部分のコロニーが青色を帯びた。低い割合の白色のコロニーを選別した。交叉(cross
over)によってゲノム内に挿入されたベクター配列がゲノムから除去されるで、これらの
２次選別された菌株はベクター配列を有していない。これらの菌株は、最終的にカナマイ
シンに対する感受性について試験し、ＰＣＲによる遺伝子構造確認過程を経て最終選定さ
れた。
【００３４】
［実施例２：変異によるリジン産生コリネバクテリウムグルタミカム（ＫＦＣＣ−１０
８８１）の調製］
リジン生合成経路に関係する複数の遺伝子が挿入された菌株は、Ｓ−（２−アミノエチ
ル）システイン（以下「ＡＥＣ」という）に対する耐性およびホモセリン漏れ(homoserin
e leaky)の特徴を有するコリネバクテリウムグルタミカム（ＫＦＣＣ−１０８８１）をベ
ースとした。
【００３５】
前記変異株ＫＦＣＣ−１０８８１は、コリネバクテリウムグルタミカム野生株（ＡＴＣ
Ｃ１３０３２）から調製した。突然変異誘発源であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」という）を細胞１０７〜１０８／ｍＬの濃度で母株
を含む培地に対して３０℃で５００μｇ／ｍＬで３０分間処理し、ＡＥＣを５ｇ／Ｌの濃
度で含有した複合プレートで成長するコロニーを選択した。前記１次変異株に対するＡＥ
Ｃ耐性度とリジン生産能を分析した後、ＮＴＧによる２次変異を誘導した。その後、形成
された複数のコロニーを、ホモセリンを添加した最小培地とホモセリンが添加されていな
い最小培地に接種(tooth picking)することにより、ホモセリンが添加されていない最小
培地で成長できないホモセリン要求性菌株（２次変異株）を分離した。このホモセリン要
求性菌株からさらにホモセリン漏れ型菌株を作製するために３次変異を誘導した。この株
は、ホモセリン１０ｍｇ／Ｌが含有された最小培地に接種することによって同定した。培
地中で成長する菌株を、リジン生産能について試験した（表１）。最終的にＡＥＣ耐性お
よびホモセリン漏れ型の特徴を有するリジン生産菌株を獲得し、これを社団法人韓国種菌
協会（Korean Federation of Culture Collection）に寄託し、寄託番号第ＫＦＣＣ−１
０８８１号を与えられた。この実施例で使用した前記最小培地と前記生産培地は下記のと
おりである。
【表１】
2015171366.tif 000002
［最小培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖  １００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆タンパク質  ２．５ｇ、コー
ンスティープソリッド(Corn Steep Solids)  ５ｇ、尿素  ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、
ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン  １００μｇ、チアミン塩酸塩  １０００μｇ
、パントテン酸カルシウム  ２０００μｇ、ニコチンアミド  ３０００μｇ、ＣａＣＯ３
３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖  １００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆タンパク質  ２．５ｇ、コー
ンスティープソリッド(Corn Steep Solids)  ５ｇ、尿素  ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、
ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン  １００μｇ、チアミン塩酸塩  １０００μｇ
、ＣａＣＯ３  ３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。
【００３６】
［実施例３：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１由来
のａｓｐＢ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ａｓｐＢ）の構築、お
よびａｓｐＢ挿入菌株の調製］
本実施例では、実施例２で調製したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦ
ＣＣ−１０８８１の核ＤＮＡを鋳型として用い、リジン生合成経路に関与するａｓｐＢ遺
伝子に対してＰＣＲを行った。米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）
のデータからａｓｐＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号  ＮＣ＿００３４５０、
Ｎｃｇｌ０２３７）を得て、これを使用して２組のプライマーを設計し、プロモーター領
域から終止コドンにわたるａｓｐＢ遺伝子を増幅させた（表２）。
【表２】
2015171366.tif 000003
【００３７】
コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、前記配
列番号１と２のオリゴヌクレオチドまたは前記配列番号３と４のオリゴヌクレオチドのセ
ットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａTM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５
３℃、３０秒；および伸長反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行
った。このようにして得たＰＣＲ産物は、１，４９３ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ
含んだ２種のａｓｐＢ遺伝子（ａｓｐＢ−ＡおよびａｓｐＢ−Ｂ）であった。ａｓｐＢ−
Ａは配列番号１と２のセットにより、ａｓｐＢ−Ｂは配列番号３と４のセットにより産生
された。このＰＣＲ産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、組換えベクターｐＣＲ−ａｓｐＢ
−ＡおよびｐＣＲ−ａｓｐＢ−Ｂを得た。これらのｐＣＲベクターを、ａｓｐＢ−Ａとａ
ｓｐＢ−Ｂの反対の末端（opposite end）に特異的な制限酵素（ａｓｐＢ−Ａ：ＳａｍＩ
＋ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｓｐＢ−Ｂ：ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＮｈｅＩ）でそれぞれ処理し、前記
ｐＣＲベクターからａｓｐＢ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクタ
ーのＥｃｏＲＶ−ＮｈｅＩ部位に３ピースライゲーション(3-piece ligation)によってク
ローニングし、ａｓｐＢの２コピーが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ
−２ａｓｐＢを製作した。図２は、コリネバクテリウム属に核標的化遺伝子を挿入するた
めのｐＤＺ−２ａｓｐＢベクターのマップである。
【００３８】
組換えベクターｐＤＺ−２ａｓｐＢを、実施例２で調製したリジン生産コリネバクテリ
ウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上でａ
ｓｐＢ遺伝子のすぐ隣に１コピーのａｓｐＢ遺伝子をさらに挿入して、２コピーのａｓｐ
Ｂ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、これをコリネバクテリウムグルタミカム  Ｋ
ＦＣＣ１０８８１−ＣＪ１と名づけた。２コピーのａｓｐＢ遺伝子が隣接して位置するこ
とは、この２コピーのａｓｐＢ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能な配列番号１
７と１８（表３）のプライマーセットを用いたＰＣＲによって最終確認した。
【表３】
2015171366.tif 000004
【００３９】
［実施例４：リジン生産コリネバクテリウムグルタミクム  ＫＦＣＣ−１０８８１由来
のｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子の構築、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄ）の
製作、およびｌｙｓＣ／ａｓｄ挿入菌株の調製］
実施例３と同様の方法で、ｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子の塩基配列の情報（ＮＣＢＩ登録番
号  ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ０２４７〜０２４８）をＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋのデ
ータから得て、これを用いて２組のプライマーを設計し、ａｓｐＢ遺伝子をプロモーター
領域から終止コドンの範囲まで増幅した（表４）。
【表４】
2015171366.tif 000005
【００４０】
コリネバクテリウムグルタミクム  ＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番
号１と２のオリゴヌクレオチドまたは配列番号３と４のオリゴヌクレオチドのセットをプ
ライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａTM高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５２℃、３
０秒；および伸長反応７２℃、３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。
【００４１】
こうして得たＰＣＲ産物は、２，８０５ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種
のｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子（ｌｙｓＣ／ａｓｄ−ＡおよびｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂ）であっ
た。ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ａは配列番号５と６のセットによって、ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂは
配列番号７と８のセットによってそれぞれ産生された。前記ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１に
クローニングして、組換えベタターｐＣＲ−ｌｙｓＣ／ａｓｄ−ＡとｐＣＲ−ｌｙｓＣ／
ａｓｄ−Ｂを得た。
【００４２】
これらのｐＣＲベクターを、ｌｙｓＣ／ａｓｄ−ＡおよびｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ｂの反
対の末端に特異的な制限酵素（ｌｙｓＣ／ａｓｄ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｍＩ、ｌｙｓＣ
／ａｓｄ−Ｂ：ＳａｍＩ＋ＰｖｕＩ）でそれぞれ処理し、前記ｐＣＲベクターからｌｙｓ
Ｃ／ａｓｄ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターのＢａｍＨＩ−
とＰｖｕＩ部位に３ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクローニングし、
２コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ｌ
ｙｓＣ／ａｓｄを得た。図３は、コリネバクテリウム属に核標的化遺伝子を挿入するため
のｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄベクターのマップである。
【００４３】
組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを、実施例３で調製したリジン生産コリネ
バクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ１に形質転換し、交叉過程を経て
核ＤＮＡ上でｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子をさ
らに挿入し、２コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子を有するリジン生産菌株を産生し、この
株をコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ２と名付けた。２コピ
ーのａｓｐＢ遺伝子が隣接して位置することは、この２コピーのａｓｐＢ遺伝子の間の連
結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（図５）を用いたＰＣＲによって最終
確認した。
【表５】
2015171366.tif 000006
【００４４】
［実施例５：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１由来
のｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／
ｄａｐＢ）の構築、およびｄａｐＡ／ｄａｐＢ挿入菌株の調製］
ｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号  ＮＣ＿００３４５０、
Ｎｃｇｌ１８９６〜１８９８）をＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋのデータから得た。ｄａｐＡ遺
伝子は、ｄａｐＢ遺伝子とオペロンを含み、それらの間には機能が解明されていないＯＲ
Ｆ（Ｎｃｇｌ１９８７）があることが確認された。この情報を用いて２組のプライマーを
設計し、ｄａｐＢプロモーターから終止コドンにおよぶｄａｐＢ−ＯＲＦ（Ｎｃｇｌ１８
９７）−ｄａｐＡ遺伝子全体を増幅した（表６）。
【表６】
2015171366.tif 000007
【００４５】
コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番
号９と１０のオリゴヌクレオチドまたは配列番号１１と１２のオリゴヌクレオチドのセッ
トをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５
２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行
った。
【００４６】
こうして得たＰＣＲ産物は、３，２１０ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２
種のｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子（ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ａ、ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂ）で
あった。ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ａは配列番号９と１０のセットによって、ｄａｐＡ／ｄａ
ｐＢ−Ｂは配列番号１１と１２のセットによってそれぞれ産生された。前記ＰＣＲ産物を
ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣ
Ｒ２．１にクローニングして、組換えベクターｐＣＲ−ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−ＡとｐＣＲ
−ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂを得た。
【００４７】
これらのｐＣＲベクターを、ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−ＡおよびｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ｂの
反対の末端に特異的である対応する制限酵素（ｄａｐＡ／ｄａｐＢ−Ａ：ＥｃｏＲＩ＋Ｓ
ａｃＩ、ｄｐａＡ／ｄａｐＢ−Ｂ：ＳａｃＩ＋ＸｈｏＩ）で処理し、前記ｐＣＲベクター
からｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターの
ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に３ピースライゲーション(3-piece ligation)によってクロー
ニングし、２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢが連続的にクローニングされた組換えベクター
ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを構築した。図４は、ｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢベク
ターのマップである。
【００４８】
組換えベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを、実施例４で調製したリジン生産コリ
ネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ２に形質転換し、交叉過程を経
て核ＤＮＡ上でｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝
子をさらに挿入して、２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子を有するリジン生産菌株を作
製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ３と名付け
た。２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子が隣接して位置することは、２コピーのｄａｐ
Ａ／ｄａｐＢ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット（表７）
を用いたＰＣＲによって最終確認した。
【表７】
2015171366.tif 000008
【００４９】
［実施例６：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１由来
のｌｙｓＡ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｌｙｓＡ）の構築、お
よびｌｙｓＡ挿入菌株の調製］
ｌｙｓＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号 ＮＣ＿００３４５０、Ｎｃｇｌ１
１３２〜１１３３）をＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋのデータから得た。ｌｙｓＡ遺伝子を分析
すると、ａｒｇＳ遺伝子（ａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡシンテターゼ）とオペロンを含んで
いた。この情報を使用して、ａｒｇＳのプロモーターから終止コドンにおよびａｒｇＳ−
ｌｙｓＡ遺伝子全体を増幅するための２組のプライマーを設計した（表８）。
【表８】
2015171366.tif 000009
【００５０】
コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番
号１３と１４のオリゴヌクレオチドまたは配列番号１５と１６のオリゴヌクレオチドのセ
ットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング
５２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、４分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し
行った。
【００５１】
こうして得たＰＣＲ産物は、３，３５９ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ２種
のａｒｇＳ／ｌｙｓＡ遺伝子（ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−ＡおよびａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂ）
であった。ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ａは配列番号１３と１４のセットによって、ａｒｇＳ／
ｌｙｓＡ−Ｂは配列番号１５と１６のセットによって、それぞれ産生された。前記ＰＣＲ
産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸菌ベクタ
ーｐＣＲ２．１にクローニングして、組換えベクターｐＣＲ−ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ａと
ｐＣＲ−ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂを得た。
【００５２】
これらのｐＣＲベクターを、ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−ＡおよびａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂの
反対の末端に特異的な対応する制限酵素（ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ａ：ＨｉｎｄＩＩＩ＋Ｎ
ｏｔＩ、ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ−Ｂ：ＮｏｔＩ＋ＸｂａＩ）で処理し、前記ｐＣＲベクター
からａｒｇＳ／ｌｙｓＡ遺伝子を分離した。これらのフラグメントを、ｐＤＺベクターの
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に３ピースライゲーションでクローニングし、２コピーの
ａｒｇＳ／ｌｙｓＡ２コピーが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２ｌ
ｙｓＡを構築した。図５は、ｐＤＺ−２ｌｙｓＡベクターのマップである。
【００５３】
組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＡを、実施例５で調製したリジン生産コリネバクテリ
ウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ３に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ
上でｌｙｓＡ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｌｙｓＡ遺伝子をさらに挿入して、２コピーの
ｌｙｓＡ遺伝子を含むリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカ
ム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４と名付けた。２コピーのｌｙｓＡ遺伝子が隣接して位置
することは、２コピーのｌｙｓＡ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマ
ーのセット（表９）を用いたＰＣＲによって最終確認した。
【表９】
2015171366.tif 000010
【００５４】
インビボでリジン生合成に関連した６種の遺伝子を有するリジン生産菌株のコリネバク
テリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４を２００６年８月２１日付けで韓国
微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０７７０Ｐを与えられた。
【００５５】
［実施例７：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１由来
のｐｙｃ遺伝子のクローニング、組み換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｙｃ）の構築、および
ｐｙｃ挿入菌株の調製］
実施例３と同様一の方法で、ｐｙｃ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿０
０３４５０、Ｎｃｇｌ０６５９）をＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋのデータから得て、これを用
いて２組のプライマーを設計し、プロモーター領域から終止コドンにおよぶｐｙｃ遺伝子
を増幅した（表１０）。
【表１０】
2015171366.tif 000011
【００５６】
コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１の核ＤＮＡを鋳型とし、配列番
号３１と３２のオリゴヌクレオチドまたは配列番号３３と３４のオリゴヌクレオチドのセ
ットをプライマーとして、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）の存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング
５２℃、３０秒；および伸長反応７２℃、４分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し
行った。こうして得たＰＣＲ産物は、３９２５ｂｐのプロモーター領域をそれぞれ含んだ
２種のｐｙｃ遺伝子（ｐｙｃ−Ａおよびｐｙｃ−Ｂ）であった。ｐｙｃ−Ａは配列番号３
１と３２のセットによって、ｐｙｃ−Ｂは配列番号３３と３４のセットによって、それぞ
れ産生された。前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして、組換えベクターｐＣＲ−
ｐｙｃ−ＡおよびｐＣＲ−ｐｙｃ−Ｂを得た。
【００５７】
これらｐＣＲベクターを、ｐｙｃ−Ａおよびｐｙｃ−Ｂの反対の末端に特異的な対応す
る制限酵素（ｐｙｃ−Ａ：ＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＶ、ｐｙｃ−Ｂ：ＥｃｏＲＶ＋ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）で処理し、前記ｐＣＲベクターからｐｙｃ遺伝子を分離した。これらのフラグメン
トを、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に３ピースライゲーションでクロ
ーニングし、２コピーのｐｙｃが連続的にクローニングされた組換えベクターｐＤＺ−２
ｐｙｃを構築した。図６は、ｐＤＺ−２ｐｙｃベクターのマップである。
【００５８】
組換えベクターｐＤＺ−２ｐｙｃを、実施例６で調製したリジン生産コリネバクテリウ
ムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４に形質転換し、交叉過程を経て核ＤＮＡ上
でｐｙｃ遺伝子のすぐ隣に１コピーのｐｙｃ遺伝子をさらに挿入して、２コピーのｐｙｃ
遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム  Ｋ
ＦＣＣ１０８８１−ＣＪ５と名付けた。２コピーのｐｙｃ遺伝子が隣接して位置すること
は、２コピーのｐｙｃ遺伝子の間の連結領域を増幅することが可能なプライマーのセット
（表１１）を用いたＰＣＲによって最終確認した。
【表１１】
2015171366.tif 000012
【００５９】
その結果、リジン生合成に関連した７種の遺伝子を有するリジン生産菌株のコリバクテ
リウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ５を獲得した。
【００６０】
［実施例８：リジン生合成遺伝子複合挿入菌株におけるリジン生産］
それぞれ実施例６と実施例７で調製した、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリア
グルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４とＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ５を、Ｌ−
リジンの生産のために、下記の方法で培養した。
【００６１】
下記の種培地２５ｍＬを含有する２４０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバク
テリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４およびＫ
ＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ５を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍにて振とう培養し
た。その後、下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコ
に、前記培養された１ｍＬの種培養液をそれぞれ接種し、３０℃で１２０時間２００ｒｐ
ｍにて振とう培養した。前記種培地と前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである
。
［種培地（ｐＨ７．０）］
グルコース  ２０ｇ、ペプトン  １０ｇ、酵母抽出物  ５ｇ、尿素  １．５ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン  １００
μｇ、チアミンＨＣｌ  １０００μｇ、パントテン酸カルシウム  ２０００μｇ、ニコチ
ンアミド  ２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７．０）］
ブドウ糖  １００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆タンパク質  ２．５ｇ、コー
ンスティープソリッド  ５ｇ、尿素  ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  
０．５ｇ、ビオチン  １００μｇ、チアミン塩酸塩  １０００μｇ、パントテン酸カルシ
ウム  ２０００μｇ、ニコチンアミド  ３０００μｇ、ＣａＣＯ３  ３０ｇ（蒸留水１Ｌ
基準）。
【００６２】
培養終了の後、ＨＰＬＣ分析を行って、これらの株によって産生されたＬ−リジンの量
を測定した。コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ１０８
８１−ＣＪ４およびＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ５の培養物中のＬ−リジンの濃度は、以下
の表１２のとおりである。
【表１２】
2015171366.tif 000013
【００６３】
表１２に示すように、６個のリジン生合成に関与する遺伝子を有するコリネバクテリウ
ムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１に比べ
てリジンの生産が約７％程度増加したことを確認した。また、６個のリジン生合成遺伝子
に加えてｐｙｃ遺伝子も有するコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１
−ＣＪ５は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１に比べてリジンの生産が約８％程度増加したこ
とを確認した。
【００６４】
［実施例９：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１由来
の３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ挿入菌株の調製］
実施例４で調製した組換えベクターｐＤＺ−２ｌｙｓＣ／ａｓｄを、実施例６で調製し
たリジン生産コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４に形質転換し
、交叉過程を経て核ＤＮＡ上で隣接する２コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子のすぐ隣に１
コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子をさらに挿入して、３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子
を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ
１０８８１−ＣＪ６と名付けた。３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子が連続して整列して
いることは、３コピーのｌｙｓＣ／ａｓｄ遺伝子のなかの連結領域を増幅することが可能
なプライマーのセット（表１３）を用いたＰＣＲによって最終確認した。
【表１３】
2015171366.tif 000014
【００６５】
リジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６のア
スパラギン酸キナーゼの活性を、Ｐｅｃｈｅｒｅ Ｊ−ＦとＣａｐｏｎｙ Ｊ−Ｐのアスパ
ラギン酸ヒドロキサメートを用いた測定法(Anal Biochem 22 : 536-539, 1968)によって
測定した結果、ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６がＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４より２．１倍
程度高い活性を持つことを確認した。
【表１４】
2015171366.tif 000015
【００６６】
［実施例１０：リジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１由
来の３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子挿入菌株の調製］
実施例５で調製した組換えベクターｐＤＺ−２ｄａｐＡ／ｄａｐＢを、実施例９で調製
したリジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ６に形質転
換し、交差過程を経て核ＤＮＡ上で隣接する２コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のすぐ
隣に１コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子をさらに挿入して、３コピーのｄａｐＡ／ｄａ
ｐＢ遺伝子を有するリジン生産菌株を作製し、この株をコリネバクテリウムグルタミカム
ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ７と名付けた。３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子が連続
して整列していることは、３コピーのｄａｐＡ／ｄａｐＢ遺伝子のなかの連結領域を増幅
することが可能なプライマーのセット（表１５）を用いたＰＣＲによって最終確認した。
【表１５】
2015171366.tif 000016
【００６７】
［実施例１１：リジン生合成に関係する複合遺伝子複合挿入菌株におけるリジン生産］
実施例１０で調製したＬ−リジン生産菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカム  
ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７を、Ｌ−リジンの生産のために、下記の方法で培養した。
【００６８】
下記の種培地２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバク
テリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４とＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７
を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、下記の生産培地２
４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに、各々の培養物１ｍＬを接種
し、３０℃で１２０時間（２００ｒｐｍ）で振とう培養した。前記種培地および前記生産
培地の組成はそれぞれ下記のとおりである。
［種培地（ｐＨ７．０）］
グルコース  ２０ｇ、ペプトン  １０ｇ、酵母抽出物  ５ｇ、尿素  １．５ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン  １００
μｇ、チアミンＨＣｌ  １０００μｇ、パントテン酸カルシウム  ２０００μｇ、ニコチ
ンアミド  ２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７.０）］
ブドウ糖  １００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆タンパク質  ２．５ｇ、コー
ンスティープソリッド  ５ｇ、尿素  ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  
０．５ｇ、ビオチン  １００μｇ、チアミン塩酸塩  １０００μｇ、パントテン酸カルシ
ウム  ２０００μｇ、ニコチンアミド  ３０００μｇ、ＣａＣＯ３  ３０ｇ（蒸留水１Ｌ
基準）。
【００６９】
培養終了の後、ＨＰＬＣ分析を行って、これらの株によって産生されたＬ−リジンの量
を測定した。コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ４とＫＦＣ
Ｃ−１０８８１−ＣＪ７の培養物中のＬ−リジンの濃度は、以下の表１６のとおりである
。
【表１６】
2015171366.tif 000017
【００７０】
表１６に示すように、３個のリジン生合成に関与する遺伝子を三重で有するコリネバク
テリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＣＪ７は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１
−ＣＪ４に比べてリジンの生産が約１１％程度増加したことを確認することができた。
【００７１】
［実施例１２：リジン生合成遺伝子についてのプロモーター置換用ベクターの構築、お
よび外来プロモーター置換の菌株の調製］
本実施例では、ｐＤＺを基本ベクターとして使用し、リジン生合成遺伝子の固有のプロ
モーターを外来の強力なＣＪ７プロモーターで置換した。ＣＪ７プロモーターは、配列番
号４４〜５０に示される塩基配列を有するコリネバクテリウムアンモニアゲネス由来の強
力なプロモーターであって、本出願人に対して許可された韓国特許第０６２００９２号に
おいて開示されている。コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１の核ｌ
ｙｓＣをＣＪ７プロモーターの存在下で発現させた場合、固有プロモーターを用いたとき
よりアスパラギン酸キナーゼの活性が約２倍程度増加することを確認した。
【００７２】
ＣＪ７プロモーターをリジン生産菌株の核ＤＮＡ上に導入するためのベクターは、以下
のとおり調製した。
【００７３】
まず、ｐＤＺベクターを制限酵素ＸｂａＩとＮｄｅＩで処理した。コリネバクテリウム
アンモニアゲネスの核ＤＮＡのＣＪ７プロモーターから増幅するＰＣＲ産物の５’末端お
よび３’末端に、それぞれＸｂａＩ部位とＮｄｅＩ部位とを挿入するように設計したプラ
イマーとして、配列番号４２および４３（表１７）を用いてＰＣＲを行った。ＣＪ７プロ
モーターＰＣＲ増幅産物をＸｂａＩとＮｄｅＩで処理した後、切断型（truncated）ｐＤ
Ｚベクターに連結することにより、菌株の核ＤＮＡ上にＣＪプロモーターを導入するため
の１次プラスミドとして機能するｐＤＺ−ＰＣＪ７を製作した（図７）。
【表１７】
2015171366.tif 000018
【００７４】
実施例２で調製したリジン生産菌株のコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０
８８１の核ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、核ＤＮＡ上に導入される遺伝子のそれぞれ
の固有のプロモーターをＣＪ７プロモーターで置換するために必要な２種のＤＮＡフラグ
メント、すなわち固有プロモーターの部分フラグメント（約３００ｂｐ）と＋２コドンか
ら下流側へ約３００ｂｐ程度のＯＲＦの一部を得た。このＰＣＲに使用したプライマーは
、固有プロモーターの部分フラグメントのＰＣＲ産物の反対の末端にＸｂａＩ部位を挿入
し、そして部分ＯＲＦのＰＣＲ産物の反対の末端にＮｄｅＩ部位が挿入されるように設計
した。これらのＰＣＲ産物をそれぞれの制限酵素で処理した。ｐＤＺ−ＰＣＪ７は、固有
プロモーターの部分フラグメントの切断型ＰＣＲ産物にライゲーションするためにＸｂａ
Ｉで消化し、次いで、部分ＯＲＦの切断型ＰＣＲ産物にライゲーションするためにＮｄｅ
Ｉで消化して、組換えプラスミドを構築した。これらはそれぞれｐＤＺ−ＰＣＪ７−ａｓ
ｐＢ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｌｙｓＣａｓｄ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｄａｐＡ、ｐＤＺ−ＰＣ
Ｊ７−ｄａｐＢ、ｐＤＺ−ＰＣＪ７−ａｒｇＳｌｙｓＡおよびｐＤＺ−ＰＣＪ７−ｐｙｃ
と命名した。これらはそれぞれ２つのＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントの間に位置するＣＪ７
プロモーターを含んでいた（図８〜図１３）。
【００７５】
前記プラスミドを、以下の標的遺伝子の組み換えのために使用した。まず、組換えベク
ターｐＤＺ−ＰＣＪ７−ａｓｐＢをリジン生産コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣ
Ｃ１０８８１に形質転換した後、交叉過程を経て、核ＤＮＡ上でａｓｐＢ遺伝子のプロモ
ーター領域にＣＪ７プロモーターが挿入された菌株を獲得した。これと同一の方法で、Ｃ
Ｊ７プロモーターがａｓｐＢ、ｌｙｓＣａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢおよびａｒｇＳｌｙ
ｓＡ遺伝子のプロモーター領域に位置する新規株ＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＪ７−５を作
製するために、他の組み換えプラスミドを形質転換した。これらのプロモーターに加えて
、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターまでＣＪ７プロモーターで置換して、ＫＦＣＣ−１０８８
１−ＰＣＪ７−６も製作した。
【００７６】
［実施例１３：リジン生合成遺伝子のための外来プロモーターを有する菌株におけるリ
ジン生産］
Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−
ＰＣＪ７−５とＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６を、Ｌ−リジンの生産のために、下
記の方法によって培養した。
【００７７】
下記の種培地２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバク
テリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０８８１ＰＣＪ７−５およ
びＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６をそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐ
ｍで振とう培養した。その後、各々の培養物１ｍＬを下記の生産培地２４ｍＬを含有する
２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃で１２０時間（２００ｒｐｍ）
で振とう培養した。前記種培地および前記生産培地の組成はそれぞれ下記のとおりである
。
［種培地（ｐＨ７．０）］
グルコース  ２０ｇ、ペプトン  １０ｇ、酵母抽出物  ５ｇ、尿素  １．５ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ビオチン  １００
μｇ、チアミンＨＣｌ  １０００μｇ、パントテン酸カルシウム  ２０００μｇ、ニコチ
ンアミド  ２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）
［生産培地（ｐＨ７.０）］
ブドウ糖  １００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４０ｇ、大豆タンパク質  ２．５ｇ、コー
ンスティープソリッド  ５ｇ、尿素  ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  
０．５ｇ、ビオチン  １００μｇ、チアミン塩酸塩  １０００μｇ、パントテン酸カルシ
ウム  ２０００μｇ、ニコチンアミド  ３０００μｇ、ＣａＣＯ３  ３０ｇ（蒸留水１Ｌ
基準）。
【００７８】
培養終了の後、ＨＰＬＣ分析を行って、これらの株によって産生されたＬ−リジンの量
を測定した。コリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１、ＫＦＣＣ−１０
８８１−ＰＣＪ７−５およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−６の培養物中のＬ−リジ
ンの濃度は、以下の表１８のとおりである。
【表１８】
2015171366.tif 000019
【００７９】
表１８に示すように、６個のリジン生合成に関与する遺伝子がそれぞれ外来ＣＪ７プロ
モーターを有するコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−
５と、前記６個の遺伝子とプロモーターに加えて、さらにｐｙｃ遺伝子とそのＣＪ７プロ
モーターを有するコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−
６は、母菌株ＫＦＣＣ−１０８８１に比べてリジンの生産がそれぞれ約１７．４％と１８
．６％増加したことを確認することができた。
【００８０】
［実施例１４：リジン生合成に関係する追加遺伝子を有し、置換された外来プロモータ
ーを有する菌株におけるリジン生合成酵素の活性］
実施例６、実施例１０および実施例１２でそれぞれ調製した、Ｌ−リジン生産菌株であ
るコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４、ＫＦＣＣ１０８８１
−ＣＪ７およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−５を、リジン生合成酵素の代表として
、酵素活性の測定が比較的容易なアスパラギン酸キナーゼとジアミノピメリン酸デカルボ
キシラーゼの活性についてアッセイした。この改変されたリジン産生菌株は、アスパラギ
ン酸キナーゼの活性はＰｅｃｈｅｒｅ Ｊ−ＦとＣａｐｏｎｙ Ｊ−Ｐの測定法(Anal Bioc
hem 22:536-539, 1968)によって測定し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性
はＪ．Ｃｒｅｍｅｒなどの測定法によって測定した結果、最初の母菌株であるＫＦＣＣ１
０８８１に比べて酵素活性が増加したことを確認した（表１９）。
【表１９】
2015171366.tif 000020
【図１】
2015171366.tif 000021
【図２】
2015171366.tif 000022
【図３】
2015171366.tif 000023
【図４】
2015171366.tif 000024
【図５】
2015171366.tif 000025
【図６】
2015171366.tif 000026
【図７】
2015171366.tif 000027
【図８】
2015171366.tif 000028
【図９】
2015171366.tif 000029
【図１０】
2015171366.tif 000030
【図１１】
2015171366.tif 000031
【図１２】
2015171366.tif 000032
【図１３】
2015171366.tif 000033
【配列表】
2015171366000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月18日(2015.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性がそれぞれの内在性活性と比較して増加した、コリネバクテリウム属微生物であって、
前記増加した酵素の活性は、遺伝子コピー数の増加、固有のプロモーターのより強力なプロモーターへの置換または変異による活性の増加の導入によって達成される、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性と比較して増加している、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは、それぞれ、ａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｌｙｓＡ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子によってコードされ、それらは、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０および３７のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記遺伝子コピー数の増加は、外来対立遺伝子の１つ以上のコピーを導入されることによって達成され、前記外来対立遺伝子は、前記微生物の核ＤＮＡに挿入される、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記強力なプロモーターが、外来プロモーターである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物を培養する工程と、
前記微生物の細胞または細胞培養物からＬ−リジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンの生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
［実施例１４：リジン生合成に関係する追加遺伝子を有し、置換された外来プロモーターを有する菌株におけるリジン生合成酵素の活性］
実施例６、実施例１０および実施例１２でそれぞれ調製した、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４、ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ７およびＫＦＣＣ−１０８８１−ＰＣＪ７−５を、リジン生合成酵素の代表として、酵素活性の測定が比較的容易なアスパラギン酸キナーゼとジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性についてアッセイした。この改変されたリジン産生菌株は、アスパラギン酸キナーゼの活性はＰｅｃｈｅｒｅ Ｊ−ＦとＣａｐｏｎｙ Ｊ−Ｐの測定法(Anal Biochem 22:536-539, 1968)によって測定し、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの活性はＪ．Ｃｒｅｍｅｒなどの測定法によって測定した結果、最初の母菌株であるＫＦＣＣ１０８８１に比べて酵素活性が増加したことを確認した（表１９）。
【表１９】
2015171366.tif 000034
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性がそれぞれの内在性活性と比較して増加した、コリネバクテリウム属微生物。
［２］
前記微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が内在性活性と比較して増加している、上記［１］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［３］
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子およびｌｙｓＡ遺伝子の発現の増加によるものである、上記［１］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［４］
前記ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性の増加は、コリネ型細菌群のｐｙｃ遺伝子の発現の増加によるものである、上記［２］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［５］
前記発現の増加は、前記微生物の内在性遺伝子に対応する外来対立遺伝子の１つ以上のコピーを導入されることによるものである、上記［３］または［４］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［６］
前記微生物は、受託番号ＫＦＣＣ１０８８１のコリネ型細菌群である、上記［５］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［７］
前記ａｓｐＢ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｌｙｓＡ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０および３７のヌクレオチド配列を有する、上記［５］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［８］
前記導入は、それぞれ図２〜図６の切断地図を有するベクターをコリネ型細菌群に形質転換することにより行われる、上記［５］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［９］
前記外来の対立遺伝子は、前記微生物の核ＤＮＡに挿入される、上記［５］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［１０］
前記微生物は、受託番号ＫＣＣＭ１０７７０Ｐのコリネバクテリウムグルタミカム  ＫＦＣＣ１０８８１−ＣＪ４である、上記［５］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［１１］
前記発現の増加は、各遺伝子に対する外来プロモーターの導入によってなされる、上記［３］〜［１０］のいずれか１項に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［１２］
前記外来プロモーターは、配列番号４４〜５０のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する、上記［１１］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［１３］
前記外来プロモーターは、配列番号４４に示されるヌクレオチド配列である、上記［１２］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［１４］
前記外来プロモーターの導入は、図８〜図１３に示されるベクターの少なくとも一つをコリネ型細菌群に導入することにより行われる、上記［１１］に記載のコリネバクテリウム属微生物。
［１５］
上記［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の微生物を培養する工程と、
前記微生物の細胞または細胞培養物からリジンを回収する工程とを含む、Ｌ−リジンの生産方法。