(57)【要約】【課題】新規な血管平滑筋細胞増殖抑制剤を提供すること。【解決手段】血管平滑筋細胞増殖抑制剤に、その有効成分として味噌抽出物を含有せしめる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
味噌抽出物を有効成分として含有する血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
前記味噌抽出物が、味噌抽出液を分画分子量３ｋＤａ未満の濾過膜で濾過して得られる分子量３ｋＤａ未満の画分である、請求項１に記載の血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管平滑筋細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本食文化の代表である味噌は、元来、寺院や貴族階級に珍重されるほど贅沢品で貴重な食品であり、味噌汁として調理されることよりも、おかずや薬として利用されていた。鎌倉時代に「一汁一菜」という武士の食事習慣が確立し、味噌汁の形で食することが流行してから、今では日本人の食生活には欠かせない必需品となっている。
【０００３】
味噌の主な原料は大豆で、これに麹や塩を混ぜ合わせ、発酵させることによって栄養が豊富となり、大豆タンパク質が消化しやすく、また、旨みの元であるアミノ酸が多量に遊離している。その他にも、サポニン、イソフラボン、酵素、ビタミン、カリウム、繊維質等の数多くの栄養素が含まれており、健康維持や生活習慣病予防への効果が期待されている。一方、含有される食塩に対する懸念から、味噌の及ぼす健康効果について過少評価されてきたきらいがある。味噌には食塩以外にも多くの栄養素が含まれ、これらによる消化管での食塩吸収の抑制、血管拡張、内皮細胞保護効果等も期待され、食塩による影響以上に血管・臓器への保護効果が高いと考えられる。しかし、味噌の健康への効果については、これまで味噌の構成栄養素から推測することが多く、味噌の長期摂取が実際高血圧でみられる血管障害に保護効果を発揮し、脳・心臓・腎臓機能に有用であるか否かについては必ずしも明らかにはされていない。
【０００４】
このような状況の下、長期味噌摂取が、雄Ｄａｈｌラットにおける食塩感受性高血圧を減弱し、臓器保護作用を示すことが、本発明者によって報告されている（非特許文献１)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Uehara Y等, Nutrition 2012; 28: 924-931.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な血管平滑筋細胞増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、味噌抽出物を有効成分として含有する血管平滑筋細胞増殖抑制剤を提供する。
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の好ましい態様において、味噌抽出物は、味噌抽出液を分画分子量３ｋＤａ未満の濾過膜で濾過して得られる分子量３ｋＤａ未満の画分である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規な血管平滑筋細胞増殖抑制剤として、味噌抽出物を有効成分として含有する血管平滑筋細胞増殖抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】血管平滑筋細胞の倍加時間の測定結果を示す図である。
【図２】Ｇ０／Ｇ１期に同調した血管平滑筋細胞の増殖開始後１８時間（Ｇ０／Ｇ１〜Ｓ期）におけるＤＮＡ含量の測定結果を示す図である。
【図３】Ｇ０／Ｇ１期に同調した血管平滑筋細胞の増殖開始後１８時間（Ｇ０／Ｇ１〜Ｓ期）におけるタンパク質量の測定結果を示す図である。
【図４】Ｇ１／Ｓ期に同調した血管平滑筋細胞の増殖開始後８時間（Ｓ期）におけるＤＮＡ含量の測定結果を示す図である。
【図５】Ｇ１／Ｓ期に同調した血管平滑筋細胞の増殖開始後８時間（Ｓ期）におけるタンパク質量の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤は、味噌抽出物を有効成分として含有する。本発明において、「味噌抽出物」には、味噌抽出液、味噌抽出液の希釈液、濃縮液若しくは乾燥物、又はこれらの精製物のいずれの形態も含まれる。
【００１１】
味噌抽出物を得る際に抽出原料として使用される味噌は、食用の味噌である限り特に限定されない。味噌としては、例えば、米味噌（大豆（脱脂加工大豆を除く。以下同じ）を蒸煮したものに、米を蒸煮して麹菌を培養したもの（以下「米麹」という。）を加えたものに食塩を混合したもの）、麦味噌（大豆を蒸煮したものに、大麦又ははだか麦を蒸煮して麹菌を培養したもの（以下「麦麹」という。）を加えたものに食塩を混合したもの）、豆味噌（大豆を蒸煮して麹菌を培養したもの（以下「豆麹」という。）に食塩を混合したもの）、調合味噌（米味噌、麦味噌又は豆味噌を混合したもの、米麹に麦麹又は豆麹を混合したものを使用したもの等、米味噌、麦味噌及び豆味噌以外のもの）（以上、原料に基づく分類）、甘口味噌、辛口味噌（以上、味に基づく分類）、赤味噌、淡色味噌，白味噌（以上、色に基づく分類）等が挙げられるが、これらのうち、米味噌が好ましく、米味噌のうち辛口味噌がさらに好ましい。味噌は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて抽出原料として使用することができる。
【００１２】
味噌抽出物を得る際に抽出原料として使用される味噌は、常法に従って醸造された自家製の味噌及び市販の味噌のいずれであってもよい。
一般的な味噌の醸造方法は、米、麦等の穀類又は豆類を蒸煮したものに麹菌を添加して培養し、米麹、麦麹、豆麹等の各種麹を得る製麹工程と、大豆を蒸煮したもの（必要に応じて、米、麦等の穀類又は豆類を蒸煮したものを加えてもよい）、製麹工程で得られた各種麹、塩、水、その他の材料を所望の割合で混合して麹混合材料を得る仕込み工程と、麹混合材料を発酵・熟成させて醸造物を得る発酵・熟成工程とを含む。
【００１３】
味噌の醸造に使用される穀類としては、例えば、米、麦（例えば、大麦、裸麦、はと麦、ライ麦、小麦等）、トウモロコシ、ソバ、アワ、ヒエ等が挙げられる。豆類としては、例えば、大豆、緑豆、えんどう豆、黒豆、小豆、そら豆等が挙げられる。穀類及び豆類の品種、産地等は特に限定されない。
【００１４】
各種麹を得るために添加・培養される麹菌は、味噌の醸造に一般的に使用される麹菌である限り特に限定されない。麹菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ）等が挙げられる。麹菌は、種麹の形態で穀類及び／又は豆類を蒸煮したものに添加してもよい。麹菌を添加して培養する温度は、使用する麹菌の最適生育温度に依存するが、通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。
【００１５】
味噌の醸造に使用される塩は、食用の塩である限り特に限定されず、例えば食塩、特級塩、岩塩、並塩、白塩等が挙げられる。
【００１６】
味噌の醸造に使用されるその他の材料としては、例えば、耐塩性の酵母、耐塩性の乳酸菌等が挙げられ、これらを仕込み工程においてさらに添加・混合して、麹混合材料を調製してもよい。耐塩性の酵母としては、例えば、チゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、カンジダ・エチェルシー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）等が挙げられ、耐塩性の乳酸菌としては、例えば、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）等が挙げられる。
【００１７】
味噌の醸造に使用される各種材料（穀類、豆類、塩、その他の材料等）は、醸造すべき味噌の種類に応じて適宜調整した割合で配合することができる。例えば、麹の配合割合は、通常５割麹〜２０割麹であり、好ましくは５割麹である。塩の配合割合は、通常５重量％以上、好ましくは８〜１３重量％である。麹混合材料に含有される水分量は、全ての材料に含有される水分量を考慮して、通常３５〜５５重量％の範囲に調整される。
【００１８】
仕込み工程で得られた麹混合材料を発酵・熟成工程で発酵・熟成させることにより、醸造物、すなわち味噌が醸造される。発酵・熟成工程は、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３５℃又は４５〜６０℃で行う。発酵・熟成工程の途中で必要に応じて適宜攪拌を行ってもよい。発酵・熟成工程の期間は、熟成温度にもよるが、例えば２５〜３５℃では通常約１ヶ月〜１年、４５〜５５℃では通常約１〜７日である。
【００１９】
味噌抽出物を得る際に抽出溶媒として使用される溶媒は、好ましくは極性溶媒である。極性溶媒としては、例えば、水、極性有機溶媒、又はこれらの混合液が挙げられるが、好ましくは水である。水としては、例えば、水道水、脱イオン水、蒸留水等が挙げられ、極性有機溶媒としては、例えば、一価アルコール、多価アルコール、ケトン等が挙げられる。一価アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ペンチルアルコール、イソペンチルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール等が挙げられ、多価アルコールとしては、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールが挙げられ、ケトンとしては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等の低級脂肪族ケトンが挙げられる。これらの溶媒は、通常、室温又は溶媒の沸点以下の温度で抽出溶媒として使用される。２種以上の溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。
【００２０】
味噌抽出物を得るための抽出法は、極性溶媒に可溶な味噌成分を溶出可能である限り特に限定されず、食品から成分を分離する際に使用される通常の抽出法を使用することができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、可溶性成分を溶出した後、静置、濾過又は遠心分離により固形物を除去し、抽出液を得ることができる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜３０倍量（重量比）、好ましくは１０〜２５倍量（重量比）である。抽出溶媒として水を使用する場合、抽出温度は、通常４〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃である。遠心条件は、通常５０００〜１５０００ｇ、好ましくは８０００〜１２０００ｇで、通常５〜１５分間、好ましくは８〜１２分間である。
【００２１】
得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。味噌抽出物は、その生理活性の低下を招かない範囲で、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液−液向流分配等の方法により精製してもよい。
【００２２】
味噌抽出物は、味噌抽出液を分画分子量３ｋＤａ未満の濾過膜で濾過して得られる分子量３ｋＤａ未満の画分であることが好ましい。濾過膜としては、例えば、分子ふるい膜（限外濾過膜）、逆浸透膜等が挙げられるが、好ましくは分子ふるい膜（限外濾過膜）である。濾過は、４℃下で実施することが好ましい。
【００２３】
味噌抽出物は、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。作用成分の詳細は、現在のところ判明してないが、味噌抽出物が血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有することは後述する実施例から明らかである。
【００２４】
味噌抽出物は、そのままでも血管平滑筋細胞増殖抑制剤として使用することができるが、製剤学的に許容されるキャリアーその他の助剤を使用して、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、トローチ剤、ドリンク剤、注射剤、点滴剤、座剤等の所望の剤形に製剤化して使用することもできる。製剤化に使用される助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、増量剤、希釈剤、矯味・矯臭剤等が挙げられる。
【００２５】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の投与経路は特に限定されないが、好ましくは経口投与である。本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の投与量及び投与回数は、投与対象、投与経路等に応じて適宜調整することができる。本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の有効成分である味噌抽出物は、人体に対して無毒性であるから、その摂取量に特に制限はないが、例えば、成人に経口投与する場合には、味噌抽出物の量に換算して、１日の投与量が８〜２４ｇ／日となるよう、１日１〜３回程度投与することができる。
【００２６】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤は、細胞増殖周期のＧ０／Ｇ１期及びＳ期の延長を通じて、血管平滑筋細胞増殖を抑制することができる。但し、本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の作用機序は、Ｇ０／Ｇ１期及びＳ期の延長に限定されるわけではない。本発明において、「血管平滑筋細胞」とは、血管（主として中膜）に存在する平滑筋細胞を意味する。本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤の対象となる血管平滑筋細胞は、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳動物の血管に存在する平滑筋細胞が挙げられ、哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター等が挙げられ、血管としては、大動脈、頸動脈、冠状動脈、腎動脈、大腿動脈、四肢の末梢動脈等の動脈が挙げられる。また、本発明において、「血管平滑筋細胞増殖抑制」とは、血管平滑筋細胞の増殖が対照と比較して統計的な有意差を持って遅延することを意味する。例えば、本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤は、対照を１００％としたとき、血管平滑筋細胞の倍加時間を１３０％以上に延長することができる。血管平滑筋細胞の倍加時間の測定方法としては、例えば、血管平滑筋細胞数を計測する方法、細胞の核数を計測する方法、細胞の代謝活性（例えば、ミトコンドリアの呼吸活性）を適当な色素で検出して定量する方法、細胞内のタンパク質量又はＤＮＡ量を測定する方法等が挙げられる。これらの方法はいずれも常法に従って実施することができる。
【００２７】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制剤は、血管平滑筋細胞増殖に起因する疾患、例えば、脳卒中、虚血性心臓病、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症、その他大動脈及び中小の動脈硬化症と狭窄症の予防剤及び／又は治療剤として有効である。
【実施例】
【００２８】
１．実験方法
（１）試薬
本実施例では、以下の試薬を使用した。
・ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ社製）
・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）
・ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）
・０．２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）
・ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液（和光純薬工業社製）
・ヒドロキシウレア（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）
・ハイピュアＰＣＲテンプレートプレパレーションキット（ロッシュ社製）
・Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
【００２９】
（２）機器
血管平滑筋細胞の培養には、以下の機器を使用した。
・クリーンベンチＳＣＶクラスＩＩＡ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）
・電子着火式ガスバーナ（日本医化器械製作所社製）
・ユニット恒温槽ＳＤＮ−Ｂ（タイテック社製）
・エアージャケットタイプ  ＣＯ2／マルチガス  インキュベーター（アステック社製）
【００３０】
血管平滑筋細胞の倍加時間の測定には、以下の機器を使用した。
・培養顕微鏡ＣＫＸ４１Ｎ−３１ＰＨＰ−Ｄ（オリンパス社製）
・ＳｃｏｐｅＰａｄ−５００（ジェレックスインターナショナル社製）
・超音波ホモジナイザＫｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＣＨ−６０１０（ＰＯＬＹＴＲＯＮ社製）
【００３１】
培養平滑筋細胞からのＤＮＡの抽出には、以下の機器を使用した。
・微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０１（Ｔｏｍｙ社製）
・Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  ＵＨ−５０（エスエムテー社製）
・Ｇｅｎｉｕｓ  Ｄｒｙ  Ｂａｔｈ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ＭＤ−０１Ｎ（Ｍａｊｏｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
・ラコムテスタ−卓上型ＰＨ計ＰＨ５１０型（アズワン社製）
・ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒTM（ＩＭＰＬＥＮ社製）
【００３２】
タンパク質量の測定には、以下の機器を使用した。
・Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  ＵＨ−５０（エスエムテー社製）
・Ｖ−５２０−ＳＲ型分光光度計（日本分光社製）
【００３３】
（３）血管平滑筋細胞培養法
ペントバルビタール麻酔下に雄Ｄａｈｌ食塩感受性ラット（三協ラボサービス株式会社から購入）を開胸した後、大動脈弓部と横隔膜部を切断し、無菌的に胸部大動脈を摘出した。摘出後直ちに、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に入れ、外膜を分離し、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて十分に洗浄した。その後、外膜を分離した大動脈を１ｍｍ2の小片に切断し、１つの小片を、その内皮が下向きとなるように１０ｃｍのプレートに付着させ、半乾燥状態とした。その後、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）１０ｍＬを加え、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2の培養条件にて初代培養を行った。培養顕微鏡を用いて、平滑筋細胞の成長状態を観察し、細胞がコンフルエントな状態であることを確認した後、０．２５％トリプシン溶液を用いて、培養細胞をプレートから剥がして均等に分け、２枚のプレートに植え、初代培養と同じ培養液を用いて、継代培養を行った。
【００３４】
（４）血管平滑筋細胞（vascular smooth muscle cells：ＶＳＭＣ）の倍加時間の測定
コンフルエントな状態の４〜６継代培養細胞を６ウェルプレートに播種し（プレート当たり３×１０4個の平滑筋細胞）、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2の条件にて培養した。Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｙｃｌｉｎｇ状態のＶＳＭＣに、濾過滅菌した味噌水溶液の遠心上清（０．１ｇ／ｍＬ）１ｍＬ又はＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬを添加し、２４時間ごとに細胞をトリパンブルー染色し、血球計数盤を用いて３日間連続して細胞数を計測した。なお、味噌水溶液の遠心上清として、味噌１０ｇに約４℃の水１００ｍＬを加えて十分に撹拌した後、１０，０００ｇで１０分間遠心して得られた上清を使用し、味噌として、市販の辛口の米味噌（麹歩合：５歩，塩分：１２．５％，原料：米（国産）・塩（国産）・大豆（北米産））を使用した。
対数的増殖期にある２点において細胞の計測を行い、下記の式を用いて倍加時間（ＰＤＴ）を算出した。
倍加時間（ＰＤＴ）＝（ｔ−ｔ0）ｌｏｇ２／（ｌｏｇＮ−ｌｏｇＮ0）
なお、上記式中、Ｎ0は第１点における細胞密度の測定値を表し、Ｎは第２点における測定値を表し、ｔ0は培養開始から第１点までの時間を表し、ｔは第２点までの時間を表す。
【００３５】
（５）培養血管平滑筋細胞のＧ０／Ｇ１期同調法
Ｒａｎｄｏｍ  ｃｙｃｌｉｎｇ状態のＶＳＭＣをＧ０／Ｇ１期に同調させるために、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭを用いて３日間培養した。その後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いて細胞の増殖を再開させた。Ｇ０／Ｇ１期に同調した細胞にＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬ又は濾過滅菌した味噌水溶液の遠心上清（０．１ｇ／ｍＬ）１ｍＬを添加し、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2の培養条件にて１８時間培養した。なお、使用した味噌水溶液の遠心上清は、上記と同様である。その後、プレートから細胞を剥がし、５０００ｒｍｐで１０分間遠心して細胞を回収した。回収した細胞は、ＤＮＡ又はタンパク質の定量を行うまで−２０℃で保存した。増殖開始時のＶＳＭＣ数は、増殖開始時のＤＮＡ濃度／タンパク濃度で評価した。
【００３６】
（６）培養血管平滑筋細胞のＧ１／Ｓ期同調法
Ｒａｎｄｏｍ  ｃｙｃｌｉｎｇ状態のＶＳＭＣを５日間培養した後、１ｍＭヒドロキシウレアを添加し、さらに４８時間培養してＧ１／Ｓ期に同調させた。培養液を新鮮な培養液（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に変え、細胞増殖を再開した。Ｇ１／Ｓ期に同調した細胞にＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬ、味噌水溶液の遠心上清（０．１ｇ／ｍＬ）１ｍＬ又はそのＭＷ＜３ｋＤａ画分（０．１ｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2の培養条件にて８時間培養した後、細胞を回収してＤＮＡ又はタンパク質の定量を行うまで−２０℃で保存した。細胞数は両増殖開始時のタンパク量から評価した。なお、使用した味噌水溶液の遠心上清は、上記と同様である。また、ＭＷ＜３ｋＤａ画分として、味噌水溶液の遠心上清を分画分子量３ｋＤａ未満の分子ふるい膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ＮＭＷＬ３，０００）で濾過して得られた分子量３ｋＤａ未満（ＭＷ＜３ｋＤａ）の画分を使用した。
【００３７】
（７）ＤＮＡの精製と定量法
Ｇ０／Ｇ１期に同調した細胞及びＧ１／Ｓ期に同調した細胞に、Ｃａ+及びＭｇ+を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）０．５ｍＬを加え、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒにて３０秒間、細胞を粉砕し、細胞ホモジネート２００μＬをＤＮＡ量の測定試料とした。ハイピュアＰＣＲテンプレートプレパレーションキットを用いて、測定試料２００μＬに結合バッファー２００μＬ及びプロテイナーゼＫ４０μＬを加え、速やかに混合し、７２℃にて１０分間インキュベートした。その後、イソプロパノール１００μＬを加え、よく混合した。混合液（全量）をハイピュアフィルターチューブに加え、８０００×ｇにて１分間遠心し、通過画分（flow-through）を含む回収用チューブを捨て、新しい回収用チューブを取り付けた。次いで、阻害物質除去用バッファー（Inhibitor removal buffer）５００ｍＬを加え、８０００×ｇにて１分間遠心し、通過画分を含む回収用チューブを捨て、新しい回収用チューブを取り付けた。阻害物質を除去した後、洗浄バッファー５００μＬを加え、８０００×ｇにて１分間遠心し、通過画分を含む回収用チューブを捨て、新しい回収用チューブを取り付けた。この洗浄操作を合計２回行った。次いで、最大速度で１分間遠心した後、回収用チューブを捨て、新しい回収用チューブを取り付けた。次いで、溶出バッファー（７０℃）２００μＬを加え、８０００×ｇで１分間遠心し、細胞から抽出されたＤＮＡを回収用チューブに回収した。このチューブにエタノール（９９．５％）１０００μＬを加え、乾燥させた後、ＴＥ１０μＬに溶解し、ナノフォトメーターTMを用いて、ＤＮＡ濃度を測定した。
【００３８】
（８）培養血管平滑筋細胞タンパク質量の測定
細胞ホモジネート中のタンパク質量は、５倍に希釈した反応試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定した。標準液、測定試料、蒸留水（ブランク）をそれぞれ１００μＬとり、反応試薬５ｍＬを加え、直ちによく混ぜた。１５分間インキュベートしてから５９５ｎｍで吸光度測定を行った。検量線により、試料中のタンパク質の濃度を算出した。
【００３９】
（９）統計解析
データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡを用いて分散分析、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ（ＬＳＤ）により検定した。両側検定でｐ＜０．０５を有意とした。
【００４０】
２．結果
（１）血管平滑筋細胞の倍加時間の測定結果（図１）
Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｙｃｌｉｎｇ状態のＶＳＭＣに、味噌水溶液の遠心上清又はＤ−ＰＢＳを添加したところ、図１に示すように、味噌水溶液の遠心上清添加群（図１中「ＭＩＳＯ群」）では、Ｄ−ＰＢＳ添加群（図１中「対照群」）と比較して、細胞増殖の倍加時間が有意に増加した（４６．３±３．３時間  vs  ３５．６±３．１，p＜０．０５）。
【００４１】
（２）Ｇ０／Ｇ１期に同調したＶＳＭＣの増殖開始後１８時間（Ｇ０／Ｇ１〜Ｓ期）におけるＤＮＡ含量及びタンパク質量（図２及び図３）
図２に示すように、味噌水溶液の遠心上清添加群（図２中「ＭＩＳＯ群」）では、Ｄ−ＰＢＳ添加群（図２中「対照群」）と比較して、Ｇ０／Ｇ１期に同調したＶＳＭＣの増殖開始後１８時間（Ｇ０／Ｇ１〜Ｓ期）におけるＤＮＡ含量が有意に低下した（１５．５３４±１．４０８μｇ／ｍｇタンパク質  vs  １８．９９０±１．４２２μｇ／ｍｇタンパク質，ｐ＜０．０５）。
【００４２】
図３に示すように、味噌水溶液の遠心上清添加群（図３中「ＭＩＳＯ群」）では、Ｄ−ＰＢＳ添加群（図３中「対照群」）と比較して、Ｇ０／Ｇ１期に同調したＶＳＭＣの増殖開始後１８時間（Ｇ０／Ｇ１〜Ｓ期）におけるタンパク質量が有意に増加した（１．５３７±０．１０２任意単位  vs  １．７４７±０．０４５任意単位，ｐ＜０．０５)。なお、図３中、タンパク質量は、分裂していないＧ０／Ｇ１期のＲａｎｄｏｍ  Ｃｙｃｌｉｎｇ状態の細胞のタンパク質量を１とした場合の値である。
【００４３】
（３）Ｇ１／Ｓ期に同調したＶＳＭＣの増殖開始後８時間（Ｓ期）におけるＤＮＡ含量及びタンパク質量（図４及び図５）
図４に示すように、味噌水溶液の遠心上清添加群（図４中「ＭＩＳＯ群」）又はＭＷ＜３ｋＤａ画分添加群（図４中「ＭＷ＜３ｋＤａ群」）では、Ｄ−ＰＢＳ添加群（図４中「対照群」）と比較して、Ｇ１／Ｓ期に同調したＶＳＭＣの増殖開始後８時間（Ｓ期）におけるＤＮＡ含量が有意に低下した（９．０１３±２．８０３μｇ／ｍｇタンパク質  vs  １３．４６０±４．０６３μｇ／ｍｇタンパク質，ｐ＜０．０５；８．００４±０．６５６μｇ／ｍｇタンパク質  vs  １３．４６０±４．０６３μｇ／ｍｇタンパク質，ｐ＜０．０５）。
【００４４】
図５に示すように、Ｇ１／Ｓ期に同調したＶＳＭＣの増殖開始後８時間（Ｓ期）におけるタンパク質量については、味噌水溶液の遠心上清添加群（図５中「ＭＩＳＯ群」）、ＭＷ＜３ｋＤａ画分添加群（図５中「ＭＷ＜３ｋＤａ群」）、及びＤ−ＰＢＳ添加群（図５中「対照群」）の間で有意な変化は観察されなかった（０．９８７±０．２０３任意単位  vs  １．０１３±０．１７２任意単位  vs  ０．９９８±０．１６２任意単位）。
【００４５】
３．考察
味噌水溶液の遠心上清の添加により、血管平滑筋細胞の倍加時間が延長したことから、味噌成分中には血管平滑筋細胞の増殖を抑制する因子が存在することが示された。血管平滑筋細胞の増殖は血管壁のリモデリングと関係し、動脈硬化進展に重要な役割を果たしていることから、血管平滑筋細胞の増殖抑制は血管壁肥厚を軽減して血圧下降に関与すると考えられる。
【００４６】
Ｇ０／Ｇ１期に同調した血管平滑筋細胞への味噌水溶液の遠心上清の添加により、増殖開始後１８時間（Ｇ０／Ｇ１〜Ｓ期）における細胞内ＤＮＡ量が、Ｄ−ＰＢＳ添加群と比較して有意に低下したことから、味噌成分による血管平滑筋細胞増殖抑制作用には、Ｇ０／Ｇ１期及びＳ期の延長が関与することが示唆された。
【００４７】
Ｇ１／Ｓ期に同調した血管平滑筋細胞への味噌水溶液の遠心上清及びそのＭＷ＜３ｋＤａ分画の添加により、増殖開始後８時間（Ｓ期）における細胞内ＤＮＡ量が有意に低下したことから、味噌成分による血管平滑筋細胞増殖抑制作用には、Ｓ期の延長が関与することが示唆され、さらに、この活性因子は、味噌水溶液の遠心上清のＭＷ＜３ｋＤａ分画中に存在することが示唆された。但し、Ｇ０／Ｇ１期を延長する活性因子と、Ｓ期を延長する活性因子とが同一のものか否かは定かではない。
【００４８】
以上のことから、味噌成分には、細胞増殖周期のＧ０／Ｇ１期及びＳ期を延長する因子が存在し、Ｇ０／Ｇ１期及びＳ期の延長を通じて、血管平滑筋細胞増殖を抑制することが示された。この作用は、血管障害を防ぎ、血圧を低下し、動脈硬化の進展を抑制する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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