(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリヒドロキシアルカノアートを製造するための組換え宿主、及び、再生可能な炭素基質からポリヒドロキシアルカノアートを製造するための方法の提供。【解決手段】５炭素化合物、例えば５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）、グルタラート、及び、１，５ペンタンジオール（ＰＤＯ）を産生する組換え宿主。ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼ及び５−ヒドロキシバレラート−ＣｏＡ（５ＨＶ−ＣｏＡ）トランスフェラーゼからなる群から選択される異種酵素をコードする遺伝子を発現する組換え宿主。該宿主は、５ＨＶを含有する重合体を産生する。好ましくは、該宿主はポリヒドロキシアルカノアートシンターゼ及び５ＨＶ−ＣｏＡトランスフェラーゼの両方を発現する。該宿主は原核生物又は真核生物であり、好ましくは原核宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。【選択図】図２Ａ
2015211681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタラートセミアルデヒドまたは５−アミノペンタノアートを５炭素単量体、その重合体または共重合体に変換するように遺伝的に操作された組換え生物であって、該組換え生物が、リシン２−モノオキシゲナーゼ，ＥＣ  １．１３．１２．２；５−アミノペンタンアミダーゼ（δ−アミノバレロアミダーゼ），ＥＣ  ３．５．１．３０；５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼ（δ−アミノバレラートトランスアミナーゼ），ＥＣ  ２．６．１．４８；リシンデカルボキシラーゼ，ＥＣ  ４．１．１．１８；スクシナートセミアルデヒドレダクターゼ（別名：グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ），ＥＣ  １．１．１．６１；ＣｏＡ−トランスフェラーゼ，ＥＣ  ２．８．３．１４およびＥＣ  ２．８．３．ｎ；アシル−ＣｏＡシンテターゼ，ＥＣ  ６．２．１．３；ＰＨＡシンターゼ，ＥＣ  ２．３．１．ｎ；β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ，ＥＣ  ２．３．１．９；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ，ＥＣ  １．１．１．３６；グルタラート−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ，ＥＣ  １．２．１．２０；プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ，ＥＣ  １．２．１．３；アルコールデヒドロゲナーゼ，ＥＣ１．１．１．１；１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ  ＥＣ  １．１．１．２０２からなる群から選択される１以上の酵素をコードする少なくとも１つ又はそれ以上の遺伝子を発現し、ならびに該組換え生物が、未修飾生物の場合より大量のグルタラートセミアルデヒドまたは５−アミノペンタノアートを産生し、ならびに該グルタラートセミアルデヒドまたは５−アミノペンタノアートが該組換え生物により該５炭素単量体、その重合体または共重合体に変換される、組換え生物。
【請求項２】
５炭素単量体が、グルタラート、１，５ペンタンジオール、５−アミノバレラートおよび５−ヒドロキシバレラートからなる群から選択される、請求項１の組換え生物。
【請求項３】
重合体または共重合体がポリヒドロキシアルカノアートを含む、請求項１から２のいずれか一項の組換え生物。
【請求項４】
単量体が５−ヒドロキシバレラートを含む、請求項１から３のいずれか一項の組換え生物。
【請求項５】
組換え生物が５−アミノペンタノアートをグルタラートセミアルデヒドに変換する、請求項１から４のいずれか一項の組換え生物。
【請求項６】
組換え生物がリシンを５−アミノペンタノアートに変換する、請求項１から５のいずれか一項の組換え生物。
【請求項７】
リシンを生物に供給する、請求項６の組換え生物。
【請求項８】
組換え生物を構築するために使用した生物が、未修飾生物と比較してリシンを過剰産生するように修飾されている、請求項１から７のいずれか一項の組換え生物。
【請求項９】
組換え生物が毒性リシン類似体Ｓ−（２−アミノエチル）システインに対して耐性である、請求項１から８のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１０】
組換え生物が、リシンフィードバック耐性ジヒドロジピコリナートシンターゼを発現する、請求項１から８のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１１】
組換え生物がリシンフィードバック耐性アスパルタートキナーゼＩＩＩを発現する、請求項１から９のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１２】
再生可能な炭素基質を生物に供給する、請求項８から１のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１３】
組換え生物が、リシン輸出を抑制または阻止するように更に操作されている、請求項１から１２のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１４】
組換え生物がグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現または過剰発現し、ならびに５炭素単量体がグルタラートである、請求項１から１３のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１５】
グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼが、ｄａｖＤ、ｙｎｅＩおよびｇａｂＤからなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項１４の組換え生物。
【請求項１６】
組換え生物がグルタラートを細胞外環境中に遊離する、請求項１から１３のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１７】
生物が、グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を軽減または排除するように修飾されており、ならびに５炭素単量体がグルタラートではない、請求項１から１３のいずれか一項の組換え生物。
【請求項１８】
グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼが、ｄａｖＤ、ｙｎｅＩおよびｇａｂＤまたはそれらのホモログからなる群から選択される１以上の遺伝子を欠失させ又は破壊することにより軽減または排除される、請求項１７の組換え生物。
【請求項１９】
組換え生物が５−ヒドロキシバレラートを細胞外環境中に遊離する、請求項１から１３および１７から１８のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２０】
組換え生物が５−ヒドロキシバレラートを細胞外環境中に遊離し、ならびに５−ヒドロキシバレラートがデルタ−バレロラクトンと平衡状態にある、請求項１７から１８のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２１】
組換え生物が５−ヒドロキシバレラートを５−ヒドロキシバレラートＣｏＡに変換する、請求項１から１３および１７から１８のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２２】
組換え生物が５−ヒドロキシバレラート−ＣｏＡをポリヒドロキシアルカノアートに変換する、請求項１から１３および２１のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２３】
組換え生物が５−ヒドロキシバレラートを１，５ペンタンジオールに変換する、請求項１から１３および２１のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２４】
組換え生物が５−ヒドロキシバレラートをポリ（５−ヒドロキシバレラート）またはその共重合体に変換する、請求項１から１３および２１のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２５】
共重合体が、ポリ（３−ヒドロキシプロピオナート−コ−５ＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−５ＨＶ）およびポリ（４−ヒドロキシブチラート−コ−５ＨＶ）からなる群から選択される、請求項２４の組換え生物。
【請求項２６】
組換え生物が原核生物である、請求項１から２５のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２７】
組換え生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１から２６のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２８】
組換え生物が真核微生物である、請求項１から２５のいずれか一項の組換え生物。
【請求項２９】
リシンから重合体を製造するための組換え生物であって、該組換え生物が、５−ヒドロキシバレラート単量体を含むポリヒドロキシアルカノアートを産生するために、リシン２−モノオキシゲナーゼ，ＥＣ  １．１３．１２．２；５−アミノペンタンアミダーゼ（δ−アミノバレロアミダーゼ），ＥＣ  ３．５．１．３０；５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼ（δ−アミノバレラートトランスアミナーゼ），ＥＣ  ２．６．１．４８；リシンデカルボキシラーゼ，ＥＣ  ４．１．１．１８；スクシナートセミアルデヒドレダクターゼ（別名：グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ），ＥＣ  １．１．１．６１；ＣｏＡ−トランスフェラーゼ，ＥＣ  ２．８．３．１４およびＥＣ  ２．８．３．ｎ；アシル−ＣｏＡシンテターゼ，ＥＣ  ６．２．１．３；ＰＨＡシンターゼ，ＥＣ  ２．３．１．ｎからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に操作されている、組換え生物。
【請求項３０】
組換え生物がリシンを産生しない、請求項２９の組換え生物。
【請求項３１】
組換え生物が機能性グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性を発現しない、請求項２９の組換え生物。
【請求項３２】
リシンから１，５−ペンタンジオールを製造するための組換え生物であって、該組換え生物が、リシン２−モノオキシゲナーゼ，ＥＣ  １．１３．１２．２；５−アミノペンタンアミダーゼ（δ−アミノバレロアミダーゼ），ＥＣ  ３．５．１．３０；５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼ（δ−アミノバレラートトランスアミナーゼ），ＥＣ  ２．６．１．４８；リシンデカルボキシラーゼ，ＥＣ  ４．１．１．１８；スクシナートセミアルデヒドレダクターゼ（別名：グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ），ＥＣ  １．１．１．６１；ＣｏＡ−トランスフェラーゼ，ＥＣ  ２．８．３．１４およびＥＣ  ２．８．３．ｎ；アシル−ＣｏＡシンテターゼ，ＥＣ  ６．２．１．３、およびプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ，ＥＣ  １．２．１．３；アルコールデヒドロゲナーゼ，ＥＣ  １．１．１．１；１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ  ＥＣ  １．１．１．２０２からなる群から選択される少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に操作されている、組換え生物。
【請求項３３】
組換え生物がリシンを産生しない、請求項３２の組換え生物。
【請求項３４】
組換え生物が機能性グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性を発現しない、請求項３２の組換え生物。
【請求項３５】
リシンからの重合体の製造方法であって、該重合体が製造されるように、リシンおよび他の再生可能な炭素供給原料を請求項２９の組換え生物に供給することを含む、製造方法。
【請求項３６】
リシンまたは他の再生可能な炭素供給原料を請求項１記載の遺伝的に操作された細胞に供給することを含む、５炭素に基づく単量体、その重合体または共重合体の製造方法であって、前記の遺伝的に操作された細胞が、未修飾細胞の場合より大量のグルタラートセミアルデヒドまたは５−アミノペンタノアートを産生するように操作されており、該グルタラートセミアルデヒドまたは５−アミノペンタノアートが、前記の遺伝的に操作された細胞により、５炭素単量体、その重合体または共重合体に変換される、製造方法。
【請求項３７】
再生可能な炭素供給原料が、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せから選択される、請求項３６の製造方法。
【請求項３８】
単量体が、グルタラート、１，５−ペンタンジオールおよび５−ヒドロキシバレラートからなる群から選択される、請求項３６の製造方法。
【請求項３９】
重合体がポリヒドロキシアルカノアートを含む、請求項３６のいずれか一項の製造方法。
【請求項４０】
ポリヒドロキシアルカノアートが５−ヒドロキシバレラートを含む、請求項３９の製造方法。
【請求項４１】
ポリヒドロキシアルカノアートが、ポリ（５−ヒドロキシバレラート）、ポリ（３−ヒドロキシプロピオナート−コ−５ＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−５ＨＶ）およびポリ（４−ヒドロキシブチラート−コ−５ＨＶ）から選択される、請求項４０の製造方法。
【請求項４２】
ポリヒドロキシアルカノアート、その重合体または共重合体を回収することを更に含む、請求項３９の製造方法。
【請求項４３】
ポリヒドロキシアルカノアート重合体または共重合体を溶媒抽出または水性加工により回収する、請求項４２の製造方法。
【請求項４４】
リシン、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せから選択される再生可能な炭素基質を請求項１から１２の組換え生物に供給し、ならびにグルタラートを過剰産生させ、培地に分泌させ、それから回収することを含む、再生可能な炭素基質からグルタラートを過剰産生させるための方法が提供される。
【請求項４５】
再生可能な炭素基質から製造された１，５ペンタンジオール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、５−ヒドロキシバレラートおよび５炭素含有化学的中間体（Ｃ５化合物）を含有するポリヒドロキシアルカノアートおよびその共重合体を産生するトランスジェニック生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）は、フィルム（例えば、包装用フィルム、農業用フィルム、マルチングフィルム）、ゴルフティー、キャップおよびクロージャー、農業用支柱および杭、紙およびボードコーティング（例えば、カップ、板、箱などに対するもの）、熱成形品（例えば、トレー、容器、ヨーグルトポット、植木鉢、ヌードルボウル、成形品など）、ハウジング（例えば、電子製品用のもの）、袋（バッグ）（例えば、ゴミ袋、食料雑貨用袋、食品用袋、堆肥袋など）、衛生用品（例えば、おむつ、女性用衛生用品、失禁用品、使い捨てワイプなど）およびペレット化製品（例えば、ペレット化肥料、除草剤、農薬、種子など）用のコーティング（これらに限定されるものではない）を製造するために使用されうる生分解性プラスチックである。ＰＨＡは、縫合材、修復用装置、修復用パッチ、吊色帯、心血管パッチ、整形外科用ピン、癒着バリヤー、ステント、誘導組織修復／再生装置、関節軟骨修復装置、神経誘導装置、腱修復装置、骨髄基礎構造、および創傷用包帯を含む生物医学的装置を開発するためにも使用されている。
【０００３】
ポリヒドロキシアルカノアートは発酵法により製造されうる。ポリヒドロキシアルカノアートを製造するための既存の発酵法は、所望のＰＨＡ重合体組成を得るために特異的基質上で培養される野生型またはトランスジェニック微生物を利用する。多くの場合、関心のある重合体は、１つの他の３、４、または５−ヒドロキシ酸と共重合した３−ヒドロキシブチラートの（Ｄ）−異性体の共重合体である。これらの共重合体は該細胞の内部の顆粒状細胞含有物として産生され、ランダム共重合体である。共重合体であるポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−５−ヒドロキシバレラート）（ＰＨＢ５ＨＶ）および同種重合体（ホモポリマー）であるポリ（５−ヒドロキシバレラート）（Ｐ５ＨＶ）は、生分解性および生物再吸収性物質であるという利点を有する材料およびプラスチックとして産業上有用である。現在のところ、これらの物質は、５−ヒドロキシ吉草酸（５ＨＶ）または１，５−ペンタンジオールのような石油由来５炭素基質を、これらの物質を活性化単量体５ＨＶ−補酵素Ａへと代謝しＰＨＡポリメラーゼの作用によりそれを重合してＰＨＢ５ＨＶまたはＰ５ＨＶ重合体を形成する能力を有する微生物に供給することにより製造されているが、これらの方法により製造されるＰＨＢ５ＨＶおよびＰ５ＨＶ重合体は、再生可能な資源からは部分的に製造されるに過ぎず、そして該５炭素基質の高いコストのため高い経費を要する。コストを低下させること、および再生可能な資源から完全に製造される物質を得ることの両方を達成するためには、ＰＨＶ５ＨＶおよびＰ５ＨＶ重合体の製造のための供給原料として、非石油系の再生可能な炭素基質を使用することが非常に望ましい。また、温室効果ガスの生成を減少させるこれらの重合体の製造方法を開発することが望ましい。適当な再生可能な資源には、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトース、アラビノースおよびアミノ酸供給原料（リシンおよびプロリンを含む）から選択される１以上の供給原料を含む、農業から入手可能な炭水化物供給原料が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、石油由来ではない基質から製造される例えば５−ヒドロキシバレラートのような単量体を合成する新規株を作製するために野生型または遺伝的に操作されたポリヒドロキシアルカノアート産生体に遺伝子を導入することを可能にする方法および組換え生物を提供することが本発明の１つの目的である。
【０００５】
本発明のもう１つの目的は、唯一の構成成分として又はコモノマーとして５−ヒドロキシバレラートを含有するＰＨＡを合成する組換え生物を安定に操作するための技術および手法を提供することである。
【０００６】
例えば５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、グルタラートおよび１，５ペンタンジオール（ＰＤＯ）のような５炭素化合物を合成する組換え生物を安定に操作するための技術および手法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概括
５ＨＶ含有ＰＨＡバイオポリマー
５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）単量体を含むポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）を製造するための組換え宿主、および再生可能な炭素基質から、５ＨＶ単量体を含むＰＨＡを製造するための方法を提供する。５炭素化合物、例えば５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５ＨＶ、グルタラートおよび１，５ペンタンジオール（ＰＤＯ）を産生する或る組換え宿主も提供する。
【０００８】
１つの実施形態は、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）シンターゼおよび５−ヒドロキシバレラート−ＣｏＡ（５ＨＶ−ＣｏＡ）トランスフェラーゼまたは５ＨＶ−ＣｏＡシンターゼと、リシン異化経路に関与する異種酵素をコードする少なくとも１つのトランスジーンとをコードする遺伝子を発現する組換え宿主を提供し、ここで、リシン、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトース、アラビノースまたはそれらの組合せから選択される再生可能な炭素基質を該生物に供給した場合、該宿主は、５ＨＶ単量体を含むＰＨＡ重合体を産生し、産生される５ＨＶ単量体のレベルは該トランスジーンの発現の非存在下より高い。典型的な宿主は、リシン２−モノオキシゲナーゼ、５−アミノペンタンアミダーゼ、５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼ、グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ、５−ヒドロキシバレラートＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびポリヒドロキシアルカノアートシンターゼをコードする１以上の遺伝子を発現して、５ＨＶ単量体を含有するＰＨＡ重合体を産生する。好ましくは、該宿主は、グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはリシン輸出体コード遺伝子をコードする遺伝子において欠失または突然変異を有する。特に好適な宿主はまた、リシンを過剰産生する能力を有し、Ｓ−（２−アミノエチル）システインのような毒性リシン類似体に抵抗性である。
【０００９】
もう１つの実施形態においては、ＰＨＡシンターゼ、５ＨＶ−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５ＨＶ−ＣｏＡシンテターゼをコードする遺伝子の１以上もトランスジーンから発現される。
【００１０】
もう１つの実施形態においては、５ＨＶ含有ＰＨＡ重合体が産生され、該重合体が該細胞から回収されるよう、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトース、アラビノースまたはそれらの組合せから選択される１以上の再生可能な炭素基質と共にリシンを該組換え生物に供給する。
【００１１】
もう１つの実施形態においては、５ＨＶ含有ＰＨＡ重合体が産生され、該重合体が該細胞から回収されるよう、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトース、アラビノースまたはそれらの組合せから選択される１以上の再生可能な炭素基質を組換え生物に供給する。
【００１２】
該組換え宿主により産生される重合体は５ＨＶ単量体の同種重合体または共重合体でありうる。好ましい共重合体はＰＨＢ５ＨＶである。該組換え宿主により産生される他の有用な重合体は、共重合体ポリ（３−ヒドロキシプロピオナート−コ−５−ヒドロキシバレラート）およびポリ（４−ヒドロキシブチラート−コ−５−ヒドロキシバレラート）ならびに同種重合体Ｐ５ＨＶである。
【００１３】
該宿主は原核生物または真核生物でありうる。好ましい原核生物宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ユートロファ（Ｅｕｔｒｏｐｈａ）、アルカリゲネス・ラツス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）およびシー・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【００１４】
リシン、またはデンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトース、アラビノースまたはそれらの組合せから選択される１以上の再生可能な炭素基質からＰＨＡ重合体を製造するための組換え宿主も提供する。典型的な宿主はリシン２−モノオキシゲナーゼ、５−アミノペンタンアミダーゼ、５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼ、グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ、５−ヒドロキシバレラートＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびポリヒドロキシアルカノアートシンターゼを発現して、５ＨＶを含む重合体を産生する。該重合体は、リシン、およびデンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースから選択される１以上の再生可能な炭素基質を供給原料として使用して製造される。好ましくは、該宿主は、グルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびリシン輸出体コード遺伝子における欠失を有する。
【００１５】
１，５−ペンタンジオールの製造
もう１つの組換え宿主は、５−ヒドロキシバレラートＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡ依存性プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを過剰発現して１，５ペンタンジオールを産生するよう遺伝的に操作される。１，５ペンタンジオールは、５−ヒドロキシバレラート、リシン、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースを単独で又は組合せて供給原料として使用して製造される。好ましくは、該組換え宿主はａｄｈＥ、ｌｄｈＡおよびａｃｋＡ−ｐｔａにおける欠失を有し、リシン２−モノオキシゲナーゼ、５−アミノペンタンアミダーゼ、５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼおよび１以上のグルタラートまたはスクシナートセミアルデヒドレダクターゼをコードする遺伝子を発現する。特に好適な宿主は、リシンを過剰産生する能力を有し、Ｓ−（２−アミノエチル）システインのような毒性リシン類似体に抵抗性である。好ましくは、該生物は、低下したグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するか、または該活性を有さない。
【００１６】
再生可能な炭素基質からの１，５−ペンタンジオールの製造方法を提供し、該製造方法においては、再生可能な炭素基質を組換え生物に供給し、１，５−ペンタンジオールを産生させ、培地に分泌させ、該培地から回収する。
【００１７】
もう１つの実施形態においては、本発明は、再生可能な資源から製造された１，５−ペンタンジオールを提供する。
【００１８】
グルタル酸の製造
リシン、またはデンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せから選択される１以上の再生可能な炭素基質からグルタラート（グルタル酸）を過剰産生させるための組換え宿主も提供する。典型的な宿主はリシン２−モノオキシゲナーゼ、５−アミノペンタンアミダーゼ、５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼおよび１以上のグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を発現する。特に好適な宿主は、リシンを過剰産生する能力を有し、Ｓ−（２−アミノエチル）システインのような毒性リシン類似体に抵抗性である。
【００１９】
再生可能な炭素基質からグルタラートを過剰産生させるための方法を提供し、該製造方法においては、リシン、デンプン、スクロース、グルコース、ラクトース、フルクトース、キシロース、マルトースおよびアラビノースまたはそれらの組合せから選択される再生可能な炭素基質を組換え生物に供給し、グルタラートを過剰産生させ、培地に分泌させ、該培地から回収する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、再生可能な資源から生物学的に製造されうる種々の５炭素分子を示す概要図である。場合によっては、これらの再生可能な資源に基づく分子は、標準的な化学法を用いて相互変換されることが可能であり、化学重合法により重合体などを製造するために使用されうる。
【図２Ａ】図２Ａは、５−ヒドロキシバレラート含有ポリヒドロキシアルカノアート重合体、ならびに５炭素化合物、例えば５−アミノペンタノアート（５−ＡＰＯ）、グルタラート、δ−バレロラクトン（ＤＶＬ）および１，５ペンタンジオールへの生化学的経路を示す概要図である。前記の所望の産物への最適な炭素流動を達成するために排除される又は活性低下される必要がありうる競合代謝経路（十字型記号（Ｘ）により示されている）も示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、生合成反応を触媒する以下の酵素を示す：（１）リシン２−モノオキシゲナーゼ，ＥＣ  １．１３．１２．２；（２）５−アミノペンタンアミダーゼ（別名：δ−アミノバレロアミダーゼ），ＥＣ  ３．５．１．３０；（３）５−アミノペンタノアートトランスアミナーゼ（別名：δ−アミノバレラートトランスアミナーゼ），ＥＣ  ２．６．１．４８；（４）スクシナートセミアルデヒドレダクターゼ（別名：５−オキソペンタノアートレダクターゼ），ＥＣ  １．１．１．６１；（５）ＣｏＡ−トランスフェラーゼ，ＥＣ  ２．８．３．ｎ；（６）アシル−ＣｏＡシンテターゼ，ＥＣ  ６．２．１．３；（７）ＰＨＡシンターゼ，ＥＣ  ２．３．１．ｎ；（８）β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ，ＥＣ  ２．３．１．９；（９）アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ，ＥＣ  １．１．１．３６；（１０）グルタラート−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ，ＥＣ  １．２．１．２０。
【図３】図３は、カダベリンおよび５−アミノペンタナールを経由する、Ｌ−リシンから５−アミノペンタノアートへの代替経路の生化学的経路を示す概要図である。
【図４】図４は、Ｌ−プロリンから５−アミノペンタノアートへの生化学的経路を示す概要図である。
【図５】図５は、アルファ−ケトグルタラートからグルタラートセミアルデヒド（５−ヒドロキシバレラートおよびその誘導体ならびにグルタラートを産生する代謝中間体である）への生化学的経路を示す概要図である。
【図６】図６は、オキサロ酢酸（ＴＣＡ回路の中間体である）からＬ−リシンへの生化学的経路を示す概要図である。
【図７】図７は、１，５ペンタンジオールへの生化学的経路を示す概要図である。
【図８】図８Ａは、株３２９１からの加工細胞培養の総イオン存在量を時間（分）に対して示すクロマトグラムである。図８Ｂは、質量電荷比「ｍ／ｚ」に対してそのイオン存在量（相対単位）を示す、株３２９１からの加工細胞培養のイオンスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中で用いる幾つかの用語を以下の節において定義し明らかにする。
【００２２】
「ＰＨＡ共重合体」なる語は、少なくとも２つの異なるヒドロキシアルカン酸単量体から構成される重合体を意味する。
【００２３】
「ＰＨＡ同種重合体」なる語は、単一のヒドロキシアルカン酸単量体から構成される重合体を意味する。
【００２４】
本明細書中で用いる「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントが挿入されて該挿入セグメントの複製を引き起こしうるレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドである。該ベクターは発現ベクターである。
【００２５】
本明細書中で用いる「発現ベクター」は、１以上の発現制御配列を含むベクターである。
【００２６】
本明細書中で用いる「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御し調節するＤＮＡ配列である。
【００２７】
本明細書中で用いる「機能的に連結」は、関心のあるコード配列の発現を発現制御配列が有効に制御するような、遺伝的構築物内への組込みを意味する。
【００２８】
本明細書中で用いる「形質転換」および「トランスフェクト」は、当技術分野で公知の多数の技術による細胞内への核酸の導入を含む。
【００２９】
本明細書中で用いる「過剰産生」は、操作された生物において、未操作生物の場合より大量に特定の化合物が産生されることを意味する。
【００３０】
本明細書中で用いる「再生可能な供給原料」、「再生可能な炭素基質」および「再生可能な基質」なる語は全て、互換的に用いられる。
【００３１】
「プラスミド」は大文字および／または数字の前および／または後の小文字「ｐ」により示される。
【００３２】
本明細書中で用いる「異種」なる語は、別の宿主に由来することを意味する。他方の宿主は、同じ又は異なる種でありうる。
【００３３】
ＩＩ．ポリヒドロキシアルカノアートおよび５炭素化合物を産生する代謝経路
５−ヒドロキシバレラート含有ポリヒドロキシアルカノアート重合体、ならびに５炭素化合物、例えば５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）、グルタラートおよび１，５ペンタンジオール（ＰＤＯ）を産生する生化学的経路のための酵素を有する組換え生物を提供する。原核生物または真核生物宿主は、再生可能な資源に基づく供給原料から５−ヒドロキシバレラート、その重合体または開示されている５炭素化合物を産生するのに必要な酵素を発現するよう、遺伝的に操作される。所望の産物を産生する酵素経路を以下に説明する。
【００３４】
Ａ．５−アミノペンタノアート
５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）は、５−アミノペンタンアミドを中間体として、α−アミノ酸であるＬ−リシンから２つの酵素段階で産生されうる（図２）。これらの酵素のうちの第１の酵素であるリシン２−モノオキシゲナーゼは種々のシュードモナス菌のリシン分解経路における第１の酵素段階である（ＴａｋｅｄａおよびＨａｙａｉｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：２７３３−２７３６；（１９６６）；Ｈａｙａｉｓｈｉ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．３０：７２０−７３１（１９６６）；ＲｅｉｔｚおよびＲｏｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２４５：３０９１−３０９６（１９７０）；ＦｌａｓｈｎｅｒおよびＭａｓｓｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：２５７９−２５８６（１９７４））。リシン２−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）において特定され、ｄａｖＢと命名された（Ｒｅｖｅｌｌｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：７５００−７５１０（２００５））。第２の酵素段階は、５−アミノペンタンアミドを５ＡＰに変換し、５−アミノペンタンアミダーゼにより触媒され（Ｒｅｉｔｚら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２６９−２７２（１９６９）；ＲｅｉｔｚおよびＲｏｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０９１−３０９６（１９７０））、これはシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）においてはｄａｖＡによりコードされる（Ｒｅｖｅｌｌｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：７５００−７５１０（２００５））。
【００３５】
図３に示すとおり、カダベリンを産生するリシンデカルボキシラーゼ、５−アミノペンテナールを生成するプトレッシントランスアミナーゼ、および５ＡＰを生合成するγ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む３つの酵素反応でＬ−リシンを５ＡＰに変換する代替経路が利用されうる。
【００３６】
図４に示すとおり、Ｄ−プロリンを生合成するプロリンラセマーゼおよび５ＡＰを生成するプロリンレダクターゼを含む２つの酵素反応で、５ＡＰは、Ｌ−リシンの代わりにＬ−プロリンからも産生されうる。
【００３７】
Ｂ．５−ヒドロキシバレラート
もう１つの５炭素化合物である５ＨＶの生合成は、図２に示されているとおり、２つの酵素段階で５ＡＰから生じうる。５ＡＰは５ＡＰトランスアミナーゼによりグルタラートセミアルデヒドに変換される（ＲｅｉｔｚおよびＲｏｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０９１−３０９６（１９７０））。そのシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来遺伝子が特定され、ｄａｖＴと命名された（Ｅｓｐｉｎｏｓａ−ＵｒｇｅｌおよびＲａｍｏｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５２１９−５２２４（２００１））。実施例７に示されているとおり、どのコード化酵素がグルタラートセミアルデヒドを５ＨＶに効率的に変換するのかを調べるために、幾つかの組換えセミアルデヒドレダクターゼ遺伝子をクローニングし、試験した。推定タンパク質ＡＴＥＧ ００５３９がこの反応を効率的に触媒することが見出され、したがって、ｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（グルタラート・セミアルデヒド・レダクターゼ）にちなんでｇｓａＲと改名された。
【００３８】
幾つかの好熱性細菌、および酵母を含む下等真菌においては、リシンはα−アミノケトアジピン酸経路により合成され（Ｘｕ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４６：４３−６４（２００６））、この場合、２−ケトアジパートが第４の中間体であり、したがって、グルタラートおよび５ＨＶのようなＣ５化合物ならびに５ＨＶ含有ＰＨＶ重合体の潜在的前駆体である。図５に示されているとおり、この経路はα−ケトグルタラートおよびアセチル−ＣｏＡから出発して、２−ケトアジパートを生合成する。これらの４つの酵素を発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株は２−ケトアジパートを産生することが示された（Ａｎｄｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：１１７９０−１１７９５（２００４）；Ｊｉａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９６：４７９−４８５（２００６）；Ｍｉｙａｚａｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１８６４−１８７１（２００３））。２−ケトアジパートは、α−ケトグルタラートと２−ケトアジパートとの構造的類似性により、α−ケトグルタラートデヒドロゲナーゼによりグルタリル−ＣｏＡに変換されうる。グルタリル−ＣｏＡは、この場合もスクシニル−ＣｏＡとグルタリル−ＣｏＡとの構造類似性により、コハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）デヒドロゲナーゼ、例えばスクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＳｕｃＤ）により変換されうる（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．１７８：８７１−８８０（１９９６））。
【００３９】
Ｃ．グルタラート
５炭素化合物であるグルタラートの生合成は、図２に示されているとおり、デヒドロゲナーゼ反応によりグルタラートセミアルデヒドから進行する（Ｉｓｃｈｉｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）４９：１５４−１５７（１９６１）；ＲｅｉｔｚおよびＲｏｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０９１−３０９６（１９７０））。シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）においてはｄａｖＤ遺伝子がそのようなグルタラートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をコードすることが確認された（Ｅｓｐｉｎｏｓａ−ＵｒｇｅｌおよびＲａｍｏｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５２１９−５２２４（２００１）；Ｒｅｖｅｌｌｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：３４３９−３４４６（２００４））。グルタラートはポリエステル、ポリエステルポリオールおよびポリアミドのような重合体の製造に有用である。奇数（すなわち、５）の炭素原子数は、例えば、重合体の弾性を減少させるのに有用である。また、１，５−ペンタンジオールは一般的な可塑剤であり、グルタラートおよびその誘導体の水素化により製造されるポリエステルの前駆体である（ＷｅｒｌｅおよびＭｏｒａｗｉｅｔｚ，“Ａｌｃｏｈｏｌｓ，Ｐｏｌｙｈｙｄｒｉｃ”  ｉｎ：  Ｕｌｈｎａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：２００２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ．ＤＯＩ  １０．１００２／１４３５６００７．ａ０１ ３０５）。
【００４０】
Ｄ．ポリ（５−ヒドロキシバレラート）
ポリ（５−ヒドロキシバレラート）（別名：Ｐ（５ＨＶ））ＰＨＡよりなる同種重合体の生合成は５ＨＶから５−ヒドロキシバレラート−ＣｏＡを経て進行しうる。２つの異なる酵素反応、すなわち、Ｈｕｉｓｍａｎら（米国特許第７，２２９，８０４号）、ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６））ならびにＥｉｋｍａｎｎｓおよびＢｕｃｋｅｌ（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７１：１０７７−１０８２（１９９０））により記載されているＣｏＡ−トランスフェラーゼによる酵素反応、またはｖａｎ  Ｂｅｉｌｅｎら（Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１２１−３１３６（１９９２））により記載されているＣｏＡ−シンテターゼによる酵素反応が、第１段階を触媒しうる。５−ヒドロキシバレラート−ＣｏＡの重合は、例えばラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）ｐｈａＣ１によりコードされるＰＨＡポリメラーゼにより触媒されうる（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９））。あるいは、Ｈｕｉｓｍａｎら（米国特許第６，３１６，２６２号）により記載されているとおりに、ＰｈａＣ３／Ｃ５シンターゼ融合タンパク質が使用されうる。
【００４１】
Ｅ．ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−５−ヒドロキシバレラート）
ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−５−ヒドロキシバレラート）（別名：Ｐ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ））を含む共重合体の生合成は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３ＨＢ−ＣｏＡ）および５−ＨＶ−ＣｏＡ単量体前駆体分子を供給することにより生じうる。図２に示されているとおり、３ＨＢ−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡから、以下の２つの酵素段階を経て生合成されうる：（ｉ）例えばラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のｂｋｔＢ（Ｓｌａｔｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（８）：１９７９−１９８７（１９９８））（これらに限定されるものではない）のような適当な遺伝子を使用してアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換するβ−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ反応（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１１６：２１−２７（１９７８））、および（ｉｉ）バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のｐｈａＢ（ＭｃＣｏｏｌおよびＣａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１（２）：５８５−５９２（１９９９））のような適当な遺伝子を使用してアセトアセチル−ＣｏＡを３ＨＢ−ＣｏＡに変換するアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ反応（Ｆｕｋｕｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９１７：３６５−３７１（１９８７））。前記のとおり、ＰＨＡ共重合体は種々のＰＨＡ合成により合成されうる。
【００４２】
Ｆ．リシン
図６は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるリシン代謝の生合成経路を示す。図の中央部の点線および実線は、それぞれ、Ｌ−リシンによるアロステリックフィードバック阻害および転写抑制を示し、これらは、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））におけるＬ−リシン産生を増加させるのに必要な遺伝的修飾の標的となる。
【００４３】
Ｇ．１，５−ペンタンジオール
図７は５ＨＶから１，５−ペンタンジオール（ＰＤＯ）の産生の概要を示す。５ＨＶは、Ｈｕｉｓｍａｎら（米国特許第７，２２９，８０４号）、ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６））ならびにＥｉｋｍａｎｎｓおよびＢｕｃｋｅｌ（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７１：１０７７−１０８２（１９９０））により記載されているＣｏＡ−トランスフェラーゼにより、またはｖａｎ  Ｂｅｉｌｅｎら（Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１２１−３１３６（１９９２））により記載されているＣｏＡ−シンテターゼにより、５ＨＶ−ＣｏＡに変換されうる。５ＨＶは、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のｐｄｕＰ（Ｌｅａｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８０：３５３−３６１（２００３））または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｅｕｔＥ（Ｓｋｒａｌｙ，ＷＯ特許番号２００４／０２４８７６）により、５−ヒドロキシペンテナールに変換されうる。５−ヒドロキシペンテナールは、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ、例えばクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＴ（Ｔｏｎｇら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７（１２）：３５４１−３５４６（１９９１））により、ＰＤＯに変換されうる。
【００４４】
Ｈ．５−ヒドロキシバレラート−コ−３−ヒドロキシプロピオナート
５−ヒドロキシバレラート−コ−ヒドロキシプロプリオナートを含有する共重合体は５ＨＶから製造されうる。ｆａｄＲ＋（脂肪酸分解（ＦＡＤ））またはｆａｄＲ−（構成的ＦＡＤ）のいずれかである大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株を、ポリヒドロキシアルカノアートおよび５−ヒドロキシバレラートＣｏＡトランスフェラーゼを発現する核酸でトランスフェクトする。好ましい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株には、ＭＧ１６５５およびＬＳ５２１８が含まれる（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １４６（３）：１１６６−１１６９（１９８１））。表６に示すとおり、ＧＣ−ＦＩＤ分析は、ＬＳ５２１８［ｐＭＳ９３］が、５２％  ５ＨＶおよび４８％  ３ＨＰの重合体組成を有する６．４％  ｄｃｗのＰＨＡを産生することを示した。一方、ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］は、５ＨＶのみからなる６３．１％  ｄｃｗのＰＨＡを与えた。さらに、ＬＳ５２１８［ｐＭ９３］のＧＣ−ＭＳ分析は該重合体サンプル中の３ＨＰの存在を証明した。したがって、ＬＳ５２１８における活性ＦＡＤ系はＮａ５ＨＶから３ＨＰを合成しうる。
【００４５】
ＩＩＩ．ポリヒドロキシアルカノアートおよび５炭素化合物を産生するトランスジェニック生物の製造
ポリヒドロキシアルカノアートおよび５炭素化合物を産生するトランスジェニック生物は、当技術分野で公知の通常の技術を用いて製造される。
【００４６】
Ａ．トランスジェニックＰ（５ＨＶ）産生体を製造するための遺伝子
５ＨＶ含有ＰＨＡおよび５炭素化合物を産生する宿主系統に関して評価および／またはクローニングされた遺伝子を、適当な酵素委員会番号（ＥＣ番号）および参照事項と共に、以下の表１Ａに示す。後記で更に詳しく説明するとおり、コドン最適化のために合成された遺伝子もあれば、天然または野生型生物のゲノムＤＮＡからのＰＣＲによりクローニングされた遺伝子もある。
【００４７】
【表１】
2015211681.tif 000003
2015211681.tif 000004
表１Ａに挙げた反応を触媒しうる他のタンパク質は、科学文献、特許を参照することにより、あるいは例えばＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）におけるヌクレオチドもしくはタンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴ検索により見出されうる。ついで、配列データベースから物質的なＤＮＡへの容易なパスを得るために、合成遺伝子が作製されうる。異種タンパク質発現を増強し、発現系および宿主に必要な特性を最適化するコドンを使用して、そのような合成遺伝子は基本構造から設計され構築される。企業、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ  ９４０２５，ＵＳＡ）はそのような常套的サービスを提供するであろう。表１Ａに挙げられている生化学反応を触媒しうるタンパク質を表１Ｂ〜１ＡＡに示す。
【００４８】
【表２】
2015211681.tif 000005
【００４９】
【表３】
2015211681.tif 000006
【００５０】
【表４】
2015211681.tif 000007
【００５１】
【表５】
2015211681.tif 000008
【００５２】
【表６】
2015211681.tif 000009
【００５３】
【表７】
2015211681.tif 000010
【００５４】
【表８】
2015211681.tif 000011
【００５５】
【表９】
2015211681.tif 000012
【００５６】
【表１０】
2015211681.tif 000013
【００５７】
【表１１】
2015211681.tif 000014
【００５８】
【表１２】
2015211681.tif 000015
【００５９】
【表１３】
2015211681.tif 000016
【００６０】
【表１４】
2015211681.tif 000017
【００６１】
【表１５】
2015211681.tif 000018
【００６２】
【表１６】
2015211681.tif 000019
【００６３】
【表１７】
2015211681.tif 000020
【００６４】
【表１８】
2015211681.tif 000021
【００６５】
【表１９】
2015211681.tif 000022
【００６６】
【表２０】
2015211681.tif 000023
【００６７】
【表２１】
2015211681.tif 000024
【００６８】
【表２２】
2015211681.tif 000025
【００６９】
【表２３】
2015211681.tif 000026
【００７０】
【表２４】
2015211681.tif 000027
【００７１】
【表２５】
2015211681.tif 000028
【００７２】
【表２６】
2015211681.tif 000029
【００７３】
【表２７】
2015211681.tif 000030
【００７４】
１つの実施形態は、Ｐ（５ＨＶ）または他の５ＨＶ単量体含有ＰＨＡを産生するトランスジェニックまたは組換え生物を提供する。該生物は原核生物または真核生物でありうる。適当な原核生物には、細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
Ｂ．組換え生物または細胞を製造するための方法および材料
１．修飾すべき生物または細胞
５ＨＶ含有ＰＨＡ生体高分子、５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）、グルタラートおよび１，５−ペンタンジオール（ＰＤＯ）を製造するために修飾されうる生物または細胞には、真核生物および原核生物が含まれる。適当な原核生物には、細菌が含まれる。多数の細菌が、ポリヒドロキシアルカノアートを産生するよう遺伝的に操作されうる。具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ラツス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｕｓ）およびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）が含まれる。追加的な原核生物には、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えばエンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）およびＫ５７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）が、公に入手可能である。
【００７６】
これらには、代替的基質を利用するように又は追加的単量体を組込むように又は産生量を増加するように修飾された、ポリヒドロキシアルカノアートを既に産生する生物、およびポリヒドロキシアルカノアートを産生せず、ポリヒドロキシアルカノアートの産生に要求される酵素を全く又は一部しか発現しない生物が含まれる。ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）は、ＰＨＡを天然で産生する生物の一例である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、ＰＨＡ産生のための酵素をコードするトランスジーンを導入することが必要であろう生物の具体例である。
【００７７】
Ｃ５化合物である５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）、グルタラートおよび１，５−ペンタンジオールの製造の場合、それらが５−ヒドロキシバレラート含有ＰＨＡへと重合しないが培地内に分泌される場合には、リシンを製造するために使用される工業用微生物を使用することが有用である。Ｌ−リシンの工業生産に使用されているコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）［その亜種ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）およびブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）を含む］（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｎｏｇｒ．５：３９−７０（２００７））は、グルタラート、１，５−ペンタンジオール、５−ヒドロキシバレラート、および本発明において記載されているリシン分解経路によりリシンから産生されうる他の産物の製造のために開発されうる微生物の一例である。操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はリシンの製造にも使用されている。Ｌ−リシンの製造のためのコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を得るための手法、例えば、ランダム突然変異誘発、およびそれに続く、Ｓ−（２−アミノエチル）システインのような毒性リシン類似体に抵抗性の突然変異体の選択、およびそれぞれアスパラギン酸キナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｌｙｓＣおよびｈｏｍのような遺伝子標的の突然変異対立遺伝子の導入は、十分に確立されており、既に記載されている（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：２６８−２７４（２００７））。アスパラギン酸キナーゼはトレオニンおよびリシンによりフィードバック阻害に付される。フィードバック阻害からのこの酵素の解放は、リシン産生株を開発するための主要課題の１つと考えられる。リシン分解経路に由来する化合物を産生しうる株の開発のための操作のもう１つの標的は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるＬｙｓＥのようなリシン輸出体である。Ｌ−リシンを産生するコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株のｌｙｓＥ遺伝子の突然変異誘発は細胞質からのリシンの排出を妨げ、したがって、リシンを産物に変換するように工夫された経路による産物の収率を増加させるであろう。ＰＨＢのようなＰＨＡの製造のためのコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を構築するための方法も当技術分野で公知である（Ｊｏ，Ｓ−Ｊら，２００６．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０２：２３３−２３６）。
【００７８】
適当な真核生物または細胞には、真菌、例えば糸状菌または酵母が含まれる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に使用される下等真核宿主微生物である。
【００７９】
２．トランスジェニック生物の作製方法
ｉ．染色体外トランスフェクション
ベクターＤＮＡは通常の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞内に導入されうる。本明細書中で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」は、化学的形質転換、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、宿主細胞内に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための、当技術分野で認識されている種々の技術を意味する。通常の形質転換技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１に記載されている。酵母内への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔ，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法により行われる。
【００８０】
ｉｉ．染色体組込み
操作された遺伝子構築物をグラム陰性およびグラム陽性細菌細胞の染色体ＤＮＡ内に組込むための方法は当業者によく知られている。典型的な組込みメカニズムは、ｒｅｃＢＣまたはｒｅｃＤ株における線状化ＤＮＡを使用する相同組換え、およびそれに続く、Ｐ１形質導入（Ｍｉｌｌｅｒ  １９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、特別なプラスミド（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７（１９８９）；Ｍｅｔｃａｌｆら，Ｐｌａｓｍｉｄ  ３５：１（１９９６）；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら，米国特許第５，４７０，７２７号）、またはトランスポゾンに基づく系を使用するランダム挿入（Ｈｅｒｒｅｒｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７（１９９０）；Ｐｅｒｅｄｅｌｃｈｕｋ  ＆  Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇｅｎｅ  １８７：２３１（１９９７）；Ｒｉｃｈａｕｄら，米国特許第５，５９５，８８９号；Ｔｕｃｋｅｒら，米国特許第５，１０２，７９７号）を含む。一般に、挿入を含有する微生物株は、該組込み構築物により供与される獲得抗生物質耐性遺伝子に基づいて選択される。しかし、栄養要求性突然変異体の相補も用いられうる。本明細書に記載されている種々の代謝経路をコードするトランスジーンのいずれかを導入するために、同じ方法が用いられうる。これらの方法の幾つかを、ｐｈａ遺伝子に関して、以下に詳細に説明する。
【００８１】
染色体組込みのための関心のある遺伝子の発現は、組込まれるＤＮＡ構築物において転写活性化配列（プロモーター）を含有させることにより達成されうる。Ｉｎｇｒａｍら，米国特許第５，０００，０００号に記載されているとおり、部位特異的相同組換えは、関心のある遺伝子の発現の増幅と組合されうる。
【００８２】
染色体組込みは、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−６６４５（２０００））の方法により、そして後記実施例７において用いられているとおりに達成されうる。
【００８３】
細菌染色体内に異種遺伝子を挿入するための一連の発現カセットが開発されている。これらのカセットは、Ｈｅｒｒｅｒｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０）；ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｄ．１７２：６５６８（１９９０）に記載されているトランスポゾン運搬系に基づく。これらの系はＲＰ４媒介接合導入をもたらし、トランスポゾンＴｎ１０およびＴｎ５のみを使用するが、トランスポゾン末端および運搬系の任意の組合せが、記載されている技術に応用されて、持続的かつ均一なＰＨＡ産生をもたらしうるであろう。
【００８４】
トランスジェニック大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＨＢ産生体を作製するためには、以下の一般的アプローチが用いられる：（１）無プロモーター抗生物質耐性（ａｂｒ）遺伝子を、適当なプラスミド、例えばｐＵＣ１８ＮｏｔＩまたはｐＵＣ１８ＳｆｉＩのポリリンカー内に、該ポリリンカーの主要部分がａｂｒの上流になるようにクローニングする；（２）ついで、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、コハク酸セミアルデヒドレダクターゼおよび４−ヒドロキシブチラート−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｈａ遺伝子をａｂｒ遺伝子の上流に、それと同じ配向でクローニングする；（３）ｐｈａ−ａｂｒカセットをＮｏｔＩまたはＡｖｒＩＩ断片（ＡｖｒＩＩはｐＵＣ１８ＳｆｉＩにおけるＳｆｉＩ部位を認識する）として切り出し、ｐＵＴ系またはｐＬＯＦ系由来のもののようないずれかのプラスミドの対応部位内にクローニングする；（４）得られたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）λｐｉｒ株内で維持し、これらのプラスミドが複製されない選択された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株内にエレクトロポレーションまたは接合し；（５）該ｐｈａ−ａｂｒカセットが染色体内に成功裏に組込まれた新たな株を、該宿主に関して（例えば、該宿主がナリジクス酸耐性の場合にはナリジクス酸）、および該カセットに関して（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、塩化水銀、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ））、選択培地上で選択する。得られたｐｈａ組込み体を、グルコースの存在下、増殖およびＰＨＢ形成に関して最少培地上でスクリーニングする。
【００８５】
この方法の幾つかの修飾が行われうる。該無プロモーター抗生物質耐性マーカーを使用しない場合には、該ＰＨＡ遺伝子の挿入物は、該ベクター内に存在するマーカーに基づいて選択され、所望のレベルのＰＨＡを産生する組込み株は、ＰＨＡ産生に関してスクリーニングすることにより検出される。ｐｈａ遺伝子は、内因性転写配列、例えば上流活性化配列、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および／またはオペレーター配列を有しうるが、それらを必要とするわけではない。ｐｈａ遺伝子がそのような配列を有さない場合、記載されているアプローチは、挿入配列を介して転写が進行しうるｐＵＴ系のようなベクターの使用に限定される。この限定は、ＲＮＡポリメラーゼがｐＬＯＦプラスミドのＴｎ１０フランキング領域をリードスルーできないことによるものである。ａｂｒ遺伝子は、所望により、それ自身の発現配列を有しうる。該宿主株が対応野生遺伝子内に突然変異を有する場合、ａｂｒ遺伝子の代わりに必須遺伝子が選択マーカーとして働くように、該構築物は設計されうる。この目的に有用な遺伝子の具体例は当技術分野で一般に公知である。異なる複数の構築物は、両方の構築物が、異なるマーカー遺伝子を担持する限り、連続的または同時に１つの宿主内に組込まれうる。複数の組込み事象を用いて、ｐｈａ遺伝子は別々に組込まれうる。例えば、まず、ｐｈａＣ−ｃａｔカセットとしてＰＨＢポリメラーゼ遺伝子が組込まれ、ついで、ｐｈａＡＢ−ｋａｎカセットとしてチオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子の組込みが生じる。あるいは、１つのカセットが全てのｐｈａ遺伝子を含有することが可能であり、一方、もう１つのカセットは、所望のＰＨＡ重合体を産生するのに必要な幾つかのｐｈａ遺伝子のみを含有する。
【００８６】
幾つかの場合には、組込み株の染色体から該選択マーカーが切り出されうるよう、トランスポゾン組込みベクター、例えばｐＪＭＳ１１（Ｐａｎｋｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：７４８−７５１）が使用されうる。これは、各挿入事象後にマーカーを切り出すことにより同一マーカー遺伝子を用いて複数のトランスポゾン構築物を挿入するメカニズムの付与を含む幾つかの理由により有用である。
【００８７】
３．ＰＨＡ形成に関与するｐｈａおよび他の遺伝子の起源
ＰＨＡ形成に関与する遺伝子の一般的参考文献としては、ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６３：２１−５３が挙げられる。該ｐｈａ遺伝子は、異なる起源に由来して単一生物において合体されることが可能であり、あるいは同一起源に由来することが可能である。
【００８８】
ｉ．レダクターゼをコードする遺伝子
レダクターゼをコードする遺伝子は、アルカリゲネス・ラツス（Ａ．ｌａｔｕｓ），ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）（Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＆  Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−３０３（１９８９））、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１５）：４５０１−７（１９９５））、シー・ビノスム（Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ）（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ  ＆  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１３５−５０（１９９２））、ピー・アシドフィラ（Ｐ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、ピー・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｌｃａｎｓ）（Ｙａｂｕｔａｎｉら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３（ｌ−２）：８５−９０（１９９５））、アール・メリロチ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：２５５３−５９（１９９５））、およびゼット・ラミゲラ（Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ）（Ｐｅｏｐｌｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１）：９７−１０２（１９８７））から単離されている。米国特許第７，２２９，８０４号は、シー・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来の４−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼをコードする４ｈｂＤ遺伝子（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８，８７１  ８８０（１９９６））を用いてＰ４ＨＢを産生するトランスジェニック生物を開示している。４ｈｂＤはＮＡＤＨを要する。好ましいレダクターゼには、ＮＡＤＨを要さないものが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的なレダクターゼには、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＡＫＲ７Ａ５（Ｇｅｎｌｎｆｏ識別番号：２７６５９７２７）（Ｈｉｎｓｈｅｌｗｏｏｄ，Ａ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５２３：２１３−２１８（２００２））、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＧＨＢＤＨ（ＧＩ：１４５３３８９３４）（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚ，Ｋ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１５５２−４１５５６）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のＡＴＥＧ ００５３９（ＧＩ：１１５４９１９９４）が含まれる。
【００８９】
ｉｉ．ＣｏＡトランスフェラーゼおよびＣｏＡシンテターゼ
適当なＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．８．３．ｎ）には、シー・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のｏｒｆＺが含まれるが、これに限定されるものではない。ｏｒｆＺの配列はＨｕｉｓｍａｎらの米国特許第７，２２９，８０４号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。もう１つの適当なＣｏＡトランスフェラーゼには、シー・アミノブチリカム（Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）由来のａｂｆＴ（Ｇｅｒｈａｒｄｔら，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７４：１８９−１９９（２０００））が含まれる。アシル−ＣｏＡを産生しうる他の酵素には、ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ  ６．２．１．３）が含まれる。これらの酵素は、カルボン酸へのＣｏＡの共有結合性付加を触媒するためにＡＴＰおよび遊離ＣｏＡを利用し、ｖａｎ  Ｂｅｉｌｅｎら（Ｍｏｌｅｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９２）６：３１２１−３１３６）およびＡｑｕｉｎら（ＷＯ  ０２／４０６９０  Ａ２）に記載されている。
【００９０】
ｉｉｉ．ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子
ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、エロモナス・キャビエ（Ｆｕｋｕｉ  ＆  Ｄｏｉ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（１５）：４８２１−３０（１９９７））、アルカリゲネス・ラツス（Ａ．ｌａｔｕｓ），ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）（Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＆  Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−３０３（１９８９））、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１５）：４５０１−７（１９９５））、シー・ビノスム（Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ）（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ  ＆  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１３５−５０（１９９２））、メチロバクテリウム・エクストークエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）（Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ＆  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３９（３）：３０９−１７（１９９３））、ノカルジア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９９６４）、ノカルジア・サルモニコロル（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ピー・アシドフィラ（Ｐ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、ピー・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（Ｕｅｄａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８（３）：７７４−７９（１９９６））、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔｉｍｍ  ＆  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９（１）：１５−３０（１９９２））、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）（Ｈｕｉｓｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１））、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）（Ｃｅｖａｌｌｏｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）：１６４６−５４（１９９６））、アール・メリロティ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１（Ｐｔ  １０）：２５５３−５９（１９９５））、ロドコッカス・ルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（Ｐｉｅｐｅｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．９６（１）：７３−８０（１９９２））、ロドスピリルム・ルブルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｒｉｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）（Ｈｕｓｔｅｄｅら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２））、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９（２−４）：２１７−３０（１９９２）；Ｈｕｓｔｅｄｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１５：７０９−１４（１９９３））、シネコシスチス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）（Ｋａｎｅｋｏ，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．３（３）：１０９−３６（１９９６））、ティー・ビオラセエ（Ｔ．ｖｉｏｌａｃｅａｅ）（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ  ＆  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（４：４９３−５０１（１９９３））およびゼット・ラミゲラ（Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６６２４２）から単離されている。
【００９１】
ＰＨＡ形成に関連づけられていないがｐｈａ遺伝子および／または対応遺伝子産物に対して有意な相同性を共有する他の遺伝子も使用されうる。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードするｐｈａＢ遺伝子に対して有意な相同性を有する遺伝子は、アゾスピリルム・ブラシリエンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ６４７７２、Ｘ５２９１３）、リゾビウム属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ５３３２７、Ｙ００６０４）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｄ９０７４５）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ３９４４１）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ３２７０１）、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ５９４３３）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ９１６３１）、シネコシスチス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｄ９０９０７）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＥ０００５７０）、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ６４４６４）、クフェア・ランセオラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ６４５６６）およびマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ６６８００）を含む幾つかの生物から単離されている。
【００９２】
ＩＩＩ．５ＨＶおよびＣ５化合物を含有するＰＨＡの製造方法
再生可能な炭素源を供給原料として使用するポリヒドロキシアルカノアートの製造方法を提供する。好ましい実施形態においては、再生可能な資源から５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）、グルタラートおよび１，５−ペンタンジオール（ＰＤＯ）ならびにそれらの重合体を産生するのに必要な遺伝子をコードする１以上の核酸構築物で細菌を形質転換またはトランスフェクトする。
【００９３】
ＩＶ．使用方法
開示されているトランスジェニック生物は、Ｃ５化合物、例えば５−アミノペンタノアート（５ＡＰ）、５−ヒドロキシバレラート（５ＨＶ）、グルタラートおよび１，５−ペンタンジオール（ＰＤＯ）、ならびに５ＨＶ単量体を含むＰＨＡ生体高分子を製造するために使用されうる。該Ｃ５化合物の製造の場合、適当なトランスジーンを発現する組換え生物（場合によっては、競合経路をコードする遺伝子が不活性化されている又は欠失している場合を含む）を、再生可能な発酵基質上で増殖させる。該基質は、炭水化物、リシン、プロリン、植物油、脂肪酸またはそれらの組合せから選択される。幾つかの実施形態に関する有用な組合せはグルコースとリシンとの混合物であろう。もう１つの適当な組合せはスクロースおよびリシンであろう。好ましくは、該供給原料は、主として、１つの基質、例えばグルコースまたはスクロースを含む。適当な炭水化物基質は、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、ラクトースおよびマルトースから選択される１以上の糖を含む。Ｃ５化合物の製造のためには、所望の最終産物が増殖培地内に蓄積するまで、再生可能な基質上で該組換え生物を増殖させ、この時点でフロキュレーション、沈降、遠心分離または濾過により該細胞を除去し、該無細胞培地から該産物を標準的な方法により取り出す。そのような方法は、発酵製造された他の酸およびジオール、例えば乳酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオールの回収に関して当技術分野で公知である。
【００９４】
該組換え生物は、再生可能な炭素源、例えばグルコース、リシンなどの存在下または所望の重合体または共重合体を与えるように選択された他の基質の存在下で該生物を培養することにより、同種重合体Ｐ５ＨＶおよび５ＨＶ含有ＰＨＡ共重合体を含む５ＨＶ含有ＰＨＡ生体高分子の発酵製造のために使用されうる。該ＰＨＡ重合体が該細胞の内部に蓄積するまで、該組換え生物を該基質上で増殖させ、この時点で、当業者に公知の方法により該ＰＨＡ重合体を該細胞から抽出する。該生物から得られた５ＨＶ含有ＰＨＡ重合体は、広範な産業用プラスチック用途、例えばフィルム、繊維、発泡体、射出成形品、吹込成形品、紙コーティングなどにおいて使用されうる。それらは、組織増強を含む生物医学的用途、および心臓弁を製造するために、および縫合材として、および脈管移植片を製造するためにも使用されうる。典型的な共重合体には、ＰＨＢ５ＨＶおよびｐ（３−ヒドロキシプロピオナート−コ−５−ヒドロキシバレラート）ｐ（４−ヒドロキシブチラート−コ−５−ヒドロキシバレラート）が含まれるが、これらに限定されるものではない。該組換え生物は、共重合体の製造のために必要に応じて、追加的な遺伝子、例えばベータ−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼを含むように遺伝的に操作されうる。
【００９５】
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、開示されている本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００９６】
実施例
【実施例１】
【００９７】
ナトリウム５−ヒドロキシバレラートからのＰ（５ＨＶ）同種重合体の生合成
５ＨＶ含有ＰＨＡが合成可能であることの最初の実例として、ナトリウム５−ヒドロキシバレラート（Ｎａ５ＨＶ）を、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼとＰＨＡシンターゼとの両方を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に供給して、供給された５ＨＶ単量体が許容され、Ｐ（５ＨＶ）同種重合体内に直接的に取り込まれるかどうかを確認した。Ｎａ５ＨＶはδ−バレロラクトン（ＤＶＬ）の塩基加水分解により合成された。この方法は、０．１ｍｏｌのＮａＯＨを５０ｍＬのメタノールに、溶解されるまで攪拌しながら加えることを含むものであった。得られた沈殿物を乾燥させ、水に溶解し、８．５にｐＨ調節し、０．２μＭ  フィルターで濾過滅菌した。該ＤＶＬの全てがけん化されたことを確認するために、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ上で該塩溶液の分析を行った。
【００９８】
Ｐ（５ＨＶ）の製造に適した最良の組合せを見出すために、ＣｏＡトランスフェラーゼ／シンテターゼおよびＰＨＡシンターゼ遺伝子の種々の組合せを試験した。試験したＣｏＡトランスフェラーゼ／シンテターゼはシー・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ｏｒｆＺおよびピー・オレオボランス（Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ａｌｋＫであり、該ＰＨＡシンターゼはアール・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）ｐｈａＣおよびティー・プフェニジイ（Ｔ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ）ｐｈａＥＣであった（表１Ａ）。この実験で使用した全ての株はＭＧ１６５５（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５（１１）：３４０１−３４０７（１９９３））から誘導された。ＣｏＡトランスフェラーゼ／シンテターゼとＰＨＡシンターゼとの異なる組合せをそれぞれが含有する４つの発現プラスミド（ｐＦＳ９２、ｐＭＳ９６、ｐＭＳ９３およびｐＭＳ１０２）を、以下の段落に記載されているとおりに構築した。
【００９９】
プラスミドの構築
ｐＡＥＴ４１（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９８−１５３０３（１９８９））をＸｍａＩおよびＳｔｕＩで消化して、アール・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）ｐｈａＣおよびその天然プロモーター（ＰＲｅ）を含有する断片を取り出すことにより、プラスミドｐＦＳ３０を構築した。プラスミドｐＡＥＴ４１は、ｐｈａＣ遺伝子を含むアール・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６からの染色体断片を含有するｐＵＣ１８ベクター（アクセッション番号Ｌ０８７５２）である。ＰＴｒｃプロモーター下でシー・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からのｏｒｆＺ遺伝子（表１Ａ）を含有するｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の誘導体であるプラスミドｐＦＳ１６（ＳｋｒａｌｙおよびＰｅｏｐｌｅｓ，米国特許第６，３２３，０１０号）をＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、ＸｍｎＩで再度消化した後、該ＰＲｅ−ｐｈａＣ  ＸｍａＩ−ＳｔｕＩ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＦＳ３０と命名した。これは構成発現ＰＲｅプロモーター下でｐｈａ−ｏｒｆＺオペロン融合体を含有していた。
【０１００】
プラスミドｐＦＳ９２は多段階法で作製した。まず、ティー・プフェニジイ（Ｔ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ）ｐｈａＥを、操作されたＥｃｏＲＩおよびＡｃｃ６５Ｉ制限部位を含有するプライマーＦＳ−Ｅ５’およびＦＳ−Ｅ３’でｐＭＯＮ２５８９３（Ｒｅｉｓｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５３（２）：２０９−２１８（２０００））から増幅した。ついで該ｐｈａＥ  ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃ６５Ｉで消化し、同様にして消化されたｐＴｒｃＮ（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：９３１１−９３２０（１９９４））に連結して、ｐＦＳ８９を得た。ＦＳ−Ｅ５’のプライマー配列は（５’）−ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＧＡＴＡＣＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣ（配列番号１）であり、ＦＳ−Ｅ３’のプライマー配列は（５’）−ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＧＣＧＧＣＧ（配列番号２）である。次にティー・プフェニジイ（Ｔ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ）ｐｈａＣを、操作されたＡｃｃ６５ＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含有するＦＳ−Ｃ５’およびＦＳ−Ｃ３’でｐＭＯＮ２５８９４（Ｒｅｉｓｅｒら，Ａｐｐｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３（２）：２０９−２１８（２０００））から増幅した。ついで該ｐｈａＣ  ＰＣＲ産物を制限酵素Ａｃｃ６５ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、同様にして消化されたｐＴｒｃＮに連結して、ｐＦＳ９０を得た。ＦＳ−Ｃ５’のプライマー配列は（５’）−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＧ（配列番号３）であり、ＦＳ−Ｃ３’のプライマー配列は（５’）−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＧＣＣＧ（配列番号４）である。にティー・プフェニジイ（Ｔ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ）ｐｈａＥおよびｐｈａＣをｐＴｒｃＮ内に個々にクローニングして、それぞれｐＦＳ８９およびｐＦＳ９０を得た後、ｐＦＳ８９をＭｌｕＩおよびＡｃｃ６５Ｉで消化し、該ｐｈａＥ含有断片を単離し、それを、同様に消化されたｐＦＳ９０の調製物に連結することにより、ｐｈａＥをｐｈａＣの上流にクローニングした。得られたプラスミドｐＦＳ９１はＰＴｒｃプロモーター下にｐｈａＣオペロン融合体を含有していた。最後に、ｐｈａＥＣを含有するｐＦＳ９１からのＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＦＳ１６に連結することにより、ｐＦＳ９２を作製した。プラスミドｐＦＳ９２はＰＴｒｃプロモーター下にｐｈａＥＣ−ｏｒｆＺオペロン融合体を含有する。
【０１０１】
ａｌｋＫ（表１Ａを参照されたい）をｐｈａＥＣの下流のｐＦＳ９１内にクローニングすることにより、プラスミドｐＭＳ９６を作製した。まず、ＰＣＲ産物の末端にＢａｍＨＩ部位を含むように操作されたプライマーＫ５−１およびＫ３−１を使用して、ピー・オレオボランス（Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ゲノムＤＮＡからａｌｋＫをＰＣＲ増幅した。プライマーＫ５−１の配列は（５’）−ＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＡＴＣ（配列番号５）であり、プライマーＫ３−１の配列はＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧ（配列番号６）である。増幅後、ａｌｋＫ  ＰＣＲ断片およびｐＦＳ９１（前記段落に記載されている）をＢａｍＨＩで消化し、連結してｐＭＳ９６を得た。ｐＭＳ９６におけるａｌｋＫの配向はｐｈａＥＣと同じ方向であることが制限酵素消化により確認された。したがって、これはＰＴｒｃプロモーター下のｐｈａＥＣ−ａｌｋＫオペロン融合体の適切な構築を保証するものである。
【０１０２】
ｐＡＣＹＣ１７７（アクセッション番号Ｘ０６４０２）を、まず、ＢｓｐＨＩで消化してｋａｎマーカーを取り出し、それをｐＦＳ３０の唯一のＢｓｐＨＩ部位内に連結してｐＦＳ７３（これは縦列プロモーターＰＴｒｃおよびＰＲｅの制御下にｐｈａＣ−ｏｒｆＺを含有する）を得ることにより、プラスミドｐＭＳ９３およびｐＭＳ１０２を構築した。ＰＲｅとｐｈａＣ  ＣＤＳの５’末端からの８３７ｂｐとの両方を含有するｐＦＳ７３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＥＩ断片を、ｐｈａＣの５’末端からの８３７ｂｐのみを含有するｐＫＡＳ４（Ｐｅｏｐｌｅｓら，米国特許第５，４８０，７９４号）からのＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＥＩ断片で置換することにより、該ＰＲｅプロモーター領域を除去した。この得られたプラスミドはＰＴｒｃプロモーターのみの制御下でｐｈａＣ−ｏｒｆＺを含有し、該プラスミドをｐＭＳ９３と命名した。ｐＭＳ１０２を作製するために、該ｏｒｆＺ遺伝子をｐＦＳ７３から除去した。これは、ＤｒａＩで消化し、該プラスミドバックボーンを自己連結してｐＭＳ７４を得ることにより行った。プライマーＫ５−２およびＫ３−２を使用して、プラスミドｐＴｒｃＮ−Ａ．ｅｕｔ−ＡｌｋＫ（後記）からａｌｋＫ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマーＫ５−２の配列は（５’）−ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＡＴＣ（配列番号７）であり、プライマーＫ３−２の配列は（５’）−ＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧ（配列番号８）である。ついでプラスミドｐＭＳ７４をＳｐｅＩおよびＳｂｆＩで消化し、ついでクレノウ・フィル・イン（クレノウを使用して埋めること）により平滑末端化し、該ａｌｋＫ  ＰＣＲ断片を該平滑化ｐＭＳ７４バックボーンに連結してｐＭＳ９２を得た。したがってプラスミドｐＭＳ９２は縦列プロモーターＰＴｒｃおよびＰＲｅの制御下にｐｈａＣ−ａｌｋＫオペロン融合体を含有する。該オペロンを専らＩＰＴＧ誘導性ＰＴｒｃプロモーターから発現させるために、ＰＲｅとｐｈａＣ  ＣＤＳの５’末端からの８３７ｂｐとの両方を含有するｐＦＳ７３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＥＩ断片を、ｐｈａＣの５’末端からの８３７ｂｐのみを含有するｐＭＳ９３からのＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＥＩ断片で置換することにより、該ＰＲｅプロモーター領域を除去した。この得られたプラスミドはＰＴｒｃプロモーターのみの制御下でｐｈａＣ−ａｌｋＫを含有し、該プラスミドをｐＭＳ１０２と命名した。
【０１０３】
プライマーＰｏｓｙｎｒｂｓ．ｃ（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧ）（配列番号９）およびＰｏｓｙｎｒｂｓ．ｒ（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＧ）（配列番号１０）を使用して、ピー・オレオボランス（Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）ゲノムＤＮＡからのａｌｋＫを、まず、ＰＣＲ増幅し、プラスミドｐＴｒｃＮ−Ａ．ｅｕｔ−ＡｌｋＫを作製した。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、同様にして消化されたｐＴｒｃＮに連結して、ｐＴｒｃＮ−ＡｌｋＫを得た。ついで、プライマーＡ．ｅｕｔＰｈａＧ．ｃ（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧＣＴＧＧＣ）（配列番号１１）およびＡ．ｅｕｔ．ＥｃｏＲＩ．ｒ（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＣＴ）（配列番号１２）を使用して、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）ゲノムＤＮＡから該ＰＲｅプロモーターをＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、同様にして消化されたｐＴｒｃＮ−ＡｌｋＫに連結してｐＴｒｃＮ−Ａ．ｅｕｔ−ＡｌｋＫを得た。
【０１０４】
プラスミドｐＦＳ９２、ｐＭＳ９６、ｐＭＳ９３およびｐＭＳ１０２を個々にＭＧ１６５５（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（１１）：３４０１−３４０７（１９９３））内に形質転換して、ＣｏＡトランスフェラーゼ／シンテターゼ（ｏｒｆＺまたはａｌｋＫ）とＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣまたはｐｈａＥＣ）との異なる組合せを含有する４プラスミド含有株を得た。以下の節に記載されているとおり、Ｐ（５ＨＶ）同種重合体の産生を特徴づけるために、これらの株を２５０ｍＬの振とうフラスコ内で増殖させた。
【０１０５】
振とうフラスコ培養におけるＰ（５ＨＶ）同種重合体の製造のための培地、増殖条件および試験
適当な抗生物質で補足された３ｍＬのＬＢ（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））を含有する試験管内で各プラスミド含有ＭＧ１６５５株を３７℃で２５０ｒｐｍの振とうで一晩増殖させた。各株に適した抗生物質は以下のとおりである：ｐＦＳ９２およびｐＭＳ９６含有ＭＧ１６５５株の一晩培養に１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを加え、ｐＭＳ９３およびｐＭＳ１０２含有ＭＧ１６５５株の一晩培養に５０μｇ／ｍＬ  Ｋｍを加えた。翌日、０．５ｍＬの一晩培養を使用して、適当な抗生物質で補足された５０ｍＬの新鮮なＬＢを含有する振とうフラスコに接種し、３７℃で２５０ｒｐｍの振とうで増殖させた。３．５時間の時点で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを該液体培養に加え、５時間の時点で該培養を４１５０ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ卓上遠心機）で遠心沈殿させ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび同じ抗生物質を含有する５０ｍＬの生産培地に再懸濁させた。該生産培地は、１０ｇ／Ｌ  グルコース、２．５ｇ／Ｌ  ＬＢ、１０ｇ／Ｌ  Ｎａ５ＨＶ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４および１×微量塩溶液を含有する１×Ｅ２最少塩溶液からなる。５０×Ｅ２ストック溶液は１．２７５Ｍ  ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ、１．６４３Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４および１．３６Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４からなる。１０００×ストック微量塩溶液は、１．５Ｎ  ＨＣＬ、５０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｇ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７および１０ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１Ｌ当たりに加えることにより調製される。
【０１０６】
該再懸濁培養を２５０ｍＬの振とうフラスコに移し、振とうしながら３０℃で２４〜７２時間温置した。該実験の終了時に、培養を４１５０ｒｐｍで遠心沈殿させ、蒸留水で１回洗浄し、少なくとも３０分間にわたり−８０℃で凍結させ、一晩にわたり凍結乾燥させた。翌日、測定された量の凍結乾燥細胞ペレットをガラス管に加え、ついで、２ｍｇ／ｍＬ  ジフェニルメタンを内部標準として含有するジオキサン中の９９．９％  ｎ−ブタノールおよび４．０Ｎ  ＨＣｌの等容量混合物からなる３ｍＬのブタノリシス試薬を加えた。該管に蓋をした後、それらを手短にボルテックスし、９３℃に設定された加熱ブロック上に、定期的にボルテックスしながら６時間配置した。ついで該管を室温に冷却した後、３ｍＬの蒸留水を加えた。該管を約１０秒間ボルテックスした後、６２０ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ卓上遠心機）で２分間遠心沈殿させた。１ｍＬの有機相をＧＣバイアル内にピペッティングし、ついでこれをガスクロマトグラフィー−フレームイオン化検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ）により分析した。別のブタノリシス反応において一定量のＤＶＬを加えることにより作成した標準曲線と比較することにより、該細胞ペレット中のＰ（５ＨＶ）同種重合体の量を決定した。該標準曲線を作成するために、２〜６ｍｇの範囲の３つのＤＶＬ標準物を使用した。
【０１０７】
実験結果
表２は、全ての構築物がＰ（５ＨＶ）を産生することが可能であったことを示している。しかし、ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］は、その他の株のいずれよりも有意に大量のＰ（５ＨＶ）を産生した。このことは、Ｐ（５ＨＶ）を重合するための最適な遺伝子の組合せがｐｈａＣおよびｏｒｆＺであることを示している。
【０１０８】
【表２８】
2015211681.tif 000031
【実施例２】
【０１０９】
ナトリウム５−ヒドロキシバレラートからのＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の生合成
次の実験は、３ＨＢ−ＣｏＡおよび５ＨＶ−ＣｏＡ単量体を合成しそれらをＰＨＡ内に組込みうる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株におけるＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の製造を示すためのものであった。
【０１１０】
株の構築
この実験で使用した株はＭＢＸ２６４１であった。これは、染色体内にランダムに組込まれるアール・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６  ｂｋｔＢ−Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｐｈａＢ−ｋａｎからなるオペロンを含有するＭＧ１６５５誘導体である。該オペロン組込みを行うために、文献（Ｄｅ  ＬｏｒｅｎｚｏおよびＴｉｍｍｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２３５：３８６−４０５（１９９４））から選ばれたプロトコールを用いて、ｐＣＪ０２２（後記）を含有する株Ｓ１７−１λｐｉｒ（ＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（６）：２５７５−２５８３（１９８８））を、ＭＧ１６５５のナリジクス酸耐性突然変異体であるＭＢＸ１９８７と接合させた。染色体内に該ｂｋｔＢ−ｐｈａＢ−ｋａｎカセットを含有するＭＢＸ１９８７の誘導体を、３０μｇ／ｍＬ  ナリジクス酸（ＮＩ）および５０μｇ／ｍＬ  カナマイシン（Ｋｍ）を含有するＬＢプレート上で選択した。ＮｌＲＫｍＲ表現型を示す１つのそのような組込み体をＭＢＸ２０７９として確保した。ついで、組込みベクターｐＵＴ−Ｃ１６−ｃａｔ（後記）を含有するＳ１７−１λｐｉｒ株との接合により、ｐｈａＥＣ−ｃａｔをＭＢＸ２０７９の染色体内にランダムに組込んだ。染色体内にｐｈａＥＣ−ｃａｔカセットを含有するＭＢＸ２０７９の組込み体を、２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール（Ｃｍ）を含有するＬＢプレート上で選択した。ＮｌＲＫｍＲＣｍＲ表現型を含有する幾つかの組込み体をプールし、１００μｇ／ｍＬ  Ｃｍを含有するＬＢプレート上での選択を伴うニトロソグアニジン突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２））に付した。１つの突然変異体を単離し、ＭＢＸ２１１４と命名した。最後に、Ｍｉｌｌｅｒ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２））により記載されているとおり、ＫｍＲを選択因子として用いて、Ｐ１ライセートをＭＢＸ２１１４上で産生させ、ＭＧ１６５５内に形質導入することにより、ＭＢＸ２６４１を作製した。１つのそのような形質導入体を確保し、ＭＢＸ２６４１と命名した。これは、ゲノム内にランダムに組込まれたｂｋｔＢ−ｐｈａＢ−ｋａｎ遺伝子カセットを含有するＭＧ１６５５である。
【０１１１】
プラスミドｐＦＳ９２（実施例１を参照されたい）およびｐＪＢ８４（構築は後記）を、染色体内にランダムに組込まれたｂｋｔＢ−ｐｈａＢ−ｋａｎを含有するＭＢＸ２６４１内に個々に形質転換した。
【０１１２】
プラスミドの構築
ｋａｎマーカーの上流にｂｋｔＢ−ｐｈａＢを含有する小型Ｔｎ５組込みベクターを作製することにより、プラスミドｐＣＪ０２２を作製した。これを行うために、まず、ｐＭＯＮ２５７６５（Ｓｌａｔｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（８）：１９７９−１９８７（１９９８））からプライマーＭＳ０６９およびＭＳ０７０でｂｋｔＢをＰＣＲ増幅することにより、ｂｋｔＢ−ｐｈａＢオペロンをｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で合体させた。プライマーＭＳ０６９の配列は（５’）−ＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧ（配列番号１３）であり、プライマーＭＳ０７０の配列は（５’）−ＧＧＴＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＣＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧ（配列番号１４）である。得られたＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、同じ酵素で切断されたｐＳＥ３８０に連結した。得られたプラスミドをｐＳＥ３８０−ｂｋｔＢと命名した。次に、プライマーＭＳ０７１およびＭＳ０７２でｐｈａＢをｐＧＭ１０（ＭｃＣｏｏｌおよびＣａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１（２）：５８５−５９２（１９９９））からＰＣＲ増幅した。プライマーＭＳ０７１の配列は（５’）−ＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＧ（配列番号１５）Ｔであり、プライマーＭＳ０７２の配列は（５’）−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＡＡＧＣＣＧＣＣＧＴＴＡＡＴ（配列番号１６）である。得られたＰＣＲ断片をＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で処理されたｐＳＥ３８０−ｂｋｔＢに連結した。得られたプラスミドをｐＳＥ３８０−ｂｋｔＢｐｈａＢ１９と命名した。該オペロンを合体させた後、ｐＳＥ３８０−ｂｋｔＢｐｈａＢ１９をＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、ｂｋｔＢ−ｐｈａＢ含有断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断されたｐＴｒｃＮ−ｋａｎに連結することにより、該オペロンをｐＴｒｃＮ−ｋａｎ（ｂｌａ遺伝子がｋａｎ遺伝子で置換されているｐＴｒｃＮの誘導体）に移した。得られたプラスミドをｐＭＳ１１５と命名した。ついでｂｋｔＢ−ｐｈａＢオペロンをｐＭＳ１１５からｐＢＳＬ１１８組込みベクター（Ａｌｅｘｅｙｅｖら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：１０５３−１０５５（１９９５））に移した。これは、ｐＭＳ１１５およびｐＢＳＬ１１８をＢａｍＨＩで消化し、互いに連結してプラスミドｐＣＪ０２２を得ることにより行った。該プラスミドを使用して、ｂｋｔＢ−ｐｈａＢをＭＧ１６５５の染色体内に組込んだ。
【０１１３】
ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでｐｈａＥＣをｐＦＳ９１から取り出し、クレノウを使用して粘着末端を平滑化することにより、プラスミドｐＵＴ−Ｃ１６ｃａｔを作製した。組込みベクターｐＵＴ−ｃａｔ（Ｄｅ  ＬｏｒｅｎｚｏおよびＴｉｍｍｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３５：３８６−４０５（１９９４））をＡｖｒＩＩで消化し、クレノウ・フィル・インを用いて平滑化し、ついで該ｐｈａＥＣ断片に連結した。ｐｈａＥＣが下流ｃａｔマーカーと同じ配向であることを確認した後、該プラスミドをｐＵＴ−Ｃ１６ｃａｔと命名した。
【０１１４】
５’隣接末端にＢｓｐＨＩ部位を含むように操作されたＪＢ１２３ｂおよびＪＢ１２４ａを使用してｐＢＳＬ２０２（Ａｌｅｘｅｙｅｖら，Ｃａｎ．Ｊ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：１０５３−１０５５（１９９５））からａａｃＣ（ＧｍＲ）マーカーをＰＣＲ増幅することにより、プラスミドｐＪＢ８４を構築した。プライマーＪＢ１２３ｂの配列は（５’）−ＴＴＡＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＣＣＴＣＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＧＣＴＣ（配列番号１７）であり、プライマーＪＢ１２４ａの配列は（５’）−ＴＴＡＴＴＴＣＡＴＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号１８）である。ａａｃＣ遺伝子を含有する得られたＰＣＲ断片をＢｓｐＨＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＭＳ９３に連結してｐＪＢ８４を得た。この最終工程は、ｐＭＳ９３上の元のｂｌａ（ＡｐＲ）マーカーを同じ配向でａａｃＣ（ＧｍＲ）で置換するために行ったことに注目されたい。
【０１１５】
実験結果
実施例１に記載されているとおりに、プラスミドｐＦＳ９２（実施例１に記載されている）またはｐＪＢ８４を含有するＭＢＸ２６４１株を増殖させ、ＧＣ−ＦＩＤ分析のために調製した。表３に示すとおり、ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ８４］は、より大量の共重合体を産生し（６９．５％  ｄｃｗ）、より大量の５ＨＶを共重合体内に組込んだ（８２．３％  ＰＨＡ）。
【０１１６】
【表２９】
2015211681.tif 000032
【実施例３】
【０１１７】
Ｐ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体における調節可能な５ＨＶ単量体組成および物質特性に対する効果
生産培地に加えるＮａ５ＨＶおよびグルコースの量を変化させることにより、共重合体組成を調節した。これを達成するための代替方法は、（１）実施例６に示すとおり、Ｌ−リシンから５ＨＶを産生しうる組換え細胞の増殖培地に種々の量のＬ−リシンを供給し、または（２）実施例９および１０に示されているとおり、グルコースからＬ−リシンを経由して５ＨＶを産生しうる組換え細胞におけるＬ−リシン経路の遺伝子を脱調節することを含む。
【０１１８】
Ｐ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体における調節可能な５ＨＶ単量体組成を実証するために、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ｏｒｆＺ）およびＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）に加えて３ＨＢ経路の酵素（ｂｋｔＢおよびｐｈａＢ）を発現する株ＭＢＸ２６４１［ｐＦＳ３０］を使用した。ＭＢＸ２６４１［ｐＦＳ３０］の並行実験用培養物を、漸減濃度のグルコース（１０、５、１、０．５、０．１、０ｇ／Ｌ）またはＮａ５ＨＶ（１０、５、１、０．５、０．１、０ｇ／Ｌ）のいずれかにおいて増殖させ、実施例１に記載されているとおりに重合体含量に関して分析した。表４は、種々の量の５ＨＶがＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体内に組込まれうることを示している。
【０１１９】
【表３０】
2015211681.tif 000033
【０１２０】
もう１つの実験において、広範な５ＨＶ組成を有する合計１０個のＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体サンプルを調製し、ついで示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析のために抽出した。表５は、該Ｐ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体における５ＨＶの組成比率が増加するにつれてガラス転移温度（Ｔｇ）が減少したことを示している。これは、５ＨＶコモノマー組成を調節することにより広範な物質特性が得られうることを示している。
【０１２１】
【表３１】
2015211681.tif 000034
【実施例４】
【０１２２】
脂肪酸分解系を経由するＮａ５ＨＶからの３−ヒドロキシプロピオナートの合成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の脂肪酸分解（ＦＡＤ）系が５ＨＶをアセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ（３ＨＰ−ＣｏＡ）に分解しうるかどうかを判定するために、プラスミドｐＭＳ９３（ＰｔｒｃプロモーターからｐｈａＣ−ｏｒｆＺを発現する；実施例１を参照されたい）を、ｆａｄＲ＋，ａｔｏＣ＋（抑制ＦＡＤ）またはｆａｄＲ−，ａｔｏＣｃｏｎｓｔ（脱抑制ＦＡＤ）のいずれかである大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株内に形質転換した。ＭＧ１６５５およびＬＳ５２１８（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６（３）：１１６６−１１６９（１９８１））を、それぞれｆａｄＲ＋，ａｔｏＣ＋およびｆａｄＲ−，ａｔｏＣｃｏｎｓｔ株として使用した。実施例１に記載されているとおりに振とうフラスコ内にＮａ５ＨＶを供給することにより、ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］およびＬＳ５２１８［ｐＭＳ９３］を試験した。ＬＳ５２１８［ｐＭＳ９３］はＰ（５ＨＶ−コ−３ＨＰ）を産生するが、ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］はそれを産生しないことを、ＧＣ−ＦＩＤおよびＧＣ−質量分析（ＭＳ）分析は示した（表６）。これは、活性脂肪酸の分解が５ＨＶから３ＨＰを産生することを示している。
【０１２３】
【表３２】
2015211681.tif 000035
【実施例５】
【０１２４】
Ｌ−リシンからのＰ（５ＨＶ）同種重合体の生合成
Ｌ−リシンをＰ（５ＨＶ）に変換するために案出された経路を図２Ｂに図示する。該経路は、以下の６つの異種遺伝子がクローニングされ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されることを要する：ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｄａｖＢ、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｄａｖＡ、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｄａｖＴ、エイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ｇｓａＲＡｔ、シー・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ｏｒｆＺおよびアール・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）ｐｈａＣ（表１Ａを参照されたい）。ｄａｖＢＡＴ遺伝子がｐＡＣＹＣ１８４（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６（１９７８））内にクローニングされ、ｇｓａＲＡｔ、ｏｒｆＺおよびｐｈａＣがｐＳＥ３８０内にクローニングされるよう、クローニング法を計画した。これらのプラスミドは、それぞれｐＪＢ９１およびｐＭＺ２８と称され、それらの構築を次節で説明する。
【０１２５】
プラスミドの構築
プライマーＪＢ１３４（５’−ＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣ）（配列番号１９）およびＪＢ１３５（５’−ＡＡＴＡＡＣＡＣＧＴＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＴ）（配列番号２０）でプラスミドｐＳＥ３８０のマルチクローニング部位をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢｍｇＢＩで消化し、ＥｃｏＲＶおよびＮｒｕＩで消化されたプラスミドｐＡＣＹＣ１８４内にクローニングしてｐＪＢ７８を得た。
【０１２６】
プラスミドｐＪＢ９１を３工程法で構築した。まず、ＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩ制限部位をｄａｖＢＡ  ＰＣＲ産物のそれぞれ５’および３’末端に組込むように操作されたＪＢ１３６およびＪＢ１３７を使用して、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来のｄａｖＢＡをゲノムＤＮＡ調製物からＰＣＲ増幅した。プライマーＪＢ１３６の配列は（５’）−ＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡ（配列番号２１）であり、プライマーＪＢ１３７の配列は（５’）−ＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡ（配列番号２２）である。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、同じ酵素で処理されたｐＪＢ７８に連結してプラスミドｐＪＢ７９を得た。次に、ＳｐｅＩおよびＡｐａＬＩ制限部位をｄａｖＴ  ＰＣＲ産物のそれぞれ５’および３’末端に組込むように操作されたＪＢ１３８およびＪＢ１３９を使用して、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来のｄａｖＴ遺伝子をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プライマーＪＢ１３８の配列は（５’）−ＴＡＴＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＡＡＴＣ（配列番号２３）であり、プライマーＪＢ１３９の配列は（５’）−ＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＴＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣ（配列番号２４）である。得られたＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＡｐａＬＩで消化し、同じ酵素で処理されたｐＪＢ７９に連結してプラスミドｐＪＢ８０を得た。最後に、ＢｍｇＢＩおよびＡｓｅＩ制限部位を５’および３’末端に組込むように操作されたＪＢ１４１およびＪＢ１４２を使用して、ｏｍｐＡプロモーターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢｍｇＢＩおよびＡｓｅＩで消化し、ＳｎａＢＩおよびＮｄｅＩで処理されたｐＪＢ８０に連結してプラスミドｐＪＢ８２を得た。プライマーＪＢ１３６およびＪＢ１３７（前記のとおり）を使用して得られたｄａｖＢＡ  ＰＣＲ産物をＤｒａＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＪＢ８２に該５０７ｂｐ断片を連結してプラスミドｐＪＢ９１を得ることにより、プラスミドｐＪＢ９１を構築した。この構築は、ｐＪＢ８２のｄａｖＢ  ＣＤＳにおいて見出されたナンセンス突然変異を矯正するために行った。プラスミドｐＪＢ８０は構成的Ｐｔｅｔプロモーター下にｄａｖＢＡＴオペロンを含有し、プラスミドｐＪＢ９１は強力なＰｏｍｐＡプロモーター下に同じオペロンを含有する。
【０１２７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２内での発現に関してコドン最適化されたｇｓａＲＡｔを含有する、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により作製される構築物であるプラスミドｐＪ３１：７９５０をＢｓｒＧＩで消化することにより、プラスミドｐＭＺ２８を構築した。ｇｓａＲＡｔを含有する得られた断片を、同様にＢｓｒＧＩで切断されたｐＦＳ３０に連結した。ｇｓａＲＡｔの配向がｐｈａＣ−ｏｒｆＺと同じ方向であることを制限酵素消化により確認した後、得られたプラスミドをｐＭＺ２８と命名した。
【０１２８】
実験結果
Ｌ−リシンからＰ（５ＨＶ）への不完全な経路を発現するＭＧ１６５５［ｐＭＺ２８］、およびＬ−リシンからＰ（５ＨＶ）への完全な経路を発現するＭＧ１６５５［ｐＭＺ２８、ｐＪＢ９１］を、適当な抗生物質（ｐＪＢ９１では２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール；ｐＭＺ２８では１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で補足された３ｍＬのＬＢを含有する試験管内に接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。翌日、０．５ｍＬの各一晩培養物を使用して、適当な抗生物質で補足された５０ｍＬの新鮮なＬＢを含有する振とうフラスコに接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で増殖させた。３．５時間の時点で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを該液体培養に加え、５時間の時点で該培養を４１５０ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ卓上遠心機）で遠心沈殿させ、１０ｇ／Ｌ  グルコース、２．５ｇ／Ｌ  ＬＢ、１０ｇ／Ｌ  Ｌ−リシン、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１×微量塩溶液および０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する１×Ｅ２最少塩溶液からなる５０ｍＬの生産培地に再懸濁させた。Ｅ２塩および微量塩溶液の調製法は実施例１に記載されている。
【０１２９】
振とうフラスコ増殖条件、およびＰＨＡ含量に関する分析法は、実施例１に記載されているとおりである。表７は、ｄａｖＢＡＴオペロンの導入後に８倍多いＰ（５ＨＶ）が産生されたことを示している。
【０１３０】
【表３３】
2015211681.tif 000036
【実施例６】
【０１３１】
Ｌ−リシンからのＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の生合成
また、Ｌ−リシンから、そして結局はグルコースからＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体を産生させるために、Ｌ−リシンをＰ（５ＨＶ）に変換するために案出された経路を、ｂｋｔＢおよびｐｈａＢを発現する株ＭＢＸ２６４１内に導入した。
【０１３２】
プラスミドの構築
この実施例における経路を含む遺伝子には、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｄａｖＢ、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｄａｖＡ、ピー・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｄａｖＴ、シー・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ｏｒｆＺ、アール・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）ｐｈａＣ、およびエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ｇｓａＲＡｔまたはエイ・テレウス（Ａ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ｇｓａＲＡｔ２（表１Ａを参照されたい）が含まれる。
【０１３３】
ｇｓａＲＡｔ２、ｐｈａＣおよびｏｒｆＺ遺伝子からなる代替経路を含有するプラスミドｐＪＢ９０を以下のとおりに作製した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２における発現に関してコドン最適化されたエイ・テレウス（Ａ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ｇｓａＲＡｔ２遺伝子を、プライマーＪＢ１４５およびＪＢ１４６を使用して、ｐＳＧ４０（ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により作製された構築物）からＰＣＲ増幅した。どちらのプライマーも５’末端にＢｇｌＩＩ部位を含有していた。プライマーＪＢ１４５の配列は（５’）−ＴＴＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＧ（配列番号２５）であり、プライマーＪＢ１４６の配列は（５’）−ＴＴＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＣＧＧＡＡＡＴＡＧＴＴＴＧＧＡＣ（配列番号２６）である。得られたＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩで消化し、ｐＪＢ８４の対応部位内に連結してｐＪＢ９０を得た。
【０１３４】
実験結果
Ｌ−リシンおよびグルコースからのＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）の産生を特徴づけるために、実施例１および２に記載されているとおりに、株ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ７８、ｐＪＢ８４］、ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ９１、ｐＭＺ２８］およびＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ９１、ｐＪＢ９０］を振とうフラスコ内で増殖させ、ＰＨＡ含量および組成に関して分析した。ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ７８、ｐＪＢ８４］、ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ９１、ｐＭＺ２８］およびＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ９１、ｐＪＢ９０］を、２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールおよび１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンで補足された３ｍＬのＬＢを含有する試験管内に接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。翌日、０．５ｍＬの各一晩培養物を使用して、同じ抗生物質で補足された５０ｍＬの新鮮なＬＢを含有する振とうフラスコに接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で増殖させた。３．５時間の時点で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを該液体培養に加え、５時間の時点で該培養を４１５０ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ卓上遠心機）で遠心沈殿させ、１０ｇ／Ｌ  グルコース、２．５ｇ／Ｌ  ＬＢ、１０ｇ／Ｌ  Ｌ−リシン、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１×微量塩溶液および０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する１×Ｅ２最少塩溶液からなる５０ｍＬの生産培地に再懸濁させた。Ｅ２塩および微量塩溶液の調製法は実施例１に記載されている。
【０１３５】
表８に示されているとおり、Ｌ−リシンを５ＨＶに変換する遺伝子を有さない株ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ７８、ｐＪＢ８４］はＬ−リシンから５ＨＶを産生できず、Ｐ（３ＨＢ）同種重合体のみを産生した。Ｌ−リシンから５ＨＶ−ＣｏＡへの全経路を共に含有する株ＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ９１、ｐＭＺ２８］およびＭＢＸ２６４１［ｐＪＢ９１、ｐＪＢ９０］は全共重合体のそれぞれ２．５％ｗｔおよび５％ｗｔまで５ＨＶを組込んだ。これは、Ｌ−リシンから５ＨＶ含有共重合体を産生させるためにはｄａｖＢＡＴおよびｇｓａＲ遺伝子が発現される必要があることを示している。
【０１３６】
【表３４】
2015211681.tif 000037
【実施例７】
【０１３７】
Ｌ−リシンからの５ＨＶ含有ＰＨＡ重合体の生合成の改善
５ＨＶは意外に低レベルで組込まれたため、競合経路の存在に注目した。グルタラートがＬ−リシンから産生されうるかどうかを調べるために、該プラスミドからｄａｖＢＡＴ遺伝子を発現するＭＧ１６５５［ｐＪＢ９１］を、２５ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地内で、振とうしながら３０℃で６時間増殖させた。２５μＬの中期対数相の培養物のアリコートを４７５μＬのＥ０最少培地に接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間温置した。該Ｅ０最少培地は１０ｇ／Ｌ  グルコース、４ｇ／Ｌ  リシン、５８ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素からなるものであった。上清中に存在するグルタラートを以下のとおりにＧＣ−ＭＳにより測定した。遠心分離により発酵ブロスからの上清を得、該サンプルの１μＬを、１μＬの１ｇ／Ｌ  ４−アミノブチラート（ＧＡＢＡ）を内部標準として含有する新鮮なエッペンドルフ管にピペッティングした。サンプルをＬａｂｃｏｎｃｏセントリバプ（ｃｅｎｔｒｉｖａｐ）において乾燥させ、１００μＬのアセトニトリル（ＡＣＮ）：Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−Ｎ−メチルトリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）１：１溶液に３時間にわたり音波処理により再懸濁させた。ついでサンプルを６５℃で３０分間誘導体化し、遠心分離して不溶性物質を除去し、以下の獲得パラメーターを用いて、ＨＰ−５ｍｓカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ５９７５  ＧＣ−ＭＳ内に上清を注入した：キャリヤーガス  ヘリウム流量２ｍｌ／分、走査モードｍ／ｚ６５〜７００、溶媒遅延３．５分間、オーブンプログラム：１５０℃で２分間、ついで３℃／分で２８０℃まで上昇、イオン源温度２３０℃、四重極質量フィルター温度１５０℃。
【０１３８】
興味深いことに、ｄａｖＢＡＴオペロンがＭＧ１６５５において過剰発現された場合に、０．６ｇ／Ｌ  グルタラートがＬ−リシンから産生された。該ｄａｖＢＡＴオペロンは、Ｌ−リシンをＧＳＡに変換する酵素をコードする遺伝子を発現する。グルタラートは、コード化酵素がＧＳＡをグルタラートへと酸化する内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子により産生されうる。
【０１３９】
ＧＳＡからグルタラートへの有りそうな酵素反応の精査は２つの可能な内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＳＡデヒドロゲナーゼ遺伝子ｇａｂＤおよび／またはｙｎｅＩの特定をもたらした（表１Ａを参照されたい）。これらの２つの遺伝子はコハク酸セミアルデヒドをコハク酸へと酸化することが既に確認されているが（ＤｅｎｎｉｓおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，米国特許第６，１１７，６５８号）、ＧＳＡをグルタラートへと酸化することは未だ示されていない。ｇａｂＤ−およびｙｎｅＩ−陰性株がＬ−リシンからグルタラートを尚も産生するかどうかを試験するために、以下の株を構築した。
【０１４０】
ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−６６４５（２０００））により記載されているＲｅｄ／ＥＴリコンビニアリング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）法により、単一のヌルｇａｂＤおよびｙｎｅＩ突然変異体を構築した。ＭＧ１６５５の染色体からｇａｂＤを欠失させる方法は、ＰＣＲ媒介相同組換えによるＦＲＴ隣接ｋａｎマーカーでのｇａｂＤの置換を含むものであった。プライマー
【０１４１】
【化１】
2015211681.tif 000038
を使用して、該ＦＲＴ隣接ｋａｎマーカーをプラスミドｐＫＤ４（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｒｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−６６４５（２０００））からＰＣＲ増幅した。
【０１４２】
ＦＲＴ隣接ｋａｎマーカーでの置換によりＭＧ１６５５の染色体から該ｙｎｅＩ遺伝子を欠失させた。欠失すべき遺伝子に対して相同な５０ｂｐの隣接領域を導入するプライマーＭＳ２２０  ５’−ＧＣＡＡＧＡＧＴＡＡＡＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＣＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号２９）およびＭＳ２１７  ５’−ＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＣＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴ（配列番号３０）を使用して、このマーカーをプラスミドｐＫＤ４からＰＣＲ増幅した。このＤＮＡ断片でのｙｎｅＩの置換は機能しなかったため、遺伝子置換のための相同性の増強された領域を有する別のＰＣＲ断片を作製した。これを達成するために、前記で作製されたＰＣＲ断片を鋳型として使用し、プライマーＭＳ２２３  ５’−ＴＣＧＡＴＴＣＧＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＧＣＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＴＡＡＡＴＣＴＧＣＧＴＡＴＣ（配列番号３１）およびＭＳ２２４  ５’−ＧＣＣＡＣＴＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＧ（配列番号３２）を使用して、追加的なラウンドのＰＣＲを行った。ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴでのｙｎｅＩの置換の成功がもたらされた。ついでＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０−６６４５（２０００））に記載されているとおりに該ｋａｎマーカーを除去した。
【０１４３】
ＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴからＭＧ１６５５ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴへのＰ１媒介形質導入によりＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ，ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴを構築し、前記と同じ方法を用いて残存ｋａｎマーカーを更に除去した。得られた株ＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ，ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴをｐＪＢ９１で形質転換し、ｄａｖＢＡＴ遺伝子を対応プラスミドから発現するＭＧ１６５５［ｐＪＢ９１］を使用する前記のものに類似した実験において、Ｌ−リシンからのグルタラート産生に関して分析した。
【０１４４】
Ｌ−リシンから０．６ｇ／Ｌ  グルタラートを産生したＭＧ１６５５［ｐＪＢ９１］とは対照的に、株ＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ，ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴ［ｐＪＢ９１］はＬ−リシンからグルタラートを全く産生しなかった。このことは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内因性ｇａｂＤおよび／またはｙｎｅＩがＧＳＡからグルタラートへの変換をもたらしたことを示している。
【０１４５】
Ｌ−リシンからのＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の産生の改善
３ＨＢ−コ−５ＨＶ共重合体を産生する株において内因性ＧＳＡデヒドロゲナーゼコード遺伝子ｇａｂＤおよびｙｎｅＩを欠失させることにより、Ｌ−リシンからの５ＨＶ流動の改善が達成された。
【０１４６】
プラスミドｐＪＢ９１およびｐＪＢ９０を株ＭＢＸ２６４１内に形質転換することにより、ＭＢＸ２８５５を構築した。この株は、グルコースおよびＬ−リシンからＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）を産生するための全ての遺伝子を有する。
【０１４７】
ＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ，ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴを、実施例２に記載されているとおり、ＰＨＢ産生能を付与するドナー株ＭＢＸ２１１４でＰ１形質導入した。この株を更に、それぞれ実施例６および５に記載されているとおりにＬ−リシンからＰ（５ＨＶ）への経路の遺伝子を発現するｐＪＢ９０およびｐＪＢ９１で形質転換した。得られた株をＭＢＸ３３７８と命名した。該株は、グルコースおよびＬ−リシンからＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）を産生するための全ての遺伝子を有するが、ＭＢＸ２８５５とは異なり、ｇａｂＤおよびｙｎｅＩ遺伝子の両方が該ゲノムから除去されている。
【０１４８】
株ＭＢＸ２８５５およびそのＧＳＡデヒドロゲナーゼ欠損対応物ＭＢＸ３３７８を使用して、振とうプレート発酵を行った。前記と同じ条件下（３０℃で３００ｒｐｍでの振とう）で、細胞を温置し、分析した。前実施例に記載されているとおり、Ｅ０最少培地は１０ｇ／Ｌ  グルコース、２ｇ／Ｌ  Ｌ−リシン、５８ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール、５μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素からなるものであった。表９に示すとおり、野生型ＧＳＡデヒドロゲナーゼ活性を含有するＭＢＸ２８５５と比較してＧＳＡデヒドロゲナーゼ欠損株ＭＢＸ３３７８においては、Ｌ−リシンから５ＨＶへの炭素流動が劇的に改善された。５ＨＶ含有ＰＨＡの産生を有意に改善するためには、ＧＳＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、例えばｇａｂＤおよびｙｎｅＩが産生宿主のゲノムから除去される必要がある。
【０１４９】
【表３５】
2015211681.tif 000039
【実施例８】
【０１５０】
グルコースからのＬ−リシンの生合成
Ｌ−リシン経路においては、遺伝子ｌｙｓＣおよびｄａｐＡによりアロステリックフィードバック調節が生じる。したがって、グルコースからのＬ−リシン産生の増大を可能にするためには、この制御が排除される必要がある。これを行うための方法は十分に確立されており、両方に遺伝子に関して既に記載されている（Ｋｏｊｉｍａら，米国特許第６，０４０，１６０号）。脱調節ｌｙｓＣおよびｄａｐＡを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異体は、まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からｍｅｔＬおよびｔｈｒＡを欠失させることにより得られうる。ＬｙｓＣ、ＭｅｔＬおよびＴｈｒＡは、全て同一アスパルタートキナーゼ反応を触媒するアイソザイムであるため、ｌｙｓＣにおける突然変異が陽性選択されうる前に後者の２つを除去することが必要であろう。ΔｍｅｔＬΔｔｈｒＡ株が作製されたら、それはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）で突然変異されうる。ついで、得られた突然変異体プールは、ｌｙｓＣおよびｄｐａＡに対して圧をかけるためにＬ−リシンの非代謝可能類似体であるＳ−２−アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）を含有する最少培地内で増殖されるであろう。ｍｅｔＬおよびｔｈｒＡが欠失しているため、ｌｙｓＣおよびｄｐａＡをＬ−リシン（またはそのＡＥＣ類似体）に対して脱感作する突然変異のみが、該細胞がＬ−リシン、トレオニンおよびメチオニンを合成して生存することを可能にするであろう。流動能を増加させ、転写調節を排除するために、脱調節ｌｙｓＣ、脱調節ｄｐａＡおよび他の経路遺伝子を組換えプロモーターから過剰発現させることにより、更なる操作が行われうる。
【実施例９】
【０１５１】
グルコースからのＰ（５ＨＶ）同種重合体の生合成
５ＨＶ−ＣｏＡ単量体をグルコースから合成しそれをＰＨＡ内に組込みうる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株において、唯一の炭素源としてのグルコースからＰ（５ＨＶ）を製造した。そのために、Ｌ−リシンからＰ（５ＨＶ）同種重合体を産生するのに要求される遺伝子を発現するばかりでなく、Ｌ−リシンフィードバック耐性ジヒドロジピコリナートシンターゼをコードするｄａｐＡｆｂｒと称される突然変異ｄｐａＡ遺伝子をも発現する株を構築した。この実施例の第１部では、この能力を示すのに必要なプラスミドの構築を説明することとする。
【０１５２】
プラスミドの構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においては、それぞれｌｙｓＣおよびｄｐａＡ遺伝子によりコードされるアスパルタートキナーゼＩＩＩおよびジヒドロジピコリナートシンターゼによりＬ−リシン経路においてアロステリック調節が生じる（図６）。グルコースからのＬ−リシンおよび最終的にはＰ（５ＨＶ）同種重合体の産生を増加させるためには、該アロステリック調節が低下または完全に排除される必要がある。これを行うための方法は十分に確立されており、両方の遺伝子に関して既に記載されている（Ｋｏｊｉｍａら，米国特許第６，０４０，１６０号）。第３５２ヌクレオチド残基がシトシンからチミンに変化したＬ−リシンフィードバック耐性ｄａｐＡｆｂｒ遺伝子（ｄａｐＡＣ３５２Ｔ）を構築した。これは、所望の塩基変化を導入するプライマーを使用する、２つのＤＮＡ断片を与える染色体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｐａＡ遺伝子のＰＣＲ増幅、およびそれに続く、それらの２つのＤＮＡ断片を融合する重複伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）スプライシングにより得た。ＳＯＥ−ＰＣＲ法は既に記載されている（Ｈｏら，Ｇｅｎｅ  ７７（１）：５１−９（１９８９））。詳細には、一方のＤＮＡ断片は、プライマーＤＥ０８１（５’−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＣＡＣＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣ）（配列番号３３）およびＤＥ０８２（５’−ＡＧＣＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＡＴＡＣＴＧＡＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＣ）（配列番号３４）で増幅された、ｄｐａＡ遺伝子の第１〜第３６６ヌクレオチド対を含有し、もう一方のＤＮＡ断片は、プライマーＤＥ０８３（５’−ＧＡＡＧＧＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＴ）（配列番号３５）およびＤＥ０８４（５’−ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴ）（配列番号３６）で増幅された、ｄｐａＡの第３３７〜第８７９ヌクレオチド対を含有していた。プライマーＤＥ０８２およびＤＥ０８３は逆相補的であり、第３５２ヌクレオチド残基においてシトシンからチミンへの塩基変化を導入するように設計された。第１ラウンドのＰＣＲからの２つのＤＮＡ断片を、プライマーＤＥ０８１およびＤＥ０８４を使用して、ＳＯＥ−ＰＣＲにより融合させた。得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、ＳｐｅＩおよびＳａｃＩで消化されたｐＤＥ０３１に連結してプラスミドｐＤＥ０３５を得た。合成された６３ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片（５’−ＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＣＣ）（配列番号３７）をＸｂａＩおよびＰｍｅＩで消化し、これらの部位を含有するように予め操作されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の同じ制限酵素部位内に連結することにより、合成構成的プロモーター（ＰｓｙｎＩ）を含有するプラスミドｐＤＥ０３１を構築した。ｐＤＥ０３５内のＰｓｙｎＩ−ｄａｐＡＣ３５２Ｔ遺伝子構築物をＸｈｏＩおよびＰｍｅＩで消化し、ついで、ＢｓｒＧＩで消化されヤエナリヌクレアーゼで平滑化されＸｈｏＩで再度消化されたプラスミドｐＪＢ９０（実施例６に記載されている）に連結して、ＰｔｒｃプロモーターからｐｈａＣ−ｇｓａＲＡｔ−ｏｒｆＺオペロンを、そしてＰｓｙｎＩプロモーターからｄａｐＡＣ３５２Ｔを発現するプラスミドｐＪＧを得た。
【０１５３】
実験結果
プラスミドｐＪＧ２２をプラスミドｐＪＢ９１（実施例５に記載されている）と共に株ＭＢＸ３３４２（ＭＧ１６５５  ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ，ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴ）内に形質転換して、株ＭＢＸ３３４２［ｐＪＢ９１、ｐＪＧ２２］を得た。また、プラスミドｐＳＥ３８０およびｐＡＣＹＣ１８４（それぞれｐＪＧ２２およびｐＪＢ９１を構築するために使用した空ベクター）を株ＭＢＸ３３４２内に形質転換して陰性対照株ＭＢＸ３３４２［ｐＳＥ３８０，ｐＡＣＹＣ１８４］を得た。これらの株を、２×Ｅ２培地内で、３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間温置し、前記実施例に記載されているとおりに分析した。該培地は、１５ｇ／Ｌ  グルコース、５２ｍＭ  ＮａＮＨ４ＨＰＯ４、６６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、５４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素（前記のとおり）からなるものであった。ＭＢＸ３３４２［ｐＪＢ９１，ｐＪＧ２２］の培地では２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールおよび５μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンで補足し、ＭＢＸ３３４２［ｐＳＥ３８０，ｐＡＣＹＣ１８４］には１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを加えた。ＭＢＸ３３４２［ｐＪＢ９１，ｐＪＧ２２］は２．６０％乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のＰ（５ＨＶ）同種重合体を産生したが、株ＭＢＸ３３４２［ｐＳＥ３８０，ｐＡＣＹＣ１８４］はＰＨＡを全く産生しなかったことを、表１０におけるデータは示している。これらの結果は、Ｌ−リシンからＰ（５ＨＶ）への経路の遺伝子に加えてフィードバック耐性ｄａｐＡ遺伝子を発現する株が唯一の炭素源としてのグルコースからＰ（５ＨＶ）を産生しうることを示している。
【０１５４】
【表３６】
2015211681.tif 000040
【実施例１０】
【０１５５】
グルコースからのＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の生合成
次の実験は、３ＨＢ−ＣｏＡおよび５ＨＶ−ＣｏＡ単量体を合成しそれらをＰＨＡ内に組込みうる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株におけるグルコースからのＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の産生を示すためのものであった。
【０１５６】
実験結果
株ＭＢＸ２１１４からのｂｔｋＢ−ｐｈａＢ−ｋａｎ遺伝子をＭＢＸ３３４２内にＰ１形質導入して株ＭＢＸ３３４４を得た。ＭＢＸ３３４４をプラスミドｐＪＢ９１およびｐＪＧ２２で形質転換して株ＭＢＸ３３４４［ｐＪＢ９１，ｐＪＧ２２］を得た。また、ｐＪＧ２２およびｐＪＢ９１を構築するために使用した空ベクターであるそれぞれプラスミドｐＳＥ３８０およびｐＡＣＹＣ１８４をＭＢＸ３３４４内に形質転換して陰性対照株ＭＢＸ３３４４［ｐＳＥ３８０，ｐＡＣＹＣ１８４］を得た。これらの株を、２×Ｅ２培地内で、３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間温置し、前記実施例に記載されているとおりに分析した。該培地は、１５ｇ／Ｌ  グルコース、５２ｍＭ  ＮａＮＨ４ＨＰＯ４、６６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、５４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素（前記のとおり）からなるものであった。ＭＢＸ３３４２［ｐＪＢ９１，ｐＪＧ２２］の培地では２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールおよび５μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンで補足し、ＭＢＸ３３４４［ｐＳＥ３８０，ｐＡＣＹＣ１８４］には２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールおよび１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを加えた。２４時間の温置の後、該培養ブロスを１０ｇ／Ｌ  グルコースで補足した。表１１は、唯一の炭素源としてのグルコースから、Ｐ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）代謝経路遺伝子の全てを含有する株内に５ＨＶが組込まれることが可能であったことを示している。
【０１５７】
【表３７】
2015211681.tif 000041
【０１５８】
次に、株ＭＢＸ３８２４（Ｗ３１１０  ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ  ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴ  ΔｃａｄＡ：：ＦＲＴ  ΔｌｄｃＣ：：ＦＲＴ  ΔａｒｇＯ：：ＦＲＴ  ｂｋｔＢ−ｐｈａＢ−ｋａｎ）を、グルコースからＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体を産生させるための宿主株として試験した。この株においては、Ｌ−リシンを５ＨＶ−ＣｏＡコモノマーからそらしうる競合経路を該大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムから除去した。
【０１５９】
第１競合経路はＬ−リシンをカダベリンに変換することが可能であり、ｃａｄＡ（ＭｅｎｇおよびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（８）：２６５９−２６６９（１９９２）；ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号：ＥＧ１０１３１）およびｌｄｃＣ（表１Ａを参照されたい；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７２（３）：１６７−７２（１９９７）；ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号：Ｇ６０９４）によりコードされる２つのＬ−リシンデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ番号４．１．１．１８）からなるものであった。
【０１６０】
第２競合経路は、Ｌ−リシンを微生物細胞から輸出しうる。コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、該Ｌ−リシン輸出タンパク質はＬｙｓＥとして特定されている（表１Ａ；Ｖｒｌｊｉｃら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２（５）：８１５−８２６（１９９６））。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における推定Ｌ−リシン輸出遺伝子を特定するために、幾つかの文献および特許検索ならびにＢＬＡＳＴおよびＰｓｉ−ＢＬＡＳＴ検索（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＬｙｓＥを問合せ配列として使用するもの）を行った。６つのタンパク質が、該細胞から外部へのＬ−リシン輸送を妨げるための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムからの除去のための標的であることが判明した。それらには以下のものが含まれる：（１）ＡｒｇＯ（別名ＹｇｇＡ，ＮａｎｄｉｎｅｎｉおよびＧｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：３５３９−３５４６（２００４））、（２）ＹｆｉＫ（別名ＥａｍＢ；Ｆｒａｎｋｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：１１６１−１１６６（２００３））、（３）ＲｈｔＢ（旧名ＹｉｇＫ；Ｚａｋａｔａｅｖａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２（３）：２２８−３２（１９９９））、（４）ＹａｈＮ（Ｋｕｔｕｋｏｖａら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ．）３９（３）；３７４−３７８（２００５））、（５）ＲｈｔＣ（旧名ＹｉｇＪ；Ｚａｋａｔａｅｖａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２（３）：２２８−３２（１９９９））および（６）ＹｅａＳ（別名ＬｅｕＥ；Ｋｕｔｕｋｏｖａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９（２１）：４６２９−３４（２００５））。ＡｒｇＯは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を問合せ体として使用するＢＬＡＳＴＰ検索における２ｅ−２２のその最低ｅ値、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＬｙｓＥおよび６つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホモログでのＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２（１９９７））の後の近隣結合木（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎ  Ｔｒｅｅ）におけるＬｙｓＥに対する最接近クラスタリング、ならびにＬ−リシンに対する３倍増加耐性およびａｒｇＯが過剰発現された場合にベクター単独対照株より３８％高いＬ−リシン蓄積の報告（Ｌｉｖｓｈｉｔｓら，米国特許第６，９７９，５６０号）に基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からＬ−リシンを輸出する最も可能性の高い候補であると思われた。しかし、その他の特定されたタンパク質もＬ−リシンを輸出する可能性があり、したがって同様に遺伝子欠失の標的である。
【０１６１】
もう１つの競合経路はＬ−リシンを（Ｒ）−β−リシンに変換することが可能であり、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｙｊｅＫ（ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号：Ｇ７８３６；Ｂｅｈｓｈａｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５（４２）：１２６３９−４６（２００６））によりコードされるリシン２，３−アミノムターゼ（ＥＣ番号５．４．３．−）により触媒される。
【０１６２】
以下のプライマーを使用して、既に記載されているとおりに、Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＲｅｄ／ＥＴリコンビニアリング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）法により、単一のヌルｃａｄＡおよびｌｄｃＣ突然変異体を構築した：ΔｃａｄＡ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ突然変異に関してはＤＥ１１８（５’−ＴＧＴＣＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ）（配列番号３８）およびＤＥ１１９（５’−ＧＡＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＣＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ）（配列番号３９）、ならびにΔｌｄｃＣ：：ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ突然変異に関してはＤＥ１２２（５’−ＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ）（配列番号４０）およびＤＥ１２３（５’−ＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ）（配列番号４１）。プライマーＤＥ１０６（５’−ＧＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＧＧＣＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ）（配列番号４２）およびＤＥ１０７（５’−ＣＴＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＴＡＣＣＧＴＣＴＣＴＣＧＣＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ）（配列番号４３）を使用して、Ｒｅｄ／ＥＴリコンビニアリング法により、単一のヌルａｒｇＯ突然変異を構築した。株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３６（４）：５２５−５５７（１９７２））内へのΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ、ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ、ΔｃａｄＡ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ、ΔｌｄｃＣ：：ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ、ΔｃａｄＡ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットの反復Ｐ１媒介形質導入、およびそれに続く、前記実施例に記載されているとおりの各Ｐ１媒介形質導入後のｋａｎまたはｃａｔマーカーの除去により、Ｗ３１１０  ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ  ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴ  ΔｃａｄＡ：：ＦＲＴ  ΔｌｄｃＣ：：ＦＲＴ  ΔａｒｇＯ：：ＦＲＴを構築した。得られた株ＭＢＸ３８１８を供与株ＭＢＸ２１１４でＰ１形質導入して、ＭＢＸ３８２４の構築を完了した。プラスミドｐＪＧ２２およびｐＪＢ９１をＭＢＸ３８２４内に形質転換し、得られた株ＭＢＸ３８２４［ｐＪＧ２２，ｐＪＢ９１］をＭＢＸ３３４４［ｐＪＧ２２，ｐＪＢ９１］と共にＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の産生に関して試験した。これらの株を、１．５×Ｅ２培地内で、３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間温置し、前記実施例に記載されているとおりに分析した。該培地は、１５ｇ／Ｌ  グルコース、３９ｍＭ  ＮａＮＨ４ＨＰＯ４、４９．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、４０．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素（前記のとおり）からなるものであった。該培地を２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールおよび５μｇ／ｍＬ  ゲン��マイシンで補足した。表１２は、種々の遺伝的背景を有する種々の株が、重合体において５ＨＶの種々の組成を有するＰ（３ＨＢ−コ−５ＨＶ）をグルコースから産生する能力を有することを示している。特に、５ＨＶ−ＣｏＡから炭素をそらす競合経路の除去、例えば、Ｌ−リシン輸出タンパク質ａｒｇＯまたは２つのリシンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡおよびｌｄｃＣの除去は、ＰＨＡ内への５ＨＶの組込みを増加させる。
【０１６３】
【表３８】
2015211681.tif 000042
【実施例１１】
【０１６４】
ナトリウム４−ヒドロキシブチラートおよびナトリウム５−ヒドロキシバレラートからのＰ（４ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の生合成
次の実験は、４ＨＢ−ＣｏＡおよび５ＨＶ−ＣｏＡ単量体を合成しそれらをＰＨＡ内に組込みうる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株におけるＰ（４ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体の産生を示すためのものであった。組換え生物において４ＨＢコモノマーを操作するための方法は、米国特許第６，１１７，６５８号、米国特許第６，３１６，２６２号、米国特許第６，６８９，５８９号、米国特許第７，０８１，３５７号、米国特許第７，２２９，８０４号、米国特許第６，７５９，２１９号および米国特許出願公開第２００４／０２５３６９３号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。実施例１に記載されているものに類似した実験において、ナトリウム５−ヒドロキシバレラート（Ｎａ５ＨＶ）をナトリウム４−ヒドロキシブチラート（Ｎａ４ＨＢ）と共に株ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］に供給した。株ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］は遺伝子ｏｒｆＺおよびｐｈａＣを含有し、それらは共に、Ｎａ４ＨＢおよびＮａ５ＨＶからそれぞれ４ＨＢ−ＣｏＡおよび５ＨＶ−ＣｏＡを産生させるために、ならびに該前駆体をＰ（４ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体に重合させるために必要である。基質として使用するＮａ４ＨＢは、実施例１にＮａ５ＨＶの製造に関して記載されているのと同様の方法で、ＤＶＬの代わりにγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）を使用して製造した。共重合体の製造に用いた培養条件も、生産培地に４ｇ／ＬのＮａ４ＨＢを加えたこと以外は、実施例１に記載されているものと同じであった。ＰＨＡ産生期間の後、ＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］培養物の重合体含量の分析を、実施例１に記載されているとおりに進めた。ただし、この場合は、５ＨＶ含量の決定のために作成された標準曲線のほかにＧＢＬ標準物を使用して、４ＨＢ含量を決定するための標準曲線を作成した。この分析は、Ｎａ４ＨＢおよびＮａ５ＨＶが同時供給されたＭＧ１６５５［ｐＭＳ９３］培養が、６７％  ４ＨＢおよび３３％  ５ＨＶの組成を有し６７％ｄｃｗを含むＰ（４ＨＢ−コ−５ＨＶ）共重合体を与えることを示した。この重合体の抽出サンプルを、ＤＳＣを用いて分析したところ、該サンプルは−５４．９℃のＴｇを有し、検出可能なＴｍを有さないことが確認された。
【実施例１２】
【０１６５】
グルコースからのグルタラートの生合成
２つの遺伝子産物のどちらが、実施例７において特定された主要ＧＳＡデヒドロゲナーゼであるのかを識別するために、野生型株ＭＧ１６５５［ｐＪＢ９１］、ＭＧ１６５５ΔｙｎｅＩ：：ＦＲＴ［ｐＪＢ９１］およびＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ：：ＦＲＴ［ｐＪＢ９１］を、Ｌ−リシンとＧＳＡとの間の中間代謝産物である５−アミノペンタノアートからグルタラートを産生するそれらの能力に関して比較した（図２を参照されたい）。３つの株は全て、実施例５に記載されているとおりＰｏｍｐＡプロモーターからｄａｖＢＡＴを発現するプラスミドｐＪＢ９１を含有する。それらの３つの株を、前記のとおりに２ｇ／Ｌ  ５−アミノペンタノアートを含有するＥ０最少培地内で増殖させ、培養上清からのグルタラートをＧＣ−ＭＳ法により測定した。該温置方法および条件は、実施例７に記載されているものと同じであった。
【０１６６】
ＭＧ１６５５ΔｇａｂＤ［ｐＪＢ９１］は、残りの２つの株とは異なり、検出可能なグルタラートを全く蓄積しなかった。したがって、ｇａｂＤによりコードされるデヒドロゲナーゼはＧＳＡに対する主要活性を有する。したがって、大量のグルタラートを産生させたい場合には、生産宿主はｇａｂＤまたはそのホモログ（表１Ｐを参照されたい）を発現する必要がある。しかし、ＭＧ１６５５ΔｙｎｅＩ［ｐＪＢ９１］は、ＭＧ１６５５［ｐＪＢ９１］と比較して若干低い量の、５−アミノペンタノアートからのグルタラートを蓄積したため（それぞれ０．７５ｇ／Ｌ  グルタラートおよび１．０ｇ／Ｌ  グルタラート）、ｙｎｅＩによりコードされるデヒドロゲナーゼもＧＳＡに対する中等度の活性を有する。したがって、ｙｎｅＩまたはそのホモログ（表１Ｑを参照されたい）の過剰発現もＧＳＡ、Ｌ−リシンまたはグルコースから大量のグルタラートを産生しうる。
【０１６７】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）において存在する２つの最良のＧａｂＤホモログは、（１）ＮＡＤ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アクセッション番号ＮＰ ５９９３０２）および（２）仮想的タンパク質ｃｇＲ ００６８（アクセッション番号ＹＰ ００１１３６９３１）を含む。意外にも、これらの２つのコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＹｎｅＩに最も近い２つのホモログとしても特定された。
【０１６８】
次に、グルコースからグルタラートを産生させた。Ｌ−リシン過剰産生株を得るために、Ｌ−リシンフィードバック耐性ｄａｐＡＣ３５２Ｔ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＥ０３３を以下のとおりに構築した。実施例９に記載されているｄａｐＡＣ３５２Ｔ遺伝子の構築のためのＳＯＥ−ＰＣＲの産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化し、ついで、同じ酵素で消化されたｐＳＥ３８０に連結して、プラスミドｐＤＥ０３３を得た。ｐＤＥ０３３におけるｄａｐＡＣ３５２Ｔ遺伝子はＩＰＴＧ誘導性プロモーターＰｔｒｃ下にある。プラスミドｐＤＥ０３３およびｐＪＢ９１（前記）をＭＧ１６５５株内に形質転換して株ＭＧ１６５５［ｐＤＥ０３３，ｐＪＢ９１］を得た。株ＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５［ｐＤＥ０３３，ｐＪＢ９１］を、２５ｇ／Ｌ  グルコース、１６ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ３、１ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、２ｇ／Ｌ  酵母エキス、３０ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素（前記のとおり）を含有する培地内で、３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間温置した。ＭＧ１６５５［ｐＤＥ０３３，ｐＪＢ９１］の培地を１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび２５μ／ｍＬ  クロラムフェニコールで補足した。実施例７に記載されているとおりにグルタラートを測定した。ＭＧ１６５５［ｐＤＥ０３３，ｐＪＢ９１］は０．７ｇ／Ｌ  グルタラートを培地内に分泌したが、陰性対照株ＭＧ１６５５はグルタラートを全く産生しなかったことを、表１３に示すデータは実証している。この結果は、ＧＳＡデヒドロゲナーゼをコードする宿主細胞において、Ｌ−リシンをＧＳＡに変換するためのｄａｖＢＡＴオペロンと共に、Ｌ−リシンを蓄積するためのフィードバック耐性ｄａｐＡ遺伝子を使用することが、唯一の炭素源としてのグルコースからグルタラートを産生させるために十分なものであることを、明らかに示している。
【０１６９】
【表３９】
2015211681.tif 000043
【実施例１３】
【０１７０】
ナトリウム５−ヒドロキシバレラートからの１，５−ペンタンジオールの生合成
株の構築
１，５−ペンタンジオール（ＰＤＯ）が蓄積され培地内に分泌されうるかどうかを評価するための宿主株として、株ＭＢＸ３０１７（ＬＳ５２１８  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ，ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ＦＲＴ）およびＫ−１２株ＭＧ１６５５を使用した。Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＲｅｄ／ＥＴ法により各単一欠失株を構築した。それらの３つの経路に関するノックアウトカセットを構築するためのプライマーを表１４に示す。簡潔に説明すると、種々の染色体欠失体の構築のために以下のプライマーを使用した：ΔａｄｈＥカセットにはＭＳ２８６およびＭＳ２８７；ΔａｃｋＡ−ｐｔａカセットにはＭＳ２８９およびＭＳ２９０；ならびにΔｌｄｈＡカセットにはＭＳ２９２およびＭＳ２９３。前記実施例に記載されているとおりに、各単一ヌル突然変異をＬＳ５２１８内に反復的にＰ１形質導入し、該マーカーを除去することにより、ＬＳ５２１８  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ，ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ＦＲＴを得た。
【０１７１】
【表４０】
2015211681.tif 000044
【０１７２】
ＣｏＡ依存性プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のｐｄｕＰをプライマーＪＲＧ４７およびＪＲＧ４８により増幅した。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードするクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のｄｈａＴ（表１Ａを参照されたい；Ｔｏｎｇら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７（１２）：３５４１−３５４６（１９９１））をプライマーＪＲＧ４９およびＪＲＧ５０で増幅した。それらの２つの遺伝子を、プライマーＪＲＧ４７およびＪＲＧ５０を使用するＳＯＥ−ＰＣＲにより互いに融合させた。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＢｓｐＨＩ部位を介してｐＪＢ７８内にクローニングし、得られたプラスミドをｐＪＧ１０と命名した。
【０１７３】
ｐＦＳ１６またはｐＳＥ３８０およびｐＪＧ１０またはｐＪＢ７８を含有する株ＭＢＸ３０１７またはＭＧ１６５５をＰＤＯ研究に使用した。
【０１７４】
５ＨＶ含有Ｅ２培地内で酸素制限条件下で株を４０時間増殖させた。該培地は、１０ｇ／Ｌ  グルコース、２ｇ／Ｌ  ５ＨＶ、２６ｍＭ  ＮａＮＨ４ＨＰＯ４、３３ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび微量元素（前記のとおり）からなるものであった。新鮮な培地を含有する密封培養チューブ内に一晩培養物を約０．２の最終ＯＤ６００まで接種した。該培養の酸素制限が確保されるよう、該培養チューブの上部空間は小さかった。該培養を３０℃で温置した。４８時間の温置の後、１００μＬのサンプルを取り出し、遠心分離し、得られた上清に内部標準としての１，４−ブタンジオール（０．１ｇ／Ｌ）を添加し、それをＬａｂｃｏｎｃｏセントリバプ（ｃｅｎｔｒｉｖａｐ）において乾燥させ、１００μＬのアセトニトリル（ＡＣＮ）に３時間にわたり音波処理により再懸濁させた。該アセトニトリル溶液を遠心分離して不溶性物質を除去し、以下の獲得パラメーターを用いて、ＤＢ−２２５ｍｓカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ５９７５  ＧＣ−ＭＳ内に上清を注入した：キャリヤーガス  ヘリウム流量１ｍｌ／分、走査モードｍ／ｚ３０〜４００、オーブンプログラム：４０℃で２分間、ついで１０℃／分で２２０℃まで上昇、イオン源温度２３０℃、四重極質量フィルター温度１５０℃。
【０１７５】
測定されたＰＤＯの結果を表１４に示す。宿主株ＭＢＸ３０１７とｏｒｆＺ−ｄｈａＴ−ｐｄｕＰの過剰発現との組合せが０．３２ｇ／Ｌの最高ＰＤＯ収量を与えた。これらの３つの遺伝子を含有する株ＭＧ１６５５は、０．２２ｇ／Ｌの、より低い収量を与えたが、これは恐らく、公知電子受容体（Ｃｌａｒｋ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５：２２３−３４（１９８９））でありＮＡＤ（Ｐ）Ｈに関して５ＨＶ経路と競合しうるその活性エタノール、アセタートおよびラクタート経路によるものであろう。興味深いことに、ｏｒｆＺのみを含有するＭＧ１６５５も少量のＰＤＯを産生し、一方、ＭＢＸ３０１７宿主は検出可能なＰＤＯを全く産生しなかった（表１５）。これは、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ、例えばａｄｈＥが、５ＨＶ−ＣｏＡに対する弱い活性を有することを示している。図８に示すとおり、測定されたＰＤＯはＰＤＯ標準およびＮＩＳＴライブラリーＰＤＯ基準スペクトルに対するＧＣ−ＭＳにより確認された。これらの結果は、ｏｒｆＺ遺伝子が発現されて５ＨＶ−ＣｏＡを産生し、ｐｄｕＰ−ｄｈａＴ遺伝子が発現されて５ＨＶ−ＣｏＡを５−ヒドロキシペンテナールおよびＰＤＯに変換すると、Ｎａ５ＨＶからＰＤＯが産生されうることを示している。
【０１７６】
【表４１】
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【０１７７】
遺伝子ＩＤ００１  ヌクレオチド配列：アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ＮＩＨ２６２４グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ遺伝子ｇｓａＲＡｔ２
【０１７８】
【化２】
2015211681.tif 000046
【０１７９】
遺伝子ＩＤ００１  アミノ酸配列：アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）ＮＩＨ２６２４グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ遺伝子ｇｓａＲＡｔ２
【０１８０】
【化３】
2015211681.tif 000047
【０１８１】
遺伝子ＩＤ００２  ヌクレオチド配列：アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ遺伝子ｇｓａＲＡｔ
【０１８２】
【化４】
2015211681.tif 000048
【０１８３】
遺伝子ＩＤ００２  アミノ酸配列：アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）グルタラートセミアルデヒドレダクターゼ遺伝子ｇｓａＲＡｔ
【０１８４】
【化５】
2015211681.tif 000049
【０１８５】
遺伝子ＩＤ００３  ヌクレオチド配列：シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）／ズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼ融合遺伝子ｐｈａＣ３／Ｃ５
【０１８６】
【化６】
2015211681.tif 000050
【０１８７】
遺伝子ＩＤ００３  アミノ酸配列：シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）／ズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼ融合遺伝子ｐｈａＣ３／Ｃ５
【０１８８】
【化７】
2015211681.tif 000051
【０１８９】
遺伝子ＩＤ００４  ヌクレオチド配列：チオカプサ・フェニジイ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｐｈｅｎｉｇｉｉ）ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼサブユニットｐｈａＥ
【０１９０】
【化８】
2015211681.tif 000052
【０１９１】
遺伝子ＩＤ００４  アミノ酸配列：チオカプサ・フェニジイ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｐｈｅｎｉｇｉｉ）ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼサブユニットｐｈａＥ
【０１９２】
【化９】
2015211681.tif 000053
【０１９３】
遺伝子ＩＤ００５  ヌクレオチド配列：チオカプサ・フェニジイ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｐｈｅｎｉｇｉｉ）ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼサブユニットｐｈａＣ
【０１９４】
【化１０】
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【０１９５】
遺伝子ＩＤ００５  アミノ酸配列：チオカプサ・フェニジイ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｐｈｅｎｉｇｉｉ）ポリヒドロキシアルカノアートシンターゼサブユニットｐｈａＣ
【０１９６】
【化１１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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