(57)【要約】【課題】ＯＲ非依存性応答による影響を抑制又は回避しつつ匂い分子を評価できる方法を提供する。【解決手段】嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価方法を、嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用したレポーター遺伝子の発現によって被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、を備えるものとし、嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路を抑制するようにする。【選択図】図１
2015062356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価方法であって、
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、評価方法。
【請求項２】
前記活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃファミリータンパク質及びＭＥＫ経路関連タンパク質からなる群から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼ及び／又はプロテインキナーゼＣを含む、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記活性化経路は、プロテインキナーゼＣを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
前記活性化経路を阻害する阻害剤を前記活性化経路に作用させた状態で前記評価工程を実施する、請求項１〜４のいずれかに記載の評価方法。
【請求項６】
前記評価工程は、前記ｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化によるレポーター遺伝子の発現を利用する、請求項１〜５のいずれかに記載の評価方法。
【請求項７】
前記匂い分子のＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）が、１．５以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の評価方法。
【請求項８】
嗅覚受容体を用いた匂い分子のスクリーニング方法であって、
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項９】
嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、嗅覚受容体非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記被験物質による前記嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、スクリーニング方法。
【請求項１０】
匂い分子のマスキング剤の評価又はスクリーニング方法であって、
マスキング剤又はその候補化合物の存在下で、嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制した状態で、嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記マスキング剤又はその候補化合物による前記嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、方法。 
【請求項１１】
匂い分子を評価するための嗅覚受容体の評価又はスクリーニング方法であって、
前記匂い分子に関し、被験嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して前記被験嗅覚受容体の応答性の評価を行う評価工程、
を備え、
被験嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、方法。 
【請求項１２】
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用したレポーター遺伝子の発現を利用する匂い分子の評価キットであって、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路を抑制する阻害剤、
を備える、評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、嗅覚受容体（Olfactory Receptor、以下、単に、ＯＲともいう。）を用いた匂い分子の評価方法及びこの評価方法を利用したマスキング剤のスクリーニング方法、ＯＲのスクリーニング方法、匂い分子評価キット、マスキング剤のスクリーニングキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活環境における匂い分子の利用や匂い分子のマスクなどが種々検討されている。こうした匂い分子の利用やマスクのためには、匂い分子に対するヒトなどの動物の応答性、すなわち、嗅覚感度を定量的に評価する必要がある。
【０００３】
匂い分子の動物における嗅覚感度の評価方法の１つとして、当該匂い分子に対して応答性のある嗅覚受容体（ＯＲ）を用いた評価方法がある（特許文献１〜５、非特許文献１）。この評価方法は、細胞膜に所望のＯＲを備え、かつ、ｃＡＭＰ応答性エレメント（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ；ＣＲＥ）−ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたＤＮＡを核内に保持する形質転換ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞由来、アデノウイルス５型による形質転換株）を用いたレポーターアッセイである。
【０００４】
すなわち、この評価用細胞のＯＲと各種の匂い分子とを接触させこれらを結合させることで、細胞内において、Ｇタンパク質、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が順次活性化されて、ｃＡＭＰが上昇する。これに伴いプロテインキナーゼ（ＰＫＡ）がリン酸化されて下流のシグナル伝達系を活性化する。その一方でＰＫＡが核内に移行して、転写因子ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を活性化し、ＣＲＥ結合タンパク質がＣＲＥに結合して、その結果ルシフェラーゼが活性化されて発光する。このＣＲＥを介した応答（以下、単にＣＲＥ応答ともいう。）に基づく発光強度を測定して匂い分子の嗅覚感度を評価する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１０５６６０号公報
【特許文献２】特開２０１２−２５０９５８号公報
【特許文献３】特開２０１２−５０７８１号公報
【特許文献４】特開２０１２−５０４１１号公報
【特許文献５】特表２００８−５３８２７８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Harumi S et al., Science Signaling. 2009 Mar;2(60):ra9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、本発明者らが、ＯＲを細胞膜に発現しない以外は従来の評価用細胞と同様の細胞と匂い分子とを接触させたところ、一部の匂い分子は、ＯＲが存在しないにもかかわらずＣＲＥ応答を示す傾向があることがわかった。すなわち、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答を示すことがわかった。
【０００８】
したがって、匂い分子の各種ＯＲ応答を評価する場合には、従来のようにＯＲ存在細胞のみで評価していては、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答によるバックグラウンド値が高くなり、匂い分子に対する嗅覚感度を正確に評価できないことがわかった。また、正確な評価のためには、別途コントロールとしてＯＲ非存在細胞でも評価することが必要になってしまうことがわかった。この場合、特に、匂い分子の濃度依存性を評価する場合には評価労力は一層増大してしまうことになる。
【０００９】
また、本発明者らによれば、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答が認められる匂い分子は、概してバックグラウンド値が高いため、微弱なＯＲ応答を呈していたとしても、判別がほとんど不可能であった。
【００１０】
本明細書の開示は、ＯＲ非依存性応答による影響を抑制又は回避しつつ匂い分子の評価できる方法及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の発生要因について種々検討した。その結果、図１に示すように、ｃＡＭＰ量の増大を介したＣＲＥ結合タンパク質を活性化する可能性のある因子に着目した。そしてこうした因子として、ＰＫＣｓ、ＰＩ３−キナーゼ、ＭＥＫ、Ｓｒｃファミリーキナーゼなどの酵素が挙げられることがわかった。さらに、これらの酵素の阻害剤の併存下でＯＲ非依存性応答の抑制効果を評価したところ、阻害剤はＯＲ非依存性応答によるバックグラウンド値を低減しえた。これにより、高い確度で匂い分子のＯＲ依存性ＣＲＥ応答を評価できるという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づき、以下の手段を提供する。
【００１２】
（１）嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価方法であって、
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、評価方法。
（２）前記活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃファミリータンパク質及びＭＥＫ経路関連タンパク質からなる群から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含む、（１）に記載の評価方法。
（３）前記活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼ及び／又はプロテインキナーゼＣを含む、（１）又は（２）に記載の評価方法。
（４）前記活性化経路は、プロテインキナーゼＣを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法。
（５）前記活性化経路を阻害する阻害剤を前記活性化経路に作用させた状態で前記評価工程を実施する、（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法。
（６）前記評価工程は、前記ｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化によるレポーター遺伝子の発現を利用する、（１）〜（５）のいずれかに記載の評価方法。
（７）前記匂い分子のＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）が、１．５以上である、（１）〜（６）のいずれかに記載の評価方法。
（８）嗅覚受容体を用いた匂い分子のスクリーニング方法であって、
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、スクリーニング方法。
（９）嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、嗅覚受容体非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記被験物質による前記嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、スクリーニング方法。
（１０）匂い分子のマスキング剤の評価又はスクリーニング方法であって、
マスキング剤又はその候補化合物の存在下で、嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制した状態で、嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記マスキング剤又はその候補化合物による前記嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、方法。
（１１）匂い分子を評価するための嗅覚受容体の評価又はスクリーニング方法であって、
前記匂い分子に関し、被験嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して前記被験嗅覚受容体の応答性の評価を行う評価工程、
を備え、
被験嗅覚受容体に非依存性的なｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、方法。
（１２）嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用したレポーター遺伝子の発現を利用する匂い分子の評価キットであって、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路を抑制する阻害剤、
を備える、評価キット。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本明細書の開示の概要を示す図である。
【図２】匂い分子のＯＲ非依存性ＣＲＥ応答とＬｏｇＤ値との関係を示す図である。
【図３】阻害剤存在下におけるＯＲ非発現細胞での１−ノナノールのＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の抑制を示す図である。
【図４】阻害剤存在下におけるＯＲ非発現細胞でのジヒドロジャスモンのＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の抑制を示す図である。
【図５】１−ノナノール（１ｍＭ）による各種ＯＲのＣＲＥ応答を示す図である。
【図６】阻害剤（Ｒｏ−３１−８２２０）存在下における１−ノナノール（１ｍＭ）による各種ＯＲのＣＲＥ応答を示す図である。
【図７】ジヒドロジャスモン（１ｍＭ）による各種ＯＲのＣＲＥ応答を示す図である。
【図８】阻害剤（Ｒｏ−３１−８２２０）存在下におけるジヒドロジャスモン（１ｍＭ）による各種ＯＲのＣＲＥ応答を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書の開示は、匂い分子のＯＲ依存性ＣＲＥ応答に基づく評価方法等に関する。本明細書の開示によれば、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答に基づくＣＲＥ結合性タンパク質の活性化の影響を抑制又は回避できる。このため、匂い分子をより正確に評価することができるし、確度の高いスクリーニングができる。また、簡易に精度の高い評価方法及びスクリーニング方法が実現される。
【００１５】
また、本明細書の開示によれば、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の影響を抑制又は回避することで、ＯＲ依存性のＣＲＥ応答を正確に評価できる。このため、マスキング剤の評価やスクリーニング、ＯＲの評価やスクリーニングのほか、ＯＲ非依存性ＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路の阻害剤の評価の正確性やスクリーニングの確度も向上させることができる。以下、本明細書の開示に関し、詳細に説明する。
【００１６】
本明細書において「匂い分子」とは、特に限定されない。ヒトにおいて官能的に匂いを感じるものである必要はなく、いずれかの動物の嗅覚受容体に結合し、応答する成分であればよい。匂い分子としては、例えば、ＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）が、１．５以上であることが好ましい。こうした疎水性の匂い分子は、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答によるｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化の程度が大きく、この活性化経路の阻害が有効である。なお、ＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）は、分配係数の指標であり、ｐＨ７．５における液−液系〔オクタノール−水〕における各相における成分濃度の対数である。本明細書において、ＬｏｇＤは、ＳＰＡＲＣ（SPARC Performs Automated Reasoning in Chemistry ,ジョージア大学）による構造−物性物質計算を使用して取得できる。なお、ＳＰＡＲＣによる計算は、SPARC on-line calculatorで利用可能である。
【００１７】
本明細書において、匂いに関して「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段(例えば、封じ込め)、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、ＯＲ（嗅覚受容体）は、嗅細胞（嗅覚受容神経）にあるＧタンパク質結合受容体の一種であればよく、由来動物種を特に限定しない。概して、１つの匂い分子は、１又は２以上の嗅覚受容体に結合し刺激し、１つの嗅覚受容体は、１又は２以上の匂い分子と結合するようになっている。
【００１９】
（ＯＲを用いた匂い分子の評価方法）
本明細書に開示される匂い分子の評価方法は、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して匂い分子としての評価を行う評価工程を備えている。
【００２０】
本評価方法では、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して匂い分子としての評価を行う。ＯＲを介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路については、図１に示したとおりであって当業者において周知である。
【００２１】
ＯＲは、本明細書において必要な受容体の機能を失わない限り、どのような形態で使用されてもよい。例えば、ＯＲは、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然にＯＲを発現する組織や細胞、又はそれらの培養物のほか、当該ＯＲを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用されるＯＲの範囲に含まれる。こうした各種形態のＯＲは当業者であれば公知技術に基づいて適宜準備することができる。
【００２２】
ＯＲとして、好ましくは、嗅細胞等の天然にＯＲを発現する細胞、又はＯＲを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、ＯＲをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００２３】
ＯＲは、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。あるいは、数十以上のＯＲを組み合わせて用いることもできる。ＯＲは、各細胞に発現させるようにすることが好ましい。ＯＲは、匂い分子に対して特定の組合せであってもよいし、網羅的に多数のＯＲを用いてもよい。匂い分子の評価の目的に応じて決定される。
【００２４】
ＯＲを介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して評価する形態は、特に限定されない。活性化したＣＲＥ結合タンパク質がＣＲＥに結合して下流の遺伝子の発現を促進することを利用して、当該下流の遺伝子として、レポーター遺伝子を導入し、当該レポーター遺伝子の発現レベルを測定してもよい。レポーター遺伝子としては、公知の蛍光タンパク質をコードする遺伝子など、当業者であれば適宜選択できる。またレポーター遺伝子の発現レベルは、用いるレポーター遺伝子の種類に応じて適宜決定される。
【００２５】
本明細書に開示される方法では、ＯＲに非依存性のＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路を抑制する。こうすることで、こうした意図しない活性化による影響を抑制又は回避してＯＲ依存的ＣＲＥ結合タンパク質の活性化に基づく評価が可能となる。
【００２６】
ＯＲ非依存性ＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路（以下、単に、非依存性活性化経路という。）は、本発明者らによれば、ＰＩ３−キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃファミリータンパク質及びＭＥＫ経路関連タンパク質からなる群から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含んでいる。これらのタンパク質は、いずれも、ＯＲ発現細胞内における酵素である。
【００２７】
ここで、ＰＩ３キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３７）は、イノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基（−ＯＨ基）のリン酸化を行う酵素である
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。イノシトールリン脂質は真核生物の細胞膜を構成する成分の一つであり、ＰＩ３Ｋ（キナーゼ）をはじめとしたキナーゼ（リン酸化酵素）の触媒作用を受けてホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸  ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３となり、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／Ａｋｔの活性化を起こす。このシグナル伝達経路はＰＩ３
【００２８】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（ＥＣ２．７．１１．１３）は、少なくとも１０種類以上のアイソザイムから構成されるタンパク質ファミリーである。ＰＫＣは基質に存在するセリンおよびスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化する。
【００２９】
Ｓｒｃファミリーとは、細胞表面受容体と共役して細胞内情報伝達を行うチロシンキナーゼファミリーであり，Ｓｒｃファミリータンパク質としては、ｃ−Ｓｒｃ，ｃ−Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，ｃ−Ｆｇｒ，Ｈｃｋ，Ｂｌｋが哺乳動物，さらにＹｒｋ（ニワトリ）が挙げられる。
【００３０】
ＭＥＫ経路関連タンパク質は、ＭＡＰキナーゼファミリーを意味しており、ＭＥＫ（ＭＥＫ１、ＭＥＫ２）、ＥＲＫ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）を含んでいる。ＭＥＫはＭＡＰキナーゼキナーゼである。ＭＡＰＫ（キナーゼ）は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Ｍitogen-activated Protein Kinase、ＥＣ ２．７．１１．２４）である。ＭＡＰキナーゼは、ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ：Extracellular Signal-regulated Kinase）である。
【００３１】
非依存性活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼを含む経路であってもよいし、プロテインキナーゼＣを含む経路であってもよい。これら２つの経路であってもよい。好ましくは、少なくともプロテインキナーゼＣを含む経路とする。この活性化経路によって、意図しないＣＲＥ結合タンパク質の活性化が生じていることが多いからである。
【００３２】
こうした非依存性活性化経路を抑制するには、非依存性活性化経路として特定されるタンパク質の活性を抑制することが好ましい。タンパク質の活性を抑制するとは、当該タンパク質量を低減するほか、不活性タンパク質を発現させたり、当該タンパク質の阻害剤を供給すること等が挙げられる。阻害剤を利用することが簡便であり阻害剤の効果をすぐに確認できる点において好ましい。
【００３３】
これらの非依存性活性化経路の阻害剤は、それぞれ上記したタンパク質などの阻害剤を適宜用いることができる。こうした阻害剤は、商業的にも入手可能である。例えば、ＰＩ３キナーゼの阻害剤としては、Wortmannin((1alpha,11alpha)-11-(Acetyloxy)-1-(methoxymethyl)-2-oxaandrosta-5,8-dieno(6,5,4-bc)furan-3,7,17-trione）が挙げられる。また、Ｒｏ−３１−８２２０としては、Ｒｏ−３１−８２２０（Bisindolylmalemimde、ＩＸ）が挙げられる。Ｓｒｃファミリーの阻害剤としては、ＳＵ６６５６（2-oxo-3-4,5,6,7-tetrohydro-1H-indol-3-ylmethylene）-2,3-dihydro-1H0-indol-5-sulfonic acid dimethylamide)が挙げられる。ＭＥＫの阻害剤としては、Ｕ０１２６（1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene）が挙げられる。なかでも、ＰＫＣの阻害剤であるＲｏ−３１−８２２０が好ましい。特に、１-ノナノール、ジヒドロジャスモンにおいてはＲｏ−３１−８２２０が好ましい。
【００３４】
阻害剤を用いて非依存性活性化経路を抑制する方法は特に限定されない。非依存性活性化経路を阻害する阻害剤を非依存性活性化経路に作用させた状態であればよい。例えば、ＯＲを細胞膜上に有する細胞に対して、予め阻害剤を供給しておき、その後、阻害剤を除去した状態で匂い分子と接触させて評価工程を実施してもよいし、阻害剤と匂い分子とを同時にＯＲを有する細胞とに接触させて評価工程を実施してもよい。さらに、阻害剤を予め細胞に供給しておき、その後に、阻害剤の存在下で細胞と匂い分子とを接触させてもよい。
【００３５】
以上説明した評価工程を備えることで、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答に基づくＣＲＥ結合性タンパク質の活性化の影響を抑制又は回避できる。このため、匂い分子をより正確に評価することができる。
【００３６】
なお、上記評価工程は、そのまま、匂い分子のスクリーニング方法に用いることもできる。被験物質としての匂い分子の評価を行うことで、高い反応性を示すなどの意図した匂い分子を高い確度でスクリーニングすることができる。
【００３７】
なお、被験物質の評価は、例えば、被験物質添加群と対照群（例えば、被験物質非添加群若しくは対照物質添加群）との間でｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を比較することによって行われ得る。対照群と比較して、被験物質添加群におけるｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化が増大していれば、当該被験物質は、用いたＯＲを介してｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質を活性化できることが肯定でき、用いたＯＲを刺激する匂い分子の候補として選択できる。好ましくは、被験物質添加群における活性化レベルが対照群と比較して２倍以上増加していれば、当該被験物質を、用いたＯＲに対する応答性のある匂い分子の候補物質として選択できる。また、被験物質の濃度を段階的に変化させてｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを比較することによっても行うことができる。活性化レベルが、被験物質の濃度に応じて増大するとき、用いたＯＲに対して反応する匂い分子として肯定でき、用いたＯＲを刺激する匂い分子の候補として選択できる。
【００３８】
（ＯＲを用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法）
本明細書によれば、ＯＲを用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法も提供される。ここでいう試薬とは、既に説明した非依存性活性化経路のタンパク質の阻害剤を含んでいる。本方法によれば、適切な阻害剤となる試薬をスクリーニングすることができ、こうした阻害剤を用いてより適切な匂い分子の評価系を構築できる。また、阻害剤の適切な濃度も決定することができる。
【００３９】
本方法は、被験物質の存在下で、ＯＲ非依存性のＣＲＥ結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程を備えることができる。この工程では、活性化レベルに基づいて、被験物質による非依存性活性化経路の抑制程度を評価する。この抑制程度は、例えば、ＯＲ非存在の状態で、阻害剤のない状態でのレポーター遺伝子の発現レベルと、ＯＲ非存在の状態での阻害剤と匂い分子とが併存する状態でのレポーター遺伝子の発現レベルとを比較することによって評価できる。コントロールレベル（阻害剤も匂い分子もない状態）に阻害剤併存下でのレポーター遺伝子の発現レベルが近づくほど、阻害剤としての活性が肯定される。
【００４０】
（匂い分子のマスキング剤の評価又はスクリーニング方法）
本明細書によれば、匂い分子のマスキング剤又はその候補化合物の評価又はスクリーニング方法も提供される。本方法によれば、匂い分子に対して適切なマスキング剤を評価及びスクリーニングすることができる。また、マスキング剤の適切な濃度も決定することができる。
【００４１】
本方法は、マスキング剤又はその候補化合物の存在下で、非依存性活性化経路を抑制した状態で、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程を備えることができる。この工程においては、非依存性活性化経路の影響を抑制又は回避して得られた活性化レベルに基づいて、マスキング剤による匂い分子のＯＲ依存性ＣＲＥ応答活性化経路の抑制程度を評価する。非依存性活性化経路の抑制程度は、上記試薬のスクリーニング方法と同様に実施できる。
【００４２】
（匂い分子を評価するためのＯＲの評価又はスクリーニング方法）
本明細書によれば、匂い分子を評価するためのＯＲの評価又はスクリーニング方法も提供される。本方法によれば、匂い分子を評価するための１種又は２種以上のＯＲを評価又はスクリーニングできる。
【００４３】
本方法は、匂い分子に関し、被験ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して被験ＯＲの応答性の評価を行う評価工程を備えている。この工程において、被験ＯＲに関して非依存性活性化経路を抑制するようにする。こうすることで、非依存性活性化経路の影響を抑制又は回避して、特定の匂い分子を評価するための適切なＯＲを選定することができる。
【００４４】
（評価キット）
本明細書によれば、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用した匂い分子の評価キットも提供される。このキットは、既に説明した、非依存性活性化経路の阻害剤を備えている。阻害剤は、ＯＲの種類に応じて、あるいは、匂い分子の種類に応じて１種又は２種以上が組み合わされる。
【実施例】
【００４５】
以下、本明細書の開示を具体例を挙げて説明するが、本明細書の開示は、以下の具体例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
（ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の測定）
ＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地にて培養し、以下の表に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で３０分放置した後、３８４ウェル（ポリ−Ｌ−リジンコート・ホワイトプレート）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞を２．８×１０5／ｃｍ2の割合で各ウェルに播種し、ＣＯ2インキュベータ内で２４時間培養して、ＯＲ非発現であってＯＲ非依存性ＣＲＥ応答評価用のＨＥＫ２９３細胞を調製した。
【００４７】
なお、ＣＲＥ応答の測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＬ−ＴＫ）を融合させたものを同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で調整した匂い分子（各１ｍＭ）を添加し、４時間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。匂い分子は４８種類を評価した。
【００５０】
ルシフェラーゼ活性はDual-Glo Luciferase assay system（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の添付プロトコルに準じて測定した。匂い分子刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値をコントロール群の発光値で割った値をFold induction of luciferaseとして、応答強度の指標とした。コントロール群は、非匂い分子処理群であり、各匂い分子の代わりにＤＭＳＯを添加した。結果を図２に示す。
【００５１】
図２に示すように、４８種類の匂い分子のうち、２２種類の匂い分子のFold induction of luciferaseが2以上を示した。また、これらの匂い物質は、いずれも、ＳＰＡＲＣによって取得したＬｏｇＤが１．５以上を示していることがわかった。
【実施例２】
【００５２】
（細胞死評価）
実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞を培養し、実施例１の表１と同様の組成で同様に遺伝子導入してＯＲ非発現ＨＥＫ２９３細胞を調製し播種した。ただし、９６ウェル透明プレートを用いた。２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で目的濃度調整した各阻害剤を各々に２０μＬずつ添加し、１時間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。用いた阻害剤はＲｏ−３１−８２２０、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｕ０１２６およびＳＵ６６５６である。
【００５３】
放置後、培地を取り除き無血清培地で目的濃度に調整した匂い分子（各１ｍＭ）および阻害剤の混合液を２０μＬずつ添加した。匂い分子は１−ノナノールおよびジヒドロジャスモンを用いた。なお、本検討にはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いた。製品プロトコルに従い、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を１０μＬずつ添加し、４時間ＣＯ2インキュベータ内で呈色反応させた。その結果、実施例２で使用した阻害剤および匂い分子の濃度域では細胞死は確認されなかった。
【実施例３】
【００５４】
（阻害剤によるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の抑制）
実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞を培養し、実施例１の表１と同様の組成で遺伝子導入してＯＲ非発現ＨＥＫ２９３細胞を調製して播種し、ルシフェラーゼアッセイを適用した。２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で目的濃度に調整した各阻害剤を各々に２０μｌずつ添加し、３０分間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。用いた阻害剤はＲｏ−３１−８２２０、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｕ０１２６およびＳＵ６６５６であった。
【００５５】
放置後、培地を取り除き無血清培地で目的濃度に調整した匂い分子（各１ｍＭ）および阻害剤の混合液を２０μＬずつ添加した。匂い分子は１−ノナノールおよびジヒドロジャスモンを用いた。実施例１と同様の手順で、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３及び図４に示す。
【００５６】
図３に示すように、１−ノナノールはＲｏ−３１−８２２０、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｕ０１２６およびＳＵ６６５６で濃度依存的にＣＲＥ応答が抑制された。また、図４に示すように、ジヒドロジャスモンはＲｏ−３１−８２２０およびＵ０１２６で抑制された。Ｒｏ−３１−８２２０により、１−ノナノールおよびジヒドロジャスモンのＣＲＥ応答値は基準応答値（匂い分子がない状態での応答値）に近づくことがわかった。
【実施例４】
【００５７】
（阻害剤によるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の抑制）
実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞を培養した。以下の表２に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で３０分放置した後、３８４ウェル（ポリーＬ−リジンコート・ホワイトプレート）の各ウェルに添加してＯＲ発現細胞を調製した。ＯＲは、ＰＣＲにより増幅した各ＯＲ遺伝子をＮ末端にＦＬＡＧ配列が付加されるようにｐＦ５Ａ ＣＭＶ−ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega)に挿入し、ＯＲ発現ベクターとして構築したものを用いた。次いで、ＯＲ発現ＨＲＫ２９３細胞を２．８×１０5／ｃｍ2の割合で各ウェルに播種し、ＣＯ2インキュベータ内で２４時間培養した。その後、実施例１と同様の手順によるルシフェラーゼアッセイを行った。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地でＲｏ−３１−８２２０（５μＭ）を各々に２０μＬずつ添加し、３０分間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。放置後、培地を取り除き無血清培地で目的濃度に調整した匂い分子（１−ノナノール、ジヒドロジャスモン各１ｍＭ）およびＲｏ−３１−８２２０の混合液を２０μＬずつ添加した。実施例１と同様の手順で、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図５〜図８に示す。
【００６０】
図５及び図６に示すように、各種ＯＲ発現細胞において、１−ノナノールによるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答は、阻害剤（Ｒｏ−３１−８２２０）の添加により、基準応答値（各種ＯＲ発現細胞における非匂い分子処理群の蛍光強度）に近づくことがわかった。また、図７及び図８に示すように、各種ＯＲにおいて、ジヒドロジャスモンによるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答は、阻害剤（Ｒｏ−３１−８２２０）の添加により、基準応答値（各種ＯＲ発現細胞における非匂い分子処理群の蛍光強度）に近づくことがわかった。
【００６１】
以上のことから、ＯＲを用いた匂い分子の評価にあたり、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答を抑制することで、ＯＲと匂い分子との反応性が正確に評価できることがわかった。したがって、ＯＲを用いた匂い分子、匂い分子のマスキング剤、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の阻害剤を評価したりあるいはスクリーニングするのにあたっては、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答レベルを考慮し必要に応じてそれを抑制することが重要であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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