(57)【要約】【課題】血中のｓ−ＲＯＢＯ１に対する反応性に比べてがん等の組織のＲＯＢＯ１に対する反応性の高い抗ＲＯＢＯ１抗体改変体の提供。【解決手段】ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第５イムノグロブリン様ドメインから選ばれる一のドメイン（領域１）に対する第一の特異性、及びＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第３フィブロネクチン３型ドメインから選ばれる一のドメイン（領域２）に対する第二の特異性を有することを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第５イムノグロブリン様ドメインから選ばれる一のドメイン（領域１）に対する第一の特異性、及びＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第３フィブロネクチン３型ドメインから選ばれる一のドメイン（領域２）に対する第二の特異性を有することを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項２】
前記領域１が第５イムノグロブリン様ドメインである、請求項１記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項３】
第一の特異性が抗ＲＯＢＯ１抗体Ｂ５２０９ＢのＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する請求項１又は２に記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項４】
前記領域２が第３フィブロネクチン３型ドメインである、請求項１〜３のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項５】
第二の特異性が抗ＲＯＢＯ１抗体Ｂ２２１２ＡのＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する請求項１〜４のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項６】
第一の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＨ鎖の可変領域と第二の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＬ鎖の可変領域とをペプチドリンカーで連結させた第一の一本鎖ポリペプチドと、第一の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＬ鎖の可変領域と第二の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＨ鎖の可変領域とをペプチドリンカーで結合させた第二の一本鎖ポリペプチドとの複合体である請求項１〜５のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーが、３〜３０個のアミノ酸からなるペプチドである請求項６記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項８】
２種類の一本鎖ポリペプチドから構成される請求項６又は７に記載のダイアボディ型二重特異性抗体のいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域を構成するポリペプチド。
【請求項９】
請求項６又は８に記載の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１０】
核酸が発現される宿主細胞における至適コドンを有する請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
大腸菌に対する至適コドンを有する請求項９又は１０に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１３】
プラスミドベクターである請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
大腸菌である請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを特徴とする一本鎖ポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法で得られた一本鎖ポリペプチドを会合せしめ、形成された請求項１〜７のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体を分離して回収することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体又はその標識体、請求項８記載の一本鎖ポリペプチド、請求項１０又は請求項１１に記載の核酸、請求項１２又は１３に記載のベクター、及び、請求項１４又は１５に記載の宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする診断薬又は医薬組成物。
【請求項１９】
ダイアボディ型二重特異性抗体又はその標識体を有効成分とする請求項１８に記載の診断薬又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体医薬及び診断薬として有用なＲＯＢＯ１タンパク質に対するダイアボディ型二重特異性抗体及びこれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＯＢＯ１は、Ｓｌｉｔタンパク質の受容体として働くことが報告されている膜タンパク質である。また、ＲＯＢＯ１遺伝子は癌抑制遺伝子であることも知られており、ＲＯＢＯ１は、肝癌、肺癌、乳癌、子宮癌、胃癌、脳腫瘍、大腸癌等の癌細胞で高発現しており、抗ＲＯＢＯ１抗体がＲＯＢＯ１発現細胞に対して補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を有することが知られている（特許文献１）。
また、ＲＯＢＯ１は、新生血管の内皮細胞にも発現していることから、抗ＲＯＢＯ１抗体はがんのみならず炎症性疾患の治療薬としても有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９５９８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ＲＯＢＯ１の発現は、癌細胞だけでなく、脳などの正常組織にも見られることから、細胞膜から遊離した細胞外ドメイン（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＲＯＢＯ１：ｓＲＯＢＯ１）が血中にも存在する可能性がある。癌等の診断や治療の目的で投与した抗ＲＯＢＯ１抗体は、血中のｓＲＯＢＯ１に吸収され、目的とするがん組織に到達しないことが考えられる。
【０００５】
従って、本発明の課題は、血中のｓＲＯＢＯ１に対する反応性に比べてがん等の組織のＲＯＢＯ１に対する反応性の高い抗ＲＯＢＯ１抗体改変体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の抗ＲＯＢＯ１抗体の改変体を作製し、そのｓＲＯＢＯ１及び組織に存在するＲＯＢＯ１に対する反応性を検討したところ、ＲＯＢＯ１タンパク質における特定の２つの領域に対する特異性を有するダイアボディ型二重特異性抗体が、ｓＲＯＢＯ１に対する反応性に比べて組織に存在するＲＯＢＯ１に対する反応性が高く、その特異性はｓｃＦｖや一つの領域に対する抗ＲＯＢＯ１抗体に比べても顕著に高いことを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１９〕を提供するものである。
〔１〕ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第５イムノグロブリン様ドメインから選ばれる一のドメイン（領域１）に対する第一の特異性、及び
ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第３フィブロネクチン３型ドメインから選ばれる一のドメイン（領域２）に対する第二の特異性を有することを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
〔２〕前記領域１が第５イムノグロブリン様ドメインである、〔１〕記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
〔３〕第一の特異性が抗ＲＯＢＯ１抗体Ｂ５２０９ＢのＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する〔１〕又は〔２〕に記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
〔４〕前記領域２が第３フィブロネクチン３型ドメインである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
〔５〕第二の特異性が抗ＲＯＢＯ１抗体Ｂ２２１２ＡのＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
〔６〕第一の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＨ鎖の可変領域と第二の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＬ鎖の可変領域とをペプチドリンカーで連結させた第一の一本鎖ポリペプチドと、第一の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＬ鎖の可変領域と第二の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＨ鎖の可変領域とをペプチドリンカーで結合させた第二の一本鎖ポリペプチドとの複合体である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
〔７〕前記ペプチドリンカーが、３〜３０個のアミノ酸からなるペプチドである〔６〕記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
〔８〕２種類の一本鎖ポリペプチドから構成される〔６〕又は〔７〕に記載のダイアボディ型二重特異性抗体のいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域を構成するポリペプチド。
〔９〕〔６〕又は〔８〕に記載の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードすることを特徴とする核酸。
〔10〕核酸が発現される宿主細胞における至適コドンを有する〔９〕に記載の核酸。
〔11〕大腸菌に対する至適コドンを有する〔９〕又は〔１０〕に記載の核酸。
〔12〕〔９〕〜〔11〕のいずれかに記載の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
〔13〕プラスミドベクターである〔１２〕記載のベクター。
〔14〕〔１２〕又は〔１３〕記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
〔15〕大腸菌である〔１４〕に記載の宿主細胞。
〔16〕〔１５〕に記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを特徴とする一本鎖ポリペプチドの製造方法。
〔17〕〔１６〕に記載の方法で得られた一本鎖ポリペプチドを会合せしめ、形成された〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体を分離して回収することを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体の製造方法。
〔18〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のダイアボディ型二重特異性抗体、〔８〕記載の一本鎖ポリペプチド、〔１０〕又は〔１１〕に記載の核酸、〔１２〕又は〔１３〕に記載のベクター、及び、〔１４〕又は〔１５〕に記載の宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする診断又は医薬組成物。
〔19〕ダイアボディ型二重特異性抗体を有効成分とする、〔１８〕に記載の診断又は医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、血中に存在するｓＲＯＢＯ１に対する反応性に比べて、組織に存在するＲＯＢＯ１に対する反応性が高いという特徴を有する。従って、本発明ダイアボディ型二重特異性抗体をがんや炎症性疾患患者に投与した場合、血中のｓＲＯＢＯ１に吸収されることなく、標的組織において高発現しているＲＯＢＯ１と特異的に結合し、当該部位を検出し又は当該部位に対する細胞障害活性を発揮することが可能となる。また、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、ＲＯＢＯ１に対し、もとの抗体やｓｃＦｖに匹敵する親和性を有するという特徴も有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】５２０９ＶH−２２１２ＶLと２２１２ＶH−５２０９ＶLのベクターの概略図を示す。
【図２】５２０９ＶH−２２１２ＶL及び２２１２ＶH−５２０９ＶLの発現を示す図である。
【図３】５２０９ＶH−２２１２ＶL及び２２１２ＶH−５２０９ＶLの精製を示す図である。
【図４】ダイアボディＢ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａの精製を示す図である。
【図５】ダイアボディＢ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２ＡのＩＴＣ測定結果を示す。
【図６】ダイアボディＢ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａのサイズ排除クロマトグラフィー結果を示す図である。
【図７】ダイアボディＢ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａの可溶性ＲＯＢＯ１（ｓＲＯＢＯ１）に対する反応性を示す図である。
【図８】ダイアボディＢ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａの細胞膜ＲＯＢＯ１に対する反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、「ダイアボディ型二重特異性抗体」とは、二つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントであり且つ小さなフラグメントであるものを指し、該フラグメントは、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）に結合するＬ鎖の可変領域（ＶＬ）をその同じポリペプチド鎖 （ＶＨ−ＶＬ） 中に含有しているものである。代表的なダイアボディは、同一の鎖の上にある該二つのドメインの間ではその対合を形成するには短すぎる長さのリンカーを使用することにより、そのドメインを別の鎖の相補性のドメインと対合せしめ、二つの抗原結合部位を作り出すものである。ダイアボディ及びその製造技術については、米国特許第４，７０４，６９２号明細書；米国特許第４，９４６，７７８号明細書；米国特許第５，９９０，２７５号明細書；米国特許第５，９９４，５１１号明細書；米国特許第６，０２７，７２５号明細書；ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照することができ、これらの文献における開示の内容はそれらを参照することにより本明細書の内容に含まれる。
【００１１】
より具体的には、「ダイアボディ型二重特異性抗体」とは、例えば、（１）第一の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ａ）と第二の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｂ）とを同一のペプチド鎖上に有する第一のポリペプチド（ｉ）、及び（２）第一の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｃ）と第二の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｄ）とを同一のペプチド鎖上に有する第二のポリペプチド（ii）を含有し、異なる二種の抗原認識能を有する融合蛋白質を意味する。その形態としては、（ア）上記（ｉ）と（ii）とが融合した典型的なダイアボディ型、（イ）シングルチェインダイアボディ、（ウ）タンデム型ＦV、（エ）同一抗原を別のエピトープで認識する２種の抗体を別個に発現し、その後にスパイキャッチャー（cspycatcher）とスパイタグ(spytag)を介して複合体を形成したダイアボディ型、（オ）同一抗原を別のエピトープで認識する２種の抗体を別個に発現し、その後に相互に反応するペプチドを介して複合体を形成したタイアボティ型等が挙げられる。
【００１２】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、ＲＯＢＯ１タンパク質の領域１に対する第一の特異性、及び、領域１以外の領域２に対する第二の特異性を有することを特徴とする。好ましくは第一の特異性がＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第５イムノグロブリン様ドメインから選ばれる一のドメイン（領域１）に対する抗体に由来する部位により発現され、第二の特異性がＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外ドメイン中の第１〜第３フィブロネクチン３型ドメインから選ばれる一のドメイン（領域２）に対する抗体に由来する部位により発現される。
従って、第一の特異性は、ＲＯＢＯ１タンパク質の領域１に対する抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する特異性であり、具体的にはＲＯＢＯ１タンパク質の領域１に対する抗体のＨ鎖の可変領域の抗体結合部位（ａ）と、ＲＯＢＯ１タンパク質の領域１に対する抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｃ）とからなる。
一方、第二の特異性は、ＲＯＢＯ１タンパク質の領域２に対する抗体のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する特異性であり、具体的には、ＲＯＢＯ１タンパク質の領域２に対する抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｂ）と、ＲＯＢＯ１タンパク質の領域２に対する抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｄ）とからなる。
【００１３】
より具体的には、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、（１）第一の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＨ鎖の可変領域と第二の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＬ鎖の可変領域とをペプチドリンカーで連結させた第一の一本鎖ポリペプチドと、（２）第一の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＬ鎖の可変領域と第二の特異性を有する抗ＲＯＢＯ１抗体のＨ鎖の可変領域とをペプチドリンカーで結合させた第二の一本鎖ポリペプチドとの、複合体である。さらに具体的には、（１）ＲＯＢＯ１タンパク質の領域１に対する抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ａ）とＲＯＢＯ１タンパク質の領域２に対する抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｂ）とをペプチドリンカーで連結させた第一の一本鎖ポリペプチドと、（２）ＲＯＢＯ１タンパク質の領域１に対する抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｃ）とＲＯＢＯ１タンパク質の領域２に対する抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｄ）とをペプチドリンカーで連結させた第二の一本鎖ポリペプチドとの複合体である。
【００１４】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、第一の特異性（領域１）と第二の特異性（領域２）の両者が、ＲＯＢＯ１タンパク質のｓＲＯＢＯ１、すなわちＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域中に存在する。ＲＯＢＯ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、バリアント１についてはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００２９４１（配列番号１）、バリアント２についてはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿１３３６３１（配列番号２）、バリアント４についてはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００１１４５８４５．１（配列番号３）に開示されている。本発明において、ＲＯＢＯ１タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。ＲＯＢＯ１タンパク質の細胞外領域は例えば、バリアント２の場合、配列番号２のアミノ酸配列において１−８５９番目が相当する（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１，２９−３５，１９９８）。領域１は、細胞外ドメイン中の第１〜第５イムノグロブリン様ドメインから選ばれる一のドメインであればよいが、より好ましくは第３〜第５イムノグロブリン様ドメインから選ばれる一のドメインであり、さらに好ましくは第４又は第５イムノグロブリン様ドメインであり、特に好ましくは第５イムノグロブリン様ドメインである。
一方、領域２は細胞外ドメイン中の第１〜第３フィブロネクチン３型ドメインから選ばれる一のドメインであればよいが、より好ましくは第２又は第３フィブロネクチン３型ドメインであり、さらに好ましくは第３イムノグロブリン３型ドメインである。ここで各ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている。すなわち、配列番号２のアミノ酸番号として第１イムノグロブリン様ドメインが４３−１１０、第２イムノグロブリン様ドメインが１４５−２０３、第３イムノグロブリン様ドメインが２３７−２９３、第４イムノグロブリン様ドメインが３２９−３９４、第５イムノグロブリン様ドメインが４３３−４９１、第１フィブロネクチン３型ドメインが５２５−６１０、第２フィブロネクチン３型ドメインが６３７−７２７、第３フィブロネクチン３型ドメインが７３９−８２８である。
各ドメインのアミノ酸配列は、バリアントによって若干相違するが本発明においては、その変異体がいずれも含まれる。
【００１５】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体の可変領域を提供する第一の特異性を有する抗体及び第二の特異性を有する抗体は、例えば国際公開第２００５／０９５９８１号に記載の方法により製造することができる。
【００１６】
例えば、ポリクローナル抗体であれば、マウス等の動物の体内にこれらの免疫原及び必要に応じてアジュバントを複数回、皮下及び腹腔内等の適当な径路で注射することによって、動物の体内に生成せしめることが出来る。
【００１７】
一方、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して実質的に均質な抗体の母集団から得られるし、あるいは組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）によって作ることができる。
【００１８】
更に、別法としては、トランスジェニック動物（例えばマウス）を作成して、この体内でヒト抗体を産生させることが可能である（例えば、Ｄｕｃｈｏｓａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８（１９９２）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）参照）。また、ヒト抗体はファージ・ディスプレイライブラリーから誘導することもできる（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１３０：４１−６８（１９９２）；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９（１９９６））。
【００１９】
上記の抗体を得るための更なる方法として、抗体または抗体断片は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載されている技術を使用して抗体ファージライブラリーから、単離することができる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ， Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）には、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離についてのそれぞれの記載がある）。適当な抗体または抗体断片を選択するためには、上記抗原を使用して行うことができる。さらには、チェイン・シャッフリング法（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ） によって高親和性（ｎＭのオーダーの範囲）のヒト抗体を産生したり（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））、極めて大きいファージライブラリーを構築するための手法として、組合せ感染（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））なども知られている。
【００２０】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２つのポリペプチドの少なくとも一方において、Ｈ鎖の可変領域とＬ鎖の可変領域とを連結するリンカーを含有している。本明細書中、「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」とは、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）とＬ鎖の可変領域（ＶＬ）とを結合して一本鎖ポリペプチドを与える働きをするオリゴペプチド又はポリペプチドである。本発明では、好ましくは該リンカーはペプチドリンカーである。該ペプチドリンカーは、二つのポリペプチドを機能的に結合せしめて一つの一本鎖ポリペプチドを与えることのできるものであれば特に限定されず、例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカーを改変したものの中から選択して使用することが可能である。該ペプチドリンカーは、例えば１〜５０個のアミノ酸からなるペプチドであってよく、好ましくは３〜３０個のアミノ酸からなるペプチド、さらに好ましくは３〜２０個のアミノ酸からなるペプチド、さらに好ましくは３〜１０個のアミノ酸からなるペプチド、さらに好ましくは３〜８個のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。ここで「機能的に結合」せしめるとは、ポリペプチドを適切に折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）、オリジナルのタンパク質（当該ポリペプチドは該オリジナルのタンパク質に由来するものあるいは該オリジナルのタンパク質から誘導されたものである）の機能、例えば生物活性などの一部あるいはその全てを模擬することができる三次元構造を持った融合タンパク質を与えるような結合を意味する。
【００２１】
また、当該リンカーの長さは、結合されるプチドの性状にもよるが、生成する一本鎖ポリペプチド（あるいは融合タンパク質）に所望の活性を与えるものであればよい。該リンカーの長さは、生成せしめられる一本鎖ポリペプチドが適切に折り畳まれて所望の生物活性を得るに十分な長さのものであるべきである。また該リンカーの長さは、所望の生物活性について各種の長さのリンカーで結合した一連の一本鎖ポリペプチドをテストすることにより実験して決定することができる。リンカーについては、上記ダイアボディ及びその製造技術に関連して挙げられた文献などを参照することができる。本発明のダイアボディ型二重抗体のリンカーは、３〜３０個のアミノ酸という短いリンカーを有するものが好ましく、さらに３〜２０個のアミノ酸、さらに３〜１０個のアミノ酸、特に３〜８個のアミノ酸が好ましい。リンカーの具体例としてはＧＧＧＧＳ（配列番号１０）が挙げられる。
【００２２】
尚、一本鎖ポリペプチドにおけるＶＬとＶＨの配置は、Ｎ−末端側がＶＬでそれにリンカー、続いてＶＨと配置されているもの（ＶＬ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＶＨ構築体）でも、Ｎ−末端側がＶＨでそれにリンカー、続いてＶＬと配置されているもの（ＶＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ構築体）のいずれであってもよい。
【００２３】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体はヒト型化抗体とすることが可能である。これらのヒト型化抗体は、例えばマウス抗体由来の高い反応特異性を有する一方で、その他の部分をヒト抗体由来とすることによって、ヒトに投与された際に免疫原となり得る可能性が低減されている為にヒトに対する臨床上極めて有利な抗体である。
【００２４】
「ヒト型化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）の残基の少なくとも一部において、マウス、ラット、またはウサギといったような非ヒト動物（ドナー抗体）であり且つ所望の特異性、親和性、および能力を有するＣＤＲ に由来する残基によって置換されている抗体を意味する。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される場合もある。さらに、ヒト型化抗体は、レシピエント抗体および導入されたＣＤＲ またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに優れたものあるいは最適なものとするために行われる。更に詳しくは、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２９（１９８８）；ＥＰ−Ｂ−２３９４００；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，５９３−５９６（１９９２）；およびＥＰ−Ｂ−４５１２１６を参照することができる。
【００２５】
ヒト型化抗体は当業者に公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、レシピエント抗体及びドナー抗体の３次元イムノグロブリンモデルを使用し、種々の概念的ヒト型化生成物を分析する工程により、ヒト型化抗体が調製される。３次元イムノグロブリンモデルは、当業者にはよく知られている。更に詳細については、ＷＯ９２／２２６５３を参照することができる。
【００２６】
従って、ヒト型化抗体である本発明のダイアボディ型二重特異性抗体の例として、可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来である抗体を挙げることができる。
【００２７】
本発明では更に、ヒト型化によって抗体自身の機能低下等が生起する場合があるので、一本鎖ポリペプチド中の適当な部位、例えば、ＣＤＲ構造に影響を与える可能性があるフレームワーク（ＦＲ）中の部位、例えば、ｃａｎｏｎｉｃａｌ配列又はｖｅｒｉｎｅｒ配列において部位特異的変異を起こさせることによってヒト型化抗体の機能の改善をすることが出来る。このようにして得られた抗体も本発明のヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体に含まれる。
【００２８】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は２種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるが、本発明はそのいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域（例えば、各抗体由来の夫々の可変領域）を構成するポリペプチドにも係るものである。すでに記載したように、この一本鎖ポリペプチドは第一（又は第二）の抗体のＨ鎖の可変領域及び第二（又は第一）の抗体のＬ鎖、並びにこれらを連結するリンカーから構成されるが、更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出及び精製等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ及びＨｉｓ−ｔａｇ）をその末端等に含むことが出来る。
【００２９】
本発明の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は当業者に公知の方法で取得し、その塩基配列を決定することが出来る。例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより行うことができる（Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３−３８３７（１９９３））。上記したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、こうした方法におけるＤＮＡの供給源として使用することが出来る。
【００３０】
より具体的には、本発明の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸は、既に構築され当業者に公知である、一本鎖Ｆｖ（（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）又は「ｓｃＦｖ」）又はダイアボディ型二重特異性抗体をコードする核酸に基づき、その中のＶＨないしＶＬを別の特異性を有する抗体由来のものと夫々入れ換えることによって調製することが出来る。ここで「ｓｃＦｖ」とは、ある抗体のＶＨとＶＬのドメインを含有しているもので、該ドメインが一本のポリペプチド鎖中にあるものを指している。一般的には該ＦｖポリペプチドはさらにＶＨとＶＬのドメイン間にポリペプチドリンカーを含有し、抗原結合のために必要な構造を与えることを可能にしている。ｓｃＦｖについては、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ （Ｅｄ．）， "Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"， Ｖｏｌ． １１３， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．２６９−３１５ （１９９４）を参照することができる。
【００３１】
更に、ヒト型化されたダイアボディ型二重特異性抗体の一本鎖ポリペプチドにおける可変領域をコードする核酸を作成する場合には、予め設計されたアミノ酸配列に基づきオーバーラップＰＣＲ法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものである。
【００３２】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）技術により単離されうる。一旦単離されれば、ＤＮＡは発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、またはイムノグロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクションさせ、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えばＲ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０，１９８５；Ｒ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７，１９８８；Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．，"ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）； Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，"ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０））；Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅ ａｎｄ Ｇ． Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ（Ｅｄ．），ＰＣＲ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２（１９８８）などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００３３】
ハイブリダイゼーションについてはＬ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．），"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"，Ｖｏｌ．２９（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７４）などを参考にすることができる。ＤＮＡなど核酸の配列決定は、例えばＳａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９７７）などを参考にすることができる。また一般的な組換えＤＮＡ技術は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄ．），"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．），"ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ ｔｏ ４，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などを参考にできる。
【００３４】
こうして取得された本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変することができる。この様にＤＮＡ を遺伝子的に改変又は修飾する技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ（Ｅｄ．），（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９１）における総説において示されており、例えば、位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法及びポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）変異生成法を挙げることができる。
【００３５】
ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。このようにして、本発明のヒト型化されたダイアボディ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドを得ることが出来る。
【００３６】
又は、本明細書の実施例に記載されているように、アミノ酸自体は変更せずに、その宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内における一本鎖ポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
【００３７】
尚、リンカー等は、組換え技術等の遺伝子工学的手法及びペプチド化学合成等の当業者に公知の任意の技術手段を用いて、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド内に適宜導入することが出来る。
【００３８】
一本鎖ポリペプチドは、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、上記核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、それを回収し、精製することによって製造することが出来る。通常、このようなベクターには本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドのうちのいずれか一方の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸が含まれている。このような場合には得られる２種類のベクターは同一の宿主細胞に導入することが好ましい。或いは、２種類の一本鎖ポリペプチドの夫々をコードする２種類の核酸を同一のベクターに含有させることも可能である。
【００３９】
ここで、「複製可能な発現ベクター（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」および「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、ＤＮＡ（通常は二本鎖である）の断片（ｐｉｅｃｅ）をいい、該ＤＮＡは、その中に外来のＤＮＡの断片を挿入せしめることができる。外来のＤＮＡは、異種ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ）として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないＤＮＡである。ベクターは、外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来ＤＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
【００４０】
このようなベクターは、適切な宿主中で ＤＮＡ配列を発現するように、適切な制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とそれが機能するように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（即ち、外来ＤＮＡが発現できるように）連結せしめられたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物（ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を意味している。そうした制御配列としては、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来ＤＮＡの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。
【００４１】
該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｅｒｔ）等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
【００４２】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。
【００４３】
このような宿主細胞における発現等により得られた一本鎖ポリペプチドは、好ましくは一本鎖ポリペプチドは、一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。一本鎖ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トライトン−Ｘ１００） を使用して膜から遊離せしめることができる。
【００４４】
精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
【００４５】
尚、回収された一本鎖ポリペプチドは不溶性画分に含まれていることも多いために、精製操作は、一本鎖ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。
【００４６】
更に、こうして精製された一本鎖ポリペプチドを会合（巻き戻し）せしめ、形成されたダイアボディ型二重特異性抗体を分離して回収することによって、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を製造することが出来る。
【００４７】
会合処理は、単独の一本鎖ポリペプチドを適切な空間的配置に戻すこによって、所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリペプチド同志あるいはドメイン同志を会合した状態に戻すという意味も有しているので「再会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構成ということもでき、或いは、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）とも呼ぶことが出来る。会合処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グアニジン）の濃度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成されたダイアボディ型二重特異性抗体の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
【００４８】
本発明の診断又は医薬組成物は、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体又はその標識体、特にヒト型化されたダイアボディ型二重特異性抗体、一本鎖ポリペプチド、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする。かかる有効成分は、ｓＲＯＢＯ１に対する反応性に比べて組織に存在するＲＯＢＯ１に対する反応性が高く、またその標識体によってはＲＯＢＯ１を発現する細胞に対して細胞障害活性を有するので、がん細胞画像化剤、抗癌剤、抗炎症剤として有用である。ＲＯＢＯ１が発現している細胞としては、好ましくは肝癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、胃癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞である。従って、本発明の診断又は医薬組成物は細胞増殖に起因する疾患、例えば肝細胞癌、肺癌、乳癌、子宮癌、胃癌、脳腫瘍、大腸癌などの診断、治療、予防を目的として使用できる。
【００４９】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体の標識体としては、診断薬として使用する場合にはＣｏ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｃｒ等の金属元素の常磁性イオンを有する核磁気共鳴診断用金属錯体、Ｘ線診断用錯体、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、２０１Ｔｄ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、８５Ｓｒ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒなどの放射性金属などが挙げられる。また、治療薬として用いる場合には、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕなどの放射性金属が用いられる。
【００５０】
これらの放射性金属をダイアボディ型二重特異性抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属が金属キレート試薬を介ダイアボディ型二重特異性抗体に結合している。
【００５１】
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
【００５２】
これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
【００５３】
ダイアボディ型二重特異性抗体への放射性金属の結合は、常法に従って行うことができる。例えばダイアボディ型二重特異性抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
【００５４】
本発明の有効成分の有効量は、例えば診断手段、治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
【００５５】
本発明の診断又は医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
【００５６】
本発明の診断又は医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
【００５７】
持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
【００５８】
本発明の診断又は医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正 日本薬局方解説書、平成８年７月１０日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
【００５９】
なお、明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【実施例】
【００６０】
以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。 なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、ＤＮＡクローニングでは Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ ｔｏ ４，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；特にＰＣＲ 法では、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）及びＭ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）や添付の薬品等を使用している。
【００６１】
実施例１
抗ＲＯＢＯ１抗体は、特開２００８−２９０９９６号に記載の方法により製造した。Ｂ５２０９Ｂを産生するハイブリドーマはＰＰＭＸ０６０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２１）として、またＢ２２１２Ａを産生するハイブリドーマはＢ２２１２Ａ（ＦＥＲＭ  Ｐ−０１７０９）として寄託されている。
【００６２】
（抗ＲＯＢＯ１抗体のクローニング）
抗ＲＯＢＯ１抗体Ｂ５２０９Ｂ、抗ＲＯＢＯ１抗体Ｂ２２１２Ａの産生マウスＢ細胞ハイブリドーマからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを下記の参考論文１に基づき合成したクローニングプライマーを用いＰＣＲを行い、Ｂ５２０９ＢｓｃＦｖ（以下５２０９ｓｃＦｖ）、Ｂ５２０９Ｂ可変領域ＶＨ（以下５２０９ＶH）及びＶＬ（以下５２０９ＶL）の配列を、Ｂ２２１２ＡｓｃＦｖ（以下２２１２ｓｃＦｖ）、Ｂ２２１２Ａ可変領域ＶＨ（以下２２１２ＶH）及びＶＬ（以下２２１２ＶL）の配列を明らかにした（配列番号４〜９）。
【００６３】
参考論文１ −Ｋｒｅｂｂｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１，３５−５５．（１９９７）．
【００６４】
実施例２
（Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製）
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、５２０９ＶH−２２１２ＶLと２２１２ＶH−５２０９ＶLの二つの分子から作製される。発現ベクターはすでに構築されているＭＵＣ１及びＣＤ３を標的としたＭｘ３ ｄｉａｂｏｄｙ（以下Ｍｘ３）発現ベクターを基に作製した（国際公開第ＷＯ０２／０６４８６号パンフレット参照）。
【００６５】
即ち、制限酵素部位を導入したＡ−Ｂプライマーを用いＰＣＲ法により５２０９ＶHを増幅後ＮｃｏＩ−ＥａｇＩで消化し、Ｍｘ３発現ベクターの一つｐＳＮＥ４−ＭＨＯＬ（抗ＭＵＣ１抗体ＭＵＳＥ１１ ＶＨ（以下ＭＨ）−ＧＧＧＧＳ（以下Ｇ１）−抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３ ＶＬ（以下ＯＬ））のＭＨと入れ換えｐＲＡ−５ＨＯＬを作製した。同様にＣ−Ｄプライマーを用い５Ｌを増幅後ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩで消化し、ｐＳＮＥ４−ＯＨＭＬ（ＯＫＴ３ ＶＨ（以下ＯＨ）−Ｇ１−ＭＵＳＥ１１ ＶＬ（以下ＭＬ））のＭＬと入れ換えｐＲＡ−ＯＨ５Ｌを作製した（図１）。
Ｃ末端側には精製のためのＨｉｓ−ｔａｇ （Ｈｉｓｘ６：ヒスチジン６量体ｔａｇ）が導入されている。
【００６６】
実施例３
（大腸菌を用いた５２０９ＶH−２２１２ＶLと２２１２ＶH−５２０９ＶLの発現）
発現ベクターｐＲＡ−５２０９ＶH−２２１２ＶLとｐＲＡ−２２１２ＶH−５２０９ＶLでそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、及び、Ｒｏｓｓｅｔａ２（ＤＥ３）を形質転換し、培養はＬＢ培地を用い２８℃で行った。Ｏ．Ｄ．６００＝約０．８となったところで、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧにより発現を誘導し、１７時間振盪培養した。菌体を遠心分離後（この操作により分けられた上清を培地上清ｓｕｐとする）、超音波破砕し、さらに遠心分離後の上清を菌体内可溶性画分、沈殿を菌体内不溶性画分ｐｐｔとした。
【００６７】
各画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果、５２０９ＶH−２２１２ＶL（５２０９Ｈ２２１２Ｌ）と２２１２ＶH−５２０９ＶL（２２１２Ｈ５２０９Ｌ）共にほとんどが菌体内不溶性画分に発現していることが確認されたため、この画分からの蛋白質の調製を行った（図２）。
【００６８】
実施例４
（５２０９ＶH−２２１２ＶLと２２１２ＶH−５２０９ＶLの精製、巻き戻し）
菌体内不溶性画分を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ  １％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で一度、超純水で２度洗浄した後、６Ｍ塩酸グアニジン／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌに一晩４℃で浸し、タンパク質を可溶化した後、変性状態でＨｉｓ Ｔａｇと特異的に結合する金属キレート樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ：ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。精製後の収量は形質転換培養液１Ｌ当たりそれぞれ約５ｍｇであった。
【００６９】
精製されたタンパク質は塩酸グアニジンにより変性状態となっているので活性を保持した三次構造をもつタンパク質を得るためには巻き戻し操作が必要となる。５２０９ＶH−２２１２ＶLと２２１２ＶH−５２０９ＶLそれぞれを７．５μＭに希釈し等量混合（全蛋白質濃度７．５μＭ）、終濃度１ｍＭとなるようＥＤＴＡを加えた後、サンプルを透析膜に入れ外液の塩酸グアニジン濃度を３Ｍ（６ｈｒ）、２Ｍ（６ｈｒ）、１Ｍ（１２ｈｒ）、０．５Ｍ（１２ｈｒ）、０Ｍと徐々に下げていく段階透析法によって、変性剤の除去を行い、途中の１Ｍと０．５Ｍの透析段階において、凝集抑制剤としてＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を終濃度０．４Ｍ透析外液に加え４℃に保温することによる酸化反応の促進を図った。
【００７０】
巻き戻し操作後、０．２２μｍのフィルターにより凝集を除去した後、巻き戻しに用いた蛋白質の総量と巻戻し後に可溶性蛋白質として溶液中に存在している蛋白質量との比較により算出した巻き戻し効率は約３０％だった。続いて、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Superdex 200（GE Healthcare社）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから非常に精製度が高く、かつ均一なヘテロ二量体を形成していることが確認された（図４）。以下、前記ヘテロ二量体をＤｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａともいう。
【００７１】
参考例１
ｓＲＯＢＯ１の調整法
ヒトＲＯＢＯ１のｃＤＮＡはAlexander細胞より調整したｃＤＮＡライブラリーより、ＰＣＲ法によりクローニングし、pcDNA3.1/V5-His TOPOベクター(Invitrogen社製)に挿入した（Ito H et al, Identiticatio of ROBO1 as a Novel Hepatocellular Carcinoma Antigen and a Potential Therapeutic and Diagnostic Target, Clinical Cancer Research, 12. 3257-3264. 2006）。このpcDNA3.1/V5-His TOPOベクターより、細胞外領域（ヒトＲＯＢＯ１isoform bのアミノ酸残基１−８６２）のＣ末にＨｉｓタグを付加した可溶型ＲＯＢＯ１（ｓＲＯＢＯ１−ＨＩｓ）を作製した。遺伝子をpBlueBac4.5TOPOベクターに挿入し、トランスファーベクターROBO1/pBBを作製した。Invitrogen社の指示書にしたがいBacNBlue DNAとともに宿主細胞Ｓｆ９細胞にトランスフェクションし、リコンビナントウイルスを作製した。ｓＲＯＢＯ１リコンビナントウイルスのハイタイターストックを作製し、Ｓｆ９細胞に感染させ、２７℃で７２時間培養し、培養上清を集め、Ｈｉｓタグカラムにて精製した。精製品をＰＤ１０カラムにてリン酸バッファー（ＰＢＳ）に置換し、実験に用いた。
【００７２】
実施例５
（ｓＲＯＢＯ１とＤｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２ＡとのＩＴＣ測定）
ｉＴＣ２００（GE Healthcare社）を用いてセル内のｓＲＯＢＯ１にシリンジからＤｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａを滴下した際の反応熱を測定することによりｓＲＯＢＯ１−Ｄｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａ間相互作用を精査した。検討の結果、Ｄｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２ＡとＲＯＢＯ１との相互作用を確認することができた。また、発熱プロファイルより、結合に伴う二次的な作用があること、滴定条件の差による飽和点の変化より、速度論的な相互作用が示唆された。
【００７３】
実施例６
（ｓＲＯＢＯ１とＤｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａとの複合体形成確認）
実施例５に記載のITC測定を行ったサンプルを Superdex 200 10/300カラム（GE Healthcare社）によるサイズ排除クロマトグラフィーによって解析した。その結果、分子量の大きく異なるsROBO1およびDiabody B5209B-B2212Aが同じ溶出位置に溶出され、複合体の形成が確認された。
【００７４】
実施例７
可溶性ROBO１（ｓＲＯＢＯ１）に対する反応性の検討  競合ＥＬＩＳＡ（図７）
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに００６８により精製したｓＲＯＢＯ１を５０ナノグラム/ウェルを固相化した。抗ＲＯＢＯ１whole抗体Ｂ５２０９ＢおよびＢ２２１２Ａはそれぞれヌードマウスにハイブリドーマ細胞を注入し、腹水を採取して硫安沈殿により精製したものを生理食塩水に溶解した。競合ELISAに用いる抗ＲＯＢＯ１whole抗体Ｂ５２０９ＢおよびＢ２２１２ＡはLightning-Link(TM) HRP Conjugation Kit (Innova Biosciences, Cambridge, UK)にてHRP標識後，４０％ブロックエース―１０ｍM TBSバッファーにてB5209−HRPは30ng/ml, B2212Aは60ng/mlに希釈して反応に用いた。Ｂ５２０９ＢのｓｃＦｖは抗体遺伝子配列より大腸菌発現用ベクターを構築し、大腸菌発現系により調製し、用いた。
HRP標識したそれぞれの抗体とB5209Bwhole抗体（青色）、B2212Awhole抗体（赤色）、ダイアボディ（緑色）、B5209B scFv（紫色）を４０％ブロックエース−TBSバッファーにて濃度を変えて希釈し同時に１時間室温で反応させた。３回洗浄後、ＴＭＢ試薬(ScyTek Laboratories, Logan, UT)を加え、呈色反応をTMB Stop Buffer (ScyTek Laboratories)で停止させたのち、４５０nmの吸光度をプレートリーダー(Biotrak II, GE Healthcare, Pscataway, NJ)にて測定した。
【００７５】
実施例８
ＣＨＯ−ＲＯＢＯ１の調整法
全長ＲＯＢＯ１タンパク質のＣ端にＨＡタグを付加したＲＯＢＯ１−ＨＡを発現するステーブル細胞株ＣＨＯ−ＲＯＢＯ１はライフテクノロジー社のＦｌｐ−Ｉｎシステムを用いて指示書に従い作製した。ＲＯＢＯ１のＣ端にＨＡタグを付けた遺伝子を参考例１記載のpcDNA3.1/V5-His TOPOベクターよりＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ  ベクターに制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩ  とＸｈｏＩを用いて挿入した。これをｐＯＧ４４  ｖｅｃｔｏｒ，（Ｆｌｐ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）とともに  Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクションし、１ｍｇ／ｍＬ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ入りの選択培地にて数日培養し、生じたコロニーからRobo1-HA を高発現するクローンを選出した。
【００７６】
競合ＥＬＩＳＡにより、Ｄｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２ＡとｓＲＯＢＯ１との反応性を測定した結果、Ｂ５２０９ＢｗｈｏｌｅＩｇＧとの競合において（図左パネル）Ｄｉａｂｏｄｙは５２０９ｓｃＦｖと同等の反応性を示し、ｗｈｏｌｅＩｇＧよりＩＣ５０において数十倍弱い結合活性であった。またＢ２２１２Ａとの競合においては（図右パネル）、ｗｈｏｌｅＩｇＧとほぼ同じか少し弱い結合活性であることが示された。
【００７７】
細胞膜ＲＯＢＯ１に対する反応性の検討
細胞膜ＲＯＢＯ１に対する反応性は細胞ＥＬＩＳＡにて検討した（図８）。
実施例８において調整したＲＯＢＯ１−ＨＡ発現Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞あるいはコントロールとしてＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を、ポリＤリジンコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１０5個／ウェルの濃度に播種し、２０００回転で遠心後、上清を捨て、ブロッキングバッファー（４０％ブロックエース（大日本住友製薬）入りの１０ｍＭトリスバッファー）にて３０分間ブロッキングを行った。ブロッキングバッファーを取り除き、一次抗体をブロッキングバッファーにてそれぞれの濃度に希釈して1時間室温でインキュベートした。０．０６％Ｔｗｅｅｎ２０入り生理食塩水にて2回洗浄後、ｓｃＦｖあるいはダイアボディに対しては抗Ｈｉｓ抗体（ＯＧＨｉｓ：ＭＢＬ株式会社医学生物学研究所）１μｇ／ｍｌを、whole抗体に対してはバッファーを加えて1時間室温で反応させた。同様に2回洗浄後、三次反応としてペルオキシダーゼ付加抗ＩｇＧＦｃ特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)３０００倍希釈したものを加え、さらに1時間室温で反応させた。３回洗浄後、ＴＭＢ試薬(ScyTek Laboratories, Logan, UT)を加え、呈色反応をTMB Stop Buffer (ScyTek Laboratories)で停止させたのち、４５０nmの吸光度をプレートリーダー(Biotrak II, GE Healthcare, Pscataway, NJ)にて測定した。
【００７８】
ＲＯＢＯ１を安定発現するＣＨＯ細胞株（実施例８）を用いて、Ｄｉａｂｏｄｙ  Ｂ５２０９Ｂ−Ｂ２２１２Ａの細胞膜上ＲＯＢＯ１に対する反応性を調べた。ＲＯＢＯ１を発現しないコントロールＣＨＯ細胞ではどの抗体も結合がみられなかった（右パネル）。安定発現細胞に対しては、Ｂ５２０９ＢｗｈｏｌｅＩｇＧ抗体とＢ２２１２ＡＷｈｏｌｅＩｇＧ抗体はほぼ同じ結合活性（ややＢ５２０９Ｂが強い）がみられ、Ｄｉａｂｏｄｙもほぼこれらの抗体と同等の結合活性を示した。これに対し、５２０９ｓｃＦｖは図に示した濃度範囲では結合がみられなかった。
【００７９】
図７と図８の結果より、ＤｉａｂｏｄｙはｓＲＯＢＯ１に対しては、それぞれのｓｃＦｖと同様な結合を示し、細胞膜上のＲＯＢＯ１に対してはＷｈｏｌｅ抗体と同等の結合活性をもつことが示された。Ｂ５２０９Ｂが認識する第５イムノグロブリン様ドメインとＢ２２１２Ａが認識する第３フィブロネクチン３型ドメインとは２００アミノ酸残基以上離れていることから、可溶型ＲＯＢＯ１では、ドメインが直鎖状になり、Ｄｉａｂｏｄｙの両ドメインエピトープへの結合が困難であるが、細胞膜上の膜型ＲＯＢＯ１では、なんらかのコンフォメーションの違いにより、ドメイン間の距離が縮まり、Ｄｉａｂｏｄｙの反応が増すと考えられる。
【図１】
2015062367.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015062367.tif 000006
【図６】
2015062367.tif 000007
【図７】
2015062367.tif 000008
【図８】
2015062367.tif 000009
【配列表】
2015062367000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月2日(2014.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
実施例１
抗ＲＯＢＯ１抗体は、特開２００８−２９０９９６号に記載の方法により製造した。Ｂ５２０９Ｂを産生するハイブリドーマはＰＰＭＸ０６０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２１）として、またＢ２２１２Ａを産生するハイブリドーマはＢ２２１２Ａ（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７０９）として寄託されている。