(57)【要約】【課題】本発明は、アトピー性皮膚炎に伴う痒みや過剰な炎症反応を顕著に抑制することができ、非常に優れた抗掻痒作用と抗炎症作用を示すアトピー性皮膚炎抑制剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤は、下記式（Ｉ）で表されるセスキテルペン化合物を有効成分として含有することを特徴とする。2015057377.tif 000007［式中、Ｒ1は、水素原子またはＣ2-18アルカノイル基を示す］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるセスキテルペン化合物を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎抑制剤。
【化１】
2015057377.tif 000006
［式中、Ｒ1は、水素原子またはＣ2-18アルカノイル基を示す］
【請求項２】
Ｒ1が水素原子である請求項１に記載のアトピー性皮膚炎抑制剤。
【請求項３】
セスキテルペン化合物（Ｉ）が２−ヒドロキシメチルプロペン酸［（３ａＲ，９ａβ，９ｂα）−デカヒドロ−５ａβ−ビニル−３，９−ビス（メチレン）−２，８−ジオキソ−２Ｈ−フロ［２，３−ｆ］［２］ベンゾピラン−４β−イル］である請求項１または２に記載のアトピー性皮膚炎抑制剤。
【請求項４】
外用剤である請求項１〜３のいずれかに記載のアトピー性皮膚炎抑制剤。
【請求項５】
化粧品である請求項１〜３のいずれかに記載のアトピー性皮膚炎抑制剤。
【請求項６】
入浴剤である請求項１〜３のいずれかに記載のアトピー性皮膚炎抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎の予防や治療に有効なアトピー性皮膚炎抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎はアレルギー体質やドライスキンなどが原因であると考えられている皮膚疾患であり、強い痒みを伴う湿疹が寛解と増悪を繰り返しながら慢性的に継続する。特に強いドライスキンを伴う場合、皮膚のバリア機能の低下からアレルゲンが侵入し易くなっており、また、引掻行動によりさらにバリア機能が低下し、症状が悪化して痒みが強くなるという悪循環に陥る。かつては、アトピー性皮膚炎は２歳で半数の患者が治り、１０歳でさらに半数が治り、１８〜２０歳でほとんど治るといわれていたが、現在では成人しても治らない患者や成人後に再発する患者の数が増えてきており、問題となっている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎の治療には、副腎皮質ホルモンを主体とするステロイド外用剤が主に用いられている。しかし、ステロイド外用剤には皮膚を薄くするといった副作用があったり、また、痒みの軽減には比較的効果が小さいという問題がある。
【０００４】
本発明者らは、ステロイド以外でアトピー性皮膚炎の抑制作用を有するものとして、熱帯アフリカに広く自生するキク科潅木であるベルノニア  アミグダリナ（Vernonia amygdalina）の抽出物を開発している（特許文献１）。当該抽出物は、アトピー性皮膚炎に起因する痒みを有効に低減できると共に、付随する炎症反応を抑制する作用も有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４２９７０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、本発明者らは、ベルノニア  アミグダリナの抽出物、特に水抽出物とアルコール抽出物が、アトピー性皮膚炎に起因する痒みやアトピー性皮膚炎に伴う炎症反応を低減できることを見出している。
【０００７】
しかし、アトピー性皮膚炎患者の増加などによって、アトピー性皮膚炎の諸症状をより一層有効に抑制できる薬剤が切望されている。特に、アトピー性皮膚炎では引掻行動による症状の悪化が非常に問題であり、現在、一般的に使用されている治療薬では痒みを十分に軽減できないので、より一層優れた抗掻痒作用を示す薬剤が求められている。
【０００８】
そこで本発明は、アトピー性皮膚炎に伴う痒みや過剰な炎症反応を顕著に抑制することができ、非常に優れた抗掻痒作用と抗炎症作用を示すアトピー性皮膚炎抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ベルノニア  アミグダリナから単離精製された化合物が、先に開発した抽出物よりも顕著に優れたアトピー性皮膚炎抑制作用を示し、特に、優れた抗掻痒作用を示すことを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤は、下記式（Ｉ）で表されるセスキテルペン化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１１】
【化１】
2015057377.tif 000002
【００１２】
［式中、Ｒ1は、水素原子またはＣ2-18アルカノイル基を示す］
【００１３】
上記セスキテルペン化合物（Ｉ）としては、Ｒ1が水素原子であるもの、また、２−ヒドロキシメチルプロペン酸［（３ａＲ，９ａβ，９ｂα）−デカヒドロ−５ａβ−ビニル−３，９−ビス（メチレン）−２，８−ジオキソ−２Ｈ−フロ［２，３−ｆ］［２］ベンゾピラン−４β−イル］が好適である。
【００１４】
本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤の剤形としては外用剤が好ましく、特に化粧品または入浴剤が好ましい。これら剤形は、アトピー性皮膚炎の予防や治療に適している。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤は、アトピー性皮膚炎による皮膚の発赤、乾燥、浮腫、また、痒みを原因とする掻痒行動などによる出血、痂皮形成、擦傷、組織損傷などを軽減することができ、特に、優れた抗掻痒作用を示す。また、アトピー性皮膚炎に伴う過剰な炎症反応を抑制することができる。よって本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤は、アトピー性皮膚炎を有効に予防および治療できるものとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明化合物をＦＴ−ＭＳで分析した結果を示すチャートである。
【図２】図２は、本発明化合物を1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果を示すチャートである。
【図３】図３は、本発明化合物を13Ｃ−ＮＭＲで分析した結果を示すチャートである。
【図４】図４は、本発明化合物を13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＥＰＴ）で分析した結果を示すチャートである。
【図５】図５は、本発明化合物を２Ｄ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）で分析した結果を示すチャートである。
【図６】図６は、本発明化合物を２Ｄ−ＮＭＲ（ＨＨ−ＣＯＳＹ）で分析した結果を示すチャートである。
【図７】図７は、比較的軽度のアトピー性皮膚炎モデルマウスの患部の写真である。
【図８】図８は、比較的重度のアトピー性皮膚炎モデルマウスの患部の写真である。
【図９】図９は、アトピー性皮膚炎モデルマウスの対照群（溶媒のみ）、ＶＡＭ葉抽出物投与群および本発明化合物投与群の背部における皮膚炎重症度スコアの経時的変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、アトピー性皮膚炎モデルマウスの対照群（溶媒のみ）、ＶＡＭ葉抽出物投与群および本発明化合物投与群の耳介部における皮膚炎重症度スコアの経時的変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、アトピー性皮膚炎モデルマウスの対照群（溶媒のみ）、ＶＡＭ葉抽出物投与群および本発明化合物投与群の背部と耳介部における総合皮膚炎重症度スコアの経時的変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＶＡＭ葉抽出物と本発明化合物とを等量用いた場合おける炎症性サイトカインＴＮＦ−αの産生抑制率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明化合物を０．１質量％または１質量％含むローション剤を塗布したマウスと対照マウスにおける、（１）痒みに関連する遺伝子ＩＬ３３と（２）皮膚修復に関連する遺伝子であるＦＬＧの発現を定量化した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤は、上記セスキテルペン化合物（Ｉ）を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１８】
本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）のＲ1である「Ｃ2-18アルカノイル基」は、Ｃ1-17アルキル−カルボニル基をいい、ここで「Ｃ1-17アルキル基」は、炭素数１以上、１７以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和炭化水素基をいう。Ｃ2-18アルカノイル基としては、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、イソプロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ピバロイル基、ｎ−ヘキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ノニルカルボニル基、６−メチルオクチルカルボニル基、７−メチルオクチルカルボニル基、ｎ−デシルカルボニル基、８−メチルノニルカルボニル基、ｎ−ウンデシルカルボニル基、９−メチルデシルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、１０−メチルウンデシルカルボニル基、ｎ−トリデシルカルボニル基、１１−メチルドデシルカルボニル基、ｎ−テトラデシルカルボニル基、ｎ−ペンタデシルカルボニル基、ｎ−ヘキサデシルカルボニル基、ｎ−ヘプタデシルカルボニル基などが挙げられる。
【００１９】
本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）としては、Ｒ1が水素原子である化合物、即ち下記式（Ｉ1）で表される化合物が好適である。
【００２０】
【化２】
2015057377.tif 000003
【００２１】
さらに、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）としては、２−ヒドロキシメチルプロペン酸［（３ａＲ，９ａβ，９ｂα）−デカヒドロ−５ａβ−ビニル−３，９−ビス（メチレン）−２，８−ジオキソ−２Ｈ−フロ［２，３−ｆ］［２］ベンゾピラン−４β−イル］、即ち下記式（Ｉ2）で表される化合物が好適である。
【００２２】
【化３】
2015057377.tif 000004
【００２３】
上記の好適化合物の優れたアトピー性皮膚炎抑制効果は、後述する実験結果により実証されている。
【００２４】
本発明化合物、特に上記セスキテルペン化合物（Ｉ1）と（Ｉ2）は、ベルノニア  アミグダリナ（Vernonia amygdalina，以下、「ＶＡＭ」と略記する）の葉から単離精製することができる。
【００２５】
ＶＡＭは熱帯アフリカに広く自生するキク科潅木であり、アフリカでは食品材料にも用いられている安全なものである。本発明では、ＶＡＭの葉を主に用いる。その産地や採取時期などは特に制限されないが、ＶＡＭの新葉を好適に用いる。但し、葉と共に、枝、幹、根などを原材料として用いてもよい。
【００２６】
ＶＡＭは、必要に応じて洗浄したり乾燥してもよい。乾燥の条件は特に制限されないが、有効成分の変性や材料の腐敗を考慮すると、収穫後、風通しのよい場所で天日乾燥することが好ましい。
【００２７】
製造効率を高めるため、ＶＡＭは粉砕することが好ましい。粉砕方法は特に限定されず、例えば、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミル、ロッドミル、サンプルミル、スタンプミル、エヒスインテグレーター、冷却装置付きブレンダーなどを用い、約１ｍｍ〜１０ｍｍ程度のサイズに粉砕することが好ましい。
【００２８】
粉砕されたＶＡＭは、溶媒に浸漬して抽出し、さらにクロマトグラフィなどで本発明に係るセスキテルペン化合物を単離精製すればよい。本発明者らの実験的知見によれば、上記セスキテルペン化合物（Ｉ1）と（Ｉ2）はアセトンと水に溶解性を示すことから、抽出溶媒としては、水やアセトンを用いればよい。但し、水と酢酸エチルとで分液した場合には酢酸エチル層に含まれることから、かかる分液操作により精製を進めることができ、また、酢酸エチルも抽出溶媒として用いることができる。
【００２９】
抽出条件は適宜調整すればよい。例えば、抽出は常温で行うことができるが、抽出効率を高めるために、気温によっては３０〜６０℃程度に加温してもよい。また、抽出効率を高めるために抽出時には撹拌することが好ましい。或いは、ＶＡＭに抽出溶媒を加えた後に、ＶＡＭを抽出溶媒中で粉砕してもよい。また、抽出時間は特に制限されないが、例えば、１時間以上、１０日以下程度にすることができる。
【００３０】
抽出操作後は、さらに、アトピー性皮膚炎の抑制作用を測定しつつ、薄層クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、分取クロマトグラフィなどのクロマトグラフィにより活性成分を特定していけばよい。なお、アトピー性皮膚炎の抑制作用の測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン産生抑制試験やアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いた引掻回数抑制試験により簡便に行うことができる。
【００３１】
Ｒ1がＣ2-18アルカノイル基であるセスキテルペン化合物（Ｉ）は、Ｒ1が水素原子であるセスキテルペン化合物（Ｉ1）と（Ｉ2）をエステル化することにより製造することができる。かかるエステル化は、Ｃ2-18アルカノイル基に対応する酸、またはその活性化エステル化合物や酸クロライド化合物、さらには必要に応じて縮合剤を用い、当業者にとり公知の方法で行うことができる。
【００３２】
本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）は、アトピー性皮膚炎抑制剤の有効成分として用いることができる。なお、本発明における「抑制」には、アトピー性皮膚炎の発症の抑制、即ち「予防」と、発症したアトピー性皮膚炎の軽減、即ち「治療」の両方の概念が含まれる。従って、本発明のアトピー性皮膚炎抑制剤は、アトピー性皮膚炎の発症前に予防的に使用してもよいし、症状が比較的軽度なうちに治療するか或いは症状の進行を阻害するために使用してもよいし、重度な症状を軽減するために使用してもよい。
【００３３】
アトピー性皮膚炎の重症度は、ある治療ガイドラインによれば、以下の４段階に分けられる。
軽微：  面積にかかわらず、軽度の皮疹のみみられる
中等度：  強い炎症を伴う皮疹が体表面積の１０％未満にみられる
重症：  強い炎症を伴う皮疹が体表面積の１０％以上、３０％未満にみられる
最重症：  強い炎症を伴う皮疹が体表面積の３０％以上にみられる
【００３４】
上記分類において、「軽度の皮疹」は軽度の紅斑、乾燥、落屑が主体の病変をいい、「強い炎症を伴う皮疹」とは紅斑、丘疹、びらん、浸潤、苔癬などを伴う病変をいう。アトピー性皮膚炎の薬物療法では、一般的に、重症度が低い場合には非ステロイド薬が用いられ重症度に応じてステロイド薬が用いられる。本発明のアトピー性皮膚炎抑制剤は、合成医薬品と比較して副作用は少ないと考えられることから重症度にかかわらず使用することもできるが、特に「軽微」または「中等度」といった重症度が比較的低いアトピー性皮膚炎に特に有効である。
【００３５】
本発明のアトピー性皮膚炎抑制剤の剤形は特に制限されず、例えば、軟膏剤、ローション剤、溶液剤、懸濁剤、貼付剤、リニメント剤、パップ剤などの外用剤；トローチ剤や坐剤などの粘膜的溶剤；注射剤；散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エキス剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、チンキ剤、シロップ剤などの経口剤とすることができるが、アトピー性皮膚炎が皮膚疾患であることから、外用剤とすることが好ましい。
【００３６】
本発明のアトピー性皮膚炎抑制剤は、有効成分であるセスキテルペン化合物（Ｉ）の他、その剤形などに応じて、基材、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料などを配合することができる。
【００３７】
本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）の投与量は、患者の症状、年齢、性別、患部の面積、予防的な使用であるか治療的な使用であるかなどに応じて適宜調整すればよいが、例えば、ヒトに投与する場合には、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、５０ｍｇ／ｋｇ体重／日以下程度とすることができる。また、１日当たりの投与回数も、症状の重篤度、特に痒みの程度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、１回／日以上、６回／日以下程度にすることができる。
【００３８】
その他、本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤は、日用品として用いることができる。
【００３９】
例えば、乳液、化粧水、クリーム、洗顔料、ジェル、美容液、パック・マスクなどの基礎化粧品；ファンデーション類、口紅類、白粉・打粉類、頬紅類、眉目類、美爪類などのメーキャップ化粧品；シャンプーやリンスなどの洗髪用化粧品；ヘアスタイリング剤、ヘアトリートメント剤、育毛剤、パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、ヘアブリーチなどの毛髪用化粧品；香水やコロンなどの芳香化粧品；石鹸、液体ボディ洗浄料、サンケア製品、ハンドケア製品、防臭化粧品、脱色剤・除毛剤などのボディ化粧品；歯磨類や口中清涼剤などの口腔用化粧品などの化粧品とすることができる。即ち、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）を、アトピー性皮膚炎を抑制する目的で、上記化粧品の成分として配合してもよい。
【００４０】
その他、入浴は、肌を清潔にする、汗を流す、湿度を与える、体温を高めるなどの点でアトピー性皮膚炎に有効である。そこで、本発明に係るアトピー性皮膚炎抑制剤を入浴剤として用いる。即ち本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）をお湯に加えてもよい。
【００４１】
この場合、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ）を湯中に直接入れて使用してもよいし、或いはその溶液を不織布などからなる多孔質袋体に浸み込ませた後に乾燥し、湯中に浸漬して揉み出しながら使用してもよい。また、温泉成分である塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カリウムなどの無機塩類と配合してもよい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４３】
実施例１  本発明化合物の単離
マレーシア産のベルノニア  アミグダリナ（Vernonia amygdalina，以下、「ＶＡＭ」と略記する）の葉を日干しして十分に乾燥し、粉砕した。得られた粉砕葉（２５０ｇ）にアセトンを加え、抽出物を得た。得られたアセトン抽出物から、水とｎ−ヘキサンとの分液、得られた水層と酢酸エチルとの分液、および酢酸エチル層の濃縮物に対する各種クロマトグラフィによりほぼ単一の化合物を精製した（収量：約３０ｍｇ，収率：０．０６％）。
【００４４】
得られた上記化合物をＦＴ−ＭＳで分析したところ、測定された分子イオンピークは３６１．１２９０９であった。また、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＥＰＴ）、２Ｄ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）および２Ｄ−ＮＭＲ（ＨＨ−ＣＯＳＹ）により分析した。ＦＴ−ＭＳの結果を図１に、1Ｈ−ＮＭＲの結果を図２に、13Ｃ−ＮＭＲの結果を図３に、13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＥＰＴ）の結果を図４に、２Ｄ−ＮＭＲ（ＨＳＱＣ）の結果を図５に、２Ｄ−ＮＭＲ（ＨＨ−ＣＯＳＹ）の結果を図６に示す。これらの分析結果から得られた化合物の化学構造を特定し、セスキテルペン化合物（Ｉ2）であることを明らかにした。
【００４５】
実施例２  アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する試験
（１）  アトピー性皮膚炎モデルマウスの作製
購入したＮＣ／Ｎｇａマウスを３週間検疫馴化飼育し、１週間に１回以上、状態や外観を観察し、異常の無いことを確認した。当該マウスの背部と耳介部をバリカンと電気シェーバーを用いて毛刈りした後、除毛剤（カネボウ社製，製品名「エピラット」）を適量塗布して除毛した。除毛剤を拭き取った後、マイクロピペットのチップ裏部を用い、アトピー性皮膚炎誘発試薬（ビオスタ社製，製品名「ビオスタＡＤ」）１００ｍｇを除毛した背部と耳介部に均一塗布することにより初回のアトピー性皮膚炎惹起を行った。２回目以降の惹起は、１週間に２回、３週間にわたり計６回、以下のとおり行った。即ち、必要に応じて電気シェーバーで除毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットで頚背部に滴下しながらマイクロピペットチップの裏部で均一に塗布した。次いで、ドライアーを用いて冷風をあてることによりある程度乾燥させ、さらに２〜３時間自然乾燥させた後、上記アトピー性皮膚炎誘発試薬１００ｍｇを同様に頚背部に均一塗布した。
【００４６】
（２）  被検物質の投与と評価
得られたアトピー性皮膚炎モデルマウスの皮膚につき、発赤・出血、痂皮形成・乾燥、浮腫、擦傷・組織欠損を０（症状無し）〜３（重度）の４段階で評価した。症状が比較的軽度のマウスの代表例を図７に、症状が比較的重度のマウスの代表例を図８に示す。皮膚炎重症度スコア（上記点数の合計）が４〜１０のマウスを選別し、各群の体重と平均皮膚炎重症度スコアが均一、即ち統計的有意差が無いように、４匹ずつ、対照群、抽出物投与群および本発明化合物投与群の３群に分けた。
【００４７】
上記実施例１と同様にして得られたＶＡＭ葉のアセトン抽出物をいったん減圧濃縮し、再びアセトンに溶解して１０ｍｇ／ｍＬアセトン溶液とした。また、上記実施例１で得た本発明化合物（セスキテルペン化合物（Ｉ2））をアセトンに溶解し、１００μｇ／ｍＬアセトン溶液とした。
【００４８】
対照群にはアセトンを、抽出物投与群には１０ｍｇ／ｍＬ抽出物溶液を、本発明化合物投与群には１００μｇ／ｍＬ本発明化合物溶液を、１日１回、１７時３０分に、１００μＬ／匹で１４日間連日経皮投与した。投与開始から３日目、７日目、１０日目および１４日目に目視にて上記と同様に皮膚炎重症度を評価した。背部の結果を図９に、耳介部の結果を図１０に、背部の結果と耳介部の結果を合わせた総合評価を図１１に示す。なお、図９〜１１中、「＊」は、ｔ検定によりｐ＜０．０５で対照群に対して有意差があることを示す。
【００４９】
図９〜１１のとおり、ＶＡＭ葉アセトン抽出物でも、対照群に比して改善傾向が見られるものの、その効果は大きなものではなかった。それに対して本発明化合物を投与した場合には、ＶＡＭ葉アセトン抽出物の実に１００分の１の用量であっても、特に自己引掻行動を顕著に抑制できたことから、症状の悪化が抑制された。また、患部を見る限り、過剰な炎症反応を明らかに抑制できた。このように本発明化合物は、痒みの抑制と炎症反応の抑制の両方の作用効果によって、対照群に対して有意差をもって顕著な症状の改善効果を示すことが明らかとなった。
【００５０】
実施例３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
アトピー性皮膚炎では炎症反応が伴い、血清中のＩｇＥ濃度が上昇してＩｇＥ抗体が過剰に産生されることになり、さらには炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αが多量に産生されて炎症反応が過剰に進行して症状が悪化するという悪循環に陥るので、アトピー性皮膚炎の抑制にはＴＮＦ−αの産生抑制がポイントの一つとなる。そこで、本発明化合物のＴＮＦ−α産生抑制作用を試験した。
【００５１】
先ず、比較のためにＶＡＭ葉のメタノール抽出物を調製した。具体的には、実施例１と同様に粉砕したＶＡＭ葉１ｇにメタノール２０ｍＬを加え、撹拌した。固形分を濾別した後、得られた濾液を減圧濃縮することにより、ＶＡＭ葉のメタノール抽出物を得た。
【００５２】
別途、マクロファージ細胞株（ＲＡＷ２４６．７細胞）を９６ｗｅｌｌプレートで予備培養した。また、実施例１で得たセスキテルペン化合物（Ｉ2）または上記ＶＡＭメタノール抽出物をＤＭＳＯに溶解し、培地中での各化合物の最終濃度が０．１６μｇ／ｍＬ、０．０７８μｇ／ｍＬまたは０．０３９μｇ／ｍＬになり、且つＤＭＳＯ濃度が０．５容量％になるようにＤＭＥＭで希釈して加えた。１時間後、培地中の最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＤＭＥＭで希釈したＬＰＳを加えた。２４時間後に上清を用いてＥＬＩＳＡにより生成したＴＮＦ−αを定量した。
【００５３】
結果を図１２に示す。図１２のとおり、同用量を用いた場合、本発明化合物は、ＴＮＦ−αの生成をＶＡＭ葉抽出物よりも顕著に抑制することができる。従って、本発明化合物は、アトピー性皮膚炎の抑制に極めて有効であることが明らかとなった。
【００５４】
実施例４  セスキテルペン化合物（Ｉ2）を含むローション剤の効果
本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ2）を含むローション剤を調製し、アトピー性皮膚炎の初期症状に対する改善効果を遺伝子発現レベルで検討した。
【００５５】
（１）  ローション剤の調製
表１の配合に従って、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ2）を含むローション剤を調製した。なお、表１に示す成分以外の残部は水であり、表１中のパーセンテージは質量％である。また、対照として、セスキテルペン化合物（Ｉ2）を含まない以外は同様の成分構成を有するローション剤も調製した。
【００５６】
【表１】
2015057377.tif 000005
【００５７】
（２）  動物実験
ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）／ＶＡＦ（Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒｅｅ）で７週齢の雌性ＮＣ／ＮＧＡ  Ｔｎｄ  Ｃｌｉｊマウスの背中をバリカンおよび除毛クリームにて脱毛した。翌朝、上記（１）で調製した各ローション剤（約５ｍＬ）を、３匹ずつのマウスの除毛部分に塗布した。１時間後、２，４，６−トリニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ，刺激物質）のアセトン：オリーブオイル＝１：１の混合溶媒の１％溶液を約５ｍＬ塗布した。ＴＮＣＢ溶液を塗布してから６時間後と１２時間後に、トレパン・パンチを使ってマウス皮膚を切り抜き、すぐに液体窒素中で凍結した。得られた凍結試料から、ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製「ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）」を使って全ＲＮＡを抽出した。
【００５８】
上記ＲＮＡ試料（２μｇ）、５０ｎｇ／ｍＬランダムヘキサマー（１μＬ）および１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１μＬ）に蒸留水を加えて１３μＬとし、６５℃で５分間加熱した後に０℃に冷却した。当該反応液に、５×ＦＳバッファー（４μＬ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（１μＬ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（１μＬ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（１μＬ）を加え、２５℃で５分間、５０℃で６０分間、７０℃で１５分間インキュベートした後に冷却し、全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを作製した。
【００５９】
上記ｃＤＮＡ（２μＬ）に、痒みに関連するＩＬ３３遺伝子に対応するプライマーまたは皮膚修復に関連するＦＬＧ遺伝子に対応するプライマーと各遺伝子に特異的に結合するＦＡＭ標識プローブとの混合物（１μＬ）、内部標準遺伝子であるＨＰＲＴ（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子に対応するプライマーとＨＰＲＴ遺伝子に特異的に結合するＶＩＣ標識プローブとの混合物（１μＬ）、および水（６μＬ）を加え、９５℃で２０秒間の熱変性に続いて、９５℃で１秒間、９５℃で２０秒間のサイクルを４０回繰り返し、ＩＬ３３遺伝子またはＦＬＧ遺伝子とＨＰＲＴ遺伝子を選択的に増幅させた。
【００６０】
増幅反応中にＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムを使い、内部標準遺伝子であるＨＰＲＴ遺伝子に対するＩＬ３３遺伝子またはＦＬＧ遺伝子の発現を定量化した。内部標準ＨＰＲＴ遺伝子で補正したＩＬ３３の発現量を図１３（１）に、ＦＬＧの発現量を図１３（２）に示す。
【００６１】
図１３（１）に示す結果のとおり、痒みと相関するサイトカインとして新たに機能が同定されたＩＬ３３の遺伝子発現は、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ2）の塗布量に依存して、対照に対して１４〜３０％減少した。
【００６２】
また、図１３（２）のとおり、皮膚修復時に必要なタンパク質であるフィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子発現レベルも、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ2）の塗布量に依存して低下した。つまり、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ2）を塗布した場合には、刺激物質が塗布されても皮膚はダメージを受けていないことが示された。
【００６３】
上記結果のとおり、本発明に係るセスキテルペン化合物（Ｉ2）を皮膚に塗布した場合には、ＴＮＣＢで刺激しても痒みが抑制されており、また、修復を必要とするダメージが起こっておらず、急性炎症がほとんど起こっていないことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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