(57)【要約】      （修正有）【課題】不可逆的インヒビターの設計のためのアルゴリズムの提供。【解決手段】A）標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルの提供、B）可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に隣接する標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の特定、C）標的ポリペプチドに共有結合する候補インヒビターの構造モデルの作製、D）候補インヒビターが結合部位に結合された場合に、頭部の反応性化学官能基が標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に存在するようになる可逆的インヒビターの置換可能な位置の決定、E）候補インヒビターが結合部位に結合された場合に標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内である頭部を含む候補インヒビターについて、候補インヒビターが結合部位に結合された場合に結合部位内のCys残基と頭部の反応性化学官能基間に共有結合を形成させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
A）  標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程、ここで、可逆的インヒビターは該結合部位と非共有性接触を行なう；
B）  可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基を特定する工程；
C）  標的ポリペプチドに共有結合する候補インヒビターの構造モデルを作製する工程、ここで、各候補インヒビターは、可逆的インヒビターの置換可能な位置に結合された頭部を含み、頭部は、反応性化学官能基と、任意に、反応性化学官能基を標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に配置するリンカーとを含む；
D）  候補インヒビターが結合部位に結合された場合に、頭部の反応性化学官能基が標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に存在するようになる可逆的インヒビターの置換可能な位置を決定する工程；
E）  候補インヒビターが結合部位に結合された場合に標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内である頭部を含む候補インヒビターについて、候補インヒビターが結合部位に結合された場合に結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部の反応性化学官能基間に共有結合を形成させる工程、ここで、約2Å未満の共有結合長さは、候補インヒビターが標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターであることを示す、
を含む、標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターを設計するための方法。
【請求項２】
Cys残基が、標的ポリペプチドを含むタンパク質ファミリーに保存されていない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ポリペプチドが触媒活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
結合部位が基質または補因子の結合部位である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Cys残基が触媒性残基ではない、請求項３記載の方法。
【請求項６】
さらに、
F）  共有結合が結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部の反応性化学官能基間に形成された場合、結合部位が閉塞されているかどうかを調べる工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
E）で形成させる共有結合を、頭部とCys残基の側鎖を柔軟性にし、候補インヒビターの構造の残部と結合部位を固定するコンピューター使用による方法を用いて形成させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
B）において、可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内の各Cys残基が特定される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
C）の候補インヒビターの構造モデルが複数の候補インヒビターのモデルを含み、頭部が、該複数の各構成員の異なる置換可能な位置に結合されている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
頭部が、式-X-L-Y（式中、 
Xは、結合または二価のC1〜C6飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖であり、ここで、任意に、該炭化水素鎖の1つ、2つまたは3つのメチレン単位は、独立して、-NR-、-O-、-C（O）-、-OC（O）-、-C（O）O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C（=S）-、-C（=NR）-、-N=N-、または-C（=N2）-で置き換えられており；
Lは、共有結合または二価のC1〜8飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖であり、ここで、Lの1つ、2つまたは3つのメチレン単位は、任意に独立して、シクロプロピレン、-NR-、-N（R）C（O）-、-C（O）N（R）-、-N（R）SO2-、-SO2N（R）-、-O-、-C（O）-、-OC（O）-、-C（O）O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C（=S）-、-C（=NR）-、-N=N-、または-C（=N2）-で置き換えられており；
Yは、水素であるか、オキソ、ハロゲンもしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜3個のヘテロ原子を有する3〜10員の単環式もしくは二環式、飽和、部分不飽和もしくはアリール環であり、ここで、前記環は、独立して-Q-Z、オキソ、NO2、ハロゲン、CN、またはC1〜6脂肪族から選択される1〜4個の基で置換されており、ここで：
Qは、共有結合または二価のC1〜6飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素鎖であり、ここで、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意に独立して、-NR-、-S-、-O-、-C（O）-、-SO-、または-SO2-で置き換えられており；
Zは、水素または任意にオキソ、ハロゲンもしくはCNで置換されたC1〜6脂肪族であり；
各R基は、独立して、水素であるか、またはC1〜6脂肪族、フェニル、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員単環式ヘテロアリール環から選択される任意に置換された基であり
各R基は、独立して、水素であるか、またはC1〜6脂肪族、フェニル、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員単環式ヘテロアリール環から選択される任意に置換された基である）
を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
標的ポリペプチドがキナーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
可逆的インヒビターがATP結合部位と相互作用する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
可逆的インヒビターがATP結合部位のヒンジ領域と相互作用する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
キナーゼがタンパク質キナーゼである、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
キナーゼが脂質キナーゼである、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
標的ポリペプチドがプロテアーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスプロテアーゼがHCVプロテアーゼである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
プロテアーゼがカスパーゼである、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
プロテアーゼがプロテアソームまたはプロテアソームの成分である、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
標的ポリペプチドがホスホジエステラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
標的ポリペプチドがデアセチラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
標的ポリペプチドが熱ショックタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
標的ポリペプチドがGタンパク質共役受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
標的ポリペプチドがトランスフェラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
標的ポリペプチドがメタロ酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
標的ポリペプチドが核ホルモン受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
Cys残基の-SH基との反応性に適合させるために、さらに該化合物の構造を精密化する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルが3次元構造モデルである、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
結晶構造または解像構造から得られた構造情報を用いて3次元構造モデルを作製する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
3次元構造モデルが相同性モデルである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
コンピューター使用による方法を用いて3次元構造モデルを作製する、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
インシリコで行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
1つ以上のコンピューター使用による方法を用いて行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
該ポリペプチドが触媒活性を有し、可逆的インヒビターが該ポリペプチドの活性を約50μM以下のIC50で阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
該ポリペプチドが触媒活性を有し、可逆的インヒビターが該ポリペプチドの活性を約50μM以下のKiで阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
標的ポリペプチドが変異体または薬物耐性タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
可逆的インヒビターが強力な可逆的インヒビターである、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
可逆的インヒビターが標的ポリペプチドを弱いまたは中程度の効力で阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターが標的ポリペプチドを、可逆的インヒビターと比べて改善された効力で阻害する、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
A）  標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程、ここで、可逆的インヒビターは該結合部位と非共有性接触を行なう；
B）  可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基を特定する工程；
C）  頭部基の構造モデルを提供する工程、ここで、該頭部は、Cys残基と反応することができ、結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部基の反応性化学官能基間に共有結合を形成することができる反応性化学官能基を含む；
D）  頭部基が、任意にリンカーを介して、結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部基の反応性化学官能基間に形成される結合が約2Å未満の結合長さを有するように結合され得る可逆的インヒビターの置換可能な位置を特定する工程；
E）  頭部基を、任意にリンカーを介して、可逆的インヒビターの置換可能な位置に結合させる工程
を含む、標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターを設計するための方法。
【請求項４２】
標的ポリペプチド上の結合部位に結合する化学部分および共役エノンを含む頭部を含む不可逆的インヒビター。
【請求項４３】
頭部が、式
【化１】
2015062428.tif 000134
（式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、C1〜C6アルキル、または-NRxRyで置換されたC1〜C6アルキルであり；
RxおよびRyは、独立して、水素またはC1〜C6アルキルである）
を有する、請求項４２記載の不可逆的インヒビター。
【請求項４４】
共役エノン頭部を含む不可逆的インヒビターと、システインを含むポリペプチドとの反応生成物であり、式 
X-M-S-CH2-R
（式中：
Xは、標的ポリペプチドの結合部位に結合する化学部分であり、ここで、標的ポリペプチドの結合部位はシステイン残基を含み；
Mは、エノン含有頭部と前記システイン残基のイオウ原子との共有結合によって形成される修飾部分であり；
S-CH2は、前記システイン残基のイオウ-メチレン側鎖であり；
Rは、標的ポリペプチドの残部である）
を有する、ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項４５】
式：
【化２】
2015062428.tif 000135
（式中、Xは、標的ポリペプチドの結合部位に結合する化学部分であり、該結合部位はシステイン残基を含み；
S-CH2は、前記システイン残基の側鎖であり；
Rは、標的ポリペプチドの残部であり；
R1、R2およびR3は、独立して、水素、C1〜C6アルキル、または-NRxRyで置換されたC1〜C6アルキルであり； 
RxおよびRyは、独立して、水素またはC1〜C6アルキルである）
のものである、請求項４４記載のポリペプチドコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不可逆的インヒビターの設計のためのアルゴリズムに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
酵素などのポリペプチドの活性を阻害する化合物は、重要な治療剤である。大部分のインヒビターは、その標的ポリペプチドに可逆的に結合し、その標的ポリペプチドの活性を可逆的に阻害する。効果的な治療剤である可逆的インヒビターが開発されているが、可逆的インヒビターは、ある欠点を有する。例えば、キナーゼの多く可逆的インヒビターは、ATP結合部位と相互作用する。ATP結合部位の構造はキナーゼ間で高度に保存されているので、1つ以上の所望のキナーゼを選択的に阻害するか逆的インヒビターを開発することは非常に困難である。また、可逆的インヒビターはその標的ポリペプチドから解離されるので、阻害時間は所望よりも短くなることがある。従って、可逆的インヒビターを治療剤として使用する場合、目的の生物学的効果を達成するために、所望の場合よりも多量および/または高頻度用量が必要になることがある。これにより毒性を生じ得るか、または他の望ましくない効果を生じ得る。
【０００３】
標的ポリペプチドに共有結合する不可逆的インヒビターが記載されている。薬物標的の共有結合性負荷逆インヒビターは、治療剤として、その可逆的対応物に対していくつかの重要な利点を有する。薬物標的の長い抑制は最大の薬力学的効果のために必要であり得、存在する薬物標的の活性を永続的に排除する（新規の標的ポリペプチドが合成される場合にのみ回復する）ことにより、不可逆的インヒビターはこの利点をもたらし得る。不可逆的インヒビターが投与される場合、標的ポリペプチドをインヒビターに一時的に曝露して、標的の活性を不可逆的に抑制するのに充分な時間だけ、不可逆的インヒビターの治療血漿濃度が達成される必要がある。次いで、標的ポリペプチドを不活性にしたままで、血漿レベルを急速に下げることができる。これは、効果を損なうことなく治療活性が生じる最低血漿濃度を低下し、多数の投与要件を最小限にし、長い血漿半減期の必要性を排除するという強力な利点を有する。これらの考えの全ては、高いまたは長い血漿レベルで生じ得る任意の非特異的オフターゲット相互作用が原因の毒性を低減し得る。不可逆的インヒビターは、薬物耐性の解消にも利点を有すると思われる。
【０００４】
特許文献１には、小分子インヒビターによる修飾に利用可能ないくつかのキナーゼの結合部位におけるCysを同定するための、構造バイオインフォマティクスの使用が記載される。該出願には、同定されたCysと共有結合を形成する化合物の調製物も記載されている。非特許文献１には、スクリーニング作戦によるBruton’sチロシンキナーゼ（BTK）を阻害し得る骨格の同定、該骨格に基づいた一連の化合物の調製およびBTKの共有結合インヒビターの同定が記載される。非特許文献２には、血管内皮増殖因子受容体-2（VEGFR2）キナーゼの共有結合不可逆的インヒビターである一連の化合物の調製が記載されている。該化合物は、キナゾリンコア構造および高度に反応性のキノンを含む。これらの参考文献には、不可逆的にインヒビターの設計または公知の可逆的インヒビターの不可逆的アナログの設計のための一般化できる方法を記載するものはない。実質的に、かかる方法により、不可逆的インヒビターの開発の時間およびコストが低減される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US 2007/0082884
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pan et al. ChemMedChem 2(1):58-61 (2007)
【非特許文献２】Wissner et al., J. Med. Chem. 48(24):7560-81 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、不可逆的インヒビターの設計のためのアルゴリズムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、標的ポリペプチドの不可逆的インヒビターの設計のためのアルゴリズムおよび方法に関する。本明細書に記載されるアルゴリズムおよび方法により設計される不可逆的インヒビターは、標的ポリペプチド中のアミノ酸側鎖と共有結合を形成する。ここで、本発明を使用すると、公知の可逆的インヒビターから開始した不可逆的インヒビターの効率的な設計が可能になる。このアプローチにより、創薬および開発のための従来のスクリーニングおよび構造活性関連開発アプローチに伴う時間およびコストが低減される。該アルゴリズムおよび方法は、候補不可逆的インヒビターと標的ポリペプチドの間に結合を形成する工程を含む。
【０００９】
該アルゴリズムおよび方法は、A) 標的ポリペプチド中の結合部位に結合する可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程、ここで可逆的インヒビターは結合部位と非共有結合する；B) 可逆的インヒビターが結合部位に結合した際に、可逆的インヒビターと近接する標的ポリペプチドの結合部位中にあるCys残基を同定する工程；C) 標的ポリペプチドに共有結合する候補インヒビターの構造モデルを作製する工程、ここでそれぞれの候補インヒビターは、可逆的インヒビターの置換可能な位置に結合する頭部（warhead）を含み、該頭部は、反応性化学官能基および任意に標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基の結合距離内に反応性化学官能基を配置するリンカーを含む；D) 候補インヒビターが結合部位に結合した際に、標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基の結合距離内にある頭部の反応性化学官能基を生じさせる、不可逆的インヒビターの置換可能位置を決定する工程；E) 候補インヒビターが結合部位に結合した際に標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基の結合距離内にある頭部を含む候補インヒビターについて、該候補インヒビターが結合部位に結合した際に、結合部位中のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に共有結合を形成する工程を含む。結合部位中のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に形成された結合について、約2Å未満の共有結合の長さは、候補インヒビターが標的ポリペプチドに共有結合することを示す。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕A）  標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程、ここで、可逆的インヒビターは該結合部位と非共有性接触を行なう；
B）  可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基を特定する工程；
C）  標的ポリペプチドに共有結合する候補インヒビターの構造モデルを作製する工程、ここで、各候補インヒビターは、可逆的インヒビターの置換可能な位置に結合された頭部を含み、頭部は、反応性化学官能基と、任意に、反応性化学官能基を標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に配置するリンカーとを含む；
D）  候補インヒビターが結合部位に結合された場合に、頭部の反応性化学官能基が標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に存在するようになる可逆的インヒビターの置換可能な位置を決定する工程；
E）  候補インヒビターが結合部位に結合された場合に標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内である頭部を含む候補インヒビターについて、候補インヒビターが結合部位に結合された場合に結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部の反応性化学官能基間に共有結合を形成させる工程、ここで、約2Å未満の共有結合長さは、候補インヒビターが標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターであることを示す、
を含む、標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターを設計するための方法、
〔２〕Cys残基が、標的ポリペプチドを含むタンパク質ファミリーに保存されていない、〔１〕記載の方法、
〔３〕該ポリペプチドが触媒活性を有する、〔１〕記載の方法、
〔４〕結合部位が基質または補因子の結合部位である、〔３〕記載の方法、
〔５〕Cys残基が触媒性残基ではない、〔３〕記載の方法、
〔６〕さらに、
F）  共有結合が結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部の反応性化学官能基間に形成された場合、結合部位が閉塞されているかどうかを調べる工程
を含む、〔１〕記載の方法、
〔７〕E）で形成させる共有結合を、頭部とCys残基の側鎖を柔軟性にし、候補インヒビターの構造の残部と結合部位を固定するコンピューター使用による方法を用いて形成させる、〔１〕記載の方法、
〔８〕B）において、可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内の各Cys残基が特定される、〔１〕記載の方法、
〔９〕C）の候補インヒビターの構造モデルが複数の候補インヒビターのモデルを含み、頭部が、該複数の各構成員の異なる置換可能な位置に結合されている、〔１〕記載の方法、
〔１０〕頭部が、式-X-L-Y（式中、 
Xは、結合または二価のC1〜C6飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖であり、ここで、任意に、該炭化水素鎖の1つ、2つまたは3つのメチレン単位は、独立して、-NR-、-O-、-C（O）-、-OC（O）-、-C（O）O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C（=S）-、-C（=NR）-、-N=N-、または-C（=N2）-で置き換えられており；
Lは、共有結合または二価のC1〜8飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖であり、ここで、Lの1つ、2つまたは3つのメチレン単位は、任意に独立して、シクロプロピレン、-NR-、-N（R）C（O）-、-C（O）N（R）-、-N（R）SO2-、-SO2N（R）-、-O-、-C（O）-、-OC（O）-、-C（O）O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C（=S）-、-C（=NR）-、-N=N-、または-C（=N2）-で置き換えられており；
Yは、水素であるか、オキソ、ハロゲンもしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜3個のヘテロ原子を有する3〜10員の単環式もしくは二環式、飽和、部分不飽和もしくはアリール環であり、ここで、前記環は、独立して-Q-Z、オキソ、NO2、ハロゲン、CN、またはC1〜6脂肪族から選択される1〜4個の基で置換されており、ここで：
Qは、共有結合または二価のC1〜6飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素鎖であり、ここで、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意に独立して、-NR-、-S-、-O-、-C（O）-、-SO-、または-SO2-で置き換えられており；
Zは、水素または任意にオキソ、ハロゲンもしくはCNで置換されたC1〜6脂肪族であり；
各R基は、独立して、水素であるか、またはC1〜6脂肪族、フェニル、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員単環式ヘテロアリール環から選択される任意に置換された基であり
各R基は、独立して、水素であるか、またはC1〜6脂肪族、フェニル、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員複素環、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員単環式ヘテロアリール環から選択される任意に置換された基である）
を有する、〔１〕記載の方法、
〔１１〕標的ポリペプチドがキナーゼである、〔１〕記載の方法、
〔１２〕可逆的インヒビターがATP結合部位と相互作用する、〔１１〕記載の方法、
〔１３〕可逆的インヒビターがATP結合部位のヒンジ領域と相互作用する、〔１２〕記載の方法、
〔１４〕キナーゼがタンパク質キナーゼである、〔１１〕記載の方法、
〔１５〕キナーゼが脂質キナーゼである、〔１１〕記載の方法、
〔１６〕標的ポリペプチドがプロテアーゼである、〔１〕記載の方法、
〔１７〕プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、〔１６〕記載の方法、
〔１８〕ウイルスプロテアーゼがHCVプロテアーゼである、〔１７〕記載の方法、
〔１９〕プロテアーゼがカスパーゼである、〔１６〕記載の方法、
〔２０〕プロテアーゼがプロテアソームまたはプロテアソームの成分である、〔１６〕記載の方法、
〔２１〕標的ポリペプチドがホスホジエステラーゼである、〔１〕記載の方法、
〔２２〕標的ポリペプチドがデアセチラーゼである、〔１〕記載の方法、
〔２３〕標的ポリペプチドが熱ショックタンパク質である、〔１〕記載の方法、
〔２４〕標的ポリペプチドがGタンパク質共役受容体である、〔１〕記載の方法、
〔２５〕標的ポリペプチドがトランスフェラーゼである、〔１〕記載の方法、
〔２６〕標的ポリペプチドがメタロ酵素である、〔１〕記載の方法、
〔２７〕標的ポリペプチドが核ホルモン受容体である、〔１〕記載の方法、
〔２８〕Cys残基の-SH基との反応性に適合させるために、さらに該化合物の構造を精密化する工程を含む、〔１〕記載の方法、
〔２９〕標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルが3次元構造モデルである、〔１〕記載の方法、
〔３０〕結晶構造または解像構造から得られた構造情報を用いて3次元構造モデルを作製する、〔２９〕記載の方法、
〔３１〕3次元構造モデルが相同性モデルである、〔３０〕記載の方法、
〔３２〕コンピューター使用による方法を用いて3次元構造モデルを作製する、〔３０〕記載の方法、
〔３３〕インシリコで行なわれる、〔１〕記載の方法、
〔３４〕1つ以上のコンピューター使用による方法を用いて行なわれる、〔１〕記載の方法、
〔３５〕該ポリペプチドが触媒活性を有し、可逆的インヒビターが該ポリペプチドの活性を約50μM以下のIC50で阻害する、〔１〕記載の方法、
〔３６〕該ポリペプチドが触媒活性を有し、可逆的インヒビターが該ポリペプチドの活性を約50μM以下のKiで阻害する、〔１〕記載の方法、
〔３７〕標的ポリペプチドが変異体または薬物耐性タンパク質である、〔１〕記載の方法、
〔３８〕可逆的インヒビターが強力な可逆的インヒビターである、〔１〕記載の方法、
〔３９〕可逆的インヒビターが標的ポリペプチドを弱いまたは中程度の効力で阻害する、〔１〕記載の方法、
〔４０〕標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターが標的ポリペプチドを、可逆的インヒビターと比べて改善された効力で阻害する、〔３９〕記載の方法、
〔４１〕A）  標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程、ここで、可逆的インヒビターは該結合部位と非共有性接触を行なう；
B）  可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基を特定する工程；
C）  頭部基の構造モデルを提供する工程、ここで、該頭部は、Cys残基と反応することができ、結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部基の反応性化学官能基間に共有結合を形成することができる反応性化学官能基を含む；
D）  頭部基が、任意にリンカーを介して、結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部基の反応性化学官能基間に形成される結合が約2Å未満の結合長さを有するように結合され得る可逆的インヒビターの置換可能な位置を特定する工程；
E）  頭部基を、任意にリンカーを介して、可逆的インヒビターの置換可能な位置に結合させる工程
を含む、標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターを設計するための方法、
〔４２〕標的ポリペプチド上の結合部位に結合する化学部分および共役エノンを含む頭部を含む不可逆的インヒビター、
〔４３〕頭部が、式
【化１−１】
2015062428.tif 000002
（式中、R1、R2およびR3は、独立して、水素、C1〜C6アルキル、または-NRxRyで置換されたC1〜C6アルキルであり；
RxおよびRyは、独立して、水素またはC1〜C6アルキルである）
を有する、〔４２〕記載の不可逆的インヒビター、
〔４４〕共役エノン頭部を含む不可逆的インヒビターと、システインを含むポリペプチドとの反応生成物であり、式 
X-M-S-CH2-R
（式中：
Xは、標的ポリペプチドの結合部位に結合する化学部分であり、ここで、標的ポリペプチドの結合部位はシステイン残基を含み；
Mは、エノン含有頭部と前記システイン残基のイオウ原子との共有結合によって形成される修飾部分であり；
S-CH2は、前記システイン残基のイオウ-メチレン側鎖であり；
Rは、標的ポリペプチドの残部である）
を有する、ポリペプチドコンジュゲート、
〔４５〕式：
【化１−２】
2015062428.tif 000003
（式中、Xは、標的ポリペプチドの結合部位に結合する化学部分であり、該結合部位はシステイン残基を含み；
S-CH2は、前記システイン残基の側鎖であり；
Rは、標的ポリペプチドの残部であり；
R1、R2およびR3は、独立して、水素、C1〜C6アルキル、または-NRxRyで置換されたC1〜C6アルキルであり； 
RxおよびRyは、独立して、水素またはC1〜C6アルキルである）
のものである、〔４４〕記載のポリペプチドコンジュゲート
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、不可逆的インヒビターの設計のためのアルゴリズムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｂ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｃ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｄ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｅ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｆ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｇ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｈ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｉ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｊ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｋ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｌ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｍ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｎ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｏ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｐ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図１Ｑ】図1A〜1Qは、本発明に使用され得る114個の例示的な頭部の構造、およびそれぞれの頭部と標的ポリペプチドのCys残基で形成されたチオール付加物を示す。チオール付加物において、Cys側鎖の硫黄原子は、頭部およびCys残基のβ炭素に結合し、Cys残基のβ炭素はRに結合する。Rは標的ポリペプチドの残りを表す。
【図２】図2Aは、c-KITのATP結合部位中の化合物1のモデルの像である。標的Cys残基、c-KITのCys788も示される。図2Bは、c-KITのATP結合部位中の化合物1のモデルの像である。この画像中で、化合物1はc-KITのCys788と共有結合を形成している。
【図３】図3Aは、FLT3のATP結合部位中の化合物4のモデルの像である。標的Cys残基、FLT3のCys828も示される。図3Bは、FLT3のATP結合部位中の化合物4のモデルの像である。この像中で、化合物4は、FLT3のCys828と共有結合を形成している。
【図４】図4Aは、C型肝炎ウイルス（HCV）プロテアーゼ、より具体的には該ウイルスのNS3/4A HCVプロテアーゼ成分の結合部位中の化合物5のモデルの像である。標的Cys残基、HCVプロテアーゼのCys159も示される。図4Bは、HCVプロテアーゼの結合部位中の化合物5のモデルの像である。この像中で、化合物5は、HCVプロテアーゼのCys159と共有結合を形成している。
【図５】図5は、参照化合物および化合物2によるEOL-1細胞の細胞増殖の用量応答阻害を示す。
【図６】図6は、EOL-1細胞を使用した「洗浄」実験における参照化合物および化合物2によるPDGFRの阻害を示す。
【図７】図7は、化合物3で処理したPDGFRのトリプシン消化の質量分析の結果を示す。結果により化合物3がCys814と結合を形成したことが確認される。
【図８】図8は、化合物5で処理したNS3/4A HCVプロテアーゼの質量分析の結果を示す。結果により、化合物5で処理したHCVプロテアーゼの質量が増加すること、それに伴うタンパク質と化合物5の間の付加物の形成が示される。Cys159がSerで置換されたHCVプロテアーゼの突然変異形態では付加物は形成されなかった。
【図９】図9は、化合物6で処理されたHCV NS3/4Aプロテアーゼの質量分析の結果を示す。結果により、化合物6で処理したHCVプロテアーゼの質量が増加すること、それに伴うタンパク質と化合物6の間の付加物の形成が示される。Cys159がSerで置換されたHCVプロテアーゼの突然変異形態では付加物は形成されなかった。
【図１０】図10Aおよび図10Bは、cKITリン酸化アッセイ（10A）およびERKリン酸化を測定した下流シグナル伝達アッセイ（10B）において、ソラフェニブと比較した不可逆的インヒビター化合物7による、cKIT活性の延長された阻害を示すヒストグラムである。
【図１１】図11は、化合物8で処理されたHCV NS3/4Aプロテアーゼの質量分析の結果を示す。結果により、化合物8で処理されたHCVプロテアーゼの質量が増加すること、それに伴うタンパク質と化合物8の間の付加物の形成が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される場合、「近接」は、可逆的インヒビターが標的ポリペプチドに結合する際に、可逆的インヒビターの近傍にある標的ポリペプチド中のアミノ酸残基のことをいう。例えば、可逆的インヒビターが標的ポリペプチドに結合した際にアミノ酸残基の任意の非水素原子が可逆的インヒビターの非水素原子の約20Å、約18Å、約16Å、約14Å、約12Å、約10Å、約8Å、約6Å、約4Åまたは約2Å内にある場合、標的ポリペプチド中のアミノ酸残基は、可逆的インヒビターに近接している。可逆的インヒビターが標的ポリペプチドに結合した際に可逆的インヒビターに接する標的ポリペプチド中のアミノ酸残基は、可逆的インヒビターに近接している。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「置換可能な位置」は、可逆的インヒビターの標的ポリペプチドへの結合に影響することなく置換および/または除去され得る他の原子または化学基（例えば水素）に結合する、可逆的インヒビター中の非水素原子のことをいう。
【００１５】
本明細書で使用される場合、結合様式および可逆的インヒビターが標的結合部位にある時間が実質的に変化しない場合、可逆的インヒビターの結合は「影響されない」。例えば、適切なアッセイにおいてインヒビターの能力（例えば、IC50、Ki）が、1000倍未満、100倍未満、または10倍未満で変化する場合、可逆的インヒビターの結合は影響されない。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「結合距離」は、約6Å以下、約4Å以下、または約2Å以下の間隔のことをいう。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「共有結合」および「原子価結合」は、通常結合中で、結合した原子が電子を共有することにより生成される、2つの原子間の化学結合のことをいう。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「非共有結合」は、共有結合の形成を伴わない原子および/または分子間の相互作用のことをいう。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「不可逆的インヒビター」は、実質的に永続的な共有結合により標的ポリペプチドと共有結合し、タンパク質の機能的な寿命よりも長い時間、標的ポリペプチドの活性を阻害する化合物である。通常、不可逆的インヒビターは、時間依存性を特徴とする、すなわち、標的ポリペプチドが不可逆的インヒビターと接触している時間とともに、活性がなくなるまで、標的ポリペプチドの阻害の程度は増加する。不可逆的インヒビターにより阻害された際の標的ポリペプチド活性の回復は、新規のタンパク質合成に依存する。不可逆的インヒビターにより阻害された標的ポリペプチド活性は、「洗浄」実験中、実質的に阻害されたままである。化合物が不可逆的インヒビターであるかどうかを決定する適切な方法は、当該技術分野で周知である。例えば、不可逆的阻害は、酵素の共有結合修飾を示すための、標的ポリペプチドと化合物の阻害プロフィールの（例えば、競合的、競合しない、非競合的）動態解析、インヒビター化合物の存在下で修飾されたタンパク質薬物標的の質量分析の使用、「洗浄」試験としても知られる非連続的な曝露、および放射性標識インヒビターなどの標識の使用、または当業者に公知の他の方法を使用して、同定または確認することができる。特定の好ましい態様において、標的ポリペプチドは触媒活性を有し、不可逆的インヒビターは触媒性残基ではないCys残基と共有結合を形成する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「可逆的インヒビター」は、標的ポリペプチドに可逆的に結合し、標的ポリペプチドの活性を阻害する化合物である。可逆的インヒビターは、非共有結合的に、または一過的共有結合を含む機構により、その標的ポリペプチドに結合し得る。可逆的インヒビターにより阻害された際の標的ポリペプチド活性の回復は、標的ポリペプチドからの可逆的インヒビターの解離により生じ得る。標的ポリペプチド活性は、洗浄試験において可逆的インヒビターが「洗浄」される場合に回復される。好ましい可逆的インヒビターは、その標的ポリペプチドの活性の「強力な」インヒビターである。「強力な」可逆的インヒビターは、約50μM以下、約1μM以下、約100nM以下もしくは約1nM以下のIC50、および/または約50μM以下、約1μM以下、約100nM以下もしくは約1nM以下のKiで、標的ポリペプチドの活性を阻害する。
【００２１】
用語「IC50」および「阻害濃度50」は、限定されないが、触媒活性、細胞生存、タンパク質翻訳活性などの目的の生物学的プロセスの活性の50%を阻害する分子の濃度を意味することが理解される技術用語である。
【００２２】
用語「Ki」および「阻害定数」は、ポリペプチド（例えば酵素）-インヒビター複合体の解離定数であることが充分に理解される技術用語である。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「実質的に永続的な共有結合」は、生理学的条件下で、標的ポリペプチドの機能的寿命よりも長い間維持される、インヒビターと標的ポリペプチドの間の共有結合である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「一過的共有結合」は、生理学的条件下で、標的ポリペプチドの機能的寿命よりも短い間維持される、インヒビターと標的ポリペプチドの間の共有結合である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「頭部」は、反応性化学官能基または官能基を含み、任意にリンカー部分を含む化学基である。反応性官能基は、システインなどのアミノ酸残基（すなわちシステイン側鎖中の-SH基）、または標的タンパク質の結合ポケット中に存在する共有結合により修飾され得る他のアミノ酸残基と共有結合を形成して、それにより標的ポリペプチドを不可逆的に阻害し得る。本明細書で以下に定義され記載されるように、-L-Y基は、タンパク質を共有結合により不可逆的に阻害するための頭部基を提供することが理解されよう。
【００２６】
用語「インシリコ」は、例えば、コンピューターシミュレーションを作製するために、コンピューターモデリングプログラム、コンピューター化学、分子グラフィクス、分子モデリング等を使用して、コンピューター上で実行される方法およびプロセスをいうことが理解される技術用語である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「コンピューターモデリングプログラム」は、タンパク質および小分子の視覚化および改変を扱うコンピューターソフトウェアプログラムのことをいい、限定されないが、コンピューター化学、ケモインフォマティクス、エネルギー計算、タンパク質モデリング等が挙げられる。かかるプログラムの例は当業者に公知であり、特定の例が本明細書に示される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「配列整列」は、2つ以上のタンパク質または核酸配列の整列のことをいい、その類似性（または相違性）の比較および強調を可能にする。配列整列のための方法およびコンピュータープログラムは周知である（例えばBLAST）。可能な限り、縦列同士が関与する配列の同一または類似の文字を含むように、配列のギャップは埋められる（pad）（通常ダッシュで示される）。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「結晶」は、X線を回折する分子の任意の三次元順序配列のことをいう。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「原子座標」および「構造座標」は、三次元モデル/構造またはタンパク質の実験的構造中の原子の位置を説明する数学的座標（「X」、「Y」および「Z」値で表される）のことをいう。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「相同性モデリング」は、ホモログについての既存の三次元構造から巨大分子についてのモデルを得る実務のことをいう。相同性モデルは、目的の分子の配列が公知構造の分子の配列と同じでない位置で、残基の同一性を変化させることが可能なコンピュータープログラムを使用して得られる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「コンピューター化学」は、分子の物理的および化学的性質の推定のことをいう。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「分子グラフィクス」は、原子の、好ましくはコンピュータースクリーン上での二次元または三次元表示のことをいう。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「分子モデリング」は、コンピューターありまたはなしで実施され、1つ以上のモデルを作製し、任意にリガンドの構造活性関係について予測することができる方法または手順のことをいう。分子モデリングに使用される方法は、分子グラフィクスからコンピューター化学までに及ぶ。
【００３５】
本発明は、酵素などの標的ポリペプチドの不可逆的インヒビターを設計するためのアルゴリズムおよび方法に関する。本発明を使用して設計された不可逆的インヒビターは、標的ポリペプチドを強力かつ選択的に阻害し得る。一般に、本発明は、設計選択が標的ポリペプチドの構造、標的ポリペプチドの可逆的インヒビターの構造、および可逆的インヒビターと標的ポリペプチドの相互作用により誘導される有理的アルゴリズムおよび設計方法である。本発明の方法を使用して設計される不可逆的インヒビターまたは候補不可逆的インヒビターは、1つ以上の頭部が結合する鋳型または骨格を含む。得られる化合物は標的ポリペプチドに対して結合親和性を有し、結合すると、頭部は、標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基と反応して共有結合を形成し、標的ポリペプチドの不可逆的阻害が生じる。
【００３６】
本発明は、標的ポリペプチドと共有結合するインヒビターを設計するための方法を提供する。該方法は、標的ポリペプチドの結合部位に結合する可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程を含む。可逆的インヒビターは、結合部位と非共有結合接触を形成する。構造モデルを使用して、可逆的インヒビターが結合部位に結合した際に可逆的インヒビターと近接する標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基を同定する。可逆的インヒビターが結合部位に結合した際の可逆的インヒビターに近接する単一Cys残基、全てのCys残基または所望の数のCys残基を同定し得る。
【００３７】
標的ポリペプチドと共有結合するように設計される1つ以上の候補インヒビターの構造モデルを作製する。該候補インヒビターは、可逆的インヒビターの置換可能位置に結合する頭部を含む。頭部は、Cys残基の側鎖のチオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性化学官能基、および任意に、標的ポリペプチドの結合部位中で同定されたCys残基の1つの結合距離内に、該反応性化学官能基を配置するリンカーを含む。候補インヒビターが結合部位に結合した際に、頭部の反応性化学官能基を、標的ポリペプチドの結合部位中の同定されたCys残基の結合距離内に生じさせる可逆的インヒビターの置換可能位置を同定する。
【００３８】
候補インヒビターが結合部位に結合した際に、同定された置換可能位置に接続し、標的ポリペプチドの結合部位の同定されたCys残基の結合距離内にある頭部を含む候補不可逆的インヒビターが標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターであり得るかどうか、好ましくは標的ポリペプチドの不可逆的インヒビターであるかどうかの決定は、候補インヒビターが結合部位に結合した際に結合部位中のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に共有結合が形成されることによりなされる。結合部位のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に形成された結合について約2.1Å〜約1.5Åまたは約2Å未満の長さの共有結合は、候補インヒビターが標的ポリペプチドと共有結合するインヒビターであることを示す。
【００３９】
本発明の方法は、物理的モデル好ましくは分子グラフィクスなどの任意の適切な構造モデルを使用して実施することができる。該方法は、手動で行うことができるかまたは自動化できる。好ましくは、該方法はインシリコで実施される。
【００４０】
前述の記載および以下のより詳細な記載から明らかなように、本発明のアルゴリズムおよび方法は、概念的に、A) 標的および可逆的インヒビターを提供する工程、B) 標的システインを同定する工程、C) 頭部を含む候補インヒビターの構造モデルを作製する工程、D) 頭部と標的システインの近位性を測定する工程、ならびにE) 共有結合を形成する工程を含む。
【００４１】
A)  標的および可逆的インヒビターの提供
本発明は、可逆的インヒビターが結合部位と非共有性接触を行う、標的ポリペプチド中の結合部位に結合する可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程を含む。標的ポリペプチドの結合部位に結合する可逆的インヒビターの任意の適切な構造モデルを提供して使用し得る。一般的に、公知または既存の標的ポリペプチドの強力な可逆的インヒビターを使用して、標的ポリペプチドと共有結合するインヒビターを設計するための開始点（例えば、鋳型または骨格）を、本発明を使用して、提供する。従って、例えば、標的タンパク質の可逆的インヒビターが前もって同定されている（例えば文献に報告されているかまたは当業者に公知の任意の方法より同定されている）場合、公知の可逆的インヒビターを使用して、該インヒビターと複合体化した標的ポリペプチドの構造モデルを作製することができる。しかしながら、所望の場合、新規または既知の可逆的インヒビターを、該インヒビターと複合体化した標的ポリペプチドの構造モデルを作製するために使用することができる。
【００４２】
強力な可逆的インヒビター、弱い可逆的インヒビターまたは適切な効力を有する可逆的インヒビターなどの任意の適切な可逆的インヒビターを使用して、不可逆的インヒビターを設計するために該アルゴリズムおよび方法を使用することができる。例えば、実施例8に記載されるように、本発明のアルゴリズムおよび方法は、標的タンパク質に共有結合する能力を設計することにより可逆的インヒビターの効力を増加するために使用することができる。いくつかの態様において、アルゴリズムおよび方法には、強力な可逆的インヒビターの構造を使用する。他の態様において、共有結合を設計することにより、効力を向上させるためにアルゴリズムおよび方法を使用し、IC50またはKiが≧10nM、≧100nM、約1μM〜約10nM、約1μM〜約100nM、約100μM〜1μM、または約1mM〜約1μMのインヒビターなどの弱いまたは中度の効力のインヒビターの構造を使用する。
【００４３】
多くの適切な標的ポリペプチドの三次元構造が公知であり、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB available on line at world wide web pdb.org; H.M. Berman et al.,: Nucleic Acids Research, 28 pp. 235-242 (2000) and www.rcsb.org), and worldwide Protein Data Bank (wwPDB; Berman et al, Nature Structural Biology 10(12):980 (2003)も参照)などの公開情報源から容易に利用可能である。タンパク質データバンクにおいて構造が利用可能である適切な標的ポリペプチドの非限定的なリストを表1に示す。所望の場合、標的タンパク質の三次元構造は、任意の適切な方法を使用して入手可能である。液相核磁気共鳴（NMR）スペクトル分析、固相NMRスペクトル分析、X線結晶学などの構造を決定するための適切な方法は、当該技術分野において周知かつ常套的である（例えば、Blow, D, Outline of Crystallography for Biologists. Oxford: Oxford UniversityPress. ISBN 0-19-851051-9 (2002)参照）。
【００４４】
標的ポリペプチドの構造モデルは、例えばタンパク質の一次および二次構造に基づいた相同性モデリングまたはフォールディング試験などのコンピューターモデリングの周知かつ慣用的な方法を使用しても作製できる。相同性モデルを作製するための適切な方法は当該技術分野において周知である（例えば、John, B. and Sali, A. Nucleic Acids Res 31(14):3982-92 (2003)参照）。相同性モデリングに適切なプログラムとしては、例えば、Modeler（Accelrys, Inc. San Diego）およびPrime（Schrodinger Inc., New York）が挙げられる。例えば、本明細書の実施例3に記載するように、FLT3キナーゼの相同性モデルを、Auroraキナーゼの公知の構造に基づいて作製した。相同性モデルを作製するために使用し得る、配列情報が利用可能な適切な標的ポリペプチドの非限定的なリストを表2に示す。好ましい構造モデルは、可逆的インヒビターとの複合体において標的ポリペプチドの原子座標または標的ポリペプチドの少なくとも結合部位を使用して作製される。これらの原子座標は、可逆的インヒビターと複合体化した多くの標的ポリペプチドについてのタンパク質データバンクで入手可能であり、X線結晶、核磁気共鳴スペクトル分析を用いて、相同性モデリング等を用いて決定することができる。
【００４５】
同様に、可逆的インヒビターのみまたは標的ポリペプチドと複合体化した可逆的インヒビターの構造モデルは、公知の原子座標に基づいてまたは他の適切な方法を使用して作製し得る。インヒビターと標的タンパク質をドッキングさせるための適切な方法およびプログラムは当該技術分野において周知である（例えば、Perola et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 56:235-249 (2004)参照）。一般に、標的ポリペプチドに複合体化された可逆的インヒビターの構造は知られておらず、該複合体のモデルは、可逆的インヒビターの可能なまたは推定結合モデルに基づいて調製され得る。可逆的インヒビターについての可能なまたは推定結合モデルは、例えば可逆的インヒビターと公知の結合様式を有する別のインヒビターとの構造類似性に基づいて、当業者が容易に同定し得る。例えば、実施例5に記載されるように、HCVプロテアーゼと10より多い異なるインヒビターとの複合体の構造が公知であり、全てのインヒビターがプロテアーゼに対する結合様式について構造類似性を有することが明らかである。可逆的インヒビターV-1の推定結合様式の知識に基づいて、HCVプロテアーゼと複合体化したV-1の構造モデルを作製し、HCVプロテアーゼのCys159に共有結合する不可逆的インヒビターを成功裡に設計するために使用した。
【００４６】
標的ポリペプチドの結合部位に結合した可逆的インヒビターの構造モデルは、好ましくはコンピューターモデルである。VIDATM、視覚化ソフトウェア（OpenEye Scientific Software, New Mexico）、Insight II(登録商標)またはDiscovery Studio(登録商標)、グラフィック分子モデリングソフトウェア（Accelrys Software Inc., San Diego, CA）などの任意の適切なソフトウェアを使用してコンピューターモデルを作製して視覚化することができる。
【００４７】
【表１−１】
2015062428.tif 000004
【表１−２】
2015062428.tif 000005
【表１−３】
2015062428.tif 000006
【００４８】
【表２−１】
2015062428.tif 000007
【表２−２】
2015062428.tif 000008
【００４９】
B)  標的システインの同定
本発明は、可逆的インヒビターが結合部位に結合した際に、可逆的インヒビターに近接する標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基を同定する工程を含む。可逆的インヒビターと複合体化した標的ポリペプチドの構造モデルを使用して、頭部との共有結合形成の標的化に適切な、標的ポリペプチドのCys残基を同定する。頭部との共有結合形成の標的化に適したCys残基は、構造モデル中の可逆的インヒビターに近接する。構造モデル中の可逆的インヒビターに近接するCys残基は、分子間距離を測定する任意の適切な方法を使用して同定することができる。VIDATM、視覚化ソフトウェア（OpenEye Scientific Software, New Mexico）、Discovery Studio、視覚化ソフトウェア（Accelrys, Inc. San Diego）などの、コンピューターモデルにおいて分子間距離をコンピュータ計算するためのいくつかのプログラムは、当該技術分野において周知である。
【００５０】
一例において、分子間距離（例えば単位Å）は、標的ポリペプチド結合部位中の全てのCys残基の全ての非水素原子と可逆的インヒビターの全ての非水素原子間で測定される。可逆的インヒビターに近接するCys残基は、これらの分子間距離から容易に同定される。近接するCys残基が可逆的インヒビターの約10Å、約8Åまたは約6Å内にあることが一般的に好ましい。
【００５１】
所望の場合、可逆的インヒビターに近接するCys残基は、標的ポリペプチド中のCys残基の接触可能表面の変化を分析することにより同定し得る。このことは、例えば、標的ポリペプチドが可逆的インヒビターと複合体化される場合、および標的ポリペプチドが可逆的インヒビターと複合体化されない場合の標的ポリペプチド中のCys残基（例えば標的ポリペプチドのインヒビター結合部位）の接触可能表面積を測定することにより達成できる。可逆的インヒビターが標的ポリペプチドと複合体化される場合に接触可能表面積の変化を有するCys残基は、可逆的インヒビターに近接していると思われる。例えば、表面接触性についてLee, B. and Richared, F.M., J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)参照。このことは、所望の場合、分子間距離を測定することにより確認できる。
【００５２】
C)  頭部を含む候補インヒビターの構造モデルの作製
本発明は、標的ポリペプチドに共有結合するように設計された候補インヒビターの構造モデルを作製する工程を含み、ここでそれぞれの候補インヒビターは可逆的インヒビターの置換可能位置に結合する頭部を含む。近接するCys残基と共有結合を形成し得る候補インヒビターは、可逆的インヒビターの置換可能位置に頭部基を付加することにより設計される。例えば、頭部は、標的ポリペプチド中のCys残基に近接する不飽和炭素原子に結合し得る。別の例において、可逆的インヒビター標的ポリペプチド複合体中で、Cys残基は可逆的インヒビターの一部によりふさがれるかまたは一部ふさがれる。この状況では、可逆的インヒビターの一部を除去し、適切な頭部と置換することにより、可逆的インヒビターでふさがれるかまたは一部ふさがれたCys残基に共有結合するインヒビターを作製することができる。このアプローチは、除去されて頭部と置換される可逆的インヒビターの一部を、可逆的インヒビターの結合に影響を及ぼさないように除去できる場合に適している。結合に影響を及ぼすことなく除去し得る可逆的インヒビターの部分は容易に同定することができ、例えば、標的ポリペプチドとの水素結合、ファンデルワールス相互作用および/または疎水性相互作用に関与しない部分が挙げられる。
【００５３】
頭部は、Cys側鎖と反応して、反応性化学官能基とCys側鎖の硫黄原子の間に共有結合を形成する反応性化学官能基を含む。頭部は任意に、反応性化学官能基を、標的ポリペプチド結合部位のCys側鎖の結合距離内に配置するリンカーを含む。頭部は、Cys側鎖との所望の程度の反応性に基づいて選択され得る。リンカーは、存在する場合には、反応性化学官能基を、標的Cys残基の結合距離内に配置するように働く。例えば、近接するCys残基が、可逆的インヒビターから、反応性化学官能基を可逆的インヒビターの置換可能位置に直接結合させるには遠すぎる場合、反応性化学官能基は、二価のC1〜C18飽和または不飽和、直鎖または分岐炭化水素鎖などの適切なリンカーを介して可逆的インヒビターの置換可能位置に結合し得る。
【００５４】
頭部の適切な例としては、本明細書、例えば図1に開示されるものが挙げられる。いくつかの適切な頭部は、式＊-X-L-Yを有し、式中、＊は可逆的インヒビターの置換可能位置に対する結合点を示し、
Xは、結合または二価のC1〜C6飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、任意に、該炭化水素鎖の1つ、2つまたは3つのメチレン単位は独立して-NR-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(=S)-、-C(=NR)-、-N=N-または-C(=N2)-で置き換えられる；
Lは、共有結合または二価のC1〜8飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lの1つ、2つまたは3つのメチレン単位は、任意にかつ独立してシクロプロピレン、-NR-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-SO-、-SO2-、-C(=S)-、-C(=NR)-、-N=N-または-C(=N2)-で置き換えられる；
Yは、水素であるか、オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されるC1〜6脂肪族、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する3〜10員単環式もしくは二環式、飽和、部分不飽和またはアリール環であり、前記環は1〜4個のRe基で置換され；
各Reは、独立して-Q-Z、オキソ、NO2、ハロゲン、CN、適切な脱離基、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されるC1〜6脂肪族から選択され；
Qは、共有結合または二価のC1〜6飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意にかつ独立して、-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-または-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-または-SO2N(R)-で置き換えられ；
Zは、水素またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族である。
【００５５】
いくつかの態様において、Xは、結合、-O-、-NH-、-S-、-O-CH2-C≡C-、-NH-CH2-C≡C-、-S-CH2-C≡C-、-O-CH2-CH2-O-、-O-(CH2)3-または-O-(CH2)2-C(CH3)2-である。
【００５６】
特定の態様において、Lは共有結合である。
【００５７】
特定の態様において、Lは二価のC1〜8飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖である。特定の態様において、Lは-CH2-である。
【００５８】
特定の態様において、Lは、共有結合、-CH2-、-NH-、-CH2NH-、-NHCH2-、-NHC(O)-、-NHC(O)CH2OC(O)-、-CH2NHC(O)-、-NHSO2-、-NHSO2CH2-、-NHC(O)CH2OC(O)-または-SO2NH-である。
【００５９】
いくつかの態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立して、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-、-C(O)O-、シクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられる。
【００６０】
特定の態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-または-C(O)O-で置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立してシクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられる。
【００６１】
いくつかの態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は-C(O)-で置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立してシクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられる。
【００６２】
上述のように、特定の態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは少なくとも1つの二重結合を有する。かかる二重結合は、炭化水素主鎖内に存在していてもよく、主鎖に対して「エキソ」であり、アルキリデン基を形成していてもよいことは、当業者に理解されよう。例として、アルキリデン分岐鎖を有するかかるL基は、-CH2C(=CH2)CH2-を含む。従って、いくつかの態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つのアルキリデニル二重結合を有する。例示的なL基としては、-NHC(O)C(=CH2)CH2-が挙げられる。
【００６３】
特定の態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-C(O)-で置き換えられる。特定の態様において、Lは、-C(O)CH=CH(CH3)-、-C(O)CH=CHCH2NH(CH3)-、-C(O)CH=CH(CH3)-、-C(O)CH=CH-、-CH2C(O)CH=CH-、-CH2C(O)CH=CH(CH3)-、-CH2CH2C(O)CH=CH-、-CH2CH2C(O)CH=CHCH2-、-CH2CH2C(O)CH=CHCH2NH(CH3)-または-CH2CH2C(O)CH=CH(CH3)-または-CH(CH3)OC(O)CH=CH-である。
【００６４】
特定の態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-OC(O)-で置き換えられる。
【００６５】
いくつかの態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-または-C(O)O-で置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立してシクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられる。いくつかの態様において、Lは、-CH2OC(O)CH=CHCH2-、-CH2-OC(O)CH=CH-または-CH(CH=CH2)OC(O)CH=CH-である。
【００６６】
特定の態様において、Lは、-NRC(O)CH=CH-、-NRC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NRC(O)CH=CHCH2O-、-CH2NRC(O)CH=CH-、-NRSO2CH=CH-、-NRSO2CH=CHCH2-、-NRC(O)(C=N2)C(O)-、-NRC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NRSO2CH=CH-、-NRSO2CH=CHCH2-、-NRC(O)CH=CHCH2O-、-NRC(O)C(=CH2)CH2-、-CH2NRC(O)-、-CH2NRC(O)CH=CH-、-CH2CH2NRC(O)-または-CH2NRC(O)シクロプロピレン-であり、各Rは、独立して水素であるか、または任意に置換されたC1〜6脂肪族である。
【００６７】
特定の態様において、Lは、-NHC(O)CH=CH-、-NHC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NHC(O)CH=CHCH2O-、-CH2NHC(O)CH=CH-、-NHSO2CH=CH-、-NHSO2CH=CHCH2-、-NHC(O)(C=N2)C(O)-、-NHC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NHSO2CH=CH-、-NHSO2CH=CHCH2-、-NHC(O)CH=CHCH2O-、-NHC(O)C(=CH2)CH2-、-CH2NHC(O)-、-CH2NHC(O)CH=CH-、-CH2CH2NHC(O)-または-CH2NHC(O)シクロプロピレン-である。
【００６８】
いくつかの態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは少なくとも1つの三重結合を有する。特定の態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの三重結合を有し、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立して-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(=S)-、-C(=NR)-、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられる。いくつかの態様において、Lは少なくとも1つの三重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)-、-C(O)O-または-OC(O)-または-O-で置き換えられる。
【００６９】
例示的なL基としては、-C≡C-、-C≡CCH2N(イソプロピル)-、-NHC(O)C≡CCH2CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡CCH2O-、-CH2C(O)C≡C-、-C(O)C≡C-または-CH2OC(=O)C≡C-が挙げられる。
【００７０】
特定の態様において、Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lの1つのメチレン単位は、シクロプロピレンで置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、独立して-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-または-SO2N(R)-で置き換えられる。例示的なL基としては、-NHC(O)-シクロプロピレン-SO2-および-NHC(O)-シクロプロピレン-が挙げられる。
【００７１】
先に一般的に定義したように、Yは、水素であるか、任意にオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されるC1〜6脂肪族、または窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する3〜10員単環式もしくは二環式、飽和、部分不飽和またはアリール環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、独立して-Q-Z、オキソ、NO2、ハロゲン、CNまたはC1〜6脂肪族から選択され、Qは、共有結合または二価のC1〜6飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意にかつ独立して、-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-または-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-または-SO2N(R)-で置き換えられ；Zは、水素または任意にオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6脂肪族である。
【００７２】
特定の態様において、Yは水素である。
【００７３】
特定の態様において、Yは、任意にオキソ、ハロゲン、NO2またはCNで置換されるC1〜6脂肪族である。いくつかの態様において、Yは、オキソ、ハロゲン、NO2またはCNで任意に置換されるC2〜6アルケニルである。他の態様において、Yは、オキソ、ハロゲン、NO2またはCNで任意に置換されたC2〜6アルキニルである。いくつかの態様において、Yは、C2〜6アルケニルである。他の態様において、Yは、C2〜4アルキニルである。
【００７４】
他の態様において、Yは、オキソ、ハロゲン、NO2またはCNで置換されたC1〜6アルキルである。かかるY基としては、-CH2F、-CH2Cl、-CH2CNおよび-CH2NO2が挙げられる。
【００７５】
特定の態様において、Yは、独立して窒素、酸素または硫黄から選択される0〜3個のヘテロ原子を有する飽和3〜6員単環式の環であり、Yは、1〜4個のRe基で置換され、各Reは先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００７６】
いくつかの態様において、Yは、酸素または窒素から選択される1個のヘテロ原子を有する飽和3〜4員複素環式の環であり、前記環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。例示的なかかる環は、エポキシドおよびオキセタン環であり、各環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００７７】
他の態様において、Yは、酸素または窒素から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する飽和5〜6員複素環式の環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。かかる環としては、ピペリジンおよびピロリジンが挙げられ、各環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様において、Yは、
【化１−３】
2015062428.tif 000009
であり、各R、Q、ZおよびReは先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００７８】
いくつかの態様において、Yは、飽和3〜6員炭素環式環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様において、Yは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルであり、各環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様において、Yは、
【化２】
2015062428.tif 000010
であり、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様において、Yは、ハロゲン、CNまたはNO2で任意に置換されるシクロプロピルである。
【００７９】
特定の態様において、Yは、独立して窒素、酸素または硫黄から選択される0〜3個のヘテロ原子を有する部分不飽和3〜6員単環式の環であり、該環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８０】
いくつかの態様において、Yは、部分不飽和3〜6員炭素環式環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載された通りである。いくつかの態様において、Yは、シクロペンチル、シクロブテニル、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルであり、各環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様においてYは、
【化３】
2015062428.tif 000011
であり、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８１】
特定の態様において、Yは、独立して窒素、酸素または硫黄から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する部分不飽和4〜6員複素環式の環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様においてYは；
【化４】
2015062428.tif 000012
から選択され、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８２】
特定の態様において、Yは、0〜2個の窒素を有する6員芳香族環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様において、Yは、フェニル、ピリジルまたはピリミジニルであり、各環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８３】
いくつかの態様において、Yは；
【化５】
2015062428.tif 000013
から選択され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８４】
他の態様において、Yは、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員へテロアリール環であり、前記環は、1〜3個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである。いくつかの態様において、Yは、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員部分不飽和環またはアリール環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Re基は先に規定され、本明細書に記載される通りである。例示的なかかる環は、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリル、フラニル、チエニル、トリアゾール、チアジアゾールおよびオキサジアゾールであり、各環は、1〜3個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである。特定の態様において、Yは；
【化６】
2015062428.tif 000014
から選択され、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８５】
特定の態様において、Yは、独立して窒素、酸素または硫黄から選択される0〜3個のヘテロ原子を有する8〜10員二環式、飽和、部分不飽和またはアリール環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。別の局面によると、Yは、独立して窒素、酸素または硫黄から選択される1〜3個のヘテロ原子を有する、9〜10員二環式、部分不飽和またはアリール環であり、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。例示的なかかる二環式環としては、2,3-ジヒドロベンゾ[d]イソチアゾールが挙げられ、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである。
【００８６】
一般的に先に規定されるように、各Re基は、独立して-Q-Z、オキソ、NO2、ハロゲン、CN、適切な脱離基、または任意にオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されるC1〜6脂肪族から選択され、Qは、共有結合または二価のC1〜6飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意にかつ独立して、-N(R)-、-S-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SO-または-SO2-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)SO2-または-SO2N(R)-で置き換えられ；Zは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族である。
【００８７】
特定の態様において、Reは、オキソ、ハロゲン、NO2またはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族である、他の態様において、Reは、オキソ、NO2、ハロゲンまたはCNである。いくつかの態様において、Reは-Q-Zであり、Qは共有結合であり、Zは水素である（すなわち、Reは水素である）。他の態様において、Reは-Q-Zであり、Qは、二価のC1〜6飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意にかつ独立して、-NR-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-または-SO2-で置き換えられる。他の態様において、Qは、少なくとも1つの二重結合を有する二価のC2-6直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Qの1つまたは2つのメチレン単位は、任意にかつ独立して、-NR-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-S-、-O-、-C(O)-、-SO-または-SO2-で置き換えられる。特定の態様において、Re基のZ部分は水素である。いくつかの態様において、-Q-Zは、-NHC(O)CH=CH2または-C(O)CH=CH2である。
【００８８】
特定の態様において、各Reは、独立して、オキソ、NO2、CN、フッ素、塩素、-NHC(O)CH=CH2、-C(O)CH=CH2、-CH2CH=CH2、-C≡CH、-C(O)OCH2Cl、-C(O)OCH2F、-C(O)OCH2CN、-C(O)CH2Cl、-C(O)CH2F、-C(O)CH2CNまたは-CH2C(O)CH3から選択される。
【００８９】
特定の態様において、Reは、適切な脱離基、すなわち求核性の置換を受ける基である。「適切な脱離基」は、目的のシステインのチオール部分など所望の侵入化学部分により容易に置換される化学基である。適切な脱離基は、当該技術分野において周知であり、例えば「Advanced Organic Chemistry」、Jerry March, 5thEd., pp. 351-357, John Wiley and Sons, N.Y.を参照。かかる脱離基としては、限定されないが、ハロゲン, アルコキシ、スルホニルオキシ、任意に置換されたアルキルスルホニルオキシ、任意に置換されたアルケニルスルホニルオキシ、任意に置換されたアリールスルホニルオキシ、アシルおよびジアゾニウム部分が挙げられる。適切な脱離基の例としては、塩素、ヨウ素、臭素、フッ素、アセチル、メタンスルホニルオキシ（メシルオキシ）、トシルオキシ、トリフリルオキシ、ニトロ-フェニルスルホニルオキシ（ノシルオキシ）およびブロモ-フェニルスルホニルオキシ（ブロシルオキシ）が挙げられる。
【００９０】
特定の態様において、以下の態様および-L-Yの組合せは、以下の通りである；
(a) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立して、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-、-C(O)O-、シクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられ；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(b) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-または-C(O)O-で置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立して、シクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられ；Yは、水素、または任意にオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(c) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-C(O)-で置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立してシクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられ；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(d) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-C(O)-で置き換えられ；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(e) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つの二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-OC(O)-で置き換えられ；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(f) Lは、-NRC(O)CH=CH-、-NRC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NRC(O)CH=CHCH2O-、-CH2NRC(O)CH=CH-、-NRSO2CH=CH-、-NRSO2CH=CHCH2-、-NRC(O)(C=N2)-、-NRC(O)(C=N2)C(O)-、-NRC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NRSO2CH=CH-、-NRSO2CH=CHCH2-、-NRC(O)CH=CHCH2O-、-NRC(O)C(=CH2)CH2-、-CH2NRC(O)-、-CH2NRC(O)CH=CH-、-CH2CH2NRC(O)-または-CH2NRC(O)シクロプロピレン-であり、Rは、Hまたは任意に置換されたC1〜6脂肪族であり；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(g) Lは、-NHC(O)CH=CH-、-NHC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NHC(O)CH=CHCH2O-、-CH2NHC(O)CH=CH-、-NHSO2CH=CH-、-NHSO2CH=CHCH2-、-NHC(O)(C=N2)-、-NHC(O)(C=N2)C(O)-、-NHC(O)CH=CHCH2N(CH3)-、-NHSO2CH=CH-、-NHSO2CH=CHCH2-、-NHC(O)CH=CHCH2O-、-NHC(O)C(=CH2)CH2-、-CH2NHC(O)-、-CH2NHC(O)CH=CH-、-CH2CH2NHC(O)-または-CH2NHC(O)シクロプロピレン-であり；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(h) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは、少なくとも1つのアルキリデニル二重結合を有し、Lの少なくとも1つのメチレン単位は、-C(O)-、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-または-C(O)O-で置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立して、シクロプロピレン、-O-、-N(R)-または-C(O)-で置き換えられ；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(i) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lは少なくとも1つの三重結合を有し、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、任意にかつ独立して、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-または-C(O)O-で置き換えられ、Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(j) Lは、-C≡C-、-C≡CCH2N(イソプロピル)-、-NHC(O)C≡CCH2CH2-、-CH2-C≡C-CH2-、-C≡CCH2O-、-CH2C(O)C≡C-、-C(O)C≡C-または-CH2OC(=O)C≡C-であり；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(k) Lは、二価のC2〜8直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Lの1つのメチレン単位は、シクロプロピレンで置き換えられ、Lの1つまたは2つのさらなるメチレン単位は、独立して、-NRC(O)-、-C(O)NR-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-OC(O)-または-C(O)O-で置き換えられ；Yは、水素、またはオキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC1〜6脂肪族であるか；あるいは
(l) Lは共有結合であり、Yは：
(i) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6アルキル
(ii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルケニル；または
(iii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルキニル；または
(iv) 酸素または窒素から選択される1つのヘテロ原子を有する飽和3〜4員複素環式の環、前記環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(v) 酸素または窒素から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する飽和5〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vi)
【化７】
2015062428.tif 000015
、各R、Q、ZおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vii) 飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(viii) 独立して窒素、酸素または硫黄から選択される0〜3個のヘテロ原子を有する部分不飽和3〜6員単環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(ix) 部分不飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(x)
【化８】
2015062428.tif 000016
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xi) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する部分不飽和4〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に帰されるとおりである；または
(xii)
【化９】
2015062428.tif 000017
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiii) 0〜2個の窒素を有する6員芳香族環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiv)
【化１０】
2015062428.tif 000018
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xv) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員へテロアリール環、前記環は、1〜3個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvi)
【化１１】
2015062428.tif 000019
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである、または
(xvii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する8〜10員二環式飽和、部分不飽和またはアリール環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである、
から選択されるか；
(m) Lは-C(O)-であり、Yは：
(i) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6アルキル；または
(ii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルケニル；または
(iii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルキニル；または
(iv) 酸素または窒素から選択される1つのヘテロ原子を有する飽和3〜4員複素環式の環、前記環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(v) 酸素または窒素から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する飽和5〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vi)
【化１２】
2015062428.tif 000020
、各R、Q、ZおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである、または
(vii) 飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(viii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する部分不飽和3〜6員単環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(ix) 部分不飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；
(x)
【化１３】
2015062428.tif 000021
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xi) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する部分不飽和4〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xii)
【化１４】
2015062428.tif 000022
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiii) 0〜2個の窒素を有する6員芳香族環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiv)
【化１５】
2015062428.tif 000023
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載されるとおりである；または
(xv) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員へテロアリール環、前記環は、1〜3個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvi)
【化１６】
2015062428.tif 000024
各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する8〜10員二環式、飽和、部分不飽和またはアリール環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである、
から選択されるか；
(n) Lは-N(R)C(O)-であり、Yは：
(i) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6アルキル；または
(ii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルケニル；または
(iii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルキニル；または
(iv) 酸素または窒素から選択される1つのヘテロ原子を有する飽和3〜4員複素環式の環、前記環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(v) 酸素または窒素から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する飽和5〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vi)
【化１７】
2015062428.tif 000025
、各R、Q、ZおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vii) 飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基から選択され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(viii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する部分不飽和3〜6員単環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(ix) 部分不飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；
(x)
【化１８】
2015062428.tif 000026
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xi) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する部分不飽和4〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xii)
【化１９】
2015062428.tif 000027
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiii) 0〜2個の窒素を有する6員芳香族環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiv)
【化２０】
2015062428.tif 000028
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xv) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール、前記環は、1〜3個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvi)
【化２１】
2015062428.tif 000029
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する8〜10員二環式、飽和、部分不飽和、またはアリール環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである、
から選択されるか；
(o) Lは、二価のC1〜8飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐炭化水素鎖であり、Yは：
(i) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6アルキル；または
(ii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルケニル；または
(iii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルキニル；または
(iv) 酸素または窒素から選択されるヘテロ原子を有する飽和3〜4員複素環式の環、前記環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(v) 酸素または窒素から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する飽和5〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vi)
【化２２】
2015062428.tif 000030
、各R、Q、ZおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vii) 飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(viii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する部分不飽和3〜6員単環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(ix) 部分不飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；
(x)
【化２３】
2015062428.tif 000031
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xi) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する部分不飽和4〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xii)
【化２４】
2015062428.tif 000032
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiii) 0〜2個の窒素を有する6員芳香族環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiv)
【化２５】
2015062428.tif 000033
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xv) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール環、前記環は、1〜3個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvi)
【化２６】
2015062428.tif 000034
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する8〜10員二環式、飽和、部分不飽和、またはアリール環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである、
から選択されるか；
(p) Lは、共有結合、-CH2-、-NH-、-C(O)-、-CH2NH-、-NHCH2-、-NHC(O)-、-NHC(O)CH2OC(O)-、-CH2NHC(O)-、-NHSO2-、-NHSO2CH2-、-NHC(O)CH2OC(O)-または-SO2NH-であり；Yは：
(i) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで置換されたC1〜6アルキル；または
(ii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルケニル；または
(iii) オキソ、ハロゲン、NO2もしくはCNで任意に置換されたC2〜6アルキニル；または
(iv) 酸素または窒素から選択される1個のヘテロ原子を有する飽和3〜4員複素環式の環、前記環は、1〜2個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(v) 酸素または窒素から選択される1〜2個のヘテロ原子を有する飽和5〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vi)
【化２７】
2015062428.tif 000035
、各R、Q、ZおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(vii) 飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(viii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する部分不飽和3〜6員単環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(ix) 部分不飽和3〜6員炭素環式環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；
(x)
【化２８】
2015062428.tif 000036
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xi) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜2個のヘテロ原子を有する部分不飽和4〜6員複素環式の環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xii)
【化２９】
2015062428.tif 000037
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiii) 0〜2個の窒素を有する6員芳香族環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xiv)
【化３０】
2015062428.tif 000038
、各Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xv) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5員ヘテロアリール環、前記環は、1〜3個のRe基で置換され、各Re基は、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvi)
【化３１】
2015062428.tif 000039
、各RおよびReは、先に規定され、本明細書に記載される通りである；または
(xvii) 窒素、酸素または硫黄から独立して選択される0〜3個のヘテロ原子を有する8〜10員二環式、飽和、部分不飽和またはアリール環、前記環は、1〜4個のRe基で置換され、Reは、先に規定され、本明細書に記載される通りである
から選択される。
【００９１】
特定の態様において、式IのY基は、以下の表3に記載されるものから選択され、式中の各波線は、分子の残部との結合点を表す。表2に示される各Re基は、独立してハロゲンから選択される。
【００９２】
【表３−１】
2015062428.tif 000040
【表３−２】
2015062428.tif 000041
【表３−３】
2015062428.tif 000042
【表３−４】
2015062428.tif 000043
【００９３】
特定の態様において、R1は、-C≡CH、-C≡CCH2NH(イソプロピル)、-NHC(O)C≡CCH2CH3、-CH2-C≡C-CH3、-C≡CCH2OH、-CH2C(O)C≡CH、-C(O)C≡CHまたは-CH2OC(=O)C≡CHである。いくつかの態様において、R1は、-NHC(O)CH=CH2、-NHC(O)CH=CHCH2N(CH3)2または-CH2NHC(O)CH=CH2から選択される。
【００９４】
特定の態様において、R1は、以下の表4に記載されるものから選択され、式中の各波線は、分子の残部との結合点を表す。
【００９５】
【表４−１】
2015062428.tif 000044
【表４−２】
2015062428.tif 000045
【表４−３】
2015062428.tif 000046
【表４−４】
2015062428.tif 000047
【表４−５】
2015062428.tif 000048
（式中、各Reは、独立して、適切な脱離基、NO2、CNまたはオキソである）
【００９６】
頭部を含む候補インヒビターの構造モデルは、任意の適切な方法を使用して調製し得る。例えば、本明細書に記載され、例示されるように、頭部は、適切な分子モデリングプログラムを使用して、可逆的インヒビター鋳型に対して三次元で構築することができる。適切なモデリングプログラムとしては、Discovery Studio(登録商標)およびPipeline PilotTM（分子モデリングソフトウェア、Accelrys Inc., San Diego, CA）、Combibuild、Combilibmaker 3D（化合物ライブラリーを作製するためのソフトウェア、Tripos L.P., St. Louis, MO）、SMOG（小分子コンピューターコンビナトリアル設計プログラム；DeWitte and Shakhnovich, J. Am. Chem. Soc. 118:11733-11744 (1996)；DeWitte et al., J. Am. Chem. Soc. 119:4608-4617 (1997)；Shimada et al., Protein Sci. 9:765-775 (2000)；MaestroTM、CombiGlideTM、GlideTMおよびJaguarTM（モデリングソフトウェアパッケージ、Schroedinger, LLC.  120 West 45th Street, New York, NY 10036-4041)）が挙げられる。標的ポリペプチドのCys残基に近接する各置換可能位置、または選択された置換可能位置、または所望の場合は単一の置換可能位置に、頭部を結合させることができる。FROG（3D立体構造ジェネレーター；Bohme et al., Nucleic Acids Res. 35(web server issue):W568-W572 (2007).）、Discovery Studio(登録商標)またはPipline PilotTM（Accelrys, Inc., San Diego）、Combilibmaker 3D（Tripos, St. Louis）、SMOG（DeWitte and Shakhnovich, J. Am. Chem. Soc. 118:11733-11744 (1996); DeWitte et al., J. Am. Chem. Soc. 119:4608-4617 (1997); Shimada et al., Protein Sci. 9:765-775 (2000)）等の任意の適切な方法またはプログラムを使用して、頭部を化合物に結合させることができる。例えばDiscovery Studio(登録商標)を用いて手動で、または例えばPipline PilotTM（Accelrys, Inc., San Diego）を用いて自動様式で、頭部を結合させることができる。
【００９７】
いくつかの好ましい態様において、複数の候補インヒビターの構造モデルを作製する。頭部が異なる置換可能位置に結合した化合物を含む構造モデル、およびそれぞれの強力な置換可能位置に対する結合は、少なくとも1つの化合物により提示される。
【００９８】
D)  頭部と標的システインの近位性の測定
本発明は、候補インヒビターが結合部位に結合した際に、標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基の結合距離内に頭部の反応性化学的官能基を生じさせる可逆的インヒビターの置換可能位置を決定する工程を含む。候補インヒビターの構造モデルを解析して、可逆的インヒビター中のどの置換可能位置が、標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基の結合距離内に、頭部の反応性化学官能基を生じるかを決定する。構造モデル中のCys残基の結合距離内に反応性化学官能基を生じさせるCys残基-置換可能位置の組合せは、制約を受けてまた受けずに、分子間距離を測定する任意の適切な方法を用いて確認され得る。例えば、Cys残基結合の間隔中に反応性化学官能基を生じさせるCys残基-置換可能位置の組合せは、1) 標的ポリペプチドを固定するがCys側鎖を柔軟にし、かつ候補インヒビターを固定するが頭部を柔軟にする、2) 標的ポリペプチドを柔軟にし、かつ候補インヒビターを柔軟にする、3) 標的ポリペプチドを柔軟にし、かつ候補インヒビターを固定するが頭部を柔軟にする、または4) 標的ポリペプチドを固定するがCys側鎖を柔軟にし、かつ候補インヒビターを柔軟にし、適切なコンピューター法を使用して確認され得る。好ましくは、標的ポリペプチドを固定するがCys側鎖を柔軟にし、候補インヒビターを固定するが頭部を柔軟にする。
【００９９】
Cys残基の結合距離内に反応性化学官能基をもたらすCys残基-置換可能位置の組合せの同定に適切ないくつかのコンピューター法は、当該技術分野において周知である。例えば、分子間距離の計算、分子ダイナミクス、エネルギー最小化、体系的立体構造検索および手動モデリングに適切なプログラムは、当該技術分野において周知である。例えば、適切なプログラムとしては、Discovery Studio(登録商標) and Charmm（Accelrys, Inc. San Diego）、Amber（Amber Software Administrator, USSF, 600 16th Street, Room 552, San Fransico, CA 94158 and ambermd.org/）等が挙げられる。化合物分解エネルギーおよび静電的相互作用を評価し得るコンピュータープログラムが当該技術分野において利用可能であり、例えばGaussian 92, revision C（M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa.）；AMBER, version 4.0（P. A. Kollman, University of Californiaat San Francisco, Calif.）；QUANTA/CHARMM（Accelrys, Inc., Burlington, Mass.）が挙げられる。これらのプログラムは、例えばコンピューターワークステーションを使用して実行され得る。他の適切なハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが当業者に知られている。候補インヒビターのドッキングは、Flexx（Tripos, St. Louis, Missouri）、Glide（Schrodinger, New York）、ICM-Pro（Molsoft, California）等の適切なソフトウェアを使用して、次いで標準分子機械的力場を用いたOPLS-AA、CHARMMまたはAMBERなどのエネルギー最小化および分子ダイナミクスを行なって達成される。
【０１００】
E)  共有結合の形成
本発明は、結合部位中のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に共有結合を形成することを含む。Cys残基の結合距離内に反応性化学官能基をもたらすCys残基-置換可能位置の組合せの確認により、Cys残基を共有結合により改変し得る候補インヒビターが同定される。しかしながら、モデルのみでの反応性化学官能基とCys側鎖の球面近位性は、反応性化学官能基とCys側鎖の間に共有結合が形成されることの充分な指標ではない。従って、本発明のアルゴリズムおよび方法において、結合は、反応性化学官能基とCys側鎖の間に形成され、形成された結合の長さを解析する。結合部位中のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に形成される結合について、約2.1Å〜約1.5Å、好ましくは約2Å未満の共有結合の長さは、候補インヒビターが、標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターであることを示す。好ましくは、反応性化学官能基とCys側鎖の間に形成される結合の長さは、約2Å、約1.9Å、約1.8Å、約1.7Å、約1.6Åまたは約1.5Åである。結合の形成および結合長さの解析のための適切な方法およびプログラムは、当該技術分野において公知であり、Discovery Studio(登録商標) and Charmm（Accelrys, Inc. San Diego）、Amber（Amber Software Administrator, USSF, 600 16th Street, Room 552, San Fransico, CA 94158 and http://ambermd.org/）、Guassian（340 Quinnipiac St. Bldg 40, Wallingford CT 06292 USA and www.gaussian.com/）、Qsite（Schrodinger Inc., New York）および共有結合ドッキングプログラム（BioSolvIT GmbH, Germany www.biosolveit.de）、MaestroTM、MacroModelTMおよびJaguarTM（Modeling softwar packages, Schroedinger, LLC.  120 West 45th Street, New York, NY 10036-4041）が挙げられる。
【０１０１】
所望の場合、該方法を使用して設計された化合物を、さらに解析および/または構造的に精密化し得る。例えば、所望の場合、本発明は、結合部位中のCys残基の硫黄原子と頭部の反応性化学官能基の間に共有結合が形成される場合、標的ポリペプチドの結合部位がブロックされている（すなわち、リガンド、基質または補因子が結合部位に結合できない）かを決定するさらなる工程を含み得る。この工程は、標的ポリペプチド-Cys残基に共有結合する不可逆的インヒビター複合体の構造モデルを使用して実行され得る。インヒビターの標的ポリペプチドへの結合を、反応性化学官能基とCys残基の間の共有結合の形成の際に変化させることが可能である。しかしながら、ほとんどの場合、化合物は、標的ポリペプチドの結合部位をブロックし、リガンド、基質または補因子の結合部位への結合は防がれる。共有結合の形成の際のインヒビターの結合様式の変化および、結合部位が阻害されているかは、本明細書に開示される適切な方法およびプログラムを使用して、共有結合の形成後に標的ポリペプチドと複合体化したインヒビターの構造モデルの解析により決定することができる。
【０１０２】
別の例において、本発明を使用して設計された化合物は、形成された共有結合の立体構造などの好適または好ましい特性についてさらに解析される。実施例1および6に記載されるように、Cysとアクリルアミド頭部の間に形成された共有結合は、アミドのシス配置またはトランス配置を有し得、トランス配置が好ましい。別の例において、好ましい化合物は、頭部とCys残基の反応によって形成された生成物のエネルギーに基づいて、同様の構造を有する化合物から選択されるが、低いエネルギー生成物が好ましい。生成物のエネルギーは、量子力学または分子力学を使用するなどの任意の適切な方法を使用して測定し得る。
【０１０３】
本発明を使用して、標的ポリペプチドの結合部位中のCys残基と共有結合を形成することにより、任意の所望の標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターを設計し得る。本発明により設計されたインヒビターと共有結合を形成するCys残基が、標的ポリペプチドを含むタンパク質ファミリー中に保存されないことが好ましい。Cys残基が保存されないこの長所により、いくつかの種類のタンパク質ファミリーを阻害する種々の可逆的インヒビターを、より少ないまたは一種類のみのタンパク質ファミリーを阻害するより選択的な不可逆的インヒビターに変換することが可能である。
【０１０４】
本発明のいくつかの適用において、標的ポリペプチドは触媒活性を有する。例えば、標的ポリペプチドは、ウイルスプロテアーゼ、リン酸化酵素などのキナーゼ、プロテアーゼまたは他の酵素であり得る。標的ポリペプチドが触媒活性を有する場合、本発明により設計されたインヒビターと共有結合を形成するCys残基が触媒残基ではないことが好ましい。特定の好ましい態様において、本発明を使用して設計された不可逆的インヒビターは、触媒プロセスの間に、基質を共有結合不活性物質に変換する酵素のプロセスにより生じるインヒビターである自殺インヒビターまたは機構に基づいた阻害剤ではない。
【０１０５】
好ましくは、可逆的インヒビターは、リガンド、補因子または基質についての結合部位である標的ポリペプチド上の部位に結合する。標的ポリペプチドがキナーゼである場合、可逆的インヒビターが、キナーゼのATP結合部位に結合または相互作用することが好ましい。例えば、可逆的インヒビターは、ATP結合部位のヒンジ領域と相互作用し得る。
【０１０６】
本明細書に記載されるアルゴリズムおよび方法は、標的ポリペプチドの結合部位の完全構造および可逆的インヒビターの構造を使用して実施され得る。任意に、アルゴリズムが実施される場合、可逆的インヒビターの構造および標的ポリペプチドの結合部位のCysのみが考慮される。この選択肢において、Cys残基および可逆的インヒビターの三次元方向は、それらが標的ポリペプチドの結合部位の構造を欠如している場合と同じである。結合部位のCysのみを考慮して不可逆的インヒビターまたは候補不可逆的インヒビターを設計すると結合部位の完全モデルが考慮されて、所望の場合、結合部位のCysの結合距離内に頭部をもたらす置換可能位置の数を減少させる立体衝突を同定し得るさらなる構造情報および制約が提供され得る。本明細書に記載される実施例において、可逆的インヒビターおよび標的ポリペプチドの結合部位のCysの構造を考慮してアルゴリズムを実施した。このアプローチにより、いくつかの標的ポリペプチドの不可逆的インヒビターを成功裡に作製した。実施例に記載される作業中に同定された可逆的インヒビター上の置換可能位置の数が少なかったため、結合部位の完全モデルにより課され得るさらなる制約は必要なかったが、使用することができた。
【０１０７】
便宜上、アルゴリズムおよび方法の工程は、本発明の明確かつ正確な説明を可能にする順序で本明細書に記載される。しかしながら、本発明の工程を記載された順序で実施することが好ましいが、任意の適切な順序で行ってもよい。例えば、該方法は、頭部とCys残基の間に結合を形成して付加物を形成し、次いで、可逆的インヒビター上の置換可能位置に頭部を、任意にリンカーを介して結合させて、実施し得る。
【０１０８】
エノン含有頭部、不可逆的インヒビターおよびコンジュゲート
本発明はまた、共役(conjugated)エノンを含む頭部、α、β不飽和カルボニルを有する不可逆的インヒビターに関する。本発明はまた、共役エノン頭部とポリペプチド中のシステイン残基の-SHの反応により形成された、ポリペプチドコンジュゲートにも関する。エノンは、構造-C(O)-CH=CH-を含む反応性官能基の一種類である。この構造は、直鎖、分岐または環状の化学部分の一部であり得る。エノンは、一般的に低反応性で、溶液中のシステインの-SHとは反応しないという利点をもたらす。しかしながら、ポリペプチドのCysの結合距離内に配置される場合、エノンは、システイン残基の-SHと選択的に反応し得る。従って、共役エノンを使用して、高度に選択的な頭部および不可逆的インヒビターを提供し得る。
【０１０９】
一局面において、共役エノンを含む頭部は、式
【化３２】
2015062428.tif 000049
（式中、R1、R2およびR3は独立して、水素、C1〜C6アルキルまたは-NRxRyで置換されるC1〜C6アルキルであり；RxおよびRyは、独立して水素またはC1〜C6アルキルである）
を有する。
【０１１０】
共役エノンを含む例示的な頭部としては、I-a〜I-h
【化３３】
2015062428.tif 000050
が挙げられる。
【０１１１】
本発明は、本発明のアルゴリズムを使用して設計された不可逆的インヒビターなど、標的ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する、共役エノン頭部を含む不可逆的インヒビターに関する。いくつかの態様において、共役エノン頭部は式Iである。特定の態様において、共役エノン頭部は、I-a、I-b、I-c、I-d、I-e、I-fおよびI-gから選択される。
【０１１２】
本発明はまた、システイン残基を有する結合部位を含むポリペプチドと、標的ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する共役エノン頭部を含む不可逆的インヒビター、例えば本発明のアルゴリズムを使用して設計された不可逆的インヒビターを接触させることにより、標的ポリペプチドを不可逆的に阻害する方法に関する。
【０１１３】
本発明はまた、共役エノン含有頭部とCys残基の-SH基の反応により形成されるポリペプチドコンジュゲートに関する。かかるコンジュゲートは、種々の用途を有する。例えば、共役エノン頭部を含む不可逆的インヒビターにより治療された患者から得た生物学的試料において、コンジュゲートされていない標的ポリペプチドに対するコンジュゲートされた標的ポリペプチドの量は、投与（例えば、投与される量および/または投与の間隔）を調節するために使用され得る。一局面において、コンジュゲートは、式
X-M-S-CH2-R
を有し、式中：
Xは、システイン残基を含む標的ポリペプチドの結合部位に結合する化学部分であり、
Mは、共役エノン含有頭部基と前記システイン残基の硫黄原子の共有結合により形成された修飾(modifier)部分であり；
S-CH2は、前記システイン残基の側鎖硫黄-メチレンであり；
Rは、標的ポリペプチドの残部である。
【０１１４】
いくつかの態様において、共役エノン含有頭部は式Iであり、コンジュゲートは式II：
【化３４】
2015062428.tif 000051
であり、
式中、Xは、標的ポリペプチドのシステイン残基を含む結合部位に結合する化学部分であり、；
S-CH2は、前記システイン残基の側鎖であり；
Rは、標的ポリペプチドの残りであり；
R1、R2およびR3は、独立して、水素であるか、C1〜C6アルキルまたは-NRxRyで置換されるC1〜C6アルキルであり；RxおよびRyは、独立して水素またはC1〜C6アルキルである。
【０１１５】
特定の態様において、コンジュゲートは、II-a、II-b、II-c、II-d、II-e、II-f、II-gおよびII-h
【化３５】
2015062428.tif 000052
から選択される式を有し、XおよびRは、式IIにおいて規定されたとおりである。
【実施例】
【０１１６】
実施例
実施例1.  不可逆的イマチニブ
イマチニブは、cKIT、PDGFR、ABLおよびCSF1Rキナーゼの強力な不可逆的インヒビターである。本明細書に記載される設計アルゴリズムを使用して、この可逆的インヒビターを迅速かつ効果的に、cKit、PDGFRおよびCSF1Rキナーゼの不可逆的インヒビターに変換した。また、イマチニブおよび標的ABLについての以下の実施例の場合のように、主題の方法により、標的の可逆的インヒビターを該標的の不可逆的インヒビターに容易に変換することが可能でない場合が確認されることを示す。
【化３６】
2015062428.tif 000053
【０１１７】
A. cKIT
設計方法
イマチニブに結合するcKIT（pdbcode 1T46）のX線複合体の座標は、タンパク質データバンク（world wide web rcsb.org）から入手した。イマチニブの座標を抽出し、Discovery Studio（v2.0.1.7347; Acccelrys Inc., CA）を使用して、cKITに結合した際にイマチニブの20Å以内にある全てのタンパク質Cys残基を同定した。これにより7つの残基、Cys660、Cys673、Cys674、Cys788、Cys809、Cys884およびCys906を同定した。次いで15の置換可能位置をイマチニブ鋳型（式I-1）上、三次元で調査し、どの位置が頭部で置換されて、頭部がcKIT結合部位中のCys残基の1つ（Cys660、Cys673、Cys674、Cys788、Cys809、Cys884またはCys906）と共有結合を形成するかを決定した。
【０１１８】
設計方法1.1
この方法において、イマチニブ鋳型上に頭部を手動で構築し、次いで分子ダイナミクスを使用して、頭部がcKitの結合部位中のCysと結合を形成する可能性を評価した。Discovery Studioを使用して、イマチニブ鋳型上にアクリルアミド頭部を三次元で構築した。イマチニブ鋳型を式I-1に示す。得られた化合物の構造を調べて、頭部の位置を決定し、頭部が、同定された結合部位中のCys残基のいずれかに到達できるかどうか調べた。
【０１１９】
【化３７】
2015062428.tif 000054
頭部および側鎖位置の柔軟さをサンプリングするために、頭部および側鎖位置の分子ダイナミクスシミュレーションを実施して解析し、頭部が結合部位中のCys残基のいずれかの6Å以内に存在するか、および頭部と残基の間に立体衝突があるかを調べた。分子ダイナミクスシミュレーションについてDiscovery StudioのStandard Dynamics Cascade Simulationsプロトコールにおいて標準的な設定を使用した。Discovery Studioの4psシミュレーションのMMFF力場を使用した。分子ダイナミクスシミュレーションの間、非頭部位置およびCys主鎖原子の座標を維持して固定した。
【０１２０】
このシミュレーションにより、cKITのCys788に近位の3つの鋳型位置およびCys809に近位の2つの鋳型位置を同定した（表5）。
【０１２１】
【表５】
2015062428.tif 000055
【０１２２】
次いで、標準的な分子ダイナミクスシミュレーションを使用して、これら5つの鋳型位置を、2Å未満の結合の形成に関与する候補インヒビターとCys残基（Cys788またはCys809）の間でアクリルアミド反応生成物が形成され得ることを必要とする最終フィルターに供した。この制約で3つの位置R1、R2およびR4と1つのCys残基Cys788だけが残った。これらの鋳型位置のうち、位置R2およびR4に頭部を含む結合は、あまり好ましくない頭部のアミド基のシス立体構造を含んだ。位置R1に頭部を含む結合は、好ましい頭部のアミド基のトランス立体構造を含んだ。
【０１２３】
設計方法1.2
この方法において、イマチニブ鋳型上で頭部を自動モデル化して、次いで、cKitの結合部位中のCysとの、頭部の結合形成能力を評価するために分子ドッキングを使用した。
【０１２４】
Accelryes SciTegic Pipeline列挙プロトコルを用いてイマチニブ鋳型上に頭部を構築し、15の見込みのある仮想化合物から13の仮想化合物を生じた。これは、R2とR4ならびにR3とR5（式I-1）が対称性のために同等であることによるので、R2とR3のみをさらに評価した。次いでこれらの化合物を、Discovery Studioのリガンド調製プロトコルを使用して3Dに変換した。次いで、これらの3D仮想化合物を、Discovery StudioのCDOCKERプロトコルを使用してcKit X線構造にドッキングした。X線構造において規定されるイマチニブのコア（式I-1）をドッキング手順の制約として使用した、強制ドッキングアルゴリズムを使用した。それぞれの仮想化合物の10個の立体構造を作製し、各化合物の上部立体構造を、cKitの結合部位中のCysに対する距離により、その近位性について評価した。距離フィルター（＜6Å）を適用した後、R1およびR2に頭部を有する2つの化合物のみが、結合部位中でCysに近位であると見出された。これらの2つの化合物は、両方Cys788に近位であり、その後、結合形成能についてこれらを評価した。タンパク質および化合物を維持して固定したが、Cys788の側鎖および頭部は拘束しなかった。最小化の完了後、新たに形成された共有結合および強力なエネルギーを調べた。R1位置に頭部を有する仮想化合物を、最も好ましいものとしてランク付けした。
【０１２５】
以下に詳細に示されるように、R1位置にアクリルアミドを有する化合物、化合物1および化合物2が合成され、cKitの阻害を示した。
【０１２６】
化合物の合成
【化３８】
2015062428.tif 000056
【０１２７】
中間体Aの合成
工程1:  3-ジメチルアミノ-1-ピリジン-3-イル-プロペノン：3-アセチルピリジン（2.5g、20.64mmol）およびN,N-ジメチル-ホルムアミドジメチルアセタール（3.20ml、24mmol）を、エタノール（10mL）中で一晩還流した。反応混合物を室温に冷却して、減圧下で蒸発させた。ジエチルエーテル（20mL）を残渣に添加して、混合物を0℃に冷却した。混合物をろ過して、黄色結晶の3-ジメチルアミノ-1-ピリジン-3-イル-プロペノン（1.9g、10.78mmol）を得た（収率：52%）。さらに精製することなく、この物質を次の工程に使用した。
【０１２８】
工程2:  N-(2-メチル-5-ニトロ-フェニル)-グアニジニウムニトレート：2-メチル-5-ニトロアニリン（10g、65mmol）をエタノール（25mL）に溶解し、濃HNO3（4.6mL）を溶液に滴下して、次いでシアナミドの50%水溶液（99mmol）を添加した。反応混合物を一晩還流して、0℃に冷却した。混合物をろ過して、残渣を酢酸エチルおよびジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させてN-(2-メチル-5-ニトロ-フェニル)-グアニジニウムニトレートを得た（4.25g、収率：34%）。
【０１２９】
工程3:  2-メチル-5-ニトロフェニル-(4-ピリジン-3-イル-ピリミジン-2-イル)-アミン：3-ジメチルアミノ-1-ピリジン-3-イル-プロペノン（1.70g、9.6mmol）およびN-(2-メチル-5-ニトロ-フェニル)-グアニジニウムニトレート（2.47g、9.6mmol）の懸濁液に、2-プロパノール（20mL）中でNaOH（430mg、10.75mmol）を添加し、得られた混合物を24時間還流した。反応混合物を0℃に冷却し、得られた沈殿をろ過した。固体残渣を水に懸濁し、ろ過して、2-プロパノールおよびジエチルエーテルで洗浄して乾燥させた。0.87g（2.83mmol）の2-メチル-5-ニトロフェニル-(4-ピリジン-3-イル-ピリミジン-2-イル)-アミンを単離した（収率：30%）。
【０１３０】
工程4:  4-メチル-N-3-(4-ピリジン-3-イル-ピリミジン-2-イル)-ベンゼン-1,3-ジアミン（中間体A）：SnCl2.2 H2O（2.14g、9.48mmol）の溶液を、濃塩酸（8mL）中、2-メチル-5-ニトロ-フェニル-(4-ピリジン-3-イル-ピリミジン-2-イル)-アミン（0.61g、1.98mmol）に激しく攪拌しながら添加した。攪拌の30分後混合物を砕いた氷に注ぎ、K2CO3でアルカリ化し、酢酸エチル（50ml）で3回抽出した。有機相を合わせて、MgSO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。ジクロロメタンから再結晶化し、オフホワイト固体の252.6mg（0.91mmol）の4-メチル-N-3-(4-ピリジン-3-イル-ピリミジン-2-イル)-ベンゼン-1,3-ジアミンを得た（収率：46%）。
【０１３１】
化合物1の合成
【化３９】
2015062428.tif 000057
工程1:  4-アミノ安息香酸（1.40g、10mmol）の4-(アクリルアミド)安息香酸A溶液を、DMF（10mL）およびピリジン（0.5ml）中で0℃に冷却した。この溶液に塩化アクリロイル（0.94g、10mmol）を添加し、得られた混合物を3時間攪拌した。混合物を200mlの水に注ぎ、得られた白色固体をろ過して水およびエーテルで洗浄した。高真空下で乾燥させ、1.8gの所望の生成物を得、これを精製することなく次の工程に使用した。
【０１３２】
工程2:  4-(アクリルアミド)安息香酸（82mg、0.43mmol）および中間体A（100mg、0.36mmol）を窒素下で、ピリジン（4ml）に溶解し、攪拌した。この溶液に、1-プロパン環状無水ホスホン酸（0.28g、0.43mmol）を添加し、得られた溶液を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させて小容量にし、50mlの冷水に注いだ。形成された固体をろ過して、黄色粉体を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（95:5 CHCl3:MeOH）で精製し、白色粉体の30mgの4-アクリルアミド-N-(4-メチル-3-(4-(ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル)ベンズアミド（化合物1）を得た。MS (M + H+): 251.2; 1H NMR (DMSO-D6, 300 MHz) δ(ppm): 10.42 (s, 1H), 10.11 (s, 1H), 9.26 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 8.99 (s, 1H), 8.68 (dd, 1H, J = 3.0 and 1.7 Hz), 8.51 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.48 (m, 1H), 8.07 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 7.95 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.79 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.45 (m, 3H), 7.19 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 6.47 (dd, 1H, J = 16.7 and 9.6 Hz), 6.30 (dd, H, J = 16.7 and 1.9 Hz), 5.81 (dd, 1H, J = 9.9 and 2.2 Hz), 2.22 (s, 3H).
【０１３３】
化合物2の合成
4-アクリルアミド-N-(4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル-3-(トリフルオロメチル)ベンズアミド
【化４０】
2015062428.tif 000058
【０１３４】
1)  メチル4-アクリルアミド-3-ニトロベンゾエート
【化４１】
2015062428.tif 000059
ヨウ化メチル（1.4g、9.86mmol）を、30mL DMF中4-ニトロ-3-(トリフルオロメチル)安息香酸（1.0g、4.25mmol）および炭酸カリウム（1.5g、10.85mmol）の攪拌溶液に、室温で滴下した。混合物を室温で一晩攪拌した。ジエチルエーテル（120mL）を添加して、混合物を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して1.0gの粗製メチル4-ニトロ-3-(トリフルオロメチル)ベンゾエートを得た。30mLメタノール中0.87g（3.49mmol）のメチル4-ニトロ-3-(トリフルオロメチル)ベンゾエートおよび0.2g 10% Pd/Cの溶液を、水素（40psi）下、室温で一晩攪拌した。混合物をろ過して減圧下で濃縮し、白色固体の0.8gの粗製メチル4-アミノ-3-(トリフルオロメチル)ベンゾエートを得た。40mLのジクロロメタン中塩化アクリロイル（0.35mL、3.65mmol）を0.8 gのメチル4-アミノ-3-(トリフルオロメチル)ベンゾエートおよびトリエチルアミン（0.9g、8.9mmol）の溶液に、0℃で添加した。室温で3時間攪拌後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液および飽和NaCl水溶液で連続して洗浄した。ジクロロメタン溶液をNa2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮して、粗生成物を得、これを、1% CH3OH-CH2Cl2を使用したシリカゲル上のクロマトグラフィーでさらに精製し、0.818mgの白色固体の表題化合物を得た。
【０１３５】
2)  4-アクリルアミド-3-ニトロ安息香酸
【化４２】
2015062428.tif 000060
20mL THF中メチル4-アクリルアミド-3-ニトロベンゾエート（0.8g、2.93mmol）の攪拌溶液に、20mLの1N LiOH溶液を添加した。得られた溶液を、10%水性HClでpH1に酸化して、1回40mLの酢酸エチルで3回抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を飽和水性NaClで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過して真空下で乾燥まで濃縮させ、0.75gの白色固体の表題の化合物を得た。
【０１３６】
3)  4-アクリルアミド-N-(4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル-3-(トリフルオロメチル)ベンズアミド
【化４３】
2015062428.tif 000061
10mLピリジン中N-(4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニルアミン（87mg、0.31mmol）および4-アクリルアミド-3-(トリフルオロメチル)安息香酸（95mg、0.37mmol）の攪拌溶液に、250mg（0.39mmol）無水プロピルホスホン酸を添加した。得られた溶液を室温で72時間攪拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣を50mLの水で攪拌し、黄色固体を得てこれを濾過して単離した。5% CH3OH-CH2Cl2を使用してシリカゲルクロマトグラフィーで粗生成物を精製し、101mgの表題の化合物を得た。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ(ppm): 10.41 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.28 (d, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.69 (d, 1H), 8.68 (dd, 1H), 8.49 (m, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.24 (d, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.79, (m, 3 H), 7.23 (d, 1H), 6.59 (dd, 1H), 6.28 (dd, 1H), 5.81 (dd, 1H), 2.24 (s, 3H).
【０１３７】
cKIT阻害アッセイ
ヒト組換えc-KIT（Milliporeから入手、カタログ番号14-559）を使用し、フルオレセイン標識ペプチド基質（1.5μM）のリン酸化をモニタリングして、c-KITのインヒビターとして化合物をアッセイした。反応は、100mM HEPES（pH7.5）、10mM MnCl2、1mM DDT、0.015%Brij-35、および300μMのATP中、試験化合物とともに、またはなしで行なった。反応は、ATPを添加し、室温で1時間インキュベートすることにより開始した。100mM HEPES（pH7.5）、30mM EDTA、0.015%Brij-35、および5%DMSOを含有する停止バッファーの添加によって反応を終了させた。電気泳動移動シフトを利用し、電荷によってリン酸化基質と非リン酸化基質を分離した。形成された生成物を対照ウェルと比較し、酵素活性の阻害または増強を測定した。化合物1および化合物2のc-KIT阻害データを表6に示す。
【表６】
2015062428.tif 000062
【０１３８】
B. PDGFR
設計方法
上記のイマチニブ（pdbcode 1T46）に結合させたcKITのx線複合体の座標を使用し、PDGFR-αキナーゼ（Uniprotコード：P16234）の相同性モデルを作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、表示したcKIT-PDGFRα整列を用いて構築した。次いで、イマチニブテンプレート上の15の置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で、該頭部が結合部位内のCysと共有結合を形成し得るように置換され得るかを決定した。該方法論により、3つのテンプレート位置R1、R2およびR4、ならびにアクリルアミド頭部と共有結合を形成し得るCys814が確認された。これらのテンプレート位置のうち、位置R2およびR4で頭部に関与した結合は、あまり好ましくない頭部のアミド基のシス配置に関与した。R1で頭部に関与した結合は、より好ましい頭部のアミド基のトランス配置に関与した。
【化４４】
2015062428.tif 000063
【０１３９】
PDGFR阻害アッセイ
方法A：
化合物をPDGFRのインヒビターとして、Z’-LYTETM生化学的アッセイ手順または同様の生化学的アッセイを用いて、Invitrogen Corp（Invitrogen Corporation、1600 Faraday Avenue、Carlsbad、California、CA；ワールドワイドウェブinvitrogen.com/downloads/Z-LYTE_Brochure_1205.pdf）に記載の方法と実質的に同様の様式でアッセイした。Z’-LYTETM生化学的アッセイは、蛍光系カップリング酵素形式が使用され、リン酸化ペプチドおよび非リン酸化ペプチドのタンパク質分解性切断に対する感受性の違いに基づく。
【０１４０】
化合物1を0.1μMおよび1μMで二重で試験した。化合物1は、1μMで76%および0.1μMで29%のPDGFR-αの平均阻害を示した。
【０１４１】
方法B
簡単には、10XストックのPDGFRα（PV3811）酵素、1.13X ATP（AS001A）およびY12-Soxペプチド基質（KCZ1001）を、20mM Tris、pH7.5、5mM MgCl2、1mM EGTA、5mM β-グリセロホスフェート、5%グリセロール（10Xストック、KB002A）および0.2mM DTT（DS001A）からなる1Xキナーゼ反応バッファー中で調製した。5μLの酵素を、Corning（#3574）384ウェル白色非結合表面マイクロタイタープレート（Corning、NY）内で27℃で30分間、0.5μL容量の50%DMSOおよび50%DMSO中で調製した連続希釈化合物とともにプレインキュベートした。45μLのATP/Y9またはY12-Soxペプチド基質混合物の添加によってキナーゼ反応を開始し、30〜9秒毎に60分間、λex360/λem485で、BioTek（Winooski、VT）製のSynergy4プレートリーダーでモニタリングした。各アッセイの最後に、各ウェルの進行曲線を線形反応速度論について調べ、統計にフィットさせた（R2、95%信頼区間、絶対二乗和）。時間（分）に対する相対蛍光単位のプロットの傾きから各反応の初期速度（0分〜20+分）を求め、次いで、インヒビター濃度に対してプロットし、GraphPad Software（San Diego、CA）製のGraphPad Prismのlog[Inhibitor] vs Response、Variable SlopeモデルからIC50を推定した。[PDGFRα] = 2〜5nM、[ATP] = 60μMおよび[Y9-Soxペプチド] = 10μM（ATP KMapp = 61μM）
【０１４２】
化合物1および化合物2のPDGFR阻害データを表7に示す。
【表７】
2015062428.tif 000064
【０１４３】
化合物1のPDGFR質量スペクトル解析
化合物1の存在下でPDGFR-αの質量スペクトル解析を行なった。PDGFR-αタンパク質（Invitrogenから供給：PV3811）を、1μM、10μM、および100μMの化合物1とともに60分間インキュベートした。具体的には、1μLの0.4μg/μL PDGFR-α（Invitrogen PV3811）ストック溶液（50mM Tris HCl ph 7.5、150mM NaCl、0.5mM EDTA、0.02%Triton X-100、2mM DTT、50%グリセロール）を、10%DMSO中9μLの化合物1（1μM、10μM、および100μMの終濃度）に添加した。60分後、9μLの50mM 重炭酸アンモニウム、3.3μLの50mM 重炭酸アンモニウム中6mM ヨードアセトアミド、および1μLの35ng/μL トリプシンを添加して反応を停止させた。
【０１４４】
トリプシン消化物を質量分析計（MALDI-TOF）によって10μMで解析した。PDGFR-αタンパク質に見られる5つのシステイン残基のうち、4つのシステイン残基は、ヨードアセトアミドによって修飾されているが、第5システイン残基は化合物1によって修飾されていると確認された。トリプシン消化物の質量スペクトル解析は、PDGFR-αタンパク質にCys814で共有結合している化合物1と一致した。トリプシン消化物のMS/MS解析により、Cys814に化合物1の存在が確認された。
【０１４５】
EOL-1細胞増殖アッセイ
DSMZから購入したEOL-1細胞（ACC 386）を、RPMI（Invitrogen #21870）+ 10%FBS +1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen # 15140-122）中に維持した。細胞増殖アッセイのため、完全培地中の細胞を96ウェルプレート内に、2 x 104細胞/ウェルの密度で平板培養し、500nM〜10pMの範囲の化合物とともに72時間、二重でインキュベートした。細胞増殖は、Alamar Blue試薬（Invitrogenカタログ番号DAL1100）を用いて代謝活性を測定することによりアッセイした。37℃でのAlamar Blueとの8時間のインキュベーション後、590nmで吸光度を読み取り、細胞増殖のIC50をGraphPadを用いて計算した。参照化合物および化合物2でのEOL-1細胞の細胞増殖の用量応答阻害を図5に示す。
【０１４６】
EOL-1細胞洗い流しアッセイ
EOL-1細胞を完全培地中で懸濁培養し、化合物を、試料あたり2 x 106細胞に対して1時間添加した。1時間後、細胞をペレット化し、培地を除去し、化合物なしの培地と交換した。細胞を2時間毎に洗浄し、化合物なしの新鮮培地中に再懸濁した。細胞を特定の時点で収集し、細胞抽出バッファー中で溶解させ、15μgの全タンパク質溶解物を各レーンに負荷した。PDGFRリン酸化を、Santa Cruz抗体sc-12910を用いたウエスタンブロットによってアッセイした。この実験の結果を図6に示し、図において、DMSO対照および可逆的参照化合物と比べて、化合物2は、「洗い流し」の0時間後および4時間後で、EOL-1細胞においてPDGFRの酵素阻害を維持していたことが示される。
【０１４７】
C. CSF1R
設計方法
上記のイマチニブ（pdbcode 1T46）に結合させたcKITのx線複合体の座標を使用し、CSF1Rキナーゼ（Uniprotコード：P07333）の相同性モデルを作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、表示したcKIT-CSF1R整列を用いて構築した。次いで、イマチニブテンプレート上の15の置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で、該頭部が結合部位内のCysと共有結合を形成し得るように置換され得るかを決定した。該方法論により、2つのテンプレート位置（R1およびR2）ならびにアクリルアミド頭部と共有結合を形成し得るCys774が確認された。
【化４５】
2015062428.tif 000065
【０１４８】
CSF1R阻害アッセイ
化合物をPDGFRのインヒビターとして、Z’-LYTETM生化学的アッセイ手順または同様の生化学的アッセイを用いて、Invitrogen Corp（Invitrogen Corporation、1600 Faraday Avenue、Carlsbad、California、CA）に記載の方法と実質的に同様の様式でアッセイした。2X CSF1R（FMS）/Tyr 01ペプチド混合物を、50mM HEPES pH7.5、0.01%BRIJ-35、10mM MgCl2、1mM EGTA中で調製した。最終の10μL キナーゼ反応液は、50mM HEPES pH7.5、0.01%BRIJ-35、10mM MgCl2、1mM EGTA中0.2〜67.3ngのCSF1R（FMS）および2μMのTyr 01ペプチドからなるものであった。1時間のキナーゼ反応インキュベーション後、5μLの展開試薬Bの1：128希釈物を添加した。
【０１４９】
化合物1は、10μMでCSF1Rに対して72%阻害を示し、化合物2は、10μMでCSF1Rに対して89%阻害を示した。
【０１５０】
質量スペクトル解析データ
質量スペクトル解析を使用し、化合物2がCSF1Rの共有結合修飾体であるかどうかを調べた。トリプシン消化の前に、CSF1R（0.09μg/μl）を化合物2（Mw 518.17）とともに3時間、10倍過剰でインキュベートした。化合物のインキュベーション後、ヨードアセトアミドをアルキル化剤として使用した。マトリックスとしてαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中5mg/ml）を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC18 Zip Tippingの前に、トリプシン消化物は、2μlの等分量（0.09μg/μl）を10μlの0.1%TFAで希釈した。
【０１５１】
トリプシン消化物について、機器をリフレクトロンモードに設定し、パルス抽出を1800に設定した。較正は、Laser Biolabs Pep Mix標準（1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20）を用いて行なった。CID/PSD解析のため、カーソルを用いてイオンゲートタイミングを設定するペプチドを選択し、断片化は約20%高いレーザー出力で行ない、HeをCID用衝突ガスとして使用した。断片の較正は、カーブドフィールドリフレクトロンのためのP14R断片化較正を用いて行なった。CSF1Rのトリプシン消化物のデータベース検索により、これが正しいことが確認された。また、化合物2修飾（518.17）の組込みにより、標的ペプチドが、存在する唯一の修飾ペプチドであると予測したNCIHR（MH+ 642.31+518.17=1160.48）であることが確認された。このペプチドシグナル（1160.50）のPSD解析により、このペプチドの配列を確認するデータベースMS/MSイオン検索を可能にするのに充分な断片が得られた。
【０１５２】
D.ABL
設計方法
上記のイマチニブ（pdbcode 1T46）に結合させたcKITのx線複合体の座標を使用し、ABLキナーゼ（Uniprotコード：P00519）相同性モデルを作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、表示したcKIT-ABL整列を用いて構築した。次いで、イマチニブテンプレート上の15の置換可能な位置を3次元で調べ、結合部位内のCysと共有結合を形成するアクリルアミド頭部の位置を調べた。該方法論により、テンプレート位置または修飾され得る適当なCysは確認されなかった。
【化４６】
2015062428.tif 000066
【０１５３】
実施例2.不可逆的ニロチニブ
ニロチニブは、ABL、cKIT、PDGFRおよびCSF1Rキナーゼの強力な可逆的インヒビターである。本明細書に記載の構造に基づく設計アルゴリズムを使用し、ニロチニブを、cKITおよびPDGFRを阻害することが示された不可逆的インヒビターに迅速に効率的に変換した。
【化４７】
2015062428.tif 000067
【化４８】
2015062428.tif 000068
【０１５４】
A. ABL
ABLに結合させたニロチニブ（pdbcode 3CS9）のx線複合体の座標を、タンパク質データバンク（ワールドワイドウェブrcsb.org）から入手した。ニロチニブ(nilotinb)の座標を抽出し、ABLと結合している場合のニロチニブの20オングストローム以内のタンパク質の全Cys残基を確認した。次いで、ニロチニブテンプレート（II-1）上の14の置換可能な位置を3次元で調べ、どれがクロロアセトアミド頭部で置換され、結合部位内のCysと共有結合を形成し得るかを決定した。該方法論により、テンプレート位置または修飾され得る適当なCysは確認されなかった。
【０１５５】
B.  PDGFRa
PDGFRαキナーゼ（Uniprotコード：P16234）の相同性モデルを、テンプレートとしてABLに結合させたニロチニブ（pdbcode 3CS9）のx線構造を用いて作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、表示したABL-PDGFRa整列を用いて構築した。次いで、ニロチニブテンプレート（II-1）上の14の置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で置換され、結合部位内のCysと共有結合を形成し得るかを決定した。該方法論により、1つのテンプレート位置（R11）およびクロロアセトアミド頭部と共有結合を形成し得る1つのCys（Cys814）が確認された。R11にクロロアセトアミドを含む化合物3を合成した。
【化４９】
2015062428.tif 000069
【０１５６】
C.  CSF1R
CSF1Rキナーゼ（Uniprotコード：P07333）の相同性モデルを、テンプレートとしてABLに結合させたニロチニブ（pdbcode 3CS9）のx線構造を用いて作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、表示したABL-CSF1R整列を用いて構築した。次いで、ニロチニブテンプレート（II-1）上の14の置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で置換され、結合部位内のCysと共有結合を形成し得るかを決定した。該方法論により、1つのテンプレート位置（R11）およびクロロアセトアミド頭部と結合を形成し得る1つのCys（Cys774）が確認された。
【化５０】
2015062428.tif 000070
【０１５７】
D.  cKIT
cKITキナーゼ（Uniprotコード：P10721）の相同性モデルを、テンプレートとしてABLに結合させたニロチニブ（pdbcode 3CS9）のx線構造を用いて作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、表示したABL-cKIT整列を用いて構築した。次いで、ニロチニブテンプレート（II-1）上の14の置換可能な位置を3次元で調べ、どれがクロロアセトアミド頭部で置換され、結合部位内のCysと共有結合を形成し得るかを決定した。この制限により、1つのテンプレート位置（R11）および1つのCys（Cys788）が得られた。
【化５１】
2015062428.tif 000071
【０１５８】
化合物3の合成
【化５２】
2015062428.tif 000072
スキーム3-A
【化５３】
2015062428.tif 000073
a) NH2CN, EtOH/HCl, 90℃, 15時間, b) DMF-DMA, エタノール, 還流, 16時間, c) NaOH/EtOH, 還流, 16時間
【０１５９】
工程-1：エタノール（12.5mL）中アニリンエステル（5g、30.27mmol）の攪拌溶液に、濃HNO3（3mL）を添加した後、シアナミドの50%水溶液（1.9g、46.0mmol）を室温で添加した。反応混合物を90℃で16時間加熱し、次いで0℃に冷却した。固体が沈殿し、これを濾過し、酢酸エチル（10mL）、ジエチルエーテル（10mL）で洗浄し、乾燥し、対応するグアニジン（4.8g、76.5%）を薄いピンク色固体として得、これをさらに精製せずに使用した。
【０１６０】
工程-2：エタノール（40mL）中3-アセチルピリジン（10.0g、82.56mmol）およびN,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（12.8g、96.00mmol）攪拌溶液を16時間還流した。次いで、これを室温に冷却し、減圧濃縮し、粗製塊を得た。残基をエーテル（10mL）中に入れ、0℃に冷却し、濾過し、対応するエナミド（7.4g、50.8%）を黄色の結晶性固体として得た。
【０１６１】
工程-3：エタノール（27mL）中グアニジン誘導体（2g、9.6mmol）、エナミド誘導体（1.88g、10.7mmol）およびNaOH（0.44g、11.0mmol）の攪拌混合物を90℃で48時間還流した。次いで、反応混合物を冷却し、減圧濃縮し、残渣を得た。残渣を酢酸エチル（20mL）中に入れ、水（5mL）で洗浄した。有機層と水層を分離し、別々に処理してそれぞれ、対応するエステルおよび中間体Cを得た。水層を冷却し、1.5N HCl（pH約3〜4）で酸性化すると、このとき白色固体が沈殿した。沈殿物を濾過し、乾燥し、トルエン（2x10mL）での共沸蒸留によって過剰の水を除去し、中間体C（0.5 g）を黄白色固体として得た。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.32（s，3H），7.36（d，J = 10.44 Hz，1H），7.53（d，J = 6.84 Hz，1H），760-7.72（m，2H），8.26（s，1H），8.57（d，J = 6.84 Hz，1H），8.64（d，J = 10.28 Hz，1H），8.70-8.78（bs、1H），9.15（s，1H），9.35（s，1H）．有機抽出物をブライン（3mL）で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、減圧濃縮し、エステルの中間体Cを粗製固体として得た。これを、カラムクロマトグラフィー（SiO2、60〜120メッシュ、MeOH/CHCl3：10/90）によってさらに精製し、エステルの中間体C（0.54 g）を黄色固体として得た。
【０１６２】
スキーム3-B
【化５４】
2015062428.tif 000074
【０１６３】
工程-1：THF（0.3mL）中ニトロアニリン（0.15g、0.7mmol）の攪拌溶液に、Et3N（0.11mL、0.73mmol）およびDMAP（0.05g、0.44mmol）を添加した。これに、BOC無水物（0.33mL、1.52mmol）を添加し、反応液を5時間還流した。次いで、反応混合物を冷却し、THF（15mL）で希釈し、ブライン（5mL）で洗浄した。有機相を分離し、Na2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、粗製塊を得た。カラムクロマトグラフィー（SiO2、230〜400メッシュ、ヘキサン/EtOAc：8/2）によって粗生成物をさらに精製し、対応するジ-Boc保護アニリン（0.25g、88%）を白色結晶性固体として得、これを、さらに精製せずに次の工程に使用した。
【０１６４】
工程-2：MeOH（5mL）中Boc保護アニリン（0.25g、0.62mmol）の溶液を、10%Pd/C（0.14g、0.13mmol）上で、20℃で12時間水素化した（H2、3 Kg）。反応混合物を短いセライト（登録商標）パッドに通し、減圧濃縮し、対応するアニリンをオフホワイト色固体（0.18g、77.6%）として得た。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ（ppm）：1.36（s，18 H），6.84-6.87（m，1H），6.95-6.97（m，2H）.
【０１６５】
スキーム3-C
【化５５】
2015062428.tif 000075
a) HATU, DIEA, CH3CN, 85℃, 16時間, b) TFA/CH2Cl2, 0℃〜室温, 3時間
【０１６６】
工程1：アセトニトリル中HATU、DIEAの存在下での中間体Cとジboc保護アニリンとのカップリングにより対応するアミドが得られ得る。
【０１６７】
工程2：中間体Dを得るためのBoc基の脱保護は、塩化メチレン中0℃でアミドをTFAで処理し、次いで、室温まで加温することによりなされ得る。
【０１６８】
THF（10mL）中、中間体D（0.1g、0.22mmol）の0℃の攪拌溶液に、N2下でEt3N（0.033g、0.32mmol）を添加した。塩化クロロアセチル（0.029g、0.26mmol）を攪拌しながら滴下し、反応混合物を室温にし、12時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮して残渣を得、これをEtOAc（10mL）中に入れた。この溶液を水（2mL）で洗浄し、水層を再度EtOAc（2x10mL）で抽出した。EtOAc画分を合わせ、ブライン（2mL）で洗浄した。Na2SO4上での乾燥および濾過後、EtOAc溶液を減圧濃縮して粗製残渣を得、次いで、これを、カラムクロマトグラフィー（SiO2、60〜120メッシュ、CHCl3/MeOH：9/1）によって精製し、III-14（50mg、43%）を黄白色固体として得た。1H NMR（DMSO-d6）δppm：2.34（s，3H），4.30（s，2H），7.42-7.48（m，4H），7.73-7.75（m，1H），8.05-8.10（m，1H），8.24（d，J = 2.2 Hz，1H），8.29（s，1H），8.43（d，J = 8.04 Hz，1H），8.54（d，J = 5.16 Hz，1H），8.67（dd，J = 1.6 & 4.76 Hz，1H），9.16（s，1H），9.26（d，J = 2.2 Hz，1H），9.89（s，1H），10.50（s，1H）；LCMS：m/e 541.2（M+1）
【０１６９】
標的阻害
cKITまたはPDGFRを阻害する化合物3の能力を、実施例1に記載のcKIT阻害アッセイまたはPDGFR阻害アッセイを用いて評価した。データにより、化合物3はcKIT（IC50 = 0.7nM）およびPDGFR（IC50 = 9nM）の強力なインヒビターであることが示された（表8）。
【表８】
2015062428.tif 000076
【０１７０】
PDGFR質量スペクトル解析
化合物3の存在下でPDGFR-αの質量スペクトル解析を行なった。トリプシン消化の前に、PDGFR-α（43pmol）を化合物3（434pmol）とともに3時間、10倍過剰でインキュベートした。化合物のインキュベーション後、ヨードアセトアミドをアルキル化剤として使用した。マトリックスとしてαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中5mg/ml）を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC18 Zip Tippingの前に、トリプシン消化物は、5μlの等分量（7pmol）を10μlの0.1%TFAで希釈した。
【０１７１】
トリプシン消化物を質量分析計（MALDI-TOF）によって解析した。トリプシン消化物の質量スペクトル解析は、PDGFR-αタンパク質にCys814で共有結合している化合物3と一致した（図7）。トリプシン消化物のMS/MS解析により、Cys814に化合物3の存在が確認された。
【０１７２】
c-KIT質量スペクトル解析
化合物3の存在下でc-KITの質量スペクトル解析を行なった。具体的には、
トリプシン消化の前に、c-KITキナーゼ（86pmol）を化合物3（863pmol）とともに3時間、10倍過剰でインキュベートした。化合物のインキュベーション後、ヨードアセトアミドをアルキル化剤として使用した。マトリックスとしてαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中5mg/ml）を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC18 Zip Tippingの前に、トリプシン消化物は、5μlの等分量（14pmol）を10 ulの0.1%TFAで希釈した。
【０１７３】
トリプシン消化物を質量分析計（MALDI-TOF）によって解析した。トリプシン消化物の質量スペクトル解析は、c-KITタンパク質に2つの標的システイン残基Cys788（主）および：Cys808（副）で共有結合している化合物3と一致した。
【０１７４】
cKIT洗い流しアッセイ
GIST430細胞（Bauer et al.、Cancer Research、66（18）：9153-9161（2006）参照）を6ウェルプレート内に8 x 105細胞/ウェルの密度で播種し、翌日、完全培地中に希釈した1μMの化合物3で90分間処理した。90分後、培地を除去し、細胞を化合物なしの培地で洗浄した。細胞を2時間毎に洗浄し、化合物なしの新鮮培地中に再懸濁した。細胞を特定の時間点で収集し、Roche完全プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche 11697498001）およびホスファターゼインヒビター（Roche 04 906 837 001）を加えた細胞抽出バッファー（Invitrogen FNN0011）中で溶解させ、10μgの全タンパク質溶解物を各レーンに負荷した。c-KITリン酸化を、pTyr（4G10）抗体およびCell Signaling Technologyの全キット抗体を用いたウエスタンブロットによってアッセイした。結果を表9に示す。表は、化合物3が、「洗い流し」の0時間後および6時間後で、GIST430細胞においてc-KIT酵素阻害を維持していることを示す。
【表９−１】
2015062428.tif 000077
【表９−２】
2015062428.tif 000078
【０１７５】
実施例3.不可逆的VX-680 
VX-680は、FLT3キナーゼの強力な可逆的インヒビターである。本明細書に記載の構造に基づく設計アルゴリズムを使用し、VX-680を、FLT-3の不可逆的インヒビターに迅速に効率的に変換した。
【化５６】
2015062428.tif 000079
【０１７６】
VX-680を有するオーロラキナーゼ複合体の結晶構造が測定されているため、
VX-680と関連オーロラキナーゼとの結合様式からの推測によって、Flt3とのVX-680の結合様式を調べた。オーロラキナーゼ（pdbcode 2F4J）のx線構造を使用し、Accelrys Discovery Studio（Discovery Studio v2.0.1.7347、Accelrys Inc）のタンパク質モデル設計成分を用いてFLT3の相同性モデルを構築した。
モデルの構築に使用した整列は、FLT3とオーロラキナーゼのx線複合体の構造整列を基にした。これらの2つのタンパク質間の高い構造類似性、および結合部位の位置の高い類似性により、該相同性モデル設計ストラテジーがさらに支持された。
【０１７７】
256の構造的に同等の位置を有し、RMSDが3Åである、FLT3（1RJB）とオーロラキナーゼ/VX-680複合体（2FB4）間の構造整列。
【化５７】
2015062428.tif 000080
【０１７８】
VX680を有するFlt3の相同性モデルにより、Flt3内に、結合VX680の20オングストローム以内に6つのCys残基が確認された（Cys694、Cys695、Cys681、Cys828、Cys807、およびCys790）。次いで、VX-680テンプレート（式III-1）上の7つの置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で置換され、FLT3結合部位内の確認されたCys残基のうちの1つと共有結合し得るかを決定した。頭部は、Discovery Studioを用いてVX-680テンプレートを基に3次元で構築し、得られた化合物の構造を確認し、頭部が結合部位内のCysに達し得るかどうかを調べた。
【化５８】
2015062428.tif 000081
【０１７９】
頭部および側鎖位置の柔軟性のサンプリングのため、頭部および側鎖位置の標準的な分子力学シミュレーションを行ない、頭部が結合部位内の確認されたCys残基のいずれかの6オングストローム以内であるかどうかを調べて確認した。分子力学シミュレーションのためのAccelrys Discovery Studio v2.0.1.7347（Accelrys Inc）プロトコルのStandard Dynamics Cascade Simulationsプロトコルにおいて、標準的な設定を使用した。分子力学シミュレーション中、頭部でない位置およびCys主鎖原子の座標は固定したままにした。
【０１８０】
これにより3つのテンプレート位置（R4、R6およびR7）が確認され、これらはCys828付近であった（表10）。これらのテンプレート位置を、標準的な分子力学シミュレーションの使用での2オングストローム未満の結合の形成に関与する、候補インヒビターとCys828との間でアクリルアミド反応生成物が形成され得ることを要件とする最終フィルタリングに供した。3つのすべての位置は、この制限を良好に満足した。アクリルアミドをR7位に含む化合物4を合成した。
【表１０】
2015062428.tif 000082
【０１８１】
化合物4の合成
【化５９】
2015062428.tif 000083
工程1.  4,6-ジクロロ-2-メチルスルホニルピリミジン
【化６０】
2015062428.tif 000084
4,6-ジクロロ-2-（メチルチオ）ピリジン（24g、0.123mol）を、攪拌および氷浴下で500mlのCH2Cl2に溶解した。メタ-クロロペルオキシ安息香酸（約0.29mol）を40分間でゆっくり添加した。反応混合物を4時間攪拌し、CH2Cl2で希釈し、次いで50%Na2S2O3/NaHCO3溶液で処理した。有機相を飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。真空下での溶媒の除去により、約24gの標題化合物を薄紫色に着色した固体として得た。
【０１８２】
工程2.  N-（4-メルカプトフェニル）カルバミン酸tert-ブチル
【化６１】
2015062428.tif 000085
4-アミノチオフェノール（25g、0.2mol）を250mlのEtOAcに溶解した。溶液を氷浴で冷却し、重炭酸ジ-t-ブチル（48g、0.22mol）を攪拌しながら滴下した。1時間攪拌後、飽和NaHCO3水（200ml）を添加した。反応混合物を一晩攪拌した。有機相を水、飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。真空下での有機溶媒の除去により、約68gの黄色油状物を得、これをヘキサンで処理し、約50gの標題化合物を黄色固体として得た。
【０１８３】
工程3.  4-（4,6-ジクロロピリミジン-2-イルチオ）フェニルカルバミン酸tert-ブチル
【化６２】
2015062428.tif 000086
150mlのt-BuOH中N-（4-メルカプトフェニル）カルバミン酸tert-ブチル（5g、0.022mol）および4,6-ジクロロ-2-メチルスルホニルピリミジン（5g、0.026mol）の混合物を還流下で1時間加熱し、次いでNaOAc（0.5g）を添加した。反応を還流下でさらに14時間加熱した。溶媒を真空除去し、残渣を酢酸エチルに溶解した。有機相をK2CO3溶液および飽和NaCl水溶液で逐次洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。溶媒の除去により、約5gの標題化合物を黄色固体として得た。
【０１８４】
工程4.  4-（4-クロロ-6-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ）ピリミジン-2-イルチオ）フェニルカルバミン酸tert-ブチル
【化６３】
2015062428.tif 000087
1mlのDMF中4-（4,6-ジクロロピリミジン-2-イルチオ）フェニルカルバミン酸tert-ブチル（100mg、0.27mmol）、3-メチル-5-アミノ-1H-ピラゾール（28.7mg、0.3mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（41.87mg）、およびNaI（48.6mg、0.324mmol）の溶液を85℃で4時間加熱した。冷却および20mLの酢酸エチルでの希釈後、有機相を水および飽和NaCl水溶液で逐次洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。溶媒の真空除去により約120mgの粗生成物を得、これをシリカゲル（30%EtOAc/ヘキサン）によって精製し、64mgの標題化合物を得た。
【０１８５】
工程5.  4-（4-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ）-6-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピリミジン-2-イルチオ）フェニルカルバミン酸tert-ブチル
【化６４】
2015062428.tif 000088
4-（4-クロロ-6-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ）ピリミジン-2-イルチオ）フェニルカルバミン酸tert-ブチル（61mg、0.14mmol）と1mlのメチルピペラジンの混合物を110℃で2時間加熱した。反応混合物を20mLの酢酸エチルで希釈した。有機相を水で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。溶媒の真空除去により約68.2mgの粗生成物を明褐色固体として得、これをシリカゲル（30%EtOAc/ヘキサン）によって精製し、49.5mgの標題化合物を得た。MS（M+H+）：497.36.
【０１８６】
工程6.  2-（4-アミノフェニルチオ）-N-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ）-6-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピリミジン-4-アミン
【化６５】
2015062428.tif 000089
5mlのMeOH中4-（4-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ）-6-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピリミジン-2-イルチオ）フェニルカルバミン酸tert-ブチル（44.5mg）の溶液を、2mlの5N HClで処理した。TLCで出発材料が残留していないことが示されたら、反応混合物を酢酸エチルで希釈した。有機相をNaHCO3および飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。溶媒の真空除去により約32.1mgの標題化合物を得た。1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ11.68（s，1 H），9.65（s，1 H），9.25（s，1 H），7.60（d，2 H），7.45（d，2 H），6.00（s，1H），5.43（s，1H），2.38（m，4 H），2.20（m，2 H），2.05（m，2 H），1.52（s，6 H），MS（M+H+）：397.18.
【０１８７】
工程7.  N-（4-（4-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ）-6-（4-メチルピペラジン(piperiazin)-1-イル）ピリミジン-2イルチオ）フェニル）アクリルアミド
【化６６】
2015062428.tif 000090
塩化アクリロイル（6.85mL、7.33mg、0.081mmol）を、3mlのCH2Cl2中2-（4-アミノフェニルチオ）-N-（3-メチル-1H-ピラゾール-5-イル）-6-（4-メチルピペラジン-1-イル）ピリミジン-4-アミン（32.1mg、0.081mmol）の溶液に0℃で添加した。30分後、反応混合物を酢酸エチルで希釈した。有機相をNaHCO3溶液、飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、次いで濾過した。溶媒の除去により粗生成物を得、これをシリカゲルによって精製し、20mgの生成物を得た。MS（M+H+）：451.36.
【０１８８】
生化学的試験
化合物4は、FLT3生化学的アッセイにおいてFLT3リン酸化の阻害に対して2.2nMのIC50を有した。VX-680は、該アッセイにおいて10.7nMのIC50を有した。
【０１８９】
FLT3生化学的アッセイ
連続読取キナーゼアッセイを使用し、活性FLT-3 酵素に対する化合物の活性を測定した。該アッセイは、供給元（Invitrogen、Carlsbad、CA、ワールドワイドウェブinvitrogen.com/content.cfm?pageid=11338）に記載の方法と実質的に同様の様式(mannor)で行なった。簡単には、InvitrogenまたはBPS Bioscience（PV3660もしくは40301）のKDRまたはFLT-3（PV3182）酵素、1.13X ATP（AS001A）およびY9-SoxまたはY12-Soxペプチド基質（KCZ1001）の10Xストックを、20mM Tris、pH7.5、5mM MgCl2、1mM EGTA、5mM β-グリセロホスフェート、5%グリセロール（10Xストック、KB002A）および0.2mM DTT（DS001A）を含有する1Xキナーゼ反応バッファー中で調製した。5μLの酵素を、Corning（#3574）384ウェル白色非結合表面マイクロタイタープレート（Corning、NY）内で27℃で30分間、0.5μL容量の50%DMSOおよび50%DMSO中で調製した連続希釈化合物とともにプレインキュベートした。45μLのATP/Y9またはY5-Soxペプチド基質混合物の添加によってキナーゼ反応を開始し、30〜90秒毎に60分間、λex360/λem485で、BioTek（Winooski、VT）製のSynergy4プレートリーダーでモニタリングした。各アッセイの最後に、各ウェルの進行曲線を線形反応速度論について調べ、統計にフィットさせた（R2、95%信頼区間、絶対二乗和）。時間（分）に対する相対蛍光単位のプロットの傾きから各反応での初期速度（0分〜20+分）を求め、次いで、インヒビター濃度に対してプロットし、GraphPad Software（San Diego、CA）製のGraphPad PrismのLog[Inhibitor] vs Response、Variable SlopeモデルからIC50を推定した。
最適プロトコルにおいて使用した[試薬]：
[PDGFRα] = 2〜5nM、[ATP] = 60μMおよび[Y9-Soxペプチド] = 10μM（ATP KMapp = 61μM）
[FLT-3] = 15nM、[ATP] = 500μMおよび[Y5-Soxペプチド] = 10μM（ATP KMapp = 470μM）
【０１９０】
質量スペクトル解析
トリプシン消化の前に、Flt3を化合物4とともに3時間、100X過剰でインキュベートした。化合物のインキュベーション後、ヨードアセトアミドをアルキル化剤として使用した。マトリックスとしてαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中5mg/ml）を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC18 Zip Tippingの前に、トリプシン消化物は、5ul 等分量（7pmol）を10 ulの0.1%TFAで希釈した。
【０１９１】
質量分析機器をリフレクトロンモードに設定し、パルス抽出を1800に設定した。較正は、Laser Biolabs Pep Mix標準（1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20）を用いて行なった。CID/PSD解析のため、カーソルを用いてイオンゲートタイミングを設定するペプチドを選択し、断片化は約20%高いレーザー出力で行ない、HeをCID用衝突ガスとして使用した。断片の較正は、カーブドフィールドリフレクトロンのためのP14R断片化較正を用いて行なった。
【０１９２】
化合物4と結合した配列ICDFGLARを有するトリプティックペプチドの修飾形態は1344.73にピークが形成された。対照消化物は、化合物4修飾ペプチドを示す証拠である1344ピークを示さなかった。
【０１９３】
実施例4.  不可逆的ボセプレビル
ボセプレビルは、C型肝炎ウイルス（HCV）プロテアーゼの強力な可逆的インヒビターである。本明細書に記載の構造に基づく設計アルゴリズムを使用し、ボセプレビルを、可逆的インヒビターからHCVプロテアーゼの不可逆的インヒビターに迅速に効率的に変換した。
【０１９４】
HCVプロテアーゼ（pdbcode 2OC8）に結合させたボセプレビルのx線複合体の座標をタンパク質データバンクから入手した。ボセプレビルの座標を抽出し、ボセプレビルの20オングストローム以内のタンパク質の全Cys残基を確認した。これにより、5つの残基Cys16、Cys47、Cys52、Cys145およびCys159が確認された。次いで、ボセプレビルテンプレート（式IV-1）上の4つの置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で、該頭部がボセプレビル(boceprivir)結合部位内のCysと共有結合を形成し得るように置換され得るかを決定した。アクリルアミド頭部は、Accelrys Discovery Studio v2.0.1.7347（Accelrys Inc、CA）を用いてボセプレビルテンプレート（式IV-1）を基に3次元で構築し、得られた化合物の構造を確認し、頭部がHCVプロテアーゼ結合部位内の確認されたCys残基の1つに達し得るかどうかを調べた。
【化６７】
2015062428.tif 000091
【０１９５】
頭部および側鎖位置の柔軟性のサンプリングのため、本発明者らは、頭部および側鎖位置の標準的な分子力学シミュレーションを行ない、頭部が結合部位内の確認されたCys残基のいずれかの6オングストローム以内であるかどうかを調べて確認した。これにより、2つのテンプレート位置（R1およびR3）が確認され、これらはCys159の近くに存在した（表11）。次いで、これらの2つのテンプレート位置を、標準的な分子力学シミュレーションの使用での2オングストローム未満の結合の形成に関与する、候補不可逆的インヒビターとCys159との間で反応生成物が形成されることを要件とする最終フィルタリングに供した。この制限により、1つのテンプレート位置R3が得られた。化合物5を合成し、生化学的アッセイ（HCVプロテアーゼFRETアッセイ）において1.3μMのIC50_APPを有することが示され、レプリコン細胞アッセイにおいてHCV複製を阻害することが示され、EC50は230nMであった。
【表１１】
2015062428.tif 000092
【０１９６】
化合物5の合成
【化６８】
2015062428.tif 000093
【０１９７】
化合物5は、以下に記載する工程および中間体に従って調製した。
【０１９８】
スキーム4-A
【化６９】
2015062428.tif 000094
【０１９９】
工程1：中間体4a
【化７０】
2015062428.tif 000095
4mL THF/MeOH（1：1）中（1R,2S,5S）-3-tert-ブチル2-メチル6,6-ジメチル-3-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-2,3-ジカルボキシレート（0.30g、1.1mmol）の溶液に、1N LiOH水溶液（2.0mL）を添加した。室温で10時間攪拌後、反応混合物を1.0N HClで中和した。有機溶媒を真空蒸発させ、1.0N HClを用いて残りの水相をpH約3に酸性化し、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒の除去後、0.28gの中間体1aを得た：MS m/z：254.2（ES-）.
【０２００】
工程2：中間体4b
【化７１】
2015062428.tif 000096
10.0mlの無水アセトニトリル中工程1の生成物（0.28g、1.0mmol）および3-アミノ-4-シクロブチル-2-ヒドロキシブタンアミド（0.27g、1.3mmol）の溶液に、攪拌下室温でHATU（0.45g、1.2mmol）およびDIEA（0.5ml、3.0mmol）を添加した。TLC解析により、10時間後にカップリング反応の終了が起こったことが示された。50ml分のEtOAcを添加し、混合物をNaHCO3水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を分離し、Na2SO4上で乾燥した。溶媒の除去後、粗生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した（溶離液：EtOAc/ヘキサン）。合計0.4gの標題化合物を得た（88%）。MS m/z：432.2（ES+、M+Na）.
【０２０１】
工程3：中間体4c 
【化７２】
2015062428.tif 000097
工程2の生成物（0.40g、1.0mmol）を5mLのジオキサン中4N HClに溶解した。混合物を室温で1時間攪拌した。溶媒の除去後、10mL分のDCMを注入した後、乾燥するまで蒸発させた。このDCM添加プロセスの後、蒸発を4回繰り返し、残渣固体を得、これを次の工程に直接使用した：MS m/z：310.1（M+H+）.
【０２０２】
工程4：中間体4d
【化７３】
2015062428.tif 000098
3.0mLの無水アセトニトリル中工程3の生成物（0.10g、0.28mmol）および（S）-3-（tert-ブトキシカルボニルアミノ）-2-（3-tert-ブチルウレイド）プロパン酸（0.10g、0.33mmol）の溶液に、HATU（125mg、0.33mmol）およびDIEA（0.17mL、1.0mmol）を攪拌下室温で添加した。1時間後、15mLのEtOAcを添加し、混合物をNaHCO3水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を分離し、Na2SO4上で乾燥した。溶媒の除去後、粗生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供し（溶離液：EtOAc/ヘキサン）、103mgの標題化合物（60%）を得た。MS m/z：595.2（M+ H+）.
【０２０３】
工程5：中間体4e
【化７４】
2015062428.tif 000099
工程4の生成物（75mg、0.12mmol）を3mLのジオキサン中4N HClに溶解し、反応液を室温で1時間攪拌した。溶媒の除去後、3mL分のDCMを注入した後、乾燥するまで蒸発させた。このDCM添加プロセスの後、蒸発を3回繰り返し、明褐色固体を得、次の工程に直接使用した。MS m/z：495.2（M+H+）.
【０２０４】
工程6：中間体4f
【化７５】
2015062428.tif 000100
アクリル酸（13.6mg、0.19mmol）を、HATUを有する工程5の生成物（65mg、0.17mmol）と、工程2に記載の手順に従ってカップリングさせ、標題化合物（60mg、粗製）を得た。MS m/z：549.3（M+H+）.
【０２０５】
工程7：工程6の粗生成物（60mg、0.11mmol）を5mlのジクロロメタンに溶解した後、デス-マーチン過ヨウ化物(periodinane)（60mg、0.15mmol）を添加した。得られた溶液を室温で1時間攪拌した。次いで、溶媒を除去し、残渣をシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供し（溶離液：EtOAc/ヘプタン）、13mgの化合物5を得た。MS m/z：547.2（M+H+）.
【０２０６】
質量スペクトル解析
化合物5の存在下でのHCVの質量分析を、以下のプロトコルを用いて行なった。HCV NS3/4A野生型（wt）を1時間、タンパク質に対して化合物5を10X倍過剰でインキュベートした。脱着マトリックス（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中10mg/ml）としてシナピン酸を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC4 ZipTippingの前に、2μlの等分量の試料を10μlの0.1%TFAで希釈した。機器は、パルス抽出設定24,500および機器を較正するための標準としてアポミオグロビンを用いて線形モードに設定した。化合物5なしのタンパク質と比べ、化合物5とともにインキュベートしたタンパク質は有意に反応して、HCVプロテアーゼよりも重いほぼ547Daであり、化合物5の質量547Daと一致する新たな種をもたらした。
【０２０７】
Cys159がSerに変異されたHCVプロテアーゼの変異形態を用いた化合物5のさらなる解析により、化合物5は変異体HCVプロテアーゼを修飾しないことが示された。
【０２０８】
単鎖HCVプロテアーゼ（wt）のペプチド発現および精製
単鎖タンパク質分解性ドメイン（NS4A21-32-GSGS-NS33-631）をpET-14b（Novagen、Madison、WI）内にクローニングし、DH10B細胞（Invitrogen）を形質転換した。得られたプラスミドを、以前に記載されたようにして大腸菌BL21（Novagen）に移してタンパク質を発現させ、精製した（1、2）。簡単には、培養物を、100μg/mLのアンピシリンを含有するLB培地中、37℃で、600nm（OD600）での光学密度が1.0に達するまで培養し、1mMまでのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導した。18℃で20時間さらにインキュベーション後、6,000×gで10分間の遠心分離によって細菌を回収し、50mM Na3PO4、pH8.0、300mM NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、10%グリセロール、0.5%Igepal CA630、ならびに1mM フッ化フェニルメチルスルホニル、0.5μg/mL ロイペプチン、ペプスタチンA、および2mM ベンズアミジンからなるプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する溶解バッファー中に再懸濁した。細胞は、凍結および解凍後、超音波処理によって溶解させた。12,000×gで30分間の遠心分離によって細胞残屑を除去し、0.45μmフィルター（Corning）に通すことによって上清みをさらに清澄にし、次いで、NiSO4を充填したHiTrapキレートカラム（Amersham Pharmacia Biotech）上に負荷した。結合タンパク質を100から500mMまでの線形勾配でのイミダゾール溶液で溶出した。選択した画分をNi2+カラムクロマトグラフィーに流し、10%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル上で解析した。12%SDS-PAGEゲル中での電気泳動によって精製タンパク質を分離し、次いで、ニトロセルロース膜上に移した。NS3に対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によってタンパク質を解析した。二次抗体としてのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Pierce）とともに化学発光キット（Roche）を使用することによりタンパク質を可視化した。タンパク質は等分にして-80℃で保存した。
【０２０９】
HCVプロテアーゼおよびC159Sバリアントのクローニングおよび発現
PCRおよびpET 発現ベクター内へのクローニングによってNS4A/NS3の変異体DNA断片を作製した。BL21コンピテント細胞の形質転換後、IPTGで発現を2時間誘導した。親和性カラム、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを使用し、Hisタグ化融合タンパク質を精製した。
【０２１０】
生化学的アッセイ
HCV NS3/4A 1b Enzyme（IC50_APP）のためのHCVプロテアーゼFRETアッセイを使用した。以下のプロトコルを使用し、「見かけ上の」IC50（IC50_APP）値を得た。特定の理論に拘束されることを望まないが、IC50_APPは、IC50値とは対照的に、より有用な時間依存性阻害の表示、したがって、より代表的な結合親和性をもたらし得ると考えられる。プロトコルは、以下のようにして、HCV NS3/4A 1bプロテアーゼ酵素の野生型およびC159S、A156S、A156T、D168A、D168V、R155K変異体に対する化合物の効力、ランク順および抵抗性プロフィールを評価するために開発された変形FRET系アッセイ（v_03）である：Bioenza（Mountain View、CA）製のNS3/4Aプロテアーゼ酵素の10XストックおよびAnaspec（San Jose、CA）製の1.13X 5-FAM/QXLTM520 FRETペプチド基質を、50mM Tris-HCl、pH7.5、5mM DTT、2%CHAPSおよび20%グリセロール中で調製した。Corning（#3575）384ウェルの黒色マイクロタイタープレート（Corning、NY）に、0.5μL容量の50%DMSOおよび50%DMSO中で調製した連続希釈化合物をスポットした後、5μLの各酵素を添加した。45μLのFRET基質の添加による酵素添加後、プロテアーゼ反応が直ちに開始され、BioTek（Winooski、VT）製のSynergy4プレートリーダーで、λex485/λem520にて60〜90分間モニタリングした。各アッセイの最後に、各ウェルの進行曲線を線形反応速度論について調べ、統計にフィットさせた（R2、95%信頼区間、絶対二乗和）。時間（分）に対する相対蛍光単位のプロットの傾きから各反応の初期速度（0分〜15+分間）を求め、次いで、インヒビターなしおよび酵素なし対照に対する割合としてインヒビター濃度に対してプロットし、GraphPad Software（San Diego、CA）製のGraphPad Prismのlog[Inhibitor] vs Response、Variable Slopeモデルから見かけ上のIC50を推定した。
【０２１１】
化合物5は、このアッセイにおいてHCVプロテアーゼを1.3μMのIC50で阻害した。
【０２１２】
レプリコンアッセイ
レプリコン由来ルシフェラーゼ活性を使用し、化合物の抗ウイルス活性および細胞傷害性を評価するために化合物をアッセイした。このアッセイでは、安定なルシフェラーゼ（Luc）レポーターおよび3つの細胞培養適応性変異を有するHCV RNAレプリコンを含むヒトHuh7肝細胞癌細胞株である細胞株ET（luc-ubi-neo/ET）を使用した。
【０２１３】
ET細胞株を、ダルベッコ改変必須培地（DMEM）、10%ウシ胎仔血清（FBS）、1%ペニシリン-ストレプトマイシン（pen-strep）、1%グルタミン、1%非必須アミノ酸、400μg/mL G418中、5%CO2で37℃のインキュベータ内で培養した。すべての細胞培養試薬はInvitrogen（Carlsbad）から入手した。細胞をトリプシン処理し（1%トリプシン：EDTA）、細胞数（細胞傷害性）または抗ウイルス活性の評価のための特定用途の白色96ウェルアッセイプレート（Costar）内で5 x 103細胞/ウェルで平板培養した。化合物を6重で(at six)各々、3倍濃度で添加し、アッセイをDMEM、5%FBS、1%pen-strep、1%グルタミン、1%非必須アミノ酸中で実施した。各実施において、ヒトインターフェロンα-2b（PBL Biolabs、New Brunswick、NJ）を陽性対照化合物として含めた。化合物添加の72時間後、細胞がまだコンフルエントでないときに細胞を処理した。Steady-Glo Luciferase Assay System（Promega、Madison、WI）を製造業者の使用説明書に従って用いてレプリコン由来ルシフェラーゼ活性を解析することにより、抗ウイルス活性を測定した。各ウェル内の細胞の数をCell Titer Blue Assay（Promega）によって測定した。適用可能なEC50（ウイルス複製が50%阻害される有効濃度）、EC90（ウイルス複製が90%阻害される有効濃度）、IC50（細胞生存能が50%低下する濃度）およびSI50（選択指数：EC50/IC50）値を計算することにより、化合物プロフィールを得た。
【０２１４】
化合物5は、このアッセイにおいて230nMのEC50_APPで活性を阻害した。
【０２１５】
実施例5.  C型肝炎ウイルスプロテアーゼの不可逆的インヒビター
化合物V-1は、HCVプロテアーゼの強力な可逆的インヒビターである（実施例4に記載の生化学的アッセイにおいて0.4nMのIC50_APP）。
【化７６】
2015062428.tif 000101
【０２１６】
HCVプロテアーゼ（pdbcode 2OC8）に結合させたボセプレビルのx線複合体の座標をタンパク質データバンクから入手した（ワールドワイドウェブrcsb.org）。HCVプロテアーゼの結晶構造を、これに結合させた10種類より多くの小分子ペプチド系インヒビターを用いて調べると、その結合様式に有意な構造類似性がある。ボセプレビルの構造を使用し、Discovery Studioを用いてHCVプロテアーゼ内のV-1の構造をモデル構築した。
【０２１７】
モデル内のV-1の20オングストローム以内のタンパク質の全Cys残基を確認した。これにより、5つの残基Cys16、Cys47、Cys52、Cys145およびCys159が確認された。次いで、V-1上の4つの置換可能な位置（V-2テンプレートを使用）を3次元で調べ、どれが頭部で、該頭部がHCVプロテアーゼ結合部位内の確認されたCys残基と共有結合を形成し得るように置換され得るかを決定した。頭部は、Discovery Studio（Accelrys Inc、CA）を用いてテンプレート（式V-2）を基に3次元で構築し、得られた化合物の構造を確認し、頭部が結合部位内の確認されたCys残基の1つに達し得るかどうかを調べた。
【０２１８】
【化７７】
2015062428.tif 000102
頭部および側鎖位置の柔軟性のサンプリングのため、頭部および側鎖位置の標準的な分子力学シミュレーションを行ない、頭部が結合部位内の確認されたCys残基のいずれかの6オングストローム以内であるかどうかを調べて確認した。これにより、2つのテンプレート位置（R1およびR3）が確認され、これらはCys159付近であった。次いで、これらの2つのテンプレート位置を、標準的な分子力学シミュレーションの使用での2オングストローム未満の結合の形成に関与する、アクリルアミド反応生成物が候補インヒビターおよびCys159間で形成され得ることを要件とする最終フィルタリングに供した。この制限により、1つのテンプレート位置R3が得られた。
【０２１９】
化合物6を合成し、HCVプロテアーゼの強力なインヒビターであることが示され（IC50 0.4nM）、HCVプロテアーゼのCys159を修飾することが示された（図4）。
【０２２０】
化合物6の合成
【化７８】
2015062428.tif 000103
【０２２１】
N-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-3-[（2-プロペノイル）アミノ]-L-アラニル-（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：標題化合物を以下に記載する工程および中間体に従って調製した。
【０２２２】
中間体5-1
【化７９】
2015062428.tif 000104
エチル-1-[[[（2S,4R）-1-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-2-ピロリジニル]カルボニル]アミノ]-2-エテニル-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキシレート：100mlのDCM中（1R、2S）-1-アミノ-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルトルエンスルホン酸（2.29g、7.0mmol）およびN-Boc（2S、4R）-（2-フェニル-7-メトキシキノリン-4-オキソ）プロリン（3.4g、7.3mmol）の溶液に、攪拌下、HATU（3.44g、9.05mmol）、次いでDIEA（3.81ml、21.9mmol）を添加した。混合物を室温で2時間攪拌した。出発材料の完全消費後、反応混合物をブラインで2回洗浄し、MgSO4上で乾燥した。溶媒の除去後、粗生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した（ヘキサン：EtOAc = 2：1）。3.45gの標題化合物を得た：Rf 0.3（EtOAc：ヘキサン = 2：1）；MS m/z：602.36（M+H+）.
【０２２３】
中間体5-2
【化８０】
2015062428.tif 000105
1-[[[（2S,4R）-1-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-2-ピロリジニル]カルボニル]アミノ]-2-エテニル-（1R,2S）-シクロプロパンカルボン酸：140mlのTHF/H2O/MeOH（9：5：1.5）中、中間体5-1の生成物（1.70g、2.83mmol）の溶液に、水酸化リチウム一水和物（0.95g、22.6mmol）を添加した。室温で24時間攪拌後、反応混合物を1.0N HClで中和した。有機溶媒を真空蒸発させ、1.0N HClを用いて残りの水相をpH約3に酸性化し、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒の除去後、1.6gの標題化合物を得た：Rf 0.2（EtOAc：MeOH = 10：1）；MS m/z：574.36（M+H+）.
【０２２４】
中間体5-3
【化８１】
2015062428.tif 000106
N-（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル）-（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：20mlのDMF中、中間体5-2の生成物（1.24g、2.16mmol）の溶液に、HATU（0.98g、2.58mmol）およびDIEA（1.43ml、8.24mmol）を添加し、混合物を1時間攪拌した後、15mlのDMF中ベンゼンスルホンアミド（1.30g、8.24mmol）、DMAP（1.0g、8.24mmol）およびDBU（1.29g、8.4mmol）の溶液を添加した。攪拌をさらに4時間継続した。反応混合物をEtOAcで希釈し、水性NaOAcバッファー（pH約5、2×10ml）、NaHCO3溶液およびブラインで洗浄した。MgSO4上での乾燥および溶媒の除去後、一部のDCMを添加することにより純粋な生成物を沈殿させた。濾液を濃縮し、残渣を、ヘキサン/EtOAc（1：1〜1：2）を用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した。合計0.76gの標題化合物を得た：Rf 0.3（EtOAc：ヘキサン = 3：1）、MS m/z：713.45（M+H+）、735.36（M+Na+）。
【０２２５】
中間体5-4
【化８２】
2015062428.tif 000107
（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：30mlのDCM中中間体5-3からの生成物の溶液に、15mlのTFAを滴下した。混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒の除去後、20ml分のDCMを注入した後、乾燥するまで蒸発させた。このDCM添加プロセスの後、蒸発を4回繰り返した。トルエン（20ml）を添加し、次いで、乾燥するまでの蒸発によって除去した。このサイクルの2回の反復により残渣を得、これは、標題化合物のTFA塩として0.9gの白色粉末に固化した。このTFA塩の少量の試料をNaHCO3で中和し、標題化合物を得た：Rf0.4（DCM：MeOH = 10：1）；MS m/z：613.65（M+H+）.
【０２２６】
中間体5-5
【化８３】
2015062428.tif 000108
N-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-3-[[（9H-フルオレン-9-イルメトキシ）カルボニル]アミノ]-L-アラニル-（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：3.0mlのDMF中、中間体5-4の生成物（0.15g、0.178mmol）およびN-Boc-3-（Fmoc）アミノ-L-アラニン（0.107g、0.25mmol）の溶液に、HATU（85.1mg、0.224mmol）およびNMM（90.5mg、0.895mmol）を、攪拌下室温で添加した。TLC解析により、1時間後にカップリング反応の終了が起こったことが示された。20ml分のEtOAcを注入し、混合物を、バッファー（pH約4、AcONa/AcOH）、NaHCO3およびブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥した。溶媒の除去後、粗製油状生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した（溶離液：EtOAc/ヘキサン）。合計0.12gの標題化合物を得た：Rf 0.4（EtOAc：ヘキサン = 1：1）；MS m/z：1021.56（M+H+）.
【０２２７】
中間体5-6
【化８４】
2015062428.tif 000109
N-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-3-アミノ-L-アラニル-（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：12%のピペリジンを含む1mlのDMF中、中間体5-5の生成物110mg（0.108mmol）の溶液を室温で1.5時間攪拌し、次いで、高真空下で乾燥するまで蒸発させた。残渣をヘキサン/エーテル（4：1）とともに磨砕し、70mgの標題化合物を得た：Rf 0.25（EtOAc：MeOH = 10：1）；MS m/z：798.9（M+H+）.
【０２２８】
化合物6
【化８５】
2015062428.tif 000110
N-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-3-[（2-プロペノイル）アミノ]-L-アラニル-（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：塩化アクリロイル（11uL、0.132mmol）を0℃で、3当量のトリエチルアミンを含有する3mlのDCM中、中間体5-6からの生成物69mgの攪拌溶液に滴下した。反応混合物を室温で1.5時間攪拌し、次いで10mlのDCMで希釈した。得られた溶液をブラインで2回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒の除去によって粗生成物を得、これをシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって、まずヘキサン/EtOAc（1：3〜1：5）で、次いでDCM-メタノール（50：1〜25：1）で溶出して精製した。合計36mgの標題化合物を得た：Rf 0.25（DCM：MeOH = 25：1）；MS m/z：892.55（M+H+）.
【０２２９】
質量スペクトル解析
質量スペクトル解析により、WTプロテアーゼの修飾が示されたが、化合物6による標的Cysの特異的修飾を支持するC159S変異体は示されなかった。
【０２３０】
HCV野生型またはHCVバリアントC159Sの質量分析は、試験化合物の存在下で行なった。100pmolのHCV野生型（Bioenza CA）を化合物とともに1時間および3時間、タンパク質に対して化合物6を10倍過剰でインキュベートした。脱着マトリックスとしてシナピン酸（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中10mg/ml）を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC4 ZipTippingの前に、1μlの等分量の試料（総容量4.24ul）を10μlの0.1%TFAで希釈した。解析は、Shimadzu Biotech Axima TOF2（Shimadzu Instruments）マトリックス支援レーザー脱着/イオン化時間飛行型（MALDI-TOF）質量分析計で行なった。同じ手順を、HCVプロテアーゼのHCV C159S変異体100pmolに対して3時間、タンパク質に対して化合物6を10倍過剰で行なった。
【０２３１】
インタクトなHCVタンパク質は24465のMH+に存在し、対応するシナピン（マトリックス）付加物は約200Da上に存在した。化合物6（分子量852Da）の化学量論的組込みが存在し、ほぼ850〜860Da大きい新たな質量ピーク（MH+は25320〜25329）が生じた（図9）。これは、化合物6の単一の分子の組込みと一致する。化合物の10倍濃度で、1時間後であっても有意な反応がに起こり、10倍濃度で3時間後にほぼ完全に変換される。該酵素のC159Sバリアント形態は、化合物がCys159を修飾していることを確認する修飾の証拠をなにも示さなかった。
【０２３２】
質量スペクトル解析により、HCVプロテアーゼへの化合物6の添加によって853ダルトンの質量シフトがもたらされることが確認され、HCVプロテアーゼと化合物との付加物が形成されたことが示された。また、化合物6は、アクリルアミド頭部に対するCysとSerの反応性の違いに基づいて予測されたように、Cys159がセリンに変更されたHCVプロテアーゼの変異形態と付加物を形成しなかった。これらのデータは、本明細書に記載の方法を用いてHCVプロテアーゼの特異的不可逆的インヒビターが設計されたことを示す。
【０２３３】
生化学的および細胞データ
化合物6を、実施例4に記載の生化学的およびレプリコンアッセイにおいて試験した。化合物6は、生化学的アッセイにおいて2.8nMのIC50_APPおよびレプリコンアッセイにおいて174nMのEC50を有した。
【０２３４】
実施例6.  不可逆的ソラフェニブ 
ソラフェニブは、cKITキナーゼドメインの強力な可逆的インヒビターである。本明細書に記載の設計アルゴリズムを使用し、ソラフェニブは、cKITの不可逆的インヒビターに迅速に効率的に変換した。
【化８６】
2015062428.tif 000111
cKITキナーゼ（Uniprotコード：P10721）の相同性モデルを、テンプレートとしてB-Rafに結合させたソラフェニブ（pdbcode 1UWH）のx線構造を用いて作製した。相同性モデルは、Discovery StudioのBuild Homologyモジュールを使用し、以下に示すcKIT-B-RAF整列を用いて構築した。次いで、ソラフェニブテンプレート（式VI-1）上の10個の置換可能な位置を3次元で調べ、どれが頭部で、該頭部が結合部位内のCysと共有結合を形成し得るように置換され得るかを決定した。該方法論により、2つのテンプレート位置（R9およびR10）ならびにアクリルアミド頭部を用いて共有結合を形成し得る1つのCys（Cys788）が確認された。しかしながら、R9位置に関与している結合は、あまり好ましくないシスアミドの採用に関与したが、R10位置に関与している結合は、より好ましいトランスアミドを形成することができた。化合物7を合成し、これを、R10位置に頭部を有する重要性について試験した。
【化８７】
2015062428.tif 000112
【化８８】
2015062428.tif 000113
【０２３５】
化合物7の合成
4-（4-（3-（4-アクリルアミド-3-（トリフルオロメチル）フェニル）ウレイド）フェノキシ）-N-メチルピコリンアミド
【化８９】
2015062428.tif 000114
【０２３６】
工程1.  C,C’-ビス-tert-ブチルN-4-アミノ-2-トリフルオロメチルフェニル）イミノジカーボネート
【化９０】
2015062428.tif 000115
1,4-ジオキサン（50mL）中4-ニトロ-2-トリフルオロメチルアニリン（4.12g、20mmol）の攪拌溶液に、4-DMAP（1.22g、10mmol）およびBoc無水物（13.13g、50mmol）を室温で添加した。反応混合物を110℃で2時間加熱した。反応混合物を冷却し、減圧濃縮し、残渣をEtOAc（25mL）に溶解した。これを、10%クエン酸溶液（5mL）、水（5mL）および飽和NaCl水溶液（2mL）で洗浄した。Na2SO4上での乾燥の後、減圧濃縮によって残渣を得、これをカラムクロマトグラフィーによって精製し（SiO2、60-120、ペット(pet)エーテル/酢酸エチル、6/4）、5.3 g（13mmol）のbis-Boc中間体をかすかに黄色固体として得た。この物質を50mLのメタノールに溶解した。この溶液に、窒素雰囲気下、酢酸（3mL）を添加した後、鉄粉末（1.71g、19.4g-原子）を添加した。反応混合物を70℃で2時間加熱し、室温に冷却し、セライト（登録商標）床によって濾過した。濾液を減圧濃縮し、残渣をEtOAc（30mL）で希釈した。これを水（2mL）および飽和NaCl水溶液（2mL）で洗浄し、Na2SO4上で乾燥した。減圧濃縮により残渣を得、これを、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製し（SiO2、60-120、ペットエーテル/酢酸エチル、6/4）、3.19gの標題化合物をオフホワイト色固体として得た。
【０２３７】
工程2.
4-（4-（3-（4-アミノ-3-（トリフルオロメチル）フェニル）ウレイド）フェノキシ）-N-メチルピコリンアミド
【化９１】
2015062428.tif 000116
【０２３８】
トルエン（5mL）中C,C’-ビス-tert-ブチルN-4-アミノ-2-トリフルオロメチルフェニル）イミノジカーボネート（0.5g、1.32mmol）およびEt3N（0.6mL、5.97mmol）の攪拌溶液に、ホスゲン（トルエン中20%溶液、0.91mL、1.85mmol）を添加した。反応混合物を還流下で16時間加熱し、次いで、室温に冷却した。4-（4-アミノフェノキシ）-N-メチル-2-ピリジンカルボキサミド（0.32g、1.32mmol）を添加し、反応混合物を還流下で2時間加熱した。その後、反応混合物を換気フード内で水（5mL）でクエンチし、EtOAc（2x20mL）で抽出した。酢酸エチル抽出物を飽和NaCl水溶液（15mL）で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、減圧濃縮して0.62gの標題化合物を得た。
【０２３９】
工程3.  4-（4-（3-（4-アクリルアミド-3-（トリフルオロメチル）フェニル）ウレイド）フェノキシ）-N-メチルピコリンアミド
【化９２】
2015062428.tif 000117
DMF（5mL）中4-（4-（3-（4-アミノ-3-（トリフルオロメチル）フェニル）ウレイド）フェノキシ）-N-メチルピコリンアミド（0.1g、0.22mmol）およびピリジン（0.035g、0.45mmol）の攪拌溶液に、塩化アクリロイル（0.03g、0.33mmol）を0℃で添加した。反応液を室温にし、さらに12時間攪拌し、氷冷水（10mL）でクエンチし、EtOAc（2x20mL）で抽出した。酢酸エチル抽出物を飽和NaCl水溶液（5mL）で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、減圧濃縮し、粗製CNX-43を得た。粗生成物をまず中性アルミナカラムクロマトグラフィーによって、次いで分取用HPLCによって精製し、18mgの標題化合物を白色固体としてを得た。1H NMR（MeOD）δppm：2.94（s，3H），5.82（d，J = 10.0 Hz，1H），6.37（dd，J = 1.76 & 17.16 Hz，1H），6.50（dd，J = 10.28 & 17.16 Hz，1H），7.06（dd，J = 2.6 & 5.94 Hz，1H），7.11-7.15（m，2H），7.45（d，J = 8.64 Hz，1H），7.56-7.61（m，3H），7.67（dd，J = 2.24 & 8.48 Hz，1H），8.0（s，1H），8.45-8.55（m，1H）；LCMS：m/e 501（M+2）
【０２４０】
生化学的試験
ソラフェニブは、cKITリン酸化の阻害に対して50.5nMのIC50を有したが、化合物7は、cKITリン酸化の阻害に対して31nMのIC50を有した。生化学的試験は、cKITについて実施例1に記載のアッセイを用いて行なった。
【０２４１】
GIST882細胞アッセイ
GIST882細胞を6ウェルプレート内で、完全培地中、8 x 105細胞/ウェルで密度で播種した。翌日、細胞を完全培地で希釈した1uMの化合物で90分間処理した。90分後、培地を除去し、細胞を化合物なしの培地で洗浄した。細胞を2時間毎に洗浄し、化合物なしの新鮮培地中に再懸濁した。細胞を特定の時点で収集し、Roche完全プロテアーゼインヒビター錠剤（Roche 11697498001）およびホスファターゼインヒビター（Roche 04 906 837 001）を加えた細胞抽出バッファー（Invitrogen FNN0011）中で溶解させ、28.5ゲージシリンジに各10回通すことにより溶解物を剪断した。タンパク質濃度を測定し、10μgの全タンパク質溶解物を各レーンに負荷した。cKITリン酸化を、pTyr（4G10）抗体およびCell Signaling Technologyの全キット抗体を用いたウエスタンブロットによってアッセイした。
【０２４２】
ソラフェニブおよび化合物7を、GIST882細胞株において1マイクロモルで細胞活性について試験した。両方の化合物は、cKIT自己リン酸化、またERKの下流シグナル伝達も阻害した。不可逆的インヒビターによる長期阻害があるかどうかを理解するため、細胞を化合物なしで洗浄した。可逆的インヒビターであるソラフェニブの場合、ckitおよび下流シグナル伝達の阻害活性には打ち勝つが、化合物7の不可逆的阻害は少なくとも8時間持続した。このデータは、可逆的インヒビターソラフェニブよりも不可逆的インヒビター化合物7の作用の持続の優越性を支持する。
【０２４３】
質量スペクトル解析
トリプシン消化の前に、c-KIT（15pmol）を化合物7（150pmol）とともに3時間、10倍過剰でインキュベートした。化合物のインキュベーション後、ヨードアセトアミドをアルキル化剤として使用した。また、化合物7の添加を有しない対照試料を調製した。トリプシン消化物は、マトリックスとしてαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（0.1%TFA：アセトニトリル50：50中5mg/ml）を用いた直接MALDI標的上へのマイクロC18 Zip Tippingの前に、2μlの等分量（3.3pmol）を10μlの0.1%TFAで希釈した。
【０２４４】
機器：
トリプシン消化物について、機器をリフレクトロンモードに設定し、パルス抽出を2200に設定した。較正は、Laser Biolabs Pep Mix標準（1046.54、1296.69、1672.92、2093.09、2465.20）を用いて行なった。CID/PSD解析のため、カーソルを用いてイオンゲートタイミングを設定するペプチドを選択し、断片化は約20%高いレーザー出力で行ない、HeをCID用衝突ガスとして使用した。断片の較正は、カーブドフィールドリフレクトロンのためのP14R断片化較正を用いて行なった。
【０２４５】
化合物7によって修飾されていることが予測されたペプチドは、配列NCIHRを有し、1141.5のMH+に観察された（化合物7のモノアイソトピック質量は499.15であった）。比較として、化合物7を含まなかったcKITの対照消化物では、この質量ピークは完全に非存在ではなかった。また、データは、配列ICDFGLARを有するペプチドペプチドに修飾が存在し得ることも示した。
【０２４６】
実施例7.  C型肝炎ウイルスプロテアーゼの不可逆的インヒビター
実施例5に記載のように、化合物V-1は、HCVプロテアーゼの強力な可逆的インヒビターである。HCVプロテアーゼ内のV-1のモデル構築構造を使用し（実施例5参照）、モデル内のV-1の20オングストローム以内のタンパク質の全Cys残基を確認した。これにより、5つの残基Cys16、Cys47、Cys52、Cys145およびCys159が確認された。次いで、エノン頭部で、該頭部がHCVプロテアーゼ結合部位内の確認されたCys残基と共有結合を形成し得るように置換され得るV-1上の4つの置換可能な位置を3次元で調べた。頭部は、Discovery Studio（Accelrys Inc、CA）を用いてテンプレート（式V-2）を基に3次元で構築し、得られた化合物の構造を確認し、頭部が結合部位内の確認されたCys残基の1つに達し得るかどうかを調べた。
【０２４７】
頭部および側鎖位置の柔軟性のサンプリングのため、頭部および側鎖位置の標準的な分子力学シミュレーションを行ない、頭部が結合部位内の確認されたCys残基のいずれかの6オングストローム以内であるかどうかを調べて確認した。これにより、2つのテンプレート位置（R1およびR3）が確認され、これらはCys159付近であった。次いで、これらの2つのテンプレート位置を、標準的な分子力学シミュレーションの使用での2オングストローム未満の結合の形成に関与する、候補インヒビターとCys159間でエノン反応生成物が形成され得ることを要件とする最終フィルタリングに供した。この制限により、1つのテンプレート位置R3が得られた。
【０２４８】
化合物8を合成し、HCVプロテアーゼの強力なインヒビターであることが示され、（IC50_APP＜0.5nM）、HCVプロテアーゼのCys159を修飾することが示された。
【化９３】
2015062428.tif 000118
【０２４９】
化合物8の合成
化合物8
tert-ブチル-（S）-1-（（2S,4R）-2-（（1R,2S）-1-（シクロプロピルスルホニルカルバモイル）-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル）-4-（7-メトキシ-2-フェニルキノリン-4-イルオキシ）ピロリジン-1-イル）-7-メチル-1,5-ジオキソオクト-6-エン-2-イルカルバメート：標題化合物を、以下に記載する工程および中間体に従って調製した：
【化９４】
2015062428.tif 000119
【０２５０】
中間体8-1：
6mlのDMF中、中間体5-2（0.9g、1.57mmol）の溶液に、CDI（0.28g、1.7mmol）を添加した。混合物を1時間攪拌した後、2mlのDMF中シクロプロピルスルホンアミド（0.25g、2.0mmol）、DBU（0.26ml、1.8mmol）およびDIEA（0.9ml、5mmol）の溶液を添加した。得られた混合物を60℃で10時間攪拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、水性NaOAcバッファー（pH約5、2×10ml）、NaHCO3溶液およびブラインで洗浄した。Na2SO4上での乾燥および溶媒の除去後、残渣を、ヘキサン/EtOAc（1：1〜1：2）を用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した。合計0.8gの中間体8-1を得た：Rf 0.3（EtOAc：ヘキサン = 3：1）、MS m/z：677.2（M+H+）。
【０２５１】
中間体8-2：
中間体8-1（0.8g、1.18mmol）を5mlのジオキサン中4N HClに溶解し、反応液を室温で1時間攪拌した。溶媒の除去後、20ml分のDCMを注入した後、乾燥するまで蒸発させた。このDCM添加プロセスの後、蒸発を3回繰り返し、中間体8-2をそのHCl塩として得た。MS m/z：577.2（M+H+）.
【０２５２】
中間体8-3：
10.0mlの無水THF中N-Boc-ピログルタミン酸（0.23 g 1.0mmol）の溶液に、2-メチルプロプ-1-エニル）マグネシウムブロミド（THF中0.5M、5mL、2.5mmol）を-78℃でゆっくり添加した。反応混合物を-78℃で1時間攪拌した。1N HCl（2.5ml）水溶液を添加し、混合物を室温までゆっくり加温した。1N HClによってpHを約3に調整した。次いで、THFを真空除去し、残りの水性物をDCM（3X 20mL）によって抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、溶媒を除去し、粗生成物を得た。
【０２５３】
化合物8：
tert-ブチル-（S）-1-（（2S,4R）-2-（（1R,2S）-1-（シクロプロピルスルホニルカルバモイル）-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル）-4-（7-メトキシ-2-フェニルキノリン-4-イルオキシ）ピロリジン-1-イル）-7-メチル-1,5-ジオキソオクト-6-エン-2-イルカルバメート：HATUを用いて中間体8-2と中間体8-3をカップリングした後、化合物6の合成における中間体5-5で記載のカップリング反応によって標題化合物を作製した。
合計70mgの標題化合物を得た（65%）：Rf 0.5（EtOAc）；
MS m/z：844.2（M+H+）.
【０２５４】
生化学的データ
化合物8を実施例4に記載の生化学的アッセイにおいて試験し、HCVプロテアーゼの強力なインヒビターであることが示された（IC50_APP＜0.5nM）。
【０２５５】
質量スペクトル解析
質量分析を実施例5に記載のようにして行なった。解析により、HCVプロテアーゼへの化合物8の付加によって、ほぼ844ダルトンの質量シフトがもたらされ、HCVプロテアーゼと該化合物との付加物が形成されることが確認された（図11）。
【０２５６】
実施例8.  共有原子価による効力の改善
この実施例は、効力が中程度または弱い可逆的インヒビターから始める強力な不可逆的インヒビターを設計するための設計アルゴリズムおよび方法の適用を示す。
【０２５７】
8.A.  Btkキナーゼのインヒビター
化合物9は、Btkキナーゼの弱い可逆的インヒビターである（IC50 生化学的アッセイ中8.6μM）。本明細書に記載の構造に基づく設計アルゴリズムを使用し、化合物9を、Btkの不可逆的インヒビターに迅速に効率的に変換した。
【化９５】
2015062428.tif 000120
【０２５８】
Btkにおける化合物9の結合様式を、Btkアポ構造（pdbコード：1K2P）およびDiscovery Studio（Discovery Studio v2.0.1.7347、Accelrys Inc）のタンパク質モデル設計成分を有するEGFR インヒビター（pdbコード：2RGP）の共結晶構造を使用し、ドッキング法によって得た。
【０２５９】
化合物9とBtkとの結合モデルにより、化合物9の20オングストローム以内に5つのCys残基（Cys464、Cys481、Cys502、Cys506、およびCys527）が確認された。しかしながら、3次元構造では、5つのシステインのうち4つ（Cys464、Cys502、Cys506、およびCys527）は、側鎖またはタンパク質主鎖によってブロックされていた。該システインは、立体衝突のため容易に接近可能でない。したがって、システイン1つだけ（Cys481）が到達可能であり、好ましい距離内である。化合物9テンプレート上の1つの置換可能な位置を3次元で調べた（式VIII-1内のR1）。頭部（アクリルアミド）をDiscovery Studioを用いて化合物9テンプレートを基に構築し、得られた化合物の構造を、Accelrys Discovery Studio v2.0.1.7347（Accelrys Inc）を用いてBtk内にドッキングした。最終の3次元構造を確認し、頭部が結合内（Cysから6オングストローム以内）のCysに達し得るかどうかを調べた。
【０２６０】
式VIIIA-1
【化９６】
2015062428.tif 000121
このアプローチにより、化合物9テンプレート上の選択されたR1位置はCys481付近であること、および距離は6オングストローム未満であることが確認された。標準的な分子力学シミュレーションの使用での2オングストローム未満の結合の形成に関与する、アクリルアミド反応生成物が候補インヒビターとCys481間で形成された。この位置は、この制限を良好に満足した。
【０２６１】
以下に記載する方法およびアッセイを使用し、R1位にアクリルアミドを含む化合物10を合成し、生化学的アッセイにおいて、Btkキナーゼの強力なインヒビターであることが示され、IC50は1.8nMであった。これは、化合物9（IC50 8.6μM）と比べて効力の有意な改善である。また、化合物10の活性もラモス細胞アッセイにおいて評価した。化合物9は、生化学的アッセイにおいて、Btkの大変弱い(week)インヒビターであったため、細胞アッセイにおいて阻害活性を有すると予測されなかった。しかしながら、1μMの濃度で使用すると、化合物10は、ラモス細胞においてBtkシグナル伝達の85%阻害を示した。これらのデータは、本発明のアルゴリズムおよび方法を用いて弱い可逆的インヒビター（化合物9）の効力が改善されたこと、および細胞において強力な不可逆的インヒビター（化合物10）が活性を有したことを示す。
【０２６２】
化合物10の合成
N-{3-[6-（4-フェノキシフェニルアミノ）-ピリミジン-4-イルアミノ]フェニル}-2 プロペンアミド
【化９７】
2015062428.tif 000122
5mLのTHF中3-[6-（4-フェノキシフェニルアミノ）-ピリミジン-4-イルアミノ]フェニルアミン（250mg、0.7mmol）およびトリエチルアミン（180mg、1.75mmol）の溶液を室温で攪拌した。塩化アクリロイル（80mg、0.9mmol）を反応混合物に添加し、これを室温で1時間攪拌した。真空蒸発によって溶媒を除去し、粗生成物を、EtOAc/DCM溶媒系を用いたシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、115mg（40%収率）の標題化合物を薄く着色した固体として得た。MS（m/z）：MH+= 424. 1H NMR（DMSO）：9.14（s，1H），9.10（s，1H），8.22（s，1H）、7.89（s，1H），7.52（d，2H，J = 9.0 Hz）、7.35-6.92（m，11H），6.42（dd，1H，J1 = 10.1 Hz，J2 =  16.9 Hz）、6.22（dd，1H，J1= 1.9 Hz，J2 =  16.9 Hz）、6.12（s，1H），5.70（dd，1H，J1= 1.9 Hz，J2 =  10.1 Hz）ppm.
【０２６３】
Btkに対する効力評価のためのオムニア(Omnia)アッセイプロトコル
以下のプロトコルは、活性形態のBtk酵素に対する化合物の固有効力を測定するための連続読取キナーゼアッセイを示す。アッセイ基盤の機構は、供給元（Invitrogen、Carlsbad、CA）により、ワールドワイドウェブ上のinvitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Drug-Discovery/Target-and-Lead-Identification-and-Validation/KinaseBiology/KB-Misc/Biochemical-Assays/Omnia-Kinase-Assays.htmlに最もよく記載されている。簡単には、Invitrogen製の5nM Btk、1.13X 40μMのATP（AS001A）および10μM（ATP KMapp 約36mM）Tyr-Soxコンジュゲートペプチド基質（KCZ1001）の10Xストックを、20mM Tris、pH7.5、5mM MgCl2、1mM EGTA、5mM β-グリセロホスフェート、5%グリセロール（10Xストック、KB002A）および0.2mM DTT（DS001A）からなる1Xキナーゼ反応バッファー中で調製した。5μLの酵素を、Corning（#3574）384ウェル白色非結合表面マイクロタイタープレート（Corning、NY）内で30分間27℃で、0.5μL容量の50%DMSOおよび50%DMSO中で調製した連続希釈化合物とともにプレインキュベートした。45μLのATP/Tyr-Soxペプチド基質混合物の添加によってキナーゼ反応を開始し、30〜90秒毎に60分間、λex360/λem485で、BioTek（Winooski、VT）製のSynergy4プレートリーダーでモニタリングした。各アッセイの最後に、各ウェルの進行曲線を線形反応速度論について調べ、統計にフィットさせた（R2、95%信頼区間、絶対二乗和）。時間（分）に対する相対蛍光単位のプロットの傾きから各反応の初期速度（0分〜約30分）を求め、次いで、インヒビター濃度に対してプロットし、GraphPad Software（San Diego、CA）製のGraphPad Prismのlog[Inhibitor] vs Response、Variable SlopeモデルからIC50を推定した。
【０２６４】
Btkラモス細胞アッセイ
化合物CNX-85をラモスヒトバーキットリンパ腫細胞においてアッセイした。ラモス細胞をT225フラスコ内で懸濁培養し、スピンダウンし、50mlの無血清培地中に再懸濁し、1時間インキュベートした。化合物を1、0.1、0.01、または0.001μMの終濃度で、無血清培地中のラモス細胞に添加した。ラモス細胞を化合物とともに1時間インキュベートし、再度洗浄し、100ulの無血清培地に再懸濁した。次いで、細胞を1μgのヤギF（ab’）2抗ヒトIgMで刺激し、氷上で10分間インキュベートし、B細胞受容体シグナル伝達経路を活性化した。10分後、細胞をPBSで1回洗浄し、次いで氷上でInvitrogen Cell Extractionバッファーで溶解させた。溶解物由来の16μg 全タンパク質をゲル上に負荷し、ブロットを、Btk基質PLCγ2のリン酸化についてプローブ結合した。
【０２６５】
8.B.  HCVプロテアーゼのインヒビター
化合物11は、HCVプロテアーゼの弱い可逆的インヒビターである（生化学的アッセイにおいて165nMのIC50）。本明細書に記載の構造に基づく設計アルゴリズムを使用し、化合物11を、HCVプロテアーゼの不可逆的インヒビターに迅速に効率的に変換した。
【化９８】
2015062428.tif 000123
10を超える小分子ペプチド系インヒビターとの複合体内のHCVプロテアーゼの結晶構造を調べると、該インヒビターの３つの結合様式において有意な構造類似性がある。ボセプレビル（pdbcode 2OC8）との複合体のx線構造をタンパク質データバンク（ワールドワイドウェブrcsb.org）から入手し、Discovery Studioを用いてHCVプロテアーゼにおける化合物11の構造をモデル構築するために使用した。
【０２６６】
モデル内のドッキングさせた化合物の20オングストローム以内のHCVプロテアーゼの全Cys残基を確認した。これにより、5つの残基Cys16、Cys47、Cys52、Cys145およびCys159が確認された。次いで、化合物11テンプレート上の1つの置換可能な位置（式VIIIB-1内のR1）を3次元で調べ、頭部で、該頭部がHCVプロテアーゼ結合部位内の確認されたCys残基と共有結合を形成し得るように置換され得るかどうかを調べた。頭部（アクリルアミド）を、テンプレート（式VIIIB-1）を基に3次元で構築し、可逆的インヒビターの残部は変更なしのままにした。得られた化合物の構造を確認し、頭部が結合部位内の確認されたCys残基の1つに達し得るかどうかを調べた。
【化９９】
2015062428.tif 000124
【０２６７】
頭部および側鎖位置の柔軟性のサンプリングのため、頭部および側鎖位置の標準的な分子力学シミュレーションを行ない、頭部が結合部位内の確認されたCys残基のいずれかの6オングストローム以内であるかどうかを調べて確認した。このアプローチにより、テンプレート上のR1位置はCys159付近であることが確認された。次いで、この位置を、標準的な分子力学シミュレーションの使用での2オングストローム未満の結合の形成に関与する、候補インヒビターとCys159との間でアクリルアミド反応生成物が形成され得ることを要件とする最終フィルタリングに供した。化合物12はこれらの制限を満足した。
【０２６８】
以下に記載するように、化合物12を合成し、HCVプロテアーゼの強力なインヒビターであることが示された。
【０２６９】
化合物12の合成
（2S,4R）-1-（2-アクリルアミドアセチル）-4-（7-メトキシ-2-フェニルキノリン-4-イルオキシ）-N-（（1R,2S）-1-（フェニルスルホニルカルバモイル）-2-ビニルシクロプロピル）ピロリジン-2-カルボキサミド：
【化１００】
2015062428.tif 000125
標題化合物を以下に記載する工程および中間体に従って調製した。
【０２７０】
【化１０１】
2015062428.tif 000126
エチル-1-[[[（2S,4R）-1-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-2-ピロリジニル]カルボニル]アミノ]-2-エテニル-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキシレート：100mlのDCM中（1R、2S）-1-アミノ-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸エチルエステルトルエンスルホン酸（2.29g、7.0mmol）およびN-Boc（2S、4R）-（2-フェニル-7-メトキシキノリン-4-オキソ）プロリン（3.4g、7.3mmol）の溶液に、HATU（3.44g、9.05mmol）、次いでDIEA（3.81ml、21.9mmol）を攪拌下で添加した。混合物を室温で2時間攪拌した。出発材料の完全消費後、反応混合物をブラインで2回洗浄し、MgSO4上で乾燥した。溶媒の除去後、粗生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した（ヘキサン：EtOAc = 2：1）。3.45gの標題化合物を得た：Rf 0.3（EtOAc：ヘキサン = 2：1）；MS m/z：602.36（M+H+）.
【０２７１】
【化１０２】
2015062428.tif 000127
1-[[[（2S,4R）-1-[（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル]-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-2-ピロリジニル]カルボニル]アミノ]-2-エテニル-（1R,2S）-シクロプロパンカルボン酸：140mlのTHF/H2O/MeOH（9：5：1.5）中、中間体8.B-1の生成物（1.70g、2.83mmol）の溶液に、水酸化リチウム一水和物（0.95g、22.6mmol）を添加した。室温で24時間攪拌後、反応混合物を1.0N HClで中和した。有機溶媒を真空蒸発させ、1.0N HClを用いて残りの水相をpH約3に酸性化し、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒の除去後、1.6gの標題化合物を得た：Rf 0.2（EtOAc：MeOH = 10：1）；MS m/z：574.36（M+H+）.
【０２７２】
【化１０３】
2015062428.tif 000128
N-（1,1-ジメチルエトキシ）カルボニル）-（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：20mlのDMF中、中間体8.B-2の生成物（1.24g、2.16mmol）の溶液に、HATU（0.98g、2.58mmol）およびDIEA（1.43ml、8.24mmol）を添加し、混合物を1時間攪拌した後、15mlのDMF中ベンゼンスルホンアミド（1.30g、8.24mmol）、DMAP（1.0g、8.24mmol）およびDBU（1.29g、8.4mmol）の溶液を添加した。攪拌をさらに4時間継続した。反応混合物をEtOAcで希釈し、水性NaOAcバッファー（pH約5、2×10ml）、NaHCO3溶液およびブラインで洗浄した。MgSO4上での乾燥および溶媒の除去後、一部のDCMを添加することにより純粋な生成物を沈殿させた。濾液を濃縮し、残渣を、ヘキサン/EtOAc（1：1〜1：2）を用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーに供した。合計0.76gの標題化合物を得た：Rf 0.3（EtOAc：ヘキサン = 3：1）、MS m/z：713.45（M+H+）、735.36（M+Na+）。
【０２７３】
【化１０４】
2015062428.tif 000129
（4R）-4-[（7-メトキシ-2-フェニル-4-キノリニル）オキシ]-L-プロリル-1-アミノ-2-エテニル-N-（フェニルスルホニル）-（1R,2S）-シクロプロパンカルボキサミド：30mlのDCM中、中間体8.B-3からの生成物の溶液に、15mlのTFAを滴下した。混合物を室温で2時間攪拌した。溶媒の除去後、20ml分のDCMを注入した後、乾燥するまで蒸発させた。このDCM添加プロセスの後、蒸発を4回繰り返した。トルエン（20ml）を添加し、次いで、乾燥するまでの蒸発によって除去した。このサイクルの2回の反復により残渣を得、これは、標題化合物のTFA塩として0.9gの白色粉末に固化した。このTFA塩の少量の試料をNaHCO3で中和し、標題化合物を得た：Rf0.4（DCM：MeOH = 10：1）；MS m/z：613.65（M+H+）.
【０２７４】
【化１０５】
2015062428.tif 000130
（2S,4R）-1-（2-t-ブトキシカルボニルアミノアセチル）-4-（7-メトキシ-2-フェニルキノリン-4-イルオキシ）-N-（（1R,2S）-1-（フェニルスルホニルカルバモイル）-2-ビニルシクロプロピル）ピロリジン-2-カルボキサミド：3.0mLのアセトニトリル中、中間体8.B-4の生成物（0.10g、0.15mmol）およびN-Boc-グリシン（0.035g、0.20mmol）の溶液に、HATU（85.1mg、0.22mmol）およびDIEA（0.09mL、0.5mmol）を攪拌下室温で添加した。反応混合物を2時間攪拌した。LC-MSおよびTLC解析により、カップリング反応の終了が示された。20-mLのEtOAcを注入し、混合物をバッファー（pH約4、AcONa/AcOH）、NaHCO3およびブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥した。溶媒の除去後、粗生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィー（溶離液：EtOAc/ヘキサン）に供した。合計0.11gの標題化合物を得た：Rf 0.2（EtOAc：ヘキサン = 2：1）；MS m/z：770.3（M+H+）.
【０２７５】
【化１０６】
2015062428.tif 000131
（2S,4R）-1-（2-アミノアセチル）-4-（7-メトキシ-2-フェニルキノリン-4-イルオキシ）-N-（（1R,2S）-1-（フェニルスルホニルカルバモイル）-2-ビニルシクロプロピル）ピロリジン-2-カルボキサミド：中間体8.B-5の生成物（0.11g、0.13mmol）を2mLのジオキサン中4N HClに溶解し、反応液を室温で1時間攪拌した。溶媒の除去後、3mL分のDCMを注入した後、乾燥するまで蒸発させた。このDCM添加プロセスの後、蒸発を3回繰り返し、化合物中間体6をそのHCl塩（0.10 g）として得た。MS m/z：670.2（M+H+）.
【０２７６】
【化１０７】
2015062428.tif 000132
（2S,4R）-1-（2-アクリルアミドアセチル）-4-（7-メトキシ-2-フェニルキノリン-4-イルオキシ）-N-（（1R,2S）-1-（フェニルスルホニルカルバモイル）-2-ビニルシクロプロピル）ピロリジン-2-カルボキサミド（I-27）：HATUを用いて中間体8.B-6とアクリル酸をカップリングした後、中間体8.B-5で記載したカップリング反応によって標題化合物を作製した。合計0.10gの標題化合物を得た。87%：Rf 0.5（5%MeOH in DCM）；MS m/z：724.3（M+H+）.
【０２７７】
生化学的および細胞データ
化合物12を、実施例4に記載のレプリコンアッセイにおいて試験した。化合物12は、該アッセイにおいて204nMのEC50を有したが、可逆的化合物11は該アッセイにおいて3000nMより大きいEC50を有した。
【０２７８】
野生型および変異体NS3/4A 1b酵素（IC50）のHCVプロテアーゼFRETアッセイ
プロトコルは、In Vitro Resistance Studies of HCV Serine Protease Inhibitors、2004、JBC、vol. 279、No. 17、pp17508-17514の修正FRET系アッセイ（v_02）である。HCV NS3/4A 1bプロテアーゼ酵素のA156S、A156T、D168A、およびD168V変異体に対する化合物の固有効力を以下のようにしてアッセイした：Bioenza（Mountain View、CA）製のNS3/4Aプロテアーゼ酵素の10XストックおよびAnaspec（San Jose、CA）製の1.13X 5-FAM/QXLTM520 FRETペプチド基質を、50mM HEPES、pH7.8、100mM NaCl、5mM DTTおよび20%グリセロール中で調製した。5μLの各酵素をCorning（#3573）384ウェルの黒色非処理マイクロタイタープレート（Corning、NY）内で、30分間 25℃で、0.5μL容量の50%DMSOおよび50%DMSO中で調製した連続希釈化合物とともにプレインキュベートした。45μLのFRET基質の添加によってプロテアーゼ反応を開始し、120分間λex487/λem514で、
BioTek（Winooski、VT）製のSynergy4プレートリーダー内のQuad4モノクロメーター(monochromoters)でモニタリングした。各アッセイの最後に、各ウェルの進行曲線を線形反応速度論について調べ、統計にフィットさせた（R2、絶対二乗和）。時間（分）に対する相対蛍光単位のプロットの傾きから各反応の初期速度（0分〜30+分間）を求め、次いで、インヒビター濃度に対してプロットし、GraphPad Software（San Diego、CA）製のGraphPad Prismのlog[Inhibitor] vs Response、Variable SlopeモデルからIC50を推定した。結果を表12に示す。
【表１２】
2015062428.tif 000133
【０２７９】
データは、HCVプロテアーゼに共有結合する頭部を含む化合物12は野生型および変異体HCVプロテアーゼの(or)強力なインヒビターであるが、可逆的化合物11はそうでないことを示す。
【０２８０】
本明細書に挙げたすべての特許、公開出願および参考文献の教示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。本発明を、その実施例態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解されよう。
【図１Ａ】
2015062428.tif 000136
【図１Ｂ】
2015062428.tif 000137
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2015062428.tif 000139
【図１Ｅ】
2015062428.tif 000140
【図１Ｆ】
2015062428.tif 000141
【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図１Ｑ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月26日(2014.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
A）  標的ポリペプチド内の結合部位に結合される可逆的インヒビターの構造モデルを提供する工程、ここで、可逆的インヒビターは該結合部位と非共有性接触を行なう；
B）  可逆的インヒビターが該結合部位に結合された場合に可逆的インヒビターに隣接する標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基を特定する工程；
C）  標的ポリペプチドに共有結合する候補インヒビターの構造モデルを作製する工程、ここで、各候補インヒビターは、可逆的インヒビターの置換可能な位置に結合された頭部を含み、頭部は、反応性化学官能基と、任意に、反応性化学官能基を標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に配置するリンカーとを含む；
D）  候補インヒビターが結合部位に結合された場合に、頭部の反応性化学官能基が標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内に存在するようになる可逆的インヒビターの置換可能な位置を決定する工程；
E）  候補インヒビターが結合部位に結合された場合に標的ポリペプチドの結合部位内のCys残基の結合距離内である頭部を含む候補インヒビターについて、候補インヒビターが結合部位に結合された場合に結合部位内のCys残基のイオウ原子と頭部の反応性化学官能基間に共有結合を形成させる工程、ここで、約2Å未満の共有結合長さは、候補インヒビターが標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターであることを示す、
を含む、標的ポリペプチドに共有結合するインヒビターを設計するための方法。