(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子サイレンシングにおける使用のためのｓｈＲＮＡ、フラクチャーされたｓｈＲＮＡ、およびＴ字型ＲＮＡに関連する方法および組成物の提供。【解決手段】（ａ）１５ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖であって、前記標的ヌクレオチド配列がウイルス配列であるガイド鎖、及び（ｂ）１０ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドからなり、前記ガイド鎖の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖、を含むｓｈＲＮＡ分子。【選択図】図１
2015211680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１５ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖であって、前記標的ヌクレオチド配列がウイルス配列であるガイド鎖、及び
（ｂ）１０ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドからなり、前記ガイド鎖の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的であるパッセンジャー鎖、
を含むｓｈＲＮＡ分子であって、
ｉ．前記ガイド鎖が前記パッセンジャー鎖に直接結合する、又は
ｉｉ．前記ガイド鎖が前記パッセンジャー鎖にループによって結合し、前記ループが１から２ヌクレオチドからなり、
ここで、前記ループが前記ガイド鎖の３’末端と前記パッセンジャー鎖の５’末端を結合することを特徴とする、ｓｈＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記ｓｈＲＮＡ分子がＤｉｃｅｒの基質ではないことを特徴とする、請求項１記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記ガイド鎖が１７ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記パッセンジャー鎖が１６ヌクレオチド〜１８ヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記標的ヌクレオチド配列がＣ型肝炎ウイルス配列であることを特徴とする、請求項１記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記標的ヌクレオチド配列がＣ型肝炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列中のＣ型肝炎ウイルス配列であることを特徴とする、請求項１記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項７】
請求項１記載のｓｈＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡ配列。
【請求項８】
配列番号１〜３９のいずれか１つのＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子。
【請求項９】
被験体中のＣ型肝炎ウイルスの発現または活性を阻害する方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスを含む細胞と請求項１のｓｈＲＮＡ分子を接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ｓｈＲＮＡ分子が被験体におけるインターフェロン応答を誘導しないことを特徴とする、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって資金援助された研究開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からのＮＩＨ補助金Ｒ４４ＡＩ０５６６１１（ＢＨＪ）によって援助された作業の間に部分的になされた。政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ウイルス遺伝子発現、例えば、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いる、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ媒介性遺伝子発現の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、分解および翻訳減衰のために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とする細胞プロセスである。このプロセスは遺伝子特異的であり、標的配列の小さな変化に不応性であり、そして多重遺伝子標的化が受け入れ可能である。この現象は１９９０年に植物において最初に報告された（Ｎａｐｏｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｅｔｕｎｉａ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９０，２（４）：２７９−２８９）。これは後に、真菌および蠕虫を含む他の生物において観察された（Ｒｏｍａｎｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕｅｌｌｉｎｇ：ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，６（２２）：３３４３−５３）。機構的には、長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによって短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖に切断できる。続いて、これらの小さな二重鎖が、ヘリカーゼ活性と相同転写物の分解を媒介するエンドヌクレアーゼ活性の両方を含むマルチサブユニット複合体であるＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と相互作用する。約１９〜２９ｂｐの合成ｓｉＲＮＡが哺乳動物細胞および動物において遺伝子発現を効果的に阻害できるというこの発見が、治療剤としてこれらの阻害剤を開発するための相次ぐ活動をもたらした（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１（６８３６）：４９４−８）。アルゴリズムに基づく合理的設計選択を含む、高度なｓｉＲＮＡ選択法の最近の進歩は、鍵となる配列および標的配列非依存的である熱力学的パラメーターによって潜在的なｓｉＲＮＡ二重鎖を研究者が選択することを可能にする（Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｉＲＮＡｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｉａｓ．Ｃｅｌｌ，２００３，１１５（１）：２０９−２１６）。
【０００４】
化学的に合成されるか、またはバクテリオファージ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）もしくは哺乳動物（Ｕ６もしくはＨ１などのｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターから発現された１９〜２９ｂｐの低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）もまた、哺乳動物細胞における標的遺伝子の強固な阻害を示している。さらに、その単一分子構造を有する合成ｓｈＲＮＡは、２つの鎖を含むｓｉＲＮＡよりも効力および単純性において利点を有しており、この後者は、様々な純度プロフィールおよび標的を外れる効果を有し得る２つの別々の鎖の正確な化学量論的量の注意深いアニーリングを必要とする（Ｓｉｏｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｈＲＮＡｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ＲＮＡｉ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２３（２）：２２７−２３１；Ｖｌａｓｓｏｖ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，ｓｈＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００７，１７：２２３−２３６）。
【０００５】
しかし、ｓｈＲＮＡの設計および開発の過程にわたっていくつかの難問が生じてきた。第１に、研究者達は、様々なｓｈＲＮＡによって誘導されるサイレンシングのレベルの広い範囲の変動性を観察してきた。第２に、ステム長、ループ長、およびループ位置が変動しているｓｈＲＮＡは、様々なノックダウン能力を有する（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎｓ．ＲＮＡ，２００２，８：８４２−８５０；Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｉｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００３，１３：８３−１０５；Ｌｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｈａｉｒｐｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．ＲＮＡ，２００７，１３：１７６５−１７７４；Ｖｌａｓｓｏｖ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，ｓｈＲＮＡｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００７，１７：２２３−２３６）。ヘアピンの５’末端に１９ヌクレオチドのガイド鎖（左側ループ）を有するいくつかのｓｈＲＮＡは、ヘアピンの３’末端にそれらのガイド鎖（右側ループ）を有するものよりも有効であることが見い出されてきたのに対して（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．ＵＳ  ２００４／００５８８８６  Ａ１）、他のｓｈＲＮＡは、右側ループ構造がより有効であると報告された（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．ＵＳ  ２００６／０２２３７７７  Ａ１）。ヘアピンの３’末端に１９マーのガイド鎖（右側ループ）を有するｓｈＲＮＡは、２５または２９マーのｓｈＲＮＡ（右側ループを有する）よりも強力であることが見い出された。以前に利用可能であった限られたデータは、右側ループを伴う１９ｂｐステムを有するｓｈＲＮＡの最適なループサイズは、４ヌクレオチドより長く、好ましくは９または１０ヌクレオチドであることを示唆した。第３の難問は、合成ｓｈＲＮＡ、とりわけ、１９マーのヘアピンの細胞質におけるプロセシングの機構が不明なことである。長いｄｓＲＮＡおよび２９マーのｓｈＲＮＡとは異なり、１９マーのｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒによって切断されない（Ｓｉｏｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｈＲＮＡｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ＲＮＡｉ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２３（２）：２２７−２３１）。それゆえに、より高度に機能的な阻害剤を提供するために、優れたｓｈＲＮＡのための信頼できる設計、ならびに構造−活性相関およびｓｈＲＮＡのプロセシングのより良好な理解を有することが有利であ��。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、遺伝子サイレンシングにおける使用のためのｓｈＲＮＡ、フラクチャーされたｓｈＲＮＡ、およびＴ字型ＲＮＡに関連する方法および組成物に関する。従って、本発明は、ＲＮＡ干渉の効率を増加させるための組成物、方法、およびキットを提供する。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、第１の配列（例えば、第１のＲＮＡ配列）、例えば、ガイド鎖；第１の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、第１の配列の長さよりも１０ヌクレオチドから１ヌクレオチドの間の短い長さを有する、第２の配列（例えば、第２のＲＮＡ配列）、例えば、パッセンジャー鎖；任意に、第１の配列と第２の配列の間に配置され、１〜１００ヌクレオチドからなるループ配列；および任意に、１または２ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴とする。
【０００８】
別の態様において、本発明は、１６ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、第１の配列（例えば、第１のＲＮＡ配列）、例えば、ガイド鎖；第１の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、第１の配列よりも少なくとも１ヌクレオチド多く、かつ１００ヌクレオチドを超えない第２の配列（例えば、第２のＲＮＡ配列）、例えば、パッセンジャー鎖；任意に、第１の配列と第２の配列の間に配置され、１〜１００ヌクレオチドからなるループ配列；および任意に、１または２ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴とする。
【０００９】
別の態様において、本発明は、１６ヌクレオチド〜１８ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、第１の配列（例えば、第１のＲＮＡ配列）、例えば、ガイド鎖；第１の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、第１の配列と同じ数のヌクレオチドを有する第２の配列（例えば、第２のＲＮＡ配列）、例えば、パッセンジャー鎖；任意に、第１の配列と第２の配列の間に配置され、１または２ヌクレオチドからなるループ配列；および任意に、１または２ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１０】
別の態様において、本発明は、１９ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、第１の配列（例えば、第１のＲＮＡ配列）、例えば、ガイド鎖；第１の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドからなる第２の配列（例えば、第２のＲＮＡ配列）、例えば、パッセンジャー鎖；任意に、第１の配列と第２の配列の間に配置され、１〜１００ヌクレオチドからなるループ配列；および任意に、１または２ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１１】
別の態様において、本発明は、１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、第１の配列（例えば、第１のＲＮＡ配列）、例えば、ガイド鎖；第１の配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である配列を含み、第１の配列と同じかまたはより少ない数のヌクレオチドを有する第２の配列（例えば、第２のＲＮＡ配列）、例えば、パッセンジャー鎖；任意に、第１の配列と第２の配列の間に配置され、１ヌクレオチドからなるループ配列；および任意に、１または２ヌクレオチドからなるヌクレオチド突出を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１２】
別の態様において、本発明は、約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドからなり、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である、第１のＲＮＡ配列、例えば、ガイド鎖；第１の配列とヘアピン構造を形成可能であり、このヘアピン構造は約２３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む第２のＲＮＡ配列、例えば、パッセンジャー鎖、そしてこの第２の配列は以下を含む：第１の配列と少なくとも８０％相同性を有しかつ第１の配列と１９塩基対より少ない第１の二重鎖領域を形成可能である第１の領域；第１の領域と連結された第２の領域；第２の領域と連結された第３の領域；および第３の領域と連結され、第２の領域と少なくとも８０％相同性を有し、第２の領域と第２の二重鎖領域を形成可能であって、その結果、第３の領域が第２の二重鎖領域に隣接するループを形成し、第１の二重鎖領域と第２の二重鎖領域の長さの合計が２３塩基対未満である、第４の領域；および任意に、ＲＮＡ分子の５’または３’末端で約６ヌクレオチドより少ない突出を含む、ＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１３】
別の態様において、本発明は、配列番号１〜３９のいずれか１つのＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１４】
別の態様において、第３の領域は、５’−ＵＵ−３’の配列を有するヌクレオチドを含むループを形成する。さらに、第２の鎖は、５’リン酸基を有するパッセンジャー鎖の一部を含むことができる。１つの実施形態において、５’リン酸基を有する第２の鎖は、第２の鎖の第４の領域に隣接する。別の実施形態において、５’リン酸基を有する第２の鎖は、第２の鎖の第４の領域に隣接していない。
【００１５】
別の態様において、本発明は、標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である第１のＲＮＡ配列、例えば、ガイド鎖、第２のＲＮＡ配列、例えば、パッセンジャー鎖、および第３のＲＮＡ配列を含み、ここで、第１の配列は、第２の配列の第１の領域に対して少なくとも８０％の相補性である約１８ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドまでを有する第１の領域を含み；この第１の配列は、第３の配列の第１の領域に対して少なくとも約９０％の相補性である約４ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドまでを有する第２の領域をさらに含み；第２の配列は、第１の配列の第１の領域に対して少なくとも約８０％の相補性である約１８ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドまでを有する第１の領域を含み；第２の配列は、第３の配列の第２の領域に少なくとも約９０％相補性である約４ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドを有する第２の領域をさらに含み、ここで、第３の配列の第２の領域は、第３の配列の第１の領域に対して３’で隣接しており、そして任意に、ＲＮＡ分子の５’または３’末端で約６ヌクレオチドよりも少ない突出をさらに含む、Ｔ字型ＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１６】
本明細書に記載されたいずれかの態様のある実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、約３０ヌクレオチドから約８４ヌクレオチドまでを含むことができる。
【００１７】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、第１の配列の少なくとも一部に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％相補性である配列を含む第２の配列を含む。特定の実施形態において、第２の配列は、第１の配列の５’末端の部分に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％相補性である、例えば、第２の配列の３’末端における配列を含む。
【００１８】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾、例えば、本明細書に記載される化学修飾を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの約２０％〜約１００％、例えば、約４０％〜約９０％が化学修飾される。１つの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子の約２０％〜約１００％のＵおよびＣが２’Ｏ−メチル修飾または２’Ｆである。
【００１９】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、少なくとも１つの非ヌクレオチド分子を含むループを含む。
【００２０】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の３’末端または５’末端において突出を含む。例えば、この突出は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のヌクレオチドである。
【００２１】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、ポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、第１の配列と第２の配列の間の１個または２個のミスマッチを含む。１つの実施形態において、ミスマッチは、５’末端およびパッセンジャー鎖の逆鎖のヌクレオチドから数えて、ガイド鎖上の１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、または１７位、好ましくは、５’末端およびパッセンジャー鎖の逆鎖のヌクレオチドから数えて、ガイド鎖上の１４位に存在する。
【００２２】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、第１の配列は第２の配列に対して３’である。他の実施形態において、第１の配列は第２の配列に対して５’である。
【００２３】
本明細書に記載されるいずれかの態様のある実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子は、リンカーを介してＲＮＡ分子のループ領域または３’末端に結合された少なくとも１つの結合体部分をさらに含む。この結合体部分は、ステロイド分子、ビタミン、ペプチド、ガラクトースおよびその誘導体、またはタンパク質であり得る。ある実施形態において、この結合体部分は、コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、およびエルゴステロールからなる群より選択されるステロイド分子である。他の実施形態において、この結合体部分はコレステロールであり、リンカーはＣ５リンカー分子である。なお他の実施形態において、この結合体部分はビタミンＥである。
【００２４】
他の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子のループ領域または３’末端に結合された少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む。ある実施形態において、検出可能な標識は色素分子である。ある実施形態において、このＲＮＡ分子は、結合体部分と検出可能な標識の両方を含むことができる。
【００２５】
ある実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列、例えば、ウイルス配列の発現を阻害することが可能である。ある実施形態において、ウイルス配列はＣ型肝炎ウイルス配列である。特定の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、Ｃ型肝炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列中の配列である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡ配列、または本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡ配列を含む発現ベクターを特徴とする。ある実施形態において、このベクターはレトロウイルスベクターである。
【００２７】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を特徴とする。別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする配列を含むベクターを含む組成物を特徴とする。
【００２８】
別の態様において、本発明は、遺伝子の発現または活性を阻害する方法を特徴とし、この方法は、遺伝子を発現する細胞を本明細書に記載されるＲＮＡ分子と接触させることを包含し、ここで、第１のＲＮＡ配列は、遺伝子の少なくとも一部によってコードされる標的ヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的である。
【００２９】
別の態様において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの発現または活性を阻害する方法を特徴とし、この方法は、Ｃ型肝炎ウイルスを発現する細胞を本明細書に記載されるＲＮＡ分子と接触させることを包含し、ここで、第１のＲＮＡ配列はＣ型肝炎ウイルス配列に対して少なくとも部分的に相補的である。
【００３０】
これらの態様のいずれかにおいて、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類におけるものであり得る。
【００３１】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子は、ＩＦＮ応答を誘導しない。
【００３２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡ分子を含む容器；および任意に減少させた血清組織培養培地を含むキットを特徴とする。
【００３３】
以下の図面は例示目的のみのために提示され、限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、種々の構成を含むヘアピンの実施形態の構造を描写する。
【図２】図２は、Ｔ字型ＲＮＡ分子の構造、ならびに第１鎖および第２鎖の第２の領域に相補的な反復配列とともに、長い第３鎖を有することによるＴ字型ＲＮＡ分子の増大を描写する。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、５’パッセンジャー鎖を有するｓｈＲＮＡおよび５’ガイド鎖を有するｓｈＲＮＡの用量応答を比較する。これらのｓｈＲＮＡはＩＤＴによって合成され、ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、２０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．５、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有）で再構築された。２９３ＦＴ細胞（９６ウェルプレート中のウェルあたり２３，０００細胞）が、ｓｈＲＮＡ、およびホタルルシフェラーゼ発現がＨＣＶ  ＩＲＥＳに依存する標的ＤＮＡプラスミド（ＩＲＥＳ−ｆＬｕｃ）と同時トランスフェクトされた。リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がトランスフェクション試薬として使用された。４８時間後、細胞が溶解され、ホタルルシフェラーゼ活性がルミノメーターによって測定された。すべてのデータは、３連で実行された個々の独立した実験の結果である。図３Ｄ〜３Ｆは、Ｏｌｉｇｏ  ４．０によって計算されたｓｈＲＮＡの内部安定性について同じｓｈＲＮＡのセットを比較する。結果は、５’−ガイド鎖を有するｓｈＲＮＡが５’−パッセンジャー鎖を有するｓｈＲＮＡと比較して機能が増強されたことを実証する。増強の程度は配列依存性であり、５’末端の内部安定性の違いは重要な寄与を生じる。
【図４】図４は、種々のループ長、配列、およびループを閉じる塩基対を有するｓｈＲＮＡの用量応答を描写する。この実験は、図３において記載された様に行われた。図４Ａは、１０ヌクレオチド、５ヌクレオチド、２ヌクレオチド、および１ヌクレオチド（ｎｔ）のループを有するｓｈＲＮＡの効力を比較する。二重鎖領域の配列は、これらのｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ  １９−３の中で同じである。これらの結果は、５’−ガイド鎖を有するｓｈＲＮＡが、ループサイズがより大きい場合（５または１０ｎｔ）よりもループサイズが非常に小さい（１または２ｎｔ）場合に、高い効力を有することを示す。ループ配列は、おそらく、ｓｈＲＮＡ活性に影響を与えない。なぜなら、３つの異なるループ配列が使用されているからである。図４Ｂは、ループの直前のＵ：ＡおよびＣ：Ｇ塩基対を有するｓｈＲＮＡの活性を比較する。ループの配列（下線）および隣接する塩基対は括弧内に示される。二重鎖領域の配列は、これらのｓｈＲＮＡの中で同じである。この比較は、ループが２ｎｔ長である場合に、ループに隣接するＣ：Ｇ塩基対を有するｓｈＲＮＡが、隣接するＵ：Ａ対を有するものよりも良好な効力を与えることを示す。図４Ｃは、ｓｈＲＮＡのループ中のＵＵ−リボヌクレオチド配列が、ｓｈＲＮＡの効力に影響を与えることなく、ＴＴ−デオキシリボヌクレオチド配列で置き換えできることを示す。二重鎖の配列は、これらのｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ１９−３の両方について同じである。
【図５】図５は、種々の二重鎖長および３’突出を有するｓｈＲＮＡの用量応答を描写する。この実験は図３に記載されたように行われた。図５Ａは３’突出のあるなしでｓｈＲＮＡの活性を比較する。結果は、平滑末端または３’−ＴＴ突出を有するｓｈＲＮＡが、３’−ＵＵ突出を有する対応するｓｈＲＮＡと非常によく似た効力を有することを示す。図５Ｂは、種々の長さの二重鎖またはパッセンジャー鎖を有するｓｈＲＮＡの効力を比較する。ｇ／ｐ値は、ガイド鎖／パッセンジャー鎖の長さを表す。この比較は、１９ｎｔのガイド鎖の長さを維持しながら、１７または１６ｎｔまでパッセンジャー鎖を短縮することが、遺伝子サイレンシング活性を有意に減少することを示唆する（ＳＧ１１５およびＳＧ１１６）。しかし、パッセンジャー鎖とガイド鎖の両方を１８ｎｔ長まで短縮することは、効力に有意な影響を与えなかった（ＳＧ１１７）。図５Ｃは、さらに短い二重鎖長を有するｓｈＲＮＡの活性を描写する。二重鎖中に１７または１６塩基対を有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１１７およびＳＧ１１９）は非常に類似した効力を有する。二重鎖中に１１塩基対を有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１２０）は、サイレンシング活性の顕著な喪失を示し、この分子のＩＣ５０はなおナノモル以下の範囲にある。
【図６】図６は、種々の短いステム長を有するｓｈＲＮＡの用量応答を描写する。この実験は、図３において記載されたように行われた。図６Ａは、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の両方の長さを変化させたｓｈＲＮＡの活性を比較する。結果は、１４塩基対以下の長さの二重鎖を有するｓｈＲＮＡが使用された場合（ＳＧ１３２およびＳＧ１２０）、ｓｈＲＮＡの効力が顕著に減少することを示す。図６Ｂは、ガイド鎖の長さを１９ｎｔに維持しながら、１０〜１３ｎｔのパッセンジャー鎖を有するｓｈＲＮＡの活性を描写する。結果は、ｓｈＲＮＡの活性が、パッセンジャー鎖について１１ｎｔの最小長を含むヘアピンを必要とすることを示す。
【図７】図７は、様々な標的に対する種々の構造のｓｈＲＮＡの効力を描写する。この実験は、図３に記載されたように行われた。図７Ａおよび７Ｂは、ｓｉ７２およびｓｉ７４と同じ標的に対するｓｈＲＮＡの活性をそれぞれ示すが、構造は異なっている。結果は、３’−ＵＵ突出がｓｈＲＮＡの活性のためには必須ではないことを示す。二重鎖領域の短縮は、標的遺伝子ノックダウン活性を部分的に減少できた。
【図８】図８は、二重鎖領域の様々な位置で単一のミスマッチを有するｓｈＲＮＡの用量応答を描写する。図８Ａは、パッセンジャー鎖の５’末端からの６位（ガイド鎖の５’末端からの逆鎖の１４位）に単一のミスマッチを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１１０）と有さないｓｈＲＮＡ（ＳＧ１４２）の間で同様の活性を示す。図８Ｂは、単一のミスマッチを有さないｓｈＲＮＡ（ＳＧ１４２）と、パッセンジャー鎖の５’末端から６位（ＳＧ１２６）、７位（ＳＧ１２７）、５位（ＳＧ１２８）、および４位（ＳＧ１２９）（ガイド鎖の５’末端から逆鎖の１４位、１３位、１５位、および１６位）に単一のミスマッチ変異をそれぞれ有するｓｈＲＮＡの間で同様の活性を示す。単一のミスマッチに伴うこの活性喪失の欠如は、ミスマッチの型と無関係であるようであり（例えば、Ｕ−Ｕ（ＳＧ１１０）＝Ｕ−Ｃ（ＳＧ１２６））、この形質が配列非依存的であることを示唆する。すべてのｓｈＲＮＡは５’−ＵＵ−３’ループおよび３’−ＵＵ突出を有する。
【図９】図９は、ｓｈＲＮＡの標的阻害がダイマーまたはオリゴマーの形成に起因していないことを描写する。図９Ａは、加熱および即時冷却のありなしでのｓｈＲＮＡの標的阻害を比較する。複数の種を有するｓｈＲＮＡよりもわずかに低いが、加熱および即時冷却によって得られたｓｈＲＮＡモノマーの単一の種は、試験された配列または長さに関わらず標的遺伝子サイレンシングにおいて高い活性を示す。図９Ｂは、加熱（９５℃で４分間）および氷冷バス中でのｓｈＲＮＡの即時冷却のあるなしでの、１０％ネイティブポリアクリルアミドゲル中でのｓｈＲＮＡのモノマー、ダイマー、およびオリゴマーを示す。このゲルはＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。
【図１０】図１０は、モノマーおよび混合種におけるｓｈＲＮＡの様々な挙動を描写する。図１０Ａは、大部分がモノマーである場合にはＳＧ１１９がより高いサイレンシング活性を有するのに対して、大部分がダイマーである場合にはＳＧ１２０がより高いサイレンシング活性を有することを示す。図１０Ｂは、加熱（９５℃で４分間）および氷冷バス中でのｓｈＲＮＡの即時冷却のあるなしでの、１０％ネイティブポリアクリルアミドゲル中でのｓｈＲＮＡのモノマー、ダイマー、およびオリゴマーを示す。
【図１１】図１１は、ニックのあるなしの、およびＴ字型ＲＮＡのｓｈＲＮＡの効力を描写する。この実験は、図３に記載されたように行われた。これらの実験において使用されたｓｈＲＮＡの濃度には、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ、および０．００３ｎＭが含まれる。２通りの濃度（０．３および０．０３ｎＭ）のみがＳＧ１０２で試験された。ＳＧ６８Ｌ、ＳＧ１４６、およびＳＧ１４２は、３’−ＵＵ突出を伴う同じ二重鎖配列を有する。ＳＧ６８ＬおよびＳＧ１４６は５’−ＣＡＡＵＡ−３’ループを有するのに対して、ＳＧ１４２は５’−ＵＵ−３’ループを有する。ＳＧ１４６はＤｈａｒｍａｃｏｎのｓｉＲＮＡアニーリング指示書に従って一緒にアニーリングされた２つのＲＮＡ分子から構成される。第１の分子はガイド鎖、ループ、および４−ヌクレオチドパッセンジャー鎖を含み；第２の分子は１５ヌクレオチドのパッセンジャー鎖の３’末端および３’突出を含む。ＳＧ１０２は、第１の鎖および第２の鎖の第１の領域にガイド鎖およびパッセンジャー鎖を有する３ＲＮＡ分子から構成される（図２Ａ）。第３の鎖は第１の鎖および第２の鎖の第２の領域に相補的である。
【図１２】図１２は、肝細胞癌細胞系統Ｈｕｈ７におけるｓｈＲＮＡの効力を描写する。２９３ＦＴ細胞における結果と一致して、ＳＧ６８ＬはＳＧ６８よりも効力が高い。陰性対照であるＳＧ１０１は、いかなる所定の濃度においてもホタルルシフェラーゼ遺伝子発現を減少させなかった。
【図１３】図１３は、いくつかの高度に強力なｓｈＲＮＡの阻害活性がＩＦＮ応答または細胞傷害性に起因しないことを示す。図１３Ａは、ｓｈＲＮＡトランスフェクション後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−応答性遺伝子ＯＡＳ１の発現を描写する。図１３Ｂは、ｓｈＲＮＡトランスフェクション後のヒト肝細胞癌細胞系統（Ｈｕｈ７）における３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の取り込みを描写する。まとめると、図１３Ａおよび１３Ｂのこれらのパネルは、ＩＦＮ応答または細胞傷害性がこれらのｓｈＲＮＡによって誘導されたのではないことを示す。
【図１４】図１４は、１９以下の塩基対のステム長を有するｓｈＲＮＡが組換えＤｉｃｅｒのための基質であることを示す。Ｄｉｃｅｒによる処理の生成物は、非変性ＰＡＧＥ（図１４Ａ）および変性ＰＡＧＥ（図１４Ｂ）によって分析される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な方法および材料は本発明の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料は以下に説明される。ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示のみであって、限定することを意図しない。
【００３６】
本開示の実施形態は、ｓｈＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングを実施するための組成物および方法に向けられる。ｓｈＲＮＡ、修飾ｓｈＲＮＡ、フラクチャーｓｈＲＮＡ、修飾フラクチャーｓｈＲＮＡ、Ｔ字型ＲＮＡ、およびこれらの誘導体の使用により、ＲＮＡ干渉の効率が改善されてもよい。従って、本開示は、ｓｈＲＮＡの機能を増加するための組成物、方法、およびキットを提供する。好ましくは、本開示は、ウイルス遺伝子発現を阻害するため、および／またはヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染を治療するために、ｓｈＲＮＡの機能を改善するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｓｈＲＮＡ構築物は、ｓｈＲＮＡのガイド鎖配列によって認識される標的配列の中または近傍のウイルスポリヌクレオチド配列の切断を誘導することによって、ウイルスの遺伝子発現を阻害する。
【００３７】
本明細書で使用される「ショートヘアピンＲＮＡ」という語句または「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉを実施することが可能であり、かつパッセンジャー鎖、ループ、およびガイド鎖を有する単分子ＲＮＡをいう。好ましくは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、互いに実質的に相補的である。ガイド鎖は約１６〜約２９ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜１９ヌクレオチド長であり得る。パッセンジャー鎖は約１１〜約２９ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜１９ヌクレオチド長であり得る。ガイド鎖は、標的ｍＲＮＡに相補的である少なくとも１７塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的に相補的なガイド鎖はミスマッチを含むことができる。その配列は、遺伝的変異または表現型の配列に相補的であるように標的配列を変化させることによって、標的、例えば、ウイルス標的の1つ以上の遺伝的変異または表現型を標的とするために変動可能である。いくつかの実施形態において、配列は、複数のウイルス系統、例えば、ＨＣＶのウイルス系統を標的とすることができるが、配列は、標的配列の少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１個、２個、または３個のヌクレオチド）によって、１つの系統の標的とは異なり得る。ｓｈＲＮＡは、例えば、０〜約２４ヌクレオチド長、好ましくは、０〜約１０ヌクレオチド長、およびより好ましくは、２ヌクレオチド長までの長さのループを有してもよい。このループの配列は、標的に無関係なヌクレオチド残基を含むことができる。１つの特に好ましい実施形態において、ループは５’−ＵＵ−３’である。いくつかの実施形態において、これは非ヌクレオチド部分を含んでもよい。さらに他の実施形態において、このループはいかなる非ヌクレオチド部分も含まない。任意に、ｓｈＲＮＡは、分子の３’末端に２塩基の突出領域を有することができる。ｓｈＲＮＡは、ミスマッチおよび／またはバルジを含むステム−ループ構造を伴うＲＮＡもまた含むことができる。標的に対して相同であるパッセンジャー鎖は、例えば、天然に存在するマイクロＲＮＡにはよくあることだが、約１〜約５ヌクレオチドのミスマッチ、挿入、または欠失を有することによって、約０〜約５箇所の部位において異なり得る。上記の構造のいずれかを含むＲＮＡは、ループがヌクレオチド、非ヌクレオチド、またはヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの組み合わせを含む構造を含有することができる。任意のｓｈＲＮＡの中で、好ましくは、複数の、より好ましくはすべてのヌクレオチドがリボヌクレオチドである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｓｈＲＮＡは、少なくとも１つの結合体部分を任意に含む。
【００３９】
本明細書で使用される「フラクチャーｓｈＲＮＡ」という語句は、２つ以上の離れた鎖を含むショートヘアピンＲＮＡをいう。このような分子は、種々の様式で組織化でき（例えば、５’−パッセンジャー−フラクチャー−パッセンジャー−ループ−ガイド、５’−ガイド−ループ−パッセンジャー−フラクチャー−パッセンジャー）、分子中のフラクチャーは、ニック、1つ以上の不対ヌクレオチドに接するニック、またはギャップを含むことができる。
【００４０】
本明細書で使用される「Ｔ字型ＲＮＡ」という語句は、少なくとも別々の３つの鎖：第１の鎖、第２の鎖、および第３の鎖を含むＴ字型ＲＮＡをいう。第１の鎖と第２の鎖の両方は、以下のような２つの領域（ＩおよびＩＩ）を含む：第１の鎖の第１の領域は、第２の鎖の第１の領域とアニーリングまたはハイブリダイズが可能であり；１つの鎖の第１の領域は標的ｍＲＮＡに相補的な少なくとも１７塩基を含むことができ；両方の鎖の第１の領域は約１７〜２９ヌクレオチド長、好ましくは２２ヌクレオチド長であり得；第１の鎖の第２の領域は、第３の鎖の部分とアニールまたはハイブリダイズでき；第２の鎖の第２の領域は、第１の鎖の第２の領域とハイブリダイズする部分に対して隣接しかつ３’である第３の鎖の部分とアニールまたはハイブリダイズでき；第１の鎖および第２の鎖の第２の領域は互いに相補的ではなく、約４〜約１０ヌクレオチド長、好ましくは８ヌクレオチド長であり得；第３の鎖は少なくとも約８ヌクレオチド長であり得；第３の鎖は、第１の鎖および第２の鎖の対（ｈｅｒ  ｐａｉｒｓ）の第２の領域に対して相補的である複数の配列を有してもよく、その結果、第１の鎖および第２の鎖から構成される複数の二重鎖が第３の鎖にアニールすることができ；任意に、第２の鎖の３’末端に２塩基の突出領域が存在する。
【００４１】
本明細書に記載されるｓｈＲＮＡ、フラクチャーｓｈＲＮＡ、およびＴ字型ＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを実施する際に有用であり得る。また、いくつかの例において、これらはヘアピンのステムの長さと同様または等価である長さを有する二重鎖より好ましくあり得、このことは、本明細書に記載されるｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉がより効率的であり、かつ細胞のストレスおよび／または毒性を誘導する可能性がより少なくあり得るという事実に起因する。
【００４２】
加えて、「ショートヘアピンＲＮＡ」という語句および「ｓｈＲＮＡ」という用語は、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド間連結、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、およびこれらの言及されたヌクレオチドのアナログを含むがこれらに限定されない、リボヌクレオチド部分以外の部分もまた含有する核酸を含む。
【００４３】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、各々の末端において二重鎖領域および非相同残基の３’突出を含むＲＮＡ分子をいう。二重鎖領域は、典型的には、約１８〜約３０ヌクレオチド長であり、突出は任意の長さの非相同残基の突出であってもよいが、２ヌクレオチド突出が好ましい。
【００４４】
本明細書で使用される「ガイド鎖」という語句は、目的の標的核酸に実質的に相補的であるか（例えば、８０％以上）または１００％相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域をいう。ｓｈＲＮＡのガイド鎖はまた、そのパッセンジャー鎖に少なくとも実質的に相補的である。ガイド鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＲＮＡ／ＤＮＡであるポリヌクレオチド領域から構成できる。ガイド鎖中の任意のヌクレオチドが、そこに結合される置換基を、例えば、２’修飾において、含むことによって修飾できる。ガイド鎖はまた、小分子および／または結合体の多様な群で修飾できる。例えば、ガイド鎖は、メッセンジャーＲＮＡの分子、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ネガティブ鎖およびポジティブ鎖ウイルスＲＮＡ、およびその相補ＲＮＡ）またはコード鎖もしくは非コード鎖のいずれかであるＤＮＡの配列に対して、全体としてまたは部分的に相補的であってもよい。
【００４５】
ガイド鎖は、ガイド鎖ヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、より大きな鎖の一部であってもよい。例えば、Ｔ字型ＲＮＡ構造の場合において、第１の鎖または第２の鎖は、ガイド鎖、および第３の鎖に対して相補的であるが、標的に対しては相補的ではないさらなるヌクレオチドを含んでもよい。フラクチャーヘアピンの場合において、ガイド鎖は、ループ領域およびガイド鎖の一部に相補的である第３の領域もまた含む鎖の一部であり得る。
【００４６】
本明細書で使用される「パッセンジャー鎖」という語句は、メッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡの配列などの標的核酸と同じヌクレオチド配列を、全体としてまたは部分的に有する、ポリヌクレオチドまたは領域をいう。配列が慣例によって提供されるとき、他に示されない限り、これはパッセンジャー鎖（または領域）であり、相補的なガイド鎖（または領域）の存在は暗黙である。
【００４７】
本明細書で使用される「相補性」という用語は、互いと塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力をいう。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域におけるヌクレオチド単位の間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン−クリック様式で（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）または安定な二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対形成できる。
【００４８】
本明細書で使用される「完全な相補性」または「１００％相補性」とは、１つのポリヌクレオチド鎖または領域（ｒｅｇｉｏｉｎ）の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチド単位と水素結合を形成できる状態をいう。完全より少ない相補性とは、２つの鎖または２つの領域のいくつかの、しかしすべてではないヌクレオチド単位が、互いに水素結合できる状態をいう。例えば、２つの１９マーについては、各鎖または各領域上の１７塩基対がお互いに水素結合できる場合、これらのポリヌクレオチド鎖は８９．５％相補性を示す。実質的な相補性は、８０％以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖または領域をいう。
【００４９】
本明細書で使用される「デオキシヌクレオチド」という用語は、適切な結合および／または２’，３’末端ジデオキシを有する糖部分の２’または３’位のＯＨ基を欠き、代わりに２’および／または３’炭素に結合された水素を有する、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。
【００５０】
本明細書で使用される「デオキシリボヌクレオチド」および「ＤＮＡ」という用語は、そのリボシル部分の２’位において、ＯＨの代わりにＨを有する少なくとも１つのリボシル部分を含む、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。
【００５１】
本明細書で使用される「ミスマッチ」という用語は、ワトソン−クリック塩基対形成が、ガイド鎖のヌクレオチドとパッセンジャー鎖のヌクレオチドの間で起こらない状況を含み、ここで、これらのヌクレオチドは、ミスマッチ位置のすぐ後で（５’方向で）開始する５’方向のミスマッチの塩基対、およびミスマッチ位置のすぐ後で（３’方向で）開始する３’方向のミスマッチの塩基対を含む二重鎖によって隣接される。ミスマッチの例には、Ｇに向き合ったＡ、Ａに向き合ったＣ、Ｃに向き合ったＵ、Ａに向き合ったＡ、Ｇに向き合ったＧ、Ｃに向き合ったＣなどが非限定的に含まれる。ミスマッチには、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドに向き合った無塩基残基、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドに向き合った非環式残基、ギャップ、または不対ループもまた含まれる。その最も広い意味において、ミスマッチには、変化が出現する位置またはその近傍において熱力学的安定性を減少し、その結果、特定の位置における二重鎖の熱力学的安定性が、その位置におけるワトソン−クリック塩基対の熱力学的安定性よりも小さい、所定の位置における任意の変化が含まれる。好ましいミスマッチには、Ａに向き合ったＧ、Ｃに向き合ったＡが含まれる。特に好ましいミスマッチには、Ａに向き合ったＡ、Ｇに向き合ったＧ、Ｃに向き合ったＣ、およびＵに向き合ったＵが含まれる。
【００５２】
「ＲＩＳＣ」および「ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体」という語句は、本明細書で交換可能に使用され、ＲＮＡｉを媒介するタンパク質の複合体を表す（例えば、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５  ５７９（２６）：５８５０−７を参照のこと）。
【００５３】
「ＲＮＡ干渉」という語句および「ＲＮＡｉ」という用語は本明細書で交換可能に使用され、一本鎖、二本鎖、またはＴ字型の分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）が、Ｄｒｏｓｈａ、ＤＩＳＣ、Ｄｉｃｅｒなどを含むがこれらに限定されないＲＮＡｉ経路の1つ以上の構成要素と相互作用することによって生物学的プロセスに対して効果を発揮するプロセスをいう。このプロセスは、ｍＲＮＡを分解することによる遺伝子サイレンシング；翻訳の減衰、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡとの相互作用；ならびに補助タンパク質を用いるＤＮＡの阻害およびメチル化を包含するがこれらに限定されない。加えて、ＲＮＡｉを調節する分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ阻害剤）は、ＲＮＡｉ経路を増強する分子のリストに含まれる（例えば、Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００５，１９（５）：５１７−２９を参照のこと）。
【００５４】
本明細書で使用される「サイレンシング」という語句は、例えば、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、ＰＣＲベースの方法、ノーザンブロット分析、分枝ＤＮＡ、ウェスタンブロット分析、および当該分野で認識されている他の技術などのレポーター方法を含む任意の数の方法によって測定できる、遺伝子発現におけるＲＮＡｉ媒介性の減少を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、飽和または不飽和、および置換または非置換であり得る炭化水素部分をいう。これは、直鎖状、分枝状、環状、および／または複素環式であり、エーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸などのような官能基を含む部分を含んでもよい。他に特定されない限り、アルキル基は、環状、複素環式ではなく、または官能基を含む。
【００５６】
例示的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコイル（ｅｉｃｏｙｌ）、およびより大きな数の炭素のアルキル基の置換および非置換基、ならびに２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、および（ｎａｄ）２−エチルヘキシルが含まれるがこれらに限定されない。アルキルという用語は、ビニル基、アリル基、アラルキル基、およびアルキニル基などのアルケニル基もまた包含する。他に特定されない限り、アルキル基は置換されていない。
【００５７】
アルキル基の中での置換は、存在すると特定される場合、アルキル部分の中で容認できる任意の原子または基を含むことができ、これには、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（１級、２級、または３級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が含まれるがこれらに限定されない。アルキル基は、例として、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、またはニトリル基、イミダゾールなどの複素環、ヒドラジンまたはヒドロキシアミノ基、イソシアネート基またはシアネート基、ならびにスルホキシド、スルホン、スルフィド、およびジスルフィドなどの硫黄含有基などの修飾もまた含むことができる。他に特定されない限り、アルキル基は、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン、アミド、エーテル、エステル、アルコール、酸素、または上記に列挙された修飾を含まない。
【００５８】
さらに、アルキル基はまた、ヘテロ置換を含んでもよく、これは、例えば、窒素、酸素、または硫黄による炭素原子の置換である。複素環式置換とは、1つ以上のヘテロ原子を有するアルキル環をいう。複素環部分の例には、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリジノが含まれるがこれらに限定されない。他に特定されない限り、アルキル基は、ヘテロ置換、または1つ以上のヘテロ原子を有するアルキル環（すなわち、複素環置換）を含まない。
【００５９】
２’修飾のための好ましいアルキル基は、リボシル部分の２’炭素へのＯ連結を有するメチル基、すなわち、２’−Ｏ−メチル基を含む２’Ｏ−アルキルである。
【００６０】
「２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド」という語句は、本明細書で使用される場合、糖部分、例えば、酸素原子が、糖の２’位に配置された炭素原子とアルキル基の両方に結合されるように、２’位において修飾されているデオキシリボシル部分を有するヌクレオチド（ｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）単位をいう。種々の実施形態において、このアルキル部分は、炭素および水素から本質的になる。特に好ましい実施形態は、アルキル部分がメチルであるものである。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「２’炭素修飾」という用語は、糖部分、例えば、糖サブユニットの２’位において修飾されている部分を有するヌクレオチド単位をいう。「２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド」は、この位置で修飾され、その結果、酸素原子が糖の２’位に結合されるのと、アルキル基に位置することの両方であり、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、および２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）である。本明細書で使用される場合、「２’炭素パッセンジャー鎖修飾」は、パッセンジャー鎖上のヌクレオチドの２’炭素の位置における修飾をいう。本明細書で使用される場合、「２’炭素ガイド鎖修飾」は、ガイド鎖上のヌクレオチドの２’炭素の位置における修飾をいう。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはこれらの修飾型、ならびにそれらのアナログをいう。ヌクレオチドには、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体およびアナログ、ならびにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体およびアナログを含む種が含まれる。好ましくは、「ヌクレオチド」は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、またはグアニン部分を含む。
【００６３】
ヌクレオチドアナログには、塩基、糖、および／またはリン酸の化学構造の修飾を有するヌクレオチドが含まれ、これらには、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンの修飾、および５−ブロモウラシルの置換が含まれるがこれらに限定されず；ならびに２’位糖修飾が含まれるがこれらに限定されず、ここでは、２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮなどの基によって置き換えられる糖修飾リボヌクレオチドが含まれ、ここで、Ｒは本明細書で定義されるようなアルキル部分である。ヌクレオチドアナログは、イノシン、クエオシン、キサンチンなどの塩基、２’−メチルリボースなどの糖、メチルホスホネート、ホスホロチオエート（ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ）、およびペプチドなどの非天然ホスホジエステル結合を伴うヌクレオチドもまた含む。
【００６４】
修飾塩基は、1つ以上の原子または基の置き換えまたは付加によって修飾された、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシル、キサンチン、イノシン、およびクエオシンなどのヌクレオチド塩基をいう。修飾の型のいくつかの例には、塩基部分に関して修飾されているヌクレオチドが含まれ、これには、種々の組み合わせにおける、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、またはアセチル化された塩基が含まれるがこれらに限定されない。より特定の修飾塩基には、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２’−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｅｎ）、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジンおよび４−チオウリジンおよび２−チオシチジンなどの他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、クエオシン、アーカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼンなどのフェニルおよび修飾フェニル基、Ｇ−クランプヌクレオチドとして働く修飾シトシン、８−置換アデニンおよびグアニン、５−置換ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、ならびにアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが含まれる。修飾ヌクレオチドはまた、糖部分に関して修飾されているヌクレオチド、ならびにリボシルではない糖またはそのアナログを有するヌクレオチドを含む。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４−チオリボース、および他の糖、複素環または炭素環であってもよく、またはこれらの糖をベースにしてもよい。ヌクレオチドアナログという用語は、普遍的な塩基として当該分野において公知であるものもまた含む。例として、普遍的塩基には、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンが含まれるがこれらに限定されない。
【００６５】
さらに、ヌクレオチドアナログという用語には、例えば、ヌクレオチドに結合された放射活性部分もしくは蛍光部分、または質量標識などの検出可能な標識を有する種もまた含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「突出」という用語は、第１の鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて伸びる１つの鎖または領域から生じる末端の非塩基対形成ヌクレオチドをいう。水素結合を通して二重鎖を形成することが可能である1つ以上のポリヌクレオチドは突出を有することができる。二重鎖の３’末端を超えて伸びる一本鎖領域は突出と呼ばれる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語および「リボ核酸」（ＲＮＡ）という語句は、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または非修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の１’位におけるＮグリコシド結合で結合された窒素性塩基を有するリボシル部分の２’位に結合した酸素、および別のヌクレオチドへの連結を可能にするか、または連結を防止するかのいずれかである部分を含む。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」という語句は、本開示の組成物を動物またはヒトに投与するための薬学的に許容される塩、溶媒、懸濁剤、または媒体を意味する。キャリアは液体、半固体、または固体であってもよく、しばしば、希釈剤、賦形剤、または塩と同義語的に使用される。「薬学的に許容される」という語句は、開示される成分、賦形剤、キャリア、または成分が、合理的な損益比率と釣り合っている、過度の有害な副作用（毒性、炎症、およびアレルギー反応など）を伴うことなくヒトおよび／または動物での使用のために適切であるものであることを意味する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）を参照のこと。
【００６９】
「約」という用語は、所与の数値の±２０％の値を意味するために本明細書で使用される。従って、「約６０％」は、６０±（６０の２０％）の間の値（すなわち、４８と７０の間）を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「含む」は、「含有する」「包含する」または「によって特徴付けられる」と同義語であり、包括的またはオープンエンド型であり、さらなる列挙されていない構成要素または方法の工程を除外しない。本明細書で使用される場合、「からなる」は、請求項の要素において特定されていない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない物質または工程を除外しない。本明細書における各々の例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語は、他の２つの用語のいずれかで置き換えられてもよい。本明細書において適切に例示的に説明された本開示は、本明細書において具体的に開示されていない構成要素の任意の要素、１つまたは複数の限定の非存在下で実施されてもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ配列を標的とするｓｈＲＮＡを試験する方法が、十分な活性（例えば、このような配列の選択された群の中で最高の活性）を有する配列を、治療としての使用のための候補として同定するために含まれる。試験はまた、望ましくない標的を外れた効果を有するｓｈＲＮＡをスクリーニングすることもまた含んでもよい。標的を外れる効果には、非限定的に、標的としていない遺伝子のノックダウン、標的としていない遺伝子の発現の阻害、および天然のマイクロＲＮＡ経路との競合が含まれる。細胞傷害性効果を同定するための方法は当該分野において公知である。
【００７２】
１つの実施形態において、本明細書に記載されるｓｈＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの配列に相補的な配列を含む。
【００７３】
ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）発現がＨＣＶ  ＩＲＥＳに依存する二重レポータールシフェラーゼプラスミドが使用された。上流レニラルシフェラーゼの発現はＨＣＶ  ＩＲＥＳ依存的ではなく、Ｃａｐ依存的プロセスで翻訳される。ＨＣＶ  ＩＲＥＳ  ｓｈＲＮＡの直接トランスフェクションは、ヒト２９３ＦＴ細胞およびＨｕｈ７細胞において、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介ｆｌｕｃ発現を効率的に阻止した。二重変異を含む対照ｓｈＲＮＡは、ｆＬｕｃ発現に効果がほとんどないかまたは効果が全くなく、単一の変異のみを含むｓｈＲＮＡは部分的な阻害を示した。これらのｓｈＲＮＡは、ＤＮＡ構築物が、尾静脈を介する流体力学的トランスフェクションによって肝臓中の細胞に送達されたマウスモデルにおいてもまた評価された。二重ルシフェラーゼ発現プラスミド、ｓｈＲＮＡ、および分泌性アルカリホスファターゼプラスミドは、肝臓中の細胞をトランスフェクトするために使用され、これらの動物は１２〜９６時間にわたる時点で画像化された。インビボ画像化は、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ  ｓｈＲＮＡが、直接的に、または代替的にはｐｏｌＩＩＩプラスミドベクターから発現され、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ依存性レポーター遺伝子発現を阻害し；変異型または無関係なｓｈＲＮＡはほとんど効果がなかったかまたは全く効果がなかったことを明らかにした。これらの結果は、ＲＮＡとして送達されたか、またはウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターから発現されたｓｈＲＮＡが、ＨＣＶおよび関連するウイルスの制御のために有効な抗ウイルス剤として有用であることを示す。
【００７４】
ＲＮＡｉ活性と合成ｓｈＲＮＡの構造との間の関連性をさらに研究するために、ＨＣＶ  ＩＲＥＳの配列に相補的なガイド鎖配列および同じ配列を含む対応する合成ｓｉＲＮＡを有する、複数のｓｈＲＮＡ、フラクチャーｓｈＲＮＡ、およびＴ字型ＲＮＡが、阻害活性、ＩＦＮ、および細胞傷害性についてアッセイされた。試験された構築物の多くが高レベルのＲＮＡｉ活性を示した。一般的に、ヘアピンの５’末端にガイド鎖を有するｓｈＲＮＡは、３’末端に同じガイド鎖を有するものよりも強力であった。次いで、５’ガイド鎖を有するｓｈＲＮＡの構造改変体がさらに研究された。
【００７５】
ｓｈＲＮＡのループ領域のサイズおよび配列もまた研究された。ループは、ｓｈＲＮＡ活性に有意な影響を与えることなく１ヌクレオチドまで小さくあり得、ループサイズには明確な上限がない；一般的に、ループは２〜１０ヌクレオチドの間であり、一般的には、例えば、非標的遺伝子に対して相補的であることによって、意図されない効果を引き起こすことはない配列である。しかし、５’末端にガイド鎖を有するｓｈＲＮＡには短いループが有利である。具体的には、２ヌクレオチドループ（５’−ＵＵ−３’）は、１０ヌクレオチド、５ヌクレオチド、または１ヌクレオチドのループを有するｓｈＲＮＡの間で最良の効力をｓｈＲＮＡに与えた。ループの直前のループを閉じる塩基対は、短いループ（例えば、２ヌクレオチドループ）に対して重要であるが、ｓｈＲＮＡの高い機能を維持するためには長いループ（５ヌクレオチドループ）に対して重要なほどではない。従って、二重鎖形成を強化するために働くことができた、ＵＵループの直前に「ＣＧクランプ」を有するｓｈＲＮＡは、ＡＵ塩基対を有するものよりも４．６倍低いＩＣ５０を与えた（図５Ｂ）。別の態様において、このループは、ｓｈＲＮＡの遺伝子ノックダウン活性に影響を与えることなく、パッセンジャー鎖の５’末端に直接結合された、ガイド鎖の３’部分を含むことができる。この場合において、このループは２〜８ヌクレオチド長である。
【００７６】
ループ構造はまた、デオキシリボヌクレオチド、非ヌクレオチドモノマー、およびＳ−Ｓ結合などの可逆的連結を含むことができ、これは、例えば、（Ｅａｒｎｓｈｗａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，２７４：１９７−２１２；Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｉｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９９，１８：７１−７７）記載されるように、ヌクレオチド残基に導入された−ＳＨ基の酸化によって形成できる。
【００７７】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。これらの実施例は例示目的のみのために提供される。これらは、いかなる場合においても、本発明の範囲および内容を限定するものとしては解釈されない。
フォームの始まり
【実施例】
【００７８】
実施例１−標的ノックダウンにおける効力を改善するためのｓｈＲＮＡ構造の最適化
標的ノックダウンにおける効力が増加したｓｈＲＮＡ構造を同定するために、５’−パッセンジャー鎖（右側のループ）を有する３セットのｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ６８、ｓｈＲＮＡ  ７２、ｓｈＲＮＡ  ７４）および５’−ガイド鎖（左側のループ）を有する３つが、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅｄ，ＩＡ）によって化学合成され、ＲＮａｓｅおよびパイロジェンを含まない緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に再懸濁され、そして評価された。具体的には以下の通りであった：
構造５’−パッセンジャー鎖−５ｎｔループ−ガイド鎖−３’（ＳＧ６８、ＳＧ７２、およびＳＧ７４）を有するｓｈＲＮＡ
【００７９】
ｓｈＲＮＡ中の二重鎖の長さもまた、標的遺伝子抑制に影響を与える。ガイド鎖が１９ヌクレオチド長で維持される間、３’末端から（１７または１６ヌクレオチド長まで）短縮されたｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖を有するｓｈＲＮＡは、有意に低いサイレンシング効力を有する。ガイド鎖を１９ヌクレオチドで維持しながらパッセンジャー鎖を５’末端から（１７ヌクレオチド長まで）短縮することは、ｓｈＲＮＡ活性に影響を与えない。興味深いことに、ｓｈＲＮＡは、ガイド鎖が１９ヌクレオチド長に維持される場合に、１１ヌクレオチド長まで短い（５’末端から短縮化される）パッセンジャー鎖で何らかの活性を維持する。短縮化されたパッセンジャー鎖とガイド鎖の両方を有するｓｈＲＮＡ（各１８ヌクレオチド長であり、二重鎖中に１８塩基対を形成する）は、１９塩基対二重鎖を有するｓｈＲＮＡと比較して非常に類似した効力を示した。特定の位置における単一のミスマッチは、ｓｈＲＮＡの効力に影響を与えることなく、ｓｈＲＮＡの二重鎖領域に導入できる。
【００８０】
フラクチャーｓｈＲＮＡおよびＴ字型ＲＮＡもまた試験され、実施例６において示されるように、高レベルのＲＮＡｉ活性が見られた。
【００８１】
範囲が本明細書中で与えられるときにはいつでも、例えば、温度範囲、時間範囲、配列同一性パーセント、配列相補性範囲、長さ範囲、または組成もしくは濃度の範囲、すべての中間の範囲および部分的な範囲、ならびに与えられた範囲に含まれるすべての個々の値は、本開示に含まれることが意図される。  構造５’−ガイド鎖−５ｎｔループ−パッセンジャー鎖−３’（ＳＧ６８Ｌ、ＳＧ７２Ｌ、およびＳＧ７４Ｌ）を有するｓｈＲＮＡ
【００８２】
これらのｓｈＲＮＡの配列は表１に示される。ｓｈＲＮＡループに下線を付す。３’突出を形成するヌクレオチドは小文字によって示される。
【００８３】
【表１】
2015211680.tif 000003
【００８４】
ヒト２９３ＦＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを補充した、１０％  加熱不活化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を有するＤＭＥＭ中に維持された。トランスフェクションの前日に、細胞は９６ウェルプレート中のウェルあたり２３，０００細胞で播種され、トランスフェクションの時点で約８０％細胞コンフルエンシーを生じた。製造業者の指示書に従って、細胞はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてトランスフェクトされた。具体的には、示された濃度（例えば、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、および０．００３ｎＭ）の合成ｓｈＲＮＡサンプル、１３ｎｇ  ＤＮＡ  プラスミドｐＳＧ１５４ｍ（これはＨＣＶ  ＩＲＥＳ標的配列およびホタルルシフェラーゼレポーター配列を含む）、２０ｎｇ  ｐＳＥＡＰ２−対照プラスミド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、トランスフェクション対照として）は、ＯｐｔｉＭｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中０．２５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００と混合され、３連で２９３ＦＴ細胞に導入された。４８時間後、上清は取り除かれ、６５℃で１５〜３０分間加熱され、そして５〜１０μｌの上清が１５０μｌ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート液体基質システム（ｐＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）に加えられた。室温で３０〜６０分間のインキュベーション後、サンプルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダー上で読み取られ（４０５ｎｍ）、ＳＯＦＴｍａｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して定量された。残っている細胞は溶解され、ルシフェラーゼ活性はＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９６Ｐルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用して測定された。
【００８５】
これらの実験の結果は図３Ａ〜３Ｃに提示される。３つのｓｈＲＮＡの１つ、ｓｈ６８は、（右側の代わりに）左側のループが使用されたときに、ほぼ３０倍高い効力を示した。他の２種のｓｈＲＮＡ、特に、ｓｈ７２は、右側および左側のループを有するｓｈＲＮＡの間で効力の有意な違いを示さなかった。
【００８６】
５’−ガイド鎖を有するｓｈＲＮＡの効力の増強に関連する鍵となる特性を同定するために、５’−パッセンジャー鎖を有するｓｈＲＮＡおよび５’−ガイド鎖を有するｓｈＲＮＡの内部安定性が、プログラムＯｌｉｇｏ  ４．０を使用して計算された。５’鎖の１９塩基のみが計算された。
【００８７】
計算の結果は図３Ｄ〜３Ｆに提示され、左側ループを有するｓｈ７２における活性増加の欠如がおそらく配列特異的であり、５’末端の内部安定性の違いに少なくとも部分的に起因することを実証する。右側ループおよび左側ループを有するｓｈＲＮＡの５’末端の内部安定性は、ｓｈ６８においては互いに非常に近かったが、ｓｈ７２ではそうではなかった。左側ループを有するｓｈＲＮＡはガイド鎖の侵入を簡単にし、ガイド鎖の優先的な使用を助長することが可能である。なぜなら、これは、５’末端にありかつ５’リン酸を有し、このことは、ＲＩＳＣにおいてＤｉｃｅｒおよびＡｇｏ２に結合するための必要条件であるからである。この利点は、右側ループを有するｓｈＲＮＡと左側ループを有するｓｈＲＮＡの間で５’末端の内部安定性が有意に異なるときに消失する。
【００８８】
実施例２：ｓｈＲＮＡの最適なループ構造およびループを閉じる塩基対の同定
ｓｈ１９−３のループ構造は（本明細書に具体的に参照により組み込まれるＷＯ２００７／０３２７９４において記載されるように）以前に研究された。ｓｈ１９−３と同じＩＲＥＳ領域を標的とするＳＧ６８対ＳＧ６８Ｌの効力の増強を考慮して、ループ構造が再試験された。２９３ＦＴ細胞におけるＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介性レポーター発現を阻害する能力に対する種々のループ構造の効果は実施例１に記載された。結果は図４に示される。ＳＥＡＰレベルはすべてのサンプルにおいて均一であり、０．００３ｎＭ〜０．３ｎＭのｓｈＲＮＡ濃度において、効率的なトランスフェクションおよび非特異的阻害または毒性効果の非存在を示す。
【００８９】
ループ長は、ｓｉＲＮＡ  １９−３（ｓｉ１９−３）と同じＩＲＥＳ領域を標的とするｓｈＲＮＡを使用して最初に調べられた。ｓｈＲＮＡの構造は、５’−ガイド鎖−ループ−パッセンジャー鎖−３’（左側ループ）であった。この二重鎖長は１９塩基対であり、パッセンジャー鎖の３’末端にＵＵ−突出を伴った。種々のループの長さを有するｓｈＲＮＡの配列は表２に列挙される。ｓｈＲＮＡループに下線を付す。３’突出のヌクレオチドは小文字で示される。
【００９０】
１０ヌクレオチドループ（ＳＧ１１３、５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ−３’）、５ヌクレオチドループ（ＳＧ６８Ｌ、５’−ＣＡＡＵＡ−３’）、２ヌクレオチドループ（ＳＧ１４２、５’−ＵＵ−３’）、および１ヌクレオチドループ（ＳＧ１１４、５’−Ｕ−３’）を有するｓｈＲＮＡが試験され、結果は図４Ａに示される。５’パッセンジャー鎖（右側ループ）を有するｓｈＲＮＡを用いた結果とは異なり（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １７：２２３−２３６，２００７）、５’ガイド鎖（左側ループ）を有するｓｈＲＮＡは、ループサイズが大きいとき（５または１０ｎｔ）よりも、非常に小さいとき（１または２ｎｔ）に高い効力を有した（図４Ａ）。このループ構造は、おそらく、ｓｈＲＮＡ活性に影響を与えない。なぜなら、ｍｉＲ−２３  マイクロＲＮＡループ構造から誘導されたものを含む、３つの異なるループ配列が使用されたからである。ＳＧ１４２（左側５’−ＵＵ−３’ループ）のＩＣ５０は最低４．６ｐＭまで−ｓｉＲＮＡ  １９−３よりも強力であり、これは、同じ領域を標的とする。右側ループを有するｓｈＲＮＡは、ループに直に隣接する塩基対としてＡ：Ｕを有し、左側ループを有するそれは同じ位置にＣ：Ｇ対を有する。これらの対は、実際、２ｎｔループから潜在的な緊張を軽減するために塩基対形成しなくてもよい。そのような状況であれば、ＳＧ１１８のＣ：Ｇ塩基対形成は、ＳＧ１０３の４ｎｔループＡＵＵＵよりも安定である４ループ構造（ＣＵＵＧ）に関与する可能性がある。興味深いことに、４ループ形成ＳＧ１１８は、最も低いＩＣ５０を有した（図４Ｂ、ＳＧ１１８）。二重鎖領域の配列はこれらのｓｈＲＮＡの中で同じであり、表２に列挙される。
【００９１】
エンドリボヌクレアーゼによる切断に対して抵抗性があるループを作製するために、２’−デオキシジヌクレオチドＴＴがループとして試験された。ループ配列ＵＵ（ＳＧ１４２）をＴＴ（ＳＧ１１２）で置き換える際に、顕著な活性の損失は検出されず（図４Ｃ）、デオキシ置換は、機能的活性を犠牲にすることなく、リボヌクレアーゼ抵抗性のためにループに適用できたことを示す。Ｄｉｃｅｒも任意の他のエンドリボヌクレアーゼも、１９ｂｐ  ｓｈＲＮＡのプロセシングに関与しないこともまた示唆される。なぜなら、任意の他のデオキシリボヌクレアーゼは、おそらくジヌクレオチドの５’側を例外として、ＲＮａｓｅによって切断できないからである。
【００９２】
これらのｓｈＲＮＡの配列は表２に示される。ｓｈＲＮＡループには下線を付す。３’突出のヌクレオチドは小文字によって示される。
【００９３】
【表２】
2015211680.tif 000004
【００９４】
実施例３：効力と、ｓｈＲＮＡ突出および二重鎖長の間の関連性の研究
Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．は、３’−ＵＵ突出の存在が１９−ｂｐ  ｓｈＲＮＡの効力を増加することを見い出した（Ｖｌａｓｓｏｖ、ｅｔ  ａｌ．２００７）。この以前の研究において使用されたｓｈＲＮＡは右側ループを有した（５’−パッセンジャー鎖−ループ−ガイド鎖−３’）。従って、ガイド鎖の３’末端におけるＵＵ突出は、ガイド鎖の３’−ＵＵ突出へのＡｇｏ  ＰＡＺドメインの結合を容易にする可能性がある。左側ループを有するｓｈＲＮＡ（５’−ガイド鎖−ループ−パッセンジャー鎖−３’）は、より良好な標的遺伝子抑制を示したので、ｓｈＲＮＡ効力に対する、パッセンジャー鎖の３’末端におけるＵＵ突出の効果が試験された。図５Ａに示されるように、３’−ＵＵ配列を欠くｓｈＲＮＡ（ＳＧ１０５）および突出としてデオキシリボヌクレオチド３’−ＴＴを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１１１）は、３’−ＵＵ突出を有する対応するｓｈＲＮＡに非常に類似した効力を有した。
【００９５】
ｓｈＲＮＡ活性に対するステム長の効果もまた調べられた。図５Ｂに示されるように、ガイド鎖の長さを１９ｎｔに維持しながら、パッセンジャー鎖を１７ｎｔまたは１６ｎｔに短縮することは、遺伝子サイレンシング活性を有意に減少した（ＳＧ１１５およびＳＧ１１６）。しかし、両方の鎖を１８ｎｔ長に短縮することは、効力に有意な影響を有さなかった（ＳＧ１１７）。驚くべきことに、１６ｂｐまで短いステムを有するｓｈＲＮＡ（１９ｎｔガイド鎖および１７ｎｔパッセンジャー鎖を有するＳＧ１１９）は、１７ｂｐステムを有するもの（ＳＧ１１７）と類似の阻害を示した（図５Ｃ）。しかし、１５ｂｐのステムを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１３１）は阻害活性の減少を示し始めた（図６Ａ）。このことは、高いサイレンシング活性は１６ｂｐ以上の二重鎖の長さを必要とすることを示す。
【００９６】
極端な場合を試験するために、１１ｂｐ二重鎖および８ｎｔループを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１２０）（１１ｎｔパッセンジャー鎖に直接連結された１９ｎｔガイド鎖）によるサイレンシングが測定された（図５Ｃ）。効力は他と比較すると低かったが、ショートＲＮＡヘアピンはなお２００ｐＭ未満のＩＣ５０を有した。同様に、１３ｂｐ二重鎖および６ｎｔループを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１３４）（１３ｎｔパッセンジャー鎖に直接連結された１９ｎｔガイド鎖）は、同じレベルの標的ノックダウンを与えた（図６Ｂ）。パッセンジャー鎖の１０ｎｔへのさらなる短縮は、サイレンシングを顕著に減少させた。ヘアピンの３’末端から５’末端まで１１ｎｔパッセンジャー鎖を変化させること（ＳＧ１３５）はサイレンシングを無効にした（図６Ｂ）。
【００９７】
突出長およびステム長が配列特異的であるか否かを調べるために、図５および６において使用されたもの以外の２つの標的配列が試験された（図７Ａおよび７Ｂ）。３’−ＵＵ突出の欠乏は、ヘアピンの標的サイレンシングを有意に減少させなかった。ステムの１８ｂｐ（ＳＧ１３９）または１６ｂｐ（ＳＧ１３６）への短縮は、ヘアピンの標的ノックダウン能力を減少させ、このことは、本ステム短縮戦略がある程度の配列依存性を有することを示した。
【００９８】
これらのｓｈＲＮＡの配列は表３に示される。ｓｈＲＮＡループには下線を付す。３’突出のヌクレオチドは小文字で示される。
【００９９】
【表３】
2015211680.tif 000005
【０１００】
実施例４：１９ｂｐ  ｓｈＲＮＡにおける単一のミスマッチの位置および型の効果の研究
ｓｉＲＮＡのガイド鎖とパッセンジャー鎖の両方がＲＩＳＣ複合体に取り込み可能であることが示されてきた。このことは、ｓｈＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖に適用可能であるかもしれない。パッセンジャー鎖（特にシード領域）がメッセンジャーＲＮＡのコード領域または３’−ＵＴＲに対して相補的である場合、Ａｇｏによるパッセンジャー鎖の選択が望ましくない効果を誘導可能であったので、、単一の変異が、パッセンジャー鎖の５’末端から４位〜７位で作製された。
【０１０１】
図８Ａおよび８Ｂに示されるように、これらの変異は、１９ヌクレオチド長の両方の鎖、３’ＵＵ突出、およびＵＵ−ループを有するｓｈＲＮＡの効力に有意に影響を与えなかった。加えて、単一のミスマッチを伴う活性の持続は、ミスマッチの型に無関係なように見え（例えば、Ｕ−Ｕ（ＳＧ１１０）＝Ｕ−Ｃ（ＳＧ１２６））、この形質が配列非依存的であることを示唆した。
【０１０２】
これらのｓｈＲＮＡの配列は表４に示される。ｓｈＲＮＡループに下線を付す。３’突出のヌクレオチドは小文字によって示される。ミスマッチヌクレオチドは斜字体で示される。
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
実施例５：ｓｈＲＮＡの効力に対するモノマーおよびダイマーの効果の研究
ＩＤＴによって合成され、ＨＰＬＣ精製されたｓｈＲＮＡは、ネイティブポリアクリルアミドゲル中で３つの主要な種：モノマー、ダイマー、およびトリマーを含むことが見い出された。対照的に、変性条件下（８Ｍ  尿素および２０％  ホルムアミドを含む１２％  ポリアクリルアミドゲル）では、この混合物は単一の主要バンドのみを示した。ｓｈＲＮＡが９５℃まで４分間加熱され、アイスバス中で迅速に冷却されたときに、モノマー、ダイマー、およびトリマーのこの混合物は、大部分がモノマーに転換でき（図９Ｂおよび図１０Ｂ）、モノマーｓｈＲＮＡは、２９３ＦＴ細胞の中で、その混合物よりもわずかに弱いとしても、ＩＲＥＳ依存性ルシフェラーゼ発現の強力な阻害剤のままであった（図９Ａ）。ｓｈＲＮＡが１６ヌクレオチドまで短縮され（ＳＧ１１９）、この分子のダイマーが、バルジまたはミスマッチなしで完全な二重鎖を形成したときに、モノマーは、モノマー−ダイマー混合物よりも良好な効力を有した（図１０Ａ）。これは、おそらく、ダイマーがＤｉｃｅｒによる非効率的な切断または種々の切断生成物を有したという事実に起因した。しかし、ｓｈＲＮＡが極度に短い場合（ループとしての残りのガイド鎖を伴う１１塩基対）、ヘアピンは混合物中でより活性であり、おそらく、モノマーのみの型よりもダイマー型であった（図１０Ａ）。しかし、純粋なモノマー型においてさえ、ＳＧ１２０は高い効率で標的遺伝子発現を減少させ、９８．６ｐＭのＩＣ５０であった。
【０１０５】
実施例６：機能性の増強を伴う最適なｓｈＲＮＡ構成の同定
遺伝子ノックダウンの増強を有する最適なｓｈＲＮＡ構成を同定するために、ＩＲＥＳの同じ領域を標的とする３つのｓｈＲＮＡが合成され、評価された。
ａ．ＳＧ６８Ｌ：５’ガイド鎖−ＣＡＡＵＡ（ループ）−パッセンジャー鎖−３’
ｂ．ＳＧ１４６：２つのＲＮＡ分子からのアニール生成物。ＳＧ１４６−１、５’−ガイド鎖−ＣＡＡＵＡ（ループ）−部分パッセンジャー鎖−３’；ＳＧ１４６−２、ガイド鎖に相補的である５’−部分パッセンジャー鎖
ｃ．ＳＧ１４２：５’−ガイド鎖−ＵＵ（ループ）−パッセンジャー鎖−３’
【０１０６】
様々な濃度（０．３、０．１、０．０３、０．０１、および０．００３ｎＭ）のｓｈＲＮＡサンプル、および１３μｇ  ＤＮＡプラスミドｐＳＧ１５４ｍ（標的配列ＨＣＶ  ＩＲＥＳおよびレポーター配列ホタルルシフェラーゼを含む）、およびｐＵＣ１９（同じ量の核酸から作製）が、ＯｐｔｉＭｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で０．２５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに混合され、２９３ＦＴ細胞に導入された（９６ウェルプレートのウェルあたり２３，０００細胞）。ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンは、４８時間目にルミノメーターによって測定された。
【０１０７】
これらの実験の結果は図１１に提示され、１）２−ヌクレオチドループを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ１４２）が、５−ヌクレオチドループを有するｓｈＲＮＡ（ＳＧ６８Ｌ）よりもわずかに強力であったこと、および２）２つの分子からアニールされたｓｈＲＮＡ（ＳＧ１４６）が良好なノックダウン機能を有したことを実証する。
【０１０８】
これらのｓｈＲＮＡの配列は表５に示される、ｓｈＲＮＡループに下線を付す。３’突出のヌクレオチドは小文字で示される。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
実施例７：肝細胞腫細胞系統におけるｓｈＲＮＡのサイレンシング効果の研究
細胞系統が肝細胞癌細胞系統Ｈｕｈ７に変更されたこと以外は、これらの実験は実施例１において記載されたものと同様に実施された（図１２）。ＳＧ６８、ＳＧ６８Ｌ、および陰性対照ＳＧ１０１（配列：５’−ＣＧＵ  ＧＣＵ  ＵＡＧ  ＧＡＵ  ＵＵＧ  ＧＡＧ  ＵＣＡ  ＡＵＡ  ＡＣＵ  ＣＣＡ  ＡＡＵ  ＣＣＵ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＧＵＵ−３’）を含む、種々の濃度を有する３つのｓｈＲＮＡが比較された。ホタルルシフェラーゼの減少は、ＳＧ１０１でトランスフェクトされた細胞において見い出されなかった。２９３ＦＴ細胞における結果と一致して、ＳＧ６８Ｌは、肝細胞癌細胞における標的遺伝子発現のサイレンシングにおいてＳＧ６８よりもはるかに強力である。
【０１１１】
実施例８：ｓｈＲＮＡの高い効力はＩＦＮ応答または細胞傷害性に起因しない
いくつかのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＩＦＮ応答および／または標的を外れた効果を誘導する。上記に試験されたｓｈＲＮＡがこれらの望ましくない特徴を有したか否かを調べるために、ＩＦＮ応答性遺伝子ＯＡＳ１がｓｈＲＮＡトランスフェクションの後で測定された。具体的には、ヒトＰＢＭＣが、密度勾配遠心分離によってバフィーコートから調製され、洗浄され、次いで、１０％熱不活化ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁された。これらの細胞は、２４ウェルプレートのウェルあたり５×１０５細胞で培養され、次いで、ｓｈＲＮＡ（２０ｎＭ、約１７０〜１８０ｎｇ）／／ＤＯＴＡＰ（１．５μｌ、Ｒｏｃｈｅ）複合体で２４時間トランスフェクトされた。次いで、これらの細胞は、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解し、総ＲＮＡは製造業者の指示書に従って抽出された。ｑＲＴ−ＰＣＲは、製造業者の指示書に従って、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＯＡＳ１  （Ｈｓ００２４２９４３＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）Ｔａｑｍａｎプローブ、ならびにＦａｓｔ  ７５００リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して行った。
【０１１２】
図１３Ａに示されるように、ＤＯＴＡＰを用いてトランスフェクトされた陽性対照、ポリ（Ｉ：Ｃ）ウェルあたり１８ｎｇ（ウェルあたりのｓｈＲＮＡの量に等価）は、未処理の陰性対照と比較して、１０．６倍のＯＡＳ１発現の増加を生じた。しかし、試験されたｓｈＲＮＡはどれもＯＡＳ１の増加を生じず、ＩＦＮがヒトＰＢＭＣの中で誘導されなかったことを示した。
【０１１３】
細胞傷害性は、ｓｈＲＮＡトランスフェクションの後のヒト肝細胞癌細胞系統（Ｈｕｈ７）において、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の取り込みを測定することによってもまた試験された。前日の夜に９６ウェルプレートに播種されたＨｕｈ７細胞（１３，０００細胞／ウェル）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＬＦ２Ｋ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、標的ＤＮＡと一緒に１０ｎＭ  ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた。ポリ（Ｉ：Ｃ）（３３ｎｇ）は陽性対照として使用された。４８時間後、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中５ｍｇ／ｍｌ中の１６μｌ／ウェルのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）が培養に加えられた。これらの細胞は、酸性イソプロパノール（０．０４Ｎ  ＨＣｌ）で溶解される前３時間の間、さらにインキュベートされた。溶解されたホルマザンレベルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダーによって測定され、ＳＯＦＴｍａｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して定量され、５７０ｎｍの試験波長および６５０ｎｍの参照波長を用いた。
【０１１４】
図１３Ｂに示されるように、陰性対照である、リポフェクタミン中のプラスミドＤＮＡに対して有意な細胞死は見い出されなかった。陽性対照である、リポフェクタミン中のポリ（Ｉ：Ｃ）は、５０％より多い細胞死を誘導した。全体として、上記で試験したｓｈＲＮＡは、ヒトＰＢＭＣおよび肝細胞癌細胞において、ＩＦＮを示さず、有意な細胞傷害性を示さなかった。
【０１１５】
実施例９：１９塩基対以下の二重鎖長さを有するｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒの基質ではない
１９塩基対以下の二重鎖長さを有するｓｈＲＮＡがＤｉｃｅｒによって切断できるか否かを調べるために、いくつかのｓｈＲＮＡがインビトロＤｉｃｅｒ切断分析のために選択された。２５塩基対（５’−ＧＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＵＣＣＵＡＡＡＣＣＵＣＡＡＡＧＡＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡＵＣＵＵＵＧＡＧＧＵＵＵＡＧＧＡＵＵＣＧＵＧＣＵＣＵＵ−３’）（配列番号４０）の二重鎖長さを有するｓｈＲＮＡ（ｓｈ１）が陽性対照として使用された。具体的には、すべての合成ｓｈＲＮＡは、２０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．５）、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で５μＭ最終濃度に溶解した。すべての分子がヘアピンモノマーを形成したことを保証するために、ｓｈＲＮＡは９５℃で４分間加熱し、次いで、直ちに氷冷バスに移動させ、さらなる使用の前に１０〜２０分間冷却させた。各ｓｈＲＮＡの８ｐｍｏｌが、１Ｕの組換えｄｉｃｅｒ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２４０１００）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、および２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１×緩衝液の存在下で、１０μＬ反応において、３７℃で１８時間インキュベートされた。各ｓｈＲＮＡを含むがｄｉｃｅｒ酵素を欠いている対照反応が並行してインキュベートされた。
【０１１６】
サンプルは、１０％非変性ＰＡＧＥ（図１４Ａ）と１２％変性ＰＡＧＥ（８Ｍ尿素／２０％ホルムアミド）（図１４Ｂ）の両方によって分析され、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色された。図１４に示されるように、２５塩基対長、１０ヌクレオチドループ、ならびに５’−および３’−突出を含んだｓｈ１  ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって切断されて、２０塩基対から２５塩基対の間のサイズを有する生成物を生じた。１９塩基対のステム、および２または５ヌクレオチド長のヘアピン、ならびに１８塩基対および２ヌクレオチドのヘアピンのステムを有するものを有する３つを含む、試験されたｓｈＲＮＡの他のすべては、非変性ＰＡＧＥと変性ＰＡＧＥにおいていかなる切断生成物も示さなかった。これらの結果は、１９塩基対以下の二重鎖長さを有するショートヘアピンはＤｉｃｅｒの基質ではないことを示す。
【０１１７】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は、例示することが意図され、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することは意図されないことが理解される。他の態様、利点、および改変は添付の特許請求の範囲の中にある。
【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
2015211680.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2015211680.tif 000013
【図１１】
2015211680.tif 000014
【図１２】
2015211680.tif 000015
【図１３】
2015211680.tif 000016
【図１４】
2015211680.tif 000017
【図１】
2015211680.tif 000018
【図３】
2015211680.tif 000019
【図４】
2015211680.tif 000020
【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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