(57)【要約】【課題】多発性硬化症、関節炎リウマチ等の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用なＩＬ−１０産生誘発剤のスクリーニング方法等を提供すること。【解決手段】以下の工程を備えたことにより、ＩＬ−１０産生誘発剤をスクリーニングする。（ａ）野生型Ｂ細胞、及びＡｈＲノックアウトＢ細胞を、被検物質の存在下又は非存在下にＣｐＧで刺激した後、培養する工程；（ｂ）培養上清中のＩＬ−１０濃度を個別に測定する工程；（ｃ）野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下の方が非存在下よりも高く、ＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下と非存在下で変化がなく、かつ、被検物質の非存在下において、野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度がＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度よりも高い場合、かかる被検物質をＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンド（ＩＬ−１０産生誘発剤）と評価する工程；【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を備えたことを特徴とするＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドのスクリーニング方法。
（ａ）野生型Ｂ細胞、及びＡｈＲノックアウトＢ細胞を、被検物質の存在下又は非存在下にＩＬ−１０産生促進剤で刺激した後、培養する工程；
（ｂ）培養上清中のＩＬ−１０濃度を個別に測定する工程；
（ｃ）野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下の方が非存在下よりも高く、ＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下と非存在下で変化がなく、かつ、被検物質の非存在下において、野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度がＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度よりも高い場合、かかる被検物質をＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドと評価する工程；
【請求項２】
ＩＬ−１０産生促進剤がＣｐＧであることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドを含むＩＬ−１０産生誘発剤。
【請求項４】
ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドが、ＦＩＣＺ又はＩＴＥである請求項３記載のＩＬ−１０産生誘発剤。
【請求項５】
請求項３又は４記載のＩＬ−１０産生誘発剤を有効成分とする自己免疫疾患の予防又は治療剤。
【請求項６】
自己免疫疾患が、多発性硬化症又は関節炎リウマチである請求項５記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。
【請求項７】
野生型Ｂ細胞をＩＬ−１０産生促進剤で刺激した後、ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドで処理したＩＬ−１０産生Ｂ細胞。
【請求項８】
ＩＬ−１０産生促進剤がＣｐＧであることを特徴とする請求項７記載のＩＬ−１０産生Ｂ細胞。
【請求項９】
請求項７又は８記載のＩＬ−１０産生Ｂ細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療剤。
【請求項１０】
自己免疫疾患が、多発性硬化症又は関節炎リウマチである請求項９記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドのスクリーニング方法、ＩＬ−１０産生
誘発ＡｈＲリガンドを含むＩＬ−１０産生誘発剤、該ＩＬ−１０産生誘発剤を有効成分と
する自己免疫疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
芳香族炭化水素受容体（Aryl Hydrocarbon Receptor、ＡｈＲ）は、ｂＨＬＨ−ＰＡＳ（Basic Helix-Loop-Helix−Per-Arnt-Sim）ファミリーに属する転写因子である。ＡｈＲはリガンドと結合することにより、種々の遺伝子の転写活性を引き起こすことが知られている。
【０００３】
ダイオキシン受容体としても知られているＡｈＲは、近年、免疫応答に関与していることが報告されている。インターロイキン（interleukin、ＩＬ）−１７を産生するヘルパーＴ細胞であるＴｈ１７細胞は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis、ＥＡＥ）の発症に関与している。また、レギュラトリーＴ細胞（regulatory T cells、Ｔｒｅｇ細胞）は、他のＴ細胞の活性を抑制する働きを有し、ＥＡＥを抑制する。ＡｈＲはリガンド特異的に、Ｔｈ０細胞からＴｈ１７細胞への分化とＴｈ０細胞からＴｒｅｇ細胞への分化の両方を誘導しているとの報告がある（非特許文献１）。また、ＡｈＲリガンドは、その種類によっては自己免疫疾患発症の補因子となるという報告もある（非特許文献２）。
【０００４】
免疫反応においてＢ細胞は、抗体産生やＴ細胞活性を通じて関与していることは知られていたが、近年、炎症反応を制御するＢ細胞が存在することが明らかになった（非特許文献３）。このＢ細胞はレギュラトリーＢ細胞（regulatory B cells、Ｂ１０細胞）と呼ばれ、ＩＬ−１０を産生することにより、自己免疫や炎症反応の抑制に重要な役割を果たしている。しかし、Ｂ１０細胞において、ＡｈＲ及びＡｈＲリガンドが果たす役割についての報告は未だ存在しない。
【０００５】
免疫応答に関与するＡｈＲリガンドのスクリーニング方法としては、酵母を用いたＡｈＲリガンドの定性法が開示されている（特許文献１）。しかし、特許文献１のスクリーニング法はＡｈＲが特定の遺伝子配列に結合する場合においてのみ検出できる系である。従って、特許文献１のスクリーニング法ではＡｈＲの機能全体を網羅することは出来ず、自己免疫疾患に対して治療効果のあるＡｈＲリガンドのスクリーニングには適していない。自己免疫疾患の治療方法としては、ガレクチン９をリガンドとしてＴｈ１細胞が関与する自己免疫疾患の治療方法が開示されている（特許文献２）。しかし、自己免疫疾患においてＴｈ１細胞はごく一部の自己免疫疾患にしか関与しておらず、特許文献２にて開示されたスクリーニング法を自己免疫疾患の治療に応用することは現実的ではない。また、自己免疫疾患の原因のひとつであるＩＬ−６のシグナル伝達を、抗ＩＬ−６抗体を用いることによりブロックし、自己免疫疾患を治療する生物製剤も開示されている（特許文献３）。しかし、生物製剤は非常に高価であり、全ての患者が平等に使える訳ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２６１３７３号公報
【特許文献２】特表２０１２−５１５７６６号公報
【特許文献３】特表２００９−５２１９０９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Francisco J., et al, Control of Treg and TH17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor, Nature, 2008, 453(1) p65-71.
【非特許文献２】Veldhoen M., et al, The aryl hydrocarbon receptor links TH17-cell-mediated autoimmunity to environmental toxins, Nature, 2008, 453(1) p106-109.
【非特許文献３】Yanaba K., et al, Regulatory B cells. Jpn. J. Clin. Immuno. 2009, 32(3) p135-141.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、多発性硬化症、関節炎リウマチ等の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用なＩＬ−１０産生誘発剤のスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
近年、炎症反応や自己免疫疾患を抑制する新たなＢ細胞集団のＢ１０細胞が同定された。このＢ１０細胞は抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を産生するが、本発明者らはＡｈＲがこのＢ１０細胞の分化誘導に関与していることを見いだした。また、一部のＡｈＲリガンドによりＢ１０細胞が分化促進することや、Ｂ１０細胞を自己免疫疾患モデルマウスに移入すると疾患が劇的に抑制されることも確認した。かかる知見に基づき、本発明者らは、Ｂ１０細胞の分化を促進させるＡｈＲリガンドのスクリーニング方法として、野生型のＢ細胞とＡｈＲ欠損Ｂ細胞を用い、既知のＡｈＲリガンドやＡｈＲリガンド候補として知られている低分子化合物を各々のＢ細胞に添加してＩＬ−１０の産生を検出する方法を構築した。野生型のＢ細胞でＩＬ−１０産生が促進されており、他方ＡｈＲ欠損Ｂ細胞ではそれが確認できなければ自己免疫疾患の治療薬となり得るＡｈＲリガンドということになり、このスクリーニング方法は簡便かつ確実な方法である。スクリーニングにより選出された低分子化合物を直接自己免疫疾患モデルマウスに投与し治療効果を確認するとともに、それら低分子化合物によりＢ１０細胞を誘導しそのＢ１０細胞を自己免疫疾患モデルマウスに移入することで治療効果を確認することができる。
【００１０】
すなわち、本発明を以下に示す。
（１）以下の工程を備えたことを特徴とするＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドのスクリーニング方法。
（ａ）野生型Ｂ細胞、及びＡｈＲノックアウトＢ細胞を、被検物質の存在下又は非存在下にＩＬ−１０産生促進剤で刺激した後、培養する工程；
（ｂ）培養上清中のＩＬ−１０濃度を個別に測定する工程；
（ｃ）野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下の方が非存在下よりも高く、ＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下と非存在下で変化がなく、かつ、被検物質の非存在下において、野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度がＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度よりも高い場合、かかる被検物質をＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドと評価する工程；
（２）ＩＬ−１０産生促進剤がＣｐＧであることを特徴とする上記（１）記載のスクリーニング方法。
（３）ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドを含むＩＬ−１０産生誘発剤。
（４）ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドが、ＦＩＣＺ又はＩＴＥである上記（３）記載のＩＬ−１０産生誘発剤。
（５）上記（３）又は（４）記載のＩＬ−１０産生誘発剤を有効成分とする自己免疫疾患の予防又は治療剤。
（６）自己免疫疾患が、多発性硬化症又は関節炎リウマチである上記（５）記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。
（７）野生型Ｂ細胞をＩＬ−１０産生促進剤で刺激した後、ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドで処理したＩＬ−１０産生Ｂ細胞。
（８）ＩＬ−１０産生促進剤がＣｐＧであることを特徴とする上記（７）記載のＩＬ−１０産生Ｂ細胞。
（９）上記（７）又は（８）記載のＩＬ−１０産生Ｂ細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療剤。
（１０）自己免疫疾患が、多発性硬化症又は関節炎リウマチである上記（９）記載の自己免疫疾患の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
ＡｈＲリガンドでもＢ１０細胞の分化を促進するものとそうでないものが確認され、自己免疫疾患の治療に使えるものとそうでないＡｈＲリガンドがあることが判明した。またリガンドの濃度によってもその効果が変わってくることも判明している。Ｂ１０細胞の分化を促進するＡｈＲリガンドは、自己免疫疾患の治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡｈＲが自己免疫の抑制に関与していることを示す実験の模式図である。下図：ＡｈＲノックアウトマウス由来Ｂ細胞を移入後ＥＡＥ（Experimental autoimmune encephalomyelitis、実験的自己免疫性脳脊髄炎）を誘導したマウス（ＥＡＥ＋Ｂ  ｃｅｌｌ（ＡｈＲ  ＫＯ））、野生型由来Ｂ細胞を移入後ＥＡＥを誘導したマウス（ＥＡＥ＋Ｂ  ｃｅｌｌ（ＷＴ））、及びコントロールであるＢ細胞を移入せずＥＡＥを誘導したマウス（ＥＡＥ）を用いた、マウスのＥＡＥ誘導後の臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）の推移を示したグラフである。臨床スコア（グラフ縦軸）は、０：正常、１：尾の完全下垂、２：歩行異常、３：後肢の完全脱力、４：体幹部の麻痺、５：前肢麻痺を含む後肢の完全脱力、６：死亡、である。グラフ横軸は、ＥＡＥ誘導後の日数である。
【図２】ＡｈＲノックアウトマウス由来Ｂ細胞（ＡｈＲ  ＫＯ）及び、野生型由来Ｂ細胞（ＷＴ）を用いた、ＩＬ−１０の分泌量を示すグラフである。ＡｈＲリガンドはＦＩＣＺ（6-Formylindolo[3,2-b]carbazole）を用いている。
【図３】図２と同様の実験において、ＡｈＲリガンドにＩＴＥ（2-(1H-Indol-3-ylcarbonyl)-4-thiazol ecarboxylic acid methyl ester）を用いた際の、ＩＬ−１０の分泌量を示すグラフである。
【図４】ＭａｆＫ（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog K）かつＭａｆＧ（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G）ノックアウトマウス由来Ｂ細胞（ＭａｆＫ／Ｇ  ＫＯ／Ｈｅ）及び、野生型由来Ｂ細胞（ＷＴ）を用いた、ＩＬ−１０の分泌量を示すグラフである。ＡｈＲリガンドはＬＰＳ（Lipopolysaccharide）を用いている。
【図５】野生型由来Ｂ細胞をＣｐＧで刺激した後、細胞ライセートを抗ＭａｆＫ抗体、抗ＭａｆＦ（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog F）抗体、抗ＭａｆＧ抗体、及び抗ＡｈＲ抗体を用い、ウェスタンブロッティング法で検出した結果である。
【図６】野生型由来Ｂ細胞をＣｐＧ若しくはＬＰＳで刺激した後、ＡｈＲで免疫沈降し、ＡｈＲと結合している標的タンパクをウェスタンブロッティング法で検出した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンド」における「ＩＬ−１０産生誘発」とは、炎症反応を抑制するサイトカインであるＩＬ−１０を産生する細胞において、そのＩＬ−１０産生能を高めることを意味し、ＩＬ−１０産生細胞としては、Ｔｈ細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞等を挙げることができるが、中でもＢ細胞を好適に例示することができる。
【００１４】
本発明における「ＡｈＲリガンド」としては、ＡｈＲと結合することにより種々の遺伝子の転写活性を引き起こす物質であれば特に制限されず、ＡｈＲリガンドには外因性リガンドと内因性リガンドとが存在するが、本発明においてはそのいずれであってもよい。かかるＡｈＲリガンドとしては、ダイオキシン類、ジベンゾフラン類、アゾベンゼン類、ナフタレン類、ＰＣＢ類、３−メチルコラントレン、ベンゾピレン、β−ナフトフラボン、インディゴ（indigo）、リポキシンＡ４、プロスタグランジンＧ２、ビリルビン、３−インドール酢酸、ＦＩＣＺ（6-Formylindolo[3,2-b]carbazole、ＣＡＳ登録番号：172922-91-7）、ＩＴＥ（2-(1H-Indol-3-ylcarbonyl)-4-thiazolecarboxylic acid methyl ester、ＣＡＳ登録番号：448906-42-1）、エキレニン（equilenin）、大豆イソフラボン類、フラボン類などを挙げることができる。
【００１５】
本発明において「ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンド」とは、上記ＡｈＲリガンドの中で、その存在下にＩＬ−１０産生細胞を培養したときに、その非存在下と比べて、培養上清におけるＩＬ−１０産生能を有意に高めることができるＡｈＲリガンドをいう。かかるＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドとして、ＦＩＣＺ、ＩＴＥ等を具体的に例示することができる。
【００１６】
本発明における「Ｂ細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を好ましく挙げることができ、中でもヒトやマウスを特に好ましく挙げることができる。また、本発明のスクリーニング方法の工程ａにおける野生型Ｂ細胞とＡｈＲノックアウトＢ細胞は同じ由来のＢ細胞を用いることが好ましい。
また、Ｂ１０細胞からＩＬ−１０が産生される際にはＭａｆＫ（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog K）も必要でＭａｆＫがＡｈＲと結合してＩＬ−１０産生に関与しており、実際にＭａｆＫ欠損細胞ではＩＬ−１０産生が減弱していることから、本発明に用いるＢ細胞にはＭａｆＫが発現していることが望ましい。上記ＭａｆＫはがん関連転写因子であり野生型Ｂ細胞には通常発現しているタンパクであり、本発明のスクリーニング方法に用いるＡｈＲノックアウトＢ細胞にもＭａｆＫが発現していることが望ましい。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法の工程ａにおける「野生型Ｂ細胞の調製方法」としては、市販のＢ細胞株を用いる方法、野生型哺乳動物の末梢血より末梢血単核球を採取した後末梢血単核球からＢ細胞を単離する方法などが挙げられるが、脾臓を摘出し、得られた脾臓からＢ細胞を単離する方法を好ましく挙げることができる。哺乳動物から脾臓を摘出し脾臓細胞に処理する過程、及び脾臓細胞からＢ細胞を単離する工程は既知の方法を用いることができるが、例えば、マウス脾臓を脾臓細胞に処理する方法としてはメッシュ上でスパーテルにより破砕する方法を、脾臓細胞からＢ細胞を単離する方法としてはＢ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社製）を用いる方法を、それぞれ好適に例示することができる。また、「ＡｈＲノックアウトＢ細胞」の調製方法としては、上記方法にて得られた野生型Ｂ細胞を遺伝子組み換え技術を用いてＡｈＲ発現遺伝子をノックアウトする方法などが挙げられるが、ＡｈＲノックアウト哺乳動物を用い、野生型Ｂ細胞の調製方法と同様に行う方法を好適に例示することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法の工程ａにおける「ＩＬ−１０産生促進剤」としては、Ｂ細胞を刺激することによってＩＬ−１０産生を促進しうるものであれば特に制限されず、ＣｐＧ、ＬＰＳ、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３５、ＴＮＦ−α、カテコールアミン、α−ガラクトシルセラミドなどを挙げることができるが、中でもＣｐＧ、ＬＰＳを好適に例示することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法の工程ａにおける「被検物質」としては、既知のＡｈＲリガンドや、ＡｈＲリガンド候補物質を挙げることができる。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法の工程ａにおいて、野生型Ｂ細胞、及びＡｈＲノックアウトＢ細胞を、被検物質の存在下又は非存在下にＩＬ−１０産生促進剤で刺激する方法としては、これらＢ細胞の培養培地に被検物質やＩＬ−１０産生促進剤を添加して培養する方法を例示することができる。細胞培養は、Ｂ細胞培養用の培地を用い、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１８〜３０時間おこなう。かかるＢ細胞培養用の培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ナカライテスク社製など）、イーグル最小必須培地（Ｅ−ＭＥＭ）（ナカライテスク社製など）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）（ナカライテスク社製など）、α改変イーグル培地（αＭＥＭ）（ナカライテスク社製など）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ナカライテスク社製など）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）（ナカライテスク社製など）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ナカライテスク社製など）、リーボビッツＬ１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５）（ナカライテスク社製など）、及びこれら培地を適宜混合したものを好ましく挙げることができ、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ナカライテスク社製など）をより好ましく挙げることができる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法の工程ｂにおける、培養上清中のＩＬ−１０濃度の測定には、市販のＥＬＩＳＡ測定キットを用いることができる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法の評価工程ｃにおける「野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下の方が非存在下よりも高く」とは、野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下の方が非存在下よりも、統計学上有意水準０．１、好ましくは有意水準０．０５、より好ましくは有意水準０．０１で有意に高いことを意味し、また、「ＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下と非存在下で変化がなく」とは、ＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、被検物質の存在下と非存在下で、統計学上有意水準０．１、好ましくは有意水準０．０５、より好ましくは有意水準０．０１で有意に差がないことを意味し、さらに、「被検物質の非存在下において、野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度がＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度よりも高い」とは、被検物質の非存在下において、野生型Ｂ細胞におけるＩＬ−１０濃度が、ＡｈＲノックアウトＢ細胞におけるＩＬ−１０濃度よりも、統計学上有意水準０．１、好ましくは有意水準０．０５、より好ましくは有意水準０．０１で有意に高いことを意味する。
【００２３】
ＦＩＣＺ、ＩＴＥ等のＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドを含む本発明のＩＬ−１０産生誘発剤は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であっても、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液製剤であってもよい。かかる液製剤の製造方法としては、例えば本発明におけるＩＬ−１０産生誘発剤を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＩＬ−１０産生誘発剤を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。かかる製剤は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として、経口投与、非経口投与、皮下又は皮内投与の形態で予防・治療有効量が投与される。
【００２４】
本発明のＩＬ−１０産生誘発剤を有効成分とする自己免疫疾患の予防又は治療剤の投与量としては、対象の体重、症状や疾患の性質及び重篤度などに応じて適宜調節することができ、例えば１０ｍｇ〜０．５ｇ／ｋｇを投与することができる。
【００２５】
本発明のＩＬ−１０産生Ｂ細胞としては、野生型Ｂ細胞をＣｐＧ等のＩＬ−１０産生促進剤で刺激した後、ＩＬ−１０産生誘発ＡｈＲリガンドで処理した細胞であれば特に制限されず、かかるＩＬ−１０産生Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を高産生するので、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。ＩＬ−１０産生Ｂ細胞の対象への投与は、静脈を介して直接生体内に移入する方法を挙げることができる。
【００２６】
本発明のＩＬ−１０産生Ｂ細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療剤の投与量としては、対象の体重、症状や疾患の性質及び重篤度などに応じて適宜調節することができ、例えばＩＬ−１０産生Ｂ細胞の細胞数として、約１０３〜１０２０個の範囲内を挙げることができ、約１０５〜１０１５個の範囲内を好ましく挙げることができる。また、本発明のＩＬ−１０産生Ｂ細胞のみを含有していてもよいが、薬学的に許容される担体をさらに含有していることが好ましい。かかる薬学的に許容される担体としては、本発明のＩＬ−１０産生Ｂ細胞によるＩＬ−１０産生を妨げない限り特に制限されず、生存率低下抑制剤、希釈剤、注入剤、塩、緩衝剤、安定剤および当技術分野において周知である他の材料を挙げることができる。
【００２７】
本発明における「自己免疫疾患」としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、シェーグレン症候群、ライター症候群、多発性筋炎・皮膚筋炎、全身性硬化症、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性精巣炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性血小板減少症、筋無力症、グレーブス病、潰瘍性大腸炎等を挙げることができるが、中でも多発性硬化症や関節リウマチを好適に挙げることができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［ＡｈＲ欠損Ｂ細胞移植マウスを用いたＥＡＥ誘導後の臨床スコアの比較］
（１）Ｂ細胞の単離
６〜８週齢のＡｈＲノックアウトマウス（慶應義塾大学医学部動物実験センターにて飼育維持）及びＢ６／Ｊマウス（野生型：ＷＴ、慶應義塾大学医学部動物実験センターにて飼育維持）を頸椎脱臼により安楽死させた後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓はシャーレに移し、メッシュ上でスパーテルにより破砕することにより、脾臓細胞を得た。その後、Ｂ細胞単離キット（ミルテニーバイオテク社製）を用いて、脾臓細胞からＢ細胞を単離した。
【００３０】
（２）ＣｐＧによるＢ細胞の刺激
得られたＡｈＲノックアウトマウス由来、及び野生型由来のＢ細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ナカライテスク社製）を用いて培養した。培養開始直後の培地に、ＣｐＧ  ＤＮＡ（InvivoGen社製）を終濃度１μＭとなるように添加した。添加後、Ｂ細胞を３７℃、２４時間でインキュベートした。
【００３１】
（３）Ｂ細胞のマウスへの移入
ＣｐＧで刺激したＡｈＲノックアウトマウス由来、及び野生型由来のＢ細胞は、ＰＢＳ液（ナカライテスク社製）に懸濁した。８週齢のＢ６／Ｊマウス（東京実験動物より購入）にＣｐＧで刺激したＢ細胞を１×１０７個、腹腔内投与した。
【００３２】
（４）ＭＯＧペプチドエマルジョンの作製
ＭＯＧペプチド（スクラム社製）（終濃度５ｍｇ／ｍＬ）は、Mycobacterium tuberculosis死菌（終濃度５ｍｇ／ｍＬ）と共に、ＣＦＡ（Complete Freund's adjuvant、シグマアルドリッチ社製）に混ぜ撹拌することでエマルジョンとした。
【００３３】
（５）Ｂ細胞移入マウスにおけるＥＡＥの誘導
文献（Immunity. 2011 May 27;34(5):741-54.）に従い、ＭＯＧペプチド及び百日咳毒素をマウスに投与した。
ＡｈＲノックアウトマウス由来、及び野生型由来のＢ細胞を移入１日後のマウスに、ＰＢＳ液に溶解させた百日咳毒素（CALBIOCHEM社製）５００ｎｇを腹腔投与し、エマルジョン化したＭＯＧペプチドを、ＭＯＧペプチド量に換算して２００μｇとなるように背部に１〜２箇所皮下注射することにより投与した。Ｂ細胞移入２日後、百日咳毒素ＰＢＳ液に溶解させた５００ｎｇを腹腔投与することにより更に投与し、ＥＡＥを誘導した。
【００３４】
ＡｈＲノックアウトマウス由来Ｂ細胞を移入後ＥＡＥを誘導したマウス（ＥＡＥ＋Ｂ  ｃｅｌｌ（ＡｈＲ  ＫＯ））、野生型由来Ｂ細胞を移入後ＥＡＥを誘導したマウス（ＥＡＥ＋Ｂ  ｃｅｌｌ（ＷＴ））、及びコントロールであるＢ細胞を移入せずＥＡＥを誘導したマウス（ＥＡＥ）を用いた本実験の模式図が図１上、及びこれらマウスのＥＡＥ誘導後の臨床スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）の推移を示したのが図１下である。コントロール及び野生型由来Ｂ細胞を移入後ＥＡＥを誘導したマウスにおいては、ＥＡＥ誘導後一週間ほどで臨床スコアは上がるものの、その後スコアは減少し、一定の値を維持する。これに対し、ＡｈＲノックアウトマウス由来Ｂ細胞を移入後ＥＡＥを誘導したマウスにおいては、他マウスよりも２日早く臨床スコアが上昇しはじめた上、上昇した臨床スコアがその後も下がることなく高値を維持した。これは、ＡｈＲが自己免疫の抑制に関与していることを示している。
【実施例２】
【００３５】
［Ｂ細胞における、ＡｈＲリガンドによるＩＬ−１０の産生促進］
（１）Ｂ細胞の単離及び培養
実施例１（１）の方法と同様にして、ＡｈＲノックアウトマウス由来、及び野生型由来のＢ細胞を得た。得られたＢ細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ナカライテスク社製）を用いて培養した。
【００３６】
（２）ＡｈＲリガンドのＢ細胞への投与
ＣｐＧ及びＡｈＲリガンドをＢ細胞に投与した。培養開始直後のＢ細胞培養培地に、ＣｐＧを終濃度１μＭ、及びＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）に溶解したＡｈＲリガンドを既定の濃度で添加した。添加後、Ｂ細胞を３７℃、２４時間でインキュベートした。
【００３７】
（３）ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１０産生量の測定
ＣｐＧ及びＡｈＲリガンドを投与したＢ細胞より、培養上清を回収し、培養上清画分とした。この培養上清に含まれるＩＬ−１０量を、ＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ測定キット(eBioscience社製)を用いて測定した。
【００３８】
ＡｈＲリガンドとして、ＦＩＣＺ（6-Formylindolo[3,2-b]carbazole、Enzo社製）を投与した際のデータを図２に示す。
野生型由来のＢ細胞においては、ＣｐＧを添加すると何も添加しなかったＢ細胞に比べてＩＬ−１０の分泌量が増加した。ＣｐＧと共にＦＩＣＺを添加すると、ＩＬ−１０の分泌量はＣｐＧのみを添加したＢ細胞に比べて更に増加した。ＦＩＣＺの添加量を増加させると、低濃度のＦＩＣＺで培養した時に比べＩＬ−１０産生が減少した。これに対し、ＡｈＲノックアウトマウス由来のＢ細胞においては、ＣｐＧを添加すると何も添加しなかったＢ細胞に比べてＩＬ−１０の分泌量が増加するものの、野生型由来のＢ細胞と比較すると低い値に留まった。また、ＣｐＧと共にＦＩＣＺを添加しても、ＩＬ−１０分泌量に変化は見られなかった。これは、ＡｈＲリガンドであるＦＩＣＺが、ＩＬ−１０の分泌を促進していることを示している。
【００３９】
ＡｈＲリガンドとして、ＩＴＥ（2-(1H-Indol-3-ylcarbonyl)-4-thiazolecarboxylic acid methyl ester、TOCRIS社製）を野生型由来Ｂ細胞に投与した際のデータを図３に示す。
ＦＩＣＺを添加した場合と同様、ＣｐＧとＩＴＥとを添加した野生型由来Ｂ細胞のＩＬ−１０の分泌量は、ＣｐＧのみを添加したＢ細胞に比べて増加した。これは、ＩＴＥがＩＬ−１０の分泌を促進していることを示している。
【実施例３】
【００４０】
［Ｂ細胞における、ＭａｆＫの発現の有無によるＩＬ−１０の産生比較］
ＭａｆＫかつＭａｆＧノックアウトマウス由来Ｂ細胞（ＭａｆＫ／Ｇ  ＫＯ／Ｈｅ）及び、野生型由来Ｂ細胞（ＷＴ）を用い、実施例２と同様にＥＬＩＳＡによるＩＬ−１０産生量の測定を行った。ＡｈＲリガンドはＬＰＳを用いている。結果を図４に示す。ＭａｆＫ／Ｇ  ＫＯ／ＨｅはＷＴと比較し、ＩＬ−１０産生が減少した。
また、野生型由来Ｂ細胞においてはＣｐＧ刺激後、ＭａｆＫは発現するがＭａｆＦ及びＭａｆＧは発現しないことを、細胞ライセートを用いたウェスタンブロッティング法にて確認した。この結果を図５に示す。
【００４１】
更に、野生型由来Ｂ細胞をＣｐＧ若しくはＬＰＳで刺激した後、ＡｈＲで免疫沈降し、ＡｈＲと結合している標的タンパクをウェスタンブロッティング法で検出した結果を図６に示す。図左側が細胞ライセートをそのままウェスタンブロッティング法で検出した結果、図右側が免疫沈降後にウェスタンブロッティング法で検出した結果である。これより、ＣｐＧ若しくはＬＰＳでの刺激後、ＡｈＲがＭａｆＫをはじめＡｒｎｔやＳｔａｔ１、及びＳｔａｔ３と結合していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、医療の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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