(57)【要約】【課題】貫通孔の数や大きさなどを容易にカスタマイズできるスパージャーを提供すること。【解決手段】スパージャー５０は複数の貫通孔２１を有する軟質チューブ１０と、軟質チューブ１０に連結された硬質コネクター４２、４３、４４とを有する。軟質チューブ１０は一対の端部１０Ａ、１０Ｂを有するとともにリング状に形成され、硬質コネクタ４２、４３、４４は一対の端部１０Ａ、１０Ｂ間に設けられて一対の端部１０Ａ、１０Ｂを互いに連結する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液を収納する培養袋内に配置され、前記培養袋内の前記培養液に対して気体を供給するスパージャーにおいて、
壁面に複数の貫通孔が形成された中空状のチューブと、
前記チューブの端部に連結されたコネクターとを備え、
前記チューブは３．０〜９．０ｍｍの内径を有することを特徴とするスパージャー。
【請求項２】
前記チューブには１３〜１７個の貫通孔が形成され、前記貫通孔の平均直径は０．５〜１．５ｍｍであることを特徴とする請求項１記載のスパージャー。
【請求項３】
前記チューブは軟質チューブからなり、前記コネクターは、前記軟質チューブより硬質な硬質コネクターからなることを特徴とする請求項１または２記載のスパージャー。
【請求項４】
前記コネクターは直線型コネクター、コック付き直線型コネクター、Ｔ字型コネクター、およびＹ字型コネクターからなる群から選択される少なくとも１つを有することを特徴とする請求項１乃至２のいずれか記載のスパージャー。
【請求項５】
前記チューブは２本のチューブ部分を有し、前記２本のチューブ部分によって互いに向き合う２つの対の端部が形成され、前記コネクターは各一対の端部を連結するコック付き直線型コネクター、Ｔ字型コネクター、またはＹ字型コネクターとを有することを特徴とする請求項４記載のスパージャー。
【請求項６】
前記コック付き直線型コネクターは開閉自在のコックを有し、前記培養袋内の前記培養液に対して気体を供給する間、当該コックは閉じられていることを特徴とする請求項５記載のスパージャー。
【請求項７】
前記培養袋内においてスパージャーは水平方向に配置され、前記貫通孔は内側であってかつ斜め上方を向くことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか記載のスパージャー。
【請求項８】
培養液を収納するとともに、前記培養液に対して気体を供給するスパージャーを内部に備えた細胞培養袋において、
前記スパージャーは壁面に複数の貫通孔が形成された中空状のチューブと、
前記チューブの端部に連結されたコネクターとを備え、
前記チューブは３．０〜９．０ｍｍの内径を有することを特徴とする細胞培養袋。
【請求項９】
培養液を収納するとともに、前記培養液に対して気体を供給するスパージャーを内部に備え、前記スパージャーは壁面に複数の貫通孔が形成された中空状のチューブと、前記チューブの端部に連結されたコネクターとを備え、前記チューブは３．０〜９．０ｍｍの内径を有する培養袋を使った細胞培養方法において、
前記培養袋内に前記培養液を収納する工程と、
前記スパージャーから前記培養液に対して気体を供給する工程とを備えたことを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シングルユース型細胞培養袋の内部に設置されるスパージャー、細胞培養袋
および細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬やワクチンなどのバイオ医薬品の開発や製造において、シングルユース製品（使い捨て製品）が着実に浸透しつつある。シングルユース製品は洗浄や滅菌の作業が必要ないこと、交叉汚染がないこと、簡易的に無菌環境が得られることなどのメリットがあるため、バイオ医薬品の開発コストを大幅に削減できる場合がある。
【０００３】
近年注目されているシングルユース製品の１つが３Ｄ細胞培養袋である。これはフィルム、チューブ、ポート、スパージャー、攪拌機構、溶存酸素センサー、ｐＨセンサー、温度センサーなどの様々な材料、部品、機構を有する細胞培養袋である。この細胞培養袋のなかに細胞培養用の培養液（培地ともいう）を充填し、培地へ供給する気体の流量、培地を攪拌する速度、培地の温度などを制御しながら細胞培養を行う。培地へ供給する気体は空気、酸素、窒素、二酸化炭素などであるが、とりわけ酸素の供給が細胞培養に重要である。
【０００４】
この酸素供給で重要な役割を担う部品が気体供給装置として機能するスパージャーである。最も一般的なスパージャーは射出成型を含む方法によって得られるプラスチック製のリング型スパージャーである（非特許文献１）。スパージャーの表面には直径１ｍｍ前後の貫通孔が多数設けられている。この貫通孔の数や大きさは、細胞への物理的ダメージや培地への酸素供給率に直接影響するため、培養する細胞に合わせて最適化するのが理想的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０７０７９１号公報
【特許文献２】特表２００８−５３６６８６号公報
【特許文献３】特開平５−３０４９４３号公報
【０００６】
【非特許文献１】ザルトリウス・ステディム・ジャパン（株）  「ザルトリウス・ステディムのシングルユース バイオリアクター」  カタログＮｏ．ＢＴ−３１  Ｒｅｖ．Ｂ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、射出成型を含む方法で製造されるスパージャーは金型作製に莫大な費用がかかるため、十分な最適化検討ができないのが実情であった。
【０００８】
本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、金型を用いることなく貫通孔の数や大きさなどを容易にカスタマイズできるスパージャー、細胞培養袋および細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、培養液を収納する培養袋内に配置され、前記培養袋内の前記培養液に対して気体を供給するスパージャーにおいて、壁面に複数の貫通孔が形成された中空状のチューブと、前記チューブの端部に連結されたコネクターとを備え、前記チューブは３．０〜９．０ｍｍの内径を有することを特徴とするスパージャーである。
【００１０】
本発明は、前記チューブには１３〜１７個の貫通孔が形成され、前記貫通孔の平均直径は０．５〜１．５ｍｍとなっていてもよい。
【００１１】
本発明は、チューブは軟質チューブからなり、前記コネクターは、前記軟質チューブより硬質な硬質コネクターからなっていてもよい。
【００１２】
本発明は、前記コネクターは直線型コネクター、コック付き直線型コネクター、Ｔ字型コネクター、およびＹ字型コネクターからなる群から選択される少なくとも１つを有していてもよい。
【００１３】
本発明は、前記チューブは２本のチューブ部分を有し、前記２本のチューブ部分によって互いに向き合う２つの対の端部が形成され、前記コネクターは各一対の端部を連結するコック付き直線型コネクター、Ｔ字型コネクター、またはＹ字型コネクターとを有してもよい。
【００１４】
本発明は、前記コック付き直線型コネクターは開閉自在のコックを有し、前記培養袋内の前記培養液に対して気体を供給する間、当該コックは閉じられていてもよい。
【００１５】
本発明は、前記培養袋内においてスパージャーは水平方向に配置され、前記貫通孔は内側であってかつ斜め上方を向いていてもよい。
【００１６】
本発明は、培養液を収納するとともに、前記培養液に対して気体を供給するスパージャーを内部に備えた細胞培養袋において、前記スパージャーは壁面に複数の貫通孔が形成された中空状のチューブと、前記チューブの端部に連結されたコネクターとを備え、前記チューブは３．０〜９．０ｍｍの内径を有することを特徴とする細胞培養袋である。
【００１７】
本発明は、培養液を収納するとともに、前記培養液に対して気体を供給するスパージャーを内部に備え、前記スパージャーは壁面に複数の貫通孔が形成された中空状のチューブと、前記チューブの端部に連結されたコネクターとを備え、前記チューブは３．０〜９．０ｍｍの内径を有する培養袋を使った細胞培養方法において、前記培養袋内に前記培養液を収納する工程と、前記スパージャーから前記培養液に対して気体を供給する工程とを備えたことを特徴とする細胞培養方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、金型を作製せずに貫通孔の数や大きさなどを容易にカスタマイズできるスパージャーを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は本発明によるスパージャーの軟質チューブを示す図。
【図２】図２（ａ）（ｂ）（ｃ）は軟質チューブの貫通孔の向きを示す図。
【図３】図３（ａ）（ｂ）（ｃ）は軟質チューブの貫通孔から気泡が出る様子を示す図。
【図４】図４（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は硬質コネクターを示す図。
【図５】図５（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は本発明によるスパージャーを示す平面図。
【図６】図６は本発明によるスパージャーが配置された培養袋を示す全体概略図。
【図７】図７は袋本体を構成するフィルムを示す図。
【図８】図８は袋本体を示す側面図。
【図９】図９（ａ）（ｂ）は袋本体を図８と反対方向からみた側面図。
【図１０】図１０は袋本体を示す平面図。
【図１１】図１１（ａ）（ｂ）は袋本体を示す底面図。
【図１２】図１２は袋本体の上部フィルムを示す詳細図。
【図１３】図１３は袋本体の側部フィルムを示す詳細図。
【図１４】図１４（ａ）は回転シャフトと、上端部と、第１回転支持部の取付構造を示す図、図１４（ｂ）は第１支持部を示す平面図、図１４（ｃ）は第１支持部を示す底面図、図１４（ｄ）は第１支持部を示す部分断面図。
【図１５】図１５は上端部を示す底面図。
【図１６】図１６は回転シャフトと、下端部と、第２回転支持部の取付構造を示す図。
【図１７】図１７（ａ）（ｂ）はスパージャーの取付構造を示す図、図１７（ｃ）（ｄ）はスパージャーの他の取付構造を示す図。
【図１８】図１８は撹拌用羽根を示す図。
【図１９】図１９は温度センサおよびｐＨセンサの取付構造を示す図。
【図２０】図２０（ａ）は回転シャフトの上端部を示す平面図、図２０（ｂ）はその底面図、図２０（ｃ）はその側断面図、図２０（ｄ）はその側面図、図２０（ｅ）は図２０（ｂ）の磁石収納部を示す拡大図である。
【図２１】図２１（ａ）は回転シャフトの下端部を示す底面図、図２１（ｂ）はその側面図。
【図２２】図２２は回転シャフトを示す側面図。
【図２３】図２３（ａ）は第２回転支持部を示す側面図、図２３（ｂ）はその側断面図、図２３（ｃ）はその平面図、図２３（ｄ）はその底面図。
【図２４】図２４は羽根を示す図。
【図２５】図２５（ａ）は撹拌用羽根の固定リングを示す平面図、図２５（ｂ）はその側面図。
【図２６】図２６（ａ）（ｂ）は袋本体を構成するフィルムの積層構造を示す図。
【発明の実施形態】
【００２０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。
【００２１】
（培養袋）
まず図６により本実施の形態によるスパージャーが配置される培養袋１１０について説明する。
【００２２】
図６に示すように、培養袋１１０は、被培養物１０８ａを含む培養液（培地ともいう）１０８を収容する袋本体１１１と、袋本体１１１内の培養液１０８を撹拌する攪拌器１３０と、を備えている。このうち、袋本体１１１は、複数のフィルム１１１ａをヒートシールして形成されている。フィルム１１１ａに用いる材料としては、可撓性を有するとともに耐ガンマ線滅菌性を有する樹脂材料であれば特に限定されることはない。例えば、フィルム１１１ａには、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロン、エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリエチレン（ＰＥ）等を用いることができる。
【００２３】
攪拌器１３０は、袋本体１１１に回転自在に設けられた、袋本体１１１の上下方向に延びる回転シャフト１３１と、回転シャフト１３１に設けられ、袋本体１１１内の培養液１０８を撹拌する撹拌用羽根１３２と、回転シャフト１３１を回転可能に支持し、袋本体１１１から外方（図６において上方）に突出する第１回転支持部（上側回転支持部）１３３と、回転シャフト１３１を回転可能に支持し、袋本体１１１から外方（図６において下方）に突出する第２回転支持部（下側回転支持部）１３４と、を有している。
【００２４】
このうち、第１回転支持部１３３は、袋本体１１１の上部にヒートシールされている。
回転シャフト１３１は、袋本体１１１から外方に延びており、回転シャフト１３１の上端部は、第１回転支持部１３３まで延びている。回転シャフト１３１の上端部には、撹拌器側磁石が設けられている。この撹拌器側磁石が培養システムの撹拌駆動装置１０６と磁気カップリング方式で磁気結合されることにより、撹拌駆動装置１０６から回転シャフト１３１に回転駆動力が伝達されるようになっている。
【００２５】
第２回転支持部１３４は、袋本体１１１の下部にヒートシールされている。回転シャフト１３１の下端部は、袋本体１１１内に配置されており、第２回転支持部１３４は、回転シャフト１３１の下端部を、袋本体１１１内において回転可能に支持している。
【００２６】
袋本体１１１の上部には、培養液１０８を注入する培養液注入部１５０が設けられている。この培養液注入部１５０には、培養システムの培養液供給部から、被培養物１０８ａを含む培養液１０８が供給されて、培養液１０８が袋本体１１１内に注入されるようになっている。また、袋本体１１１の上部には、培養液注入部１５０から袋本体１１１に培養液１０８を注入する際、袋本体１１１内の気体を排出する気体排出部１５１が設けられている。なお、上述した第２回転支持部１３４が、袋本体１１１から培養液１０８を排出する機能を有しており、当該第２回転支持部１３４から、袋本体１１１内の培養液１０８が排出されるようになっている。
【００２７】
袋本体１１１内に、本実施の形態によるスパージャー（気体供給装置）５０が設けられている。このスパージャー５０は、袋本体１１１内に収容された培養液１０８に空気１０９等の気体を導入するためのものである。スパージャー５０から袋本体１１１の上部を貫通して気体供給チューブ１５３が延びている。この気体供給チューブ１５３は、外方の培養システムの気体供給源１６０からスパージャー５０に空気１０９を供給するためのものである。
【００２８】
袋本体１１１には、温度センサ１５４、ｐＨセンサ１５５およびＤｏ（溶存酸素）センサ１５６が取り付けられている。このうち温度センサ１５４は、培養中の培養液１０８の温度を計測し、ｐＨセンサ１５５は、培養中の培養液１０８のｐＨを計測するためのものである。Ｄｏセンサ１５６は、培養中の培養液１０８の溶存酸素量を計測するためのものである。
【００２９】
また、袋本体１１１に、サンプリングチューブ１５７が取り付けられている。このサンプリングチューブ１５７は、培養中の培養液１０８を取り出し可能になっている。
【００３０】
なお、上述した培養液注入部１５０、温度センサ１５４等の配置は、図６に示すような配置に限られることはなく、各々の機能を果たすことが可能であれば任意とすることができる。
【００３１】
次に図７乃至図２４により、培養袋１１０について更に述べる。
【００３２】
上述のように、培養袋１１０は複数のフィルム１１１ａをヒートシールすることにより形成された袋本体１１１を有している。この場合、袋本体１１１を構成するフィルム１１１ａは、一対の側部フィルム１１１Ａ、１１１Ｂと、上部フィルム１１１Ｃと、底部フィルム１１１Ｄとからなる（図７参照）。そしてこれら一対の側部フィルム１１１Ａ、１１１Ｂ、上部フィルム１１１Ｃ、底部フィルム１１１Ｄを互いに重ね合せて、互いの周縁をヒートシールすることにより袋本体１１１を得ることができる。
【００３３】
次に図８乃至図１３により、袋本体１１１の構成を詳述する。
【００３４】
図８乃至図１３に示すように、袋本体１１１の側部フィルム１１１Ａには、温度センサ１５４、ｐＨセンサ１５５、Ｄｏセンサ１５６およびサンプリングチューブ１５７を装着するための開口１５４ａ、１５５ａ、１５６ａ、１５７ａが各々形成されている（図８および図１３参照）。
ここで袋本体１１１としては２００Ｌ用袋本体と、５０Ｌ用袋本体がある。２００Ｌ用袋本体１１１は、２００Ｌまで培養液を入れることができるものであり、容量は２００Ｌ以上あり、２００Ｌ以下の培養液、例えば１００Ｌの培養液を入れることもできる（図９（ａ）および図１１（ａ）参照）。
一方、５０Ｌ用袋本体１１１は、５０Ｌまで培養液を入れることができるものである（図９（ｂ）および図１１（ｂ）参照）。
なお２００Ｌ用袋本体と、５０Ｌ用袋本体としては、共通の部品を用いることができるが、以下の部品の形状が異なる。
回転シャフト１３１の長さ、
回転リング１３２ａの大きさ、
回転リング１３２に使用するねじ１３２ｂの大きさ、
撹拌用羽根１３２の大きさ、
側部フィルム１１１Ａ、１１１Ｂの固定フィルムの数、
底部フィルム１１１Ｄの固定フィルムの配置（向き）、
スパージャー５０の形状、大きさ、
貫通孔２１の数
【００３５】
また図１０、図１１および図１２に示すように、袋本体１１１の上部フィルム１１１Ｃには、第１回転支持部１３３を装着するための開口１３３ａが形成され、また培養液注入部１５０および気体排出部１５１を装着するための開口１５０ａおよび開口１５１ａが各々形成されている。
【００３６】
また、底部フィルム１１１Ｄには、第２回転支持部１３４を装置するための開口１３４ａが形成されている。さらに底部フィルム１１１Ｄの内面には、スパージャー５０を袋本体１１１内に固定するため、スパージャー５０を保持する３つの保持バンド５０ａ、５０ａ、５０ａが取付けられている。
【００３７】
次に図１４（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）乃至図１７により、回転シャフト１３１、第１回転支持部１３３および第２回転支持部１３４の構造について詳述する。ここで回転シャフト１３１、第１回転支持部１３３および第２回転支持部１３４は、いずれも合成樹脂製となっている。
【００３８】
図１４（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）および図１５に示すように、回転シャフト１３１には、上端部１３５がネジ止めされ、この上端部１３５は第１回転支持部１３３の下方に位置している。また回転シャフト１３１の上端部１３５には攪拌器側磁石１３５ａが設けられ、この攪拌器側磁石１３５ａが攪拌駆動装置１０６の駆動磁石１０６ａと磁気カップリング方式で磁気結合される。
【００３９】
この場合、回転シャフト１３１の上端部１３５には６個の攪拌器側磁石１３５ａが設けられ、これら６個の攪拌器側磁石１３５ａはＮ極とＳ極の磁石が交互に配置されている。
【００４０】
なお、図１４（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）において、第１回転支持部１３３の側面には、攪拌駆動装置１０６を連結するための連結溝１３３ｃが形成されている。また第１回転支持部１３３は、上部フィルム１１１Ｃの開口１３３ａに装着されるとともに、上部フィルム１１１Ｃの内面にヒートシールされて固着されている。また、第１支持部１３３は上面１３３ｄと底面１３３ｅとを有し、上面１３３ｄの裏側には複数の補強リブ１３３ｇが設けられている。また、底面１３３ｅにはその裏側に補強リング１３３ｒが設けられ、この補強リング１３３ｒから内方に延びる複数の補強リブ１３３ｈが設けられている。更に、底面１３３ｅのうち、補強リブ１３３ｈの延長線上に厚肉部１３３が形成されている。
【００４１】
また、図１６に示すように、回転シャフト１３１には下端部１３６がネジ止めされ、この下端部１３６は第２回転支持部１３４により回転自在に支持されている。
【００４２】
また下端部１３６内には第２回転支持部１３４に対して回転シャフト１３１を回転方向に支持するベアリング１３６ａが設けられ、このベアリング１３６ａは金属Ｃリング１３６ｂにより下端部１３６に固定されている。また第２回転支持部１３３は、底部フィルム１１１Ｄの開口１３４ａに装着されているとともに、底部フィルム１１１Ｄの内面ヒートシールされて固着されている。
【００４３】
次に図２０乃至図２３により、回転シャフト１３１、第１回転支持部１３３および第２回転支持部１３４の取付構造の詳細について述べる。
【００４４】
上述のように、回転シャフト１３１の上端には、第１回転支持部１３３側へ延びる上端部１３５がネジ止めにより取付けられている。ここで図２０（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）に示すように、上端部１３５はその上面に設けられ、攪拌機側磁石１３５ａを収納するための磁石収納部１３５Ａと、その下面に設けられ、ベアリング１３５ｂを収納するためのベアリング収納部１３５Ｂを有している。また、上端部１３５の下方には、回転シャフト１３１の外ネジ１３１ａが係合する内ネジを有する連結部１３５Ｄが形成されている（図２２参照）。
【００４５】
また回転シャフト１３１の下端には、第２回転支持部１３４に支持される下端部１３６がネジ止めにより取り付けられている。ここで図２１（ａ）（ｂ）に示すように、下端部１３６には、ベアリング１３６ａ、１３６ｂを収納するためのベアリング収納部１３６Ａを有している。また下端部１３６の上方には、回転シャフト１３の外ネジ１３１ｂが係合する内ネジを有する連結部１３６Ｄが形成されている（図２２参照）。
【００４６】
また図２３（ａ）（ｂ）（ｃ）に示すように、第２回転支持部１３４は、回転シャフト１３１の下端部１３６を回転自在に支持している。また第２回転支持部１３４は底部フィルム１１１Ｄにヒートシールされるシール板１３８を有しており、さらに袋本体１１１内側に位置する排出口１３８ａを有している。
【００４７】
図２３（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）において、袋本体１１１内の培養液１０８は、排出口１３８ａから第２回転支持部１３４の内側通路１３８ｂ内に入る。次に培養液１０８は、第２回転支持部１３４の内側通路１３８ｂに接続された排出ライン１３８ｃに入り、次に排出ライン１３８ｃに取付られた閉止弁１３８ｄを開くことにより、外方へ排出される。
【００４８】
次に図１７（ａ）（ｂ）によりスパージャー５０の取付構造について述べる。スパージャー５０は後述のように軟質チューブ１０と、硬質コネクタ４３とを備えている。このようなスパージャー５０は、袋本体１１１の底部フィルム１１１Ｄ内面に、３つの合成樹脂製保持バンド５０ａ、５０ａ、５０ａにより固定されている。
【００４９】
図１７（ａ）（ｂ）に示すように、３つの保持バンド５０ａ、５０ａ、５０ａのうち２つの保持バンド５０ａ、５０ａは軟質チューブ１０を保持し、残りの保持バンド５０ａは硬質コネクタ４３を保持している。各保持バンド５０ａは底部フィルム１１１Ｄ内面において、円周状に互いに１２０°ずつの間隔をおいて離間して配置されている。そして保持バンド５０ａの両端部が底部フィルム１１１Ｄに接着され、中央部の非接着部が軟質チューブ１０および硬質コネクタ４３を外周から覆って保持している。
次に図１７（ｃ）（ｄ）によりスパージャー５０の他の取付構造について述べる。スパージャー５０は軟質チューブ１０と、硬質コネクタ４３とを備えている。このようなスパージャー５０は、袋本体１１１の底部フィルム１１１Ｄ内面に、４つの合成樹脂製保持バンド５０ａ、５０ａ、５０ａにより固定されている。
図１７（ｃ）（ｄ）に示すように、４つの保持バンド５０ａ、５０ａ、５０ａのうち３つの保持バンド５０ａ、５０ａ、５０ａは軟質チューブ１０を保持し、残りの保持バンド５０ａは硬質コネクタ４３を保持している。軟質チューブ１０を保持する３つの保持バンド５０ａは底部フィルム１１１Ｄ内面において、円周状に互いに１２０°ずつの間隔をおいて離間して配置されている。そして各保持バンド５０ａの両端部が底部フィルム１１１Ｄに接着され、中央部の非接着部が軟質チューブ１０および硬質コネクタ４３を外周から覆って保持している。なお、各保持バンド５０ａはスパージャー５０の貫通孔２１を塞ぐことがないよう、保持バンド５０ａの中央部は両端部に比べて幅が狭くなっている。
【００５０】
次に図１８、図２４および図２５により撹拌用羽根１３２について述べる。図１８および図２４に示すように、撹拌用羽根１３２は、回転シャフト１３１の軸線方向にわずかにずれて配置された３つの扇形状羽根１３２Ａを有し、各羽根１３２Ａは略１２０°の扇形状をなし、かつ１２０°ずつ円周方向に離間している。
【００５１】
各羽根１３２Ａは、各々独立した固定リング１３２ａに取付けられている。この場合、各羽根１３２Ａは、固定リング１３２ａとの当接面１３２Ｂを有し、この当接面１３２Ｂ側を固定リング１３２ａ内に挿入し、羽根１３２Ａと固定リング１３２ａとをネジ孔１３２Ｄに挿入したネジにより堅固に固定する。このようにして、各羽根１３２Ａは固定リング１３２ａに取付けられる。次に図２５（ａ）（ｂ）を用いて各羽根１３２Ａの固定リング１３２ａについて述べる。
【００５２】
固定リング１３２ａは回転シャフト１３１が挿入される開口１３２ｄを有するとともに、固定リング１３２ａを固定するためのネジ１３２ｂが挿入される開口１３２ｅを有している。
【００５３】
次に温度センサ１５４、ｐＨセンサ１５５およびＤｏセンサ１５６の取付構造について図１９により述べる。
【００５４】
ここでｐＨセンサ１５５およびＤｏセンサ１５６の取付構造は略同一であるため、図１９においてはｐＨセンサ１５５および温度センサ１５４の取付構造を説明する。
【００５５】
図１９に示すように、ｐＨセンサ１５５は、円筒状のセンサ本体１５５Ａと、側部フィルム１１１Ａの開口１５５ａに装着されたポートディスク１５５ｂと、先端にｐＨセンサチップ１５５Ｂが取付けられたセンサホルダ１５５ｃとを有している。またセンサ本体１５５Ａとポートディスク１５５ｂとは結束バンド１５５ｄにより連結され、センサ本体１５５Ａとセンサホルダ１５５ｃも、結束バンド１５５ｄにより連結されている。
【００５６】
また図１９に示すように、温度センサ１５４は、円筒状のセンサ本体（チューブ）１５４Ａと、側部フィルム１１１Ａの開口１５４ａに装着されたポートディスク１５４ｂと、センサホルダ１５４ｃとを有している。またセンサ本体１５４Ａとポートディスク１５４ｂとは結束バンド１５４ｄにより連結され、センサ本体１５４Ａとセンサホルダ１５４ｃも、結束バンド１５４ｄにより連結されている。
【００５７】
またセンサホルダ１５４ｃ内には温度センサ１５４Ｂが配置され、温度センサ１５４Ｂには信号ライン１５４ｌが接続され、この信号ライン１５４ｌは外方まで延びている。
【００５８】
次に各構成部材の材料について述べる。
【００５９】
袋本体１１１を構成するフィルム１１１ａとしては、上述した材料の他、ナイロン／ＥＶＯＨ／ポリプロピレン（ＰＰ）系接着剤／ＰＥからなる総厚みが５０〜５００μｍのインフレフィルムが用いられる（図２６（ａ）参照）。あるいはフィルム１１１ａとして、１０〜５０μ厚の（ＰＥＴ）／１０〜５０μｍ厚のナイロン／１０〜５０μｍ厚のエチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）／１０〜３５０μｍ厚のポリエチレン（ＰＥ）からなるドライラミネーションフィルムを用いることもできる（図２６（ｂ）参照）。
この場合、各フィルム間の接着剤としては、ポリウレタン系の接着剤を用いることができる。
【００６０】
またスパージャー５０を保持する保持バンド５０ａは底部フィルム１１１Ｄに設けられ、この保持バンド５０ａはフィルム１１１ａと同様の材料を用いることもできるが、接着剤からの溶出を考慮すると５０〜３５０μｍ厚のポリエチレン単層フィルムを用いることが望ましい。
【００６１】
さらに第１回転支持部１３３および第２回転支持部１３４は、いずれも高密度ポリエチレン（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｏｌｙｅｔｈｌｅｎｅ：以下「ＨＤＰＥ」とも言う）を射出成型または切削加工することにより得られる。
【００６２】
また、温度センサ１５４、ｐＨセンサ１５５、Ｄｏセンサ１５６、サンプリングチューブ１５７、接着注入部１５０、および気体排出部１５１を袋本体１１１に取付けるためポートディスク１５４ｂ、１５５ｂ等が設けられており、これらポートディスクとしてはＰＥ系樹脂の射出成型品を用いることができる。
【００６３】
さらに回転シャフト１３１の上端部１３５としては、ＨＤＰＥの射出成形品を用いることができる。さらに上端部１３５内に設けられたベアリング１３５ｂは樹脂製または金属製となっており、このベアリング１３５ｂは金属Ｃリングにより上端部１３５に固定されている。
【００６４】
また上端部１３５内には、図２０（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）に示すように、６個の撹拌機側磁石１３５ａが設置されており、これらの撹拌機側磁石１３５ａは、上端部１３５の磁石収納部１３５Ａ内に接着剤を用いて固定されている。各磁石収納部１３５Ａの内側には２本の保持リブ１３５Ｅが設けられており、攪拌機側磁石１３５ａを磁石収納部１３５Ａ中央に配置するのに都合がよい。すなわち、２本の保持リブ１３５Ｅがないと６個の攪拌機側磁石１３５ａが互いに引き合って、各攪拌機側磁石１３５ａを磁石収納部１３５Ａの中央に配置することが困難となるが、この保持リブ１３５Ａにより攪拌機側磁石１３５ａを磁石収納部１３５Ａの中央に配置することができる。なお、上端部１３５には、６個の磁石収納部１３５Ａが円周上に設けられており、各磁石収納部１３５Ａは、補強リブ１３５Ｆによって互いに連結されている。
【００６５】
また、回転シャフト１３１の下端部１３６としては、ＨＤＰＥの射出成形品を用いることができる。また下端部１３６内に設けられたベアリング１３６ａは金属Ｃリング１３６ｂにより固定されている。
【００６６】
さらに回転シャフト１３１はポリカーボネート（ＰＣ）の削り出し材からなり、両端部に外ネジ１３１ａ、１３１ｂが形成されている。
【００６７】
また撹拌用羽根１３２の固定リング１３２ａはＰＣの削り出し材からなっており、更に各羽根１３２ＡはＰＣの射出成型品からなる。
【００６８】
（スパージャー）
次にこのような構成からなる培養袋１１０内に配置された本実施の形態によるスパージャー５０について述べる。
【００６９】
スパージャー５０は、図５（ａ）に示すように、リング状に延びるとともに一対の端部１０Ａ、１０Ｂを有し、壁面２０に複数の貫通孔２１が形成された中空状の軟質チューブ１０と、軟質チューブ１０の一対の端部１０Ａ、１０Ｂを互いに連結する硬質コネクタ４３とを備えている。
【００７０】
このうち、軟質チューブ１０は、円形のリング状に延びるとともに、後述のようにリング状に曲げても折れない柔軟な素材からなり、内部に空間１１を有するとともに、壁面２０に複数の貫通孔２１が形成されている（図１および図５（ａ）参照）。
【００７１】
また硬質コネクター４３はＴ字型コネクターからなり、軟質チューブ１０よりも硬質の素材で形成されている。また硬質コネクター４３は、気体供給源１６０側に連通する気体供給チューブ１５３に連結された接続部４３ａを有している。
【００７２】
ここで「リング状に延びる軟質チューブ１０」とは、軟質チューブ１０が環状に延びることをいい、必ずしも円形を形成する必要はなく、軟質チューブ１０はだ円形を形成してもよい（図５（ｂ）参照）。
【００７３】
図５（ｂ）に示すように、スパージャー５０は、だ円状に延びるとともに一対の端部１０Ａ、１０Ｂを有し、壁面２０に複数の貫通孔２１が形成された中空状の軟質チューブ１０と、軟質チューブ１０の一対の端部１０Ａ、１０Ｂを互いに連結する硬質コネクター４４とを有している。この硬質コネクター４４はＹ字状コネクターからなっており、硬質コネクター４４は気体チューブ１５３に連結された連結部４４ａを有している。
【００７４】
また、リング状に延びる軟質チューブ１０は、複数、例えば２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂを有していてもよい（図５（ｃ）参照）。
【００７５】
図５（ｃ）に示すように、軟質チューブ１０は２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂを有しており、２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂによって互いに向き合う２つの対の端部１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃ、１０Ｄが形成されている。そして一対の端部１０Ａ、１０Ｂ間に、硬質コネクターとしてコック付き直線型コネクター４２が設けられ、一対の端部１０Ｃ、１０Ｄ間に硬質コネクターとして、Ｔ字型コネクター４３が設けられている。またコック付き直線型コネクター４２はコック４２ａを有するとともに、Ｔ字型コネクター４３は気体チューブ１５３に連結された連結部４３ａを有している。
【００７６】
なお、各々の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂの壁面２０には複数の貫通孔２１が形成されている。
【００７７】
同様に図５（ｄ）に示すように、リング状に延びる軟質チューブ１０は、複数、例えば２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂを有していてもよい。
【００７８】
図５（ｄ）に示すように、軟質チューブ１０は２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂを有しており、２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂによって互いに向き合う２つの対の端部１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃ、１０Ｄが形成されている。そして一対の端部１０Ａ、１０Ｂ間に、硬質コネクターとしてＴ字型コネクター４３が設けられ、一対の端部１０Ｃ、１０Ｄ間に硬質コネクターとして、Ｔ字型コネクター４３が設けられている。また各々のＴ字型コネクター４３は気体チューブ１５３に連結された連結部４３ａを有している。
【００７９】
なお、各々の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂの壁面２０には複数の貫通孔２１形成されている。
【００８０】
次に以下、各部の構造について述べる。
【００８１】
（軟質チューブ）
軟質チューブ１０は、リング状に曲げても折れない柔軟な素材でできた中空管からなり、内部に空間１１が形成された壁面２０を有する（図１参照）。具体的には、軟質チューブ１０の素材としては熱可塑性エラストマー、白金処理シリコン、酸化物処理シリコン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリオレフィン、フッ素樹脂などが挙げられるが、溶出性の観点から米国薬局方クラスVI、ヨーロッパ薬局方、日本薬局方などに適合した熱可塑性エラストマーが望ましい。
【００８２】
軟質チューブ１０の内径は特に限定されないが、軟質チューブ１０に設けたすべての貫通孔２１から均等に気泡を発生させるためには３．０〜９．０ｍｍの内径をもつことが好ましい。これは、貫通孔２１を通って軟質チューブ１０の流路内に浸入した培養液１０８が、再び貫通孔２１を通って軟質チューブ１０の外側へ出て行きやすいからである。軟質チューブ１０の外径は内径よりも２．０〜６．０ｍｍ程度大きくすることが望ましい。
【００８３】
（貫通孔）
軟質チューブ１０に設けられる貫通孔２１は、ステンレス製の丸刃やドリルを含む公知の手段で設けることができる。その形状は円形であることが好ましいが、三角形や四角形、不定形であってもよい。貫通孔が円形の場合、最適な貫通孔の直径は培養する細胞によって異なるが、多くの場合０．５〜１．５ｍｍが望ましい。
【００８４】
すなわち、貫通孔２１の直径が０．５ｍｍ以下の場合、気泡が小さすぎるため細胞によってはダメージを受ける。他方、貫通孔２１の直径が１．５ｍｍ以上の場合、気泡が大きすぎるため気体供給効率が低くなり、また、標準条件ですべての貫通孔から気泡を出すのが難しい。
【００８５】
ここで、標準条件とは、圧力：０．１〜０．３ＭＰa、流速：５〜３０Ｌ／分の条件を言う。
【００８６】
このことから、本実施の形態においては、適度な大きさの気泡をすべての貫通孔２１から出すのに適した直径の範囲を０．５〜１．５ｍｍと定めた。
【００８７】
培養袋１１０内においてスパージャー５０を水平方向に配置した場合、貫通孔２１は内側であってかつ斜め上方を向くことが好ましい（図２（ａ）参照）。ここで、「内側」とは、図５（ａ）に示すような、リング状に延びるとともに一対の端部１０Ａ、１０Ｂを有し、壁面２０に複数の貫通孔２１が形成された中空状の軟質チューブ１０と、軟質チューブ１０の一対の端部１０Ａ、１０Ｂを互いに連結する硬質コネクタ４３とを備えている場合において、リング状となったスパージャー５０が形成するリングの中心側の面を示している。
【００８８】
これは、スパージャー５０が何らかの原因（自身の浮力など）で傾いてしまった場合でも、すべての貫通孔２１から気泡１０９が出やすいからである。貫通孔２１が真上を向いたり（図２（ｂ）参照）あるいは貫通孔２１が真横を向く場合（図２（ｃ）参照）、一部の貫通孔２１から気泡１０９が出ないことがある。
【００８９】
これらの現象は、スパージャー５０が傾くと軟質チューブ１０内の気体の分布が偏ることと関係している。例えばスパージャー５０が左側へ約３０°傾く場合を考える。貫通孔２１が真上を向いている場合、左半分の貫通孔は真上を向かなくなる上、左側の気体の一部が右側へ移動する。このため左半分だけ気泡１０９が出づらくなる（図３（ｂ）参照）。同様に、貫通孔２１が内側真横を向いている場合も、左側の気体の一部が右側へ移動するため気泡１０９が出づらくなる（図３（ｃ）参照）。
【００９０】
これに対して貫通孔２１が内側であってかつ斜め上方を向いている場合は、左半分の貫通孔はほぼ真上を向くようになるため、左側へ気体の一部が移動したとしても気泡１０９が出やすい（図３（ａ）参照）。
【００９１】
ところで軟質チューブ１０の１本あたりの貫通孔２１の数は３〜３０個であることが好ましく、それらはほぼ等間隔で設けられていることが望ましい。培養液への気体供給効率を上げるため比較的小さな気泡１０９を発生させたい場合は、貫通孔２１の数は１３個以上であることがより好ましい。ただし、１８個以上になるとすべての貫通孔から気泡を出すのが難しくなる。
逆に、大きな気泡１０９を発生させたい場合は、貫通孔２１の数は３〜８個であることが好ましい。
【００９２】
一般に、細胞培養では気体供給効率を上げるため比較的小さな気泡が好まれるので、貫通孔の数は１３個以上であることがより好ましい。  
【００９３】
このことから、本実施の形態においては、適度な大きさの気泡をすべての貫通孔２１から出すのに適した最適な貫通孔２１の数を１３〜１７個と定めた。
【００９４】
（硬質コネクター）
上述のように硬質コネクターとしては、連結部４３ａを有するＴ字型コネクター４３、連結部４４ａを有するＹ字型コネクター４４、コック４２ａを有するコック付き直線型コネクター４２を用いることができ、その他直線型コネクター４５を用いてもよい（図４（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）参照）。
【００９５】
このうち硬質コネクター４２は端部４２Ａを有し、硬質コネクター４３は端部４３Ａを有し、硬質コネクター４４は端部４４Ａを有し、硬質コネクター４５は端部４５Ａを有する。
【００９６】
硬質コネクター４２、４３、４４、４５は、軟質チューブ１０よりも硬い素材でできた、中空管である。具体的には、プラスチック、ガラス、金属などが挙げられるが、溶出性の観点から米国薬局方クラスVI、ヨーロッパ薬局方、日本薬局方などに適合したプラスチックが望ましい。
【００９７】
硬質コネクター４２、４３、４４、４５の端部４２Ａ、４３Ａ、４４Ａ、４５Ａの径は対応する軟質チューブ１０の内径と同じかそれよりもやや大きいものが選択される。
【００９８】
硬質コネクター４２、４３、４４、４５の端部４２Ａ、４３Ａ、４４Ａ、４５Ａの数は特に限定されないが、典型的には２個または３個である。２個の端部を有する典型的な硬質コネクターはコック付き直線型コネクター４２（図４（ｃ）参照）または直線型コネクター４５（図４（ｄ）参照）である。また３個の端部を有する典型的な硬質コネクターはＴ字型（コネクター４３（図４（ａ）参照）またはＹ字型コネクター４４（図４（ｂ）参照））である。ただし、Ｙ字型コネクター４４は３つの端部４４Ａが等角で枝分かれしていることが望ましい。
【００９９】
コック付き直線型コネクター４２は開閉可能なコック（４２ａ）を備えている。一般に、コック４２ａを閉じたときの方がすべての貫通孔２１から気泡１０９が出やすい。これは、コック４２ａを閉じることによって軟質チューブ１０の流路内に浸入した培地１０８が再び貫通孔２１を通って軟質チューブ１０の外側へ出て行きやすくなるためである。このため、スパージャー５０の運転中、すなわち培養袋１１０内の培養液１０８に対して気体を供給する間、コック付き直線型コネクター４２のコック４２は閉としておくことが好ましい。
【０１００】
Ｔ字型コネクター４３またはＹ字型コネクター４４の３つの端部４３Ａ、４４Ａのうち１つは気体供給源１６０側へ接続された気体チューブ１５３に連結部４３ａまたは連結部４４ａを介して連結される。残り２つの端部４３Ａ、４４Ａは、気体供給量の左右バランスをとるため、連結部４３ａまたは連結部４４ａ側の流路に対して等しい角度で分岐していることが望ましい。例えば、図５（ａ）に示すＴ字型コネクター４３は左右へそれぞれ９０°分岐し、図５（ｂ）に示すＹ字型コネクター４４は左右へそれぞれ１２０°分岐している。
【０１０１】
Ｔ字型コネクター４３またはＹ字型コネクター４４は１つのスパージャー５０に２つ以上含まれていてもよい。上述のように、図５（ｄ）に示すスパージャー５０はＴ字型コネクター４３が２つ含まれている。この場合、それぞれのＴ字型コネクター４３は同一または異なる気体供給源１６０へ連結される。
【０１０２】
ところで、図５（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）に示すように、軟質チューブ１０の脱落を防ぐために軟質チューブ１０と硬質コネクター４２、４３、４４、４５との嵌合部にインシュロック５１を取り付けることが望ましい。
【０１０３】
（製造方法）
本実施の形態によるスパージャー５０を製造する場合、まず軟質チューブ１０と、硬質コネクター４２、４３、４４、４５を用意する。次に軟質チューブ１０に複数の貫通孔２１を設けた後、軟質チューブ１０と、硬質コネクター４２、４３、４４、４５の１種もしくは２種以上とを互いに嵌合させる。このようにしてスパージャー５０が得られる。
【０１０４】
このうち例えば、図５（ｃ）に示すスパージャー５０を製造する場合、まず、軟質チューブ１０を適当な長さにカットし、長さ２２０ｍｍの２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂを準備する。次に、これらを１個のＴ字型コネクター４３と、１個の二方コック（閉栓）４２ａを有するコック付き直線型コネクター４２に嵌合させてリング状の軟質チューブ１０を得る。その後、ステンレス製の丸刃（直径１ｍｍ）を用いて２本の軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂにそれぞれ７個の貫通孔２１をほぼ等間隔に設ける。最後に、軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂの脱落を防ぐため嵌合部にインシュロック５１を取り付ける。
なお、軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂに貫通孔２１を設ける工程は、軟質チューブ部分１０ａ、１０ｂと硬質コネクター４２、４３とを互いに嵌合させる工程の前に行なってもよい。
【実施例１】
【０１０５】
次に本発明による具体的実施例について説明する。
【０１０６】
本実施例において、図５（ｃ）に示すスパージャー５０を製造するとともに、軟質チューブ１０の内径と貫通孔２１の向きが異なる様々なスパージャー５０異型サンプルを準備した。
【０１０７】
軟質チューブ１０の内径を３．２ｍｍ、４．８ｍｍ、６．４ｍｍ、７．９ｍｍ、９．５ｍｍ、１１．１ｍｍの６通り変化させた軟質チューブ１０を準備した。また貫通孔２１の向きを真上（図２（ｂ）参照）、内側であってかつ斜め上方（図２（ａ）参照）、内側真横（図２（ｃ）参照）の３通り変化させた軟質チューブ１０を準備した。軟質チューブ１０はＣ−フレックス（Ｒ）（サンゴバン株式会社）を使用した。貫通孔の直径は１ｍｍに統一した。
【０１０８】
これらのサンプルを水中に沈め、約０°（水平）に維持したときと、約３０°傾けたときの貫通孔２１から出る気泡１０９の均等性を調べた（表１）。この場合、スパージャー５０へ供給した空気の流速と圧力はそれぞれ５Ｌ／分と０．１ＭＰａとした。軟質チューブ１０の内径が３．２ｍｍ、４．８ｍｍ、６．４ｍｍのときは貫通孔２１の向きやスパージャー５０の傾きに関わらずすべての貫通孔２１から均等に気泡１０９が出た。軟質チューブ１０の内径が７．９ｍｍのときは、貫通孔２１の向きが内側であってかつ斜め上方のときだけスパージャー５０の傾きに関わらずすべての貫通孔２１から均等に気泡１０９が出た。
【０１０９】
軟質チューブ１０の内径が９．５ｍｍときは、貫通孔２１の向きが内側であってかつ斜め上方であっても一部の貫通孔２１から気泡１０９が出なかった。軟質チューブ１０の内径が１１．１ｍｍときは、貫通孔２１の向きやスパージャー５０の傾きに関わらず半分以上の貫通孔から気泡１０９が出なかった。
【０１１０】
なお表１において、貫通孔が内側であってかつ斜め上方を向く場合、「内側斜め」と記載した。
【表１】
2015142546.tif 000003
【実施例２】
【０１１１】
本実施例において、図５（a）に示すスパージャー５０を製造するとともに、貫通孔２１の数を１〜２０の２０通り変化させた軟質チューブ１０を準備した。なお、軟質チューブ１０はＰｈａｒｍａ５０  Ｔｕｂｉｎｇ（ダウコーニング株式会社）を使用した。また、軟質チューブ１０の内径は６．４ｍｍ、貫通孔２１の直径は１．０ｍｍに統一した。
【０１１２】
これらのサンプルを水中に沈め、水平に維持したときの貫通孔２１から出る気泡１０９の直径と、気泡が出なかった貫通孔の数を調べた（表２）。なお、スパージャー５０へ供給した空気の流速と圧力はそれぞれ３Ｌ／分と１ｋＰａとした。その結果、貫通孔２１の数が増加するにつれて気泡径が減少し、１３以上でほぼ一定となった。また、貫通孔２１の数が１７以下のときはすべての貫通孔２１から均等に気泡が出たが、１８以上では一部の貫通孔から気泡が出なかった。以上のことから、すべての貫通孔から比較的小さな気泡を出すためには貫通孔２１の数は１３〜１７であることが望ましいことが分かった。
【表２】
2015142546.tif 000004
【符号の説明】
【０１１３】
１０  軟質チューブ
１０ａ  軟質チューブ部分
１０ｂ  軟質チューブ部分
１１  空洞
２０  壁面
２１  貫通孔
４２  コック付き直線型コネクター
４２ａ  コック
４３  Ｔ字型コネクター
４３ａ  連結部
４４  Ｙ字型コネクター
４４ａ  連結部
４５  直線型コネクター
５０  スパージャー
５１  インシュロック
１０８  培養液（培地）
１１０  培養袋
【図１】
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【図２】
2015142546.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015142546.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2015142546.tif 000021
【図１８】
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【図１９】
2015142546.tif 000023
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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