(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルギー又は自己免疫疾患等の予防又は治療の為の新規な免疫原性ペプチドおよびそのホモログの提供。【解決手段】抗原提示細胞に対するＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞の集団の同定する方法であって、同定方法は、ＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞によりＣＤ４を発現すること、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞を発現しないこと、Ｋｒｏｘ−２０を発現すること、ならびに、グランザイム及びＦａｓリガンドを生成すること、を判定する方法。抗原（自己または非自己）のＴ細胞エピトープであって、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）決定基によって提示され、リンカーの使用によって低下した活性を有するアミノ酸配列、例えばチオレダクターゼ配列に結合されたＣＤ４＋Ｔ細胞、より詳細にはアレルゲン又は自己抗原によって認識される免疫反応を引き起こす可能性を備えているＴ細胞エピトープである免疫原性ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞に対するＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞の集団を同定する方法であって、
−前記ＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞によりＣＤ４を発現すること、
−ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞を発現しないこと、
−Ｋｒｏｘ−２０を発現すること、ならびに、
−グランザイムおよびＦａｓリガンドを生成すること、を判定することを含む、方法。
【請求項２】
抗原提示細胞に対するＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞の集団を同定する方法であって、
−非細胞傷害性Ｔｒｅｇｓによりこれらのマーカーの発現と比較した場合の、活性化時におけるＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＦａｓＬおよびＩＣＯＳを含む表面マーカーの発現増進、
−ＣＤ２５の高度発現、ＣＤ４、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲの発現およびＣＤ１２７（ＩＬ７−Ｒ）の低発現または無発現、
−転写因子Ｔ−ｂｅｔおよび／またはｅｇｒ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の発現、
−転写抑制因子Ｆｏｘｐ３の無発現、
−ＩＦＮ−ガンマの高度産生、
−ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＴＧＦ−ベータがないか、ごく微量、
−活性化時のＦａｓＬならびにグランザイムＢおよびＣを含むマーカーの発現増進、の１つ以上を判定することを含む、方法。
【請求項３】
抗原提示細胞に対するＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞がＴＣＲ認識による活性化に応答しないことを判定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸１２〜５０個の長さを有する単離免疫原性ペプチドであって、
−抗原タンパク質のＴ細胞エピトープ、
−モチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃであって、前記モチーフが前記エピトープと隣接するか、または１個のアミノ酸のリンカーによって前記エピトープから隔離されるかのどちらかであるか、または、
−モチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃであって、前記モチーフにおける少なくとも１個のＸがＨｉｓまたはＰｒｏであり、前記モチーフが前記エピトープと隣接するか、または多くとも４個のアミノ酸のリンカーによって前記エピトープから隔離されるかのどちらかである
を含む、単離免疫原性ペプチド。
【請求項５】
アレルギー状態の治療および予防に使用するためのものである、請求項４に記載の単離免疫原性ペプチド。
【請求項６】
アミノ酸１２〜５０個の長さを有する単離免疫原性ペプチドであって、
−自己抗原のＴ細胞エピトープ、
−モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｃであって、前記モチーフが前記エピトープと隣接するか、または多くとも７個のアミノ酸のリンカーによって前記エピトープから隔離されるかのどちらかである、
を含む、単離免疫原性ペプチド。
【請求項７】
アミノ酸１２〜５０個の長さを有する単離免疫原性ペプチドであって、
−自己抗原のＴ細胞エピトープ、
−モチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃであって、前記モチーフが前記エピトープと隣接するか、または多くとも７個のアミノ酸のリンカーによって前記エピトープから隔離されるかのどちらかである、
を含み、自己免疫疾患の治療および予防に使用するためのものである、単離免疫原性ペプチド。
【請求項８】
細胞傷害性ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性を抑制する能力を有する、アミノ酸１２〜５０個の免疫原性ペプチドを調製する方法であって、
−抗原タンパク質の配列におけるＴ細胞エピトープを同定するステップと、
−前記抗原タンパク質の配列におけるモチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］を同定するステップと、
−同定されたＴ細胞エピトープおよびモチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃまたは［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃをさらに含むアミノ酸１２〜２０個の長さを有するペプチドを調製するステップであって、前記モチーフおよび前記エピトープは互いに隣接するか、または多くとも７個のアミノ酸のリンカーによって前記エピトープから隔離されるかのどちらかであり、ここにおいて調製された免疫原性ペプチドの配列は免疫原性タンパク質の配列と異なる、ステップ
とを含む、方法。
【請求項９】
抗原を提示する抗原提示細胞に対するＣＤ４＋細胞傷害性Ｔ細胞の集団を得る方法であって、
ａ）アミノ酸１２〜５０の長さの免疫原性ペプチドであって、
−前記抗原タンパク質のＴ細胞エピトープと、
−モチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃであって、前記モチーフが前記エピトープと隣接するか、または多くとも７個のアミノ酸のリンカーによって前記エピトープから隔離されるかのどちらかである、
とを含む免疫原性ペプチドを単離末梢血球と接触するステップと、
ｂ）ＩＬ−２の存在下で前記細胞を増殖させるステップ
とを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって取得できる細胞傷害性Ｔ細胞の集団であって、アレルギー状態または自己免疫障害の治療および予防に使用するためのものである、細胞傷害性Ｔ細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫原性ペプチドならびにアレルギーおよび自己免疫障害を抑制する治療でのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳類免疫系は、体外および体内の危機に陥らせる因子から被験体を保護するように作用する複雑なネットワークである。しかしながら一部の状況において、本複雑な保護機構は被験体内での、たいていは慢性的な意味を持つ障害の原因を維持するか、またはそれ自体が原因となる。多くのこのような免疫障害が存在しており、２つの重要な免疫障害はアレルギー疾患および自己免疫障害である。アレルギー疾患は、従来、１型媒介疾患またはＩｇＥ媒介疾患として説明されており、過去２０年間にわたってほぼ２倍となったその罹患率が確認されている。アレルギー疾患の臨床徴候としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品に対する過敏症および虫刺されまたは薬物に対するアナフィラキシー反応が挙げられる。アレルギー患者の治療に関連する経済的負担は、年月を重ねるにつれて着実に増加している。１例として、米国におけるアレルギー治療の処方に関連する費用は、２００６年には約１００億米ドルに達することが予想される。可能ならば常時のアレルゲン除去による、および／または気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、副腎皮質ステロイドおよび免疫調節薬、たとえばシクロスポリンを使用する対症療法による管理下に置かれているこのような疾患に有効な療法は現在ない。患者が感作されているアレルゲンの定期的投与に存するアレルゲン脱感作は、アレルギー性鼻炎での有効性を示しているが、喘息およびアトピー性皮膚炎では議論の余地を残している。一部の臨床症状、たとえば食物アレルゲンに関する臨床症状は、脱感作によって治療できない。
【０００３】
自己免疫は、生物がそれ自体の構成要素部分（準分子レベルに至るまで）を「自己」として認識できないことであり、それ自体の細胞および組織に対して免疫応答を引き起こす。このように異常な免疫応答から生じるいずれの疾患も自己免疫疾患と呼ばれる。顕著な例は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群および関節リウマチ（ＲＡ）である。自己免疫疾患は、２つの種類、すなわち全身性疾患および器官特異的疾患に大きく分類される。全身性自己免疫疾患の明確な病因は同定されていない。これに対して、器官特異的自己免疫疾患は、器官を標的として、それにより局所炎症の慢性状態を誘発および維持する、ＢおよびＴ細胞を含む特異的免疫応答に関連している。器官特異的自己免疫疾患の例としては、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、甲状腺炎、多発性硬化症、セリアック病、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、副腎炎、多内分泌腺症候群、胃炎、悪性貧血、ブドウ膜炎などの眼疾患、および蝸牛炎などの内耳疾患が挙げられる。
【０００４】
自己免疫反応はそれゆえ、自己の細胞または組織に、さらに詳細には「自己抗原」、すなわち哺乳類生物に自然に存在する（タンパク質の）抗原に向けられている。本機構において、自己抗原は、自己抗原を含む組織を攻撃するために免疫系を活性化するＢおよび／またはＴ細胞によって認識される。免疫系の抑制が有益であり、一部の場合では、一部の例における器官機能の部分的または完全な回復につながることが十分に認識されている。この種類の療法はしかしながら、すべての器官特異的自己免疫疾患で効果的というわけではなく、現在まで、抗原特異的方法では免疫抑制は達成不可能である。現在の療法は、特異性の欠如に関連する著しい副作用をすべて示し、それによりその使用およびその全体的な有効性を制限している、副腎皮質ステロイドおよび免疫抑制剤の使用によって得られた非特異的免疫抑制を利用する。
【０００５】
興味深いことに、理解には程遠い理由のために、自己免疫疾患の発生率は、アレルギー疾患で見られた増加とほぼ並行して、過去２０年間にわたって２倍になっている。再度、自己免疫疾患の治療に関連する費用は近年、非常に増加しており、新たな形の療法への要求にさらなる議論を加えている。
【０００６】
従来技術では、アレルゲンのＴ細胞エピトープは脱感作目的で利用されてきた。１個または２、３個のＴ細胞エピトープを含有するアレルゲン由来ペプチドは、ＷＯ９３／０８２７９に記載されているように、特異的Ｔ細胞活性化を阻害して、Ｔ細胞無応答の状態を誘発する試みにおいて、動物実験またはヒトにおいて使用されている。本概念の１つのヒト用途は、ネコ感受性個人における皮下注射による、ＦｅＩ  ｄ  Ｉアレルゲンに存在するＴ細胞エピトープの配列に由来するペプチドの投与である（Ｗａｌｌｎｅｒ  ＆  Ｇｅｆｔｅｒ（１９９４）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４９，３０２−３０８）。あるいは本概念の補足的手法も動物実験において使用されている。使用されたペプチドは、特異的Ｂ細胞のＭＨＣクラスＩＩ決定基に結合するような方法で修飾されたが、これらのペプチドは、対応するＴ細胞を活性化するその能力を失った（Ｏ’Ｈｅｈｉｒら、（１９９１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，８１９−８２６）。
【０００７】
このタンパク質からの重複ペプチドのセットによるイエダニのアレルゲンＤｅｒ  ｐ  ２のスクリーニングは、１つの特異的ペプチドｐ２１−３５がユニバーサルエピトープとして挙動して、Ｔ細胞アネルギー誘発の適切な候補でありうるＴ細胞エピトープを含むことを示す（Ｗｕら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，１４３０−２４３５，ＷＯ０１７０２６３）。関連刊行物において、本ペプチドおよびその誘導体が、Ｂ細胞を提示する抗原のＣＤ４＋ＣＤ２５＋媒介アポトーシスに対するエピトープ特異的効果を有することが示された（Ｊａｎｓｓｅｎｓら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，４６０４−４６１２）。しかしながら本ペプチドの同定は、アレルゲンの網羅的なスクリーニングを必要とし、１つ１つの抗原タンパク質、たとえばアポトーシス誘発効果を持つペプチドが同定されうるという指摘はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
より効果的、より特異的で、より少ない副作用を有し、疾患の症状を単に治療する代わりに治療に有効であり、さらに詳細には低い費用で容易に入手可能である、アレルギーまたは自己免疫疾患などの免疫疾患の予防または治療のための新規な方法または薬物への要求があることは明らかである。さらに詳細には、アレルギー疾患のための、安全であり、長期にわたって有益な効果を生成する、関与するアレルゲンに特異的である新たな形の療法の開発のための要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、細胞傷害活性を備えた新規な免疫原性ペプチドに関する。本発明のペプチドは、（ｉ）抗原（自己または非自己）の少なくとも１つのＴ細胞エピトープであって、（ｉｉ）低下した活性を有する有機化合物、たとえばチオレダクターゼ配列に場合によりリンカーによって結合された、免疫反応を引き起こす可能性を備えているＴ細胞エピトープを含み、さらに場合により（ｉｉｉ）エンドソームターゲティングアミノ酸配列を含む。
【００１０】
１態様において、本発明は、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープおよびモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃを含む人工配列を備え、該モチーフが低下した活性を有し、本ペプチドと接触させたときにＴ細胞による特異的応答を生じる抗原タンパク質に由来する単離免疫原性ペプチドを提供する。
【００１１】
詳細な実施形態において、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープおよびモチーフＣ−Ｘ（２）−Ｃを含む人工配列を含み、それにより該モチーフが人工配列内で多くてもアミノ酸７個のリンカーによってエピトープに隣接して、またはエピトープから隔離されてのどちらかで位置決めされた、抗原タンパク質に由来する単離免疫原性ペプチドが提供される。さらなる詳細な実施形態において、抗原タンパク質に由来する単離免疫原性ペプチドは、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープおよびモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃを含む人工配列を含み、それにより該モチーフは人工配列内で多くてもアミノ酸７個のリンカーによってエピトープに隣接して、またはエピトープから隔離されてのどちらかで位置決めされ、それにより該モチーフはエピトープが由来するタンパク質中のＴ細胞エピトープのＮ末端側またはＣ末端側のアミノ酸１１個の領域内で自然発生しない。さらなる詳細な実施形態は、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープおよびモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＳＴ］または［ＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃを含む人工配列を含み、それにより該モチーフは人工配列内で多くてもアミノ酸７個のリンカーによってエピトープに隣接して、またはエピトープから隔離されてのどちらかで位置決めされ、それによりモチーフがＣ−Ｘ（２）−ＳまたはＳ−Ｘ（２）−Ｃであるこのようなペプチドにおいて、Ｔ細胞エピトープがＤｅｒ  ｐ  ２のｐ２１−３５ペプチドの配列ＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列番号：１］を備えていない、抗原タンパク質に由来する単離免疫原性ペプチドを提供する。さらなる詳細な実施形態は上記の免疫原性ペプチドに相当し、モチーフがＣ−Ｘ（２）−ＳまたはＳ−Ｘ（２）−Ｃであるこのようなペプチドでは、抗原タンパク質がＤｅｒ
ｐ  ２ではない。
【００１２】
本発明のさらなる詳細な実施形態は、人工配列に結合された晩期エンドソームターゲティング配列をさらに含む、上記のような免疫原性ペプチドに関する。
【００１３】
本発明のさらなる詳細な実施形態は、エピトープのＮ末端側に位置決めされたモチーフを含む、上記のような免疫原性ペプチドに関する。
【００１４】
本発明のさらなる詳細な実施形態は、人工配列がアミノ酸１２〜１９個の長さを有する、上記のような免疫原性ペプチドに関する。
【００１５】
本発明の詳細な実施形態において、モチーフ中のＸがＴｙｒ、または別のかさ高いアミノ酸、たとえばＴｒｐまたはＰｈｅでない、上記のような免疫原性ペプチドが提供される。且つ／あるいは、詳細な実施形態において、モチーフ中のＸの少なくとも１つは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。且つ／あるいは、詳細な実施形態において、モチーフ中のＸの少なくとも１つは、ＨまたはＰである。
【００１６】
本発明の詳細な実施形態において、相当するモチーフ中のシステインがメチル化されている、上記のような免疫原性ペプチドが提供される。モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｃの場合、モチーフ中の１つまたは両方のシステインがメチル化されうる。
【００１７】
本発明の免疫原性ペプチドは、免疫抑制効果を作り出すのに有用であり、それにより標的化された免疫抑制効果はエピトープの由来する抗原タンパク質の性質を決定することが予想される。上記の免疫原性ペプチドの詳細な実施形態において、抗原タンパク質は自己抗原、さらに詳細にはサイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インスリン（プロインスリン）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリン乏突起膠細胞タンパク質、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５から成る群より選択される自己抗原である。
【００１８】
上記の免疫原性ペプチドのさらに詳細な実施形態において、抗原タンパク質はアレルゲン、さらに詳細にはシラカンバＢｅｔ  ｖ１アレルゲン、ウシベータラクトグロブリンおよびＤｅｒ  ｐ  １から成る群より選択されるアレルゲンである。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、上記の免疫原性ペプチドの治療的および予防的用途に関する。したがっ医薬的に許容される担体を含む、上記のペプチドの１つ以上を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、自己免疫障害の治療および予防における上記のペプチドの使用に関する。上で指摘したように、ペプチドは治療効果および予防効果の両方を有し、それにより自己免疫疾患の発生の低減、自己免疫疾患の再発の発生および／または重症度の低減、ならびに／あるいは自己免疫疾患の予防を可能にすると説明されている。それゆえ本発明は、自己免疫障害の治療および予防での使用のための上記の免疫原性ペプチドを提供する。本発明の文脈で予想される自己免疫疾患の具体的な実施形態としては、これに限定されるわけではないが、多発性硬化症、自発的インスリン依存性糖尿病および自己免疫甲状腺炎が挙げられる。
【００２１】
本発明のなおさらなる態様は、アレルギー状態の治療および予防における上記のペプチドの使用に関する。上で指摘したように、ペプチドは治療効果および予防効果の両方を有し、それによりアレルギー状態の発生および／または重症度の低減、ならびに／あるいはアレルギー状態の予防、ならびに／あるいはアレルギー状態の症状の低減を可能にすると説明されている。さらに詳細には、本発明は、チリダニアレルギー、牛乳アレルギーおよびカンバ花粉アレルギーから成る群より選択されるアレルギー状態の治療および予防での使用のための、本発明に記載したようなペプチドを提供する。
【００２２】
本発明のなおさらなる態様は、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を誘発できる抗原タンパク質のペプチドを調製する方法を提供し、前記方法は、（ａ）抗原タンパク質のＴ細胞エピトープから成るペプチド配列を提供するステップと、モチーフおよびエピトープが相互に隣接すること、あるいは多くてもアミノ酸７個のリンカーによって隔離されることのどちらかであるように、本ペプチド配列をモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃを含む配列に結合するステップとを備える。詳細な実施形態において、モチーフは、モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｃである。本発明の本態様による方法の詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞エピトープのＮ末端側またはＣ末端側のアミノ酸１１個の領域内にモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃを天然には含まない抗原タンパク質のエピトープであり、Ｔ細胞エピトープはモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃに結合されている。本発明の本態様による方法のなお他の詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープがＤｅｒ  ｐ
２のｐ２１−３５ペプチドの配列ＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列番号：１］を含む場合、モチーフはＣ−Ｘ（２）−ＳまたはＳ−Ｘ（２）−Ｃではない。さらなる詳細な実施形態において、抗原タンパク質はＤｅｒ  ｐ  ２ではない。
【００２３】
詳細な実施形態において、本発明の方法は、エピトープ中のアミノ酸を修飾することによってこのように得たペプチドの配列を修飾することと、それによりＭＨＣ  ＩＩ溝に適合する能力が維持されるように修飾ペプチドにおけるエピトープの配列が確実に修飾されるようにすることをさらに含む。このような修飾はアミノ酸置換を含むが、アミノ酸鎖中の変化、たとえばアミノ酸またはなお非天然的に発生する非天然アミノ酸側鎖の翻訳後修飾に遭遇する修飾も含む。
【００２４】
本発明のなおさらなる態様は、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を誘発できる抗原タンパク質の単離免疫原生ペプチドを調製する方法に関し、該方法は、抗原タンパク質内で、Ｔ細胞エピトープのＮ末端側またはＣ末端側のアミノ酸１１個の領域内のモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃに抗原タンパク質中で隣接されたＴ細胞エピトープを備えた配列を同定するステップと、アミノ酸１２〜１９個の単離ペプチドとして本配列を含むペプチドを産生するステップとを含む。この方法では、特定の免疫原性特性を備えたペプチドが産生されうることは、先に証明されていない。詳細な実施形態において、抗原タンパク質はＤｅｒ  ｐ  ２ではない。
【００２５】
さらなる詳細な実施形態により、本発明の本態様による方法は、モチーフ中のアミノ酸を修飾することによって、および／またはモチーフとエピトープとの間のアミノ酸の数を変更することによって、および／またはエピトープ配列を修飾することによって、前記ペプチドの配列を修飾することを含み、それにより前記修飾されたペプチドにおいて：
−Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ  ＩＩ溝に適合する能力が維持される、
−モチーフが保存される、ならびに
−前記モチーフおよび前記エピトープが相互に隣接されたまま、または多くてもアミノ酸７個のリンカーによって隔離される、
ことを確実にする。
【００２６】
さらなる詳細な実施形態において、本発明の本態様による方法は、晩期エンドソームターゲティング配列を、上記のように得たペプチドに結合するステップをさらに含む。
【００２７】
本発明のなおさらなる態様は、細胞傷害性Ｔｒｅｇの集団を同定する方法に関する。詳細な実施形態において、細胞がＣＤ４を発現して、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータを発現せず、Ｋｒｏｘ−２０を発現して、グランザイム（特にグランザイムＢおよびＣ）およびＦａｓリガンドを生成することを判定することを含む方法が提供される。
【００２８】
さらなる詳細な実施形態において、本発明の本態様による方法は、非細胞傷害性Ｔｒｅｇと比較したときに次の特徴の１つ以上を判定することを含む：
ａ）活性化時におけるＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＦａｓＬおよびＩＣＯＳを含む表面マーカーの発現増進、
ｂ）ＣＤ２５の高度発現、ＣＤ４、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲの発現およびＣＤ１２７（ＩＬ７−Ｒ）の低発現または無発現、
ｃ）転写因子Ｔ−ｂｅｔおよび／またはｅｇｒ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の発現、しかし転写抑制因子Ｆｏｘｐ３の無発現、
ｄ）ＩＦＮ−ガンマの高度生成およびＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＴＧＦ−ベータがないか、ごく微量、
ｅ）活性化時のＦａｓＬならびにグランザイムＢおよびＣを含むマーカーの発現増進。
【００２９】
さらなる詳細な実施形態において、本発明の本態様による方法は、これらの細胞がＴＣＲ認識による活性化に応答しないことを判定するステップを含む。
【００３０】
本発明のなおさらなる態様は、細胞傷害特性を備えた抗原特異的調節Ｔ細胞の集団を得る方法を提供する。詳細な実施形態において、本態様による方法は：
−末梢血球を提供するステップと、
−前記血球に上記の免疫原性ペプチドを接触させるステップと、
−ＩＬ−２の存在下で前記細胞を増殖させるステップと、
を含む。
【００３１】
さらなる詳細な実施形態において、これらの方法は、本発明による免疫原性ペプチドを被験体に投与することと、前記被験体から細胞傷害性特性を備えた抗原特異的調節Ｔ細胞を単離することとを含む。
【００３２】
本発明のなおさらなる態様は、上記の本発明の方法によって取得できる（および／または同定できる）細胞傷害性特性を備えた調節Ｔ細胞の集団に関する。
【００３３】
本発明のなおさらなる態様は、アレルギー状態または自己免疫障害の治療または予防における、上記のＴ調節細胞の集団の使用を提供する。
【００３４】
本発明の本態様の詳細な実施形態において：
−治療される被験体の末梢血球を提供するステップと、
−該血球に本明細書に記載する免疫原性ペプチドを接触させるステップと、
−血球を増殖させるステップと、
−増殖した血球を治療される被験体に投与するステップと、
を含む方法が提供される。
【００３５】
本明細書で提供される方法においてさらに詳細には、治療される疾患プロセスに関与する抗原タンパク質から由来するＴ細胞エピトープの免疫原性ペプチドが使用される。最も詳細には、抗原はドミナント抗原である。
【００３６】
本発明は、本明細書に記載するような１つ以上の免疫原性ペプチドを前記被験体に投与するステップを含む、被験体における自己免疫障害を治療または予防する方法をさらに提供する。その上、本発明は、本明細書に記載するような免疫原性ペプチドの１つ以上を前記被験体に投与するステップを含む、被験体における症状およびアレルギー状態を治療または低減する方法を提供する。本明細書で提供される方法においてさらに詳細には、治療される疾患プロセスに関与する抗原タンパク質から由来するＴ細胞エピトープの免疫原性ペプチドが使用される。最も詳細には、抗原はドミナント抗原である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、インスリン還元アッセイ（濁度アッセイ）における、Ｄｅｒ  ｐ  ２のｐ２１−３５がジスルフィド架橋を還元する能力を示す（点線：対照；三角形付き実線：Ｂ４ペプチド；正方形付き実線：Ｔｒｘ（チオレドキシン）。
【図２】図２は、サブドミナントＴ細胞エピトープの添加による、抗原提示細胞によるｐ２１−３５の取り込みの増加を示す（標的Ｗｅｈｉ  Ｂ細胞のアポトーシスによりアッセイ）（正方形付き灰色線：Ｔ−Ｂペプチド（破傷風毒素のマイナーＴエピトープ（ｐ８３０−８４４）に結合されたｐ２１−３５；三角形付き黒線：ｐ２１−３５ペプチド）。
【図３】図３は、本発明の実施形態による、Ｔｒｅｇクローン増殖に対する、Ｐ２１−３５における位置２１〜２４のアラニンへの変異の効果を示す（３Ｈチミジン取り込み（パネルＢ）およびＷｅｈｉ細胞溶解（パネルＣ））。ｐ２１−３５においてＭＨＣ−クラスＩＩ結合溝を形成するモチーフおよび残基がパネルＡに示されている（ｎｅｇ：ペプチドなし；ａ２１：Ｃｙｓ２１Ａｌａ変異；ａ２２：Ｈｉｓ２２Ａｌａ変異；ａ２３：Ｇｌｙ２３Ａｌａ変異、ａ２４：Ｓｅｒ２４Ａｌａ変異）。
【図４】図４は、本発明の実施形態によるＤｅｒ  ｐ  ２タンパク質の注射時の、アレルギーのインビボマウスモデルにおけるＴ−Ｂによる予備免疫の効果を示す。「Ｄｅｒ  ｐ  ２モデル」はマウスの対照群であり、ＴｂａｌｕｍはＴ−Ｂペプチドによって予備処理された実験群である。パネルＡ：対照および実験群におけるマクロファージ、好酸球およびリンパ球の量（総数として表す）。パネルＢ：０〜６の強度スコアリングシステムを使用して表現された好酸球、リンパ球および杯細胞の量。パネルＣ：対照および実験群における気道過敏性。過敏性は、マウスを上昇する濃度のメタコリンに曝露することによって得たＰｅｎＨ値の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって測定される。
【図５】図５は、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ標識細胞の細胞分取によって測定した同種Ｔｒｅｇ細胞の酸化代謝に対するｐ２１−３５の効果を示す。パネルＡ：ＰＢＳ（負の対照）；パネルＢ：ｐ２１−３５ペプチド；パネルＣ：ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（正の対照）。
【図６】図６は、細胞溶解パーセンテージとして示された、ｐ２１−３５ペプチドの添加時に抗原提示細胞として使用されたＷＥＨＩＢ細胞系統に対するＴｒｅｇ系統（Ｇ１２１）の細胞傷害性特性を示す（菱形：ＷＥＨＩ＋Ｔ細胞、正方形：ＷＥＨＩ細胞＋Ｔ細胞＋ｐ２１−３５ペプチド、三角形Ｔ細胞＋ｐ２１−３５ペプチドと共に予備ロードされたＷＥＨＩ細胞）。
【図７】図７は、本発明の実施形態による細胞傷害性による、同じ抗原の別のエピトープに特異的な、または別の抗原に特異的なＴ細胞の活性化に対するＴｒｅｇ細胞クローンによる抑制を示す。パネルＡおよびＢ：Ｄｅｒ  ｐ  １に特異的なＴ細胞系統。パネルＣおよびＤ：Ｄｅｒ  ｐ  ２のペプチドｐ７１−８５に特異的なＴ細胞系統。パネルＡおよびＣは、ペプチド２１−３５に特異的な細胞傷害性Ｔｒｅｇクローンによるインキュベーション前の、細胞系統の増殖を示す。パネルＢおよびＤは、ペプチド２１−３５に特異的な細胞傷害性Ｔｒｅｇクローンによるインキュベーション後の、細胞系統の増殖を示す。
【図８】図８は、本発明のＴｒｅｇ細胞が特徴的な表現型プロフィールを有することを示す。図は、ペプチドｐ２１−３５、図４のようなペプチドＴ−Ｂによって処理したマウスに由来する、４つのペプチドｐ２１−３５特異的Ｔｒｅｇクローンのサイトカイン生成を示す（左パネル）。細胞培養物の上清は、抗原提示細胞（未処理マウスからの照射脾臓細胞１０５個）およびペプチドｐ２１−３５（２μｇ／ｍｌ、２００μｌ）による刺激の４日後にサイトカイン含有量について分析した。Ｔｒｅｇクローンが主としてＩＦＮ−Ｇを、そしてごく微量のＴＮＦ−ａおよびＩＬ−１０を産生したことがわかる。右パネルは、このようなＴｒｅｇ細胞のｍＲＮＡの分析において、転写抑制因子Ｆｏｘｐ３の転写物は検出されなかったが、Ｔ−ｂｅｔ、グランザイムＡおよびグランザイムＢが強力に発現されたことを示している。
【図９】図９は、蛍光励起細胞分取（Ｆａｃｓ）を使用した静止時の４つのｐ２１−３５特異的Ｔ細胞クローンの各種の細胞マーカーの発現を示す。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態による、対照ペプチド（標的シグナル−Ｄｅｒ  ｐ  １エピトープ）および実験ペプチド（標的シグナル−ＣＦＧＳ−Ｄｅｒ  ｐ  １エピトープ）による刺激後の、細胞傷害特性を備えたＴ細胞クローンの産生の図式概要を示す。「ｎ」は、Ｔ細胞クローンの総数であり、「溶解」は、ＷＥＨＩ細胞を溶解させる能力を有するこれらのクローンの数である。
【図１１】図１１は、本発明の実施形態による変異残基を持つエピトープ配列を使用する抗原特異的調節Ｔ細胞の誘発を示す。パネルＡ：アポトーシスの誘導（ｐ２１−３５（三角形）、ｐ２１−３５ｍｅｔ（メチル化システインを含むｐ２１−３５ペプチド）（×印）またはｍｐ２１−３５（破傷風トキソイドのマイナーエピトープおよびＰ２１−３５の融合ペプチド）（正方形）で予備ロードされ、Ｇ１２１細胞溶解性Ｔｒｅｇクローンと共に２４時間同時培養されたＷｅｈｉ細胞を使用して、ＣＤ１９＋ゲート細胞でのアネキシン−Ｖ発現として示す。）少なくとも３回の実験を表す結果；パネルＢ：全Ｄｅｒ  ｐ  ２タンパク質（黒色）、ｐ２１−３５ｍｅｔ（メチル化システインを含むｐ２１−３５ペプチド）（白色）またはｐ８３０（破傷風トキソイドのペプチドｐ８３０−８４４）およびｐ２１−３５ｍｅｔの混合物（灰色）によって誘発された脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の抑制（［３］Ｈチミジン取り込みとして測定）。ヒストグラムは、個別に３通り試験されたマウス６匹からの平均ｃｐｍ±標準誤差についてである：パネルＣ：パネルｂに示された、ペプチドによって予備処理された脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカインの生成。３つの細胞集団はすべて未処理Ｄｅｒ  ｐ  ２によって刺激した。ヒストグラムは、個別に試験されたマウス６匹からの平均濃度±標準誤差についてである：パネルＤ：ＡＰＣとしての接着脾臓細胞およびエフェクタｐ２１−３５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン（Ｇ２２１Ｎ）を使用して判定したｐ２１−３５ｍｅｔ、ｍｐ２１−３５およびＤｅｒ  ｐ  ２の処理および提示。ＡＰＣは示した阻害薬によって前処理した。Ｔ細胞の増殖は刺激指数として示される。棒は３回分の培養物の標準誤差値を表す。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態に従ってｍｐ２１−３５Ａｓｎ（破傷風トキソイドペプチドおよび変異ｐ２１−３５（ｌｌ２８Ａｓｎ）の融合ペプチドによって得た細胞溶解性Ｔｒｅｇクローンの表現型特徴付けを示す。ミョウバン中のＴｒｅｇクローンを表面マーカー発現および細胞内ＣＴＬＡ−４について試験した。パネルＡ：Ｔｒｅｇクローンからの表面マーカー（Ｆａｃｓ）の発現；パネルＢ：蛍光標識特異的抗体（黒色）を使用する、Ｆｏｘｐ３、Ｔ−ｂｅｔ、グランザイムＢ（Ｇｒｚ−Ｂ）、パーフォリンおよび表面ＣＤ１２７の細胞内検出。アイソタイプ適合抗体を用いた対照染色も示されている（白色）。パネルＣ：４つの細胞溶解性クローンでの最後の刺激の１２日後に検出されたＧｒｚ−ＡおよびＧｒｚ−Ｂ  ｍＲＮＡ転写物のＲＴ−ＰＣＲ。レーン１、３、４および５はＴｒｅｇクローンを示し、レーン２は対照ｐ２１−３５特異的ＣＤ４＋エフェクタＴ細胞クローンを示す。ベータアクチンを対照として使用した。パネルＤ：未処理マウスから得て、ｍｐ２１−３５Ａｓｎをロードした照射Ｔ細胞除去脾臓細胞を用いた刺激の３日後の４つのクローンにおけるサイトカインのＥＬＩＳＡ検出。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態による抗原提示細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。パートＡ：左パネル：ｐ２１−３５とＲ３ＴＢ７  Ｔ細胞クローン（比２／１）で予備ロードした脾臓Ｂ細胞のインキュベーション（１８時間）。右パネル：ｐ２１−３５と対照ＣＤ４＋エフェクタＴ細胞クローンで予備処理した脾臓Ｂ細胞のインキュベーション（１８時間）。点線を用いた白色区域は、Ｔ細胞なしで培養したＢ細胞中でのカスパーゼ−３発現を表す；実線を用いた灰色区域は、細胞溶解性Ｔｒｅｇクローン（左パネル）またはＣＤ４＋エフェクタクローン（右パネル）の存在下でのカスパーゼ−３の発現を示す。開裂カスパーゼ３に対するＡｂによる染色。データは最低３つの独立した実験による評価を表す。パートＢ：左パネル：樹状細胞（ＬＰＳによって活性化されたＣＤ１１ｃ＋樹状細胞）  右パネル：ＷＥＨＩ細胞どちらの細胞タイプもｐ２１−３５をロードして、Ｒ３ＴＢ７  Ｔｒｅｇ（黒色区域）または同じ特異性の対照非細胞溶解性クローン（Ｇ２２１Ｎ）（白色区域）と同時培養する。アポトーシスは、開裂カスパーゼ３に対するＡｂを使用して測定する。細胞カウントは、１８時間のインキュベーション後に生存しているＷＥＨＩ細胞の数を指す。２回の実験を代表するデータ。表示した抑制％は、Ｒ３ＴＢ７によるＷｅｈｉ成長の抑制％である。パートＣ：左パネル：抗ＦａｓＬ抗体を用いたＷＥＨＩ細胞のインキュベーション（ｐ２１−３５ｍｅｔをロードして、Ｒ３ＴＢ７  Ｔｒｅｇでインキュベーションした（１／１比））。右パネル：ＧＺ−Ｂに拮抗するペプチド（Ｚ−ＡＡＤ−ＣＭＫ）（黒色正方形）またはセリンプロテアーゼの化学阻害薬（ＤＣＩＣ：３，４−ジクロロイソ−クマリン）（白色正方形）を用いたＷＥＨＩ細胞のインキュベーション（ｐ２１−３５ｍｅｔをロードして、Ｒ３ＴＢ７  Ｔｒｅｇでインキュベーションした（１／１比））。パートＤ：左パネル：樹状細胞（ｐ２１−３５をロードして、Ｇ１２１  Ｔｒｅｇの存在下で１／１比にて１８時間インキュベートしたＣＤ１１ｃ＋細胞）のアネキシンＶ発現によって測定されたアポトーシス（灰色区域）右パネル：左パネルと同様であるが、ＤＣおよびＴｒｅｇ細胞はトランスウェル培養系の半透性膜によって分離される。（白色区域（パネルＤでは隠れている）は、細胞傷害性Ｔ細胞を含まないＤＣへのアネキシンＶ結合を表す）。結果は２回の独立した実験を代表している。パートＥ：ＷＥＨＩ細胞の２つの集団を８０ｎＭまたは３００ｎＭ  ＣＦＳＥのどちらかで標識して、ｐ２１−３５またはｐ７１−８５によってそれぞれ１時間インキュベートした。細胞を次にＧ１２１  Ｔｒｅｇ（左パネル）または対照ＣＤ４＋エフェクタＴ細胞（右パネル）によってインキュベートした。アネキシンＶの結合は、１８時間のインキュベーション後にフローサイトメトリによって分析した。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態による、細胞傷害性Ｔ細胞によるバイスタンダＴ細胞の抑制。パートＡ：ＡＰＣとして使用したＴ細胞除去脾臓細胞、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、１μｇ／ｍｌのｐ２１−３５、および細胞溶解性Ｔｒｅｇ細胞系によってインキュベートした、ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）脾臓細胞のＣＦＳＥ染色細胞のＦＡＣＳ分析。ＴｒｅｇをＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞に対して１／３比で、細胞接触を最適化するためのＶ字形ウェルを備えた未コーティングポリスチレン培養プレートにて使用した。左パネル：細胞溶解性細胞系Ｇ１２１中パネル：細胞溶解性Ｔｒｅｇ細胞系Ｒ３ＴＢ７右パネル：細胞溶解性Ｔｒｅｇが未標識ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）脾臓細胞によって置換される対照細胞培養物（右パネル）。細胞数、細胞分裂および細胞サイズは生細胞ゲーティング後にＦａｃｓによって評価した。上パネル：４８時間のインキュベーション下パネル：７２時間のインキュベーションパートＢ：Ｒ３ＴＢ７  Ｔｒｅｇ細胞系との同時培養の１８時間後（中パネル）および２４時間後（右パネル）のＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞へのアネキシンＶ結合の分析。左パネルは、細胞溶解性Ｔｒｅｇを含まない対照培養物（２４時間）を示す。パートＣ：パートＡの下パネルの実験環境を用いる実験だが、ＥＧＴＡおよび細胞溶解性Ｔｒｅｇ細胞系なしで（左パネル）、２ｍＭのＥＧＴＡ（中パネル）の存在下で、または４ｍＭのＥＧＴＡ（右パネル）の存在下で、ＣＦＳＥ分裂を同時培養の７２時間後に評価した（左パネルを除く）。パートＤ：ＣＦＳＥを用いたＤｅｒ  ｐ  １特異的Ｔｈ２細胞クローンの標識および同種ペプチド（Ｄｅｒ  ｐ  １からのアミノ酸１１４〜１２８）をロードしたＴ細胞除去脾臓細胞を用いた７２時間の培養。ヨウ化プロピジウム陰性ＣＦＳＥ陽性細胞にゲーティングを行った。左パネルは、同じ未標識Ｔｈ２細胞の存在下（比１／１）での左側への蛍光移動で判定された増幅を示す。左の第２パネルは、Ｇ１２１  Ｔｒｅｇ（Ｔｈ２クローンと１／１比）およびｐ２１−３５（１μｇ／ｍｌ）の培養物への添加時に、対照抗体の存在下で得た結果を示す。次の３つのパネル（左から右）は、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲまたはＬａｇ３に対する抗体を細胞溶解性クローンとの同時培養の開始から添加したときに得た効果を示す。各抗体は１０μｇ／ｍｌで使用した。パーセンテージは、ＣＦＳＥ細胞の集団全体での標識されたＰＩ陰性ＣＦＳＥの割合である。パートＥ：同数の同じ未標識クローンを用いた７２時間のＤｅｒ  ｐ  ２のｐ７１−８５に特異的なＣＦＳＥ標識Ｔｈ１クローンのインキュベーション（左パネル）。増幅は左側への蛍光移動として示されている。本実験を単一のウェルにおいて（中パネル）、またはトランスウェル膜によって隔離されたウェル２個において（右パネル）繰り返したが、ただし未標識クローンを細胞溶解性Ｔｒｅｇで置換した。細胞比は１／１であった。結果は３回の独立した実験を代表している。ヒストグラムはＰＩ陰性ＣＦＳＥ標識細胞を表す。パートＦ：ＣＦＳＥ標識ｐ７１−８５特異的Ｔｈ１クローンを用いたＴ細胞除去脾臓細胞の１８時間のインキュベーション。対照（最左パネル）を除いて、各場合でｐ７１−８５ペプチドを添加してクローンを活性化した。本培養物にｐ８３０−８４４対照細胞クローンをその特異的ペプチド（左パネル）、あるいはｐ２１−３５ペプチドを含むまたは含まない（それぞれ最右および右パネル）細胞溶解性クローン（Ｒ３ＴＢ７）と共に添加した。細胞比は１／１であった。密度点プロットを示す。結果は、平均ＦＳＣ値（上の値、黒色）および芽球化ＣＦＳＥ細胞のパーセンテージ（下の値、灰色）として示す。芽球形成は生リンパ球ゲートにおけるＣＦＳＥ陽性細胞の細胞サイズから計算した（ＦＳＣ／ＳＳＣプロットより確立）。静止リンパ球ゲートは最高密度の非刺激細胞を示す領域に調整した（最左パネル）。データは少なくとも３回の実験を代表している。
【図１５】図１５は、本発明の実施形態による、アレルゲン曝露マウスの肺での細胞溶解性Ｔｒｅｇの局在化および抗原提示Ｂ細胞によるアポトーシスのインビボ誘導を示す。Ａ：未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスからの磁気ビーズによって単離された脾臓Ｂ細胞は、ｐ２１−３５およびｇｐ７５タンパク質をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質移入した。左パネルは、細胞溶解性Ｔ細胞クローン（比２／１）によって１８時間インキュベートしたＢ細胞を表す。右パネルは同じであるが、対照ＣＤ４＋エフェクタ細胞を用いて実施したアッセイを表す。点線は、Ｔ細胞なしで培養したＢ細胞における抗カスパーゼ−３染色を表す。Ｂ：ｐ２１−３５形質移入Ｂ細胞５ｘ１０６個を各マウス（ｎ＝６）に静脈内投与して、５日後に細胞溶解性Ｔｒｅｇ５ｘ１０５個を続けた。２週間後、マウスを屠殺処分して、密度勾配精製および磁気ビーズを用いたＣＤ１９＋選択によって細胞を脾臓および肺から調製した。トランスジェニックＢ細胞を産生するのに使用したレトロウイルス構築物をコードするｍＲＮＡの存在をＰＣＲによって検出した。形質移入Ｂ細胞を投与したが、細胞溶解性Ｔ細胞を投与しなかったマウスの群（ｎ＝６）を同様に処分した。各群の６匹のマウスを分析し、代表的な結果は、細胞溶解性Ｔｒｅｇによって処理したマウス２匹の脾臓についてレーンＡに、対照群のマウス２匹についてレーンＢに示す。Ｃ：５ｘ１０５個のＶβ８．１＋細胞溶解性Ｔｒｅｇ、またはＶ８．１＋対照Ｔ細胞クローンを未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与して、２４時間後にＤｅｒ  ｐ  ２  １００マイクログラムによる点鼻投与を３回続けた。２週間後、マウスを屠殺処分して、密度勾配遠心分離によって肺リンパ球を調製した。Ｖベータ８．１を発現する細胞の割合をＣＤ４＋細胞の集団内でＦａｃｓによって計算した。結果は、各群におけるマウス６匹からの平均％±標準誤差として表す。％ＣＤ４は、全リンパ球集団内のＣＤ４のパーセンテージである；％Ｖｂ８．１は、全ＣＤ４細胞集団内でＶｂ８．１を発現する細胞のパーセンテージである。
【図１６】図１６は、本発明の実施形態による細胞溶解性Ｔｒｅｇクローンによる、実験的喘息の予防（ａ〜ｆ）および抑制（ｇ〜ｌ）を示す。パネルＡ〜Ｆは、Ｄｅｒ  ｐ  ２による腹腔内感作前のｍｐ２１−３５  Ａｓｎ特異的細胞溶解性Ｔｒｅｇ（クローンＴ１およびＴ３）によって処理したマウスからのデータを示す（「対照Ｔ細胞クローン」は、破傷風トキソイドのペプチド８３０−８４４に特異的であり、「Ｄｅｒ  ｐ  ２モデル」は、細胞に細胞が投与されない実験を指す）。パネルＧ〜Ｌにおいて、Ｄｅｒ  ｐ  ２による腹腔内感作後に上の細胞系によって処理された場合のマウスからのデータを示す。パネルＡおよびＧは、全ＢＡＬＦ細胞数を示す；パネルＢおよびＨは、ＢＡＬＦ細胞カウントの差を示す；パネルＣおよびＩは、ＥＬＩＳＡによって測定したＢＡＬＦサイトカインを示す；パネルＤおよびＪは、好酸球およびリンパ球による肺浸潤の半定量的スコアリングを示す。パネルＥおよびＫは、杯細胞計数を示す。結果は、ＰＡＳ染色後の上皮細胞の集団内での杯細胞の割合（％）として表す。パネルＦおよびＬは、上昇する濃度のメタコリンの吸入によって評価した気道過敏性を示す。ＰｅｎＨ値は、全身プレチスモグラフを使用して決定した。結果は、ＰｅｎＨ値について「曲線下面積」（ＡＵＣ）として示す。比較のために、独立した実験での未処理マウスで得たＡＵＣ値を示す（未処理）。本群は、予防および抑制アッセイの両方でバックグラウンド値を与える。データは、群につき最低５匹のマウスからの結果を表す。棒は平均±標準誤差を表す。Ｄｅｒ  ｐ  ２モデルと比較して（片側Ｐ値）＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態による、ＣＦＳＥによって標識され、対応するペプチド（１１４−１２８）（上パネル）によってロードされたＡＰＣによってインキュベートした、Ｄｅｒ  ｐ１  Ｔ細胞エピトープ（１１４−１２８）に特異的なエフェクタＣＤ４Ｔ細胞系によるアポトーシスの誘導を示す。下パネルは、同数のエフェクタ細胞（未標識）が調節Ｔ細胞クローンに置換されたときのベースライン死亡率（４０％）を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、１００μｇのＤｅｒ  ｐ  １（モデル）またはＮａＣｌ（陰性）のどちらかによる点鼻投与後のＢＡＬＦ細胞数の差を示す。マウスには、Ｄｅｒ  ｐ  １による最初のシリーズの点鼻投与の前（予防）または後（抑制）のどちらかに細胞溶解性Ｔ細胞を養子移入した。棒は平均±標準誤差を表し、陰性群と比較して＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、本発明の実施形態による細胞溶解性Ｔ細胞の養子移入後の組織学的スコアリングを示す。０〜６（病変なしから広範囲の浸潤）のスコアを使用して、好酸球、リンパ球およびプラズマ細胞浸潤についてスコアを確立した。マウスには１００μｇのＤｅｒ  ｐ１（モデル）またはＮａＣｌ（陰性）のどちらかによる点鼻投与３回を２シリーズ投与した。マウスには、Ｄｅｒ  ｐ  １による最初のシリーズの点鼻投与の前（予防）または後（抑制）のどちらかに細胞溶解性Ｔ細胞を養子移入した。棒は平均±標準誤差を表し、モデル群と比較して＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１９Ａ】図１９Ａは、本発明の実施形態による、ペプチドを使用せずに、野生種ｐ２１−３５ペプチド（Ｃ−ｘ−ｘ−Ｓ）、またはＳｅｒ２４Ｃｙｓ変異ｐ２１−３５（Ｃ−ｘ−ｘ−Ｃ）を使用してＡＰＣによって刺激された細胞溶解性クローンのＴＮＦ−アルファ（黒色ヒストグラム）およびＩＮＦ−ガンマ（灰色ヒストグラム）の生成を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、グランザイム（レーン１〜３）およびＦａｓ−Ｌ（レーン６〜８）転写物の半定量的ＰＣＲ検出を示す。細胞傷害性クローンは、野生種ｐ２１−３５（レーン１、６）、Ｓｅｒ２４Ｃｙｓ修飾ｐ２１−３５（レーン２、７）をロードした、またはペプチドを含まない（レーン３、８）、ＡＰＣによって刺激した。レーン４および５は分子量マーカーである。
【図２０】図２０は、本発明の実施形態による、ＣＦＳＥで標識して、ＡＰＣ細胞によって同時培養したエフェクタＴ細胞のアポトーシスを示す。棒は未標識Ｔエフェクタ細胞および野生種ＭＯＧペプチドを示す；Ｔエフェクタ細胞  野生種ＭＯＧ；Ｔｒ細胞および未修飾ＭＯＧペプチド：Ｔｒ細胞  野生種ＭＯＧ；Ｔｒ細胞およびチオレドキシン配列を含有する修飾ＭＯＧペプチド：Ｔｒ細胞コンセンサス配列ＭＯＧ）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、チオレドキシンコンセンサス配列（ＣＳＭＯＧ）を含有するＭＯＧペプチドによって免疫化した動物から得た。エフェクタＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は、ＥＡＥ動物（Ｔエフェクタ）より得た。
【図２１】図２１は、マウスモデルにおけるＭＳの発生時の注入未修飾ＭＯＧペプチドに対する効果を示す（０：疾患なし、１：跛行、２：跛行および１０％を超える体重減少、３：後肢の部分麻痺、４：肢の完全麻痺）。モデル：Ｃ５７ＢＬ／６マウス３匹には、第０日目にＣＦＡ中ＭＯＧペプチド１００μｇ／マイコバクテリウム・ブチリカム４００μｇの皮下注射およびＮａＣｌ中ボルデテラ・ペルトゥッシス３００ｎｇの腹腔内注射を行った。第２日目に、Ｂ．ペルトゥッシスの２回目の注射を投与した。養子移入：マウス３匹にモデル群と同様に、疾患誘発２４時間前に５００，０００個のＴｒｅｇによる静脈内注射を行った。
【図２２】図２２は、多発性硬化症モデルでのＭＯＧペプチド注射による予防を用いた、または用いないマウスの臨床スコアリングを示す。
【図２３】図２３は、２つのＮＯＤマウス脾臓細胞からのＣＦＳＥ標識ポリクローナルＣＤ４細胞におけるアポトーシスのインビトロ誘導を示す。これらの細胞は、修飾ペプチド処理ＮＯＤマウスから精製したポリクローナルＣＤ４細胞と共にＧＡＤ６５ペプチド５２４−５４３［配列番号：３４］をロードしたＡＰＣと同時培養した。図は、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶ−ＰＥを用いた標的ＣＤ４細胞の染色を示す。表は二重陽性細胞（死細胞）のパーセンテージを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
定義
「ペプチド」という用語は本明細書に使用するように、ペプチド結合によって結合されているアミノ酸２〜２００個のアミノ酸配列を含むが、詳細な実施形態において（たとえば結合有機化合物のように）非アミノ酸構造を含みうる分子を指す。本発明によるペプチドは、従来のアミノ酸２０個のいずれかまたはその修飾版を含有しうるか、あるいは化学ペプチド合成によってまたは化学もしくは酵素修飾によって包含された非天然発生型アミノ酸を含有しうる。
【００３９】
「抗原」という用語は本明細書で使用するように、巨大分子、通例はタンパク質（多糖類を含むまたは含まない）、または１つ以上のハプテンを含み、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質組成物より成る構造を指す。「抗原タンパク質」という用語は本明細書で使用するように、１つ以上のＴ細胞エピトープを含むタンパク質を指す。自己抗原または自己抗原タンパク質は本明細書で使用するように、免疫反応を同じヒトまたは動物体内で誘発する、体内に存在するヒトまたは動物タンパク質を指す。
【００４０】
「食物または医薬抗原タンパク質」という用語は、食物または医薬製品、たとえばワクチンなどにおいて天然に存在する抗原タンパク質を指す。
【００４１】
「エピトープ」という用語は、抗体またはその部分（Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）によって特異的に認識および結合される抗原タンパク質の１つまたは複数の部分（立体配座エピトープを定義しうる）、あるいはＢまたはＴ細胞リンパ球の細胞表面に存在して、前記結合によって免疫応答を誘導できる受容体を指す。
【００４２】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は本発明の文脈において、ドミナント、サブドミナントまたはマイナーＴ細胞エピトープ、すなわちＴリンパ球の細胞表面において受容体によって特異的に認識および結合される抗原タンパク質の一部を指す。エピトープがドミナント、サブドミナントまたはマイナーであるかどうかは、エピトープに対して誘発された免疫反応に依存する。優性は、このようなエピトープがＴ細胞によって認識され、タンパク質の考えられるすべてのＴ細胞エピトープの中でそれらを活性化できる頻度に依存する。
【００４３】
詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ  ＩＩ分子の溝に適合する＋／−アミノ酸９個の配列より成るＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識されるエピトープである。Ｔ細胞エピトープを示すペプチド配列の中で、図３Ａに示すように、エピトープ中のアミノ酸はＰ１〜Ｐ９の番号が付けられ、エピトープのアミノ酸Ｎ末端はＰ−１、Ｐ−２などのように番号が付けられ、エピトープのアミノ酸Ｃ末端はＰ＋１、Ｐ＋２などのように番号が付けられる。
【００４４】
「ホモログ」という用語は本明細書で使用するように、本発明の文脈で使用されるエピトープに関連して、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の天然発生型エピトープとのアミノ酸同一性を有し、それによりエピトープが抗体あるいはＢおよび／またはＴ細胞の細胞表面受容体を結合する能力を維持する分子を指す。エピトープのホモログの詳細な実施形態は、多くて３個、さらに詳細には多くて２個、最も詳細には１個のアミノ酸中の修飾された天然型エピトープに相当する。
【００４５】
「誘導体」という用語は本明細書で使用するように、本発明のペプチドに関連して、少なくともペプチド活性部分（すなわち細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を誘発できる）を含有し、それに加えて各種の目的、たとえばペプチドを安定化すること、あるいはペプチドの薬物動態または薬力学特性を変化させることを有しうる相補部分を含む分子を指す。
【００４６】
２個の配列の「配列同一性」という用語は本明細書で使用するように、２個の配列を整列させたときに、短いほうの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の数によって除算した、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸を持つ位置の数を指す。詳細な実施形態において、前記配列同一性は、７０％〜８０％、８１％〜８５％、８６％〜９０％、９１％〜９５％、９６％〜１００％、または１００％である。
【００４７】
「ペプチドコードポリヌクレオチド（または核酸）」および「ポリヌクレオチド（または核酸）コードペプチド」という用語は本明細書で使用するように、適切な環境において発現されたときに、関連するペプチド配列あるいはその誘導体またはホモログの産生をもたらすヌクレオチド配列を指す。このようなポリヌクレオチドまたは核酸としては、ペプチドをコードする正常配列はもちろんのこと、要求される活性を備えたペプチドを発現できるこれらの核酸の誘導体または断片も挙げられる。１実施形態により、本発明によるペプチドをコードする核酸またはその断片は、哺乳類を起源とするまたは哺乳類に相当するペプチドまたはその断片、最も詳細にはヒトペプチド断片をコードする配列である。
【００４８】
「還元活性を有する有機化合物」という用語は、本発明の文脈において、タンパク質のジスルフィド結合に対する還元活性を備えた化合物、さらに詳細にはアミノ酸配列を指す。「免疫障害」または「免疫疾患」という用語は、免疫系の反応が生物における機能不全または非生理学的状況に関与するか、または維持する疾患を指す。免疫障害には特にアレルギー障害および自己免疫疾患が含まれる。
【００４９】
「アレルギー疾患」または「アレルギー障害」という用語は本明細書で使用するように、アレルゲンと呼ばれる特定の物質（たとえば花粉、虫刺され、薬物、または食品）に対する免疫系の過敏性反応を特徴とする疾患を指す。アレルギーは、個々のアトピー患者がその感作されているアレルゲンに遭遇するときに常に観察される一連の徴候または症状であり、各種の疾患、特に呼吸器疾患および症状、たとえば気管支喘息を引き起こしうる。各種の分類が存在し、大半のアレルギー障害は、それが起こる哺乳類体内の箇所に応じて異なる名称を有する。「過敏症」は、個体がその感作されるようになっている抗原への曝露時に生じる望ましくない（損傷を与える、不快感を生じる、時には致死的な）反応である；「即時型過敏症」は、ＩｇＥ抗体の生成に依存しており、したがってアレルギーと同等である。
【００５０】
「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」という用語は、生物がそれ自体の構成要素部分（分子下レベルに至るまで）を「自己」として認識できないことのために、生物のそれ自体の細胞および組織に対する異常な免疫応答から生じる疾患である。疾患の群は２種類、すなわち器官特異的疾患および全身性疾患に分けられる。
【００５１】
「アレルゲン」は、素因のある、特に遺伝的傾向のある個々の（アトピー）患者においてＩｇＥ抗体の生成を誘発する物質、通常は巨大分子またはタンパク組成物として定義される。同様の定義は、Ｌｉｅｂｅｒｓら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ
２６，４９４−５１６に示されている。
【００５２】
「治療的有効量」という用語は、患者において所望の治療的または予防的効果を生じる本発明のペプチドまたはその誘導体の量を指す。たとえば疾患または障害に関連して、それは疾患または障害の１つ以上の症状をある程度まで低減する量、さらに詳細には疾患または障害に関連する、あるいはその原因となる生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全に正常に戻す量である。本発明の詳細な１実施形態により、治療的有効量は、正常な生理学的状況の改善または回復につながる本発明のペプチドまたはその誘導体の量である。たとえば免疫障害に罹患した哺乳類を治療的に治療するために使用されるとき、治療的有効量はペプチド１日量／前記哺乳類の体重１ｋｇである。あるいは投与が遺伝子療法による場合、裸のＤＮＡまたはウイルスベクターの量は、本発明のペプチド、その誘導体またはホモログの関連する投薬の局所的生成を確保するように調整される。
【００５３】
「天然の」という用語は、本明細書でペプチドまたは配列を指すときに、配列が天然発生型配列と同一であるという事実に関連している。それに対して、「人工的な」という用語は、それ自体は天然には発生しない配列またはペプチドを指す。場合により人工配列は、天然発生型配列中の１個以上のアミノ酸を変化させることなどの制限された修飾によって、あるいは天然発生型配列のＮ末端側またはＣ末端側にアミノ酸を付加することによって、天然配列から得られる。アミノ酸は本明細書では、その正式な名称、その３文字の省略形またはその１文字の省略形を用いて呼ばれる。
【００５４】
アミノ酸配列のモチーフは本明細書では、Ｐｒｏｓｉｔｅの形式に従って記載する。記号Ｘは、いずれのアミノ酸も許容される位置に使用する。選択肢は、角カッコ（‘［］’）の間に所与の位置の許容されるアミノ酸を挙げることによって示す。たとえば：［ＣＳＴ］は、Ｃｙｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒより選択されるアミノ酸を表す。選択肢として除外されるアミノ酸は、中カッコ（‘｛｝’）の間にそれらを挙げることによって示す。たとえば：｛ＡＭ｝は、ＡｌａおよびＭｅｔを除くいずれのアミノ酸も表す。モチーフ内の別の要素は、ハイフン−によって相互に隔離される。モチーフ内の同一要素の繰り返しは、その要素の後にカッコに入れた数値または数値範囲を配置することによって示されうる。たとえば：Ｘ（２）はＸ−Ｘに相当し、Ｘ（２，４）はＸ−ＸまたはＸ−Ｘ−ＸまたはＸ−Ｘ−Ｘ−Ｘに相当し、Ａ（３）はＡ−Ａ−Ａに相当する。
【００５５】
本発明は、Ｔ細胞エピトープおよび還元活性を有するペプチド配列を含むペプチドが、抗原提示細胞に対して細胞傷害性効果を有する調節Ｔ細胞の集団を産生できるという発見に基づいている。
【００５６】
したがってその最も広い意味において、本発明は、還元活性を有する有機化合物、たとえばチオレダクターゼ配列モチーフに結合されて免疫応答を引き起こす可能性を備えた、抗原（自己または非自己）の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドに関する。Ｔ細胞エピトープおよび有機化合物は場合により、リンカー配列によって隔離される。さらなる任意の実施形態において、ペプチドはエンドソームターゲティング配列および／または追加の「フランキング」配列をさらに含む。
【００５７】
本発明のペプチドは、Ａ−Ｌ−ＢまたはＢ−Ｌ−Ａとして図式的に示すことができ、ここでＡは、免疫反応を引き起こす可能性を備えた抗原（自己または非自己）のＴ細胞エピトープを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｂは還元活性を有する有機化合物を表す。
【００５８】
有機化合物の還元活性は、インスリンの溶解性が還元時に変更される、本明細書の実施例で記載するインスリン溶解性アッセイのように、または蛍光標識インスリンを用いて、スルフヒドリル基を還元するその能力についてアッセイされうる。還元有機化合物は、Ｔ細胞エピトープのアミノ酸末端側に、またはＴ細胞エピトープのカルボキシ末端に結合されうる。
【００５９】
一般に、還元活性を備えた有機化合物はペプチド配列である。還元活性を備えたペプチド断片は、グルタレドキシン、ヌクレオレドキシン、チオレドキシンおよび他のチオール／ジスルフィドオキシドレダクターゼを含む小型ジスルフィド還元酵素であるチオレダクターゼ内にて遭遇される（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ（２０００）Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ
Ｓｉｇｎａｌ  ２，８１１−８２０；Ｊａｃｑｕｏｔら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  ６４，１０６５−１０６９）。それらは多機能性、遍在性であり、多くの原核生物および真核生物で見出される。それらは、保存された活性ドメインコンセンサス配列：Ｃ−Ｘ（２）−Ｃ、Ｃ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｃ−Ｘ（２）−Ｔ、Ｓ−Ｘ（２）−Ｃ、Ｔ−Ｘ（２）−Ｃ（Ｘはいずれのアミノ酸も表す）内の酸化還元活性システインを通じて、タンパク質（たとえば酵素）のジスルフィド結合に対して還元活性を作用させる（Ｆｏｍｅｎｋｏら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，１１２１４−１１２２５；Ｆｏｍｅｎｋｏら（２００２）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：２２８５−２２９６）。このようなドメインは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣなどのより大型のタンパク質にも見出される（表１）。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
したがって詳細な実施形態において、本発明によるペプチドはチオレダクターゼ配列モチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］を含み、ここで［ＣＳＴ］の少なくとも１つはＣｙｓである；それゆえモチーフは［Ｃ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［Ｃ］のどちらかである。本出願において、このようなテトラペプチドは「モチーフ」と呼ばれるであろう。詳細な実施形態において、本発明のペプチドは配列モチーフ［Ｃ］−Ｘ（２）−［ＣＳ］または［ＣＳ］−Ｘ（２）−［Ｃ］を含有する。さらに詳細な実施形態において、ペプチドは配列モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｓ−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−Ｃを含有する。
【００６２】
下でさらに詳細に説明するように、本発明のペプチドは、非天然アミノ酸の包含を可能にする化学結合によって作製されうる。したがって本発明の詳細な実施形態による還元化合物のモチーフにおいて、Ｃはチオール基を備えたシステインまたは別のアミノ酸のどちらか、たとえばメルカプトバリン、ホモシステインあるいはチオール官能基を備えた他の天然または非天然アミノ酸を表す。還元活性を有するために、モチーフ中に存在するシステインは、システインジスルフィド架橋の一部として出現することは望ましくない。それにもかかわらず、モチーフは、インビボでチオール基を有さないシステインに変換される修飾システイン、たとえばメチル化システインを含みうる。
【００６３】
本発明の還元化合物の詳細な実施形態の［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフ中のアミノ酸Ｘは、Ｓ、Ｃ、またはＴを含むいずれかの天然アミノ酸でありうるか、あるいは非天然アミノ酸でありうる。詳細な実施形態において、Ｘは、小型側鎖を備えたアミノ酸、たとえばＧｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。さらなる詳細な実施形態において、Ｘは、かさ高い側鎖を備えたアミノ酸、たとえばＴｙｒでない。さらなる詳細な実施形態において、［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフ中の少なくとも１つのＸは、ＨｉｓまたはＰｒｏである。
【００６４】
上記のモチーフを還元化合物として含む本発明のペプチドにおいて、エピトープがＭＨＣ溝内に適合するときに、モチーフがＭＨＣ結合溝の外側に残存するようにモチーフが配置される。モチーフは、ペプチド中のエピトープ配列に直接隣接して配置されるか、またはリンカーによってＴ細胞エピトープから隔離されるかのどちらかである。さらに詳細には、リンカーはアミノ酸７個以下のアミノ酸配列を含む。最も詳細には、リンカーはアミノ酸１、２、３、または４個を含む。あるいはリンカーは、アミノ酸６、８または１０個を含みうる。モチーフ配列がエピトープ配列に隣接している本発明のペプチドのこのような詳細な実施形態において、これはエピトープ配列と比較して、位置Ｐ−４〜Ｐ−１またはＰ＋１〜Ｐ＋４として示される。
【００６５】
ペプチドリンカーとは別に、他の有機化合物がペプチドの部分を相互に（たとえばモチーフをＴ細胞エピトープ配列に）結合するリンカーとして使用されうる。
【００６６】
本発明のペプチドは、Ｔ細胞エピトープおよび還元化合物（モチーフ）を含む（人工）配列のＮまたはＣ末端側の追加の短いアミノ酸配列をさらに含みうる。このようなアミノ酸配列は本明細書で、一般に「フランキング配列」と呼ばれる。フランキング配列は、エピトープとエンドソームターゲティング配列との間に、および／または還元化合物（たとえばモチーフ）とエンドソームターゲティング配列との間に位置決めされうる。エンドソームターゲティング配列を含まないさらなる実施形態において、短いアミノ酸配列は、ペプチド中で還元化合物および／またはエピトープ配列のＮおよび／またはＣ末端側に存在しうる。さらに詳細には、フランキング配列はアミノ酸１〜７個の配列、最も詳細にはアミノ酸２個の配列である。
【００６７】
本発明のペプチドの詳細な実施形態において、モチーフはエピトープからＮ末端側に配置される。
【００６８】
さらなる詳細な実施形態において、ペプチド中に存在するモチーフが１個のシステインを含有する場合、本システインはモチーフ中のエピトープから離れた位置に存在し、それゆえモチーフは、エピトープのＮ末端側にＣ−Ｘ（２）−［ＳＴ］またはＣ−Ｘ（２）−Ｓとして出現するか、あるいはエピトープのＣ末端側に［ＳＴ］−Ｘ（２）−ＣまたはＳ−Ｘ（２）−Ｃとして出現する。
【００６９】
本発明のある実施形態において、１つ以上のペプチド配列およびモチーフ配列を含むペプチドが提供される。さらなる詳細な実施形態において、モチーフはペプチド中に複数回（１、２、３、４回またはそれ以上の回数）、たとえば１個以上のアミノ酸によって相互に隔離されうるモチーフの繰り返し（たとえばＣＸＸＣ  Ｘ  ＣＸＸＣ  Ｘ  ＣＸＸＣ）として、相互に隣接する繰り返し（ＣＸＸＣ  ＣＸＸＣ  ＣＸＸＣ）として、または相互に重複する繰り返し（ＣＸＸＣＸＸＣＸＸＣまたはＣＸＣＣＸＣＣＸＣＣ）として出現する。あるいは１個以上のモチーフがＴ細胞エピトープ配列のＮ末端またはＣ末端の両方に設けられる。
【００７０】
本発明のペプチドのために想定される他の変形としては、各エピトープ配列にモチーフが先行するおよび／または続くＴ細胞エピトープ配列の繰り返し（たとえば「モチーフ−エピトープ」の繰り返しまたは「モチーフ−エピトープ−モチーフ」の繰り返し）を含有するペプチドが挙げられる。本明細書でモチーフはすべて同じ配列を有しうるが、このことは必須ではない。モチーフをそれ自体の中に含むエピトープを含むペプチドの繰り返し配列が、「エピトープ」および「モチーフ」の両方を含む配列も生じることに注目する。このようなペプチドにおいて、１つのエピトープ配列内のモチーフは第２のエピトープ配列の外側でモチーフとして機能する。
【００７１】
しかしながら詳細な実施形態において、本発明のペプチドは１つのＴ細胞エピトープのみを含む。
【００７２】
したがって本発明によるペプチドは、還元化合物に加えて、用途に応じて抗原、通例はアレルゲンまたは自己抗原に由来するＴ細胞エピトープを含む。後述するように、タンパク質配列中のＴ細胞エピトープは、機能アッセイおよび／または１つ以上のコンピュータでの予測アッセイによって同定されうる。Ｔ細胞エピトープ配列中のアミノ酸は、ＭＨＣタンパク質の結合溝中のその位置に従って番号付けされる。詳細な実施形態において、本発明のペプチド内に存在するＴ細胞エピトープは、アミノ酸８〜２５個、なおさらに詳細にはアミノ酸８〜１６個、なお最も詳細にはアミノ酸８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個より成る。さらに詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープはアミノ酸９個の配列より成る。さらなる詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＴ細胞に提示されるエピトープである。本発明の詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープ配列は、ＭＨＣ  ＩＩタンパク質の溝内に適合するエピトープ配列、さらに詳細にはＭＨＣ  ＩＩ溝内に適合するノナペプチドである。
【００７３】
本発明のペプチドのＴ細胞エピトープは、修飾Ｔ細胞エピトープが天然Ｔ細胞エピトープ配列と同様に、ＭＨＣ溝内に結合するその能力を保持するという条件で、タンパク質の天然エピトープ配列に相当しうるか、またはその修飾版でありうるかのどちらかである。修飾Ｔ細胞エピトープは、天然エピトープと同様のＭＨＣタンパク質に対する結合親和性を有しうるが、低下した親和性も有しうる。詳細な実施形態において、修飾ペプチドの結合親和性は、元のペプチドの１０倍以上、さらに詳細には倍以上である。本発明の発見は、本発明のペプチドがタンパク質複合体に対して安定化効果を有することである。したがってペプチド−ＭＨＣ複合体の安定化効果は、ＭＨＣ分子の修飾エピトープの低下した親和性を代償する。その例は、Ｄｅｒ  ｐ  ２ペプチドのＩｌｅ２８Ａｓｎ置換であり、ＭＨＣ  ＩＩ溝への低い親和性にもかかわらず、天然Ｄｅｒ  ｐ  ２ペプチドｐ２１−３５と同じＴ細胞応答を誘発できる。
【００７４】
詳細な実施形態において、ペプチド内にＴ細胞エピトープおよび還元化合物を含む配列は、ＭＨＣクラスＩＩ決定基内での処理および提示のために晩期エンドソーム内へのペプチドの取り込みを促進するアミノ酸配列（または別の有機化合物）にさらに結合される。晩期エンドソームターゲティングは、タンパク質の細胞質尾部に存在するシグナルによって媒介され、十分に同定されたペプチドモチーフ、たとえばジロイシンベース［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬモチーフ（たとえばＤＸＸＸＬＬ）、チロシンベースＹＸＸφモチーフまたはいわゆる酸性クラスタモチーフに対応する。記号φは、かさ高い疎水性側鎖を備えたアミノ酸残基、たとえばＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐを表す。晩期エンドソームターゲティング配列は、ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原由来Ｔ細胞エピトープの処理および効率的な提示を可能にする。このような晩期エンドソームターゲティング配列はたとえばｇｐ７５タンパク質（Ｖｉｊａｙａｓａｒａｄｈｉら（１９９５）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３０，８０７−８２０）、ヒトＣＤ３ガンマタンパク質、ＨＬＡ−ＢＭβ（Ｃｏｐｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，１０１７−１０２７）、ＤＥＣ２０５受容体の細胞質尾部（Ｍａｈｎｋｅら（２０００）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５１，６７３−６８３）内に含有される。エンドソームに対する局在化シグナルとして機能するペプチドの他の例は、Ｂｏｎｉｆａｃｉｏ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｂ（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，３９５−４４７の総説に開示されている。あるいは配列は、抗原、すなわちアレルゲンまたは自己抗原由来Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を克服することなく、晩期エンドソームでの取り込みを促進する、タンパク質からのサブドミナントまたはマイナーＴ細胞エピトープの配列でありうる。
【００７５】
晩期エンドソームターゲティング配列は、効率的な取り込みおよび処理のためにアレルゲンまたは自己抗原由来ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかに位置することができ、フランキング配列、たとえばアミノ酸１０個までのペプチド配列を通じて連結もされうる。マイナーＴ細胞エピトープをターゲティング目的で使用するとき、後者は通例、アレルゲンまたは自己抗原由来ペプチドのアミノ末端に位置する。
【００７６】
したがって本発明は、抗原タンパク質のペプチドおよび特異的免疫反応を誘発することでのその使用を想定している。本発明のペプチドはいずれも、その配列内に本発明の特徴、すなわち多くて１０個、好ましくは７個以下のアミノ酸によって隔離された還元化合物およびＴ細胞エピトープを含むタンパク質の断片に相当しうる。あるいは、大半の抗原タンパク質で、本発明のペプチドは、本発明の特徴を得るために、還元化合物、さらに詳細には本明細書に記載する還元モチーフを、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープに（それに直接隣接して、または多くて１０個の、さらに詳細には多くて７個のアミノ酸のリンカーによってのどちらかで）Ｎ末端側またはＣ末端側に結合することによって産生される。さらに天然発生型配列と比較して、タンパク質および／またはモチーフのＴ細胞エピトープ配列は修飾されうるか、ならびに／あるいは１個以上のフランキング配列および／またはターゲティング配列は導入（または修飾）されうる。それゆえ本発明の特徴が目的の抗原タンパク質の配列内に見出されうるか否かに応じて、本発明のペプチドは、「人工」または「天然発生型」である配列を含みうる。
【００７７】
本発明のペプチドは、長さが実質的に変化しうる。詳細な実施形態において、還元化合物が本明細書に記載するようなモチーフに相当する場合、ペプチドの長さはアミノ酸１２〜１３個で変化し、すなわちアミノ酸８〜９個のエピトープと、それに隣接するアミノ酸４個、アミノ酸５０個またはそれ以上の本明細書に記載するようなモチーフとから成る。たとえば本発明によるペプチドは、アミノ酸４０個のエンドソームターゲティング配列、アミノ酸約２個のフランキング配列、アミノ酸４個の本明細書に記載するようなモチーフ、アミノ酸４個のリンカー、およびアミノ酸９個のＴ細胞エピトープペプチドを含みうる。
【００７８】
したがって詳細な実施形態において、完全なペプチドは、アミノ酸１２個〜２０個、最大２５、３０、５０、７５、１００または２００個より成る。さらに詳細な実施形態において、ペプチドはアミノ酸１０〜２０個より成る。さらに詳細には、還元化合物が本明細書に記載するようなモチーフである場合、エンドソームターゲティング配列を含まない、リンカーによって場合により結合されたエピトープおよびモチーフを含む（人工または天然）配列（本明細書では「エピトープ−モチーフ配列」と呼ばれる）の長さは重要である。「エピトープ−モチーフ」はさらに詳細には、アミノ酸１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の、最適にはアミノ酸１８個以下の長さを有する。アミノ酸１２または１３〜１８個のこのようなペプチドは、サイズがあまり重要でないエンドソームターゲティングシグナルに場合により結合されうる。
【００７９】
上で詳説したように、詳細な実施形態において、本発明のペプチドは、Ｔ細胞エピトープ配列に結合された本明細書に記載するような還元モチーフを含む。詳細な実施形態により、ペプチドは、そのネイティブな天然配列内にて目的のエピトープの付近に（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端側のアミノ酸１１個の配列内に）酸化還元特性を備えたアミノ酸配列を含まない、さらに詳細にはそのネイティブな天然配列中にて目的のエピトープの付近にチオレドキシン、グルタレドキシンまたはチオレダクターゼあるいはそのホモログのコンセンサス配列を含まないタンパク質からのペプチドである。最も詳細には、本発明は、Ｃ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｓ−Ｘ（２）−Ｃ、Ｃ−Ｘ（２）−Ｃ、Ｓ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｃ−Ｘ（２）−Ｔ、Ｔ−Ｘ（２）−Ｃより選択される配列、あるいはチオレドキシン、グルタレドキシンまたはチオレダクターゼのコンセンサス配列に特有である他のいずれかのコンセンサス配列を目的のエピトープの付近に、すなわちエピトープ配列のＮ末端またはＣ末端側のアミノ酸１１個の配列内に含まない抗原タンパク質からの免疫原性ペプチドを産生することを含む。さらなる詳細な実施形態において、本発明は、酸化還元特性を備えた上記のアミノ酸配列をその配列内に含まない抗原タンパク質の免疫原性ペプチドを提供する。さらなる詳細な実施形態において、抗原タンパク質は、エピトープ配列のＮ末端またはＣ末端側のアミノ酸１１個の配列内に配列Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｓを天然に含まない。さらに詳細には、本発明は、Ｄｅｒ  ｐ  ２のｐ２１−３５ペプチド（ＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ［配列番号：２］）のエピトープＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列番号：１］およびモチーフＣ−Ｈ−Ｇ−Ｓ［配列番号：３］を含むペプチド、さらに詳細には本モチーフがエピトープ配列からＮ末端側に位置するペプチド、たとえば従来技術で産生され、Ｄｅｒ  ｐ  ２のエピトープマッピングにおける文脈で免疫応答を誘導するのに使用されたペプチドに相当するペプチド（Ｗｕら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，２４３０−２４３５）以外のペプチドを主張する。
【００８０】
さらなる詳細な実施形態において、本発明のペプチドは、その天然配列内に酸化還元特性を備えたアミノ酸配列を含まないＴ細胞エピトープを含むペプチドである。
【００８１】
しかしながら代わりの実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、エピトープのＭＨＣ溝への結合を確実にするアミノ酸のいずれの配列も含みうる。抗原タンパク質の目的のエピトープがそのエピトープ配列内に本明細書に記載したようなモチーフを含む場合、本発明による免疫原性ペプチドは、本明細書に記載したようなモチーフの配列および／または（溝内に埋め込まれたエピトープ内に存在するモチーフとは反対に）結合されたモチーフが還元活性を確保できるように、エピトープ配列のＮ末端またはＣ末端側に結合された別の還元配列の配列を含む。
【００８２】
詳細な実施形態において、本発明のペプチドは、Ｔ細胞エピトープに加えて、本明細書に記載するようなモチーフを含有して、それによりモチーフが多くても７個の、最も詳細には４個までのアミノ酸より成るリンカーによってＴ細胞エピトープから場合により隔離されている、天然ではなく、人工のペプチドである。
【００８３】
詳細な実施形態において、本明細書に記載するようなモチーフおよびＤｅｒ  ｐ  ２エピトープを含むＤｅｒ  ｐ  ２タンパク質の本発明によるペプチドが提供される。さらに詳細には、Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフより成る還元モチーフにそれぞれ結合されたＤｅｒ  ｐ
２のノナペプチドエピトープＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列番号：１］の１つ以上の複製を備えたペプチドが提供される。あるいはモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃに結合されたＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列番号：１］を含む配列以外のＴ細胞エピトープを含むＤｅｒ  ｐ  ２タンパク質を備えたペプチドが提供される。本発明のペプチドは、エンドソームターゲティング配列を場合により含む。最も詳細には、Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフを含むＤｅｒ  ｐ  ２の免疫原性ペプチドが提供される。
【００８４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載した本発明の免疫原性ペプチドを産生するプロセスに関する。
【００８５】
本発明による方法の第１の実施形態において、細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を誘発できる抗原タンパク質のペプチドは、前記抗原タンパク質のＴ細胞エピトープから成るペプチド配列を提供するステップと、前記エピトープを還元化合物に結合するステップによって調製される。本発明によるさらに詳細な方法は、前記モチーフおよび前記エピトープが相互に隣接するか、あるいは多くてもアミノ酸７個、さらに詳細には多くてもアミノ酸４個のリンカーによって隔離されるかのどちらかであるように、前記Ｔ細胞エピトープにモチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃに相当するアミノ酸の配列を結合することを含む。さらに詳細には、モチーフはＣ−Ｘ２−Ｃに相当する。
【００８６】
本発明の方法の詳細な実施形態において、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープは、その天然配列中にエピトープおよび前記エピトープのＮ末端またはＣ末端側のアミノ酸１１個の領域内の本発明によるモチーフの複合配列に相当する配列を含まないように選択される。さらなる詳細な実施形態において、エピトープがＤｅｒ  ｐ  ２のｐ２１−３５ペプチドの配列ＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列：１］を含む場合、モチーフは［ＣＴ］−Ｘ２−ＣまたはＣ−Ｘ２−［ＣＴ］、さらに詳細にはＣ−Ｘ２−Ｃに相当する。本発明の方法は、抗原タンパク質の天然産生Ｔ細胞エピトープによって産生されない、またはその程度まで産生されない、特異的免疫応答を誘導する免疫原性ペプチドを産生する。本効果は、Ｔ細胞エピトープおよび還元化合物の、さらに詳細にはＴ細胞エピトープおよび還元モチーフの特異的組合せによって確保される。
【００８７】
したがって上記の方法は、本明細書に記載したようなモチーフをその配列内に含まないタンパク質、あるいは本明細書に記載したようなモチーフが目的のエピトープ配列内に完全または部分的に存在するタンパク質、あるいはモチーフが目的のエピトープ配列の外側に、しかし目的のエピトープ配列から（すなわち４、７、または１０個を超えるアミノ酸）離れて存在するタンパク質によるアレルゲンまたは自己抗原からの免疫原性ペプチドの産生に特に適している。
【００８８】
上記の方法の詳細な実施形態において、リンカーがＴ細胞エピトープと還元化合物との間に導入される、ならびに／あるいはさらなる配列（たとえばターゲティング配列）が付加される、ならびに／あるいは１つ以上のフランキング配列および／または修飾がペプチドのエピトープ配列中に導入される、１つ以上のさらなるステップが提供される。
【００８９】
抗原タンパク質の細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を誘発できるペプチドを得る、本発明による方法のさらなる実施形態において、抗原タンパク質内での適切な免疫原性ペプチドの同定を確実にする方法が提供される。これらの実施形態において、本発明の方法は、抗原タンパク質がその天然配列内にＴ細胞エピトープを含むか否か、それにより該タンパク質がＴ細胞エピトープのＮ末端またはＣ末端側のアミノ酸１１個の領域、さらに詳細にはアミノ酸８個の領域内に本明細書に記載したような還元モチーフをさらに含むか否かを判定することを含む。したがってこれらの実施形態は、免疫原性ペプチドとしての使用のために適切な配列の、抗原タンパク質内での同定および同定された配列に相当するペプチドの産生を含む。さらに詳細には、このように産生された単離ペプチドは、アミノ酸１２〜１９個の長さを備える。ペプチドの産生方法は後述する。適切な酵素開裂部位がタンパク質中に存在する場合、本発明のペプチドがネイティブなタンパク質からの酵素開裂によっても産生されうることがさらに想定される。
【００９０】
上記の各種方法の詳細な実施形態において、さらなる配列、たとえばターゲティング配列および／または１つ以上のフランキング配列が得られたペプチドに付加される、ならびに／あるいはペプチドのエピトープ、リンカーおよび／または還元モチーフに修飾が導入される、１つ以上のさらなるステップが提供される。これらの修飾は、ペプチドの免疫原性特性をさらに向上させるか、またはペプチドの他の特徴、たとえば合成の容易さ、溶解性などを改善しうる。
【００９１】
上記の方法は、目的のエピトープの付近にＣ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃモチーフを天然に含む抗原タンパク質の選択のためだけに、本発明による免疫原性ペプチドの産生を可能にするであろう。詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、Ｄｅｒ  ｐ  ２のｐ２１−３５ペプチドの配列ＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰ［配列番号：１］を含まない。詳細な実施形態において、抗原タンパク質は、目的のエピトープに隣接する最大アミノ酸１１個の配列内にＣ−Ｘ（２）−［ＳＴ］または［ＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃを自然に含むことができ、本発明の方法は、前記モチーフおよび前記エピトープ配列を含む単離ペプチドを産生して、本明細書に記載した免疫原性特性をさらに向上させるために前記モチーフをＣ−Ｘ（２）−Ｃに修飾する。
【００９２】
上の方法に記載したようなペプチドの産生での使用のための抗原タンパク質の適切なＴ細胞エピトープの同定は、下で詳説する。
【００９３】
本発明によるペプチド（またはこのようなペプチドを含む組成物）の哺乳類への投与（すなわち注射）時に、該ペプチドが抗原（すなわちアレルゲンまたは自己抗原）由来Ｔ細胞エピトープを認識するＴ細胞の活性化を誘発して、表面受容体の還元によってＴ細胞への追加シグナルを提供することが示されてきた。このような最適を超える活性化は、Ｔ細胞エピトープを提示する細胞に対する細胞傷害特性はもちろんのこと、バイスタンダＴ細胞への抑制特性も獲得するＴ細胞を生じる。このようにして、抗原由来Ｔ細胞エピトープと、エピトープ外の還元化合物とを含有する、本発明に記載したペプチドまたはペプチドを含む組成物は、ヒトを含む哺乳類の直接免疫化に使用されうる。
【００９４】
本発明の１態様はそれゆえ、薬剤としての使用のための本発明のペプチドまたはその誘導体を提供する。したがって本発明は、本発明による１つ以上のペプチドをその必要がある患者に投与することを含む治療方法を提供する。
【００９５】
本発明は、細胞傷害特性を与えられたアレルゲン／抗原特異的Ｔ細胞が小型ペプチドによる免疫化によって誘発されうる方法を提供する。（ｉ）抗原（すなわちアレルゲン、自己抗原）からのＴ細胞エピトープをコードする配列および（ｉｉ）酸化還元特性を備えたコンセンサス配列を含有し、効率的なＭＨＣクラスＩＩ提示のために晩期エンドソーム内へのペプチドの取り込みを促進して、抑制因子Ｔ細胞を誘発する配列も場合によりさらに含むペプチドが見出されている。
【００９６】
本発明のペプチドの免疫原性特性は、免疫反応の治療または予防において特に興味深い。したがって本発明の別の態様は、本明細書に記載したペプチドの薬剤としての使用、さらに詳細には哺乳類、さらに詳細にはヒトにおける免疫障害の予防または治療のための医薬の製造のための使用を提供する。
【００９７】
本発明の別の態様はそれゆえ、本発明のペプチド、そのホモログまたは誘導体を使用することによる、このような治療または予防が必要な哺乳類の免疫障害の治療または予防の方法に関し、該方法は、免疫障害に罹患した、または免疫障害のリスクに瀕する前記哺乳類に、免疫障害の症状を低減するように本発明のペプチド、そのホモログまたは誘導体の治療的有効量を投与するステップを含む。ヒトおよび動物、たとえばこれに限定されるわけではないが、ペットおよびウマのどちらの治療も想定される。
【００９８】
上で言及した免疫障害は、詳細な実施形態において、アレルギー疾患および自己免疫疾患より選択される。アレルギー疾患は従来、１型媒介疾患またはＩｇＥ媒介疾患として記載されている。アレルギー疾患の臨床徴候としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品に対する過敏症および虫刺されまたは薬物に対するアナフィラキシー反応が挙げられる。アレルギー疾患は、アレルゲンと呼ばれる特定の物質（たとえば花粉、虫刺され、薬物、または食品）に対する免疫系の過敏性反応によって引き起こされる。アレルギー障害の最も重篤な形は、医学的な緊急事態であるアナフィラキシーショックである。アレルゲンとしては、浮遊アレルゲン、たとえばチリダニ、ペットおよび花粉の浮遊アレルゲンが挙げられる。アレルゲンは、果物、野菜および牛乳を含む食品過敏症の原因となる摂取アレルゲンも含む。
【００９９】
上の疾患を治療するために、本発明のペプチドは、該疾患の原因因子であるとして知られているまたは考えられている抗原タンパク質またはアレルゲンより産生される。Ｔ細胞エピトープの選択に使用されうるアレルゲンは通例：
−ラッカセイ、魚、たとえばタラ、卵白、甲殻類、たとえばエビ、乳、たとえば牛乳、コムギ、穀類、バラ科の果物（リンゴ、プラム、イチゴ）、ユリ科、アブラナ科、ナス科およびセリ科の野菜、ナッツ、ゴマ、ラッカセイ、ダイズおよび他のマメ科アレルゲン、香辛料、メロン、アボカド、マンゴ、イチジク、バナナに存在する食物アレルゲン、
−ヒョウダニ類またはヤケヒョウヒダニ、コナヒョウダニおよびデルマトフィスミクロセラス（Ｄ．ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）またはブロミア種（Ｂｌｏｍｉａ  ｓｐ）より得たチリダニ、
−ゴキブリまたは膜翅目に存在する昆虫からのアレルゲン、
−花粉、特に木、牧草および雑草の花粉からのアレルゲン、
−動物からの、特にネコ、イヌ、ウマおよびげっ歯類からのアレルゲン、
−真菌からの、特にアスペルギルス、アルテルナリアまたはクラドスポリウムからのアレルゲン、
−ラテックス、アミラーゼなどの製品中に存在する職業性アレルゲン
から成る群より選択されるアレルゲンである。
【０１００】
本発明の文脈での使用に適切な抗原タンパク質（または免疫原）に相当するＴ細胞エピトープは通例、ユニバーサルまたは乱交雑Ｔ細胞エピトープ（すなわちＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分に結合できるＴ細胞エピトープ）であり、さらに詳細には浮遊アレルゲンまたは食物由来アレルゲンに存在する。詳細な実施形態において、前記アレルゲンは、鼻副鼻腔炎、アレルギー性気管支喘息アレルゲンおよびアトピー性皮膚炎アレルゲンから成る群より選択される。
【０１０１】
アレルゲンは、カビまたは各種の薬物、たとえばホルモン、抗生剤、酵素などに存在する主アレルゲンでもありうる（たとえばＣｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２６，４９４−５１６（１９９６）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｒ．Ｂｕｓｈ（１９９６）の定義も参照）。特定のアレルギー性疾患に関連する他のアレルゲンも当分野で周知であり、インターネット、たとえばｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｏｍｅ．ｏｒｇ．で見いだされうる。
【０１０２】
自己免疫疾患は、２つの種類、全身性疾患および器官特異的疾患に大きく分類される。全身性自己免疫疾患の正確な病因は同定されていない。これに対して、器官特異的自己免疫疾患は、器官を標的として、それにより局所炎症の慢性状態を誘発および維持する、ＢおよびＴ細胞を含む特異的免疫応答に関連している。器官特異的自己免疫疾患の例としては、１型糖尿病、重症筋無力症、甲状腺炎および多発性硬化症が挙げられる。これらの各状態において、インスリン、アセチルコリン筋肉側受容体、甲状腺ペルオキシダーゼ、および主要塩基性タンパク質をそれぞれ含む、１つのまたは少数の自己抗原が同定されている。本器官特異的免疫応答の抑制は有益であり、器官機能の部分的または完全な回復をもたらすことが十分に認識されている。しかしながら、抗原特異的な方法でこのような免疫応答を抑制する治療法はない。現在の療法はむしろ、その特異性の非存在に関連する著しい副作用をすべて示し、それによりその使用およびその全体的な有効性を制限している、副腎皮質ステロイドおよび免疫抑制剤の使用によって得られた非特異的抑制を利用する。表２は、器官特異的自己免疫障害に関連しており、本発明の文脈で想定される公知の自己抗原の例の非制限的なリストを示す。
【０１０３】
【表２】
2015142578.tif 000003
【０１０４】
本発明により、免疫応答を引き起こす可能性を備えた抗原（自己または非自己）、たとえばアレルゲンまたは自己抗原、たとえば表２に記載するようなもののＴ細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドが提供される。詳細な実施形態において、Ｔ細胞エピトープはドミナントＴ細胞エピトープである。
【０１０５】
したがって詳細な実施形態において、本発明の治療および予防方法は、本明細書に記載するような免疫原性ペプチドの投与を含み、該ペプチドは治療される疾患において役割を果たす抗原タンパク質（たとえば表２に記載したものなど）のＴ細胞エピトープを含む。さらなる実施形態において、使用したエピトープはドミナントエピトープである。
【０１０６】
本発明の文脈での使用のための、このような抗原タンパク質からの、さらに詳細にはアレルゲンまたは自己抗原からのＴ細胞エピトープの同定および選択は、当業者に公知である。
【０１０７】
本発明の文脈での使用に適切なエピトープを同定するために、抗原タンパク質の単離ペプチド配列は、ペプチド配列がＴ細胞応答を誘発するか否かを判定するために、たとえばＴ細胞生物技法によって試験される。Ｔ細胞応答を誘発することが見出されたペプチド配列は、Ｔ細胞刺激活性を有すると定義される。
【０１０８】
ヒトＴ細胞刺激活性は、たとえばダニアレルゲンに感受性である個体（すなわちダニアレルゲンに対するＩｇＥ媒介免疫応答を有する個体）から得たＴ細胞をアレルゲンに由来するペプチド／エピトープと共に培養することと、たとえばトリチウム化チミジンの細胞取り込みによって測定されるように、Ｔ細胞の増殖がペプチド／エピトープに応答して起こるか否かを判定することとによってさらに試験されうる。ペプチド／エピトープに対するＴ細胞による応答の刺激指数は、対照ＣＰＭによって除算された、ペプチド／エピトープに応答する最大ＣＰＭとして計算されうる。バックグラウンドレベルの２倍以上のＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、「陽性」と見なされる。陽性結果は、試験したペプチド／エピトープの群について各ペプチド／エピトープの平均刺激指数を計算するために使用する。
【０１０９】
非天然（または修飾）Ｔ細胞エピトープはさらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するその結合親和性に関して場合により試験されうる。これは異なる方法で実施されうる。たとえば溶解性ＨＬＡクラスＩＩ分子は、所与のクラスＩＩ分子についてホモ接合の細胞の溶解によって得られる。後者はアフィニティクロマトグラフィによって精製される。溶解性クラスＩＩ分子は、そのクラスＩＩ分子に対するその強い結合親和性に従って生成されたビオチン標識基準ペプチドと共にインキュベートされる。クラスＩＩ結合について評価されるペプチドは次に、各種の濃度でインキュベートされ、基準ペプチドをそのクラスＩＩ結合から置換するその能力はニュートラアビジンの添加によって計算される。方法はたとえば、Ｔｅｘｉｅｒら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４，３１７７−３１８４）に見出されうる。
【０１１０】
本発明の方法により、Ｔ細胞エピトープの免疫原性特性は、それを還元化合物に結合させることによって上昇する。特に、本明細書に記載するような少なくとも１つのＴ細胞エピトープおよび還元化合物を含む本発明のペプチドは、２．０以上の平均Ｔ細胞刺激指数を有する。２．０以上のＴ細胞刺激指数を有するペプチドは、治療剤として有用であると見なされる。さらに詳細には、本発明によるペプチドは、少なくとも２．５、少なくとも３．５、少なくとも４．０、またはなお少なくとも５．０の平均Ｔ細胞刺激指数を有する。加えて、ペプチドは通例、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、または少なくとも約２５０の陽性指数（Ｐ．Ｉ．）指数を有する。ペプチドの陽性指数は、平均Ｔ細胞刺激指数に、チリダニに感受性の個体の集団における（たとえば少なくとも９名、少なくとも１６名、または少なくとも２９または３０、あるいはなおそれ以上）、ペプチドに応答するＴ細胞を有する個体のパーセントを乗算することによって決定される（それゆえペプチド／エピトープの乱交雑特性が乗算されたＳＩに相当する）。それゆえ陽性指数は、チリダニに感受性である個体の集団におけるペプチドに対するＴ細胞応答の強度（Ｓ．Ｉ．）およびペプチドに対するＴ細胞応答の頻度の両方を表す。
【０１１１】
たとえばファインマッピング技法によって最適Ｔ細胞エピトープを決定するために、Ｔ細胞刺激活性を有し、それゆえＴ細胞生物技法によって決定されたような少なくとも１つのＴ細胞エピトープを有するペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかにおいてアミノ酸残基の付加または欠失によって修飾され、Ｔ細胞反応性における修飾ペプチドへの変更を判定するために試験される。Ｔ細胞生物技法によって判定されるように、ネイティブなタンパク質配列内で重複区域を共有する２つ以上のペプチドがヒトＴ細胞刺激活性を有することが見出される場合、このようなペプチドの全部または一部を含む追加のペプチドが生成可能であり、これらの追加のペプチドは同様の手順で試験されうる。本技法に従って、ペプチドが選択され、組み換えまたは合成によって生成される。Ｔ細胞エピトープまたはペプチドは、ペプチド／エピトープ（たとえば刺激指数）に応答するＴ細胞応答の強度および個体の集団におけるペプチドに対するＴ細胞応答の頻度を含む、各種の因子に基づいて選択される。
【０１１２】
且つおよび／またはあるいは、１つ以上のインビトロアルゴリズムは、抗原タンパク質内のＴ細胞エピトープ配列を同定するために使用されうる。適切なアルゴリズムとしては、これに限定されるわけではないが、次のウェブサイトに見出されるアルゴリズムが挙げられる：
−ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｉｇｅｎ．ｉ２ｒ．ａ−ｓｔａｒ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｐｒｅｄＢａｌｂｃ／；
−ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｉｇｅｎ．ｉ２ｒ．ａ−ｓｔａｒ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｐｒｅｄＢａｌｂｃ／：
−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｑｈａｖａ／ｍｈｃｂｎ／；
−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ；
−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｓ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｋ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／ＳＶＭＨＣ；
−ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ａｎｔｉｇｅｎｉｃ．ｈｔｍｌ；
−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＭＨＣＰｒｅｄ／。
さらに詳細には、このようなアルゴリズムは、ＭＨＣ  ＩＩ分子の溝内に適合するであろう１つ以上のノナペプチド配列の抗原タンパク質内の予測を可能にする。
【０１１３】
本発明のペプチドは、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞において、組み換えＤＮＡ技法を使用して産生されうる。ペプチドの制限長を考慮して、それらはペプチドが異なるアミノ酸を相互に結合することによって調製される化学ペプチド合成によって調製されうる。化学合成は、たとえばＤ−アミノ酸、非天然型側鎖を備えたアミノ酸または修飾側鎖を備えた天然アミノ酸、たとえばメチル化システインの包含に特に適切である。
【０１１４】
化学ペプチド合成方法は十分に説明されており、ペプチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの会社および他の会社に注文できる。
【０１１５】
ペプチド合成は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）または反対に液相ペプチド合成のどちらかとして実施されうる。最も公知のＳＰＰＳ方法は、ｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｓ固相化学である。
【０１１６】
ペプチド合成の間、複数の保護基が使用される。たとえばヒドロキシルおよびカルボキシル官能基はｔ−ブチル基によって保護され、リジンおよびトリプトファンはｔ−Ｂｏｃ基によって保護され、アスパラギン、グルタミン、システインおよびヒスチジンはトリチル基によって保護され、アルギニンはｐｂｆ基によって保護される。詳細な実施形態において、このような保護基は合成後にペプチドに残されうる。
【０１１７】
最初にＫｅｎｔによって記載され（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ＆  Ｋｅｎｔ（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０，１８０−１９３）、たとえばＴａｍら、（２００１）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６０，１９４−２０５で総説されているような、ＳＰＰＳの範囲を超えたタンパク質合成を達成する多大な可能性を与えるライゲーション法（２つの未保護ペプチド断片の化学選択的結合）を使用して、ペプチドは互いに連結してより長いペプチドを形成するために相互に結合されうる。サイズが１００〜３００残基の多くのタンパク質が、本方法によって正しく合成されてきた。合成ペプチドは、ＳＰＰＳにおける並外れた進歩のために、生化学、薬理学、神経生物学、酵素学および分子生物学の研究分野で高まり続ける重大な役割を果たし続けてきた。
【０１１８】
あるいはペプチドは、コードヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクターにおいて本発明のペプチドをコードする核酸分子を使用することによって合成されうる。このようなＤＮＡ分子は、自動ＤＮＡ合成装置および遺伝コードの周知のコドン−アミノ酸関係を使用して容易に調製されうる。このようなＤＮＡ分子は、オリゴヌクレオチドプローブおよび従来のハイブリダイゼーション方法を使用してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとしても得られる。このようなＤＮＡ分子は、適切な宿主、たとえば細菌、たとえば大腸菌、酵母細胞、動物細胞または植物細胞におけるＤＮＡの発現およびポリペプチドの生成に適している、プラスミドを含む発現ベクター内に包含されうる。
【０１１９】
目的のペプチドの物理的および化学的特性（たとえば溶解性、安定性）は、ペプチドが治療組成物での使用に適切であるかどうか／あろうかどうかを判定するために検査される。通例、これはペプチドの配列を調整することによって最適化される。場合によりペプチドは、当分野で公知の技法を使用して、合成後に修飾されうる（化学修飾、たとえば官能基の付加／欠失）。
【０１２０】
Ｔ細胞エピトープはそれ自体、抗原提示細胞の表面における適切なＨＬＡ分子に結合して、関連Ｔ細胞亜集団を刺激することによって、Ｔヘルパー細胞のレベルにおいて早期事象を引き起こすと考えられる。これらの事象は、Ｔ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所炎症反応、追加免疫細胞の部位への補充、および抗体の生成につながるＢ細胞カスケードの活性化を引き起こす。これらの抗体の１つのアイソタイプであるＩｇＥはアレルギー症状の発症において本質的に重要であり、その生成は事象のカスケードの早期に、Ｔヘルパー細胞のレベルにて、分泌されたリンホカインの性質によって影響される。Ｔ細胞エピトープはＴ細胞受容体による認識の基本要素または最小単位であり、該エピトープはタンパク質のアミノ酸配列中で近接している、受容体認識に必須であるアミノ酸残基を含む。
【０１２１】
しかしながら本発明によるペプチド（酸化還元配列に結合されたＴ細胞エピトープを含む）またはその組成物の投与時に、次の事象が起こると考えられる：
・ＭＨＣ−クラスＩＩ分子によって提示された抗原（すなわちアレルゲンまたは自己抗原）由来ペプチドとの同種相互作用から生じる抗原（すなわちアレルゲンまたは自己抗原）特異的Ｔ細胞の活性化；
・その第２ドメインが束縛されたジスルフィド架橋を含有する、Ｔ細胞表面タンパク質、たとえばＣＤ４分子（およびＣＤ３も）減少させるレダクターゼコンセンサス配列。これはシグナルをＴ細胞内に形質導入する。増大した酸化経路に関連する一連の結果のうち、重要な事象はカルシウム流入の増加およびＮＦ−κＢ転写因子の核への転座である。後者は、細胞に細胞傷害特性を獲得させるＩＦＮ−ガンマおよびグランザイムの転写増加をもたらす；
・細胞傷害性は、グランザイムＢ分泌、およびＦａｓ−ＦａｓＬ相互作用を含む機構によって、ペプチドを提示する細胞に影響する。抗原提示標的細胞の破壊は、同じ抗原に位置するエピトープに特異的な、または同じ抗原提示細胞によって処理されるであろう無関係の抗原に対して特異的な他のＴ細胞の活性化を防止する；
・Ｔ細胞活性化のさらなる結果は、細胞間接触依存機構によるバイスタンダＴ細胞の活性化を抑制することである。このような場合では、異なる抗原提示細胞によって提示された抗原によって活性化されたＴ細胞も、細胞傷害性およびバイスタンダＴ細胞の両方が密に近接しているという条件で、抑制される。
【０１２２】
上で仮定された作用機構は、実験データによって実証される（下の実施例を参照）。一部の実験は加えて、細胞の生存に必須のアミノ酸であるトリプトファン異化の上昇はもちろんのこと、活性化Ｔｒｅｇによる微粒子の生成も引き起こす、パーフォリン経路の関与および／または標的細胞におけるインドールアミンオキシダーゼの活性化も示唆している。
【０１２３】
後述するインビボモデルでの実験は、本発明によるペプチドまたはその組成物の投与（すなわち注射）が抗原特異的免疫応答を予防または抑制しうることを証明している。１例として、アレルゲンＤｅｒ  ｐ  ２に対する感作に起因する喘息のマウスモデルにおいて、上記の本発明によるペプチドを用いた予備免疫は、喘息の特徴である肺炎症性細胞浸潤を防止する。メタコリンの増加する投薬量の吸引によって測定されたような非特異的気道過敏性は、同じ実験プロトコルによって本質的に防止される。気管支肺胞液中への細胞の移動も完全に防止される（実施例４を参照）。さらに（組成物によって免疫化された動物に由来する）Ｔ細胞クローンの養子移入は、レシピエントにおける炎症細胞の浸潤および気道過敏症の両方を完全に防止および抑制する。本発明によるペプチドの投与により誘発されるこのようなＴ細胞クローンは、現在同定されているＴｒｅｇ、天然Ｔｒｅｇまたは適応Ｔｒｅｇのどちらからも該クローンを異なるものとする多数の表現型特徴を提示する。それゆえ細胞傷害性Ｔｒｅｇは、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＦａｓＬおよびＩＣＯＳを含む表面マーカーの発現増進を示す（活性化時）。それらは静止時ですらＣＤ２５高、そしてＣＤ１２７低（ＩＬ７−Ｒ）である。転写因子発現はＴ−ｂｅｔを含むが、天然Ｔｒｅｇの特徴であると考えられる転写抑制因子Ｆｏｘｐ３は含まない。ＩＦＮ−ガンマの高度生成とは別に、このようなクローンは、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＴＧＦ−ベータを分泌しないか、ごく微量分泌する。上の特徴は排他的ではないが、このような細胞傷害性Ｔｒｅｇが他の公知のＴｒｅｇから区別できるという事実の例証として与えられている。
【０１２４】
したがって、なおさらなる態様において、本発明は、抗原特異的Ｔｒｅｇをインビボまたはインビトロで産生する方法、およびそれと独立して上記の特徴的な発現データに基づいて他のＴｒｅｇから細胞傷害性Ｔｒｅｇを識別する方法を提供する。
【０１２５】
本発明の１態様は、本発明の抗原特異的Ｔｒｅｇの生成のためのインビボ方法に関する。詳細な実施形態は、本明細書に記載するように本発明のペプチドによって（ヒトを含む）動物を免疫化することと、次にＴｒｅｇを前記免疫化動物から単離することとによって、前記Ｔｒｅｇを生成または単離する方法に関する。さらに詳細な手順は、本明細書に実施例の節に記載されており、本発明の一部である。
【０１２６】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗原特異的Ｔｒｅｇの生成のためのインビトロ方法に関する。Ｔｒｅｇは免疫調節において重要であり、治療上の大きな可能性を有する。Ｔｒｅｇベース免疫療法の有効性は、調節Ｔ細胞のＡｇ特異性に決定的に依存する。その上、Ａｇ特異的Ｔｒｅｇの使用はポリクローナル増殖Ｔｒｅｇに対して、療法に必要なＴｒｅｇの総数を減少させる。当分野で公知の方法を使用するインビトロでの調節Ｔ細胞の産生は、多数の重要な欠点を有する。単離末梢細胞のサンプル内のＴｒｅｇのパーセンテージは約５％であり、Ｔｒｅｇの量が常に制限されているので、Ｔｒｅｇ細胞の培養は困難である。その上、このようにして産生されたＴｒｅｇは非特異的であり、それゆえ特異的免疫応答を抑制することができないが、患者に投与されたときに一般的な免疫抑制効果のみ有する。したがって非常に強力なＡｇ特異的Ｔｒｅｇの選択および増殖を可能にする選択手順の開発のための方法が生み出されてきた。しかしながらこのようにして得られた抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞の数は制限されたままである。
【０１２７】
本発明は、細胞傷害活性を有する抗原特異的調節Ｔ細胞を産生する方法を提供する。
１実施形態において、末梢血球の単離、本発明の免疫原性ペプチドによるインビトロでの細胞集団の刺激およびさらに詳細にはＩＬ−２の存在下での刺激された細胞集団の増殖を含む方法が提供される。本発明による方法は、より多数のＴｒｅｇが生成されるという利点および抗原タンパク質に特異的なＴｒｅｇが産生されうる（抗原特異的エピトープを含むペプチドを使用して）という利点を有する。
【０１２８】
代わりの実施形態において、Ｔｒｅｇは、たとえば本明細書に記載した免疫原性ペプチドの被験体への注射、およびインビボで産生されたＴｒｅｇの採取によって、インビボで産生されうる。
【０１２９】
本発明の方法によって得られる抗原特異的調節Ｔ細胞は、アレルギー反応の予防および自己免疫疾患の再発の治療における免疫療法のための哺乳類への投与にとって特に興味深い。異種細胞および自己細胞の両方の使用が想定される。
【０１３０】
したがって本発明の１態様は、後述するように特徴付けられる細胞傷害性Ｔｒｅｇ集団を提供することである。さらに詳細には、本発明のＴｒｅｇ集団の集団は、本明細書に記載する方法によって得られる。
【０１３１】
したがって本発明は、医薬としての使用のための、さらに詳細には養子細胞療法における使用のための、さらに詳細には急性アレルギー反応および多発性硬化症などの自己免疫疾患の再発の治療における、本発明による細胞傷害特性を備えた抗原特異的Ｔｒｅｇを提供する。本発明は、本明細書に記載するように産生された前記単離ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇ細胞集団の使用、さらに詳細には免疫障害の予防または治療用医薬の製造のための本明細書に記載するように産生された抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞集団にも関する。同様に、本発明は前記単離Ｔｒｅｇまたは産生Ｔｒｅｇ集団を使用することによる治療方法に関する。
【０１３２】
本発明のさらなる態様は、細胞の発現特徴に基づいて細胞傷害性Ｔｒｅｇ細胞を他のＴｒｅｇ細胞から識別する方法を提供する。さらに詳細には、本発明による方法は、Ｔ細胞集団が非細胞傷害性Ｔｒｅｇ細胞集団と比較して、次の特徴の１つ以上を示すか否かを判定することを含む：
−活性化時におけるＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＦａｓＬおよびＩＣＯＳを含む表面マーカーの発現増進、
−ＣＤ２５の高度発現、
−ＣＤ４、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲの発現およびＣＤ１２７（ＩＬ７−Ｒ）の低発現または無発現、
−転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびｅｇｒ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の発現、しかし転写抑制因子Ｆｏｘｐ３の無発現、
−ＩＦＮ−ガンマの高度生成およびＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＴＧＦ−ベータがないか、ごく微量。
【０１３３】
さらに詳細には、本発明の方法は、細胞がＣＤ４を発現すること、それらがＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータを発現しないこと、それらがＫｒｏｘ−２０を発現して、グランザイムおよびＦａｓリガンドを生成することを判定することを含む。最も詳細には、これらの細胞はさらに、ＴＣＲ認識による活性化に応答しない細胞として機能的に選択される。さらなる詳細な実施形態において、該方法は上記の特徴すべてを判定することを含む。
【０１３４】
ここ数年、生理学的条件および病理学的条件の両方において調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特徴付けで大幅な進歩がもたらされている。さらに詳細には、一部の疾患治療にＴｒｅｇを使用する可能性が議論されている。本発明は、インビトロまたはインビボ誘導に使用された方法および特異的特性による、先に報告されたＴｒｅｇとは異なる抗原特異的養子Ｔｒｅｇの新たに定義されたサブセットの開発を扱う。Ｔｒｅｇは、２つの広範な種類、すなわち天然Ｔｒｅｇおよび誘導（または適応）Ｔｒｅｇに属する。天然Ｔｒｅｇは最初に１９９５年にマウスで説明され、胸腺で能動的に選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットとして定義された。このような細胞は、静止細胞におけるＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３を含む多数の表面マーカーの発現を特徴とする。さらに近年では、天然ＴｒｅｇはＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）の発現の欠失によってさらに定義されている。Ｆｏｘｐ３転写抑制因子は、天然Ｔｒｅｇの選択で決定的な役割を果たす。Ｆｏｘｐ３の変異は、天然Ｔｒｅｇの非存在下で、多発性内分泌腺症、腸疾患、アトピー発現および致死的感染を伴うＸ連鎖免疫調節解除と共に生じる。このような天然Ｔｒｅｇは、胃腸症候群を含む各種の炎症プロセスを抑制する。分子レベルにおいて、Ｆｏｘｐ３はＡＰ１との競合においてＮＦＡＴ転写因子と結合して、それにより多数のサイトカインの転写を調節する。天然Ｔｒｅｇの作用機構は鋭意調査中である。インビトロでは、このような細胞はＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを生成する。インビボではしかしながら、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ｂの中和は抑制を克服せず、他の機構が効果を現していることを示す。インビトロでは、天然Ｔｒｅｇが細胞接触に依存した方法で適応応答を抑制する。興味深いことに、天然Ｔｒｅｇはグランザイム−Ａ（ＧＺ−Ａ）およびグランザイム−Ｂ（ＧＺ−Ｂ）などのグランザイムプロテアーゼを発現する。なお議論の余地があるが、天然Ｔｒｅｇのさらなるまたは代わりの作用機構は、グランザイムのエキソサイトーシスによって標的細胞を溶解させるその能力に依拠するように思われる。ＧＺ−Ｂ欠乏Ｔｒｅｇは、免疫応答を抑制するその能力を部分的に緩める。適応Ｔｒｅｇは、共通して抗原特異的であり、バイスタンダＴ細胞に抑制活性を及ぼし、末梢にて誘導される必要のある、Ｔ細胞の異種ファミリを構成する。Ｔｈ３細胞は、抗原の経口投与によって主に生成され、腸間膜リンパ節に見出される。このような細胞は、高レベルのＴＧＦ−ベータを可変量のＩＬ−４およびＩＬ−１０と共に生成することによりその抑制活性を及ぼす。Ｔｒ１細胞は高濃度のＩＬ−１０および可変量のＴＧＦ−ベータを生成する。これらは未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞の高濃度のＩＬ−１０への曝露または抗ＣＤ３および抗ＣＤ４６抗体による複合活性によってインビトロで誘導される。Ｔｈ３細胞とＴｒ１細胞との間の精密な関係は、特異的表現型マーカーの非存在下では確立されない。これらの２つの適応Ｔｒｅｇの間の重複が存在するように思われるだけでなく、追加のサブセットも今後数年で定義されると思われる。適応Ｔｒｅｇは、Ｆｏｘｐ３抑制因子を発現しない。ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータなどの抑制サイトカインの生成とは別に、ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞は抗ＣＤ３および抗ＣＤ４６抗体刺激によって誘導されてグランザイム、主にＧＺ−Ｂを発現しうることが報告されている。これらの非特異的インビトロ誘導Ｔｒｅｇがグランザイム分泌のために細胞傷害活性を及ぼすか否かは明らかでない。本発明のペプチドは、生存している動物、通例ヒトへの投与時に、バイスタンダＴ細胞へ抑制活性を及ぼす特異的Ｔ細胞を誘発するであろう。ペプチドは明らかに、同種相互作用後のＴ細胞の酸化代謝を活性化して、ＣＤ４分子の第２細胞外ドメインの束縛されたジスルフィド架橋を減少させる。
【０１３５】
本発明のペプチドは、ある抗原の特異的Ｔ細胞エピトープを含むが、同じ抗原の他のＴ細胞エピトープに対する免疫反応によって誘発された障害の予防または治療に、あるいはある状況で他の異なる抗原が同じ機構を通じて本発明のペプチドによって活性化されたＴ細胞の付近でのＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される場合は、他の異なる抗原の他のＴ細胞エピトープに対する免疫反応によって誘発された障害の治療にすら使用されうることを、本機構も示唆しており、実験結果が示している。
【０１３６】
本発明のさらなる詳細な態様はそれゆえ、ＣＤ４を発現すること、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータを発現しないこと（他の適応Ｔ細胞はＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータを生成するが）、Ｋｒｏｘ−２０を発現して、グランザイムおよびＦａｓリガンドを生成することを特徴とするＴ細胞、特に詳細にはＴｒｅｇまたはＴ抑制細胞である細胞タイプに関する。さらに詳細には、これらの細胞はさらに、ＴＣＲ認識による活性化に応答しない細胞として機能的に選択される。さらに詳細には、本明細書に記載した特徴を有するＴｒｅｇ細胞タイプの集団が提供され、それによりアネルギー応答は抗原特異的である。
【０１３７】
さらなる詳細な実施形態において、本発明のＴｒｅｇ細胞は、それらが：
−ＣＤ２５、ＣＤ４、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲの発現、およびＣＤ１２７（ＩＬ７−Ｒ）の無発現、Ｆｏｘｐ３を除く転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびｅｒｇ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の発現、
−活性化時のＦａｓＬならびにグランザイム（ＢおよびＣ）を含むマーカーの発現増進、−ＩＮＦ−ガンマの高度生成
を有することを特徴とする。
【０１３８】
さらなる詳細な実施形態において、本発明は、Ｔ細胞、特に詳細にはＴｒｅｇまたはＴ抑制細胞である細胞タイプであって、それらが：
−ＣＤ２５、ＣＤ４、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲの発現、およびＣＤ１２７（ＩＬ７−Ｒ）の無発現、Ｆｏｘｐ３を除く転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびｅｒｇ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の発現、
−活性化時のＦａｓＬならびにグランザイム（ＢおよびＣ）を含むマーカーの発現増進、−ＩＮＦ−ガンマの高度生成
を有することを特徴とする細胞タイプを提供する。
【０１３９】
最も詳細には、本発明のＴｒｅｇ細胞または細胞集団は、それらが：
−活性化時におけるＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＦａｓＬおよびＩＣＯＳを含む表面マーカーの発現増進、
−他の適応Ｔ細胞がＣＤ２５陰性であるが、ＣＤ２５の高度発現、ＣＤ４、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲの発現およびＣＤ１２７（ＩＬ７−Ｒ）の低発現または無発現、
−転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびｅｇｒ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の発現、しかし他の適応Ｔ細胞がＦｏｘｐ３陽性であるが、転写抑制因子Ｆｏｘｐ３の無発現、
−ＩＦＮ−ガンマの高度生成およびＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＴＧＦ−ベータがないか、ごく微量、
−活性化時のＦａｓＬならびにグランザイム（ＢおよびＣ）を含むマーカーの発現増進
を有することを特徴とする。
【０１４０】
さらに詳細には、本発明は、加えて抗原特異的である、すなわち抗原特異的免疫応答を抑制できる、上記の特徴を有する細胞タイプの単離細胞集団を提供する。したがって本発明は、上記のように特徴付けられる単離抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を提供する。さらに詳細には、本発明は、Ｄｅｒ  ｐ  ２によって誘発される以外の抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を提供する。
【０１４１】
本発明によるペプチドは、当分野で周知の遺伝子療法方法でも使用でき、本発明で使用する、本明細書によるペプチドの使用について説明する用語は、本発明による免疫原性ペプチドをコードまたは発現する核酸の使用も含む。
【０１４２】
したがって本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドをコードする核酸配列およびその使用方法に関する。
【０１４３】
哺乳類にてインビボで遺伝子療法によって本発明によるペプチド、そのホモログまたは誘導体のレベルを達成する各種の方法が、本発明の文脈内で想定される。
【０１４４】
タンパク質配列をコードする組み換え核酸分子は、標的細胞への送達のために、裸のＤＮＡとしてあるいはリポソームまたは他の脂質系において使用されうる。ヒト遺伝子療法での使用のためのプラスミドＤＮＡの細胞内への直接移入の他の方法は当業者に周知であり、プラスミドＤＮＡをタンパク質へ複合体化することによりＤＮＡを細胞の受容体に標的化することを含む。その最も簡単な形において、遺伝子移入は、微量注入のプロセスによって微量のＤＮＡを細胞の核へ単に注入することによって実施されうる。組み換え遺伝子がいったん細胞内に導入されると、それらは細胞の通常の転写および翻訳機構によって認識可能であり、遺伝子産物が発現されるであろう。ＤＮＡをより多数の細胞に導入するための他の方法も試みられている。これらの方法は：ＤＮＡがリン酸カルシウムによって沈殿され、飲作用によって細胞内へ取り込まれる、形質移入；細胞がホールを膜中に導入するために大きい電圧パルスに曝露される、電気穿孔）；標的細胞と融合する親油性小胞にＤＮＡが充填される、リポフェクション／リポソーム融合；および小型発射体に結合されたＤＮＡを使用する微粒子銃を含む。ＤＮＡを細胞中に導入する別の方法は、ＤＮＡを化学修飾タンパク質に結合することである。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化させて、ＤＮＡの細胞中への取り込みを増進させることができる。ＤＮＡ複合体を含有する溶液へのアデノウイルスの混合、またはタンパク質架橋剤を使用する、アデノウイルスに共有結合したポリリジンへのＤＮＡの結合は、組み換え遺伝子の取り込みおよび発現を実質的に改善する。アデノ結合ウイルスベクターも、血管細胞内への遺伝子送達にも使用されうる。本明細書で使用するように、「遺伝子移入」は、遺伝子によってコードされた特定の生成物の発現を可能にするために一般に実施される外来核酸分子を細胞中に導入するプロセスを意味する。前記生成物としては、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは酵素活性ＲＮＡが挙げられる。遺伝子移入は培養細胞において、または哺乳類への直接投与によって実施されうる。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明によるペプチドをコードする核酸分子配列を含むベクターが提供される。詳細な実施形態において、核酸分子配列が特定の組織中のみで発現されるようにベクターが産生される。組織特異的遺伝子発現を達成する方法は、当分野で周知である。１実施形態により、これは、１つ以上の特定の組織で発現を指示するプロモータの制御下に本発明によるペプチドをコードする配列を配置することによって達成される。
【０１４６】
ウイルス、たとえばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＲＮＡウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターは、本発明のペプチド、そのホモログまたは誘導体をコードするヌクレオチド配列（たとえばｃＤＮＡ）の標的組織または細胞集団内への送達に使用されうる。当業者に周知である方法を使用して、このようなコード配列を含有する組み換えウイルスベクターを構築する。
【０１４７】
したがって本発明は、アレルギーまたは自己免疫疾患の治療および／または予防のための、インビボで本発明のペプチドを発現できる核酸の使用を開示する。１実施形態により、インビボで本発明によるペプチドを発現できる核酸は、プロモータに操作可能に連結された、このようなペプチドをコードする配列である。このような配列は直接または間接的に投与されうる。たとえば本発明によるペプチドのコード配列を含有する発現ベクターは細胞中に挿入することができ、その後、前記細胞はインビトロで増殖され、次に患者に注射または輸液される。あるいはインビボで本発明によるペプチドを発現できる核酸は、細胞の内因性発現を修飾する配列である。遺伝子療法方法は、本発明によるペプチド、そのホモログまたは誘導体をコードするヌクレオチド配列または本発明によるペプチドをコードする裸の核酸分子を含むアデノウイルスベクターの使用を含みうる。あるいは本発明によるペプチドをコードする核酸分子を含有する組み換え細胞が注入されうる。
【０１４８】
本発明による１つ以上のペプチドの投与が遺伝子移入によって保証される場合（すなわち投与時にインビボでの本発明によるペプチドの発現を保証する核酸の投与）、核酸の適切な投薬量は、たとえば投与後の血中ペプチド濃度を決定することによって、核酸の結果として発現されたペプチドの量に基づいて決定されうる。それゆえ詳細な実施形態において、本発明のペプチドは、発現ベクター中か否かにかかわらず、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用によって投与され、それゆえ本発明は遺伝子療法にも関する。別の詳細な実施形態は、免疫障害の治療または予防のための本発明のペプチドの局所過剰発現を誘導する方法の使用に関する。
【０１４９】
本発明のなお別の態様は、本発明による１つ以上のペプチドを含み、医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物を提供する。上で詳説したように、本発明は、薬剤としての使用のための組成物、または前記組成物を使用することによって免疫障害の哺乳類を治療する方法、および免疫障害の予防または治療用の医薬製造のための前記組成物の使用にも関する。
【０１５０】
医薬組成物はたとえば、免疫障害、特に浮遊または食物由来アレルギーはもちろんのこと、アレルギー起源の疾患も治療または予防するのに適切であるワクチンでありうる。本明細書でさらに述べる医薬組成物の例として、本発明によるペプチドは、哺乳類への投与に適切なアジュバント、たとえば水酸化アルミニウム（ミョウバン）に吸着される。通例、ミョウバンに吸着されたペプチド５０μｇを皮下経路によって、２週間間隔で３回注射する。当業者には、経口、経鼻または筋肉内を含む他の投与経路が可能なことが明らかであることが望ましい。また、注射回数および注射量は、治療される状態に応じて変化しうる。さらにミョウバン以外の他のアジュバントは、それらがＭＨＣクラスＩＩ提示でのペプチド提示およびＴ細胞活性化を促進するという条件で使用されうる。それゆえ活性成分は単独で投与されることが可能であるが、それらは通例、医薬調合物として与えられる。本発明の動物用およびヒト用の調合物はどちらも、上記のような少なくとも１つの活性成分を１つ以上の医薬的に許容される担体と共に含む。本発明の詳細な実施形態は、医薬的に許容される担体と混合された、活性成分として本発明による１つ以上のペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、治療または予防方法に関して下で示されるような、活性成分の治療的有効量を含むことが望ましい。場合により、組成物は他の治療成分をさらに含む。適切な他の治療成分は、それらが属するクラスに応じたその通常の投薬量と同様に当業者に周知であり、免疫障害を治療するのに使用される他の既知の薬物より選択されうる。
【０１５１】
「医薬的に許容される担体」という用語は本明細書で使用するように、たとえば前記組成物を溶解、分散または拡散することによって治療部位へのその塗布または浸透を促進するために、および／またはその有効性を損なわずにその貯蔵、輸送または取り扱いを容易にするために、活性成分と共に処方されるいずれの材料または物質も意味する。それらはありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤（たとえばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（たとえば糖または塩化ナトリウム）などを含む。組成物中でのモノクローナル抗体活性成分の作用期間を制御するために、追加の成分も含まれうる。医薬的に許容される担体は、固体または液体または圧縮されて液体を形成する気体であってもよく、すなわち本発明の組成物は濃縮剤、エマルジョン剤、液剤、顆粒剤、ダスト剤、スプレー剤、エアゾール剤、懸濁剤、軟膏、クリーム、錠剤、ペレットまたは粉剤として適切に使用されうる。前記医薬組成物およびその調合物での使用のために適切な医薬担体は当業者に周知であり、本発明ではその選択には特定の制限はない。それらは添加剤、たとえば湿潤剤、分散剤、粘着剤、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤（たとえばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（たとえば糖または塩化ナトリウム）なども、それらが薬務と一致するという条件で、すなわち哺乳類に恒久的な損傷を生じない担体および添加剤を含みうる。本発明の医薬組成物は、いずれの公知の方法でも、たとえば選択された担体材料、および適切な場合には界面活性剤などの他の適切な添加剤と共に、１ステップまたは多ステップ手順で、活性成分を均質に混合、コーティングおよび／または粉砕することによって調製されうる。それらはたとえば通常約１〜１０μｍの直径を有するミクロスフェア形態で得る目的で、すなわち活性成分の制御または持続放出のためのマイクロカプセル製造のために、微粒子化によっても調製されうる。
【０１５２】
エマルジェントまたは乳化剤としても公知である、本発明の医薬組成物で使用される適切な界面活性剤は、良好な乳化、分散および／または湿潤特性を有する非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性材料である。適切なアニオン性界面活性剤としては、水溶性石鹸および水溶性合成界面活性剤の両方が挙げられる。適切な石鹸は、高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）の、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、非置換または置換アンモニウム塩、たとえばオレイン酸またはステアリン酸の、あるいはヤシ油または獣脂油から入手できる天然脂肪酸混合物のナトリウム塩またはカリウム塩である。合成界面活性剤としては、ポリアクリル酸のナトリウム塩またはカルシウム塩；脂肪スルホネートおよびサルフェート；スルホン化ベンズイミダゾール誘導体およびアルキルスルホネートが挙げられる。脂肪スルホネートおよびサルフェートは通常、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩あるいは８〜２２個の炭素原子を有するアルキルまたはアシルラジカルによって置換されたアンモニウム塩、たとえばリグノスルホン酸またはドデシルスルホン酸のナトリウムまたはカルシウム塩あるいは天然脂肪酸から得た脂肪アルコールサルフェート、硫酸またはスルホン酸エステルのアルカリまたはアルカリ土類金属塩（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）および脂肪アルコール／エチレンオキシド付加体のスルホン酸の混合物形態である。適切なスルホン化ベンズイミダゾール誘導体は通例、８〜２２個の炭素原子を含有しうる。アルキルアリースルスホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸またはジブチル−ナフタレンスルホン酸のナトリウム塩、カルシウム塩またはアルカノールアミン塩あるいはナフタレンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物である。対応するホスフェート、たとえばリン酸エステルの塩およびｐ−ノニルフェノールとエチレンおよび／またはプロピレンオキシドとの付加体、またはリン脂質も適切である。本目的のための適切なリン脂質は、セファリンまたはレシチン型の天然（天然または植物細胞から生じる）または合成リン脂質、たとえばホスファチジル−エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リゾレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびその混合物である。
【０１５３】
適切な非イオン性界面活性剤としては、分子中に少なくとも１２個の炭素原子を含有するアルキルフェノール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪族アミンまたはアミドのポリエトキシ化およびポリプロポキシ化誘導体、アルキルアレーンスルホネートおよびジアルキルスルホスクシネート、たとえば脂肪族および脂環式アルコール、飽和および不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコール誘導体が挙げられ、前記誘導体は通例、（脂肪族）炭化水素部分に３〜１０個のグリコールエーテル基および８〜２０個の炭素原子を含有し、アルキルフェノールのアルキル部分に６〜１８個の炭素原子を含有する。さらに適切な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドとポリプロピレングリコール、アルキル鎖中に１〜１０個の炭素原子を含有するエチレンジアミノポリプロピレングリコールとの水溶性付加体であり、該付加体は２０〜２５０個のエチレングリコールエーテル基および／または１０〜１００個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。このような化合物は通常、プロピレングリコール１単位当たりエチレングリコールを１〜５単位含有する。非イオン性界面活性剤の代表的な例は、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加体、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリエチレンソルビタン（たとえばポリオキシエチレンソルビタントリオレアート）、グリセロール、ソルビタン、スクロースおよびペンタエリスリトールの脂肪酸エステルも、適切な非イオン性界面活性剤である。適切なカチオン性界面活性剤としては、ハロ、フェニル、置換フェニルまたはヒドロキシによって場合により置換された４炭化水素ラジカルを有する、４級アンモニウム塩、特にハライド；たとえばＮ置換基として少なくとも１個のＣ８〜Ｃ２２アルキルラジカル（たとえばセチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイルなど）、さらなる置換基として、非置換またはハロゲン化低級アルキル、ベンジルおよび／またはヒドロキシ低級アルキルラジカルを含有する４級アンモニウム塩が挙げられる。
【０１５４】
本目的のために適切な界面活性剤のさらに詳細な説明は、たとえば“ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  Ａｎｎｕａｌ”（ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｒｏｐ．，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９８１），“Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｗ”，２ｄ  ｅｄ．（Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｖｉｅｎｎａ，１９８１）および“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）に見出される。本発明によるペプチド、そのホモログまたは誘導体（および「活性成分」という用語にすべて含まれるその生理学的に許容される塩および医薬組成物）は、治療される状態に適切な、そして投与される化合物、ここではタンパク質および断片に適切ないずれかの経路によって投与されうる。考えられる経路としては、領域、全身、経口（固体形態または吸入）、経直腸、経鼻、局所（眼内、頬側および舌下を含む）、経膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、髄腔内、および硬膜外）が挙げられる。好ましい投与経路は、たとえばレシピエントの状態および治療される疾患によって変化しうる。本明細書に記載するように、（複数の）担体は、調合物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないという点で最適に「許容」される。調合物としては、経口、経直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、経膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、髄腔内、および硬膜外）投与に適したものが挙げられる。調合物は単位投薬形態で好都合に存在し、調剤分野で周知のいずれの方法によっても調製されうる。このような方法は、活性成分を１つ以上の副成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に調合物は、活性成分を液体担体、または微粉化固体担体、あるいは両方と均質および密接に結合させて、次に必要ならば生成物を成形することによって調製される。経口投与に適切な本発明の調合物は、活性成分の所定の量をそれぞれ含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの別個の単位として；粉剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体中の液剤または懸濁剤として；あるいは水中油型エマルジョン剤または油中水型エマルジョン剤として与えられうる。活性成分は、ボーラス、舐剤またはペースト剤としても存在しうる。錠剤は、場合により１つ以上の副成分を用いて圧縮または成形によって作製されうる。圧縮錠剤は、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、界面活性剤または分散化剤と混合された粉末または顆粒などの易流動形の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製されうる。成形錠剤は、適切な機械で不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって作製されうる。錠剤は場合によりコーティングまたは分割され、中の活性成分の低速または制御放出を提供するために調合されうる。
【０１５５】
たとえば関節などの皮膚への局所治療では、調合物は、たとえば０．０７５〜２０％ｗ／ｗ（０．６％ｗ／ｗ、０．７％ｗ／ｗなどの０．１％ｗ／ｗ刻みの０．１％〜２０％の範囲で（複数の）活性成分を含む）、特に０．２〜１５％ｗ／ｗおよびさらに特に０．５〜１０％ｗ／ｗの量の活性成分を含有する局所軟膏またはクリームとして場合により塗布される。軟膏に調合されるとき、活性成分はパラフィン系または水混和軟膏ベースのどちらかと共に利用されうる。あるいは活性成分は、水中油型クリームベースによってクリームへ調合されうる。所望ならば、クリームベースの水層はたとえば、少なくとも３０％ｗ／ｗの多価アルコール、すなわち２個以上のヒドロキシル基を有するアルコール、たとえばプロピレングリコール、ブタン、１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００を含む）およびその混合物を含みうる。局所調合物は望ましくは、皮膚または他の罹患範囲を通じた活性成分の吸収または浸透を強化する化合物を含みうる。このような皮膚浸透強化剤の例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連類似物質が挙げられる。本発明のエマルジョン剤の油相は、公知の方法で公知の成分から構成されうる。該相は乳化剤（そうでなければエマルジェントとして公知）のみを含みうるが、該相は望ましくは、少なくとも１つの乳化剤と脂肪または油、あるいは脂肪および油の両方との混合物を含む。場合により、親水性乳化剤は、通例は油および脂肪の両方を含むことによって安定剤として作用する親油性乳化剤と共に含まれる。同時に、（複数の）安定剤を含むまたは含まない（複数の）乳化剤はいわゆる乳化ワックスを構成して、ワックスは油および脂肪と共に、クリーム調合物の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏ベースを構成する。
【０１５６】
医薬乳化調合物に使用されると思われる大部分の油中の活性化合物の溶解性は非常に低いため、調合物のための適切な油または脂肪の選択は、所望の化粧品特性を達成することに基づく。それゆえクリームは場合により、チューブまたは他の容器からの漏れを回避するために適切な稠度を備えた、べたつかず、色が付かず、洗い流せる製品であることが望ましい。直鎖または分枝鎖、１または２塩基アルキルエステル、たとえばジイソアジペート、イソセチルステアレート、ヤシ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、イソプロピルミリステート、ドデシルオレアート、イソプロピルパルミテート、および特にブチルステアレート、２−エチルヘキシルパルミテートまたはＣｒｏｄａｍｏｌ  ＣＡＰとして公知の分枝鎖エステルのブレンドが使用されうる。これらは要求される特性に応じて単独で、または組合せて使用されうる。あるいは高融点脂質、たとえば白色ワセリンおよび／または流動パラフィンあるいは他の鉱油が使用されうる。眼への局所投与に適切な調合物としては、活性成分が適切な担体、特に活性成分用の水性溶媒に溶解または懸濁されている点眼薬が挙げられる。活性成分は場合により、このような調合物に０．５〜２０％、好都合には０．５〜１０％、特に約１．５％ｗ／ｗの濃度で存在する。口内での局所投与に適切な調合物としては、着香ベース、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント中に活性成分を含む口内錠；不活性ベース、たとえばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴム中に活性成分を含むトローチ錠；および適切な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄液が挙げられる。経直腸投与用の調合物は、たとえばココアバターまたはサリチル酸塩を含む適切なベースを用いた坐剤として提供されうる。担体が固体である経鼻投与に適切な調合物としては、嗅剤が摂取される方法で、すなわち鼻付近で保持された粉末容器からの鼻通路を通じた迅速な吸入によって投与される、たとえば２０〜５００ミクロンの範囲の粒径（３０ミクロン、３５ミクロンなどの、５ミクロン刻みの２０〜５００ミクロンの範囲内の粒径を含む）を有する粗い粉末が挙げられる。たとえば経鼻スプレー剤または点鼻薬としての投与のための担体が液体である適切な調合物としては、活性成分の水性または油性溶液が挙げられる。エアゾール投与に適切な調合物は在来の方法に従って調製でき、他の治療剤と共に送達されうる。膣内投与に適した調合物は、活性成分に加えて当分野で適切であることが既知である担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー調合物として提供されうる。非経口投与に適切な調合物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および調合物を対象のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有しうる水性および非水性滅菌注射用液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含みうる水性および非水性滅菌懸濁剤が挙げられる。調合物は、単回用量または多数回用量容器、たとえば密封アンプルおよびバイアルとして提供され、注射のために使用直前に滅菌液体担体、たとえば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵されうる。即時注射用液剤および懸濁剤は、上述した種類の滅���粉剤、顆粒剤および錠剤から調製されうる。
【０１５７】
代表的な単位投薬調合物は、活性成分の、本明細書で上述したような１日用量または単位１日分割用量、あるいはその適切な一部を含有するものでありうる。本発明の調合物が特に上で挙げた成分に加えて、問題の調合物の種類に関して当分野で在来の他の薬剤を含みうること、たとえば経口投与に適切な調合物が着香剤を含みうることが理解されることが望ましい。本発明によるペプチド、そのホモログまたは誘導体を用いて、活性成分として本発明の１つ以上の化合物（「制御放出調合物」）を含有する制御放出医薬調合物を提供し、活性成分の放出が制御または調節されて、より少ない投薬を可能にするかまたは所与の本発明の化合物の薬物動態学的または毒性プロフィールを改善する。別個の単位が本発明の１つ以上の化合物を含む、経口投与に適した制御放出調合物は、在来の方法に従って調製されうる。組成物中での活性成分の作用期間を制御するために、追加の成分も含まれうる。制御放出組成物はそれゆえ、たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチル−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プロタミンサルフェートなどの適切なポリマー担体を選択することによって達成されうる。薬物放出速度および作用期間も、活性成分をハイドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメチルメタクリレートおよび他の上記のポリマーなどのポリマー性物質の粒子、たとえばマイクロカプセルに包含させることによって制御されうる。このような方法は、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルなどのコロイド薬物送達系を含む。投与経路に応じて、医薬組成物は保護コーティングを必要としうる。注射に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液または分散剤およびその即時調製用の滅菌粉剤が挙げられる。したがって本目的のための代表的な担体としては、生体適合性水性緩衝剤、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどおよびその混合物が挙げられる。複数の活性成分が組合せて使用されるときに、それらが治療される哺乳類においてその連携治療効果を直接、同時に必ずしも発揮しないという事実を考慮して、相当する組成物は２つの成分を個別のしかし隣接した容器または仕切りに含有する医療キットまたはパッケージの形態でもありうる。したがって後者の場合では、各活性成分は他の成分とは異なる投与経路に適切な方法で調合され、たとえばその１つは経口または非経口調合物の形態であるのに対して、残りは静脈注射用アンプルまたはエアゾールの形態である。
【０１５８】
本発明の実験部は、抗原特異的な、インビボ誘発型の、増殖しやすい、調節特性を持つＴ細胞のサブセットを示す。後者は：（１）樹状細胞およびＢ細胞の両方に影響を及ぼし、インビトロおよびインビボの両方で示された、ＭＨＣクラスＩＩ依存性同種活性化後のＡＰＣアポトーシスの誘導、および（２）ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−ベータの非存在下での接触依存性機構によるバイスタンダＴ細胞の抑制を含む。本発明はさらに、誘導された細胞傷害性Ｔｒｅｇを天然および適応Ｔｒｅｇの両方から識別する方法を開示する。１５個のクローンの特徴付けに基づいて、表面表現型がＣＤ２５ｈｉ、ＣＴＬＡ−４ｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＩＣＯＳ＋として定義されるが、ＣＤ１２７（−）は除く。このようなクローンは、低レベルのＣＤ６２ＬおよびＣＤ１０３を発現するが、ＣＣＲ７は発現しない。サイトカイン生成は、ＴＧＦ−ベータまたはＩＬ−１０は伴わず、ＩＦＮ−ガンマに限定された。すべてのクローンはＦｏｘｐ３（−）であったが、グランザイムＢに対する高い転写レベルと共に、Ｔ−ｂｅｔおよびＥｇｒ−２に対して強い陽性であった。天然ＴｒｅｇはＦｏｘｐ３の発現およびＣＤ１２７の非存在によって定義され、少なくともインビトロで高レベルのＩＬ−１０を生成し、自己抗原に対して特異的である。これまでに述べた多数の適応Ｔ細胞の中で、大半がＩＬ−１０（そしてＴｈ３細胞などの一部の場合ではＴＧＦ−ベータ）の生成を分担して、Ｆｏｘｐ３およびＣＤ２５陰性である。Ｔ−ｂｅｔの強力な発現が細胞溶解性Ｔｒｅｇにとって重要である。Ｔ−ｂｅｔはＳＴＡＴ−１依存性経路を介してＩＮＦ−γによって誘導され、ＩＬ−２転写の抑制、グランザイム転写の誘導を含む各種の活性を及ぼし、Ｔｈ１分化の成熟因子である。
【０１５９】
本発明のＴ細胞クローンではＩＬ−２の転写は見られず、興味深いことに外来性ＩＬ−２はインビトロで繰り返しされた刺激サイクルの後でも、ＩＬ−２転写を回復しなかった。これは細胞溶解性Ｔｒｅｇが後成的変化を受けて、その調節活性をインビトロおよびインビボで維持することを示唆している。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１サブセットの成熟に必要であるが、その発現は必ずしも細胞がこのような系統に属するとは言えない。Ｔ−ｂｅｔによるグランザイムＢの誘導は、ＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞によって観察されている。本明細書に記載したＴｒｅｇは、それらがその抗原受容体の架橋時にＩＬ−２を増殖および／または生成できなかったという意味でアネルギー性である。興味深いことに、本アネルギー状態はＩＬ−２の添加によって克服されうる。ｐ２１ｃｉｐ１およびｐ２７ｋｉｐなどの細胞サイクル阻害薬をアップレギュレートする、転写因子Ｅｇｒ−２（Ｋｒｏｘ−２０）の高度発現が観察された。ＩＬ−２がおそらくＮＦ−ｋＢの活性化によってＥｇｒ−２媒介抑制に優先しうることが公知である。後者は、グランザイムの生成に対してＴ−ｂｅｔと相乗作用しうるグランザイム転写をアップレギュレートする。細胞がＩＬ−２添加によって刺激されるときに調節特性が失われないことに留意すべきである。詳細な実施形態において、これはＩＬ−２依存性活性化にその調節活性を与える外見的に安定な細胞サブセットである、本細胞溶解性Ｔｒｅｇの特性である。アポトーシスの誘導は、調節活性の根底にある機構である。このことはカスパーゼ３および／またはアネキシンＶ結合の活性化を示すことによって、ＡＰＣおよびバイスタンダＴ細胞の両方のレベルで示された。アポトーシスに至る２つの主要な経路が細胞溶解性Ｔｒｅｇにおいて活性化されることが示された。ＧｒＢおよびパーフォリン生成の両方がＴｒｅｇの活性化によって誘導され、ＧｒＢの転写が増加したが、グランザイムＡの転写は増加しなかった。ＧｒＢはＧｒＡに対抗して、少なくとも２つの機構、すなわちプロカスパーゼ３の直接活性化および間接活性化によってアポトーシスを誘導し、間接活性化はミトコンドリアおよびカスパーゼ９活性化によるチトクロムＣの放出によってである。ＧｒＢの特異的阻害薬は、アポトーシス誘導の著しい低下を、細胞傷害性に近い濃度においてのみ示した。ＥＧＴＡが有意な程度までアポトーシスを少しも遮断しなかったので、パーフォリンがこのような活性にとって必要か否かは疑わしい。アポトーシスが誘導されうる第２経路は、Ｆａｓ−ＦａｓＬ経路である。興味深いことに、ＦａｓＬはグランザイムと共にエキソサイトーシス顆粒中に存在して、Ｔ細胞中でのＦａｓＬ発現の主経路を構成する細胞活性化時に膜に固着する。ＦａｓＬはＦａｓを通じてシグナル伝達して、シトクロムＣのミトコンドリアからの放出を通してカスパーゼ３およびカスパーゼ９の下流活性化と共に、カスパーゼ８活性化を引き起こし、それによりＧｒＢと相乗作用する。アポトーシスの部分阻害はＦａｓＬ特異的抗体を使用して得られた。ＧｒＢおよびＦａｓＬ経路の相対的関与はＦａｓＬ発現の程度によって決定された。それゆえＦａｓの構成的高度発現を有するＷｅｈｉ細胞は、たとえば樹状細胞と比較して、Ｔｒｅｇによって容易に溶解される。２つの阻害薬の組合せが標的細胞アポトーシスを消失させなかったことを予備実験が示しているので、ＧｒＢおよびＦａｓＬの複合作用がすべての細胞溶解活性を説明するか否かは十分に確証されていない。グランザイムは、一部のＴｒｅｇによって分泌されることが公知である。それゆえグランザイムＢはヒトおよびマウスの両方で、天然Ｔｒｅｇが免疫応答を制御する機構に関与する。ＧｒＢ  ＫＯマウスは調節に欠陥を有する。しかしながら誘導されたＴｒｅｇがその調節活性を与えるためにグランザイムをどの程度まで使用するかを確証することは困難である。１つの報告は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ４６抗体によって活性化されたある割合のＴｒ様ＴｒｅｇがＧｒＢを発現することを示している。グランザイムに関するまだ解決されていない問題は、特異的で効率的な阻害薬がないことである。本発明で使用されるような（実施例１１）化学またはペプチド阻害薬は、活性となるために高い濃度を必要とした。Ｆａｓ−ＦａｓＬ経路の使用は適応Ｔｒｅｇで先に報告されておらず、天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇもＦａｓ−Ｌを機構として使用できたことを示すデータはごくわずかである。注目すべきことに、アポトーシス誘導が樹状細胞およびＢ細胞によって観察され、１次および２次免疫応答の両方が調節されうることが示唆されている。加えて、さらに複合抗原からの単一Ｔ細胞エピトープを認識するＴｒｅｇは、抗原提示細胞を除去することによってタンパク質全体に対する応答を抑制する能力を有する。これは、全アレルゲンＤｅｒ  ｐ  ２に対する応答が単一Ｔｒｅｇクローンの養子移入後に抑制されるインビボデータによって十分に示されている。本効果は、バイスタンダＴ細胞が別のＡＰＣとの相互作用によって活性化されているときでも、ＴｒｅｇとエフェクタＴ細胞との間の細胞接触が可能であるという条件で、バイスタンダＴ細胞の抑制によって強化される。興味深いことに、Ｔｒｅｇは各種の成熟段階、Ｔｈ０、Ｔｈ１またはＴｈ２においてエフェクタＴ細胞を調節しうる。重要なのは、細胞溶解性Ｔｒｅｇが標的細胞において、壊死ではなくアポトーシスを誘導することである。アポトーシス性ＡＰＣは抑制で役割を果たしうる。抗原提示細胞によって取り込まれたアポトーシス細胞が耐性を誘導するが、これに対して壊死細胞はむしろ炎症を誘導することが実際に証明されている。インビボでは、肺内での炎症のほぼ完全な抑制が、壊死の代わりに標的細胞アポトーシスの証拠として確実に見なされることが望ましい。本発明の態様は、Ｂ細胞アポトーシスがインビボでも発生するということの証明である。それゆえｐ２１−３５を発現するトランスジェニックＢ細胞、続いて対応する特異性の細胞溶解性Ｔｒｅｇを養子移入されたマウスは、脾臓で検出されたようなＢ細胞の完全な消失を示す。トランスジェニックＢ細胞が他の部位に移動したとは思えない。このような細胞の証拠は肺または肝臓で見出されなかった。ｐ２１−３５トランスジェニック細胞の機能特性は、在来のロードアッセイにおいてペプチドでインキュベートされたＢ細胞の機能特性と同じである。ここではトランスジェニックＢ細胞が細胞溶解性Ｔｒｅｇとの同時培養によって、インビトロでアポトーシスへと誘導されることが示され、ＡＰＣ細胞溶解のインビボ関連性の良好な証拠が示されている。ＩＬ−１０の考えられる関与に対して特に注意が払われた。天然Ｔｒｅｇは、全部ではないにしても大半の記載された適応Ｔｒｅｇのサブセットと同様にＩＬ−１０を生成する（Ｌｅｖｉｎｇｓら（２００２）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９，２６３−２７６）。これらのサブタイプの１つは、アレルゲンに対する呼吸による曝露の後に誘導され、Ｆｏｘｐ３、ＧＡＴＡ３を発現して、ＩＦＮ−γを発現しなかった（Ａｋｂａｒｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，１０２４−１０３２）。強いＴｈ１分極状態の間に（アジュバントとしてリステリア菌）の間に別のタイプが誘導され、Ｆｏｘ３、Ｔ−ｂｅｔを発現して、ＩＦＮ−γを生成した（Ｓｔｏｃｋら（２００４）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１１４９−１１５６）。どちらのサブセットもＩＬ−１０依存性機構による気道過敏症および炎症を阻害できた。Ｆｏｘｐ３陰性細胞傷害性ＴｒｅｇあるいはＳＴＡＴ３またはＳＰ１活性化による、ＩＬ−１０生成の証拠はなかった。アポトーシスの誘導が、トランスウェル実験で示されたような直接細胞接触を必要とする観察と、細胞溶解性Ｔｒｅｇすべてによって高レベルで生成されるＩＦＮ−ガンマによるＩＬ−１０転写の公知の抑制は、細胞傷害性Ｔｒｅｇ活性へのＩＬ−１０の著しい関与に対する証拠として解釈された。驚くべきことに、必要であったのはミョウバンなどの弱いアジュバントだけである。興味深いことに、ＣＦＡ／ＩＦＡにて行われたｍｐ２１−３５ペプチドによる免疫化は、気道炎症および過敏症を抑制するのになおさらに効果的であったが、このことは肺内への多数のＴｈ１リンパ球蓄積には不利であった。加えて、このことはＣＦＡにおける免疫化が細胞溶解性Ｔｒｅｇを誘発できなかったことを示す。システインのメチル化はＭＨＣクラスＩＩ提示を増加させたが、このことはペプチドの安定性向上およびＡＰＣによる取り込み増加に起因する。興味深いことに、Ｄｅｒ  ｐ  ２の２番目に主要なＴ細胞エピトープ、ｐ７１−８５に対して細胞溶解性Ｔｒｅｇを誘導することは可能でなかった。イソロイシン２８のアスパラギンによる置換は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合親和性を低下させ、このことは細胞溶解性Ｔｒｅｇの誘発にとって有害でないことが示された。Ｔ細胞エピトープを持つ変化を受けたペプチドは、結合親和性および／またはＴＣＲ認識のどちらかを上昇させるか、あるいは予測が困難な結果である、耐性を誘導することが報告されている。この場合において、エフェクタおよび細胞溶解性Ｔｒｅｇは同じエピトープを認識し、インビトロでｐ２１−３５によって、その野生種および変異配列のどちらかにおいて増殖されうる。
【０１６０】
本試験の興味深い態様は、細胞溶解性ＴｒｅｇがアレルゲンＤｅｒ  ｐ  ２への気道曝露時に肺に向かって移動することの証明であり、これは末梢アレルゲン感作の非存在下においてであった。Ｔリンパ球の肺への誘引に関与するケモカインは精密には同定されていない。本明細書に記載した細胞溶解性ＴｒｅｇはＣＤ１０３を発現するが、ＣＣＲ７は発現せず、このことはそれらに炎症組織へ移動する能力を付与する。ＣＣＲ５およびＣＣＲ３などの他のケモカインは検出されなかった。しかしながら細胞溶解性Ｔｒｅｇが養子移入されたマウスに１週間間隔の３回の点鼻投与を２連続した、本明細書で使用したモデル系は、アレルゲン吸入のみを受けさせた対照マウスで見られたような、肺での著しい炎症を誘発しない。末梢感作およびアレルゲン吸入を含む喘息実験モデルにおいて、Ｔｒｅｇが、気管支喘息の特徴である炎症性浸潤および気道過敏症の両方を予防および抑制する能力を有することが示された。アレルギー喘息に罹患している患者の大多数に関与している主アレルゲン、Ｄｅｒ  ｐ  ２のＬＰＳを含まない組み換え形態を使用した。並行試験では、ｐ２１−３５ペプチドがＤｅｒ  ｐ  ２に感作された患者からのＣＤ４＋エフェクタＴ細胞を活性化することが判定された。このような患者に由来するｐ２１−３５特異的Ｔ細胞クローンは、マウス細胞溶解性Ｔｒｅｇの特性に匹敵する特性を示し、これは細胞溶解性ＴｒｅｇがＤｅｒ  ｐ  ２などのアレルゲンに対する正常な免疫応答の一部として産生されることを示唆している。
【０１６１】
これらの観察は、診療所でアレルギー性喘息を治療するための本発明による細胞溶解性Ｔｒｅｇの有用性を裏付けている。細胞溶解性ＴｒｅｇはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープ提示によって活性化および容易に増殖され、臨床用途に必要とされる特異性を与える抑制性サイトカインを生成しない。加えてこのようなＴｒｅｇは、マイコバクテリウムまたはＣＦＡなどの細菌由来物質を必要とせずに、在来のアジュバント、すなわちミョウバンを使用して免疫化時に得られる。非特異的刺激薬、すなわちメタコリンに対する気道過敏症がアレルゲン感作後でさえ著しく低下したという観察が最も有望である。気道炎症および過敏症が必ずしも関連付けられていないため、このことは予想外であった。実際に、Ｄｅｒ  ｐ  ２に対する喘息モデルにおいて、２つの現象は相互から解離している。
【０１６２】
本発明はここで、制限する意図なしで与えられる次の実施例によって例証されるであろう。さらに本明細書に記載したすべての参考文献は、参照により本明細書に明示的に含まれる。
【実施例１】
【０１６３】
実施例１：Ｐ２１−３５は、チオレドキシン／グルタレドキシンコンセンサス配列を含有する。
【０１６４】
表１は、異なる生物からのタンパク質中のｐ２１−３５の断片およびＣ−Ｘ（２）−Ｓ酸化還元モチーフとの間のアミノ酸配列相同性を示す。
【０１６５】
図１は、ｐ２１−３５がインスリン還元アッセイ（比濁アッセイ）中のジスルフィド架橋を減少させる能力を示す。ここでＤＬ−ジチオスレイトールを含有するインスリン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を還元タンパク質またはペプチドまたは対照によって２５℃にて２０分間インキュベートした。次にｐＨ７における還元インスリンの沈殿による６５０ｎｍにおける光学密度の上昇（Ｙ軸）を異なる時点（Ｘ軸）にて測定した。ｐ２１−３５（Ｂ４）［配列番号：４］の組み換えテトラマーを、正の対照としての組み換えチオレドキシンと共に使用した。
【実施例２】
【０１６６】
実施例２：抗原提示細胞によるｐ２１−３５の取り込みは、サブドミナントｔ細胞エピトープの添加によって上昇する（図２）。
【０１６７】
ＷＥＨＩ  Ｂ細胞のアポトーシスの誘導は、抗原取り込みおよび提示の尺度として使用した。ペプチドｐ２１−３５特異的Ｔｒｅｇクローン（比１／１）および低下する濃度のペプチドｐ２１−３５（Ｘ軸）、または破傷風毒素からのマイナーＴエピトープに結合された同じペプチド（ｐ８３０−８４４；Ｔ−Ｂ）と混合された、ＷＥＨＩ  Ｂ細胞（２ｘ１０４個）。１８時間後、細胞を抗ＣＤ１９−ＰＥ抗体（ＷＥＨＩ細胞のマーカー）およびアポトーシスマーカーであるアネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識した。サンプルは次にフローサイトメトリで分析した。結果は、アネキシンＶに対して陽性のＷＥＨＩ細胞の割合を示している。図２に示すように、ペプチドｐ２１−３５がマイナーＴ細胞エピトープに結合されたときに、アポトーシスを誘導する能力の１００倍の上昇が観察された。
【実施例３】
【０１６８】
実施例３：チオレドキシン様コンセンサス配列に関与するアミノ酸残基は、調節特性の発現に役立つ。
【０１６９】
図３のパネルＡは、ペプチドｐ２１−３５内のチオレドキシン様配列モチーフの位置を示す。ＣＨＧＳ［配列番号：３］配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に隣接している。チオレドキシン様Ｃ−Ｘ（２）−Ｓモチーフの残基２１Ｃまたは残基Ｓ２４のアラニン置換は、Ｔｒｅｇクローンの増殖（３Ｈ−チミジン取り込み）によって測定されたようにＴ細胞エピトープ認識を損なわず、図３のパネルＢに示されている。増殖は、ペプチド６μＭを用いて３７℃にて１時間インキュベートしたＷＥＨＩ細胞５ｘ１０４個を使用して実施した。細胞を次に洗浄して、Ｔ細胞５ｘ１０４個と共に４日間同時培養した。培養終了の２４時間前に３Ｈ−チミジンを添加した。繊維ガラスフィルタに吸着させた細胞で放射能をカウントした。残基２１および２４の置換は、実施例２に記載したように実施したアポトーシス誘導アッセイ（図３のパネル２を参照）においてＴｒｅｇクローンが抗原提示細胞を溶解させる能力を無効にする。
【実施例４】
【０１７０】
実施例４：マウスへのＴ−Ｂｂ注射時の、生理学的特性を備えたＴｒｅｇの産生。
ペプチドＴ−ＢがＤｅｒ  ｐ  ２誘導喘息を予防する能力を次のように評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹の群（図４でＴｂａｌｕｍとして示す）に、ミョウバンに吸着させたＴ−Ｂペプチドを用いて２週間間隔で実施された３回の足踵注射（注射１回当たり２０μｇ）を行った。最後の注射の２週間後、すべてのマウスに、ミョウバン吸着全長ｒＤｅｒ
ｐ  ２（注射１回当たり４０μｇ）の２週間間隔での腹腔内注射３回、続いて生理食塩水中ｒＤｅｒ  ｐ  ２の点鼻投与（投与１回当たりＰＢＳ  ５０μｌ中ｒＤｅｒ  ｐ  ２
１００μｇ）を行った。結果は、ｒＤｅｒ  ｐ  ２によって処理されたが、ペプチド注射は投与されなかったマウスの群（図４で「Ｄｅｒ  ｐ  ２モデル」として示されている）との比較によって評価した。図は、ペプチドを用いた予備免疫がメタコリンの濃度上昇に対する反応性によって判定されたサイトスピン（図４、パネルＡ）、肺組織診断スコア（図４、パネルＢ）および気道過敏症（図４、パネルＣ）にて評価されたＢＡＬ細胞カウントを著しく減少させることを示している。
【実施例５】
【０１７１】
実施例５：同種Ｔｒｅｇ細胞の酸化代謝に対するＰ２１−３５の効果。
Ｐ２１−３５に特異的なＴｒｅｇクローン（細胞１０５個）を、ＰＢＳ（図５、パネルＡ）、ペプチドｐ２１−３５（ＰＢＳ  ２００μｌ中２０μｇ／ｍｌ；図５、パネルＢ）または反応性酸素種（ＲＯＳ）の誘導物質であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＰＢＳ中１００μＭ；図５、パネルＣ）によって９０分間インキュベートした。次に細胞を、生細胞中のＲＯＳ用の蛍光発生マーカーであるカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（１２μＭ）によって３０分間標識して、次にフローサイトメトリによって分析した。図は、ペプチドｐ２１−３５が同種Ｔｒｅｇ細胞の酸化代謝を刺激して、ＲＯＳの増加による蛍光強度の倍加を誘発することを示す。
【実施例６】
【０１７２】
実施例６：ＴＲＥＧ細胞クローンが抗原提示細胞に対する細胞傷害特性を示す。
Ｔｒｅｇ系統（Ｇ１２１）の細胞傷害特性を、抗原提示細胞として使用されるＷＥＨＩ
Ｂ細胞系に対して試験した。図６は、細胞傷害性細胞系のみ（ＷＥＨＩ（細胞１０４個）＋Ｔ細胞（細胞１０４個））、ｐ２１−３５ペプチドの添加を伴うＴ細胞系（ＷＥＨＩ＋Ｔ細胞＋ｐ２１）、またはｐ２１−３５ペプチドが予備ロードされたＷＥＨＩ細胞（ＷＥＨＩｐ２１＋Ｔ細胞）の存在下での、１４時間にわたって溶解された細胞の％を示す。ＷＥＨＩ細胞の溶解は、ＪＡＭアッセイ（ＤＮＡ断片化の定量的アッセイ）を使用して測定した。ＷＥＨＩ細胞１０４個は、３Ｈ−チミジン（４．５μＣｕ／ｍｌ、１ｍｌ）を用いて３７℃にて１０時間予備インキュベートして、次に洗浄してＴｒｅｇ系統と同時培養した。上清中での３Ｈ−チミジンの放出は、ＷＥＨＩ細胞溶解の尺度として解釈した。データは、Ｔ細胞系を活性化するためにペプチドの存在が必要とされることを示している。
【実施例７】
【０１７３】
実施例７：ＴＲＥＧ細胞クローンは、同じ抗原上の別のエピトープに対して特異的な、または別の抗原に対して特異的なＴ細胞の活性化を細胞傷害性によって抑制する（図７）。
【０１７４】
Ｄｅｒ  ｐ  ２とは無関係のアレルゲンである、Ｄｅｒ  ｐ  １に対して特異的な、またはＤｅｒ  ｐ  ２に位置する代替的なメジャーＴ細胞エピトープ（ｐ７１−８５）に対して特異的なＴ細胞系（ＴＣＬ；細胞１０５個）をＣＦＳＥ（細胞質タンパク質の標識であり、細胞分裂するたびに５０％まで低下する染色強度に基づいて、細胞分裂回数を評価できるようにする）によって標識した（１２．５ナノＭ）（図７）。このようなＣＦＳＥ標識Ｄｅｒ  ｐ  １特異的ＴＣＬ（パネルＡおよびＢ）またはｐ７１−８５ＴＣＬ（パネルＣおよびＤ）の増殖を、細胞毒性Ｔｒｅｇクローン（比１／１）によるインキュベーションの前（パネルＡおよびＣ）または後（パネルＢおよびＤ）に測定した。抗原提示細胞には、特異的アレルゲン（Ｄｅｒ  ｐ  １またはＤｅｒ  ｐ  ２；それぞれの場合で１０μｇ／ｍｌを含有する、０．５ｍｌ）およびペプチド２１−３５（１０μｇ／ｍｌを含有する、０．５ｍｌ）の両方を予備ロードした。インキュベーションの７２時間後、細胞を採取して、ヨウ化プロピジウムで染色して、フローサイトメータで分析した。図のパートＢおよびＤのヒストグラムおよびパーセンテージは、残存する生ＣＦＳＥ陽性細胞の割合を表す（生細胞は、ヨウ化プロピジウム陰性であることによって区別された）。図は、ペプチド２１−３５に対して特異的な細胞傷害性Ｔｒｅｇクローンが、２つのバイスタンダＴ細胞それぞれの増殖（ＣＦＳＥ分割）を大きく低減させたことを示している。ＣＦＳＥ染色細胞の大半は、アポトーシスマーカーのヨウ化プロピジウムに陽性となり、バイスタンダＴ細胞がアッセイにて死滅したことが示された。
【実施例８】
【０１７５】
実施例８：Ｔｒｅｇ細胞の表現型プロフィールの判定。
図８は、実施例４のようなペプチドＴ−Ｂ組成物によって処理したマウスに由来する、４つのｐ２１−３５特異的Ｔｒｅｇクローンのサイトカイン生成を示す（左パネル）。細胞培養物の上清は、抗原提示細胞（未処理マウスからの照射脾臓細胞１０５個）およびペプチドｐ２１−３５（２μｇ／ｍｌ、２００μｌ）による刺激の４日後にサイトカイン含有量について分析した。Ｔｒｅｇクローンは主にＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−Ｇ）と、ごく微量のＴＮＦ−α（ＴＮＦ−ａ）およびＩＬ−１０を生成した。右パネルは、このようなＴｒｅｇ細胞のｍ−ＲＮＡ分析を示す。転写抑制因子Ｆｏｘｐ３の転写物は検出されなかったが、Ｔ−ｂｅｔ、グランザイムＡおよびグランザイムＢは強い転写レベルを示した。
【０１７６】
図９は、蛍光励起細胞分取（Ｆａｃｓ）による静止時の２１−３５ペプチド特異的Ｔ細胞クローンの各種遺伝子の発現レベルを示す。表４には、４つの異なるクローン（Ｔ１〜Ｔ４）（細胞２ｘ１０５個）の平均蛍光強度が与えられている。高レベルのＣＤ２５、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ１０３および細胞内ＣＴＬＡ−４が観察された。ＣＤ２８は無発現であるか、不十分に発現された。ＣＤ６２−ＬおよびＣＤ４５ＲＢは低レベルで発現された。すべての抗体はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＮＪ、ＵＳＡ）からであった。
【０１７７】
【表３】
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【実施例９】
【０１７８】
実施例９：細胞傷害特性を備えたＴｒｅｇ細胞は、グルタレドキシン様コンセンサス配列に結合されたアレルゲンＤｅｒ  ｐ  １のドミナントＴ細胞エピトープより成るペプチドを用いた免疫化によって誘発される（図１０）。
【０１７９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ  ｐ１１４−１２８［配列番号：５］によって認識されたアレルゲンＤｅｒ  ｐ  １のドミナントＴ細胞エピトープは、大腸菌ｋ１２からのグルタレドキシン様コンセンサス配列を持つ配列ＣＧＦＳ（モチーフ配列［配列番号：６］）に従って合成された。後者は、Ｔ細胞エピトープのアミノ末端に付加された（ｓ１１４をＰ１とする）。
【０１８０】
全ペプチドは配列ＣＧＦＳＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ［配列番号：７］を有する。グルタレドキシン様コンセンサス配列［配列番号：５］を含まないＤｅｒ  ｐ  １  Ｔ細胞エピトープを含有する配列を対照として使用した。
【０１８１】
Ｔ細胞エピトープを晩期エンドソームにターゲティングするために、どちらのペプチドもリンカー配列ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ［配列番号：８］によって配列のアミノ末端にて、ｇｐ７５タンパク質の膜貫通ドメインおよび切断サイトゾル側末端に相当する配列ＩＩＴＩＡＶＶＡＡＬＬＬＶＡＡＩＦＧＶＡＳＣＬＩ  ＲＳＲＳＴＫＮＥＡＮＱＰＬＬＴＤＳ［配列番号：９］のアミノ末端に結合される（ジロイシンベースモチーフには下線が付けてある）。
【０１８２】
ターゲティング配列、リンカー、モチーフおよびエピトープ配列を含むペプチドの全配列は：
ＣＧＦＳ  ＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ  ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ
ＩＩＴＩＡＶＶＡＡＬＬＬＶＡＡＩＦＧＶＡＳＣＬＩＲＳＲＳＴＫＮＥＡＮＱＰＬＬＴＤＳ  ［配列番号：１０］であるが、これに対して配列ＣＧＦＳ［配列番号：６］を含まない対照ペプチドは配列：
ＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ  ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ ＩＩＴＩＡＶＶＡＡＬＬＬＶＡＡＩＦＧＶＡＳＣＬＩＲＳＲＳＴＫＮＥＡＮＱＰＬＬＴＤＳ［配列番号：１１］を有する。
【０１８３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を実験用ペプチド［配列番号：１０］または水酸化アルミニウムに吸着された対照ペプチド［配列番号：１１］によって皮下的に免疫化した（２０μｇ）。２週間間隔で３回の注射を実施した。最後の免疫化の１０日後に、マウスを屠殺処分して、磁気ビーズを用いて脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。次にＣＤ４＋Ｔ細胞（細胞２ｘ１０６個）をインビトロで、抗原提示細胞として作用する接着脾臓細胞によって提示されたＤｅｒ  ｐ  １  Ｔ細胞エピトープ（２０μｇ）によって刺激した。
【０１８４】
刺激の１０日後に、各群で得た特異的Ｔ細胞系の数を限界希釈分析によって計算した。各細胞系は、実施例６に記載したように、ＭＨＣクラスＩＩ決定基による抗原提示におけるその有効性のために選択されたＢ細胞系であるＷＥＨＩ細胞を溶解させるその能力について評価した。グルタレドキシンコンセンサス配列を含有するペプチドによって免疫化された動物より得た細胞のみがＷＥＨＩ細胞を溶解させる能力を獲得して、溶解は同種Ｄｅｒ  ｐ  １  Ｔ細胞エピトープの存在下でのみ起こる。
【０１８５】
図１０は、Ｔｒｅｇ特性を備えたＴ細胞クローンが、対照ペプチドを投与されたマウスからではなく、グルタレドキシン様酸化還元モチーフおよびｇｐ７５に結合されたＤｅｒ
ｐ  １エピトープより成る構築物を投与されたマウスからだけ由来しうることを示す。構築物による処理後に得られ、インビトロで再刺激されたすべてのＴ細胞クローンは細胞傷害性であった。
【実施例１０】
【０１８６】
実施例１０：多発性硬化症のインビボモデルにおけるＭＯＧタンパク質のドミナントＴ細胞エピトープの使用。
【０１８７】
多発性硬化症は、ＭＯＧタンパク質のアミノ酸残基３７−５２に相当する、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：１２］による免疫化によって実験モデル内で誘導されうる。本ペプチドは、ドミナントＴ細胞エピトープを含有する。Ｐ１位置、すなわちＭＨＣクラスＩＩ溝内に固着された第１アミノ酸は、Ｙ４０である（Ｐ１−Ｐ９配列には下線が付いている）。ペプチドのアミノ末端のアミノ酸３個は、ヒトチオレドキシン配列、残基２１〜２４）に相当する配列ＣＧＰＳ［配列番号：１３］によって置換され、ペプチドＣＧＰＳＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：１４］を生じる。Ｔ細胞エピトープを晩期エンドソームにターゲティングするために、実験ペプチド［配列番号：１４］および対照ペプチド［配列番号：１２］は、リンカー配列ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ［配列番号：８］によって、ＨＬＡ−ＤＭβタンパク質の膜貫通ドメインおよび切断サイトゾル側末端に相当する配列ＶＳＶＳＡＶＴＬＧＬＧＬＩＩＦＳＬＧＶＩＳＷＲＲＡＧＨＳＳＹＴＰＬＰＧＳＮＹＳＥＧＷＨＩＳ［配列番号：１５］のアミノ末端にて結合される（チロシンベースモチーフには下線が付けてある）。
【０１８８】
ターゲティングされたペプチドの配列は：
ＶＳＶＳＡＶＴＬＧＬＧＬＩＩＦＳＬＧＶＩＳＷＲＲＡＧＨＳＳＹＴＰＬＰＧＳＮＹＳＥＧＷＨＩＳ  ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ  ＣＧＰＳ  ＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：１６］および
ＶＳＶＳＡＶＴＬＧＬＧＬＩＩＦＳＬＧＶＩＳＷＲＲＡＧＨＳＳＹＴＰＬＰＧＳＮＹＳＥＧＷＨＩＳ  ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ  ＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：１７］である。
【０１８９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群は、多発性硬化症様症候群を誘導することになっているプロトコルの後に、ＣＤ４＋ＭＯＧ特異的エフェクタＴ細胞クローンが養子移入される。これは完全フロイントアジュバント中のＭＯＧペプチドの投与および百日咳毒素の注射２回を含む。本プロトコルはエフェクタＴ細胞クローンの増殖を誘発し、これはＭＯＧペプチド投与後１２日以内に多発性硬化症と一致する徴候の発症を引き起こす。
【０１９０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの第２の群は、ＭＯＧ特異的調節Ｔ細胞クローン（上記のペプチド［配列番号：１６および１７］を使用して得た）が最初に養子移入され、１日後に疾患誘導の完全プロトコルが続く。
【０１９１】
細胞溶解性Ｔ細胞クローンによって予備処理されたマウスが発生させた臨床スコアは、エフェクタＴ細胞クローンのみを投与されたマウスと比較して著しく低下することが観察される。
物質および材料
マウス。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを組織内施設より入手した。インビボ試験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｕｖｅｎの倫理委員会によって承認された。
【０１９２】
試薬。ヤケヒョウダニグループ２アレルゲン（Ｄｅｒ  ｐ  ２）Ｄｅｒ  ｐ  １および破傷風トキソイドに由来するペプチドを合成した（純度、＞８５％）。配列は：ｐ２１−３５、ＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ［配列番号：２］；ｐ１１４−１２８（Ｄｅｒ  ｐ  １からのアミノ酸１１４−１２８）、ＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ  ［配列番号：５］；ｐ８３０（破傷風トキソイドからのアミノ酸８３０−８４４）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ［配列番号：１８］；ｍｐ２１−３５  ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ［配列番号：１９］；ｍｐ２１−３５Ａｓｎ  ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧＣＨＧＳＥＰＣＮＩＨＲＧＫＰＦ［配列番号：２０］である。組み換え全長Ｄｅｒ  ｐ  ２はピキア・パストリス中で産生された。
【０１９３】
アレルゲン感作。動物は第１日目、第１４日目および第２８日目に、ＡＬ（ＯＨ）３  ６ｍｇに吸収された組み換えアレルゲン４０μｇの腹腔内注射によって感作された。第４３日目、第４４日目および第４５日目に、マウスを点鼻投与によって生理食塩水５０μｌ中のアレルゲン１００μｇに曝露し、全身プレチスモグラフによる第１回の肺機能測定を続けた。第５０日目、第５１日目および第５２日目には第２シリーズの点鼻投与を実施して、全身プレチスモグラフによる肺機能の判定を続けた。
【０１９４】
細胞精製。ペプチド免疫化後に脾臓ＣＤ４  Ｔ細胞を得た。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配精製（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）の後、それらはＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）およびＬＳ分離カラムを使用して陰性選択によって濃縮した。脾臓樹状細胞は、ＬＳ分離カラムでＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して陽性選択した。それらを５μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）によって５時間刺激して、次に洗浄し、ＣＯ２インキュベータ内で１８時間保管した；生細胞は死細胞およびアポトーシス細胞を、ＬＳカラム上のアネキシンＶマイクロビーズおよびＭｉｄｉＭａｃｓ（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃより）によって除去することによって回収した。
【０１９５】
Ｂリンパ球は未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞から、ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して陽性選択によって調製した。抗原提示細胞として、脾臓細胞をＬＤ除去カラム上のＣＤ９０マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＴ細胞から除去した。一部のアッセイにおいて、脾臓接着細胞は脾臓細胞を培地中で３７℃にて２時間インキュベートすることによって調製した。非接着細胞を除去して、残存する細胞をアッセイのために回収した。
【０１９６】
肺リンパ球は、先に記載されたように（Ａｂｒａｈａｍら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，２１１７−２１２２）、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）消化およびＰｅｒｃｏｌｌ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）遠心分離によって調製した。
【０１９７】
細胞培養。樹状細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を５％  ＦＣＳ、５０μＭ  ２−ＭＥ、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。Ｗｅｈｉ２３１細胞は欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）より購入した。
【０１９８】
エフェクタＴ細胞クローンＧ２２１Ｎは、ペプチドｐ２１−３５に対して特異的である。
【０１９９】
Ｇ１２１、Ｒ３ＴＢ７、Ｔ１およびＴ３は、本試験にて試験される細胞溶解性Ｔ細胞クローンを同定する（実施例１１において）。
【０２００】
ペプチド処理アッセイ。増殖アッセイで試験されたペプチドｐ２１−３５に特異的なエフェクタＴ細胞クローンであるＧ２２１Ｎは、ＡＰＣとして使用される脾臓接着細胞である。それらを０．２μＭロイペプチン、０．１ｍＭクロロキン、６０μＭコルヒチンのいずれかで予備処理するか、未処理のまま３０分間放置した。ＰＢＳによる３回の洗浄の後、ＡＰＣにペプチドｐ２１−３５、ｍｐ２１−３５またはＤｅｒ  ｐ  ２を３７℃にて１時間ロードした。それらを次に培地で２回洗浄して、Ｇ２２１Ｎクローン（それぞれ１０５個）に７２時間にわたって添加した。エンドサイトーシスを遮断するために、ＡＰＣもＮａＮ３／デオキシグルコース（それぞれ２ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ）でペプチドを用いたインキュベーション時間全体にわたって処理して、冷ＰＢＳによる洗浄を３回続けた。
増殖は、最後の１８時間の間に〔３Ｈ〕チミジン（ＩＣＮ）１μＣｉ／ウェルの添加によってアッセイした。細胞を採取して、包含された同位体をカウントした（ｃｐｍ）。データは、ペプチドロードＡＰＣによって刺激されたＧ２２１Ｎ  Ｔ細胞について得られたｃｍｐを未ロードＡＰＣによって得られた値で除算することによって計算された刺激指数として表された。
【０２０１】
調節Ｔ細胞クローンの誘導体化。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２週間間隔の、ミョウバン中の２０μｇ／ｍｌペプチドｍｐ２１−３５Ａｓｎの足踵注射３回によって免疫化した。最後の注射の１０日後、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ペプチドｍｐ２１−３５Ａｓｎの存在下で、未処理マウスからのＴ細胞除去脾臓細胞によって刺激した。１０日後、細胞を同じ条件で、しかし１０Ｕ／ｍｌマウスＩＩ−２（Ｒｏｃｈｅ）を用いて再刺激した。５回目の再刺激の後、Ｔ細胞を１０Ｕ／ｍｌＩＬ−２の存在下で限界希釈によってサブクローニングした。次の特異的刺激は、２０Ｕ／ｍｌマウスＩＬ−２の存在下で実施した。Ｇ１２１  Ｔ細胞系は上述のように誘導した（Ｊａｎｓｓｅｎｓら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，４６０４−４６１２。）
ＦＡＣＳ分析。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を分析フローサイトメトリに使用して、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによって分析した。最後の再刺激の１０日後、Ｔ細胞をＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ６２−Ｌ、ＣＤ１０３、ＣＤ４５ＲＢ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ１１ｃ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＧＩＴＲ、Ｆｏｘｐ３、Ｇｒａｎｚｙｍｅ−Ｂ、Ｔ−ｂｅｔ（４Ｂ１０）、パーフォリン、ＣＤ１２７、およびＶｂ８．１  ＴＣＲ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体によって染色した。
【０２０２】
バイスタンダ抑制アッセイ。標的ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＴヘルパークローンを３７℃のＰＢＳ中で１２５ｎＭ  ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって１５分間標識した。３０％ＦＢＳを含有するＰＢＳによって細胞を洗浄することによって、反応を停止させた。これらの細胞（３ｘ１０５個）を１０５個の細胞傷害性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンおよびＴ細胞除去脾臓細胞と共に１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて同時培養した。Ｔヘルパークローンの抑制のために、細胞１０５個を同じ数の細胞傷害性細胞およびＴ細胞除去脾臓細胞と共に同時培養した。４８時間または７２時間後に、細胞を収集して、フローサイトメトリによって分析した。
【０２０３】
一部の培養では、ＦＡＳ−Ｌ、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３に対する遮断抗体を１０μｇ／ｍｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて使用した。トランスウェルアッセイを２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。
【０２０４】
アポトーシス検出。アネキシンＶ−ＦＩＴＣまたは−ＰＥを使用して、Ｂ細胞、樹状細胞およびＴ細胞における細胞死を検出した（アネキシンＶ検出キット、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。一部の実験において、アポトーシスは、製造者の説明書に従った、ＦＩＴＣ−またはＰＥ−標識抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた活性化カスパーゼ−３の細胞内検出によって、またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた核標識によって測定した。
【０２０５】
ＧＺ−Ｂ活性の阻害には、指示された濃度でＺ−ＡＡＤ−ＣＭＫ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩＣ）（ＳＩＧＭＡ）を全同時培養期間中に添加した。
【０２０６】
サイトカイン検出。Ｔｒｅｇ細胞１００万個を照射Ｔ細胞除去脾臓細胞３００万個によって７２時間にわたって再刺激した。各種のサイトカインの存在について上清を判定した。ＩＬ−１０およびＩＬ−１３は、ＯｐｔＥＩＡマウスＥｌｉｓａキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１３は、ＤｕｏＳｅｔ抗マウスＴＧＦ−ｂ１またはＤｕｏＳｅｔ抗マウスＩＬ−１３アッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってそれぞれ評価した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α生成は、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリによって分析した。
ポリクローナルＣＤ４＋細胞刺激のために、細胞１０６個を照射Ｔ細胞除去脾臓細胞（未処理マウスより）５ｘ１０５個および１０μｇ／ｍｌ  Ｄｅｒ  ｐ  ２で７２時間刺激した。
【０２０７】
ポリクローナルＣＤ４＋細胞増殖。ペプチド処理マウスからの脾臓ＣＤ４細胞１０５個をＴ細胞除去脾臓細胞１０５個および１０μｇ／ｍｌ  ｍｐ２１−３５、５μｇ／ｍｌペプチドｐ８３０または１０μｇ／ｍｌ  Ｄｅｒ  ｐ  ２によって刺激した。（３Ｈ）−チミジン取り込みをすでに記載したようにアッセイした。結果は、個別に３通り試験されたマウス６匹からの平均アイソトープカウント（ｃｐｍ）±標準誤差として示す。
【０２０８】
気道過敏性。気道過敏性（ＡＨＲ）は、公開された方法（Ｈａｍｅｌｍａｎｎら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５６，７６６−７７５）に従って、全身プレチスモグラフ（ＥＭＫＡ）を使用して、拘束されていないマウスで測定した。ピーク向上休止（ｐｅａｋ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ（ＰｅｎＨ））を気管支収縮のパラメータとして使用した。動物を、用量を増加したエアゾール化メタコリン（１０〜１００ｍｇ／ｍｌ）に１分間曝露し、３分間の休止が続き、その間に呼吸パラメータを評価した。ＰｅｎＨ値は、各メタコリン曝露後の３分間の期間にわたって３０秒ごとに実施した測定の平均として表した。肺コンプライアンスは、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔシステム（Ｓｃｉｒｅｑ）によって測定した。
【０２０９】
気管支肺胞洗浄液収集（ＢＡＬＦ）。メタコリンチャレンジの３日後、マウスを屠殺処分して、気管を分離し、カニューレを挿入した。ＢＡＬＦは、５％ＢＳＡ（サイトカイン検出のために使用）を含有する生理食塩水１ｍｌ、次に続いて生理食塩水１ｍｌｘ２によって洗浄して収集した。細胞カウントが確証された。１４００ｒｐｍで６分間の遠心分離によってサイトスピンを調製して、染色した（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ法）。細胞同定のために３つの別のフィールドにおいて細胞１００個をカウントした。
【０２１０】
肺組織診断。肺は、４％ホルムアルデヒドによって固定して、脱水し、切片作製（７μｍ厚スライド）のためにパラフィン包埋して、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。好酸球はＭａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色によって検出した。気道粘膜における杯細胞は、過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）によって同定した。ＰＡＳ陽性細胞をカウントして、全上皮細胞のパーセンテージとして表した。各マウスについて、中央気管支からはもちろんのこと、細気管支からの各肺切片より５フィールドを検査した。好酸球およびリンパ球浸潤の密度を次のように等級付けした：非存在：０；低いが組織的ではない：１；低い：２；低い〜中程度：３；中程度：４；中程度〜高い：５；高い：６。
【０２１１】
スライドをすべて、マウスが属した群を知らない病理学者を含む２名が検査した。
移入Ｔ細胞の分析では、肺をパラホルムアルデヒドで固定して、２０％スクロースを用いて一晩凍結保護して、ＯＣＴ培地中で急速凍結した。クリオスタット切片（９μｍ）を切断して、アセトン中で固定し、アンチフェード試薬（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をマウントして、共焦点顕微鏡法によって分析した。分析は、３ＣＣＤビデオカメラ（ＤＸＣ−９３ＯＰ、Ｓｏｎｙ）に接続されたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２、およびＫＳ３００ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）で実施した。
【０２１２】
Ｂリンパ球におけるペプチドの標的化発現。腫瘍レトロウイルスｐＭＮＤ−ＳＮベクターはＵＳＣのＤ．Ｋｏｈｎ博士より入手した。リンカーＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ［配列番号：８］によって連結されたｐ２１−３５（Ｄｅｒ  ｐ  ２のアミノ酸２１〜３５）およびｇｐ７５のカルボキシ末端（アミノ酸４８８〜５３９）を含有する融合構築物をＰＣＲによって作製して、ｐＭＮＤベクター内にクローニングした。先に記載されたように、生じたベクターｐＭＮＤ−ｐ２１ｇｐ７５をウイルスタンパク質をコードするベクターと併せて用いて２９３Ｔ細胞を一過性形質移入して、腫瘍レトロウイルス生成細胞を得た（Ｊａｎｓｓｅｎｓ  Ｗ．ら、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １４，２６３−２７６（２００３））。５０μｇ／ｍｌ細菌ＬＰＳによって２４時間予備活性化させた脾臓Ｂ細胞を、ポリブレン（６μｇ／ｍｌ）およびＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、濾過したウイルス含有上清と同時培養した。次に、未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスへの養子移入前に、Ｂ細胞を徹底的に洗浄した。
【０２１３】
ｍＲＮＡの分析。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を先に記載されたように実施した（Ｊａｎｓｓｅｎｓ  Ｗ．ら（２００３），Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １４，２６３−２７６。）Ｔ細胞では、細胞１０６個を再刺激後、第１２日目に分析した。プライマー配列は：グランザイムＡ、（フォワード）５’ｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃｃｇｇｇｇｃｃａｔｃ  ３’［配列番号：２１］および（リバース）５’ｔａｔｇｔａｇｔｇａｇｃｃｃｃａａｇａａ  ３’［配列番号：２２］；グランザイムＢの場合、（フォワード）５’ｃｔｃｃａｃｇｔｇｃｔｔｔｃａｃｃａａａ
３’［配列番号：２３］および（リバース）５’ｇｇａａａａｔａｇｔａｃａｇａｇａｇｇｃａ  ３’［配列番号：２４］；β−アクチンの場合、（フォワード）５’ｃａｔｔｇｔｇａｔｇｇａｃｔｃｃｇｇａｇａｃｇｇ  ３’［配列番号：２５］および（リバース）５’ｃａｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｇａａｇｔｃｔａｇａｇｃ  ３’［配列番号：２６］。アニーリング温度は、２７サイクルにわたって５５℃であった。
【０２１４】
インビボでの形質導入Ｂ細胞の検出。ｐＭＮＤ−ｐ２１ｇｐ７５形質導入Ｂ細胞と、続くＴ細胞クローン移入を受けたマウスを屠殺処分して、脾臓Ｂ細胞をＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって精製した。全ＲＮＡ５μｇをｃＤＮＡ調製のために逆転写した。ＰＣＲはｃＤＮＡに対して、レトロウイルスベクター特異的プライマー（フォワード）５’ｃｃｃｔｔｔａｔｃｃａｇｃｃｃｔｃａｃｔｃ  ３’［配列番号：２７］および（リバース）５’ｃｃｔｇｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｃａｃｃｃ  ３’［配列番号：２８］を使用して実施した。アニーリング温度は、２８サイクルにわたって５６℃であった。
【０２１５】
統計分析。平均間の差を評価するために、非パラメトリックアッセイを使用した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）。気管過敏性を判定するために、曲線下面積を計算して、差をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって評価した。
【実施例１１】
【０２１６】
実施例１１：インビボ誘導細胞溶解性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞は実験的喘息を予防および抑制する。インビボでの抗原特異的調節Ｔ細胞の誘発
第１の細胞溶解性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞クローン（Ｇ１２１）は、アレルゲンＤｅｒ  ｐ  ２のメジャーＴ細胞エピトープを含む合成ペプチドｐ２１−３５で免疫化されたマウスより得た。このような細胞溶解性Ｔ細胞の頻度は、同じ特異性のＣＤ４＋エフェクタ細胞の頻度と比較すると、極めて低かった。ミョウバンなどの代わりのアジュバントを使用して、同じ特性を備えたＴ細胞を得る試みは、成功しなかった。
【０２１７】
これは、たとえば迅速な分解および／または不十分な晩期エンドソーム取り込みによる不十分なペプチド提示のためでありうる。Ｇ１２１調節Ｔ細胞クローンによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用されるＢ細胞系（Ｗｅｈｉ細胞）のアポトーシスを誘導する、ペプチドの各種の形のインビトロでの能力を試験した。２つのシステインのメチル化は、ペプチドの安定化（ｐ２１−３５ｍｅｔ）を向上させうる。あるいは公知のサブドミナントＴ細胞エピトープを持つペプチドにｐ２１−３５を結合させることは、晩期エンドソーム取り込みを向上させうる。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、破傷風トキソイドのアミノ酸残基８３０〜８４４を含む配列は、このようなマイナーエピトープ（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ、［配列番号：１８］）を表す。したがってグリシン２個によってｐ２１−３５に結合された破傷風トキソイドのアミノ酸８３０〜８４４を含む合成ペプチドが生成され（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬＧＧＣＨＧＳＥＰＣＮＩＨＲＧＫＰＦ、［配列番号：２０］）、安定性の理由でシステイン２個もメチル化された（修飾ペプチド、ｍｐ２１−３５）。ｍｐ２１−３５は、Ｇ１２１  Ｔｒｅｇの存在下でＷｅｈｉ細胞アポトーシスを誘導するのに、ｐ２１−３５と比較して１００倍効果的である（図１１ａ）。ｐ２１−３５（ｐ２１−３５ｍｅｔ）のシステイン残基２個のメチル化も、ＭＨＣクラスＩＩ提示を向上させ、この安定化されたペプチドはｍｐ２１−３５と同じくらい効果的であった。ｍｐ２１−３５の構成要素２個の順序を逆転させることによって作製した対照ペプチドは、ＷＥＨＩ細胞アポトーシスの誘導において不十分であった。
【０２１８】
ｐ２１−３５のメチル化形態（ｐ２１−３５ｍｅｔ）または結合された変形（ｍｐ２１−３５）を、細胞溶解性Ｔ細胞の十分なインビボ誘発に関して試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスをミョウバン中のＤｅｒ  ｐ  ２によって免疫化して、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ再刺激は、Ｄｅｒ  ｐ  ２が刺激に使用されたときには強い増殖を示したが、ｐ２１−３５提示にはわずかな応答を示した（図１１ｂ：生理食塩水対照群）。次に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの予備免疫化によってｍｐ２１−３５がＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を防止する能力を、ｍｐ２１−３５またはｐ８３０−８４４およびｐ２１−３５ｍｅｔ、すなわちｍｐ２１−３５の２つのペプチド構成要素の混合物のどちらかによって試験した。これには、上のようにミョウバン中のＤｅｒ  ｐ  ２の腹腔内投与が続いた。Ｄｅｒ  ｐ  ２誘導増殖の著しい低下は、ｍｐ２１−３５が予備免疫化に使用されたときにのみ観察された（図１１ｂ）。Ｄｅｒ  ｐ  ２で刺激されたＣＤ４＋脾臓細胞によって作製されたサイトカインの生成は対照群と、２つの独立したペプチド構成要素によって予備免疫化した群とで同じであり（図１１ｃ）、Ｔｈ２様応答を示した。ｍｐ２１−３５で予備処理した群において、サイトカイン生成は検出できない濃度まで低下した。
【０２１９】
注目すべきことに、ｍｐ２１−３５またはペプチドの混合物のどちらかによって予備処理されたマウスから得たＣＤ４＋脾臓細胞のインビトロ刺激は、ｐ８３０−８４４に対する増殖（図１１ｂ）、またはサイトカイン生成を誘発せず、破傷風トキソイド由来のペプチドがＴｒｅｇの産生を妨害しなかったことを示す。
【０２２０】
ｍｐ２１−３５は、各種の阻害薬の存在下でのｐ２１−３５エフェクタＴ細胞（Ｇ２２１Ｎ）の活性化を判定することによって示されるように（図１１ｄ）、効果的な提示のために処理される必要があった。このことは、ｐ２１−３５ｍｅｔ、ｍｐ２１−３５およびＤｅｒ  ｐ  ２が抗原提示細胞への内部移行（ＮａＮ３／デオキシグルコースによって阻害）、晩期エンドソームとの融合および晩期エンドソームの酸性化（それぞれコルヒチンおよびクロロキノンによって阻害）を必要としたことを示す。ロイペプチン、セリン／システインプロテアーゼ阻害薬の添加による阻害が存在しないことによって示されるように、ＭＨＣクラスＩＩ分子がアミノ酸１５個までの配列を収容する能力を反映して、ペプチド処理はｐ２１−３５ｍｅｔには不要であった。
【０２２１】
まとめて考えると、これらのデータは、ｍｐ２１−３５が、その２つの構成要素の混合物とは対照的にインビボで効率的に処理されたことと、ｍｐ２１−３５による予備免疫がアレルゲン特異的Ｔ細胞活性化を予防したこととを示している。調節がＴ細胞エピトープの類似物質によってより容易に達成されうることを示すという発見に基づいて、腹腔内免疫化後に各種の単一アミノ酸ｐ２１−３５変異体がＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発する能力をミョウバン中で判定した。詳細には、Ｐ４  ＭＨＣクラスＩＩアンカー残基に相当する公知の位置であるｌｌｅ２８Ａｓｎ変形のある変異ペプチドは、Ｔ細胞増殖を誘導する能力のごくわずかな低下を示した。したがってｍｐ２１−３５（ｍｐ２１−３５Ａｓｎ）の変異形を本実施例の残りの実験で使用した。
【０２２２】
Ｔｒｅｇクローンの誘導体化および表現型特徴付け
表現型分析のためのＴ細胞クローンは、ミョウバン中のｍｐ２１−３５Ａｓｎ、ＣＦＡ／ＩＦＡ（完全または不完全フロイントアジュバント）中のｍｐ２１−３５Ａｓｎ、Ｄｅｒ  ｐ  ２または対照としての生理食塩水のいずれかを注射されたマウスの脾臓に由来した。合計１７個のクローンが得られ、その増殖はＩＬ−２の添加に完全に依存していた。これらのクローンはＣＤ２５の発現を判定する前に、１０日間静止のまま維持された。陽性クローンは次に、アネキシンＶ結合をリードアウトとして使用して、ｐ２１−３５ロードＷｅｈｉ細胞のアポトーシスを誘導するその能力についてスクリーニングした。ミョウバン中ｍｐ２１−３５Ａｓｎで免疫化されたマウスに由来するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞クローン（８／８）はすべて細胞溶解性であることが示されたが、ＣＦＡ／ＩＦＡ中のｍｐ２１−３５Ａｓｎによって（０／５）、またはＤｅｒ  ｐ  ２によって免疫化されたマウスから（０／４）は、このようなクローンは得られなかった。興味深いことに、少数のＣＤ４＋エフェクタＴ細胞が非免疫化マウスから得られたが（下を参照）、いずれも細胞溶解性でなかった。
【０２２３】
細胞溶解性Ｔｒｅｇの表現型を特徴付けした。別個の免疫化から得た合計１５個のクローンについても、同様の結果を得た。表面マーカーの代表的なＦａｃｓ結果を図１２ａ（１つの代表的なクローン）および表５（４つのクローン）に示し、均質な発現レベルが示されている。
【０２２４】
【表４】
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【０２２５】
すべてのクローンは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１０３の低い発現、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ７のほぼ検出できない発現ではあるが、顕著である高レベルのＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲおよびＩＣＯＳ１を発現した。Ｆｏｘｐ３ではなく、Ｔ−ｂｅｔは均一に発現されたが、ＣＤ１２７はごく微量であった（図１２ｂ）。加えて、Ｔｒｅｇクローンは、高レベルのグランザイムＢおよびパーフォリンを発現する。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、検出可能なレベルのグランザイムＡ  ｍＲＮＡを示すが、グランザイムＢよりもはるかに低いレベルである（図１２ｃ）。サイトカイン分泌パターンは、ほぼＩＦＮ−ガンマのみを示すが、ＩＬ−１０を示さないか、ごくわずかなＩＬ−１０を示し、ＴＧＦ−ベータは示さなかった（図１２ｄ）。表面結合ＴＧＦ−βは検出されなかった。
【０２２６】
すべての細胞溶解性Ｔｒｅｇは、添加されたＩＬ−２の非存在下で抗原活性化に応答しなかったためアネルギー性であった。後者は、再刺激サイクル後に示されるように、ＩＬ−２転写を回復することなく、調節特性の消失を伴わずに、アネルギーを逆転させた。これは、おそらくＴ−ｂｅｔの過剰発現に関連した後成的変化を示唆している。加えてこれらのクローンは、細胞サイクル陰性調節因子の転写を活性化することが公知である、ｅｒｇ−２を高レベルで発現した。
【０２２７】
これらの細胞は高レベルのＣＤ４４を発現したが、ＣＤ４５ＲＢ（そして上記のようなＣＤ６２Ｌ）の低い発現を示し、それらを記憶細胞として同定した。抑制性サイトカインの生成が存在しないことは、その作用機構が細胞間接触を必要とすることを示唆している。グランザイムおよびパーフォリンの発現は、このようなクローンを細胞溶解の可能性を備えたＴ細胞に位置付けられるとした。最後に、Ｖβ８．１の優勢を示す細胞溶解性ＴｒｅｇのＶβの用法が判定され、一部のクローンはＶβ７ファミリに属していた。多数のクローンのベータ鎖が配列決定されて、ＣＤＲ３における著しい相違が示され、それはｐ２１−３５ペプチドに対する応答がオリゴクローナルであることを示した。
【０２２８】
したがってＴｒｅｇクローンを機能的に評価して、標的細胞溶解の機構およびバイスタンダＴ細胞抑制を誘発するその能力の両方を判定した。
【０２２９】
抗原提示細胞におけるアポトーシスの誘導
抗原提示細胞の溶解は、Ｂ細胞および樹状細胞の両方で得られた。ｐ２１−３５が予備ロードされた、未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓Ｂ細胞は、対照ＣＤ４＋エフェクタｐ２１−３５特異的Ｔ細胞が添加されたときではなく（図１３ａ：右パネル）、Ｒ３ＴＢ７細胞溶解性Ｔ細胞クローン（すなわち同様の方法で得られた、細胞溶解活性を備えた別のＴ細胞クローン）によってインキュベートされたときにのみ（図１３ａ：左パネル）、カスパーゼ３活性化に対して誘導された。アネキシンＶをアポトーシスマーカーとして使用して同じ実験を繰り返して、同じ結果を得た。
【０２３０】
実験は、ｐ２１−３５ロードＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（図１３ｂ：左パネル）またはＷＥＨＩ細胞（図１３ｂ：右パネル）を用いて実施した。Ｒ３ＴＢ７を用いたインキュベーション時に、本質的にすべての樹状細胞（ＤＣ）またはＷｅｈｉ細胞は、カスパーゼ３活性化によって測定されたように、アポトーシスへ誘導された。アネキシンＶを用いて同じ実験が実施され、同一の結果を示した。
【０２３１】
アポトーシスはＦａｓ−ＦａｓＬ経路またはグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の分泌のどちらかによって誘導されうる。これらの経路それぞれを阻害する試みが行われた。上昇する濃度のＦａｓＬに対する抗体またはグランザイムＢ阻害薬の、ｐ２１−３５ロードＷＥＨＩ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞クローンを含有する細胞培養物への添加は、生存ＷＥＨＩ細胞の数を用量依存方法で増加させた（図１３ｃ）。多数の実験において、抗ＦａｓＬ抗体がＷＥＨＩ細胞生存を８０％まで回復したことが示された。グランザイムＢ阻害薬によって、そして細胞傷害性に近い高用量が使用されたときにのみ、生存の部分的な回復のみが得られ、グランザイムＢが細胞溶解性の多くの原因とならないことが示された。追加の実験では、顆粒エキソサイトーシスの阻害薬としてＥＧＴＡが使用され、再度Ｗｅｈｉ細胞生存の部分的な回復のみを示した。
【０２３２】
標的細胞溶解が細胞間の接触を必要としたか否かがさらに評価された。このためにｐ２１−３５（または並行実験においてｍｐ２１−３５Ａｓｎ）がロードされたＣＤ１１＋ＤＣを使用した。ロードされたＤＣ細胞をＧ１２１細胞溶解性Ｔ細胞クローンと共にインキュベートしたときに、アネキシンＶ発現によって測定されたように、溶解が細胞の８９％で観察された（図１３ｄ、左パネル）。同じ実験をトランスウェルシステムで実施したときに、ＤＣ溶解は１５％に制限され、溶解が細胞間の直接接触を必要とすることを示した（図１３ｄ、右パネル）。
【０２３３】
ＡＰＣ溶解が細胞溶解性Ｔ細胞との直接接触を必要としたことをｐ２１−３５のＭＨＣクラスＩＩ提示によってさらに確認するために、ｐ２１−３５または無関係なペプチド（ｐ７１−８５）のどちらかがロードされたＷｅｈｉ細胞の２つの同じ集団において実験を実施した。これらの２つの集団は、ＣＦＳＥ標識の差によって区別されうる。図１３ｅから、ｐ２１−３５を提示するＷＥＨＩ細胞は完全に溶解されたが、ｐ７５−８５ロード細胞のわずか４０％が影響されたことがわかる。
【０２３４】
全体として、細胞溶解性Ｔ細胞クローンがＭＨＣクラスＩＩ依存性ペプチド提示による免疫シナプスの形成を必要とする機構によって、ＤＣおよびＢ細胞のアポトーシスを誘導したことが明らかになる。Ｆａｓ−ＦａｓＬの著しい関与が示されているが、グランザイムＢは制限された関与のみである。
【０２３５】
バイスタンダＴ細胞抑制
バイスタンダＴ細胞抑制の機構は、ポリクローナルＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞によって、そして各種のＣＤ４＋エフェクタＴ細胞クローンによって調査した。
【０２３６】
最初にＴｒｅｇが、抗原提示細胞の存在下で抗ＣＤ３活性化後にＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞の増殖を抑制する能力をアッセイした。２つの細胞溶解性Ｔ細胞クローン（Ｇ１２１およびＲ３ＴＢ７）について得られた結果を図１４ａに示す。検出可能なＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞の数は、観察された分裂の回数と同様に、２つの細胞溶解性クローンのどちらか一方が添加されたときに（左上および中パネル）、４８時間のインキュベーション中に劇的に低下した。本効果は、第２のＴ細胞クローンで７２時間にてより顕著であった（下中パネル）。興味深いことに、芽球形成を示す垂直軸からわかるように、活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞のみが溶解された。Ｔｒｅｇが同数の未標識ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞によって置換された対照実験（右パネル）は、培地中の全細胞の変動数に関連した、考えられるアーチファクトを除去した。
【０２３７】
次に抑制の動力学を分析した。図１４ｂに示す実験において、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞の４８％および７８％が、図１４ａと同じアッセイ系を使用して、細胞溶解性Ｔｒｅｇ（Ｒ３ＴＢ７）とのそれぞれ１８時間および２４時間の同時インキュベーションの後に、アネキシンＶを発現することがわかる。
【０２３８】
このように迅速な効果は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって使用されたのと同様の分泌経路の関与を示唆している。したがって、培養物へのＥＧＴＡの添加による顆粒エキソサイトーシスの阻害が抑制を阻害するか否かを検証するために実験を繰り返した。基本的に、バイスタンダＴ細胞の抑制の阻害は、２つの濃度のＥＧＴＡによって７２時間後に観察されなかった（図１４ｃ）。
【０２３９】
次に定義された特異的および異なる表現型のＴ細胞クローンが、非特異的抗ＣＤ３活性化の代わりに、対応する抗原の同種認識によって活性化されるときに、細胞溶解性Ｔ細胞によって抑制されうるか否かが評価された。このために３つのクローン、すなわち同じ源からの第２の無関係なアレルゲン（Ｄｅｒ  ｐ  １）に対して特異的なＴｈ２細胞、Ｄｅｒ  ｐ  ２の第２のメジャーＴ細胞エピトープ（アミノ酸７１−８５）に特異的なＴｈ１細胞および破傷風トキソイドの８３０−８４４サブドミナントＴ細胞エピトープに特異的なＴｈ０クローンがＢＡＬＢ／ｃマウスから誘導体化された。これらの３つのクローンそれぞれをここで報告したすべてのアッセイ系で使用した。各アッセイでの単一クローンについての結果を示すが、結果はアッセイおよびクローンの考えられるすべての組合せで確認した。
【０２４０】
アッセイの第１のセットでは、Ｔ細胞除去脾臓細胞による対応する抗原の提示後にＣＦＳＥ標識細胞を使用して、Ｔ細胞クローンの増殖を測定した。培地中の栄養素の競合によるアーチファクトを除去するために、ＣＦＳＥ標識Ｔｈ２クローンに同量の未標識Ｔｈ２クローンを添加した。Ｄｅｒ  ｐ  １に対して特異的なＴｈ２クローンは、７２時間の期間にわたって測定されたように容易に増殖した（図１４ｄ）。並行アッセイにおいて、ＡＰＣにまたｐ２１−３５をロードして、細胞溶解性Ｔ細胞クローンを１／１の比でＤｅｒ
ｐ  １特異的Ｔｈ２クローンに添加した。図は、Ｔｈ２クローンの５％のみが７２時間のインキュベーション後に生き残ったことを示す。図は、全インキュベーション期間にわたってＦａｓＬへの特異的抗体の添加が抑制の部分阻害を引き起こしたのに対して（３６％残存Ｔｈ２クローン）、抗ＧＩＴＲまたは抗Ｌａｇ３抗体は効果を有さなかったことも示す。Ｄｅｒ  ｐ  ２に対するＴｈ１クローンおよび破傷風トキソイドに対するＴｈ０クローンによって同じ結果が得られた。したがって活性化がＭＨＣクラスＩＩ同種相互作用を通じて起きる条件で、クローンは成熟状態とは無関係に細胞溶解性Ｔ細胞による抑制を受けやすかった。
【０２４１】
接触相互作用が細胞溶解性Ｔ細胞とバイスタンダＴ細胞との間で必要か否かに関する問題は、トランスウェル培養系で調査した。結果を図１４ｅに示す。ｐ２１−３５およびｐ７１−８５の両方をロードしたＴ細胞除去脾臓細胞は、ｐ７１−８５特異的Ｔｈ１クローンの増殖を維持した。ｐ２１−３５細胞溶解性Ｔｒｅｇの添加は増殖を抑制した（中パネル）。ペプチドロードＡＰＣがトランスウェル培養系にて隔離され、細胞溶解性細胞系が１つのコンパートメントに、７１−８５特異的Ｔｈ１クローンが第２のコンパートメントに添加されたとき、抑制は観察されなかった（右パネル）。したがって抑制は溶解性因子によって媒介されなかったことが結論付けられる。これらの実験は、Ｄｅｒ  ｐ  １に対してＴｈ２細胞クローンを使用して確認した。
【０２４２】
細胞溶解性Ｔｒｅｇは、バイスタンダＴ細胞芽球形成を効率的に抑制した。バイスタンダＴ細胞の平均細胞サイズは、図１４ｆに示すように活性化細胞溶解性Ｔｒｅｇ（Ｒ３ＴＢ７）の存在下で同時培養するときには、ごくわずかに増大する。これには、ＣＦＳＥ標識バイスタンダ細胞によって測定されたように、細胞死の割合の上昇が伴った。細胞死のパーセンテージは、バイスタンダ細胞単独では２６％、細胞溶解性クローンの代わりに対照ｐ８３０−８４４クローンを使用して３６％、活性化を伴わない細胞溶解性クローンで３４％、活性化ペプチドの存在下での細胞溶解性クローンで５１％であった。
【０２４３】
バイスタンダ抑制が一部は、ＡＰＣの溶解によるアーチファクトのためでありうることを除外するために、ＡＰＣ（Ｗｅｈｉ−２３１  Ｂ細胞）の２つの別個の集団がそれぞれｐ２１−３５、またはリードアウトペプチド（Ｄｅｒ  ｐ  １由来Ｔ細胞エピトープまたは破傷風トキソイドのｐ８３０−８４４）のどちらかによってインキュベートされる追加のアッセイを実施した。２つのＡＰＣを同じウェルで培養して、細胞溶解性Ｔ細胞クローンおよびＣＦＳＥ標識エフェクタ細胞の両方。標識Ｔ細胞クローンが抑制されることが観察された。細胞溶解性Ｔｒｅｇを活性化するのに必要とされたｐ２１−３５のＡＰＣ提示は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の組合せによって代替された。このような状況下で、同種認識によって活性化されたエフェクタ細胞の増殖も抑制された。図１４ｅで報告した実験とひとまとめにすると、これは細胞溶解性Ｔ細胞クローンがＡＰＣアポトーシス誘導の非存在下でバイスタンダＴ細胞を抑制することを示している。
【０２４４】
細胞溶解性Ｔｒｅｇはｐ２１−３５ロードＢ細胞をインビボで溶解させる
細胞溶解性ＴｒｅｇはインビトロでＡＰＣのアポトーシスを誘導する。本活性がインビボ設定で関連するか否かを判定するために、ＭＨＣクラスＩＩ決定基の文脈でｐ２１−３５を発現するトランスジェニックＢ細胞を使用した。このようなトランスジェニックＢ細胞を、養子移入後、脾臓内で少なくとも３ヶ月間持続する。最初に、細胞溶解性ＴｒｅｇがトランスジェニックＢ細胞のアポトーシスをインビトロで誘発できるか否かを検証した。Ｂ細胞の５２％が細胞溶解性Ｔ細胞クローンとの１８時間のインキュベーション後にアポトーシスを誘導する（図１５ａ）。トランスジェニックＢ細胞およびＴｒｅｇの両方を移入されたマウスの脾臓においてではなく（レーンＡ）、対照マウスの脾臓における（レーンＢ）構築物の発現が、図１５ｂに示されている。ウイルス構築物は、アレルゲン曝露の非存在下で肺細胞中で検出されなかった。これらのデータは、細胞溶解性Ｔ細胞が、インビボ移入後に同種抗原を提示するＢ細胞を溶解するその能力を維持したことを示した。
【０２４５】
細胞溶解性Ｔｒｅｇはアレルゲン曝露時に肺中へ蓄積する
Ｔｒｅｇの記憶表現型は、ＣＣＲ７の非存在および低レベルのＣＤ１０３と組み合わされて、それらが肺に移動可能であり、肺でその抑制活性を発揮しうることを示唆している。
２つの異なる細胞溶解性Ｔ細胞系ｗｏＣＦＳＥまたはＳＮＡＲＦのどちらかで標識して（どちらも細胞質タンパク質のマーカーで、異なる波長で発光する）、別の実験で使用した。ＣＦＳＥ標識細胞の蓄積は血管周囲および気管支肺領域で見出された（データは示さず）。アレルゲン投与ではなく、標識Ｔｒｅｇを投与された対照マウスは実質的に肺蛍光を示さなかった。
【０２４６】
Ｔｒｅｇが著しい割合の肺へのリンパ球蓄積を示すか否かを確証するために、そして蛍光標識の固有の毒性に関連した、考えられるアーチファクトを除去するために、未標識ＴｒｅｇをＢＡＬＢ／ｃマウスに養子移入した。このような実験では、細胞溶解性細胞がＶβ８．１を発現して、アレルゲンの点鼻投与後に肺に蓄積するＣＤ４＋集団全体を超える陽性細胞の割合をカウントしたという事実が利用された。このような条件下では、ごくわずかのリンパ球が喘息のＤｅｒ  ｐ  ２モデルの肺に引き付けられることが公知である。細胞溶解性Ｔ細胞クローンを移入されたマウスの群では、ＣＤ４＋細胞の９０％超がＶβ８．１を発現し、これに対して対照Ｖβ８．１＋細胞系で処理した群、および吸入によりＤｅｒ  ｐ  ２を投与されたが、Ｔ細胞は投与されなかったマウスの対照群それぞれにおいて、このような細胞が２５％および２０％だけ検出された（図１５ｃ）。
【０２４７】
したがって細胞溶解性Ｔｒｅｇが点鼻投与によるアレルゲンチャレンジ時に肺内へ蓄積することが結論付けられる。
【０２４８】
細胞溶解性Ｔｒｅｇクローンは、実験的喘息を予防および抑制する
上記の実験は、細胞溶解性Ｔ細胞クローンがインビボでの特異的免疫応答の制御に有用でありうることを示唆した。ＭＨＣクラスＩＩ同種相互作用およびＡＰＣのアポトーシスの誘導に対する要求は、単一の抗原に対する応答全体を抑制する機会を与える。加えて肺組織へのその蓄積は、喘息と関連する特徴の一部に対するその調節活性に好都合でありうる。
【０２４９】
これは、予防的および抑制的設定の両方でｐ２１−３５に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を養子移入することによって試験した。Ｄｅｒ  ｐ  ２に対する実験的喘息モデルを上記のように使用した。ｍｐ２１−３５Ａｓｎで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスから得たような、２つの細胞溶解性Ｔ細胞系を使用した。
【０２５０】
予防的実験の結果を図１６（ａ〜ｆ）に示す。Ｄｅｒ  ｐ  ２感作の誘導前の細胞溶解性Ｔ細胞の移入が、マクロファージを除いて実質的に細胞を伴わずに、ＢＡＬＦから回収した細胞の数を未処理動物で観察された値まで減少させたことがわかる（図１６には示さず）。対照細胞は、陽性対照群と比較してＢＡＬＦ細胞回収には影響を有さなかった。２つの細胞溶解性細胞クローンは本質的に同じ効果を生じた。ＢＡＬＦにおけるＴＧＦ−βの生成は２つのＴｒｅｇでは検出できなかったが、第２のクローンによってＩＬ−１０生成が抑制された。肺好酸球浸潤および杯細胞過形成の著しい減少が観察された。加えて、用量を増加したメタコリンの吸入によって測定された気道過敏性は、未処理マウス（未処理）で観察されたレベルまで実際に低下した。
【０２５１】
Ｄｅｒ  ｐ  ２感作後に２つの細胞溶解性細胞系を使用したとき、生物学的および機能的パラメータの同様の改善が観察された（図１６（ｇ〜ｌ））。しかしながら１つの顕著な例外は、杯細胞過形成の存在であった。興味深いことに、メタコリンに対する気道過敏性は未処理動物の気道過敏性に匹敵した。追加試験では、これらの最後の結果を動的コンプライアンス測定によって検証したが、実質的に同じ結果が得られた。
【実施例１２】
【０２５２】
実施例１２：Ｄｅｒ  ｐ  １由来ペプチドによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの２つの群を皮下経路によって、ペプチド２０μｇとアレルゲンＤｅｒ  ｐ  １のＴ細胞エピトープ配列（ＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ［配列番号：５］）またはＮ末端に配列ＣＧＦＳ［配列番号：６］を有するその修飾版ＣＧＦＳＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ［配列番号：７］のどちらかを用いて免疫化した。
【０２５３】
溝内に存するＤｅｒ  ｐ  １のアミノ酸は、Ｓ１１４（またはＮ１１５）−Ｐ１２２（またはＰ１２３）である（溝内のアミノ酸９個を結合するＭＨＣクラスＩＩハプロタイプが関係する）。Ｄｅｒ  ｐ  １に存在するＳＮＹＣ配列はそれゆえアクセス不能であり、他のタンパク質と相互作用して、その還元活性を及ぼすことができない。
【０２５４】
３回の注射後、マウスを屠殺処分して、脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、限界希釈によってクローニングした。ＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ［配列番号：５］ペプチドによって免疫化したマウスから得たＴ細胞クローンは、ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ提示との同種相互作用後の増殖およびサイトカイン分泌を特徴とする、エフェクタＣＤ４＋Ｔ細胞を生成した。ペプチドＣＧＦＳ  ＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＡＮＫＩＲ［配列番号：７］によって免疫化したマウスは、実施例１０で記載したのと同様のアッセイで判定されたように、細胞溶解特性を備えたＴ細胞クローンを生成した。
【０２５５】
細胞溶解特性を備えたＴ細胞（実施例１０で示したような）がエフェクタＴ細胞のアポトーシスを誘導する能力を有するか否かを判定するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を接着脾臓細胞から調製した。ＡＰＣはＭＨＣクラスＩＩ決定基中への提示のためにＤｅｒ  ｐ  １アレルゲンでインキュベートした。
【０２５６】
図１７に示すように、ＣＤ４エフェクタ細胞は、抗原ロードＡＰＣに添加すると容易に増殖した。細胞溶解性Ｔ細胞の添加は、ＣＤ４エフェクタ細胞の死を誘導した（７−ＡＡＤ陽性染色（ＦＬ３−Ｈ））。図１７は、エフェクタ細胞の７３％におけるアポトーシスと、ＣＤ４エフェクタ細胞の増殖の強い抑制を示している。
【実施例１３】
【０２５７】
実施例１３：細胞溶解活性を備えたＴ細胞クローンの養子移入は、Ｄｅｒ  ｐ  １アレルゲンの点鼻投与によって誘発された喘息を完全に予防および抑制する。
【０２５８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスには、Ｄｅｒ  ｐ  １アレルゲン１００μｇを使用して、３回の１日点鼻投与を１週間間隔で２シリーズ投与した。最後の点鼻投与後の日にマウスを屠殺処分して、気管支肺胞空間および肺でのアレルギー喘息に特徴的な変化が存在しないか調べた。
【０２５９】
マウスの２つの追加群は、モチーフを備えたＤｅｒ  ｐ  １ペプチドを使用して、実施例１１に記載したように得た細胞溶解性Ｔ細胞クローンを、１度目の点鼻投与の前または後に養子移入した。
【０２６０】
ＢＡＬＦ分化細胞カウントを、点鼻投与の最終シリーズの４日後に実施した（群当たりＢＡＬＢ／ｃ６匹）。細胞は、肺の気管支肺胞洗浄によって得て、サイトスピンでマクロファージ、好中球、好酸球またはリンパ球として同定した。マウスには１００μｇのＤｅｒ  ｐ１（モデル）またはＮａＣｌ（陰性）のどちらかによる点鼻投与３回を２シリーズ投与した。図１８ＡおよびＢは、最初の点鼻投与シリーズの前または後に細胞溶解性Ｔ細胞を投与するとき、これが気管支への好酸球浸潤の完全な抑制をもたらすことを示している。図示されたように、洗浄液中で回収された細胞の総数は、未処理動物より得られる細胞総数の範囲内である。
【０２６１】
気管支肺胞洗浄液をサイトカインの存在について試験した（表６）。細胞傷害性クローンを投与したマウスは、該モデルにおいて著しく上昇するＩＬ−１０濃度を含めて、非常に低いサイトカイン回収を示した。
【０２６２】
【表５】
2015142578.tif 000006
【実施例１４】
【０２６３】
実施例１４：細胞溶解性調節Ｔ細胞を活性化する能力に対する修飾ペプチドの酸化還元効力を上昇させる効果。
【０２６４】
抗原提示細胞に、その未処理構造のｐ２１−３５［配列番号：２］または位置２４のセリンがシステインによって置換されたｐ２１−３５、ＣＨＧＣＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ［配列番号：２９］をロードした。本置換は、Ｃ−ｘ−ｘ−Ｃ型の酸化還元部分を生成する。
細胞溶解活性を備えた複数の調節Ｔ細胞クローンをＡＰＣでインキュベートした。
【０２６５】
図１９は、Ｃ−ｘ−ｘ−Ｃ酸化還元配列を持つペプチドが、サイトカイン生成によって判定された、そのＣ−ｘ−ｘ−Ｓ対応物よりも高度のＴ細胞活性化を誘導することを示している。Ｃ−ｘ−ｘＣ配列が、ＦａｓＬおよびグランザイムの両方でそのＣ−ｘ−ｘ−Ｓ対応物よりもｍＲＮＡ転写を誘導することも示されている。グランザイムは、標的細胞のアポトーシスの誘導の主要な担い手のうちの２つである。
【実施例１５】
【０２６６】
実施例１５：ベータ−ラクトグロブリンアレルギーの予防および抑制。
ウシベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）は、ヒト牛乳アレルギーの主なアレルゲンである。マウスモデルを使用して、修飾ペプチドがＢＬＧに対する特異的応答を変化しうるか否かを判定する。ＢＬＧのＴ細胞エピトープに結合されたチオ酸化還元モチーフ配列Ｃ−Ｈ−Ｇ−Ｃ［配列番号：３１］を含むペプチドＣＨＧＣ  ＡＱＫＫＩＩＡＥＫ［配列番号：３０］を合成する。 
【０２６７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ミョウバン中配列ＣＨＧＣ  ＡＱＫＫＩＩＡＥＫ［配列番号：３０］のペプチド２０μｇを用いた皮下注射２回によって免疫化する。これにＢＬＧ（ミョウバン中５μ）に対する腹腔内感作を１５日後に２週間間隔で２回続ける。あるいはＢＬＧへの腹腔内感作の１５日後にペプチドを投与する。
【０２６８】
ＢＬＧに対する過敏症は、マウスでのＢＬＧの鼻内投与後の気管支過敏性を判定することによって検証する。すべてのマウスに、最後の注射の１０日後に生理食塩水中ＢＬＧ１０μｇの鼻内投与を受けさせる。ペプチド免疫化なしで腹腔内感作を実施する対照群が含まれる。
【０２６９】
感作の前または後に修飾ペプチドエピトープを注射したマウスは、ＢＬＧ点鼻投与と反応する能力を完全に消失していた。このことは、好酸球および過敏性の両方が観察される対照群と比較して、気管支肺胞洗浄液中に好酸球がないことと、用量を増加したメタコリンによるチャレンジに対する過敏性の非存在とによって示される。
【実施例１６】
【０２７０】
実施例１６：多発性硬化症の予防および抑制。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群を、水酸化アルミニウムに吸着させたペプチド（配列モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｓを含有する、ＣＨＧＳ  ＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：３２］）または対照ペプチド（ＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：３３］）によって皮下的に免疫化（２０μｇ）する。２週間間隔で３回の注射を実施する。最後の免疫化の１０日後に、マウスを屠殺処分して、磁気ビーズを用いて脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞（細胞２ｘ１０６個）を調製する。次にＣＤ４＋Ｔ細胞を、接着脾臓細胞（細胞２ｘ１０６個）によって提示されたＭＯＧ  Ｔ細胞エピトープ（２０μｇ／ｍｌ）によってインビトロで刺激する。
【０２７１】
４回の再刺激後、バイスタンダ抑制アッセイにおいて、ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）が有効である動物から得たポリクローナルＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を標的細胞として用いて、Ｔ細胞系を試験する。図２０によって示すように、Ｃ−Ｘ（２）−Ｓ配列モチーフを含有するペプチドによって免疫化された動物から得た細胞のみが、ＥＡＥ動物からのエフェクタＣＤ４＋ＣＤ２５−に存する対照と比較して、標的細胞における死を誘導する能力を有する。
【０２７２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群は、ＣＤ４＋ＭＯＧ特異的調節Ｔ細胞クローンが養子移入され、１日後に多発性硬化症様症候群を誘導することになっているプロトコルが続く。これは完全フロイントアジュバント中のＭＯＧペプチドの投与および百日咳毒素の注射２回を含む。本プロトコルはエフェクタＴ細胞クローンの増殖を誘発し、これはＭＯＧペプチド投与後１２日以内に多発性硬化症と一致する徴候の発症を引き起こす。細胞溶解性Ｔ細胞クローンによって予備処理されたマウスが発生させた臨床スコアは、疾患誘導の全プロトコルのみを投与されたマウスと比較して著しく低下されることが観察される（図２１）。図２１に示すように、細胞溶解性Ｔ細胞クローンによって予備処理されたマウスが発生させた臨床スコアは、エフェクタＴ細胞クローンのみを投与されたマウスと比較して著しく低下されることが観察される。
【実施例１７】
【０２７３】
実施例１７：ペプチド免疫化による多発性硬化症の予防。
モデル群において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス３匹に、第０日目にＣＦＡ中ＭＯＧペプチド１００μｇ／マイコバクテリウム・ブチリカム４００μｇの皮下注射およびＮａＣｌ中ボルテテラ・ペルトゥッシス３００ｎｇの腹腔内注射を投与した。第２日目に、Ｂ．ペルトゥッシスの２回目の注射を投与した。
【０２７４】
予防群において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス５匹を、ＩＦＡ中に配列モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｓを含有するＣＳＭＯＧペプチド（ＣＨＧＳ  ＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲ［配列番号：３２］）２０μｇを用いた注射５回によって、モデル群と同様に疾患誘導前に、１４日間隔で免疫化する。対照実験は、そのＮ末端にモチーフのないペプチド［配列番号：３３］を用いて実施する。
【０２７５】
スコアは、０：疾患なし、１：跛行、２：跛行および１０％を超える体重減少、３：後肢の部分麻痺として確立した。
【０２７６】
図２２は、修飾ペプチド［配列番号：３２］による予備処理が症候群の発症を完全に除去することを示している。
【実施例１８】
【０２７７】
実施例１８：ＧＡＤ６５由来ペプチドによる自発的インスリン依存型糖尿病の予防および抑制。
【０２７８】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、自発的インスリン依存型糖尿病に適切な動物モデルを構成する。
【０２７９】
ヒトなどのこのような動物では、自己抗原グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５）に対する早期免疫応答は、応答が細胞内および細胞間伝播によって広がる膵島炎が見られる時点に観察される。新生児に対するタンパク質の投与によるＧＡＤに対する耐性の誘導が、糖尿病の発症を予防する。
【０２８０】
ＧＡＤ６５のカルボキシ末端領域、そして特に断片５２４−５４３  ＳＲＬＳＫ５２８ＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭＥＹＧＴＴ［配列番号：３４］は、特異的Ｔ細胞によって認識される。このようなＴ細胞の一部、たとえば断片５３０−５４３を認識するＴ細胞は病原性であり、これに対して他のＴ細胞、たとえば断片５２４−５３８を認識するＴ細胞は疾患を誘発しない。
【０２８１】
Ｌｙｓ５２８は、Ｐ１アンカー残基を構成する。本発明によるペプチドの産生では、セリン残基Ｐ−４およびＰ−１はシステインによって置換され、ＣＲＬＣ  ＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭ［配列番号：３５］を生じる。
【０２８２】
細胞傷害特性を備えたＴｒｅｇ細胞は、ＧＡＤ６５タンパク質のＴ細胞エピトープを含む上記の修飾ペプチドによる免疫化によって誘発される。２０週齢のＮＯＤマウスの膵臓より得たＴ細胞は、顕性糖尿病と同様に膵島炎が存在する時点で、病原性Ｔ細胞クローンを産生するためにペプチド５２４−５４３によってインビトロで増殖する。
【０２８３】
ＮＯＤマウスは、２週齢からＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）中のチオレドキシンコンセンサス配列を含有するペプチドによって免疫化する。Ｔ細胞をインビトロで増殖し、調節特性を備えたクローンを産生する。
【０２８４】
チオレドキシンコンセンサス配列で免疫したマウスから精製したポリクローナル細胞は、ペプチド５２４−５４３がロードされた抗原提示細胞によって刺激されるときに、ペプチド５２４−５４３免疫化ＮＯＤマウスから得たポリクローナルＣＤ４細胞にてアポトーシスを誘導する（図２３を参照）。図２３の表は、調節集団なしで得たバックグラウンド値の減算後、二重陽性細胞（死細胞）のパーセンテージを表す。
【０２８５】
ＮＯＤマウスにおける２週齢での、すなわち膵島炎発症（３週齢）前のＴｒｅｇの養子移入は、糖尿病発症を完全に予防することが示されている。
【０２８６】
２週齢からのペプチドＣＲＬＣ  ＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭ［配列番号：３５］によるＮＯＤマウスの直接免疫化は、糖尿病および膵島炎の病変を完全に予防することが示されている。
【０２８７】
抑制設定では、６〜２０週の異なる週齢でのＴｒｅｇの養子移入は、ＮＯＤマウスでの糖尿病および膵島炎を抑制することが示されている。膵島炎がすでに顕著である週齢（１５週齢）後のペプチドＣＲＬＣ  ＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭ［配列番号：３５］による免疫化は、糖尿病および膵島炎を抑制することが示されている。
【実施例１９】
【０２８８】
実施例１９：インスリン由来ペプチドによる自発的インスリン依存型糖尿病の予防および抑制。
【０２８９】
細胞溶解性を備えたＴｒｅｇは、グリシンリンカーの有無でモチーフＣ−Ｘ（２）−Ｃに結合されたインスリンのＴ細胞エピトープによるＮＯＤマウスを免疫化することによって誘発される。
【０２９０】
合成されるペプチドは：
ＥＡＬＹＶＣＧＥＲＧ  ＣＧＰＣ［配列番号：３６］
ＥＡＬＹＶＣＧＥＲＧ  Ｇ  ＣＧＰＣ［配列番号：３７］
ＥＡＬＹＶＣＧＥＲＧ  ＧＧ  ＣＧＰＣ［配列番号：３８］
ＥＡＬＹＶＣＧＥＲＧ  ＧＧＧ  ＣＧＰＣ［配列番号：３９］
ＥＡＬＹＶＣＧＥＲＧ  ＧＧＧＧ  ＣＧＰＣ［配列番号：４０］
である。
【０２９１】
これらのペプチドによって得られたＴｒｅｇ細胞は、病原性細胞および調節細胞の両方がインスリンの提示によって活性化されるインビトロ系でインスリン特異的病原性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。それらはさらに、膵島炎の自発的発症の前（２週齢）または後（６週齢）でのＴｒｅｇの養子移入後にそれぞれ、糖尿病および膵島炎の発症を予防または抑制する。
【０２９２】
これらのペプチドによって得られたＴｒｅｇ細胞は、予防のためには２週齢にて、または抑制のためには１５週齢にてそれぞれ開始するチオレドキシンコンセンサス配列を含有する配列のペプチドによる免疫化時にインビボで誘発されたときに、糖尿病および膵島炎の発症を予防または抑制する。  
【実施例２０】
【０２９３】
実施例２０：甲状腺ペルオキシダーゼ由来ペプチドによる自己免疫甲状腺炎の予防および抑制。
【０２９４】
ヒトの自己免疫甲状腺炎は、甲状腺ペルオキシダーゼに対する抗体の生成に関連付けられる。ＴＰＯに対する抗体および特異的Ｔ細胞は、細胞傷害性および細胞溶解性機構の組み合わせによる甲状腺細胞破壊を生じて、甲状腺機能低下を引き起こす。Ｃ５７ＢＩ／６マウスのＴＰＯによる免疫化は、意図的にヒト病態と同じ疾患状態を誘発して、したがって自己免疫甲状腺炎に適切なモデルと見なされる。
【０２９５】
ＴＰＯの断片５４０−５５９（ＱＧＱＬＭ５４４ＮＥＥＬＴＥＲＬＦＶＬＳＮＶ［配列番号：４１］は、Ｃ５７ＢＩ／６マウスによって認識されたＴＰＯのドミナントＴ細胞エピトープを含む。
【０２９６】
各種のアルゴリズムの使用によって、残基Ｍｅｔ５４４を、ＭＨＣクラスＩＩ決定基への最初のアンカー残基として同定した。アミノ酸Ｐ−４〜Ｐ−１は、Ｄ−異性体ＣＧＰＣ［配列番号：４２］の配列によって置換され、配列（ＣＧＰＣ）Ｄ−異性体ＭＮＥＥＬＴＥＲＬ［配列番号：４３］を産生する。
【０２９７】
Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、ＣＦＡ／ＩＦＡ中の実験ペプチド［配列番号：４３］または対照ペプチド［配列番号：４１］またはＱＧＱＬＭ５４４ＮＥＥＬＴＥＲＬ［配列番号：４８］で２回免疫化する。最後の免疫化の１０日後、マウスを屠殺処分して、脾臓からＴ細胞を調製する。５４０−５５９配列をロードした抗原提示細胞を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロで増殖させる。Ｔ細胞クローンを限界希釈によって得る。
【０２９８】
実験ペプチド（ＣＧＰＣ）Ｄ−異性体ＭＮＥＥＬＴＥＲＬ［配列番号：４３］によって産生されたＴ細胞クローンが配列５４０−５５９のペプチドによる免疫化によって得られたエフェクタＴ細胞の活性化を抑制する能力をインビトロで試験する。本明細書では、抗原提示細胞にペプチド５４０−５５９をロードする。エフェクタＴ細胞クローンの添加は、チミジン取り込みによって測定されるように、このような細胞の活性化および増殖を引き起こす。調節活性を備えたＴ細胞クローンをエフェクタクローンと共に系に添加するとき、後者の活性化および増殖は完全に阻害される。
【０２９９】
ペプチド５４０−５５９による免疫化の前または後の調節Ｔ細胞のＣ５７ＢＩ／６マウスへの養子移入は、甲状腺のリンパ球浸潤を判定することによって評価されるように、甲状腺炎の誘導をそれぞれ予防または抑制した。
【実施例２１】
【０３００】
実施例２１：サイログロブリン由来ペプチドによる自己免疫甲状腺炎の予防および抑制。
サイログロブリンに対する免疫応答は、ヒト自己免疫甲状腺炎の一般的な特徴である。Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの注射時の実験的甲状腺炎におけるこのような応答の誘導は、Ｈ２ｋマウスなどの遺伝的に素因のある動物で得られている。
【０３０１】
サイログロブリン断片２３４０−２３５９（ＱＶＡ２３４２ＡＬＴＷＶＱＴＨＩＲＧＦＧＧＤＰＲ［配列番号：４４］は、ＡＫＲ／Ｊマウスによって認識されたサイログロブリンのドミナントＴ細胞エピトープを含む。各種のアルゴリズムの使用によって、残基Ａｌａ２３４２をＭＨＣクラスＩＩ決定基への最初のアンカー残基として同定する。アミノ酸Ｐ−４〜Ｐ−１は、配列ＣＧＳＰ［配列番号：１３］の配列によって置換され、配列ＣＧＰＳ  ＡＡＬＴＷＶＱＴＨ［配列番号：４５］を産生する。
【０３０２】
ＡＫＲ／Ｊマウスは、ＣＦＡ／ＩＦＡ中の実験ペプチド［配列番号：４５］および対照ペプチドＬＤＱＶＡＡＬＴＷＶＱＴＨ［配列番号：４９］で２回免疫化する。最後の免疫化の１０日後、マウスを屠殺処分して、脾臓からＴ細胞を調製する。２３４０−２３５９断片をロードした抗原提示細胞を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロで増殖させる。Ｔ細胞クローンを限界希釈によって得た。
【０３０３】
ペプチドＣＧＰＳ  ＡＡＬＴＷＶＱＴＨ［配列番号：４５］によって産生されたＴ細胞クローンが配列２３４０−２３５９のペプチドによる免疫化によって得られたエフェクタＴ細胞の活性化を抑制する能力をインビトロで試験する。本明細書では、抗原提示細胞にペプチド２３４０−２３５９をロードした。エフェクタＴ細胞クローンの添加は、チミジン取り込みによって測定されるように、このような細胞の活性化および増殖を引き起こした。調節活性を備えたＴ細胞クローンをエフェクタクローンと共に系に添加するとき、後者の活性化および増殖は完全に阻害される。
【０３０４】
ペプチド２３４０−２３５９による免疫化の前または後の調節Ｔ細胞のＡＫＲ／Ｊマウスへの養子移入は、甲状腺のリンパ球浸潤を判定することによって評価されるように、甲状腺炎の誘導をそれぞれ予防または抑制する。
【実施例２２】
【０３０５】
実施例２２：カンバ花粉アレルゲン由来ペプチドによる花粉アレルギーの予防および抑制。
【０３０６】
カンバ花粉への感受性は、鼻炎および喘息の一般的な原因である。しかしながらカンバ花粉感作被験体の約６０％が、バラ科の果実、たとえばリンゴ、ナシ、プラムおよびサクランボの摂取時に症状を発症する。Ｂｅｔ  ｖ１（主カンバ花粉アレルゲン）とこのような食物との間の交差反応が、特異的ＩｇＥ抗体およびＴ細胞のレベルの両方で証明されている。特にＴ細胞エピトープは、各種のアイソフォーム間で保存されているＢｅｔ  ｖ１分子のカルボキシ末端に位置して、リンゴの同等のアレルゲン（Ｍａｌ  ｄ１）の配列との高度の相同性が示された。Ｂｅｔ  ｖ１の断片１４２−１５６を認識するエフェクタＴ細胞は、Ｍａｌ  ｄ１対応エピトープに曝露されたときに強く活性化される。
【０３０７】
Ｂｅｔ  ｖ１の残基１４４−１５４に対応し、Ｔ細胞エピトープを含有するペプチドＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨ［配列番号：４６］は、そのアミノ末端での配列（ＣＧＰＣ）Ｄ−異性体［配列番号：４２］の添加によって修飾され、（ＣＧＰＣ）Ｄ−異性体ＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨ［配列番号：４７］を生じる。
【０３０８】
本ペプチドは、ミョウバン１ｍｇに対してペプチド５０μｇを使用して、水酸化アルミニウム上に吸着させる。ペプチド５０μｇの皮下注射３回を、２週間間隔で実施した。最後の注射の２週間後、末梢静脈から血液を採取して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気ビーズでの細胞分取によって精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を培地に添加して、そこで抗原提示細胞として使用された組織適合性樹状細胞をＢｅｔ  ｖ１抗原、または対照としての破傷風トキソイドのどちらかで室温にて２時間インキュベートした。次に細胞を洗浄および精製して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を培地に添加した。このようなＣＤ４＋Ｔ細胞は、破傷風トキソイドタンパク質を提示する樹状細胞ではなく、Ｂｅｔ  ｖ１抗原を提示する樹状細胞のアポトーシスを誘導した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の、Ｍａｌ  ｄ１抗原がロードされた樹状細胞によるインキュベーションは、樹状細胞アポトーシスを生じた。
【０３０９】
リンゴ摂取に対する口腔咽頭アレルギーと共にカンバ花粉への曝露時にアレルギー症状を示し、ペプチドＣＧＰＣ  ＬＲＡＶＥＳＹＬＬＡＨ［配列番号：４７］の皮下注射３回によって処置された患者は、花粉への曝露または口腔咽頭粘膜のリンゴとの接触のどちらとも反応できなかった。
【０３１０】
酸化還元部分を含有するように修飾されたカンバ花粉からのアレルゲンＢｅｔ  ｖ１由来のＴ細胞エピトープを含有するペプチドによるワクチン接種は、カンバ花粉曝露に関連する症状および相同性Ｔ細胞エピトープを持つ果実の摂取から生じる症状を除去する細胞傷害性調節Ｔ細胞を誘発する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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