(57)【要約】【課題】Ｎｒｆ２の転写活性による抗酸化ストレス酵素群の発現を向上させるペプチドを提供すること、及び上記抗酸化ストレス酵素群の発現により疾患し得る医薬を提供すること。【解決手段】式（１）（R）ｎLQLDEETGEFLPIQ      （１）［式中、ｎは、６〜１２の自然数を示す］で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又は上記式（１）で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、及び当該ペプチドを含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
（R）ｎLQLDEETGEFLPIQ      （１）
［式中、ｎは、６〜１２の自然数を示す］
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又は上記式（１）で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
ｎが７〜９の自然数を示す、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項４】
細胞の酸化ストレスに起因する疾患を治療及び／又は予防するための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞の酸化ストレスに起因する疾患が、歯周病、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症及び癌の骨転移からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞透過性ペプチド及び当該ペプチドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスは、歯周炎等の骨破壊疾患の因子の一つであると考えられている。活性酸素（ＲＯＳ）によりもたらさた酸化ストレスは、例えば、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）シグナリングに続く細胞内シグナル分子として破骨細胞形成において役割を果たしている。この破骨細臨の活性化にROS（酸化ストレス）が細胞内シグナル伝達物質として働いていることが知られている。また酸化ストレスは細胞にとって障害因子となり得るためそれを防ぐメカニズムが存在し、転写因子Nrf2を介した抗酸化ストレス酵素群の発現制御機構が知られている。Nrf2は通常状態ではタンパク質Ｋｅａｐ１と結合し、ユピキチン化され分解される．このNrf2とKeap1との結合部位がETGE配列である。
【０００３】
しかし、当該ETGE配列自体を単に細胞に添加した場合、有意な量のETGE配列が細胞内に到達せず、Nrf2のKeap lへの結合及びそれに続く、Nrf2の分解が生じてしまい、抗酸化ストレス酵素群の発現制御を十分に行うことはできなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Free Radie Biol Med. 2012 Jan 15;52(2）444-5l
【非特許文献２】ACS Med Chem Lett. 2012 May 10;3(5):407-410.
【非特許文献３】Kanzaki H, Shinohara F, Kajiya M, Kodama T. The keap1/ Nrf2 Axis Plays A Role In Osteoclast Diffefentiation By Regulating Intracellular ROS Signaling, Journal of Biological Chemistry 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、Ｎｒｆ２の転写活性による抗酸化ストレス酵素群の発現を向上させるペプチドを提供すること、及び上記抗酸化ストレス酵素群の発現により疾患し得る医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のような状況の下、本発明者は、鋭意研究した結果、ＥＴＧＥ配列ペプチドのＮ末端にアルギニンを一定数結合させた融合ペプチドを用いた場合、当該ペプチドが細胞膜を透過して、細胞内でのＮｒｆ２の転写活性を向上させることを見出した。本発明者らは、さらに、Ｎｒｆ２の転写活性の向上により処置され得る疾患の予防、治療に上記融合ペプチドが有用であることを見出した。本発明は、これらの新規の知見に基く。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のペプチドは、細胞内に送達されてNrf2とKeaplとの結合を妨げ、Nrf2の分解を阻止することで抗酸化ストレス酵素群の発現を上昇させることができる。従って、本発明のペプチドは、酸化ストレスに起因する疾患の予防、治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例における7R-ETGEペプチドによる破骨細胞形成の阻害を示す。(A) RAW 264.7細胞をRANKL (100 ng/ml)で刺激した。(B)RANKL及び7R-ETGEの添加、(C) RANKL及びETGE-7Rの添加、(D) RANKL及びETGEペプチドの添加を行い、TRAP染色を実施した。矢印で示す部分がTRAP+ 多核化細胞である。Bar = 100 μm。 (E) ウェルあたりのTRAP+ 多核化細胞の数を計測した。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。＊は、p < 0.05を示す。NSは有意差無しを示す。(F)コントロールマウス初代腹腔マクロファージ、(G)RANKL (100 ng/ml)刺激した初代マクロファージ、(H)RANKL (100 ng/ml)刺激し、7R-ETGEを添加した初代マクロファージについて、TRAP染色を行った。矢印で示す部分がTRAP+ 多核化細胞である。Bar = 100 μm。代表的な写真を示す。(I)ウェルあたりのTRAP+多核化細胞の数を計測した。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。＊は、p < 0.05を示す。
【図２】図２は、本願実施例における7R-ETGEによる破骨細胞マーカー遺伝子発現の減少を示す。破骨細胞マーカー遺伝子ATP6v0d2, DC-STAMP及びOSCARの発現を、RAW 264.7細胞において、リアルタイムPCRで試験した。コントロールに対する相対値を示す。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。＊ は、RANKL 単独刺激群に対しp < 0.05であったことを示す。NS: RANKL 単独刺激群に対し有意差無しを示す。
【図３】図３は、本願実施例における、破骨細胞性吸収活性の7R-ETGEペプチドによる低減を示す。RAW 264.7細胞を、(A)RANKL (100 ng/ml)で刺激したもの、(B)さらに7R-ETGEペプチド添加したもの、(C)ETGE-7Rペプチド添加したもの及び(D)ETGEペプチドを添加したものを骨吸収アッセイプレート上で培養した。矢印が示す部分が吸収欠損した部分。Bar = 100 μm。代表的写真を示す。（E)吸収された領域の面積のパーセンテージを算出した。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。＊ は、RANKL 単独刺激群に対しp < 0.05であったことを示す。NS: RANKL 単独刺激群に対し有意差無しを示す。
【図４】図４は、本願実施例における細胞内ROSのフローサイトメトリー分析の結果を示す。RAW 264.7細胞における細胞内ROSレベルをフローサイトメトリーを用いて試験した。(A)RANKLは細胞内ROSを誘導した。実線はコントロールを示し、点線はRANKL刺激群を示す。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。(B) RANKL に誘導されたRAW 264.7における細胞内ROSを、7R-ETGEペプチドは減少させたが、ETGE-7RペプチドもETGE 7R-ETGEペプチドも減少させなかった。点線はRANKL及び7R-ETGEペプチド添加を示し、実線は、RANKL単独添加、RANKL及びETGE-7Rペプチド添加、又はRANKL及びETGE添加を示す。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。
【図５】図５は、本願実施例における、mRNA 及びタンパク質レベルでの細胞保護酵素発現のNrf2を介するアップレギュレーションの、7R-ETGEペプチドによる誘導を示す。 (A)核Nrf2のウエスタンブロット分析。抽出した等量の核タンパク質を電気泳動し、PDVFメンブレンに移した。ロードした核タンパク質の等量性を確認するために、細く切ったメンブレンを抗Histone H3抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。濃度解析を用いて、コントロールに対する比率を測定し、そして各々のパネルの上に３回の試験の平均値を示す。(B) HO1, NQO1及びGCS のmRNA発現をリアルタイムPCRにより試験した。コントロールに対する各々の遺伝子の相対値を示す。白：コントロール、黒：7R-ETGE添加細胞。＊は、コントロールに対しp < 0.05であったことを示す。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。(C) HO1、NQO1及びGCSのウエスタンブロット分析。抽出した等量の核タンパク質を電気泳動し、PDVFメンブレンに移した。独立した試験を３回行い、代表的なデータを図に示す。(D) ロードした核タンパク質の等量性を確認するために、TGX Stain-Free Precast Gels (BioRad Laboratories)を用い、ＵＶ処理をして、全タンパク質を可視化した。メンブレン上の可視化したタンパク質を、UV透光下、ImageQuant LAS-4000で画像化した。 (E) 図5Cに示す各々のバンドの濃度分析により、コントロールを基準としたHO1, NQO1及びGCSの各々の相対的発現量を計算した。これらの値は、図５Ｄに示す可視化した全タンパク質の量で標準化してある。３回の試験の平均値を示す。
【図６】図６は、本願実施例における、実験動物でのETGE含有ペプチドによる骨破壊の阻害を示す。7R-ETGEペプチド添加又は無添加の、LPS (10 μg/site)又はPBSを１日おきに５回、各々のマウスに注射した。(A)リアルタイムPCR分析をグループあたり３つのＲＮＡサンプルを用いて実施した。＊はp < 0.05を示す。(B)グループあたり５サンプルでMicroCTイメージを取得し、代表的写真を示す。矢印が示すのは、吸収により頭蓋骨に生じた欠損部又は穴である。Bar = 1 mm. (C)頭蓋骨における吸収領域の面積をImage-J softwareを用いて算出した。吸収部分のパーセンテージの平均値を示す (解析した画像中の頭蓋骨におけるピクセル数に対する、頭蓋骨中の吸収された領域のピクセル数の比率から計算した)。*は、コントロールに対してp < 0.05を示す。NSは、コントロールに対して有意差無を示す。†: p < 0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
細胞透過性ペプチド
本発明は、（R）ｎLQLDEETGEFLPIQ      （１）（配列番号１）
［式中、ｎは、６〜１２の自然数を示す］
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又は上記式（１）で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００１０】
上記のように、本発明のペプチドは、Nrf2のアミノ酸配列のうち、Keap1との結合部位に相当する配列LQLDEETGEFLPIQ（配列番号２）のＮ末端にアルギニンが６〜１２個結合した構造を有する。式（１）において、Ｎ末端のアルギニンの数は６〜１２個であり、好ましくは、７〜１０個であり、より好ましくは７〜９個である。
【００１１】
また、本発明のペプチドは、上記式（１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、また、本発明の効果がもたらされる範囲において、上記式（１）で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。上記式（１）で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている実施形態において、欠失、置換又は付加は、上記式（１）で表されるアミノ酸配列のうちどの位置で生じていてもよいが、配列LQLDEETGEFLPIQ部分において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているものが好ましい。
【００１２】
本発明のペプチドは、自体公知の方法、例えば、固層合成法等の有機合成化学的ペプチド合成、遺伝子工学的方法等により製造することができる。
【００１３】
医薬組成物
本発明は、上記ペプチドを含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、細胞の酸化ストレスに起因する疾患を治療及び／又は予防するために用いることができる。      
【００１４】
本発明の医薬組成物は、上記ペプチドに加え、薬学的に許容される各種担体（ 賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等が含まれる）と配合した製剤であってもよい。上記製剤は慣用の添加剤を含んでいてよい。
【００１５】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤； 注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。好ましい製剤形態としては、例えば、局所注射剤、歯肉粘膜への塗布剤、含嗽剤等が挙げられる。
【００１６】
製剤中の本発明のペプチドの含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ペプチドの１日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500mg程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの3分の１量が含まれていればよい。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【００１８】
本発明のペプチドは、細胞膜を透過し、細胞内で転写因子Ｎｒｆ２と結合することでＮｒｆ２とＫｅａｐ１との結合を妨げ、Ｎｒｆ２の分解を妨げることで抗酸化ストレス酵素群の発現を上昇させることにより作用する。従って、本発明のペプチドを有効成分とする医薬組成物は、酸化ストレスに起因する疾患、特に転写因子Ｎｒｆ２を介して発現する抗酸化ストレス酵素群により処置され得る疾患の予防、治療に有効である。細胞の酸化ストレスに起因する疾患の例としては、転写因子Ｎｒｆ２を介して発現する抗酸化ストレス酵素群により予防、治療され得る疾患を広く挙げることができ、例えば、歯周病、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、癌の骨転移等が挙げられる。
【００１９】
歯周病は加齢とともに罹患率が上昇する生活習慣病の一つであり、歯周病原菌感染によって過度の免疫反応が歯周組織で惹起されることで発症する。重度の歯周病では歯槽骨骨破壊により歯の支持組織が失われ咀嚼障害が生じ、著しくQOLが低下する。この骨破壊は破骨細胞による過剰な骨吸収促進によって生じることが知られており、破骨細胞形成と活性化への必須因子であるRANKL(Yasuda H,  ShimaN,  Nakagawa N,  Yamaguchi K,  Kinosaki M,  Mochizuki S,  TomoyasuA, Yano K,  Goto M,  Murakami A,  Tsuda E,  Morinaga T,  Higashio K,  UdagawaN,  Takahashi N, Suda T. 1998 0steoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(7):3597-602.)が歯周病の歯周組織においてmRNAレベルならびにタンパク質レベルで発現が上昇している事も報告されている(Kawai T, Matsuyama T, Hosokawa Y, Makihira S, Seki M, Karimbux NY, GoncalvesRB, Valverde P, Dibart S, Li YP, Miranda LA, Ernst CW, Izumi Y, Taubman MA. 2006 B and T Lymphocytes Are the Primary Sources of RANKL in the Bone Resorptive Lesion of PeriodontaI Disease. Am J Pathol 169:987-998；及びTeng YT, Nguyen H, Gao X, Kong YY, Gorczynski RM, Singh B, Ellen RP, Pennlnger JM. 2000 Functional humanT-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. J Clin Invest. 106(6):R59-67)。また歯周病においてどのような細胞がRANKLを発現しているかについては、歯肉組織に浸潤したリンパ球(B細胞やT細胞)がこの上昇したRANKLの主要源になっていることも報告されている（上記Kawai T et al.）。
【００２０】
RANKLの破骨細胞内でのシグナル伝達系としてReactive Oxygen Species (ROS)が働いていることが報告されている（Exp. Cell Res. (2004) 301:119-127）。ROSは細胞内シグナル伝達物質として働くのみならず、一般的には核酸・タンパク質・脂質の酸化など細胞にとっては有害物質として働く(Free Radic. Biol. Med. (1991) 11:81-128; Toxicol. Sci. (2009) 108:4-18)。そのため細胞は酸化ストレスを消去する酵素群の発現を転写因子Nrf2を介して制御する防御機構を有している（Annu Rev Pharmacol Toxicol (2007) 47:89-116）。Nrf2はKeap1と結合することでユビキチン化され分解されることでその転写活性が低く抑えられている(Trends Mol Med (2004) 10:549-557)。
【００２１】
本発明のペプチドは、Nrf2がKeap1と結合する部位をmimicした主要配列LQLDEETGEFLPIQに、細胞膜透過配列RRRRRRRを付加することで細胞膜透過性を与えたペプチドであり、標的細胞外へ投与してもその細胞膜透過性から細胞質内へ移行し、Nrf2とKeap1の結合を阻害しNrf2が分解されることを阻止することでNrf2を介した抗酸化ストレス酵素群の発現を増強する効果がある。破骨細胞を標的細胞とした場合、Nrf2を介した抗酸化ストレス酵素群の発現増強によってRANKLの細胞内シグナル伝達物質であるROSが消去され、RANKLのシグナル伝達が阻害されることで破骨細胞の分化・活性化を阻害することが可能である。このことからＲＡＮＫＬ依存性の破骨細胞形成及び骨破壊を抑える働きを有するため、歯周病の治療、予防に非常に有効である。
【００２２】
また、慢性関節リウマチ及び変形性関節炎での骨破壊病態と歯周病における病態の類似性が指摘されており（Inflamm Res. 2004 Nov;53(11):596-600. Bone lysis and inflammation. Haynes DR.）、慢性関節リウマチにおいて、活性化リンパ球がRANKLを発現しRANKLやTNF-alphaが関節破壊に重要な役割を果たしていること（Bone. 2002 Feb;30(2):340-6. Involvement of receptor activator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-alpha in bone destruction in rheumatoid arthritis. Romas E, Gillespie MT, Martin TJ.）等が報告されている。
【００２３】
また、腫瘍の骨転移の阻害に関しては腫瘍細胞がRANKLを発現し、破骨細胞分化・活性化を促進させそれによって骨転移をおこなうことが知られている。
【００２４】
以下に、実施例を用いて本発明の特定の実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
1.細胞
1.1. RAW 264.7 単球細胞系統由来のマウス細胞
RAW 264.7細胞を理研バイオリソースセンターから入手した。
【００２６】
1.2.マウス初代腹腔マクロファージ
３匹のC57/B6マウス(Japan SLC Inc., Hamamatsu, Japan)を殺処分し、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、腹腔に注入した。腹腔洗浄液を回収し、遠心分離をして細胞を採取した。沈殿ペレットから回収した細胞を、50 ng/ml ofの組み換えマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)と共に４日間、前培養し、そして付着した細胞を腹腔マクロファージとして用いた（Hata K, Kukita T, Akamine A, Kukita A, Kurisu K. Trypsinized osteoclast-like multinucleated cells formed in rat bone marrow cultures efficiently form resorption lacunae on dentine. Bone 1992;13: 139-46）。組み換えM-CSF (20 ng/ml) を培養培地に添加した。
【００２７】
2. 細胞培養
全ての細胞を、10% (V/V) ウシ胎仔血清(HyClone; Thermo Scientific, South Logan, UT)を含み、抗生物質(100 U/ml penicillin及び100mg/ml streptomycin)を添加したalpha-modified Eagle培地 (a-MEM;和光純薬)中、37°C、5% CO2インキュベーターで培養した。
【００２８】
3. ETGE含有ペプチドの構築
ETGEペプチド(LQLDEETGEFLPIQ)配列はユビキチン化促進タンパク質Keap1に対するNrf2の結合ドメインと同一であると報告されており、Nrf2へのKeap1の結合を阻害すると報告されているものである。ETGEペプチド及びETGEペプチド含有細胞透過性配列（7R-ETGE:
RRRRRRRRLQLDEETGEFLPIQ（配列番号３）、及びETGE-7R: LQLDEETGEFLPIQRRRRRRRR（配列番号４）)を、株式会社医学生物学研究所に依頼して合成した。これらのペプチドが合成されたことは、HPLC分析により確認した。7R-ETGEペプチド、ETGE-7Rペプチド及びETGEペプチドについて、
HPLC分画のUV210nmにおけるシグナルの各ピーク比で測定した実測純度は、それぞれ、８７．５％、９５％、９８．１％であった。また、7R-ETGEペプチド、ETGE-7Rペプチド及びETGEペプチドについて、TOF-Massで測定した実測分子量は、それぞれ、２８８２．５、２８８２．４及び１６３３．０であった。これらのペプチドをN,N-ジメチルホルムアミド (DMF)中に溶解し、(50mM)フリーザーに貯蔵した。尚、本実施例において、7R-ETGEペプチド、ETGE-7Rペプチド及びETGEペプチドを総称してETGE含有ペプチドと示す。
【００２９】
4. 破骨細胞形成アッセイ
RAW 264.7細胞を、組み換えsRANKL (100 ng/ml最終濃度;和光純薬)の存在下又は不存在下で、かつETGE含有ペプチド（最終濃度50マイクロモラー（））を添加するか、または添加しない状態で、96-ウェルプレートに１０３cells/wellで播種した。培養後の細胞に対し、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)の染色を、酸ホスファターゼキット(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)を製造者の指示書に従い用いて行った。濃紅の多角化細胞（> 3 nuclei）をTRAP陽性多角化細胞としてカウントした。
【００３０】
5.リアルタイムPCR分析
上記「4. 破骨細胞形成アッセイ」と同様に処理したRAW 264.7細胞について、GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO)を製造者の指示書に従い用いてRNAを抽出した。RNA濃度の測定後、単離したRNA (100 ng each)をiScript cDNA Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて逆転写し、そしてTris-EDTA (TE)バッファーでcDNAストックを希釈(×5)した。リアルタイムRT-PCRを、SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories)及びCFX96 instrument (Bio-Rad Laboratories)を用いて実施した。PCRプライマーは、Kanzaki H, Shinohara F, Kajiya M. Kodama T. The Keap1/Nrf2 Axis Plays A Role In Osteoclast Differentiation By Regulating Intracellular ROS Signaling. Journal of Biological Chemistry 2013の実験で用いられているものを使用した。
【００３１】
6.吸収アッセイ
RAW 264.7細胞を合成リン酸カルシウム基質(bone resorption  assay plate; PG Research, Tokyo, Japan)上に播種し、RANKL(100ng/ml)で刺激した。ETGE含有ペプチド添加群については、RANKL刺激開始時に、最終濃度50マイクロMとなるようETGE含有ペプチドを添加した。７日間の培養後、細胞をブリーチで除去し、リン酸カルシウム基質を蒸留水でリンスし、そして乾燥した。写真を撮影し、領域中の吸収エリアの割合の平均を、Image-Jsoftware (National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて、各サンプルにつき１２枚の画像から算出した。
【００３２】
7.細胞内ROS検出
細胞内ROSレベルを、Total ROS/Superoxide Detection Kit (Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY, USA)を製造者の指示書に従い用いて検出した。細胞をETGE含有ペプチド有又は無しで２４時間プレカルチャーし、次いでPBSで洗浄した。細胞をsRANKL(100ng/ml)で６時間刺激し、ETGE含有ペプチド添加群についてはRANKL刺激開始時に、最終濃度50μMとなるようETGE含有ペプチドを添加し、洗浄し、2％ウシ胎仔血清(FBS)を添加したPBSで回収した。細胞懸濁液を酸化ストレス検出試薬と共に３０分間、氷上でインキュベートした。PBSでの洗浄後、細胞内ROSをAccuri C6 フローサイトメーター (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)で検出した。生きた単球／マクロファージフラクションをmonocyte/macrophage fraction was gated on an FSC/SSCプロット上にゲーティングし、ROSレベルをFL-1 チャネルでモニターした。
【００３３】
8. 核タンパク質溶解物の調製
核タンパク質溶解物を、DUALXtractcytoplasmic and nuclear protein extraction kit (Dualsystems Biotech AG, Schlieren,Switzerland)を製造者の指示書に従い用いて、上記「4. 破骨細胞形成アッセイ」と同様に処理したRAW 264.7から調製した。培養細胞をPBSで洗浄し、そしてcell溶解バッファーで処理した。遠心分離の後、核ペレットを２回洗浄し、核溶解試薬を用いて溶解した。遠心分離後、透明な、上清を核タンパク質抽出物として用いた。各々の核溶解物のタンパク質濃度は、Quick Start Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories)を用いて測定し、濃度が同一になるように調整した。メルカプトエタノールを含有する×4サンプルバッファーを混合した後、サンプルを７０℃で１０分間熱変性した。
【００３４】
9. ウエスタンブロット分析
上記で調製した、等量のタンパク質を含む核溶解物を、TGX Precast gel (BioRad Laboratories)上で電気泳動し、iBlot blotting system (Life Technologies Japan Ltd.,
Tokyo, Japan)を用いてタンパク質をポリビニリデン  ジフルオリド（PVDF)メンブレンに移した。タンパク質を映したメンブレンをQentix Western Blot Signal Enhancer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)を製造者の指示書に従い処理した。脱イオン水で洗浄した後、メンブレンをBlockAce (DS Pharma Biomedical Inc., Osaka, Japan)で３０分間ブロックし、次いで、ウサギIgG抗Nrf2工程(Santa Cruz Biotechnology Inc.) in Can Get Signal Solution-1(Toyobo Co. Ltd, Tokyo, Japan)と共に１時間インキュベートした。0.5% Tween-20 (PBS-T)を含むPBSで洗浄した後、メンブレンをhorseradish peroxidase(HRP)-conjugated protein A/G (Thermo Fisher Scientific Inc.)のCan Get Signal Solution-2(Toyobo Co. Ltd) 溶液で１時間インキュベートし、そしてPBS-Tで洗浄した。Luminata Forte (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)を用いて化学発光を生じさせ、ImageQuant LAS-4000 digital imaging system (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan)で検出した。ロードした核タンパク質の等量性を確認するために、メンブレンをRestore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific Inc.)で１５分間リプローブ（re-probe）し、洗浄し、ブロックし、そして抗ヒストン H3抗体(Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan)次いで HRP-conjugated protein A/Gでブロッティングを行った。細胞質タンパク質サンプルをHO-1, NQO1及びGCSの測定に用いた。これらの実験で用いた抗体は、抗HO-1抗体(StressMarq Biosciences Inc, Victoria, BC), 抗NQO1抗体(Abcam plc, Cambridge, MA)及び抗GCS抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.)である。ロードした細胞質タンパク質の等価性を確認するために、TGX Stain-Free Precast Gels (BioRad Laboratories) を用いた。電気泳動ゲル中のタンパク質を、PVDFに移す前に紫外線 (UV)処理で可視化した。メンブレン上の可視化されたタンパク質を、ImageQuant LAS-4000 under UV transilluminationで画像化し、そして、total protein band density の値をキャリブレーションに用いた。
【００３５】
10.インビボ骨破壊モデル
全ての動物実験プロトコルは東北大学環境・安全委員会  動物実験専門委員会によりレビューされ、承認を受けている。動物実験は、東北大学の動物実験及び関連する活動についての規則に従い実施した。インビボ骨破壊モデルでは、LPS(一回当たり10 μg/site、５回)を繰り返し注射した[Ayon Haro ER, Ukai T, Yokoyama M, Kishimoto T, Yoshinaga Y, Hara Y. Locally administered interferon-gamma accelerates lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis independent of immunohistological RANKL upregulation. J Periodontal Res 2011:46: 361-73.]。この骨破壊モデルは、RANKL依存性の破骨細胞形成及び広汎な骨破壊を引き起こした。３２匹の8週令のC57B/6 雌マウス(Japan SLC Inc., Hamamatsu, Japan)を実験に用いた。これらのマウスは、ランダムに下記４つのグループに分けられた: PBS注射グループ(コントロールグループ); 7R-ETGEペプチド注射グループ (7R-ETGEグループ);LPS-誘導骨吸収グループ(LPSグループ);及びLPS誘導骨吸収かつ7R-ETGEペプチド注射グループ(LPS + 7R-ETGEグループ)。Escherichia coli O111:B4 (Sigma Chemical Co.)由来の精製したLPSをPBS中に 1 μg/μLの濃度となるよう溶解した。2 μL of DMF 又は7R-ETGEペプチド (50mM)を含む10μL のLPS溶液をLPSグループ及びLPS + 7R-ETGEグループにそれぞれ注射した。2 μL のDMF又は7R-ETGEペプチド(50mM)を含む10μLのPBSをコントロールグループ及び7R-ETGEグループの動物にそれぞれ注射した。注射は、１、３、５、７及び９日目に、麻酔下、頭蓋骨の両目の間の正中線上の点に30ゲージの針で行った。１１日目に、頸椎脱臼によりマウスを殺処分した。切除した注射部位付近の頭蓋組織由来のRNA (グループあたり３つのRNAサンプル)を抽出し、上記で詳述したように逆転写した。遺伝子発現は、リアルタイムPCRで試験した。他の頭蓋組織サンプル（グループあたり５つのサンプル）を4%パラホルムアルデヒドのPBS溶液で１晩固定し、切片をX-ray micro tomography (microCT) system (ScanXmate-E090; Comscan Tecno Co., Ltd.,Kanagawa, Japan)でスキャンした。スキャンしたmicroCT画像を、ConeCTexpress software (Comscan Tecno Co., Ltd.)を用いて再構築した。 再構築し、DICOMファイルを得た後、Pluto software (http://pluto.newves.org/trac)を用いて3D-ボリュームレンダリングを行った。
【００３６】
11.統計解析
全てのデータは平均±標準偏差 (SD)で示す。全てのインビトロデータは、３回の独立した試験の平均である。複数データの比較は、Tukey’s test(MEPHAS; http://www.gen-info.osaka-u.ac.jp/testdocs/tomocom/tukey-e.html)で行った。P < 0.05 を統計的に有意と考えた。
【００３７】
結果
1. ETGE含有ペプチドによる破骨細胞形成及び吸収活性の阻害
まず、ETGE含有ペプチドがRANKLを介する破骨細胞形成の阻害活性を有するか否かを試験した。TRAP染色により、7R-ETGEペプチド(図1B)は、破骨細胞形成(図1A)を阻害したが、ETGE-7R (図1C)、ETGEペプチド (図1D)は破骨細胞形成を阻害しなかった。TRAP陽性の多核化細胞は、RANKL単独とRANKL及び7R-ETGEペプチドとで、統計的に相違した。RANKL単独と、RANKL及びETGE-7Rペプチドと、RANKL及びETGEペプチドとでは、統計的に差がなかった。同様の結果は、マウス初代腹腔マクロファージでも得られた(図1F-I)。7R-ETGEペプチド(図1H)は、RANKLを介する破骨細胞形成(図1G)を阻害した。TRAP陽性の多核化細胞の数は、RANKL単独とRANKL及び7R-ETGEペプチドとで統計的に相違した(図1I)。
【００３８】
次に、RANKLを介する破骨細胞マーカー遺伝子誘導に対するETGE含有ペプチドの効果を調べた。7R-ETGEペプチドは、RANKLを介するATP6v0d2, DC-STAMP及びOSCARの誘導をそれぞれ阻害したが、ETGE-7R ペプチド及びETGEペプチドは、これらの遺伝子の誘導を阻害しなかった（図2). 次に、RANKL を介する吸収活性に対するETGE含有ペプチドの効果を試験した (図3)。RANKL単独(図3A)と比較して、7R-ETGE ペプチドはRANKLを介する吸収活性を阻害した(図3B)。ETGE-7R及びETGEペプチドはRANKLを介する吸収活性に対して阻害効果を示さなかった(図3C and D)。図3Eは、吸収されたアッセイプレートの面積のパーセンテージを示す。RANKL単独とRANKL及び7R-ETGEのみが統計的に有意な差を示した。これらの結果から、細胞透過性7R-ETGEペプチドはRANKLを介する破骨細胞形成及び破骨細胞活性化を阻害するが、ETGE-7R及びETGEペプチドは、これらを阻害しないことが分かる。
【００３９】
2. 7R-ETGEペプチドによるRANKLを介する細胞内ROSの低減
次に、7R-ETGEペプチドがRANKLを介するROSシグナリングに干渉するか否かをフローサイトメトリーを用いて調べた。図４Ａ及びＢにおいて、細胞数のピークが右に行くほど、細胞中でＲＯＳが産生されていることを示す。RANKLの添加により、細胞内ROSの形成が誘導された(図4A)。このRANKLを介するROS誘導は、7R-ETGEペプチドの添加により低減されたが、ETGE-7R及びETGEペプチドでは低減は認められなかった（図4B)。これらの結果から、細胞透過性7R-ETGEペプチドがRANKLを介する細胞内ROSシグナリングを低下させることが分かる。
【００４０】
3. 7R-ETGEペプチドによる、用量依存性の核Nrf2誘導 
RANKLを介する破骨細胞形成の7R-ETGEペプチドによる阻害のメカニズムをさらに調べるために、核内Nrf2をウエスタンブロット分析で調査した（図5A)。7R-ETGEペプチドは、核内Nrf2を用量依存的に誘導した。これらのデータは、7R-ETGEペプチドが細胞保護酵素のNrf2依存性転写に好適であることを示唆している。
【００４１】
4. 7R-ETGEペプチドによる、細胞保護酵素発現の、ｍRNA及びタンパク質レベルでのアップレギュレーション
次に、HO1, NQO1及びGCSといった細胞保護酵素の発現に対する7R-ETGE ペプチドの効果を試験した (図5B)。 リアルタイムPCR分析によりこれらの３つの遺伝子が全て、7R-ETGEペプチド処理によりアップレギュレートされることが明らかになった。mRNAアップレギュレーションと同様に、HO1, NQO1及びGCSのタンパク質レベルのアップレギュレーションもウエスタンブロットにより明確に検出された (図5C)。stain-freeブロットに対する総タンパク質染色で標準化した相対バンド強度(図5D)において、7R-ETGE処理後に、HO1, NQO1及びGCSの発現が、それｚれ、2.1倍、7.2倍、及び6.8倍増加した(図5E)。これらの結果は、7R-ETGEペプチドがNrf2依存性の転写を介する細胞保護酵素の発現をアップグレードすることを示唆している。 
【００４２】
5. 実験動物における、ETGE含有ペプチドによる骨破壊の抑制 
最後に、7R-ETGEペプチドがRANKLを介する骨破壊を抑制するか否かをインビボで試験した。繰り返しでのLPS注射により、破骨細胞形成サイトカイン（RANKL及びTNF-α）のmRNAがアップレギュレートされた(図6A)。このRANKL及びTNF-α増加は、MMP9及びTRAP といった破骨細胞マーカー遺伝子のアップレギュレーションをもたらした(図6A)。7R-ETGEペプチドは、破骨細胞形成サイトカイン及び破骨細胞マーカー遺伝子発現の両方を有意に減少させた。MicroCT分析によりLPSの繰り返し注射で頭蓋骨の抗範囲での吸収が生じることが明らかとなった(図6B)。7R-ETGEペプチドは、このLPSにより誘導され、RANKLを介する骨破壊を低減した(図6B)。頭蓋骨において算出した吸収領域の面積において、LPS単独添加群と、LPS及び7R-ETGEペプチド添加群とで統計的に有意差があることが明らかとなった(図6C)。さらに、コントロールと、LPS及び7R-ETGEペプチド添加群とで統計的に有意な差はなかったことから、7R-ETGEペプチドがLPSにより誘導され、RANKLを介する骨破壊をほぼ完全に抑制したことが分かる。これらのデータは、7R-ETGEペプチドが破骨細胞形成をインビボでも抑制できることを示している。
【００４３】
上記に示すように、本願実施例では、ETGEペプチドのN末端にアルギニンを一定数結合させることにより、ETGEペプチドの活性を損なうことなく細胞透過性が付与され、その結果、破骨細胞形成及び吸収活性の阻害、細胞内ROSの低減、用量依存性の核Nrf2誘導、細胞保護酵素発現のアップレギュレーション及び実験動物での骨破壊の抑制効果をもたらすことが明らかになった。一般にあるペプチドに細胞透過性を付与するためのオリゴペプチドを結合させた場合、当該オリゴペプチドの作用により元々のペプチドの活性に影響を与えてしまうことが非常に多い。従って、本願実施例で示された効果は驚くべきものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のペプチドは、細胞内に送達されてNrf2とKeaplとの結合を妨げ、Nrf2の分解を阻止することで抗酸化ストレス酵素群の発現を上昇させることができる。従って、本発明のペプチドは、酸化ストレスに起因する疾患の予防、治療に用いることができる。例えば、本発明のペプチドは、上記のような機構により破骨細胞の活性化を阻止、抑制することができる。従って、本発明は、骨破壊疾患での破骨細胞活性化を阻止することで骨破壊の進行を停止させる治療薬の開発につながり、今後の超高齢化社会へ大きく賞献できるものと考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１  細胞透過性ペプチド
配列番号２  ＥＴＧＥペプチド
配列番号３  ７Ｒ−ＥＴＧＥペプチド
配列番号４  ＥＴＧＥ−７Ｒペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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