(57)【要約】      （修正有）【課題】スクアレンなどのイソプレノイドを生成するための組成物および方法の提供。【解決手段】スクアレン生成に関与する酵素、例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、及びスクアレンシンターゼの発現又は活性が変化している遺伝的に改変された酵母であって、イソプレノイド、好ましくは、スクアレンを生成する酵母。遺伝的に改変された酵母の１つ以上の遺伝子が、遺伝子修復オリゴ核酸塩基によって修飾することができ、遺伝的に改変された酵母を使用したスクアレンの生成方法及び、遺伝的に改変された酵母によって生成されるスクアレン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増加した濃度のイソプレノイドを生成するように修飾された遺伝的に改変された酵母を含む組成物。
【請求項２】
遺伝的に改変された酵母から抽出されるイソプレノイドを含む組成物。
【請求項３】
遺伝的に改変された酵母を含む組成物であって、
前記遺伝的に改変された酵母は１つ以上の設計変異を有する１つ以上の修飾酵素を発現し、
前記１つ以上の設計変異は、前記酵素内の規定位置に存在し、
前記酵母は、天然酵母と比較して、増加した量のイソプレノイドを生成する、
ことを特徴とする組成物。
【請求項４】
遺伝的に改変された酵母によって、スクアレンを生成する方法であって、
イソプレノイド生合成経路中の１つ以上の酵素の活性または発現を増加または減少させることを含み、
前記酵素活性または発現は１つ以上の設計変異によって増加または減少され、
前記１つ以上の設計変異は、前記酵素内の規定位置に存在し、
前記遺伝的に改変された酵母は、天然酵母と比較して、増加した量のイソプレノイドを生成する、ことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記イソプレノイドは、スクアレンである、請求項１-４のいずれかに記載の組成物また
は方法。
【請求項６】
前記酵母は、対応する天然酵母と比較して増加した濃度のスクアレンを生成する、請求項１-５のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項７】
前記遺伝的に改変された酵母は油性酵母に由来する、請求項１-６のいずれかに記載の組
成物または方法。
【請求項８】
前記酵母は、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ、Ｌ．ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌ．テトラｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃ．ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｃｕｒｖａｔａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｎｄｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから成る群から選択される、請求項１-７のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項９】
前記酵母は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、およびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓから成る群から選択される、請求項１-８のいずれ
かに記載の組成物または方法。
【請求項１０】
前記酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに由来するものではない、請求項１-６のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項１１】
前記修飾酵素は、前記イソプレノイド生合成経路中の酵素である、請求項３-１０のいず
れかに記載の組成物または方法。
【請求項１２】
前記修飾酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（「ＡＣＣａｓｅ」）、ＨＭＧ-Ｃｏ
Ａレダクターゼ、スクアレンエポキシダーゼスクアレンシンターゼ、およびＡＴＰクエン酸リアーゼから成る群から選択される、請求項３-１１のいずれかに記載の組成物または
方法。
【請求項１３】
前記修飾酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼである、請求項３-１１のいずれかに
記載の組成物または方法。
【請求項１４】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、減少した活性または発現を有する、請求項１２-１３のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項１５】
前記活性または発現は、対応する天然酵母の活性または発現の約９０％、または約８０％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％、または約５％まで減少している、請求項１２-１４
のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項１６】
前記活性または発現は、対応する天然酵母の活性または発現の９０-９５％、または８０-９０％、または７０-８０％、または６０-７０％、または５０-６０％、または４０-５０％、または約３０-４０％、または約２０-３０％、または約１０-２０％、または約５-１０％、または約２-５％まで減少している、請求項１２-１４のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項１７】
前記修飾酵素は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼである、請求項３-１６のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項１８】
前記ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼは、増加した活性または減少した発現を有する、請求項
３-１７のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項１９】
前記活性または発現は、対応する天然酵母の活性または発現の少なくとも１．２倍、または１．５倍、または２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または１０倍、または１０倍、または２０倍、または５０倍、または１００倍、または１，０００倍、または１０，０００倍、または１００，０００倍、または１，０００，０００倍以上増加している、請求項１７-１８のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２０】
前記修飾酵素は、スクアレンエポキシダーゼである、請求項３-１９のいずれかに記載の
組成物または方法。
【請求項２１】
前記スクアレンエポキシダーゼは、減少した活性または発現を有する、請求項３-２０の
いずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２２】
前記活性または発現は、対応する天然酵母の活性または発現の約９０％、または約８０％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％、または約５％まで減少している、請求項２０-２１
のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２３】
前記活性または発現は、対応する天然酵母の活性または発現の９０-９５％、または８０-９０％、または７０-８０％、または６０-７０％、または５０-６０％、または４０-５０％、または約３０-４０％、または約２０-３０％、または約１０-２０％、または約５-１
０％、または約２-５％である、請求項２０-２１のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２４】
前記修飾酵素は、スクアレンシンターゼまたはＡＴＰクエン酸リアーゼである、請求項３-２３のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２５】
前記スクアレンシンターゼまたはＡＴＰクエン酸リアーゼは、増加した活性または発現を有する、請求項３-２４のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２６】
前記活性または発現は、対応する天然酵母の活性または発現の少なくとも１．２倍、または１．５倍、または２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または１０倍、または１０倍、または２０倍、または５０倍、または１００倍、または１，０００倍、または１０，０００倍、または１００，０００倍、または１，０００，０００倍以上増加している、請求項２４-２５のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２７】
前記修飾酵素は、遺伝子修復オリゴ核酸塩基によって変異される、請求項３-２６のいず
れかに記載の組成物または方法。
【請求項２８】
前記遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド非含有分子、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドから成る群から選択される、請求項３-
２７のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項２９】
前記遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、混合二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項３-２
８のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３０】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドは、２'-ヒドロキシルの代わりに、フルオロ、クロロ、またはブロモ官能基を有する、請求項２７-２９のいずれかに
記載の組成物または方法。
【請求項３１】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドは、２'-Ｏ上に置換基を有する、請求項２７-３０のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３２】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、すべて非置換リン酸ジエステル結合によって連結されている、請求項２７-２９のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３３】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、２'置換ヌクレオチドである、請求項２７-２９のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３４】
前記２'置換ヌクレオチドは、２'-フルオロ、２'-メトキシ、２'-プロピルオキシ、２'-
アリルオキシ、２'-ヒドロキシルエチルオキシ、２'-メトキシエチルオキシ、２'-フルオロプロピルオキシ、および２'-トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドから成る群から選択される、請求項２７-３３のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３５】
前記２'置換ヌクレオチドは、２'-フルオロ、２'-メトキシ、２'-メトキシエチルオキシ
、および２'-アリルオキシ置換ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項２７-３
４のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３６】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、非置換リン酸ジエステル結合によって連結されている、請求項２９-３５のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３７】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、１００個未満のヌクレオチドであるが、５０個超
のヌクレオチドである、請求項２９-３６のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３８】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、８５個未満のヌクレオチドであるが、５０個超のヌクレオチドである、請求項２９-３６のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項３９】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドのストランドは、リンカーによって共有結合されている、請求項２９-３６のいずれかに記載の組成物または方法。
【請求項４０】
前記リンカーは、一本鎖ヘキサ、ペンタ、またはテトラヌクレオチドであり、
第１および第２のストランドは、１つの３'末端と１つの５'末端とを有する単一のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントである、請求項３９に記載の組成物または方法。
【請求項４１】
前記３'末端および５'末端はヘアピンキャップを含み、
３'末端および５'末端ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドとワトソン・クリック型塩基対形成している、請求項４０に記載の組成物または方法。
【請求項４２】
３'末端および５'末端から離れた位置における前記第１と第２のストランドとの間の接点に第２のヘアピンキャップをさらに含み、
前記第１と第２のストランドとの間のワトソン・クリック塩基対は安定化されている、請求項４０に記載の組成物または方法。
【請求項４３】
前記混合二本鎖オリゴヌクレオチドの第１および第２のストランドは、標的遺伝子の２つのフラグメントと相同である２つの領域を含む、請求項２７-４２のいずれかに記載の組
成物または方法。
【請求項４４】
請求項３-４３のいずれかに記載の遺伝的に改変された酵母から抽出されるイソプレノイ
ドを含む組成物。
【請求項４５】
前記イソプレノイドはスクアレンである、請求項４４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２００８年５月２３日出願の米国特許仮出願第６１／０５５，９３１号「酵母を使用したスクアレンの生成」に基づく優先権を主張し、この出願は、あらゆる目的のために、参照により全体として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
酵母を使用して、スクアレン等のイソプレノイドを生成するための方法および組成物が提供される。
【背景技術】
【０００３】
以下の本発明の背景技術の説明は、本発明を理解する際の補助として提供されるものにすぎず、本発明に対して、従来技術を記載または構成すると認めるものではない。
【０００４】
スクアレン等のイソプレノイドは、商業上重要な種類の脂質である。これらは、優れた潤滑性、酸化安定性、低流動点、低凝固点、高引火点、および易生分解性を有する。スクアレンは、現在、オリーブ油または冷水サメ肝油からの抽出によって、高単価で生成されている。高単価であるために、スクアレンおよびスクアラン（スクアレンの完全に水素化された誘導体）の経済的に実現可能な使用は、腕時計用潤滑油、医薬品／栄養補助食品、化粧品、香水、および高価値生成物の化学中間産物等、小市場用途である。
【０００５】
しかしながら、生分解性潤滑油、潤滑油添加剤、および油圧油の大きな潜在的市場の可能性が存在する。これらの生成物の生分解性は、特に、農業用途あるいは相当量の潤滑油または油圧油が環境中で損失され得る場合等、環境に敏感な用途に重要である。生分解性潤滑油、潤滑油添加剤、および油圧油の潜在的市場は、非常の大きく、年間約５００万メートルトンと推測される。
【０００６】
植物および動物性油脂から誘導される、生分解性潤滑油、潤滑油添加剤、および油圧油が利用可能であるが、それらは欠点を有する。典型的には、比較的に高温で固化（すなわち、寒冷気候で固化）し、高温条件下での使用には低過ぎる引火点を有する（すなわち、通常の熱気機関条件下では、故障または燃焼する）。
【０００７】
したがって、生分解性潤滑油、潤滑油添加剤、および油圧油におけるスクアレンおよびスクアランの大規模製造ならびに普及を可能にするであろう、費用効果的スクアレンの生成方法が所望される。
【０００８】
Ｃｈａｎｇら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，７８，９６３-７２）は、「大量のスクアレンおよびいくつかの多価不飽和脂肪酸」を生
成する、野生型酵母Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．ＪＣＣ２０７の発見について開示している。Ｃｈａｎｇらは、米国グアム近郊から収集された海水からＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．ＪＣＣ２０７の単離について記載しているが、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．ＪＣＣ２０７が、Ｐ．ｒｅｇｕｌｏｓａまたはＰ．ａｐｈｉｄｉｓの新種または変異体であるかどうかについては不確かである。論文では、「［Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．ＪＣＣ２０７］のスクアレン生成の効率について、異なる条件下で調べた」と述べられている。
【０００９】
Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ（Ｕｓｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｃｏｓｔ-Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏ
ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｕｓｒｅｐｏｒｔｓ．ａｔｐ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｒｔｓ／９５-０１-０１４８ＰＤＦ．ｐｄｆ））は、「脂肪性（油性）酵母の代謝特性を改変し、生合成を通してイソプレンを生成する酵母の能力を向上させる遺伝子工学の使用の提案」について開示している。具体的には、４つの酵素が、標的とされている（ＡＣＣａｓｅ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、スクアレン合成酵素、およびスクアレンエポキシダーゼ）。
【００１０】
米国特許第５，４６０，９４９号は、「酵母中のスクアレンおよび特異的ステロールの蓄積を増加させる方法」について開示している。特に、「スクアレンおよびステロールの蓄積は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発
現レベルを上昇させることによって増加する」ことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，４６０，９４９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇら  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，７８，９６３-７２
【非特許文献２】Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ  Ｕｓｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｃｏｓｔ-Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｕｓｒｅｐｏｒｔｓ．ａｔｐ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｒｔｓ／９５-０１-０１４８ＰＤＦ．ｐｄｆ）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、酵母からスクアレンを生成するための組成物および方法を提供する。
【００１４】
一側面では、イソプレノイドを生成する、遺伝的に改変された酵母が提供される。ある実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、スクアレンを生成する。
【００１５】
関連する側面では、酵母が、対応する天然酵母と比較して増加した濃度のスクアレンを生成するように遺伝的に改変される、遺伝的に改変された酵母が提供される。本発明の上述の側面のある実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、１つ以上の変異を有する、１つ以上の修飾酵素を発現する。上述の側面のある実施形態では、遺伝的に改変された酵母中の１つ以上の酵素の発現レベルは、対応する天然酵母に対して増加または減少している。関連する実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、１つ以上の変異を有する、１つ以上の修飾酵素を発現し、遺伝的に改変された酵母中の１つ以上の酵素の発現レベルは、対応する天然酵母に対して増加または減少している。ある好ましい実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母は、遺伝子修復オリゴ塩基を使用して、変異を酵素中に導入することによって、遺伝的に改変される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母は、例えば、米国特許出願第１０／４１１，９６９号および第１１／６２５，５８６号に記載のように、酵素の発現を増加または減少させるように、酵素をコードする遺伝子の翻訳開始部位またはその近傍に１つ以上の変異を導入することによって、遺伝的に改変される。ある実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母中の修飾酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（すなわち、「ＡＣＣａｓｅ」）、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、スクアレンシ
ンターゼ、およびＡＴＰクエン酸リアーゼから成る群から選択される１つ以上の酵素を含む。
【００１６】
核酸塩基は、プリン、ピリミジン、あるいはそれらの誘導体または類似体である塩基を含む。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分、例えば、任意に置換されたリボシドまたは２'-デオキシリボシドを含有する、核酸塩基である。ヌクレオシドは、リンを含有または非含有し得る、いくつかの連結部分のうちの１つによって連結可能である。非置換ホスホジエステル連結によって連結されたヌクレオシドは、ヌクレオチドと称される。本明細書で使用される「核酸塩基」は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む。
【００１７】
オリゴ核酸塩基は、核酸塩基のポリマーであって、そのポリマーは、相補的配列を有するＤＮＡとワトソン・クリック塩基対形成することによって、ハイブリダイズ可能である。オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの最終核酸塩基である、単一の５'および３'末端を有する。特定のオリゴ核酸塩基鎖は、あらゆる種類の核酸塩基を含有可能である。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的な１つ以上のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物であって、ワトソン・クリック塩基対形成によってハイブリダイズされる。核酸塩基は、デオキシリボ型またはリボ型のいずれかである。リボ型核酸塩基は、核酸塩基を含有するペントースフラノシルであって、２'炭素は、ヒドロキシル、アルキルオキシ、またはハロゲンと置換されたメ
チレンである。デオキシリボ型核酸塩基は、リボ型核酸塩基以外の核酸塩基であって、ペントースフラノシル部分を含有しない、あらゆる核酸塩基を含む。
【００１８】
オリゴ核酸塩基ストランドは、一般的に、オリゴ核酸塩基鎖と、オリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域との両方を含む。オリゴ核酸塩基ストランドは、３'端および５'端を有する。オリゴ核酸塩基ストランドが、鎖と同一の広がりを持つ場合、ストランドの３'
および５'端もまた、鎖の３'および５'末端である。
【００１９】
用語「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、以下に詳述されるように、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド非含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、および他の遺伝子修復分子を含む、オリゴ核酸塩基を表すものとして本明細書では使用される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母は、油性酵母から誘導される。ある好ましい実施形態、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、およびＲｈｏｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｎｄｏｉｄｅｓから成る群から選択される酵母から誘導される。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓから成る群から選択される酵母から誘導される。関連する実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓから成る群から選択される酵母から誘導される。ある好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから誘導されたものではない。
【００２１】
ある好ましい実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母中の修飾酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（すなわち、「ＡＣＣａｓｅ」）である。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、その活性および／または発現が、対応する天然酵母に対して減少するように、あるいは活性および／または発現が排除されるように修飾される。他の実施形態では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、その基質選択性が、改変されるように修飾されてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性および／または発現が対応する天然酵母に対して減少しているが、活性が
排除されないように修飾される。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の約９０％、または約８０％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％、または約５％まで減少するように修飾される。関連する実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の９０-９５％、または８０-９０％、または７０-８０％、または６０-７０％、または５０-６０％、または４０-５０％、または約３０-４０％、または約２０-３０％、または約１０-２０％、または約５-１０％、または約２-５％であるように修飾される。
【００２２】
ある好ましい実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母中の修飾酵素は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼである。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に
改変された酵母中のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼは、その活性および／または発現が、対
応する天然酵母に対して増加するように修飾される。他の実施形態では、ＨＭＧ-ＣｏＡ
レダクターゼは、基質選択性が改変されるように修飾されてもよい。ある好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のＨＭＧ-ＣｏＡレダク
ターゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の少なくとも１．２倍、または１．５倍、または２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または１０倍、または１０倍、または２０倍、または５０倍、または１００倍、または１，０００倍、または１０，０００倍、または１００，０００倍、または１，０００，０００倍以上まで増加するように修飾される。
【００２３】
ある好ましい実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母中の修飾酵素は、スクアレンエポキシダーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母中のスクアレンエポキシダーゼは、その活性および／または発現が、対応する天然酵母に対して減少するように、あるいは活性および／または発現が排除されるように修飾される。他の実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、その基質選択性が改変されるように修飾されてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、スクアレンエポキシダーゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母に対して減少しているが、活性が排除されないように修飾される。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のスクアレンエポキシダーゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の約９０％、または約８０％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％、または約５％まで減少するように修飾される。関連する実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のスクアレンエポキシダーゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の９０-９５％、または８０-９０％、または７０-８０％、または
６０-７０％、または５０-６０％、または４０-５０％、または約３０-４０％、または約２０-３０％、または約１０-２０％、または約５-１０％、または約２-５％であるように修飾される。
【００２４】
ある好ましい実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母中の修飾酵素は、スクアレンシンターゼである。いくつかの好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母中のスクアレンシンターゼは、その活性および／または発現が、対応する天然酵母とに対して増加するように修飾される。他の実施形態では、スクアレンシンターゼは、その基質選択性が、改変されるように修飾されてもよい。ある好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のスクアレンシンターゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の少なくとも１．２倍、または１．５倍、または２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または１０倍、ま
たは１０倍、または２０倍、または５０倍、または１００倍、または１，０００倍、または１０，０００倍、または１００，０００倍、または１，０００，０００倍以上増加するように修飾される。
【００２５】
ある好ましい実施形態では、本明細書に提供される遺伝的に改変された酵母中の修飾酵素は、ＡＴＰクエン酸リアーゼである。いくつかの実施形態では、ＡＴＰクエン酸リアーゼ遺伝子のサブユニット（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＰクエン酸リアーゼ；Ｇｅｎｏｌｅｖｅｒｅｓ  ＹＡＬＩ０Ｄ２４４３１ｇおよびＹＡＬＩ０Ｅ３４７９３ｇ）の一方または両方が、本明細書に説明されるように修飾される。ある実施形態では、修飾酵母中のＡＴＰクエン酸リアーゼの活性は、単一サブユニットのホロ酵素を含む、動物ＡＴＰリアーゼ遺伝子の挿入および／または異種発現によって増加する。いくつかの好ましい実施形態では遺伝的に改変された酵母中のＡＴＰクエン酸リアーゼは、その活性および／または発現が、対応する天然酵母に対して増加するように修飾される。ある好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝的に改変された酵母中のＡＴＰクエン酸リアーゼの活性および／または発現が、対応する天然酵母の活性および／または発現の少なくとも１．２倍、または１．５倍、または２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または１０倍、または１０倍、または２０倍、または５０倍、または１００倍、または１，０００倍、または１０，０００倍、または１００，０００倍、または１，０００，０００倍以上増加するように修飾される。
【００２６】
上述の側面のある好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝子的に修飾された酵母である。他の好ましい実施形態では、遺伝的に改変された酵母は、遺伝子導入酵母である。さらなる実施形態は、遺伝子導入および遺伝子改変の両方を含む、酵母である。
【００２７】
本明細書で使用される語句「遺伝的に改変された酵母」は、遺伝子導入酵母または遺伝的に修飾された酵母を指す。
【００２８】
本明細書で使用される用語「天然酵母」は、遺伝子的に修飾された（すなわち、遺伝子導入または遺伝子的に改変された）、酵母を指す。天然酵母は、野生型酵母ならびに特定の特性を達成するように選択的に繁殖された酵母を含む。
【００２９】
語句「遺伝子導入酵母」は、別の酵母種または非酵母種からの遺伝子を有する、酵母を指す。そのような遺伝子は、「導入遺伝子」と称される場合がある。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「標的遺伝子」は、修飾される酵素をコードする遺伝子を指す。
【００３１】
語句「遺伝的に改変された酵母」は、１つ以上の設計変異を含有する、導入遺伝子および／または修飾酵素等の１つ以上の遺伝子的修飾を有する、酵母を指す。そのような設計変異は、天然酵素と異なる活性を有する、修飾酵素をもたらす場合がある。そのような差異として、基質特異性または活性レベルの差異を含み得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子導入酵母」は、「遺伝的に改変された酵母」の種類のうちの１つである。
【００３２】
語句「油性酵母」は、有機体から抽出可能な少なくとも約２０％の乾燥菌体重量（ｃｄｗ）脂質を含有する、酵母を指す。少なくとも約２０％のｃｄｗ脂質レベルを蓄積するための能力は、特定の属に限定されない。約２０％超のｃｄｗ脂質は、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｐｏｆｅｒ、Ｌ．ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｌ．ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃ．ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｃｕｒｖａｔａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて報告されている。例えば、Ｔａｔｓｕｍｉらの米国特許第４，０３２，４０５号およびＲａｔｔｒａｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．１（１９９８）を参照されたい。
【００３３】
本明細書で使用される用語「約」は、定量的観点から、±１０％を意味する。例えば、「約３％」は、２．７-３．３％を包含し、「約１０％」は、９-１１％を包含するであろう。
【００３４】
別途指示がない限り、本明細書に記載される任意の割当は、重量パーセントである。
【００３５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の説明および請求項から明白となるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
遺伝的に改変された酵母によって生成される増加した量のイソプレノイドは、イソプレノイド生合成経路内の１つ以上の酵素を変異または修飾の結果であり得る。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（すなわち、「ＡＣＣａｓｅ」）、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクタ
ーゼ、スクアレンエポキシダーゼ、およびスクアレンシンターゼを修飾または変異することができる。
【００３７】
好ましい実施形態では、修飾酵素を発現する遺伝的に改変された酵母は、本明細書に説明されるように、遺伝子修復オリゴ核酸塩基の使用を通して、酵素中の変異を導入することによって生成される。本方法は、当技術分野において周知の方法のいくつかのうちのいずれかによって、着目標的遺伝子の特異的変異を含有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基を酵母細胞中に導入し（例えば、マイクロキャリア、マイクロファイバ、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＬｉＯＡｃ、微粒子銃、スフェロプラスト化、および／またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，ＣＭ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｗｏｎ-Ｃｈｕｎｇ，ＫＪ．（２００５）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：９０４-９１３参照）、そして、
変異酵素を有する細胞を識別することを含む。
【００３８】
本発明の一側面では、本明細書に開示される遺伝的に改変された酵母から抽出されるイソプレノイドが提供される。関連する側面では、本明細書に説明される遺伝的に改変された酵母から抽出されるスクアレンが提供される。
【００３９】
本発明の別の側面では、イソプレノイド、好ましくは、スクアレンを生成する方法が提供される。ある実施形態では、本方法は、本明細書に説明される遺伝的に改変された酵母を提供し、そして酵母からスクアレンを抽出することを含む。
【００４０】
本発明の上述の側面のさらなる実施形態では、上述の遺伝的に改変されたまたは遺伝子導入酵母から抽出されるイソプレノイドが提供される。
【００４１】
酵母の種類
本明細書に開示される組成物および方法は、いくつかの酵母種または菌株のうちのいずれかに基づき得る。ある実施形態では、酵母は、油性酵母である。例えば、酵母は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ（例えば、ＡＴＣＣ  ２０５０８）、Ｙａｒｒ
ｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ  ２０６８８またはＡＴＣＣ  ９０８１１）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ（例えば、ＡＴＣＣ  １０７８８またはＡＴＣＣ  ２０４０９１）、およびＲｈｏｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓであってもよい。発明者らは、ある他の酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ等）と比較して、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓは、多くの培養条件下、幅広い基質上で非常に高い細胞密度に成長し、大量の総脂質を生成することを発見した。故に、ある実施形態では、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓは、本明細書に開示される組成物および方法にとって、特に有用であり得る。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのために開発され、特異的である、多くの遺伝子的手段（例えば、形質転換プロトコル、選択可能マーカー）が存在する。したがって、いくつかの実施形態では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが、本明細書に開示される組成物および方法にとって、特に有用であり得る。
【００４２】
遺伝子修復オリゴ核酸塩基
本発明は、以下に詳述されるような配座および化学的性質を有する、「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」によって実施することができる。本発明の「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド非含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、および後述の特許および特許公開に記載の他の遺伝子修復分子を含む。また、本発明の「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、「リコンビナジェニックオリゴ核酸塩基」、「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド」、「キメラオリゴヌクレオチド」、「混合二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）」、「ＲＮＡ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）」、「ジーンターゲッティングオリゴヌクレオチド」、「ゲノプラスト」、「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」、「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異ベクター」、「二本鎖変異ベクター」、および「ヘテロ二本鎖変異ベクター」を含む、他の名称を使用して、公開されている科学および特許文献中にも記載されている。
【００４３】
Ｋｍｉｅｃによる米国特許第５，５６５，３５０号（Ｋｍｉｅｃ  Ｉ）およびＫｍｉｅｃによる米国特許第５，７３１，１８１号（Ｋｍｉｅｃ  ＩＩ）（参照することによって、本明細書に援用される）に記載される配座と化学的性質とを有する、オリゴ核酸塩基は、本発明の「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」としての使用に好適である。Ｋｍｉｅｃ  Ｉおよび／またはＫｍｉｅｃ  ＩＩにおける遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、２つの相補的ストランドを含有し、その一方は、他方のストランドのＤＮＡ型ヌクレオチドと塩基対形成する塩基である、ＲＮＡ型ヌクレオチドのうちの少なくとも１つのセグメント（「ＲＮＡセグメント」）を含有する。
【００４４】
Ｋｍｉｅｃ  ＩＩは、プリンおよびピリミジン塩基含有非ヌクレオチドが、ヌクレオチドと置換可能であることを開示している。本発明のために使用可能な付加的遺伝子修復分子は、米国特許第５，７５６，３２５号、第５，８７１，９８４号、第５，７６０，０１２、５，８８８，９８３、５，７９５，９７２、第５，７８０，２９６号、第５，９４５，３３９号、第６，００４，８０４、および第６，０１０，９０７号、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号、国際特許公開第ＷＯ９８／４９３５０号、第ＷＯ９９／０７８６５号、第ＷＯ９９／５８７２３号、第ＷＯ９９／５８７０２号、および第ＷＯ９９／４０７８９に記載されている（それぞれ、全体として本明細書に援用される）。
【００４５】
一実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドが、２'-ヒドロキシルをフルオロ、クロロ、またはブロモ官能基と置き換える、または２'-Ｏ上に置換基を置くことによってＲＮａｓｅ耐性となる、混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。好適な置換基として、Ｋｍｉｅｃ  ＩＩによって教示される、置換基を含む。代替置換基として、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）
号によって教示される置換基と、特許公開第ＥＰ６２９  ３８７号および第ＥＰ６７９  ６５７（集合的に、Ｍａｒｔｉｎの出願）によって教示される置換基とを含む（参照することによって、本明細書に援用される）。本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、あるいはＭａｒｔｉｎの出願またはＳｐｒｏａｔに記載される置換基と置換される２'-ＯＨを有するリボヌクレオチドの２'-フルオロ、クロロ、またはブロモ誘導体は、「２'-置換リボヌクレオチド」と称される。本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル連結、あるいはＫｍｉｅｃ  ＩまたはＫｍｉｅｃ  ＩＩによって教示される非天然連結のいずれかによって、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドに連結された、２'-ヒドロキシルまたは２'-置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル連結、あるいはＫｍｉｅｃ  ＩまたはＫｍｉｅｃ  ＩＩによって教示される非天然連結のいずれかによって、遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドに連結することができる２'-Ｈを有するヌクレオチドを意味する。
【００４６】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、非置換リン酸ジエステル結合によってのみ連結された、混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、連結は、置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、およびＫｍｉｅｃ  ＩＩによって教示される非リン系連結による。さらに別の実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレオチド中の各ＲＮＡ型ヌクレオチドは、２'置換ヌクレオチドである。２'-置換リボヌ
クレオチドの特定の好ましい実施形態は、２'-フルオロ、２'-メトキシ、２'-プロピルオキシ、２'-アリルオキシ、２'-ヒドロキシルエチルオキシ、２'-メトキシエチルオキシ、２'-フルオロプロピルオキシ、および２'-トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２'-置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、２'-フルオロ、２'-メトキシ、２'-メトキシエチルオキシ、および２'-アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、非置換リン酸ジエステル結合によって連結される。
【００４７】
単一種類の２'-置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、より便宜的に合成されるが、本発明の方法は、２つ以上の種類のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する、混合二本鎖オリゴヌクレオチドによって実施可能である。ＲＮＡセグメントの機能は、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチド間へのデオキシヌクレオチドの導入により生じる中断によって影響され得ず、故に、用語「ＲＮＡセグメント」は、「断続ＲＮＡセグメント」等を包含する。非断続ＲＮＡセグメントは、連続的ＲＮＡセグメントと称される。別の実施形態では、ＲＮＡセグメントは、ＲＮａｓｅ耐性と非置換２'-ＯＨの交互ヌクレオチドを含有し得る。混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１００未満、より好ましくは、８５未満であるが、５０超のヌクレオチドを有する。第１および第２のストランドは、ワトソン・クリック塩基対形成する。一実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのストランドは、第１および第２のストランドが、単一の３'と単一の５'端とを有する、単一のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように、一本鎖ヘキサ、ペンタ、またはテトラヌクレオチド等のリンカーによって共有結合している。３'および５'端は、「ヘアピンキャップ」の追加によって保護可能であって、それによって、３'および
５'末端ヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対形成する。
加えて、第２のヘアピンキャップは、第１と第２のストランドとの間のワトソン・クリック塩基対が安定化されるように、３'および５'端から離れた第１と第２のストランドとの間の接点に存在することができる。
【００４８】
第１および第２のストランドは、標的遺伝子の２つのフラグメントと相同である、すなわち、標的遺伝子と同一配列を有する、２つの領域を含有する。相同領域は、ＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含有し、接続ＤＮＡセグメントの１つ以上のＤＮＡ型ヌクレオチドを含有してもよく、また、介在ＤＮＡセグメント内に存在しないＤＮＡ型ヌクレオチド
を含有してもよい。相同の２つの領域は、「異種領域」と称される、標的遺伝子の配列と異なる配列を有する領域によって、分離され、かつそれぞれ、それに隣接する。異種領域は、１つ、２つ、または３つの不整合ヌクレオチドを含有し得る。不整合ヌクレオチドは、連続的であり得る、または代替として、標的遺伝子と相同である１つまたは２つのヌクレオチドによって分離することができる。代替として、異種領域はまた、１つ、２つ、３つ、または５つ以下のヌクレオチドの挿入断片も含有し得る。代替として、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、混合二本鎖オリゴヌクレオチドからの１つ、２つ、３つ、または５つ以下のヌクレオチドの欠失によってのみ、標的遺伝子の配列と異なってもよい。異種領域の長さおよび位置は、この場合、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、異種領域内に存在しなくても、欠失の長さであるとみなされる。２つの相同領域に対して相補的標的遺伝子のフラグメント間の距離は、理想的には、置換または複数の置換が意図される場合の異種領域の長さである。異種領域が、挿入断片を含有する場合、相同領域は、それによって、遺伝子中のそれらの相補的相同フラグメントからさらに離れて、混合二本鎖オリゴヌクレオチド中で分離され、異種領域が欠失をコードする場合、その逆が適用される。
【００４９】
混合二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントはそれぞれ、相同領域、すなわち、標的遺伝子のフラグメントと配列が等しい領域の一部であって、そのセグメントは、合わせて、好ましくは、少なくとも１３のＲＮＡ型ヌクレオチド、好ましくは、１６-２５の
ＲＮＡ型ヌクレオチド、さらにより好ましくは、１８-２２のＲＮＡ型ヌクレオチド、最
も好ましくは、２０のヌクレオチドを含有する。一実施形態では、相同領域のＲＮＡセグメントは、介在ＤＮＡセグメントによって分離され、それに隣接する、すなわち、「それによって接続される」。一実施形態では、異種領域の各ヌクレオチドは、介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含有する、介在ＤＮＡセグメントは、「変異誘発セグメント」と称される。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号、米国特許第６，２７１，３６０号、第６，４７９，２９２号、および第７，０６０，５００号（参照することによって、全体として本明細書に援用される）に開示される、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異ベクター（ＳＳＯＭＶ）である。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、第５，８７１，９８４号、第５，７６０，０１２号、第５，８８８，９８３号、第５，７９５，９７２号、第５，７８０，２９６号、第５，９４５，３３９号、第６，００４，８０４号、および第６，０１０，９０７号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／４９３５０号、第ＷＯ９９／０７８６５号、第ＷＯ９９／５８７２３号、第ＷＯ９９／５８７０２号、および第ＷＯ９９／４０７８９号に記載される、変異ベクターと同一原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、変異誘発領域と称される、所望の遺伝子的改変を含有する領域によって分離される標的配列と相同である、２つの領域を含有する。変異誘発領域は、標的配列中の相同領域を分離する配列と同一長であるが、異なる配列を有する、配列を有し得る。そのような変異誘発領域は、置換を生じさせ得る。代替として、ＳＳＯＭＶ中の相同領域は、相互に連続的であり得る一方、同一配列を有する標的遺伝子中の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上のヌクレオチドによって分離される。そのようなＳＳＯＭＶは、ＳＳＯＭＶに欠如しているヌクレオチドの標的遺伝子から欠失を生じさせる。最後に、相同領域と等しい標的遺伝子の配列は、標的遺伝子中で隣接するが、ＳＳＯＭＶの配列中の１つ、２つ、またはそれ以上のヌクレオチドによって分離されてもよい。そのようなＳＳＯＭＶは、標的遺伝子の配列中に挿入断片を生じさせる。
【００５１】
ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、未修飾リン酸ジエステル結合によって連結されるが、３'末端および／または５'末端ヌクレオチド間連結、あるいは代替として、２つの３'末端
および／または５'末端ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートまたはホスホロアミ
ダートであり得る、デオキシリボヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、ヌクレオチド間連結は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチド間の連結であって、３'端ヌクレオチドま
たは５'端ヌクレオチドとブロッキング置換基との間の連結を含まない（上記参照）。特
定の実施形態では、ＳＳＯＭＶの長さは、２１-５５のデオキシヌクレオチドであって、
故に相同領域の長さは、全長少なくとも２０のデオキシヌクレオチドであって、少なくとも２つの相同領域はそれぞれ、少なくとも８のデオキシヌクレオチドの長さを有するはずである。
【００５２】
ＳＳＯＭＶは、標的遺伝子のコードまたは非コードストランドのいずれかに相補的であるように設計することができる。所望の変異が、単一塩基の置換である場合、両変異誘発ヌクレオチドがピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果の達成と一致する範囲において、相補的ストランド中の両変異誘発ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドは、ピリミジンであることが好ましい。特に、トランスバージョン変異をコードする、すなわち、ＣまたはＴ変異誘発ヌクレオチドが、それぞれ、相補的ストランド中のＣまたはＴヌクレオチドと不整合である、ＳＳＯＭＶが好ましい。
【００５３】
オリゴデオキシヌクレオチドに加え、ＳＳＯＭＶは、リンカーを通して５'末端炭素に
付着される、５'ブロッキング置換基を含有し得る。リンカーの化学的性質は、その長さ
以外は重要ではなく、好ましくは、少なくとも６原子長であって、リンカーは、柔軟性があるはずである。ビオチン、コレステロール、または他のステロイド、あるいは非インターカレート型陽イオン蛍光色素等の種々の非毒性置換基を使用することができる。特に、ＳＳＯＭＶを生成するための試薬として好ましいのは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｖａ．）からＣｙ３（ＴＭ）およびＣｙ５（ＴＭ）として市販されている試薬であって、オリゴヌクレオチド中への混入によって、それぞれ、３，３，３'，３'-テトラメチルＮ，Ｎ'-イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカル
ボシアニン色素を産出する、ブロッキングされたホスホロアミダイトである。Ｃｙ３は、最も好ましい。インドカルボシアニンが、Ｎ-オキシアルキル置換される場合、５'末端ホスフェートを伴うホスホジエステルとして、オリゴデオキシヌクレオチドの５'末端に便
利に連結することができる。色素とオリゴデオキシヌクレオチドとの間の色素リンカーの化学的性質は重要ではなく、合成上の便宜性のために選択される。市販のＣｙ３ホスホラミダイトが、指示通りに使用される場合、結果として生じる５'修飾は、ブロッキング置
換基およびリンカーを含み、合わせて、Ｎ-ヒドロキシプロピルＮ'-ホスファチジルプロ
ピル３，３，３'，３'-テトラメチルインドモノカルボシアニンとなる。
【００５４】
好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素は、インドール環の３および３'位
置において四置換される。理論に制限されることなく、これらの置換は、色素がインターカレート型色素であることを妨げる。これらの位置における置換基の識別は重要ではない。加えて、ＳＳＯＭＶは、３'ブロッキング置換基を有し得る。同様に、３'ブロッキング置換基の化学的性質は、重要ではない。
【００５５】
異種発現
ある実施形態では、異種発現は、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｄ）中の外来性遺伝子または内在性遺伝子の余剰コピーを発現させるために使用される。酵母中の異種発現は、当技術分野において周知の方法を使用して行なうことが可能である。異種発現を使用した酵母中の外来性遺伝子または内在性遺伝子の余剰コピーの発現は、（ａ）転写開始のためのプロモーター配列、（ｂ）転写の終結のためのターミネーター配列、および（ｃ）選択可能マーカーを含む、ベクターの使用を伴ってもよい。異種発現および発現ベクターは、例えば、Ｍａｄｚａｋ，Ｃ，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ，Ｃ，ａｎｄ
Ｂｅｃｋｅｒｉｃｈ，Ｊ-Ｍ．，２００４  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｎ-Ｃｏ
ｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０９：６３-８１
に記載されているようなものであってもよい。使用し得る選択可能マーカー遺伝子の非限定的リストとして、ｕｒａ３、ｌｙｓ５、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ａｄｅ１、ハイグロマイシン耐性をコードするＥ．ｃｏｌｉ  ｈｐｈ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＳＵＣ２を含む。使用し得るプロモーターの非限定的リストとして、ｐＬＥＵ２、ｐＸＰＲ２、ｐＰＯＸ２、ｐＰＯＴ１、ｐＩＣＬ１、ｐＧ３Ｐ、ｐＭＴＰ、ｐＴＥＦ、およびｐＲＰＳ７を含む。使用し得るターミネーター配列の非限定的リストとして、ＸＰＲ２ｔ、ＬＩＰ２ｔ、およびＰＨＯ５ｔを含む。
【００５６】
ある実施形態では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＬＹＳ１（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ  ＹＡＬＩ０Ｂ１５４４４ｇ）、ＴＲＰ１（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ  ＹＡＬＩ０Ｂ０７６６７ｇ）、およびＡＤＥ１（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ  ＹＡＬＩ０Ｅ３３０３３ｇ）遺伝子のうちの１つ以上が、選択可能マーカーとして使用される。
【００５７】
ある実施形態では、統合的発現ベクターとして、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ解糖経路遺伝子、アルカンまたはグリセロール利用遺伝子、ＡＣＣ１、ＨＭＧ１、ＥＲＧ１、およびＥＲＧ９から成る群から選択される１つ以上のプロモーターおよび／またはターミネーター配列を含む。
【００５８】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの一方または両方のサブユニットのある実施形態では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ中のＡＴＰクエン酸リアーゼ（Ｇｅｎｏｌｅｖｅｒｅｓ  ＹＡＬＩ０Ｄ２４４３１ｇおよびＹＡＬＩ０Ｅ３４７９３ｇ）は、過剰発現される。
【００５９】
修飾酵素
脂肪酸生合成経路およびイソプレノイド生合成経路中に伴われる酵素をコードする遺伝子は、変異のための好ましい標的である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、アシルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする。他の実施形態では、標的遺伝子は、ＨＭＧ-Ｃ
ｏＡレダクターゼをコードする。他の実施形態では、標的遺伝子は、スクアレンエポキシダーゼをコードする。他の実施形態では、標的遺伝子は、スクアレンシンターゼをコードする。ある実施形態では、標的遺伝子は、ＡＴＰクエン酸リアーゼをコードする。変異は、酵素の活性を減少または排除する、酵素の活性を向上させる、あるいは酵素の活性を改変する（例えば、基質選択性を変化）させるように設計することができる。
【００６０】
野生型油性酵母中では、アセチルＣｏＡは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）を介して、脂肪酸生合成中へと広範囲に導かれる。したがって、スクアレン合成に利用可能なアセチルＣｏＡの量を増加させるためには、ＡＣＣａｓｅの酵素的発現または特異的活性を減少することが望ましい。ＡＣＣａｓｅの例示的遺伝子配列は、登録番号Ｚ７１６３１に示されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＡＣＣ１遺伝子である。故に、ＡＣＣａｓｅの細胞内活性が減少したある実施形態では、メバロン酸塩生合成とトリグリセリド生合成との間の分岐点における酵素は、油脂合成のために区分されたアセチルＣｏＡの量を減少させ、それによって、イソプレン経路へのその可用性を増加させるであろう。
【００６１】
ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性は、イソプレン生合成のための律速酵素である。ＨＭ
Ｇ-ＣｏＡレダクターゼの例示的遺伝子配列は、それぞれ、登録番号ＮＣ＿００１１４５
およびＮＣ＿００１１４４に示されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＨＭＧ１ならびにＨＭＧ１遺伝子を含む。故に、ある実施形態では、ＨＭＧ-Ｃｏ
Ａレダクターゼ活性は、ＨＭＧＲ遺伝子を修飾し、転写を増加させ、得られた蛋白質を安
定化させ、および／または生成物のフィードバック阻害を減少させることによって増加するであろう。
【００６２】
酵母中のＡＣＣａｓｅ活性の減少および／またはＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ活性の増
加は、経路中の後続酵素の操作によって、いくつかの関連イソプレノイド生成物を生成可能な核となるイソプレノイド生成有機体を生じさせ得る。
【００６３】
スクアレンエポキシダーゼは、ステロール生合成の第１の関与段階に触媒作用を及ぼす。スクアレンエポキシダーゼの例示的遺伝子配列は、登録番号ＮＣ＿００１１３９に示されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＥＲＧ１遺伝子である。故に、ある実施形態では、スクアレンエポキシダーゼ活性および／または発現は、酵母、例えば、酵素のアミノ酸配列中の触媒的に重要な残留物によって、減衰されるであろう。
【００６４】
スクアレンシンターゼは、２つのｃｌ５イソプレン前駆体（ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ））を濃縮することによって、スクアレンの合成に触媒作用を及ぼす。スクアレンシンターゼの例示的遺伝子配列は、登録番号ＮＣ＿００１１４０に示されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＥＲＧ９遺伝子である。故に、ある実施形態では、スクアレンシンターゼ活性および／または発現は、酵母中で増加するであろう。
【００６５】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．８）は、クエン酸塩を触媒的に開裂し、アセチルＣｏＡおよびオキサロ酢酸を生成する。アセチルＣｏＡは、脂肪酸生合成のためのＡＣＣａｓｅによって、イソプレンおよびスクアレン等の誘導体の生成のためのアセチルＣｏＡアセチル転移酵素によって使用される。
【００６６】
代謝性変化の結果は、アセチルＣｏＡからスクアレンへと炭素を導き、この炭素流の主要な競合経路を減衰させ、生成されるスクアレンの大幅な増加をもたらすことになるであろう。
【００６７】
酵母細胞中への遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達
遺伝子修復
オリゴ核酸塩基を伴う酵母細胞を形質転換するために、任意の一般的に知られている方法が、本発明の方法において使用可能である。例示的方法として、マイクロキャリアまたはマイクロファイバの使用、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＬｉＯＡｃ、微粒子銃、スフェロプラスト化、および／またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，ＣＭ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ，ａｎｄ  Ｋｗｏｎ-Ｃｈ
ｕｎｇ，ＫＪ．（２００５）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
４２：９０４-９１３参照）を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、金属マイクロキャリア（ミクロスフェア）は、投射物体の貫入（微粒子銃送達）によって、細胞壁を有する酵母細胞中へとＤＮＡの大量のフラグメントを導入するために使用されるものであって、当業者には周知である。マイクロキャリアを選択するための一般的技術および、それらを投射するためのデバイスは、米国特許第４，９４５，０５０号、第５，１００，７９２号、および第５，２０４，２５３号に記載されている。
【００６９】
本発明の方法においてマイクロキャリアを使用するための特定の条件は、国際公開第ＷＯ９９／０７８６５号、第ＵＳ０９／１２９，２９８号に記載されている。例えば、氷冷マイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２、および０．１Ｍスペルミジンをその順番で添加し、例えば、１０分間、渦流攪拌することによって、混合物を徐々に撹拌し、１０分間、室温で放置し
、それによって、マイクロキャリアが、５倍量のエタノール中に希釈され、遠心分離され、１００％エタノール中で再懸濁される。接着溶液中の成分の例示的濃度として、８-１
０μｇ／μＬマイクロキャリア、１４-１７μｇ／μＬ混合二本鎖オリゴヌクレオチド、
１．１-１．４Ｍ  ＣａＣｌ２、および１８-２２ｍＭスペルミジンを含む。一実施例では、成分濃度は、８μｇ／μＬマイクロキャリア、１６．５μｇ／μＬ混合二本鎖オリゴヌクレオチド、１．３Ｍ  ＣａＣｌ２、および２１ｍＭ  スペルミジンである。
【００７０】
また、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、マイクロファイバを使用して細胞壁および細胞膜に貫通させる本発明の実施のために、酵母細胞中に導入することができる。Ｃｏｆｆｅｅらの米国特許第５，３０２，５２３号は、Ｂｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ  Ｓｗｅｅｔの懸濁トウモロコシ培養物の形質転換を促進するために、３０ｘ０．５μｍおよび１０ｘ０．３μｍ炭化ケイ素ファイバの使用について記載している。マイクロファイバを使用して、酵母細胞の形質転換のために、ＤＮＡを導入するために使用し得る任意の機械的技術が利用され、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達可能である。
【００７１】
遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバ送達の一実施例は、以下の通りである。滅菌マイクロファイバ（２μｇ）を、約１０μｇの混合二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する、１５０μＬの酵母成長媒体中に懸濁させる。酵母培養物を沈殿させ、等量の濃縮細胞および滅菌ファイバ／ヌクレオチド懸濁液を、１０分間、渦流攪拌し、培養皿に撒く。選択培地は、特定の形質のために適切となるように、直ちに、または最大約１２０時間の遅延を伴って、適用される。
【００７２】
別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、酵母細胞から誘導されるプロトプラストのエレクトロポレーションによって、酵母細胞に送達可能である。プロトプラストは、当業者に周知の技術に従って、酵母細胞の酵素的処理によって形成される（例えば、Ｇａｌｌｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５５：８９-１０７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ
，Ｎ．Ｊ；Ｋｉｐｐ ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３３：２１３-２２１，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔ
ｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．参照）。プロトプラストは、エレクトロポレーションに先立って、成長培地中で培養される必要がない。エレクトロポレーションの例証的条件は、０．６-
４μｇ／ｍＬの遺伝子修復オリゴ核酸塩基の濃度を伴う、総体積０．３ｍＬ中、３ｘ１０５のプロトプラストである。
【００７３】
さらに別の別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、酵母細胞のウィスカーまたはマイクロインジェクションによって、酵母細胞に送達可能である。ウィスカーと呼ばれる技術は、本質的に、Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：９４１-９４８に記載されているように行なわれる。遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、ウィス
カーに添加され、酵母細胞を形質転換するために使用される。遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、遺伝子修復が、オリゴヌクレオチドと標的遺伝子中の標的配列との間で触媒作用を受けるように、酵母細胞中にリコンビナーゼおよび／または遺伝子修復錯体を形成可能な蛋白質をコードする配列を含むプラスミドと共インキュベートしてもよい。
【００７４】
所望の修飾酵素を有する酵母の選択
修飾酵素を発現する酵母は、いくつかの手段のうちのいずれかを通して同定可能である。一方法は、同一実験中、遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）を使用して、選択可能遺伝子変換（すなわち、マーカー）および非選択可能遺伝子変換（例えば、着目標的遺伝子）の両方を標的にする、同時遺伝子変換方式である。このようにして、ＧＲＯＮが送達されなかった、またはＲＯＮによって指定された遺伝子変換を伝達不可能であった細胞は、排除されるであろう。非関連遺伝子を標的にするＧＲＯＮの送達は、ある頻度において
、選択的であることが期待されないため、成功裏に選択された遺伝子変換を伴うコロニーは、他の標的遺伝子のうちの１つ中にも遺伝子変換を有することが予測されるであろう。遺伝子変換事象は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析によって解明されるであろう。
【００７５】
したがって、ゲノムＤＮＡは、酵母から抽出され、各標的に対して、ＳＮＰ検出技術、例えば、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＰＣＲ）を使用して、個々のＤＮＡ試料が選別される。陽性酵母中の配列変化を個別に確認するために、標的遺伝子の適切な領域が、ＰＣＲ増幅され、結果として生じる単位複製配列が、直接配列決定されるか、またはクローニングされ、多重挿入断片が配列決定されてもよい。
【００７６】
代替として、着目遺伝子中への変異の混入は、抽出された核酸中の単一ヌクレオチド変異を検出するように設計されたいくつかの分子生物学技術のうちのいずれかによって同定可能である（例えば、ＰＣＲおよび単一ヌクレオチドプライマ伸長分析などの増幅方法）。より大きな変異は、変異される標的遺伝子の領域の増幅および配列決定によって検出可能である。
【００７７】
代替として、修飾酵素を含有する酵母または酵母細胞は、例えば、酵母によって生成される、イソプレノイドの組成の分析によって同定可能である。したがって、酵母を成長させ、油脂を抽出し、当技術分野において周知の方法（例えば、ガスクロマトグラフィ）を使用して分析可能である。
【実施例】
【００７８】
実施例１  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ
ｇｌｕｔｉｎｉｓ形質転換系
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ（ＡＴＣＣ菌株２０５０８）およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ（ＡＴＣＣ菌株１０７８８と２０４０９１）形質転換系を生成するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対するカナマイシン耐性を与えるＫＡＮＭＸ発現カセット（プロモーター遺伝子ターミネーター）を選択可能マーカーとして使用され、カナマイシン感受性から耐性に菌株を遺伝子変換する（例えば、Ｂａｕｄｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２１）３３２９-３３３０参照）。菌株は、発現カセット単独によって形質転換され、同
様に、ＫＡＮＭＸは、ＤＮＡ複製起点を含有するＲ．ｇｌｕｔｉｎｕｓ（例えば、Ｏｌｏｋｅ．Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．（２００６）Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５（４）：３２７-３３２参照）中に現れ
る、プラスミドの制限フラグメントに結合される。ＤＮＡは、エレクトロポレーション、ＬｉＯＡｃ、微粒子銃、スフェロプラスト化、および／またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｉｉｍ（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，ＣＭ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｗｏｎ-Ｃｈ
ｕｎｇ，Ｋ．Ｊ．（２００５）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：９０４-９１３）によって、Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲ．ｇｌｕｔｉｎｉ
ｓ中に導入される。
【００７９】
実施例２  選択可能マーカー
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ中にウラシル栄養要求性変異株を生成するために、抗代謝性５-フルオロオロ
チン酸を含有する最少培地中で細胞を成長させ、ｕｒａ３またはｕｒａ５遺伝子中に病変を伴う耐性変異株を選択した。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓの３３の安定した５-ＦＯＡＲコロニーおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓの２０の
安定した５-ＦＯＡＲコロニーを堆積させた。Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔ
ｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓの両方から野生型ＵＲＡ３遺伝子をクローニングし、５-ＦＯＡＲ分離株中の変異株ｕｒａ３遺伝子の配列を決定する。
【００８０】
他の栄養要求性マーカーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の機能的相補性によってクローニングされる（Ｈｏ，Ｙ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．（１９８８）Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２１（１）：１-８参照）。ゲノムおよび／またはｃＤ
ＮＡライブラリは、菌株ＹＰＨ５００（ＭＡＴαｕｒａ３-５２  ｌｙｓ２-８０１  ａｄｅ２-１０１  ｔｒｐｌ-Δ６３  ｈｉｓ３-Δ２００  ｌｅｕ２-ΔＩ）への形質転換のためのウラシル選択可能Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ発現ベクターへの結合のために、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓから構築され、リシン、アデニン、トリプトファン、ヒスチジン、およびロイシン原栄養体を選択する。これらの原栄養体から、ＬＹＳ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２の対応する遺伝子が、ゲノムまたはｃＤＮＡ挿入断片から配列決定される。
【００８１】
実施例２  ＲＴＤＳ技術を使用した酵母の遺伝的改変
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株ＡＴＣＣ  ９０８１１（ｌｅｕ２-３５
ｌｙｓ５-１２  ｕｒａ３-１８  ＸＰＲ２Ｂ）から、ｌｅｕ２、ｌｙｓ５、およびｕｒａ３遺伝子の対立遺伝子を、ＰＣＲならびに野生型対立遺伝子と比較したその配列によってクローニングし、差異を同定した。
【００８２】
ｕｒａ３の場合、差異は、位置１３６５（Ａ→Ｇ変異、リシンに対してＡＡＡ→ＡＡＧコーディングの静止変化をもたらす）、１５０３（ＡＴＣＣ  ９０８１１中のＡＡＧＡＡ余剰配列フレーム変化をもたらすが、１５１１でフレームに戻り、７つの付加アミノ酸をもたらし、その後、配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＹＬ  ＵＲＡ３として継続する）、１５１１（ＡＴＣＣ  ９０８１１中の余剰Ｔ）、および１９７８（Ｃ→Ｔ変異、カルボキシ末端が欠如した蛋白質２４アミノ酸を短縮する停止変異につながる）において認められた。ＧＲＯＮオリゴヌクレオチドは、ＳＴＯＰ（ＴＧＡ）-＞Ｒ（ＣＧＡ）遺伝子変換を行い、
Ｙ１Ｕｒａ３-ＹＬＵ４０５６４アミノ酸番号付与に基づく２６４Ｒを産出することによ
って、原栄養性を回復するように設計された。使用されるＧＲＯＮは、Ｙ１Ｕｒａ３１２６４／Ｃ／４０／５'Ｃｙ３／３'ｉｄＣ（配列ＶＣＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＨを有する）、およびＹ１Ｕｒａ３１２６４／ＮＣ／４０／５'Ｃｙ３／３'ｉｄＣ（配列ＶＣＣＴＣＣＴＣＡＡＴＡＧＧＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＧＴＡＣＡＧＡＣＣＴＣＧＨ（Ｖ＝ＣＹ３；Ｈ＝３'ＤＭＴ  ｄ
Ｃ  ＣＰＧ）を有する）である。１０、３０、５０μｇの各ＧＲＯＮを、酢酸リチウム系の方法を使用して、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株ＡＴＣＣ  ９０８１１に形質転換し、ｕｒａ-２％グルコース上に固定した。コーディングストランドを使用し
たＧＲＯＮ設計によって、合計８２のｕｒａ＋コロニーと、非コーディングストランドを使用したＧＲＯＮ設計によって、６つのコロニーを得、間隙修復オリゴヌクレオチドによる形質転換によく見られるストランドバイアスを実証した。１８のコーディングストランド形質転換体の配列が、１７のクローンにおける意図された変化を実証した。
【００８３】
ＬＥＵ２の場合、差異は、位置１７１０（フレームシフトおよび早期蛋白質終結につながる余剰Ｃ欠失）、１８９６（余剰Ｔ）、２０３６（停止コドン後に位置するＴ→Ａ変異）、および２１７７（余剰Ｔは欠落、停止コドン後に位置する）において認められた。
【００８４】
ＬＥＵ２の場合、差異は、位置１０９２（Ｇ→Ａ  ＴＣＧ→ＴＣＡ、同類置換（Ｓｅｒｉｎｅ））；１２７８（Ｇ→Ａ  ＣＡＧ→ＣＡＡ、同類置換（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ））、および１２７９（Ｇ→Ａ  ＧＧＴ→ＡＴＴ、変化Ｖ→Ｉ）において認められた。
【００８５】
故に、変異は、種々の目的のために使用し、例えば、原栄養性酵母を遺伝子変換し、栄養要求性とする、またはその逆を行うことも可能である。
【００８６】
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓにおけるＲＴＤＳ技術の有効性を実証するための類似方式は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに関して説明されるように行われるものであって、そこでは、ｕｒａ３変異が、原栄養性を回復するように修正される。
【００８７】
実施例３  標的遺伝子のクローニング
ＮＣＢＩデータベースにおいて入手可能なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよび他の酵母のＡＣＣａｓｅ、ＨＭＧＲ、スクアレンシンターゼ、ならびにスクアレンエポキシダーゼの配列を、ＰＣＲプライマーのソースとして使用し、対応する遺伝子を、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓとともに、その対応する調節領域（プロモーター、ターミネーター）からクローニングする。それぞれ、転写を増加または減少する「アップ」および「ダウン」プロモーター変異を同定するために、これら４つの遺伝子のプロモーターを、比較的に変異性であるＤＮＡポリメラーゼによってクローニングし、プロモーター中に点変異を生成し、およびこれらのフラグメントを、Ｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＥ  ｃｏｌｉにおいて、インビトロ試験を行うために、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）またはβガラクトシダーゼレポーター遺伝子と融合されたプラスミド中にクローニングする。プロモーター「アップ」変異が、ＲＴＤＳによって、ＨＭＧＲおよびスクアレンシンターゼゲノム配列中に再導入される一方、「ダウン」プロモーター変異が、ゲノムＡＣＣａｓｅおよびスクアレンエポキシダーゼ配列中で行われる。異種遺伝子発現において使用するために、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＣ．ｃｕｒｖａｔｕｓ中の必須遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、アクチン）から、プロモーターをクローニングする。ＰＣＲクローニングのためのプライマーは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のこれらの遺伝子に対する相同性から設計される。
【００８８】
実施例４  スクアレン生成増加のための標的遺伝子の操作
ＡＣＣａｓｅ。ＡＣＣａｓｅ遺伝子の複製数は、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＣ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、ならびに他の酵母において判定される。ＲＴＤＳを利用して、停止コドンを任意余剰複製中の翻訳開始部位直後に導入することによって、ＡＣＣａｓｅ発現を減少させる。ＡＣＣａｓｅ  ｍＲＮＡレベルとＡＣＣａｓｅ酵素特異的活性との間の相関が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて実証された。
【００８９】
スクアレンエポキシダーゼ。同様に、Ｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるスクアレン蓄積の増加は、２倍体中のスクアレンエポキシダーゼの複製のうちの１つの分裂によって達成された（Ｋａｍｉｍｕｒａ，Ｎ．，Ｈｉｄａｋａ，Ｍ．，Ｍａｓａｋｉ，Ｈ．，ａｎｄ
Ｕｏｚｕｍｉ，Ｔ．（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２：３５３-３５７）。Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＣ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、ならびに他の酵母
中のスクアレンエポキシダーゼの複製数が判定され、ＲＩＤＳを使用して、第１の複製を越えて、余剰複製中の翻訳開始部位直後に停止コドンを生成または挿入する。
【００９０】
ＨＭＧＲ。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｄ哺乳類ＨＭＧＲ酵素は両方とも、真核細胞において、急速な細胞内代謝回転を受ける多くの短寿命蛋白質中に存在する、そのリンカー領域中にアミノ酸配列を含有する（Ｒｏｇｅｒｓ．Ｓ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ，Ｍ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３４：３６４  ３６８，ａｎｄ  Ｃｈｕｎ，Ｋ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｉｍｏｍ，Ｒ．Ｄ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（６）４２３６-４２４６参照）。類似
配列（存在する場合）を、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＣ．ｃｕｒｖａｔｕｓ中のＨＭＧＲ遺伝子において同定し、ＲＴＤＳを使用して排除し、ＨＭＧＲ蛋白質の代謝回転を減少させる。そのような類似配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅスクアレンシンターゼ遺伝子中に認められており、また、そのような配列がＲ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＣ．ｃｕｒｖ
ａｔｕｓ中のスクアレンシンターゼ遺伝子に存在するかどうかも判定される。また、配列が、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよびＣ．ｃｕｒｖａｔｕｓスクアレンシンターゼ中に存在する場合、ＲＴＤＳを使用して、蛋白質の代謝回転を減少させる。
【００９１】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＨＭＧＲは、２つの高度に保存されたドメインを含み、そのＮ-末端５５２アミノ酸は、膜結合性に関与する。Ｃ-末端触媒部分のみ含有する短縮ＨＭＧ１蛋白質の過剰発現は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、４０倍のＨＭＧ-Ｃ
ｏＡ活性をもたらした、スクアレンの蓄積を乾物の５．５％まで増加させた（Ｐｏｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｔ．，Ｓｔａｈｌ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｌａｎｇ，Ｃ．（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４９：６６-７１）。Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓおよ
びＣ．ｃｕｒｖａｔｕｓ  ＨＭＧＲ蛋白質が類似構造を有しているかどうか判定され、そうである場合、ＲＴＤＳが使用され、可溶性触媒ドメインのみ発現させる。
【００９２】
ＨＭＧＲの蛋白質構造およびＤＮＡ配列は、膜結合性Ｎ-末端ドメインおよび触媒Ｃ-末端ドメインを伴う、菌類から哺乳類の真核細胞間において高度に保存される。２つのドメイン間の境界は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１遺伝子（Ｇｅｎｅｌｏｕｖｒｅｓ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＹＡＬＩ０Ｅ０４８０７ｇ）中のアミノ酸５００-６００の領域にマップ可能であって、そこで、疎水性プロットは
、疎水性から親水性へと遷移する。残基５４８および５４４は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１の疎水性プロット、ならびに短縮Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｄｏｎａｌｄ，Ｋ．Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，１９９７．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６３（９）：３３４１-３３４４）とＣａｎｄｉｄ
ａ  ｕｔｉｌｉｓ（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，１９９８．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６４（７）：２６７６-２６８０）蛋白質のＮ-末端に対するその相同性の評価から選択される。故に、一実施例では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１  ＩのＣ-末端ドメインのアミノ酸５４８-１０００が発現し、第２の実施例では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１  ＩのＣ-末端ドメインのア
ミノ酸５４４-１０００が発現する。関連実施例では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ  ＨＭＧ１  ＩのＣ-末端ドメインのアミノ酸５４３-１０００が発現する、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１  ＩのＣ-末端ドメインのアミノ
酸５４５-１０００が発現する、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭ
Ｇ１  ＩのＣ-末端ドメインのアミノ酸５４６-１０００が発現する、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１  ＩのＣ-末端ドメインのアミノ酸５４７-１０００が発現する、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＨＭＧ１  ＩのＣ-末
端ドメインのアミノ酸５４９-１０００が発現する。
【００９３】
シリアンハムスターでは、ＨＭＧＲ触媒ドメインの活性は、ＡＭＰ-依存性キナーゼ（
Ｏｍｋｕｍａｒ，Ｒ．Ｖ．，Ｄａｒｎａｙ、Ｂ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｏｄｗｅｌｌ，Ｖ．Ｗ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６８１０-６８１４）によるリン酸化
されることによって、減少調節され、類似調節様式は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関して説明されている。Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、および他の酵母中のＨＭＧＲ蛋白質が、同様に調節されるかどうかを判定し、そうである場合、ＲＴＤＳを用いて、リン酸化反応部位を排除する。
【００９４】
スクアレンシンターゼ。哺乳類系中のスクアレンシンターゼを、ＳＲＥＢＰ（ステロール調節要素結合蛋白質）（Ｓｚｋｏｐｉｎｓｄａ，Ａ．，Ｓｗｉｅｚｅｗｓｋａ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｋａｒｓｔ，Ｆ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６７：４７３-４７７）によって、ＨＭＧ-ＣｏＡシンターゼおよびファルネシル二リン酸シンターゼとともに、転写レベルに基づいて、協調的に調節される。ＳＲＥＢＰは、３つの形態で存在、その１つは、スクアレンシンターゼプロモーターを結合する。その
ような転写因子および／または結合部位が、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、および他の酵母中のスクアレンシンターゼプロモーターに存在するかどうか判定し、存在する場合、ＲＴＤＳを使用して、スクアレンシンターゼの転写を向上させる、そのような転写因子および／または結合部位を変化させる。
【００９５】
実施例５  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓの成長条件
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓの成長を評価して、最良の炭素源を判定し、培地中のその細胞質量を最大限にした。酵母抽出物系の肥沃な培地では（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン）、Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓは、２-２０％ｗ／ｖグルコ
ース中で良好に成長し、４日後、１６％ｗ／ｖグルコース以上において、最大レベルの５５ｇ／Ｌ乾燥菌体重量（ＣＤＷ）を達成した。同様に、Ｃ、ｃｕｒｖａｔｕｓは、３-１
２％ｗ／ｖグリセロールの同一培地中でも成長し、５日後、１２％ｗ／ｖグリセロール中４０ｇ／ＬのＣＤＷを達成した。また、Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓは、バイオディーゼルグリセロール（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｏａｃｈｅｌｌａ，ＣＡ）中でも、最大３．５％ｗ／ｖまで成長し、２３ｇ／Ｌ  ＣＤＷをもたらした。
【００９６】
実施例６  増加スクアレン生成増加のための標的遺伝子の環境操作
環境操作を試験し、スクアレンの正味収率を増加させる。これらは、ｉｎｃｌｕｄｅ（ａ）オレイン酸、オリーブまたは他の植物油、イノシトール、コリン、ソラフェン、フルアジホップ、およびクレトジム、または他のＡＣＣａｓｅ抑制除草剤による、ＡＣＣａｓｅ発現および／または活性の抑制、（ｂ）テルビナフィン、トルナフテート、およびエルゴステロール、または他のスクアレンエポキシダーゼ抑制殺菌剤による、スクアレンエポキシダーゼ発現および／または活性の抑制、（ｃ）グリセロール系培地中のＣ／Ｎ比の操作（開始培地中において、または添加剤によって）、（ｄ）培地中の窒素源の変更（有機対無機対単体／複合体）、（ｅ）炭素添加形態の変更（例えば、バッチ対流加）、（ｆ）炭素源以外の栄養素枯渇作用の検証、（ｇ）糖、糖アルコール、アルコール、多価アルコール、および有機酸の混合物を含めるための炭素源の変更、（ｈ）ロバスタチンまたは他のスタチン型抑制剤等のＨＭＧＲ抑制化合物による成長の選択、および（ｉ）親油性色素あるいは染料を使用する、および／または、例えば、重量測定あるいはガスクロマトグラフィ法を使用する抽出可能脂質の分析による、培地中の高油生成の選択を含む。
【００９７】
実施例として、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ９０９０４を、１２０時間、３０℃および３００ｒｐｍにおいて、０乃至５０μｇ／ｍｌのテルビナフィンが添加された高炭素／窒素比培地（Ｃ／Ｎ＝４２０，Ｌｉ，Ｙ-Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，
Ｚｈａｏ，Ｚ-Ｂ．，ａｎｄ  Ｂａｉ，Ｆ-Ｗ．２００６“Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ａｎｄ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ”Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（４）：６５０-６５６）（以降、「ＣＹＭ００１培地」）中で培養した。１２
．５μｇ／ｍｌ以上の濃度のテルビナフィンは、スクアレンとして、最大１８．５％の総脂質をもたらした。
【００９８】
別の実施例では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ９０９０４を、１２０時間、３０℃および３００ｒｐｍにおいて、０乃至５０μｇ／ｍｌのオレイン酸が添加されたＣＹＭ００１培地を培養した。１０μｌ／ｍｌのオレイン酸の添加は、脂質蓄積を６３．３％の脂質／ＣＤＷ（乾燥菌体重量）へと向上させることが認められた。
【００９９】
さらなる実施例では、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＴＣＣ  ９０９０４を、１２０時間、３０℃および３００ｒｐｍにおいて、０乃至２００μＭのクレトジムが添加されたＣＹＭ００１培地中で培養した。２００μＭのクレトジムの添加は、６０-
ｍｌフラスコあたり６０倍のスクアレンの収率（ｍｇ）増加をもたらした。
【０１００】
酸素増加は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＨＭＧ１およびＨＭＧ２の分別調整を生じさせ、好気条件下において、ＨＭＧ２の急速分解およびＨＭＧ１の発現増加をもたらすことが認められた（Ｃａｓｅｙ，Ｗ．Ｍ．，Ｋｅｅｓｌｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｐａｒｋｓ，Ｌ．Ｗ．（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：７２８３-７２８８）。我々の油性酵母中のＨ
ＭＧＲ遺伝子の数が、酸素によって影響を受けるかどうか判定し、そうである場合、その発現および活性は、酸素レベルを変更することによって、発酵槽中で操作される。
【０１０１】
「ＣＹＭ００１培地」（Ｌｉ，Ｙ-Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｚｈａｏ，Ｚ-Ｂ．，ａｎｄ  Ｂａｉ，Ｆ-Ｗ．（２００６）Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ  ２２（４）：６５０-６５６）から開始し、種々の成分および成分濃度を
変更し（新しい成分の添加を含む）、細胞増殖、細胞の％総脂質含量／単位質量、および％スクアレン／総脂質を向上させる。評価される培地成分として、炭素源：グリセロール、グルコース、窒素源：アンモニウム化合物、硝酸、アミノ酸、無機塩：カリウム、マグネシウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、カルシウム、銅、酵母抽出物、脂質前駆体、および脂質合成影響因子：テルビナフィン、クレトジム、おレイン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、リノレン酸、および消泡剤を含む。評価される他の因子として、％接種材料、発酵経過時間、温度、ｐＨ、背圧、溶存酸素（ＤＯ）、供給組成、供給方式、および撹拌方式を含む。
【０１０２】
実施例７  菌株選択
従来の菌株選択方法を、油性酵母中で使用し、その正味スクアレン生産性を向上させる。ＵＶ、ニトロソグアニジン、またはエタンメチルスルホン酸によって変異を生じさせた菌株を、スクアレン蓄積増加のために、スクリーニングおよび／または選択する。また、菌株を、３％グリセロールを含有するＹＥＰ（１５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌペプトン）培地またはロバスタチンおよび他の周知のＨＭＧＲ抑制剤を含有する培地上の反復通過等、繰り返し選択圧に曝す。また、菌株を、可変量のグリセロールおよび／またはグルコースを含有するＣＹＭ００１培地、あるいはロバスタチンおよび他の周知のＨＭＧＲ抑制剤および／またはスクアレンシンターゼ抑制剤を含有する培地上の反復通過に曝し、ＨＭＧＲおよび／またはスクアレンシンターゼ活性の増加によって、自然発生変異株を得る。そのような変異は、ＨＭＧＲ、スクアレンシンターゼ、または他の遺伝子においてであってもよい（「二次的部位変異」）。
【０１０３】
別様に定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する当技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【０１０４】
本明細書で例証的に説明される本発明は、本明細書に具体的には開示されない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下でも好適に実施することができる。したがって、例えば、用語「成る」、「含む」、「含有する」等は、広義的かつ制限なく、解釈されるものとする。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、制限としてではなく、説明の観点から使用され、図示および説明される特徴またはそれらの一部の任意の同等物を排除するように、そのような用語および表現の使用を意図するものではなく、種々の修正が、請求される発明の範囲内で可能であることを認識されたい。
【０１０５】
したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって、具体的に開示されるが、本明細書に開示される、具現化された本発明の、修正、改良、および変形は、当業者によって企図され得、そのような修正、改良、および変形は、本発明の範囲内であるとみなされることを理解されたい。本明細書に提供される、材料、方法、および実施例は
、好ましい実施形態の代表かつ例示であって、発明の範囲の制限として意図されるものではない。
【０１０６】
本発明は、本明細書において、広義かつ包括的に説明されてきた。包括的開示内に属するより狭義の種および亜属群もそれぞれ、本発明の一部を形成する。これは、除去される材料が、本明細書において、具体的に明記されるかどうかにかかわらず、属から任意の対象物質を除去するという、条件付きまたは否定的制限を伴う、本発明の包括的説明を含む。
【０１０７】
加えて、本発明の特徴または側面が、マーカッシュ群の観点から説明される場合、当業者は、本発明が、また、それによって、マーカッシュ群の任意の個々の部材または部材の亜群の観点からも説明されることを認識するであろう。
【０１０８】
本明細書に記載される刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、参照することによって、それぞれ個々に援用される場合と同様に、参照することによって、全体として明示的に援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書を優先するものとする。
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月2日(2015.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母によりスクアレンを生成する方法であって、
方法は、前記酵母を殺菌剤と共に培養することを含み、
酵母は、ＡＴＣＣ  ２０６８８、ＡＴＣＣ  ９０８１１、およびＡＴＣＣ  ９０９０４から選択されるＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株であり、
殺菌剤は、スクアレンエポキシダーゼ抑制殺菌剤であり、
酵母は、外来性スクアレンシンターゼ遺伝子を発現し、これにより遺伝学的に改変させられたものである、
方法。
【請求項２】
殺菌剤が、テルビナフィンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
酵母は、遺伝学的に改変された酵母であり、
方法は、イソプレノイド生合成経路中の１つ以上の酵素の活性または発現を増加または減少させることを含み、
前記酵素活性または発現は、１つ以上の設計変異によって増加または減少され、
前記１つ以上の設計変異は、前記酵素内の規定位置に存在し、
前記遺伝的に改変された酵母は天然酵母と比較して増加した量のイソプレノイドを生成する、
方法。
【請求項４】
１つ以上の酵素が、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド非含有分子、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドから成る群から選択される遺伝子修復オリゴ核酸塩基により改変された、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子修復オリゴ核酸塩基が、混合二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
混合二本鎖オリゴヌクレオチドが、５０ヌクレオチド長を超え、１００ヌクレオチド長未満である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
混合二本鎖オリゴヌクレオチドの第一ストランドおよび第二ストランドが、標的遺伝子の２つの断片と相同性を有する２つの領域を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の酵素が、アセチルCoAカルボキシラーゼ（「ACCase」）、HMG-CoAレダクターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、スクアレンシンターゼ、およびATPクエン酸リアーゼから成る群から選択される酵素を含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アセチルCoAカルボキシラーゼが、低減した活性または発現を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
HMG-CoAレダクターゼが、増加した活性または発現を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
スクアレンエポキシダーゼが、低減した活性または発現を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
スクアレンシンターゼまたはATPクエン酸リアーゼが、増加した活性または発現を示す、請求項８に記載の方法。
【外国語明細書】
2015211675000001.pdf