(57)【要約】【課題】毛細血管を形成する新規な技術を提供する。【解決手段】３次元編目状の空隙１０３が設けられた基材１０１に、血管形成能を有する細胞１０５、および、細胞１０５の培養液１０７を添加する工程と、基材１０１を貫通する空隙１０３内に培養液１０７の流れ１１１を生じさせながら細胞１０５を培養することにより、流れ１１１に沿って、細胞１０５から構成された毛細血管１１３を形成する工程と、を含む、毛細血管の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元編目状の空隙が設けられた基材に、血管形成能を有する細胞、および、前記細胞の培養液を添加する工程と、
前記基材を貫通する前記空隙内に前記培養液の流れを生じさせながら前記細胞を培養することにより、前記流れに沿って、前記細胞から構成された毛細血管を形成する工程と、
を含む、毛細血管の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の毛細血管の製造方法において、
毛細血管を形成する前記工程が、前記細胞を灌流培養する工程を含む、毛細血管の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の毛細血管の製造方法において、
前記基材が、３次元繊維性スキャフォルドを含み、
前記空隙が、前記３次元繊維性スキャフォルドを構成する繊維間の空隙部である、毛細血管の製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項に記載の毛細血管の製造方法において、
毛細血管を形成する前記工程が、前記基材に包埋して設けられた管状部材の供給口から前記基材に前記培養液を供給しながら前記細胞を培養する工程を含み、
前記管状部材に、複数の前記供給口が前記管状部材の延在方向に沿って配置されている、毛細血管の製造方法。
【請求項５】
３次元編目状の空隙が設けられた基材であって、血管形成能を有する細胞が接種される前記基材と、
前記基材に前記細胞の培養液を供給し、前記基材を貫通する前記空隙内に前記培養液の流れを生じさせる供給手段と、
を含む、毛細血管の製造装置。
【請求項６】
請求項５に記載の毛細血管の製造装置において、前記基材が、３次元繊維性スキャフォルドを含み、
前記空隙が、前記３次元繊維性スキャフォルドを構成する繊維間の空隙部である、毛細血管の製造装置。
【請求項７】
請求項５または６に記載の毛細血管の製造装置において、
前記供給手段が、
前記基材に前記培養液を供給する供給部材と、
前記供給部材への前記培養液の供給を調節する調節手段と、
を含む、毛細血管の製造装置。
【請求項８】
請求項７に記載の毛細血管の製造装置において、
前記供給部材が、前記基材に包埋して設けられた管状部材を含むとともに、前記管状部材の延在方向に沿って複数の供給口が前記管状部材に設けられており、
前記調節手段が、前記管状部材に前記培養液を供給するポンプを含む、毛細血管の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細血管の製造方法および毛細血管の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工血管の構築に関連する技術として、非特許文献１〜４に記載ものがある。
非特許文献１には、高分子膜上に血管内皮細胞を接着させて培養し、高分子膜上に内皮層を形成する技術が記載されている。
非特許文献２には、繊維性スキャフォルド上に繊維芽細胞を接着させて、培養する技術が記載されている。
【０００３】
非特許文献３には、エラスチンファイバー上に平滑筋細胞を培養することで、エラスチンファイバーと平滑筋細胞で構成された人工血管を形成する技術が記載されている。
また、非特許文献４には、細胞が接着し培養しやすい繊維の作製に関する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】H. Borteh他２名、「POROUS MICROFLUIDICS: A UNIQUE PLATFORM FOR TRANSVASCULAR STUDY」、Tech. Dig. IEEE Electro Mech. Syst.、２０１１年、第２４巻、第２号、ｐ．９５２−９５５
【非特許文献２】舟久保昭夫他２名、「人工臓器と細胞の融合技術に関する基礎研究」、２００９年、Research Report 2009, FRONTIER R&D CENTER, Tokyo Denki University
【非特許文献３】小西綾子他５名、「エラスチンファイバーマトリックスを用いる血管平滑筋細胞の培養評価、第７回生活支援工学系学会連合大会講演要旨集、２００９年、第７巻、ＲＯＭＢＵＮＮＯ．２Ｉ２−３（１６２）、Ｐ．４３
【非特許文献４】和田知明他３名、「繊維性スキャフォルドの配向制御による小口径人工血管開発への試み」、人工臓器、２０１２年、第４１巻、第２号、ｐ．Ｓ．１６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の技術のうち、非特許文献１に記載の技術は、人工的に作成した足場の上に細胞を接着させて培養をおこない、血管の類似構造を形成しようとするものである。
また、非特許文献２〜４に記載の技術は、人工的に作成した足場の上に細胞を接着させて培養をおこない、足場を構成する繊維と細胞とから構成される小口径人工血管を形成しようとするものである。足場として繊維を用いる場合、形成される人工血管のサイズは、上記繊維の太さより大きくなる。
このように、非特許文献１〜４に記載の技術を用いて血管を形成しようとした場合、足場自体が人工血管の一部をなす構成となる。
【０００６】
一方、細胞を３次元空間内で培養したり、組織化したりすることは、２次元空間内にて細胞を培養する場合に比べて技術的な困難性が高いことから、細胞により構成されている血管を生体外で形成することは困難であった。
こうしたことから、５μｍ〜１０数μｍ程度の内径、つまり毛細血管の内径程度の太さを有する血管および血管網を構築する技術は、未だに確立されていない。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、毛細血管を形成する新規な技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、血管内皮細胞等の血管形成能を有する細胞が、流体の流れのある部分に集まって管を形成する性質を有することを見出した。さらに、流れのある３次元網目状の空隙内でかかる細胞を培養し、空隙内の培養液の流れに沿って細胞を集合させることにより、毛細血管を形成する技術を完成させるに至った。
【０００９】
本発明によれば、
３次元編目状の空隙が設けられた基材に、血管形成能を有する細胞、および、前記細胞の培養液を添加する工程と、
前記基材を貫通する前記空隙内に前記培養液の流れを生じさせながら前記細胞を培養することにより、前記培養液の流れに沿って、前記細胞から構成された毛細血管を形成する工程と、
を含む、毛細血管の製造方法が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、
３次元編目状の空隙が設けられた基材であって、血管形成能を有する細胞が接種される前記基材と、
前記基材に前記細胞の培養液を供給し、前記基材を貫通する前記空隙内に前記培養液の流れを生じさせる供給手段と、
を含む、毛細血管の製造装置が提供される。
【００１１】
なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、毛細血管を形成する新規な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施形態における毛細血管の製造方法を模式的に説明する図である。
【図２】実施形態における毛細血管の製造装置の構成を説明する図である。
【図３】実施形態における毛細血管の製造装置の構成を説明する図である。
【図４】実施例における毛細血管の製造装置の構成を示す図である。
【図５】実施例におけるランダムスキャフォルドの製造方法を説明する図である。
【図６】実施例におけるランダムスキャフォルドの構成部材を示す図である。
【図７】実施例における細胞培養の手順および条件を説明する図である。
【図８】実施例における位相差顕微鏡観察結果を示す図である。
【図９】実施例における位相差顕微鏡観察結果を示す図である。
【図１０】実施例における位相差顕微鏡観察結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１５】
図１（ａ）〜図１（ｄ）は、本実施形態における毛細血管の製造方法を模式的に説明する図である。
図１に示した毛細血管の製造方法は、たとえば、以下の工程を含む。
（工程１）３次元編目状の空隙１０３が設けられた基材１０１（図１（ａ））に、血管形成能を有する細胞１０５、および、細胞１０５の培養液１０７を添加する（図１（ｂ））工程；ならびに、
（工程２）基材１０１を貫通する空隙１０３内に、培養液１０７の流れ１１１を生じさせながら、細胞１０５を培養することにより（図１（ｃ））、流れ１１１に沿って、細胞１０５から構成された毛細血管１１３を形成する（図１（ｄ））工程。
【００１６】
はじめに、工程１について説明する。
工程１は、さらに具体的には、３次元編目状の空隙１０３が設けられた基材１０１を準備する工程（図１（ａ））を含む。基材１０１の材料および構造に限定はなく、３次元編目状の空隙１０３が形成されており、たとえば少なくとも一部の空隙１０３が基材１０１を貫通しているものであればよい。
また、図１（ａ）において、基材１０１中の空隙１０３が繋がって、培養液１０７（培地）の流れる通路となっている。基材１０１の外部から供給された培養液１０７は、空隙１０３を通って基材１０１の外部に流出する。
【００１７】
空隙１０３の幅は、空隙１０３内に細胞１０５が毛細血管を形成することができる程度の大きさであればよく、たとえば１０μｍ以上、好ましくは２０μｍ以上とする。また、毛細血管の太さに対応する程度の内径を有する血管を空隙１０３内に効率よく形成する観点からは、空隙１０３の幅をたとえば５０μｍ以下、好ましくは３０μｍ以下とする。
【００１８】
また、空隙１０３の網目の態様に特に制限はなく、空隙１０３が３次元方向にランダムな網目状であってもよい。または、空隙１０３の延在方向または配置方向が基材１０１内において所定の方向に沿って配向していてもよい。より生体内に近い場を細胞１０５に与える観点からは、空隙１０３がランダムな網目状であることが好ましい。
【００１９】
基材１０１は、３次元構造を有するものであれば形状や大きさに制限はなく、形成したい毛細血管１１３の大きさや空間配置に応じた形状、大きさとすることができる。
本実施形態の方法においては、３次元（たとえば、奥行きや深さ）方向にも細胞１０５を培養することができるため、基材１０１に所定の厚みを持たせることができる。
【００２０】
また、基材１０１の材料として、たとえば、有機材料、無機材料、金属材料、生体材料およびこれらの複合材料が挙げられる。毛細血管１１３をより一層確実に形成する観点からは、基材１０１が生体適合性に優れた材料により構成されていることが好ましい。
【００２１】
基材１０１には、たとえばこれを貫通する複数の空隙１０３が網目状に３次元に張り巡らされており、基材１０１は空隙１０３の外壁を構成する。
このような構造の具体例として、図１（ａ）〜図１（ｄ）には、基材１０１が３次元繊維性スキャフォルドを含み、空隙１０３が、３次元繊維性スキャフォルドを構成する繊維間の空隙部である構造を示した。以下、基材１０１が３次元繊維性スキャフォルド等の繊維基材である例を中心に説明するが、基材１０１の構造はこれに限られない。
【００２２】
３次元繊維基材を構成する繊維の材料の例として、有機材料、無機材料、金属材料、生体材料等が挙げられる。
また、繊維が高分子材料により形成されていてもよく、その具体例として、セグメント化ポリウレタン（Segmented Polyurethane：ＳＰＵ）等のポリウレタン系高分子、ポリ乳酸等が挙げられる。材料自体の耐久性と生体適合性とのバランスの観点からは、ポリウレタン系高分子が好ましい。
繊維の形成方法は、材料の種類および繊維の太さに応じて適宜選択される。たとえば、ナノ〜マイクロメートルオーダーの繊維を３次元的に形成する方法として、エレクトロスピニング法が挙げられる。
【００２３】
繊維の外径は、空隙１０３内の細胞１０５の過度の移動を抑制し、流れ１１１に沿ってより一層安定的に毛細血管１１３を形成する観点からは、たとえば１．０μｍ以上、好ましくは１．５μｍ以上とする。
また、毛細血管１１３をより一層効率よく形成する観点からは、繊維の外径を１０μｍ以下、好ましくは５μｍ以下とする。
毛細血管１１３の径のばらつきを抑制する観点からは、繊維状基材を構成している繊維の外径のばらつきを小さくすることが好ましい。
【００２４】
また、繊維性基材の空隙率は、細胞培養の観点からは、たとえば１０％以上、好ましくは１５％以上とする。また、空隙１０３内での細胞１０５の易動性を適度に高める観点からは、繊維性基材の空隙率をたとえば４０％以下、好ましくは３０％以下とする。
【００２５】
なお、繊維の外径および繊維性基材の空隙率は、たとえば繊維性基材の走査型電子顕微鏡観察により算出することができる。
このうち、繊維の外径は、たとえば数平均であり、観察された繊維性基材像中の複数の繊維の粒子径を測定することにより算出できる。
また、繊維性基材の空隙率は、たとえば非特許文献２に記載の方法に準じて求めることができる。具体的には、１ｃｍ×１ｃｍ×２００μｍの角材状に切断した繊維性基材の重量Ｗ（ｇ）および体積（Ｖ）を求めることにより、以下の式から空隙率Ｐ（％）が算出される。
Ｐ＝（１−Ｗ／Ｖ）×１００
【００２６】
以上、基材１０１が繊維状基材である場合を例に説明した。基材１０１の構造はこれには限られず、他のメッシュ状、スポンジ状等の３次元構造であってもよい。また、他の基材１０１の構造の例として、たとえば脱細胞した生体スキャフォルドが挙げられる。
【００２７】
次に、基材１０１に添加される細胞１０５は、毛細血管形成能を有するものであり、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞等が挙げられる。
また、培養液１０７は、用いる細胞１０５の種類に応じて適宜選択される。
【００２８】
つづいて、工程２の毛細血管を形成する工程（図１（ｃ）および図１（ｄ））を説明する。
工程２は、たとえば、空隙１０３内に、培養液１０７の流れ１１１に沿って毛細血管１１３を形成させる工程である。また、工程２は、たとえば、細胞１０５が培養液１０７の流れ１１１を包み込むように毛細血管１１３を形成する工程である。
【００２９】
また、工程２は、たとえば細胞１０５を灌流培養する工程を含む。灌流培養により、空隙１０３内に培養液１０７の流れ１１１を継続的かつ効率的に生じさせることができるため、簡便で確実に毛細血管１１３を形成することができる。
【００３０】
なお、図１（ｃ）および図１（ｄ）では、流れ１１１のある系で培養をおこなう例として、基材１０１の内部または一辺に複数の管状の送液部１０９が互いに平行に配置され、送液部１０９の各末端（供給口）から培養液１０７を供給しながら細胞１０５を培養する方法を示したが、空隙１０３内に流れ１１１を生じさせる態様に制限はない。
【００３１】
たとえば、図３（ａ）および図３（ｂ）を参照して後述するように、工程２の毛細血管を形成する工程は、基材１０１に包埋した管状部材を設け、管状部材に設けられた複数の供給口から基材１０１に培養液１０７を供給しながら細胞１０５を培養する工程を含んでいてもよい。
【００３２】
基材１０１への培養液１０７の供給速度は、空隙１０３内に好適な流れ１１１を生じさせる観点からは、たとえば１．０ｍＬ／ｍｉｎ以上、好ましくは１．５ｍＬ／ｍｉｎ以上とする。また、細胞１０５に毛細血管１１３をさらに確実に形成させる観点からは、基材１０１への培養液１０７の供給速度をたとえば１０ｍＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは５ｍＬ／ｍｉｎ以下とする。ただし、送液部１０９の供給口やチューブ１２３の供給口１２５（図３（ｂ））の開口幅により培養液１０７の供給速度は大きく異なる。
【００３３】
次に、工程２において形成される毛細血管１１３について説明する。
毛細血管１１３は、生体内または生体外において、当該生体の毛細血管またはその一部として用いうる程度の形状を有する毛細管であって、細胞１０５から実質的に構成される。さらに具体的には、毛細血管１１３は、たとえば基材１０１の材料を実質的に含まない毛細管である。また、毛細血管１１３の側壁は、たとえば単層の細胞１０５により構成される。
【００３４】
毛細血管１１３の長さは、毛細血管１１３の用途に応じて決めることができる。
また、毛細血管１１３は、たとえば生体の毛細血管と同程度の内径を有する。毛細血管１１３内で赤血球を好適に移動させうる構成とする観点からは、毛細血管１１３の内径をたとえば３μｍ以上、好ましくは５μｍ以上とする。また、生体内で形成される毛細血管の内径に対応させる観点からは、毛細血管１１３の内径をたとえば２０μｍ以下、好ましくは１５μｍ以下とする。
【００３５】
また、得られた毛細血管１１３は、たとえばピンセットで取り出すなどの所定の方法で基材１０１から分離して用いることができる。
たとえば、生体外で形成された毛細血管１１３を生体内の所定の位置に配設することにより、生体内に毛細血管１１３を起点とする毛細血管網を発達させることができる。
また、人工肺、人工心臓等の人工臓器や組織培養による再生臓器の構成部材として毛細血管１１３を用いることもできる。
【００３６】
次に、毛細血管１１３の形成装置の具体例を示す。
図２は、本実施形態における毛細血管１１３の形成装置を示す図である。
図２に示した装置１２０は、３次元編目状の空隙１０３が設けられた基材１０１であって、血管形成能を有する細胞１０５が接種される基材１０１と、基材１０１に細胞１０５の培養液１０７を供給し、基材１０１を貫通する空隙１０３内に培養液１０７の流れ１１１を生じさせる供給手段１２１と、を含む。
図２においても、基材１０１が３次元繊維性スキャフォルドである構成が例示されている。図２の装置１２０においても、繊維間の空隙部すなわち空隙１０３に培養液（図２には不図示）が流れる。
【００３７】
また、図３（ａ）および図３（ｂ）は、図２に示した装置１２０のより詳細な構成例を示す図である。
図３（ａ）に示した装置１２２では、供給手段１２１が、基材１０１に培養液１０７を供給する供給部材（チューブ１２３）と、チューブ１２３への培養液１０７の供給を調節する調節手段（ポンプ１２７）と、を含む。
【００３８】
チューブ１２３は、ポンプ１２７の供給部材であって、基材１０１に包埋して設けられた管状部材である。図３（ａ）では、基材１０１に包埋しこれを貫通するチューブ１２３が配置されている。
また、図３（ｂ）は、装置１２２において、基材１０１の厚さ方向の断面図であり、基材１０１内に埋設されたチューブ１２３の構成を示す図である。図３（ｂ）では、図３（ａ）に示した基材１０１のうち、チューブ１２３の下方にある基材１０１ａが示されている。
【００３９】
チューブ１２３の材料として、有機材料、無機材料、金属材料、生体材料およびこれらの複合材料等が挙げられる。チューブ１２３は、生体適合性に優れた材料により構成されていることが好ましい。たとえば、人工血管の側壁にこれを貫通する供給口を形成したものをチューブ１２３として用いることもできる。
【００４０】
チューブ１２３には、その延在方向に沿って複数の供給口１２５が設けられている。複数の供給口１２５は、チューブ１２３の延在方向に沿って配置されている。また、このとき、複数の供給口１２５は、たとえば基材１０１に対して同じ方向に開いており、図３（ｂ）では、基材１０１の上面に平行な同じ向きに開いている。また複数の供給口１２５は、基材１０１に対してランダム方向に開いていてもよく、供給口１２５により基材１０１内に培養液１０７の流れ１１１が出来ることが重要である。
【００４１】
また、チューブ１２３の内径および供給口１２５の開口幅は、基材１０１内に培養液１０７を効率よく供給する観点から、たとえば、チューブ１２３の内径を１〜３ｍｍ程度とする。
また、供給口１２５の開口幅をたとえば３０〜５００μｍ程度とする。また、チューブ１２３が基材１０１に埋設されるとき、たとえば、基材１０１の厚さがチューブ１２３の外径よりも大きい構成とする。
【００４２】
また、供給口１２５は、空隙１０３に直接連通することが好ましい。こうすることにより、たとえばチューブ１２３に接続する毛細血管１１３を形成することも可能となるため、得られた毛細血管１１３と基材１０１との分離を容易におこなうことができる。また、さらに、チューブ１２３として、人工血管として機能しうる性状のものを用いることにより、チューブ１２３および毛細血管１１３の複合体としての利用も可能となる。
また、ポンプ１２７は、チューブ１２３に培養液１０７を供給する。ポンプ１２７は、基材１０１への培養液１０７の供給または排出を調節する機能を有する。
【００４３】
図３（ａ）および図３（ｂ）に示した装置１２２を用いることにより、細胞１０５を灌流培養することができるため、空隙１０３内に培養液１０７の流れ１１１を継続的かつ効率的に生じさせて、簡便で確実に毛細血管１１３を形成することができる。
【００４４】
次に、本実施形態の作用効果を説明する。
本実施形態においては、基材１０１を貫通する空隙１０３に培養液１０７の流れ１１１を生じさせながら細胞１０５を培養する。このため、流れ１１１に沿って細胞１０５を集め、細胞１０５から構成される毛細血管を形成することができる。
【００４５】
前述した非特許文献１〜４においては、人工物の足場に細胞を接着させて培養していたのに対し、本実施形態においては、空隙１０３の流れ１１１領域において細胞１０５に自発的に毛細血管１１３を形成させることができる。３次元繊維性スキャフォルド等の基材１０１には、３次元網目状の空隙１０３が設けられているため、基材１０１中に流れ１１１領域を効率よく形成することができ、細胞１０５による毛細血管の形成を効果的に促すことができる。
【００４６】
また、再生医療分野においては、３次元空間内での細胞培養が必要不可欠であるものの、発明が解決する課題の項において前述したとおり、細胞の３次元培養は２次元培養に比べて技術的に大きな困難を伴うものであった。
すなわち、２次元培養の場合、細胞は培養液上にほぼ均一に播種されるため、それぞれの細胞が培養液に接触することができ、栄養を摂取することができる。また、酸素の取り込みも容易であり、細胞の増殖に関わる不足事項が特に存在しない状態で細胞を培養することができる。
【００４７】
しかし、３次元培養の場合、培養液に接している表面部分の細胞に関しては、栄養分やガスの供給がおこなわれるものの、奥行き（深さ）方向に存在する細胞に関しては、直接培養液やガスに接触することができず、長時間にわたって細胞を培養し、生存させておくことはできなかった。
【００４８】
また、ｉＰＳ細胞等を使用した再生医療では、細胞の２次元的な培養は容易に実現できるものの３次元培養は困難であった。３次元のスキャフォルドは作製可能であっても、奥行き方向に存在する細胞に対して栄養や酸素を供給することができないため、表面以外の部分の細胞は細胞死を起こしてしまう。
【００４９】
これに対し、本実施形態においては、３次元網目状の空隙１０３に培養液１０７の流れ１１１を生じさせながら細胞１０５を培養する構成となっている。このため、毛細血管を構築させた三次元繊維性スキャフォルドに心筋細胞などの目的とする細胞を３次元方向に培養または増殖させるとともに、３次元方向における細胞へのガスや培養液の供給や老廃物の排出が可能となるため、細胞の組織化およびこれによる毛細血管の安定的な形成が可能となる。
【００５０】
また、血管を作る場所を人為的にコントロールすることは難しいが、本実施形態においては血管内皮細胞等の細胞１０５が必要に応じて毛細血管網を拡大していくので、細胞１０５にとって最適な毛細血管網が構築できる。
生体組織や臓器のほとんどは３次元構造を形成しており、今後の再生医療には３次元培養技術が必要不可欠であるところ、本実施形態により構築された毛細血管網は、３次元的な広がりを有することが可能であるため、３次元の細胞培養を初めて安全に実施させるための方法として再生医療の発展に大きく貢献することが期待される。
【００５１】
また、本実施形態においては、基材１０１として３次元スキャフォルドを用いることにより、スキャフォルドを構成する繊維間の空隙１０３領域に、毛細血管を形成することができる。またとえばランダムネットワーク構造を有する３次元スキャフォルドを用いることにより、空隙領域にランダムに毛細血管網を構築することも可能となる。
【００５２】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００５３】
本実施例では、細胞固定培養および灌流培養の２つの方法による毛細血管の形成をおこなった。
【００５４】
まず、本実施例で用いた装置の構成および作製方法を説明する。
図４（ａ）〜図４（ｃ）は、灌流培養に用いた毛細血管の製造装置の構成を示す図である。以下の実施例においては、図４（ａ）〜図４（ｃ）に示した装置１３０を用いて毛細血管を形成した。図４（ｂ）は、図４（ａ）の点線内を拡大して示す図である。また、図４（ｃ）は、装置内の培地の流れを説明する図である。
【００５５】
装置１３０は、装置１２２（図３（ａ）および図３（ｂ））の構成を有する。装置１３０において、プレートの片面に３次元ランダムスキャフォルドを積層させ、その積層面の上に供給口１２５を設けたチューブ１２３を取り付けた。そしてその上から３次元ランダムスキャフォルドを再び積層させ、チューブ１２３が包埋された基材１０１を用いた。基材１０１はシャーレ１３５内に配置されている。また、基材１０１内を、供給口１２５のあいたチューブ１２３が貫通している。
本実施例では、チューブ１２３としては、人工血管を用いた。人工血管の一端には、培地を供給する供給管１３１が接続され、他端には培地を排出する排出管１３３が接続されている。供給管１３１および排出管１３３はポンプ１２７に接続されており、ポンプ１２７を用いて培地の供給および排出を調節しながら、灌流培養がおこなわれる。
装置１３０およびその構成部材の作製方法は、以下の通りである。
【００５６】
（人工血管の作製）
チューブ１２３として用いた人工血管は、ＳＰＵのエレクトロスピニングにより、以下の手順で作製した。表１に、人工血管の作製条件をまとめて示す。また、図６（ｃ）に、得られた人工血管を示す。
１．エレクトロスピニング装置に１．５ｍｍのマンドリルを設置した。
２．２０ｍＬのシリンジに、濃度１３％のＳＰＵを充填し、１８Ｇのニードルを接続した。
３．エレクトロスピニング装置にＳＰＵを充填したシリンジを設置した。
４．電極間を２００ｍｍ、トラバース距離を２００ｍｍに設定した。
５．印加電圧１５ｋＶ、シリンジ速度０．１５ｍｍ／ｍｉｎ、トラバース速度２５ｃｍ／ｍｉｎ、ターゲット速度２００ｒｐｍに設定し、４．０ｍｉｎ間スピニングした。
６．スピニング終了後、エレクトロスピニング装置からマンドリルを外し、乾燥させた。
７．マンドリルから人工血管を外した。
８．人工血管を４５ｍｍの長さに切断した。
９．４５ｍｍの人工血管を２１Ｇのニードルにつけ、５ｍｍ間隔で片面に目印をプロットした。
１０．２７Ｇの注射針を用いて、プロット点に供給口をあけた（片面）。
【００５７】
【表１】
2015062392.tif 000003
【００５８】
（人工血管付き基材の作製）
装置１３０中の基材１０１としては、３．７ｃｍ×３．７ｃｍのプレート上にセグメント化ポリウレタンをエレクトロスピニングして得られたランダムスキャフォルドを用いた。
図５は、本実施例におけるランダムスキャフォルドの製造方法を説明する図である。また、図６（ａ）および図６（ｂ）に、それぞれ、用いたプレートおよび得られたランダムスキャフォルドを示す。
【００５９】
具体的な作製手順は、以下の通りである。
１．ハイブリッド細胞シート用プレート（以下、単に「プレート」ともいう。）を２００ｍｍ×２００ｍｍの陰極板に両面テープで固定した。
２．２０ｍＬのシリンジに濃度１３％のＳＰＵを充填し、１８Ｇのニードルを接続した。
３．エレクトロスピニング装置にＳＰＵを充填したシリンジを設置した。
４．電極間を２００ｍｍとし、陰極板を設置した。
５．印加電圧１５ｋＶ、シリンジ速度０．１５ｍｍ／ｍｉｎに設定し、１０．０ｍｉｎ間スピニングした。
６．スピニング後、陰極板からスキャフォルドとプレートを分離した。
７．１ｍＬのシリンジと２１Ｇのニードルを用いて、ＳＰＵによりスキャフォルドをプレートの一方の面に堆積した。
８．前述した方法で得られた人工血管（図６（ｃ））を、供給口が側面に配置されるようにスキャフォルド面上に配置し、人工血管とスキャフォルドとをＳＰＵで固定した。
９．人工血管を固定したプレートを陰極板に固定した。
１０．電極間を２００ｍｍ、印加電圧１５ｋＶ、シリンジ速度０．１５ｍｍ／ｍｉｎに設定し、５．０ｍｉｎ間スピニングした。
１１．スピニング後、陰極板からスキャフォルドとプレートを分離した。
１２．１ｍＬのシリンジと２１Ｇのニードルを用いて、プレートに固定したスキャフォルドと人工血管固定化面の上にさらにＳＰＵによりスキャフォルドを堆積した。
【００６０】
表２に、ランダムスキャフォルドの作製条件をまとめて示す。
【００６１】
【表２】
2015062392.tif 000004
【００６２】
（灌流培養システムの作製）
以下の手順により、灌流培養システムとして機能する装置１３０を作製した。
１．タイゴンチューブ（内径４ｍｍ、外径６ｍｍ）を５５ｃｍ長さに切断し、両端にルアーフィティング（メス）を接続した。
２．底面から５ｍｍの高さまで、６０ｍｍシャーレを削った。
３．人工血管付き基材を２．５φのルアーフィティング（オス）と接続した。
４．６０ｍｍシャーレと人工血管付き基材のルアーフィティングとをシリコーン樹脂で固定した。
５．タイゴンチューブを１０ｍｍの長さに切断し、２．５φのルアーフィティング（オス）と接続した。
６．６０ｍｍシャーレ上面の端から５ｍｍの位置に３．０φの穴をあけ、タイゴンチューブを接続した２．５φのルアーフィティング（オス）をシリコーン樹脂で固定した。
７．人工血管付き基材のスキャフォルド面がシリコーンシートに密着するように、スキャフォルドシートを６０ｍｍシャーレに配置した。
８．チューブと人工血管付き基材を固定した６０ｍｍシャーレをＥＯＧ滅菌した。
以上の手順により、装置１３０を得た。
【００６３】
次に、細胞固定培養法および灌流培養法による細胞培養方法および培養結果を説明する。
【００６４】
（細胞固定培養）
細胞固定培養条件を表３に示す。また、図７は、細胞培養の手順および条件を説明する図である。
【００６５】
【表３】
2015062392.tif 000005
【００６６】
具体的な固定培養手順を以下に示す。
１．ＦＢＳ入りのＤ−ＭＥＭ培地を２０μＬずつプレート（３３穴）の各穴にいれ、オーバーナイトでコーティングした。
２．プレート面積を１３．７ｃｍ2として、Ｘ0＝１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の接種濃度でプレートにＲＣＢ１９９４細胞を接種した。
３．ＣＯ2インキュベータ内にプレートを入れたシャーレを設置し培養をおこなった。
４．接種後２４時間後、シリコーンシートを取り除き、スキャフォルド面が上になるようにプレートをひっくり返し設置した。
【００６７】
インキュベータ内で１４日間培養した後の基材を位相差顕微鏡により観察した。結果を図８に示す。
図８において、穴Ａ〜穴Ｃのいずれの領域においても、スキャフォルドを構成する繊維網とは異なる太さの網目構造が形成されていることが確認された。この新たに形成された網目構造が、毛細血管網である。
【００６８】
（灌流培養）
装置１３０を用いて灌流培養をおこなった。図４（ｃ）に示したように、灌流培養中、人工血管に設けられた５つの供給口から培養液を基材中に流出させた。灌流培養条件を表４に示す。
【００６９】
【表４】
2015062392.tif 000006
【００７０】
また、具体的な灌流培養手順を以下に示す。
１．クリーンベンチ内で、ローラーポンプ（図４（ａ）のポンプ１２７）にチューブを設置した。
２．チューブとシャーレとを接続した。
３．チューブ内に培地を６ｍＬ添加した。
４．シャーレ内に培地を８ｍＬ添加した。
５．ＣＯ2インキュベータ内にローラーポンプを含む灌流回路を設置した。
６．培地流速を１．５ｍＬ／ｍｉｎとして培養した。
７．２４時間ごとに、位相差顕微鏡観察をおこなった。
８．４日目に回路内の培地を交換した。
【００７１】
図９（ａ）〜図９（ｅ）は１２日後、図１０は１８日後の位相差顕微鏡観察結果を示す図である。
図９（ａ）には、図４（ｃ）に示したシャーレ１３５を面内方向に１８０度回転した配置となっている。つまり、図９（ａ）において、人工血管の供給口は、図中下方向に開いており、ランダムスキャフォルドの図中下側に培養液が供給された。
図９（ｂ）より、人工血管に接していて、供給口が設けられていない部分には、毛細血管の形成が認められなかった。一方、図９（ｃ）より、人工血管に接しており、供給口をあけた側には、供給口のあいている部分に毛細血管の形成が認められた。
また、図９（ｄ）および図９（ｅ）より、スキャフォルドを構成する繊維網とは異なる太さの網目構造が繊維間の空隙部に形成されていることが確認された。
【００７２】
また、図１０は、３次元繊維性スキャフォルドから形成された毛細血管を引っ張り出した観察結果を示す図である。図１０より、ランダムスキャフォルドを構成する繊維とは異なる網目構造が、管状体であることが確認された。
【符号の説明】
【００７３】
１０１  基材
１０１ａ  基材
１０３  空隙
１０５  細胞
１０７  培養液
１０９  送液部
１１１  流れ
１１３  毛細血管
１２０  装置
１２１  供給手段
１２２  装置
１２３  チューブ
１２５  供給口
１２７  ポンプ
１３０  装置
１３１  供給管
１３３  排出管
１３５  シャーレ
【図１】
2015062392.tif 000007
【図２】
2015062392.tif 000008
【図３】
2015062392.tif 000009
【図４】
2015062392.tif 000010
【図５】
2015062392.tif 000011
【図６】
2015062392.tif 000012
【図７】
2015062392.tif 000013
【図８】
2015062392.tif 000014
【図９】
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【図１０】
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