(57)【要約】【課題】本発明は、本発明は、細胞間接着力が強く、強度の高い細胞積層体を得るための手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、細胞積層体を製造するための細胞培養容器であって、細胞非接着性の内底面と、内底面に配置された第１の隔壁及び第２の隔壁とを備え、内底面と第１の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第１の収容部を形成し、内底面と第１の隔壁と第２の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第２の収容部を形成し、第１の隔壁が内底面に着脱可能に取り付けられている前記細胞培養容器に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞積層体を製造するための細胞培養容器であって、
細胞非接着性の内底面と、内底面に配置された第１の隔壁及び第２の隔壁とを備え、
内底面と第１の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第１の収容部を形成し、
内底面と第１の隔壁と第２の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第２の収容部を形成し、
第１の隔壁が内底面に着脱可能に取り付けられている
前記細胞培養容器。
【請求項２】
第１の隔壁と第２の隔壁が筒状であり、第２の隔壁の内側に第１の隔壁が配置される、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
第１の隔壁がエラストマー材料で形成される、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
細胞積層体の製造方法であって、
ａ）細胞培養容器を準備する工程であって、
細胞培養容器が、細胞非接着性の内底面と、内底面に配置された第１の隔壁及び第２の隔壁とを備え、
内底面と第１の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第１の収容部を形成し、
内底面と第１の隔壁と第２の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第２の収容部を形成し、
第１の隔壁が内底面に着脱可能に取り付けられている、前記工程
ｂ）第１の収容部に細胞及び培地を添加する工程、
ｃ）内底面方向へ遠心力を作用させながら細胞培養を行い、細胞積層体を形成する工程、
ｄ）第２の収容部に培地を添加する工程、
ｅ）第１の隔壁を除去する工程、及び
ｆ）細胞積層体を培養する工程
を含む、前記方法。
【請求項５】
第１の隔壁と第２の隔壁が筒状であり、第２の隔壁の内側に第１の隔壁が配置される、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、厚さ方向に複数の細胞が積層された細胞積層体を製造するための細胞培養容器、及び該細胞培養容器を用いた細胞積層体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン等の培養担体上で細胞を培養させて製造される生体組織は細胞密度が低いため、医療目的の移植用組織として適したものではない。移植に適した、細胞密度が高い細胞シートなどの組織を製造する技術はティッシュエンジニアリングの分野において重要な技術であるといえる。しかしながら、従来の高細胞密度の生体組織の製造法には幾つかの問題点が存在する。
【０００３】
細胞を培養支持体上に播種し、細胞シートを形成することは一般に広く行われている。細胞シートの剥離を容易にする目的で、細胞接着面に温度応答性高分子化合物の層を設け、細胞の剥離を促進させる技術も開発されており、異物をほとんど含まない細胞シートの回収が可能である。しかしながらこの方法により形成される細胞シートは単層又は３層以下の細胞層から構成されることが通常である。このため、多層化を行うには、細胞シートを複数重ね合わせることが必要である。細胞シートは極めて薄く、取り扱いが困難であるため、複数重ね合わせることは容易でなく手間がかかる。例えば非特許文献1には、ウサギより採取した軟骨細胞を、温度応答性高分子層を有する培養皿を用いてシート化し、移植可能な状態である３層積層化させるのに３週間要したとの記述がある。したがって、容易に多層の細胞積層体を作製できる方法の開発が求められていた。
【０００４】
特許文献１〜３には、遠心力等の加重によって細胞積層体を形成させ移植に供するという試みが記載されている。これらの方法は、一度に多層からなる細胞積層体を作製できることが特徴である。さらに、特許文献２及び３では、遠心処理によって細胞積層体を作製後、更に培養を行うことで細胞間接着を増す方法を採用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１６１９５４号
【特許文献２】特開２０１０−２２６９６２号
【特許文献３】特開２０１０−４６０５３号
【非特許文献１】Kaneshiro et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 349巻 723〜731ページ 2006年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術では、遠心処理後の更なる培養のために、細胞積層体を別の細胞培養容器に移し替えているが、その際に、細胞積層体が破れてしまうという問題があることが判明した。また、細胞積層体を別の細胞培養容器に移し替えることなくそのまま培養を継続すると、細胞数に対して培地の量が不足することとなり細胞積層体中の細胞が培養中に死んでしまう現象が見られることが判明した。
【０００７】
本発明は、細胞間接着力が強く、強度の高い細胞積層体を得るための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、培養容器の内部を、着脱可能な隔壁により複数の収容部に区切り、一部の収容部で遠心力により細胞積層体を形成した後で、隔壁を除去し、より広い収容部で細胞積層体をさらに培養することにより、細胞積層体の細胞間接着力を増強できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）細胞積層体を製造するための細胞培養容器であって、
細胞非接着性の内底面と、内底面に配置された第１の隔壁及び第２の隔壁とを備え、
内底面と第１の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第１の収容部を形成し、
内底面と第１の隔壁と第２の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第２の収容部を形成し、
第１の隔壁が内底面に着脱可能に取り付けられている
前記細胞培養容器。
（２）第１の隔壁と第２の隔壁が筒状であり、第２の隔壁の内側に第１の隔壁が配置される、（１）に記載の細胞培養容器。
（３）第１の隔壁がエラストマー材料で形成される、（１）又は（２）に記載の細胞培養容器。
（４）細胞積層体の製造方法であって、
ａ）細胞培養容器を準備する工程であって、
細胞培養容器が、細胞非接着性の内底面と、内底面に配置された第１の隔壁及び第２の隔壁とを備え、
内底面と第１の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第１の収容部を形成し、
内底面と第１の隔壁と第２の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第２の収容部を形成し、
第１の隔壁が内底面に着脱可能に取り付けられている、前記工程
ｂ）第１の収容部に細胞及び培地を添加する工程、
ｃ）内底面方向へ遠心力を作用させながら細胞培養を行い、細胞積層体を形成する工程、
ｄ）第２の収容部に培地を添加する工程、
ｅ）第１の隔壁を除去する工程、及び
ｆ）細胞積層体を培養する工程
を含む、前記製造方法。
（５）第１の隔壁と第２の隔壁が筒状であり、第２の隔壁の内側に第１の隔壁が配置される、（４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞間接着力が強く、強度の高い細胞積層体を製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す概略図である。Ａ１及びＢ１は上面図を示し、Ａ２及びＢ２は断面図を示す。また、Ａ１及びＡ２は、第１の隔壁が配置された状態を示し、Ｂ１及びＢ２は、第１の隔壁が除去された状態を示す。
【図２】図２は、本発明の細胞積層体の製造方法の一実施形態を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の細胞培養容器の一実施形態を示す写真である。
【図４】図４は、細胞積層体を示す写真である。
【図５】図５は、試験例１における操作をまとめた表である。
【図６】図６は、試験例における細胞積層体の回収結果をまとめた表である。
【図７】図７は、細胞積層体の層構造を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の細胞培養容器は、細胞積層体を製造するための細胞培養容器であり、細胞非接着性の内底面と、内底面に配置された第１の隔壁及び第２の隔壁を備える。内底面と第１の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第１の収容部を形成し、内底面と第１の隔壁と第２の隔壁とが、細胞及び培地を収容可能な第２の収容部を形成する。そして、少なくとも第１の隔壁は、内底面に着脱可能に取り付けられている。本発明の細胞培養容器は、好ましくは、内底面方向へ遠心力を作用させて細胞積層体を製造するための細胞培養容器である。
【００１３】
本発明の細胞培養容器は、少なくとも２つの隔壁と、少なくとも２つの収容部を有するが、さらなる隔壁及びさらなる収容部を有していてもよい。
【００１４】
一実施形態において、第１の隔壁と第２の隔壁は筒状であり、第２の隔壁の内側に第１の隔壁が配置される。このような実施形態の一態様として、例えば、図１に示す細胞培養容器を例示できる。図１に示す細胞培養容器１は、内底面２と側壁３を備える培養皿の内底面に、筒状の第１の隔壁４が配置された構造を有する。このような構造では、培養皿の側壁３が第２の隔壁を構成することになる。そして、内底面２と第１の隔壁４とにより第１の収容部５が形成され、内底面２と第１の隔壁４と第２の隔壁３（培養皿の側壁）とにより第２の収容部６が形成される。内底面と側壁を備える培養皿を用いることにより、内底面に第１の隔壁を配置するだけで、簡便に本発明の細胞培養容器を製造することができる。
【００１５】
培養皿としては、特に制限されないが、開口部が好ましくは円形で、開口幅（例えば、図１のＲ）が、好ましくは２５〜６０ｍｍ、特に３５ｍｍであり、深さ（例えば、図１のＬ１）が、好ましくは１０〜２５ｍｍのものが用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレから簡便に作製できること、及び既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。
【００１６】
内底面と第２の隔壁、一実施形態においては培養皿を構成する材料は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。
【００１７】
第１の隔壁は、好ましくは筒状であり、筒の軸に垂直な断面形状は、特に制限されないが、例えば、円形、楕円形、及び正多角形（正三角形、正方形、菱形、正五角形、正六角形、正八角形など）が挙げられ、好ましくは円形である。断面形状が円形や正多角形である筒状の隔壁を第１の隔壁とすることで、容器の内底面に安定に配置することができ、細胞培養容器の内底面方向に遠心力を作用させる際にも、第１の隔壁が動くことや、それによって第１の収容部に収容された培地や細胞が漏れ出すのを防止できる。さらに好ましくは筒の軸に垂直な断面形状が点対称であるものを用いる。断面形状が点対称である筒状の隔壁を用いることにより、面内で厚みが均一の細胞積層体を作製することができる。点対称な図形とすることにより、例えば遠心機でスイングしている際に上下で細胞数に偏りが生じて重心が中心からずれてしまい不均一になることを防止できる。
【００１８】
筒状である第１の隔壁は、その軸に垂直な断面により形成される図形の重心と、内底面の重心とが重なるように配置されていることが好ましい。例えば、内底面が円形であり、第１の隔壁の断面により形成される形状が円形である場合は、両者の円の中心が重なるように第１の隔壁を配置することが好ましい（図１）。それにより、容器の内底面に安定に配置することができ、細胞培養容器の内底面方向に遠心力を作用させる際にも、第１の隔壁が動くことや、それによって第１の収容部に収容された培地や細胞が漏れ出すのを防止できる。
【００１９】
第１の隔壁のサイズは、第２の隔壁の内側に収容可能なサイズ、一実施形態においては培養皿の側壁の内側に収容可能なサイズであれば、特に制限されない。例えば、第２の隔壁が円筒状であり、好ましくは開口部が円形の培養皿の側壁であり、第１の隔壁が円筒状である場合、第１の隔壁の軸に垂直な断面が形成する円の外周の直径（例えば、図１のｒ１）が、第２の隔壁が形成する円の内周の直径（例えば、図１のＲ）より小さいことが好ましい。例えば３５ｍｍサイズのディッシュを第２の隔壁として用いる場合（Ｒ＝３５ｍｍ）、第１の隔壁の軸に垂直な断面が形成する円の外周の直径（例えば、図１のｒ１）は、好ましくは６〜３０ｍｍであり、内周の直径（例えば、図１のｒ２）は、好ましくは５〜２５ｍｍである。
【００２０】
第１の隔壁の厚みは、その材質により適宜設計することができ、特に制限されないが、好ましくは１〜１０ｍｍである。一定以上の厚みとすることで、遠心力をかけた際に培地からかかる水圧に耐えることができ、一定以下の厚みとすることで、スペースの無駄を無くすことができる。
【００２１】
第１の隔壁の高さ（例えば、図１のＬ２）は、特に制限されないが、第２の隔壁の高さ、一実施形態においては培養皿の側壁の高さ（例えば、図１のＬ１）より低いことが好ましい。第１の隔壁の高さが、第２の隔壁の高さより高いと、細胞培養容器に蓋をして密閉することが困難だからである。一方、第１の隔壁は、内底面と第１の隔壁とによって形成される第１の収容部が、十分な量の細胞及び培地を収容可能な高さを有するよう構成される。第１の隔壁の高さは、例えば５〜２０ｍｍである。
【００２２】
第１の隔壁は、容器の内底面に着脱可能に取り付けられている。着脱可能な取り付け方法としては特に制限されないが、接着剤を介して取り付ける方法が挙げられる。接着剤としては、生体親和性を有するものが好ましい。また、外力をかけることで着脱可能な程度の接着強度で接着可能なものが好ましい。例えば、フィブリン系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、ゼラチンをホルムアルデヒド又はグルタールアルデヒドで架橋させたゼラチン系接着剤、ポリウレタン系接着剤、生分解性高分子（アルブミン、コラーゲン及びゼラチンなど）を含む接着剤（例えば、特許４８４４８０６号参照）、ならびに林著、溶接学会誌、第７０巻、１９〜２３ページ、２００１年に記載される接着剤などが挙げられる。また、着脱可能な取り付け方法としては第１の隔壁と容器の内底面とが互いに嵌め合うようにする方法等であってもよい。
【００２３】
第１の隔壁を構成する材料は、特に制限されず、内底面と第２の隔壁を構成する材料、一実施形態においては培養皿を構成する材料と同様の材料であってもよい。一実施形態において第１の隔壁は、エラストマー材料で形成されることが好ましい。第１の隔壁をエラストマー材料とすることにより、接着剤を用いなくても、圧着させるだけで、第１の隔壁を容器の内底面に着脱可能に取り付けることができる。その場合、第１の隔壁を配置する対象となる内底面を構成する材料を、ガラス又はプラスチックとすることにより、第１の隔壁と内底面とを圧着させる場合の密着性を増すことができる。
【００２４】
エラストマー材料には、ゴム材料、熱硬化性樹脂系エラストマー材料、及び熱可塑性樹脂系エラストマー材料が包含されるが、耐熱性の観点から熱硬化性樹脂系エラストマー材料が好ましい。ゴム材料には、天然ゴム及び合成ゴム（ポリブタジエン系ゴム、ニトリル系ゴム、クロロプレン系ゴム）が包含される。エラストマー材料の具体例としては、ウレタンゴム、ニトリルゴム、シリコーンゴム、シリコーン樹脂（例えば、ポリジメチルシロキサン）、フッ素ゴム、アクリルゴム、イソプレンゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴム、クロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブタジエンゴム、及びポリイソブチレンゴムなどが挙げられる。シリコーンゴム及びシリコーン樹脂は、耐熱性に優れ、固体として安定しているため、特に好ましい。また、シリコーンゴム及びシリコーン樹脂は、弾性を硬化剤の量で調整できる点でも好適である。
【００２５】
第１の隔壁としてエラストマー材料からなるものを用いる場合でも、接着剤を用いて、第１の隔壁と内底面とをより安定に固定することができる。その場合、接着剤として、第１の隔壁を構成する材料と同じ又は同種の材料からなる接着剤を用いることが好ましい。例えば、シリコーンゴム製又はシリコーン樹脂製の第１の隔壁を固定する場合は、シリコーンゴム接着剤又はシリコーン樹脂接着剤を用いることが好ましい。上記組合せであれば、接着剤の効果により安定な固定化が可能であるとともに、第１の隔壁の着脱も容易に実施できる。
【００２６】
本発明の細胞培養容器の内底面は細胞非接着性であるが、細胞培養容器のその他内表面の細胞接触領域も、細胞非接着性であることが、細胞積層体の剥離の容易性という観点から好ましい。例えば、第１の隔壁の表面、第２の隔壁の表面、又は内底面と第２の隔壁を形成する培養皿の内表面も、細胞非接着性であることが好ましい。細胞接着性及び細胞非接着性は、一の領域と他の領域における細胞の接着度合いの相対的な関係を示すものである。細胞接着性とは、細胞が接着しやすいことをいう。細胞接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりやすいか否かで決定される。
【００２７】
細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
【００２８】
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。
【００２９】
内底面をはじめとする内表面が細胞非接着性である細胞培養容器は、例えば、第１の隔壁、第２の隔壁、及び内底面を個性する材料の表面、又は一実施形態においては内底面と第２の隔壁を構成する培養皿を構成する材料の表面に親水化処理を施して親水性面とすることにより得ることができる。
【００３０】
親水化処理は、当技術分野で通常用いられる方法で実施することができ、特に制限されない。例えば、プラズマ処理、コーティング処理、ＵＶ照射処理、ＥＢ照射処理、表面への親水性ポリマー等のグラフト重合処理等が挙げられるが、処理対象の形状が３次元的に微細で複雑な構造を有していても全体を均一に処理できる観点からプラズマ処理が好ましい。
【００３１】
プラズマ処理としては、不活性ガスを用いたプラズマ処理が挙げられる。不活性ガスとしては、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、キセノン（Ｘｅ）等の希ガス、窒素（Ｎ２）、酸素（Ｏ２）、フッ化炭素ガス等が挙げられる。フッ化炭素としては、フッ化エチレン（Ｃ２Ｆ４）、及び六フッ化プロピレン（ＣＦ３ＣＦＣＦ２）等の不飽和フッ化炭素（不飽和結合を有するフッ化炭素）、四フッ化炭素（ＣＦ４）、六フッ化炭素（Ｃ２Ｆ６）、八フッ化シクロブタン（Ｃ４Ｆ８）、トリフルオロメタン（ＣＨＦ３）及び八フッ化プロパン（Ｃ３Ｆ８）等の飽和フッ化炭素が挙げられる。フッ化炭素として、一塩化三フッ化エチレン（Ｃ２ＣｌＦ３）、三塩化一フッ化炭素（ＣＣｌ３Ｆ）、一臭化三フッ化炭素（ＣＢｒＦ３）、六フッ化アセトン（（ＣＦ３）２ＣＯ）、六フッ化アルコール（（ＣＦ３）２ＣＨＯＨ）等のフッ素以外のハロゲン元素を含有するものを使用してもよいが、フッ素と炭素のみからなるフッ化炭素が好ましい。処理対象への長期親水化保持の観点から酸素ガスやアルゴンガスを用いたプラズマ処理が好ましい。また、表面の劣化（分解やエッチング）等を防ぐ観点では、大気圧下で発生させる低温プラズマ処理が好ましい。
【００３２】
コーティング処理としては、親水性ポリマーによるコーティング処理が挙げられる。親水性ポリマーは、炭素成分を含み、ポリマーの主鎖もしくは側鎖に親水性の官能基を含むポリマーのことを指す。親水性ポリマーは、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を含む水溶性ポリマーであることが好ましい。親水性ポリマーは、恒常的に水溶性や水膨潤性を有するものであってもよいし、光、温度、ｐＨなどの所定の刺激により水溶性や水膨潤性を示すものであってもよい。
【００３３】
親水性ポリマーの具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ−２−ヒドロキシメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）、これらと他のモノマーとのコポリマーやグラフトポリマー、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー（ＭＰＣポリマー）などが挙げられる。中でもポリアルキレングリコールは様々な分子量のものが市販されており、かつ生体適合性に優れているので好適に用いることができる。ポリアルキレングリコールの具体例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられ、本発明においては親水性ポリマーとして、ポリエチレングリコールが特に好適に用いられる。
【００３４】
上記のような親水性ポリマーなどの親水性材料で、第１の隔壁及び第２の隔壁等を含む細胞培養容器を形成することにより、親水化処理なしでもその表面を親水性面とすることができる。その他の親水性材料としては、ポリアクリロニトリル、ナイロン６、ポリエチレンテレフタラート、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、フェノール樹脂などが挙げられる。
【００３５】
親水性面とは、水接触角が７０°以下である面のことをいう。親水性面の水接触角は、好ましくは６０°以下、より好ましくは５０°以下、さらに好ましくは４５°以下であり、好ましくは１０°以上である。水接触角が上記範囲であれば、十分な親水性を有しているといえる。なお、水接触角は、２３℃において測定される水接触角をさす。
【００３６】
本発明において、細胞非接着性の面には、細胞接着性から細胞非接着性に変化することが可能な面も包含される。このような表面は、温度応答性材料、ｐＨ応答性材料及びイオン応答性材料からなる群から選択される少なくとも１種の刺激応答性材料を基材の表面に固定化することにより形成することができる。刺激応答性材料としては特に温度応答性ポリマーが好ましいがこれには限定されない。
【００３７】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーとしては、細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞積層体の回収時の温度下において親水性を示すものである。本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃であるポリマーが好ましい。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的には、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
【００３８】
本発明の細胞培養容器には、第１の隔壁が内底面に配置されていない状態、すなわち、内底面に第２の隔壁が配置された容器（一実施形態においては、内底面と第２の隔壁を構成する培養皿）と第１の隔壁との組み合わせ形態も包含される（例えば、図１のＢ１及びＢ２に示される組み合せ形態）。
【００３９】
本発明はまた、上述の細胞培養容器を用いた細胞積層体の製造方法に関する。本発明の細胞積層体の製造方法は、例えば、図２に示すように、
ａ）上述の細胞培養容器１を準備する工程、
ｂ）第１の収容部５に細胞７及び培地８を添加する工程、
ｃ）内底面方向へ遠心力９を作用させながら細胞培養を行い、細胞積層体１０を形成する工程、
ｄ）第２の収容部６に培地８を添加する工程、
ｅ）第１の隔壁を除去する工程、及び
ｆ）細胞積層体１０を培養する工程
を含む。
【００４０】
本発明に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞などの骨細胞などが挙げられる。
【００４１】
これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
【００４２】
これらの細胞を、予め通常の方法で培養して増殖させ、酵素処理することにより剥離する。培地としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。接着性細胞は、培養の際の培養容器の表面に接着して増殖するため、これを酵素処理により培養容器から剥離の上、培地中に懸濁させることにより回収することができる。
【００４３】
工程ｂ）は、このようにして回収した細胞を、培地と共に、細胞培養容器の第１の収容部に添加する工程である。ここで、酵素処理により剥離回収した細胞を、細胞培養容器の第１の収容部に添加する際には、細胞を培地に再懸濁させてこれを添加することが好ましい。細胞を懸濁させる培地としては、特に制限されず、上記のような各種培地や緩衝液など細胞の種類に応じて選択することができる。例えば、リン酸緩衝バッファー（ＰＢＳ）、ハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ）などが挙げられる。細胞の生存に最適な培地であることが好ましい。ただし、細胞生存の観点からｐＨは、好ましくは７．０〜７．６、より好ましくは７．２〜７．４の範囲とする。また細胞懸濁液には、細胞間接着タンパク質をさらに添加することにより細胞積層体の強度を向上させてもよい。また、細胞生存性を向上させる観点から、細胞懸濁液に動物由来の血清を添加してもよい。
【００４４】
工程ｃ）は、細胞培養容器の内底面方向へ遠心力を作用させながら細胞培養を行い、細胞積層体を形成する工程である。本工程では、遠心力により細胞が内底面の形状に応じて内底面に密着した状態で、細胞同士が接着し、所望の形状の組織が形成される。
【００４５】
内底面方向とは、好ましくは内底面に垂直な方向である。内底面に垂直な方向とは、内底面に対し厳密に垂直であることを意図するものではなく、例えば、厳密に垂直な方向に対し、３０°以内のずれがあってもよい。
【００４６】
遠心力の大きさは、細胞の機能に悪影響を与えることなく組織の形成が可能な範囲で適宜選択することができる。好ましくは２〜２０００Ｇ、より好ましくは１０〜１０００Ｇ、より好ましくは５０〜８００Ｇで遠心力を付与する。遠心処理においては、細胞懸濁液を収容した培養容器を遠心器に設置し、遠心処理を行うことで遠心力を付与することができる。
【００４７】
遠心時間に関しても、細胞の機能に悪影響を与えることなく組織の形成が可能な範囲で適宜選択することができる。好ましくは５分以上、より好ましくは６０分以上、さらに好ましくは９０分以上であり、好ましくは８４０分以内、より好ましくは７２０分以内、さらに好ましくは３６０分以内である。
【００４８】
細胞培養は、細胞間接着が形成される条件で行うことが好ましい。「細胞間接着が形成される条件」とは細胞が活動して細胞同士が接着できる条件を指す。培養する細胞の種類に応じて変動するが、例えば温度条件は２０〜４０℃が好ましく、雰囲気ガス条件としては二酸化炭素濃度が３〜５％であることが好ましい。
【００４９】
遠心処理では細胞間接着が形成されれば十分であり、細胞数を増殖により増やすことは必須ではない。培地中における細胞数を適宜調節することにより、作製される細胞積層体の厚さ（すなわち厚さ方向の細胞積層数）を制御することが可能である。遠心処理工程において細胞の増殖を行う必要がないため、比較的短時間で細胞積層体を得ることができる。また細胞積層体の厚さ、形状を自在に調節することができる。
【００５０】
遠心処理終了後に、得られた細胞積層体は、例えばピペッティング操作などの簡単な物理的な操作よって、細胞培養容器の内底面から剥離することができる。遠心処理で用いる細胞培養容器は内底面が細胞非接着性であることから、この操作は容易であり短時間の培養で細胞積層体の作製及び剥離が可能である。内底面が刺激応答性材料などの細胞非接着性に変化する表面である場合には、細胞非接着性となるような環境（例えば下限臨界温度以下の温度）において剥離操作を行う。得られる細胞積層体は、好ましくは層構造、より好ましくは３層以上の層構造を有する細胞シートの形状である。
【００５１】
工程ｄ）は、第２の収容部に培地を添加する工程である。ここで添加する培地としては、上記と同様のものを用いればよいが、細胞積層体の更なる培養のために栄養素を補充することを目的とすることから、細胞の生存に必要な栄養素を含み、細胞の生存に最適な培地であることが好ましい。細胞の生存に必要な栄養素としては、例えば、グルコース等を始めとした炭素源、窒素源及び無機イオン、各種アミノ酸やタンパク質等が挙げられる。
【００５２】
第２の収容部に培地を添加する際には、第１の収容部に収容された細胞と培地の混合物の液の高さと同等の高さとなるような量で添加することが好ましい。そうすることで、工程ｅ）において第１の隔壁を除去するときに、液の揺れや振動を抑制することができ、細胞積層体が損傷を受けるのを防止できる。工程ｃ）の遠心処理で形成された細胞積層体においては、細胞間接着が形成されているが、強固なものではないため、できるだけ刺激を抑制して損傷を回避することが望ましい。
【００５３】
工程ｅ）は、第１の隔壁を除去する工程である。第１の隔壁の除去は、ピンセット等により行うことができるが、上記のとおり、遠心処理で形成された細胞積層体にダメージを与えないように、できるだけ液揺れや振動が生じないように実施することが好ましい。第１の隔壁を除去することにより、第１の収容部の内容物と第２の収容部の内容物が混合されることになる。
【００５４】
工程ｆ）は、細胞積層体を更に培養する工程である。第１の隔壁が除去されていることから、細胞積層体は、より広い領域で、第２の収容部から混合された追加の培地の存在下で培養されることになる。したがって、遠心処理下での細胞積層体の形成において培地中の栄養素等が消費され不足していても、第２の収容部に添加された培地に含まれる栄養素等が追加されることにより、細胞積層体に含まれる細胞の生存を維持することができる。更に、追加された栄養素により細胞培養を促進させることができ、細胞間接着の形成も促進することができる。
【００５５】
工程ｆ）における細胞積層体の培養条件は、特に制限されないが、上記と同様に、細胞間接着が形成される条件で行うことが好ましい。例えば温度条件は２０〜４０℃が好ましく、雰囲気ガス条件としては二酸化炭素濃度が４〜６％であることが好ましい。培養時間は、特に制限されないが、例えば１２〜４８時間であることが好ましい。１２時間以上とすることで十分な細胞間接着を形成させることができ、４８時間以下とすることで培地成分の消費により細胞が壊死するのを防止できる。
【００５６】
本発明の方法は、更なる隔壁及び更なる収容部を有する細胞培養容器を用い、工程ｃ）〜ｆ）を繰り返すことにより、遠心処理と培養を繰り返し実施してもよい。例えば、第２の隔壁の外側に、第３の隔壁を有し、内底面と第２の隔壁と第３の隔壁により形成される第３の収容部を有する細胞培養容器を用いることができる。例えば、工程ｄ）において細胞積層体を培養して細胞間接着を増強させた後、好ましくは更に細胞を添加し、工程ｃ）を繰り返して遠心処理を実施し、よりサイズの大きい細胞積層体を形成することができる。そして、工程ｄ）を繰り返して第３の収容部に培地を添加し、工程ｅ）を繰り返して第３の隔壁を除去し、工程ｆ）を繰り返して細胞積層体を培養することにより細胞間接着を増強させることができる。第３の隔壁の外側に第４の隔壁を有する細胞培養容器を用いる場合も同様である。
【００５７】
本発明の方法では、遠心処理後の細胞積層体の培養のために、細胞積層体を別の細胞培養容器に移し替える必要がなく、移し替えの際に、細胞積層体が破れてしまうという問題を回避できる。細胞積層体を別の細胞培養容器に移し替えることなくそのまま培養を継続すると、細胞数に対して培地の量が不足することとなり細胞が死滅するという問題も回避できる。培地不足を補うために単に培地をピペット等で追加すると、振動や液揺れにより細胞積層体が損傷してしまう場合があるが、本発明により細胞積層体に損傷を与えることなく、培地を追加することができる。
【００５８】
本発明によれば、細胞が高密度化された細胞積層体を得ることが可能となる。さらに、本発明により得られる細胞積層体は、細胞間接着力が向上しており、容易に回収可能な強度を有する。したがって、ハンドリングの際に破れにくく、移植用途に好ましい。
【００５９】
また、第１の隔壁のサイズを適宜変更することにより、所望のサイズの細胞積層体を製造することができる。
【００６０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。実施例において％は、特に記載がない限り、質量％をさすものとする。
【実施例】
【００６１】
＜実施例１＞
ポリジメチルシロキサンＫＥ−１８３０と触媒ＣＡＴ−１３００Ｌ−３（共に信越化学社）を重量比率１０：１で混合した後に攪拌を行った。その後、シリコーン製の鋳型に流し込み脱気した上で、７５℃にて９０分間、オーブンで加熱することにより硬化させた。
【００６２】
硬化後、鋳型から剥離した第１の隔壁を、上と同じポリジメチルシロキサンを接着剤として用い、ポリスチレン製３．５ｃｍペトリディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）の底面に接着させ、上記と同様の条件でオーブン加熱することにより硬化させた。
【００６３】
作製した培養容器の写真を図３に示す。第１の隔壁の内周の直径は１８ｍｍであり、第２の隔壁（ペトリディッシュ側壁）の内周の直径は２８ｍｍであった。第１の隔壁は、ピンセット等で力をかけることで取り外し可能であった。
【００６４】
＜試験例１＞
実施例１で作製した培養容器を用い、細胞積層体を作製した。実施例１で作製した培養容器は、７０％エタノールによる滅菌及びリン酸緩衝バッファー（ＰＢＳ）による洗浄を施した上で使用に供した。
【００６５】
１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）を用いて増殖させたＣＣＬ１６３細胞（マウス線維芽細胞）をトリプシン処理により回収した。実施例１で作製した培養容器の第１の隔壁の内側、すなわち第１の収容部に、細胞を１×１０７個播種し、上記と同じ培地中、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件で、１０００ｒｐｍで３時間遠心し細胞を積層化させた。培地が漏れること無く細胞積層化を実施できた。
【００６６】
実施例２では、遠心処理終了後、培地をピペッティングすることで細胞積層体を剥離した。続いて、第１の隔壁とディッシュ側壁との間、すなわち第２の収容部に培地を満たし、その後、滅菌されたピンセットを用いて第１の隔壁を除去し、３７℃で１５時間培養を行った。その結果得られた細胞積層体の写真を図４に示す。
【００６７】
比較例１では、遠心処理終了後、第１の隔壁を外さずにそのまま培養を継続させた（３７℃で１５時間の培養）。
【００６８】
比較例２では、第１の隔壁を有しない３．５ｃｍペトリディッシュを用い、上記と同様の遠心処理により細胞積層体を作製し、遠心処理終了後、培地を２ｍｌ追加し、３７℃で１５時間の培養を行った。
【００６９】
比較例３では、第１の隔壁を有しない３．５ｃｍペトリディッシュを用い、上記と同様の遠心処理により細胞積層体を作製し、得られた細胞積層体を、約９ｍｌの培地を満たした６ｃｍペトリディッシュに移し、３７℃で１５時間の培養を行った。
【００７０】
なお上記、比較例２及び３においてはＣＣＬ１６３細胞を実施例とほぼ細胞密度が同等になるように３×１０７個播種してから同様に遠心を行って細胞を積層化させた。
【００７１】
実施例２及び比較例１〜３の操作のまとめを図５の表に示す。
【００７２】
比較例１及び２では培地のピペッティングにより細胞積層体の回収はできたものの、遠心後の培養で培地が黄色に変色し、また、細胞積層体のシートに穴が開きバラバラになっていた。これは細胞数に対して培地の量が少なかったため栄養素が不足し細胞が死滅したためと考えられる。
【００７３】
比較例３では培地のピペッティングにより細胞積層体の回収はできたものの、６ｃｍペトリディッシュに移す際に細胞積層体のシートに破れが観察された。
【００７４】
結果のまとめを図６の表に示す。表中の○は欠損無く細胞積層体が回収できたことを示し、△は細胞積層体の回収はできたものの破れ等の欠損が見られたことを示し、×は細胞積層体がバラバラになり回収できなかったことを示す。
【００７５】
＜試験例２＞
試験例１の実施例２で作製した細胞積層体の細胞間接着の様子を観察するため以下の解析を行った。
【００７６】
細胞積層体を４％パラホルムアルデヒド溶液に室温で２０分間浸漬することで細胞を固定化させた。その後、ろ紙の上に載せ、パラフィン置換を行って包埋し、ミクロトームで厚さ５μｍの切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色を行った。具体的なプロトコールはそれぞれの染色試薬（和光純薬工業社）に添付された資料に記載された方法に従って行った。
【００７７】
比較例４として遠心直後の細胞積層体を回収し同様にＨＥ染色を行った。
【００７８】
結果を図７に示す。これより比較例４のように細胞を積層化しただけで追加の培養を行わない場合は、内部に空隙が多くあるのに対して、実施例２のように遠心処理後に追加の培養を行った場合は、細胞間接着が密になっていることが判明した。また、細胞の生存も確認された。
【００７９】
＜試験例３＞
実施例１と同様に作製した第１の隔壁を、ポリジメチルシロキサンを用いることなく、ポリスチレン製３．５ｃｍペトリディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）の底面に圧着することで固定した。
【００８０】
続いてＤＭＥＭ培地１ｍｌを第１の隔壁の内部に入れ、漏れがないことを確認した上で試験例１記載の条件で遠心処理を行い培地の漏れや第１の隔壁が動くかどうかを検討した。
【００８１】
その結果、培地の漏れや第１の隔壁のずれは観察されなかった。これより、エラストマー材料の第１の隔壁を用いる場合は接着剤による固定は必須ではないことが判明した。
【符号の説明】
【００８２】
１：細胞培養容器
２：内底面
３：第２の隔壁（培養皿の側壁）
４：第１の隔壁
５：第１の収容部
６：第２の収容部
７：細胞
８：培地
９：遠心力
１０：細胞積層体
【図１】
2015142525.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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