(57)【要約】【課題】微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から、被分離体を損傷させることなく、その寸法（サイズ）に応じて選択的に分離する方法及び当該分離方法に用いられる被分離体分離用基板を提供する。【解決手段】微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から、被分離体を分離する方法は、凹凸パターン３を有する凹凸構造体に被分離体混合物を接触させることにより、凹凸パターン３に被分離体を付着させ、被分離体を被分離体混合物から分離する工程を含み、凹凸パターン３は、被分離体と実質的に同一の寸法を有する。【選択図】図１
2015142526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から、前記被分離体を分離する方法であって、
凹凸パターンを有する凹凸構造体に前記被分離体混合物を接触させることにより、前記凹凸パターンに前記被分離体を付着させ、前記被分離体を前記被分離体混合物から分離する工程を含み、
前記凹凸パターンは、前記被分離体と実質的に同一の寸法を有することを特徴とする被分離体の分離方法。
【請求項２】
前記凹凸パターンは、１０〜５００ｎｍの寸法を有することを特徴とする請求項１に記載の被分離体の分離方法。
【請求項３】
前記凹凸構造体のうち、前記被分離体混合物と接触する領域は、複数の領域に区分され、
前記複数の領域のそれぞれに設けられている前記凹凸パターンの寸法は、相互に異なることを特徴とする請求項１又は２に記載の被分離体の分離方法。
【請求項４】
前記被分離体混合物と接触する前記凹凸構造体の表面が、親水性表面であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の被分離体の分離方法。
【請求項５】
前記被分離体は、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞、細胞小器官、小胞、顆粒、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム及びウィルスの少なくとも一種であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の被分離体の分離方法。
【請求項６】
微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から前記被分離体を分離するために用いられる被分離体分離用基板であって、
基材と、前記基材の一方の表面に形成されてなる凹凸パターンとを備え、
前記凹凸パターンは、前記被分離体と実質的に同一の寸法を有し、
前記被分離体分離用基板に前記被分離体混合物を接触させることにより、前記凹凸パターンに前記被分離体を付着させ、前記被分離体を前記被分離体混合物から分離可能であることを特徴とする被分離体分離用基板。
【請求項７】
前記凹凸パターンの寸法が、１０〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項６に記載の被分離体分離用基板。
【請求項８】
前記凹パターン及び前記凸パターンは、前記基材の一方の表面を区分してなる複数の領域のそれぞれに形成されており、
前記複数の領域のそれぞれに設けられている前記凹凸パターンの寸法は、相互に異なることを特徴とする請求項６又は７に記載の被分離体分離用基板。
【請求項９】
前記凹凸パターンの表面は、親水性表面であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の被分離体分離用基板。
【請求項１０】
前記被分離体は、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞、細胞小器官、小胞、顆粒、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム及びウィルスの少なくとも一種であることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の被分離体分離用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被分離体を分離する方法及び被分離体を分離するために用いられる基板に関し、特に微小粒子状の被分離体を分離する方法及び当該被分離体を分離するために用いられる基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体分野における微細加工技術であるナノインプリントリソグラフィー（ＮＩＬ）技術を応用し、微小粒子の分離、分析のために用いられるマイクロチップが開発されている。このマイクロチップは、上記微細加工技術としてのナノインプリントリソグラフィー技術により形成された、微細な分離用流路等を備えており、極少量の試料をマイクロチップに導入することにより、当該試料に含まれる微小粒子の分離、分析が可能となっている。特に、細胞、生体組織等の分離、分析を目的として用いられるマイクロチップの開発が活発になされている。
【０００３】
このようなマイクロチップとして、従来、基板上に形成された周曲流路を有し、周曲流路を通流する微小粒子（例えば、細胞、微生物（細菌類、ウィルス類等）、リポソーム、染色体、ミトコンドリア、細胞小器官（オルガネラ）等の生体関連微小粒子；ラテックス粒子、ゲル粒子、工業用粒子等の合成粒子等）を、遠心力の作用を利用して、微小粒子の比重に応じて遠心力方向に分離可能なものが提案されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１６２６４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述したような遠心力の作用を利用した分離方法によれば、比重に応じた分離が可能であるものの、各分離対象物（被分離体）をそのサイズに応じて分離するのは困難である。特に、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等の生体関連微粒子の中には、サイズは異なるものの比重が同程度のものが存在する。そのため、遠心力の作用を利用した分離方法では、それらを分離するのが困難であるという問題がある。上記生体関連微粒子のうち、生体内細胞から分泌され、体液中に存在する膜小胞（エクソソーム）は、細胞内情報伝達に重要な役割を果たし、ヒトの疾病に対する治療や、バイオマーカーとしての使用可能性を有することが知られている。この膜小胞（エクソソーム）を一個体ずつ分離することで、各膜小胞（エクソソーム）が保有するマイクロＲＮＡを解析することができ、また、そのマイクロＲＮＡを治療や診断に活用することができる。
【０００６】
微小粒子状の被分離体の中でも、特に膜小胞（エクソソーム）等の生体関連微小粒子は、細胞内情報伝達に重要な役割を果たし、ヒトの疾病に対する治療や、バイオマーカーとして使用可能性を有することで注目されており、当該膜小胞（エクソソーム）等の生体関連微小粒子をその寸法（サイズ）に応じて選択的に分離する方法の提案が求められている。
【０００７】
このような課題に鑑みて、本発明は、微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から、被分離体をその寸法（サイズ）に応じて選択的に分離する方法及び当該分離方法に用いられる被分離体分離用基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から、前記被分離体を分離する方法であって、凹凸パターンを有する凹凸構造体に前記被分離体混合物を接触させることにより、前記凹凸パターンに前記被分離体を付着させ、前記被分離体を前記被分離体混合物から分離する工程を含み、前記凹凸パターンは、前記被分離体と実質的に同一の寸法を有することを特徴とする被分離体の分離方法を提供する（発明１）。
【０００９】
微小粒子状の被分離体は、凹凸パターンを有する凹凸構造体に接触させたときに、当該被分離体と実質的に同一の寸法を有する凹凸パターンに選択的に付着し易い性質を有する。そのため、上記発明（発明１）によれば、被分離体と実質的に同一寸法の凹凸パターンを有する凹凸構造体に被分離体混合物を接触させることで、当該凹凸パターンと実質的に同一寸法の被分離体を選択的に分離することができる。
【００１０】
なお、本発明において「実質的に同一の寸法」とは、被分離体の寸法と凹凸パターンの寸法との比が１：０．５〜２．０の範囲であることを意味し、好ましくは１：０．７〜１．５、特に好ましくは１：０．８〜１．２である。
【００１１】
上記発明（発明１）において、前記凹凸パターンは、１０〜５００ｎｍの寸法を有するのが好ましい（発明２）。被分離体の寸法が１０〜５００ｎｍ程度であることで、被分離体が実質的に同一寸法の凹凸パターンにより選択的に付着し易くなるため、かかる発明（発明２）によれば、凹凸パターンと実質的に同一寸法の被分離体を選択的に分離することができる。
【００１２】
上記発明（発明１，２）において、前記凹凸構造体のうち、前記被分離体混合物と接触する領域は、複数の領域に区分され、前記複数の領域のそれぞれに設けられている前記凹凸パターンの寸法は、相互に異なるのが好ましい（発明３）。
【００１３】
上記発明（発明１〜３）において、前記被分離体混合物と接触する前記凹凸構造体の表面が、親水性表面であるのが好ましい（発明４）。かかる発明（発明４）によれば、被分離体混合物と接触する凹凸構造体の表面が親水性表面であることで、親水性表面に付着し易い被分離体を、その寸法に応じて選択的に分離することができる。
【００１４】
上記発明（発明１〜４）において、前記被分離体は、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム及びウィルスのうちの少なくとも一種であるのが好ましい（発明５）。
【００１５】
また、本発明は、微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から前記被分離体を分離するために用いられる被分離体分離用基板であって、基材と、前記基材の一方の表面に形成されてなる凹凸パターンとを備え、前記凹凸パターンは、前記被分離体と実質的に同一の寸法を有し、前記被分離体分離用基板に前記被分離体混合物を接触させることにより、前記凹凸パターンに前記被分離体を付着させ、前記被分離体を前記被分離体混合物から分離可能であることを特徴とする被分離体分離用基板を提供する（発明６）。
【００１６】
上記発明（発明６）において、前記凹凸パターンの寸法が、１０〜５００ｎｍであるのが好ましく（発明７）、前記凹パターン及び前記凸パターンは、前記基材の一方の表面を区分してなる複数の領域のそれぞれに形成されており、前記複数の領域のそれぞれに設けられている前記凹凸パターンの寸法は、相互に異なるのが好ましく（発明８）、前記凹凸パターンの表面は、親水性表面であるのが好ましく（発明９）、前記被分離体は、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム及びウィルスのうちの少なくとも一種であるのが好ましい（発明１０）。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物から、被分離体をその寸法（サイズ）に応じて選択的に分離する方法及び当該分離方法に用いられる被分離体分離用基板を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る被分離体分離用基板の概略構成を示す切断端面図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る被分離体分離用基板の他の構成を概略的に示す平面図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る被分離体分離用基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
図１は、本実施形態に係る被分離体分離用基板の概略構成を示す切断端面図であり、図２は、本実施形態に係る被分離体分離用基板の他の構成を概略的に示す平面図である。
【００２０】
図１に示すように、本実施形態に係る被分離体分離用基板１は、基材部２と、基材部２の主面２１に形成されてなる凹凸パターン３とを有する凹凸構造体であり、微小粒子を含む被分離体混合物から、特定の寸法の微小粒子（被分離体）を分離するために用いられるものである。
【００２１】
本実施形態に係る被分離体分離用基板１は、被分離体混合物に含まれる微小粒子の寸法が１０〜５００ｎｍ程度、好ましくは５０〜２００ｎｍ程度である場合に、その中から特定の寸法の被分離体を選択的に分離するのに有用である。特に、微小粒子状（寸法１０〜５００ｎｍ程度）の生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等の被分離体を含む、被分離体混合物としての生体内細胞等の培養液、血清等から、それらを寸法に応じて選択的に分離するのに有用である。
【００２２】
基材部２を構成する材料としては、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料等を用いることができる。特に、基材部２を構成する材料として上記透明材料を用いると、被分離体の凹凸パターン３への付着状態を顕微鏡などで観察しながら被分離体の分離操作を行うことができるため好ましい。さらには、基材部２を構成する材料として石英ガラス等の親水性表面を有する材料を用いると、親水性表面に付着し易い被分離体（例えば、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等）を選択的に分離することができるため好ましい。
【００２３】
なお、本実施形態において「透明」とは、波長１９０〜８００ｎｍの光を対象物（本実施形態においては基材部２）の片側から照射した際、照射された側とは反対側へ光が到達することを意味する。好適な基準を透過率で示すならば２０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。
【００２４】
基材部２の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、平面視略矩形状、平面視略円形状等を挙げることができる。また、平面視における基材部２の大きさや、基材部２の厚さも特に限定されるものではなく、被分離体分離用基板１の用途等に応じて適宜設定され得る。例えば、被分離体としての生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等の生体組織等を含む細胞培養液（被分離体混合物）から、それらの被分離体を分離するために、シャーレ等の容器に収容された細胞培養液に被分離体分離用基板１を接触させる場合、被分離体分離用基板１の平面視における大きさは、当該容器内に被分離体分離用基板１を載置可能な大きさに設定され得る。同様に、被分離体分離用基板１の厚さも、上記容器内に被分離体分離用基板１を載置したときに、その凹凸パターン３が細胞培養液に接触可能な厚さに設定され得る。
【００２５】
凹凸パターン３は、基材部２と一体的な構造物として、基材部２の主面２１に形成されている。
凹凸パターン３の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、平面視略円形又は略矩形のピラー状やホール状、ラインアンドスペース状等を挙げることができる。
【００２６】
凹凸パターン３の寸法は、被分離体混合物に含まれる被分離体のうち、分離対象物である被分離体の寸法と実質的に同一である。例えば、分離対象物である被分離体の寸法が、１００ｎｍ程度である場合、凹凸パターン３の寸法は、５０〜２００ｎｍ程度、好ましくは７０〜１５０ｎｍ程度、特に好ましくは８０〜１２０ｎｍ程度に設定され得る。
【００２７】
なお、凹凸パターン３の寸法とは、例えば、凹凸パターン３が平面視略円形又は略矩形のピラー状凸部３２又はホール状凹部３１である場合、当該ピラー状凸部３２又はホール状凹部３１の直径又は短辺長さを意味し、凹凸パターン３がラインアンドスペース状である場合、ライン状凸部３２及びスペース状凹部３１の短手方向の幅を意味する。
【００２８】
図１に示す例において、凹凸パターン３の凹部３１及び凸部３２は略同一寸法で設けられているが、このような態様に限定されるものではなく、凹凸パターン３の凹部３１及び凸部３２の寸法が異なっていてもよい。例えば、凹凸パターン３の凸部３２の寸法を１００ｎｍとし、凹部３１の寸法を３００ｎｍとしてもよい。このようにすることで、凹凸パターン３の凸部３２に寸法１００ｎｍ程度の被分離体を付着させ、凹部３１に寸法３００ｎｍ程度の被分離体を付着させることができ、寸法の異なる被分離体を交互に配列させるようにして選択的に分離することができる。
【００２９】
凹凸パターン３の高さ（アスペクト比）は、特に限定されるものではなく、凹凸パターン３の寸法に応じて、適宜設定され得る。通常、凹凸パターン３のアスペクト比が０．５〜５程度になるように、凹凸パターン３の高さが設定され得る。
【００３０】
基材部２の主面２１には、被分離体の寸法に応じた一の寸法（例えば、１００ｎｍ程度）の凹凸パターン３が設けられていてもよいし、複数の異なる寸法（例えば、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ）の凹凸パターン３が設けられていてもよい。
【００３１】
前者においては、被分離体混合物に含まれる被分離体のうち、当該凹凸パターン３の寸法と実質的に同一寸法の被分離体のみを選択的に分離することができる。すなわち、被分離体混合物に含まれる被分離体のうち、寸法１００ｎｍ程度の被分離体を選択的に分離することができる。
【００３２】
一方、後者においては、被分離体混合物に含まれる被分離体のうち、凹凸パターン３の各寸法に応じた被分離体を分離することができる。また、後者の場合、図２に示すように、基材部２の主面２１を複数のパターン領域２１１〜２１３に区分し、各パターン領域２１１〜２１３に異なる寸法の凹凸パターン３が設けられていてもよい。例えば、パターン領域２１１には寸法１００ｎｍの凹凸パターン３が、パターン領域２１２には寸法２００ｎｍの凹凸パターン３が、パターン領域２１３には寸法３００ｎｍの凹凸パターン３が設けられていてもよい。図２に示す構造の被分離体分離用基板１であれば、複数の異なる寸法の被分離体を、一度の操作で、その寸法に応じて各パターン領域２１１〜２１３にて選択的に分離することができる。
【００３３】
凹凸パターン３の表面は、分離対象物である被分離体の性質や、基材２を構成する材料等に応じて、適宜表面処理がなされていてもよい。例えば、被分離体が生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等である場合、それらの表面は親水性を示すことが知られている。そこで、凹凸パターン３の表面を親水性表面とする表面処理（例えば、親水性表面処理剤の塗布等）を行うことで、親水性表面に付着し易い被分離体（生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等）を容易に選択的に分離することができる。なお、基材２を構成する材料として石英ガラスを用いる場合には、凹凸パターン３の表面が親水性表面であるため、上記表面処理をしなくてもよい。
【００３４】
なお、凹凸パターン３の表面が親水性表面である場合、基材２の主面２１のうち、凹凸パターン３の表面以外の表面を、疎水性表面とする処理を施しておいてもよい。これにより、親水性表面に付着し易い被分離体を凹凸パターン３により付着させ易くなる。
【００３５】
上述したような構成を有する、本実施形態に係る被分離体分離用基板１によれば、微小粒子状の被分離体を含む被分離体混合物に凹凸パターン３を接触させるだけで、凹凸パターン３の寸法に応じた被分離体を選択的に分離することができるため、被分離体をその寸法（サイズ）に応じて選択的に分離することができる。また、本実施形態に係る被分離体分離用基板１が、１個の被分離体の寸法と実質的に同一の寸法の凹凸パターン３を有していれば、微小粒子状の被分離体を、その集合体としてではなく、個として分離することができるという効果も奏し得る。特に、被分離体が、生体内細胞又は培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）や、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等である場合、それらを寸法（サイズ）に応じて個として分離することができるため、生体関連微小粒子に異常（異質）が生じた場合、正常の生体関連微小粒子と比較して、個として差異を解析することもできる。
【００３６】
上述したような構成を有する被分離体分離用基板１は、例えば、下記のようにして製造することができる。図３は、本実施形態に係る被分離体分離用基板１の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。
【００３７】
図３（ａ）に示すように、まず、ハードマスク層３０を備える基材２を準備し、当該基材２のハードマスク層３０上にレジスト膜４０を形成し、電子線描画装置等を用いてレジスト膜４０にパターン潜像を形成する。
【００３８】
基材２としては、本実施形態に係る被分離体分離用基板１の構成材料（例えば、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料）からなる基板等を用いることができる。
【００３９】
ハードマスク層３０は、後述する工程（図３（ｄ）参照）により基材２をエッチングするために用いられるハードマスクパターン３１を形成するための層である。そのため、基材２を構成する材料とのエッチング選択比を考慮した材料により構成される。例えば、基材２が石英ガラスにより構成される場合、ハードマスク層３０は金属クロム等により構成されるのが望ましい。
【００４０】
レジスト膜４０を構成するレジスト材料としては、特に限定されるものではなく、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。
【００４１】
レジスト膜４０に形成されるパターン潜像は、被分離体分離用基板１における凹凸パターン３の寸法と実質的に同一の寸法（１０〜５００ｎｍ程度）で形成される。
【００４２】
次に、図３（ｂ）に示すように、レジスト膜４０に現像処理を施し、レジストパターン４１を形成し、図３（ｃ）に示すように、レジストパターン４１をマスクとしてハードマスク層３０をエッチングし、ハードマスクパターン３１を形成する。
【００４３】
その後、図３（ｄ）に示すように、ハードマスクパターン３１をマスクとして基材２をエッチングして、基材２の主面２１に凹凸パターン３を形成し、最後にハードマスクパターン３１を剥離することで、図３（ｅ）に示すように、基材２と、基材２の主面２１に形成された凹凸パターン３とを有する被分離体分離用基板１を製造することができる。
【００４４】
上述した構成を有する被分離体分離用基板１は、被分離体を含む被分離体混合物に凹凸パターン３を接触させることにより、凹凸パターン３の寸法と実質的に同一の寸法の被分離体を選択的に分離するための、被分離体の分離方法に適用することができる。
【００４５】
被分離体分離用基板１の凹凸パターン３を、被分離体を含む被分離体混合物に接触させる方法としては、例えば、被分離体混合物を収容する容器内に被分離体分離用基板１を載置し、凹凸パターン３と被分離体（被分離体混合物）とを接触させる方法、傾斜させて載置した被分離体分離用基板１の凹凸パターン３上に被分離体混合物を流動させる方法等が挙げられる。
【００４６】
被分離体混合物を収容する容器内に被分離体分離用基板１を載置して凹凸パターン３と被分離体とを接触させる方法において、当該凹凸パターン３と被分離体とを接触させる時間は、被分離体を選択的に分離するのに十分な時間である限り、特に制限されるものではない。
【００４７】
なお、本実施形態における被分離体混合物は、所定の流動性を有する限り、微小粒子状の被分離体を含む液体（例えば、微小粒子状の被分離体を含む懸濁液、被分離体としての膜小胞（エクソソーム）、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム、ウィルス等の生体関連微小粒子を含む生体内体液や細胞培養液等）に制限されるものではなく、液体を分散媒とするコロイド等であってもよい。
【００４８】
上述したように、本実施形態に係る被分離体分離用基板１を用いることで、被分離体を含む被分離体混合物から、凹凸パターン３の寸法と実質的に同一の寸法の被分離体を選択的に分離することができる。また、被分離体分離用基板１の凹凸パターン３と被分離体（被分離体混合物）とを単に接触させるだけで、所望とする寸法の被分離体を選択的に分離することができるため、従来の遠心力を利用した分離方法のように被分離体に対して負荷をかけることなく被分離体の分離が可能である。よって、被分離体を損傷させることなく分離することができるという効果を奏する。
【００４９】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
【００５０】
上記実施形態においては、基材２の主面２１に一体的な凹凸構造として形成された凹凸パターン３を有する被分離体分離用基板１を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、被分離体分離用基板１は、基材２の主面２１に、基材２とは別個の部材として構成される凹凸パターン３を有する凹凸構造体（例えば、凹凸パターン３を有するシート状部材等）を取り付けてなるものであってもよい。
【００５１】
上記実施形態においては、エッチングにより凹凸パターン３を形成し、その後ハードマスクパターン３１を剥離することで被分離体分離用基板１を製造しているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、凹凸パターン３が形成された基材２を、当該凹凸パターン３の寸法及び高さを変動させることなく薄板化してもよい。また、基材２上の複数の領域に凹凸パターン３を形成し、領域ごとに切断（個片化）することで、被分離体分離用基板１を製造してもよい。
【００５２】
上記実施形態においては、被分離体分離用基板１を用いて被分離体を分離する方法として、被分離体混合物を収容する容器内に被分離体分離用基板１を載置し、凹凸パターン３と被分離体（被分離体混合物）とを接触させる方法や、傾斜させて載置した被分離体分離用基板１の凹凸パターン３上に被分離体混合物を流動させる方法等を用いた分離方法を例に挙げているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、上記被分離体分離用基板１を用いた被分離体の分離方法は、凹凸パターン３と被分離体とを接触させるとともに、さらに遠心力の作用をも利用して被分離体を分離する方法であってもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等により何ら限定されるものではない。
【００５４】
〔被分離体分離用基板１の製造例〕
厚さ６ｎｍのＣｒからなるハードマスク層３０が主面２１に設けられている基材２としての石英ガラス基板を用意し、電子線感応型レジスト（製品名：ＳＥＢＰ−９０１２，信越化学工業社製）をハードマスク層３０上に塗布してレジスト膜４０を形成した。当該レジスト膜４０上に電子線描画装置を用いてピラー状のレジストパターン４１（寸法：５０ｎｍ）を形成した。
【００５５】
次に、レジストパターン４１をマスクとして用いてハードマスク層３０をドライエッチング（エッチングガス：Ｃｌ2＋Ｏ2）し、残存するレジストパターン４１を除去して、ハードマスクパターン３１を形成した。
【００５６】
上述のようにして形成されたハードマスクパターン３１をマスクとして用いて石英ガラス基板２をエッチングし、石英ガラス基板２の主面２１に、寸法５０ｎｍのピラー状の凹凸パターン３を形成した。最後に、ハードマスクパターン３１を剥離して、被分離体分離用基板１を製造した（試料１）。
【００５７】
また、レジストパターン４１の寸法を、それぞれ１００ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍに変更し、寸法１００ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍのピラー状の凹凸パターン３をそれぞれ石英ガラス基板２の主面２１に形成した以外は、上記と同様にして被分離体分離用基板１を製造した（試料２〜５）。
【００５８】
〔実施例１〕
幹細胞培養液の上澄み液（被分離体混合物）を収容した容器を５個用意し、各容器内に、上記製造例により製造した被分離体分離用基板１（試料１〜５）をそれぞれ載置し、上澄み液と被分離体分離用基板１とを接触させた。所定時間経過後、各被分離体分離用基板１を取り出し、光学顕微鏡、レーザー顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて凹凸パターン３上を観察した。その結果、試料１の被分離体分離用基板１の凹凸パターン３（寸法：５０ｎｍ）上には３０〜６０ｎｍの膜小胞が付着していることが確認された。また、試料２の被分離体分離用基板１の凹凸パターン３（寸法：１００ｎｍ）上には８０〜１２０ｎｍの膜小胞が付着していることが確認された。さらに、試料３の被分離体分離用基板１の凹凸パターン３（寸法：２００ｎｍ）上には１６０〜２４０ｎｍの膜小胞が付着していることが確認された。さらにまた、試料４の被分離体分離用基板１の凹凸パターン３（寸法：２５０ｎｍ）上には２００〜３００ｎｍの膜小胞が付着していることが確認された。また、試料５の被分離体分利用基板１の凹凸パターン３（寸法：３００ｎｍ）上には２４０ｎｍ〜３６０ｎｍの膜小胞が付着していることが確認された。
【００５９】
この実施例の結果から、上記被分離体分離用基板１によれば、被分離体を含む被分離体混合物から、凹凸パターン３の寸法に応じた寸法の被分離体を選択的に分離可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、微小粒子状の被分離体の選択的分離を必要とする技術分野、特に膜小胞（エクソソーム）等の生体関連微粒子を選択的に分離し、分析する技術分野において有用である。
【符号の説明】
【００６１】
１…被分離体分離用基板
２…基材部
２１…主面
２１１〜２１３…パターン領域
３…凹凸パターン
３１…凹部
３２…凸部
【図１】
2015142526.tif 000003
【図２】
2015142526.tif 000004
【図３】
2015142526.tif 000005