(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸分子に１つ以上の変異を導入するための変異誘発方法の提供。【解決手段】鋳型核酸分子から合成し、親分子に対して１以上の変異を含有する１本鎖型変異誘発プライマーを親分子にアニーリングさせ；そして、変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製する方法。該方法は分子集団に、例えば分子集団の作製又はスクリーニングに適用することができ、複数の変異誘発プライマーを用いて複数の親分子を変異させる組み合わせ様式に用いることもできる変異を含有する環状型様酸分子を作製する方法。【選択図】図６
2015171369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、１以上の変異を核酸分子に導入する方法：
（ａ）親分子に対して１以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から合
成し；
（ｂ）１本鎖型変異誘発プライマーを単離し；
（ｃ）１本鎖型変異誘発プライマーを１本鎖型親分子にアニーリングさせ；そして、
（ｄ）変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製す
る。
【請求項２】
アニーリング工程（ｃ）の前に、１本鎖プライマーを１本鎖親分子と混合させる、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】
分離媒体を使用して工程（ｂ）の１本鎖プライマーを単離する、請求項１に記載の方法
。
【請求項４】
工程（ｃ）の前に１本鎖親分子を単離する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の前に１本鎖親分子について行われるサイズ排除工程を更に含む、請求項４
に記載の方法。
【請求項６】
１本鎖親分子が１本鎖環状ＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
親分子が発現ベクター又はファージディスプレイベクターである、請求項１〜６のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項８】
環状型分子が共有結合的に閉じた環状ＤＮＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項９】
変異核酸分子で宿主細胞を形質転換させる工程を更に含む、請求項１〜８のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項１０】
エレクトロポレーションで形質転換を行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
変異含有相補鎖が優先的に選択される条件下で行われる工程を含む、請求項１〜１０の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
親分子の優先的消化から相補鎖の優先的選択が起こる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
相補鎖が優先的に選択されるように親分子が修飾を含有する、請求項１１に記載の方法
。
【請求項１４】
修飾を導入する工程を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
修飾が、ｄＴの代わりにｄＵを導入することである、請求項１３又は１４に記載の方法
。
【請求項１６】
修飾がメチル化又は条件的致死遺伝子の導入である、請求項１３又は１４に記載の方法
。
【請求項１７】
相補的非修飾鎖に選択的な宿主細胞を工程（ｄ）の環状型分子で形質転換することによ
り優先的選択が行われる、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣＲに基づいた方法で変異誘発プライマーを合成する、請求項１〜１７のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項１９】
第１鎖から第２鎖を合成する際にエラーを導入する合成法により、変異誘発プライマー
を合成する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
合成法がエラープロンＰＣＲである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
変異誘発プライマー合成のための鋳型配列が、親分子に見られるものと同一である、請
求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
変異誘発プライマーを合成する工程が、変異誘発プライマーの＋鎖か−鎖に結合部分を
導入し、分離媒体上の結合パートナーに結合している結合部分を介して分離が行われる、
請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
結合部分が変異誘発プライマーの＋鎖に導入され、変異誘発プライマーの−鎖は分離媒
体から溶離される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
結合部分がビオチンであり、結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項２２
又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
変異に置換が含まれる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
変異に欠失が含まれる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
変異に付加が含まれる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
変異が、複数のヌクレオチドにおける変異である、請求項１〜２７のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項２９】
変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも８０％の相補性を有する、請求項１〜２８
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも９０％の相補性を有する、請求項２９に記
載の方法。
【請求項３１】
変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも９５％の相補性を有する、請求項３０に記
載の方法。
【請求項３２】
変異誘発プライマーの大きさが１００〜４０００ヌクレオチドである、請求項１〜３１
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）において、親分子に対する変異誘発プライマーのモル比が約３：１である、
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
複数の親分子及び／又は複数の変異誘発プライマー分子が存在する、請求項１〜３３の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
親分子、鋳型、又は変異誘発プライマーが抗体可変ドメインを含有する、請求項１〜３
５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
抗体可変ドメインが抗体ＶＬドメインである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体可変ドメインが抗体ＶＨドメインである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
親分子が抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が
親分子のＶＬドメインを変異させるための抗体ＶＬドメインを含有する、請求項３５に記
載の方法。
【請求項３９】
親分子が抗体ＶＬドメイン及び抗体ＶＨドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が
親分子のＶＨドメインを変異させるための抗体ＶＨドメインを含有する、請求項３５に記
載の方法。
【請求項４０】
第１及び第２の変異誘発プライマーを用いて親分子を変異させ、第１変異誘発プライマ
ーは親分子上のＶＨドメインを変異させるための抗体ＶＨドメインを含有し、第２変異誘
発プライマーは親分子上のＶＬドメインを変異させるための抗体ＶＬドメインを含有する
、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
別個の変異誘発反応工程に第１及び第２の変異誘発プライマーを用いる、請求項４０に
記載の方法。
【請求項４２】
同一の変異誘発反応工程に第１及び第２の変異誘発プライマーを用いる、請求項４１に
記載の方法。
【請求項４３】
ＶＨ及びＶＬドメインを含有する単一変異誘発プライマーを用いて親分子上のＶＨ及び
ＶＬドメインを変異させる、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４４】
親分子がｓｃＦｖをコードする核酸を含む、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異核酸分子の産生方法に関するものである。特に、本発明は、変異誘発反
応に使用されるプライマー（変異誘発プライマー）自体が鋳型核酸分子から合成される方
法に関するものである。変異誘発反応の産物は、例えば更なる修飾を必要とすることなく
細菌を形質転換できる変異環状核酸分子である。好ましい態様では、当該方法は分子集団
に、例えば分子集団の作製又はスクリーニングに適用することができる。当該方法は、複
数の変異誘発プライマーを用いて複数の親分子を変異させる組み合わせ様式に用いること
もできる。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学的技術に関与する工程の１つはベクターへの核酸の導入である。例えば、Ｄ
ＮＡ断片又はＤＮＡ断片の集団は、消化され、連結反応によりベクターへ導入されること
ができる。例えば、ＤＮＡ断片（又は断片集団）は、サブクローニングとして知られる工
程で、消化され、第１のベクター（例えばプラスミド）から取り出されて第２のベクター
へ導入されることができる。したがって、連結反応のための相補的突出末端を生ずるよう
に、第１のベクターは第２のベクターと同一の制限酵素で消化される。次に、ＤＮＡ断片
と第２のベクターとがそれらの相補的突出末端により連結され、その結果が、ＤＮＡ断片
を含有する、宿主細胞（例えば細菌）において複製できる完成ベクターである。
【０００３】
したがって、さまざまな分子生物学的応用に使用するための大量のＤＮＡを産生するこ
とができる。又は、ＤＮＡが導入されているベクターは、特定の目的を有することができ
る（例えば発現ベクターであり得る）。そのような発現ベクターにいったん導入されると
、制限断片によってコードされるタンパク質が宿主細胞中のベクターから発現され得る。
いったん発現すると、得られたタンパク質をその最終用途のために精製することができる
。又は、特に当該方法がＤＮＡ断片の集団を発現ベクターへ組み込むために使用される場
合、発現したタンパク質は（例えば標的分子への結合親和性によって）スクリーニングに
用いることができる。
【０００４】
ＤＮＡへ変異を導入するさまざまな方法も公知である。Ｂａｒｉｋの研究から（Ｂａｒ
ｉｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第１９２巻：ＰＣ
Ｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、ｐ１８９−１９６、Ｂ−Ｙ  Ｃｈｅ
ｎ及びＨ．Ｗ  Ｊａｎｅｓ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社、トトワ、ニュージャージー
州；Ｂｕｒｋｅ及びＢａｒｉｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ  第２２６巻：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、ｐ５２５−５３１、ＪＭＳ
Ｂａｒｔｌｅｓｓ及びＤ  Ｓｔｉｒｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社、トトワ
、ニュージャージー州）、ＰＣＲに基づいたアプローチを用いて線状ＤＮＡに変異を導入
することが知られている。これらの方法にしたがい、ＰＣＲにて線状鋳型へ変異を導入す
るためにいわゆるメガプライマーが用いられている。しかしながら、そのような方法は、
例えばスケールアップやタンパク質発現のための複製型を産生するにはそれ自身を適切な
ベクターへサブクローニングする必要がある線状２重鎖ＤＮＡ産物を生ずる。
【０００５】
Ｍｉｙａｚａｋｉは、全プラスミドのＰＣＲを包含する方法を提唱した（Ｍｉｙａｚａ
ｋｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｄｉｒｅｃｔｅｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｅｄｓ  Ａｒｎｏｌｄ及びＧｅｏｒｇｉｏｕ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐ
ｒｅｓｓ社、トトワ、ニュージャージー州；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３：１０３
３−１０３８）。この方法では、２重鎖プラスミドをＰＣＲの鋳型として用い、そこへ、
導入すべき変異を含有する２重鎖ＰＣＲ産物をプライミングのために加える。しかしなが
ら、プライマー及び鋳型の２重鎖性は、プライマー鎖及び鋳型鎖を、交差アニーリングよ
りも自己アニーリングさせ得るため、自己アニーリングを最小化させるにはプライマー対
鋳型の特定比を用いる。
【０００６】
２重鎖鋳型から生ずる自己アニーリングの問題に加えて、２重鎖鋳型をＰＣＲに用いる
場合、更なる問題がある。指数関数的反応では、１ラウンドで導入されるエラーは、更な
るラウンドのそれぞれに指数基底で繰り越されるため、導入されるエラーの最大量が大き
い。更に、このＰＣＲ鋳型がベクター、例えばプラスミドのような大きな鋳型である場合
、これは、導入されるエラーの見込みを更に増加させる。
【０００７】
合成オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡを変異させることも知られている（Ｋｕｎｋｅ
ｌら、（１９８５）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、第８２巻、ｐｐ４８８−４９２；Ｓｉｄｈｕら
、新規結合ペプチドを選択するためのファージディスプレイ）。しかしながら、化学合成
できるオリゴヌクレオチドの長さには限界がある。更に、シンセサイザーのプログラムを
作るためには、配列が公知であって、産生用のシンセサイザーに前もって入力する必要が
ある。
【０００８】
したがって、代替変異誘発法の必要性が存在する。特に、細菌を直接形質転換でき、発
現スクリーニングにおけるような下流の使用の準備が整った（核酸を適切なベクターへ導
入するための更なる消化工程や連結工程の必要性を回避しながら）産物を産生する方法に
関し、必要性が存在する。高速で効率的な変異誘発方法や、例えばスクリーニングやライ
ブラリーの作製のための集団の産生に使用するスケールアップに適した方法に対する必要
性もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１つの側面では、本発明は、１以上の変異を核酸分子へ導入する方法を提供するもので
あり、当該方法は：鋳型核酸分子から合成し、親分子に対して１以上の変異を含有する１
本鎖型変異誘発プライマーを親分子へアニーリングさせ；そして、変異誘発プライマーか
ら相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製することを含む。
【００１０】
１つの側面では、本発明は、１以上の変異を核酸分子へ導入する方法を提供するもので
あり、当該方法は以下の工程を含む：
（ａ）親分子に対し１以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から合成
し；
（ｂ）１本鎖型変異誘発プライマーを分離し；
（ｃ）１本鎖型変異誘発プライマーを１本鎖型親分子へアニーリングさせ；そして、
（ｄ）変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製す
る。
【００１１】
このように、変異誘発プライマーは、鋳型核酸分子から、好適な酵素を用い、当該技術
分野に公知の方法を用いて合成される。変異誘発プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）に基づいた方法を用いて合成されることが好ましい。
【００１２】
鋳型分子と親分子は同一でもよく、変異誘発プライマーの合成の基礎を形成する同一配
列を含有していてもよい。このように、ある態様では、変異誘発プライマー合成のための
鋳型の配列は、親分子に見られるものと同一である。これらの態様では、鋳型分子から変
異誘発プライマーを合成するあいだのエラーの導入によって、例えばエラープロンポリメ
ラーゼによって変異を導入することができる。このように、ある態様では、変異誘発プラ
イマーは、第１鎖から第２鎖が合成される際にエラーが導入される合成法、好ましくはエ
ラープロンＰＣＲによって合成される（当該技術分野に熟練した者には好適な方法が公知
である。例えば、分子クローニング：実験室マニュアル：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９、コールドスプリングハーバー研究所出版）。当該技術分野では、エラープロン
ＰＣＲを実施するためのＤｉｖｅｒｓｉｆｙ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６３０７０
）のようなさまざまなキットが利用可能である。他のアプローチでは、ＤＮＡ配列にエラ
ーを導入する大腸菌株を鋳型分子で形質転換することができる（当該技術分野において好
適な株が利用可能である。例えばＸＬ１−ＲＥＤ（ストラタジーン））。鋳型から作製す
る際に変異誘発プライマーへエラーを導入する他の方法は、当該技術分野に熟練した者に
は公知であろう。
【００１３】
鋳型と親分子は異なる分子でもよく、即ち、親分子と鋳型分子とのあいだにそれぞれ配
列相違性がある領域を含有していてもよい。このように、変異誘発プライマーを鋳型から
合成する際、変異誘発プライマーは親分子と比べて変異を含有する（この場合、エラーを
導入する反応、例えばエラープロンＰＣＲは必要ない）。
【００１４】
当該技術分野に熟練した者は、変異誘発プライマーを鋳型から合成するための好適な試
薬や反応条件について知っている（例えば、分子クローニング：実験室マニュアル：第２
版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、コールドスプリングハーバー研究所出版を参照され
たい）。変異誘発プライマーをポリメラーゼ連鎖反応にて合成する場合、当該技術分野に
熟練した者によって、使用される鋳型を考慮しつつ好適なプライマーが選択される。変異
誘発プライマーを作製するために用いられるプライマーを、本明細書において初期プラマ
ーと称する。これらの初期プライマーは、フォワードプラマーとリバースプラマーで構成
され、これらは通常、増幅すべき配列の末端、即ち変異誘発プライマーになる配列の末端
に基づいている。初期プライマーは通常合成オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオ
チドシンセサイザーを用いて標準法にて作製される。これらの初期プライマーは任意の好
適な長さであり得、例えば長さおよそ１５〜１００ヌクレオチド、例えば長さおよそ１５
〜７５ヌクレオチド、長さおよそ１５〜５０ヌクレオチド、通常、長さ１８〜２５ヌクレ
オチドである。熟練した者は、例えば鋳型分子の配列、得られる変異誘発プライマーの大
きさ及び／又は当該方法の適用に応じて、好適な初期プラマーを選択又は設計することが
できる。
【００１５】
本発明の更なる利点は、変異誘発プライマーは鋳型核酸分子から合成されるため、変異
誘発プライマーの配列が使用者にとって未知であり得るという事実に起因する。例えば、
変異誘発プライマーを、鋳型の公知部分を対象とした初期プライマーを用いてＰＣＲにて
作製する場合、これら初期プライマーによって増幅された領域は未知であり得る。このよ
うに、ある態様では、変異誘発プライマーの配列は、アニーリングの前は未知である。こ
れは、本発明の方法がライブラリーに適用される特定の応用を有する（以下で更に議論さ
れる）が、これらに限定されるものではない。サブクローニングでは特定配列は未知であ
るが、それが含有されるベクターの境界は知られている他の応用が数多く存在する（１例
は「ショットガン」クローニングであろう）。熟練した者は、親分子に関する知識に基づ
いて好適な初期プライマーを選択することができる。
【００１６】
このように、工程（ｂ）に規定される分子は、その相補鎖から単離された１本鎖変異誘
発プライマーであり、分離及び単離という用語は１本鎖変異誘発プライマーに関して同義
的に用いられる。１本鎖変異誘発プライマーのその相補鎖からの分離又は単離は、以下に
記載のような分離媒体（ビーズや分離カラムなど）を用いて行われることが好ましい。こ
の方法では、合成する際、結合部分を変異誘発プライマーの一方の鎖に導入することがで
き、したがって、変異誘発プライマーの一方の鎖を、例えば以下に記載するような捕捉工
程において他方から単離することができる。
【００１７】
工程（ｂ）に規定される１本鎖プライマーは、分離媒体の使用により分離することが好
ましい。例えば、変異誘発プライマーを合成する工程は、変異誘発プライマーの＋鎖又は
−鎖に結合部分を導入することができ、したがって、変異誘発プライマーのその＋鎖と−
鎖への分離は、分離媒体上でその結合パートナーに結合している結合部分を介して行うこ
とができる。分離媒体は、ビーズやカラムなどの好適な固相媒体（例えば結合パートナー
が結合するビーズやカラム）であり得る。
【００１８】
より詳細には、結合部分は、変異誘発プライマーの＋鎖に導入することができ（例えば
結合部分を導入する変異誘発反応において初期フォワードプライマーを用いることによっ
て）、したがって、変異誘発プライマーの−鎖は、＋鎖が分離媒体に結合した後に溶離さ
せることができる。結合部分はビオチンであり、結合パートナーはストレプトアビジンで
あることが好ましい。他の好適な結合部分と結合パートナーは、当該技術分野に熟練した
者に公知であり、フルオレセインとジゴキシン、及び抗体（断片及び誘導体を含む）と抗
原が含まれる。
【００１９】
熟練した者は、使用できる他の結合部分と結合パートナーについて熟知している。例え
ば、ストレプトアビジンに加えて、ビオチンに結合するアビジンやニュートラアビジンな
どの他の結合パートナーが利用可能である。熟練した者は、好適な結合部分と結合パート
ナーを選択して、鎖分離に関与する捕捉工程に使用できる。更に、ビオチン及び／又はス
トレプトアビジンの類似体も使用できる（例えばＪ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９４）Ｓｅ
ｐ  ３０：２４２（４）：５５９−６５）を参照されたい）。ビオチンとストレプトアビ
ジンが最も好ましい。
【００２０】
例えば、特定の抗原性部分を、上記のビオチンの例について記載したのと類似の方法で
、合成中に変異誘発プライマーの一方の鎖へ組み込むことができる。次に、抗原に対する
抗体を含有するカラムを用いて、一方の鎖を他方から分離できるであろう。
【００２１】
他のアプローチは、特異的ＤＮＡ配列に結合するタンパク質を含有する分離システムを
用いることである。例えば、当該技術分野では、ＨａｅＩＩＩメチラーゼは特異的５’Ｄ
ＮＡ配列に結合し、特異的ＤＮＡ配列に結合するタンパク質の他の例はＰ２Ａであること
が知られている。そのようなアプローチについての議論は、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ及
びＮｅｒｉ、『Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ』（２００４）、第１７巻、第６９９頁を参照されたい。
【００２２】
結合パートナーと結合部分は、ＤＮＡ鎖の分離に用いられる処置に耐えるための十分な
親和性を有する必要がある。鎖分離には、高ｐＨ又は低ｐＨを用いることができる。低ｐ
Ｈを用いる場合、好ましくはｐＨ３以下、より好ましくはｐＨ２以下、更により好ましく
はｐＨ１以下である。塩酸やクエン酸は好ましい酸である。高ｐＨがより好ましい。高ｐ
Ｈを用いる場合、好ましくはｐＨ１１以上、より好ましくはｐＨ１２以上、更により好ま
しくはｐＨ１３以上である。好ましいアルカリ化剤には、水酸化ナトリウム、及びＬｉＯ
ＨやＫＯＨのような他の第Ｉ族水酸化物が含まれる。Ｂｅ（ＯＨ）２やＢａ（ＯＨ）２は
別として、第ＩＩ族水酸化物も使用できるであろう。水酸化ナトリウム（例えば０．１Ｎ
ＮａＯＨ、ｐＨ１３）を用いて鎖を分離することが最も好ましい。当該技術分野に熟練
した者は、適切な薬剤や条件を選択することができる。最も好ましいのは、上で定義した
ようなビオチンやストレプトアビジン及び／又はそれらの類似体、並びに高ｐＨ鎖分離処
置の使用である。
【００２３】
化学基を用いて、一方の鎖を支持体に化学的に結合させることもできるであろう。例え
ば、アミン基やチオール基などの特定の化学基を組み込むようにオリゴヌクレオチドを合
成することが可能である。実際、そのようなオリゴヌクレオチドを供給業者から購入する
ことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを本発明の反応において一方の初期プライ
マーとして用いる場合、関連する化学基は、得られた変異誘発プライマーの関連する鎖に
組み込まれるであろう。次に、これらの化学物質（すでにＤＮＡ鎖に組み込まれている）
を、１例としてアミン連結剤又はチオール連結剤にカップリングさせることによって鎖分
離を引き起こすことができ、当該技術分野に熟練した者には、好適な物質が利用可能であ
る。
【００２４】
上記のようにして１本鎖型変異誘発プライマーを作製した後、親分子に導入し、アニー
リング工程（ｃ）を行う。このような方法で、１本鎖型変異誘発プライマーを親分子に加
えてアニーリング反応に使用する。
【００２５】
工程（ｃ）では、変異誘発プライマーと親分子とのアニーリングは、例えば変異誘発プ
ライマーの大きさに応じて、好適な条件及び試薬を用いることができる。適切な条件の選
択は、当該技術分野に熟練した者に理解される。１例として、変異誘発プライマー対鋳型
のモル比３：１を用いることができる。好適な反応条件は、９０℃で２分間、５０℃で３
分間、及び２０℃で５分間のインキュベーションである。必要であれば当該技術分野に熟
練した者によって条件を変更することができる。
【００２６】
また、工程（ｄ）から生ずる環状型核酸分子は、本明細書において「変異誘発反応の産
物」(又は、短く「産物」)と称する。反応の産物は複製可能であることが好ましく、これ
は、宿主細胞の形質転換の際、複製してそれ自体のコピーを産生できることを意味する。
これは、変異誘発反応の産物で、更なる操作を必要とすることなく、例えば、核酸の関連
部分を制限酵素で切り出して更なるプラスミドへ連結させる必要もなく、直接宿主細胞（
核酸からタンパク質を発現させるための宿主細胞など）を形質転換することができるとい
う利点を有する。
【００２７】
あるいは又は更に、変異誘発反応の産物は２重鎖であり、制限酵素による消化を可能に
することが好ましい。
環状型分子（変異誘発反応の産物）は、共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ、好ましくは２
重鎖ＤＮＡであることが最も好ましい。
【００２８】
上述の通り、工程（ｄ）は親分子から環状反応産物を産生する。そのような反応には、
アニーリングした変異誘発プライマーからの相補鎖合成のプライミングが含まれ、得られ
る相補鎖が変異誘発プライマー由来の変異を含有する。一般に、反応混合物は、好適量の
ヌクレオチド塩基、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及び適切なバッファー（実施
例は好適量を提示する）を含有するであろう。これを、第２鎖合成を完成させる適切な条
件下でインキュベーションする。そのような方法は当該技術分野に熟練した者に公知であ
る。この反応は、連続的増幅サイクルを含まない非増幅型（例えば非ＰＣＲ型反応）であ
ることが好ましく、したがって、線状反応と表現されるであろう（即ち、１本の親分子鎖
あたり１本の相補鎖を産生する）。例えば、本発明の反応では、１本鎖親分子上の変異誘
発反応は、１本鎖親分子に対して反対向きの第２の１本鎖を産生する。このように、１本
鎖親分子が＋鎖である場合、変異誘発反応で合成される第２鎖は−鎖であろう。
【００２９】
変異誘発反応に１本鎖鋳型と１本鎖プライマーを用いることによって、自己アニーリン
グに関する問題が回避される。更に、変異誘発反応の産物は２本鎖であり、それ自体は、
１本鎖分子よりも効率的に細菌を形質転換する。したがって、細菌宿主を形質転換する場
合、変異２本鎖型は、１本鎖鋳型よりも優先して細菌を形質転換するであろう（非変異鋳
型よりも変異型を有効に選択する）。
【００３０】
本発明の方法は、上記工程を含む（ここで、含む（comprise）という用語は包含する（
include）の意味に用いられ、即ち、１以上の更なる特徴、例えば反応工程の存在を可能
にする）。したがって、本発明の方法には、限定されるものではないが、本明細書のいず
れかに記載の工程を含めた更なる工程を含めることができる。あるいは、本発明の方法は
、上記工程、又は本明細書に記載の工程から成ることができる。反応の工程は、１つの反
応容器で組み合わせることができ、それぞれの工程を別の容器で行う必要はない。例えば
、変異誘発プライマーを親分子にアニーリングさせる工程と、相補鎖を合成する工程とを
１つの容器で行うことができる。
【００３１】
１本鎖親分子は１本鎖環状ＤＮＡであることが好ましい。例えば、１本鎖親分子は、フ
ァージ粒子から抽出される１本鎖環状ＤＮＡであり得る。
本発明の方法では、アニーリング工程（ｃ）の前に、１本鎖親分子を１本鎖プライマー
へ加える別の工程が存在することが好ましい。より好ましくは、本発明の方法は、工程（
ｃ）の前に、１本鎖親分子を単離する工程を更に含む。
【００３２】
変異誘発プライマーに関する工程及び親分子に関する工程の順序は、それぞれ連続的で
ある必要はない。したがって、１本鎖型親分子を単離する前に１本鎖型変異誘発プライマ
ーを分離することができる。または、１本鎖型変異誘発プライマーを分離する前に１本鎖
型親分子を単離することができる。または、１本鎖変異誘発プライマーの分離と、１本鎖
親分子の単離はそれぞれ、並列して又は同時に行うことができる。
【００３３】
本発明の方法は、工程（ｃ）の前に１本鎖親分子について行われるサイズ排除工程を更
に含むことが好ましい。例えば、小さな断片は樹脂に捕捉され、より大きな親分子は通過
する多孔性樹脂に１本鎖親分子を通過させる。この工程は短い線状のＤＮＡ断片（鋳型と
ともに精製される分解産物であると思われる）を除去する。これら断片の除去は、変異を
誘発しない短い断片のプライミングイベントを回避することによって変異誘発効率を向上
させる。
【００３４】
親分子は、本発明の方法による産物の下流の使用に必要な配列要素を含有するであろう
。親分子として使用するための好適なベクターは当該技術分野において利用可能であり、
又は熟練した者によって慣用技術により構築することができる。そのようなベクターは、
プロモーター配列、終止配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子などを含めた適切な調
節配列を含む。ベクターは、好適な型、例えばプラスミド、ファージ、ファージミドなど
であり得る。例えば、本発明の方法の産物をタンパク質発現に用いる場合（例えば、発現
産物をスクリーニングするため）、親分子は、宿主細胞におけるタンパク質発現に必要な
配列を含有するであろう。
【００３５】
好適な発現システムは当該技術分野に周知であり、さまざまな宿主細胞を用いることが
できる。これらには、細菌、酵母、昆虫、及び哺乳動物の細胞が含まれる（例えば、Ｈｅ
Ｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞）。細菌細胞が好ましく、大腸菌が最も好ましい
。これらそれぞれの宿主に好適なベクターが当該技術分野で利用可能であり、又は所定の
方法で構築することができる。バキュロウイルスシステムや植物ウイルス発現システムの
ようなウイルス発現システムを用いることもできる。ＤＮＡの操作技術は当該技術分野に
周知である（例えば、クローニング、配列決定、発現、解析など）。公知の方法の更なる
詳細は、例えば、『分子クローニング：実験室マニュアル』第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、１９８９、コールドスプリングハーバー研究所出版；又は『分子生物学の最新プロトコ
ール』第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２に見る
ことができる。
【００３６】
本発明の方法は、変異核酸分子で宿主細胞を形質転換する工程を更に含むことが好まし
い。形質転換は、好適な方法でよく、これらは熟練した者に公知である。例として熱ショ
ック法が含まれる。形質転換をエレクトロポレーションで行うことが好ましい。変異産物
で形質転換する工程は、工程（ｄ）の直後に行ってもよく、工程（ｄ）と宿主細胞の形質
転換とのあいだに中間工程が存在してもよい。以下に議論する好ましい態様では、非変異
親分子よりも変異相補鎖を優先的に選択するために宿主細胞の形質転換を用いる。
【００３７】
本発明の方法は、変異を含有する相補鎖を優先的に選択する条件下で行われる工程を含
むことができる。そのような相補鎖の優先的選択は、宿主細胞における親分子の優先的消
化又は相補鎖の優先的残存から起こり得る。
【００３８】
親分子は、相補鎖が優先的に選択されるような修飾を含有することができる。本発明の
方法は、修飾を導入する工程を更に含むことができる。好ましい態様では、親分子におけ
る修飾には、ｄＴの代わりにｄＵを導入することが含まれる。本発明の方法がそのような
変異を導入する工程を更に含む場合、これには、親分子がそのような修飾を最初に含有し
、更なる修飾がこの工程で導入される態様、及び最初に修飾が全くなく、そのような修飾
がこの工程によって導入される態様が含まれることが理解される。
【００３９】
ｄＵでｄＴを置換する状況は、以下のように説明することができる。親分子を、ウラシ
ルの導入を支持する大腸菌株、例えばＣＪ２３６のようなｄｕｔ  ｕｎｇ株（Ｋｕｎｋｅ
ｌら、（１９８５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、第８２巻、４８８−４９２頁；Ｓｉｄｈｕら、新
規結合ペプチドを選択するためのファージディスプレイ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ  ２０００、第２３８巻、第３３３−３６３頁）中で増やす。これらのプ
ロトコールによれば、親分子は大腸菌中にてファージミド型で増加する。ウラシル含有１
本鎖ＤＮＡを標準法により抽出する（例えばキアゲンＭ１３  Ｓｐｉｎ  Ｐｒｅｐキット
）。変異誘発プライマーをウラシル含有１本鎖ＤＮＡへアニーリングさせた後、相補鎖を
合成する（合成反応にはｄＵよりもｄＴが用いられる）。これは、一方の鎖（親鎖）がｄ
Ｕ含有であって所望の変異を含有せず、第２鎖（工程（ｄ）で合成される相補鎖）がｄＴ
含有であって変異を含有する、ヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子を生ずる。次に、得られた分子で
、ウラシルの存在を支持しない大腸菌宿主、例えばＪＭ１０１のようなｄｕｔ＋  ｕｎｇ
＋宿主を形質転換する。したがって、変異を有する相補鎖は、変異を含有しない親鎖より
も優先して複製される（ｄＵ含有親鎖は、ｄｕｔ＋  ｕｎｇ＋宿主内でウラシル−グリコ
シラーゼによって加水分解される）。
【００４０】
他の選択法にはメチル化の使用が含まれる。親分子はほとんど全ての大腸菌株でメチル
化されるであろう。工程（ｄ）では、メチル化しないｉｎ  ｖｉｔｒｏで相補鎖を合成す
ることができ、変異を含有しないメチル化親鎖と、変異を含有する非メチル化相補鎖とを
含むヘテロ２本鎖を生ずる。次に、２本鎖ＤＮＡを５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’部位で切断
し、メチル化ＤＮＡ又は半メチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩ制限酵素でヘテロ２本鎖を
消化する。したがって、親鎖は消化され、変異を含有する相補鎖は消化されない。例えば
ＤｐｎＩ以外の代替酵素を用いてもよい。
【００４１】
選択法の更なる可能性として、条件的致死遺伝子を用いてもよい。１例はｃｃｄＢであ
り、「細胞死制御」遺伝子としても知られている。この遺伝子は、親分子の、変異誘発反
応の後に置換される領域へ挿入されるであろう。親分子は、この遺伝子に感受性でない大
腸菌株から調製されるであろう。次に、変異誘発反応は、ｃｃｄＢ遺伝子を目的遺伝子に
置換するであろう。それらの非変異親分子は、依然としてｃｃｄＢを発現するが、大腸菌
宿主を死滅させるであろう。このようにして、変異誘発反応から生ずる変異分子が選択さ
れる。
【００４２】
ヘテロ２本鎖の親鎖の選択的分解に関与する限り、他の好適なシステム及び選択的酵素
を用いてもよい。例としてエンドヌクレアーゼ及びエンドグリコシラーゼが挙げられる。
したがって、好ましい態様では、本発明の方法は、ヌクレオチドの修飾（例えばｄＵで
ｄＴを置換）を含む１本鎖親分子の使用を包含する。変異誘発プライマーからプライミン
グした相補鎖の合成は、そのような変異を含まない、新たに合成された変異鎖を産生する
（例えば、合成反応ではｄＵＴＰよりもｄＴＴＰを用いることによって）。修飾されてい
ない、新たに合成された変異鎖は、優先的に選択される（例えば、修飾されていない、新
たに合成された変異鎖のみの複製を支持する宿主細胞をヘテロ２本鎖分子で形質転換する
ことによって、又は親鎖を選択的酵素で消化することによって）。
【００４３】
好ましい態様では、本発明は、非修飾相補鎖（新たに合成された非修飾変異鎖）に対し
て選択的な宿主細胞を工程（ｄ）由来の環状型分子で形質転換することにより、優先的選
択が行われる方法を提供する。
【００４４】
したがって、好ましい態様では、本発明は、１以上の変異を核酸分子へ導入する方法を
提供するものであり、以下の工程を含む：
（ａ）親分子に対して１以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から（
好ましくはＰＣＲによって）合成し；
（ｂ）１本鎖型変異誘発プライマーを分離し；
（ｃ）１本鎖型変異誘発プライマーを、１以上の選択可能な修飾を含有する１本鎖型親分
子へアニーリングさせ；
（ｄ）変異誘発プライマーの相補鎖を合成して修飾を含有しない環状型核酸分子を作製し
；
（ｅ）相補鎖が親分子よりも優先して選択されるように選択工程を行う。
【００４５】
好ましい態様では、本発明の方法は、分子集団へ適用することができる。したがって、
上記方法を用いて分子集団を変異させることができ、又はスクリーニング（例えば発現ス
クリーニング）のために配列集団を適切なベクターへ挿入することができる。
【００４６】
例えば、本発明の方法は、分子ライブラリーの作製に用いることができる。このような
方法で、複数の変異誘発プライマーを用いて好適なベクターを変異させ、産物のライブラ
リーを作製できる。複数の変異誘発プライマーと複数の親分子とを用いた組み合わせ変異
誘発を用いて、広範囲の置換を有するライブラリーを作製することもできる。例えば、分
子の第１の位置に変異を有する複数の親分子を、変異誘発反応において、第２の位置に変
異を導入する複数の変異誘発プライマーとともに用いることができ、それにより、第１の
位置と第２の位置との変異の組み合わせ又は順列の結果として広範囲のライブラリーを作
製する。これを実施例１に例示し、図６に図解する。
【００４７】
本発明の方法を用いて、分子集団のスクリーニングを容易にすることもできる。例えば
、変異誘発プライマーの集団は鋳型分子集団に由来することもできる。次にこの集団は、
例えばスクリーニング用発現ベクターのような一般的ベクターへ導入することができる。
これを実施例２に例示する。
【００４８】
このように、好ましい態様では、本発明の方法は、分子集団へ、分子集団のスクリーニ
ング又は分子集団のサブクローニングにおいてライブラリーを作製するために応用される
。したがって、複数の変異誘発プライマー、鋳型及び/又は親分子が存在し得る。そのよ
うな集団の大きさは、少なくとも１０００分子、より好ましくは少なくとも１０４分子、
より好ましくは少なくとも１０５分子、より好ましくは少なくとも１０６分子、より好ま
しくは少なくとも１０７分子、より好ましくは少なくとも１０８分子、より好ましくは少
なくとも１０９分子、より好ましくは少なくとも１０１０分子、より好ましくは少なくと
も１０１１分子、より好ましくは少なくとも１０１２分子、より好ましくは少なくとも１
０１３分子であり得る。
【００４９】
本発明の方法を集団、特にライブラリーに応用することに関連した利点は、変異誘発プ
ライマー配列はプロトコール開始時に公知であることを要しないという事実に部分的に基
づいている。鋳型分子におけるある短い領域又は共通性を有する領域に関する知識（例え
ば、可変領域に隣接する公知配列又は鋳型分子を含有するベクターの公知配列）は、初期
プライマーの設計を可能にする。したがって、これら初期プライマーを用いて、初期プラ
イマーが指向する共通領域に加えて可変領域も有する分子集団全体を増幅させることがで
きる。同様に、変異誘発プライマーと親分子とのあいだに相補性領域が存在することを条
件に、発現スクリーニングなどのスクリーニングのために、分子集団を共通親分子（例え
ばベクター）へ挿入することができる。この相補性領域は、鋳型分子において初期プライ
マーが指向した領域と同一でも、部分的に同一でもよい。
【００５０】
したがって、本発明の方法では、複数の鋳型、又は鋳型の複数の型が存在し得る。例え
ば、鋳型は、ベクター、例えばプラスミド内に含有されたさまざまな分子のライブラリー
であり得る。したがって、次に、工程（ｄ）で相補鎖が合成される際、複数の変異誘発プ
ライマーのそれぞれが異なる変異を親分子へ導入するため、そのようなライブラリーから
作製された複数の変異誘発プライマーを用いて、多くの環状型変異産物を作製することが
できる。これら複数の産物で好適な宿主、例えば大腸菌などの細菌宿主を形質転換する場
合、得られるコロニーはそれぞれ複数の変異誘発プライマーの１つから生ずる産物を含有
する。
【００５１】
複数の異なる変異誘発プライマーをライブラリー、例えばプラスミドライブラリーから
作製する場合、変異誘発プライマーの合成に用いられる初期プライマーは、ライブラリー
に共通するベクター領域に相補的であるように選択される。したがって、複数の鋳型は、
可変領域と、複数の鋳型間で共通する領域とを含むことができる。例えば、可変領域は、
任意抽出されていない領域に隣接する、核酸の任意抽出領域であり得る。他の例では、同
一基盤ベクターの複数の分子へ導入されている複数の挿入物を介して可変領域を作製する
ことができる。したがって、初期プライマーは、可変領域の外側に存在する鋳型領域に相
補的であるように、例えば、鋳型の任意抽出されていない領域の全部若しくは一部、又は
基盤ベクターの一部に相補的であるように選択される。このようにして、複数の変異誘発
プライマーを１つの合成反応にて同一初期プライマーを用いて作製することができる。
【００５２】
あるいは又は更に、複数の親分子が存在してもよい。したがって、工程（ｃ）では、変
異誘発プライマーを複数の異なる親分子へアニーリングさせることができる。先に記載し
たように複数の変異誘発プライマーが存在する場合、これらを複数の親分子へアニーリン
グさせることもできる。したがって、複数の変異誘発プライマーを複数の親分子へアニー
リングさせ、変異誘発プライマーと親分子との組み合わせを生ずる組み合わせ効果をもた
らすことができる。
【００５３】
したがって、本発明の方法は、複数の親分子及び／又は複数の変異誘発プライマー分子
を包含することができる。
これは、幅広いレパートリーの親分子及び／又は鋳型に、例えば幅広いレパートリーの
親分子及び／又は鋳型を組み合わせるために用いることができるという利点を有する。好
ましいレパートリーサイズは、少なくとも１００の親分子及び／又は鋳型、より好ましく
は少なくとも１０００、更により好ましくは少なくとも２５００である。
【００５４】
組み合わせアプローチを用いることにより、例えばさまざまな親分子をさまざまな変異
誘発プライマーと組み合わせた後で、幅広いレパートリーを作製することができ、少なく
とも１０００終局産物、より好ましくは少なくとも１０４、より好ましくは少なくとも１
０５、より好ましくは少なくとも１０６、より好ましくは少なくとも１０７、より好まし
くは少なくとも１０８、より好ましくは少なくとも１０９、より好ましくは少なくとも１
０１０、より好ましくは少なくとも１０１１、より好ましくは少なくとも１０１２、より
好ましくは少なくとも１０１３の終局産物が存在し得る。
【００５５】
本発明の方法によって導入され得る変異には、置換、欠失、及び付加が含まれる。変異
は複数のヌクレオチドに存在し得る（しかし、単一ヌクレオチドのみに存在してもよい）
。例えば、親分子内で変異誘発プライマーによって複数の置換をつくることができ、又は
多くのヌクレオチドを欠失若しくは付加させてもよい。さまざまなタイプの変異の組み合
わせも可能である。したがって、置換と欠失の組み合わせ、置換と付加の組み合わせ、付
加と欠失の組み合わせ、又は付加、欠失、及び置換の組み合わせが存在し得る。
【００５６】
複数の変異領域、例えば、１以上のヌクレオチドが置換されており、（この間隙領域に
は変異誘発プライマーと親分子とのあいだに相補性があるため）変異誘発プライマーによ
って変異がつくられていない領域によって離れている２つの領域が存在してもよい。
【００５７】
更なる可能性には：１以上のヌクレオチドが置換されており、相補性領域によって離れ
ている複数の領域；１以上のヌクレオチドが付加されており、相補性領域によって離れて
いる複数の領域；１以上のヌクレオチドが欠失されており、相補性領域によって離れてい
る複数の領域が含まれる。組み合わせも可能である。したがって、ヌクレオチドが置換さ
れている１以上の領域と、ヌクレオチドが付加されており、相補性領域によって離れてい
る１以上の領域；ヌクレオチドが置換されている１以上の領域と、ヌクレオチドが欠失さ
れており、相補性領域によって離れている１以上の領域；ヌクレオチドが欠失されている
１以上の領域と、ヌクレオチドが付加されており、相補性領域によって離れている１以上
の領域；及びヌクレオチドが置換されている１以上の領域と、ヌクレオチドが付加されて
いる１以上の領域と、ヌクレオチドが欠失されており、相補性領域によって離れている１
以上の領域が存在し得る。
【００５８】
変異の性質と数は、親分子と変異誘発プライマーとのあいだのようなミスマッチの数と
性質によって決定される。したがって、変異誘発プライマーに親分子と比較して１つのヌ
クレオチドに付加が存在する場合、１つのヌクレオチドは変異誘発反応によって付加され
るであろう。変異誘発プライマーに親分子と比較してミスマッチの分散した領域が存在す
る場合（例えば上で設定したような付加、欠失、及び置換分散した領域）、これは、変異
誘発反応の結果として対応する変異の分散した領域を生ずるであろう。変異誘発プライマ
ーで親分子内のヌクレオチドのストレッチを置換することができる。例えば、変異誘発プ
ライマーは、親分子に対して約７０％相補性の領域を含有することができ、このような方
法で、変異誘発反応の後、親分子内のこの領域を変異誘発プライマー由来の７０％相補性
領域で置換する。
【００５９】
変異誘発プライマーをアニーリングさせるには、変異誘発プライマーと親分子とのあい
だにある程度の相補性が存在する必要がある。典型的には、変異誘発プライマーの末端に
相補性が最小の領域が存在するであろう。変異誘発プライマーがＰＣＲで作製されており
、初期プライマー（上で定義）が親分子に対して相補性である場合、これらは変異誘発プ
ライマーの末端に１８〜２５塩基対の相補性が最小の領域を提供する。
【００６０】
変異誘発プライマー全体に対する相補性の程度は、好ましくは少なくとも６０％、より
好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なく
とも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より
好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％である。例として、少な
くとも９７％の相補性は、長さ８３０ヌクレオチドの変異誘発プライマーでは２０のミス
マッチに相当する（８１０が相補性）。少なくとも６０％の相補性は、長さ７３０ヌクレ
オチドの変異誘発プライマーではミスマッチ領域に相当し、長さ８３０ヌクレオチドの変
異誘発プライマーでは親分子に対して７０％同一である（「７０％領域」のいずれの端も
親分子に対して完全に相補性である２端）。変異誘発プライマーの非限定的な例を図面に
示す。
【００６１】
変異誘発プライマーは長さ１００ヌクレオチド〜４０００ヌクレオチドであり得、好ま
しくは２００〜３０００ヌクレオチド、より好ましくは３００〜２０００ヌクレオチド、
より好ましくは４００〜１５００ヌクレオチド、より好ましくは４００〜１０００ヌクレ
オチド、更により好ましくは長さ４００〜８５０ヌクレオチド又は長さ８００〜１５００
ヌクレオチドであり得る。
【００６２】
変異誘発プライマーの大きさは親分子の大きさに依存することができる。例えば、親分
子が５．５ｋｂである場合、変異誘発プライマーは１ｋｂ以下であることが好ましい。し
たがって、変異誘発プライマーのヌクレオチドの長さは、好ましくは親分子の大きさのお
よそ１／５０〜１／５、より好ましくは１／２５、より好ましくは親分子の大きさの３／
１０、最も好ましくは親分子の大きさのおよそ１／５である。
【００６３】
工程（ｃ）における変異誘発プライマー対親分子のモル比はおよそ２：１〜５：１であ
ることが好ましく、最も好ましくはおよそ３：１である。
本発明の方法の好ましい応用には、ライブラリー、特に抗体ライブラリーのスクリーニ
ング又は作製が含まれる。例えば、親分子は、抗体又は抗体ドメインの発現用ベクターで
よい。変異を親分子へ導入することにより（例えば、抗体ドメインのライブラリーで構成
される鋳型から変異誘発プライマーを作製することによって）、得られる変異親分子は好
適な宿主中で発現し、適切な抗原に対してスクリーニングすることができる（更なる情報
には、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１
４巻、第３０９−３１４頁；及びＥｄｗａｒｄｓら（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、
３３４、ｐｐ１０３−１１８頁を参照されたい）。抗体に関連した他の例には、免疫グロ
ブリン受容体プラスミド、例えばＩｇＧ受容体プラスミドへの抗体ドメインのサブクロー
ニングが含まれる（ｐＥＵ  ＩｇＧ発現ベクターなど、Ｐｅｒｓｉｃら（１９９７）Ｇｅ
ｎｅ  １８７：９−１８を参照されたい）。抗体という用語は免疫グロブリンを表し、天
然型と合成型が含まれる。この用語は、抗体結合ドメインであるか又は実質的にこれと相
同である抗体結合ドメインを有するポリペプチドを包含する。例として、Ｆａｂ（ＶＬド
メイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメイン）、ｓｃＦｖ（（Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３などのリンカーに連結されたＶＨドメイン及びＶＬド
メイン、例えばＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３−４２６；Ｈｕ
ｓｔｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５、ｐｐ５８７９−５８８３）、Ｆｖ（単
一抗体のＶＬドメインとＶＨドメイン）、Ｆｄ（ＶＨドメインとＣＨ１ドメイン）；ｄＡ
ｂ（Ｈｏｌｔら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１、ｐｐ４８４−
４９０）及び２重特異性抗体（ＷＯ９４／１３８０４号）が挙げられる。
【００６４】
したがって、好ましい態様では、親分子、鋳型、又は変異誘発プライマーは、抗体可変
ドメインをコードする配列を含む。抗体可変ドメインはＶＨドメインでもＶＬドメインで
もよい。親分子はｓｃＦｖを含むことが好ましい。
【００６５】
抗体又は抗体ドメインがベクターなどの核酸との関連で本明細書において言及される場
合、その抗体又はドメインをコードする核酸配列について言及していることが理解される
。
【００６６】
本発明の方法を用いて抗体ドメインを入れ換え、抗体レパートリーを作製することもで
きる。したがって、親分子は抗体ＶＨドメインを含有して変異誘発プライマー分子は抗体
ＶＬドメインを含有してもよく、又は親分子は抗体ＶＬドメインを含有して変異誘発プラ
イマー分子は抗体ＶＨドメインを含有してもよい。抗体ＶＨドメインのライブラリーは、
抗体ＶＬドメインのライブラリーと組み合わせ（入れ換え）てもよく、その逆もまた同様
である。したがって、２つのライブラリーのうち一方を鋳型として用いて複数の変異誘発
プライマーを形成し、他方のライブラリーは複数の親分子のライブラリーとして存在して
もよい。
【００６７】
したがって、本発明は、親分子が抗体ＶＨドメイン及び抗体ＶＬドメインを含有し、変
異誘発プライマー分子が親分子のＶＬドメインを変異させるための抗体ＶＬドメインを含
有する方法を提供するものである。また、本発明は、親分子が抗体ＶＬドメイン及び抗体
ＶＨドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子の抗体ＶＨドメインを変異させ
るための抗体ＶＨドメインを含有する方法を提供する。このようにして、抗体ＶＨドメイ
ンのライブラリーを抗体ＶＬドメインのライブラリーと組み合わせ（入れ換え）てもよく
、その逆もまた同様である。
【００６８】
親分子のＶＬドメインとＶＨドメインのうちの一方のみが変異されることが望まれても
よく、親分子のＶＬドメインとＶＨドメインが共に変異されることが望まれてもよい。例
えば構築体がＶＬドメインを含有し（しかしＶＨドメインはない）、ＶＬドメインはＶＬ
変異誘発プライマーによって変異するか、例えば構築体がＶＨドメインを含有し（しかし
ＶＬドメインはない）、ＶＨドメインはＶＨ変異誘発プライマーによって変異する単一ド
メインシステムも想定される。本発明は、これら全ての可能性を提供する。
【００６９】
したがって、本発明は、親分子のＶＨドメイン及びＶＬドメインがこれらドメインのそ
れぞれを含有する変異誘発プライマーによって変異されるであろう状況を包含する。した
がって、ＶＨ変異誘発プライマーは親分子のＶＨドメインを変異させ、ＶＬ変異誘発プラ
イマーは親分子のＶＬドメインを変異させるであろう。これらドメインをともに含有する
単一変異誘発プライマーを用いることもできるであろう。
【００７０】
したがって、本発明は、第１及び第２の変異誘発プライマーを用いて親分子を変異させ
、第１の変異誘発プライマーは親分子のＶＨドメインを変異させるための抗体ＶＨドメイ
ンを含有し、第２の変異誘発プライマーは親分子のＶＬドメインを変異させるための抗体
ＶＬドメインを含有する方法を提供する。第１及び第２の変異誘発プライマーは、第１及
び第２の変異誘発プライマーが別個の変異誘発反応に任意の順序で関与し得る別個の変異
誘発反応工程に用いてもよい（即ち、第１の変異誘発プライマーを、第２の変異誘発プラ
イマーを包含する変異誘発反応に先行するか又は後続の変異誘発反応に用いることができ
るであろう）。他の可能性は、第１及び第２の変異誘発プライマーを同一の変異誘発反応
工程に用いることである。
【００７１】
本発明の方法を、抗体との関連でＶＨドメインのライブラリーをＶＬドメインのライブ
ラリーと組み合わせる（入れ換える）ために用いる上記側面は、ドメインの組み合わせの
入れ換えが望ましい、一般に免疫グロブリンやマルチドメインタンパク質に関連する他の
分子のような他のシステムへ応用できるであろう。したがって、本発明は、抗体の側面に
関して上に記載したように、第１のドメインのライブラリーを第２のドメインのライブラ
リーと組み合わせる方法を提供する（第１のドメインはＶＨドメインであって第２のドメ
インはＶＬドメインであり、逆もまた同様である）。
【００７２】
ある好ましい態様では、親分子はｓｃＦｖをコードする核酸を含む。
本発明は、上記方法を実施するためのキットも提供する。例えば、そのようなキットは
、１本鎖プライマー分子を鋳型分子から合成するのに好適な初期プライマー、１本鎖親分
子、及び使用説明書を含むことができる。親分子は本明細書に記載のようにして修飾する
ことができる。本明細書において参照するような好適な試薬及びバッファーも含めること
ができる。本発明の方法の態様のいずれかに規定されるような更なるキット成分を含める
こともできる。
【００７３】
上述のように、本発明の方法及びキットには以下を含めた多くの適用がある。本発明の
方法はサブクローニングに用いることができ、例えば核酸のある領域を核酸の消化と連結
の必要性を回避しながら工程（ａ）によって作製し、適切なベクターへ変異誘発反応によ
って導入することができる。例えば、標的抗原は発現ベクターへクローン化することがで
きる。本発明の方法は、上記のようにライブラリーの作製及びスクリーニングに応用する
ことができる。より特定の用途は以下に概説する。
【００７４】
本明細書に記載の方法を用いて、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片（単一ペプチドとしてリ
ンカーを介して連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン）をＩｇＧ分子へ変換すること
ができる。したがって、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをＩｇＧ−ＶＨ受容体プラスミド
及びＩｇＧ−ＶＬ受容体プラスミドへ導入することができる。いわゆる一般的オリゴヌク
レオチドである初期プラマーを用いて、ｓｃＦｖを含有するベクターの非可変部分か又は
２つのドメイン間のリンカーへ指向させる（例えば、それぞれのドメインの上流又は下流
の配列を指向する第１の初期プライマーと、２つのドメイン間のリンカーを指向する第２
の初期プライマー）。例えばＶａｕｇｈａｎらに記載のｓｃＦｖを用いる場合、初期プラ
イマーの一方はｐＣａｎｔａｂ６内のＶＨドメインの上流配列を指向し、他方はリンカー
を指向するであろう（即ち（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３をコードする
配列部分を指向する）。
【００７５】
本発明の方法を用いて未感作ライブラリー（即ち、非免疫ヒトドナー由来のライブラリ
ー）を作製することもできる。現在、非免疫ヒトドナー由来の未感作抗体のＶＨ領域とＶ
Ｌ領域とについてＰＣＲを行い、続いて制限消化と受容体プラスミドへの連結によってこ
れらを作製している。本発明の方法を用いて、変異誘発プライマーを、非免疫ドナー由来
のこれらＰＣＲ産物から分離することができる。また、上記方法の使用により、制限消化
と連結の必要性が取り除かれる。好適なプライマーは、重鎖の両端及び軽鎖の両端の配列
に基づくことができる（例えばＶａｕｇｈａｎら、上記を参照されたい）。
【００７６】
本発明の側面及び態様を、実施例により添付の図面を参照して説明する。
実施例
【実施例１】
【００７７】
最適化したＶＨ領域とＶＬ領域とを組換えるための変異誘発方法
１．  方法の概説
最適化したＶＨ領域とＶＬ領域との組換えは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗体の親和性
成熟のあいだの可能性増大をもたらすことが示されている（Ｏｓｂｏｕｒｎら（１９９６
）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ１８１−１９６）。この実施例では
、本発明の変異誘発法を用いて、ＶＨＣＤＲ３が任意抽出されている１つの変異体プール
を、ＶＬＣＤＲ３が任意抽出されている他の変異体プールと組み合わせる。２つの変異体
プールは、ＶＨＣＤＲ３及びＶＬＣＤＲ３内の短いランダム化領域を除き、同一のオリジ
ナル抗体配列を含有する。ランダム化の後、ＶＨプール及びＶＬプールは親和性を向上さ
せるためにそれぞれ２ラウンドのファージディスプレイ選択を受けている。第２ラウンド
の選択のＶＨ産物とＶＬ産物は、それぞれ推定１０５〜１０６の異なる変異体配列を含有
するが、この実施例に記載の組換え法の開始点を形成する。
【００７８】
この実施例の方法では、５’端にビオチン化ＰＡＭＡ−ＩＮオリゴヌクレオチドを、３
’端にＨ−ＬＩＮＫオリゴヌクレオチドを用いてＶＨプールをＰＣＲで増幅する（図２を
参照されたい）。ストレプトアビジンビーズ上で捕捉した後、非ビオチン化鎖を溶離させ
、これが変異誘発プライマーを形成する。
【００７９】
バクテリオファージ粒子をｄｕｔ−ｕｎｇ−大腸菌株ＣＪ２３６から取り出した後ＶＬ
プールを１本鎖プラスミドとして調製する。変異誘発プライマーをコードするＶＨを、Ｖ
Ｌプールを代表する１本鎖プラスミドと一緒にすることによって、ＶＨ領域とＶＬ領域と
の組換えが生ずる。
【００８０】
２．  オリゴの設計
Ｍ１３から単離したｄＵ−１本鎖ＤＮＡ鋳型は＋鎖であり、変異誘発プライマーは＋鎖
に対して相補的である（即ち−鎖である）。フォワードプライマーをビオチン化すること
によって、ストレプトアビジン上で捕捉した後、−鎖を溶出させることができる。用いた
オリゴヌクレオチドは以下の通りである（５’から３’）：
Ｂｉｏ−ＰＡＭＡ−ＩＮ：ビオチン−ＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧ
Ｈ−ＬＩＮＫ：ＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣ
３．  ２本鎖プラスミドＤＮＡとしてのＶＬ産物の調製
１．  ｐＣａｎｔａｂ６内のＶＬレパートリーのグリセロールストック（Ｖａｕｇｈａｎ
ら）１００μｌを、小さな三角フラスコ中の５０ｍｌの２×ＴＹＡに植菌した。
２．  培養物を３００ｒｐｍにて３７℃で２時間増殖させた。
３．  細胞を３２００ｒｐｍで１０分間の遠心により５０ｍｌファルコンチューブ中に沈
殿させた。
４．  キアゲンのハイスピードプラスミドミディキットのプロトコールを実施して２本鎖
プラスミドＤＮＡを１ｍｌの水中に単離した。
５．  ＤＮＡ濃度をＵＶ分光法又はアガロースゲルで確認した。
【００８１】
４．  ｄＵ−１本鎖ＤＮＡ鋳型の調製
第３項の２本鎖プラスミドＤＮＡを次に以下のプロトコールに用いた：
試薬：
ｐＣａｎｔａｂ６内のＶＬレパートリーのプラスミドミニプレップ（Ｖａｕｇｈａｎら）
１０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ＣＡＭ）エタノール溶液、−２０℃保存
０．２５ｍｇ／ｍｌウリジン（シグマＵ−６３８１）水溶液、４℃保存
２×ＴＹＡＧ（＋１０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭ）プレート：（ＴＹはＳａｍｂｒｏｏｋら、上
記に記載のもの＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａ）及び２％グルコース（Ｇ）、クロ
ラムフェニコール（ＣＡＭ）のストック２０μｌを８０μｌのエタノールに加えてプレー
トに塗布する）。
【００８２】
ＣａＣｌ２コンピテントＣＪ２３６の調製
１．  ５ｍｌの２×ＴＹ培地（＋１０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭ）に大腸菌ＣＪ２３６細胞（例
えばバイオラッドによって供給）の１つのコロニーを植菌する。細胞を３００ｒｐｍにて
３７℃で一晩増殖させた。ＣＡＭはＣＪ２３６中のＦ’エピソームを選択する。
２．  ５００ｍｌの２×ＴＹに５ｍｌの一晩培養物を植菌し、３７℃で振とうしながらイ
ンキュベーションした。
３．  ６００ｎｍのＯＤが０．９に達したときに培養物を４℃にて遠心し、集菌した（５
分間、５，０００ｒｐｍ）。上清を流して捨て、細胞沈殿物の水気をきった。細胞を１０
０ｍｌの氷冷１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２に穏やかに再懸濁させた。
４．  細胞を遠心により再度集菌し（４℃で遠心）、沈殿物の水気をきった。細胞を、滑
らかな懸濁液が得られるまで２０ｍｌの冷１００ｍＭ  ＣａＣｌ２に穏やかに再懸濁させ
た。２００ｍｌの冷１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えて混合した。細胞を氷上に３０〜９０
分間置いた。
５．  細胞を低温で遠心して集菌し、沈殿物の水気をきった。細胞を２０ｍｌの冷８５ｍ
Ｍ  ＣａＣｌ２及び１５％グリセロールに再懸濁させた。
６．  細胞懸濁液を直ちに分注した（必要であればアリコートをドライアイス／エタノー
ル中で凍結させることができる）。
【００８３】
鋳型によるＣＪ２３６の形質転換
１．  上記のＣＪ２３６  ＣａＣｌ２コンピテント細胞を氷上で融解させた（そしてプロ
トコールを通して氷上に維持した）。
２．  第３項のＶＬレパートリーを含有する５μｌのｐＣａｎｔａｂ６プラスミドをＰＣ
Ｒチューブ中で１００μｌのコンピテント細胞に加えた。
３．  ＰＣＲマシーンブロック上で以下のプログラムを実行した：
０．１℃で３０分、４２℃で４５秒、０．１℃で２分。
４．  細胞を０．５ｍｌの２×ＴＹの入った１５ｍｌファルコンチューブに移した。
５．  細胞を２００ｒｐｍにて振とうさせながら３７℃で４５〜６０分間インキュベーシ
ョンした。
６．  ０．５ｍｌの細胞を２×ＴＹＡＧ（＋１０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭ）プレートに蒔き、
プレートを３７℃で一晩インキュベーションした。
【００８４】
ＣＪ２３６からのファージの回収とＤＮＡの調製
１．  上記工程６から生ずるＣＪ２３６形質転換体の菌叢をこすって１ｍｌの２×ＴＹに
入れる。５００μｌを５０ｍｌの２×ＴＹＧＡＣ（即ち２％グルコース、１００μｇ／ｍ
ｌ  ＡＭＰ、１０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭ）に植菌し、ＯＤ６００＝０．５〜１になるまで３
７℃にて３００ｒｐｍでインキュベーションした。
２．  細胞濃度をＯＤ測定値（ＯＤ６００１＝５×１０８細胞／ｍｌ）から計算し、野生
型ＫＯ７ヘルパーファージ（アマシャムバイオサイエンスＭ１３  ＫＯ７ヘルパーファー
ジ）を、感染効率（ＭＯＩ）ファージ１０：細胞１（野生型ＫＯ７ストックは通常０．３
３μｌ中に１０１０ファージを含有する）を確保するように加えた。次に細胞を３７℃で
１０分間インキュベーション（振とうなし）して感染させた。
３．  １ｍｌの培養物を、２５μｇ／ｍｌ  ＫＡＮ（ＫＯ７を選択するため）及び０．２
５μｇ／ｍｌウリジン（ウラシル含有鋳型を合成させるため）を添加した３０ｍｌの２×
ＴＹＡＣへ移した。これを３７℃にて一晩、３００ｒｐｍでインキュベーションした。
４．  細胞を２℃にて１０分間、１５０００ｒｐｍでＳＳ−３４ローターにて遠心した。
上清を新しいチューブへ移し、１／５容量のＰＥＧ−ＮａＣｌを加えた（２０％ＰＥＧ８
０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）。これを室温で５分間インキュベーションし、次に２℃に
て１０分間、１００００ｒｐｍでＳＳ−３４ローターにて遠心した。
５．  小さな白いファージ沈殿物が生じた。上清を静かに捨て、チューブをティッシュペ
ーパーの上に逆さにして水気をきった。ファージ沈殿物を０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁さ
せた（管壁をリンスしてできる限り多くのファージを捕捉した）。ファージをエッペンド
ルフチューブへ移し、マイクロ遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、残留不要物
を沈殿させた。上清を新しいエッペンドルフチューブへ移した。
６．  ｄＵ−１本鎖ＤＮＡ鋳型を、キアゲンＭＰバッファー（Ｓｉｄｈｕら、上記）の添
加から始まってキアゲンのキアプレップスピンＭ１３キットを用いて精製した。ＤＮＡを
１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶出させ、１％アガロースゲ
ルで調べた。１本鎖ＤＮＡの調製物が異なるバンドとして２．５ｋｂに泳動され、これを
第６項の変異誘発反応に用いた。
【００８５】
５．  ＶＨレパートリーからの１本鎖ＤＮＡ変異誘発プライマーの調製
さまざまなＶＨ配列のレパートリーを代表する領域をｐＣａｎｔａｂ６からオリゴヌク
レオチドｂｉｏ−ＰＡＭＡ−ＩＮ及びＨ−ＬＩＮＫを用いてＰＣＲで増幅させた。第３項
で調製したミディプレップ鋳型の希釈系列に標準のＰＣＲ条件を用いることができる。
Ａｂｇｅｎｅ  （２×）マスターミックス  ２５μｌ
鋳型ミディプレップ  １μｌ［原液、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−
５、１０−６、なし］
Ｂｉｏ−ＰＡＭＡ−ＩＮ  １μｌ
Ｈ−ＬＩＮＫ  １μｌ
水  ２２μｌ
５μｌのＰＣＲ産物をそれぞれ１％アガロースゲルで泳動した（例えばこれは産物の大
きさを裏付け、収率を示す）。
１．  マイクロＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：１３０−０４２−７
０１）を磁気ラック中に置いた。
２．  ２５０μｌの１×結合バッファー（２×結合バッファー：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐ
Ｈ７．５、２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）を貫流させ
た。
３．  ４５μｌのＰＣＲ産物を、１０５μｌのマイクロＭＡＣＳストレプトアビジンビー
ズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：１３０−０７４−１０１）及び１５０μｌの２×
結合バッファーと混合し、２分間インキュベーションした。
４．  ＤＮＡ＋ビーズをマイクロＭＡＣＳカラムにかけて貫流させた。
５．  カラムを２×１ｍｌの１×結合バッファーで洗浄した。
６．  ＤＮＡを２００μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ（用事調製）でエッペンドルフチューブ
に溶出させた。
７．  溶出したＤＮＡに２０μｌの酢酸ナトリウム  ｐＨ５．２、５５０μｌのエタノー
ル、１μｌのグリコーゲンを加えた。
８．  これを−７０℃で３０分間インキュベーションした。
９．  これを１３０００ｒｐｍで１０分間遠心してＤＮＡを沈殿させた。上清を除去し、
５００μｌの７０％エタノールで置換した。
１０．  これを１３０００ｒｐｍで更に５分間遠心し、上清を除去し、３７℃の加熱ブロ
ックにて２分間空気乾燥させた。ＤＮＡを５０μｌの水に再懸濁させた。
【００８６】
６．  変異誘発反応
試薬：
ＴＭバッファー（１０×）：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＡＴＰ：（１Ｍストックは０．６０５２ｇを１ｍｌの水に溶解し、０．１Ｍ  
ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整して作製した。ストックを１：１００に希釈して１０ｍＭ
ＡＴＰを作製する。ストックは−７０℃で保存することができる。）
１００ｍＭ  ＤＴＴ：（１Ｍストックは０．１５４２ｇを１ｍｌの０．０１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．２）に溶解して作製した。ストックを１：１０に希釈して１００ｍＭ  Ｄ
ＴＴを作製する。ストックは−２０℃で保存することができる）。
酵素：ニューイングランドバイオラブス社（ＮＥＢ）製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、及びＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ。
２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
キアゲン  キアクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）
変異誘発プライマーのリン酸化
以下のものをエッペンドルフチューブに加えた：
１本鎖ＤＮＡ変異誘発プライマー  １．０μｇ（１．０μｇ／１３２０００ダルトン＝７
．６ピコモル）
ＴＭバッファー（１０×）  ５．５μｌ
１０ｍＭ  ＡＴＰ  ５μｌ
１００ｍＭ  ＤＴＴ  ２．５μｌ
全量５３μｌになるまで水を加えた。２μｌ（２０Ｕ）のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（１０Ｕ／μｌ）を加え、３７℃で１時間インキュベーションした。
【００８７】
変異誘発プライマーの鋳型への３：１の比でのアニーリング
以下のものをエッペンドルフチューブに加えた：
ｄＵ−１本鎖ＤＮＡ鋳型（第４項より）  ４．４μｇ（４．４μｇ／１，７５０，０００
ダルトン＝２．５ピコモル）
リン酸化変異誘発プライマー  １．０μｇ（１．０μｇ／１３２０００ダルトン＝７．６
ピコモル）
ＴＭバッファー（１０×）  ２５μｌ
容量２５０μｌになるまで水を加えた。
【００８８】
２５０μｌを、９０℃で２分間、５０℃で３分間、２０℃で５分間インキュベーション
し、変異誘発プライマーを鋳型へアニーリングさせた。
変異誘発反応
アニーリングさせたオリゴ／鋳型混合物に以下のものを加えた：
１０ｍＭ  ＡＴＰ  １０μｌ
２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １０μｌ
１００ｍＭ  ＤＴＴ  １５μｌ
３０Ｗｅｉｓｓ  ｕｎｉｔｓのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（６Ｕ／μｌ）＊  ５μｌ
３０ユニットのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）  ３μｌ
＊酵素チューブ上に記された単位はＷｅｉｓｓ  ｕｎｉｔｓではない−６Ｕ／μｌは酵
素活性の正しい濃度である。
【００８９】
反応混合物を２０℃で３時間インキュベーションした。
反応産物をそれぞれキアゲンのキアクイックＰＣＲ精製キットを用いて３５μｌの水へ
親和性精製した。１μｌの反応産物をそれぞれ１％アガロースゲルで泳動し、変異誘発プ
ライマーの有無による反応の産物と比較した。「プライマーなし」のレーンで強い１本鎖
ＤＮＡのバンド（ｐＣａｎｔａｂ６について２．５ｋｂ）が観察された。「プラマーあり
」のレーンでは、この１本鎖ＤＮＡのバンドの強度は減少し、ｃｃｃＤＮＡ（共有結合的
に閉じた環状ＤＮＡ）を表す１本以上の長いバンドに置き換わっていた（ｐＣａｎｔａｂ
６について＞３ｋｂ）。
【００９０】
７．  大腸菌ＴＧ１へのエレクトロポレーション
以下のプロトコールにしたがい、新鮮なエレクトロコンピテントＴＧ１細胞（ストラタ
ジーン）を調製した：
１．  適当量の２×ＴＹ培地に、ＴＧ１最小培地プレートからの１つのコロニーを植菌し
た。細胞を２５℃で一晩３００ｒｐｍにて増殖させた。
２．  それぞれ５００ｍｌの２×ＴＹを含有する５本のフラスコに、１０ｍｌ（フラスコ
あたり）の一晩培養物を植菌した。これを２５℃にて３００〜３５０ｒｐｍでＯＤ６００
がおよそ０．５〜０．６になるまで増殖させた（これには通常およそ２〜３時間かかる）
。
３．  ５００ｍｌの遠心管６本とＳｏｒｖａｌ  ＳＬＡ３０００ローターを予め２℃まで
冷却した。
４．いったん最適ＯＤに達したら、細胞を遠心管中で氷上にて３０分間冷却し、２℃にて
４，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。
５．  上清を注ぎ捨て、沈殿物を少量の氷冷オートクレーブＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させ
た。これを水でおよそ３００ｍｌにし、２℃にて４，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。
６．  上清を注ぎ捨て、少量の残留水に再懸濁し、次いで３００ｍｌの水を加え、上記の
ように遠心した。
７．  ５０ｍｌのファルコンチューブ８本を−２０℃で予め冷却した。Ｓｏｒｖａｌｌ卓
上遠心機を２℃まで予め冷却した。
８．  上清を注ぎ捨て、沈殿物を残留水に再懸濁させた。
９．  いったん再懸濁させたら、これをファルコンチューブにあけ、５０ｍｌになるまで
水を加えた。これを３，２００ｒｐｍｓで１０分間遠心した。
１０．  上清を除去し、それぞれの沈殿物を少量の水に再懸濁し、細胞を１本の５０ｍｌ
のファルコンチューブ中で混ぜ合わせ、水で５０ｍｌにし、上記のように遠心した。
１１．  上清を除去し、細胞を残留量の水に再懸濁させた。
【００９１】
エレクトロポレーションのため、細胞の希釈系列（細胞のみ）を用いて好適な濃度を決
定した（例えば細胞の希釈１００％、８０％、６０％、及び５０％）。細胞のみの対照を
２×ＴＹＡＧプレートに蒔き、コンピテント細胞調製物中にアンピシリン耐性細胞がない
ことを確認する。
【００９２】
合計３５μｌの変異誘発反応完了物を、１本のキュベット中の４００μｌのエレクトロ
コンピテントＴＧ１細胞へ、以下の設定を用いて直接エレクトロポレーションした（バイ
オラッド大腸菌パルサーキュベット  電極ギャップ０．２ｃｍ；カタログ番号１６５−２
０８６）：
電界強度２．５ｋＶ
抵抗２００Ω
静電容量２５μＦ
時定数およそ４．２ミリ秒。
【００９３】
エレクトロポレーション直後、１ｍｌの２×ＴＹＧをキュベットに加え、細胞を５０ｍ
ｌのファルコンチューブに移した。更に１ｍｌの２×ＴＹＧでキュベットをリンスし、キ
ュベットの底からファルコンチューブへ（細長いＰ２００ピペットチップで）細胞を移し
た。これを３７℃、約１５０〜２５０ｒｐｍのインキュベーターへ移し、細胞を１時間回
復させた。
【００９４】
それぞれのライブラリーの希釈系列（それぞれのファルコンチューブ）を小さな２×Ｔ
ＹＡＧプレートに捲いてライブラリーの大きさを推定し、残っている細胞を大きな２×Ｔ
ＹＡＧプレーとに蒔いた。ラージプレートに蒔く前に、残留細胞を遠心し（３２００ｒｐ
ｍで１０分）、１ｍｌの２×ＴＹＧに再懸濁させた。プレーとを３０℃で一晩インキュベ
ーションした。
【００９５】
次にライブラリーをラージプレートから掻き取って５ｍｌの２×ＴＹに入れ、次いで２
．５ｍｌの５０％グリセロールを添加した。１：１００希釈のＯＤ６００を調べて細胞濃
度を計算した（ＯＤ６００  １＝５×１０８細胞／ｍｌ）。保存のため、それぞれのライ
ブラリーの複数のアリコートを−７０℃で保存した。それぞれのアリコートはライブラリ
ーの大きさに対して１０倍過剰の細胞を含有している。ライブラリーをファージとして救
済するため、例えば親和性結合によるファージの選択のため、次に１本のアリコートを融
解し、５００ｍｌ培養に加えることができる（Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ、２２６、ｐｐ８８９−８９６）。
【００９６】
この方法の結果は以下の通りであり、図４にも示す：
【００９７】
【表１】
2015171369.tif 000003
【実施例２】
【００９８】
リボソームディスプレイ産物のサブクローニング
この実施例は、リボソームディスプレイの産物のサブクローニングに関するものである
。このサブクローニング法では、鋳型はｓｃＦｖであり、親ｓｃＦｖと記載した。用いた
プロトコールは実施例１の通りである。
【００９９】
リボソーム・ディスプレイ・ライブラリーの産物（即ちＲＴ−ＰＣＲ産物）について、
初期プライマーを用いて変異誘発プライマーを産生する初期ＰＣＲ工程を実施する（Ｊｅ
ｒｍｕｔｕｓら（２００１）ＰＮＡＳ、９８（１）、７５−８０を参照されたい）。初期
ＰＣＲプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドを図３に示す。
【０１００】
このように、リボソームディスプレイの産物に由来するさまざまなｓｃＦｖ配列のレパ
ートリー（Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ、２００１、９８、ｐｐ７５−８０）を
、ＶＨの初めでアニーリングしているビオチン化フォワードプライマーと、ＶＬの末端の
すぐ下流にあるｍｙｃタグにプライム化しているリバースプライマーｍｙｃＲｅｓｔｏｒ
ｅとを用いてＰＣＲで増幅させた（図３を参照されたい）。
【０１０１】
重鎖の初めのアミノ酸配列に応じて、Ｂｉｏ−ＥＶＱ又はＢｉｏ−ＱＶＱを用いた。標
準のＰＣＲ条件を用いた（詳細は実施例１を参照されたい）。
得られたＰＣＲ産物を実施例１に記載のように１本鎖型へ分離して変異誘発プライマー
を形成し、変異誘発反応に用いた。
【０１０２】
変異誘発反応の親分子はｐＣａｎｔａｂ６中の１本鎖ｓｃＦｖである（Ｖａｕｇｈａｎ
ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、ｐｐ３０９−３１４
）。この実施例では唯一の配列ｓｃＦｖ親ｐＣａｎｔａｂ６を用いた。したがって、単一
親分子が複数の変異誘発プライマーによって変異され、それによりリボソームディスプレ
イからの複数の産物を親プラスミドへサブクローニングする。
【０１０３】
１本鎖親分子の調製、変異誘発反応及び細胞の形質転換のプロトコールは実施例１の通
りである。
変異誘発反応の産物は、エレクトロポレーションの後で＞１００００形質転換体を生じ
た。逆に、変異誘発プライマーも酵素もない対照は−１０形質転換体を生じた。
【０１０４】
上記実施例の結果は以下の通りであった：
【０１０５】
【表２】
2015171369.tif 000004
【０１０６】
上で参照する変異誘発プライマーを図面に示す。比較すると、合成オリゴヌクレオチド
を変異誘発反応に用いる場合（典型的には１８塩基のミスマッチの両端に１８相補性塩基
）、平均変異誘発効率は６４％である（ｎ＝３５０配列）。
【実施例３】
【０１０７】
サイズ排除法
変異誘発反応の前に実施例２の１本鎖親分子についてサイズ排除工程を行うことにより
変異誘発効率を更に改善した。これは、変異誘発効率を１．５倍改善させた（配列解析、
うまく変異した配列数の計数により測定）。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、本発明の方法に用いる変異誘発プライマーを示す。いずれの場合も、数字は適切な塩基数であり、ミスマッチ領域はグレーで示す。図１ａは、実施例１で用いた変異誘発プライマー１を示す（ＶＨ／ＶＬ組換え）。図１ｂは、ＶＨＣＤＲ３変異体用に実施例２で用いた変異誘発プライマー２ａを示す（リボソームディスプレイサブクローニング）。図１ｃは、ＶＬＣＤＲ３変異体用に実施例２で用いた変異誘発プライマー２ｂを示す。図１ｄは、ＶＨ変異体又はＶＬ変異体を産生するための変異誘発プライマーを示す。グレーの領域は、実施例２の鋳型と約７０％同一である。図１ｅは、ＩｇＧ受容体プラスミドへクローニングするための変異誘発プライマーを示す。図１ｆは、未感作ライブラリーを作製用のＶＨ受容体プラスミド及びＶＬ受容体プラスミドへクローニングするための変異誘発プライマーを示す。
【図２】図２は、ＶＨ／ＶＬ組換え態様（例えば実施例１）に用いる変異誘発プライマーを合成するための初期プライマーの位置を示す。ＡとＢはそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマーを示す。
【図３】図３は、リボソームディスプレイ側面（例えば実施例２）に用いる変異誘発プライマーを合成するための初期プライマーの位置を示す。ＡとＢはそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマーを示す。
【図４】図４は、実施例１の変異誘発法の結果を示す。
【図５】図５は、本発明の変異誘発法を示す概略図である。概略図では、ＶＨＣＤＲ３内に特定の変異を含有する（星印で示す）ｓｃＦｖ含有プラスミド由来のＶＨＣＤＲ３をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲでプライマーによって導入されるビオチンにより１本鎖型へ分離する。ＶＬＣＤＲ３内に特定の変異を含有する（やはり星印で示す）ｓｃＦＶ含有プラスミドから１本鎖ＤＮＡを精製する。ＶＨＣＤＲ３変異を含有する１本鎖ＰＣＲ産物とＶＬＣＤＲ３変異を含有する１本鎖プラスミドとのあいだの変異誘発反応において２つの変異が組み合わされて両変異を含有するｓｃＦｖ含有プラスミドを生ずる。
【図６】図６は、本発明の組み合わせ態様を示す。図面上部に変異ａ、ｂ、及びｃを含有する複数の鋳型分子を示す。変異を含有するこれら分子の領域をＰＣＲで増幅し、ビオチンを用いて複数の１本鎖変異誘発プライマーへ分離する。図面下部に、変異ｘ、ｙ、及びｚを含有する複数の親分子を示す。１本鎖ＤＮＡは、それぞれ変異ｘ、ｙ、又はｚを含有する複数の親分子を生ずるようにこれらの分子から産生される。変異誘発反応では、変異ａ、ｂ、及びｃを含有する変異誘発プライマーを用いて複数の親分子を変異させる。これは、図面の右に示す産物の組み合わせを生ずる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月19日(2015.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、１以上の変異を核酸分子に導入する方法：
（ａ）親分子に対して１以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から合成し；
（ｂ）１本鎖型変異誘発プライマーを単離し；
（ｃ）１本鎖型変異誘発プライマーを１本鎖型親分子にアニーリングさせ；そして、
（ｄ）変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製する。
【外国語明細書】
2015171369000001.pdf