(57)【要約】【課題】生体機能性成分を特定し、利用可能にする。【解決手段】テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、抗アレルギー剤、脱顆粒抑制剤、IgE産生抑制剤、アレルギー症状の改善剤を提供する。テアブラウンおよび／またはテアフラビンとして、石鎚黒茶組成物を用いることができる。本発明は、アレルギーに関する医療、保健、健康増進、食品、ペット用機能性食品等の分野で有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、抗アレルギー剤。
【請求項２】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、脱顆粒抑制剤。
【請求項３】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、IgE産生抑制剤。
【請求項４】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、アレルギー症状の改善剤。
【請求項５】
Ｉ型アレルギーの処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
アレルギー性鼻炎、気管支ぜんそく、じんましん、またはアトピー性皮膚炎の処置のための、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを、石鎚黒茶組成物として含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の剤。
【請求項８】
一食当たり、800 mg以上のテアブラウンを含有する、アレルギーを処置するための食品。
【請求項９】
一食当たり、800 mg以上のテアブラウンを含有する、アレルギー症状を緩和するための食品。
【請求項１０】
茶飲料、キャンディー、饅頭、大福、アイスクリーム、石鎚黒茶茶葉製品、またはカプセル剤もしくはタブレットの形態である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の食品。
【請求項１１】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを対象に摂取させる工程を含む、アレルギーの処置のための方法（医療行為を除く。）。
【請求項１２】
テアブラウン160mg/g以上および／またはテアフラビン40mg/g以上を含有する、非ヒト動物用食品。
【請求項１３】
茶飲料、石鎚黒茶茶葉製品、缶詰、ドライフード、レトルトフード、またはカプセル剤もしくはタブレットの形態である、請求項１２に記載の食品。
【請求項１４】
テアブラウンおよび／またはテアフラビンを非ヒト動物に投与する工程を含む、アレルギーの処置のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テアブラウンおよび／もしくはテアフラビン、または石鎚黒茶組成物を有効成分とする抗アレルギー剤に関する。本発明は、アレルギーに関する医療、保健、健康増進、食品、ペット用機能性食品等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
日本において最も重要な屋外アレルゲンはスギ花粉アレルゲンであり、花粉アレルゲン全体の7割を占めている。現在、スギ花粉の精製アレルゲンとして正式に掲載されているのはCry j1とCry j2の2つの主要なアレルゲンであり、高濃度のCry j1をマウスの鼻腔内へ感作させることで、免疫系がTh2優位に変化し、血中IgE量の増加を伴ったアレルギー性鼻炎が誘導されることが報告されている。
【０００３】
I型アレルギー反応には、抗原特異的なIgE抗体とIgE特異的な高親和性IgE受容体FcεRIをもつ肥満細胞や好塩基球が関わる。FcεRIを介して肥満細胞や好塩基球の表面に結合しているIgEが抗原によって架橋されると、FcεRIは脂質ラフトにおいて凝集し、活性化されることでその下流へとシグナルが伝達され、ヒスタミンやタンパク質分解酵素などの細胞内顆粒内容物が放出される。この現象を脱顆粒と呼ぶ。ヒスタミンにより血管透過性の亢進や平滑筋の収縮が誘導され、タンパク質分解酵素によって組織のリモデリングが誘導される。その後、プロスタグランジンなどの脂質メディエーターやサイトカインが放出され、アレルギー症状はさらに亢進する。そのため、このようなI型アレルギーの発症を抑えるためには、肥満細胞や好塩基球からの脱顆粒の抑制が重要である。
【０００４】
アレルギーを処置するためには、種々の成分が検討されてきた。例えば特許文献１は、ソルガムの一部、ソルガムの全部およびソルガム抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを含む、アレルギー抑制活性剤を提案する。また、特許文献２はクラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤を提案する。さらに特許文献３は、甲殻類より調製した殻成分を除去したエキスを活性成分として含有するアレルギー抑制剤を提案する。
【０００５】
一方、石鎚黒茶は、愛媛県西条市小松町石鎚地区に古くから伝わる茶である。この石鎚黒茶は後発酵茶といわれ、梅雨後の成熟した茶葉を蒸煮後、桶に軽く詰め込んで好気的発酵を行い、次いで軽く揉んで嫌気的発酵を行った後に、天日で乾燥するという、いわゆる二段発酵により製造される。石鎚黒茶については、製造方法、成分特性、貯蔵法等の観点から検討がされてきた（非特許文献１）。そして、石鎚黒茶と同じく後発酵茶である碁石茶については、コレステロール負荷家兎における高脂血症と動脈硬化に対する抑制作用が報告されている（非特許文献２）。また、発酵茶に関しては、茶に含まれる色素であるテアブラウン、テアルビジンおよびテアフラビンに着目し、テアルビジンとテアフラビンの量を相対的に多くした発酵茶が提案されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2007-254338公報
【特許文献２】特開2010-173937公報
【特許文献３】特開2011-178750公報
【特許文献４】特開2010-510781公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】松本恭郎ら：石鎚黒茶の成分特性と貯蔵法の開発, 平成10年度農林水産加工利用開発会議技術開発研究成果報告書, 11-29(1999).
【非特許文献２】宮村充彦ら, 薬学雑誌, 128(7), 1037-1044(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
食品は、第一次機能としての栄養性、第二次機能としての嗜好性に加えて、第三次機能として、生体調節作用を有しており、当該機能性を利用した種々の製品がいわゆる健康食品等として、広く一般に受け入れられ、利用されてきている。食経験の比較的長い食品由来の物質は特に、アレルギーのような比較的長期にわたり処置を必要とする疾患または状態に対し、繰り返し長期間使用するに際して安心感がある点でも、好ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、動物細胞培養技術、分子生物学的手法、および実験動物を用いて種々の生体調節機能に関与する活性を持つ機能性分子の探索を行ってきた。その中で、今般、石鎚黒茶由来の物質に、抗アレルギー作用があることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は以下を提供する。
[１]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、抗アレルギー剤。
[２]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、脱顆粒抑制剤。
[３]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、IgE産生抑制剤。
[４]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを含有する、アレルギー症状の改善剤。
[５]  Ｉ型アレルギーの処置のための、[１]〜[４]のいずれか一に記載の剤。
[６]  アレルギー性鼻炎、気管支ぜんそく、じんましん、またはアトピー性皮膚炎の処置のための、[５]に記載の剤。
[７]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを、石鎚黒茶組成物 として含有する、[１]〜[６]のいずれか一に記載の剤。
[８]  一食当たり、800 mg以上のテアブラウンを含有する、アレルギーを処置するための食品。
[９]  一食当たり、800 mg以上のテアブラウンを含有する、アレルギー症状を緩和するための食品。
[１０]  茶飲料、キャンディー、饅頭、大福、アイスクリーム、石鎚黒茶茶葉製品、またはカプセル剤もしくはタブレットの形態である、[８]〜[１０]のいずれか一に記載の食品。
[１１]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを対象に摂取させる工程を含む、アレルギーの処置のための方法（医療行為を除く。）。
[１２]  テアブラウン160mg/g以上および／またはテアフラビン40mg/g以上を含有する、非ヒト動物用食品。
[１３]  茶飲料、石鎚黒茶茶葉製品、缶詰、ドライフード、レトルトフード、またはカプセル剤もしくはタブレットの形態である、[１２]に記載の食品。
[１４]  テアブラウンおよび／またはテアフラビンを非ヒト動物に投与する工程を含む、アレルギーの処置のための方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】石鎚黒茶抽出物の脱顆粒抑制効果
【図２】ゲル濾過による分子量の推定。(A)溶出液量13mLの位置に、活性成分のピークが見られた。(B)活性成分の分子量は23kDaと推定された。
【図３】図3(A)にSykとp-Syk（リン酸化Syk）に関するウェスタンブロッティングの結果を示した。また、画像解析装置により求めたSykに対するp-Sykの相対量を、図3(B)に示した。抗原により刺激した際、石鎚黒茶抽出物の添加の有無により、Syk量には差がほとんど認められなかったが、リン酸化されたp-Syk量は、石鎚黒茶抽出物の添加により明らかに減少した。石鎚黒茶抽出物は、抗原刺激によるシグナル伝達を、Sykがリン酸化される段階で停止させているものと考えられた。図(C)にp-PLCγ1（リン酸化PLCγ1）等に関するウェスタンブロッティングの結果を示した。
【図４】マウスの鼻のひっかき行動(石鎚黒茶抽出物による症状抑制効果)
【図５】石鎚黒茶抽出物の培養細胞U266に対するIgE産生抑制効果。(A)濃度効果、(B)経時変化
【図６】石鎚黒茶抽出物の培養細胞U266に対する作用機序。(A)IgE産生量、(B)IgE mRNA発現量。石鎚黒茶抽出物は、IgEの産生量を抑制するものの、遺伝子の転写活性には影響しないと推察された。
【図７】石鎚黒茶抽出物の培養細胞U266に対する作用機序。(A)分泌阻害剤(Monensin)、(B)石鎚黒茶抽出物。石鎚黒茶抽出物によるIgEの産生量抑制効果は、分泌阻害でもないことから、翻訳阻害による可能性が示唆された。
【図８】石鎚黒茶抽出物中の活性成分の推定。石鎚黒茶抽出物中の活性成分は、タンパク質分解酵素の影響を受けないことが示された。
【図９】アレルギー誘発マウスへの経口投与による血中抗体量への影響。石鎚黒茶抽出物には、血中IgEレベルを抑制する傾向が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において数値範囲を「X〜Y」または「X - Y」で表すときは、特に記載した場合を除き、その範囲は両端の数値XおよびYを含む。本発明で、組成物等おける成分に関し「%」や比で表すときは、特に記載した場合を除き、重量に基づく値である。
【００１３】
本発明は、テアブラウンおよび／またはテアフラビンを有効成分とする、抗アレルギー剤を提供する。
【００１４】
本発明でいう「テアブラウン」とは、下記の方法で得られうる成分（下記の方法で得られた成分と、その成分と同じ成分であって、他の方法で得られた成分とを含む。）をいう。
発酵茶の茶葉の、水系溶媒による抽出液を、酢酸エチルを用いて分画し、水層を得る。得られた水層を、さらにn-ブタノールを用いて分画し、水層を得る。得られた水層にエタノール(エタノール：水層＝8：2)を加え、沈殿物を回収する。回収した沈殿物が、本発明でいう、テアブラウンである。
【００１５】
本発明において有効成分と一つとして用いることのできるテアフラビンは、下記の構造を有する。
【化１】
2015010041.tif 000002
【００１６】
参考のため、その他の色素成分であるテアルビジンの推定構造を以下に示す。
【化２】
2015010041.tif 000003
【００１７】
本発明で「石鎚黒茶組成物」というときは、特に記載した場合を除き、石鎚黒茶の茶葉から得られた抽出物（例えば、本明細書の実施例の項に記載された石鎚黒茶熱水抽出物）、ならびに抽出物の濃縮物、乾燥物および粗精製物を含む。
【００１８】
本発明で石鎚黒茶というときは、一般的な製法により調製された石鎚黒茶の茶葉由来のものを指す。石鎚黒茶は、天狗黒茶と称されることもある。石鎚黒茶の茶葉の典型的な製法を次に示す。出発原料として、ツバキ科の多年性植物である、カメリア・シネンシスの、十分に成熟した比較的固い葉を用いる。洗浄した茶葉を、茶の実と共に1〜数時間蒸した後、木桶に詰め、環境温度で一次発酵（好気発酵）を行う。白色菌糸体が十分に観られた茶葉をよく揉んで、密封可能な容器に詰め、環境温度で10〜14日間、二次発酵（嫌気発酵）を行う。得られた茶葉を3日ほど天日干しし、黒色の茶葉を得ることができる。同様の発酵工程を経て調製される茶には、徳島県の「阿波番茶」、高知県の「碁石茶」があるが、それぞれ地域特有のものであり、製造工程詳細は異なるものと考えられる。
【００１９】
石鎚黒茶の典型的な淹れ方は、熱湯1000 mLに対して茶葉を約5〜15 g入れ、しばらく置くことによる。
【００２０】
本発明者の検討によると、石鎚黒茶組成物は、ラット好塩基球白血病(Rat basophilic leukemia)細胞株であるRBL-2H3を抗原により刺激した際、β-ヘキソサミニダーゼの放出を抑制した。すなわち、好塩基球において脱顆粒を抑制した。なお、RBL-2H3細胞は、ヒトの好塩基球や肥満細胞と同様の機能を持つことが知られており、RBL-2H3細胞からのβ-ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果がI型アレルギー抑制効果の一つの指標として考えられている。また、本発明者らの検討によると、スギ花粉アレルゲンで花粉症を誘導したBalb/cマウスに石鎚黒茶を摂取させることにより、鼻の引っかき行動が減少した。したがって、本発明は、抗アレルギー、脱顆粒抑制、またはアレルギー症状の改善のために有用である。
【００２１】
本発明は、特にI型アレルギーの処置のために有用である。I型アレルギーはIgEが関与することで引き起こされるアレルギーである。IgEはTh2が産生するIL-4、IL-13によりB細胞がIgE産生細胞へと分化することで産生され、肥満細胞、好塩基球のFcεRIに結合し、そこにアレルゲンが結合するとFcεRIが凝集し、ヒスタミン、ロイコトリエンC4、PAF、好酸球走化因子らが分泌(脱顆粒)され、アレルギー症状が発現する。ヒスタミンによる血管透過性亢進、血管拡張、かゆみ等の症状は、数時間で収まることも多いため、I型アレルギーは、即時型アレルギーと呼ばれることもある。FcεRIは単量体IgEが結合することでFcεRIが安定化し、肥満細胞表面のFcεRIの発現が20〜30倍増強、すなわち、アレルゲン刺激に対する感受性が亢進する。I型アレルギーとして知られているものには、気管支喘息（肥満細胞、好塩基球から出るLTにより、強烈な気管支収縮が起こることによる。）、アレルギー性鼻炎(花粉症含む。鼻粘膜の肥満細胞、好塩基球から出るヒスタミンにより、血管拡張・血管透過性亢進に端を発して、むくみ(鼻づまり)、知覚反射（くしゃみ、鼻水）が伴うことも多い。）、じんましん（食物、刺激により皮膚の肥満細胞、好塩基球から出るヒスタミンなどが、かゆみ、炎症を起こすことによる。）、アトピー性皮膚炎（基本はじんましんと同じだが、セラミドの不足による皮膚バリア機能の低下によるアレルゲンの進入しやすさ、IgEが産生しやすい体質等により、炎症性の症状が継続しやすい。）がある。
【００２２】
本発明で疾患または状態について「処置」というときは、発症リスクの低減、発症の遅延、予防、治療、進行の停止、遅延を含む。処置には、医師が行う、病気の治療を目的とした行為と、医師以外の者、例えば栄養士（管理栄養士、スポーツ栄養士を含む。）、保健師、助産師、看護師、臨床検査技師、スポーツ指導員、美容部員、エステティシャン、医薬品製造者、医薬品販売者、食品製造者、食品販売者等が行う、非治療的行為とが含まれる。また処置には、獣医師が行う、非ヒト動物の病気の治療を目的としたとした行為と、獣医師以外の者、例えば獣医看護士、愛玩動物飼養管理士、厩務員、飼育員、動物医薬品製造者、動物医薬品販売者、ペット用食品製造者、ペット用食品販売者等が行う、非治療行為が含まれる。さらに処置には、特定の食品の投与または摂取の推奨、食事指導、保健指導、栄養指導（傷病者に対する療養のため必要な栄養の指導、および健康の保持増進のための栄養の指導を含む。）、給食管理、給食に関する栄養改善上必要な指導を含む。
【００２３】
本発明における処置の対象は、ヒト（個体）を含み、好ましくは、上述したいずれかの処置を施すことが望ましいか、または上述したいずれかの処置を施す必要のあるヒトである。
本発明における処置の対象は、ヒト以外の動物であってもよく、この例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、リス等のペット（愛玩動物、コンパニオンアニマルということもある。）、牛、豚等の家畜、マウス、ラット等の実験動物、動物園等で飼育されている動物が挙げられる。対象となる非ヒト動物の成長段階には特に限定がなく、本発明の処置の対象は、例えば、幼犬、成犬、高齢犬、幼猫、成猫、高齢猫であり得る。
【００２４】
本発明で「剤」というときは、特に記載した場合を除き、石鎚黒茶組成物そのものである場合と、テアブラウンおよび／もしくはテアフラビンまたは石鎚黒茶組成物と、それら以外の成分とを含む場合とがあるが、テアブラウン、テアフラビンおよび石鎚黒茶自体は含まず、また石鎚黒茶を含有する既存の食品は、含まない。
【００２５】
本発明の剤における有効成分であるテアブラウン、テアフラビンまたは石鎚黒茶組成物の摂取量は、目的の効果が発揮される量であればよい。テアブラウンに関しては、250 mg/day以上とすることができ、500 mg/day以上とすることが好ましく、1,000 mg/day以上とすることがより好ましく、1,500 mg/day以上とすることがより好ましく、2,000 mg/day以上とすることがより好ましく、2,500 mg/day以上とすることがより好ましく、3,000 mg/day以上とすることがより好ましく、4,000 mg/day以上とすることがより好ましく、5,000 mg/da以上yとすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、100,000 mg/day以下とすることができ、50,000 mg/day以下とすることが好ましく、20,000 mg/day以下とすることがより好ましく、10,000 mg/day以下とすることがさらに好ましい。テアフラビンに関しては、50 mg/day以上とすることができ、100 mg/day以上とすることが好ましく、200 mg/day以上とすることがより好ましく、300 mg/dayと以上することがより好ましく、400 mg/day以上とすることがより好ましく、500 mg/day以上とすることがより好ましく、600 mg/day以上とすることがより好ましく、800 mg/day以上とすることがより好ましく、1,000 mg/day以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、20,000 mg/day以下とすることができ、10,000 mg/day以下とすることが好ましく、4,000 mg/day以下とすることがより好ましく、2,000 mg/day以下とすることがさらに好ましい。固形分量75 mg/mLの、石鎚黒茶抽出物（通常程度の濃度の石鎚黒茶の約1/20濃縮物）換算では、5.0 mL/day以上とすることができ、10 mL/day以上とすることが好ましく、20 mL/day以上とすることがより好ましく、30 mL/day以上とすることがより好ましく、40 mL/day以上とすることがより好ましく、50 mL/day以上とすることがより好ましく、60 mL/day以上とすることがより好ましく、80 mL/day以上とすることがより好ましく、100 mL/day以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、1,000 mL/day以下とすることができ、500 mL/day以下とすることが好ましく、200 mL/day以下とすることがより好ましく、150 mL/day以下とすることがさらに好ましい。摂取は、一日に1〜数回に分けて行うことができる。なお、本発明で茶飲料に関し、固形分量というときは、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例の項に記載したように、茶飲料を酢酸エチル等の溶媒で分画した際の、すべての画分の乾燥物の総量を指す。これは茶飲料に含まれる可溶性の固形分の総量にほぼ相当する。
【００２６】
本発明の剤には、目的の効果を発揮しうる限り、有効成分以外の他の成分を配合することができる。他の成分は、食品として許容される種々の添加剤、または医薬として許容される種々の添加剤であり得る。この例には、賦形剤、酸化防止剤抗（酸化剤）、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料等、酵素、光沢剤、酸味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、結合剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、凝固剤等である。
【００２７】
他の成分は、テアブラウン、テアフラビンまたは石鎚黒茶組成物以外の機能性成分であってもよい。他の機能性成分に例としては、カテキン類、アミノ酸類（例えば、分岐鎖アミノ酸類、オルニチン）、不飽和脂肪酸類（例えば、ARA、EPA、DHA、αリノレン酸、オメリノール酸、オレイン酸）、ビタミン類、微量金属類、ポリフェノール類、卵黄抽出物、はちみつ加工品、黒糖、オリゴ糖、食物繊維、コンドロイチン硫酸類、CoQ10、フコイダン、フコキサンチン、アスタキサンチン、セサミン、プラセンタ、酵母エキス、黒酢濃縮物、ニンニク抽出物、イチョウ葉抽出物、ビルベリー抽出物、ブルーベリー抽出物、各種人参抽出物、マカ抽出物、豆種皮抽出物、セントジョーンズワート抽出物、松樹皮抽出物、アサイー抽出物、ノニ抽出物等が挙げられる。
【００２８】
本発明の剤が有効成分と有効成分以外の他の成分からなる場合、有効成分の含有量は、当業者であれば、製造し安さ、用いやすさ等の点から適宜設計でき、例えば、0.1〜99.9％とすることができ、また1〜95％とすることができ、また10％〜90％とすることができる。
【００２９】
本発明の剤は、上述したように、石鎚黒茶および石鎚黒茶を含有する既存の食品を除き、種々の形態であり得る。例えば、本発明の剤は、それ自体で経口医薬品または食品であり得る。また本発明の剤は、経口医薬品または食品に添加するために用いることができる。本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、固形物のみならず、液状のもの、例えばスープ、飲料およびドリンク剤を含む。また、本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、ヒトを対象としたものと、非ヒト動物を対象としたものを含む。さらに本発明で「食品」というときは、特に記載した場合を除き、健康食品、サプリメント、保健機能食品（栄養機能食品および特定保健用食品を含む。）、一般食品（医薬品（新指定医薬部外品を含む）ではなく、かつ保健機能食品ではない食品）を含み、また治療食（治療の目的を果たすもの。医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの。）、食事療法食、成分調整食、減塩食、介護食、減カロリー食、ダイエット食を含む。非ヒト動物を対象とした食品は、ペットフード、ペット用飲料、ペット用サプリメント、飼料を含む。本発明で「医薬（品）」というときは、特に記載した場合を除き、ヒト用のものと動物用のものとを含む。
【００３０】
本発明により提供される剤または食品が、経口医薬品、健康食品、サプリメントの形態である場合、その剤形の例としては、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、錠剤（タブレット）、丸剤、粉末剤、顆粒剤、細粒剤、ゼリー剤、チューブ入り剤、ドリンク剤を挙げることができる。
【００３１】
軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤または丸剤等の形態とする場合、有効成分である石鎚黒茶組成物の一剤当たりの含量は、テアブラウンに関しては、50 mg以上とすることができ、100 mg以上とすることが好ましく、200 mg以上とすることがより好ましく、300 mg以上とすることがより好ましく、400 mg以上とすることがより好ましく、500 mg以上とすることがより好ましく、600 mg以上とすることがより好ましく、800 mg以上とすることがより好ましく、1,000 mg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、2,000 mg以下とすることができ、1,800 mg以下とすることが好ましく、1,600 mg以下とすることがより好ましく、1,500 mg以下とすることがさらに好ましい。テアフラビンに関しては、一剤当たり、10 mg以上とすることができ、20 mg以上とすることが好ましく、40 mg以上とすることがより好ましく、60 mg以上とすることがより好ましく、80 mg以上とすることがより好ましく、100 mg以上とすることがより好ましく、120 mg以上とすることがより好ましく、160 mg以上とすることがより好ましく、200 mg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、1,500 mg以下とすることができ、1,000 mg以下とすることがより好ましく、500 mg以下とすることがより好ましく、400 mg以下とすることがさらに好ましい。固形分量75 mg/mLの、石鎚黒茶抽出物（通常程度の濃度の石鎚黒茶の約1/20濃縮物）換算では、一剤当たり、1 mL以上とすることができ、2 mL以上とすることが好ましく、4 mL以上とすることがより好ましく、6 mL以上とすることがより好ましく、8 mL以上とすることがより好ましく、10 mL以上とすることがより好ましく、12 mL以上とすることがより好ましく、16 mL以上とすることがより好ましく、20 mL以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、200 mL以下とすることができ、100 mL以下とすることが好ましく、40 mL以下とすることがより好ましく、30 mL以下とすることがさらに好ましい。
【００３２】
本発明により提供される食品は、上記以外に、種々の形態であり得る。具体的としては、飲料（例えば、茶飲料、清涼飲料、乳飲料、果汁飲料、野菜飲料、青汁、希釈用濃縮飲料、粉末飲料）、菓子類（例えば、飴、饅頭、大福、わらびもち、ようかん、ういろう、冷菓（アイスクリーム、シャーベットを含む。）、焼菓子（クッキー、ビスケット、サブレ、ケーキ、バームクーヘン、フィナンシェを含む。）、レアチーズケーキ、チューインガム、錠菓、グミ、ゼリー、チョコレート、スナック菓子）、製菓用シロップ、チルド惣菜、冷凍惣菜、レトルトパウチ惣菜、即席めん、フライ類（例えば、フライドポテト、フライドチキン、フライドフィッシュ）、魚すり身製品、畜肉製品、チーズ、バター、発酵乳製品（例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料）、チーズ類（例えば、ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、チーズスプレッド、発酵バター）、発酵植物製品（キムチ、すぐき、ぬか漬け、ピクルス、ザワークラウト）、保存食（例えば、酢漬け、塩漬け）、調味料組成物（例えば、サラダドレッシング、マヨネーズ、トマトケチャップ、チキンコンソメ、ビーフコンソメ、化学調味料組成物、ウスターソース、とんかつソース、たれ、ハーブ塩、味噌、醤油、めんつゆ、だし）、スープまたはスープの素（例えば、コーンスープ、オニオンスープ、トマトスープ、ブイヤベース、コンソメスープ、味噌汁、吸い物）、ソース類（例えば、ホワイトソース、デミグラスソース、トマトソース、ミートソース、カレールウ、パスタソース）、ふりかけ、石鎚黒茶茶葉製品を挙げることができる。石鎚黒茶茶葉製品は、茶葉そのものは含まない。石鎚黒茶茶葉製品の具体例としては、石鎚黒茶茶葉を含む粉茶、圧縮茶葉、玄米入り茶葉、混合茶葉、ティーバック、茶ミルクの素を挙げることができる。
【００３３】
上述のような食品の形態とする場合、有効成分である石鎚黒茶組成物の含量は、一食としての摂取量を勘案して設計することができる。一食の形態は、例えば80〜1,000mL、好ましくは、150〜750mLの容器詰飲料がある。食品の形態とする場合、有効成分である石鎚黒茶組成物の一食当たりの含量は、テアブラウンに関しては、100 mg以上とすることができ、200 mg以上とすることが好ましく、400 mg以上とすることがより好ましく、600 mg以上とすることがより好ましく、800 mg以上とすることがより好ましく、1,000 mg以上とすることがより好ましく、1,200 mg以上とすることがより好ましく、1,600 mg以上とすることがより好ましく、2,000 mg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、20,000 mg以下とすることができ、18,000 mg以下とすることが好ましく、16,000 mg以下とすることがより好ましく、15,000 mg以下とすることがさらに好ましい。テアフラビンに関しては、一食当たり、20 mg以上とすることができ、40 mg以上とすることが好ましく、80 mg以上とすることがより好ましく、120 mg以上とすることがより好ましく、160 mg以上とすることがより好ましく、200 mg以上とすることがより好ましく、240 mg以上とすることがより好ましく、320 mg以上とすることがより好ましく、400 mg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、3,000 mg以下とすることができ、2,000 mg以下とすることがより好ましく、1,000 mg以下とすることがより好ましく、800 mg以下とすることがさらに好ましい。石鎚黒茶抽出物（通常程度の濃度の石鎚黒茶の約1/20濃縮物）換算では、一食当たり、2 mL以上とすることができ、4 mL以上とすることが好ましく、8 mL以上とすることがより好ましく、12 mL以上とすることがより好ましく、16 mL以上とすることがより好ましく、20 mL以上とすることがより好ましく、24 mL以上とすることがより好ましく、32 mL以上とすることがより好ましく、40 mL以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、400 mL以下とすることができ、300 mL以下とすることが好ましく、200 mL以下することがより好ましく、100 mL以下とすることがさらに好ましい。
【００３４】
本発明により提供される剤または食品が、ペット用のものである場合、その形態の具体的としては、缶詰、ドライフード、レトルトフード茶飲料、石鎚黒茶茶葉製品、缶詰、ドライフード、レトルトフード、またはカプセル剤もしくはタブレットを挙げることができる。
【００３５】
ペット用食品の形態とする場合、有効成分である石鎚黒茶組成物の含量は、一食としての摂取量を勘案して設計することができる。ペット用食品の形態とする場合、有効成分である石鎚黒茶組成物の含量は、テアブラウンに関しては、10 mg以上とすることができ、20 mg以上とすることが好ましく、40 mg/g以上とすることがより好ましく、80 mg/g以上とすることがより好ましく120 mg/g以上とすることがより好ましく、160 mg/g以上とすることがより好ましく200 mg/g以上とすることがより好ましく、240 mg/g以上とすることがより好ましく、300 mg以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、4000 mg以下とすることができ、3000 mg/g以下とすることが好ましく、2000 mg/g以下とすることがより好ましく、1500 mg/g以下とすることがさらに好ましい。テアフラビンに関しては、20 mg/g以上とすることができ、10 mg/g以上とすることが好ましく、20 mg/g以上とすることがより好ましく、30 mg/g以上とすることがより好ましく、40 mg/g以上とすることがより好ましく、50 mg/g以上とすることがより好ましく、60 mg/g以上とすることがより好ましく、80 mg/g以上とすることがより好ましく、100 mg/g以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、1,000 mg/g以下とすることができ、800 mg/g以下とすることがより好ましく、400 mg/g以下とすることがより好ましく、200 mg/g以下とすることがさらに好ましい。石鎚黒茶抽出物（通常程度の濃度の石鎚黒茶の約1/20濃縮物）換算では、0.4 mg/g以上とすることができ、0.8 mg/g以上とすることが好ましく、1.6 mg/g以上とすることがより好ましく、2.4 mg/g以上とすることがより好ましく、3.2 mg/g以上とすることがより好ましく、4.0 mg/g以上とすることがより好ましく、4.8 mg/g以上とすることがより好ましく、6.4 mg/g以上とすることがより好ましく、8.0 mg/g以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合であっても、40 mg/g以下とすることができ、30 mg/g以下とすることが好ましく、20 mg/g以下することがより好ましく、10 mg/g以下とすることがさらに好ましい。
【００３６】
本発明の剤または食品は、食事と共に、例えば、食前、食事中、食後に、摂取することができる。本発明の剤または食品は、脱顆粒抑制もしくはIgE産生抑制剤に起因する疾患または状態、Ｉ型アレルギーまたはアレルギー性鼻炎、気管支ぜんそく、じんましんもしくはアトピー性皮膚炎の発症前に、発症リスクの低減や予防等を目的として、対象に摂取させることができ、またそれらの発症後に、諸症状を改善すること等を目的として、対象に摂取させることができる。
【００３７】
本発明の剤または食品は、種々の公知の技術を用いて製造することができる。有効成分である石鎚黒茶組成物を所定の比および／または濃度になるように調整する工程は、製造工程の種々の段階で適用できる。当業者であれば、各成分の溶解性、安定性、揮発性等を考慮して、本発明の剤のための製造工程を、適宜設計しうる。茶葉抽出物の原料としては、通常の緑茶や包種茶に製した茶葉などを用いることができる。茶葉抽出物の調製は、茶葉を水あるいは熱水等の溶媒を用いて抽出することによって行うことができる。例えば、茶葉１質量部に対し、5〜100質量部の溶媒を加え、室温〜100℃程度の温度で、1〜120分間程度抽出する方法が挙げられる。
【００３８】
本発明の剤または食品には、上述の疾患または状態の処置のために用いることができる旨を表示することができ、また上述の対象に対して摂取を薦める旨を表示することができる。より具体的には、本発明の剤または食品には、脱顆粒抑制もしくはIgE産生抑制剤に起因する疾患または状態、Ｉ型アレルギーまたはアレルギー性鼻炎、気管支ぜんそく、じんましんもしくはアトピー性皮膚炎の発症リスクの低減や予防等のために、または脱顆粒抑制もしくはIgE産生抑制剤に起因する疾患または状態、Ｉ型アレルギーまたはアレルギー性鼻炎、気管支ぜんそく、じんましんもしくはアトピー性皮膚炎による諸症状を改善することを表示することができる。表示は、直接的にまたは間接的にすることができ、直接的な表示の例は、製品自体、パッケージ、容器、ラベル、タグ等の有体物への記載であり、間接的な表示の例は、ウェブサイト、店頭、展示会、看板、掲示板、新聞、雑誌、テレビ、ラジオ、郵送物、電子メール等の場所または手段よる、広告・宣伝活動を含む。
【００３９】
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明の範囲は実施例に記載したものに限られない。
【実施例】
【００４０】
〔実施例１：石鎚黒茶抽出物の調製〕
石鎚黒茶(さつき会製) 5 gをフードプロセッサーを用いて粉砕後、蒸留水50 mLに懸濁し、121℃、20分熱水抽出を行った。次いで12,000 rpm、20分、4℃の条件で遠心を行い、その後14 KDaカットの透析膜(和光純薬製)を用いて10 mM NaPBで透析し、フィルター滅菌したものを石鎚黒茶抽出物とした(下図)。なお、以下では、石鎚黒茶抽出物を「IKE」と表記する場合がある。
【００４１】
【化３】
2015010041.tif 000004
【００４２】
〔実施例２：脱顆粒抑制作用の評価〕
この試験では、ラット好塩基球白血病細胞株 (RBL-2H3) を用い、好塩基球の顆粒中に豊富に存在するリソソーム酵素の一つであるβ-ヘキソサミニダーゼを脱顆粒の指標として測定することにより、サンプルの脱顆粒抑制作用の有無を評価した。サンプルとして、上述の石鎚黒茶抽出物、および同様に調製した緑茶抽出物を用いた。また茶抽出物に代えて水を用いた群をコントロールとした。
【００４３】
(1)方法
＜ラット好塩基球細胞株RBL-2H3細胞の前培養＞
1. 0.02% EDTA-0.25% トリプシン-リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37℃で温めておいた。
2. 培地である10% ウシ胎児血清(FBS)-DMEM培地を遠心管に調製し、室温に戻した。
3. RBL-2H3細胞をインキュベータから取り出し、ディッシュ中の培地を吸引除去した。
4. ディッシュにPBSを10 mL加え、RBL-2H3細胞を洗浄した。
5. PBSを吸引除去し、0.02% EDTA-0.25% トリプシン-PBS 1 mLとPBS 1 mLを加え、全体になじませて37℃で2 分30 秒ほどインキュベートした。
6. インキュベータから取り出し、ディッシュに10% FBS-DMEM培地を8 mL加え、ピペッティングすることで細胞をはがし、遠心管に回収した。
7. 1,000 rpm、5分の条件で遠心後、上清を除去し、10% FBS-DMEM培地で細胞数を約2.0×105 cells/mLに合わせた。
8. 細胞懸濁液を各ウェルに200μLずつ分注し、炭酸ガスインキュベーターにおいて、37℃、湿度100%、5% CO2条件下で一晩培養した。
【００４４】
＜脱顆粒誘導＞
1. 10% FBS-DMEMを用いて抗 DNP-IgE(シグマ社製)を50 ng/mLとなるよう希釈した。
(*DNP:ジニトロフェノール)
2. RBL-2H3細胞を一晩培養した96穴プレートをインキュベータから取り出し、PBSで洗浄後、調製した抗 DNP-IgE溶液を一穴あたり120μL入れ、インキュベータで2時間培養することで細胞を感作させた (抗 DNP-IgEの終濃度：25 ng/mL)。また、Blankには抗 DNP-IgEの入っていない培地を入れた。
3. インキュベート中にTyrode's Bufferを用いてDNP-BSA(シグマ社製)を2.5μg/mLとなるよう希釈した。また、2倍濃度Tyrode's Bufferを用いてサンプル溶液、及びコントロール溶液(10mM リン酸緩衝液(NaPB))を調製した。
(*BSA:ウシ血清アルブミン)
4. 2時間培養後、抗 DNP-IgE溶液を除去し、200μL/well Tyrode's Bufferで2回洗浄した。
5. 調製したサンプルを各120μLずつプレートに分注した後、インキュベータで10分間培養した。
6. DNP-BSA溶液を10μL加え(終濃度 50 ng/mL)、よく混合し、インキュベータで30分間培養した。
7. インキュベート中にTriton X-100をTyrode's Bufferで0.1%に希釈し、また基質であるp-nitrophenyl-2-acetoamido-2deoxy-β-D-glucopyranosideも3.3 mMで100 mM Citrate Bufferに溶解させた。
8. インキュベータから96穴プレートを取り出し、10分間氷冷して反応を止めた。
9. 培養上清を別の96穴プレートに移した。
10. 残った細胞に7で調製した0.1% Triton X-100溶液を入れ、氷冷しながら超音波破砕を行うことで細胞を破砕させた。
11. 上清と細胞破砕液を96穴プレートに50μLずつとり、5分間37℃でプレインキュベートした。
12. 7で調製した基質溶液を100μLずつ加えて攪拌後、25分間37℃でインキュベートした。
13. 反応停止液として2 M Glycine Bufferを100μLずつ分注し、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。なお、サンプルが405 nmに吸収を持つ可能性があるため、反応停止液、基質溶液の順で加えた際の吸光度を同時に測定し、これをブランクとした。
14. β-ヘキソサミニダーゼ放出率は下式により算出した。
【００４５】
【化４】
2015010041.tif 000005
【００４６】
(2)結果
結果を図1に示した。
石鎚黒茶抽出物には、濃度依存的にβ-ヘキソサミニダーゼ放出を抑制することが分かった。石鎚黒茶抽出物はβ-ヘキソサミニダーゼ放出を抑制する作用は、緑茶抽出物より強力であった。
【００４７】
〔実施例３：活性成分の分画と各抽出画分の活性〕
石鎚黒茶抽出物に含まれる主な色素成分はテアフラビンなどのポリフェノール類である。テアフラビンは酢酸エチルで分離ができ、テアルビジンはn-ブタノールで分離される。さらに、エタノール沈殿させることでテアブラウンが分離される。この試験では、上述したのと同様に、β-ヘキソサミニダーゼを脱顆粒の指標として測定することにより、分画した各色素成分の脱顆粒抑制作用の有無を評価した。
【００４８】
(1)液-液分配方法
1. 石鎚黒茶抽出物20 mLをエバポレーターを用いて約4倍に濃縮した。
2. 酢酸エチルを5 mL、3回加え酢酸エチル画分を回収した。
(テアフラビン画分)
3. 水層画分にn-ブタノールを5 mL、3回加え、ブタノール画分を回収した。
(テアルビジン画分)
4. 残りの水層画分約1 mLに対し4 mLのエタノール(エタノール：水層画分=8：2)を加え、3,500 rpm、10 分遠心にかけ上清及び沈殿を回収した。
(沈殿物：テアブラウン画分)
5. 沈殿は一晩ドラフト内で有機溶媒を揮発させた。
6. 酢酸エチル画分、ブタノール画分、上清画分は凍結乾燥遠心機を用いて有機溶媒を揮発させ、一晩ドラフト内で完全に有機溶媒を揮発させた。
7. 全ての画分を20 mLの蒸留水にて懸濁した。
8. ブタノール画分は約1分、70℃のウォーターバスで熱することで溶解させた。酢酸エチル画分のみ同条件では溶解できなかった。
9. 得られた画分は全て0.22μLの滅菌フィルターでろ過した。
【００４９】
【化５】
2015010041.tif 000006
【００５０】
(2)結果
結果を下表に示した。
【００５１】
【表１】
2015010041.tif 000007
【００５２】
石鎚黒茶抽出物に由来する成分のうち、テアフラビン画分とテアブラウン画分に、高いβ-ヘキソサミダーゼ抑制活性が認められた。
【００５３】
〔実施例４：ゲル濾過による分子量の推定〕
【００５４】
(1)ゲル濾過クロマトグラフィー
1. PBSをフィルターに通し、30分間脱気した。
2. HPLC本体とパソコンの電源を入れた。また、200μLのループを装着した。
3. HPLCのレバーがLoadになっていることを確認し、Aポンプの先を脱気したPBSに入れた。
4. 3 分ほど空気抜きをした。
5. カラムを取りつけていない状態でAポンプ：100%、Flow：1.0に設定し、約5分流しポンプ内置換を行った。
6. G4000SWXLの(東ソー株式会社。排除限界分子量  推定 7,000,000。充てん剤の物性: 基材: シリカ、粒子径: 8μm、細孔径: 45 nm、官能基: ジオール基、pH 範囲: 2.5〜7.5、分画分子量範囲: 20,000-7,000,000(球状タンパク質))カラムを初めは逆に取り付け、カラムをPBSで満たした後、通常の向きに付け替えて約30 分程度流し、安定化させた。
7. サンプル(上述の実施例３で得られた沈殿(テアブラウン画分)を蒸留水に懸濁したもの)をインジェクションし、ピークを確認した。
8. 同条件で下表に示す分子量マーカーをインジェクションした。
9. 分子量マーカーを基にキャリブレーション曲線を作製し、推定分子量を求めた。
【００５５】
【表２】
2015010041.tif 000008
【００５６】
(2)結果
図2に示すグラフからも明らかであるように、活性成分の分子量は23ｋDaと推定された。
【００５７】
〔実施例５：石鎚黒茶の作用メカニズムの解明〕
実施例２の結果から、石鎚黒茶抽出物には脱顆粒抑制作用があることが分かった。この試験は、アレルゲン刺激によるシグナル伝達が(下図参照)、どの段階で停止されているかを評価するために行った。
【００５８】
【化６】
2015010041.tif 000009
【００５９】
(1)ウェスタンブロット法
＜細胞からのタンパク質の抽出＞
1. 先に記した方法で、RBL-2H3細胞に対して脱顆粒を誘導した。
2. 上清を除去し、PBSで細胞を2度洗浄した。
3. その後、細胞溶解バッファー(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 50 mM NaF, 30 mM Na4P2O7, 1% v/v Triton-X) にインヒビター(5 mg/mLの Pefabloc SC (AEBSF)、2μg/mL Aprotinin、Complete; EDTA free、Phosphatase(Roche社製）)を加え氷上で30分静置し、セルスクレーパー（BDバイオサイエンス社製）で細胞を回収した。
4. 12,000×g、15分で遠心し、上清を回収した。
5. タンパク質定量法にてタンパク質量を定量し、サンプル間のタンパク質量をそろえた。
【００６０】
＜SDS-PAGE＞
1. ガラス板をメタノールで拭き、汚れがないことを確認した。
2. ガラスを器具に固定した。
3. 分離ゲルと濃縮ゲルを以下のように調製した。
【００６１】
【表３】
2015010041.tif 000010
【００６２】
4. 分離ゲルを脱気 (1〜2分) した。
5. その後、APSを加えてガラス板の間にゲルを注いだ。
6. イソブタノールを150 μL程度加え、ゲルの液面を平らにした。
7. ラップをかけて37℃で1 時間程度静置した。
8. 分離ゲルがかたまったことを確認し、濃縮ゲルを脱気した。
9. 分離ゲルを台からはずし、ゲルを蒸留水で洗浄し、ろ紙を用いて水気を切った。
10. 脱気した濃縮ゲルにAPSを加え、分離ゲルの上に注いだ。
11. ガラス板の上端まで濃縮ゲルを注ぎ、空気が入らないようにコームを差し込んだ。
12. ラップをかけて37℃で1時間静置した。
13. サンプルをタンパク定量し、サンプル間のタンパク量を等量にした (Final: 5μg)。
14. サンプルとマーカーをサンプルバッファーと1:1で調製した。
15. 14.で調製したものを100℃で5分間加熱した。
16. コームをゲルから水平にはずし、泳動バッファーで洗浄した。
17. 泳動バッファーを中央、周りの順で注いだ。
18. ガラス板の下にある気泡を注射器で取り除いた。
19. サンプルを10μLずつ、プレステインマーカーを3μLずつアプライした。
20. 定電流(30 mA/gel)で流し、バンドが下の方にくるまで泳動を行った。
【００６３】
＜ブロッティング＞
1. 電気泳動を行っている間にPVDF membrane (GE Healthcare社製, Hybond-P; 5 cm×8.5 cm) を親水化のためにMeOHに1分程度浸した。
2. MeOHに浸した後、超純水に2分程度浸した。
3. 転写バッファー(Towbin buffer; 15 mM Tris, 192 mM Glycine, 15% v/v Methanol)に20分以上(PVDF膜が水を弾かなくなるまで)浸した。
4. 泳動の終了後、ゲルとろ紙も転写バッファーに20分以上浸した。
5. ブロッティング装置の底の表面を転写バッファーで湿らせ、湿らせておいたろ紙を3枚重ねて置いた。
6. その上に、PVDF膜、ゲルの順に重ねて、最後にろ紙を3枚重ねて置いた。
7. 手で上から軽く押すことで、空気を抜きブロッティング装置の蓋をした。
8. 0.8 mA/cm2の定電流で1 時間ブロッティングを行い、タンパク質を膜に転写した。
9. 転写後の膜を5%スキムミルク-TBS-tでブロッキングを行った (室温、1時間)。
(*TBS-t：0.05% Tween20含有Tris緩衝生理食塩水)
10. TBS-t (0.05%)で 5 min×3 洗浄した。
11. 一次抗体を5% BSA-TBS-tで希釈し、膜と反応させた (4℃、一晩)。
12. TBS-t (0.05%) 5 min×3 洗浄した。
13. 二次抗体goat anti-rabbit IgG-HRP (2000倍希釈) 、またはdonkey anti-goat IgG-HRP (4000倍希釈) を5% スキムミルク-TBS-tで希釈し、膜と反応させた (室温、1時間)。
14. TBS-t (0.05%) 5 min×4 洗浄した。
15. Immunostar LD (Wako)のReagent 1と2を1:1で1 mL混合した。
16. メンブレンと反応した後、画像解析装置(Bio-Rad社製)でバンドを検出した。
【００６４】
＜抗体リスト＞
一次抗体
・Syk Antibody, Cell Signaling Technology社製
・Phospho-Syk (Tyr525/526) (p-Syk)  Rabbit mAb, Cell Signaling Technology社製
・PLCγ1 (D9H10) XP(登録商標) Rabbit mAb, Cell Signaling Technology社製
・Phospho-PLCγ1 (Tyr783) (p-PLCγ1)  Antibody, Cell Signaling Technology社製
・PLCγ2 Antibody, Cell Signaling Technology社製
・Phospho-PLCγ2 (Tyr1217) (p-PLCγ2)  Antibody, Cell Signaling Technology社製
・PI3 Kinase p85 (19H8) Rabbit mAb, Cell Signaling Technology社製
・PI3 Kinase P55 (D2B3) Rabbit mAb Cell signaling Technology社製
・Phospho-PI3 Kinase p85(Tyr458)/p55(Tyr199) (p-PI3K) Antibody, Cell Signaling Technology社製
・Actin (I-19) : sc-1616, Santa Cruz Biotechnology社製
【００６５】
二次抗体
・Anti-rabbit IgG-HRP Antibody, Cell Signaling Technology社製
・Donkey anti-goat IgG-HRP Antibody: sc-2020, Santa Cruz Biotechnology社製
【００６６】
(2)結果
図3(A)にSykとp-Sykに関するウェスタンブロッティングの結果を示した。また、画像解析装置（Bio-Rad社製）により求めたSykに対するp-Sykの相対量を、図3(B)に示した。抗原により刺激した際、石鎚黒茶抽出物の添加の有無により、Syk量には差がほとんど認められなかったが、リン酸化されたp-Syk量は、石鎚黒茶抽出物の添加により明らかに減少した。石鎚黒茶抽出物は、抗原刺激によるシグナル伝達を、Sykがリン酸化される段階で停止させているものと考えられた。図3(C)にp-PLCγ1等に関するウェスタンブロッティングの結果を示した。
【００６７】
〔実施例６：花粉症モデルマウスを用いた評価〕
(1)方法
コントロール群には水道水、投与群には実施例1にしたがって調製した石鎚黒茶抽出物を0日目から自由摂取させ、3日に一度摂取量を測定し、体重も同様に測定した。各群7匹。
【００６８】
下に示すスケジュールでスギ花粉アレルゲンCry j1(アサヒフードアンドヘルスケア社製)によりBalb/cマウスへの花粉症の誘導を行った。
【００６９】
【化７】
2015010041.tif 000011
【００７０】
0, 7, 14日目: PBSへ溶解させたCry j1 (1.0μg/10μL) を1匹あたり10μL、計3回鼻腔内投与した。
21〜26日目: PBSへ溶解させたCry j1 (0.2μg/10μL) を1匹あたり10μL、計7回連日鼻腔内投与した。
27日目: Cry j1の最終投与後30 分間、マウスのくしゃみの回数を計測し、即時型反応の炎症性スコアとして評価した。
【００７１】
(2)結果
結果を図4に示した。石鎚黒茶抽出物を摂取した群では、鼻のひっかき行動が、コントロール群に対して有意に減少した(P<0.05、n=7)。なお、水分摂取量は、石鎚黒茶抽出物を摂取させた群では、3.7mL/匹/dayであり、コントロール群では4.0mL/匹/dayであった。両群に体重差は認められなかった。
【００７２】
〔実施例７：ヒト骨髄腫細胞株U266細胞を用いたIgE産生抑制活性評価試験〕
(1)方法
＜IgE産生量の測定＞
ヒト骨髄腫細胞株U266細胞を37℃、5％ CO2、100％湿度の条件下で培養した。継代の際は、培地として、10％のウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum；以降FBSと記載)を含むERDF培地(極東製薬工業(株)製)を用いた。IgE産生抑制活性評価試験では、ITES-ERDF培地(ERDF培地に、5μg/mLのインスリン、20μg/mLのトランスフェリン、20μMのエタノールアミン、25 nMのSodium seleniteを添加したもの)に、石鎚黒茶抽出物又は10 mMリン酸緩衝液(コントロール群)を添加したものを用いた。評価試験用の培地で1日間培養したのち、培養上清を採取し、培養上清中に分泌されたIgE量を、一次抗体(抗-ヒトIgE抗体)および二次抗体(抗-ヒトIgE-ビオチン結合体)を使用したELISA法により定量した。
【００７３】
＜IgE mRNA発現量の測定＞
タンパク質濃度として所定の終濃度になるように石鎚黒茶抽出物を添加したITES-RPMI 1640培地で、U266細胞を24時間培養した後、培養上清中に分泌されたIgE量を上述の方法で測定した。他方、培養後に回収した細胞からセパゾール(ナカライテスク製)を用いてRNAを抽出し、常法により逆転写後、適切なプライマーを用いたリアルタイムPCR法により、IgE mRNAの相対発現量を解析した。また石鎚黒茶抽出物の代わりに10 mMリン酸緩衝液を添加した群を、コントロールとした。
【００７４】
＜分泌阻害試験＞
タンパク質濃度として所定の終濃度になるように石鎚黒茶抽出物を添加したITES-RPMI 1640培地で、U266細胞を24時間培養した後、培養上清中に分泌されたIgE量と、培養後に回収した細胞破砕物中のIgE量とを、上述の方法で測定した。他方、分泌阻害剤monensin（和光純薬社製）を所定の濃度で共存させた実験区についても、分泌されたIgE量および細胞内のIgE量を同様に測定した。
【００７５】
＜タンパク質分解酵素による処理＞
0.1 g/mLとなるように茶葉に蒸留水を加え、121℃、20分間加熱抽出した石鎚黒茶抽出物に12.5 μg/mLのTrypsin(Difco Laboratories社製)または2.5 μg/mL のProteinase K(タカラバイオ社製)を加え、37℃で30分間処理し、100℃で3分間加熱してタンパク質分解酵素を失活させた後、ITES-RPMI 1640培地に加え、U266細胞を24時間培養した。培養上清中に分泌されたIgE量を上述の方法で測定した。また石鎚黒茶抽出物の代わりに10 mMリン酸緩衝液を添加した群をコントロールとした。コントロールでのIgE産生量を1として、各群の相対IgE産生量を算出した。
【００７６】
(2)結果
IgE産生に関する結果を図5に示した。石鎚黒茶抽出物を添加した実験群では、添加濃度に相関して、IgE産生量が減少した(図5(A))。また、タンパク質濃度10μg/mL(培養系における終濃度)で石鎚黒茶抽出物を添加した実験群では、培養時間が、12時間、24時間および36時間の時点で、コントロール群に比較して、有意にIgE産生量を抑制した(p<0.001、n＝5)。石鎚黒茶抽出物は、IgE産生量を抑制することが分かった。
【００７７】
IgE mRNA発現量に関する試験の結果を図6に示した。石鎚黒茶抽出物を添加した実験群では、コントロールと比較して、IgEの産生量は抑制されたが(図6(A))、IgE mRNAの発現量には大きな差は認められなかった(図6(B))。石鎚黒茶抽出物の添加は、IgEの産生量を抑制するが、IgE遺伝子の転写活性には影響していないことが分かった。石鎚黒茶抽出物は、IgE生合成における翻訳段階、あるいは分泌段階を抑制することで、IgEの産生を抑制している可能性が推察された。
【００７８】
分泌阻害に関する試験の結果を、図7に示した。分泌阻害剤monensinを添加した群では、細胞内IgE量と分泌されたIgE量の総和には大きな変化が見られなかった(図7(A))。それに対して、石鎚黒茶抽出物を添加した群では、石鎚黒茶抽出物の量に依存してIgE量の総和が低減した。石鎚黒茶抽出物によるIgEの産生抑制は、分泌阻害ではないことが分かった。翻訳阻害による可能性が示唆された。
【００７９】
タンパク質分解酵素を用いた試験の結果を図8に示した。石鎚黒茶抽出物をTrypsinまたはProteinase Kで処理した場合であっても、未処理の場合とIｇE産生抑制効果は変わらなかった。石鎚黒茶抽出物の活性成分は、タンパク質分解酵素の影響を受けないことが分かった。
【００８０】
〔実施例８：マウスを用いたアレルギー抑制活性評価試験〕
(1)方法
7〜8週齢のBALB/cマウス(メス)に、実施例１で調製した石鎚黒茶抽出物または水を自由摂取させた。摂取開始後7日目に、アルミニウムアジュバントと共に0.1 mg/匹の卵白アルブミン(「OVA」と記載することがある。)を腹腔内投与し、2週間後に2回目の免疫を行った。2回目の免疫の7日後に屠殺して採血を行った。採血した血液中に含まれる総IgE量、総IgA量、総IgM量、総IgG量をELISA法により定量した。
【００８１】
(2)結果
結果を図9に示した。感作を行わない無処置の群に比べてコントロール群の血中総IgE量は増加しており、アレルギー状態が惹起されていることが確認された。石鎚黒茶抽出物を摂取させた群では、血中IgEレベルが抑制される傾向にあると考えられた。
【００８２】
〔実施例９：石鎚黒茶の成分分析結果〕
石鎚黒茶の茶葉5gを400mLの水に煮出したもの(標準的なお茶濃度)に含まれるテアブラウン濃度を確認した。比較として、市販のウーロン茶(サントリーウーロン茶、サントリーフーズ株式会社販売)の含量を求めた。
【００８３】
(1)方法
実施例３と同様に、有機溶媒を用いて色素成分を分配し、各画分を凍結乾燥し、溶媒を十分に除いて重量を測定した。
【００８４】
(2)結果
結果を下表に示した。
【００８５】
【表４】
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【００８６】
【表５】
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【００８７】
これらの結果から、一般の石鎚黒茶(お湯で淹れた茶、固形分量 0.375 %)には、0.45 mg/mLのテアフラビン、および1.95 mg/mLのテアブラウンが含まれていると計算される。また、石鎚黒茶の乾燥茶葉には、36 mg/gのテアフラビン、および156 mg/gのテアブラウンが含まれていると計算される。なお、市販のウーロン茶飲料(固形分量 0.310 %)には、0.35 mg/mLのテアフラビン、および0.9 mg/mLのテアブラウンが含まれていると計算される。
【００８８】
〔実施例１０：食品製造例〕
(1)石鎚黒茶飲料
原料石鎚黒茶（乾燥茶葉）12.5 gを、熱水1 Lで121℃で数十分間抽出し、抽出液を回収する。抽出液を1/20に濃縮し、石鎚黒茶濃縮物を得る。原料石鎚黒茶（乾燥茶葉）を十分量の熱水で必要な時間、抽出することにより得られた通常の濃度の石鎚黒茶液に、先の石鎚黒茶濃縮物を5%添加し、濾過する。必要に応じ、20℃以下に冷却してビタミンC及び重炭酸水素ナトリウムを添加してpHを調整する。必要に応じ無菌的に容器に充填し、または充填後レトルト殺菌し、茶飲料とする。テアブラウン濃度が約3.80 mg/mL、一食（350 mL）あたり1331 mgのテアブラウンを含む、茶飲料が得られる。
【００８９】
(2)濃縮石鎚黒茶キャンディー
グラニュー糖 42重量部、水飴（水分20％）36重量部、上述の石鎚黒茶濃縮物 20重量部、石鎚黒茶茶葉粉末 5重量部を準備する。茶葉粉末以外を混合し、十分に加熱した後、茶葉粉末を混合して、最終の水分量が2％の製品を得る。この最終製品においては、テアブラウンが、790 mg/g含まれると計算される。
【００９０】
(3)カプセル剤
上述の石鎚黒茶の1/20濃縮物やその乾燥物等を利用し、カプセルあたり100 mgのテアブラウンを含む、カプセル剤を調製する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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