(57)【要約】【課題】  本発明の目的はマトリックスメタロプロテアーゼを阻害する皮膚外用剤に関する。さらに詳しく述べればシワ防止、老化防止用の皮膚外用剤、さらには慢性関節リウマチや変形性関節症の滑膜及び慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤を得ることにある。【解決手段】  二枚貝貝殻の靭帯および外套峡（中心部）に存在する１３．６kDaのタンパク質がマトリックスメタロプロテアーゼ−２、−９、−１２、−１３を少量で阻害することがわかり、これを含む二枚貝貝殻の靭帯および外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物が上記の課題を解決することがわかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１のマトリックスメタロプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ−２、マトリックスメタロプロテアーゼ−９、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２、マトリックスメタロプロテアーゼ−１３であるマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物を有効成分とする皮膚外用剤。
【請求項４】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物を有効成分とする老化防止用皮膚外用剤。
【請求項５】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物を有効成分とするシワ防止用皮膚外用剤。
【請求項６】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物を有効成分とする慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤。
【請求項７】
貝類がアコヤガイである請求項１乃至請求項６のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤、皮膚外用剤、老化防止用皮膚外用剤、シワ防止用皮膚外用剤、慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤。
【請求項８】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）の抽出物が酸溶解物である請求項１乃至請求項６のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤、皮膚外用剤、老化防止用皮膚外用剤、シワ防止用皮膚外用剤、慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤。
【請求項９】
二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）の抽出物がアコヤガイの靭帯および／または外套峡（中心部）の酸溶解物で１３．６kDaのタンパク質である請求項１乃至請求項６のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤、皮膚外用剤、老化防止用皮膚外用剤、シワ防止用皮膚外用剤、慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくも９０％の同一性を示すタンパク質を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤、皮膚外用剤、老化防止用皮膚外用剤、シワ防止用皮膚外用剤、慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼを阻害し、シワ防止、老化防止用の皮膚外用剤や慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワやきめの消失、弾力性の低下等については、加齢のほか紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等のある種の外的因子により亢進する。
これらの変化をミクロ的にみれば、コラーゲン、エラスチン等の真皮マトリックス成分が減少し、この変化を誘導する因子として、特にマトリックスプロテアーゼの関与が指摘されてきている。
マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase）は、細胞外マトリックスのタンパク質成分を分解する金属酵素の総称であり、通常以下の５群に分類されている。
コラゲナーゼ群には、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３等が含まれる。ＭＭＰ−１３にはタイプIコラーゲン等の分解作用を有する。
ゼラチナーゼ群には、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９等が含まれる。これらＭＭＰ−２、９は、基底膜成分であるタイプIVコラーゲンやラミニン、真皮マトリックス成分のエラスチン等を分解する酵素として知られている。
ＭＭＰ−２は、紫外線の照射によりその発現が大きく増加するＭＭＰ−１によっても、活性化され、肌の老化は一層進む事となる（非特許文献１）。   ストロムライシン群には、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０等が含まれる。これらＭＭＰ−３、１０は、基底膜成分であるプロテオグリカンや、タイプIVコラーゲン、ラミニン、その他フィブロネクチン等を分解する酵素として知られている。
膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ群には、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、及びＭＭＰ−１７が含まれる。
その他の群としてＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１１、及びＭＭＰ−１２が含まれる。
ＭＭＰ−１２はマクロファージで発現するマクロファージエラスターゼ（ＨＭＥ）とも称され、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーの一メンバーであり、エラスチンを分解する。また、エラスチンの他に、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどのマトリックス、ノンマトリックス成分を分解する。
また、これらのマトリックスメタロプロテアーゼと各種疾患との関係が徐々に明らかになってきており、慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防にマトリックスメタロプロテアーゼが深く関与している。（特許文献１）
【０００３】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、フラボン類およびアントシアニジン、エスクレチン誘導体、スルフォニルアミノ酸誘導体、ＴＩＭＰｓなどが知られているが、活性、体内での吸収、毒性などを考慮すると、新しいマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が望まれる。（特許文献２〜５）
一方、二枚貝貝殻はカルシウム剤や道路舗装材等に利用されているが、真珠やホタテ養殖より発生する膨大な貝殻のごく一部を利用しているにすぎない。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−３４４６７２号公報
【特許文献２】特開平８−１０４６２８号公報
【特許文献３】特開平８−１８３７８５号公報
【特許文献４】特開平９−３０９８７５号公報
【特許文献５】特開平１０−１７４９２号公報
【非特許文献１】皮膚老化・美白・保湿化粧品の開発 株式会社シーエムシー発行 Ｐ５４，２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はマトリックスメタロプロテアーゼを阻害する皮膚外用剤と慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、皮膚外用剤等に利用されることは過去になかった二枚貝貝殻の靭帯および外套峡（中心部）に、マトリックスメタロプロテアーゼを阻害する成分が存在することを見出し、高度な利用の少なかった二枚貝貝殻の利用を高める新たな用途を見出した。
このマトリックスメタロプロテアーゼを阻害する成分は約１３.６kDaのタンパク質（以下ＰｆＴＩＭＰとも称する）で、貝殻の靭帯のほか外套峡の中心部に存在することが確認された。
以下に詳しく説明する。
二枚貝の貝殻、なるべく新鮮な貝殻より、ナイフ等を用いて靭帯および／または外套峡（中心部）を取り出す。これはあまり靭帯および／または外套峡（中心部）のみに拘る必要はなく、靭帯や外套峡（中心部）を含む周辺部を得ればよい。
必要に応じて粉砕するが、粉砕する場合は加温されないように場合によっては冷却等を行いつつ、粉砕する。
このままマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、或いは皮膚外用剤として利用できる。
さらに二枚貝貝殻の靭帯や外套峡（中心部）を抽出物として用いてもよい。
酸水溶液を加えて抽出物を得る。酸は塩酸、硫酸、硝酸、蟻酸、酢酸、乳酸、クエン酸等の無機酸、有機酸のいずれか１種以上を用いるが、酸の濃度は、酸の種類や反応時間、靭帯にも、或いは靭帯や外套峡（中心部）の採取方法によって一部貝殻も混入する場合もあり、炭酸カルシウムが存在するので、酸の一部がこれに消費されるのでその消費される部分を除いて、０．１〜２０モル、好ましくは０．３〜５モル濃度がよい。
必要に応じて撹拌しつつ、二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）に酸を加えた溶液で抽出する。
この抽出物をそのまま或いは、必要に応じて、中和さらに脱塩して用いることができる。   さらに、精製して用いることもできる。その方法は、限外濾過、透析、クロマトグラフィー等の方法があり、その１つ或いは複数を用いて精製する。
本発明者らは、アコヤガイの場合、酸溶解物で１３．６kDaのタンパク質がマトリックスメタロプロテアーゼを阻害していることを確認した。
勿論、このタンパク質は、大腸菌、酵母菌、または蚕のいずれか１つから選択される宿主細胞を利用して、公知の遺伝子工学的に多量に製造することができる。例えば、国際公開番号ＷＯ９６／３５７８６号公報記載の方法で製造でき、このような方法で得られたタンパク質も用いることもできる。
【０００７】
このタンパク質及びこれを含む二枚貝貝殻の靭帯および／または外套峡（中心部）或いはそれらの抽出物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタリンワックス等の鉱物油。
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。
【０００８】
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
【０００９】
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。
【００１０】
レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。
【００１１】
赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。
【００１２】
馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥、真珠末、真珠コンキオリン加水分解物等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。
【００１３】
パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００１４】
これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
【実施例】
【００１５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
三重県志摩市浜島町ミキモト多徳養殖場で採取したアコヤガイの貝殻をよく洗浄し、ナイフで貝殻の靭帯部を削り出した。乾燥後に粉砕し、３００メッシュ以下とした。
【００１６】
実施例２（ＰｆＴＩＭＰ）
三重県志摩市浜島町ミキモト多徳養殖場で採取したアコヤガイの貝殻をよく洗浄し、ナイフで貝殻の靭帯部を削り出した。この靭帯部０．５ｇに１Ｍ酢酸水溶液１０ml加え、撹拌しつつ、２４時間放置した。遠心分離し、上清を限外ろ過により脱塩・濃縮した。
これを以下の条件の逆相ＨＰＬＣで分離した。
１．カラム  PEGASIL-300 C4P (センシュー科学)
２．０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液から０．０５％トリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリルのリニアグラジェント
逆相ＨＰＬＣの溶出パターンを図１に示す。なお、矢印の部分を分画した。
この分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。
【００１７】
この実施例２を試験品として、マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害の試験を行った。
方法は、MMP Inhibitor Profiling Kit（#AK-308）（Enzo Life Sciences）を用いて、励起波長５３２nm、蛍光波長５８０nmで蛍光強度を２〜２０分間測定した。（バリアブルイメージアナライザー(Typhoon
9400) ）
試験は最終濃度０．０８８μg/１００μlで行った結果を図３に示す。
図３の結果から計算したマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害率を図４に示す。
さらにＭＭＰ−１３に関しては、最終濃度を０．０１６７μg/100μl、０．００１６７μg/100μlで行った。その結果を図５に示す。
【００１８】
精製した１３．６ｋＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はプロテインシーケンサを用いて解析した。Ｎ末端から５１アミノ酸残基を決定した。この配列を基にデータベースより検索を行い、相当する塩基配列を得た。この塩基配列を基にプライマーを作製し、ＲＴ−ＰＣＲを行い１３．６ｋＤａのタンパク質全ｃＤＮＡ配列の確認を行った。
配列番号１はアコヤガイ靭帯から得たタンパク質のアミノ酸配列である。
【００１９】
実施例のタンパク質がアコヤガイの体組織のどこで発現しているか確認するため、ＲＴ−ＰＣＲを用いた部位特異的発現解析を行った。
各組織よりRNAを抽出し、逆転写を行いcDNAを合成した。これに対し１３．６kDaのタンパク質の配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、各組織における遺伝子の発現状態の確認を行った。
確認したのは、以下の７部位である。
１．mantle isthmus(center)（外套峡（中心部））
２．mantle isthmus(edge)（外套峡（周辺部））
３．mantle edge（外套膜縁）
４．mantle pallium（外套縁膜）
５．gill（鰓）
６．muscle（筋肉）
７．gonad（生殖腺）
【００２０】
結果を図６に示す。その結果、外套峡（中心部）に多く発現し、外套膜縁部分や膜部分では発現量が少ないことが判明した。
以上の結果をまとめると、二枚貝貝殻の靭帯と外套峡（中心部）に存在する１３．６kDaのタンパク質はマトリックスメタロプロテアーゼ−２、−９、−１２、−１３を少量で阻害し、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、皮膚外用剤、慢性関節リウマチ、動脈硬化、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、ＨＩＶ感染症、または糖尿病合併症の治療および予防剤として有用なことがわかった。
【００２１】
実施例をそのまま皮膚外用剤や各種疾病の治療および予防剤としても利用できるが、これに他の原料を配合して皮膚外用剤や各種疾病の治療および予防剤を作成することも可能である。
【００２２】
外用剤１
オリーブ油                                                    ０．５
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート  ２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油                ２．０
エタノール                                                  １０．０
精製水                                                      ８０．０
実施例１                                                      ０．３
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
【００２３】
外用剤２
オリーブ油                                                    ０．５
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート  ２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油                ２．０
エタノール                                                  １０．０
精製水                                                      ８０．２
実施例２                                                      ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
【００２４】
外用剤３
Ａ
スクワラン                                                  ２０．０
オリーブ油                                                    ２．０
ミンク油                                                      １．０
ホホバ油                                                      ５．０
ミツロウ                                                      ５．０
セトステアリルアルコール                                      ２．０
グリセリンモノステアレート                                    １．０
ソルビタンモノステアレート                                    ２．０
実施例１                                                      ０．０００１
Ｂ
精製水                                                      ５１．６９９９
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート  ２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油                １．０
グリセリン                                                    ５．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                            ２．０
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
【００２５】
外用剤４
Ａ
スクワラン                                                  ２０．０
オリーブ油                                                    ２．０
ミンク油                                                      １．０
ホホバ油                                                      ５．０
ミツロウ                                                      ５．０
セトステアリルアルコール                                      ２．０
グリセリンモノステアレート                                    １．０
ソルビタンモノステアレート                                    ２．０
Ｂ
精製水                                                      ５１．６９
実施例２                                                      ０．０１
ジプロピレングリコール                                        ２．０
グリセリン                                                    ３．０
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアレート  ２．０
ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油                １．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                            ２．０
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）におけるＰｆＴＩＭＰの溶出パターンを示す。
【図２】ＰｆＴＩＭＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図３】ＰｆＴＩＭＰのマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害の試験（最終濃度0.088μg/100μl）の結果を示す。
【図４】ＰｆＴＩＭＰのマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害率（最終濃度0.088μg/100μl）の結果である。
【図５】ＰｆＴＩＭＰのマトリックスメタロプロテアーゼ−１３活性阻害の試験の結果である。
【図６】ＰｆＴＩＭＰの各部位でのＲＴ-ＰＣＲの結果である。
【図１】
2015010081.tif 000002
【図２】
2015010081.tif 000003
【図３】
2015010081.tif 000004
【図４】
2015010081.tif 000005
【図５】
2015010081.tif 000006
【図６】
2015010081.tif 000007
【配列表】
2015010081000001.app