(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ウイルス作用や抗腫瘍作用等を有するラムナン硫酸を分解して低分子化する細菌を分離する方法及び分離したラムナン資化性細菌の提供。【解決手段】（１）食藻性を示す生物の消化管内容物を微生物源として得る微生物源調製工程、（２）炭素源としてラムナン硫酸を含むラムナン硫酸含有固形培地を用いて、前記微生物源を培養する初期培養工程、（３）前記固形培地上に認められたコロニーを前記ラムナン硫酸含有固形培地に塗布し、微生物菌株を単離できるまで培養する単離培養工程を備えたことを特徴とするラムナン硫酸資化性細菌の分離方法によって達成される。更に、（４）前記微生物菌株のラムナン硫酸分解活性を調べる分解活性評価工程を設けることが好ましい。ラムナン硫酸を含有するのは海藻のヒトエグサであり、当該植物に食藻性を示す生物の中からメガイアワビ、コツブムシ、アイゴを選択し、その消化管から前記微生物株を分離した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）食藻性を示す生物の消化管内容物を微生物源として得る微生物源調製工程、（２）炭素源としてラムナン硫酸を含むラムナン硫酸含有固形培地を用いて、前記微生物源を培養する初期培養工程、（３）前記固形培地上に認められたコロニーを前記ラムナン硫酸含有固形培地に塗布し、微生物菌株を単離できるまで培養する単離培養工程を備えたことを特徴とするラムナン硫酸資化性細菌の分離方法。
【請求項２】
更に、（４）前記微生物菌株のラムナン硫酸分解活性を調べる分解活性評価工程を備えたことを特徴とするラムナン硫酸資化性細菌の分離方法。
【請求項３】
前記食藻性を示す生物が、アイゴ、メガイアワビ及びコツブムシからなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項１または２に記載のラムナン硫酸資化性細菌の分離方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つの分離方法によって分離されたラムナン硫酸資化性細菌またはその抽出物を用いて、ラムナン硫酸を分解して低分子量化することを特徴とするラムナン硫酸の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラムナン硫酸資化性細菌の分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
三重県特産品の海藻であるヒトエグサには、ラムナン硫酸が含まれている。ラムナン硫酸は硫酸多糖類の一種であり、抗ウイルス作用や抗腫瘍作用などを有することから、医薬品、機能性食品などへの利用が期待されている（特許文献１）。
しかしながら、ラムナン硫酸は非常に高分子であるため、その機能を発揮するためには、相当の低分子化が必要であると考えられている。現在、酸による低分子化が行われているが（特許文献１）、急速に低分子化するため、安定した分解産物が得られなかったり、過度の低分子化によりラムナン硫酸の有する機能自体を失うという問題が生じている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０６−２４７８６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記問題の解決策として、微生物が産生する酵素を用いて緩やかな分解を行う方法が考えられた。しかし、ラムナン硫酸資化性細菌の有効な分離方法については、知られていなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ラムナン硫酸を分解する細菌を有効に分離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討の結果、食藻性を示す生物の消化管内容物からラムナン硫酸資化性細菌を分離できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記課題を解決するための発明に係るラムナン硫酸資化性細菌の分離方法は、（１）食藻性を示す生物の消化管内容物を微生物源として得る微生物源調製工程、（２）炭素源としてラムナン硫酸を含むラムナン硫酸含有固形培地を用いて、前記微生物源を培養する初期培養工程、（３）前記固形培地上に認められたコロニーを前記ラムナン硫酸含有固形培地に塗布し、微生物菌株を単離できるまで培養する単離培養工程を備えたことを特徴とする。
【０００６】
上記（１）微生物源調製工程〜（３）単離培養工程を経ることにより、ラムナン硫酸資化性細菌を得ることができる。しかしながら一般に、細菌類については、資化性と分解性とは、必ずしも一致しないことがある。このため、ラムナン硫酸資化性を標的として単離した微生物については、ラムナン硫酸分解活性を調べることが好ましい。こうして、（４）前記微生物菌株のラムナン硫酸分解活性を調べる分解活性評価工程を設けることが好ましい。
【０００７】
ラムナン硫酸とは、ラムノースを構成単糖の主成分とする硫酸化多糖類のことを意味している。天然のラムナン硫酸の分子量は、数十万〜数百万程度までに広く分布している。ラムナン硫酸の精製中に酸処理などにより、容易に加水分解されて分子量が小さくなることが知られている。但し、分子量が小さくなりすぎると、所定の生物活性が失われてしまう可能性があるため、所定の分子量まで分解することが求められている。
食藻性を示す生物とは、藻を食物として生活する生物を意味しており、例えば魚類（メジナ類、ブダイ類、アイゴ類など）、甲殻類（ワレカラ類、ヨコエビ類など）、貝類（アワビ、サザエなど）、棘皮動物（ウニなど）などが例示される。
ラムナン硫酸含有固形培地には、炭素源としてラムナン硫酸以外の有機物を含んでいても良いが、ラムナン硫酸を単一の炭素源として含むことが好ましい。
また、別の発明に係るラムナン硫酸の分解方法は、上記発明によって分離されたラムナン硫酸資化性細菌またはその抽出物を用いて、ラムナン硫酸を分解して低分子量化することを特徴とする。
分離されたラムナン硫酸資化性細菌を用いることにより、巨大な分子量を持つラムナン硫酸を適当な分子量となるまで低分子化することが可能となる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ラムナン硫酸資化性細菌を容易に分離できる。この細菌を用いることにより、ラムナン硫酸を適当な分子量まで分解できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】強いラムナン硫酸分解作用を示した菌株について、16S rDNAの塩基配列の相同性解析を行った結果を示す図である。
【図２】ラムナン硫酸の吸光スペクトルを示すグラフである。
【図３】分子量3000未満の画分をHPLCで測定した結果を示すチャートである。
【図４】分子量3000〜30000の画分をHPLCで測定した結果を示すチャートである。
【図５】分子量30000〜100000の画分をHPLCで測定した結果を示すチャートである。
【図６】分子量100000以上の画分をHPLCで測定した結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく実施できる。
＜ラムナン硫酸資化性細菌の分離方法＞
１．微生物源調製工程
食藻性を示す生物（例えば、メジナ類、ブダイ類、アイゴ類、ワレカラ類、ヨコエビ類、アワビ、サザエ、ウニなど）の消化管内容物を集め、微生物源として用いる。このとき、多くの微生物を生かした状態で得るために、新鮮な生物を使用することが好ましい。消化管内容物は、一種類の生物から得たものでも良く、複数種類の生物から得たものを混合して用いることもできる。
【００１１】
２．初期培養工程
消化管内容物を固形培地の表面に塗布し、適当な条件で培養する。このとき使用する固形培地としては、例えば寒天を用いることができる。また、固形培地中の炭素源としては、ラムナン硫酸を単一で用いることもできるし、他の炭素源を混合して用いることもできる。
３．単離培養工程
初期培養工程で得られたコロニーは、必ずしも単一の微生物のみから形成されている訳ではない。ラムナン硫酸を安定的に低分子化するためには、単一の微生物株を得ることが好ましい。このため、初期培養工程で得られたコロニーを再び固形培地に塗布し、単離培養する。単離培養工程については、必ずしも一度だけではなく、複数回に渡って繰り返すことで、より確実に単離された微生物株を得ることができる。このとき用いる固形培地としては、初期培養工程に用いた固形培地をそのまま使用しても良いし、ラムナン硫酸、その他の成分を変化させたものを用いることもできる。
【００１２】
４．分解活性評価工程
上記単離培養工程までを経ることで、相当の割合でラムナン硫酸を分解する微生物株を得られる。しかしながら、安定的にラムナン硫酸を分解できるようにするためには、各微生物菌株のラムナン硫酸分解活性を調べる工程を実施する。
この工程には、ラムナン硫酸を含む液体培地（ラムナン硫酸を単一の炭素源として含んでも良いし、その他の炭素源を混合してもよい）中で菌株を培養し、ラムナン硫酸の残存性、及びラムナン硫酸の分解物を調べることで分解活性を評価できる。
＜ラムナン硫酸の低分子量化方法＞
ラムナン硫酸を含む試料と、ラムナン硫酸分解性細菌またはその抽出物（粗抽出物、精製抽出物を含む）とを混合し、培養することで、ラムナン硫酸を低分子量化できる。目的とする分子量のラムナン硫酸を得るためには、細菌株の特性と、反応条件を検討することで行える。そのような条件設定については、周知の生化学的な常識を用いれば良い。
【００１３】
次に、本発明の実施例について、更に詳細に説明するが、下記実施例によって、本発明の技術的範囲は限定されない。
＜試験方法＞
１．供試生物腸管からの組織液抽出
供試生物として、メガイアワビ、コツブムシ、アイゴを用いた。供試生物を入手後、ただちに消化管を取り出し、2 mLチューブに入れた。回収した消化管重量を計測し、消化管1 gに対し9 mlの割合で75 %滅菌天然海水を添加し、鉄球ビーズを2個入れた状態でビーズビーター（タイテック製, 4000 rpm, 1 min）を用いて消化管の破砕を行い、これを消化管組織液とした（微生物源調製工程）。
２．消化管組織液からのラムナン硫酸資化性細菌の分離
0.5%ラムナン硫酸・0.01%酵母エキス平板培地（ラムナン硫酸5g、酵母エキス0.1g、寒天15g、天然海水750ml、精製水250mlを含む（pH7.6〜7.8）。以下「RY平板培地」という。）を作製し、消化管組織液を塗抹し20℃で一週間培養した（初期培養工程）。培養後できたコロニーをRY平板培地に塗布・培養を3回繰り返し、ラムナン硫酸を資化する微生物株を純粋分離した（単離培養工程）。
【００１４】
３．トルイジンブルーを用いた活性染色によるラムナン硫酸資化性細菌のスクリーニング
RY平板培地に分離株を穿刺し、一週間20℃で培養を行った。その後培養した平板にpH7.0に調整した0.05%トルイジンブルー溶液を用いて2時間浸漬したのち蒸留水で2回洗浄を行った。そして脱色液（エタノール50％、酢酸20％）に30分浸漬し脱色を行った。ラムナン硫酸の分解が認められた菌株はトルイジンブルーにより染色されず透明ゾーンが出現した。一方、分解が認められなかった場合は透明ゾーンが見られず紫色に呈色した（分解活性評価工程）。
４．16S rRNA遺伝子の相同性解析
核酸の熱水抽出法を用いて菌体DNAの抽出を行った。各分離株をZobell 2216E液体培地に接種・培養を行った。培養液をエッペンチューブに1000 μl加え、遠心分離(15000 rpm, 2 min)を行った。沈殿した菌体を吸わないように上清だけをすて、菌体を滅菌ミリQ 200 μlで懸濁した。ヒートブロックを用いて、懸濁液を100 ℃, 5 minで熱水抽出後、遠心分離(10000 g, 10 min)を行い、得られた上清をテンプレートとしてPCRを用いて16S rRNA遺伝子領域の増幅を行った。そして、ダイターミネーターを用いてPCR産物をラベリング処理し、DNAシークエンシングによりDNAの塩基配列情報を得た。そして得た塩基配列をもとにBLAST検索を行い、最も近縁な生物種名とその遺伝子相同性を求めた。
【００１５】
５．HPLCによるラムナン硫酸低分子化の評価
５−１．培養上清の分画
RY液体培地に各菌株を接種し20℃一週間撹拌培養した。その後、分子量フィルタ（Microcon centrifugal filter）を用いて分子量10万以上、3万〜10万、3千〜3万、3千以下にそれぞれ分画した。
５−２．ラムナン硫酸の吸光値測定
マイクロプレートリーダー（テカン製,インフィニットM200 PRO FAL）を使用して0.5 %ラムナン硫酸添加液体培地の吸光値を測定した。キュベットの測定部位をミリQ水で洗浄後、まず基準値としてミリQ水のみで吸光値を測定した。その後、RY液体培地をキュベットに入れ測定した。
５−３．分画培養上清のHPLC測定
以下のHPLC測定は東ソー社のTSK-GELを装着したHPLCで行った。75 mM H2SO4をHPLC用の溶媒として用いた。測定条件は波長265 nm（ラムナン硫酸の吸光値測定の結果を見て決定）、Flow rateが0.6 ml/min、カラム温度は40 ℃、インジェクションボリュームは30 μl、測定時間は60分で行った。RY液体培地及び各分子量画分に分画した培養上清に対してHPLC測定を行い、ピークのリテンションタイムを比較し分解能を測定した。
【００１６】
＜結果＞
１．培養法によるラムナン硫酸資化細菌の分離
アイゴ、メガイアワビ及びコツブムシの消化管内容物から合計で39種類の菌株が得られた（アイゴについて6株、メガイアワビについて9株、コツブムシについて24株）。通常のZobell 2216E培地から栄養素であるポリペプトンを除き、0.5 %ラムナン硫酸を添加した組成の液体培地（RY液体培地）で培養した結果、すべての菌が増殖能を示したため39菌株すべての菌でラムナン硫酸資化性が確認できた。
その後、トルイジンブルーを用いた活性染色によるスクリーニングの結果、6株が強い分解活性を示した。
【００１７】
２．16SrRNA遺伝子の相同性解析
強いラムナン硫酸分解作用を示した6種類の菌株（RHK3, RLK12, Rh4d, RLK11, RHK10, Rh4c）について、16S rDNAの塩基配列の相同性解析を行った結果を図１に示した。各菌株は、Phaeobacter sp., Psychrobacter sp., Shewanella sp. 及びVibrio sp. と高い相同性を示した。
３．HPLCによるラムナン硫酸低分子化の評価
培養上清の分子量別に画分を得た。ラムナン硫酸の吸光値測定の結果より、ラムナン硫酸の吸光値のピークを265 nmと推定した（図２）。分画した画分のHPLC測定の結果より、分子量別に各培養上清のデータを重ね合わせたグラフを図３〜図６に示した。HPLCによるラムナン硫酸低分子化の評価では、分子量3万以上の画分でラムナン硫酸の低分子化が顕著に認められ、低分子化されたラムナン硫酸も検出された（図５及び図６）。また、HPLCによるラムナン硫酸分解産物の解析より、6株のそれぞれに特異の分解産物ピークを示した。これらの結果から、海洋性細菌を用いたラムナン硫酸の低分子化が可能であることが初めて示された。
このように本実施形態によれば、ラムナン硫酸を分解して、低分子化する細菌を得ることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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