(57)【要約】【課題】染色性が抑制され、ピロロキノリンキノン類の効果が維持されたピロロキノリンキノン類を含む分散液を提供することを目的とする。【解決手段】  ピロロキノリンキノン類と、乳化剤と、油と、を含み、  前記ピロロキノリンキノン類が前記油中に分散した、分散液。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン類と、乳化剤と、油と、を含み、
前記ピロロキノリンキノン類が前記油中に分散した、分散液。
【請求項２】
前記乳化剤は、ＨＬＢ５以下である、請求項１に記載の分散液。
【請求項３】
前記乳化剤は、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、グリセリン縮合リシノレイン酸エステル、及びソルビタン脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む、請求項１又は２に記載の分散液。
【請求項４】
前記乳化剤は、ポリエルカ酸スクロース、ポリオレイン酸スクロース、ポリステアリン酸スクロース、ポリパルミチン酸スクロース、ポリミリスチン酸スクロース、及びポリラウリン酸スクロース、モノグリセリンオレイン酸エステル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、ペンタオレイン酸テトラグリセリル、ペンタオレイン酸デカグリセリル、へプタオレイン酸デカグリセリル、デカオレイン酸デカグリセリル、テトラグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ヘキサグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、オレイン酸ソルビタン、ジオレイン酸ソルビタン、及びトリオレイン酸ソルビタンからなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分散液。
【請求項５】
前記ピロロキノリンキノン類は、ピロロキノリンキノン、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩、及びピロロキノリンキノンのアルカリ土類金属塩からなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分散液。
【請求項６】
前記ピロロキノリンキノン類を０．０１〜２０質量％含み、
前記乳化剤を１〜５０質量％含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分散液。
【請求項７】
前記油中に分散した前記ピロロキノリンキノン類は、２ｎｍ〜１００μｍの平均粒径を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分散液。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分散液を含む、食品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分散液を含む、化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノン類を含む分散液に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式（１）で表される化合物であるピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」ともいう。）は、健康補助食品等の食品分野、化粧品分野等において、有用な化合物として注目を集めている。その上、ＰＱＱは、補酵素として重要な働きを有し、その他、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用及びグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用等多くの生理活性を有することが明らかにされており、医薬品分野への利用も期待されている。
【化１】
2015010085.tif 000002
【０００３】
このＰＱＱは、水溶性化合物であり、水中において精製する方法が知られている（特許文献１）。また、アルカリ金属イオンを１〜３個含むＰＱＱアルカリ金属塩等のＰＱＱ類も水溶性化合物である。これらの化合物は油中には溶けない。
【０００４】
従来、医薬品分野、食品分野、化粧品分野等で用いるために、水溶性化合物を油溶化させることが検討されてきた。例えば、特許文献２では、水溶性化合物の配合量が多い場合でも、水溶性化合物を透明な状態で、かつ長期間安定に油溶化することができる油溶化剤を提供することを目的として、ポリグリセリン縮合リシノール酸エステルからなる水溶性化合物の油溶化剤が開示されている。
【０００５】
また、引用文献３では、粒径が小さくとも、内包物の封入量が多いＳ／Ｏエマルジョンを提供することを目的として、Ｗ／Ｏエマルジョンを加熱脱水又は真空脱水することにより、平均粒径２０ｎｍ〜１０μｍの粒子として水溶性固体化合物が油相中に分散したＳ／Ｏサスペンションを製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平７−１１３０２４号公報
【特許文献２】特開２００７−０７０５７６
【特許文献３】特許４３４９６３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、本発明者らの研究によれば、ＰＱＱは、上記のように医薬品分野、食品分野、化粧品分野において利用が期待される一方で、体の組織を特定の色に染める（以下、「染色性」ともいう。）という特有の問題を有していることが判明している。例えば、このような染色性を有するＰＱＱを、肌に用いる化粧品や、絆創膏等の医薬品若しくは医薬部外品、飴、ガム等の食品に用いると、体の組織を染色してしまうおそれがある。そのため、従来はＰＱＱの利用可能な用途が制限されている。
【０００８】
しかしながら、特許文献２〜３では、ＰＱＱを分散させること、及びＰＱＱの染色性を改善することについては一切検討をしていない。ＰＱＱの染色性を改善することができ、かつその上でＰＱＱの各種効果を発揮できる分散剤が得られれば、化粧品分野、医薬品分野、食品分野において、さらに広くＰＱＱを用いることが可能となる。
【０００９】
そこで、本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、染色性が抑制され、かつピロロキノリンキノン類の効果を発揮できる、ピロロキノリンキノン類を含む分散液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、乳化剤を使用して、ＰＱＱを油中に分散することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕
ピロロキノリンキノン類と、乳化剤と、油と、を含み、
前記ピロロキノリンキノン類が前記油中に分散した、分散液。
〔２〕
前記乳化剤は、ＨＬＢ５以下である、前項〔１〕に記載の分散液。
〔３〕
前記乳化剤は、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、グリセリン縮合リシノレイン酸エステル、及びソルビタン脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む、前項〔１〕又は〔２〕に記載の分散液。
〔４〕
前記乳化剤は、ポリエルカ酸スクロース、ポリオレイン酸スクロース、ポリステアリン酸スクロース、ポリパルミチン酸スクロース、ポリミリスチン酸スクロース、及びポリラウリン酸スクロース、モノグリセリンオレイン酸エステル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、ペンタオレイン酸テトラグリセリル、ペンタオレイン酸デカグリセリル、へプタオレイン酸デカグリセリル、デカオレイン酸デカグリセリル、テトラグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ヘキサグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、オレイン酸ソルビタン、ジオレイン酸ソルビタン、及びトリオレイン酸ソルビタンからなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む、前項〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の分散液。
〔５〕
前記ピロロキノリンキノン類は、ピロロキノリンキノン、ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩、及びピロロキノリンキノンのアルカリ土類金属塩からなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む、前項〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の分散液。
〔６〕
前記ピロロキノリンキノン類を０．０１〜２０質量％含み、
前記乳化剤を１〜５０質量％含む、前項〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の分散液。
〔７〕
前記油中に分散した前記ピロロキノリンキノン類は、２ｎｍ〜１００μｍの平均粒径を有する、前項〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の分散液。
〔８〕
前項〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の分散液を含む、食品。
〔９〕
前項〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の分散液を含む、化粧品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、染色性が抑制され、かつピロロキノリンキノン類の効果を発揮できる、ピロロキノリンキノンの分散液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）は組織への染色性試験において用いた鶏胸肉の写真であり、（Ｂ）〜（Ｃ）は組織への染色性試験において用いたとり皮の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００１５】
〔分散液〕
本実施形態に係る分散液は、
ＰＱＱ類と、乳化剤と、油と、を含み、
前記ＰＱＱ類が前記油中に分散した、分散液。
【００１６】
〔ＰＱＱ類〕
本実施形態に係る分散液は、ＰＱＱ類を含む。ＰＱＱ類としては、特に限定されないが、例えば、式（２）で表される酸化型のピロロキノリンキノン、式（３）で表される還元型のピロロキノリンキノン、ピロロキノリンキノンの塩、ピロロキノリンキノンのエステル体、上記化合物の水和物や溶媒和物が挙げられる。また、ＰＱＱ類としては、ＰＱＱのエステル体とＰＱＱの塩の任意の組み合わせが含まれる。すなわち、モノアルキルエステルジカルボン酸塩、ジアルキルエステルモノカルボン酸塩等も含まれる。
【化２】
2015010085.tif 000003
（式（２）、（３）中、Ｒ１は、互いに独立に、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリメチルアミン塩、リジン塩、アルギニン塩、アルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基、又はアルキニル基を示す。）
本文では、式（２）においてＲ１がＨの時、ＰＱＱ固体の例フリー体と記すことがある。
【００１７】
上記ＰＱＱの塩としては、特に限定されないが、例えば、ＰＱＱに存在する３つのカルボン酸のアルカリ塩であってもよく、ピリジンやピロールの酸塩であってもよい。また、ＰＱＱの塩は、例えば、モノカルボン酸塩、ジカルボン酸塩、トリカルボン酸塩であってもよく、モノカルボン酸塩については、いずれのカルボン酸の塩であってもよく、ジカルボン酸塩については、２つのカルボン酸の塩であれば任意の組み合わせの塩であってもよい。
【００１８】
ＰＱＱの塩としては、特に限定されないが、例えば、式（２）、（３）中、Ｒ１が、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリメチルアミン塩等の有機アミン塩；リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩等のものが挙げられる。このなかでも、ピロロキノリンキノンのフリー体、ナトリウム塩、カリウム塩が好ましく、ジナトリウム塩がより好ましい。このようなＰＱＱの塩は製造がより容易である。
【００１９】
ＰＱＱの塩としては、特に限定されることなく、従来公知の方法により対応する酸又は塩基をＰＱＱに対して適当量加えることにより製造することができるが、製造が容易であることから、ＰＱＱのナトリウム塩又はカリウム塩が使用しやすく、より好ましくはジナトリウム塩である。
【００２０】
ＰＱＱのエステル体としては、特に限定されないが、例えば、式（２）、（３）中、Ｒ１が、アルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基、又はアルキニル基のものが挙げられる。
【００２１】
ＰＱＱのトリエステル体は、特に限定されないが、例えば、ＰＱＱ又はその塩を酸性条件下でアルコール類と反応させる方法（特開平３−１２３７８１号公報、特開平３−１４５４９２号公報）や、ＰＱＱ又はその塩と、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アルキルアリール、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニル等と、を塩基の存在下で反応させる方法等により合成することができる。
【００２２】
また、上記方法によって得られるＰＱＱのトリエステル体を酸性又は塩基性条件下で部分加水分解することで、モノエステル体、ジエステル体を得ることができる。また、エステル形成反応において、部分エステル化してモノエステル体、ジエステル体を得ることもできる。
【００２３】
ＰＱＱ類は、ＰＱＱ、ＰＱＱのアルカリ金属塩、又はＰＱＱのアルカリ土類金属塩を含むことが好ましい。このようなＰＱＱ類であることにより、分散液中の含有率を向上させることが出来る点により優れる傾向にある。また、製造プロセスが簡易であり、安価で入手でき、使用しやすい。
【００２４】
ＰＱＱ類の含有量は、分散液全体に対して、０．０１〜２０質量％が好ましく、０．０２〜１０質量％がより好ましく、０．０５〜５．０質量％がさらに好ましい。含有量が０．０１質量％以上であることにより、ＰＱＱ類の有する効果がより良好に発揮される傾向にある。また、含有量が２０質量％以下であることにより、油中でのＰＱＱ類の分散性がより優れる傾向にある。
【００２５】
〔ＰＱＱの製造方法〕
ＰＱＱの製造方法としては、特に限定されないが、例えば、有機化学的方法又は発酵法が挙げられる。このなかで発酵法とは、例えば、メタノール資化性を有し、かつＰＱＱを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを使用して培養することによりＰＱＱを製造する方法である。ＰＱＱのエステル体は、このようにして得られたＰＱＱを出発物質として、常法のエステル化反応に従って合成することができる。
【００２６】
ＰＱＱ類又はその塩は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、又は溶媒抽出法等の通常の方法により、反応液中から分離、精製することができる。また、それらの同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、質量分析等の各種手段が用いられる。
【００２７】
〔乳化剤〕
本実施形態に係る分散液は、乳化剤を含む。乳化剤は、ＰＱＱ類の周囲を覆うことでＰＱＱ類を油中に分散させるという役割を果たし、分散液を水と混合した場合でも乳化剤に覆われたＰＱＱが水層へ移動しないように機能する。これにより、本実施形態に係る分散液は、ＰＱＱ類の油中分散性と、組織への染色性の低減とを供に達成しうるものとなる。また、驚くべきことに、変色性が抑制されているにもかかわらず、分散液中のＰＱＱ類は各種機能を果たすことができる。
【００２８】
乳化剤のＨＬＢ値は、５．０以下が好ましく、４．０以下がより好ましく、３．５以下がさらに好ましく、３．０以下がよりさらに好ましい。ＨＬＢ値が５．０以下であることにより、ＰＱＱ類と乳化剤とが複合体を形成し、この複合体の油相への分散がより容易となる傾向にある。この理由は、ＰＱＱ類−乳化剤の複合体は、中心のＰＱＱ類を、親油性の傾向が強い小さなＨＬＢ値を有する乳化剤が覆うように層を形成しているためと推定される。
【００２９】
乳化剤としては、特に限定されないが、具体的には、ポリエルカ酸スクロース、ポリオレイン酸スクロース、ポリステアリン酸スクロース、ポリパルミチン酸スクロース、ポリミリスチン酸スクロース、及びポリラウリン酸スクロース等のショ糖脂肪酸エステル；モノグリセリンオレイン酸エステル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、ペンタオレイン酸テトラグリセリル、ペンタオレイン酸デカグリセリル、へプタオレイン酸デカグリセリル、デカオレイン酸デカグリセリル等のグリセリン脂肪酸エステル；テトラグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ヘキサグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル等のグリセリン縮合リシノレイン酸エステル；オレイン酸ソルビタン、ジオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン等のソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。これら乳化剤を用いることにより、ＰＱＱ類の分散性により優れ、ＰＱＱ類の染色性をより抑制でき、かつ、ＰＱＱ類の効果をより発揮できる傾向にある。これらは、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３０】
乳化剤の含有量は、分散液全体に対して、１〜５０質量％が好ましく、３〜４０質量％がより好ましく、１０〜３０質量％がさらに好ましい。含有量が１質量％以上であることにより、油中でのＰＱＱ類の分散性がより優れる傾向にある。また、含有量が５０質量％以下であることにより、流動性により優れる傾向にある。
【００３１】
ＰＱＱ類と乳化剤との混合比率は、ＰＱＱ類１００質量部に対して、乳化剤が１．０〜５００００質量部であることが好ましく、１０〜４００００質量部であることがより好ましく、１００〜２００００質量部であることがさらに好ましい。
【００３２】
油中に分散したＰＱＱ類の平均粒径は、２ｎｍ〜１００μｍであることが好ましく、２ｎｍ〜１０μｍであることがより好ましく、２ｎｍ〜１．０μｍであることがさらに好ましい。平均粒径が１００μｍ以下であることにより、沈降しにくく、均一性に優れる傾向にある。また、粒径が特に２ｎｍ〜１μｍである場合、溶液が透明に見え、見た目から好ましい。また、この小さな粒子は均一に保持されやすく好ましい。なお、平均粒径は、実施例に記載の方法により測定することができる。ここでいう「油中に分散したＰＱＱ類の平均粒径」とは、油中に分散したＰＱＱ類が乳化剤で覆われている場合には、乳化剤の層分を含めた粒径であり、球体モデルでの粒径を言う。
【００３３】
〔油〕
本実施形態に係る分散液は、油を含む。油は、医薬品分野、食品分野、化粧品分野等で用いるものが好ましい。このような油としては、特に限定されないが、例えば、植物油、動物油、炭化水素油、エステル油、シリコーン油等が挙げられる。なお、油は常温で液状であっても、固形状であってもよい。これらは、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
上記植物油としては、特に限定されないが、例えば、大豆油、菜種油、カカオ脂、綿実油、パーム油、ひまし油、ごま油、ホホバ油、オリーブ油、サフラワー油、アーモンド油、アボカド油、椿油等が挙げられる。これら油は、特に限定されないが、例えば、食品分野で特に用いられることが多い。本実施形態に係る分散液が植物油を含む場合には、食品分野で好適に用いられうる分散液となる。
【００３５】
上記動物油としては、特に限定されないが、例えば、牛脂、ラード、魚油、スクワレン、ミンク油、タートル油、卵黄油等が挙げられる。また、トリアセチン、中鎖脂肪酸油も使用できる。これら油は、特に限定されないが、例えば、食品分野、化粧品分野で特に用いられることが多い。本実施形態に係る分散液が動物油を含む場合には、食品分野、化粧品分野で好適に用いられうる分散液となる。食品分野、化粧品分野では、ＰＱＱ類を含む分散液は、体組織を染色することなく、例えば細胞活性化等の効果を発揮しうる。
【００３６】
なお、中鎖脂肪酸油としては、炭素数４〜１４のものが挙げられる。
【００３７】
上記炭化水素油としては、特に限定されないが、例えば、流動パラフィン、スクワラン、スクワレン、ワセリン等が挙げられる。これら油は、特に限定されないが、例えば、医薬品分野、化粧品分野で特に用いられることが多い。本実施形態に係る分散液が炭化水素油を含む場合には、医薬品分野、化粧品分野で好適に用いられうる分散液となる。医薬品分野、化粧品分野では、ＰＱＱ類を含む分散液は、体組織を染色することなく、例えば細胞活性化等の効果を発揮しうる。
【００３８】
上記エステル油としては、特に限定されないが、例えば、オクチルデシルミリステート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、セチルイソオクタノエート、ネオペンチルグリコールジイソオクチレート、グリセリルトリイソオクチレート等が挙げられる。これら油は、特に限定されないが、例えば、化粧品分野で特に用いられることが多い。本実施形態に係る分散液がエステル油を含む場合には、化粧品分野で好適に用いられうる分散液となる。化粧品分野では、ＰＱＱ類を含む分散液は、体組織を染色することなく、例えば細胞活性化等の効果を発揮しうる。
【００３９】
上記シリコーン油としては、特に限定されないが、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等が挙げられる。これら油は、特に限定されないが、例えば、化粧品分野で特に用いられることが多い。本実施形態に係る分散液がシリコーン油を含む場合には、化粧品分野で好適に用いられうる分散液となる。化粧品分野では、ＰＱＱは、ＰＱＱ類を含む分散液は、体組織を染色することなく、例えば細胞活性化等の効果を発揮しうる。
【００４０】
〔分散〕
本実施形態に係る分散液は、上記ＰＱＱ類が上記油中に分散したものである。ここで、「分散」とは、ＰＱＱ類と油との混合液を調製し、調製から４８時間経過後に、ＰＱＱ類の沈降、ＰＱＱ類と油の分離などが観察されず、均一な分散液状態が保たれていることをいう。
【００４１】
分散性は、ＰＱＱ類と乳化剤との混合比率、油中に分散したＰＱＱ類の平均粒径、油中に分散したＰＱＱ類の含水量及び／又は含塩量、乳化剤の種類などにより調整することができる。
【００４２】
〔水〕
本実施形態に係る分散液は、水をさらに含んでもよい。水の具体例としては、特に限定されないが、水道水、イオン交換水、精製水等を用いることができる。水を含むことにより、乳化性の向上という効果が期待される。
【００４３】
分散液に含まれる水の含有量は、ＰＱＱ類１００質量部に対して、０〜３００質量部であることが好ましく、１〜２５０質量部であることがより好ましく、１〜２２５質量部であることがさらに好ましい。水の含有量が上記範囲内にあることにより、油中でのＰＱＱ類の分散性がより優れ、ＰＱＱ類の効果をより良好に発揮できる傾向にある。
【００４４】
〔塩〕
本実施形態に係る分散液は、塩をさらに含んでもよい。塩を含むことにより、ＰＱＱ含有量の向上、浸透圧調製、味の調製等の効果が期待される。
【００４５】
分散液に含まれる塩の含有量は、ＰＱＱ類１００質量部に対して、０〜７５質量部であることが好ましく、１０〜５０質量部であることがより好ましく、１５〜２５質量部であることがさらに好ましい。縁の含有量が上記範囲内にあることにより、ＰＱＱ類をより高濃度に油中に分散させることが可能となり、油中でのＰＱＱ類の分散性がより優れ、ＰＱＱ類の効果をより良好に発揮できる傾向にある。
【００４６】
塩としては、特に限定されないが、水に溶けた際、アルカリ性を示す塩が好ましい。例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｎａ３ＰＯ３、Ｋ３ＰＯ３、ＮａＨＰＯ３、ＫＨＰＯ３、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣＯ３、ＣａＣｌ２、リン酸とアルカリ金属の塩などが挙げられる。これらは、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００４７】
〔その他の成分〕
本実施形態に係る分散液には必要に応じて上記以外の成分を加えることができる。
【００４８】
乳化剤の補助剤としては、特に限定されないが、例えば、テトライソステアリン酸ポリオキシエチレンソルビット、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビット、トリイソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル、ポリオキシエチレンオレイン酸グリセリル、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、ジイソステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、イソステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリグリセリンイソステアリン酸エステル、ポリグリセリンラウリン酸エステル及びポリグリセリンオレイン酸エステルが挙げられる。これらは、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００４９】
〔分散液の製造方法〕
本実施形態に係る分散液は以下の様にして製造することができる。
ＰＱＱ類を溶かす、又は懸濁状態にした水溶液を用意し、乳化剤を加えた油に加える。ホモミキサー等で乳化後、水分を除去して油へ分散した状態を形成する。なお、乳化の際の温度は４０〜１００℃が好ましく、より好ましくは７０〜９５℃である。水分の除去はエバポレーター等を使用して減圧すること、又は凍結乾燥することによって行なうことができる。なお、減圧で水分を除去する際の温度は２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは４０〜８０℃である。また、エバポレーターの代わりの操作として、乳化処理後に溶液に対して窒素ガスを吹きつけ、攪拌しながら温度を例えば２００℃まで上げて所定時間維持することで水分を除去することもできる。
【００５０】
〔用途〕
本実施形態に係る分散液は、染色性が抑制され、かつピロロキノリンキノン類の効果を発揮できるため、化粧品分野、医薬品分野、食品分野において、さらに広く用いることが可能である。以下に分散液の用途を例示するが、用途はこれに限定されない。
【００５１】
本実施形態に係る分散液は、栄養補助成分としてビタミン類に混合できる。ビタミン類としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、トコフェロール、葉酸、コバラミン、コエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０、レシチン等が挙げられる。
【００５２】
また、本実施形態に係る分散液は、マヨネーズ、揚げ物用油、ホイップクリーム、マーガリン、ドレッシング、調味油等の食品に混合することができる。
【００５３】
さらに、本実施形態に係る分散液は、石鹸、シャンプー、クレンジングオイル、乳液、ファンデーション等の化粧品に混合することができる。
【００５４】
本実施形態に係る分散液を製剤に添加することもできる。この場合に製剤の投与形態は、特に限定されないが、例えば、経口投与、又は静脈内、腹膜内、皮下若しくは経皮等の非経口投与を挙げることができる。
【００５５】
剤形としては、特に限定されないが、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等を挙げることができる。
【００５６】
経口剤として製剤化する際には、特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
【００５７】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物としては、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体；安息香酸ナトリウム等の保存剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して製剤化することができる。
【００５８】
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤又は顆粒剤等の場合には、特に限定されないが、例えば、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類；バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉；炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物；結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤；澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等を添加して製剤化することができる。
【００５９】
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば食甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。経口投与に適当な製剤は、そのまま、又は例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態のものであってもよいし、健康食品、機能性食品、栄養補助食品等の飲食品として用いてもよい。
【００６０】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張であるＰＱＱ類又はその塩を含む滅菌水性剤と、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。また、これら非経口剤においても、特に限定されないが、例えば、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種又はそれ以上の補助成分を添加することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例及び比較例によって本実施形態をより詳細に説明するが、本実施形態はこれらの例に限定されるものではない。
【００６２】
使用する試薬は特に明記のないものについては、和光純薬社製を使用した。
【００６３】
〔粒径測定〕
実施例及び比較例で得られた分散液中のＰＱＱ類の平均粒径は、分散液０．１ｍLを中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナードＭＴ）１０ｍLに希釈後、大塚電子社製ＥＬＳ−Ｚを使用して動的光散乱法により測定した。なお、比較例では分散状態を維持できなかったため粒径測定は行なわなかった。
【００６４】
〔分散性試験〕
実施例１〜４、比較例３で調製した分散液１０ｍＬを室温（２５℃）で保管して分散状態を目視にて観察した。調製から４８時間経過後に、ＰＱＱ類の沈降、ＰＱＱ類と油の分離などが観察されず、均一な分散液状態が保たれていれば分散性があると判断した。その結果を表１に示す。比較例２〜４については、すぐに沈降し分散状態を維持できなかったため分散性試験は行なわなかった。
【００６５】
〔油−水分配試験〕
各テストチューブ（イナオプティカ社製、製品名ＳＣ−０２００）に水１ｍＬと中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、日清オイリオ製ＯＤＯ）１ｍＬを加えた。ここに実施例１〜４、比較例４で調製した分散液３０μＬをそれぞれ加えた。テストチューブを上下に入れ替えて１５分間混合した。その後、テストチューブ内の液体を遠心分離器にかけ、油層と水層とを分け、水層部分だけを取り出し、水層に含まれるＰＱＱ類量を測定をＵＶスペクトルメーター（Ｓｉｍａｚｕ社製、製品名ＵＶ１８００）で測定し、水層への分配量を算出した。
【００６６】
なお、比較例１の分散液の油−水分配試験においては、テストチューブに水１ｍＬと、比較例１の分散液１００μＬと、中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、日清オイリオ製ODO）１００μＬとを加えたこと以外は、上記と同様の操作を行い、試験結果を得た。なお、比較例２，３については分散状態ではないため油−水分配試験は行なわなかった。
【００６７】
〔製造例：ＰＱＱジナトリウム塩及びＰＱＱフリー体の調製〕
特許第２６９２１６７号公報に記載の培養法、回収・精製方法に従って、カラム精製後のＰＱＱ溶液を得て、得られたＰＱＱ溶液をｐＨ７に調整し、塩化ナトリウムを加えて赤い固体を得た。この固体を５０％エタノール水溶液で洗浄し、過剰の塩化ナトリウムを除去して、含水ＰＱＱトリナトリウム塩を得た。
【００６８】
このようにして得られた、含水ＰＱＱトリナトリウム塩の固体６０ｇ（そのうちＰＱＱ分は２０ｇ）を、イオン交換水５００ｍＬとエタノール５００ｍＬの混合液に加えた。このとき、固体は溶けきっていなかった。ここに、室温下で塩酸を加え、ｐＨを３．５にした。塩酸の添加は約２時間かけてゆっくり行った。塩酸の添加後２日間攪拌した。溶液中に析出した固体を濾過して、含水ＰＱＱジナトリウム塩（以下、「Ｎａ２ＰＱＱ」ともいう。）含水結晶を収率９９ｍｏｌ％で得た。
【００６９】
このＮａ２ＰＱＱ３ｇを水１Ｌに溶かし、塩酸を加えてｐＨ１にして、赤い固体を析出させた。これを濾過し、２Ｎ塩酸で洗い、水洗した。減圧乾燥してＰＱＱフリー体を収率８５ｍｏｌ％で得た。以下の実験はこれらの原料を使用した。
【００７０】
〔実施例１：０．１％ＰＱＱＭＣＴ〕
製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ０．０８ｇを水３９．９２ｍＬに溶かして水溶液を得た。一方で、乳化剤としてポリグリセリンリシノレイン酸エステル（坂本薬品工業社製ＣＲＳ−７５）１０ｇと、油として中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナードＭＴ）５０．００ｇを室温で混合して、油溶液を得た。得られた油溶液に水溶液を加え、プライミクス社製ホモミキサーを使用して乳化後、乳化液をナスフラスコに入れた。ナスフラスコ中の乳化液を温浴の温度を５０℃に設定したエバポレーターで減圧して、水分を除去し、赤色の透明な溶液を実施例１の分散液として得た。得られた溶液はＮａ２ＰＱＱ０．１３質量％、乳化剤１６．６質量％、水分０．１８質量％を含み、Ｎａ２ＰＱＱが、中鎖脂肪酸グリセリンエステル中に分散した分散液であった。
【００７１】
実施例１の分散液に対し、粒径測定、保存安定性試験、及び保存安定性試験を行なった。分散液の組成と、各結果を表１に示す。
【００７２】
〔実施例２：０．６％ＰＱＱＭＣＴ〕
表１に示す組成としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、実施例２の分散液を得た。実施例２の分散液に対し、粒径測定、保存安定性試験、及び保存安定性試験を行なった。分散液の組成と、各結果を表１に示す。
【００７３】
〔実施例３：１％ＰＱＱＭＣＴ〕
表１に示す組成としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、実施例３の分散液を得た。実施例３の分散液に対し、粒径測定、保存安定性試験、及び保存安定性試験を行なった。分散液の組成と、各結果を表１に示す。なお、プライミクス社製ホモミキサーを使用し乳化した際に、乳化液は白く濁っており、透明性がなかったが、エバポレーターで減圧して水分を除去したところ赤色の透明な溶液が得られた。
【００７４】
〔実施例４：４．６％ＰＱＱＭＣＴ〕
表１に示す組成としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、実施例４の分散液を得た。実施例４の分散液に対し、粒径測定、保存安定性試験、及び保存安定性試験を行なった。分散液の組成と、各結果を表１に示す。
【００７５】
なお、上記実施例における油への分散操作中に、ＰＱＱが分解及び／又は反応していないことを確認するために、以下の操作によって分散したＰＱＱを回収し、回収量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。
まず、実施例４で得られた分散液０．１ｇを１０％食塩水５０ｇと混合して１５分間１０００回転でホモジナイズした。これから水層を取り出し、水層の溶液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。測定条件は以下の通りとした。その結果、ＰＱＱＮａ２  含有量４．４質量％。９６％回収され、分解等は生じていなかったことを確認した。他の実施例についても同様の操作によりＰＱＱが分解及び／又は反応していないことを確認した。
装置：  島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−２０Ａ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＴＭＳ（５μｍ）、１５０ｘ４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．
測定温度：４０℃
検出：２６０ｎｍにおける吸光度
溶離液：１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４  （３０／７０，ｐＨ５．１）
溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
【００７６】
〔比較例１：４．６％ＰＱＱａｑ）〕
製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ４．６ｇを水９６ｍＬに加え、攪拌し、赤色の懸濁液を得た。得られた懸濁液中のＮａ２ＰＱＱは一日経過後には沈降しており、均一な分散液は得られなかった。
【００７７】
〔比較例２：１％ＰＱＱｎｏｎＳ〕
製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ１．６３ｇと炭酸カリウム０．２９ｇとを水６３．０８ｍＬに溶かし水溶液を調整した。この水溶液と、中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナ−ドMT）３５．００ｇとを混合し、混合液をプライミクス社製ホモミキサーを使用して乳化後、乳化液をナスフラスコに入れた。ナスフラスコ中の乳化液をエバポレーターで減圧して水分を除去したところ、ナスフラスコの壁面に赤い結晶が析出して付着し、均一な分散液を調製できなかった。
【００７８】
〔比較例３：１１．６％ＭＣＴ（４．６％ＰＱＱＭＣＴｎｏｎＷａｔｅｒ）〕
実施例４(４．６％ＰＱＱＭＣＴ)より水を用いない例として行なった。製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ４．６ｇと、ポリグリセリンリシノレイン酸エステル（坂本薬品工業社製ＣＲＳ−７５）５．００ｇとを、中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナ−ドMT）３０．００ｇに混合した。混合液をプライミクス社製ホモミキサーを使用して乳化し、赤色の懸濁液を得た。得られた懸濁液中のＮａ２ＰＱＱは懸濁液の調整から一日後には沈降し、均一な分散液は得られなかった。
【００７９】
〔比較例４：１％ＭＣＴｎｏｎＳ〕
製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ０．１ｇと、中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナ−ドMT）９．９ｇとを混合し混合液を得た。得られた混合液中のＮａ２ＰＱＱはすぐに沈降し、均一な分散液は得られなかった。
【００８０】
【表１】
2015010085.tif 000004
【００８１】
［ＰＱＱフリー体を用いた高濃度分散液の製造例］
〔実施例５−１：０．０８％ＰＱＱｆｒｅｅＭＣＴ〕
製造例で得たＰＱＱフリー体０．０４ｇを水５０ｇに加熱溶解して水溶液を調製した。一方で、乳化剤としてポリグリセリンリシノレイン酸エステル（坂本薬品工業社製ＣＲＳ−７５）１０gと、油として中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナードＭＴ）４０ｇとを混合して油溶液を調製した。得られた水溶液と油溶液とを混合しプライミクス社製ホモミキサーを使用して乳化後、乳化液をナスフラスコに入れた。ナスフラスコ中の乳化液を温浴の温度を５０℃に設定したエバポレーターで減圧して、水分を除去し、紫色の透明な溶液を分散液として得た。得られた溶液は、ＰＱＱフリー体０．０８質量％を含み、ＰＱＱフリー体が中鎖脂肪酸グリセリンエステル中に分散した分散液であった。分散液中に分散した粒子の平均粒径は３１．５nmであった。
【００８２】
〔実施例５−２：０．１６％ＰＱＱｆｒｅｅＭＣＴ〕
ＰＱＱフリー体０．０４ｇを水５０ｇに溶解した水溶液を調製した。得られた水溶液と油溶液として実施例５−１で得た分散液５０gとを混合し、プライミクス社製ホモミキサーを使用して乳化後、該乳化液をナスフラスコに入れた。ナスフラスコ中の乳化液を温浴の温度を５０℃に設定したエバポレーターで減圧して、水分を除去し、赤色の透明な溶液を得た。得られた溶液は、ＰＱＱフリー体０．１６質量％を含み、ＰＱＱフリー体が中鎖脂肪酸グリセリンエステル中に分散した分散液であった。分散液中に分散した粒子の平均粒径は７５nmであった。
【００８３】
〔実施例５−３：０．２４％ＰＱＱｆｒｅｅＭＣＴ〕
実施例５−２で得た分散液を使用し、上記と同様の操作を繰り返した。赤色のわずかに濁った溶液を得た。得られた溶液は、ＰＱＱフリー体０．２４質量％を含み、ＰＱＱフリー体が中鎖脂肪酸グリセリンエステル中に分散した分散液であった。分散液中に分散した粒子の平均粒径は１４２nmであった。
【００８４】
〔実施例５−４：０．３２％ＰＱＱｆｒｅｅＭＣＴ〕
実施例５−３で得た分散液を使用し、上記と同様の操作を繰り返した。赤色のわずかに濁った溶液を得た。得られた溶液は、ＰＱＱフリー体０．３２質量％を含み、ＰＱＱフリー体が中鎖脂肪酸グリセリンエステル中に分散した分散液であった。分散液中に分散した粒子の平均粒径は１０５nmであった。
【００８５】
〔実施例５−５：０．４０％ＰＱＱｆｒｅｅＭＣＴ〕
実施例５−４で得た分散液を使用し、上記と同様の操作を繰り返した。赤色のわずかに濁った溶液を得た。得られた溶液は、ＰＱＱフリー体０．４０質量％を含み、ＰＱＱフリー体が中鎖脂肪酸グリセリンエステル中に分散した分散液であった。分散液中に分散した粒子の平均粒径は１２９nmであった。
【００８６】
〔比較例５−１：０．０８％ＰＱＱｆｒｅｅａｑ〕
製造例で得られたＰＱＱフリー体０．０８ｇを水９９．９２ｍＬに加え、攪拌し、赤色の懸濁液を得た。得られた懸濁液中のＰＱＱフリー体は一日経過後には沈降しており、均一な分散液は得られなかった。
【００８７】
〔比較例５−２：０．４％ＰＱＱｆｒｅｅａｑ〕
製造例で得られたＰＱＱフリー体０．４ｇを水９９．６ｍＬに加え、攪拌し、赤色の懸濁液を得た。得られた懸濁液中のＰＱＱフリー体は一日経過後には沈降しており、均一な分散液は得られなかった。
【００８８】
【表２】
2015010085.tif 000005
【００８９】
実施例５−１〜５−５より、ＰＱＱフリー体も油溶化できることが示された。また、実施例で得られた分散液を油溶液として用いることにより、より高濃度のＰＱＱ類を含む分散液が得られることが示された。
【００９０】
［実施例６〜９：各種乳化剤を使用した分散液の調製］
製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ０．０８ｇ、炭酸カリウム０．０３ｇを水１０ｍＬに溶かして水溶液を得た。一方で、表３に示す各種乳化剤１０ｇと、油として中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナードＭＴ）７０ｇとを混合して、油溶液を得た。得られた油溶液と水溶液とを混合し、９５℃でプライミクス社製ホモミキサーを使用して乳化後、乳化液をナスフラスコに入れた。ナスフラスコ中の乳化液をエバポレーターで減圧して、８０℃で水分の除去を１度行った。その結果を以下の表３に示す。
【００９１】
【表３】
2015010085.tif 000006
【００９２】
実施例６〜９より、各種乳化剤によりＰＱＱ類を油溶化できることがわかった。
【００９３】
〔組織への染色性試験〕
実施例３、５−１、５−５、６〜９の分散液、比較例１の分散液（４．６％ＰＱＱａｑ）を水で希釈した、１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液（１．０％ＰＱＱａｑ）及び０．１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液（０．１％ＰＱＱａｑ）、並びに、比較例５−１及び５−２の分散液、を用いて染色性試験を行なった。
【００９４】
鶏胸肉に指でくぼみを作製し、そこに分散液及び水溶液１００μＬをそれぞれ載せた。その鶏胸肉を３７℃で１時間保管した後、水道水で洗浄した。また、とり皮にも指でくぼみを作製し、そこに分散液及び水溶液１００μＬをそれぞれ載せた。そのとり皮を３７℃で１時間保管した後、水道水で洗浄した。
【００９５】
図１（Ａ）に、実施例３の分散液と１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液とを用いて組織への染色性試験を行なった鶏胸肉の写真を示し、（Ｂ）〜（Ｃ）に、実施例３の分散液と１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液を用いて組織への染色性試験を行なったとり皮の写真を示す。図１（Ａ）、（Ｂ）に示されるように、実施例３の分散液を用いた場合には、鶏肉、とり皮どちらも変色せず染まっていないことが示された。一方で、図１（Ａ）、（Ｃ）に示されるように、１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液を用いた場合には、鶏肉、とり皮どちらも黄色く変色していたことが示された。
【００９６】
上記のように評価をした組織への染色性試験の結果を以下の表４に示す。
【００９７】
【表４】
2015010085.tif 000007
【００９８】
１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液及び０．１質量％Ｎａ２ＰＱＱ水溶液、並びに、比較例５−１及び５−２の分散液は、濃度が低くても組織を染色することが分かった。これに対し、実施例３、５−１、５−５、６〜９の分散液は、濃度や、ＰＱＱフリー体かＰＱＱジナトリウムのいかんや、乳化剤の種類にかかわらず、いずれも組織を染色しないことが分かった。
【００９９】
〔有機溶媒への溶解試験〕
実施例１〜４及び比較例３で得られた各液１００μＬと、表５に示す有機溶媒１０００μＬと、を混合して、実施例１〜４及び比較例３で得られた各液が各有機溶媒に溶解するか否かを確認した。その結果を表５に示す。
【０１００】
【表５】
2015010085.tif 000008
【０１０１】
表５に示されるよう、実施例１，３〜４の各分散液は他の有機溶媒にも均一に分散できることが示された。これにより、このような溶媒を使用する分野においても有用な技術であることが示された。
【０１０２】
〔細胞増殖性試験〕
細胞増殖性試験では、特に断りがない限りＧＩＢＣＯ社から購入した試薬を使用した。また、牛胎児血清（ＦＢＳ）はニッスイ社製を使用した。
【０１０３】
（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を使用した試験）
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を使用して細胞増殖性試験を行なった。培地として、α−ＭＥＭ培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを使用した。ＣＨＯ細胞の培養は、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下３７℃で行なった。
【０１０４】
実施例１、３、４の分散液、比較例１の分散液、及びポリグリセリンリシノレイン酸エステル（坂本薬品工業社製ＣＲＳ−７５）と中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナードＭＴ）との混合溶液Ｃを、表６に記載の希釈倍率となるよう培地でそれぞれ希釈した（以下、「各希釈液」ともいう。）。
【０１０５】
ＣＨＯ細胞濃度１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬである細胞懸濁液を、０．４ｍＬずつ２４ウェルプレートの各ウェルに撒き、付着細胞を介してＣＨＯ細胞をウェルの底に単層で付着させた。１日培養した後、ウェル内の培地を、新たな各希釈液に入れ替えて、さらに１日培養した。その後、ウェルから、培地を抜き、リン酸バッファーで洗い、トリプシンでＣＨＯ細胞をウェルの底からはがした。ＣＨＯ細胞がはがれた状態のウェルに培地をさらに加えてＣＨＯ細胞懸濁液を作製し、該懸濁液を遠心分離チューブに移した。その後、遠心分離によりＣＨＯ細胞を分画して、０．４ｍＬに再懸濁した。際懸濁した溶液を顕微鏡で観察し、細胞濃度を計測した。１つの条件につき３個のウェルで細胞濃度を計測した。その結果を表６に示す。
【０１０６】
【表６】
2015010085.tif 000009
【０１０７】
実施例の分散液を用いた試験結果では、コントロールと比べ細胞濃度が２．５倍以上となった。これにより、ＰＱＱを含む分散液による細胞増殖を促進する効果が非常に高く、効果的であることが示された。
【０１０８】
〔ヒトリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）を使用した実験〕
ヒトリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）を使用して細胞増殖性試験を行なった。培地として、ＲＰＭＩ１６４０にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを使用した。浮遊細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞は、培地内を浮遊した状態で増殖させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞の培養は、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下３７℃で行なった。
【０１０９】
Ｊｕｒｋａｔ細胞濃度１２．５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬである細胞懸濁液を、２４ウェルプレートの各ウェルに撒き、実施例３の分散液又は水にＰＱＱジナトリウムを１質量％懸濁した液（１％ＰＱＱａｑ）を培地で希釈して表７の希釈倍率になるようにウェルにそれぞれ添加した。４日後、ウェル中の細胞培養液をトリパンブルーで染色して顕微鏡観察により生細胞数を算出した。その結果を表７に示す。
【０１１０】
なお、１％ＰＱＱａｑは、製造例で得られたＮａ２ＰＱＱ１．０ｇを水９９ｍＬに加え、攪拌し、赤色の懸濁液として得た。得られた懸濁液中のＮａ２ＰＱＱはすぐに沈降し、均一な分散液は得られなかった。
【０１１１】
【表７】
2015010085.tif 000010
【０１１２】
実施例のＰＱＱを含む分散液を用いてＪｕｒｋａｔ細胞を培養した場合には、培養細胞が高濃度となった場合に生じる細胞障害を生じずに、細胞増殖をすることが分かった。これにより、ＰＱＱを含む分散液による濃度障害を防止する効果が高く、効果的であることが示された。
【０１１３】
〔ヒト女性皮膚繊維芽細胞ＬｏｔＤＦＭ１１０３１０Ｂを使用した実験〕
ヒト女性皮膚繊維芽細胞を使用して細胞増殖性試験を行なった。培地として、培地ＤＦＭ１００を使用した。ヒト女性皮膚繊維芽細胞の培養は、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下３７℃で行なった。この細胞は正常細胞で繊維状の形態でシャーレに付着する。
【０１１４】
ヒト女性皮膚繊維芽細胞の細胞懸濁液を、細胞２５００個／Ｗｅｌｌになるように９６ウェルプレートの各ウェルに撒いた。１日後、Ｎａ２ＰＱＱの濃度（μｍｇ／ｍＬ）が表８に記載の濃度となるように実施例３の分散液又は水にＰＱＱジナトリウムを１質量％懸濁した水溶液（１％ＰＱＱａｑ）を培地で希釈したサンプルをそれぞれのウェルに加えた。また、コントロールとして、ポリグリセリンリシノレイン酸エステル（坂本薬品工業社製ＣＲＳ−７５）と、中鎖脂肪酸グリセリンエステル（ＭＣＴ、花王社製ココナードＭＴ）との混合溶液Ｄを培地で同様の倍率で希釈したサンプルを加えたウェルも用意した。３日後に培地を入れ替え、同仁化学製ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ８で細胞数を測定した。このキットでは４５０ｎｍの吸光度と細胞数とが比例する。プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、コントロールの吸光度を１００として以下の表８に表した。
【０１１５】
【表８】
2015010085.tif 000011
【０１１６】
他の細胞増殖性試験の結果と同様、ＰＱＱを含む分散液は、細胞増殖を促進する能力があり、コントロールと比べて３５％以上の促進効果があった。ＰＱＱを含む分散液の効果のあった領域（Ｎａ２ＰＱＱ：１２５〜５００μｇ／ｍＬ）では、１％ＰＱＱａｑを添加したウェルの細胞は死んでいた。１％ＰＱＱａｑを添加したウェルでは細胞へのＰＱＱの過剰取り込みがあったと推察される。これより、ＰＱＱを含む分散液は、ＰＱＱの活性を奏するばかりでなく、ＰＱＱの過剰の取り込みを抑制し、細胞増殖能を上げる効果があることが分かった。
【０１１７】
このように、ＰＱＱを含む分散液を用いることにより、細胞の種類は関係なく、ＰＱＱの有する高い増殖促進効果が認められる。また、ＰＱＱを高濃度で使用しても細胞への障害は表れておらず、ＰＱＱを含む分散液は過剰な取り込みによる障害を防ぐ効果があることが示された。ＰＱＱを含む分散液は培地中に油的として存在することで増殖促進、細胞障害抑制を行っていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明のＰＱＱ類を含む分散液は、医薬品分野、食品分野、化粧品分野等において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2015010085.tif 000012