(57)【要約】【課題】微細藻類の培養において、培養器の設置面積効率を向上させる。【解決手段】少なくとも二台の培養器を重ねて多段培養法を行う。それぞれの培養器は、培養ステージの異なる培養スキームで培養を行う。種藻の供給のみを行う培養器を設置することができる。光源に近い培養器は、主として光を利用し、遠い培養器は、主として糖をエネルギー源として用いる。また、下段の培養器への導光を行い、光の有効活用を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類の培養方法において、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる、液面浮遊培養方法であり、かつ
少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う、微細藻類の多段培養方法。
【請求項２】
微細藻類の培養方法において、
少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う多段培養方法であり、かつ
上段の培養器の微細藻類は光により独立栄養的に培養され、下段の培養器の微細藻類は微細藻類が資化可能な糖を含有した培地により培養される、微細藻類の多段培養方法。
【請求項３】
微細藻類の培養方法において、
少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う多段培養方法であり、かつ
上段の培養器で使用される培地に比較して糖濃度が高い培地により下段の培養器の微細藻類が培養される、微細藻類の多段培養方法。
【請求項４】
下段の培養器に光が供給される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
一方の培養器における培養ステージが、誘導期、対数増殖期、有用物質蓄積期又は培養停止期であり、他方の培養器における培養ステージとは異なるように培養される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
上段の培養器による培養が種藻を提供するために行われ、下段の培養器による培養が、有用物質を提供するために行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
上段の培養器から得られた種藻が、下段の培養器に供給される、請求項６に記載の培養方法。
【請求項８】
上段の培養器において、形成されたバイオフィルム及び底面上の微細藻類の少なくとも一方を、培養器の一部の領域に移動させ、それにより下段へ供給される光量が増加する工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項９】
上段の培養器と下段の培養器との間に設置された光源により光が供給される、請求項１〜８のいずれか１項に記載された培養方法。
【請求項１０】
導光手段により光が供給される、請求項１〜９のいずれか1項に記載された培養方法。
【請求項１１】
微細藻類が緑藻である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１２】
微細藻類が、ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｓｐ．に属するものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１３】
微細藻類が、ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓに属するものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１４】
微細藻類が、ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項の培養方法を含む培養工程；及び
培養工程により増殖した藻類を回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
【請求項１６】
藻類バイオマスが、オイルである、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載された方法を実施するための、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の液面浮遊培養を多段にて行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的には、微細藻類の培養は、培地中に分散させながら行われている（以下、分散培養という）。しかしこの様な培養法では、攪拌を行うためのエネルギー源が必要となり、分散している微細藻類を回収するためには、遠心分離機や凝集剤などが必要となる。そのために、培養及び回収は非常にコスト高となり、菌体内外に燃料に応用できる可能性を持ったオイルを蓄積する微細藻類が発見されているものの、その商業化の成功例はまだない。
【０００３】
バイオマスエネルギーにおいて、面積あたりの燃料生産性は、微細藻類を用いた場合、トウモロコシと比べて約３４０倍、藻類以外で最も生産性が高いとされているオイルパームと比べても約１０倍の生産性であることが知られている（非特許文献１）。しかし、国土が狭い国や離島など、また、火力発電所や製鉄所など二酸化炭素を多く排出する工場がある地域は、一般的に、広大な土地を確保することが困難で、さらなる土地の有効活用が望まれていた。
【０００４】
この様な問題点を解決する方法として、培養器を多段化し、設置面積を有効活用する方法が提案されてきた。例えば、特許文献１及び２では、培養器を多段化し、それぞれの培養器に光源を設置している。この方法であれば設置面積を有効活用することができるが、光源を設置するための費用が高く、多くのエネルギーも投入する必要があり、高付加価値有用物質の生産しか行うことはできなかった。また、コストの安い太陽光を、最上段を除き利用することはできなかった。
【０００５】
上記の問題点を改善するために、特許文献３では、多段化した培養器のそれぞれに対して、太陽光を導光するための光ガイドを設置する方法が提案されている。しかし、この方法でも、導光の効率が悪く、また、導光材料は一般的に高価格であり、上記と同様に高付加価値化合物の生産を除いて、商業化を行うことはできなかった。さらに、燃料用オイルのような低価格な有用物質の生産には、これらの方法を使用することはできなかった。
【０００６】
また、分散培養や付着培養では、多段化した培養器を用いた報告例はあったが、液面浮遊培養法においては、その様な報告例はなかった。そのために、培養工程、回収工程及び乾燥工程で多くのコストが発生する問題点があった（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１９５１６３号公報
【特許文献２】特開２００９−１１８７８５号公報
【特許文献３】特開平７−２８９２３９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２９４，２５（２００７）．
【非特許文献２】松本光史ら、第６２回日本生物工学会大会（２０１０）  トピックス集  ｐ３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、微細藻類の培養方法に関し、液面上にバイオフィルムを形成させつつ、液面上に浮かせながら培養する液面浮遊培養法を提案してきた。本培養法は、液面上に微細藻類のバイオフィルムが浮いていることから、遠心分離機などの高価な装置を使用せずに藻体を回収することができ、静置培養であることから攪拌のためのエネルギーも不要であり、従来法と比較して、低エネルギーかつ低コストな培養法である。しかも、回収後の含水率が低く、乾燥工程に使用するエネルギー量を従来法と比較して大幅に低く抑えることができる。
【００１０】
本発明が解決しようとしている課題は、培養器設置面積あたりの微細藻類量、すなわち、微細藻類由来のバイオマス量をこれまで以上に高める方法を、従来培養法とは異なる培養形態を採用している液面浮遊培養法に対応した方法で提供することにある。これにより、培養、回収及び乾燥工程を低コストかつ低エネルギーで行うことができる。微細藻類の培養開始時には、藻体濃度は非常に低く、多くの光子を無駄にしている。この光子を有効活用することも本発明の課題の一つである。そのため、培養のステージを、培養器上下で工夫することも本発明の課題としている。また、光源が一つの場合の多段培養は、下段になるほど光の量が減少する問題点があったが、この問題点を解決することも本発明の課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、培養器を多段化した液面浮遊培養法を新たに開発した。また、微細藻類の増殖速度や有用物質の生産性を向上させるために、各段における培養とバイオフィルム回収などのタイミングを調整すべきことを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、以下を提供する。
［１］  微細藻類の培養方法において、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる、液面浮遊培養方法であり、かつ
少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う、微細藻類の多段培養方法。
［２］  微細藻類の培養方法において、
少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う多段培養方法であり、かつ
上段の培養器の微細藻類は光により独立栄養的に培養され、下段の培養器の微細藻類は微細藻類が資化可能な糖を含有した培地により培養される、微細藻類の多段培養方法。
［３］  微細藻類の培養方法において、
少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う多段培養方法であり、かつ
上段の培養器で使用される培地に比較して糖濃度が高い培地により下段の培養器の微細藻類が培養される、微細藻類の多段培養方法。
［４］  下段の培養器に光が供給される、［１］〜［３］のいずれか一に記載の培養方法。
［５］  一方の培養器における培養ステージが、誘導期、対数増殖期、有用物質蓄積期又は培養停止期であり、他方の培養器における培養ステージとは異なるように培養される、［１］〜［４］のいずれか一に記載の培養方法。
［６］  上段の培養器による培養が種藻を提供するために行われ、下段の培養器による培養が、有用物質を提供するために行われる、［１］〜［５］のいずれか一に記載の培養方法。
［７］  上段の培養器から得られた種藻が、下段の培養器に供給される、［６］に記載の培養方法。
［８］  上段の培養器において、形成されたバイオフィルム及び底面上の微細藻類の少なくとも一方を、培養器の一部の領域に移動させ、それにより下段へ供給される光量が増加する工程を含む、［１］〜［７］のいずれか一に記載の培養方法。
［９］  上段の培養器と下段の培養器との間に設置された光源により光が供給される、
［１］〜［８］のいずれか一に記載された培養方法。
［１０]  導光手段により光が供給される、［１]  〜［９]  のいずれか一に記載された培養方法。
［１１］  微細藻類が緑藻である、［１］〜［１０］のいずれか一に記載の培養方法。
［１２］  微細藻類が、ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｓｐ．に属するものである、［１］〜［１１］のいずれか一に記載の培養方法。
［１３］  微細藻類が、ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓに属するものである、［１］〜［１２］のいずれか一に記載の培養方法。
［１４］  微細藻類が、ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株である、［１］〜［１３］のいずれか一に記載の培養方法。
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれか一の培養方法を含む培養工程；及び
培養工程により増殖した藻類を回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
［１６］  藻類バイオマスが、オイルである、［１５］に記載の製造方法。
［１７］  ［１］〜［１６］のいずれか一に記載された方法を実施するための、装置。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法、すなわち、培養器を多段化し、さらに、種藻の調製、培養、回収のタイミングを調整し、場合によっては、培養段下部に光を導光することによって、培養器の設置面積あたりの藻体量、すなわち、バイオマス量を従来法と比較して、大幅に増加させることができる。
【００１４】
多段培養を液面浮遊培養法で行うことによって、実質的に攪拌が不要なことから培養時のエネルギー投入量が少なく、回収が容易、かつ、回収物の含水率が低く、乾燥工程で投入しなければならないエネルギーを大幅に減らすことができる。
【００１５】
さらに、上段と下段との培養のステージをずらすことで、上段バイオフィルムの増殖による下段への光の供給量の減少を可能な限り改善することができる。さらに、液面上の微細藻類バイオフィルムは、液面上に浮かせたまま、ほとんど沈むことなく、基板などを用いて移動させることができる。すなわち、液面上での微細藻類バイオフィルムの占有面積を減らすことができ、微細藻類バイオフィルムが存在していないか、または、非常に少ない領域を生み出すことによって、下段への光量の供給を優位にすることができる。これは、分散培養ではできない特徴である。
なお、底面上の微細藻類も同時に移動させることもできる。これにより、さらに、下段への光量の供給を優位にすることができる。
【００１６】
さらに、導光によって下段にも光を到達させることができ、糖の使用によって、光の届きにくい下段での増殖速度の低下を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の模式図。培養器を垂直方向に数個重ねて培養する方法の一例を図示した。（ａ）が、微細藻類懸濁液を培養器に入れた直後、（ｂ）が、しばらく静置することで、微細藻類が培養器底面に沈んだ様子、（ｃ）が、培養を行うことで、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された状態、（ｄ）が、液面上の微細藻類を回収している状態。回収後、（ｂ）と類似の状態になり、再度培養を行うことができる。なお、（ａ）から（ｂ）への工程で、（ｂ）の培養初期の頃は、分散した藻体が培養器底面に沈んだものであり、バイオフィルム構造はできていないが、時間の経過と共に、バイオフィルム構造が形成される。また、（ｄ）から（ｂ）への工程を経由した場合には、バイオフィルム構造が底面にできている。
【図２】本発明の模式図。培養のステージをずらしながら培養する方法の一例を図示した。（ａ）の上段が誘導期、下段が有用物質蓄積期、（ｂ）の上段が対数増殖期、下段が培養停止期、（ｃ）の上段が有用物質蓄積期、下段が誘導期、（ｄ）の上段が培養停止期、下段が対数増殖期を示している。なお、それぞれの培養ステージは、明確に区切られたものではなく、連続的に変化する。
【図３】本発明の模式図。培養のステージをずらしながら培養する方法において、培養ステージを模式化したもの。（ａ）から（ｄ）は、ほぼ図２の（ａ）から（ｄ）に対応する。なお、枠は、一日を想定して図示しているが、必ずしもこの限りではない。
【図４】本発明の模式図。培養器上段に種藻を培養する培養器を設置したもの。（ａ）と（ｂ）とがそれぞれ９０°異なる方向から見た側面図、（ｃ）が上面から見た場合の図。
【図５】本発明の模式図。培養器上段に種藻を培養する培養器を設置したもの。ただし、下段の本培養器は、二台あり、上段の種藻培養器から時間をずらしながら、本培養器に種藻を供給する。
【図６】ＣＳｉＦＦ０３培地の組成
【図７】実施例１の培養の様子。左側が、導光を用いない場合、右側が、導光を用いた場合。培養器は、いずれも４台重ねている。
【図８】実施例１の培養の結果。凡例は、培養の段数を示し、数値が小さいほど、光源に近い。また、”あり”とは、導光を行っているもの、”なし”とは、導光を行っていないものを示す。
【図９】ＣＳｉＦＦ０４培地の組成
【図１０】実施例２の培養の結果
【図１１】微細藻類ボツリオコッカス  スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）ＡＶＦＦ００７株の１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列の一部（配列番号１）
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明による微細藻類の培養方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
【００１９】
［本発明の方法］
本発明の培養方法の基本的な構成を図１〜３に示した。なお、本模式図は、本発明を説明するためのものであることから、簡略化して表記されている部分がある。
【００２０】
［本発明の方法１：単純な多段培養］
図１には、本発明で開発した液面浮遊培養法を多段培養に応用した場合の模式図を示した。なお、培養器を固定するための治具などは省略している。また、培養器は三段を図示しているが、二段でも、四段以上でもかまわない。また、培養器は同一サイズのものを重ねているが、異なったサイズのものを重ねてもかまわない。
【００２１】
図１の（ａ）に示した様に、微細藻類の懸濁液を調製し、培養器に入れる。次に、培養器を静置状態にしておくと、図１の（ｂ）に示したように、微細藻類の種類に応じて、数秒から数十分で微細藻類は底面に沈む。なお、微細藻類が底面に沈むとは、大部分が底面に沈むことをいい、液面上や液中、培養器側面やその他表面や培地中から完全に微細藻類が存在しなくなる状態を言うものではない。この状態で、しばらく培養すると、図１の（ｃ）に示した様に、液面上に微細藻類から構成されたバイオフィルムが形成される。なお、図１の（ｃ）に示した様に、培養器底面にも微細藻類は存在し、図には記載していないが、微細藻類は、培養器側面やその他の表面にも存在し、存在量はかなり少ないが培地中にも存在する。
【００２２】
この（ｃ）の状態で、例えば、微細藻類の有用物質（例えばオイルなど）含有量を向上させるために、少なくとも一部の培地を置換しても良い。例えば、窒素化合物もしくはリン化合物の少なくとも一方の濃度が、置換前の培養開始時に使用していた濃度よりも少ない濃度の培地と置換することができる。また、液面上の微細藻類と培養器の壁面とが接触している部位では、微細藻類バイオフィルムが壁面に付着していることが多く、培地の除去に伴う液面の低下で、微細藻類バイオフィルムが予定外の部位に付着したり、バイオフィルムが破けたりする問題があったが、この問題を改善するために、液面上の微細藻類バイオフィルムと培養器壁面との付着部位を金属へらのようなもので剥がす操作を行うことができる。なお、培養の進行に伴って培地の液量が蒸発などにより徐々に減少する場合がある。その場合にも、失われた液量に相当する液量を添加してから、バイオフィルムと壁面との付着部位を剥がすこともできる。なお、剥がす方法は、目的を達成できるものであれば特に限定しない。金属製のへらのようなものや棒、フィルムなどを用いることができる。また、道具を使わなくとも、液面の波や超音波などで脱離させることもできる。これは、図２〜５でも同様である。
【００２３】
なお、図１の液面上の微細藻類はフィルム状構造体で図示しているが、三次元状構造体であっても良い。
なお、図の上面が光源の位置である。
【００２４】
［本発明の方法２：培養ステージをずらしながら培養する場合］
図２には、微細藻類バイオフィルムの多段培養で、各培養器の培養時期をずらしながら培養する場合の模式図を示した。なお、本模式図では、多段培養の例として二段培養を用いた場合の例を示した。また、段数が多いほどその効率は減少するが、本模式図を若干改良するだけで、三段以上の多段培養を行うことができる。
【００２５】
図２の（ａ）の状態は、上段が誘導期の状態、下段が有用物質蓄積期の状態を図示したものである。上段は、微細藻類バイオフィルムの成長が未成熟なため、下段への光の透過が多く、下段のオイル蓄積期に必要な光を十分に届けることができる。なお、誘導期、対数増殖期、オイル蓄積期などの表現は、厳密にこれらの期間を規定したものではなく、連続して推移するものとする。また本模式図の上段、下段の表現は、三段以上の培養様式において、対象としている二つの培養器の上側と下側とを指す場合があり、必ずしも二段での培養を示しているものではない。
【００２６】
図２の（ｂ）の状態は、上段が対数増殖期、下段が培養停止期である。上段の微細藻類バイオフィルムはかなり増殖しており、下段への光の供給は、図２の（ａ）の時よりもかなり減少している。従って、下段では、基本的には培養を行えていないが、僅かな光が漏れた場合には、それに対応した増殖をする場合がある。なお、培養停止期は、液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した後の状態である。
【００２７】
図２の（ｃ）の状態は、上段の培養器に対して基板を用い液面上の微細藻類バイオフィルム及び底面上の微細藻類を培養器の一部の領域に移動させることによって、移動後の培養器の領域に微細藻類の存在量を大幅に減らすことで下段の培養器にも光が透過しやすいようにした場合の模式図である。上段の培養ステージは、有用物質蓄積期である。下段の増殖ステージは、誘導期である。なお、基板を用いて、上段の微細藻類を移動させているが、その移動量は、培養の状況に応じて決めることができ、下段の増殖状態を見ながら移動量を決めても良い。例えば、模式図の様に培養器の４／５程度を移動させても良い。さらに、模式図では、移動後には、液面及び底面に微細藻類が残っていないように表現しているが、一部が残っていても良いし、底面の微細藻類を移動させずに、液面の微細藻類のみを移動させても良い。また、図の下段の底面藻は、誘導期にあると表現しているが、かならずしもその限りではない。
【００２８】
図２の（ｄ）の状態は、上段が液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した後の培養停止期、下段が、対数増殖期を示したものである。模式図では、上段の液面上の微細藻類を回収し、底面上の微細藻類を回収していないが、回収しても良い。
本発明では、図２の（ｄ）の後、図２の（ａ）と同様の状態にすることができ、繰り返し培養を行うことができる。
【００２９】
図３は、時間ごとに、微細藻類培養の誘導期、対数増殖期、オイル蓄積期、培養停止期を、上段、下段の二段培養を一例として示したものである。図の（ａ）から（ｄ）が、図２の（ａ）から（ｄ）におおよそ対応するものである。図では、誘導期、対数増殖期、オイル蓄積期を明確に区別しているが、実際の培養時には、これらは連続して行われており、厳密な区切りはない。また、図には、日程ごとに図示しているが、日程の経過状態を示すものであり、一枡が必ずしも一日に相当するものではない。
【００３０】
なお、図２の上段の培養器の底面の素材は、下段に対して光を透過させる目的から、光が通過する材料であることが望ましい。
【００３１】
［本発明の方法３：上段に種藻を培養する培養器を設置した場合の培養］
図４は、上段に前培養用の培養器、下段に本培養用の培養器を配置した場合の液面浮遊培養法の模式図である。（ａ）と（ｂ）が側面から見た場合、（ｃ）が上面から見た場合の模式図である。なお、（ａ）と（ｂ）とは、９０°異なる角度から見たものである。上段の培養器は、下段の培養器よりも小さい方が好ましい。これにより、下段への光の到達量が大きく、前培養から本培養への微細藻類の増殖倍率が高く、上段の培養器のコストも小さくなることから好ましい。なお、本図は、図２の（ｂ）の上段部分の段階のものを図示したものであり、そのほかの培養ステージのものも同様に描けるものとする。また、上段の培養器を用いての種藻の培養は、下段の培養器のオイル蓄積工程の段階に入る前後から培養を開始するのが好ましい。これは、下段の微細藻類の回収後に、直ちに下段の培養を開始するための種藻を上段から供給することができ、培養器を効率的に使用することができるからである。
【００３２】
また、図５の様に、種藻を培養する培養器一つに対して、本培養を行う培養器を二つ設置しても良い。この様にすることで、図４の場合には、下段の本培養工程の培養状態に合わせて、一時的な期間しか上段の培養器を使用することができず非効率であったが、模式図の下段の培養器の左側と右側とで培養のステージをずらすことで、上段の培養器の未使用期間を極力減らすことができ、効率的だからである。
【００３３】
上段の培養器は、どの様な形態でも、下段の上側である限り、どこに設置してもかまわないが、培養器の長辺側の形状に添った形で設置することが望ましい。これは、上段の培養器から下段の培養器へと種藻を供給する場合に、下段に投入された種藻の拡散する距離が短く、下段の培養器に対する種藻の分布がより均一化し易いからである。
【００３４】
上段の培養器から下段の培養器へと藻体を供給する方法は、いかなる方法を用いても良い。例えば、上段の種藻を回収し、下段の培養器に播種しても良い。また、上段の培養器を傾けて、下段の培養器に種藻を供給しても良いし、上段の培養器の側面を開けて供給しても良いし、培地をあふれさせるともに、液面上の微細藻類バイオフィルムを下段に供給しても良い。
【００３５】
［本発明の方法４：上段への光の照射、下段への糖の添加］
模式図の図１において、上段は光を用いて培養し、下段は上段ほど光の利用はせずに糖を主として用いる培養法を選択することも本発明では可能である。これにより、下段になるほど光量が低下し、その結果増殖量が低下する問題点を改善することができる場合があるからである。糖をエネルギー源として用いた場合、分散培養の場合には、水深が深いほど面積あたりのバイオマス量は増加する。その一方で、水深が深いほど攪拌の制御が困難である。一方、液面浮遊培養の場合には、水深を深くするほどバイオマス量が増加するのであるが、ある一定の水深を超えると水深に対するバイオマスの増加量が減少してくる。従って、液面浮遊培養の場合には、水深が浅いほど効率が良く、液面浮遊培養法の場合には、水深を極限まで浅くすることができ効率的である。また、水深が浅いほど、多段化の数を増やすことができ、水深あたりのバイオマス量を分散培養とは比較にならないほど高密度に培養することができる。以上から、糖をエネルギー源として多段培養する方法は、面積あたりの藻体量を極めて大きなものにすることができる。
【００３６】
上段へは光を照射し、下段に用いられる培地へ糖を添加して行う本発明の方法は、典型的には、上段の培養器の微細藻類は光により独立栄養的に培養され、下段の培養器の微細藻類は、微細藻類が資化可能な糖を含有した培地により培養される。この場合、上段、下段とも、光と糖の両方からエネルギーを得ることがあってもよい。すなわち、上段は、主として光からエネルギーを得て培養されるが、糖を含有する培地を用いることもでき、下段では糖を含有した培地が用いられるが、光からもエネルギーを得られるように構成してもよい。
【００３７】
上段の培養器で使用される培地に比較して糖濃度が高い培地により下段の培養器の微細藻類を培養することも本発明では可能である。この場合、複数の個培養器の中で、ある特定の隣接する上下二段の培養器に着目して、上段よりも下段の方が糖の濃度が高い培地を用いてもよい。
【００３８】
なお、糖を含有した培地を用いた本発明の培養方法は、水面浮遊培養に限らず、いかなる公知の培養方法でも用いることができる。
【００３９】
［微細藻類の繰り返し培養］
図１の（ｄ）の液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した後の状態は、図１の（ｂ）の状態になる。すなわち、培地中に増殖のための栄養成分が残っている限り、底面上やその他の部位に残っている微細藻類を種藻として再度培養することが、何度でも可能である。繰り返し培養は、培地中に増殖のための栄養成分が残っている限り行うことが可能であるが、あまりにも低濃度であると増殖速度が遅くなってしまう可能性が高いため、その様な場合には、培地を新たに添加したり、少なくとも一部の培地を置換したり、固形物状の栄養成分や高濃度の栄養成分を培地に添加したりすることができる。
また、繰り返し培養の代表例として、図１を中心に記載したが、図２、図４、図５でも同様に回収することができる。
【００４０】
［培養器の設置］
培養器の設置は、図１に示した様に、同一サイズの培養器を垂直方向に重ねて設置しても良いし、最上段の培養器の投影面積（平面図の面積。真上から平行光線で水平面に投影した場合の、投影面の面積。）を最も小さくし、最下段の培養器の投影面積を最も大きくしても良いし、最上段から最下段に至るまで培養器の大きさを徐々に大きくし、上段側の培養器による下段側の培養器による光量の低下を最小限にするために、下段側の培養器を少し大きくすることで、上下の培養器の設置面積の差の部分を導光用の空間として確保しても良い。この様にすることで、光量の低下による微細藻類の増殖量の低下を改善することができる。
【００４１】
本発明の方法では、少なくとも２台の培養器を重ねて、すなわち複数の培養器を上下方向に多段に配した状態で、微細藻類を培養する。培養器の重なりの程度は、一部重なっていればよく、特に制限はない。ある培養器と別の培養器との重なりは、それぞれの培養器において培養に利用される部分の投影面の重なりの程度を、投影面積が小さい方の培養器を（同じであれば、いずれか一方を）基準として表すことができる。培養器の重なりは、１％以上とすることができ、２０％以上とすることが好ましく、５０％以上とすることがより好ましく、７５％以上とすることがさらに好ましい。重なりの上限は１００％であるが、それ以下とすることもできる。各培養器は、接触するように重ねてもよく、接触しないように間隔をあけて重ねてもよい。例えば、下段の培養器の上に上段の培養器を直接置いてもよく、また適切な治具で上段の培養器を支えて、上段培養器と下段の培養器とを離してもよい。
【００４２】
［光源の設置］
本発明の方法は、光源として太陽光を用いることが最も好ましく、培養器の最上段に対してのみ太陽光を照射することが最も好ましいが、培養器のそれぞれに対して人工の光源を設置し、培養を行っても良い。また、人工の光源は、一段おきに、例えば一段目と二段目との間及び三段目と四段目との間に、設置しても良い。この方法と培養ステージをずらしながら培養する方法との組み合わせを行うことにより、光量を有効活用することが可能となり、増殖速度を向上させることができるからである。なお、培養器の最上段に対してのみ太陽光を照射するとは、最上段以外の培養器に対して太陽光を全く照射しないというものではない。
【００４３】
［導光］
本発明の方法は、光を下段に導光するための導光路等の導光手段を設置することも好ましい。これにより、上段の微細藻類バイオフィルムの増殖による下段への光量の低下を最小限にすることができ、増殖速度を好適に向上させることができるからである。設置方法は、公知のいかなる方法でも選択することができ、導光のための材料を設置しても良いし、光ファイバーを用いて導光しても良いし、空気層を設置し、そこを光が導光するようにしても良い。本発明では、空気層を導光用の空間として使用することが、導光の効率と設置コストの観点から好ましい。また、空気層を導光媒体として利用する場合には、最下層の培養器は、同一設置高さの培養器同士を結合（空気層を設けずに培養器を接触させる）させても良い。また、この部位に当たる壁面を設置しないようにしても良い。これにより、最下層の設置面積を有効に活用でき、藻体量を増加させることができる。
【００４４】
［微細藻類］
本発明の微細藻類とは、人の肉眼では、個々の存在が識別できないような微小な藻類を指す。微細藻類としては、液面上においてバイオフィルム形成能を有するものであれば特に制限はなく、原核生物、真核生物のいずれであってもよい。
上記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、上記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、緑藻であることがより好ましい。バイオマスを産生する点で、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）属、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）属がより好ましい。
上記微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などがあげられる。なお、本発明で用いられる微細藻類は、純化工程を経由したものであることが好ましい。
【００４５】
本発明では、上記微細藻類の中でも有用物質を生産できることが好ましい。特に、医薬品、化粧品、健康食品の中間体や最終生成物、合成化学で使用する原料、炭化水素化合物やトリグリセリド、脂肪酸化合物のようなオイル状物、水素ような気体などを生成する微細藻類が好ましい。なお、本発明では、これらを生産物と呼ぶことがある。さらに本発明では、液面上での培養および液面からの回収が良好であること、高い増殖速度を持つこと、高いオイル含有率で有していること、少なくとも培養中は臭いが殆どなく、有毒物質の発生も確認されていないこと、のいずれかを満たす微細藻類を用いることが好ましい。
【００４６】
［バイオフィルム］
本発明でのバイオフィルムとは、岩などの表面に付着している微細藻類構造体（微細藻類集合体もしくは微細藻類膜、生物膜）のことを言うが、これらに加えて本発明では、液面のような流動性のある表面に存在している、微細藻類から構成されたフィルム状構造体または三次元状構造体のこともバイオフィルムという。なお、自然界でのバイオフィルムは、目的微細藻類とともに、ゴミや植物の破片などを含んでいることがあるが、本発明では純化工程を経由して得られた試料であれば、これらを含んでいてもよい。しかし、理想的には、本発明に係る微細藻類と該微細藻類の増殖時に分泌される細胞間マトリックスなどのような物質のみから構成されていることがより好ましい。また、底面上の微細藻類もフィルム状構造体を形成していれば、バイオフィルムということができる。
またバイオフィルムは、個々の微細藻類同士が直接もしくは細胞間マトリックスのような物質（例えば、多糖等）を介して付着しあっている構造であることが好ましい。
また、純化工程とは、微細藻類を単一の種類にする目的で行う工程であり、必ずしも完全に単独の微細藻類のみにすることを言うものではない。
【００４７】
本発明では、液面上でバイオフィルムが形成可能な微細藻類を用いる必要がある。そのような微細藻類の好ましい例は、ボツリオコッカス  スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）やクロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属をあげることができる。より具体的な例として、ボツリオコッカス  スデティクス  ＡＶＦＦ００７株（以下、ＡＶＦＦ００７株と略称する。）やＦＦＧ０３９ｐ１株をあげることができる。なお１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列解析の結果、ＦＦＧ０３９ｐ１株はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．と同定されている。
【００４８】
［ＡＶＦＦ００７株］
本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＡＶＦＦ００７株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０として、２０１１年（平成２３年）９月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託されているた。なお、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターの業務は、２０１２年（平成２４年）４月１日より、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に引き継がれている。
【００４９】
ＡＶＦＦ００７株は、本発明者らが、日本国京都府の淡水池から単離した淡水微細藻類の新規株である。ＡＶＦＦ００７株は、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部（配列番号：１、図１１）を国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータに基づき、ＢＬＡＳＴで解析した結果、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＵＴＥＸ２６２９（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）株に近縁の微細藻類であると同定された（ＵＴＥＸ２６２９株側の１１１８塩基中、ＡＶＦＦ００７株側の１１０９塩基が同一であった。）。ＡＶＦＦ００７株は、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｍａｒｙ  ９／２１  Ｔ−３ｗとも近縁の微細藻類であり、今後、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属に変更される可能性もある。その場合、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとし、また、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属以外に変更された場合にも、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとする。
【００５０】
本発明には、ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質を以下に示す。
【００５１】
ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質
１．形態的性質
緑色円形状である。浮遊性であり、液面及び底面で増殖することができる。サイズは４〜３０μｍである（液面上の藻体は比較的大きく、底面上の藻体は比較的小さい。）。液面上で増殖し、フィルム状構造体を形成する。増殖に伴って、液面上に気泡を発生し、これらが重なり合って液面上に三次元構造体を形成する。また、オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４（ＣＳｉ培地を改良したもの。組成を図９に示した）。ＮａＯＨ又はＨＣｌにてｐＨ  ６．０に調整する。培地は、１２１℃、１０分で滅菌することができる。
（２）培養温度：好適温度は２３℃であり、３７℃以下であれば培養できる。
（３）培養期間（概ね定常期に達するまでの期間）は、初期使用藻体量によるが、２週間〜１ヶ月である。通常、１×１０５個／ｍＬで培養することができる。
（４）培養方法：好気培養、静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００〜１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。継代培養の際は、４０００ルクスで培養することができる。
【００５２】
なお、ＡＶＦＦ００７株は、上記の培養的性質（培養方法）にしたがった継代培養により、保管することができる。植え継ぎは、液面上に浮いている微細藻類を採取し、ピペッティングなどの分散を行った後、新しい培地に分散させることにより、行うことができる。なお、継代直後は、培養器底面に沈んでいるが、１週間程度で液面上にバイオフィルムを形成し始める。継代直後から液面上に存在させても、増殖することができる。植え継ぎ間隔は、約１ヶ月である。なお黄色味を帯びてきたら継代する。
【００５３】
ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株には、微細藻類であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５．０％、好ましくは９８．０％、より好ましくは９９．０％、さらに好ましくは９９．５％、最も好ましくは９９．９％の配列同一性を有するものが含まれる。
【００５４】
本発明で塩基配列について配列同一性というときは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、整列した領域内の２つの配列間で共有する一致した塩基の数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した塩基の数／塩基の全数）×１００で算出でき、市販もしくは一般に公開されているアルゴリズムを用いて計算することができる。塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者にはよく知られている。
【００５５】
［ＦＦＧ０３９ｐ１株］
本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＦＦＧ０３９ｐ１株は、本発明者らが日本国奈良県において採取したものである。ＡＶＦＦ００７株に比較して、増殖性が良く、オイル生産性に優れる。また、バイオフィルムの構造が壊れにくく、回収が容易であるという特徴を有する。なお、ＦＦＧ０３９ｐ１株はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．である。
【００５６】
［浮遊培養］
本発明では、微細藻類を培地中に分散させた状態で培養することを浮遊培養と呼んでいる。なお本発明では、液面上での培養を浮遊培養とは呼ばないものとする。浮遊培養は、本培養工程では行わないが、前培養工程では目的に応じて使用できる。
【００５７】
［液面浮遊培養］
本発明では、液面上で微細藻類を培養する培養方法のことを液面浮遊培養と言う。なお、培養器底面、側面、その他表面上や培地中などに微細藻類が同時に存在していても、主たる目的が液面上での培養である場合には、液面浮遊培養という。また液面上でにはバイオフィルムとともに泡沫がたくさん存在し、液面がどの位置か必ずしも明確でない場合があり、またバイオフィルムが自重によって液面下に多少沈んでいる場合があるが、本発明で液面上というときは、完全な液面のみならず、このような場合も含む。ただし、微細藻類を液中、培養器の底面のいずれか一方のみ、または、両方で培養する培養方法は液面浮遊培養には含まれない。
なお本発明における液面とは、典型的には後述する液体培地の液面であり、通常、液体培地と空気との界面である。また、水が主成分となる場合は、水面のことである。また、本発明での液面浮遊培養を行っていると、液面上バイオフィルムからひだ状の構造体が液中へと侵入する現象が見られることがある。本発明では、この様な状況での培養も液面浮遊培養に含むものとしている。
【００５８】
液面浮遊培養を行うための種藻としては、懸濁処理を行った後、培養器に添加してもよく、種藻の添加後、液体培地との混合を促進するために攪拌を行っても良い。また、微細藻類バイオフィルムを培養器の液面に対して添加し、浮かせた状態で培養を開始しても良いし、浮かせてから微細藻類バイオフィルムの液面からの離脱が最小限になるように、微細藻類バイオフィルムを可能な限り沈まないように液面上で分割処理し、さらに、培養器液面上に分散するように攪拌してもかまわない。
【００５９】
［前培養工程］
本発明の前培養工程とは、純化工程を終了した後に得られた保存用微細藻類を増殖させ、本培養が行えるまで微細藻類の数を増やす工程のことである。前培養工程の培養法は、公知のいかなる培養方法でも選択可能である。例えば、分散培養法や付着培養法、本発明者らにより開発された液面浮遊培養や本発明の培養法などを行うことも可能である。また、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養を数回行っても良い。また、前培養工程では、目的に応じて静置培養を行っても良いし、振盪培養などの非静置培養を行っても良い。
また、一般的には、１ｃｍ２〜１ｍ２以下の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能である。
【００６０】
［本培養工程］
本培養工程とは、前培養工程を行った後の培養工程のことであり、最終回収工程を行う直前までの培養工程のことを言う。本培養工程は、液面上のフィルム状構造体もしくは三次元状構造体が十分な量形成されたときに終了することができる。本培養工程は、例えば、数日〜数週間で、より特定すると、５日〜４週間で終了することができる。また、本培養工程は、複数回行っても良いものとする。
また、一般的には、１００ｃｍ２以上の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能であるが、屋外での培養の方が好ましい。
【００６１】
［種藻］
本発明での種藻とは、前培養工程や本培養工程の開始時に使用する微細藻類のことを指し、前培養工程や本培養工程における微細藻類の培養の元となる微細藻類のことを言う。
【００６２】
また、液面に微細藻類バイオフィルムを浮かせた状態や底面に微細藻類が存在している状態で培養を開始することもでき、それらの場合にも、これらの微細藻類を種藻として利用することができる。さらに、底面や培養器のその他の場所、培養を構成するその他の治具などに付着存在している微細藻類も、種藻として利用することができる。
また、回収工程の後に、液面上に残存している微細藻類を種藻として用いて、培養を再開することができる。
【００６３】
［液面上の微細藻類の種藻としての利用］
本発明では、液面上の微細藻類を種藻として使用することで培養を行うこともできる。回収工程で、液面上の微細藻類バイオフィルムの一部を残しておく方法である。また、回収工程の後、一部の微細藻類バイオフィルムを採取し、これを液面上に浮かせることで培養を開始することも可能である。さらに、液面上のバイオフィルムを可能な限り液面に浮かせた状態で分割処理を行い、培養を開始することもできる。この様にすることで、培養器の液面を有効活用することができ、微細藻類非存在領域に対しても存在させることができることから、増殖速度を向上させることができる場合が多いからである。
なお、これらの方法は、すべての培養器で行っても良いし、一部の培養器に対して行っても良い。
【００６４】
［底面藻］
本発明での底面藻とは、培養器底面近傍に存在している微細藻類のことを指す。この中には、底面に付着し、軽い液流程度では剥がれないものや、底面近傍に存在し、軽い液流程度で移動してしまう非付着性底面藻も存在している。また、回収操作によって微細藻類バイオフィルム構造体から離れ、底面近傍へと沈んでしまった液面藻も、本発明では非付着性底面藻に含めることができる。
なお、本発明の模式図では液面上への微細藻類の供給が底面から行われるように記されているが、液面や底面以外の培地中にも低濃度ながら微細藻類が存在している場合には、これらが種藻の供給源となる可能性もある。また、培養器底面から液面上への微細藻類の供給とは、底面の微細藻類の増殖を伴わずに液面上に移動する場合と、微細藻類が底面から液面上に移動しながら増殖する場合との両方がある。
【００６５】
［底面上の微細藻類の種藻としての利用］
本発明では、底面上の微細藻類を種藻として使用し、培養を継続することもできる。図１の（ｄ）から（ｂ）を経て（ｃ）への工程、図３のオイル蓄積期から誘導期への工程などである。培地中に栄養成分が残っていれば、使用済みの培地をそのまま使用して培養を継続しても良いし、使用済みの培地の一部を廃棄し、新しい培地を添加しても良い。新しい培地の添加量は、廃棄量と同等の液量加えても良いし、それよりも少なくても多くてもかまわない。なお、新しい培地を添加する方が、後段の本培養での微細藻類の増殖速度を向上させることができる観点からより好ましい。
【００６６】
底面上の微細藻類を種藻として利用する場合、底面藻の一部を剥がし、それを培地中へと分散させても良い。この様にすることによって、藻体の一部しか培地と接触することができない状態の微細藻類を、より多くの培地と接触させることが可能となり、増殖速度を好適に向上させることが可能だからである。
【００６７】
底面上に存在する非付着性微細藻類を除去しても良い。底面上に不必要に微細藻類が存在していると、栄養成分の不必要な消費が原因と考えられる増殖速度の低下が見られるからである。また、種藻として使用する底面藻の存在量を調整しても良い。このことにより、適切な培養を行うことが可能だからである。培養を開始するにあたっての底面上での微細藻類の存在量は、０．００１μｇ／ｃｍ２以上１００ｍｇ／ｃｍ２以下が好ましく、０．１μｇ／ｃｍ２以上１０ｍｇ／ｃｍ２がさらに好ましく、１ｍｇ／ｃｍ２以上５ｍｇ／ｃｍ２が最も好ましい。０．１μｇ／ｃｍ２以上であれば、培養前後の微細藻類量の比を短時間で大きくすることができることから好ましい。
この方法は、培養段の全段で用いても良いし、一部の段で用いても良い。
【００６８】
［懸濁処理］
本発明では、懸濁処理した微細藻類試料を用いても良い。懸濁処理を行うことで、溶液中の微細藻類が均一化し、培養後の膜厚が均一化する結果、培養面積あたりの微細藻類量が増加する場合があるからである。懸濁処理としては、公知のいかなる方法でも用いることができるが、ピペッティングや容器内に入れた微細藻類溶液を手で振る処理、スターラーチップや攪拌棒による処理などの弱い処理、超音波処理や高速振盪処理などの強い処理、細胞間マトリックスのような接着物質を分解する酵素などの物質を用いる方法などをあげることができる。
【００６９】
［培養器］
培養器（培養池）の形状は、培地を保持できる限り、公知のいかなる形状でも用いることができる。例えば、円柱状、方形状、球状、板状、チューブ状、プラスチックバッグなどの不定形状のものを使用することができる。また、オープンポンド（開放池）型、レースウェイ型、チューブ型（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９２，  １１３，  ２００１）など様々な公知の方式を用いることができる。培養器として使用することの可能な形状は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０  （１９９９）  ３１３−３２１，  Ｅｎｇ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ９，  １６５−１７７  （２００９）．  に記載の培養器をあげることができる。これらの中で、オープンポンド型もしくはレースウェイ型を用いることが、コスト面からは好ましい。
【００７０】
本発明で使用可能な培養器は、開放型、閉鎖型のいずれでも使用することができるが、大気中よりも高い二酸化炭素濃度を使用した際の、培養器外への二酸化炭素の拡散を防ぐために、閉鎖型の培養器を用いる方が好ましい。閉鎖型の培養器を用いることで、培養目的外微生物やゴミの混入防止、培地の蒸発抑制、風によるバイオフィルム構造体への影響などを最小限にすることができる。しかし、商業生産を行う場合には、建設コストが安価であるなどの観点から、開放系での培養が好ましい。
【００７１】
［基板］
本発明での基板とは、図２の（ｃ）などで使用される固体状物のことである。基板の形状は、フィルム状、板状、繊維状、多孔質状、凸状、波状などいかなる形状のものでも良いが、転写のしやすさ、および基板からの微細藻類の回収のしやすさから、フィルム状又は板状であることが好ましい。
【００７２】
［貫通状構造体］
本発明の方法では、貫通状構造体を同時に使用することもできる。本構造体の使用で、回収後の微細藻類バイオマス中の含水率を大幅に下げることができる。
具体的には、培地中に貫通状構造体を浸漬し、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された後、該貫通状構造体を培養器内で上昇させ、気相中へと移動後、培養を継続する方法、培養器の気相中に貫通状構造体を設置しておき、液面上の微細藻類バイオフィルムの三次元状構造体が、該貫通状構造体に接触、又は、該貫通状構造体の貫通部位を通過した状態で培養することもできる。さらに、微細藻類バイオフィルムが接触、または、貫通部位を通過した状態で、貫通構造体を培養器内の気相中でさらに上昇させることで培養することもできる。これにより、回収物中の含水率を大幅に下げることができることから好ましい。
貫通状構造体の培地中、気相中での移動は、培地を添加することで行っても良いし、培地を除去することで行っても良い。さらに、本方法と、培地の置換とを組み合わせても良い。
【００７３】
本発明に用いられる貫通状構造体は、少なくとも一つの貫通部位を有する。貫通部位とは、構造体に対して貫通穴を開けたもののことを言い、貫通穴の形成法についてはどの様な方法で形成しても良い。例えば、シート状物に穴を開けても良いし、糸状物を重ねることで織物や編物状にしても良い。
【００７４】
膜貫通の数も特に制限なく設置することができ、そのサイズは均一であっても良く、不均一であっても良い。貫通部位の形は、円形、方形、線形、不定形など様々な形を用いることができる。なお、貫通状構造体とは、例えば、金網などをあげることができる。また、貫通状構造体は、移動を行っていないときは培養器に固定できるほうが好ましい。
【００７５】
［素材］
本発明で使用可能な培養器、基板、貫通状構造体の素材は、特に限定することはなく、公知のものを使用することができる。例えば、有機高分子化合物、無機化合物、金属、それらの複合体から構成された素材を使用することができる。また、それらの混合物を用いることも可能である。
【００７６】
有機高分子化合物としては、ポリエチレン誘導体、ポリ塩化ビニル誘導体、ポリエステル誘導体、ポリアミド誘導体、ポリスチレン誘導体、ポリプロピレン誘導体、ポリアクリル誘導体、ポリエチレンテレフタレート誘導体、ポリブチレンテレフタレート誘導体、ナイロン誘導体、ポリエチレンナフタレート誘導体、ポリカーボネート誘導体、ポリ塩化ビニリデン誘導体、ポリアクリロニトリル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエーテルスルホン誘導体、ポリアリレート誘導体、アリルジグリコールカーボネート誘導体、エチレン−酢酸ビニル共重合体誘導体、フッ素樹脂誘導体、ポリ乳酸誘導体、アクリル樹脂誘導体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体等などを用いることができる。
無機化合物としては、ガラス、セラミックス、コンクリートなどを用いることができる。
金属化合物としては、鉄、アルミニウム、銅やステンレスなどの合金を用いることができる。
【００７７】
上記の中でも、基板や培養器の素材の一部は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリエステルの中から選ばれる少なくとも一つから構成されていることが好ましい。
また、培養器、基板、貫通状構造体の素材が同一であっても良く、異なっていても良い。
また、閉鎖型の培養器を用いる場合には、受光面は、光が透過する素材である方が良く、透明材料であればさらに良い。
【００７８】
［培地（液体培地）］
本発明では、微細藻類を培養できる限り、公知のいかなる培地（液体培地）も使用することができる。公知の培地として、ＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＦ培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＫＭ培地、ＭＮＫ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＷＥＳＭ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地などを挙げることができる。このうち淡水性のものはＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地である。前述のＡＶＦＦ００７株を培養する培地としては、Ｃ培地、ＣＳｉ培地、ＣＨＵ培地、及びこれら培地の混合物が好ましい。なお、培地は、培養する微細藻類の種類に応じて選択することが望ましい。
【００７９】
培地は、紫外線滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌しても良く、しなくても良い。
培地は、前培養工程と本培養工程で異なる培地を使用しても良い。また、培養工程の途中で異なる培地に変更しても良い。
【００８０】
［糖］
また、培地に微細藻類が資化可能な糖を含有させても良い。糖を含有していると、微細藻類の増殖速度、オイル含有量の中から選ばれる少なくとも一つを向上させることができる場合があるからである。また、糖と光の両方を使用しても良く、光を使用せずに糖のみを使用しても良い。本発明で用いることのできる糖とは、単糖、二糖、三糖もしくは多糖の少なくとも一つを含むものである。単糖としては、公知のいかなるものも用いることができるが、ガラクトース、マンノース、タロース、リボース、キシロース、アラビノース、エリトロース、トレオース、グリセルアルデヒド、フルクトース、キシルロース、エリトルロースなどを用いることができる。二糖としては、公知のいかなるものも使用することができるが、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトースなどを用いることができる。また、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖のいずれも用いることができる。多糖としては、デンプン、アミロース、グリコヘゲン、セルロースなどを用いることができ、その他、オリゴ糖として、ガラクトオリゴ糖やデオキシリボース、グルクロン酸、グルコサミン、グリセリン、キシリトールなどを用いることができる。
【００８１】
培地中の糖の濃度としては、０．１μｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以上が最も好ましい。０．１μｇ／ｍＬ以上であると、微細藻類の増殖速度を好適に向上させることができることから好ましい。また、上限は特に設けないが、好ましくは、溶解度以下、より好ましくは、溶解度の半分以下、さらに好ましくは、溶解度の１／１０濃度である。なお、糖の濃度とは、培養を開始する直前の濃度のことであり、培養中の糖の濃度は、継続的に変化することが多い。また、培養器が上段であるほど、糖の濃度を薄くしても良い。これは、エネルギー源として、光を利用できる可能性が高くなるからである。
【００８２】
糖としては、単一種の糖を用いても良いし、二種以上の糖を用いても良い。
【００８３】
本発明では、光と糖との両方を用いることもできるし、光を用いずに糖だけで培養することも可能である。
糖を用いた場合には、光と二酸化炭素を用いた場合と比較して、微細藻類以外のバクテリアの増殖速度も向上するために、閉鎖型培養器を用いる方が好ましい。すなわち、開放型培養器を用いた場合、外気中のバクテリアが混入し、培地中の糖を消費してしまう。
また、光と糖、光と二酸化炭素と糖、二酸化炭素と糖との組み合わせで培養を行っても良い。
【００８４】
また、本発明では、微生物の代謝などによって生成された糖を用いることもできる。さらに、培養器外の微生物の代謝によって生成された糖を用いることもできるし、微細藻類と微生物とを同時に培養し、微生物の代謝などによって生成された糖を用いることも可能である。
【００８５】
［二酸化炭素］
多くの微細藻類の培養には、二酸化炭素の供給が必要である。
前培養工程で分散培養を行った場合には、従来のようにバブリングによって二酸化炭素を培地中に供給しても良いが、液面浮遊培養を行った場合には、二酸化炭素を気相中から供給した方が好ましい。これは、培地中に二酸化炭素をバブリングなどの方法で供給すると液面上の微細藻類バイオフィルムの構造が破壊され、藻体量の斑が発生し、回収工程で基板上へのバイオフィルム回収効率が悪く、回収藻体量が減少する可能性があるからである。
【００８６】
本発明では、大気中の二酸化炭素の利用も可能であるが、大気濃度よりも高濃度の二酸化炭素を利用することもできる。この場合には、拡散による二酸化炭素の損失を防ぐために、閉鎖型の培養器または農業用フィルムなどの被覆物で覆った培養器中で培養することが望ましい。この場合の二酸化炭素の濃度は本発明の効果が達成できる限り特に限定しないが、好ましくは大気濃度以上、２０体積％未満であり、好ましくは０．０１〜１５体積％であり、より好ましくは０．１〜１０体積％である。また、二酸化炭素は、燃焼装置によって排出された二酸化炭素であってもよい。また、試薬によって二酸化炭素を発生させてもよい。
【００８７】
［光源及び光量］
本発明で用いることのできる光源は、公知のいかなる光源も用いることができるが、太陽光、ＬＥＤ光、蛍光燈、白熱球、キセノンランプ光、ハロゲンランプなどを用いることができ、この中でも、自然エネルギーである太陽光、発光効率の良いＬＥＤ、簡便に使用することのできる蛍光燈を用いることが好ましい。
【００８８】
光量は、１００ルクス以上１００万ルクス以下であることが好ましく、３００ルクス以上５０万ルクス以下がさらに好ましい。最も好ましい光量は、１０００ルクス以上２０万ルクス以下である。光量が１０００ルクス以上であると、微細藻類の培養が可能であり、２０万ルクス以下であると、光障害による培養への悪影響が少ない。
光は、連続照射、ある一定の時間間隔で照射と非照射を繰り返す方法のいずれでもかまわないが、１２時間間隔で光をＯＮ、ＯＦＦすることが好ましい。
【００８９】
光の波長は、光合成が行える波長であれば、どの様な波長でも用いることができ、その制限を設けないが、好ましい波長は、太陽光または太陽光に類似の波長である。単一の波長を照射することで光合成生物の育成速度が向上する例も報告されており、本発明でもこの様な照射方法を用いることもできる。
【００９０】
［その他培養条件］
本発明では、前培養工程や本培養工程で使用する液体培地（以下、液体培地のことを培養溶液とも言う）のｐＨは１〜１３の範囲内であることが好ましく、３〜１１の範囲内でることがより好ましく、５〜９の範囲内であることがさらに好ましく、６〜８の範囲内であることが最も好ましい。
【００９１】
また、微細藻類の種類に応じて、好適なｐＨは変化することから、微細藻類の種類に応じたｐＨを選択することが好ましい。なお、液体培地のｐＨとは、培養開始時のｐＨのことである。また、培養工程内のｐＨとは、培養に伴って変化する場合があることから、培養工程内でｐＨは変化しても良い。
【００９２】
本発明では、培地中のｐＨを一定に保つ緩衝作用を持った物質を培地中に添加することができる。これにより、微細藻類の培養の進行とともに培地中のｐＨが変化する問題を抑制することや、培地中への二酸化炭素の供給でｐＨが変化する現象を抑制できる場合がある。緩衝作用を持った物質としては、公知の物質を使用することができ、その使用には制限がないが、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）や、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などを好適に用いることができる。これら、緩衝物質の濃度や種類は、微細藻類の種類や培養環境に応じて決めることができる。
【００９３】
培養温度は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、０℃以上９０℃以下であることが好ましく、１５℃以上５０℃以下がより好ましく、２０℃以上４０℃未満が最も好ましい。培養温度が２０℃以上４０℃未満であると、微細藻類を好適に増殖させることができる。
【００９４】
微細藻類の下限投入微細藻類量、すなわち、培養開始時に使用する微細藻類量は、培養範囲内において１個あれば、時間をかけさえすれば増殖は可能であるため、その制限は特に設けないが、好ましくは１個／ｃｍ3以上であり、より好ましくは１０００個／ｃｍ3以上であり、さらに好ましくは１×１０４個／ｃｍ3以上である。微細藻類の上限投入微細藻類量は、どの様な高濃度でも増殖が可能であるため、その制限は特に設けないが、ある濃度以上であると微細藻類量が多ければ多いほど、投入微細藻類量と増殖後の微細藻類量の比が低下することから、１×１０９個／ｃｍ3以下が好ましく、１×１０８個／ｃｍ3以下がより好ましく、５×１０７個／ｃｍ3以下がさらに好ましい。
【００９５】
本発明での前培養期間、本培養期間は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定しないが、１日以上３００日以下が好ましく、３日以上１００日以下がより好ましく、７日以上５０日以下がさらに好ましい。
【００９６】
液面浮遊培養で使用する液体培地の水深は、特に限定しないが、水深は浅い方が好ましい。これは、水の使用量が少なく、ハンドリング効率が良くなるからである。また、培養器全体の高さを低くすることができることから、多段培養がしやすくなる。水深は０．４ｃｍ以上が好ましく、１．０ｃｍ〜１０ｍがより好ましく、２．０ｃｍ〜１ｍがさらに好ましく、４．０ｃｍ〜３０ｃｍが最も好ましい。水深が０．４ｃｍ以上であるとバイオフィルムの形成が可能となり、水深が１０ｍ以下であると、ハンドリングが容易である。水深が、４．０ｃｍ〜３０ｃｍであると、水分の蒸発による影響が最小限であり、培地や微細藻類を含む溶液のハンドリングが容易である。
【００９７】
［培地の置換］
微細藻類の培養において、藻体内外のオイル含有量など、有用物質の蓄積を促進させるために、培養途中で培地の置換を行うことが一般的に行われている。例えば、微細藻類のオイル含有量を増加させるために、培地中の窒素化合物やリン化合物などの栄養成分の濃度を下げた培地と置換することが行われている。
また、繰り返し培養を行う場合には、栄養成分が減少している場合が多く、その場合にも培地の置換を行うことができる。
【００９８】
培地の置換は、液面上の微細藻類と底面上の微細藻類との間の微細藻類の存在量が少ない領域から培地を吸い出し、再び同領域に対して培地を添加する方法が好ましい。また、培地を追加添加することで、添加前の培地と異なる組成の培地にしても良い。さらに、培地置換前後で、液面上の微細藻類バイオフィルムが培養器の壁面に付着していることがあるが、この部位をはがす処理をしても良い。これにより、培地置換に伴って、液面上の微細藻類バイオフィルムが破けたり、不必要な場所に付着したりすることで、培養が非効率になるのを防ぐことができるからである。液面上の微細藻類を種藻として利用せず、底面上の微細藻類を種藻として利用する場合には、上記の領域から培地の出し入れを行う必要はない。すなわち、底面上の微細藻類の構造を乱すことなく培地を置換する、もしくは、底面上の微細藻類の存在量を培養に悪影響を与えないように培地を置換することが好ましい。
【００９９】
新しい培地を添加する場合には、栄養成分を液体に溶解させた状態で添加しても良いし、固形分として添加しても良い。固形分として添加した場合には、培地を攪拌しなければならない場合があることから、液体に溶解させた状態で添加することの方がより好ましい。
培地の添加は、添加前の培養開始時に使用した培地と同一成分の培地を使用しても良いし、成分が異なる培地を添加しても良い。
【０１００】
［液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの大きさと増殖速度］
微細藻類バイオフィルムの大きさは０．１ｃｍ２以上であることが好ましく、１ｃｍ２以上がより好ましく、１０ｃｍ２以上がさらに好ましく、培養器の液面面積と等しいことが最も好ましい。０．１ｃｍ２以上であれば、培養開始時の微細藻類量に対する培養終了時の微細藻類量との比を短時間で大きくすることができることから好ましい。
また、微細藻類バイオフィルムは、培養領域内で複数個存在していても良い。
微細藻類バイオフィルムの厚さは、１μｍ〜１００００μｍの範囲であることが好ましく、１μｍ〜１０００μｍの範囲であることがより好ましく、１０μｍ〜１０００μｍの範囲であることが最も好ましい。１０μｍ〜１０００μｍの範囲であると、強度が高く、十分な量のバイオフィルムを収穫することができる。
【０１０１】
本発明に係るバイオフィルムが、フィルム状構造体の一部または複数の部分で気泡状に盛り上がることで形成された立体的な三次元状構造体である場合、培地の液面を基準とした該三次元状構造体の一般的な高さは、０．０１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲であることが好ましく、０．１ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であることがより好ましく、５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であることが最も好ましい。５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であると、含水率を十分に下げることができ、培養器の高さを低く抑えることができる。
また本発明にかかる微細藻類は、液面上における増殖速度が大きいことが好ましく、対数増殖期における増殖速度（すなわち、対数増殖期の期間における一日あたりの平均増殖速度）が、乾燥重量で０．１ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることが好ましく、０．５ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることがより好ましく、１ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることがさらに好ましく、３ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることが最も好ましい。微細藻類の対数増殖期における増殖速度は、乾燥重量で一般的に１０００ｇ／ｍ２／ｄａｙ以下である。なお、増殖速度は、培養器一台あたりの増殖速度を記載している。
【０１０２】
本発明に係るバイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は、０．００１ｍｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、０．１ｍｇ／ｃｍ２以上であることがより好ましく、１ｍｇ／ｃｍ２以上であることが特に好ましい。最も好ましくは、５ｍｇ／ｃｍ２以上である。単位面積あたりの乾燥藻体重量が大きい方が、得られるオイルなどのバイオマスの量が大きくなることが見込まれるからである。バイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は通常１００ｍｇ／ｃｍ２以下である。
また本発明の微細藻類としては、上記の構造や、上記範囲の面積、厚さ、高さ、増殖速度、単位面積あたりの乾燥藻体重量を有するバイオフィルムを液面上に形成可能な微細藻類であることが、上記と同様の理由で好ましい。
【０１０３】
［液面上の微細藻類バイオフィルムの転写法による回収］
転写法とは、液面上の微細藻類バイオフィルム（フィルム状構造体もしくは三次元状構造体）を基板に写し取る方法のことであり、付着の一種で、実質的に増殖を伴わない付着である。基板を液面に対して、平行、もしくは、それに近い角度になるように静かに挿入し、液面上の微細藻類バイオフィルムを基板の表面に付着させる。なお、挿入を行う際、基板を液面に対して若干斜めに挿入し、最終的に液面に対して平行にするようにすると、多くのバイオフィルムを少ない転写回数で回収でき好ましい。転写は、転写率が向上することから、複数回行っても良い。
また、転写法を用いた回収法は、図１、図２、図４、図５のいずれでも使用することができる。
また、基板として、貫通状構造体を使用することもできる。
【０１０４】
［液面上の微細藻類バイオフィルムの堆積法による回収］
図１の（ｄ）に示した様に、基板を用いて、液面上の微細藻類を回収する方法が堆積法による回収法である。図に示した様に、培養器の液面上のバイオフィルムに対して、基板を斜めに挿入し、バイオフィルム面をなぞるように挿引するとともに、基板の表面にバイオフィルムを堆積させながら回収する方法である。
図では、右側から左側に基板を移動させているが、基板の移動方向は、逆方向（すなわち、左側から右側への移動）でも良いし、複数回回収しても良い。複数回回収を行うことによって、回収率が向上するからである。複数回回収する場合には、バイオフィルムを付着させたままの基板を用いても良いし、新しい基板を準備して使用しても良い。また、図１では１枚の基板しか記していないが、複数枚の基板を同時に用いても良い。これにより、回収率が向上する。なお、この中で基板の強度が許す限り、一枚の基板を用い、回収したバイオフィルムを除去した後、次の回収に用いることが、回収装置の設置コストの面などから好ましい。また、基板の大きさ、液面に対する基板の角度や移動速度などは目的に応じて自由に設定することができる。
基板のサイズは、培養器のサイズに応じて適宜変更できるが、培養器の内壁の表面積よりも少し小さな基板を用いる方が好ましい。これにより、基板を移動している時に、培養器の内壁に対して不必要な接触を避けることができるとともに、液面上のバイオフィルムが、培養器と基板との間の隙間を通ることによる回収漏れが発生しにくくなる。
また、培養の状態によっては、培養器内の液面上で増殖している微細藻類バイオフィルムは、フィルム状から、ひだ状に培地内で成長することがある。この場合には、基板の液中への挿入深度を深くすることによって、ひだ状になったバイオフィルムを採取することもできる。また、回収の代表例として、図１を中心に記載したが、図２、図４、図５でも同様に回収することができる。
また、基板として、貫通状構造体を使用することもできる。
【０１０５】
［液面上の微細藻類バイオフィルムの回収量］
上述の回収方法は、液面上に形成されたバイオフィルムの７０％以上を回収することが好ましく、８０％以上を回収することがより好ましく、９０％以上を回収することが更に好ましく、９９％以上回収することが最も好ましい。液面上に形成されたバイオフィルムの回収率は、例えば、目視で確認することができる。
【０１０６】
［基板からの微細藻類バイオフィルムの脱着］
脱着は、回収の一部の工程である。基板上の微細藻類バイオフィルムを脱着する方法としては、基板上から微細藻類を剥がすことのできる方法であればいかなる方法を用いても良いが、水流を加えたり、基板を入れた容器を超音波処理したり、基板を入れた容器の蓋を閉めた後、激しく振ったり、高速振盪処理を行ったり、セルスクレーバーのようなものを用いたりすることで微細藻類バイオフィルムを基板から剥ぎ取ることができる。このうち、基板を傷つけない素材が使用されている治具、例えば、セルスクレーバーのようなものを用いて基板から微細藻類バイオフィルムを剥ぎ取る方法が好ましい。さらに、基板を傾けるだけで、基板上から微細藻類バイオフィルムを剥がすこともできる。本方法は、簡便であることから、最も好ましい方法である。また、基板は、何度でも再利用してもかまわない。
【０１０７】
また模式図では、３個の培養器に対して同時に回収を行っているが、回収時期を別々にしても良い。
また、図１の模式図では、基板を培養器外へと取り出してから、微細藻類バイオフィルムを脱着しているが、培養器の中で脱着してもかまわない。
【０１０８】
［乾燥藻体］
本発明における乾燥藻体は、本発明によって得られた微細藻類回収物を乾燥させたものである。
【０１０９】
当該微細藻類回収物を乾燥させる方法としては、微細藻類回収物中の水分を減らすことができる方法であれば、いかなる公知の方法を用いることができ、特に制限されない。例えば、微細藻類回収物を天日干しにする方法、微細藻類回収物を加熱乾燥させる方法、微細藻類回収物を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法、微細藻類回収物に乾燥空気を吹き付ける方法等があげられる。これらのうち、微細藻類回収物に含まれる成分の分解を抑制できる観点から凍結乾燥、短時間で効率的に乾燥できる観点から加熱乾燥または天日干しする方法が好ましい。
【０１１０】
［含水率］
本発明での含水率とは、回収物中に含まれる水分の重量を、回収物の重量で割って、１００を掛けたものである。本発明での微細藻類バイオフィルムの含水率は、９９〜６０％が好ましく、９５〜８０％がさらに好ましく、９０〜８５％が最も好ましい。なお、貫通状構造体を用いて培養した場合には、この限りではない。
分散培養で培養し、遠心分離機を用いて微細藻類を回収した場合の含水率は、一般的に９０％程度とされ、本発明での培養法によって得られた液面上バイオフィルムの含水率は、それよりも低く、従来法と比べて優れている点である。なお、フィルム状構造体よりも三次元状構造体の方が含水率は低い。これは、三次元状構造体の方が液面から離れており、かつ、光源に近く、ある程度の乾燥が進行していることが原因と推定している。
【０１１１】
［有用物質］
本発明での有用物質とは、微細藻類由来のバイオマスの一種で、バイオマスから抽出工程、精製工程などの工程を経由することによって得られた産業にとって有益な物質の総称である。この様な物質として、医薬品や化粧品や健康食品などの最終生成物や中間物や原料、化学合成物の原料、中間物や最終生成物、炭化水素化合物、さらにはオイル、アルコール化合物、水素やメタンなどのエネルギー代替物質、酵素、タンパク、核酸、糖やＤＨＡなどの脂質化合物、アスタキサンチンなどを含む。有用物質は、有用物質蓄積工程によって、微細藻類中に蓄積させることもできる。
［バイオマス及びオイル］
本発明でのバイオマスとは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などをあげることができる。藻類バイオマスには、微細藻類自体（バイオフィルム状であってもよい。）、有用物質を採取した後の微細藻類残滓が含まれる。
【０１１２】
本発明でのオイルとは、可燃性の流動性物質のことであり、主として、炭素、水素から構成された化合物のことであり、場合によっては、酸素原子、窒素原子などを含む物質のことである。オイルは、一般的に混合物であり、ヘキサンやアセトンなどの低極性溶媒を用いて抽出される物質である。その組成は、炭化水素化合物や脂肪酸、トリグリセリドなどから構成される場合や、これらから選ばれる複数種の組成から構成されている場合もある。また、エステル化して、バイオディーゼルとして使用することもできる。
【０１１３】
微細藻類回収物中に含まれる有用物質やオイルを採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。
【０１１４】
オイルの一般的な抽出方法は、最終回収物を加熱乾燥させて、乾燥藻体を得た後、細胞破砕を行い、有機溶媒を用いてオイルを抽出する。抽出したオイルは、一般的に、クロロフィルなどの不純物を含むため精製を行う。精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるもの、蒸留（例えば、特表２０１０−５３９３００に記載の蒸留方法）によるものなどがある。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
【０１１５】
また、超音波処理によって微細藻類を破砕したり、プロテアーゼや酵素などによって微細藻類を溶解したりした後、有機溶媒を用いて藻体内のオイルを抽出する方法もある（例えば、特表２０１０−５３０７４１に記載の方法）。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
また本発明に係るバイオフィルムは、バイオマスとしての有用性の観点から、オイル含有量が高いことが好ましい。具体的には、バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量が５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることが特に好ましい。バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量は通常８０質量％以下である。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］
前培養によって調製したＡＶＦＦ００７株の液面上の微細藻類バイオフィルムを培養器の内寸短辺と同一の幅を持つ厚さ１ｍｍのナイロン６フィルムを用いて堆積法にて回収し、これを５ｍＬのホモジナイズ用チューブ（株式会社トミー精工、ＴＭ−６５５Ｓ）に入れ、ビーズ式細胞破砕装置（ＭＳ−１００、トミー精工株式会社、ビーズは使用せず）にセットし、４２００ｒｐｍで２０秒間のホモジナイズ処理を３回行うことで、ＡＶＦＦ００７株の懸濁液ａを得た。
【０１１７】
懸濁液ａをＣＳｉＦＦ０３培地（図６）で希釈し、予め作製しておいた６６０ｎｍの吸光度と藻体数との関係式を用いて、６６０ｎｍの吸光度から藻体濃度を算出した。この濃度から、１×１０５個／ｍＬになるように、ＣＳｉＦＦ０３培地を用いて懸濁液ａを希釈し、１４００ｍＬの懸濁液ｂを得た。
【０１１８】
培養器として、スチロール角型ケース８型（アズワン株式会社、１−４６９８−０８）を８個準備し、それぞれの培養器に１７０ｍＬずつの懸濁液ｂを入れた。これを垂直に４個積み重ねた（図７、なお、図は培養２０日後の様子。）。すなわち、それぞれの段の間において、重なりを１００％とした。また、片方（図７の左方）は、側面から光が入らない様に側面全体を遮光板で覆い、もう片方（図７の右方）は、側面のうち短辺側の２面を遮光板で覆った。すなわち、前者は、上面のみから光が入射し、後者は、上面だけではなく、導光により側面からも光が入るようにした。なお後者の長辺側の面と遮光板との間隔は４．５ｃｍであった。
培養条件は、光量１５０００ルクス（１２時間ごとにＯＮ−ＯＦＦ制御）、温度２３℃、ＣＯ２濃度大気濃度を用いた。
この状態で、培養を１４日間行った。液面上の微細藻類バイオフィルムを堆積法によって回収後、懸濁処理をし、６６０ｎｍの吸光度を測定することで、藻体量とした。
【０１１９】
結果を図８に示した。凡例の数値が培養器の段数で、数値が少ないほど光源に近いことを意味している。”なし”は導光がない場合、”あり”は導光を行った場合の結果である。導光を行わない場合には、培養器が光源から遠ざかるほど液面上の藻体量は少なくなった。それでも、一段だけの培養器での藻体量よりも、全四段の合計藻体量は約２倍になった。一方、導光を行った場合には、第一段目と第二段目とがほぼ同等の藻体量となり、三段目、四段目も、導光なしのものと比べて藻体量は大幅に増加した。また、導光を行うことによって、藻体量は約３倍となった。
以上から、多段培養を行うことによって、面積あたりの藻体量を増加させることができることがわかった。また、導光を利用することで、光の有効活用を行うことにより、さらに藻体量を増加させることができることがわかった。
【０１２０】
［実施例２：糖を添加することによる下段の増殖速度の低下を抑制する方法］
実施例１と同様の方法で、前培養を行った。
実施例１と同様の方法で、多段培養を行った。ただし、導光は行わなかった。また、培地として、ＣＳｉＦＦ０４培地（図９）を用い、上方二段には、ＣＳｉＦＦ０４培地を、下方二段には、１０ｍｇ／ｍＬのグルコースを含むＣＳｉＦＦ０４培地を用いた。また、微細藻類バイオフィルムを回収後、凍結乾燥を行い、その重量を乾燥藻体量とした。また、藻類種として、ＦＦＧ０３９ｐ１株を用いた。オイル含有量は、ヘキサン抽出によって行った。また、得られた回収物の乾燥藻体重量（ｍｇ）と、そこから抽出したオイル重量（ｍｇ）からオイル含有量（％）を計算した。
【０１２１】
結果を、図１０に示した。グルコースを含まない上方２段では、２段目よりも１段目の方が藻体量は若干多くなった。これは、１段目の光量の方が高いことが原因と考えている。３段目と４段目には、培地中にグルコースが入っており、主として、グルコースをエネルギー源として増殖しているものと考えられる。すなわち、図８のようにグルコースを用いずに光だけで培養を行った場合には、光源から遠い培養器ほど光量不足により乾燥藻体量は低下するからである。すなわち、本実施例は、光の光量が低下する光源から離れた側の培養器へのグルコースの添加は有効であることを示している。オイル含有量も同様の結果となった。
【０１２２】
［実施例３：ステージをずらしながらの培養］
実施例１と同様の方法で、前培養を行った。
実施例１と同様の方法で、二段培養を行った。ただし、導光はしていない。また、培地として、ＣＳｉＦＦ０４培地を用い、図３に示したステージで培養を行い、上段の誘導期から培養を開始した。培養８日後に下段の培養を開始し、培養１４日後に上段の水面上の微細藻類を回収した。培養１６日後に上段の培養を開始し、培養２１日後に下段の微細藻類を回収した。培養２９日後に、上段の液面上の微細藻類を回収した。なお、上段のオイル蓄積期は、図２の（ｃ）の様に、基板を用いて、液面上及び底面上の微細藻類を培養器の一部の領域に集めた。乾燥藻体量は、実施例２と同様の方法で算出した。
【０１２３】
上段の最初の培養の乾燥藻体量は、７．４ｍｇ／ｃｍ２であった。次の培養は、６．６ｍｇ／ｃｍ２であった。下段の乾燥藻体量は、６．８ｍｇ／ｃｍ２であった。一方、上下同じ培養ステージで培養した場合には、上段が６．５ｍｇ／ｃｍ２、下段が４．５ｍｇ／ｃｍ２であった。
【０１２４】
以上から、培養ステージをずらしながら培養した場合には、１５日間で１３．８ｍｇ／ｃｍ２となり、培養ステージを同時にした場合には、１４日間で１１ｍｇ／ｃｍ２となった。後者を１５日相当として計算しなおすと、１１．８ｍｇ／ｃｍ２になることから、培養ステージをずらしながら培養することは、藻体量を増加させる方法として有効であることが示された。
なお、本実施例は、図３の培養ステージを用いたが、１枡が一日に相当する。
【０１２５】
［実施例４］
実施例１と同様の方法で、前培養を行った。
実施例１と同様の方法で、二段培養を行った。培養器は、図５のように設置した。ただし、下段は、スチロール角型ケース１０型（アズワン株式会社、１−４６９８−０５）を、上段は、スチロール角型ケース５型（アズワン株式会社、１−４６９８−１０）を用いた。また、下段は、短径の方を二台の培養器が接触する様に配置した。また、培地として、ＣＳｉＦＦ０４培地を用い、培養ステージは、上段を培養開始してから、７日後に上段の微細藻類を堆積法によって回収した後、下段左の培養器の水面上に微細藻類を播種し、直ちに、上段の培養を開始し、さらに培養７日後に、上段の水面藻を堆積法によって回収した後、下段の右側の培養器の水面上に、微細藻類を播種した。さらに、７日後、下段左側の培養器の水面上の微細藻類を回収し、さらに、７日後、下段右側の微細藻類を回収した。
【０１２６】
下段左側の乾燥藻体量は、７．２ｍｇ／ｃｍ２、下段右側の乾燥藻体量は、７．３ｍｇ／ｃｍ２となった。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号１：ＡＶＦ００７株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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