(57)【要約】【課題】心筋細胞への分化をモニタリングする方法を提供する。【解決手段】心筋細胞への分化をモニタリングする方法は、心筋細胞への分化能を有する細胞に、心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することを含む。この方法は、さらに、前記細胞を生存状態で維持し、前記細胞から放射される発光を撮像して発光画像を取得することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞への分化能を有する細胞に、心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することと、
前記細胞を生存状態で維持し、前記細胞から放射される発光を撮像して発光画像を取得することと
を含む心筋細胞への分化をモニタリングする方法。
【請求項２】
前記細胞の明視野画像を取得することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記明視野画像は動画を含み、
前記動画に基づいて運動解析を行うことをさらに含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記運動解析は、画像相関法を用いて行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記運動解析によって、前記細胞の拍動を解析することと、
前記発光画像に基づいて前記心筋分化マーカー遺伝子の発現を解析することと、
前記拍動と前記発現との関係性を評価することと、
をさらに含む請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記発光画像を取得することは、経時的に撮像することによって複数の前記発光画像を取得することを含み、
前記複数の発光画像に基づいて、前記細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を取得することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記発光量の変化を数値化することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
未分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することをさらに含む、請求項１乃至７のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子は、複数種類の前記心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成されている、請求項１乃至８のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は、幹細胞又は心筋前駆細胞である、請求項１乃至９のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、胚様体又は細胞シートの形態を有する、請求項１乃至１０のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の分化の状態を判定することをさらに含む、請求項１乃至１１のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の内部のカルシウム濃度を解析することをさらに含む、請求項１乃至１２のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞の電位を測定することをさらに含む、請求項１乃至１２のうち何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞への分化をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療の分野において、疾患部位や病変により失われた部位を再生させる再生医療が注目されている。このような再生医療の分野において、様々な細胞への分化能を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞を心筋細胞に分化させ、心筋梗塞などの疾患を持つ患者の治療に役立てようとする試みが注目されている。
【０００３】
しかしながら、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が各種の細胞に分化する仕組みには未だ不明な点が多い。分化の過程で遺伝子がどのように発現しているかを調べることは、分化プロセスを明らかにする上で非常に重要である。
【０００４】
遺伝子発現を解析する方法の一つとして、レポーター遺伝子を用いた転写活性測定の手法が挙げられる。転写活性測定の手法としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列やそれに結合する転写因子の解析が挙げられる。また、この手法には、特定のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現量を指標として、細胞内シグナル伝達経路の活性化状態の解析又は受容体−リガンドの解析など、様々な細胞内分子メカニズムの解析が挙げられる。この手法はまた、ドラッグ・ディスカバリーにおいて大規模スクリーニングのツールとして、また化学物質の毒性評価の指標として、使用されている。
【０００５】
一般に、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞の分化誘導プロセスにおける遺伝子発現の解析には、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を用いた蛍光イメージング、抗体染色、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリーなどの手法が用いられている。
【０００６】
しかし、蛍光イメージングは、励起光による光ダメージや自家蛍光の影響のため、遺伝子発現を長期間経時的かつ定量的に観察することが難しいという問題を有する。また、抗体染色やウェスタンブロッティングは、サンプルを固定する必要があるため、同じ対象の遺伝子発現を経時的に観察できないという問題点を有する。
【０００７】
近年、蛍光タンパク質を用いる蛍光イメージングに限らず、蛍などに代表される発光生物がもつ生物発光を用いた発光イメージングが行われている。生物発光は、種々の化学発光反応によって、生物またはそれらに由来する物質によって、可視光が放射される現象である。生物発光反応は、主にルシフェリン（基質）、ルシフェラーゼ（酵素）及び分子状酸素の３つの成分を必要とする。
【０００８】
ルシフェラーゼは、レポーター遺伝子として、細胞に与える外来因子の影響の評価、細胞内情報伝達の伝播、個々のタンパク質群の発現解析などに用いられている。ルシフェラーゼが用いられるシステムでは、例えば、まず転写活性領域にホタルルシフェラーゼ遺伝子が挿入される。次に、細胞内に遺伝子構築体が導入される。続いて、レポーター遺伝子が導入された培養細胞は、所定の時間、薬剤等で処理される。その後、細胞は回収され、発光基質が加えられる。その結果、細胞内で合成されたルシフェラーゼ量の測定、転写活性の評価が行われ得る。
【０００９】
一般に、ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイの転写活性の評価には、ルミノメーターが用いられている。しかしながら、ルミノメーターはウェルの中に存在する全細胞の発光を測定するものである。またプロトコルによっては細胞を溶解する必要がある。これらのため、ルミノメーターを用いたアッセイでは、個々の細胞の発光強度の変化を同じ細胞で経時的に測定することができない。
【００１０】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞の再生医療への利用においては、株ごとに遺伝子発現の度合いや性質が異なることが報告されている。このため、均一な性質の細胞を調整、維持することが課題となる。そこで、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の分化誘導過程において、遺伝子がどのように発現しているかを個別の一細胞レベルで明らかにする必要がある。
【００１１】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞をイメージングする技術が、特許文献１や特許文献２に開示されている。しかし、特許文献１及び特許文献２に開示されている技術は、複数の幹細胞の遺伝子発現の総和をルミノメーターにより測定する技術であったり、幹細胞をマウス体内に移植して生体内でイメージングを行う手法であったりする。すなわち、特許文献１及び特許文献２に開示されている技術は、個々の細胞レベルでの遺伝子発現をイメージングするものではない。
【００１２】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞の分化や、分化に関与する遺伝子の発現をモニタリングする技術が、特許文献３に開示されている。特許文献３に開示されている技術では、抗体染色法が用いられている。この場合、細胞を固定する必要があり、エンドポイントのデータしか得られない。さらに、抗体染色時の検出法として蛍光が用いられている。細胞シートや胚様体などの集積構造を有する細胞は、強い自家蛍光を持つ。このため、蛍光を用いた定量的な解析は、困難な場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０２９７９８号
【特許文献２】国際公開第２００７／０８０６２２号
【特許文献３】国際公開第２０１０／１０１２２５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、心筋細胞への分化誘導を可視化及び解析するといった、心筋細胞への分化をモニタリングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、心筋細胞への分化をモニタリングする方法は、心筋細胞への分化能を有する細胞に、心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することと、前記細胞を生存状態で維持し、前記細胞から放射される発光を撮像して発光画像を取得することとを含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、心筋細胞への分化誘導を可視化及び解析するといった、心筋細胞への分化をモニタリングする方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一実施形態に係る心筋細胞への分化をモニタリングする方法の概略を示すフローチャートである。
【図２】一実施形態に係る発光画像に基づく遺伝子発現の解析と明視野連続画像に基づく機能発現の解析とを同時に行えるシステムの構成例の概略を示す図である。
【図３】マウスＥＳ細胞由来の胚様体にＧＦＰ用の励起光を照射した際の自家蛍光を示す画像であり、明視野画像である。
【図４】マウスＥＳ細胞由来の胚様体にＧＦＰ用の励起光を照射した際の自家蛍光を示す画像であり、蛍光画像である。
【図５】心筋特異的に発現するｃＴｎＴのプロモーターにルシフェラーゼを繋いだレポーターベクターを導入したマウスＥＳ細胞由来の胚様体が心筋に分化する過程でのｃＴｎＴ発現を示す画像であり、明視野画像である。
【図６】心筋特異的に発現するｃＴｎＴのプロモーターにルシフェラーゼを繋いだレポーターベクターを導入したマウスＥＳ細胞由来の胚様体が心筋に分化する過程でのｃＴｎＴ発現を示す画像であり、発光画像である。
【図７】心筋特異的に発現するｃＴｎＴのプロモーターにルシフェラーゼを繋いだレポーターベクターを導入したマウスｉＰＳ細胞由来の胚様体が心筋に分化する過程でのｃＴｎＴ発現を示す画像であり明視野画像である。
【図８】心筋特異的に発現するｃＴｎＴのプロモーターにルシフェラーゼを繋いだレポーターベクターを導入したマウスｉＰＳ細胞由来の胚様体が心筋に分化する過程でのｃＴｎＴ発現であり、発光画像である。
【図９】マウスｉＰＳ細胞由来の胚様体が心筋へ分化していく過程のｃＴｎＴの発現を経時的に観察した明視野画像である。
【図１０】マウスｉＰＳ細胞由来の胚様体が心筋へ分化していく過程のｃＴｎＴの発現を経時的に観察した発光画像である。
【図１１】ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４を示す図である。
【図１２】図１０で示したマウスｉＰＳ細胞由来の胚様体が心筋へ分化していく過程のｃＴｎＴの発現を経時的に観察した発光画像の発光強度の変化を示す図であり、図１１に示したＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４について解析した結果である。
【図１３】画像相関法による細胞の拍動の解析を行った領域を示す図である。
【図１４】観察開始後９１時間後について、明視野連続画像を用いた画像相関法による解析を行った結果を示す図である。
【図１５】観察開始後６６時間後、７１時間後、７６時間後、８１時間後、８６時間後、及び９１時間後における明視野画像、発光画像に画像相関法による解析結果を重畳した画像、及び拍動強度を示す画像を表す図である。
【図１６Ａ】観察開始７６時間後の、細胞の明視野画像に画像相関法による解析結果を重畳した画像と、拍動強度を示す画像とを表す図である。
【図１６Ｂ】観察開始７６時間後の各解析点における速度の経時変化を表す図である。
【図１６Ｃ】観察開始７６時間後の第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２との速度の関係を示した図である。
【図１６Ｄ】観察開始７６時間後の第１の点Ｐ１と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１６Ｅ】観察開始７６時間後の第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１６Ｆ】観察開始７６時間後の速度の自己相関を示す図である。
【図１６Ｇ】観察開始７６時間後の速度の相互相関を示す図である。
【図１７Ａ】観察開始８１時間後の、細胞の明視野画像に画像相関法による解析結果を重畳した画像と、拍動強度を示す画像とを表す図である。
【図１７Ｂ】観察開始８１時間後の各解析点における速度の経時変化を表す図である。
【図１７Ｃ】観察開始８１時間後の第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２との速度の関係を示した図である。
【図１７Ｄ】観察開始８１時間後の第１の点Ｐ１と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１７Ｅ】観察開始８１時間後の第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１７Ｆ】観察開始８１時間後の速度の自己相関を示す図である。
【図１７Ｇ】観察開始８１時間後の速度の相互相関を示す図である。
【図１８Ａ】観察開始８６時間後の、細胞の明視野画像に画像相関法による解析結果を重畳した画像と、拍動強度を示す画像とを表す図である。
【図１８Ｂ】観察開始８６時間後の各解析点における速度の経時変化を表す図である。
【図１８Ｃ】観察開始８６時間後の第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２との速度の関係を示した図である。
【図１８Ｄ】観察開始８６時間後の第１の点Ｐ１と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１８Ｅ】観察開始８６時間後の第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１８Ｆ】観察開始８６時間後の速度の自己相関を示す図である。
【図１８Ｇ】観察開始８６時間後の速度の相互相関を示す図である。
【図１９Ａ】観察開始９１時間後の、細胞の明視野画像に画像相関法による解析結果を重畳した画像と、拍動強度を示す画像とを表す図である。
【図１９Ｂ】観察開始９１時間後の各解析点における速度の経時変化を表す図である。
【図１９Ｃ】観察開始９１時間後の第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２との速度の関係を示した図である。
【図１９Ｄ】観察開始９１時間後の第１の点Ｐ１と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１９Ｅ】観察開始９１時間後の第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３との速度の関係を示した図である。
【図１９Ｆ】観察開始９１時間後の速度の自己相関を示す図である。
【図１９Ｇ】観察開始９１時間後の速度の相互相関を示す図である。
【図２０】観察開始からの経過時間と決定係数との関係を示す図である。
【図２１】観察開始からの経過時間と拍動強度及び発光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態について説明する。本実施形態は、心筋細胞への分化をモニタリングする方法に関する。本実施形態に係る方法の概略を図１に示す。
【００１９】
ステップＳ１に示すように、本方法は、心筋細胞への分化能を有する細胞に、心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することを含む。心筋分化マーカーとは、例えば心筋分化の過程で発現する遺伝子である。心筋分化マーカーには、異なる複数の遺伝子が含まれ得る。
【００２０】
本実施形態に係る方法では、心筋細胞への分化能を有する少なくとも１つの細胞を、心筋分化マーカー遺伝子及び／又は未分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することを含む。本実施形態に係る方法は、さらに緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を併用することを含んでもよい。本実施形態に係る方法は、心筋細胞の拍動を解析すること、心筋細胞内のカルシウムイオンの変化を調べるためのカルシウムイメージング、心筋の活動電位の測定などを含んでもよい。ここで、拍動とは、互いに接着した細胞集団が協調して収縮と弛緩を繰り返すことによる細胞集団単位の周期的運動をいう。拍動現象は、細胞集団に属する個々の細胞の位置が、一定の軌道上を周期的に移動することによって認識され得る。顕微鏡による観察では、個々の細胞は典型的には一定の直線上を往復するように観察される。拍動現象は、同一の細胞集団が同一の周期で運動することと、個々の細胞が周辺の細胞と類似した方向・大きさで運動することとの２点によって、拍動以外の位置変位と明確に区別され得る。
【００２１】
撮影画像によって拍動を認識するためには、収縮及び弛緩の過程に要する時間に比べて早いフレームレートによって連続的に撮影された連続画像（動画）が必要である。各フレームにおける個々の細胞位置は、前後の時間のフレーム画像を手がかりとして、手動又は各種の画像認識手法によって決定することができる。また、個々の細胞位置を特定せずに、画像の明暗パターンの運動をオプティカルフローや画像相関法などの手法によって解析することによっても拍動を認識することが可能である。カルシウムイメージングは、ｏｂｅｌｉｎなどのカルシウム応答性ルシフェラーゼを細胞に導入し、細胞内のカルシウム応答をイメージングすることを含む。心筋の活動電位の測定とは、電位測定用の電極を細胞に触れさせた状態で、拍動時の細胞の電位の変化を測定するものである。
【００２２】
細胞は、種々の生物に由来する細胞であり得る。細胞は、例えば、多細胞生物に由来する細胞であり得る。細胞は、特に、ヒトやマウスといった哺乳類に由来する細胞であり得る。細胞は、培養細胞であってもよい。細胞は、単一の種類であってもよい。また、細胞は、複数の種類を含んでもよい。
【００２３】
また、細胞は、細胞シートなど層状の構造を有していてもよい。細胞は、分化能を有する。すなわち、細胞は、未分化の状態の細胞であり、少なくとも心筋への分化能を有する。また、細胞は、ある程度分化しているものの、更に心筋に分化し得る状態の、例えば前駆細胞といった細胞であり得る。細胞は、本実施形態の実施において時間経過とともに分化が進行してよい。細胞は、本実施形態における最初の段階において、心筋への分化能を有する細胞である。細胞は、例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞などの幹細胞から分化した細胞を含む。細胞は、例えば、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を含む。
【００２４】
心筋分化マーカー遺伝子及び／又は未分化マーカー遺伝子は、例えば、その遺伝子が発現すること及び／又は発現しないことに基づいて細胞の心筋への分化の状態を判定することが可能となる遺伝子である。これらの遺伝子は、心筋分化に関連する遺伝子であり、分化の開始前に、分化の進行に伴って及び／又は分化の完了後に、発現が変動する。これらのマーカー遺伝子は、対象とする細胞が本来有する遺伝子であることが好ましい。また、これらのマーカー遺伝子は、対象とする細胞の由来する生物とは異なる生物のホモログ遺伝子であっても良い。例えば、マウスの細胞でヒトの同等機能のマーカー遺伝子、ヒトの細胞でマウスの同等機能のマーカー遺伝子であってもよい。
【００２５】
心筋分化マーカー遺伝子は、例えば、心筋細胞に特異的に、又は細胞が心筋細胞に分化したときに特異的に発現する遺伝子である。心筋分化マーカー遺伝子は、例えば、ｃＴｎＴ、ＧＡＴＡ４、ＮＣＸ１などを含む。未分化マーカー遺伝子は、例えば、幹細胞が未分化な状態において発現する遺伝子である。未分化マーカーは、例えばＮａｎｏｇ、Ｔｃｆ３といった未分化マーカー遺伝子を含む。
【００２６】
心筋分化マーカー遺伝子及び／又は未分化マーカー遺伝子は、例えば、その発現に依存して発光タンパク質の発現が促進されるように設計されている。例えば、細胞が有する核酸において、これらのマーカー遺伝子のための転写因子結合領域の下流に、発光タンパク質の遺伝子が配置され得る。この場合、本来マーカー遺伝子の発現を制御するための転写因子が、この転写因子結合領域に結合することで、発光タンパク質の遺伝子の発現が促進される。
【００２７】
発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質の一例として、ルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは、ＡＴＰが存在する場合に、基質であるルシフェリンの酸化反応を触媒する。この反応の際、ルシフェリンが発光する。
【００２８】
ルシフェラーゼは、ホタルやバクテリアといった種々の生物に由来するものであってよい。ルシフェラーゼは、例えば、緑色の発光を生じさせるＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光を生じさせるＣＢＲルシフェラーゼ、青色の発光を生じさせるウミシイタケルシフェラーゼなどであり得る。これらルシフェラーゼの遺伝子は、市販されているものであってよい。ルシフェラーゼ遺伝子を予め含有する市販のベクターの例として、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃ  ｖｅｃｔｏｒ（東洋紡）、ＣＢＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｎａｎｏ−Ｌｕｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
【００２９】
心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入することとは、例えば、上述したように、マーカー遺伝子の転写因子結合領域と、その下流に位置する発光タンパク質の遺伝子とを含む核酸を細胞に導入することである。マーカー遺伝子の転写因子結合領域と発光タンパク質とのセットは、複数使用されていてもよい。複数使用される場合、これらの複数のセットは互いに異なるものであってもよい。
【００３０】
ステップＳ２に示すように、本実施形態に係る方法は、細胞を生存状態で維持し、細胞から放射される発光を撮像して発光画像を取得することを含む。すなわち、細胞が標識された後、細胞は生存状態で維持される。この状態で、発光画像が取得される。細胞が生存状態で維持されるとは、例えば、細胞が固定されていない状態である。好ましくは、細胞は、分化し得る状態に維持される。また、細胞は、未分化の状態に戻り得る状態にされる。具体的には、細胞は、ＬＩＦ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ  Ｃ、Ｃｙｃｒｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａなどが添加された培地において培養される。あるいは、細胞は、分化が阻害される条件下で培養され、例えば、分化の阻害剤が添加された培地において培養される。
【００３１】
発光は経時的に撮像され、複数の画像が取得され得る。本実施形態では、発光を撮像することにより得られた画像を発光画像と称することにする。発光画像は、発光する細胞に由来する発光シグナルが検出された領域と、発光しない細胞及び細胞が存在しない部分に由来する発光シグナルが検出されない領域とを含む。このため、細胞毎又はコロニー毎の発光を推定することができる。またマイクロウェルプレート等のマルチウェル容器や、複数のディッシュ等を併用することで、多数の試料に対してそれぞれ発光画像の取得を行ってもよい。複数の観察を並行して行うことで、化合物、増殖因子、ｓｉＲＮＡ等の添加物の有無、また添加物の濃度依存性の比較評価が行われ得る。さらに、複数の反応容器を用いることで、実験の再現性の検討も可能となる。
【００３２】
撮像は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光のみを主に透過させるフィルターと、光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す処理手段とを含む装置を用いて行われ得る。発光画像を取得するための装置の例は発光イメージングシステムである。発光イメージングシステムは、例えば、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を含む。
【００３３】
ステップＳ３に示すように、本実施形態に係る方法は、細胞の明視野画像を取得することをさらに含み得る。明視野画像とは、例えば、幹細胞に対して照射された照明光が幹細胞を反射及び／又は透過して生じる光を撮像することにより得られる画像である。すなわち発光に基づくことなく、幹細胞の位置及び形態等が観察され得る。明視野画像は、位相差画像や微分干渉観察画像（ＤＩＣ観察画像）を含む。明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得され得る。あるいは、明視野画像は、発光画像の取得からは独立して、任意のタイミングで取得され得る。また、明視野画像は、動画としての連続画像であってもよい。
【００３４】
ステップＳ４に示すように、撮像が繰り返されるかが判定され、撮像は経時的に行われ得る。すなわち、撮像は、任意の間隔で連続的に行われ得る。例えば、撮像は、１分から１時間の間隔で行われ得る。また、１回の撮像の時間は任意に設定され得る。１回の撮像時間は、十分な発光シグナルが検出されるように調整され得る。
【００３５】
ステップＳ５に示すように、本実施形態に係る方法は、発光画像の取得に続き、発光画像に基づいて、細胞の分化の状態が識別可能となるように、発光量の変化を解析することをさらに含み得る。すなわち、複数の発光画像から発光量の変化が読み取られ、分化状態を識別できる表現形式に変換され得る。例えば、発光量の変化が、視覚的に確認できるように表現され得る。例えば、測定した時点の発光量は、その測定時間とともに記録され、表としてまとめられ得る。あるいは、測定した時点の発光量を、経過時間−発光量の平面上にプロットすることで、発光量の変動がグラフとして表現され得る。
【００３６】
複数の発光画像から発光量の変化が読み取られる際、その変化を細胞毎に読み取ることができる。例えば、１つの発光画像において読み取るべき細胞を選択した後、その他の発光画像からも同じ細胞を選択して、発光量の変化を読み取ることができる。そのような選択は、例えば、コンピューター上で実行されるプログラムを用いて行うことができる。この場合、１つの発光画像において、細胞を含む領域を四角で囲むことで、又はフリーハンドで囲むことで関心領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）が指定される。その他の画像においてもこの関心領域が追跡される。指定された領域について、例えばコンピューター上のプログラムを用いて発光量が数値化され、記録される。ＲＯＩは１つの発光画像内において複数選択されてよい。
【００３７】
ステップＳ６に示すように、本実施形態に係る方法は、細胞の分化の状態を判定することをさらに含み得る。選択された一つ又は複数の領域の遺伝子の発現は、発光量の変化として解析され得る。選択した複数領域の発光量の比較が行われることで、細胞又は領域ごとの発光量変化の比較が行われてもよい。複数の異なる遺伝子の発現を解析する場合、例えばそれぞれの遺伝子のマーカーとして赤色と緑色といった色の異なるルシフェラーゼを用いて、各々のルシフェラーゼの発光量の比較を行うことで、各遺伝子の発現量の違いを検出してもよい。また異なるルシフェラーゼの発光量を経時的に観察することで、各遺伝子発現の比率の変動を調べてもよい。
【００３８】
本実施形態に係る方法は、可視化された心筋細胞への分化誘導に関する情報から、心筋分化の状態と心筋分化マーカー遺伝子及び／又は未分化マーカー遺伝子の発現量との関係を判定することを含み得る。この方法では、例えば、得られた情報に基づいて、分化の状態とマーカー遺伝子の発現量との関係式が得られる。さらに、そのような関係式から、ある発現量を示すときの分化の状態が特定され得る。細胞の分化の状態の判定には、細胞の明視野画像が利用されてもよい。
【００３９】
本実施形態によれば、例えば以下のような効果が得られる。この方法によれば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞における遺伝子発現を生きた細胞で観察することが可能となる。生存状態で細胞を観察することで、心筋細胞に分化する際の遺伝子発現の過程が観察され得る。
【００４０】
このとき、観察が発光イメージングを用いて行われることで、高い定量性が実現され得る。また、幹細胞から心筋細胞に分化する過程の遺伝子発現を長時間経時的に観察することが可能になる。この方法において、細胞毎に観察を行うことにより、細胞群内における状態のバラツキに左右されることなく、細胞毎の状態を可視化することができる。発光観察が行われることで、例えば胚様体のような自家蛍光が強い標本においても、定量的な解析が行われ得る。励起光を照射することによる光毒性が含まれる蛍光を用いた観察に比べて、本方法によれば、細胞へのダメージを小さくしつつ高精度で長時間細胞を観察することができる。
【００４１】
本方法のように遺伝子発現を観察することによって、例えば拍動のみを観察することで心筋細胞への分化を解析する場合に比べて、より多くの情報を取得することができる。
【００４２】
この方法において、明視野画像を取得して光を放射する細胞の位置を確認することによって、発光画像だけからは判断できない細胞の状態を確認することができる。例えば、観察する領域に、細胞が存在しているのか、存在していないのかを確認することができる。また、観察している細胞が生きているのか、死んでいるのかなどを確認することができる。また、細胞が分裂している段階か否かを確認することができる。分裂の影響で細胞が移動する可能性がある。また、細胞が分裂して２つに分かれることで１つの細胞が含む発光タンパク質の量が一時的に減少したり、細胞分裂が縦方向に生じることで焦点の合っている位置から細胞がずれて発光シグナルが低下したりすることがある。このような細胞の状態は発光画像だけで判断することは難しい。このため、明視野画像に基づいて分裂の状態を確認することは重要である。このように明視野画像を取得することで、発光画像の有効性が補強される。
【００４３】
この方法において、少なくとも胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含む幹細胞から分化した細胞を観察の対象とすることにより、再生医療等への応用において重要な分化に関する情報を得ることができる。
【００４４】
複数のマーカーを用いることにより、例えば分化の各過程を識別することができる。このとき、発光を利用することにより、蛍光を用いる場合よりも実験系のデザインの自由度が高まる。
【００４５】
本方法に含まれる解析によれば、細胞の分化の状態が正確に判定され得る。これらの情報により、幹細胞の心筋分化のメカニズム解明や心筋再生医療への応用を促進することができる。
【００４６】
本方法において、細胞の拍動の解析や、カルシウム濃度の解析や、細胞電位の解析がさらに含まれることで、取得される情報量が増加し、細胞の心筋細胞への分化についてさらに多くの情報が得られる。
【００４７】
本方法は、動画としての明視野連続画像の取得を含み、この動画に基づいて、細胞の拍動といった運動解析を行うことをさらに含み得る。一般に、画像に基づいて物体の運動を解析する方法が知られている。このような運動解析の手法には様々なものがある。例えばコンピュータビジョンでしばしば用いられるオプティカルフローや、流体力学に関する解析でしばしば用いられる相関解析といった手法がある。相関解析では、画像の相関関数の演算から物質の流速が求められる。このような方法は、画像相関法と呼ばれている。
【００４８】
画像相関法には、同一の撮像素子に二重露光した画像の自己相関関数を演算する方法と、異なる時刻に撮影された２枚の画像の相互相関関数を演算する方法とがある。撮像素子の進歩に伴い、高速に画像を取得することが容易となったため、相互相関関数を用いることが主流となっている。
【００４９】
例えばＷｅｉｓｍａｎらは、細胞移動に伴う足場タンパク質の移動を解析するために、時空間画像相関分光法（Ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＴＩＣＳ）を開発した（B. Hebert et al. (2005), “Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells”, Biophys. J. 88, 3601-3614.）。例えばＳＴＩＣＳといった画像相関法では、画像の中の濃淡を検出するので、細胞のような輪郭がはっきりしない画像をも解析対象とすることができる。この点は、特徴点等を利用するオプティカルフロー等の解析と比較して、細胞等を解析対象とすることに特に効を奏する。
【００５０】
ＳＴＩＣＳについて簡単に説明する。なお、ここで説明するＳＴＩＣＳは画像相関法の一例であり、適宜、改変が加えられてもよいし、画像間の相関を求める処理を含む別の方法が用いられてもよい。説明のため、連続画像の空間座標ｘ及びｙと時間座標ｔとを整数として取り扱う。撮影倍率と撮影間隔から決定する比例係数を掛けることにより、容易に試料の実際の位置及び撮影時間に換算できる。また、ここでは画像は二次元であるものとして説明するが、立体的な情報を持つ三次元画像に対しても、容易に拡張可能である。
【００５１】
試料を、画像の大きさをＭ×Ｍピクセルとして一定時間間隔で撮影して、動画としてのＮ枚の連続画像を取得する。このＮ枚の連続画像から時間間隔τである２枚１組の画像について画像相関演算を行う。Ｎ枚の連続画像からは、（Ｎ−τ）組の画像について画像相関演算が行われる。次に、画像相関演算によって得られた（Ｎ−τ）枚の相関像を平均した平均画像相関像を求める。平均画像相関像は、それぞれの相関像の対応するピクセル位置の画像データを加算して平均値を演算することで求められる。
【００５２】
以上の処理を数式で表すと次のようになる。時刻ｔに取得された座標（ｘ，ｙ）における画像の信号強度がＩ（ｘ，ｙ；ｔ）であるとき、平均画像相関は、次式（１）で表される。
【００５３】
【数１】
2015077122.tif 000003
【００５４】
ここで、δＩ（ｘ、ｙ；ｔ）は、信号強度の変動値であり、次式（２）で表される。
【００５５】
【数２】
2015077122.tif 000004
【００５６】
式（１）、式（２）中の＜Ｉ（ｘ，ｙ；ｔ）＞は、Ｍ×Ｍピクセルの大きさの画像のｘ及びｙについて画像データを平均化することを示している。すなわちｘ，ｙ，ｔの関数Ｆに対して、＜Ｆ（ｘ，ｙ；ｔ）＞は次式（３）で定義される。
【００５７】
【数３】
2015077122.tif 000005
【００５８】
なお、ｘ及びｙについて、周期的境界条件、すなわち、整数ｎ及びｍについて、Ｆ（ｘ＋ｎＭ，ｙ＋ｍＭ；ｔ）＝Ｆ（ｘ，ｙ；ｔ）が成立する場合は、式（１）の分子に記載される相互相関関数はフーリエ変換を用いて高速に計算され得る。
【００５９】
また、時間とともに試料中の発現分布が移動することを鋭敏に捕らえるために、解析する時間区分内で不動な成分、又は低速な成分を予め除去しておくことができる。除去の方法は、B. Hebert et al. (2005)に記載されているように各座標ごとに信号強度変化の低周波成分を除去してもよい。また、定常成分が除去されてもよい。すなわち、移動成分Ｉｍｏｖを次式（４）に従って計算し、Ｉｍｏｖを式（１）のＩ（ｘ，ｙ；ｔ）の代わりに用いても良い。
【００６０】
【数４】
2015077122.tif 000006
【００６１】
次に、平均画像相関像を用いた解析方法について説明する。連続画像中の分布画像が時間とともに特定の方向へ移動しているとき、上述の方法によって得られる平均画像相関像Ｒ（ξ，η；τ）は画像の中心から外れた位置に極大値を持つ分布画像となる。この極大値の位置を決定する方法の一つとして、ガウシアン分布を仮定して、相互相関画像に対して当てはめを行う方法がある。
【００６２】
すなわち、次式（５）で表されるガウシアンをＡ，β，ｐ，ｑ，Ｃを可変パラメータとして平均画像相関像に対して最小二乗法によって当てはめを行う。
【００６３】
【数５】
2015077122.tif 000007
【００６４】
当てはめによって得られたｐ，ｑが、時間間隔τにおける平均画像相関像の極大位置（ｐτ，ｑτ）である。したがって、遅延時間τ（＝１〜Ｎ−１）ごとに平均画像相関像の極大位置（ｐτ，ｑτ）が決定される。
【００６５】
画像中の分布の移動速度（ｖｘ，ｖｙ）は、次式（６）で表される極大位置と遅延時間の比例係数ｖｘ，ｖｙとして決定される。
【００６６】
【数６】
2015077122.tif 000008
【００６７】
統計的に正確なｖｘ，ｖｙを導出するため、最小二乗法などを用いた回帰分析によって比例係数ｖｘ，ｖｙを算出してもよい。
【００６８】
Ｍ×Ｍピクセルの全体画像に内包される、ｍ×ｍピクセルの部分領域内の画像に対して上述の解析を行うことにより、その部分領域内での局所的な移動速度を導出することができる。すなわち、ｘがｘｉからｘｉ＋ｍ−１であり、ｙがｙｉからｙｉ＋ｍ−１である部分領域Ａｉに対して画像相関を計算し、その部分領域に対する移動速度を決定することができる。多数の部分画像について局所的な移動速度を求めることによって、移動速度の分布が得られる。
【００６９】
撮影時刻の異なる複数枚の画像から、時刻ｔの直近のｎ枚の画像からなる時間区分を取り出し、上記の解析を行うことにより、時刻ｔの時点での移動速度を導出することができる。すなわち、ｔがｔｉからｔｉ＋ｎ−１である画像に対して画像相関を計算し、例えば、この時間区分の中央の時刻ｔ＝ｔｉ＋（ｎ−１）／２における移動速度として決定することができる。この時間区分を連続的、あるいは離散的にずらして移動速度を求めていくことにより、変化する移動速度を把握することができ、移動速度の経時的な解析を行うことができる。
【００７０】
上述の解析方法によって得られた移動速度は、画面上に表示することによって、結果を可視化し、利用者が結果を視覚的に理解することを補助することができる。表示方法としては、例えば、連続画像上に速度ベクトルを表す図形を重ねて表示する方法が考えられる。速度ベクトルを表す図形としては、長さが移動速度の大きさに比例し、矢頭がベクトルの方向を示す矢印がある。また、矢印の色彩を速度の大きさに応じて表示することもできる。
【００７１】
画像中の部分領域内で解析を行い、局所的な発現分布の移動速度を解析した場合、各部分領域の中央にベクトル表示を行うことにより、速度分布を可視化することができる。経時的な解析を行った場合、時刻ｔの画像上に、その時刻ｔにおける速度ベクトルを重ねて表示することによって、移動速度の経時的変化を可視化することができる。
【００７２】
上記のような運動解析を行えば、心筋に分化した細胞の拍動を解析することができる。すなわち、この運動解析によれば細胞の機能発現を解析することができる。本方法では、発光画像と動画である明視野連続画像とを、同一の試料について同時に取得することができる。ここで同時にとは、物理的に完全に同時にということを意味せず、生物学的に同時に、すなわち、例えば数分の差があっても同時とみなせる同時期にということを意味する。発光画像と動画である明視野連続画像とを、同一の試料について同時に取得することができるので、幹細胞から心筋細胞への分化を、遺伝子発現と機能発現との両面から詳細に解析することができる。
【００７３】
なお、ここではＳＴＩＣＳについて説明したが、ＳＴＩＣＳに限らず種々の画像相関法が用いられ得るし、さらにオプティカルフローなど種々の運動解析法が用いられてもよい。
【００７４】
心筋の機能を解析する方法としては、例えばマルチエレクトロードアレイを用いて細胞電位を計測する方法などがある。しかしながらこのような電位を計測する方法では、電極が配された部分における局所的な測定に留まり、細胞群のどの部分が拍動しているかといった情報を取得することができない。一方で明視野画像を用いて解析する方法では、観察視野内のすべての細胞における細胞の位置や拍動の速さといった情報を取得することができる。
【００７５】
このような、発光画像に基づく遺伝子発現の解析と明視野画像の動画に基づく機能発現の解析とを同時に行えるシステムの概略を図２に示す。図２に示すように、この解析システム１は、顕微鏡１０と、例えばパーソナルコンピュータといった各種演算を行うことができる演算装置２０と、例えばキーボードやマウスといった演算装置２０にユーザによる指示を入力するための入力部２９とを備える。
【００７６】
顕微鏡１０には、光学系１２と光源１４と撮像装置１６とが設けられている。光学系１２は、種々のレンズやミラーを含む。光源１４から射出された光は、光学系１２を介して例えば幹細胞といった試料５０に照射される。撮像装置１６は、例えばＣＣＤといった撮像素子を含み、光学系１２を介して試料５０の顕微鏡画像に係る画像信号を生成する。
【００７７】
演算装置２０は、撮影制御部２１と、画像取得部２２と、光源制御部２３と、光学系制御部２４と、静止画解析部２５と、動画解析部２６と、記録部２７とを備える。撮影制御部２１は、撮像装置１６の動作を制御する。画像取得部２２は、撮像装置１６から画像を取得し、必要な画像変換等を行う。
【００７８】
光源制御部２３は、光源１４の動作を制御する。光学系制御部２４は、光学系１２を制御する。例えば明視野画像が取得されるときは、光源１４から射出された照明光は、光学系１２を介して試料５０に照射される。また、明視野画像が取得されるときは、露光時間は比較的短くされる。一方、発光画像が取得されるときは、光源１４から射出された照明光は遮断され、試料５０は照明されない。また、発光画像が取得されるときは、露光時間は比較的長く設定される。
【００７９】
静止画解析部２５は、例えば発光画像といった静止画の解析を行う。動画解析部２６は、例えば上述の運動解析といった解析を行う。記録部２７は、例えば発光画像や動画や静止画の解析結果や運動解析の結果を記録する。
【００８０】
以上のような解析システム１によれば、上記したとおり発光画像と動画である明視野画像とを、同一の試料について同時に取得することができる。さらに、取得した画像に基づいて、幹細胞から心筋細胞への分化を、遺伝子発現と機能発現との両面から詳細に解析することができる。
【実施例】
【００８１】
［実施例１：幹細胞由来胚様体における自家蛍光の影響の調査］
幹細胞由来の胚様体に蛍光タンパク質励起用の励起光を当てた際に、自家蛍光の影響がどれほどあるかマウスＥＳ細胞を用いて調べた。
【００８２】
（１）マウスＥＳ細胞の培養
マウスＥＳ細胞（ＢＲＣ６株、理研ＢＲＣ）の培養には、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地（１５％  ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ  １００倍希釈）、ＮＥＡＡ（ＳＩＧＭＡ  １００倍希釈）、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（終濃度２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（終濃度０．１ｍＭ）入り）を用いた。マウスＥＳ細胞の培養は、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたマウス胎児線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏ−ｂｌａｓｔ；ＭＥＦ細胞）上で行った。
【００８３】
（２）マウスＥＳ細胞の胚様体の形成
培養したマウスＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がした後、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃インキュベーターで４時間インキュベートした。フィーダー細胞（ＭＥＦ）を固着させることでマウスＥＳ細胞のみが浮遊する状態にした。マウスＥＳ細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、１ｍｌのＫＯ  ＤＭＥＭ培地又はＩＭＤＭ培地（１５％  ＦＢＳ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ  １００倍希釈）、ＮＥＡＡ（ＳＩＧＭＡ  １００倍希釈）、２−メルカプトエタノール（終濃度０．１ｍＭ）入り）に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、ＩＭＤＭ培地を加えたＬｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ培養培地（９６ウェル丸底；日油株式会社）の各ウェルに細胞数が２５００個又は５０００個になるように細胞混濁液を加え、３乃至７日間３７℃で培養し、胚様体を形成させた。
【００８４】
（３）マウスＥＳ細胞の自家蛍光の影響の調査
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した３５ｍｍディッシュに移し、３７℃で一晩インキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させた。その後、ＥＧＦＰ用のフィルター（４６０−４８０ｎｍ、４９５−５４０ｎｍ）を用いて励起光を照射し、自家蛍光の影響がどれだけあるかを、倒立型蛍光顕微鏡ＩＸ７０及び顕微鏡デジタルカメラＤＰ７０（オリンパス株式会社製）を用いて観察した。
【００８５】
図３及び図４は、マウスＥＳ細胞にＥＧＦＰ用励起光を当てた際の明視野画像と蛍光画像とをそれぞれ示す。図３及び図４より、幹細胞由来の胚様体は強い自家蛍光を持つことが明らかになった。このことから、蛍光観察では、自家蛍光が大きく影響し、定量性のある解析を行うことが難しいことが示された。
【００８６】
［実施例２：ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の心筋誘導過程における心筋特異的マーカーの発現解析］
心筋特異的トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎＴ；ｃＴｎＴ）は心筋に特異的に発現するタンパク質である。ｃＴｎＴは、心筋分化のマーカー遺伝子として利用されている。このｃＴｎＴ遺伝子の発現を指標に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の心筋への分化誘導過程の可視化が可能であるかを検討した。
【００８７】
［実施例２−１：マウスＥＳ細胞の心筋への分化過程におけるｃＴｎＴ発現の解析］
（１）ｃＴｎＴ遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸が導入されたマウスＥＳ細胞の作製
ｃＴｎＴ遺伝子のためのプロモーター領域のクローニングを、非特許文献「Jin et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1995 Vol.214, No.3, p1168-1174」を参考に行い、プロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。また、プライマーは、以下の２つを使用した。  
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １：ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＣ（配列番号２）。
【００８８】
取得したｃＴｎＴ遺伝子のためのプロモーター配列をネオマイシン耐性のｐＧＬ４．１７ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、「ｃＴｎＴ遺伝子発現特異的発光ベクターｐｃＴｎＴ−ＧＬ４」を作製した。
【００８９】
ベクターを導入するマウスＥＳ細胞（ＢＲＣ６株、理研ＢＲＣ）の培養には、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を用いた。このＥＳ細胞は、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたＭＥＦ細胞上で培養した。
【００９０】
Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬）によるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ法を用いて、マウスＥＳ細胞にｐｃＴｎＴ−ＧＬ４遺伝子発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を一晩ＫＯ  ＤＭＥＭ培地でネオマイシン耐性フィーダー細胞とともに培養した後、抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたＫＯ  ＤＭＥＭ培地に培地を交換して、選択的な培養を行った。このようにして、安定発現細胞株を取得した。以下、この細胞をｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞と呼ぶ。
【００９１】
（２）ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の胚様体の形成
培養したｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がした後、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃インキュベーターで４時間インキュベートした。フィーダー細胞（ＭＥＦ）を固着させることで、マウスＥＳ細胞のみが浮遊する状態にした。マウスＥＳ細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、１ｍｌのＫＯ  ＤＭＥＭ培地又はＩＭＤＭ培地に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、ＩＭＤＭ培地を加えたＬｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ培養培地（９６ウェル丸底；日油株式会社）の各ウェルに細胞数が２５００個又は５０００個になるように細胞混濁液を加え、３乃至７日間３７℃で培養し、胚様体を形成させた。
【００９２】
（３）ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の心筋への分化誘導
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した３５ｍｍディッシュに移し、３７℃で一晩インキュベートしてディッシュ表面に胚様体を接着させた。その後、３７℃で５乃至１４日間ほど培養し、拍動する心筋細胞への分化誘導を行った。
【００９３】
（４）ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の観察及び解析
３７℃で培養を続け、一部に拍動する心筋細胞が見られるようになったｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の胚様体について、Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（和光純薬製）を終濃度１ｍＭとなるよう加え、拍動する細胞を解析ソフトウェアであるアクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）を搭載した発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いて観察した。
【００９４】
撮影条件は以下として、ｃＴｎＴ遺伝子の発現を観察した。ＣＣＤカメラ  ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）をｂｉｎｎｉｎｇ１×１の条件で使用した。露光時間１５分としてｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞を撮像した。
【００９５】
図５に拍動する心筋細胞に分化したｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞の明視野画像を、図６に同細胞の発光観察画像を示す。図５及び図６に示すように、拍動する心筋細胞において発光が確認された。すなわち、ｃＴｎＴが発現している様子を発光を用いて観察することができた。
【００９６】
なお、実施例２−１では、薬剤耐性遺伝子を導入して薬剤選択を行った安定発現株細胞を使用したものの、一過性発現細胞株を使用することもできる。このことは以下の実施例においても同様である。
【００９７】
［実施例２−２：マウスｉＰＳ細胞の心筋への分化過程におけるｃＴｎＴ発現の解析］
（１）ｃＴｎＴ遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸が導入されたマウスｉＰＳ細胞の作製
ｃＴｎＴ遺伝子のためのプロモーター領域のクローニングを、非特許文献「Jin et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1995 Vol.214, No.3, p1168-1174」を参考に行い、プロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。また、プライマーには、上記のＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １及びＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １を使用した。
【００９８】
取得したｃＴｎＴ遺伝子のためのプロモーター配列をネオマイシン耐性のｐＧＬ４．１７ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、「ｃＴｎＴ遺伝子発現特異的発光ベクターｐｃＴｎＴ−ＧＬ４」を作製した。
【００９９】
ベクターを導入するマウスｉＰＳ細胞（ｉＰＳ-ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７、京都大学）の培養には、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を用い、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたＭＥＦ細胞上で培養を行った。
【０１００】
Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬）によるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ法を用いて、マウスｉＰＳ細胞にｐｃＴｎＴ−ＧＬ４遺伝子発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を一晩ＫＯ  ＤＭＥＭ培地でネオマイシン耐性フィーダー細胞とともに培養した後、抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたＫＯ  ＤＭＥＭ培地に培地を交換して選択的な培養を行うことで、安定発現細胞株を取得した。以下、この細胞をｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞と称する。
【０１０１】
（２）ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の胚様体の形成
培養したｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％  トリプシンＥＤＴＡで剥がした後、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を加えて、３７℃インキュベーターで４時間インキュベートした。フィーダー細胞（ＭＥＦ）を固着させることで、マウスｉＰＳ細胞のみが浮遊する状態にした。マウスｉＰＳ細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、１ｍｌのＫＯ  ＤＭＥＭ培地又はＩＭＤＭ培地に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、ＩＭＤＭ培地を加えたＬｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ培養培地（９６ウェル丸底；日油株式会社）の各ウェルに細胞数が２５００個又は５０００個になるように細胞混濁液を加え、３乃至７日間３７℃で培養し、胚様体を形成させた。
【０１０２】
（３）ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の心筋への分化誘導
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した３５ｍｍディッシュに移し、３７℃で一晩インキュベートしてディッシュ表面に胚様体を接着させた。その後、３７℃で５乃至１４日間ほど培養することで、拍動する心筋細胞への分化誘導を行った。
【０１０３】
（４）ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の観察及び解析
３７℃で培養を続け、一部に拍動する心筋細胞が見られるようになったｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の胚様体について、Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（和光純薬製）を終濃度１ｍＭとなるよう加え、拍動する細胞をアクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）を搭載した発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いて観察した。撮影条件を以下としてｃＴｎＴ遺伝子の発現を観察した。ＣＣＤカメラ  ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）をｂｉｎｎｉｎｇ１×１の条件で使用した。露光時間１５分として、ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞を撮像した。
【０１０４】
図７は、拍動する心筋細胞に分化したｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞を含む胚様体由来細胞の明視野画像を示す。図８は、同細胞の発光観察画像を示す。図７及び図８に示すように、拍動するｉＰＳ細胞由来の心筋細胞において発光が確認された。すなわち、ｃＴｎＴが発現している様子を、発光を用いて観察することができることが示された。
【０１０５】
［実施例２−３：マウスｉＰＳ細胞の心筋分化過程におけるｃＴｎＴ発現の経時変化の解析］
実施例２−２で作製したｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞が心筋に分化する過程を長時間経時的に観察し、ｃＴｎＴの発現の変化を解析した。
【０１０６】
（１）ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の培養
ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞を、Ｇ４１８（終濃度２５０μｇ／ｍｌ）入りＫＯ  ＤＭＥＭ培地を用い、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたネオマイシン耐性ＭＥＦ細胞上で培養した。
【０１０７】
（２）ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の胚様体の形成と心筋分化誘導
ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％  トリプシンＥＤＴＡで剥がした後、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃インキュベーターで４時間インキュベートした。フィーダー細胞（ＭＥＦ）を固着させることで、ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞のみが浮遊する状態にした。ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、１ｍｌのＩＭＤＭ培地に細胞を再混濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、ＩＭＤＭ培地を加えたＬｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ培養培地（９６ウェル丸底；日油株式会社）の各ウェルに細胞数が２５００個又は５０００個になるように細胞混濁液を加え、３乃至７日間３７℃で培養し、胚様体を形成させた。
【０１０８】
（３）ｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の心筋への分化誘導とｃＴｎＴ発現の経時変化の解析
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した３５ｍｍディッシュ（ＩＭＤＭ培地、ルシフェリン終濃度１ｍＭ入り）に移し、３７℃で２４ｈインキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させた。培地を新しいＩＭＤＭ培地（ルシフェリン終濃度１ｍＭ）に交換し、アクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）を搭載した発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いて約５日間長期観察を行った。撮影条件は以下として、ｃＴｎＴ遺伝子の発現を観察した。ＣＣＤカメラＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）をｂｉｎｎｉｎｇ１×１の条件で使用した。ｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞を露光時間１０分、撮影間隔１５分で撮影した。その際、心筋に分化した細胞が拍動している様子を観察するために、明視野撮影時にアクアコスモスのＨＤレコーディング機能を使用した動画撮影を同時に行った。動画の撮影条件は撮影時間１２４ｍｓ、撮影間隔１２４ｍｓとし、５０乃至１００枚連続撮影することにより動画を取得した。得られたデータはアクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）で解析した。撮影画像によって認識する場合は、収縮及び弛緩の過程に要する時間に比べて早いフレームレートによって連続的に撮影された連続画像（動画）が必要である。各フレームにおける個々の細胞位置は、前後の時間のフレーム画像を手がかりとして、手動又は各種の画像認識手法によって決定することができる。また、個々の細胞位置を特定せずに、画像の明暗パターンの運動をオプティカルフローや画像相関法などの手法によって解析することによっても拍動を認識することが可能である。
【０１０９】
図９は観察開始後２４時間ごとのｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ由来の胚様体のｃＴｎＴ発現の様子の明視野画像を示し、図１０は同胚葉体の発光画像を示す。図１２は、図１１の画像中にあるＲＯＩの発光強度の変化を、アクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）で解析したグラフを示す。図９及び図１０に示すように、時間経過とともにｃＴｎＴの発現領域が次第に広がっている様子が観察された。また、ＨＤレコーディング機能により、約７２時間経過後からｃＴｎＴが発現している部位で細胞が拍動している様子が観察された。図１２のように、ＲＯＩで囲った部分の発光量が時間経過とともに増大し、ｃＴｎＴの発現が時間経過とともに高まっている様子が観察された。
【０１１０】
［実施例２−４：マウスｉＰＳ細胞の心筋分化過程における拍動の解析］
本実施例では、画像相関法による運動解析のうちＳＴＩＣＳに基づいて、マウスｉＰＳ細胞の心筋分化過程における拍動の解析を行った。
【０１１１】
（１）解析方法
実施例２−３で用いたものと同様のｃＴｎＴ−ＧＬ４発現マウスｉＰＳ細胞の心筋への分化過程において明視野連続画像及び発光画像を取得した。明視野連続画像については、観察期間を通して１５分おきに６１秒又は７４秒の連続画像を取得した。連続画像に含まれる各画像の撮影間隔は０．６１秒又は０．３７秒とした。撮影した５１２×５１２ピクセルの画像から、右中央部分の横２６４ピクセル×縦２５６ピクセルの解析領域を抽出した。抽出した解析領域を図１３に領域Ｒ１０として示した。抽出した解析領域内で３２×３２ピクセルのサブ領域を、相互に縦又は横に８ピクセルずつずれるように隈なく設定し、各サブ領域において各々以下のような運動解析を行い、サブ領域内の局所的な運動を定量的に評価した。
【０１１２】
各サブ領域において、連続画像の第ｎフレームが撮影された時刻をｔｎとしたときに、ｔｎとｔｎ＋１の２枚の画像について相互相関画像を計算し、そのピーク位置をガウシアンのフィッティングによって決定した。ピーク位置が（ｐ，ｑ）であったとき、そのサブ領域の時刻ｔｎにおける被写体の速度を（ｐ／Δｔ，ｑ／Δｔ）であるとした。ここで、Δｔは２枚の画像の撮影時刻の間隔ｔｎ＋１−ｔｎである。この速度値に撮像光学系の倍率と撮像素子間隔から決定するピクセル・実距離の換算係数を乗じることによって試料位置での実速度が計算され得る。
【０１１３】
各サブ領域において、上記のように計算した瞬間的な速度（ｖｘ（ｔ），ｖｙ（ｔ））の１分間の変位の標準偏差をその地点・時間領域での拍動強度と定義した。拍動強度の定義としては、今回採用した定義の他にも時間領域内の速度変位の分散や大きさの最大値を代わりに用いてもよい。上記のように８ピクセル間隔のサブ領域で計算された拍動強度の値を自然近傍補間法によって２６４ピクセル×縦２５６ピクセルの解析領域全体に補完して拍動分布画像を描画した。
【０１１４】
各サブ領域の各時刻に対応する位置において、速度ベクトルを矢印として描画したり、速度ベクトルを速度の大きさによって異なる色彩で表示したりすることによって速度の分布と時間変化を視覚的に把握することができる。また、その表示を対応する明視野画像や発光画像上に重ねることによって、その位置の状態と速度の関係を視覚的に把握することが可能となる。その位置の状態としては、明視野画像であれば細胞の大きさや厚み、胚様体や組織内での位置関係などが挙げられる。発光画像であれば、その部位での細胞内の遺伝子発現量や分化の程度などが挙げられる。
【０１１５】
２つのサブ領域間で相互の速度成分を用いた解析を行うことによって、その領域間での運動の関係性を評価することができる。速度成分としては、撮影画像に対する水平・垂直方向成分のうち変位の大きい成分や時間領域を通して最も変位の大きい方向の成分などがある。時刻ｔｎにおける第１の領域での速度成分ｖ１（ｔｎ）と第２の領域での速度成分ｖ２（ｔｎ）を散布図として描画することによって、２点間の運動の同期の程度を評価することが可能となる。２点での運動が同期している場合は各時刻での（ｖ１，ｖ２）の点は上昇又は下降する直線上に並び、その同期の度合いは回帰分析から得られるパラメータ、例えば決定係数Ｒ２によって定量的に見積もることができる。同期の度合いとしては、その他に相関係数の絶対値｜ｒ｜や回帰分析によって決定した直線モデルからのずれの二乗平均平方根を用いてもよい。
【０１１６】
また、ｖ１（ｔｎ）とｖ２（ｔｎ）の相互相関Ｃ１２（τ）＝Σｔ［ｖ１（ｔｎ）・ｖ２（ｔｎ＋τ）］を計算することによって、同期の持続時間を見積もることが可能となる。第１の領域における自己相関Ｃ１１（τ）＝Σｔ［ｖ１（ｔｎ）・ｖ１（ｔｎ＋τ）］、及び同様に定義される第２の領域における自己相関Ｃ２２と相互相関Ｃ１２を比較することによって、例えばＣ１２２／（Ｃ１１×Ｃ２２）又はその平方根などを計算することによって各領域での運動の継続時間に対する領域間の同期の持続時間を相対的に評価することができる。
【０１１７】
（２）解析結果
本実施例の解析結果について説明する。上述の通り図１３における画像に含まれる四角形の領域Ｒ１０は、本実施例２−４において図１４乃至２１に示す解析に用いた画像の領域を示す。また、図１３に丸印で示した３つの位置は、本実施例２−４で解析対象とするデータを取得した領域である。これらの領域を第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３と称することにする。
【０１１８】
図１４に観察開始後９１時間後について、動画である明視野連続画像を用いたＳＴＩＣＳ解析の結果を示す。解析した対象は、図１３に示す領域Ｒ１０である。図１４は、４．０３秒間に含まれる各時間における各部の速度を矢印の長さで示している。各図の左上に経過時間を示し、矢印の長さのスケールを図１４の右下に示す。図１４に示すように、図１３に示した第１の点Ｐ１、第２の点Ｐ２、及び第３の点Ｐ３において、時間経過とともに各点の速度及び向きが変化していること、すなわち、これらの位置において拍動が起こっていることが明らかになった。
【０１１９】
図１５に観察開始後６６時間後、７１時間後、７６時間後、８１時間後、８６時間後、及び９１時間後における解析結果を示す。図１５において「観察開始後時間」と記した１列目には、観察開始からの経過時間を示す。図１５において「明視野」と記した２列目の各図は、各時間における明視野画像である。
【０１２０】
図１５において「ＳＴＩＣＳ／遺伝子発現」と記した３列目の図は、図１０に示した画像と同様に実施例２−３に示した方法で取得したｃＴｎＴの発現を示す発光画像に、ＳＴＩＣＳの解析結果を重畳した画像である。発光画像において明るい部分は、ｃＴｎＴの発現量が多い部分である。またＳＴＩＣＳの結果を示す矢印が長い部分は、速度が高い部分である。
【０１２１】
図１５において「拍動」と記した４列目の画像は、６１秒乃至７４秒間に連続して取得された１００乃至２００枚の画像に基づいてＳＴＩＣＳ解析を行い得られた速度の、各点における標準偏差を拍動強度として輝度で表したものである。標準偏差が大きいほど輝度が高く表されている。言い換えると、各点において速度の変化が大きいほど、すなわち拍動が強いほど輝度が高く表されている。図１５の３列目と４列目の画像を比較して分かるようにｃＴｎＴ遺伝子の発現が多い領域ほど、拍動が強いことが分かる。
【０１２２】
観察開始から７６時間経過時、８１時間経過時、８６時間経過時、及び９１時間経過時の解析結果についてさらに詳述する。図１６Ａ乃至図１６Ｇは観察開始後７６時間の解析結果を示し、図１７Ａ乃至図１７Ｇは観察開始後８１時間の解析結果を示し、図１８Ａ乃至図１８Ｇは観察開始後８６時間の解析結果を示し、図１９Ａ乃至図１９Ｇは観察開始後９１時間の解析結果を示す。
【０１２３】
図１６Ａ、図１７Ａ、図１８Ａ、及び図１９Ａのそれぞれの左図は、細胞の明視野画像にＳＴＩＣＳによる解析結果を矢印で表した図を重畳表示したものである。図１６Ａ、図１７Ａ、図１８Ａ、及び図１９Ａのそれぞれの右図は、図１５の４列目と同様に、ＳＴＩＣＳにより得られた速度の標準偏差を表した図であり、拍動強度が輝度によって表されている。図１６Ａ、図１７Ａ、図１８Ａ、及び図１９Ａに丸印で示した第１の点Ｐ１と、第２の点Ｐ２と、第３の点Ｐ３とについて、ＳＴＩＣＳの結果について解析を行った。
【０１２４】
図１６Ｂ、図１７Ｂ、図１８Ｂ、及び図１９Ｂは、観察開始からの各時間帯における、第１の点Ｐ１（Ｐｏｉｎｔ１）、第２の点Ｐ２（Ｐｏｉｎｔ２）及び第３の点Ｐ３（Ｐｏｉｎｔ３）における速度の経時変化を表す。各図において、横軸は経過時間（秒）を示し、縦軸は速度（μｍ／秒）を示す。各図において、破線は第１の点Ｐ１における速度を示し、灰色の実線は第２の点Ｐ２における速度を示し、一点鎖線は第３の点Ｐ３における速度を示す。ここで、第１の点Ｐ１及び第２の点Ｐ２における速度は、図１６Ａ等に示した画像の縦方向（ｙ軸方向）の速度成分を示し、第３の点Ｐ３における速度は、図１６Ａ等に示した画像の横方向（ｘ軸方向）の速度成分を示す。第１の点Ｐ１及び第２の点Ｐ２では縦方向、第３の点Ｐ３では横方向の速度成分に注目したのは、観察開始後９１時間において、第１の点Ｐ１及び第２の点Ｐ２では縦方向の変位が大きく、第３の点Ｐ３では横方向の変位が大きかったためである。
【０１２５】
図１６Ｂ、図１７Ｂ、図１８Ｂ、及び図１９Ｂから明らかなように、観察開始から時間が経過するに従って、速度の最大値は徐々に大きくなった。すなわち、観察開始から時間が経過するに従って、拍動が強くなっていくことが分かった。また、これらの図から、第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２及び第３の点Ｐ３とでは、速度の向きが逆向き（位相が１８０度異なる）となっているものの、第１の点Ｐ１、第２の点Ｐ２、及び第３の点Ｐ３の全ての点において、速度変化のタイミングが一致していること、すなわち、全ての点において拍動が同期していることが明らかになった。
【０１２６】
図１６Ｂに示した観察開始７６時間後のデータについて、各位置における速度の相関を解析した。すなわち、同時に計測された第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第２の点Ｐ２における速度を縦軸として図１６Ｃにプロットした。各点は、図１６Ｂに示した速度データに対応する約２００のデータを表す。図１６Ｃでは、速度の最大値が１となるように規格化してある。さらに、図１６Ｃには、プロットしたデータについて線形近似を表す直線と、相関係数Ｒの２乗である決定係数Ｒ２が示されている。決定係数Ｒ２が１に近いほど、第１の点Ｐ１における拍動と第２の点Ｐ２における拍動とが同期していることを表す。
【０１２７】
同様に、図１６Ｂに示した観察開始７６時間後のデータについて、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１６Ｄに示し、第２の点Ｐ２における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１６Ｅに示す。
【０１２８】
同様に、図１７Ｂに示した観察開始８１時間後のデータについて、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第２の点Ｐ２における速度を縦軸としてプロットした図を図１７Ｃに示し、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１７Ｄに示し、第２の点Ｐ２における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１７Ｅに示す。
【０１２９】
同様に、図１８Ｂに示した観察開始８６時間後のデータについて、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第２の点Ｐ２における速度を縦軸としてプロットした図を図１８Ｃに示し、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１８Ｄに示し、第２の点Ｐ２における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１８Ｅに示す。
【０１３０】
同様に、図１９Ｂに示した観察開始９１時間後のデータについて、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第２の点Ｐ２における速度を縦軸としてプロットした図を図１９Ｃに示し、第１の点Ｐ１における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１９Ｄに示し、第２の点Ｐ２における速度を横軸とし、第３の点Ｐ３における速度を縦軸としてプロットした図を図１９Ｅに示す。
【０１３１】
これらの図に示すように、第１の点Ｐ１、第２の点Ｐ２、及び第３の点Ｐ３の何れの位置においても、観察開始からの時間が経過するに従って、決定係数Ｒ２が増加した。すなわち、観察開始からの時間経過に従って、各位置において観察される拍動は、より高い同期を示すことが明らかになった。
【０１３２】
また、図１６Ｂに示した観察開始７６時間後のデータについて、自己相関を求めた結果を図１６Ｆに示す。図１６Ｆにおいて、実線は第１の点Ｐ１（Ｐｏｉｎｔ１）の速度についての自己相関を示し、破線は第２の点Ｐ２（Ｐｏｉｎｔ２）の速度についての自己相関を示し、点線は第３の点Ｐ３（Ｐｏｉｎｔ３）の速度についての自己相関を示す。ここで、値は最大値を１として規格化されている。
【０１３３】
また、図１６Ｂに示した観察開始７６時間後のデータについて、相互相関を求めた結果を図１６Ｇに示す。図１６Ｇにおいて、実線は第１の点Ｐ１の速度と第２の点Ｐ２の速度との相互相関を示し、破線は第２の点Ｐ２の速度と第３の点Ｐ３の速度との相互相関を示し、点線は第１の点Ｐ１の速度と第３の点Ｐ３の速度との相互相関を示す。この図においても、値は最大値を１として規格化されている。
【０１３４】
同様に、図１７Ｂに示した観察開始８１時間後のデータについて、自己相関を求めた結果を図１７Ｆに、相互相関を求めた結果を図１７Ｇに、それぞれ示す。同様に、図１８Ｂに示した観察開始８６時間後のデータについて、自己相関を求めた結果を図１８Ｆに、相互相関を求めた結果を図１８Ｇに、それぞれ示す。同様に、図１９Ｂに示した観察開始９１時間後のデータについて、自己相関を求めた結果を図１９Ｆに、相互相関を求めた結果を図１９Ｇに、それぞれ示す。
【０１３５】
例えば最も傾向が顕著に認められる観察開始９１時間後の解析結果である図１９Ｆ及び図１９Ｇによれば、第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３とで、常に周期がずれることなく同期していることが明らかになった。また、７秒程度の周期で拍動が大きくなったり小さくなったりすることが明らかになった。このように、自己相関と相互相関とを解析することによって周期性と持続性とを評価できることが分かる。
【０１３６】
図１６Ｃ乃至図１６Ｅ、図１７Ｃ乃至図１７Ｅ、図１８Ｃ乃至図１８Ｅ、及び図１９Ｃ乃至図１９Ｅに示した決定係数について、観察開始からの経過時間との関係を図２０に示す。図２０に示すように、観察開始からの時間経過に伴って、決定係数が上昇することが明らかになった。すなわち、時間経過に伴って拍動の同期性が増すことが明らかになった。
【０１３７】
また、第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３との相関は、第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２との相関及び第１の点Ｐ１と第３の点Ｐ３との相関と比較して低いことが分かった。このことから、この例では、第１の点Ｐ１を中心として、第１の点Ｐ１の細胞と第２の点Ｐ２の細胞との間、及び第１の点Ｐ１の細胞と第３の点Ｐ３の細胞との間で何らかの情報伝達が行われていることが推測された。各点における相関を見ることで、ペースメーカー機能を持つ細胞の同定を行うことも可能である。
【０１３８】
また、図２１に第１の点Ｐ１と第２の点Ｐ２と第３の点Ｐ３とにおける観察開始からの経過時間と拍動（右縦軸）及び遺伝子発現（左縦軸）との関係を示す。ここで、図２１においてマーカー付きの太線で表した拍動は、図１５の４列目に「拍動」として画像を示した速度の標準偏差に相当するものである。また細線で表した遺伝子発現は、発光画像における発光強度によって表されている。拍動と遺伝子発現との何れにおいても、実線が第１の点Ｐ１の結果を示し、破線が第２の点Ｐ２の結果を示し、点線が第３の点Ｐ３の結果を示す。図２１において、横軸と平行な直線は、拍動と遺伝子発現量の最大値を示し、横軸と平行な破線は、実線で示した最大値の半分の値（半値）を示している。また、図２１には、遺伝子発現量が半値に達した時刻と心拍強度が半値に達した時刻との差を矢印と数値とで示してある。
【０１３９】
図２１に示すように、遺伝子発現と機能発現とはその時期が一致しないことが明らかになった。特に第１の点Ｐ１及び第２の点Ｐ２においては、機能が遺伝子よりも遅れて発現していることが明らかになった。また、第３の点Ｐ３においては、機能発現が遺伝子発現よりも早かった。
【０１４０】
本実施例では、生きた細胞の遺伝子の発現量を発光画像に基づいて解析し、同じ細胞の同時期の拍動現象を、同じ細胞の同時期に取得された明視野連続画像に基づく画像相関法によって取得した。発光画像と明視野画像とを同細胞で同時期に取得することができるので、本実施例のように、遺伝子発現と機能発現との関連性を評価することが可能であることが示された。また、本実施例によれば、遺伝子発現と拍動とに関する方向性、強さ、周期性といった情報を視覚的に分かりやすく提供することができる。
【０１４１】
心筋の機能を解析する方法としては、例えばマルチエレクトロードアレイを用いて細胞電位を計測する方法などがある。しかしながらこのような電位を計測する方法では、電極が配された部分における局所的な測定に留まり、細胞群のどの部分が拍動しているかといった情報を取得することができない。一方で本実施例のように明視野画像を用いて解析する方法では、観察視野内のすべての細胞における細胞の位置や拍動の速さといった情報を取得することができる。
【０１４２】
なお、ここに示した拍動の解析では撮影間隔を０．６１秒又は０．３７秒として速度を算出しているが、この例とは異なる撮影間隔、例えば３０分の１秒毎に撮影された動画であっても同様に速度を算出して解析することもできる。
【０１４３】
［実施例２−５：マウスＥＳ細胞の心筋分化過程におけるｃＴｎＴ発現の経時変化の解析］
実施例２−３と同様に、実施例２−１で作製したｃＴｎＴ―ＧＬ４発現マウスＥＳ細胞が心筋に分化する過程を長時間経時的に観察し、ｃＴｎＴの発現の変化を解析することができる。
【０１４４】
［実施例３：マウスＥＳ細胞又はマウスｉＰＳ細胞の心筋分化過程におけるｃＴｎＴ以外の心筋特異的マーカー遺伝子発現の経時変化の解析］
ｃＴｎＴ以外の心筋特異的マーカー、例えばＧＡＴＡ４、ＮＣＸ１等を用いても、実施例２と同様に、マウスＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の心筋への分化過程を経時的に解析することができる。また、例えば上述の複数の心筋特異的マーカーのうち、複数の心筋特異的マーカーを用いて、マウスＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の心筋への分化過程を解析することができる。
【０１４５】
［実施例４：心筋分化促進因子による心筋特異的マーカー遺伝子の発現の経時変化の解析］
上記実施例２及び実施例３において、心筋分化促進因子を添加した際のマウスＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の心筋への分化過程を経時的に解析することができる。
【０１４６】
［実施例５：未分化マーカー／心筋分化マーカーを指標とした心筋分化過程の複数の遺伝子の発現の解析］
上記実施例２及び実施例３のような心筋分化マーカーや、例えばＮａｎｏｇ、Ｔｃｆ３といった未分化マーカーを組み合わせて、複数の遺伝子の発現の解析を行うこともできる。
【０１４７】
［実施例６：細胞シート心筋分化過程における心筋特異的マーカー発現の解析］
細胞シートを解析対象としても、上記実施例２乃至実施例５のような解析を行うことができる。
【０１４８】
［実施例７：ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の心筋分化過程における心筋マーカー発現の発光、蛍光併用イメージング］
上述の心筋細胞への分化の解析には、蛍光イメージングが併用されてもよい。
【０１４９】
［実施例８：ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞心筋分化過程におけるＣａイメージング］
カルシウム応答性ルシフェラーゼを用いることにより、心筋に分化し拍動を開始した細胞内のカルシウムのイメージングを行うことができる。
【０１５０】
（１）カルシウム応答性ルシフェラーゼが組み込まれたマウスＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の作製
カルシウム応答性ルシフェラーゼが導入されたマウスＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を用いて、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたＭＥＦ細胞上で培養する。
【０１５１】
Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬）によるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ法を用いて、マウスＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞にカルシウム応答性ルシフェラーゼを組み込んだベクターをトランスフェクションする。トランスフェクションした細胞を一晩ＫＯ  ＤＭＥＭ培地でネオマイシン耐性フィーダー細胞とともに培養した後、抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたＫＯ  ＤＭＥＭ培地に培地を交換して選択的な培養を行うことで、安定発現細胞株を取得する。以下、この細胞をカルシウム応答性ＥＳ細胞又はカルシウム応答性ｉＰＳ細胞と呼ぶ。
【０１５２】
（２）カルシウム応答性ＥＳ細胞及びカルシウム応答性ｉＰＳ細胞の胚様体の形成
培養したカルシウム応答性ＥＳ細胞又はカルシウム応答性ｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がした後、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃インキュベーターで４時間インキュベートする。フィーダー細胞（ＭＥＦ）を固着させて、マウスｉＰＳ細胞のみが浮遊する状態にする。細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、１ｍｌのＫＯ  ＤＭＥＭ培地又はＩＭＤＭ培地に細胞を再混濁する。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、ＩＭＤＭ培地を加えたＬｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ培養培地（９６ウェル丸底；日油株式会社）の各ウェルに細胞数が２５００個又は５０００個になるように細胞混濁液を加え、３乃至７日間３７℃で培養し、胚様体を形成させる。
【０１５３】
（３）カルシウム応答性ＥＳ細胞又はカルシウム応答性ｉＰＳ細胞の心筋への分化誘導
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した３５ｍｍディッシュに移し、３７℃で一晩インキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させる。その後、３７℃で５乃至１４日間ほど培養することで、拍動する心筋細胞への分化誘導を行う。
【０１５４】
（４）カルシウム応答性ＥＳ細胞又はカルシウム応答性ｉＰＳ細胞の観察及び解析
３７℃で培養を続け、一部に拍動する心筋細胞が見られるようになったカルシウム応答性ＥＳ細胞又はカルシウム応答性ｉＰＳ細胞の胚様体について、セレンテラジン（和光純薬製）を終濃度１ｍＭとなるよう加え、拍動する細胞をアクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）を搭載した発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いて観察する。撮影条件は以下である。ＣＣＤカメラ  ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）をｂｉｎｎｉｎｇ１×１の条件で使用した。露光時間１５分として、カルシウム応答性ＥＳ細胞又はカルシウム応答性ｉＰＳ細胞についてカルシウムイメージングを行う。
【０１５５】
［実施例９：ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来細胞シートにおける拍動電位測定］
ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来細胞シートにおける拍動電位を測定することができる。
例えばマルチエレクトロードアレイ上で細胞を培養することによって、細胞の拍動電位が測定され得る。
【符号の説明】
【０１５６】
１…解析システム、１０…顕微鏡、１２…光学系、１４…光源、１６…撮像装置、２０…演算装置、２１…撮影制御部、２２…画像取得部、２３…光源制御部、２４…光学系制御部、２５…静止画解析部、２６…動画解析部、２７…記録部、２９…入力部。
【図１】
2015077122.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2015077122.tif 000023
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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