(57)【要約】【課題】液体試料中の特定の物質を選択的に分離可能な、化合物の分離方法、およびそれに用いられる分離用デバイスを提供する。【解決手段】本発明の分離用デバイスは、容器中に金属担体が保持されている。分離対象となる物質は、金属とキレート形成能を有する化合物である。本発明の分離方法は、液体試料を金属担体と接触させ、物質を金属担体に吸着させた後、金属担体と液体試料とを分離する吸着ステップを有する。物質を吸着した金属担体を洗浄液と接触させ、前記物質以外の成分を洗浄液中へ溶出させた後、当該洗浄液と金属担体とを分離する洗浄ステップや、物質を吸着した金属担体を溶出液と接触させ、前記物質を溶出液中へ溶出させた後、当該溶出液と金属担体とを分離する溶出ステップをさらに有していてもよい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の特定の物質を、前記液体試料から分離する方法であって、
前記物質は、金属とキレート形成能を有する化合物であり、
液体試料を金属担体と接触させ、前記物質を前記金属担体に吸着させた後、金属担体と液体試料とを分離する吸着ステップを有する、分離方法。
【請求項２】
前記物質は、２以上の酸性官能基を有する化合物である、請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
前記酸性官能基がカルボキシル基である、請求項２に記載の分離方法。
【請求項４】
前記物質を吸着した金属担体を洗浄液と接触させ、前記物質以外の成分を洗浄液中へ溶出させた後、当該洗浄液と金属担体とを分離する洗浄ステップをさらに有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項５】
前記物質を吸着した金属担体を溶出液と接触させ、前記物質を溶出液中へ溶出させた後、当該溶出液と金属担体とを分離する溶出ステップをさらに有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項６】
前記溶出液は、前記物質よりも優先的に前記金属とキレートを形成する化合物を含有する溶液である、請求項５に記載の分離方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の分離方法に用いるための分離用デバイスであって、
容器中に金属担体が保持されている、分離用デバイス。
【請求項８】
前記金属担体は、少なくとも１種の第一遷移金属を含有する、請求項７に記載の分離用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体操作によって、液体試料中の特定の物質を分離する方法、およびそれに用いられる分離用デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料、食品、飲料等は、多種多様な化学物質の混合物である。複数の分離手段を組み合わせることにより、このような複雑な混合物中の成分を分離し、分析する手法が開発され、応用されている。このような複雑な混合物中の微量物質の分析や、高精度の定量分析では、夾雑物由来のバックグラウンド等に起因して分析精度が低下する場合がある。そのため、試料を前処理して夾雑物を除去し、目的物質を分離・精製した上で、分析に供する必要がある。
【０００３】
例えば、食品や飲料中の、カビ毒（マイコトキシン）の分析においては、各カビ毒をｐｐｂオーダーで定量することが要求される場合がある。カビ毒は、カビが産生する二次代謝産物の中で、ヒトや動物に健康被害を及ぼす化合物であり、３００種以上が知られている。カビ毒の一種であるフモニシン類には、数種の同族体が存在し、主なものとしてフモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３が知られている。フモニシン類は、１分子中に複数のカルボキシル基を有するため、その精製においては、陰イオン交換基を有する固相カラムが広く用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
目的物質に対する選択的な吸着を利用した分離方法として、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（immobilized  metal ion affinity chromatography、ＩＭＡＣ）が知られている（例えば特許文献１参照）。ＩＭＡＣは、多座の配位子を表面に有する固相マトリクスに、金属イオンをキレート化させたものを用い、このキレート金属錯体に、タンパク質の特定の官能基が特異的に配位することを利用する手法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０４２２４９号国際公開パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】田端節子、「カビ毒の分析法」、ぶんせき、２００８年  第１０号、５３１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
イオン交換クロマトグラフィーは、フモニシン類等のカビ毒の分離以外に、種々の化合物やタンパク質、ＤＮＡ等の生体分子の分離・精製にも用いられている。しかしながら、一般にイオン交換クロマトグラフィーは、カラム担体への吸着の選択性が高いとは言えない。そのため、試料中に目的化合物と電荷特性が類似する夾雑物が含まれている場合等には、目的化合物の分離が困難となったり、分離操作が煩雑となる傾向がある。
【０００８】
一方、ＩＭＡＣは、目的物質を選択的に吸着させるため、特定の対象化合物の分離性に優れている。しかしながら、ＩＭＡＣで分離可能な化合物は、Ｈｉｓタグ（６個程度の連続するヒスチジン残基からなるタグペプチド）配列を有するペプチド等、ごく一部のものに限られており、カビ毒等の低分子量化合物の分離への適用は困難である。
【０００９】
上記に鑑み、本発明は、低分子量化合物にも適用可能であり、かつ特定の物質を選択的に分離可能な、化合物の分離方法、およびそれに用いられる分離用デバイスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが検討の結果、フモニシン類等の特定の化合物が金属粒子に選択的に吸着されること、および金属粒子を所定の溶出液と接触させることにより吸着化合物を脱着可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
本発明は、液体試料中の特定の物質を、液体試料から分離する方法に関する。分離対象となる液体試料中の物質は、金属とキレート形成能を有する化合物である。本発明の分離方法により、液体試料からの特定の物質の分離除去や、液体試料中の特定の物質の精製・濃縮等を行い得る。
【００１２】
本発明の分離方法は、液体試料を金属担体と接触させ、前記物質を金属担体に吸着させた後、金属担体と液体試料とを分離する吸着ステップを有する。金属担体としては、金属粒子等が好適に用いられる。金属としては、アルカリ土類金属や遷移金属が好適に用いられ、中でも、第一遷移金属（Ｓｃ，Ｔｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，ＮｉおよびＣｕ）が好ましい。
【００１３】
本発明の分離方法は、吸着ステップの後、前記物質を吸着した金属担体を洗浄液と接触させ、前記物質以外の成分を洗浄液中へ溶出させた後、当該洗浄液と金属担体とを分離する洗浄ステップをさらに有してもよい。
【００１４】
本発明の分離方法は、前記物質を吸着した金属担体を溶出液と接触させ、前記物質を溶出液中へ溶出させた後、当該溶出液と金属担体とを分離する溶出ステップをさらに有してもよい。溶出液としては、例えば、金属担体に吸着された物質よりも優先的に金属とキレートを形成する化合物を含有する溶液が用いられる。
【００１５】
本発明の分離方法において、分離対象となる液体試料中の物質は、好ましくは２以上の酸性官能基を有する化合物である。酸性官能基としては、カルボキシル基やリン酸基等が挙げられる。中でもカルボキシル基が好ましい。
【００１６】
さらに、本発明は上記の分離方法に用いるための分離用デバイスに関する。本発明の分離用デバイスは、容器中に金属担体が保持されている。容器は、内壁面が非金属からなるものが好ましい。
【００１７】
容器は、金属担体を内部に保持できるものであれば、その形状は特に限定されない。１つの開口から上記液体試料、洗浄液および溶出液等の液体の注入および排出の両方を行うバッチ式の容器、一方の開口から液体を注入し他方の開口から液体を排出するカラム式の容器のいずれも使用可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の分離方法では、金属とキレート形成能を有する目的化合物を、液体試料から、選択性高く分離可能である。そのため、本発明の分離方法は、飲料等からの有害物質の分離除去、液体試料中の特定の物質の精製・濃縮、機器分析のための試料の前処理等に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】分離方法の各ステップの概要を説明するための概念図である。
【図２】本発明の分離デバイスを機器分析に用いる実施形態を示す概念図である。
【図３】本発明の分離デバイスを機器分析に用いる実施形態を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、本発明の分離方法の概要を説明するための概念図である。図１（ａ）に示すように、本発明の分離用デバイス５０は、容器１０中に金属担体７０が保持されている。金属担体７０は、容器１０内で移動可能に収納されていてもよく、容器内の一定の位置に固定されていてもよい。
【００２１】
[分離方法の概要]
以下、バッチ式の分離デバイスを用いて、液体試料からフモニシン類を分離する例を中心に、図１に沿って、本発明の分離方法について説明する。なお、フモニシン類はカビ毒の一種であり、主なものとして、以下に示すフモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３が知られている。これらのフモニシン類は、１分子中に４個のカルボキシル基を有し、金属とキレートを形成し得る。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
＜吸着ステップ＞
本発明の分離方法では、液体試料２０が金属担体７０と接触させられる。図１に示す形態では、液体試料２０が容器１０内へ注入されることにより、液体試料が金属担体と接触する（図１（ａ）および（ｂ））。なお、金属担体を液体試料中へ添加することによって、液体試料と金属担体とを接触させてもよい。
【００２４】
液体試料２０中には、分離対象となる物質としてフモニシン類が含まれている。なお、分離対象となる物質は、金属とキレート形成能を有する化合物であれば、フモニシン類に限定されない。フモニシン類を含む液体試料と金属担体とが接触すると、液体試料中のフモニシン類が金属とキレートを形成することによって、金属担体７０に吸着される。この際、撹拌等の方法により、液体中に金属担体を分散させ、金属担体と液体試料との接触機会を増加させ、吸着効率を高めることもできる。
【００２５】
金属担体にフモニシン類を吸着させた後、液体２１と、フモニシン類を吸着した金属担体７１とが固液分離される（図１（ｃ））。吸着ステップ、ならびに後述する洗浄ステップおよび溶出ステップでは、遠心分離によって金属担体と液体との分離を行うことによって、より確実かつ効率的に固液分離を行うことができる。金属担体が磁性体である場合、磁場操作によって金属担体を移動させ、固液分離を行うこともできる。
【００２６】
飲料等の液体試料からのフモニシン類の分離除去を目的とする場合は、分離後の液体２１を回収することにより、元の液体試料２０から対象物質であるフモニシン類が分離除去された液体２１が得られる。一方、液体試料中のフモニシン類の分離回収を目的とする場合は、分離後の金属担体７１が、さらに別のステップに供される。
【００２７】
＜洗浄ステップ＞
フモニシン類を吸着させた金属担体７１は、必要に応じて洗浄ステップに供される。洗浄ステップでは、金属担体７１が洗浄液３０と接触させられる（図１（ｄ）および（ｅ））。なお、金属担体７１を洗浄液中へ添加することによって、洗浄液と金属担体とを接触させてもよい。
【００２８】
洗浄を行うことで、金属担体７１に付着した夾雑物や、容器１０内の液体試料２１の残液等が除去されるため、分離効率が高められる。洗浄に際しては、撹拌等の方法により、液体中に金属担体を分散させ、金属担体と洗浄液との接触機会を増加させ、洗浄効率を高めることもできる。
【００２９】
金属担体７１と洗浄液とを接触させて洗浄を行った後、使用後の洗浄液３１とフモニシン類を吸着した金属担体７１とが分離される（図１（ｆ））。洗浄効率を高めるために、複数回の洗浄が行われてもよい。複数回の洗浄が行われる場合、各洗浄液は同一でもよく、異なるものでもよい。
【００３０】
飲料等の液体試料からのフモニシン類の分離除去を目的とする場合は、分離後の洗浄液３１は、液体試料２１とともに回収されてもよい。一方、液体試料中のフモニシン類の分離回収を目的とする場合は、分離後の金属担体７１が、さらに溶出ステップに供される。
【００３１】
＜溶出ステップ＞
フモニシン類を吸着させた金属担体７１は、必要に応じて溶出ステップに供される。溶出ステップでは、金属担体７１が溶出液４０と接触させられる（図１（ｇ）および（ｈ））。なお、金属担体７１を溶出液中へ添加することによって、溶出液と金属担体とを接触させてもよい。
【００３２】
溶出液４０は、金属とキレートを形成し得る化合物（例えばクエン酸塩）を含む溶液である。溶出液４０は、フモニシン類よりも優先的に金属とキレートを形成する化合物を含有することが好ましい。
【００３３】
金属担体７１と溶出液４０が接触すると、溶出液中のキレート形成能を有する化合物が金属に吸着するため、金属担体７１に吸着されていたフモニシン類が脱着し、溶出液中に溶出する。この際、撹拌等の方法により、液体中に金属担体を分散させ、金属担体と溶出液との接触機会を増加させ、溶出効率を高めることもできる。
【００３４】
金属担体からフモニシン類を脱着させ、溶出液中に溶出させた後、溶出液４１とフモニシン類が脱着された金属担体７２とが固液分離される（図１（ｉ））。
【００３５】
上記の各ステップを経て、溶出液中にフモニシン類が分離回収される。分離回収されたフモニシン類は、必要に応じてさらに精製や脱塩処理が行われた後、分析等に供される。
【００３６】
上記方法によれば、フモニシン類のように金属とキレート形成能を有する化合物を、簡便な方法で分離できる。なお、本発明の金属を用いた分離方法は、前述の固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とは異なる方法である。すなわち、ＩＭＡＣは、金属キレートを担体として用い、そのキレート化合物の空配位座にＨｉｓタグ等の特定の化合物（官能基）が特異的に配位することを利用して分離を行うものであり、金属キレートと特定化合物との親和性に基づいている。これに対して、本発明の方法は、金属そのものを担体として用い、金属と特定化合物とのキレート形成能を利用して分離が行われる。
【００３７】
[分離方法の具体的形態]
上記では、バッチ式の容器１０を用いて、フモニシン類の分離を行う例に基づいて、分離方法の概要を説明したが、本発明の分離対象や分離操作は、上記以外の形態にも応用可能である。本発明の分離方法および分離デバイスの具体的形態について、以下に例を挙げて説明する。
【００３８】
＜分離対象となる物質＞
本発明において、分離対象となる物質はフモニシン類に限定されず、金属とキレート形成能を有する化合物を分離対象とすることができる。金属とキレート形成能を有する化合物としては、カルボキシル基やリン酸基等が挙げられる。中でも、金属とのキレート形成能が高いことから、対象物質は、カルボキシル基を有することが好ましい。また、金属とキレートを形成して、選択的に金属担体に吸着させるとの目的を達成するために、対象物質は２以上の酸性官能基を有することが好ましく、２以上のカルボキシル基を有する化合物が特に好ましい。
【００３９】
リン酸基を有する化合物としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）等のリボヌクレオチドや、デオキシヌクレオチド、リン酸化糖、リン酸化ペプチド等が挙げられる。カルボキシル基を有する化合物の例としては、ポリグルタミン酸等の酸性ペプチドや前述のフモニシン類等が挙げられる。
【００４０】
分離対象物質の分子量は特に限定されないが、金属担体への吸着および脱着の選択性を高める観点から、好ましくは分子量２００〜５０００程度、より好ましくは分子量３００〜４０００程度の化合物を分離対象物質とできる。
【００４１】
＜液体試料＞
液体試料は、上記の対象となる物質を含む液体であり、水系液体、有機系液体のいずれでもよい。本発明は、上記物質を選択的に分離可能であるため、食品、飲料、生体由来試料等の複雑な混合物を含む液体試料にも適用可能である。液体試料は、事前に他のカラム等を通して前処理が行われたものでもよい。
【００４２】
＜金属担体＞
金属担体は、金属粒子からなるものが好ましい。金属粒子は、容器内で保持可能なものであれば、その形状や粒径は特に限定されない。対象物質の吸着性を高める観点からは、金属担体の表面積が大きいことが好ましい。そのため、金属粒子は、凝集を生じない範囲でその粒径が小さい方が好ましい。金属粒子の平均粒径は、０．５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度が好ましく、１ｎｍ〜５００ｎｍ程度がより好ましく、５ｎｍ〜３００ｎｍ程度がさらに好ましい。なお、金属粒子の粒径は一定でもよく、粒径分布を有していてもよい。また、粒子の形状は、球状に限定されず、扁平形状や針状等の形状であってもよい。
【００４３】
金属担体を構成する金属は、上記物質に対してキレートを形成し得るものであれば、特に限定されない。キレートを形成し得る金属としては、アルカリ土類金属や遷移金属が好適に用いられる。中でも、第一遷移金属（Ｓｃ，Ｔｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，ＮｉおよびＣｕ）が好ましい。金属担体は複数種の金属元素からなるものでもよく、ステンレス等の合金でもよい。また、金属担体が複数種の金属を含む場合や合金である場合、アルカリ土類金属や遷移金属と、それ以外の金属を含むものや、これらの合金も好適に利用可能である。
【００４４】
分離対象物質がフモニシン類である場合、金属担体はＮｉを含むものが特に好適に用いられる。Ｎｉはフモニシン類に対する吸着の選択性が高く、吸着ステップにおいて試料中のフモニシン類のほぼ全量を吸着し、溶出ステップにおいて吸着されたフモニシン類のほぼ全量を脱着して溶出液中に溶出させることができる。そのため、定量分析のための前処理にも、本発明を好適に利用できる。
【００４５】
＜容器＞
容器は、金属担体を保持し得るものであれば、その形状は特に限定されない。金属担体の容器外への流出を防止するために、フリットや、ガラスフィルター、膜フィルター、濾紙等のフィルター類等が容器内に配置されていてもよい。
【００４６】
図１では、１つの開口を有する容器１０を用いたバッチ式の分離方法が図示されている。この場合、液体試料、洗浄液および溶出液等の液体の注入および排出の両方が当該開口を介して行われる。なお、図１に示す形態では、吸着、洗浄、および溶出の全てのステップが１つの容器１０内で行われているが、金属担体を別の容器に移動させ、各ステップを別の容器内で実施することもできる。
【００４７】
金属担体としてＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉ等の常磁性金属が用いられる場合、金属担体を移動させる方法として、磁場操作を用いることもできる。例えば、ＷＯ２００５／０６９０１５号国際公開パンフレットや特開２０１１−２３２２６０号公報等に開示されているように、容器内に封入されたオイル中に、液体試料、洗浄液および溶出液の液滴を配置し、磁場操作によって、これらの液滴間で金属担体を移動させて、吸着、洗浄および溶出の各ステップを行うこともできる。
【００４８】
後述する図２および図３の実施形態に示すように、一方の開口から液体を注入し、他方の開口から液体を排出するカラム式の容器１５を用いることもできる。この場合、カラム内に金属担体が保持され、このカラム内に液体を通液されることによって、液体試料、洗浄液および溶出液と金属担体との接触および分離が連続して行われる。カラム式の容器が用いられる場合、通液させる液体の組成を段階的あるいは連続的に変化させ、洗浄ステップと溶出ステップとを連続して実施してもよい。
【００４９】
カラムの変形例として、スピンカラムやシリンジフィルター等に本発明を適用することもできる。スピンカラムでは、容器上部の開口から液体が注入されて金属担体と接触し、遠心力や重力等によって、容器の下方から液体が排出される。フィルター筐体内に金属担体が保持されたシリンジフィルターでは、シリンジから注入された液体が、金属担体に接触した後、シリンジからの圧力によって、筐体外へと排出される。
【００５０】
一方の開口から液体を注入し、他方の開口から液体を排出する方式の容器として、濾過器を用いることもできる。濾過器の底面には、金属担体の流出を防止するために、ガラスフィルター等が設けられており、濾過器上部の開口から注入され、金属担体に接触した液体が、フィルターを介して濾過器外へと排出される。吸引や加圧等の手段により、濾過効率を高めてよもよい。
【００５１】
容器を構成する材料は特に限定されないが、対象物質の容器への吸着を抑止する観点から、内壁面が非金属からなる容器が好ましく用いられる。非金属としては、ガラス、セラミック、シリコーン、有機樹脂等が挙げられる。容器を構成する有機樹脂材料としては、ポリプロピレンやポリエチレン等のポリオレフィン、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート等のエンジニアリングプラスチック、ポリアリレート、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、芳香族エーテルケトン、ポリイミド、ポリエーテルイミド、フッ素樹脂等のスーパーエンジニアリングプラスチック、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、環状ポリオレフィン等が挙げられる。また、セラミック、ガラス、シリコーン、金属等の内壁面がフッ素系樹脂やシリコーン等によりコートされたものも好適に用いられる。
【００５２】
＜洗浄液＞
洗浄液は、金属担体に物質が吸着された状態を保持したまま、金属担体に付着した夾雑物や、容器内の液体試料の残液等を洗浄・除去し得るものであれば、特に限定されない。洗浄液が水系液体の場合は、水の他、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒を、分析対象化合物が溶出しない程度に含有する水溶液が用いられてもよい。洗浄液が有機系の場合は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル等の他、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、メチレンクロライド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、あるいはこれらの混合有機溶媒等を用いることができる。洗浄液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の塩を、分析対象化合物が溶出しない程度に（例えば、０〜数重量％程度）含有するものでもよい。また、洗浄液中には、必要に応じて界面活性剤等が添加されていてもよい。
【００５３】
＜溶出液＞
溶出液は、金属担体に吸着された物質を金属担体から脱着させ、液体中に溶出させるために用いられる。金属担体に吸着された物質の脱着方法としては、金属担体に対する吸着力がより大きい他の物質を金属担体に吸着させる方法が挙げられる。例えば、吸着物質よりも優先的に金属とキレートを形成する化合物を含有する溶出液を用いれば、溶出液中のキレート形成能を有する化合物が金属担体に吸着され、金属担体に吸着されていた物質が効率的に脱着される。
【００５４】
このように、優先的に金属とキレートを形成する化合物としては、各種のキレート剤が挙げられる。キレート剤としては、クエン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチレンジアミン四酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二フマル酸（ＥＤＤＦ）、エチレンジアミン二リンゴ酸（ＥＤＤＭ）、エチレンジアミン二酒石酸（ＥＤＤＴ）、エチレンジアミン二マレイン酸（ＥＤＤＭＡＬ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二グルタル酸（ＥＤＤＧ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジエチレントリアミン五メチレンホスホン酸（ＤＥＴＰＭＰ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、イミノ二フマル酸（ＩＤＦ）、イミノ二酒石酸（ＩＤＴ）、イミノ二マレイン酸（ＩＤＭＡＬ）、イミノ二リンゴ酸（ＩＤＭ）、イミノ二コハク酸（ＩＤＳ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、アスパラギン酸ジエトキシコハク酸（ＡＥＳ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰＡ）、アミノトリメチレンホスホン酸（ＡＴＭＰ）、グリシンアミド−Ｎ，Ｎ’二コハク酸（ＧＡＤＳ）、２−ヒドロキシプロピレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二コハク酸（ＨＰＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸，Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）等が挙げられる。これらの中でも、クエン酸ナトリウムやクエン酸カリウム等のクエン酸塩は、揮発性が低く取り扱いが容易である上に、フモニシン類等の脱着作用に優れるため、好適に用いられる。
【００５５】
[応用例]
上述のように、本発明の分離方法は、有害物質等の分離除去や、分析対象物質の前処理、精製、濃縮等に適用可能である。
【００５６】
＜対象物質の分離・精製を行う実施形態＞
図２は、本発明の応用例として、カラム１５内に金属担体７５が保持された分離デバイス５５を用いてフモニシン類の精製を行い、分析装置１００に供する実施形態の模式図である。なお、図２に示す形態において、液体試料２５、洗浄液３５および溶出液４５は、ポンプ等の適宜の送液手段（不図示）を用いて、上流側から下流側へ送液される。
【００５７】
分離デバイス５５の上流には、流路９３が接続されており、その上流には切り替えバルブ８１が接続されている。バルブ８１の上流の流路９１は、液体試料２５を保持する容器に接続されており、流路９２は、洗浄液３５および溶出液４５を保持する容器に接続されている。
【００５８】
まず、液体試料２５が、流路９１，バルブ８１および流路９３を介して、分離デバイス内に送液される。液体試料がデバイス内を通液し、金属担体７５と接触することにより、液体試料中の対象物質（例えばフモニシン類）は、金属担体７５（例えばニッケル粒子）に吸着され、その他の夾雑物および液体は、流路９４，バルブ８２および流路９８を介して、系外へ排出される。
【００５９】
液体試料２５の全量がデバイス内に注入された後、流路９２と流路９３とが連通するように、バルブ８１が切り替えられ、洗浄液３５が、流路９２ａから流路９２，バルブ８１および流路９３を介して分離デバイス５５内に送液される。洗浄液がデバイス内を通液し、金属担体７５と接触することにより、容器１５内に残留している液体試料や、金属担体７５の表面に付着している夾雑物等が洗い流される。通液後の洗浄液は、流路９４，バルブ８２および流路９８を介して、系外へ排出される。デバイスを通液後の洗浄液中に、液体試料由来の夾雑物が含まれなくなるまで、十分に洗浄が行われることが好ましい。なお、洗浄が十分か否かをモニタするために、流路９８から排出された洗浄液の分析が行われてもよい。また、バルブ８２を切り替えて、分析装置１００へ洗浄液を送液して、分析が行われてもよい。
【００６０】
十分に洗浄が行われた後、溶出液４５が、流路９２ｂから、流路９２、バルブ８１および流路９３を介して分離デバイス５５内に送液される。また、流路９４と流路９５とが連通するようにバルブ８２が切り替えられ、流路９６と流路９７とが連通するようにバルブ８３が切り替えられる。なお、洗浄液３５と溶出液４５との切り替えは、流路上に設けられたバルブ（不図示）によって行われてもよい。
【００６１】
溶出液がデバイス内を通液し、金属担体７５と接触することにより、金属担体に吸着されていた対象物質が脱着され、溶出液内へ溶出される。対象物質を伴った溶出液は、脱塩カラム９０を介して、分析装置１００へと送液され、分析が行われる。分析装置としては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や、分光スペクトル測定装置、質量分析装置（ＭＳ）等の任意の分析装置が用いられる。ＬＣやＭＳ，あるいはＬＣとＭＳとを接続したＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等による機器分析では、夾雑物の影響によって分析精度が低下する傾向がある。そのため、上記方法による対象物質の分離・精製が行われた後に、分析に供することで、夾雑物によるバックグラウンド等の悪影響を抑制して、分析精度の向上を図ることができる。
【００６２】
なお、図２に示す脱塩カラム９０やバルブ８２，８３は任意の構成であり、分離デバイス５５と分析装置１００とが、流路を介して直接接続されていてもよい。また、脱塩カラムに代えて（あるいは脱塩カラムに加えて）、他の前処理カラムやフィルター等が設けられていてもよい。分離デバイス５５の上流側に、他の前処理カラムやフィルター等が設けられていてもよい。
【００６３】
また、各流路に、非金属からなるものや、内壁面が非金属でコートされたものを用いることで、対象物質の不所望の吸着を抑制し、分析の定量性を高めることができる。同様の観点から、バルブ等も流路の内壁面が非金属であることが好ましい。また、分析装置がオートサンプラ―を備える場合、分取容器や分取用のニードルも、樹脂製のものや、内面が樹脂コートされたものが好適に用いられる。
【００６４】
＜対象物質の分離除去を行う分析例＞
図３は、本発明の応用例として、カラム１５内に金属担体７５が保持された分離デバイス５５をガードカラムとして、液体試料２５を分析装置１００に供する実施形態の模式図である。この実施形態では、金属担体７５に吸着される対象物質は、例えば、分析に不所望の結果をもたらす夾雑物である。なお、図３に示す形態において、液体試料は、ポンプ等の適宜の送液手段（不図示）を用いて、下流側へ送液される。
【００６５】
分離デバイス５５の上流には、流路９１が接続されており、流路９１は、液体試料２５を保持する容器に接続されている。液体試料２５が、分離デバイス５５内に送液される。液体試料が、デバイス内を通液し、金属担体７５と接触することにより、液体試料中の対象物質は、金属担体７５に吸着され、その他の物質を含む液体は、流路９６、バルブ８３および流路９７を介して、分析装置１００へと送液され、分析が行われる。
【００６６】
この実施形態では、分離デバイス５５によって対象物質が吸着されることによって、液体試料から対象物質が除去され、除去後の液体試料が分析に供される。すなわち、分離デバイス５５をガードカラムとして用いることによって、不所望の物質の分析装置へ導入が抑制される。そのため、分析精度の向上や、分析装置内での不所望の物質の凝集等の不具合の抑制に寄与し得る。
【実施例】
【００６７】
以下に、実施例として、フモニシン類の金属担体への吸着による分離例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［実施例１］
【００６９】
樹脂製の遠心管内に、平均粒径６０ｎｍ〜８０ｎｍの鉄粉末４ｍｇを入れ、これを分離用デバイスとした。遠心管内に、フモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３を各５ｐｐｍの濃度で含有する水溶液を１ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで約１分間撹拌して、水溶液中に鉄粉末を懸濁させた。１００００ｒｐｍで遠心分離した後、ピペットで上清液を回収して、溶液と鉄粉末とを分離した。この上清液を、上清Ａとする。
【００７０】
遠心管内に、洗浄液（５０体積％アセトニトリル水溶液）１ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで約１分間撹拌して、洗浄液中に鉄粉末を懸濁させた。１００００ｒｐｍで遠心分離した後、ピペットで上清液を回収して、洗浄液と鉄粉末とを分離した。この上清液を、上清Ｂとする。
【００７１】
遠心管内に、溶出液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液）１ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで約１分間撹拌して、溶出液中に鉄粉末を懸濁させた。１００００ｒｐｍで遠心分離した後、ピペットで上清液を回収して、溶出液と鉄粉末とを分離した。この上清液を、上清液Ｃとする。
【００７２】
［実施例２］
鉄粉末に代えて平均粒径約２０ｎｍのニッケル粉末を用いたこと以外は、実施例１と同様にして分離操作を行い、各上清液を回収した。
【００７３】
［分離結果の評価］
【００７４】
実施例１および実施例２のそれぞれについて、各分離操作で得た上清液を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（島津製作所製、Ｎｅｘｅｒａ  ＬＣＭＳ−８０４０）により分析した。ブランクとして、フモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３を各５ｐｐｍの濃度で含有する水溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した際のフモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３由来のピーク面積を基準（１００）として、各上清液中のフモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３のそれぞれの含有量を定量した。結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
2015025680.tif 000004
【００７６】
実施例１では、鉄粉末と液体試料とを接触させることにより、フモニシンの種類によらず９０％以上が液体試料から除去されており、洗浄液中への各フモニシンの溶出量も１％程度であることから、金属粉末にフモニシン類が吸着されていることがわかる。また、クエン酸ナトリウム水溶液で溶出することにより、フモニシンＢ１，Ｂ２，Ｂ３のそれぞれを５０〜６０％程度の回収率で回収できた。この結果から、金属担体を用いて、フモニシン類の分離および回収が可能であることがわかる。
【００７７】
また、実施例２では、金属担体としてニッケル粉末を用いることで、液体試料からフモニシン類をほぼ完全に除去できるとともに、吸着されたフモニシン類のほぼ全量を溶出液中に溶出させることができた。この結果から、金属の種類を最適化すれば、対象物質を溶出液中に定量的に回収可能であり、定量分析の前処理としても、本発明の分離方法を利用できることがわかる。
【符号の説明】
【００７８】
１０，１５      容器（カラム）
２０，２５      液体試料
３０，３５      洗浄液
４０，４５      溶出液
５０，５５      分離用デバイス
７０，７５      金属担体
８１〜８３      バルブ
９１〜９９      流路
１００          分析装置
【図１】
2015025680.tif 000005
【図２】
2015025680.tif 000006
【図３】
2015025680.tif 000007