(57)【要約】【課題】  FlimPIAにおけるアクセプタのバックグラウンド発光を低減する手段を提供する。【解決手段】  甲虫類由来のルシフェラーゼ変異体であって、北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はメチオニンに置換されていることを特徴とするルシフェラーゼ変異体、及びこの変異体を利用した分子間の相互作用の検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲虫類由来のルシフェラーゼ変異体であって、北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はメチオニンに置換されていることを特徴とするルシフェラーゼ変異体。
【請求項２】
北米ホタルの529位のリジンに相当するアミノ酸が、アルギニン、メチオニン、又はアスパラギンに置換されていることを特徴とする請求項１に記載のルシフェラーゼ変異体。
【請求項３】
甲虫類が、北米ホタル、ヘイケボタル、ゲンジボタル、ヒメボタル、ミヤコマドボタル、クメジマボタル、又はヒカリコメツキであることを特徴とする請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ変異体。
【請求項４】
酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第一の分子と、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第二の分子とを、ルシフェリン及びATPの存在下で、接触させる工程、及び前記ルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとの反応による発光を検出する工程を含む第一の分子と第二の分子の相互作用を検出する方法であって、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体として、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のルシフェラーゼ変異体を用いることを特徴とする分子間の相互作用の検出方法。
【請求項５】
ATPの濃度が、0.1〜10mMであることを特徴とする請求項４に記載の分子間の相互作用の検出方法。
【請求項６】
酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体として、北米ホタルの245位のヒスチジンに相当するアミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、又はアラニンに置換されているルシフェラーゼ変異体を用いることを特徴とする請求項４又は５に記載の分子間の相互作用の検出方法。
【請求項７】
酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第一の分子と、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第二の分子とを、ルシフェリン及びATPの存在下で、接触させる工程、及び前記ルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとの反応による発光を検出する工程を含む第一の分子と第二の分子の相互作用を検出する方法であって、ATPの濃度が、0.1〜10mMであることを特徴とする分子間の相互作用の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェラーゼ変異体、及びルシフェラーゼ変異体を利用した分子間の相互作用の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト細胞内には、15万〜30万の蛋白質間相互作用があると言われ、蛋白質間相互作用検出についての解析は、生命現象の理解・創薬開発のために必須である。
【０００３】
ホタルルシフェラーゼ (Fluc)は、N末ドメインとC末ドメインが柔軟なヒンジ部位を介して連結した構造を持つ。Flucは、まず、あるコンフォメーションで基質であるルシフェリン (LH2)とアデニル化ルシフェリン (LH2-AMP)を産生するアデニル化反応を行い、次にC末ドメインが140度回転し、別のコンフォメーションで酵素中のLH2-AMPに酸素を付加し、発光物質オキシルシフェリン (OxL)を産生する酸化的発光反応を行う、とされる（図１Ａ、Ｂ）。
【０００４】
その根拠として、Flucと同じファミリー(Acyl-adenylate forming enzyme superfamily)に属する酵素はそのC末ドメインが回転しながら２つの反応を行うこと、Flucにおいても、他のファミリー酵素同様アデニル化反応・酸化的発光反応のそれぞれの半反応に重要な残基が異なること、それぞれの反応状態に対応する結晶構造が解かれていること、がある（非特許文献１〜３）。すなわちアデニル化反応に重要な残基はK529である一方、酸化的発光反応に重要な残基はK443であり、これは反応に伴い、ドメインが回転するという報告を強く支持している。また本発明者は以前、これに加え、北米ホタルルシフェラーゼ（Ppy Fluc）においてN末ドメイン活性部位近傍のH245をAspに変異させたH245D変異体では、酸化的発光反応のみが選択的に抑えられる、という知見を得ている（非特許文献４）。
【０００５】
以上の知見をもとに、最近本発明者は、反応中間体LH2-AMPの受け渡しを原理とした蛋白質間相互作用検出系FlimPIA (firefly luminescent intermediate-based protein-protein interaction assay)を構築した（特許文献１、非特許文献５）。そのために、Ppy Flucを用いて、まず、反応中間体を供給する「ドナー」として、アデニル化反応はほぼ正常だが、酸化的発光反応が非常に遅い変異体、H245D/K443A/L530Rを作製した。また、反応中間体を受け取る「アクセプタ」として、逆にアデニル化反応が遅く、酸化的発光反応がほぼ正常な変異体K529Qを作製した。また酵素の安定化のため、これらには、熱安定性変異E354Kをさらに導入した。そして、相互作用タンパク質とドナー・アクセプタをそれぞれ融合させプローブとした。相互作用をしていない時と比べ、相互作用時、ドナー・アクセプタが近接することで、ドナーからアクセプタへの中間体の受け渡しの効率が上昇し、ドナーから放出された中間体をアクセプタが使用して発光物質OxLを産生する。図１Ｃでは、相互作用検出例として、炎症・がんの関連因子、FK506 binding protein-12 (FKBP12)・FKBP12-rapamycin associated protein (FRB)の相互作用パートナーについての検出を示した。FKBP12, FRBは、抗生物質ラパマイシン依存的に相互作用する。
【０００６】
FlimPIAは、試験管内・細胞内の両方で使用できるが、特に試験管内における精製プローブを用いた相互作用検出において以下のメリットが確認されている（非特許文献６）。
１）Flucを用いたProtein-fragment Complementation Assay（PCA）よりも本系のシグナル発光値が高い。
２）PCAより高い熱安定性を持つ。すなわちFlucを用いたPCAとともに、プローブを37℃で0-60分間処理してから相互作用検出を行った結果、FlimPIAでは、PCAに比べて熱処理による発光減少速度が約４倍遅いことが示された。
３）ラパマイシンの検出限界を比較した結果、試験管内において50 nMのプローブを使用した場合、Flucを用いたPCAの試験管内検出では250 pMであったのに対して、本系では25 pMと高い感度を示した。
４）相互作用パートナーとプローブの間に剛直なリンカーとして、長さ7 nmのFibronectin Type III domains 7-8を挿入した場合、繁用される蛋白質間相互作用検出法であるFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)やPCAではほとんどシグナルが得られなかったが、FlimPIAにおいては、ややS/B比が低いが顕著なシグナルがみられた。すなわち、FRET及びPCAと比較して、相互作用分子間の距離の制約がより少なく、大きな蛋白質間の相互作用が検出可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-268793号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】B.R. Branchini, T.L. Southworth, M.H. Murtiashaw, S.R. Wilkinson, N.F. Khattak, J.C. Rosenberg and M. Zimmer "Mutagenesis Evidence that the Partial Reactions of Firefly Bioluminescence Are Catalyzed by Different Conformations of the Luciferase C-Terminal Domain" Biochemistry 44, 1385-1393 (2005).
【非特許文献２】T. Nakatsu, S. Ichiyama, J. Hiratake, A. Saldanha, N. Kobashi, K. Sakata and H. Kato "Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence" Nature 440, 372-376 (2006).
【非特許文献３】J.A. Sundlov, D.M. Fontaine, T.L. Southworth, B.R. Branchini and A.M. Gulick "Crystal structure of firefly luciferase in a second catalytic conformation supports a domain alternation mechanism" Biochemistry 51, 6493-6495 (2012).
【非特許文献４】K. Ayabe, T. Zako and H. Ueda "The role of firefly luciferase C-terminal domain in efficient coupling of adenylation and oxidative steps " FEBS Lett. 579, 4389-4394 (2005).
【非特許文献５】Y. Ohmuro-Matsuyama, K. Nakano, A. Kimura, K. Ayabe, M. Ihara, T. Wada and H. Ueda "A protein-protein interaction assay based on the functional complementation of mutant firefly luciferases" Anal. Chem. 85, 7935-7940 (2013)
【非特許文献６】Y. Ohmuro-Matsuyama, Y. Hara and H. Ueda "Improved protein-protein interaction assay FlimPIA by the entrapment of luciferase conformation" Anal. Chem. 86, 2013-2018 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように利点の多いFlimPIAではあるが、従来その問題点として、アクセプタ由来の高いバックグラウンド発光と、それに伴う低いシグナル/バックググラウンド(S/B)比があった。本発明は、FlimPIAにおけるアクセプタのバックグラウンド発光を低減する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸を嵩高い側鎖を持つアミノ酸に置換することにより、ルシフェラーゼにおけるアデニル化活性を抑制でき、このようなルシフェラーゼ変異体をFlimPIAのアクセプタとして用いることにより、バックグラウンド発光を低減できることを見出した。
【００１１】
また、本発明者は、使用するATPの濃度を低くすることによって、アクセプタのバックグラウンド発光を低減できるとともに、シグナル発光を増強できる場合があることを見出した。このようなシグナル発光の増強は全く予想外のことであった。なぜなら、ATPはルシフェラーゼの基質の一つであり、基質の濃度を低くすれば反応速度が低下し、発光値が低下するのが一般的だからである。
【００１２】
更に本発明者は、北米ホタルの529位のリジンに相当するアミノ酸が、アルギニン、メチオニン、又はアスパラギンに置換されているルシフェラーゼ変異体がFlimPIAのアクセプタとして適しており、北米ホタルの245位のヒスチジンに相当するアミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、又はアラニンに置換されているルシフェラーゼ変異体がFlimPIAのドナーとして適していることを見出した。
【００１３】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【００１４】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（７）を提供するものである。
（１）甲虫類由来のルシフェラーゼ変異体であって、北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はメチオニンに置換されていることを特徴とするルシフェラーゼ変異体。
【００１５】
（２）北米ホタルの529位のリジンに相当するアミノ酸が、アルギニン、メチオニン、又はアスパラギンに置換されていることを特徴とする（１）に記載のルシフェラーゼ変異体。
【００１６】
（３）甲虫類が、北米ホタル、ヘイケボタル、ゲンジボタル、ヒメボタル、ミヤコマドボタル、クメジマボタル、又はヒカリコメツキであることを特徴とする（１）又は（２）に記載のルシフェラーゼ変異体。
【００１７】
（４）酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第一の分子と、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第二の分子とを、ルシフェリン及びATPの存在下で、接触させる工程、及び前記ルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとの反応による発光を検出する工程を含む第一の分子と第二の分子の相互作用を検出する方法であって、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体として、（１）乃至（３）のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を用いることを特徴とする分子間の相互作用の検出方法。
【００１８】
（５）ATPの濃度が、0.1〜10mMであることを特徴とする（４）に記載の分子間の相互作用の検出方法。
【００１９】
（６）酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体として、北米ホタルの245位のヒスチジンに相当するアミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、又はアラニンに置換されているルシフェラーゼ変異体を用いることを特徴とする（４）又は（５）に記載の分子間の相互作用の検出方法。
【００２０】
（７）酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第一の分子と、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第二の分子とを、ルシフェリン及びATPの存在下で、接触させる工程、及び前記ルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとの反応による発光を検出する工程を含む第一の分子と第二の分子の相互作用を検出する方法であって、ATPの濃度が、0.1〜10mMであることを特徴とする分子間の相互作用の検出方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、検出感度が高く、迅速、簡便な分子間の相互作用の検出や薬剤のスクリーニングなどが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ホタルルシフェラーゼの発光反応に関する図。図１Ａは、アデニル化反応と酸化的発光反応の反応式を示す。図１Ｂは、ホタルルシフェラーゼのアデニル化反応フォームと酸化的発光反応フォームを示す。図１Ｃは、FlimPIAの原理を示す。
【図２】ルシフェラーゼ変異体を用いたFlimPIA（プローブ濃度：50nM、ラパマイシン濃度：50nM）の結果を示す図。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は１秒当たりの発光値（図２Ａ−Ｅ）又はS/B比（ラパマイシン添加時の発光値/ラパマイシン非添加時の発光値）（図２Ｆ）を示す。ルシフェラーゼ変異体としては、北米ホタルルシフェラーゼの440位のセリンをロイシン（S440L）、フェニルアラニン（S440F）、トリプトファン（S440W）、メチオニン（S440M）に置換したものを用いている。図２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、それぞれ野生型ルシフェラーゼ（WT）、S440L、S440F、S440W、S440Mをアクセプタとして用いた場合の結果を示す。図２Ｆの曲線上のL、M、F、W、WTは、それぞれアクセプタとしてS440L、S440M、S440F、S440W、野生型ルシフェラーゼを用いたことを示す。
【図３】ルシフェラーゼ変異体を用いたFlimPIA（プローブ濃度：17nM、ラパマイシン濃度：17nM）の結果を示す図。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は１秒当たりの発光値（図３Ａ−Ｅ）又はS/B比（ラパマイシン添加時の発光値/ラパマイシン非添加時の発光値）（図３Ｆ）を示す。図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、それぞれ野生型ルシフェラーゼ、S440L、S440F、S440W、S440Mをアクセプタとして用いた場合の結果を示す。図３Ｆの曲線上のL、M、F、W、WTは、それぞれアクセプタとしてS440L、S440M、S440F、S440W、野生型ルシフェラーゼを用いたことを示す。
【図４】各S440変異体の積算S/B比（ラパマイシン添加時の発光積算値/ラパマイシン非添加時の発光積算値）を示す図。
【図５】アクセプタとして、野生型ルシフェラーゼを使用し、ATP濃度を1mMとし、LH2濃度を16μMとした場合のFlimPIAの結果を示す図。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は１秒当たりの発光値（左）又はS/B比（ラパマイシン添加時の発光値/ラパマイシン非添加時の発光値）（右）を示す。
【図６】アクセプタとして、S440Lを使用し、ATP濃度を2mMとし、LH2濃度を63μMとした場合のFlimPIAの結果を示す図。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は１秒当たりの発光値（左）又はS/B比（ラパマイシン添加時の発光値/ラパマイシン非添加時の発光値）（右）を示す。
【図７】アクセプタとして、S440Fを使用し、ATP濃度を2mMとし、LH2濃度を63μMとした場合のFlimPIAの結果を示す図。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は１秒当たりの発光値（左）又はS/B比（ラパマイシン添加時の発光値/ラパマイシン非添加時の発光値）（右）を示す。
【図８】アクセプタとして、S440Wを使用し、ATP濃度を4mMとし、LH2濃度を16μMとした場合のFlimPIAの結果を示す図。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は１秒当たりの発光値（左）又はS/B比（ラパマイシン添加時の発光値/ラパマイシン非添加時の発光値）（右）を示す。
【図９】ヘイケボタルルシフェラーゼを用いたFlimPIAの結果を示す図。ヘイケボタルルシフェラーゼとしては、531位のリジンがグルタミンに置換されたルシフェラーゼ（LL Fluc K531Q）と531位のリジン及び442位のセリンがそれぞれグルタミン及びメチオニンに置換されたルシフェラーゼ（LL Fluc K531Q/S442M）を用いた。図９ＡはLL Fluc K531Qを用い、ATP濃度を20mMとし、LH2濃度を75μMとした場合の結果を示し、図９ＢはLL Fluc K531Q/S442Mを用い、ATP濃度を20mMとし、LH2濃度を75μMとした場合の結果を示し、図９ＣはLL Fluc K531Q/S442Mを用い、ATP濃度を1mMとし、LH2濃度を75μMとした場合の結果を示す。
【図１０】ヘイケボタルのルシフェラーゼ変異体を用いたラパマイシン依存的FKBP-FRB相互作用の検出結果を示す図。図１０Ａは442位のセリン及び531位のリジンが両方メチオニンに置換されたルシフェラーゼ（S442M/K531M）をアクセプタとした場合の結果を示し、図１０Ｂは442位のセリン及び531位のリジンがそれぞれメチオニン及びアルギニンに置換されたルシフェラーゼ（S442M/K531R）をアクセプタとした場合の結果を示し、図１０Ｃは442位のセリン及び531位のリジンがそれぞれメチオニン及びアスパラギンに置換されたルシフェラーゼ（S442M/K531N）をアクセプタとした場合の結果を示す。図１０Ｄは、各ルシフェラーゼ変異体のS/B比を示す。横軸は基質添加からの時間を示し、図１０Ａ〜Ｃの縦軸は発光値を示し、図１０Ｄの縦軸はS/B比を示す。プローブ濃度を50nMとし、ラパマイシン濃度を50nMとした。各実験は3回行った。
【図１１】ヘイケボタルのルシフェラーゼ変異体を用いたラパマイシン依存的FKBP-FRB相互作用の検出結果を示す図。図１１Ａは445位のリジンがアラニンに置換されたルシフェラーゼ（K445A）をドナーとした場合の結果を示し、図１１Ｂは247位のヒスチジン及び445位のリジンがそれぞれグルタミン酸及びアラニンに置換されたルシフェラーゼ（H247E/K445A）をドナーとした場合の結果を示す。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は発光値を示す。プローブ濃度を50nMとし、ラパマイシン濃度を50nMとした。H247E/K445Aを用いた場合、LH2濃度を75μMとし、ATP濃度を1.25mM、5mM、又は20mMとした。各実験は3回行った。K445Aをドナーとして用いた場合、ラパマイシンを添加しても発光値は上昇しなかった。一方、H247E/K445Aをドナーとして用いた場合、ラパマイシン添加による顕著なシグナル上昇がみられた。
【図１２】ヘイケボタルのルシフェラーゼ変異体を用いたラパマイシン依存的FKBP-FRB相互作用の検出結果を示す図。図１２Ａは442位のセリン及び531位のリジンがそれぞれフェニルアラニン及びメチオニンに置換されたルシフェラーゼ（S442F/K531M）をアクセプタとした場合の結果を示し、図１２Ｂは442位のセリン及び531位のリジンがそれぞれトリプトファン及びメチオニンに置換されたルシフェラーゼ（S442W/K531M）をアクセプタとした場合の結果を示す。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は発光値又はS/B比を示す。プローブ濃度を50nMとし、ラパマイシン濃度を50nMとし、LH2濃度を75μMとし、ATP濃度を1.25mM、5mM、又は20mMとした。各実験は3回行った。S442F/K531M及びS442W/K531Mのいずれを用いた場合も、ラパマイシン添加による顕著なシグナル上昇がみられた。
【図１３】各ルシフェラーゼ変異体のアデニル化活性を示す図。図１３Ａは245位のヒスチジン、443位のリジン、及び530位のロイシンがそれぞれアスパラギン酸、アラニン、及びアルギニンに置換された北米ホタルのルシフェラーゼ（H245D/K443A/L530R）を用いた場合の結果を示し、図１３Ｂは247位のヒスチジン及び445位のリジンがそれぞれグルタミン酸及びアラニンに置換されたヘイケボタルのルシフェラーゼ（H247E/K445A）を用いた場合の結果を示し、図１３Ｃは440位のセリン及び529位のリジンがそれぞれロイシン及びグルタミンに置換された北米ホタルのルシフェラーゼ（S440L/K529Q）を用いた場合の結果を示し、図１３Ｄは442位のセリン及び531位のリジンがそれぞれフェニルアラニン及びメチオニンに置換されたヘイケボタルのルシフェラーゼ（S442F/K531M）を用いた場合の結果を示す。横軸はN末ドメイン添加からの時間を示し、縦軸は発光値を示す。図中の0.5m、1m、2m、4m、6m、及び8mはそれぞれ0.5、1、2、4、6、及び8分後に反応を停止させたことを示す。
【図１４】北米ホタル又はヘイケボタルのルシフェラーゼ変異体を用いたラパマイシン依存的FKBP-FRB相互作用の検出結果を示す図。図１４Ａは245位のヒスチジン、443位のリジン、及び530位のロイシンがそれぞれアスパラギン酸、アラニン、及びアルギニンに置換された北米ホタルのルシフェラーゼ（H245D/K443A/L530R）をドナーとし、440位のセリン及び529位のリジンがそれぞれロイシン及びグルタミンに置換された北米ホタルのルシフェラーゼ（S440L/K529Q）をアクセプタとした場合の結果を示し、図１４Ｂは247位のヒスチジン及び445位のリジンがそれぞれグルタミン酸及びアラニンに置換されたヘイケボタルのルシフェラーゼ（H247E/K445A）をドナーとし、442位のセリン及び531位のリジンがそれぞれフェニルアラニン及びメチオニンに置換されたヘイケボタルのルシフェラーゼ（S442F/K531M）をアクセプタとした場合の結果を示す。横軸は基質添加からの時間を示し、縦軸は発光値又はS/B比を示す。プローブ濃度を50nMとし、ラパマイシン濃度を50nMとした。北米ホタルのルシフェラーゼを用いた場合はLH2濃度を33μMとし、ATP濃度を1.25mMとし、ヘイケボタルのルシフェラーゼを用いた場合はLH2濃度を225μMとし、ATP濃度を20mMとした。各実験は3回行った。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ルシフェラーゼ変異体
本発明のルシフェラーゼ変異体は、甲虫類由来のルシフェラーゼ変異体であって、北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸が嵩高い側鎖を持つアミノ酸に置換されていることを特徴とするものである。
【００２４】
甲虫類由来のルシフェラーゼとしては、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ヒカリコメツキルシフェラーゼなどを挙げることができる。ホタルルシフェラーゼとしては、例えば、北米ホタル（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼ（そのアミノ酸配列の一例を配列番号１に示す。）、ヘイケボタル（Luciola lateralis）由来のルシフェラーゼ（そのアミノ酸配列の一例を配列番号２に示す。）、ゲンジボタル（Luciola cruciata）由来のルシフェラーゼ（そのアミノ酸配列の一例を配列番号３に示す。）、ヒメボタル（Luciola parvula）由来のルシフェラーゼ、ミヤコマドボタル（Pyrocoelia miyako Nakane）由来のルシフェラーゼ、クメジマボタル（Luciola owadai）由来のルシフェラーゼなどを挙げることができる。
【００２５】
「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」とは、アミノ酸配列の同一性に基づいて、北米ホタル由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列と整列させた場合に、北米ホタル由来のルシフェラーゼの440位のセリンに相当するアミノ酸（例えば、セリン、グルタミン酸など）を意味する。例えば、ヘイケボタル由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」は、442位のセリンであり、ゲンジボタル由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」は、442位のセリンであり、ヒメボタル由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」は、442位のセリンであり、ミヤコマドボタル由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」は、441位のセリンであり、ヒカリコメツキの一種 Pyrophorus plagiophthalamus由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」は、437位のグルタミン酸である。
【００２６】
嵩高い側鎖を持つアミノ酸としては、例えば、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はメチオニンを挙げることができる。好ましいアミノ酸は、ルシフェラーゼの種類などによって異なり、例えば、北米ホタル由来のルシフェラーゼでは、ロイシンが好ましく、ヘイケボタル由来のルシフェラーゼでは、フェニルアラニン、トリプトファン、又はメチオニンが好ましく、フェニルアラニンがより好ましい。
【００２７】
本発明のルシフェラーゼ変異体は、北米ホタルの440位のセリンに関する変異のみを含むものであってもよいが、他の変異を含むものであってもよい。このような他の変異としては、例えば、アデニル化反応の速度を低下させる変異である北米ホタルの529位のリジンに相当するアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異を挙げることができる。他のアミノ酸としては、従来から知られているグルタミン（K529Q）のほか、アルギニン（K529R）、メチオニン（K529M）、又はアスパラギン（K529N）などを挙げることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体は、前記した変異以外にも、例えば、熱安定性を増大させる変異である北米ホタルの354位のグルタミン酸に相当するアミノ酸をリジンに置換する変異（E354K）、北米ホタルの215位のアラニンに相当するアミノ酸をロイシンもしくはイソロイシンに置換する変異（A215L/I）などを含んでもよい。なお、「北米ホタルの529位のリジンに相当するアミノ酸」等は、上記の「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」と同様、アミノ酸配列の同一性に基づいて整列させることにより、特定することができる。例えば、ヘイケボタル由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの529位のリジンに相当するアミノ酸」は、531位のリジンである。
【００２８】
本発明のルシフェラーゼ変異体は、酸化的発光反応がほぼ正常で、アデニル化反応が野生型ルシフェラーゼよりも非常に遅いので、FlimPIAのアクセプタとして有用である。
【００２９】
（２）分子間の相互作用の検出方法
本発明の分子間の相互作用の検出方法は、酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第一の分子と、アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体を連結させた第二の分子とを、ルシフェリン及びATPの存在下で、接触させる工程、及び前記ルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとの反応による発光を検出する工程を含むものである。
【００３０】
酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体としては、アデニル化反応がほぼ正常であるが、酸化的発光反応が非常に遅いルシフェラーゼ変異体を使用するのが好ましい。ここで、「アデニル化反応がほぼ正常」とは、例えば、アデニル化活性が、野生型ルシフェラーゼのアデニル化活性の50％以上であることをいい、「酸化的発光反応が非常に遅い」とは、例えば、酸化的発光活性が、野生型ルシフェラーゼの酸化的発光活性の1％以下であることをいう。このようなルシフェラーゼ変異体としては、酸化的発光反応の速度を低下させる変異を含むルシフェラーゼ変異体を使用することができる。酸化的発光反応の速度を低下させる変異としては、北米ホタルの245位のヒスチジンに相当するアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異を挙げることができる。他のアミノ酸としては、従来から知られているアスパラギン酸（H245D）のほか、グルタミン酸（H245E）、アスパラギン（H245N）、セリン（H245S）、又はアラニン（H245A）などを挙げることができる。これ以外にも、酸化的発光反応の速度を低下させる変異としては、北米ホタルの443位のリジンに相当するアミノ酸をアラニンに置換する変異（K443A）などを挙げることができる。酸化的発光反応が遅いルシフェラーゼ変異体には、これらの変異の全てが含まれていてもよいし、一部のみが含まれていてもよい。また、酸化的発光反応の速度を低下させる変異以外の変異、例えば、アデニル化活性を向上させる変異である北米ホタルの530位のロイシンに相当するアミノ酸をアルギニンに置換する変異（L530R）、熱安定性を増大させる変異であるE354Kなどの変異が含まれていてもよい。なお、「北米ホタルの245位のヒスチジンに相当するアミノ酸」等は、上記の「北米ホタルの440位のセリンに相当するアミノ酸」と同様、アミノ酸配列の同一性に基づいて整列させることにより、特定することができる。例えば、ヘイケボタル由来のルシフェラーゼにおける「北米ホタルの245位のヒスチジンに相当するアミノ酸」は、247位のヒスチジンである。
【００３１】
アデニル化反応が遅いルシフェラーゼ変異体としては、酸化的発光反応がほぼ正常であるが、アデニル化反応が非常に遅いルシフェラーゼ変異体を使用するのが好ましい。ここで、「酸化的発光反応がほぼ正常」とは、例えば、酸化的発光活性が、野生型ルシフェラーゼの酸化的発光活性の50％以上であることをいい、「アデニル化反応が非常に遅い」とは、例えば、アデニル化活性が、野生型ルシフェラーゼのアデニル化活性の1％以下であることをいう。このようなルシフェラーゼ変異体としては、上述した本発明のルシフェラーゼ変異体やFlimPIAのアクセプタとして以前から使用されているルシフェラーゼ変異体を使用することができる。FlimPIAのアクセプタとして以前から使用されているルシフェラーゼ変異体としては、例えば、アデニル化反応の速度を低下させる変異であるK529Qを含む変異体、K529Qの他に熱安定性を増大させる変異であるE354Kを含む変異体を挙げることができる。
【００３２】
第一の分子及び第二の分子は、分子間の相互作用の検出対象となる分子であり、どのような分子であってもよいが、一方又は両方が生体分子であることが好ましく、一方又は両方がタンパク質であることがより好ましい。第一の分子及び／又は第二の分子がタンパク質である場合は、それらはルシフェラーゼ変異体との融合タンパク質とすることができる。第一の分子及び第二の分子は、ルシフェラーゼ変異体と連結させるが、直接連結させてもよく、リンカーなどを介して連結させてもよい。
【００３３】
第一の分子と第二の分子の接触方法は、これらの分子間に相互作用があれば、両分子が近接できるような方法であれば特に限定されないが、通常は、溶液中に両分子を共存させることにより行う。
【００３４】
第一の分子と第二の分子の接触は、ルシフェリン及びATPの存在下で行う。ATPの濃度は、0.1〜10mMとするのが好ましく、0.5〜8mMとするのがより好ましく、1〜4mMとするのが更に好ましい。ATPの濃度をこのような範囲にすることにより、ATPに対するKm値が野生型酵素より高い、アクセプタの自己発光に由来するバックグラウンド発光を抑制し、S/B比を向上させることができる。さらに、ドナーの反応中間体産生能はATP濃度低下によりあまり悪影響を受けず、おそらく阻害物質となる反応中間体アナログ、デヒドロルシフェリルAMP(L-AMP)の産生が抑えられる結果、相互作用時の発光活性をむしろ高める事ができる。ルシフェリンは、使用するルシフェラーゼ変異体の基質となるものであれば特に限定されず、例えば、ホタルルシフェリンなどを使用することができる。ルシフェリンの濃度は特に限定されないが、5〜200μMとするのが好ましく、10〜100μMとするのがより好ましく、15〜75μMとするのが更に好ましい。なお、第一の分子と第二の分子の接触の際には、上述したルシフェリン及びATPだけでなく、他の成分、例えば、マグネシウムイオンなどが存在していてもよい。
【００３５】
ルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとの反応による発光の検出は、ルシフェラーゼを利用した発光の検出に一般的に利用される方法に従って行うことができる。
【実施例】
【００３６】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  Ppy FLucを用いたFlimPIAにおけるアクセプタ改良
（１）FRB融合アクセプタのプラスミドへのS440F, S440L変異導入
1) FRB融合K529Q変異体プラスミドを制限酵素EcoRIとPacIで処理した。2) テンプレートとして、S440F, S440Lの変異を導入するために、プライマー１（配列番号４）とプライマー２（配列番号５）を用いてPCRを行った。3) アガロースゲルを用いて1)2)の電気泳動を行い、1)の制限酵素処理で生成された約7 kbpのバンドと2)のPCRで増幅されたバンドを精製した。4) In-Fusion HD Cloning Kit (タカラバイオ、滋賀)を用いて、プロトコルに従って1)2)を融合させたプラスミドを持つ大腸菌株JM109を得た。5) 4)の数クローンについて、LBA培地で培養を行い、プラスミド抽出を行った。6) プライマー３（配列番号６）を用いて塩基配列解析を行い、FRB融合K529Q/S440F, 及びFRB融合K529Q/S440Lのプラスミドを得た。
（２）FRB融合アクセプタのプラスミドへのS440W変異導入
プライマー２の代わりにプライマー４（配列番号７）を用いて、（１）と同じように行った。
（３）FRB融合アクセプタのプラスミドへのS440M変異導入
プライマー２の代わりにプライマー５（配列番号８）を用いて、（１）と同じように行った。
【００３７】
（４）蛋白質の発現精製
得られた４種類のプラスミドによって大腸菌SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs Japan, 東京)の形質転換を行い、30℃でLBAプレートにて一晩培養し、得られたコロニーをLBA培地1 mlに植菌し、30℃で約４時間培養した。次にその培養液400 μl をLBA培地100 mlに植菌し、30℃でOD600が約0.5に達したときに、イソプロピルチオガラクトピラノシド  0.4 mMを添加し、蛋白質発現を誘導し、16℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離操作によって回収し、10 ml のExtraction bufferに再懸濁し、氷上で超音波破砕した後、11,000 g, 20分、4℃で遠心分離し、上清を回収した。発現させた蛋白質にはHis6タグが融合されており、TALON affinity resin (Talon system manual, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)を用いて精製を行った。TALON affinity resin 100 μlに上清10 mlを添加し、4℃で20分穏やかに反転混合しながら蛋白質を結合させた。700 g, 2分の遠心分離によって、上清を除いてresinを回収した。そのresinに10 mlのExtraction bufferを加えて懸濁し、4℃で10分穏やかに反転混合し、700 g, 2分の遠心分離によって、上清を除いてresinを回収する洗浄作業を３回行った。次に簡易カラムにresinと3 mlのExtraction bufferを入れて、resinの洗浄作業を行った。さらに2 mlのExtraction bufferで洗浄を行った。Elution buffer 500 μlを加えて、蛋白質のresinからの溶出操作を行った。得られた蛋白質溶液は、最終濃度約15 %のグリセロールを添加し、-80℃で保存した。
【００３８】
（５）FKBP融合ドナーとFRB融合アクセプタの混合液にラパマイシンを添加した場合における発光強度上昇の測定
白色96穴プレートに発現精製して得られたFRB融合K529Q/S440L, FRB融合K529Q/S440F, FRB融合K529Q/S440W, FRB融合K529Q/S440Mの各々をFKBP融合ドナーとペアにして、それぞれ100 nMになるように100 mM MOPS, 10 mM MgSO4を含むpH.7.3に調整した溶液を50 μlずつ分注した。それぞれの混合液に10 μM ラパマイシンを1 %加えたもの（溶液中の濃度は100 nM）と、対照としてDMSOを1 %加えたものを用意した。これらの溶液が入った各穴に100 mM MOPS, 10 mM MgSO4, 150 μM LH2, 40 mM ATPを含むpH 7.3に調整した溶液（基質溶液）を50 μlずつ添加し、マイクロプレートルミノメーター(AB-2350, ATTO, 東京)を用いて添加直後から4秒間の発光強度を測定した。なお終濃度は、各プローブ50 nM, ラパマイシン 50 nM, LH2 75 μM, ATP 20 mMになる。発光強度測定はすべて３回ずつ行い、結果の平均値を標準偏差SDと共に示した。
(測定結果) FKBPを融合させたドナー、FRBを融合させたアクセプタを50 nMずつ混合し、50 nMのラパマイシン添加の有無によるシグナル変化について検討した。20 mMのATP、75 μMのD-luciferin (LH2)と反応させた結果、S440残基をL, F, W, Mに変えた場合、ラパマイシン添加によって顕著にシグナルが向上することが示された (図２Ａ−Ｅ)。最大S/B比は、変異を加えていないアクセプタを用いた場合は約2倍であるのに対し、S440L変異導入アクセプタを用いた場合は約8倍、S440F変異導入アクセプタの場合は約6倍、S440Wの場合は約5倍、S440Mの場合は約3.5倍であった（図２Ｆ）。
さらに、同じプローブを17 nMずつ混合し、17 nMのラパマイシン添加の有無によるシグナル変化について検討した。上記と同じ濃度の基質と反応させた結果、S440残基をL, F, W, Mに変えた場合、ラパマイシン添加によって顕著にシグナルが向上し (図３Ａ−Ｅ)、最大S/B比は、変異を加えていないアクセプタを用いた場合は約1.5倍であるのに対し、S440L変異導入アクセプタの場合は約3.5倍、S440F変異導入アクセプタの場合は約4倍、S440Wの場合は約3.5倍、S440Mの場合は約3倍であった（図３Ｆ）。
【００３９】
（６）各変異体のアデニル化活性の測定
まず、終濃度1 nMの各変異体と終濃度20 mM ATP, 終濃度75 μM LH2を反応させ、終濃度0.1 Mになるように塩酸を反応開始から0.5, 1, 2, 3, 4, 5分後に加えて、反応を停止させた。白色96穴プレート内で、反応物5 μlに対して、北米ホタルのルシフェラーゼのN末ドメイン800 nMを50 μl加え、30秒間発光値を測定した。N末ドメインは通常の基質ATP, LH2存在下でも特異的にLH2-AMPを検出できる（非特許文献４）。その結果、WTと比較して、S440L, F, W, M変異体では、アデニル化活性の抑制がみられた（表１）。
【表１】
2015211668.tif 000002
【００４０】
（７）各変異体の酸化的発光活性の測定
終濃度10 nMの各変異体50 μlと、非特許文献４に従い化学合成した各濃度のLH2-AMP 50μlを白色96穴プレート内で反応させ、発光値を測定し、各変異体の中間体に対するミカエリス定数(Km)と最大反応速度Vmaxを計算した。その結果、低濃度基質に対する反応速度 (Vmax/Km)については、WTと比較してS440L/F/W/M変異体でほとんど変化がなく、酸化的発光活性がほぼ維持されていることが明らかになった（表２）。
【表２】
2015211668.tif 000003
【００４１】
（８）各S440変異体のS/B比の比較
上記以外のS440X変異体遺伝子の構築は、S440L/F/W/Mと同様にして行い、塩基配列決定により確認した。これらの変異が導入されたFRB-アクセプタを同様に発現・精製し、終濃度各50 nMのFKBP-ドナー、FRB-アクセプタ混合液に対しラパマイシン添加の有無によるシグナル変化について、同様に検討した。終濃度20 mMのATP、75 μMのD-luciferin (LH2)と反応させ、得られたそれぞれの発光強度を基質添加後0.5秒間積算し、これらの比を積算S/B比として表した（図４）。
これにより、XがS(野生型)では1.7、Cで2.2であったのに対し、嵩高い側鎖を持つアミノ酸であるL/F/W/Mの場合には、これらより顕著に大きいS/B比が得られた。
【００４２】
〔実施例２〕Ppy FLucを用いたFlimPIAにおけるATP濃度等の至適化
アクセプタ酵素はアデニル化反応時にATPのリン酸部位を安定化するK529を変異させているためATP基準のKmが高まっているのに対し、ドナー酵素は野生型と同じ低いATP基準Kmを保っていると考えられる。すなわち、ATP濃度を低くすることで、アクセプタの発光値を選択的に抑えられる可能性がある。そこでS440変異を導入していないアクセプタ、及びS440L/F/W変異導入アクセプタを用いたFlimPIAにおいてATP濃度・LH2濃度の最適化を試みた。
【００４３】
FKBP/Donor, FRB/Acceptor (WT), ラパマイシンを50 nMずつ使用した場合、最適基質濃度は、ATPが1 mM, LH2が16 μMであった（図５）。最適基質濃度条件下で反応を行った場合、20 mM ATP, 75 μM LH2と反応させた場合（図２Ａ）と比較して、シグナル発光が２倍以上上昇し、バックグラウンド発光が著しく抑制された結果、最大S/B比が25倍以上まで向上した。
【００４４】
FKBP/Donor, FRB/Acceptor (S440L), ラパマイシンを50 nMずつ使用した場合、最適基質濃度は、ATPが2 mM, LH2が63 μMであった（図６）。最適基質濃度条件下で反応を行った場合、20 mM ATP, 75μM LH2と反応させた場合（図２Ｂ）と比較してシグナル発光が２倍以上に上昇し、バックグラウンド発光が著しく抑制された結果、最大S/B比が70倍以上にまで向上した。
【００４５】
一方FKBP/Donor, FRB/Acceptor (S440F), ラパマイシンを50 nMずつ使用した場合、最適基質濃度は、ATPが2 mM, LH2が63 μMであった（図７）。最適基質濃度条件下で反応を行った場合、20 mM ATP, 75μM LH2と反応させた場合（図２Ｃ）と比較して、シグナル発光がやや上昇し、バックグラウンド発光が著しく抑制された結果、最大S/B比が約35倍まで向上した。
【００４６】
さらにFKBP/Donor, FRB/Acceptor (S440W), ラパマイシンを50 nMずつ使用した場合、最適基質濃度は、ATPが4 mM, LH2が16 μMであった（図８）。最適基質濃度条件下で反応を行った場合、20 mM ATP, 75μM LH2と反応させた場合（図２Ｄ）と比較して、シグナル発光が維持されたまま、バックグラウンド発光が著しく抑制された結果、最大S/B比が約30倍まで向上した。
【００４７】
〔実施例３〕熱安定化ヘイケボタル発光酵素LL FLucを用いたFlimPIAにおけるアクセプタ酵素の構築とその改良
（１）FRB/LLアクセプタ (FRB/LL FlucK531Q, FRB/LL Fluc K531Q/S442M)の作製
プライマー６（配列番号９）、プライマー７（配列番号１０）を使用したQuikChange法により、配列番号２の287番目のアミノ酸をアラニンに、392番目のアミノ酸をイソロイシンに改変した熱安定化ヘイケボタル発光酵素(LL Fluc)発現プラスミド(キッコーマン)にK531Q変異(Ppy FlucのK529Qに相当)を導入したプラスミドを持つ大腸菌株JM109を得た。プライマー３、プライマー８（配列番号１１）を用いて塩基配列解析を行い、目的プラスミドを得た。
次にFRBと上記プラスミドを融合させた。まず、1) FRB/Ppy FlucK531Q変異体プラスミドを制限酵素NotIおよびXhoIで処理した。2) プライマー９（配列番号１２）とプライマー１０（配列番号１３）で、K531Q変異体プラスミドをテンプレートにして、PCRを行った。増幅されたバンドをエタノール沈殿処理後、NotI, XhoIで処理した。1)で得られた約6 kbpのバンドと2)で得られたバンドをLigation High (東洋紡、大阪)を用いてligationを行った。大腸菌株JM109をligation溶液で形質転換し、LBA培地で培養した。数クローンについて、LBA培地で培養を行い、プラスミド抽出を行った。プライマー３、プライマー１１（配列番号１４）を用いて塩基配列解析を行い、目的プラスミドを得た。
FRB/LL FlucK531QにS442M変異(Ppy FlucのS440Mに相当)を導入するために、FRB融合K531Qをテンプレートとし、プライマー１２（配列番号１５）、プライマー１３（配列番号１６）を用いてPCRを行った。In-Fusion HD Cloning Kitを用いて得られた大腸菌株JM109の数クローンをLBA培地で培養した。大腸菌からプラスミド精製後、プライマー３、プライマー１１を用いて塩基配列解析を行い、目的プラスミドを得た。
【００４８】
（２）（１）の蛋白質の発現精製
実施例１の（４）と同様に行った。
（３）FRB/LLアクセプタを用いたFlimPIA
（２）で得られたプローブをFRB/Ppy Flucアクセプタの代わりに用いた他は、実施例１の（５）と同様に行った。
（測定結果）  FRB/LL Fluc K531QをFKBP/Ppy Fluc Donorと共に、FlimPIAに使用した。プローブを50 nMずつ混合し、50 nMのラパマイシン添加の有無によるシグナル変化について検討した。20 mM ATP、75 μM LH2と反応させた結果、ラパマイシン添加によるシグナル上昇が認められた（図９Ａ）。
FRB/LL Fluc K531Q/S442MをFKBP/Ppy Fluc Donorと共に、FlimPIAに使用した。プローブを50 nMずつ混合し、50 nMのラパマイシン添加の有無によるシグナル変化について検討した。20 mM ATP、75 μM LH2と反応させた結果、FRB/LL Fluc K531Q使用時よりも顕著にS/B比が向上した (図９Ｂ)。
【００４９】
（４）FRB/LL アクセプタを用いたFlimPIA における1 mM ATPの使用
1 mM ATP, 75 μM LH2の反応条件下、FKBP/Ppy Donor, FRB/LL K531Q/S442Mを50 nMずつ混合し、50 nMのラパマイシン添加の有無によるシグナル変化について検討した。その結果、20 mM ATP, 75 μM LH2の反応条件下におけるFlimPIAと比較して、バックグラウンド発光に比べてシグナル発光がより大きく上昇し、その結果、著しいS/B比の向上がみられた（図９Ｃ）。すなわち、PpyとLLという複数のFlucにおいて、FlimPIAにおけるアクセプタ酵素のS440（あるいはS442）変異と低ATP濃度の効果が示された。
【００５０】
〔実施例４〕LL Fluc Acceptor 531位の最適化
上記で構築したS442M/K531Qアクセプタの更なる性能向上を目標として、アデニル化活性部位である531位をランダム化し、ATP/LH2およびLH2-AMPを基質とした活性スクリーニングを行い、FlimPIAにおいてより高いS/B比を与える変異体の取得を試みた。
【００５１】
このため、pET32/FRB/LL(S442M/K531Q)を鋳型とし、プライマー１４（配列番号１７）及びプライマー１５（配列番号１８）、KOD plus neo DNA polymerase (Toyobo, Osaka)を用いたPCR法によりプラスミド全長を増幅し、K531X libraryを作製した。PCR反応後、反応液に10Uの制限酵素DpnIを加えて37℃、1 hインキュベートし、Damメチル化された鋳型プラスミドを分解した。ここから一部をとり、In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio, Shiga, Japan)を用いて環化し、得られたプラスミドを用いて大腸菌SHuffle T7 express lysYを形質転換した。288個のコロニーを丸底96-well plate内でOvernight ExpressTM Autoinduction System 1 (Novagen)を用いて、25℃、24 h培養した。培養後、大腸菌をペレットにし、20μl のBugbuster (Novagen)を加えてライセートを作製し、80μl のMOPS buffer (100 mM MOPS, 10 mM MgSO4)で希釈した。これを20μlずつ発光測定用の白色half well 96-well plate (Corning)に移し、(1) 4 mM ATP、150 μM LH2、あるいは(2) 2 nM LH2-AMPを20 μlずつ各wellに添加し、発光値を測定した。これらをもとに、((2)を添加したときの２秒間の発光積算値)/((1)を添加したときの２秒間の発光積算値)の値が高いクローンを選択し、それらからプラスミドを調整し塩基配列解析を行った。この結果、これらのクローンの531位のコドンはR、M、もしくはNをコードしていた。
【００５２】
ATP 20 mM、LH2 75 μM、プローブ50 nMの条件で、上記で選択したクローンをAcceptorとして用い、FKBP/Ppy Fluc Donorとともに、ラパマイシン(50 nM)依存的な相互作用検出を行った。その結果、K531Mが最も大きいSignal/Background (S/B)比を示し、アクセプタに適した変異体と判断された（図１０）。
【００５３】
〔実施例５〕LL Fluc Donorの構築
ヘイケボタルのルシフェラーゼのみからなるFlimPIA系を構築するため、LL Flucの247位ならびに445位（それぞれPpy Flucの245位と443位に対応）に変異を導入した。まず、Ppy K443Aに対応するLL K445AをコードするベクターpET32/FRB/LL(K445A)を、pET32/FRB/LLを鋳型としてプライマー１６（配列番号１９）、プライマー１７（配列番号２０）を用いたQuikChange法により作製した。これを用いてFKBP/LL K445Aを発現、精製し、これとFRB/Ppy K529Qを用いてATP 20 mM、 LH2 75 μMの条件下、FlimPIAを行った。しかし、この変異のみでは発光強度のラパマイシン依存性は検出できなかった（図１１Ａ）。
【００５４】
そこで次にこのプラスミドを鋳型に、247位の最適化を行った。pET32/FKBP/LL(K445A) の247位をプライマー１６（配列番号１９）とプライマー１７（配列番号２０）を用いたPCR法によりライブラリ化し、実施例４と同様な方法で288 コロニーから((2)を添加したときの２秒間の発光積算値)/((1)を添加したときの２秒間の発光積算値)の値が低いクローンをスクリーニングした。この結果、H247E、H247N、H247S、H247Aを得た。
ATP 20、5、1.25 mM、LH2 75 μM、プローブ50 nMの条件で、アクセプタとして FRB/LL S442M/K531Mを用いてラパマイシン依存的な相互作用検出を試みた結果、H247E変異体を用いた場合に、ラパマイシン(50 nM)添加による顕著な発光値の上昇が認められた（図１１Ｂ）。そこで、以後この変異体(H247E/K445A)をLL Fluc Donorとして用いる事とした。
【００５５】
〔実施例６〕LL Acceptor 442位の最適化
アクセプタをさらに最適化するため、FRB/LL Fluc K531Mの442位について、S442M以外の変異の効果を調べた。具体的にはPpy Acceptorの場合にS440Mより性能を向上させたL、F、Wへの置換を行った。なお、S442L変異体については、FRB融合K531Mをテンプレートとし、実施例３（１）に記載した方法で目的配列を得た。
【００５６】
S442(F/W)を得るために、FRB融合K531Mをテンプレートとし、プライマー１８（配列番号２１）とプライマー１３（配列番号１６）を用いてPCRを行った。In-Fusion HD Cloning Kitを用いて環化し、得られたプラスミドを形質転換した大腸菌JM109の数クローンをLBA培地で培養した。これからプラスミドを精製し、プライマー３、プライマー１１を用いて塩基配列解析を行い、目的プラスミドを得た。
【００５７】
タンパク質の発現精製は実施例３の（２）と同様に行った。
得られたFRB/LLアクセプタを用いたFlimPIAは、実施例３（３）と同様の方法で行った。具体的には、ATP 20、5、1.25 mM、LH2 75μM、プローブ50 nMの条件で、FKBP/LL(H247E/K445A)とともに、FRB/LL(S442L/K531M)、FRB/LL(S442F/K531M)、FRB/LL(S442W/K531M)を用いてラパマイシン依存的な相互作用の検出を試みた。その結果、FRB/LL(S442L/K531M)を除く二つの変異体(S442F、S442W)はいずれもAcceptorとして適した性質を持つことが示されたが、S442Fの方が特に高いATP濃度においてやや高いS/B比を与えた（図１２）。
【００５８】
〔実施例７〕各変異体の評価
（１）LL Donor、LL Acceptor、Ppy Donor、Ppy Acceptorのアデニル化活性の比較
37.5μM LH2、10 mM ATPと0.5μMの各酵素 LL(H247E/K445A)(以下LL Donorと記す)、LL(S442F/K531M)(以下LL Acceptorと記す)、Ppy(H245D/K443A/L530R)(以下Ppy Donorと記す)、Ppy(S440L/K529Q) (Ppy Acceptorと記す)を反応させ、0.5、1、2、4、6、8分後に1/10量の1N HClを加えて反応を停止させた。反応液5μLと0.4μM N末ドメイン 50μLを反応させ、発光値を400 nM N末ドメイン添加後から30秒間測定した。
その結果、Donorについては、Ppy Donorの方がLL Donorよりも中間体産生量が多かったが、Acceptorについては同程度であることが示された（図１３）。
【００５９】
（２）LL Donor、LL Acceptor、Ppy Donor、Ppy Acceptorの酸化的発光活性の比較
LH2-AMPを8-40μMから2倍ずつ段階希釈を行い、1nMの各酵素(LL Donor, LL Acceptor, Ppy Donor, Ppy Acceptor)を8秒間反応させた。各LH2-AMP濃度について、最高の発光値についてプロットし、反応パラメーターを算出した（表３）。
【００６０】
その結果、初期速度 (Vmax/Km)から、Donorについては、Ppy Donorの方がLL Donorよりも中間体消費量が少なく、Acceptorについては同程度であることが示された。
【表３】
2015211668.tif 000004
【００６１】
（３） 最適基質濃度条件下でのPpy DonorとLL Donorの比較
以上より、LL Donorと比較して、Ppy Donorの方が中間体産生量が多く、中間体消費量が少ないことから、Ppy Donorの方がLL DonorよりもDonorとしての適性が高いことが示唆された。そこで次に、FKBP/Ppy DonorとFRB/Ppy Acceptor、FKBP/LL DonorとFRB/LL Acceptorのペアについて、ラパマイシン依存的な相互作用検出時におけるATP、LH2の最適濃度条件を決めた後、比較を行った。
FKBP/Ppy DonorとFRB/Ppy Acceptorのペアの場合、各50 nMの酵素±ラパマイシンを用いた時、1.25 mM ATP、33 μM LH2の条件で、最大のS/B比を示した（図１４Ａ）。
FKBP/LL DonorとFRB/LL Acceptorのペアの場合、各50 nMの酵素±ラパマイシンを用いた時、基質濃度依存的に高いS/B比と発光値が観察された。図１４Ｂに、最高濃度の基質を用いた場合の発光強度の時間変化を示す。
FKBP/Ppy DonorとFRB/Ppy Acceptor、FKBP/LL DonorとFRB/LL Acceptorの両ペアを比較すると、最大S/B比はほぼ同じであるが、前者に比べ後者の方がより早く高いS/B比に到達した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、タンパク質間相互作用にかかわる薬剤のスクリーニングに有用なので、製薬産業などの産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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