(57)【要約】【課題】個体における皮膚の老化の予防又は処置、特に美容的予防又は処置における使用のための歯肉線維芽細胞由来産生物の提供。【解決手段】歯肉線維芽細胞自体から得られるか又は歯肉線維芽細胞分泌物を含む任意の産生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における皮膚の老化の美容的予防又は処置のための方法であって、美容的に活性な量の歯肉線維芽細胞由来産生物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項２】
皮膚の老化が実年齢及び／又は光による老化の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
皺又は肌の弾力性喪失を美容的に予防し又は処置するための請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
顔の皮膚の老化を予防し又は処置するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
真皮内でエラスチン及び／又はコラーゲン合成を増加させるための請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体に局所的に又は皮内注射によって投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、歯肉線維芽細胞全体、歯肉線維芽細胞培養物、歯肉線維芽細胞抽出物、及び歯肉線維芽細胞培養上清からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体から採取された歯肉線維芽細胞から得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
−個体から歯肉線維芽細胞を採取し；
−歯肉線維芽細胞を培養し；
−培養歯肉線維芽細胞から歯肉線維芽細胞由来産生物を得て；
−歯肉線維芽細胞由来産生物を個体に投与する
ことを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照により本明細書中に援用される、２００８年３月３１日出願の米国仮出願第６１／０４０，８９１号の利益を主張する。
【０００２】
皮膚の老化では、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の合成と、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によるその分解との間のバランスに不均衡が生じる。不均衡は、細胞外マトリックスの過剰な分解、皮膚の老化の特徴をもたらす（Ｃａｕｃｈａｒｄ  ＆  Ｈｏｒｎｅｂｅｃ（２００４）Ｖｉｖａｎｔ  ５）。皮膚の老化は、皺の数と深さの増加、真皮の巨大分子（例えば、コラーゲン及びエラスチン）の分解の直接の結果に関連している。
【０００３】
真皮では、実年齢及び光誘導の加齢を引き起こすＭＭＰ過剰生産は、酸化されたフリーラジカルによって刺激される。その上、太陽に晒された皮膚領域、例えば、顔の皮膚においては、ＵＶ線の他の有害効果が生じ、特に、不完全なコラーゲン合成、皮膚色素沈着、及び太陽弾性線維症（皮膚の弾性格子の崩壊として示される）が挙げられる。さらに、インビトロの試験によって、ＭＭＰがＵＶ線処理を受けた皮膚線維芽細胞によって過剰生産される（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７８：４３−４８）。
【０００４】
コラゲナーゼ１及び３（ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１３）、並びにＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）はコラーゲンを分解し、ゼラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９）はエラスチンを分解する。他のメタロプロテイナーゼ、例えば、ストロメライシン１（ＭＭＰ−３）はコラーゲンとエラスチン分解の両方に関与する。
【０００５】
真皮線維芽細胞は、皮膚の老化の処置の骨組みに使用されてきた（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ．３３：２６３−８）。コラーゲン格子の増加は、深い皺に自己の真皮線維芽細胞（２，０００万個／ｍｌ）を注射された２１５の対象において観察された。皺の改善は、注射後の１年で、対象の８０％でなおも明確に見ることができた。
【０００６】
歯肉線維芽細胞は、歯肉の軟結合組織内で移動、接着及び増殖し、機械的ストレス、細菌感染、又はｐＨ及び温度変化などの多数の攻撃に晒される歯肉組織の完全性を維持することができる間葉細胞である。歯肉線維芽細胞は、特に、Ｇｏｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｏｒａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１：１４７−１５２；Ｇｏｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：１４４７−１４５４；ａｎｄ  Ｅｊｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．７４：１８８−１９５に記載されている。
【０００７】
環境条件に依存して、歯肉線維芽細胞は、それらの表現型を変化させ、増殖、移動、マトリックス成分及びマトリックス関連酵素の合成に応答することができる。
【０００８】
歯肉線維芽細胞は、コラーゲン（例えば、Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩ型）、弾性線維（オキシタラン、エラウニン及びエラスチン）、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、及び糖タンパク質（例えば、フィブロネクチン、テネイシン）を合成する。同時に、歯肉線維芽細胞は、巨大分子成分（マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＭＭＰ）を分解され得る酵素、さらにＭＭＰの活性型を阻害する酵素（メタロプロテイナーゼの阻害剤；ＴＩＭＰ）を合成する。このようにして、歯肉線維芽細胞は細胞外マトリックスリモデリングの重要な作用因子である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、本発明者らによって、歯肉線維芽細胞が、ＵＶ処理された皮膚線維芽細胞を起源とするＭＭＰ活性を阻害するための皮膚線維芽細胞よりも適しているという予期せぬ見解から生じている。
【００１０】
したがって、本発明は、個体における皮膚の老化の美容的予防及び処置のための方法であって、美容的に活性な量の歯肉線維芽細胞由来産生物を該個体に投与することを含む方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、個体における皮膚の老化の予防又は処置、特に美容的予防又は処置における使用のための歯肉線維芽細胞由来産生物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】未処理ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）；７．５ジュール／ｃｍ2ＵＶ−Ａ処置されたヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦｉ１）；ヒト歯肉線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ１（ｃｍｈＧＦ）；ヒト皮膚線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ１（ｃｍｈＤＦ）；１５ジュール／ｃｍ2ＵＶ−Ａ処置されたヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦｉ２）；ヒト歯肉線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ２（ｃｍｈＧＦ）；及びヒト皮膚線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ２（ｃｍｈＤＦ）の培地中のＭＭＰ−９量（縦軸、ｐｇ／１００，０００細胞）を表す。
【図２】ヒト皮膚線維芽細胞培養上清（ｃｍｈＤＦ）、７．５ジュール／ｃｍ2（ｈＤＦｉ１）又は１５ジュール／ｃｍ2（ｈＤＦｉ２）でＵＶ−Ａ処理されたヒト皮膚線維芽細胞の培養上清、又はヒト歯肉線維芽細胞培養上清（ｃｍｈＧＦ）中のＴＩＭＰ−１の濃度（縦軸、ｐｇ／ｍｌ／１００，０００細胞）を表す。
【図３】未処理ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）；７．５ジュール／ｃｍ2ＵＶ−Ａ処置されたヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦｉ１）；ヒト歯肉線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ１（ｃｍｈＧＦ）；ヒト皮膚線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ１（ｃｍｈＤＦ）；１５ジュール／ｃｍ2ＵＶ−Ａ処置されたヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦｉ２）；ヒト歯肉線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ２（ｃｍｈＧＦ）；及びヒト皮膚線維芽細胞培養上清の存在下でのｈＤＦｉ２（ｃｍｈＤＦ）の培地中のＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体の濃度（縦軸、ｐｇ／ｍｌ／１００，０００細胞）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中で意図するとき、「皮膚の老化」は、慢性的因子、例えば、機械的、酸化的、及び／又は光ストレスにより、皮膚成分の崩壊の結果として生じる皮膚欠陥に関する。
【００１４】
特に、皮膚の老化は、実年齢及び／又は光による老化の結果であり得る。「実年齢」とは、加齢の結果として生じる皮膚欠陥を指す。「光による老化」とは、光、特にＵＶ線、より具体的にはＵＶ−Ａ線への皮膚被曝の結果として生じる皮膚欠陥を指す。
【００１５】
皮膚欠陥は、顕著には皺又は皮膚弾力性の欠損であり得る。崩壊した皮膚成分は、本発明に係る方法が真皮内での合成の増大に有用であるエラスチン及び／又はコラーゲンであり得る。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法は、顔の皮膚の老化の予防又は処置のためである。
【００１７】
好ましくは、個体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００１８】
歯肉線維芽細胞を採取し、培養し、保存する手法は当業者に周知であり、特に、Ｎａｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．７７：２３８−４７  ａｎｄ  ｉｎ  Ｇｏｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２７：１９８４−９０に記載されている。
【００１９】
好都合には、歯肉線維芽細胞は容易にサンプリングされ、培養される。さらに、歯肉線維芽細胞は高い増殖率を有する。
【００２０】
好ましくは、本発明に係る方法に使用される歯肉線維芽細胞は自家性であり、即ち、それらが個体から採取され、歯肉線維芽細胞由来産生物がその個体に投与されることを意図する。
【００２１】
好都合には、歯肉線維芽細胞は、ほとんど制限のない供給源自己線維芽細胞を提供する。さらに、加齢した皮膚の場合、培養成分自家性歯肉線維芽細胞は、通常、なおも利用可能であり、一方、対照的に、培養成分自家性皮膚線維芽細胞の供給源は多くない。
【００２２】
しかしながら、歯肉線維芽細胞はまた、同じ種の別の個体から採取される同種であってもよく、又は別の種の別の個体から採取される異種であってもよい。
【００２３】
本明細書中で意図されるとき、「歯肉線維芽細胞由来産生物」とは、歯肉線維芽細胞自体から得られるか又は歯肉線維芽細胞分泌物を含む任意の産生物を指す。例えば、歯肉線維芽細胞由来産生物は、歯肉線維芽細胞の細胞全体、歯肉線維芽細胞培養物、歯肉線維芽細胞抽出物、及び歯肉線維芽細胞培養上清からなる群から選択されることが好ましい。
【００２４】
歯肉線維芽細胞抽出物は、当該技術分野において知られている任意の細胞フラグメンテーション法によって得ることができる。
【００２５】
歯肉線維芽細胞の培養上清は、液体細胞培地などの任意の培地を指し、特に歯肉線維芽細胞が培地中に分泌するのに十分な時間、歯肉線維芽細胞によって接触されている。
【００２６】
好ましくは処置されるべき皮膚近傍の部位への歯肉線維芽細胞由来産生物の投与は、当該技術分野において知られている任意の方法によって行なうことができる。しかしながら、歯肉線維芽細胞由来産生物は、局所的又は皮内注射によって投与されることが好ましい。このような投与経路は当業者に十分に知られ、顕著には、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ．３３：２６３−８）に記載されている。
【００２７】
好ましくは、本発明に係る方法は、以下：
−個体から歯肉線維芽細胞を採取し；
−歯肉線維芽細胞を培養し；
−培養歯肉線維芽細胞から歯肉線維芽細胞由来産物を得て；
−歯肉線維芽細胞由来産物を個体に投与する
工程を含む。
【００２８】
引用された引用文献全ては、参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【００２９】
方法
１．細胞培養
５つのヒト歯肉線維芽細胞（ｈＧＦ）及び３つの皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）培養物を、健常な患者（２０〜３０歳）の歯肉及び皮膚外植片から得た。初代外植片培養物を確立し、３〜５経代を使用した。
【００３０】
ｈＧＦ又はｈＤＲ培養上清の調製
コンフルエントなｈＧＦ及びｈＤＦ培養物の７５ｃｍ2フラスコから培地（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を捨てた。次に、２４ｍｌのＤＭＥＭを添加し、２４時間後に回収した。その後、培養上清を使用するまで凍結した。
【００３１】
細胞調製
３つの１２ウェルプレートを、コンフルエントの２つの２５ｃｍ2フラスコからのｈＤＦで播種した。濃度（１５０，０００細胞／ウェル）が到達した場合、２プレートをそれぞれ７．５及び１５ジュール／ｃｍ2でＵＶＡ照射し、３番目のプレートを対照として使用し、照射なしでのＭＭＰ−９の不存在についてチェックした。
【００３２】
培地を照射後に交換した。各フラスコについて、以下の培地：
−４ウェルに対してのみＤＭＥＭ（１ｍｌ／ウェル）
−４ウェルに対してｈＧＦ培養上清（１ｍｌ／ウェル）
−４ウェルに対してｈＤＦ培養上清（１ｍｌ／ウェル）
を添加した。
【００３３】
次に、２４時間後に培地を回収し、分注し、さらにタンパク質選択分析のために−８０℃で保存した。細胞をウェル中で固定し、ＧＩＥＭＳＡ染色した。
【００３４】
２．ＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ−１分泌分析
ゼラチンザイモグラフィー（ＭＭＰ−９）
ゼラチンザイモグラフィーを、２０μｌの培地で行なった。１０μｌのプロＭＭＰ−９（９２ｋＤａ）及び１０μｌのプロＭＭＰ−２（７２ｋＤａ）（１０ｎｇ）（ＢＣ０５８及びＢＣ０５７；ＡＢＣｙｓ）を、ＭＭＰ型の同定を促進するために同一ゲル上で行なった。さらに、３７℃で１時間、ＡＰＭＡ（２ｍＭ）とともにインキュベートした１０μｌのプロＭＭＰ−９を、ＭＭＰ−９位置を視覚化するために並行して行なった。
【００３５】
ドットブロッティング（ＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ−１）
１０μｌの培地をニトロセルロースメンブレンに適用した。次に、メンブレンを、一次抗ＭＭＰ−９（遊離型）及び抗ＴＩＭＰ−１（それぞれＩＭ３７及びＩＭ３２；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）モノクローナルマウス抗体（１／５００希釈）で処理した。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）中で洗浄後、メンブレンを、ペルオキシダーゼ標識された抗マウス二次抗体（１／１０００、ＤＣ０８Ｌ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともに１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲフィルム上で視覚化した。ブロットの大きさ（表面積）及びグレイ強度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ；http:/rsb. info. nih.gov/ij/index. html）を用いて分析した。濃度を、１０ｐｇ  ＭＭＰ−９又はＴＩＭＰ−１標準（それぞれＰＦ１４０及びＰＦ０１９；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）との比較によって決定した。
【００３６】
遊離ＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ−１の相補定量的分析を、ＥＬＩＳＡによって行った（ＤＭＰ９００及びＤＴＭ１００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００３７】
種々の実験間の統計分析を、対応のあるステューデントｔ−検定を用いて行なった。
【００３８】
３．ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体確定
全ヒトＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体を、酵素免疫測定吸着法キット（ＥＬＩＳＡ）（ＤＹ１４４９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量した。
【００３９】
結果
１．ヒト歯肉線維芽細胞由来の培養上清は、ＵＶ照射されたヒト皮膚線維芽細胞からのＭＭＰ−９を阻害する。
図１は、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）が７．５ジュール／ｃｍ2（ｈＤＦｉ１）又は１５ジュール／ｃｍ2（ｈＤＦｉ２）による照射後を除いて、ＭＭＰ−９を産生しないことを示す。ヒト歯肉線維芽細胞の培養上清（ｃｍｈＧＦ）は、ＵＶ処理された皮膚線維芽細胞によるＭＭＰ−９産生を５０％まで減少させ、一方、ヒト皮膚線維芽細胞の培養上清（ｃｍｈＤＦ）は、たった１５％によってＭＭＰ−９産生を減少させた。
【００４０】
２．ヒト歯肉線維芽細胞はヒト皮膚線維芽細胞よりも多くのＴＩＭＰ−１（ＭＭＰ−９組織阻害因子）を産生する
図２は、培養上清は、照射された場合又は照射されない場合でｈＤＦよりも少なくとも３倍を超えるＴＩＭＰ−１を含んでいることを示す。
【００４１】
３．ヒト歯肉線維芽細胞の存在下でのＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体の量の増加
図３は、ＴＩＭＰ−１／ＭＭＰ−９複合体の量がｃｍｈＤＦ存在下と比較して、ｃｍｈＧＦの存在下で重要であることを示す。
【図１】
2015057419.tif 000002
【図２】
2015057419.tif 000003
【図３】
2015057419.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月10日(2014.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における皮膚の老化の美容的予防又は処置用の歯肉線維芽細胞由来産生物であって、前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、歯肉線維芽細胞抽出物、及び歯肉線維芽細胞培養上清からなる群から選択される、産生物。
【請求項２】
前記皮膚の老化が実年齢及び／又は光による老化の結果である、請求項１に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【請求項３】
皺又は肌の弾力性喪失を美容的に予防し又は処置するための請求項１又は２に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【請求項４】
顔の皮膚の老化を予防し又は処置するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【請求項５】
真皮内でエラスチン及び／又はコラーゲン合成を増加させるための請求項１〜４のいずれか１項に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【請求項６】
前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体に局所的に又は皮内注射によって投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【請求項７】
前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体から採取された歯肉線維芽細胞から得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【請求項８】
前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体から採取され及び培養された歯肉線維芽細胞から得られ、そして前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体に投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の歯肉線維芽細胞由来産生物。
【外国語明細書】
2015057419000001.pdf