(57)【要約】【課題】新規な緑藻、ジテルペンおよびジテルペン樹脂酸の供給源、ならびにそれらの生産方法を提供する。【解決手段】緑藻用に最適化した改変ジテルペン環化酵素遺伝子を導入した緑藻を用いて、ジテルペンを生産する。また、改変ジテルペン環化酵素遺伝子および酸化酵素遺伝子を導入した緑藻を用いて、ロジン代替物としてのジテルペン樹脂酸を生産する。さらに、改変ジテルペン環化酵素遺伝子および緑藻用に最適化した改変酸化酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え緑藻を用いて、ロジン代替物としてのジテルペン樹脂酸を生産する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑藻用にコドンが改変されていることを特徴とする、ジテルペン環化酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ジテルペン環化酵素がＴＰＳ−ｄ３サブファミリーから選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ジテルペン環化酵素がＰｂｍｄｉＴＰＳ１、ＰｃｍｄｉＴＰＳ１、ＰｃｍｄｉＴＰＳ２、ＰｃｍｄｉＴＰＳ３、ＰｂｍＩＳＯ１、ＰｃｍＩＳＯ１、ＰｂｍＰＩＭ１、ＰｃｍＰＩＭ１、ＧｂＬＳ、ＡｂＣＡＳ、ＡｂＩＳＯ、ＡｂＬＡＳ、ＡｇＡＳ、ＰｂＬＡＳ１、ＰｔＬＡＳ、ＰｃＬＡＳ２、ＰｃＬＡＳ１、ＰｓｉＩＳＯ、ＰａＩＳＯ、ＰｓｉＬＡＳ、およびＰａＬＡＳからなる群から選択される、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、ジテルペン環化酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、緑藻形質転換用ベクター。
【請求項７】
酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記酸化酵素がシトクロムＰ４５０である、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記酸化酵素がＣＹＰ７２０Ｂ１である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、緑藻。
【請求項１１】
酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０に記載の緑藻。
【請求項１２】
請求項６に記載のベクターで形質転換することにより作製される、請求項１０に記載の緑藻。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれか一つに記載のベクターで形質転換することにより作製される、請求項１１に記載の緑藻。
【請求項１４】
前記緑藻がクラミドモナス目（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ボルボックス目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）またはクロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）である、請求項１０〜１３のいずれか一つに記載の緑藻。
【請求項１５】
前記緑藻がクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）である、請求項１４に記載の緑藻。
【請求項１６】
前記緑藻がクラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）である、請求項１５に記載の緑藻。
【請求項１７】
請求項６〜９のいずれか一つに記載のベクターを用いて緑藻を形質転換することを特徴とする、緑藻を形質転換する方法。
【請求項１８】
請求項１０または１２に記載の緑藻によって生産される、ジテルペン。
【請求項１９】
請求項１１または１３に記載の緑藻によって生産される、ジテルペン樹脂酸。
【請求項２０】
請求項１０または１２に記載の緑藻によってジテルペンを産生し、産生したジテルペンを回収することを含む、ジテルペンの生産方法。
【請求項２１】
請求項１１または１３に記載の緑藻によってジテルペン樹脂酸を産生し、産生したジテルペン樹脂酸を回収することを含む、ジテルペン樹脂酸の生産方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法を経て得られたジテルペン樹脂酸および／または請求項２１に記載の方法を用いて得られたジテルペン樹脂酸を含む、ロジン代替物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え緑藻を用いて生産されるジテルペン、ジテルペン樹脂酸およびロジン代替物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ロジンはマツから工業生産される天然樹脂成分であり、製紙用サイズ剤、合成ゴム用乳化剤、塗料、接着剤、滑り止め剤、香料、さらには化粧品や医薬品など様々な用途に使用されている。代表的な例として「ガムロジン」、「トールロジン」および「ウッドロジン」があり、これらはその採取方法によって分類される。
【０００３】
ロジンの生産量は年間１２０万トンであって、中国が最大の生産国である。近年、中国での内需の増加や同国政府の政策により、ロジンの価格が高騰していることが問題となっている。また、マツの生育には１０年から１５年を要し、急速な事業拡大は難しい。さらに、ロジンの採取方法は、例えばガムロジンの場合であれば、松の木の幹に傷をつけ、分泌する生松脂を採取し、濾過して不純物をとり除き、その後、蒸留して精製する、という方法であり、機械化が難しい手間と時間のかかる作業である。これらのことから、世界情勢や気候変動に左右されず、安定的かつ大量にロジンを生産する方法が必要とされている。
【０００４】
ロジンの主成分はジテルペン樹脂酸である。これは、採取方法、マツの産地等により異なるが、一般的には、アビエチン酸、ネオアビエチン酸、パラストリン酸、ピマール酸、イソピマール酸、デヒドロアビエチン酸等のジテルペン樹脂酸の混合物である。このジテルペン樹脂酸は炭素数２０のイソプレノイドであるジテルペンの酸化により、生成される。ジテルペン樹脂酸の前駆体であるジテルペンは、ゲラニルゲラニル二リン酸を生合成前駆体として、環化反応を経て生成される。これまで、ジテルペンおよびジテルペン樹脂酸は、これらを生産する植物などから抽出することにより、獲得されてきた。
【０００５】
近年、ジテルペンおよびジテルペン樹脂酸の生合成に関わる遺伝子が複数同定されてきた。特に、ジテルペン樹脂酸の生合成において、環化酵素やチトクロムＰ４５０が重要な酵素であることが解明されており（非特許文献１および２）、ジテルペンおよびジテルペン樹脂酸の新たな生産方法の開発において注目されている。
【０００６】
実際、ジテルペンを短期間で獲得するための新しい方法として、大腸菌および酵母などにジテルペン合成遺伝子を導入し、得られた遺伝子組換え微生物によってジテルペンを生産する方法が検討されている（特許文献１）。しかしながら、大腸菌および酵母などは従属栄養生物であるため、培養する際にグルコース、ショ糖などの糖源を必要とする。そのため、ジテルペンの大量生産を目的としてこれらの微生物を大量培養するには、大規模な設備投資やランニングコスト等が必要とされるという問題点がある。従って、短期間でジテルペンおよび／またはジテルペン樹脂酸を安定的にかつ低コストで供給することができる新たな供給源および方法の開発が、依然として望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１０−５３９９０２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｌｌ  ＤＥら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３，  Ｖｏｌ．  １６１，  ｐｐ．６００−６１６
【非特許文献２】Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  Ｂら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１，  Ｖｏｌ．  １５７，  ｐｐ．１６７７−１６９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の解決課題は、ロジンの主成分であるジテルペン樹脂酸およびその前駆体であるジテルペンについての、マツに代わる新たな供給源である緑藻を提供することである。具体的には、ジテルペン樹脂酸およびジテルペンを短期間で安定的にかつ低コストで供給するための遺伝子組換え緑藻を提供すること、ならびに、当該遺伝子組換え緑藻を生産するためのヌクレオチドおよび緑藻形質転換用ベクターを提供することである。また、本発明の他の解決課題は、マツからの産出によらない、ジテルペン、ジテルペン樹脂酸およびジテルペン樹脂酸を含むロジン代替物を提供すること、ならびに、マツを用いないジテルペンおよびジテルペン樹脂酸の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、緑藻にジテルペンおよびジテルペン樹脂酸の生合成に関わる環化酵素の遺伝子を導入することにより、内在性の基質を利用して、ジテルペン樹脂酸の前駆体であるジテルペンを生産する系を確立した。また、前記環化酵素と共に酸化酵素の遺伝子も緑藻に導入することにより、内在性の基質を利用して、ジテルペン樹脂酸を生産する系を確立した。これにより、従来法よりも比較的容易に、安定的にかつ低コストでジテルペンおよびジテルペン樹脂酸を生産できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである：
（１）緑藻用にコドンが改変されていることを特徴とする、ジテルペン環化酵素をコードするポリヌクレオチド；
（２）ジテルペン環化酵素がＴＰＳ−ｄ３サブファミリーから選択される、（１）に記載のポリヌクレオチド；
（３）ジテルペン環化酵素がＰｂｍｄｉＴＰＳ１、ＰｃｍｄｉＴＰＳ１、ＰｃｍｄｉＴＰＳ２、ＰｃｍｄｉＴＰＳ３、ＰｂｍＩＳＯ１、ＰｃｍＩＳＯ１、ＰｂｍＰＩＭ１、ＰｃｍＰＩＭ１、ＧｂＬＳ、ＡｂＣＡＳ、ＡｂＩＳＯ、ＡｂＬＡＳ、ＡｇＡＳ、ＰｂＬＡＳ１、ＰｔＬＡＳ、ＰｃＬＡＳ２、ＰｃＬＡＳ１、ＰｓｉＩＳＯ、ＰａＩＳＯ、ＰｓｉＬＡＳ、およびＰａＬＡＳからなる群から選択される、（２）に記載のポリヌクレオチド；
（４）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（５）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、ジテルペン環化酵素活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（６）（１）〜（５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、緑藻形質転換用ベクター；
（７）酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、（６）に記載のベクター；
（８）前記酸化酵素がシトクロムＰ４５０である、（７）に記載のベクター；
（９）前記酸化酵素がＣＹＰ７２０Ｂ１である、（８）に記載のベクター；
（１０）（１）〜（５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、緑藻；
（１１）酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、（１０）に記載の緑藻；
（１２）（６）に記載のベクターで形質転換することにより作製される、（１０）に記載の緑藻；
（１３）（７）〜（９）のいずれか一つに記載のベクターで形質転換することにより作製される、（１１）に記載の緑藻；
（１４）前記緑藻がクラミドモナス目（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ボルボックス目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）またはクロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）である、（１０）〜（１３）のいずれか一つに記載の緑藻；
（１５）前記緑藻がクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）である、（１４）に記載の緑藻；
（１６）前記緑藻がクラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）である、（１５）に記載の緑藻；
（１７）（６）〜（９）のいずれか一つに記載のベクターを用いて緑藻を形質転換することを特徴とする、緑藻を形質転換する方法；
（１８）（１０）または（１２）に記載の緑藻によって生産される、ジテルペン；
（１９）（１１）または（１３）に記載の緑藻によって生産される、ジテルペン樹脂酸；
（２０）（１０）または（１２）に記載の緑藻によってジテルペンを産生し、産生したジテルペンを回収することを含む、ジテルペンの生産方法；
（２１）（１１）または（１３）に記載の緑藻によってジテルペン樹脂酸を産生し、産生したジテルペン樹脂酸を回収することを含む、ジテルペン樹脂酸の生産方法；および
（２２）（２０）に記載の方法を経て得られたジテルペン樹脂酸および／または（２１）に記載の方法を用いて得られたジテルペン樹脂酸を含む、ロジン代替物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来法における大腸菌および酵母では必須であった糖源を必要とすることなく、ジテルペンおよびジテルペン樹脂酸を生産することが可能になる。そのため、従来法よりも比較的容易に、安定的にかつ低コストでジテルペンおよびジテルペン樹脂酸を生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】改変ＬＡＳ遺伝子と、ＰａＬＡＳ遺伝子の配列比較。
【図１−２】改変ＬＡＳ遺伝子と、ＰａＬＡＳ遺伝子の配列比較（図１−１の続き）。
【図１−３】改変ＬＡＳ遺伝子と、ＰａＬＡＳ遺伝子の配列比較（図１−２の続き）。
【図１−４】改変ＬＡＳ遺伝子と、ＰａＬＡＳ遺伝子の配列比較（図１−３の続き）。
【図２】改変ＬＡＳ遺伝子を含む緑藻形質転換用ベクターのベクターマップ。Ａ：ＰａＬＡＳ／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ  ｉｎ  ｐＣＴＳ３。Ｂ：ＰａＬＡＳ／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ｉｎ  ｐＣＴＳ３。
【図３】形質転換クラミドモナスのＰＣＲ解析の結果。Ａ：葉緑体ゲノム特異的プライマー。Ｂ：改変ＬＡＳ特異的プライマー。
【図４】形質転換クラミドモナスのウェスタンブロットの結果。
【図５】ＧＣ−ＭＳ解析の結果。クラミドモナス抽出物のＧＣ解析。ＮＣ：形質転換していないクラミドモナスΔＤ２−２株。ＬＡＳ−１６Ｓ＿７およびＬＡＳ−１６Ｓ＿１７：ＰａＬＡＳ／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ｉｎ  ｐＣＴＳ３で形質転換したクラミドモナスΔＤ２−２株。ＬＡＳ−ＰｔｕｆＡ＿２、ＬＡＳ−ＰｔｕｆＡ＿３およびＬＡＳ−ＰｔｕｆＡ＿４：ＰａＬＡＳ／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ  ｉｎ  ｐＣＴＳ３で形質転換したクラミドモナスΔＤ２−２株。
【図６】ＧＣ−ＭＳ解析の結果。Ａ：図５のピーク１のＭＳ解析。Ｂ：レボピマラジエンのＭＳ解析。
【図７】ＧＣ−ＭＳ解析の結果。Ａ：図５のピーク２のＭＳ解析。Ｂ：アビエタジエンのＭＳ解析。
【図８】ＧＣ−ＭＳ解析の結果。Ａ：図５のピーク３のＭＳ解析。Ｂ：ネオアビエタジエンのＭＳ解析。
【図９−１】改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子と、テーダマツ由来のＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子の配列比較。
【図９−２】改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子と、テーダマツ由来のＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子の配列比較（図９−１の続き）。
【図９−３】改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子と、テーダマツ由来のＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子の配列比較（図９−２の続き）。
【図１０】改変ＬＡＳ遺伝子および改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子を含む緑藻形質転換用ベクターのベクターマップ。Ａ：ＣＹＰ７２０Ｂ１／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ＰａＬＡＳ／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ。Ｂ：ＰａＬＡＳ／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ＣＹＰ７２０Ｂ１／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ。
【図１１】形質転換クラミドモナスのＰＣＲ解析の結果。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１つの実施態様において、本発明は、緑藻用にコドンが改変されていることを特徴とする、ジテルペン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
ジテルペン環化酵素は、テルペン合成酵素（ＴＰＳ）のグループに含まれる酵素であり、ジテルペン合成酵素とも称される。これは、ゲラニルゲラニル二リン酸を環化させることにより、種々のジテルペンを生成する。針葉樹のジテルペン合成酵素は、Ｔｐｓ−ｃ、Ｔｐｓ−ｄおよびＴｐｓ−ｅ／ｆのファミリーに分類され、Ｔｐｓ−ｄはさらに、Ｔｐｓ−ｄ１、Ｔｐｓ−ｄ２およびＴｐｓ−ｄ３のサブファミリーに分類されることが、既に知られている（Ｂｏｈｌｍａｎｎら、１９９８ａ；Ｍａｒｔｉｎら、２００４；Ｃｈｅｎら、２０１１；Ｋｅｅｌｉｎｇら、２０１１ａ）。
【００１６】
一実施形態では、本発明で用いられるジテルペン環化酵素は、ＴＰＳ−ｄ３サブファミリーから選択される。好ましくは、前記酵素は、ＰｂｍｄｉＴＰＳ１（例、ＮＣＢＩ登録番号：ＪＱ２４０３１７）、ＰｃｍｄｉＴＰＳ１（ＪＱ２４０３１８）、ＰｃｍｄｉＴＰＳ２（ＪＱ２４０３１９）、ＰｃｍｄｉＴＰＳ３（ＪＱ２４０３２０）、ＰｂｍＩＳＯ１（ＪＱ２４０３１３）、ＰｃｍＩＳＯ１（ＪＱ２４０３１４）、ＰｂｍＰＩＭ１（ＪＱ２４０３１６）、ＰｃｍＰＩＭ１（ＪＱ２４０３１５）、ＧｂＬＳ（Ｑ９４７Ｃ４）、ＡｂＣＡＳ（ＪＮ２５４８０８）、ＡｂＩＳＯ（ＪＮ２５４８０６）、ＡｂＬＡＳ（ＪＮ２５４８０５）、ＡｇＡＳ（Ｑ３８７１０）、ＰｂＬＡＳ１（ＪＱ２４０３１２）、ＰｔＬＡＳ（Ｑ５０ＥＫ２）、ＰｃＬＡＳ２（ＪＱ２４０３１１）、ＰｃＬＡＳ１（ＪＱ２４０３１０）、ＰｓｉＩＳＯ（ＡＤＺ４５５１２）、ＰａＩＳＯ（Ｑ６７５Ｌ５）、ＰｓｉＬＡＳ（ＡＤＺ４５５１７）およびＰａＬＡＳ（Ｑ６７５Ｌ４）からなる群から選択される。より好ましくは、前記酵素は、ＡｂＩＳＯ（例、ＮＣＢＩ登録番号：ＪＮ２５４８０６）、ＡｂＬＡＳ（ＪＮ２５４８０５）、ＡｇＡＳ（Ｑ３８７１０）、ＰｂＬＡＳ１（ＪＱ２４０３１２）、ＰｔＬＡＳ（Ｑ５０ＥＫ２）、ＰｃＬＡＳ２（ＪＱ２４０３１１）、ＰｃＬＡＳ１（ＪＱ２４０３１０）、ＰｓｉＩＳＯ（ＡＤＺ４５５１２）、ＰａＩＳＯ（Ｑ６７５Ｌ５）、ＰｓｉＬＡＳ（ＡＤＺ４５５１７）およびＰａＬＡＳ（Ｑ６７５Ｌ４）からなる群から選択される。さらに好ましくは、前記酵素は、ＰａＬＡＳ（例、ＮＣＢＩ登録番号：Ｑ６７５Ｌ４）である。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ジテルペン環化酵素であるレボピマラジエン／アビエタジエン合成酵素（ＬＡＳ）活性を有するポリペプチドをコードする、改変ＬＡＳ遺伝子である。
【００１８】
別の実施態様では、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、ジテルペン環化酵素活性、好ましくはＬＡＳ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９６％以上の配列同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９８％以上の配列同一性を有する。
【００１９】
配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドは、それによってコードされるポリペプチドがジテルペン環化酵素活性、好ましくはＬＡＳ活性を有する限り、配列番号１に記載の塩基配列と比較して、数個、例えば１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入されていてもよい。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドには、該ポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドが含まれうる。「相補的」とは、一つの核酸鎖が別の核酸鎖と塩基対形成することを意味する。「実質的に相補的」とは、各核酸鎖の全ての塩基について塩基対形成が起こっている状態だけでなく、一定数または一定率の塩基が対形成していないか誤って対形成している状態も含むということを意味する。正しく対形成している塩基のパーセンテージは、好ましくは少なくとも７０％、例えば７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドとは、本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。「ストリンジェントな条件」とは、２つの配列間に特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．１９８９），  ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドには、さらに、本発明のポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。
【００２３】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において互換的に用いられる。また、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換的に用いられる。
【００２４】
本明細書において、「緑藻用にコドンが改変されている」とは、対象の遺伝子の塩基配列におけるコドンが、緑藻のコドン使用頻度に合うように最適化されていることを意味する。当業者であれば、ある生物のコドン使用頻度を、例えば、かずさＤＮＡ研究所のデーターベースＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を利用して、調査することができる。あるいは、ＧＥＮＥＡＲＴ社の遺伝子配列設計プログラムＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）などを用いて、調査することもできる。さらに、そのようにして得られたコドン使用頻度の情報に基づいて、常套的な手段を用いて、対象の遺伝子のコドンを最適化することができる。
【００２５】
上述のコドンの最適化は、緑藻の全ゲノムのコドン使用頻度に基づいてもよい。あるいは、核ゲノム、葉緑体ゲノムおよびミトコンドリアゲノムなど、細胞小器官に存在する特定のゲノムのコドン使用頻度に基づいてもよい。当業者であれば、対象の遺伝子を発現させたい細胞小器官に合わせて、上述の常套的な手段を用いて、対象の遺伝子のコドンを最適化することができる。
【００２６】
本明細書において、用語「改変ジテルペン環化酵素遺伝子」とは、ある生物由来のジテルペン環化酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列に、複数個の塩基置換を導入することにより、そのコドン使用頻度を緑藻での遺伝子転写／翻訳に適したコドン使用頻度を有するように最適化した塩基配列を有する遺伝子をいう。「複数個」とは、改変前の塩基配列において、１〜１０００個、好ましくは２００〜８００個、より好ましくは４００〜６００個、さらに好ましくは５００〜６００個、最も好ましくは５３０〜５７０個である。あるいは、改変前の塩基配列のうち、例えば４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれより多いヌクレオチドが置換されている。用語「改変ジテルペン環化酵素」とは、「改変ジテルペン環化酵素遺伝子」によってコードされるタンパク質であって、ジテルペン環化酵素活性を有するタンパク質をいう。
【００２７】
「改変ジテルペン環化酵素遺伝子」における上述の塩基置換は、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列と比較して、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸を変化させないものであってもよい。あるいは、改変ジテルペン環化酵素がジテルペン環化酵素活性を有する限り、改変前のジテルペン環化酵素と比較して、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸を変化させるものであってもよい。
【００２８】
「改変ジテルペン環化酵素」には、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列相同性または配列同一性を有する。より好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列と少なくとも９６％以上の配列相同性または配列同一性を有する。さらに好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列と少なくとも９８％以上の配列相同性または配列同一性を有する。最も好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有する。
【００２９】
また、「改変ジテルペン環化酵素」には、改変前のジテルペン環化酵素のアミノ酸配列から輸送ペプチド配列に該当する部分を除いた、Ｎ末端切断型の配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のＮ末端切断型アミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列相同性または配列同一性を有する。より好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のＮ末端切断型アミノ酸配列と少なくとも９６％以上の配列相同性または配列同一性を有する。さらに好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のＮ末端切断型アミノ酸配列と少なくとも９８％以上の配列相同性または配列同一性を有する。最も好ましくは、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列は、改変前のジテルペン環化酵素のＮ末端切断型アミノ酸配列と１００％の配列同一性を有する。
【００３０】
本発明において、「改変ジテルペン環化酵素遺伝子」は、その変異体も包含する。変異体は、例えば、改変ジテルペン環化酵素遺伝子の塩基配列において、数個、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個の塩基が、置換、欠失および／または付加された塩基配列を含み得る。本発明において、「改変ジテルペン環化酵素」は、その変異体も包含する。変異体は、例えば、改変ジテルペン環化酵素のアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含み得る。
【００３１】
本発明において、「改変ジテルペン環化酵素」は、好ましくは「改変ＬＡＳ」である。用語「改変ＬＡＳ遺伝子」とは、オウシュウトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）由来のレボピマラジエン／アビエタジエン合成酵素（ＰａＬＡＳ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列（配列番号２）に、複数個の塩基置換を導入することにより、そのコドン使用頻度を緑藻での遺伝子転写／翻訳に適したコドン使用頻度を有するように最適化した塩基配列を有する遺伝子をいう。「複数個」とは、配列番号２の塩基配列において、１〜１０００個、好ましくは２００〜８００個、より好ましくは４００〜６００個、さらに好ましくは５００〜６００個、最も好ましくは５３０〜５７０個である。用語「改変ＬＡＳ」とは、「改変ＬＡＳ遺伝子」によってコードされるタンパク質であって、ＬＡＳ活性を有するタンパク質をいう。
【００３２】
「改変ＬＡＳ遺伝子」における上述の塩基置換は、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と比較して、改変ＬＡＳのアミノ酸配列におけるアミノ酸を変化させないものであってもよい。あるいは、改変ＬＡＳがジテルペン環化酵素活性、好ましくはＬＡＳ活性を有する限り、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と比較して、改変ＬＡＳのアミノ酸配列におけるアミノ酸を変化させるものであってもよい。
【００３３】
「改変ＬＡＳ」には、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、改変ＬＡＳのアミノ酸配列は、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と少なくとも９０％以上の配列相同性または配列同一性を有する。より好ましくは、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と少なくとも９６％以上の配列相同性または配列同一性を有する。さらに好ましくは、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と少なくとも９８％以上の配列相同性または配列同一性を有する。最も好ましくは、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）と１００％の配列同一性を有する。
【００３４】
また、「改変ＬＡＳ」には、ＰａＬＡＳのアミノ酸配列（配列番号３）からそのＮ末端側に位置する輸送ペプチド配列（配列番号４）を除いたＮ末端切断型の配列（配列番号５）を有するポリペプチドと少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、改変ＬＡＳのアミノ酸配列は、ＰａＬＡＳのＮ末端切断型アミノ酸配列（配列番号５）と少なくとも９０％以上の配列相同性または配列同一性を有する。より好ましくは、ＰａＬＡＳのＮ末端切断型アミノ酸配列（配列番号５）と少なくとも９６％以上の配列相同性または配列同一性を有する。さらに好ましくは、ＰａＬＡＳのＮ末端切断型アミノ酸配列（配列番号５）と少なくとも９８％以上の配列相同性または配列同一性を有する。最も好ましくは、ＰａＬＡＳのＮ末端切断型アミノ酸配列（配列番号５）と１００％の配列同一性を有する。
【００３５】
本発明において、「改変ＬＡＳ」は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、ジテルペン環化酵素活性、好ましくはＬＡＳ活性を有するポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、「改変ＬＡＳ」は、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
【００３６】
本明細書において、「配列同一性」とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度をさし、２つの配列間の比較において、同一であるアミノ酸または塩基の数をさす。アミノ酸配列における「配列相同性」とは、保存的アミノ酸変化を含みうる。配列同一性および配列相同性は、当技術分野において知られている標準的なアラインメントツールによって決定できる。かかるアラインメントツールには、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）などが挙げられる。アラインメントは、グローバル（配列の全長にわたって、すべてのアミノ酸または塩基を含む、配列のアラインメント）であってもよく、ローカル（最も類似した領域または複数の領域のみを含む、配列の一部のアラインメント）であってもよい。
【００３７】
「配列同一性」および「配列相同性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列について、最良アラインメント後に得られる、比較しようとする２つの配列間で同一であるアミノ酸または塩基のパーセンテージ（％）で表す。２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布する。２つの配列間の配列比較は、それらを最適にアラインメントした後にこれらの配列を比較することによって行われる。「配列同一性」および「配列相同性」のパーセンテージは、比較される２つの配列間で同一な位置の数を決定し、その数を比較した位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じることによって算出される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む、緑藻形質転換用ベクターを提供する。当業者であれば、当該ベクターを導入する緑藻の種類、目的等に応じて、ベクターの種類、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列以外に含まれうる塩基配列等を、適宜選択できる。前記ベクターは、緑藻内で発現誘導が可能なプロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列をコードする遺伝子、形質転換体選択用マーカー遺伝子、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などを適宜有していてもよい。プロモーターの例としては、翻訳伸長因子ＴｕｆＡプロモーター配列（配列番号６）およびｐｓｂＤプロモーター配列などが挙げられる。プロモーター−５’ＵＴＲの例としては、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター配列とａｔｐＡ遺伝子の５’ＵＴＲ配列の組み合わせ（配列番号７）およびｐｓｂＡプロモーター配列／５’ＵＴＲ（Ｒａｓａｌａら、Ｐｌａｍｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  ２０１１，  ９，  ｐｐ．６７４−６８３）などが挙げられる。３’ＵＴＲの例としては、ａｔｐＢ遺伝子の３’ＵＴＲ配列（配列番号８）、ｒｂｃＬ遺伝子の３’ＵＴＲ配列（配列番号９）、ｐｓｂＡ（Ｒａｓａｌａら、Ｐｌａｍｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  ２０１１，  ９，  ｐｐ．６７４−６８３）などが挙げられる。また、ポリペプチドの発現の確認を容易にするため、ＧＦＰやルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をコードする配列、および／またはＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、チオレドキシンもしくはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）などの任意のタグをコードする配列が付加されていてもよい。さらに、本発明のポリヌクレオチドとタグ配列の間に、８×Ｇｌｙスペーサー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）をコードする配列（配列番号１０）などのスペーサー配列が含まれていてもよい。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明は、酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターを提供する。好ましい実施形態では、前記酸化酵素はシトクロムＰ４５０である。より好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０である。さらに好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０Ｂ１およびＣＹＰ７２０Ｂ４などのＣＹＰ７２０Ｂである。最も好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０Ｂ１である。前記酸化酵素は、緑藻で酸化酵素活性を有する限り、その由来は限定されない。好ましくは、前記酸化酵素はテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来のＣＹＰ７２０Ｂ１である。
【００４０】
本発明の緑藻形質転換用ベクターは、核形質転換用、葉緑体形質転換用またはミトコンドリア形質転換用のいずれであってもよい。また、核ゲノムＤＮＡ、葉緑体ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアゲノムＤＮＡへの相同性組換え効率を上げるため、ゲノムに挿入されるべき配列の５’側および３’側に、ゲノムＤＮＡに由来する配列（アーム配列）を配置してもよい。アーム配列は、少なくとも５００ｂｐ程度、一般的には１ｋｂ以上の長さであることが好ましい。当業者であれば、配列が挿入されるゲノム上の位置に応じて、必要なアーム配列を適宜選択することができる。
【００４１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻を提供する。かかる緑藻は、本発明のポリヌクレオチドを、少なくとも核、葉緑体またはミトコンドリアのいずれかに含む。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、核ゲノムＤＮＡ、葉緑体ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアゲノムＤＮＡに組み込まれている。
【００４２】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻は、本発明の緑藻形質転換用ベクターで形質転換することにより作製される。この場合、緑藻は、ベクターに含まれる本発明のポリヌクレオチドの塩基配列以外に含まれうる塩基配列、例えばプロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、形質転換体選択用マーカー遺伝子、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの一部分を本発明のポリヌクレオチドと共に含んでもよい。あるいは、本発明のベクターの骨格となっているベクターに由来する塩基配列を含んでもよい。
【００４３】
他の態様において、本発明は、酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻を提供する。かかる緑藻は、本発明のポリヌクレオチドおよび酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを、核、葉緑体またはミトコンドリアのいずれかにおいて含んでいる。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、核ゲノムＤＮＡ、葉緑体ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアゲノムＤＮＡに組み込まれている。
【００４４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの両方を含む緑藻は、本発明の緑藻形質転換用ベクターで形質転換することにより作製される。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの両方を含む緑藻は、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターと酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターの両方で、共形質転換をすることにより作製される。この場合、酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターで緑藻を形質転換する前に、同時に、あるいは後に、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターで該緑藻を形質転換することができる。いずれの場合においても、緑藻は、ベクターに含まれる本発明のポリヌクレオチドおよび酸化酵素の塩基配列以外に含まれうる塩基配列、例えばプロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、形質転換体選択用マーカー遺伝子、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの一部分を本発明のポリヌクレオチドおよび酸化酵素をコードするポリヌクレオチドと共に含んでもよい。あるいは、本発明のベクターの骨格となっているベクターに由来する塩基配列を含んでもよい。
【００４５】
好ましい実施形態では、前記酸化酵素はシトクロムＰ４５０である。より好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０である。さらに好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０Ｂ１およびＣＹＰ７２０Ｂ４などのＣＹＰ７２０Ｂである。最も好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０Ｂ１である。前記酸化酵素は、緑藻で酸化酵素活性を有する限り、その由来は限定されない。好ましくは、前記酸化酵素はテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来のＣＹＰ７２０Ｂ１である。
【００４６】
「緑藻（緑藻植物門：Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）」とは、光合成の主要色素としてクロロフィルａおよびｂを有し、光合成を行う緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）内の一群である。光合成によりデンプンを生産し、葉緑体内に貯蔵する生産者である。緑藻には、オオヒゲマワリ類およびクロレラ類などが含まれ、これらはさらにコナミドリムシを含むクラミドモナス目、ボルボックス（オオヒゲマワリ）目、ならびに、クロレラ、アミミドロおよびクンショウモを含むクロロコックム目などへと分類される。好ましい実施形態では、本発明の緑藻は、クラミドモナス目（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ボルボックス目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）またはクロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）である。より好ましい実施形態では、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）である。さらに好ましい実施形態では、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）である。
【００４７】
クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）は、鞭毛を有する単細胞緑藻であり、生育が速いことで知られている。また、遺伝子操作を容易に行うことができるため、本発明に用いる緑藻として適している。
【００４８】
緑藻は、光合成における炭酸固定反応であるカルビン経路で生成したグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）と、ピルビン酸を用いて、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）経路を介して、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を産生する。ついで、ＩＰＰとＤＭＡＰＰから、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼにより、カロテノイド生合成経路の初期中間体であるゲラニルゲラニル二リン酸を産生する。本発明の緑藻は、改変ＬＡＳの働きにより、ゲラニルゲラニル二リン酸からアビエタジエンなどのジテルペンを産生することができる。また、酸化酵素をさらに含む本発明の緑藻は、改変ＬＡＳの働きによってゲラニルゲラニル二リン酸からアビエタジエンなどのジテルペンを産生し、次いで産生したジテルペンから、酸化酵素の働きによりジテルペン樹脂酸を産生することができる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、本発明のベクターを用いて緑藻を形質転換することを特徴とする、緑藻を形質転換する方法を提供する。好ましい実施形態では、前記緑藻は、クラミドモナス目、ボルボックス目またはクロロコックム目である。より好ましい実施形態では、クラミドモナス属である。さらに好ましい実施形態では、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）である。
【００５０】
当業者であれば、緑藻を形質転換するための方法を当然に理解できる。また、当業者であれば、形質転換体の選択に利用できる薬剤耐性マーカーなどを、形質転換された緑藻の種類、導入したベクターの種類、および形質転換の方法などに応じて、適宜選択することができる。また、常套的な実験を用いて、培養条件（培地組成、培養温度、培養時間等）を容易に定めることができる。
【００５１】
例えば、クラミドモナス属の場合、核、葉緑体およびミトコンドリアの形質転換を行うことができる。クラミドモナスの核ゲノムＤＮＡのサイズは１００〜１６０Ｍｂであり、葉緑体およびミトコンドリアのタンパク質を含む、大部分の遺伝情報をコードしている。核の形質転換は、ＤＮＡを付着させたタングステン微粒子もしくは金粒子（直径約１μｍ）を微粒子銃でクラミドモナス細胞へ撃ち込むことにより行うことができる（例えば、Ｄｅｂｕｃｈｙ  Ｒら，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｖｏｌ．８，  ｎｏ．１０，  ｐｐ．２８０３−２８０９，  １９８９を参照）。また、クラミドモナス細胞懸濁液に、ＤＮＡと直径約０．５ｍｍのガラスビーズを加え、激しく撹拌することで細胞表面に傷をつけ、ＤＮＡを細胞内に導入する、ガラスビーズ法によっても行うことができる（Ｋｉｎｄｌｅ  ＫＬ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．８７，  ｐｐ．１２２８−１２３２，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ，  １９９０を参照）。さらに、エレクトロポレーションによっても行うことができる（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａ  Ｋ．ら，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １４８：１８２１−１８２８，  Ａｐｒｉｌ，  １９９８を参照）。核に導入されたＤＮＡは、核ゲノムにランダムに組み込まれうる。
【００５２】
クラミドモナスの核の形質転換の場合、形質転換体の選択のためのマーカーとして、フレオマイシン耐性を付与するｂｌｅ遺伝子などを用いることができる。また、クラミドモナス用に改変された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを用いることもできる。あるいは、栄養要求株を野生型の遺伝子で相補する方法で、形質転換体を選択することも可能である。
【００５３】
クラミドモナスの葉緑体ゲノムＤＮＡのサイズは１９６ｋｂであり、約７０〜８０コピーのＤＮＡが存在する。葉緑体の形質転換にも、上述のような微粒子銃法を用いることができる。ＡＴＰ合成酵素のβサブユニットをコードするａｔｐＢ遺伝子欠損株を宿主として利用することで、形質転換体の選択をすることができる（Ｂｏｙｎｔｏｎ  ＪＥら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，  １９８８，  Ｊｕｎ，  １０；２４０（４８５８）：１５３４−８を参照）。また、葉緑体タンパク質合成酵素阻害剤に対する耐性を付与するａａｄＡカセットを用いて、スペクチノマイシン存在下で培養することにより、選択を行うこともできる（Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４２６，  （１９９８），  １４０−１４４を参照）。あるいは、ｐｓｂＤ遺伝子欠損株などの光合成能を欠く変異株を宿主として利用し、恒明条件下での光合成能の修復の有無により形質転換体を選択することができる。葉緑体に導入されたＤＮＡは、相同組換えにより、葉緑体ゲノムＤＮＡに組み込まれうる。形質転換後しばらくは、野生型と形質転換型のコピーが両方存在するヘテロプラスミックな状態となるが、選択圧下、単一のコロニーを数回ピックすることで、全てのコピーが形質転換型に置き換わり、ホモプラズミックな状態の細胞を獲得することができる。
【００５４】
クラミドモナスのミトコンドリアゲノムＤＮＡのサイズは１５．８ｋｂであり、直鎖状の分子を構成している。細胞当たりのＤＮＡコピー数は約５０コピーである。ミトコンドリアの形質転換にも、上述のような微粒子銃法を用いることができる。また、葉緑体と同様、導入されたＤＮＡは、相同組換えにより、ミトコンドリアゲノムＤＮＡに組み込まれうる。
【００５５】
クロレラの形質転換には、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法または微粒子銃法等を用いることができる。ボルボックスの形質転換には、微粒子銃法等を用いることができる。
【００５６】
本発明において、好ましい形質転換の方法は、葉緑体形質転換である。
【００５７】
一実施形態では、緑藻を形質転換する方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターと酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターの両方で、共形質転換をすることを特徴とする。この場合、酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターで緑藻を形質転換する前に、同時に、あるいは後に、本発明のポリヌクレオチドを含む緑藻形質転換用ベクターで該緑藻を形質転換することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、前記酸化酵素はシトクロムＰ４５０である。シトクロムＰ４５０として、ＣＹＰ８８ファミリー、ＣＹＰ９９ファミリー、ＣＹＰ７０１ファミリー、ＣＹＰ７１４ファミリー、ＣＹＰ７１６ファミリー、ＣＹＰ７２０ファミリーなどが例示できる。より好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ８８Ａサブファミリー、ＣＹＰ９９Ａサブファミリー、ＣＹＰ７０１Ａサブファミリー、ＣＹＰ７１４Ａサブファミリー、ＣＹＰ７１４Ｄサブファミリー、ＣＹＰ７１６Ｄサブファミリー、ＣＹＰ７２０Ｂサブファミリーなどが例示できる。さらに好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０Ｂ１およびＣＹＰ７２０Ｂ４などのＣＹＰ７２０Ｂサブファミリーである。最も好ましい実施形態では、前記酸化酵素はＣＹＰ７２０Ｂ１である。前記酸化酵素は、緑藻で酸化酵素活性を有する限り、その由来は限定されない。好ましくは、前記酸化酵素はテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来のＣＹＰ７２０Ｂ１である。
【００５９】
本発明において用いられ得る酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、その塩基配列に、複数個の塩基置換を導入することにより、そのコドン使用頻度を緑藻での遺伝子転写／翻訳に適したコドン使用頻度を有するように最適化した塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。「複数個」とは、改変前の塩基配列において、１〜８００個、好ましくは１００〜７００個、より好ましくは２００〜５００個、さらに好ましくは３００〜４００個、最も好ましくは３３０〜３７０個である。あるいは、改変前の塩基配列のうち、例えば４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれより多いヌクレオチドが置換されている。かかる酸化酵素をコードする塩基配列の例として、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来のＣＹＰ７２０Ｂ１をコードする塩基配列（配列番号１１）を、クラミドモナス用にそのコドンを最適化した、「改変ＣＹＰ７２０Ｂ１」をコードする塩基配列（配列番号１２）が挙げられる。
【００６０】
改変された酸化酵素をコードする遺伝子における上述の塩基置換は、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と比較して、改変された酸化酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸を変化させないものであってもよい。あるいは、改変された酸化酵素が酸化酵素活性を有する限り、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と比較して、改変された酸化酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸を変化させるものであってもよい。
【００６１】
改変された酸化酵素には、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、例えば８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。好ましくは、改変された酸化酵素のアミノ酸配列は、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列相同性または配列同一性を有する。より好ましくは、改変された酸化酵素のアミノ酸配列は、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と少なくとも９６％以上の配列相同性または配列同一性を有する。さらに好ましくは、改変された酸化酵素のアミノ酸配列は、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と少なくとも９８％以上の配列相同性または配列同一性を有する。最も好ましくは、改変された酸化酵素のアミノ酸配列は、改変前の酸化酵素のアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、本発明の緑藻によって生産されるジテルペンに関する。さらに、酸化酵素を含む本発明の緑藻によって生産されるジテルペン樹脂酸に関する。いずれの場合であっても、当業者であれば、前記緑藻の種類などに応じて、常套的な実験を用いて、ジテルペンおよび／またはジテルペン樹脂酸を生産するための、緑藻の培養条件（培地組成、培養温度、培養時間等）を容易に定めうるものである。
【００６３】
別の態様において、本発明は、本発明の緑藻によってジテルペンを産生し、産生したジテルペンを回収することを含む、ジテルペンを生産する方法に関する。また、酸化酵素を含む本発明の緑藻によってジテルペン樹脂酸を産生し、産生したジテルペン樹脂酸を回収することを含む、ジテルペン樹脂酸を生産する方法に関する。さらに、本発明の緑藻によってジテルペンを産生し、産生したジテルペンを回収すること、ならびに、回収されたジテルペンを化学的・工業的に酸化させることを含む、ジテルペン樹脂酸を生産する方法に関する。いずれの場合であっても、当業者であれば、前記緑藻の種類などに応じて、常套的な実験を用いて、培養条件（培地組成、培養温度、培養時間等）を容易に定めることができる。
【００６４】
ジテルペンまたはジテルペン樹脂酸を回収する方法には特に制限はなく、当業者が通常用いる手段が用いられる。例えば、培養した緑藻を回収し、当業者が通常用いる乾燥手段（ドラム乾燥、熱風式乾燥、嘖霧乾燥、凍結乾燥など）によって乾燥させることにより、緑藻の乾燥物を得る。次いで、水および／または有機溶媒を用いた抽出、機械的破碎（例えば、ビーズビータ一など）もしくは圧搾、またはこれらを組み合わせた抽出が行われる。水および／または有機溶媒を用いた抽出を利用した場合には、抽出後、当業者が通常用いる手段によって水および／または有機溶媒が除去される。
【００６５】
本発明により生産されるジテルペンは、例えば、アビエタジエン（ａｂｉｅｔａｄｉｅｎｅ）（以下、式１）、ネオアビエタジエン（ｎｅｏａｂｉｅｔａｄｉｅｎｅ）（以下、式２）、パルストラジエン（ｐａｌｕｓｔｒａｄｉｅｎｅ）（以下、式３）、ピマラジエン（ｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ）（以下、式４）、イソピマラジエン（ｉｓｏｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ）（以下、式５）、レボピマラジエン（ｌｅｖｏｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ）（以下、式６）、デヒドロアビエタジエン（ｄｅｈｙｄｒｏａｂｉｅｔａｄｉｅｎｅ）（以下、式７）、サンダラコピマラジエン（ｓａｎｄａｒａｃｏｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ）（以下、式８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【化１】
2015057952.tif 000003
【化２】
2015057952.tif 000004
【化３】
2015057952.tif 000005
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
2015057952.tif 000009
【化８】
2015057952.tif 000010
【００６６】
本発明により生産されるジテルペン樹脂酸は、例えば、共役樹脂酸であるアビエチン酸（ａｂｉｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式９）、ネオアビエチン酸（ｎｅｏａｂｉｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１０）およびパラストリン酸（ｐａｌｕｓｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１１）、ならびに非共役樹脂酸であるピマール酸（ｐｉｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１２）、イソピマール酸（ｉｓｏｐｉｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１３）、レボピマール酸（ｌｅｖｏｐｉｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１４）およびデヒドロアビエチン酸（ｄｅｈｙｄｒｏａｂｉｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１５）、サンダラコピマール酸（ｓａｎｄａｒａｃｏｐｉｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、式１６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【化９】
2015057952.tif 000011
【化１０】
2015057952.tif 000012
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【００６７】
本発明の方法を用いて生産されたジテルペン樹脂酸は、そのままの態様で、または他のジテルペン樹脂酸などと混合して、ロジン代替物として用いることができる。すなわち、本発明は、本発明の方法を経て得られたジテルペン樹脂酸および／または本発明の方法を用いて得られたジテルペン樹脂酸を含む、ロジン代替物に関する。本発明の方法を経て得られたジテルペン樹脂酸とは、例えば、本発明の方法を用いて得られたジテルペンを酸化することによって得られた、ジテルペン樹脂酸である。本明細書において「ロジン」とは、マツ科の植物の樹液である松脂を蒸留して製造される、樹脂酸を主成分とする天然樹脂をさす。「ロジン代替物」とは、マツ科の植物以外の生物資源を原料として製造される、ロジンと同様の特性を有する樹脂様物質をさす。ロジン代替物は、共役樹脂酸であるアビエチン酸、ネオアビエチン酸およびパラストリン酸、ならびに非共役樹脂酸であるピマール酸、イソピマール酸およびデヒドロアビエチン酸等を主成分とする。前記ロジン代替物は、例えば、トールロジン代替物、ガムロジン代替物またはウッドロジン代替物である。トールロジン代替物は、例えば、３０〜４５重量％のアビエチン酸；２〜５重量％のネオアビエチン酸；１０〜１５重量％のパラストリン酸；３〜８重量％のピマール酸；４〜１０重量％のイソピマール酸；および１５〜２５重量％のデヒドロアビエチン酸を含む。ガムロジン代替物は、例えば、２０〜４０重量％のアビエチン酸；１５〜２５重量％のネオアビエチン酸；２０〜３０重量％％のパラストリン酸；３〜８重量％のピマール酸；１０〜２０重量％のイソピマール酸；および３〜８重量％のデヒドロアビエチン酸を含む。ウッドロジン代替物は、例えば、３５〜４５重量％のアビエチン酸；２〜１０重量％のネオアビエチン酸；１０〜２０重量％のパラストリン酸；５〜８重量％のピマール酸；１０〜１５重量％のイソピマール酸；および１０〜１５重量％のデヒドロアビエチン酸を含む。
【００６８】
本発明のロジン代替物の酸価、軟化点および等級は、例えば、以下の表１の通りである。
【表１】
2015057952.tif 000019
【００６９】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を用いて生産されたジテルペンおよび／またはジテルペン樹脂酸を用いることを特徴とする、ロジン代替物を生産する方法に関する。前記ロジン代替物は、例えば、トールロジン代替物、ガムロジン代替物またはウッドロジン代替物である。トールロジン代替物を生産する方法は、例えば、３０〜４５重量％のアビエチン酸；２〜５重量％のネオアビエチン酸；１０〜１５重量％のパラストリン酸；３〜８重量％のピマール酸；４〜１０重量％のイソピマール酸；および１５〜２５重量％のデヒドロアビエチン酸を混合する工程を含む。ガムロジン代替物を生産する方法は、例えば、２０〜４０重量％のアビエチン酸；１５〜２５重量％のネオアビエチン酸；２０〜３０重量％％のパラストリン酸；３〜８重量％のピマール酸；１０〜２０重量％のイソピマール酸；および３〜８重量％のデヒドロアビエチン酸を混合する工程を含む。ウッドロジン代替物を生産する方法は、例えば、３５〜４５重量％のアビエチン酸；２〜１０重量％のネオアビエチン酸；１０〜２０重量％のパラストリン酸；５〜８重量％のピマール酸；１０〜１５重量％のイソピマール酸；および１０〜１５重量％のデヒドロアビエチン酸を混合する工程を含む。
【００７０】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明の例示のために用いられ、限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００７１】
１．改変ＬＡＳ遺伝子の作製（図１−１〜図１−４）
改変ＬＡＳ遺伝子は、オウシュウトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）由来のレボピマラジエン／アビエタジエン合成酵素（ＰａＬＡＳ）のＯＲＦの塩基配列（配列番号２）を基に、コドン使用頻度をクラミドモナスの葉緑体のものに最適化することで作製した。ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）  Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを利用して、コドンの最適化および改変ＬＡＳ遺伝子を含む人工合成遺伝子（配列番号１３）の合成を行った。合成した改変ＬＡＳ遺伝子を含む人工合成遺伝子は、５’→３’の方向に、制限酵素ＮｄｅＩ切断部位−改変ＬＡＳ遺伝子（配列番号１から終止コドン「ＴＡＡ」を除いた配列）−８×Ｇｌｙスペーサー配列をコードする配列（配列番号１０）−ＦＬＡＧタグ配列（配列番号１４）をコードする配列−終止コドン「ＴＡＡ」−制限酵素ＸｂａＩ切断部位を有する。なお、ＮｄｅＩ切断部位の第４〜６番目のヌクレオチドＡＴＧは、改変ＬＡＳ遺伝子の開始コドンに該当する。
【００７２】
図１−１〜図１−４に、改変ＬＡＳ遺伝子（配列番号１）と、ＰａＬＡＳ遺伝子（配列番号２）の配列比較を示す。
【実施例２】
【００７３】
２．改変ＬＡＳ遺伝子含有ベクターの作製（図２）
クラミドモナスゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーセット（１６Ｓ＿Ｐｒｏ＿Ｆｗ＿ＢｇｌＩＩ（配列番号１５）／１６Ｓ＿Ｐｒｏ＿Ｒｖ＿ＫａｓＩ（配列番号１６））を用いて１６Ｓプロモーター配列を取得した。同様に、プライマーセット（ａｔｐＡ５’＿Ｆｗ＿ＫａｓＩ（配列番号１７）／ａｔｐＡ５’＿Ｒｖ＿ＮｄｅＩ＿１（配列番号１８））を用いてａｔｐＡ５’ＵＴＲ配列を取得した。ｐＣＬ３１４ベクター（松尾拓哉博士（名古屋大学）より分譲。名古屋大学にて分譲可能な状態で保存されている。）を鋳型に、プライマーセット（ｒｂｃＬ３’＿Ｆｗ＿ＸｂａＩ（配列番号１９）／ｒｂｃＬ３’＿Ｒｖ（配列番号２０））を用いてｒｂｃＬ３’ＵＴＲ配列を取得した。これらの断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、ｐＴ７ＢＴ／１６Ｓ、ｐＴ７ＢＴ／ａｔｐＡ５およびｐＴ７ＢＴ／ｒｂｃＬ３を構築した。ｐＴ７ＢＴ／ａｔｐＡ５をＫａｓＩおよびＮｄｅＩで消化した。得られた断片を、ＫａｓＩおよびＮｄｅＩで消化したｐＴ７ＢＴ／１６Ｓにライゲーションさせ、ｐＴ７ＢＴ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５を構築した。ｐＴ７ＢＴ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５をＳｍａＩおよびＸｂａＩで消化した。得られた断片を、ＨｉｎｃＩＩおよびＸｂａＩで消化したｐＴ７ＢＴ／ｒｂｃＬ３にライゲーションさせ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ｒｂｃＬ３’を構築した。
【００７４】
骨格ベクターとしてｐＣＴＳ３（Ｍａｔｓｕｏ  Ｔ，ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｆｅｂ．２００６、ｐ．８６３−８７０）、サブクローニングのためのベクターとしてｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＴａｔｐＢ（Ｍａｔｓｕｏ  Ｔ，ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｆｅｂ．２００６、ｐ．８６３−８７０）およびｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ｒｂｃＬ３’を用いて、改変ＬＡＳ遺伝子を含有するクラミドモナス葉緑体用形質転換ベクターを構築した。具体的には、実施例１で作製した人工合成遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化したｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＴａｔｐＢまたはｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ｒｂｃＬ３’とライゲーションした。構築したｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＬＡＳ＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ＴａｔｐＢおよびｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ＬＡＳ＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ｒｂｃＬ３’ベクターをＢａｍＨＩで消化し、ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＴＳ３とライゲーションした。プラスミドＤＮＡの抽出、ＤＮＡの電気泳動、ＤＮＡの制限酵素による消化、平滑化、ライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの操作は、従来法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って行った。
【００７５】
ベクター構築の宿主には、大腸菌ＤＨ５α（ライフテクノロジーズ株式会社）を使用した。大腸菌の培養は、ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて行い、必要に応じてそれぞれ最終濃度５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを培地に添加した。大腸菌の形質転換は従来法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って行った。ＤＮＡの塩基配列の決定は、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、メーカーのマニュアルに従って行った。決定した塩基配列は、塩基配列解析ソフトであるＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｃｏｒｐ．）を用いて解析した。
【００７６】
構築したベクター「ＰａＬＡＳ／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ  ｉｎ  ｐＣＴＳ３」および「ＰａＬＡＳ／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ｉｎ  ｐＣＴＳ３」を、図２ＡおよびＢに示す。各ベクターは、表２に示すようにプロモーター配列、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。さらに、各ベクターは、葉緑体ゲノムＤＮＡへの相同性組換え効率を上げるため、葉緑体ゲノムＤＮＡに相同な配列（左アームおよび右アーム）を含む。
【表２】
2015057952.tif 000020
【実施例３】
【００７７】
３．クラミドモナスの形質転換
微粒子銃法（Ｍｉｎａｇａｗａ  Ｊら，  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ．  Ｒｅｓ．  ４２：１２１−１３１）により、クラミドモナス・ラインハーディの葉緑体に、実施例２で構築したベクターを導入した。形質転換の宿主には、クラミドモナス・ラインハーディ変異株ΔＤ２−２（皆川純博士（北海道大学）より分譲）を用いた。このΔＤ２−２は、クラミドモナス・ラインハーディ野生株２１３７ｍｔ＋を遺伝的背景にもつｐｓｂＤ欠失株であり、光合成能を欠く。形質転換後、ＨＭＳ培地（１．５％アガー含有）で、恒明条件下、２４℃で３週間程度培養し、光合成能の修復の有無により形質転換体を選択した。さらに、選択圧下、単一のコロニーを数回ピックして、ホモプラズミックな形質転換体を単離した。
【実施例４】
【００７８】
４．改変ＬＡＳ遺伝子の確認（図３）
実施例３で作製した改変ＬＡＳ遺伝子を含む緑藻が、改変ＬＡＳ遺伝子を有することを確認するため、ＰＣＲ解析を行った。まず、緑藻を従来法（Ｃａｏら，Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ，Ｍａｒ．  ２００９，２３５，  ｐ．  １０７−１１０）に従って全細胞抽出物を獲得した。次に、その抽出物を鋳型に、葉緑体ゲノム特異的または挿入遺伝子特異的なプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行った。用いたプライマーセットは表３の通りである。ＰＣＲサイクル条件は以下の通りである；（ディネイチャー９８℃；アニーリング５０℃；エクステンション７２℃、４分；３５サイクル）。陰性対照として、ベクターを導入していないΔＤ２−２の全細胞抽出物を鋳型としてＰＣＲを行った。
【表３】
2015057952.tif 000021
【００７９】
ＰＣＲ解析の結果を図３に示す。図３Ａは、葉緑体ゲノム特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果である。陰性対照（ＮＣ）では１１５ｂｐのバンドが、形質転換体では３６００ｂｐのバンドが確認できた。これは、形質転換体の葉緑体ゲノムにＤＮＡが挿入されていることを示している。また、図３Ｂは、挿入遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲの結果である。各形質転換体でバンドが確認され、改変ＬＡＳ遺伝子が挿入されていることがわかる。
【実施例５】
【００８０】
５．ＬＡＳタンパク質の検出（図４）
実施例３で作製した改変ＬＡＳ遺伝子を含む緑藻が、改変ＬＡＳを産生しているかを確認するために、ウェスタンブロット解析を行った。ＴＡＰ液体培地で４日間培養した菌体を遠心操作によって回収した。回収した菌体を溶解バッファー（０．２Ｍリン酸塩  ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤）に懸濁した。さらに超音波処理によって可溶化させ、遠心操作を行った。上澄みを可溶性画分とし、沈殿物に変性溶解結合バッファー（７Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）を加え不溶性画分とした。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料とした。１２．５％  アクリルアミドゲル、１０倍希釈ランニングバッファー溶液（１０ｘ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用、トリス−グリシン（ナカライテスク）を用い、２００Ｖ、２０ｍＡ、１００分間の電気泳動を行なった。メンブレンにＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐトランスファーメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。１２Ｖ、３００ｍＡで６０分間電圧をかけ、ブロッティングを行なった。一次抗体にモノクローナル抗−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２、クローンＭ２（ＳＩＧＭＡ）、Ｅａｓｙ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｕｐｅｒ（Ｂｅａｃｌｅ，  Ｉｎｃ．）およびＬｕｍｉｎａｔｅ（商標）Ｆｏｒｔｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＰＲ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、添付のプロトコルに従って反応を行なった。シグナルはＴｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ７０００を用いて検出した。
【００８１】
ウェスタンブロットの結果を図４に示す。形質転換体の不溶性画分に９３ｋＤａのバンドが確認できる。これは、改変ＬＡＳが形質転換体において産生されていることを示す。
【実施例６】
【００８２】
６．ジテルペンの検出（図５〜８）
上記形質転換による、遺伝子組換え緑藻としての遺伝子組換えクラミドモナスが、ジテルペンを産生していることを、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ法）により解析した。解析には、クラミドモナス培養物のｎ−ペンタン抽出物を用いた。菌体を播種した２００ｍｌ  ＴＡＰ培養液を恒明条件、２４℃、１３５ｒｐｍの振とうで４日間培養した。サンプル２５ｍｌに対して１０から１５ｍｌのｎ−ペンタンを加えて混合した後、ｎ−ペンタン抽出物を回収した。この操作を３回繰り返した。ｎ−ペンタン抽出物に約５ｇの硫酸ナトリウムを加え、脱脂綿を詰めたろうとでｎ−ペンタン抽出物を濾過した。得られたｎ−ペンタン抽出物を減圧下で約１ｍｌになるように濃縮し、ＧＣ−ＭＳ分析の試料として用いた。ＧＣ−ＭＳは、Ａｕｔｏｍａｓｓ（ＪＥＯＬ）−６８９０Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、カラムは、ＨＰ−５ＭＳカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；０．２５ｍｍ×３０ｍ；０．２５μｍ  ｆｉｌｍ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を用い、以下の条件で生成物を分析した。カラムオーブンの昇温条件は６０℃から２８０℃まで毎分３℃で昇温し、２８０℃で６分４０秒保持とした。インジェクション温度は２５０℃、ＧＣインターフェイス温度は２８０℃とした。キャリアガスにはヘリウムを用い、流速は毎分０．７ｍＬ、サンプル注入量１μＬ、スプリット比１：１０とした。質量分析計は電子イオン化法を用い、イオン化エネルギーは７０ｅＶ、イオン源温度は２５０℃とした。ｍ/z：４０−３５０について１回０．５秒でスキャンした。
【００８３】
ＧＣ−ＭＳの結果を図５〜８に示す。遺伝子組換えクラミドモナス抽出物からは、ジテルペンと見られる３種類の化合物が検出された。ＧＣ解析では、陰性対照（ＮＣ）である形質転換をしていないΔＤ２−２株と比較して、図５の１〜３で示されるピークが確認できた。図６〜８はそれぞれのピークのＭＳ解析結果である。図６Ａに示されるピーク１のＭＳ解析結果は、図６Ｂに示されるレボピマラジエンのＭＳ解析結果（Ｍａｒｔｉｎら，  ２００４，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １３５：１９０８−１９２７）と合致した。これより、遺伝子組換えクラミドモナスは、ジテルペンの一つであるレボピマラジエンを産生していることが示された。また、図７Ａに示されるピーク２のＭＳ解析結果は、図７Ｂに示されるアビエタジエンのＭＳ解析結果（Ｍａｒｔｉｎら，  ２００４）と合致した。これより、遺伝子組換えクラミドモナスが、ジテルペンの一つであるアビエタジエンを産生していることが示された。さらに、図８Ａに示されるピーク３のＭＳ解析結果は、図８Ｂに示されるネオアビエタジエンのピークＭＳ解析結果（Ｍａｒｔｉｎら，  ２００４）と合致した。これより、遺伝子組換えクラミドモナスが、ジテルペンの一つであるネオアビエタジエンを産生していることが示された。
【実施例７】
【００８４】
７．改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子の作製（図９−１〜図９−３）
改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子は、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列（配列番号１１）を基に、コドン使用頻度をクラミドモナスの葉緑体のものに最適化することで作製した。ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）  Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを利用して、コドンの最適化および改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子を含む人工合成遺伝子（配列番号２６）の合成を行った。合成した改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子を含む人工合成遺伝子は、５’→３’の方向に、制限酵素ＮｄｅＩ切断部位−改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子（配列番号１２から終止コドン「ＴＡＡ」を除いた配列）−８×Ｇｌｙスペーサー配列をコードする配列（配列番号１０）−ＦＬＡＧタグ配列（配列番号１４）をコードする配列−終止コドン「ＴＡＡ」−制限酵素ＸｂａＩ切断部位を有する。なお、ＮｄｅＩ切断部位の第４〜６番目のヌクレオチドＡＴＧは、改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子の開始コドンに該当する。
【００８５】
図９−１〜図９−３に、改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子（配列番号１２）と、テーダマツ由来ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子（配列番号１１）の配列比較を示す。
【実施例８】
【００８６】
８．テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子をさらに含む、改変ＬＡＳ遺伝子含有ベクターの作製（図１０）
酸化酵素をさらに含む、改変ＬＡＳ遺伝子含有緑藻葉緑体用形質転換ベクターを構築した。実施例７で作製した人工合成遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化したｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＴａｔｐＢまたはｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ｒｂｃＬ３’とライゲーションした。調製されたｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＣＹＰ７２０Ｂ１＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ＴａｔｐＢおよびｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃ／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ＣＹＰ７２０Ｂ１＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ｒｂｃＬ３’をＢａｍＨＩで消化し、ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＴＳ３とライゲーションした。ｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＬＡＳ＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ＴａｔｐＢをＢａｍＨＩで消化し、ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＴＳ３／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ＣＹＰ７２０Ｂ１＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ｒｂｃＬ３’とライゲーションした。また、ｐＨＳＧ／ＰｔｕｆＡ：：ＣＹＰ７２０Ｂ１＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ＴａｔｐＢをＢａｍＨＩで消化し、ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＴＳ３／１６Ｓ−ａｔｐＡ５’：：ＰａＬＡＳ＿Ｃｒ＿ｏｐｔ：：ｒｂｃＬ３’とラーゲーションした。
【００８７】
構築したベクター「ＣＹＰ７２０Ｂ１／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ＰａＬＡＳ／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ」および「ＰａＬＡＳ／１６Ｓ−ａｔｐＡ−ｒｂｃＬ  ＣＹＰ７２０Ｂ１／ＰｔｕｆＡ−ＴａｔｐＢ」を、図１０ＡおよびＢに示す。各ベクターは、表４に示すようにプロモーター配列、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。さらに、各ベクターは、葉緑体ゲノムＤＮＡへの相同性組換え効率を上げるため、葉緑体ゲノムＤＮＡに相同な配列（左アームおよび右アーム）を含む。
【表４】
2015057952.tif 000022
【実施例９】
【００８８】
９．改変ＬＡＳ遺伝子および改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子を含むベクターでのクラミドモナスの形質転換（図１１）
実施例８で作製した、改変ＬＡＳ遺伝子および改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子を含むベクターを用いて、実施例３と同様に、クラミドモナスを形質転換した。単離した遺伝子組換えクラミドモナスについて、実施例４と同様に、ＰＣＲ解析よって遺伝子の挿入を確認した。用いた挿入遺伝子特異的プライマーは表５の通りである。ＰＣＲの結果を図１１に示す。
【表５】
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【実施例１０】
【００８９】
１０．ジテルペン樹脂酸の検出
実施例９で作成したクラミドモナス形質転換体から、実施例５と同様に、発現した酵素タンパク質の確認をすることができる。また実施例６と同様に、かかる遺伝子組換えクラミドモナスによって産生されたジテルペンの確認をすることができる。さらに、当技術分野における常套的な手段を用いて、かかる遺伝子組換えクラミドモナスによって産生されたジテルペン樹脂酸を確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、緑藻を用いてジテルペンおよびジテルペン樹脂酸を生産することができる。また、そのようにして得られたジテルペン樹脂酸は、ロジン代替物として用いることができる。したがって、本発明は、製紙用サイズ剤、合成ゴム用乳化剤、塗料、接着剤、滑り止め剤、香料、化粧品、医薬品などの分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１：改変ＬＡＳ遺伝子
配列番号２：オウシュウトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）由来ＬＡＳ（ＰａＬＡＳ）遺伝子
配列番号３：ＰａＬＡＳアミノ酸配列
配列番号４：ＰａＬＡＳ輸送ペプチド配列
配列番号５：Ｎ末端切断型ＰａＬＡＳアミノ酸配列
配列番号６：ＴｕｆＡプロモーター配列
配列番号７：１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター配列−ａｔｐＡ遺伝子の５’ＵＴＲ配列
配列番号８：ａｔｐＢ遺伝子の３’ＵＴＲ配列
配列番号９：ｒｂｃＬ遺伝子の３’ＵＴＲ配列
配列番号１０：８×Ｇｌｙスペーサー配列をコードする配列
配列番号１１：テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）由来ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子
配列番号１２：改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子
配列番号１３：改変ＬＡＳ遺伝子を含む合成塩基配列
配列番号１４：ＦＬＡＧタグ配列
配列番号１５：プライマー１６Ｓ＿Ｐｒｏ＿Ｆｗ＿ＢｇｌＩＩ
配列番号１６：プライマー１６Ｓ＿Ｐｒｏ＿Ｒｖ＿ＫａｓＩ
配列番号１７：プライマーａｔｐＡ５’＿Ｆｗ＿ＫａｓＩ
配列番号１８：プライマーａｔｐＡ５’＿Ｒｖ＿ＮｄｅＩ＿１
配列番号１９：プライマーｒｂｃＬ３’＿Ｆｗ＿ＸｂａＩ
配列番号２０：プライマーｒｂｃＬ３’＿Ｒｖ
配列番号２１：プライマーｐＣＴＳ３＿４６７６＿Ｆｗ
配列番号２２：プライマーｐＣＴＳ３＿４７９０＿Ｒｖ
配列番号２３：プライマーＰｔｕｆＡ＿Ｆｗ
配列番号２４：プライマーＴａｔｐＢ＿Ｒｖ
配列番号２５：プライマー１５１４／ＰａＬＡＳＣｒｏｐｔＦｗ１９０４
配列番号２６：改変ＣＹＰ７２０Ｂ１遺伝子を含む合成塩基配列
配列番号２７：プライマー１８１８／ＰａＬＡＳ＿ＣｒｏｐｔＲｖ２１８
配列番号２８：プライマー１８１９／ＣＹＰ７２０Ｂ１＿ＣｒｏｐｔＲｖ２１５
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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