(57)【要約】【課題】本発明は、ラクトフェリンの新たな用途を提供する。【解決手段】ラクトフェリンを含有する癌転移抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを含有する、癌転移抑制剤。
【請求項２】
癌が、上皮癌である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
上皮癌が、扁平上皮癌である、請求項２に記載の癌転移抑制剤。
【請求項４】
扁平上皮癌が、口腔扁平上皮癌である、請求項３に記載の癌転移抑制剤。
【請求項５】
転移抑制が、骨浸潤抑制である、請求項１〜４のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
【請求項６】
ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の癌転移抑制剤を含有する経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンを含有する癌転移抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリンは、鉄トランスポーターファミリーに属する約８０ｋＤの多機能タンパク質であり、母乳や牛乳などの乳や、涙、唾液等の粘膜からの分泌物に多く含まれる。これまでにラクトフェリンの機能として、抗菌・抗ウイルス作用（非特許文献１、２、特許文献１等参照)、抗腫瘍作用（特許文献２等参照）、抗疼痛作用（非特許文献３等参照）、免疫調整作用（特許文献３、４等参照）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平５−３２００６８号公報
【特許文献２】特開２００１−０４８８０４号公報
【特許文献３】特開２００４−３５９６４７号公報
【特許文献４】特開２００４−３５９６４８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Pediatrics、第９４巻、１頁： １９７９年
【非特許文献２】Nonnecke, B. J. & Smith, K.L.; Journal of Dairy Science、６７ 巻、６０６頁：１９８４年
【非特許文献３】The Journal of veterinary medical science、６６巻、２号、１４９頁：２００４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、その主な目的は、ラクトフェリンの新たな用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、ラクトフェリンががん細胞の転移を抑制する作用を有することを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の項に記載の主題を包含する。
項１．  ラクトフェリンを含有する、癌転移抑制剤。
項２．  癌が、上皮癌である、上記項１に記載の癌転移抑制剤。
項３．  上皮癌が、扁平上皮癌である、上記項２に記載の癌転移抑制剤。
項４．  扁平上皮癌が、口腔扁平上皮癌である、上記項３に記載の癌転移抑制剤。
項５．  転移抑制が、骨浸潤抑制である、上記項１〜４のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
項６．  ラクトフェリンを含んだリポソームを含有する、上記項１〜５のいずれかに記載の癌転移抑制剤。
項７．  上記項１〜６のいずれかに記載の癌転移抑制剤を含有する経口組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の癌転移抑制剤及び経口組成物はがん細胞の転移を抑制する作用を有しており、特に口腔扁平上皮癌の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１におけるがん細胞の観察結果を示す図である。
【図２】実施例１におけるがん細胞の遊走抑制率を示すグラフである。
【図３】実施例２において用いた培養チャンバーを示す図である。
【図４】実施例２におけるチャンバー下面に出現した細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図５】実施例２におけるチャンバー下面に出現した細胞数を示すグラフである。
【図６】実施例３におけるがん細胞の細胞数の経時変化を示すグラフである。
【図７】実施例４におけるFACS解析の結果を示す図である。
【図８】実施例５における腫瘍サイズの測定結果を示す図である。
【図９】実施例５におけるマイクロCTの撮影結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、ラクトフェリンを含有する癌転移抑制剤に係る。
【００１２】
本発明に用いるラクトフェリンは、その由来は限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳動物から得られるラクトフェリンを使用することができる。このうちウシ由来のウシラクトフェリン又はヒト由来のヒトラクトフェリンが好ましい。ラクトフェリンは例えばこれらの動物の乳又は脱脂乳又はホエー等の乳処理物から常法により分離されることにより得ることができる。また、本明細書では、アポラクトフェリンや金属飽和ラクトフェリンもラクトフェリンに含まれる。アポラクトフェリンは例えばラクトフェリンをクエン酸等により脱鉄して得ることができ、金属飽和ラクトフェリンは例えばラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせることにより得ることができる。その他、遺伝子工学的な手法により、微生物、動物細胞、動物等で生産した各種ラクトフェリンを使用してもよい。また、ラクトフェリンには、ラクトフェリンの加水分解物も含まれる。ラクトフェリンの分子量は特に限定されないが、１０００〜２０００００程度が好ましい。
【００１３】
また、本発明に用いるラクトフェリンはリポソームに含まれた態様であることが好ましい。換言すると、本発明では、ラクトフェリンを含んだリポソームを用いることが好ましい。ラクトフェリンを含んだリポソームを用いる場合には、がん細胞の転移を抑制する効果がより増強される。本発明において、リポソームはリン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。リポソームは水溶性薬物をその内水層に、脂溶性薬物を脂質二重層へ取り込むことができ、薬物のターゲティング、徐放化、副作用の軽減などを目的にDDS製剤の薬物運搬体としてその応用が試みられている。また、リポソームは生体膜の成分から構成されているため安全性が高いことも知られている。
【００１４】
一般的に、リポソームは脂質二重層の数に基づいて分類され、多重膜リポソーム（MLV）と一枚膜リポソームに分類される。一枚膜リポソームは、そのサイズに応じて、更にSUV（small unilamella vesicle）、LUV（large unilamella vesicle）、GUV（giant unilamella vesicle）などに分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはMLVである。本発明では、リポソームの大きさは、通常30〜1000nm、好ましくは30〜600nm、より好ましくは50〜200nmである。
【００１５】
本発明において使用されるラクトフェリンを含んだリポソームにおいて、ラクトフェリンはリポソーム膜に囲まれる空間に封入されていることが好ましいが、ラクトフェリンがリポソーム膜構成成分として含まれていても良いし、多重膜リポソームを構成する多重膜の間に含まれていても良いし、リポソーム膜のうちの最も外側の膜にラクトフェリンが付着又は結合する形態で含まれていても良い。
【００１６】
ラクトフェリンを含んだリポソームは、従来の方法により製造することができる。例えば、所望量のレシチン及び必要に応じて所望量のステロールを、例えばエタノールなどの適当な有機溶媒で可溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これにラクトフェリンや任意の生理活性物質を含む水溶液を添加して、例えば、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌して、リポソーム懸濁液を調製することにより、ラクトフェリンを封入したリポソームを得ることができる。
【００１７】
また、この方法とは別に、所望量のレシチン及び必要に応じて所望量ステロールを少量のエタノールに溶解後、水溶液又は緩衝液に分散して予備乳化を行った後、高圧で分散させて脂質二重層を形成させてリポソーム懸濁液を調製することによってもラクトフェリンを封入したリポソームを得ることができる。
【００１８】
得られた懸濁液に対しては、必要に応じて、リポソーム外液中のラクトフェリンを除去する操作、例えば懸濁液を濾過後，得られた濾液を透析する操作を行ってもよい。
【００１９】
リポソームの懸濁液は、液状のままでも使用できるが、凍結乾燥した乾燥物として使用することもできる。リポソームは、その乾燥物を錠剤やカプセル化したものをはじめ、様々な経口摂取に適した形態とすることが可能である。
【００２０】
ラクトフェリンを含んだリポソーム中におけるラクトフェリンの含有量は好ましくは10〜99重量％程度、より好ましくは20〜95重量％程度、さらに好ましくは30〜90重量％程度である。
【００２１】
レシチンとしては、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、ひまわりレシチン、ピーナッツレシチンなどを１種単独で又は２種以上組み合わせて使用することができるがこれらに限定されない。本発明では、これらの水素添加物を用いることもできる。レシチンはホスファチジルコリン又は１，２−ジアシルグリセロール ３−ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、上記例示のレシチンに加えて、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが特に好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。好ましい不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸を使用できる。特に２位にオレイン酸、リノール酸が多く結合したレシチンが好ましい。具体的には、卵黄レシチン、大豆レシチンが好ましい。
【００２２】
ステロールとしては、コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール；β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、エルゴスタディエノール、シトステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロール等が挙げられ、１種単独で又は２種以上組み合わせて使用できる。これらの中でも、コレステロール又はフィトステロールが好ましく用いられる。
【００２３】
リポソームにおけるレシチンとステロールのモル比は、55：45〜95：5程度が好ましく、60：40〜90：10程度がより好ましく、75：25〜85：15程度が最も好ましい。モル比がこれらの範囲にあるとリポソーム膜の安定性が向上する。
【００２４】
ラクトフェリンを含んだリポソームにおけるレシチンの含有量は、好ましくは1〜80重量％程度、より好ましくは3〜65重量％程度、さらに好ましくは5〜50重量％程度である。
【００２５】
ラクトフェリンを含んだリポソームにおけるステロールの含有量は、好ましくは0〜40重量％程度、より好ましくは0.1〜30重量％程度、さらに好ましくは1〜20重量％程度である。
【００２６】
レシチン又はステロールの含有量は既知の方法で測定できる。例えば、レシチンの含有量はFiske-Subbarow法など、ステロールの含有量はHPLC、比色法などによって定量できる。
【００２７】
さらに、ラクトフェリンを含んだリポソームの表面をコーティングすることができ、このコーティング物も有効成分として利用できる。好ましいコーティングとしては、硫酸基を含有する多糖類によるコーティングがあげられる。硫酸基含有多糖類としては、フコイダン、カラギーナン、寒天、ヘパリンなどが挙げられる。また、該硫酸基含有多糖類としては、硫酸基を含まない多糖を硫酸化したものも包含され、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などであってもよい。
【００２８】
硫酸基含有多糖類としては、分子量が5000〜300000程度のものが好ましく用いられる。これらの硫酸基含有多糖類の中でもフコイダン及びカラギーナンを好ましく用いることができ、特にフコイダンが好ましい。
【００２９】
硫酸基含有多糖類の使用量は、例えば、リポソームに含有されるレシチン100重量部に対して、10〜500重量部程度が好ましく、20〜200重量部程度がより好ましい。
【００３０】
コーティングは、例えば、ラクトフェリンを含んだリポソームを含む懸濁液に、硫酸基含有多糖類を加え、1000〜3000rpm程度で2〜5分間程度撹拌することにより行うことができる。なお、１つのコーティング膜の中に複数のリポソームが含まれていてもよい。
【００３１】
リポソームが硫酸基含有多糖類でコーティングされていることは、例えば、リポソーム溶液のゼータ電位が、硫酸基含有多糖類を添加して撹拌することにより変化することにより確認できる。
【００３２】
ラクトフェリンを含んだリポソームにはレシチン、フィトステロール以外にも必要に応じて、トコフェロール、アスコルビン酸などの抗酸化剤、乳酸、クエン酸などの有機酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質、キトサン、フコイダン、ヒアルロン酸などの天然高分子、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマーなどの合成高分子、トレハロース、ラクチュロース、マルチトールなどの糖質、グリセリンなどのポリオール等を加えることができる。
【００３３】
また、ラクトフェリンを含んだリポソームには、必要に応じて、ラクトフェリンに加えて、様々な物質を内容物として封入することができる。例えば、クロラムフェニコール、硫酸フラジオマイシン、エデト酸ナトリウム・セトリミド、エピジヒドロコレステリン、塩化亜鉛、塩化デカリニウム、塩化ベンゼトニウム、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フッ化ナトリウム、非ステロイド性抗炎症薬、副腎皮質ステロイド薬、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、ペニシラミン、ブシラミン、ロベンザリット二ナトリウム、サラゾスルファピリジン、アクタリット、メトトレキサート、ミゾリビン、抗TNF抗体、可溶性TNFレセプター、抗インターロイキン1抗体、抗インターロイキン6抗体、エストラジオール、エストリオール等のエストロゲン製剤、塩酸ラロキシフェン、アレンドロネート、エチドロネート、リセドロネート等のビスホスホネート製剤、エルカトニン、カルシトニン、イプリフラボンなどである。
【００３４】
本発明の癌転移抑制剤及び経口組成物におけるラクトフェリンの含有量は、剤形等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。
【００３５】
本発明の癌転移抑制剤は、経口組成物に配合することが可能であり、経口組成物の中でも医薬組成物としての利用が特に好ましい。
【００３６】
本発明の癌転移抑制剤を医薬組成物として利用する場合には、フィトステロールを含んだリポソームに、必要に応じて薬学的に許容される担体を配合し、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤などの固形剤或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤等の経口投与可能な形態の医薬組成物として使用できる。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、経口医薬組成物は香料等の各種添加剤を含むこともできる。
【００３７】
担体として例えばマルチトール、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、タルク、リン酸一水素カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、カカオ脂等の賦形剤、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、クロスポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、結晶セルロース、粉末セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カリウム、アラビアゴム末、プルラン、デキストリン、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、ゼラチン、キサンタンガム、トラガント、トラガント末、マクロゴール等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。カプセル剤は有効成分を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００３８】
液体製剤は水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤であってもよく、通常の添加剤を用いて常法に従い、調製される。
【００３９】
着香剤または香料としては、例えば、ハッカ油、ユーカリ油、ケイヒ油、ウイキョウ油、チョウジ油、オレンジ油、レモン油、ローズ油、フルーツフレーバー、ミントフレーバー、ペパーミントパウダー、ｄｌ−メントール、ｌ−メントール等が挙げられる。
【００４０】
本発明の経口組成物において経口組成物全量に対するラクトフェリン含有量は、組成物の剤型等に応じて適宜設定されるが、通常0.5〜95重量％程度、好ましくは0.8〜80重量％程度、より好ましくは1〜50重量％程度である。
【００４１】
本発明の癌転移抑制剤及び経口組成物の摂取量（投与量）は、成人一人１日あたり、ラクトフェリンの摂取重量が、好ましくは10mg〜10000mg程度、より好ましくは50mg〜2000mg程度となる量である。
【００４２】
本発明の癌転移抑制剤は、がん細胞の転移を抑制する作用を有しており、特に、がん細胞の遊走、浸潤を抑制する作用を有する。また、本発明の癌転移抑制剤が対象とする癌の種類としては、好ましくは上皮癌、より好ましくは扁平上皮癌、特に好ましくは口腔扁平上皮癌である。特に、本発明の癌転移抑制剤は、口腔扁平上皮癌の骨浸潤を抑制する作用を有していることから、口腔扁平上皮癌の治療に有用である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１：がん細胞に対する遊走抑制作用の検討
ヒト扁平上皮癌由来の細胞株（HOC313細胞）を、10 % ウシ胎児血清（FBS）（Invitrogen, Grand Island, USA）及び抗生剤（100U/mL penicillin-streptomycin）（Invitorgen）含有 Dulbecco’s Modified Eagle Mediun（DMEM）中で、37℃、5％ＣＯ２存在下にて継代培養を行った。その後、HOC313細胞を6×105個で直径 6cm 培養プレートに播種し、細胞接着後、72 時間 10 % FBS 含有 DMEM で培養を行い、ウシラクトフェリン（bLF）を1、10又は100 μg/mL投与したラクトフェリン投与群及び非投与のコントロール群に分け、遊走抑制作用の検討を行った。遊走抑制作用の検討は、1 cm 幅で培養プレートを線状剥離し、細胞の遊走による剥離部位の閉鎖を経時的に観察した。0、6、12 及び 24 時間経過後の細胞の観察結果を図 1 に示す。また、顕微鏡画像解析により、各時間における同部位の剥離距離を計測し、0 時間の剥離距離に対する 6、12 及び 24 時間経過後の剥離距離を百分率で算出したものを遊走抑制率とした。遊走抑制率を示すグラフを図 2 に示す。
【００４５】
検討結果より、ラクトフェリン投与群では、コントロール群と比較して線状剥離部に遊走した細胞数が少ないことが確認された。これらの結果から、ラクトフェリンはがん細胞の遊走を抑制する作用を有することが分かった。
【００４６】
実施例２：がん細胞に対する浸潤抑制作用の検討
ヒト扁平上皮癌由来の細胞株（HOC313細胞）を、ウシラクトフェリン（bLF）を1、10 又は 100 μg/mL 投与したラクトフェリン投与群及び非投与のコントロール群に分け、10 % ウシ胎児血清（FBS）（Invitrogem, Grand Island, USA）及び抗生剤（100U/mL penicillin-streptomycin）（Invitorgen）含有Dulbecco’s Modified Eagle Mediun（DMEM）中で 72 時間培養を行った。次いで、各群の細胞を2×104個となるように調整して、図 3 に示すCell Culture Insert内に播種し、Insertの外側には500μLの無血清培地を添加して、37 ℃、5 % CO2存在下にて培養を行った。24 時間経過後に培養チャンバー下部の細胞をホルマリンにて 1 時間の固定を行い、ヘマトキシリン 3G （サクラファインテックジャパン株式会社）にて核染色を行った後、検鏡し、Cell Culture Insert下面に出現した細胞数を計測した。なお、浸潤能の高い細胞は、マトリゲルを突き破ってチャンバー下部へと移動する。各群の顕微鏡写真を図 4 に、計測した細胞数を示すグラフを図 5 に示す。
【００４７】
検討結果より、ラクトフェリン投与群では、コントロール群と比較してチャンバー下部に移動した細胞数が少ないことが確認された。これらの結果から、ラクトフェリンはがん細胞の浸潤を抑制する作用を有することが分かった。
【００４８】
実施例３：がん細胞に対する増殖抑制作用の検討
ヒト扁平上皮癌細胞由来の細胞株（HSC3細胞）を、10 % ウシ胎児血清（FBS）（Invitrogem, Grand Island, USA）及び抗生剤（100U/mL penicillin-streptomycin）（Invitorgen）含有 RPMI1640（ナカライテスク株式会社）中で 37 ℃、5% CO2 存在下にて継代培養を行った。その後、HSC3 細胞を 3×103 個で24 well プレートに播種し、ウシラクトフェリン（bLF）を 1、10 又は 100 μg/mL 投与したラクトフェリン投与群及び非投与のコントロール群に分け、10 % FBS および抗生剤（100U/mL penicillin-streptomycin）含有 RPMI1640 中で37 ℃、5% CO2 存在下にて培養を行い、1、2、4 及び 6 日後の細胞数を計測した。計測した細胞数を示すグラフを図 6 に示す。
【００４９】
検討結果より、ラクトフェリン投与群では、コントロール群と比較して細胞の増加率が低いことが確認された。これらの結果から、ラクトフェリンはがん細胞の増殖を抑制する作用を有することが分かった。
【００５０】
実施例４：がん細胞に対するアポトーシス誘導作用の検討
ヒト扁平上皮癌細胞由来の細胞株（HSC3細胞）を、10 % ウシ胎児血清（FBS）（Invitrogem, Grand Island, USA）及び抗生剤（100U/mL penicillin-streptomycin）（Invitorgen）含有 RPMI1640（ナカライテスク株式会社）中で 37 ℃、5% CO2 存在下にて継代培養を行った。その後、HSC3 細胞を 3×103 個で24 well プレートに播種し、ウシラクトフェリン（bLF）を1、10 又は又は 100 μg/mL 投与したラクトフェリン投与群及び非投与のコントロール群に分け、10 % FBS および抗生剤（100U/mL penicillin-streptomycin）含有 RPMI1640 中で37 ℃、5% CO2 存在下にて 72 時間培養を行った。72 時間経過後、細胞を回収し、PE Annexin V Apotosis Detection kit I（Becton, Dickinson and Company, NJ, USA）を使用し、7-AAD と Annexin V-PE で二重染色を行い、FACS Calibur（Becton, Dickinson and Company, NJ, USA）にて解析を行った。FACS 解析の結果を図７に示す。
【００５１】
検討結果より、ラクトフェリン投与群では、コントロール群と比較してアポトーシスに陥った細胞数の割合が大きいことが確認された。これらの結果から、ラクトフェリンはがん細胞のアポトーシスを誘導する作用を有することが分かった。
【００５２】
実施例５：口腔扁平上皮癌に対する骨浸潤抑制作用の検討
8 週齢雄性 C3H マウス（日本チャールズリバー）を、ラクトフェリンの投与量が100 mg/kg/day又は 500 mg/kg/day のラクトフェリン投与群（各群 5 匹）及びコントロール群（5 匹）に分け、それぞれの被験試料を 1 週間経口投与した。なお、ラクトフェリン投与群に投与したラクトフェリンは、蒸留水に、大豆レシチン 4 ％、ラクトフェリン 12 ％を分散・溶解し、予備乳化の後、高圧ホモジネーションを行って得られた平均粒子径 40〜100 nm のラクトフェリン封入リポソーム（SL-bLF）であり、コントロール群には蒸留水のみを摂取させた。
【００５３】
その後、10 % ペントバルビタールナトリウム全身麻酔下で、口腔歯肉癌由来細胞株 SCC VIIを 1×104 個で左側咬筋内へ移植した。腫瘍サイズは 1、2、3 週経過時にデンタルノギス（ミツトヨ、川崎）を用いて楕円形を呈する腫瘍の直径を縦横で測定し、楕円形として近似値を算出した。腫瘍サイズの測定結果を図 8 に示す。次いで、移植から 4 週間経過後に頭部を一塊として摘出し、4 % periodate-lysine-parformaldehyde （PLP) 固定液を用いて4℃、24 時間固定後、マイクロ CT（SkyScan、東陽テクニカ）にて撮影を行った。マイクロ CT の撮影結果を図 9 に示す。
【００５４】
検討結果より、ラクトフェリン投与群では、コントロール群と比較して腫瘍サイズが小さくなり、さらに、頬骨及び下顎骨の骨吸収が著しく低下することが確認された。これらの結果から、ラクトフェリンは口腔扁平上皮癌の増殖ならびに骨吸収を伴った骨浸潤を抑制する作用を有することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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