(57)【要約】【課題】  標的ＤＮＡのみならず、該ＤＮＡ以外の領域にも、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみが標的ＤＮＡに導入された植物細胞の製造方法を提供すること。【解決手段】  標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程と、  前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程と、  前記工程にて選択された細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させ、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを前記標的ＤＮＡより除去する工程とを含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法
（ｉ）標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（ｉｉ）前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させ、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを前記標的ＤＮＡより除去する工程。
【請求項２】
標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物が導入されることにより、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の方法により製造された、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞を含む植物体。
【請求項５】
請求項４に記載の植物体の子孫又はクローンである植物体。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の植物体の繁殖材料。
【請求項７】
標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１に記載の方法に用いるための、下記（ａ）及び（ｂ）を含むキット
（ａ）請求項７に記載のＤＮＡ構築物
（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを植物細胞内で恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、並びに該植物体の子孫、クローン及び繁殖材料に関する。また、本発明は、前記植物細胞の製造方法、その製造方法に用いるためのＤＮＡ構築物、並びにそのＤＮＡ構築物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジーンターゲッティング（ＧＴ）は、ＤＮＡの塩基配列の相同性を利用した組換えによりゲノム上の標的ＤＮＡを任意に改変する技術であり、植物の分野においても、基礎研究と育種素材の開発とにおいて非常に有望な技術である。
【０００３】
しかしながら、高等植物における相同組換えの頻度は低く、ＧＴを介して標的ＤＮＡを改変すべく、標的ＤＮＡに相同な配列上に任意の変異を持つベクター（ＧＴベクター）を細胞外から導入した際には、その殆どはゲノム中にランダムに挿入されてしまう。そこで、ＧＴに成功した細胞を効率よく選抜するためにポジティブ・ネガティブ選抜法が開発されている。この方法は、ＧＴベクターがゲノムにランダムに組み込まれた細胞をネガティブ選抜マーカー遺伝子の発現で排除し、ＧＴによって標的ＤＮＡに変異が導入された細胞をポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現によって単離する選抜法である。
【０００４】
しかしながら、この方法を用いた場合、ポジティブ選抜マーカー遺伝子の発現カセットが標的ＤＮＡに残ってしまうため、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入したい場合はこのカセットを除去する必要がある。この点に関し、これまでに、部位特異的組換え酵素を用いてＧＴ後にポジティブ選抜マーカー遺伝子を除去する系が報告されている。しかしながら、この系を用いるとマーカー除去後に部位特異的組換え酵素の認識配列が残ってしまう。短い塩基配列の挿入も周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼすことも報告されているため、自然突然変異と同等な変異の導入系を構築するに際し、ＧＴ後に足跡が残らないマーカー除去を行える技術の開発が待ち望まれていた。
【０００５】
このような技術に関し、哺乳動物細胞においては、転移後に足跡を残さない特殊なトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（以下、「ｐｉｇｇｙＢａｃ」とも称する）を利用することにより、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入できたことが報告されている（非特許文献１）。すなわち、マウス及びヒト由来の培養細胞においては、ＧＴによる標的ＤＮＡの改変後にｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース（以下、「トランスポゼース」とも称する）を一過的に発現させることにより、ポジティブ選抜マーカー遺伝子を標的ＤＮＡより除去できることが明らかになっている。
【０００６】
しかしながら、かかる哺乳動物細胞における変異導入系において、ｐｉｇｇｙＢａｃ及びポジティブ選抜マーカー遺伝子の除去効率は低いため、これらが除去された細胞を得るためにネガティブ選抜を行う必要があった。さらに、このようにして選抜された細胞において、標的ＤＮＡとは異なるゲノム領域へのｐｉｇｇｙＢａｃの再挿入が、６８〜７９％という高い頻度で生じていた。また、ｐｉｇｇｙＢａｃは昆虫由来のトランスポゾンであるため、植物細胞においても哺乳動物細胞同様に転移が生じるかは明らかになっていなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、植物細胞においてもｐｉｇｇｙＢａｃの転移を利用して不要な配列を除去できるかどうかについて検証すべく、ｐｉｇｇｙＢａｃ内にレポーター遺伝子を組み込んだベクターを、植物細胞のゲノムＤＮＡ内にランダムに挿入した系を構築した。そして、この系においてトランスポゼースを恒常的に発現させた結果、挿入されたレポーター遺伝子をｐｉｇｇｙＢａｃごと痕跡を残すことなく除去できることを明らかにしている（非特許文献２〜５）。
【０００８】
しかしながら、この系において、植物細胞のゲノムＤＮＡ内にランダムに挿入されているｐｉｇｇｙＢａｃの除去効率は約７２％ではあるものの、除去されたｐｉｇｇｙＢａｃがゲノムＤＮＡに再度挿入する率は４１％と高かった。したがって、この系を利用して、植物細胞の標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入する際には、標的ＤＮＡ以外の領域にｐｉｇｇｙＢａｃが再挿入されている細胞を除外するための、さらなる操作が必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】遊佐  宏介ら、「人工多能性幹細胞における、α１アンチトリプシン欠損症の標的遺伝子修復（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年４月２０日、４７８巻、７３６９号、３９１〜３９４ページ
【非特許文献２】横井−西澤  彩子、土岐  精一、「植物におけるトランスポゾンを用いた足跡を残さないマーカー遺伝子除去系の開発」、第５４回日本植物生理学会年会要旨集、２０１３年３月１４日
【非特許文献３】横井−西澤  彩子、土岐  精一、「２０２７  イネにおける高精度なゲノム工学（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｒｉｃｅ）」、キーストンシンポジウム要旨集、２０１３年３月１７日
【非特許文献４】横井  彩子、土岐  精一、「植物におけるトランスポゾンを用いた足跡を残さないマーカー遺伝子除去系の開発」、育種学研究、２０１３年３月２７日、１５巻、１７２ページ
【非特許文献５】雑賀  啓明、土岐  精一、「植物における新ゲノム改変技術の開発と応用」、バイオサイエンスとインダストリー、２０１３年５月、７１巻、３号、２７５〜２７８ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、植物細胞において、標的ＤＮＡのみならず、該ＤＮＡ以外の領域にも、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、標的ＤＮＡに必要な変異のみを導入することを可能とする方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、植物細胞において、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみを標的ＤＮＡに導入することを可能とするため、図１に示す系を構想した。
【００１２】
すなわち先ず、図１の第１工程に示すように、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃが挿入され、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入することによって、相同組換えを生じさせる。
【００１３】
そして、前記マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を選抜する。
【００１４】
さらに、図１の第２工程に示すように、このようにして選抜された細胞に、トランスポゼースを恒常的に発現させることにより、前記相同組換えにより挿入されたマーカー遺伝子を、標的ＤＮＡからｐｉｇｇｙＢａｃごと除去する。この構想によれば、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する変異植物体を作製することが可能となる。
【００１５】
そこで、図１に示す系を実際に構築し、その有効性を検証した。その結果、植物細胞において、相同組換えによりゲノムＤＮＡ内に挿入された不要な配列（マーカー遺伝子）をｐｉｇｇｙＢａｃの利用により痕跡残すことなく除去できることが初めて明らかになった。しかも、その効率は９０％以上であり、哺乳動物におけるそれや植物細胞においてランダムにゲノムＤＮＡ内に挿入されたｐｉｇｇｙＢａｃを除去する効率（非特許文献１〜５  参照）と比して、顕著に高いものであった。さらに、これら文献において開示されている従前の系においては、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースにより切り出されたｐｉｇｇｙＢａｃがゲノムＤＮＡに再挿入される率は、哺乳動物の系においては約７０％、従前の植物の系においては約４０％と高いのに対して、驚くべきことに、図１に示す系におけるそれは１％と極めて低いものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
したがって、本発明は、標的ＤＮＡのみならず、該ＤＮＡ以外の領域においても、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみが標的ＤＮＡに導入された植物細胞の製造方法、該方法により製造された植物細胞、並びに該製造方法に用いるためのキット等に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法
（ｉ）標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（ｉｉ）前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させ、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを前記標的ＤＮＡより除去する工程。
（２）  標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物が導入されることにより、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞。
（３）  （１）に記載の方法により製造された、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞。
（４）  （２）又は（３）に記載の細胞を含む植物体。
（５）  （４）に記載の植物体の子孫又はクローンである植物体。
（６）  （４）又は（５）に記載の植物体の繁殖材料。
（７）  標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物。
（８）  （１）に記載の方法に用いるための、下記（ａ）及び（ｂ）を含むキット
（ａ）（７）に記載のＤＮＡ構築物
（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを植物細胞内で恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、植物細胞において、相同組換えによりゲノムＤＮＡ内に挿入された不要な配列を、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンごと痕跡残すことなく除去できる。しかも、その効率は９０％以上と顕著に高く、さらにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースにより切り出されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンがゲノムＤＮＡに再挿入される率は１％と極めて低い。したがって、本発明によれば、植物細胞において、標的ＤＮＡのみならず、該ＤＮＡ以外の領域にも、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、必要な変異のみを標的ＤＮＡに導入することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法を示す概略図である。図中、ＧＴベクター上の双方向の矢印はマーカー遺伝子（ポジティブ選抜マーカー遺伝子）を示し、ＧＴベクター上の対になっている矢印はネガティブ選抜マーカー遺伝子を示す。星印は、標的ＤＮＡに導入される所望の変異部位を示す。ＰＢａｓｅと付された矢印は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするＤＮＡを示す。また、ＰＢａｓｅと付された矢印の両側と、ＧＴベクター上の対になっている矢印の両側とに付されている黒い棒は、ＧＴベクター及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするＤＮＡを植物細胞にアグロバクテリウムを介して導入する際に利用される、右側境界配列（ＲＢ）及び左側境界配列（ＬＢ）を示す。
【図２】イネ由来のＡＬＳ遺伝子（ＯｓＡＬＳ）を標的とし、本発明の標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法の有効性を検証するためのスキームを示す概略図である。
【図３】イネ由来のＡＬＳ遺伝子座と、ＧＴベクターと、該ベクターとの相同組換え及びその後のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの除去により所望の点変異２点のみ（Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）が導入されたＡＬＳ遺伝子座とを各々、制限酵素ＭｆｅＩを用いたＣＡＰＳ（切断増幅多型配列）法により分析した際に、検出されることが予想される断片及びその長さを示す、概略図である。
【図４】イネ由来のＡＬＳ遺伝子座と、ＧＴベクターと、該ベクターとの相同組換え及びその後のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの除去により所望の点変異２点のみ（Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）が導入されたＡＬＳ遺伝子座とを各々、制限酵素ＭｆｅＩを用いたサザンブロット法により分析した際に、検出されることが予想される断片及びその長さを示す、概略図である。また、サザンブロット分析に用いたプローブ（ｐｒｏｂｅ）１〜３がアニールする各ＤＮＡ上の位置も付記する。
【図５】野生型イネ（図中「Ｗｔ」）、ＧＴベクターを導入したイネ（ＧＴ系統Ａ、図中「ＧＴ  ｌｉｎｅ  Ａ」、及びさらにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させたＧＴ系統Ａ（ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ：６及び１０の各２個体、図中「ＧＴ  ｌｉｎｅ  Ａ＿ｈｙ  ６  １」、「ＧＴ  ｌｉｎｅ  Ａ＿ｈｙ  ６  ２」、「ＧＴ  ｌｉｎｅ  Ａ＿ｈｙ  １０  １」、「ＧＴ  ｌｉｎｅ  Ａ＿ｈｙ  １０  ２」）から抽出したゲノムＤＮＡを、図４に示すプローブ１を用いたサザンブロット法により分析した結果を示す写真である。また、図中「Ｍ」はサイズマーカーを示す。なお、図中の表記は、以下の図６及び７において同じである。
【図６】野生型イネ、ＧＴ系統Ａ、並びにＧＴ系統Ａ＿ｈｙ：６及び１０の各２個体から抽出したゲノムＤＮＡを、図４に示すプローブ３を用いたサザンブロット法により分析した結果を示す写真である。
【図７】野生型イネ、ＧＴ系統Ａ、並びにＧＴ系統Ａ＿ｈｙ：６及び１０の各２個体から抽出したゲノムＤＮＡを、マーカー遺伝子ｈｐｔに特異的なプローブを用いたサザンブロット法により分析した結果を示す写真である。
【図８】イネ由来のｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ  １遺伝子（Ｏｓｃｌｙ１）中のｍｉＲＮＡ結合部位（標的サイト）を標的とし、本発明の標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法の有効性を確認するためのスキームを示す概略図である。すなわち、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座（図中、一番上）と、ＧＴベクター（図中、上から２番目）と、該ベクターとの相同組換え（図中、上から３番目）及びその後のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの除去により所望の変異が導入されたＯｓｃｌｙ１遺伝子座（図中、上から４番目）とを各々、制限酵素ＥｃｏＲＶによって処理し、サザンブロット法により分析した際に、検出されることが予想される断片及びその長さを示す、概略図である。また、サザンブロット分析に用いたプローブ（ｐｒｏｂｅ）１〜３がアニールする各ＤＮＡ上の位置も付記する。
【図９】野生型イネ（図中「ｗｔ」）、ＧＴベクターを導入したイネ（図中、「ｃｌｙ１  ＧＴ−１」及び「ｃｌｙ１  ＧＴ−２」）、並びにさらにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させたイネ（図中、「ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ  ２９−１」、「ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ  ２９−２」、「ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ  ３８−１」、「ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ  ３８−２」、「ｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙ  ３６−１」及び「ｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙ  ３６−２」）から抽出したゲノムＤＮＡを、図８に示すプローブ１〜３各々を用いたサザンブロット法により分析した結果を示す写真である。また、図中の左端のレーンはサイズマーカーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜植物細胞の製造方法＞
本発明の植物細胞の製造方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法である
（ｉ）標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する工程、
（ｉｉ）前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させ、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを前記標的ＤＮＡより除去する工程。
【００２０】
そして、かかる方法によって、後述の実施例において示す通り、植物細胞において、標的ＤＮＡに、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく必要な変異のみを導入することを可能となる。
【００２１】
工程（ｉ）において、標的ＤＮＡに変異を導入するために植物細胞に導入される「ＤＮＡ構築物」は、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物である。
【００２２】
本発明において「標的ＤＮＡ」とは、変異導入の対象となるゲノム上のＤＮＡを意味する。標的ＤＮＡは、植物細胞のゲノムＤＮＡから任意に選択することができ、またタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、機能性ＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡであってもよい。さらに、標的ＤＮＡには、タンパク質やノンコーディングＲＮＡをコードしていない領域（ＵＴＲ等）のみならず、タンパク質をコードする転写産物やノンコーディングＲＮＡの発現を調節する領域も含まれる。また、標的ＤＮＡは、通常内因性のものであるが、植物細胞のゲノムＤＮＡに外来的に挿入されているＤＮＡであってもよい。
【００２３】
標的ＤＮＡに導入される「変異」としては、特に制限はなく、ナンセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異又はスプライス部位変異等のヌル変異であってもよく、サイレント変異であってもよい。また、標的ＤＮＡにおける変異としては、例えば、該ＤＮＡにおける、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、付加及び／又は挿入が挙げられる。さらに、標的ＤＮＡにおける変異の個数としても、特に制限はなく、１個でもよく、また複数個でもよい。
【００２４】
「標的ＤＮＡと相同なＤＮＡ」とは、前述のゲノム上の標的ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを意味し、本発明のＤＮＡ構築物においては、後述のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの両端に付加されている。
【００２５】
また、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡのヌクレオチド数としては、該相同ＤＮＡと標的ＤＮＡとの間で相同組換えが生じ得る数であればよく、通常、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの両側には各々、５００〜７０００ヌクレオチド（好ましくは１０００〜５０００ヌクレオチド、より好ましくは２０００〜４０００ヌクレオチド、さらに好ましくは約３０００ヌクレオチド（例えば、２５００〜３５００ヌクレオチド））からなる標的ＤＮＡと相同なＤＮＡが付加される。
【００２６】
本発明において、「ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン」は、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ）という蛾に由来し、後述のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースによりゲノムＤＮＡから切り出されるＤＮＡのことである。すなわち、該トランスポゼースが特異的に認識するｐｉｇｇｙＢａｃ逆向き反復転移因子（ＩＶＲ）を両端に配置するＤＮＡのことである。ＩＶＲとしては、その一方又は他方が、例えば、配列番号：１（ｃｃｃｔａｇａａａｇａｔａ）、配列番号：２（ｃｃｃｔａｇａａａｇａｔａｇｔｃｔｇｃｇｔａａａａｔｔｇａｃｇｃａｔｇ）、配列番号：３（ｃｃｃｔａｇａａａｇａｔａａｔｃａｔａｔｔｇｔｇａｃｇｔａｃｇｔｔａａａｇａｔａａｔｃａｔｇｃｇｔａａａａｔｔｇａｃｇｃａｔｇ）、配列番号：４（ｃａｔｇｃｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｇｃａｔｇａｔｔａｔｃｔｔｔａａｃｇｔａｃｇｔｃａｃａａｔａｔｇａｔｔａｔｃｔｔｔｃｔａｇｇｇ）又は配列番号：５（ｃａｔｇｃｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｇｃａｇａｃｔａｔｃｔｔｔｃｔａｇｇｇ）に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、前記トランスポゼースが特異的に認識され得る限り、該ヌクレオチド配列と高い相同性を示す配列からなるＤＮＡも、ＩＶＲとして本発明において利用することができる。
【００２７】
また、ＩＶＲ間の距離としては、相同組換えが生じ、さらにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースにより切り出され得るヌクレオチド数であればよく、後述の挿入されるマーカー遺伝子等のヌクレオチド数にも依るものでもあるが、通常１〜１００００ヌクレオチド以内である。
【００２８】
また、本発明の「ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン」には、相同組換えによって標的ＤＮＡが導入された植物細胞を、その発現を指標として選択するためのマーカー遺伝子が含まれている。すなわち、該マーカー遺伝子の両端には前記ＩＶＲが付加されている。
【００２９】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに含まれる「マーカー遺伝子」は、その発現が標的ＤＮＡが導入された少数の形質転換細胞を大多数の非形質転換細胞の中から効率良く選択するための指標となるものであればよく、例えば、導入された細胞の増殖に必須なタンパク質又は該増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子（いわゆる、薬剤耐性遺伝子等のポジティブ選抜マーカー遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＤｓＲｅｄ遺伝子等のレポーター遺伝子が挙げられるが、マーカー遺伝子の発現を検出するために煩雑な操作（例えば、ＦＡＣＳによるスクリーニング）を必要としないという観点から、薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｈｐｔ）、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ＡＬＳ（ＡＨＡＳ）遺伝子やＰＰＯ遺伝子等の除草剤耐性遺伝子が挙げられるが、これらの中では、イネカルスを用いた形質転換においては、その選抜効率が高いという観点から、ハイグロマイシン耐性遺伝子が好ましい。
【００３０】
また、本発明のＤＮＡ構築物においては、前記マーカー遺伝子に、導入された植物細胞において該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための制御領域が作動可能に連結されている。
【００３１】
該タンパク質を恒常的に発現させる場合には、制御領域として、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来のポリユビキチン１プロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、イネ由来の伸長因子１αプロモーター等のプロモーターと、該プロモーター等により誘導された遺伝子の転写を終結するためのターミネーター配列（イネ由来の熱ショックタンパク質１７．３ターミネーター、イネ由来の熱ショックタンパク質１６．９ａターミネーター、イネ由来のアクチンターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター等）が挙げられる。さらに、遺伝子の発現効率を高めるために、ＣａＭＶ  ３５Ｓエンハンサー、転写エンハンサーＥ１２、オメガ配列等のエンハンサー等のエンハンサーも、前記制御領域には含まれていてもよい。
【００３２】
また、タンパク質を誘導的に発現させる場合には、例えば、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、イネｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター、イネｈｓｐ８０遺伝子及びｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター、シロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子プロモーター、パセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、テトラサイクリン、エストラジオール、デキサメタゾン等の薬剤に応答して発現を誘導するプロモーター等の、刺激に応答して発現を誘導するプロモーターが好適に用いられる。
【００３３】
また、前記マーカー遺伝子の他、本発明のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンにおいては、前記ＩＶＲの間に配置されている限り、他のＤＮＡが挿入されていてもよい。かかる他のＤＮＡとしては特に制限はないが、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入された標的ＤＮＡがコードするタンパク質等を不活性化するという観点から、ターミネーターが挙げられる。また、前記ＤＮＡ構築物を導入した後に、標的ＤＮＡからｐｉｇｇｙＢａｃを除去させるためにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを発現させるベクターを再度導入する工程を省略できるという観点から、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを誘導的に発現させることが可能なＤＮＡ構築物（発現カセット）が挙げられる。
【００３４】
本発明の「ＤＮＡ構築物」において、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡの両端に、導入された細胞の増殖を阻害するタンパク質又は該増殖を抑制するタンパク質をコードする遺伝子（いわゆる、ネガティブ選抜マーカー遺伝子）が付加されていてもよい（図１の「ＧＴベクター」参照）。
【００３５】
「ネガティブ選抜マーカー遺伝子」としては、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子、エクソトキシンＡ遺伝子、リシントキシンＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子、ＲＮａｓｅ  Ｔ１遺伝子、バルナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらの中では、イネカルス等に関しては、高いネガティブ選抜効率と、細胞間移行能がないために周囲の細胞に悪影響を及ぼさないという観点から、ＤＴ−Ａ遺伝子が好ましい。また、ネガティブ選抜マーカー遺伝子には、前述のマーカー遺伝子同様、本発明のＤＮＡ構築物においては、導入された植物細胞において該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための制御領域が作動可能に連結されている。
【００３６】
そして、このようなネガティブ選抜マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を植物細胞に導入した際に、ＤＮＡ構築物の一部（標的ＤＮＡと相同なＤＮＡ）が相同組換えにより標的ＤＮＡに組み込まれれば、ネガティブ選抜マーカー遺伝子は該相同ＤＮＡの外側にあるため、該細胞のゲノムＤＮＡに挿入されることはない。そのため、植物細胞は該遺伝子の影響を受けることなく増殖することができる。一方、ＤＮＡ構築物が植物細胞のゲノムＤＮＡにランダムに挿入された際には、ネガティブ選抜マーカー遺伝子も挿入されうるため、ランダム挿入が生じた植物細胞の増殖は抑制又は阻害されうる。したがって、ネガティブ選抜マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を植物細胞に導入することにより、ランダム挿入は生じず、相同組換えにより、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞を効率よく選択することができる。
【００３７】
以上、本発明の「ＤＮＡ構築物」について説明したが、本発明の製造方法の工程（ｉ）において、かかるＤＮＡ構築物を植物細胞に導入する方法としては特に制限はなく、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００３８】
次に、本発明の製造方法の工程（ｉｉ）においては、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する。
【００３９】
かかる「選択」は、当業者であれば用いるマーカー遺伝子の種類に合わせて適宜公知の手法により選択して行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、工程（ｉ）において本発明のＤＮＡ構築物を導入した植物細胞を、対応する薬剤存在下にて培養することにより、標的ＤＮＡに変異等が導入された植物細胞を選択することができる。ＧＦＰ遺伝子等のレポーター遺伝子を用いた場合には、工程（ｉ）において本発明のＤＮＡ構築物を導入した植物細胞をＦＡＣＳ等にかけることにより、標的ＤＮＡに変異等が導入された植物細胞を選択することができる。
【００４０】
また、該工程においては、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する他、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入されたことを、後述の実施例において示す通り、ＰＣＲ法、シークエンシング法、サザンブロット法、ＣＡＰＳ（切断増幅多型配列）法等により確認してもよい。
【００４１】
次に、本発明の製造方法の工程（ｉｉｉ）においては、前述の工程（ｉｉ）にて選択された細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させ、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを前記標的ＤＮＡより除去する。
【００４２】
本発明における「ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース」は、植物細胞において、前述のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンをゲノムＤＮＡより除去する活性を有するものであればよく、例えば、イラクサギンウワバに由来する野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース（典型的には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８７３７５で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質）が挙げられる。
【００４３】
また、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。したがって、このような変異体も、前記除去する活性を有する限り、本発明に含まれる。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースの変異体としては、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８７３７５で特定されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「複数」とは、通常、１２０アミノ酸以内、１００アミノ酸以内、８０アミノ酸以内、６０アミノ酸以内、４０アミノ酸以内、２０アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００４４】
このような変異体としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＦＮ８９７８５、ＡＢＳ１２１１２、ＡＢＣ８８６８０、ＡＢＣ８８６７８、ＡＢＣ８８６７７、ＡＢＣ８８６７５、ＡＢＣ８８６７１又はＡＡＥ６８０９８にて特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００４５】
また、「Ｙｕｓａ  Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、２０１１年１月、１０８巻、４号、１５３１〜１５３６ページ」の記載によれば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ８７３７５で特定されるアミノ酸配列において、Ｇ２Ｃ、Ｑ４０Ｒ、Ｉ３０Ｖ、Ｇ１６５Ｓ、Ｔ４３Ａ、Ｓ６１Ｒ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０３Ｔ、Ｍ１９４Ｖ、Ｒ２８１Ｇ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ３１６Ｅ、Ｉ４２６Ｖ、Ｑ４９７Ｌ、Ｎ５０５Ｄ、Ｑ５７３Ｌ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５７１Ｓ（又はＮ５７０Ｓ）、Ｎ５３８Ｋ、Ｑ５９１Ｐ、Ｑ５９１Ｒ及びＦ５９４Ｌから選択される少なくとも１のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列からなるタンパク質は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンをゲノムＤＮＡより除去する活性が野生型のそれよりも向上されていることが明らかになっている。
【００４６】
したがって、本発明においても、これら少なくとも１のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列からなるタンパク質が好適に用いられ、Ｉ３０Ｖ、Ｓ１０３Ｐ、Ｇ１６５Ｓ、Ｍ２８２Ｖ、Ｓ５０９Ｇ、Ｎ５７１Ｓ（又はＮ５７０Ｓ）及びＮ５３８Ｋが導入されているアミノ酸配列からなるタンパク質（後述の実施例において示される、ｈｙＰＢａｓｅ、配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）が、より好適に用いられる。
【００４７】
また、本発明において「ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース」には、機能性タンパク質が付加していてもよい。機能性タンパク質は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側に、直接的に又は間接的に付加させることができる。機能性タンパク質としては特に制限はなく、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、該タンパク質の検出等をし易くするという観点から、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。また、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを安定的に核内において機能させるという観点から、核内移行シグナルが付加されていてもよい。
【００４８】
工程（ｉｉｉ）において、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させる方法としては、特に制限はないが、例えば、該トランスポゼースをコードする遺伝子を含み、該遺伝子を恒常的に発現させるための制御領域を備えたＤＮＡ構築物を、工程（ｉｉ）にて選択された細胞に導入する方法が挙げられる。さらに、導入された該ＤＮＡ構築物は、恒常かつ安定的にｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを発現させるという観点から、植物細胞のゲノムＤＮＡに挿入されていることが好ましい。
【００４９】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを「恒常的に発現させるための制御領域」としては、上述の「本発明のＤＮＡ構築物」の説明の際に列挙した「恒常的に発現させる場合の制御領域」を用いることができるが、それらの中でも、プロモーターに関しては、あらゆる組織で発現量が高く、特にカルスのような分裂細胞において発現量が高いという観点から、トウモロコシ由来のポリユビキチン１プロモーターが好ましい。
【００５０】
また、工程（ｉｉｉ）において、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させる別の態様としては、例えば、該トランスポゼースをコードする遺伝子を含み、該遺伝子を誘導的に発現させるための制御領域を備えたＤＮＡ構築物を、導入した植物細胞を発現誘導の条件である刺激の存在下にて培養する方法が挙げられる。
【００５１】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを誘導的に発現させるための当該ＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入する時期としては、工程（ｉ）において、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含む前述のＤＮＡ構築物の導入と同時であってもよく、それよりも前であってもよい。さらには、工程（ｉｉ）において、前記マーカー遺伝子の発現を指標とする選択の前であってもよく、その選択の後であってもよい。
【００５２】
また、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを「誘導的に発現させるための制御領域」としては、上述の「本発明のＤＮＡ構築物」の説明の際に列挙した「誘導的に発現させる場合の制御領域」を用いることができる。
【００５３】
さらに、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物（ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを誘導的に発現させるための前記ＤＮＡ構築物も含まれる、以下同じ）には、該ＤＮＡ構築物が導入された植物細胞を効率よく選択できるという観点から、前述のレポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等が含まれていてもよい。
【００５４】
さらに、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物を植物細胞に導入する方法としては特に制限はなく、アグロバクテリウムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００５５】
そして、このようにして、工程（ｉｉ）にて選択された細胞にｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させることにより、後述の実施例において示す通り、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンごとマーカー遺伝子を除去することにより、標的ＤＮＡに所望の変異のみが導入されている植物細胞を、極めて高い頻度（９２〜９９％）にて得ることができる。さらに、このようにして除去されたｐｉｇｇｙＢａｃのゲノムＤＮＡの再挿入率は１％と極めて低いため、本発明においては、再挿入が生じている細胞を除外するための工程（ネガティブ選抜等）が不要である。
【００５６】
＜植物細胞＞
前述の通り、本発明の製造方法によれば、標的ＤＮＡに所望の変異のみが導入されている植物細胞を、極めて高い頻度（９２〜９９％）にて得ることができる。したがって、本発明は、前記製造方法により製造された、標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞を提供するものである。
【００５７】
また、後述の実施例において示す通り、相同組換えによりｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが標的ＤＮＡ内に挿入された植物細胞は、本発明において初めて作製されたものであり、前述の通り、標的ＤＮＡに所望の変異のみが導入された植物細胞を作製する上で有用である。したがって、本発明は、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入され、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物が導入されることにより、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞をも提供するものである。
【００５８】
本発明において「植物」とは特に制限はなく、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等の単子葉植物や、タバコ、ジャガイモ、ナス、ナタネ等の双子葉植物が挙げられる。また、「植物細胞」には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【００５９】
＜植物体等＞
本発明の植物細胞は、再生させることにより植物体を得ることができる。特に、本発明の製造方法により製造された植物細胞は、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有しているため、このような植物細胞から再生させた植物体は、当該変異に伴い、表現型が変化しうる。したがって、本発明の方法を利用すれば、植物の育種を効率的に行うことが可能であり、また標的ＤＮＡの機能を効率よく分析することが可能となる。
【００６０】
植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、アラビドプシスであればＡｋａｍａら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：  ７−１１，  １９９２）に記載の方法が挙げられ、イネであればＤａｔｔａ（Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）ｐｐ６６−７４，１９９５）に記載された方法、Ｔｏｋｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３−１５０７，１９９２）に記載された方法、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２，１９９１）に記載された方法及びＨｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２，１９９４）に記載された方法が挙げられ、オオムギであれば、Ｔｉｎｇａｙら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１３６９−１３７６，１９９７）に記載された方法、Ｍｕｒｒａｙら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２２：３９７−４０２，２００４）に記載された方法、及びＴｒａｖａｌｌａら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２３：７８０−７８９，２００５）に記載された方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：５８１，１９８９）に記載された方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３，１９９０）に記載された方法が挙げられ、トマトであればＭａｔｓｕｋｕｒａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４：１８３７−１８４５，１９９３）に記載された方法が挙げられ、ダイズであれば、特許公報（米国特許第５，４１６，０１１号）に記載された方法が挙げられ、ジャガイモであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，７８：５９４，１９８９）に記載された方法が挙げられ、タバコであればＮａｇａｔａとＴａｋｅｂｅ（Ｐｌａｎｔａ，９９：１２，１９７１）に記載された方法が挙げられる。ここに挙げた以外の植物についても、例えば、田部井豊編「形質転換プロトコール植物編」（（株）化学同人発行）に記載された方法を用いることによって、当業者であれば植物体への再生が可能である。
【００６１】
一旦、このようにして標的ＤＮＡに変異が導入された細胞を含む植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって、本発明には、本発明の植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。
【００６２】
また、本発明の製造方法において製造された植物細胞の標的ＤＮＡにおいては、所望の変異のみが導入されているが、該細胞においては外来的に導入されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするＤＮＡが残存することとなる。しかしながら、本発明の製造方法において製造された植物細胞を含む植物体と、野生型のそれとを交配させ、戻し交配を行うことにより、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするＤＮＡをも除去することができる。
【００６３】
また、本発明は、本発明の植物細胞、植物体、繁殖材料から製造される加工物をも提供する。本発明における加工物としては特に制限はなく、従来より植物から作られている加工物全般のことであり、例えば、植物体からの抽出液、植物体の乾燥粉末、加工食品が挙げられる。より具体的には、イネであれば米飯及び煎餅等、小麦であればパン及び麺類等、トウモロコシであればコーン油、コーンスターチ及びコーンチップス等、ダイズであれば大豆油、豆腐及び納豆等、ジャガイモであればポテトチップス及びデンプン等、トマトであればケッチャップ等、キャノーラであればキャノーラ油等が挙げられる。
【００６４】
＜キット等＞
前述の通り、本発明のＤＮＡ構築物は、本発明の製造方法において有用であり、その有効性も本発明において初めて示されたものである。したがって、本発明は、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物をも提供するものである。
【００６５】
また、前述の通り、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを植物細胞内で恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物も本発明の製造方法において有用である。したがって、本発明は、本発明の製造方法に用いるための、下記（ａ）及び（ｂ）を含むキットをも提供するものである。
（ａ）標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物
（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを植物細胞内で恒常的に発現させるためのＤＮＡ構築物。
【００６６】
これらＤＮＡ構築物については各々、上述の本発明の製造方法における工程（ｉ）及び（ｉｉｉ）についての記載の通りであるが、これらの形態は１本鎖ＤＮＡであってもよく、２本鎖ＤＮＡであってもよい。また、直鎖状ＤＮＡであってもよく、環状ＤＮＡであってもよく、前述の植物細胞への導入方法に適した形態に調製し得る。
【００６７】
例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に導入する場合には、前記ＤＮＡ構築物の形態として、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系又はｐＳＭＡ系のベクター等が挙げられ、また、より好適な形態として、バイナリーベクター系のベクター（ｐＺＨＧ、ｐＫＯＤ４、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＧ２１１３等）が挙げられる。
【００６８】
また、電気穿孔法等の他の方法により植物細胞に導入する場合には、前記ＤＮＡ構築物の形態として、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等のｐＵＣ系ベクターが挙げられる。さらに、ＣａＭＶ、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターの形態も、前記ＤＮＡ構築物はとり得る。
【００６９】
また、このようなＤＮＡ構築物は、後述の実施例において示す通り、ＰＣＲ法、制限酵素処理、クローニング法等の公知の遺伝子組み換え技術を利用して当業者であれば適宜調製することができる、また、市販の自動化ＤＮＡ配列合成装置等を用いて化学的に合成することもできる。
【００７０】
さらに、（ａ）に記載のＤＮＡ構築物の作製において、当業者であれば部位特異的変異誘発法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２に記載の方法）等により、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡに、所望の変異を導入することができる。
【００７１】
また、前述の通り、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースは蛾に由来するタンパク質である。そのため、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを植物細胞内に高発現させるという観点から、（ｂ）に記載のＤＮＡ構築物には、該ＤＮＡ構築物を導入する植物のコドン使用頻度に最適化したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするＤＮＡが挿入されていてもよい。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
本発明者らは従前、２つのアミノ酸変換を生じさせる２つの点変異を、ジーンターゲティング（ＧＴ）を介して、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子座に導入することによって、除草剤ビスピリバックナトリウム（ＢＳ）耐性イネの植物体を創出することに成功している（Ｅｎｄｏ  Ｍ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００７年、５２巻、１５７〜１６６ページ  参照）。
【００７４】
なお、ＡＬＳ遺伝子における２つの点変異とは、５４８番目のトリプトファンをコードするＴＧＧを、ロイシンをコードするＴＴＧに変化させる変異（Ｗ５４８Ｌ）と、６２７番目のセリンをコードするＡＧＴを、イソロイシンをコードするＡＴＴに変化させる変異（Ｓ６２７Ｉ）とのことである。また、これら点変異を導入するためのＧＴは滅多に生じないものの、ＢＳ含有培地にて培養することにより、ＧＴが生じた細胞を容易に選択することができた。
【００７５】
しかしながら、このような選抜は、大概の標的ＤＮＡへの変異導入においては行うことはできない。そこで、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する変異植物体を作製するための、普遍的な戦略を確立するため、図１に示すような系を構想した。
【００７６】
すなわち先ず、図１の第１工程に示すように、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子（ポジティブ選択マーカー遺伝子）を含むｐｉｇｇｙＢａｃが挿入されており、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物を、植物細胞に導入することによって、相同組換えを生じさせる。
【００７７】
なお、この際、前記相同ＤＮＡの外側にネガティブ選択マーカー遺伝子を配することにより、前記ＤＮＡ構築物が、標的ＤＮＡ以外の領域にランダムに挿入された細胞は排除されることとなる。
【００７８】
また、前記ポジティブ選択マーカー遺伝子の発現を指標としたスクリーニングを行うことにより、前記変異及び前記ｐｉｇｇｙＢａｃが相同組換えによって標的ＤＮＡに導入された植物細胞を選抜する。
【００７９】
そして、図１の第２工程に示すように、このようにして選抜された細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを恒常的に発現させることにより、前記相同組換えにより挿入されたポジティブ選択マーカー遺伝子を、標的ＤＮＡからｐｉｇｇｙＢａｃごと除去することができれば、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する変異植物体を作製することが可能となる。
【００８０】
そこで、以下に示す方法にて、図１に示す系を構築し、その有効性を検証した。なお、本実施例においては、標的ＤＮＡ及び該ＤＮＡに導入する変異として、前述のイネＡＬＳ遺伝子、並びに２点の点変異（Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ）を選択した。また、ポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子として、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）及びジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ−Ａ）を各々用いた。
【００８１】
（実施例１）
＜ＧＴベクターの構築＞
標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する変異植物体を作製するため、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入され、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物（ＧＴベクター）を以下のようにして構築した。
【００８２】
先ず、前記「Ｅｎｄｏ  Ｍ．ら、２００７年」に記載のＴ−ＤＮＡを、ＨｐａＩ及びＥｃｏＲＩにて処理することにより、前記点変異２点を保持しているＡＬＳ遺伝子を含む９．４ｋｂ長の断片を切り出し、ｐＥＮＴＲ  Ｌ１／Ｌ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のＳｎａＢＩ認識部位及びＥｃｏＲＩ認識部位に組み込んだ。
【００８３】
次に、メガヌクレアーゼＩ−ＳｅｃＩの認識部位を含む、ｐｉｇｇｙＢａｃ逆向き反復転移因子（ＩＶＲ）を、前記ＡＬＳ遺伝子内のＨｐａＩ認識部位に導入し、クローニングすることにより、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）ｍＡＬＳｐｂを調製した。Ｉ−ＳｅｃＩの認識部位を含むＩＶＲについては、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ−Ｙｏｋｏｉ  Ａ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１４年２月、７７巻、３号、４５４〜４６３ページ（２０１３年１２月９日オンライン公開）参照のこと。また、前記ＡＬＳ遺伝子内へのＨｐａＩ認識部位の導入は、下記プライマーセットを用いたエクスプレッション−ＰＣＲ（Ｅ−ＰＣＲ）にて行った（Ｌａｎａｒ  ＤＥ.及びＫａｉｎ  ＫＣ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．、１９９４年１０月、４巻、２号、Ｓ９２−９６  参照）。
５’−ｔｇｃｔｇｇａｔｇａｇｔｔａａｃｇａａａｇｇｔｇａｇｇ−３’（配列番号：８）及び
５’−ｃｃｔｃａｃｃｔｔｔｃｇｔｔａａｃｔｃａｔｃｃａｇｃａ−３’（配列番号：９）。
【００８４】
次に、イネ由来のアクチンターミネーター、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）及びイネ由来の熱ショックタンパク質１７．３ターミネーターを含有する、４．３ｋｂ長断片を、Ｉ−ＳｃｅＩにて消化し、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）ｍＡＬＳに挿入し、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）ｍＡＬＳｐＨＰＴｂを調製した。
【００８５】
次に、ｍＡＬＳｐＨＰＴｂに含まれている１１．３ｋｂ長断片をゲートウェイＬＲクロナーゼＩＩ反応（登録商標、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）発現カセット２つを含むジーンターゲッティングバイナリーベクターｐＫＯＤ４に導入して再クローニングし、ｐＫＯＤ４／ｍＡＬＳを調製した。ｐＫＯＤ４は、ｐＺＨＧに由来するベクターである。ｐＺＨＧについては、Ｏｓａｋａｂｅ  Ｋ．ら、「イネにおけるジーンターゲッティングのための高効率ネガティブ選抜マーカーとしての、シトシンデアミナーゼ変異遺伝子  ｃｏｄＡ（Ｄ３１４Ａ）（Ａ  Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ，ｃｏｄＡ（Ｄ３１４Ａ），ａｓ  ａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｒｉｃｅ」、Ｐｌａｎｔ＆Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１４年１月２２日オンライン公開  参照のこと。ＤＴ−Ａ発現カセットとしては、「トウモロコシ由来のポリユビキチン１プロモーター＋ＤＴ−Ａ＋イネ由来の熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）１６．９ａターミネーター」と、「イネ由来の伸長因子１αプロモーター＋ＤＴ−Ａ＋イネ由来のｈｓｐ１６．９ａターミネーター」とを用いた（Ｔｅｒａｄａ  Ｒ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年、２０巻、１０３０〜１０３４ページ  参照）。
【００８６】
このようにして構築されたＧＴベクター  ｐＫＯＤ４／ｍＡＬＳは、ネガティブ選択マーカー遺伝子であるＤＴ−Ａ遺伝子を発現させるためのカセットと、ＡＬＳコーディング領域とを含む６．４−ｋｂ長の断片を保持している。また、前述の通り、該ＡＬＳコーディング領域には、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉにて特定される変異の他、Ｗ５４８Ｌの３０１ｂｐ上流にＨｐａＩ認識部位を導入するためのサイレントな変異（ＧＣＴＧＡＣからＧＡＡＴＴＣへの変更）も導入されている。なお、該サイレントな変異は、イネ由来のアクチンターミネーターと、ポジティブ選択マーカー遺伝子であるｈｐｔ遺伝子を発現させるためのカセットを保持するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとを挿入するために、導入されたものである。また、このＧＴベクターとの相同組換えを生じたＡＬＳ遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子発現カセットの挿入により分断され、不活化されることとなる。
【００８７】
（実施例２）
次に、前記ＧＴベクターを用い、以下に示す方法にて、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する植物体の作製を試みた。
【００８８】
すなわち先ず、前記ＧＴベクター（ｐＫＯＤ４／ｍＡＬＳベクター）を、アグロバクテリウム  ツメファシエンス株  ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ  Ｅ.ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３年、２巻、４号、２０８〜２１８ページ  参照）に、電気穿孔法にて導入した。
【００８９】
次に、得られたアグロバクテリウムによるイネカルス（日本晴由来の４週齢のカルス）の形質転換は、「Ｔｏｋｉ  Ｓ.ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６年、４７巻、９６９〜９７６ページ」に記載の方法に沿って行った。
【００９０】
そして、「Ｓａｉｋａ  Ｈ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１１年、１５６巻、１２６９〜１２７７ページ」に記載の方法に沿って、イネにＧＴ形質転換を施した。すなわち、前述のｐＫＯＤ４／ｍＡＬＳを保持するアグロバクテリウムにより形質転換したイネカルスを、カルス誘導用培地上にて４週間培養することにより選択した。なお、該培地として、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン及び２５ｍｇ／Ｌ  メロペネム（共に、和光純薬工業株式会社製）を含有し、０．４％ゲルライト（登録商標、和光純薬工業株式会社製）にて固化したＮ６Ｄ培地を用いた。また、その結果、表１に示す通り、３２５９のカルスから、独立した１００のハイグロマシン耐性カルスを選抜することができた。
【００９１】
【表１】
2015171358.tif 000002
【００９２】
さらに、ＡＬＳ遺伝子座にてＧＴイベントが生じたトランスジェニックカルスを同定するため、得られたハイグロマシン耐性カルスを、以下に示すＰＣＲ及びシークエンシング分析によるスクリーニングに供した。
【００９３】
＜ＰＣＲ＞
イネカルスの小塊からゲノムＤＮＡを、アジェンコート  クロロピュア（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用い、添付のメーカープロトコールに従って抽出した。そして、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ＦＸ又はＫＯＤ  ＦＸネオ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と、以下に示すプライマーセットを用い、ＰＣＲ増幅を行った（ＡＬＳ遺伝子座とプライマーのアニーリング位置については、図２参照）。
ＡＬＳ遺伝子  ５’増幅用プライマーセット
ＡＬＳ  ＧＴ−Ｆ（５’−ｇａｃａｔｇａｃａａｃｃａｇｔｃａｔｃｃｇａｔｔａｇｇｔｔｔ−３’（配列番号：１０））及びＴａｃｔ−Ｒ（５’−ｃｔｇａｃｇａｔｇａｇａａｔａｔａｔｃｔｇａｔｇｃｔｇｔｇａ−３’（配列番号：１１））
ＡＬＳ遺伝子  ３’増幅用プライマーセット
Ｔｈｓｐ１７．３−Ｆ（５’−ａｃａｔａｃｃｃａｔｃｃａａｃａａｔｇｔｔｃａａｔｃｃｃｔｔ−３’（配列番号：１２））及びＡＬＳ  ＧＴ−Ｒ（５’−ｔｃｔｇｇａｇａｔａｇｃａｔａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔｇｇｔ−３’（配列番号：１３））。
【００９４】
そして、このＰＣＲの結果、表１に示す通り、独立した６のカルスにおいて、ジャンクション断片の上流及び下流を検出することができ、これらカルスにおいて、ＧＴベクターと標的ＤＮＡとの間にて相同組換えが生じ、ＡＬＳ遺伝子座にポジティブ選択マーカー遺伝子が導入されていることが確認された。
【００９５】
＜シークエンシング分析＞
次に、ＡＬＳ遺伝子の５’側を増幅して得られた４，３０２ｂｐ長の断片、及び、該遺伝子の３’側を増幅して得られた３，９４３ｂｐ長の断片を、ＴＯＰＯクローニング法により、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に導入してクローニングし、シークエンシング分析に供した。
【００９６】
具体的には、ユニバーサルプライマーＭ１３−Ｒ（５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ−３’（配列番号：１４））及びＭ１３−Ｆ（５’−ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ−３’（配列番号：１５））を用い、ジャンクション配列が予期しているものであるかどうかを確認した。
【００９７】
また、前記３，９４３ｂｐ長の断片に、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉの変異が存在しているか否か、プライマーＡＬＳ−Ｒ１（５’−ａｃｔｔｇｇｇａｔｃａｔａｇｇｃａｇｃａ−３’（配列番号：１６））及びＡＬＳ−Ｒ２（５’−ｃｃｔｔａｇｃａｇｔｃａｇｇａａｔａｇｃｔｔｇ−３’（配列番号：１７））を各々用いて、チェックした。
【００９８】
そして、このシークエンシング分析の結果、表１に示す通り、Ｗ５４８Ｌ変異の欠如、及び、Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異の欠如が、２つのカルス系統にて各々検出された。
【００９９】
したがって、最終的には、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉの変異導入が確認された４つのカルス系統（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４）をＧＴ候補カルスとして同定し、それらの中から、２系統（Ａ及びＢ１）を、以下に示すｐｉｇｇｙＢａｃ除去処理に供した。
【０１００】
＜ｐｉｇｇｙＢａｃ除去処理＞
Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉの変異導入が確認されたカルス（ＧＴ候補カルス系統  Ａ及びＢ１）を、ハイグロマイシン及びメロペナムが添加されていないＮ６Ｄ培地に移し、４週間培養した。
【０１０１】
次に、ポジティブ選択マーカー遺伝子（ｈｐｔ）を含むｐｉｇｇｙＢａｃを標的ＤＮＡから除去すべく、ｐＰＮ／ｈｙＰＢａｓｅ発現ベクターを保持するアグロバクテリウムを、ＧＴ候補カルスに感染させた。なお、該発現ベクターには、トウモロコシ由来のポリユビキチン１プロモーターによって発現が誘導される高活性型のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース（ｈｙＰＢａｓｅ、非特許文献１  参照）がコードされている（前記「Ｎｉｓｈｉｚａｗａ−Ｙｏｋｏｉ  Ａ．ら、２０１４年２月  参照のこと）。
【０１０２】
そして、形質転換後のカルスを、３５ｍｇ／Ｌ  ジェネティシン（ナカライテスク社製）及び２５ｍｇ／Ｌ  メロペナムを添加したＮ６Ｄ培地にて培養することにより、ｈｙＰＢａｓｅを恒常的に発現しているカルス（ＧＴ＿ｈｙカルス）を、各ＧＴ候補カルス系統につき５又は６系統選択した（ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ：５、６、１０、１３及び２４、並びにＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙ：５、９、１１、１２、１９及び２０）。
【０１０３】
次に、このようにして得られたＧＴ＿ｈｙカルスを、２５ｍｇ／Ｌメロペナムを添加した再分化用培地に移した。そして、カルスから生じたシュートを、植物ホルモンを添加していないムラシゲ＆スクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ．及びＳｋｏｏｇ  Ｆ．、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、１９６２年、１５巻、３号、４７３〜４９７ページ  参照）に移して培養することにより、前記１１系統のカルスからＴ０再分化植物体を、各系統につき２０個体ずつ調製した。
【０１０４】
（試験例１）
＜ｐｉｇｇｙＢａｃによる標的ＤＮＡからのマーカー除去についての検証１＞
実施例２にて調製したＴ０再分化植物体における、ｐｉｇｇｙＢａｃ転移を介したポジティブ選択マーカー遺伝子の除去効率を評価するため、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）を指標とするマーカー除去分析に供した（前記「Ｅｎｄｏ  Ｍ．ら、２００７年」参照）。
【０１０５】
すなわち先ず、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ及びＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙの葉からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライムスターＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、並びにプライマーセット（ＡＬＳ−Ｆ１及びＡＬＳ  ＧＴ−Ｒ）を用い、３，８３３ｂｐ長のｐｉｇｇｙＢａｃ除去断片をＰＣＲにて増幅した。そして、このＰＣＲ産物をＭｆｅＩにより処理してゲル電気泳動に供し、得られる切断断片のパターンを検出した。また、ｐｉｇｇｙＢａｃの再挿入頻度を分析するため、ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライムスターＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、並びにマーカー遺伝子を特異的に検出するためのプライマーセット  ＨＰＴ−Ｆ（５’−ｃａａａｇａｔｃｇｔｔａｔｇｔｔｔａｔｃｇｇｃａｃｔｔｔｇ−３’（配列番号：１８））及びＨＰＴ−Ｒ（５’−ｃｔｃｇａｇｃｔａｔｔｔｃｔｔｔｇｃｃｃｔｃ−３’（配列番号：１９））を用い、ＰＣＲ分析を行った。得られた結果を、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙについては表２に示し、ＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙについては表３に示す。
【０１０６】
なお、ＡＬＳ−Ｆ１（５’−ｇｔａｃｇｃａａａｔｔａｔｇｃｃｇｔｇｇａ−３’（配列番号：２０））は、ｐｉｇｇｙＢａｃの挿入部位より３５９ｂｐ上流にアニーリングするプライマーである。ＡＬＳ  ＧＴ−Ｒは、内在性のＡＬＳ遺伝子座（ｐｉｇｇｙＢａｃ挿入部位より３，４７８ｂｐ下流）に特異的なプライマーである（ＡＬＳ遺伝子座とプライマーのアニーリング位置については、図３参照）。また、これらプライマーによって、マーカー遺伝子が含まれている８，７２６ｂｐ長の断片を増幅することはできない（図３参照）。
【０１０７】
また、ＡＬＳ遺伝子座における、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉの２つの点変異は、制限酵素ＭｆｅＩの認識部位（ＣＡＡＴＴＧ）を生じさせるため、該制限酵素による切断の有無を指標として、簡便にＧＴの有無を検出することができる。
【０１０８】
さらに、標的のＡＬＳ遺伝子座からｐｉｇｇｙＢａｃがｈｙＰＢａｓｅの発現により除去された場合には、プライマーセットＡＬＳ  Ｆ１及びＡＬＳ  ＧＴ−Ｒを用いたＰＣＲ増幅と、その後のＭｆｅＩ処理にて、２９３８ｂｐ、６５７ｂｐ及び２３８ｂｐ長の断片が検出されることとなる（図３参照）。
【０１０９】
また、ＡＬＳ遺伝子座においてヘテロ接合性を示すＴ０再分化植物体においては、前記３断片に加えて、ＭｆｅＩによって切断されることのない３８３３ｂｐ長の断片も検出されることとなる（図３参照）。一方、ｈｙＰＢａｓｅが発現している植物個体において、標的のＡＬＳ遺伝子座にｐｉｇｇｙＢａｃが残存している場合には、前記ＰＣＲの条件では増幅することのできない、マーカー遺伝子の配列を含む８，７２６ｂｐの断片が検出されることが予想される（図３参照）。
【０１１０】
【表２】
2015171358.tif 000003
【０１１１】
【表３】
2015171358.tif 000004
【０１１２】
前記ＣＡＰＳを指標とするマーカー除去分析を行った結果、図には示さないが、検出されたＭｆｅＩの切断断片のパターンから、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ及びＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙのいずれのＡＬＳ遺伝子座においても、Ｗ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉ変異の導入が認められ、さらにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃが除去されていることが明らかになった。
【０１１３】
また、表２及び３に示す通り、再分化植物体の９０％以上において、ｈｙＰＢａｓｅの発現により標的のＡＬＳ遺伝子座から効率良くｐｉｇｇｙＢａｃが除去されたことを示す、ＭｆｅＩの切断断片が検出された（平均して、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙにおいては１００％、ＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙにおいては９２．５％の植物体から、該断片が検出された）。
【０１１４】
さらに、マーカー遺伝子（ｈｐｔ）を特異的に検出するためのプライマーセットを用いたＰＣＲ分析を行った結果、表２及び３に示す通り、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ及びＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙにおいて、各１個体のみにＣＡＰＳ分析によるＭｆｅＩ切断断片に、ｈｐｔ特異的断片が含まれていた。
【０１１５】
このように、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ及びＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙの各々９９％及び９２％の再分化植物体において、ＡＬＳ遺伝子座にＧＴを介して２つの点変異Ｗ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉが導入され、かつマーカー遺伝子は除去されていることが明らかになった。
【０１１６】
（試験例２）
＜ｐｉｇｇｙＢａｃによる標的ＤＮＡからのマーカー除去についての検証２＞
前記Ｔ０再分化植物体のＡＬＳ遺伝子座における、マーカー遺伝子の除去及びＷ５４８Ｌ及びＳ６２７Ｉの点変異の導入について、ダイレクトシークエンシング法を用いて分析した。
【０１１７】
すなわち、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙ及びＧＴ系統Ｂ１＿ｈｙの植物体から各々ランダムに選択した６個体及び１６個体について、プライマーセット  ＡＬＳ  Ｆ１及びＡＬＳ  ＧＴ−Ｒを用いたＰＣＲにより得られた増幅断片をダイレクトシークエンシングした。
【０１１８】
その結果、全ての分析した植物体にて、Ｗ５４８Ｌ、Ｓ６２７Ｉ及びＨｐａＩ認識部位を付加するサイレント変異が導入されていることが明らかになった。
【０１１９】
（試験例３）
＜ｐｉｇｇｙＢａｃによる標的ＤＮＡからのマーカー除去についての検証３＞
Ｔ０植物体のＡＬＳ遺伝子座における、ＧＴを介したＷ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉ変異導入、及び、ｐｉｇｇｙＢａｃ転移によるマーカー遺伝子の除去について確認するため、野生型、ＧＴ系統Ａの再分化植物体、並びにＧＴ系統Ａ＿ｈｙの独立した２系統のＴ０植物体（系統番号：６及び１０）からゲノムＤＮＡを抽出し、以下に示す方法にて、サザンブロット分析を行った。
【０１２０】
＜サザンブロット分析＞
苗の葉から、ヌクレオン  フィトピュア抽出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、添付のメーカープロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、抽出したゲノムＤＮＡ２μｇをＭｆｅＩにて処理し、１．０％アガロースゲルにて分画した。そして、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）アプリケーションマニュアル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）に従って、サザンブロット分析を行った。得られた結果を、図５〜７に示す。
【０１２１】
なお、ＡＬＳ遺伝子座に特異的なＤＮＡプローブは、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、並びに以下に示すプライマーを用い、添付のメーカープロトコールに従って合成した。
プローブ−１（５’−ｔｔｃｔｔｔｔｔｃａａｔａｃｔｔｔｃｃｔｃｇｃｔｔｇｃｔｃｔ−３’（配列番号：２１）  及び  ５’−ａｔｔｃａｇｃｃａｃｔｔａｔｃｔｔｇａｃａｃａａｃｃａｔｔｔ−３’（配列番号：２２））
プローブ−２（５’−ｔｇｔｇａｃａｇｃｃｃａｇｔｃａｔｃａｔ−３’（配列番号：２３）  及び  ５’−ｃｇｔｔｇｇａｔｃｇａｃａｔｃａｔｃａｇ−３’（配列番号：２４））
プローブ−３（５’−ｃａａａｇａｔｃｇｔｔａｔｇｔｔｔａｔｃｇｇｃａｃｔｔｔｇ−３’（配列番号：２５）  及び  ５’−ｃｔｃｇａｇｃｔａｔｔｔｃｔｔｔｇｃｃｃｔｃ−３’（配列番号：２６））。
また、各プローブとＡＬＳ遺伝子座との位置関係については、図４参照のこと。
【０１２２】
図５に示す通り、ＭｆｅＩにて処理したＤＮＡを、プローブ−１を用いたサザンブロット分析に供したところ、野生型ＡＬＳ遺伝子座に由来する由来のバンド（１１．８−ｋｂ）と、ＧＴベクター由来のバンド（６．８−ｋｂ）とが、ＧＴ系統Ａの再分化植物体において検出された。
【０１２３】
一方、図５に示す通り、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙの再分化植物体においては、プローブ−１を用いたサザンブロット分析により、野生型ＡＬＳ遺伝子座に由来する由来のバンド（１１．８−ｋｂ）と、ｐｉｇｇｙＢａｃが除去されたＡＬＳ遺伝子座に由来する４．８−ｋｂ長のバンドとが、検出された。
【０１２４】
また、図６に示す通り、プローブ−３を用いたサザンブロット分析により、野生型ＡＬＳ遺伝子座に由来するバンド（１１．８−ｋｂ）と、ＧＴによりＷ５４８Ｌ／Ｓ６２７Ｉが導入されたＡＬＳ遺伝子座に由来する６．８−ｋｂ長のバンドとが、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙの再分化植物体において検出された。
【０１２５】
さらに、図７に示す通り、ｈｐｔに特異的なプローブを用いたサザンブロット分析により、マーカー遺伝子に由来する２．３−ｋｂ長のバンドは、ＧＴ系統Ａの再分化植物体のみにおいて検出された。
【０１２６】
したがって、ＧＴ系統Ａ＿ｈｙの再分化植物体において、切り出されたｐｉｇｇｙＢａｃが、他のゲノム領域に再挿入されていないことが明らかになった。
【０１２７】
非特許文献１において示される、哺乳動物細胞におけるＧＴ遺伝子座からのｐｉｇｇｙＢａｃ除去においては、切り出されたｐｉｇｇｙＢａｃは、６８〜７９％という高い頻度にて、標的ＤＮＡとは異なるゲノム領域に再挿入されることが明らかになっている。
【０１２８】
また、非特許文献２〜５において示されるように、植物細胞のゲノムＤＮＡ内にランダムに挿入されているｐｉｇｇｙＢａｃにおいては、その除去効率は約７２％ではあるものの、除去されたｐｉｇｇｙＢａｃ等の再挿入率は４１％と高いことが、本発明者らにより明らかになっている。
【０１２９】
一方、前述の試験例１〜３の結果から明らかな通り、本発明によれば、標的ＤＮＡに所望の変異が導入されているが、マーカー遺伝子を含む不要な配列が除去されている植物体を、高頻度（９２〜９９％）に得ることができる。さらに、切り出されたｐｉｇｇｙＢａｃの再挿入率は１％と極めて低いため、本発明においては、再挿入が生じている細胞を除外するための工程（ネガティブ選抜等）が不要である。
【０１３０】
次に、上述のジーンターゲッティング（ＧＴ）による標的ＤＮＡの改変及びｐｉｇｇｙＢａｃによる足跡を残さないマーカー除去からなる系が、標的とする遺伝子に依らず、普遍的に活用できる技術であることを確認するため、本発明によって、イネのｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ  １（Ｏｓｃｌｙ１）遺伝子を改変することを試みた。
【０１３１】
なお、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子は、イネアノテーションプロジェクト（ＲＡＰ）−データベース（ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）にて、アクセッション番号：Ｏｓ０４ｇ０６４９１００として登録されている遺伝子である（ｃｌｙ１遺伝子の機能等については、Ｃｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、３０３巻、２０２２〜２０２５ページ、Ｎａｉｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０１０年、１０７巻、４９０〜４４９ページの記載を参照のこと）。
【０１３２】
一方、Ｃｌｙ１遺伝子は、花器官の形態形成に関わるシロイヌナズナのＡＰ２転写因子（Ｊｏｆｕｋｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１９９４年、６巻、１２１１〜１２２５ページ  参照）のオーソログであり、オオムギでは閉花性を示す栽培品種の原因遺伝子として同定されている（前記Ｎａｉｒら、２０１０年  参照）。また、この品種ではｍｉｃｒｏＲＮＡ結合サイトに１塩基置換（アデニンからグアニンへの１塩基置換（ＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣからＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣとする変異、配列番号：２７及び２８）が生じていることにより、閉花性の表現型が示されることも明らかになっている。
【０１３３】
したがって、痕跡を残すことなく前記１塩基置換をＯｓｃｌｙ１遺伝子に導入することができれば、イネに閉花性の性質のみを付与することができ、ひいては閉花性によってもたらされる赤かび病等への抵抗性も向上された育種素材を得ることもできる。
【０１３４】
そこで、かかる育種素材の開発における有効性を確認するということも含め、図８及び以下に示す方法により、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合サイトに前記１塩基置換を導入した後、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを転移させることによってマーカーを除去し、最終的に点変異のみを残せることを確認した。
【０１３５】
（実施例３）
＜ＧＴベクターの構築＞
標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する変異植物体を作製するため、標的ＤＮＡと相同なＤＮＡを含むＤＮＡ構築物であって、該相同ＤＮＡにマーカー遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挿入され、かつ所望の変異が導入されているＤＮＡ構築物（ＧＴベクター）を以下のようにして構築した。
【０１３６】
すなわち先ず、ＯｓＣｌｙ１遺伝子のコード領域を含む６−ｋｂのゲノム配列を、プライマー５’−ｔｔｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔｇｔｃｇｔｃａｃｇｃｇｃｃａｇｔｔｃ−３’
（配列番号：２９）と５’−ｃｃｔｔａａｔｔａａｔｃｃａｇｇｇａａａｔｃｃａｃｃａｃｔａｃｔａｃｔ−３’（配列番号：３０）とで増幅し、エントリーベクターｐＥＮＴＲ  Ｌ１／Ｌ２のＡｓｃＩ／ＰａｃＩサイトに挿入し、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）Ｏｓｃｌｙ１ベクターを作製した。
【０１３７】
また、ＯｓＣｌｙ１遺伝子において、１０番目のエクソン中にあるｍｉｃｒｏＲＮＡ結合配列（ｓｔｏｐコドンより８８ｂｐ上流）に、前述のアデニンからグアニンへの１塩基置換が導入され、さらに当該遺伝子の３’−ＵＴＲのＴＴＡＡサイトにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの配列が挿入された、人工合成ＤＮＡ配列を調製した。
【０１３８】
そして、前述のｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）Ｏｓｃｌｙ１及び人工合成ＤＮＡ配列をＥｃｏＲＩにて処理することによって、当該ベクター中の野生型ＯｓＣｌｙ１配列を、前記１塩基変異及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの配列が導入されたＯｓＣｌｙ１配列に置き換えて、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）Ｏｓｃｌｙ１ｐｂを作製した。
【０１３９】
次いで、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）Ｏｓｃｌｙ１ｐｂのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン内部のＩ−ＳｃｅＩサイトに、Ｉ−ＳｃｅＩで処理した４．３ｋｂ長断片を挿入することにより、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）Ｏｓｃｌｙ１ｐＨＰＴｂを作製した。なお、この断片には、イネ由来のアクチンターミネーター、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）及びイネ由来の熱ショックタンパク質１７．３ターミネーターが含まれている。
【０１４０】
そして、ｐＥ（Ｌ１−Ｌ２）Ｏｓｃｌｙ１ｐＨＰＴｂ中の１０．９−Ｋｂの配列を、ゲートウェイＬＲクロナーゼＩＩ反応によって、ＤＴ−Ａ発現カセット２つを含むジーンターゲッティングバイナリーベクターｐＫＯＤ４に導入して再クローニングし、ｐＫＯＤ４／Ｏｓｃｌｙ１ｐＨＰＴｂを調製した。
【０１４１】
（実施例４）
次に、実施例２に記載の方法と同様の方法にて、このようにして得られたＧＴベクター（ｐＫＯＤ４／Ｏｓｃｌｙ１ｐＨＰＴｂ）を用い、標的ＤＮＡに所望の変異のみを有する植物体の作製を試みた。
【０１４２】
その結果、表４に示す通り、５１３９のカルスから、独立した７４のハイグロマシン耐性カルスを選抜することができた。
【０１４３】
【表４】
2015171358.tif 000005
【０１４４】
さらに、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座にてＧＴイベントが生じたトランスジェニックカルスを同定するため、得られたハイグロマシン耐性カルスを、以下に示すＰＣＲ及びシークエンシング分析によるスクリーニングに供した。
【０１４５】
＜ＰＣＲ＞
イネカルスの小塊からゲノムＤＮＡを、アジェンコート  クロロピュアを用い、添付のメーカープロトコールに従って抽出した。そして、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ＦＸ又はＫＯＤ  ＦＸネオと、以下に示すプライマーセットを用い、ＰＣＲ増幅を行った（Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座とプライマーのアニーリング位置については、図８参照）。
Ｏｓｃｌｙ１の５’側の増幅に用いたプライマーセット：
Ｏｓｃｌｙ１  ＧＴ−Ｆ（５’−ｔｃｇｇｔｃｇｇｃｔａａｇｇｔｔｔｇｃｔａｃｔａａａａａｃａ−３’（配列番号：３１））及びＴａｃｔ−Ｒ
Ｏｓｃｌｙ１の３’側の増幅に用いたプライマーセット：
Ｔｈｓｐ１７．３−Ｆ及びＯｓｃｌｙ１  ＧＴ−Ｒ（５’−ｃｔｔｇｃａｃｇａｃｇｇｔｔｃｔａｃａｇｇａｇａｔｔａｇｔｇ−３’（配列番号：３２））。
【０１４６】
そして、このＰＣＲの結果、表４に示す通り、独立した４のカルスにおいて、ジャンクション断片の上流及び下流を検出することができ、これらカルスにおいて、ＧＴベクターと標的ＤＮＡとの間にて相同組換えが生じ、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座にポジティブ選択マーカー遺伝子が導入されていることが確認された。
【０１４７】
＜シークエンシング分析＞
次に、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子の３’側を増幅して得られた３，９４２ｂｐ長の断片、及び、該遺伝子の３’側を増幅して得られた４２５７ｂｐ長の断片を、ＴＯＰＯクローニング法により、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターに導入してクローニングし、シークエンシング分析に供した。
【０１４８】
具体的には、ユニバーサルプライマー  Ｍ１３−Ｒ及びＭ１３−Ｆを用い、ジャンクション配列が予期しているものであるかどうかを確認した。
【０１４９】
また、前記４２５７ｂｐ長の断片内のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列に１点変異が挿入されていることを、プライマーＯｓｃｌｙ１  Ｓｅｑ−５１０１Ｆ（５’−ｃｇａｃｃａｇａａｃｔｃｇａａｃｃａｔｃ−３’（配列番号：３３））を用いて、シークエンシング分析によりチェックした。
【０１５０】
このシークエンシング分析の結果、表４に示す通り、ｍｉＲＮＡ標的サイトの変異であるアデニンからグアニンへの塩基置換が、２つのカルス系統にて各々検出された。
【０１５１】
そして、これら２系統（ｃｌｙ１  ＧＴ−１及びｃｌｙ１  ＧＴ−２）を、上述のＧＴ候補カルス系統  Ａ及びＢ１同様の方法（実施例２）にて、ｐｉｇｇｙＢａｃを除去するための処理に供し、ｈｙＰＢａｓｅを恒常的に発現しているカルス（ＧＴ＿ｈｙカルス）を、各カルス系統につき６又は４系統選択した（ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ−２２，２３，２７，２８，２９及び３８、並びにｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙ−２１，２３，３６及び３７）。
【０１５２】
次に、このようにして得られたＧＴ＿ｈｙカルスを、上述のＧＴ系統Ａ＿ｈｙ：５等と同様の方法にて再分化させ、前記１０系統のカルスからＴ０再分化植物体を、各系統につき１９〜２５個体ずつ調製した。
【０１５３】
（試験例４）
＜ｐｉｇｇｙＢａｃによる標的ＤＮＡからのマーカー除去についての検証４＞
実施例４にて調製したＴ０再分化植物体における、ｐｉｇｇｙＢａｃ転移を介したポジティブ選択マーカー遺伝子の除去効率を評価するため、ＰＣＲによる解析を行った。
【０１５４】
すなわち先ず、ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ及びｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙの葉からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライムスターＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びにプライマーセット（Ｏｓｃｌｙ１  ＧＴ−Ｆ及びＴａｃｔ−Ｒのセット、又は、Ｏｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｆ：５’−ｇｇａｔｇｃｔａｔｔｃｔｔｔｔｇｃｔｃｔａｃｃｔｔｔｔｔ−３’（配列番号：３４）及びＯｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｒ：５’−ｔｔａｃｔｔｔａｇｔａｃｃａａｃａｔｃｔａｇａａｇｇａｃｇａ−３’（配列番号：３５）のセット）を用いたＰＣＲを行った。ｈｙＰＢａｓｅの発現によってＯｓＣｌｙ１  ＧＴ遺伝子座からｐｉｇｇｙＢａｃが除去されていた場合、０．６−ｋｂ長の断片がＯｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｆ及びＯｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｒからなるプライマーセットにより増幅されることとなる。一方、除去されていなかった場合は、５．５−ｋｂ長の断片と３．９−ｋｂ長の断片とが、Ｏｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｆ及びＯｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｒからなるプライマーセットと、Ｏｓｃｌｙ１  ＧＴ−Ｆ及びＴａｃｔ−Ｒからなるプライマーセットとによってそれぞれ増幅される。
【０１５５】
なお、Ｏｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｆは、ｐｉｇｇｙＢａｃの挿入部位より３８０ｂｐ上流にアニーリングするプライマーである。Ｏｓｃｌｙ１  ３’  ＵＴＲ−Ｒは、ｐｉｇｇｙＢａｃ挿入部位より２２３ｂｐ下流にアニーリングするプライマーである（Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座とプライマーのアニーリング位置については、図８参照）。
【０１５６】
また、ｐｉｇｇｙＢａｃの再挿入頻度を分析するため、ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライムスターＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、並びにマーカー遺伝子を特異的に検出するためのプライマーセット  ＨＰＴ−Ｆ及びＨＰＴ−Ｒを用い、ＰＣＲ分析を行った。得られた結果を表５及び６に示す。
【０１５７】
【表５】
2015171358.tif 000006
【０１５８】
【表６】
2015171358.tif 000007
【０１５９】
表５及び６に示す通り、再分化植物体の９０％以上において、ｈｙＰＢａｓｅの発現により標的のＯｓｃｌｙ１遺伝子座から効率良くｐｉｇｇｙＢａｃが除去されたことを示すＰＣＲ増幅断片が検出された（平均して、ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙにおいては９１％、ｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙにおいては９８％の植物体から、該断片が検出された）。
【０１６０】
このように、ｃｌｙ１  ＧＴ−１及びｃｌｙ１  ＧＴ−２の各々９０．７％及び９８％の再分化植物体において、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座にＧＴを介して点変異が導入され、かつマーカー遺伝子は除去されていることが明らかになった。
【０１６１】
（試験例５）
＜ｐｉｇｇｙＢａｃによる標的ＤＮＡからのマーカー除去についての検証５＞
前記Ｔ０再分化植物体のＯｓｃｌｙ１遺伝子座における、マーカー遺伝子の除去及び点変異の導入について、ダイレクトシークエンシング法を用いて分析した。
【０１６２】
すなわち、ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ及びｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙの植物体から各々ランダムに選択した１０個体及び６個体を対象として、プライマーセットＯｓＣｌｙ１−３８９５Ｆ（５‘−ｃｔａｔｔｃｃｃｔｇｃｔｃｇｃｃｃａａｔ−３’（配列番号：３６））及びＯｓＣｌｙ１  ７２７６Ｒ（５’−ａｇａｃｔｇａａａａｃｇｇｃｃａａｔｇｃ−３’（配列番号：３７））を用いたＰＣＲを行った。そして、得られた増幅断片を、ＯｓＣｌｙ１−５１０１Ｆ及びＯｓＣｌｙ１−６５３６Ｒ（５’−ｃｔｔｃｇａｇａｔｇｔｔａｇａｔａｔｇｔｇｔｇｃ−３’（配列番号：３８））によりダイレクトシークエンシングした。
【０１６３】
その結果、図には示さないが、全ての分析した植物体にて、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合サイトにアデニンからグアニンへの１塩基置換が導入されていることが明らかになった。また、ｐｉｇｇｙＢａｃが転移した後のＯｓｃｌｙ１遺伝子の配列を解析したところ、ｐｉｇｇｙＢａｃは足跡を残さずに転移していた。
【０１６４】
（試験例６）
＜ｐｉｇｇｙＢａｃによる標的ＤＮＡからのマーカー除去についての検証６＞
Ｔ０植物体のＯｓｃｌｙ１遺伝子座における、ＧＴを介した変異導入、及び、ｐｉｇｇｙＢａｃ転移によるマーカー遺伝子の除去について確認するため、野生型、ＧＴ系統の再分化植物体（ｃｌｙ１  ＧＴ−１及びｃｌｙ１  ＧＴ−２）、並びにｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ（系統番号：２９−１、２９−２、３８−１、３８−２）及びｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙ（系統番号：３６−１、３６−２）の独立した２系統のＴ１植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡを処理する制限酵素をＭｆｅＩからＥｃｏＲＶに変更し、後述のプローブを用いた以外は、試験例３に記載と同様の方法にて、サザンブロット分析を行った。得られた結果を図９に示す。
【０１６５】
なお、Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座に特異的なＤＮＡプローブは、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、並びに以下に示すプライマーを用い、添付のメーカープロトコールに従って合成した。
プローブ−１（５’−ｇｇｔｔｃｃａｔｔｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｇｃｃｃａｃｃｔ−３’（配列番号：３９）及び５’−ｃａｇｔｇａａｔｇａｔｇｃａａｃａｔｇａｇａｃｃｇａａｃａ−３’（配列番号：４０））
プローブ−２（５’−ｔｇｔｇａｃａｇｃｃｃａｇｔｃａｔｃａｔ−３’（配列番号：２３）及び５’−ｃｇｔｔｇｇａｔｃｇａｃａｔｃａｔｃａｇ−３’（配列番号：２４））
プローブ−３（５’−ｃａｇｔｃａｔｃｔｇｇａｃｔｔｇｔｔｇｇａａｔｔｇ−３’（配列番号：４１）及び５’−ｃａｔｃｇｇａｔｇａｇａｃｃａｃａｔｔａａｃｔｔ−３’（配列番号：４２））。
また、各プローブとＯｓｃｌｙ１遺伝子座との位置関係については、図８を参照のこと。
【０１６６】
図９に示す通り、ＥｃｏＲＶにて処理したＤＮＡを、プローブ−１を用いたサザンブロット分析に供したところ、ポジティブマーカー遺伝子のないＯｓｃｌｙ１遺伝子座に由来のバンド（１９．８−ｋｂ）と、ＧＴベクター由来のバンド（９．８−ｋｂ）とが、ｃｌｙ１  ＧＴ−１及びｃｌｙ１  ＧＴ−２の再分化植物体において検出された。また、図９に示す通り、プローブ−３を用いたサザンブロット分析に供したところ、ポジティブマーカー遺伝子のないＯｓｃｌｙ１遺伝子座に由来のバンド（１９．８−ｋｂ）と、ＧＴベクター由来のバンド（１２．６−ｋｂ）とが、ｃｌｙ１  ＧＴ−１及びｃｌｙ１  ＧＴ−２の再分化植物体において検出された。
【０１６７】
一方、ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ及びｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙの再分化植物体においては、プローブ−１とプローブ−３のどちらを用いたサザンブロット分析でも、野生型Ｏｓｃｌｙ１遺伝子座由来のバンド（１９．８−ｋｂ）のみが、検出された。
【０１６８】
さらに、図９に示す通り、ｈｐｔに特異的なプローブを用いたサザンブロット分析により、マーカー遺伝子に由来する２．３−ｋｂ長のバンドは、ｃｌｙ１  ＧＴ−１及びｃｌｙ１  ＧＴ−２の再分化植物体のみにおいて検出された。
【０１６９】
したがって、ｃｌｙ１  ＧＴ−１＿ｈｙ及びｃｌｙ１  ＧＴ−２＿ｈｙの再分化植物体において、切り出されたｐｉｇｇｙＢａｃが、他のゲノム領域に再挿入されていないことが明らかになった。
【０１７０】
以上の通り、本発明によれば、標的とするＤＮＡの種類に依らず、所望の変異のみを植物細胞に導入できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
以上説明したように、本発明によれば、標的ＤＮＡのみならず、該ＤＮＡ以外の領域にも、マーカー遺伝子等の不要な配列を残すことなく、標的ＤＮＡに所望の変異のみを導入した植物細胞等を得ることが可能となる。
【０１７２】
したがって、本発明の標的ＤＮＡに変異が導入された植物細胞の製造方法等は、遺伝子の機能解析等の基礎研究や、育種素材の開発とにおいて非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７３】
配列番号：１〜５
＜２２３＞  逆向き反復配列
配列番号：６及び７
＜２２３＞  高活性型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース
配列番号：８〜２６及び２９〜４２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：２７及び２８
＜２２３＞  ｍｉＲＮＡの標的部位
【図１】
2015171358.tif 000008
【図２】
2015171358.tif 000009
【図３】
2015171358.tif 000010
【図４】
2015171358.tif 000011
【図５】
2015171358.tif 000012
【図６】
2015171358.tif 000013
【図７】
2015171358.tif 000014
【図８】
2015171358.tif 000015
【図９】
2015171358.tif 000016
【配列表】
2015171358000001.app