(57)【要約】【課題】高塩濃度の培養液から回収した微生物から、効率よくベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法の提供。【解決手段】アルコールに対して難溶性の塩類を含む等張液を用いて、ベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを含有する好塩性微生物を洗浄する洗浄工程と、前記洗浄した好塩性微生物を集菌する集菌工程と、前記集菌した好塩性微生物中のベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを前記アルコールに溶解させる溶解工程と、前記アルコールに溶解しなかった物質を除去する除去工程と、前記アルコールに溶解したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを回収する分離工程と、を含む、好塩性微生物からベタインを抽出する抽出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールに対して難溶性の塩類を含む等張液を用いて、ベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを含有する好塩性微生物を洗浄する洗浄工程と、
前記洗浄した好塩性微生物を集菌する集菌工程と、
前記集菌した好塩性微生物中のベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを前記アルコールに溶解させる溶解工程と、
前記アルコールに溶解しなかった物質を除去する除去工程と、
前記アルコールに溶解したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを回収する分離工程と、
を含むことを特徴とする、好塩性微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法。
【請求項２】
前記分離工程において、前記アルコールを蒸発させることによってベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを蒸発残留物として回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記回収したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを水に溶解して得た水溶液から、イオン交換法によってベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを精製することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩類が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好塩性の細菌や藻類などの好塩性微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベタイン（別名：グリシンベタイン、又はトリメチルグリシン）は、食品の保存性、味質、旨味の浸透等の向上のために食品添加物として従来から使用されており、近年においては脂肪肝の抑制、肝硬変の予防等の機能性食品としても期待されている物質である。ベタインを得る方法としては、栽培された甜菜（ビート）から抽出・精製する方法が一般的であるが、甜菜の栽培は天候に左右され、収穫の回数も年２回程度に限られている。
【０００３】
甜菜の他にベタインを含有する生物として、ある種の好塩性微生物が知られている（特許文献１）。ベタインは好塩性微生物の細胞内に存在して、浸透圧調整物質として機能している。好塩性微生物は培養の条件を整えることによって、一年を通して培養することができる。このため、ベタインを生産可能な好塩性微生物を培養し、この微生物からベタインを抽出することによって、甜菜から抽出するよりも効率良くベタインを得ることが期待できる。また、化粧品や皮膚用製剤等の材料として有用なグルコシルグリセロール（グリセリルグルコシド）を、ベタインと同様に上記微生物から抽出することも期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−４８７７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、好塩性微生物は塩分を多く含む培養液を用いて培養されるため、培養液から集菌（回収）した微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出・精製する際に、脱塩処理が必要になる問題がある。すなわち、植物からの抽出物を精製する一般的な方法であるイオン交換法を用いるためには、まず、微生物に付着した培養液に含まれる高濃度の塩分を除く必要がある。ところが、脱塩するために微生物を水で洗浄する方法は、浸透圧差によって微生物の細胞を破裂させてしまい、洗浄水中に目的のベタイン及びグルコシルグリセロールを拡散させてしまうため、採用できない。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、高塩濃度の培養液から回収した微生物から、効率よくベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達するために、本発明は以下の手段を提供している。なお、本発明において「ベタイン」は、トリメチルグリシンを意味する。
また、本明細書及び特許請求の範囲において、「ベタイン及び／又はグルコシルグリセロール」は、「ベタイン及びグルコシルグリセロールのうち少なくとも何れか一方」を意味する。
【０００８】
（１）  アルコールに対して難溶性の塩類を含む等張液を用いて、ベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを含有する好塩性微生物を洗浄する洗浄工程と、前記洗浄した好塩性微生物を集菌する集菌工程と、前記集菌した好塩性微生物中のベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを前記アルコールに溶解させる溶解工程と、前記アルコールに溶解しなかった物質を除去する除去工程と、前記アルコールに溶解したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを回収する分離工程と、を含むことを特徴とする、好塩性微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法。
【０００９】
上記（１）の方法によれば、洗浄工程において、好塩性微生物に付着していた培養成分を洗浄し、前記アルコールに対して難溶性の塩類が主に好塩性微生物に付着した状態にすることができる。その後、溶解工程において、前記塩類が付着した好塩性微生物から前記アルコール中にベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを溶解させる。その一方、前記塩類は前記アルコールに溶解し難いため、続く除去工程において好塩性微生物の残渣と共に前記塩類をアルコール非溶解性物質として除去することができる。その後、分離工程において、ベタイン及び／又はグルコシルグリセロールをアルコールから分離することによって、目的のベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを効率良く簡便に得ることができる。
【００１０】
（２）  前記分離工程において、前記アルコールを蒸発させることによってベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを蒸発残留物として回収することを特徴とする前記（１）に記載の方法。
上記（２）の方法によれば、好塩性微生物から抽出したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを、アルコールを蒸発させた後に残る蒸発残留物として、効率良く簡便に得ることができる。
【００１１】
（３）  前記回収したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを水に溶解して得た水溶液から、イオン交換法によってベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを精製することを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の方法。
上記（３）の方法によれば、好塩性微生物から前記アルコールに抽出された成分から、目的のベタインを精製して、高純度のベタインを得ることができる。
【００１２】
（４）  前記アルコールがエタノールであることを特徴とする前記（１）〜（３）の何れか一項に記載の方法。
上記（４）の方法によれば、好塩性微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを容易に抽出することができる。
【００１３】
（５）  前記塩類が塩化ナトリウムであることを特徴とする前記（１）〜（４）の何れか一項に記載の方法。
上記（５）の方法によれば、除去工程において、塩化ナトリウムをアルコール非溶解性物質として効率よく除去するとともに、分離工程で得られるベタイン及び／又はグルコシルグリセロールに含まれる塩分濃度を一層低減することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の好塩性微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法によれば、高塩濃度の培養液から回収した微生物から、効率よくベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出するとともに、抽出したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールと培養液中の塩類とを分離することができる。このため、抽出したベタイン及び／又はグルコシルグリセロールをイオン交換法等によって容易に精製することが可能であり、高純度のベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを低コストで得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】参考例における、標準試料のＨＰＬＣのチャートである。
【図２】実施例１における、微生物から抽出して得たろ過液のＨＰＬＣのチャートである。
【図３】実施例２における、微生物から抽出して得たろ過液のＨＰＬＣのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、好適な実施の形態に基づいて本発明を説明する。
本発明にかかる方法の実施形態は、少なくとも、洗浄工程と、集菌工程と、溶解工程と、除去工程と、分離工程と、を含む、好塩性微生物からベタイン及び／又はグルコシルグリセロールを抽出する方法である。
まず、これらの各工程の一連の流れを説明する。
【００１７】
以下、ベタインを抽出する場合を説明する。グルコシルグリセロールを抽出する場合も、ベタインの場合と同様に行うことができる（「ベタイン」を「グルコシルグリセロール」に読み換えることができる）ので、グルコシルグリセロールを抽出する場合の説明を省略する。なお、使用する微生物がベタイン及びグルコシルグリセロールの両方を含有する場合には、両者を同時に抽出することができる。抽出したベタインとグルコシルグリセロールとは、クロマトグラフィー等の公知方法によって分離することができる。
【００１８】
＜洗浄工程＞において、培養液から回収された好塩性微生物の菌体と浸透圧が等しい等張液（洗浄液）を用いて、菌体から培養成分等の夾雑物及び後の精製阻害する種々の塩類を洗浄することができる。
【００１９】
続く＜集菌工程＞において、遠心分離又はろ過等の処理によって洗浄に用いた等張液と菌体とを分離して菌体を集めることができる。集菌された菌体には、等張液に含まれる前記アルコールに対して難溶性の塩類が主に付着している。
【００２０】
次の＜溶解工程＞において、前記アルコール中に洗浄後の菌体を懸濁し、当該アルコールによって菌体の細胞膜を溶解させるか、又は超音波破砕若しくはホモジナイズ等の処理によって菌体中に含まれるベタイン等の細胞成分を菌体外に溶出させることができる。この結果、ベタインは前記アルコールに溶解される。
【００２１】
その後、＜除去工程＞において、前記アルコールに溶解しなかった菌体の残渣および前記等張液に含まれていた前記塩類等の前記アルコールに対して非溶解性の物質を、遠心分離又はろ過等の処理によって、前記アルコールから除去する。
【００２２】
次に＜分離工程＞において、蒸発、蒸留、乾燥、真空乾燥又は凍結乾燥等の処理により前記アルコールを蒸発（留去）することよって、蒸発残留物として前記アルコールに溶解していたベタインを回収することができる。
【００２３】
洗浄工程の前に、予め目的のベタインを含有する好塩性微生物を培養する培養工程を設けてもよい。また、洗浄工程の前に、培養液又は塩水から目的のベタインを含有する好塩性微生物を回収する回収工程を設けてもよい。
【００２４】
洗浄工程で洗浄する好塩性微生物は、高塩濃度の培養液中で培養された微生物であってもよいし、海洋、塩湖、塩田、温泉等の高塩濃度環境（塩水中）で自然に生息している微生物であってもよい。ここで、好塩性微生物には、グリシン及び／又はベタインを体内に含有する好塩性藻類、放線菌等が含まれる。
前記塩水から目的のベタインを含有する好塩性微生物を回収（集菌）する方法は特に制限されないが、例えば、遠心分離、沈殿、ろ過等の手段が挙げられる。通常、回収された好塩性微生物は、湿潤状態のペレットとして回収される。このペレットには培養液又は塩水が少量含まれており、このペレットに含まれる塩類がベタインと共存すると、そのベタインをイオン交換法によって精製することが難しくなる。
【００２５】
洗浄工程において、培養液等から回収された好塩性微生物に付着している培養液等を、好塩性微生物の細胞を浸透圧差によって破裂させる恐れのない塩分濃度に調整した等張液で洗浄する。ここで、等張液に含まれる塩類は、溶解工程で使用するアルコールに対して溶解性が非常に低い、難溶性の塩類である。
【００２６】
等張液に含まれる塩類の前記アルコールに対する溶解度は、小さい程好ましく、例えば、０．５ｇ／１００ｍＬ以下が好ましく、０．１ｇ／１００ｍＬ以下がより好ましく、０．０７ｇ／１００ｍＬがさらに好ましい。
【００２７】
等張液に含まれる塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
【００２８】
等張液で好塩性微生物を洗浄する方法としては、好塩性微生物を破壊することなく、好塩性微生物に付着している余分な培養成分等を洗浄可能な方法であれば特に制限されない。例えば、好塩性微生物を回収したペレットを等張液に懸濁する方法が挙げられる。ペレットの体積に対して、過剰量の等張液にペレットを懸濁することによって、好塩性微生物に付着していた不要な成分を等張液中に拡散して希釈することができる。具体例として、例えばペレットの体積の２０倍体積の等張液にペレットを懸濁した後、好塩性微生物を回収して得られたペレットに付着している不要な成分は、理論的には洗浄前の２０分の１に減少する。
【００２９】
等張液の調製方法は特に制限されず、純水（精製水）に前記塩類を所定量で溶解させればよい。等張液における塩分濃度は、使用する好塩性微生物の細胞を破裂させない等張液となるように、使用する好塩性微生物の種類に応じて適宜調製すればよい。具体例として、例えば好塩性微生物として放線菌の一種であるActinopolysporaや、緑藻の一種であるDunaliellaを使用する場合、純水に塩化ナトリウムを１００〜２００ｇ／Ｌで溶解した等張液が挙げられる。この塩化ナトリウム濃度は、好塩性微生物の細胞に対して等張液となるように調整することが好ましい。
【００３０】
集菌工程において好塩性微生物を集菌する方法としては、例えば、等張液に懸濁した好塩性微生物を、遠心分離、沈殿、ろ過等の手段によって湿潤状態のペレットとして回収する方法が挙げられる。
【００３１】
溶解工程において、前記集菌した好塩性微生物中のベタインを前記アルコールに溶解させる方法としては、集菌した好塩性微生物のペレットを前記アルコール中に懸濁して、微生物の細胞膜が自然に溶解して、細胞内に含まれるベタインが前記アルコール中に溶出されるのを待つ方法が挙げられる。また、ペレットを前記アルコール中に懸濁した後、懸濁液を激しく撹拌するか、又は超音波による衝撃によって細胞膜を積極的に破壊してもよい。また、ペレットを前記アルコール中に懸濁した後、懸濁液をホモジナイザーにかけて、菌体を磨砕することによって、菌体から積極的にベタインを溶出させてもよい。
【００３２】
溶解工程で使用するアルコールは、好塩性微生物から抽出されたベタインを溶解可能であり、洗浄工程で使用する等張液に含まれる塩類を溶解し難いアルコールであれば、特に制限されない。溶解工程で使用するアルコール１００ｇに対するベタインの溶解度としては、１ｇ／１００ｇ以上が好ましく、４ｇ／１００ｇ以上がより好ましく、７ｇ／１００ｇ以上がさらに好ましい。この溶解度は高い程好ましいため、その上限値は特に制限されないが、上限値の目安としては、通常１００ｇ／１００ｇ程度であると考えられる。溶解工程で使用するアルコールの具体例としては、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール等の炭素数１〜５程度の第一級アルコールが挙げられる。エタノール１００ｇに対するベタインの溶解度は約８．７ｇ（２０℃）である。
【００３３】
溶解工程で使用するアルコールに対する、ベタインの溶解度と、等張液に含まれる塩類の溶解度の質量比は、ベタインの収率を高めて、塩類の除去率を高める観点から、大きい程好ましい。この溶解度の質量比（ベタインの溶解度／等張液に含まれる塩類の溶解度）としては、例えば、１０以上が好ましく、５０以上がより好ましく、１００以上がさらに好ましい。この質量比の上限値は特に制限されず、その目安としては通常１００００程度であると考えられる。
【００３４】
例えば、エタノール１００ｇに対するベタインの溶解度は約８．７ｇであり、エタノール１００ｇに対する塩化ナトリウムの溶解度は約０．０６５ｇであるから、溶解度の質量比は約１３３．８（８．７÷０．０６）である。
なお、グルコシルグリセロールのエタノールに対する溶解度はベタインとは異なるが、塩化ナトリウムよりも遥かによく溶ける。
【００３５】
溶解工程後に得られたアルコール溶液にはベタインが溶解されている。一方、菌体の残渣及び菌体ペレットに少量含まれていた等張液を構成する前記塩類等のアルコール非溶解性物質は、アルコール溶液中に浮遊するか又は沈殿している。
【００３６】
除去工程において、これらのアルコール非溶解性物質を除去する方法は特に制限されないが、例えば、遠心分離、沈殿、ろ過等の手段によって残渣等をペレット又は凝集物として除去する方法が挙げられる。アルコール非溶解性物質を除去した後のアルコール溶液は分離工程に供される。
【００３７】
分離工程において、アルコール溶液からベタインを分離する方法は特に制限されない。好適な方法としては、例えば、ベタインを溶解する溶媒であるアルコールを溶液から蒸発させることによって、目的のベタインを蒸発残留物として回収する方法が挙げられる。
【００３８】
ベタインを含むアルコール溶液からアルコールを蒸発させる方法としては、加熱、蒸留、乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等の処理をアルコール溶液に施す方法が挙げられる。
蒸発させる際の加熱の温度及び蒸留の温度は、ベタインが熱によって分解しない範囲で、なるべく高い温度に設定することが好ましい。このように設定することによって、アルコールの蒸発を促進することができる。
【００３９】
ベタインを含む蒸発残留物には、好塩性微生物の細胞成分のうち、溶解工程で使用したアルコールに溶解可能な成分が含まれる。この成分にはグルコシルグリセロールが含まれ得る。蒸発残留物を水又は水系溶媒に投入することによって、ベタイン等の水溶性物質は溶解し、非水溶性物質は溶解せずに水中に浮遊するか又は沈殿する。この非水溶性物質を遠心分離、沈殿、ろ過等の手段によって除去することができる。ベタインが溶解した水溶液から、イオン交換法等の公知の精製方法によって、高純度のベタインとグルコシルグリセロールとをそれぞれ分離して、得ることができる。
【００４０】
以上で説明した、好塩性微生物からベタインを抽出する方法は、ベタインに代えて、好塩性微生物からグルコシルグリセロールを抽出する方法としても適用可能である。
【実施例】
【００４１】
［参考例］
グルコシルグリセロール（成分I＆II）及びベタインを所定濃度で含む標準水溶液に、塩化ナトリウム（NaCl）を０wt％、０．０１wt％、０．０２wt％、０．０６wt％又は０．０８wt％で添加した試料をそれぞれ準備した。各試料に含まれる成分を公知のクロマトグラフィー（HPLC）によって分離した。この結果を図１に示す。なお、１％以上のNaClが存在すると、そのピークが非常に大きくなるため、グルコシルグリセロール（成分I＆II）及びベタインのピークが被ってしまい区別できない。
図１のチャートから、試料中に含まれる微量のNaClを、ベタイン及びグルコシルグリセロールのピークと区別して検出できることが確認できた。  
【００４２】
［実施例１］
ベタイン及びグルコシルグリセロールを含有する好塩性Geitlerinema（藍藻の一種）属の一種を潮の満ち引きの激しい海沿いの潮だまりより単離し、NaCl１０wt％に相当する浸透圧の培養液で培養した。この微生物を２０wt％NaCl水溶液で洗浄し、常法により集菌した微生物をエタノールに分散させて、細胞膜を溶解させるとともに、超音波破砕により菌体内に含まれる成分をエタノール中に抽出した。このエタノール抽出液を遠心して不溶成分を除いた後、ろ紙を用いてろ過して得られたろ液を、参考例と同様にHPLCにかけた。この結果を図２に示す。
【００４３】
図２のチャートから、ろ液中に含まれるNaClは微量（０．１wt％以下）であり、微生物の洗浄液として使用した１０wt％NaCl水溶液と比べて、NaCl濃度が充分に低減していることが確認できた。また、ろ液中にベタインが回収されていることも確認できた。HPLCの各ピークに対応する分画を分取することにより、ベタイン、NaClを分離して回収できた。得られた分画の溶媒であるエタノールをエバポレーターによって蒸発させることにより、目的のベタインを蒸発残留物として得ることができた。
これらの結果から、本発明にかかる抽出方法によって、好塩性微生物の培養に使用される塩類を容易に除去して、目的のベタインを高純度で回収できることが確認できた。
【００４４】
［実施例２］
ベタイン及びグルコシルグリセロールを含有する好塩性Cyanobacterium属の一種を潮の満ち引きの激しい海沿いの潮だまりより単離し、NaCl５wt％に相当する浸透圧の培養液で培養した。この微生物を５wt％NaCl水溶液で洗浄し、後の処理は実施例１と同様に行った。この結果を図３に示す。
【００４５】
図３のチャートから、ろ液中に含まれるNaClは微量（０．１wt％以下）であり、微生物の洗浄液として使用した５wt％NaCl水溶液と比べて、NaCl濃度が充分に低減していることが確認できた。また、ろ液中にグルコシルグリセロールが回収されていることも確認できた。
【００４６】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
【図１】
2015101549.tif 000002
【図２】
2015101549.tif 000003
【図３】
2015101549.tif 000004