(57)【要約】【課題】本発明の目的は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する技術を提供することである。【解決手段】(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合し、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有するプローブとを含み、且つ前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質として、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にあるものを使用することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記第１工程及び第２工程を含むことを特徴とする、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法：
第１工程：被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程；
ここで、前記(i)リガンドが、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドであり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第２工程：前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。
【請求項２】
前記被検核酸試料がＲＮＡを含む試料であり、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に検出する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記(i)リガンドが、チオフラビンＴ、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにＮ―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の３’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端の塩基をｎ位とした場合にｎ−１位〜ｎ−２５位である、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の５’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端の塩基をｎ位とした場合にｎ＋１位〜ｎ＋２５位である、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記(ii)核酸プローブに含まれる塩基数が５〜２０個である、請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記(i)リガンドがチオフラビンＴであり、(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質がＲＯＸである、請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出するための検出キットであって、
(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法、より詳細には配列特異的に核酸鎖の四重螺旋構造を検出する方法に関する。更に、本発明は、当該核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法を行うための検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸鎖において、グアニジンに富む配列部分がグアニン四量体（Ｇ-ｑｕａｒｔｅｔ）を形成して四重螺旋構造を形成することが知られている。核酸鎖の四重螺旋構造は、様々な遺伝子の発現や酵素機能を制御することで、細胞の加齢、ガン化等に関与していることが知られている。
【０００３】
また、四重螺旋構造を形成できる塩基配列は、ＤＮＡでは３０万種類以上、ＲＮＡでは３千種類以上存在すると考えられており（非特許文献１参照）、特に、ガン関連遺伝子（例えば、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＲＡＳ、ＢＣＬ２等）、細胞分化関連遺伝子（例えば、ＨＣＫ等）、血管新生関連遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ等）、翻訳因子（例えば、ＦＯＳ等）のｍＲＮＡには、四重螺旋構造を形成できる配列が局在化していることも知られている。そのため、医薬品やバイオプローブの開発の観点から、配列特異的に核酸鎖の四重螺旋構造を検出する技術が求められている。
【０００４】
これまでに、ベルベリン、チオフラビンＴ、銅フタロシアニンテトラスルホン酸、Ｎ―メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）等の低分子化合物は、核酸鎖の四重螺旋構造に対して親和性と特異性を持ち、核酸鎖の四重螺旋構造と結合すると蛍光を発する性質があることが解明されており、従来、核酸鎖の四重螺旋構造の検出には、これらの低分子化合物（リガンド）が使用されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
しかしながら、このような低分子化合物では、極めて多様な配列が形成する類似の４重螺旋構造を配列特異的に識別することができない。とりわけ、ＲＮＡが形成する四重螺旋構造は、配列に依らず立体構造の類似性が極めて高いことが知られており（非特許文献３参照）、従来技術で、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に識別することは不可能といえる。
【０００６】
そこで、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する技術を開発できれば、疾患の診断、治療薬の開発、生理機能の究明等に福音をもたらすことが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nucleic acids Res., 2005; 24(9):2908
【非特許文献２】Curr. Pharm. Des., 2012; 18(14):1992
【非特許文献３】Biochemistry, 2010; 49(21):4554
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する技術を開発することにある。即ち、本発明は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法、及び当該検出方法に使用される検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有するプローブとを含み、且つ前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質として、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にあるものを使用することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出できることを見出した。より具体的には、検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に対して前記(i)リガンドと前記(ii)プローブを接触させると、前記(i)リガンドが四重螺旋構造に特異的に結合し、更に前記(ii)核酸プローブが検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖を特異的に認識して結合することにより、検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖には前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブが結合した状態になり、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質によって蛍光エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）が生じる。この蛍光エネルギー移動を測定することにより、検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖の検出が可能になる。
【００１０】
本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の検出方法及び検出キットを提供する。
項１．  下記第１工程及び第２工程を含むことを特徴とする、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法：
第１工程：被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程；
ここで、前記(i)リガンドが、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドであり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第２工程：前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。
項２．  前記被検核酸試料がＲＮＡを含む試料であり、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に検出する、項１に記載の検出方法。
項３．  前記(i)リガンドが、チオフラビンＴ、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにＮ―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の検出方法。
項４．  前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の３’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端の塩基をｎ位とした場合にｎ−１位〜ｎ−２５位である、項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
項５．  前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の５’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端の塩基をｎ位とした場合にｎ＋１位〜ｎ＋２５位である、項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
項６．  前記(ii)核酸プローブに含まれる塩基数が５〜２０個である、項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
項７．  前記(i)リガンドがチオフラビンＴであり、(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質がＲＯＸである、項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
項８．  核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出するための検出キットであって、
(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出することができる。特に、本発明によれば、配列に依らず立体構造の類似性が極めて高いことが知られているＲＮＡの四重螺旋構造であっても、配列特異的にＲＮＡの四重らせん構造を検出することが可能になっている。
【００１２】
また、本発明を利用した配列特異的な四重螺旋構造の検出技術は、癌細胞等の検出キットの開発、新規バイオマーカーの探索、新たな四重螺旋構造のリガンドとなる化合物の探索、核酸鎖の四重螺旋構造を標的とした医薬の開発、核酸鎖で四重螺旋構造を形成する部位の特定等の検討を加速させ、様々な分野で福音をもたらすことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】グアニジンに富む塩基配列部分がグアニン四量体（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ）を形成して四重螺旋構造（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）が形成されている模式図である。
【図２】核酸鎖の四重螺旋構造部分に(i)リガンドが結合し、且つ当該核酸鎖の四重螺旋構造の近傍にある塩基配列に(ii)核酸プローブがハイブリダイズした状態の模式図である。
【図３】(a)には、実施例１において、条件１（実施例）及び条件２（コントロール１）において２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線を測定した結果を示し、(b)には、実施例１において、条件１（実施例）及び条件３（コントロール２）において２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線を測定した結果を示す。
【図４】実施例２において、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドを共存させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図５】実施例３において、核酸鎖１及びリガンドの有無の各種条件で核酸プローブ１を添加させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して５９３ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例４において、核酸鎖３及びリガンドの共存下で、核酸鎖３に対して相補的な配列を有する核酸プローブ３、又は核酸鎖３に対してハイブリダイズできない核酸プローブ４を添加させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図７】実施例５において、核酸鎖４（ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列）又は核酸鎖５（ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列）及びリガンドの共存下で核酸プローブ３（ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列）を添加させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図８】(a)は、実施例６において、核酸鎖４（ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列）及びリガンドの共存下で核酸プローブ５（ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列）を添加させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図であり、(b)は、実施例６において、核酸鎖５（ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列）及びリガンドの共存下で核酸プローブ６（ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列）を添加させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図９】実施例７において、各種核酸鎖、各種核酸プローブ、及びリガンドを添加し、FERT効率を測定した結果を示す図である。
【図１０】実施例８において、塩基が長い核酸鎖６、リガンド、及び核酸プローブ１を添加させた後に、４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法
本発明の検出方法は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法であって、被検核酸試料に対して(i)特定のリガンドと(ii)特定の核酸プローブを接触させる第１工程、及び蛍光エネルギー移動を測定する第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の検出方法について詳述する。
【００１５】
[検出対象]
図１に示すように、ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸鎖において、グアニジンに富む塩基配列部分がグアニン四量体（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ）を形成して四重螺旋構造（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成することが知られている。本発明の検出方法では、核酸鎖における四重螺旋構造を配列特異的に検出する。
【００１６】
また、本発明の検出対象となる核酸鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれであってもよい。ＲＮＡにおいて、四重螺旋構造は、塩基配列の種類に依らず平行型と呼ばれる立体構造を形成し、従来の四重螺旋構造の検出方法では、配列特異的な検出は不可能であったが、本発明によれば、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に検出することができる。かかる本発明の効果に鑑みれば、本発明の検出対象となる核酸鎖として、好ましくはＲＮＡ、更に好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。
【００１７】
また、本発明の検出対象となる核酸鎖の種類については特に制限されず、四重螺旋構造の検出目的等に応じて適宜設定されるが、例えば、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＲＡＳ、ＢＣＬ２等のガン関連遺伝子；ＨＣＫ等の細胞分化関連遺伝子；ＶＥＧＦ等の血管新生関連遺伝子；ＦＯＳ等翻訳因子；これらのｍＲＮＡ等が挙げられる。
【００１８】
また、本発明の検出対象となる核酸鎖の由来についても、特に制限されず、ヒト又は非ヒト動物から採取した生体サンプル（血液、毛髪細胞、粘膜細胞、皮膚細胞、組織等）であってもよく、またiPS細胞等の人工的に作成された細胞、培養細胞、ＰＣＲ法や化学合成法等によって人工的に製造されたもの等であってもよい。
【００１９】
本発明の検出対象となる核酸鎖の塩基数については、特に制限されないが、例えば、１０〜１０００塩基、好ましくは２５〜２００塩基、更に好ましくは３５〜５０塩基が挙げられる。
【００２０】
本発明は、被検核酸試料において、検出対象となる核酸鎖の四重螺旋構造を定性的又は定量的に検出する方法であり、当該被検核酸試料は、ＲＮＡ又はＤＮＡの公知の抽出法によって調製することができる。
【００２１】
[(i)リガンド]
本発明では、リガンドとして、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質を使用する。
【００２２】
核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合可能で、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質については公知である。このような特性を示す蛍光物質としては、具体的には、チオフラビンＴ（Ｅｘ４５０ｎｍ、Ｅｍ４８５ｎｍ）、銅フタロシアニンテトラスルホン酸又はそのナトリウム塩等の塩（Ｅｘ６６０ｎｍ、Ｅｍ６６８０ｎｍ）、Ｎ―メチルメソポルフィリン（Ｅｘ３９９ｎｍ、Ｅｍ６１０ｎｍ）等が挙げられる。なお、前記蛍光物質に示す括弧内の「Ｅｘ」は励起波長、「Ｅｍ」は四重螺旋構造に結合した状態で当該励起波長の光照射を受けた際に発する蛍光波長である。
【００２３】
これらのリガンドは、後述する(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質との関係に基づいて、蛍光エネルギー移動が生じ得るものを適宜選択すればよい。
【００２４】
[(ii)核酸プローブ]
本発明では、検出対象となる特定の核酸鎖に結合する蛍光標識核酸プローブを使用する。
【００２５】
当該核酸プローブとして、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在する塩基配列であって、当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するものを使用する。
【００２６】
ここで、標的となる四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列（以下、「核酸プローブ標的配列」と表記することもある）とは、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造に前記(i)リガンドが結合した際に、蛍光エネルギー移動が可能な領域に存在する塩基配列である。このような塩基配列にハイブリダイズできるプローブを使用することによって、前記前記(i)リガンドと当該核酸プローブに結合している蛍光物質によって蛍光エネルギー移動を生じさせることが可能になる。
【００２７】
核酸プローブ標的配列として、具体的には、核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端又は３’末端の塩基を起点として、当該起点となる塩基に対して結合している塩基又は１〜１５塩基離れた領域にある塩基を開始点とする塩基配列が挙げられる。より具体的には、核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端の塩基をｎ位とした場合に、ｎ−１位〜ｎ−２５位、好ましくはｎ−２位〜ｎ−１５位の塩基を開始点（３’末端）として核酸鎖の５’末端側に位置する塩基配列；標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端の塩基をｎ位とした場合に、ｎ＋１位〜−ｎ＋２５位、好ましくはｎ＋２位〜−（ｎ＋１５）位の塩基を開始点（５’末端）として核酸鎖の３’末端側に位置する塩基配列が挙げられる。なお、本明細書において、塩基配列における塩基の位置に関する表記は、起点となる塩基をｎ位とした場合に、起点となる塩基から５’末端側にｍ番目に位置する塩基をｎ−ｍ位とし、起点となる塩基から３’末端側にｍ番目に位置する塩基をｎ＋ｍ位とする。
【００２８】
また、検出対象となる核酸鎖において、当該核酸プローブの塩基数（核酸プローブ標的配列の塩基数）については、ハイブリダイズが可能であることを限度として特に制限されないが、例えば５〜５０塩基、好ましくは５〜２５塩基、更に好ましくは１０〜２０塩基が挙げられる。
【００２９】
また、当該核酸プローブは、前記標的配列の相補鎖であることが好ましいが、前記標的配列にハイブリダイズが可能であることを限度として、前記標的配列の相補鎖に対して１又は数個の塩基においてミスマッチがある塩基配列であってもよい。
【００３０】
また、当該核酸プローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれであってもよいが、検出対象となる核酸鎖がＲＮＡである場合は、当該核酸プローブはＤＮＡであることが好ましい。また、当該核酸プローブは、酵素耐性の向上やハイブリダイズを安定に行えるように化学修飾を施した人工核酸（例えば、Locked Nucleic AcidやPeptide Nucleic Aid）であってもよい。
【００３１】
検出対象となる核酸鎖の塩基配列、及び四重螺旋構造を形成する塩基配列は公知であるので、当該核酸プローブに備えさせるべき塩基配列は、当業者であれば適宜設定することが可能である。
【００３２】
また、当該核酸プローブとして、前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動が生じ得る蛍光物質で標識したものを使用する。このような蛍光物質としては、使用する前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動が可能なものを適宜設定すればよいが、例えば、ＲＯＸ（5'-calboxy-X-rhodamine）（Ｅｘ５７６ｎｍ、Ｅｍ６０１ｎｍ）、ＰＩ（Propidium iodide 3,8-diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenyl-, diiodide）（Ｅｘ５３５ｎｍ、Ｅｍ６１７ｎｍ）、ヘキシジウムイオジド（3,8-diamino-5-hexyl-6-phenyl-, iodide）（Ｅｘ５１８ｎｍ、Ｅｍ６００ｎｍ）、ＹＯＹＯ−３イオジド(Quinolinium, 4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-, diiodide)（Ｅｘ６１２ｎｍ、Ｅｍ６３１ｎｍ）、ＬＤＳ７５１(Quinolinium, 6-(dimethylamino)-2-[4-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3-butadienyl]-1-ethyl, perchlorate)（Ｅｘ５５１ｎｍ、Ｅｍ７１３ｎｍ）、ＤＡＰＩ(1H-Indole-6-carboximidamide, 2-[4-(aminoiminomethyl)phenyl]-, dihydrochloride)（Ｅｘ３５８ｎｍ、Ｅｍ４６１ｎｍ）、ヘキスト33342(2,5'-Bi-1H-benzimidazole, 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl))（Ｅｘ３５０ｎｍ、Ｅｍ４６１ｎｍ）、ＴＯＴＯ−３イオジド(4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-, diiodide)（Ｅｘ６４２ｎｍ、Ｅｍ６６１ｎｍ）、アクリジンオレンジ(3,6-Acridinediamine, N,N,N',N'-tetramethyl-, monohydrochloride) （Ｅｘ４６０ｎｍ、Ｅｍ６５０ｎｍ）等が挙げられる。
【００３３】
当該核酸プローブにおいて、前記蛍光物質の標識部位については、前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動が生じ得ることを限度として特に制限されず、当該核酸プローブを構成する核酸の５’末端、３’末端、又は非末端領域のいずれであってもよい。前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動の効率を高めるという観点から、当該核酸プローブが、四重螺旋構造を有する核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端側にハイブリダイズする場合には、当該核酸プローブを構成する核酸の５’末端に蛍光物質が標識されていることが好ましい。また、四重螺旋構造を有する核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端側にハイブリダイズする場合には、当該核酸プローブを構成する核酸の３’末端に蛍光物質が標識されていることが好ましい。
【００３４】
[(i)リガンドと(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の関係]
本発明では、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が蛍光エネルギー移動を起すことによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出される。即ち、本発明では、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質は、それぞれ蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にあるものが選択して使用される。
【００３５】
前記(i)リガンドがドナー蛍光物質であり、且つ前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質がアクセプター蛍光物質であってもよく、また、前記(i)リガンドがアクセプター蛍光物質であり、且つ前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質がドナー蛍光物質であってもよい。
【００３６】
蛍光エネルギー移動を起すドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の組み合わせについては公知であり、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の組み合わせについては適宜設定することが可能である。具体的には、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴをドナー蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるアクセプター蛍光物質として、ＲＯＸ、ＰＩ又はヘキシジウムイオジドを選択すればよい。また、例えば、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴをアクセプター蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるドナー蛍光物質として、ＤＡＰＩ又はヘキスト33342を選択すればよい。また、例えば、前記(i)リガンドとしてＮ―メチルメソポルフィリンをドナー蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるアクセプター蛍光物質として、ＹＯＹＯ−３イオジド又はＬＤＳ７５１を選択すればよい。また、例えば、前記(i)リガンドとして銅フタロシアニンテトラスルホン酸又はそのナトリウム塩等の塩をドナー蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるアクセプター蛍光物質として、ＴＯＴＯ−３イオジド又はアクリジンオレンジを選択すればよい。
【００３７】
これらの(i)リガンドと(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の組み合わせの中でも、好ましくは、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴをドナー蛍光物質として使用し、(ii)核酸プローブの標識にＲＯＸをアクセプター蛍光物質として使用する組み合わせ態様が挙げられる。
【００３８】
[第１工程]
本発明の検出方法における第１工程では、被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる。被検核酸試料に、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖が含まれている場合には、当該核酸鎖の四重螺旋構造部分に前記(i)リガンドが結合し、且つ当該核酸鎖の四重螺旋構造の近傍にある塩基配列に前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズした状態になる（図２に示す状態）。このような状態で、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖と、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブとが複合化することにより、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の間で蛍光エネルギー移動が生じる状態になる。なお、図２には、便宜上、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖としてＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（総塩基数３４、５’末端側から１〜１８位の塩基配列において四重螺旋構造を形成）、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴ、前記(ii)核酸プローブとしてＲＯＸ標識されたＤＮＡプローブ（総塩基数１５、前記核酸鎖の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）を使用した場合の模式図が示されている。
【００３９】
被検核酸試料に対して前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブを接触させるには、前記(i)リガンドが四重螺旋構造に結合可能で且つ前記(ii)核酸プローブが核酸鎖にハイブリダイズできる反応溶液中に、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを添加して共存させればよい。このような反応溶液は、使用する前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブの種類等に応じて適宜設定すればよく、例えば、緩衝液が好適に使用される。また、当該反応溶液のｐＨとしては、例えば３〜１０、好ましくは６〜９が挙げられる。また、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴを使用する場合であれば、チオフラビンＴが四重螺旋構造に結合するためには、一価のカチオン（ナトリウム、カリウム、リチウム等）が必要になるため、一価のカチオンが１〜１０００ｍＭ程度存在する溶液、好ましくはＫＣｌを１〜２００ｍＭ程度含む溶液を使用すればよい。
【００４０】
反応溶液中の被検核酸試料の濃度については、特に制限されないが、例えば、当該被検核酸試料に含まれる核酸が総量で１０〜１００００ｎＭ、好ましくは１００〜１０００ｎＭとなるように設定すればよい。
【００４１】
また、反応溶液中の前記(i)リガンドの濃度については、特に制限されないが、例えば、１００〜５００００ｎＭ、好ましくは１０００〜１００００ｎＭとなるように設定すればよい。
【００４２】
更に、反応溶液中の前記(ii)核酸プローブの濃度については、特に制限されないが、例えば、１〜５００００ｎＭ、好ましくは１０〜１００００ｎＭとなるように設定すればよい。
【００４３】
また、反応溶液中で、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させるのに先立って、反応液中で被検核酸試料に対して５０〜１００℃程度、好ましくは８５〜９５℃程度で、０．５〜１０分間程度、好ましくは１〜３分間程度加熱することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を一本鎖状態に一旦解いた後に、０．１〜５℃／分程度、好ましくは０．５〜１℃／分で冷却してアニーリングさせて再度四重螺旋構造を形成させることが望ましい。このように加熱処理後にアニーリングさせることによって、検出対象となる核酸鎖の四重螺旋構造が反応溶液中で安定化され、より一層効率的に四重螺旋構造を有する核酸鎖を検出することが可能になる。なお、当該加熱処理は、反応溶液中に被検核酸試料を添加した後に行えばよく、当該加熱処理に供される反応溶液は、被検核酸試料以外に、前記(i)リガンド及び／又は前記(ii)核酸プローブが既に添加されている状態であってもよい。勿論、前記加熱処理による被検核酸試料のアニーリングは、行わなくてもよい。
【００４４】
[第２工程]
本発明の検出方法における第２工程では、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させた状態で、前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する。前述するように、被検核酸試料に検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」が含まれている場合には、蛍光エネルギー移動が生じるので、当該蛍光エネルギー移動を測定することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に定性的又は定量的に求めることが可能になる。
【００４５】
第２工程においてドナー蛍光物質を励起させるには、ドナー蛍光物質の種類に応じた励起光を照射すればよい。
【００４６】
また、第２工程において蛍光エネルギー移動を測定するには、アクセプター蛍光物質の蛍光強度を測定してもよく、またドナー蛍光物質の蛍光硬度を測定してもよい。
【００４７】
アクセプター蛍光物質の蛍光強度を測定する場合であれば、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の量が多い程、高い蛍光強度を示すことになる。
【００４８】
また、ドナー蛍光物質の蛍光硬度を測定する場合であれば、予め、アクセプター蛍光物質を添加しない状態でのドナー蛍光物質の蛍光硬度をコントロールとして測定しておき、当該コントロールのドナー蛍光物質の蛍光強度に対して、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させた状態でのドナー蛍光物質の蛍光強度が低い程、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の量が多いと判定される。
【００４９】
また、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の濃度が既知の標準サンプルを用いて、予め濃度と測定される蛍光強度の関係を示す標準曲線を作成しておくことにより、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の量を定量することも可能になる。
【００５０】
２．核酸鎖の四重螺旋構造の検出するためのキット
本発明の検出キットは、前記「１．核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法」を実施するために使用されるキットであって、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブを含むことを特徴とする。
【００５１】
本発明の検出キットに含まれる前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブの内容については、前記「１．核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法」に示す通りである。
【００５２】
また、本発明の検出キットには、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブ以外に、必要に応じて、前述する反応溶液、実験手順書等が含まれていてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００５４】
実施例１：四重螺旋構造を有する核酸鎖、リガンド、及び核酸プローブの複合体の形成の確認
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖２：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号２：5'-AGAAGAGAAGGAAGA-3'、四重螺旋構造の形成なし）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ２：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号４：5'-TCTTCCTTCTCTTCT-3'、配列番号２の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００５５】
２．実験方法
（条件１：実施例）
反応溶液中に、２０μＭの核酸鎖１、２０μＭの核酸プローブ１、及び１０μＭのリガンドを添加して混合した後に、０〜９０℃温度領域における２６０ｎｍにおける吸光度（２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線）と、０〜９０℃温度領域における２９５ｎｍにおける吸光度（２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線）を、紫外可視近赤外分光光度計（UV-1800、島津製作所社製）を用いて測定した。
（条件２：コントロール１）
反応溶液中に、２０μＭの核酸鎖２、２０μＭの核酸プローブ２、及び１０μＭのリガンドを添加して混合した後、前記条件１と同様に、２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線を測定した。
（条件３：コントロール２）
反応溶液中に、２０μＭの核酸鎖１、及び１０μＭのリガンドを添加して混合した後、前記条件１と同様に、２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線を測定した。
【００５６】
３．結果
得られた結果を図３に示す。図３から明らかなように、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドを共存させた場合（条件１）では、核酸鎖２、核酸プローブ２及びリガンドを共存させた場合（条件２）とは２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線が異なっているが融解挙動が見られた。更に、核酸鎖１及びリガンドを共存させた場合（条件３）とは２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線が異なっていたが、融解挙動が見られた。２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解挙動と２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解挙動は、二重螺旋構造の熱変性と四重螺旋構造の熱変性を示している。即ち、本実験結果から、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドを共存させることによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖と、リガンドと、核酸プローブによって複合体が形成されていることが示された。
【００５７】
実施例２：蛍光エネルギー移動を利用した四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的検出
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００５８】
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖１及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ１を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００５９】
３．結果
得られた結果を図４に示す。図４に示されているように、核酸プローブ１の添加量を増やすほど、リガンドであるチオフラビンＴの蛍光強度（４８５ｎｍ）が減少し、核酸プローブ１に使用されているＲＯＸ蛍光強度（６０１ｎｍ）が増加する傾向が確認された。即ち、本結果から、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドが複合体を形成し、リガンドであるチオフラビンＴから核酸プローブ１のＲＯＸに蛍光エネルギー移動が生じ、チオフラビンＴの蛍光強度の低下とＲＯＸの蛍光強度の上昇が起こったことが明らかとなった。
【００６０】
実施例３：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有するＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列の配列特異的検出
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００６１】
２．実験方法
反応溶液中に０又は１μＭの核酸鎖１、及び０又は１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ１を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して５９３ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００６２】
３．結果
得られた結果を図５に示す。図５に示されているように、核酸鎖１及びリガンドのいずれか一方又は双方を塩化しなかった場合には、ＲＯＸの蛍光波長に対応する５９３ｎｍの蛍光強度の上昇は観察されなかったが、核酸鎖１、リガンド及び核酸プローブ１が添加されたされた場合には、５９３ｎｍの蛍光強度の著しい上昇が認められた。即ち、本結果から、核酸プローブ１が核酸鎖１に配列特異的に結合することによって、リガンドであるチオフラビンＴから核酸プローブ１のＲＯＸに蛍光エネルギー移動が生じていることが明らかとなった。
【００６３】
実施例４：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有するＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列の検出における配列特異性の評価
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖３：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号５：5'-GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGUCCCGGCGGGGCGGAG-3'、５’末端側から１〜２０位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ３：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号６：5'-CTCCGCCCCGCCGGG-3'、配列番号５の５’末端側から２２〜３６位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ４：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号７：5'-CTCCGAAAAACCGGG-3'、配列番号５の５’末端側から２２〜２６及び３２〜３６位の塩基配列に対して相補的な塩基配列であるが、配列番号５の５’末端側から２７〜３１位塩基配列に対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基配列である）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００６４】
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖３及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ３又は核酸プローブ４を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００６５】
３．結果
得られた結果を図６に示す。図６に示されているように、核酸鎖３及びリガンドの存在下で、核酸鎖３に対して相補的な配列を有する核酸プローブ３を添加した場合には、核酸プローブ３の添加量の増加に伴って、リガンドであるチオフラビンＴの蛍光波長に対応する４８５ｎｍの蛍光強度の低下、及びＲＯＸの蛍光波長に対応する５９３ｎｍの蛍光強度の上昇が認められた。一方、核酸鎖３及びリガンドの存在下で、核酸鎖３に対してハイブリダイズできない核酸プローブ４を添加した場合には、核酸プローブ４の添加量を増加させても、チオフラビンＴの蛍光強度の減少とＲＯＸの蛍光強度の上昇は共に認められなかった。即ち、本結果から、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖を配列特異的に検出可能になることが明らかとなった。
【００６６】
実施例５：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の検出における核酸プローブの直交性の評価
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖４：ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列（配列番号８：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、５’末端側から１〜１８位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖５：ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列（配列番号９：5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、５’末端側から１７〜４１位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ３：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号６：5'-CTCCGCCCCGCCGGG-3'、配列番号５の５’末端側から２２〜３６位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００６７】
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖４又は核酸鎖５、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ３を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００６８】
３．結果
得られた結果を図７に示す。図７から明らかなように、核酸鎖４及び核酸鎖５のいずれの場合でも、核酸プローブ３の添加量を増加させても、チオフラビンＴの蛍光強度の減少とＲＯＸの蛍光強度の上昇は共に認められなかった。即ち、本結果から、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用しない場合には、蛍光エネルギー移動が生じないことが確認された。
【００６９】
実施例６：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的検出における一般性
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖４：ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列（配列番号８：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、５’末端側から１〜１８位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖５：ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列（配列番号９：5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、５’末端側から１７〜４１位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ５：５’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１０：5'-CATGCGGCAGGCCGC-3'、配列番号８の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ６：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１１：5'-GAGAAAGAAGAGGAG-3'、配列番号９の５’末端側から１〜１５位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００７０】
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖４、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ５を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００７１】
また、別途、反応溶液中に１μＭの核酸鎖５、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ６を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００７２】
３．結果
得られた結果を図８に示す。図８から明らかなように、ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列である核酸鎖４、及びＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列である核酸鎖５のいずれの場合でも、当該核酸鎖に相補的な配列を有する核酸プローブとリガンド（チオフラビンＴ）を添加した場合に、核酸プローブの添加量の増加に伴って、チオフラビンＴの蛍光強度の減少とＲＯＸの蛍光強度の上昇が認められ、蛍光エネルギー移動が生じたことが確認された。即ち、本結果からも、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖を配列特異的に検出可能になることが明らかとなった。
【００７３】
実施例７：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的検出における一般性
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖４：ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列（配列番号８：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、５’末端側から１〜１８位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖５：ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列（配列番号９：5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、５’末端側から１７〜４１位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ５：５’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１０：5'-CATGCGGCAGGCCGC-3'、配列番号８の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ６：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１１：5'-GAGAAAGAAGAGGAG-3'、配列番号９の５’末端側から１〜１５位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００７４】
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖１、核酸鎖４又は核酸鎖５、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、１μＭの核酸プローブ１、核酸プローブ５又は核酸プローブ６を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して、４８５ｎｍの蛍光強度（ドナー蛍光物質の蛍光強度）を測定した。また、核酸プローブを添加しないこと以外は、上記と同様の条件で、４８５ｎｍの蛍光強度（ドナー蛍光物質の蛍光強度）を測定した。次いで、下記算出式に基づいて、FRET効率を求めた。
FRET効率＝１−（ＦDA／ＦD）
ＦDA：アクセプター蛍光物質（核酸プローブ）存在下でのドナー蛍光物質の蛍光強度
ＦD：アクセプター蛍光物質（核酸プローブ）非存在下でのドナー蛍光物質の蛍光強度
【００７５】
３．結果
得られた結果を図９に示す。図９に示されているように、核酸鎖と当該核酸鎖にハイブリダイズ可能な核酸プローブの組み合わせの場合においてのみ、高いFRET効率が認められた。即ち、本結果からも、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的な検出が可能になることが明らかとなった。
【００７６】
実施例８：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する調査核酸鎖の配列特異的な検出
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖６：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１２：5'-GCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGUGCUAGCUCGGGCCGGGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAGUGGCGACUCGGCGCUCGGAA-3'、５’末端側から５２〜６９位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１２の５’末端側から７１〜８５位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
【００７７】
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖６、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ１を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【００７８】
３．結果
得られた結果を図１０に示す。図１０に示されているように、核酸鎖が長鎖ＲＮＡであっても、当該核酸鎖にハイブリダイズ可能な核酸プローブとリガンド（チオフラビンＴ）を共存させることにより、蛍光エネルギー移動が生じることが確認された。即ち、本結果から、比較的長い核酸鎖を検出対象としても、四重螺旋構造を配列特異的に検出できることが明らかとなった。
【図１】
2015062388.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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