(57)【要約】【課題】ヨーネ病遺伝子検査において、検出感度を落とすことなく多検体処理を可能とするプール処理技術を提供すること。また、当該プール処理技術を応用したヨーネ病遺伝子検査のスクリーニング検査法および精密検査法を提供すること。【解決手段】複数の異なる被検体由来の糞便サンプルを混合し、遠心分離した後に上清を廃棄することにより濃縮し、当該濃縮糞便からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病のスクリーニング検査法、並びに、同一の被検体由来の糞便サンプルを、遠心分離した後に上清を廃棄することにより濃縮し、当該濃縮糞便からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病の精密検査法、を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心分離により濃縮された複数の糞便サンプルの混合物からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病の遺伝子検査法。
【請求項２】
複数の異なる被検体由来の糞便サンプルを混合し、遠心分離した後に上清を廃棄することにより濃縮し、当該濃縮糞便からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病のスクリーニング検査法。
【請求項３】
同一の被検体由来の糞便サンプルを、遠心分離した後に上清を廃棄することにより濃縮し、当該濃縮糞便からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病の精密検査法。
【請求項４】
前記糞便サンプルが２〜５０の異なる被検体由来のものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記遠心分離が900×ｇ，15分間以上に相当する条件下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ヨーネ菌遺伝子検査が、PCRによりヨーネ菌に特異的なDNA塩基配列を増幅した後、解離温度解析によりヨーネ菌特異的増幅産物を定性的に検出するか、あるいは、ヨーネ菌特異的遺伝子量を定量することにより、サンプル中のヨーネ菌遺伝子を検出するものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記糞便サンプルが牛、羊または山羊由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヨーネ病の遺伝子検査法に関し、特にヨーネ病リアルタイムPCR検査において多検体処理を可能とするための糞便のプール処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨーネ病は、わが国の酪農・肉牛経営に甚大な損害を与えている細菌性伝染病である。有効な治療法がないヨーネ病では定期的な検査による感染・排菌牛の早期摘発と淘汰が防疫上重要である。ヨーネ病の診断法において糞便培養検査によるヨーネ菌分離が最も信頼性が高いが、検査期間が３ヵ月以上と長期間であるため、迅速な対応がとれないといった問題がある。
【０００３】
現在、糞便培養検査に代わる迅速な抗原検出手法として、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構  動物衛生研究所より定量的リアルタイムPCR検査法（非特許文献１参照；以下、「qPCR」ということもある。）が開発され、農林水産省のヨーネ病検査要領にも採用されている。当該検査法については、現在２種類のDNA抽出キット（例えば特許文献１参照）が指定されている。両キットに共通する問題として、個体の診断用であるために、多頭飼育農場で実施する場合、多大な時間、資金及び労力が必要という点がある。
【０００４】
このことから、多検体処理を可能とするため糞便のプール処理の検討（例えば非特許文献２参照）がなされている。しかし、糞便にはPCR阻害物質が含まれるため、糞便液を濃縮するとPCR阻害物質も濃縮され、PCRが正常に反応しないと考えられている。そのため、これらのプール処理方法では、プールした糞便を濃縮せずに一部分を回収（平均化）してDNA抽出に用いることから、検出感度が低下する問題があり実用化に至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−０８０８５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構  動物衛生研究所、「ヨーネ病検査マニュアル」、[online]、2013年3月29日、[2013年8月30日検索]、インターネット（URL:http://www.naro.affrc.go.jp/niah/disease/files/NIAH_yone_kensahou_130329.pdf）
【非特許文献２】本間ら、北海道獣医師会雑誌、第53巻、第410頁（2009年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヨーネ病遺伝子検査において、検出感度を落とすことなく多検体処理を可能とするプール処理技術を提供することを課題とする。
また、本発明は、当該プール処理技術を応用したヨーネ病遺伝子検査のスクリーニング検査法および精密検査法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、多検体処理を行う糞便サンプルの‘全量’を遠心分離により濃縮して１サンプルにまとめてヨーネ病遺伝子検査に供試した場合にも、サンプル中に含まれる極微量のヨーネ菌遺伝子を確実に検出できることを見出し、本発明を完成させたのである。
【０００９】
すなわち、請求項１に係る本発明は、遠心分離により濃縮された複数の糞便サンプルの混合物からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病の遺伝子検査法である。
請求項２に係る本発明は、複数の異なる被検体由来の糞便サンプルを混合し、遠心分離した後に上清を廃棄することにより濃縮し、当該濃縮糞便からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病のスクリーニング検査法である。
請求項３に係る本発明は、同一の被検体由来の糞便サンプルを、遠心分離した後に上清を廃棄することにより濃縮し、当該濃縮糞便からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病の精密検査法である。
請求項４に係る本発明は、前記糞便サンプルが２〜５０の異なる被検体由来のものである、請求項１または２記載の方法である。
請求項５に係る本発明は、前記遠心分離が900×ｇ，15分間以上に相当する条件下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法である。
請求項６に係る本発明は、ヨーネ菌遺伝子検査が、PCRによりヨーネ菌に特異的なDNA塩基配列を増幅した後、解離温度解析によりヨーネ菌特異的増幅産物を定性的に検出するか、あるいは、ヨーネ菌特異的遺伝子量を定量することにより、サンプル中のヨーネ菌遺伝子を検出するものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法である。
請求項７に係る本発明は、前記糞便サンプルが牛、羊または山羊由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプール処理法によれば、ヨーネ病遺伝子検査において、検出感度を落とすことなく多検体処理を行うことが可能となり、ヨーネ病のスクリーニング検査技術が初めて確立される。
また、本発明のプール処理法を応用することにより、ヨーネ病の精密検査技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１での糞便のプール処理試験の操作（3プールの場合）を示す図である。
【図２】実施例１での糞便のプール処理試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例２での糞便のプール処理試験の結果を示すグラフである。
【図４】実施例３での糞便のプール処理試験の操作（10プールの場合）を示す図である。
【図５】実施例３での遠心処理時間別のプール処理試験の結果を示すグラフである。
【図６】実施例４での陽性糞便0.001pg/well群のプール処理試験の結果を示すグラフである。
【図７】実施例４での陽性糞便0.0005pg/well群のプール処理試験の結果を示すグラフである。
【図８】実施例５での濃縮試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、遠心分離により濃縮された複数の糞便サンプルの混合物からDNAを抽出してヨーネ病遺伝子検査に供試することを特徴とする、ヨーネ病の遺伝子検査法を提供するものである。
【００１３】
本発明における「ヨーネ病」とは、マイコバクテリウム属のヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）の経口感染によって起る反芻獣の慢性肉芽腫性腸炎であり、家畜伝染病予防法における法定伝染病である。
【００１４】
本発明における「糞便サンプル」としては、牛、山羊、羊などの糞またはその懸濁液が挙げられる。糞便懸濁液としては、たとえば、糞便1.0gに対し15〜25mlの溶媒を添加し、激しく混合撹拌した後、20〜40分間静置した後の上清、が好適に用いられる。懸濁液の溶媒としては、生理食塩水、滅菌蒸留水などが好適である。
【００１５】
〔プール処理工程〕
本発明では、多検体処理を行う目的で複数の糞便サンプルを１サンプルにまとめることを、「プール処理」または「プールする」という。本発明の方法は、複数の糞便サンプルをプールし、プール後の糞便からヨーネ菌DNAを抽出して、ヨーネ病遺伝子検査を行うことを特徴とする。
【００１６】
従来の糞便のプール法では、プールした糞便懸濁液の一部分からDNAを抽出し、遺伝子検査に供していた。しかし、この方法では糞便中のヨーネ菌を全量回収できないため、糞便サンプル中にヨーネ菌がごく微量しか含まれない場合には、ヨーネ菌DNAを検出できないおそれがあった。
【００１７】
そこで本発明では、プールした糞便サンプルを濃縮し、ヨーネ菌を‘全量’回収してDNA抽出に供試することで、ヨーネ病遺伝子検査によるDNA検出率を向上させることができた。なお、糞便サンプルを5倍濃縮しても、リアルタイムPCRによるヨーネ菌DNAの定量結果は予測値とほぼ同じであった。
【００１８】
本発明において、糞便サンプルを「濃縮する」とは、糞便サンプル中のヨーネ菌濃度を高めることをいう。具体的な濃縮手段は限定されないが、例えば、糞便サンプルを遠心分離してヨーネ菌を沈降させた後に、上清を除去（廃棄）する操作により、糞便サンプルを濃縮することができる。
【００１９】
濃縮後に残存する糞便サンプルの量（遠心後に廃棄する上清の量）は、ヨーネ菌DNAを抽出するために必要なサンプル量に準じて適宜決定することができる。市販のヨーネ菌DNA抽出キットを用いてDNA抽出を行う場合、DNA抽出に必要とされる糞便サンプルの量は当該キットにより規定されるため、濃縮後のサンプル量は、当該キットでの規定量に応じて決定すればよい。
【００２０】
本発明における「遠心分離」の条件は、例えば室温にて遠心加速度900×gで遠心時間15分間以上、より好ましくは15〜45分間とすることができる。糞便サンプル中のヨーネ菌が沈殿すれば、遠心分離の条件は上記の条件に限定されない。ヨーネ菌が十分に沈殿しない場合には遠心力を高めても良いし、遠心時間を延長してもよい。
【００２１】
本発明のプール処理法は、上記の‘濃縮工程’をいつ行うかによって、以下の２つの態様に分けることができる。
【００２２】
〔本発明の第一の態様〕
各糞便サンプルについて濃縮を繰り返す方法、すなわち、容器に１つの糞便サンプルを添加し、遠心分離し、上清を廃棄する、という操作を、プールする糞便サンプルの数だけ繰り返すことにより、プール処理を行う方法である（図１参照）。なお、図１は3プールの場合、つまり3サンプルをプールする場合のプール処理法を例示するものである。
この方法の利点としては、プール処理用の大容量の容器を必要とせず、市販のヨーネ菌DNA抽出キットに含まれているような1検体用のチューブ等を用いてプール処理を行えること、などが挙げられる。
【００２３】
〔本発明の第二の態様〕
全ての糞便サンプルをプールした後に濃縮する方法、すなわち、容器にプールする複数の糞便サンプルを全て添加・混合した後に、遠心分離し、上清を廃棄する、というプール処理法である（図４参照）。なお、図４は10プールの場合、つまり10サンプルをプールする場合のプール処理法を示す。
この方法の利点としては、遠心分離処理が１回で済むため、プール処理を短時間で行えること、などが挙げられる。
【００２４】
上記２つの態様のいずれにおいても、プールする「複数の」糞便サンプルは、例えば2〜50サンプルとすることができ、好ましくは2〜40サンプル、より好ましくは2〜30サンプル、さらに好ましくは2〜20サンプル、特に好ましくは2〜15サンプル、最も好ましくは2〜10サンプルとすることができる。プールする糞便サンプル数が50を超えると、遺伝子検査におけるヨーネ菌DNAの検出率が低下するため好ましくない。
【００２５】
〔DNA抽出工程〕
本発明では、次に、上述のプール処理工程によって得られる濃縮糞便からDNAを抽出する。
本発明において、ヨーネ病遺伝子検査に供するヨーネ菌DNAを糞便サンプルから抽出する方法としては、細胞を破壊し、夾雑物を除去して核酸を抽出できる方法であれば特に限定はなく、例えば市販されているヨーネ菌DNA抽出用キット（具体例：「ヨーネスピン」（登録商標）、（株）ファスマック製）を用いて、糞便中のDNAを抽出することができる。
【００２６】
〔ヨーネ病遺伝子検査〕
次に、上述のDNA抽出工程によって得られるDNA液をヨーネ病遺伝子検査に供試する。
本発明における「ヨーネ病の遺伝子検査」とは、ヨーネ菌の特異的遺伝子や挿入配列（IS）を利用して、Polymerase Chain Reaction（PCR）によりサンプル中のヨーネ菌遺伝子を検出する方法である。
【００２７】
具体的には、前述の動物衛生研究所が開発したqPCR（非特許文献１参照）では、ヨーネ菌のみが持つIS900中の特定塩基配列を、PCRにより試験管内で増幅する。この時、二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素であるSYBR Green Iを反応系に添加しておくことにより、反応の進行に伴って増幅された二本鎖DNAにSYBR Green Iが取り込まれ（インターカレーション）、DNAへの結合により蛍光強度が増加する。PCRの伸展反応過程で反応液の蛍光強度を測定することにより、PCR産物の増加をリアルタイムで検出することが可能となる。
【００２８】
インターカレーション法によるリアルタイムPCRでは、非特異的なDNAが増幅された場合にも蛍光強度が増す為、特異的反応と非特異反応を区別する為に解離温度解析（メルトカーブ解析、あるいはディソシエーション解析）を行う。２本鎖DNAはその塩基配列によりTm値（２本鎖DNAの半分が１本鎖に解離する温度）が決まる為、PCR後に反応液の温度を少しずつ上昇させ、２本鎖が１本鎖に分かれる温度、つまりDNAに取り込まれていた蛍光色素が外れて、蛍光強度が急激に低下する温度を分析する。
【００２９】
ヨーネ菌指示陽性DNAを用いて増幅されるIS900のPCR産物について解離温度（１本鎖に分かれる温度）を求め、被検サンプルでの解離温度が指示陽性DNAでのそれと一致すれば、被検サンプルが陽性（ヨーネ菌DNAを含む）であると判定できる。一方、陽性指示DNAでの解離温度と異なる解離温度を示した検体は、陰性（ヨーネ菌DNAを含まない）であると判定できる。
【００３０】
さらに、リアルタイムPCR検査ではPCRによりターゲット遺伝子の増幅が指数関数的に起こる領域内に閾値を設定し、蛍光増幅曲線が閾値と交差する点をThreshold cycle（Ct）値とし、Ct値から各サンプル中のターゲット遺伝子の初期濃度を算出することが可能である。
【００３１】
被検サンプル中のヨーネ菌DNA濃度（ヨーネ菌特異的遺伝子量）を定量した結果、ヨーネ菌DNAが検出された被検サンプルは陽性（ヨーネ菌DNAを含む）であると判定できる。また、ヨーネ菌DNAが検出されなかった被検サンプルは陰性（ヨーネ菌DNAを含まない）であると判定できる。
【００３２】
このように、本発明の「ヨーネ病の遺伝子検査」においては、PCRによりヨーネ菌に特異的なDNA塩基配列を増幅した後、解離温度解析によりヨーネ菌特異的増幅産物を定性的に検出するか、あるいは、ヨーネ菌特異的遺伝子量を定量することにより、サンプル中のヨーネ菌遺伝子を検出することができる。
【００３３】
〔ヨーネ病のスクリーニング検査法〕
本発明の遺伝子検査法は、プールする複数の糞便サンプルが、複数の異なる被検体由来のものである場合は、遺伝子検査による‘ヨーネ病のスクリーニング検査法’といえる。本発明のプール処理法をヨーネ病のスクリーニング検査技術に活用することで、迅速かつ極めて確実性の高いヨーネ病診断が可能となる。
本発明のスクリーニング検査で被検サンプルが陽性と判定された場合は、プールした各糞便サンプルについて定法により個別のヨーネ病判定を行うことになる。
【００３４】
〔ヨーネ病の精密検査法〕
また、本発明において、同一の被検体由来の複数の糞便サンプルをプールする、言い換えれば、同一の被検体から‘通常よりも多い量’の糞便サンプルを採取する場合には、糞便中のヨーネ菌を濃縮することで、遺伝子検査におけるヨーネ菌DNA検出率を上げることができる。
したがって、プールする複数の糞便サンプルが同一の被検体に由来するものである場合、本発明の遺伝子検査法は、遺伝子検査による‘ヨーネ病の精密検査法’といえる。
【００３５】
上記において、糞便サンプルの‘通常よりも多い量’とは、例えば前述の動物衛生研究所が開発したqPCR（非特許文献１参照）に従う場合は、1gの糞便を20mlの溶媒で希釈した糞便懸濁液から1mlを採ってDNA抽出することから、通常量を1mlとして、その2〜10倍量（2〜10ml）とすることができ、好ましくは2〜7倍量（2〜7ml）、より好ましくは2〜6倍量（2〜6ml）、さらに好ましくは2〜5倍量（2〜5ml）とすることができる。プールする糞便の量が上記の上限を超えると、糞便中のPCR阻害物質によりヨーネ菌DNAの定量が正確に行われないため好ましくない。
【実施例】
【００３６】
以下に試験例、実施例、および比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００３７】
（１）糞便
ヨーネ菌実験感染牛の糞便をヨーネ菌陽性糞便（以下、陽性糞便）として、以後の試験に供した。また、独立行政法人家畜改良センターで飼養されるヨーネ菌非感染牛の糞便をヨーネ菌陰性糞便（以下、陰性糞便）として、以後の試験に供した。
【００３８】
（２）ヨーネ菌特異遺伝子の定量
以後の試験においては、動物衛生研究所のヨーネ病検査マニュアル（前記非特許文献２；以下、定法）に基づいて、ヨーネ菌核酸調製試薬（ヨーネスピン（登録商標）、（株）ファスマック、神奈川）を用い糞便より核酸抽出を行い、リアルタイムPCR装置（7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems, 東京）によりヨーネ菌DNAを定量した。
【００３９】
実施例１（本発明の第１の態様：糞便のプール処理試験（3,5,6プール））
（１）糞便液の調製
定法に基づき、滅菌蒸留水で陽性糞便を20倍（W/V）に希釈し、30分間激しく混合撹拌した。30分間静置した後、上清を採取し‘陽性糞便液’とした。陽性糞便液をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２倍（n＝3）、４倍（n＝4）及び８倍（n＝4）に希釈した各1mlについて、ヨーネ菌特定遺伝子量（以下、DNA量）を定量した。
また、陰性糞便についても、上記と同様に滅菌蒸留水で20倍（W/V）に希釈した上清（以下、陰性糞便液）を作製し、1ml中のヨーネ菌DNA量を定量した。
【００４０】
その結果、陽性糞便液2倍希釈，4倍希釈及び8倍希釈のDNA量は、それぞれ0.0197 ± 0.0049 pg/well，0.0110 ±0.0029 pg/well，0.0044 ±0.0032 pg/well であった。陰性糞便液からはDNA が検出されなかった。
【００４１】
8倍希釈では0.005pg/well 以下になったため、下記の試験では、8倍希釈した陽性糞便液を用いることとした。陽性糞便を再度、8倍に希釈後、下記の試験に供するまで凍結保存した。
【００４２】
（２）糞便のプール処理試験
前述の陽性糞便液及び陰性糞便液を用い、3（n＝4）、5（n＝4）及び6プール処理（n＝4）した。
すなわち、「ヨーネスピン」に添付されているジルコニアビーズ入り2mlチューブ（以下、ビーズチューブ）に陽性糞便液を1ml添加し、遠心分離（20K×g、5分間、室温）後、上清を除去した。次に、その同じビーズチューブに陰性糞便液1ml を添加し、遠心分離（20K×g、5分間、室温）後、上清を除去する操作を、それぞれ3プール処理区は2回、5プール処理区は4回、6プール処理区は5回反復した（図１）。
なお、図１は3プールの場合のプール処理法を示す。5プールの場合は※を4回、6プールの場合は※を5回反復後、定法の操作に戻り核酸抽出を行う。
【００４３】
また、陰性糞便液のみを用い、3（n＝4）、5（n＝4）及び6プール処理（n＝4）した。
すなわち、ビーズチューブに陰性糞便液を1ml 添加し、遠心分離（20K×g、5分間、室温）後、上清を除去する操作を3プールは3回、5プールは5回、6プールは6回反復した。
【００４４】
プール処理後、定法の操作に従ってDNAを定量した。
すなわち、プール処理後の各ビーズチューブに対し、以下に示す定法のプロトコルの3.以降の操作を行い、DNA液を得た。
【００４５】
〔「ヨーネスピン」を用いる糞便からのDNA抽出〕
1.牛糞便１ｇを20 mlの滅菌生理食塩水で希釈し、激しく混合撹拌（30分間）した後、30分間静置し、上清を採取する（牛糞便懸濁液上清）。
2.2.0 mlチューブ（ビーズチューブ）に1.の牛糞便懸濁液上清1.0 mlを移し、遠心（20K×g、5分間、室温）した後、上清を除去する。
3.600μlの抽出液Ｉ及び６μlの酵素液を添加する。
4.ビーズ式破砕機に3.のチューブをセットし、良く破砕する（破砕条件：ミニビードビーター（和研薬（株））使用の場合、4,600rpm、3分）。
5.ビーズチューブ内に発生した気泡が少なくなるまで室温で５分間静置する。あるいは、５分間静置せず、遠心（13K×g、60秒間、室温）により気泡を落としても良い。
6.75μlの抽出液IIを添加し、10〜12回チューブを転倒し、よく混和する。
7.遠心（20K×g、10分間、室温）する。
8.上清500μlを新しい1.5 m1チューブに移す。
9.400μlの吸着液IIIを添加し、10〜12回チューブを激しく転倒させ、よく混和する。
10.9.の混合液900μlをスピンカラムに移し、遠心（13K×g、30秒間、室温）し、濾液は廃棄する。
11.600μlの洗浄液IVを10.で使用したスピンカラムに添加した後、遠心（13K×g、60秒間、室温）する。
12.スピンカラムを新しい1.5 mlマイクロチューブに移す。
13.50μlの溶出液Ｖをスピンカラムに滴下した後、３分間室温で静置する。
14.遠心（13K×g、60秒間、室温）し、濾液を回収する。
【００４６】
次に、上記により得られたDNA液についてQuantiTect SYBR Green PCR Kit(キアゲン社）（核酸増幅試薬）を用いたリアルタイムPCRにより、DNAを定量した。
具体的なプロトコルを以下に示す。
【００４７】
〔ヨーネ菌DNAの検出〕
1)サンプル当たり以下のようにPCR反応液を調製する。
【００４８】
PCR Master Mix（「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」キアゲン社）  25  （μL）
Primer 10−1（100pmol／μL）                                    0.25
Primer 11−1（100pmol／μL）                                    0.25
ウラシル−DNA  グリコシラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社）
（2 units／μL）                                    0.25
蒸留水                                                         19.25
糞便由来DNA液                                                   5.0
全量                                                           50
【００４９】
（プライマー）
MP10−1：5’ ATGCGCCACGACTTGCAGCCT 3’（配列番号１）
MP11−1：5’ GGCACGGCTCTTGTTGTAGTCG 3’（配列番号２）
【００５０】
2)0.6mLのチューブ等に、1)のDNA液以外のPCR反応液を45μLずつ分注する。サンプルのDNA液を5μL添加し、マイクロピペットで良く攪拌後、PCR用96−wellプレートの１well当たり25μLずつ、２wellに分注する。
3)ヨーネ菌参照DNAを所定の濃度に希釈し、陽性対照wellに分注する。陰性対照として、DNA液の代わりにTE緩衝液（Tris-HCl（pH8.0）10mM、EDTA 1mM）あるいは蒸留水を添加した反応液を、所定のwellに分注する。
4)キャップあるいはシールを用いて96−wellプレートを密封した後、PCRサイクル等の条件を以下のように設定し、PCR及び産物の解離曲線解析(Melt curve解析、Dissociation curve解析)を行う。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
さらに、プールなし（1プール）として、陽性糞便液1ml 及び陰性糞便液1ml をそれぞれ定法の操作でDNAを定量（陽性糞便液n＝4，陰性糞便液n＝4）し，上記で得られた陽性糞便液を混ぜた3，5及び6プール並びに陰性糞便液のみの3，5及び6プールのDNA量について比較した。また，各プール数でのDNA検出率を算出した。
【００５３】
（３）結果と考察
結果を図２に示す。なお、図２中、■は陰性糞便液のみプール処理（n＝4）、◆は陽性糞便液及び陰性糞便液のプール処理（n＝4）、▲は陽性糞便液及び陰性糞便液のプール処理の平均、のヨーネ菌特異遺伝子量（pg/well）を示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【００５４】
陽性糞便液及び陰性糞便液のプール処理については，3プール，5プールの平均DNA量は，プールなしの平均DNA 量とほぼ同量であった。6プールの平均DNA量は，プールなしの平均DNA量の半量であった。また，すべてのプールサンプルにおいてDNA検出率は100％であった（図２）。
陰性糞便液のみのプール処理については，すべてのサンプルにおいてDNA検出率は0％であった（図２）。
【００５５】
DNA量が少ないほどPCR阻害物質の影響を大きく受けることから，上記試験では，陽性糞便液1mlに対して陰性糞便液をプールする処理数が増加するごとにDNA量が漸減するかまたは，あるプール数までは同量でその後減少することが予想された。本試験では，5プールまでは平均DNA量が減少しなかった。6プールにおいては，プールなしの半量であった。このことは，5プールまではPCR阻害物質の影響を受けずにDNAが検出・定量されるが，6プールでは糞便由来のPCR阻害物質が増加し，PCR反応が抑制されることにより，計算上のヨーネ菌DNA量が低下したものと考えられた。
【００５６】
実施例２（本発明の第１の態様：ヨーネ菌DNA量別におけるプール処理の比較（2〜10プール））
実施例１と同様の操作により、陽性糞便液及び陰性糞便液を用い、2〜10プール処理した。なお、本実施例では、‘中濃度排菌牛モデル’及び‘低濃度排菌牛モデル’の検査を想定し、陽性糞便液として原液（DNA量平均：0.0126pg/well）及びその4倍希釈液（DNA量平均：0.0024pg/well）を用いた。
【００５７】
すなわち、ビーズチューブに陽性糞便液を1ml添加し、遠心分離後、上清を除去した。次に、陰性糞便液1ml を添加し、遠心分離後、上清を除去する操作を、それぞれ2プール処理区は1回、3プール処理区は2回、4プール処理区は3回、5プール処理区は4回、6プール処理区は5回、7プール処理区は6回、8プール処理区は7回、9プール処理区は8回、10プール処理区は9回（すべてn＝5）、反復した。
プール処理後、実施例１と同様にDNAを定量した。
【００５８】
さらに、プールなし（1プール）として、陽性糞便液1mlを定法の操作でDNAを定量（n＝5）し，上記で得られた2〜10プールのDNA量について比較した。また，各プール数でのDNA検出率を算出した。
【００５９】
結果を図３、表２及び表３に示す。なお、図３中、黒線（上側の折れ線）は0.01pgグループ（中濃度排菌牛モデル、n＝6）、灰色線（下側の折れ線）は0.0025pgグループ（低濃度排菌牛モデル、n＝5）、のヨーネ菌特異遺伝子量平均値（pg/well）を、バーは標準誤差を示す。また、＊はプールなしとの間で有意差（p<0.05）があることを示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【００６０】
【表２】
2015077098.tif 000003
【００６１】
【表３】
2015077098.tif 000004
【００６２】
0.01pgグループ（中濃度排菌牛モデル）については，6プールまでの平均DNA量は，プールなしの平均DNA量とほぼ同量であったが、7〜10プールの平均DNA量は，プールなしの平均DNA 量の約半量であった。8プールと10プールの平均DNA量は、プールなしとの間で有意差（p<0.05）が見られた（図３）。また，すべてのプールサンプルにおいてDNA検出率は100％であった。
【００６３】
0.0025pgグループ（低濃度排菌牛モデル）については，ばらつきはあるものの、8プールまでの平均DNA量は，プールなしの平均DNA量とほぼ同量であったが、9プールと10プールの平均DNA量は，プールなしの平均DNA 量の約半量であった（図３）。また，すべてのプールサンプルにおいてDNA検出率は100％であった。
【００６４】
本試験では，ばらつきはあるものの、8プールないし6プールまではPCR阻害物質の影響を受けずにDNAが検出・定量され、平均DNA量が減少しなかった。また、いずれのプールサンプルもDNA検出率は100％であった。
【００６５】
したがって、実施例１の結果も併せて考慮すると，実施例１及び本実施例でのプール処理法は、10プール以下であれば，プール処理法として十分に有効であると考えられ，また，多検体処理が可能と考えられた。検査経費についても定法の約1/10になることから，ヨーネ病遺伝子検査のスクリーニング検査としての応用が可能であると考えられる。
【００６６】
実施例３（本発明の第２の態様：遠心分離条件の検討（5,10プール））
実施例１，２の方法ではプール数が増加した場合に工程が複雑となることから、本実施例では糞便液を一度に濃縮することとし、遠心条件についても検討した。
【００６７】
実施例１と同様に作製した陽性糞便液（DNA量平均：0.0026pg/well）及び陰性糞便液を用い、遠心処理時間を変えて、それぞれ5プール及び10プール処理（いずれもn＝5）した後、定法の操作に従ってDNAを定量した。
【００６８】
すなわち、50ml遠沈管に、陽性糞便液を1ml、陰性糞便液を5プール処理区は4ml、10プール処理区は9ml添加し、15、30又は45分間遠心分離（900×g、室温）した。遠心後、5プール処理区は4ml、10プール処理区は9mlの上清を除去し、ピペッティングして糞便液を再懸濁した（図４）。
なお、図４は10プールの場合のプール処理法を示す。5プールの場合は、陰性糞便液を4ml添加し、糞便液は合計5mlとなる。
次に、遠沈管内の糞便液全量（1ml）を、「ヨーネスピン」に添付されているビーズチューブに接種し、実施例１に示す定法（「ヨーネスピン」を用いる糞便からのDNA抽出）のプロトコルの2.以降の操作を行うことにより、DNA液を得た。さらに、当該DNA液について、実施例１と同様にDNAを定量した。
【００６９】
次に、プールなし（1プール）として、陽性糞便液1mlを定法の操作でDNAを定量し（n＝7），上記で得られた5プール,10プールのDNA量について比較した。また，各プール数でのDNA検出率を算出した。
【００７０】
結果を図５及び表４に示す。なお、図５中、◆（実線）は5プール、■（実線）は10プール、マーカーの無い破線はプールなし、のヨーネ菌特異遺伝子量平均値（pg/well）を、バーは標準誤差を示す。また、＊はプールなしとの間で有意差（p<0.01）があることを示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【００７１】
【表４】
2015077098.tif 000005
【００７２】
5プール処理区では、30分間以上の遠心処理により、プールなしと同程度のDNA量が得られた（図５）。また、すべての遠心処理時間においてDNA検出率は100％であった。
10プール処理区では、すべての遠心処理時間において、プールなし（平均0.0026pg/well）のほぼ半分のDNA量であった（図５）が、DNA検出率は100％であった。
【００７３】
本実施例では、実際の遺伝子量と計算上の遺伝子量の差が少ないと考えられる5プールで各遠心処理時間の遺伝子量を比較した結果、900g、30分間でヨーネ菌を全量回収できると判断し、以後の試験は900g、30分間の遠心条件で実施した。
【００７４】
しかし、すべてのプールサンプルにおいてDNA検出率は100％であった。スクリーニングの遺伝子検査法の開発をする上では、正確な遺伝子量の測定ではなく、確実に検出できる定性性が重要である。それゆえ、少なくとも900g、15分間以上の遠心条件であれば、本実施例での方法はヨーネ病遺伝子検査における糞便プール処理法として十分に有効であると考えられた。
【００７５】
実施例４（本発明の第２の態様：遺伝子量別プール処理の検出率の比較(1〜50プール)）
実施例３と同様の操作により、陽性糞便液及び陰性糞便液を用い、10,20,30及び50プール処理した。なお、家畜伝染病予防法施行規則が平成25年4月1日に改正され、定法のヨーネ病遺伝子検査により患畜と判定する特異遺伝子量の基準が0.001pg/well以上に変更されたことを受けて、本実施例では、診断基準となる0.001pg/wellと、その半分のDNA量の2種類の陽性糞便液を用いた。
【００７６】
すなわち、50ml遠沈管に、陽性糞便液を1ml、陰性糞便液を10プール処理区は9ml、20プール処理区は19ml、30プール処理区は29ml、50プール処理区は49ml添加し、遠心分離（900×g、30分間、室温）した。遠心後、10プール処理区は9ml、20プール処理区は19ml、30プール処理区は29ml、50プール処理区は49mlの上清を除去し、糞便液を再懸濁した。
【００７７】
次に、陰性糞便液のみを用い、上記と同様に10,20,30及び50プール処理した（陰性糞便液群）。
すなわち、50ml遠沈管に、陰性糞便液を10プール処理区は10ml、20プール処理区は20ml、30プール処理区は30ml、50プール処理区は50ml添加し、遠心分離（900×g、30分間、室温）した。遠心後、10プール処理区は9ml、20プール処理区は19ml、30プール処理区は29ml、50プール処理区は49mlの上清を除去し、糞便液を再懸濁した。
【００７８】
プール処理後、遠沈管内の糞便液全量（1ml）をビーズチューブに接種し、実施例３と同様にしてDNAを定量した。
【００７９】
また、プールなし（1プール）として、陽性糞便液1mlを定法の操作でDNAを定量し，上記で得られた陽性糞便液10〜50プールのDNA 量について比較した。また，各プール数でのDNA検出率を算出した。
【００８０】
陽性糞便0.001pg/well群の結果を図６と表５に、陽性糞便0.0005pg/well群の結果を図７と表６に、陰性糞便液群の結果を表７に、それぞれ示す。なお、図６〜７中、◇（灰色）はヨーネ菌特異遺伝子量（pg/well）の実測値を、■は各プール数でのヨーネ菌特異遺伝子量（pg/well）の平均値を、それぞれ示す。また、太い実線はリアルタイムPCR検査における診断基準値（0.001pg/well）を示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【００８１】
【表５】
2015077098.tif 000006
【００８２】
【表６】
2015077098.tif 000007
【００８３】
【表７】
2015077098.tif 000008
【００８４】
0.001pg/well群については、すべてのプールサンプルでDNA検出率が100％であった。
0.001pg/wellの半分程度の遺伝子量である0.0005pg/well群については、陽性検体が1検体で、その他9検体が陰性の10プールまでは、100％のDNA検出率となった。また、陽性検体が1検体で、その他49検体が陰性である50プールの場合でも、80％と高い検出率であった。
陰性糞便液のみをプール処理した陰性糞便群については、すべてDNA未検出となった。
【００８５】
以上の結果から、ヨーネ病遺伝子検査の診断基準（0.001pg/well）と同程度のDNA量の陽性検体については、1〜50プールのすべての場合において100％検出できることが分かった。
また、陽性検体のDNA量が診断基準の半分（0.0005pg/well）程度である場合でも、10プールまでは100％検出可能であり、また50プールまででも非常に高い確率で検出できることが分かった。
したがって、実施例３及び本実施例での方法は、ヨーネ病遺伝子検査における糞便のプール処理方法として十分に有効であることが分かった。
【００８６】
比較例１（従来方式のプール処理）
実施例１と同様に作製した陽性糞便液及び陰性糞便液を用い、一般的なプール処理法により、それぞれ2プール及び3プール処理した後、定法の操作に従ってDNAを定量した。なお、陽性糞便として、2プール処理区では平均DNA量が0.00455pg/wellのものを、3プール処理区では平均DNA量が0.00737pg/wellのものを用いた。
【００８７】
すなわち、陽性糞便液1mlと陰性糞便液1mlを混合して2プール（合計2ml）とし、また陽性糞便液1mlと陰性糞便液2mlを混合して3プール（合計3ml）とした。次に、各プール検体から1ml採取して、市販ヨーネ菌DNA抽出試薬「ヨーネスピン」を用いて、ヨーネ病検査マニュアルに記載された操作を行うことにより、DNA液を得た。さらに、当該DNA液について、実施例１と同様にDNAを定量した。
【００８８】
また、プールなしとして、各陽性糞便液1mlについて定法によりDNAを定量し、プール処理後のDNA量と比較した。さらに、DNA検出率をプールなしとプール処理後で比較した。
【００８９】
結果を表８に示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【００９０】
【表８】
2015077098.tif 000009
【００９１】
2プール処理（陽性検体  1検体：陰性検体  1検体）では、プール処理後のDNA量はプールなしの場合の半分以下であった。また、20反復行ったうちの3検体ではリアルタイムPCRによりDNA未検出となったため、検出率は85％（17/20）であった。
3プール処理（陽性検体  1検体：陰性検体  2検体）では、プール処理後のDNA量はプールなしの場合の1/4以下であった。また、20反復行ったうちの4検体ではリアルタイムPCRによりDNA未検出となったため、検出率は80％（16/20）であった。
【００９２】
従来のプール処理法では、プールしたサンプルを濃縮せずに、一部を抽出して検査するため、糞便中のDNA量が少ない検体では、プール処理での検出が困難であると考えられた。実際、本試験では、定法での診断基準である0.001pg/wellより多い遺伝子量の陽性糞便液を用いているにもかかわらず、プール処理後の遺伝子量の減少により、2プールでも85％という低い検出率となり、確実な診断は不可能であった。
【００９３】
これに対して、上記の実施例４においては、陽性検体のヨーネ菌特異遺伝子量が診断基準（0.001pg/well）と同程度であれば、陽性検体が1検体で、その他49検体が陰性であっても、100％検出できた。また、陽性検体のヨーネ菌特異遺伝子量が診断基準の半分（0.0005pg/well）程度である場合でも、10プールまでは100％検出可能であり、また50プールまででも高い検出率を維持することができた。
その理由として、本発明のプール処理法（実施例４）では、プールした糞便液の全量を濃縮して検査に用いるため、糞便液の一部を抽出（平均化）して用いる従来法（本比較例）よりも、DNA量の減少を抑えることができたと考えられた。
【００９４】
スクリーニングの遺伝子検査法においては、いかに確実な判定が行えるかが重要である。本発明の方法は、極微量のヨーネ菌DNAであっても確実に検出できる、極めて実用性の高い技術であると考えられた。
【００９５】
実施例５（本発明の第１の態様：濃縮試験）
実施例１記載のプール法により、同一の陽性糞便液を1〜6プールし、各プールの遺伝子量が（1プールの遺伝子量）×（プール数）になるかどうか確認した。
【００９６】
すなわち、実施例１と同様に作製した陽性糞便液1mlを、ビーズチューブに添加し，遠心分離（20K×g，5分間，室温）後，上清を除去する操作を2プールは2回，3プールは3回，4プールは4回，5プールは5回，6プールは6回（すべてn＝2）反復した。プール処理後，実施例１と同様に、定法の操作に従ってDNAを定量した。
同時に、プールなし（1プール）として、プール処理を行わない陽性糞便液1mlのDNAを定量し，各プール処理のDNA量についてMicrosoft Excelを用いて回帰分析を行った。
【００９７】
結果を図８に示す。なお、図８中、◆はヨーネ菌特異遺伝子量（pg/well）を、■はヨーネ菌特異遺伝子量の予測値（pg/well）を、それぞれ示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【００９８】
プールなし，2プール，3プール，4プール，5プール及び6プールのDNA量は，0.0023 ±0.0020 pg/well，0.0039 ± 0.0019 pg/well，0.0069 ± 0.0025 pg/well，0.0099 ± 0.0022 pg/well，0.0126 ± 0.0020 pg/well 及び0.0156 ± 0.0048 pg/well（いずれも平均値±標準偏差）となった。回帰分析の結果，予測値〔（1プールの遺伝子量）×（プール数）〕と各プールのDNA量は，ほぼ同じであった（図８）。
したがって、本実施例でのプール処理法により、ヨーネ菌を濃縮することで検出感度を向上させ、精密検査に応用可能と考えられた。
【００９９】
実施例６（本発明の第２の態様：濃縮試験）
実施例３記載のプール法により、同一の陽性糞便液5mlを、1mlに濃縮した。
すなわち、実施例１と同様に作製した陽性糞便液5mlを、50ml遠沈管に添加して遠心分離後、4mlの上清を除去し、糞便液を再懸濁した。次に、遠沈管内の糞便液全量（1ml）をビーズチューブに接種し、実施例３と同様にしてDNAを定量した。
また、プールなし（1プール）として、陽性糞便液1mlを定法の操作でDNA を定量し，上記で得られた5プールのDNA量について比較した。また，各プール数でのDNA検出率を算出した。
結果を表９に示す。ただし、1well中のDNA液量は2.5μLである。
【０１００】
【表９】
2015077098.tif 000010
【０１０１】
プールなしでは、検出されなかったサンプル(3検体)の遺伝子量を0pg/wellとして計算した6検体の遺伝子量が平均0.0002pg/wellであり、DNA検出率は50％（3/6）であった。
5プール処理では、遺伝子量が平均0.00192pg/wellであり、DNA検出率は100％であった。
【０１０２】
5プール処理における遺伝子量平均をプール数で割ると0.0004pg/wellとなり、これは、プールなしでヨーネ菌DNAが検出されたサンプル（3検体）の中での遺伝子量平均（0.0005pg/well）とほぼ同じであった。よって、本実施例のプール処理法により、サンプル中のヨーネ菌を濃縮できることが分かった。
また、プール処理をしない定法では検出率50％となる極微量の遺伝子量の陽性検体であっても、本実施例のプール処理法により5倍に濃縮することで、100％の検出率となり、検出感度を向上させることができた。
【０１０３】
したがって、本発明のプール処理法は、複数個体の被検体に適用する場合はスクリーニング検査として利用でき、同一個体の被検体に適用する場合は精密検査として利用できるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、ヨーネ病のスクリーニング検査および精密検査として、畜産、獣医並びに医学分野における貢献が期待される。
【図１】
2015077098.tif 000011
【図２】
2015077098.tif 000012
【図８】
2015077098.tif 000013
【図３】
2015077098.tif 000014
【図４】
2015077098.tif 000015
【図５】
2015077098.tif 000016
【図６】
2015077098.tif 000017
【図７】
2015077098.tif 000018
【配列表】
2015077098000001.app