(57)【要約】【課題】有効かつ安全性の高いバイオフィルム形成阻害剤を提供する。【解決手段】セロトニンまたはセロトニン誘導体を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニンまたは式（Ｉ）：
【化１】
2015010076.tif 000012
［式中、Ａはポリフェノールまたは炭素数１〜６個のアルキル基を意味し、
ＲはＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、ＳＯ３Ｈ、炭素数１〜６個のアルキル基または炭素数１〜６個のアルコキシ基を意味し、ｎは０〜３の整数を意味する］
で示されるセロトニン誘導体を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項２】
有効成分がセロトニンである請求項１記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項３】
有効成分が式（Ｉ）で示されるセロトニンの誘導体であり、ｎが０であり、Ａがポリフェノールである請求項１記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項４】
ポリフェノールがタンニン酸、カフェイン酸、ルテオリン、クマル酸、フィセチン、サクラネチン、ミリセチン、バイカレイン、ケンフェロール、フェルラ酸からなる群より選択されるポリフェノールまたはその誘導体である、請求項３記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項５】
口腔用組成物である請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項６】
歯磨き剤である請求項５記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項７】
洗口剤である請求項５記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項８】
チューインガム、キャンディーまたは錠菓の形態である請求項５記載の口腔用組成物。
【請求項９】
洗浄剤である請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオフィルム形成阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは細菌によって産生される多糖を成分とする構造体であり、口腔内では虫歯の原因となり、配管の詰まりや汚染の原因、流しや風呂のぬめり、あるいは医療器具の汚染などの原因となる。バイオフィルムの典型例としては、口腔内でストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（S.mutansと略）がそのグルカンシュークラーゼ（ＧＴＦ）により形成させる不溶性グルカンが挙げられ、形成された不溶性グルカンに他の細菌が住み着いて虫歯を発生させる。
【０００３】
バイオフィルム形成を抑制して、虫歯や配管の詰まり、流しや風呂のぬめり、あるいは医療器具の汚染などを軽減しようとする試みが従来からなされている。例えば、酵素を配合した口腔用組成物（特許文献１参照）、植物抽出物を配合した口腔用組成物（特許文献２参照）、ラクトフェリンを配合したバイオフィルム抑制剤（特許文献３参照）などが報告されている。それにもかかわらず、現在でもより効果が優れた、しかも安全性の高いバイオフィルム形成阻害剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１８１１６３号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１３／０３５３３Ａ１明細書
【特許文献３】特開２０１３−０７５９２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
有効かつ安全性の高いバイオフィルム形成阻害剤を提供することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、セロトニンおよびその誘導体が結合した化合物がグルカンシュークラーゼ（ＧＴＦ）活性を阻害することだけでなく、S.mutansのバイオフィルム形成阻害効果を有することを見いだし、さらにセロトニンおよびその誘導体はバイオフィルム形成菌の生育を阻害しないことも見いだして、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
したがって、本発明は下記のものを提供する：
（１）セロトニンまたは式（Ｉ）：
【化１】
2015010076.tif 000002
［式中、Ａはポリフェノールまたは炭素数１〜６個のアルキル基を意味し、
ＲはＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、ＳＯ３Ｈ、炭素数１〜６個のアルキル基または炭素数１〜６個のアルコキシ基を意味し、ｎは０〜３の整数を意味する］
で示されるセロトニン誘導体を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤。
（２）有効成分がセロトニンである（１）記載のバイオフィルム形成阻害剤。
（３）有効成分が式（Ｉ）で示されるセロトニンの誘導体であり、ｎが０であり、Ａがポリフェノールである（１）記載のバイオフィルム形成阻害剤。
（４）ポリフェノールがタンニン酸、カフェイン酸、ルテオリン、クマル酸、フィセチン、サクラネチン、ミリセチン、バイカレイン、ケンフェロール、フェルラ酸からなる群より選択されるポリフェノールまたはその誘導体である、（３）記載のバイオフィルム形成阻害剤。
（５）口腔用組成物である（１）〜（４）のいずれかに記載のバイオフィルム形成阻害剤。
（６）歯磨き剤である（５）記載のバイオフィルム形成阻害剤。
（７）洗口剤である（５）記載のバイオフィルム形成阻害剤。
（８）チューインガム、キャンディーまたは錠菓の形態である（５）記載の口腔用組成物。
（９）洗浄剤である（１）〜（４）のいずれかに記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、セロトニンまたはその誘導体を有効成分とするもので、優れたバイオフィルム形成阻害効果を有し、しかも安全性も高い。さらに、本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、バイオフィルム形成菌の生育を阻害することなくバイオフィルム形成を阻害するので、耐性菌が出現しにくいという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１はセロトニン濃度とバイオフルム形成阻害活性の関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２はセロトニン類縁体のバイオフィルム形成阻害活性を調べた結果を示すグラフである。
【図３】図３はセロトニンによるS.mutansの生育阻害活性を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
バイオフィルムは微生物の集合体により形成される構造物で、流しや風呂のぬめりや歯垢を形成し、あるいは配管や医療器具の汚染を引き起こす。例えば歯に付着した食べかす中の糖分を栄養源にS.mutansが増殖し、そのグルカンシュークラーゼ（ＧＴＦ）の働きにより不溶性のグルカン（バイオフィルム）が形成される。これが歯垢となり、歯垢に様々な微生物が付着・定着して酸を生成し、虫歯を発生させる。また、配管やタンク、流し、浴槽、風呂釜、入れ歯の洗浄、医療器具などに微生物が生息してバイオフィルムを形成すると、悪臭、濁り、生体に対する有害物質の発生などを引き起こす。
【００１１】
S.mutansは３種のＧＴＦ（ＧＴＦ−Ｓ、ＧＴＦ−Ｉ、ＧＴＦ−ＳＩ）を有しており、ＧＴＦ−Ｓは可溶性グルカンを生成し、ＧＴＦ−Ｉは不溶性グルカンを形成し、ＧＴＦ−ＳＩは可溶性グルカンおよび不溶性グルカンを生成する。したがって、ＧＴＦ−ＩおよびＧＴＦ−ＳＩ活性を阻害する物質は、不溶性グルカンの生成を抑制するものであり、したがってバイオフィルムの形成を抑制するものである。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ＧＴＦ−ＳＩのグルカン形成活性に対する阻害剤を検索することとした。
【００１３】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、セロトニンがＧＴＦ−ＳＩのグルカン形成活性を阻害することを見いだし、本発明を完成させるに至った。本発明者らは、セロトニンのアミノ基を介してポリフェノールを結合した化合物がＧＴＦ−ＳＩのグルカン形成活性を阻害することも見いだした。
【００１４】
したがって、１の態様において本発明は、
セロトニンまたは式（Ｉ）：
【化２】
2015010076.tif 000003
［式中、Ａはポリフェノールまたは炭素数１〜６個のアルキル基を意味し、
ＲはＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、ＳＯ３Ｈ、炭素数１〜６個のアルキル基または炭素数１〜６個のアルコキシ基を意味し、ｎは０〜３の整数を意味する］
で示されるセロトニン誘導体を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤を提供する。
【００１５】
セロトニンは５−ヒドロキシトリプタミンとも呼ばれる生理活性インドールアミンであり、動植物界に広く分布する。セロトニンの構造式を式（ＩＩ）に示す。ヒトにおいては生体リズム、神経内分泌、睡眠、体温調節などに関与していることが知られている。しかし、セロトニンがＧＴＦ−ＳＩのグルカン形成活性を阻害し、バイオフィルム形成を阻害することは全く知られていなかった。この点において本発明は画期的なものである。
【化３】
2015010076.tif 000004
【００１６】
しかもセロトニンはサプリメントとしても販売されており、比較的安全性が高い物質である。したがって、本発明はヒトや動物に対して安全性が高く、環境にも優しい発明である。
【００１７】
上記本発明のバイオフィルム形成阻害剤における有効成分はセロトニン単独であってもよく、酵素や静菌剤などの公知の他の物質と併用されてもよい。
【００１８】
上記本発明のバイオフィルム形成阻害剤における有効成分はセロトニン誘導体であってもよい。セロトニン誘導体において、インドール環のベンゼン環が、１個〜３個のＲ基、例えばＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、ＳＯ３Ｈ、炭素数１〜６個のアルキル基または炭素数１〜６個のアルコキシ基によって置換されていてもよい。ここで、アルキル基は直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル基などが例示されるがこれらに限らない。アルコキシ基についても炭素骨格が直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基などが例示されるがこれらに限らない。上記本発明のバイオフィルム形成阻害剤において、セロトニン誘導体を酵素や静菌剤などの公知の他の物質と併用してもよい。
【００１９】
上記本発明のバイオフィルム形成阻害剤における有効成分であるセロトニン誘導体は、セロトニン（インドール環のベンゼン環が上記のごとく置換されていてもよい）のアミノ基を介してポリフェノールが結合した化合物であってもよい。ポリフェノールは分子内に複数のフェノール性ヒドロキシ基を有する化合物をいい、そのほとんどが植物界に見いだされる。その種類は４０００種類以上であるとされている。ポリフェノールは光合成によって生じる植物の色素や苦みの成分であり、植物細胞の活性化にも関与している。またポリフェノールは抗酸化作用や脂肪燃焼補助作用があることも知られている。ポリフェノールの例としては、タンニン酸、カフェイン酸、ルテオリン、クマル酸、フィセチン、サクラネチン、ミリセチン、バイカレイン、ケンフェロール、フェルラ酸、アカセチン、あるいはこれらのポリフェロールの誘導体が挙げられるが、これらはほんの例示であって、限定するものでない。ここでポリフェノールの誘導体は、ポリフェノールの炭素骨格またはベンゼン環が、１個または複数のＯＨ、ハロゲン、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、ＳＯ３Ｈ、炭素数１〜６個のアルキル基または炭素数１〜６個のアルコキシ基によって置換されているものをいう。本明細書において、ポリフェノールというときは、その誘導体も包含するものとする。
【００２０】
上記本発明のバイオフィルム形成阻害剤における有効成分であるセロトニン誘導体は、セロトニン（インドール環のベンゼン環が上記のごとく置換されていてもよい）のアミノ基を介して炭素数１〜６個のアルキル基が結合した化合物であってもよい。炭素数１〜６個のアルキル基については上で説明したとおりである。
【００２１】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤の有効成分であるセロトニン誘導体のうち好ましいものは、上式（Ｉ）においてｎが０（Ｒ基が不存在）であり、Ａがポリフェノールである化合物である。好ましいポリフェノールとしては、タンニン酸、カフェイン酸、ルテオリン、クマル酸、フィセチン、サクラネチン、ミリセチン、バイカレイン、ケンフェロール、フェルラ酸からなる群より選択されるポリフェノールまたはその誘導体が挙げられる。
【００２２】
ポリフェノールにはバイオフィルム形成阻害効果のあるものが知られているが、セロトニンと結合したものがバイオフィルム形成阻害効果を有することが本発明によって初めて明らかになった。そのなかには、フェルロイルセロトニンのように、ポリフェノール（フェルラ酸）単独の場合（バイオフィルム形成阻害率５．５７％）よりもセロトニンと結合することによってバイオフィルム形成阻害効果が増大（バイオフィルム形成阻害率２０．２７％）するものがある（実施例１参照）。
【００２３】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤中の有効成分であるセロトニンまたはセロトニン誘導体の量は、使用目的、必要とされる効果などを考慮して定めることができる。以下に説明する口腔組成物の場合には、例えば、液体の洗口剤中約１〜約１００ｍＭのセロトニン、好ましくは約５〜約５０ｍＭのセロトニンが含まれていてもよい。
【００２４】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、口腔用組成物として用いることができる。本発明の口腔用組成物は、虫歯や歯周病の予防に適したものである。本発明の口腔用組成物の形態は、歯磨き剤（例えば、ペースト状、液体、粉末）、洗口剤（例えば、液体、スプレイ）、チューインガム、キャンディー、錠菓などの形態であってもよく、これらの形態に限定されない。歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、錠菓などの製造方法は当業者に公知である。
【００２５】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤は洗浄剤として用いることができる。本発明の洗浄剤は、例えば上下水道のタンクや配管、流し、洗濯機の洗濯槽、浴槽、風呂釜、入れ歯、内視鏡などの医療器具、歯科用器具などの洗浄剤として用いることができ、微生物によるバイオフィルム形成抑制に効果を発揮する。本発明の洗浄剤は、公知の静菌剤、殺菌剤、あるいは公知の洗浄成分（例えば石けん、界面活性剤など）、酵素（例えば多糖類分解酵素、蛋白分解酵素など）、およびその他の物質を含んでいてもよい。本発明の洗浄剤は、当業者に公知の技術を用いて液体、固体（粉末、顆粒、タブレット、ブロック）、半固体（クリーム、ペーストなど）、スプレイなど、いずれの形態にすることもできるが、これらの形態に限定されない。本発明の洗浄剤中の有効成分であるセロトニンまたはセロトニン誘導体の量は、使用目的、必要とされる効果などを考慮して定めることができる。
【００２６】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例１】
【００２７】
実施例１．天然物からのＧＴＦ阻害物質のスクリーニング
（１）ＧＴＦ阻害剤のスクリーニング方法
サンプル（被験物質を蒸留水またはメタノールに溶解したもの）、ＧＴＦ−ＳＩ  ΔＮＣ  １６０μｍｏｌ／ｈ／ｍｇ、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）および滅菌精製水を混合して９０μｌとし、３７℃で１０分間インキュベーションした後、基質（５００ｍＭ  ショ糖）を１０μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた後、３分間煮沸することにより反応を停止させた。得られた反応物を９６ウェルマイクロプレートに移し、グルコースCII−テストワコー（和光純薬製）を用いて、生成グルコースを定量し、コントロールと比較して阻害活性を評価した。この実験に用いたＧＴＦ−ＳＩ  ΔＮＣは、ＧＴＦ−ＳＩのグルカン結合部位を欠失させた組換えタンパク質（ＧＴＦ−ＳＩ  ΔＮＣ）を大腸菌で発現させ、精製した酵素である。
【００２８】
セロトニンのアミノ基を介してポリフェノールが結合している化合物（ｐ−クマロイルセロトニン、カフェオイルセロトニン、フェルロイルセロトニン）については以下のようにして合成した。Ｎ-ヒドロキシスクシニイミドとｐ-クマル酸、あるいはカフェイン酸、あるいはフェルラ酸を、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて縮合し、それぞれのＮ-ヒドロキシスクシニイミドエステルを合成した。得られた、Ｎ-ヒドロキシスクシニイミドエステルとセロトニン塩酸塩を塩基性条件で反応させ、ｐ-クマロイルセロトニン、カフェオイルセロトニン、フェルロイルセロトニンを得た。
【００２９】
（２）結果
各種天然由来成分のＧＴＦ阻害活性を調べた。その結果、ポリフェノールではタンニン酸、カフェイン酸、ルテオリン、クマル酸、フィセチン、サクラネチン、ミリセチン、バイカレイン、ケンフェロール、フェルラ酸にＧＴＦ阻害活性が見られた。
【００３０】
そして意外なことに、セロトニンがＧＴＦ阻害活性を有していることが判明した。セロトニンのアミノ基を介してポリフェノールが結合している化合物（ｐ−クマロイルセロトニン、カフェオイルセロトニン、フェルロイルセロトニン）についてもＧＴＦ阻害活性が確認された。
【００３１】
これらの化合物のＧＴＦ阻害率を表１に示す（値は％、ｐ＜０．０１）。
【表１】
2015010076.tif 000005
【実施例２】
【００３２】
実施例２．セロトニンによるＧＴＦ阻害形式の解析
実施例１に記載した方法にしたがってセロトニンのＧＴＦ阻害活性を調べ、Lineweaver-Burkプロットを行ったところ、非拮抗阻害のタイプであることがわかった。また、Dixonプロットを行ったところ、Ｋｉ値は７．９ｍＭと算出された。
【実施例３】
【００３３】
実施例３．セロトニンによるグルカン形成阻害活性
（１）グルカン形成阻害活性測定法
精製ＧＴＦ酵素（全長のＧＴＦ−ＳＩまたはＧＴＦ−ＳＩ  ΔＮＣ）、１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１００ｍＭ  ショ糖（基質）、５０μｇ／ｍｌ  デキストラン（基質）、および滅菌精製水を加えて１０００μｌとした。この混合物を３７℃で１時間インキュベーションし、形成されたグルカンの濁度（６００ｎｍ）を測定した。
【００３４】
（２）結果
表２に示すように、セロトニン濃度に応じてグルカン形成阻害率が上昇した。
【表２】
2015010076.tif 000006
【実施例４】
【００３５】
実施例４．セロトニン濃度とバイオフィルム形成阻害の関係
（１）セロトニンのバイオフィルム形成阻害活性測定方法
滅菌水（コントロール）またはセロトニン（サンプル）  ２０μｌ、S.mutans １日培養液  １０μｌ、ブレインハートインフュージョン培地  ７０μｌを混合し、９６穴マイクロプレートに添加し、３７℃で１日インキュベーションした。滅菌水で２回洗浄し、１％クリスタルバイオレットで染色し、４０分放置後滅菌水で２回洗浄し、１００％エタノール（２００μｌ）で脱色し、１００μｌを取り、別の９６穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダー（５９５ｎｍ）で測定した。
【００３６】
（２）結果
結果を図１に示す。５ｍＭのセロトニンは約１５％の阻害率を示し、１０ｍＭのセロトニンは約４３％の阻害率を示した。
【実施例５】
【００３７】
実施例５．セロトニン類縁体のバイオフィルム形成阻害活性
実施例４に記載した方法によりセロトニン類縁体（Ｄ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファン、セロトニン、メラトニン、トリプタミン）のバイオフィルム形成阻害活性を測定した。結果を図２に示す。試験した化合物のなかでセロトニンだけが顕著なバイオフィルム形成阻害活性を有していた。この結果から、セロトニンの５−ヒドロキシ基がバイオフィルム形成阻害活性にとって重要であることが示唆された。
【実施例６】
【００３８】
実施例６．セロトニンによるS.mutansの生育阻害活性
（１）実験方法
滅菌水（コントロール）またはセロトニン（サンプル）  １６００μｌ、S.mutans １日培養液  ８００μｌ、ブレインハートインフュージョン培地  ５６００μｌを混合し、３７℃で培養した。
【００３９】
（２）結果
図３に示すように、５ｍＭおよび１０ｍＭのセロトニンによるS.mutansの生育阻害は認められなかった。この結果から、本発明のバイオフィルム形成阻害剤に対する耐性菌が出現しにくいと考えられる。
【実施例７】
【００４０】
実施例７．洗口剤の調製
表３に示す処方の洗口剤を常法に従って調製した。
【表３】
2015010076.tif 000007
【実施例８】
【００４１】
実施例８．練り歯磨きの調製
表４に示す処方の練り歯磨きを常法に従って調製した。
【表４】
2015010076.tif 000008
【実施例９】
【００４２】
実施例９．入れ歯洗浄剤の調製
表５に示す配合にて入れ歯洗浄剤を調製した。
【表５】
2015010076.tif 000009
上記配合物５ｇ（粉末）を調製し、水２００ｍｌに溶解して使用する。
【実施例１０】
【００４３】
実施例１０．内視鏡洗浄剤の調製
表６に示す配合にて内視鏡洗浄剤を調製した。
【表６】
2015010076.tif 000010
上記配合物１０ｍｌ（液体）を調製し、水で１００倍希釈し、セロトニン３．５ｇを添加して使用する。
【実施例１１】
【００４４】
実施例１１．パイプ洗浄剤の調製
下記配合にてパイプ洗浄剤を調製した。
【表７】
2015010076.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明はオーラルケア、歯科、医療器具、歯科器具、洗浄剤、医薬品、医薬部外品、水道、清掃業などの分野などにおいて利用可能である。
【図１】
2015010076.tif 000013
【図２】
2015010076.tif 000014
【図３】
2015010076.tif 000015