(57)【要約】【課題】危険性が少なく、安価かつ効率的に１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体を製造する手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、フェニル基が置換されていてもよい１−フェニルエタン−１，２−ジオールの製造方法であって、フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノールをナフタレンジオキシゲナーゼと接触させる工程を含む、前記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニル基が置換されていてもよい１−フェニルエタン−１，２−ジオールの製造方法であって、フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノールをナフタレンジオキシゲナーゼと接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ナフタレンジオキシゲナーゼがαサブユニットおよびβサブユニットを含み、
ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットが、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチド、
から選択され、
ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットが、以下の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチド、
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ナフタレンジオキシゲナーゼが、フェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシンをさらに含み、
フェレドキシンレダクターゼが、以下の（ｇ）〜（ｉ）：
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、
から選択され、
フェレドキシンが、以下の（ｊ）〜（ｌ）：
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｋ）配列番号８のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するポリペプチド、
（ｌ）配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するポリペプチド
から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ナフタレンジオキシゲナーゼと接触させる工程が、ナフタレンジオキシゲナーゼを産生する微生物またはその培養物と接触させる工程である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−フェニルエタノールから１−フェニルエタン−１，２−ジオールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１−フェニルエタン−１,２−ジオールの製造法としては、マンデル酸メチルエステルを水素化アルミニウムリチウムで還元する方法（非特許文献１）が知られており、また１−（３−クロロフェニル）エタン−１，２−ジオールの製造法としては、３−クロロマンデル酸をボラン・ジメチルスルフィドコンプレックスで還元する方法（特許文献１）が知られている。しかしながら、還元剤が毒性や発火の危険性を有すること、また高価なことが課題であった。また光学活性を有する生成物を取得するためには、光学活性を有する原料を用いる必要があった。
【０００３】
酵素を用いる方法として、スチレンオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１４．１１）により、スチレンからスチレンオキサイドを生成し、次いで、エポキシドヒドロゲナーゼ（ＥＣ３．３．２．３）により開環することで１−フェニルエタン−１,２−ジオールを生成する方法が知られている（特許文献２および非特許文献２）。しかし、この方法は、２段階の反応を用いること、スチレンおよびスチレンオキサイドが重合しやすいこと、スチレンおよびスチレンオキサイドが水に難溶のため水／有機２相系で反応をする必要があること、スチレンおよびスチレンオキサイドが有毒であることなどの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２８１０５号
【特許文献２】特開２０１２−６０９０３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８１：６４５６（１９５９）
【非特許文献２】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１（７）：３９９５−４００３（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、危険性が少なく、安価かつ効率的に１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体を製造する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、ナフタレンジオキシゲナーゼが、２−フェニルエタノールおよびその誘導体の水酸基を酸化することなく２位を水酸化する活性を有し、ナフタレンジオキシゲナーゼを用いることにより、２−フェニルエタノールおよびその誘導体から１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体を製造できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）フェニル基が置換されていてもよい１−フェニルエタン−１，２−ジオールの製造方法であって、フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノールをナフタレンジオキシゲナーゼと接触させる工程を含む、前記方法。
（２）ナフタレンジオキシゲナーゼがαサブユニットおよびβサブユニットを含み、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットが、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチド、
から選択され、
ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットが、以下の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチド、
から選択される、（１）に記載の方法。
（３）ナフタレンジオキシゲナーゼが、フェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシンをさらに含み、フェレドキシンレダクターゼが、以下の（ｇ）〜（ｉ）：
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、
から選択され、
フェレドキシンが、以下の（ｊ）〜（ｌ）：
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｋ）配列番号８のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するポリペプチド、
（ｌ）配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するポリペプチド
から選択される、（２）に記載の方法。
（４）ナフタレンジオキシゲナーゼと接触させる工程が、ナフタレンジオキシゲナーゼを産生する微生物またはその培養物と接触させる工程である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、危険性が少なく、安価かつ効率的に１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体を製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】１−フェニルエタン−１，２−ジオールのＴＩＣ、ＭＳおよびＵＶスペクトルを示す。
【図２】２−フェニルエタノールを基質とした反応生成物のＴＩＣ、ＭＳおよびＵＶスペクトルを示す。
【図３】２−（４−クロロフェニル）エタノールを基質とした反応生成物のＴＩＣ、ＭＳおよびＵＶスペクトルを示す。
【図４】２−（４−ブロモフェニル）エタノールを基質とした反応生成物のＴＩＣ、ＭＳおよびＵＶスペクトルを示す。
【図５】２−（ｐ−トリル）エタノールを基質とした反応生成物のＴＩＣ、ＭＳおよびＵＶスペクトルを示す。
【図６】２−（ｍ−トリル）エタノールを基質とした反応生成物のＴＩＣ、ＭＳおよびＵＶスペクトルを示す。
【図７】１−フェニルエタン−１，２−ジオールのＴＩＣおよびＭＳスペクトルを示す。
【図８】２−フェニルエタノールを基質とした反応生成物のＴＩＣおよびＭＳスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
２−フェニルエタノールは、以下の式Ｉａ：
【化１】
2015062396.tif 000002
で表される化合物であり、フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノールは、式Ｉａにおけるフェニル基が１、２、３、４または５個の置換基でさらに置換されていてもよい化合物をさし、例えば、式Ｉ：
【化２】
2015062396.tif 000003
[式中、Ｒはそれぞれ同一または異なる置換基であり、ｎは１、２、３、４または５である]
で表される。本明細書において、２−フェニルエタノールの誘導体には、フェニル基が置換された２−フェニルエタノールが含まれる。
【００１２】
１−フェニルエタン−１,２−ジオールは、式ＩＩａ：
【化３】
2015062396.tif 000004
で表される化合物であり、フェニル基で置換されていてもよい１−フェニルエタン−１,２−ジオールは、式ＩＩａにおけるフェニル基が１、２、３、４または５個の置換基でさらに置換されていてもよい化合物をさし、例えば、式ＩＩ：
【化４】
2015062396.tif 000005
[式中、Ｒおよびｎは式Ｉと同義である]
で表される。本明細書において、１−フェニルエタン−１,２−ジオールの誘導体には、フェニル基が置換された１−フェニルエタン−１,２−ジオールが含まれる。
【００１３】
フェニル基の置換基、すなわち上記化学式におけるＲは、同一でも異なってもよく、水素原子、ハロゲンで置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキル基、ハロゲンで置換されていてもよい炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルコキシ基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ハロゲンを示すか、または２つの置換基が一緒になって低級アルキレンジオキシ基を形成していてもよい。ハロゲンとしては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩが挙げられる。低級アルキレンとは、炭素数１〜６のアルキレン基をさす。
【００１４】
本発明者らは、ナフタレンジオキシゲナーゼが、フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノール、例えば、式Ｉの化合物の水酸基を酸化することなく２位を水酸化する活性を有すること、したがって、２−フェニルエタノールまたはその誘導体をナフタレンジオキシゲナーゼと接触させることにより、１−フェニルエタン−１,２−ジオールまたはその誘導体を製造できることを見出した。
【００１５】
ナフタレンジオキシゲナーゼを用いた反応で、ベンジルアルコールを基質とした際にはベンズアルデヒドが、１−フェニルエタノールを基質とした際にはアセトフェノン、次いで２−ヒドロキシアセトフェノンが生成することが報告されている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（９）：３１０１−３１０６（１９９６））。よって、２−フェニルエタノールを基質した際には２―フェニルアセトアルデヒドやさらに酸化されたフェニル酢酸が生成することが予想されたが、いずれも検出されず、驚くことに１−フェニルエタン−１,２−ジオールが生成することを確認した。
【００１６】
原料としてフェニル基が置換された２−フェニルエタノールを用いる場合、生成するフェニル基が置換された１−フェニルエタン−１,２−ジオールにおいて、フェニル基上の置換基の配置、すなわち置換基の種類、数および位置は、好ましくは原料であるフェニル基が置換された２−フェニルエタノールにおけるフェニル基上の置換基の配置と同一である。
【００１７】
本発明者らはまた、ナフタレンジオキシゲナーゼを用いることにより、光学活性を有する原料を用いることなく、光学活性な１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体を製造できることを見出した。光学活性な１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体は、エナンチオマーとして実質的に純粋な１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体をさす。エナンチオマーとして実質的に純粋なとは、単独のエナンチオマー（Ｒ体またはＳ体）の純度が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であることをいう。本発明により、その光学純度が、好ましくは３０ｅｅ％以上、より好ましくは４０ｅｅ％以上、さらに好ましくは５０ｅｅ％以上の光学活性な１−フェニルエタン−１,２−ジオールおよびその誘導体を製造することができる。
【００１８】
ナフタレンジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１２．１２）は、ナフタレンをはじめとする芳香族化合物の水酸化反応を触媒することが報告されている酵素である（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６，１７（５−６）：３８−４５７）。本発明において用いるナフタレンジオキシゲナーゼは、以下の反応を触媒する活性を有するポリペプチドであれば、制限なく用いることができる。
【００１９】
【化５】
2015062396.tif 000006
【００２０】
ナフタレンジオキシゲナーゼとしては、ヒトを含む動物由来の酵素、植物由来の酵素、または微生物由来の酵素のいずれも使用できる。好ましくは微生物由来の酵素を用いる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物としては、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｓｐ.が挙げられる。具体的には、以下の表１に記載の菌株が挙げられる。
【００２１】
【表１】
2015062396.tif 000007
【００２２】
ナフタレンジオキシゲナーゼは、好ましくは、αサブユニット（大サブユニット）とβサブユニット（小サブユニット）からなるジオキシゲナーゼ本体酵素を含む多成分酵素であり、好ましくは、さらにフェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼ（別名：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−フェレドキシンレダクターゼ）を構成要素とする。
【００２３】
ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットとしては、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドも、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットに包含される。配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列からなり、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチド、ならびに配列番号２のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチドが挙げられる。数個とは、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性は、ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットと一緒になって、ジオキシゲナーゼ活性を発揮する活性をさす。
【００２４】
ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットとしては、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドも、ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットに包含される。配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドには、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列からなり、ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチド、ならびに配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチドが挙げられる。ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性は、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットと一緒になって、ジオキシゲナーゼ活性を発揮する活性をさす。
【００２５】
フェレドキシンレダクターゼとしては、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドも、フェレドキシンレダクターゼに包含される。配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドには、配列番号６のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するポリペプチド、ならびに配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２６】
フェレドキシンとしては、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドも、フェレドキシンに包含される。配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドには、配列番号８のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するポリペプチド、ならびに配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシン活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノールをナフタレンジオキシゲナーゼと接触させる工程は、フェニル基が置換されていてもよい２−フェニルエタノールを、ナフタレンジオキシゲナーゼを産生する微生物またはその培養物と接触させることにより実施できる。ナフタレンジオキシゲナーゼを産生する微生物としては、天然の微生物であっても組換え微生物であってもよい。ナフタレンジオキシゲナーゼを産生する微生物としては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ属に属する微生物が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物としては、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｓｐ.が挙げられる。具体的には、上記表１に記載の菌株が挙げられる。
【００２８】
組換え微生物として、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットをコードする遺伝子およびナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットをコードする遺伝子が導入された組換え微生物を使用することができる。好ましくは、フェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子およびフェレドキシンをコードする遺伝子がさらに導入された組換え微生物を使用する。
【００２９】
ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットをコードする遺伝子（ｎａｈＡｃ）としては、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチドには、核酸が包含され、核酸には、一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドも、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットをコードする遺伝子に包含される。配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドには、配列番号１の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有する塩基配列からなり、ナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに上述の配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットをコードする遺伝子（ｎａｈＡｄ）としては、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドも、ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットをコードする遺伝子に包含される。配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドには、配列番号３の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有する塩基配列からなり、ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに上述の配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
フェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子（ｎａｈＡａ）としては、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドも、フェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子に包含される。配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドには、配列番号５の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有する塩基配列からなり、フェレドキシンレダクターゼの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに上述の配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
フェレドキシンをコードする遺伝子（ｎａｈＡｂ）としては、配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドも、フェレドキシンをコードする遺伝子に包含される。配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドと機能的に同等のポリヌクレオチドには、配列番号７の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有する塩基配列からなり、フェレドキシンの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに上述の配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
ナフタレンジオキシゲナーゼを産生する組換え微生物は、上記のような遺伝子を宿主に導入することにより作製することができる。遺伝子導入は、上記遺伝子またはその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現し得るように宿主に導入することにより、または相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子またはその一部を挿入することにより実施できる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる各遺伝子の一部分を指す。
【００３４】
目的の遺伝子の塩基配列は公共のデータベースより検索可能であり、配列情報未知の生物に由来する遺伝子は、配列が既知の類縁微生物の遺伝子情報を利用し、クローニングにより取得することができる。所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば、遺伝子配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換（遺伝子導入）に適した量のＤＮＡを得ることができる。配列が未知の遺伝子は、既知の遺伝子配列に基づいて適当に設計された合成ＤＮＡプライマーを鋳型として用いたハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法などにより取得することができる。
【００３５】
例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物におけるナフタレンジオキシゲナーゼαサブユニットをコードする遺伝子（ｎａｈＡｃ）、ナフタレンジオキシゲナーゼβサブユニットをコードする遺伝子（ｎａｈＡｄ）、フェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子（ｎａｈＡａ）およびフェレドキシン（ｎａｈＡｂ）の配列相同性は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａＡＴＣＣ１７４８４を基準とした場合、以下の表２のとおりである。
【００３６】
【表２】
2015062396.tif 000008
【００３７】
遺伝子のクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１．２１（１９８９）に記載されている。
【００３８】
遺伝子を導入する宿主の種類は限定されず、細菌、真菌、各種の酵母などの単細胞真核生物、又は動物若しくは植物の生細胞を任意に選択できるが、本発明においては、微生物が好ましく、特に大腸菌が好ましい。宿主大腸菌は通常遺伝子工学に用いられる大腸菌Ｋ−１２株の中から適切なものを選択する。代表的なものとしてＪＭ１０５やＪＭ１０９が挙げられるが、ＤＨ５あるいは誘導型の発現系に用いられるＢＬ２１、Ｎ９９ｃＩ＋などを使用してもよい。
【００３９】
遺伝子導入のために遺伝子を連結するベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージおよびコスミド等が挙げられる。プラスミドとしては、大腸菌のプラスミド（例えば、ｐＥＴ２１ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）、ｐＥＴ３９ｂ（＋）、ｐＥＴ４０ｂ（＋）、ｐＥＴ４３．１ａ（＋）、ｐＥＴ４４ａ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、また酵母でもＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ用のプラスミド（例えば、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＦＬＤ、ｐＪＬ−ＩＸ、ｐＪＬ−ＳＸ等）などが挙げられる。また、クローニング、シークエンス確認用にｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（商標登録）などの市販のクローニングベクターを用いてもよい。
【００４０】
または、相同組換えによる遺伝子導入では、プラスミドを用いることなく、ＰＣＲ等によって、遺伝子配列の両末端相同組換え部位の遺伝子配列と導入遺伝子配列を含む線状の遺伝子配列を合成したものを用いることができる。本線状遺伝子は配列の両末端に宿主ゲノム上の遺伝子と相同配列を有し、本相同配列を介して宿主染色体中へ導入される。
【００４１】
上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当なプロモーターを連結する。使用するプロモーターは、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよい。構成的プロモーターや発現誘導型プロモーターを用いてもよい。構成的プロモーターは、宿主細胞内外の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現せしめるプロモーターをいう。構成的プロモーターの例としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、ＤＮＡジャイレース遺伝子、５ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、および２３ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子等のプロモーター、ならびにＰＧＫなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
発現誘導型プロモーターは、外的要因、例えば、薬剤、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩等の刺激によって、その下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。誘導型プロモーターの例としては、Ｔ７プロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーター、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
ベクターには、プロモーターおよび目的の遺伝子に加えて、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。また、導入する遺伝子配列は、選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは目的遺伝子が宿主へ導入された組換え株を選抜するのに用いることができる。選択マーカーの例としては、ホルムアルデヒド耐性マーカー、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００４４】
遺伝子を連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法およびそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００４５】
遺伝子の導入方法としては、特に制限されないが、例えば、電気パルス法、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。エレクトロポレーション法が好ましい。
【００４６】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を、相同組換えを利用して導入することもできる。
【００４７】
得られた組換え微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、組換え微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４８】
炭素源としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセリンなどのポリオール類、エタノールなどのアルコール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミンなどのアルキルアミン類、またはアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、導入したプロモーターに応じた遺伝子発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００４９】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３７℃、特に好ましくは１５〜３７℃で行う。培養期間中、培地のｐＨは酵素の活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ３〜９程度の範囲である。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５０】
培養後、１−フェニルエタン−１，２−ジオールおよびその誘導体が菌体内に生産される場合には、通常知られている方法、例えば、菌体を機械的方法、リゾチームなどを用いた酵素的方法または界面活性剤などを用いた化学的処理によって破壊することにより１−フェニルエタン−１，２−ジオールおよびその誘導体を抽出できる。また、１−フェニルエタン−１，２−ジオールおよびその誘導体が菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。
【００５１】
培養物（培養液、培養上清、培養菌体、菌体の破砕物などが包含される）からの１−フェニルエタン−１，２−ジオールおよびその誘導体の採取および単離方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離などで除去した後、カチオンおよびアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば１−フェニルエタン−１，２−ジオールおよびその誘導体の結晶を取得することができる。培養物中に蓄積された１−フェニルエタン−１，２−ジオールおよびその誘導体は、そのまま単離することなく用いてもよい。その際、キラルカラム法、優先晶析法、ジアステレオマー法等の光学分割法を組み合わせて光学純度を高めてもよい。
【００５２】
以下本発明を、実施例を参照することにより詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの培養菌体を用いた菌体反応
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１７４８４はＡＴＣＣより購入し、以下の手順で培養した。
【００５４】
まず、菌株のグリセロールストック２０μＬをＬＢ培地４ｍＬに植菌し（試験管）、インキュベートした（３０℃、３００ｒｐｍ、一晩）。続いて、０．１ｗｔ／ｖｏｌ％ナフタレン添加ＬＢ培地１００ｍＬに初期ＯＤ６６０が０．０５となるように植菌し（坂口フラスコ）、インキュベートした（３０℃、１２０ｒｐｍ２４ｈ）。リン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて集洗菌した後、反応に使用するまで−８０℃にて凍結保存した。
【００５５】
凍結菌体をリン酸バッファーにて懸濁した後、下記の反応液を調製した。基質として、２−フェニルエタノール（和光純薬）、２−（４−クロロフェニル）エタノール（東京化成）、２−（４−ブロモフェニル）エタノール（東京化成）、２−（ｐ−トリル）エタノール（東京化成）、２−（ｍ−トリル）エタノール（東京化成）を用いた。
【００５６】
【表３】
2015062396.tif 000009
【００５７】
（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析）
上述の菌体反応液をそれぞれの基質ごとに調製し、インキュベート（３０℃、３００ｒｐｍ、２４ｈ）し、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、標品の１−フェニルエタン−１，２−ジオール（東京化成）と同様のＲＴおよびＭＳスペクトルを示す生成物のピークを確認した。以下に分析条件を示す。
分析条件
ＭＳ：３２００Ｑ−ｔｒａｐ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）
移動層：Ａ液  ０．１％ギ酸、Ｂ液  アセトニトリル
カラム：カプセルパックＡＱ  粒子径３μｍ  内径２ｍｍ  長さ２５ｃｍ
カラム温度：４０℃
検出波長：２５４ｎｍ
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間：１５ｍｉｎ
ＭＡＳＳモード：Ｑ  ｐｏｓｉ
測定ｍ／ｚ：１００−２５０
【００５８】
【表４】
2015062396.tif 000010
【００５９】
図１〜図６に得られたスペクトルを示し、以下の表に分析結果をまとめる。
【００６０】
【表５】
2015062396.tif 000011
【００６１】
（ＧＣ−ＭＳ分析）
ＧＣ−ＭＳにより、上述の菌体反応液を分析したところ（基質：２−フェニルエタノール、基質濃度２ｍＭ）、標品である１−フェニルエタン−１，２−ジオール（東京化成）と同様のＲＴおよびＭＳスペクトルを示す生成物のピークを確認した。以下に分析条件を示し、図７および図８にスペクトルを示す。
分析条件
装置：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０（島津）
カラム：ＤＢ−１７ＨＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
気化室温度：２５０℃
注入モード：スプリット
制御モード：線速度
線速度：３８．１ｃｍ／ｓｅｃ
圧力：７７．０ｋＰａ
イオン源温度：２００℃
インターフェース温度：２５０℃
カラムオーブンプログラム：
【００６２】
【表６】
2015062396.tif 000012
【００６３】
（ＬＣ分析による光学純度の測定）
２−フェニルエタノールを基質とする上述の菌体反応液を調製し、インキュベートした（反応時間：２４ｈ）。生成物である１−フェニルエタン−１，２−ジオールの光学純度を以下の条件にて分析した。
分析条件
ＬＣ：Ｄ−７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
移動層：ヘキサン：イソプロパノール＝７６：２４
カラム：ＣＨＩＲＡＣＥＬ  ＯＢ−Ｈ  ２５０×４．６（ダイセル）
カラム温度：３０℃
検出波長：２５４ｎｍ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
結果を以下の表に示す。
【００６４】
【表７】
2015062396.tif 000013
【００６５】
＜実施例２＞組換え大腸菌の培養菌体を用いた菌体反応
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１７４８４由来のナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子群を導入した組換え大腸菌を構築し、この培養菌体を用いて、２−フェニルエタノールを基質とした休止菌体反応を試みた。その結果、１−フェニルエタン−１，２−ジオールの生成を確認した。ナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子群を挿入した組換え大腸菌は以下のとおり構築した。
【００６６】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１７４８４のナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子群（ｎａｈＡａ：配列番号５、ｎａｈＡｂ：配列番号７、ｎａｈＡｃ：配列番号１、ｎａｈＡｄ：配列番号３）を発現ベクターｐＥＴ２１−ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入した組換えプラスミドｎａｈＡａ−ｄ／ｐＥＴ２１−ｂ（＋）を構築した。
【００６７】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１７４８４のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマーおよびＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｎａｈＡａ−ｄ断片を得た。
ｎａｈＡ＿Ｆ：ｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＡＣＡＡＣＣ（配列番号９）
ｎａｈＡ＿Ｒ：ｃｇａａｔｔｃｇｇａｔｃｃｃｇＴＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧ（配列番号１０）
【００６８】
ｐＥＴ２１−ｂ（＋）をテンプレートとし、以下のプライマーおよびＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐＥＴ２１−ｂ（＋）断片を得た。
ｐＥＴ２１ｂ＿Ｆ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣ（配列番号１１）
ｐＥＴ２１ｂ＿Ｒ：ＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２）
【００６９】
前記のＰＣＲ増幅により得たｎａｈＡａ−ｄ断片およびｐＥＴ２１−ｂ（＋）断片を用いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲクローニングキット（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従ってクローニングを行い、組換えプラスミド、ｎａｈＡａ−ｄ／ｐＥＴ２１−ｂ（＋）を構築した。なお宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ社）を用いた。
【００７０】
得られた組換えプラスミドおよび遺伝子を導入していないｐＥＴ２１−ｂ（＋）をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換し、組換え大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／（ｎａｈＡａ−ｄ／ｐＥＴ２１−ｂ（＋））およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１−ｂ（＋）を構築した。
【００７１】
得られた組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／（ｎａｈＡａ−ｄ／ｐＥＴ２１−ｂ（＋））およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１−ｂ（＋）を以下の手順でＩＰＴＧ発現誘導培養した。
【００７２】
菌株を１００ｍｇ／Ｌアンピシリン添加ＬＢ培地４ｍＬに植菌し（試験管）、インキュベートした（３０℃、３００ｒｐｍ、一晩）。続いて、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンおよび１０ｇ／Ｌグルコース添加ＬＢ培地１００ｍＬに初期ＯＤ６６０が０．０５となるように植菌し（坂口フラスコ）、インキュベートした（３０℃、１２０ｒｐｍ）。ＯＤ６６０が０．４−０．５になったら終濃度が１００μＭになるようにＩＰＴＧ（和光）を添加し、インキュベートした（３０℃、１２０ｒｐｍ、培養開始２４ｈ）。リン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて集洗菌した後、使用するまで、−８０℃にて凍結保存した。
凍結菌体をリン酸バッファーにて懸濁し、下記の反応液を調製し、反応を開始した（３０℃、３００ｒｐｍ、２４ｈ）。
【００７３】
【表８】
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【００７４】
実施例１と同様の手法にて、ＬＣ−ＭＳおよびＧＣ−ＭＳにより分析した。結果を以下の表９に示す。
【００７５】
【表９】
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【００７６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／（ｎａｈＡａ−ｄ  ／ｐＥＴ２１−ｂ（＋））を用いたときのみ、１−フェニルエタン−１，２−ジオールの生成が確認された。よって、２−フェニルエタノールから１−フェニルエタン−１，２−ジオールを生成する反応を触媒する酵素がナフタレンジオキシゲナーゼであることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015062396.tif 000022
【図８】
2015062396.tif 000023
【配列表】
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