(57)【要約】【課題】本発明は、メタボリックシンドロームの病態の成因解明や、治療法の開発に供するため、高脂肪食の過剰摂取や遺伝子改変を行うことなく、野生型マウスに給餌するだけで、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドローム病態のマウス及びその作製方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることによって、当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈することを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウスまたはその作製方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型マウスに、
NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることによって、
当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、
内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈する
ことを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウス。
【請求項２】
野生型マウスに、
NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることによって、
当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、
内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製する
ことを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウスの作製方法。
【請求項３】
野生型マウスに、
NO2-及びNO3-を含まない餌を１２週以上与えることによって、
当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、
内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製する
ことを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウスの作製方法。
【請求項４】
野生型マウスに、
NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることによって、
当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、
内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製する
ことを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウス作製のための給餌方法。
【請求項５】
野生型マウスに、
NO2-及びNO3-を含まない餌を１２週以上与えることによって、
当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、
内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製する
ことを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウス作製のための給餌方法。
【請求項６】
野生型マウスを、
当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、
内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態にするマウス用の餌であって、
NO2-及びNO3-を含まない
ことを特徴とするメタボリックシンドローム病態モデルマウス作製用の餌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂肪食・果糖摂取や遺伝子改変を行うことなく、野生型マウスに給餌するだけで、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドローム病態を呈するマウスを作製する方法及びそのマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、過食や運動不足などのライフスタイルの欧米化を背景に、肥満・高脂血症・高血圧・高血糖などの、いわゆるメタボリックシンドロームといわれる病態が増加している。メタボリックシンドローム患者では、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患の発症リスクが著明に増加することから、克服すべき重要な疾患と見なされている（厚生労働省 健康日本２１）。メタボリックシンドロームの診断基準は、2005年4月に公表された日本肥満学会、日本動脈硬化学会、日本糖尿病学会、日本高血圧学会、日本循環器学会、日本腎臓病学会、日本血栓止血学会、日本内科学会の8学会合同の基準によると、内臓脂肪蓄積（ウエスト周囲径 男性 85cm以上、女性 90cm以上）を必須条件とし、さらに、(1)血清脂質異常〔トリグリセライド値 150mg/dL以上、HDLコレステロール（HDL-C）値 40mg/dL未満のいずれか、または両方〕、(2)血圧高値（収縮期血圧 130mmHg以上、拡張期血圧 85mmHg以上のいずれか、または両方）、(3)高血糖（空腹時血糖値 110mg/dL以上）、の3項目から2つ以上を有する場合をメタボリックシンドロームと診断するとされている。
【０００３】
しかし、近年発表された厚生労働省研究班（主任研究者＝滋賀医科大学社会医学・上島弘嗣教授）の調査によると、肥満者のみならず、非肥満者であっても、内臓脂肪蓄積、高脂血症、高血圧、高血糖などの危険因子が重複すると、動脈硬化性疾患の発症リスクが著明に増加することが明らかにされ、現行のウエスト周囲径を必須条件としたメタボリックシンドロームの診断基準では、非肥満者のリスク集団を見落としてしまう可能性が指摘されている（Diabetes Care  2007;30:1533-1538）。
【０００４】
ところで、メタボリックシンドロームの発症には、一酸化窒素（ＮＯＳ）が重要な役割を果たしている。ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）には、神経型（ｎＮＯＳ、ＮＯＳ１）、誘導型（ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２）、内皮型（ｅＮＯＳ、ＮＯＳ３）の３種類のアイソフォームが存在することが知られている。過去に、ｅＮＯＳ遺伝子を単独に欠損させた遺伝子改変動物が作製され、メタボリックシンドロームの病態解明に供されている。しかし、各ＮＯＳ間には代償機構が働くため、ＮＯＳシステム全体に由来するＮＯの役割については、未だ十分に解明されていない。
そこで、本発明者は、３つのＮＯＳ遺伝子を全て欠損させた完全欠損マウス（トリプル  ｎ／ｉ／ｅ  ＮＯＳｓ欠損マウス）を、世界に先駆けて作製した（非特許文献１）。この完全欠損マウスは、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドロームの病態が全て認められた。
【０００５】
ところが、この完全欠損マウスは、出生率（繁殖力）及び生存率が極めて低く、作製費も高額であるため、実験に広く使用することが難しい。また、従来のメタボリックシンドロームの動物モデルには、高脂肪食や果糖を摂取させたモデルや、遺伝子変異を伴うモデル（ｏｂ／ｏｂマウス、ＺＤＦラット他）などがあるが、いずれも体重増加を伴った肥満状態のモデルであり、非肥満状態でメタボリックシンドロームの病態を示すモデルは、これまで全く開発されていなかった。近年では、非肥満者であってもメタボリックシンドロームの危険因子が重複すれば、動脈硬化性疾患の発症リスクが飛躍的に増加することが指摘されており、そのようなメタボリックシンドロームの成因の解明や治療法の開発には、体重増加を伴わない非肥満状態のメタボリックシンドロームモデル動物の作製が必要不可欠である。
【０００６】
そこで、本発明者は、鋭意研究の結果、高脂肪食や果糖を摂取させたり、遺伝子改変をすることなく、特定の栄養成分を含まない食餌（及び飲水）を与えるだけで、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドロームの病態を呈するモデルマウスを作製することに成功した。このモデルマウスは、極めて安価に簡便な方法で作製することができ、且つ、生存率は１００％であることから、従来の遺伝子改変マウスに比べて、実験に広く使用する利点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】筒井  正人  外６名、「Development of Genetically Engineered Mice Lacking All Three Nitric Oxide Synthase Isoforms」、公益社団法人日本薬学会（The Pharmaceutical Society of Japan）、薬学雑誌 127(9) 1347―1355 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記観点からなされたものであり、高脂肪食や果糖を摂取させたり、遺伝子改変をすることなく、野生型マウスに特定の栄養成分を含まない食餌（及び飲水）を与えるだけで、安価に簡便な方法で、且つ、１００％の生存率で、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドローム病態を呈する非肥満状態のモデルマウス及びその作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明において、次の単語または表現は、それぞれ次の意味で用いる。NO2-は、亜硝酸イオンまたは亜硝酸塩を意味し、NO3-は、硝酸イオンまたは硝酸塩を意味する。
また、NO2-及びNO3-を含まないとは、食餌及び飲水に含まれるNO2-及びNO3-の量が、０または測定感度以下であることを意味する。
本発明におけるメタボリックシンドローム病態とは、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性が重複している病態を意味し、高血圧の症状を含まない。
野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を与え続けることで、徐々に内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の傾向が高まるが、一定期間継続して給餌させることが望ましい。
給餌または投与とは、食餌や飲水を経口摂取させることを意味する。
【００１０】
本発明に係るメタボリックシンドローム病態モデルマウスは、野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることによって、当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明に係るメタボリックシンドローム病態モデルマウスの作製方法は、
野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることによって、当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係るメタボリックシンドローム病態モデルマウスの作製方法は、野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を１２週以上与えることによって、当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製することを特徴とする。
【００１３】
本発明に係るメタボリックシンドローム病態モデルマウス作製のための給餌方法は、特定の野生型マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製するため、前記の野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を与えることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係るメタボリックシンドローム病態モデルマウス作製のための給餌方法は、特定の野生型マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態を呈するマウスを作製するため、前記の野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない餌を１２週以上与えることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係るメタボリックシンドローム病態モデルマウス作製用の餌は、野生型マウスを、当該マウスに与えるのと同じ条件で給餌した対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性の病態にするマウス用の餌であって、NO2-及びNO3-を含まないことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
１）遺伝子改変を行うことなく、野生型マウスに給餌（経口摂取）させるだけで、対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドローム病態を呈するモデルマウスを作製することができる。
２）対照区のマウスに比べて、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドローム病態のモデルマウスを作製することを、野生型マウスに給餌する飼育方法によって実現できる。
３）体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドローム病態のモデルマウスを作製できる餌を提供することができる。
４）食餌中（食事中）または飲水中のNO2-及びNO3-の量を増やすだけで、メタボリックシンドロームを改善できる可能性がある。
５）NO2-及びNO3-を経口摂取することによるメタボリックシンドローム改善方法を提供できる可能性がある。
６）緑葉野菜に多く含有されているNO3-が含まれた、メタボリックシンドロームを改善するヒトまたは動物用の医薬、機能性食品、食品添加物を提供できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】通常食及び低NO2-／NO3-食の組成を示す表
【図２】血漿NO2-／NO3-レベルを比較したグラフ
【図３】食餌摂取量を比較したグラフ
【図４】体重を比較したグラフ
【図５】血圧値を比較したグラフ
【図６】内臓脂肪量を比較したグラフ
【図７】血漿総コレステロール値を比較したグラフ
【図８】糖負荷試験の結果を比較したグラフ
【図９】インスリン負荷試験の結果を比較したグラフ
【図１０】血漿アディポネクチン値を比較したグラフ
【図１１】腸内細菌数（門）を比較したグラフ
【図１２】腸内細菌数（綱）を比較したグラフ
【図１３】腸内細菌数（目）を比較したグラフ
【図１４】腸内細菌数（科）を比較したグラフ
【図１５】腸内細菌数（属）を比較したグラフ
【図１６】腸内細菌数（種）を比較したグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（実験動物）
野生型マウス（生後6週齢、雄、C57BL/6J）
【００１９】
（食餌及び飲水）
前記マウスを実験区、対照区に分け、それぞれに、低NO2-／NO3-食（低NO2-／NO3-飼料及び超純水）、通常食（通常飼料及び水道水）、を12週間経口投与した(n=6〜12)。
低NO2-／NO3-食と通常食の各給餌量（各飲水を含む）は、設定も制限もせず、自由に摂食させた。
なお、一日の食餌摂取量（給餌量）は、後記「（実験結果）３」に示すとおり、対照区（通常食群）と実験区（低NO2-／NO3-食群）の間で差が無かった（図３）。
【００２０】
通常食及び低NO2-／NO3-食に含まれる栄養成分は、図１のとおりであり、以下にNO2-、NO3-の含有量を抜粋して示す。
１．通常食（対照区）
（１）通常飼料（Lab Diet社、5001）
亜硝酸塩含有量（NO2-）：6.5μmol/kg未満（測定感度以下）
硝酸塩含有量（NO3-）：548.3μmol/kg
（２）水道水
亜硝酸イオン含有量（NO2-）：0.13μmol/kg
硝酸イオン含有量（NO3-）：6.07μmol/kg
２．低NO2-／NO3-食（実験区）
（１）低NO2-／NO3-飼料（オリエンタル酵母工業株式会社のアミノ酸食、特注）
脂肪、炭水化物、蛋白質含有量、カロリー、Ｌ−アルギニン含有量：通常食と同一
亜硝酸イオン含有量（NO2-）：6.5μmol/kg未満（測定感度以下）
硝酸イオン含有量（NO3-）：4.8μmol/kg未満（測定感度以下）
（２）超純水（Millipore、Milli-Q水）
亜硝酸イオン含有量（NO2-）：0.01μmol/kg未満（測定感度以下）
硝酸イオン含有量（NO3-）：0.01μmol/kg未満（測定感度以下）
【００２１】
（実験方法）
生後6週齢のオスの野生型C57BL/6Jマウスを実験に使用した(n=6〜12)。
通常食あるいは低NO2-／NO3-食を、マウスに12週間経口投与した。
生後6週齢から低NNO2-／NO3-食の投与を開始し、毎週体重を測定した。
生後17週齢に糖負荷試験を実施した。
生後18週齢にインスリン負荷試験、心臓採血と内臓脂肪量測定、腸内細菌の解析を行った。
【００２２】
（実験結果）
１．血漿NO2-／NO3-レベル
低NO2-／NO3-食または通常食をそれぞれ12週間投与した後、18時間の絶食後に心臓採血を行った（ヘパリンコーティングの採血管（富士フイルム、富士ヘパリンチューブ）を使用）。
採血後、直ちに3500回転、4℃で10分間遠心し、血漿を-80℃で保存した。
その血漿を溶解し、NO2-／NO3-解析システム（Eicom、ENO-20）を用いてGriess法で血漿NO2-／NO3-レベルを測定した。
低NO2-／NO3-食群では、通常食群に比して、著明に低下していた（図２）。
２．食餌摂取量
代謝ケージを用いて、一日の食餌摂取量を測定した。
低NO2-／NO3-食群と通常食群の間で差は無かった（図３）。
３．体重
食餌を投与後、1週間おきに毎週体重を測定した。
低NO2-／NO3-食群と通常食群の間で差は無かった（図４）。
４．血圧値
食餌を投与後10週目に、覚醒下でtail-cuff法（室町機械、Model MK-2000ST）を用いて収縮期血圧を測定した。 
低NO2-／NO3-食群と通常食群の間で差は無かった（図５）。
５．内臓脂肪量（精巣上体白色脂肪組織重量）
前記１の採血時に、精巣上体白色脂肪組織を摘出し、その重量を測定した。
低NO2-／NO3-食群では、通常食群に比して、有意に増加していた（図６）。
６．血漿総コレステロール値
富士ドライケム（富士フイルム）を用いて、血漿総コレステロール値を比色法で測定した。
低NO2-／NO3-食群では、通常食群に比して、有意に増加していた（図７）。
７．血糖値（糖負荷試験）
pentobarbital 50mg/kg（東京化成工業）の腹腔内投与による全身麻酔下で糖負荷試験を行った。
1g/kgのブドウ糖（扶桑薬品工業）を腹腔内に投与し、投与0、30、60、90、120分後の血糖値を糖センサー（アークレイ、Glucocard MyDIA）で測定した。
低NO2-／NO3-食群では、通常食群に比して、有意に高値であった（図８）。
８．血糖値（インスリン負荷試験）
pentobarbital 50mg/kg（東京化成工業）の腹腔内投与による全身麻酔下でインスリン負荷試験を行った。
0.3 unit/kgのインスリン（Eli Lilly）を腹腔内に投与し、投与0、30、60、90、120分後の血糖値を糖センサー（アークレイ、Glucocard MyDIA）で測定した。
低NO2-／NO3-食群では、通常食群に比して、血糖値の低下率が有意に小さかった（図９）。
９．血漿アディポネクチン値
高分子アディポネクチン測定キット（シバヤギ）を用いてELISA法で、血漿アディポネクチン値を測定した。
低NO2-／NO3-食群では、通常食群に比して、有意に低下していた（図１０）。
１０．腸内細菌数
腸内の糞便を採取し、DNAを抽出してRNAに変換し、次世代シークエンサーを用いて16S ribosomal RNAの解析を行った。
図１１〜１６のグラフは、腸内細菌の分類階級（門、綱、目、科、属、種）ごとに比較したもので、各グラフの縦軸の数値は、各腸内細菌の総遺伝子数に対する割合（％）を示している。
全ての腸内細菌を同一のグラフで表すと、細菌数が非常に少ない腸内細菌が分かりにくいため、各グラフの右上に、縦軸のスケールを変えたグラフを添えている。
低NO2-／NO3-食群と通常食群の間で、有意に増加または低下した腸内細菌が多数認められた（図１１〜１６、いずれのグラフもP＜0.05、各群n=5）。
【００２３】
以上のとおり、低NO2-／NO3-食を給餌した野生型マウス（実験区）は、通常食を給餌したマウス（対照区）に比べ、体重増加を伴わずに、有意な内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性が認められた。これは、メタボリックシンドロームの病態を示すもので、野生型マウスに、NO2-及びNO3-を含まない食餌、飲水を経口摂取させるだけで、高脂肪食・果糖摂取や遺伝子改変を行うことなく、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性といったメタボリックシンドロームの病態を野生型マウスに発現させたことになる。このことから、高脂肪食・果糖摂取や遺伝子改変を行わなくても、安価に簡便な方法で、しかも生存率１００％のメタボリックシンドローム病態のモデルマウスを、NO2-及びNO3-を含まない食餌、飲水を経口摂取させるだけで作製できることが明らかになった。そして、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性のメタボリックシンドローム病態モデルマウスを作製するには、NO2-及びNO3-を含まない食餌、飲水を給餌することが有効であることが確認できた。
【００２４】
これによって、体重増加を伴わずに、内臓脂肪蓄積、高脂血症、耐糖能異常、インスリン抵抗性のメタボリックシンドローム病態を発現した野生型マウス及びその作製方法、さらに、同モデルマウスを作製するための飼育方法、同マウス作製用の餌を提供することができる。また、食事中のNO2-及びNO3-量を増やしたり、NO2-及びNO3-を経口摂取することによって、メタボリックシンドロームを改善できる方法を提供できる可能性がある。さらに、緑葉野菜に多く含有されているNO3-が含まれた、メタボリックシンドロームを改善するヒトまたは動物用の医薬、機能性食品、食品添加物を提供できる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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