(57)【要約】【課題】本発明は、生体適合性材料として利用できる生分解性の温度応答性タンパク質およびその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有するタンパク質のループ部位にアミノ酸残基を挿入することを特徴とする、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有するタンパク質のループ部位にアミノ酸残基を挿入することを特徴とする、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質の製造方法。
【請求項２】
ループ部位に１〜１０個のアミノ酸残基を挿入する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ループ部位に２〜５個のアミノ酸残基を挿入する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位がヘリックスバンドル構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位が３本のα−ヘリックスおよび２つのループ、または４本のα−ヘリックスおよび３つのループで構成される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ループ部位に数個のアミノ酸残基が挿入された複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有する、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質。
【請求項７】
ループ部位に１〜１０個のアミノ酸残基が挿入された、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
ループ部位に２〜５個のアミノ酸残基が挿入された、請求項６記載のタンパク質。
【請求項９】
複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位がヘリックスバンドル構造を有する、請求項６〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１０】
複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位が３本のα−ヘリックスおよび２つのループ、または４本のα−ヘリックスおよび３つのループで構成される、請求項６〜９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項記載のタンパク質の溶液中での相転移温度を変化させる方法であって、該タンパク質の溶液中の塩濃度、および／または該タンパク質溶液のｐＨ、および／または該タンパク質の濃度を変化させることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度に応答して可逆的に相転移するタンパク質およびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質の状態が変化する現象を相転移という。例えば、気体、液体、固体間の転移、ゾル・ゲル転移、常磁性、強磁性、反強磁性間の転移、金属・絶縁体転移、常伝導・超伝導転移など多様なものがある。
【０００３】
温度変化に伴って相転移する温度応答性合成高分子としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルグリシンアミド）−コ−ポリ（Ｎ−アセチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルアスパラギンアミド）、ポリ（アリルアミン）−コ−ポリ（アリルウレア）などが知られており、タンパク質会合体形成制御、センサー材料、細胞シート作製、薬物輸送などへの応用が期待されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
例えば、ポリ(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド)（ＰＮＩＰＡＭ）は、３１℃付近で相転移する温度応答性合成高分子である（例えば、非特許文献４参照）。ＰＮＩＰＡＭは、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下では、水和して広がったランダム型の構造を取り、ＬＣＳＴ以上では、高分子鎖の脱水和が起こり、疎水的相互作用で収集したコンパクトな球状構造へと変化し、生成した多数の球状構造の分子が疎水的相互作用により凝集会合し、溶液が白濁する。
【０００５】
また、その他の温度応答性合成高分子としては、所定の温度変化に応答した薬剤の可逆的な放出制御での利用を目的とした、温度応答性高分子を架橋してなる構造体部と無機高分子からなる構造体部とが共有結合により一体化してなる相分離構造を有する温度応答性ハロイドゲルや（特許文献１）、温度変化に応じて透明性変化が可逆的に繰り返す高分子材料であって、少なくとも２種の非ハロゲン系重合体からなる温度応答性高分子組成物（特許文献２）も知られている。
【０００６】
一方、医療分野における生体材料や、医薬分野におけるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などには、生体適合性高分子材料が利用される。かかる生体適合性高分子材料は、生体内で機能を発揮した後、酵素などにより生体内で分解されると好都合な場合も多い。
生分解性の合成高分子としては、温度応答性のポリアミノ酸（非特許文献５および非特許文献６参照）や、温度に応答してゲル転移を起こす人工ポリペプチドが報告されている（非特許文献７〜９参照）。
しかしながら、さらに有用な高分子材料の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−２２８６３９
【特許文献２】特開２００７−２３１２６５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Z. Ding, A. S. Hoffman et al. Nature, 411, 59 (2001)
【非特許文献２】N. Yamada, T. Okano et al. Macromol. Chem. Rapid Commun., 11, 571 (1990)
【非特許文献３】A. S. Hoffman, J. Control Release, 6, 297 (1987)
【非特許文献４】T. Tanaka et al., Science, 218, 467 (1981)
【非特許文献５】Y. Tachibana et al., Biomacromolecules, Vol.4, 1132-1134 (2003)
【非特許文献６】Y. Tachibana et al., Chem. Commun., 106-107 (2003)
【非特許文献７】W. A. Petka et al, Science, Vol.281, 389-392 (1998)
【非特許文献８】D. J. Pochan et al., J. AM. CHEM. SOC., Vol.125, No.39, 11802-11803 (2003)
【非特許文献９】K. Rajagopal et al., Eur Biophys J., Vol.35, 162-169 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体適合性材料として利用できる生分解性の温度応答性タンパク質およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、タンパク質はアミノ酸からなり、それぞれのタンパク質に特有の立体構造を形成することができるので、従来の合成高分子よりも高い生体適合性が期待できると考えた。タンパク質は、従来の合成高分子と同様、水の存在下で多数の水分子が水和することにより溶解する。本発明者らは、温度変化によりタンパク質の水和量を制御できれば、タンパク質集合体形成を可逆的に温度制御でき、生体適合性の高い温度応答性材料となると考え、鋭意研究した。その結果、複数のα−ヘリックスとループで構成された立体構造部位を有するタンパク質のループ部位にアミノ酸を数個挿入することにより、温度変化に伴って可逆的に相転移する温度応答性タンパク質が得られることを見出し、本願発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有するタンパク質のループ部位にアミノ酸残基を挿入することを特徴とする、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質の製造方法、
［２］ループ部位に１〜１０個のアミノ酸残基を挿入する、［１］記載の方法、
［３］ループ部位に２〜５個のアミノ酸残基を挿入する、［１］記載の方法、
［４］複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位がヘリックスバンドル構造を有する、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法、
［５］複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位が３本のα−ヘリックスおよび２つのループ、または４本のα−ヘリックスおよび３つのループで構成される、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法、
［６］ループ部位に数個のアミノ酸残基が挿入された複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有する、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質、
［７］ループ部位に１〜１０個のアミノ酸残基が挿入された、［６］記載のタンパク質、
［８］ループ部位に２〜５個のアミノ酸残基が挿入された、［６］記載のタンパク質、
［９］複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位がヘリックスバンドル構造を有する、［６］〜［８］のいずれか１つに記載のタンパク質、
［１０］複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位が３本のα−ヘリックスおよび２つのループ、または４本のα−ヘリックスおよび３つのループで構成される、［６］〜［９］のいずれか１つに記載のタンパク質、および
［１１］［６］〜［１０］のいずれか１つに記載のタンパク質の溶液中での相転移温度を変化させる方法であって、該タンパク質の溶液中の塩濃度、および／または該タンパク質溶液のｐＨ、および／または該タンパク質の濃度を変化させることを特徴とする方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有するタンパク質のループ部位にアミノ酸残基を挿入することにより、化学修飾を伴うことなく、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質を得ることができる。本願発明の温度応答性タンパク質は、アミノ酸から成るので生分解性を有し、また、生体適合性が極めて高い。さらに、本願発明の温度応答性タンパク質は、生理的条件下でも使用可能である。
したがって、本発明の温度応答性タンパク質は、医療分野における生体材料、融合タンパク質ツール、例えば、他のタンパク質へ遺伝子的に融合するタンパク質タグとして、センサー材料、細胞シート作製、ＤＤＳ等、および農薬・農業資材としての触媒担体、センサー、または芳香剤の基材、接着剤、感温材料、サーモクロミック材料等に幅広く応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ミオヘムエリスリン（Ｍｈｒ）のループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＧ）のＤＬＳによる流体力学的直径測定結果を示す。ここに、「Ｌ１−ＧＧ」は、ＭｈｒのループＬ１にグリシン残基を２個挿入した変異体をいう（以下、同じ）。
【図２】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＳＧＳＧ）のＤＬＳによる流体力学的直径測定結果を示す。ここに、「Ｌ１−ＧＳＧＳＧ」は、ＭｈｒのループＬ１にＧＳＧＳＧの５残基を挿入した変異体をいう（以下、同じ）。
【図３】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＫＧＤＧ）のＤＬＳによる流体力学的直径測定結果を示す。ここに、「Ｌ１−ＧＫＧＤＧ」は、ＭｈｒのループＬ１にＧＫＧＤＧの５残基を挿入した変異体をいう（以下、同じ）。
【図４】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＧおよびＬ１−ＧＳＧＳＧ）のタンパク質濃度による相転移温度の変化を示す。
【図５】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＧ）の塩濃度による相転移温度の変化を示す。
【図６】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＳＧＳＧ）の塩濃度による相転移温度の変化を示す。
【図７】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＧおよびＬ１−ＧＳＧＳＧ）の塩濃度による相転移温度の変化の比較を示す。
【図８】Ｍｈｒループ変異タンパク質（Ｌ１−ＧＧ）のｐＨによる相転移温度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるタンパク質に関し、「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有する」とは、タンパク質が少なくともその一部に、複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位を有することを意味する。したがって、本発明のタンパク質は、「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位」のほかに、他の立体構造部位を含んでいてもよい。また、本発明のタンパク質は、２以上の異なる「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位」を含んでいてもよい。
ここで、「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位」は、α−ヘリックスおよびループのほかに１以上のβ−シートを含んでいてもよく、該立体構造部位において、α−ヘリックスとα−ヘリックス間、α−ヘリックスとβシート間、および／またはβ−シートとβ−シート間は、ループによって連結されている。本発明において、好ましくは、「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位」は、複数のα−ヘリックスおよび１以上のループから成り、該立体構造部位において、α−ヘリックスとα−ヘリックス間はループによって連結されている。
【００１５】
本発明において、ループにはターンも包含される。
【００１６】
本発明において、「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位」の「複数のα−ヘリックス」とは、例えば、２〜６本のα−ヘリックス、好ましくは３〜５本のα−ヘリックス、より好ましくは４本のα−ヘリックスである。該立体構造部位に含まれるループの最大数は、α−ヘリックスの数およびβ−シートの数の和から１を減じた数である。したがって、本発明のタンパク質の該立体構造部位は、例えば、３本のα−ヘリックスおよび２つのループ、４本のα−ヘリックスおよび３つのループ、または５本のα−ヘリックスおよび４つのループで構成され、好ましくは、４本のα−ヘリックスおよび３つのループで構成される。
【００１７】
本発明のタンパク質の該立体構造部位中における複数のα−ヘリックスの配置は、特に限定されず、例えば、互いに直交するように配置していてもよく、互いに平行または逆平行に配置していてもよく、あるいはランダムに配置していてもよい。好ましくは、α−へリックスは、互いに平行または逆平行に配置される。
【００１８】
本発明におけるタンパク質の該立体構造部位は、好ましくは、複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成されるヘリックスバンドル構造を有する。ヘリックスバンドル構造では、複数のα−ヘリックスが平行または逆平行に配置され、各α−ヘリックスがループによって連結されている。本発明のタンパク質のヘリックスバンドル構造は、例えば、２〜６本のα−ヘリックス、好ましくは３〜５本のα−ヘリックス、より好ましくは４本のα−ヘリックスで構成される。該ヘッリックスバンドル構造に含まれるループの数は、α−ヘリックスの数から１を減じた数である。したがって、本発明のタンパク質のヘリックスバンドル構造は、好ましくは、３本のα−ヘリックスおよび２つのループ、４本のα−ヘリックスおよび３つのループ、または５本のα−ヘリックスおよび４つのループで構成され、より好ましくは、４本のα−ヘリックスおよび３つのループで構成される。
【００１９】
本発明におけるタンパク質は、上記の「複数のα−ヘリックスおよび１以上のループで構成される立体構造部位」を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ミオヘムエリスリン、ヘムエリスリン、シトクロムｃ’、シトクロムｂ５６２、Ｔ４ファージ・リゾチーム、フェリチン、ヒト成長ホルモン、サイトカインなどが挙げられる。
【００２０】
本発明では、タンパク質の上記立体構造部位のループ部位にアミノ酸残基を挿入する。本発明において、「ループ部位」とは、タンパク質の上記立体構造部位を構成するループ中の任意の位置を意味し、例えば、ループの中央付近、ループの端付近、またはその他の位置のいずれであってもよい。
【００２１】
本発明において、タンパク質がその立体構造部位において複数のループを含む場合、アミノ酸残基を挿入するループは特に限定されず、いずれのループであってもよい。ループの長さは様々であるが、例えば、短いループにアミノ酸残基を挿入する。また、１つのループにアミノ酸残基を挿入してもよく、または複数のループにアミノ酸残基を挿入してもよい。
【００２２】
例えば、タンパク質がその立体構造部位において４本のα−ヘリックスおよび３つのループを含む場合、α−ヘリックス１とα−ヘリックス２との間のループ（Ｌ１）、α−ヘリックス２とα−ヘリックス３との間のループ（Ｌ２）、およびα−ヘリックス３とα−ヘリックス４との間のループ（Ｌ３）のうち、いずれのループにアミノ酸残基を挿入してもよく、例えば、Ｌ１にアミノ酸残基を挿入する。例えば、４ヘリックスバンドル構造を有するミオヘムエリスリンを用いる場合、好ましくは、Ｌ１にアミノ酸残基を挿入する。なお、本明細書において、Ｎ末端から数えて１番目のα−ヘリックスを「α−ヘリックス１」、Ｎ末端から数えて２番目のα−ヘリックスを「α−ヘリックス２」、Ｎ末端から数えて３番目のα−ヘリックスを「α−ヘリックス３」、Ｎ末端から数えて４番目のα−ヘリックスを「α−ヘリックス４」という。
【００２３】
本発明において、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数は、特に限定されず、例えば、１〜１０個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個が挙げられる。また、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の種類は、特に限定されず、いずれのアミノ酸であってもよい。例えば、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の少なくとも１つは、疎水性または中性のアミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、またはシステインであってもよい。
【００２４】
ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数が２以上である場合、挿入されるアミノ酸残基は、同じ種類のアミノ酸残基であってもよく、または複数種類のアミノ酸残基の組み合わせであってもよい。このような複数種類のアミノ酸残基の組み合わせに、特に限定はない。
【００２５】
本発明において、アミノ酸残基の代わりに、非アミノ酸からなるリンカーまたはスペーサーをループ部位に挿入してもよい。該リンカーまたはスペーサーとしては、当該分野で既知のリンカーまたはスペーサー、例えばアルキル鎖、糖、非天然アミノ酸等が使用できる。
【００２６】
本発明において、ループ部位へのアミノ酸残基の挿入は、当該分野で知られた遺伝子工学的手段を用いて、タンパク質のコード配列に変異を導入することにより行うことができる。例えば、目的のタンパク質の既知の配列情報に基づいて、該タンパク質を有する生物由来のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ、エタノール沈澱、電気泳動等の既知の技術によって該タンパク質をコードする遺伝子を単離し、適当なベクター中にクローニングする。次いで、このようにして得られた目的タンパク質の遺伝子を組み込んだベクターを鋳型ＤＮＡとし、該タンパク質の既知の配列情報に基づいて設計された変異導入用のプライマー対を用いたＰＣＲ法により、変異が導入されたＰＣＲ増幅産物を得る。得られたＰＣＲ増幅産物を用いて適当な大腸菌株を形質転換して、ベクター中に含まれる薬物耐性等の選択マーカーによってスクリーニングすることにより、変異が導入された目的タンパク質が得られる。
【００２７】
上記のとおり、タンパク質のループ部位へアミノ酸残基を挿入することによって、可逆的に相転移する温度応答性タンパク質が製造される。本発明のタンパク質に関して「相転移」とは、水の存在下において、タンパク質が溶解状態から不溶状態になること、または不溶状態から溶解状態になることを意味する。タンパク質は、溶解状態において多数の水分子と水和しており、不溶状態において、複数のタンパク質分子が会合して集合体を形成する。「温度応答性」とは、温度変化に伴って相転移することを意味する。本発明のタンパク質は、温度変化に伴って可逆的に相転移する。
【００２８】
したがって、本発明の可逆的に相転移する温度応答性タンパク質（以下、「本発明の温度応答性タンパク質」という）は、水の存在下において、ある温度を臨界点（転移点）として、溶解状態から不溶状態に、あるいは不溶状態から溶解状態に転移するタンパク質である。本発明の温度応答性タンパク質は、水の存在下において、ある温度（以下、「相転移温度」ともいう）より低い温度では溶解してタンパク質溶液を形成しているが、相転移温度以上では、溶液中のタンパク質分子が集合体を形成して不溶化する、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有するタンパク質であってもよく、または、水の存在下において相転移温度より高い温度では溶解してタンパク質溶液を形成しているが、相転移温度以下では、溶液中のタンパク質分子が集合体を形成して不溶化する、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有するタンパク質であってもよい。
【００２９】
不溶状態において、本発明の温度応答性タンパク質は、例えば、固体またはゲルであってもよい。
【００３０】
本発明の温度応答性タンパク質の相転移は、タンパク質溶液が濁ることによって目視により、またはタンパク質溶液の濁度測定により確認できる。本明細書においては、タンパク質溶液の透過率変化の中点温度を相転移温度という。
【００３１】
本発明の温度応答性タンパク質の相転移温度は、タンパク質の種類、挿入するアミノ酸残基の数および種類等によって異なるが、例えば、約０〜５０℃のいずれかの温度に設定することができ、例えば、約５〜４０℃のいずれかの温度に設定してもよい。例えば、本発明によれば、８〜２０℃付近で相転移する温度応答性タンパク質を得ることができる。また、本発明によれば、生理的条件下（体温付近）で相転移する温度応答性タンパク質を得ることもできる。
【００３２】
本発明の温度応答性タンパク質の相転移温度は、挿入するアミノ酸残基の数および種類等のループ部位の精密設計により、適宜調節することができる。さらに、本発明では、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数および種類の他、溶液中のタンパク質濃度、タンパク質溶液中の塩濃度、およびタンパク質溶液のｐＨが相転移温度に影響することが見出された。溶液中のタンパク質濃度としては、挿入するアミノ酸残基の数および種類等の他の条件にもよるが、例えば、１μＭ〜１ｍＭのいずれかの濃度であってもよく、例えば５０μＭ〜７００μＭのいずれかの濃度を用いてもよい。溶液中のタンパク質濃度が高いほど相転移温度が低くなる。タンパク質溶液中の塩濃度は、挿入するアミノ酸残基の数および種類等の他の条件にもよるが、例えば、１００ｍＭ〜５００ｍＭ  ＮａＣｌが挙げられ、塩濃度が高いほど相転移温度が低くなる。タンパク質溶液に添加する塩の種類は特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、燐酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム等が挙げられる。タンパク質溶液のｐＨは、挿入するアミノ酸残基の数および種類等の他の条件にもよるが、例えば、ｐＨ２〜１４のいずれかのｐＨが挙げられ、また、ｐＨ６〜９のいずれかのｐＨであってもよく、相転移温度はｐＨ８付近で最も低くなる。
【００３３】
したがって、本発明では、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数および種類、溶液中のタンパク質濃度、タンパク質溶液中の塩濃度、および／またはタンパク質溶液のｐＨを適宜調節することによって、所望の相転移温度を有する温度応答性タンパク質を製造することができる。さらに、本発明は、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数および種類、溶液中のタンパク質濃度、タンパク質溶液中の塩濃度、および／またはタンパク質溶液のｐＨを適宜調節することを特徴とする、温度応答性タンパク質の相転移温度を制御する方法を提供する。またさらに、本発明は、温度応答性タンパク質の溶液中での相転移温度を変化させる方法であって、該タンパク質の溶液中の塩濃度、および／または該タンパク質溶液のｐＨ、および／または該タンパク質溶液中のタンパク質濃度を変化させることを特徴とする方法を提供する。
【００３４】
さらに、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数および種類、および溶液中のタンパク質濃度は、タンパク質が相転移する際に形成されるタンパク質集合体の粒径にも影響することが見出された。例えば、電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リジン、アスパラギン酸等）をループ部位に挿入すると、タンパク質が相転移する際に形成される集合体の粒径が小さくなることが見出された。また、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数を増やすと（例えば、Ｌ１−ＧＧからＬ１−ＧＳＧＳＧ）、タンパク質が相転移する際に形成される集合体の粒径が大きくなることが見出された。
【００３５】
したがって、本発明では、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数および種類、および／または溶液中のタンパク質濃度を適宜調節することによって、所望の粒径の集合体を形成可能な温度応答性タンパク質を製造することができる。さらに、本発明は、ループ部位に挿入するアミノ酸残基の数および種類、溶液中のタンパク質濃度、タンパク質溶液中の塩濃度、および／またはタンパク質溶液のｐＨを適宜調節することを特徴とする、温度応答性タンパク質の集合体の粒径を制御する方法を提供する。例えば、本発明によれば、約１４℃以上で約０．１〜１μｍの粒径を有する集合体を形成可能な温度応答性タンパク質を製造することができる。
【００３６】
かくして、本発明によれば、タンパク質の相転移（すなわち、タンパク質の集合体形成）を温度制御することができる。これまでに、タンパク質の集合体形成を可逆的に温度制御したとの報告例はない。
【００３７】
本発明の温度応答性タンパク質は、様々な用途に応用することができる。例えば、本発明の温度応答性タンパク質は生分解性であるので、医療分野における生体材料、融合タンパク質ツール、例えば、他のタンパク質へ遺伝子的に融合するタンパク質タグとして、センサー材料、細胞シート、ＤＤＳ等、または農薬・農業資材としての触媒担体として、特に有用である。さらに、本発明の温度応答性タンパク質は、上記したように、体温付近で相転移するように制御することができるので、生理的条件下で使用可能である。また、温度感知センサーや、芳香剤の基材、接着剤、感温材料、サーモクロミック材料等にも応用できる。さらに、本発明の温度応答性タンパク質は、化学修飾を伴わず、アミノ酸のみから成るので、遺伝子工学的に操作することができるという利点がある。したがって、従来の合成高分子よりも広い用途に利用することができる。
本発明によれば、上記のとおり相転移温度および集合体形成時の粒径を制御することができるので、その用途に適した相転移温度および集合体形成時の粒径を有する温度応答性タンパク質を適宜得ることができる。
【００３８】
さらに、本発明の温度応答性タンパク質は、鉄などの金属イオンをその構造中に有する場合、相転移に伴って該金属イオンが脱着することが確認された。本発明の温度応答性タンパク質は、このような性質を利用して、金属の運搬やＤＤＳへの応用も可能である。
【００３９】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
実施例１：ミオヘムエリスリンのループ変異タンパク質の作製
本実施例では、タンパク質として、ミオヘムエリスリン（以下、「Ｍｈｒ」ともいう）を用いた。ミオヘムエリスリンは、海洋無脊椎動物の筋肉中にある酸素運搬タンパク質（アミノ酸残基数：１１８、分子量：１４，０３５）であり、４ヘリックスバンドル構造を有する。また、ミオヘムエリスリンは、１分子中に２個の鉄イオンを含有する。
【００４１】
１．Ｍｈｒタンパク質のループへの変異導入
人工合成法により５’末端に制限酵素ＮｄｅＩサイト、３’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトをもつＭｈｒをコードする遺伝子を得た（配列番号１）。
ｐＥＴ２９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、これにＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理した上記Ｍｈｒコード遺伝子を挿入してｐＥＴ２９ｂＭｈｒベクターを得た。
このベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲに付した。
【００４２】
（１）ＰＣＲ反応液
【表１】
2015062350.tif 000002
（２）ＰＣＲサイクル
【表２】
2015062350.tif 000003
【００４３】
得られたＰＣＲ産物について、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的物が増幅されたことを確認した。大腸菌ＤＨ  ５α（５０μＬ，細胞数１０７）にＰＣＲ産物を１μＬ加え、氷上で３０分間静置した。その後、４２℃で１分間加熱し、氷上で２〜３分静置した後、ＳＯＣ培地を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離により沈殿と上澄みに分け、上澄みを取り除き、沈殿物をＬＢ寒天培地（カナマイシン含有）に植菌し、３７℃で１晩培養した。
シングルコロニーを２ｍＬのＬＢ培地（カナマイシン含有）に植菌し、６時間振とう培養した。培養液１．５ｍＬからプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサーにより配列を確認した。残りの培養液０．５ｍＬを５０％グリセロールと混合し、ストックした。
【００４４】
上記のＰＣＲ法により、ＭｈｒのループＬ１に、（１）２残基削除、（２）グリシン残基２個挿入（ＧＧ）、（３）５残基挿入（ＧＳＧＳＧ）、（４）５残基挿入（ＧＫＧＤＧ）の４パターンの変異を導入した。各変異導入のためのプライマー対は、以下の通りである。
【表３】
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【００４５】
２．Ｍｈｒループ変異体の発現
上記方法により得られたｐＥＴ２９ｂＭｈｒ変異体ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、ＬＢ培地（カナマイシン含有）２ｍＬに植菌し、３７℃で１晩振とう培養した。
上記で培養したＬＢ培地（カナマイシン含有）２ｍＬから１００μＬをＬＢ培地（カナマイシン含有）２０ｍＬに植菌し、３７℃で３〜４時間振とう培養した。
上記で培養したＬＢ培地（カナマイシン含有）２０ｍＬから２ｍＬを２ＬのＳＢ培地（カナマイシン含有）に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した（ＯＤ６００＝０．５まで）。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）溶液を１ｍＬ添加後、２７℃に温度を下げ、１晩振とう培養した（ＯＤ６００＝２．１）。
【００４６】
３．Ｍｈｒループ変異体の抽出および精製
上記で得られた培養液について遠心分画（８０００ｇ，５分，４℃）を行い、培養した大腸菌を沈殿物として回収した。菌体重量１ｇに対して４ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０，４℃）を添加し、筆で菌体を懸濁させた。得られた懸濁液を液体窒素による凍結、流水による融解を３回繰り返し、菌体からＭｈｒを抽出した。
菌体重量２０ｇに対して１ｍｇのＤＮａｓｅを加え、１時間攪拌した。遠心分画（３００００ｇ，３０分，４℃）を行い、上澄み液を回収した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０，４℃）で上澄み液を透析した（３時間，６時間で透析液交換）。次いで、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥ）で不純物を取り除いた。
得られたＭｈｒ溶出液を限外ろ過により、濃縮した。次いで、０．４５μｍのフィルターに通した後、ＦＰＬＣ（中高圧液体クロマトグラフィー）を用いて粗精製を行った。
（ＦＰＬＣ条件）  ＨｉＬｏａｄ ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５，流速：１ｍＬ／分，ロード体積：５ｍＬ，検出波長：２８０ｎｍ，３２６ｎｍ，３７８ｎｍ，緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
得られたＭｈｒ溶液を、１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０，４℃）で透析した（３時間、６時間で透析液交換）。次いで、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥ）によって不純物を取り除いた。
得られたＭｈｒループ変異体のうち、ＭｈｒのループＬ１にグリシン残基を２個挿入した変異体（以下、「Ｌ１−ＧＧ変異体」ともいう）のヌクレオチド配列を配列番号１０に示し、アミノ酸配列を配列番号１１に示す。ＭｈｒのループＬ１にＧＳＧＳＧの５残基を挿入した変異体（以下、「Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体」ともいう）のヌクレオチド配列を配列番号１２に示し、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。ＭｈｒのループＬ１にＧＫＧＤＧの５残基を挿入した変異体（以下、「Ｌ１−ＧＫＧＤＧ変異体」ともいう）のヌクレオチド配列を配列番号１４に示し、アミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【実施例２】
【００４７】
実施例２：相転移確認試験
（方法）
実施例１で製造した各Ｍｈｒループ変異体の濃度を吸光度から計算し、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてＬ１−ＧＧ変異体は７００μＭ、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体は１５０μＭに調整した。分光光度計（製品名ＵＶ−２４５０、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）にサンプルをセットし、１℃温度を可変するごとに１０分間静置した後、透過率を測定した（検出波長：８００ｎｍ）。透過率変化の中点温度を相転移温度とした。
（結果）
Ｌ１−ＧＧ変異体は、１３〜１５℃付近で透過率が変動し、１４．０℃の相転移温度を有した。また、Ｌ１−ＧＧの溶液は、１３〜１５℃付近以上で濁った。
Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体は、１３．５〜１５．５℃付近で透過率が変動し、１４．５℃の相転移温度を有した。また、Ｌ１−ＧＳＧＳＧの溶液は、１３．５〜１５．５℃付近以上で濁った。
また、Ｌ１−ＧＧ変異体およびＬ１−ＧＳＧＳＧ変異体について、いったん昇温した変異体タンパク質溶液を降温すると、昇温時とは逆向きに同様の透過率変動を示し、同様の相転移温度を示した。
Ｌ１−ＧＫＧＤＧ変異体は、ＤＬＳ（動的光錯乱法）による流体力学的直径の測定より４〜３０℃の間で相転移が見られたが（下記実施例４および図３参照）、Ｌ１−ＧＫＧＤＧの１５０μＭ溶液は、試験した温度範囲において濁らなかった。したがって、目視では確認できないほどの小さい粒子径の集合体が形成されていると考えられた。
一方、ＭｈｒのループＬ１から２残基を削除した変異体は、いずれの温度においても透過率が変動せず、濁りもしなかった。
【実施例３】
【００４８】
実施例３：顕微鏡による粒子の観察
（方法）
実施例１で製造したＬ１−ＧＳＧＳＧ変異体を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に２００μＭになるように溶解し、溶液を４℃および１５℃に調整し、２０倍対物レンズで粒子を観察した。
（結果）
４℃で粒子が見られなかったが、１５℃で直径約１μｍの粒子が観測された。
【実施例４】
【００４９】
実施例４：粒径測定
（方法）
実施例１で製造したＬ１−ＧＧ変異体、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体、およびＬ１−ＧＫＧＤＧ変異体について、ＤＬＳ（動的光錯乱法）による流体力学的直径の測定を行った。
各Ｍｈｒループ変異体を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中にＬ１−ＧＧ変異体を２００μＭ、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体およびＬ１−ＧＫＧＤＧ変異体を２００μＭおよび５０μＭになるように溶解した。Ｌ１−ＧＧ変異体の２００μＭ溶液は４℃および３０℃、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体およびＬ１−ＧＫＧＤＧ変異体の２００μＭ溶液を４℃に調整し、５０μＭ溶液を３０℃に調整し、セルに調整したタンパク溶液３００μｌを入れ、ゼータサイザーＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて測定を行った。
（結果）
Ｌ１−ＧＧ変異体については、４℃で流体力学的直径３．１ｎｍ、３０℃で流体力学的直径３４０ｎｍであった（図１）。したがって、温度変化により、流体力学的直径が約１１０倍になることが確認された。
Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体については、４℃で流体力学的直径２．７ｎｍ、３０℃で流体力学的直径６１０ｎｍであった（図２）。したがって、温度変化により、流体力学的直径が約２３０倍になることが確認された。
Ｌ１−ＧＫＧＤＧ変異体については、４℃で流体力学的直径２．３ｎｍ、３０℃で流体力学的直径３４０ｎｍであった（図３）。したがって、温度変化により、流体力学的直径が約１５０倍になることが確認された。
なお、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体の３０℃における流体力学的直径６１０ｎｍは、実施例３で顕微鏡によって観測された粒径とほぼ対応する。
【実施例５】
【００５０】
実施例５：タンパク質濃度による相転移温度の変化
（方法）
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に、実施例１で製造したＬ１−ＧＧ変異体を７００μＭおよび７０μＭ、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体を１５０μＭおよび５０μＭとなるように溶解し、実施例２と同様の方法で分光光度計により透過率を測定した。
（結果）
結果を図４に示す。Ｌ１−ＧＧ変異体は７００μＭ溶液、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体は１５０μＭ溶液の方が低い相転移温度を有した。したがって、タンパク質濃度が高いほど相転移温度が低くなることが確認された。
【実施例６】
【００５１】
実施例６：塩濃度による相転移温度の変化
（方法）
実施例１で製造したＬ１−ＧＧ変異体を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に７００μＭ、Ｌ１−ＧＳＧＳＧ変異体を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に１５０μＭとなるように溶解し、ＮａＣｌを１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、および５００ｍＭとなるようにサンプルに添加した。次いで、実施例２と同様の方法で分光光度計により透過率を測定し、相転移温度を求めた。
（結果）
結果を図５〜６に示す。Ｌ１−ＧＧ変異体およびＬ１−ＧＳＧＳＧ変異体のどちらも、塩濃度が高くなるにつれて相転移温度が低くなった。したがって、タンパク質溶液に塩を添加すると相転移温度が低くなることが確認された。
また、どちらの変異体も、塩添加により相転移温度が直線的に低下し、Ｌ１−ＧＧ変異体の方がＬ１−ＧＳＧＳＧ変異体より塩の効果を受けやすいことが分かった（図７）。これは、挿入残基の数や種類の違いによるものと考えられた。
【実施例７】
【００５２】
実施例７：ｐＨによる相転移温度の変化
（方法）
実施例１で製造したＬ１−ＧＧ変異体およびＬ１−ＧＳＧＳＧ変異体を、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、７．０、８．０、９．０）中に５００μＭとなるように溶解し、分光光度計（製品名ＵＶ−２４５０、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）にサンプルをセットし、１℃温度を可変するごとに１０分間静置した後、透過率を測定した（検出波長：８００ｎｍ）。透過率変化の中点温度を相転移温度とした。
（結果）
結果を図８に示す。ｐＨ８で最も相転移温度が低くなった。
【実施例８】
【００５３】
実施例８：鉄イオンの脱着試験
実施例１で製造したＬ１−ＧＳＧＳＧ変異体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に６．１μＭ以上となるように溶解し、４℃に調整した。このとき、タンパク質溶液は薄い褐色の透明溶液であった。この薄い褐色は、ミオヘムエリスリン分子中に含まれる鉄イオンに由来すると考えられた。
次いで、該溶液の温度を２０℃に上昇させ、溶液が濁り、タンパク質の集合体が形成されたことを確認した。遠心分画によって沈殿を回収した。回収した沈殿を純水に溶解させると、無色透明の溶液が得られた。
したがって、Ｍｈｒループ変異体は、相転移により集合体を形成したときに鉄イオンを遊離したことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の温度応答性タンパク質は、医療分野における生体材料、融合タンパク質ツール、センサー材料、細胞シート作製、ＤＤＳ等、および農薬・農業資材としての触媒担体、センサー、または芳香剤の基材、接着剤、感温材料、サーモクロミック材料等に幅広く応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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