(57)【要約】      （修正有）【課題】インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットのＸ線結晶学による高分解能の構造データと、ＰＢ２のＲＮＡ結合ポケットと結合することができＲＮＡポリメラーゼ活性を妨げる化合物を同定する演算及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法と、ウイルス感染症の治療のための化合物を含む薬理学的組成物の提供。【解決手段】ＰＢ２及びその変異体の可溶性断片と、ＲＮＡキャップ類似体を含むその結晶化複合体。ＲＮＡキャップ結合ポケットと相互作用する化合物をスクリーニング及び設計するための、前記複合体の構造座標を使用する演算方法。前記ＰＢ２ポリペプチド断片を使用することにより、化合物を同定する方法。マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスにより引き起こされるウイルス感染による疾患状態の治療のための化合物、及びこの同定した化合物を含む薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２又はその変異体由来であり、且つ（ｉｉ）ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる、可溶性ポリペプチド断片。
【請求項２】
結晶化に適切な程度まで精製されている、請求項１に記載のポリペプチド断片。
【請求項３】
該インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２が、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス若しくはインフルエンザＣウイルス又はその変異体由来である、請求項１又は２に記載のポリペプチド断片。
【請求項４】
（ｉ）Ｎ末端が配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５１０以下と同一であるか若しくはそれに対応する、
（ｉｉ）Ｎ末端が配列番号２によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２２以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号２によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５１１以下と同一であるか若しくはそれに対応する、又は
（ｉｉｉ）Ｎ末端が配列番号３によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２７以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号３によるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５２８以下と同一であるか若しくはそれに対応するポリペプチド断片、及びＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持するその変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
【請求項５】
配列番号４〜配列番号１３によるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するか又はそれに対応するポリペプチド断片、及びＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持するその変異体である、請求項４に記載のポリペプチド断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド断片と、ＲＮＡキャップ又はその類似体とを含む、複合体。
【請求項７】
該キャップ類似体が、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択される、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記ポリペプチド断片が配列番号１１によるアミノ酸配列から成り、前記キャップ類似体がｍ７ＧＴＰであり、図１８に示すような構造座標により規定される構造を有する、請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
空間群Ｃ２２２１と、ａ＝９．２ｎｍ、ｂ＝９．４ｎｍ、ｃ＝２２．０ｎｍ（±０．３ｎｍ）の単位格子寸法とを有する結晶形態を有する、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
該結晶が、３．０Å以上、好ましくは２．４Å以上の分解能までＸ線を回折する、請求項８及び９に記載の複合体。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド、又は請求項１２に記載の組換えベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットの全部又は一部と会合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）図１８に示すような請求項８に記載の複合体の構造座標により規定される前記結合ポケットのコンピュータモデルを構築する工程、
（ｂ）有望な結合化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させ前記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）前記化合物の新規リガンド設計
から成る群から選択される方法により有望な結合化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を使用する工程であって、該結合ポケットにおける前記化合物のエネルギを最小化した立体配置を提供するために、前記化合物と前記結合ポケットとのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、演算手段を使用する工程、並びに
（ｄ）前記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、前記化合物と該結合ポケットモデルとの間の会合を定量化し、それにより前記結合ポケットと会合する前記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程、
を含む、同定する方法。
【請求項１５】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４、又はそれに対応するアミノ酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３、又はそれに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合ポケットが、アミノ酸Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合ポケットが、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の構造座標により規定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の構造座標によりさらに規定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標によりさらに規定される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標によりさらに規定される、請求項２０又は２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標によりさらに規定される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＢ２ポリペプチド変異体の該結合ポケットが、前記結合ポケットのアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の骨格原子からの２．５Å以下の二乗平均平方根偏差を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
（ｅ）前記化合物を合成し、任意に前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に処方するさらなる工程を含む、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ｆ）前記化合物、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片、又は請求項１２に記載の組換え宿主細胞と、ＲＮＡキャップ又はその類似体とを接触させるさらなる工程であって、前記ＰＢ２ポリペプチド断片と前記ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害する前記化合物の能力を確定する、接触させるさらなる工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４〜２７に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ）１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つＰＢ２又はその変異体の該ＲＮＡキャップ結合ポケットと結合することができる、化合物。
【請求項２９】
請求項１４〜２７に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ）１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ該ＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と該ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害することができる、化合物。
【請求項３０】
ＰＢ２の該ＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する化合物を同定する方法であって、（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片、又は請求項１３に記載の組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）ＰＢ２と結合する前記試験化合物の能力を分析する工程を含む、同定する方法。
【請求項３１】
ＲＮＡキャップ又はその類似体を添加するさらなる工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡキャップ若しくはその類似体の存在下においてＰＢ２若しくはその変異体と結合する前記試験化合物の能力、又は前記ＲＮＡキャップ若しくはその類似体とＰＢ２若しくはその変異体との結合を阻害する前記試験化合物の能力を分析する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡキャップ又はその類似体を、前記試験化合物の添加の前、同時又は後に添加する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
ハイスループット設定において行われる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試験化合物が小分子である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験化合物がペプチド又はタンパク質である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に処方する工程をさらに含む、請求項２６、２７又は３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７又は３７に記載の方法により製造可能な薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ）１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ該ＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と結合することができる、化合物。
【請求項４０】
請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ）１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ該ＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と該ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害することができる、化合物。
【請求項４１】
ＰＢ２の該ＲＮＡキャップ結合ドメインを対象とする抗体。
【請求項４２】
配列番号１４〜配列番号２２により規定されるポリペプチドの群から選択されるポリペプチド断片を認識する、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスでのウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、請求項２８、２９、３９若しくは４０に記載の化合物、請求項３６に記載の薬学的組成物、又は請求項４１若しくは４２に記載の抗体の使用。
【請求項４４】
前記疾患状態が、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科及びラブドウイルス科を含むモノネガウイルス目のウイルス感染により引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記疾患状態が、オルトミクソウイルス科、アレナウイルス科又はブニヤウイルス科により引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
前記疾患状態が、ボルナ病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、センダイウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ニパーウイルス、ヘンダウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、トゴトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、ハンタンウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス及びラクロスウイルスから成る群から選択されるウイルスにより引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【請求項４７】
前記疾患状態が、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、トゴトウイルス及びハンタンウイルスから成る群から選択されるウイルスにより引き起こされる、請求項４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２及びその変異体の可溶性断片と、ＲＮＡキャップ類似体を含むその結晶化複合体とに関する。本発明は、ＲＮＡキャップ結合ポケットと相互作用する化合物をスクリーニング及び設計するための、上記複合体の構造座標（structural coordinates）を使用する演算（computational）方法にも関する。加えて、本発明は、好ましくはハイスループット設定において、上記ＰＢ２ポリペプチド断片を使用することにより、ＲＮＡキャップ結合ポケットを含むＰＢ２ポリペプチド断片と結合し、好ましくはＲＮＡキャップ又はその類似体との相互作用を阻害する化合物を同定する方法に関する。本発明は、マイナスセンス（negative-sense）一本鎖ＲＮＡウイルスにより引き起こされるウイルス感染による疾患状態の治療のための化合物、及びこの同定した化合物を含む薬学的組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、世界中での高い罹患率及び死亡率に関与し、多くの人により、ヒトにとって最も重大なウイルスの脅威に属すると考えられている。例年、インフルエンザの流行が地球を襲い、時折新しい毒性株が、破壊力の大きな世界的大流行を引き起こす。現在のところインフルエンザウイルスの流行を制御する主要な手段はワクチン接種である。しかし、ワクチン接種の効果を回避する突然変異インフルエンザウイルスが、迅速に発生する。新しいインフルエンザワクチンを作り出すのに約６ヶ月かかるという事実に照らすと、特に、迅速に拡散する流行病に対する防御の第一線として、代替的な治療手段（すなわち抗ウイルス薬）が必要である。
【０００３】
抗ウイルス薬の開発のための優れた出発点は、必須ウイルスタンパク質の構造データである。したがって、インフルエンザウイルス表面抗原ノイラミニダーゼの結晶構造決定（非特許文献１）は、細胞からのウイルスの放出を防止する（しかしウイルス産生は防止しない）抗ウイルス活性を有するノイラミニダーゼ阻害剤の開発を直接もたらした。これら及びそれらの誘導体は、その後抗インフルエンザ薬ザナミビル（Glaxo）及びオセルタミビル（Roche）へと発展し、これらは現在、最終的な流行病に対する防御の第一線として多くの国により貯蔵されている。しかし、これらの薬物は、臨床疾患の期間の低減をもたらすのみである。代替的に、アマンタジン及びリマンタジン等の他の抗インフルエンザ化合物は、細胞内のウイルスの脱殻（uncoating）を妨げるウイルス膜において、イオンチャネルタンパク質（すなわちＭ２タンパク質）を標的とする。しかしそれらは、その副作用と、耐性ウイルス突然変異体の迅速な発生とのために広範には使用されていない（非特許文献２）。加えて、より非特異的なウイルス剤（リバビリン等）が、インフルエンザ感染症の治療のために有効であることが示されている（非特許文献３）。しかし、リバビリンは、おそらく重度の副作用のために、数カ国でしか承認されていない（非特許文献４）。明らかに、好ましくは様々な標的を対象とする、新しい抗ウイルス化合物が必要とされている。
【０００４】
インフルエンザウイルス及びトゴトウイルスは、ハンタウイルス、ナイロウイルス、オルトブニヤウイルス及びフレボウイルスを含むブニヤウイルス（Bunyaviridae）科と同様にマイナス鎖（negative stranded）ＲＮＡウイルスである、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科に属する。それらのゲノムは分節され、（ｉ）一本鎖ビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のウイルスｍＲＮＡへの初期コピーと、（ｉｉ）ｖＲＮＡ複製とを実施するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むリボ核タンパク質粒子となる。ウイルスｍＲＮＡの生成のために、ポリメラーゼは、いわゆる「キャップ・スナッチング（cap-snatching）」機構を使用する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ポリメラーゼは、細胞ｍＲＮＡ分子の５’ＲＮＡキャップと結合し、ＲＮＡキャップをヌクレオチドのストレッチと共に切断する。キャップを有する（capped）ＲＮＡ断片は、ウイルスｍＲＮＡの合成のためのプライマーの役割を果たす。ポリメラーゼは、ＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質）、ＰＢ２及びＰＡの３つのサブユニットから構成される。ＰＢ１はエンドヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性を保有するが、ＰＢ２はＲＮＡキャップ結合ドメインを含有する。
【０００５】
ポリメラーゼ複合体は、ウイルスｍＲＮＡの合成とウイルス複製とに必須であり、また宿主細胞タンパク質中に見出されるものと顕著に異なる可能性がある幾つかの機能的活性部位を含有するので、適当な抗ウイルス剤の標的であると考えられる（非特許文献２）。したがって例えば、ＰＢ１内のＰＡ結合ドメインと類似するアミノ酸数２５のペプチドにより、ポリメラーゼサブユニットの集合化を妨げることが試みられている（非特許文献９）。さらに、ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性が標的とされており、一連の４−置換２，４−ジオキソブタン酸化合物が、インフルエンザウイルスにおけるこの活性の選択的阻害剤として同定されている（非特許文献１０）。加えて、真菌の種であるデリツチア・コンファータスポラ（Delitschia confertaspora）の抽出物中で同定されたフルチミド（flutimide）（置換２，６−ジケトピペラジン）により、インフルエンザウイルスのエンドヌクレアーゼを阻害することが示されている（非特許文献１１）。また、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシン等のヌクレオシド類似体によりウイルス転写を妨げることが試みられており（非特許文献１２）、置換ピラジン化合物であるＴ−７０５が、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤として機能し得ることが示されている（非特許文献４）。最終的には、ヒトキャップ結合タンパク質ｅＩＦ４ＥのＲＮＡキャップ構造との結合様式と、インフルエンザウイルスＲＮＰのＲＮＡキャップ構造との相互作用との間の比較研究により、非特許文献１３は、インフルエンザウイルスと選択的に相互作用し、ヒトキャップ結合タンパク質とは相互作用しない新規なキャップ類似体を同定した。しかし、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットと相互作用し、且つＲＮＡキャップ結合を妨げることによりＲＮＡポリメラーゼ活性を妨げる可能性がある化合物を同定するための主要な障壁は、上記結合ポケットの構造及び正体（identity）が現在まで未知であることであった。
【０００６】
ＲＮＡキャップ結合部位を明らかにするために幾つかの試みがなされているが、結果は議論の余地を残すものとなっている。架橋実験により、ＰＢ２の２つの別々の配列（１つはＮ末端（２４２〜２８２）近位部、１つはＣ末端（５３８〜５７７）近位部）が、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡキャップ結合部位を構成することが示された（非特許文献１４）。さらなる架橋実験により、ＰＢ２タンパク質サブユニットにおける５３３位のアミノ酸から５６４位のアミノ酸までに及ぶ配列、特にアミノ酸残基Ｔｒｐ５５２が、ＲＮＡキャップに関する有望な（potential）相互作用部位として同定された（非特許文献１５）。さらに、突然変異解析により、ＰＢ２内に有望なＲＮＡキャップ結合アミノ酸残基Ｐｈｅ３６３及びＰｈｅ４０４がもたらされた（非特許文献１６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】von Itzstein et al., 1993  "Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication", Nature, 363, pp. 418-423
【非特許文献２】Magden et al., 2005  "Inhibitors of virus replication: recent developments and prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, pp. 612-621
【非特許文献３】Eriksson et al., 1977  Inhibition of Influenza virus ribonucleic acid polymerase by ribavirin triphosphate. Antimicrob. Agents Chemother., 11, pp. 946-951
【非特許文献４】Furuta et al., 2005  "Mechanism of action of T-705 against influenza virus", Antimicrob. Agents Chemother., 49, pp. 981-986
【非特許文献５】Plotch et al., 1981  "A unique cap(m7GpppXm)-dependent influenza virion endo- nuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription", Cell, 23, pp. 847-858
【非特許文献６】Kukkonen et al., 2005  "L protein, the RNA-dependent RNA polymerase of hantaviruses", Arch. Virol., 150, pp. 533-556
【非特許文献７】Leahy et al., 1997  "In Vitro Polymerase Activity of Thogoto Virus: Evidence for a Unique Cap-Snatching Mechanism in a Tick-Borne Orthomyxovirus", J. Virol., 71, pp. 8347-8351
【非特許文献８】Noah and Krug, 2005  "Influenza virus virulence and its molecular determinants", Adv. Virus Res., 65, pp. 121-145
【非特許文献９】Ghanem et al., 2007  "Peptide-mediated interference with influenza A virus polymerase". J. Virol., 81, pp. 7801-7804
【非特許文献１０】Tomassini et al., 1994  "Inhibition of cap (m7GpppXm)-dependent endonuclease of influenza virus by 4-substituted 2,4-diocobutanic acid compounds", Antimicrob. Agents Chemother., 38, pp. 2827-283
【非特許文献１１】Tomassini et al., 1996  "A novel antiviral agent which inhibits the endonuclease of influenza viruses", Antimicrob. Agents Chemother., 40, pp. 1189-1193
【非特許文献１２】Tisdale, M. et al., (1995), "Inhibition of influenza virus transcription by 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine", Antimicrob. Agents Chemother., 39, pp. 2454-2458
【非特許文献１３】Hooker, L. et al., (2003), "Quantitative analysis of the influenza virus RNP interaction with RNA cap structures and comparison to human cap binding protein eIF4E", Biochemistry, 42, pp. 6234-6240
【非特許文献１４】Honda, A. et al., (1999), "Two separate sequences of PB2 subunit constitute the RNA cap-binding site of influenza virus RNA polymerase", Genes to Cells, 4, pp. 475-485
【非特許文献１５】Li, M.-L. et al., (2001), "The active site of the influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits", EMBO J., 20, pp. 2078-2086
【非特許文献１６】Fechter, P. et al., (2003), "Two aromatic residues in the PB2 subunit of influenza A RNA polymerase are crucial for cap binding", J. Biol. Chem., 278, pp. 20381-20388
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（ｉ）Ｘ線結晶学によるＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットの高分解能の構造データと、（ｉｉ）好ましくはハイスループット設定において、ＰＢ２のＲＮＡ結合ポケットと結合することができ、好ましくはＲＮＡキャップ結合と競合することによりＲＮＡポリメラーゼ活性を妨げる化合物を同定する、演算及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法と、（ｉｉｉ）ウイルスｍＲＮＡの合成のためのキャップ・スナッチング機構を使用する、ウイルスにより引き起こされる感染症の治療のためのこのような化合物を含む薬理学的（pharmacological）組成物とを提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
本発明は、独立して折り畳まれた（folded）ドメイン内におけるＰＢ２のＲＮＡキャップ結合部位の、正確な定義を初めて可能にする。どこにその部位が位置し得るかについては、現在でも十分に議論の余地がある。機能的キャップ結合部位には、全部で３つのポリメラーゼサブユニットが必要であると一般に考えられており、おそらくウイルスＲＮＡもそうであった（Cianciet al., 1995、非特許文献１４）。機能的ＲＮＡキャップ結合ポケットを含む可溶性ＰＢ２ポリペプチド断片を組換え技術により作製するという本発明者らの驚くべき達成により、容易に入手可能な材料を使用して簡単な発現系からインフルエンザウイルスポリメラーゼにおける機能的部位の阻害剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのハイスループットスクリーニングを行うことが可能になる。キャップ結合阻害剤に関する過去の研究は、例えば、インフルエンザビリオンから精製した完全リボ核タンパク質粒子を使用している（非特許文献１３）。さらに、ＰＢ２内のＲＮＡキャップ結合ポケットの詳細な構造座標を提供することにより、本発明は、キャップ結合阻害剤の設計に対して、すなわちｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのスクリーニング及びリード最適化において、構造基準アプローチを使用することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２又はその変異体由来であり、且つ（ｉｉ）ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる、可溶性ポリペプチド断片に関する。
【００１１】
さらなる一態様では、本発明は、本発明の可溶性ポリペプチド断片と、ＲＮＡキャップ又はその類似体とを含む複合体に関する。
【００１２】
さらなる一態様では、本発明は、本発明の単離可溶性ポリペプチド断片をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
さらなる一態様では、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
【００１４】
さらなる一態様では、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチド、又は本発明の組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００１５】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットの全部又は一部と会合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）図１８に示すような本発明の複合体の構造座標により規定される上記結合ポケットのコンピュータモデルを構築する工程、
（ｂ）有望な結合化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させ上記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）上記化合物の新規（de novo）リガンド設計
から成る群から選択される方法により有望な結合化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を使用する工程であって、結合ポケットにおける上記化合物のエネルギを最小化した（energy-minimized）立体配置を提供するために、上記化合物と上記結合ポケットとのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、演算手段を使用する工程、並びに
（ｄ）上記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、上記化合物と結合ポケットモデルとの間の会合を定量化し、それにより上記結合ポケットと会合する上記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程、
を含む、同定する方法に関する。
【００１６】
さらなる一態様では、本発明は、本発明のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン又はＴ−７０５ではなく、且つＰＢ２又はその変異体のＲＮＡキャップ結合ポケットと結合することができる、化合物に関する。
【００１７】
さらなる一態様では、本発明は、本発明のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン又はＴ−７０５ではなく、且つＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片とＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害することができる、化合物に関する。
【００１８】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する化合物を同定する方法であって、（ｉ）本発明のポリペプチド断片、又は本発明の組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）ＰＢ２と結合する上記試験化合物の能力を分析する工程を含む、同定する方法に関する。
【００１９】
さらなる一態様では、本発明は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法により製造可能な薬学的組成物に関する。
【００２０】
さらなる一態様では、本発明は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン又はＴ−７０５ではなく、且つＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片と結合することができる、化合物に関する。
【００２１】
さらなる一態様では、本発明は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン又はＴ−７０５ではなく、且つＰＢ２ポリペプチド、その変異体又はその断片とＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害することができる、化合物に関する。
【００２２】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインを対象とする抗体に関する。
【００２３】
さらなる一態様では、本発明は、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスでのウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、本発明の化合物、本発明の薬学的組成物、又は本発明の抗体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】インフルエンザポリメラーゼのＰＢ１サブユニットに対する有望な結合部位と、従来技術により予測された有望なＲＮＡキャップ結合部位とを有する全長ＰＢ２を例示する図である（Ｃａｐ−Ｎ／Ｃａｐ−Ｃは非特許文献１３を参照されたい。Ｃａｐ−Ｃ（Ｔｒｐ５５２）は非特許文献１４を参照されたい。Ｃａｐ−Ｍは非特許文献１５を参照されたい）。加えて、様々なＰＢ２断片が細菌発現に関して生成されたことが示される。これらの構築物の全てが、高レベルで発現され、且つ可溶性である。最上部から最下部までに、１３種類の単離クローンによりコードされるＰＢ２断片の長さを示す（これらにより７個の特有のＰＢ２断片がコードされていた）。単離クローンは、配列番号２５の、以下のヌクレオチドに及ぶ：クローン６８：８８６〜１４４９、クローン１６：８７１〜１４５２、クローン１５：８７１〜１４５２、クローン５７：８４４〜１４４９、クローン１３：８４４〜１４４９、クローン１０：８３２〜１４４３、クローン２８：８０５〜１４５２、クローン２３：８０５〜１４５２、クローン１２：７２３〜１４２５、クローン４：７０６〜１４９１、クローン３０：７０６〜１４９１、クローン０７：７０６〜１４９１及びクローン０５：７０６〜１４９１。Clone:  クローンPB1  binding:  ＰＢ１結合部位
【図２】図２Ａは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラムでのＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸位置３１８〜４８３）の精製を示すグラフである。任意の単位での２８０ｎｍでの吸光が、溶出時間及び画分番号に対してプロットされる。Absorption  at  280nm  in  arbitrary  unit:  任意の単位での２８０ｎｍでの吸光Fractions  :  画分100.0%  Buffer  B  :１００．０％緩衝液ＢHrs:min:sec  :  時間：分：秒            図２Ｂは、ゲル濾過後の、ＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸位置３１８〜４８３）の画分２４〜画分３４の、クーマシー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す図である。分子量マーカーは、１１６ｋＤ、６６．２ｋＤ、４５ｋＤ、３５ｋＤ、２５ｋＤ、１８．４ｋＤ及び１４．４ｋＤのサイズを有する。
【図３】図３Ａは、沈殿剤溶液１．６Ｍギ酸ナトリウム、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．６）で形成したｍ７ＧＴＰ（５ｍＭ）との複合体での、ＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸位置３１８〜４８３）の未変性の（native）結晶を示す図である。            図３Ｂは、沈殿剤溶液１．６Ｍギ酸ナトリウム、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．６）で形成したｍ７ＧＴＰ（５ｍＭ）との複合体での、部分的にセレノ−メチオニル化した（seleno-methionylated）ＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸位置３１８〜４８３）の結晶を示す図である。
【図４】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ＦａｃｉｌｉｔｙでのビームラインＢＭ１４で未変性の結晶に関して得られたＸ線回折パターンを示す図である。回折パターンは格子寸法ａ＝９２．２Å、ｂ＝９４．４Å、ｃ＝２２０．４Åの、空間群Ｃ２２２１での指標となる（indexes）。右上の挿入図は、分解能２．４Åに及ぶ回折を示す。右下の挿入図は、データ収集のために使用した凍結結晶を示し、該結晶のおよそのサイズは１５×１５×５０μｍ３である。Influenza  polymerase  PB2  subunit  cap-binding  domain(native  protein  BM14)  :  インフルエンザポリメラーゼＰＢ２サブユニットキャップ結合ドメイン（未変性のタンパク質）ＢＭ１４2.4Å  resolution  :  ２．４Å  分解能50  microns  :  ５０ミクロン
【図５】ｍ７ＧＴＰとの複合体でのＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸位置３１８〜４８３）の構造のリボン図である。二次構造要素を、ＤＳＳＰにより算出した（Holm, L. and Sander, C., 1993）ように表示し、αヘリックスを濃い灰色で、β鎖（beta-strands）を薄い灰色で示す。ＧＴＰを、Ｐｈｅ３２３、Ｐｈｅ４０４及びＨｉｓ３５７の側鎖と共に、球棒モデルとして示す。残基３４８及び残基４２０を中心とする重要なループを、構造において可視的なＮ末端及びＣ末端の残基（それぞれ、３２０及び４８３）と共に、表示する。420-loop  :  ４２０ループ348-loop  :  ３４８ループ
【図６】４２０ループが溶媒中に突き出ていることを明らかにする、ｍ７ＧＴＰとの複合体でのＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸位置３１８〜４８３）の構造の代替図である。420-loop  :  ４２０ループ348-loop  :  ３４８ループCommunication  loop  to  PB1  :  ＰＢ１に対するコミュニケーションループ
【図７】ＰＢ２内のＲＮＡキャップ結合ポケットを形成する幾つかのアミノ酸により取り囲まれるｍ７ＧＴＰの立体構造及び不偏（unbiased）実験電子密度を示す図である。電子密度は、実験位相（phase）及び０．９５シグマで作成した（contoured）非結晶学的対称平均化を使用して、ＲＥＳＯＬＶＥにより得られたマップに対応する。
【図８】ＰＢ２内のＲＮＡキャップ結合ポケットに埋め込まれたキャップ類似体ｍ７ＧＴＰを、有望な相互作用する原子と共に示す図である。推定水素結合を、点線により示す。
【図９】インフルエンザＡ（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５株）及びインフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０株）由来のＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５の二次構造（ＤＳＳＰで算出した（Holm and Sander, 1993））を、配列アライメントの上に表示する。構造基準の配列アライメントをＥＳＰＲＩＰＴ（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）でプロットした。背景がベタ塗りの黒色である残基は、２つの配列の間で同一である。三角形は、キャップ類似体ｍ７ＧＴＰと相互作用する主残基を示す。
【図１０】インフルエンザＡ（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５株）、インフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０株）及びインフルエンザＣ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／５０株）由来のＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。注釈は図９に関するものと同様である。
【図１１】ＲＮＡキャップ類似体ｍ７ＧＴＰとＰＢ２内のＲＮＡキャップ結合ポケットとの間の相互作用を概略的に示す図である。キャップ類似体ｍ７ＧＴＰ（Ｍ７Ｇと表示する）を濃い灰色の結合で、タンパク質残基を中位の灰色の結合で、水分子を薄い灰色の球で、描く。水素結合を、ドナーとアクセプタとの間における単位Åの距離を有する点線として示す。濃い灰色の球の斜線を付した部分は、リガンドとファンデルワールス接触状態にある残基を示す。図は、座標ファイルにおいて鎖記号（designation）Ｂを有する分子に対応する。非対称単位（鎖Ａ、鎖Ｂ、鎖Ｄ及び鎖Ｆ）の４つの他の分子は、距離と水の位置とに微小な差異を有する同様の図をもたらす。図を、ＬＩＧＰＬＯＴを使用して作成した（Wallaceet al., 1995）。
【図１２】４℃でｍ７ＧＴＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂と結合した後での、表示した野生型及び単一点突然変異体のＰＢ２のキャップ結合ドメインの溶出の結果の、クーマシー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す図である。突然変異体Ｅ３６１Ａ、Ｆ４０４Ａ、Ｈ３５７Ａ及びＫ３７６Ａは、野生型タンパク質が結合する条件下でｍ７ＧＴＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂と結合することができなかったが、Ｆ３２３Ａは弱い結合活性が残っており、Ｆ３２５Ａは野生型とほぼ同様に樹脂と結合した。しかし、この結合活性は、３７℃で劇的に低減する（表３を参照されたい）。Ｈ３５７Ｗ突然変異体も、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣがこの残基をこの位置に有するので、作製した。この突然変異体を、可溶性のものとして（solubly）精製し、野生型と比較してｍ７ＧＴＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂との結合がわずかに増強していることが見出された。突然変異体ΔＶＱが、残基Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６（４２０ループ）を３つのグリシンで置換することにより生成され、キャップ結合活性を示す。L=Loaded  fractions  :  Ｌ＝装荷した画分E=Eluted  fractions  :  Ｅ＝溶出した画分
【図１３】野生型又は突然変異体の組換えポリメラーゼ複合体のキャップ結合活性を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養物を、ＰＢ１及びＰＡを発現するプラスミドで同時トランスフェクトする（Φ）か、又はＰＢ１、ＰＢ２−Ｈｉｓ若しくはその突然変異体及びＰＡを発現するプラスミドで同時トランスフェクトした。細胞抽出物を、４℃でｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いるプルダウン法により分析した。ｍ７ＧＴＰで保持及び溶出したポリメラーゼ複合体を、ＰＡ特異的抗体を用いるウェスタンブロット法により明らかにした。ＩＮ及びＥは、それぞれ、投入した細胞抽出物、及び溶出したタンパク質を示す。ＰＡ特異的バンドの位置を右に表示し、分子量マーカーの移動度を左に示す。突然変異体ΔＶＱは、残基Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６（４２０ループ）を３つのグリシンで置換することにより生成された。
【図１４】野生型又は突然変異体のポリメラーゼの複製活性を示すグラフである。野生型及び突然変異体ｍｉｎｉ−ＲＮＰをｉｎ  ｖｉｖｏで再構築し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースを用いるアフィニティクロマトグラフィにより精製した。子孫ＲＮＰの蓄積を、抗ＰＡ抗体及び抗ＮＰ抗体を使用するウェスタンブロット法により確定した。データは、野生型の値の百分率として示し、２つの実験の平均及び範囲である。突然変異体ΔＶＱは、残基Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６（４２０ループ）を３つのグリシンで置換することにより生成された。RNP  accumulation(%  of  WT  value)  :  ＲＮＰ蓄積（ＷＴの値の％）Mutant  :  突然変異体
【図１５】プライマーとしてＡｐＧを使用する、精製した野生型又は突然変異体のＲＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写活性を示すグラフである。示したデータは、２つの実験の平均及び範囲である。突然変異体ΔＶＱが、残基Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６（４２０ループ）を３つのグリシンで置換することにより生成された。ApG-Dependent  Transcription(%  of  WT  value)  :  ＡｐＧ依存性転写（ＷＴの値の％）Mutant  :  突然変異体
【図１６】β−グロブリンのｍＲＮＡをプライマーとして使用する、精製した野生型又は突然変異体のＲＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写活性を示すグラフである。示したデータは、２つの実験の平均及び範囲である。突然変異体ΔＶＱが、残基Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６（４２０ループ）を３つのグリシンで置換することにより生成された。β-Globin-Dependent  Transcription(%  of  WT  value)  :  β−グロブリン依存性転写（ＷＴの値の％）Mutant  :  突然変異体
【図１７】精製した野生型又は突然変異体のＲＮＰのＡｐＧ対β−グロブリンのｍＲＮＡ依存性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写活性の比を示すグラフである。示したデータは、２つの実験の平均及び範囲である。突然変異体ΔＶＱが、残基Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６（４２０ループ）を３つのグリシンで置換することにより生成された。Ratio  β-Globin/ApG-Dependent  Transcription  β−グロブリン依存性転写／ＡｐＧ依存性転写の比Mutant  :  突然変異体
【図１８】Ｌｙｓ３８９を有する配列番号１のＰＢ２ポリペプチド断片のアミノ酸３１８〜４８３に関する精密な原子構造座標のリストである。断片は、ＲＮＡキャップ類似体７−メチル−グアノシン三リン酸（ｍ７ＧＴＰ）との複合体での配列番号１１によるアミノ酸配列を有する。非対称単位に鎖Ａ、鎖Ｂ、鎖Ｄ、鎖Ｅ、鎖Ｆを有する５つの分子が存在する。ＲＮＡキャップ類似体ｍ７ＧＴＰは、各鎖の残基番号１である。２９３個の水分子が存在する。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラム中の最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コードが与えられ、アミノ酸配列位置が与えられる。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有率因子は、各原子が座標により特定される位置を占有する分子の割合（fraction）を表す。値「１」は、各原子が結晶の全ての分子において同じ立体構造、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。異方性温度因子は、「ＡＮＩＳＯＵ」と記したラインにおいて与えられる。この命名は、ＰＤＢファイル形式に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中で説明する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２６】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel,Switzerland, (1995)に記載されているように規定される。
【００２７】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲全体を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「含む（comprise）」という単語、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変化形は、記載された整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。
【００２８】
複数の文書が、本明細書の文章全体を通じて引用される。本明細書中で引用される文書の各々（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）が、上記又は下記に関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくこのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈すべきではない。
【００２９】
「ポリペプチド断片」という用語は、単一のアミノ酸鎖から構成されるタンパク質の一部分を表す。「タンパク質」という用語は、二次構造及び三次構造を回復するポリペプチド断片を含み、複数のアミノ酸鎖、すなわち複数のサブユニットから構成され、四次（quartenary）構造を形成するタンパク質をさらに表す。「ペプチド」という用語は、アミノ酸数が最大５０であり二次構造又は三次構造を必ずしもとる必要はない短いアミノ酸鎖を表す。「ペプトイド（peptoid）」は、Ｎ−置換グリシンのオリゴマー集合化から得られるペプチド模倣物質（peptidomimetic）である。
【００３０】
２つ以上のポリペプチドにおける残基は、その残基がポリペプチド構造における類似の位置を占有する場合、互いに「対応する（correspond）」と言う。当該技術分野では既知であるように、２つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列又は構造的類似性に基づきポリペプチド配列を整列させることにより確定することができる。このようなアライメントツールは当業者に既知であり、例えば、ワールドワイドウェブ、例えば標準的な設定（好ましくはＡｌｉｇｎに関してはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）において、得ることができる。当業者は、満足なアライメントを生成するためにいずれかの配列にギャップを導入することが必要な場合があることを理解する。例えば、インフルエンザＡウイルスＰＢ２サブユニットにおける２２０位〜５１０位の残基は、インフルエンザＢウイルスＰＢ２サブユニットにおける２２２位〜５１１位の残基、及びインフルエンザＣウイルスＰＢ２サブユニットにおける２２７位〜５２８位の残基に、それぞれ対応する。したがって、３つの（thrre）ＰＢ２サブユニットに関して生成されたアライメントを、図１０に示す。２つ以上のインフルエンザウイルスＰＢ２サブユニットにおける残基が最良の配列アライメントにおいて整列する場合、それらの残基が「対応する」と言う。２つのポリペプチドの間の「最良の配列アライメント」は、同一残基の整列数が最大となるアライメントと定義される。２つの整列させた配列の間の配列類似性、好ましくは配列同一性が、１０個、２０個又は３０個のアミノ酸の長さにわたり３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満に低下した場合には、より好ましくは１０個、２０個又は３０個のアミノ酸の長さにわたり３０％未満に低下した場合には、「最良の配列アライメントの領域」は途切れ、それにより類似性スコアの確定のための比較配列の長さの境界及び範囲（metesand bounds）を確定する。インフルエンザＡ（アミノ酸位置３１５〜４９８）、インフルエンザＢ（アミノ酸位置３１７〜４９９）及びインフルエンザＣ（アミノ酸位置３２７〜５１６）のＰＢ２サブユニットのアミノ酸配列に関する最良の配列アライメントの一部分を、図９及び図１０に示す。
【００３１】
本発明は、ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる、可溶性インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット断片を含む。「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２」という用語は、好ましくは配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されたアミノ酸配列を有する、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス及びインフルエンザＣウイルスのＰＢ２を表すことが好ましい。「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２変異体」は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。天然のＰＢ２変異体を配列番号１、配列番号２又は配列番号３によるＰＢ２サブユニットと整列させる場合、そのアライメントが２つのタンパク質の全長にわたり、したがってアライメントスコアをこれに基づき確定することが好ましい。しかし、天然の変異体が、例えばＮ末端又はＣ末端の融合を通じて、Ｃ末端／Ｎ末端の又は内部の欠失又は付加を含み得ることも考え得る。この場合には、それぞれ類似性及び同一性の評価のために、最も良く整列した領域のみが使用される。
【００３２】
好ましくは、また以下でより詳細に示すように、これらの変異体由来の可溶性断片は、好ましくはＲＮＡキャップ結合に必要とされる領域内において、それぞれ表示した類似性及び同一性を示す。したがって、配列番号１、配列番号２又は配列番号３とＰＢ２変異体との間の任意のアライメントが、好ましくはＲＮＡキャップ結合ポケットを含むはずである。したがって、配列番号１、配列番号２又は配列番号３のそれぞれとの上記の配列類似性及び同一性が、好ましくはＲＮＡキャップ結合ポケットを含む、少なくとも１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１６５個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、３００個又はそれ以上のアミノ酸の長さにわたり生じる。したがって、好ましい一実施形態では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２変異体は、１００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１１０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１２０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１３０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１４０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１５０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１６０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１６５個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１７０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１８０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１９０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２１０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２２０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２３０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２４０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２５０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、又は３００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号１との配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。
【００３３】
好ましい一実施形態では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２変異体は、１００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１１０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１２０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１３０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１４０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１５０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１６０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１６５個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１７０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１８０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１９０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２１０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２２０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２３０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２４０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２５０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、又は３００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号２との配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。
【００３４】
好ましい一実施形態では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２変異体は、１００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１１０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１２０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１３０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１４０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１５０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１６０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１６５個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１７０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１８０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、１９０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２１０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２２０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２３０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２４０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、２５０個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有するか、又は３００個のアミノ酸の長さにわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列番号３との配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。
【００３５】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３による配列の多数の天然のＰＢ２変異体が既知であり、文献で説明されている。これらのＰＢ２変異体の全てが含まれ、本発明の可溶性断片の基礎であり得る。配列番号１が参照配列として使用される場合には、インフルエンザＡに関する好ましい例は、Ｖａｌ２２７、Ａｒｇ２５１、Ｉｌｅ２５５、Ｓｅｒ２７１、Ｇｌｎ２８８、Ｉｌｅ３３８、Ｖａｌ３４４、Ａｒｇ３５５、Ｉｌｅ３７３、Ｌｅｕ３７４、Ａｓｎ４５６、Ｖａｌ４６１及び／又はＳｅｒ４９７の１つ又は複数での突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記変異体は以下の突然変異：Ｖａｌ２２７Ｍｅｔ、Ａｒｇ２５１Ｌｙｓ、Ｉｌｅ２５５Ｖａｌ、Ｉｌｅ２５５Ｔｈｒ、Ｓｅｒ２７１Ａｌａ、Ｇｌｎ２８８Ｌｅｕ、Ｉｌｅ３３８Ｖａｌ、Ｉｌｅ３３８Ｔｈｒ、Ｖａｌ３４４Ｌｅｕ、Ａｒｇ３５５Ｌｙｓ、Ｉｌｅ３７３Ｔｈｒ、Ｌｅｕ３７４Ｉｌｅ、Ａｓｎ４５６Ｓｅｒ、Ｖａｌ４６１Ｉｌｅ及び／又はＳｅｒ４９７Ａｓｎの１つ又は複数を含む。インフルエンザＡウイルスＰＢ２サブユニットの好ましい変異体は、上述の突然変異の１つ又は複数と任意に組み合わせて、アルギニンからリジンへのアミノ酸交換をもたらす３８９位での突然変異を含む（例えば、配列番号１１）。配列番号２が参照配列として使用される場合には、インフルエンザＢウイルスＰＢ２サブユニットの好ましい変異体は、以下のアミノ酸位置：Ｔｈｒ２５４、Ｍｅｔ２６１、Ｉｌｅ２６９、Ｔｈｒ３０１、Ｉｌｅ３０３、Ｌｅｕ３１９、Ｉｌｅ３４６、Ｌｙｓ３８０、Ａｒｇ３８２、Ｍｅｔ３８３、Ｌｙｓ３８５、Ｌｙｓ３９７、Ａｓｎ４４２、Ｓｅｒ４５６、Ｇｌｕ４６７、Ｌｅｕ４６８及び／又はＴｈｒ４９４の１つ又は複数での突然変異を含む。好ましい一実施形態では、ＰＢ２サブユニット変異体は以下の突然変異：Ｔｈｒ２５４Ａｌａ、Ｍｅｔ２６１Ｔｈｒ、Ｉｌｅ２６９Ｖａｌ、Ｔｈｒ３０１Ａｌａ、Ｉｌｅ３０３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ３１９Ｇｌｎ、Ｉｌｅ３４６Ｖａｌ、Ｌｙｓ３８０Ｇｌｎ、Ａｒｇ３８２Ｌｙｓ、Ｍｅｔ３８３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３８５Ａｒｇ、Ｌｙｓ３９７Ａｒｇ、Ａｓｎ４４２Ｓｅｒ、Ｓｅｒ４５６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４６７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４６８Ｓｅｒ及び／又はＴｈｒ４９４Ｉｌｅの１つ又は複数を含む。配列番号３が参照配列として使用される場合には、インフルエンザＢウイルスＰＢ２サブユニットの好ましい変異体は、以下のアミノ酸位置：Ｌｅｕ３１１、Ｐｒｏ３３０及び／又はＳｅｒ４３６の１つ又は（ore）複数での突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記突然変異は、以下の通りである：Ｌｅｕ３１１Ｐｒｏ、Ｐｒｏ３３０Ｇｌｎ及び／又はＳｅｒ４３６Ｔｈｒ。
【００３６】
本発明の可溶性断片は、したがって、上で規定したようなＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２又はその変異体に基づく。したがって以下の本明細書では、「可溶性ポリペプチド断片（複数可）」及び「ＰＢ２ポリペプチド断片」という用語は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示したようなＰＢ２タンパク質由来のこのような断片、及び上で示したようなそのＰＢ２タンパク質変異体由来の断片の両方であって、ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる断片を常に含む。しかし、本明細書は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２変異体由来のＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる可溶性ＰＢ断片を具体的に表すために、「ＰＢ２ポリペプチド断片変異体」又は「ＰＢ２断片変異体」という用語も使用する。したがって本発明の可溶性ＰＢ２断片は、好ましくは、天然のインフルエンザウイルスサブユニットＰＢ２の配列を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る。しかし、ＰＢ２断片変異体が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又はそれ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸置換をさらに含有し、且つ配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有することも想定される。本発明のＰＢ２断片が、ＰＢ２由来でない付加的なアミノ酸（例えばタグ、酵素等）を含むことがあり、このような付加的なアミノ酸はこのようなアライメントにおいては考慮されない（すなわち、アライメントスコアの算出から除外される）ことが理解される。好ましい一実施形態では、上で示したアライメントスコアは、少なくとも１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１６５個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個又は２７０個のアミノ酸の長さにわたり、断片の配列を配列番号１、配列番号２又は配列番号３（ここで配列番号１、配列番号２又は配列番号３のそれぞれの配列は、ＲＮＡキャップ結合ポケットを含むことが好ましい）と整列させると得られる。
【００３７】
好ましい一実施形態では、可溶性ＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＢ２の３２３位〜４０４位（配列番号１３）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はそれから成り、且つ配列番号１３に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、（%m）８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＢ２の３１８位〜４８３位（配列番号１１）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号１１に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＢ２の２３５位〜４９６位（配列番号４）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号４に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＡウイルスＰＢ２の２２０位〜５１０位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号１に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわ���り、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。好ましい実施形態では、本発明のインフルエンザＡウイルスＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、配列番号１と比較して以下のアミノ酸残基：Ｖａｌ２２７、Ａｒｇ２５１、Ｉｌｅ２５５、Ｓｅｒ２７１、Ｇｌｎ２８８、Ｉｌｅ３３８、Ｖａｌ３４４、Ａｒｇ３５５、Ｉｌｅ３７３、Ｌｅｕ３７４、Ｌｙｓ３８９、Ａｓｎ４５６、Ｖａｌ４６１及び／又はＳｅｒ４９７の１つ又は複数での突然変異等の、突然変異、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記突然変異は、以下の通りである：Ｖａｌ２２７Ｍｅｔ、Ａｒｇ２５１Ｌｙｓ、Ｉｌｅ２５５Ｖａｌ、Ｉｌｅ２５５Ｔｈｒ、Ｓｅｒ２７１Ａｌａ、Ｇｌｎ２８８Ｌｅｕ、Ｉｌｅ３３８Ｖａｌ、Ｉｌｅ３３８Ｔｈｒ、Ｖａｌ３４４Ｌｅｕ、Ａｒｇ３５５Ｌｙｓ、Ｉｌｅ３７３Ｔｈｒ、Ｌｅｕ３７４Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８９、Ａｓｎ４５６Ｓｅｒ、Ｖａｌ４６１Ｉｌｅ及び／又はＳｅｒ４９７Ａｓｎ。インフルエンザＡウイルスＰＢ２サブユニット断片の好ましい変異体は、上述の突然変異の１つ又は複数と任意に組み合わせて、アルギニンからリジンへのアミノ酸交換をもたらす３８９位での突然変異を含む（例えば、配列番号１１）。
【００３８】
好ましい一実施形態では、ＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＢ２の３２５位〜４０６位（配列番号２由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はそれから成り、且つ配列番号２に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＢ２の３２０位〜４８４位（配列番号２由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号２に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＢ２の２３７位〜４９７位（配列番号２由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号２に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＢウイルスＰＢ２の２２２位〜５１１位（配列番号２由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号２に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。好ましい実施形態では、本発明のインフルエンザＢウイルスＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、配列番号２と比較して以下のアミノ酸位置：Ｔｈｒ２５４、Ｍｅｔ２６１、Ｉｌｅ２６９、Ｔｈｒ３０１、Ｉｌｅ３０３、Ｌｅｕ３１９、Ｉｌｅ３４６、Ｌｙｓ３８０、Ａｒｇ３８２、Ｍｅｔ３８３、Ｌｙｓ３８５、Ｌｙｓ３９７、Ａｓｎ４４２、Ｓｅｒ４５６、Ｇｌｕ４６７、Ｌｅｕ４６８及び／又はＴｈｒ４９４の１つ又は複数での、突然変異、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記断片変異体は、以下の突然変異：Ｔｈｒ２５４Ａｌａ、Ｍｅｔ２６１Ｔｈｒ、Ｉｌｅ２６９Ｖａｌ、Ｔｈｒ３０１Ａｌａ、Ｉｌｅ３０３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ３１９Ｇｌｎ、Ｉｌｅ３４６Ｖａｌ、Ｌｙｓ３８０Ｇｌｎ、Ａｒｇ３８２Ｌｙｓ、Ｍｅｔ３８３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３８５Ａｒｇ、Ｌｙｓ３９７Ａｒｇ、Ａｓｎ４４２Ｓｅｒ、Ｓｅｒ４５６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４６７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４６８Ｓｅｒ及び／又はＴｈｒ４９４Ｉｌｅの１つ又は複数を含む。
【００３９】
好ましい一実施形態では、ＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＢ２の３３５位〜４１６位（配列番号３由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又はそれから成り、且つ配列番号３に示したアミノ酸配列と、断片の全長にわたり、少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列類似性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＢ２の３３０位〜５０１位（配列番号３由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号３に示したアミノ酸配列と、断片の全長にわたり、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％の配列類似性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＢ２の２４２位〜５１４位（配列番号３由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号３に示したアミノ酸配列と、断片の全長にわたり、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％の配列類似性を有し、より好ましくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、インフルエンザＣウイルスＰＢ２の２２７位〜５２８位（配列番号３由来）のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を少なくとも含み、且つ配列番号２に示したアミノ酸配列と、断片の全長にわたり、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％の配列類似性を有する。好ましい実施形態では、本発明のインフルエンザＣウイルスＰＢ２ポリペプチド断片変異体は、配列番号３と比較して以下のアミノ酸残基：Ｌｅｕ３１１、Ｐｒｏ３３０及び／又はＳｅｒ４３６の１つ又は複数における突然変異等の、突然変異、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましい一実施形態では、上記断片変異体は、以下の突然変異：Ｌｅｕ３１１Ｐｒｏ、Ｐｒｏ３３０Ｇｌｎ及び／又はＳｅｒ４３６Ｔｈｒの１つ又は複数を含む。
【００４０】
「配列類似性」という用語は、最良の配列アライメントの同じ位置でのアミノ酸が同一又は類似である、好ましくは同一であることを意味する。「類似のアミノ酸」は、類似の特性、例えば極性、溶解性、親水性、疎水性、電荷又はサイズを有する。類似のアミノ酸は好ましくは、ロイシン、イソロイシン及びバリン；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン；リジン、アルギニン及びヒスチジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；グリシン、アラニン及びセリン；トレオニン、アスパラギン、グルタミン及びメチオニンである。当業者には、例えばワールドワイドウェブ（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html）上で利用可能な、配列類似性検索ツールが十分に明らかである。
【００４１】
本明細書中で使用する場合の「可溶性（soluble）」という用語は、有効濃度のグアニジン又は尿素等の変性剤の非存在下における、５ｍｇ／ｍｌものタンパク質濃度での、例えば０．１４Ｍ塩化ナトリウム又はスクロースのような生理学的等張条件下での、水性緩衝液中における１０００００×ｇでの３０分間の遠心分離後にポリペプチド断片が上清中に残存する状態を表す。その溶解性に関して試験されるタンパク質断片は、以下で示される細胞発現系の１つにおいて発現されることが好ましい。このようなタンパク質断片の発現と、好ましくは精製とが、実施例２において以下でより詳細に示すように実施されることが特に好ましい。
【００４２】
ポリペプチドに関して「精製（purified）」という用語は、均質調製物のように絶対的に純粋であることを要求せず、むしろそのポリペプチドが自然環境中の状態よりも相対的に純粋であることを表す。概して、精製したポリペプチドは、好ましくは機能的に顕著なレベルで、例えば少なくとも８５％の純度（pure）、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度で、該ポリペプチドが自然状態で会合する他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の材料を実質的に有しない。「結晶化に適切な程度まで精製されている」という表現は、純度が８５％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％、より好ましくは９５％〜１００％であり、沈殿することなく３ｍｇ／ｍｌ超、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ超、より好ましくは１８ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮され得るタンパク質を表す。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技法を使用して、ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主バンドを生じる。
【００４３】
本発明の方法で化合物を同定する文脈において使用されるところの「会合する（associate）」という用語は、或る分子部分（moiety）（すなわち、化学的分子若しくは化合物又はその一部分（portions）若しくはその断片）とＰＢ２の結合ポケットとの間の近接状態を表す。会合は、非共有的であり得る（すなわち、例えば水素結合性相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用又は疎水的相互作用により、近接位置（juxtaposition）がエネルギ的に有利である場合には）か、又は共有的であり得る。
【００４４】
「ＲＮＡキャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出され、異常な５’間（5' to 5'）三リン酸結合を介してｍＲＮＡと連結したグアニンヌクレオチドから成るキャップ構造を表す。このグアノシンは、７位がメチル化されている。さらなる修飾は、ｍＲＮＡの５’末端の最初の３つのリボース糖の２’ヒドロキシ基の起こり得るメチル化を含む。「ＲＮＡキャップ類似体」は、ＲＮＡキャップ構造に類似する構造を表す。ＲＮＡキャップ類似体の例は、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、７−メチル−グアノシン一リン酸（ｍ７ＧＭＰ）、７−メチル−グアノシン三リン酸（ｍ７ＧＴＰ）、５’間三リン酸架橋を介してグアノシンと連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＧ）、リボースの２’位のＯＨがメチル化されたグアノシンと５’間三リン酸架橋を介して連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＧｍ）、５’間三リン酸架橋を介してアデノシンと連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＡ）、リボースの２’位のＯＨがメチル化されたアデノシンと５’間三リン酸架橋を介して連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＡｍ）、５’間三リン酸架橋を介してシチジンと連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＣ）、リボースの２’位のＯＨがメチル化されたシチジンと５’間三リン酸架橋を介して連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＣｍ）、５’間三リン酸架橋を介してウリジンと連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＵ）、リボースの２’位のＯＨがメチル化されたウリジンと５’間三リン酸架橋を介して連結した７−メチル−グアノシン（ｍ７ＧｐｐｐＵｍ）を含む。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、キャップ類似体は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍ（ここでＮはヌクレオチド、好ましくはＧ、Ａ、Ｕ又はＣである）から成る群から選択される。別の好ましい実施形態では、ＲＮＡキャップ類似体は、例えば１個〜１５個（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個）のさらなるヌクレオチドを含み得る（ここでヌクレオチドは好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ及び／又はＴから成る群から独立して選択される）。これらのさらなるヌクレオチドは、ホスホエステル結合、ホスホジエステル結合若しくはホスホトリエステル（phosphotrieester）結合、又はその非加水分解性の類似結合（analog）を介して、ｍ７ＧｐｐｐＮ又はｍ７ＧｐｐｐＮｍ中の最初のヌクレオチドＮと連結されるのが好ましい。
【００４５】
本明細書中で使用する場合の「ヌクレオチド」という用語は、例えばKornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed.（Freeman, San Francisco,1992）において説明されるように、１’位でペントースと連結した、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン等のプリン、デアザプリン又はピリミジンヌクレオシド塩基から成る化合物（２’−デオキシ型及び２’−ヒドロキシル型を含む）を表し、例えばScheit,Nucleotide Analogs （John Wiley, N. Y., 1980）により概説される修飾塩基分子部分及び／又は修飾糖分子部分を有する合成ヌクレオシドをさらに含むがこれらに限定されない。
【００４６】
「結合ポケット」という用語は、本発明のポリペプチド断片により形成される三次元構造、すなわちＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインを表し、これはＲＮＡキャップと直接接触するアミノ酸、又はＲＮＡキャップと直接接触するアミノ酸残基を位置決めするアミノ酸残基（第２層のアミノ酸残基）（例えばＡｒｇ３３２及びＳｅｒ３３７）が並んでいる。その形状のために、結合ポケットはＲＮＡキャップ又はその類似体を収容することができる。ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットは、ＲＮＡキャップ結合部位を含むＰＢ２ポリペプチド断片と、ＲＮＡキャップ類似体との間の複合体の結晶構造データの分析から得られる構造座標により規定される。「結合ポケット」という用語は、ＰＢ２ポリペプチド断片変異体の結合ポケットも含む。
【００４７】
「ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメイン」という用語は、その未変性の三次元構造中にＲＮＡ結合ポケットを含むＰＢ２の最小のポリペプチド断片を表す。
【００４８】
「単離（isolated）ポリヌクレオチド」という用語は、（ｉ）その自然環境から単離した、（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した、又は（ｉｉｉ）全体的に若しくは部分的に合成したポリヌクレオチドを表し、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む。この用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び組換えＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体又はその一部分から成り得る。
【００４９】
本明細書中で使用する場合の「組換えベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む当業者に既知の任意のベクターを含む。上記ベクターは、発現ベクター及びクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み、概して、所望のコード配列と、特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳動物）又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系における操作可能に連結したコード配列の発現に必要な適当なＤＮＡ配列とを含有する。クローニングベクターは概して、或る特定の所望のＤＮＡ断片を操作し（engineer）増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要とされる機能的配列を欠くことがある。
【００５０】
本明細書中で使用する場合の「組換え宿主細胞」は、対象のポリペプチド断片、すなわち本発明によるＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を表す。このポリヌクレオチドは、（ｉ）それ自体が自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクター中に取り込まれて、又は（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡ中に組み込まれて、宿主細胞内に見出され得る。組換え細胞は、対象のポリヌクレオチドの発現のために、又は本発明のポリヌクレオチド若しくは組換えベクターの増幅のために、使用することができる。「組換え宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチド又は組換えベクターで形質転換するか、トランスフェクトするか、又は感染させた元の細胞の子孫を含む。組換え宿主細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）若しくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母細胞、植物細胞、ＳＦ９細胞若しくはＨｉ５細胞等の昆虫細胞、又は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨＥＬＡ細胞等である。
【００５１】
本明細書中で使用する場合の「結晶（crystal）」又は「結晶性（crystalline）」という用語は、平面が一定の角度で交差し（faces intersect）、構成要素である化学種の規則的な構造（内部構造等）が存在する、構造（三次元固体集合体（aggregate）等）を意味する。「結晶」という用語は、以下のいずれか１つを含み得る：実験的に調製した結晶等の固体の物理的結晶形態、結晶から誘導可能な結晶構造（二次構造要素及び／又は三次構造要素及び／又は四次構造要素を含む）、結晶構造に基づく２Ｄモデル及び／又は３Ｄモデル、その略式表示若しくはその図式表示等のその表示、又はコンピュータ用のそのデータ組。一態様では、結晶はＸ線結晶学技法において使用可能である。ここで、使用する結晶は、Ｘ線ビームへの曝露に耐えることができ、Ｘ線結晶学的構造を解くのに必要な回折パターンデータを作製するために使用される。結晶は、T.L. Blundell and L. N. Johnson, "Protein Crystallography", AcademicPress, New York（1976）に示される結晶形態の１つにより規定されるパターンで、Ｘ線を回折することができることを特徴とし得る。
【００５２】
「単位格子（unit cell）」という用語は、基本的な平行六面体形状のブロックを表す。結晶の全体積は、このようなブロックの規則的な集合化により構築され得る。各単位格子は、その繰り返しが結晶を構築するパターンの単位の完全な表示を含む。
【００５３】
「空間群」という用語は、結晶の対称要素の配置を表す。空間群の指定においては、大文字は格子形を示し、他の記号は、その外観を変化させることなく非対称単位の内容（contents）に関して実施され得る対称操作を表す。
【００５４】
「構造座標」という用語は、複数軸（axes）の系との関連で１つ又は複数のアミノ酸残基の位置を規定する一組の値を表す。この用語は、分子（単数又は複数）の三次元構造を規定するデータ組（例えば、デカルト座標、温度因子及び占有率）を表す。構造座標は、わずかに修正してもよいが、それでもほぼ同一の三次元構造をもたらす。構造座標の特有の一組の尺度は、得られた構造の二乗平均平方根偏差（root mean square deviation）である。３Å、２Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満の二乗平均平方根偏差で互いに離れる三次元構造（特に結合ポケットの特定の三次元構造）をもたらす構造座標は、当業者により非常に類似のものとみなされ得る。
【００５５】
「二乗平均平方根偏差」という用語は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向又は目標（object）からの偏差又は変動を表現する方法である。本発明の目的のために、「二乗平均平方根偏差」は、図１８によるＰＢ２−ｍ７ＧＴＰ複合体の構造座標により規定されるような、ＰＢ２又はその中のＲＮＡキャップ結合ポケットの骨格からの、ＰＢ２ポリペプチド断片の変異体又はその中のＲＮＡキャップ結合ポケットの骨格の変動を規定する。
【００５６】
本明細書中で使用する場合の「コンピュータモデルを構築すること」という用語は、原子構造情報及び相互作用モデルに基づく分子の構造及び／又は機能の定量的分析及び定性的分析を含む。「モデリング」という用語は、従来の数値基準の分子動的モデル及びエネルギ最小化モデル、相互作用的コンピュータグラフィックモデル、改変（modified）分子力学モデル、距離幾何学法、並びに他の構造基準制約モデルを含む。
【００５７】
「フィッティングプログラム操作」という用語は、化学的分子を結合ポケット、分子若しくは分子複合体又はその一部分と会合させるために、化学的分子、結合ポケット、分子若しくは分子複合体又はその一部分の構造座標を利用する操作を表す。これは、化学的分子を結合ポケット中で位置決め、回転又は平行移動し、結合ポケットの形状及び静電的相補性を適合させることにより、達成することができる。共有的相互作用と、水素結合、静電的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用等の非共有的相互作用と、反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用及び電荷−双極子相互作用等の非相補的な静電的相互作用とが、最適化され得る。代替的に、化学的分子と結合ポケットとの結合の変形エネルギを最小化することができる。
【００５８】
本明細書中で使用する場合の「試験化合物」という用語は、対象のポリペプチド断片、すなわち本発明のＰＢ２ポリペプチド断片、又はＲＮＡキャップ結合ポケットを含むその変異体と結合するその能力に関して試験される化合物、分子又は複合体を含む薬剤を表す。試験化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド、核酸、有機小分子若しくは無機小分子、化学的化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン並びにその組合せ及び誘導体を含むがこれらに限定されない任意の薬剤であり得る。「小分子」という用語は、５０〜約２５００ダルトンの分子量、好ましくは２００〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を表す。加えて、本発明による試験化合物は、検出可能な標識を任意に含み得る。このような標識は、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物及び生物発光化合物を含むがこれらに限定されない。このような検出可能な標識を試験化合物に結合するために、既知の方法が使用され得る。本発明の試験化合物は、天然生成物、又は混合コンビナトリアル合成の生成物を含有する抽出物等の、物質の複雑な混合物も含み得る。これらも試験することができ、標的ポリペプチド断片と結合する成分を、その後の工程で混合物から精製することができる。試験化合物は、合成又は天然の化合物のライブラリから抽出する（derived）か、又は選択することができる。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall, UK）、ChemBridge Corporation（San Diego, CA）又はAldrich（Milwaukee, WI）から市販されている。天然化合物ライブラリは、例えば、TimTecLLC（Newark, DE）から入手可能である。代替的に、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞並びに組織抽出物の形態の天然化合物のライブラリを使用することができる。さらに、試験化合物を、個々の化合物として、又は混合物としてコンビナトリアルケミストリを使用して、合成的に製造することができる。コンビナトリアルケミストリを使用して作製した化合物のコレクションは、本明細書中でコンビナトリアルライブラリと称される。
【００５９】
「ハイスループット設定において」という用語は、対象のポリペプチド断片と結合する能力に関して試験化合物のライブラリをスクリーニングするために使用される、ハイスループットスクリーニングアッセイ、及び様々な種類の技法を表す。典型的には、ハイスループットアッセイは多ウェル形式で行われ、無細胞アッセイ及び細胞基準アッセイを含む。
【００６０】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方、すなわち、抗原又はハプテン、すなわちＰＢ２又はそのペプチドのＲＮＡキャップ結合ドメインを認識することができる任意の免疫グロブリンタンパク質又はその一部分を表す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法により、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断により作製され得る。幾つかの実施形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体等のキメラ抗体、ダイアボディ（diabodies）、及びポリペプチドとの特異的抗原結合をもたらすのに十分な抗体を少なくとも一部分含有するポリペプチドを含む。
【００６１】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明の方法により同定可能な化合物、又は本発明の化合物の塩を表す。適切な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明の化合物の溶液を、薬学的に許容可能な酸（例えば、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸）の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩を含む。さらに、化合物が酸性分子部分を保有する場合には、その適切な薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩）；及び適切な有機リガンド（例えば、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、アルキルスルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対陰イオンを使用して形成した、アンモニウム陽イオン、四級アンモニウム陽イオン及びアミン陽イオン）で形成される塩を含み得る。薬学的に許容可能な塩の例示的な例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ（camphorate）、スルホン酸ショウノウ（camphorsulfonate）、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオナート（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むがこれらに限定されない（例えば、S.M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19（1977）を参照されたい）。
【００６２】
本明細書中で使用される場合の「添加物」という用語は、例えば担体、結合剤、滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝液、香料又は着色料等の、活性成分ではない、薬学的製剤中の全ての物質を示すことが意図される。
【００６３】
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター等を含む。
【００６４】
本発明者らは、可溶性であり且つＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができ、それ故に結晶化して構造情報を取得するのに、また組換えタンパク質での結合研究を実施するのに適切な、インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２由来の断片が存在することを見出した。（ｉ）インフルエンザウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２由来であり、且つ（ｉｉ）ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合することができる、可溶性ポリペプチド断片を提供することが、本発明の一態様である。本発明の可溶性断片が得られるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２は、好ましくはインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス又はインフルエンザＣウイルス由来である。本発明の可溶性断片の最小の長さは、ＲＮＡキャップ又はその類似体と結合するその能力により確定される。したがって、本発明のＰＢ２ポリペプチド断片は、配列番号１の３２３位〜４０４位若しくは３２０位〜４８３位のアミノ酸残基、又は例えばＰＢ２ポリペプチド断片変異体におけるそれに対応するアミノ酸を少なくとも含むか、又はそれから成ること；配列番号２の３２５位〜４０６位若しくは３２０位〜４８４位のアミノ酸残基、又は例えばＰＢ２ポリペプチド断片変異体におけるそれに対応するアミノ酸を少なくとも含むか、又はそれから成ること；又は配列番号３の３３５位〜４１６位若しくは３３０位〜５０１位のアミノ酸残基、又は例えばＰＢ２ポリペプチド断片変異体におけるそれに対応するアミノ酸を少なくとも含むか、又はそれから成ることが好ましい。一方で、断片の長さが或る特定のＣ末端及び／又はＮ末端の境界を超えて伸張する場合には、断片の溶解性が減少することが観察されている。インフルエンザＡ型由来の可溶性断片に関しては、これらの境界は、配列番号１との関連で、好ましくは、Ｎ末端に関しては２２０位のアミノ酸、又は変異体におけるそれに対応するアミノ酸であり、Ｃ末端に関しては５１０位のアミノ酸、又は変異体におけるそれに対応するアミノ酸である。インフルエンザＢ型由来の可溶性断片に関しては、これらの境界は、配列番号２との関連で、好ましくは、Ｎ末端に関しては２２２位のアミノ酸、又は変異体におけるそれに対応するアミノ酸であり、Ｃ末端に関しては５１１位のアミノ酸、又は変異体におけるそれに対応するアミノ酸である。インフルエンザＣ型由来の可溶性断片に関しては、これらの境界は、配列番号３との関連で、好ましくは、Ｎ末端に関しては２２７位のアミノ酸、又は変異体におけるそれに対応するアミノ酸であり、Ｃ末端に関しては５２８位のアミノ酸、又は変異体におけるそれに対応するアミノ酸である。この文脈における「可溶性」という用語は、溶媒１ｍｌ当たり少なくとも０．１ｍｇ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で溶解可能なポリペプチド断片を表す。適切な溶媒は、０．０１Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ〜１Ｍの範囲の濃度のＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ３〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９）と、任意に１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はＴＣＥＰ．ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロキシクロリド）等の還元剤とを含む緩衝系である。
【００６５】
好ましい一実施形態では、上記ポリペプチド断片は、結晶化に適切な程度まで精製されている。好ましくは少なくとも９５％、９６％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の純度を有する。タンパク質の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色法による染色、又はＨＰＬＣ及び２８０ｎｍでの検出を含む標準的な方法により評価することができる。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、
（ｉ）上記ポリペプチド断片のＮ末端は、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸配列の、アミノ酸位置２２０以上、例えば２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０若しくは３２３と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、例えば５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２２０と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０、５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２２５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２３０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２３５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２４０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２４５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２５０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２５５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２６０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２６５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２７０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２７５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２９０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２９５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３００以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３０５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３１０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３１５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３２０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；又はより好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３２３以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１０以下、特に５０５、５００、４９５、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５、４８４若しくは４８３と同一であるか若しくはそれに対応し；
（ｉｉ）上記ポリペプチド断片のＮ末端は、配列番号２によるＰＢ２のアミノ酸配列の、アミノ酸位置２２２以上、例えば２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５と同一であるか若しくはそれに対応し（orresponds）、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２２２以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに（to to）対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２２５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２３０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２３５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２４０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２４５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２５０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２５５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２６０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２６５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２７０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２７５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２９０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２９５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３００以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３０５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３１０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３１５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３２０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；又はより好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３２５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５１１以下、例えば５１０、５０５、５００、４９９、４９８、４９７、４９６、４９５、４９４、４９３、４９２、４９１、４９０、４８９、４８８、４８７、４８６、４８５若しくは４８４と同一であるか若しくはそれに対応し；又は
（ｉｉｉ）上記ポリペプチド断片のＮ末端は、配列番号３によるＰＢ２のアミノ酸配列の、アミノ酸位置２２７以上、例えば２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０若しくは３３５と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２２７以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２３０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２３５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２４０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２４５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２５０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２５５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２６０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２６５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２７０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２７５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２８５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２９０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２９５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３００以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３０５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置２２７以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置３１０以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３１５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３２０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３２５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；より好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３３０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応し；又はより好ましくは上記ポリペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸位置３３５以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端は、アミノ酸位置５２８以下、例えば５２５、５２０、５１９、５１８、５１７、５１６、５１５、５１４、５１３、５１２、５１１、５１０、５０９、５０８、５０７、５０６、５０５、５０４、５０３、５０２若しくは５０１と同一であるか若しくはそれに対応する。
【００６７】
別の実施形態では、上記ポリペプチド断片は、配列番号４〜配列番号１３によるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列から成るか、それから本質的に成るか、又はそれに対応するポリペプチド断片、及びＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持し且つ可溶性であるその変異体である。好ましい実施形態では、上記ポリペプチド断片は、上で示したように、アミノ酸の置換、挿入又は欠失、好ましくは天然の突然変異を含む。好ましくは本発明のＰＢ２ポリペプチド断片は、２３５位〜４９６位（配列番号４）、２４１位〜４８３位（配列番号５）、２６８位〜４８３位（配列番号６）、２７７位〜４８０位（配列番号７）、２８１位〜４８２位（配列番号８）、２９０位〜４８３位（配列番号９）、２９５位〜４８２位（配列番号１０）、３１８位〜４８３位（配列番号１１）、３２０位〜４８３位（配列番号１２）又は３２３位〜４０４位（配列番号１３）のアミノ酸残基を有するか、又はそれに対応する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、上で説明したようなＰＢ２ポリペプチド断片とＲＮＡキャップ又はその類似体とを含む複合体を提供する。好ましくはキャップ類似体は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択される。本発明の一実施形態では、複合体におけるポリペプチド断片は配列番号１１によるアミノ酸配列から成り、キャップ類似体はｍ７ＧＴＰであり、複合体は図１８に示すような構造座標により規定される構造を有する。好ましい一実施形態では、任意の本発明の複合体は、好ましくは空間群Ｃ２２２１と、ａ＝９．２ｎｍ、ｂ＝９．４ｎｍ；ｃ＝２２．０ｎｍ±０．３ｎｍの単位格子寸法とを有する結晶形態を含む。好ましくは上記結晶は、３．０Å以上、好ましくは２．８Å以上、より好ましくは２．６Å以上、最も好ましくは２．４Å以上の分解能までＸ線を回折する。
【００６９】
一実施形態では、結晶化に適切なタンパク質溶液は、水溶液中において、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体と、２ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは３ｍＭ〜８ｍＭ、より好ましくは４ｍＭ〜６ｍＭの濃度のＲＮＡキャップ類似体と、任意に０．０１Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ〜１Ｍの範囲の濃度のＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ３〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９）等の緩衝系と、任意に１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はＴＣＥＰ．ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロキシクロリド）等の還元剤とを含み得る。ＰＢ２ポリペプチド断片若しくはその変異体、又はＰＢ２ポリペプチド断片若しくはその変異体とＲＮＡキャップ若しくはその類似体とを含む複合体は、結晶化溶液中において、好ましくは純度が８５％〜１００％であり、より好ましくは純度が９０％〜１００％であり、さらにより好ましくは純度が９５％〜１００％である。結晶を作製するために、結晶化に適切なタンパク質溶液は、ギ酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、様々なサイズのポリエチレングリコール等の等量の沈殿剤溶液と、混合される。好ましい一実施形態では、結晶化媒体は、１．５Ｍ〜２Ｍギ酸ナトリウム及び０．０５Ｍ〜０．１５Ｍクエン酸を含む（ｐＨ４〜ｐＨ５）同様の好ましくは等しい量の沈殿剤溶液と混合した、０．０５μｌ〜２μｌ、好ましくは０．８μｌ〜１．２μｌの結晶化に適切なタンパク質溶液を含む。別の実施形態では、沈殿剤溶液は、７％  ＰＥＧ６０００、１Ｍ  ＬｉＣｌ、０．１Ｍ  クエン酸（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ．ＨＣｌを含む。
【００７０】
結晶は、ハンギング−シッティングドロップ（hanging and sitting drop）法と、サンドイッチドロップ法と、透析法と、マイクロバッチ又はマイクロチューブバッチデバイスとを含む（がこれらに限定されない）当業者に既知の任意の方法により成長させることができる。単独での又は化合物との複合体での、本発明のＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体の結晶を作製する他の結晶化条件を特定するために、上で開示した結晶化条件を変更することが、当業者には容易に明らかであろう。このような変更は、ｐＨ、タンパク質濃度及び／又は結晶化温度を調整すること、使用する塩及び／又は沈殿剤の特性又は濃度を変化させること、結晶化のための様々な方法を使用すること、又は結晶化に役立つ洗浄剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（モノラウリル酸塩）、ＬＤＯＡ、Ｂｒｉｊ  ３０（４ラウリルエーテル））、糖（例えば、グルコース、マルトース）、有機化合物（例えば、ジオキサン、ジメチルホルムアミド）、ランタニドイオン若しくは多価イオン性（poly-ionic）化合物等の添加剤を導入することを含むがこれらに限定されない。ハイスループット結晶化アッセイが、結晶化条件を見出すか、又は最適化するのを支援するために使用されることもある。
【００７１】
マイクロシーディング（Microseeding）を、結晶のサイズ及び質を増大させるために使用することができる。簡潔には、微結晶を粉砕し、ストックシード（stockseed）溶液を得る。ストックシード溶液を段階希釈する。ニードル、ガラスロッド又は一本の髪の毛（strand of hair）を使用して、各希釈溶液からの小量の試料を、シードの存在なしに結晶を創出するのに必要とされる濃度以下のタンパク質濃度を含有する一組の平衡化した液滴に添加する。目的は、液滴中での結晶成長の核となる働きをする単一シード結晶を最終的に得ることである。
【００７２】
本明細書中で説明したような、図１８に示すような構造座標を取得する方法、座標の解釈、及びタンパク質構造を理解する際のその有用性は、当業者により、及びJ. Drenth, "Principles of protein X-ray crystallography",2nd Ed., Springer Advanced Texts in Chemistry, New York (1999)、及びG.E. Schulz and R. H. Schirmer, "Principles of Protein Structure",Springer Verlag, New York（1985）等の標準的なテキストを参照して、一般的に理解されている。例えば、１００Ｋまで凍結して凍結保護した結晶（例えば、２０％〜３０％グリセロールで）を多くの場合使用し、例えばＸ線源としてシンクロトロン施設でビームライン又は回転陽極を使用して、Ｘ線回折データを初めに取得する。その後位相問題を一般的に既知の方法（例えば、多波長異常回折（ＭＡＤ）、重原子同形置換（multipleisomorphous replacement）（ＭＩＲ）、単一波長異常回折（ＳＡＤ）又は分子置換（ＭＲ）により解決する。部分構造（sub-structure）を、ＳＨＥＬＸＤ（Schneiderand Sheldrick, 2002）を使用して解明し、ＳＨＡＲＰ（Vonrhein et al., 2006）で位相を算出し、溶媒平坦化（solventflattening）及び非結晶学的対称平均化（例えば、ＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger, 2000）で）で改良することができる。モデル自動構築を例えばＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakiset al., 1999）で、精密化を例えばＲＥＦＭＡＣ（Murshudov, 1997）で、行うことができる。さらに、本発明により提供されるＰＢ２断片の構造座標（図１８）は、分子置換法を使用する、他のオルトミクソウイルス科の属のＰＢ２ポリペプチド、又はアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するＰＢ２ポリペプチド変異体の構造決定に有用である。
【００７３】
上で言及したＰＢ２ポリペプチド断片及びその変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供することは、本発明の別の態様である。このような単離ヌクレオチド断片を取得するために適用される分子生物学的方法は、概して当業者に既知である（標準的な分子生物学的方法に関しては、Sambrook et al., Eds., "Molecular Cloning: A LaboratoryManual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（1989）（これは参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。例えば、ＲＮＡを、インフルエンザウイルスに感染した細胞から単離することができ、ランダムプライマー（例えば、ランダムな六量体若しくは（of）十量体）、又は対象の断片の生成に特異的なプライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を適用して、ｃＤＮＡを生成することができる。その後対象の断片を、断片特異的プライマーを使用する標準的なＰＣＲにより増幅することができる。
【００７４】
好ましい一実施形態では、好ましい実施形態の可溶性ＰＢ２ポリペプチド断片をコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号２３（インフルエンザＡ）、配列番号２６（インフルエンザＢ）又は配列番号２７（インフルエンザＣ）由来である。好ましい一実施形態では、可溶性のインフルエンザＡウイルスＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体をコードする単離ポリヌクレオチドは配列番号２５由来であり、配列番号１と比較して３８９位でのアルギニンからリジンへのアミノ酸交換を含む。さらにより好ましい実施形態では、インフルエンザＡウイルスＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体をコードする単離ポリヌクレオチドは配列番号２６由来であり、大腸菌コドン使用に関して最適化したＤＮＡ配列である。この文脈では、「由来（derived）」は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６又は配列番号２７が全長ＰＢ２ポリペプチドをコードし、したがって、好ましいＰＢ２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが、それぞれコードされるＰＢ２ポリペプチド断片による要求に応じて、ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端に欠失を含むことを表す。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、上記単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。当業者には、対象のポリヌクレオチド配列のベクター中への取り込みに使用される技法は、十分に明らかである（Sambrook et al., 1989も参照されたい）。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む、当業者に既知の任意のベクターを含む。上記ベクターは、原核生物発現又は真核生物発現に適切な発現ベクターであり得る。上記プラスミドは、複製開始点（ｏｒｉ）、多重クローニング部位、及びプロモーター（構成的な又は誘導性の）等の調節配列、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、ポリアデニル化シグナル、及び突然変異又は欠失の相補性に基づく抗生物質耐性マーカー又は栄養要求性マーカー等の選択マーカーを含み得る。一実施形態では、対象のポリヌクレオチド配列は、調節配列と操作可能に連結している。
【００７６】
別の実施形態では、上記ベクターは、対象のポリペプチド断片の精製を容易にするエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグをコードするヌクレオチド配列を含む。このようなエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグは、ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ポリＨｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）、マルトース結合タンパク質タグ（ＭＢＰタグ）、ＮｕｓＡタグ及びチオレドキシンタグ、又は（高感度）緑色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＧＦＰ）、（高感度）黄色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（イソギンチャクモドキ（Discosoma）の種由来の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、若しくは単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ））、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等の蛍光タンパク質タグ等を含むがこれらに限定されない。好ましい一実施形態では、エピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグを、例えばトロンビン、第Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶプロテアーゼ等のようなプロテアーゼを使用して、対象のポリペプチド断片から切断することができる。このようなプロテアーゼに関する認識部位は、当業者に既知である。別の実施形態では、ベクターは、組換え宿主細胞の培養培地中への、又は細菌の細胞膜周辺腔中への、対象のポリペプチド断片の分泌をもたらす機能的配列を含む。シグナル配列断片は、通常、細胞からのタンパク質の分泌に関する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中に（グラム陽性細菌）、又は細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔中に（グラム陰性細菌）分泌される。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断され、シグナルペプチド断片と外来遺伝子との間でコードされ得るプロセシング部位（processing sites）が存在する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、上記単離ポリヌクレオチド又は上記組換えベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞は、古細菌細胞及び細菌細胞等の原核生物細胞、又は酵母、植物、昆虫若しくは哺乳動物細胞等の真核生物細胞であり得る。好ましい一実施形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞である。当業者には、上記単離ポリヌクレオチド又は上記組換えベクターを上記宿主細胞中に導入する方法は、十分に明らかである。例えば、細菌細胞は、例えば化学的形質転換（例えば、塩化カルシウム法）又はエレクトロポレーションを使用して、容易に形質転換することができる。酵母細胞は、例えば、酢酸リチウム形質転換法又はエレクトロポレーションを使用して、形質転換することができる。他の真核生物細胞は、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitrogen）等の市販のリポソーム系トランスフェクションキット、Ｆｕｇｅｎｅ（Roche Diagnostics）等の市販の脂質系トランスフェクションキット、ポリエチレングリコール系トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（微粒子銃）、エレクトロポレーション又はウイルス感染を使用して、トランスフェクトすることができる。本発明の好ましい一実施形態では、組換え宿主細胞は、対象のポリヌクレオチド断片を発現する。さらにより好ましい実施形態では、上記発現は、本発明の可溶性ポリペプチド断片をもたらす。これらのポリペプチド断片は、上で言及したエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグを任意に利用して、当業者に既知のタンパク質精製法を使用して、精製することができる。
【００７８】
別の態様では、本発明は、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットの全部又は一部と会合する化合物を同定する方法であって、（ａ）図１８に示すような複合体の構造座標により規定される上記結合ポケットのコンピュータモデルを構築する工程、（ｂ）有望な結合化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させ上記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）上記化合物の新規リガンド設計から成る群から選択される方法により有望な結合化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を使用する工程であって、結合ポケットにおける上記化合物のエネルギを最小化した立体配置を提供するために、上記化合物と上記結合ポケットとのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、演算手段を使用する工程、並びに（ｄ）上記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、上記化合物と結合ポケットモデルとの間の会合を定量化し、それにより上記結合ポケットと会合する上記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程を含む、同定する方法に関する。
【００７９】
初めて、本発明は、図１８による上記結合ポケットの構造座標に基づき、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２のポリペプチド変異体のＲＮＡキャップ結合ポケットに対する有望な結合パートナー、好ましくはＲＮＡキャップ結合の阻害剤を同定、選択又は設計する分子設計技法の使用を可能とする。このような予測モデルは、上記結合ポケットと結合する可能性を有する多数の多様な化合物の調製及び試験に関連する費用が高いという観点から貴重である。ＲＮＡキャップ類似体との複合体でのＰＢ２ポリペプチド断片に関して生成した構造座標を使用するために、構造座標を三次元形状に変換することが必要である。これは、一組の構造座標から分子又はその一部分の三次元グラフ表示を生成することができる市販のソフトウェアの使用により達成される。このようなコンピュータプログラムの例は、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩホモロジーソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（９７．０）、Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA））中で実行されるＭＯＤＥＬＥＲ（A.Sali and T. L. Blundell, J. Mol. Biol., 234, pp. 779-815（1993））である。
【００８０】
当業者は、ＰＢ２又はＰＢ２ポリペプチド変異体のＲＮＡキャップ結合ポケットと結合する能力に関して、化学的分子又は断片をスクリーニングする複数の方法を使用することができる。このプロセスは、例えば、図１８による構造座標に基づくＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットの三次元コンピュータモデルの目視検査により、開始し得る。選択した断片又は化学的化合物は、その後様々な配向で位置づけられ、又は結合ポケット内にドッキングし得る。Ｃｅｒｉｕｓ、Ｑｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌ（Tripos Associates, St. Louis, MO）等のソフトウェアを使用してドッキングを達成することができ、その後ＯＰＬＳ−ＡＡ、ＣＨＡＲＭＭ及びＡＭＢＥＲ等の標準的な分子動力学力場を用いてエネルギ最小化及び分子動力学的検討を行う。適切な化合物又は断片を選択するプロセスにおいて当業者を支援することができるさらなる特定のコンピュータプログラムは、例えば、（ｉ）ＡＵＴＯＤＯＣＫ（D.S. Goodsell et al., "Automated Docking of Substrates to Proteins bySimulated Annealing", Proteins: Struct., Funct., Genet., 8, pp. 195-202（1990）；ＡＵＴＯＤＯＣＫはTheScripps Research Institute（La Jolla, CA）から入手可能である）、及び（ｉｉ）ＤＯＣＫ（I. D. Kuntz etal., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J.Mol. Biol., 161, pp. 269-288（1982）；ＤＯＣＫは、カリフォルニア大学（San Francisco, CA）から入手可能である）を含む。
【００８１】
適切な化合物又は断片が選択されると、それらをを設計するか、又は集合化させ単一の化合物又は複合体とすることができる。この手動のモデル構築は、Ｑｕａｎｔａ又はＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを使用して行われる。個々の化合物又は断片を連結する際に当業者を支援する有用なプログラムは、例えば、（ｉ）ＣＡＶＥＡＴ（P. A. Bartlett et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate theStructure-Derived Design of Biologically Active Molecules", in MolecularRecognition in Chemical and Biological Problems", Special Publication,Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196（1989）, G. Lauri and P. A. Bartlett,"CAVEAT: A Program to Facilitate the Design of Organic Molecules", J.Comp. Aid. Mol. Des., 8, pp. 51-66（1994）;ＣＡＶＥＡＴはカリフォルニア大学（Berkley, CA）から入手可能である）、（ｉｉ）ＩＳＩＳ（MDLInformation Systems（San Leandro, CA）,Y. C. Martin, "3D Database Searchingin Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154（1992）中で概説されている）等の３Ｄデータベースシステム、及び（ｉｉｉ）ＨＯＯＫ（M.B. Eisen et al., "HOOK: A Program for Finding Novel MolecularArchitectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a MacromoleculeBinding Site", Proteins: Struct., Funct., Genet., 19, pp. 199-221（1994）；ＨＯＯＫはMolecularSimulations Incorporated（San Diego, CA）から入手可能である）を含む。
【００８２】
本発明により可能となる別のアプローチは、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと全体的に又は部分的に結合することができる化合物に関する小分子データベースの演算によるスクリーニングである。このスクリーニングでは、このような化合物の結合ポケットへの適合（fit）の質は、形状相補性により、又は推定相互作用エネルギにより、判断することができる（E. C. Meng et al., J.Comp. Chem., 13, pp. 505-524（1992））。
【００８３】
代替的に、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットに対する有望な結合パートナー、好ましくはＲＮＡキャップ結合の阻害剤は、図１８によるＲＮＡキャップ類似体との複合体でのＰＢ２ポリペプチド断片の３Ｄ構造をもとに新規に設計され得る。当業者が利用可能な、様々な新規のリガンド設計方法が存在する。このような方法は、（ｉ）ＬＵＤＩ（H.-J. Bohm, "The Computer Program LUDI: A New Method for the DeNovo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Mol. Des., 6, pp. 61-78（1992）；ＬＵＤＩはMolecularSimulations Incorporated（San Diego, CA）から入手可能である）、（ｉｉ）ＬＥＧＥＮＤ（Y. Nishibata andA. Itai, Tetrahedron, 47, pp. 8985-8990（1991）；ＬＥＧＥＮＤはMolecular SimulationsIncorporated（San Diego, CA）から入手可能である）、（ｉｉｉ）ＬｅａｐＦｒｏｇ（Tripos Associates（St.Louis, MO）から入手可能）、（ｉｖ）ＳＰＲＯＵＴ（V. Gillet et al., "SPROUT: A Program for StructureGeneration", J. Comp. Aid. Mol. Des., 7, pp. 127-153（1993）；ＳＰＲＯＵＴはリーズ大学（UK）から入手可能である）、（ｖ）ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（S.H. Rotstein and M. A. Murcko "GroupBuild: A Fragment-Based Method for DeNovo Drug Design", J. Med. Chem., 36, pp. 1700-1710（1993））、及び（ｖｉ）ＧＲＯＷ（J.B. Moon and W. J. Howe, "Computer Design of Bioactive Molecules: A Methodfor Receptor-Based De Novo Ligand Design", Proteins, 11, pp 314-328（1991））を含む。
【００８４】
加えて、ＲＮＡキャップ結合ポケットと相互作用し得る化合物の新規の設計及びモデリングの際に当業者を支援することができる複数の分子モデリング技法（参照により本明細書に援用される）が説明されており、例えば、N. C. Cohen et al., "Molecular Modeling Software and Methodsfor Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33, pp. 883-894（1990）、 M. A.Navia and M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in DrugDesign", Curr. Opin. Struct. Biol., 2, pp. 202-210（1992）、L. M. Balbes etal., "A Perspective in Modern Methods in Computer-Aided Drug Design",Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz and D. B. Boyd,Eds., VCH, New York, pp. 37-380（1994）、W. C. Guida, "Software forStructure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biol., 4, pp. 777-781（1994）を含む。
【００８５】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２変異体の結合ポケットと結合するものとして設計又は選択された分子は、その結合状態において好ましくは標的領域との反発的な静電的相互作用を欠くように、さらに演算的に最適化することができる。このような非相補的な（例えば、静電的な）相互作用は、反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用及び電荷−双極子相互作用を含む。具体的には、結合状態における結合化合物と結合ポケットとの間の全静電的相互作用の合計は、好ましくは結合のエンタルピに対する中和的な又は好ましい寄与をもたらす。化合物変形エネルギ及び静電的相互作用を評価することができる特定のコンピュータプログラムが、当業者に利用可能である。適切なプログラムの例は、（ｉ）Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９２、ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｃ（M. J. Frisch, Gaussian, Incorporated（Pittsburgh, PA））、（ｉｉ）ＡＭＢＥＲ、４．０版（P.A. Kollman, カリフォルニア大学（San Francisco, CA））、（ｉｉｉ）ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（MolecularSimulations Incorporated（San Diego, CA））、（ｉｖ）ＯＰＬＳ−ＡＡ（W. L. Jorgensen,"OPLS Force Fields", Encyclopedia of Computational Chemistry,Schleyer, Ed., Wiley, New York（1998）Vol. 3, pp. 1986-1989）、及び（ｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（BiosysmTechnologies Incorporated（San Diego, CA））を含む。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション、ＩＲＩＳ  ４Ｄ／３５又はＩＢＭ  ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を使用して、実行することができる。他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケージが、当業者に既知である。
【００８６】
上で説明したように、対象の分子が選択又は設計されると、その後、その結合特性を改善又は修正するために、その原子又は側基の幾つかにおいて置換が為され得る。概して、初期置換は保存的であり、すなわち、置換基は元の基とほぼ同じサイズ、形状、疎水性及び電荷である。勿論、立体構造を変化させることが当該技術分野で既知の成分は避けるべきであると理解すべきである。このような置換した化学的化合物は、その後、上で詳細に説明した同様の演算（computer）方法により、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２変異体の結合ポケットへの適合の効率に関して分析することができる。
【００８７】
上記で説明される本発明の方法の一実施形態において、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットは、配列番号１によるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３、又はそれに対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＭｅｔ４３１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３及びＭｅｔ４３１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６及びＭｅｔ４３１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６及びＭｅｔ４３１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９、Ｈｉｓ４３２及びＭｅｔ４３１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＳｅｒ３３７、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＭｅｔ４３１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｍｅｔ４３１、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＰｈｅ３２５、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＧｌｕ３６１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５及びＧｌｕ３６１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施形態では、上記結合ポケットが配列番号１によるアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。さらに、他の実施形態では、上で規定した結合ポケットは任意に、配列番号１によるアミノ酸Ｍｅｔ４３１に対応するアミノ酸、又はそれに対応するアミノ酸を含み得る。
【００８８】
上記で説明される本発明の方法のさらなる一態様において、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットは、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の構造座標により規定される。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標により規定される。さらに別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＭｅｔ４３１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３及びＭｅｔ４３１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６及びＭｅｔ４３１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６及びＭｅｔ４３１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９、Ｈｉｓ４３２及びＭｅｔ４３１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＳｅｒ３３７の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＭｅｔ４３１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｍｅｔ４３１、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＰｈｅ３２５の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＧｌｕ３６１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５及びＧｌｕ３６１の構造座標により規定される。別の実施形態では、上記結合ポケットが、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５及びＬｙｓ３７６の構造座標により規定される。さらに、他の実施形態では、上で規定したような結合ポケットは任意に、図１８による配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｍｅｔ４３１の構造座標によりさらに規定され得る。
【００８９】
一態様では、本発明は、図１８によるＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットに対する変異体である結合ポケットと会合することができる化合物に関する、上記で説明される方法による演算によるスクリーニング方法を提供する。一実施形態では、上記結合ポケットの上記変異体は、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の；アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＭｅｔ４３１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３及びＭｅｔ４３１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６及びＭｅｔ４３１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６及びＭｅｔ４３１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｇｌｎ４０６、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９、Ｈｉｓ４３２及びＭｅｔ４３１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ｐｈｅ３６３、Ｇｌｕ３６１及びＳｅｒ３３７の、アミノ酸Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＭｅｔ４３１の、アミノ酸Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５、Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｍｅｔ４３１、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＰｈｅ３２５の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＧｌｕ３６１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４及びＬｙｓ３７６の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５及びＧｌｕ３６１の、アミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７、Ｐｈｅ４０４、Ｐｈｅ３２５及びＬｙｓ３７６の骨格原子由来の二乗平均平方根偏差を有し、上記のアミノ酸の組合せが任意に３Å以下の図１８によるアミノ酸Ｍｅｔ４３１を含む。別の実施形態では、上記の二乗平均平方根偏差が２.５Å以下である。別の実施形態では、上記の二乗平均平方根偏差が２Å以下である。別の実施形態では、上記の二乗平均平方根偏差が１.５Å以下である。別の実施形態では、上記の二乗平均平方根偏差が１Å以下である。別の実施形態では、上記の二乗平均平方根偏差が０.５Å以下である。
【００９０】
好ましい一実施形態では、ｍ７ＧＴＰは、溶媒側のＨｉｓ３５７と、タンパク質側の５つのフェニルアラニンのクラスター（主としてはＰｈｅ３２３及びＰｈｅ４０４であるが、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３も含まれる）とに挟まれている。この好ましい実施形態では、グアノシン塩基の特異的な認識は主に、グアニンのＮ２位置及びＮ１位置へのＧｌｕ３６１水素結合により達成され、このことはまたｍ７ＧＴＰの非局在化した正電荷が中和するのを助ける。また、Ｌｙｓ３７６はＯ６との長い水素結合を作製する。Ｇｌｕ３６１、Ｌｙｓ３７６及びＧｌｎ４０６と相互作用するが、リガンドとは直接的に相互作用しないリガンドポケットには、２つの規則的に並んだ（well-ordered）埋没水分子が存在する。重要な第２層の残基は、Ｈｉｓ３５７と水素結合するＡｒｇ３３２及びＳｅｒ３３７が好ましい。水分子又はＳｅｒ３２０のいずれかが塩基のＮ２の水素結合距離内にある。Ｎ７メチル基は、Ｇｌｎ４０６の側鎖とファンデルワールス力で接触しており（３.４Å）、Ｐｈｅ４０４のカルボニル酸素はＭｅｔ４３１の側鎖とさらにわずかに離れて接触している（３.４Å）。この実施形態では、三リン酸は塩基に向かって円型に曲がっている。α−ホスファートはＨｉｓ４３２及びＡｓｎ４２９と相互作用し、γ−ホスファートは塩基性残基Ｈｉｓ３５７、Ｌｙｓ３３９及びＡｒｇ３５５と相互作用する。
【００９１】
本明細書中の上で説明される方法によるコンピュータモデリングが、化合物とＰＢ２のＲＮＡ結合ポケット又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットとの結合を示す場合、上記化合物を合成することができ、また任意に上記結合ポケットと結合する上記化合物の能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで試験することができ、上記ＰＢ２ポリペプチド断片と、上記ＲＮＡキャップ又はその類似体との結合を阻害する上記化合物の能力を確定するために、（ｅ）上記化合物を合成する工程と、任意に（ｆ）ＰＢ２ポリペプチド断片若しくはその変異体、又は本発明の組換え宿主細胞及びＲＮＡキャップ若しくはその類似体に上記化合物を接触させる工程とをさらに含む。かかる化合物と結合ポケットとの適合の質を形状の相補性又は推定相互作用エネルギのいずれかにより判断してもよい（E. C. Meng et al., J. Comp. Chem., 13, pp. 505-524 （1992））。上記化合物を合成する方法が当業者に既知であり、又はかかる化合物は市販され得る。同定した化合物の上記ＲＮＡキャップ結合阻害効果を確定する方法の例は本明細書中の上で説明される。
【００９２】
上記で説明される方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ及びｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択されるＲＮＡキャップ類似体、又はＲＮＡキャップ結合の小分子阻害剤、２-アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン（ＲＯ０７９４２３８、Hooker etal., 2003）、又はＴ−７０５（Furuta et al., 2005）のいずれでもなく、且つＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットと結合することができる、化合物を提供することは本発明の別の態様である。別の態様では、本発明は、上記で説明される方法により同定可能な化合物であって、ただし、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ及びｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択されるＲＮＡキャップ類似体、又はＲＮＡキャップ結合の小分子阻害剤、２-アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン又はＴ−７０５のいずれでもなく、且つＰＢ２ポリペプチド断片とＲＮＡキャップ又はその類似体との結合を阻害することができる、化合物を表す。本発明の化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、有機小分子又は無機小分子、化学的化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン及びそれらの組合せ及び誘導体を含むが、これらに限定されない任意の薬剤であり得る。「小分子」という用語は、分子量が５０〜約２５００ダルトン、好ましくは２００〜８００ダルトンの範囲である分子を表す。加えて、本発明による試験化合物は任意に、検出可能な標識を含み得る。かかる標識としては、酵素標識、放射性同位体又は放射性の化合物又は元素、蛍光性の化合物又は金属、化学発光化合物及び生物発光化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
さらなる一態様では、本発明は、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する化合物を同定する方法であって、（ｉ）ＰＢ２ポリペプチド断片、又は本発明の組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｉｉ）ＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体と結合する試験化合物の能力を分析する工程を含む、同定する方法を提供する。
【００９４】
一実施形態において、ＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体と試験化合物との相互作用をプルダウンアッセイ形態で分析してもよい。例えば、ＰＢ２ポリペプチド断片は精製され、ビーズ上で固定され得る。一実施形態では、ビーズ上で固定されたＰＢ２ポリペプチド断片は、例えば（ｉ）別の精製タンパク質、ポリペプチド断片若しくはペプチド、（ｉｉ）タンパク質、ポリペプチド断片若しくはペプチドの混合物又は（ｉｉｉ）細胞若しくは組織の抽出物と接触させてもよく、タンパク質、ポリペプチド断片又はペプチドの結合が、クーマシー染色若しくはウェスタンブロッティングと組み合わせて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検証してもよい。未知の結合パートナーが、質量分光分析により同定され得る。
【００９５】
別の実施形態において、ＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体と試験化合物との相互作用を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）基準の実験形態で分析してもよい。一実施形態では、本発明によるＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体はＥＬＩＳＡプレート表面上に固定され、試験化合物と接触させられ得る。例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びエピトープタグ付け化合物に対する試験化合物の結合が、試験化合物に特異的な抗体又はエピトープタグにより検証され得る。これらの抗体は酵素と直接的に結合し得るか、又は適切な基質と組み合わせて、化学発光反応（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）又は比色反応（例えばアルカリホスファターゼ）を実施する上記酵素と結合した二次抗体によって検出され得る。別の実施形態では、抗体では検出することができない化合物の結合は、試験化合物と直接的に結合する標識により検証され得る。かかる標識には、酵素標識、放射性同位体又は放射性の化合物若しくは元素、蛍光性の化合物又は金属、化学発光化合物及び生物発光化合物が含まれ得る。別の実施形態では、試験化合物は、ＥＬＩＳＡプレート表面上に固定され、本発明による可溶性のＰＢ２のポリペプチド断片又はその変異体と接触させられ得る。上記ポリペプチドの結合はＰＢ２ポリペプチド断片特異的抗体と、上で説明されるような化学発光反応又は比色反応とにより検証され得る。
【００９６】
さらなる一実施形態において、精製された可溶性ＰＢ２ポリペプチド断片をペプチドアレイと共にインキュベートし、ＰＢ２ポリペプチド断片と、特異的なペプチド配列に対応する特異的なペプチドスポットとの結合は、例えばＰＢ２ポリペプチド特異的抗体、ＰＢ２ポリペプチド断片と融合したエピトープタグを対象とする抗体により、又はＰＢ２ポリペプチド断片と結合した蛍光タグから放出された蛍光シグナルにより分析され得る。
【００９７】
別の実施形態において、本発明による組換え宿主細胞を試験化合物に接触させる。これは、試験タンパク質又はポリペプチドの共発現と、例えば蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）又は免疫共沈降による相互作用の検証とにより達成され得る。別の実施形態では、直接的に標識された試験化合物は組換え宿主細胞の培地に添加され得る。試験化合物が膜に浸透し、ＰＢ２ポリペプチド断片と結合する可能性は、例えば上記ポリペプチドの免疫沈降と標識の存在の検証とにより検証され得る。
【００９８】
好ましい一実施形態において、上で説明される、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する化合物を同定する方法は、ＲＮＡキャップ又はその類似体を添加するさらなる工程を含む。上記方法の別の実施形態では、上記ＲＮＡキャップ又はその類似体の存在下でＰＢ２と結合する上記試験化合物の能力又は上記ＲＮＡキャップ又はその類似体とＰＢ２との結合を阻害する上記試験化合物の能力が分析される。ＲＮＡキャップ又はＲＮＡキャップ類似体と同じモル濃度の化合物により、結合が２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、好ましくは６０％超、好ましくは７０％超、好ましくは８０％超、好ましくは９０％超低減した場合、この化合物がＲＮＡキャップ又はＲＮＡキャップ類似体結合を阻害したとみなす。好ましい実施形態では、上で説明されるプルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ペプチドアレイ、ＦＲＥＴ及び免疫共沈降実験は、試験化合物の存在下又は非存在下で、ＲＮＡキャップ構造又はその類似体、好ましくは標識ＲＮＡキャップ構造又はその類似体の存在下で実施され得る。一実施形態では、ＲＮＡキャップ又はその類似体を、上記試験化合物を添加する前に添加する。さらなる一実施形態では、ＲＮＡキャップ又はその類似体を、上記試験化合物を添加すると同時に添加する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡキャップ又はその類似体を、添加の上記試験化合物を添加した後に添加する。
【００９９】
好ましい一実施形態において、本発明のＰＢ２ポリペプチド断片とＲＮＡキャップ又はその類似体との相互作用を妨げる、同定可能な試験化合物の能力は、上記化合物の存在下又は非存在下で上記ポリペプチド断片を７−メチル−ＧＴＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂（GE Healthcare）とインキュベートし、例えばクーマシー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で、又はウェスタンブロット分析を使用することにより、上記化合物を用いて及び用いずに結合したＰＢ２ポリペプチド断片の量を比較、好ましくは定量化することにより試験され得る。
【０１００】
試験化合物の存在下又は非存在下で本発明によるＰＢ２断片又はその変異体と会合するＲＮＡキャップ又はその類似体の能力を評価する。一実施形態では、これは、Natarajan et al. （2004）により説明されるような蛍光分極アッセイにおいて、蛍光標識ＲＮＡキャップ類似体、蛍光標識７−メチル−グアノシン一リン酸（ｍ７ＧＭＰ）を使用することにより達成され得る。代替的に別の実施形態では、リボースをジオール修飾した蛍光キャップ類似体であるアントラニロイル−ｍ７ＧＴＰが、Renet al. （1996）により示されるような蛍光分光アッセイに使用され得る。さらなる一実施形態では、放射性標識したＲＮＡキャップを、試験化合物の存在下又は非存在下でＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体と共にインキュベートしてもよく、ここではＲＮＡキャップを、試験化合物の添加の前に、添加と同時に、又は添加の後に添加してもよい。キャップ結合反応は、Hookeret al. （2003）により説明されるようにＵＶ架橋し、変性してゲル電気泳動により分析する。別の実施形態では、本発明のＰＢ２ポリペプチド断片は、マイクロタイタープレート上で固定され、試験化合物の存在下又は非存在下で、標識ＲＮＡキャップ又はその類似体と共にインキュベートされ、ここではＲＮＡキャップ又はその類似体を、試験化合物の添加の前に、添加と同時に、又は添加の後に添加してもよく、キャップ結合は、プレートを完全に洗浄した後に標識の存在を検証することにより分析される。試験化合物を用いた、ウェルにおけるＲＮＡキャップ又はＲＮＡキャップ類似体の標識のシグナル強度と、試験化合物を用いない、上記標識のシグナル強度とを比較し、上で説明されるように、結合が５０％超、好ましくは６０％超、好ましくは７０％超、好ましくは８０％超、好ましくは９０％超低減した場合、化合物がＲＮＡキャップ又はＲＮＡキャップ類似体の結合を阻害したとみなす。
【０１０１】
好ましい一実施形態において、上で説明される、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する、好ましくはＲＮＡキャップ又はその類似体の結合を阻害する化合物を同定する方法は、ハイスループット設定において行う。好ましい一実施形態では、上記方法を、固定化した本発明によるＰＢ２ポリペプチド断片又はその変異体と、標識ＲＮＡキャップ又はその類似体とを使用して、上で説明されるように多ウェルマイクロタイタープレートで実施する。好ましい一実施形態では試験化合物は、合成化合物又は天然化合物のライブラリに由来する。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet, Cornwall, UK）、ChemBridge Corporation（SanDiego, CA）又はAldrich（Milwaukee, WI）から市販されている。天然化合物ライブラリは例えば、TimTec LLC（Newark,DE）より利用可能である。代替的に、細菌、真菌、植物及び動物抽出物形態の天然化合物のライブラリを使用することができる。さらに、試験化合物を、個々の化合物又は混合物のいずれかとして、コンビナトリアルケミストリを使用して合成的に作製することができる。ＲＮＡキャップ又はその類似体を、ライブラリ化合物の添加の前に、添加と同時に、又は添加の後に添加してもよい。ＲＮＡキャップ結合を阻害する化合物の能力を上で説明されるように評価してもよい。
【０１０２】
別の実施形態において、同定した化合物のインフルエンザウイルスのライフサイクルに対する阻害効果をｉｎ  ｖｉｖｏ設定で試験してもよい。２９３Ｔヒト胚腎臓細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞又はトリ胚線維芽細胞等のインフルエンザウイルスに感染しやすい細胞株を、同定した化合物の存在下又は非存在下でインフルエンザウイルスに感染させ得る。好ましい一実施形態では、同定した化合物を、様々な濃度で細胞の培養培地に添加し得る。ウイルスプラーク形成は、インフルエンザウイルスの感染能に関する読出し情報（read out）として使用され、同定した化合物で処理している細胞と処理していない細胞とで比較され得る。
【０１０３】
本発明のさらなる一実施形態において、上で説明される方法のいずれかで適用される試験化合物は小分子である。好ましい一実施形態では、上記小分子は、ライブラリ、例えば小分子阻害剤ライブラリに由来する。別の実施形態では、上記試験化合物はペプチド又はタンパク質である。好ましい一実施形態では、上記ペプチド又はタンパク質はペプチド又はタンパク質ライブラリに由来する。
【０１０４】
上で説明される、本発明によるＰＢ２ポリペプチド断片又は変異体のＲＮＡキャップ結合ポケットと会合する、及び／又は上記結合ポケットとのＲＮＡキャップ結合を阻害する化合物を演算及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定する方法の別の実施形態において、上記方法は、同定可能な化合物又はそれらの薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に処方する工程をさらに含む。別の態様では、本発明は、上述の方法により製造可能な薬学的組成物を提供する。本発明による化合物を単独で投与することができるが、ヒト療法では概して、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択される、適切な薬学的な添加物、希釈剤又は担体と混合して投与する（以下を参照されたい）。
【０１０５】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット又はＰＢ２変異体の結合ポケットに関する結合パートナーの演算によるモデリング又はスクリーニングの態様において、調合薬として投与される分子に有益であり得る化学的分子部分を対象の分子に導入することが可能であり得る。例えば、分子と標的領域との結合には直接影響し得ないが、例えば薬学的に許容可能な担体における分子の溶解度全体、分子のバイオアベイラビリティ、及び／又は分子の毒性に寄与する化学的分子部分を対象の分子に導入する、又は化学的分子部分を対象の分子から除外することが可能であり得る。対象の分子の薬理を最適化するための検討事項及び方法は、例えば"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics",8th Edition, L. S. Goodman, A. Gilman, T. W. Rall, A.S. Nies, &P. Taylor, Eds., Pergamon Press （1985）、W. L. Jorgensen & E. M. Duffy,Bioorg. Med. Chem. Lett, 10, pp. 1155-1158 （2000）に見出され得る。さらに、対象の有機分子の物理的に重要となる記載及び薬学的に関連する特性に関する迅速な予測を提供するのに、コンピュータプログラム「Ｑｉｋ  Ｐｒｏｐ」を使用することができる。新たに合成された化合物の経口吸収を推測するのに、「５の法則（Ruleof Five）」見込み法を使用することができる（C. A. Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 23, pp. 3-25（1997））。ファーマコフォア（pharmacophore）選択及び設計に適したプログラムとしては、（ｉ）ＤＩＳＣＯ（Abbot Laboratories,Abbot Park, IL）、（ｉｉ）Ｃａｔａｌｙｓｔ（Bio-CAD Corp., Mountain View, CA）及び（ｉｉｉ）Ｃｈｅｍ  ＤＢＳ−３Ｄ（ChemicalDesign Ltd., Oxford, UK）が挙げられる。
【０１０６】
本発明で考慮される薬学的組成物は、当業者にとって既知の様々な方法で処方され得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、錠剤、ピル、カプセル（軟ゲルカプセルを含む）、カシェ剤、ロゼンジ、腔坐剤、粉末、顆粒若しくは坐剤形態のような固体形態、又はエリキシル、溶液、エマルション若しくは懸濁液形態のような液体形態であり得る。
【０１０７】
固体投与形態は、微小結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシン及びデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカのデンプン）等の添加物、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び或る特定のケイ酸錯体等の崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシア等の造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルク等の平滑剤が含まれ得る。類似の型の固体組成物をゼラチンカプセルにおける充填剤として利用してもよい。これに関する好ましい添加物としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１０８】
経口投与に適した水性の懸濁液、溶液、エリキシル及びエマルションに関して、化合物を、様々な甘味料又は香料、着色物質又は染料、乳化剤及び／又は懸濁化剤、及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン等の希釈剤、並びにそれらの組合せと組み合わせてもよい。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物は例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、硬化ヒマシ油、カルナバワックス、パラフィンワックス、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー及びそれらの混合物を含む放出速度調整剤を含有し得る。
【０１１０】
本発明の薬学的組成物は、即時分散性又は溶解性の剤形製剤（fast dispersing or dissolving dosage formulations）（ＦＤＤＦ）形態であり、以下の成分を含有し得る：アスパルテーム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミントフレバー、ポリエチレングリコール、フュームドシリカ、二酸化ケイ素、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール。
【０１１１】
坐剤を調製するために、初めに脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物等の低融点ワックスを融解させ、撹拌等により、活性成分をこの中に均一に分散させる。それから融解された均一混合物を手頃な大きさのモールドに入れ、冷却することにより、固体化させる。
【０１１２】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液形態で使用することが最良とされ、これには他の物質、例えばこの溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースが含有されていてもよい。必要に応じて、水溶液を好適に緩衝させる必要がある（好ましくは３〜９のｐＨ）。
【０１１３】
鼻腔内投与及び吸入による投与に適した薬学的組成物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ．ＴＭ．）若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ．ＴＭ．）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は別の適切なガス等の好適な推進剤を使用して、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザから、乾燥粉末吸入剤又はエアロゾル噴霧剤形態で送達されることが最良とされる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザは、例えば溶媒としてエタノールと推進剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液又は懸濁液を含有させてもよく、平滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有してもよい。
【０１１４】
別の実施形態において本発明は、本発明のＰＢ２ポリペプチド断片若しくはＰＢ２ポリペプチド断片変異体、又は本発明の組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程を含む、上で説明される方法により同定可能な化合物を提供し、これはｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択されるＲＮＡキャップ類似体、及びキャップ結合の小分子阻害剤２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ-プリン−６−オン（ＲＯ０７９４２３８、Hooker et al., 2003）及びＴ−７０５（Furuta et al., 2005）とは異なり、ＰＢ２と結合することができる。好ましい一態様では本発明は、本発明のＰＢ２ポリペプチド断片若しくはその変異体、又は組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程を含む、上で説明される方法により同定可能な化合物に関し、これはｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択されるＲＮＡキャップ類似体、及びキャップ結合の小分子阻害剤２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ-プリン−６−オン及びＴ−７０５とは異なり、ＰＢ２とＲＮＡキャップ又はその類似体との結合を阻害することができる。
【０１１５】
別の態様において、本発明は、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインを対象とする抗体を提供する。好ましい一実施形態では、上記抗体は、上で示される、特に配列番号１４〜配列番号２２により規定されるポリペプチド群から選択されるポリペプチド断片又は断片の変異体のＲＮＡキャップ結合ドメインを認識する。特に、上記抗体は、結合ポケットを規定する、上で示されるアミノ酸を１つ又は複数含むエピトープと特異的に結合する。これに関して、エピトープという用語は、当該技術分野で認識される意味を有し、好ましくは４個〜２０個のアミノ酸、好ましくは５個〜１８個、６個〜１６個、又は７個〜１４個のアミノ酸のストレッチを表す。したがって好ましいエピトープは、４個〜２０個、５個〜１８個、好ましくは６個〜１６個、又は７個〜１４個のアミノ酸の長さを有し、配列番号１のＳｅｒ３２０、Ｐｈｅ３２３、Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７、Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ｈｉｓ３５７、Ｇｌｕ３６１、Ｐｈｅ３６３、Ｌｙｓ３７６、Ｐｈｅ４０４、Ｇｌｎ４０６、Ｍｅｔ４３１及び／又はＨｉｓ４３２、又は対応するアミノ酸を１つ又は複数含む。本発明の抗体は、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、又はその一部分であり得る。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法、又は無傷抗体の酵素切断若しくは化学的切断により作製され得る。幾つかの実施形態では、抗原結合部分としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体等のキメラ抗体、ダイアボディ、並びにポリペプチドとの特異的な抗原結合をもたらすのに十分な抗体を少なくとも一部分含有するポリペプチドが挙げられる。本発明の抗体を標準的なプロトコルに従って生成する。例えば、ポリクローナル抗体は、当業者に既知の標準的な方法に従って、任意にフロインド完全又は不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）等のアジュバントと組み合わせて、対象の抗原を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ又はウマ等の動物に免疫付与することによって生成され得る。ＰＢ２又はその断片のＲＮＡキャップ結合ドメインを対象とするポリクローナル抗血清は、免疫付与動物を採血（bleeding）又は屠殺することにより動物から得られる。（ｉ）動物から得られる血清を使用することができ、（ｉｉ）免疫グロブリン画分は血清から得ることができ、又は（ｉｉｉ）ＰＢ２又はその断片のＲＮＡキャップ結合ドメインに特異的な抗体は血清から精製することができる。モノクローナル抗体を当業者に既知の方法により生成することができる。要するに、免疫付与後、動物を屠殺し、リンパ節及び／又は脾臓のＢ細胞を当該技術分野で既知の任意の手段により不死化される。細胞を不死化する方法は、細胞を癌遺伝子とトランスフェクトすること、細胞に腫瘍ウイルスを感染させること、不死化細胞に関して選択する条件下で細胞を培養すること、細胞を発癌性化合物又は突然変異化合物に曝露すること（subjecting）、細胞を不死化細胞、例えば骨髄腫細胞と融合させること、並びに腫瘍抑制遺伝子を不活性化させることを含むが、これらに限定されない。不死化細胞は、ＰＢ２又はその断片のＲＮＡキャップ結合ドメインを使用してスクリーニングされる。ＰＢ２又はその断片のＲＮＡキャップ結合ドメインを対象とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマが選択され、クローニングして、さらに堅固な成長、高い抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性に関してスクリーニングする。ハイブリドーマを、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏでは同系動物で、（ｉｉ）免疫系を失った動物、例えばヌードマウスで、又は（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは細胞培養液で増殖することができる。ハイブリドーマを選択、クローニング及び増殖する方法は当業者に既知である。当業者は、抗体の生成に関する支持のために、"Antibodies:A Laboratory Manual", E. Harlow and D. Lane, Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold  Spring Harbor, New York （1990）（これは参照により本明細書中に援用される）のような標準テキストを参照することができる。
【０１１６】
別の態様において、本発明は、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスによるウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと結合することができる、及び／又はＲＮＡキャップ又はその類似体と、上記結合ポケット、上で説明される薬学的組成物、又は本発明の抗体との結合を阻害することができる、上で説明される方法により同定可能な化合物の使用に関する。好ましい一実施形態では、上記疾患状態が、セグメントされていないマイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、すなわちボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科及びラブドウイルス科を含むモノネガウイルス目によるウイルス感染により引き起こされる。より好ましい一実施形態では、上記疾患状態は、オルトミクソウイルス科（インフルエンザＡウイルス属、インフルエンザＢウイルス属、インフルエンザＣウイルス属、トゴトウイルス属及びイサウイルス属を含む）、アレナウイルス科及びブニヤウイルス科（ハンタウイルス属、ナイロウイルス属、オルトブニヤウイルス属、フレボウイルス属及びトスポウイルス属を含む）を含む、セグメントするマイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスにより引き起こされる。さらに好ましい好ましい一実施形態では、上記疾患状態は、ボルナ病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、センダイウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ニパーウイルス、ヘンダウイルス（Henda virus）、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、トゴトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、ハンタンウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、好ましくはインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、トゴトウイルス又はハンタンウイルス、より好ましくはインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、最も好ましくはインフルエンザＡウイルスから成る群から選択されるウイルス種による感染により引き起こされる。
【０１１７】
上記疾患状態を治療、改善又は予防するために、本発明の薬物を、動物患者、好ましくは哺乳動物患者、好ましくはヒト患者に、経口、口腔、舌下、鼻腔内、吸入等により肺経路を介して、直腸経路を介して、又は非経口、例えば洞内（intracavernosally）、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、尿道内、胸骨内、脳内、筋肉内、又は皮下に投与することができ、本発明の薬物は融合法又は無針注射法により投与してもよい。
【０１１８】
本発明の薬学的組成物は、当業者にとって既知の様々な方法で処方され得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、錠剤、ピル、カプセル（軟ゲルカプセルを含む）、カシェ剤、ロゼンジ、腔坐剤、粉末、顆粒若しくは座剤形態のような固体形態、又はエリキシル、溶液、エマルション若しくは懸濁液形態のような液体形態であり得る。
【０１１９】
固体投与形態は、微小結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシン及びデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカのデンプン）等の添加物、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び或る特定のケイ酸錯体等の崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシア等の造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルク等の平滑剤が含まれ得る。類似の型の固体組成物をゼラチンカプセルにおける充填剤として利用してもよい。これに関する好ましい添加物としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１２０】
経口投与に適した水性の懸濁液、溶液、エリキシル及びエマルションに関して、化合物を、様々な甘味料又は香料、着色物質又は染料、乳化剤及び／又は懸濁化剤、及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン等の希釈剤、並びにそれらの組合せと組み合わせてもよい。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、硬化ヒマシ油、カルナバワックス、パラフィンワックス、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー及びそれらの混合物を含む放出速度調整剤を含有し得る。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物は、即時分散性又は溶解性の剤形製剤（ＦＤＤＦ）形態であり、以下の成分を含有し得る：アスパルテーム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミントフレバー、ポリエチレングリコール、フュームドシリカ、二酸化ケイ素、グリコール酸ナトリウムデンプン、ステアリルフマル酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール。
【０１２３】
坐剤を調製するために、初めに脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物等の低融点ワックスを融解させ、撹拌等により、活性成分をこの中に均一に分散させる。それから融解された均一混合物を手頃な大きさのモールドに入れ、冷却することにより、固体化させる。
【０１２４】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液形態で使用することが最良とされ、これには他の物質、例えばこの溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースが含有されていてもよい。必要に応じて、水溶液を好適に緩衝させる必要がある（好ましくは３〜９のｐＨ）。
【０１２５】
鼻腔内投与及び吸入による投与に適した薬学的組成物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ．ＴＭ．）若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ．ＴＭ．）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は別の適切なガス等の好適な推進剤を使用して、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザから、乾燥粉末吸入剤又はエアロゾル噴霧剤形態で送達されることが最良とされる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザは、溶媒としてエタノールと推進剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液又は懸濁液を含有してもよく、平滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有してもよい。
【０１２６】
薬学的調製物は単位投薬形態であるのが好ましい。かかる形態では、調製物を適当な量の活性成分を含有する単位用量にさらに分割する。単位投薬形態は、パッケージングされた調製物、別々の量の調製物を含有するパッケージ、例えばバイアル又はアンプル中に入れられた錠剤、カプセル及び粉末であり得る。また、単位投薬形態自体がカプセル、錠剤、カシェ剤又はロゼンジであってもよく、又は単位投薬形態はパッケージング形態である適当な数のこれらのいずれかであってもよい。
【０１２７】
本発明の使用において投与される単位投薬調製物における活性成分の量は、特定の用途及び活性成分の効力に応じて約１ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２に変更又は調整してもよい。
【０１２８】
本発明の医学的使用に利用される化合物を、１日で約０.０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの初期投薬量で投与する。約０.０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が好ましく、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が最も好ましい。しかしながら投与量は、患者の要件、治療される状態の重症度、及び利用される化合物に応じて変わり得る。特定の状況に対する適切な投与量の決定は実践者の技術内である。概して、治療は化合物の最適用量よりも少ない投与量から始める。その後、或る環境下で最適な効果が達成されるまで、投与量を少しずつ増大させる。所望であれば便宜的に、１日の総投与量を分割し、１日の間で何回かに分けて（portion）投与してもよい。
【実施例】
【０１２９】
実施例は、本発明をさらに説明するために設計され、より良い理解に役立つ。実施例は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるものではない。
【０１３０】
実施例１：ＰＢ２発現構築物の生成
インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５（Ｈ３Ｎ２）ＰＢ２のアミノ酸配列に基づく（de Ia Luna et al., 1989）大腸菌コドン最適化ＰＢ２遺伝子（Geneart）配列番号２５を、指向性エキソヌクレアーゼＩＩＩ切断のために５’ＡａｔＩＩ／ＡｓｃＩ及び３’ＮｓｉＩ／ＮｏｔＩ制限部位対を導入するように修飾したベクターｐＥＴ９ａ（Novagen）にクローニングし、Ｃ末端ビオチンアクセプタペプチドＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥをコードする３’配列を与える。第１の単向性切断プラスミドライブラリを３’末端から生成し（Tarendeauet al., 2007）、プールして、５’欠失反応に対する基質として使用した。１５０個〜２５０個のアミノ酸挿入をコードする線状化プラスミドをアガロースゲルから単離し、再ライゲーションをして、Ａｌｅｘａ４８８ストレプトアビジン（Invitrogen）とコロニーブロット（Tarendeauet al., 2007）とのハイブリダイゼーションを使用する発現スクリーニングのために、ＲＩＬプラスミド（Stratagene）を含有する大腸菌ＢＬ２１  ＡＩを形質転換させるのに使用した。クローンをそれらの蛍光シグナルでランク付けし、初めの３６個のクローンをＮｉ２＋アフィニティクロマトグラフィにより精製可能なタンパク質の発現に関して試験した。１３個のクローンを同定し、シーケンシングして、対象の領域で７個の特有の構築物を明らかにした（図１を参照されたい）：
ヌクレオチド７０３〜１４８８（アミノ酸２３５〜４９６）、
ヌクレオチド７２１〜１４４９（アミノ酸２４１〜４８３）、
ヌクレオチド８０２〜１４４９（アミノ酸２６８〜４８３）、
ヌクレオチド８２９〜１４４０（アミノ酸２７７〜４８０）、
ヌクレオチド８４１〜１４４６（アミノ酸２８１〜４８２）、
ヌクレオチド８６８〜１４４９（アミノ酸２９０〜４８３）、
ヌクレオチド８８３〜１４４６（アミノ酸２９５〜４８２）。
【０１３１】
これらのＰＢ２ポリヌクレオチド断片を、鋳型として合成遺伝子を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成し、ＮｃｏＩ部位とＸｈｏＩ部位との間の発現ベクターｐＥＴＭ１１プラスミド（ＥＭＢＬ）にクローニングした。ｐＥＴＭ１１発現ベクターが、Ｈｉｓ６タグ付け融合タンパク質の発現を可能にする。Ｈｉｓ６タグは、ＴＥＶプロテアーゼを使用して融合タンパク質を切断することができる。
【０１３２】
実施例２：最小のキャップ結合断片の同定
ＰＢ２ポリペプチド断片２３５〜４９６、２４１〜４８３、２６８〜４８３及び２９０〜４８３を、実施例１で説明されるプラスミド構築物と、実施例３で説明される一般的な発現及び精製プロトコルとを使用して大腸菌で発現させた。精製ＰＢ２断片２３５〜４９６は低濃度でしか可溶性ではないが、断片２４１〜４８３、２６８〜４８３及び２９０〜４８３はより可溶性であり、ｍ７ＧＴＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに特異的に結合することができ、このことがキャップ結合活性を示していることが分かった。これらのアッセイのために、０．２ｍｇのタンパク質を５０μＬの７−メチル−ＧＴＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂（GE Healthcare）に入れ、結合させるために４℃で３時間インキュベートした。５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、１ｍＭのｍ７ＧＴＰを含有する同じ緩衝液と共に遠心分離により溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。これらの実験中、より小さい分解断片をｍ７ＧＴＰと結合させることもでき、これがＮ末端シークエンシング及び質量分析により残基３１８〜４８３であると同定され、さらにこの断片がタンパク質分解的に安定であったことは留意すべきことであった。対応するポリヌクレオチド断片（ヌクレオチド９５２〜１４４９）を、実施例１で説明されたようにｐＥＴＭ１１にクローニングした。
【０１３３】
実施例３：ＰＢ２断片の発現及び精製
上記プラスミドを、化学的形質転換を使用して大腸菌細胞に形質転換した。タンパク質は、ＬＢ培地中の大腸菌株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ（Stratagene）において発現した。０．２ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）との２５℃での１６時間〜２０時間（h hours）のインキュベーションの後、細胞を採取し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール）中で再懸濁し、超音波処理した。遠心分離後、透明な溶解物をニッケルアフィニティカラム（Ｎｉ２＋イオンが充填されたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、GEHealthcare）に直接入れた。Ｎｉ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を、５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのイミダゾール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール緩衝液で、その後５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール緩衝液で広範に洗浄した。それから、タンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのイミダゾール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール緩衝液で溶出した。精製タンパク質をＴＥＶプロテアーゼ切断のために１０℃で一晩インキュベートした。５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのイミダゾール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール緩衝液に対する透析の後に、２回目のニッケルアフィニティ工程を行い、Ｈｉｓタグ標識ＴＥＶプロテアーゼを取り除いた。非結合タンパク質を回収し、純度を改善するためのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（GEHealthcare）でのゲル濾過のために５ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＰＢ２ポリペプチド断片（アミノ酸３１８〜４８３）に関するゲル濾過の結果を図２Ａに示す。この断片（アミノ酸３１８〜４８３）を最高２４ｍｇ／ｍｌまで濃縮することができる。タンパク質の純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により評価した（図２Ｂを参照されたい）。典型的な収率は、細菌培養液１リットル当たり１２０ｍｇの純粋なタンパク質である。
【０１３４】
実施例４：ＰＢ２とｍ７ＧＴＰとの共結晶化
結晶化試験のために、５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭのｍ７ＧＴＰ（Sigma）中、１１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌのＰＢ２断片３１８〜４８３のタンパク質溶液を使用した。自動装置（robot）（Cartesian）を使用して、１００μｌのタンパク質溶液を０.１μｌの異なる沈殿剤溶液と混合することによりシッティングドロップ蒸気拡散法を用いて５７６個の結晶化条件をスクリーニングした。結晶を２つの異なる条件で同定した。これらの条件は、１μｌの沈殿剤溶液と混合した１μｌのタンパク質溶液によってハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて手動で最適化した。最良の結晶は、０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ４.６）、１.６Ｍ〜１.８Ｍのギ酸ナトリウムを含む沈殿剤溶液を用いて得られた。これらの結晶は空間群Ｃ２２２１であり、単位格子の寸法はａ＝９．２ｎｍ、ｂ＝９．４ｎｍ；ｃ＝２２.０ｎｍ±０.３ｎｍÅであった。小さい結晶の幾つかが、分解能が少なくとも２.４ÅであるＸ線回折をもたらした。大きい結晶は、単結晶ではないという点で不安定であることを見出した。見出された第２の結晶化条件では、沈殿剤溶液は、７％  ＰＥＧ６０００、１ＭのＬｉＣｌ、０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ５.０）、１０ｍＭのＴＣＥＰ  ＨＣｌを含む。この条件が、少なくとも３.３Åの分解能に対する回析の痕跡を示す、空間群が未確定の薄板状の結晶を与えたが、回折の精度（quality）はかなり低く、これらの結晶は追及しなかった。
【０１３５】
実施例５：セレノ−メチオニン標識タンパク質の調製
セレノ−メチオニン化（methionated）タンパク質を、以前に説明されたように（Van Duyne, 1993）、Ｍ９最小培地で産生した。完全にセレノ−メチオニン化されたタンパク質が結晶化されなかったので、６０ｍｇ／ｌのセレノメチオニンの代わりに５０ｍｇ／Ｌのセレノメチオニン及び５ｍｇ／Ｌのメチオニンを使用して、部分的に標識されたタンパク質を産生した。発現、溶解及び精製の条件は未変性のタンパク質と同様のものとした（実施例３）。エレクトロスプレー質量分析は、完全にセレノ−メチオニン化されたタンパク質が、置換される１１／１１メチオニンに対応する１９６５４ダルトンの分子量を有していたのに対し、部分的に標識されたタンパク質は１９５７８の平均分子量を有していたことを示し（９.４／１１、すなわち８５％置換）、個々のピークが７個〜１１個のセレニウムを有するタンパク質種で得られた。
【０１３６】
実施例６：構造決定及び精密化
実施例５で説明されたように、部分的にセレノ−メチオニル化されたタンパク質を使用する単一波長異常分散（ＳＡＤ）法によって構造を決定した。部分的にセレノ−メチオニル化されたタンパク質は実際には、野生型よりも大きい単結晶を生じた。天然タンパク質のデータを、ＥＳＲＦでのベースラインＢＭ１４上で空間群Ｃ２２２１の小さい結晶（サイズ１５×１５×５０μｍ３）及び格子寸法ａ＝９２．２、ｂ＝９４．４、ｃ＝２２０．４Åに関して２.４Åの分解能で収集した（図４）。部分的にセレノ−メチオニン標識されたタンパク質結晶を、構造決定のために２．９Åの分解能でＩＤ２９で、その後構造精密化のためにより大きい結晶において２.３Åの分解能でＩＤ１４−ＥＨ１で測定した。構造をＡＵＴＯＳＨＡＲＰを使用するＳＡＤ方法により解析した（solved）（Vonrheinet al., 2006）。５０／５５のセレニウム原子位置を見出した。位相及びマップを、セレニウム位置から確定される非結晶学的な４回対称を利用するＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger,2000）を用いて改良したが、実際に非対称ユニットで５つの分子が存在することが分かっている（溶媒含量５５％）。これらは通常とは異なって配置される。Ａ〜Ｄで表される、４つの規則的に並んだ分子（平均Ｂ因子  約３０Å２）は、４回点対称で配置される。５番目の分子は、結晶学的なｃ方向での五量体の封入を媒介するが、部分的に無秩序である（平均Ｂ因子  約５１Å２）。位相を天然タンパク質のデータに移した後、ＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis et al., 1999）は、ほとんどの構造を自動的に構築することができた。はっきりした残留電子密度が、各分子と結合したｍ７ＧＴＰで観察された。各分子の大部分で密接なＮＣＳレストレイント（restraints）と、各分子全体としてＴＬＳパラメータとを使用するＲＥＦＭＡＣ（Murshudov,1997）で精密化を行った。最終Ｒ因子（Ｒ−ｆｒｅｅ）は、２９３個の水分子で０.１８６（０.２３５）である。ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ（Lovell et al.,2003）によれば、構造の精度は、このサーバ出力によって示されるように優れている：
【０１３７】
ＲＥＭＡＲＫ  ４０
ＲＥＭＡＲＫ  ４０  ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＶＡＬＩＤＡＴＩＯＮ
ＲＥＭＡＲＫ  ４０  ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ  ＯＵＴＰＵＴ  ＳＣＯＲＥＳ：
ＲＥＭＡＲＫ  ４０  ＡＬＬ−ＡＴＯＭ  ＣＬＡＳＨＳＣＯＲＥ：８.４０
ＲＥＭＡＲＫ  ４０  ＢＡＤ  ＲＯＴＡＭＥＲＳ：３.４％  ２４／７０８（ＴＡＲＧＥＴ  ０％〜１％）
ＲＥＭＡＲＫ  ４０  ＲＡＭＡＣＨＡＮＤＲＡＮ  ＯＵＴＬＩＥＲＳ：０.０％  ０／７９５（ＴＡＲＧＥＴ  ０.２％）
ＲＥＭＡＲＫ  ４０  ＲＡＭＡＣＨＡＮＤＲＡＮ  ＦＡＶＯＲＥＤ：９７.７％  ７７７／７９５（ＴＡＲＧＥＴ  ９８.０％）
【０１３８】
ＰＢ２のキャップ結合ドメインはコンパクトに整列された混合α−βフォールドを有し、突出した逆並行型βシートがα１、α２、α３及びα４を含むへリックス束上に封入されたβ１鎖、β２鎖、β５鎖、β６鎖及びβ７鎖を含み、最長のα１ヘリックス及びα３へリックスがおおよそ逆並行に整列する。β２とβ５との連結が、β３鎖とβ４鎖と３４８ループを含む長いβヘアピンに広がり、これは分子のへリックス側を越える。α２とα３との間で、規則性が低い（poorly ordered）ループが溶媒への４２０ループの突出を設計した（図４及び図５）。インフルエンザＡのＰＢ２キャップ結合ドメインでは、ｍ７Ｇは、Ｐｈｅ３２３（リボースに対してより積層されたβ１から）及びＰｈｅ４０４（塩基に対してより積層されたへリックスα１のＣ末端から）により主に形成される疎水性プラットフォーム上にあるが、いずれも塩基とは正確には並行ではない。これらの２つの芳香族残基は、５つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３も含む）の顕著なクラスターの一部である。リガンドの溶媒側で、サンドウィッチが、この役割ではこれまでに見られなかった種類の残基であるＨｉｓ３５７（β４のＣ末端から）によって完成される。重要な酸性残基は、水素がグアニンのＮ１位置及びＮ２位置に結合するＧｌｕ３６１であり、またＬｙｓ３７６は、Ｏ６との相互作用を介して塩基特異的な認識に関与する（図６、図７及び図１０）。キャップ結合タンパク質では通常とは異なり（unusually）、いずれのリボースヒドロキシルとも直接的には相互作用しない。三リン酸は塩基に向かって円型に曲がる。α−ホスファートはＨｉｓ４３２及びＡｓｎ４２９と相互作用し、γ−ホスファートは塩基性残基Ｈｉｓ３５７、Ｌｙｓ３３９及びＡｒｇ３５５と相互作用する。
【０１３９】
実施例７：キャップ結合部位の突然変異解析
構造的に観察されたタンパク質−リガンド相互作用がｉｎ  ｖｉｔｒｏキャップ結合に重要であることを検証するために、本発明者らは、QuickChangeの部位特異的な突然変異誘発キット（Stratagene）を使用して、７つのｍ７ＧＴＰ接触残基（Ｆ３２３、Ｆ３２５、Ｅ３６１、Ｆ３６３、Ｆ４０４、Ｈ３５７、Ｋ３７６）のアラニン突然変異を行った。これらの単一の点突然変異体は、キャップ結合活性の低減を示すことが期待され、この活性は、４℃でのｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂との結合能によって評価した（表４、図１２）。野生型ＰＢ２に関して、突然変異体を実施例３で説明されたように精製した。突然変異体Ｆ３６３Ａは発現が乏しく、おそらくはミスフォールディングのために、大腸菌における可溶性が低かったので、さらなる追跡は行わなかった。突然変異体Ｈ３５７Ａ、Ｅ３６１Ａ、Ｋ３７６Ａ及びＦ４０４Ａは、可溶性の形態で十分に発現したが、アッセイ条件下ではｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合することはなく、Ｆ３２３Ａは弱い結合活性を有していた（図１２）。驚くべきことに、突然変異体Ｆ３２５Ａは発現が乏しいにもかかわらず、野生型とほとんど同様に樹脂と結合した。本発明者らは、この突然変異体の活性が強い温度依存性であることを示している（表３）。またＨ３５７Ｗ置換体も作製し、これは期待される塩基との積層の改善を伴い、この突然変異体ドメインは、ｍ７ＧＴＰ結合の増強を示していた。結果を図１２及び表４に示す。
【０１４０】
実施例８：表面プラズモン共鳴測定を使用するキャップ結合アフィニティの定量分析
様々な突然変異体の結合アフィニティのより定量的な比較を提供するために、本発明者らは、被分析物として固定されたキャップ結合ドメイン及びｍ７ＧＴＰを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。ＳＰＲ分析を、ＣＭ５センサーチップを備えたBiacoreのＴ１００機（Biacore AB, Uppsala, Sweden）で行った。野生型及び突然変異体のＰＢ２キャップ結合ドメインを１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６.０）中で５０μｇ／ｍＬまで希釈し、標準的なアミンカップリング化学を使用してセンサー表面に固定した。活性化／不活性化センサー表面は参照として役目を果たした。０.４７ｍＭ〜１ｍＭの範囲のｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ及びＧＴＰの２倍段階希釈液を、３０μＬ／分の流速で固定されたＰＢ２タンパク質及び参照表面に注入した。泳動緩衝液は、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含有する１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.４）であった。結合の際の温度の影響を試験するために、実験を５℃、１５℃、２５℃及び３７℃で行った。得られたセンサーグラムを全て、二重参照を用いて処理し、平衡解離定数を、BiacoreのＴ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた安定状態のアフィニティ評価によって確定した。これらは、固定化に関連する表面化学及び分子配向が値に影響し得るため、「見掛けの（apparent）」解離定数とも呼ばれる。誤差は、ソフトウェアによって報告されたようなフッティングに関連するものである。タンパク質の様々な固定化による実験の間の変動は２５％未満であった（データ図示せず）。２５℃で得られた見掛けの平衡解離定数ＫＤの結果（表１）は、ｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合結果と一致する傾向を示し、最も高いアフィニティは、Ｈ３５７Ｗ突然変異体であり（ＫＤ＝２４±３μＭ）、野生型が続き（ＫＤ＝１７７±３４μＭ）、Ｅ３６１Ａ及びＫ３７６Ａ突然変異体が最も低いアフィニティを有する（ＫＤ＞１５００μＭ）。
【０１４１】
表１：２５℃でのＳＰＲにより確定された、ｍ７ＧＴＰとＰＢ２キャップ結合ドメインの異なる点突然変異体との間の相互作用に関する見掛けの平衡解離定数（ＫＤ）
【表１】
2015062417.tif 000002
【０１４２】
まとめると、上記のデータにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＢ２ドメインによるｍ７ＧＴＰとのこれらの接触残基の機能的重要性が確認される。野生型キャップ結合ドメインとのジヌクレオチドキャップ類似体、ｍ７ＧｐｐｐＧ及びＧＴＰ結合に関するさらなる結果を表２に示す。
【０１４３】
表２：キャップ類似体によるキャップを有するＲＮＡの架橋の阻害により測定されたＩＣ５０の値（Hooker et al. 2003）と比較した、２５℃でのＳＰＲにより確定された、ＰＢ２の野生型キャップ結合ドメインと異なるキャップ類似体との間の相互作用に関する見掛けの平衡解離定数（ＫＤ）
【表２】
2015062417.tif 000003
【０１４４】
キャップ結合ドメインとｍ７ＧＴＰとの結合の温度依存性を調べるために、本発明者らは、３７℃までの様々な温度で野生型及び選択された突然変異体のドメインに関して、ＫＤのＳＰＲ測定を行った（表３）。試験した全てのタンパク質のキャップ結合アフィニティは温度が増大するにつれて有意に減少した。しかしながら、野生型の見掛けのＫＤが５℃〜３７℃で２.７倍増大したのに対し、Ｆ３２５Ａ突然変異体の見掛けのＫＤは２０倍超増大した。また野生型ドメインとは異なり、Ｆ３２５Ａ突然変異体の結合活性は、３７℃でのインキュベーション後に不可逆的に失われ（データ図示せず）、これは熱変性によるためと思われる。そのためこの温度感受性は、ドメイン及び三量体の両方で４℃でＦ３２５Ａ突然変異体の観察された正常に近いキャップ結合活性と、３７℃でのＦ３２５Ａ突然変異体ポリメラーゼの機能障害とに関して一貫した理論的解釈を与える（実施例１０を参照されたい）。
【０１４５】
表３：ｍ７ＧＴＰとキャップ結合ドメインの異なる点突然変異体との間の相互作用に関する解離定数（ＫＤ）の温度依存性
【表３】
2015062417.tif 000004
【０１４６】
実施例９：野生型及び突然変異体のポリメラーゼ複合体のキャップ結合活性
キャップ結合部位とインフルエンザＲＮＰの生物活性との関連性を調べるために、本発明者らは、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５の全長ＰＢ２に同じ突然変異を導入し、得られた三量体ポリメラーゼ又は組換えＲＮＰの活性を試験した。突然変異体はいずれもポリメラーゼ複合体に関して発現された場合にはＰＢ２の蓄積を変えず、また三量体ポリメラーゼ複合体を形成するＰＢ２の能力を変えなかった（表４）。
【０１４７】
三量体ポリメラーゼのキャップ結合のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼのＰＢ１サブユニットをコードするプラスミドｐＣＭＶＰＢ１、ＰＢ２野生型サブユニットをコードするプラスミドｐＣＭＶＰＢ２Ｈｉｓ又はその突然変異体、及びＰＡサブユニットをコードするプラスミドｐＣＭＶＰＡと同時トランスフェクトし、細胞抽出物をトランスフェクションの２４時間後に調製した。抽出物を、ｐＨ７.５で５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０.２％  ＮＰ４０、タンパク質阻害剤（Roche、Ｃｏｍｐｌｅｔｅカクテル）を含有する緩衝液中で調製し、４℃で３時間、ｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（GEHealthcare）と共にインキュベートした。１００容量の同じ緩衝液で洗浄した後、保持タンパク質を、１ｍＭのｍ７ＧＴＰを含有する同じ緩衝液で溶出し、ＰＡ特異的抗体を使用するウェスタンブロットにより分析した（図１３）。これらの条件下で、野生型ポリメラーゼは、対照のＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂上には保持されなかった。突然変異体Ｈ３５７Ｗが野生型として働く一方で、他の突然変異は、依然として結合していたＦ３２５Ａを除いて全て結合がなく、このことは単離ドメインに関して得られた結果（the results the results）を反映していた。
【０１４８】
実施例１０：野生型及び突然変異体の組換えｍｉｎｉ−ＲＮＰの複製活性及び転写活性
野生型又は突然変異体のポリメラーゼの複製活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで組換え系におけるＲＮＰの蓄積を測定することにより試験した（Ortega et al., 2000；Martin-Benito et al., 2001）。ＲＮＰ再構築のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム沈殿プロトコルを使用して、プラスミドｐＣＭＶＰＢ１、ｐＣＭＶＰＢ２Ｈｉｓ、ｐＣＭＶＰＡ、ｐＣＭＶＮＰ及びｐＨＨクローン２３と同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、抽出物を調製し、ＲＮＰを、説明されるようにＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロース樹脂上でのクロマトグラフィにより精製した（Areaet al., 2004）。ウェスタンブロット法を、ＰＡ及びＮＰに特異的な抗体を使用して実施した。子孫ＲＮＰを抽出し、精製して、それらの蓄積を抗ＰＡ抗体及び抗ＮＰ抗体を使用してモニタリングした。ほとんどの突然変異はＲＮＰの複製活性を実質的に変えなかった（図１４及び表４）。突然変異Ｆ３２５Ａ及びＫ３７６ＡだけがＲＮＰの蓄積を一部低減した。
【０１４９】
精製された野生型又は突然変異体のＲＮＰの転写活性を、プライマーとしてＡｐＧ又はβ−グロブリンのｍＲＮＡのいずれかを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、それぞれキャップ非依存性又はキャップ依存性の転写を明らかにした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ合成のために、ウェスタンブロットにより確定されるように、等量の精製ＲＮＰを、３０℃で６０分間、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのジチオスレイトール、各０.５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、１０μＭのα−３２Ｐ−ＧＴＰ（０.５μＣｉ／ｎｍｏｌ）、１０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、１Ｕ／ｍｌのヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、及び１００μＭのＡｐＧ又は１０μｇ／ｍｌのβ−グロブリンのｍＲＮＡのいずれかを含有する、２０μｌの反応混合物中でインキュベートした。合成ＲＮＡをＴＣＡ沈殿し、ドットブロット機器における濾過により回収した。取り込みをｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒで定量化した。ほとんどの突然変異体ＲＮＰはＡｐＧで初回刺激した（primed）場合、完全に活性であった（図１５及び表４）。突然変異Ｈ３５７Ａ及びＦ４０４Ａは、野生型よりも転写効率的にＲＮＰをもたらし、突然変異体Ｆ３２５Ａだけが強い欠損を示した。
【０１５０】
これに対して、β−グロブリンｍＲＮＡ依存性転写が、それぞれ完全に及び部分的に活性であった突然変異Ｈ３５７Ｗ及びＨ３５７Ａを除くほとんどの突然変異体で大きな影響を与えた（図１６及び表４）。β−グロブリン初回刺激転写活性とＡｐＧ初回刺激転写活性との比（図１７及び表４）は、Ｈ３５７Ｗを除く全ての突然変異体が、転写のためのプライマーとしてβ−グロブリンのｍＲＮＡを使用するその能力に強く影響したことを示している。
【０１５１】
キャップ結合活性を低減するように設計された突然変異の１つを除く全てが、タンパク質ドメイン及び突然変異体ポリメラーゼ複合体の両方としてｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとの相互作用を破壊した（表４、図１２及び図１３）。例外であるＦ３２５Ａは、ドメインに対して弱く発現し、３７℃でポリメラーゼ又はＲＮＰレベルでほとんどの機能的アッセイにおいて大きな影響を与えた（表４）。しかしながら、Ｆ３２５Ａは、４℃で適度なキャップ結合アフィニティを保持しており（図１２及び図１３）、これは温度感受性表現型の可能性を示唆していた。
【０１５２】
表４：ＰＢ２のキャップ結合部位突然変異体の生化学的及び生物学的活性の概要
【表４】
2015062417.tif 000005
【０１５３】
実施例１１：キャップ依存性転写は、４２４ループの完全性を必要とする
本発明者らは、その配列がインフルエンザＡとインフルエンザＢとの間で比較的十分に保存される（図９）、目立って露出された４２０ループに注目した（図５及び図６）。このループの考え得る機能を調べるために、本発明者らは、Ｖａｌ４２１〜Ｇｌｎ４２６の残基を３つのグリシンで置換することによりこのループを短縮した（突然変異体ΔＶＱ）。この突然変異を保有する単離キャップ結合ドメインは、ｍ７ＧＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合活性（図１２）及び見掛けのＫＤ（データ図示せず）に関して野生型として働いた。三量体ポリメラーゼ及び組換えＲＮＰに関して、この突然変異体は、程度は低減したが、キャップ類似体樹脂との結合能を保持し、野生型レベルの複製及びＡｐＧ初回刺激転写活性を生じた（図１４及び図１５）。これに対して、突然変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ−グロブリン依存性の転写を行うことはできなかった（図１６、図１７及び表４）。したがってΔＶＱ突然変異体はキャップ依存性転写を欠いているが、キャップ結合は欠いていない。本発明者らは、このループがＰＢ１サブユニットの活性を調節するのにアロステリックな役割を果たし得ると推測している。
【０１５４】
REFERENCES CITED
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【図１８−１４１】
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【図１８−１４２】
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【図１８−１４３】
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【図１８−１４４】
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【図１８−１４５】
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【図１８−１４６】
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【図１８−１４７】
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【図１８−１４８】
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【図１８−１４９】
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【図１８−１５０】
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【図１８−１５１】
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【図１８−１５２】
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【図１８−１５３】
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【図１８−１５４】
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【図１８−１５５】
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【図１８−１５６】
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【図１８−１５７】
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【図１８−１５８】
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【図１８−１５９】
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【図１８−１６０】
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【図１８−１６１】
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【図１８−１６２】
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【図１８−１６３】
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【図１８−１６４】
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【図１８−１６５】
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【図１８−１６６】
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【図１８−１６７】
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【図１８−１６８】
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【図１８−１６９】
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【図１８−１７０】
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【図１８−１７１】
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【図１８−１７２】
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【図１８−１７３】
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【図１８−１７４】
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【図１８−１７５】
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【図１８−１７６】
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【図１８−１７７】
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【図１８−１７８】
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【図１８−１７９】
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【図１８−１８０】
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【図１８−１８１】
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【図１８−１８２】
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【図１８−１８３】
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【図１８−１８４】
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【図１８−１８５】
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【図１８−１８６】
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【図１８−１８７】
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【図１８−１８８】
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【図１８−１８９】
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【図１８−１９０】
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【図１８−１９１】
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【図１８−１９２】
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【図１８−１９３】
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【図１８−１９４】
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【図１８−１９５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月6日(2014.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｎ末端が配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２０以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５１０以下と同一であるか若しくはそれに対応する、可溶性ポリペプチド断片、
（ｉｉ）Ｎ末端が配列番号２に示されるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２２以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号２に示されるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５１１以下と同一であるか若しくはそれに対応する、可溶性ポリペプチド断片、及び
（ｉｉｉ）Ｎ末端が配列番号３に示されるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置２２７以上と同一であるか若しくはそれに対応し、Ｃ末端が配列番号３に示されるＰＢ２のアミノ酸配列のアミノ酸位置５２８以下と同一であるか若しくはそれに対応する、可溶性ポリペプチド断片、のうち、
（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つの可溶性ポリペプチド断片又はその変異体であって、該可溶性ポリペプチド断片又は該変異体はＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持するものであり、
該ＲＮＡキャップ類似体は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるか、又はＲＮＡキャップにさらなるヌクレオチドを含み、
該変異体は、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載の可溶性ポリペプチド断片と少なくとも８０％の配列同一性を有する、可溶性ポリペプチド断片。
【請求項２】
配列番号４〜配列番号１３に示されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するか又はそれに対応するポリペプチド断片、及びＲＮＡキャップ又はその類似体と会合する能力を保持するその変異体であり、該ＲＮＡキャップ類似体は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるか、又はＲＮＡキャップにさらなるヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド断片。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチド断片と、ＲＮＡキャップ又はその類似体とを含む複合体であって、該ＲＮＡキャップ類似体は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるか、又はＲＮＡキャップにさらなるヌクレオチドを含むものである、複合体。
【請求項４】
ＲＮＡキャップ類似体が、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ及びｍ７ＧｐｐｐＵｍから成る群から選択される、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
可溶性ポリペプチド断片が配列番号１１に示されるアミノ酸配列から成り、ＲＮＡキャップ類似体がｍ７ＧＴＰであり、可溶性ポリペプチド断片が図１８に示される構造座標により規定される構造を有する、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリペプチド断片をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド、又は請求項７に記載の組換えベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項９】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットの全部又は一部と会合する化合物を同定する方法であって、
（ａ）図１８に示すような請求項５に記載の複合体の構造座標により規定される前記結合ポケットのコンピュータモデルを構築する工程、
（ｂ）有望な結合化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させ前記化合物とすること、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択すること、及び
（ｉｉｉ）前記化合物の新規リガンド設計
から成る群から選択される方法により有望な結合化合物を選択する工程、
（ｃ）演算手段を使用する工程であって、該結合ポケットにおける前記化合物のエネルギを最小化した立体配置を提供するために、前記化合物と前記結合ポケットとのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、演算手段を使用する工程、並びに
（ｄ）前記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、前記化合物と該結合ポケットモデルとの間の会合を定量化し、それにより前記結合ポケットと会合する前記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程、
を含む、同定する方法。
【請求項１０】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットが、配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４、又はそれに対応するアミノ酸を含むか、及び／又は
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットが、以下の群から選択されるいずれか少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項９に記載の方法：
・配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３、又はそれに対応するアミノ酸、及び／又は
・配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６、又はそれに対応するアミノ酸、及び／又は
・配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６、又はそれに対応するアミノ酸、及び／又は
・配列番号１に示されるＰＢ２のアミノ酸Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２、又はそれに対応するアミノ酸。
【請求項１１】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットが、図１８に示される配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２３、Ｈｉｓ３５７及びＰｈｅ４０４の構造座標により規定される、及び／又は
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケットが、以下の群から選択されるいずれか少なくとも１つで規定される、請求項９に記載の方法：
・図１８に示される配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｐｈｅ３２５、Ｐｈｅ３３０及びＰｈｅ３６３の構造座標によりさらに規定される
・図１８に示される配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｇｌｕ３６１及びＬｙｓ３７６の構造座標によりさらに規定される
・図１８に示される配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｓｅｒ３２０、Ａｒｇ３３２、Ｓｅｒ３３７及びＧｌｎ４０６の構造座標によりさらに規定される
・図１８に示される配列番号１のＰＢ２のアミノ酸Ｌｙｓ３３９、Ａｒｇ３５５、Ａｓｎ４２９及びＨｉｓ４３２の構造座標によりさらに規定される。
【請求項１２】
（ｅ）結合化合物を合成し、任意に前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に薬学的組成物を製造するさらなる工程を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｆ）結合化合物、請求項１又は２に記載のポリペプチド断片、又は請求項８に記載の組換え宿主細胞と、ＲＮＡキャップ又はｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるか若しくはＲＮＡキャップにさらなるヌクレオチドを含むＲＮＡキャップ類似体とを接触させるさらなる工程であって、前記ＰＢ２ポリペプチド断片と前記ＲＮＡキャップ又はその類似体との間の結合を阻害する前記化合物の能力を確定する、接触させるさらなる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット、又はＰＢ２ポリペプチド変異体の結合ポケットと会合する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）請求項１又は２に記載のポリペプチド断片、又は請求項８に記載の組換え宿主細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び
（ｉｉ）ＰＢ２と結合する前記試験化合物の能力を分析する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
ＲＮＡキャップ又はｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるか若しくはＲＮＡキャップにさらなるヌクレオチドを含むＲＮＡキャップ類似体を添加するさらなる工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡキャップ若しくはｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるか若しくはＲＮＡキャップにさらなるヌクレオチドを含むＲＮＡキャップ類似体の存在下において、
ＰＢ２若しくはその変異体と結合する試験化合物の能力、又は前記ＲＮＡキャップ若しくはその類似体とＰＢ２若しくはその変異体との結合を阻害する前記試験化合物の能力を分析する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＢ２と結合する試験化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物（複数可）及び／又は担体（複数可）と共に薬学的組成物を製造する工程をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ドメインに結合する抗体。
【請求項１９】
配列番号１４〜配列番号２２により規定されるポリペプチドの群から選択されるポリペプチド断片を認識する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスでのウイルス感染により引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の製造のための、
請求項９〜１２のいずれかに記載の方法で同定される化合物、又は
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法で同定される化合物であって、
前記化合物は、ｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｍ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｍ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｍ、ｍ７ＧｐｐｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｍ、２−アミノ−７−ベンジル−９−（４−ヒドロキシ−ブチル）−１，９−ジヒドロ−プリン−６−オン、Ｔ−７０５又はｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ）１−１５（ＮはＡ、Ａｍ、Ｇ、Ｇｍ、Ｃ、Ｃｍ、Ｕ又はＵｍである）ではなく、且つ
ＰＢ２のＲＮＡキャップ結合ポケット若しくはその変異体と結合することができ、又はＰＢ２ポリペプチド若しくはその変異体とＲＮＡキャップ若しくはｍ７Ｇ、ｍ７ＧＭＰ、ｍ７ＧＴＰ、ｍ７ＧｐｐｐＮ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍからなる群から選択されるＲＮＡキャップ類似体との間の結合を阻害することができるものであり、又は
請求項１８若しくは１９に記載の抗体
の使用。