(57)【要約】【課題】加齢や紫外線等の外的刺激により誘導されるマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生に対し優れた抑制効果を有し、安全性および使用性においても問題のない、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を提供する。【解決手段】オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物を含有させて、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤とする。【選択図】図１
2015067546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物を含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項２】
抽出物が、エタノールまたはブタンジオールを含む抽出溶媒により抽出して得られる抽出物である、請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項３】
抽出溶媒中のエタノールの濃度が、５０（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％である、請求項２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項４】
ブタンジオールが１，３−ブタンジオールである、請求項２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項５】
抽出溶媒中のブタンジオールの濃度が５０（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％である、請求項２または４に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項６】
皮膚の老化の防止または改善用である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を含有する、医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を含有する、医薬部外品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を含有する、化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（以下、本明細書において「ＭＭＰ−１」と表記することがある）産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＭＰ−１は、真皮線維芽細胞により産生され、細胞外マトリックスのＩ型コラーゲンを分解するが、加齢により、また少量の紫外線によっても、産生が促進されることが知られている。
ＭＭＰ−１産生の促進は、細胞外マトリックス成分であるＩ型コラーゲンの過剰な分解を招き、しわ、たるみ等の皮膚の老化の発現および進行を促進する。
また、ＭＭＰ−１は、皮膚の老化のみではなく、リューマチ関節症、変形性関節症等の疾患や創傷治癒に関与し、かかる病変組織や慢性的な創傷部位において産生が促進されることが報告されている（非特許文献１、２）。
【０００３】
従って、加齢の他、紫外線、病変等の外的刺激によって惹起され、促進されるＭＭＰ−１産生を阻害または抑制する成分の探索が行われ、たとえば、キサントリゾール（特許文献１）、リグナン系化合物（特許文献２）、トルメント酸（特許文献３）、アセトゲニン（特許文献４）等が開示されている。
また、ブドウ種子抽出物（特許文献５）、イチョウ葉、ビワ葉抽出物（特許文献６）、ササクレヒトヨタケ抽出物（特許文献７）等、植物抽出物のＭＭＰ−１産生阻害または抑制活性も多く報告されている。
【０００４】
しかしながら、上記のような外的刺激により促進されるＭＭＰ−１産生、特に真皮における病的なＭＭＰ−１産生に対し、十分な抑制効果を有し、安全性、使用性等の点でも問題のないＭＭＰ−１産生抑制剤が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５３０４１２号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３０４１３号公報
【特許文献３】特開２０１２−０５６９３７号公報
【特許文献４】特表２０１３−５０８３５２号公報
【特許文献５】特開２００６−２７３８５７号公報
【特許文献６】特開２０１１−２２５５５０号公報
【特許文献７】特開２０１２−０９２０８５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】A. J. Freemont et al. ; Anuals of the Rheumatic Diseases 56 542-549 (1997)
【非特許文献２】MA. Moses et al. ; J. Cell Biochem. 60 (3) 375-386 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、加齢や紫外線等の外的刺激により促進されるＭＭＰ−１産生に対し優れた抑制効果を有し、特に皮膚に対する刺激性等、安全性および使用性においても問題のない、ＭＭＰ−１産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、種々検討した結果、オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物に、優れたＭＭＰ−１産生抑制活性を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の［１］〜［９］に関する。
［１］オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物を含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
［２］抽出物が、エタノールまたはブタンジオールを含む抽出溶媒により抽出して得られる抽出物である、上記［１］に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
［３］抽出溶媒中のエタノールの濃度が、５０（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％である、上記［２］に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
［４］ブタンジオールが１，３−ブタンジオールである、上記［２］に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
［５］抽出溶媒中のブタンジオールの濃度が５０（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％である、上記［２］または［４］に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
［６］皮膚の老化の防止または改善用である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
［７］上記［１］〜［６］のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を含有する、医薬品。
［８］上記［１］〜［６］のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を含有する、医薬部外品。
［９］上記［１］〜［６］のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を含有する、化粧品。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るＭＭＰ−１産生抑制剤は、加齢や紫外線等の外的刺激により促進されるＭＭＰ−１産生に対し優れた抑制効果を有し、特に、加齢や紫外線等の外的刺激により促進される細胞外マトリックス成分であるＩ型コラーゲンの過剰な分解を抑制して、しわ、たるみ等の皮膚の老化の発現および進行を防止または改善する効果に優れる。
また、本発明に係るＭＭＰ−１産生抑制剤において、有効成分として含有されるオオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物は、植物由来であり、低濃度で十分なＭＭＰ−１産生抑制活性を有するため、皮膚に対する刺激性等、安全性および使用性の点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】紫外線により誘導されるＭＭＰ−１産生に対する、本発明の実施例７のＭＭＰ−１産生抑制剤の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の皮膚の酸化的ストレス抑制剤は、オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実より、抽出溶媒により抽出して得られる抽出物を含有する。
【００１３】
本発明で用いるオオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）は、バラ科（Rosaceae）に属する落葉樹であり、本発明においては、果実を用いる。
オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実は水洗し、そのまま、または細切、乾燥、粉砕等を行うことにより、スラリー状、細粒状、顆粒状または粉末状として抽出に供する。抽出溶媒としては、通常、メタノール、エタノール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン等の極性有機溶媒の１種または２種以上、または前記極性有機溶媒の１種または２種以上と水との混合溶媒が用いられるが、エタノールまたはブタンジオールを含む抽出溶媒を用いることが好ましく、５０（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％エタノール、５０（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％ブタンジオールがより好ましく用いられる。なお、ブタンジオールとしては、１，３−ブタンジオールが好ましく用いられる。また、エタノールを含む抽出溶媒としては、５０（ｖ／ｖ）％エタノールが特に好ましく、ブタンジオールを含む抽出溶媒としては、５０（ｖ／ｖ）％ブタンジオールが特に好ましい。
【００１４】
抽出は、オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実１００ｇに対し、通常１００ｍＬ〜５００ｍＬの抽出溶媒を用いて行い、２００ｍＬ〜３００ｍＬの抽出溶媒を用いることが好ましい。
抽出条件は、抽出溶媒によっても異なるが、通常、１０℃〜３０℃で２日間〜９０日間程度である。特に、エタノールを含む抽出溶媒の場合、通常２０℃〜３０℃で２日間〜６０日間行い、２５℃〜３０℃で２日間〜７日間行うことが好ましい。また、ブタンジオールを含む抽出溶媒の場合は、通常２０℃〜３０℃で２日間〜６０日間行い、２５℃〜３０℃で７日間〜６０日間行うことが好ましい。
抽出後、定法に従い、たとえばろ過、遠心分離等により、抽出液を回収し、オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物を得る。
【００１５】
本発明においては、オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物は、上記溶媒による抽出物をそのまま用いてもよく、該抽出物を希釈もしくは濃縮し、または乾燥して用いてもよく、粗精製または精製して用いてもよい。前記抽出物の粗精製および精製は常法に従って行えばよく、たとえば「ダイヤイオンＨＰ」（三菱化学株式会社製）等のイオン交換樹脂、「Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８」（ウォーターズ社製）等の吸着剤による吸着および溶出、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００１６】
上記したオオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物は、後述するように、強いＭＭＰ−１産生抑制活性を有し、特に、ヒト真皮線維芽細胞において、加齢や紫外線（ＵＶＢ）曝露等の外的刺激によって誘導されるＭＭＰ−１の過剰産生を抑制する作用を有する。それゆえ、これを有効成分として含有するＭＭＰ−１産生抑制剤は、加齢や紫外線等の外的刺激による過剰なＭＭＰ−１産生の誘導による真皮マトリックス成分の分解を抑制し、しわ、たるみ等の皮膚の老化症状の発現または進行を良好に抑制し、かかる症状を防止または改善することができる。また、前記抽出物は植物由来であり、ＭＭＰ−１産生抑制活性が強いことから、低濃度で十分なＭＭＰ−１産生抑制効果を奏し、皮膚に対する刺激性等、安全性および使用性における問題も生じにくい。
【００１７】
なお、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤において、十分な効果を得るために必要なオオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の抽出物の量は、抽出溶媒および抽出条件により異なるが、エタノールを含む抽出溶媒による抽出物の場合、乾燥重量として、０．００５重量％〜０．１重量％含有させることが好ましく、０．０５重量％〜０．１重量％含有させることがより好ましい。また、ブタンジオールを含む抽出溶媒による抽出物の場合、ポリフェノール（没食子酸）に換算した量として、０．０００５（ｗ／ｖ）％〜０．０１（ｗ／ｖ）％含有させることが好ましく、０．００５（ｗ／ｖ）％〜０．０１（ｗ／ｖ）％含有させることがより好ましい。
【００１８】
本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の上記抽出物をそのまま、または、水、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン等の多価アルコールといった液状担体、乳糖、デンプン、デキストリン等の粉末担体に含有させ、必要に応じて分散剤、懸濁剤、抗酸化剤、増粘剤、ゲル化剤、保存剤等、製剤化に際して一般的に使用される添加剤を加えて、液状、懸濁液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、粉末状等の形態で提供することができる。
【００１９】
さらに本発明は、上記本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を有効成分として含有する医薬品を提供する。
本発明の医薬品には、必要に応じて、動植物性油脂、ロウ、脂肪酸、脂肪族アルコール、エステル油、炭化水素油、シリコーン油等の油性基剤；エタノール、プロピレングリコール等の溶解剤；グリセリン、１，３−ブタンジオール、マクロゴール等の湿潤剤；アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート等の懸濁化剤；グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート等の乳化剤；アルギン酸プロピレングリコールエステル、ベントナイト、ポリソルベート、マクロゴール等の分散剤；カルボキシビニルポリマー、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の粘稠剤；クレー、結晶セルロース、デキストリン、トウモロコシデンプン等の賦形剤；アルファー化デンプン、カルメロース、乳糖、微結晶セルロース等の結合剤；ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、タルク等の滑沢剤；クロスポビドン、沈降炭酸カルシウム、ポビドン等の崩壊剤；アジピン酸ジオクチル、フタル酸ジオクチル、ミリスチン酸イソプロピル等の可塑剤；塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等のｐＨ調整剤；アスコルビン酸、エリソルビン酸、酢酸トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；安息香酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、デヒドロ酢酸、パラオキシ安息香酸メチル等の防腐剤；ｄｌ−カンフル、スペアミント油、ハッカ油、ｄｌ−メントール等の芳香剤；アスパルテーム、サッカリンナトリウム、酢酸、ブドウ糖等の矯味剤；黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化亜鉛、食用青色１号、食用赤色２号等の着色剤など、製剤化に際し一般的に配合される添加剤を含有させることができる。
【００２０】
本発明の医薬品は、液剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤等の剤形で提供することができ、製剤学的に一般的な製造方法、たとえば第１６改正日本薬局方製剤総則に記載された方法により、調製することができる。
本発明の医薬品は、好ましくは、皮膚外用医薬品として提供される。かかる皮膚外用医薬品は、ローション剤、ゲル剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、リニメント剤等、種々の形態で提供することができる。
【００２１】
また、本発明は、上記本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を含有する医薬部外品を提供する。本発明の医薬部外品も、上記医薬品と同様に、必要に応じて油性基剤、分散剤、懸濁化剤、乳化剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、矯味剤、着色剤等の添加剤を加えて、液剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、粉末剤等の種々の剤形で提供され得る。
本発明の医薬部外品は、好ましくは皮膚外用医薬部外品として提供される。かかる皮膚外用医薬部外品は、ローション剤、ゲル剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、リニメント剤等の種々の形態とすることができる。
【００２２】
さらに本発明は、上記本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を含有する化粧品を提供する。
本発明の化粧品は、アーモンド油、アボカド油、オリーブ油、カカオ脂、ゴマ油、サフラワー油、大豆油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、モクロウ、ヤシ油等の植物性油脂；タートル油、ミンク油、卵黄油等の動物性油脂；カルナウバロウ、キャンデリラロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ；スクワラン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、流動パラフィン、ワセリン等の炭化水素油；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸等の脂肪酸；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、ラノリンアルコール等の脂肪アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルデシル等のエステル；ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤；テトラアルキルアンモニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩等の陽イオン性界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニウムベタイン、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸等の両性界面活性剤；赤色２号、黄色４号、青色１号、β−カロテン等の色素；タルク、カオリン、酸化チタン、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄等の顔料；ペパーミント油、スペアミント油、ローズ油等の香料；パラアミノ安息香酸エチル、パラメトキシ桂皮酸エチルヘキシル、オキシベンゾン等の紫外線吸収剤；酢酸トコフェロール、ビタミンＥ等の抗酸化剤；エデト酸ナトリウム、フェノキシエタノール、パラオキシ安息香酸メチル等の防腐剤など、一般的な化粧品原料を用いて、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚用化粧品、ファンデーション、アイカラー、チークカラー等のメイクアップ化粧品などとして提供される。
【００２３】
本発明の化粧品は、好ましくは、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚用化粧品として提供される。
【００２４】
なお、上記した本発明の医薬品、医薬部外品または化粧品は、加齢、紫外線等の外的刺激による皮膚の老化を防止または改善するための皮膚外用医薬品、皮膚外用医薬部外品または皮膚用化粧品として、特に好ましく提供される。
【００２５】
上記皮膚の老化を防止または改善するための皮膚外用医薬品、皮膚外用医薬部外品または皮膚用化粧品には、本発明の特徴を損なわない範囲で、グルコシルルチン、コメヌカ油、シソ抽出物、タンニン酸、ルイボス抽出物等の抗酸化剤；コエンザイムＱ１０、デオキシリボ核酸ナトリウム、アシタバ抽出物、クロレラ抽出物、酵母抽出物、オタネニンジン抽出物、ヒバマタ抽出物、ロイヤルゼリー抽出物等の細胞賦活剤；アスコルビルリン酸ナトリウム、アスコルビルリン酸マグネシウム、アルブチン、コウジ酸、ソウハクヒ抽出物、プラセンタ抽出物等の美白剤；加水分解シルク、カッコン抽出物、シャクヤク抽出物、卵殻膜タンパク質、レチノール等の抗シワ・抗老化剤；アズレン、アラントイン、カミツレ抽出物、カンゾウ抽出物、キダチアロエ抽出物、グリチルリチン酸等の抗炎症・肌荒れ防止剤；シコン抽出物、ビサボロール、ヒノキチオール等の抗菌剤；塩化セチルピリジニウム、グルコン酸亜鉛、オウバク抽出物等の抗ざ瘡剤；ＤＬ−アラニン、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、コンドロイチン、スフィンゴ脂質、セラミド、ヒアルロン酸等の保湿剤；塩化カプロニウム、センブリ抽出物、ハトムギ抽出物等の血行促進剤などを含有させることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１〜６］液状ＭＭＰ−１産生抑制剤
オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実１００ｇを水洗し、５０（ｖ／ｖ）％エタノール、７５（ｖ／ｖ）％エタノール、１００（ｖ／ｖ）％エタノール、５０（ｖ／ｖ）％１，３−ブタンジオール、７５（ｖ／ｖ）％１，３−ブタンジオール、１００（ｖ／ｖ）％１，３−ブタンジオール各３００ｍＬに浸漬し、ときどき撹拌しながら、２５℃にて静置して抽出した。５０（ｖ／ｖ）％エタノール、７５（ｖ／ｖ）％エタノール、１００（ｖ／ｖ）％エタノールのそれぞれにより抽出する場合は７日間、５０（ｖ／ｖ）％１，３−ブタンジオール、７５（ｖ／ｖ）％１，３−ブタンジオール、１００（ｖ／ｖ）％１，３−ブタンジオールのそれぞれにより抽出する場合は、２か月間静置した後、ろ過してろ液を回収し、実施例１〜６の液状ＭＭＰ−１産生抑制剤とした。
【００２８】
上記実施例１〜６の液状ＭＭＰ−１産生抑制剤について、下記の通り、ポリフェノール含量、タンパク質含量、糖含量および乾燥重量を定量した。
（１）ポリフェノール含量
没食子酸を標品として、Folin-Denins法により定量し、没食子酸量に換算した量により表した。
（２）タンパク質含量
Quick Star Protein Assay(Bio Rad)により、ウシ血清アルブミンを用いて検量線を作成して定量した。
（３）糖含量
グルコースを標品として、フェノール硫酸法により定量し、グルコース量に換算した量により表した
（４）乾燥重量
上記実施例のＭＭＰ−１産生抑制剤各１００ｍＬをエバポレーターで減圧濃縮し、次いで蒸留水に溶解し、−８０℃で凍結乾燥して、凍結乾燥後の重量を測定した。
【００２９】
定量結果は、上記各実施例のＭＭＰ−１産生抑制剤における含量または乾燥重量（すなわちオオヤマザクラの果実１００ｇの抽出物中における量）として、表１に示した。なお、５０（ｖ／ｖ）％、７５（ｖ／ｖ）％、１００（ｖ／ｖ）％の１，３−ブタンジオールにより抽出して得た実施例４〜６のＭＭＰ−１産生抑制剤については、凍結乾燥することができなかった。
【００３０】
【表１】
2015067546.tif 000003
【００３１】
［実施例７］粉末状ＭＭＰ−１産生抑制剤
上記実施例１のＭＭＰ−１産生抑制剤（オオヤマザクラ（Cerasus sargentii (Rehder) H.Ohba）の果実の５０（ｖ／ｖ）％エタノールによる抽出物）を減圧下に濃縮し、次いで凍結乾燥して、実施例７の粉末状ＭＭＰ−１産生抑制剤を得た。
【００３２】
［試験例１］ＭＭＰ−１産生抑制効果の評価
実施例７のＭＭＰ−１産生抑制剤を試料として、紫外線（ＵＶＢ）により誘導されるＭＭＰ−１産生に対する抑制効果を評価した。評価方法を以下に示す。
（１）５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト表皮角化細胞（HaCaT Keratinocyte）を各シャーレ（直径１０ｍｍ）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２濃度）にて、３７℃でコンフルエント状態になるまで培養した。
なお、培地は、５％牛胎児血清（FBS）含有ダルベッコ変法イーグル培地（Doulbecco’s modified Eagle’s Medium）（DMEM）（ニッスイ）＜１＞（日水製薬株式会社製、code:5915）と、CERTIFIED FOETAL BOVINE SERUM（BIOLOGICAL INDUTRIES社製、cat.04-001-1E）を用いて調製した。
（２）新鮮な培地に交換し、さらに２４時間培養後、Hanks緩衝液（HBSS+）１０ｍＬに交換し、ＵＶＢランプ（ＰＨＩＬＩＰＳ  ＢＲＯＡＤＢＡＮＤ  ＴＬ２０Ｗ１２  ＲＳ  ＵＬＴＲＡＶＩＯＲＥＴ−Ｂ、フィリップス社製）でＵＶＢを照射（８００ｍＪ／ｃｍ２（照射強度０．４８５ｍＷ／ｃｍ２で２７分照射））した。
（３）各濃度の試料を含有する培地５ｍＬに交換し、２４時間培養後、培養上清を回収した。
ここで、試料を添加しないで同様に処理した群、および上記ＵＶＢ照射を行わない群を対照（コントロール）群とした（各群についてｎ＝２）。
（４）細胞密度１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのFibroblast細胞分散液を調製し、各シャーレ（直径３．５ｃｍ）に２ｍＬずつ播種して、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２濃度）にて、３７℃でほぼコンフルエント状態になるまで培養した。
（５）各シャーレの細胞をPBS（−）２ｍＬで１回洗浄した後、上記（３）で回収した各HaCaT Keratinocyte培養上清２ｍＬに交換し、４８時間培養した。
（６）各群の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法によりＭＭＰ−１を定量した。また、培養上清回収後の各Fibroblast細胞をPBS（−）で１回洗浄した後、０．５％  Triton X-100溶液１ｍＬを添加して細胞を溶解し、BCA protein assay kitを用い、ＢＣＡ法により細胞溶解液のタンパク質を定量した。
なお、ＥＬＩＳＡ法によるＭＭＰ−１の定量は、Quantikine Human Pro-MMP-1 Immunoassay Kit（R&D Systems、Cat.#DMP100）を用い、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−１産生量を定量することにより行った。
【００３３】
各群について、タンパク質１ｍｇあたりのＭＭＰ−１量を算出し、図１に示した。図１に示されるように、実施例７のＭＭＰ−１産生抑制剤を添加しないコントロール群では、ＵＶＢ照射によりＭＭＰ−１量が２倍近く増加したが、実施例７のＭＭＰ−１産生抑制剤を添加した群（０．５ｍｇ（乾燥重量）／ｍＬ添加群および１．０ｍｇ（乾燥重量）／ｍＬ添加群）では、有意なＭＭＰ−１量の減少が認められた。オオヤマザクラ果実の抽出物の乾燥重量にして、１．０ｍｇ／ｍＬのＭＭＰ−１産生抑制剤の添加により、紫外線により誘導されるＭＭＰ−１産生は、ＭＭＰ−１産生抑制剤無添加コントロール群の場合の約１／２まで減少した。
【００３４】
上記結果より、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、ＵＶＢにより誘導されるＭＭＰ−１の産生を有意に抑制することが示された。
【００３５】
次に、本発明の皮膚外用医薬品および皮膚化粧品の処方例を示す。
【００３６】
［実施例８］ローション剤
（１）実施例１のＭＭＰ−１産生抑制剤                        ０．５（重量％）
（２）グリセリン                                            ５
（３）ポリエチレングリコール１５００                        ２
（４）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（１５Ｅ．Ｏ．）    ２
（５）エタノール                                          １５
（６）水酸化カリウム                                        ０．０３
（７）パラオキシ安息香酸メチル                              ０．１
（８）精製水                                      全量を１００とする量
製法：（１）〜（３）および（６）を（８）に添加して溶解する。（５）に（４）および（７）を溶解して、前記溶液に加えて均一とし、ろ過する。
【００３７】
［実施例９］水中油型乳剤性軟膏
（１）白色ワセリン                                        ２５．０（重量％）
（２）ステアリルアルコール                                ２５．０
（３）グリセリン                                          １２．０
（４）ラウリル硫酸ナトリウム                                １．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル                              ０．１
（６）精製水                                      全量を１００とする量
（７）実施例７のＭＭＰ−１産生抑制剤                        ０．０５
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合、溶解して均一とし、７５℃に加熱する。一方、（５）を（６）に溶解して７５℃に加熱し、これに前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて（７）を添加、混合する。
【００３８】
［実施例１０］水中油型クリーム
（１）１，３−ブタンジオール                                ５（重量％）
（２）グリセリン                                          １０
（３）キサンタンガム                                        ０．１５
（４）クエン酸ナトリウム                                    ０．１
（５）エデト酸二ナトリウム                                  ０．０１
（６）パラオキシ安息香酸メチル                              ０．１２
（７）エタノール                                            ２
（８）実施例１のＭＭＰ−１産生抑制剤                        ０．５
（９）ジオクチルカルボン酸                                  ３
（１０）バチルアルコール                                    １．８
（１１）ベヘニルアルコール                                  １．２
（１２）マイクロクリスタリンワックス                        １
（１３）ミツロウ                                            ２．５
（１４）キャンデリラロウ                                    ０．８
（１５）水素添加パーム油                                    ２．５
（１６）ヘキサメチルシクロトリシロキサン                  ２５
（１７）スクワラン                                          ３
（１８）精製ホホバ油                                        ２
（１９）マカデミアナッツ油                                  １
（２０）ポリヒドロキシステアリン酸                          ０．２
（２１）トリポリヒドロキシステアリン酸ジペンタエリスリチル  ０．３
（２２）香料                                                ０．０２
（２３）精製水                                    全量を１００とする量
製法：（２３）に（１）〜（６）を添加、溶解して７０℃〜７５℃に加熱する（水相成分）。（９）〜（２１）を混合し、７０℃〜７５℃に加熱して均一とする（油相成分）。前記水相成分を撹拌しながら、前記油相成分を徐々に添加して乳化する。４０℃まで冷却した後、（７）に溶解した（８）、および（２２）を順次添加して混合し、均一とする。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上詳述したように、本発明により、ＭＭＰ−１産生に対し、優れた抑制効果を有するＭＭＰ−１産生抑制剤を提供することができる。
本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、加齢、紫外線等の外的刺激により誘導されるＭＭＰ−１の産生を良好に抑制することができるため、特に皮膚において、ＭＭＰ−１による細胞外マトリックス成分の分解を抑制し、加齢、紫外線等による皮膚の老化を良好に防止または改善することができる。
また、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、皮膚に対する刺激性等、安全性および使用性においても問題はなく、有利である。
【図１】
2015067546.tif 000004