(57)【要約】【課題】ダイオキシン類を効率良く分解することができる新規なダイオキシン分解酵素遺伝子群を提供すること。【解決手段】  ダイオキシン類を効率良く分解できる新規なダイオキシン分解酵素遺伝子群を持つ微生物を自然界より分離した。このダイオキシン分解酵素遺伝子群の塩基配列は、多数の関連ダイオキシン分解酵素をコードしていて、各々の構造と機能を解明するとともに、その効果を調べたところ、ダイオキシン分解酵素を有する微生物はダイオキシンを効率よく分解することができることが判明した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示す塩基配列または該塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項２】
請求項１に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記塩基配列が５’側からＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）Ｃ３、２、１およびＯＲＦ１、２、３、４、５、６、挿入配列、７、８、９、１０、１１から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。（図１参照）。
【請求項３】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦＣ３が塩基番号９７１−９０のアミノ酸残基数２９４個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項４】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦＣ２が塩基番号１８５７−１０５７のアミノ酸残基数２６７個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項５】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦＣ１が塩基番号３６２９−４９３４のアミノ酸残基数４３５個からなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項６】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ１が塩基番号３６２９−４９３４のアミノ酸残基数４３５個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項７】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ２が塩基番号４９３３−５４７０のアミノ酸残基数１７９個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項８】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ３が塩基番号５７４５−６５７９のアミノ酸残基数２７８個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項９】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ４が塩基番号６７２７−９１５１のアミノ酸残基数８０８個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ５が塩基番号９２８１−９５９９のアミノ酸残基数１０６個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ６が塩基番号９６５１−１０４０１のアミノ酸残基数２５０個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ７が塩基番号１１３２２−１２３８１のアミノ酸残基数３５３個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ８が塩基番号１２３８３−１３４５１のアミノ酸残基数３５６個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ９が塩基番号１３４７８−１４３７５のアミノ酸残基数２９９個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１５】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ１０が塩基番号１４３７４−１５０８２のアミノ酸残基数２３６個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のダイオキシン分解酵素遺伝子群において、前記ＯＲＦ１１が塩基番号１５０８４−１５７４４のアミノ酸残基数２２０個から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１７】
配列番号２で示す塩基配列からなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【請求項１８】
請求項１７に記載のダイオキシン分解遺伝子群において、前記塩基配列が５’側からＯＲＦＣ３、２、１およびＯＲＦ１、２、３、４、５、６、挿入配列、７、８、９、１０、１１から構成されていることからなるダイオキシン分解酵素遺伝子群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】この発明は、新規ダイオキシン分解酵素遺伝子群ならびにかかる遺伝子群を有するダイオキシン分解菌を使用したダイオキシン生分解方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  一般に、ダイオキシン類とは、ポリ塩化ジベンゾーｐージオキシン（ＰＣＤＤ）ならびにポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）などのポリ塩化ジベンゾ化合物を総称する化合物であって、特に動物に対する毒性が強いことから、環境汚染原因物質として広く認められている（非特許文献１）。【０００３】  ダイオキシン類は、ダイオキシン骨格の１ないし４と６ないし９の位置に置換する塩素の数によって、ＰＣＤＦには７５種類、またＰＣＤＤには１３５種類もの異性体が存在する。
ダイオキシン類は非常に強い毒性を有することが知られているが、その毒性はダイオキシンの種類によって大きく異なっている。ダイオキシンのうちでも、２，３，７，８−ＴＣＤＤは、最も毒性が強く、人工物質としては最も強い毒性を持つ物質であると言える。【０００４】  ダイオキシンは、自然界でも発生することがあるが、主に、廃棄物の焼却による燃焼工程等のさまざまな燃焼工程において発生している。このように廃棄物の焼却炉などで発生したダイオキシンは、大気中に排出され、大気中の粒子などに付着して、土壌や河川などを汚染している。
ダイオキシンは、無色無臭の固体であって、ほとんど水には溶けないが、脂肪などには溶け易い性質を有している。また、ダイオキシンは、他の化学物質や酸、アルカリとは容易に反応しないが、紫外線で徐々に分解される性質を持っている。【０００５】  ダイオキシンのうちでも最も毒性が強い２，３，７，８−ＴＣＤＤは、動物実験や人への影響の評価をもとに、人に対する発がん性があるという評価がなされている。また、ダイオキシンは、妊娠中のネズミなどの動物実験によって、奇形を起こすこともわかっている。さらに、ダイオキシンは、動物実験において、体内のホルモンと類似する作用により、甲状腺機能の低下、生殖器官への影響、免疫機能の低下などの影響を及ぼしているとの報告もある。
このように、ダイオキシンが環境や人などに対して悪影響を及ぼすとともに、環境を汚染していることが判明するにつれて、ダイオキシンの排出規制はもとより、すでにダイオキシンで汚染された土壌や河川などの環境を浄化する必要性が痛感されるようになってきている。【０００６】  わが国では、ダイオキシンの約９割が生活用品のゴミや産業廃棄物を焼却する時に出ると言われている。そこで、現在では、大気汚染防止法や廃棄物処理法によって、焼却施設などから発生するダイオキシンの対策が講じられている。【０００７】  また、ダイオキシンで汚染された土壌や地下水や飛灰などに存在するダイオキシンを分解して除去・洗浄する方法や装置がいくつか提案されているがいまだ有効な手段が講じられていないのが現状である。【０００８】  例えば、ダイオキシン類で汚染された土壌や飛灰を有機溶媒で抽出し、この有機溶媒をアルカリと反応させて、ダイオキシン類を分解する方法（特許文献１）、汚染土壌中のダイオキシンを溶媒に抽出し、超音波を照射して常温・常圧下でダイオキシンを分解処理する方法ならびに装置（特許文献２）などの化学的手法や物理的手法が提案されている。しかしながら、これらの化学的ならびに／もしくは物理化学的方法や装置は、広い範囲で汚染されている土壌や河川などの環境汚染に対しては有効ではない。【０００９】  そこで、ダイオキシン類などの汚染物質で汚染されている土壌や河川などの広い範囲を浄化するための微生物ならびにその酵素などを用いた生化学的手法が提案され、かかる微生物の検索が行われた結果、様々な土壌微生物ならびにその酵素などが検索されてきた。【００１０】  そのような生化学的手法が下記特許文献に記載されている。例えば、ラッカーゼを用いるダイオキシン分解方法（特許文献３）、塩素化ダイオキシン分解酵素を用いてダイオキシン類を分解して無害化する方法（特許文献４）、ダイオキシン分解能を有する担子菌を用いたダイオキシン分解方法（特許文献５）、ダイオキシン分解遺伝子を有するシュードモナス属細菌を用いたダイオキシン分解処理法（特許文献６）、白色腐朽菌を用いた土壌中のダイオキシン分解方法（特許文献８）、コリネバクテリウム属の菌株を用いたダイオキシン分解方法（特許文献９）などの微生物学的手法が提案されている。【００１１】  上記特許文献に加えて、非特許文献にも、ダイオキシン類を分解できる微生物が記載されている。
かかる微生物としては、例えば、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する白色腐朽菌（非特許文献２、３）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株ＨＨ６９（非特許文献４）ならびに菌株ＣＡ１０（非特許文献５）、スフィンゴバクテリウム・ムルチボルム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ならびにシュードモナス・ニトロレデユセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）と称する菌株を用いたダイオキシン分解処理方法（特許文献７）、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）属菌株（非特許文献８）、ブルホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌株（非特許文献９）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属菌株ＲＷ１（非特許文献６、７）、が記載されている。
また、上記刊行物には、これらの細菌はいずれもダイオキシン類のうちでも、比較的毒性が低い塩素置換数が２個以下のダイオキシン類を分解するとの例では報告されているだけで、毒性が特に強い塩素置換数が４個以上のダイオキシン類に対して分解できるという例は報告されていない。【００１２】  そこで、比較的毒性が低い塩素置換数が３個以下のダイオキシン類ばかりではなく、毒性が特に強い塩素置換数が４個以上のダイオキシン類をも同時に分解することができるダイオキシン分解方法が強く要請されている。
【非特許文献１】Ｓａｆｅ，Ｓ．（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２１，５１−８８
【非特許文献２】Ｈａｍｍｅｌ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１６９４８−１６９５２
【非特許文献３】Ｔａｋａｄａ，ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，４３２３−４３２８
【非特許文献４】Ｆｏｒｔｎａｇｅｌ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６，１１４８−１１５６
【非特許文献５】Ｓａｔｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，４８５０−４８５８
【非特許文献６】Ｈａｌｄｅｎ，Ｒ．Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５，２２４６−２２４９
【非特許文献７】Ｍｅｇｈａｒａｊ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８，１０９−１１４
【非特許文献８】Ｓｃｈｍｉｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，４８５８
【非特許文献９】Ｂｅｉｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７，１９０−１９９
【特許文献１】特開２００１年２７８８７８号公報
【特許文献２】特開２００４年３１３８１６号公報
【特許文献３】特開２００１年３７４６５号公報
【特許文献４】特開２００１年２３２３４６号公報
【特許文献５】特開２００２年２５３２０８号公報
【特許文献６】特開２００２年２５３２１４号公報
【特許文献７】特開２００３年２０４７８２号公報
【特許文献８】特開２００４年４２０２３号公報
【特許文献９】特開２００３年１５３６８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００１３】  かかる強い要請に応えるべく鋭意研究した結果、本発明者らは、毒性が強いダイオキシン類を分解することができるスフィンゴモナス属に属するダイオキシン分解菌株が有するダイオキシン分解酵素遺伝子群を解析して、そのダイオキシン分解酵素遺伝子群が新規であることを見出して、この発明を完成するに至った。【００１４】  したがって、この発明は、新規ダイオキシン分解酵素遺伝子群を提供することを目的とする。
この発明は、新規ダイオキシン分解酵素遺伝子群を有するスフィンゴモナス属に属するダイオキシン分解菌を提供することを目的とする。
更に、この発明は、かかるダイオキシン分解能を有するスフィンゴモナス属に属する菌を用いてダイオキシン類を分解することができるダイオキシン分解方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  上記目的を達成するために、この発明は、配列表の配列番号２に記載する塩基配列または該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する新規なダイオキシン分解酵素遺伝子群を提供する。【００１６】  この発明において、用語「実質的に同一の塩基配列」とは、配列番号２に示す塩基配列が各種修飾、例えば塩基の追加、挿入、欠失などを有することによりその塩基配列は完全には一致していないが、そのダイオキシン分解能は同様である塩基配列を意味している。【００１７】  また、この発明は、上記の新規ダイオキシン分解酵素遺伝子群を有するスフィンゴモナス属に属する菌を提供する。【００１８】  さらに、この発明は、かかるスフィンゴモナス属に属する菌を使用してダイオキシン類を分解して無毒化することからなるダイオキシン分解方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】  この発明に係るダイオキシン分解菌は、日本各地の汚染土壌４箇所（千葉、埼玉、大阪、福岡）の土壌試料から単離した。これらの菌株は、通常の微生物スクリーニング法に従って単離することができる。つまり、土壌試料を、塩素化ジベンゾフラン類（ＤＦ）や塩素化ジベンゾジオキシン類（ＤＤ）などを唯一の炭素源として含有する培地に添加して、その培地を適切な培養条件で培養して形成したコロニーから菌種を単離することができる。これらの分離されたダイオキシン分解菌のうち、最も強い能力を持つ菌株をＮＢ−１と命名した（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−２５１）。【００２０】  上記単離方法によって単離された菌株の特定は、文献記載の方法によって行うことができる。つまり、ＰＣＲ直接シーケンシング法によって１６ＳｒＤＮＡのヌクレオチド配列のフラグメントを決定することによって行うことができる。そのフラグメントのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシーケンサーで解析し、ＢＬＡＳＴサーチを用いてＥＭＢＬデーターベース中の配列と比較して決定することができる。【００２１】  この解析結果から、単離した菌株は、スフィンゴモナス属に属する菌株であると特定した。【００２２】  上記菌株Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は下記の通りである（配列番号１）。【００２３】
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【００２４】  この１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株とは、そのアライメント・スコアが９１％と低く、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｒｏｓａ（ＩＦＯ１５２０８）と最も相同性が高いことが判明した。このことから、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．は、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株とは、遺伝的には離れた菌種であることが明らかになった。【００２５】  この発明において、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．をエリスロマイシン含有培地などの薬剤添加培地で培養して単雕されたエリスロマイシン耐性菌株であり、栄養素要求性は完全であり（Ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）、特別な添加物は必要でない。【００２６】  次に、上記菌株のダイオキシン分解酵素遺伝子群は、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のダイオキシン分解酵素遺伝子群の塩基配列を参考にしてＰＣＲ用プライマーを設計し、そのＰＣＲ産物をクローニングし、シーケンサーを用いて解析することができる。【００２７】  この発明に使用することができるプライマーとしては、例えば次のようなプライマーを使用することができる。
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ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ（６３７ｂｐ）をＤＩＧでラベルし、サザンハイブリダイゼーションで陽性反応を示した約３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（約３．５ｋｂｐ）は、ベクター配列のＭ１３フォワードプライマーとＭ１３リパースプライマーを用いてシークエンスを決定した。
他のＰＣＲは、以下のプライマーを用いて行い、シークエンスはプライマーウォ−キングで決定。
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【００２８】  上記のように解析された上記菌株のダイオキシン分解酵素遺伝子群（ダイオキシンジオキシゲナーゼ）の塩基配列の結果から、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．のダイオキシン分解酵素遺伝子群は、図１で示す構成からなっていることが見出された。つまり、上記菌株のダイオキシン分解酵素遺伝子群は、５’側からＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）Ｃ３、２、１およびＯＲＦ１、２、３、４、５、６、挿入配列、７、８、９、１０、１１から構成されている。これらのダイオキシン分解酵素遺伝子群の機能検索結果は表１の通りである。またスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のダイオキシン分解酵素遺伝子群の機能を簡略化した比較を図１に示す。【００２９】
【表１】
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【００３０】  上記解析結果から、この発明に係るスフィンゴモナス属菌株のダイオキシン分解酵素遺伝子群は、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のダイオキシンジオキシゲナーゼ遺伝子クラスター（ｄｘｎＡ１，Ａ２，ｄｂｆＢ１、ｄｘｎＢ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）と高い相同性を示していることを見出した。しかし、サリチル酸代謝に関わるｄｘｎＤ遺伝子部位及び、ダイオキシン認識に関わると考えられるｄｘｎＣ遺伝子部位に差異がみられた。この遺伝子構造の相違が、この発明のスフィンゴモナス属菌株とスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株におけるＤＦを基質としたときの生育及び、中間代謝産物の差異に関与していると考えられた。また、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のダイオキシンジオキシゲナーゼの活性発現に必須の遺伝子（ｆｄｘ１及びｒｅｄＡ２）と相同性の高い遺伝子を本発明のスフィンゴモナス属菌株も有していることが明らかになった。ダイオキシン分解酵素遺伝子群とｆｄｘ１及びｒｅｄＡ２遺伝子を含む１００ｋｂｐ以上の遺伝子の水平伝播が種を越えて起こっていることが推察できる。【００３１】  更に詳細には、この発明に係るスフィンゴモナス属菌株のダイオキシンジオキシゲナーゼの構造のうち、ＯＲＦＣ３、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ５、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、及びＯＲＦ１１はそれぞれスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株で報告されているｄｂｆＢ、ｄｘｎＡ１、ｄｘｎＡ２、ｄｘｎＢ、ｆｄｘ３、ｄｘｎＥ、ｄｘｎＦ、ｄｘｎＧ、及びｄｘｎＨとアミノ酸レベルで９８％以上の高い相同性を示した。また、ｄｂｆＢとｄｘｎＡ１に類似するＯＲＦの間には、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓのｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒとＪａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｊ３のｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅと相同性があるＯＲＦ（Ｃ２、Ｃ１）の存在が明らかになった。スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のダイオキシン分解酵素遺伝子群の同じ位置にもこれらのＯＲＦは存在した（図１）。しかし、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株ではＯＲＦＣ１に相当する遺伝子が３つ並んで存在しており、ＰＣＲ産物のサイズの差異となっていることが明らかになった。【００３２】  本発明のスフィンゴモナス属菌株のＯＲＦ４に相当する部位は、塩基配列はスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株と非常に高い相同性があるが、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株では、複数のＯＲＦに別れていた。このＯＲＦ４は８０８アミノ酸残基からなり、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｉｒａｋｅｎｓｅのｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓａｌｉｃｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとアミノ酸レベルで３０％の相同性があった。またサリシン（ｓａｌｉｃｉｎ）は、ベンゼン環と糖がエーテル結合した化合物で、ダイオキシン類やその代謝産物に類似していることから、このレセプター様のタンパクが本発明のスフィンゴモナス属菌株のダイオキシン類の認識に関わっている可能性が示唆された。【００３３】  本発明のスフィンゴモナス属菌株のＯＲＦ６及びＯＲＦ７は、それぞれスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株でサリチル酸分解に関わると報告されている４−Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ｄｘｎＤ）のＮ末端から２４９番目のアミノ酸残基までと、２７８からＣ末端までと非常に高い相同性が認められた。つまり、本発明のスフィンゴモナス属菌株では、このｄｘｎＤに相当する部位に約１ｋｂｐの挿入が有り、４−Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ遺伝子が分断されていることが明らかになった。本発明のスフィンゴモナス属菌株はスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株と異なり、サリチル酸を分解出来ないことより、ｄｘｎＤが分断され、４−Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅが発現されていないことに起因すると考えられる。【００３４】  スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のダイオキシンジオキシゲナーゼは、電子運搬体ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ（ｆｄｘ１）と電子供与体ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｒｅｄＡ２）が存在しないと機能出来ないこと、また、これらの遺伝子がダイオキシン分解酵素遺伝子群とはそれぞれ少なくとも４０ｋｂｐ以上はなれた染色体遺伝子上に存在することが報告されている。これらの遺伝子についてもＰＣＲで増幅を試みた。その結果、本発明のスフィンゴモナス属菌株もスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株と同様に増幅産物が得られ、その塩基配列は、スフィンゴモナス属菌ＲＷ１株のものと１００％の相同性を示した（図１）。これらの結果とスフィンゴモナス属菌ＲＷ１株と本発明のスフィンゴモナス属菌株が遺伝学的に離れた菌種であることや、ダイオキシン分解酵素遺伝子群中のｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ様の遺伝子の存在等から、ダイオキシン分解酵素遺伝子群とｆｄｘ１及びｒｅｄＡ２を含む１００ｋｂｐ以上の遺伝子の水平伝播が種を越えて起こっていることが推察できる。【００３５】  本発明のスフィンゴモナス属菌株のダイオキシン分解能は、被験物質であるダイオキシン類を添加した培地に菌株を培養して、ダイオキシン類の分解率を測定することによって行うことができる。
【実施例１】
【００３６】  スフィンゴモナス属菌株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）は次のようにして得られた。
自然界でたくましく生きている土壌細菌は、全ての栄養素を外部より吸収し、自己の代謝系で全ての必要物質を作り出す能力を具えている。そこで、栄養源として必要な物質を精製した化学薬品で調合した培地を「最小培地」と称して、この分野の研究ではよく使用されるが、その際も、炭素源としてグルコース等を少量加えて、始めて菌の増殖が起きる。しかし、グルコースの代わりにダイオキシンが利用できれば、その特殊な菌は、ダイオキシンのベンゼン環を分解して、炭素源として利用していることとなる。このような方法は、微生物遺伝学や分子生物学では菌のスクリーニング方法としてよく使用される手法であり、その道の専門家であれば精通している方法である。各地より採取した土壌中の細菌を上記方法でで培養したところ、ほとんどの試験管では増殖しないが、非常に希に（１００本中１〜２本）菌の増殖が観察された。過去５ヵ年でのスクリーニングの結果、約５Ｋｇの土壌より強弱の差はあるものの、２０株の分解菌株が分離できたので、その出現頻度は１０７〜１０８に一匹程度と推定された。
【実施例２】
【００３７】  実施例１のスフィンゴモナス属菌株を、標準寒天培地に３０度で２日間培養後、無機塩類溶液に１ｍｌ当たり１０９個の菌数になるように懸濁液を作製し、エリスロマイシン５０μｇ／ｍｌとなるように添加した標準寒天培地に５０μｌを塗布した。３日培養後、出現したコロニーを得た。この菌がエリスロマイシン５０μｇ／ｍｌに耐性を有し、かつＤＦ分解能を有していることを確認した。従って、本菌は栄養学的には野生型（プロトトロフィック）であり、薬剤耐性としては、エリスロマイシン耐性菌と称することができる。
【実施例３】
【００３８】  本発明のスフィンゴモナス属菌株のダイオキシン分解能は次のようにして測定した。
（前培養）
実施例１のスフィンゴモナス属菌株をＬＢ培地に３０度で１晩培養後、吸光度１．９０の菌液１０ｍｌを遠心分離し、得られた菌体をＷ培地５．０ｍｌに懸濁し、ＤＦ５ｍｇ（最終濃度０．１％）を添加して３０度で１晩培養した。
（培養）
前培養で得られた菌液を遠心分離して得られた菌体をＷ培地１．０ｍｌに懸濁し、５０ｍｌ遠沈管に入れた。これに５０μｇ／ｍｌ濃度の２，３−ジクロロジベンゾーｐージオキシン１２５μｌを添加して、遠沈管の口にアルミホイルを被せ、それに孔を開けて、３０度で３日間培養した。
（抽出）
培養後、遠沈管にトルエン２．０ｍｌを添加し、更に０．２５ｍｇ／ｍｌ濃度のジクロロアントラセン・トルエン溶液２５μｌを添加し攪拌した。その後、超音波で１５分間処理し、２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を採り、硫酸ナトリウムを添加して脱水した。
（ＧＣ／ＭＳ測定）
上記のように処理して得られたサンプルをＧＣ／ＭＳで測定して、ダイオキシン類の分解率を算出した。その結果を表２に示す。【００３９】
【表２】
2015211664.tif 000008
【実施例４】
【００４０】  前記実施例と同様にして、焼却灰を処理してダイオキシン類の分解率を測定した結果を図２に示す。
【実施例５】
【００４１】  前記実施例と同様にして、底質土を処理してダイオキシン類の分解率を測定した結果を図３に示す。【００４２】（参考例）
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＮＢ−１株とＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＲＷ−１株（ドイツ株）をダイオキシン類汚染土壌（河川底質土）中で培養した後の増殖程度を調べた。なお、ＮＢ−１株とドイツ株とはそれぞれ前培養菌液をパスツールで１滴添加し、培地は土壌２ｇに１０％ＬＢ加ＣＦＭＭ培地３．０ｍｌを添加した。増殖程度は、培養３日〜１０日後に調べた。その結果を下表３ならびに図４に示す。【００４３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００４４】  この発明は、強い毒性を有するダイオキシン類によって汚染されている土壌や河川などの環境を、ダイオキシン類を抽出するなどの前処理を行うことなく浄化することができ極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＲＷ−１株及びＮＢ−１株が有するダイオキシン分解遺伝子群の比較を示す模式図。
【図２】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＮＢ−１株による焼却灰中の各異性体の分解率を示す図。
【図３】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＮＢ−１株による底質土中の各異性体の分解率を示す図であって、黒はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＮＢ−１株を、白はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＲＷ−１株による分解率を示している。
【図４】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＮＢ−１株とＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＲＷ−１株（ドイツ株）のダイオキシン類汚染土壌中での増殖の比較を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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