(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）を生成しモナチンを合成する方法の提供。【解決手段】Ｉ３Ｐから少なくともＲモナチン前駆体（Ｒ−ＭＰ）を含むモナチン前駆体（ＭＰ）をＬ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、又はＬ−アミノ酸オキシダーゼ及びその組合せから選ばれ酵素群により生成し、次いでＭＰからモナチンをＤ−アミノトランスフェラーゼ又はＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びその組合せから選ばれる１つ又は複数の第３の酵素によって生成する方法。モナチン及びＲ，Ｒモナチン、Ｓ，Ｒモナチン、その塩のごときモナチンのある種の立体異性体をポリペプチド及び生合成経路を用いて生成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸（「Ｉ３Ｐ」）を生成し、
Ｉ３Ｐから少なくともＲモナチン前駆体（「Ｒ−ＭＰ」）を含むモナチン前駆体（「ＭＰ」）を生成し、
次いでＭＰからモナチンを生成すること
を含む経路を介してモナチンまたはその塩を生成することを含むことを特徴とする方法であって、
モナチンは、少なくともＲ，Ｒモナチンを含み、
Ｌ−トリプトファンからのＩ３Ｐの生成は、モナチン前駆体、モナチン、またはその双方よりもＬ−トリプトファンに対するより高い活性、より高い特異性、またはその双方を有する１つまたは複数の第１の酵素によって促進され、該１つまたは複数の第１の酵素は、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＬ−アミノ酸オキシダーゼならびにその組合せから選ばれ、
該Ｒ−ＭＰからの該Ｒ，Ｒモナチンの生成は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはその組合せから選ばれる１つまたは複数の第３の酵素によって促進される該方法。
【請求項２】
該１つまたは複数の第１の酵素が、シノリゾビウム・メリロティＴａｔＡ、ＨＥＸＡｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ、およびその組合せから選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つまたは複数の第１の酵素が、モナチン前駆体、モナチン、またはその双方に対して制限された活性、制限された特異性、またはその双方を有し、該１つまたは複数の第２の酵素が、Ｓ−アルファ−ケト酸モナチンに対して制限された活性、制限された特異性、またはその双方を有していてもよいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０１、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０２、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０３、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０５、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０６、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０７、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０８、およびその組合せから選ばれ、
該Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼのうちの１つまたは複数から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼの活性を有する酵素、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素、
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、または
ｄ）ａ〜ｃの組合せ
であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼが、受入番号ＮＰ−２４３６７７に挙げられるアミノ酸配列を含み；
該バチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼが、イー・コリＦ３７Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＹ９６Ｆに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＹ１６５Ｌに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１２７Ｋに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＲ９８Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１０８Ｒに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１１０Ｈに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１２７Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、およびイー・コリＲ４１Ｋに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼから選ばれ；
該ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼが、配列番号９９であり；
ＡＴＣＣ７０６３からの該Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、配列番号８７であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生成された該Ｒ，Ｒモナチンが、生成された全モナチンの少なくとも約６０重量％であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ−ＭＰが、化学的アルドール縮合反応においてＩ３Ｐから生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｉ３ＰからのＲ−ＭＰの生成が、Ｒ−ＭＰをＳ−モナチン前駆体（「Ｓ−ＭＰ」）に対して約１：１よりも大きな比で生成する１つまたは複数の第２の酵素によって促進されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該１つまたは複数の第２の酵素が、ａ）シノリゾビウム・メリロティＨＭＧアルドラーゼからのアルドラーゼ、ｂ）ａ）の相同体、ｃ）ａ）に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素、ｄ）配列番号２２または配列番号１０４に示される配列を有するアルドラーゼ、およびｅ）その組合せから選ばれる、Ｒ特異的アルドラーゼ活性を有する酵素であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該１つまたは複数の第３の酵素が、Ｓ−アルファ−ケト酸モナチンまたはインドール−３−ピルビン酸についてよりもＲ−モナチン前駆体に対するより高い活性、より高い特異性、またはその双方を有し、該１つまたは複数の第２の酵素が、Ｓ−アルファ−ケト酸モナチンまたはインドール−３−ピルビン酸に対する制限された活性、制限された特異性、またはその双方を有していてもよいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼから選ばれる１つまたは複数の第１の酵素を用いてＭＰ組成物からＲ，Ｒモナチンを生成することを含み、少なくともＲ−ＭＰを含む該ＭＰ組成物および該１つまたは複数の酵素が、Ｓ−ＭＰよりもＲ−ＭＰからモナチンへの変換を選択的に促進することを特徴とする方法。
【請求項１２】
１つまたは複数の酵素が、バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼおよびバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッド、ならびにその組合せから選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸（「Ｉ３Ｐ」）を生成し、
Ｉ３ＰからＭＰ組成物を生成すること
をさらに含み、
ＬトリプトファンからのＩ３Ｐの生成が、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、およびその組合せから選ばれる１つまたは複数の第２の酵素によって促進され、
Ｉ３ＰからのＭＰ組成物の生成が、１つまたは複数の非立体特異性アルドラーゼによって促進されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
モナチンを生成するための経路におけるある反応の生成物を、モナチンを生成するための経路における他の反応の反応物として再生するための方法であって、
Ｌ−トリプトファンが反応してＩ３Ｐを生成する場合に、アルファ−ケト基質からＬ−アミノ酸を生成し、
アミノ酸ラセマーゼを用いてＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換し、
Ｉ３ＰからＭＰを生成し、
ＭＰを反応させてモナチンを形成し、次いで
ＭＰが反応してモナチンを形成する場合に、Ｄ−アミノ酸からアルファ−ケト基質を再生成することを含み、
アルファ−ケト基質は、アルファ−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸、およびその組合せから選ばれ、
アミノ酸ラセマーゼは、アルファ−ケト基質がピルビン酸である場合、アラニンラセマーゼであり、アルファ−ケト基質がアルファ−ケトグルタル酸である場合、グルタミン酸ラセマーゼであり、アルファ−ケト基質がオキサロ酢酸である場合、アスパラギン酸ラセマーゼであることを特徴とする該方法。
【請求項１５】
該アラニンラセマーゼが、バチルス・ステアロサーモフィルスからのアラニンラセマーゼおよびゲオバチルス・ステアロテルモフィルスからのアラニンラセマーゼの熱安定性相同体から選ばれ、該グルタミン酸ラセマーゼが、Ｌ．ブレビスグルタミン酸ラセマーゼおよびＰ．ペントサセウスグルタミン酸ラセマーゼから選ばれ、該アスパラギン酸ラセマーゼはＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社のＡＳＰＲ−１０１であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｉ３ＰからのＭＰの生成が、Ｒ−ＭＰをＳ−ＭＰに対して約１：１よりも大きな比で優先的に生成する１つまたは複数のアルドラーゼ酵素によって促進されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたは複数のアルドラーゼ酵素が、Ｒ特異的アルドラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｌ−アミノ酸および立体反転アミノトランスフェラーゼの存在下でＲ−ＭＰを反応させてＲ，Ｒモナチンを生成することを含み、Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、およびＬ−グルタミン酸から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１９】
トリプトファンからＩ３Ｐを生成し、Ｉ３ＰからＲ−ＭＰを含むＭＰを生成することをさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アミノトランスフェラーゼ酵素がトリプトファンからＩ３Ｐを生成することを促進し、アルドラーゼ酵素がＩ３ＰからＲ−ＭＰを生成することを促進することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アルドラーゼ酵素が、Ｒ−ＭＰをＳ−ＭＰに対して１：１よりも大きな比で優先的に生成することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
アルドラーゼ酵素がＲ特異的アルドラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
平衡反応に対してモナチンの収量を増加させるための方法であって、
アルファ−ケト基質およびＬ−アミノトランスフェラーゼ酵素の存在下でトリプトファンを反応させてＩ３Ｐを生成し、アルファ−ケト基質が反応してＬ−アミノ酸を形成し、
Ｉ３Ｐを反応させてＭＰを生成し、
ＭＰを反応させてモナチンを生成し、次いで
不可逆的反応でＬ−アミノ酸を反応させることによって、平衡経路からＬ−アミノ酸生成物を除去すること
を含むことを特徴とする該方法。
【請求項２４】
アルファ−ケト基質がオキサロ酢酸であり、Ｌ−アミノ酸生成物がＬ−アスパラギン酸であり、不可逆的反応が、アスパラギン酸４−デカルボキシラーゼの存在下でＬ−アスパラギン酸を反応させてＬ−アラニンおよび二酸化炭素を生成するものであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌ−アミノ酸生成物を、Ｒ−ＭＰ反応のためのＤ−アミノ酸基質に変換することをさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｌ−アミノ酸生成物がＬ−アラニンであり、Ｌ−アラニンが、アラニンラセマーゼ活性を有する酵素を用いてＤ−アラニンに変換されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アルファ−ケト基質が、オキサロ酢酸およびアルファ−ケトグルタル酸ならびにその組合せから選ばれ、
アルファ−ケト基質がオキサロ酢酸である場合、Ｌ−アミノ酸生成物はＬ−アスパラギン酸であり、不可逆的反応が、アスパラギン酸デカルボキシラーゼの存在下でＬ−アスパラギン酸を反応させてベータアラニンおよび二酸化炭素を生成するものであり、
アルファ−ケト基質がアルファ−ケトグルタル酸である場合、Ｌ−アミノ酸生成物はＬ−グルタミン酸であり、不可逆的反応が、グルタミン酸デカルボキシラーゼの存在下でＬ−グルタミン酸を反応させて４−アミノブタン酸および二酸化炭素を生成するものであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
経路におけるある工程で生成されたＬ−アミノ酸生成物を経路における他の工程で有用なＤ−アミノ酸基質に変換することを含む経路でモナチンを生成することを含み、経路は、
Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いてＬ−トリプトファンからＩ３Ｐを生成し、
アルファ−ケトグルタル酸の反応によってＬ−アミノ酸生成物としてＬ−グルタミン酸を生成し、該アルファ−ケトグルタル酸反応はＬ−トリプトファン反応と共役し、
Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼを用いて、Ｌ−グルタミン酸とピルビン酸を反応させることによってＬ−アラニンを生成し、
Ｉ３ＰからＲ−ＭＰを生成し、
アラニンラセマーゼを用いてＬ−アラニンからＤ−アミノ酸基質としてＤ−アラニンを生成し、
ＭＰと共に基質としてＤ−アラニンを用いて、モナチンおよびピルビン酸を形成することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
アルドラーゼ酵素がＩ３ＰからＲ−ＭＰを生成することを促進することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アルドラーゼ酵素がＲ特異的アルドラーゼ酵素であり、Ｒ，Ｒモナチンが生成されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アルドラーゼ酵素がＲ−ＭＰをＳ−ＭＰに対して約１：１よりも大きな比で生成し、Ｒ，Ｒモナチンが生成されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｌ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成し、
Ｄ−トリプトファンからＩ３Ｐを生成し、
Ｉ３ＰからＲ−ＭＰを生成し、次いで
Ｒ−ＭＰからモナチンを生成することを含む経路を介してＲ，Ｒモナチンまたはその塩を生成することを含むことを特徴とする方法であって、
Ｌ−トリプトファンからのＤ−トリプトファンの生成は、トリプトファンラセマーゼ、トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、およびその組合せから選ばれる１つまたは複数の酵素によって促進され、
トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼは、配列番号４１に対応し、Ｙ３５４Ｃ突然変異、Ｙ３５４Ｔ突然変異、Ｙ３５４Ｇ突然変異、Ｙ３５４Ｌ突然変異、Ｙ３５４Ｎ突然変異、Ｙ３５４Ｓ突然変異、Ｙ３５４Ｉ突然変異、Ｙ３５４Ｍ突然変異、Ｙ３５４Ｐ突然変異、ならびにＹ３５４Ａ、Ｍ３５Ｖ、およびＲ１９５Ｈの突然変異の組合せから選ばれる突然変異を有するアラニンラセマーゼ、配列番号４３のアラニンラセマーゼ、配列番号４１に対応し、Ｍ３５Ｃ突然変異、Ｆ６６Ｅ突然変異、Ｙ３５４Ａ突然変異、およびＰ１９７Ｌ突然変異ならびにその組合せから選ばれる突然変異を有するアラニンラセマーゼから選ばれ、
広域特異性アミノ酸ラセマーゼは、
ａ）配列番号１２０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｙ３９６Ｃ突然変異を有する、配列番号１２０に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２８の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号１２８に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス・プチダ（シュードモナス・ストリアタとしても知られている）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６の配列を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＫＴ２４４０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オレオボランスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダ１２６３３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＳＣＲＣ７４４から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５を含む遺伝子によってコードさ���た広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、およびその活性断片、
ｂ）ａ）の広域特異性アミノ酸ラセマーゼのいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列およびその活性断片を含む酵素、
ｃ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１９によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２７によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＣＰ  ００００２０．１  ＧＩ：５９４７８７０８の領域８００８４２．．８０２０５３によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＣ＿００６８４０によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＫＴ２４４０  Ｂａｒ  ＤＮＡによってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＹ３９６Ｃ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１１９に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１２７に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５４を含む配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＺ＿ＡＡＬＭ０１０００００２ヌクレオチド５３１７３．．５４４０２によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＬ３８３Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１９３に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ならびに
ｄ）ｃ）の広域特異性アミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素
から選ばれ、
Ｒ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成は、広域特異性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼによって促進される該方法。
【請求項３３】
Ｄ−トリプトファンからのインドール−３−ピルビン酸の生成が１つまたは複数の酵素によって促進され、Ｒ−モナチン前駆体からのＲ，Ｒモナチンの生成がＤ−トリプトファンからのインドール−３−ピルビン酸の生成を促進する酵素と同じ１つまたは複数の酵素によって促進されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成が、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼのうちの１つまたは複数から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼの活性を有する酵素、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素、
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、または
ｄ）ａ〜ｃの組合せ
から選ばれる広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼによって促進されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
Ｉ３ＰからのＲ−ＭＰの生成が、Ｒ−ＭＰをＳ−ＭＰに対して１：１よりも大きな比で優先的に生成するアルドラーゼ酵素によって促進されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
アルドラーゼ酵素がＲ特異的アルドラーゼ酵素であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を有する配列を含む酵素、
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、およびバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼから選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼ、ならびに
ｄ）ａ）〜ｃ）の組合せ
から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＤ−トリプトファンをアミノ基転移することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
モナチンを生成することをさらに含み、少なくとも１つの精製工程をさらに含み、該Ｒ，Ｒモナチンが、全有機化合物の少なくとも約６０重量％の純度の程度まで精製されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
生成されたモナチンの少なくとも約７５重量％が、Ｒ，Ｒモナチンであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
生成されたモナチンの少なくとも約８０重量％が、Ｒ，Ｒモナチンであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）配列番号８６のＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）配列番号８６に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素、
ｃ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの二重突然変異、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの二重突然変異、またはその組合せから選ばれる１つまたは複数の突然変異を含む配列番号８６のＤ−アミノトランスフェラーゼ
ｄ）ｃ）のＤ−アミノトランスフェラーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含み、１つまたは複数の突然変異を有するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｅ）配列番号８７のＤ−アミノトランスフェラーゼ、ならびに
ｆ）配列番号８７に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含むＤ−アミノトランスフェラーゼ
から選ばれる単離Ｄ−アミノトランスフェラーゼ。
【請求項４２】
ａ）配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１９２、ならびにその活性断片および相同体、配列番号１７９ならびにその活性断片および相同体、配列番号１７７ならびにその活性断片および相同体、ならびに配列番号１９４ならびにその活性断片および相同体を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ならびに
ｂ）配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１９２およびその活性断片、配列番号１７９およびその活性断片、配列番号１７７およびその活性断片、ならびに配列番号１９４およびその活性断片に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ酵素
から選ばれる単離広域特異性アミノ酸ラセマーゼ。
【請求項４３】
配列番号９９を含むハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼおよびその相同体ならびに配列番号９９に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含むハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素から選ばれる単離ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ。
【請求項４４】
イー・コリＦ３７Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＹ９６Ｆに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＹ１６５Ｌに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１２７Ｋに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＲ９８Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１０８Ｒに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１１０Ｈに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１２７Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＲ４１Ｋに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼから選ばれた、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有する単離されたバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ。
【請求項４５】
配列番号４３を含むラセマーゼならびに配列番号４３に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含み、Ｍ３５Ｃ、Ｆ６６Ｅ、およびＹ３５４Ａの突然変異を有するラセマーゼ酵素から選ばれる単離ラセマーゼ。
【請求項４６】
配列番号１５４を含む核酸、配列番号１５４に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１５０を含む核酸、配列番号１５０に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１９１を含む核酸、配列番号１９１に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１９５を含む核酸、配列番号１９５に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１９６を含む核酸、配列番号１９６に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１７８を含む核酸、配列番号１７８に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１７６を含む核酸、配列番号１７６に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸、配列番号１９３を含む核酸、および配列番号１９３に対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを含む核酸から選ばれる単離核酸。
【請求項４７】
ＬトリプトファンおよびＤトリプトファン、Ｄ−アミノトランスフェラーゼの活性を有する１つまたは複数の酵素、トリプトファンラセマーゼ、トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有するラセマーゼから選ばれる１つまたは複数の酵素、ならびにＲ特異的アルドラーゼの活性を有する１つまたは複数の酵素のうちの１つまたは複数を含む無細胞組成物。
【請求項４８】
Ｒ−モナチン前駆体、Ｌ−トリプトファン、Ｄ−アミノ酸、およびモナチン前駆体またはモナチンのいずれかよりもＬ−トリプトファンに対するより高い活性、より高い特異性、またはその双方を有する１つまたは複数の酵素を含み、該１つまたは複数の第１の酵素は、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、および立体反転アミノトランスフェラーゼから選ばれ、組成物は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼから選ばれる１つまたは複数の酵素、Ｒ特異的アルドラーゼ活性を有する１つまたは複数の酵素、アラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、およびアスパラギン酸ラセマーゼから選ばれる１つまたは複数の酵素を含んでいていてもよい組成物。
【請求項４９】
Ｒ，Ｒモナチンが、０．０１％〜０．１％（容量／容量）界面活性剤および１％〜１０％（容量／容量）ポリオールから選ばれる１つまたは複数の界面活性剤の存在下で生成されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、ピリドキサール−５’−リン酸の存在下で精製されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
酵素が、固体担体上に固定化されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼの存在下でモナチン前駆体を反応させて、モナチンを生成することを含み、１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼは、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せまたはその組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を含むＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素、ならびに
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、またはその組合せから選ばれる１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼ
から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項５３】
（ａ）ｔｎａＴ遺伝子、（ｂ）改変フェニルアラニンパーミアーゼタンパク質、（ｃ）一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼ、（ｄ）一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分およびフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分を有するキメラタンパク質、（ｅ）Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ、ならびに（ｆ）ｔＲＮＡｔｒｐおよび適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼのうちの１つまたは複数を発現または過剰発現するように、モナチンを生成する微生物を遺伝子操作し、該微生物を用いて該モナチンを生成することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項５４】
最小量のＬアミノ酸のみを含有する培地中で、モナチンを生成する微生物を成長させ、該モナチンを生成することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項５５】
モナチンを生成している微生物からのインドール３ピルビン酸の分泌を阻止または低減することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項５６】
モナチンを生成している微生物によるインドール３ピルビン酸の取り込みを増加させることを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項５７】
インドール３ピルビン酸がモナチンを生成している微生物内で分解されるのを阻止または低減することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項５８】
モナチンを生成するように遺伝子操作された微生物のバイオマスを生成し、次いで該微生物でモナチンオペロンを誘導することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項５９】
モナチンを生成している微生物のための成長培地中でＤトリプトファン以外のＤ−アミノ酸の使用を最小化することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項６０】
Ｄトリプトファンの取り込みの阻害が起こる閾値未満のレベルで、モナチンを生成する微生物のための成長培地中にＤトリプトファンを提供し、該モナチンを生成することを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項６１】
（ａ）ｔｎａＴ遺伝子、（ｂ）改変フェニルアラニンパーミアーゼタンパク質、（ｃ）一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼ、（ｄ）一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分およびフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分を有するキメラタンパク質、（ｅ）Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ、ならびに（ｆ）ｔＲＮＡｔｒｐおよび適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼのうちの１つまたは複数を発現または過剰発現するように遺伝子操作された、モナチンを生成する微生物。
【請求項６２】
モナチン前駆体と、Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、Ｆ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異、またはその組合せを有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼから選ばれる１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼとを反応させることを含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項６３】
モナチン前駆体と、Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、Ｆ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異、またはその組合せを有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼのうちの１つまたは複数から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼとを反応させること
を含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項６４】
該配列同一性パーセントが少なくとも９５％であることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
モナチン前駆体と、バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、またはその組合せから選ばれる１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼとを反応させること
を含むことを特徴とする、モナチンまたはその塩を生成するための方法。
【請求項６６】
ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オレオボランスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、アミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１���６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、その活性断片、およびその組合せから選ばれる１つまたは複数の酵素を利用することを含む、
（ａ）ＬトリプトファンからＤトリプトファンまたは（ｂ）ＤトリプトファンからＬトリプトファンを生成することを含むことを特徴とする方法。
【請求項６７】
ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オレオボランスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、アミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１���６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、その活性断片から選ばれる１つまたは複数の広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む１つまたは複数の酵素を利用することを含む、
（ａ）ＬトリプトファンからＤトリプトファンまたは（ｂ）ＤトリプトファンからＬトリプトファンを生成することを含むことを特徴とする方法。
【請求項６８】
該配列同一性パーセントが少なくとも９５％であることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ピリドキサール−５’−リン酸の存在下でＤ−アミノトランスフェラーゼを精製することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｄ−トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸、Ｒ−２−ヒドロキシ−２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（Ｒ−ＭＰ）、およびＲ，Ｒモナチン、Ｓ，Ｒモナチン、その塩のごときモナチンのある種の立体異性体の生成に有用であるポリペプチドおよび生合成経路を提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年４月２６日に出願された米国特許仮出願第６０／６７４，９３２号の利益を主張する２００６年４月２６日に出願された米国特許出願第１１／４１１，２２９号の一部継続出願である２００６年１０月２０日に出願された米国特許出願第１１／５８４，０１６号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００３】
モナチンは、次の化学式を有する高強度甘味料である。
【０００４】
【化１】
2015211679.tif 000002
【０００５】
モナチンは、４つの潜在的な立体異性体の立体配置に導く２つのキラル中心を含む。Ｒ，Ｒ立体配置（「Ｒ，Ｒ立体異性体」または「Ｒ，Ｒモナチン」）；Ｓ，Ｓ立体配置（「Ｓ，Ｓ立体異性体」または「Ｓ，Ｓモナチン」）；Ｒ，Ｓ立体配置（「Ｒ，Ｓ立体異性体」または「Ｒ，Ｓモナチン」）；およびＳ，Ｒ立体配置（「Ｓ，Ｒ立体異性体」または「Ｓ，Ｒモナチン」）。特記されない限りは、本明細書に用いた用語「モナチン」は、モナチンのすべての４種の立体異性体を含む組成物、モナチン立体異性体のいずれかの組合せを含む組成物（例えば、モナチンのＲ，ＲおよびＳ，Ｓ立体異性体のみを含む組成物）、および単一の異性体形態を指すために用いられる。
【０００６】
本開示において、モナチン炭素主鎖は、上記に示されるように番号を付けられ、アルコール基に直接的に共有結合した炭素は、２位の炭素として識別され、アミノ基に直接的に共有結合した炭素は、４位の炭素として識別される。従って、Ｒ，Ｒモナチン、Ｓ，Ｓモナチン、Ｒ，Ｓモナチン、およびＳ，Ｒモナチンに対する本明細書での言及は、他に示されない限り、それぞれ、２Ｒ，４Ｒモナチン、２Ｓ，４Ｓモナチン、２Ｒ，４Ｓモナチン、および２Ｓ，４Ｒモナチンを意味する。
【０００７】
文献では、モナチン炭素主鎖は、同様に、代替の規則を用いて番号を付けられていることに注目されたい、また、アルコール基に結合された炭素は、４位の炭素であり、アミノ基に結合された炭素は、２位の炭素である。従って、例えば、本開示における２Ｓ，４Ｒモナチンに対する言及は、代替の番号付け規則を用いる文献における２Ｒ，４Ｓモナチンに対する言及と同じであろう。
【０００８】
さらに、種々の命名規則のために、モナチンは、次のものを含めた多数の代替の化学名によって知られている：２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−ペンタン二酸；４−ヒドロキシ−４−（３−インドールメチル）グルタミン酸；および３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）インドール。
【０００９】
モナチンのある種の異性体形態は、南アフリカのトランスバール地方にあるシュレロチトン・イリシホリアス（Ｓｃｈｌｅｒｏｃｈｉｔｏｎ  ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）植物の根皮内に見出すことができる。ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願第１０／４２２３６６号（「’３６６出願」）、第１０／９７９８２１号（「’８２１出願」）、および第１１／１１４９２２号（「’９２２出願）は、とりわけ、モナチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの生成のためのポリペプチド、経路、および微生物を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ｄ−トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸、Ｒ−２−ヒドロキシ−２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（Ｒ−ＭＰ）、およびＲ，Ｒモナチン、Ｓ，Ｒモナチン、その塩のごときモナチンのある種の立体異性体の生成に有用であるポリペプチドおよび生合成経路を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、とりわけ、Ｄ−トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸、Ｒ−２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（Ｒ−アルファケト酸モナチン、Ｒ−モナチン前駆体、Ｒ−ＭＰ、およびモナチンのアルファケト型とも称される）、およびＲ，Ｒモナチン、Ｓ，Ｒモナチン、その塩のごときモナチンのある種の立体異性体の生成に有用であるポリペプチドおよび生合成経路を提供する。方法は、１つまたは複数のポリペプチド、特に、ラセマーゼ（例えば、グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼ、およびアラニンラセマーゼ）、広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、およびＤ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＬ−アラニン−アミノトランスフェラーゼを含む）、アルドラーゼ（例えば、Ｒ特異的アルドラーゼ）、Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）、Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、およびアスパラギン酸−４−デカルボキシラーゼのごとき酵素の使用を、４−Ｒ異性体の形態で豊富なモナチン組成物を生成するために、および／またはＭＰアミノ化のためにアミノ酸供与体として理論量のＤ−アミノ酸基質を使用せずにＲ，Ｒモナチンを生成するために含む。
【００１２】
簡潔にするために、中間体／生成物が、本明細書および特許請求の範囲において形成されるとして同定される（例えば、モナチン、またはモナチン前駆体）場合には、適用可能な場合、用語「および／またはその塩」が含まれると理解されるべきである。換言すれば、例えば、語句「インドール−３−ピルビン酸はＭＰに変換される」は、「インドール−３−ピルビン酸はＭＰおよび／またはその塩に変換される」と解釈されると理解されるべきである。当業者は、実際に、示された反応条件下で中間体／生成物の塩が実際に存在すること、または存在するであろうことも十分に理解すると考えられる。
【００１３】
いくらかの具体例によれば、方法は、モナチン組成物を生成し、組成物のモナチン成分は、モナチンのＲ，ＲおよびＳ，Ｒの形態のみを含む。用語「のみ」は、ある種の異性体のみが形成されることを示すために用いる場合、特記されない限りは、経路は、ラセミ化が起こらなかったならば、同定された異性体のみを生成するであろうということを意味する。結果的に、用語「のみ」は、他の異性体が存在しないことを意味するとみなされるべきではなく、むしろ当業者は、生じる可能性のあるラセミ化により、他の異性体形態が、相対的に少量で存在する可能性があることを理解すると考えられる。いくらかの具体例によれば、方法は、組成物のモナチン成分が、モナチンのＲ，Ｒ形態のみを含むモナチン組成物を生成する（かくして、エクステントラセミ化が起こり、他の異性体形態をもたらされる場合を除くことを意味する）。
【００１４】
本明細書に用いた語句「モナチン組成物」は、モナチンの１つまたは複数の異性体を含む組成物を意味し、その用語はまた、文脈に応じて、ただ、モナチンの単一の異性体形態のみを含む組成物を意味することもできる。
【００１５】
本発明によるいくらかの具体例において、モナチン組成物を生成するためのプロセスが提供され、プロセスは、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、インドール−３−ピルビン酸から２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「ＭＰ」）を生成し、次いでＭＰからモナチンを生成することを含む。インドール−３−ピルビン酸を生成するためのＬ−トリプトファンの反応は、Ｒ−ＭＰ、Ｒ，Ｒモナチン、またはその双方よりも、基質としてのＬ−トリプトファンに対して、より高い特異性、より高い活性、またはその双方を有する酵素によって促進される。ある種の具体例によれば、インドール−３−ピルビン酸の反応は、Ｒ−特異的アルドラーゼ活性を有する酵素によって促進され、結果的にＲ−ＭＰを生成する。ある種の具体例によれば、Ｌ−トリプトファンアミノ基転移反応の副生成物として形成される（またはトリプトファン反応の副生成物であるもう１つのアミノ酸から形成される）アミノ酸の、ある異性体形態から他の異性体形態へのエピマー化を促進できるラセマーゼ酵素が提供される。
【００１６】
本発明によるいくらかの具体例において、モナチン組成物を生成するプロセスが提供され、プロセスは、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、インドール−３−ピルビン酸から２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「ＭＰ」）を生成し、次いでＭＰからモナチンを生成することを含む。インドール−３−ピルビン酸を生成するためのＬ−トリプトファンの反応は、Ｒ−ＭＰ、Ｒ，Ｒモナチン、またはその双方よりも、基質としてのＬ−トリプトファンに対して、より高い特異性、より高い活性、またはその双方を有する酵素によって促進され、モナチンを形成するためのＭＰの反応は、Ｒ−ＭＰに立体選択的である酵素によって促進される。
【００１７】
前項においてのごとき一連の反応が言及される場合、本発明は、各工程が明示的に行われることを必要としないことに注目されるべきであり、工程が暗黙的に行われてもよいということで十分である。換言すれば、例えば、モナチン組成物を生成するためのプロセスは、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、インドール−３−ピルビン酸から２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「ＭＰ」）を生成し、次いでＭＰからモナチンを生成することを含み、各反応は、適切な酵素によって促進され、酵素とＬ−トリプトファンを組み合わせて、列挙された反応が起こり得るように条件を設定することによって行うことができる。かかる場合には、Ｌ−トリプトファンを反応させてインドール−３−ピルビン酸を生成でき、Ｌ−トリプトファン反応から生成されたインドール−３−ピルビン酸を反応させて、ＭＰを形成でき、次いで、インドール−３−ピルビン酸から生成されたＭＰを反応させて、モナチンを形成できる。プロセスはまた、一例として、Ｌ−トリプトファン生成が起こるのに適した条件下で、Ｌ−トリプトファンを生成できる化合物を供し、それらの反応が起こるのに適した条件下で、記載された一連の反応を促進できる酵素とその化合物を組み合わせることによって行うこともできる。他の例として、プロセスは、記載された経路によってモナチンを生成するように遺伝子操作された微生物を供し、発酵プロセスが起こるのに適した条件を提供することによって行うことができる。例えば、大量のＬ−トリプトファン（またはＤ−トリプトファン）を自然に生成する微生物は、モナチンへの経路における反応を促進するために用いる１つまたは複数の酵素を生成するまたは過剰生成するように遺伝子操作できる、また、微生物がそれによってモナチンを生成するのに適した条件を提供できる。
【００１８】
本発明による他の具体例において、モナチンを生成するためのプロセスが提供され、Ｌ−トリプトファンがインドール−３−ピルビン酸に変換される場合、α−ケト酸基質は、Ｌ−アミノ酸を形成し、インドール−３−ピルビン酸がＭＰ（好ましくはＲ−ＭＰのみをまたはＲ−ＭＰを顕著に含むが、Ｒ−ＭＰおよびＳ−ＭＰの双方を含むことができる）を形成するように反応し、Ｒ−ＭＰがＲ，Ｒモナチンに変換される場合、Ｌ−アミノ酸は、α−ケト酸基質を再生する（「再利用する」とも称される）ように反応する。Ｒ，Ｒモナチンを形成するためのＲ−ＭＰの反応は、Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４１）またはＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼに由来する酵素のごとき立体反転アミノトランスフェラーゼによって促進される。
【００１９】
本発明による他の具体例において、モナチン組成物を生成するプロセスが提供され、プロセスは、Ｌ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成し、Ｄ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、インドール−３−ピルビン酸からＲ−ＭＰを生成し、次いでＲ−ＭＰからＲ，Ｒモナチンを生成することを含む。Ｌ−トリプトファンからのＤ−トリプトファンの生成は、トリプトファンラセマーゼおよびその機能的等価物によって促進される。他の具体例において、インドール−３−ピルビン酸を形成するためのＤ−トリプトファンの反応およびモナチンを形成するためのＭＰの反応は、同一の酵素によって促進される。他の具体例において、インドール−３−ピルビン酸の反応は、Ｒ−特異的アルドラーゼ活性を有する酵素によって促進され、結果的にＲ−ＭＰは形成され、インドール−３−ピルビン酸を形成するためのＤ−トリプトファンの反応およびＲ，Ｒモナチンを形成するためのＲ−ＭＰの反応は、同一の酵素によって促進される。
【００２０】
本発明による他の具体例において、（ａ）トリプトファンラセマーゼを利用してＬ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成し（ラセマーゼは、モナチンに対する制限された活性を有するかまたは活性を有していないであろう）、（ｂ）Ｄ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、（ｃ）インドール−３−ピルビン酸からＲ−モナチン前駆体を生成し、次いで（ｄ）Ｒ−モナチン前駆体からＲ，Ｒ−モナチンを生成することを含むまたは本質的にそれらからなるＲ，Ｒ−モナチンまたはその塩の製法が本明細書に開示される。
【００２１】
多数の具体例が開示されるが、本発明の他の具体例は、本明細書から当業者に明らかになってもよい。本明細書の説明から認識されるように、本発明は、本発明の精神および範囲から全く逸脱することなく、種々の態様において変形ができる。従って、図面および詳細な説明は、実質的に例示的なものであり、限定的なものではないとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明による、Ｌ−トリプトファンからＲ，Ｒモナチンを生成するための酵素プロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、Ｒ−ＭＰに対してよりも基質としてのＬ−トリプトファンに対するより高い特異性および／もしくは選択性を有する、Ｌ−トリプトファンの反応におけるＬ−アミノトランスフェラーゼ（例としてＬ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＬ−アラニンアミノトランスフェラーゼを含む）を用いることを含み、ならびに／または、プロセスは、基質としてのＲ，Ｒモナチンに対して制限された活性および／もしくは特異性を持つＬ−アミノ酸オキシダーゼを用いることを含む。図１に図示される特定の具体例において、Ｌ−アミノトランスフェラーゼまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｌ−トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換し、インドール−３−ピルビン酸は、Ｒ特異的アルドラーゼおよびピルビン酸と反応して、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）を生成し、Ｒ−ＭＰは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼまたはＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼによってＲ，Ｒモナチンに変換される。図１に示されるように、反応は、可逆的であるが、本発明の目的のために、反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図２】図２は、本発明による、Ｒ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、Ｒ−ＭＰに立体選択性である、Ｒ−ＭＰをモナチンに変換するための酵素を用いることを含む。図２に図示される特定の具体例において、トリプトファンは、可逆的反応でインドール−３−ピルビン酸に変換されることが示される。インドール−３−ピルビン酸は、非立体特異性アルドラーゼと反応して、可逆的にアルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰおよびＳ−ＭＰの双方）を形成することができる。Ｒ−ＭＰは、立体選択性Ｄ−アミノトランスフェラーゼまたは立体選択性Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼによって可逆的にＲ，Ｒモナチンに変換される。立体選択性Ｄ−アミノトランスフェラーゼまたはＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼが利用される場合、非立体特異性アルドラーゼによって形成されるあらゆるＳ−ＭＰは、インドール−３−ピルビン酸に変換し戻され得る。本発明の目的のために、可逆的であるとして示された反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図３】図３は、本発明による、Ｌ−トリプトファンからＲ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、Ｒ，Ｒモナチンを形成する反応に対して共役する反応における基質としてのインドール−３−ピルビン酸を形成する反応に対して共役する反応において、トリプトファンラセマーゼを用いてＬ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換することおよびＤ−アミノ酸生成物を用いることを含む。図３に図示される特定の具体例において、Ｌ−トリプトファンは、可逆的反応でトリプトファンラセマーゼによってＤ−トリプトファンに変換される。Ｄ−トリプトファンは、アルファ−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）および広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼと反応して、インドール−３−ピルビン酸およびＤ−グルタミン酸を生成する。インドール−３−ピルビン酸は、ピルビン酸およびＲ特異的アルドラーゼと反応し、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）に変換され、Ｒ−ＭＰは、広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−グルタミン酸と反応して、Ｒ，Ｒモナチンおよびアルファ−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）を形成する。図３に示されるように、反応のそれぞれは、可逆的であるが、本発明の目的のために、反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図４】図４は、本発明による、Ｌ−トリプトファンからＲ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、Ｌ−トリプトファン反応と共役する反応において形成されたＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することを含み、このＤ−アミノ酸は、Ｒ−ＭＰがＲ，Ｒモナチンに変換される反応のためのアミノ供与体として作用する。図４に図示される特定の具体例において、Ｌ−トリプトファンは、Ｌ−アミノトランスフェラーゼおよびアルファ−ケトグルタル酸と反応して、インドール−３−ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸を生成する。インドール−３−ピルビン酸は、ピルビン酸およびＲ特異的アルドラーゼと反応し、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）に変換され、Ｒ−ＭＰは、広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−グルタミン酸と反応して、Ｒ，Ｒモナチンおよびアルファ−ケトグルタル酸を形成する。図４に示されるように、反応は、可逆的であるが、本発明の目的のために、反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図５】図５は、本発明による、Ｌ−トリプトファンからＲ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、Ｌ−トリプトファン反応に対して共役する反応によって形成されたＬ−アミノ酸が、Ｒ−ＭＰのＲ，Ｒモナチンへの反応に対して共役する反応のための基質として用いることができるように、立体反転酵素を用いて、Ｒ，ＲモナチンへのＲ−ＭＰの変換を酵素的に促進することを含んでいる。図５に図示される特定の具体例において、Ｌ−トリプトファンは、Ｌ−アミノトランスフェラーゼおよびオキサロ酢酸、ピルビン酸、またはアルファ−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）と反応して、インドール−３−ピルビン酸およびＬ−アスパラギン酸（オキサロ酢酸が用いられる場合）、Ｌ−アラニン（ピルビン酸が用いられる場合）、またはＬ−グルタミン酸（α−ＫＧが用いられる場合）を生成する。インドール−３−ピルビン酸は、ピルビン酸およびＲ特異的アルドラーゼと反応し、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）に変換され、Ｒ−ＭＰは、立体反転アミノトランスフェラーゼおよびＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、またはＬ−グルタミン酸と反応して、Ｒ，Ｒモナチンおよびオキサロ酢酸（Ｌ−アスパラギン酸が用いられる場合）、ピルビン酸（Ｌ−アラニンが用いられる場合）、またはアルファ−ケトグルタル酸（α−ＫＧ、Ｌ−グルタミン酸が用いられる場合）を形成する。図５に示されるように、反応は、可逆的であるが、本発明の目的のために、反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図６】図６は、本発明による、Ｒ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、一連の変換反応を通して、インドール−３−ピルビン酸を形成する反応において生成されたＬ−アミノ酸を、Ｒ，Ｒモナチンを形成する反応においてＲ−ＭＰとの反応物として用いられるＤ−アミノ酸に再利用することを含む。図６に図示される特定の具体例において、Ｌ−トリプトファンは、Ｌ−アミノトランスフェラーゼおよびオキサロ酢酸と可逆的に反応して、インドール−３−ピルビン酸およびＬ−アスパラギン酸を生成する。インドール−３−ピルビン酸は、ピルビン酸およびＲ特異的アルドラーゼと可逆的に反応し、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）に変換され、Ｒ−ＭＰは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アラニンと可逆的に反応して、Ｒ，Ｒモナチンおよびピルビン酸を形成する。Ｌ−アスパラギン酸は、アスパラギン酸４−デカルボキシラーゼを用いてＬ−アラニンおよびＣＯ２に変換される。Ｌ−アラニンは、アラニンラセマーゼを用いてＤ−アラニンに変換される。本発明の目的のために、可逆的であるとして示された反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図７】図７は、本発明による、Ｒ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、その反応のＬ−アミノ酸副生成物を他の生成物に変換することによって、Ｌ−トリプトファン反応を前に押し進めることを含む（すなわち、インドール−３−ピルビン酸の生成に向けて反応を駆動する）。この例では、Ｌ−アミノ酸Ｌ−アスパラギン酸副生成物は、デカルボキシラーゼを用いて不可逆反応においてＬ−アラニンに変換される。図７に図示される特定の具体例において、Ｌ−トリプトファンは、Ｌ−アミノトランスフェラーゼとおよびアルファ−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）またはオキサロ酢酸と可逆的に反応して、インドール−３−ピルビン酸、Ｌ−グルタミン酸（α−ＫＧが用いられる場合）またはＬ−アスパラギン酸（オキサロ酢酸が用いられる場合）を生成する。インドール−３−ピルビン酸は、ピルビン酸およびＲ特異的アルドラーゼと可逆的に反応し、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）に変換される。Ｒ−ＭＰは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アミノ酸と可逆的に反応して、Ｒ，Ｒモナチンおよびオキサロ酢酸、ピルビン酸、またはα−ＫＧのいずれかを形成する。Ｌ−アミノトランスフェラーゼ反応の生成物であるＬ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸は、グルタミン酸デカルボキシラーゼまたはアスパラギン酸デカルボキシラーゼを用いて、４−アミノブタン酸およびＣＯ２（Ｌ−グルタミン酸が基質である場合）にまたはβ−アラニンおよびＣＯ２（Ｌ−アスパラギン酸が基質である場合）に変換される。本発明の目的のために、可逆的であるとして示された反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図８】図８は、本発明による、Ｒ，Ｒモナチンを生成するための他のプロセスの例を示す流れ図である。この例では、プロセスは、一連の変換反応を通して、Ｒ−ＭＰ反応のアミノ酸反応物にＬ−トリプトファン反応のアミノ酸副生成物を再利用することを含む。図８に図示される特定の具体例において、Ｌ−トリプトファンは、Ｌ−アミノトランスフェラーゼとおよびアルファ−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）と可逆的に反応して、インドール−３−ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸を生成する。インドール−３−ピルビン酸は、ピルビン酸およびＲ特異的アルドラーゼと可逆的に反応し、Ｒ−アルファ−ケト酸モナチン（Ｒ−ＭＰ）に変換される。Ｒ−ＭＰは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アラニンと可逆的に反応して、Ｒ，Ｒモナチンおよびピルビン酸を形成する。Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼおよびピルビン酸を用いることにより、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ反応の生成物であるＬ−グルタミン酸は、副生成物としてのＬ−アラニンと共にα−ＫＧに可逆的に変換し戻される。アラニンラセマーゼは、Ｌ−アラニンを、第３の反応、（Ｄ−アミノトランスフェラーゼ反応で有用なＤ−アラニンに可逆的に変換する。本発明の目的のために、可逆的であるとして示された反応が逆方向に進行することは必要とされない。
【図９Ａ−Ｂ】図９（ＡおよびＢ）は、種々の公開されたバチルスＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（「ＤＡＡＴ」）のアミノ酸配列アラインメントを示す。下線を引いたアミノ酸は、相同領域を示す。５つのＰＣＲプライマーを保存領域に基づいて設計した。ＰＣＲプライマーは以下の通りである：５’−ＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴ−３’（配列番号６５）（順方向プライマー、図９Ａ中に示されるＦ１）、５’−ＧＡＴＧＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＡＡＴＣ−３’（配列番号６６）（順方向プライマー、図９Ａ中に示されるＦ２）、５’−ＡＧＡＴＴＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＣＧＴＡＡＣ−３’（配列番号６７）（逆方向プライマー、図９Ａ中に示されるＲ１）、５’−ＧＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＡ−３’（配列番号６８）（逆方向プライマー、図９Ａ中に示されるＲ２）、５’−ＡＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＡＴＡＡＡＧ−３’（配列番号６９）（逆方向プライマー、図９Ｂ中に示されるＲ３）。ＢｓｐｈＤＡＴ遺伝子によってコードされたＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは配列番号２０５であり、Ｂ．ハロデュランスのＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは配列番号２０６であり、ＧｓｔｅＤＡＴ遺伝子によってコードされたＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは配列番号２０７であり、Ｂ．セレウス１４５のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは配列番号２０８であり、ＢｓｕｂＤＡＴは配列番号２０９であり、Ｂ．リケニフォルミスのＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは配列番号２１０である。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０（ＡおよびＢ）は、２つの新規なＤＡＡＴ：ＡＴＣＣ４９７８（Ｂ．ロタンス、図１０Ａ；配列番号２１１）からのＤＡＡＴおよびＡＴＣＣ７０６３（Ｂ．セロシティディス（Ｂ．ｓｅｒｏｓｉｔｉｄｉｓ）、図１０Ｂ（配列番号２１２））からのＤＡＡＴの、実施例１８でクローニングしたＢ．スファエリクスＤＡＡＴ（配列番号２０５および配列番号２１３）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。非相同アミノ酸に下線を引く。
【図１１】図１１は、Ｇ．ステアロサーモフィルス由来のアラニンラセマーゼおよびその変異体（Ｙ３５４Ａ）と比較した、広域特異性アミノ酸ラセマーゼ（「ＢＡＲ」）のトリプトファンラセミ化アッセイ結果を示す。比較したラセマーゼ調製物は、（＃１）ＢＡＲ−２００μｇ（＃２）ＢＡＲ粗抽出物−５０μＬ；（＃３）ＢＡＲ粗抽出物−１０μＬ；（＃４）ＢＡＲ粗抽出物−５μＬ；（＃５）Ｙ３５４Ａ−１０００μｇ；（６）Ｙ３５４Ａ−２００μｇ；（＃７）野生型（ＷＴ）アラニンラセマーゼ−１０００μｇ；（＃８）野生型（ＷＴ）アラニンラセマーゼ−２００μｇ；（９）酵素なしとした。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
略語および用語
用語および方法の以下の説明は、本開示をより十分に記載し、かつ本開示の実施において当業者を誘導するために提供される。本明細書に用いた「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。用語「〜を含む」が用いるところはいかなるところでも、「〜を含むが、限定されない」と意味されることが、「限定されない」が明示的に述べられているまたはいないのいずれにせよ理解される。さらに、単数形「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに指定しない限り、複数の言及を含む。例えば、「タンパク質を含む」についての言及は、１つまたは複数の上記のタンパク質を含み、「細胞を含む」についての言及は、１つまたは複数の細胞および当業者に知られている等価物についての言及を含む等とする。用語「約」は、いかなる測定においても起こる実験誤差の範囲を包含する。特に述べられていない限り、測定数はすべて、「約」という語が明確に用いられていなくとも、それらの前に「約」という語を有するとみなされる。
【００２４】
保存的置換：置換がポリペプチドの活性に対して影響をほとんどまたは全く及ぼさない、ポリペプチドにおける、あるアミノ酸の他のアミノ酸への置換。置換は、交換されたアミノ酸が構造上または機能的に類似するようであるかどうかとは無関係に保存的であると考えられる。例えば、理想的には、１つまたは複数の保存的置換を含むトリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を保持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲまたは当業者に知られている他の方法のごとき標準的手順を用いて、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように生成できる。
【００２５】
タンパク質における本来のアミノ酸の代わりに置換されてもよい、かつポリペプチドの活性に対してほとんどまたは全く影響を及ぼさない場合に保存的置換とみなされてもよいアミノ酸の非限定的な例は、ｓｅｒまたはｔｈｒで置換されたａｌａ；ｇｌｎ、ｈｉｓ、またはｌｙｓで置換されたａｒｇ；ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、またはａｓｐで置換されたａｓｎ；ａｓｎ、ｇｌｕ、またはｇｌｎで置換されたａｓｐ；ｓｅｒまたはａｌａで置換されたｃｙｓ；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ、またはａｒｇで置換されたｇｌｎ；ａｓｎ、ｇｌｎ  ｌｙｓ、またはａｓｐで置換されたｇｌｕ；ｐｒｏで置換されたｇｌｙ；ａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、またはｔｙｒで置換されたｈｉｓ；ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、またはｐｈｅで置換されたｉｌｅ；ｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、またはｐｈｅで置換されたｌｅｕ；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、またはａｒｇで置換されたｌｙｓ；ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、またはｐｈｅで置換されたｍｅｔ；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ、またはｌｅｕで置換されたｐｈｅ；ｔｈｒ、またはａｌａで置換されたｓｅｒ；ｓｅｒまたはａｌａで置換されたｔｈｒ；ｐｈｅ、またはｔｙｒで置換されたｔｒｐ；ｈｉｓ、ｐｈｅ、またはｔｒｐで置換されたｔｙｒ；およびｍｅｔ、ｉｌｅ、またはｌｅｕで置換されたｖａｌを含む。
【００２６】
保存的置換についてのさらなる情報は、文献の中でも、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７５７，（１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎら，Ｇｅｎｅ  ７７：２３７−２５１，（１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：２４０−２４７，（１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１３２１−１３２５，（１９８８）、国際公開第００／６７７９６号（Ｃｕｒｄら）にならびに遺伝学および分子生物学の標準的な教科書に見出すことができる。
【００２７】
由来する：本明細書および特許請求の範囲において、物質は、いずれかの１つまたは複数の以下のものが真である場合、生物または源に「由来する」：１）物質が、生物／源の中に存在する；２）物質が、天然の宿主から取り出される；または３）物質が、天然の宿主から取り出され、例えば、突然変異誘発によって進化する。
【００２８】
単離された：本明細書に用いた用語「単離された」は、その天然の宿主から取り出されたいずれかの物質を指し、物質は、どのような特定の純度を示す必要もない。例えば、「単離核酸」は、それが由来する生物の自然発生のゲノムの中で直接的に隣接する配列の双方（５’端の配列および３’端の配列）に直接的に隣接していない自然発生の核酸を指す。例えば、単離核酸は、自然発生ゲノムにおける組換えＤＮＡ分子の直接的に側面に位置して見つかる核酸配列の一方が除去されるまたはないという条件で、限定されないが、いずれかの長さの組換えＤＮＡ分子とすることができる。従って、単離核酸は、限定されないが、他の配列とは無関係に分離した分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡおよびベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）の中にまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込まれた組換えＤＮＡを含む。さらに、単離核酸は、ハイブリッド核酸配列または融合核酸配列の一部である組換えＤＮＡ分子を含むことができる。
【００２９】
核酸に関して本明細書に用いた用語「単離された」はまた、非自然発生核酸配列が、天然には見出されず、自然発生のゲノムの中に直接的に隣接する配列を有していないので、いずれかの非自然発生核酸も含む。例えば、操作された核酸のごとき非自然発生核酸は、単離核酸であると考えられる。操作された核酸は、一般の分子クローニングまたは化学的核酸合成技術を用いて作製できる。単離非自然発生核酸は、他の配列とは無関係とすることができ、ベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡの中に組み込むことができる。さらに、非自然発生核酸は、ハイブリッド核酸配列または融合核酸配列の一部である核酸分子を含むことができる。
【００３０】
例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー内の数百から数百万もの他の核酸分子中に存在する核酸またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライスは、単離核酸と考えられない。
【００３１】
断片：タンパク質またはポリペプチドまたは核酸に関して本明細書に用いられる「断片」は、それぞれ、タンパク質、ポリペプチド、または核酸の一部分である。断片は、断片が由来するより長いタンパク質、ポリペプチド、または核酸配列と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列または核酸配列を有することができる。より長いタンパク質、ポリペプチド、または核酸の３次元構造と比較して異なる３次元構造を有する断片もまた含まれる。この例は、有意により高い活性を有する成熟酵素を生成するために開裂によって改変することができる低活性プロタンパク質のごとき「プロ形態」分子である。タンパク質またはポリペプチドの断片は、タンパク質またはポリペプチドの酵素的に活性な部分とすることができる。
【００３２】
精製された：本明細書に用いた用語「精製された」は、混入物が、注目する試料から除去されたことを示す。用語「精製された」は、文脈によって他に示されない限り、絶対的な純度を必要としないが、相対的な用語としてむしろ意図される。従って、例えば、精製されたポリペプチドまたは核酸の調製物は、対象のポリペプチドもしくは核酸が、ポリペプチドもしくは核酸が生物内でその自然環境にあるよりも高濃度でまたは取り出された環境よりも高濃度であるものとすることができる。
【００３３】
立体反転アミノトランスフェラーゼ：「立体反転アミノトランスフェラーゼ」は、アミノ供与体として反対のキラル基質を用いながらキラルアミノ酸生成物（モナチンのごとき）を優先的にまたは選択的に生成できるポリペプチドである。例えば、立体反転アミノトランスフェラーゼは、Ｒ，Ｒモナチンを生成するために基質として優先的にまたは選択的にＬ−グルタミン酸を用いるＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）であってもよい。立体反転アミノトランスフェラーゼの非限定的な例は、Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４１）およびＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ活性またはＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素を含む。
【００３４】
補完遺伝子：「補完遺伝子」は、発現した場合に、生物における突然変異を無効にする遺伝子である。例えば、生物が、細胞によるトリプトファンの合成に必要な遺伝子のうちの１つに無発現変異を有する場合、補完遺伝子は、発現した場合に、株が最少培地（すなわち、トリプトファンなし）上で成長するのを可能にする遺伝子となることができる。
【００３５】
立体選択性酵素：「立体選択性酵素」は、他の立体異性体に対する特異性および／または活性と比較して、ある立体異性体に対するより高い特異性および／またはより高い活性を有する酵素である。例えば、立体選択性酵素は、Ｓ−ＭＰよりもＲ−ＭＰに対するより高い特異性および／またはより高い活性を有する酵素である。好ましい具体例において、立体選択性酵素は、他の立体異性体と比較して、ある立体異性体に対して制限された活性を有する。「制限された」活性は、例えば、本明細書に提供される実験によって決定されるように、最小に認められるかまたは認められない活性を意味する。実施例６は、例えば、ＨＥＸＡｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇを、Ｓ，Ｓモナチンに対して制限された活性を持つ酵素として同定する。実施例８は、Ｓ．メリロティＴａｔＡを、Ｓ−ＭＰに対して制限された活性を持つもう一つの酵素として同定する。実施例１８では、Ｂ．ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼは、Ｓ−ＭＰと比較して、Ｒ−ＭＰに対するより高い選択性を有する結果、Ｒ，Ｒモナチンのより高い立体純度を生じた。また、実施例１９は、ハイブリッドＤＡＴが、Ｒ−ＭＰと比較して、Ｓ−ＭＰに対して制限された活性を有することを示す。
【００３６】
同族体：本明細書に用いた用語「同族体」は、タンパク質または核酸が、標準的方法を用いて２つの配列を整列させた場合に、他のタンパク質または核酸の配列に対して、相対的に高度な配列同一性を呈することを示す。例えば、標準的方法を用いて２つの配列を整列させた場合に、Ｒ特異的アルドラーゼが、配列番号２２のアルドラーゼに対して少なくとも約５０％の配列同一性を含有するならば、Ｒ特異的アルドラーゼは、配列番号２２のアルドラーゼの同族体である。
【００３７】
ＥＣ番号：酵素分類番号は、国際生化学分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって指定される。
【００３８】
モナチン誘導体：本明細書に用いた語句「モナチン誘導体」は、以下の構造を有する。
【００３９】
【化２】
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式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、またはヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、もしくはフッ素原子のごときハロゲン原子から選択される任意の置換基を表す。しかしながら、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、同時にすべて水素とすることはできない。あるいは、ＲｂおよびＲｃならびに／またはＲｄおよびＲｅは、それぞれ、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を共に形成してもよい。
【００４０】
置換トリプトファン：本明細書に用いた「置換トリプトファン」は、トリプトファンのインドール環の１つまたは複数の炭素原子が、上記に定義されるＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅ置換基の１つまたは複数で独立して置換されることを意味する。しかしながら、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、同時にすべて水素とすることはできない。一具体例において、置換トリプトファンは、インドール環上に最終モナチン誘導体と同じ置換基（複数可）を含有する。
【００４１】
モナチンのＲ，Ｒおよび他の立体異性体を生成する生合成経路
とりわけ国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号（例えば、図１〜３および１１〜１３参照）に記載のように、モナチンは、生物学的変換（すなわち、基質から生成物への反応をポリペプチドで促進すること）を含む複数工程の経路によってトリプトファンから生成できる。記載した経路は、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に生物学的に変換し、インドール−３−ピルビン酸を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「ＭＰ」）に生物学的に変換し、ＭＰをモナチンに生物学的に変換することを含む。モナチンを生成するために用いる本発明の生合成の経路は、１つまたは複数の下記に記載される工程、メカニズム、および／または経路を含んでいてもよいまたは本質的にそれからなってもよい。下記に記載される工程、メカニズム、および／または経路は、単に例示的であることが意図される。
【００４２】
モナチンまたはその塩を生成する１つの方法は、（ａ）Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、（ｂ）インドール−３−ピルビン酸からモナチン前駆体を生成し、次いで（ｃ）モナチン前駆体からモナチンを生成することを含む。
【００４３】
トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸に変換するのに有用な酵素は、酵素分類（「ＥＣ」）２．６．１．２７、１．４．１．１９、１．４．９９．１、２．６．１．２８、１．４．３．２、１．４．３．３、２．６．１．５、２．６．１．−、２．６．１．１、２．６．１．２１、および３．５．１．−のメンバーを含む。これらのクラスは、Ｌ−トリプトファンおよびα−ＫＧ（すなわち、α−ケトグルタル酸、２−オキソグルタル酸とも呼ばれる）をインドール−３−ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸に変換するトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−トリプトファンおよび２−オキソ酸をインドール−３−ピルビン酸およびアミノ酸に変換するＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファンおよびＮＡＤ（Ｐ）をインドール−３−ピルビン酸およびＮＨ３およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するトリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸およびＦＡＤをインドール−３−ピルビン酸およびＮＨ３およびＦＡＤＨ２に変換するＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−トリプトファンおよびフェニルピルビン酸をインドール−３−ピルビン酸およびＬ−フェニルアラニンに変換するトリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、Ｌ−アミノ酸およびＨ２ＯおよびＯ２を２−オキソ酸およびＮＨ３およびＨ２Ｏ２に変換するＬ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸およびＨ２ＯおよびＯ２を２−オキソ酸およびＮＨ３およびＨ２Ｏ２に変換するＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ならびにＬ−トリプトファンおよびＨ２ＯおよびＯ２をインドール−３−ピルビン酸およびＮＨ３およびＨ２Ｏ２に変換するトリプトファンオキシダーゼのごときポリペプチドを含む。これらのクラスは、さらに、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸（またはＤ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ、および多数のアミノトランスフェラーゼ活性を有し、それらのうちのいくつかは、トリプトファンおよび２−オキソ酸をインドール−３−ピルビン酸およびアミノ酸に変換できる広域（多基質）アミノトランスフェラーゼを含有する。さらに、これらのクラスは、水の存在下で、トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸およびアンモニウムに変換できるフェニルアラニンデアミナーゼを含む。
【００４４】
インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換するのに有用な酵素は、酵素クラスＥＣ４．１．３．−、４．１．３．１６、４．１．３．１７、および４．１．２．−のメンバーを含む。これらのクラスは、２つのカルボン酸基質の縮合を触媒するアルドラーゼのごとき炭素間合成酵素／リアーゼを含む。酵素クラスＥＣ４．１．３．−は、求電子体としてオキソ酸基質（インドール−３−ピルビン酸のごとき）を利用する炭素間結合を形成するそれらの合成酵素／リアーゼであり、一方、ＥＣ４．１．２．−は、求電子体としてアルデヒド基質（ベンズアルデヒドのごとき）を利用する炭素間結合を形成する合成酵素／リアーゼである。例えば、ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）およびＰｒｏＡアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）は、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸をＭＰに変換することで知られている。ＰｒｏＡアルドラーゼは、本明細書で、コマモナス・テストステローニに由来する４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼのみを同定すると考えることができるが、用語ＰｒｏＡアルドラーゼは、特記されない限りは、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ活性を有するいずれかのポリペプチドを意味するために用いる。Ｐｒｏアルドラーゼの適した例は、コマモナス・テストステローニＰｒｏＡ（配列番号１（核酸配列）、配列番号２（アミノ酸配列））およびシノリゾビウム・メリロティＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ受入番号：ＣＡＣ４６３４４）またはコマモナス・テストステローニＰｒｏＡ（配列番号１（核酸配列）、配列番号２（アミノ酸配列））および／もしくはシノリゾビウム・メリロティＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ受入番号：ＣＡＣ４６３４４）に対して相同性を示す酵素を含む。例えば、適した酵素は、コマモナス・テストステローニＰｒｏＡ（配列番号２）および／またはシノリゾビウム・メリロティＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ受入番号：ＣＡＣ４６３４４）と少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、および／または９９％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。ＭＰは、さらに、アルドール縮合のごとき化学反応を用いて生成できる。
【００４５】
ＭＰのモナチンへの変換に有用な酵素には、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（２．６．１．２７）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（１．４．１．１９）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（１．４．９９．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（１．４．１．２−４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（１．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（２．６．１．２８）の酵素クラス（ＥＣ）のメンバー、またはより一般的には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（２．６．１．５）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、もしくはＤ−アラニン（２．６．１．２１）アミノトランスフェラーゼなどのアミノトランスフェラーゼファミリー（２．６．１．−）のメンバーが含まれる（国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の図２を参照）。この反応は、化学反応を用いて行うこともできる。ケト酸（ＭＰ）のアミノ化は、アンモニアおよびシアノボロ水素化ナトリウムを用いた還元性アミノ化によって行う。国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の図１１〜１３は、ＭＰをモナチンに変換するため、およびモナチンからインドール−３−ピルビン酸またはトリプトファンへの収率の増加を提供するために用いることができるさらなるポリペプチドを示す。
【００４６】
モナチン組成物の味プロフィールは、組成物中のモナチンの様々な立体異性体の相対量を制御することによって変更できる。本開示は、所望の割合のＲ，Ｒモナチンおよび／またはＳ，Ｒモナチンを有するモナチン組成物を生成するための経路および物質を提供する。
【００４７】
本明細書に例示される経路のごとき経路によって生成されるモナチン化合物のキラリティは、ｐＨおよび生物学的変換に用いるポリペプチドの双方によって変えることができる。生合成経路を用いてモナチンが形成される場合、以下を考慮できる。生体触媒反応では、モナチン炭素−２（上記の化学構造を参照されたい）のキラリティは、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換する酵素によって決定される。多数の酵素（例えば、ＥＣ４．１．２．−、４．１．３．−からの）は、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換できる。従って、所望の異性体を形成する酵素を選ぶことができる。あるいは、インドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換する酵素のエナンチオ特異性は、進化分子工学の使用を通して改変できるまたは触媒抗体は、所望の反応を触媒するために操作できる。ＭＰが生成される（酵素的にまたは化学的縮合によって）と、アミノ基は、立体特異的に追加され得る。炭素−４のＲまたはＳ立体配置のいずれか（先の化学構造を参照されたい）は、Ｄ−またはＬ−芳香族酸アミノトランスフェラーゼが用いるかどうかに依存して生成できる。多くのアミノトランスフェラーゼはＬ−異性体に特異的であるが、しかし、特定の植物中にはＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼが存在する（ＫｏｈｉｂａおよびＭｉｔｏ、ビタミンＢ６およびカルボニル触媒作用の第８回国際シンポジウムの予稿集（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ６  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ）、大阪、日本１９９０）。さらに、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）、Ｄ−メチオニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４１）および（Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロパン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．６１）、（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロパン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２２）の双方、ならびにＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼが同定されている。特定のアミノトランスフェラーゼは、この反応の基質をＣ２炭素の特定の立体配置でしか許容しない場合がある。従って、ＭＰへの変換が立体特異的でない場合でも、アミノトランスフェラーゼの適切な選択によって最終産物の立体化学を制御できる。反応は可逆的であるので、未反応のＭＰ（望ましくない異性体）をその構成物に再利用して戻すことができ、ＭＰのラセミ混合物を再度形成できる。
【００４８】
ここで図を参照して、以下に注目されたい。流れ図は、モナチンを生成するための経路の例を明らかにするが、図に示される経路および本発明の方法は、特記されない限りは、経路を実施するためのいずれかの特定の方法に限定されない。例えば、経路は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはその組合せで実施してもよい。
【００４９】
さらに、本明細書に開示される１つまたは複数の経路を利用して本発明の方法を実施することに、同定された成分（例えば、反応物および酵素）のそれぞれが実施者によって明示的に提供されることを必要としない。むしろ、成分（または成分の源）および反応条件が、組成物（または宿主細胞）中に存在するまたはそうでない場合は、経路が可能性として進行できるよう利用可能であることで十分である。換言すれば、例えば、図が、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を生成し、インドール−３−ピルビン酸から２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」すなわち「ＭＰ」）を生成し、ＭＰからモナチンを生成し、それぞれの反応が適切な酵素によって促進されることが含まれる、モナチン組成物を生成するプロセスを示す場合、その経路の実施には、Ｌ−トリプトファンをα−ケトグルタル酸および同定した反応を促進することを企図する酵素と、インドール−３−ピルビン酸またはＭＰを明確に提供することもなしに反応のそれぞれが起こるために適切な条件下で合わせることが含まれることが企図される。そのような場合、Ｌ−トリプトファンがα−ケトグルタル酸と反応してインドール−３−ピルビン酸を生成できる。条件および提供された酵素に依存して、Ｌ−トリプトファン反応から生成されたインドール−３−ピルビン酸は、ＭＰを形成するように反応でき、次いで、条件および提供された酵素に依存して、インドール−３−ピルビン酸反応から生成されたＭＰは、モナチンを形成するように反応できる。
【００５０】
本明細書に開示される１つまたは複数の経路を利用する本発明の方法の実施は、上記の物質または酵素が、そうでない場合は、既に存在するもしくは利用可能であるまたは反応環境において既に存在するもしくは利用可能である物質から合成できる場合、実施者が、同定された出発物質または酵素を明示的に提供することを必要としないこともまた注目されたい。換言すれば、Ｌ−トリプトファンを出発物質として同定するいずれかの経路の実施には、Ｌ−トリプトファンを生成できる化合物を、Ｌ−トリプトファンの生成が起こる条件下で提供し、その化合物を一連の反応を促進できる酵素と、それらの反応が起こるために適切な条件下で合わせることが含まれることを企図する。別の例として、同定した経路の実施には、記載した経路に従ってモナチンを産生するように遺伝子操作した微生物を供し、発酵プロセスが起こるために適切な条件を提供することが含まれることを企図する。例えば、自然に大量のＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンを産生する微生物（米国特許第５７２８５５５号参照）を、モナチンへの経路中の反応を促進（触媒）するための酵素の１つまたは複数を産生または過剰産生するように遺伝子操作でき、それにより微生物がモナチンを産生するように適切な条件を提供できる。
【００５１】
ここで図１を参照すると、示された流れ図は、Ｒ，Ｒモナチンを含めたモナチン組成物を作製するための本発明に従ったプロセスを模式的に示す。図１に示すように、全体的な経路は、インドール−３−ピルビン酸を形成するトリプトファンの反応、ＭＰを生成するインドール−３−ピルビン酸の反応、およびＲ，Ｒモナチンを含めたモナチンを生成するＭＰの反応を含む。
【００５２】
図１はさらに、モナチンのＳ，Ｓ、Ｒ，ＳおよびＳ，Ｒ体を犠牲にしてモナチンのＲ，Ｒ体の生成を増加するように設計した、この全体的な経路の特定の順列をさらに例示する。具体的には、図１は、Ｌ−トリプトファンの反応で利用するアミノトランスフェラーゼ酵素が、その反応に対して、ＭＰと４Ｓモナチンとの反応と比較してより高い活性および／もしくは特異性を有する、またはオキシダーゼがＬ−トリプトファンに対して４Ｒモナチンよりも高い活性および／もしくは特異性を有し、インドール−３−ピルビン酸の反応を促進する酵素がＲ−特異的アルドラーゼであり、ＭＰの反応を促進する酵素が広い特異性のＤ−酵素、好ましくはＭＰのＲ異性体でより効率的に作動するように進化した酵素である具体例を例示する。
【００５３】
図１はまた、Ｒ，Ｒモナチンの生成をより経済的にするように設計した特定の順列も例示する。例えば、図１では、Ｄ−トリプトファンまたはＬ−およびＤ−トリプトファンの組合せではなく、Ｌ−トリプトファンを出発物質として同定する。トリプトファンの特定の形態の選択はモナチン組成物中の最終的なモナチン化合物のキラリティに影響を与えないが（トリプトファン反応は、キラリティを有さないインドール−３−ピルビン酸を形成するので）、少なくともＬ−トリプトファンが現在Ｄ−トリプトファンよりも安価であり、より容易に入手可能であるので、Ｌ−トリプトファンを出発物質として利用することを好む場合がある。
【００５４】
ここで図１に示す第１の反応に注目して、トリプトファンがインドール−３−ピルビン酸に変換される際、α−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、および／またはピルビン酸のいずれかの１つまたは複数がトリプトファンと反応してアミノ酸（それぞれグルタミン酸、アスパラギン酸、およびアラニン）およびヘンドール−３−ピルビン酸を形成する。図１は、トリプトファン出発物質がＬ−トリプトファンであり、α−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、および／またはピルビン酸がアミノ酸のＬ−異性体を形成する（例えば、それぞれＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、および／またはＬ−アラニン）具体例を示す。
【００５５】
図１に示すように、Ｒ，Ｒモナチンの生成を増強する手法は、Ｌ−トリプトファンとＭＰまたはモナチンよりもトリプトファンに対するより高い特異性、より高い活性、またはどちらもを有する酵素との反応を促進すること、およびＭＰとＤ−特異的酵素との反応を促進することを含む。国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号に開示のように、特定の酵素が、インドール−３−ピルビン酸を生成するトリプトファンの反応、およびモナチンを生成するＭＰのアミノ化反応を促進できる。アミノ化工程においてＬ−アミノトランスフェラーゼを用いることにより、Ｄ−酵素の使用ではモナチンＣ−４位でＤキラル中心が作製されることに対して、モナチンのＣ−４位でＳキラル中心が作製される。従って、トリプトファン反応を促進するＬ−アミノトランスフェラーゼもＭＰ反応中で活性がある場合には、存在するＭＰの形態に応じてＲ，ＳおよびＳ，Ｓモナチンを形成できる。さらに、特定の他の酵素、すなわちＬ−アミノ酸オキシダーゼは、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸への反応を促進できるだけでなく、Ｒ，Ｒモナチンを分解する副活性も有し得る。いくらかの具体例によれば、この４Ｒ副活性を最小化するまたは排除する。モナチンの４Ｓ体に対するオキシダーゼの副活性は、それらを最終産物から低下または排除し、所望の最終組成物次第では望ましい場合がある。その結果、ＭＰまたはモナチンと比較してトリプトファンに対するＬ−酵素の特異性および／または活性が高いほど、Ｓ，ＳおよびＲ，Ｓモナチンと比較してより大量のＲ，ＲおよびＳ，Ｒが生成される。
【００５６】
図１に例示した具体例に従ったトリプトファン反応の適切な酵素には、インドール−３−ピルビン酸を形成するＬ−トリプトファンの反応を促進でき、その反応に対して、モナチンの４Ｓ異性体を形成するＲ−ＭＰの反応よりも高い特異性を有するＬ−アミノトランスフェラーゼ、インドール−３−ピルビン酸を形成するＬ−トリプトファンの反応を促進でき、その反応に対して、ＭＰを形成するモナチンの４Ｒ異性体の反応と比較してより高い特異性および／または活性を有するＬ−アミノ酸オキシダーゼ、ならびに前述のいずれかのものの機能的な等価物が含まれる。より具体的には、適切な酵素の非限定的な例は、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．２７）およびチロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．５）およびＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）、ならびにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素に由来する変異体から選択できる。
【００５７】
実施例６は、それぞれインドール−３−ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、およびＬ−アラニンを形成する、Ｌ−トリプトファンとα−ＫＧ、オキサロ酢酸、ピルビン酸、またはその組合せとの反応の促進に有用な、特定の酵素、すなわち、Ｐｒｏ９からＴｙｒへの置換およびＡｒｇ１２２からＧｌｙへの置換が含まれる変異体ＨＥＸａｓｐＣポリペプチドを同定する。「制限された」活性を有する別の特定の酵素は、ＴａｔＡ、すなわちエス・メリロチからのＬ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼである。図１に示す経路の好ましい具体例に従ったトリプトファン反応に適した他の酵素には、以下の特徴を有するもの、すなわち、実施例６に記載のように、Ｌ−トリプトファンの１／１０の割合もしくはそれ未満でＭＰをトランスアミノ化する酵素、または実施例９に記載のように、ラセマーゼと共に用いた場合に、９０％を超えるモナチンの４Ｒ異性体を生成する酵素が含まれる。
【００５８】
ＭＰからモナチンへの変換と比較してＬ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸への変換に対する特異性が低い酵素の例には、ＨＥＸＡｓｐＣ（実施例６）、リーシュマニア・メジャーの広い特異性のアミノトランスフェラーゼ（国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号）、ブタアミノトランスフェラーゼ（国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号）およびロドバクター・スファロイデスのＴａｔＡ（実施例９）が含まれる。しかし、これらの酵素は、例えば、突然変異誘発によって、トリプトファンと比較してＲ−ＭＰおよび／またはＲ，Ｒモナチンに対して制限された活性を有するように進化させ得る。
【００５９】
ここで図１に同定した第２の反応に注目して、インドール−３−ピルビン酸からＭＰへの反応を促進する（または触媒する）酵素の選択は、生成されるＲ，Ｒモナチン対Ｓ，Ｒモナチンの相対量に影響を与える。一般的に、生成されるＲ−ＭＰ対Ｓ−ＭＰの相対量が多いほど、生成されるＲ，Ｒモナチン対Ｓ，Ｒモナチンの相対量が多くなる（Ｄ−酵素がＭＰからモナチンへの反応を促進する場合）。この点に関して有用な酵素は、イー・コリＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ７４９２０．１）、バチルスＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＢ１４１２７．１）、またはコマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ（配列番号１（核酸配列）、配列番号２（アミノ酸配列））のうちのいずれか１つによって促進された場合にインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸の反応によって生成されるよりも高いＲ−ＭＰ：Ｓ−ＭＰ比を生成するいずれかの酵素を含む。従って、優先的にＲ−ＭＰを生成することが望まれる場合、Ｓ−ＭＰと比較してより大量のＲ−ＭＰを生成できる１つまたは複数の酵素を用いることができる。その唯一のモナチン成分としてモナチンのＲ，Ｒ形態を有するモナチン組成物が望まれる場合、Ｓ−ＭＰに対立するものとしてＲ−ＭＰを選択的に生成する酵素（「Ｒ特異的酵素」）が用いるべきである。実施例３に示されるように、Ｓ−ＭＰに対立するものとしてＲ−ＭＰを選択的に生成するために用いられてもよいＲ特異的酵素の例は、配列番号２２のアルドラーゼ、配列番号１０４のアルドラーゼおよびシノリゾビウム・メリロティＨＭＧアルドラーゼである。
【００６０】
図１は、Ｒ特異的アルドラーゼが、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸の反応を促進して、Ｒ−ＭＰを形成する特定の具体例を明らかにする。しかしながら、Ｒ−ＭＰを優先的に生成するインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸の反応のためのアルドラーゼならびにイー・コリＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ７４９２０．１）、バチルスＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＢ１４１２７．１）、またはコマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ（配列番号１（核酸配列）、配列番号２（アミノ酸配列））のうちのいずれか１つによって生成されるよりも高いＲ−ＭＰ：Ｓ−ＭＰ比を生成するアルドラーゼの使用もまた企図される。さらに、インドール−３−ピルビン酸が、異なるＣ３源（例えば、セリンまたはシステイン）と反応して、Ｒ−ＭＰを形成してもよく、従って、他の酵素（例えば、他のリアーゼまたは合成酵素）が上記の反応を促進してもよいこともまた企図される。ピルビン酸（オキサロ酢酸のごとき）に容易に変換される他の基質もまた用いられてもよい。実施例３は、配列番号２２のアルドラーゼのごとき優先的にもしくは選択的にＲ−ＭＰを生成する可能性があるまたはイー・コリＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ７４９２０．１）、バチルスＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＢ１４１２７．１）、もしくはコマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ（配列番号１（核酸配列）、配列番号２（アミノ酸配列））のうちのいずれか１つによって促進された場合にインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸の反応によって生成されるよりも高いＲ−ＭＰ：Ｓ−ＭＰ比を生成する可能性があるアルドラーゼ酵素の源を提供する。実施例５は、さらに、上記の酵素を同定するためのスクリーニング法を提供する。優先的にもしくは選択的にＲ−ＭＰを生成するまたはイー・コリＫＨＧアルドラーゼ（ＧｅｎｂａｎｋＮｏ．ＡＡＣ７４９２０．１）、バチルスＫＨＧアルドラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＢ１４１２７．１）、コマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ（配列番号１（核酸配列）、配列番号２（アミノ酸配列））、配列番号２２のアルドラーゼもしくは配列番号１０４のアルドラーゼのうちのいずれか１つよりも多くのＲ−ＭＰを生成する酵素は、知られているまたは自然界に見つけられるアルドラーゼから進化させてもよいこともまた企図される。例えば、野生型酵素と比較して、所望の特徴を改善するために−基質に対する酵素の活性を増加させる等のために−酵素を進化させるための、当技術分野で知られているいずれかの技術を用いることができる。実施例４、５、６、７、９、１０、および１１は、酵素を進化させるためのいくつかの技術を提供する。
【００６１】
ここで、図１で明らかにされた経路の最後の工程に焦点を当てると、Ｒ，Ｒモナチンを形成するためのＲ−ＭＰの反応は、広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、例えば、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼもしくはＤ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとしても知られている）またはＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼによって促進されることが示される。上記に論じられるように、ＭＰからモナチンへの変換は、モナチンのＣ−４炭素でキラル中心を作り出すアミノ化反応である。Ｒ−キラル形態がＣ−４位で望まれる場合、アミノ酸中で「Ｒ」キラル中心を生成する酵素を用いるべきである。非限定的な例示的な酵素は、次のものを含む：バチルス・ハロデュランスに由来するＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（実施例１８）を含むバチルスに由来するＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（実施例１５〜１８）、改変された立体特異性を有する突然変異分岐鎖アミノトランスフェラーゼ（実施例７）、およびバチルスに由来する突然変異Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（実施例６Ｂ）。
【００６２】
他の例示的な酵素は、ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼを含む。ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼは、２つの異なるアミノ酸アミノトランスフェラーゼからの構造要素を含有できる。次いで、ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼは、モナチンへのＭＰの変換における性能の改善のために（例えば、突然変異誘発または組換え操作を介して）さらに進化させることができる。上記のハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼの例は、実施例１９に示される。実施例１９に示されるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼは、Ｂ．スファエリクスからのＤ−アミノトランスフェラーゼおよびＧ．ステアロテルモフィルスからのＤ−アミノトランスフェラーゼからの要素を含んだ。Ｒ，Ｒ−モナチンは、このＤ−アミノトランスフェラーゼを利用して生成された（実施例１９）。
【００６３】
実施例２は、さらに、種々のＤ−アミノトランスフェラーゼを利用するＲ，Ｒモナチンの生成を示す。
【００６４】
いくらかの具体例によれば、Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、インドール−３−ピルビン酸よりも、基質としてのＲ−ＭＰに対する特異性、活性、またはその双方が高い。ある種の他の具体例において、Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、基質としてのインドール−３−ピルビン酸に対する制限された活性を有する。例えば、実施例６に示されるように、上記の特徴を有する酵素は、既存の酵素から進化させてもよいまたは突然変異させてもよい。
【００６５】
さらに、いくらかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチンを形成するためのＲ−ＭＰの反応は、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼによって促進できる。実施例２０は、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＡＡＤＨ−１０１〜１０８、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）を利用するＲ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成を示す。これらのＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼは、性能の改善のために（例えば、突然変異誘発または組換え操作を介して）さらに進化させてもよい。
【００６６】
図２は、Ｒ，Ｒモナチンの生成を標的とするためのもう一つの戦略を表す。図１の具体例において、Ｒ−ＭＰを形成するためのインドール−３−ピルビン酸の反応中で用いるアルドラーゼは、形成されるＲ，Ｒ：Ｓ，Ｒの比に影響を及ぼすが、図２の具体例において、モナチンへのＭＰの変換を促進するＤ−酵素は、形成されたＲ，Ｒ：Ｓ，Ｒの比に影響を及ぼす。図２の具体例によれば、非立体特異性酵素は、ＭＰへのインドール−３−ピルビン酸の変換を促進するために用いられてもよく、従って、Ｓ−ＭＰおよびＲ−ＭＰの双方を形成され得る。Ｓ，Ｒモナチンに対するＲ，Ｒモナチンの所望の比を得るために、Ｄ−酵素は、Ｒ−ＭＰに対するＳ−ＭＰに対しての適切な立体選択性で選ばれる（または進化させる）。その唯一のモナチン成分としてモナチンのＲ，Ｒ形態を有するモナチン組成物が望まれる場合、モナチンへのＳ−ＭＰに対立するものとしてモナチンへのＲ−ＭＰの反応を選択的に促進する酵素が好まれると考えられる。例えば、バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ（実施例１８）ならびにバチルス・スファエリクスおよびゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（実施例１９）の双方からの構造要素を含有するハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼは、モナチンへのＲ−ＭＰの反応を選択的に促進する酵素として利用されてもよい。
【００６７】
図３は、Ｒ，Ｒモナチンが豊富な組成物の生成のための他の代替経路を示す。図３の経路は、図１の経路の改変である。図３に示される経路では、インドール−３−ピルビン酸は、Ｌ−トリプトファンから、直接的にではなく間接的に生成される。より具体的に、Ｌ−トリプトファンは、Ｄ−トリプトファンに変換され、次いで、Ｄ−トリプトファンは、インドール−３−ピルビン酸に変換される。実施例４は、トリプトファンラセマーゼまたは広域特異性アミノ酸ラセマーゼを用いる、Ｌ−トリプトファンからのＲ，Ｒモナチンの生成を示す。
【００６８】
Ｄ−トリプトファンへのＬ−トリプトファンの変換は、トリプトファンラセマーゼまたはその機能的等価物によって促進できる。実施例４は、トリプトファンラセマーゼおよび広域特異性アミノ酸ラセマーゼの潜在的な源ならびに上記の酵素を同定するためのスクリーニング法を提供する。実施例４は、Ｌ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換することができるトリプトファンラセマーゼおよび広域特異性アミノ酸ラセマーゼの例を記載する。これらのトリプトファンラセマーゼは、（例えば突然変異誘発または組換え操作を介して）性能の改善のためにさらに進化させることができる。トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼの例は、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から単離されたアラニンラセマーゼである。より具体的に、トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼの例は、Ｙ３５４Ａ突然変異を有する、配列番号４１に対応するアラニンラセマーゼのごとき配列番号４１に由来するアラニンラセマーゼである。
【００６９】
トリプトファンラセマーゼの非限定的な例には、アミノ酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．−）の同族体または変異体、例えば、セリンラセマーゼが含まれ、同族体または変異体は、Ｌ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換できる。アミノ酸ラセマーゼが由来し得る源の非限定的な例には、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ジオバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ペディオコッカス・ペントサウセス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンチ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、アキフェックス・ピロフィラス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス、ストレプトコッカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アナバエナｓｐ．（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、シュードモナス・ストリアタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒｉａｔａ）、レンチナス・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）、スカファルカ・ブロウトニ、デスルフロコッカスｓｐ．（Ｓｃａｐｈａｒｃａ  ｂｒｏｕｈｔｏｎｉｉ  Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サーモコッカスｓｐ．（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、およびシュードモナス・ストリアタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒｉａｔａ）などの微生物が含まれる。アミノ酸ラセマーゼが由来し得る源のさらなる非限定的な例には、カイコ、ラット脳、またはマウス脳が含まれる。これらのアミノ酸ラセマーゼは、Ｄ−トリプトファンへのＬ−トリプトファンの変換における性能の改善のために（例えば、突然変異誘発または組換え操作を介して）進化させてもよい。
【００７０】
適切なトリプトファンラセマーゼが由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、シュードモナス、例えば、シュードモナス・クロロラフィス（シュードモナス・アウレレオファシエンス）（ＡＴＣＣ１５９２６）、およびブルクホルデリア・ピロシーナ（ＡＴＣＣ１５９５８）などの微生物が含まれる。適切なトリプトファンラセマーゼが由来し得る潜在的な源のさらなる非限定的な例には、植物、例えば、ニコチアナ・タバカムなどのタバコ植物、トリチカム・アエスチバムなどのコムギ植物、ビート、トマト、およびスクレロチドン・イリシフォリウスが含まれる。
【００７１】
適した広域特異性アミノ酸ラセマーゼの非限定的な例は、配列番号１２０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｙ３９６Ｃ突然変異を有する、配列番号１２０に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２８の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号１２８に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、プチダ菌（シュードモナス・プチダ）（シュードモナス・ストリアタとしても知られている）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＫＴ２４４０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、蛍光菌（Ｐ．オレオボランス）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダ１２６３３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＳＣＲＣ−７４４から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンス（Ｐ．ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、アミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｊａｎｄｅｉ）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｏｂｒｉａ）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス���キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５の部分配列を含有する遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６の部分配列を含有する遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４６の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ならびにその活性断片および相同体から選ばれる広域特異性アミノ酸ラセマーゼを含む。
【００７２】
適した広域特異性アミノ酸ラセマーゼの他の非限定的な例は、配列番号１２０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｙ３９６Ｃ突然変異を有する、配列番号１２０に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２８の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号１２８に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス・プチダ（シュードモナス・ストリアタとしても知られている）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＫＴ２４４０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オレオボランスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダ１２６３３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＳＣＲＣ−７４４から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、アミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵���、配列番号１９５の部分配列を含有する遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６の部分配列を含有する遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４６の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、およびその活性断片から選ばれる１つまたは複数の広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対する少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む１つまたは複数の酵素を含む。いくつかの具体例において、配列同一性パーセントは、少なくとも９５％である。
【００７３】
適した広域特異性アミノ酸ラセマーゼのさらに他の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１９によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２７によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＣＰ  ００００２０．１  ＧＩ：５９４７８７０８の領域８００８４２．．８０２０５３によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＣ＿００６８４０によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＫＴ２４４０  Ｂａｒ  ＤＮＡによってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＹ３９６Ｃ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１１９に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１２７に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の部分遺伝子配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５４の部分遺伝子配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＺ＿ＡＡＬＭ０１０００００２ヌクレオチド５３１７３．．５４４０２によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＬ３８３Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１９３に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、およびその相同体を含む。
【００７４】
適した広域特異性アミノ酸ラセマーゼの他の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１９によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２７によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＣＰ  ００００２０．１  ＧＩ：５９４７８７０８の領域８００８４２．．８０２０５３によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＣ＿００６８４０によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＫＴ２４４０  Ｂａｒ  ＤＮＡによってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＹ３９６Ｃ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１１９に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１２７に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の部分遺伝子配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５４の部分遺伝子配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＺ＿ＡＡＬＭ０１０００００２ヌクレオチド５３１７３．．５４４０２によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＬ３８３Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１９３に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、および配列番号１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼから選ばれる１つまたは複数の広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼを含む。いくつかの具体例において、上述の配列同一性パーセントは、少なくとも９５％である。
【００７５】
いくつかの具体例において、ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼの活性を有する酵素、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼの活性を有する酵素、Ｇｅｎｂａｎｋ受入ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼの活性を有する酵素、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、アミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・プチダから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、アミノ酸ラセマーゼシュードモナス・プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、配列番号１２０に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５の部分配列を含有する遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６の部分配列を含有する遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１４６の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸���セマーゼの活性を有する酵素、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１５５の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、および配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素ならびにその活性断片から選ばれる１つまたは複数の酵素を利用して、Ｄ−トリプトファンはＬ−トリプトファンから生成されるまたはＬ−トリプトファンはＤ−トリプトファンから生成される。
【００７６】
図３に示す経路は、Ｒ，Ｒモナチンが所望の生成物である場合でもインドール−３−ピルビン酸を生成する反応と生成物としてモナチンを生成する反応とで同一の酵素を用い得ることを含めた、特定の利点を有する。すなわち、図１に例示した経路では、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（または適切なＬ−酵素）がインドール−３−ピルビン酸を生成する反応を促進するが、Ｄ−アミノトランスフェラーゼがモナチンを生成する反応を促進する。対照的に、図３の経路では、インドール−３−ピルビン酸を生成する反応を促進する特定のＤ−アミノトランスフェラーゼが、モナチンを生成する反応も促進できる。その結果、図３に従った経路では、インドール−３−ピルビン酸を形成する反応とモナチンを形成する反応とで同一の酵素を用いる要求がある場合は、広い特異性のＤ−アミノトランスフェラーゼが好ましい場合がある。対照的に、図１、２、４、６、７、および８に従った経路では、Ｒ−ＭＰと比較してインドール−３−ピルビン酸に対して制限された活性および／または特異性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼを選択した場合は、モナチンの生成がより効率的であり得る。
【００７７】
図３に模式的に表した経路の別の利点は、ここでは、インドール−３−ピルビン酸を生成する反応に関連する反応のアミノ酸生成物を、モナチンを生成する反応に関連する反応において基質として用いることができることである。すなわち、図１に例示した経路では、Ｌ−トリプトファンが反応してインドール−３−ピルビン酸を生成し、同時にオキサロ酢酸、α−ケトグルタル酸および／またはピルビン酸が反応してＬ−アミノ酸を生成する。モナチンを形成するＲ−ＭＰの反応がＤ−アミノ酸を基質として利用する反応に関連しているので、インドール−３−ピルビン酸を形成する反応のＬ−アミノ酸は、示した条件下では、Ｒ−ＭＰの反応に関連する反応で用いるために再利用されない。対照的に、図３に例示した経路では、インドール−３−ピルビン酸を形成するＤ−トリプトファンの反応はＤ−アミノ酸生成物を形成する反応に関連しており、Ｒ−ＭＰの反応に関連する反応で用いるためにＤ−アミノ酸を再利用できる。これにより、工程１で非理論量のアミノアクセプターを用いることが可能となり、工程３のアミノ供与体は工程１で生成される。本発明のいくつかの具体例において、Ｄ−アミノ酸はＤ−アラニンである。
【００７８】
図４および５は、図１に示した経路のさらなる改変を例示する。これらの改変は、Ｌ−トリプトファントランスアミノ化反応に関連する反応によって形成されたアミノ酸生成物を、ＭＰからモナチンへの反応に関連する反応のアミノ酸反応物質で再利用することに向けられている。
【００７９】
図４を参照して、再利用は、Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸への変換およびその逆を促進できる酵素を提供することによって達成する。より具体的には、図４に示すように、Ｌ−トリプトファンが反応してインドール−３−ピルビン酸を形成する際にα−ＫＧが反応してＬ−グルタミン酸を形成する場合に、Ｌ−グルタミン酸からＤ−グルタミン酸への変換およびその逆促進できる、グルタミン酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．３）または機能的な等価物を提供できる。そのような場合、インドール−３−ピルビン酸の生成と一緒に生成物として形成されたＬ−グルタミン酸は、Ｄ−グルタミン酸へのその変換によって部分的に除去され、Ｌ−グルタミン酸の変換から形成されたＤ−グルタミン酸は、ＭＰからモナチンの反応に関連する反応の基質として利用可能となる。同様に、Ｄ−グルタミン酸の反応で形成されたα−ＫＧは、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸の反応に関連する反応の基質として利用可能である。
【００８０】
グルタミン酸ラセマーゼが由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、ペディオコッカス・ペントサウセス、バチルス・プミルス、ラクトバチルス・ファーメンチ、ラクトバチルス・ブレビス、イー・コリ、アキフェックス・ピロフィラス、およびバチルス・サチリスが含まれる。より具体的には（かつ非限定的）、グルタミン酸ラセマーゼは、ペディオコッカス・ペンタオサシウスｍｕｒＩ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ２２７８９）などの核酸から発現させるか、またはラクトバチルス・ブレビス  グルタミン酸ラセマーゼであり得る。
【００８１】
Ｌ−トリプトファンが反応してインドール−３−ピルビン酸を形成する際にオキサロ酢酸が反応してＬ−アスパラギン酸を形成する場合、Ｌ−アスパラギン酸をＤ−アスパラギン酸に変換するためにアスパラギン酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．１３）または機能的な等価物を提供できる。そのような場合、インドール−３−ピルビン酸を生成する同一の反応で形成されたＬ−アスパラギン酸は、Ｄ−アスパラギン酸へのその変換によって部分的に除去され、Ｄ−アスパラギン酸は、ＭＰからモナチンの反応に関連する反応の基質として利用可能となる。同様に、Ｄ−アスパラギン酸の反応で形成されたオキサロ酢酸は、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸の反応に関連する反応の基質として作用するために利用可能である。
【００８２】
アスパラギン酸ラセマーゼ活性を有する適切な酵素の非限定的な例には、ＡＳＰＲ−１０１（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、１２９Ｎ．Ｈｉｌｌ  Ａｖｅ，Ｓｕｉｔｅ  １０３，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ  ９１１０６−１９５５）およびＬ−アスパラギン酸からＤ−アスパラギン酸への変換を促進できるアミノ酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．−）の同族体または変異体が含まれる。
【００８３】
アスパラギン酸ラセマーゼが由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、デスルフロコッカス、サーモコッカス、二枚貝軟体動物スカファルカ・ブロウトニ、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカエグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、バチルス、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、コーロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デサルフィトバクテリウム（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デスルホタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マンハイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、メディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、オーシアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ポラリバクター（Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラルソニア（Ｒａｌｓｏｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が含まれる。
【００８４】
Ｌ−トリプトファンが反応してインドール−３−ピルビン酸を形成する際にピルビン酸が反応してＬ−アラニンを形成する場合、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換するためにアラニンラセマーゼまたは機能的な等価物を提供できる。そのような場合、インドール−３−ピルビン酸を生成する同一の反応で形成されたＬ−アラニンは、Ｄ−アラニンへのその変換によって除去され、Ｌ−アラニンの変換から形成されたＤ−アラニンは、ＭＰからモナチンの反応に関連する反応の基質として作用するために利用可能となる。同様に、Ｄ−アラニンの反応で形成されたピルビン酸は、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸の反応に関連する反応の基質として作用するために利用可能である。
【００８５】
適切なアラニンラセマーゼの非限定的な例には、Ａ８９３６（Ｓｉｇｍａ、ＰＯ  Ｂｏｘ１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，６３１７８）および実施例４に記載のゲオバチルス、ステアロテルモフィルスのアラニンラセマーゼが含まれる。
【００８６】
アラニンラセマーゼが由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、ブルセラ・アボルタス、ストレプトコッカス・ファカエリス、サルモネラ・チフィムリウム、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス、シュードモナス・アエルギノーザ、ビブリオ・コレラ、シゾサッカロミセス・ポンベ、バチルス・セレウスおよびレンチナス・エドデスが含まれる。
【００８７】
実施例９および１２は、上記ラセマーゼの使用、所望のモナチン生成物の比の増加に対するその影響を例示し、ラセマーゼ酵素の潜在的な源を提供する。
【００８８】
図５を参照して、立体反転アミノトランスフェラーゼを用いてＲ−ＭＰからモナチンへの反応を促進する。典型的には、Ｒ，Ｒモナチン（またはＳ，Ｒモナチン）を形成するＲ−ＭＰ（またはＳ−ＭＰ）の反応は、Ｄ−アミノ酸の反応と関連しているが、立体反転アミノトランスフェラーゼは、Ｒ，Ｒモナチン（またはＳ，Ｒモナチン）を形成するＲ−ＭＰ（またはＳ−ＭＰ）の関連する反応を、Ｌ−アミノ酸を用いて促進できる。このようにして、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ反応のＬ−アミノ酸生成物をＭＰからモナチンへのトランスアミノ化の基質として用いることができ、ＭＰからモナチンの反応に関連する反応の生成物（すなわち、オキサロ酢酸、ピルビン酸、および／またはα−ＫＧ）を、Ｌ−トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸の反応に関連する反応の出発物質として用いることができる。使用し得る立体反転アミノトランスフェラーゼの非限定的な例には、Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．７２、Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼとしても知られる）、Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４１、Ｄ−メト−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−メチオニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼとしても知られる）に由来する変異体およびその同族体が含まれる。Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼの変異体が由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、シュードモナス・プチダＬＷ−４およびシュードモナス・スツツゼリＳＴ−２０１などのシュードモナスが含まれる。Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼが由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、カリフラワーおよびピーナッツが含まれる。
【００８９】
実施例１０および１１は一緒に、立体反転酵素の潜在的な源、およびそのような酵素を作製する方法を提供する。これらの実施例はまた、そのような酵素を同定するためのスクリーニング方法も提供する。そのような酵素は、知られているまたは自然に見つかる立体反転酵素から進化させ得ることも企図される。非限定的な例として、立体反転アミノトランスフェラーゼは、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの同族体もしくは変異体またはアミノ酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．−）の同族体もしくは変異体であり得る。
【００９０】
図６および７はまた、図１の経路の改変も例示する。図６および７に例示した経路は、不可逆反応でトリプトファン反応の副産物を除去し、一部の例ではＭＰ反応の基質を提供することによって平衡反応を前に（すなわち、モナチン生成の方向に）推し進める方法を提供する。
【００９１】
図６を参照して、示した経路は、トリプトファン反応に関連する反応のＬ−アミノ酸生成物を、異なるＬ−アミノ酸およびＣＯ２に変換することによって除去し、その後、新しく形成されたＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することによって、ＭＰの反応に関連する反応の基質を提供する。具体的には、Ｌ−トリプトファンは、オキサロ酢酸と一緒に反応してインドール−３−ピルビン酸およびＬ−アスパラギン酸を形成することが示されている。アスパラギン酸４−脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．１２）または機能的な等価物を用いてＬ−アスパラギン酸からＬ−アラニンおよび二酸化炭素への変換を促進し、アラニンラセマーゼ活性を有する酵素を用いてＬ−アラニンからＤ−アラニンへの変換を促進し、Ｄ−アラニンは、Ｒ−ＭＰからモナチンへの変換のアミノドナーとして役割を果たすことができる。
【００９２】
図７を参照して、示した経路は、トリプトファン反応に関連する反応のＬ−アミノ酸生成物を除去するさらなる方法を例示する。図に示した具体例は、例えば、揮発性（二酸化炭素など）または非反応性の最終産物への自発的変換によって逆方向に反応できない副産物（または複数の副産物）を生成する。そのような手法の例には、α−ＫＧがＬ−トリプトファンと一緒に反応してＬ−グルタミン酸を生成し、および所望の場合、Ｌ−グルタミン酸から４−アミノブタノエートへの変換（副産物として二酸化炭素）を促進できるグルタミン酸脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．１５）または機能的な等価物を提供できる具体例が含まれる。Ｌ−グルタミン酸  脱炭酸酵素が由来し得る潜在的な源の非限定的な例には、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、シー・ウェルチ、またはイー・コリが含まれる。
【００９３】
トリプトファン反応を前方に（モナチン生成の方向に）駆動するための上記のアプローチの他の例は、オキサロ酢酸が、Ｌ−トリプトファンを利用する反応中で補助基質として利用され、オキサロ酢酸が、Ｌ−アスパラギン酸に変換される反応を含む。所望の場合、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１１）または機能的等価物は、β−アラニンへのＬ−アスパラギン酸の変換（副生成物としての二酸化炭素と共に）を促進するために提供できる。
【００９４】
図８を参照して、示す経路は、トリプトファン反応に関連する反応のＬ−アミノ酸生成物を、ＭＰの反応に関連する反応の基質に変換する、さらなる方法を例示する。具体的には、α−ＫＧがＬ−トリプトファンと同一の反応で利用され、ここでα−ＫＧがＬ−グルタミン酸を形成する場合、Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素およびピルビン酸を提供でき、Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼ酵素は、Ｌ−アラニンを形成するピルビン酸とＬ−グルタミン酸との反応を促進する。Ｌ−アラニンからＤ−アラニンへの変換を促進するために、アラニンラセマーゼまたは機能的な等価物も提供でき、Ｄ−アラニンは、モナチンおよびピルビン酸を形成するためにＭＰと共に基質として用いることができる。実施例１２を参照されたい。
【００９５】
Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンまたはＲモナチン前駆体を含むモナチン前駆体の生成のために生合成の経路において必要とされる１つまたは複数の化合物および／または酵素を含有する混合物が、上記の生合成の経路および下記の実施例に記載される反応において暗黙的に記載される。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成については、本明細書に記載される生合成経路または本明細書に記載される経路の個々の工程のうちのいずれかまたはすべては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶液もしくはｉｎ  ｖｉｖｏで、宿主細胞中で、連続して、または並行して進めることができる。本発明の方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる１つまたは複数の反応を利用する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる生合成反応は、反応（複数可）のための所望の成分を水性反応媒体または溶液中での混合によって組み合わせることにより行うことができる。そのように形成された反応混合物は、所望の生成物（複数可）が合成されるのに十分な期間、維持される。
【００９７】
さらに、１つまたは複数の酵素の活性は、１つまたは複数の酵素の精製の間の補因子の継続的な使用を通して増強できる。例えば、Ｂ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼを精製する場合にピリドキサール−５’−リン酸を含むと、活性の増加がもたらされる（実施例１４）。
【００９８】
本発明の経路における１つまたは複数の反応が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることになる場合、本明細書に記載される生合成の経路において利用される酵素のうちのいずれかまたはすべては、所望により、固体担体上に固定化できる。上記の固体担体の例は、エポキシ、アルデヒド、キレーター、または第一級アミン基を含有するものを含む。適した固体担体の特定の例は、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社、フィラデルフィア、ＰＡ）樹脂ビーズおよびＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＥＰ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ社）を含むが、これらに限定されない。実施例２１は、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ樹脂ビーズ上へのＢ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼの固定化を示す。実施例２２は、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ樹脂ビーズ上へのシノリゾビウム・メリロティＰｒｏＡアルドラーゼの固定化を示す。これらの固定化酵素を利用するＲ，Ｒモナチンの生成は、実施例２３に示される。
【００９９】
本発明の経路における１つまたは複数の反応が、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われることとなる場合、当業者は、種々の方法によって、Ｒ，Ｒモナチンを含む、微生物でのモナチンの生成をルーチン的に最適化してもよい。そのような微生物は、以下の非限定的な例の具体例の１つもしくは複数で他の微生物よりも自然に優れている微生物、または（そのような改変の前の微生物と比較して）
・ｔｎａＴ遺伝子を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作する等、微生物によるトリプトファンの取り込みを増加させる、
・（ｉ）Ｌ−アミノ酸の最小量のみを含有する培地中で微生物を成長させること、（ｉｉ）フェニルアラニンパーミアーゼタンパク質を改変すること、および／または（ｉｉｉ）一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分およびフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分を有するキメラタンパク質を作り出すこと等によって、微生物によるＤ−トリプトファンの取り込みを増加させる（Ｃｏｓｇｒｉｆｆ  ＡＪ、Ｂｒａｓｉｅｒ  Ｇ、Ｐｉ  Ｊ、Ｄｏｇｏｖｓｋｉ  Ｃ、Ｓａｒｓｅｒｏ  ＪＰ、Ｐｉｔｔａｒｄ  ＡＪ．「Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＡｒｏＰ−ＰｈｅＰ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２（８）：２２０７〜１７頁（２０００年））、
・微生物によるインドール−３−ピルビン酸の分泌を阻止または低減する、
・微生物によるインドール−３−ピルビン酸の取り込みを増加させる、
・利用可能なインドール−３−ピルビン酸が微生物内で分解されるのを阻止または低減する、
・（ｉ）デアシラーゼが欠乏していない微生物でｔＲＮＡｔｒｐを過剰生成すること、（ｉｉ）適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作すること、（ｉｉｉ）ｔＲＮＡｔｒｐを発現または過剰発現するようにおよび適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作すること、（ｉｖ）遺伝子操作された微生物のバイオマスを生成し、次いでモナチンオペロンを誘導すること、（ｖ）栄養素要求株を補完するためにフェニルアラニン、チロシン、およびイソロイシンに富むペプチドもしくはタンパク質を用いること、（ｖｉ）一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作すること、（ｖｉｉ）Ｄ−トリプトファン以外のＤ−アミノ酸を用いないもしくはその使用を最小化すること、（ｖｉｉｉ）外部からの基質としてＬ−トリプトファンを提供し、Ｌ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換するラセマーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作すること、および／または（ｉｘ）Ｄ−トリプトファンの取り込みの阻害が起こる閾値未満のレベルでＤ−トリプトファンを提供すること等によって、Ｄ−トリプトファンの毒性を緩和する
ように改変された微生物とすることができる。
【０１００】
上記の具体例は下記により詳細に記載される。
【０１０１】
各最適化方法の相対的な効果は、遺伝子操作された微生物によって生成されたモナチンの量を、適切なコントロール、例えば、遺伝子操作されていないおよび／または最適化方法にさらされていない微生物と比較することにより決定されてもよい。利用されることとなる適切なコントロールは、試験されている最適化方法から当業者にとって明らかとなるであろう。
【０１０２】
上記に示されるように、微生物によって生成されるモナチンの量を増加させるための１つの方法は、微生物による、上記に記載されるモナチン生合成の経路で利用される基質のうちの１つであるトリプトファンの取り込みを増加させることである。微生物が取り込むトリプトファンの量が増加する可能性がある１つの方法は、ナトリウム依存性の神経伝達物質輸送体に相同であるまたはそのファミリーであるタンパク質をコードするｔｎａＴ遺伝子をモナチン生成株で発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することである。一具体例において、そのようなｔｎａＴ遺伝子は、シンビオバクテリウム・サーモフィラム（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）に由来する遺伝子である。理論によって拘束されることなく、イー・コリでのＳ．サーモフィラムｔｎａＴ遺伝子の発現は、細菌宿主に、培地からトリプトファンを蓄積するための能力および唯一の炭素源としてトリプトファンで成長するための能力を付与すると考えられている。したがって、ｔｎａＴ遺伝子、例えばＳ．サーモフィラムからのｔｎａＴを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、微生物を成長させている培地からのトリプトファン取り込みの増加をもたらすために用いられてもよい。細菌および古細菌で見つかった、Ｓ．サーモフィラムに由来するｔｎａＴ遺伝子の相同体もまた用いられてもよい。したがって、ｔｎａＴ遺伝子、例えばＳ．サーモフィラムに由来するｔｎａＴ遺伝子またはその相同体を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１０３】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、モナチン生合成の経路で利用されてもよい基質であるＤ−トリプトファンの取り込みを増加させることによって増加させてもよい。微生物が取り込むＤ−トリプトファンの量が増加する可能性がある１つの方法は、微生物の成長培地中に少量のＬ−アミノ酸をただ含むことである。理論によって拘束されることなく、成長培地中のＬ−アミノ酸の枯渇に際して、一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼ系は、成長培地からのＤ−トリプトファンの取り込みを媒介すると考えられている。したがって、少量のＬ−アミノ酸を有する成長培地中で微生物を成長させることは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１０４】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、Ｄ−トリプトファンの取り込みを増加させるようにフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質を改変することによって増加させてもよい。微生物は、そのような改変フェニルアラニンパーミアーゼタンパク質を発現するまたは過剰発現してならびにＴｎａＴ輸送体を発現するまたは過剰発現して、次いでモナチンに変換される可能性がある、微生物の内部で利用可能なＤ−トリプトファンの量を増加させるように遺伝子操作されてもよい。したがって、改変フェニルアラニンパーミアーゼタンパク質を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１０５】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分およびフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質の活性を付与する、配列の少なくともその部分を有するキメラタンパク質を作り出すことによって増加させてもよい。一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼタンパク質およびフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質のキメラタンパク質はトリプトファンを輸送するのにより有効である可能性がある。したがって、一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼタンパク質およびフェニルアラニンパーミアーゼタンパク質のキメラタンパク質を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を最大にするのを助けるために用いられてもよい。
【０１０６】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、微生物からのインドール−３−ピルビン酸の分泌を阻止または低減することによって増加させてもよい。インドール−３−ピルビン酸は上記に記載されるモナチン合成経路中の中間体である。微生物からのインドール−３−ピルビン酸の分泌が阻止または低減される可能性がある１つの方法は、インドール−３−ピルビン酸またはオーキシンのごとき関連化合物を輸送するための能力を有する輸送体の活性を微生物から排除することである。例えば、これらの輸送体は、モナチンを生成するために用いられる微生物で「ノックアウト」されてもよい。したがって、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンは、微生物からインドール−３−ピルビン酸を輸送するための能力を有する輸送体が「ノックアウト」されている微生物で生成されてもよい。
【０１０７】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、微生物によるインドール−３−ピルビン酸の取り込みを増加させることによって増加させてもよい。微生物によるインドール−３−ピルビン酸の取り込みが増加する可能性がある１つの方法は、微生物の中にインドール−３−ピルビン酸を輸送する輸送体の発現を増加させることである。活性化されてもよいまたは活性が増加されてもよい輸送体の例は、輸送体のアミノ酸／オーキシンファミリーおよびＡＵＸ１に対する相同性を呈するプロトン共輸送パーミアーゼを含むが、これらに限定されない。これらの輸送体はすべて、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）のごとき菌類に存在することが報告されている。Ｐｒｕｓｔｙ，Ｒ．およびＧｒｉｓａｆｉ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：４１５３〜４１５７頁（２００４年）。さらに、他の微生物に由来する相同輸送体もまた利用されてもよい。したがって、微生物の中へのインドール−３−ピルビン酸の取り込みを増加させる輸送体を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１０８】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、利用可能なインドール−３−ピルビン酸が微生物内で分解されるのを阻止または低減することによって増加させてもよい。インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸の間の反応の生成物である、高濃度のモナチン前駆体は、モナチンの生成に向けて平衡状態に移るであろう。インドール−３−ピルビン酸が微生物内で分解されるのを阻止または低減する可能性がある１つの方法は、ｉｐｄＣ遺伝子またはその相同体を「ノックアウトする」ことである。ｉｐｄＣ遺伝子またはその相同体はインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする。インドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼは、インドール−３−ピルビン酸からカルボキシル基を除いて、インドール−３−アセトアルデヒドを産生する。インドール−３−アセトアルデヒドの存在は、さらなる分解反応のカスケードを開始する。インドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼの生成を「ノックアウトする」ことによって、利用可能なインドール−３−ピルビン酸は分解されないはずである。より高濃度のインドール−３−ピルビン酸は、モナチンの生成に向けて平衡状態に移るはずである。したがって、ｉｐｄＣ遺伝子またはその相同体の発現または過剰発現が低減されるように微生物を遺伝子操作することは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１０９】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを不活性化することによって増加させてもよい。インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、インドール−３−アセトアルデヒドの分解経路に関連する。インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを不活性化することによって、インドール−３−アセトアルデヒドの濃度は増加し、インドール−３−ピルビン酸の生成に向けて平衡状態に戻るはずである。その結果として、より高濃度のインドール−３−ピルビン酸は、モナチンの生成に向けて反応の平衡状態に移るはずである。したがって、インドール−３−アセトアルデヒドの発現が低減されるように微生物を遺伝子操作することは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるのに有効である可能性がある。
【０１１０】
いくつかの具体例において、Ｒ，Ｒモナチン生成を含むｉｎ  ｖｉｖｏモナチン生成は、Ｄ−トリプトファンの毒性を緩和することならびに／または微生物によるＤ−トリプトファンの耐性および取り込みを増加させることによって増加させてもよい。上記に記載されるモナチンの生成のための生合成経路のうちのいくつかは、出発物質としてＤ−トリプトファンを利用するが、Ｄ−トリプトファンは微生物に対して有毒である可能性がある。したがって、毒性を緩和することならびに／または微生物によるＤ−トリプトファンの耐性および取り込みを増加させることは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１１】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性がある１つの方法は、ｔＲＮＡｔｒｐ（つまりトリプトファンのためのｔＲＮＡ）を過剰生成するように、デアシラーゼが欠乏していない微生物を遺伝子操作することである。
【０１１２】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性がある他の方法は、チロシンまたはトリプトファンのＤ−アミノ酸デアシラーゼを含む適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することである。適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼを発現または過剰発現することによって、ｔＲＮＡ類の再利用が起こり、ｔＲＮＡｔｒｐのごとき、Ｄ−アミノ酸で満たされたｔＲＮＡのプールの集積が回避されることが期待される。したがって、適切なＤ−アミノデアシラーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるのに有効である可能性がある。
【０１１３】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性があるさらに別の方法は、ｔＲＮＡｔｒｐを発現または過剰発現するようにおよびチロシンまたはトリプトファンのＤ−アミノ酸デアシラーゼを含む適切なＤ−アミノ酸デアシラーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することである。したがって、ｔＲＮＡｔｒｐの発現または過剰発現と組み合わせて、適切なＤ−アミノデアシラーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１４】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性があるさらに別の方法は、遺伝子操作された微生物のバイオマスを生成し、次いでモナチンオペロンを誘導することである。次いで、モナチン生成のために誘発されたバイオマスは、Ｌ−アミノ酸が枯渇した新鮮培地に移されてもよい。Ｌ−アミノ酸を枯渇させた新鮮培地へのバイオマスの移動は、Ｌ−チロシンの阻害効果を緩和し、さらにＤ−トリプトファンの取り込みを促進するはずである。したがってバイオマスを生成し、低濃度のＬ−アミノ酸を有する培地にそれを移すことは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１５】
栄養要求性株、特にチロシンおよびフェニルアラニンの栄養要求性株で、Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性がある他の方法は、栄養素要求株を補完するためのフェニルアラニン、チロシン、およびイソロイシンに富むペプチドもしくはタンパク質を用いることならびにＤ−トリプトファンのごときＤ−アミノ酸の輸送についての競合を緩和することである。したがって、フェニルアラニン、チロシン、およびイソロイシンに富むペプチドまたはタンパク質を含有する培地中で微生物を成長させることは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１６】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性があるさらに別の方法は、Ｄ−トリプトファンの取り込みを増加させるであろう一般的な芳香族アミノ酸パーミアーゼ（「ａｒｏＰ」）を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することである。ａｒｏＰ遺伝子の発現または過剰発現は、高コピー数プラスミド上にａｒｏＰ遺伝子をクローニングすることによって増加させてもよい。ａｒｏＰ遺伝子およびモナチンオペロンは、Ｄ−トリプトファンを取り込み、次いで、Ｄ−トリプトファンをモナチンに変換することができる細胞を生成するために同時に誘発されてもよい。したがって、ａｒｏＰ遺伝子を発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することおよび同時にモナチンオペロンを誘導することは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１７】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性があるさらに別の方法は、Ｄ−トリプトファン以外のＤ−アミノ酸の使用を回避することである。したがって、Ｄ−トリプトファン以外のＤ−アミノ酸を含有していない培地中で微生物を成長させることは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１８】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性がある他のメカニズムは、Ｄ−トリプトファンではなく、外部基質としてＬ−トリプトファンを提供することである。次いで、ラセマーゼは、Ｌ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換するために用いられてもよい。Ｌ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換する、上記に記載されるラセマーゼのごときラセマーゼを発現または過剰発現するように微生物を遺伝子操作することは、微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１１９】
Ｄ−トリプトファンの毒性が緩和される可能性があるまたはＤ−トリプトファンの耐性および取り込みが増加する可能性があるさらに別のメカニズムは、Ｄ−トリプトファンの取り込みの阻害が起こる閾値未満のレベルでＤ−トリプトファンを提供することである。したがって、阻害量よりも低い量のＤ−トリプトファンを含有する培地中で微生物を成長させることは、遺伝子操作された微生物によって生成される、Ｒ，Ｒモナチンを含むモナチンの量を増加させるために用いられてもよい。
【０１２０】
さらに、本明細書に記載される生合成経路は、甘い可能性が高いモナチン誘導体を産生するために置換トリプトファンを利用することができる。いくつかの具体例において、本明細書に記載される生合成経路で用いられることとなる置換トリプトファンは塩化トリプトファンおよび５−ヒドロキシトリプトファンを含む。
【０１２１】
例えば、Ｒ，Ｒモナチンに対する構造類似性を有する塩化Ｄ−トリプトファンは、栄養がない甘味料（詳細には６−クロロ−Ｄ−トリプトファン）として同定された。同様に、モナチンのハロゲン化形態およびセドロキシ基置換形態は、甘いことがわかった。米国特許出願公開第２００５／０１１８３１７号。ハロゲンおよび水酸基は、Ｄ−もしくはＬ−トリプトファン、インドール−３−ピルビン酸、ＭＰ、またはモナチンへの続く変換に干渉することなく、詳細には、トリプトファンのインドール中のベンゼン環の位１〜４で水素と置換可能となるはずである。置換インドールは、ＰＬＰ−酵素に適した基質であることが文献に示され、置換トリプトファンを生成した。Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｓ．ら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ  ｂｙ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２１：８４１〜４３頁（１９７１年）。ハロゲンは、トリプトファンシンターゼベータサブユニット触媒メカニズムを立体的に妨害するようには考えられず、エナンチオ特異性もまた損なわれていなかった。
【０１２２】
本明細書に記載される生合成経路において示される個々の反応は、単一の酵素または同時に作用する多数の酵素の混合物によって促進する（触媒する）ことができる。
【０１２３】
本発明の方法は、所望の百分率のＲ，Ｒ−モナチンまたは最低限の所望の百分率のＲ，Ｒ−モナチンを含有するモナチン組成物を作製するために用いることができる。上記に記載される反応工程に加えて、特定の反応工程は、結果として生じた組成物または調製物が、例えば、最低限の所望の百分率のＲ，Ｒ−モナチンまたは最大限の所望の百分率のＲ，Ｒ−モナチンを含む所望の百分率のＲ，Ｒ−モナチンを含有するように、１つを超える酵素、例えば、酵素の混合物によって触媒できる。あるいは、本発明の方法による２つの別々の操作された経路によって作製されたモナチンは、上記の所望の百分率のＲ，Ｒ−モナチンを含有する組成物または調製物を生成するために組み合わせられる。
【０１２４】
指定のクラスの酵素のうちの１つの酵素が例として利用される場合、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の相同性を有する酵素を、その反応において利用できるということが予想される。例えば、配列番号２２のアルドラーゼに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の相同性を有するＲ特異的アルドラーゼを、Ｒ，Ｒモナチンを産生するために、上記に記載される経路のうちのいずれかにおいて利用できる。Ｒ，Ｒモナチンを産生するために、上記の記載される経路のうちのいずれかで利用することができると考えられる酵素の他の非限定的な例は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の相同性を、Ｔ２４３Ｎ突然変異を有する、ＡＴＣＣ４９７８に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼに対して有するＤ−アミノトランスフェラーゼを含む。Ｒ，Ｒモナチンを産生するために、上記の記載される経路のうちのいずれかで利用することができると考えられる酵素の他の非限定的な例は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の相同性を、配列番号１２０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対して有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼを含む。
【０１２５】
さらに、指定のクラスの酵素のうちの１つの酵素が例として利用される場合、同一の活性を有するその酵素の断片を、その反応において利用できるということが予想される。例えば、アルドラーゼとして同様に機能する配列番号２２のアルドラーゼの断片は、Ｒ，Ｒモナチンを生成するために、上記に記載される経路のうちのいずれかにおいて利用できる。
【０１２６】
本明細書中に開示したポリペプチドまたは生合成経路の１つまたは複数を利用して生成したモナチンは、一般的に、生成されたモナチン全体の重量の少なくとも約０．５〜約３０％のＲ，Ｒ−モナチンである。他の具体例において、本明細書中に開示したポリペプチドまたは生合成経路の１つまたは複数を利用して生成したモナチンは、生成されたモナチン全体の重量の３０％を超えるＲ，Ｒ−モナチンである。例えば、Ｒ，Ｒ−モナチンは、生成されたモナチン全体の４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。あるいは、所望の割合のＲ，Ｒ−モナチンである調製物をもたらすために、様々な量のモナチンの２つ以上の調製物を合わせることができる。例えば、３０％のＲ，Ｒ−モナチンであるモナチン調製物を９０％のＲ，Ｒ−モナチンのモナチン調製物と合わせることができ、等量の３０％および９０％のＲ，Ｒ−モナチン調製物を合わせた場合は、生じるモナチン調製物は６０％のＲ，Ｒ−モナチンとなる。
【０１２７】
本明細書中に開示したポリペプチドまたは生合成経路の１つまたは複数を利用して生成したモナチン、または中間体（モナチン前駆体を含む）は、反応の構成要素から精製し得る。一具体例において、モナチン、またはモナチン前駆体などの中間体は、それが合成された酵素調製物から、精製する物質を単純に取り出すことによって精製し得る。
【０１２８】
他の具体例において、中間体、モナチン前駆体、またはモナチンは、生じる「精製した」組成物または調製物が有機化合物全体の重量の少なくとも約５〜６０％のモナチンであるように、それが合成された調製物から精製する。別の具体例において、モナチン、またはモナチン前駆体などの中間体は、有機化合物全体の重量の少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の純度まで精製し得る。本明細書中に開示したポリペプチドまたは生合成経路の１つまたは複数を利用して生成したモナチン、または中間体（モナチン前駆体を含む）は、反応の構成要素から、当業者に知られているいずれかの方法によって精製し得る。一具体例において、モナチンまたは中間体は、実施例１３に記載のように精製されてもよい。最適には、精製したモナチンまたは中間体を所望の純度に達するまで繰り返し再結晶化し得る。
【０１２９】
本明細書に引用される特許および刊行物はすべて、それらの全体が本明細書に参照によって完全に組み込まれる。
実施例
【実施例１】
【０１３０】
モナチン、モナチン前駆体、トリプトファン、アラニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の検出
本実施例は、モナチン、モナチン前駆体（「ＭＰ」）、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、およびグルタミン酸の存在を検出するために用いる方法を記載する。本実施例は、さらに、モナチンの４種の立体異性体の分離および検出のための方法を記載する。
【０１３１】
モナチンおよびトリプトファンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング（「ＭＲＭ」）分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ生化学反応から誘導されたモナチンおよびトリプトファンについての、混合物の分析は、クロマトグラフおよびＭｉｃｒｏｍａｓｓ社製Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ三連四重極質量分析計の間に直列で設置されたＷａｔｅｒｓ社製９９６フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）吸光度モニターと共にＷａｔｅｒｓ社製２７９５液体クロマトグラフを含むＷａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）機器を用いて行った。ＬＣ分離は、４０℃でＸｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ８逆相クロマトグラフィーカラム、２．１ｍｍ×２５０ｍｍを用いて行った。ＬＣ移動相は、Ａ）（ｉ）０．０５％（容量／容量）トリフルオロ酢酸または（ｉｉ）０．３％ギ酸および１０ｍＭギ酸アンモニウムのいずれかを含有する水ならびにＢ）（ｉ）０．０５％（容量／容量）トリフルオロ酢酸または（ｉｉ）０．３％ギ酸および１０ｍＭギ酸アンモニウムのいずれかを含有するメタノールからなるものとした。
【０１３２】
ＬＣ移動相が、Ａ）０．０５％（容量／容量）トリフルオロ酢酸を含有する水およびＢ）０．０５％（容量／容量）トリフルオロ酢酸を含有するメタノールからなるものとした場合、勾配溶出は、０〜４分間は５％Ｂから３５％Ｂまで直線的であり、４〜６．５分間は３５％Ｂから６０％Ｂまで直線的であり、６．５〜７分間は６０％Ｂから９０％Ｂまで直線的であり、７〜１１分間は９０％Ｂの均一溶媒とし、１１〜１２分間は９０％Ｂから９５％Ｂまで直線的であり、１２〜１３分間は９５％Ｂから５％Ｂまで直線的であり、実行の間の再平衡化期間は２分間とした。流速は、０．２５ｍＬ／分とし、ＰＤＡ吸光度は、２００ｎｍから４００ｎｍまでモニターした。ＥＳＩ−ＭＳのパラメータはすべて、注目する分析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の発生および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、かつ選択した。以下の機器パラメータは、モナチンおよびトリプトファンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）分析のために用いた：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン：４０Ｖ；Ｈｅｘ１：２０Ｖ；開口部：０Ｖ；Ｈｅｘ２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／時；コーンガス：５０Ｌ／時；低質量分解能（Ｑ１）：１２．０；高質量分解能（Ｑ１）：１２．０；イオンエネルギー：０．２；入口：−５Ｖ；衝突エネルギー：８；出口：１Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．５；増倍管：６５０。モナチンに特異的な５つの、親から娘へのＭＲＭトランジションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応におけるモナチンを特に検出するために用いる。モニターするトランジションは、２９３．１から１５８．３、２９３．１から１６８．２、２９３．１から２１１．２、２９３．１から２３０．２、および２９３．１から２５７．２とする。トリプトファンは、ＭＲＭトランジション２０４．７から１４６．４でモニターする。モナチンおよびトリプトファンの内部標準物質による定量化のために、ｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンに対する４つの異なる比の各分析物を含有する４つの検量標準物質を分析した。これらのデータは、モナチンおよびトリプトファンについての検量線を作成するために線形最小二乗法にかける。各試料に、定量のｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンを追加し（ｄ５−モナチンは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号からの方法に従ってｄ５−トリプトファンから合成した）、混合物中の各分析物の量を算出するために、上記に記載される検量線と共に、応答比（モナチン／ｄ５−モナチン；トリプトファン／ｄ５−トリプトファン）を用いる。
【０１３３】
ＬＣ移動相が、Ａ）０．３％ギ酸および１０ｍＭギ酸アンモニウムを含有する水ならびにＢ）０．３％ギ酸および１０ｍＭギ酸アンモニウムを含有するメタノールとした場合、勾配溶出は、０〜８．５分間は５％Ｂから４５％Ｂまでの直線的なものとし、８．５〜９分間は４５％Ｂから９０％Ｂまでの直線的なものとし、９〜１２．５分間は９０％Ｂから９０％Ｂまでの均一溶媒とし、１２．５〜１３分間は９５％Ｂから５％Ｂまでの直線的なものとし、実行の間の再平衡化期間を４分間とした。流速は、０．２７ｍＬ／分とし、ＰＤＡ吸光度は、２１０ｎｍから４００ｎｍまでモニターした。ＥＳＩ−ＭＳのパラメータはすべて、注目する分析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の発生および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、かつ選択した。この第２の移動相に用いた機器パラメータは上記と同じである。モナチンに特異的な４つの、親から娘へのＭＲＭトランジションおよびトリプトファンに特異的な１つの、親から娘へのトランジションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応におけるモナチンおよびトリプトファンを特に検出するために用いる。モニターしたトランジションは、２９３．１から１５８．０、２９３．１から１６８．０、２９３．１から２１１．５、および２９３．１から２５７．０である。トリプトファンは、ＭＲＭトランジション２０５．２から１４６．１でモニターする。モナチンおよびトリプトファンの内部標準物質による定量化のために、ｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンに対する４つの異なる比の各分析物を含有する４つの検量標準物質を分析した。これらのデータは、モナチンおよびトリプトファンについての検量線を作成するために線形最小二乗分析にかける。各試料に、定量のｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンを追加し（ｄ５−モナチンは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号からの方法に従ってｄ５−トリプトファンから合成した）、混合物中の各分析物の量を算出するために、上記に記載される検量線と共に、応答比（モナチン／ｄ５−モナチン；トリプトファン／ｄ５−トリプトファン）を用いる。ｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンについてモニターした親から娘への質量トランジションは、それぞれ、２１０．２から１５１．１および２９８．１から１７２．０である。
【０１３４】
モナチンの正確な質量測定
高分解能ＭＳ分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  Ｑ−Ｓｔａｒハイブリッド四重極／飛行時間型質量分析計を用いて行った。プロトン化モナチンの測定質量には、トリプトファンを内部質量検量標準物質として用いた。元素組成Ｃ１４Ｈ１７Ｎ２Ｏ５に基づいた、プロトン化モナチンの算出質量は、２９３．１１３７である。実施例２および３に記載される生体触媒プロセスを用いて生成されるモナチンは、２９３．１１４４の測定質量を示した。これは、１００万分の２（「ｐｐｍ」）未満の質量測定誤差であり、酵素的に生成されたモナチンの元素組成の決定的証拠を提供する。
【０１３５】
モナチンのキラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（「ＭＲＭ」）測定
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応におけるモナチンの立体異性体分布の決定は、１−フルオロ−２−４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミド（「ＦＤＡＡ」）を用いた誘導体化に続けて、逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  ＭＲＭ測定によって達成した。
【０１３６】
ＦＤＡＡを用いたモナチンの誘導体化
５０μＬの試料または標準物質および１０μＬの内部標準物質に、アセトン中ＦＤＡＡの１％溶液を１００μＬまたは２００μＬ追加した。それぞれ２０μＬまたは４０μＬの１．０Ｍ炭酸水素ナトリウムを追加し、混合物は、時々混合しながら４０℃で１時間インキュベートした。試料は、取り出して、冷却し、２０μＬの２．０Ｍ  ＨＣｌを用いて中和した（緩衝生物学的混合物の中和をもたらすために、より多くのＨＣｌを必要としてもよい）。脱気完了後、試料は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析の準備が整った。
【０１３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応における、モナチンの立体異性体分布の決定のためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング
分析は、上記に記載されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ計測装置を用いて行った。モナチン（特にＦＤＡＡ−モナチン）の４種の立体異性体すべてを分離できるＬＣ分離は、４０℃で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製Ｌｕｎａ  ２．０×２５０ｍｍ（３μｍ）Ｃ１８（２）逆相クロマトグラフィーカラムで行った。ＬＣ移動相は、Ａ）０．０５％（質量／容量）酢酸アンモニウムを含有する水およびＢ）アセトニトリルからなるものとした。溶出は、０〜２分間は１３％Ｂで均一溶媒とし、２〜１５分間は１３％Ｂから３０％Ｂまで直線的であり、１５〜１６分間は３０％Ｂから８０％Ｂまで直線的であり、１６〜２１分間は８０％Ｂで均一溶媒とし、２１〜２２分間は８０％Ｂから１３％Ｂまで直線的であり、実行の間の再平衡化期間は８分間とした。流速は、０．２３ｍＬ／分とし、ＰＤＡ吸光度は、２００ｎｍから４００ｎｍまでモニターした。ＥＳＩ−ＭＳのパラメータはすべて、ＦＤＡＡ−モナチンの脱プロトン化分子イオン（［Ｍ−Ｈ］−）の発生および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、かつ選択した。
【０１３８】
以下の機器パラメータは、陰イオンＥＳＩ／ＭＳモードにおける、モナチンのＬＣ／ＭＳ分析のために用いた：キャピラリー：２．０ｋＶ；コーン：２５Ｖ；Ｈｅｘ１：１０Ｖ；開口部：０Ｖ；Ｈｅｘ２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／時；コーンガス：５０Ｌ／時；低質量分解能（Ｑ１）：１２．０；高質量分解能（Ｑ１）：１２．０；イオンエネルギー：０．２；入口：−５Ｖ；衝突エネルギー：２０；出口：１Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１２；高質量分解能（Ｑ２）：１２；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．０；増倍管：６５０。ＦＤＡＡ−モナチンに特異的な３つの、親から娘へのトランジションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応におけるＦＤＡＡ−モナチンを特に検出するために用いる。モナチンについてモニターしたトランジションは、５４３．２から２６８．１、５４３．２から４９９．３、および５４３．２から５２５．３である。モニターしたモナチン内部標準物質誘導体質量トランジションは５４８．２から５３０．３であった。ＦＤＡＡ−モナチン立体異性体の同定は、精製合成モナチン立体異性体と比較したクロマトグラフィーの保持時間および質量スペクトルデータに基づく。内部標準物質は、反応の進行をモニターし、Ｓ，Ｓ立体異性体の保持時間を確定するために用いる。
【０１３９】
グルタミン酸およびアラニンを含めたアミノ酸の液体クロマトグラフィーポストカラム蛍光検出
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応におけるグルタミン酸およびアラニンの決定のためのポストカラム蛍光検出を有する液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＯＰＡ）は、Ｗａｔｅｒｓ社製４７４走査蛍光検出器およびＷａｔｅｒｓ社製ポストカラム反応モジュールと組み合わせたＷａｔｅｒｓ社製２６９０ＬＣシステムまたはその等価物で行った。モナチンおよびトリプトファンの半定量分析もまたこの方法を用いて行った。ＬＣ分離は、６０℃で、相互作用ナトリウム装填イオン交換カラムで行った。移動相Ａは、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ社製Ｎａ  ３２８緩衝液（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社；マウンテンビュー、ＣＡ）とした。移動相Ｂは、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ社製Ｎａ  ７４０緩衝液とした。勾配溶出は、試料マトリックスに依存して、０〜２０分間は０％Ｂから１００％Ｂまでとし、２０〜３６分間は１００％Ｂで均一溶媒とし、３６〜３７分間は１００％Ｂから０％Ｂまで直線的であり、実行の間の再平衡化期間は少なくとも５分間とした。移動相の流速は、０．５ｍＬ／分とした。ＯＰＡポストカラム誘導体化溶液の流速は、０．５ｍＬ／分とした。蛍光検出器設定は、ＥＸ３３８〜３４０ｎｍおよびＥｍ４２０〜４２５ｎｍとした。ノルロイシンを分析のための内部標準物質として使用した。アミノ酸の同定は、精製標準物質についてのクロマトグラフィーの保持時間データに基づくものとした。
【０１４０】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の検出
生化学反応実験からのリシン、アラニン、メチオニン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸のごときＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の混合物を含有する試料は、タンパク質を変性させるためにギ酸を用いて最初に処理した。次いで、試料は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析前に遠心分離し、０．４５μｍナイロンシリンジフィルターで濾過した。Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の同定は保持時間および質量選択的検出に基づくものとした。ＬＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ社製２６９０液体クロマトグラフィーシステムおよびＡＳＴＥＣ社製２．１ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  ＴＡＧクロマトグラフィーカラムをカラム温度を４５℃に設定して用いることによって達成した。ＬＣ移動相ＡおよびＢは、それぞれ、０．２５％酢酸およびメタノール中０．２５％酢酸とした。均一溶媒溶出は、Ｌ異性体およびＤ異性体を分離するためのすべての方法に用いた。リシンは、８０％移動相Ａおよび２０％Ｂを用いて溶出した。グルタミン酸、アラニン、およびメチオニンは、６０％移動相Ａおよび４０％Ｂならびに０．２５ｍＬ／分の流速で溶出して分離した。アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびフェニルアラニンは、すべてについて、３０％移動相Ａおよび７０％Ｂで異性体を分離し、フェニルアラニン以外は０．３ｍＬ／分の流速、フェニルアラニンは０．２５ｍＬ／分の流速で実行した。
【０１４１】
Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の分析のための検出システムは、Ｗａｔｅｒｓ社製９９６フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検知器およびＭｉｃｒｏｍａｓｓ社製Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ三連四重極質量分析計を含んだ。１９５から３５０ｎｍまでを走査するＰＤＡは、クロマトグラフィーシステムおよび質量分析計の間に直列で設置した。正エレクトロスプレーイオン化モード（＋ＥＳＩ）で作動するＭｉｃｒｏｍａｓｓ社製Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ三連四重極質量分析計のパラメータは、以下のように設定した：キャピラリー：３．０ｋＶ；コーン：２０Ｖ；Ｈｅｘ１：１５Ｖ；開口部：１Ｖ；Ｈｅｘ２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス：５３０Ｌ／時；コーンガス：３０Ｌ／時；低質量Ｑ１分解能：１２．５；高質量Ｑ１分解能：１２．５；イオンエネルギー１：０．２；入口：−５；衝突：８；出口１：１０；低質量Ｑ２分解能：１２．５；高質量Ｑ２分解能：１２．５；イオンエネルギー２：０．５；増倍管：６５０Ｖ。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを用いたＭＳ／ＭＳ実験は、グルタミン酸については１４７．８から８４．２および１４７．８から１０２．１、アスパラギン酸については１３４．００から７４．３０および１３４．００から８８．２、リシンについては１４７．３から８５．０、メチオニンについては１５０．３から１０４．８、チロシンについては１８２．３から１３７．０、ロイシンについては１３２．３から８７．０、およびフェニルアラニンについては１６６．３から１２１．０の反応トランジションを選択的にモニターするために設定した。２つのトランジションが記録された場合、後のトランジションを定量化に用いた。トリプトファンについては、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを用いたＭＳ／ＭＳ実験は、２０５．２から１１８．２、２０５．２から１４６．１、および２０５．２から１８８．２の反応トランジションならびにｄ８−ＤＬトリプトファンについては、２１２．１から１５１．１のトランジションを選択的にモニターするために設定した。トリプトファン定量化は、内部標準物質ｄ８−Ｄ，Ｌトリプトファンの分析物応答に対する、トランジション２０５．２から１４６．１の分析物応答の比を決定することにより達成した。あるいは、トリプトファン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸の定量化は、ｍ／ｚ＝１４６．５、ｍ／ｚ＝１０２．１、およびｍ／ｚ＝８８．２のシグナル応答にそれぞれ基づくものとした。
【０１４２】
標準物質およびアッセイのためのモナチンおよびモナチン前駆体（「ＭＰ」）の生成
モナチンの生成
Ｒ，ＲモナチンおよびＳ，Ｓモナチンのラセミ混合物は、米国特許第５１２８４８２号に記載されるように合成して生成した。
【０１４３】
Ｒ，ＲモナチンおよびＳ，Ｓモナチンは誘導体化および加水分解の工程によって分離した。簡潔に言えば、モナチンラセミ混合物をエステル化し、遊離アミノ基はＣｂｚを用いてブロックして、ラクトンを形成し、Ｓ，Ｓラクトンは、固定化プロテアーゼ酵素を用いて選択的に加水分解した。モナチンはまた、Ｂａｓｓｏｌｉ，Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８：１６５２−１６５８，（２００５）に記載されるよう分離することもできる。
【０１４４】
ＭＰ生成
Ｒ−ＭＰは、アミノ受容体としてピルビン酸ナトリウムを用いて、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中のＡＴ−１０３広範囲Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）を用い、Ｒ，Ｒモナチンのアミノ基転移によって生成した。Ｓ−ＭＰは、アミノ受容体としてピルビン酸ナトリウムを用いて、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中のＡＴ−１０２Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）を用い、Ｓ，Ｓモナチンのアミノ基転移によって生成した。両反応は、約２０時間、約８．０〜８．３のｐＨで３０℃で行った。両化合物は、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社製（フィラデルフィア、ＰＡ）疎水性樹脂（ＸＡＤ（商標）１６００）を用いた調整用スケールのＨＰＬＣを用いて、精製し、水中に溶出させた。９０％を超える純度のモナチン前駆体を含有する試料を収集し、凍結乾燥した。
【実施例２】
【０１４５】
インドール−３−ピルビン酸からのモナチンの生成
ＡＴ−１０３トランスアミナーゼは、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社（パサデナ、ＣＡ）から購入したトランスアミナーゼライブラリーの一部であり、またこの酵素は、Ｃ．テストステローニからのＰｒｏＡアルドラーゼを用いる共役反応におけるモナチンの生成について試験した。アルドラーゼは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号に記載のように調製した。ＡＴ−１０３は、アミノ酸供与体としてＤ−アミノ酸（Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸、またはＤ−アラニンのごとき）を必要とするバチルス種からの広域特異性Ｄ−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）である。酵素および付加的な成分／基質を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、１００ｍＭアミノ供与体、および０．１ｍＭピリドキサール−５’−リン酸（「ＰＬＰ」）を含有したキット中に提供された反応緩衝液に直接的に追加した。１ｍＬの反応緩衝液に、以下のものを追加した：４ｍｇインドール−３−ピルビン酸、２０ｍｇピルビン酸、細胞抽出物中に提供される約５０μｇ  ＰｒｏＡ、１μＬ  ２Ｍ  ＭｇＣｌ２、および２ｍｇアミノトランスフェラーゼ酵素（ＡＴ−１０３）。反応は二通り行った。反応は、緩やかに振盪させながら（１００ｒｐｍ）、３０℃で一晩インキュベートした。試料は、実施例１に記載のように濾過し、逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。結果は、約３７０μｇ／ｍＬモナチンがＡＴ−１０３酵素を用いて生成されたことを示した。結果は、クロマトグラフ分離の間に分離する２種の立体異性体プールのピーク面積に基づき、Ｒ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチンに対するＳ，Ｒ／Ｒ，Ｓモナチンの比を決定するためにさらに分析した。ＡＴ−１０３によって生成された全モナチンのうち、６９％は、混合異性体と比較してＲ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチンであった。この酵素（ＡＴ−１０３）は、Ｄ−アミノ酸に対して広域特異性を有することで知られている、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号に記載されるバチルス・スブチリスＤＡＴ酵素に相同である。キラル分析を、実施例１に記載されるＦＤＡＡ方法論を用いて行い、Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、予想どおり、Ｒ，ＲモナチンおよびいくらかのＳ，Ｒモナチンを圧倒的に作製することを検証した。基質としてＳ，ＳモナチンまたはＲ，Ｒモナチンおよびα−ケトグルタル酸を用いたさらなるアミノ基転移実験は、予想どおり、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製酵素が、炭素４のＤ−立体配置に高度に選択的であることを検証した。これらの実験では、グルタミン酸は、基質としてＳ，Ｓモナチンおよびケトグルタル酸を用いた反応において検出されなかった。
【０１４６】
ＡＴ−１０３（広範囲Ｄ−トランスアミナーゼ）およびＰｒｏＡアルドラーゼを用いた共役反応における副生成物として生成されたＳ，ＳモナチンまたはＲ，Ｓモナチンの量を減少させるために、アルドラーゼは、メーカーのプロトコールに従って、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを用いて精製した（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）。精製酵素は、好ましくは、細胞抽出物中に存在し得る野生型Ｌ−アミノトランスフェラーゼ活性（天然イー・コリのＡｓｐＣ活性またはＴｙｒＢ活性のごとき）を含有しないはずである。Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ溶出液は、ＰＤ−１０カラム（Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、イミダゾールを除去するために脱塩し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７中に溶出した。実験は、１ｍＬの容量で二通り実行し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．８、５０μｇ  ＰｒｏＡアルドラーゼ、４ｍｇインドール−３−ピルビン酸、１または２ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭリン酸カリウム、０．１ｍＭ  ＰＬＰ、および１４．７ｍｇのＤ−グルタミン酸を含有した。チューブは、緩やかに振盪させながら３０℃でインキュベートした。２時間の時点のものを取り、−２０℃で直ちに凍結させた。ｐＨはＮａＯＨを用いて５〜７および８の間に２時間の時点で調整し、アッセイは一晩インキュベートした。試料は、実施例１に記載のように、濾過し、モナチンについて分析した。２時間の試料は、おそらく低ｐＨのために、検出可能な量のモナチンを有していなかった。一晩の試料は、１ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合に、約１９０ｎｇ／ｍＬモナチンを含有し、約８４％はＲ，Ｒモナチンであり、１６％はＳ，Ｒモナチンであった。２ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合、５４０ｎｇ／ｍＬモナチンが生成され、約７１％はＲ，Ｒモナチンであった。
【０１４７】
同様の実験を、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＰＬＰ、および１００ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸を含有したＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ緩衝液を用いて進めた。固体インドール−３−ピルビン酸およびＤ−アミノトランスフェラーゼを上記のように追加した。ＰｒｏＡアルドラーゼ（５０μｇ）、ＭｇＣｌ２、および５０ｍＭピルビン酸をストック溶液から追加した。この場合ｐＨ調整は必要ではなかったが、アッセイは上記のように処理した。ネガティブコントロールは、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社供給の酵素および緩衝液だけを用いて行い、モナチンを含有していなかった。実験結果を表１に示す。
【０１４８】
【表１】
2015211679.tif 000004
【０１４９】
リン酸緩衝液中での、モナチンの生成は、Ｔｒｉｓ緩衝系での生成よりもり明らかに高い。
【０１５０】
国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号からのクローニングしたＢ．スブチリスＤＡＴの活性をＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製酵素（ＡＴ−１０３）と比較するために、付加的なアッセイを行った。Ｂ．スブチリスｄａｔ遺伝子は、さらに、ｐＥＴ３０ａ中にサブクローニングし、Ｈｉｓ−６タグを除去した。タグなしおよびタグ付き酵素は、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号に記載のように、ＢＬ２１（ＤＥ３）中で生成した。細胞抽出物を作製し、全タンパク質アッセイを、先に記載のようにタンパク濃度を評価するために行った。以下のものを含有する二通りの１ｍＬの反応を行った：５００μｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、５０μｇ  ＰｒｏＡアルドラーゼ、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍｇ  インドール−３−ピルビン酸、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、７．３５ｍｇ（５０ｍＭ）Ｄ−グルタミン酸、および０．１ｍＭ  ＰＬＰ。試料は、１時間、２時間、および一晩、３０℃でインキュベートし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために濾過した。実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化プロトコールによって決定されるように、試料は、モナチンのＳ，ＲおよびＲ，Ｒ立体異性体のみを含有した。結果を下記の表２に要約する。ＲＲ％は、逆相クロマトグラフィーによって分離されたピーク面積によって決定した。
【０１５１】
【表２】
2015211679.tif 000005
【０１５２】
ＨＩＳ−６タグの除去は、Ｂ．スブチリスＤ−アミノトランスフェラーゼの活性を改善したようである。しかしながら、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製Ｄ−アミノトランスフェラーゼ相同体は明らかに最も高い活性を有した。それは、さらに、Ｒ−モナチン前駆体に対してより高い基質選好性を示した。インキュベーション期間の増加は、生成されるＲ，Ｒモナチンのエナンチオマー過剰率を低下させるようである。
【０１５３】
バチルスＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素が、アミノ受容体としてのピルビン酸およびアミノ供与体としてのＤ−アラニンに対する選好性を有するので、Ｄ−アラニンは、同様のまたはより優れた結果を伴う、モナチンへのＭＰの変換のためのアミノ供与体として利用できると予想された。以下のものを含有する二通りの１ｍＬの反応を行った：５００μｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、５０μｇ精製ＰｒｏＡアルドラーゼ、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍｇインドール−３−ピルビン酸、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸またはＤ−アラニン、および０．１ｍＭ  ＰＬＰ。試料は、２時間インキュベートし、分析前に上記のように処理した。Ｄ−アラニンをアミノ供与体として用いた場合、わずかに高いレベルのモナチンが予想どおり生成された（２１ｐｐｍに対して２３ｐｐｍ）。さらに、高濃度のピルビン酸は、アミノ基転移工程を阻害する可能性があり、従って、長い間にわたるより少量のピルビン酸の添加が、モナチン生成の全体の速度を改善する可能性があることが予想される。上記の表と比較して２分の１のピルビン酸がこの場合に使用されたにもかかわらず、著しくより多くのモナチンが生成されたことが上記のデータから理解できる。たとえ文献におけるＰｒｏＡアルドラーゼが、アルドール縮合生成物のＳ−エナンチオマーを主に生成することが報告されたとしても、本研究で用いるＰｒｏＡアルドラーゼは、高百分率のＲ−ＭＰを明らかに作製し、共役アッセイにおいてＲ，Ｒモナチンを９２％まで生成する。実施例１９に示されたように、高百分率のＲ，Ｒモナチンは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ選択性によるものではない。
【実施例３】
【０１５４】
３Ａ：Ｄ−トリプトファンからのＲ，Ｒモナチンの生成
以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：約６０μｇ  Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ（国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号に記載のように細胞抽出物において供給）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン、０．５ｍｇ  ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０３）、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５または１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、３ｍＭリン酸カリウム（アセテート反応にのみ）、および１０ｍＭ  α−ケトグルタル酸。実験は、アルドラーゼを追加しないネガティブコントロールと共に二通り実行した。試料は、緩やかに振盪させながら、３０℃で、一晩（２０時間）インキュベートした。酢酸ナトリウム試料の実際のｐＨは約５とし、リン酸緩衝試料の最終ｐＨは約７とした。アルドラーゼのどれも、ｐＨ５で著しい活性を有するようではなく、ＰｒｏＡアルドラーゼを含有する試料は、ネガティブコントロールをわずかに超えたが、おそらく実験誤差を超えなかった。リン酸カリウム中では、ＰｒｏＡアルドラーゼは、１．７：１のＲ，Ｒ：Ｓ，Ｒの比で７３．４ｐｐｍのモナチンを生成した（Ｄ−トリプトファンから約６３％Ｒ，Ｒ）。
【０１５５】
バチルスＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素が、アミノ受容体としてのピルビン酸およびアミノ供与体としてのＤ−アラニンに対する選好性を有するので、Ｄ−トリプトファンからＲ，ＲまたはＳ，Ｒモナチンを生成する場合、アルファ−ケトグルタル酸の追加は不必要であることが予想された。上記の実験は、精製ＰｒｏＡアルドラーゼ（５０〜６０μｇ）および２．５時間のインキュベーション期間を用いて、繰り返した（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で）。アルファ−ケトグルタル酸有りおよびなしで二通りの実験を実行した。１０ｍＭアルファ−ケトグルタル酸を追加した場合、５６．１ｐｐｍモナチンが、基質としてのＤ−トリプトファンを用いて形成された（７９．５％Ｒ，Ｒ、２０．５％Ｓ，Ｒ）。アルファ−ケトグルタル酸を省略した場合、１０２．５ｐｐｍモナチンが形成された（７９％Ｒ，Ｒ、２１％Ｓ，Ｒ）。
【０１５６】
シノリゾビウム・メリロティからのＨＭＧアルドラーゼ、Ｃ．テストステローニからのＨＭＧアルドラーゼ、および配列番号２２のアルドラーゼについての全モナチン生成量および異性体分布の比較
ＡＴ−１０３トランスアミナーゼ（広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼ）をＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社（パサデナ、ＣＡ）から購入し、この酵素または実施例１８で生成したＢ．スファエリクス組換え酵素のいずれかを、ＨＭＧアルドラーゼとの共役反応に用いて、米国特許出願公開第２００５２８２２６０号に記載のように、Ｄ−トリプトファンおよびピルビン酸からモナチンを生成した。
【０１５７】
Ｃ．テストステローニ（ＰｒｏＡ）およびＳ．メリロティからのＨＭＧアルドラーゼは、米国出願公開第２００４００６３１７５号および国際公開第０３０９１３９６Ａ２号に記載のように調製し、精製した。試験量の配列番号２２のアルドラーゼを生成するために、５０ｍＬ培養物は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（「ＬＢ」）培地中で約０．５のＯＤ６００まで成長させた。配列番号２１の構築物を含有する株は、２００μｇ／Ｌアンヒドロテトラサイクリンを用いて誘発した。細胞は、誘発後５時間成長させ、細胞抽出物は、メーカーのプロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬）に従って調製した。ベンゾヌクレアーゼ（ｂｅｎｚｏｎｕｃｌｅａｓｅ）およびプロテアーゼインヒビターもまた追加した。細胞抽出物中の可溶性タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．９８．０を用いて濃度および発現パーセントについて分析した。配列番号２２のアルドラーゼは、粗（未精製）酵素として下記の反応のために用いた。
【０１５８】
以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：約５０μｇアルドラーゼ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン、０．５ｍｇ精製Ｂ．スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。実験は、アルドラーゼを追加しないネガティブコントロールと共に二通り実行した。試料は、緩やかに振盪させながら、３０℃で、１時間および一晩（１８時間）インキュベートした。マグネシウムおよびリン酸によって触媒された非酵素反応により、少量のモナチン（＜０．５ｐｐｍ）が一晩の反応でアルドラーゼなしで生成された。それらの値は下記に示す数から差し引いた、また平均した結果を示す。これらの方法を用いて、モナチンが生成された場合に検出された唯一の立体異性体はＲ，ＲおよびＳ，Ｒである。Ｒ，Ｒパーセントを表３において下記に挙げる、またＲ，Ｒパーセントは逆相ＬＣピーク面積によって決定した。
【０１５９】
【表３】
2015211679.tif 000006
【０１６０】
配列番号２２のアルドラーゼについての１８時間試料は、さらに、実施例１に挙げられるＦＤＡＡ誘導体化法によって立体異性体の分布について分析し、結果として９４．９％Ｒ，Ｒモナチンおよび５．１％Ｓ，Ｒモナチンを産生した。配列番号２２のアルドラーゼは、Ｃ．テストステローニおよびＳ．メリロティのＨＭＧアルドラーゼと比較して、Ｒ−ＭＰの生成についてより高いエナンチオ特異性を有する。
【０１６１】
開始基質としてＬ−トリプトファンを用い、かつ米国特許出願公開第２００５２８２２６０号に記載のように生成して、精製した広域特異性Ｌ−アミノトランスフェラーゼであるＨｅｘＡｓｐＣとアルドラーゼを共役させて同実験を並行して行った。これらの反応は、Ｓ，ＳモナチンおよびＲ，Ｓモナチンを主に産生するはずである。反応に、Ｌ−トリプトファンアミノ基転移のためのアミノ受容体として１０ｍＭアルファ−ケトグルタル酸をさらに補足した。さらに、全モナチンについて、二通りの結果を下記に平均し（アルドラーゼが存在しないバックグラウンドレベルを差し引く）、Ｓ，Ｓモナチンパーセントを逆相ＬＣピーク面積に基づいて示す。いくつかの場合では、アルドラーゼはかなりＲ特異的であり、また生成される全モナチンはわずかであるので、立体異性体の分布の逆相による評価は、Ｓ，Ｓ／Ｒ，Ｒモナチンピークと共溶出し得るトリプトファンピークのいくらかのテーリングのためにそれほど正確ではなくなってしまう。この傾向は、それでもなお、アルドラーゼのＲ−特異性の比較において有益である。ＦＤＡＡ誘導体化法を用いるさらなる分析からの結果を数種の試料について括弧中に下記表４に示すが、これらの結果はより正確である。約４００ｐｐｍを超える全モナチン数は、結果を定量するために用いる標準物質の目盛りの直線範囲よりも高く、よって定性的な結果となる。米国特許出願公開第２００５２８２２６０号に示されるように、Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼは、通常、９５〜１００％のＳ，Ｓモナチンを生成する。
【０１６２】
【表４】
2015211679.tif 000007
【０１６３】
配列番号２２のアルドラーゼのＲ−特異性は、ベンチマークＰｒｏＡ酵素と比較してかなり高いことを理解できる。このＲ−特異性はまた、これらの反応におけるＳ−ＭＰに対するＨｅｘＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼの高度な特異性にもかかわらず、生成されたＳ，Ｓモナチン％が低いことにも反映されている。さらに、Ｓ．メリロティＨＭＧアルドラーゼは、生成されたＳ，Ｓモナチンのレベルに基づいて、Ｒ−特異性の点から、Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼおよび配列番号２２のアルドラーゼの間にとどまる。全モナチン数は、Ｒ，Ｒモナチン生成量に対してＳ，Ｓモナチン生成量を比較する場合、アルドラーゼ活性を示すものではない。Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、詳細にはこれらの反応におけるＭＰの濃度では、ＭＰアミノ基転移反応のためのＨｅｘＡｓｐＣほど活性ではない。
【０１６４】
配列番号２２のアルドラーゼのＣ．テストステローニからのＰｒｏＡ酵素とのさらなる比較のために、アルドラーゼに対する様々な比のＤ−アミノトランスフェラーゼを、Ｄ−トリプトファンから開始させる反応で利用した（これらの実験について二通りの試料はない）。反応は、上記に記載のように行った。アルドラーゼ濃度を一定に保った反応については、約５０μｇアルドラーゼを用いた。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの量を一定に保った反応については、０．５ｍｇを用いた。２ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＤ−アミノトランスフェラーゼについては、凍結乾燥した酵素を用いた。２つの最も高いＤ−アミノトランスフェラーゼ濃度については、二通り実行した。
【０１６５】
【表５】
2015211679.tif 000008
【０１６６】
４００ｐｐｍを超えるモナチンレベルについては、結果は標準曲線の直線範囲にはなく、近似値にすぎない。生成されたＲ，Ｒモナチンの最大量は、適切に希釈した場合、約１１００ｐｐｍであった。１０ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ試料を用い、配列番号２２のアルドラーゼについて、ＦＤＡＡ立体異性体の分析を行った。２時間で、試料は、９８．５％Ｒ，Ｒモナチンを含有した。１７時間で、試料は、９５．９％Ｒ，Ｒモナチンを含有した。配列番号２２のアルドラーゼは、長期のインキュベーション期間の後で、かつ大量のアミノトランスフェラーゼを用いたにもかかわらず高百分率のＲ，Ｒモナチンを生成した。十分なＤ−アミノトランスフェラーゼが供給された場合、配列番号２２のアルドラーゼは、Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼと同じくらいの全モナチンを生成し、同様の
特異的活性を示す。
【０１６７】
【表６】
2015211679.tif 000009
【０１６８】
アルドラーゼ濃度を変動させても、全モナチンはあまり増加しない。Ｒ，Ｒパーセントは、詳細にはＤ−アミノトランスフェラーゼが制限されている場合、時間と共に、さらにはアルドラーゼ濃度と共に減少する。
【０１６９】
試験したアルドラーゼのＲ−特異性をさらに調査するために、実験は、Ｌ−トリプトファンおよび米国特許出願公開第２００５２８２２６０号に記載のように生成し、精製したＨｅｘＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼで開始して行った。ＨｅｘＡｓｐＣは、Ｒ−ＭＰに対してＳ−ＭＰのアミノ基転移に強い選択性を示し、従って、５０％を超えるＲ，Ｓモナチン百分率により、アルドラーゼが非常に立体特異的であることを示す。１０ｍＭアルファ−ケトグルタル酸をアミノ受容体として供給した。しかしながら、高濃度では、ピルビン酸もまたＬ−アミノトランスフェラーゼによって利用される。これらの反応では、通常、Ｓ，ＳモナチンおよびＲ，ＳモナチンのみがＦＤＡＡ誘導体化プロトコールの検出限界内で生成される。
【０１７０】
【表７】
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【０１７１】
【表８】
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【０１７２】
配列番号２２のごとき高度にＲ特異的なアルドラーゼについては、生成される全モナチンはより少なく、アルドラーゼの量を増加させると全モナチン（およびＳ，Ｓ％）が増加する。これらのアルドラーゼが生成する、用いるＬ−アミノトランスフェラーゼにとって好ましい基質であるＳ−ＭＰ基質はより少ない。ＰｒｏＡのごときそれほどＲ特異的ではない酵素については、アルドラーゼを増加させても全モナチン生成量またはＳ，Ｓモナチン％は著しく改善されない。追加するＬ−アミノトランスフェラーゼの量を増加させると、生成されるＳ，Ｓモナチンの百分率は減少する。
【０１７３】
配列番号２２のアルドラーゼの活性および特異性を、２つの緩衝系−上記の１００ｍＭリン酸カリウムおよび１００ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）（３ｍＭリン酸カリウムを有する）においてさらに研究した。アッセイは、１ｍｇ／ｍｌ  ＡＴ−１０３  Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよび５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファンを用いて上記のように行った。実験は、４．５時間、二通り実行した。配列番号２２のアルドラーゼは、リン酸カリウム中で、１１６ｐｐｍモナチンおよび９９．１％Ｒ，Ｒモナチンを生成した（ＦＤＡＡ誘導体化法）。ＭＯＰＳ中では、配列番号２２のアルドラーゼは、７５．５ｐｐｍモナチンを生成し、９６．２％はＲ，Ｒモナチンであった。コントロールにおいてでさえ、配列番号２２のアルドラーゼなしでＭＯＰＳ中で生成されたモナチンのバックグラウンドレベルは、著しくより高く、Ｒ，Ｒパーセントは、ＭＯＰＳでより低かった。Ｄ−アミノトランスフェラーゼ選択性および活性は、ＭＯＰＳの存在によって影響される可能性がある。
【０１７４】
配列番号２１のサブクローニング
配列番号２１のアルドラーゼ遺伝子は、Ｄｉｖｅｒｓａ社、サンディエゴ、カリフォルニアから得た。配列番号２１は、アルドラーゼ遺伝子についてＤｉｖｅｒｓａ社によってスクリーニングされた環境ライブラリーの一部であった。しかしながら、配列番号２１のアルドラーゼ遺伝子は、当業者に知られているいずれかの方法によって再構築されてもよい。例えば、配列番号２１のアルドラーゼ遺伝子は、実施例１０、１８、および１９に記載のように、アセンブリーＰＣＲ法を利用して再構築されてもよい。
【０１７５】
以下のプライマーは、アルドラーゼ遺伝子（配列番号２１）をＰＣＲ増幅するために用いた：5'-gaggagctcgagtcagacgtatttcagtcctttttc-3'（配列番号２３）および5'-agaagacatatgatttatcagccggggac-3'（配列番号２４）。結果として生じたＰＣＲ産物は、操作してプライマーにした部位で切断するためにＸｈｏＩおよびＮｄｅＩを用いて消化した。断片はゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ））、ＸｈｏＩおよびＮｄｅＩを用いて消化し、かつゲル精製したｐＥＴ２８ｂ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｎｏｖａｇｅｎ社マディソン、ＷＩとライゲーションした（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用）。ライゲーションしたものは、ＴＯＰ１０Ｆ’化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）中に形質転換した。平板上で成長するコロニーを挿入断片についてスクリーニングし、挿入断片を有する数個の単離物をＤＮＡ配列分析（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社、ビバリー、ＭＡ）にかけた。
【０１７６】
配列番号２２のアルドラーゼの精製
確認したアルドラーゼクローンは、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）のいずれかに形質転換した。適切な抗生物質を用いて成長させた一晩培養物を、新鮮な培地中に希釈し（通常１：１００）、３７℃で通気しながらＯＤ６００〜０．６まで成長させた。次いで、培養物は、１ｍＭ  イソプロピルチオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を用いて誘発し、３０℃（通気有り）に移し、インキュベーションを一晩継続した。細胞は、遠心分離によって採取した。細胞ペレットは、細胞溶解を助けるために、通常、１回の凍結解凍サイクルにかけた。細胞ペレットは、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中で溶解させた（メーカーのプロトコールに従って）。細胞片は遠心分離によって除去した。粗タンパク質抽出物は、メーカーのプロトコールに従って調製したＨｉｓＢｉｎｄカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）にかけた。カラムは洗浄し、タンパク質はメーカーのプロトコールに従って溶出した。精製タンパク質は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて脱塩した。交換に用いた緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２とした。精製タンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ社製遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ）を用いて濃縮した。
【０１７７】
３Ｂ：配列番号１０３のクローニングおよび配列番号１０４のアルドラーゼのアッセイ
配列番号１０４のアルドラーゼをコードする遺伝子（遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１０３として示される）を精製を考慮するためにＮ末端Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ｂ発現ベクター（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の中にサブクローニングした。
【０１７８】
クローニングのために用いるプライマーを下記に示す。
5'-ATAAGACATATGCCTATCGTTGTTACGAAG-3'（Nde I制限部位）（配列番号105）および
5'-ATAAGAGGATCCTTATTCCTCGGGCAGCCGCTC-3'（BamH I制限部位）（配列番号106）。
【０１７９】
配列番号１０３を含有するクローンを、Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから得て、ＰＣＲのための鋳型として用いた。しかしながら、配列番号１０３は、当業者に知られている他の方法によって再構築することができる。例えば、配列番号１０３は、実施例１０、１８、および１９に記載されるように、アセンブリーＰＣＲ法を利用して再構築することができる。配列番号１０３は、ＰＣＲによって増幅し、適切な酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を用いて消化し、かつゲル精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））。消化物は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、かつゲル精製したｐＥＴ２８ｂ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にライゲーションした。ライゲーションしたものは、ＴＯＰ１０イー・コリ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換した。コロニーからのミニプレップＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動を用いるサイズ比較によって挿入断片の存在について分析した。挿入断片を有する単離物をＤＮＡ配列分析（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）にかけた。
【０１８０】
アルドラーゼの精製
確認したアルドラーゼクローンを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に形質転換した。配列番号２２のアルドラーゼもまた活性の比較のために同時に調製した。誘発は、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを用いて３０℃でＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴａｒｔｏｆｆおよびＨｏｂｂｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｆｏｃｕｓ  ９：１２（１９８７年）中で一晩行った。適切な抗生物質を用いて成長させた一晩培養物を、新鮮な培地中に希釈し（通常１：１００）、３７℃で通気しながらＯＤ６００〜０．６まで成長させた。次いで、培養は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発し、３０℃（通気有り）に移し、インキュベーションを一晩継続した。細胞は、遠心分離によって採取した。細胞ペレットは、細胞溶解を助けるために、通常、１回の凍結解凍サイクルにかけた。細胞ペレットは、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で溶解させた（メーカーのプロトコールに従って）。細胞片は遠心分離によって除去した。粗タンパク質抽出物は、メーカーのプロトコールに従って調製した１０ｍｇ容量ＨＩＳ−Ｂｉｎｄカラム（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にかけた。カラムは洗浄し、タンパク質はメーカーのプロトコールに従って溶出した。精製タンパク質は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて脱塩し、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５中に溶出した。精製タンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ遠心濃縮器（５０００  ＭＷカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて濃縮させた。濃縮の後、配列番号１０４のアルドラーゼのうちのいくつかが沈殿したことに注目した。しかしながら、その沈殿は、酵素の活性のレベルに影響するようには考えられなかった。アッセイを行うまで、タンパク質は−８０℃で保存した。タンパク質アッセイは、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）およびタンパク質標準物質としてウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を用いるマイクロタイタープレートプロトコールを用いて行った。Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｐｒｏ２６０電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）は、精製試料中のアルドラーゼの百分率を算出するためにならびに可溶性細胞抽出物におけるおよび全タンパク質における発現レベルを評価するために用いた。
【０１８１】
精製アルドラーゼの試験
精製アルドラーゼは、Ｄ−トリプトファンからＲ，Ｒモナチンを生成するそれらの能力について試験した。アッセイは、アッセイ当たり同じ濃度の酵素（５０μｇ／ｍＬ）を用いて、精製タンパク質を用いて、微量遠心チューブ中で二通り行った。２ｍｇ／ｍＬのＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ  ＡＴ−１０３をＤ−アミノトランスフェラーゼとして用いた。以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：アルドラーゼ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。試料は、振盪させながら３０℃でインキュベートした。３０分間、１時間、３時間、および一晩（１９時間）の試料を測った。表９は、逆相ピーク面積によって決定されるように、各時点で生成された全モナチンの平均した結果および生成されたＲ，Ｒモナチン％を示す。実施例１に記載されるさらなるＦＤＡＡ誘導体化ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を反応のうちのいくつかについて行った、また括弧中に示す。
【０１８２】
【表９】
2015211679.tif 000012
【０１８３】
配列番号１０４のアルドラーゼは配列番号２２のアルドラーゼよりも高い活性およびＲ，Ｒモナチンの生成についてのより高い立体特異性を有した。
【０１８４】
配列番号１０４のアルドラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を下記に示す。
atgcctatcg ttgttacgaa gatcgaccga cccagcgcgg cggacgtcga 
aaggatcgcc gcctatggtg tcgcgacctt gcatgaagcg caaggacgaa 
ccgggttgat ggcgtccaat atgcgcccaa tctatcgccc tgcgcacatt 
gccgggcccg cggtgacctg ccttgtggcg cctggcgaca attggatgat 
ccatgtcgcc gtcgaacagt gccagccggg agatgtcctg gtcgtggtac 
cgaccagccc ctgcgaagac ggctatttcg gcgatctgct ggcgacctcg 
ctgcggtcgc gcggggtcaa aggtctgatc atcgaggccg gcgtacgcga 
tatcgcgaca ttgaccgaga tgaaattccc ggtctggtcc aaggcggtgt 
tcgcgcaagg aacggtcaag gagaccatcg ccagcgtcaa tgtgcccctc 
gtctgcgcgg gcgcccgcat cgtgccgggc gatctgatcg ttgccgacga 
cgacggggtc gtcgtgattc caagacgttc cgttccggcg gtcctttcca 
gcgccgaggc ccgcgaagag aaggaagccc gcaaccgcgc ccgcttcgaa 
gctggcgagc tgggcctcga cgtctacaac atgcgccagc gcctggccga 
caagggcttg cgctatgtcg agcggctgcc cgaggaatag（配列番号103）。
【０１８５】
配列番号１０４のアルドラーゼのタンパク質配列は以下の通りである。
Met Pro Ile Val Val Thr Lys Ile Asp Arg Pro Ser Ala Ala Asp Val Glu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Val Ala Thr Leu His Glu Ala Gln Gly Arg Thr Gly Leu Met Ala Ser Asn Met Arg Pro Ile Tyr Arg Pro Ala His Ile Ala Gly Pro Ala Val Thr Cys Leu Val Ala Pro Gly Asp Asn Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln Cys Gln Pro Gly Asp Val Leu Val Val Val Pro Thr Ser Pro Cys Glu Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Arg Gly Val Lys Gly Leu Ile Ile Glu Ala Gly Val Arg Asp Ile Ala Thr Leu Thr Glu Met Lys Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Val Phe Ala Gln Gly Thr Val Lys Glu Thr Ile Ala Ser Val Asn Val Pro Leu Val Cys Ala Gly Ala Arg Ile Val Pro Gly Asp Leu Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Val Ile Pro Arg Arg Ser Val Pro Ala Val Leu Ser Ser Ala Glu Ala Arg Glu Glu Lys Glu Ala Arg Asn Arg Ala Arg Phe Glu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Val Tyr Asn Met Arg Gln Arg Leu Ala Asp Lys Gly Leu Arg Tyr Val Glu Arg Leu Pro Glu Glu（配列番号104）。
【実施例４】
【０１８６】
４Ａ：（１）トリプトファンラセマーゼ
Ｒ，Ｒ−モナチンは、Ｄ−トリプトファンを出発物質として用いた場合に、Ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびアルドラーゼを用いて生成した（実施例３）。それにもかかわらず、Ｌ−トリプトファンはいくつかの理由で好ましい出発物質となる可能性がある。例えば、Ｌ−トリプトファンは、Ｄ−トリプトファンよりも高価ではなく、容易に入手可能である可能性がある。本開示は、活性トリプトファンラセマーゼを得るための数種の方法を記載する。Ｒ，Ｒモナチンの収量は、Ｒ特異的アルドラーゼ、すなわち、Ｒ−ＭＰを優先的にまたは選択的に生成するアルドラーゼを用いることより改善される。図１および２は、トリプトファンラセマーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、およびＲ特異的アルドラーゼを用いて、Ｌ−トリプトファンから立体異性的に豊富なＲ，Ｒモナチンを生成するための方法を示す。
【０１８７】
トリプトファンラセマーゼについて選択は、成長のために活性ラセマーゼを必要とする株を構築することによりもたらされた。トリプトファン栄養素要求株は、最少培地上で成長する場合、Ｌ−トリプトファン源を必要とする。Ｄ−トリプトファンの培地への補足は、Ｄ−トリプトファンをＬ−トリプトファンに変換するラセマーゼを選択するための１つの方法となる。Ｄ−トリプトファンを補足した最少培地上での成長についてトリプトファン栄養素要求株を試験した。株、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  ＣｅｎｔｅｒからのＣＡＧ１８４５５およびＣＡＧ１８５７９ならびにＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４（さらにｌｉｐＡ−、λＤＥ３溶原化、そのプラスミドが抜かれている）は、Ｄ−トリプトファンを補足した場合、成長しなかったが、Ｌ−トリプトファンを補足した場合、成長した。イー・コリを宿主生物として用いてもよいが、酵母、他の細菌、または他の真核生物のごとき他の宿主生物もまた用いてもよい。トリプトファン栄養素要求株（特にＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４（さらにｌｉｐＡ−、λＤＥ３溶原化、そのプラスミドが抜かれている））は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼで形質転換した場合、Ｄ−トリプトファンで成長するであろう。これにより、細胞にＤ−トリプトファンを輸送するイー・コリの能力が確認される。
【０１８８】
ＳａｌｃｈｅｒおよびＬｉｎｇｅｎｓは、シュードモナス・オーレオファシエンス（ＡＴＣＣ１５９２６）におけるトリプトファンラセマーゼの存在を記載した。Ｓａｌｃｈｅｒ，Ｏ．およびＬｉｎｇｅｎｓ，Ｆ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２１：４６５−４７１（１９８０）。トリプトファンラセマーゼはまた、タバコ、ビート、トマト、および小麦を含めた数種の植物においても記載されており、酵素は、浸透ストレスまたは乾燥の状態によって誘発されるようである。トリプトファンラセマーゼは、天然のモナチン生成経路においてスクレロキトン・イリキフォリウスで役割を果たす可能性がある。このラセマーゼ活性を単離するために、発現ライブラリーをＡＴＣＣ１５９２６（またはトリプトファンラセマーゼ活性を有する他の生物）から構築し、ライブラリーをトリプトファン栄養素要求株に形質転換する。トリプトファン源としてＤ−トリプトファンを用いて成長するであろう株が選択される。Ｄ−トリプトファンに対して活性を有するラセマーゼを探すために知られているラセマーゼを用いて多くの株をスクリーニングするために、類似する方法もまた用いられる。Ｄ−トリプトファンに対する活性を有し得るラセマーゼの例は、アラニンラセマーゼ、セリンラセマーゼ、およびグルタミン酸ラセマーゼを含む。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ．およびＥｓａｋｉ，Ｎ．，「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒａｃｅｍａｓｅｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９６，１０３−１０９，（２００３）。
【０１８９】
アラニンラセマーゼはピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性であり、サルモネラ・チフィリウムからクローニングされた（ｄａｄＢ遺伝子）。アラニンラセマーゼの他の源は、エシェリキア・コリ、バチルス・スブチリス、シュードモナス・エルジノーサ、ビブリオ・コレレ、シゾサッカロミセス・ポンベ、およびバチルス・セレウスである。担子菌類のキノコ、シイタケもまた活性の広いアラニンラセマーゼを含有する。
【０１９０】
セリンラセマーゼもまたＰＬＰ依存性であり、真核生物（例えば、カイコ、ラット脳、マウス脳ｃＤＮＡ）におよび細菌（エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ））に発見されている。
【０１９１】
グルタミン酸ラセマーゼは、ＰＬＰ非依存性であり、ペディオコッカス・ペントサセウス、バチルス・プミルス、ラクトバチルス・ファーメンチ、ラクトバチルス・ブレビス、イー・コリ、アクイフェックス・ピロフィルス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ）、およびバチルス・スブチリスからクローニングされた。いくつかのグルタミン酸ラセマーゼは非常に特異的であり、結果的に、構造上類似するアミノ酸、アスパラギン酸、アスパラギン、およびグルタミンでさえ酵素に対する基質とならない可能性がある。
【０１９２】
アスパラギン酸ラセマーゼもまた存在し、ＰＬＰ非依存性である。アスパラギン酸ラセマーゼは、ラクトバチルス株、ストレプトコッカス株、ならびにデスルフロコッカス株およびサーモコッカス株のごときいくつかの古細菌に発見されている。二枚貝軟体動物アカガイもまたアスパラギン酸ラセマーゼを含有する。
【０１９３】
文献に見い出される他のラセマーゼは、アナベナ種およびシュードモナス・ストリアタからのアミノ酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．１０）、プロリンラセマーゼ、ならびに多機能フェニルアラニンラセマーゼを含む。関連するエピメラーゼまたはラセマーゼもまた試験されている。潜在的なラセマーゼは、それらがＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼではないことを確かめるために試験される。潜在的なラセマーゼのスクリーニングは、配列分析および／または酵素アッセイによって行われる。トリプトファンラセマーゼの選択のためのこのスクリーニング法は、さらに、トリプトファンラセマーゼが記載された他の細菌または古細菌におよび発現を可能にする様式で構築された真核生物ｃＤＮＡライブラリーに用いられる。
【０１９４】
トリプトファンラセマーゼとして試験を通過する酵素は、実施例８に記載のように、モナチンに対する活性についてスクリーニングする。トリプトファンに非常に特異的で、モナチンに対してラセマーゼ活性をほとんどまたは全く有していない酵素を得ることが理想的である。
【０１９５】
トリプトファンラセマーゼはまた、既存のラセマーゼ、トランスアミナーゼ、またはエピメラーゼから（突然変異誘発または組換え操作を介して）進化させてもよいおよび／または改善させてもよい。さらに、アラニンアミノトランスフェラーゼ（および他のアミノトランスフェラーゼ）の結晶構造が知られているので、これらは、合理的で構造に基づく突然変異誘発の基礎として用いてもよい。上記に記載されるプロセスは、トリプトファンラセマーゼ活性についての最初の選択としておよび改善された活性のスクリーニングとして用いられる。
【０１９６】
（２）トリプトファンラセマーゼライブラリー
ライブラリーの構築：
バークホルデリア・ピロシナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎａ）（ＡＴＣＣ１５９５８）およびシュードモナス・クロロラフィス（ＡＴＣＣ１５９２６）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９、マナサス、ＶＡ、２０１０８、ＵＳＡから得た。それらは、ＡＴＣＣによって推奨されるように成長させ、ゲノムＤＮＡは、Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．，「Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ」，Ｃｅｌｌ  ３５：２５３−２６３，（１９８３）に記載される方法に従って調製した。ゲノムＤＮＡは、Ｓａｕ３ＡＩ制限酵素を用いて部分的に消化した。１〜３Ｋｂｐ断片を、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いてゲル精製した。精製ＤＮＡは、上記のようにＢａｍＨＩを用いて消化し、かつ精製したｐＴｒｃ９９ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）にライゲーションした。ライゲーションは、ベクターに対する挿入断片の３：１のモル比を用いて、一晩のインキュベーションにより室温で行った。ライゲーションライブラリーは、ＴＯＰ１０Ｆ’化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）中に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを用いてＬＢ培地上で平板培養した。形質転換平板培養物の一晩のインキュベーションの後、コロニーを平板からこすり取り、液体ＬＢ培地で洗浄した。適切なサイズの細胞ペレットを、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いてミニプレップした。約３０，０００コロニーをプールし、ミニプレップした。
【０１９７】
プールしたプラスミドは、（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒからの）ＣＡＧ１８４５５（ｔｒｐＣ８３：：Ｔｎ１０、ｒｐｈ−１）またはＣＡＧ１８５７９（ｔｒｐＣ：：Ｔｎ１０ｋａｎ、ｒｐｈ−１）中に形質転換した。両株は、トリプトファン栄養素要求株であり、従って、培地にトリプトファンを補足しない限り、それらはＭ９最少培地（Ｄｉｆｃｏ社）上で成長しないであろう。形質転換体は、Ｄ−トリプトファンを補足したＭ９最少培地上で平板培養した。これにより、Ｄ−トリプトファンをＬ−トリプトファンに変換できる株を選択する。
【０１９８】
ライブラリーの形質転換前に、株は、ＬまたはＤ−トリプトファンを有する最少培地上での成長について試験した。Ｄ−トリプトファンを補足した最少培地上での成長について株を試験すると、成長は観察されなかった。両株は、Ｄ−トリプトファンの代わりにＬ−トリプトファンを補足した同一の培地上で成長した。さらに、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４の誘導体（用いる株は、トリプトファンオペロンプラスミドが抜かれ、λＤＥ３で溶原化され、他の染色体にコードされた突然変異（ｓｅｒＢ、ΔｔｒｐＥＤ、ｔｎａＡ２、ａｒｏＰ）に加えてｌｉｐＡが欠失していた））をバチルス・スブチリスからのＤ特異的アミノトランスフェラーゼを用いて形質転換した（国際公開第０３／０９１３９６号）。ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４株は、Ｄ−トリプトファンを補足した最少培地上で成長できなかったが、Ｄ−トリプトファンの代わりにＬ−トリプトファンを補足した同一の培地上で成長した。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現はＴ７プロモーターによって駆動された。形質転換株は、Ｄ−トリプトファンを補足したＭ９最少培地上で成長できた。
【０１９９】
Ｄ−トリプトファン培地上で成長したコロニーをスクリーニングする。プラスミドは、Ｄ−トリプトファン培地上での成長が、宿主突然変異ではなくプラスミドに依存性であることを確認するために、単離し、親株（ＣＡＧ１８４５５またはＣＡＧ１８５７９）に再形質転換する。トリプトファン栄養要求性を補完するプラスミドのヌクレオチド配列を分析する。トリプトファンラセマーゼ遺伝子を含有すると決定されたクローンをさらに分析する。
【０２００】
他の組織源からのトリプトファンラセマーゼを類似する様式で単離する。タバコ組織培養細胞（タバコ  Ｌ．品種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ３８）（Ｍｉｕｒａ，Ｇ．Ａ．およびＭｉｌｌｓ，Ｓ．Ｅ．，「Ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｔｏ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ」，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７：４８３−４８７，（１９７４））ならびに小麦（コムギ）の粗タンパク質抽出物（Ｒｅｋｏｓｌａｖｓｋａｙａ，Ｎ．Ｉ．ら，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４：１９６−２０３，（１９９７））の双方においてトリプトファンラセマーゼ活性の文献報告がある。ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、文献に記載のように組織から作製し、発現ライブラリーは、上記に記載のようにトリプトファン栄養素要求株を形質転換するために用いる。
【０２０１】
文献に記載されるのと同一の株が使用され、かつ同一の成長条件が再生成される場合、トリプトファンラセマーゼ活性を有する酵素を単離できることまたはｍＲＮＡを単離できることおよびトリプトファンラセマーゼ活性を有する酵素のコード配列を含有するであろうｃＤＮＡ発現ライブラリーを調製できることが予想されると考えられる。例えば、ある種の成長段階またはある種の培地成分は、トリプトファンラセマーゼ活性を有する酵素の細胞性生成を誘発するために必要とされる可能性がある。
【０２０２】
（３）トリプトファンラセマーゼアッセイ
トリプトファンラセマーゼを可能性として有するとして同定されたクローンを、ＢＬ２１のごとき組換えタンパク質の発現に一般的に用いられるイー・コリの株に形質転換する。細胞は、０．４〜０．６の６００ｎｍの光学濃度までＬＢブロス中で成長させる。ラセマーゼの発現を駆動するプロモーターは、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（０．１ｍＭ最終濃度）を用いて誘発する。誘発の後、細胞に、３７℃（通気有り）で１〜３時間タンパク質を発現させる。細胞は、採取し、フレンチプレス、超音波処理によって、または化学的手段（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）のごとき）によって溶解させる。溶解させた細胞は、細胞片を除去するために遠心分離する。清澄抽出物をアッセイに直接的に用いる。
【０２０３】
様々な量の抽出物を、溶液に追加し、最終濃度を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）および２ｍＭ  Ｌ−トリプトファンとする。ピリドキサール−５’−リン酸を１０μＭの最終濃度で追加する。試料は、インキュベートし、次いでＬＣ／ＭＳによって分析する。Ｌ−トリプトファンのみが基質として用いられる場合のＤ−トリプトファンピークの存在は、ポジティブの結果を示す。Ｄ−トリプトファン濃度は、平衡に達するまで、時間の経過と共に増加するはずであり、酵素の濃度が十分に高くなって酵素が基質で飽和されなくなるまで、速度もまたタンパク質濃度と共に増加するはずである。Ｄ−トリプトファンは、さらに、上記のようにＬ−トリプトファンに変換され得る。
【０２０４】
補完遺伝子は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼをコードしてもよい。このアミノ基転移反応は、アミノ受容体としてのα−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸塩、またはピルビン酸のごときアルファ−ケト酸を必要とする。これらの化合物は、通常少量で、細胞抽出物中におそらく存在するであろう。これらの化合物はＰＤ−１０脱塩カラムを用いて除去してもよく、アッセイは、なお、粗抽出物中で行ってもよい。同様に、補完遺伝子はまた、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼをコードしてもよい。これらの酵素もまた、ＰＤ−１０脱塩カラムによって除去できる補因子および補助基質を必要とする。トリプトファンラセマーゼ活性は従来のカラムクロマトグラフイーを用いて精製する。最終的に、可能性のあるトリプトファンラセマーゼとして同定されたオープンリーディングフレームは、アフィニティータグを有する発現ベクター中にクローニングする。次いで、潜在的なトリプトファンラセマーゼはアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。いずれの場合も、精製タンパク質は、本質的に上記に記載のように酵素アッセイに用いられる。
【０２０５】
（４）トリプトファンラセマーゼの逆遺伝子操作
トリプトファンラセマーゼは、硫安分画を含めた従来のタンパク質精製技術および従来のカラムクロマトグラフイーによって、植物源または微生物源のいずれかから精製できる。スポットが２次元ゲル上で単離できるようにタンパク質が精製されると、ペプチドマイクロシークエンシング技術または従来のＥｄｍａｎ型アミノ酸配列決定が利用される（この種の作業に通常用いられるプロトコールおよび設備の記載について「ｇｏｌｇｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ／」をインターネットで参照されたい）。しかしながら、いくつかの場合では、生物のゲノム配列は、タンパク質精製のためのタンパク質源として使用できない、というのは、上記配列がまだ決定されていないからである。そういった状況では、一次縮重プライマーを、最も近い、知られている類縁のタンパク質源からの入手可能な配列に基づき設計してもよい。次いで、縮重ＰＣＲおよびゲノムウォーキングを、トリプトファンラセマーゼコード配列を単離するために確立されたプロトコールに従って行う。
【０２０６】
（５）ゲオバチルス・ステアロテルモフィルスからのアラニンラセマーゼのクローニング
ゲオバチルス・ステアロテルモフィルスからのアラニンラセマーゼ（配列番号４１）をクローニングした。Ｇ．ステアロテルモフィルス（ＡＴＣＣ１２９８０Ｄ）からのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ（マナッサス、ＶＡ）から購入した。以下のプライマーは、Ｇ．ステアロテルモフィルスからのアラニンラセマーゼ遺伝子を増幅するために用いた：5'-atggacgagtttcaccgcga-3'（配列番号２５）および5'-ttatgcatcgcttcatccgc-3'（配列番号２６）。ＰＣＲ生成物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにライゲーションした。適正なクローンは配列決定によって確認した（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社、ビバリー、ＭＡ）。適正なクローンは、引き続いてのＰＣＲ反応における鋳型として用いた。
【０２０７】
以下のプライマーは、アラニンラセマーゼを増幅するために用いた：5'-ataataggatcctcatccgcggccaacggcg-3'（配列番号２７）および5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3'（配列番号２８）。ＰＣＲ生成物は、制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。これらの酵素は、操作してプライマーにした部位で切断した。消化ＰＣＲ生成物は、ゲル精製し、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、かつ続いてゲル精製したイー・コリプラスミドベクターｐＴｒｃ９９ａにライゲーションした。ライゲーションしたものは、ＴＯＰ１０Ｆ’化学的コンピテント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足したＬＢ平板上で平板培養した。単離物を挿入断片についてスクリーニングし、挿入断片を有する数個の単離物は、配列分析（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社、ビバリー、ＭＡ）によって適正な配列（配列番号４０）を有することを確認した。
【０２０８】
ｐＴｒｃ９９ａ／アラニンラセマーゼ構築物は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製（ラ  ホーヤ、ＣＡ）Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（「ＳＤＭ」）にかけた。突然変異誘発性プライマーは以下の通りとした：
5'-gccggacgacacgcacattnnkgcggtcgtgaaggcgaacgcc-3'（配列番号２９）；
5'-gtgaaggcgaacgcctatggannkggggatgtgcaggtggcaagg-3'（配列番号３０）；
5'-cctcccgcctggcggttgccnnkttggatgaggcgctcgctttaa-3'（配列番号３１）；
5'-caaccaggcgaaaaggtgagcnnkggtgcgacgtacactgcgcag-3'（配列番号３２）；
5'-gatcgggacgattccgatcggcnnkgcggacggctggctccgccg-3'（配列番号３３）；および
5'-gccatttggaaacgatcaacnnkgaagtgccttgcacgatcag-3'（配列番号３４）
（ｎ＝任意のヌクレオチドおよびｋ＝ｇまたはｔ）。
【０２０９】
突然変異誘発のための残基は、Ｇ．ステアロテルモフィルスアラニンラセマーゼの既存の結晶構造の分析によって選択した。活性部位から５および１０Å間で位置する大きなアミノ酸残基を選んだ。
【０２１０】
すべての６つのプライマーは、メーカーのプロトコールに指示されるようにＳＤＭ反応において用いた。ＳＤＭ反応物は、メーカーのプロトコールに従ってＸＬ−１０  ＧＯＬＤに形質転換した。形質転換反応物は、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢ培地上で平板培養した。ＬＢブロスを平板に追加し、コロニーを平板からこすり取った。再懸濁した細胞は、数時間３７℃で成長させ、プラスミドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ミニプレップキットを用いて、ミニプレップした。次いで、結果として生じた突然変異誘発ライブラリーは、トリプトファン栄養素要求株ＣＡＧ１８４５５を形質転換するために用いた。形質転換したものは、グルコース、微量元素、ビタミン、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ、および３ｍＭ  Ｄ−トリプトファンを補足したＭ９最少培地上で平板培養した。３７℃でのインキュベーションの数日後に、コロニーは成長した。これらのコロニーは、ＬＢ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）上で画線培養した。プラスミドはこれらの単離物から単離し、ＣＡＧ１８４５５中に再形質転換した。再形質転換した細胞は、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ上で平板培養した。単離されたコロニーが形成された後、それらは、上記に記載のようにＭ９  Ｄ−トリプトファン培地上で画線培養した。コロニーすべてが、再成長するように見え、これは、成長が、ラセマーゼの突然変異誘発バージョンによるものであったことを示す。コントロール細胞の成長は観察されなかった。
【０２１１】
数個の単離物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性についてアッセイした。細胞は、ＯＤ６００を約０．６まで成長させ、１００μＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。細胞は、さらに２時間３７℃でインキュベートし、遠心分離によって採取した。細胞ペレットは、翌日用いるまで−８０℃で保存した。細胞ペレットは氷上で解凍した。細胞は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（第一級アミンなし）細胞溶解試薬およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）を用いて破壊した。細胞片は、遠心分離（４℃で３０分間、約１０，０００×ｇ）によって除去した。上清は粗細胞抽出物として保存した。
【０２１２】
アッセイ緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１０μＭピリドキサールリン酸、０．０１％β−メルカプトエタノール、および５０ｍＭ  Ｄ−またはＬ−トリプトファンを含有した。２００μＬ抽出物をアッセイ１ｍＬ当たりに追加した。期間０時点ならびに３０分および一晩の時点にあたる試料を凍結させた。試料は、実施例１に記載されるように遠心し、濾過し、キラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
【０２１３】
【表１０】
2015211679.tif 000013
【０２１４】
【表１１】
2015211679.tif 000014
【０２１５】
この単離物中のラセマーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を決定し（配列番号４２）、単離物は、３つの突然変異を有することがわかった。対応するタンパク質単離物中の突然変異は以下の通りである：Ｍ３５Ｃ、Ｆ６６Ｅ、およびＹ３５４Ａ（配列番号４３）。付加的な突然変異（Ｐ１９７Ｌ）がこの変異体において判明した。これは、自然突然変異であり、部位特異的突然変異誘発の一部ではなかった。
【０２１６】
突然変異誘発ラセマーゼは、発現および精製のためにｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中にクローニングした。以下のプライマーは、ｐＴｒｃ９９ａ構築物からのラセマーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するために用いた：5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3'（配列番号３５）および5'-gcggcgccatggacgagtttcaccgcg-3'（配列番号３６）。ＰＣＲ生成物は、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化させ、続いてゲル精製したｐＥＴ３０にライゲーションした。ライゲーションしたものは、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）中に形質転換した。形質転換からしたものからの単離物を挿入断片についてスクリーニングした。挿入断片を有するプラスミドを、配列決定（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社、ビバリー、ＭＡ）にかけた。適正な配列を有する単離物は、発現および精製のためにＢＬ２１  λＤＥ３またはＢＬ２１λ  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ中に形質転換した。新しい構築物は、ｐＥＴ３０Ｔｒｐラセマーゼと指定する。
【０２１７】
（６）トリプトファンラセマーゼの精製
ｐＥＴ３０Ｔｒｐラセマーゼ構築物を有する一晩培養物は、適切な抗生物質（５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を有する新鮮なＬＢ培地中に継代培養させ、ＯＤ６００を約０．６まで成長させた（通気有りで３７℃）。発現を１００μＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発し、インキュベーションは、２時間通気有りで３７℃で継続させた。細胞は、遠心分離によって採取し、使用まで−８０℃で保存した。細胞ペレットは、氷上で解凍し、細胞は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｍｉｎｅ  Ｆｒｅｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ＲｅａｇｅｎｔおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）を用いて溶解した。細胞片は、遠心分離によって除去し、上清は、粗タンパク質抽出物として用いた。粗タンパク質抽出物は、０．４５μｍシリンジフィルターを用いて濾過し、メーカーの指示に従って、あらかじめ平衡化したＨｉｓＢｉｎｄカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）にかけた。カラムは洗浄し、タンパク質はメーカーのプロトコールに指示されるように溶出した。精製タンパク質は、溶出液として５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭピリドキサール−５’−リン酸（「ＰＬＰ」））を用いて、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて脱塩した。脱塩したタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ社製遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ）を用いて濃縮した。野生型のアラニンラセマーゼは、上記に記載のように精製した。
【０２１８】
（７）トリプトファンラセマーゼのアッセイ
精製ラセマーゼは、数種のアッセイにおいて試験した。あるアッセイにおいて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼによる過酸化水素の生成を検出システムとして用いた。オキシダーゼについてのＤ−トリプトファン基質は、本実施例において記載のように単離されたラセマーゼ酵素を介してＬ−トリプトファンから生成された。アッセイは、アッセイ当たりに０、１、１０、２５、５０、１００、２００μｇの酵素、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭ  ＰＬＰ、５０ｍＭ  Ｌ−トリプトファンを含んだ。アッセイは、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、１００ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＯＤ−１０１  ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社、パサデナ、ＣＡ）および０．５ｍＭ  ＦＡＤを反応ミックスに追加した。過酸化水素の発生は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＨＴＳ  ７０００  Ｐｌｕｓ  ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ウェルズリー、ＭＡ）を用いて測定した。アッセイデータを下記の表１２および１３に要約する。
【０２１９】
【表１２】
2015211679.tif 000015
【０２２０】
【表１３】
2015211679.tif 000016
【０２２１】
アッセイの結果は、変異体ラセマーゼが過酸化水素の生成に必要とされることを示す。追加した変異体ラセマーゼの量を増加した場合、生成された過酸化水素の量は増加した。
【０２２２】
アラニンに対するラセマーゼ（野生型および変異体）の活性を分析した。反応緩衝液は次のものを含有した：１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭ  ＰＬＰ、５０ｍＭ  Ｌ−アラニン、１２μｇ／ｍＬ野生型ラセマーゼまたは９４μｇ／ｍｌ変異体ラセマーゼ。反応は、１容量の０．５Ｍギ酸を用いて停止し、実施例１に記載のように、Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃカラムを用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０２２３】
アッセイデータを、下記の表１４に要約する。
【０２２４】
【表１４】
2015211679.tif 000017
【０２２５】
突然変異ラセマーゼは、本来の基質であるアラニンに対して活性を保持するようである。
【０２２６】
突然変異ラセマーゼの活性は、基質として、Ｌ−トリプトファン、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−アラニン、およびＤ−アラニンのうちの１つを用いて試験した。反応物緩衝液は次のものを含有した：１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭ  ＰＬＰ、５０ｍＭ基質、９４μｇ／ｍｌ変異体ラセマーゼ。反応は、１容量の０．５Ｍギ酸を用いて停止し、実施例１に記載のように分析した。基質としてアラニンを用いたアッセイは、室温（約２２℃）でインキュベートし、基質としてトリプトファンを用いたアッセイは、３７℃でインキュベートした。結果を下記の表１５に要約する。
【０２２７】
【表１５】
2015211679.tif 000018
【０２２８】
ラセマーゼ酵素は、双方向に働き、野生型の活性を保持する。
【０２２９】
変異体ラセマーゼを数種の基質に対して試験した。アッセイに用いた酵素は、先に論じられるように精製した。アッセイ条件は以下の通りとする：５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭ  ＰＬＰ、２５ｍＭ基質、４０μｇ／ｍｌ変異体ラセマーゼ。反応は、１容量の２Ｍギ酸を用いて停止し、実施例１に記載のように分析した。アッセイは３７℃でインキュベートした。結果（Ｌ−異性体から生成されたＤ−異性体  ｐｐｍ）を下記の表１６に要約する（ｎｄ＝検出せず）。
【０２３０】
【表１６】
2015211679.tif 000019
【０２３１】
このラセマーゼは、ここで試験したアミノ酸に加えて他のアミノ酸をラセミ化するであろう。
【０２３２】
突然変異ラセマーゼは、種々様々のアミノ酸に対して活性を有するようであるが、モナチンに対するいかなるラセマーゼ活性もあるようではない。アッセイにおいて用いた酵素は、先に論じられるように精製した。アッセイ条件は以下の通りとする：１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭ  ＰＬＰ、５０ｍＭモナチン、１ｍｇ／ｍｌ変異体ラセマーゼ。アッセイは３７℃でインキュベートした。アッセイは、実施例１に記載のようにＦＤＡＡ誘導体化によって分析した。アッセイの結果を下記の表１７に示す。
【０２３３】
【表１７】
2015211679.tif 000020
【０２３４】
１８時間後でさえ、変異体ラセマーゼを用いた、Ｓ，ＲモナチンへのＳ，ＳモナチンのまたはＲ，ＳモナチンへのＲ，Ｒモナチンの明らかな変換はなかった。
【０２３５】
理想的な酵素は、トリプトファンに対して活性を有するが、他のアミノ酸またはアミノ酸様化合物、詳細にはモナチンに対して活性をほとんどまたは全く有していない。酵素がモナチンに対して著しい活性を有する場合、トリプトファン活性を不変に保ちながらまたは酵素がモナチン生成に有用であるのに十分に高いレベルに保ちながら、モナチンおよび／またはグルタミン酸に対する活性を減少させるために酵素は突然変異誘発させてもよい。突然変異誘発に用いられてもよい技術は、エラープローンＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発標的（基質結合に関連する潜在的な部位）を同定するためのモデリング、突然変異誘発性株による継代、およびＤＮＡシャフリングを含むが、これらに限定されない。
【０２３６】
（８）トリプトファンラセマーゼによるモナチン生成
以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：配列番号２２の約５０μｇアルドラーゼ、１６ｍｇ／ｍＬ精製トリプトファンラセマーゼ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、０．５ｍｇＤ−アミノトランスフェラーゼ（実施例１４に記載のようにバチルス・スファエリクスから精製）、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。ピルビン酸は、広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼに対して許容し得るアミノ受容体であるので、α−ケトグルタル酸は使用しなかった。Ｄ−トリプトファンを開始基質とし、ラセマーゼを含まないコントロールを含んだ。試料は、緩やかに振盪させながら、３０℃で、２時間または一晩（２０時間）インキュベートした。試料は、実施例１に記載のように分析した。アッセイの結果を表１８において下記に示す（ｎｄ＝検出せず）。
【０２３７】
【表１８】
2015211679.tif 000021
【０２３８】
表１８は、Ｌ−トリプトファン基質をＤ−トリプトファンに変換するためにトリプトファンラセマーゼを用いる、Ｒ，Ｒモナチンの生成を示す。トリプトファンラセマーゼを用いない、Ｄ−トリプトファンからのＲ，Ｒモナチンの生成は、コントロールとして利用した。生成されたＲ，Ｒモナチンパーセントは、出発物質としてのＬ−またはＤ−トリプトファンのどちらを用いてもほぼ同じである。この結果は、ラセマーゼが、Ｒ，Ｒモナチンのラセミ化の触媒において検出可能な活性を有していないことを示す。
【０２３９】
（９）重要なアミノ酸変化の単離
突然変異誘発アラニンラセマーゼの数種の復帰変異体を作り出した。復帰変異体は、以下のプライマーを用いて、先に記載のように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）を用いて部位特異的突然変異誘発によって作製した。
5'-gccatttggaaacgatcaactatgaagtgccttgcacgatcag-3'（配列番号３７）；
5'-ctcccgcctggcggttgccttcttggatgaggcgctcgctttaag-3'（配列番号３８）；および
5'gccggacgacacgcacattatggcggtcgtgaaggcgaacgcc-3'（配列番号３９）
【０２４０】
プライマーは、別々にならびに３５、６６、および３５４位における３つの突然変異の６つの可能な組合せをなすために組み合わせて用いた（番号付けは、ＡＴＣＣ１２９８０由来のアミノ酸配列に基づく）。突然変異の数種の組合せを作り出し、トリプトファンラセマーゼ活性について試験した。アッセイ条件は以下の通りとした：５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭ  ＰＬＰ、３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、１００μｇ／ｍｌ酵素。アッセイは、特定の時間、３７℃でインキュベートした。試料は、実施例１に記載のように分析した。
【０２４１】
アッセイの結果を下記の表１９に要約する（ｎｄ＝検出せず）。
【０２４２】
【表１９】
2015211679.tif 000022
突然変異リスト：
ＭＦ１：Ｎ４１Ｓ（自然突然変異）、Ｐ１９７Ｌ、Ｙ３５４Ａ
ＭＦ２：Ｆ６６Ｅ、Ｐ１９７Ｌ、Ｙ３５４Ａ
ＭＹ１：Ｍ３５Ｃ、Ｆ６６Ｅ、Ｐ１９７Ｌ
突然変異誘発ラセマーゼ：Ｍ３５Ｃ、Ｆ６６Ｅ、Ｐ１９７Ｌ、Ｙ３５４Ａ
【０２４３】
結果は、Ｙ３５４Ａ突然変異がトリプトファンに対する活性に必要とされることを示す。この突然変異がない場合、トリプトファンに対する検出可能な活性はなかった。基質特異性を広げる際のこの残基の重要性をさらに示すＷ．Ｍ．Ｐａｔｒｉｃｋ、Ｊ．Ｗｅｉｓｎｅｒ、およびＪ．Ｍ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００２年  第８号、７８９〜７９２頁もまた参照されたい。
【０２４４】
アラニンラセマーゼは、突然変異誘発性ＰＣＲ、突然変異誘発性株による継代、または当業者に知られている他の方法のごときランダムな方法によって、広域特異性ラセマーゼにさらに変換させてもよい。アラニンラセマーゼのより集中したな進化は、Ｌｙｓ１２９、Ｍｅｔ１３４、ならびにＧｌｙ２８３およびＴｒｐ２８残基を含む、Ｇｌｙ２８３およびＴｒｐ２８の間にある残基（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスからの番号付け）を含む活性部位残基上に集中させてもよい。
【０２４５】
４Ｂ：Ｙ３５４Ａ単一変異体の単離
実施例４ＡでｐＥＴ３０中にクローニングした野生型ジオバチルス  ステアロサーモフィルスアラニンラセマーゼ（配列番号：４１）を、部位特異的突然変異誘発のための鋳型として用い、Ｙ３５４Ａの変化を加えた。突然変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ−Ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。以下の突然変異誘発性プライマーは、Ｙ３５４Ａの変化を加えるために用いた、５’−ｇｃｃａｔｔｔｇｇａａａｃｇａｔｃａａｃｇｃｇｇａａｇｔｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｔｃａｇ−３’（配列番号：１０７）。部位特異的突然変異誘発は、メーカーのプロトコールに記載されるように行った。数種の単離物は配列決定し（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、適正な配列を有する単離物は、さらなる分析のために選択し、用いた。
【０２４６】
ｐＥＴ３０Ｙ３５４Ａの単一の変異体はイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換した。精製タンパク質は以下の通り調製した。株は、０．４〜０．６のＯＤ６００までＬＢまたはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させ（通気させながら３７℃で）、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。インキュベーションは約３時間通気させながら３７℃で継続した。細胞は、遠心分離によって採取し、細胞ペレットは−８０℃で保存した。
【０２４７】
細胞ペレットは氷上で解凍し、次いで、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を加えた適切な容量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再度懸濁させた。細胞片は、遠心分離によって除去し、無細胞抽出物は、Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液を用いて平衡化したＨＩＳ−Ｂｉｎｄカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にかけた。カラムは、Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液およびＷａｓｈ緩衝液を用いて洗浄し、タンパク質は、Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液を用いて溶出させた（メーカーのプロトコールに指示されるように）。精製タンパク質はＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて脱塩した。タンパク質は、メーカーのプロトコールに従って、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０および１０μＭピリドキサール−５’−リン酸中に脱塩させた。タンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ、ＭＡ）を用いて濃縮した。精製濃縮タンパク質は、少量のアリコートに分け、使用まで−８０℃で保存した。
【０２４８】
精製Ｙ３５４Ａは、アラニンアッセイおよびトリプトファンアッセイの双方で野生型アラニンラセマーゼ（上記に記載される様式で調製）と比較した。アッセイは、４００μＬの精製濃縮タンパク質（＞１ｍｇ／ｍｌ最終濃度）および５０ｍＭ基質を用いて、実施例４Ａに記載されるように、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８および１０μＭ  ＰＬＰ中で行った。Ｄ−アラニンおよびＤ−トリプトファンの検出は、実施例１に記載されるキラルアミノ酸方法論を用いて行った。結果を下記の表２０に示す。
【０２４９】
【表２０】
2015211679.tif 000023
*nd=検出せず
【０２５０】
これらのデータは内部標準物質を用いないで分析した、したがって、半量的であり、比較の目的のために用いられるべきである。それにもかかわらず、これらの結果は、代替基質を用いるアミノ酸ラセミ化を触媒することができるようにアラニンラセマーゼの特異性を広げるのにＹ３５４Ａ単一突然変異が十分であることを示す。酵素が、基質としてのアラニンと活性であるので、ゼロ時間で、反応が、既に、本質的に平衡状態に達していたことに注目されたい。
【０２５１】
４Ｃ：ジオバチルス・ステアロサーモフィルスアラニンラセマーゼの位３５４の飽和突然変異誘発
数種の変異体を以下の通り単離した。プライマーは、位３５４で「ＮＮＫ」ランダム突然変異誘発を進めるために作製した。プライマー、５’−ｇｃｃａｔｔｔｇｇａａａｃｇａｔｃａａｃｎｎｋｇａａｇｔｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｔｃａｇ−３’（配列番号１０８）は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）と共に用いた。反応に用いた鋳型は、ｐＥＴ３０の中にクローニングした野生型Ｇ．ステアロサーモフィルスアラニンラセマーゼとした。突然変異誘発はメーカーのプロトコールに従って進めた。数種の変異体はこの方法を用いて単離した。以下の変異体はこの方法を用いて単離した：Ｙ３５４Ｄ、Ｙ３５４Ｅ、Ｙ３５４Ｌ、Ｙ３５４Ｈ、およびＹ３５４Ｋ。他のアミノ酸置換はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｋｉｔおよびこれらのプライマー：
Ｙ３５４Ｎ  ５’−ｃｃａｔｔｔｇｇａａａｃｇａｔｃａａｃａａｃｇａａｇｔｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｔｃａｇ−３’（配列番号１０９）および
Ｙ３５４Ｇ  ５’−ｇｃｃａｔｔｔｇｇａａａｃｇａｔｃａａｃｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｔｃａｇ−３’（配列番号１１０）を用いて作製した。
【０２５２】
さらなる突然変異は標準的なＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔならびに以下のプライマー：Y354C 5'-TCGCCATTTGGAAACGATCAACTGCGAAGTGCCTTGCACG-3'（配列番号111）およびY354T 5'-GGAAACGATCAACACGGAAGTGCCTTGCACG-3'（配列番号112）およびそれぞれの逆方向補完物を用いて作製した。所望の配列を有するプラスミド（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を発現株イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。遺伝子誘発は、例４Ｂに記載されるように実行した。活性を有する変異体を下記の表で比較する。アッセイは、ポジティブコントロールとしてＹ３５４Ａ変異体を用いて、上記に記載されるように基質としてＬ−トリプトファンを用いて行った。変異体ラセマーゼの相対的活性はすべて、下記の表でＹ３５４Ａと比較する。タンパク質を精製し、アッセイは、１００μｇの精製タンパク質を用いて実施例４Ｂに記載されるように行った。結果を下記の表２１に示す。
【０２５３】
【表２１】
2015211679.tif 000024
【０２５４】
Ｙ３５４Ｉ、Ｙ３５４Ｍ、およびＹ３５４Ｐは、検出の限界を考慮すれば、数量化できなかった微量の活性を有した。
【０２５５】
Ｙ３５４Ｄ、Ｙ３５４Ｅ、Ｙ３５４Ｈ、およびＹ３５４Ｋは、このアッセイの条件下で活性をほとんどまたは全く有しなかった。
【０２５６】
Ｙ３５４Ｆ、Ｙ３５４Ｑ、Ｙ３５４Ｒ、およびＹ３５４Ｗ変異体は上記のように同様の方法を用いて構築した、またこのアッセイの条件下で活性を有していないように考えられた。
【０２５７】
４Ｄ：ジオバチルス・ステアロサーモフィルスアラニンラセマーゼのアミノ酸位３５および２６５の突然変異誘発
数種の変異体を以下の通り単離した。２つのプライマーは、鋳型としてＹ３５４Ａ変異体（実施例４Ｂに記載）を用いて、アミノ酸位３５および２６５での「ＮＮＫ」ランダム突然変異誘発を進めるために作製した。Ｙ２５４Ａをコードする遺伝子は、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ｐＰＲＯＮｃｏベクターの中にサブクローニングし、この構築物を突然変異誘発反応に用いた。ｐＰＲＯＮｃｏプラスミドは、ＮｃｏＩ部位のうちの一方を突然変異Ｔ１５３８Ｃによって除去した、ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ１２２ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の誘導体である。以下のプライマー（５’−リン酸化）を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）と共に用いた：
Y265X：5'-CAA CCA GGC GAA AAG GTG AGC NNK GGT GCG ACG TAC ACT GCG CAG-3'（配列番号113）および
M35X：5'-GCC GGA CGA CAC GCA CAT TNN KGC GGT CGT GAA GGC GAA CGC C-3'（配列番号114）
ＮはＧ、Ｃ、Ｔ、またはＡを示し、ＫはＧまたはＴを示す。
【０２５８】
突然変異誘発はメーカーのプロトコールに従って進めた。突然変異遺伝子を含有するプラスミドをエレクトロコンピテントトリプトファン栄養要求性株ＣＹ１５０７７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅから得た）中に形質転換した。数種の変異体は、０．４％グルコース、微量元素、ビタミン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μＭ  ＩＰＴＧ、および３ｍＭ  Ｄ−トリプトファンを補足した、Ｍ９最少培地含有するＮｏｂｅｌ寒天平板上での成長の数日後に単離した。Ｒ１９５Ｈ自然突然変異がいくつか場合で起こった。
【０２５９】
以下の変異体はこの方法を用いて単離した（すべてＹ３５４Ａをさらに含有する）：Ｙ２６５Ｍ、Ｙ２６５Ｃ、Ｍ３５Ｖ／Ｒ１９５Ｈ、Ｍ３５Ｓ／Ｙ２６５Ｓ。
【０２６０】
クローンは、例４Ｂに記載されるように、カナマイシンを含有するＬＢ培地中で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。アッセイは無細胞抽出物を用いて進めた。標的タンパク質の発現のレベルは、ＥｘｐｅｒｉｏｎＰｒｏ２６０電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて評価した。１ｍＬアッセイは、３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８、および５０μＭ  ＰＬＰならびに約２００μｇの変異体酵素を含有した。試料は、一晩３０℃でインキュベートした。試料は、２％ギ酸を用いて酸性化し、遠心し、濾過し、実施例１に記載されるようにＤ−トリプトファンの検出のために１０倍に希釈した。Ｍ３５Ｖ／Ｒ１９５Ｈ変異体のみが検出可能な活性を有した、またＹ３５４Ａのみと同じ桁数であると考えられる。
【０２６１】
さらに、Ｙ２６５Ａアミノ酸置換は、メーカーのプロトコールを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および以下のプライマーを用いて、ｐＥＴ３０構築物中のＹ３５４Ａ（実施例４Ｂからの）、Ｙ３５４Ｎ（実施例４Ｃからの）、および野生型バックグラウンド中に作製した。5'-AGG CGA AAA GGT GAG CGC GGG TGC GAC GTA CAC TG-3'（配列番号115）。プラスミドＤＮＡは、単離し、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、誘発し、上記のようにアッセイした。Ｙ２６５Ａ突然変異を含有する構築物のどれも、これらの条件下で活性を有するとは考えられなかった。
【０２６２】
４Ｅ：シュードモナス・プチダＫＴ２４４０広域特異性アミノ酸ラセマーゼ（「ＢＡＲ」）のクローニング
ＢＡＲ（広域特異性アミノ酸ラセマーゼ）は、文献からの情報を用いて、Ｐ．プチダＫＴ２４４０中で同定した。（Ｒｏｉｓｅ，Ｄ．、Ｓｏｄａ，Ｋ．、Ｙａｇｉ，Ｔ．、Ｗａｌｓｃｈ，Ｃ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３、５１９５〜５２０１頁、（１９８４年））。Ｐ．プチダＫＴ２４４０はまたＡＴＣＣ４７０５４としても知られている。Ｐ．ストリアタからのＢＡＲ酵素の活性部位は、配列決定され、報告された（ＬＴＡＶＬＫＡＤＡＹＧＸＧＩＧＬ（配列番号：１１６）、Ｘは任意の自然発生アミノ酸を示す）。この配列は、ＮＣＢＩで入手可能なＰ．プチダＫＴ２４４０ゲノム配列をＢＬＡＳＴするのに用いた。ほとんど同一のコンセンサス配列を有するタンパク質を同定した。プライマーは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得たゲノムＤＮＡからの遺伝子をクローニングするために設計した、また、以下の通りとする。
5'-AGAAGACATATGCCCTTTCGCCGTAGGG-3'（配列番号117）および
5'-AGAAGAGGATCCTCAGTCGACGAGTATCTTCG-3'）（配列番号118）。
【０２６３】
ＰＣＲは、標準的な条件下で進め、ＰＣＲ産物を精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）。精製ＰＣＲ産物はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。消化ＰＣＲ産物を、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、同様の方法で消化し、かつゲル精製したｐＥＴ３０およびｐＥＴ２８にライゲーションした。挿入断片を有するクローンを配列決定し（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、適正な配列を有する単離物を同定し（ｐＥＴ３０  ＫＴ２４４０  ＢＡＲおよびｐＥＴ２８  ＫＴ２４４０  ＢＡＲ）、後の研究で用いた。
【０２６４】
ＫＴ２４４０  ＢＡＲ  ＤＮＡ配列（配列番号１１９）は以下の通りである。
atgccctttcgccgtacccttctggctgcatccctggcacttctgatcaccggacaggcccccctgtatgcggcaccaccgttgtcgatggacaacggcaccaacaccctgaccgtgcaaaacagcaatgcctgggtcgaagtcagcgccagcgccctgcagcacaacatccgcacgctgcaggccgagctggccggcaagtccaagctgtgcgccgtgctcaaggccgatgcctatggccacggtatcggcctggtaatgccatcgatcatcgcccaaggcgtgccctgcgtggcggtggccagcaacgaggaggcccgcgtggtccgcgccagtggcttcaccgggcaactggtgcgggtacgcctggccagcctcagcgagctggaagatggcttgcagtacgacatggaagagctggtgggcagcgcggaatttgcccgccaggccgatgccatcgccgcgcgccatggcaagaccttgcgcattcacatggcgctcaactccagcggcatgagccgcaacggggtggagatggccacctggtccggccgtggcgaagcgctgcagatcaccgaccagaagcacctcaagctggtcgcgctgatgacccacttcgccgtggaagacaaggacgatgtacgcaagggcctggcggcattcaacgagcagaccgactggttgatcaagcacgccaggctggaccgcagcaagctcaccctgcacgccgccaactcgttcgctacgctggaagtgccggaagcgcgcctggacatggtacgaacgggtggcgcgctgttcggcgacaccgtgccggcgcgcaccgagtacaaacgtgcgatgcagttcaaatcgcacgtggcggcggtgcacagctatccggccggcaacaccgtgggctatgaccgcaccttcaccctggcccgtgattcgcggctggccaacattacggtcgggtactccgatggctaccgccgggtattcaccaacaagggccatgtgctgatcaacggccaccgtgtgccggtcgtgggcaaggtgtcgatgaacacgctgatggtcgatgtcaccgacttccctgatgtgaaggggggtaacgaagtggtgctgttcggcaagcaggccgggggcgaaatcacccaggccgagatggaagaaatcaacggcgcgttgctcgccgatttgtacaccgtatggggcaattccaacccgaagatactcgtcgactga。
【０２６５】
ＫＴ２４４０  ＢＡＲアミノ酸配列（配列番号１２０）は以下の通りである。
MPFRRTLLAASLALLITGQAPLYAAPPLSMDNGTNTLTVQNSNAWVEVSASALQHNIRTLQAELAGKSKLCAVLKADAYGHGIGLVMPSIIAQGVPCVAVASNEEARVVRASGFTGQLVRVRLASLSELEDGLQYDMEELVGSAEFARQADAIAARHGKTLRIHMALNSSGMSRNGVEMATWSGRGEALQITDQKHLKLVALMTHFAVEDKDDVRKGLAAFNEQTDWLIKHARLDRSKLTLHAANSFATLEVPEARLDMVRTGGALFGDTVPARTEYKRAMQFKSHVAAVHSYPAGNTVGYDRTFTLARDSRLANITVGYSDGYRRVFTNKGHVLINGHRVPVVGKVSMNTLMVDVTDFPDVKGGNEVVLFGKQAGGEITQAEMEEINGALLADLYTVWGNSNPKILVD。
【０２６６】
Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲの精製。
上記に記載されるｐＥＴ３０  ＫＴ２４４０  ＢＡＲプラスミドはＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換した。結果として生じた株は、０．４〜０．６のＯＤ６００まで通気させながら３７℃でＬＢまたはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。インキュベーションは、通気させながら３７℃で３〜４時間継続した。細胞は、遠心分離によって採取し、細胞ペレットは使用まで−８０℃で保存した。細胞ペレットは氷上で解凍した。細胞は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて溶解した。細胞片は、遠心分離によって除去し、無細胞抽出物は直ちに用いるか、または−８０℃で保存した。ＫＴ２４４０  ＢＡＲ遺伝子は、さらに、ｐＥＴ２８のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換した。この構築物は、可溶性タンパク質をあまり効率的に発現したとは考えられず、したがって、タグなしバージョン（ｐＥＴ３０  ＫＴ２４４０  ＢＡＲ）をその後の研究で用いた。
【０２６７】
抽出物は、少なくとも５カラム容量の緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１０μＭピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ））を用いて平衡化したＵｎｏＱカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にかけた。カラムは、２カラム容量の緩衝液Ａを用いて洗浄した。タンパク質は、２０カラム容量を超える、０〜１００％緩衝液Ｂの、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）の直線的な勾配を用いて溶出した。５ｍｌ画分は、勾配を開始した時から収集した。画分は、実施例４Ａ（７）に記載されるＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ法を用いてアッセイした。簡潔に言えば、１００μｇ  Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．０５ｍＭ  ＦＡＤ、２５ｍＭ  Ｌ−ｔｒｐ、およびアッセイされることになる少容量の画分を、５０μＬ  Ｈ２Ｏ中で組み合わせ、メーカーのプロトコールに指示されるように調製した５０μＬ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ反応緩衝液に追加した。活性を有する画分はＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて脱塩し、Ａｍｉｃｏｎ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ、ＭＡ）を用いて濃縮した。精製タンパク質は−８０℃で保存した。
【０２６８】
ＢＡＲ酵素のアッセイ
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイは本実施例に記載されるように設定した。Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲは２００μｇで用いた（本実施例に記載されるように精製）。野生型Ｇ．ステアロサーモフィルスアラニンラセマーゼおよびＹ３５４Ａは実施例４Ｂに記載されるように精製し、２００μｇまたは１０００μｇのいずれかで用いた。ＣＥは、本実施例に記載されるように調製した無細胞抽出物である。６０分の時点での結果を下記の表２２に示す。全時間的経過を図１１に示す。
【０２６９】
【表２２】
2015211679.tif 000025
【０２７０】
精製タンパク質もまた、実施例４Ａに記載されるように、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８、１０μＭ  ＰＬＰ、および３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン中でトリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした。２００μｇまたは１０００μｇのいずれかの精製酵素をアッセイで用いた（括弧中に示す）。Ｄ−トリプトファンは、検出について実施例１のキラルアミノ酸法を用いて分析した。結果を下記の表２３に示す。
【０２７１】
【表２３】
2015211679.tif 000026
【０２７２】
アッセイは、Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲ酵素が、Ｇ．ステアロサーモフィルス由来の酵素およびその変異体よりもトリプトファンに対してはるかに活性であることを示す。Ｐ．プチダＫＴ２４４０およびＰ．プチダＮＢＲＣ１２９９６のＢＡＲ酵素は、米国特許出願公開第２００５／００９５６７０  Ａ１号に記載されるが、それらは、トリプトファンをラセミ化する能力についてアッセイされなかった。
【０２７３】
ＫＴ２４４０  ＢＡＲアミノ酸配列は、全ゲノム配列がパブリックドメインで入手可能である生物に存在する他の潜在的なＢＡＲタンパク質を検索するために用いた。以下の表は、ＫＴ２４４０  ＢＡＲに相同な酵素を有する生物およびＢＬＡＳＴ  Ｐ−スコアの表を示す。結果を表２４に示す。対応するタンパク質のＧｅｎｂａｎｋ受入番号は左欄に示す。
【０２７４】
【表２４】
2015211679.tif 000027
【０２７５】
ＢＬＡＳＴ  Ｐ−スコアは、ＫＴ２４４０  ＢＡＲに対して高度に相同である酵素があることおよびこれらの高度に相同な酵素は、たとえそれらが公的なデータベースでアラニンラセマーゼとして注解されているとしても、アラニン以外の基質に対して活性を有する可能性があることを示す。高度に関連するラセマーゼの分類があることおよび次いで、相同性の低下はムーレラ・サーモアセチカ以後に起こることが分かる。ＮＣＢＩをＢＬＡＳＴすることによって、他の密接に関連する相同遺伝子がＰ．タエトロレンス（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６、ヌクレオチド配列）およびＰ．プチダＦ１（ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０、タンパク質配列、ＮＺ＿ＡＡＬＭ０１０００００２ヌクレオチド５３１７３．．５４４０２によってコード）から見出された。この情報に基づいて、さらなるクローニング作業を、他のシュードモナス種、ビブリオ菌、エルシニア属、およびフォトバクテリウム属のＢＡＲ遺伝子を単離するために行った。実施例４Ｉ、４Ｊ、４Ｋ、４Ｌ、および４Ｎを参照されたい。
【０２７６】
さらに、文献レビューにより、広域特異性アミノ酸ラセマーゼがどこに存在する可能性があると考えられるかが示された。以下は、広域特異性アミノ酸ラセマーゼの存在を示唆する刊行物がある生物および各生物についての１つの参考文献の表である。
１．Ｐ．プチダＩＦＯ１２９９６、ＮＢＲＣ１２９９６、Ｐ．プチダ１２９９６、およびＰ．ストリアタとしても知られている（Ｎａｇａｔａ，Ｓｈｉｎｊｉ；Ｅｓａｋｉ，Ｎｏｂｕｙｏｓｈｉ；Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；Ｔａｎａｋａ，Ｈｉｄｅｈｉｋｏ；Ｓｏｄａ，Ｋｅｎｊｉ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５年）、４９（４）、１１３７〜４１頁）
２．Ｐ．プチダＳＣＲＣ−７４４（Ａｓａｎｏ，Ｙａｓｕｈｉｓａ；Ｅｎｄｏ，Ｋａｏｒｉ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８年）、２９（６）、５２３〜７頁）
３．Ｐ．グラベオレンス（Ｐ．タエトロレンスとしても知られている）（Ｓｏｄａ，Ｋｅｎｊｉ；Ｙｏｒｉｆｕｊｉ，Ｔａｋａｍｉｔｓｕ；Ｏｇａｔａ，Ｋｏｉｃｈｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９７１年）、２４６（１６）、５０８５〜９２頁）
４．エロモナス・キャビエ、エロモナス・パンクタータ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）亜種キャビエとしても知られている（Ｉｎａｇａｋｉ，Ｋｅｎｊｉ；Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；Ｔａｎａｋａ，Ｈｉｄｅｈｉｋｏ；Ｓｏｄａ，Ｋｅｎｊｉ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７年）、５１（１）、１７３〜８０頁）
５．Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８１３（Ｓｏｄａ，Ｋｅｎｊｉ；Ｏｓｕｍｉ，Ｔａｋａｈａｒｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９６９年）、３５（３）、３６３〜８頁）
６．Ｐ．オーレオファシエンス（Ｓａｌｃｈｅｒ，Ｏｌｇａ；Ｌｉｎｇｅｎｓ，Ｆｒａｎｚ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８０年）、１２１（２）、４６５〜７１頁）
７．Ｐ．プチダ１２６３３（Ｗｏｌｆ，Ｌａｒｉｓｓａ  Ｂ．；Ｓｏｎｋｅ，Ｔｈｅｏ；Ｔｊｅｎ，Ｋｉｍ  Ｃ．Ｍ．Ｆ．；Ｋａｐｔｅｉｎ，Ｂｅｒｎａｒｄ；Ｂｒｏｘｔｅｒｍａｎ，Ｑｕｉｒｉｎｕｓ  Ｂ．；Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｈａｎｓ  Ｅ．；Ｒｕｔｊｅｓ，Ｆｌｏｒｉｓ  Ｐ．Ｊ．Ｔ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ（２００１年）、３４３（６＋７）、６６２〜６７４頁）
８．Ｐ．フルオレッセンス株（Ｊｕ，Ｊｉａｎｓｏｎｇ；Ｙｏｋｏｉｇａｗａ，Ｋｕｍｉｏ；Ｍｉｓｏｎｏ，Ｈａｒｕｏ；Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋｏｕｈｅｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００５年）、１００（４）、４０９〜４１７頁）
９．Ｐ．ミヤミズ（Ｐ．ｍｉｙａｍｉｚｕ）（Ｃｈｉｂａｔａ，Ｉｃｈｉｒｏ；Ｔｏｓａ，Ｔｅｔｓｕｙａ；Ｓａｎｏ，Ｒｙｕｊｉｒｏ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９６５年）、１３（４）、６１８〜２４頁）
１０．Ｐ．オレオボランス株（Ｐ．プチダとしても知られている）
１１．シュードモナス株２１５０（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｈｉｒｏｓｈｉ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９６８年）、３２（２）、２５４〜６頁）
【０２７７】
この文献に基づいて、例４Ｉおよび４Ｏに記載されるように、さらなる作業を、Ｐ．プチダ１２９９６およびエロモナス種からＢＡＲコード遺伝子をうまく単離するために行った。当業者は、例えば実施例１１に記載されるように、逆遺伝学技術またはゲノム／ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて、これらの生物の残り（ゲノム配列データは限られている）から、ＢＡＲ酵素をコードする遺伝子を単離することができると考えられる。Ｐ．タエトロレンス（グラベオレンス）酵素（実施例４Ｌに記載）と同様に、本実施例（４Ｅおよび４Ｉ）で試験した２つのシュードモナス・プチダラセマーゼ相同体は、共に、広域特異性アミノ酸ラセマーゼであったので、すべての相同なシュードモナス由来のラセマーゼ（上記の文献に記載されるもの等）もまた広域活性を有すると考えられることが期待される。
【０２７８】
４Ｆ：Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲを用いたモナチン生成
モナチン生成アッセイは、精製Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲ（実施例４Ｅで精製）（１００μｇ）または精製Ｙ３５４Ａ（実施例４Ｂで精製）（５００μｇ）、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ  ＡＴ−１０３（Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ））（５００μｇ）、および配列番号１０４のアルドラーゼ（実施例３Ｂ）（５０μｇ）を用いて行った。上記の酵素に加えて、以下のものを１ｍＬの反応混合物当たりに追加した：４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。コントロールとして、実験は、ラセマーゼなしでかつＤ−トリプトファンで始めて、行った。結果の概要を下記の表２５に示す。
【０２７９】
【表２５】
2015211679.tif 000028
【０２８０】
モナチンは、本実験ではＹ３５４Ａを用いて検出されなかった。このラセマーゼは、モナチンを生成するために過去に用いられてきたが、はるかに高いレベルの酵素を用いた（より高いレベルのモナチンを検知するためには少なくとも２ｍｇかつ１０ｍｇまで）。Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲはＬ−トリプトファンからモナチンを生成するために用いた。本実験で用いられる１００μｇ  ＫＴ２４４０  ＢＡＲは、２時間後にモナチン生成を検知するには十分ではなかったが、１８時間後にモナチン生成を検知するのに十分であった。立体異性体分布は、生成された大部分のモナチンがＲ，Ｒ異性体であることを示した。Ｒ，Ｓ異性体は生成されなかった。これは、ＫＴ２４４０  ＢＡＲがモナチンのＲ，Ｒ異性体を検出可能にラセミ化することができないことを示す（Ｒ，Ｒ異性体のラセミ化によりＲ，Ｓ異性体が生成されるであろうと考えられる）。本実験で生成された著しい量のＳ，Ｓ異性体があった。これは、おそらく、本実験で用いたＡＴ−１０３が高度に精製されておらず、かつ細胞抽出物からのＬ−アミノトランスフェラーゼを含有する可能性があるという事実およびＳ−ＭＰのアミノ基転移のためのアミノ供与体として働くように存在する大量のＬ−トリプトファンがあるという事実によるものである。
【０２８１】
４Ｇ：位３９６でのＰ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲの突然変異誘発
Ｐ．プチダＫＴ２４４０（実施例４Ｅに記載）に由来するＢＡＲ酵素をコードする遺伝子を、Ｙ３９６Ｃ突然変異を有する酵素を生成するために改変した。同様の突然変異は、「Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒａｃｅｍａｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｒｏａｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒａｃｅｍａｓｅ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｓａｔｏ，Ｍ．ら、１０ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｐｒａｇｕｅ、Ｊｕｎｅ  ２４〜２８  ２０６）と題するポスターならびにＫ．Ｋｉｎｏ、Ｍ．Ｓａｔｏ、Ｍ．Ｙｏｎｅｙａｍａ、およびＫ．Ｋｉｒｉｍｕｒａ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７年）７３：１２９９〜１３０５頁に記載された。突然変異誘発は、タグなしタンパク質をもたらすｐＥＴ３０中のＢＡＲ遺伝子を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ−Ｍｕｌｔｉ  部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。以下の突然変異誘発性プライマーはＹ３９６Ｃ変化を加えるために用いた。5'-TTGCTCGCCGATTTGTGCACCGTATGGGGCAATTC-3'（配列番号121）。
【０２８２】
部位特異的突然変異誘発は、メーカーのプロトコールに記載されるように行った。数種の単離物は配列決定し（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、適正な配列を有する単離物は、さらなる分析のために選択し、用いた。
【０２８３】
プラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に形質転換した。組換えタンパク質は、メーカーのプロトコールに従って、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で生成した。無細胞抽出物は、メーカーのプロトコールに従ってＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて調製し、上記に記載されるＥｘｐｅｒｉｏｎ法を用いて、標的タンパク質の発現パーセントについて分析した。
【０２８４】
全タンパク質アッセイはＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて行った。変異体酵素を用いるトリプトファンラセマーゼアッセイは、ポジティブコントロールと同じ方法で調製した野生型酵素を用いて三通り行った。アッセイは１ｍＬ当たり次のものを含有した：３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８、１０μＭ  ＰＬＰ、および無細胞抽出物中、約２００μｇのラセマーゼタンパク質。０、２０分間、１時間、および一晩の試料を収集し、２％ギ酸を用いて処理し、濾過し、かつ実施例１に記載されるキラルアミノ酸法を用いる分析のために１：１０に希釈した。２０分間の時点で、野生型酵素についての７６１ｐｐｍと比較して、Ｙ３９６Ｃ変異体は約２６４ｐｐｍのＤ−トリプトファンを生成した。１時間で、野生型酵素についての１１１０ｐｐｍと比較して、変異体は、平均４４４ｐｐｍのＤ−トリプトファンを生成した。一晩の試料は２３００ｐｐｍのＤ−トリプトファンを含有していたが、野生型酵素は約３０００ｐｐｍのＤ−トリプトファンを生成することによって平衡状態に達した。
【０２８５】
変異体酵素の活性は、試験した条件下では野生型の約３５〜４０％である。しかしながら、この変異体は、野生型と比較して、アラニンに対して有意に低い活性を有し、これはモナチンを生成するための反応で有利である可能性があることが期待された。Ｄ−アラニンがより少ないと、副生成物としてＬ−アラニンに変換されることが期待されると考えられる。Ｓａｔｏらは、Ｉ３８４Ｍ突然変異のみを含有するＰ．プチダＩＦＯ  １２９９６に由来するＢＡＲ酵素は、アラニンに対して２６０００ｎｍｏｌ／分／ｍｇの特異的活性を有したが、Ｉ３８４Ｍ／Ｙ３９６Ｃ変異体はアラニンに対してたった８２５ｎｍｏｌ／分／ｍｇの活性しか有していなかったことを報告した。ＫＴ２４４０酵素は、先天的に位３８４でメチオニンを既に含有しており、したがって、ＩＦＯ１２９９６に見つけられるＩ３８４Ｍ変異体に匹敵する。
【０２８６】
さらなる実験を、Ｙ３９６Ｃ変異体のアラニンラセマーゼ活性をアッセイするために進めた。条件は、Ｌ−トリプトファンラセマーゼ活性について上記に記載される通りとしたが、４０分間および２時間の時点で測った。ＫＴ２４４０に由来する野生型ＢＡＲと比較すると、Ｙ３９６Ｃ変異体は、アラニンラセマーゼ活性が実際に少なかった。しかしながら、実施例４Ｆでのように、モナチン生成実験を繰り返した場合、この変異体は、全モナチンの生成での利点をもたらさなかった（約１／３の量のモナチンを生成した）。Ｙ３９６Ｃ変異体はまたＲ，Ｒモナチンの純度がより低かった（実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化技術を用いて、野生型酵素についての９７．６〜９９．３Ｒ，Ｒモナチン％に対して８６．２〜８７．３Ｒ，Ｒ％）。
【０２８７】
４Ｈ：代替の配列タグを有するＰ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲのクローニング
実験概要
実施例４Ｅに記載されるシュードモナス・プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲは、ｐＥＴ２８構築物からのＮ末端Ｈｉｓタグが不溶性タンパク質を生成するように考えられたので、可溶性を改善し、精製を促進するために、様々な配列タグと共に発現させた。遺伝子は、サブクローニングし、発現させ、Ｄ−トリプトファンへのＬ−トリプトファンの変換での活性について試験した。
【０２８８】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲをコードする遺伝子は、実施例４Ｅに記載されるｐＥＴ３０構築物からサブクローニングした。ポリメラーゼ連鎖反応は、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグを生成するｐＥＴ３０ａベクター（終止コドンなし、Ｃ末端Ｈｉｓタグを生成する）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＥＴ２２−ｂ（＋）（周辺質リーダー配列）、およびｐＡＳＫ−ＩＢＡ３（ＩＢＡ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にクローニングするための５’制限部位およびオーバーハングを用いて設計されたプライマーを用いて行った。同じＮ末端プライマーを、実施例４Ｅでように、ｐＥＴ３０ａクローニングに用いた。用いるプライマー配列は以下の通りである。
pET30 C末端-XhoI：5'-AAGTCGCTCGAGGTCGACGAGTATCTTCGGG-3'（配列番号122）；
pASK N末端：5'-ACGGTAGGTCTCAAATGCCCTTTCGCCGTACC-3'（配列番号123）；
pASK C末端：5'-AACCGTGGTCTCAGCGCTGTCGAGGAGTATCTTCGGG-3'（配列番号124）；
pET 22 N末端：5'-GCTCCACATGTCTCCCTTTCGCCGTACCCTTCTGGCTGCATC-3'（配列番号125）；および
pET22 C末端：5'-CCGCCGGATCCTCAGTCGACGAGTATCTTCGGGTTGGAATTGC-3'（配列番号126）。
【０２８９】
以下のＰＣＲプロトコールをｐＥＴ３０構築物およびｐＡＳＫ構築物に用いた：５０μＬの反応で、１μＬ鋳型、１μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、およびＭｇ入りの１×Ｅｘｐａｎｄ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いた。用いられるサーモサイクラープログラムは、３分間９４℃でのホットスタート、その後、以下の工程の８回の繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間５１℃、および２分間７２℃を含んだ。さらに２２回サイクルを５５℃のアニール温度を用いて実行した。３０サイクルの後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。正確なサイズのきれいなＰＣＲ産物を得た（約１２００ｂｐ）。ｐＥＴ２２構築物については、同様の増幅プロトコールを利用した。しかしながら、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、メーカーに推奨されるプロトコールのポリメラーゼとして用いられた。
【０２９０】
クローニング
ｐＥＴ３０構築物およびｐＡＳＫ−ＩＢＡ３構築物についてのＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。産物およびベクターを、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ（ｐＥＴ３０ａ）またはＢｓａＩ（ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３）で消化し、その後、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルから精製した。消化したベクターおよび挿入断片は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてライゲーションした。約５０ｎｇの処理した挿入断片、１００ｎｇの処理したベクター（ベクターに対する挿入断片の３対１のモル比）、５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および１×ライゲーション緩衝液を室温で２０分間インキュベートした。ライゲーション混合物を、ＴＯＰ１０化学的コンピテントイー・コリ細胞中に形質転換し、適切な抗生物質を含有するＬＢ平板上で平板培養した。ｐＥＴ２２構築物についてのＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。挿入断片配列は、検証し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位の中へＢａｍＨＩ／ＰｃｉＩ断片としてクローニングした。
【０２９１】
プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するように考えられるプラスミドの配列は、ジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。
【０２９２】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）中でのｐＥＴ３０構築物およびｐＥＴ２２構築物の誘発は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩプロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて行った。ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３構築物の誘発はメーカーのプロトコールに従って行った。細胞抽出物は、メーカーのプロトコールに従って、ベンゾナーゼヌクレアーゼを含有するＮｏｖａｇｅｎ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中に細胞ペレットを懸濁させることによって一晩培養物から調製した。上清（細胞抽出物）は、可溶性タンパク質の分析および発現パーセントの評価のために４〜１５％勾配ゲル上に装填した。全タンパク質アッセイは、標準物質としてＢＳＡを用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ法）を用いて進めた。Ｃ末端ＨｉｓタグＢＡＲは、十分に発現し、可溶性であり、Ｎ末端Ｈｉｓタグタンパク質に対して有意に改善した。しかしながら、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３  Ｓｔｒｅｐタグタンパク質は、全タンパク質または可溶性画分中で十分に発現するようには考えられなかった。Ｃ末端ＨｉｓタグＢＡＲは、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカラムを用いて精製し、溶出の後になお可溶性であるように考えられた。しかしながら、一晩のイミダゾール中での−８０℃での保存に際して、タンパク質は融解の際に沈殿した。したがって、タンパク質は細胞性抽出物中でアッセイした。タンパク質がイミダゾール溶出緩衝液からより適切に取り出された場合、タンパク質は可溶性のままであろうということが期待される。
【０２９３】
細胞抽出物は以下のプロトコールを用いて、トリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした。１ｍＬ反応は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１０μＭ  ＰＬＰ、および３０ｍＭ  Ｌトリプトファン中で行った。反応は、約２００μｇのラセマーゼ酵素の追加によって開始し、一晩３０℃で５分間、３０分間、１２０分間、および一晩インキュベートした。３パーセントのギ酸を、反応を停止させるために各時点で追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。試料は１：１０に希釈し、実施例１に記載されるキラルアミノ酸法によってＤ−トリプトファンについて分析するまで−８０℃で凍結させた。このアッセイでは、内部標準物質は用いられず、半定量分析となった。タグなしＰ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲを同じ方法で調製し、ポジティブコントロールとして用いた。精製ＢＡＲ（実施例４Ｅからの）もまたポジティブコントロールとして用いた。結果を下記の表２６に示す。
【０２９４】
【表２６】
2015211679.tif 000029
【０２９５】
ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３細胞抽出物は、発現が非常に乏しかったので、通常活性が検出不可能であったまたは期待どおり活性が低かった。Ｃ末端Ｈｉｓタグ酵素および周辺質タグＢＡＲ酵素は、ＫＴ２４４０に由来するタグなしＢＡＲ酵素と等しいまたはそれよりも大きな活性を明らかに有する。反応は、２時間までに、周辺質タグＢＡＲについては３０分間までに通常平衡状態に達した。反応は異なる量の酵素を用いて繰り返した。傾向は一貫しており、周辺質ＫＴ２４４０  ＢＡＲはタグなしＢＡＲに類似するまたはそれよりも大きな活性を有する。活性は、アッセイに追加した細胞性抽出物の量に伴って直線的に高くならないことが注目された。しかしながら、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ緩衝液中に阻害性のものがあるまたは濃度の増加が酵素の凝集を引き起こす可能性がある。アッセイは、他に記載されるようにＰＤ−１０カラムを用いてタンパク質を脱塩し、１０μＭ  ＰＬＰを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８中に溶出した後に繰り返した。界面活性剤およびＴｒｉｓ緩衝液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒから）の除去は、より多くの容量の細胞抽出物をアッセイに利用した場合、結果を改善するように考えられる。
【０２９６】
細胞性抽出物を、Ｃ末端ＨＩＳタグＫＴ２４４０  ＢＡＲ酵素についてさらに調製した。期待どおり、溶出緩衝液に由来するイミダゾールをＰＤ−１０カラムを用いて直ちに除去すると、タンパク質は溶液中に残存していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は期待された分子量の高度に精製されたバンドを示した。精製Ｃ末端ＨＩＳタグタンパク質を上記のように再アッセイし、凍結の前および後の双方で野生型（タグなし）ＢＡＲ酵素と比較した。双方の場合で、Ｃタグ精製酵素はタグなしタンパク質に匹敵する活性を示した。
【０２９７】
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）のＳｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒを用いる分析により、このラセマーゼについての、長さが２４アミノ酸のリーダー配列が予測される。
【０２９８】
４Ｉ：Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲのクローニング
Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲ配列は、株ＫＴ２４４０に由来する上記に記載されるＢＡＲタンパク質とＤＮＡレベルで９１％同一およびタンパク質レベルで９４％同一である。Ｐ．プチダのＮＢＲＣ１２９９６株は、日本のＮＩＴＥ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。プライマーは、実施例４Ｅに記載されるＰ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲ遺伝子のクローニングに用いたプライマーと同じものとした。株は、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ、蒸留水１Ｌ、寒天１５ｇ、ｐＨ７．０を含有する培地上で成長させた。細胞はペトリ皿からこすり取り、４００μＬの脱イオン化し、加圧滅菌したＨ２Ｏ中に再懸濁させた。この細胞懸濁液を鋳型としてＰＣＲ反応に用いた。結果として生じたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化した。消化ＤＮＡを１％アガロースゲル上で走らせ、最も目立つバンドをゲルから切り抜いた。ＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。結果として生じた断片は、上記に記載されるようにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、精製したｐＥＴ３０にライゲーションした。ライゲーションしたものは、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補足したＬＢ平板上で平板培養した。単離コロニーは、画線培養し、精製し、プラスミドプレップの培養を開始するために用いた。挿入断片の存在を確認するために、プラスミドをゲル上で走らせた。挿入断片を有するプラスミドを、配列決定のためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に送付した。適正な配列を有する単離物を同定し、後の研究に用いた。
【０２９９】
ＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲ  ＤＮＡ配列は（配列番号１２７）：
atgccctttcgccgtaccctcctggctgcatccctcgctctgctgatcactggccaggccccgctgtacgccgcaccgcccctgtcgatggacaacggcaccaccgccctgaccgcgcagaacagcaacgcctgggtcgaaatcagtgccggcgcactgcaacacaacatccgtaccttgcaggccgagttgggcggcaagtccaagctgtgcgccgtgctcaaggccgacgcctatggccacggtatcggcctggtgatgccgtcgatcatcgcccagggcgtgccctgcgtggcggtggccagcaacgaggaggcacgcgtggtccgcgccagtggcttcaccgggcaactggtgcgggtacgcctggccagcctcggcgaagtggaagatgccttgcagtacgacatggaagagctggttggcagcgccgagttcgcccgccagctcgatgccatcgccgaacgccacggcaagaccctgcgcattcacatggcgctcaattccagcggcatgagccgcaacggcgtggaaatgaccacctggtccggccggggtgaagcgctgcagatcactgaccagaagcacctccagctggtcgcgctgatgactcacttcgccgtggaagacaaggacgatgtgcgcaaaggcctggcagcgttcaacgaacagaccgactggctgatcaagcacgcgaagcttgatcgcagcaagctcaccctgcatgccgccaactccttcgctacgctggaagtgccggaagcgcacctggacatggtgcgtaccggtggcgcgctgttcggcgacaccgtgccgacgcgcaccgaataccaacgtgtcatgcagttcaagtcgcacgtggcggcggtgcacagctacccggcaggcaacaccgtcggctacgaccgcaccttcaccctggcgcgtgattcgcgcctggccaacatcaccgtgggttactccgatggctaccgccgggtgttcaccaacaagggccatgtgctgatcaacggccaccgagtgccagtggtgggcaaggtgtcgatgaacaccttgatggtcgatgtcaccgatttccccgatgtgaaggggggcaacgaagtggtgctgttcggcaaacaggccgggagggagatcacccaggccgagatagaagaaatcaacggcgcgctgctcgccgacctctacaccgtatggggcagttccaacccgaagatactcgtcgactgaである。
【０３００】
ＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲアミノ酸配列（配列番号１２８）は、
MPFRRTLLAASLALLITGQAPLYAAPPLSMDNGTTALTAQNSNAWVEISAGALQHNIRTLQAELGGKSKLCAVLKADAYGHGIGLVMPSIIAQGVPCVAVASNEEARVVRASGFTGQLVRVRLASLGEVEDALQYDMEELVGSAEFARQLDAIAERHGKTLRIHMALNSSGMSRNGVEMTTWSGRGEALQITDQKHLQLVALMTHFAVEDKDDVRKGLAAFNEQTDWLIKHAKLDRSKLTLHAANSFATLEVPEAHLDMVRTGGALFGDTVPTRTEYQRVMQFKSHVAAVHSYPAGNTVGYDRTFTLARDSRLANITVGYSDGYRRVFTNKGHVLINGHRVPVVGKVSMNTLMVDVTDFPDVKGGNEVVLFGKQAGREITQAEIEEINGALLADLYTVWGSSNPKILVDである。
【０３０１】
Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０プログラム（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いる分析により、このラセマーゼについての、長さが２４アミノ酸のシグナルペプチドが予測される。
【０３０２】
ＮＢＲＣ１２９９６ＢＡＲのアッセイ
ｐＥＴ３０  ＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲをＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換し、タンパク質を発現させ、無細胞抽出物を、実施例４Ｅに記載されるように調製した。精製ＫＴ２４４０  ＢＡＲ（実施例４Ｅに記載）（１００μｇ）を１２９９６ＢＡＲ（１００μＬの無細胞抽出物）と比較した。結果を下記の表２７に示す。
【０３０３】
【表２７】
2015211679.tif 000030
【０３０４】
ＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲは、トリプトファンのラセミ化のための活性を有する。ＮＢＲＣ  ＢＡＲを本実験のために精製していなかったまたは定量していなかったので、ＫＴ２４４０  ＢＡＲの活性をＮＢＲＣ１２９９６  ＢＡＲと定量的に比較することは可能ではない。
【０３０５】
「Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒａｃｅｍａｓｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｒｏａｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒａｃｅｍａｓｅ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｍ．Ｓａｔｏ、Ｍ．Ｙｏｎｅｙａｍａ、Ｋ．Ｋｉｒｉｍｕｒａ、およびＫ．Ｋｉｎｏ、１０ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｐｒａｇｕｅ、Ｊｕｎｅ  ２４〜２８  ２０６）と題するポスターは、このタンパク質のＩ３８４Ｍ変異体がより高いトリプトファンラセマーゼ活性をもたらすであろうということを示唆した。Ｋ．Ｋｉｎｏ、Ｍ．Ｓａｔｏ、Ｍ．Ｙｏｎｅｙａｍａ、およびＫ．Ｋｉｒｉｍｕｒａ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７年）７３：１２９９〜１３０５頁もまた参照されたい。
【０３０６】
突然変異誘発は、タグなしタンパク質をもたらすｐＥＴ３０で１２９９６ＢＡＲ遺伝子を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ−Ｍｕｌｔｉ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。以下の突然変異誘発性プライマーはＩ３８４Ｍ変化を加えるために用いた。5'-ACCCAGGCCGAGATGGAAGAAATCAACG-3'（配列番号129）。
【０３０７】
部位特異的突然変異誘発は、メーカーのプロトコールに記載されるように行った。数種の単離物は配列決定し（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、適正な配列を有する単離物は、さらなる分析のために選択し、用いた。プラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）コンピテント細胞中に形質転換した。組換えタンパク質は、メーカーのプロトコールに従って、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で生成した。無細胞抽出物は、メーカーのプロトコールに従ってＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて調製し、脱塩し、上記に記載されるＥｘｐｅｒｉｏｎ法を用いて、標的タンパク質の発現パーセントについて分析した。
【０３０８】
全タンパク質アッセイはＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて行った。変異体酵素を用いるトリプトファンラセマーゼアッセイは、ポジティブコントロールと同じ方法で調製した野生型酵素を用いて行った。アッセイは１ｍＬ当たり次のものを含有した：３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８、１０μＭ  ＰＬＰ、および無細胞抽出物中、約１００μｇのラセマーゼタンパク質。１００μｇを用いなかった（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ発現％およびＰｉｅｒｃｅの全タンパク質数に基づく）場合、結果は標準化した。０、３０分間、２時間、および一晩の試料を収集し、２％ギ酸を用いて処理し、濾過し、かつ実施例１に記載されるキラルアミノ酸法を用いる分析のために１：１０に希釈した。
【０３０９】
未精製タンパク質を利用したので、完全に定量的ではないが、データは、Ｉ３８４Ｍ突然変異が酵素の活性に有意に影響を与えるように考えられなかったことを示唆する。
【０３１０】
４Ｊ：ビブリオ・フィシェリアラニンラセマーゼのクローニングおよび発現
実験概要
ビブリオ・フィシェリの推定上のアラニンラセマーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質受入番号ＡＡＷ８５２３０．１またはＹＰ＿２０４１１８）をコードする遺伝子をクローニングし、発現させ、Ｄ−トリプトファンへのＬ−トリプトファンの変換での活性について試験した。
【０３１１】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
ビブリオ・フィシェリ・ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００６０１Ｄ）を鋳型としてアラニンラセマーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅に用いた。プライマーは、株ＥＳ１１４（ＣＰ００００２０．１  ＧＩ：５９４７８７０８の（ＮＣ＿００６８４０としても挙げられる）領域８００８４２．．８０２０５３）からの公開遺伝子配列に基づいて設計した。ポリメラーゼ連鎖反応は、ｐＥＴ２８ベクターおよびｐＥＴ３０ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にクローニングするために５’制限部位およびオーバーハングを用いて設計したプライマーを用いてゲノムＤＮＡに対して行った。
プライマー配列：
N末端：
5'-GCGGCCCATATGAAGTTTACTAAATGTGCAT-3'（配列番号130）および
C末端：
5'-GGCCGCGGATCCCTATTTGTAGATCTTAGGATTTG-3'（配列番号131）。
【０３１２】
Ｖ．フィシェリからの遺伝子は、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。２μＬのゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）をＰＣＲのための鋳型として用いた。１００μＬの反応中、２μＬ鋳型（ゲノムＤＮＡ  １００ｎｇ／μＬ）、０．５ｍＬの各プライマー（１００μＭストック溶液）、０．３ｍＭ各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  ｄＮＴＰミックス（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））、１μＬ  Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。用いるサーモサイクラープログラムは、３分間９５℃でのホットスタート、以下の工程の１０回の繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間５２℃、および３分間７２℃、その後、以下の工程の２０回の繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間５５℃、および３分間７２℃を含んだ。２０回繰り返した後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールにより１．２ｋｂの産物を生成した。
【０３１３】
クローニング
ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。産物は、ＴＯＰＯクローニングし、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従ってＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するように考えられるプラスミドの配列は、汎発性のＭ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを用いてジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証し、配列は、上記に挙げた受入番号と同一であることが分かった。
【０３１４】
適正なＴＯＰＯクローンは、メーカー推奨のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。ベクターｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０は、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた消化により調製し、その後、エビアルカリフォスファターゼを用いる処理（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＱｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いる０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからの精製が続いた。
【０３１５】
消化したベクターおよび挿入断片は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてライゲーションした。約５０ｎｇの処理した挿入断片、１００ｎｇの処理したベクター（ベクターに対する挿入断片の３対１のモル比）、５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および１×ライゲーション緩衝液を室温で５分間インキュベートした。ライゲーション反応は、イー・コリＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を形質転換するために用いた。３μＬの各ライゲーション反応物を４０μＬのＴＯＰ１０細胞に追加し、これらの細胞を４２℃での３０秒間の熱ショックパルスを用いて形質転換し、その後、５分間の氷上でのインキュベーションを続けた。細胞を、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間２５０μＬの室温のＳＯＣ培地中で回復させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、（１９８９年）、１．７６〜１．８１＆Ａ．２））。細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。
【０３１６】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にサブクローニングした。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。
【０３１７】
ＢＬ２１ＤＥ３中での誘発は、ｐＥＴ２８（タグ付き）ベクターおよびｐＥＴ３０（タグなし）ベクターで行った。時間的経過研究は、３７℃で、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有する１００ｍＬ  ＬＢ中で０．５のＯＤ６００まで成長させた培養物を用いて行い、１００ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発し、誘発後、０および３時間にサンプリングした。０時間および４時間の時点からの細胞は、２−メルカプトエタノールを含有する１×ドデシル硫酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、１０分間９５℃で加熱し、冷却した。これらの全細胞タンパク質試料のアリコートを、４〜１５％勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３１８】
細胞抽出物は、さらに、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＮｏｖａｇｅｎ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中の５ｍＬの培養物からの細胞ペレットを緩やかに振盪させながら２０分間室温で懸濁させることによってならびに細胞片を除去するために１６，０００ｘｇで遠心分離することによって４時間培養物から調製した。上清（細胞抽出物）は、細胞可溶性タンパク質の分析のために４〜１５％勾配ゲル上に装填した。クローニングしたＶ．フィシェリアラニンラセマーゼからの４時間試料は、ｐＥＴ２８（タグ付き）ベクターおよびｐＥＴ３０（タグなし）ベクター中の適正なサイズ（約４５ｋＤａ）に相当する全タンパク質バンドを示した。
【０３１９】
誘発した培養物（１００ｍＬ）からの細胞は、遠心分離し、０．８５％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。細胞ペレットは、５μＬ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含有する５ｍＬ／湿細胞重量ｇのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）試薬中で再懸濁させた。試料は、オービタルシェーカー上で２０分間室温でインキュベートした。不溶性細胞片は、４℃で２０分間１６，０００ｘｇでの遠心分離によって除去した。
【０３２０】
細胞抽出物は以下のプロトコールを用いて、トリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした。１ｍＬ反応は、０．０５ｍＭ  ＰＬＰおよび３０ｍＭ  Ｌトリプトファンを有する５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）中で行った。反応は、無細胞抽出物（または精製ポジティブコントロールラセマーゼ）の追加によって開始し、一晩３０℃でインキュベートした。試料のアリコートは一晩のインキュベーションの後に測った（０分間の試料はコントロール反応物として取り扱った）。濃縮ギ酸（５μＬ）は、反応を停止させるために各２５０μＬ試料のアリコートに追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。上清は、取り出し、実施例１のキラルアミノ酸法によってＤ−トリプトファンについて分析するまで−８０℃で凍結させた。
【０３２１】
１００ｍＭ  ＩＰＴＧを用いたｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０の誘発からの細胞抽出物からのアッセイ結果（３時間）は、Ｖ．フィシェリクローンがＬ−トリプトファンに対してラセマーゼ活性を示し、実施例４Ｅで生成されたポジティブコントロールＫＴ２４４０  ＢＡＲ精製ラセマーゼのように、Ｄ−トリプトファン生成をもたらすことを実証する。各チューブに等価な量のラセマーゼタンパク質を追加することをすべて試みた。アッセイの条件下で、発明者らは、Ｖ．フィシェリラセマーゼがｐＥＴ２８（Ｈｉｓタグ）に対してｐＥＴ３０（タグなし）中にクローニングされた場合、より高いＤ−トリプトファン生成を観察した。結果を表２８に示す。当業者は、ふさわしい折りたたみを確実にすること、可溶性発現および安定性の増加、ならびに他のところで記載される突然変異誘発法を通して、Ｖ．フィシェリラセマーゼの酵素活性を改善することができるかもしれない。
【０３２２】
【表２８】
2015211679.tif 000031
【０３２３】
４Ｋ：フォトバクテリウム・プロファンダムＢＡＲ相同体のクローニング
２種のＰ．プロファンダムＢＡＲ相同体のアミノ酸配列を公的データベース（ＮＣＢＩ）から得た。ＣＲ３７８６７３（ヌクレオチド３４２４４４．．３４３６５８）の推定上のアラニンラセマーゼコード配列をプライマーから構築した。アミノ酸配列（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＧ２１６７０）は、ＧｅｎｅＣｏｍｐｏｓｅｒソフトウェアパッケージ（バージョン１．０、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｌａｎｄ、ＷＡ）を用いて最適なＤＮＡ配列を設計するために用いた。ＣＲ３７８６７３最適化ＤＮＡ配列（配列番号１３２）は以下の通りである。
atgaagctgaagctgagcctggtcgccctggcactgatgggtcagactactgctaatgccgcaccactgctggtggacttcgataacaatgagcgtgaggaacgtgtgcaaagctctaatgcgtggctggagattgatacccaagcattcagtggcaatattcagttactgcagaaccaactgaaagccgacaccaagatctgtgcgattatgaaggcggatgcatacggtaatggcattgccggcttgatgcctagtatcattgctaaccaagtgccttgtgttggtatcaccagcaatgaggaagcgcgggtggttcgtaaacatggctttattgggaagatcatgcgtgtccgtgcagcctcgaagaatgaaattgagggtggcttgcagtaccagatggaagaattgatcggtacgaaggctcaagccgatcaaatcatcgaaattgcacgcgcaaatggcacgacgattccggttcatttagccttgaatacaagcggcatgggccgcaacggtctggacctgacgacctacgaaggccaagttgaaggtgtagagattgctggcgatccaaacctggagattgtcggcatgatgactcatttcccgaacgagggactggacgaaatcaaacggaaagtcaaacgtttcaaagtagaaacgaaatggttaatggattccactgacttgaagcgcaaagatgtgacgctccacgtcgcaaacagctatatcaccttgaatctgcctgaagcgcatctggatatggtacgcccaggtggcatgctgtatggcgactatccggcgacagcgccgtatcagcgtatcgtaagcttcaagacccacgttgcctctttgcaccactttccggctggctcaaccattgggtacggatctaccgctgttctggaacgtgattcagttctggctaatctgccgattggctattcggatggcttcgcgcgctcgttaggaaataaagccgaagtcctgattaacggccagcgtgcgcgcgtcatgggtatggtcagtatgaacacgacgatggtcgatgtaacggatattgtggatgttcagaccaatgaagaagtcgtgatctttggccgccagggtttcgaagagattacgggcgaggagacggaagagaagtctaatcgtattcttccggaacattacactgtgtggggcgccacaaacccgcgtatttatcgctaa。
【０３２４】
プライマーは、全配列ならびにコード鎖および非コード鎖を包含するように設計した。配列は、以下のプライマーを最終的な増幅に用いて実施例１０でのように構築した。5'-agaagacatatgaagctgaagctgagcc-3'（配列番号133）および5'-agaagaggatccttagcgataaatacgcggg-3'（配列番号134）。結果として生じたＰＣＲ産物は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ中にクローニングした。挿入断片を有するプラスミドを、配列決定のためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に送付した。適正な配列を有するプラスミドを同定し、続くクローニング工程に用いた。適正な配列を有するＴＯＰＯ単離物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、消化物を１％アガロースゲル上で走らせ、適正な断片をゲルから切り抜いた。ＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。結果として生じたＤＮＡ断片は、上記に記載されるように消化し、精製したｐＥＴ３０にライゲーションした。挿入断片を有するクローンを、単離し、配列決定のためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に送付した。適正な配列を有するクローンを単離し、さらなる研究に用いた。
【０３２５】
Ｐ．プロファンダムに由来する推定上のアラニンラセマーゼ（タンパク質配列受入番号ＣＡＧ２３７９７）をコードするＣＲ３７８６８１（ヌクレオチド６０１９１．．  ６１４０８）遺伝子は、以下のプライマーを最終的な増幅に用いて、上記と同じ方法で単離した。(5'-GGCCTTGGCATATGAACTTTAAGATGACTCTG-3'（配列番号135）および5'-TTCCAATTGGATCCTTACTTCAGGTAGTAACGCGGATTC-3'（配列番号136））。
【０３２６】
最適化ＣＲ３７８６８１ラセマーゼのＤＮＡ配列（配列番号１３７）は次の通りである。
ATGAACTTTAAGATGACTCTGTTAAGCCTGGCCATTACATTCCCGAGCTTCAGCATCTATAGCGCGCCACTGGTCATTGATCAGAACCTGCCAAGCGAACAGTCGATTCAGCAAAGCAACAGCTGGCTGGAAGTTAGCCTGGGCCAGTTTAAATCCAATATTGAACAATTTAAATCTCATATTAAAGCCGATACTAAGATTTGTGCCGTTATGAAAGCCGATGCATACGGCAATGGCATCTTCGGTCTGATGCCGACAATTCTGGAACAGCAAATCCCATGCGTGGCGATTGCAAGTAACGCGGAAGCTCGCGCTGTGCGTGAAAGCGGGTTTAAGGGCCAGCTGCTGCGTGTCCGCAGCGCGAGCTTAGGCGAGATTAAACAGTCACTGGACCTGAACATTGAAGAACTGATCGGCTCACATCAGCAGGCGAAGTTCATTGCAGAGCTGGGTGTAGAACGTAATCAGAAGATTAACGTTCATTTAGCTCTGAACGACGGAGGGATGGGTCGCAATGGGATCGATATGTCTACCGAACAAGGCAAAGCCGAGGCCCTCGACATCGCGACCCAGGCAAATCTGAACATTGTTGGTATTATGACTCACTTCCCGAACTATAATGCGGATAAAGTGCGTGTGAAGCTGAAAGACTTCCAGACAAACTCCAGCTGGCTGATCAAGCAGGCGGATCTGAAGCGCGATGAACTCACGCTCCACGTGGCCAACAGCTATGTGTCCATTAATGTTCCAGAAGCGCAACTGGATATGGTTCGCCCGGGCGGCGTGCTGTATGGCGATCTTCCGACCAATCCGGAATATCCGAGCATCGTATCGTTCAAGACGCGGATTGCGTCAATTCACCAGCTGCCAGCATCCCAGACCGTGGGCTACGATTCGACCTATATTACGAAACGTGATAGCGTTCTGGCAAACCTGCCAGTCGGCTACAGTGATGGCTATCCGCGCCGTATGGGTAATCAGGCTGATGTGATTATCAACGGACAACGCGCCAAAGTGGTGGGTGTGACCAGCATGAATACTAGTATCGTCGATATTACCGATATTAAAGGCGTTAAACAGGGTCAAGAAGTTACCCTGTTTGGCAAGCAGAAGAATGTGCAGATTAGCGTGGCCGAAATGGAGGATTATTCGAAGTTAATCTTCCCGGAACTGTACACCATGTGGGGTCAGGCGAATCCGCGTTACTACCTGAAGTAA（配列番号137）。
【０３２７】
プラスミドをＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳに形質転換し、この株を発現に用いた。プラスミドを有する株を約０．６のＯＤ６００まで成長させ、発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。通気をしながらの３０℃（ＣＲ３７８６８１）または２６℃（ＣＲ３７８６７３）でのインキュベーションの後に、細胞ペレットを遠心分離によって採取し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットは、氷上で解凍し、細胞は、適切な容量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（製品挿入物を参照されたい）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて溶解させた。溶解物は細胞片を除去するために遠心分離し、結果として生じた無細胞抽出物をラセマーゼアッセイに用いた。これらの条件下で、Ｄ−ｔｒｐへのＬ−ｔｒｐの変換を検出することはできなかった。酵素はまた、界面活性剤を無細胞抽出物から除去した場合でさえ、トリプトファンについての上記と同様の方法でアッセイした場合、Ｄ−アラニンへのＬ−アラニンの変換を触媒するようにも考えられなかった。アッセイで生成されたＤ−アラニンのレベルは、過剰発現ラセマーゼ遺伝子なしの細胞性抽出物と比較して類似しており、Ｄ−トリプトファンのバックグラウンド生成が内因的なイー・コリアラニンラセマーゼによるものであったことを示した。酵素は、十分に発現するようには考えられなかった、また、活性は、発現が増強される場合または当業者らに知られている突然変異誘発法によって酵素が改善される場合、検出される可能性がある。タンパク質活性はまた、生成されたラセマーゼ酵素の多くが、可溶性であるようには考えられず、きわめて容易に凝集したまたは沈殿したので、ふさわしい折りたたみを促すことができる方法によって増強される可能性がある。酵素活性は、不適当な折りたたみまたはピリドキサール−５’−リン酸補助因子の不適当な挿入により検出するのが困難となる可能性がある。ふさわしい折りたたみまたは補助因子の挿入を促すことは酵素活性を非常に増強する可能性がある。
【０３２８】
４Ｌ：シュードモナス・タエトロレンスアルギニンラセマーゼのクローニングおよび発現
実験概要
シュードモナス・タエトロレンス（Ｐ．グラベオレンスとしても知られている）アルギニンラセマーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６、核酸配列）およびそのＩ３８４Ｍ変異体は、クローニングし、発現させ、Ｄ−トリプトファンへのＬ−トリプトファンの変換での活性について試験した。この遺伝子は、上記に記載される、ＫＴ２４４０に由来するＰ．プチダＢＡＲ遺伝子に７２％同一であり、ＮＢＲＣ１２９９６に由来するＰ．プチダＢＡＲ遺伝子に７３％同一である。アミノ酸配列は双方のＰ．プチダＢＡＲタンパク質に７２％同一である。
【０３２９】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
シュードモナス・タエトロレンス（ＡＴＣＣ４６８３）は、２２５ｒｐｍで振盪させながら２８℃で栄養ブロス中で成長させた。ポリメラーゼ連鎖反応は、ｐＥＴ２８ベクターおよびｐＥＴ３０ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にクローニングするために５’制限部位およびオーバーハングを用いて設計したプライマーを用いて全細胞に対して行った。
【０３３０】
プライマー配列は次の通りであった。
N末端：5'-ATAATACATATGCCCTTCTCCCGTACCC-3'（配列番号138）および
C末端：5'-GCGGCGGGATCCTTACTGATCTTTCAGGATT-3'（配列番号139）。
【０３３１】
Ｐ．タエトロレンスに由来する遺伝子は、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。２５μＬの成長させた細胞を１０分間９６℃で溶解した。細胞片は、遠心分離によって除去し、上清はＰＣＲのための鋳型として用いた。１００μＬ反応は、５μＬ鋳型（溶解した細胞の上清）、１．６μＭの各プライマー、０．３ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  ｒＴｔｈ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、１×ＸＬ緩衝液、および１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含有した。用いるサーモサイクラープログラムは、３分間９４℃でのホットスタート、以下の工程の８回の繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、および２分間６８℃、その後、以下の工程の２２回の繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間５８℃、および２分間６８℃を含んだ。２２回繰り返した後、試料は、７分間６８℃での維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールにより１２３０ｂｐの産物を生成した。
【０３３２】
クローニング
ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。産物は、ＴＯＰＯクローニングし、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従ってＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するように考えられるプラスミドの配列は、汎発性のＭ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを用いてジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０３３３】
適正なＴＯＰＯクローンは、メーカー推奨のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。ベクターｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０は、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた消化により調製し、その後、エビアルカリフォスファターゼを用いる処理（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＱｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いる０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからの精製を続けた。消化したベクターおよび挿入断片は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてライゲーションした。約５０ｎｇの処理した挿入断片、１００ｎｇの処理したベクター（ベクターに対する挿入断片の３対１のモル比）、５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および１×ライゲーション緩衝液を室温で５分間インキュベートした。ライゲーション反応は、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて脱塩し、イー・コリＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を形質転換するために用いた。１０μｌの各ライゲーション反応に、４０μＬのＤＨ１０Ｂ細胞を追加し、以下の条件下でＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ  ＩＩを用いてエレクトロポレーションによって形質転換した：０．２ｃｍキュベット中２．５ｋＶ、２５μＦ、２００オーム。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間、１ｍＬの室温ＳＯＣ中で回復させた。細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。
【０３３４】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に形質転換した。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。
【０３３５】
ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ中での誘発は、ｐＥＴ２８ベクター（ヒスチジンタグ付き）およびｐＥＴ３０（タグなし）ベクターの双方で最初に行った。時間的経過研究は、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有する１００ｍＬ  ＬＢ中で０．５のＯＤ６００まで３７℃で成長させた培養物を用いて行い、１００μＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発し、誘発後、０および３時間にサンプリングした。０時間および３時間の時点からの細胞は、２−メルカプトエタノールを含有する１×ドデシル硫酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、１０分間９５℃で加熱し、冷却した。これらの全細胞タンパク質試料のアリコートを、４〜１５％勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３３６】
細胞抽出物は、さらに、ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＮｏｖａｇｅｎ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中の５ｍＬの培養物からの細胞ペレットを緩やかに振盪させながら２０分間室温で懸濁させることによってならびに細胞片を除去するために１６，０００ｘｇで遠心分離することによって３時間培養物から調製した。上清（細胞抽出物）は、細胞可溶性タンパク質の分析のために４〜１５％勾配ゲル上に装填した。
【０３３７】
クローニングしたＰ．タエトロレンスアルギニンラセマーゼからの３時間試料は、ｐＥＴ３０（タグなし）ベクター中の適正なサイズ（約４５ｋＤａ）に相当する全タンパク質バンドを示した。Ｐ．タエトロレンスｐＥＴ３０遺伝子産物は、Ｐ．タエトロレンスｐＥＴ２８（ヒスチジンタグ付き）遺伝子産物よりも高いレベルで過剰発現したが、どちらのベクターからも目に見える可溶性タンパク質バンドは生じなかった。
【０３３８】
誘発した培養物（１００ｍＬ）からの細胞は、遠心分離し、０．８５％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。細胞ペレットは、５μＬ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含有する５ｍＬ／湿細胞重量ｇのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）試薬中で再懸濁させた。試料は、オービタルシェーカー上で２０分間室温でインキュベートした。不溶性細胞片は、４℃で２０分間１６，０００ｘｇでの遠心分離によって除去した。
【０３３９】
細胞抽出物は以下のプロトコールを用いて、トリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした。１ｍＬ反応は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、および３０ｍＭ  Ｌトリプトファン中で行った。反応は、無細胞抽出物の追加によって開始し、一晩３０℃でインキュベートした。試料アリコートは一晩のインキュベーションの後に測った（０分間の試料はコントロール反応物として取り扱った）。濃縮ギ酸（５μＬ）は、反応を停止させるために各２５０μＬ試料のアリコートに追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。上清は、取り出し、実施例１に記載されるキラルアミノ酸法によってＤ−トリプトファンについて分析するまで−８０℃で凍結させた。
【０３４０】
１００μＭ  ＩＰＴＧを用いたｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０の誘発からの細胞抽出物からのアッセイ結果（３時間）は、Ｐ．タエトロレンスクローンがＬ−トリプトファンに対してラセマーゼ活性を示すことを実証する。さらに、ＢＡＲのタグ付きバージョンはそれほど活性ではないように考えられ、沈殿する可能性があるまたはタグなし（ｐＥＴ２８）ほど可溶性ではない可能性がある。可溶性の非常に乏しいタンパク質が得られたので定量的ではないが、下記の表２９に最初の結果を示す。
【０３４１】
【表２９】
2015211679.tif 000032
【０３４２】
ｐＥＴ３０（タグなし）構築物の誘発は、上述と同じ条件を用いて繰り返し、目に見える可溶性タンパク質バンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察された。アッセイは、上記に記載される同じ条件を用いて繰り返し、結果は、表３０に示すように得られた。
【０３４３】
【表３０】
2015211679.tif 000033
【０３４４】
さらに、容量を倍増しても活性は上がらなかったことが注目された。その後の作業については、細胞抽出物の調製の後にＢｕｇｂｕｓｔｅｒからタンパク質をできるだけ速く除去し、かつ０．０１ｍＭ  ＰＬＰを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８にタンパク質を保存することを決定した。Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ中の界面活性剤は、反応を阻害する可能性があるまたは保存に際して活性の損失を引き起こす可能性がある。
【０３４５】
ｐＥＴ３０構築物の誘発をもう一度実行し、細胞抽出物は、より純粋な抽出物を生じさせるために陰イオン交換クロマトグラフィー（実施例４Ｅでのように）を用いて処理した。アッセイは、この部分的に精製したプレップを用いて繰り返した。下記の表３１のラセマーゼ抽出物の列の括弧中の数は、アッセイで用いた部分的に精製したラセマーゼ酵素のおよその量を示す。アッセイの結果を下記の表３１に示す。
【０３４６】
【表３１】
2015211679.tif 000034
【０３４７】
この場合の一晩の試料が非直線性であるのは、おそらく、反応が平衡に達しているという事実による。明らかに、Ｐ．タエトロレンスＢＡＲは、１２９９６  ＢＡＲおよびＫＴ２４４０  ＢＡＲのように、トリプトファンのラセミ化に対して著しい活性を有する。ＫＴ２４４０  ＢＡＲおよびＰ．タエトロレンスＢＡＲは、１２９９６  ＢＡＲよりもわずかに高い、同様の活性を有するように考えられる。
【０３４８】
Ｐ．タエトロレンスアルギニンラセマーゼのＤＮＡ配列は、配列番号１４０として下記に示す。ＰＣＲ配列は、公開ＮＣＢＩ配列と比較して２つの変化を生じていた。特に、ＰＣＲ配列は、位９０２にグアニンではなくアデノシンを、かつ位９２１にグアニンではなくシトシンを含有した。これらのＤＮＡ変化はさらに、１つのサイレント突然変異およびアミノ酸位３０１でのグリシンからアスパラギン酸への１つの変化をもたらした。
ATGCCCTTCTCCCGTACCCTGCTCGCCCTTTCCCTTGGCATGGCATTGCTGCAAAACCCGGCCTTTGCTGCGCCACCCCTGTCGATGACCGACGGCGTAGCTCAAGTGAATACCCAGGACAGCAATGCCTGGGTCGAAATCAATAAAGCCGCGTTCGAGCACAACATACGGACTCTGCAAACCGCCCTCGCCGGCAAGTCGCAGATCTGCGCCGTACTCAAGGCGGATGCCTATGGCCACGGTATCGGCTTGTTGATGCCCTCGGTGATCGCCATGGGTGTTCCCTGTGTCGGTGTCGCCAGCAACGAAGAAGCCCGCGTCGTGCGCGAGAGCGGTTTCAAGGGTCAACTGATACGCGTGCGCACCGCTGCCCTGAGCGAACTGGAAGCTGCACTGCCGTACAACATGGAAGAGCTGGTGGGCAACCTGGACTTCGCGGTCAAGGCCAGCCTGATTGCCGAGGATCACGGTCGCCCGCTGGTGGTGCACCTGGGTCTGAATTCCAGCGGCATGAGCCGTAACGGAGTGGACATGACCACCGCTCAGGGCCGTCGTGATGCGGTAGCTATCACCAAGGTGCCAAACCTGGAAGTGCGGGCGATCATGACCCACTTCGCGGTCGAAGATGCTGCCGACGTGCGTGCCGGGCTCAAGGCCTTCAATCAGCAAGCCCAATGGCTGATGAACGTGGCCCAGCTTGATCGCAGCAAGATCACCCTGCACGCGGCCAACTCGTTCGCCACACTGGAGGTGCCCGAATCGCATCTGGACATGGTCCGCCCCGGCGGCGCGCTGTTCGGCGACACCGTACCGTCCCACACCGAGTACAAGCGGGTCATGCAGTTCAAGTCCCACGTGGCGTCGGTCAACAGCTACCCCAAGGGCAACACCGTCGGTTATGACCGCACGTACACCCTGGGCCGCGACTCGCGGCTGGCCAACATCACCGTCGGCTACTCTGACGGCTACCGCCGCGCGTTTACCAATAAAGGGATTGTGCTGATCAACGGCCATCGCGTGCCAGTGGTGGGCAAAGTCTCGATGAACACCCTGATGGTGGACGTCACTGACGCGCCGGATGTGAAAAGCGGCGATGAAGTGGTGCTGTTCGGGCACCAGGGCAAGGCCGAGATTACCCAGGCTGAGATCGAAGACATCAACGGTGCACTGCTTGCGGATCTGTATACCGTGTGGGGCAATTCCAACCCTAAAATCCTGAAAGATCAGTAA
（配列番号140）。
【０３４９】
Ｐ．タエトロレンスアルギニンラセマーゼのアミノ酸配列は、配列番号２０４として下記に示す。
MPFSRTLLALSLGMALLQNPAFAAPPLSMTDGVAQVNTQDSNAWVEINKAAFEHNIRTLQTALAGKSQICAVLKADAYGHGIGLLMPSVIAMGVPCVGVASNEEARVVRESGFKGQLIRVRTAALSELEAALPYNMEELVGNLDFAVKASLIAEDHGRPLVVHLGLNSSGMSRNGVDMTTAQGRRDAVAITKVPNLEVRAIMTHFAVEDAADVRAGLKAFNQQAQWLMNVAQLDRSKITLHAANSFATLEVPESHLDMVRPGGALFGDTVPSHTEYKRVMQFKSHVASVNSYPKGNTVGYDRTYTLGRDSRLANITVGYSDGYRRAFTNKGIVLINGHRVPVVGKVSMNTLMVDVTDAPDVKSGDEVVLFGHQGKAEITQAEIEDINGALLADLYTVWGNSNPKILKDQ
（配列番号204）。
【０３５０】
配列番号１４０の遺伝子によってコードされるタンパク質は、シグナルペプチド予測プログラムＳｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）によって分析し、２３個のアミノ酸のリーダー配列を予測した。
【０３５１】
以下のＰＣＲプライマー対を、リーダー配列のアミノ酸２〜２３のないＰ．タエトロレンス遺伝子をクローニングするために用いた。
Ｐ．ｔａｅｔリーダーなし  Ｆ  ＮｄｅＩ：5'-GGTTAATTCATATGGCGCCACCCCTGTCGAT-3'（配列番号180）
Ｐ  ｔａｅｔＣ末端Ｘｈｏ：5'-AAGTCGCTCGAGCTGATCTTTCAGGATTTTAG-3'（配列番号181）。
【０３５２】
上記に示されるＣ末端プライマーはまた、Ｐ．プチダＫＴ２４４０  ＢＡＲについて実施例４Ｈに記載されるように精製を考慮した様式で野生型タンパク質を生成するために配列番号１３８と共に用いた。リーダーなしＰ．タエトロレンスラセマーゼは、完全長遺伝子の発現産物と比較して、発現した場合に、かなりの量の活性を失うことが分かった。周辺質および細胞質のタンパク質画分を、ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に記載されるように野生型発現産物およびリーダーなし構成物について単離した。発現した野生型ＢＡＲは、周辺質画分中に存在したが、リーダーなしＢＡＲの発現は有意に低下した。リーダーなしＰ．タエトロレンスＢＡＲの活性の損失は、細胞質中で発現した場合のプロセシングおよび／または折りたたみの変化によるものである可能性がある。
【０３５３】
Ｐ．タエトロレンスＢＡＲのＩ３８４Ｍ突然変異誘発
突然変異誘発は、タグなしタンパク質をもたらすｐＥＴ３０中のＰ．タエトロレンスＢＡＲ遺伝子を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ−Ｍｕｌｔｉ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。以下の突然変異誘発性プライマーはＩ３８４Ｍ変化を加えるために用いた。5'-TACCCAGGCTGAGATGGAAGACATCAACG-3'（配列番号141）。
【０３５４】
部位特異的突然変異誘発は、メーカーのプロトコールに記載されるように行った。数種の単離物は配列決定し（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、適正な配列を有する単離物は、さらなる分析のために選択し、用いた。
【０３５５】
プラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に形質転換した。組換えタンパク質は、メーカーのプロトコールに従って、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で生成した。無細胞抽出物は、メーカーのプロトコールに従ってＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて調製し、脱塩し、上記に記載されるＥｘｐｅｒｉｏｎ法を用いて、標的タンパク質の発現パーセントについて分析した。
【０３５６】
全タンパク質アッセイはＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて行った。変異体酵素を用いるトリプトファンラセマーゼアッセイは、ポジティブコントロールと同じ方法で調製した野生型酵素を用いて行った。アッセイは１ｍＬ当たり次のものを含有した：３０ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８、１０μＭ  ＰＬＰ、および無細胞抽出物中、約１００μｇのラセマーゼタンパク質。１００μｇを用いなかった（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ発現％およびＰｉｅｒｃｅの全タンパク質数に基づく）場合、結果は標準化した。０、３０分間、２時間、および一晩の試料を収集し、２％ギ酸を用いて処理し、濾過し、かつ実施例１に記載されるキラルアミノ酸法を用いる分析のために１：１０に希釈した。
【０３５７】
定量化は、粗溶解物を利用したといった事実により困難であった。野生型酵素は、Ｉ３８４Ｍ変異体と比較して、３０分間および２時間の時点で同様の量のＤ−トリプトファンを生成するように考えられた。Ｉ３８４Ｍ変異体は、試験した条件下で、野生型のせいぜい約２倍の活性を有するように考えられた。アッセイを、実施例４Ｆでのようにモナチン生成について行った場合、Ｉ３８４Ｍは、試験した条件下で、野生型Ｐ．タエトロレンス酵素に対していかなる有益性をも提供するようには考えられなかった。
【０３５８】
４Ｍ：ストレプトマイセス・セリカラーラセマーゼアッセイ
ストレプトマイセス種は、Ｄ−トリプトファンのごときＤ−アミノ酸を含有する、カルシウム依存性の抗生物質を生成することで知られている。トリプトファンが抗生物質中への取り込み前またはその後にラセミ化されるかどうかは知られていない。公的なストレプトマイセスゲノムは、シュードモナス種に由来する活性を有するアラニンラセマーゼに対して高度に相同なアラニンラセマーゼを含有していないが、実際に酵素が同様に広域特異性を有するかどうかを決定するためにクローニング作業を試みた。
【０３５９】
ストレプトマイセス・ビオラセオルーバー（ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７１はストレプトマイセス・セリカラーとして委託）をＩＳＰ培地１（ＢＤカタログ＃２７６９１０、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中で成長させた。細胞を超音波処理によって溶解させ、細胞片を遠心分離によって除去した。無細胞抽出物をトリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした（Ｌ−トリプトファンで始めた）。試験した条件下で、Ｄ−ｔｒｐへのＬ−ｔｒｐの変換を検出することはできなかった。
【０３６０】
ストレプトマイセス・セリカラーは、３種のアラニンラセマーゼを含有するとしてＥＲＧＯ（商標）で注解されている（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿６２８９０３、ＮＰ＿６２８０８９、およびＮＰ＿６２９１３９）。公開ＤＮＡ配列はＰＣＲによってＳ．セリカラーから増幅した。各遺伝子は、制限部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて、ベクターｐＥＴ３０の中にクローニングした。
【０３６１】
プラスミドを発現宿主ＢＬ２１  ＤＥ３中に形質転換した。タンパク質ＮＰ＿６２８０８９およびＮＰ＿６２９１３９をコードするプラスミドを有する株を約０．６のＯＤ６００まで成長させ、発現を１００μＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。通気ありでの３７℃のインキュベーションの後に、細胞ペレットを遠心分離によって採取し、−８０℃で凍結させた。タンパク質ＮＰ＿６２８９０３をコードするプラスミドを有する株を３０℃でＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ培地ＩＩ中で成長させ、メーカーの指示（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって誘発した。細胞ペレットを遠心分離によって採取し、−８０℃で凍結させた。
【０３６２】
細胞ペレットは氷上で解凍し、細胞は、適切な容量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて溶解させた。溶解物は細胞片を除去するために遠心分離し、結果として生じた無細胞抽出物は実施例４Ｅに記載されるようにラセマーゼアッセイで用いた。これらの条件下では、界面活性剤を細胞性抽出物から除去した場合でさえ、Ｄ−トリプトファンへのＬ−トリプトファンの変換を検出することができなかった。酵素はまた、組換えラセマーゼが存在しないイー・コリの細胞性抽出物と比較して、同様にアッセイした場合にＬ−アラニンからＤ−アラニンを生成するようにも考えられなかった。これらの酵素が誤って注解されているまたはそれらがアッセイされた条件下で非常に低い活性を有する可能性がある。しかしながら、酵素がイー・コリで正確に生成されなかった可能性もある。
【０３６３】
４Ｎ：エルシニア・シュードツベルクロシスＢＡＲ相同体のクローニング
Ｙ．シュードツベルクロシスＢＡＲ相同体は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＶｉｒｇｉｎｉａ  ＭｉｌｌｅｒおよびＭａｔｔ  Ｌａｗｒｅｎｚから得たゲノムＤＮＡからクローニングした（株ＹＰＩＩＩ）。用いたプライマーは以下の通りである：５’−ｇｃｇｇｃｇｃａｔａｔｇｃａｃｇｔｔｃｇｔｔｔｔｃｇｔｃ−３’（配列番号１４２）および５’−ｇｇｃｇｇｃｇｇｇａｔｃｃｃｇｇｔｇａａａｔａａｃｔｔａａｔｃｔａｃ−３’（配列番号１４３）。遺伝子をＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。断片はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。消化物を１％アガロースゲル上で走らせ、ラセマーゼ断片はゲルから切り取った。ＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲルから精製した。断片は、上記に記載されるように消化し、精製したｐＥＴ３０にライゲーションした。ライゲーションしたものは、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、挿入断片についてスクリーニングするために１％アガロースゲル上で走らせた。挿入断片を有する数種のプラスミド単離物を、配列決定のためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に送付した。適正な配列を有する単離物を選択し、発現株を作製するためにＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳコンピテント細胞中に形質転換した。
【０３６４】
発現株を約０．６のＯＤ６００まで成長させ、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。培養物を３時間３７℃で成長させ、細胞ペレットを遠心分離によって採取した。細胞ペレットは使用まで−８０℃で保存した。
【０３６５】
細胞ペレットは、氷上で解凍し、細胞を溶解するために、適切な容量のＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（製品挿入物を参照されたい）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再懸濁させた。細胞片を遠心分離によって除去し、結果として生じた無細胞溶解物を実施例４Ｅでのようにラセマーゼアッセイで用いた。抽出物は、検出可能なトリプトファンラセマーゼ活性を有するようには考えられなかった。
【０３６６】
発現株を、０．６のＯＤ６００までさらに成長させ（３つの１００ｍｌ培養物）、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。培養物のうちの１つは６時間３７℃でインキュベートし、もう１つは３０℃で一晩インキュベートし、３つ目は２６℃で一晩インキュベートした。細胞は、遠心分離によって採取し、細胞ペレットは保存して凍結させた。細胞ペレットは氷上で解凍し、無細胞抽出物を、本実施例に記載されるように、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて作製した。ＳＤＳゲル（４〜１５％の勾配（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））を走らせた。３７℃での誘発は、非常に少量の可溶性ラセマーゼの発現に至り、可溶性ラセマーゼのレベルは、３０℃を発現温度とした場合、より高く、２６℃を発現温度とした場合、さらに高かった。２６℃で作製した無細胞抽出物をラセマーゼアッセイで用い、再び、トリプトファンラセマーゼはこの無細胞抽出物中で検出されなかった。しかしながら、基質としてＬ−アラニンを用いる活性アッセイにより、Ｄ−トリプトファンへの非常に低い変換が生じ、これは、天然イー・コリアラニンラセマーゼによって説明することができる。Ｙ．シュードツベルクロシスＢＡＲ相同体は異なる条件下で活性を有する可能性があり、当業者らに知られている突然変異誘発技術によってＹ．シュードツベルクロシスＢＡＲ相同体に対する活性を改善することが可能である。タンパク質活性はまた、ふさわしい折りたたみを促すことができる方法によっても増強される。酵素活性は、不適当な折りたたみまたはピリドキサール−５’−リン酸補助因子の不適当な挿入により検出するのが困難となる可能性がある。ふさわしい折りたたみまたは補助因子の挿入を促すことは酵素活性を非常に増強する可能性がある。
【０３６７】
Ｙ．シュードツベルクロシスＹＰＩＩＩ  ＢＡＲ相同体ＤＮＡ配列は配列番号１４４であり、下記のように示される。
atgcacgttcgttttcatcatttattcttattaccattaataactttggtcgcttgtagccaacccgtatcaaaaaaccatcttagcctgacctcactatctgccaacgcccagcaacctgtagtaaataatgcgtggcttgaaatctctcaaggtgcgctggatttcaatactaaaaagatgcttacactgctggataataaatccacactttgtgcaatattaaaaggtgatgcctatggacatgacctgaccttagtcacaccggtgatgctaaaaaacaatgtgcaatgtattggggttgccagcaatcaggaactaaaaacggtacgtgatctaggatttacggggcagttgatacgggtcagaagtgcaacattaaaagaaatgcaacaagctatggcttacgatgttgaagaacttattggcgataaaaccgtcgctgagcagttaaataatattgcaaaactgaatggaaaagttctgcgtatccatctggcactgaactccgcagggatgtctcgtaatgggctggaggtcagtaaggcccgcggtttaaatgacgcaaagacaattgtaggtttaaaaaatctgacaatcgttggcatcatgtcgcactacccggtggaagatgctagcgaaatcaaagcagacttggctcgattccagcaacaagccaaagatgttatcgcggtcacggggctaaaacgtgaaaagattaagctccacgtcgccaatacattcgcgaccttagcggtgcctgattcatggttggatatggtccgtgtgggaggggtgttttatggtgacaccatcgccagcacagagtataagcgggtcatgaccttcaaatctaacatcgcatcgctgaacaactaccctaagggcggtactgttggctatgaccggacctatacattgaaacgtgattccctgctggcgaatatccccgtgggttatgccgatgggtatcgccgagtatttagtaatgcggggcatgtgattattcaaggtcagcgcctgcccgtattaggcaaaacatcaatgaatacggtcatggtagacgtcaccgatctgaaaaaagtgagtttaggtgatgaagttgtcttgttcggtaagcaaggcaatgcggaaattcaggcagaagaaattgaagatctcagtggcgcactctttaccgaaatgtcaattctgtggggcgcaaccaataagcgtattctggtagattaa（配列番号144）。
【０３６８】
Ｙ．シュードツベルクロシスＹＰＩＩＩ  ＢＡＲ相同体アミノ酸配列は配列番号１４５であり、下記のように示される。
MHVRFHHLFLLPLITLVACSQPVSKNHLSLTSLSANAQQPVVNNAWLEISQGALDFNTKKMLTLLDNKSTLCAILKGDAYGHDLTLVTPVMLKNNVQCIGVASNQELKTVRDLGFTGQLIRVRSATLKEMQQAMAYDVEELIGDKTVAEQLNNIAKLNGKVLRIHLALNSAGMSRNGLEVSKARGLNDAKTIVGLKNLTIVGIMSHYPVEDASEIKADLARFQQQAKDVIAVTGLKREKIKLHVANTFATLAVPDSWLDMVRVGGVFYGDTIASTEYKRVMTFKSNIASLNNYPKGGTVGYDRTYTLKRDSLLANIPVGYADGYRRVFSNAGHVIIQGQRLPVLGKTSMNTVMVDVTDLKKVSLGDEVVLFGKQGNAEIQAEEIEDLSGALFTEMSILWGATNKRILVD（配列番号145）。
【０３６９】
４Ｏ：エロモナス種ＢＡＲ遺伝子の同定
実施例４Ｅに言及されるように、エロモナス種は、シュードモナスに由来する酵素に同様の特性を有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼを含有するといった証拠が文献にある。この例は、Ａ．ハイドロフィラ、Ａ．ジャンデイ、Ａ．ソブリアおよびＡ．キャビエの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの同定および単離ならびにＡ．キャビエ細胞性抽出物中のトリプトファンラセマーゼ活性の同定を記載する。この例はまた、Ａ．シューベルティーおよびＡ．サルモニシダのＢＡＲ相同体の部分的な核酸配列の単離をも記載する。
【０３７０】
ＴＩＧＲウェブサイト（ｔｉｇｒｂｌａｓｔ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｕｆｍｇ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ａ＿ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ％７Ｃｓｅｑ）上のエロモナス・ハイドロフィラＡＴＣＣ７９６６Ｔゲノムの、公的なシュードモナス・タエトロレンスアルギニンラセマーゼタンパク質配列（受入番号ＡＢ０９６１７６によってコード）に由来するＢＡＲタンパク質配列とのｂｌａｓｔ分析は、アミノ酸レベルで６０％の同一性を有する部分的なタンパク質配列の同定をもたらした。コンティグ１０４７０８５９２３７４７上のＤＮＡ位３３９１２〜３２７４６は３９０個のアミノ酸の相同領域に相当した。部分配列を下記に示す。
【０３７１】
エロモナス・ハイドロフィラ−タンパク質１（配列番号１４６）に由来する推定上のＢＡＲの部分配列：
AVAAPYLPLASDHRNGEVQTASNAWLEVDLGAFEHNIQTLKDRLGDKGPKICAIMKADAYGHGIDLLVPSVVKAGIPCIGIASNEEARVAREKGFTGRLMRVRAATPAEVEQALPYKMEELIGSLVSAQGIADIAQRHHTNIPVHIALNSAGMSRNGIDLRLADSKEDALAMLKLKGITPVGIMTHFPVEEKEDVKMGLAQFKLDSQWLLEAGKLDRSKITIHAANSFATLEVPDAYFDMVRPGGLLYGDSIPSYTEYKRVMAFKTQVASVNHYPAGNTVGYDRTFTLKRDSWLANLPLGYSDGYRRALSNKAYVLIQGQKVPVVGKTSMNTIMVDVTDLKGVKPGDEVVLFGRQGEAEVKQADLEEYNGALLADMYTIWGYTNPKKIK（配列番号146）。
【０３７２】
エロモナス・ハイドロフィラに由来する部分的な推定上のＢＡＲアミノ酸配列とＮＣＢＩのＢＬＡＳＴは、シュードモナス・プチダＦ１（受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０）、次いでシュードモナスＫＴ２４４０に対して最も高い配列同一性を有するアラニンラセマーゼを同定し、これがおそらくアミノ酸ラセマーゼタンパク質であることが確認される。実施例４Ｅは、シュードモナスＫＴ２４４０に由来するＢＡＲタンパク質が活性であり、Ｌ−トリプトファンをＤ−トリプトファンに変換することを実証する。したがって、おそらく、Ａ．ハイドロフィラＡＴＣＣ７９６６Ｔラセマーゼもまた同様に広域特異性を有すると考えられた。
【０３７３】
シュードモナス・タエトロレンスＢＡＲ遺伝子配列（受入番号ＡＢ０９６１７６）またはシュードモナスＫＴ２４４０  ＢＡＲ遺伝子配列（受入番号ＮＣ＿００２９４７．３：６０１８１１７．．６０１９１９０）をＴＩＧＲウェブサイトをＢＬＡＳＴするために用いた場合、１２１６個の塩基対に対して高度な相同性（６９％）を有するＤＮＡ配列は、コンティグ１０４７０８５９２３７４７：ａ＿ハイドロフィラで観察された。１．５  Ｅ−１１０のＰスコアが観察された。そのマッチに対応するヌクレオチド番号は３２７５４〜３３９５４である。これらのアラインメントから得られたＡ．ハイドロフィラ部分遺伝子配列の配列は、以下の通りである（配列番号１４７）。
tcttggggtt ggtgtagccc cagatggtgt acatgtccgc cagcagggcg 
ccgttgtact cttccagatc cgcctgtttc acctcagcct caccctggcg 
gccgaacagc accacctcgt caccgggttt gacccctttc agatcggtca 
cgtccaccat gatggtgttc atggaggtct tgcccaccac cggcaccttc 
tggccctgga tcagcacata ggccttgttg ctcagcgccc ggcgatagcc 
gtcggagtag cccagcggca ggttggcgag ccaggagtcg cgcttgaggg 
tgaaggtgcg gtcataaccg acggtgttgc cggccgggta gtggttgacg 
gaggcaacct gggtcttgaa cgccatcacc cgcttgtact cggtgtagga 
ggggatggag tcaccgtaca gcaggccgcc cgggcgcacc atgtcgaagt 
aggcgtccgg cacttccagg gtggcgaagg agttggcggc gtggatggtg 
atcttgctgc gatccagctt gcccgcttcc agcagccact gggagtccag 
tttgaactgg gccagcccca tcttgacgtc ctctttctcc tccaccggga 
agtgggtcat gatgccgacc ggggtgatcc ccttgagctt gagcatggcc 
agcgcgtctt ccttggagtc agccaggcgc agatcgatgc cgttgcggct 
catgccggcg gagttgagcg cgatgtgcac cgggatattg gtgtggtggc 
gctgggcgat gtcggcgatg ccctgagcac tcaccaggct gccgatgagc 
tcttccatct tgtagggcag ggcctgttcc acttcggccg gggtggcggc 
acgtacccgc atcaggcggc cggtgaagcc cttctcacgg gccacgcggg 
cctcttcgtt gctggcgatg ccgatgcagg ggatgccggc cttgaccacc 
gagggcacca gcaggtcgat gccgtggccg taggcgtcgg ccttcatgat 
ggcgcagatc ttcggccctt tgtcaccgag gcgatccttg agggtctgga 
tgttgtgctc gaaggcgccg agatcgactt ccagccaggc attgctggcg 
gtctgcactt cgccgttgcg atgatcgctg gccagcggca ggtaaggggc 
cgcgacggcc  tgaccggcca gcaggcccag gatcagcgtg gccagcagtg t（配列番号147）。
【０３７４】
重なる分析により、タンパク質配列の各端からの５つのアミノ酸のみが不在であったことが示唆されたので、キメラタンパク質は、他の広域特異性ラセマーゼに基づいて、上記の知られているタンパク質配列断片およびコンセンサス配列を用いて設計した。以下のプライマーは、ＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を用いてｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０の中にクローニングするためのこのキメラを構築するために設計した。
ハイドロフィラＦＮｄｅ１（配列番号１４８）：5'-TTCCAAGGCATATGCCCTTCTCCCGTACACTGCTGGCCACGCTGATCCT 3'；および
ハイドロフィラＲＢａｍＨ１（配列番号１４９）：5'-GGAACCTTGGATCCTCAATCTTTGATTTTCTTGGGGTTGGTGTAGCCCCAGATG 3'。
【０３７５】
Ａ．ハイドロフィラに由来するキメラ遺伝子は、上記に記載されるプライマーおよび以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬ反応中、１μＬ鋳型（ゲノムＤＮＡ  ＡＴＣＣ７９６５）、１．６μＭの各プライマー、０．３ｍＭ  各ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、１×Ｐｆｕ緩衝液、および２．５μＬジメチルスルホキシドを用いた。用いたサーモサイクラープログラムは、３分間９４℃でのホットスタート、以下の工程の８回の繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間５３℃、および２．５分間７２℃、その後、以下の工程の２２回の繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間６０℃、および２．５分間７２℃を含んだ。２２回繰り返した後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールにより約１２３０ｂｐの産物を生成した。
【０３７６】
クローニング
ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。産物は、ＴＯＰＯクローニングし、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従ってＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するように考えられるプラスミドの配列は、汎発性のＭ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを用いてジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０３７７】
下記で得られたコンセンサス配列は、Ａ．ハイドロフィラ（上記のタンパク質１）についての公開ＴＩＧＲ配列に対してアミノ酸レベルで９５％相同であるタンパク質をコードする。
【０３７８】
Ａ．ハイドロフィラキメラタンパク質についてのアミノ酸配列は、配列番号１５１として下記に示される。
MPFSRTLLATLILGLLAGQAVAAPYLPLASDHRNGEVQTASNAWLEVDLTAFEQNLQTKTRLGDKGPQICAIMKADAYGHGIDLLVPSVIKAEIPCIGIASNEEARVAREKGFSGRLMRVRAATPIEVEQALPYKLEELVGSLVSAQGISDIALRHHTTIPVHVALNSAGMSRNGIDLRLADAKQDALAMLKLKGITPVGIMTHFPVEEKEDVKLGLAQFKLDSQWLLEAGKLDRSKITIHAANSFATLAVPDAYFDMVRPGGLLYGDSIPSYTEYKRVMAFKTQVASVNHYAAGNTVGYDRTFTLKRDSWLANLPLGYSDGYRRALSNKAYVLIQGQKVPVVGKTSMNTIMVDVTDLKGVKPGDEVVLFGRQGEAEVKQADLEEYNGALLADMYTIWGYTNPKKIKD（配列番号151）。
【０３７９】
ＰＣＲから得られたＡ．ハイドロフィラキメラ配列のＤＮＡ配列は、配列番号１５０として下記に示される。
ATGCCCTTCTCCCGTACACTGCTGGCCACGCTGATCCTGGGCCTGCTGGCCGGTCAAGCCGTCGCAGCCCCCTATCTGCCTCTGGCAAGCGATCATCGCAACGGCGAAGTACAAACCGCCAGCAACGCCTGGCTGGAAGTAGATCTGACCGCGTTTGAACAGAATCTGCAGACCCTCAAGACCCGCCTCGGCGACAAGGGCCCGCAGATCTGCGCCATCATGAAGGCGGACGCCTACGGTCACGGTATCGATCTGCTGGTTCCCTCCGTCATCAAGGCCGAGATCCCCTGTATCGGCATCGCCAGCAACGAAGAGGCCCGCGTCGCCCGCGAGAAGGGGTTCAGCGGCCGCCTGATGCGGGTACGGGCCGCCACACCTATCGAAGTGGAACAGGCCCTGCCCTACAAGCTGGAAGAGCTGGTTGGCAGCCTGGTGAGTGCTCAGGGGATCTCCGACATCGCCCTGCGCCACCACACCACCATTCCGGTGCATGTCGCCCTCAACTCCGCCGGTATGAGCCGCAACGGCATCGACCTGCGTCTGGCCGATGCCAAGCAAGATGCGCTGGCCATGCTCAAGCTCAAGGGGATCACCCCGGTCGGCATCATGACCCACTTCCCGGTGGAGGAGAAAGAGGACGTCAAGCTGGGGCTGGCTCAGTTCAAGCTGGACTCCCAGTGGCTGCTGGAAGCAGGCAAGCTGGATCGCAGCAAGATCACCATCCATGCCGCCAACTCCTTCGCCACCCTGGCAGTGCCGGACGCCTACTTTGACATGGTGCGCCCGGGCGGCCTGCTCTACGGCGACTCCATCCCCTCCTACACCGAATACAAGCGGGTGATGGCATTCAAGACCCAGGTCGCCTCGGTCAACCACTATGCGGCGGGCAACACAGTCGGTTATGACCGCACCTTTACTCTCAAACGTGACTCCTGGCTCGCCAACCTGCCGCTCGGTTACTCCGACGGCTATCGCCGTGCGCTCAGCAACAAGGCCTATGTGCTGATCCAGGGTCAGAAGGTGCCGGTGGTCGGCAAGACCTCCATGAACACCATCATGGTGGACGTGACCGATCTCAAAGGGGTAAAGCCCGGTGATGAAGTGGTGCTGTTTGGCCGTCAGGGTGAGGCAGAAGTGAAACAGGCTGATCTGGAGGAGTACAACGGCGCCCTGTTGGCGGACATGTACACCATCTGGGGCTACACCAACCCCAAGAAAATCAAAGATTGA（配列番号150）。
【０３８０】
適正なＴＯＰＯクローンは、メーカー推奨のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、適切な制限酵素を用いた消化により調製し、その後、エビアルカリフォスファターゼを用いる処理（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＱｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いる０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからの精製を続けた。消化したベクターおよび挿入断片は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてライゲーションした。約６５ｎｇの処理した挿入断片、１００ｎｇの処理したベクター（ベクターに対する挿入断片の３対１のモル比）、５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および１×ライゲーション緩衝液を室温で５分間インキュベートした。ライゲーション反応は、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて脱塩し、イー・コリＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を形質転換するために用いた。１０μｌの各ライゲーション反応に、４０μｌのＤＨ１０Ｂ細胞を追加し、以下の条件下でＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ  ＩＩを用いてエレクトロポレーションによって形質転換した：０．２ｃｍキュベット中２．５ｋＶ、２５μＦ、２００オーム。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間、１ｍＬの室温ＳＯＣ中で回復させた。細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製した。
【０３８１】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に形質転換した。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。ＢＬ２１ＤＥ３での誘発は、メーカーの指示に従ってＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ培地中で行った（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【０３８２】
誘発した培養物からの細胞は、遠心分離し、０．８５％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。細胞ペレットは、５μＬ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含有する５ｍＬ／湿細胞重量ｇ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）試薬中で再懸濁させた。試料は、オービタルシェーカー上で２０分間室温でインキュベートした。不溶性細胞片は、４℃で２０分間１６，０００ｘｇでの遠心分離によって除去した。抽出物は、１０μＭ  ＰＬＰを含有する５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０中で平衡化したＰＤ１０カラムを用いて脱塩した。細胞抽出物タンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、約４５ｋＤａの期待されたサイズのタンパク質を示した。
【０３８３】
細胞抽出物は以下のプロトコールを用いてトリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした。１ｍＬ反応は、０．０５ｍＭ  ＰＬＰおよび３０ｍＭ  Ｌトリプトファンを有する５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）中で行った。反応は、無細胞抽出物の追加によって開始し、一晩３０℃でインキュベートした。試料のアリコートは、２時間でおよび一晩のインキュベーションの後に測った（０分間の試料はコントロール反応物として取り扱った）。濃縮ギ酸（５μＬ）は、反応を停止させるために各２５０μＬ試料のアリコートに追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。上清は、取り出し、実施例１に記載されるキラルアミノ酸法によってＤ−トリプトファンについて分析するまで−８０℃で凍結させた。
【０３８４】
ｐＥＴ３０の誘発からの細胞抽出物からのアッセイ結果は、Ａ．ハイドロフィラクローンがＬ−トリプトファンに対してラセマーゼ活性を示すことを実証する。これらのデータを考慮して完全長ＴＩＧＲ  Ａ．ハイドロフィラ野生型配列（Ｎ末端およびＣ末端の領域が完全な上記のタンパク質１）はまたトリプトファンに対してラセマーゼ活性を有するタンパク質を生ずるであろうということが期待された。Ａ．ハイドロフィラＢＡＲの完全長遺伝子配列は実施例１５に記載されるＧｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ法を用いて決定した。天然Ａ．ハイドロフィラ遺伝子の遺伝子配列は、配列番号１７６として下記に示される。
atgcacaaga agacactgct ggccaccttg atcctgggcc tgctggccgg tcaagccgtc
gcagccccct atctgcctct ggcaagcgat catcgcaacg gcgaagtaca aaccgccagc
aacgcctggc tggaagtaga tctgaccgcg tttgaacaga atctgcagac cctcaagacc
cgcctcggcg acaagggccc gcagatctgc gccatcatga aggcggacgc ctacggtcac
ggtatcgatc tgctggttcc ctccgtcatc aaggccgaga tcccctgtat cggcatcgcc
agcaacgaag aggcccgcgt cgcccgcgag aaggggttca gcggccgcct gatgcgggta
cgggccgcca cacctatcga agtggaacag gccctgccct acaagctgga agagctggtt
ggcagcctgg tgagtgctca ggggatctcc gacatcgccc tgcgccacca caccaccatt
ccggtgcatg tcgccctcaa ctccgccggt atgagccgca acggcatcga cctgcgtctg
gccgatgcca agcaagatgc gctggccatg ctcaagctca aggggatcac cccggtcggc
atcatgaccc acttcccggt ggaggagaaa gaggacgtca agctggggct ggctcagttc
aagctggact cccagtggct gctggaagca ggcaagctgg atcgcagcaa gatcaccatc
catgccgcca actccttcgc caccctggca gtgccggacg cctactttga catggtgcgc
ccgggcggcc tgctctacgg cgactccatc ccctcctaca ccgaatacaa gcgggtgatg
gcattcaaga cccaggtcgc ctcggtcaac cactatgcgg cgggcaacac agtcggttat
gaccgcacct ttactctcaa acgtgactcc tggctcgcca acctgccgct cggttactcc
gacggctatc gccgtgcgct cagcaacaag gcctatgtgc tgatccaggg tcagaaggtg
ccggtggtcg gcaagacctc catgaacacc atcatggtgg acgtgaccga tctcaaaggg
gtaaagcccg gtgatgaagt ggtgctgttt ggccgtcagg gtgaggcaga agtgaaacag
gctgatctgg aggagtacaa cggcgccctg ttggcggaca tgtacaccat ctggggctac
accaacccca agaagatcaa acgctga
（配列番号176）。
【０３８５】
Ａ．ハイドロフィラＢＡＲについての対応する天然タンパク質は、配列番号１７７として下記に示される。
1  mhkktllatl ilgllagqav aapylplasd hrngevqtas
41  nawlevdlta feqnlqtlkt rlgdkgpqic aimkadaygh
81  gidllvpsvi kaeipcigia sneearvare kgfsgrlmrv
121  raatpieveq alpykleelv gslvsaqgis dialrhhtti
161  pvhvalnsag msrngidlrl adakqdalam lklkgitpvg
201  imthfpveek edvklglaqf kldsqwllea gkldrskiti
241  haansfatla vpdayfdmvr pggllygdsi psyteykrvm
281  afktqvasvn hyaagntvgy drtftlkrds wlanlplgys
321  dgyrralsnk ayvliqgqkv pvvgktsmnt imvdvtdlkg
361  vkpgdevvlf grqgeaevkq adleeyngal ladmytiwgy
401  tnpkkikr
（配列番号177）。
【０３８６】
最初の２１個のＮ末端アミノ酸残基は、実施例４Ｌに記載されるように、プログラムＳｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０を用いると、シグナルペプチドであることが予測される。
【０３８７】
【表３２】
2015211679.tif 000035
【０３８８】
天然Ａ．ハイドロフィラ遺伝子は、キメラについて上記の方法と同様にしてクローニングし、発現させた。同じＮ末端プライマーは、ｐＥＴ３０中のタグなしおよびＣ末端Ｈｉｓタグ付き構成物の双方に利用した。以下のプライマーを用いた。
Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈ  Ｆ  Ｎｄｅ１  5'-GGAACCTTCATATGCACAAGAAGACACTGCTGG-3'（配列番号182）；
Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈ  Ｒ  ＢａｍＨ１（タグなし）  5'-GGTTCCAAGGATCCTCAGCGTTTGATCTTCTTGGG-3'（配列番号183）；および
Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈ  Ｒ  Ｘｈｏ１（Ｃ末端タグ）  5'-GGCCAATTCTCGAGGCGTTTGATCTTCTTGGGGT-3'（配列番号184）。
【０３８９】
天然Ａ．ハイドロフィラＢＡＲ（Ｃタグ付きバージョンおよびタグなしバージョンの双方）は、匹敵する活性を有することが分かり、キメラタンパク質と同じ桁数の活性を有した。特異的活性の算出は未精製酵素の使用により困難となった。
【０３９０】
Ａ．キャビエ抽出物アッセイ
エロモナス・キャビエＡＴＣＣ１４４８６は３７℃で栄養ブロス中で成長させた。培養物からの細胞（２００ｍＬ）は、遠心分離し、０．８５％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。細胞ペレットは、５μＬ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含有する５ｍＬ／湿細胞重量ｇのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）試薬中で再懸濁させた。試料は、オービタルシェーカー上で２０分間室温でインキュベートした。不溶性細胞片は、４℃で２０分間１６，０００ｘｇでの遠心分離によって除去した。無細胞抽出物はＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で脱塩した。
【０３９１】
無細胞抽出物は以下のプロトコールを用いて、トリプトファンラセマーゼ活性についてアッセイした。１ｍＬ反応は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、および３０ｍＭ  Ｌトリプトファン中で行った。反応は、無細胞抽出物（１００μＬまたは５００μＬのいずれか）の追加によって開始し、一晩３０℃でインキュベートした。試料のアリコートは、２時間でおよび一晩のインキュベーションの後に測った（０分間の試料はコントロール反応物として取り扱った）。濃縮ギ酸（５μＬ）は、反応を停止させるために各２５０μＬ試料のアリコートに追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。上清は、取り出し、実施例１に記載されるキラルアミノ酸法によってＤ−トリプトファンについて分析するまで−８０℃で凍結させた。
【０３９２】
Ａ．キャビエの細胞抽出物からのアッセイ結果は、表３３に示されるようにＬ−トリプトファンに対するラセマーゼ活性を実証した。
【０３９３】
【表３３】
2015211679.tif 000036
【０３９４】
Ａ．キャビエ細胞抽出物中の活性を発見した後、縮重プライマーは、この種からのＢＡＲ遺伝子を得るために設計した（知られているＢＡＲ相同体の保存領域に基づく）。縮重プライマー配列を下記に示す。
Ａｅｒ  ｄｅｇ  Ｆ２：5'-GCCAGCAACGARGARGCMCGCGT-3'（配列番号152）；および
Ａｅｒ  ｄｅｇ  Ｒ１：5'-TGGCCSTKGATCAGCACA-3'（配列番号153）
ＫはＧまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示し、ＳはＣまたはＧを示し、ＭはＡまたはＣを示す。
【０３９５】
上記のプライマーは、Ａ．キャビエ（ＡＴＣＣ１４４８６）ゲノムＤＮＡからの７１５ｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するために用いた。以下のＰＣＲプロトコールを用いた：５０μＬ反応は、０．５μＬ鋳型（約１００ｎｇのＡ．キャビエゲノムＤＮＡ）、１．６μＭの各プライマー、０．３ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  ｒＴｔｈ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、１×ＸＬ緩衝液、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、および２．５μＬジメチルスルホキシドを含有した。用いたサーモサイクラープログラムは、３分間９４℃でのホットスタートならびに以下の工程の３０回の繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間５３℃、および２分間６８℃を含んだ。３０回繰り返した後、試料は、７分間６８℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールにより７１５ｂｐの産物を生成した。
【０３９６】
クローニング
ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。産物は、ＴＯＰＯクローニングし、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従ってＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＥｃｏＲ１を用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するように考えられるプラスミドの配列は、汎発性のＭ１３順方向プライマーを用いたジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０３９７】
Ａ．キャビエＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は、配列番号１５４）として下記に示す、また縮重プライマー配列領域には下線を引いた。
GCCAGCAACGARGARGCMCGCGTTGCCCGCGAGAAGGGCTTCGAAGGTCGCCTGATGCGGGTACGTGCCGCCACCCCGGATGAAGTGGAGCAGGCCCTGCCCTACAAGCTGGAGGAGCTCATCGGCAGCCTGGAGAGCGCCAAGGGGATCGCCGACATCGCCCAGCGCCATCACACCAACATCCCGGTGCACATCGGCCTGAACTCCGCCGGCATGAGCCGCAACGGCATCGATCTGCGCCAGGACGATGCCAAGGCCGATGCCCTGGCCATGCTCAAGCTCAAGGGGATCACCCCGGTCGGCATCATGACCCACTTCCCGGTGGAGGAGAAAGAGGACGTCAAGCTGGGGCTGGCCCAGTTCAAGCTGGACTACCAGTGGCTCATCGACGCCGGCAAGCTGGATCGCAGCAAGCTCACCATCCACGCCGCCAACTCCTTCGCCACCCTGGAAGTACCGGAAGCCTACTTTGACATGGTGCGCCCGGGCGGCATCATCTATGGCGACACCATTCCCTCCTACACCGAGTACAAGAAGGTGATGGCGTTCAAGACCCAGGTCGCCTCCGTCAACCACTACCCGGCGGGCAACACCGTCGGCTATGACCGCACCTTCACCCTCAAGCGCGACTCCCTGCTGGCCAACCTGCCGATGGGCTACTCCGACGGCTACCGCCGCGCCATGAGCAACAAGGCCTATGTGCTGATCMASGGCCA（配列番号154）、ＲはＡまたはＧを示し、ＳはＣまたはＧを示し、ＭはＡまたはＣを示す。
【０３９８】
部分的なＡ．キャビエＢＡＲ酵素のアミノ酸配列を下記に示す。
ASNEEARVAREKGFEGRLMRVRAATPDEVEQALPYKLEELIGSLESAKGIADIAQRHHTNIPVHIGLNSAGMSRNGIDLRQDDAKADALAMLKLKGITPVGIMTHFPVEEKEDVKLGLAQFKLDYQWLIDAGKLDRSKLTIHAANSFATLEVPEAYFDMVRPGGIIYGDTIPSYTEYKKVMAFKTQVASVNHYPAGNTVGYDRTFTLKRDSLLANLPMGYSDGYRRAMSNKAYVLIXG（配列番号155）。
ＸはＨ、Ｑ、Ｎ、またはＫである。
【０３９９】
上記の配列番号１５５のコンセンサスタンパク質配列断片は、Ａ．ハイドロフィラについての公開ＴＩＧＲ配列（上記のタンパク質１（配列番号１４６））にアミノ酸レベルで８９％相同である。高度に関連するエロモナス・ハイドロフィラタンパク質がＡ．キャビエ細胞抽出物と同様に広域特異性ラセマーゼ活性を呈したので、Ａ．キャビエについての完全長コード領域は、得られると、トリプトファンに対する活性を有する広域特異性を同様に有するであろうラセマーゼを生成するであろうということが期待された。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ法は、配列番号１７８として下記に示されるＡ．キャビエＢＡＲ遺伝子の完全長遺伝子配列を得るために、実施例１５に記載されるように利用した。
atgcacaaga aaacactgct cgcgaccctg atctttggcc tgctggccgg ccaggcagtc gccgccccct atctgccgct cgccgacgac caccgcaacg gtcaggaaca gaccgccgcc aacgcctggc tggaagtgga tctcggcgcc ttcgagcaca acatccagac cctgaagaat cgcctcggtg acaagggccc gcagatctgc gccatcatga aggcggacgc ctacggtcac ggcatcgacc tgctggtccc ttccgtggtc aaggcaggca tcccctgcat cggcatcgcc agcaacgaag aagcacgtgt tgcccgcgag aagggcttcg aaggtcgcct gatgcgggta cgtgccgcca ccccggatga agtggagcag gccctgccct acaagctgga ggagctcatc ggcagcctgg agagcgccaa ggggatcgcc gacatcgccc agcgccatca caccaacatc ccggtgcaca tcggcctgaa ctccgccggc atgagccgca acggcatcga tctgcgccag gacgatgcca aggccgatgc cctggccatg ctcaagctca aggggatcac cccggtcggc atcatgaccc acttcccggt ggaggagaaa gaggacgtca agctggggct ggcccagttc aagctggact accagtggct catcgacgcc ggcaagctgg atcgcagcaa gctcaccatc cacgccgcca actccttcgc caccctggaa gtaccggaag cctactttga catggtgcgc ccgggcggca tcatctatgg cgacaccatt ccctcctaca ccgagtacaa gaaggtgatg gcgttcaaga cccaggtcgc ctccgtcaac cactacccgg cgggcaacac cgtcggctat gaccgcacct tcaccctcaa gcgcgactcc ctgctggcca acctgccgat gggctactcc gacggctacc gccgcgccat gagcaacaag gcctatgtgc tgatccatgg ccagaaggcc cccgtcgtgg gcaagacttc catgaacacc accatggtgg acgtcaccga catcaagggg atcaaacccg gtgacgaggt ggtcctgttc ggacgccagg gtgatgccga ggtgaaacaa tctgatctgg aggagtacaa cggtgccctc ttggcggaca tgtacaccgt ctggggctat accaacccca agaagatcaa gcgctaa
（配列番号178）。
【０４００】
Ａ．キャビエ天然ＢＡＲについての対応するアミノ酸配列は配列番号１７９として示される。
1  mhkktllatl ifgllagqav aapylpladd hrngqeqtaa
41  nawlevdlga fehniqtlkn rlgdkgpqic aimkadaygh
81  gidllvpsvv kagipcigia sneearvare kgfegrlmrv
121  raatpdeveq alpykleeli gslesakgia diaqrhhtni
161  pvhiglnsag msrngidlrq ddakadalam lklkgitpvg
201  imthfpveek edvklglaqf kldyqwlida gkldrsklti
241  haansfatle vpeayfdmvr pggiiygdti psyteykkvm
281  afktqvasvn hypagntvgy drtftlkrds llanlpmgys
321  dgyrramsnk ayvlihgqka pvvgktsmnt tmvdvtdikg
361  ikpgdevvlf grqgdaevkq sdleeyngal ladmytvwgy
401  tnpkkikr
（配列番号179）。
【０４０１】
以下のＰＣＲプライマーは上記の方法と同様にして天然完全長Ａ．キャビエＢＡＲをタグ付きおよびＣ末端ｈｉｓタグ付きの双方にクローニングするために利用した。
Ａ．キャビエＦ  Ｎｄｅ１  5'-GGAACCTTCATATGCACAAGAAAACACTGCTCGCGACC-3'（配列番号185）；
Ａ．キャビエＲ  ＢａｍＨ１（タグなし）  5'-GGTTCCAAGGATCCTTAGCGCTTGATCTTCTTGGGGTTG-3'（配列番号186）；および
Ａ．キャビエＲ  Ｘｈｏ１（Ｃ末端タグ）  5'-TTCCAAGGCTCGAGGCGCTTGATCTTCTTGGGGTTGGTA-3'（配列番号187）。
【０４０２】
Ｃ末端タグ付き酵素は、タグなし天然Ａ．キャビエＢＡＲに匹敵する活性を有した。２００μｇの精製（タグ付き）ラセマーゼ酵素を上記に記載されるようにトリプトファンラセマーゼアッセイで用いた場合、３０分間で、Ａ．ハイドロフィラＢＡＲは２４９μｇ／ｍＬのＤ−トリプトファンを生成したが、Ａ．キャビエＢＡＲは１０３４μｇ／ｍＬを生成し、Ｐ．タエトロレンスＢＡＲは７９９μｇ／ｍＬを生成した。
【０４０３】
配列番号１７９の最初の２１個のＮ末端アミノ酸残基は、実施例４Ｌに記載されるように、プログラムＳｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０を用いると、シグナルペプチドであることが予測される。以下のＮ末端プライマーを、アミノ酸２〜２１のリーダー配列のないＡ．キャビエ遺伝子をクローニングするために用いた。
Ａ．ｃａｖリーダーなし  Ｆ  ＮｄｅＩ  5' CCTTGGAACATATGGCCCCCTATCTGCCGCT 3（配列番号188）.'
【０４０４】
リーダーなしラセマーゼは、完全長遺伝子の発現産物と比較して、発現した場合に、約６５％の活性を保持することが分かった。周辺質および細胞質のタンパク質画分を、ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に記載されるように野生型発現産物およびリーダーなし構成物について単離した。大多数の発現野生型ＢＡＲは、周辺質中に見出されたが、リーダーなしＢＡＲは細胞質中にとどまるように考えられた。リーダーなしＡ．キャビＢＡＲの活性の低下は、細胞質中で発現した場合のプロセシングおよび／または折りたたみの変化によるものである可能性がある。
【０４０５】
実施例４Ｉおよび４ＧでＰ．プチダＢＡＲ配列で成された突然変異に基づいて、同様の改変を、上記に記載される部位特異的突然変異誘発法を用いて導入して、Ａ．キャビエ野生型ＢＡＲでＹ３９５Ｈ、Ｙ３９５Ｃ、およびＬ３８３Ｍの変異体を産生した。Ｙ３９５での突然変異誘発は、Ｌ３８３Ｍ突然変異と組み合わせた場合でさえ、基質としてＬ−トリプトファンを用いる活性の９５％以上の損失を引き起こす。Ｌ３８３Ｍ変異体は、２時間の時点でＬ−トリプトファンに対する約８３％の活性を有した。これらの結果は、Ｋｉｎｏらの論文で成された突然変異は、Ｌ−トリプトファンに対する活性についてのＢＡＲ酵素の改善に普遍的に適用可能でないことを示唆する。さらなるエロモナスＢＡＲ配列を、上記に記載される縮重ＰＣＲ法によって得たが、以下のプライマーを用いた。
Ａｅｒ  ｄｅｇ  Ｆ１  ｍｏｄ：5'-AAGGCSGAYGCCTAYGGYCACGG-3'（配列番号189）
ＳはＣまたはＧおよびＹはＣまたはＴである、ならびに
Ａｅｒ  ｄｅｇ  Ｒ３：5'-CGGCGRTAGCCRTCRGAGTA-3'（配列番号190）、ＲはＡまたはＧである。
【０４０６】
このプライマー対により、Ａ．ソブリア（ＡＴＣＣ３５９９４）、Ａ．ジャンデイ（ＡＴＣＣ４９５７２）、Ａ．シューベルティー（ＡＴＣＣ４３７０１）、およびＡ．サルモニシダ（ＡＴＣＣ２７０１３およびＡＴＣＣ１４１７４）についての部分配列が生じた。得られた完全長配列は以下の通りである。
【０４０７】
Ａ．ソブリアＤＮＡ配列は、配列番号１９１として下記に示す。
ATGCACAAGAAAACGCTATTGGCCACCCTGATCTTCGGCCTGCTCGCGGGCCAAGCCGTTGCGGCTCCCTATCTGCCCCTTGCGACGGATCATCGCAACGGTCAGGAGCAAACCGCCAGCAACGCCTGGTTGGAAGTGGATCTGGGCGCCTTCGAACACAATATCCAGACCCTCAAGGATCGCCTCGGTGACAAGGGTCCGCAGATCTGCGCCATCATGAAGGCCGACGCCTATGGTCATGGCATCGACCTGCTGGTCCCCTCCGTGGTCAAGGCCAATATCCCCTGCATCGGCATCGCCAGCAACGAAGAGGCCCGCGTCGCCCGCGAGAAGGGCTTTACCGGCCGTCTGATGCGGGTGCGTGCCGCCACACCGGCCGAAGTGGAGCAGGCGCTGCCCTACAAGATGGAAGAGCTGATCGGCAGTCTGGTGAGTGCTCAGGGGATCGCCGACATCGCCCAGCGCCACCACACCAATATTCCGGTACACATTGGTCTCAACTCTGCTGGCATGAGCCGCAACGGTATCGACCTGCGTCTGGCCGATGCCAAGCAGGATGCGCTGGCCATGCTCAAGCTCAAGGGGATCACCCCGGTCGGCATCATGACCCACTTCCCGGTGGAGGAGAAAGAGGACGTCAAGATGGGGCTGGCCCAGTTCAAACTGGACTCTCAGTGGCTGCTGGAAGCGGGCAAGCTGGATCGCAGCAAGATCACCATCCACGCCGCCAACTCCTTCGCCACCCTGGAAGTGCCGGATGCCTACTTCGACATGGTGCGTCCGGGTGGCCTGCTCTACGGCGACTCCATCCCCTCCTACACCGAATACAAGCGGGTGATGGCATTCAAGACCCAGGTCGCCTCGGTCAACCACTACCCGGCGGGCAATACCGTTGGCTATGACCGTACCTTTACCCTCAAGCGTGAATCCTGGCTCGCCAACCTGCCGCTGGGCTACTCCGATGGCTACCGCCGTGCGCTCAGCAACAAGGCCTATGTGCTGATCCAGGGTCAGAAGGTGCCGGTGGTCGGCAAGACCTCCATGAACACCATCATGGTGGACGTCACTGATCTCAAAGGGGTGAAACCCGGTGATGAGGTGGTGCTGTTTGGCCGTCAGGGCGAGGCCGAGGTGAAACAGGCTGATCTGGAAGAGTACAACGGCGCCCTGTTAGCGGACATGTACACCATCTGGGGCTACACCAACCCCAAGAAGATCAAACGCTGA
（配列番号191）。
【０４０８】
Ａ．ソブリアタンパク質配列は、配列番号１９２として下記に示す。
MHKKTLLATLIFGLLAGQAVAAPYLPLATDHRNGQEQTASNAWLEVDLGAFEHNIQTLKDRLGDKGPQICAIMKADAYGHGIDLLVPSVVKANIPCIGIASNEEARVAREKGFTGRLMRVRAATPAEVEQALPYKMEELIGSLVSAQGIADIAQRHHTNIPVHIGLNSAGMSRNGIDLRLADAKQDALAMLKLKGITPVGIMTHFPVEEKEDVKMGLAQFKLDSQWLLEAGKLDRSKITIHAANSFATLEVPDAYFDMVRPGGLLYGDSIPSYTEYKRVMAFKTQVASVNHYPAGNTVGYDRTFTLKRESWLANLPLGYSDGYRRALSNKAYVLIQGQKVPVVGKTSMNTIMVDVTDLKGVKPGDEVVLFGRQGEAEVKQADLEEYNGALLADMYTIWGYTNPKKIKR
（配列番号192）。
【０４０９】
Ａ．ジャンデイＤＮＡ配列は、配列番号１９３として下記に示す。
ATGCACAAGAAAACACTGCTGGCCACCCTGATCCTCGGCCTGCTGGCCGGGCAAGCGGTTGCAGCCCCCTACCTGCCGCTGGCCAGCGATCACCGCAACGGCGAAGTCCAGACCGCCAGCAATGCCTGGCTGGAAGTCGATCTCGGCGCCTTCGAGCACAATATCCAGACCCTCAAGGATCGTCTCGGTGACAAGGGGCCGAAGATCTGCGCCATCATGAAGGCGGATGCCTATGGCCACGGTATCGATCTGCTGGTTCCCTCGGTGGTGAAAGCGGGTATCCCCTGCATCGGTATCGCCAGCAATGAAGAAGCTCGTGTCGCCCGCGAGAAGGGCTTCACCGGTCGTCTGATGCGGGTACGTGCTGCCACCCCGGACGAAGTGGAGCAGGCCCTGCCCTACAAGATGGAGGAGCTGATCGGCAGTCTGGTGAGTGCTCAGGGCATCGCCGATATCGCCCAGCGCCACCACACCACCATTCCGGTGCATATCGCCCTCAACTCCGCCGGCATGAGCCGCAACGGCATCGATCTGCGGCTGGCCGACTCCAAGCAGGATGCGCTGGCCATGCTCAAGCTCAAGGGGATCACCCCGGTCGGCATCATGACCCACTTCCCGGTGGAGGAGAAAGAGGACGTCAAGATGGGTCTGGCCCAGTTCAAACTGGACTCCCAGTGGCTGCTGGAAGCGGGCAAGCTGGATCGCAGCAAGATCACCATCCACGCCGCCAACTCCTTCGCAACACTTGAAGTGCCGGATGCCTACTTCGACATGGTGCGCCCGGGTGGCCTGCTCTACGGTGACTCCATCCCCTCCTACACCGAGTACAAGCGGGTGATGGCGTTCAAGACCCAGGTTGCCTCCGTCAACCACTACCCGGCCGGCAACACCGTCGGTTATGACCGCACCTTCACCCTCAAGCGCGACTCCTGGCTCGCCAACCTGCCGCTCGGTTACTCCGATGGCTATCGCCGCTCCCTGAGCAACAAGGCCTATGTGCTGATCCAGGGCCAGAAGGTGCCGGTGGTCGGCAAGACCTCCATGAACACCATCATGGTGGATGTGACCGACCTGAAAGGGGTGAAACCCGGTGACGAAGTGGTGCTGTTCGGCCGTCAGGGAAATGCCGAGGTGAAGCAGGCGGATCTGGAGGAGTACAACGGCGCCCTGCTGGCGGACATGTACACCATCTGGGGCTACACCAACCCCAAGAAGATCAAGCACTAA
（配列番号193）。
【０４１０】
Ａ．ジャンデイタンパク質配列は、配列番号１９４として下記に示す。
MHKKTLLATLILGLLAGQAVAAPYLPLASDHRNGEVQTASNAWLEVDLGAFEHNIQTLKDRLGDKGPKICAIMKADAYGHGIDLLVPSVVKAGIPCIGIASNEEARVAREKGFTGRLMRVRAATPDEVEQALPYKMEELIGSLVSAQGIADIAQRHHTTIPVHIALNSAGMSRNGIDLRLADSKQDALAMLKLKGITPVGIMTHFPVEEKEDVKMGLAQFKLDSQWLLEAGKLDRSKITIHAANSFATLEVPDAYFDMVRPGGLLYGDSIPSYTEYKRVMAFKTQVASVNHYPAGNTVGYDRTFTLKRDSWLANLPLGYSDGYRRSLSNKAYVLIQGQKVPVVGKTSMNTIMVDVTDLKGVKPGDEVVLFGRQGNAEVKQADLEEYNGALLADMYTIWGYTNPKKIKH
（配列番号194）。
【０４１１】
以下の部分的なＤＮＡ配列もまた得た。
Ａ．サルモニシダ（ＡＴＣＣ２７０１３およびＡＴＣＣ１４１７４）（配列番号１９５）：
AAGGCSGATGCCTAYGGTCACGGTATCGACCTGCTGGTCCCCTCCGTGGTCAAGGCCAATATCCCCTGTATCGGCATCGCCAGCAACGAAGAGGCCCGCGTGGCGCGCGAGAAGGGGTTCAGCGGCCGCCTGATGCGGGTACGGGCCGCCACACCGATCGAAGTGGAACAGGCCCTGCCCTACAAGCTGGAAGAGCTGGTTGGCAGCCTGGTGAGTGCTCAGGGGATCTCCGACATCGCCCTGCGCCACCACACCACCATTCCGGTGCATGTCGCCCTCAACTCCGCCGGCATGAGCCGCAACGGCATCGACCTGCGTCTGGCCGATGCCAAGCAAGATGCGCTGGCCATGCTCAAGCTCAAGGGGATCACCCCGGTCGGCATCATGACCCACTTCCCGGTGGAGGAGAAAGAGGACGTCAAGCTGGGGCTGGCCCAGTTCAAGCTGGACTCCCAGTGGCTGCTGGAAGCAGGCAAGCTGGATCGCAGCAAGATCACCATCCATGCCGCCAACTCCTTCGCCACCCTGGCAGTGCCGGACGCCTACTTTGACATGGTGCGCCCGGGCGGCCTGCTCTACGGCGACTCCATCCCCTCCTACACCGAATACAAGCGGGTGATGGCATTCAAGACCCAGGTCGCCTCGGTCAACCACTATGCGGCGGGCAACACAGTCGGTTATGACCGCACCTTTACTCTCAAACGTGACTCCTGGCTCGCCAACCTGCCTCTCGGTTACTCCGAYGGCTAYCGCCG
（配列番号195）ＳはＣまたはＧおよびＹはＣまたはＴである。
Ａ．シューベルティー（ＡＴＣＣ４３７０１）（配列番号１９６）：
AAGGCGGATGCCTATGGTCACGGCATCGATCTGCTGGTCCCCTCCGTGATCAAGGCCGGCATTCCTTGCATCGGCATCGCCAGCAACGAAGAGGCTCGCGTCGCCCGTGAGAAGGGCTTCGAAGGCCGTCTGATGCGGGTGCGCGCCGCCACCCCGCAAGAGGTGGAAGCCGCCCTCCCCTACAAGATGGAGGAGCTGGTCGGCAGCCTGGAGAGCGCCCGTCTGATGTCGGAGATTGCCCTGCGTCACCACACCACCATTGCGTACCATCTGGGGCTCAACTCCGCCGGCATGAGCCGCAACGGCCTGGATCTGCGCCTCTCCGACGCCAAGCGCGACGCACTCGACCTGATGAAGCTCAAGGGGCTGCAGGTGGTCGGCATCATGACCCACTTCCCGGTCGAGGAGAAAGAGGACGTGAAGATGGGCTTCGCCCAGTTTCAGCTCGACACCCAGTGGCTCATCGAAGCCGCTCGTCTGGATCGCAGCAAGTTGACCCTGCACTGTGCCAACTCCTTTACCACCCTGGAGGTGCCCGAGGCCTATCTGGACATGGTCCGCCCGGGCGGCATCATCTATGGCGACACCATTCCCTCCTACACCGAATACAAGAAGGTGATGGCCTTCAAGACCCGGGTCGCCTCGGTCAATCACTACCCGAAGGGAAATAGCGTCGGCTATGACCGCACCTTCACCCTGGCACGCGACTCCTGGCTCGCCAACCTGCCGCTGGGCTACTCCGACGGCTACCGCCGGGCGCTGAGCAACAAGGCCTATGTGCTGGTGAATGGCCAGAAGGCCCCCGTGGTGGGCAAGACATCCATGAACACCATCATGGTGGACGTGACCGACATCAAGGGGGTCAAACCGGGTGACGAGGTGGTGCTGTTTGGCCGCCAGGGCAACGCCGAGGTGAAGCAGTCCGATCTCGAGGAGTACAACGGCGCCCTCCTGGCGGACATGTACACCATCTGGGGCTACACCAATCCACGTATCATCAAGCGCTGA
【０４１２】
上記に記載されるゲノムウォーキング法によって入手可能なＡ．サルモニシダおよびＡ．シューベルティーの完全長遺伝子配列もまた活性ＢＡＲ酵素をコードするであろうということが期待される。
【０４１３】
以下のＰＣＲプライマーは、Ａ．ジャンデイおよびＡ．ソブリアのＢＡＲ遺伝子をクローニングするために設計した。
Ａ．ジャンデイ：
順方向ＮｄｅＩ  5'-CCGGAACCTTCATATGCACAAGAAAACACTGCTGGCCAC-3'（配列番号197）および
逆方向ＸｈｏＩ  5'-TTCCAAGGCTCGAGGTGCTTGATCTTCTTGGGGTTGGT-3'（配列番号198）。
Ａ．ソブリア
順方向ＮｄｅＩ  5'-CCGGAACCTTCATATGCACAAGAAAACGCTATTGGCCAC-3'（配列番号199）および
逆方向ＸｈｏＩ  5'-TTCCAAGGCTCGAGGCGTTTGATCTTCTTGGGGTTGGT-3'（配列番号200）。
【０４１４】
ＢＡＲ酵素のクローニング、発現、および精製の方法は上記に記載される。Ｐ．タエトロレンス、Ａ．キャビエ、Ａ．ジャンデイ、およびＡ．ソブリアに由来する精製Ｃ末端タグ付きＢＡＲ（１ｍＬアッセイ中１００μｇ）は、用いたＬ−トリプトファンの初期濃度を約７ｍｇ／ｍＬとした以外は上記に記載されるようにアッセイした。６０分間の時点で、以下の量のＤ−トリプトファンが各ＢＡＲ酵素によって生成された：Ａ．キャビエ、１４５２μｇ／ｍＬ；Ａ．ジャンデイ、４０７μｇ／ｍＬ；Ａ．ソブリア、１４５μｇ／ｍＬ；およびＰ．タエトロレンス、５０２μｇ／ｍＬ。Ａ．キャビエＢＡＲは一貫してより高い反応速度を有し、試験した他のＢＡＲ酵素よりも速く平衡状態に達する。
【０４１５】
高度に活性なＢＡＲ相同体を一次配列保存について分析した。実施例４Ｅに記載されるモチーフ（配列番号１１６）で、本実施例の広域特異性ラセマーゼはすべてモチーフＫＡＤＡＹＧＨＧＩ（配列番号２０１）を含有するが、トリプトファンラセミ化についての活性がより低いアラニンラセマーゼは通常モチーフＫＡＮＡＹＧＨＧＩ（配列番号２０２）を含有することが注目された。Ａ．キャビエＢＡＲのＤ７６Ｎ変異体はこの位置が広域活性にとって重大であるかどうか決定するために作製した。突然変異誘発は、ｐＥＴ３０中のＣタグＡ．キャビエＢＡＲ遺伝子を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ−Ｍｕｌｔｉ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。以下の突然変異誘発性プライマーはＤ７６Ｎ変化を加えるために用いた（ヌクレオチド位２２６）。5'-CGCCATCATGAAGGCGAACGCCTACGGTCACG-3'（配列番号203）。部位特異的突然変異誘発は、メーカーのプロトコールに記載されるように行った。変異体および野生型酵素は上記に記載されるように生成し、２００マイクログラムの精製タンパク質および基質としての約７ｍｇ／ｍＬのＬ−トリプトファンを用いて上記に記載されるようにアッセイした。３０分間の時点で、野生型酵素についての１ｍＬ当たり１１４９マイクログラムと比較して、変異体は、１ｍＬのＤ−トリプトファン当たり１９２９マイクログラムを生成した。Ｄ７６Ｎ変異体はまたより早期の時点で平衡状態にも達した。活性に改善は期待外であった。エロモナスおよびシュードモナスのＢＡＲ酵素についてのこの領域中の高い相同性に基づいて、他の広域活性ラセマーゼでの同様の突然変異もまた有益であろうと考えられることが期待される。
【０４１６】
４Ｐ：ＢＡＲ酵素のＮ末端リーダー配列のプロセシング
イー・コリで生成した、Ｐ．タエトロレンス（配列番号２０４）、Ａ．キャビエ（配列番号１７９）、およびＡ．ハイドロフィラ（配列番号１７７）に由来する精製Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き広域アミノ酸ラセマーゼ（ＢＡＲ）の試料を逆相液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化四重飛行時間型質量分析（ＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）によって特徴づけ、各タンパク質のリーダー配列がどの位置で開裂するかを決定した。質量スペクトルは、ｍ／ｚ  ３００〜ｍ／ｚ  １３００の範囲にわたり収集した。各タンパク質について獲得した質量スペクトルのデコンボリューション（結合した異なる数のプロトンを有する同じ質量のタンパク質分子に起因するｍ／ｚ値の包絡線の分子量への数学的な変換）はＭＳ計測装置を備えた最大エントロピーデコンボリューションソフトウェアを用いて達成した。Ｐ．タエトロレンスＢＡＲについて観察された分子量は４２６５１Ｄａであり、このタンパク質がアミノ酸Ａ２３の後で開裂することを示した（理論的な分子量＝４２６５４Ｄａ）。Ａ．キャビエＢＡＲについて観察された分子量は４３５６５Ｄａであり、このタンパク質がアミノ酸２１の後で開裂することを示した（理論的な分子量＝４３５６８Ｄａ）。Ａ．ハイドロフィラＢＡＲについて観察された分子量は４３４５０Ｄａであり、このタンパク質がアミノ酸２１の後で開裂することを示した（理論的な分子量＝４３４５３Ｄａ）。配列番号２０４のアミノ酸２〜２３をコードするコドンが除去され、部分的な遺伝子が上記の方法と同じようにイー・コリで発現する場合、精製発現産物について観察された分子量は４２４８３Ｄａである。この結果に基づいて、リーダーなし発現産物の成熟タンパク質は、最初の２つまたは３つのアミノ酸が除去されているように考えられ、それを、野生型産物の成熟タンパク質よりも１つまたは２つのアミノ酸分短くしている。配列番号１７９のアミノ酸２〜２１をコードするコドンが除去された場合、精製発現産物について観察された分子量は４３５００であり、最初の２つのアミノ酸（ＭＡ）が除去されていることに相応する（理論的な分子量＝４３４９８）。したがって、成熟タンパク質は、野生型成熟タンパク質と比較して１つのさらなるアラニンを欠いており、実施例４Ｏに示されるように、周辺質中に分泌されるようには考えられない。Ａ．キャビエおよびＰ．タエトロレンスの双方のリーダーなし発現産物から開裂するアラニンに加えて、Ｐ．タエトロレンス（配列番号２０４）リーダーなし発現産物に由来する成熟タンパク質がプロリンを欠けている場合、それは、活性の低下の増加について説明する可能性がある。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されるように発現の劇的な低下によって証拠づけられるように、タンパク質は、決して適切に発現せず、折りたたまれない可能性がある。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きタンパク質はニッケルアフィニティーカラム上で精製されないと考えられ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ３．０プログラムはリーダー配列を予測したので、上記に記載されるＰ．プチダＢＡＲ酵素は、イー・コリによって同様に処理されるであろう。
【実施例５】
【０４１７】
組換えイー・コリ中のピルビン酸アルドラーゼのスクリーニングのための選択法
実施例４Ａ（５）、９、および１０（３）に記載され、かつ図１〜８に示されるプロセスの多くは、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸からＲ−ＭＰを優先的に生成するアルドラーゼで最適に働くであろう。従って、Ｒ−ＭＰを優先的に生成するアルドラーゼをコードする核酸を含有するクローンを単離し、試験するための方法が記載される。炭素源としてのリボースを有するＭ９最少培地上で成長させる場合にピルビン酸の補足を必要とするエシェリキア・コリの株は先に記載された。Ｐｏｎｃｅ，Ｅ．ら，「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．：Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：５７１９−５７２２，（１９９５）。株の関連する遺伝子型は次の通りである：ΔｐｙｋＡ  ΔｐｙｋＦ。ダブルノックアウトは、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５，（２０００）の方法によって生成した。これらの株は、ピルビン酸生成アルドラーゼスクリーニングのためのおよびモナチンの特定の立体異性体、モナチン前駆体の特定の立体異性体、またはモナチンもしくはモナチン前駆体の類似体に対する活性が高いアルドラーゼをスクリーニングするための基礎を形成できる。モナチン前駆体の類似体は、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸、４−カルボキシ−４−ヒドロキシ−２−オキソアジペート（ｏｘｏａｄｉｐａｔｅ）、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソアジペート、またはアルドール反応においてピルビン酸に変換される他のカルボキシルリッチ化合物のごときＰｒｏＡアルドラーゼまたはＫＨＧアルドラーゼの基質として同定された化合物を含む。用いることができるモナチンの類似体の例は、４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸であり、これは、試験細胞中の天然のアミノトランスフェラーゼによって４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸（ＰｒｏＡの基質）に容易にアミノ基転移され得る。
【０４１８】
クローニング
以下のプライマーは、ｐｙｋＡノックアウトを生成するために用いた。
5'-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'（配列番号３）および
5'-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATATGAATATCCTCCTTAG-3'（配列番号４）。
【０４１９】
以下のプライマーは、ｐｙｋＦノックアウトを生成するために用いた。
5'-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3'（配列番号５）および
5'-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'（配列番号６）。
【０４２０】
ＰＣＲ反応は、標準的なプロトコールを用いて鋳型としてｐＫＤ３またはｐＫＤ４のいずれかを用いて行った。ＰＣＲ生成物は、ラムダレッド相同組換え系を発現するイー・コリの株へエレクトロポレーションした。ＰＣＲ生成物は、ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦに対する相同性を有し、それらの部位で染色体中に再結合した。ダブルクロスオーバーが起こった場合、結果として生じた子孫は、欠失したｐｙｋＡまたはｐｙｋＦの遺伝子および抗生物質抵抗性マーカーを運んだ。抗生物質抵抗性マーカーを有する欠失遺伝子は、標準的なＰ１形質導入技術を用いてイー・コリ株（ＭＧ１６５５）中に形質導入した。
【０４２１】
株分析
ダブルノックアウトは、Ｂａｌｃｈのビタミン溶液、Ｂａｌｃｈの修正微量元素溶液（Ｂａｌｃｈ，Ｗ．Ｅ．ら，「Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ：ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒｏｕｐ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０−２９６，（１９７９））、および０．４％Ｄ−リボースを補足した最少培地（Ｍ９塩）（Ｄｉｆｃｏ社）上での成長について試験した。５ｍＭピルビン酸が培地にさらに含まれていない限り、成長は、ダブル変異体について見られなかった。野生型ＭＧ１６５５は、ピルビン酸有りおよびなしの双方で上記の培地上で成長した。ダブルノックアウトは、リボースではなく０．４％グルコースを補足した上記に記載される最少培地上での成長について試験した。この培地上での成長は、野生型株を用いて見出されたものに類似していた。この培地で、ピルビン酸は、ｐｔｓＩ遺伝子産物（ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸を作製し、グルコースにリン酸を移すホスホトランスフェラーゼ系の酵素）を介してグルコースから生成され得る。ダブルノックアウト株は、さらに、リボースではなく０．４％Ｌ−アラビノースまたは０．４％Ｄ−キシロースを補足した上記に記載される培地を用いて、成長について試験した。ピルビン酸は、これらの５−炭素含有（非ＰＴＳ）基質での成長から生成されない。５ｍＭピルビン酸を補足しない限り、ダブルノックアウトはこれらの条件下で成長せず、野生型株は、ピルビン酸有りおよびなしの双方で正常に成長した。
【０４２２】
国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例２に記載されるコマモナス・テストステローニからのｐｒｏＡアルドラーゼ遺伝子（ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣ中でクローニング）および国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例３に記載されるａｓｐＣ／ｐｒｏＡ遺伝子オペロン（ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣおよびｐＥＴ３２中でクローニング）は、ｐＢＡＤ  ＴＯＰＯ  ＴＡ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ中にサブクローニングした。
【０４２３】
遺伝子（複数可）の発現は、これらの構築物において、誘発性ａｒａＢＡＤプロモーターによって制御される。アラビノース（例えば、０．４％）およびＩＰＴＧの存在下で遺伝子（複数可）は発現する。ピルビン酸またはピルビン酸の源が補足されない限り、株は、最少培地上で成長しないであろう。培地は、モナチン、モナチン前駆体、またはモナチンもしくはモナチン前駆体の類似体を補足できる。文献において用いられる基質の標準的な範囲は０．５〜５ｍＭである。ＰｒｏＡアルドラーゼは、例えば、モナチン前駆体をピルビン酸およびインドール−３−ピルビン酸に変換でき、従って、株にピルビン酸の源を供し、０．４％アラビノースを有する最少培地上での成長を可能にする。ｐｒｏＡおよびａｓｐＣの遺伝子の双方を発現する構築物は、モナチンをモナチン前駆体に変換し、モナチン前駆体をピルビン酸およびインドール−３−ピルビン酸に変換できる。さらに、アミノトランスフェラーゼは、インドール−３−ピルビン酸をＬ−トリプトファンに変換し、トリプトファン栄養要求性を補完できる。この系は、アルドラーゼについてスクリーニングするためにおよびモナチンの特定の立体異性体、モナチン前駆体の特定の立体異性体、またはモナチンもしくはモナチン前駆体の類似体に対してより活性であるアルドラーゼをスクリーニングするために用いられる。例えば、進化分子工学が国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例２に示されるアルドラーゼのうちのいずれかについて行われる場合、ＲまたはＳモナチン前駆体のいずれかを含有する培地を利用する平板アッセイは、結果として生じた変異体酵素のエナンチオ特異性を比較するために用いられる。成長が、Ｒ−モナチン前駆体を含有する平板上で起こり、成長が、Ｓ−モナチン前駆体を含有する平板上でほとんどまたは全く起こらない場合、アルドラーゼは、反応部位にＲ−キラリティを含有する基質に対して特異性を有する。
【０４２４】
１×Ｂａｌｃｈのビタミン溶液およびＢａｌｃｈの修正微量元素溶液を含有するＭ９最少培地平板を作製した。Ｂａｌｃｈ，Ｗ．Ｅ．ら，「Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ：ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒｏｕｐ．」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０−２９６，（１９７９）。グルコースまたはアラビノースが炭素源（０．４％重量／容量）として含まれ、平板は、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で溶かした５ｍＭモナチン（Ｒ，Ｒ；Ｓ，Ｓラセミ混合物）またはモナチンなしの等容量のリン酸カリウム緩衝液のいずれかを補足した。成長を下記の表３４に要約する。
【０４２５】
【表３４】
2015211679.tif 000037
【０４２６】
ＰｒｏＡおよびＡｓｐＣのレベルをコントロールする、モナチンの取り込みを増加させる、モナチンの代わりにモナチン前駆体を用いる（この場合、アミノトランスフェラーゼは、存在する必要がないと考えられる）、または上記に記載されるもののごときモナチンのそれほど疎水性でない類似体を用いることによってスクリーニングを最適化できることが予想される。モナチンの取り込みを増加させるための方法は、アミノ酸混合物の追加、特定のアミノ酸の追加、界面活性剤、抗生物質、抗生物質類似体、または細胞壁を透過処理するのを助ける酵素の使用、およびアルドラーゼが、成長を支えるのに十分なピルビン酸を提供できない場合に、成長を可能にするための少量のピルビン酸の追加を含む。ポリミキシンＢノナペプチド（ＤｉｘｏｎおよびＣｈｏｐｒａ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２９：７８１−７８８（１９８６））およびミクロシスチンＲＲ（Ｄｉｘｏｎら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３０：１６７−１７０（２００４））はイー・コリの外側の膜を透過処理する作用物質として記載された。
【０４２７】
他のプロモーター系／プラスミドをこのスクリーニング系において用いることができ、等価な結果となることが予想される。例として、Ｔ７プロモーター系ならびにｔａｃおよびｌａｃのごときＩＰＴＧ誘発性プロモーターを含む。
【０４２８】
ａｓｐＣおよびｐｒｏＡの遺伝子は、ｐＴｒｃ９９ａ発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）中にクローニングした。結果として生じたベクターは、トリプトファン栄養素要求株ＣＡＧ１８４５５またはＣＡＧ１８５７９中に形質転換した（株の説明については実施例４を参照されたい）。形質転換体は、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび５ｍＭモナチンを用いてＭ９最少培地上で平板培養した。３７℃での３日後に、オペロンプラスミドを有する株はコロニーを形成したが、親株は、成長したようではなかった。加えて、成長は、ＩＰＴＧの存在に依存性であり、オペロンの発現が成長に必要とされたことを示す。この補足性研究において、ａｓｐＣ／ｐｒｏＡオペロンは、モナチンからＭＰを形成し、ＭＰからインドール−３−ピルビン酸を形成した。次いで、インドール−３−ピルビン酸をＬ−トリプトファンに変換でき、トリプトファン栄養素要求株がＭ９最少培地上で成長することを可能にした。
【０４２９】
数種の潜在的な生物は、Ｒ特異的アルドラーゼを有する可能性があり、上記に記載のように試験できる。Ｒ，Ｒ−モナチンの存在は、コリネバクテリウム・グルタミカムの培養上清において検出された。これは、Ｒ−モナチン前駆体を作製できる酵素の存在を示唆する。さらに、モナチンの多数の異性体の存在は、逆相クロマトグラフィーを用いて、シノリゾビウム・メリロティの無細胞抽出物中で検出され、さらに、モナチン前駆体のＲ立体異性体を作製できるアルドラーゼまたはアミノトランスフェラーゼが存在する可能性のあることを示す。
【０４３０】
シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）（シュードモナス・オクラセア  ＮＧＪＩ）、シノリゾビウム・メリロティ、スフィンゴモナス種  ＬＢ１２６、アルトロバクター・ケイセリ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｅｙｓｅｒｉ）１２Ｂ、エルシニア・ペスチス株  ＣＯ９２、ブラディリゾビウム・ジャポニクム株  ＵＳＤＡ１１０、スフィンゴモナス（シュードモナス）パシモビリス（ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、エルシニア・ペスチス  ＫＩＭ、ラルストニア・メタリデュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）ＣＨ３４、エルシニア・シュードツベルクロシス  ＩＰ３２９５３、リゾビウム・レグミノサルム  ビオバル  ビキア（Ｖｉｃｉａｅ）ｒｈｉｚ２３ｇ０２−ｐ１ｋ＿１００９＿３４１（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン  ＤＳＭ１２４４４、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０、マグネトスピリルム・マグネタクティカム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ）ＭＳ−１、ロドシューモナス・パラストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＣＧＡ００９、キサントモナス・カンペストリス  ＡＴＣＣ−３３９１３、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）シトリ  ３０６、およびストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０は、鋳型としてｐｒｏＡ（コマモナス・テストステローニ）を用いたＢＬＡＳＴ分析によって発見された相同体を有する。米国出願第２００５０２８２２６０号を参照されたい。これらの生物は、ＤＮＡの源として用いることができ、上記に言及されるスクリーニングにおいて試験した。
【０４３１】
没食子酸、シリング酸、プロトカテキュ酸、フタル酸、パラヒドロキシベンゾエート、およびフルオレンで成長が可能な生物は、モナチンを作製する可能性があるアルドラーゼを有する可能性があり、上記に言及されるスクリーニングについて可能性を有する可能性がある。以下の生物は、４，５−ジオキシゲナーゼ経路を介してプロトカテキュ酸を代謝し、有用である可能性があるアルドラーゼを有する可能性がある：ボルデテラ・ブロンキセプチカ  ＲＢ５０、ボルデテラ・パラパータシス  １２８２２、クレブシエラ・ニューモニエ  ＭＧＨ７８５７８、マグネトスピリルム・マグネタクティカム  ＭＳ−１、ロドシューモナス・パラストリス  ＣＧＡ００９、スフィンゴモナス・アロマチシボラン  Ｆ１９９、キサントモナス・アキソノポディス  シトリ  ３０６、キサントモナス・カンペストリス  ＡＴＣＣ３３９１３。
【０４３２】
また以下の生物は、３，４ジオキシゲナーゼ経路を介してプロトカテキュ酸を分解し、有用である可能性があるアルドラーゼを有する：アシネトバクター・カルコアセティカス  ＡＤＰ１、アシネトバクター種  ＡＴＣＣ３３３０５、ＡＤＰ１、アグロバクテリウム・ツメファシエンス  Ｃ５８、アゾトバクター・ビネランジー  ＡｖＯＰ、ブラディリゾビウム・ジャポニクム株  ＵＳＤＡ１１０、ブラディリゾビウム・ジャポニクム株  ＵＳＤＡ４３８、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・メリテンシス  １６Ｍ、ブルセラ・メリテンシス  スイス  １３３０、バークホルデリア・セパシア  Ｊ２３１５、バークホルデリア・ファンゴラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｆｕｎｇｏｒｕｍ）ＬＢ４００、バークホルデリア・シュードマレイ  Ｋ９６２４３、リネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）ＹＳ−３１４、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ−１３０３２、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株  ｋ１０、シュードモナス・エルジノーサ  ＰＡＯ１、シュードモナス・フルオレッセンス  Ｐｆ０−１、シュードモナス・フルオレッセンス  ＳＢＷ２５、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０、シュードモナス・シリンゲ病原型トマト株  ＤＣ３０００、ラルストニア・ソラナセラム、ロドコッカス種株  Ｉ２４（ＩＧ−１５）、シノリゾビウム・メリロティ  １０２１、ストレプトマイセス・アベルミティリス  ＭＡ−４６８０、ストレプトマイセス・セリカラー  Ａ３（２）、およびキサントモナス・アキソノポディス  シトリ  ３０６、キサントモナス・カンペストリス  ＡＴＣＣ−３３９１３。
【実施例６】
【０４３３】
６Ａ：ＨＥＸＡｓｐＣの部位特異的突然変異誘発
実験概要
イー・コリＡｓｐＣ（ＨＥＸａｓｐＣ）のｈｅｘａ変異体は、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例６に記載のようにＳ，Ｓモナチンの生成についてＡｓｐＣと比較してより優れた活性を有することがわかった。ＨＥＸ（受入番号：／ＡＨＦＡ  ｇｉ：１２７１９０）は、ＡｓｐＣからの以下の突然変異を含有する（イー・コリ番号付け）：Ｖ３５Ｌ、Ｋ３７Ｙ、Ｔ４３Ｉ、Ｎ６４Ｌ、ＴＩ０４Ｓ、およびＮ２８５Ｓ。構造分析および文献報告（Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｓ．およびＫｉｒｓｃｈ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２７：５９３−６０８，（２００３）；Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：７６３−７７２，（２００４））に基づき、モナチン生成経路に利用される基質：Ｌ−トリプトファン、Ｓ−ＭＰ、またはその双方に対して速度論的活性を増加させると予想された５種以上の変異体を作り出した。変異体のうちの２種は、トリプトファンおよびＳ，Ｓモナチンの双方のアミノ基転移速度を増加させた。変異体のうちの２種は、Ｓ，Ｓモナチンの形成に対する立体選択性の増加を示したが、一方はそれほど立体選択性ではなかった。これに基づき、同様の突然変異を有するバチルス種からの広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、図３に示され、かつ実施例４（４）に記載されるＲ，Ｒモナチン経路のＤ−アミノトランスフェラーゼとして有用であろうことが予想される。変異体のうちの１種（ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ）は、Ｌ−トリプトファンアミノ基転移に対する活性を増加させたが、Ｓ，Ｓモナチン生成またはＳ，Ｓモナチンアミノ基転移における活性は著しく減少した。従って、この酵素は、図１、２、４、５、６、７、および８に示され、かつ実施例９および１０（３）に記載されるＲ，Ｒモナチン生成経路の第１の工程に有用であることが予想される。一般的に、Ｌ−トリプトファンに対するＡｓｐＣの活性に類似する活性ならびにＲ−ＭＰおよびＳ−ＭＰに対する制限された活性を有するアミノトランスフェラーゼは、図１、２、４、５、６、７、および８に表すプロセスに有用であろう。
【０４３４】
方法および材料
ｐＵＣ１９中でクローニングしたＨＥＸ遺伝子は、Ｊ．Ｆ．Ｋｉｒｓｃｈ教授（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，バークリー，バークリー，ＣＡ  ９４７２０−３２０６）によって提供されたものであり、ｐＥＴ２３ａ中への遺伝子のクローニングのために鋳型として用いた。Ｏｎｕｆｆｅｒ，Ｊ．Ｊ．およびＫｉｒｓｃｈ，Ｊ．Ｆ．，「Ｒｅｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：１７５０−１７５７（１９９５）を参照されたい。ＮＣＢＩ受入番号１ＡＨＦ＿Ａ  ＧＩ：１１２７１９０（ＨＥＸアミノ酸配列）もまた参照されたい。以下のプライマーは、ｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中にＨＥＸ遺伝子をクローニングするために設計した。
ＨＥＸａｓｐＣプライマー：
Ｎ末端:5'-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3'（配列番号７）;
Ｃ末端:5'-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3'（配列番号８）。
【０４３５】
以下のＰＣＲプロトコールを遺伝子増幅に用いた：１００μＬ反応中、５０ｎｇ  ＤＮＡ鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．２ｍＭ  各ｄＮＴＰ、１Ｕ  Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）、および１×Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ緩衝液を追加した。サーモサイクラープログラムには、５分間９４℃のホットスタートを利用し、その後、９４℃での変性工程（３０秒間）、５５℃でのアニーリング工程（１分間）、７２℃での伸長工程（２分間）の２５サイクル、および最終的な７２℃での終了工程（７分間）が続いた。精製ＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）の制限酵素を用いて消化した。ＰＣＲ生成物は、Ｒｏｃｈｅ社製Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて同様に消化したｐＥＴ２３ａ中にライゲーションした。脱塩したライゲーションしたものは、メーカーのプロトコールに従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩシステムを用いて、イー・コリＤＨ１０Ｂ細胞中にエレクトロポレーションした。ミニプレップＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて、調製し、突然変異誘発反応のための鋳型として用いた。プラスミドは、メーカーのプロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）に従ってイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質転換した。
【０４３６】
１３０位でのトリプトファン残基は、ピリドキシル環とのスタッキング相互作用に重要であると考えられるが、タンパク質モデリング観察に基づくと、Ｓ−モナチン前駆体（「Ｓ−ＭＰ」）基質との立体障害の源であるようである。従って、より小さな疎水性側鎖を有するアミノ酸（フェニルアラニン）をトリプトファンと交換するために用いた。望ましい突然変異の新しい組合せを作り出したが、残りの突然変異は文献中の反応速度データに基づくものとした。Ｗ１３０Ｆを除く、ＨＥＸａｓｐＣに対するすべての突然変異は、メーカーの指示に従って、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｇｅキットを用いて行った。Ｗ１３０Ｆ突然変異は、ＰＣＲ反応の伸長温度を６６℃に減少させたことのみを除いて、メーカーの指示に従って、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットを用いて行った。マルチーチェンジキットのためのプライマーは、Ｗ１３０Ｆ単一突然変異プライマーを除いて、〈ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ〉のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅマルチキットプライマー設計ツールを用いて設計した。
【０４３７】
プライマー配列を下記の表３５に挙げる。
【０４３８】
【表３５】
2015211679.tif 000038
a  は、5’リン酸化によって改変されたプライマーを意味する。
【０４３９】
ＨＥＸａｓｐＣ突然変異遺伝子の発現および酵素活性の分析
Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２（カタログ＃７１３６６−３；溶液１〜６の液体培養物（５ｍＬ）は、以下の株の新鮮な平板培養物または凍結グリセロールストックから接種した。
E.coli BL21(DE3)::HEXaspCpET23a
E.coli BL21(DE3)::HEXaspCW130FpET23a
E.coli BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a
E.coli BL21(DE3)::HEXaspCP9T/T156ApET23a
E.coli BL21(DE3)::HEXaspCP9T/R122GpET23a
E.coli BL21(DE3)::HEXaspCR122G/T156ApET23a
【０４４０】
培養物は、６〜８時間、２３０ｒｐｍで、３７℃でインキュベートした。各培養物のＯＤ６００を決定し、２５ｍＬ中で０．０３〜０．０５のＯＤ６００を得るのに必要な培養物の容量を算出した。算出した容量の各液体培養物は、２５ｍＬの同一の培地を含有するフラスコに移した。Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２は、誘発剤としてラクトースを用い、かつ細胞成長のモニターを必要としない、ＩＰＴＧ誘発性発現系を用いた高レベルの発現のための完全な合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）である。Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ培養物は、１８時間２３０ｒｐｍで振盪させながら３０℃でインキュベートした。細胞は、遠心分離によって採取し、低温の５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０を用いて１回洗浄した。次いで、細胞は、Ｎｏｖａｇｅｎ社推奨のプロトコールに従って、１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ＃７０７４６−３、マディソン、ＷＩ）、５μＬ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩ（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ＃５３９１３２、マディソン、ＷＩ）、および０．３３μＬ／１０ｍＬ  ｒ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ＃７１１１０−３、マディソン、ＷＩ）を含有するＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）（第一級アミンなし）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ＃７０９２３−３、マディソン、ＷＩ）を用いて溶解させた。緩やかに振盪させながら１５分間、２５℃でインキュベーションした後、各懸濁液からの細胞片は、４℃での１５分間の２１，０００ｇでの遠心分離によってペレットにした。上清は、注意深くデカントし、無細胞抽出物として分析した。封入体画分は、３０％Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）（第一級アミンなし）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中に細胞片画分を懸濁させて、１０分間２１，０００×ｇで遠心分離し、遠心分離したペレットを１０％Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）（第一級アミンなし）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中に懸濁させて、もう一度遠心分離して、洗浄ペレットを単離することより単離した。
【０４４１】
無細胞抽出物および封入体画分は、４〜１５％の勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社  ＃１６１−１１０４）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質発現について分析した。細胞抽出物試料については、２０マイクログラムの可溶性タンパク質を各ゲルレーンに装填した（１×タンパク質装填緩衝液を用いて前もって混合し、５分間９５℃で加熱）。封入体画分は、１×タンパク質装填緩衝液（０．２ｍＬ）中に溶かした。９５℃で１０分間加熱し、５μＬの各溶液をゲルレーン毎に装填した。各レーンに装填した全可溶性タンパク質と比較した各ＨＥＸ変異体の量は、Ｌａｂｗｏｒｋｓ  ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ  １次元ゲルツール（ＵＶＰ社、アプランド、ＣＡ）を用いるバンド強度分析によって算出し、また下記の表３６に報告する。
【０４４２】
【表３６】
2015211679.tif 000039
【０４４３】
ゲルの分析は、ＨＥＸａｓｐＣＲ１２２Ａ／Ｔ１５６Ａ変異体が、封入体として実質的な量で見つかった唯一のタンパク質であったことを示した。ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｔ１５６Ａタンパク質は、ＨＥＸａｓｐＣタンパク質を上回る約９０％の最も高いレベルの発現を生じた。対照的に、Ｗ１３０Ｆ、Ｔ１５６Ａ、およびＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇタンパク質は、ＨＥＸａｓｐＣよりも低い濃度で発現した。
【０４４４】
Ｓ，Ｓ−モナチンの生成のためのＨＥＸａｓｐＣ変異体タンパク質の活性は、以下の反応条件を用いて測定した：各１ｍＬの反応は、５０ｍＭ  ＴＡＰＳ、ｐＨ８．２、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム（ｐＨは８に調整）、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸（ｐＨは８に調整）、５０ｍＭトリプトファン、０．０５ｍＭピリドキサール３−リン酸、５０μｇ／ｍＬ  ＰｒｏＡアルドラーゼ（無細胞抽出物として追加）、および様々な濃度（約５０および５００μｇ／ｍＬ）のアミノトランスフェラーゼ（無細胞抽出物として追加）を含有した。脱気した水は、ストック溶液を調製し、かつ１．０ｍＬに反応混合物の容量を調整するために用いた。ピリドキサールリン酸は、酵素の追加の直前に追加した。反応チューブは、４時間緩やかに振盪させながら３０℃でインキュベートした。試料（０．０１ｍＬ）は、酵素の追加の後に、１、２、および４時間で回収し、濾過し、実施例１に記載のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。モナチン生成量は、反応中に存在するアミノトランスフェラーゼの量に基づいて標準化した。
【０４４５】
これらのアッセイの条件下で、ＨＥＸａｓｐＣおよびＨＥＸａｓｐＣＴ１５６Ａは、１ｍｇのアミノトランスフェラーゼ当たり最も多い全モナチンを生成したが、Ｐ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇタンパク質が生成したのは最も少なく、ＨＥＸａｓｐＣＷ１３０Ｆが後に続いた。ＨＥＸａｓｐＣＷ１３０ＦおよびＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ酵素は、高酵素濃度を用いた（３００μｇ／ｍＬ超）場合でさえ、Ｓ−ＭＰに対して最も高い立体選択性を示した（９８％を超えるＳ，Ｓ−モナチン）。Ｓ，Ｓ−モナチン生成物の百分率は、高濃度でＰ９Ｔ／Ｔ１５６Ａ酵素を含有する酵素反応では９０％未満まで減少した。他の変異体は、本来のＨＥＸａｓｐＣ変異体に非常に類似する生成物立体選択性を示した（約９５％Ｓ，Ｓ−モナチン）。実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化試薬を用いる、ＨＥＸａｓｐＣ酵素を含有する反応の生成物の分析は、形成される第２の立体異性体がＲ，Ｓ−モナチンであることを示した。
【０４４６】
トリプトファンおよびモナチンのアミノトランスフェラーゼ活性についてのアッセイ
変異体は、基質としてＳ，ＳモナチンおよびＬ−トリプトファンを用いるアミノ基転移活性について試験した。アミノトランスフェラーゼ活性は、実施例１に記載のように、ＯＰＡポストカラム誘導体化を用いたＨＰＬＣによって、反応の副産物であるグルタミン酸の形成に従って測定した。反応混合物は、１．０ｍＬ中、１００ｍＭ  ＨＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭアルファ−ケトグルタル酸、０．０８ｍＭピリドキサールリン酸、２５ｍＭトリプトファンまたはＳ，Ｓモナチン、および酵素（細胞抽出物タンパク質における２．５ｍｇとして供給）を含有した。酵素以外の成分はすべて、一緒に混合した。酵素は、反応を開始するために追加し、反応溶液は、９０分間、３０℃（緩やかに振盪させる）でインキュベートした。反応は、酵素を追加しないネガティブコントロールと共に二通り行った。反応は、１０％ギ酸（最終濃度）の追加によって停止させ、混合物は、２１，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清は注意深く取り出し、濾過した。データは、グルタミン酸のバックグラウンドレベルについておよびタンパク質を沈殿させるための、酸の追加による希釈について補正し、次いで、追加した変異体アミノトランスフェラーゼの量によって標準化した。トリプトファンを基質として利用した場合、ＨＥＸａｓｐＣは、毎時１ｍｇのアミノトランスフェラーゼ当たり１３．０ｍＭグルタミン酸を生成した。変異体の、百分率として表した相対的活性は、以下の通りである：ＨＥＸａｓｐＣＷ１３０Ｆ（１５６％）、ＨＥＸａｓｐＣＴ１５６Ａ（１５１％）、ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｔ１５６Ａ（６３．７％）、ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ（１１６％）、およびＨＥＸａｓｐＣＲ１２２Ｇ／Ｔ１５６Ａ（１０７％）。Ｓ，Ｓモナチンを基質として利用した場合、ＨＥＸａｓｐＣは、毎時１ｍｇのアミノトランスフェラーゼ当たり７．４３ｍＭグルタミン酸を生成した。変異体の、百分率として表した相対的活性は、以下の通りである：ＨＥＸａｓｐＣＷ１３０Ｆ（１１３％）、ＨＥＸａｓｐＣＴ１５６Ａ（８７．７％）、ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｔ１５６Ａ（６７．３％）、ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ（１１．２％）、およびＨＥＸａｓｐＣＲ１２２Ｇ／Ｔ１５６Ａ（１１４％）。
【０４４７】
ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ変異体は、トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換に対する活性を増加させたが、Ｓ，Ｓモナチンアミノ基転移に対する活性を減少させた。モナチンに対するトリプトファンの活性の比は、ＨＥＸａｓｐＣの１．７５と比較して１８．２であり、これにより、ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇ変異体は、実施例９および１０（２）に記載されるＬ−アミノトランスフェラーゼ等のＬ−アミノトランスフェラーゼを必要とする経路を用いるＲ，Ｒモナチンの生成のための望ましい候補となる。そのため、ＨＥＸａｓｐＣＰ９Ｔ／Ｒ１２２Ｇは、Ｓ，ＳモナチンおよびＭＰに対する制限された活性を持つアミノトランスフェラーゼの例となる。
【０４４８】
大部分の突然変異は、Ｌ−トリプトファン活性を改善したが、２つの変異体だけが、Ｌ−トリプトファンおよびＳ，Ｓモナチンの双方に対する活性を増加させる（ＨＥＸａｓｐＣＷ１３０ＦおよびＨＥＸａｓｐＣＲ１２２Ｇ／Ｔ１５６Ａ）。２５ｍＭの基質をこれらのアッセイに用いたので、酵素はおそらく飽和され、活性は酵素のｋｃａｔの反映となる。しかしながら、上記に記載される、Ｓ，Ｓモナチン生成についてのアッセイを行った条件下では、おそらくＳ−ＭＰの濃度は酵素を飽和させるのに十分ではなく、従って、ｋｃａｔの増加がＫｍの増加によって相殺されるので、Ｓ，Ｓモナチン生成における全体の増加はない。同様の基質に対して、いくつかの突然変異はｋｃａｔを増加させたが、アミノ酸基質に対する見かけのＫｍもまた増加させたことが報告された。増加性の濃度の基質を用いた場合、これらの２つの変異体は、ＨＥＸａｓｐＣと比較して、Ｓ，Ｓモナチンの生成速度における有益性を提供すると考えられることが予想される。ＨＥＸａｓｐＣＴ１５６Ａ突然変異は、Ｓ，Ｓモナチン生成に対する上記の条件下でのＭＰアミノ基転移速度に対して著しい効果を伴わずに、トリプトファンアミノ基転移速度を増加させたようである。
【０４４９】
ＨＥＸａｓｐＣおよびバチルス種Ｄ−アミノトランスフェラーゼ酵素のうちの１つの構造の比較によって（例えば、Ｓｕｇｉｏ，Ｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：９６６１−９６６９，（１９９５）を参照されたい）、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ構造中の対応する残基にＡｓｐＣのＷ１３０Ｆ、Ｒ１２２Ｇ、Ｔ１５６Ａ、およびＨＥＸ突然変異をマッピングできる。広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼ中の同様の突然変異は、実施例３Ａに記載のように、Ｒ，Ｒモナチンの全体の生成を改善すると考えられることが予想される。例えば、ＡｓｐＣ中のトリプトファン１３０によって提供される機能性は、バチルスＤ−アミノトランスフェラーゼ中でセリン１７９−１８１およびグルタミン酸１６６（ＹＭ−１番号付けスキーム）の側鎖間の水素結合と交換される。立体障害を減らすために、グルタミン酸をアスパラギン酸残基に突然変異させることができる。いくつかのＤ−アミノトランスフェラーゼは１７９位にトレオニン残基を有し、これは立体障害を増加させるであろうが、回避されるべきである。Ｂ．スファエリクス酵素は、１８１位にセリンの代わりにアラニンを有し、アラニンはさらに立体障害を低下させる可能性がある。
【０４５０】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼに関する研究からの付加的な情報は、Ｄ−アミノ基転移酵素に同様に適用できる。ＡｓｐＣ酵素は、ジカルボン酸基質の側鎖と相互作用する活性部位にアルギニンを有しているが、Ｄ−アミノトランスフェラーゼはＳｅｒ２４０からＳｅｒ２４３までのループを有する。Ｓｅｒ２４０、Ｔｈｒ２４２、およびＳｅｒ２４３の側鎖は、同一の方向を向き、Ｓｅｒ１８０のヒドロキシル基と共に、無極性基質および極性基質の双方が相互作用できる表面を提供するポケットを形成する。Ｓｅｒ１８０はＰＬＰ結合に関連する。しかしながら、Ｒ−ＭＰとのＤ−アミノトランスフェラーゼの活性を改善するために、Ｓｅｒ２４０、Ｔｈｒ２４２、またはＳｅｒ２４３残基は、より大きな基質を受容するようまたは負に荷電した基質に好都合となるように改変できる。例えば、Ｔｈｒ２４２は、側鎖長を減らすためにＳｅｒに突然変異させることができる。Ｓｅｒ２４３のごとき、残基のうちの１つは、リシンまたはアルギニンに突然変異させることができる。残基（ＹＭ−１番号付け）Ｖａｌ３０〜Ｖａｌ３６は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼの活性部位を横切るベータストランドに位置し、さらに、活性にとって重要である。Ｔｙｒ３１、Ｖａｌ３３、Ｇｌｕ３２、およびＬｙｓ３５は活性部位に面すると考えられる。Ｔｙｒ３１、Ｇｌｕ３２、およびＶａｌ３３はすべてのバチルス相同体において不変である。Ｒｏら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３９８：１４１−１４５，（１９９６））は、Ｖａｌ３３をＡｌａに突然変異誘発させ、アルファ−ケトグルタル酸アミノ基転移に対する触媒効率がわずかに増加し、かつよりかさ高い基質（それほど立体障害にならない）に対する触媒効率が著しく改善されることを見い出した。いくつかの相同体では、Ｌｙｓ３５はアルギニンと交換されるが、立体障害が関係する場合、Ｌｙｓ残基が好ましい可能性がある。バリン３４および３６もまた、なおまたＭＰ等の大きな分子に対してそれほど立体障害にならないので、イソロイシンのごとき、保存的置換に関して好ましい。実施例１５および１６に記載される新規なＤ−アミノトランスフェラーゼ（「４９７８」）が実施例１９に記載されるＢ．スファエリクス酵素およびハイブリッドＤＡＴよりも高い活性を有したので、それは、さらなる突然変異誘発反応のために当然選ばれる。ＹＭ−１  Ｄ−アミノトランスフェラーゼの結晶構造分析に基づいた上記のアイデアは、ＡＴＣＣ株４９７８からＤ−アミノトランスフェラーゼに適用できる。上記の番号付けは、４９７８タンパク質配列中の対応するアミノ酸ではないアミノ酸である。
【０４５１】
６Ｂ：ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼの変異体のキャラクタリゼーション
実験概要
バチルス株ＡＴＣＣ４９７８からの新規なＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子（実施例１５に記載される）は、部位特異的方法を用いて突然変異誘発させた。変異体遺伝子を発現させ、モナチン生成経路について注目する活性についてアッセイした。
【０４５２】
部位特異的突然変異誘発標的について実施例６Ａに挙げたアイデアに加えて、他のアイデアは、ＹＭ−１結晶構造の活性部位中にＲ−ＭＰを実際にドッキングさせることによっておよび一次アミノ酸配列アラインメントを用いて発展させ、４９７８タンパク質がその領域中で同様の構造的な特徴を有しそうかどうかを決定した。以下のさらなる突然変異は有益であろうと期待された（４９７８アミノ酸番号付けを使用）。アラニン１５３のアルギニンへの突然変異誘発は、基質（Ｒ−ＭＰ）の第２のカルボキシル基を安定化するであろうと考えられた。この変化は、おそらく立体障害を増加させる、したがって、これを補うために、位１８１および１８２のセリン残基をアラニンまたはグリシンに変化させた。位１８０、１８１、または１８２にアルギニンを導入し、他のセリン残基の１つまたは複数をアラニンまたはグリシンに変換し、アルギニンのよりかさ高い側鎖のために空間を作ることができるということもまた仮定された。アミノ酸２００のフェニルアラニンは、Ｒ−ＭＰが活性部位にドッキングすると予測される場所に空間的に接近しており、モナチンアミノ基転移をかなり十分に触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼの中のこの残基に多大な変異性がある。この位置のアミノ酸改変は有用となり得ると考えられた。フェニルアラニンへのロイシン１５１の突然変異は、基質のインドール環との相互作用を可能性として改善することが予測された。
【０４５３】
文献に基づき、アスパラギンへのトレオニン２４３の突然変異は、アミノ基転移反応についてのＲ−ＭＰ選択性を改善する可能性があると仮定された。同様に、アラニンへのアスパラギン１００の突然変異誘発は、モナチンアミノ基転移反応に対する酵素の特異的活性を改善する可能性があると考えられた（Ｒｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３９８：１４１〜１４５頁、（１９９６年）；Ｓｕｇｉｏ，Ｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：９６６１〜９６６９頁、（１９９５年）；欧州特許第１５８０２６８号）。
【０４５４】
Ｌｅｅらは、１４１〜１４４の領域（ループ）の変異体を特徴づけ、ＬＲｃＤ（４９７８のタンパク質に固有）ではなくＥＹｃＹを有するＤ−アミノトランスフェラーゼはジカルボン酸基質に対してより低いＫｍを有する傾向があることが分かった。（Ｌｅｅ  ＳＧ、Ｈｏｎｇ  ＳＰ、Ｓｏｎｇ  ＪＪ、Ｋｉｍ  ＳＪ、Ｋｗａｋ  ＭＳ、Ｓｕｎｇ  ＭＨ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６年２月；７２（２）：１５８８〜９４頁）。ＭＰは、アルファ−ケトグルタル酸に類似するジカルボン酸基質であり、ＭＰの濃度は標準的なモナチン生成反応混合物中でかなり低いので、Ｋｍの低減は、可能性として、モナチン生成についての変異体ＤＡＴの活性を助けることができると考えられる。
【０４５５】
下記の方法は、４９７８Ｄ−アミノトランスフェラーゼ変異体を作り出すことおよびこれらの変異体を用いたアッセイ結果を記載する。
【０４５６】
突然変異誘発
突然変異誘発のためのプライマーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｇｅキット（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に挙げられた示唆に従って設計した。プライマーは５’−リン酸化した。突然変異誘発は、メーカーの指示に従って、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｇｅキットを用いて行った。突然変異誘発のために用いた鋳型は、実施例１５に記載されるｐＥＴ３０（タグなし）またはｐＥＴ２８（タグ付き）の４９７８ＤＡＴ構築物のいずれかとした。プライマーは表３７で下記に挙げる。
【０４５７】
【表３７】
2015211679.tif 000040
【０４５８】
イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、形質転換し、結果として生じた精製プラスミド調製物は、適正な突然変異が組み込まれたかを検証するために配列決定した。
【０４５９】
発現およびアッセイ
適正な突然変異を含有するプラスミドＤＮＡをイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換し、実施例１６に記載されるように誘発した。細胞抽出物は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて調製した。１ｍｌのアッセイは、緩やかに振盪させながら３０℃で行った、また１０．２ｍｇ  Ｄ−トリプトファン、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、約５０μｇのアルドラーゼ、２００ｍＭピルビン酸、および細胞抽出物として供給された０．１５０〜０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼを含有した。全タンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）全タンパク質キット（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）またはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）ＢＣＡキットを用いて行い、Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現パーセントは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍによって評価した。試料は、３時間および一晩の時点で測った。
【０４６０】
配列番号２２のＲ特異的アルドラーゼと共に約０．１５０ｍｇ／ｍＬのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いると、第１のアッセイは、以下の変異体（タグなし）がアミノ基転移活性を有したことを示した（最も高いものから最も低いものの順）：Ｔ２４３Ｎ、Ｔ２４３Ｓ、Ｔ２４３Ｎ／Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ａ。Ｔ２４３Ｎは、生成されたＲ，Ｒモナチンの立体純度を上昇させるように考えられたこともまた注目された。アッセイは、精製コマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ（１００μｇ／ｍｌ）および０．５０ｍｇ／ｍｌのＤ−アミノトランスフェラーゼ変異体（タグなし、細胞抽出物として供給）を用いて繰り返した。試料は、２時間および一晩の時点で測った。活性タンパク質についての結果を下記に示す、また二通りの結果は平均した。Ｒ，Ｒモナチン％は逆相ＨＰＬＣのピーク面積によって決定し、次いで、実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化法を用いて測定した（結果は括弧中に示す）。結果を表３８に示す。Ｒ，ＲモナチンおよびＳ，ＲモナチンのみがＤ−トリプトファンから生成される。Ｔ２４３Ｒ変異体は、試験した条件下でモナチンを生成するようには考えられなかった、またＴ２４３Ａ変異体は、非常に低いレベルのモナチンを生成した。
【０４６１】
【表３８】
2015211679.tif 000041
【０４６２】
アッセイを行い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアを用いてＤ−アミノトランスフェラーゼパーセントを評価したが、Ｔ２４３ＳおよびＴ２４３Ｎの変異体は野生型酵素と比較して活性を増加させたことは明らかである。Ｔ２４３Ｎ変異体はまた形成されたＲ，Ｒモナチン％を劇的に増加させるさらなる有益性もまた提供した。この酵素は、アミノ基転移反応でＳ−ＭＰと比較してＲ−ＭＰに対する選好性を増加させる。Ｎ１００Ａ変異体は、文献に示唆されるように、単独でまたはＴ２４３Ｎとの組合せで活性を増加させなかった。タグなし４９７８ＤＡＴのＶ３４Ａ部位特異的変異体もまた、上記に記載されるように同様の方法を用いて作り出した。Ｖ３４Ａ部位特異的変異体は、試験した条件下で野生型酵素よりも有意に低い活性を有することがわかった。
【０４６３】
最初のアッセイにおける注目する他のポイントは、野生型酵素がＮ末端Ｈｉｓタグと共に生成された場合に、より活性を有するように考えられたことであった。続く突然変異誘発は、遺伝子のタグ付きバージョンで行った。さらに、最も有望な上記の変異体は、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ｂ中にサブクローニングした。これらは、Ｎｏｖａｇｅｎ  ＨＩＳ−結合カラムおよび推奨される緩衝液を用いるメーカーのプロトコール（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて精製した。溶出液画分の緩衝液は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＤ１０カラム（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、アッセイで用いた緩衝液に交換した。
【０４６４】
精製Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）および配列番号１０４の精製Ｒ特異的アルドラーゼ（５０μｇ／ｍｌ）を用いる１ｍｌアッセイは、緩やかに振盪させながら３０℃で進め、また１０．２ｍｇ  Ｄ−トリプトファン、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、２００ｍＭピルビン酸、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を含有した。二通りの試料は、２時間および一晩インキュベートした。ポジティブコントロールとして、バチルス・スファエリクスＤＡＴ（実施例１８でクローニング）を同じアッセイで用いた。結果を表３９に示す（ＦＤＡＡアッセイによって示されるＲ，Ｒ％は括弧中に示す）。
【０４６５】
【表３９】
2015211679.tif 000042
【０４６６】
上記のデータからＴ２４３Ｎ変異体が最も高い量のモナチンを２時間で明らかに生成することが分かる。時間が経過するにつれて、Ｂ．スファエリクスＤＡＴポジティブコントロールに対するＴ２４３Ｎ変異体の比は低下する。この結果は、Ｔ２４３Ｎ変異体が、モナチン反応の間にＢ．スファエリクスＤＡＴほど安定性ではないことを示唆する。同様の条件下でアッセイした場合、Ｔ２４３Ｓ（精製タグ付き）酵素は、Ｔ２４３Ｎ変異体に類似するレベルの活性を有した。しかしながら、生成されたＲ，Ｒパーセントモナチンはより低かった（２時間および一晩の双方で９７．２％）。Ｔ２４３Ｎ／Ｎ１００Ａ変異体はＴ２４３Ｎ変異体よりも低い活性を有した。しかしながら、Ｔ２４３ＳおよびＴ２４３Ｎ／Ｎ１００Ａの双方は野生型４９７８  ＤＡＴよりも高い活性を有した。
【０４６７】
アミノ基転移アッセイは、Ｂ．スファエリクスＤＡＴの代わりにＴ２４３Ｎ変異体を用いた場合に、どの反応速度が改善されたか決定するために行った。２分の１ｍＬアッセイは、３０℃で行い、１時間、２時間、および５時間の時点で測った。アッセイは、２５ｍＭモナチンまたはＤ−トリプトファン、２５ｍＭピルビン酸、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、５０μＭ  ＰＬＰ、および０．１ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（タグ付き、精製済み）を含有した。１００μｇ未満ＤＡＴを用いた場合、アラニンの量は、１００μｇのＤ−アミノトランスフェラーゼに標準化した。試料をギ酸を用いて処理し、副生成物であるアラニンの存在についてポストカラム蛍光検出を用いてＬＣによって分析した（実施例１に記載されるように）。結果を表４０および４１に示す。
【０４６８】
【表４０】
2015211679.tif 000043
【０４６９】
【表４１】
2015211679.tif 000044
【０４７０】
Ｄ−トリプトファン反応については、結果は、酵素のうちのいくつかが２時間で平衡に達したことを示す。Ｒ，Ｒモナチン反応は明らかに律速的であり、この活性に対する改善は、Ｄ−トリプトファンからのモナチン生成速度により多くの影響を及ぼす。
【０４７１】
さらなるアッセイは、Ｔ２４３Ｎ  ４９７８  ＤＡＴ変異体の安定性を調査するために行った。野生型酵素もまた長い間にわたって活性を失った。実施例６Ｃは、Ｔ２４３Ｎ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ変異体の安定性を改善するための方法を記載する。Ｔ２４３Ｎ変異体の新たに調製したタグなしおよびタグ付きバージョンを調整し、活性について比較すると、タグなしバージョンは、より優れた一時的な安定性を有し、タグなしバージョンを、全体として、モナチン生成反応で用いるための酵素のより優れたバージョンとしたことがわかった。
【０４７２】
４９７８  ＤＡＴのさらなる変異体は、当業者に一般に知られている方法によって作製した。しかしながら、これらの突然変異はすべて、それらが調製された条件下で不溶性であり、したがって活性についてアッセイすることができなかったタンパク質をもたらした。不溶性のタンパク質をもたらした突然変異は次の通りであった：
Ｓ１８０Ａ／Ｓ１８１Ａ／Ｓ１８２Ｒ；
Ｌ１５１Ｆ；
Ｖ３４Ｇ
Ｓ１８１Ｒ
Ａ１５３Ｒ／Ｓ１８１Ａ／Ｓ１８２Ａ；
Ａ１５３Ｒ／Ｓ１８２Ａ；
Ａ１５３Ｒ／Ｓ１８２Ｇ；
Ｓ１８０Ｒ／Ｓ１８１Ａ／Ｓ１８２Ｇ；
Ｓ１８０Ｒ／Ｓ１８１Ａ／Ｓ１８２Ａ；
Ｓ１８０Ｒ／Ｓ１８１Ｇ／Ｓ１８２Ｇ；
Ｓ１８０Ｇ／Ｓ１８１Ｒ／Ｓ１８２Ｇ；および
Ｓ１８０Ａ／Ｓ１８１Ｒ／Ｓ１８２Ａ。
【０４７３】
さらなる突然変異誘発
Ｆ２００Ｍ  ４９７８  ＤＡＴ変異体を作り出すために、実施例１５からの野生型４９７８  ＤＡＴオープンリーディングフレーム（タグ付き）は、プライマー７３および８０ならびにＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて増幅し、ｐＣＲＩＩ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングし、その配列を検証した（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。５’領域および３’領域は、プライマー８０および９６および９９および１０３をそれぞれ用いて増幅した（表４２）。次いで、増幅したＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲル精製した。それらを組み合わせ、プライマー８０および９９を用いてＰＣＲにさらにかけた（表４２）。増幅したＤＮＡは、上記に記載されるようにゲル精製し、ｐＣＲＩＩ  Ｂｌｕｎｔ中にクローニングし、その配列を検証した。ＤＡＴオープンリーディングフレームは、ｐＥＴ２８ｂ中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限消化物断片としてサブクローニングした。
【０４７４】
【表４２】
2015211679.tif 000045
【０４７５】
以下のプライマー（表４３）は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるさらなる部位特異的突然変異誘発のために設計した。突然変異誘発は、メーカーの指示に従って、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｇｅキットを用いて行った。突然変異誘発のために用いた鋳型は、実施例１５に記載されるｐＥＴ２８（タグ付き）４９７８  ＤＡＴ構築物とした。二重変異体もまた、鋳型としてＦ２００Ｙ変異体を用い、かつＴ２４３Ｎ（上記に挙げた）プライマーを用いた突然変異誘発のさらなるラウンドを行って作り出した。
【０４７６】
【表４３】
2015211679.tif 000046
【０４７７】
変異体コード領域はＤＮＡ配列決定（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）によって検証した。配列を検証したプラスミドはＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に形質転換した。
【０４７８】
発現およびアッセイ
５００ｍＬバッフル付きフラスコ中に、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを有する１００ｍＬ  ＬＢを含有する培養物に、１ｍＬ一晩培養物を接種し、約０．６の光学濃度（６００ｎｍ）まで３７℃で成長させた。タンパク質の生成は、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧによって誘発した。細胞は、ＩＰＴＧの追加後、４．５時間３０℃でインキュベートした。細胞は遠心分離し、−８０℃で凍結した。細胞は、破壊し（Ｎｏｖａｇｅｎ推奨のプロトコールに従って、１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ、５μＬ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ、および０．０３３μＬ／ｍＬ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅを含有するＮｏｖａｇｅｎ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬を用いて調製）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。変異体（１４１−ＬＲｃＤ−１４４→ＥＹｃＹ）および（２４３−ＴＳ−２４４→ＮＲ）はそれらが調製された条件下で不溶性のタンパク質をもたらした。変異体２４３−ＴＳ−２４４→ＮＫは、試験した条件下で数量化できる活性を有していなかった、また、おそらく、Ｓ２４４Ｋ変異体のように、野生型と比較して活性の弱い酵素である。
【０４７９】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質は以下のように精製した。ＨＩＳ−結合カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０μＭ  ＰＬＰを含有する１０ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８を用いて平衡化した。無細胞抽出物をカラムに装填した。カラムは、１０ｍＬの平衡化緩衝液、２５ｍＭイミダゾールを含有する１０ｍＬ平衡化緩衝液、および５０ｍＭイミダゾールを含有する１０ｍＬ平衡化緩衝液を用いて洗浄した。タンパク質は、５００ｍＭイミダゾールを含有する５ｍｌの平衡化緩衝液を用いて溶出した。タンパク質は、５０μＭ  ＰＬＰを含有する１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８中で平衡化したＰＤ１０カラムを用いて脱塩した。精製タンパク質は、濃縮し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量した。
【０４８０】
Ｄ−アミノトランスフェラーゼ変異体は、アッセイ条件として、５００μｇ／ｍＬのＤ−アミノトランスフェラーゼ、配列番号１０４の５０μｇ／ｍＬのアルドラーゼ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、および２０．４ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−トリプトファンを用いてアッセイした。最終容量は１．２５ｍＬとした。試料（２００μＬ）は、０．５、１、２、および１４時間後に取り、実験が完了するまで凍結した。試料は、濾過し、１対１０に希釈し、実施例１に記載されるようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０４８１】
実施例１６からの野生型４９７８  Ｄ−アミノトランスフェラーゼは相対的活性パーセントのための基準として用いた。表４４は、各時点での各変異体の相対的活性を示す。
【０４８２】
【表４４】
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【０４８３】
Ｔ２４３Ｎは、Ｒ，Ｒモナチンの生成における活性について試験したすべてのうちで最も優れた変異体であった。
【０４８４】
６Ｃ：株ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼのＴ２４３Ｎ変異体の安定化
実施例６Ｂに示されるように、Ｔ２４３Ｎ変異体ＤＡＴの初期活性はＢ．スファエリクスＤＡＴよりも有意に高いが、活性はより急速に減少する。下記に記載される嫌気性プロトコールを用いるさらなる実験は、Ｔ２４３Ｎ変異体ＤＡＴの初期活性はＢ．スファエリクスＤＡＴよりも８倍まで高かった、しかしながら活性は、嫌気条件下でさえ急速に減少したことを示した。以下の研究は、長期間のより高い活性の維持を試みるために行った。
【０４８５】
株４９７８に由来するＤ−アミノトランスフェラーゼのＴ２４３Ｎ変異体（実施例６Ｂに記載される）は、実施例２６に記載されるようにＨＩＳ６タグ付きとして精製した。配列番号１０４のアルドラーゼ（実施例３Ｂに記載される）およびＳ．メリロティＨＭＧアルドラーゼは、実施例２２および２７に記載されるようにＨＩＳ６タグ付きタンパク質として精製した。
【０４８６】
１４３ｍｇのＤ−トリプトファンを含有するコニカルポリプロピレンチューブ（１４ｍＬ）は、一晩、嫌気性グローブボックス中で脱酸素した。１Ｍ  ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．２）、２Ｍ  ＭｇＣｌ２、２Ｍピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ  ＰＬＰのストック溶液は、脱気水中で調製し、一晩、嫌気性グローブボックス中で平衡化した。１０％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、１％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１％（容量／容量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００％アセトン、１００％エタノール、および５０％（重量／容量）グリセロールのストック溶液は、２ｍＬ微量遠心チューブ中のトレハロース、イノシトール、ソルビトール、およびエリトリトールの各０．７ｇと共に、嫌気性グローブボックス中で平衡化した。精製酵素の調製物は氷上で解凍し、嫌気性グローブボックス中で直ちに用いた。最終濃度が１００ｍＭ  ＥＰＰＳ、２００ｍＭピルビン酸、１００ｍＭトリプトファン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、および０．０１ｍｇ／ｍＬの配列番号１０４のアルドラーゼまたは０．０５ｍｇ／ｍＬのＳ．メリロティＨＭＧアルドラーゼとなるように、ストック溶液を１４ｍＬコニカルチューブに追加した。チューブ当たり最終反応容量が７ｍＬとなるように、提唱された酵素安定化成分を種々の最終濃度で追加した（表４５および４６）。反応は、２４時間まで、緩やかに撹拌しながら嫌気性グローブボックス中で室温でインキュベートした。試料は定期的に取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング法を用いて、実施例１に記載されるようにモナチンについて分析した。初速度は、酵素の追加の後の０〜３時間の間に回収した試料から算出した。
【０４８７】
【表４５】
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【０４８８】
【表４６】
2015211679.tif 000049
【０４８９】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０のごとき０．０１％〜０．１％（容量／容量）界面活性剤またはグリセロール、トレハロース、イノシトール、もしくはソルビトールのごとき１％〜１０％（重量／容量）ポリオールの追加は、実験の継続時間にわたってＴ２４３Ｎ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼの安定性を改善した。
【実施例７】
【０４９０】
モナチンの生成における分岐鎖アミノトランスフェラーゼ（「ＢＣＡＴ」）の使用
ＡＴ−１０２およびＡＴ−１０４は、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社（パサデナ、ＣＡ）から購入した分岐鎖Ｌ−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．４２）である。酵素は、化学的に生成したＳ，ＳおよびＲ，Ｒモナチンの基質を用いて、アミノ基転移活性について試験した。反応は、０．５ｍＬの全容量で行い、二通り実行した。アッセイは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、０．０８ｍＭ  ＰＬＰ、１０ｍＭ  α−ケトグルタル酸（「α−ＫＧ」）、５ｍＭモナチン、および１ｍｇ／ｍＬアミノトランスフェラーゼ酵素を含有した。ネガティブコントロールは外来性アミノトランスフェラーゼ酵素を含有しなかった。試料は、１００ｒｐｍの振盪で３０℃で２時間インキュベートした。試料は濾過し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は、実施例１に記載のように、グルタミン酸レベルを確認するために実行した。グルタミン酸レベルは、ＭＰの生成と理論量的に関連するはずである。Ｒ，Ｒを反応基質として用いた場合、非常に低いレベルのグルタミン酸がネガティブコントロール中に存在した。ＡＴ−１０４は、ネガティブコントロールよりもわずかに多くのグルタミン酸を生成し、Ｒ，Ｒモナチン基質（Ｄ−アミノ酸）との低いレベルの活性を示した。双方の分岐鎖Ｌ−アミノトランスフェラーゼはＳ，Ｓモナチンに対して活性を示した。ＡＴ−１０２は１０２μｇ／ｍＬグルタミン酸を生成し、ＡＴ−１０４は６４μｇ／ｍＬグルタミン酸を生成した。比較については、広域特異性アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０１、同様にＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社からのもの）は、これらの条件下で７５μｇ／ｍＬを生成した。モナチンは、広域特異性アミノトランスフェラーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼに対する基質として通常役立つジカルボキシルアミノ酸および芳香族アミノ酸に対してより構造類似性を有するので、分岐鎖アミノトランスフェラーゼでの高活性はやや予想外である。しかしながら、モナチンのグルタミン酸主鎖により、アミノ供与体としてグルタミン酸を利用できる多くのアミノトランスフェラーゼもまたモナチンに対して活性を有する可能性がある。
【０４９１】
ＢＣＡＴを用いる、インドール−３−ピルビン酸からのモナチン生成
ＡＴ−１０２およびＡＴ−１０４は、Ｃ．テストステローニ（国際公開第０３０９１３９６Ａ２号に記載のように生成）からのＰｒｏＡアルドラーゼを用いる、共役反応におけるモナチンの生成について試験した。酵素および付加的な成分／基質を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、および０．１ｍＭ  ＰＬＰを含有したキット中に提供された反応緩衝液に直接的に追加した。１ｍＬの反応緩衝液に、以下のものを追加した：４ｍｇインドール−３−ピルビン酸、２０ｍｇピルビン酸、細胞抽出物中に提供される約５０μｇ  ＰｒｏＡ、１μＬ  ２Ｍ  ＭｇＣｌ２、および試験されることになる２ｍｇのアミノトランスフェラーゼ酵素。反応はすべて二通り行い、ネガティブコントロール反応は、付加的なアミノトランスフェラーゼを追加せずに行った。ポジティブコントロール（ＡＴ−１０１）は比較のために利用した。この酵素は広域特異性Ｌ−アミノトランスフェラーゼである。モナチンのバックグラウンド生成は、組換えＰｒｏＡ酵素の細胞性抽出物中に存在する天然のイー・コリアミノトランスフェラーゼによるものである。反応は、緩やかに振盪させながら（１００ｒｐｍ）、３０℃で一晩インキュベートした。試料は、実施例１に記載のように濾過し、逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。結果を下記の表４７に示す。
【０４９２】
【表４７】
2015211679.tif 000050
【０４９３】
ＡＴ−１０２およびＡＴ−１０４アミノトランスフェラーゼは、ネガティブコントロールよりも多くのモナチンを明らかに生成し、ポジティブコントロールの約５０〜６０％の活性であった。
【０４９４】
イー・コリから分岐鎖アミノトランスフェラーゼ酵素は十分に研究され、結晶構造は詳細に分析された。Ｏｋａｄａ，Ｋ．ら，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１２１：６３７−６４１，（１９９７）。酵素は、同様の全体の折りたたみおよび実施例２、３Ａ、および６Ａに言及されるもののごときバチルスＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素に対する著しい配列相同性を有する。さらに、ＢＣＡＴ酵素およびバチルスからのＤ−アミノトランスフェラーゼは、ＰＬＰに対する水素のｒｅ面追加についての立体特異性を示すたった２種類のＰＬＰ依存性のアミノトランスフェラーゼである。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：３８９７−３９００，（１９９３）。ＢＣＡＴは、アルファ−アミノ酸基質が、リン酸基と同一の側のそのカルボキシル基と結合し、酵素が、なおＬ−アミノ酸に対する特異性を保持しながら、Ｄ−アミノトランスフェラーゼに同様の折りたたみおよびメカニズムを有することを可能にする唯一の酵素であると考えられる。Ｐｅｉｓａｃｈ，Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：４９５８−４９６７，（１９９８）。ＢＣＡＴのＬ−特異性は、基質のアルファ−カルボキシル基を位置づける、Ｄ−アミノトランスフェラーゼの極性アミノ酸側鎖がＢＣＡＴにおいて無極性残基と交換されているといった事実から生じると考えられる。これらの残基のすべてまたはいくつかがバチルスＤ−アミノトランスフェラーゼの対応するアミノ酸に突然変異される場合、ＢＣＡＴをＤ特異的アミノトランスフェラーゼに変換できることが予想される。以下の突然変異は、イー・コリＢＣＡＴに対してなすことができる（受入番号ｇｉ：１４７１９４６３に基づいて番号付け）：Ｐｈｅ３７からＴｙｒ、Ｖａｌ１１０からＨｉｓ、Ｍｅｔ１０８からＡｒｇ。他の極性アミノ酸置換は、実施例６Ａに記載のように、大きなジカルボン酸基質を受容するよう酵素活性部位を調整するためにこれらの部位で同様になすことができる。Ｔｙｒ１６５は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼのＰＬＰ相互作用を模倣するために、同様にＬｅｕに変換される必要がある可能性があり、Ｔｙｒ９６（Ｐｈｅに）、Ａｒｇ４１、およびＡｒｇ９８もまたＢＣＡＴ酵素中での不正確な配向でのアルファカルボキシル基の結合を予防するために突然変異させる必要がある可能性がある。Ｔｒｐ１２７もまた、プロＳ立体配置中の疎水性側鎖結合の可能性を減少させるためにＴｙｒに突然変異させることができ、Ｔｙｒ３２およびＴｙｒ１３０は、ＢＣＡＴの活性部位中のＬ−グルタミン酸と相互作用する可能性があり、この相互作用を最小化するために負に荷電したアミノ酸に突然変異させることができる。Ｇｏｔｏ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：３７２５−３７３３，（２００３）；Ｏｋａｄａ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：７４５３−７４６３，（２００１）。
【０４９５】
Ｄ−アミノトランスフェラーゼ酵素および分岐鎖アミノトランスフェラーゼの双方がモナチンの生成において活性を有するので、ＢＣＡＴは、多くの実施例に記載される反応スキームにおいて利用するための他の潜在的なＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素を提供しながら、Ｒ，Ｒモナチン生成において活性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼに変換できることが予想される。上記の結果に基づいて、ＡＴ−１０４酵素は、モナチンのＤ−アミノ立体配置に対していくらかの活性を既に示している可能性がある。
【０４９６】
バチルス分岐鎖アミノトランスフェラーゼのクローニングおよび突然変異誘発
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、イー・コリ分岐鎖アミノトランスフェラーゼよりも、Ｄ−アミノトランスフェラーゼとより密接に関連する推定上の分岐鎖アミノトランスフェラーゼを含有する。それを、Ｄ−アミノ基転移活性についてアッセイし、イー・コリＢＣＡＴについて上記に言及した、予測された活性部位残基に基づいて突然変異誘発した。
【０４９７】
株
Ｂ．リケニホルミス（ＡＴＣＣ番号１４５８０）は、一晩３０℃で栄養寒天上で成長させた。コロニーのグループを１００μＬの滅菌水中に置き、細胞を破壊するために９５℃で１０分間加熱した。３μＬを、続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅において用いた。
【０４９８】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
プライマーは、ＮｃｏＩ部位ならびにＳａｌＩ部位を用いて、ｐＥＴ２８ｂベクターおよびｐＥＴ３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）ならびにｐＴＲＣ９９ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にクローニングするためにＢ．リケニホルミス遺伝子（９１５ｂｐ）について設計した。ｐＥＴ３０構築物はＮ末端ＨｉｓタグおよびＳタグを含有するが、ｐＥＴ２８構築物はタグ付きではない。
【０４９９】
Ｂ．リケニホルミスｂｃａｔプライマーは：
Ｎ末端5'-GGTTAAGGCCATGGGGGACCAGAAAGACCA-3'（配列番号４４）；およびＣ末端:5'-GGCCTTCCGTCGACTCAGCTGACACTTAAGCT-3'（配列番号４５）。
【０５００】
コード領域は、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬの反応中、３μＬ鋳型、１μＭの各プライマー、０．４ｍＭ  各ｄＮＴＰ、３．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、およびＭｇ入りの１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いた。用いたサーモサイクラープログラムは５分間９６℃でのホットスタートを含み、その後、以下の工程を３０回繰り返した：３０秒間９４℃、１分４５秒間５０℃、および２分１５秒間７２℃。３０サイクルの後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。正確なサイズのきれいなＰＣＲ産物を得た（約９００ｂｐ）。
【０５０１】
クローニング
ＰＣＲ生成物は、精製し、ＳａｌＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、ＭＡ）中でＳａｌＩおよびＮｃｏＩを用いて消化した。消化したベクター（ｐＥＴ２８、ｐＥＴ３０、およびｐＴＲＣ９９ａ）ならびに挿入断片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製した。ライゲーションは、Ｒｏｃｈｅ社製Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて行い、精製した。ライゲーションしたものは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社エレクトロポレーションマニュアルに記載のように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いてエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂに形質転換した。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３０分間、９００μＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた。細胞は、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製し、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するようであるプラスミドの配列は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社（ビバリー、ＭＡ）でジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。配列決定により、ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＵ２４４６８  ＧＩ：５２００４５２６に挙げられるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成する受入番号ＣＰ０００００２  ＧＩ５６１６０９８４  ２８５１２６８．．２８５０３５４に見られるコード配列を検証した。
【０５０２】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡ（ｐＥＴベクター）は、ｐＥＴベクター中の構築物のために、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中に形質転換した。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。誘発は、通常、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中で行った。細胞は、３７℃で０．４〜０．８のＯＤ６００まで成長させ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発し、誘発の３〜４時間後にサンプリングした。細胞抽出物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬付属のプロトコールに従って調製した（ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＲｏｃｈｅ社製完全プロテアーゼインヒビターカクテルを追加）。高いレベルの可溶性タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されるように、予測した分子量で得られた。細胞性抽出物中の可溶性タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【０５０３】
細胞抽出物は、以下のプロトコールを用いる、ピルビン酸（またはアルファ−ケトグルタル酸からのグルタミン酸）およびＤ−トリプトファンからの、次に続くアラニンの生成によるＤ−アミノトランスフェラーゼ活性について分析した。二通りの１ｍＬ反応は、通常、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５０μＭピリドキサールリン酸、２５ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン中で行った。反応は、無細胞抽出物または精製酵素の追加によって開始し、軽く振盪させながら３０℃で１５分間から一晩、インキュベートした。約同一のレベルのＤ−アミノトランスフェラーゼを比較の目的のために各アッセイ中に追加し（通常約０．５ｍｇ）、ＡＴ−１０３（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）は、ベンチマーク酵素として用いることが多かった。反応を停止するために、ギ酸を２パーセントの最終濃度まで追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。タンパク質を追加しないコントロール反応もまた行った。０の時点もまたネガティブコントロールとして用いた。アラニンおよびグルタミン酸は、実施例１に記載のように、ＯＰＡポストカラム誘導体化を用いて検出した。分岐鎖アミノトランスフェラーゼは、ＡＴ−１０３およびＢ．スファエリクス酵素と比較して低レベルのＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有した。
【０５０４】
分岐鎖アミノトランスフェラーゼは、さらに、Ｄ−トリプトファンからモナチンを生成する能力について試験した（実施例３Ａでのように）が、試験した条件下で活性を有するようではなかった。
【０５０５】
ｐＴＲＣ９９ａ構築物は、トリプトファン生成に対して栄養素要求性であるエレクトロコンピテント  イー・コリＣＡＧ１８４５５細胞中に形質転換した。細胞は、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−トリプトファン、０．４％グルコース、および塩化カルシウムと共にＢａｌｃｈのビタミンを有するＭ９最少培地中で成長させた。細胞は、Ｌ−トリプトファンなしで成長できなかった。誘発は、４．５時間の０．４のＯＤ６００で、１０、１００、および１０００μＭ  ＩＰＴＧで試験した。適正なＭＷのバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で認識可能であった。プラスミドは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて突然変異誘発した。メーカーによって記載のように、下記の表４８のプライマーを設計した。
【０５０６】
【表４８】
2015211679.tif 000051
【０５０７】
アミノ酸突然変異はイー・コリＢＣＡＴ結晶構造に基づくものとした、また上記の表の番号付けはイー・コリ  タンパク質についてのものとする。ＤＮＡ突然変異についての番号付けはＢ．リケニホルミスｂｃａｔ遺伝子に基づく。
【０５０８】
プライマーは、０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、約１００ｎｇの各オリゴヌクレオチドプライマーを５０μＬ突然変異誘発反応において通常用い、より大きなプライマーについては比例してより高い濃度のものを用いた。同一の鋳型領域に対するアニーリングで本質的に競合するオリゴヌクレオチドプライマーについては、時に、合計１００ｎｇをその領域におけるプライマーの全プールに用いた。２００ナノグラムの鋳型（ｐＴＲＣ９９ａ中のＢ．リケ  ｂｃａｔ）を、５μＬの１０×ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）緩衝液、２μＬ  ｄＮＴＰ、および２μＬの酵素ブレンドと共に反応に用いた。増幅産物は、３７℃で２時間、ＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）（２μＬ）を用いて処理し、エタノール沈殿のために厚壁１．５ｍＬチューブに移した。再懸濁した（濃縮した）反応ミックスを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）キットに含まれるＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐ細胞中に形質転換した（２．５μＬ）。数種のコロニーは、ミニプレップし、突然変異がランダムであることを確実にするためにおよび達成された突然変異誘発のレベルを評価するために配列決定した。コロニーは、平板から再懸濁し、大量にミニプレップを行った。次いで、ミニプレップＤＮＡは、トリプトファン栄養素要求株中に形質転換し、上記に記載される最少培地（ＩＰＴＧ有り）上でまたは唯一の窒素源としてＤ−トリプトファンを含有する最少培地を用いて平板培養した。第２および第３ラウンドの突然変異誘発は、先のラウンドで十分に組み込まれるようではないプライマーを用いて大量のミニプレップについて行った。各段階で、最少培地上で素早く成長したコロニー（より大きなコロニー）はさらなる分析のために保持した。下記の表４９に示す変異体は、選択平板から単離した。いくつかの場合では、これらの同一の変異体は、１回を超えて選択培地上に現われた。
【０５０９】
【表４９】
2015211679.tif 000052
【０５１０】
変異体構築物は、ＬＢ培地中で組換えタンパク質を作製するために誘発し、細胞抽出物は上記のように調製した。細胞抽出物中の可溶性タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．９８．０を用いて濃度および発現パーセントについて分析した。非常に低レベルの可溶性組換えタンパク質が観察され、従って、注目するバンドの定量化は可能ではなかった。アッセイは、５０〜２５０μＬの細胞性抽出物を用いて上記のようにＤ−トリプトファンアミノ基転移を試験するために行った。クローン４、６、２８、および３２は、アミノ受容体としてアルファ−ケトグルタル酸およびピルビン酸の双方を用いてアッセイし、３０℃で２時間および一晩インキュベートした。細胞性抽出物に存在するアラニン／グルタミン酸のバックグラウンドレベルは差し引いた。５−１および５−２を用いたアッセイについては、ＢＣＡＴについてＥｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアによって評価したタンパク質濃度は、野生型酵素については２７５．１ｎｇ／μｌ、ＢＣＡＴ  ５−１については４０９．３ｎｇ／μｌ、およびＢＣＡＴ  ５−２については１４８．２ｎｇ／μｌであった。アッセイの結果を下記の表５０〜５２に示す。
【０５１１】
【表５０】
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【０５１２】
【表５１】
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【０５１３】
【表５２】
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【０５１４】
大部分のＬ−アミノトランスフェラーゼと同様に、酵素が、アミノ受容体について、ピルビン酸と比較してアルファ−ケトグルタル酸に対して選好性を有することは明らかである。野生型の親のように、すべての変異体はＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有した。細胞性抽出物からのＢＣＡＴタンパク質の正確な定量化が可能ではなかったので、野生型酵素が多かれ少なかれＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を有したかどうかは明らかではない。しかしながら、変異体酵素は、野生型よりもＬ−アミノトランスフェラーゼ活性が少ないことが予想され、従って、Ｌ−アミノ基転移速度に対するＤ−の比は改善されている。突然変異誘発の継続により、モナチンへの経路における代替酵素を提供できる。
【実施例８】
【０５１５】
グルタミン酸ラセマーゼおよびアスパラギン酸ラセマーゼのクローニング、発現、および試験
本実施例は、Ｌ−グルタミン酸およびＤ−グルタミン酸（またはＬ−およびＤ−アスパラギン酸またはＬ−およびＤ−アラニン）の間で相互変換するために用いることができるアミノ酸ラセマーゼ酵素をクローニングし、試験するために用いる方法を記載する。グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼ、またはアラニンラセマーゼは、経路における工程がＬ−アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、またはＬ−アラニン）を生成し、経路の他の工程がＤ−アミノ酸（例えば、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸、またはＤ−アラニン）を消費する場合、Ｒ，Ｒモナチンを生成するための生合成経路に有用である。図４は、Ｌ−トリプトファン特異的アミノトランスフェラーゼ、Ｒ特異的アルドラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、およびグルタミン酸（またはアスパラギン酸またはアラニン）ラセマーゼを用いる、Ｌ−トリプトファンからＲ，Ｒモナチンを生成するための生合成経路を示す。
【０５１６】
タグなしタンパク質および切断可能なＮ末端ＨＩＳ６−タグ／Ｔ７−タグを有する融合タンパク質の双方を生成するために、遺伝子は、ｐＥＴ２８ベクターおよびｐＥＴ３０ベクター中にクローニングした。結果として生じたタンパク質は、固定金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【０５１７】
実験概要
ラクトバチルス・ブレビス（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｄ２９６２７、核酸配列）およびペディオコッカス・ペントサセウス（ｍｕｒＩ遺伝子）（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ２２７８９）からのグルタミン酸ラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．３）をコードする遺伝子は、イー・コリ中でクローニングし、発現させた：その抽出物は、Ｄ−グルタミン酸へのＬ−グルタミン酸の変換およびＬ−グルタミン酸へのＤ−グルタミン酸の変換における活性について試験した。ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製アスパラギン酸ラセマーゼ酵素（ＥＣ５．１．１．１３）もまたＬ−およびＤ−アスパラギン酸の間の相互転換について試験した。
【０５１８】
クローニングためのゲノムＤＮＡの単離
Ｌ．ブレビスゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ８２８７Ｄ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。Ｐ．ペントサセウス（ＡＴＣＣ２５７４５）は、ラクトバチルスＭＲＳブロス中で３７℃で成長させ、２ｍｌは、Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．，「Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ」，Ｃｅｌｌ  ３５：２５３−２６３，（１９８３）の方法を用いるゲノムＤＮＡ単離に用いた。
【０５１９】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
プライマーは、ｐＥＴ２８ベクターおよびｐＥＴ３０ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中にクローニングするために５’制限部位およびオーバーハングを用いて設計した。
【０５２０】
Ｌ．ブレビスグルタミン酸ラセマーゼプライマー：
Ｎ末端:5'-GCGGCGCCATGGAAAATGATCCGATTGGTCTAATG-3'（配列番号１５）、および
Ｃ末端:5'-GCGGCGGTCGACGCAATTACAATTGTGTTTGTC-3'（配列番号１６）。
【０５２１】
Ｐ．ペントサセウスグルタミン酸ラセマーゼプライマー：
Ｎ末端:5'-GCGGCGCCATGGATGTATGTATAATTTTATTTAG-3'（配列番号１７）、および
Ｃ末端:5'-GCGGCGGTCGACAAATTTCATTATTCATTCTAATTT-3'（配列番号１８）。
【０５２２】
Ｌ．ブレビスに由来する遺伝子は、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬ反応中、０．１５０μｇ鋳型、１．６μＭの各プライマー、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、２．８Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、０．５Ｕ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）、およびＭｇ入りの１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を用いた。用いたサーモサイクラープログラムは３分間９６℃でのホットスタートを含み、以下の工程を８回繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間５２℃、および２分間７２℃、その後、以下の工程を２２回繰り返した：３０秒間９４℃、４５秒間６０℃、および２分間７２℃。２２サイクルの後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールは、ＤＮＡサイズマーカーに対する比較により判断されるように、約８３０ｂｐの産物を生成した。
【０５２３】
Ｐ．ペントサセウスに由来する遺伝子は、以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬ反応中、０．１５μｇ鋳型、１．６μＭの各プライマー、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、２．８Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）ポリメラーゼ、０．５Ｕ  Ｐｆｕポリメラーゼ、およびＭｇ入りの１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を用いた。用いたサーモサイクラープログラムは３分間９６℃でのホットスタートを含み、その後、以下の工程を８回繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間３７℃、および２分間７２℃、その後、以下の工程を８回繰り返し：３０秒間９４℃、４５秒間４５℃、および２分間７２℃、その後、以下の工程を１４回繰り返した：３０秒間９４℃、４５秒間５５℃、および２分間７２℃。１４回繰り返した後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールは、ＤＮＡサイズマーカーに対する比較により判断されるように、約８４０ｂｐの産物を生成した。
【０５２４】
クローニング
ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ社製ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。ＰＣＲ産物は、ＳｍａｒｔＳｐｅｃ  ３０００（商標）分光光度計を用いて定量した。産物は、メーカー推奨のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、ＭＡ）に従って制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎ社製ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。ベクターｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０は、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた消化によって調製し、その後、エビアルカリフォスファターゼを用いる処理およびＱｉａｇｅｎ社製ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いる０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからの精製が続いた。
【０５２５】
消化したベクターおよび挿入断片は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いてライゲーションした。約５０ｎｇの処理した挿入断片、１００ｎｇの処理したベクター（ベクターに対する挿入断片の３対１のモル比）、５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒａｐｉｄ（商標）ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに含まれる）、および１×ライゲーション緩衝液を、室温で５分間インキュベートした。ライゲーション反応物は、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて精製し、イー・コリＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）を形質転換するために用いた。１０μｌの各ライゲーション反応に、４０μｌのＤＨ１０Ｂ細胞を追加し、以下の条件下でＢｉｏＲａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩを用いてエレクトロポレーションによって形質転換した：０．２ｃｍキュベット中２．５ｋＶ、２５μＦ、２００オーム。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間、１ｍＬの室温ＳＯＣ中で回復させた。細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ平板上で平板培養した。
【０５２６】
プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するようであるプラスミドの配列は、ジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０５２７】
遺伝子発現およびアッセイ
配列分析によって検証したプラスミドＤＮＡは、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中にサブクローニングした。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。
【０５２８】
ＢＬ２１（ＤＥ３）中での誘発は、ｐＥＴ２８（タグなし）ベクターおよびｐＥＴ３０（ヒスチジンタグ付き）ベクターの双方におけるＬ．ブレビスおよびＰ．ペントサセウスのグルタミン酸ラセマーゼで最初に行った。時間的経過研究は、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有する２５０ｍＬ  ＬＢ中で０．５〜０．６のＯＤ６００まで成長させた培養物を用いて行い、１００ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発し、誘発後、０および３時間にサンプリングした。６００μＬ（０時間）および２７５μＬ（３時間）からの細胞は、２−メルカプトエタノールを含有する４０μＬドデシル硫酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、１０分間９５℃で加熱し、冷却した。これらの全細胞タンパク質試料のアリコートを、４〜１５％勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５２９】
細胞抽出物は、さらに、０．６２５μＬベンゾナーゼヌクレアーゼおよび３μＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、サンディエゴ、ＣＡ）を含有する０．６２５ｍＬ  Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中の５ｍＬの培養物からの細胞ペレットを緩やかに振盪させながら２０分間室温で懸濁させることによってならびに細胞片を除去するために１６，０００×ｇで遠心分離することによって３時間培養物から調製した。上清（細胞抽出物）は、細胞可溶性タンパク質の分析のために４〜１５％勾配ゲル上に装填した。
【０５３０】
クローニングしたＬ．ブレビスグルタミン酸ラセマーゼおよびＰ．ペントサセウスグルタミン酸ラセマーゼからの３時間試料は、正確なサイズ（約３１ｋＤａ）に相当する全可溶性タンパク質を示した。Ｌ．ブレビスｐＥＴ３０（ヒスチジンタグ付き）遺伝子産物は、両ベクター中のＰ．ペントサセウス遺伝子産物と同様に、Ｌ．ブレビスｐＥＴ２８（タグなし）遺伝子産物よりも高レベルで過剰発現し、さらにより可溶性であった（＞２０％の可溶性タンパク質）。Ｐ．ペントサセウス遺伝子産物は、ｐＥＴ２８ベクターおよびｐＥＴ３０ベクターにおいて同等の過剰発現および可溶性を示し、Ｌ．ブレビスｐＥＴ３０遺伝子産物で観察されたものよりも著しく低かった。
【０５３１】
誘発した培養物（２５０ｍＬ）からの細胞は、遠心分離し、０．８５％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。細胞ペレットは、５μＬ／ｍＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、サンディエゴ、ＣＡ）および１μＬ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼを含有する５ｍＬ／湿細胞重量ｇのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）試薬中に再懸濁させた。試料は、オービタルシェーカー上で２０分間室温でインキュベートした。不溶性細胞片は、４℃２０分間１６，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。
【０５３２】
細胞抽出物は以下のプロトコールを用いて、グルタミン酸ラセマーゼ活性についてアッセイした。４００μＬ反応は、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）、および１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸またはＤ−グルタミン酸中で行った。反応は、２０〜１００μＬの無細胞抽出物の追加によって開始し、室温でインキュベートした。試料のアリコートは、１分間、５分間、１０分間、２０分間、および１時間の時間的経過の間に取った（０分間の試料はコントロール反応として取り扱った）。２Ｍギ酸（２５μＬ）は、反応を停止させるために各４０μＬ試料のアリコートに追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。実施例１に記載のように、上清は、取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析するまで−８０℃で凍結させた。
【０５３３】
１００ｍＭ  ＩＰＴＧ（３時間）を用いたｐＥＴ３０誘発からの細胞抽出物からのアッセイ結果は、Ｌ．ブレビス（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＡＡ０６１０６．１  ＧＩ：４６８４５０）およびＰ．ペントサセウス（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＡ１６７６１．１  ＧＩ：３４９０２９）の酵素が両グルタミン酸異性体に対して著しいレベルのラセマーゼ活性を有することを実証する。Ｐ．ペントサセウスラセマーゼ（２０μＬの細胞抽出物）は、いずれかの基質から始めて、１０〜２０分間でＬ−およびＤ−グルタミン酸の間で平衡に達した。Ｌ．ブレビス酵素（２０μＬの細胞抽出物）もまた約２０分間で平衡に達した。
【０５３４】
ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社（パサデナ、ＣＡ）から購入した部分的に精製したアスパラギン酸ラセマーゼ酵素（カタログ＃ＡＳＰＲ−１０１）は、上記のプロトコールに類似するプロトコールを用いて、Ｌ−アスパラギン酸およびＤ−アスパラギン酸に対する活性についてアッセイした。市販の酵素は、両異性体に対してラセマーゼ活性を示した。０．５〜１ｍｇの酵素を用いて、平衡は２０〜６０分間で達成された。
【０５３５】
すべての３つのラセマーゼ（Ｌ．ブレビスグルタミン酸ラセマーゼ、Ｐ．ペントサセウスグルタミン酸ラセマーゼ、およびＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製アスパラギン酸ラセマーゼ）はまた、以下のプロトコールを用いたＳ，Ｓモナチンに対する活性についてもアッセイした。４００μＬ反応は、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  Ｓ，Ｓモナチン中で行った。反応は、無細胞抽出物（Ｌ．ブレビスおよびＰ．ペントサセウス）または精製酵素（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製アスパラギン酸ラセマーゼ）の追加によって開始し、室温でインキュベートした。アリコートの試料は、１分間、５分間、１０分間、２０分間、および１時間の時間的経過の間に取った（０分間の試料は、酵素なしの試料と同様にコントロール反応として取り扱った）。２Ｍギ酸（２５μＬ）は、反応を停止させるために各４０〜μＬ試料のアリコートに追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。上清は、取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析するまで−８０℃で凍結させた（実施例１）。Ｓ，Ｓモナチン濃度の減少は、長い間にわたって示されず、Ｓ，Ｒモナチンのいかなる増加もなかった（酵素なしのコントロールでさえ、＜５％混入副生成物として最初に存在）。従って、アッセイしたラセマーゼのどれも、モナチンに対する活性を示さなかった。
【実施例９】
【０５３６】
アラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、またはアスパラギン酸ラセマーゼを用いる、Ｌ−トリプトファンからのＲ，Ｒモナチンの生成
本実施例は、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−チロシンまたは芳香族）アミノトランスフェラーゼ、ＰｒｏＡアルドラーゼ、アラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、またはアスパラギン酸ラセマーゼ、および広域特異性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いて、Ｌ−トリプトファンから立体異性的に豊富なＲ，Ｒモナチンを生成する方法を記載する。図５は経路を示す図である。立体異性的に豊富なＲ，Ｒモナチンの生成へのこのアプローチは、モナチン前駆体（ＭＰ）からのモナチンの生成において低い活性を有する、工程１の酵素を必要とする。前の結果に基づき、発明者らは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例１に記載されるシノリゾビウム・メリロティおよびロドバクター・スフェロイデスのｔａｔＡ遺伝子産物を用いた。
【０５３７】
材料および方法
Ｌ．ブレビスおよびＰ．ペントサセウスからのグルタミン酸ラセマーゼは、実施例８に記載のようにイー・コリ中で生成した。いくつかの場合では、これらの酵素のＨｉｓ６−タグ付きバージョンは、メーカーのプロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）に従ってＨｉｓ−Ｂｉｎｄ９００カートリッジを用いて精製し、ＰＤ−１０カラム（Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、脱塩し、イミダゾールを除去した。酵素は、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０中に溶出した。アスパラギン酸ラセマーゼ（ＡＳＰＲ−１０１）およびＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０３）はＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社から購入し、アラニンラセマーゼはシグマ社（セントルイス、ＭＯ）（カタログ番号Ａ８９３６）から購入した。Ｓ．メリロティおよびＲ．スフェロイデスのチロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例１に記載のように調製した。コマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼは国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例４に記載のように調製した。全タンパク質アッセイは、メーカーのプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｒａｄ社製タンパク質アッセイ（ヘラクレス、ＣＡ）を利用して行った。
【０５３８】
ラセマーゼを用いて生成されたＳ，Ｓモナチンの量の低下
反応混合物（１ｍＬ容量、二通り実行）は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸ナトリウム、またはオキサロ酢酸塩、細胞抽出物において供給された約２８０μｇ／ｍＬ  Ｓ．メリロティＴａｔＡ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０３）、１００μＬ／ｍＬのグルタミン酸ラセマーゼ細胞抽出物または１ｍｇ／ｍＬアスパラギン酸ラセマーゼ、および細胞抽出物として提供された約１００μｇ／ｍＬのＰｒｏＡアルドラーゼを含有した。固体トリプトファンは１０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で追加した。ネガティブコントロールはラセマーゼを含有しなかった。試料は、１時間、２時間、または一晩３０℃（２５０ｒｐｍで振盪しながら）でインキュベートした。試料は、沈澱物を除去するために遠心分離し、シリンジで濾過し、実施例１に記載されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いる、モナチンについての分析前に−８０℃で保存した。
【０５３９】
大部分の試料は、細胞抽出物中に存在する天然のＬ−アミノトランスフェラーゼの量のために、＞９５％のＳ，Ｓモナチンを含有した。しかしながら、ラセマーゼを含有した試料は、Ｌ−グルタミン酸をＭＰのアミノ基転移にそれほど利用可能でなくしてしまったラセマーゼ酵素の結果として、全モナチンの量が低下した。ラセマーゼなしでは、１５４５〜２３５５ｐｐｍのモナチン（圧倒的にＳ，Ｓ）が時間的経過の間に生成された。ラセマーゼが存在しても、３４０〜８７９ｐｐｍ（Ｌ．ブレビス酵素）、４４４〜５３１ｐｐｍ（Ｐ．ペントサセウス酵素）、および５０６〜１４６０ｐｐｍモナチン（アスパラギン酸ラセマーゼ）が生成されたにすぎなかった。これらのデータは、ラセマーゼがモナチンを生成するのに必要な反応条件において活性であることを示す。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのごとき細胞抽出物酵素からのＳ，Ｓモナチンの形成を最小化するために、さらなる実験を、精製酵素およびＬ−アミノトランスフェラーゼ酵素に対するより高い比のＤ−アミノトランスフェラーゼを用いて行った。
【０５４０】
モナチンの４−Ｒ含有異性体へのＬ−トリプトファンの変換
上記実験は、約５４μｇの精製Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（Ｓ．メリロティまたはＲ．スフェロイデスのＴａｔＡのいずれか）、１ｍｇアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）、１ｍｇＤ−アミノトランスフェラーゼ、アミノ受容体としての５ｍＭオキサロ酢酸塩、および７５μｇ精製アルドラーゼを用いて繰り返した。反応は、２時間のサンプリング時間および一晩のインキュベーション期間で二通り実行した。ネガティブコントロールは、ラセマーゼを用いず、Ｓ．メリロティ  Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いて行った。逆相クロマトグラフィーに基づくＲ，Ｒ／Ｓ，ＳおよびＳ，Ｒ／Ｒ，Ｓモナチンピーク定量化の定量化に加えて、各立体異性体の百分率は、実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化技術を用いて決定した。結果を下記の表５３に示す。
【０５４１】
【表５３】
2015211679.tif 000056
【０５４２】
明らかに、ラセマーゼの存在は、Ｓ．メリロティＴａｔＡをＬ−トリプトファンアミノ基転移のための酵素として用いた場合、生成されたモナチンの全量を増加させた。モナチンレベルは、２時間のアッセイで平均６．４から１６．５ｐｐｍに、一晩のアッセイで平均４１から７３ｐｐｍに増加した。さらに、形成されたＲ，Ｒのパーセントは、ラセマーゼ酵素を利用することにより約１％から５８％までも増加した。他の強力な甘味料である、モナチンのＳ，Ｒ立体異性体は、他方の主成分であり、ネガティブコントロールでほぼ０から３１％に増加した。Ｒ．スフェロイデスＴａｔＡは、明らかに、Ｓ．メリロティＬ−トランスアミナーゼよりもＳ−ＭＰに対するより大きな活性を有し、モナチンの４−Ｒ異性体が所望の生成物である場合、ＭＰと比較して、Ｌ−トリプトファンに対する高基質特異性を有する酵素を有することの重要性が実証された。２時間の時点で全モナチンの約１０％が４Ｓであるので、Ｓ．メリロティＴａｔＡはＭＰに対する制限された活性を有すると考えることができる。
【０５４３】
実験は、精製Ｓ．メリロティＴａｔＡ（５４μｇ）およびＬ．ブレビスグルタミン酸ラセマーゼを用いて繰り返した。精製グルタミン酸ラセマーゼを用いた場合、１ｍＬ反応当たり約６４μｇを用いた。グルタミン酸ラセマーゼを含有する細胞抽出物もまた試験し、１．４ｍｇの可溶性タンパク質を用いた。ラセマーゼなしのネガティブコントロールをもう一度利用し、試料はすべて二通り実行した。結果を下記の表５４に示す。
【０５４４】
【表５４】
2015211679.tif 000057
【０５４５】
さらに、ラセマーゼの追加が、Ｓ，Ｓモナチンと比較してモナチンの４Ｒ含有異性体の相対量を増加させるのみならず、Ｌ−トリプトファンから生成される全モナチンを増加させることは明らかである。精製アルドラーゼ、ラセマーゼ、およびＬ−アミノトランスフェラーゼの使用は、所望の立体異性体形成をコントロールするための能力を非常に改善する。Ｄアミノトランスフェラーゼに対するＬアミノトランスフェラーゼの比もまた、最終生成物の立体化学的性質操作するための方法である。
【０５４６】
実施例２における表１および２に示される結果を上記条件に類似する反応条件を用いた結果と比較すると、約７〜２９ｐｐｍのモナチンがインドール−３−ピルビン酸から形成され、また、形成されたＲ，Ｒモナチンの百分率は約５１〜９０％であったことが理解できる。アスパラギン酸ラセマーゼの使用は、１６〜７８ｐｐｍモナチンまで、生成されたモナチンの全量を増加させ、Ｒ，Ｒ％は約４０〜５８％であった。さらに、より安定性でかつそれほど高価ではない原料（Ｌ−トリプトファン）を利用した。実施例３Ａでは、約７３ｐｐｍモナチンは、Ｒ，Ｒ：Ｓ，Ｒの比が約１．７：１でＤ−トリプトファンから生成された。４Ｒ異性体の全量は、全モナチンの＞８０％であった。Ｒ，Ｒ−モナチンおよびＲ，Ｓ−モナチンの双方は強力な甘味料（スクロースよりも＞１０００倍甘い）であるので、高価なＤ−アミノ酸基質を必要とすることなくこれらの異性体を豊富にする能力は重大である。
【０５４７】
非特異的またはＲ特異的アルドラーゼの有用性は、形成されるＲ，Ｒモナチンの百分率を増加させるのみならず、反応速度を増加すると考えられることが予想される。実施例５を参照されたい。これらのアッセイに用いられるＣ．テストステローニからのＰｒｏＡアルドラーゼは、圧倒的に、開裂分裂反応についてＳ−立体配置の基質に好都合であることが報告されているが、このＰｒｏＡアルドラーゼは明らかにＲ−ＭＰを生成する。従って、Ｒ−立体配置のＭＰをより優先的に生成するアルドラーゼは、さらに大きな百分率のＲ，Ｒモナチン生成するのを助け得る。さらに、モナチン生成に対する活性がさらに低いＬ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼを発見することによっても、形成されるＳ，ＳおよびＲ，Ｓモナチンの量を減少させると考えられることが予想される。結論として、改善は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ酵素に対してなすことができるまたはＲ−ＭＰに対してＳ−ＭＰに対する基質特異性の増加を有すると考えられる代替Ｄ−アミノトランスフェラーゼ酵素を用いることができる。これはまた、非常に所望される場合、Ｒ，Ｒ生成物の形成を増加させると考えられる。
【０５４８】
アスパラギン酸ラセマーゼ実験は、配列番号２２のＲ−選択的アルドラーゼの活性をＣ．テストステローニからのＰｒｏＡアルドラーゼの活性と比較するために繰り返した。約５０μｇの精製Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（Ｓ．メリロティ  ＴａｔＡ）、１ｍｇアスパラギン酸ラセマーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）、１ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０３、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）、アミノ受容体としての５ｍＭオキサロ酢酸、および５０μｇの適切な精製アルドラーゼ。反応は二通り実行し、３０℃で一晩インキュベートした。各立体異性体の百分率は、実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化技術を用いて決定した。結果を表５５において下記に示す。
【０５４９】
【表５５】
2015211679.tif 000058
【０５５０】
異性体のＣ．テストステローニＰｒｏＡ分布は、前の上記の実験と一致しているが、配列番号２２のＲ−選択的アルドラーゼを用いる場合、Ｒ，Ｒパーセントははるかに高く、検出不可能な量のＳ，Ｓが形成され、Ｓ，Ｒモナチンの量はより低い。
【０５５１】
実施例２および３Ａに記載のように、Ｄ−アラニンは、モナチンへのＭＰのアミノ基転移のためのアミノ供与体として役立ち得る。多くのＬ−アミノトランスフェラーゼは、アミノ受容体としてある程度までピルビン酸を利用し、かつＬ−アラニンを生成する能力を有する。上述の反応は高濃度のピルビン酸を用いるので、ピルビン酸のうちのいくらかはおそらくＬ−アラニンに変換される。例えば、Ｌ−トリプトファンのアミノ基転移の間に、実施例６Ａに記載されるＨｅｘＡｓｐＣ酵素は、アルファ−ケトグルタル酸が不在の場合に、２時間で、１０〜１８％のピルビン酸（５０〜２００ｍＭ初期濃度）をＬ−アラニンに変換することがわかった。両アミノ受容体が高濃度（＞５０ｍＭ）で存在する場合、酵素は、アルファ−ケトグルタル酸に対する１０倍の選好性を示した。ＡｓｐＣ（国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号に記載される）もまた、ピルビン酸からいくらかのＬ−アラニンを生成した。従って、上記の反応において、アルファ−ケトグルタル酸またはオキサロ酢酸塩の追加を省略し、グルタミン酸ラセマーゼまたはアスパラギン酸ラセマーゼの代わりにアラニンラセマーゼ（ＥＣ５．１．１．１）を利用できることが予想された。
【０５５２】
アラニンラセマーゼ酵素は、ブルセラ・アボルタスおよびストレプトコッカス・フェカリスにおいて最初に同定された。Ｍａｒｒ，ＡＧ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４９：４２４−４３３，（１９５４）；Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ａ．およびＧｕｎｓａｌｕｓ，Ｉ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９０：４０３−４１６，（１９５１）。サルモネラ・チフィリウムにおけるｄａｄＢ遺伝子は、アラニンラセマーゼ活性の源として同定され、数百種の相同体はゲノミクスデータベース中に見出すことができる。アラニンラセマーゼ活性の他の知られている源は、エシェリキア・コリ、バチルス・スブチリス、シュードモナス・エルジノーサ、ビブリオ・コレレ、シゾサッカロミセス・ポンベ、およびバチルス・セレウスである。担子菌類のキノコ、シイタケもまた活性の広いアラニンラセマーゼを含有する。バチルス・ステアロサーモフィルスからの耐熱性相同体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（カタログ＃Ａ８９３６）からの購入で入手可能であり、商業的応用のために固定化された。Ｉｎａｇａｋｉ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３２６８（１９８６）。
【０５５３】
アラニンラセマーゼを用いたモナチン生成
モナチン生成は、Ｃ．テストステローニからのＰｒｏＡアルドラーゼを用いて試験した。約５０μｇの精製Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（Ｓ．メリロティ  ＴａｔＡ）、１ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−１０３、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）、アミノ受容体としてのピルビン酸、５０μｇ精製アルドラーゼ、およびシグマ社（セントルイス、ＭＯ）から購入した７０μｇアラニンラセマーゼ（カタログ番号Ａ８９３６）。反応は二通り実行し、一晩インキュベートした。各立体異性体の百分率は、実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化技術を用いて決定した。ラセマーゼのないコントロールを含んだ。結果を下記の表５６に示す。
【０５５４】
【表５６】
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【０５５５】
アラニンラセマーゼなしの試料と比較して、アラニンラセマーゼが存在した場合、１時間の時点で３倍多いＲ，Ｒモナチンがあった。この結果は、アラニンラセマーゼを用いてＲ，Ｒモナチンを生成する可能性のあることを示す。生成されるＲ，Ｒモナチンの百分率は、Ｒ−モナチン前駆体を選択的に生成するアルドラーゼ、Ｒ−モナチン前駆体に対して働かないまたは制限された活性を有するＬ−アミノトランスフェラーゼ、およびインドール−３−ピルビン酸に対して働かないまたは制限された活性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼを用いて改善できる。
【実施例１０】
【０５５６】
Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ）
図３に示されるように、立体反転アミノトランスフェラーゼは、モナチンの生成のための生合成経路で有用である。例えば、Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼまたはその変異体は、アミノ供与体としてＬ−グルタミン酸を用いてＲ−ＭＰからＲ，Ｒモナチンを生成できる。
【０５５７】
（１）オリゴヌクレオチドプライマーからのＰ．スタッツェリ４Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼのＰＣＲ合成
本実施例は、アミノ供与体としてＬ−グルタミン酸を用いて、Ｒモナチン前駆体をＲ，Ｒモナチンに変換するために用いることができる立体反転酵素である４Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼを合成するために用いられる方法を記載する。
【０５５８】
プライマー設計
シュードモナス・スタッツェリ４Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（４Ｄ−ＨＰＧ  ＡＴ）についての公開配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３１９９３５、核酸配列；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＱ８２９０、タンパク質配列）をＰＣＲプライマー設計のための鋳型として用いた。あるいは、シュードモナス・プチダ（ＣＡＤ４２４５０（タンパク質）、ＡＸ４６７２１１（ヌクレオチド））からの４−Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼを配列鋳型として用いる。合計３４個の順方向プライマーおよび３５個の逆方向プライマーを設計した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、４０塩基長であり、２０個のオーバーラップ塩基対を共有した。さらに、２つの外部プライマーは、ｐＥＴ２８ベクターおよびｐＥＴ３０ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中にクローニングするために５’制限部位およびオーバーハングを用いて設計した。
【０５５９】
Ｐ．スタッツェリ４Ｄ−ＨＰＧ  ＡＴの外部プライマー：Ｎ末（ＮｄｅＩ部位を有する）：
5'-GGCCGGCATATGTCGATCCTTAACGACTACAAACGT-3'（配列番号１９）、およびＣ末端（ＸｈｏＩ部位を有する）：
5'-GGAAGGCTCGAGTCATGATTGGTTTCCAGACAAATT-3'（配列番号２０）。
【０５６０】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
Ｐ．スタッツェリからの遺伝子配列は、以下のプロトコールを用いて増幅した。一次１００μＬ  ＰＣＲ反応は、０．０５μＭのそれぞれの６９個の内部プライマー、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  ｒＴｔｈ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＸＬ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、０．６２５Ｕ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）、１×ＸＬ緩衝液、および１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含んだ。用いられるサーモサイクラープログラムは、３分間９４℃でのホットスタートを含み、以下の工程を１５回繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間４２℃、および１５秒間６８℃、その後、以下の工程を１０回繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、および３０秒間６８℃、その後、以下の工程を１０回繰り返した：３０秒間９４℃、３０秒間６０℃、および１分１５秒間６８℃。最終の１０サイクルの後、試料は、７分間６８℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールは、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲル上で約０．５ｋｂに産物のスメアを生成した。
【０５６１】
二次ＰＣＲ反応物は、鋳型として一次ＰＣＲ反応物を用いて設定した。二次１００μＬ  ＰＣＲ反応は、２．５μＬの一次ＰＣＲ反応物、０．５μＭのそれぞれの２個の外部プライマー（ＮｄｅＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位を有する）、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０Ｕ  ｒＴｔｈ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＸＬ、０．６２５Ｕ  Ｐｆｕポリメラーゼ、１×ＸＬ緩衝液、および１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含んだ。用いたサーモサイクラープログラムは３分間９４℃でのホットスタートを含み、以下の工程を１０回繰り返し：３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、および１分３０秒間６８℃、その後、以下の工程を１５回繰り返した：３０秒間９４℃、３０秒間６０℃、および１分３０秒間６８℃。１５回繰り返した後、試料は、７分間６８℃で維持し、次いで、４℃で保存した。このＰＣＲプロトコールにより、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲル上で約１．４ｋｂに特有の産物バンドが生成された。
【０５６２】
ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ社製ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。産物は、ＴＯＰＯクローニングし、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）に従ってＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて、結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するようであるプラスミドの配列は、汎発性のＭ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを用いてジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。配列決定した１０個のクローンのうち、すべてが所望の配列からの少なくとも１つの突然変異を有した。最も優れたクローンは、アミノ酸変化をもたらした単一の塩基対突然変異を有した。このクローンの配列は、メーカーの推奨（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓプロトコールを用いて補正した。
【０５６３】
補正したＴＯＰＯクローンは、メーカー推奨のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、ＭＡ）に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎ社製ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて、０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。ベクターｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０は、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いた消化により調製し、その後、エビアルカリフォスファターゼを用いる処理およびＱｉａｇｅｎ社製ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いる０．８％ＴＡＥ−アガロースゲルからの精製が続いた。
【０５６４】
消化したベクターおよび挿入断片は、ＮＥＢ社製Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ビバリー、ＭＡ）を用いてライゲーションした。約５０ｎｇの処理した挿入断片、１００ｎｇの処理したベクター（ベクターに対する挿入断片の３対１のモル比）、５ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および１×ライゲーション緩衝液を室温で５分間インキュベートした。ライゲーション混合物は、ＴＯＰ１０Ｆ’化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に形質転換した。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間、０．２５ｍＬの室温ＳＯＣ中で回復させた。細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて、結果として生じた形質転換体から精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。
【０５６５】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中に形質転換した。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。
【０５６６】
ＢＬ２１（ＤＥ３）中での誘発は、ｐＥＴ２８ベクター（ヒスチジンタグ付き）およびｐＥＴ３０（タグなし）ベクターの双方においてＰ．スタッツェリＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼを用いて行った。時間的経過研究は、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有する２５０ｍＬ  ＬＢ中で０．５〜０．６のＯＤ６００まで成長させた培養物を用いて行い、１００ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を用いて誘発し、誘発後、０および３時間にサンプリングした。０時間および３時間からの適切な容量の細胞は、２−メルカプトエタノールを含有する４０μＬドデシル硫酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、１０分間９５℃で加熱し、冷却した。これらの全細胞タンパク質試料のアリコートを、４〜１５％勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０５６７】
細胞抽出物は、さらに、０．６２５μＬベンゾナーゼヌクレアーゼおよび３μＬプロテアーゼインヒビターカクテルセット＃３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、サンディエゴ、ＣＡ）を含有する０．６２５ｍＬ  Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中の５ｍＬの培養物からの細胞ペレットを緩やかに振盪させながら２０分間室温で懸濁させることによってならびに細胞片を除去するために１６，０００×ｇで遠心分離することによって３時間培養物から調製した。上清（細胞抽出物）は、細胞可溶性タンパク質の分析のために４〜１５％勾配ゲル上に装填した。タンパク質は、認められる場合、メーカーのプロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）に従ってＨｉｓ−Ｂｉｎｄ９００カートリッジを用いて精製し、ＰＤ−１０カラム（Ｇ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、脱塩し、イミダゾールを除去した。
【０５６８】
（２）Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（ＤＰＧＡＴ）を有する生物の単離
立体反転Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ（Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）を有するシュードモナス属および同様な属の生物は、以下の様式で単離する。土壌試料は、以下の培地を有するペトリ皿上でインキュベートする：（１リットル当たり）１５ｇ寒天、３．４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、３．５５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ酵母抽出物、１ｍｌ  １０００×微量元素溶液（Ｂａｌｃｈ，Ｗ．Ｅ．ら，「Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ：ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒｏｕｐ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０−２９６，（１９７９））、および１ｇ  Ｄ−フェニルグリシン（Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシン）。
【０５６９】
単離物は、立体反転アミノトランスフェラーゼ（プライマーは、知られているＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼから設計）の存在についてＰＣＲにより試験するまたは立体反転アミノトランスフェラーゼの存在について以下のようにさらに豊富にする：平板培養物からの単離物は、約１．０のＯＤ６００まで、振盪させながら、３０℃で、寒天なしの上記の液体培地中で成長できた。細胞は遠心分離により採取し、０．８５％ＮａＣｌを用いて２回洗浄する。１０ｍｇ（湿量）試料は、１ｍｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および５ｍＭ  Ｄ−フェニルグリシンまたはＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシン中に懸濁させる。中和した１５ｍＭ（アミノオキシ）酢酸は、上記に記載のように調製した試料を２倍にするために追加する。Ｄ−フェニルグリシン（またはＤ−４−ヒドロキシグリシン）の消費量をＨＰＬＣにより測定する。
【０５７０】
Ｄ−フェニルグリシン（またはＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシン）を分解できるが、（アミノオキシ）酢酸の存在下では分解する速度がより遅い単離物を、さらなる分析のために選択する。単離物は、立体反転アミノトランスフェラーゼ（プライマーは、知られているＤ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼから設計）の存在についてＰＣＲにより試験する。
【０５７１】
立体反転アミノトランスフェラーゼの存在は、上記に記載のように液体培地中で培養物を成長させ、細胞を採取し、無細胞粗抽出物（ＣＦＥ）を作製し、Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼまたはＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ酵素活性について試験することにより確認する。ＣＦＥは、以下の最終濃度を有する反応混合物に追加する：０．１Ｍ  ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（「ＣＡＰＳ」）（ｐＨ９．５）、６０ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム塩）、５ｍＭベンゾイルフォルメート（ｂｅｎｚｏｙｌ  ｆｏｒｍａｔｅ）または４−ヒドロキシベンゾエート、および５０μＭ  ＰＬＰ。
【０５７２】
逆反応は、以下の濃度を有する反応混合物にＣＦＥを追加することにより測定する：５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、６０ｍＭ  Ｄ−フェニルグリシン（またはＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシン）、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、および５０μＭ  ＰＬＰ。アッセイは、３５℃でインキュベートし、アリコートを複数の時点で取り、２分間煮沸することにより停止させる。生成物は、Ｇｉｌ−Ａｖ，Ｅ．ら，「Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０２：５１１５−５１１７  （１９８０）のＨＬＰＣ法によってまたはグルタミン酸形成の測定に向けられた実施例１に記載される方法によって定量されることとなる。
【０５７３】
ＰＣＲベースの方法の代わりとして、立体反転Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼは、硫安分画を含めた従来のタンパク質精製技術および従来のカラムクロマトグラフイーによって単離細菌から精製する。タンパク質が合理的な程度まで精製されると、ペプチドマイクロシークエンシング技術または従来のＥｄｏｍａｎ型アミノ酸配列が利用される（この種の作業に用いられるプロトコールおよび設備の記載についてはｈｔｔｐ：／／ｇｏｌｇｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ／を参照されたい）。縮重プライマーを、最も近い知られている類縁のタンパク質源から入手可能な配列に基づき設計する。次いで、縮重ＰＣＲおよびゲノムウォーキングを、立体反転Ｄ−フェニルグリシンアミノトランスフェラーゼコード配列を単離するために確立されたプロトコールに従って行う。
【０５７４】
（３）ＤＰＧＡＴモナチン生成
上記の（１）および（２）に記載されるＤ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼは粗無細胞タンパク質抽出物において用いるまたは上記の（１）に記載のように精製する。Ｓ．メリロティおよびＲ．スフェロイデスのチロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例１に記載のように調製する。コマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼは国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例４に記載のように調製する。全タンパク質アッセイは、メーカーのプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを利用して行う（ヘラクレス、ＣＡ）。
【０５７５】
反応混合物（１ｍＬ容量、二通り実行）は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸ナトリウム、細胞抽出物において供給された約２８０μｇ／ｍＬ  Ｓ．メリロティＴａｔＡ、１００μＬ／ｍＬのＤ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ細胞抽出物または１ｍｇ／ｍＬ精製Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼ、および細胞抽出物として提供された約１００μｇ／ｍＬのＰｒｏＡアルドラーゼを含有した。固体トリプトファンは１０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で追加する。ネガティブコントロールはＤ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼなしで設定する。試料は、約１時間または一晩、緩やかに振盪させながら３０℃でインキュベートする。試料は、沈澱物を除去するために遠心分離し、シリンジで濾過し、実施例１に記載されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いる、モナチンについての分析前に−８０℃で保存する。
【０５７６】
モナチン生成に対する改善された活性を有するＤ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼは、突然変異誘発性ＰＣＲ、突然変異誘発性株による継代、部位特異的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲを含めた、当業者に知られている突然変異誘発技術を用いてまたはＤＮＡシャフリングもしくは他の進化分子工学技術のごとき方法によって作製する。改善されたＤ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼは、窒素の源としてＲ，Ｒ−モナチンを有する最少培地上での成長によって選択する。最初、選択は成長に基づくが、改善されたアミノトランスフェラーゼが選択されると、スクリーニングは成長速度に基づく。すなわち、遺伝子の突然変異バージョンを有する細胞は成長し、遺伝子は、窒素源としてＲ，Ｒ−モナチンを有する最少培地中で発現する。遺伝子の突然変異バージョンを有する細胞の成長速度は、未突然変異バージョンと比較する。より速い成長速度を有するそれらの細胞を選択し、アミノトランスフェラーゼをさらに分析する。所望の活性が得られるまで、Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼをさらに突然変異誘発させてもよい。
【０５７７】
（４）ＤＰＧＡＴアッセイ
ＤＰＧＡＴのＨｉｓタグなしバージョンは、上記の（１）に記載のように発現させ、抽出物はアッセイに用いた。アッセイを設定した、またアッセイは、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０、６０ｍＭ  Ｄ−フェニルグリシン、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、および５０μＭピリドキサール−５’−リン酸を含んだ。アッセイは、アッセイ容量の１ｍｌ当たりに、本実施例において上記に記載のように調製した１００μＬの抽出物を追加することにより開始した。試料は、数回の時点（０、１、２、５、１０、３０、６０、および１２０分）で取り、等容量の２Ｍギ酸を用いて停止した。試料はまた、一晩のインキュベーション（約１２００分）の後にも取った。試料は、実施例１に記載されるＬＣ／ポストカラム蛍光検出（ＯＰＡ）法によってグルタミン酸生成について分析した。結果を下記の表５７に要約する。
【０５７８】
【表５７】
2015211679.tif 000060
【０５７９】
酵素は、Ｄ−フェニルグリシンに対するいくらかの活性を明らかに有する。酵素活性はまた、Ｒ，Ｒモナチンについても試験した。アッセイは上記に記載のように設定し、Ｒ，Ｒモナチンは６０ｍＭの濃度で含まれた。結果を表５８において下記に示す。
【０５８０】
【表５８】
2015211679.tif 000061
【０５８１】
Ｒ，Ｒモナチンに対する検出可能ないかなる活性もあるようではなかった。しかしながら、本実施例の第（３）部に記載されるランダムまたはＳＤＭ法は、Ｒ，ＲモナチンまたはＲ−ＭＰに対するアミノ基転移活性を改善するために利用できることが予想される。例えば、Ｐ．スタッツェリ酵素の結晶化および予備分析が行われた。Ｋｏｎｇｓａｅｒｅｅ，Ｐ．ら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５９：９５３−９５４，（２００３）。構造が公開されると、立体障害またはイオン反発性により、Ｒ，ＲモナチンがＤ−ヒドロキシフェニルグリシン基質結合部位に結合することを妨げる可能性がある場所を決定するためにドッキング実験をＡｃｃｅｌｒｙｓのごときソフトウェアを用いて行うことができる。Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンは、Ｒ，Ｒモナチンのようにやや大きなアミノ酸である。両化合物は疎水性領域およびヒドロキシル基を有する。ジカルボン酸基質に対して酵素をより適用できるようにするために実施例６Ａに記載のように改変を結合ポケットに対して行うことができる。例えば、第２のカルボキシル基の近くの残基はアルギニンのごとき塩基に改変してもよい。さらに、第（１）部に記載されるＰ．プチダ遺伝子および第（２）部に記載のように単離されてもよい付加的な遺伝子は鋳型として遺伝子シャフリングに用いることができる。さらに、本実施例で構築されたＰ．スタッツェリ遺伝子は、オリゴヌクレオチドシャフリングまたは他のランダム突然変異誘発法を用いて突然変異誘発し、上記（３）に記載のようにスクリーニングできる。
【実施例１１】
【０５８２】
Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子の発見
背景
Ｄ−メチオニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．４１）は、まれであるが、立体反転トランスアミナーゼの他の例であると考えられる。この酵素は、Ｌ−アラニンおよび４−メチルチオ−２−オキソブタノエートへのＤ−メチオニンおよびピルビン酸の可逆的な変換を触媒する。オキサロ酢酸、フェニルピルビン酸、２−オキソ酪酸、２−オキソ吉草酸、２−オキソヘプタン酸、グリオキシレート、およびオキソグルタル酸もまたアミノ受容体として役立ち得る。
【０５８３】
ＤまたはＬメチオニンのアミノ基転移は、土壌微生物（エシェリキア・コリ、シュードモナス・ピシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｉ）、シュードモナス・エルジノーサ、バチルス・ミコイデス、アシネトバクター・カルコアセティカス、エロモナス・ハイドロフィラＢ１２Ｅ、リゾビウム・トリフォーリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）Ｎ２Ｐ７、ペニシリウム・ディジタータム、サッカロマイセス・セレビシエ、コリネバクテリウムＤ７Ｆ）と同様に、高等植物（カリフラワー、トマト、リンゴ、エンドウ茎、バナナ、ピーナッツ）におけるエチレン生成への経路の一部であると考えられる。Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１８２：８２７−８３６，（１９７８）。細菌では、Ｌ−メチオニンは、エチレン生成研究における基質として通常用い、イー・コリからのＴｙｒＢまたはＡｓｐＣのごとき広域特異性酵素は、アミノ基転移を担うと考えられる。しかしながら、Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：１５９−６５，（１９７６）およびＰｒｉｍｒｏｓｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９８：５１９−５２８，（１９７７）は、イー・コリ株ＳＰＡ  Ｏ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｒｗｉｃｋ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が、バッチ培養法において、Ｌ−メチオニンからのエチレンとほとんど同じ量のエチレンをＤ−メチオニンから生成したことを示した。広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼはイー・コリにおいて同定されていないので、可能性のある１つの説明として、イー・コリＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ｄａｄＡ遺伝子によってコードされる）は、Ｄ−メチオニンを４−メチルチオ−２−オキソブタノエートに変換する、とすることができる。メチオニンラセマーゼがイー・コリにある可能性もある、しかしながら上記の酵素は文献に記載されていない。
【０５８４】
イー・コリとは対照的に、カリフラワー小花（ミトコンドリア抽出調製物）および発芽ピーナッツ種子では、エチレンの生成は、Ｌ−メチオニンおよびピルビン酸と比較して、Ｄ−メチオニンおよびピルビン酸を酵素抽出物に供給した場合に、より高かった。Ｍａｐｓｏｎ，Ｌ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１１５：６５３−６６１，（１９６９）；Ｄｕｒｈａｍ，Ｊ．Ｉ．ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：２１２３−２１２６，（１９７３）。従って、メチオニンラセマーゼおよびＬ−アミノトランスフェラーゼの組合せの可能性は、そのデータによって支持されない。デヒドロゲナーゼ活性は、カリフラワーの細胞抽出物の透析により除外し、ＮＡＤはアッセイ混合物中に存在しなかった。酸素の消費量が示されなかったようにオキシダーゼ活性は除外し、ＦＡＤの必要性はなかった。ピーナッツ組織からのＤ−メチオニンアミノトランスフェラーゼは、精製し、ＰＬＰに依存性であることを示し、Ｌ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ活性に非依存性であることを示した。これらのＤ−メチオニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼが副生成物としてＤ−アラニンを実際に生成する可能性があり（実施例２および３Ａに記載されるバチルス酵素に類似する）、また細胞が、Ｄ−アラニンを再利用して、Ｌ−アラニン（または類似のアミノ供与体）に戻すアラニンラセマーゼを含有する可能性がある。いずれの場合も、高等植物からの広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発見は、Ｒ，ＲモナチンまたはＳ，Ｒモナチンを生成するプロセスの開発に有利である。
【０５８５】
実験概要
Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼは、標準的なクロマトグラフィープロトコールおよびＰｈａｒｍａｃｉａ社製ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムを用いて、カリフラワー小花および発芽ピーナッツ胚から部分的に精製する。相同タンパク質のタンパク質配列は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳフィンガープリント技術およびＨａｒｖａｒｄ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ機関によって行われるデータベース検索により決定する。植物遺伝子のコード領域は、実施例１０（１）に記載のように、標準的なＰＣＲプロトコールを用いることによってまたは遺伝子の合成によってｃＤＮＡライブラリーからクローニングする。
【０５８６】
あるいは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、Ｄ−メチオニン存在下で成長させた（かつエチレンを生成する）カリフラワー組織またはピーナッツ種子から構築する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）。ライブラリーは、株ＲＣ５１９またはＡＢ１９３１のごとき、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（エール）からのイー・コリメチオニン栄養素要求株中に形質転換する。Ｄ−メチオニンを含有する最少培地上で成長が可能な株のプラスミドは、注目するコード領域を含有する（実施例４Ａ（１）、類似のスクリーニング技術を参照されたい）。
【０５８７】
注目するコード領域を得、標準的なイー・コリ実験株中で発現させると、結果として生じた遺伝子産物は、ｐＨが７．５（アミノトランスフェラーゼに対する至適ｐＨ）であることを除いて、Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシンアミノトランスフェラーゼの代わりに実施例１０（３）に記載のようにＲ，Ｒモナチンを生成するためにアッセイにおいて用いることができる。Ｄ−メチオニンアミノトランスフェラーゼがＤ−アミノ酸供与体基質に対して絶対的な必要性を有する場合、酵素は、実施例２および３に記載のようにＲ，Ｒモナチンを作製するために用いることができる。遺伝子は、実施例１０（３）に記載のように突然変異誘発させ、増加した活性についてスクリーニングできる。
【０５８８】
方法
カリフラワーからの単離
４００グラムの新たに摘んだカリフラワー小花は、浸漬およびブレンダーを用いる混合を交互にすることによって、４００ｍＬの４℃スクロース／緩衝液（０．４Ｍスクロースおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４）を用いて抽出する。細胞片は、チーズクロスを用いて濾過により取り出し、結果として生じた溶液は４℃で３０分間４０，０００×ｇで遠心分離する。固体材料（ミトコンドリア細胞器官を含有する）は、２０ｍＬ  １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中に再懸濁させ、酵素は、２００ｍＬ冷（−３０℃）アセトンを用いて抽出する。懸濁液は再遠心分離し、沈澱物は、Ｓａｖａｎｔ社製Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃを用いて乾燥させる。固体材料は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中に溶かし、残りのアセトンは、ＰＤ−１０カラムを用いて除去する。
【０５８９】
アミノトランスフェラーゼ活性は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の５ｍＭ  Ｄ−メチオニン、１ｍＭピルビン酸、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いた酵素調製物のインキュベーションによりアッセイする。アッセイは１６時間２５℃で行う。４−メチルチオ−２−オキソブタノエートは、実施例１に記載されるＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚは３２８）および同様の方法を用いて、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体の形成によって測定する。２Ｍ硫酸中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンの０．４％（重量／容量）溶液を調製し、容量の半分をインキュベーション後にアッセイ混合物に追加する。混合物は、３０分間３０℃で緩やかに振盪させながら混合し、沈澱物を遠心分離により収集し、ＬＣ／ＭＳによって分析する。標準的なクロマトグラフィー技術によって分離したタンパク質画分は同様の様式で活性についてアッセイするが、副産物アラニンは、実施例１に記載されるＯＰＡポストカラム誘導体化技術によって測定する。
【０５９０】
ピーナッツ（アラキス・ヒポゲアＬ．品種Ｓｔａｒｒ）からの単離
発芽ピーナッツ胚ホモジネート（子葉なし）からのＤ−メチオニンアミノトランスフェラーゼ酵素は、Ｄｕｒｈａｍ，Ｊ．Ｉ．ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：２１２３−２１２６，（１９７３）の方法に従って精製する。還元剤は、酵素を安定化するために粗抽出物の調製の間に用い、細胞片は、３３，０００×ｇでの遠心分離によって取り出す。３５〜５０％硫安画分は、低温でのインキュベーションおよび沈澱物中のタンパク質の除去によってさらに精製する。上清は、アセトンを用いてさらに分画する。次いで、活性プールは、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００、Ｇ．Ｅ．  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）によってさらに精製する。
【０５９１】
タンパク質画分がトランスアミナーゼタンパク質で豊富になるので、マイクロシークエンシングのために注目する酵素を分離するために２次元ゲル電気泳動を利用する。ＮＣＢＩに委託された植物配列の相同コード領域の解明の後に、標準的な分子生物学技術を用いてエシェリキア・コリ中でＤ−アミノトランスフェラーゼタンパク質を組換えで生成する。カリフラワー小花もしくはピーナッツ種子からの細胞抽出物または組換えで生成した相同酵素は、実施例１０（３）（立体反転トランスアミナーゼの場合）または実施例２および３Ａ（広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼの場合）に記載のように、Ｒ，Ｒモナチンの生成において用いることができることが予想される。
【実施例１２】
【０５９２】
Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼ／アラニンラセマーゼ／Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ
図８は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｌ−芳香族アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アラニン−アミノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−トリプトファン−アミノトランスフェラーゼのごとき）、Ｒ特異的アルドラーゼ、アラニンラセマーゼ、ならびにＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼを用いて、Ｌ−トリプトファンから立体異性的に豊富なＲ，Ｒモナチンを生成するための生合成経路を示す。
【０５９３】
トリプトファン特異的アミノトランスフェラーゼは実施例６Ａに記載される。あるいは、Ｓ．メリロティおよびＲ．スフェロイデスのチロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼは、国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例１に記載のように調製する。コマモナス・テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼは国際公開第０３／０９１３９６Ａ２号の実施例４に記載のように調製する。全タンパク質アッセイは、メーカーのプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを利用して行う（ヘラクレス、ＣＡ）。アラニンラセマーゼは、Ｓｉｇｍａ社（セントルイス、ＭＯ）（カタログ番号Ａ８９３６）から購入する。Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼは、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社（カタログ番号ＡＴ−１０３）（パサデナ、ＣＡ）から購入する。
【０５９４】
Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼは、真核生物、細菌、および古細菌に広く分布する。以下の生物は、Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２）を含有するとして同定された（配列相同性に基づく）：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アシュビア・ゴシピイ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、アゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ラッタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、タチフグ・ルブリペス（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびゼア・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）。さらに、多くのアミノトランスフェラーゼが低レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有し、高いレベルのＬ−グルタミン酸およびピルビン酸を与えると、それをＬ−アラニンおよびα−ケトグルタル酸に変換できる。活性が低い酵素は、エラープローンＰＣＲおよび突然変異誘発性株による継代のごとき標準的な突然変異誘発技術を用いてまたは進化分子工学��術によって改善される。Ｌ−アラニンアミノトランスフェラーゼの遺伝子は、プライマーを設計するための公的に入手可能な配列を用いてかつ標準的技術を用いてクローニングし、遺伝子／酵素を増幅し、クローニングし、発現させ、かつ精製する。
【０５９５】
反応混合物（１ｍＬ容量、二通り実行）は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸ナトリウム、細胞抽出物において供給された約２８０μｇ／ｍＬ  Ｓ．メリロティＴａｔＡ（または他のＬ−トリプトファン特異的アミノトランスフェラーゼ）（実施例４Ａ（５）、１００μｇのＬ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、１００μＬ／ｍｌのアラニンラセマーゼ細胞抽出物または１ｍｇ／ｍＬ精製アラニンラセマーゼ（Ｓｉｇｍａ社）、細胞抽出物において供給された約２８０μｇ／ｍＬ  広域特異性Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（実施例１５および１８はこの反応で働くことができるＤ−アミノトランスフェラーゼの例を有する）、および細胞抽出物として提供された約１００μｇ／ｍＬのＰｒｏＡアルドラーゼを含有する。固体トリプトファンは１０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で追加する。ネガティブコントロールはアラニンラセマーゼなしで設定する。試料は、約１時間または一晩、緩やかに振盪させながら３０℃でインキュベートする。試料は、沈澱物を除去するために遠心分離し、シリンジで濾過し、実施例１に記載されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いる、モナチンについての分析前に−８０℃で保存する。
【実施例１３】
【０５９６】
酵素反応混合物からのＲ，Ｒ−モナチンの精製
生成物、Ｒ，Ｒ−モナチンは以下の反応混合物から精製した。０．３３リットル中、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．２、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭピリドキサールリン酸（「ＰＬＰ」）、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファンを、トリプトファンが溶けるまで５００ｍＬガラスボトル中で室温で混合した。液体に数分間窒素を流し、次いで３．０ｍｇ／ｍＬ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ社製（パサデナ、ＣＡ）広範囲Ｄ−トランスアミナーゼ（カタログ＃ＡＴ−１０３）および配列番号２２の０．１ｍｇ／ｍＬ精製アルドラーゼを追加した。反応混合物は室温で緩やかに撹拌した。アルドラーゼは、実施例３Ａに記載のように精製した。５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファンの付加的なアリコートを、混合物を最初に調製した１５時間および２２時間後に固体として追加した。ヘッドスペースに各追加の後に窒素を流した。追加したトリプトファンのすべてが溶けたわけではなかったが、濃度は約５０ｍＭに維持した。４０時間後、残りの固体トリプトファンを濾過した。ポストカラム蛍光検出液体クロマトグラフィーによる反応混合物の分析（実施例１を参照されたい）は、溶液中のトリプトファンの濃度が４９ｍＭであり、モナチンの濃度が３．９ｍＭであったことを示した。
【０５９７】
生成物モナチンは、２つのイオン交換クロマトグラフィー工程を利用して精製した。濾過した反応溶液は、ＢｉｏＲａｄ社製ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（１４０ｍＬ；１．７ｍｅｑ／ｍＬの結合能力）のカラムに最初にかけた。カラムは２×１５０ｍＬ  Ｈ２Ｏを用いて洗浄し、次いで、１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（１×４５０ｍＬ、その後３×１５０ｍＬ）を用いて溶出した。ＮＨ４ＯＨ画分を組み合わせ、ＨＣｌを用いて中和し、Ｗｈａｔｍａｎ社製（メードストン、英国）ガラスマイクロファイバーフィルターおよびＧｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製（アナーバー、ＭＩ）０．４５μｍをフィルターを通して続けて濾過した。次いで、浄化溶液は、ＹＭ１００（ＭＷＣＯ  １００ｋＤａ）を用いて、Ａｍｉｃｏｎ社製限外濾過撹拌セル（モデル８２００）（ミリポア社；ビレリカ、ＭＡ）を用いて限外濾過した。限外濾過からの濾液は、微温湯槽を用いてロトエバポレーター（ｒｏｔｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を用いて、約１６０ｍＬまで蒸発させた。液体は、ガラスマイクロファイバーフィルターを通して濾過することによりさらに浄化した。
【０５９８】
結果として生じた溶液は、０．５Ｌ  １Ｍ  ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ、および１．０Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．３を用いて洗浄することにより、その後Ｈ２Ｏを用いてさらに洗浄することにより、先に炭酸水素塩形態に変換した１Ｌ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）カラムにかけた。溶液は＜２ｍＬ／分で装填し、カラムは２８０ｎｍの吸光度が＜１となるまで３〜４ｍＬ／分で水を用いて洗浄した。Ｒ，Ｒ−モナチンは、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．３（２．５Ｌ）を用いて溶出した。この画分は、微温湯槽を用いてロトエバポレーターを用いて蒸発させた。結果として生じたシロップは、結晶が形成されるまで、数日間４℃でインキュベートした。結晶を収集し、低温の１００％エタノールを用いて洗浄し、真空乾燥器中で乾燥させた（０．３８ｇ）。
【０５９９】
ＦＤＡＡ誘導体化、その後にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリングを用いる異性体純度についての固体生成物の分析（実施例１を参照されたい）は、試料が９６．３％Ｒ，Ｒモナチンおよび３．７％Ｓ，Ｒ−モナチンであったことを示した。
【０６００】
試料は、さらに、全モナチン法を用いて、他の有機化合物に関する純度について分析した（実施例１を参照されたい）。ＵＶ吸光度は、フォトダイオードアレイ検出器を用いて２００〜５００ｎｍでスキャンした。積分ピーク面積に基づくと、モナチンは面積の９６．１％を占めた（Ｒ，ＲおよびＳ，Ｒピークの双方を含む）。
【０６０１】
ポストカラム蛍光検出液体クロマトグラフィーによる試料の分析は、試料のアミノ酸組成が９８．８％モナチンであり、極微量がトリプトファン（１．２％）およびアラニン（０．０２％）であったことを示した。
【０６０２】
元素分析はＭｉｄｗｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ，ＬＬＣ社（インディアナポリス、ＩＮ）で行った。この分析は、試料が、重量で１％不燃性（無機）物質およびアンモニウムおよび炭酸水素残渣を含有することを示した。
【実施例１４】
【０６０３】
精製中のＤ−アミノトランスフェラーゼ活性保持の改善
Ｂ．スファエリクスＨＩＳ６−Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼの精製のための標準的手順
ＢＬ２１（ＤＥ３）：：Ｂ．スファエリクス  ｄａｔ  ｐＥＴ３０ａの新鮮な培養平板（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを有するＬＢ寒天）から開始して、細胞は、３〜５時間、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有する５ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（「ＬＢ」）中で成長した。続いて、培養物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ溶液１〜６（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、マディソン、ＷＩ）に加えて５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するフラスコ中に０．２５％（容量／容量）で移した。細胞は、一晩（１６〜１８時間）、３７℃および２２５ｒｐｍで成長させた。ＯＤ６００が約８．０となると、細胞は、１０分間１０，０００ｒｐｍでＪＳ−１６．２５回転子を有するＢｅｃｋｍａｎ社製（フラートン、ＣＡ）Ｊ２５ＩＩ遠心分離機中で遠心分離によって採取した。細胞ペレットは、低温の５０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて洗浄し、細胞をさらに遠心分離した。洗浄した細胞ペレットは、採取し、直ちに用いたまたは精製に必要とされるまで−８０℃で凍結させた。
【０６０４】
Ｂ．スファエリクスＨＩＳ６−Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＨＩＳ６−ＢｓｐｈＤＡＴ）タンパク質を含有する無細胞抽出物を調製するために、細胞は、３〜４倍容量の５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．２中で懸濁させ、次いで、１５℃未満に懸濁液の温度を維持して、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製ホモジナイザー（ニュートン、ＭＡ）（２０，０００ｐｓｉで３パス）を用いて破壊した。続く精製工程はすべて４℃で行った。細胞抽出物は、細胞片を除去するために１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清はデカントし、直ちに用いたまたは−８０℃で凍結させた。アリコートの無細胞抽出物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＨＩＳ−Ｂｉｎｄカラム（カタログ＃７０９７１−４）または２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．２を用いて先に平衡化したＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ニッケル（ＩＩ）形態）（ピスカタウェイ、ＮＪ）（１．２〜１．５容量／容量の比）のカラムのいずれかにかけた。試料を装填した後に、カラムは、３〜５倍容量の平衡化緩衝液、２５ｍＭイミダゾールを含有する３〜５倍容量の平衡化緩衝液、５０または１００ｍＭイミダゾールを含有する３〜５倍容量の平衡化緩衝液、および５００ｍＭイミダゾールを含有する３〜５倍容量の平衡化緩衝液を用いて続けて洗浄し／溶出した。ＨＩＳ６−ＢｓｐｈＤＡＴタンパク質は最後の洗浄で溶出した。５００ｍＭイミダゾール洗浄物は、Ａｍｉｃｏｎ社製Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−７０またはＵｌｔｒａ−１５遠心濾過デバイス（ＭＷＣＯ  ５〜１０ｋＤａ）（ビレリカ、ＭＡ）を用いて２〜１０×に濃縮した。イミダゾールおよび塩化ナトリウムは、５０μＭ  ＰＬＰを含有する５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．２を用いて先に平衡化した、使い捨てのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＰＤ１０脱塩カラムを通過させることによって除去した。
【０６０５】
脱塩溶液のタンパク質濃度はＰｉｅｒｃｅ社製ＢＣＡアッセイキット（ロックフォード、ＩＬ）を用いて決定した。各画分の純度および無細胞抽出物画分中の発現のレベルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｐｒｏ２６０マイクロキャピラリーチップシステム（ヘラクレス、ＣＡ）を用いてまたは４〜１５％の勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。通常、この手順は、Ｅｘｐｅｒｉｏｎソフトウェアで判断されるように約９０％純粋である３００ｍｇを超える酵素を生成する（６００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩ培養物から）。アリコート（１〜５ｍＬ）の精製酵素は使用まで−８０℃で保存した。
【０６０６】
手順の改善
無細胞抽出物は、上記に記載のように調製した。Ｈｉｓ６−ＢｓｐｈＤＡＴタンパク質は、以下の変化を加えて同様に精製した：細胞破壊およびタンパク質精製に用いた緩衝液はすべて、５０μＭ  ＰＬＰを有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８を含有した。タンパク質は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ニッケル（ＩＩ）形態）のみを用いて精製した。
【０６０７】
活性アッセイ
トリプトファンおよびピルビン酸からのインドール−３−ピルビン酸およびアラニンの形成は、双方の精製手順によって調製した酵素を用いてアッセイした。反応混合物は、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８、０．０５ｍＭピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、４０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン、および０．０３〜０．１ｍｇ／ｍＬ精製酵素を含有した。トリプトファンは固体として追加した。酵素以外の成分はすべて一緒に混合し、トリプトファンが溶けるまで３０℃でインキュベートした。次いで、酵素を追加し、反応溶液は室温でインキュベートした。所定の時点で、反応物をサンプリングし、試料は、直ちに氷上に保存し、実施例１に記載されるポストカラム蛍光検出液体クロマトグラフィー法によるアラニン分析のために希釈した。毎分１ｍｇの酵素当たりに形成されたアラニンの濃度として、下記の表５９に酵素調製物の特異的活性を挙げる。
【０６０８】
【表５９】
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【０６０９】
表５９に示される結果は、精製プロセスの間のピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）の使用が活性の増強をもたらしたことを示す。
【実施例１５】
【０６１０】
２つの新規なバチルスＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのクローニング
数種のバチルスＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼまたはＤ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとしても知られている）は、実施例１８に記載のように、Ｒ，Ｒモナチンの生成のための共役アッセイにおいて用いるために組換えで生成した。これらの酵素は、モナチンの生成について先に記載されるＤ−アミノトランスフェラーゼ（米国特許出願公開第２００４００６３１７５号および米国特許出願公開第２００５２８２２６０号）に相同である。新規なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（「ＤＡＡＴ」）を含有する候補とすることができる株の選択に用いられるアプローチは、ＡＴＣＣに委託されたＢ．スファエリクス株のリストを評価し、異なる種名で先に委託されたいくつかについて分析するためのものであった。以下の生物をＡＴＣＣにオーダーした：ＡＴＣＣ４９７８−−バチルス・ロタンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｔａｎｓ）として初め委託されたバチルス・スファエリクスおよびＡＴＣＣ７０６３−−バチルス・セロシティディス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｒｏｓｉｔｉｄｉｓ）として初め委託されたバチルス・スファエリクスおよびＡＴＣＣ２１５３８−バチルス・サーキュランスとして初め委託されたバチルス・スファエリクス。バチルス・スファエリクス、バチルス・ハロデュランス、ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・セレウス、バチルス・スブチリス、およびバチルス・リケニホルミスからの知られているＤＡＡＴタンパク質配列は、種々のＤＡＡＴタンパク質中の保存された配列領域を得るために整列させた。プライマーは、タンパク質配列保存の領域において設計し、上記に言及したＡＴＣＣ株からのＤＡＡＴ遺伝子配列のポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）増幅に用いた。
【０６１１】
５つのＰＣＲプライマーは、公開されたバチルスＤＡＡＴ配列のアラインメントにおける保存領域に基づいて設計した（図９のアラインメントを参照されたい）。
【０６１２】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
プライマーは、ＤＡＡＴのアラインメントにおける保存領域に基づいて上記に言及されるように設計した。オリゴヌクレオチドプライマー配列を下記に示す。5'-GAAGACCGTGGTTATCAATTT-3'（配列番号６５）（順行プライマー）、5'-GATGGTATTTACGAAGTAATC-3'（配列番号６６）（順行プライマー）、5'-AGATTTAATATCACAACGTAAC-3'（配列番号６７）（逆行プライマー）、5'-GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA-3'（配列番号６８）（逆行プライマー）、5'-ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG-3'（配列番号６９）（逆行プライマー）。知られているＤＡＡＴとのプライマー組合せのアラインメントに基づいたＰＣＲ断片の期待サイズ：配列番号６５および配列番号６７−およそ３８０ｂｐ；配列番号６５および配列番号６８−およそ３９５ｂｐ；配列番号６５および配列番号６９−およそ５３４ｂｐ；配列番号６６および配列番号６７−およそ３３６ｂｐ；配列番号６６および配列番号６８−およそ３４６ｂｐ；配列番号６６および配列番号６９−およそ５１０ｂｐ。
【０６１３】
上記のプライマーの組合せを以下のＡＴＣＣ株からのコロニーＰＣＲに用いた：ＡＴＣＣ４９７８−−バチルス・ロタンスとして初め委託されたバチルス・スファエリクス；ＡＴＣＣ７０６３−−バチルス・セロシティディスとして初め委託されたバチルス・スファエリクス；およびＡＴＣＣ２１５３８−バチルス・サーキュランスとして初め委託されたバチルス・スファエリクス。
【０６１４】
３つの上記に言及した株を３０℃で栄養寒天上で成長させた。単一のコロニーを平板からこすり取り、２５μＬ滅菌蒸留水中に再懸濁させた。細胞は１０分間９６℃で溶解させた。ＰＣＲを以下のように実行した：５０μＬ反応当たり、５μＬ  溶解細胞、０．８μＬの各プライマー、２μＬ  ｄＮＴＰ、０．８μＬ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、および１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を追加した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、３０秒間９４℃、４５秒間４０℃、および２分間７２℃を１５サイクル続けた。さらに１５回のサイクルは４５℃でアニール温度を増加して行った。終わりに、鎖伸長工程を７２℃で７分間行った。数種のプライマーの組合せにより上記の株について期待されたＰＣＲ生成物サイズが生じた。ＰＣＲ生成物は、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングし、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社（ビバリー、ＭＡ）でジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって配列決定した。ＤＮＡおよびアミノ酸のレベルの双方の配列はＢ．スファエリクスＤＡＡＴ配列と整列させた。妥当なＤＡＡＴ／ＤＡＴ配列は、３つの株、ＡＴＣＣ４９７８、ＡＴＣＣ７０６３、およびＡＴＣＣ２１５３８のすべてから得た。２つの特定の株、ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３は、翻訳された場合、Ｂ．スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ配列と比較すると別個のアミノ酸残基変化を有するタンパク質配列を産生したＰＣＲ生成物を生じた。
【０６１５】
ゲノムウォーキングはＡＴＣＣ４９７８株およびＡＴＣＣ７０６３株についての完全な遺伝子配列を得るために実行した。株ＡＴＣＣ４９７８は３０℃で栄養ブロス中で成長させた。株ＡＴＣＣ７０６３は栄養寒天上で成長させた。ゲノムＤＮＡは、メーカーのプロトコールに従ってＧｅｎｔｒａ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）を用いて各株から調製した。４つのライブラリーをメーカーのプロトコールに従って各株について構築した（ＢＤ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ｗｗｗ．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。遺伝子特異的プライマーは、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）のメーカーのプロトコールに従って、保存プライマーの組合せ（上記を参照されたい）を用いて得られた配列に基づいて設計し、本来の生成物と数百の相同塩基対オーバーラップを可能にした。これらの遺伝子特異的プライマーは、ＤＡＴ  ＯＲＦＳを完成させるために、上流および下流の配列のＰＣＲのためのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）アダプタープライマーと共に続いて用いた。
【０６１６】
遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー配列を下記に示す。
4978 DAT GSP1 Upstrm 5'-GACATGCTCCTCCGCTGTAAATAATTCACC-3'（配列番号７０）；
4978 DAT GSP1 Dwnstr 5'-CCCTGGTGATGAAGTGAAGCCAGTATTAAC-3'（配列番号７１）；
4978 DAT GSP2 Upstrm 5'-ATCGCCAAATTGATAACCACGGTCTTC-3'（配列番号７２）；
4978 DAT GSP2 Dwnstr 5'-ACGTCCCGTAGCAAACTTTGAAAAAGGTGT-3'（配列番号７３）；
7063 DAT GSP1 Upstrm 5'-TGCATAGAATCGGTCGATATGTTCAGTAGC-3'（配列番号７４）；
7063 DAT GSP1 Dwnstr 5'-GCGGAGAAACGATTACAGAAGGTTCTTCAA-3'（配列番号７５）；
7063 DAT GSP2 Upstrm 5'-GTCACCAAATTGATAACCACGGTCTTC-3'（配列番号７６）；および
7063 DAT GSP2 Dwnstr 5'-GGTGTACTTTATACGCACCCAGCAAAT-3'（配列番号７７）。
【０６１７】
アダプターオリゴヌクレオチドプライマー配列は以下の通りである。
AP1 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'（配列番号７８）および
AP2 5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'（配列番号７９）。
【０６１８】
一次ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ＰＣＲは以下のように実行した：５０μＬの反応当たり、２．５μＬのＤＮＡライブラリー、２μＬの各プライマー（ＡＰ１（配列番号７８）および適切なＧＳＰ１）、１．５μＬ  ｄＮＴＰ、１×ＸＬ  ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭ酢酸マグネシウム、および１μＬ  ＲＴＴＨポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を追加した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、その後３０秒間９４℃、３０秒間５５℃、および１分間６８℃を１０サイクル続けた。さらに２０回のサイクルは４８℃でアニール温度を減少させて行った。終わりに、鎖伸長工程を６８℃で７分間行った。二次Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ（商標）ＰＣＲは以下のように実行した：５０μＬの反応当たり、１．０μＬ（１：５０の希釈）の一次ＰＣＲ反応物、２μＬの各プライマー（ＡＰ２（配列番号７９）および適切なＧＳＰ２）、１．５μＬ  ｄＮＴＰ、１×ＸＬ  ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭ酢酸マグネシウム、および１μＬ  ＲＴＴＨポリメラーゼを追加した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、その後３０秒間９４℃、３０秒間５５℃、および１分間６８℃を１０サイクル続けた。さらに１５回のサイクルは４８℃でアニール温度を減少させて行った。終わりに、鎖伸長工程を６８℃で７分間行った。
【０６１９】
数種のライブラリーは、約２００ｂｐ〜約１．５ｋｂのサイズの範囲のＰＣＲ生成物を生じた。ＰＣＲ生成物はＴＯＰＯクローニングし（上記のように）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社（ビバリー、ＭＡ）でジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって配列決定した。これらの新しい配列は、保存プライマーの組合せを用いて得られた最初の配列と整列させ、開始コドンおよび終止コドンを同定した。このように、ＤＡＡＴの完全なＯＲＦを得た。新しいプライマー対は、ＡＴＣＣ株４９７８および７０６３から全ＤＡＡＴ遺伝子を別々にＰＣＲするために、特定の完全なＤＡＡＴ配列に基づいて設計した（クローニングのための制限部位を有する）。
【０６２０】
オリゴヌクレオチドプライマー配列を下記に示す。
ATCC4978DAATNde1F 5'-GGCCTTGGCATATGAGTTATAGCTTATGGAATGACC-3'（配列番号８０）；
ATCC4978DAATBamH1R 5'-GGCCTTAAGGATCCTTATGCGCGAATACCTTTTGGG-3'（配列番号８１）；
ATCC7063DAATNde1F 5'-GGCCTTGGCATATGAGCTACACTTTATGGAATGA-3'（配列番号８２）；および
ATCC7063DAATBamH1R2a 5'-GGCCAAGGATCCGCTACCCACTAATCATTAGA-3'（配列番号８３）。
【０６２１】
ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３  ＤＡＡＴ遺伝子のコード領域は以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬ反応中、３μＬゲノムＤＮＡ、０．８μＬの各プライマー、２μＬ  ｄＮＴＰ、０．８μＬ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、Ｍｇ入りの１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液、および０．２μＬ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）を追加した。用いたサーモサイクラープログラムは３分間９４℃でのホットスタートを含み、その後、以下の工程を８回繰り返した：３０秒間９４℃、３０秒間５０℃、および９０秒間７２℃。続いて２２サイクルを５８℃のアニール温度で行った。終わりに、鎖伸長工程を７２℃で７分間行った。正確なサイズのきれいなＰＣＲ産物を両株について得た（約８５０ｂｐ）。
【０６２２】
ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３のＤＡＡＴ遺伝子についてのＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、ＭＡ）中でＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したベクター（ｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０）ならびに挿入断片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製した。ライゲーションは、Ｒｏｃｈｅ社製Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ライゲーションしたものは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社エレクトロポレーションマニュアルに記載のように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いてエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂに形質転換した。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で３０分間、９００μＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた。細胞は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製し、ＰＣＲならびにＮｄｅＩおよびＢａｍＨを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するようであるプラスミドの配列は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社（ビバリー、ＭＡ）でジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。配列分析により、ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３からのＤＡＡＴ遺伝子についてのコード配列を確認し、配列番号８４（ＡＴＣＣ４９７８  ＤＡＡＴ  ＤＮＡ配列）および配列番号８５（ＡＴＣＣ７０６３  ＤＡＡＴ  ＤＮＡ配列）のＤＮＡ配列ならびに配列番号８６（ＡＴＣＣ４９７８  ＤＡＡＴアミノ酸配列）および配列番号８７（ＡＴＣＣ７０６３  ＤＡＡＴアミノ酸配列）のアミノ酸配列が生成された。
【０６２３】
Ｂ．スファエリクスＤＡＡＴ（実施例１８においてクローニング）との、ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３からの２つの新規なＤＡＡＴのアラインメントを図１０に示す。
【０６２４】
発明者らは、Ｂ．スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼと比較した場合に別個のアミノ酸残基変化を有するタンパク質配列を有する株ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３から新規なＤ−アミノトランスフェラーゼを得た。ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３からのＤＡＡＴは、Ｂ．スファエリクス（ＡＴＣＣ１０２０８）からのＤＡＡＴとわずか７２％および６７％の同一性を有する。これらの株の双方がＡＴＣＣにおいてＢ．スファエリクスとして現在挙げられているが、それらはＢ．ロタンスおよびＢ．セロシティディスとして委託されたものである。これらの２つの新規なＤＡＡＴおよびＢ．スファエリクスからのＤＡＡＴの間の配列アラインメントおよび目立った差異に基づき、Ｒ，Ｒモナチン生合成に対するＤＡＡＴ活性を増加させるそれらの役割（別々にまたは組み合わせて）について評価できる多くの候補残基を、これらのおよび他のＤＡＡＴ配列において同定する。
【実施例１６】
【０６２５】
遺伝子発現およびＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３のＤＡＡＴタンパク質についてのアッセイ
ＡＴＣＣ４９８７およびＡＴＣＣ７０６３からの新規なＤＡＡＴは、実施例１５に記載のように、（ｐＥＴベクター中）、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中に形質転換した。培養物は、上記に記載されるプロトコールを用いて成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離し、プラスミドの同一性を確認するために上記に記載のように制限消化によって分析した。
【０６２６】
ＤＡＡＴ遺伝子の誘発は、通常、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中で行った。細胞は、３７℃で０．４〜０．８のＯＤ６００まで成長させ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発し、誘発の３〜４時間後にサンプリングした。細胞抽出物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬付属のプロトコールに従って調製した。（ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＲｏｃｈｅ社製完全プロテアーゼインヒビターカクテルを追加）。可溶性タンパク質は、ｐＥＴベクター中のＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３の遺伝子産物の双方について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されるように、予測された分子量で得られた。より高いレベルの可溶性タンパク質はＨｉｓタグなし構築物（ｐＥＴ３０）を用いて観察された。細胞抽出物中の可溶性タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ヘラクレス、ＣＡ）で分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．９８．０を用いて濃度および発現パーセントについて分析した。
【０６２７】
タグなし（ｐＥＴ３０）構築物を有する細胞からのタンパク質抽出物は、以下のプロトコールを用いる、ピルビン酸およびＤ−トリプトファン（またはＲ，Ｒモナチン）からの、次に続くアラニンの生成によるＤ−アミノトランスフェラーゼ活性について分析した。下記に特に特定されない限り、二通りの５００μＬ反応を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、８０μＭピリドキサールリン酸、２５ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファンまたはＲ，Ｒモナチン中で実行した。反応は、無細胞抽出物（４９７８もしくは７０６３）または精製酵素（Ｂ．スファエリクス）の追加によって開始し、軽く振盪させながら３０℃で１５分間〜２時間インキュベートした。約同じレベルの全タンパク質を、以下で明記しない限り比較の目的のために各アッセイ中に追加した（１．０ｍｇ）。精製Ｂ．スファエリクス（ＡＴＣＣ番号１０２０８）アミノトランスフェラーゼはベンチマーク酵素として用いた。反応を停止するために、ギ酸を２パーセントの最終濃度まで追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。タンパク質を追加しないコントロール反応もまた行った。アラニンは、実施例１に記載のように、ＬＣ／ＯＰＡポストカラム誘導体化を用いて検出した。二通りの反応の平均した結果を下記の表６０および６１に示す。
【０６２８】
【表６０】
2015211679.tif 000063
【０６２９】
【表６１】
2015211679.tif 000064
【０６３０】
従って、発明者らは、ＡＴＣＣ４９７８およびＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼがＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を実際に持ち、Ｒ，Ｒモナチンを作製するための能力を有することを実証した。ＡＴＣＣ４９７８  ＤＡＡＴの活性はＡＴＣＣ７０６３  ＤＡＡＴについて観察されたものよりも高かった。４９７８が未精製であったので、４９７８およびＢ．スファエリクスの間の量的比較はできなかった。
【実施例１７】
【０６３１】
ＡＴＣＣ４９７８からのＤＡＡＴを用いるＲ，Ｒモナチンの生成
ＡＴＣＣ４９７８からのアミノトランスフェラーゼもまた、Ｄ−トリプトファンからモナチンを生成するための能力について試験した（実施例３Ａでのように）。以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：約５０μｇアルドラーゼ（Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼまたは配列番号２２のアルドラーゼ、精製済み）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン（固体として供給）、１．０ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。実験は、アミノトランスフェラーゼを追加しないネガティブコントロールと共に二通り実行した。試料は、緩やかに振盪させながら３０℃で種々の長さの期間インキュベートした。これらの方法を用いて、モナチンが生成された場合に検出された唯一の立体異性体はＲ，ＲおよびＳ，Ｒである。全モナチンおよびＲ，Ｒモナチンパーセントは、実施例１に記載のように検出された、またそれを下記の表６２〜６４に挙げる。表６２〜６４のそれぞれに示される結果は、二通りの反応からの平均値である。
【０６３２】
【表６２】
2015211679.tif 000065
【０６３３】
【表６３】
2015211679.tif 000066
【０６３４】
【表６４】
2015211679.tif 000067
【０６３５】
従って、発明者らは、ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼがＲ，Ｒモナチンを作製する能力を有することを実証した。ＡＴＣＣ４９７８  ＤＡＡＴの活性は、タンパク質１グラム当たりのモナチンｍｇの点から全モナチン生成量を比較する場合、Ｂ．スファエリクスＤＡＡＴについて観察されたものよりも高かった。配列番号２２のＲ特異的アルドラーゼの使用は、作製した、生成された全モナチンの量と比較して形成されたＲ，Ｒモナチンの百分率を明らかに改善した。
【実施例１８】
【０６３６】
公開されたバチルスＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのクローニング
数種のバチルスＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼまたはＤ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとしても知られている）は、Ｒ，Ｒモナチンの生成のための共役アッセイにおいて用いるために組換えで生成した。この酵素は、モナチンの生成について先に記載されるＤ−アミノトランスフェラーゼ（米国特許出願公開第２００４００６３１７５号および米国特許出願公開第２００５２８２２６０号）に相同である。
【０６３７】
株
Ｂ．スファエリクス（ＡＴＣＣ番号１０２０８）およびＢ．リケニホルミス（ＡＴＣＣ番号１０７１６）は、一晩３０℃で栄養寒天上で成長させた。コロニーのグループを１００μＬの滅菌水中に置き、細胞を破壊するために９５℃で５分間加熱した。３μＬを、続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅において用いた。ゲノムＤＮＡをＢ．ハロデュランス（ＡＴＣＣ番号ＢＡＡ−１２５Ｄ）についてオーダーし、１００ｎｇ／μＬの濃度まで水中で再懸濁させた。バチルス・セレウスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号１−９８７Ｄおよび１４５７９Ｄ）は、同様にクローニングするためにオーダーした。
【０６３８】
ポリメラーゼ連鎖反応プロトコール
プライマーは、ＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＥＴ２８ｂベクターおよびｐＥＴ３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）にクローニングするためにＢ．スファエリクスｄａｔ遺伝子について設計した。ｐＥＴ３０構築物はＮ末端ＨｉｓタグおよびＳタグを含有するが、ｐＥＴ２８構築物はタグ付きではない。
【０６３９】
バチルス・スファエリクスｄａｔプライマー：
Ｎ末端:5'-GATATACCATGGCATACTCATTATGGAATG-3'（配列番号８８）およびＣ末端：5'-GTTATCGGATCCTTAGGCATTAATTGAAATTG-3'（配列番号８９）。
Ｂ．リケニホルミスプライマーおよびＢ．ハロデュランスのプライマーは、ＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＥＴ２８ｂベクターおよびｐＥＴ３０ａベクターにクローニングするために設計した。ｐＥＴ３０構築物はこの場合タグなしであったが、ｐＥＴ２８構築物は小さなＮ末端ｈｉｓ−タグを含有した。
Ｂ．リケニホルミス  ｄａｔプライマー：
Ｎ末端5'-GGCCGGTTCATATGAAAGTTCTTTTTAACGGC-3'（配列番号９０）およびＣ末端5'-CCTTCCGGATCCTTAAACCGTTTTGGCTGTCT-3'（配列番号９１）。
Ｂ．ハロデュランスプライマー：
Ｎ末端5'-GATATACATATGGATTATTGCCTTTACCAA-3'（配列番号９２）およびＣ末端5'-GAATCCGGATCCTCACTGCTTCATCGCTGTTTG-3'（配列番号９３）。
【０６４０】
プライマーはＢ．セレウスコード配列について設計した。プライマーの一方のセットは、受入ＡＥ０１６８７７  ｇｉ：２９８９９０９６  ５１３８６３４．．．５１３９５０６（８７３ｂｐ）としてＮＣＢＩに挙げられる配列を生成した。プライマーの一方のセットは、Ｂ．チューリンゲンシスの予測されたｄａｔ  ＮＣＢＩ受入番号ＡＥ０１７３５５  ｇｉ：４９３２８２４０  ４９６５６５３．．．４９６６５３７（８８５ｂｐ）に類似した、付加的な１２ｂｐを上流に有する生成物を生成した。プライマーの双方のセットは、Ｎ末端領域についてはＮｄｅＩおよびＣ末端領域についてはＢａｍＨＩ制限部位を用いて設計した。プライマーはｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングにクローニングするために設計した。
Ｂ．セレウスプライマー：
Ｎ末端5'-TAAGAGGAATAACATATGGCATACGAAAGATTT-3'（配列番号９４）およびＣ−末端5'-GAATTCGGATCCTTAAGAAGATGACATATTGG-3'（短鎖ＰＣＲ産物）（配列番号９５）。
Ｎ末端5-TAAGAGGAATAACATATGGGATCGAAATTGGCA-3'（長鎖ＰＣＲ産物）（配列番号９６）。
【０６４１】
Ｂ．スファエリクス、Ｂ．ハロデュランス、およびＢ．リケニホルミスのｄａｔ遺伝子のコード領域は以下のＰＣＲプロトコールを用いて増幅した。５０μＬの反応中、３μＬ鋳型（ゲノムＤＮＡについては２μＬ）、１．６μＭの各プライマー、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、３．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、およびＭｇ入りの１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液を用いた。用いたサーモサイクラープログラムは３分間９４℃でのホットスタートを含み、その後、以下の工程を８回繰り返した：３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、および２分間７２℃。続いて２２サイクルを５８℃のアニール温度で行った。３０サイクルの後、試料は、７分間７２℃で維持し、次いで、４℃で保存した。正確なサイズのきれいなＰＣＲ産物を得た（ｄａｔ遺伝子は約８５０ｂｐ）。
【０６４２】
タンパク質受入番号ＡＡＡ２２２５２（ｇｉ：１４２５４２）をコードするゲオバチルス・ステアロテルモフィルス  ｄａｔ（受入番号Ｊ０４４６０  ｇｉ：１４２５４１）はアセンブリーＰＣＲ技術を用いて構築した。この遺伝子／タンパク質の源は、バチルス種、熱安定性バチルス種、またはバチルスＹＭ−１として記載されることが多い。アセンブリープロセスは以下の通りである：４３個のオリゴヌクレオチド（４０塩基長）を、上記の遺伝子配列ならびにその相補ＤＮＡ配列に基づいてＩＤＴにオーダーした、またそれらはセンス鎖およびアンチセンス鎖の間に２０個の塩基対オーバーラップを有した。プライマーは、水中で２５０μＭまで希釈し、５μＬの各プライマーはマイクロチューブ中で一緒に混合した。ＰＣＲを以下のように実行した：１００μＬの反応当たり、１．５μＬのプライマープール、４μＬ  ｄＮＴＰ、１×ＸＬ  ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭ酢酸マグネシウム、２μＬ  ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、および０．２５μＬ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）を追加した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、その後３０秒間９４℃、３０秒間４０℃、および１５秒間６８℃を１５サイクル続けた。さらに１０回のサイクルは４４℃でアニール温度を増加しておよび３０秒間（６８℃で）の伸長期間で行った。さらに１０回のサイクルは４８℃のアニール温度および７５秒間の伸長期間で行った。終わりに、鎖伸長工程を６８℃で７分間行った。二次ＰＣＲは、ＮｄｅＩ（Ｎ末）およびＢａｍＨＩ（Ｃ末）を用いてクローニングするために設計した以下のプライマーを用いて行った。
Ｎ−末端5'-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACC-3'（配列番号９７）およびＣ−末端5'-TTGGAACCGGATCCTTATATATGAAGCGGTTTTGG-3'（配列番号９８）。
【０６４３】
二次ＰＣＲ反応物は、１００μＬ当たり、２．５μＬの一次反応物、０．４μＬの各プライマー、３μＬ  ｄＮＴＰ、１×ＸＬ  ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭ酢酸マグネシウム、２μＬ  ｒＴｔｈポリメラーゼ、および０．２５μＬ  Ｐｆｕポリメラーゼを含有した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、その後３０秒間９４℃、３０秒間４２℃、および９０秒間６８℃を１０サイクル続けた。さらに１５回のサイクルは４８℃でアニール温度を増加して行った。終わりに、鎖伸長工程を６８℃で７分間行った。三次ＰＣＲ反応は、二次ＰＣＲ反応と同一の条件を用いた二次ＰＣＲからの鋳型を用いて行った。約９００ｂｐの生成物がアガロースゲル上で認識可能であった。
【０６４４】
クローニング
Ｂ．スファエリクスＤＡＴについてのＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、ＭＡ）中でＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化した。消化したベクター（ｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０）ならびに挿入断片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製した。ライゲーションは、Ｒｏｃｈｅ社製Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ライゲーションしたものは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社エレクトロポレーションマニュアルに記載のように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いてエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂに形質転換した。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で３０分間、９００μＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた。細胞は、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。正確な挿入断片を有するようであるプラスミドの配列は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社（ビバリー、ＭＡ）でジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した。配列決定により、ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＣ３３９６４（ｇｉ：３５１３７５５）に挙げられるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成する、受入番号ＡＦ０８１２７８領域：１３４．．９８５（ｇｉ：３５１３７５４）に見られるコード配列を検証した。
【０６４５】
Ｂ．リケニホルミスＤＡＴ（約８５０ｂｐ）およびＧ．ステアロテルモフィルスについてのＰＣＲ生成物は、ゲル精製し、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングした。プラスミドは、最初のスクリーニングのためにＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、制限消化によってスクリーニングし、配列は、ＮＣＢＩにおいて見つかったコード配列とマッチすることを検証した。Ｂ．リケニホルミスについては、配列は、受入番号Ｕ２６９４７領域２４７．．１０９８（ｇｉ：８５７５６０）とマッチし、ＡからＧへの４２９位での１つのサイレント突然変異を除いて受入番号Ｐ５４６９２（ｇｉ：１７０６２９２）に挙げられるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成する。Ｇ．ステアロテルモフィルスについては、配列は、上記に挙げられる受入番号とマッチした。コード領域は制限消化（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）によってサブクローニングし、ｐＥＴベクター中にライゲーションし、増幅のためにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換した。
【０６４６】
Ｂ．ハロデュランスＤＡＴについてのＰＣＲ生成物は、ゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、上記のようにｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０のベクター中にライゲーションした。ベクターの増幅はＤＨ１０Ｂ細胞中で行った。ミニプレップＤＮＡはＰＣＲによってスクリーニングし、配列を検証した。遺伝子配列は、受入番号ＮＰ＿２４３６７７（ｇｉ：１５６１５３７４）に挙げられるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする受入番号ＮＣ＿００２５７０（ｇｉ：５７５９６５９２）２９３４９０３．．２９３５７５４に見出すことができる。
【０６４７】
Ｂ．セレウスコード配列は標準的なＰＣＲプロトコールを用いて増幅し、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従ってクローニングした。
【０６４８】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、ｐＥＴベクター中の構築物のために、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中にサブクローニングした。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するために制限消化によって分析した。誘発は、通常、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中で行った。細胞は、３７℃で０．４〜０．８のＯＤ６００まで成長させ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発し、誘発の３〜４時間後にサンプリングした。細胞抽出物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬付属のプロトコールに従って調製した。（ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＲｏｃｈｅ社製完全プロテアーゼインヒビターカクテルを追加）。高いレベルの可溶性タンパク質が、双方のＢ．ハロデュランス遺伝子産物、双方のＢ．スファエリクス遺伝子産物、双方のＧ．ステアロテルモフィルス遺伝子産物、およびタグなしＢ．リケニホルミス遺伝子産物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されるように、予測した分子量で得られた。精製タンパク質を用いた反応については、Ｈｉｓタグ遺伝子産物は、メーカーのプロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）に従ってＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジを用いて精製した。溶出液画分は、ＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）カラム上で脱塩し、２５〜１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５中に溶出させた。全タンパク質アッセイは、Ｐｉｅｒｃｅ社製ＢＣＡキット（ロックフォード、ＩＬ）を用いて行い、発現パーセントはＳＤＳ−ＰＡＧＥから評価した。あるいは、細胞抽出物中の可溶性タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．９８．０を用いて濃度および発現パーセントについて分析した。Ｂ．セレウス遺伝子を含有するｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ構築物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって推奨されるように発現させたが、ＤＡＡＴの発現のレベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の間に他のタンパク質と組換えタンパク質を識別できないものであった。
【０６４９】
細胞抽出物は、以下のプロトコールを用いる、ピルビン酸およびＤ−トリプトファン（またはＲ，Ｒモナチン）からの、次に続くアラニンの生成によるＤ−アミノトランスフェラーゼ活性について分析した。二通りの１ｍＬ反応は、通常、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５０μＭピリドキサールリン酸、２５ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファンまたはＲ，Ｒモナチン中で行った。反応は、無細胞抽出物または精製酵素の追加によって開始し、軽く振盪させながら３０℃で１５分間から一晩、インキュベートした。約同じレベルのＤ−アミノトランスフェラーゼを比較の目的のために各アッセイ中に追加した（通常約０．５ｍｇ）。ＡＴ−１０３（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）はポジティブコントロール（またはベンチマーク）として用いた。反応を停止するために、ギ酸を２パーセントの最終濃度まで追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。タンパク質を追加しないコントロール反応もまた行った。０時点もまたネガティブコントロールとして用いた。アラニンは、実施例１に記載のように、ＬＣ／ポストカラムＯＰＡ誘導体化を用いて検出した。
【０６５０】
アミノトランスフェラーゼもまた、Ｄ−トリプトファンからモナチンを生成するためのそれらの能力について試験した（実施例３Ａでのように）。以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：約５０〜１００μｇアルドラーゼ（通常Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ、精製済み）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン（固体として供給）、０．５〜２ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。実験は、アミノトランスフェラーゼを追加しないネガティブコントロールと共に二通り実行した。試料は、緩やかに振盪させながら、３０℃で、１時間、２時間、および一晩（１７〜２０時間）インキュベートした。これらの方法を用いて、モナチンが生成された場合に検出された唯一の立体異性体はＲ，ＲおよびＳ，Ｒである。Ｒ，Ｒパーセントを下記に挙げる、またＲ，Ｒパーセントは逆相ＬＣピーク面積によって決定した。１時間後のＢ．スファエリクス、Ｂ．リケニホルミス、およびＢ．ハロデュランスのＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ基転移活性の結果を下記の表６５に示す。データは、１ｍＬ当たり０．５ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼに標準化した。
【０６５１】
【表６５】
2015211679.tif 000068
【０６５２】
Ｂ．スファエリクス、Ｂ．リケニホルミス、およびＢ．ハロデュランスのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いるモナチンの生成を下記の表６６に示す。各反応は、約９０μｇ  Ｃ．テストステローニＰｒｏＡを含有した。生成された全モナチンについてのデータは０．５ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼの使用に標準化した。
【０６５３】
【表６６】
2015211679.tif 000069
【０６５４】
Ｂ．スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ（タグなし）は、Ｄ−トリプトファンからのモナチンの生成について最も高い活性を有したが、Ｂ．ハロデュランス酵素は、他の酵素よりも、Ｓ−ＭＰに対してＲ−ＭＰについてはるかに高い選択性を有し、Ｒ，Ｒモナチンのより高い立体純度をもたらした。遺伝子が選ばれた宿主中で発現されなかった可能性があるが、Ｂ．セレウス細胞抽出物は試験された条件下で検出可能な量の活性を有しなかった。
【０６５５】
Ｇ．ステアロテルモフィルスＤＡＴ（タグなし、より発現した）を上記のようにアッセイし、精製Ｂ．スファエリクスＤＡＴおよびＡＴ−１０３（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）と比較した。結果を下記の表６７および６８に示す。Ｇ．ステアロテルモフィルス、ＡＴ−１０３、およびＢ．スファエリクスのＤ−アミノトランスフェラーゼのアミノ基転移活性は、１ｍＬ当たりに０．５ｍｇのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いて試験した（表６７）。
【０６５６】
【表６７】
2015211679.tif 000070
【０６５７】
【表６８】
2015211679.tif 000071
【０６５８】
天然のＧ．ステアロテルモフィルス酵素は、ＡＴ−１０３およびＢ．スファエリクスの酵素よりもモナチンアミノ基転移について明らかにそれほど活性ではない。
【実施例１９】
【０６５９】
ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼの生成
数種のバチルスＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは実施例１８および１５に記載された。Ｇ．ステアロテルモフィルス酵素は、モナチンに対する低いアミノ基転移活性を有し、Ｄ−トリプトファンからより少ない全モナチンが生成されたが、この酵素はなお注目する構造要素を有し、またこの酵素は熱安定酵素である。従って、ハイブリッドタンパク質をより高い活性の酵素（Ｂ．スファエリクス）およびゲオバチルス酵素の間で作り出した。
【０６６０】
ハイブリッドＤＡＴコード配列のアセンブリー
設計した標的タンパク質配列は配列番号９９とする。配列番号１００、配列番号９９に対応するコード配列はイー・コリコドン使用頻度に基づいて設計した。
【０６６１】
ハイブリッドＤＡＴはアセンブリーＰＣＲ技術を用いて構築した。アセンブリープロセスは以下の通りである：４３個のオリゴヌクレオチド（４０塩基長）を、上記の遺伝子配列ならびにその相補ＤＮＡ配列に基づいてＩＤＴにオーダーした、またそれらはセンス鎖およびアンチセンス鎖の間に２０個の塩基対オーバーラップを有した。プライマーは、水中で２５０μＭまで希釈し、５μＬの各プライマーはマイクロチューブ中で一緒に混合した。ＰＣＲを以下のように実行した：１００μＬの反応当たり、１．５μＬのプライマープール、４μＬ  ｄＮＴＰ、１×ＸＬ  ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭ酢酸マグネシウム、２μＬ  ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）、および０．２５μＬ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラ  ホーヤ、ＣＡ）を追加した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、その後３０秒間９４℃、１５秒間４０℃、および３０秒間６８℃を１５サイクル続けた。さらに１０回のサイクルは４４℃でアニール温度を増加しておよび３０秒間の伸長期間で行った。さらに１０回のサイクルは４８℃のアニール温度および７５秒間の伸長期間で行った。終わりに、鎖伸長工程を６８℃で７分間行った。二次ＰＣＲは、ＮｄｅＩ（Ｎ末）およびＢａｍＨＩ（Ｃ末）を用いてクローニングするために設計した以下のプライマーを用いて行った。
Ｎ−末端5'-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACCA-3'（配列番号１０１）およびＣ−末端5'-TTGGAACCGGATCCTTAGCTGTTAAGGCTCAGTGGAA-3'（配列番号１０２）
【０６６２】
ＰＣＲは、１００μＬ当たり、２．５μＬの一次反応物、３μＬ  ｄＮＴＰ、１×ＸＬ  ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭ酢酸マグネシウム、２μＬ  ｒＴｔｈ、および０．２５μＬ  Ｐｆｕポリメラーゼを含有した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、その後３０秒間９４℃、３０秒間４２℃、および７５秒間６８℃を１０サイクル続けた。さらに１５回のサイクルは４８℃でアニール温度を増加して行った。終わりに、鎖伸長工程を６８℃で７分間行った。約８５０ｂｐの生成物がアガロースゲル上で認識可能であった。
【０６６３】
クローニング
ＰＣＲ生成物は、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いてゲル精製し、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従って、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングした。プラスミドは、ＰＣＲによって最初のスクリーニングのためにＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡは制限消化によってスクリーニングし、ＤＮＡ配列を検証した。
【０６６４】
プラスミドミニプレップは、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、ＭＡ）を用いて消化した。消化したベクター（ｐＥＴ２８およびｐＥＴ３０）ならびに挿入断片はＲｏｃｈｅ社製Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いてライゲーションし、Ｒｏｃｈｅ社製Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて精製した。ライゲーションしたものは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社エレクトロポレーションマニュアルに記載のように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いてエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で３０分間、９００μＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた。細胞は、カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製スピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。
【０６６５】
遺伝子発現およびアッセイ
プラスミドＤＮＡは、メーカーのプロトコールに従って、イー・コリ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ＷＩ）中に形質転換した。培養物を成長させ、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離し、同一性を確認するためにＰＣＲによって分析した。誘発は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中で行った。細胞は、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて誘発して、３７℃で０．５のＯＤ６００まで成長させ、誘発の３時間後にサンプリングした。細胞抽出物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社製ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬付属のプロトコールに従って調製した。（ベンゾナーゼヌクレアーゼおよびＲｏｃｈｅ社製完全プロテアーゼインヒビターカクテルを追加）。高いレベルの全タンパク質が、両遺伝子産物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されるように、予測した分子量で得られた。しかしながら、タンパク質の可溶性レベルはより低かった。遺伝子産物のタグなしバージョンはより発現し、細胞性抽出物としてアッセイした。細胞抽出物中の可溶性タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｔａｔｉｏｎで分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．９８．０を用いて濃度および発現パーセントについて分析し、比較アッセイに用いられるＤ−アミノトランスフェラーゼの量を標準化した。
【０６６６】
細胞抽出物は、以下のプロトコールを用いる、ピルビン酸およびＤ−トリプトファン（またはＲ，Ｒモナチン）からの、次に続くアラニンの生成によるＤ−アミノトランスフェラーゼ活性について分析した。二通りの１ｍＬ反応は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５０μＭピリドキサールリン酸、２５ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファンまたはＲ，Ｒモナチン中で行った（他に断らない限り）。反応は、無細胞抽出物または精製酵素の追加によって開始し、軽く振盪させながら３０℃で１５分間から一晩、インキュベートした。約同じレベルのＤ−アミノトランスフェラーゼを比較の目的のために各アッセイ中に追加した（０．５ｍｇ）（他に断らない限り）。ＡＴ−１０３（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）またはＢ．スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ（実施例１８）はベンチマーク酵素として用いた。反応を停止するために、ギ酸を２パーセントの最終濃度まで追加し、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって除去した。タンパク質を追加しないコントロール反応もまた行った。０の時点もまたネガティブコントロールとして用いた。アラニンは、実施例１に記載のように、ＬＣ／ＯＰＡポストカラム誘導体化を用いて検出した。１ｍＬ反応容量当たり０．５ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いる反応の結果を下記の表６９に示す。
【０６６７】
【表６９】
2015211679.tif 000072
【０６６８】
アミノトランスフェラーゼもまた、Ｄ−トリプトファンからモナチンを生成するためのそれらの能力について試験した（実施例３Ａでのように）。以下のものを反応混合物１ｍＬ当たりに追加した：約５０〜１００μｇ精製Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン（固体として供給）、０．５〜２ｍｇ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、および０．０５ｍＭ  ＰＬＰ。実験は、アミノトランスフェラーゼを追加しないネガティブコントロールと共に二通り実行した。試料は、緩やかに振盪させながら、３０℃で、１時間、２時間、および一晩（１７〜２０時間）インキュベートした。これらの方法を用いて、モナチンが生成された場合に検出された唯一の立体異性体はＲ，ＲおよびＳ，Ｒであった。Ｒ，Ｒパーセントを下記の表７０に挙げる、またＲ，Ｒパーセントは逆相ＬＣピーク面積によって決定した。低いモナチン濃度では、Ｒ，ＲパーセントはＲＰＬＣピーク面積で判断されたほど正確ではない。従って、試料のうちのいくつかは、実施例１に記載されるＦＤＡＡ誘導体化法によってさらに分析した。それらの結果からの数は括弧中に表７０中に示す。
【０６６９】
【表７０】
2015211679.tif 000073
【０６７０】
ハイブリッドＤＡＴのモナチンアミノ基転移速度はＧ．ステアロテルモフィルス酵素よりも低いが、ハイブリッドＤＡＴは、Ｇ．ステアロテルモフィルス酵素よりも多くのモナチンを作製する。モナチン生成のための条件下（低ＭＰ濃度）では、ハイブリッドＤＡＴはおそらくより低いＫｍによりより機能する可能性がある。さらに、ハイブリッドＤＡＴは、親酵素のいずれかよりも高い百分率のＲ，Ｒを作製する。この酵素は、親酵素よりも高いＲ−ＭＰに対するエナンチオ選択性を有するようである。同一のアッセイを、ハイブリッドＤＡＴと共に、実施例３Ａに記載されるシノリゾビウムアルドラーゼを用いて行った（４時間のインキュベーション期間）。ハイブリッドＤＡＴは、上記と類似する量のモナチンを生成したが、代替のアルドラーゼを用いると、Ｃ．テストステローニＰｒｏＡアルドラーゼを用いた８０％とは対照的に、９５％Ｒ，Ｒ（ＦＤＡＡ誘導体化による）を生成した。
【０６７１】
ハイブリッドＤＡＴは、さらに、Ｓ−ＭＰに対するＲ−ＭＰ（実施例１に記載のように生成）のアミノ基転移活性について試験した。２時間および一晩のアッセイは、１０ｍＭ  Ｒ−ＭＰまたはＳ−ＭＰ、５０ｍＭ  Ｄ−アラニン、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−アミノトランスフェラーゼ、および５０μＭ  ＰＬＰを用いて３０℃で進めた。実験は二通り実行し、ＭＰ試料からのモナチンのバックグラウンドレベルは差し引いた。各基質から生成されたモナチンの比は、下記の表７１において両Ｄ−アミノトランスフェラーゼについて報告する。ピルビン酸（生成された）比をプロットすると、同様の傾向が観察された。ハイブリッドＤＡＴがＡＴ−１０３  Ｄ−アミノトランスフェラーゼよりもＲ−ＭＰに対してより選択的であり、ＡＴ−１０３  Ｄ−アミノトランスフェラーゼは選択的であるようではないことは明らかである。
【０６７２】
【表７１】
2015211679.tif 000074
【０６７３】
ハイブリッドＤＡＴ活性をさらに改善するために、部位特異的突然変異誘発を行った。プライマーは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に示唆されるように設計した。２つの異なる変異体を作り出した：ハイブリッドＤＡＴ２およびハイブリッドＤＡＴ３。ハイブリッドＤＡＴ２は、アラニンからアルギニンへのアミノ酸１５３位での突然変異およびセリン１８１の欠失を含む。アラニンのアルギニンへの突然変異は、ＡｓｐＣ  Ｌ−アミノトランスフェラーゼ中に存在することが示されたように、モナチン前駆体基質中の第２のカルボキシル基を調和させるのを助けるために設計した。セリン欠失は、より大きなモナチン前駆体分子が活性部位により容易に到達できるよう、いくつかの立体障害を除去するための試みであった。ハイブリッドＤＡＴ３は、１つのアルギニンによって置換された、セリン１８０〜１８２の欠失を含有した。１５３ａｌａのａｒｇへの突然変異またはセリン欠失のみをそれぞれ有する付加的な２つの変異体を作り出した。欠失を含有したすべての３つの変異体は、それらは非常に高濃度で過剰発現したが、可溶性タンパク質を作製しなかった。明らかに、この領域におけるアミノ酸を除去しないことは構造上重要である。ａｌａ１５３ａｒｇ変異体は、試験した条件（上記）下でモナチンを生成しなかった。１８０〜１８２領域における欠失なしでは、モナチン前駆体基質をはめることをより困難にすると考えられる、かなりの量の立体障害が１５３位の近くにある。グリシンまたはアラニンのごときより小さなアミノ酸へのセリンの突然変異は、詳細にはａｌａ１５３ａｒｇ突然変異と組み合わせた場合、モナチン前駆体に対する活性を改善すると考えられることが予想される。
【実施例２０】
【０６７４】
市販で入手可能なＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素の使用
Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼは、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社（パサデナ、ＣＡ）から購入したライブラリーの一部であった。
【０６７５】
ＭＰおよびモナチンの間の相互変換
モナチンを形成するためのＭＰのアミノ化は、アミノトランスフェラーゼまたはＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのごとき還元補因子を必要とするデヒドロゲナーゼによって触媒できる。これらの反応は可逆的であり、どちらかの方向で測定できる。デヒドロゲナーゼ酵素を用いる場合の方向性は、アンモニウム塩の濃度によって大部分はコントロールできる。
【０６７６】
市販で入手可能なデヒドロゲナーゼを用いるＭＰ（モナチン前駆体）へのモナチンの変換
モナチンの酸化的脱アミノは、ＮＡＤ＋がより多くの発色団のＮＡＤＨに変換されるにつれての、３４０ｎｍでの吸光度の増加に従ってモニターした。
【０６７７】
アッセイ混合物は、０．２ｍＬ中、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９、１０ｍＭ  ＮＡＤ＋、２０ｍｇ／ｍＬのＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＡＡＤＨ−１０１〜１０８、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）、および５０ｍＭ  Ｒ，Ｒモナチン（モノカリウム塩）を含有した。アッセイは、３０℃でインキュベーションしながら、ＵＶ透過性マイクロタイタープレート中で二通り行った。終点吸光度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーを用いて測定した。ネガティブコントロールは酵素を追加せずに実行した。一晩の反応についての吸光度の変化は以下の通りであった：酵素なしのコントロール、0.05;D-AADH-101、0.865;D-AADH-102、1.075;D-AADH-103、0.94;D-AADH-104、0.335;D-AADH-105、0.78;D-AADH-106、0.745;D-AADH-107、0.925;およびD-AADH-108、1.06。
【０６７８】
デヒドロゲナーゼを用いるＭＰからのモナチンの生成
基質としてこのアッセイに用いられるＲ−ＭＰは、アミノ受容体としてピルビン酸を用いて、リン酸カリウム緩衝液中のＡＴ−１０３広範囲Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）を用い、Ｒ，Ｒモナチンのアミノ基転移によって生成した。Ｓ−ＭＰは、アミノ受容体として２−オキソグルタル酸を用いて、リン酸カリウム緩衝液中のＡＴ−１０２Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）を用い、Ｓ，Ｓモナチンのアミノ基転移によって生成した。両化合物は、調整用スケールのＨＰＬＣを用いて精製した。
【０６７９】
アッセイ混合物は、０．２５ｍＬ中、２００ｍＭギ酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、５ｍＭ  ＮＡＤＨ、２０ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＡＡＤＨ−１０１〜１０８、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社）、および１０ｍＭ  ＭＰ（カリウム塩）を含有した。アッセイの半分に対して、２ｍｇ／ｍＬギ酸デヒドロゲナーゼ（「ＦＤＨ」）を追加した（ＦＤＨ−１０１、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社、４．８Ｕ／ｍｇ）。試料は３０℃で１６時間インキュベートした。試料はＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてモナチンについて分析し、異性体分布は実施例１に記載されるＦＤＡＡ法を用いて決定した。Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼなしのコントロールのバックグラウンドレベルは、ＭＰ中に存在するモナチン混入を考慮するために差し引いた。
【０６８０】
Ｒ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成については、酵素活性は以下の通りであった：Ｄ−ＡＡＤＨ−１０３＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０１＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０７＞Ｄ−ＡＡＤＨ  １０６＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０８＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０５。Ｄ−ＡＡＤＨ１０２から生成されたモナチンの量は、かなり低く、Ｄ−ＡＡＤＨ−１０４はＲ−ＭＰからモナチンを生成するようにではなかった。約４３ｐｐｍのＲ，Ｒモナチンは、ギ酸デヒドロゲナーゼがない状態で反応の間にＤ−ＡＡＤＨ−１０３により生成された。ＦＤＨの追加は、活性を有したすべての酵素についてモナチンの生成を改善した。２．４倍高いモナチン〜１０．１倍高いモナチンの範囲で改善された（Ｄ−ＡＡＤＨ−１０３）。Ｄ−ＡＡＤＨ−１０３は約４３４ｐｐｍのＲ，Ｒモナチンを生成した。
【０６８１】
Ｓ−ＭＰを反応基質として用い、Ｓ，Ｒモナチンの生成を伴った場合、酵素活性は以下の通りであった：Ｄ−ＡＡＤＨ−１０６＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０７＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０５＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０１＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０２＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０３＞Ｄ−ＡＡＤＨ−１０８。Ｄ−ＡＡＤＨ−１０４は、アッセイにおいてＳ，Ｒモナチンを生成するようではなかった。約１５ｐｐｍＳ，ＲモナチンがＤ−ＡＡＤＨ−１０６によって生成され、ＦＤＨ酵素もまた用いた場合２６ｐｐｍであった。
【０６８２】
インドール−３−ピルビン酸からのモナチンの生成
配列番号２２のアルドラーゼと共役する、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社製アミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素を用いる、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸からのモナチンの生成は、以下の条件下でアッセイした：１ｍｇ／ｍＬデヒドロゲナーゼ酵素、１０ｍＭ  ＮＡＤＨ、５００μｇ／ｍＬアルドラーゼ（精製済み）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／ｍＬ  インドール−３−ピルビン酸、２００ｍＭギ酸アンモニウム、および２００ｍＭピルビン酸を２０時間１００ｒｐｍで３０℃でインキュベートした。ネガティブコントロールはアミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素を含有しなかった。実験は二通り行った。デヒドロゲナーゼのどれも、ネガティブコントロールと比較して、インドールピルビン酸およびピルビン酸から数量化できる量のモナチンを生成するようではなかった（実施例１で記載されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定）。しかしながら、大量のアラニンおよびトリプトファンが生成された。デヒドロゲナーゼに対するアルドラーゼの比の増加はモナチン生成を改善すると考えられることが予想される。進化分子工学アプローチは、ピルビン酸およびインドール−３−ピルビン酸に対するＭＰに対しての還元的アミノ化活性の比を改善するために用いることができることもまた予想される。
【実施例２１】
【０６８３】
Ｂ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼの固定化
バチルス・スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼは、実施例１４で記載のようにＨＩＳ６−タグ付きタンパク質として精製した。
【０６８４】
酵素は、Ｍａｔｅｏ，Ｃら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １８：６２９−６３４，（２００２）の手順によってＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ樹脂ビーズ上に固定化した。精製酵素（６．０ｍｇ／ｍＬで４ｍＬ）は、雰囲気温度で、１時間、Ｐｉｅｒｃｅ社製Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（７Ｋ  ＭＷＣＯ；カタログ＃６６３７０；ロックフォード、ＩＬ）を用いて０．４Ｌの０．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．８中で透析した。緩衝液を換え、透析を１時間継続した。ピリドキサールリン酸（「ＰＬＰ」）を０．０５ｍＭの最終濃度まで追加し、結果として生じた溶液を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｆｌｕｋａ社カタログ＃４６１１５；セントルイス、ＭＯ）から購入した０．２ｇのＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ樹脂と混合した。酵素樹脂懸濁液は、一晩、緩やかに混合しながら雰囲気温度でインキュベートした。樹脂ビーズは、５分間の４０００×ｇでの遠心分離によって酵素溶液から分離した。上清は除去し、樹脂は、０．０５ｍＭ  ＰＬＰを含有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８の３×３ｍＬを用いて洗浄した。混合物は洗浄の間に５分間３０００×ｇで遠心分離した。樹脂に結合したタンパク質の量は、各上清中のタンパク質の量を測定し、固定化されることになる本来の量のタンパク質からその合計を差し引くことにより決定した。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるＰｉｅｒｃｅ社製ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ＃２３２２５；ロックフォード、ＩＬ）を用いて測定した。洗浄した固定化−酵素ビーズは、０．０５ｍＭ  ＰＬＰを含有する４ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８中に最終的に懸濁させた。固定化酵素ビーズの未反応エポキシ基は、緩やかに混合しながら雰囲気温度で１．９Ｍアラニンとインキュベーションすることによってブロックした。２４時間後に、ビーズは、過剰アラニンを除去するために上記に記載のように洗浄し、０．０５ｍＭ  ＰＬＰを含有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８中に最終的に再懸濁させた。固定化酵素の最終濃度は樹脂ビーズ１ｇ当たり１１８ｍｇタンパク質であった。
【実施例２２】
【０６８５】
Ｓ．メリロティＰｒｏＡアルドラーゼの固定化
シノリゾビウム・メリロティＨＭＧアルドラーゼ（「ｐｒｏＡ」）は、ＨＩＳ６−タグ付きＢ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼについて実施例１４で記載される手順に類似する手順を用いてＨＩＳ６−タグ付きタンパク質として精製した。
【０６８６】
ＢＬ２１（ＤＥ３）：：Ｓ．メリロティ  ｐｒｏＡ  ｐＥＴ３０（Ｘａ／ＬＩＣ）の新鮮な培養平板（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを有するＬＢ寒天）から開始して、細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有する５ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（「ＬＢ」）中で成長した。続いて、培養物は、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを有する８００ｍＬのＬＢブロスを含有するフラスコ中に０．５〜０．６％（容量／容量）で移した。細胞は、ＯＤ６００が０．６〜０．７に達するまで２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で成長させた。遺伝子発現は０．２ｍＭ  ＩＰＴＧの追加によって誘発した。培養物は、２２５ｒｐｍで振盪させながら４時間３０℃でさらにインキュベートし、次いで、１０分間１０，０００ｒｐｍでＪＳ−１６．２５回転子を有するＢｅｃｋｍａｎ社製Ｊ２５ＩＩ遠心分離機（フラートン、ＣＡ）中で遠心分離によって採取した。細胞ペレットは、低温の５０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．２を用いて洗浄し、細胞をさらに遠心分離した。洗浄した細胞ペレットは採取し、直ちに用いた。Ｓ．メリロティＨＩＳ６−ｐｒｏＡアルドラーゼ（ＨＩＳ６−ＳｍｅｌｐｒｏＡ）タンパク質を含有する無細胞抽出物を調製するために、細胞は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する３〜４倍容量の５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．２中で懸濁させ、次いで、１５℃未満に懸濁液の温度を維持しながら、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製ホモジナイザー（ニュートン、ＭＡ）（２０，０００ｐｓｉで３パス）を用いて破壊した。続く精製工程はすべて４℃で行った。細胞抽出物は、細胞片を除去するために１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。それぞれが１５および２０ｍｇの間の可溶性タンパク質を含有する無細胞抽出物のアリコートは、Ｎｏｖａｇｅｎ社製Ｂｉｎｄ緩衝液を用いて先に平衡化したＮｏｖａｇｅｎ社製ＨＩＳ−Ｂｉｎｄカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社カタログ＃７０９７１−４、マディソン、ＷＩ）にかけた。カラムは、２×１０ｍＬのＮｏｖａｇｅｎ社製Ｂｉｎｄ緩衝液およびＢｉｎｄ緩衝液を用いて１：１に希釈した１×１０ｍＬのＮｏｖａｇｅｎ社製Ｗａｓｈ緩衝液を用いて洗浄した。ＨＩＳ６−ＳｍｅｌｐｒｏＡは、各カラムから５ｍＬのＮｏｖａｇｅｎ社製Ｅｌｕｔｅ緩衝液を用いて溶出させた。各カラムからの溶出画分は、組み合わせ、Ａｍｉｃｏｎ社製Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過デバイス（ビレリカ、ＭＡ）（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）を用いて２×に濃縮した。緩衝液は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．２を用いて先に平衡化した使い捨てのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＰＤ１０脱塩カラム（カタログ＃１７−０８５１−０１）を通過させることによって交換した。
【０６８７】
脱塩溶液のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ社製ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ＃２３２２５；ロックフォード、ＩＬ）を用いて決定した。各画分の純度および無細胞抽出物画分中の発現のレベルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩミニゲルシステム（ヘラクレス、ＣＡ）および４〜１５％の勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。通常、この手順は、約９０％の純度を有する、３２００ｍＬのＬＢ培養物からの約６０〜７０ｍｇの酵素を生成した。アリコート（１〜５ｍＬ）の精製酵素は使用まで−８０℃で保存した。
【０６８８】
酵素は、Ｍａｔｅｏ，Ｃ．ら，（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １８：６２９−６３４，（２００２）の手順によっておよび４ｍＭ塩化マグネシウムが０．０５ｍＭ  ＰＬＰの代わりに固定化の間に緩衝液中に存在した以外はＢ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼについて実施例２１に記載のようにＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ樹脂ビーズ上に固定化した。グリシンを用いてブロックした後に、洗浄した固定化酵素は、４ｍＭ塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８中に懸濁させた。Ｓ．メリロティｐｒｏＡアルドラーゼの最終濃度は樹脂ビーズ１グラム当たり５２ｍｇタンパク質であった。
【実施例２３】
【０６８９】
固定化酵素を用いる、Ｒ，Ｒ−モナチンの生成
Ｂ．スファエリクスＨＩＳ６−タグ付きＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼおよびＲ．メリロティＨＩＳ６−タグ付きｐｒｏＡアルドラーゼは、実施例２１および２２に記載のように、精製し、固定化した。
【０６９０】
１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８中の５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、４０ｍＭ  Ｄ−トリプトファン、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５０μＭ  ＰＬＰの溶液は、ねじ込みキャップを有する１５ｍＬポリプロピレンチューブ中で調製した。これらの溶液のそれぞれに対して、４ｍＬの最終容量まで固定化酵素の双方を追加した。結果として生じた懸濁液は、２４時間まで緩やかに混合しながら室温でインキュベートした。各反応の進行の後に、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ−ＭＳ分析が続き、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アラニン、Ｒ，Ｒ−モナチン、およびピルビン酸を測定した。生成物モナチンの異性体純度は、キラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて決定した。分析法はすべて実施例１に記載される。固定化酵素を用いる実験の標準的な結果は、下記の表７２に示す。反応の間に形成されたモナチンの異性体純度の分析は、酵素反応の生成物が７４および８０％Ｒ，Ｒの間であったことを示した。
【０６９１】
【表７２】
2015211679.tif 000075
【実施例２４】
【０６９２】
イー・コリによるｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｒ，Ｒモナチンの生成および輸送
オペロンは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（「ＤＡＴ」）およびＲ特異的アルドラーゼを用いるイー・コリでのＲ，Ｒモナチンのｉｎ  ｖｉｖｏ生成を実証するために構築した。Ｒ，Ｒモナチンは、米国特許出願公開第２００５／０２８２２６０Ａ１号（図１および２ならびに実施例１１）に記載される経路を用いてＤ−トリプトファンから作製した。簡潔に言えば、Ｄ−トリプトファンは、アルファ−ケト酸もまたＤ−アミノ酸に変換されるアミノ基転移反応によって  ｉｎ  ｖｉｖｏでインドール−３−ピルビン酸に変換される。ピルビン酸は、Ｒ特異的アルドラーゼを用いて、アルドール縮合でｉｎ  ｖｉｖｏでインドール−３−ピルビン酸と反応して、圧倒的にＲ−ＭＰを生成する。終わりに、第１の反応からのＲ−ＭＰおよびＤ−アミノ酸（または細胞中の任意のＤ−アミノ酸）はＲ，Ｒモナチンおよび対応するアルファ−ケト酸にｉｎ  ｖｉｖｏで変換される。
【０６９３】
プラスミドｐＣＥＣ−Ｎｄｅの構築
プラスミドｐＣＥＣ−Ｎｄｅは、ｐＰＲＯＮｄｅプラスミド（ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＰｒｏＬＡＲ、米国特許出願公開第２００４０２３５１２３号に記載されるように修正）のｐ１５Ａ複製開始点をｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ１３３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）からのＣｏｌ  Ｅ１複製開始点と交換することによって構築した。両プラスミドは、制限酵素Ａｖｒ  ＩＩおよびＡａｔ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて処理し、適切な断片（Ｃｏｌ  Ｅ１開始点およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を運ぶｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ１３３に由来する１７３１ｂｐ断片ならびにＰｌａｃ／ａｒａプロモーター領域およびマルチクローニング部位を運ぶｐＰＲＯＮｄｅに由来する７６０ｂｐ）はアガロースゲル電気泳動によって精製し、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いる抽出および回収を続けた。精製ＤＮＡ断片は、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて共にライゲーションし、ライゲーション混合物は、化学的コンピテントイー・コリＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に形質転換した。クローンは５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で単離し、プラスミドの制限消化によって確認した。
【０６９４】
ベクターｐＣＥＣ−Ｎｄｅは、ＢａｍＨＩ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）中でＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、メーカーのプロトコールに従って、エビアルカリフォスファターゼを用いて処理した（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。ＡＴＣＣ４９７８  ＤＡＴ（配列番号８４）は、ＢａｍＨＩ緩衝液中でＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてベクターｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（実施例１５でクローニングした）から消化した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したベクターおよび挿入断片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。ライゲーションは、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて行い、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ−Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて精製した。ライゲーションしたものは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  エレクトロポレーションマニュアルに記載されるように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いてエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換した。細胞を、２２５ｒｐｍで３７℃で１時間、１．０ｍＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、（１９８９年）、１．７６〜１．８１＆Ａ．２））。細胞は、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ＰＣＲならびにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限消化によって正確な挿入断片についてスクリーニングした。ＡＴＣＣ４９７８  ＤＡＴからのアミノ酸配列は配列番号８６として示される。
【０６９５】
Ｄｉｖｅｒｓａからの配列番号１７２のアルドラーゼ遺伝子のＰＣＲ
プライマーは、Ｒ選択的アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする配列番号１７２のＤＮＡ配列に基づいて設計した。配列番号１７３のアルドラーゼおよびそのアルドラーゼをコードする核酸配列を含有するプラスミド（特定のアルドラーゼの遺伝子配列は配列番号１７２として示される、はＤｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得た。配列番号１７２は、アルドラーゼ遺伝子についてＤｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐ．によってスクリーニングされたライブラリーの一部であった。しかしながら、配列番号１７２のアルドラーゼ遺伝子は、当業者に知られている任意の方法によって再構築されてもよい。例えば、配列番号１７２のアルドラーゼ遺伝子は、当業者に知られているアセンブリーＰＣＲ法を利用して再構築されてもよい。プライマーは、クローニングおよび発現のために、制限部位およびアルドラーゼ遺伝子の前にリボソーム結合部位を含有するように設計した。用いたオリゴヌクレオチドプライマー配列は次の通りであった。
【０６９６】
アルドラーゼＦｐｓｔＩｒｂｓ：
5'-GGCCGGAACTGCAGAAGAAGGAGATATATAATGAAGCCGGTGGTGGTG-3'（配列番号174）および
アルドラーゼＲｘｂａＩ
5'-GGCCAAGGTCTAGATTAGACATAGGTGAGCCC-3'（配列番号175）。
【０６９７】
ＰＣＲは、鋳型ｐＥＴ２８／配列番号１７２を用いて上記のプライマーを用いて行った。ＰＣＲを以下のように実行した：５０μＬ当たり、０．５μＬ鋳型、０．８μＬの各プライマー、２μＬ  ｄＮＴＰ、０．８μＬ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１×Ｅｘｐａｎｄ（商標）緩衝液、および０．２μＬ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を追加した。３分間のホットスタートを９４℃で行い、３０秒間９４℃、３０秒間５０℃、および９０秒間７２℃を８サイクル続けた。さらに２２サイクルを５５℃にアニール温度を増加させて行った。終わりに、鎖伸長工程を７２℃で７分間行った。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、緩衝液３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）中でＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化した。ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化したベクターｐＣＥＣＮｄｅ／４９７８  ＤＡＴおよび挿入断片はＲｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてライゲーションし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ライゲーションしたものは、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーションマニュアルに記載されるように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いてエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換した。細胞は、２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間、１．０ｍＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた。細胞は、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。
【０６９８】
形質転換体は、２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃でクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢブロス中で成長させた。プラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、挿入断片はＰｓｔＩおよびＸｂａＩを用いる制限消化によって検証した。正確な挿入断片を有するように考えられるプラスミドの配列は、ジデオキシ連鎖停止ＤＮＡ配列決定によって検証した（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。ＲＲ２（ベクターＲＲ２）と称される結果として生じたプラスミド、ｐＣＥＣＮｄｅ／４９７８ＤＡＴ／配列番号１７２は、下記に記載されるように株エシェリキア・コリＭＧ１６５５を形質転換するために用いた。
【０６９９】
イー・コリＭＧ１６５５株は、２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃でＬＢブロス中で成長させた。エレクトロコンピテント  イー・コリＭＧ１６５５は、約０．６のＯＤ  ６００まで細胞の１％接種物を継代培養することによって調製した。細菌は、遠心分離によってペレットにし（１０，０００ｘｇで１０分間）、同容量の１０％グリセロール中で洗浄した。洗浄は、半分の容量の１０％グリセロール中で２度繰り返した。最後に、細胞は、４分の１の容量の１０％グリセロール中で洗浄した。遠心分離の後で、細胞を、５００μＬの１０％グリセロール中で再懸濁させた。３０μＬのアリコートを凍結し、使用まで−８０℃に保った。
【０７００】
ベクターＲＲ２（つまりプラスミドｐＣＥＣＮｄｅ／４９７８ＤＡＴ／配列番号１７２、上記のように調製）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーションマニュアルに記載されるように、０．２ｃｍキュベットおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩシステムを用いて、エレクトロコンピテントイー・コリＭＧ１６５５細胞中に形質転換した。細胞は、２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間、１ｍＬ  ＳＯＣ培地中で回復させた。細胞は、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天平板上で平板培養した。
【０７０１】
接種物調製については、イー・コリＭＧ１６５５：：ｐＣＥＣＮｄｅ／４９７８  ＤＡＴ／配列番号１７２は、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（「ＬＢ」）培地中で２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩成長させた。実験的処理については、イー・コリ細胞中でのトリプトファンの生成の増加のために用いた最少培地であるＴｒｐ−１＋グルコース培地（ＺｅｍａｎらＦｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：２００〜４頁、１９９０年）を以下のように調製した。８００ｍＬ  ｎａｎｏｐｕｒｅ水に以下の試薬を追加した：２ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．６ｇ  ＫＨ２ＰＯ４。ｐＨは７．０に調整し、容量は９４８ｍＬに増加させ、培地は加圧滅菌した。滅菌の後で、０．２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および０．５ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを１．８ｍＬ容量の培地に追加し、その後、０．２ｍＬのＮｅｉｄｈａｒｄｔの微量栄養素溶液を追加した（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  Ｆ．Ｃ．、Ｂｌｏｃｈ  Ｐ．Ｌ．、およびＳｍｉｔｈ  Ｄ．Ｆ．、１９７４年．Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９：７３６〜７４６頁）。Ｎｅｉｄｈａｒｄｔの培地は次のものを含む（１リットル当たり）：０．１８ｇ  （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４・４Ｈ２Ｏ、１．２４ｇ  Ｈ３ＢＯ３、０．３６ｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ  ＣｕＳＯ４（無水）、０．８ｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、および０．１４ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。５０％グルコース溶液を別々に調製し、滅菌濾過した。４０ｍＬのグルコース溶液および１０ｍＬの１Ｍ  ３−モルホリノプロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）緩衝液を基本培地（９５０ｍＬ）に追加し、１Ｌの最終容量にした。
【０７０２】
処理については、３．１容量／容量％の接種物を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを有する５００ｍＬバッフル振盪フラスコ中の１００ｍＬ培地容量に追加した。処理のための条件は、２５０ｒｐｍの撹拌を最後までおよび誘発まで３７℃、次いで誘発の後の３０℃を含んだ。０．５０〜０．５２６のＯＤ６００で、プラスミド遺伝子の誘発を開始した。誘発時に、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．５％Ｌ−アラビノース、０．５ｍＭ塩酸ピリドキシン、および０．２ｍＬのＢａｌｃｈのビタミン（Ｂａｌｃｈ，Ｗ．Ｅ．ら、１９７９年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２６０〜２９６頁）を追加した。１０ｇ／Ｌ  Ｄ−トリプトファン、１０ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、および０．０４ｍＭピリドキサール−５’−リン酸（「ＰＬＰ」）の追加は、誘発の３時間後に行ったが、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウリン酸エステル）および１０μｇ／ｍＬアンピシリンは誘発の６時間後に追加した。５ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸またはＤ−アラニンは誘発の３時間後に追加した。１０ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウムの第２の追加は接種の２４時間後に行った。モナチンおよび乾燥細胞の重量決定のための試料は４８時間目に採取した。
【０７０３】
４８時間の試料からのモナチンを、記載される方法論を用いて固相抽出（「ＳＰＥ」）カラムを介して濃縮した。Ｒ，ＲおよびＳ，Ｓの立体異性体を実施例１のＦＤＡＡ誘導体化法によって分析した。結果を下記の表７３に示す。
【０７０４】
固相抽出を利用するモナチンの濃縮のための方法
Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ  ３ｃｃ（６０ｍｇ）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を試料を濃縮するために用いた。発酵試料は、細胞物質を除去するために最初に遠心分離した。ギ酸を発酵試料に追加し、最終濃度を約１％とした。抽出カートリッジは、発酵試料の追加前に、少なくとも２ｍＬメタノール、その後２ｍＬの１％ギ酸を用いて調節した。各溶液は、抽出カートリッジを通して別々に流した。次いで、１％ギ酸を含有する無希釈の遠心分離した発酵試料の５ｍＬまでを抽出カートリッジに追加した。発酵溶液は、カートリッジを通してゆっくり流した。カートリッジは、少なくとも２ｍＬの１％ギ酸を用いてすすいだ。１ｍＬのアセトニトリルまたはメタノールをカートリッジに追加し、カートリッジを通してゆっくり流した。この溶出液は、乾燥するまで、窒素の緩やかな流れの下に置いた。乾燥試料は、１５０〜２００μＬの水または移動相に再構成した。１５０μＬを３００μＬ  ＨＰＬＣプラスチックバイアル中に入れ、液体クロマトグラフに注入した。表７３は、乾燥細胞重量当たりの全モナチンおよびＲ，Ｒ立体異性体またはＳ，Ｓ立体異性体である、合計のうちの割合を示す。
【０７０５】
【表７３】
2015211679.tif 000076
【０７０６】
Ｒ，Ｒモナチンの生成および輸送は、株イー・コリＭＧ１６５：：ｐＣＥＣＮｄｅ／４９７８  ＤＡＴ／配列番号１７２およびＤ−グルタミン酸を用いて決定的に実証した。いくらかのＳ，Ｓモナチンは、おそらく、Ｓ−ＭＰからＳ，Ｓモナチンを作製することができる内因的なＬ−アミノトランスフェラーゼを通常発現するイー・コリＭＧ１６５５株の使用の結果として生成された。Ｄ−アラニンを用いて生成された全モナチンは、生成されたモナチンの立体異性体比を決定するための分析を進めるのに十分ではなかった。しかしながら、たとえ生成された量が分析の閾値未満であったとしても、同じ比のＲ，Ｒモナチンが形成されたであろうということが期待される。Ｓ，Ｓモナチンを輸送することができる同じ輸送体がＲ，Ｒモナチンを同様に輸送することができるはずであることもまた期待される。
【０７０７】
配列番号１７２のＤＮＡ配列を下記に示す。
gaagccgg tggtggtgca gactatcgag cgggccgacc gagcgatcat cgagggtctg gccgcgtgtg gcgttgccac cgtccatgag gcgcaggggc gccgggggct gcttgcgtcc tacatgcgcc cgatctattc gggcgctgcg gttgcggcct cggccgtcac catcctctct ccaccctgcg acaactggat gctgcacgtc gccatcgagc agatccagcc gggcgacatt ctcgttctcg gcacgacctc tccgtccgat gccggctatt tcggtgatct gctggcgact tcggccaagg cgcgcggttg cgtcgggttg gtcatcgatg ccggcgtacg cgatatccgc gacctgacag cgatgcagtt tccggtctgg tccaaggccg tttcggccca gggcacgatc aaggagacgc tgggttcggt caacgtcccc gtcgtctgcg ccggtgctct ggtcaatccc ggcgacgtcg tcgtggccga tgacgacggt gtctgcgtgg tgcgccgcga ggaagccgcg gaaacgctgg aaaaggcccg ggcgcggatc gccaatgagg aggaaaagcg ccagcgcttt gccgctggcg aactcgggct cgacatctac aagatgcgcg aacgcctcgc tgccctgggg ctcacctatg tctga（配列番号172）。
【０７０８】
配列番号１７３のアルドラーゼのアミノ酸配列を下記に示す。
Met Lys Pro Val Val Val Gln Thr Ile Glu Arg Ala Asp Arg Ala Ile Ile Glu Gly Leu Ala Ala Cys Gly Val Ala Thr Val His Glu Ala Gln Gly Arg Arg Gly Leu Leu Ala Ser Tyr Met Arg Pro Ile Tyr Ser Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Ala Val Thr Ile Leu Ser Pro Pro Cys Asp Asn Trp Met Leu His Val Ala Ile Glu Gln Ile Gln Pro Gly Asp Ile Leu Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Ser Asp Ala Gly Tyr Phe Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Ala Lys Ala Arg Gly Cys Val Gly Leu Val Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Ile Arg Asp Leu Thr Ala Met Gln Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Val Ser Ala Gln Gly Thr Ile Lys Glu Thr Leu Gly Ser Val Asn Val Pro Val Val Cys Ala Gly Ala Leu Val Asn Pro Gly Asp Val Val Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Cys Val Val Arg Arg Glu Glu Ala Ala Glu Thr Leu Glu Lys Ala Arg Ala Arg Ile Ala Asn Glu Glu Glu Lys Arg Gln Arg Phe Ala Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Ile Tyr Lys Met Arg Glu Arg Leu Ala Ala Leu Gly Leu Thr Tyr Val（配列番号173）。
【実施例２５】
【０７０９】
配列番号１０４のアルドラーゼを用いるＲ，Ｒ−モナチンの生成：反応条件の最適化
実施例１８でクローニングしたバチルス・スファエリクス（ＡＴＣＣ株１０２０８）Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼをＰＬＰを含有するリン酸カリウム緩衝液を用いて、改善された方法を用いて、実施例１４に記載されるようにＨＩＳ６タグ付きタンパク質として精製した）。配列番号１０４のアルドラーゼ（実施例３Ｂでクローニング）は、実施例２７に記載されるようにＨＩＳ６タグ付きタンパク質として精製した。
【０７１０】
配列番号１０４のアルドラーゼに対する好ましい金属補因子は、様々な二価金属をスクリーニングすることにより決定した。反応は、７ｍＬ最終容量を有する１０ｍＬ血清ボトル中で嫌気的に設定した。１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、２００ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、および０．０１％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ８０からなるバルク溶液は、４８．８ｍＬの最終容量に調製し、３０分間窒素を噴霧した。Ｄ−トリプトファン（１４３ｍｇ；１００ｍＭの最終濃度）は７本の１０ｍＬ血清バイアルに分注した。バイアルのそれぞれに、塩化物から調製した二価金属カチオンの０．０１４ｍＬの２Ｍストック溶液を追加した（最終濃度は４ｍＭ）。ネガティブコントロールについては、０．０１４ｍＬのｄＨ２Ｏを追加した。血清バイアルはゴム隔膜を用いてキャップし、１６〜１８ゲージ針を介して窒素を噴霧した。嫌気条件下で、５．６２５ｍＬの嫌気性バルク溶液を各嫌気性血清ボトルに追加した。続いて、Ｂ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼおよび配列番号１０４のアルドラーゼは、それぞれ２ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで各血清ボトルに嫌気的に追加した。溶液は、１８時間緩やかに混合させながら室温でインキュベートした。最終モナチンは、アミノ酸の液体クロマトグラフィー−ポストカラム蛍光検出法を用いて、実施例１に記載される方法に従って分析した（表７４）。
【０７１１】
【表７４】
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【０７１２】
配列番号１０４のアルドラーゼに対する反応条件は、統計ソフトウェアＤｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ７．０．０（Ｓｔａｔ−Ｅａｓｅ，Ｉｎｃ．；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて計画した２水準一部実施要因実験を用いてさらに調査した。スクリーニング計画は４回の中心点での実行を有する２水準の５つの因子の単一ブロックからなる（全２０回実行）。最適化される５つの因子は、金属補因子濃度、反応ｐＨ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０濃度、トリプトファンに対するピルビン酸の比、およびアルドラーゼ濃度とした（表７５）。
【０７１３】
１４３ｍｇのＤ−トリプトファンを含有するコニカルポリプロピレンチューブ（１４ｍＬ）は、一晩、嫌気性グローブボックス（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ、Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ、ＭＩ）中で脱酸素した。２Ｍ  ＭｇＣｌ２のストック溶液；ｐＨ７．０、７．７５、および８．５の１Ｍリン酸カリウム；１０％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ８０；２Ｍピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ  ＰＬＰを脱気水中で調製し、嫌気性グローブボックス中で一晩平衡化した。精製Ｂ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼおよび配列番号１０４のアルドラーゼのストック溶液は、氷上で解凍し、嫌気性グローブボックス中で直ちに用いた。ストック溶液は、統計計画によって決定した濃度を得るためにＤ−トリプトファンを含有する１４ｍＬコニカルチューブに追加した（表７５）。脱気水は、最終容量を酵素追加分と共に７．０ｍＬにするために各チューブに追加した。チューブは、２４時間まで緩やかに混合させながら嫌気性グローブボックス中で室温でインキュベートした。モナチン濃度および異性体純度は、アミノ酸の液体クロマトグラフィー−ポストカラム蛍光検出法ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ反応における、モナチンの立体異性体分布の決定のためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング法（ＦＤＡＡ誘導体化法）を用いて、実施例１に記載される方法に従って分析した。
【０７１４】
【表７５】
2015211679.tif 000078
【０７１５】
データの統計分析は、反応ｐＨ、ピルビン酸：トリプトファン比、およびアルドラーゼ濃度が、モナチンタイター、異性体純度、および炭素収量に影響する有意な因子であることを示した。ディザイラビリティグラフは、過剰ピルビン酸の条件下での最も高いモナチンタイターおよび最も高い異性体純度といった目標を最大にするために因子を変えたＤｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアを用いて生成した。最適として示された反応条件は、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ＞８．０、０．０１％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および０．０１ｍｇ／ｍＬ配列番号１０４のアルドラーゼであった。これは、利用される標準的な量のアルドラーゼの５分の１の低下および通常用いられる二価金属の量の４分の１の低下となる。
【０７１６】
反応プロセスに対する至適ｐＨ範囲を決定するためにさらなる実験を行った。１Ｍ  ＥＰＰＳ緩衝液のストック溶液は、ｐＨ７．０および９．０の間で０．２ｐＨ単位の間隔で調製した。これらの溶液は、脱気し、一晩、嫌気性グローブボックス中で平衡化した。１４３ｍｇのＤ−トリプトファンを含有するポリプロピレンチューブ（１４ｍＬ）は、一晩、嫌気性グローブボックス中で脱酸素した。２Ｍ  ＭｇＣｌ２、１０％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、２Ｍピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ  ＰＬＰのストック溶液は、脱気水中で調製し、嫌気性グローブボックス中で平衡化した。精製Ｂ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼおよび配列番号１０４のアルドラーゼの調整物は、氷上で解凍し、嫌気性グローブボックス中で直ちに用いた。最終濃度が、チューブ当たりの７ｍＬの全容量中、１００ｍＭ  ＥＰＰＳ、２００ｍＭピルビン酸、１００ｍＭトリプトファン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、２ｍｇ／ｍＬ  Ｂ．スファエリクスＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ、および０．０１ｍｇ／ｍＬの配列番号１０４のアルドラーゼとなるように、ストック溶液を１４ｍＬコニカルチューブに追加した。反応は、２２時間、緩やかに撹拌しながら嫌気性グローブボックス中で室温でインキュベートした。試料は、取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング法を用いて、実施例１に記載されるようにモナチンについて分析した（表７６）。
【０７１７】
【表７６】
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【０７１８】
結果は、７．０〜８．０の間でｐＨを増加させると共にモナチン形成が増加することを示した。モナチン形成は、ｐＨ８．０〜８．２の範囲で最大に達し、ｐＨ８．４以上で減少した。さらに、モナチンの異性体純度はｐＨ８．４以上で減少した。
【実施例２６】
【０７１９】
ＡＴＣＣ株４９７８に由来するＤ−アミノトランスフェラーゼのＴ２４３Ｎ変異体の精製
アミノ末端ＨＩＳ６−精製タグを有するＡＴＣＣ株４９７８に由来するＤ−アミノトランスフェラーゼのＴ２４３Ｎ変異体（実施例６Ｂに記載される）は、振盪フラスコ中に５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（溶液１〜６）（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて生成した。この発現系は、細胞成長をモニターする必要のないＩＰＴＧ誘発性系の発現を誘発する。プラスミドｐＥＴ２８ｂ上のＡＴＣＣ株４９７８に由来するＴ２４３Ｎ変異体Ｄ−アミノトランスフェラーゼについての遺伝子を運ぶイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞の液体培養物または平板培養物のいずれかからの培地の２００ｍＬアリコートの接種の後（１Ｌフラスコ中）、培養物は、２２５ｒｐｍで振盪させながら一晩３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００が最小の６まで達すると、細胞は、遠心分離によって採取し、緩衝液を用いて１回洗浄した。
【０７２０】
無細胞抽出物は、メーカーのプロトコールに従って、１μＬ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ、５μＬ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩ、および０．０３３μＬ／ｍＬ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）を含有するＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（第一級アミンなし）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて調製した。続く精製工程はすべて４℃で行った。細胞抽出物は、細胞片を除去するために１５，０００ｘｇで２０〜３０分間遠心分離した。２０〜２５ｍＬアリコートの無細胞抽出物は、２００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５０μＭ  ＰＬＰを含有する１００ｍＭリン酸カリウムを用いて先に平衡化した、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ニッケル（ＩＩ）型）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の４５ｍＬカラムにかけた。ニッケル型の樹脂を生成するために、樹脂は、１５０ｍＬの２００ｍＭ硫酸ニッケル（ＩＩ）六水和物を用いて、次いで１５０ｍＬの蒸留水を用いて洗浄した。試料を装填した後に、カラムは、２５ｍＭイミダゾールを含有する１５０ｍＬの平衡化緩衝液、５０ｍＭイミダゾールを含有する１５０ｍＬの平衡化緩衝液、および５００ｍＭイミダゾールを含有する１５０ｍＬの平衡化緩衝液を用いて洗浄し／溶出した。ＨＩＳ６タグ付きタンパク質は最後の洗浄で溶出した。５００ｍＭイミダゾール洗浄物は、メーカーの指示に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０遠心濾過デバイス（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて１５〜２０ｍＬに濃縮した。イミダゾールおよび塩化ナトリウムは、先に５０μＭ  ＰＬＰを含有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８を用いて平衡化した、使い捨てのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＤ１０カラム（カラム当たり２．５ｍＬ試料）を通過させることによって除去した。精製アミノトランスフェラーゼは、カラム当たり３．５ｍＬの同じ緩衝液を用いて溶出した。各画分のタンパク質濃度は、タンパク質標準物質としてＢＳＡを用いて、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡアッセイキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。各画分の純度および無細胞抽出物画分中の発現のレベルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎマイクロキャピラリーチップシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてまたはＭｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）３セル装置でのＢｉｏ−Ｒａｄ  ４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲルの実行を用いて決定した。タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｇ−２５０  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を用いてポリアクリルアミドゲル中で可視化し、水を用いて脱染した。通常、この手順により、ＥｘｐｅｒｉｏｎソフトウェアによってまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析から判断されるように８５〜９０％純粋な２００ｍＬの一晩培養物から約２０ｍｇの酵素が生成される。アリコート（１〜５ｍＬ）の精製酵素は使用まで−８０℃で保存した。
【実施例２７】
【０７２１】
配列番号１０４のアルドラーゼの発現および精製
ｐＥＴ２８ｂプラスミド上に配列番号１０４のアルドラーゼについての遺伝子（遺伝子は配列番号１０３として示される）を運ぶイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主細胞のクローニングは実施例３Ｂに記載される。
【０７２２】
アミノ末端ＨＩＳ６−精製タグを有する、配列番号１０４のアルドラーゼは、振盪フラスコ中に５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（溶液１〜６）（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて生成した。この発現系は、細胞成長をモニターする必要のないＩＰＴＧ誘発性系の発現を誘発する。アルドラーゼ構築物の液体培養物または平板培養物のいずれかからの培地（１Ｌフラスコ中）の２００ｍＬアリコートの接種の後、培養物は、２２５ｒｐｍで振盪させながら一晩３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００が最小の６まで達すると、細胞は、遠心分離によって採取し、緩衝液を用いて１回洗浄した。
【０７２３】
アルドラーゼを含有する無細胞抽出物を調製するために、細胞は、３〜４倍容量の１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８中で懸濁させ、次いで、１５℃未満に懸濁液の温度を維持して、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ホモジナイザー（Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）（１８，０００ｐｓｉで３パス）を用いて破壊した。あるいは、無細胞抽出物は、メーカーのプロトコールに従って、１μＬ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ、５μＬ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩ、および０．０３３μＬ／ｍＬ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）を含有するＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（第一級アミンなし）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて調製した。続く精製工程はすべて４℃で行った。細胞懸濁液は、細胞片を除去するために１５，０００〜２０，０００ｘｇで２０〜３０分間遠心分離した。２０〜２５ｍＬアリコートの無細胞抽出物は、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭリン酸カリウムを用いて先に平衡化した、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ニッケル（ＩＩ）型）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の４５ｍＬカラムにかけた。ニッケル型の樹脂を生成するために、樹脂は、１５０ｍＬの２００ｍＭ硫酸ニッケル（ＩＩ）六水和物を用いて、次いで１５０ｍＬの蒸留水を用いて洗浄した。試料を装填した後に、カラムは、２５ｍＭイミダゾールを含有する１５０ｍＬの平衡化緩衝液、５０ｍＭイミダゾールを含有する１５０ｍＬの平衡化緩衝液、および５００ｍＭイミダゾールを含有する１５０ｍＬの平衡化緩衝液を用いて洗浄し／溶出した。ＨＩＳ６タグ付きタンパク質は最後の洗浄で溶出した。５００ｍＭイミダゾール洗浄物は、メーカーの指示に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０遠心濾過デバイス（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて１５〜２０ｍＬに濃縮した。イミダゾールおよび塩化ナトリウムは、先に１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８を用いて平衡化した、使い捨てのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＤ１０カラム（カラム当たり２．５ｍＬ試料）を通過させることによって除去した。精製アルドラーゼは、カラム当たり３．５ｍＬの同じ緩衝液を用いて溶出した。各画分のタンパク質濃度は、タンパク質標準物質としてＢＳＡを用いて、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡアッセイキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。各画分の純度および無細胞抽出物画分中の発現のレベルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎマイクロキャピラリーチップシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてまたはＭｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）３セル装置でのＢｉｏ−Ｒａｄ  ４〜１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲルの実行を用いて決定した。タンパク質は、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｇ−２５０  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を用いてポリアクリルアミドゲル中で可視化し、水を用いて脱染した。通常、この手順により、Ｅｘｐｅｒｉｏｎソフトウェアによって判断されるように８５〜９５％純粋な４０���ｍＬの一晩培養物から約５０ｍｇの酵素が生成される。アリコート（１〜５ｍＬ）の精製酵素は使用まで−８０℃で保存した。この様式における酵素の調製は、先に示した、酵素の沈殿のレベルを低下させた。保存緩衝液中のマグネシウムの存在は沈殿のレベルに影響を及ぼさなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2015211679.tif 000088
【図９Ｂ】
2015211679.tif 000089
【図１０Ａ】
2015211679.tif 000090
【図１０Ｂ】
2015211679.tif 000091
【図１１】
2015211679.tif 000092
【配列表】
2015211679000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月16日(2015.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナチンを生成するための経路におけるある反応の生成物を、モナチンを生成するための経路における他の反応の反応物として再生するための方法であって、
Ｌ−トリプトファンが反応してＩ３Ｐを生成する場合に、アルファ−ケト基質からＬ−アミノ酸を生成し、
アミノ酸ラセマーゼを用いてＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換し、
Ｉ３ＰからＭＰを生成し、
ＭＰを反応させてモナチンを形成し、次いで
ＭＰが反応してモナチンを形成する場合に、Ｄ−アミノ酸からアルファ−ケト基質を再生成することを含み、
アルファ−ケト基質は、アルファ−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸、およびその組合せから選ばれ、
アミノ酸ラセマーゼは、アルファ−ケト基質がピルビン酸である場合、アラニンラセマーゼであり、アルファ−ケト基質がアルファ−ケトグルタル酸である場合、グルタミン酸ラセマーゼであり、アルファ−ケト基質がオキサロ酢酸である場合、アスパラギン酸ラセマーゼであることを特徴とする該方法。
【請求項２】
Ｌ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成し、
Ｄ−トリプトファンからＩ３Ｐを生成し、
Ｉ３ＰからＲ−ＭＰを生成し、次いで
Ｒ−ＭＰからモナチンを生成することを含む経路を介してＲ，Ｒモナチンまたはその塩を生成することを含むことを特徴とする方法であって、
Ｌ−トリプトファンからのＤ−トリプトファンの生成は、トリプトファンラセマーゼ、トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、およびその組合せから選ばれる１つまたは複数の酵素によって促進され、
トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼは、配列番号４１に対応し、Ｙ３５４Ｃ突然変異、Ｙ３５４Ｔ突然変異、Ｙ３５４Ｇ突然変異、Ｙ３５４Ｌ突然変異、Ｙ３５４Ｎ突然変異、Ｙ３５４Ｓ突然変異、Ｙ３５４Ｉ突然変異、Ｙ３５４Ｍ突然変異、Ｙ３５４Ｐ突然変異、ならびにＹ３５４Ａ、Ｍ３５Ｖ、およびＲ１９５Ｈの突然変異の組合せから選ばれる突然変異を有するアラニンラセマーゼ、配列番号４３のアラニンラセマーゼ、配列番号４１に対応し、Ｍ３５Ｃ突然変異、Ｆ６６Ｅ突然変異、Ｙ３５４Ａ突然変異、およびＰ１９７Ｌ突然変異ならびにその組合せから選ばれる突然変異を有するアラニンラセマーゼから選ばれ、
広域特異性アミノ酸ラセマーゼは、
ａ）配列番号１２０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｙ３９６Ｃ突然変異を有する、配列番号１２０に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２８の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号１２８に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス・プチダ（シュードモナス・ストリアタとしても知られている）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６の配列を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＫＴ２４４０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オレオボランスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダ１２６３３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＳＣＲＣ７４４から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５を含む遺伝子によってコードさ���た広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、およびその活性断片、
ｂ）ａ）の広域特異性アミノ酸ラセマーゼのいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列およびその活性断片を含む酵素、
ｃ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１９によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２７によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＣＰ  ００００２０．１  ＧＩ：５９４７８７０８の領域８００８４２．．８０２０５３によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＣ＿００６８４０によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＫＴ２４４０  Ｂａｒ  ＤＮＡによってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＹ３９６Ｃ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１１９に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１２７に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５４を含む配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＺ＿ＡＡＬＭ０１０００００２ヌクレオチド５３１７３．．５４４０２によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＬ３８３Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１９３に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ならびに
ｄ）ｃ）の広域特異性アミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素
から選ばれ、
Ｒ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成は、広域特異性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼによって促進される該方法。
【請求項３】
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を有する配列を含む酵素、
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、およびバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼから選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼ、ならびに
ｄ）ａ）〜ｃ）の組合せ
から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＤ−トリプトファンをアミノ基転移することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼの存在下でモナチン前駆体を反応させて、モナチンを生成することを含み、１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼは、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せまたはその組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を含むＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素、ならびに
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、またはその組合せから選ばれる１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼ
から選ばれることを特徴とする方法。
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月21日(2015.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼの存在下でモナチン前駆体を反応させて、モナチンを生成することを含む方法であって、
１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼは、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せまたはその組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を含むＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素、ならびに
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、またはその組合せから選ばれる１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼ
から選ばれることを特徴とする該方法。
【請求項２】
該バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼが、受入番号ＮＰ−２４３６７７に挙げられるアミノ酸配列を含み；
該バチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼが、イー・コリＦ３７Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＹ９６Ｆに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＹ１６５Ｌに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１２７Ｋに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＲ９８Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１０８Ｒに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１１０Ｈに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、イー・コリＬ１２７Ｙに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、およびイー・コリＲ４１Ｋに対応する突然変異を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼから選ばれ；
ＡＴＣＣ４９７８の該Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、配列番号８６のアミノ酸配列を含み；
該ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼが、配列番号９９であり；
ＡＴＣＣ７０６３からの該Ｄ−アミノトランスフェラーゼが、配列番号８７であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モナチン前駆体がＲ−ＭＰであって、モナチンがＲ，Ｒモナチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼが、Ｒ，Ｒモナチンの生成において、インドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）へのＤ−トリプトファンの変換も促進することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【外国語明細書】
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