(57)【要約】      （修正有）【課題】ロイコ色素を含む測定用製品の保管期間にかかわらず、液体被検試料中におけるヘモグロビンＡ１ｃを測定する方法を提供する。【解決手段】（Ａ）酸化型ロイコ色素に特異的な吸収波長の光を照射し、反射光の強度を測定（Ｂ）ヘモグロビンに特異的な吸収波長の光を照射し、反射光の強度を測定（Ｃ）試料を点着し、含まれるヘモグロビンＡ１ｃとプロテアーゼおよびフルクトシルオキシダーゼとの反応により生じた過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより還元型ロイコ色素を酸化して発色させる（Ｄ）酸化型ロイコ色素に特異的な吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を２回測定（Ｅ）液体被検試料の点着後、ヘモグロビンに特異的な吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を測定（Ｆ）以上の測定値から、液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出。モグロビンＡ１ｃの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃを測定するための方法であって、
（Ａ）  プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび還元型ロイコ色素を含む分析用試験片に、液体被検試料を点着する前に、酸化型ロイコ色素に特異的な６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定する工程；
（Ｂ）  分析用試験片に、液体被検試料を点着する前に、ヘモグロビンに特異的な４００ｎｍ以上、５４０ｎｍ以下の吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定する工程；
（Ｃ）  分析用試験片に液体被検試料を点着し、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃとプロテアーゼおよびフルクトシルオキシダーゼとの反応により生じた過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより還元型ロイコ色素を酸化して発色させる工程；
（Ｄ）  液体被検試料の点着後、酸化型ロイコ色素に特異的な６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を２回測定する工程；
（Ｅ）  液体被検試料の点着後、ヘモグロビンに特異的な４００ｎｍ以上、５４０ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を測定する工程；および、
（Ｆ）  工程（Ａ）、工程（Ｂ）、工程（Ｄ）および工程（Ｅ）の測定値から、液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（Ｄ）において、分析用試験片への液体被検試料の点着から４０秒後以上、８０秒後以下に１回目の反射光強度測定を行い、かつ、１５０秒後以上、２１０秒後以下に２回目の反射光強度測定を行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析用試験片が多層構造を有し、光照射する側の最外層に還元型ロイコ色素を担持する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分析用試験片が多層構造を有し、光照射する側と反対側の最外層に液体被検試料を点着する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
還元型ロイコ色素として、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウムを用いる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体被検試料中におけるヘモグロビンＡ１ｃを迅速かつ精確に測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンは赤血球が有するタンパク質であり、酸素分子と結合する性質を有し、酸素を全身に運搬するという赤血球の重要な役割を補助する。ヘモグロビンのうち約９０％は、それぞれ２本ずつのα鎖とβ鎖からなるヘモグロビンＡ０であり、その他、β鎖のＮ末端のバリンにグルコースが共有結合したヘモグロビンＡ１ｃなどがある。ヘモグロビンＡ１ｃは、高血糖状態が長期間にわたって継続すると非酵素的に生成し、また、安定な化合物である上に、糖化ヘモグロビンの中で最も大きな割合を占めることから、その量は、赤血球の寿命のおおよそ半分に当たる時期の平均血糖値を反映する。赤血球の寿命は約１２０日であることから、ヘモグロビンＡ１ｃの量を測定することにより過去１〜２ヶ月の血糖の状態を推定できる。現在、ＮＧＳＰ（National Glycohemoglobin Standardization Program）の基準では、ヘモグロビン全体に占めるヘモグロビンＡ１ｃの割合が６．０％未満で正常であり、６．５％以上で糖尿病と診断されている。
【０００３】
臨床検査分野においては、臨床検査の結果に基づいて治療の方針を決定したり実際の治療を行うことから、高い精度と迅速さが求められる。そこで近年では、医療従事者が被験者の傍らで行う検査であるＰＯＣＴ（Point of care testing）が行われている。ＰＯＣＴはリアルタイムな臨床検査であるため、検査結果をその場で知ることができ、迅速な治療が行えることから注目を集めている。近年、糖尿病患者が急激に増加しており、ヘモグロビンＡ１ｃの測定でも、迅速かつ精確な手段が求められている。
【０００４】
ヘモグロビンＡ１ｃの測定法としては、これまでに高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）や免疫法ならびに酵素法が開発され、既に商品化されている。なかでも酵素法は大量の被検試料を迅速かつ精確に処理することが可能であることから、臨床検査分野で重用されている。
【０００５】
酵素法の測定原理は以下のものが知られている。初めに被検試料中のヘモグロビンＡ１ｃをプロテアーゼで加水分解し、次に、加水分解で生じたフルクトシルバリルヒスチジンをフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで酸化的に加水分解する。最後に、オキシダーゼ反応により生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼと色原体の反応により生じた色変化として比色定量する。
【０００６】
上記の酵素法で用いられる色素の種類としては、トリンダー試薬と呼ばれる色素やロイコ色素と呼ばれる色素が存在する。トリンダー試薬とは４−アミノアンチピリンなどのカップラーと各種トリンダー試薬との２種からなる色素であり、光や熱に対して安定である。しかし、トリンダー試薬は過酸化水素２分子に反応するため、感度が比較的低いという問題がある。
【０００７】
それに対してロイコ色素は、過酸化水素１分子に対して反応するためトリンダー試薬に比べて感度は高い。しかし、光や熱に対して不安定なため自己発色しやすく、ブランク上昇の問題がある。そこで、ロイコ色素の自己発色抑制に関して様々な検討が行われている。
【０００８】
例えば、特許文献１に記載の方法では、発色試液にシクロデキストリンまたは／およびその誘導体を共存させることにより、ロイコ色素の自己発色を抑制し安定化している。特許文献２の発明では、特定の界面活性剤と別の色素物質を含む安定化剤により、ロイコ色素の安定化を図っている。また、特許文献３の発明では、アスコルビン酸などの酸化防止剤によりロイコ色素の自己発色を長期にわたって発色抑制し、その安定化を図っている。
【０００９】
また、上記の酵素法を用いても、液状試薬に被検試料を添加して比色測定を行っていては、大量の被検試料を迅速に測定することはできない。そこで、かかるウェット系での測定方法に対して、例えば酵素や色素を含む試験片に液体被検試料を点着させ、特定波長光を照射し、その反射光の強度を測定することにより液体被検試料中のヘモグロビンＡ１ｃ値を自動的に測定するドライ系での測定技術が開発されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１−１１８７６８号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／１１６５７５号パンフレット
【特許文献３】特開２０１３−１０４００７号公報
【特許文献４】実用新案登録第３１７５９２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、ＰＯＣＴにより患者の血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃ値を迅速に測定するために、ドライ系の測定技術が開発されている。また、高感度であるが安定性に難のあるロイコ色素の安定性を高めるための技術も開発されている。
【００１２】
しかし、ロイコ色素の自己発色を完全に止めるということは不可能である。また、ウェット系のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法では、たとえロイコ色素が自己発色しても、被検試料の代わりに水につき測定を行い、被検試料の測定結果から自己発色分をブランクとして差し引くことにより、測定はいちおう可能であるといえる。それに対してドライ系の測定方法では、酵素反応が速やかに進行せずヘモグロビンＡ１ｃの量に応じた発色差が小さいため、ブランク値を差し引くということができないという問題がある。
【００１３】
また、ヘモグロビンＡ１ｃ以外の対象物質を測定するための酵素法では、酵素反応を十分に進行させ、対象物質の量に応じた値がそれ以上上がらないエンドポイントで測定を行うのが通常である。しかし、ドライ系での酵素反応は遅いため、迅速な測定が困難であった。
【００１４】
そこで本発明は、ロイコ色素を含む測定用製品の保管期間にかかわらず、液体被検試料中におけるヘモグロビンＡ１ｃを迅速かつ精確に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ヘモグロビンＡ１ｃの濃度は、エンドポイントアッセイに比べてレートアッセイの方が迅速に測定できるのみならず、より精確な測定が可能になることを見出して、本発明を完成した。
【００１６】
本発明に係る液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、
（Ａ）  プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび還元型ロイコ色素を含む分析用試験片に、液体被検試料を点着する前に、酸化型ロイコ色素に特異的な６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定する工程；
（Ｂ）  分析用試験片に、液体被検試料を点着する前に、ヘモグロビンに特異的な４００ｎｍ以上、５４０ｎｍ以下の吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定する工程；
（Ｃ）  分析用試験片に液体被検試料を点着し、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃとプロテアーゼおよびフルクトシルオキシダーゼとの反応により生じた過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより還元型ロイコ色素を酸化して発色させる工程；
（Ｄ）  液体被検試料の点着後、酸化型ロイコ色素に特異的な６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を２回測定する工程；
（Ｅ）  液体被検試料の点着後、ヘモグロビンに特異的な４００ｎｍ以上、５４０ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を測定する工程；および、
（Ｆ）  工程（Ａ）、工程（Ｂ）、工程（Ｄ）および工程（Ｅ）の測定値から、液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
上記の工程（Ｄ）において、分析用試験片への液体被検試料の点着から４０秒後以上、８０秒後以下に１回目の反射光強度測定を行い、かつ、１５０秒後以上、２１０秒後以下に２回目の反射光強度測定を行うことが好ましい。この範囲で２回の測定を行えば、より精確な測定が可能になる。
【００１８】
上記の分析用試験片としては、多層構造を有し、光照射する側の最外層に還元型ロイコ色素を担持するものが好ましく、また、光照射する側と反対側の最外層に液体被検試料を点着するものが好ましい。かかる分析用試験片を用いれば、反射光強度の測定をより精確に行うことができる。
【００１９】
上記の還元型ロイコ色素としては、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウムを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法によれば、ロイコ色素の経時的な自己発色による測定精度の低下を改善でき、従来方法に比べ、血液検体などの液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を迅速かつ精確に測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明方法を実施することができる装置の一例を示す図である。図１中、１ａは試験片装着部であり、２（２ａ）は発光部であり、３（３ａ）は受光部であり、４は演算部であり、５は液体被検試料点着部であり、７は表示モニターであり、１００は測定装置であり、２００ａは分析用試験片である。
【図２】図２は、本発明方法を実施することができる装置の一例を示す図である。図２中、１は試験片装着部であり、５は液体被検試料点着部であり、６は電源スイッチであり、７は表示モニターであり、１００は測定装置であり、２００は分析用試験片である。
【図３】図３は、液体被検試料を点着する分析用試験片を保存した場合の経時的な自己発色変化を示すグラフである。
【図４】図４は、酵素反応を経た血液検体に照射した波長４７０ｎｍの光の反射光の強度の経時的変化を示すグラフである。
【図５】図５は、酵素反応を経た血液検体に照射した波長６６０ｎｍの光の反射光の強度の経時的変化を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明方法で測定した血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度と、実際のヘモグロビンＡ１ｃの濃度との相関関係を示すグラフである。
【図７】図７は、エンドポイントアッセイのみで測定した血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度と、実際のヘモグロビンＡ１ｃの濃度との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を工程ごとに詳細に説明する。なお、本明細書において「測定」、「分析」、「定量」の語は特に断らない限り同義であるとする。
【００２３】
工程（Ａ）  ロイコ色素に関係するブランク測定工程
本工程では、プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび還元型ロイコ色素を含む分析用試験片に、液体被検試料を点着する前に、酸化型ロイコ色素に特異的な６３０ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定する。即ち、いわゆるブランク測定を行うことにより、より精確な測定を可能にする。
【００２４】
＜分析用試験片＞
本発明方法で用いる分析用試験片は、プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび還元型ロイコ色素が基材上に担持されている構造を有しており、液体被検試料を点着した場合、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃとこれら酵素との反応の場となるものである。
【００２５】
分析用試験片を構成する基材は、上記酵素を担持することができ且つ点着した液体被検試料を分散できるものであれば特に制限されない。例えば、基材の原料としては、親水性の繊維を挙げることができる。
【００２６】
基材の原料である親水性の繊維は、特に限定されない。例えば、綿、麻、毛、絹などの天然繊維や、レーヨン、キュプラなどの再生繊維などが例示できる。あるいは、疎水性の繊維を親水加工処理したものでもよい。親水加工処理を施すことにより、酵素などを均一に含浸することができ、加えて、分析用試験片中に展開された液体被検試料を速やかに吸収し、ヘモグロビンＡ１ｃと酵素との反応を阻害しない高分子基材を得ることができる。疎水性繊維に属するものとしては、例えば、ポリエステル系、ポリエーテルスルホン系、ポリ塩化ビニル系、ポリウレタン系、アクリル系またはナイロン系の高分子を用いた合成繊維が挙げられる。
【００２７】
詳細には、ポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリブチレンナフタレート（ＰＢＮ）等；オレフィン樹脂であるポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブテン等；ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等；アクリル樹脂；アクリレート樹脂；フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）等；ポリカーボネート樹脂；ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）等；ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等；セルロース類であるセルロースアセテート、ニトロセルロース、再生セルロース等が挙げられる。これらの中では、加工のしやすさと価格の観点からポリエステル樹脂が好ましい。
【００２８】
なお、基材の原料である繊維は単独の上記樹脂からなるものであってもよいし、複数の上記樹脂の組合せからなるものであってもよいし、上記繊維を一部含む組成物であってもよい。
【００２９】
分析用試験片の原料として疎水性の繊維を親水加工したものを用いる場合、その親水加工に用いる物質は特に限定されない。例えば親水性ポリマーが例示できる。親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリエステルポリエーテルブロック共重合体からなる群の中から選ばれるものを用いることが好ましい。中でも、ポリエチレングリコールとポリエチレンテレフタレートのブロック共重合からなる親水性ポリマーが一般的である。
【００３０】
また、上記繊維の原糸に使用するポリマー中には、抗菌性、難燃性、吸湿性、吸水性等の機能性を有する種々の機能剤や、共重合物、さらには艶消し剤等が複数含有されていても構わない。
【００３１】
分析用試験片の原料である繊維は、異形断面糸であってもよい。異形断面糸とは、横断面が円形でない繊維を意味する。異形断面糸からなる分析用試験片は、通常の糸の場合に比べ、液体被検試料の展開速度が速いという効果を有する。
【００３２】
本発明で用いる異形断面糸の形状は、特に限定されない。代表的な形状としては、三角形、四角形、五角形、六角形などの多角形、Ｙ字形、Ｔ字形、Ｈ字形、Ｕ字形、Ｗ字形等を挙げることができる。中でも、Ｙ字形断面からなるポリエステル異形断面糸（例えば、特開２００３−３３２８号公報に報告されている）が好ましい。
【００３３】
分析用試験片の基材は、液体被検試料を、その点着部分からみて同一平面上（本明細書では、便宜上「水平方向」または「ＸＹ方向」という）および垂直方向（前記「水平方向」に対して垂直な方向のことを言う。「Ｚ方向」ともいう）に適切に展開できるものであれば、いかなる形態にも限定されないが、シート構造体であることが好ましい。例えば、織物、編物、不織布など種々の形態をとることができる。中でも平織りの織物は、糸が経方向、緯方向とも均一に配置されることにより液体の水平面への展開性が均一になるため、編み物や、撚糸を使用した織物を用いた場合と比較して、毛細管現象による液体試料の移動がスムーズになり、さらに好ましい。
【００３４】
本発明方法で用いる分析用試験片は、プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび還元型ロイコ色素が基材上に担持されている構造を有している。
【００３５】
本発明に用いるプロテアーゼとしては、ヘモグロビンＡｃ１の糖化されたβ鎖Ｎ末端に作用してフルクトシルバリルヒスチジンを切り出すものであれば、いかなる種類のプロテアーゼを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。以下にプロテアーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００３６】
動物由来のプロテアーゼとしては、ファクターＸａ（ｆａｃｔｏｒＸａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、スロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ｌｅｕｃｉｎａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、パンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）、エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモトリプシンＡ（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎＡ）、アミノペプチダーゼＭ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＭ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＢ）、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ）、カテプシンＣ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＣ）、カテプシンＤ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｒｇ−Ｃ）等が挙げられる。 
【００３７】
植物由来のプロテアーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＷ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＷ）、カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、フィシン（ｆｉｃｉｎ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、キモパパイン（ｃｈｉｍｏｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等が挙げられる。
【００３８】
微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）、プロテイナーゼＮ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＮ）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ；ＩＰ酵素等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ；プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ；プロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ；ペプチダーゼＲ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅＲ）等に代表されるリゾバス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来プロテアーゼ；カルボキシペプチダーゼＰ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＰ）、ＰＤ酵素等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＧｌｕ−Ｃ）等に代表されるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来プロテアーゼ；クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）等に代表されるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＬｙｓ−Ｃ）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ；メタロエンドペプチダーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるグリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）由来プロテアーゼ；カルボキシペプチダーゼＹ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＹ）、プロテイナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ）等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ；アミノペプチダーゼＴ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＴ）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来プロテアーゼ；リジルエンドペプチダーゼ（ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）、アクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３９】
これらの中でも、安定性、反応性、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のプロテアーゼが好ましく、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。市販品としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＩＩ（シグマ社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶ、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼのプロテイナーゼＫ（ロシュ社製）等が好適に用いられる。
【００４０】
これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃをより精確に測定するとの観点から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶがより好適に用いられる。
【００４１】
前記プロテアーゼは、目的とする活性が発現すれば精製物であっても粗精製物であってもよい。また、遺伝子操作により調製されたものでもよく、化学修飾の有無も問わない。さらに、前記プロテアーゼは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４２】
前記プロテアーゼの濃度は特に限定されないが、例えばシート状の分析用試験片に対して０．１Ｕ／ｃｍ2以上、１００００Ｕ／ｃｍ2以下であることが好ましく、１Ｕ／ｃｍ2以上、１０００Ｕ／ｃｍ2以下がより好ましい。プロテアーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ2より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、プロテアーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ2より多いと、バックグラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００４３】
本発明に用いるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、公知文献では「フルクトシルアミンオキシダーゼ」、「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」、「フルクトシルペプチドオキシダーゼ」、「フルクトシルアミン酸化酵素」、「フルクトシルアミノ酸酸化酵素」、「フルクトシルペプチド酸化酵素」、「糖化アミンオキシダーゼ」、「糖化アミノ酸オキシダーゼ」、「糖化ペプチドオキシダーゼ」、「糖化アミン酸化酵素」、「糖化アミノ酸酸化酵素」、「糖化ペプチド酸化酵素」、「アマドリアーゼ」、「ケトアミンオキシダーゼ」、「ケトアミン酸化酵素」等、種々の名称で呼ばれている。
【００４４】
本発明に用いるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、プロテアーゼの作用によりヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端から切り離されたフルクトシルバリルヒスチジンに基質特異的に作用し、過酸化水素を生成する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよい。以下にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００４５】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）由来酵素、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来酵素、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）由来酵素、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）由来酵素、大腸菌由来酵素、酵母属デバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）由来酵素、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来酵素等が挙げられる。
【００４６】
これらの中でも、安定性、反応性（フルクトシルバリルヒスチジンの酸化速度）、入手の容易性、価格等の理由から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることが好ましく、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。
【００４７】
これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃをより精確に測定できるとの観点から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがさらに好ましい。
【００４８】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、目的とする活性が発現すれば精製物であっても粗精製物であってもよい。また、遺伝子操作により調製されたものでもよく、化学修飾の有無も問わない。さらに、前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、例えばシート状の分析用試験片に対して０．０１Ｕ／ｃｍ2以上、１０００Ｕ／ｃｍ2以下であることが好ましく、０．１Ｕ／ｃｍ2以上、１００Ｕ／ｃｍ2以下がより好ましい。フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ2より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ2より多いと、バックグラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００５０】
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、フルクトシルバリルヒスチジンの存在とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの作用により生じた過酸化水素と還元型ロイコ色素との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡社製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡社製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡社製）等が好適に用いられる。
【００５１】
前記ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、例えばシート状の分析用試験片に対して０．０１Ｕ／ｃｍ2以上、１０００Ｕ／ｃｍ2以下であることが好ましく、０．１Ｕ／ｃｍ2以上、１００Ｕ／ｃｍ2以下がより好ましい。ペルオキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ2より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、ペルオキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ2より多いと、バックグラウンドの上昇や高価格化の恐れがある。
【００５２】
本発明で用いる還元型ロイコ色素は、フルクトシルバリルヒスチジンの存在とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの作用により生じた過酸化水素とペルオキシダーゼの作用により酸化されて発色するものであれば特に制限されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
【００５３】
これらの中でも、モル吸光係数、極大吸収波長等の理由から、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）および１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）が好ましく、ＤＡ６７がより好ましい。
【００５４】
酸化型ロイコ色素の極大吸収波長は、６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下であることが好ましく、６３０ｎｍ以上、７５０ｎｍ以下がより好ましく、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以下が特に好ましい。ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、極大吸収波長が６００ｎｍより低波長側であると、酸化還元系発色試薬の発色スペクトルとヘモグロビンの発色スペクトルとが重なるため、感度が低下する恐れがある。一方、極大吸収波長が８００ｎｍより高波長側であると、検出機器が大型化する恐れがある。
【００５５】
還元型ロイコ色素の濃度は特に限定されないが、例えばシート状の分析用試験片に対して０．０００１ｍｇ／ｃｍ2以上、１０ｍｇ／ｃｍ2以下であることが好ましく、０．００１ｍｇ／ｃｍ2以上、１ｍｇ／ｃｍ2以下がより好ましい。還元型ロイコ色素濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ2より少ないと、感度が低下する恐れがある。一方、還元型ロイコ色素濃度が１０ｍｇ／ｃｍ2より多いと、バックグラウンドの上昇や高価格化の恐れがある。
【００５６】
その他、分析用試験片には、必要に応じて上記酵素と還元型ロイコ色素以外の成分を担持してもよい。例えば、血液試料中の血球等の固形成分を溶血するためや、液体被検試料を速やかに展開させるために、界面活性剤を用いてもよい。
【００５７】
界面活性剤の種類は特に制限されないが、非イオン界面活性剤を用いることができる。また、界面活性剤は、単独で用いても二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−ｐ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  ソルビタン  アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン  アルキル  エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等が挙げられる。具体的には、十分な溶血効果、および血液試料の展開性向上効果を有するという点で、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  ｘ−１００）、１，１，３，３−テトラメチルブチル  フェニル−ポリエチレングリコール（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１１４）、ポリオキシエチレンｐ−ノニルフェニルエーテル（ノニデット（登録商標）  Ｐ−４０）が好ましい。
【００５９】
前記界面活性剤の親水親油バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂｌａｎｃｅ：ＨＬＢ）は、１０以上、２０以下であることが好ましく、１２以上、２０以下がより好ましく、１４以上、２０以下がさらに好ましい。ＨＬＢ値が１０より小さいと、十分な溶血効果と展開性向上効果が得られない恐れがある。一方、ＨＬＢ値が２０より大きい界面活性剤は、ＨＬＢの定義上存在しない。
【００６０】
前記界面活性剤の濃度は特に限定されないが、例えばシート状の分析用試験片に対して下限は０．００１ｇ／ｍ2、上限は１ｇ／ｍ2であることが好ましい。界面活性剤濃度が０．００１ｇ／ｍ2より少ないと、十分な溶血効果と展開性向上効果が得られない恐れがある。一方、界面活性剤濃度を１ｇ／ｍ2より多くしても、効果が飽和する恐れがある。さらに好ましい下限は０．０１ｇ／ｍ2であり、さらに好ましい下限は０．０２ｇ／ｍ2である。さらに好ましい上限は０．１ｇ／ｍ2であり、さらに好ましい上限は０．０６ｇ／ｍ2であり、さらに好ましい上限は０．０４ｇ／ｍ2である。
【００６１】
また、分析用試験片には、各酵素反応が好適に進行するよう緩衝剤を担持してもよい。本発明に用いることができる緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していればいかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
【００６２】
これらの中でも、本発明に用いるプロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの至適ｐＨ範囲である６．０以上、８．５以下、より好ましくは６．０以上、７．５以下において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳがより好ましい。
【００６３】
前記緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、例えばシート状の分析用試験片に対して０．１μｇ／ｃｍ2以上、上限は２０μｇ／ｃｍ2以下程度が好ましい。
【００６４】
分析用試験片に担持してもよい上記酵素、還元型ロイコ色素、界面活性剤および緩衝剤以外の試薬としては、例えば、必要に応じてヘモグロビンの酸化剤（フェロシアン化物、アジ化物、亜硝酸塩、硝酸塩等）、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム等）、酵素安定化剤（単糖類、オリゴ糖類、多糖類、糖アルコール、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類、アルブミン類、グロブリン類、繊維性タンパク質等）、酸化還元系発色試薬安定化剤（シクロデキストリン類、還元性チオアルコール類、還元性硫酸塩類等）を挙げることができる。これらは、単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６５】
分析用試験片は一層からなるものであってもよいが、二層以上の多層からなるものが好ましい。例えば、固相状態にあるとはいえ分析用試験片中でペルオキシダーゼと還元型ロイコ色素が接触していると、還元型ロイコ色素が酸化されて自己発色が促進されるおそれがある。しかし分析用試験片を多層で構成してペルオキシダーゼと還元型ロイコ色素を別々の層に担持させ、液体被検試料を点着した場合にその水分により混合されて反応が進行するようにすれば、より精度の高い測定が可能になる。また、全酵素反応や一部の酵素反応の前に、液体被検試料を分析用試験片中で十分に拡散させるための展開層を設ければ、発色ムラが抑制され、やはりより精度の高い測定が可能になる。
【００６６】
例えば、分析用試験片を二層で構成し、液体被検試料を点着する側の層には、液体被検試料を十分に展開するため少なくとも界面活性剤を担持させ、当該層とは逆側の層、即ち特定波長光を照射する側の層には、測定精度を高めるために少なくとも還元ロイコ色素を担持させ、また、液体被検試料を点着する側の層には特定波長光を照射する側の層に存在する還元ロイコ色素との接触を避けるべく、ペルオキシダーゼを担持させる。なお、酵素や試薬を層間で分離して担持しても、液体被検試料を点着した場合にはその含有水分により各試薬は混合され、各酵素反応の進行が可能になる。
【００６７】
以下、多層構造の分析用試験片において、液体被検試料を点着する側の層を「展開層」といい、還元型ロイコ色素が担持されており、特定波長光を照射する側の層を「反応層」という。但し、反応層は、還元型ロイコ色素を最外層に担持する限り、さらに二層以上の多層構造からなる複数層にしてもよい。また、上記展開層と反応層以外に、透明支持層など、さらに任意の数の層を含んでもよい。さらに、展開層にプロテアーゼやペルオキシダーゼが担持されており、展開層で還元型ロイコ色素の酸化反応以外の反応が進行してもよいものとする。
【００６８】
これらをすべて含めた、多層の分析用試験片の層数は、実施形態に合わせて変化し得るが、２層以上、７層以下が好ましく、２層以上、６層以下がより好ましく、２層以上、５層以下がさらに好ましい。一方、層数が７層より多いと、最上層から最下層まで展開するのに必要な測定試料量が多くなるため、好ましくない。
【００６９】
分析用試験片は、任意の手順を用いて作製することができる。例えば、乾燥後の各試薬の濃度が所望のものとなるように溶液を調製し、基材を含浸した後に乾燥すればよい。また、多層の分析用試験片は、各層を上記のとおり別個に作製し、次いで最終的な試験片に組み立てればよい。
【００７０】
なお、多層の分析用試験片において、展開層は液体被検試料を十分に展開させるため、上記のとおり親水性繊維または親水加工した繊維を原料として用い、さらに界面活性剤を担持させることが好ましいが、反応層はこの限りでない。例えば、反応層の基材は展開層の基材と同様のものとすることができるが、ろ紙、布帛（織物、編物、不織布など）などの繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等の自立可能なものや、高分子ゲル等の自立不可能なものとすることもできる。
【００７１】
＜ブランク測定＞
本工程では、液体被検試料の点着前に、酸化型ロイコ色素に特異的な吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定することにより、いわゆるブランク測定を行う。本工程を行うことにより、より精確な測定が可能になる。
【００７２】
酸化型ロイコ色素の極大吸収波長は、通常、６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の範囲内である。より好ましくは６３０ｎｍ以上、７５０ｎｍ以下、特に好ましくは６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以下に吸収波長を有する酸化型ロイコ色素を選択し、当該酸化型ロイコ色素の極大吸収波長を有する光を照射することが好ましい。特に、ヘモグロビンに特異的な吸収波長は比較的短波長であることから、酸化型ロイコ色素濃度を測定するために照射する光の波長はより長波長のものを選択することが好ましい。なお、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）の酸化型の極大吸収波長は６６０ｎｍである。
【００７３】
なお、本工程の測定値、即ち上記照射光の反射光の強度は、分析用試験片における還元型ロイコ色素が酸化型ロイコ色素となって自己発色する割合が大きい程、小さくなる。
【００７４】
工程（Ｂ）  ヘモグロビンに関係するブランク測定工程
本工程では、上記分析用試験片に、液体被検試料を点着する前に、ヘモグロビンに特異的な４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を照射し、その反射光の強度を測定する。なお、ヘモグロビンを含む液体被検試料の点着前であれば、ヘモグロビンに特異的な吸収波長の光を照射しても、吸収はされないはずである。しかし、分析用試験片に上記範囲に含まれる波長の光を吸収する物質が含まれている可能性があることから、かかるブランク測定を行う。即ち、ヘモグロビンに「特異的」とは、例えば照射光がロイコ色素などに大きく吸収されるなど、測定結果に有意に悪影響を及ぼすほどヘモグロビン以外の物質に吸収されないといった意味であり、測定結果に有意に悪影響を及ぼさない限り、他の物質に吸収されてもよいものとする。本工程により、より精確な測定が可能になる。
【００７５】
ヘモグロビンは、一般的に５４０ｎｍと５７８ｎｍに極大吸収波長を有するが、５４０ｎｍや５７８ｎｍの波長の光を照射すると、酸化型ロイコ色素濃度の測定に影響するおそれがある。そこで、４００ｎｍ以上、５４０ｎｍ以下の波長の光を照射することが好ましい。当該波長としては、４３０ｎｍ以上、５２０ｎｍ以下がより好ましく、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下が特に好ましい。
【００７６】
工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、別々に実施してもよいし、同時に実施してもよい。即ち、上記２種の波長の光は、分析用試験片に対して別々に照射してそれぞれの反射光強度を別々に測定してもよいし、同時に照射してそれぞれの反射光強度を同時に測定してもよい。好適には、効率の面から、適切な測定装置を用い、同時に照射してそれらの反射光強度を同時に測定することが好ましい。
【００７７】
測定された各反射光強度は、液体被検試料の点着後における測定結果の補正のために記録しておく。
【００７８】
工程（Ｃ）  酵素反応工程
酵素法による生体成分測定方法として、「酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬（以下、「発色剤」とも表記する。）」系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法が、既に当該技術分野において確立されている。
【００７９】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法においては、後述のように、ヘモグロビンＡ１ｃを基質とするプロテアーゼの反応で生じた糖化ペプチド（フルクトシルバリルヒスチジン）を、さらにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系によるヘモグロビンＡ１ｃ濃度の測定を可能にしている。
【００８０】
本工程では、プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび還元型ロイコ色素を含む分析用試験片に液体被検試料を点着し、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃとプロテアーゼおよびフルクトシルオキシダーゼとの反応により生じた過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより還元型ロイコ色素を酸化して発色させる。
【００８１】
＜液体被検試料＞
本発明方法は、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃを測定するものであり、より詳しくは、液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を求めるものであることから、ヘモグロビンＡ１ｃを測定すべきものであれば特に制限されない。
【００８２】
液体被検試料としては、例えば、血液、血清などをあげることができる。なお、ヘモグロビンは赤血球の内部に含まれているので、界面活性剤で処理するといった溶血処理を事前に行ってもよい。
【００８３】
本発明方法は、いわゆるドライ系でヘモグロビンＡ１ｃを測定するものである。よって、液体被検試料がそのまま酵素反応の場となるよう、液体被検試料は流動性を有している必要がある。被検試料が液体でない場合や十分な流動性を有していない場合には、水、生理食塩水、緩衝液などに溶解または分散して液体被検試料としてから測定する。
【００８４】
液体被検試料の由来は特に制限されず、ヒトのみならず、イヌ、ネコ、ウシなどの愛玩動物や家畜などに由来するものも分析対象である。
【００８５】
分析用試験片に点着すべき液体被検試料の量は、特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば１μＬ以上、５０μＬ以下が好ましい。試料量が１μＬより少ないと、分析用試験片の試料点着部から最下部層まで試料が展開できない恐れがある。一方、試料量が５０μＬより多いと、例えば測定試料が血液の場合、患者の負担が大きくなるため好ましくない。当該量としては、１μＬ以上、４０μＬ以下がより好ましく、１μＬ以上、３０μＬ以下がさらに好ましい。
【００８６】
＜酵素反応＞
ヘモグロビンＡ１ｃを含む液体被検試料を分析用試験片に点着すると、液体被検試料が分析用試験片内に展開し、分析用試験片に担持されていた各試薬が液体被検試料に溶解し、酵素反応が進行する。
【００８７】
液体被検試料の点着後、分析用試験片の内部では、以下の反応が進行する：
（ｉ）  界面活性剤により液体被検試料中の赤血球が溶血し、ヘモグロビンＡ１ｃを含むヘモグロビンが放出される；
（ｉｉ）  プロテアーゼの作用により、ヘモグロビンＡ１ｃの糖化されたβ鎖Ｎ末端からフルクトシルバリルヒスチジンが切り出される；
（ｉｉｉ）  フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの作用により、遊離したフルクトシルバリルヒスチジンが酸化され、過酸化水素が発生する；
（ｉｖ）  生成した過酸化水素とペルオキシダーゼにより、還元型ロイコ色素が酸化されて発色する。
【００８８】
工程（Ｄ）  ヘモグロビンＡ１ｃの測定工程
本工程では、分析用試験片に液体被検試料を点着した後、酸化型ロイコ色素に特異的な６３０ｎｍ以上、７００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、その反射光の強度を２回測定する。測定値の変化量から、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃの量や濃度を把握することができる。
【００８９】
具体的には、上記工程（Ｃ）の酵素反応によって、還元型ロイコ色素は酸化型となって発色し、分析用試験片は呈色する。本工程では、呈色した分析用試験片に、ヘモグロビンには吸収されず、酸化型ロイコ色素に特異的に吸収される波長の光を照射し、その反射光の強度を測定する。
【００９０】
照射光の波長は、分析用試験片に担持された還元型ロイコ色素の酸化型に特異的な吸収波長であり、ヘモグロビンの測定に影響を与えないものであって、通常、６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下、より好ましくは６３０ｎｍ以上、７５０ｎｍ以下、特に好ましくは６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以下とする。また、かかる照射光は、上記工程（Ａ）で用いた照射光と同一の波長とする。
【００９１】
酸化型ロイコ色素の生成に応じて上記照射光が吸収されるため、照射光の強度に比べて反射光の強度は低減される。酸化型ロイコ色素の生成度合いは液体被検試料中のヘモグロビンＡ１ｃの含有量に依存するので、反射光強度を測定することによりヘモグロビンＡ１ｃの量を把握できる。
【００９２】
比色定量する方法には、大別して、エンドポイント法とレート法の２通りがある。理想的には、酵素の基質濃度を測定する場合、基質に対して酵素を十分量添加し、すべての基質に対して酵素反応を十分に進行させた上で発色度合いを測定するエンドポイント法が推奨される。また、酵素の濃度を測定する場合、一定の間、酵素が最大速度（Ｖmax）で継続して反応できる程度に、酵素に対して過剰量の基質を添加し、その設定範囲内で、単位時間あたりの発色度合いの変化を測定するレート法が推奨される。
【００９３】
しかしながら、反応終了まで十分な時間を確保できない、あるいは、コスト削減のため十分量の酵素や基質を添加できない等の事情により、上記の原則にとらわれることなくアッセイ条件を設定することもよく行われる。
【００９４】
例えば本発明の場合、ヘモグロビンＡ１ｃの上記酵素反応の進行は遅く、ドライ系では反応の進行はより一層遅い。そのため、反応タイムコースは、ある時間範囲内では、見かけ上単位時間あたりの発色度合いの変化が一定とみなせる。そこで、本発明方法では、測定された反射光強度の変化からレートアッセイにより液体被検試料中のヘモグロビンＡ１ｃの濃度を測定することにより、測定精度の向上を図っている。
【００９５】
上記反射光強度の測定時期は、レートアッセイにより液体被検試料中のヘモグロビンＡ１ｃの量に応じた反射率変化を精度良く測定できる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、分析用試験片への液体被検試料の点着から４０秒後以上、８０秒後以下に１回目の反射光強度測定を行い、かつ、１５０秒後以上、２１０秒後以下に２回目の反射光強度測定を行うことが好ましい。１回目の測定時期が点着から４０秒後未満であると、呈色速度が早過ぎる時期であり、精確な測定ができなくなる恐れがあり得る。一方、１回目の測定時期が点着から８０秒後超であると、迅速な測定の妨げになり得る。また、２回目の測定時期が点着から１５０秒後未満であると、１回目の測定との時期的差が小さ過ぎ、精確な測定ができなくなる恐れがあり得る。一方、１回目の測定時期が点着から２１０秒後超であると、迅速な測定の妨げになり得る。
【００９６】
＜測定装置＞
本発明方法を実施するための測定装置は、分析用試験片に特定波長光を照射することができ、且つその反射光の強度を測定できるものであれば特に制限されない。例えば、図１および図２に示す測定装置１００を用いる方法が例示される（特開２０１２−１３７４９９号公報）。測定装置１００は、分析用試験片２００を装着部１に固定でき、かつ、固定した試験片の温度制御が可能な測定装置であって、該試験片に対して、試験片の液体被検試料点着面とは反対側の面（反応層が露出している面）に向かってロイコ色素に特異的な吸収波長の光を照射でき、さらには、照射した光が反応層に反射した光を受光できるように発光素子２および受光素子３を配置してあり、得られた測光値を経時的に測定することができるよう設計されている。
【００９７】
分析用試験片を測定装置の挿入口に設置し、電源をＯＮにして発光素子と受光素子とを連動させ、発光素子から特定波長の光を照射する。液体被検試料を分析用試験片に点着させることで試薬との反応が開始する。ヘモグロビンＡ１ｃと総ヘモグロビンの濃度は、液体被検試料が浸透した分析用試験片の呈色度合いを反射光として測定し、得られた反射率から後記の式（Ｉ）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換によりＫ／Ｓ値を算出し、酸化還元系発色試薬の濃度からヘモグロビンＡ１ｃの濃度を算出することができる。
【００９８】
本明細書において「多層試験片を含むプロダクト」とは、使用者が本発明方法により測定を実行する目的で用いる１システムのうち一部または全部を構成する製品形態であって、本発明の分析用試験片を含むもの、本発明の試験片を使用することを前提とするもの、本発明方法の実施に使用するものなどを包含する。従って、本発明のプロダクトは、分析用試験片のほか、該試験片を消耗品として使用する測定機器、あるいは分析対象物測定システム全体に及ぶ。
【００９９】
工程（Ｅ）  ヘモグロビンの測定工程
本工程では、分析用試験片に液体被検試料を点着した後、ヘモグロビンに特異的な４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、反射光強度を測定する。測定された値から、液体被検試料に含まれる総ヘモグロビンの量や濃度を把握することができる。
【０１００】
液体被検試料中に含まれる総ヘモグロビン量に応じて上記照射光が吸収されるため、照射光の強度に比べて反射光の強度は低減される。なお、上記工程（Ｃ）においてはプロテアーゼの作用によりヘモグロビンＡ１ｃが分解され、その他のヘモグロビンも分解される可能性はあるが、本発明においては、その分解量は総ヘモグロビン量に対してわずかであるとして考慮しないものとする。
【０１０１】
よって、本工程の実施時期は特に問わないが、上記工程（Ｃ）の酵素反応後であってもよく、上記工程（Ｄ）と同時に行ってもよい。但し、少なくとも液体被検試料が分析用試験片の光照射部分に到達してから上記照射光を照射してその反射光の強度を測定することが好ましい。本工程（Ｅ）を上記工程（Ｄ）と同時に行う場合には、分析用試験片に液体被検試料を点着した後、酸化型ロイコ色素に特異的な６３０ｎｍ以上、７００ｎｍ以下の吸収波長を有する光と、ヘモグロビンに特異的な４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下の吸収波長を有する光を分析用試験片に照射し、それぞれの反射光強度を測定する。その際、各照射光とその反射光は、互いに影響し合うことが無いので同時測定が可能である。
【０１０２】
工程（Ｆ）  ヘモグロビンＡ１ｃ／総ヘモグロビン比の算出工程
本工程では、工程（Ａ）、工程（Ｂ）、工程（Ｄ）および工程（Ｅ）での測定値から、液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出する。本工程で得られた数値は、そのまま糖尿病の診断の指標になる。液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を各測定値から求める方法としては、例えば、以下を挙げることができる。
【０１０３】
（Ｆ−１）  酸化型ロイコ色素の生成量に基づくＫ／Ｓ値の変化量
ここでは、液体被検試料に含まれるヘモグロビンＡ１ｃの濃度に対応する値を求める。
【０１０４】
まず、工程（Ｄ）の１回目の測定値を工程（Ａ）のブランク測定値で除して、１回目の測定における反射率を算出する。なお、ここでは、工程（Ｄ）の測定値から工程（Ａ）の測定値を差し引くのではなく、工程（Ａ）の測定値に対する工程（Ｄ）の測定値の割合、即ち工程（Ｄ）の反射光の反射率を求めていることから、酵素反応の進行が遅いドライ系であっても、精確な測定が可能になっている。
【０１０５】
次いで、上記反射率を下記式（Ｉ）によりＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換してＫ／Ｓ値を算出することが好ましい。一般的に、反射光強度による呈色度合の測定では、呈色度合が高いほど反射光強度が小さくなる。しかし反射率をＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換した場合には、呈色程度が高いほどＫ／Ｓ値も高くなる。即ち、上記の反射率から算出されたＫ／Ｓ値は、測定時における試料中の酸化型ロイコ色素の濃度を反映している。
Ｋ／Ｓ値＝［（１−Ｒ）2］／（２×Ｒ）  ・・・  （Ｉ）
【０１０６】
また、工程（Ｄ）の２回目の測定値も同様に処理して、Ｋ／Ｓ値を算出する。
【０１０７】
工程（Ｄ）における２回目の測定に係るＫ／Ｓ値と１回目の測定に係るＫ／Ｓ値との差から、変化量を算出する。
【０１０８】
液体被検試料中におけるヘモグロビンＡ１ｃの量に応じた反射率Ｒ（％）の変化量は、｛｜（２回目の測定値）−（１回目の測定値）｜／（ブランク測定値）｝×１００でまとめて算出することができる。
【０１０９】
（Ｆ−２）  総ヘモグロビンに基づくＫ／Ｓ値
液体被検試料に含まれる総ヘモグロビンの濃度に対応する値を求めるために、工程（Ｅ）の測定値を工程（Ｂ）のブランク測定値で除して、反射率を算出する。得られた反射率を上記式（Ｉ）に代入し、Ｋ／Ｓ値を求める。
【０１１０】
（Ｆ−３）  総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合
次に、上記（Ｆ−１）で求めたヘモグロビンＡ１ｃ濃度に関係するＫ／Ｓ値の変化量と、上記（Ｆ−２）で求めた総ヘモグロビン濃度に関係するＫ／Ｓ値から、液体被検試料における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出する。
【０１１１】
具体的には、上記（Ｆ−１）で求めたヘモグロビンＡ１ｃ濃度に関係するＫ／Ｓ値の変化量を、上記（Ｆ−２）で求めた総ヘモグロビン濃度に関係するＫ／Ｓ値で除することにより、総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を求めることができる。
【０１１２】
以上の本発明方法では、エンドポイントアッセイによらずいわばレートアッセイにより液体被検試料中における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を測定するので、迅速な測定が可能になる。また、自己発色する傾向のあるロイコ色素を用いる上に、ウェット系ではなく反応が進行し難いドライ系で測定するにもかかわらず、精確な測定が可能である。よって本発明は、糖尿病などのためのＰＯＣＴ（Point of care testing）の利用を促進できるものである。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【０１１４】
なお、各酵素の活性は、以下のとおり定義した。
【０１１５】
１．  プロテアーゼの活性
プロテアーゼの活性は、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を用いたカゼインフォリン法により算出した。ここで、プロテアーゼの至適ｐＨ、３７℃で、１分間当たり、カゼインを加水分解して１．０μｍｏｌのチロシンに相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【０１１６】
２．  フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンとフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．５）、３７℃で、１分間当たり、糖化バリルヒスチジンを加水分解して１．０μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【０１１７】
３．  ペルオキシダーゼの活性
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）とを反応させ、生成したプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．０）、２０℃で、２０秒間当たり、１．０ｍｇのプルプロガリンに相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【０１１８】
実施例１：本発明方法によるヘモグロビンＡ１ｃ／総ヘモグロビン値の測定
（１）  分析用多層試験片の作製
表１に示す、素材がポリエステル、糸断面の形状がＹ字型の異形断面糸を用いて、表２に示す異形断面糸織物を作製した。
【０１１９】
【表１】
2015077088.tif 000002
【０１２０】
【表２】
2015077088.tif 000003
【０１２１】
当該織物を、親水加工剤（高松油脂社製，「ＳＲ１８００」）の１０ｗ／ｖ％水溶液に浸漬した後、マングルで脱水し、熱風乾燥した。これを適当な大きさにカットし、最終的な含浸量が下記各濃度となるよう、下記の試薬を含む溶液に浸漬した後、角型真空乾燥器（ヤマト科学社製，「ＤＰ８３」）を用いて、４０℃、０．１ｋＰａで１時間減圧乾燥し、展開層とした。
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製，ＰＥＯ−３０」）            ４０.０Ｕ／ｃｍ2
プロテアーゼ（シグマ社製，ＴｙｐｅＸＩ）                  １.０ｍｇ／ｃｍ2
ＮａＮＯ2（ナカライテスク社製）                         ０．７５ｍｇ／ｃｍ2
ＣａＣｌ2（ナカライテスク社製）                         ０．０９ｍｇ／ｃｍ2
非イオン界面活性剤（ナカライテスク社製，ＴｒｉｔｏｎＸ−１０（登録商標））
０．０２ｇ／ｍ2
緩衝剤（ｐＨ６．５）（同仁化学社製，ＰＩＰＥＳ）            １．５μｇ／ｍ2
【０１２２】
別途、上記展開層と同様に異形断面糸からなる織物を適当な大きさにカットし、最終的な含浸量が下記各濃度となるよう、下記の試薬を含む溶液に浸漬した後、角型真空乾燥器（ヤマト科学社製，「ＤＰ８３」）を用いて、４０℃、０．１ｋＰａで１時間減圧乾燥し、反応層とした。
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（東洋紡社製，ＦＰＯ−３０１）  ２６Ｕ／ｃｍ2
ロイコ色素（ＤＡ６７）（同仁化学社製）                    ０．０６ｍｇ／ｃｍ2
カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク社製）        ０．００５ｍｇ／ｃｍ2
非イオン界面活性剤（ナカライテスク社製，ＴｒｉｔｏｎＸ−１０）
０．０２ｇ／ｍ2
緩衝剤（ｐＨ６．５）（同仁化学社製，ＰＩＰＥＳ）              １．５μｇ／ｍ2
上記展開層を上記反応層の上に配置し積層することで、分析用多層試験片を作製した。
【０１２３】
（２）  保存安定性試験
上記（１）で得られた分析用多層試験片を４℃または２５℃で保存し、適時Ｋ／Ｓ値を測定した。結果を図３に示す。
【０１２４】
図３のとおり、室温（２５℃）で保存する場合、わずか５００時間（約２０日間）でもＫ／Ｓ値がかなり上がってしまっており、ロイコ色素が発色していることが分かる。４℃で保存する場合、Ｋ／Ｓ値の上昇は抑制されてはいるが、それでも上昇している。実際の製品の流通や保存期間を考慮すると、Ｋ／Ｓ値はさらに上がってしまい、そのままでは精確な測定ができないことが想定される。
【０１２５】
（３）  血液検体
本実験で使用した血液検体としては、ＮＯＶＡ  ＯＮＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社製のＬｉｑｕｉｄ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ヘモグロビンＡ１ｃ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ  Ｐ／Ｎ  ＮＯＤ  ＨｂＬ−Ｇ０４０４１−１００  Ｋｉｔ  Ｌｏｔ＃４６１０Ｌ０００６を使用した。本キットに含まれる血液検体におけるヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、ＨＰＬＣ法を適用した自動グリコヘモグロビン分析計（東ソー社製，「Ｇ７」）を用いて予め測定した。その結果を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
2015077088.tif 000004
【０１２７】
（４）  測定装置
本実験で使用した測定装置を図１および図２に示す。測定装置１００は、分析用多層試験片２００を装着部１に固定でき、かつ、固定した分析用多層試験片の温度制御が可能な測定装置であって、当該分析用多層試験片に対して、試料点着面とは反対側の面（反応層側）に向かって所望の波長の光を照射でき、さらには、照射した光が反応層で反射した光を受光できるように発光素子２および受光素子３を配置してあり、得られた測光値を経時的に測定することができる。
【０１２８】
（５）  レートアッセイによる反射光強度の測定
上記（１）で得た分析用多層試験片を、４℃で４８時間保存した。次いで、血液試料を点着する前に、予め３７℃に調整した上記（４）の測定装置の挿入口に設置した。次に測定装置の電源スイッチをＯＮにすることにより、発光素子と受光素子とを連動させた。分析用多層試験片に、発光素子から波長４７０ｎｍと６６０ｎｍの光を反応層側に照射し、反射光強度を測定した。以下、測定の順番と照射光の波長から、測定した反射光強度をそれぞれ「反射光強度１（４７０ｎｍ）」、「反射光強度２（６６０ｎｍ）」と示す。
【０１２９】
次いで、いったん光照射を停止した後、再度発光素子から光を照射し、測定開始から１０秒後に上記（３）の血液検体のうちＬＥＶＥＬ１のもの２０μＬを分析試験片の展開層側から点着した。次に血液検体を点着してから６０秒後における４７０ｎｍと６６０ｎｍの反光射強度を測定した。測定した反射光強度をそれぞれ「反射光強度３（４７０ｎｍ）」、「反射光強度４（６６０ｎｍ）」と示す。さらに、血液検体を点着してから１８０秒後における６６０ｎｍの反射光強度を測定した。測定した反射光強度を「反射光強度５（６６０ｎｍ）」と示す。
【０１３０】
ＬＥＶＥＬ１の血液検体の代わりにＬＥＶＥＬ２〜４の血液検体を用い、上記と同様に測定を行った。
【０１３１】
波長４７０ｎｍの反射光強度は、糖化ペプチドが酵素反応することにより生じる色素の影響を受けないので、血液検体中のヘモグロビンの総量を反映する。一方、波長６６０ｎｍでの反射光強度は、血液検体中のヘモグロビンの影響を受けないので、糖化ペプチドが酵素反応することにより発色する酸化型ロイコ色素の量を反映する。血液検体ＬＥＶＥＬ１を用いた場合の４７０ｎｍと６６０ｎｍの反射光強度から算出したＫ／Ｓ値の経時変化をそれぞれ図４と図５に示す。
【０１３２】
（６）  レートアッセイによるヘモグロビンＡ１ｃの割合の算出
上記（５）で測定した各測定時間のヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの反射強度からヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出した。６０秒後の４７０ｎｍの反射率は｛［（反射強度３（４７０ｎｍ）］／［反射強度１（４７０ｎｍ）］｝×１００（％）で算出した。血液検体におけるヘモグロビン濃度については、４７０ｎｍの反射率を上記式（Ｉ）に基づいてＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換することによりＫ／Ｓ値を求めた。次に６６０ｎｍの反射率の変化量を（｛｜［反射強度５（６６０ｎｍ）］−［反射強度４（６６０ｎｍ）｜｝／［反射強度２（６６０ｎｍ）］）×１００（％）で算出した。ヘモグロビンＡ１ｃ濃度については、上記式（Ｉ）に基づいてＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換することによりＫ／Ｓ値を求めた。総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、（ヘモグロビンＡ１ｃ濃度に関するＫ／Ｓ値の変化量／ヘモグロビン濃度に関するＫ／Ｓ値）×１００（％）から算出した。血液検体ＬＥＶＥＬ１〜ＬＥＶＥＬ４における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（表３）と、上記測定結果を比較するためのグラフを図６に示す。図６中、白抜きの丸（○）は表３に示す血液検体のヘモグロビンＡ１ｃ／ヘモグロビン値を示し、直線は、上記測定により導き出された測定値とヘモグロビンＡ１ｃ／ヘモグロビン値との関係を示す。
【０１３３】
図６のとおり、本発明方法により導き出された検量線はｙ＝０．００３３ｘ−０．００３９となり、決定係数Ｒ2＝０．９９８１であり、良好な直線関係と、実際の値との高い相関関係が認められた。
【０１３４】
比較例１：エンドポイントアッセイによる測定
（１）  エンドポイントアッセイによる反射光強度の測定
上記実施例１（５）と同様に、血液検体ＬＥＶＥＬ１〜５における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合をエンドポイントアッセイで測定した。具体的には、血液検体の点着前に反射強度６（４７０ｎｍ）と反射強度７（６６０ｎｍ）を測定した。また、血液検体を点着してから３００秒後に４７０ｎｍと６６０ｎｍの反射光強度（反射強度８（４７０ｎｍ）と反射強度９（６６０ｎｍ））を測定した。
【０１３５】
（２）  エンドポイントアッセイによるヘモグロビンＡ１ｃの割合の算出
上記実施例１（６）と同様に、上記（Ｉ）で測定した総ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃの反射光強度から、総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出した。３００秒後の４７０ｎｍの反射率は、｛［反射強度８（４７０ｎｍ）］／［反射強度６（４７０ｎｍ）］｝×１００（％）で算出した。総ヘモグロビン濃度については、４７０ｎｍの反射率を上記式（Ｉ）に基づいてＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換することによりＫ／Ｓ値を求めた。６６０ｎｍの反射率は、｛［反射強度９（６６０ｎｍ）］／［反射強度７（６６０ｎｍ）］｝×１００（％）で算出した。ヘモグロビンＡ１ｃ濃度については、上記式（Ｉ）に基づいてＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換することによりＫ／Ｓ値を求めた。総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、［（ヘモグロビンＡ１ｃ濃度）／（ヘモグロビン濃度）］×１００（％）から算出した。血液検体ＬＥＶＥＬ１〜ＬＥＶＥＬ４における総ヘモグロビンに対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（表３）と、上記測定結果を比較するためのグラフを図７に示す。図７中、白抜きの丸（○）は表３に示す血液検体のヘモグロビンＡ１ｃ／ヘモグロビン値を示し、直線は、上記測定により導き出された測定値とヘモグロビンＡ１ｃ／ヘモグロビン値との関係を示す。
【０１３６】
図７のとおり、本発明方法により導き出された検量線はｙ＝０．０２６４ｘ＋０．１０１７となり、決定係数はＲ2＝０．９５９８と明らかに低下し、実際の値と測定値との間で乖離が見られるようになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明係るヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、ロイコ色素の経時的な自己発色によるブランク上昇による測定値の精度低下を改善し、液体被検試料中におけるヘモグロビンＡ１ｃを迅速かつ精確に測定することができる。よって本発明は、大量の被検試料においてもヘモグロビンＡ１ｃを効率的に測定することができるので、糖尿病などの診断のため非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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