(57)【要約】【課題】  凍結保存細胞を融解した際の生存細胞回収量を予測する方法およびそのためのプログラムを提供する【解決手段】  細胞を凍結保存すること、凍結保存する際に発生する潜熱量を計測すること、および得られた潜熱量から生存細胞回収量の予測値を算出することを含む、凍結保存細胞からの生存細胞回収量を予測する方法により、上記課題が解決された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を凍結保存すること、
凍結保存する際に発生する潜熱量を計測すること、および
得られた潜熱量から生存細胞回収量の予測値を算出すること
を含む、凍結保存細胞からの生存細胞回収量を予測する方法。
【請求項２】
凍結保存が、同一の凍結保存条件を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生存細胞回収量の予測値の算出が、凍結保存された細胞と同一の凍結保存条件を有する母集団における潜熱量−生存細胞回収量関係式を用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
凍結保存細胞からの生存細胞の回収量を予測するためのプログラムであって、
入力された凍結保存条件と一致する凍結保存条件を有するデータをデータ格納部から抽出すること、
抽出されたデータ集団全体における、潜熱量−生存細胞回収量関係式を構築すること、および
該関係式および入力された潜熱量から、予測生存細胞回収量を算出すること、
を実行させることを特徴とする、前記プログラム。
【請求項６】
さらに、入力された凍結保存条件、潜熱の測定値および実際の生存細胞回収量をデータとしてデータ格納部に記録することを特徴とする、請求項５に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保存細胞を融解して回収する際に、回収される生存細胞の回収量を予測する方法、および予測のためのプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている。
【０００３】
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００４】
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められている。
【０００５】
このように、再生医療に基づく新たな治療方法の確立とともに、自家細胞を凍結させて保存し、人工組織やシート状細胞培養物などの三次元構造体を形成したり、直接細胞を移植したりする際に、かかる凍結保存細胞を融解して自家細胞を回収し、それを用いて治療を行う機会が近年増加してきている。
【０００６】
細胞は、液体窒素内などで凍結することにより、半永久的に保存することが可能であるが、凍結する際に発生する潜熱や、細胞内に発生する氷晶などにより細胞がダメージを受けてしまい、凍結保存された細胞を回収する際には全てを生存細胞として回収することはできない。通常は凍結保存細胞を融解後、必要な量の細胞を確保するために、融解後の細胞を培養して増殖させる必要がある。しかしながら長時間培養を行うことは手間であるため、かかる手間を削減するためになるべく多くの生存細胞を回収することが望まれる。そこでなるべく多くの生存細胞を回収するため、潜熱の発生を抑えたり、細胞内での氷晶の発生を抑えたり、凍害保護剤を添加したりする対策が施される（例えば、特許文献４および５など参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２６９９１号公報
【特許文献４】特表平５−５０２５７８号公報
【特許文献５】特開２０１２−３４６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
シート状細胞培養物の製造においては、拒否反応の少なさ等の観点から自家細胞を用いることが好ましいが、自家細胞を用いてシート状細胞培養物を製造する場合、細胞の増殖や分化に時間を要するため、製造工程を律速してしまう。そこで、細胞を実質的に増殖させることなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で細胞を播種することにより、シート状細胞培養物を形成する方法が提供された（例えば特許文献２など参照）。かかる方法により、従前より高い物理的強度を有するシート状細胞培養物を、従前より短時間で製造することが可能となった。
【０００９】
この方法でシート状細胞培養物を形成する場合、通常よりも多くの細胞を必要とするため、多くの場合レシピエントから採取した細胞を増殖培養などで増やし、凍結保存させておいたものを用いる。一方、かかる方法を用いてシート状細胞培養物を調製する場合、必要十分な量の細胞を播種しないとシート状細胞培養物が形成されず、増殖培養となったり、細胞が分化したりしてしまう。例えばかかるシート状細胞培養物を移植手術に用いる場合、術式の直前にシート状細胞培養物を調製するが、必要十分な量の細胞が確保できない場合、シート状細胞培養物の調製が間に合わなくなってしまう。しかしながら、現在のところ、凍結保存細胞を融解した際の生存細胞量をなるべく多くしようという技術は多数存在するものの、凍結保存細胞を融解した際の生存細胞量がどのくらいになるかを予測する技術は存在しない。
【００１０】
したがって本発明の目的は、細胞の凍結保存時に発生する潜熱量から、該凍結保存細胞を融解した際の生存細胞回収量を予測する方法およびそのためのプログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記シート状細胞培養物を調製する方法を研究する中で、凍結保存した細胞をシート状細胞培養物形成に用いた場合、回収できる生存細胞量にばらつきがあるため、必要量の細胞を確保できずうまくシート状細胞培養物を形成できない場合があるという課題に直面した。そこでかかる課題を解決すべく研究を続けるうちに、融解後の生存細胞回収量を融解前に予測することができれば、事前に必要十分な量の生存細胞を確保することが可能であることを見出し、さらに研究を続ける中で、凍結保存する際に発生する潜熱は、同一濃度、同一保存液、同一容器など、同一の条件で凍結させたとしてもばらつきを以て発生してしまうこと、融解後の生存細胞回収量のばらつきは、かかる潜熱のばらつきと相関があることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち本発明は以下に関する。
［１］細胞を凍結保存すること、
凍結保存する際に発生する潜熱量を計測すること、および
得られた潜熱量から生存細胞回収量の予測値を算出すること
を含む、凍結保存細胞からの生存細胞回収量を予測する方法。
［２］凍結保存が、同一の凍結保存条件を用いて行われる、［１］の方法。
［３］生存細胞回収量の予測値の算出が、凍結保存された細胞と同一の凍結保存条件を有する母集団における潜熱量−生存細胞回収量関係式を用いて行われる、［１］または［２］の方法。
［４］細胞が、骨格筋芽細胞である、［１］〜［３］の方法。
［５］凍結保存細胞からの生存細胞の回収量を予測するためのプログラムであって、
入力された凍結保存条件と一致する凍結保存条件を有するデータをデータ格納部から抽出すること、
抽出されたデータ集団全体における、潜熱量−生存細胞回収量関係式を構築すること、および
該関係式および入力された潜熱量から、予測生存細胞回収量を算出すること、
を実行させることを特徴とする、前記プログラム。
［６］さらに、入力された凍結保存条件、潜熱の測定値および実際の生存細胞回収量をデータとしてデータ格納部に記録することを特徴とする、［５］のプログラム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、従来の技術においては認識されていなかった新たな課題を解決するものである。すなわち従来は、融解後の凍結保存細胞を、増殖培養を行わずに用いることはなく、したがって凍結細胞を融解した後の増殖培養工程における手間の削減のために生存細胞の回収率を高めたいとの欲求はあったが、どの程度であれ生存細胞を回収できさえすれば、そこから増殖培養により必要量の細胞数を確保することが可能であった。しかし、例えば上記特許文献２に記載の方法など、増殖培養を経ないことに利点を有するシート状細胞培養物の製造方法が開発されてきたことに伴い、凍結保存細胞を融解後に増殖培養を経なくても確実に必要量の生存細胞を確保したいというニーズが生じているところ、本発明により、かかるニーズを解決できるものである。これにより、従前より高い物理的強度を有するシート状細胞培養物を、従前より短時間で製造することが可能な方法を、より確実に失敗無く用いることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は例１の凍結保存条件で凍結保存されたサンプルデータにおける、潜熱量−生存細胞回収量関係式を表すグラフである。グラフのｘ軸は潜熱量、ｙ軸は生存細胞回収率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施態様に基づき、本発明を説明する。
（１）生存細胞回収量予測方法
本発明は、１つの側面において、細胞を凍結保存すること、細胞を凍結保存する際に発生する潜熱量を計測すること、および得られた潜熱量から生存細胞回収量の予測値を算出することを含む、凍結保存細胞からの生存細胞回収量を予測する方法に関する。
本発明において、「凍結保存細胞」とは、通常は凍結保存された細胞そのものを意味するが、凍結保存された細胞の１つの凍結保存単位を意味することもある。この場合、凍結保存単位とは、例えば１つのチューブなど、１群として一緒に凍結保存される細胞群を意味する。また本発明において「凍結保存条件」とは、凍結保存する細胞を凍結させる際の様々な条件を意味し、これに限定するものではないが、例えば凍結細胞用容器（大きさ、材質など）、凍結保存液（組成、濃度、量など）、冷却条件（冷却時間、冷却速度冷却温度など）、細胞濃度などが挙げられる。
【００１６】
本発明において、「潜熱」とは、とくに細胞を凍結保存する際の細胞を含む容器を凍結する時に発生する凝固熱を意味し、これにより凍結保存細胞はその凍結工程において急激な温度上昇を伴うこととなる。「潜熱の量」または「潜熱量」とは、このときに発生する潜熱の量を意味し、通常は潜熱放出時の凍結保存細胞の上昇温度で表現されるが、これに限定されず、例えば発生した熱量などで表現されてもよい。
【００１７】
本発明において「生存細胞」とは、凍結保存細胞を融解して細胞を回収した際に、生きている細胞を意味する。細胞を凍結保存した場合、通常は潜熱の発生や氷晶の発生などの要因によって細胞が損傷を受けるために、凍結保存した細胞を全て生存細胞として回収できるわけではない。本発明において「生存細胞回収量」とは、融解した凍結保存細胞のうち、生存細胞として回収できた細胞の量を意味し、通常は全凍結細胞に対して生存細胞として回収できた細胞の割合で表現するが、これに限定されず、例えば生存細胞の個数などで表現されてもよい。
【００１８】
以下、本実施態様の方法について、工程ごとに説明する。
＜細胞の凍結保存＞
本工程において、細胞を凍結保存する場合の細胞の冷却条件としては、いかなる冷却条件を用いてもよいが、潜熱の発生を極力抑えるような冷却条件を用いるのが好ましく、これに限定するものではないが、例えば緩慢冷却法などが用いられる。また、本発明の方法においては、冷却条件が同一であることが好ましいため、確立されたプロトコルに従った方法で冷却することが好ましく、例えばプログラムフリーザーを用いるなど、同一の冷却条件を再現できる冷却方法が好ましい。
【００１９】
上述のとおり、本方法においては、潜熱以外の細胞へのダメージ要素による生存細胞回収量の変化を極力無くすため、同一の凍結保存条件を用いるのが好ましい。したがって上述のとおり冷却条件を同一にするのが好ましいのはもちろんのこと、凍結する細胞の種類および量、凍結保存液の組成、濃度および量、凍結細胞用容器の材質および形状など、他の条件も同一にすることが好ましい。
【００２０】
本方法に用いることができる細胞は、凍結保存することができる細胞であればとくに限定されず、当該技術分野において知られたあらゆる細胞を用いることができる。好ましくは胚性幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞などの体性幹細胞、線維芽細胞、骨格筋芽細胞、骨芽細胞などの芽細胞など、再生医療に用いられる細胞が好ましく、中でも自家細胞として採取、増殖が可能な体性幹細胞、芽細胞などが好ましく、有用性や取扱いの簡便さなどの観点から、骨格筋芽細胞が最も好ましい。細胞は、対数増殖期の細胞を用いるのが、生存細胞回収量の観点から好ましい。
【００２１】
凍結保存される細胞の量としては、凍結保存する容器の用量に応じて変化してもよい。凍結保存用の細胞懸濁液は、通常１×１０５〜５×１０７個／ｍｌ程度の細胞密度に調整し、凍結細胞用容器に分注する。
凍結保存液としては、当該技術分野において細胞の凍結保存に用いられることが知られた任意のものを用いることができ、多くのメーカーから販売されている。また、通常の細胞培養培地を用いてもよく、培地にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセロールなどの凍害保護剤を、通常は１〜２０％程度、好ましくは５〜１０％程度添加したものを用いてもよい。さらに、培地に代えて１００％血清を用いてもよい。
凍結細胞用容器は、当該技術分野において通常使用されている任意のものを用いてよく、例えば市販のクライオバイアル、アンプル、凍結保存バッグ等が用いられる。
【００２２】
＜潜熱量の計測＞
潜熱量の計測においては、細胞を凍結保存する際に発生する潜熱量を計測する。
細胞を凍結保存する際に発生する潜熱は、細胞へのダメージ要素となるため、極力抑えることが好ましい。そこで例えば緩慢冷却法などによって、潜熱の発生を極力抑える方法が知られているものの、完全に無くすことはできない。本工程においてはこの潜熱の量を計測する。潜熱量の計測手段はとくに限定されず、当該技術分野において既知の方法を用いて計測することができる。
【００２３】
＜予測値の算出＞
本工程においては、上記潜熱量の計測工程において得られた潜熱量に基づいて、生存細胞回収量の予測値を算出する。
潜熱量からの予測値の算出は種々の方法で行うことができ、例えば潜熱量と生存細胞回収量との関係を表す関係式から算出してもよいし、同じ潜熱量を示した凍結保存細胞における生存細胞回収量のデータの平均値や中間値などから統計的に算出してもよい。
【００２４】
当該技術分野においては、潜熱量を減らすと生存細胞回収量が増加することが知られている。したがって、潜熱量と生存細胞回収量の間には相関関係が存在する可能性がある。本発明において、「潜熱量−生存細胞回収量関係式」とは、特定の母集団における潜熱量と生存細胞回収量との関係を表した式を意味し、かかる式は母集団の違いにより変化し得る。
【００２５】
潜熱量−生存細胞回収量関係式は、母集団ごとに策定することができる。本方法の好ましい一態様において、予測値の算出は、予測値を算出したい凍結保存された細胞と同一の凍結保存条件を有するデータを抽出し、当該データの集合を母集団とした潜熱量−生存細胞回収量関係式を策定し、この関係式から算出する。
特定母集団における潜熱量−生存細胞回収量関係式の策定は、例えば回帰分析など、当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。
【００２６】
本態様の方法により、凍結保存された細胞を融解した際の生存細胞回収量を予測することが可能となり、凍結保存細胞を融解後、増殖培養を経ずに用いる必要がある場合であっても、必要十分な量の生存細胞数を確保することが可能となる。これにより、例えば特許文献６などに記載の方法による移植用シート状細胞培養物を現場で調製する場合であっても、確実に調製に必要な生存細胞数を確保することができ、生存細胞数の不測によるシート状細胞培養物の調製失敗という事態を回避することが可能となる。
【００２７】
（２）生存細胞回収量予測プログラム
本発明は、１つの側面において、入力された凍結保存条件と一致する凍結保存条件を有するデータをデータ格納部から抽出すること、抽出されたデータ集団全体における、潜熱量−生存細胞回収量関係式を構築すること、および該関係式および入力された潜熱量から、予測生存細胞回収量を算出すること、を実行させるプログラムに関する。
【００２８】
＜システム＞
本発明のプログラムを実行するシステムは、典型的にはデータ格納部、入力部、演算部および出力部を備えている。
データ格納部は、複数のサンプルデータを格納している部分である。本発明において「サンプルデータ」は凍結保存条件データ、潜熱計測データおよび生存細胞回収量データ等を含む、データのまとまりを意味すし、入力部により入力されたデータを格納したり、演算部からの信号に基づいて抽出したデータを演算部に提供したりすることが可能である。データ格納部は、データを保存することができれば何でもよく、データ格納部の形態としては、これに限定するものではないが、例えば磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリなど、電気的に記録されるものであってもよいし、例えば紙など、物理的に記録されるものであってもよい。演算部による演算処理の簡便さから、好ましくは電気的に記録されるものである。
【００２９】
入力部は演算部に演算部にデータを入力できるものであれば何でもよく、入力部の形態としてはこれに限定するものではないが、例えばキーボード、センサー（該センサーは潜熱量の計測に用いられる計測装置と同一のものであってもよい）、タッチパネルなどが用いられ得、またこれらを組み合わせて用いてもよい。また本発明の好ましい一態様において、入力部によって入力されたデータは、サンプルデータとしてデータ格納部に格納されてもよい。
【００３０】
演算部は、入力部から入力されたデータおよび格納部に格納されたデータに基づいて、予測値を算出する。予測値の算出方法は、上記生存細胞回収量予測方法における予測値の算出方法において記載した方法と同一の方法を用い得る。演算部の形態としては、これに限定するものではないが、例えばＣＰＵなどが挙げられる。また、本発明の一態様において、算出されたデータは、出力部以外にデータ格納部に送られてもよく、他のサンプルデータとともに格納されてよい。
演算部において算出された、回収量の予測値を含む算出結果は、出力部によって出力される。情報の出力手段としては、例えば外部モニター、ランプ、ブザー、予め登録された携帯電話やインターネットメールアドレスへの送信など、システムを操作する人間に知らせるものであってもよいし、プリンタなど、記録として出力されるものであってもよい。
【００３１】
本発明の好ましい一態様において、予測値を算出したサンプルは、実際に生存細胞回収量を測定し、回収量をサンプルデータとして入力し、データ格納部に格納される。格納されたデータは、以後の予測値算出のためのサンプルデータとして用いられる。また、予測値との差を解析することにより、システムの信頼性を評価することも可能である。
【００３２】
＜プログラム＞
本発明のプログラムは、一態様において、上記のシステムによって実行されるプログラムである。しかしながら、本発明のプログラムが実行されるシステムは、条件に従ったデータ格納部からのデータ抽出、抽出されたデータ集団における潜熱量−生存細胞回収量関係式の構築、および予測値の算出が可能であれば何でもよい。したがって必ずしも細胞の凍結保存システムおよび潜熱量の計測システムと連動している必要はない。
【００３３】
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
例１．サンプルデータ集団の構築
細胞の凍結保存は、以下の凍結保存条件および方法により行った。
骨格筋芽細胞を培養し、７０〜８０％コンフルエントにて回収した。回収した細胞懸濁液の一部を抜き取り、セルカウントを実施し、セルカウント結果から細胞数を算出した。回収した細胞懸濁液を４℃、２４０×ｇで７分間遠心した後上清を廃棄し、凍結保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭ培地）に懸濁して、細胞濃度を調製した。
調製した細胞懸濁液を１．８ｍＬ容量のクライオチューブ（Nunc製）に１ｍＬずつ分注し、プログラムフリーザーを用いて緩慢凍結法により凍結した。
【００３５】
２〜７日間の凍結保存後、上記のとおり作成したサンプル（ｎ＝６）を下記の手順に従って融解し、生存細胞の回収量を計測した。
凍結保存したクライオチューブを３７℃に設定したウォーターバスに４分間入れ、凍結保存細胞を融解した。融解した細胞懸濁液を、１．８ｍＬクライオチューブから２２５ｍＬコニカルチューブに移した。またクライオチューブに残存した細胞も回収するために、１ｍＬの洗浄液（ＨＢＳＳにアルブミンを加えたもの）でクライオチューブをリンスし、それを前記細胞懸濁液に加えた。コニカルチューブに洗浄液を３０ｍＬ加えて４℃、２４０×ｇで７分間遠心した後上清を廃棄した。再び洗浄液を３０ｍＬ加えて４℃、２４０×ｇで７分間遠心した後上清を廃棄し、洗浄液を５ｍＬ加えて細胞懸濁液を得た。
得られた細胞懸濁液の一部を抜き取り、トリパンブルーに混合した後セルカウントを実施し、セルカウント結果から融解後の生存細胞数を算出し、下記の式にて生存細胞回収率を算出した。
生存細胞回収率（％）＝融解後の生存細胞数／凍結時の生存細胞数×１００
【００３６】
例２．潜熱量−生存細胞回収量関係式の構築
例１で得られたｎ＝６のサンプルに基づいて、潜熱量−生存細胞回収量関係式を線形回帰により構築した。潜熱量と回収量の相関関係を図１に示す。図１においてｘ軸は潜熱量（単位：℃）であり、ｙ軸は生存細胞回収率（単位：％）である。両者の関係式はｙ＝−１．９１２２ｘ＋８６．６２７となり、相関係数Ｒ＝０．８１５７であった。
【００３７】
例３．生存細胞回収量の予測値算出
例１と同一の方法を用いて測定サンプルを凍結保存し、潜熱量を計測した。潜熱は１．３℃であった。該潜熱量から、例２で構築した潜熱量−生存細胞回収量関係式に基づいて、生存細胞回収量の予測値を算出したところ、予測回収率は８４．１４％であった。
例１と同一の方法を用いて測定サンプルを融解し、その生存細胞回収量を計測し、生存細胞回収率を算出した。実際の生存細胞回収率は８２．６７％であった。したがって誤差１．４７％で予測が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法によれば、凍結細胞の融解前に、凍結保存細胞から回収可能な生存細胞量を予測することができるようになり、それにより、必要な生存細胞量を得るためにはいくつのサンプルを融解すればよいかがわかるようになる。これにより、凍結保存細胞を融解した直後であっても、従来では必須工程であった増殖培養を行って必要な細胞量を確保するという工程を省略することが可能となり、とくにシート状細胞培養物などの移植片を、実質的に細胞を増殖させることなく製造する方法などにおいて、失敗無く即時調製することが可能となる。したがって、移植片の調製失敗によって手術が行えなくなるなどの事態を回避することが可能となる。
【図１】
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