(57)【要約】【課題】  細胞培養物からエンドトキシンを除去する方法を提供する。【解決手段】  細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し２回以上洗浄するステップを含む、細胞培養物からエンドトキシンを除去する方法、該方法を含む医療用細胞培養物の製造方法、該製造方法により製造された医療用細胞培養物、該医療用細胞培養物を用いた疾患の処置方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し２回以上洗浄するステップを含む、細胞からエンドトキシンを除去する方法。
【請求項２】
洗浄するステップにおいて、細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し３〜１０回洗浄する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
洗浄するステップにおいて、細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し６回洗浄する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞凝集阻害剤が、アルブミン、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、局所麻酔薬からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を含む、医療用細胞培養物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法で製造された、医療用細胞培養物。
【請求項７】
請求項６に記載の医療用細胞培養物を含む、医薬組成物。
【請求項８】
対象において疾患を処置する方法であって、請求項６に記載の細胞培養物または請求項７に記載の医薬組成物の有効量をそれ必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞からエンドトキシンを除去する方法、該方法を用いた細胞培養物製造方法、該製造方法により製造された細胞培養物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁表面に存在するリポ多糖複合体であり、体内に入ると、極めて微量であっても発熱、血圧低下、白血球数減少、血液凝固異常、血管内皮細胞障害、毛細血管透過性亢進などの症状を引き起こし、ＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）、ＭＯＦ（多臓器不全）、エンドトキシンショックなどの致死率の高い疾患の原因ともなる。したがって、生体に対して使用する医薬品や医療器具などにおいては、こうした有害事象の発生を回避するため、エンドトキシンの厳重な管理が必要となる。しかしながら、エンドトキシンは環境中に広く存在しており、比較的容易に汚染が起こるため、エンドトキシンの除去または不活化のための手法が研究されている。エンドトキシンを除去する手法としては、例えば、限外ろ過膜や逆浸透膜などによるろ過、イオン交換クロマトグラフィー、蒸留、活性炭、ポリミキシンＢ、ヒスチジン、ヒスタミン、酸化チタン（特許文献１）、ケイ酸アルミニウム（特許文献２）などの種々の吸着剤による吸着などが、エンドトキシンを不活化する手法としては、例えば、熱、酸、アルカリによる処理などが、それぞれ知られている。しかしながら、いずれの方法も多くの問題点を含んでおり、現実的に応用可能な絶対的な方法は未だ見出されていない。
【０００３】
一方、近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献３）。シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められている。
このような細胞培養物を臨床応用する場合には、移植を受けるレシピエントに対する安全性を確保するうえで、エンドトキシンの管理が重要となる。しかしながら、上述のような従来のエンドトキシンの除去や不活化のための手法は、医療用化合物や医療器具などの非生物を対象としたものであり、生体である細胞に適用可能な手法は未だ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2011-250939号公報
【特許文献２】特開2011-101846号公報
【特許文献３】特表2007-528755号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、細胞に適用可能なエンドトキシン除去方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し２回以上洗浄することにより、細胞からエンドトキシンを効果的に除去できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下に関する。
[１]細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し２回以上洗浄するステップを含む、細胞からエンドトキシンを除去する方法。
[２]洗浄するステップにおいて、細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し３〜１０回洗浄する、[１]に記載の方法。
[３]洗浄するステップにおいて、細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し６回洗浄する、[２]に記載の方法。
[４]細胞凝集阻害剤が、アルブミン、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、局所麻酔薬からなる群から選択される、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５][１]〜[４]のいずれかに記載の方法を含む、医療用細胞培養物の製造方法。
[６][５]に記載の方法で製造された、医療用細胞培養物。
[７][６]に記載の医療用細胞培養物を含む、医薬組成物。
[８]対象において疾患を処置する方法であって、[６]に記載の細胞培養物または[７]に記載の医薬組成物の有効量をそれ必要とする対象に移植するステップを含む、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のエンドトキシン除去方法により、生体に有害な量のエンドトキシンを含まない、安全性の高い医療用細胞培養物を製造することができるため、エンドトキシンによるリスクを回避することが可能となり、医療用細胞培養物を用いた処置の普及拡大が期待できる。また、本発明のエンドトキシン除去方法は細胞への負担が少なく、細胞培養物の治療活性を維持することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００１１】
本発明の一側面は、細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し２回以上洗浄するステップを含む、細胞からエンドトキシンを除去する方法（以下、「除去方法」と略す場合もある）に関する。
本発明の除去方法における細胞は特に限定されず、任意の種類のものを包含するが、医療目的で使用されるものが好ましい。医療目的としては、限定されずに例えば疾患の処置、移植医療、再生医療などが挙げられる。かかる目的で使用する細胞としては、限定されずに、例えば、血液疾患などの治療に用いる造血幹細胞、免疫療法などに用いるリンパ球、樹状細胞などの免疫細胞、シート状細胞培養物を形成し得る細胞、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。
【００１２】
細胞懸濁液は、細胞が、液体媒体中に浮遊した状態の液体を指す。液体媒体としては、細胞の操作に通常使用する任意の媒体、限定されずに、例えば、生理食塩水、リンゲル液、ハンクス平衡塩液などの平衡塩液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、液体培地などを用いることができる。浮遊細胞であれば、培養中の細胞を含む液体培地をそのまま細胞懸濁液としてもよいが、培地を上記の液体媒体と置換して細胞懸濁液を調製することも可能である。付着細胞であれば、培養中の細胞を基材から剥離し、これを上記の液体媒体に懸濁して細胞懸濁液を調製することができる。
【００１３】
本発明の除去方法における細胞凝集阻害剤は、細胞を洗浄する際に細胞同士の凝集を阻害できる物質であれば特に限定されず、下記実施例で用いたアルブミンのほか、細胞凝集阻害作用が知られている既知の任意の化合物、例えば、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン（WO 2012/063870）、局所麻酔薬（特開2006-42693）などを含む。アルブミンとしては、血清アルブミン、特に同種の血清アルブミンを用いることが好ましいが、卵アルブミン、乳アルブミン、筋アルブミンなどを用いることもできる。ここで「同種」とは、細胞を投与する対象（レシピエント）と同一の種の生物に由来することを意味する。例えば、投与する対象がヒトである場合、ヒトアルブミンが同種のアルブミンに該当する。局所麻酔薬としては、限定されずに、例えば、リドカイン、メピバカイン、ジブカイン、ブピバカイン、プロピトカイン等のアミド型局所麻酔薬、コカイン、プロカイン、クロロカイン、テトラカイン等のエステル型局所麻酔薬などが挙げられる。
【００１４】
細胞凝集阻害剤の濃度は、細胞を洗浄する際に細胞同士の凝集を阻害できるものであれば特に限定されないが、例えば、アルブミンであれば、好ましくは０．１〜５％（ｗ/ｖ）、より好ましくは０．２５〜２.５％（ｗ/ｖ）であり、トレハロースであれば、好ましくは４．５３〜３６２．４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５．１〜１８１．２ｍｇ／ｍｌであり、ヒドロキシエチルデンプンであれば、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌであり、デキストランであれば、好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｍｌ、より一層好ましくは３０〜１２５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは３０〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは６５〜１００ｍｇ／ｍｌであり、局所麻酔薬であれば、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜２.５重量％、最も好ましくは約１重量％である。
【００１５】
本発明の除去方法における洗浄液は、細胞凝集阻害剤が液体であれば、細胞凝集阻害剤のみから構成されてもよいし、細胞凝集阻害剤以外の成分、例えば希釈剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤などを含んでいてもよい。細胞凝集阻害剤が固体の場合、洗浄液は、典型的には、上記成分のほか、細胞凝集阻害剤を溶解または懸濁する溶媒を含む。溶媒としては、限定されずに、例えば、生理食塩水、リンゲル液、ハンクス平衡塩液などの平衡塩液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、液体培地などが挙げられる。洗浄液は、細胞へのダメージを低減する観点から、体液の浸透圧と等しい等張液であることが好ましい。
【００１６】
本発明の除去方法における洗浄は、培地の置換目的で行なわれている１〜２回程度のすすぎによる洗浄操作とは異なり、洗浄液に置換懸濁し、この細胞に混和撹拌操作を加えることにより洗浄を行うものをいう。この混和撹拌操作は、ピペッティングなどにより細胞に対して比較的強い力が加えられるものである。撹拌操作は、１回の洗浄あたり５回程度のピペッティングによる撹拌であることがエンドトキシンの効率的な除去と細胞の損傷防止の観点から望ましい。また洗浄回数は、洗浄液を交換して、２回以上行うことがエンドトキシンの除去に有効であるが、一方、１０回を超えて洗浄しても、洗浄効果は上がらず、むしろ細胞へのストレスが大きくなることが懸念されるため、２〜１０回とすることが好ましく、例えば、３〜９回、４〜８回または５〜７回とすることができる。中でも洗浄回数を６回とすることが特に好ましい。洗浄液の交換は、典型的には、洗浄液に懸濁させた細胞を遠心処理により沈殿させ、上清を廃棄し、沈殿した細胞を新たな洗浄液に懸濁することにより行うことができるが、同様の効果が得られる他の方法、例えば、細胞と洗浄液を濾過により分離する手法などを用いてもよい。
【００１７】
本発明の除去方法において洗浄に用いる容器としては、細胞操作に通常用いるものを用いることができるが、エンドトキシンを吸着しやすい材質のものが、エンドトキシンのより効率的な除去の観点から好ましい。かかる材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレンなどの疎水性物質が挙げられる。また、エンドトキシンを吸着することが知られている物質でコーティングされた容器を使用することもできる。エンドトキシンを吸着することが知られている物質としては、限定されずに、例えば、活性炭、ポリミキシンＢ、ヒスチジン、ヒスタミン、酸化チタン、ケイ酸アルミニウムなどが挙げられる。
【００１８】
本発明の別の側面は、本発明の除去方法を含む、医療用細胞培養物の製造方法（以下、「製造方法」と略す場合がある）、および、当該製造方法によって製造された医療用細胞培養物（以下、「細胞培養物」と略す場合がある）に関する。
本発明において「医療用」とは、医療用途、限定されずに例えば、疾患の処置、移植医療、再生医療などの用途に使用されることを意味する。したがって、本発明の「医療用細胞培養物」は、医療製品に求められる種々の基準、例えば、エンドトキシンに関する基準などを満たすものである。かかる基準としては、例えば、行政当局によって定められたものが挙げられる。例えば、現行の第十六改正日本薬局方において、エンドトキシンの規格値はＫ／Ｍとして設定され、ここでＫは発熱を誘起するといわれる体重１ｋｇ当たりのエンドトキシンの量（ＥＵ／ｋｇ）であり、投与経路による区分に基づき、脊髄腔内投与では０．２ＥＵ／ｋｇ、それ以外では５．０ＥＵ／ｋｇと設定されており、Ｍは体重１ｋｇ当たり１回に投与される最大量（頻回または持続的に投与される場合、Ｍは１時間以内に投与される最大総量）と設定されている。したがって、６０ｋｇの成人に最大で１回に細胞培養物１０ｍｌを静脈内注射する場合、上記規格値は３０ＥＵ／ｍｌとなる。ただし、これは単なる例示であり、当業者であれば、種々の状況に適合した基準値や規格値を適宜決定することができる。なお、医療は、ヒト医療および獣医療の両方を含む。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、細胞培養物は、３×１０７個の細胞を含む３ｍｌの細胞懸濁液において、１０ＥＵ／ｍｌ以上、好ましくは５ＥＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１ＥＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは０．５ＥＵ／ｍｌ以上、より一層好ましくは０．２５ＥＵ／ｍｌ以上、特に好ましくは０．１３ＥＵ／ｍｌ以上のエンドトキシンを含まない。また、本発明の細胞培養物は、好ましくは、エンドトキシンを検出可能なレベルで含まない。エンドトキシンの検出は、既知の任意の方法、例えば、限定されずに、比濁法（例えばカイネティック−比濁法）、ゲル化法、比色法、合成基質法などのリムルス法などを用いることができる。
【００２０】
本発明における細胞培養物は、細胞懸濁液や細胞構造体などの、医療用途に適した種々の形態をとることができる。細胞構造体は、シート状、柱状、塊状、栓状などの種々の形状であってよい。本発明においては、治療効果の高さなどの観点から、シート状の細胞構造体、すなわち、シート状細胞培養物が好ましい。「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００２１】
本発明の細胞培養物は、生体適合性や治療効果の高さなどの観点から、スキャフォールド（支持体）を含まないことが好ましい。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明の好ましい細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができるものである。また、本発明の細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００２２】
本発明の細胞培養物に用いる細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の多細胞生物（例えば動物など）に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどの哺乳動物が含まれる。また、細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
【００２３】
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本発明においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。
【００２４】
本発明の細胞培養物は、種々の疾患、特に組織の異常に関連する疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本発明の細胞培養物は、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳、骨髄などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）、骨髄疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、免疫不全疾患など）が挙げられる。
【００２５】
本発明の細胞培養物が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献３、非特許文献１、Arauchi et al., Tissue Eng Part A. 2009 Dec;15(12):3943-9、Ito et al., Tissue Eng. 2005 Mar-Apr;11(3-4):489-96、Yaji et al., Biomaterials. 2009 Feb;30(5):797-803、Yaguchi et al., Acta Otolaryngol. 2007 Oct;127(10):1038-44、Watanabe et al., Transplantation. 2011 Apr 15;91(7):700-6、Shimizu et al., Biomaterials. 2009 Oct;30(30):5943-9、Ebihara et al., Biomaterials. 2012 May;33(15):3846-51、Takagi et al., World J Gastroenterol. 2012 Oct 7;18(37):5145-50などに記載されている。
【００２６】
本発明の細胞培養物は、処置の対象となる組織に適用し、これを修復、再生するために使用することもできるが、ホルモンなどの生理活性物質の給源として、処置の対象となる組織以外の部位（例えば、皮下組織など）に移植することもできる（例えば、Arauchi et al., Tissue Eng Part A. 2009 Dec;15(12):3943-9、Shimizu et al., Biomaterials. 2009 Oct;30(30):5943-9など）。また、本発明のシート状細胞培養物を注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008 Feb 1;77(3):515-24）。
【００２７】
本発明の細胞培養物は、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などをさらに含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の細胞培養物は、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。
【００２８】
本発明の細胞培養物は、本発明の除去方法でエンドトキシンが除去された細胞を用いて、既知の任意の方法により製造することができる。例えば、シート状細胞培養物の製造方法は、特許文献３、特開2010-081829、特開2010-226962、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-115058、特開2011-172925などに記載されている。本発明の製造方法で用いる器具や、培地、試薬、添加物などの材料は、いずれもエンドトキシンを含まないことが好ましい。
【００２９】
本発明の製造方法の特に好ましい態様は、以下のステップを含む：
（１）細胞懸濁液を、細胞凝集阻害剤を含む洗浄液で繰り返し２回以上洗浄するステップ、
（２）ステップ（１）で得られた細胞を凍結するステップ、
（３）凍結した細胞を解凍するステップ、
（４）シート状細胞培養物を形成するステップ、
（５）形成されたシート状細胞培養物を回収するステップ。
（１）の洗浄するステップは、本発明の除去方法についてすでに上記したとおりである。
【００３０】
（２）の細胞を凍結するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には０℃以下、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−４０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて−８０℃に達するまで１〜５時間、好ましくは２〜４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）などを用いることができる。
【００３１】
凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、本発明の製造方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。
【００３２】
凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して２〜２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本発明の範囲内である。
【００３４】
（３）の凍結した細胞を解凍するステップは、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には４〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３６〜３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には２分以内であり、特に２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。
【００３５】
（４）のシート状細胞培養物を形成するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、特許文献３、特開2010-081829、特開2010-226962、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-115058、特開2011-172925などに記載されたものが挙げられる。シート状細胞培養物を形成するステップは、細胞を培養基材上に播種するステップ、および、播種した細胞をシート化するステップを含んでもよい。
【００３６】
培養基材は、細胞がその上でシート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。
【００３７】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本発明の製造方法に使用することができる。
【００３８】
培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
【００３９】
播種した細胞をシート化するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献３、特開2010-081829、特開2010-226962、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-115058、特開2011-172925などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と呼ぶ場合もある。
【００４０】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と呼ぶ場合もある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【００４１】
細胞の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
【００４２】
（５）におけるシート状細胞培養物の回収は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養して細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。
【００４３】
本発明の別の側面は、本発明の細胞培養物を含む、医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、本発明の細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の医薬組成物は、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。一態様において、本発明の医薬組成物は、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織や疾患は、本発明の細胞培養物について上記したとおりである。
【００４４】
本発明の別の側面は、対象において疾患を処置する方法であって、本発明の細胞培養物または医薬組成物の有効量をそれ必要とする対象に投与するステップを含む方法に関する。本発明の処置方法の対象となる組織や疾患は、本発明の細胞培養物について上記したとおりである。また、本発明の処置方法においては、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本発明の細胞培養物または医薬組成物と併用することができる。
【００４５】
本発明の処置方法は、本発明の製造方法に従って、細胞培養物を製造するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、細胞培養物を製造するステップの前に、対象から細胞培養物を製造するための細胞または細胞の給源となる組織を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物の投与を処置を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物の投与を処置を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物の投与を処置を受ける対象とは異種の個体である。
【００４６】
本発明において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【００４７】
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００４８】
本発明において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、細胞培養物に含まれる細胞数、細胞培養物のサイズ、重量など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
【００４９】
本発明の細胞培養物および医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の種々の経路から投与することができる。シート状細胞培養物の場合は、投与方法として、典型的には組織への直接的な適用が挙げられるが、シート状細胞培養物の断片を用いる場合には、注射による投与が可能な種々の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の経路から投与してもよい。
投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。
【実施例】
【００５０】
以下に、本発明を実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
実施例１  細胞からのエンドトキシンの除去
２．５ｇのヒトアルブミン（一般社団法人日本血液製剤機構製）を５００ｍＬのハンクス平衡塩液に加え、ヒトアルブミンを０．５ｗ/ｖ％の濃度で含む洗浄液を調製した。３×１０７個のヒト骨格筋芽細胞を３０ｍＬの洗浄液に懸濁した細胞懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに入れ、そこにエンドトキシン（E. coli UKT-B株由来、和光純薬工業（株）製）を添加した。細胞懸濁液を１００μＬ採取し、その後エンドトキシン量の測定に供した。細胞懸濁液を２４０×ｇで７分間遠心して上清を廃棄した。チューブに洗浄液を２８．５ｍＬ加え、ピペッティングにより細胞を十分に撹拌した後、２４０×ｇで７分間遠心して上清を廃棄した。この操作を６回繰り返した。６回目の洗浄操作で、上清を廃棄した後に残った細胞を３ｍＬの洗浄液に懸濁し、エンドトキシン量の測定に供した。また、未使用の洗浄液もエンドトキシン量の測定に供した。なお、洗浄液には、一般的な作業条件下で混入する可能性のあるエンドトキシンの影響を評価するために、予め一定量のエンドトキシンを添加しておいた。各検体のエンドトキシン量は、トキシノメーターＥＴ−６０００およびリムルスＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（いずれも和光純薬工業（株）製）を用いて比濁時間法（カイネティック−比濁法）にて測定した。結果を下表に示す。
【００５２】
【表１】
2015062348.tif 000002
クリアランス（％）は、「（添加エンドトキシン量−洗浄後のエンドトキシン量）÷添加エンドトキシン量×１００」で計算した。
上記結果が示すとおり、本発明の除去方法により、細胞培養物に添加したエンドトキシンを、検出限界未満となるまで、実に９９．９５％超も除去することができた。