(57)【要約】      （修正有）【課題】天然物由来成分であり、日常生活において、その摂取により効果が期待できる、安全でかつ効果的なアディポネクチン分泌促進剤を提供する。【解決手段】緑豆蛋白質を有効成分として含有するアディポネクチン分泌促進剤が提供される。緑豆蛋白質は８Ｓαグロブリンであることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とする、アディポネクチン分泌促進作用を有する食品。
【請求項２】
緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン分泌促進剤。
【請求項３】
８Ｓαグロブリンを有効成分とすることを特徴とする、請求項２に記載のアディポネクチン分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチン分泌促進作用を有する食品及びアディポネクチン分泌促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症の原因となる、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、肥満症といった生活習慣病については、その発症を未然に防ぐため、メタボリックシンドロームという概念が打ち出された。現在多くの研究者は、肥満がその最上流に位置し、肥満によって生じたインスリン抵抗性により、糖代謝異常、脂質代謝異常、血圧高値の状態となり、この状態がメタボリックシンドロームと考えられている。
【０００３】
このメタボリックシンドロームについての最近の研究では、肥満が最上流に位置することは変わりないが、この肥満がインスリン抵抗性を介さずに、糖代謝異常、脂質代謝異常、血圧高値さらには動脈硬化症の発症、進展に直接関与していることが明らかになってきた（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトの一環として行われた脂肪組織発現遺伝子解析過程において、ヒト脂肪組織が種々の分泌タンパク質遺伝子をコードしていることが判明した。特に、内臓脂肪の遺伝子の約30％が分泌タンパク質をコードしており、脂肪組織が巨大な分泌臓器であることが明らかとなった。この脂肪組織から分泌される生理活性物質が、アディポサイトカインと総称されている。
【０００５】
脂肪の過剰蓄積、すなわち肥満により、ほとんどすべてのアディポサイトカインは、その血中濃度が上昇するのに対して、唯一肥満度と逆相関するアディポサイトカインが、アディポネクチンである。
【０００６】
アディポネクチンは、脂肪細胞からのみ作られるホルモンで、血中濃度が一般的なホルモンであるインスリンや甲状腺ホルモンに比べ、1,000倍から2,000倍もの高濃度（2〜20μg/ml）であり、血中濃度を精度よく定量測定できることから、内臓脂肪肥満における肥満度のマーカーとして利用されている（非特許文献２）。
【０００７】
アディポネクチンは単なる肥満度のマーカーに止まらず、病態との関連が数多く報告されており、現在低アディポネクチン血症という概念が提唱されている。低アディポネクチン血症の代表例が、糖尿病であることは言うまでもないが、それ以外にも低アディポネクチン血症により、心臓、肝臓、腎臓の組織障害、線維化が引き起こされ、これが原因となり心不全や、慢性腎臓病（CKD）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）などの疾患につながる。
【０００８】
心臓については、血圧に関与するホルモン（アンジオテンシンII）を投与し、筋肉の線維化を誘発したところ、その障害部分にアディポネクチンが集積し、組織修復を行ったとの報告がある（非特許文献３）。腎臓では、６分の５腎摘されたアディポネクチン欠損マウスにおいて、その腎臓での強い線維化の誘発や（非特許文献４）、肝臓でも非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）や肝硬変に至る組織の線維化とアディポネクチンの関係が報告されている（非特許文献５）。さらにアディポネクチンとガン、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）といった疾患の関係についても報告されている（非特許文献６−８）。
【０００９】
このように、アディポネクチンはインスリン抵抗性から糖尿病、脂質異常症、高血圧症、さらには動脈硬化に至る病態に関与するだけでなく、心不全や、慢性腎臓病（CKD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬変、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）といった疾患、またガンといった病態に関与するアディポネサイトカインである。
【００１０】
血中アディポネクチン濃度を上昇させる医薬品として、PPARγアゴニストであるチアゾリジンジオン誘導体が知られている（非特許文献９）。しかしながら、チアゾリジンジオン誘導体は、副作用として、循環血漿量の増加によると考えられる浮腫が短期間に発現し、また、心不全が増悪、あるいは、発症することがあるとされている。また、うっ血性心不全を誘発するおそれがあるとの報告があり、服用中は、急激な過度の体重増加、呼吸困難、浮腫など、心不全の症状が現れないか、注意が必要とされている。このように、安全性に優れたアディポネクチン分泌促進剤の開発は急務な課題と言える。
【００１１】
他方、８Ｓαグロブリンは、マメ科の一年生植物であるヤエナリ（学名：Vigna radiate）の種子である緑豆のタンパク質の主要構成成分である。ヤエナリはインドが原産地で、現在は主に東アジアから南アジア、アフリカ、南アメリカ、オースラリアで栽培されており、もやしや春雨の原料となるほか、餡、粥といった料理の材料として、アジアを中心に全世界で食されている。また、漢方薬のひとつとして、解熱、解毒、消炎作用があるとされているが、アディポネクチン分泌促進作用については、これまでに全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】春日雅人(2006)：メタボリックシンドローム：解明が進むその分子メカニズム、春日雅人編「生活習慣病がわかる」、pp12-19, 羊土社、東京
【非特許文献２】Ryo M et al, Circ J., 68, 975-981 (2004)
【非特許文献３】Fujita K et al, Arteioscler Thromb Vasc Bio., 28, 863-870, 2008
【非特許文献４】Ohashi K et al, Arteioscler Thromb Vasc Bio., 27, 1910-1917, 2007
【非特許文献５】Kamada Y et al, J Hepatol., 47(4), 556-564, 2007
【非特許文献６】Miyoshi Y et al, Clin Cancer Res., 9, 5699-5704, 2003
【非特許文献７】Tanabe K et al, J Oral Tissue Engin., 7(2), 99-106, 2009
【非特許文献８】Nakanishi K et al, Am J Respir Crit Care Med., 183(9), 1164-1175, 2011
【非特許文献９】Maeda N et al, Diabetes, 50, 2094-2099, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的なアディポネクチン分泌促進剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、日常生活で摂取する食品素材の血中アディポネクチン濃度に及ぼす関係について検討した結果、緑豆の貯蔵タンパク質である８Ｓαグロブリンが、良好なアディポネクチン分泌促進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の第一は、緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とする、アディポネクチン分泌促進作用を有する食品を要旨とするものであり、本発明の第二は、緑豆蛋白質を有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン分泌促進剤を要旨とするものであり、また、本発明の第三は、その８Ｓαグロブリンを有効成分とすることを特徴とするアディポネクチン分泌促進剤を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的なアディポネクチン分泌促進剤を提供することができ、その摂取により、近年問題となっているメタボリックシンドロームや低アディポネクチン血症によって引き起こされるとされる様々な病態（心不全、慢性腎臓病（CKD）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）、骨粗鬆症、肺浮腫病変など）に極めて有用なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マクロファージ刺激による脂肪細胞での８Ｓαグロブリン添加によるアディポネクチン分泌量の増加を示す図である。なお、a、ｂは、異なる記号で有意差（p＜0.05, Turkey HSD）の存在を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（緑豆タンパク質）
本発明のアディポネクチン分泌促進剤に用いられる緑豆タンパク質とは、ヤエナリの種子である緑豆に含有されるタンパク質である。これらの中でも、主に発芽時の栄養源として利用される、種子組織の液胞中に蓄積された貯蔵タンパク質が好ましい。中でも、これら緑豆貯蔵タンパク質の主成分である８Ｓαグロブリンは、本効果を強く示すものであり、対象として最も好ましい。タンパク質の抽出方法や素材中における含量は、特に限定されるものではない。素材としての摂取量を抑える意味では、緑豆よりタンパク質を高純度で抽出することが好ましく、得られたタンパク質中に８Sαグロブリンが高純度で存在することが好ましい。
【００１９】
８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質の抽出するに当たり、ヤエナリのさやから取り出した緑豆をそのまま使用することができる。
【００２０】
８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質は、原料である緑豆に対して水を３〜10倍量投入し、20〜60℃、pH６〜９の条件で２〜１８時間、静置あるいは撹拌処理により抽出する。さらに原料を磨砕し、さらに沈殿するデンプンを除くことでタンパク質溶液を得ることができる。
【００２１】
このタンパク質溶液をそのまま殺菌・乾燥することにより、８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を得ることができる。
また、高純度の８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を抽出するため、さらに、得られたタンパク質溶液のｐＨを４〜５に調整してタンパク質を等電点沈殿させることが好ましい。この沈殿物を回収して、必要に応じてpHを調整し、殺菌・乾燥することで、高純度の８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を得ることができる。
【００２２】
（アディポネクチン分泌促進剤）
本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、上記した８Ｓαグロブリンが有効量含有していればよく、その含有量は、後述した摂取量を考慮して適宜設定することができる。
【００２３】
本発明のアディポネクチン分泌促進剤としては、粉末、顆粒、固形物、半流動物、流動物、液状物の形態で医薬品または食品等として用いることができる。
【００２４】
医薬品として用いる場合、投与方法としては経口投与用医薬が好ましい。具体的には散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。これら経口投与剤は、その形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤等を添加し、常法に従って製造することができる。これら経口投与剤への緑豆タンパク質の配合量は、一般に０．１〜１００重量％、特に５〜８０重量％が好ましい。また、投与量は、上記８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１〜１０ｇを、２〜数回に分けて投与するのが好ましい。
【００２５】
食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が挙げられる。かかる食品は、食品の種類に応じて一般に用いられる食品原料を添加し、常法に従って製造することができる。緑豆タンパク質の食品への配合量は、食品の種類によっても異なるが、一般に０．１〜１００重量％、特に５〜８０重量％が好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明の有効性を実施例とともに示すが、これら例示によって本発明の技術思想が限定されるものではない。
【００２７】
○製造例１
緑豆を粉砕機にて粉状に粉砕した。粉砕緑豆粉に対して１０倍量の５０℃の温水を加え、随時pHを7.0に調整しながら１時間撹拌した。遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）し、得られた上澄液をpH5.0に調整して、再度遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）して得られた沈殿物を回収、加水後、pH7.0に中和して殺菌し、噴霧乾燥したものを８Ｓαグロブリンとした。このようにして得られた８ＳαグロブリンをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後タンパク質を染色し、全染色域の合計に対して、８Ｓαグロブリン由来のタンパク質として分子量48 kDaをメインに、72, 60, 26 kDaのタンパク質のバンドの染色度の測定から、純度として84.9％あり、以下の検討に十分耐えうる純度であることを確認した。
【００２８】
○製造例２
緑豆の表面を水洗浄後、１０倍量の水に一晩浸漬した。浸漬物を80メッシュの裏漉し器のついた磨砕装置に供し、皮と粗繊維を分離後、通過懸濁液を得る。懸濁液を遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）し、得られた上澄液をpH5.0に調整して、再度遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）して得られた沈殿物を回収、加水後、pH7.0に中和して殺菌し、噴霧乾燥したものを８Ｓαグロブリンとした。このようにして得られた８Ｓαグロブリンを上記同様にSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後染色されたタンパク質のバンドの染色度の測定から、純度として82.6％あり、以下の検討に十分耐えうる純度であることを確認した。
【００２９】
○試験例１
ラットによるアディポネクチン分泌促進効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として２０重量％含んだものを用いた。具体的な配合を表１に示した。
【００３０】
（表１）各試験群の飼料組成
2015057954.tif 000003
【００３１】
実験動物は、５週齢雄のウィスター系雄ラットを日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で４週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５％で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
【００３２】
４週間の試験期間内の飼料摂取量と体重の増加量を毎日測定した。表２に結果を示した。
【００３３】
（表２）飼料摂取量と体重の推移（平均値 ± 標準誤差）
2015057954.tif 000004
【００３４】
食餌摂取量には有意差は認められなかったが、試験終了時の体重および体重増加量は、８Ｓαグロブリン群で有意に低値であり、内臓脂肪低下によるアディポネクチン分泌促進を裏付けるものであった。
【００３５】
試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。各臓器（肝臓、腎臓）については、個々の臓器重量を測定した。血液については、遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、アディポネクチン量を測定した。その結果を表３に示した。
【００３６】
（表３）臓器重量およびアディポネクチン量の比較（平均値 ± 標準誤差）
2015057954.tif 000005
【００３７】
８Ｓαグロブリン群で肝臓や腎臓の臓器重量が有意な低下を示した。これらの臓器は一般に疾患に伴い肥大化し、重量が増加すると言われている。これらの臓器重量が有意に低かったことから、これらの臓器が疾患状態ではない、あるいは疾患状態であっても、その程度が低いことが示された。また、血中のアディポネクチン量が、８Ｓαグロブリン群で有意に高く、脂肪組織の最適化に伴う脂肪量、体重の減少を裏付けるものであった。
【００３８】
○試験例２
試験例１同様、ラットによるアディポネクチン分泌促進効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として２０重量％含んだものを用いた。さらに生活習慣病を誘発するため、油脂として牛脂を13重量％添加し、油分20重量％の高脂肪食とした。具体的な配合を表４に示した。
【００３９】
（表４）各試験群の飼料組成
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【００４０】
実験動物は、糖代謝機能の低下した糖尿病モデルである５週齢雄のGKラット（Goto-Kakizaki rats）を日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で３週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５％で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
【００４１】
３週間の試験期間内の飼料の摂取量と体重の増加量を毎日測定した。表５に結果を示した。群間に有意な差は認められなかった。
【００４２】
（表５）飼料摂取量と体重の推移（平均値 ± 標準誤差）
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【００４３】
試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。各臓器については、個々の臓器重量を測定した。血液については、遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、アディポネクチン量を測定した。その結果を表６に示した。
【００４４】
（表６）臓器重量およびアディポネクチン量の比較（平均値 ± 標準誤差）
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【００４５】
生活習慣病を促進させる系においても、試験例１同様、肝臓重量が有意な低下を示した。肝臓が疾患状態ではない、あるいは疾患状態であっても、その程度が低いことが示された。血中のアディポネクチン量が、８Ｓαグロブリン群で有意に高く、脂肪組織の最適化を裏付けるものであった。
【００４６】
○試験例３
脂肪細胞による、アディポネクチン分泌試験を行った。８Ｓαグロブリンについては、消化酵素であるペプシン（pH2.0）、トリプシン、キモトリプシン（ともにpH7.0）にてあらかじめ分解した消化８Ｓαグロブリンとして用いた。細胞はマウス前駆脂肪細胞3T3-L1を用いた。１×104 cells/mlでマイクロプレートに播種し、37℃、５容量%CO2条件下でコンフルエントに達するまで培養した。分化誘導時は10μg/1mlインスリン、0.25μMデキサメタゾンおよび0.5mMIBMX（イソブチルメチルキサンチン）含有のDMEM培地にて48時間培養した。
【００４７】
分化した3T3-L1細胞に5μg/1mlインスリンのみ添加し、分化誘導後10日間培養した。その後、消化８Ｓαグロブリンを37℃にて９時間作用させ、それから5 ng/ml TNF-αにて刺激し、37℃にて15時間培養した。
【００４８】
なお、一定量の培養上澄み液中のアディポネクチン量を、大塚製薬製のアディポネクチンELISAキットを用いて測定した。測定結果を図１に示した。
【００４９】
脂肪細胞をサイトカイン(TNF-α)にて刺激し、アディポネクチンの分泌能への影響を見たところ、８Ｓαグロブリンによりその分泌量の低下が抑えられており、８Ｓαグロブリンが脂肪細胞からのアディポネクチン分泌を促進していることが示された。
【図１】
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