(57)【要約】      （修正有）【課題】α−メチレン−γ−ブチロラクトン類で耐熱性透明樹脂用の単量体若しくは生理活性物質の合成中間体又は、害虫忌避剤や抗変異原性剤として有用な、チューリッパリン類にチューリッポシド類を変換する酵素の中でもチューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高いタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの提供。【解決手段】本発明に係るタンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）である。（Ａ）特定の配列（ＴｇＴＣＥＢ１）又は特定の配列（ＴｇＴＣＥＢ２）に示す配列を有するタンパク質。（Ｂ）（ＴｇＴＣＥＢ１）又は特定の配列（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換，欠失，挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高い、タンパク質。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）で示されるタンパク質。
（Ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示す配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換，欠失，挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高い、タンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換，欠失，挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高いタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号９又は配列番号１２のいずれかに示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物等に有するチューリッポシド類からチューリッパリン類を得るのに有効な酵素に関し、特にチューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性が高いタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドに係る。
【背景技術】
【０００２】
チューリッパリン類はα−メチレン−γ−ブチロラクトン類に相当し、耐熱性を有する透明樹脂の単量体、生理活性物質の合成中間体、さらには害虫忌避剤や抗変異原性剤としての利用が多数報告されている利用価値が高い化合物である。
本発明者らのこれまでの研究により、チューリップの花弁，球根，葯等の各種組織から酵素の精製を試みたところ、チューリッポシド変換酵素には、チューリッポシドＡとチューリッポシドＢのそれぞれの基質に適したチューリッポシドＡ変換酵素とチューリッポシドＢ変換酵素の少なくとも二種類の酵素が存在していることが確認された。
このうち、チューリッポシドＡをチューリッパリンＡに変換する酵素活性が高いタンパク質については先に提案している（特許文献１，２）。
チューリッパリンＢは、チューリッパリンＡと比較してアレルギー性が低い特徴もあり、今回はチューリッポシドＢをチューリッパリンＢに変換するのに有用な酵素を検討し、本発明に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１２５１６２号公報
【特許文献２】特願２０１２−１５１６４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素の中でもチューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高いタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るタンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）である。
（Ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示す配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換，欠失，挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高い、タンパク質。
【０００６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかである。
（ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＢ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＢ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換，欠失，挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換する酵素活性の高いタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号９又は配列番号１２のいずれかに示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０００７】
本発明において、チューリッポシド類は、下記化学式（１）に示すチューリッポシドＡ（ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＡ）及びその類縁体又は化学式（２）に示すチューリッポシドＢ（ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＢ）及びその類縁体が含まれるが、本発明に係る酵素はそのうちチューリッポシドＢ及びその類縁体の基質に対する酵素活性に優れる。
チューリッポシドＡ及びＢの類縁体には、特許文献１，２に開示するものが含まれる。
ここで、チューリッポシドＡの類縁体とは化合物中に化学式（１）の骨格を有するものをいい、チューリッポシドＢの類縁体とは化合物中に化学式（２）の骨格を有するものをいう。
【化１】
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【化２】
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【０００８】
本発明において、チューリッパリン類とは下記化学式（３）をいい、
【化３】
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（式中、Ｒ１，Ｒ２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）
代表例としては、下記化学式（４）に示すチューリッパリンＡ（α−メチレン−γ−ブチロラクトン）及び下記化学式（５）で示すチューリッパリンＢ（α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン）が挙げられる。
【化４】
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【化５】
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【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るタンパク質は、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するが、特にチューリッポシドＢ及びその類縁体をチューリッパリンＢに変換するのに効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】花粉由来チューリッポシドＢ変換酵素遺伝子ｃＤＮＡ（ＴｇＴＣＥＢ１）と花弁及び球根由来チューリッポシドＡ変換酵素遺伝子ｃＤＮＡ（花弁；ＴｇＴＣＥＡ１、球根；ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）がコードするポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２】組換えＴｇＴＣＥＢ１酵素の各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、チューリップ花粉由来のチューリッポシドＢ変換酵素遺伝子配列の断片を取得し、大陽菌を宿主とした同組換え酵素の大量発現を可能にしたので、以下具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
＜クローニング＞
チューリップ各組織粗酵素中のチューリッポシドＡ変換酵素（tuliposide A-converting enzyme）活性とチューリッポシドＢ変換酵素（tuliposide B-converting enzyme）活性の測定から、酵素活性比（Ｂ／Ａ）は、葯において高いことが我々のこれまでの研究によって分かっていたが、酵素活性局在性の詳細な検討の結果、葯のチューリッポシドＢ変換酵素活性の大部分は葯に付着している花粉に由来するものであることが分かった。
そこで、チューリップ品種「紫水晶」の花粉から各種カラムクロマトグラフィーを経て、チューリッポシドＢ変換酵素を精製し、その内部アミノ酸配列に基づいて、下記の縮重プライマーを設計した。
ＴＣＥＢ−ｄｅｇ−Ｆ１：agyggicgcatigagcgtctigg（配列番号１）
ＴＣＥＢ−ｄｅｇ−Ｒ１：gaiatraaiagrtgrtcraaatcg（配列番号２）
「紫水晶」の花粉より精製したｍＲＮＡから逆転写反応によって合成したｃＤＮＡを鋳型として、上記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行い、当該遺伝子の部分ｃＤＮＡ配列を取得し、さらに５’ＲＡＣＥ法および３’ＲＡＣＥ法によってコード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
次に５’および３’非翻訳領域に設計した下記のプライマーを用いて、上記花粉ｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
ＴＣＥＢ−ｆｕｌｌ−Ｆ１：agtccgtcatcatcaaacagtcc（配列番号３）
ＴＣＥＢ−ｆｕｌｌ−Ｒ１：gcgttgtctttgccattgac（配列番号４）
その時の条件を以下に示す。
＜ＰＣＲ反応液（５０μｌ）組成＞
鋳型ｃＤＮＡ（４ｎｇ／μｌ）１μｌ、５０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各０．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μｌ、５  ｘ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．５μｌ、水３２．５μｌ
＜ＰＣＲ反応サイクル＞
９８℃、３０秒の加熱の後、変性（９８℃、１０秒）→アニーリング（５５℃、３０秒）→伸長（７２℃、１分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにライゲーション後、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、インサートＤＮＡの挿入が確認されたクローンについてシークエンシングしたところ、ＴｇＴＣＥＢ１、ＴｇＴＣＥＢ２と命名した２種類の全長ｃＤＮＡ配列が得られた。
その塩基配列とアミノ酸配列を下記に示す。
（１）−１．ＴｇＴＣＥＢ１の塩基配列を（配列番号７）に示す。
（１）−２．ＴｇＴＣＥＢ１のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号８）に示す。
（１）−３．ＴｇＴＣＥＢ１のアミノ酸配列を（配列番号９）に示す。
（２）−１．ＴｇＴＣＥＢ２の塩基配列を（配列番号１０）に示す。
（２）−２．ＴｇＴＣＥＢ２のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１１）に示す。
（２）−３．ＴｇＴＣＥＢ２のアミノ酸配列を（配列番号１２）に示す。
次に、「紫水晶」の葉より調製したゲノムＤＮＡに対し、これら両配列のコード領域全長（翻訳開始コドンから停止コドンまで）を増幅するように設計した下記のプライマーを用いて、ゲノムＰＣＲを行った。
ＴＣＥＢ−ＣＤＳ−Ｆ１：atgtctatcgtcagcttctgtagc（配列番号５）
ＴＣＥＢ−ＣＤＳ−Ｒ１：ttagctgctgtagggaaccg（配列番号６）
その時の条件を以下に示す。
＜ＰＣＲ反応液（５０μｌ）組成＞
鋳型ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３μｌ、１０  ｘ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌ、水３０μｌ
＜ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、２分の加熱の後、変性（９８℃、１０秒）→アニーリング／伸長（７０℃、１分）の２ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
ＰＣＲ増幅産物のクローニングとシークエンシングの結果、上記ｃＤＮＡに対応する２種のゲノムクローンが得られた。
また、ｃＤＮＡクローンとゲノムクローンの比較から、ＴｇＴＣＥＢ１およびＴｇＴＣＥＢ２はイントロンを含まない遺伝子であることが分かった。
ＴｇＴＣＥＢ１とＴｇＴＣＥＢ２の塩基配列は配列番号７と１０を比較したところ、８４５番目の１塩基のみが異なっていた。
いずれも４４０アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしており、そのアミノ酸配列は完全に一致するものであった。
ＴｇＴＣＥＢ１と、特許文献１及び２に記載したチューリップ花弁および球根から単離されたチューリッポシドＡ変換酵素遺伝子（それぞれＴｇＴＣＥＡ１およびＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）がコードするアミノ酸配列を図１に示す。
これらのアミノ酸配列を比較すると、チューリッポシドＢ変換酵素の配列とチューリッポシドＡ変換酵素の配列は明らかに異なるものであることが分かる。
ＴｇＴＣＥＢ１はＴｇＴＣＥＡ１と５２．４％、ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１と５３．４％のアミノ酸配列の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
【００１２】
＜組換え酵素の調製＞
ＴｇＴＣＥＢ１の全長アミノ酸配列と花粉からの精製酵素のＮ末端アミノ酸配列の比較によって推定されたシグナルペプチド領域を除いた成熟ポリペプチドを発現するように、当該配列を大腸菌発現ベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングした。
組換え酵素のＮ末端側にはヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を含むようにした。
組換えベクターを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）に導入し、得られた組換え菌をＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン、３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）にてＯＤ６６０＝０．６−０．８に達するまで３７℃、２００ｒｐｍで培養した後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１８℃、２００ｒｐｍで１８時間培養することで組換え酵素を発現させた。
発現誘導後の菌体に超音波処理を施し、得られた可溶性タンパク質画分をTALON Metal Affinity Resinを用いた金属アフィニティークロマトグラフィーに供した。
ＴＡＬＯＮ樹脂に結合後、溶出ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）によって溶出された活性画分に、タンパク質１ｍｇあたり１．５ユニットのトロンビンを加え４℃で一晩静置反応することで、ヒスチジンタグを含むベクター由来の１７アミノ酸残基からなるペプチドを切断した。
このものをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムによるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、活性画分を合一することで、ヒスチジンタグを含まない精製組換え酵素を得た。
組換え酵素精製過程のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２に示す。
この精製過程によって、組換え大腸菌培養液５００ｍｌから概ね１０−１５ｍｇ程度の組換え酵素を得ることができる。
精製組換え酵素のＧ３０００ＳＷｘｌカラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果、組換え酵素は花粉由来の天然型酵素と同様に２量体酵素として発現していることが分かった。
【００１３】
＜酵素活性測定＞
上記にて精製した組換え酵素の酵素活性試験を次のように行った。
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中、４ｍＭチューリッポシドＡまたは４ｍＭチューリッポシドＢと組換え酵素を含む５０μｌの酵素反応液を室温で１０分インキュベートした後、０．５Ｍリン酸を５０μｌ加えることで反応を停止し、酵素反応生成物であるチューリッパリンＡまたはチューリッパリンＢの生成量を逆相系ＨＰＬＣにて定量した。
その結果、精製したＴｇＴＣＥＢ１組換え酵素はチューリッポシドＢをチューリッパリンＢに変換する酵素活性を有していることが確認された。
本組換え酵素はチューリッポシドＡをチューリッパリンＡに変換する酵素活性も有していたが、その活性はチューリッポシドＢに対する活性の約１４０分の１と低いものであったことから、ＴｇＴＣＥＢ１およびＴｇＴＣＥＢ２はチューリッポシドＢ変換酵素をコードしていることが確認された。
また、組換え酵素精製過程において、ヒスチジンタグを含むベクター由来１７アミノ酸残基の除去によって、酵素活性は約２倍程度向上したことから、高活性の組換え酵素の調製にはタグの除去が有効であることが示された。
ＴｇＴＣＥＢ１組換え酵素と、組換えチューリッポシドＡ変換酵素（花弁由来ＴｇＴＣＥＡ１および球根由来ＴｇＴＣＥＡ−ｂ１）の酵素活性の比較を表１に示す。
【表１】
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１Ｕは１分間に１μｍｏｌの基質を生成物に変換する酵素量。
酵素活性は基質濃度４ｍＭにおける値。
いずれの組換え酵素もヒスチジンタグを含むベクター由来アミノ酸残基を除いたもの。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明は、工業原料として利用価値の高いチューリッパリン類、その中でも特にチューリッパリンＢの製造に有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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