(57)【要約】【課題】  銀ナノ粒子を固体物質に固定化した抗生物性材料を提供する。【解決手段】  本発明は、脱アセチル化度が０％〜３５％であり、表面にナノサイズの凹凸を含むように粗面化された微粒子状のキチン誘導体と、前記キチン誘導体に結合した銀ナノ粒子とを有することを特徴とする固体状の抗微生物材料である。前記ナノサイズの凹凸は、前記キチン誘導体を構成する主鎖同士が互いに解れることによって形成された繊維状構造を含むとよい。また、前記ナノサイズの凹凸は、前記キチン誘導体を摩砕した際の摩砕面であるとよい。【選択図】    図１
2015010063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱アセチル化度が０％〜３５％であり、表面にナノサイズの凹凸を含むように粗面化された微粒子状のキチン誘導体と、
前記キチン誘導体に結合した銀ナノ粒子とを有することを特徴とする固体状の抗微生物材料。
【請求項２】
前記ナノサイズの凹凸は、前記キチン誘導体を構成する主鎖同士が互いに解れることによって形成された繊維状構造を含むことを特徴とする請求項１に記載の固体状の抗微生物材料。
【請求項３】
前記ナノサイズの凹凸は、前記キチン誘導体を摩砕した際の摩砕面であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の固体状の抗微生物材料。
【請求項４】
前記キチン誘導体は、摩砕処理によって粒径が０．５μｍ〜２００μｍに調製された微粒子であることを特徴とする請求項３に記載の抗微生物材料。
【請求項５】
前記銀ナノ粒子は、平均粒径が１ｎｍ〜２０ｎｍであり、当該抗微生物材料に対する重量分率が０．０５％〜５％であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１つの項に記載の抗微生物材料。
【請求項６】
請求項１〜請求項５に記載の抗微生物材料を含有する樹脂から構成された抗微生物性を有する物品。
【請求項７】
銀イオン含有ガラス粉末と還元糖とを含む水系懸濁液を加熱し、前記水系懸濁液に溶出した前記銀イオンを還元して銀ナノ粒子コロイド溶液を得る第１工程と、
脱アセチル化度が０〜３５％のキチン誘導体を粗面化処理し、前記キチン誘導体の表面にナノサイズの凹凸を形成する第２工程と、
前記銀ナノ粒子コロイド溶液に前記粗面化処理された前記キチン誘導体を加え、前記銀ナノ粒子が前記キチン誘導体に結合したキチン／銀ナノ粒子複合体を得る第３工程と、
前記キチン／銀ナノ粒子複合体を前記水系懸濁液から分離し、乾燥することによって前記銀ナノ粒子が結合された固体状のキチン誘導体を含む固体材料を得る第４工程と
を有することを特徴とする抗微生物材料の製造方法。
【請求項８】
前記粗面化処理は、前記キチン誘導体の摩砕処理であり、前記キチン誘導体の粒径を０．５μｍ〜２００μｍまで微粒化すると同時に、摩砕面によって前記ナノサイズの凹凸を形成することを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記第１工程において、加熱によって前記還元糖をカラメル化させることを特徴とする請求項７に記載の抗微生物材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗微生物材料に係り、詳細には銀ナノ粒子を含む固体状の抗微生物材料に関する。また、抗微生物材料を含む物品と、抗微生物材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純なマクロな塊状の金属とは異なり、金属ナノ粒子は、そのサイズや形状に応じた光学的、電磁気的、化学的特性を生じることが知られている。このような金属ナノ粒子の製造方法として、ナノサイズレベルの銀ナノ粒子を含む金属コロイド溶液を、簡便な装置を用い、温和な条件で製造する方法が公知となっている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜３）。特許文献１には、還元糖の種類及び濃度を変化させることによって金属ナノ粒子の粒径を制御する技術が開示されている。また、金属コロイドの製造方法として、金属イオン含有ガラス粉末と還元糖（グルコース）とを含む水系懸濁液を、一般的なオートクレーブ装置等を用いて加圧加熱する技術が公知となっている（例えば、特許文献２）。更に、担体としてのキチン・キトサンに金属ナノ粒子を固定化した抗微生物材料が公知となっている（例えば、非特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２６８６９４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１５７６２３号公報
【非特許文献１】Y. Mori et al. Simple and environmentally friendly preparation and size control of silver nanoparticles using an inhomogeneous system with silver-containing glass powder. J Nanopart Res 13, 2799 (2011)
【非特許文献２】T. Cunha et al. Biological and pharmacological activity of chitosan and derivatives. Chitosan-based systems for biopharmaceuticals: Delivery, targeting and polymer therapeutics, First edition. Edited by Bruno Sarmento and Jose das Neves. by John Wiley&Sons, Ltd. (2012)
【非特許文献３】J.L. Elechiguerra et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. J Nanobiotechnol 3, 6 (2005)
【非特許文献４】Y. Mori et al. Antivial activity of silver nanoparticle/chitosan composites against H1N1 influenza A virus. Nanoscale Res Lett 8, 93 (2013)
【非特許文献５】V.Q. Nguyen et al. Preparation of size-controlled silver nanoparticles and chitin-based composites and their antimicrobial activities. J Nanomater, Article ID 693486, 1, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
銀ナノ粒子は、生体に対して影響を及ぼすことがいくつか報告されており、特に水生生物に対する生体毒性が危惧されている。哺乳類に対してもマウスの精子幹細胞の成長を阻害することが知られている。また、銀ナノ粒子は表面プラズモン共鳴により呈色するため、銀ナノ粒子を溶媒に分散させたコロイド溶液状態での抗微生物材料への適用は、生体への影響のみならず衣類や家財等の汚損が予期されるために困難であった。
【０００５】
そのため、銀ナノ粒子の抗微生物剤としての適用は、キチン・キトサンのような有機高分子の基質（担体）の内部に固定化したものが多かった。しかしながら、抗微生物性の発現は銀ナノ粒子部分の微生物に対する選択的な物理吸着よるものであるため、銀ナノ粒子と基質との立体構造の制御が重要になる。すなわち、銀ナノ粒子の粗大化を抑制しつつ、基質の表面に銀ナノ粒子を効率良く分散させることが重要になる。
【０００６】
本発明は、以上の背景を鑑みてなされたものであって、銀ナノ粒子を固体物質に固定化した抗生物性材料を提供することを課題とする。また、抗生物性材料を含む物品を提供することを課題とする。また、その製造方法を簡素にする（容易化する）ことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、脱アセチル化度が０％〜３５％であり、表面にナノサイズの凹凸を含むように粗面化された粒子状のキチン誘導体と、前記キチン誘導体に結合した銀ナノ粒子とを有することを特徴とする固体状の抗微生物材料である。
【０００８】
ここで、キチン誘導体は、複数のＮ−アセチルグルコサミン（Ｃ８Ｈ１３ＮＯ５）とグルコサミン（Ｃ６Ｈ１３ＮＯ５）とを直鎖状に含む分子量が数千〜数十万の多糖類である。Ｎ−アセチルグルコサミンは、そのアセチル基を脱アセチル化することによってグルコサミンとなる。キトサンは、キチンと同様に、複数のＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとを直鎖状に含む分子量が数千〜数十万の多糖類であって、脱アセチル化度によってキチンと区別されている。脱アセチル化度は、キチン誘導体中に含まれるＮ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの総数に対するグルコサミンの数の割合と定義されている。キチン誘導体は、脱アセチル化度が０〜５０％のものをキチン、５１％〜１００％のものをキトサンと定義する。
【０００９】
また、キチン誘導体は、含まれるＮ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンが付加的な官能基を有していてもよい。キチン誘導体は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの水酸基のカルボキシ化合物やアルコキシ化合物、アルチレングリコールの付加物、アシルオキシ化合物、カルバメート化合物等の各種のものを含み、具体的には例えば、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣＴ）を含む。
【００１０】
また、キチン誘導体の粗面化は、酸を用いたエッチング処理や、ボールミルや乳鉢による摩砕（破砕、粉砕）処理を含む。
【００１１】
この構成によれば、脱アセチル化度が０％〜５０％のキチン誘導体は、常温（２０℃±１５℃）において、固体となるため、銀ナノ粒子が結合された固体状の抗微生物材料を得ることができる。この抗微生物材料は、常温（２０℃±１５℃）において、水に不溶な粒子（粉体）として得られる。キチンは弱い正電荷を有するため、表面に塩化物及び酸化物が形成されて負の電荷を有する銀ナノ粒子と結合することができる。特に、キチンは、銀ナノ粒子を含むコロイド溶液に添加することによって、銀ナノ粒子と結合することができるため、キチン／銀ナノ粒子複合体の形成が容易である。
【００１２】
本発明では、キチン誘導体の表面は粗面化され、ナノサイズの凹凸を含むため、銀ナノ粒子は凹凸内に入り込むことによってキチン誘導体と相互作用可能な面積が増大し、物理吸着による相互作用が増加する。そのため、銀ナノ粒子は、キチン誘導体との静電相互作用に加え、キチン誘導体の表面との物理吸着によってキチン誘導体表面に保持される。すなわち、銀ナノ粒子のキチン誘導体に対する結合が促進される。
【００１３】
また、キチン／銀ナノ粒子複合体である抗微生物材料は、固体として形態が安定しているため、各種の繊維、紙、コットン、ゴム、プラスチック、木材、塗料等の汎用材料に混合、塗布、被覆し、抗微生物活性を付与することができる。抗微生物材料は、繊維、紙、コットン、ゴム、プラスチック、木材、塗料等の汎用材料に例えば０．０５〜２０％の重量比で混合することで、抗微生物性を付与することができる。抗微生物材料を含む汎用材料は、シート状、スポンジ状（多孔質状）等に形成することができ、銀ナノ粒子と微生物との接触面積を増大させることができる。
【００１４】
上記発明において、前記ナノサイズの凹凸は、前記キチン誘導体を構成する主鎖同士が互いに解れることによって形成された繊維状構造を含むとよい。
【００１５】
この構成によれば、キチン誘導体の表面には、キチン誘導体を構成する主鎖が繊維状に露出する。この解れた主鎖間に銀ナノ粒子が係止されることによって、銀ナノ粒子はキチン誘導体の表面に保持される。
【００１６】
上記発明において、前記ナノサイズの凹凸は、前記キチン誘導体を摩砕した際の摩砕面であるとよい。
【００１７】
この構成によれば、キチン誘導体の摩砕面を利用したナノサイズの凹凸を形成することができる。キチン誘導体の摩砕面では、キチン誘導体を構成する主鎖が互いに解れ、ナノサイズの繊維状構造が形成される。
【００１８】
上記発明において、前記キチン誘導体は、摩砕処理によって粒径が０．５μｍ〜２００μｍに調製された粉末であるとよい。
【００１９】
この構成によれば、粒径が０．５μｍ〜２００μｍに調製された粉末の摩砕面には、銀ナノ粒子を係止するために十分なナノサイズの凹凸が形成される。
【００２０】
上記発明において、前記銀ナノ粒子は、平均粒径が１ｎｍ〜２０ｎｍであり、当該抗微生物材料に対する重量分率が０．０５％〜５％であるとよい。
【００２１】
この構成によれば、抗生物性材料の抗微生物活性が高められる。
【００２２】
上記発明における前記抗微生物材料を含有する樹脂から、抗微生物性を有する物品を構成してもよい。樹脂は、例えば、ポリエチレンテレフタラートやポリアセタール、ポリカーボネート、ポリアミド等の公知の樹脂であってよく、物品は自動車のインストルメントパネルやステアリングホイール、空調装置のフィルターやダクト等の公知のプラスチック成形部分であってよい。
【００２３】
この構成によれば、公知の様々な樹脂製物品に抗生物性を付与することができる。
【００２４】
また、本発明の他の側面は、抗微生物材料の製造方法であって、銀イオン含有ガラス粉末と還元糖とを含む水系懸濁液を加熱し、前記水系懸濁液に溶出した前記銀イオンを還元して銀ナノ粒子コロイド溶液を得る第１工程と、脱アセチル化度が０〜３５％のキチン誘導体を粗面化処理し、前記キチン誘導体の表面にナノサイズの凹凸を形成する第２工程と、前記銀ナノ粒子コロイド溶液に前記粗面化処理された前記キチン誘導体を加え、前記銀ナノ粒子が前記キチン誘導体に結合したキチン／銀ナノ粒子複合体を得る第３工程と、前記キチン／銀ナノ粒子複合体を前記水系懸濁液から分離し、乾燥することによって前記銀ナノ粒子が結合された固体状のキチン誘導体を含む固体材料を得る第４工程とを有することを特徴とする。
【００２５】
この構成によれば、キチン誘導体を使用したことによって、銀ナノ粒子コロイド溶液から銀ナノ粒子の粗大化を抑制しつつ、キチン／銀ナノ粒子複合体を形成することができる。特に、還元糖を使用した銀イオンの還元による銀ナノ粒子コロイド溶液では、銀ナノ粒子と還元糖との分離が困難であるが、キチン誘導体を使用したことによって還元糖の除去が容易になる。また、この製造方法によれば、銀ナノ粒子の粒径の制御が容易である。また、キチン誘導体の表面を粗面化し、表面にナノサイズの凹凸を形成したことによって、キチン誘導体に対する銀ナノ粒子の結合が促進される。
【００２６】
上記発明において、前記粗面化処理は、前記キチン誘導体の摩砕処理であり、前記キチン誘導体の粒径を０．５μｍ〜２００μｍまで微粒子化すると同時に、摩砕面によって前記ナノサイズの凹凸を形成することが好ましい。
【００２７】
この構成によれば、キチン誘導体の摩砕処理を行い、キチン誘導体の粒径を０．５μｍ〜２００μｍまで微粒化すると、キチン誘導体の摩砕面には銀ナノ粒子の係止（吸着）に適したナノサイズの凹凸が形成される。
【００２８】
上記発明において、前記第１工程において、加熱によって前記還元糖をカラメル化させることが好ましい。
【００２９】
この構成によれば、銀ナノ粒子コロイド溶液において、カラメル化した還元糖が銀ナノ粒子を保護し、銀ナノ粒子の粗大化が抑制される。なお、後の第３工程で、銀ナノ粒子は、カラメルに代わって吸着性に優れたキチン誘導体に吸着され、キチン／銀ナノ粒子複合体を形成する。
【発明の効果】
【００３０】
以上の構成によれば、銀ナノ粒子を固体物質に固定化した抗生物性材料を提供することができる。また、抗生物性材料を含む物品を提供することができる。また、その製造方法を簡素にする（容易化する）ことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】キチン、生石灰及びゼオライトのＳＥＭ観察像
【図２】キチン／銀ナノ粒子複合体のＴＥＭ観察像
【図３】キチン／銀ナノ粒子複合体の水懸濁液を用いた遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトル
【図４】生石灰／銀ナノ粒子複合体、及びゼオライト／銀ナノ粒子複合体の水懸濁液を用いた遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトル
【図５】銀ナノ粒子の各担体への最大吸着量を示す表
【図６】各担体と銀ナノ粒子との複合体の抗ウィルス性を示すグラフ
【図７】各担体と銀ナノ粒子との複合体の抗菌活性を示すグラフ
【図８】キチン／銀ナノ粒子複合体の抗真菌活性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本実施形態に係るキチン／銀ナノ粒子複合体からなる抗微生物材料は、脱アセチル化度が０〜３５％のキチン誘導体に、銀ナノ粒子が結合されたものである。キチン誘導体は、複数のＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとを直鎖状に含む多糖類であり、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンは任意の官能基を付加的に有してもよい。キチン誘導体は、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの水酸基のカルボキシ化合物やアルコキシ化合物、アルチレングリコールの付加物、アシルオキシ化合物、カルバメート化合物等の各種のものを含み、具体的には例えば、カルボキシメチルキチン（ＣＭＣＴ）を含む。キチン誘導体は、粒径が０．５μｍ〜２００μｍの微粒子（微粉末）として調製される。
【００３３】
銀ナノ粒子は、静電相互作用や機械的結合によってキチン誘導体に結合される。銀ナノ粒子は、その表面に銀のハロゲン化物や酸化物が吸着して負電荷を有する。一方、キチン誘導体は、水溶液中では正電荷を有する。そのため、銀ナノ粒子とキチン誘導体とは、静電相互作用によって互いに結合する。
【００３４】
また、銀ナノ粒子は、キチン誘導体の表面に形成されたナノサイズの凹凸と相互作用することによって、物理吸着によりキチン誘導体に結合される。キチン誘導体の表面に形成されるナノサイズの凹凸は、ナノサイズの繊維状構造や網目構造、多孔質構造等の各種の凹凸を形成する構造を含む。これらのナノサイズの凹凸は、キチン誘導体を構成する主鎖が、例えばキチン誘導体の表面において互いに解れることによって形成されている。このようなナノサイズの凹凸は、キチン誘導体の表面を粗面化処理することによって形成される。粗面化処理には、キチン誘導体の摩砕処理や酢酸等の酸による溶解処理（エッチング）が含まれる。
【００３５】
キチン誘導体の摩砕処理によれば、キチン誘導体の表面に摩砕面が形成される。キチン誘導体の摩砕面では、キチン誘導体の主鎖の開裂や、主鎖間の解離が生じ、主鎖により形成されるナノサイズの繊維状構造が解れた形態が形成される。キチン誘導体の摩砕処理は、ボールミルや乳鉢を使用した公知の摩砕方法を適用できる。また、キチン誘導体表面の酢酸等の酸による溶解処理（エッチング）によっても、キチン誘導体の主鎖間の結合を解離することができ、ナノサイズの凹凸がキチン誘導体の表面に形成される。摩砕処理及び溶解処理は、少なくとも一方が実施されるとよい。銀ナノ粒子は、キチン誘導体の表面に形成されるナノサイズの凹凸に入り込み、相互作用（ファンデルワールス相互作用）する表面積を増加させることによってキチン誘導体の表面に保持される。
【００３６】
脱アセチル化度が０〜３５％のキチン誘導体は、常温（２０℃±１５℃）、中性領域（ｐＨ８〜６．５）において固体であり、水に不溶である。そのため、キチン／銀ナノ粒子複合体は、常温において固体であり、水に不溶であり、所定の形状を維持する。脱アセチル化度が０％〜３５％のキチン誘導体を含むキチン／銀ナノ粒子複合体は、粉体状、スポンジ状、シート状、膜状など種々の形態を取り得る。また、キチン／銀ナノ粒子複合体は、単体で又は他の樹脂材料と混合して射出成形用材料としても使用することができ、公知の様々なプラスチック物品に代替することができる。また、キチン／銀ナノ粒子複合体は、公知の様々なプラスチック物品の表面に塗布されてもよい。例えば、キチン／銀ナノ粒子複合体は、自動車のインストルメントパネルやステアリングホイール、電話機及びテレビ等の筐体、空調装置に組み込まれるフィルター材料やダクト等の公知の様々なプラスチック製品に使用することができる。
【００３７】
脱アセチル化度が５０％より大きいキトサン誘導体は、酸性領域（＞ｐＨ６）で一部が溶解してゲル化するため、その乾燥粉末は、安定なナノ繊維様表面構造を維持することができず、滑らかな表面構造をとる。また、脱アセチル化度が５０％より大きいキトサン誘導体の粒子は、形状が剛直でないため、摩砕により粒径を５０μｍ以下に調製することが困難であり、その粒径は２００μｍ〜２ｍｍになる。
【００３８】
本願発明者らの研究によれば、キチン誘導体のナノサイズの表面構造やキチン誘導体の粒径が、キチン誘導体の脱アセチル化度よりもキチン誘導体と銀ナノ粒子との結合性に与える影響が大きいことが確認されている。キチン誘導体は、脱アセチル化度が低いほど固体形状の安定が良く、１０％以下において一層安定した形態を取り得る。以上より、キチン誘導体の脱アセチル化度は、固体形状の安定性の観点と、銀ナノ粒子との結合性の観点とから、０％〜３５％であることが好ましく、より好ましくは０％〜１０％である。
【００３９】
キチン誘導体と銀ナノ粒子との結合性の観点から、キチン誘導体は表面にナノサイズの凹凸（表面構造）を有することが好ましい。このナノサイズの凹凸は、上述したようにキチン誘導体の摩砕処理によって形成される摩砕面を利用して形成することができる。そのため、脱アセチル化度が０％〜３５％のキチン誘導体を摩砕処理によって粒径を調製した場合には、粒径が０．５〜２００μｍ、より好ましくは１〜１００μｍである場合に、銀ナノ粒子との結合性を十分に確保することができるナノサイズの凹凸（表面構造）が形成される。
【００４０】
キチン及びその誘導体は、抗微生物活性（抗真菌活性、抗菌活性、及び抗ウィルス活性を含む）を有することが知られている。弱い負の電荷を有する真菌や菌、ウィルスの細胞膜に正の電荷を有するキチン誘導体が強く相互作用し、細胞膜の変化、遊走の抑制、細胞質成分の溶出を引き起こすためと考えられている（非特許文献１参照）。
【００４１】
キチン誘導体は、銀ナノ粒子が結合されてキチン／銀ナノ粒子複合体となることによって、抗真菌、抗菌活性が大きく増強される。また、銀ナノ粒子が抗ウィルス活性を有することから、キチン／銀ナノ粒子複合体も抗ウィルス活性を有する。
【００４２】
キチン／銀ナノ粒子複合体に含まれる銀ナノ粒子のサイズ（球状に近似させた場合の直径）は、抗菌用途の材料を得る場合にはマイクロオーダーより小さいことが好ましく、抗ウィルス用途の材料を得る場合には、好ましくは５０ｎｍ以下、より好ましくは１〜３０ｎｍ、更に好ましくは、２〜２０ｎｍであるとよい。
【００４３】
キチン／銀ナノ粒子複合体に含まれるキチン誘導体は、分子量が好ましくは５，０００以上、より好ましく１０，０００〜３００，０００であるとよい。
【００４４】
実施形態に係るキチン／銀ナノ粒子複合体は、医療用あるいは産業用など各種用途に適用される。銀ナノ粒子はナノサイズにまで小さくすることにより、塊状金属とは異なる光学的、電磁気学的、化学的性質を呈する。例えば、１０ｎｍ以下の銀ナノ粒子はＨＩＶ−１ウィルスのエンベロープに選択的に吸着して該ウィルスを不活化させることが見出されている（非特許文献３）。キチン／銀ナノ粒子複合体は、良好な安定性と共に強い抗ウィルス活性を呈する。ウィルスとしては、例えば、Ａ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウィルスが挙げられる。
【００４５】
以下に、キチン／銀ナノ粒子複合体の製造方法を説明する。キチン／銀ナノ粒子複合体は、調製した銀ナノ粒子コロイドにキチン誘導体を加えることによって形成され、溶液を取り除くことによって水に不溶の微粉末として精製される。
【００４６】
銀ナノ粒子コロイドは、銀イオン含有ガラス粉末と還元糖（グルコース）とを含む水系懸濁液を、一般的なオートクレーブ装置等を用いて加圧加熱することによって生成される。この手法によって生成される銀ナノ粒子は粒径が一定しており、保存安定性も良好である。この手法における懸濁液の加熱において、グルコースは加熱され、分解し、不規則に結合する結果、褐色のあめ状物質に変化し、カラメル化する。
【００４７】
銀イオン含有ガラス粉末の粒径は、好ましくは２〜２０μｍである。銀イオン含有ガラス粉末の粒径が小さいほど、銀イオンの溶出速度が速くなり、目的とする金属コロイドを得易くなる。ガラス粉末の粒径の好適な下限値は、粉末の取り扱い易さやコスト等を根拠とするほか、銀イオンの流出速度が速くなり過ぎないという点も考慮するとよい。また、銀イオン含有ガラス粉末に含まれる銀イオンの割合は、特に限定は無く、好ましくは０．５〜３重量％である。この範囲内であれば、水系懸濁液中で好ましい速度で金属イオンが溶出する。また、一価の銀イオンの形態でガラス成分に含まれることが典型的であり、具体的には硝酸銀や酸化銀の形態でガラス粉末に含まれていてもよい。
【００４８】
還元糖は、塩基性溶液中でアルデヒド基とケトン基とを形成する糖である。還元糖としては例えばグルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド等の全ての還元単糖類、ラクトース、アラビノース、マルトース等の還元二糖類・オリゴ糖等が挙げられる。溶出した銀イオンを還元するに足る還元力のある還元糖を特に限定無く用いることができ、入手の容易さ、水溶性等の観点から、単糖類であるグルコースを使用するとよい。懸濁液のオートクレーブにおいて還元糖としてのグルコースは、分解し、不規則に結合する結果、褐色のあめ状物質（カラメル）に変化し、カラメル化する。生成されたカラメルは、還元された銀ナノ粒子が粗大粒子へと成長することを阻害し、微小な銀ナノ粒子として安定化させる。
【００４９】
本実施形態では、金属の還元反応を水系溶媒中で行う。水系溶媒は少なくとも５０％以上が水であり、好ましくは水のみである。グルコースと銀イオンとの間の酸化還元反応によって銀イオンが還元されて銀ナノ粒子となり、銀ナノ粒子コロイド溶液が得られる。この酸化還元反応において、グルコースが大過剰であることが望ましい。具体的には、水系溶媒における還元糖の濃度は０．２〜８重量％とした。本発明者らの新知見によれば、得られる金属コロイド中の金属粒子のサイズは、反応系中の還元糖の量の平方根に概ね比例する。よって、還元糖の使用量は、金属コロイド中の金属粒子のサイズの制御要因になり得る。
【００５０】
本実施形態では、還元糖を水系溶媒に溶解させ、さらに、金属イオン含有ガラス粉末を分散させて水系懸濁液（以下、単に懸濁液ともいう。）を得て、その懸濁液を加熱する。加熱の好適例として、閉鎖系にて懸濁液を加熱し続けることが挙げられる。これによれば、水蒸気が生成して系内圧力が上昇するため、加圧状態での加熱が可能となる。このような加圧加熱は、一般的なオートクレーブ装置などを用いて容易に実現できる。
【００５１】
懸濁液の加圧・加熱によって還元糖としてのグルコースは、分解し、不規則に結合する結果、褐色のあめ状物質に変化する（カラメル化する）。生成したカラメルは、還元され生成した銀ナノ粒子が粗大粒子へと成長するのを阻害し、微小な銀ナノ粒子として安定化させる。本実施形態では、従来法とは異なり、酸化還元反応において特段の添加剤が不要である。これは、還元糖に由来するカラメルが添加剤の代替になっているためである。
【００５２】
銀ナノ粒子コロイド溶液を生成するためのオートクレーブの好適な条件は、圧力が１８０〜２３０ｋＰａ、温度が１１０〜１３０℃、加圧・加熱時間が１０〜２５分間である。上記範囲内では、反応速度及びグルコースのカラメル化の速度が好適なバランスを保つ結果、銀ナノ粒子コロイドは粒径が一定し、保存安定性がより一層良好となる。本実施形態では、比較的に温和な反応条件で銀ナノ粒子コロイドを製造できる。
【００５３】
懸濁液の加圧・加熱による反応終了後は、遠心分離等の適宜の手法によって、ガラス粉末を除去し、銀ナノ粒子コロイド溶液を得る。銀ナノ粒子コロイド溶液に含まれる銀ナノ粒子は、生成したカラメルが保護剤として作用するため形状が一定した球状になり易く、そのサイズ（球状に近似させた場合の直径）は、２〜３０ｎｍである。銀ナノ粒子は、サイズが小さいほど、サイズのばらつきが小さく、安定性が高い。本実施形態では、従来法と異なり、金属コロイド溶液を貯蔵する際に、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）等の安定剤を用いる必要が無い。
【００５４】
キチン誘導体は、脱アセチル化度が０％〜３５％のキチン誘導体を使用する。このキチン誘導体を摩砕処理（粗面化処理）し、キチン誘導体の表面にナノサイズの凹凸を形成すると共に、粒径を０．５〜２００μｍに調製する。摩砕処理は、公知のボールミルや乳鉢を使用して行えばよい。また、摩砕処理の前にキチン誘導体を液体窒素等によって凍結し、凍結したキチン誘導体に摩砕処理を行ってもよい。摩砕処理をする前のキチン誘導体の粒径は、特に限定されないが例えば１０００μｍであってよい。この摩砕処理によって、キチン誘導体の表面は粗面化され、ナノサイズの凹凸が形成される。摩砕が進むほど、キチン誘導体の摩砕面が増加すると共に摩砕面が摩擦によって一層損傷を受けるため、ナノサイズの凹凸が増加する。また、摩砕が進むほど、キチン誘導体の粒径が小さくなる。そのため、キチン誘導体の摩砕処理を行った場合には、キチン誘導体の粒径とナノサイズの凹凸との間に相関がある。なお、他の実施形態では、酸処理によってキチン誘導体の表面を粗面化してもよい。
【００５５】
次に、銀ナノ粒子コロイド溶液に上記の摩砕処理を行ったキチン誘導体を添加し、室温で約３０分間攪拌する。これにより、銀ナノ粒子は、キチン誘導体の表面と静電相互作用や物理吸着によって結合し、キチン／銀ナノ粒子複合体を形成し、カラメルから分離される。なお、他の実施形態では、銀ナノ粒子コロイド溶液からガラス粉末を除去する前に、摩砕処理されたキチン誘導体を加えてもよい。
【００５６】
キチン／銀ナノ粒子複合体を含む懸濁液は、遠心分離、透析、濾過等を行い、カラメルを除去する。その後、懸濁液を乾燥（空気通風乾燥、凍結乾燥等）することによって溶媒を除去し、キチン／銀ナノ粒子複合体を得る。
【００５７】
以上の製造方法によれば、キチン誘導体を懸濁液に加えることによって、カラメルによって保護された銀ナノ粒子から、カラメルを容易に取り除くことができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明による実施例を示す。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００５９】
ＳｉＯ２（約２５％）−Ｂ２Ｏ３（約６０％）−Ｎａ２Ｏ（約１５％）−ＡｇＮＯ３（１．６％）なる組成の銀イオン含有ガラス粉末（環境サイエンス社、型番ＢＳＰ２１、平均粒径１０μｍ）０．５０ｇを、１００ｍＬのガラスバイアル中で、５０ｍＬの０．８重量％のＤ−グルコース（＞９８％、和光純薬製）水溶液５０ｍＬに分散させた。かかる条件では、グルコースの量は、銀イオンを還元する当量の１００倍以上に相当する。得られた懸濁液をイケモト社製ＩＭＣ−３０Ｌのオートクレーブ装置にて、１２１℃、２００ｋＰａの加圧加熱処理に供した（約２０分）。その後、懸濁液を徐々に室温にまで冷却して、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離に供した。このとき、グルコースを含む溶媒部分（上清）は黄褐色になっていた。銀ナノ粒子コロイドを含む上清を目的の銀ナノ粒子コロイド溶液（平均粒径：５．１７±１．９２、生成濃度：６０μｇ／ｍL）として回収し、室温暗所に保存した。
【００６０】
キチン誘導体は、粉末状であり、脱アセチル化度が５％以下、１５００μｍ以上の粒径を有する工業グレードのキチンを使用した。このキチンを０．２５M酢酸処理（１８ｈ）後、液体窒素によって凍結し、乳鉢にて所定時間、摩砕処理を行った。酢酸処理や摩砕処理時間を調整することによって、平均粒径が３１±１１μｍのキチン（第１担体）、平均粒径が１０４±４２μｍのキチン（第２担体）、平均粒径が４９４±６７μｍのキチン（第３担体）、平均粒径が９２７±１４２μｍのキチン（第４担体）を得た。酢酸処理及び摩砕時間を長くするほど、キチンの平均粒径が小さくなる。サンプル１及び２は本発明の実施例として、サンプル３及び４は比較例として用意した。
【００６１】
第１〜４担体に係るキチンを銀ナノ粒子コロイド溶液に加え、撹拌しながら１時間、室温で反応させた。生成したキチン／銀ナノ粒子複合体は、ＰＢＳ(phosphate-buffered-saline)を用いた遠心分離(３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ)を２度行い、生成したカラメルを除去すると共に洗浄した。洗浄後のキチン／銀ナノ粒子複合体を加熱空気による通風乾燥し、安定な粉末状のキチン／銀ナノ粒子複合体を得た。第１担体のキチンから得られたキチン／銀ナノ粒子複合体を実施例１とし、第２担体のキチンから得られたキチン／銀ナノ粒子複合体を実施例２とし、第３担体のキチンから得られたキチン／銀ナノ粒子複合体を比較例１とし、第４担体のキチンから得られたキチン／銀ナノ粒子複合体を比較例２とする。
【００６２】
また、比較対象として、生石灰（第５担体：オホーツクカルシウム、ナチュラルジャパン株式会社、食品添加物グレード、平均粒径１５μｍ）、ゼオライト（第６担体：サンゼオライトＳＳ、平均粒径３０μｍ）をキチン誘導体以外の担体とした。第５担体及び第６担体は、第１〜４担体と同様の条件で、銀ナノ粒子コロイド溶液に加えられ、同様の処理を経て、安定な粉末状の担体／銀ナノ粒子複合体を得た。第５担体の生石灰から得られた生石灰／銀ナノ粒子複合体を比較例３とし、第６担体のゼオライトから得られたゼオライト／銀ナノ粒子複合体を比較例４とする。
【００６３】
以上のように構成した第１〜第６担体、実施例１〜２、比較例１〜４について各種評価を行った。
【００６４】
（ＳＥＭ観察）
ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）を用いて、第１〜第６担体の表面構造を観察した。ＳＥＭは、JEOL JSM-6510LA (Analytical Scanning Electron Microscope)を用いた。図１は、キチン、生石灰及びゼオライトのＳＥＭ観察像であり、（Ａ）第１担体：平均粒径が３１μｍのキチン、（Ｂ）第２担体：平均粒径が１０４μｍのキチン、（Ｃ）第３担体：平均粒径が４９４μｍのキチン、（Ｄ）第４担体：平均粒径が９２７μｍのキチン、（Ｅ）第５担体：生石灰、（Ｆ）第６担体：ゼオライトである。各図中に示すスケールバーは２μｍである。
【００６５】
図１（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、摩砕処理したキチンは、粒径が小さくなるほど表面に形成されるナノサイズの繊維状構造や網目構造等の凹凸が大きくなる。平均粒径が４９４μｍや９２７μｍの第３及び第４担体では、平滑な面が表面の大部分を占める一方、摩砕が進み、平均粒径が３１μｍや１０４μｍとなる第１及び第２担体では、表面には繊維状の構造が確認される。摩砕が進むと、キチンの摩砕面には、主鎖が開裂した端部や主鎖同士が互いに解離し、主鎖が解れた構造が形成されるようになる。図１（Ｅ）及び（Ｆ）に示すように、生石灰及びゼオライトの表面には、ナノサイズの凹凸が形成されている。
【００６６】
（ＴＥＭ観察）
実施例１及び２、比較例１、２として得られたキチン／銀ナノ粒子複合体を凍結乾燥後、１ヶ月間室温保存したキチン／銀ナノ粒子複合体のＴＥＭ像を観察した（ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１０１０、８０ｋＶ）。図２は、キチン／銀ナノ粒子複合体のＴＥＭ観察像であり、（Ａ）実施例１：キチンの平均粒径が３１μｍ、（Ｂ）実施例２：キチンの平均粒径が１０４μｍ、（Ｃ）比較例１：キチンの平均粒径が４９４μｍ、（Ｄ）比較例２：キチンの平均粒径が９２７μｍを示す。各図中に示すスケールバーは１００ｎｍである。
【００６７】
図２（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、キチン／銀ナノ粒子複合体中の銀ナノ粒子は球形であり、粗大化することなく分散されていた。ＴＥＭ観察像から、粒径解析ソフトを用いて銀ナノ粒子の粒径を測定した結果、製造工程においてＤ−グルコースの濃度を０．８重量％としたものは、銀ナノ粒子の平均粒径（直径）が５．１７±１．９２ｎｍであった。図２から、実施例１、２は、比較例１、２に対して明らかに多くの銀ナノ粒子が吸着しており、キチンの平均粒径が小さいほど吸着されえる銀ナノ粒子が増加することがわかる。この結果より、摩砕が進み、キチン表面に形成されるナノサイズの凹凸（繊維状構造）が多くなるほど、銀ナノ粒子の吸着量が増加すると考えられる。
【００６８】
（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）
実施例１、２及び比較例１〜４のキチン／銀ナノ粒子複合体コロイド溶液、生石灰／銀ナノ粒子複合体コロイド溶液、ゼオライト／銀ナノ粒子複合体コロイド溶液の遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトル（日立、Ｕ−３３００）を測定した結果を図３及び図４に示す。図３は、キチン／銀ナノ粒子複合体の水懸濁液を用いた遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトルであり、図４は、生石灰／銀ナノ粒子複合体、及びゼオライト／銀ナノ粒子複合体の水懸濁液を用いた遠心分離洗浄の際に得られた上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトルである。
【００６９】
図３及び図４の各図において、波長４００ｎｍ付近のピークは、銀ナノ粒子に起因するものである。図３に示すように、キチンの添加量が増大するほど、ピークが減少することが確認された。これは、キチンの添加量が増大するに伴って、キチンと結合してキチン／銀ナノ粒子複合体を形成する銀ナノ粒子が増大することを示している。キチン／銀ナノ粒子複合体は遠心分離によって上清中から除去されるため、上清中の銀ナノ粒子濃度は減少する。また、キチンの平均粒径が小さいほど、キチンへの銀ナノ粒子の吸着量が多くなることがわかる。図４に示すように、担体として、生石灰やゼオライトを使用した比較例３及び４でも生石灰及びゼオライトへの銀ナノ粒子の吸着が確認される。これは、図１に示すように、生石灰やゼオライトも表面にナノサイズの凹凸を有することに起因すると考えられる。これらの比較例３、４から、担体の表面に形成されるナノサイズの凹凸が銀ナノ粒子の吸着に影響を与えていることがわかる。
【００７０】
図５は、銀ナノ粒子の各担体への最大吸着量を示す表であり、１ｍｇの第１〜第６担体に吸着される銀ナノ粒子(平均粒径５．１７±１．９２ｎｍ)の最大量（μｇ／ｍｇ）を表している。第１〜第４担体の結果から、担体にキチンを使用した場合には、キチンの平均粒径が小さくなるほど銀ナノ粒子の吸着量が増大することがわかる。なお、第５及び第５担体の結果からわかるように、表面にナノサイズの凹凸を多く含む生石化及びゼオライトは銀ナノ粒子を多く吸着する。
【００７１】
（抗ウィルス活性評価）
Ａ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１型）のインフルエンザ液を実施例１及び比較例３、４に添加し、生じた懸濁液を１時間室温で攪拌し、遠心分離法でウィルスを吸着した複合体を除去し、上澄みの残存インフルエンザを被感染細胞（ＭＤＣＫ）を含む９６−ウエルプレートに段階希釈により加え、７日間培養した。プラーク形成したウエル数をカウントし、下記の数１によって表されるＴＣＩＤ５０法に基づいて評価をした。
【００７２】
【数１】
2015010063.tif 000003
数１において、ｃは１段目のウィルス濃度であり、ｐはプラーク形成したウエル数であり、ｗは１濃度あたりのウエル数であり、ｖは１ウエルあたりのウィルス液体積である。
【００７３】
図６は各担体と銀ナノ粒子との複合体の抗ウィルス性を示すグラフであり、実施例１（キチン：３１μｍ）、比較例３（生石灰）、比較例４（ゼオライト）について示す。図４の縦軸はインフルエンザの感染の程度を表している。インフルエンザの感染の程度を、縦軸における１００％を基準とし、パーセンテージが小さくなるほど抗インフルエンザ活性が高いとみなす。図５に示すように、ここで１０ｍｇの実施例１及び比較例４は銀ナノ粒子を含まなくても約５０％の抗インフルエンザ活性を有し、比較例３は銀ナノ粒子を含まなくても約７０％の抗インフルエンザ活性が確認された。また、銀ナノ粒子を含有する各複合体は、例外なく、各担体のみの場合よりも抗インフルエンザ活性が向上した。
【００７４】
（抗菌活性試験）
実施例１、２及び比較例１〜４の製造工程に従って生成した銀ナノ粒子コロイド溶液（平均粒径が５．１７±１．９２ｎｍ）に、１０ｍｇの第１〜第６担体を加え、攪拌した。第１〜第６担体は蒸留水を用いた遠心分離法で３度洗浄した後、通風空気乾燥させた。
【００７５】
E. coli (Strain B, ATCC no. 11303) 懸濁液(3 x 1010 colony forming units (AFU) / mL in PBS) を５０μＬ滴下し、３７℃で７時間培養した。１ｍＬの菌体培養液（LB：Luria - Bertani Broth ）内で、振動下室温で１５分培養した。各担体／銀ナノ粒子複合体の入った菌体培養液を１０００ｒｐｍで弱く遠心分離して、複合体をペレットし、上澄みの菌体培養液を一連の１０倍を行いＬＢ寒天入りプレート（９０×１５ｍｍ）への塗布後、３７℃で２４時間培養して生じたコロニー数をカウントした。
【００７６】
図７は、各担体と銀ナノ粒子との複合体の抗菌活性を示すグラフであり、（Ａ）第１担体、（Ｂ）第２担体、（Ｃ）第３担体、（Ｄ）第４担体、（Ｅ）第５担体、（Ｆ）第６担体を示す。図７の各図には、最も右側のバーにコントロール菌体（無処理）培養プレートのコロニー数、そして右から２番目のバーに担体のみ（第１担体１０ｍｇ、第２担体５ｍｇ、第３担体１０ｍｇ、第４担体１０ｍｇ、第５担体０．２５ｍｇ、ゼオライト５ｍｇ）の抗菌効果を示す。続いて１０ｍｇの各担体にそれぞれの量（２μｇ、１μｇ、０．５μｇ）の銀ナノ粒子（平均粒径が５．１７±１．９２ ｎｍ）を吸着させたそれぞれの担体複合体と反応させた時に生成する細菌のコロニー数を示す。ＮＤは培養プレートに全くコロニーが検出できなかったことを示す。
【００７７】
図７から、各担体（キチン各種、ゼオライト、生石灰）は、いずれも銀ナノ粒子を含まなくても、抗菌活性を有することがわかる。特に、生石灰は単独でも、強い抗菌活性を有することがわかった。そして、これらの担体に銀ナノ粒子を結合させた担体／銀ナノ粒子複合体は、更に抗菌活性が増大することが確認された。また、キチンを担体とした第１〜第４担体では、キチンの平均粒径が小さくなるほど、抗菌活性が増大することが確認された。上述したように、キチンの平均粒径が小さくほど、キチンの表面が粗面化し、ナノサイズの凹凸が表面に多く形成されていると考えられる。
【００７８】
（抗真菌活性試験）
Aspergillus（A.）niger (NBRC 105649 )(Japan Cllection of Microorganisms; Wako, Saitama, Japan )がPDA (Molten potato dextrose ager: Difco, Becton, Dickinson & Co., Sparks, Maryland, USA) 培地で継体培養された。A. niger 胞子の２０μＬ懸濁液（６．３５×１０４胞子／ｍＬ）が、図７に示した銀ナノ粒子を吸着させた各担体／銀ナノ粒子複合体を含んだ寒天培地（１ｍＬ）の入った２４−ウエルプレート（ウエルの直径１７ｍｍ；スミトモベークライト、東京）の各ウエルに植え付けられた。プレートは２５℃で、３日間暗所で培養し、発生したA. niger 胞子は、０．５ｍＬの０．３％ Tween 80溶液で溶解し、ボルテックスで混合後、Jasco V-630 spectrophotometer 550 nmの吸光度測定により定量した。
【００７９】
図８は、キチン／銀ナノ粒子複合体の抗真菌活性を示すグラフである。図８に示すように、キチンからなる各担体は、いずれも銀ナノ粒子を含まなくても、弱い抗真菌活性を有することがわかる。そして、これらの担体に銀ナノ粒子を結合させた担体／銀ナノ粒子複合体は、更に抗真菌活性が大きく増大することが確認された。また、キチンを担体とした第１〜第４担体では、キチンの平均粒径が小さくなるほど、抗菌活性が増大することが確認された。上述したように、キチンの平均粒径が小さくなるように摩砕するほど、キチンの表面が粗面化し、ナノサイズの凹凸が表面に多く形成されていると考えられる。
【００８０】
以上の結果から、キチンを担体として用いた場合、キチンに対する銀ナノ粒子の結合量（吸着量）は、キチンの平均粒径、及びキチン表面に形成されるナノサイズの凹凸に関係することがわかる。各担体／銀ナノ粒子複合体は、単体で又は他の樹脂材料と混合・塗布・被覆して使用することができ、公知の様々なプラスチック物品に代替することができ、有用な抗微生物材料となり、汎用性が高いと言える。
【００８１】
以上で具体的実施形態の説明を終えるが、本発明は上記実施形態に限定されることなく幅広く変形実施することができる。
【図３】
2015010063.tif 000004
【図４】
2015010063.tif 000005
【図５】
2015010063.tif 000006
【図６】
2015010063.tif 000007
【図７】
2015010063.tif 000008
【図８】
2015010063.tif 000009
【図１】
2015010063.tif 000010
【図２】
2015010063.tif 000011