(57)【要約】      （修正有）【課題】１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有する分離α（２→８）またはα（２→９）オリゴシアル酸誘導体の製造方法、ならびにそれを含む組成物の提供。【解決手段】代表的な製造方法は、（ｉ）還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸前駆体を、非還元端を脱Ｎ−アセチル化するための条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理する段階、および（ｉｉ）１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）又は（２→９）オリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含むオリゴシアル酸組成物の合成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法であって、
還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸前駆体を、前記非還元端を脱Ｎ−アセチル化するための条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を生成させる段階、ならびに
（ｉ）約２〜２０の重合度、および（ｉｉ）１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含み、
それにより前記分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれている、２００７年７月３日に出願した米国特許仮出願第６０／９５８，３４２号の優先権を主張するものである。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立アレルギー・感染症研究所および国立衛生研究所により授与された補助金（第ＡＩ６４３１４号）のもとに政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本開示は、オリゴシアル酸誘導体、それを含む組成物、それらの製造方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は、ノイラミン酸のＮまたはＯ置換誘導体である。Ｎ置換体は、一般的にアセチルまたはグリコリル基を有する。これに対して、Ｏ置換ヒドロキシル基は、かなり多様である可能性があり、例えば、アセチル、ラクチル、メチル、硫酸およびリン酸基などである。ポリシアル酸も、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基がＣ２ケタールＯＨを介してグリコシド結合により他の分子に結合しているかなり一般的なものであり、例えば、ポリα（２→８）Ｎ−アセチルノイラミン酸などである。
シアル酸は、細菌からヒトまでの生物に認められる、生物学的に重要な炭水化物である。それらは、糖タンパク質、グリカンおよびスフィンゴ糖脂質ならびに他の分子の末端を修飾する共通の特徴である。それらは、無数の正常細胞活動を媒介する。これは、細胞膜における複合糖質を安定化する、細胞間相互作用を調節する、化学メッセンジャーとして作用する、貫膜受容体機能を調節する、膜輸送に影響を及ぼす、循環糖タンパク質および細胞の半減期を調節する、および糸球体内皮の透過選択性に寄与するなどである。総説についてはＡｎｇａｔａおよびＶａｒｋｉ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２００２年）、１０２巻、４３９頁を参照のこと。
正常細胞活動にそれらが顕著な役割を果たしていることから、シアル酸およびその誘導体は、がんなどの異常な細胞の過程のマーカーとして用いられてきた（Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、１９９１年、５８巻、９１頁；Ｖｅｄｒａｌｏｖａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、１９９４年、７８巻、１７１頁およびＨｏｒｇａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、１９８２年、１１８巻、３２７頁およびＮａｒａｙａｎａｎ、Ｓ．Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．、１９９４年、２４巻、３７６頁）。例えば、転移し得るがん細胞は、それらが血流に入ることを促進する可能性がある大量のシアル酸修飾糖タンパク質をしばしば有する。また、腫瘍細胞のシアル酸は、正常細胞と異なる仕方で修飾される（Ｈａｋａｍｏｒｉ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９６年、５６巻、５３０９頁、Ｄａｌｌ’Ｏｌｉｏ、Ｃｌｉｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９６年、４９巻、Ｍ１２６頁、ＫｉｍおよびＶａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ、１９９７年、１４巻、５６９頁）。
【０００３】
正常細胞では異常であると考えられているが、がん細胞上に存在する１つのシアル酸誘導体は、脱Ｎ−アセチルシアル酸である（Ｈａｎａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８年、２６３巻、６２９６頁、Ｍａｎｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、２６５巻、１３０９頁、Ｓｊｏｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、２７０巻、２９２１頁、Ｃｈａｍａｓら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５９巻、１３３７頁およびＰｏｐａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、１７巻、３６７頁）。
ＳＥＡＭ３は、脱Ｎ−アセチル残基（すなわち、ノイラミン酸）を含むポリα（２→８）Ｎ−アセチルノイラミン酸（ポリシアル酸またはＰＳＡ）に結合するマウスモノクローナル抗体である（Ｍｏｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２００５年、７３巻、２１２３頁）。ＳＥＡＭ３は、外因性補体の存在下で髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）グループＢ（ＮｍＢ）細菌の溶菌を媒介し、髄膜炎菌血症のｉｎ  ｖｉｖｏ幼弱ラットモデルにおける受動的防御を与える。ＳＥＡＭ３はまた、様々なヒト腫瘍において発現するＰＳＡ抗原に結合して、アポトーシスおよび細胞死を誘発することにより、細胞成長の停止および生存能の低下をもたらす。
水素化ホウ素ナトリウムは、アルデヒド、ケトン、イミン、酸塩化物および酸無水物を還元するために用いられる還元剤である。しかし、温和な塩基性条件下では、それは、グリコサミノグリクロナンを脱Ｎ−アセチル化し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ、１９７５年、３巻、７３頁）、ポリペプチドにおけるアミド結合を切断する（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、１９８４年、２３２巻、６９９頁）ことも示された。水素化ホウ素ナトリウム還元の生成物は、ホウ酸ナトリウムである。ホウ酸塩およびボランは、様々な１，２または１，３−ジオールとの１：１または１：２の比で環状エステルを形成することが知られている。ホウ酸塩は、ｐＨ＜９ではＮ−アセチルノイラミン酸のαカルボン酸エステル（ａｌｐｈａ  ｃａｒｏｂｏｘｙｌａｔｅ）との、ｐＨ＞９では非還元端におけるグリセロール部分との複合体を形成する（Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉら、Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ、２００５年、１１巻、４０１０頁）。
【０００４】
関連文献
目的とするアミノ糖、誘導体および関連文献は、次の米国特許、第４，０２１，５４２号、第４，０６２，９５０号、第４，１７５，１２３号、第４，２１６，２０８号、第４，２５４，２５６号、第４，３１４，９９９号、第４，６５６，１５９号、第４，７１３，３７４号、第４，７９７，４７７号、第４，８０３，３０３号、第４，８４０，９４１号、第４，９１４，１９５号、第４，９６８，７８６号、第４，９８３，７２５号、第５，２３１，１７７号、第５，２４３，０３５号、第５，２６４，４２４号、第５，２７２，１３８号、第５，３３２，７５６号、第５，６６７，２８５号、第５，６７４，９８８号、第５，７５９，８２３号、第５，９６２，４３４号、第６，０７５，１３４号、第６，１１０，８９７号、第６，２７４，５６８号、第６，４０７，０７２号、第６，４５８，９３７号、第６，５４８，４７６号、第６，６９７，２５１号、第６，６８０，０５４号、第６，９３６，７０１号および第７，０７０，８０１号に、また、次の参考文献、ＡｎｇａｔａおよびＶａｒｋｉ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２００２年、１０２巻、４３９頁、Ｈａｋａｍｏｒｉ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９６年、５６巻、５３０９頁、Ｄａｌｌ’Ｏｌｉｏ、Ｃｌｉｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９６年、４９巻、Ｍ１２６頁、ＫｉｍおよびＶａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．、１９９７年、１４巻、５６９頁、Ｈａｎａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８年、２６３巻、６２９６頁、Ｍａｎｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、２６５巻、１３０９頁、Ｓｊｏｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、２７０巻、２９２１頁、Ｃｈａｍａｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９９年、５９巻、１３３７頁、Ｐｏｐａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、１７巻、３６７頁、Ｋａｙｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、２６７巻、１６９３４頁、Ｋｅｐｐｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、１１巻、１１Ｒ頁、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２００３年、３６２巻、２４９頁、Ｏｅｔｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００１年、２６８巻、４５５３頁、Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、１０巻、１１頁およびＢａｒｄｏｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、２８０巻、４２２８頁に報告されている。
抗体ＳＥＡＭ３は、Ｍｏｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２００５年、７３巻、２１２３頁に報告されている。水素化ホウ素ナトリウム反応および関連事項は、Ｈｉｒａｎｏら、Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ、１９７５年、３巻、７３頁、Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、１９８４年、２３２巻、６９９頁およびＤｊａｎａｓｈｖｉｌｉら、Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ、２００５年、１１巻、４０１０頁などの様々な参考文献に報告されている。米国特許出願公開第２００７／００１０４８２号、２００６年１２月２２日に出願された米国特許出願第１１／６４５，２５５号、国際公開第２００６／００２４０２号および２００６年１２月２２日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４８８５号も参照のこと。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル残基が富化され（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある還元端を有する分離α（２→８）およびα（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法、ならびにそれを含む組成物に関する。これは、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体で富化されている組成物、ならびに該誘導体の凝集体を含む。代表的な製造方法は、（ｉ）還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸前駆体を、非還元端を脱Ｎ−アセチル化するための条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理する段階、および（ｉｉ）１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含む。この方法により製造される分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体、ならびに該誘導体に対して特異的な抗体および該誘導体を含む組成物も提供する。凝集体を含む組成物は、凝集体を形成させ、場合によって凝集体を分離するように、（ｉｉｉ）分離されたα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を凝集条件に曝露するという追加の段階により製造する。
【０００６】
また、対象におけるがん細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体を含む有効な量の薬学的に許容される製剤を対象に投与することを含むものであり、投与が抗体に曝露させたがん細胞の生存能の低下を促進する。
また、脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを有する細菌（例えば、髄膜炎菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１）および／またはがん細胞に対する抗体を誘発する方法を特徴とする。この方法は、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、投与が細菌またはがん細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である。これは、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体で富化された免疫原性組成物を含む。また、オリゴシアル酸誘導体および組成物は、ナイセリア属菌、特に髄膜炎菌、特に髄膜炎菌グループＢおよびＣならびに大腸菌Ｋ１などの、それらの多糖莢膜に存在する脱Ｎ−アセチルシアル酸エピトープを有する細菌に対するワクチンとして用いることができる。
【０００７】
また、対象におけるがん細胞を検出する方法を提供する。この方法は、がんを有することが疑われる対象から得られる生物学的サンプルを、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体と接触させる段階を含むものであり、抗体の結合が対象におけるがん細胞の存在を示す。
本開示の１つまたは複数の組成物ならびに本開示の方法における使用に関する指示書を含むキットも提供する。
したがって、１つの態様において、本開示は、還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸前駆体を、非還元端を脱Ｎ−アセチル化するための条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を生成させる段階、ならびに（ｉ）約２〜２０の重合度および（ｉｉ）１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を分離し、それにより分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が得られる段階を含む、分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法を提供する。
【０００８】
関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体の非還元端は、脱Ｎ−アセチル化残基である。特定の実施形態において、脱Ｎ−アセチル化残基は、ノイラミン酸である。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、Ｎ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む。１つの実施形態において、Ｎ−アシル基はトリクロロアセチルである。関連実施形態において、オリゴシアル酸前駆体は、大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌血清グループＢおよび髄膜炎菌血清グループＣからなる群から選択される細菌から得ることができるポリシアル酸ポリマーの酸加水分解により得ることができる。
関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、約２〜１０の重合度を有する。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成されており、いくつかの実施形態において、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の混合物は、長さがより短い鎖および３：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含み、かつ／または長さがより長い鎖および１０：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含む。関連実施形態において、分離オリゴシアル酸誘導体は、ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２の結合を約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で阻害することができる。
【０００９】
関連実施形態において、該方法は、第２の分子を分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に結合させる段階をさらに含み、第２の分子が保護基、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸および検出可能な標識からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の分子は、免疫調節剤（例えば、毒素またはその誘導体（例えば、破傷風トキソイド））である。
他の実施形態において、該方法は、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体をエキソノイラミニダーゼに曝露することにより、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）オリゴシアル酸誘導体について富化する段階をさらに含む。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は凝集体（例えば、顕微鏡的粒子を含む凝集体）中に提供する。
本開示はまた、本開示の方法により製造される分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体ならびにそのような化合物を含む組成物を提供する。
【００１０】
他の態様において、本開示は、請求項１の方法により製造される分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含み、該分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体がそれぞれ非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する可変鎖長のオリゴシアル酸誘導体の混合物としてなる、組成物を提供する。
他の態様において、本開示は、約２〜２０の重合度、ならびに還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含み、非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含む組成物を提供する。関連実施形態において、脱Ｎ−アセチル化残基はノイラミン酸である。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体の非還元端は、脱Ｎ−アセチル化残基である。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、Ｎ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む。関連実施形態において、分離オリゴシアル酸誘導体の還元端は、還元されている。関連実施形態において、オリゴシアル酸は、大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌血清グループＢおよび髄膜炎菌血清グループＣからなる群から選択される細菌から得ることができるポリシアル酸ポリマーから得ることができる。さらなる関連実施形態において、２５種のオリゴシアル酸誘導体は、約２〜１０の重合度を含む。
関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、オリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成されており、例えば、オリゴシアル酸鎖の混合物は、長さがより短い鎖および約３：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含み、かつ／またはオリゴシアル酸鎖の混合物は、長さがより長い鎖および約１０：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含む。
【００１１】
関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、例えば、オリゴシアル酸誘導体が、保護基、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸および検出可能な標識からなる群から選択される１つまたは複数の第２の分子に結合している、結合体を含む。いくつかの実施形態において、第２の分子は、免疫調節剤（例えば、毒素またはその誘導体（例えば、破傷風トキソイド））である。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、１つまたは複数の免疫原性賦形剤を含む製剤として構成される。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２の結合を約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で阻害することができる。関連実施形態において、分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、脱Ｎ−アセチル残基で富化された非還元端を有する可変鎖長のオリゴシアル酸誘導体の混合物としてなる。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は凝集体（例えば、顕微鏡的粒子を含む凝集体）中に提供する。
他の態様において、本開示は、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を含むα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な分離抗体を提供する。関連実施形態において、該抗体は、凝集体、例えば、顕微鏡的粒子を含む凝集体の状態のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的である。関連実施形態において、該抗体は、髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）およびグループＣ（ＮｍＣ）細菌の補体媒介溶菌およびオプソニン食作用の能力がある。関連実施形態において、該抗体は、分裂または非分裂ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞白血病細胞により発現されるノイラミン酸含有抗原に結合することができ、さらなる関連実施形態において、該抗体は、非分裂ジャーカットＴ細胞性白血病細胞にＳＥＡＭ３よりよく結合する。関連実施形態において、該抗体は、マウス由来である。さらなる関連実施形態において、該抗体は、非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基に対して特異的である。
【００１２】
特定の実施形態において、該抗体は、図１９および２０に示すような軽および重鎖可変相補性決定領域ポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体であり、特定の実施形態において、図１９または２０に示す相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド配列から選択されるＣＤＲポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体である。関連実施形態において、モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
関連態様において、本開示は、がんを有することが疑われる対象から得られる生物学的サンプルを本開示による抗体と接触させる段階を含み、抗体の結合が対象におけるがん細胞の存在を示す、対象におけるがん細胞を検出する方法を提供する。さらなる関連態様において、本開示は、対象に有効な量の本開示の抗体を含む薬剤学的に許容できる製剤を投与することを含み、投与が抗体に曝露されるがん細胞の生存能の低下を促進する、対象におけるがん細胞の成長を阻害する方法を提供する。さらに他の関連態様において、本開示は、約２〜２０の重合度、ならびに還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、非還元端が１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性があり、投与が細菌の脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含む細菌に特異的に結合する、対象における抗体を誘発する方法を提供する。関連実施形態において、細菌は、髄膜炎菌グループＢ、髄膜炎菌グループＣまたは大腸菌Ｋ１である。
【００１３】
他の態様において、本開示は、約２〜２０の重合度、ならびに還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与する段階を含み、非還元端が１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基について富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性があり、投与ががん細胞の脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である、対象におけるｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含むがん細胞に対する抗体を誘発する方法を提供する。関連実施形態において、がんは、黒色腫、リンパ腫または神経芽細胞腫である。
関連実施形態において、免疫原性組成物のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、水素化ホウ素ナトリウム還元による非還元端残基の選択的脱アセチル化により調製する。関連実施形態において、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、結合体である。
【００１４】
関連実施形態において、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を注入または局所注射により投与する。関連実施形態において、投与は、がん細胞を除去するための外科的介入の前、がん細胞を除去するための外科的介入の時点もしくは後であってよく、かつ／または免疫療法、がん化学療法もしくは放射線療法の少なくとも１つとともに投与することができる。関連実施形態において、分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、ポリシアル酸誘導体の凝集体（例えば、顕微鏡的粒子を含む凝集体）を含む。関連実施形態において、
他の態様において、本開示は、１つまたは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を凝集体を形成するように凝集条件下で混合することを含む、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む凝集体を製造する方法を提供する。関連実施形態において、凝集条件は、加熱（例えば、３０℃から７０℃への加熱）または凝集賦形剤（例えば、水酸化アルミニウム）の添加である。関連実施形態において、凝集体は、粒子、例えば、顕微鏡的粒子である。関連実施形態において、ポリシアル酸誘導体は、Ｎ−アセチル残基と脱Ｎ−アセチル残基との混合を有し、エキソノイラミニダーゼによる分解に対する抵抗性を示す。
【００１５】
他の態様において、本開示は、（ｉ）約２〜２０の重合度、（ｉｉ）ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２抗体の結合の阻害の約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０、（ｉｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物を提供する。関連実施形態において、該誘導体は、１つまたは複数のＮ−トリクロロアセチルシアル酸残基を含む。関連実施形態において、該誘導体は、１つまたは複数のＮ−プロピオニルシアル酸残基を含む。関連実施形態において、該誘導体は、約２〜１０および／または約２〜６の重合度を有する。関連実施形態において、該誘導体は、二量体、三量体および四量体からなる群から選択される。関連実施形態において、該誘導体は、結合体（例えば、毒素またはその誘導体（例えば、破傷風トキソイド）などの免疫調節剤を含む第２の分子に結合している）を含む。本開示の誘導体の具体例としての免疫調節剤結合体は、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＯＳ−ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴなどである。
【００１６】
他の態様において、本開示は、（ｉ）約２〜２０の重合度、（ｉｉ）約５０％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量、および（ｉｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物を提供する。関連実施形態において、該誘導体は、約８８％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量を有する。関連実施形態において、該誘導体は、約２〜１０および／または約２〜６の重合度を有する。関連実施形態において、該誘導体は、二量体、三量体または四量体である。関連実施形態において、該誘導体ワクチンは、結合体（例えば、毒素またはその誘導体（例えば、破傷風トキソイド）などの免疫調節剤を含む第２の分子に結合している）を含む。本開示の誘導体の具体例としての免疫調節剤結合体は、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＯＳ−ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴなどである。関連実施形態において、誘導体はＤｅＮＡｃ−ＴＴである。
ワクチン組成物に関する態様において、関連実施形態は、アジュバントを含むワクチン組成物を含む。さらに、そのような態様の関連実施形態は、ワクチン組成物を投与した対象における細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効な量で誘導体が組成物中に存在するワクチン組成物を含む。
本発明の他の特徴は、本明細書に記述されており、本開示を読むことによって当業者に容易に明らかにもなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】水素化ホウ素ナトリウム処理オリゴシアル酸（ＯＳ）の陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】パルスアンペルメトリック検出を用いる高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＣ−ＰＡＤ）による陰イオン交換クロマトグラフィーからのカラム画分の分析の結果を示す図である。
【図３】ＳＥＡＭ３を一次検出抗体として用いたＯＳ−破傷風トキソイド（ＯＳ−ＴＴ）結合体ワクチンのウェスタンブロットである。
【図４】ＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンによるＣＤ１マウスの免疫処置により生ずるＯＳ特異抗体の力価を要約する図である。
【図５】ＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンにより免疫処置したマウスのプールした抗血清により媒介されたフローサイトメトリーによる生ＮｍＢ細菌上への補体因子の沈着の測定を示す図である。
【図６】ＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンにより免疫処置したマウスのプールした抗血清により媒介された細胞上への補体因子の沈着を示す細菌の蛍光顕微鏡写真である。
【図７】髄膜炎菌血症のｅｘ  ｖｉｖｏヒト血液モデルにおける髄膜炎菌血清グループＢ（ＮｍＢ）細菌の増殖に対するＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンにより免疫処置したマウスのプールした抗血清の効果を示す棒グラフである。
【図８】フローサイトメトリーによるジャーカットＴ細胞白血病細胞に結合したＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンによるＣＤ１マウスの免疫処置により誘発された抗体の測定を示す図である。
【図９】ＳＥＡＭ１８、ＳＥＡＭ２またはＳＥＡＭ３を一次検出抗体として用いたＰＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンのウェスタンブロットである。
【図１０】ＰＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンのそれぞれの２μｇまたは１０μｇの総シアル酸の１、２または３回の投与により免疫処置したＣＤ１マウスの抗血清プールのＥＬＩＳＡ力価の要約を示す図である。上パネルは同一のＰＳ抗原に対する抗血清の力価を示し、下パネルはＤｅＮＡｃ抗原に対する力価を示す。
【図１１】フローサイトメトリーによる髄膜炎菌グループＢ菌株ＮＭＢに対する対照および抗血清抗体結合の測定の結果の要約を示す図である。パネルＡは、すべての抗血清プールにおけるＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の結合を示す。パネルＢは、ＤｅＮＡｃ抗血清プールの１０μｇの３回目の注射での各ＩｇＧサブクラスの結合を示す図である。
【図１２】髄膜炎菌グループＢ菌株ＮＭＢ（パネルＡ）およびグループＣ菌株４２４３上の補体タンパク質沈着を活性化するワクチン誘発抗体の能力を示す図である。
【図１３】髄膜炎菌血症の幼弱ラットモデルにおける受動的に防御するＰＳ結合体ワクチン誘発抗血清の能力の評価の結果を示す図である。上のパネルは髄膜炎菌グループＢ菌株Ｍ９８６によるチャレンジの結果を示し、下のパネルはグループＣ菌株４２４３に関する結果を示す。
【図１４】髄膜炎菌血症のｅｘ  ｖｉｖｏヒト血液モデルにおける髄膜炎菌グループＢ菌株ＮＺ９８／２５４細菌の増殖に対するＰＳ結合体ワクチンにより免疫処置したマウスのプールした抗血清の効果を示す棒グラフである。
【図１５】フローサイトメトリーによるジャーカットＴ細胞白血病細胞に結合したＰＳ結合体ワクチンによるＣＤ１マウスの免疫処置により誘発された抗体の測定を示す棒グラフである。
【図１６】フローサイトメトリーによるジャーカットＴ細胞白血病、ＳＫ−ＭＥＬ２８黒色種およびＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫細胞上のヒト補体タンパク質の沈着を活性化するＰＳ結合体ワクチンによるＣＤ１マウスの免疫処置により誘発された抗体の能力の測定を示す棒グラフである。
【図１７】ジャーカットＴ細胞白血病細胞の生存能を低下させるＰＳ結合体ワクチンによるＣＤ１マウスの免疫処置により誘発された抗体の能力の測定を示す棒グラフである。
【図１８】破傷風トキソイド担体タンパク質またはＴｃＡｃ−破傷風トキソイドワクチンによるＣＤ１マウスの免疫処置により誘発されたポリクローナル抗血清による正常卵巣および原発卵巣腫瘍の免疫組織化学染色の一組の光学顕微鏡写真である。
【図１９】ＤＡ２重鎖可変領域遺伝子のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列翻訳と国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）の定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、ＩＭＧＴ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、Ｄ５９３〜Ｄ５９７頁）により定義された可変領域フレームワークおよびＣＤＲｓとの関係を示す図である。
【図２０】ＤＡ２軽鎖可変領域遺伝子のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列翻訳と国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）の定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、ＩＭＧＴ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、Ｄ５９３〜Ｄ５９７頁）により定義された可変領域フレームワークおよびＣＤＲｓとの関係を示す図である。
【図２１】無関係のＩｇＭ対照抗体と比較してジャーカットＴ細胞白血病細胞の生存能を低下させるモノクローナル抗体の能力の測定を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有するオリゴシアル酸誘導体がこの免疫優性エピトープを発現する大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌およびがん細胞に対して高度に特異的な抗体を誘発することが発見された。本開示の誘導体は、シアル酸のオリゴマー（二量体から、例えば、長さが約１００単量体単位までの多量体に及ぶＮ−アセチルノイラミン酸オリゴ糖（ＯＳ））を、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル残基で富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有する誘導体を有するオリゴシアル酸生成物を生成する条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理ことによって製造することができる。水素化ホウ素ナトリウム反応の生成物は、ＳＥＡＭ３などの抗体に対して高度に反応性である。活性に必要な最小限の特徴を含むＯＳ誘導体は、（ｉ）約２〜２０、特に二量体、三量体および／または四量体のその小範囲の重合度、ならびに（ｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある免疫優性非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有することも発見された。これらおよび所定の最終用途に利用することができる他の特徴を有する化合物を生成させた。担体タンパク質に結合させ、マウスを免疫にするのに用いるとき、非還元端富化脱Ｎ−アセチル化オリゴ糖生成物は、髄膜炎菌血清グループＢ（ＮｍＢ）ならびに免疫優性非還元端脱Ｎ−アセチル残基を発現する他の細菌を防御する抗体を誘発する。それらは、腫瘍細胞により発現されるノイラミン酸含有ポリシアル酸（ＰＳＡ）抗原にも結合する。本開示は、ＯＳ誘導体をα（２→８）および／またはα（２→９）結合オリゴシアル酸材料から構成させることができるという発見にさらに基づいている。本開示は、ＯＳ誘導体の凝集体が対応する非凝集ＯＳ誘導体と比較して細胞により容易に取り込まれ、細胞表面上で発現するという発見にも基づいている。凝集体は、担体タンパク質とともにまたは担体タンパク質の非存在下で強いＴ細胞依存性免疫応答を誘発するのに利用することができる。免疫優性非還元端脱Ｎ−アセチル残基エピトープに対して特異的な抗体も発見された。データは、ヒトにおける複数の種類のがんの診断および治療、ならびに大腸菌Ｋ１およびナイセリア属菌などの細菌によって引き起こされる疾患の診断および防御を含む、方法および組成物の広い使用を裏づけるものである。
【００１９】
本発明および本発明の特定の具体例としての実施形態を記述する前に、本発明は記述する特定の実施形態に限定されず、したがって、もちろん変化し得ることを理解すべきである。本発明の範囲は添付する特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いる用語は特定の実施形態を記述する目的のためのものであり、限定することを意図するものでないことも理解すべきである。
値の範囲を記載する場合は、文中で明記しない限り、対象範囲の上限と下限の間にある、下限の単位の１０分の１までの各介在値、および記載範囲の他の任意の記載値もしくは介在値は、本発明の範囲内に含まれることが理解される。記載範囲の限界が具体的に除外されることを条件として、より小さい範囲に独立に含まれていてよいこれらのより小さい範囲の上および下限も本発明の範囲内に含まれる。記載範囲が限界の１つもしくは両方を含む場合には、含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本発明に含まれる。
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の技術者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で述べるのと類似または同等の方法および材料は本発明の実施または試験にも用いることができるが、具体例としての方法および材料を次に述べる。本明細書で言及するすべての刊行物は、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示し、述べるために、参照により本明細書に組み込まれている。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文中で明記しない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は複数のそのような抗原を含み、「ペプチド（ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は１つまたは複数のペプチドおよび当業者に知られているその同等物への言及を含む、等である。
本明細書で述べる刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示のためにのみ記載するものである。本明細書におけるいずれのものも、本発明が先行特許によってそのような刊行物に先行する資格を与えられないということの承認として解釈すべきでない。さらに、記載されている公表の日付は、独立に確認する必要があり得る実際の公表日と異なっている可能性がある。
【００２１】
定義
組成物、そのようなものを含む製剤、そのよう組成物を製造し、使用する方法を述べる場合、特に示さない限り、以下の用語は以下の意味を有する。後に下で定義する部分のいずれも様々な置換基で置換することができ、各定義はそのような置換された部分をそれらの範囲内に含めることを意図することも理解すべきである。
「アミノ糖」という用語は、ヒドロキシル基の代わりにアミノ基を含む糖またはサッカリドを意味する。Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸およびシアル酸などのアミノを含む糖の誘導体は、一般的にアミノ糖の例である。
「類似体」という用語は、本開示の化合物と構造の類似性を有し、権利を主張かつ／または参照した化合物と同じまたは類似の有用性を示すと当業者が予想するであろうあらゆる化合物を制限なしに意味する。
α（２→８）オリゴシアル酸誘導体に結合させた担体の状況において用いる「担体」という用語は、抗体または抗体フラグメントなどのペプチドまたはタンパク質担体を一般的に意味する。「担体」は、化合物の免疫原性を増大させるペプチドまたはタンパク質を含む。
【００２２】
「細胞表面抗原」（または「細胞表面エピトープ」）という用語は、細胞分裂時に主として細胞外でまたは細胞外でのみアクセスできる抗原を含む、細胞の任意の細胞周期段階で細胞外でアクセスできる細胞の表面上の抗原またはエピトープを意味する。この状況における「細胞外でアクセスできる」は、細胞膜を透過性にする必要なしに、細胞外に供給される抗体が結合することができる抗原を意味する。
本明細書で用いる「化学療法」という用語は、がんの治療が特に問題となっている場合の疾患の治療における、薬剤（例えば、薬物、抗体等）、特に、がん細胞に選択的に破壊をもたらす薬剤の使用を意味する。
本明細書で用いる「がん細胞」は、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性成長阻害の喪失、足場非依存性成長能、免疫無防備非ヒト動物モデルにおける腫瘍成長および／または発生を促進する能力、および／または細胞トランスフォーメーションの適切な指標の１つまたは複数によって特徴づけることができる新生物形成細胞表現型を示す細胞を意味する。「がん細胞」は、本明細書では「腫瘍細胞」と同義で用いることがあり、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を含む。
【００２３】
「結合」という用語は、目的とする１つの分子を目的とする第２の分子と隣接して結合させる、共有結合または非共有結合、通常は共有結合である化学結合を意味する。
「脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原」（「脱Ｎ−アセチル化シアル酸抗原」または「ｄｅＮＡｃＳＡ抗原」とも呼ぶ）という用語は、ｄｅＮＡｃシアル酸エピトープ（ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ）を有するまたは模擬する化合物を意味し、エピトープは、シアル酸またはシアル酸誘導体の残基の二量体により最小限定義され、二量体は、Ｎアセチル化（例えば、アセチル化またはプロピオニル化）シアル酸残基またはシアル酸誘導体残基に隣接する少なくとも１つの脱Ｎ−アセチル化シアル酸残基を含む。脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原の例は、本開示において記載しており、脱Ｎ−アセチル化多糖誘導体（「ＰＳ誘導体」）、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドおよびシアル酸修飾タンパク質の脱Ｎ−アセチル化誘導体、特に、哺乳類細胞、特にヒト細胞、特にがん細胞、特にヒトがん細胞の細胞外表面でアクセスできるシアル酸修飾タンパク質を制限なく含む。ｄｅＮＡｃＳＡエピトープは、ナイセリア属菌、特に髄膜炎菌、特に髄膜炎菌グループＢおよび大腸菌Ｋ１の多糖莢膜にも存在する。出発分子の誘導体（例えば、ＰＳ誘導体またはガングリオシド誘導体）としてのｄｅＮＡｃＳＡ抗原の記述は、脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原の製造の方法に限定することを意味せず、具体例としてのｄｅＮＡｃＳＡ抗原の構造を記述する都合のよい方法としての意味をもつことに注目されたい。
「誘導体」という用語は、本開示の化合物の構造由来の構造を有し、構造が本明細書に開示するものと十分に類似しており、権利を主張かつ／または参照した化合物と同じまたは類似の活性および有用性を示すと当業者が予想するであろう類似性に基づくあらゆる化合物を制限なしに意味する。
【００２４】
本明細書に記載する化合物の「有効な量」という用語は、非致死性であるが、所望の効用をもたらすのに十分な化合物の量を意味することを意図する。例えば、抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗体を発生させるために対象における免疫応答を誘発する場合、有効な量は、例えば、後に分離することができる抗体の産生（例えば、モノクローナル抗体の産生におけるような）を可能にするように、あるいは細菌に対する（例えば、ナイセリア属菌または大腸菌Ｋ１によって引き起こされる疾患に対する予防的もしくは治療的免疫処置の状況におけるような）、またはｄｅＮＡｃＳＡエピトープによって特徴づけられるがんによる、対象における臨床的に意味のある免疫応答を可能にするように、有用な抗体反応を誘発する量である。下で指摘するように、必要とする正確な量は、対象の種、年齢および一般状態、治療する状態もしくは疾患の重症度、用いる個々の化合物、その投与方法などによって対象ごとに異なるであろう。したがって、正確な「有効量」を指定することは可能ではない。しかし、適切な有効量は、当業者により常用の実験のみを用いて決定することができる。
「免疫療法」という用語は、疾患抗原に対する免疫応答を調節することによる疾患（例えば、ナイセリア属菌または大腸菌Ｋ１菌感染、がん）の治療を意味する。本出願の状況において、免疫療法は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の投与により、かつ／または対象における抗腫瘍抗原免疫応答を誘発する抗原の投与により、対象における抗菌および／または抗がん免疫応答をもたらすことを意味する。
細胞の「不活性化」という用語は、本明細書では細胞が後代を形成するための細胞分裂を不可能にさせられたことを示すために用いる。細胞は、それにもかかわらず刺激に対する応答および／または例えば、細胞表面分子（例えば、細胞表面タンパク質もしくは多糖）の産生を可能にするためのある期間の生合成の能力があってよい。
【００２５】
本明細書で用いる「との併用で」という用語は、例えば、第１の療法を第２の療法の適用の全過程中に適用する場合、第１の療法を第２の療法の適用と重複する期間適用する場合、例えば、第１の療法の適用が第２の療法の適用の前に始まり、第１の療法の適用が第２の療法の適用が終わる前に終わる場合、第２の療法の適用が第１の療法の適用の前に始まり、第２の療法の適用が第１の療法の適用が終わる前に終わる場合、第１の療法の適用が第２の療法の適用が始まる前に始まり、第２の療法の適用が第１の療法の適用が終わる前に終わる場合、第２の療法の適用が第１の療法の適用が始まる前に始まり、第１の療法の適用が第２の療法の適用が終わる前に終わる場合の使用を意味する。そのようなものとして、「併用で」も２つまたはそれ以上の療法の適用を伴う投薬計画を意味し得る。本明細書で用いる「との併用で」は、同じまたは異なる製剤で、同じまたは異なる経路により、同じまたは異なる剤形で適用することができる２つまたはそれ以上の療法の適用も意味する。
「分離した」という用語は、化合物が本来はそれに付随する成分のすべてまたは一部から分離されていることを意味する。「分離した」は、製造（例えば、化学合成、組換え発現、培地など）中にそれに付随する成分のすべてまたは一部から分離されている化合物の状態も意味する。
【００２６】
「モノクローナル抗体」という用語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物を意味する。この用語は、それが作製される方法によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ファージ上でディスプレイされる単鎖フラグメント可変部（ｓｃＦｖ）、抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質、および親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野で知られており、下でより十分に述べる。
オリゴまたは多糖鎖の「非還元端」という用語は、非還元グリコシル残基を有する鎖の末端部分を意味する。
オリゴまたは多糖鎖の「還元端」という用語は、還元グリコース残基を有する鎖の末端部分を意味する。これは、塩基性溶液中で遊離アノマー炭素を有するとき、アルデヒドまたはケトンを形成することができる鎖の末端である。
本明細書で用いている「富化された」という用語は、所望の特性または要素の割合の増加を有する化合物または組成物を意味する。例えば、非還元端において脱Ｎ−アセチル化について「富化されている」α（２→８）オリゴシアル酸誘導体は、脱Ｎ−アセチル化残基が、非還元端を含む非還元端に唯一存在することを含む、主として存在するα（２→８）オリゴシアル酸誘導体である。組成物中のα（２→８）オリゴシアル酸誘導体の大部分（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％までのより大きい割合）が非還元端、特に非還元端に脱Ｎ−アセチル化残基を有する場合、組成物は脱Ｎ−アセチル化非還元端を有するα（２→８）オリゴシアル酸誘導体が「富化」されている。
【００２７】
「薬剤学的に許容できる」という用語は、生物学的にまたは他の点で望まれないことはない物質を意味する。該物質は、望まれない生物学的影響やそれが含まれている医薬組成物の他の成分のいずれかとの有害な態様の相互作用を引き起こすことなく、選択される活性な薬剤成分とともに個人に投与することができる医学的に許容できる品質および組成のものである。
本明細書で用いている「薬剤学的に許容できる賦形剤」という用語は、対象への目的とする化合物の投与のための薬剤学的に許容できる媒体となるあらゆる適切な物質を意味する。「薬剤学的に許容できる賦形剤」は、薬剤学的に許容できる希釈剤、薬剤学的に許容できる添加剤および薬剤学的に許容できる担体と呼ばれる物質を含み得る。
本明細書で同義で用いている「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生物学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含み得る、あらゆる長さのアミノ酸の重合体を意味する。該用語は、異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない異種および同種リーダー配列を含む融合体、免疫学的に標識されたタンパク質、検出可能な融合パートナーを含む融合タンパク質、例えば、融合パートナーとしての蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を含む融合タンパク質などを含むが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、あらゆるサイズのものであってよく、「ペプチド」という用語は、長さが８〜５０残基（例えば、８〜２０残基）であるポリペプチドを意味する。
【００２８】
「精製した」という用語は、目的とする化合物が本来はそれに付随する成分から分離され、濃縮された形で提供される状態を意味する。「精製した」は、製造（例えば、化学合成、組換え発現、培地など）中にそれに付随し得る成分から目的とする化合物が分離され富化された形で提供された状態も意味する。一般的に、化合物が、天然で会合している、または製造中に会合している有機分子を含まずに、少なくとも５０重量％〜６０重量％である場合に、化合物は実質的に純粋である。一般的に、製剤は、目的とする化合物が少なくとも７５重量％、通常少なくとも９０重量％、一般的に少なくとも９９重量％である。実質的に純粋な化合物は、例えば、自然源（例えば、細菌）から抽出により、化合物を化学的に合成することにより、または精製と化学修飾の組合せにより得ることができる。実質的に純粋な化合物は、例えば、目的とする抗体に結合する化合物を有するサンプルを濃縮することによっても得ることができる。純度は、適切な方法、例えば、クロマトグラフィー、質量分析、ＨＰＬＣ分析などにより測定することができる。
「ＳＥＡＭ３反応性抗原」という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＳＥＡＭ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）が特異的に結合するエピトープを有する抗原を意味する。「ＤＡ２反応性抗原」という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＤＡ２（本明細書で述べる）が特異的に結合するエピトープを有する抗原を意味する。モノクローナル抗体ＤＡ２は、隣接残基やグリコシド結合に無関係に、非還元端ノイラミン酸残基に対して高度に特異的である。具体例としてのＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原は、実施例に記載する。オリゴシアル酸結合ワクチン（ＯＳ結合ワクチン）により発生する本明細書で開示する抗体は、ＳＥＡＭ３が結合するエピトープに対する結合以外の抗原特異性を有するものも含み、同じまたは異なる抗原に結合することができるが、正常ＰＳＡ対照（すなわち、脱Ｎ−アセチル残基が欠けている正常ポリシアル酸）に結合せず、正常ＰＳＡ対照と比較してＳＥＡＭ３よりよくＯＳ結合ワクチン発生抗原に結合する。例えば、ＤＡ２は、ＳＥＡＭ３よりよく免疫優性脱Ｎ−アセチル残基エピトープに結合し、上で示したように、隣接残基やグリコシド結合に無関係に、非還元端ノイラミン酸残基を高い特異性で認識する。
【００２９】
「重合度」またはＤｐは、平均的ポリマー鎖における反復単位の数を意味する。鎖長は、モノマー単位で、分子量として、または両方で報告することができる。
「対象」という用語は、任意の方法でポリシアル酸を含むヒト、哺乳動物および他の動物を含むことを意味する。「対象」、「宿主」、「患者」および「個体」という用語は、診断または治療が望まれるあらゆる哺乳類対象、特にヒトに言及するために本明細書で同義で用いられる。他の対象は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含んでいてよい。
本明細書で記述するがんの治療および診断の状況において、「対象」または「患者」は、がんが脱Ｎ−アセチルシアル酸抗原を発現するがん細胞を伴うものである場合に、腫瘍を有する、有することが疑われる、または発現する危険性がある対象に言及するために本明細書で同義で用いられる。そのような対象から得られるサンプルは、本開示の方法において用いるのに同様に適している。
【００３０】
本明細書で用いているように、「決定」、「測定」および「評価」ならびに「分析」という用語は、同義で用い、定量的および定性的決定の両方を含む。
特許請求の範囲はあらゆる任意選択または代替要素を排除するように起草することができることがさらに指摘される。したがって、この陳述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に」、「のみ」などのような限定的な用語の使用、または「消極的な」限定の使用の根拠となることを目的とする。
本明細書で引用するすべての刊行物および特許は、あたかもそれぞれの個別の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示され、刊行物が引用されていることに関連して方法および／または材料を開示し、記述するために参照により本明細書に組み込まれているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。刊行物の引用は、出願日の前のその開示のためのものであり、本発明が先行特許によってそのような刊行物に先行する資格を与えられないということの承認として解釈すべきでない。さらに、記載されている公表の日付は、独立に確認する必要があり得る実際の公表日と異なっている可能性がある。参照により本明細書に組み込まれている文書に示されている用語の定義が本明細書で明確に定義されている用語の定義と対立する限りにおいて、本明細書で述べる定義が支配する。
本明細書で用いることができる具体例としての方法および組成物を最初により詳細に述べた後に、本開示の方法において使用される可能性がある様々な特定の組成物、製剤、キットなどを概説、また本開示の方法および組成物が使用される代表的な適用例について考察する。
【００３１】
製造の方法および組成物
上で要約したように、本開示は、この免疫優性エピトープを発現する大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌およびがん細胞に対して高度に特異的な抗体を誘発する非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有するオリゴシアル酸（ＯＳ）誘導体を提供する。該ＯＳ誘導体は、一般的に（ｉ）約２〜２０、特に二量体、三量体および／または四量体のその小範囲の重合度、ならびに（ｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある免疫優性非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する。ＯＳ誘導体は、α（２→８）および／またはα（２→９）結合オリゴシアル酸材料から構成されていることがあり得る。１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に抵抗性のある非還元端を有する分離α（２→８）またはα（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法も提供する。これは、オリゴシアル酸誘導体の凝集体ならびに組成物およびその製剤の製造の方法も含む。該方法の生成物は、例えば、本開示のオリゴシアル酸誘導体由来の免疫原性および／またはワクチン組成物および／または抗体を用いた対象の診断および／または治療のための、それを必要とする疾患または状態に罹患している宿主を処置する様々な方法における使用を含む、様々な適用分野向けのオリゴシアル酸誘導体組成物および該誘導体に対して特異的な抗体の製造に使用される（下でより詳細に述べるような）。
上で示したように、本開示の組成物は、約２〜２０の重合度、およびエキソノイラミニダーゼによる分解に抵抗性のあるＮ−アセチル化残基を含む非還元端を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む。したがって、例えば、オリゴシアル酸誘導体は、α（２→８）またはα（２→９）グリコシル結合を介して本質的に結合したシアルおよびノイラミン酸モノマーのポリマーを含むものを含む。ポリシアル酸の１つまたは複数のシアルおよびノイラミン酸モノマーは、修飾あるいはシアルおよび／またはノイラミン酸の部分的もしくは完全にＯ−アセチル化されたモノマーなどの第２の分子に結合させることができる。一般的に、オリゴシアル酸は、例えば、大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌血清グループＢおよび髄膜炎菌血清グループＣなどの細菌からのポリシアル酸ポリマーから得ることができ、あるいは下でより詳細に述べるような他の方法によりデノボ合成することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、Ｎ−アセチルノイラミン酸および脱Ｎ−アセチルノイラミン酸などのＮ−アセチルおよび脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合物から本質的になる。他の実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、トリクロロアセチルまたはプロピオニル基などのＮ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む。
特定の実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、約２〜１０、ならびに二量体、三量体および／または四量体のその小範囲の重合度などの特定の重合度を含む。いくつかの実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、オリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成されている。特定の実施形態において、オリゴシアル酸鎖の混合物は、長さがより短い鎖を含む。他の実施形態において、オリゴシアル酸鎖の混合物は、長さがより長い鎖を含む。特定の実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、所望の鎖の混合物が富化されるように精製するか、または鎖の単一種から本質的になるように精製する。
本開示の組成物は、所望の結末結果を達成するための有効な量のオリゴシアル酸誘導体を含む。例えば、組成物は、ワクチン組成物を投与した対象の細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効な量の誘導体を一般的に含む。いくつかの例において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などのＩｇＧの１つまたは複数のサブクラスが誘発される、優勢な応答を含む可能性がある免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。特に重要なものはＩｇＧ３およびＩｇＧ１である。他の実施形態において、本開示の組成物は、組成物が他のオリゴシアル酸材料を実質的に含まない分離オリゴシアル酸誘導体を含み、特定の実施形態において、Ｎ−アセチルシアル酸残基を有するオリゴシアル酸誘導体を実質的に含まない。
【００３３】
特徴とする態様は、本開示のオリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物である。ワクチン組成物は、結合体または非結合体であるオリゴシアル酸を含んでいてよく、またワクチン組成物の有効性を増大させるためのアジュバントを場合によってさらに含んでいてよい。
特定の実施形態において、ワクチン組成物は、（ｉ）約２〜２０の重合度、（ｉｉ）ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２抗体の結合の阻害の約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０、および（ｉｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む。この実施形態の特色とする態様は、オリゴシアル酸誘導が１つまたは複数のＮ−トリクロロアセチルシアル酸残基またはＮ−プロピオニルシアル酸残基などのＮ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む場合である。
他の実施形態において、ワクチン組成物は、（ｉ）約２〜２０の重合度、（ｉｉ）約５０％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量、および（ｉｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む。この特定の実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、一般的にＮ−アセチルシアル酸および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合物で本質的に構成されている。この実施形態の特色とする態様は、オリゴシアル酸誘導体が約８８％〜９８％、通常約９５％〜約９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量を有する場合である。
【００３４】
特に重要なワクチン組成物としては、オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０、約２〜６、またはそれ以下、二量体、三量体および四量体のその小範囲の重合度を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、オリゴシアル酸誘導体の単一種、例えば、二量体、三量体または四量体から本質的に構成されている。
本開示のワクチン組成物は、本明細書に開示するようなオリゴシアル酸誘導体の結合体をさらに含んでいてよい。特に重要なものとして挙げられるのは、免疫調節剤である第２の分子に結合したオリゴシアル酸誘導体である。特定の実施形態において、免疫調節剤は、毒素または破傷風トキソイドなどのその誘導体である。特に重要な破傷風トキソイド結合ワクチン組成物の例は、実験例で述べるようなＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＤｅＮＡｃ−ＴＴ、ＯＳ−ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴから選択されるもの、ならびにオリゴシアル酸誘導体の単一種が提供されるその誘導体、例えば、二量体、三量体または四量体である。
上で要約したように、本開示は、本明細書で開示するα（２→８）およびα（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法を提供する。方法の１つの特徴は、脱Ｎ−アセチル残基が富化された還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を生成するための還元反応に水素化ホウ素ナトリウムを用いることである。この方法は、（ｉ）還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸前駆体を、非還元端を脱Ｎ−アセチル化するための条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理する段階、および（ｉｉ）１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含む。この方法により製造される特に重要な組成物としては、（ｉ）約２〜２０の重合度、ならびに（ｉｉ）脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体などがある。
【００３５】
水素化ホウ素ナトリウム還元反応は、調節可能な程度の脱Ｎ−アセチル化およびシアル酸含量を有するオリゴシアル酸生成物を生成するように調節することができる。還元反応は、通常ｐＨ８程度またはそれ以上のｐＨの水溶液中で行わせる。最も一般的には、反応は９以上、通常約９〜１１、最も一般的には約１０のｐＨで進行させる。反応を約１０で行わせる場合、脱Ｎ−アセチル化は、シアル酸前駆体材料の非還元端に対して優先的であるように思われる。ｐＨは、反応の過程にわたって調節または上昇させることもできる。この実施形態において、初期反応条件のｐＨは約８であってよく、ｐＨは反応の過程にわたって調節または一般的に約１０に上昇させてよい。
水素化ホウ素ナトリウム反応の持続時間および温度は、所望の条件を調節するための有用な変数である。例えば、オリゴシアル酸などのシアル酸前駆体材料を水素化ホウ素ナトリウムおよび水と混合し、反応がその所望の終点（例えば、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある還元端を有するオリゴシアル酸誘導体）に達するまで、適切な温度（例えば、環境温度）および期間（例えば、一夜）放置することができる。
次いで、反応混合物は、分析、貯蔵、製剤化、さらなる修飾および／または即時使用のために副生成物、副反応物などから所望の物質を分離するように標準的方法（例えば、水中透析およびイオン交換後の凍結乾燥）により精製することができる。例えば、キャラクタリゼーション、ＩＣ５０の測定およびリリース目的などのために、オリゴシアル酸生成物中のシアル酸および脱Ｎ−アセチルシアル酸の量を測定し（例えば、実施例で述べるようなレゾルシノール定量法により）、かつ／または下で述べるような阻害ＥＬＩＳＡによりＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２などの抗体の標的抗原に対する結合を阻害するその能力について試験することができる。
【００３６】
オリゴシアル酸前駆体材料上で行わせる水素化ホウ素ナトリウム反応の特徴は、脱Ｎ−アセチル化材料とは対照的に、該方法により生成させたオリゴシアル酸誘導体の大部分（例えば、本質的にすべて）がシアル酸と脱Ｎ−アセチルシアル酸の両方を含むことである。オリゴシアル酸前駆体を用いた水素化ホウ素ナトリウム反応の他の特徴は、脱Ｎ−アセチル化反応が非還元端において選択的に起こる可能性があることである。例えば、反応生成物を過剰量のエキソノイラミニダーゼで処理した場合、オリゴシアル酸誘導体の量は減少せず、またオリゴシアル酸誘導体がＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸へのＳＥＡＭ３の結合を阻害する能力に影響はない。
したがって、他の実施形態において、水素化ホウ素ナトリウム脱Ｎ−アセチル化反応自体をエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を富化するために利用することができる。これは、方法を、ノイラミン酸残基のような、脱Ｎ−アセチル化残基である非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸を生成させるために利用する特定の実施形態を含む。したがって、本開示は、非還元端において脱Ｎ−アセチル化が富化されているα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の両方、ならびにα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含み、非還元端に脱Ｎ−アセチル残基を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が富化された組成物を提供する。
他の態様において、水素化ホウ素ナトリウム反応は、ホウ素との複合体であるオリゴシアル酸誘導体の非還元端を生成させることができる。水素化ホウ素ナトリウムは強い還元剤であるので、還元反応は、オリゴシアル酸誘導体の還元端が還元される物質を得るのにも用いることができる。各例において、所望の物質は、Ｎ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸へのＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２３の結合を阻害するその能力によって容易に特徴づけることができる。他の実施形態において、所望の物質は、脱Ｎ−アセチル残基含量によって特徴づけられる。特定の実施形態において、所望の物質は、本明細書の実験例で述べるような、抗体阻害、脱Ｎ−アセチル残基含量、Ｎ−アセチル残基含量、重合度、純度、補体媒介性沈着、細菌溶解、細胞生存率の低下によって特徴づけられる。また、本開示の組成物は、これらの実施形態を含むことができる。
【００３７】
本開示の水素化ホウ素ナトリウム法はオリゴシアル酸誘導体を得るのに任意選択で適用することができるが、該方法は、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するオリゴまたはポリシアル酸誘導体を富化する追加の段階を任意選択で含んでいてよい。追加の富化段階は、様々な精製法によって実施することができるが、有利には、工程を単純化し、段階の収率および生成物の品質を改善するように、エキソノイラミニダーゼによる処理とその後のエキソノイラミニダーゼ分解に抵抗性のある物質の分離によって実施することができる。この態様は、最終生成物の所望の属性、すなわち、オリゴシアル酸誘導体が脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有することを保持すると同時に、ますます長くなる鎖長の脱Ｎ−アセチル化生成物の生成における方法のさらなる拡張を促進することができる。
他の実施形態において、水素化ホウ素ナトリウム法は、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成されている生成物を生成させるのにも用いられる。例えば、反応がコロミン酸の酸加水分解生成物のような多分散性である前駆体物質を用いる場合、最終生成物は一般的に多分散性である。したがって、１つの実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、コロミン酸またはコロミン酸の酸加水分解生成物から得られる、または得ることができる前駆体物質から得られる、または得ることができる。
混合物はまた、様々な重合度を有していてもよい。例としては、水素化ホウ素ナトリウム反応に用いるオリゴシアル酸前駆体物質によって、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ならびに２０〜２５、２５〜３０、３５〜５０、５０〜７５、７５〜１００および１００〜２００およびそれ以上を含むそれ以上の範囲の重合度を有するオリゴシアル酸誘導体が挙げられる。特に重要なものとして挙げられるのは、２〜００の範囲の重合度を含むオリゴおよびポリシアル酸誘導体（およびそれらを含む本開示の組成物）であり、特に重要なオリゴシアル酸誘導体の重合度は、約２〜７５、２〜７０、２〜６５、２〜６０、２〜５５、２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、およびより具体的には２〜２０である。特定の実施形態は、約２〜２０の範囲ならびに小範囲の正の整数である重合度を有するオリゴシアル酸誘導体である。例えば、オリゴシアル酸誘導体の重合度は、約２〜６、４〜８、６〜１０、８〜１２、１０〜１４、１２〜１６および約１４〜２０であり得る。特定の例において、重合度は、約４〜６、５〜７、６〜９、７〜１０、８〜１１、９〜１２、１０〜１３、１１〜１５、１２〜１８および１３〜２０から選択される範囲にある。他の実施形態において、重合度は、上の範囲内であるか、または上の範囲と重複していてよい。上に示したように、重合度は、水素化ホウ素ナトリウム反応に用いる前駆体物質の選択ならびに当技術分野で知られている様々なクロマトグラフィー法（例えば、透析、高性能液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換など）による下流精製により調節することができる。
【００３８】
上で示したように、水素化ホウ素ナトリウム反応により生成したオリゴシアル酸材料は、シアル酸と脱Ｎ−アセチルシアル酸を含み、シアル酸と脱Ｎ−アセチルシアル酸との比は、鎖長によって異なることがあり得る。例として、短いオリゴシアル酸誘導体の一般的な比は、ほぼ３：１〜１０：１の範囲であり、より長いオリゴシアル酸についてはより大きい。したがって、オリゴシアル酸誘導体は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１および２０：１のシアル酸対脱Ｎ−アセチルシアル酸比を有するものを含む。重要な特定のオリゴシアル酸誘導体は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１および１５：１のシアル酸対脱Ｎ−アセチルシアル酸比を有し、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１および１０：１の比を有するものが特に重要である。したがって、１つの実施形態において、該方法は、長さがより短い鎖および約３：１のシアル酸対脱Ｎ−アセチル化シアル酸の比を含むα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の混合物およびひいてはそれを含む本開示の組成物を生成させる。他の関連実施形態において、所望の生成物は、長さがより長い鎖および約１０：１のシアル酸対脱Ｎ−アセチル化シアル酸の比を含むα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の混合物である。特定の例は、約２〜６の範囲の重合度を有する長さがより短い鎖である。他の例は、約１５〜２０の範囲の重合度を有する長さがより長い鎖に関する。他の例は、約６〜１５の重合度を有する長さが中間の鎖を含むα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の混合物である。
いくつかの実施形態において、分離オリゴシアル酸誘導体の製造は、（ｉ）脱Ｎ−アセチル化オリゴシアル酸を含む第１の組成物を供給する段階、（ｉｉ）脱Ｎ−アセチル化オリゴシアル酸を再Ｎ−アシル化して、Ｎ−アシルおよび脱Ｎ−アセチル残基の混合物を有する部分的再アシル化オリゴシアル酸を含む第２の組成物を生成させる段階、および次いで（ｉｉｉ）第２の組成物からエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のあるオリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含む。この実施形態において、再アシル化は、部分的脱Ｎ−アセチル化オリゴシアル酸材料の遊離アミンへのカップリングのためにハロゲン官能基化酸無水物または他の方法で活性化したアシル誘導体を用いて行わせることができる。他の方法において、分離オリゴシアル酸誘導体の製造は、（ｉ）ポリシアル酸前駆体を含む第１の組成物を供給する段階、（ｉｉ）第１の組成物を部分的に脱Ｎ−アセチル化して、Ｎ−アシルおよび脱Ｎ−アセチル残基の混合物を有する部分的脱Ｎ−アシル化オリゴシアル酸を含む第２の組成物を生成させる段階、および次いで（ｉｉ）第２の組成物からエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のあるオリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含む。
【００３９】
特に重要なオリゴシアル酸前駆体は、シアル酸のホモポリマー、例えば、コロミン酸などのホモポリマーであり、自然源からまたは合成により得ることができる。他の実施形態において、ポリシアル酸前駆体は、大腸菌Ｋ１、大腸菌Ｋ９２、髄膜炎菌血清グループＢ、髄膜炎菌血清グループＣ、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・アルガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｇａｌａｃｔｉａｅ）およびパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａｅ）のポリシアル酸材料から得ることができる。さらなる適切なポリシアル酸材料を用いることができる（Ｔｒｏｙ  Ｆ．、Ｓｉａｌｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｌｙｃｏｔｙｐｅ：Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、４章、９５〜１３３頁、Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ａｂｒａｈｍａｎ  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年）。したがって、選択する前駆体物質に応じて、Ｎ−アセチルおよび脱Ｎ−アセチル残基を有利に選択することができる。例えば、１つの実施形態において、脱Ｎ−アセチル残基は、ノイラミン酸である。他の実施形態において、Ｎ−アセチル残基は、シアル酸である。他の実施形態において、ポリシアル酸誘導体は、ノイラミン酸およびシアル酸のホモポリマーである。他の実施形態において、天然由来物質においてＣ７およびＣ８がＯ−アセチル化されている、髄膜炎菌血清グループＣのポリシアル酸から得られるポリシアル酸前駆体の場合のように、Ｎ−アセチルおよび／または脱Ｎ−アセチルノイラミン酸は、１つまたは複数の位置においてＯ−アセチル化されている。この点に関して、本開示は、最終生成物のアシル化のレベルの調節を可能にし、また特に、残基の所望の混合物を含むオリゴシアル酸誘導体を生成する能力を提供する。
【００４０】
これは、約１０％〜９８％の脱Ｎ−アセチル残基、通常約１０％〜約６０％、および特定の実施形態においてオリゴシアル酸鎖当たり約１、２、３、４または５つの脱Ｎ−アセチル残基、および特定の実施形態においてオリゴシアル酸鎖当たり約１つの脱Ｎ−アセチル残基を含むオリゴシアル酸誘導体を生成させるように、ポリシアル酸前駆体を選択する関連実施形態を含む。したがって、本明細書においてＮ−アセチル残基およびＮ−アセチル基以外のＮ−アシル化残基から選択される残基にグリコシド結合を介して結合した非還元端脱Ｎ−アセチル残基を含むオリゴシアル酸誘導体を生成させるように選択されるポリシアル酸前駆体も考えられ、オリゴシアル酸誘導体は、実質的に非酸化であり、約２〜１０の重合度を有する精製オリゴ糖である。
関連実施形態において、本開示のポリシアル酸前駆体は、様々な非天然Ｎ−アシル基により修飾することもできる。例えば、ポリシアル酸前駆体は、上で示したように再Ｎ−アシル化することができ、あるいは、細胞により発現される前駆体物質が脱Ｎ−アセチルおよびＮ−アセチル残基の所望の混合物ならびに所望の量の非天然Ｎ−アシル基を含むような所望の比のマンノサミン誘導体（例えば、Ｎ−トリハロアシルマンノサミン）およびアシルマンノサミン（例えば、Ｎ−トリハロアセチルおよびＮ−アセチルマンノサム（ｍａｎｎｏｓａｍｅ））の混合物を増殖培地に添加した、細胞培養におけるポリシアル酸の生合成の産物であってもよい。
再Ｎ−アシル化段階において、部分的再Ｎ−アシル化は、化合物の全残基に対して９０％より少ない、８５％より少ない、８４％より少ない、８０％より少ない、７５％より少ない、７０％より少ない、６０％より少ない、５５％より少ない、通常約１０％、約１５％、約１６％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％または約４５％のＮ−アセチル化残基を有するポリシアル酸誘導体の生成を可能にする。この点に関して、本開示は、所望のアシル化のレベルを有するオリゴシアル酸誘導体を得るように、最終生成物のアシル化のレベルの調節を可能にする。一般的に、再アシル化は、アシル化試薬の量を制限することによって調節または妨げられる。重要な特定の実施形態は、オリゴシアル酸鎖当たり約１、２、３、４または５つの再Ｎ−アシル化残基を有するオリゴシアル酸誘導体であり、特定の実施形態において、オリゴシアル酸鎖当たり約１つの再Ｎ−アシル化残基である。
【００４１】
ポリシアル酸誘導体が化合物の全残基（化合物は一般的に少なくとも１０個または少なくとも２０個の残基を含む）に対して９０％より少ない、８５％より少ない、８４％より少ない、８０％より少ない、７５％より少ない、７０％より少ない、６０％より少ない、５５％より少ないアミン保護残基、通常約１０％、約１５％、約１６％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％または約４５％のアミン保護残基（例えば、Ｎ−トリハロアシル化残基）を含むような所望の比のアミン保護基およびアシル基（例えば、トリハロアセチルおよびアセチル基）の混合物を用いた再Ｎ−アシル化を含む他のアプローチも可能である。この点に関して、本開示は、所望のアシル化のレベルを有するポリシアル酸誘導体を得るように、アミン保護基の除去の後の最終生成物のアシル化のレベルの調節を可能にし、遊離アミノ基による望まれない副反応を回避することを可能にする。アミン保護の除去により、脱保護残基における遊離アミンが生ずる。一般的に、脱Ｎ−アセチル残基の割合は、アミン保護試薬の量（例えば、トリハロアシル化試薬の量）を制限することにより調節される。ここで再び、特に重要な１つの実施形態は、脱Ｎ−アセチルおよびＮ−アセチル残基の所望の混合物ならびに上で示したような所望の量の非天然Ｎ−アシル基を含むオリゴシアル酸誘導体の生成である。
特定の実施形態において、製造の方法の第１の組成物は、前駆体を脱Ｎ−アセチル化するのに適する条件下で、ポリシアル酸前駆体を強塩基（例えば、水酸化ナトリウム）との併用で、または強塩基による後続処理で、強還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）で処理することによって得られる。
【００４２】
次いで、副生成物、副反応物などから所望の物質を分離するように、反応混合物を標準的方法（例えば、水中透析およびイオン交換後の凍結乾燥）により精製することができる。例えば、キャラクタリゼーションおよびリリース目的などのために、物質の品質およびオリゴシアル酸生成物中の特定の残基の量をこの時点に測定し（例えば、実施例で述べるようなレゾルシノール定量法により）、かつ／または下で述べるような、取り込まれ、細胞の表面上で抗原として発現するその能力について試験することができる。
エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のあるオリゴシアル酸誘導体の分離と組み合わせるとき、生成物は、所望の物質で富化され、細胞の表面上の抗原の含量を増加させるのに特によく適する。この方法により生成する特に重要な組成物は、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有する分離オリゴシアル酸誘導体ならびに脱Ｎ−アセチル残基が富化されている非還元端を有するオリゴシアル酸誘導体の混合物で富化されている組成物を含む。
例えば、第２の組成物からエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のあるオリゴシアル酸誘導体を分離する製造の方法の段階は、一般的に部分的再アシル化オリゴシアル酸をエキソノイラミニダーゼに曝露し、次いで、所望のオリゴシアル酸誘導体を精製する段階を含む。特に重要なエキソノイラミニダーゼは、アルトロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）（ＳＩＡＬＩＤＡＳＥ  Ａ（商標）、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）からのエキソシアリダーゼである。この点に関して、エキソノイラミニダーゼ（エキソシアリダーゼ）は、脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を有する非還元端で終わるポリシアル酸（すなわち、ノイラミン酸）または他の方法で化学的にブロックされたものを分解することはできない。したがって、ポリマー全体に位置する脱Ｎ−アセチル残基を含むオリゴシアル酸誘導体の製剤のエキソノイラミニダーゼによる消化では、エキソノイラミニダーゼが脱Ｎ−アセチル残基に遭遇するときを除いて、ポリシアル酸が分解される。その箇所では、ポリマーのさらなる分解は起こらない。また、分解されないオリゴシアル酸分子は、非還元端に脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を有すると考えられる。あるいは、所望の物質は、末端ノイラミン酸残基などのエキソノイラミニダーゼによる分解が阻止される末端の非還元端に対して選択される条件下での誘導体の標準的精製により分離することができる。
【００４３】
したがって、特定の実施形態において、製造の方法は、この目的のために適切な前駆体物質からエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある所望のポリシアル酸誘導体を直接生成させるのに用いることができる。この方法は、（ｉ）Ｎ−アセチルおよび脱Ｎ−アセチル残基の混合物を有するオリゴシアル酸誘導体を含む第１の組成物をエキソノイラミニダーゼで処理する段階、および（ｉｉ）第１の組成物からエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のあるオリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含む。前駆体物質を適切に選択し、かつ／またはＮ−アセチルおよび脱Ｎ−アセチル残基の混合物を含むように調製し、次いで、再アセチル化、アルデヒドおよびケトン副反応、望まれない架橋などの望まれない副反応ならびにエキソノイラミニダーゼ分解を受けやすい、あるいは物質の所望の特性を別の仕方で変化させるモノマーおよび中間体などの広範囲の他の望まれない混入物を避けるように、所望の生成物を精製し、分解生成物から分離する場合に、この方法は特に適している。
他の特定の実施形態において、本開示の組成物は、（ｉ）それぞれが異なる重合度、Ｎ−アシル残基および脱Ｎ−アセチル残基の異なる混合物ならびに非還元端Ｎ−アセチルシアル酸残基を有するオリゴシアル酸誘導体の混合物を含む溶液を準備する段階、（ｉｉ）溶液をイオン交換クロマトグラフィーにかけて画分を発生させる段階、および（ｉｉｉ）１つまたは複数の画分から規定の重合度およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有するオリゴシアル酸誘導体を分離する段階により製造することができる。特定の態様において、オリゴシアル酸誘導体の混合物は、非還元端Ｎ−アセチル基を有するオリゴシアル酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、個々の画分における規定の重合度を有するオリゴシアル酸誘導体を分離するか、あるいは重要な所望の活性を有するポリシアル酸誘導体を含む選択される画分をプールすることにより、画分のプールを形成させる。
【００４４】
特定の実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーを約６．５〜約１０．０のｐＨで行う。特定の実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＣ）である。特定の実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、ＱＡＥまたはＰＥＩを用いる。他の実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ６５０Ｍ、ＭｏｎｏＱ、ＳｏｕｒｃｅＱまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥを用いる。重要な特定のイオン交換クロマトグラフィー法は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（強陰イオン）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（強陽イオン）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（弱陽イオン）、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（弱陰イオン）およびＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）（弱陰イオン）（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能）などの樹脂を用いる。特に重要なものとして挙げられるものは、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの強陰イオン交換体である。そのようなイオン交換カラムおよびシステム用のサンプル／ローディング緩衝および溶出系は、一般的に目的とする個々の化合物の分離を分解するために選択する。
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陰イオン交換樹脂用の一般的な緩衝系の例は、２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液、ｐＨ８のサンプル／ローディング緩衝系、およびカラムの寸法などに応じて異なる流速で溶出させることができる２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液中塩化ナトリウムの０Ｍ〜０．２Ｍ勾配からなる溶出緩衝系である。目的とする脱Ｎ−アセチルおよびＮ−アセチルシアル酸材料を含むイオン交換画分は、パルスアンペロメトリー検出による高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＣ−ＰＡＤ）により高感度で分析することができる（例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  Ｒ．Ｒ．、（１９９５年）、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐＨ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｌｉｂｒａｒｙ、５８巻、１８１〜２０９頁、およびＭａｎｚｉら、（１９９０年）、ＨＰＬＣ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒ  ｒｅｓｉｎ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８８巻、２０〜３２頁）。分離された物質は、ゲルパーミエーション、サイズ排除、ＲＰ−ＨＰＬＣなどの１つまたは複数の直交クロマトグラフィー技術によりさらに精製することができる。所望の場合、分離オリゴシアル酸材料は、透析、凍結乾燥、晶出、製剤化などのような１つまたは複数のさらなる調製段階に供することができる。
【００４５】
上述のイオン交換および精製法は、Ｎ−アセチルおよび脱Ｎ−アセチル残基の混合物を有するオリゴシアル酸誘導体を含む第１の組成物をエキソノイラミニダーゼで処理することによって生成するオリゴシアル酸誘導体の混合物について行うことができる。該方法は、Ｎ−アシルおよび脱Ｎ−アセチル残基の混合物を有し、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある部分的再アシル化オリゴシアル酸を含む第２の組成物を生成させるために、Ｎ−アセチル化オリゴシアル酸を含む第１の組成物を再アシル化することによって生成するような再アセチル化オリゴシアル酸誘導体の混合物についても実施することができる。
重要な特定の実施形態において、上述のイオン交換および精製法は、イオン交換精製に供する最初の材料中の副生成物を少なくするように、実質的に非酸化で、定義されている分離オリゴシアル酸誘導体の製造および精製に適用される。例えば、オリゴシアル酸の望まれない酸化は、イオン交換クロマトグラフィーにより分割し、所望の材料から分離することが困難であり得る複数の重複分解および副反応生成物を発生させる。したがって、「実質的に非酸化」は、オリゴシアル酸誘導体が、正常な異性体または互変異性体平衡を除いて、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満の酸化サッカリド残基を、また通常約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上の非酸化サッカリド残基を含むことを意味する。特に重要なものとして挙げられるものは、少数の副反応生成物を含む初期の生成物を発生させ、定義された長さのより小さいオリゴシアル酸誘導体および組成物の精製を容易にする総化学合成法である。
【００４６】
特定の実施形態において、実質的に非酸化で、定義されているオリゴシアル酸誘導体は、目的とするオリゴシアル酸前駆体物質の時間制御脱Ｎ−アセチル化および／または非酸化酸加水分解により生成させる。特色とする態様は、実質的に非酸化で、定義されているオリゴシアル酸誘導体の生成のための化学合成法であり、該方法は、（ｉ）時間制御アルカリ加水分解の抑制により調製した部分的脱Ｎ−アセチル化オリゴシアル酸の非酸化酸加水分解、または（ｉｉ）時間制御アルカリ加水分解の抑制およびその後の非酸化酸加水分解によるオリゴシアル酸の部分脱Ｎアセチル化を含む。
時間制御アルカリ加水分解によるオリゴシアル酸の部分脱Ｎ−アセチル化は、（ｉ）前駆体を部分的に脱Ｎ−アセチル化するのに適する条件下でオリゴシアル酸前駆体を強塩基中で強還元剤で処理する段階を含み、処理は、オリゴシアル酸の部分的脱Ｎ−アセチル化の、分解が最小限の生成物を得るのに有効な期間にわたるものである。特定の実施形態において、処理期間は、約１時間またはそれ未満であり、一般的に、約１０〜５０分、１５〜４５分、２０〜４０分の範囲などの１分きざみの約５〜５５分の範囲にあり、通常約４０分である。したがって、反応時間は、生成物の分解が最小限で、イオン交換クロマトグラフィーにより分離できる部分的脱Ｎ−アセチル化ポリシアル酸の所望の画分が得られるように選択することができる。この方法に適する強還元剤の例は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノゲン水素化ホウ素ナトリウムなどである（すなわち、ほぼ強さの昇順がシアノゲン水素化ホウ素ナトリウム〜トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウムおよび水素化アルミニウムリチウムなどの電子を容易に失う（または供与する）試薬）。適切な強塩基の例は、水酸化ナトリウムである（すなわち、溶液のｐＨが１４まで上昇するとき完全に加水分解する塩基であり、したがって、ほぼ強さの昇順が水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウムおよび水酸化ルビジウムなどの約１３を超えるｐＫａを有する塩基）。反応は、適切な温度、通常約７０℃〜１２０℃、約８０℃〜１１０℃、より一般的に約９０℃〜１００℃を選択することによっても促進することができる。そのように、アルカリ脱Ｎ−アセチル化は、ポリマー前駆体全体にわたる規定された量の脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を含む脱Ｎ−アセチルポリシアル酸を得るため、また最小限の重複分解生成物を含む分離した画分を得るために種々の反応時間にわたり行わせることができる。さらに、時間制御部分アルカリ脱Ｎ−アセチル化法により、所望の量の脱Ｎ−アセチル残基、例えば、約２５％〜６０％の脱Ｎ−アセチル残基を含むオリゴシアル酸誘導体を得ることができる。
【００４７】
オリゴシアル酸における脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の還元端におけるグリコシド結合は加水分解に対して抵抗性があるが、該残基の非還元端における結合は抵抗性がないので、非還元端における脱Ｎ−アセチルシアル酸を含む鎖の画分を増加させるために、非酸化酸加水分解を行わせることができる。さらに、そのような非酸化条件下で酸加水分解反応を行うことによって、強酸または高濃度（１０％）の酢酸の存在下で起こり得る多糖の酸化的損傷を最小限にすることができる。さらに、非酸化酸加水分解は、非還元端において脱Ｎ−アセチルシアル酸残基が富化されたより小さいオリゴシアル酸（またはオリゴ糖）誘導体の生成を促進する。本開示のこの態様は、（ｉ）ポリシアル酸前駆体または部分的脱Ｎ−アセチル化ポリシアル酸をポリシアル酸のグリコシド結合を選択的に加水分解できる酸性条件下で曝露する段階を含み、酸性条件は、溶存ガスを排気した（例えば、真空中で溶液を交互に凍結・解凍することにより）緩衝液などである。反応溶液の酸化環境をさらに低減するために、抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーを反応混合物に加えてもよい。非酸化条件に加えて、酸性緩衝系は、一般的に酸を用いるポリシアル酸加水分解反応に適するもの、例えば、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５などである。酸性条件のさらなる例としては、塩酸（例えば、２０ｍＭ  ＨＣｌ）およびトリフルオロ酢酸（例えば、０．１Ｍ  ＴＦＡ）などがある。非酸化酸加水分解反応は、通常、約１〜３０時間、５〜２５時間、１０〜２０時間、一般的に約１５〜１８時間である、所定の最終用途に対する異なる期間行わせることができる。反応の制御の助けとするために反応温度を調節することもできる。適切な温度範囲の例は、約４０℃〜９０℃、通常約５０℃〜７０℃の温度のような約２５℃またはそれ以上である。そのように、非酸化酸加水分解法は、非還元端脱Ｎ−アセチル残基、および例えば、約２〜２０、通常約２〜１０の規定の重合度を有する生成物などの所望の重合度を有する長さがより短いオリゴシアル酸誘導体を得るのによく適している。
したがって、該方法により生成する生成物は、混入物を実質的に含まない生成物を発生させる特定の特徴を含み、それにより、非富化対照と比較して所望の誘導体が富化されている。これは、望ましい特性または要素の割合が高いオリゴシアル酸誘導体を含む。例えば、所望のオリゴシアル酸誘導体の分離は、目的とするオリゴシアル酸が所望の物質の大部分（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を超えるまたは１００％までのより大きい割合）である場合である。鎖の大部分がそれぞれ個別に脱Ｎ−アセチルおよびＮ−アシル残基の混合物を含み、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性があり、また混合物がこれらの特徴および、例えば、非還元端における脱Ｎ−アセチル化残基（すなわち、非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基）を含む、脱Ｎ−アセチル残基が富化された非還元端を有するというさらなる特徴があるならば、これはもちろん、可変鎖長を有するオリゴシアル酸誘導体の混合物を含む。
【００４８】
再び、個別のアプローチによって、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル残基を有する非還元端、末端脱Ｎ−アセチル残基などの様々な有用な構造および関連機能特性を有するオリゴシアル酸誘導体を生成させることができる。上で述べたように、特に重要な脱Ｎ−アセチル残基は、ノイラミン酸であり、したがって、非還元端の末端は、ノイラミン酸であり得る。また上で述べたように、該方法は、非還元端が脱Ｎ−アセチル残基で富化されたオリゴシアル酸誘導体、ならびにノイラミンおよびシアル酸などのホモポリマーを製造するのに用いることができる。
本開示の製造方法はまた、方法により製造または得ることができるさらなる生成物を特徴としている。特に、方法は、第２の分子を結合する段階をさらに含んでいてよい。この点に関して、分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を、保護基、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、検出可能な標識などの第２の分子に結合させる。
他の分子に結合しているオリゴシアル酸誘導体の利点は、さらなる所望の特性を付与するために結合体の第２の分子の特性を利用すると同時に所望の活性を保持することができることなどである。例えば、オリゴシアル酸誘導体は、溶解性、保存もしくは他の取扱特性、細胞透過性、半減期、特定の細胞（例えば、ニューロン、白血球など）または細胞位置（例えば、リソソーム、エンドソーム、ミトコンドリアなど）、組織もしくは他の身体位置（例えば、血液、神経組織、特定の臓器など）を標的とすることなどによる制御因子（ｃｏｎｔｒｏｌｓ）の放出および／または分布の助けとなるペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物などの第２の分子に結合させることができる。他の例は、分析、追跡などのための色素、発蛍光団もしくは他の検出可能な標識またはリポーター分子の結合などである。より具体的には、本明細書で述べるオリゴシアル酸誘導体は、Ｎ−ラウロイル、Ｎ−オレオイルなどのＮ−脂肪アシル基、ドデシルアミン、オレオイルアミンなどの脂肪アミンなどを含む脂質部分の結合（例えば、米国特許第６，６３８，５１３号を参照）のような、ペプチド、ポリペプチド、色素、発蛍光団、核酸、炭水化物、脂質などの第２の分子に結合させることができる（例えば、還元または非還元端において）。
【００４９】
本開示の特定の実施形態において、結合体は、非結合物質と比べて細胞取込みを変化させる。関連実施形態において、オリゴシアル酸誘導体結合体は、非結合物質と比べて細胞取込みを増加させる。他の実施形態において、該結合体は、非結合物質と比べて細胞取込みを減少させる。この点に関して、細胞取込みの効率は、エンドサイトーシスを促進するペプチドまたはタンパク質に結合させることによって増加または減少させることができる。例えば、所定のオリゴシアル酸誘導体は、標的受容体のリガンドまたは抗体などのエンドサイトーシスメカニズムによってより容易に飲込まれる大分子に結合させることができる。抗体または他のリガンドは、エンドサイトーシスによりインターナライズされ、酸加水分解により、またはエンドサイトーシス小胞がリソソームに融合するとき酵素活性によりペイロードが放出される。このように、結合体は、非結合オリゴシアル酸誘導体と比べてエンドサイトーシスを増大させるものであり得る。細胞取込みを減少させるために、結合体は、オリゴシアル酸誘導体を細胞の表面上に保持するリガンドを含むことができる。これは、細胞取込みに対するコントロールとして有用であり得る。あるいは場合によって、１つの細胞型における取込みを減少させるが、他の細胞型における取込みを増加させる可能性がある。
結合体の他の特徴としては、結合体が非結合オリゴシアル酸誘導体と比べて毒性を低減させることなどを挙げることができる。さらなる実施形態において、結合体は、非結合物質と比べてがん細胞を標的にする。さらなる例は、補完し、増強し、増大させ、または他の仕方でオリゴシアル酸誘導体とともに相乗作用的に働くことができる１つまたは複数の分子とオリゴシアル酸誘導体の結合体を含む。例えば、オリゴシアル酸誘導体は、腫瘍の殺滅または除去をさらに促進するためにがん細胞の部位への送達のための結合した抗がん薬、例えば、抗増殖部分（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）、毒素（例えば、抗がん毒素、例えば、リシン、シュードモナス外毒素Ａなど）、放射性核種（例えば、９０Ｙ、１３１Ｉ、１７７Ｌ、ホウ素中性子捕獲用１０Ｂなど）、抗がん薬（例えば、ドキソルビシン、カリケアマイシン、マイタンシノイドＤＭ１、オーリスタチン・カウペシタビン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテルカンなど）を場合によって含むことができ、かつ／または薬物動態プロファイルの改善をもたらすために場合によって修飾することができる（例えば、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、高グリコシル化などにより）。
【００５０】
オリゴシアル酸および結合体組成物も１つまたは複数の再Ｎ−アシル化残基を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む。例えば、特に重要な再Ｎ−アシル化残基は、アミノ保護基を含む。使用のための具体例としてのアミノ保護基は、カルバメート、アミド、Ｎ−アルキルおよびＮ−アリールアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体、Ｎ−スルホニルなどを含むが、これらに必ずしも限定されない。さらなる具体例としてのアミン保護基は、ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリルおよびｐ−トルエンスルホニルなどのアシル型、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）および置換ベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニル）−１−メチルエトキシ−カルボニル、および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの芳香族カルバメート型、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）、エトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニルおよびアリルオキシカルボニルなどの脂肪族カルバメート型、シクロペンチルオキシカルボニルおよびアダマンチルオキシカルボニルなどの環状アルキルカルバメート型、トリフェニルメチルおよびベンジルなどのアルキル型、トリメチルシランなどのトリアルキルシラン、ならびにフェニルチオカルボニルおよびジチアスクシノイルなどのチオール含有型を含むが、これらに必ずしも限定されない。アミン保護基および保護アミン基は、例えば、Ｃ．Ｂ．ＲｅｅｓｅおよびＥ．Ｈａｓｌａｍ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７３年、それぞれ３および４章、ならびにＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９１年、２および３章に記載されている。いくつかの実施形態において、再アシル化残基としては、アクリル、メタクリル、ハロアセチル、プロピオニル、メタンスルホニル、ジおよびトリハロアセチルなどのＮ−置換基などが挙げられる。したがって、Ｎ−置換基を有する再アシル化残基は、トリハロアセチルおよびトリハロプロピオニル基（例えば、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロプリオピオニル、トリフルオロプリオピオニル）などのトリハロアシル基を含んでいてよい。Ｎ−置換トリハロアセチルまたはプロプリオニル基を有する再アシル化残基が特に重要であり、トリクロロアセチル基が特に重要である。
【００５１】
目的とする特定の実施形態は、第２の分子が免疫調節剤である場合である。「免疫調節剤」とは、免疫応答を直接的または間接的に変化させる分子を意味する。免疫調節剤の特定のクラスは、免疫応答を刺激またはその刺激を補助するものを含む。例としては、抗原ならびに毒素または破傷風トキソイドなどのその誘導体などの抗原担体などが挙げられる。他の実施形態は、１つまたは複数の免疫賦形剤を含むオリゴシアル酸誘導体組成物を含む。この実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、複合体化されていてよく、あるいはされていなくてよい。それにもかかわらず、オリゴシアル酸誘導体の特定の特徴は、Ｎ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２の結合を阻害することができることである。
他の例は、本開示のオリゴシアル酸誘導体を含むワクチン、抗がん治療剤として使用するための医薬組成物、ならびに抗体の産生のための該誘導体の使用などを含む。特に重要な組成物は、上述の水素化ホウ素ナトリウム法に従って製造されるα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体を含む。該抗体は、髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）細菌の補体媒介溶菌およびオプソニン食作用の能力がある。特に重要なものは、分裂または非分裂ジャーカットＴ細胞白血病細胞により発現されるノイラミン酸含有抗原に結合できる抗体である。非分裂または分裂細胞に結合することの利点は、抗体が非分裂ジャーカットＴ細胞性白血病細胞にＳＥＡＭ３よりよく結合できることである。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、動物（例えば、マウス）、ヒト由来またはヒト化されていてよく、またそのフラグメントであってよい。本開示の抗体は、オリゴシアル酸誘導体について上で述べたように複合体化されていてもよい。
【００５２】
目的とする選択されるモノクローナル抗体は、常用の組織培養法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または哺乳類対象を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで拡大することができる。例えば、プリスタン初回抗原投与マウスに腹水産生のためにＰＢＳ中対数増殖期ハイブリドーマ細胞を接種することができる。腹水は、さらなる精製の前に−７０℃で保存することができる。目的とする特定の実施形態は、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を含むα（２→８）またはα（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な分離抗体である。例としては、髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）およびグループＣ（ＮｍＣ）細菌の補体媒介溶菌およびオプソニン食作用の能力がある抗体が挙げられる。さらなる例は、分裂または非分裂ジャーカットＴ細胞白血病細胞により発現されるノイラミン酸含有抗原に結合できる分離抗体の手がかりを与える。特定の実施形態において、分離抗体は、非分裂ジャーカットＴ細胞性白血病細胞にＳＥＡＭ３よりよく結合する。特定の実施形態において、分離抗体はマウス由来である。特定の実施形態において、分離抗体は、非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基に対して特異的である。特色のある態様は、図１９または２０に示すＣＤＲポリペプチド配列から選択されるＣＤＲポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態は、図１９および２０に示すような軽および重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体ＤＡ２である。
他の実施形態において、モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。例えば、特に抗体を予防用または治療用製剤に用いる場合、キメラ抗体も提供することができる。ヒトおよび非ヒトアミノ酸配列からなるキメラ抗体は、当技術分野で知られている標準的技術によりヒトにおけるそれらの免疫原性を低減するために、マウスモノクローナル抗体分子から形成させることができる。
【００５３】
既知の技術を用いても産生させることができる親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示すことができる抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶおよびｓＦｖ分子）も提供することができる。例えば、ファージ・ディスプレイシステムを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでモノクローナル抗体分子集団を拡大することができる。生成したならば、ファージ・ディスプレイライブラリを用いて、Ｆａｂ分子の免疫学的結合親和力を既知の技術により改善することができる。ファージ・ディスプレイライブラリから選択されるＦａｂ分子の重および軽鎖部分のコーディング配列は、分離または合成し、発現のために適切なベクターにクローニングすることができる（例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳類ベクターシステム）。
製剤を含む、特に重要な組成物としては、異なるα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の個別または混合物の凝集体を含み、例えば、適切な対照と比較して細胞表面上に存在するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の量によって取り込まれるように、対応する非凝集誘導体より良好に細胞によって取り込まれ、細胞表面上で発現することができる、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体を含むものなどがある。
凝集体は、分子凝集体または顕微鏡的凝集体であってよい。特に重要な凝集体は、顕微鏡的粒子のような粒子である。これは、対応する非凝集誘導体と比較して容易に細胞によって取り込まれ、細胞表面上で発現することができる凝集体を含む。「対応する非凝集誘導体」とは、対照標準における凝集体に認められるのと同じ誘導体を意味する。
【００５４】
他の実施形態は、１つまたは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体を含む組成物を製造する方法、ならびに該方法により製造される組成物である。この方法は、凝集体を形成するように、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を凝集条件に曝露する段階を含む。このように、上述の製造の方法は、分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体を形成する段階をさらに含んでいてよい。凝集条件の例としては、加熱、凝集を促進する賦形剤の添加などが挙げられる。
「凝集体」とは、分子の個々のモノマーの凝集複合体を含み、複合体の個々のモノマーの分子量の倍数である複合分子量を有する粒子を意味する。例えば、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の１つまたは複数のモノマーの凝集体は、凝集モノマー複合体中の個々のモノマーの分子量の１０倍以上の粒子分子量を有する凝集複合体を含む。これは、約５００００以上、約２５００００ダルトン以上まで、５０００００ダルトン以上まで、７５００００ダルトン以上まで、１００００００ダルトン以上までの、例えば、標準的低倍率光学顕微鏡下（例えば、４０倍）での光学顕微鏡観察により容易に見ることができる均一粒径を有する粒子に至るまでの分子量を有する粒子を有する凝集体を含む。
したがって、凝集体は、分子または顕微鏡的粒子であってよい。顕微鏡的粒子の場合、最適な凝集体は、例えば、１ｕｍ〜２０μｍ、通常、目的とする物質の曝露および取込みのための標的とする細胞の直径に近いか、それより小さい（例えば、細胞は直径が約１〜２０μｍである）、平均凝集体径を変化させることによって選択することができる。非可視分子粒子ならびに顕微鏡的粒子の場合、望ましい凝集体は、細胞による取込みおよびインターナリゼーションを測定することによって選択することができる。各場合に、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体は、互いに、対照とおよび／または両方と比較したとき、非凝集誘導体より十分に細胞によって取り込まれ、インターナライズされることができる。
【００５５】
上で示したように、凝集体は、１つまたは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の非凝集体を凝集条件下で混合することにより、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を凝集条件下で部分的に分解または部分的に加水分解することにより、凝集賦形剤を用いてα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体を形成させることにより、あるいはその組合せにより、形成させることができる。「凝集条件」とは、さもなければ可溶性の物質に溶液中で凝集物質を形成させる化学的物理的条件を意味する。例えば、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、凝集体を形成するように、適切な時間（例えば、１時間から一夜）にわたって加熱することができる（例えば、３０℃〜７０℃）。一般的に、温度および曝露時間は、凝集体の所望の活性を消失させないと同時に、微生物の増殖を低減または阻害する（例えば、汚染の可能性を低減する）ように選択する。
他の実施形態において、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、ノイラミン酸のような脱Ｎ−アセチル残基である非還元端を含み、誘導体を凝集条件に曝露することによって、凝集体を形成する。上述の水素化ホウ素ナトリウム法および／またはエキソノイラミニダーゼによる処理によって、加熱したときに凝集して細胞によって容易に取り込まれる粒子を形成する非還元端脱Ｎ−アセチル残基が富化する。これは、非誘導体化α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸ならびに誘導体化α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸を含む、シアル酸の他のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸にも適用される。
【００５６】
したがって、本開示は、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸またはα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体を製造する方法も提供する。この方法は、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸あるいはエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を凝集条件に曝露し、凝集体を分離する段階を含む。
他の実施形態において、誘導体の凝集を促進することができる１つまたは複数の賦形剤を加えることによって、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の凝集体を形成させる。特に重要なものとして挙げられるものは、水酸化アルミニウムなどの凝集を促進することができる物質である。
したがって、本開示は、本明細書で開示の組成物を使用する様々な方法をさらに提供する。方法の１つの特徴は、本開示のオリゴシアル酸誘導体が、対象におけるがん細胞の成長を阻害するのに有用であり得る抗体を誘発することに特定用途を見いだすことである。この方法は、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体を含む有効な量の薬剤学的に許容できる製剤を対象に投与する段階を含む。この実施形態において、投与は、抗体に曝露したがん細胞の生存能の低下を促進する。
【００５７】
他の実施形態は、脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを有する対象におけるがん細胞に対する抗体を誘発する方法である。この方法は、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与する段階を含み、投与が、がん細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である。
他の実施形態は、ナイセリア属菌（例えば、髄膜炎菌、特に髄膜炎菌グループＢおよびＣ）および大腸菌Ｋ１の多糖莢膜上に認められるような脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを有する細菌に対する抗体を誘発する方法である。この方法は、脱Ｎ−アセチル残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある還元端を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与する段階を含み、投与が、細菌のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である。
【００５８】
「ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ」とは、（ｉ）１つまたは複数の残基が脱Ｎ−アセチルノイラミン酸残基であるポリシアル酸に対する抗体との最大交差反応性を有し、（ｉｉ）特に非がん哺乳類細胞、例えばヒト細胞表面上に提示されたとき、正常ポリシアル酸に対する抗体との最小ないし無交差反応性を有する分子を意味する。したがって、特定の実施形態において、最小のｄｅＮＡｃＳＡエピトープは、１つまたは両残基がＣ５アミノ位置に遊離アミンを含むシアル酸残基の二糖であり、２つの残基のうちの１つが脱Ｎ−アセチル化されている場合、第２の残基はＮ−アセチル基を有する（しかし、いくつかの実施形態において、Ｎ−プロピオニル基でない）。この最小エピトープを定義する二糖単位は、還元端、非還元端、またはシアル酸残基のポリマー内（例えば、多糖内）にあってよい。脱Ｎ−アセチル化残基は、Ｎ−アシル化残基を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）との関連において、免疫原性であり、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープと反応性である抗体を誘発するが、ヒトＰＳＡ抗原との最小限の反応性を示すか、または検出できるほどの反応性を示さない。例えば、脱Ｎ−アセチル化ＮｍＢ多糖エピトープは、Ｇｒａｎｏｆｆら、１９９８年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６０巻、５０２８頁（抗Ｎ−ＰｒＮｍＢＰＳｍＡｂ）、米国特許第６，０４８，５２７号（抗ＮｍＢ抗体）および米国特許第６，３５０，４４９号（抗ＮｍＢ抗体）に記載されているマウス抗Ｎ−プロピオニル髄膜炎菌グループＢ（Ｎ−ＰｒＮｍＢ）多糖ｍＡｂ（モノクローナル抗体）、ＳＥＡＭ３を用いて同定された。
【００５９】
がんの治療の方法において、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体、またはそのような誘導体を含む免疫原性組成物の投与により、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体に曝露したがん細胞の生存能の低下が促進される。これらの方法の利点は、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の投与により産生される抗体がｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含むがん細胞に対して直接的または間接的に細胞毒性であり得ることである。それにより細胞成長を妨げまたは阻止し、細胞死につながるアポトーシスを誘発しさえもする効果をもたらすことができる。他の利点は、抗体の細胞毒性は用量依存的であり、したがって調節可能であり得ることである。該方法による治療に適用可能ながん細胞の特定の例は、黒色腫、白血病または神経芽細胞腫などである。
関連実施形態において、治療を受ける対象はｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有する。該エピトープは、がん細胞または細菌などの細胞内に存在するか、または細胞表面上で発現することができる。この態様は、本開示の方法の状況において、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを発現または提示する細胞が本開示の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体による治療に対してより適用可能性が高くなり得る点が有用であり得る。もちろん抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、例えば、エピトープの存在が検出できない時点に療法を開始する場合にｄｅＮＡｃＳＡエピトープに関して未経験である対象に投与することができ、したがって、限定することを意図しない。疾患の症状の最初の徴候の前、可能な疾患の最初の徴候時、あるいは検出可能なｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、ガングリオシドまたは少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されている複合糖質）を有する原発がんおよび／またはがんの転移の診断の前または後に、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体療法を開始することも可能である。
【００６０】
他の実施形態は、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体療法と併用するｄｅＮＡｃＳＡエピトープのスクリーニングを含む。この方法において、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を用いた治療を受ける、または治療に対する感受性について試験を受けている対象の細胞をｄｅＮＡｃＳＡエピトープの存在についてスクリーニングする。これは、エピトープに結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、本開示のオリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体、またはＳＥＡＭ３モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０））を用いて達成することができる。特に重要なものとして挙げられるのは、モノクローナル抗体ＤＡ２または非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基に対する同様な活性を有する抗体である。一般のがん療法と同様に、このアプローチの利点は、そうでない個人と比較して抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体療法に対してより高度に反応する可能性がある細胞増殖疾患または病期を有する個人を選択することができることである。ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有する細胞を有する対象を標的とする他の利点は、治療コースにわたる経過をモニターすることができ、投与計画、量などを含む療法をそれに応じて調節することができることである。
方法を実施するに際して、投与経路（抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を身体と接触させる経路）は変化する可能性がある。オリゴシアル酸誘導体の代表的な投与経路については下でより詳細に述べる。特定の実施形態において、オリゴシアル酸誘導体を注入または局所注射により投与する。それはまた、がん細胞を除去するための外科的介入などの他の治療的介入の前、その時点、またはその後に投与することができる。抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、免疫療法、がん化学療法または放射線療法の少なくとも１つを対象に適用する、併用療法の一部として投与することもできる（下でより詳細に述べるように）。
【００６１】
該方法において、有効な量の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体をそれを必要とする対象に投与する。特に、特に重要な抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、化合物を有効な量で投与するとき、宿主におけるがん細胞の成長を阻害するものである。投与量は、投与の目的、治療を受ける個人の健康および身体的状態、年齢、治療を受ける個人の分類群（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、所望の解消の程度、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物の製剤、治療臨床医による医学的状況の評価、ならびに他の関連因子によって異なる。量は、ルーチンの試験により決定することができる比較的広い範囲に入ると予想される。例えば、がん細胞の成長を阻害するために用いる抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の量は、対象にとって不可逆的に有毒となりかねない量（すなわち、最大耐量）より多くない。他の例において、量は、毒性閾値の近くまたはそれを十分に下回るが、免疫有効濃度範囲内にあるか、または閾値用量程度に低い。がん細胞および／または細菌感染（例えば、ナイセリア属菌および／または大腸菌Ｋ１）に対する免疫防御上および／または免疫療法上の免疫応答を誘発するためにα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を使用することを含む実施形態において、投与するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の量は、がん細胞および／または細菌感染に対する対象における免疫防御上または免疫療法上の免疫応答を誘発するのに有効な量であり、そのような免疫応答に有効な量は、上に例示したものなどの様々な対象に固有の因子によって異なる可能性がある。抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗体反応を引き起こすためにα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を投与する場合、誘発される抗体は、宿主由来のポリシアル酸への検出できる結合をほとんどまたはまったく伴わずに、標的抗原上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープの特異的結合をもたらすことができる。
【００６２】
個別の用量は、対象に対する測定可能な効果をもたらすのに必要な量より一般的に少なくなく、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の吸収、分布、代謝および排泄（「ＡＤＭＥ」）に関する薬物動態および薬理に基づいて、また対象における組成物の生体内運命に基づいて決定することができる。これは、投与経路ならびに局所（主として局所的効果を得るために作用が望まれる部位に直接適用する）、経腸（消化管の一部に保持されているときに全身または局所効果を得るために消化管を経て適用する）または非経腸（全身または局所効果を得るために消化管以外の経路により適用する）適用について調節することができる用量の考慮を含む。例えば、抗体の投与は、一般的に注射、しばしば静脈内、筋肉内、腫瘍内、またはその組合せによる。
対象における抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の生体内運命ならびにその対応する生物学的活性は、一般的に問題とする標的に存在する抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の画分について評価する。例えば、一旦投与したオリゴシアル酸誘導体は、がん細胞およびがん組織中に物質を濃縮させるポリシアル酸、複合糖質または他の生物学的標的の成分として蓄積することができる。したがって、問題とする標的に時間の経過とともに蓄積するように抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を投与する投与計画は、より低い個別用量を考慮する戦略の一部であり得る。これは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでより緩やかに除去される抗体の用量はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから計算される有効濃度と比較して低くすることができることも意味する（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効量はｍＭ濃度に近く、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＭ濃度より低い）。
【００６３】
例として、用量または投与計画の有効量は、本明細書で述べるＳＥＡＭ３阻害アッセイで記載したようなＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２の結合阻害に関する所定の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体のＩＣ５０から判断することができる。「ＩＣ５０」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで５０％の阻害に必要な薬物の濃度を意味する。あるいは、有効量は、所定のオリゴシアル酸誘導体のＥＣ５０から判断することができる。「ＥＣ５０」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの最大効果の５０％を得るのに必要な血漿濃度を意味する。
一般的に、本開示の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体に関して、有効量は、通常計算ＩＣ５０の２００倍以下である。一般的に、投与する抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の量は、計算ＩＣ５０より約２００倍より少なく、約１５０倍より少なく、約１００倍より少なく、多くの実施形態で約７５倍より少なく、約６０倍、５０倍、４５倍、４０倍、３５倍、３０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍より少なく、約８倍または２倍より少ない。１つの実施形態において、有効量は、計算ＩＣ５０の約１倍〜５０倍であり、時として計算ＩＣ５０の約２倍〜４０倍、約３倍〜３０倍または約４倍〜２０倍である。他の実施形態において、有効量は、計算ＩＣ５０と同じであり、特定の実施形態において、有効量は、計算ＩＣ５０より大きい量である。
【００６４】
他の実施形態において、有効量は、計算ＥＣ５０の１００倍以下である。例えば、投与する抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の量は、計算ＥＣ５０より約１００倍より少なく、約５０倍より少なく、約４０倍、３５倍、３０倍または２５倍より少なく、多くの実施形態で約２０倍より少なく、約１５倍より少なく、約１０倍、９倍、９倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍または、１倍より少ない。１つの実施形態において、有効量は、計算ＥＣ５０の約１倍〜３０倍であり、時として計算ＥＣ５０の約１倍〜２０倍、または約１倍〜１０倍である。他の実施形態において、有効量は、計算ＥＣ５０と同じであり、特定の実施形態において、有効量は、計算ＥＣ５０より大きい量である。
有効量は、アッセイから、安全性ならびに漸増および用量設定試験、個々の臨床医・患者関係、ならびに本明細書に記載し、下の実験の項に示すようなｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験から実験的に容易に決定することができる。
特定の実施形態において、ＩＣ５０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体結合を阻害することにより計算する。この態様は、ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸によるＳＥＡＭ３結合の阻害に関する実験例に記載するような、目的とするオリゴシアル酸誘導体が、ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２抗体の結合を阻害する能力を評価することによって実施することができる。一般的に、該方法は、約１０μｇ／ｍｌの濃度の実施例に記載するようなデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸でプレートを被覆し、次いで、抗体結合の阻害およびＩＣ５０を測定するために実施例に記載するように処理し、用いる、標準的ＥＬＩＳＡにより実施する。この目的の様々な態様に適するこれらの抗体およびその他のものを用いることができる（例えば、ＳＥＡＭ−２（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１２３８０）、ＳＥＡＭ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１７０）、ＳＥＡＭ−１８（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２１６９）、ＳＥＡＭ−１２（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１２３８１））。
【００６５】
上で示したように、方法の他の特徴は、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を１つまたは複数の他の療法と併用して対象に投与することができることである。例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物の投与以外の療法または処置を、オリゴシアル酸誘導体と同時からその前または後の５時間またはそれ以上の時点まで、例えば、１０時間、１５時間、２０時間またはそれ以上の時点までのいずれかの時点に適用することができる。特定の実施形態において、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体ならびに他の治療的介入は、例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を他の治療処置の前または後に投与する場合、連続的に投与または適用する。さらに他の実施形態において、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体と他の療法を同時に適用し、例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体と第２の療法を同時に適用する場合、例えば、第２の療法が薬物であるとき、それは、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体とともに２つの別個の製剤として、または対象に投与する単一組成物に配合して投与することができる。上で示したように連続的または同時に投与するかどうかに関係なく、治療薬は、本開示の目的のために一緒または組み合わせて投与されるとみなされる。
本方法に使用することができ、組成物中に存在することができる抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、がん細胞または細菌細胞の成長に影響を及ぼすことができる抗体を誘発するように適切な特異性および抗原性を有するものを含むが、これらに限定されない。したがって、そのような特異性を有する抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、本方法により望まれない副作用および毒性を最小限にすると同時に、がん細胞または細菌細胞の細胞増殖を調節するという意図する最終結果を達成する助けとなる。言いかえれば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体ががん細胞または細菌細胞に対する免疫応答を誘発し、かつ／またはその成長を阻害することができる限り、用いる抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は下の実施例の項で開示するものと同じである必要はない。したがって、当業者は、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体の活性に実質的に影響を及ぼすことなく、多くの抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体（下でより詳細に述べる）を調製することができることを認識するであろう。これは、薬剤学的に許容できる塩（例えば、塩酸、硫酸塩）、溶媒和物（例えば、混合イオン塩、水、有機物）、水和物（例えば、水）の組成物を含む。オリゴシアル酸組成物の場合、それらは、そのプロドラッグの形（例えば、エステル、アセチル形）、アノマー（例えば、α／β変旋光）、互変異性体（例えば、ケト−エノール互変異性）および立体異性体（例えば、β−Ｄ異性体）として提供される可能性がある。それは、アジュバント、担体などの１つまたは複数の免疫賦形剤を含む様々なα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体組成物、ならびにアジュバントまたは他の免疫原性賦形剤を本質的に含まない非免疫原性α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体組成物も含む。
【００６６】
本開示のオリゴシアル酸誘導体のプロドラッグも考えられる。そのようなプロドラッグは、一般的にｉｎ  ｖｉｖｏで必要な化合物に容易に変換できる化合物の機能的誘導体である。したがって、本開示の方法において、「投与」という用語は、具体的に開示されている化合物、または具体的に開示されていない可能性があるが、それを必要とする対象に投与した後にｉｎ  ｖｉｖｏで指定の化合物に変換する化合物を投与することを含む。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製の通常の手順は、Ｗｅｒｍｕｔｈ、「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ」、Ｗｅｒｍｕｔｈ編、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、５６１〜５８６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００３年）に記載されている。プロドラッグとしては、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、ヒト体内で）加水分解して本明細書に記載する化合物を生ずるエステルが挙げられる。適切なエステル基は、各アルキルまたはアルケニル部分が６個以下の炭素原子を有する、薬剤学的に許容できる脂肪族カルボン酸、特にアルカン、アルケン、シクロアルカンおよびアルカン二酸由来のものが制限なしに挙げられる。実例としてのエステルは、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、クエン酸エステル、コハク酸エステルおよびエチルコハク酸エステルなどである。Ｏ−アセチル化プロドラッグが特に重要である。例えば、本開示のオリゴシアル酸誘導体の１つまたは複数のヒドロキシ基は、Ｏ−アセチル化されていてよい。
所定のオリゴシアル酸誘導体またはその結合体が本開示による使用に適しているか否かは、下の実験の項で用いるような様々なアッセイを用いて容易に判断することができる。下の実験の項で述べるような細胞を用いるアッセイを用いて検討したとき、標的細胞の成長の阻害を促進する対象における免疫応答を、正常対照細胞と比較して少なくとも約２〜１０倍、通常少なくとも約５０倍、時として少なくとも約１００倍〜２００倍誘発する場合、一般的にオリゴシアル酸誘導体は、本方法に使用するのに適している。特定の実施形態において、オリゴシアル酸誘導体は、細胞に対する免疫応答（例えば、細菌またはがん細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープを増強し、本明細書に記載するような二次抗体もしくはＳＥＡＭ３および／または免疫系の１つもしくは複数の態様により殺滅に対してより感受性にすることによる細胞毒性）を発生させたとき、下の実験の項で述べる細胞を用いるアッセイにおいて観察されるような、標的細胞（特定の細菌細胞、がん細胞または細胞株）の生存能を低下させ、標的細胞の成長を阻止し、かつ／またはアポトーシスを誘発し、かつ／または細胞死を誘発する抗体を誘発するものである。
【００６７】
分離されるならば、より小さいオリゴシアル酸誘導体のいくつかは特徴づけがなされ、半合成ならびに標準的化学合成を含む他の技術により調製することができることも理解されるであろう。例えば、そのようなオリゴシアル酸誘導体は、本明細書および実施例に記載するものを含む、当業者に知られている技術により従来通り調製することができる。ＣＭＰ−Ｎ−アシル化シアル酸類似体およびシアリルトランスフェラーゼも半合成法に用いることができる（例えば、Ｗａｋａｒｃｈｕｋら（２００８年）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１８巻、１７７頁）。様々な合成アプローチ、中間体、前駆体、分析ならびに結合体の合成および調製、診断などを記載している代表的参考文献は、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，３１５，０７４号、第４，３９５，３９９号、第４，７１９，２８９号、第４，８０６，４７３号、第４，８７４，８１３号、第４，９２５，７９６号、第５，１８０，６７４号、第５，２４６，８４０号、第５，２６２，３１２号、第５，２７８，２９９号、第５，２８８，６３７号、第５，３６９，０１７号、第５，６７７，２８５号、第５，７８０，６０３号、第５，８７６，７１５号、第６，０４０，４３３号、第６，１３３，２３９号、第６，２４２，５８３号、第６，２７１，３４５号、第６，３２３，３３９号、第６，４０６，８９４号、第６，４７６，１９１号、第６，５３８，１１７号、第６，７９７，５２２号、第６，９２７，０４２号、第６，９５３，８５０号、第７，０６７，６２３号および第７，１２９，３３３号を含んでいる。開示が参照により本明細書に組み込まれている、次の参考文献も参照のこと：「Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｐｅｔｅｒ  Ｈ．Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、２００１年、Ｐｌａｎｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１年）、２９１巻（５５０８号）、１５２３頁、Ｍａｒｃａｕｒｅｌｌｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、１２巻（６号）、６９Ｒ〜７７Ｒ頁、Ｓｅａｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１年）、２９１巻、２３４４〜２３５０頁、Ｂｅｒｔｏｚｚｉら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１巻、２３５７〜２３６４頁、ＭａｃＣｏｓｓら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、１巻、２０２９頁、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）、２７４巻（５２９２号）、１５２０頁、Ｋａｙｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、２６７巻、１６９３４頁、Ｋｅｐｐｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００１年、１１巻、１１Ｒ頁、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２００３年、３６２巻、２４９頁、Ｏｅｔｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００１年、２６８巻、４５５３頁および国際公開第１９９７／０４５４３６号。
【００６８】
オリゴシアル酸誘導体の薬剤学的に許容できる塩は、遊離酸を適量の薬剤学的に許容できる塩基で処理することにより調製することができる。代表的な薬剤学的に許容できる塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどである。反応は、水中単独または不活性水混和性有機溶媒と混合した水中で約０℃〜約１００℃、また室温であってよい温度で行わせる。オリゴシアル酸化合物と用いる塩基とのモル比は、個々の塩について望ましい比となるように選択する。例えば、遊離酸出発物質のアンモニウム塩の調製については、出発物質を約１当量の薬剤学的に許容できる塩基で処理して、中性塩を得ることができる。カルシウム塩を調製する場合、約１／２モル当量の塩基を用いて中性塩を得るが、アルミニウム塩については、約１／３モル当量の塩基を用いる。
【００６９】
製剤
治療の方法に用いられる抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を含む医薬組成物も提供する。「抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物」という用語は、結合体を含む、本開示の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を含む組成物を一般的に指すために便宜上のこととして本明細書で用いる。抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体、その結合体、または両方を含んでいてよい。細胞、特に、細菌およびがん細胞の成長を調節するのに有用な組成物が本開示により意図されている。凝集体は細胞により容易に取り込まれることから、これは、特に凝集体を含む組成物を含む。本明細書で開示するワクチン組成物の有効性を増大させるために、アジュバントも用いることができる。
アジュバントは、ワクチン組成物に直接加えるか、あるいはワクチン組成物と別個、同時または直後に投与することができる。ヒトに用いることができる既知の適切なアジュバントの例は、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３重量／容積％スクアレン、０．５重量／容積％トゥイーン８０、０．５重量／容積％スパン（Ｓｐａｎ）８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンがメチル化されていない場合）、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド共重合体）（ＰＬＧ）微粒子、ＱｕｉｌＡ、インターロイキンなどを含むが、これらに必ずしも限定されない。実験動物については、フロイント、Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ぶ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ぶ）、ならびに２％スクアレン／トゥイーン８０乳剤中に細菌から抽出された３成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む、ＲＩＢＩを用いることができる。アジュバントの有効性は、免疫原性抗原に対する抗体の量を測定することによって判断することができる。
【００７０】
組成物の有効性を増大させるためのさらなる具体例としてのアジュバントは、（１）例えば、（ａ）微小流動装置を用いてサブミクロン粒子に製剤化した５％スクアレン、０．５％トゥイーン８０および０．５％スパン８５（場合によってＭＴＰ−ＰＥを含む）を含むＭＦ５９（商標）（国際公開第９０／１４８３７号；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年における１０章）、（ｂ）微小流動化によりサブミクロン・乳剤とするか、またはボルテックス混合によってより大きい粒子径の乳剤とした、１０％スクアラン、０．４％トゥイーン８０および５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％トゥイーン８０、ならびにモノホスホリ脂質Ａ（ＭＰＬ）などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含むＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）などの水中油型乳剤（ムラミルペプチド（下を参照）または細菌細胞壁成分などの他の特異免疫刺激剤を含むまたは含まない）；（２）ＱＳ２１またはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）などのサポニンアジュバントを用いることができ、またはＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体）などのそれから発生した粒子、ＩＳＣＯＭＳはさらなる界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）が欠けている可能性がある、例えば国際公開第００／０７６２１号；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開第９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アセチル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）例えば英国特許第２２２０２２１号、欧州特許出願公開第０６８９４５４号、肺炎球菌サッカリドと共に用いるときには場合によってミョウバンの実質的非存在下で、例えば国際公開第００／５６３５８号；（６）３ｄＭＰＬと例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤との組合せ、例えば、欧州特許出願公開第０８３５３１８号、欧州特許出願公開第０７３５８９８号、欧州特許出願公開第０７６１２３１号；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０００年、１９巻、６１８〜６２２頁、Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００１年、３巻、１５〜２４頁、Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７年、３巻、８４９〜８５４頁、Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９７年、９４巻、１０８３３〜１０８３７頁、Ｄａｖｉｓら、Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、１６０巻、８７０〜８７６頁、Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７年、１８６巻、１６２３〜１６３１頁、Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、２７巻、２３４０〜２３４４頁、Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８年、１６巻、１２１６〜１２２４頁、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、３７４巻、５４６〜５４９頁、Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９６年、９３巻、２８７９〜２８８３頁、Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６年、１５７巻、１８４０〜１８４５頁、Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６年、１５６巻、４５７０〜４５７５頁、Ｈａｌｐｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年、１６７巻、７２〜７８頁、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８年、７９巻、８６６〜８７３頁、Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年、１５７巻、２１１６〜２１２２頁、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年、１４７巻、１７５９〜１７６４頁、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年、１５７巻、４９１８〜４９２５頁、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年、１５７巻、５３９４〜５４０２頁、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、１６０巻、４７５５〜４７６１頁およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、１６０巻、５８９８〜５９０６頁、国際特許出願公開第９６／０２５５５号、第９８／１６２４７号、第９８／１８８１０号、第９８／４０１００号、第９８／５５４９５号、第９８／３７９１９号、および第９８／５２５８１号）、シトシンがメチル化されていない場合、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、国際公開第９９／５２５４９号；（９）オクトキシノールと併用したポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１２０７号）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン界面活性剤と併用したポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１１５２号）；（１０）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（国際公開第００／６２８００号）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子、例えば国際公開第００／２３１０５号；（１２）サポニンおよび水中油型乳剤、例えば国際公開第９９／１１２４１号；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合によって＋ステロール）、例えば国際公開第９８／５７６５９号；（１４）組成物の有効性を増大させるための免疫刺激剤として作用する他の物質を含むが、これらに限定されない。ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などがある。対象がヒトである、ヒト使用に適するアジュバントが特に重要である。特に重要なものとして挙げられるものは、病原体およびがんに対するワクチンにおいて特に有用であり得る、イヌリンに基づくアジュバントである（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  Ｎ．（２００６年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻、増補版２、Ｓ２−２６−９）。
【００７１】
例えば、薬剤学的に許容できる塩の形の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、上述のように、方法における使用のために経口、局所または非経口投与用に製剤化することができる。特定の実施形態において、例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を液体注射剤として投与する場合（静脈内または組織中に直接投与する実施形態におけるような）、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体製剤は、調製済み剤形（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）として、または薬剤学的に許容できる担体および賦形剤を含む再構成可能な貯蔵安定性粉末もしくは液体として提供する。
対象（例えば、ヒト対象）に投与するのに適する抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を製造および製剤化する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、有効な量の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体ならびに薬剤賦形剤（例えば、生理食塩水）を含む医薬組成物中に提供することができる。医薬組成物は、他の添加剤（例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤など）を場合によって含んでいてよい。有効な量の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、一般的に所望の期間にわたり対象における抗菌または抗がん反応の増強をもたらすのに有効な量である。治療の目的（例えば、腫瘍負荷の低減または細菌感染もしくは増殖防護）は、様々な投与計画に基づく単回または反復投与によって達成することができる。
例として、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、従来の薬剤学的に許容できる担体および賦形剤（すなわち、媒体）と混合し、水剤、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤、貼付剤などの形で用いることができるが、通常、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体は、注射剤として提供するものとする。そのような医薬組成物は、特定の実施形態において、約０．１〜約９０重量％の活性化合物、より一般的に約１〜約３０重量％の活性化合物を含む。医薬組成物は、トウモロコシデンプンもしくはゼラチン、乳糖、デキストロース、ショ糖、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸などの一般的な担体および賦形剤を含んでいてよい。製剤に一般的に用いられる崩壊剤としては、クロスカルメロース、結晶セルロース、トウモロコシデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムおよびアルギン酸などがある。保存剤なども含めることもできる。
【００７２】
液体組成物は一般的に、例えば、懸濁化剤、保存剤、界面活性剤、湿潤剤、着香剤または着色剤を含むエタノール、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコールなどの非水溶媒、油または水などの適切な液体担体中化合物または薬剤学的に許容できる塩の懸濁液または溶液からなっている。あるいは、液体製剤は、再構成可能な散剤から調製することができる。
錠剤の形の組成物は、固形組成物を調製するのに通常用いられる適切な薬剤担体を用いて調製することができる。そのような担体の例としては、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、乳糖、ショ糖、結晶セルロースおよび結合剤、例えば、ポリビニルピロリドンなどがある。錠剤にカラーフィルムコーティングを施すこともでき、あるいは担体の一部として色を含めることもできる。さらに、活性化合物を、親水性または疎水性マトリックスを含む錠剤しての放出制御剤形に製剤化することができる。
カプセル剤の形の組成物は、例えば、活性化合物および賦形剤を硬ゼラチンカプセルに封じ込めることによる、通常のカプセル化手順を用いて調製することができる。あるいは、活性化合物および高分子量ポリエチレングリコールの半固形マトリックスを調製し、硬ゼラチンカプセル中に充填することができ、あるいはポリエチレングリコール中活性化合物の溶液、または食用油、例えば、流動パラフィンもしくは分別ヤシ油中懸濁液を調製し、軟ゼラチンカプセル中に充填することができる。
含めることができる錠剤結合剤は、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、デンプンおよびエチルセルロースである。用いることができる滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウムもしくは他の金属のステアリン酸塩、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、ワックス、油およびコロイド状シリカなどである。
【００７３】
さらに、剤形の外観をより魅力的にしたり、製品を識別する助けとするために、着色剤を加えることが望ましいことがある。
非経口投与したときに活性である本開示の化合物およびそれらの薬剤学的に許容できる塩は、筋肉内、硬膜下腔内または静脈内投与用に製剤化することができる。
筋肉内または硬膜下腔内投与用の一般的な組成物は、油中、例えば、ラッカセイ油またはゴマ油中有効成分の懸濁液または溶液であろう。静脈内または硬膜下腔内投与用の一般的な組成物は、例えば、有効成分およびデキストロースもしくは塩化ナトリウムまたはデキストロースおよび塩化ナトリウムの混合物を含む滅菌等張水溶液であろう。他の例は、乳酸加リンゲル注射剤、デキストロース加乳酸リンゲル注射剤、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ−Ｍおよびデキストロース、ＩｓｏｌｙｔｅＥ、アシル化リンゲル注射剤などである。場合によって、共溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、および抗酸化剤、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムを製剤に含めることができる。あるいは、溶液を凍結乾燥し、投与直前に適切な溶媒で再構成することができる。
直腸投与で活性である本開示の化合物およびそれらの薬剤学的に許容できる塩は、坐剤として製剤化することができる。一般的な坐剤は、一般的に有効成分とゼラチンまたはココアバターまたは他の低融点植物もしくは合成ワックスもしくは脂肪などの結合および／または滑沢剤とからなる。
【００７４】
局所投与で活性である本開示の化合物およびそれらの薬剤学的に許容できる塩は、経皮組成物または経皮送達用具（「貼付剤」）として製剤化することができる。そのような組成物は、例えば、裏当て（ｂａｃｋｉｎｇ）、活性化合物レザバー、制御膜、ライナーおよび接触粘着剤を含む。そのような経皮貼付剤は、制御された量の本開示の化合物の連続または不連続注入を行うために用いることができる。薬剤の送達のための経皮貼付剤の構成および使用は、当技術分野でよく知られている。例えば、その全体として参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，０２３，２５２号を参照のこと。そのような貼付剤は、薬剤の連続、拍動性または必要に応じた送達用に構成することができる。
目的とする特定の実施形態において、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、単一製剤として投与する。それは、他の適切な化合物および担体を含む有効な量の他の薬剤とともに投与することもでき、また、他の実薬と併用することもできる。したがって、本開示は、薬剤学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物も含む。薬剤学的に許容できる賦形剤は、例えば、あらゆる適切な媒体、アジュバント、担体または希釈剤を含み、公衆が容易に入手できる。本開示の医薬組成物は、当技術分野でよく知られている他の活性薬をさらに含んでいてよい。
当業者は、本開示の製剤を対象または宿主、例えば、それを必要とする患者に投与する様々な適切な方法が利用可能であり、特定の製剤を投与するのに複数の経路を用いることができるが、特定の経路が他の経路より迅速かつ有効な反応をもたらし得ることを理解するであろう。薬剤学的に許容できる賦形剤も当業者によく知られており、容易に入手できる。賦形剤の選択は、個々の化合物により、また組成物を投与するのに用いる個々の方法により決定する。したがって、本開示の医薬組成物の様々な適切な製剤が存在する。以下の方法および賦形剤は、単に例示するものであり、限定するものではない。
【００７５】
経口投与に適する製剤は、（ａ）水、生理食塩水またはオレンジジュースなどの希釈剤に溶解されている有効な量の化合物などの液剤、（ｂ）それぞれあらかじめ定められた量の有効成分を固形物または顆粒として含むカプセル剤、サシェ剤または錠剤、（ｃ）適切な液体中懸濁剤、ならびに（ｄ）適切な乳剤からなり得る。錠剤は、乳糖、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカロメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤ならびに薬剤学的に許容できる賦形剤のうちの１つまたは複数のものを含んでいてよい。トローチ剤は、着香料、通常ショ糖およびアラビアゴムもしくはトラガカント中有効成分を含んでいてよく、また、パステル剤は、ゼラチンおよびグリセリンもしくはショ糖およびアラビアゴムなどの不活性基剤中に有効成分を含み、乳剤、ゲル剤などは、有効成分に加えて、当技術分野で知られているような賦形剤を含む。
本開示の製剤は、吸入により投与するエアゾール剤に調製することができる。これらのエアゾール剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容できる加圧噴射剤中に入れることができる。それらは、噴霧器または噴霧装置用などの非加圧製剤用の薬剤として調合することもできる。
【００７６】
非経口投与に適する製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図するレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る水性および非水性等張注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、粘稠剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁剤などがある。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回分用量密封容器入りで提供することができ、使用直前に滅菌済み液体賦形剤、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。準備なしの注射液剤および懸濁剤は、前述の種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
局所投与に適する製剤は、有効成分に加えて、当技術分野で適切であることが知られているような担体を含むクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤または泡剤として提供することができる。
坐剤も乳化基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することによって提供される。膣投与に適する製剤は、膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡剤として提供することができる。
各用量単位、例えば、スプーン一杯、テーブルスプーン一杯、錠剤または坐剤が１つもしくは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むあらかじめ定めた量の組成物を含む、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤などの経口または直腸投与用の単位剤形を提供することができる。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または他の製剤学的に許容できる担体に溶解した溶液としての組成物にα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含んでいてよい。
【００７７】
「単位剤形」という用語は、本明細書で用いているように、ヒトおよび動物対象用の単位用量として適する物理的に別個の単位を意味し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量と計算されたあらかじめ定めた量の本開示の化合物を薬剤学的に許容できる希釈剤、担体または媒体とともに含む。新規な単位剤形に関する仕様は、用いる個々の化合物および達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
当業者は、用量レベルは、個別の化合物、送達媒体の性質などのとの関連で変化し得ることを容易に理解するであろう。所定の化合物の適切な用量は、当業者により様々な手段によって容易に決定される。
場合によって、医薬組成物は、緩衝剤、界面活性剤、抗酸化剤、粘度調整剤、保存剤などの他の薬剤学的に許容できる成分を含んでいてよい。これらの成分のそれぞれは当技術分野でよく知られている。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９８５，３１０号を参照のこと。
本開示の製剤に用いるのに適し得る他の成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、第１８版（１９９５年６月）に見いだすことができる。１つの実施形態において、シクロデキストリン水溶液は、デキストロース、例えば、約５％デキストロースをさらに含む。
【００７８】
有用性：具体例としての適用例および関連実施形態
該方法は、様々な適用例において使用でき、多くの適用例において、該方法は、ポリシアル酸構造の媒介およびがん細胞の成長の阻害のような、少なくとも１つの細胞機能を調節し、あるいはがん細胞または細菌細胞（例えば、ナイセリア属菌または大腸菌Ｋ１）上に生ずる可能性があるようなｄｅＮＡｃＳＡエピトープに結合する抗体を誘発するための対象の免疫処置におけるような、免疫応答を調節する。
少なくとも１つの細胞機能を調節する状況ならびに抗がん細胞抗体を誘発する状況において、方法および組成物は、細胞増殖障害の治療に用いることができる。したがって、代表的な治療適用例は、一般的に細胞増殖性疾患状態、例えば、がんおよび異常な細胞増殖付随状況によって特徴づけられる関連する状態の治療である。そのような疾患状態としては、がん／腫瘍性疾患および望まれない細胞増殖、例えば、過形成の存在によって特徴づけられる他の疾患などがある。示したように、細胞増殖障害としては、抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗体またはその誘導体を用いて判断することができる、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを異常に発現するものが挙げられる。
抗細菌抗体を誘発するために免疫応答を調節する状況において、方法および組成物は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有するナイセリア属菌（例えば、髄膜炎菌、例えば、髄膜炎菌グループＢおよびＣ）または大腸菌Ｋ１の莢膜多糖におけるようなｄｅＮＡｃＳＡを有する細菌に対する免疫防御上および／または免疫療法上の免疫応答を誘発するのに用いることができる。
【００７９】
特に重要なものとして挙げられるのは、本明細書で述べるオリゴシアル酸誘導体に対する抗原結合特異性またはｍＡｂＳＥＡＭ３の抗原結合特異性を有する抗体である。特に重要なものとして挙げられるのは、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合し、ヒトポリシアル酸に対する検出可能な結合をほとんどまたはまったく伴わない抗体である。そのような抗体の例としては、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２軽鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖ポリペプチドならびに重鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖ポリペプチドが挙げられる。そのような抗体のさらなる例は、ＤＡ２軽鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖ポリペプチドならびに重鎖ポリペプチドの可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖ポリペプチドを有するものなどである。そのような抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体などがある。
「治療」とは、宿主を苦しめる状態に伴う症状の少なくとも改善が達成されることを意味し、ここで改善は、治療する状態に伴うパラメーター、例えば、症状の大きさの少なくとも低減を指す広い意味で用いられる。それとして、治療はまた、宿主がその状態または状態を特徴づける少なくとも症状をもはや経験しないような、病的状態またはそれに伴う少なくとも症状が、完全に抑制され、例えば、起こることが予防され、または止まり、例えば、終結している状況を含む。したがって、治療は、（ｉ）予防、すなわち、臨床症状を発現させないことなどの、臨床症状の発現のリスクを低減すること、例えば、有害な状態への疾患の進行を予防すること、（ｉｉ）抑制、すなわち、例えば、腫瘍負荷を低減するように（その低減は検出可能ながん細胞の除去を含み得る）、または細菌感染によって引き起こされる疾患を防御するように（その防御は検出可能な細菌細胞の除去を含み得る）、臨床症状の発現もしくはさらなる発現を阻止すること、例えば、活動性疾患を緩和もしくは完全に抑制すること、および／または（ｉｉｉ）軽減、すなわち、臨床症状の後退をもたらすことを含む。
【００８０】
様々な宿主を該方法により治療することが可能である。一般的に、そのような宿主は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含む哺乳類綱内にある生物を記述するために広く用いられている。多くの実施形態において、宿主はヒトであるものとする。抗菌ワクチン接種法の状況において、特に重要なものは、ナイセリア属菌（例えば、髄膜炎菌、特に髄膜炎菌グループＢおよびＣ）または大腸菌Ｋ１などのｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有する細菌による感染により引き起こされ得る疾患に対して感受性である宿主である。
該方法は、数ある適用例のうちで特に、有効量の抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物をそれを必要とする対象に投与する、細胞増殖性疾患状態の治療に用いることができる。治療は、例えば、疾患の症状の１つまたは複数の症状の予防または少なくとも改善、ならびにその完全な消失、ならびに疾患状態の逆転および／または完全な除去、例えば、治癒を含めるように、上で定義したように広く用いられている。
本開示の組成物は、治療上有効な量の抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物、ならびに必要に応じて他の適合性のある成分を含んでいてよい。「治療上有効な量」とは、一連の同じまたは異なる抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の一部としての１回の投与での個体へのその量の投与が対象におけるがん細胞の成長を阻害するのに有効であることを意味する。抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物のそのような治療上有効な量および細胞成長に対するその影響は、１つまたは複数の他の療法（例えば、免疫療法、化学療法、放射線療法等）との細胞の成長の協力的および／または相乗的阻害を含む。下で示すように、治療上有効な量は、投与計画および対象の状態の診断分析（例えば、ＳＥＡＭ３抗体またはオリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体を用いた細胞表面エピトープの存否のモニタリング）などに関連して調節することができる。
【００８１】
本開示の状況における動物、特にヒトに対する投与量は、妥当な時間枠にわたる動物における予防または治療反応に影響を及ぼすのに十分なものであるべきであり、投与の目的、治療を受ける個人の健康および身体的状態、年齢、治療を受ける個人の分類群（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、所望の解消の程度、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の製剤、治療臨床医による医学的状況の評価、ならびに他の関連因子によって異なる。当業者は、用量は用いる個々の化合物の濃度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）、動物の状態および動物の体重、ならびに疾患の重症度および病期などの様々な因子に依存することも認識するであろう。用量の大きさは、個々の化合物の投与に伴う可能性がある有害な副作用の存在、性質および程度によっても決定される。したがって、量は、比較的広い範囲にあるが、それにもかかわらず、上記のような対象の様々な特徴により常法により決定することができると予想される。
また、適切な用量および投与計画は、所望の成長阻害または免疫抑制反応に影響を及ぼすことが知られている抗がんまたは免疫抑制薬と比較することによって決定することができる。そのような用量は、有意な副作用を伴うことなく、細胞成長の低用量阻害をもたらす用量を含む。適切な用量で、特定の化合物の適切な投与により、本開示の化合物は、例えば、細胞成長の部分的阻害から本質的に完全な阻害までの広範の細胞への作用をもたらすことができる。この差別的な阻害はがん細胞と高度に増殖性の非悪性細胞とを区別するのに用いることができる可能性があるので、これは、本開示の状況において特に重要である。投与処置は、単一投与計画または多投与計画（例えば、漸増・減および維持用量を含む）であってよい。示したように、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、他の薬剤とともに投与することができ、したがって、用量および計画は、対象の必要に適合させるために、この状況においても変化し得る。
【００８２】
本開示の組成物は、水溶液、しばしば生理食塩溶液などの溶液であってよい、あるいは粉末の形で提供することができる、薬剤学的に許容できる賦形剤に混入して提供することができる。抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、薬剤用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、マグネシウム、カルボネートなどの他の成分を含んでいてよい。組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調節剤などの生理的状態に近づけるために必要な薬剤学的に許容できる補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでいてよい。
製剤中の本開示の抗体またはオリゴシアル酸誘導体の濃度は、約０．１％、通常約２％未満または少なくとも約２％から２０％〜５０％またはそれ以上（重量）まで変化してよく、選択される個々の投与方法および患者の必要に従って主として液体の容積、粘度などによって選択する。得られる組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、エアゾール剤などの形であってよい。
抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物（場合によって複合体化していてよい）は、単独で用いるか、または他の療法（例えば、抗菌薬、他の抗がん薬など）と併用することができる。併用する場合、様々な組成物を同じまたは異なる製剤で提供することができる。異なる製剤で投与する場合、組成物は、同じまたは異なる投与計画で投与することができる（例えば、同時または異なる時点に（例えば、同じ日または異なる日に）、同じまたは異なる経路などで）。一般的に、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の投与は、下でより詳細に述べるように、連続的に、同時に、または混合として行うことができる。投与は、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の反復投与で、連続的であってよい。具体例としての投与計画は、下でより詳細に述べる。
【００８３】
一般的に、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の投与は、添加賦形剤を含むまたは含まない錠剤、固形、粉末状、液体、エアゾール状で、経口、口腔、鼻内、鼻咽頭、非経口、腸、胃、局所、経皮、皮下、筋肉内に、局所または全身的に組成物を投与することを含め、適切な経路により行う。非経口投与できる組成物を調製する実際の方法は、当業者には既知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ（１９９５年）のような刊行物により詳細に記述されている。
経口投与する場合、抗体またはオリゴシアル酸誘導体を消化から保護すべきことであることが認識される。これは一般的に、酸および酵素加水分解に対して抵抗性にするために抗体またはオリゴシアル酸誘導体を組成物と複合体化することにより、あるいはリポソームなどの適切に抵抗性の担体に包装することにより達成される。目的とする化合物を消化から保護する手段は、当技術分野でよく知られている。
血清半減期を延長するために、注射する抗体またはオリゴシアル酸誘導体製剤は、カプセル封入、リポソームの内腔に導入、コロイドとして調製することもでき、あるいは血清半減期の延長をもたらす他の従来の技術を用いることができる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９巻、４６７頁（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号に記述されているように、リポソームを調製するのに様々な方法が利用可能である。製剤は、混合物としての、または連続的な抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の放出および投与のために放出制御または徐放性剤形で提供することもできる。
【００８４】
組成物はまた、疾患およびその合併症の発現を予防または少なくとも部分的に阻止するために疾患のリスクがある対象に投与することができる。例えば、対象が疾患の１つまたは複数の徴候または症状を示すが、それは確実な診断には不十分であり、かつ／または対象が疾患の可能性を増大させる条件に曝露された、または曝露される可能性がある場合、対象は「リスクがある」。例えば、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、がんのリスクがある、がんを有する、または細胞表面ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されている細胞表面ガングリオシド）を有するがんの転移のリスクがある対象に投与することもできる。
抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、細胞組織学、生存能、生物学的マーカープロファイルなどのモニター（例えば、選択的ｄｅＮＡｃＳＡエピトープなどの存否をモニタリングすること）を含み得るような、がん細胞の成長の阻害をもたらす方法で宿主に投与する。抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、所望の最終結果（例えば、がん細胞の成長の阻害）に必要と考えられる治療上有効な量を維持するために連続的にまたは重複して投与することができる。一般的に、各用量およびその投与のタイミングは、対象の健康が耐えられる量で一般的に提供し、上で示したＩＣ５０および／またはＥＣ５０に基づいていてよい。したがって、量は所定の治療ごとに広く変化し得る。
用量または治療に対する治療反応は、既知の方法によって測定することができる（例えば、最初の免疫処置の前後に個体から血清を入手し、例えば、免疫沈降試験、またはＥＬＩＳＡ、または殺菌検定、またはウェスタンブロット、またはフローサイトメトリー分析、または同様なものにより、上記のような個体の状態の変化を示すことにより）。投与は、最初の物質のクリアランスを可能にするためのウォッシュアウト期間を含め、その後に治療を休止または再開することができる。したがって、投与戦略はそれに応じて修正することができる。
【００８５】
１つの実施形態において、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物を少なくとも１回、通常少なくとも２回投与し、またいくつかの実施形態において、２回を超える回数投与する。関連実施形態において、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物を、投与計画および方針にのっとり化学療法と併用して投与する。他の実施形態において、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物を投与計画および方針にのっとり免疫療法と併用して投与する。さらに他の実施形態において、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物を投与計画および方針にのっとり放射線療法と併用して投与する。抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物の個々の各用量は、免疫療法、化学療法または放射線療法などの補足的療法の前、施行中または後に投与することができる。認識することができるように、抗体またはオリゴシアル酸誘導体組成物を用いる併用療法は、所定の最終的な必要について調節することができる。
具体例としてのがん療法
抗体およびオリゴシアル酸誘導体組成物は、哺乳類対象、特にヒトにおける様々ながん療法（がんの予防および診断後がん療法を含む）に用いることができる。腫瘍を有する、有することが疑われる、または発現するリスクがある対象は、本明細書で述べる療法および診断を受けることが意図される。そのような対象から得られるサンプルは、本開示の方法において使用するのに同様に適している。
【００８６】
より詳細には、本明細書で述べる抗体およびオリゴシアル酸誘導体組成物は、例えば、がん細胞の生存能の低下を促進するために、例えば、腫瘍サイズを低減し、腫瘍負荷を低減し、かつ／または患者の臨床的アウトカムを改善するために対象（例えば、ヒト患者）に投与することができる。特に、抗体およびオリゴシアル酸誘導体組成物は、がん細胞の細胞周期を混乱させ、例えば、がん細胞が細胞周期の前Ｇ０期に入ることを誘導することにより、細胞がアポトーシスに入ることを促進するために用いることができる。
特定の実施形態において、特にがん細胞が細胞外でアクセスできる細胞の表面上にｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示している場合（例えば、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化したガングリオシドまたは他の複合糖質上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープ）、抗体およびオリゴシアル酸誘導体組成物を抗がん療法に有利に用いることができる。１つの実施形態において、がんは、ＳＥＡＭ３反応性抗原および／またはＤＡ２反応性抗原を提示するものである。ＳＥＡＭ３反応性抗原および／またはＤＡ２反応性抗原を提示するがんは、当技術分野で知られている方法によって確認することができる。検出および診断の具体例としての方法を下で述べる。
【００８７】
抗がん療法が抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物の投与を含む場合、抗がん療法は、分裂中（複製中、増殖中）のがん細胞を特に対象とすることができる。下の実施例に示すように、オリゴシアル酸誘導体に対して産生された抗体は、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２抗体により特異的に結合されるエピトープを有するがん細胞に対して特に有効であった。例えば、ＳＥＡＭ３により結合される細胞外でアクセスできる抗原のレベルは、細胞分裂中に非分裂細胞と比べて増加し、ＳＥＡＭ３の結合が、細胞が後期に（前Ｇ０に）移ることを促進する。ほとんどのがんは同じ種類の正常細胞より速やかに分裂するので、ＳＥＡＭ３反応性抗原を有する細胞は、抗体およびオリゴシアル酸誘導体に基づくがん療法にとって魅力的である。また、本開示のオリゴシアル酸誘導体に対する本明細書で特定する抗体は、正常ＰＳＡ対照と比較して、ＳＥＡＭ３による結合と比べてＯＳ結合体ワクチン由来抗原に対する高い結合を示し、したがって、ＳＥＡＭ３に加えて臨床的ベネフィットを有する。例えば、ＤＡ２のような本明細書で述べる方法により調製したオリゴシアル酸誘導体組成物を用いて発生させた抗体は、正常ＰＳＡ対照と比較して、改善された結合親和力および／または結合アビジティーでＳＥＡＭ３反応性抗原に結合する可能性がある。他の例において、ＤＡ２のような本明細書で述べる方法により調製したオリゴシアル酸誘導体組成物を用いて発生させた抗体は、正常ＰＳＡ対照と比較して、ＳＥＡＭ３モノクローナル抗体により結合されるエピトープと異なるＳＥＡＭ３反応性抗原のエピトープに結合する可能性がある。実施例に示すように、ＤＡ２は、ＤＡ２反応性抗原を有するがん細胞に結合ならびにそれを殺滅するのに高度に有効であった。
したがって、本開示は、抗体および／またはＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２ｍＡｂにより認識されるエピトープを有するオリゴシアル酸誘導体組成物の投与を含む、がん細胞を対象とする抗がん療法を特に提供する。抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体療法が特に適用可能ながんは、細胞増殖のマーカー（例えば、Ｋｉ−６７抗原）を検査し、かつ／または分裂細胞におけるＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２により、あるいは本開示のオリゴシアル酸誘導体に対して特異的な抗体により結合されるｄｅＮＡｃＳＡエピトープの存在／アクセシビリティを検査する（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるように）ことによって確認することができる。
【００８８】
細胞表面でアクセス可能なｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有するがんは、少なくとも部分的に脱Ｎ−アセチル化されたガングリオシドおよび／またはｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含むシアル酸修飾を有するタンパク質を有するものなどである。脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドを有するがんが記載された。
正常ヒト組織における脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の存在は一過性で、存在量は非常に低いと思われ、少数の血管、皮膚および結腸の浸潤性単核細胞に、また皮膚メラノサイトに中等度のレベルで認められる。それは、黒色腫、白血病およびリンパ腫などの異常細胞においてのみ優勢である。高レベルのｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、脱Ｎ−アセチルガングリオシド）の発現はがん細胞において主として起こるので、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物による治療を用いて、細胞毒性を誘発することができ、腫瘍の成長を阻止することができる。さらに、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物を治療的に用いて、他の組織におけるがん細胞の接着および浸潤をもたらす／予防することができる。
ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示する具体例としてのがんとしては、脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を含む脱Ｎ−アセチルガングリオシド（例えば、ＧＭ２α、ＧＭ１α、ＧＤ１β、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１α、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１３、ＧＴ１３、ＧＴ１ｈα、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、Ｇｏｍｅｇａ１ｈα、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃおよびＧＰ１ｃ）を提示するがん細胞が挙げられる。特に重要なものとして挙げられるのは、少なくとも１つ残基が脱Ｎ−アセチル化されている、α２−８グリコシド結合により結合された２つまたはそれ以上のシアル酸残基を含むガングリオシド（例えば、ＧＤ１ｃ、ＧＴ１３、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、Ｇｏｍｅｇａ１ｈα、ＧＴ３、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃおよびＧＰ１ｃ）である。いくつかの実施形態において、α２−８グリコシド結合により結合された２つまたはそれ以上のシアル酸残基を含むガングリオシドは、ＧＤ３以外および／またはＧＭ３以外のガングリオシドである。いくつかの実施形態において、がんの標的は、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシド上に存在するもの以外のｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、シアル酸修飾タンパク質の脱Ｎ−アセチル化残基）である。
【００８９】
１つの実施形態において、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、細胞分裂中に細胞外表面でアクセスできるＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を示すがんを含む、細胞表面上にＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を提示するがんを治療するのに用いることができる。
他の実施形態において、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、細胞休止中に細胞外表面でアクセスできるＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を示すがんを含む、細胞表面上にｄｅＮＡｃＳＡエピトープを提示するがんを治療するのに用いることができる。
ｄｅＮＡｃＳＡエピトープおよび／またはＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原は、非がん細胞と比較してがん細胞上で高レベルで発現する可能性があるが、これは、本明細書で開示する療法の制限となるものではないことを注意すべきである。例えば、がんが補給することができる細胞型（例えば、白血病およびリンパ腫におけるようなＢ細胞、Ｔ細胞または造血由来の他の細胞）に関連する場合、そのような細胞の枯渇による対象の障害は治療することができる（例えば、正常細胞の再増殖を刺激するための薬物、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどにより）ので、正常細胞の成長の阻害は許容することができる。
【００９０】
本明細書で考慮するがんに関する方法としては、例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体療法の単独の使用または抗がんワクチンもしくは療法としてのｄｅＮＡｃＳＡ抗原との併用、ならびに抗がんワクチン（例えば、受動免疫による）もしくは療法におけるｄｅＮＡｃＳＡ抗原を用いて産生させた抗体の使用などがある。該方法は、癌腫、肉腫、白血病およびリンパ腫などの様々ながんを治療または予防する状況において有用である。
本明細書で開示した方法による療法が適用可能であり得る癌腫は、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌（皮膚がんの一形態）、扁平細胞癌（様々な組織）、移行上皮癌（膀胱の悪性新生物）を含む、膀胱癌、気管支癌、大腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺の小細胞癌および非小細胞癌を含む、肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性腺管癌または胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、骨原性癌、上皮癌および鼻咽頭癌を含むが、これらに限定されない。
本明細書で開示した方法による療法が適用可能であり得る肉腫は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫および他の軟組織肉腫を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書で開示した方法による療法が適用可能であり得る他の固形腫瘍は、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、オリゴデンドログリオーマ、メナンジオーマ（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫を含むが、これらに限定されない。
本明細書で開示した方法による療法が適用可能であり得る白血病は、ａ）慢性骨髄増殖性症候群（多能性造血幹細胞の腫瘍性障害）、ｂ）急性骨髄性白血病（多能性造血幹細胞または制限された系統細胞への分化能（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有する造血幹細胞の腫瘍性転化）、ｃ）Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ球性白血病および有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；免疫学的に未熟で、機能的に不適格な小リンパ球のクローン性増殖）およびｄ）急性リンパ球性白血病（リンパ芽球の蓄積により特徴づけられる）を含むが、これらに限定されない。方法を用いて治療することができるリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫などを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書で開示した方法による治療が適用可能であり得る他のがんは、異型性髄膜腫（脳）、島細胞癌（膵臓）、髄様癌（甲状腺）、間葉腫（腸）、肝細胞癌（肝臓）、肝芽細胞腫（肝臓）、明細胞癌（腎臓）および縦隔神経芽腫などである。
本明細書で開示した方法を使用する治療が適用可能であり得るさらなる具体例となるがんは、神経外胚葉および上皮起源のがんを含むが、これらに限定されない。神経外胚葉起源のがんの例は、ユーイング肉腫、脊髄腫瘍、脳腫瘍、乳児のテント上（ｓｕｐｒａｔｅｎｂｒｉａｌ）原始神経外胚葉腫、管状嚢胞癌、ムチン管状および紡錘細胞癌、腎臓癌、縦隔腫瘍、神経膠腫、神経芽腫ならびに青年および若年成人における肉腫を含むが、これらに限定されない。上皮起源の例は、小細胞肺がん、乳房、水晶体、結腸、膵臓、腎臓、肝臓、卵巣および気管支上皮のがんを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、方法は黒色腫の治療を含まない（すなわち、がんは黒色腫以外である）。他の実施形態において、方法はリンパ腫の治療を含まない（すなわち、がんはリンパ腫以外である）。特定の実施形態において、本開示の方法を用いて、脱Ｎ−アセチルガングリオシドを発現することが知られている、黒色腫およびある種のリンパ腫を含むがん細胞を治療する。上で示したように、前駆ガングリオシドＧＭ３およびＧＤ３を過剰発現するがんは、細胞表面上に最大の量の脱Ｎ−アセチルガングリオシドも発現する可能性がある。
【００９３】
他のがん療法との併用
抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物の治療的投与は、免疫療法、化学療法薬および手術（例えば、下でさらに述べるような）を含むが、これらに限定されない、追加の標準抗がん療法と併用または併用しないレジメンの一部としての投与を含み得る。さらに、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物の治療的投与は、抗がん療法による対象の治療後処置でもあり得る。ここで、抗がん療法は、例えば、手術、放射線療法、化学療法薬の投与などであり得る。モノクローナル抗体、特に標的細胞の補体媒介殺滅および／または抗体依存性細胞毒性媒介殺滅をもたらすことができるモノクローナル抗体の使用は、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチルガングリオシド）を発現する細胞からなる原発腫瘍の同定の後に特に重要なものである（例えば、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体（例えば、ＤＡ２、ＳＥＡＭ３または本開示のオリゴシアル酸誘導体に特異的な投与））。ＰＳＡ抗原／抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を用いる免疫療法と併用して本開示の抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物を用いるがん療法は、特に重要なものである（参照により本明細書に組み込まれている、米国出願番号第１１／６４５，２５５号およびＰＣＴ出願番号ＵＳ２００６／０４８８５０）。
例えば、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、１つまたは複数の化学療法薬（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビジン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン（ＣＨＯＰ）と併用して、かつ／または放射線療法と併用して、かつ／または外科的介入（例えば、腫瘍を除去するための前もしくは後手術）と併用して投与することができる。α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を外科的介入と併用する場合、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物は、がん細胞を除去するための手術の前、その時点、または後に投与することができ、全身または手術部位に局所投与することができる。抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体組成物（単独または上述の併用）は、全身（例えば、非経口投与による、例えば、静脈内経路による）または局所（例えば、局所腫瘍部位に、例えば、腫瘍内投与（例えば、固形腫瘍内、リンパ腫もしくは白血病における関係リンパ節内）、固形腫瘍供給血管内への投与等による）投与することができる。
【００９４】
様々ながん療法のいずれかを本明細書で述べる抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体に基づく療法と併用することができる。そのようながん療法としては、手術（例えば、がん組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法、生物学的反応修飾物質療法および前記の特定の組合せなどが挙げられる。
放射線療法は、ビームなどの外部適用源から、または小放射線源の埋込みにより送達されるＸ線またはガンマ線を含むが、これらに限定されない。
化学療法薬は、がん細胞の増殖を低減する非ペプチド（すなわち、非タンパク質性）化合物であり、細胞傷害性薬物および細胞成長抑制薬を含む。化学療法薬の非限定的な例は、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイドおよびステロイドホルモンなどがある。
細胞増殖を低減するように作用する物質は、当技術分野で知られ、広く用いられている。そのような物質は、メクロレタミン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イフォスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、デカルバジンおよびテモゾロミドを含むが、これらに限定されない、窒素マスタードなどのアルキル化剤、ニトロソ尿素、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキルおよびトリアゼンなどである。
【００９５】
代謝拮抗薬は、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸塩（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビンを含むが、これらに限定されない、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤などである。
適する天然産物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンフォカインおよびエピポドフィロトキシン）は、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、デオキシコフォルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレキナル、アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等、ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポシド等、抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンおよびモルフォリノ誘導体等、フェノキシゾンビシクロペプチド、例えば、ダクチノマイシン、塩基性糖ペプチド、例えば、ブレオマイシン、アントラキノングリコシド、例えば、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アントラセネジオン、例えば、ミトキサントロン、アジリノピロロインドールジオン、例えば、マイトマイシン、大環状免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等、などを含むが、これらに限定されない。
他の抗増殖細胞傷害性薬物は、ナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォサミドおよびドロロキサフィンである。
【００９６】
抗増殖活性を有する微小管作用薬も使用に適しており、アロコルヒチン（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉｎ  Ｂ）（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ３３４１０）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）、マイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、ＴＡＸＯＬ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン；エオプチロンＡ、エポチロンＢ、ジスコデルモリド、エストラムスチン、ノコダゾールなどを含むが、これらに限定されない天然および合成エポチロンを含むが、これらに限定されない。
使用に適するホルモン調節剤およびステロイド（合成類似体を含む）は、アドレノコルチコステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン等、エストロゲンおよびプロゲスチン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン等、副腎皮質抑制薬、例えば、アミノグルテチミド、１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド（Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）（ドロゲニル（Ｄｒｏｇｅｎｉｌ））、トレミフェン（Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）（ファレストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ））およびＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）を含むが、これらに限定されない。エストロゲンは、増殖および分化を刺激し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物は、この活性を阻害するのに用いられる。コルチコステロイドは、Ｔ細胞の増殖を阻害する可能性がある。
【００９７】
他の化学療法薬としては、金属錯体、例えば、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチン等、尿素、例えば、ヒドロキシ尿素、およびヒドラジン、例えば、Ｎ−メチルヒドラジン、エピドフィロトキシン、トポイソメラーゼ阻害剤、プロカルバジン、ミトキサントロン、ロイコボリン、テガファーなどがある。問題とする他の抗増殖薬としては、免疫抑制薬、例えば、ミコフェノール酸、タリドミド、デソキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ＺＤ１８３９、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン）などがある。
「タキサン」は、パクリタキセルならびに活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」（例えば、ドセタキセル、ＴＡＸＯＬ、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体などの類似体、製剤および誘導体を含むと本明細書では理解すべきである）は、当業者に知られている技術を用いて容易に調製することができる（国際公開第９４／０７８８２号、国際公開第９４／０７８８１号、国際公開第９４／０７８８０号、国際公開第９４／０７８７６号、国際公開第９３／２３５５５号、国際公開第９３／１００７６号、米国特許第５，２９４，６３７号、第５，２８３，２５３号、第５，２７９，９４９号、第５，２７４，１３７号、第５，２０２，４４８号、第５，２００，５３４号、第５，２２９，５２９号および欧州特許第５９０，２６７号も参照）か、または例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．を含む様々な商業的供給元から入手することができる（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａからのＴ７４０２、またはＴａｘｕｓ  ｙａｎｎａｎｅｓｉｓからのＴ１９１２）。
【００９８】
パクリタキセルは、パクリタキセルの化学的に入手できる一般的な形だけでなく、類似体および誘導体（例えば、上で示したようなＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）ドセタキセル）ならびにパクリタキセル結合体（例えば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストランまたはパクリタキセル−キシロース）も指すことを理解すべきである。
親水性誘導体および疎水性誘導体を含む様々な既知の誘導体も「タキサン」という語に含まれる。タキサン誘導体は、国際特許出願公開第９９／１８１１３号に記載されているガラクトースおよびマンノース誘導体、国際公開第９９／１４２０９号に記載されているピペラジノおよび他の誘導体、国際公開第９９／０９０２１号、国際公開第９８／２２４５１号および米国特許第５，８６９，６８０号に記載されているタキサン誘導体、国際公開第９８／２８２８８号に記載されている６−チオ誘導体、米国特許第５，８２１，２６３号に記載されているスルフェナミド誘導体、米国特許第５，４１５，８６９号に記載されているタキソール誘導体を含むが、これらに限定されない。それはさらに、国際公開第９８／５８９２７号、国際公開第９８／１３０５９号および米国特許第５，８２４，７０１号に記載されているものを含むが、それらに限定されない、パクリタキセルのプロドラッグを含む。
本開示の化合物による一部の個人の治療において、非悪性腫瘍細胞に対して救出薬とともに高用量療法を用いることが望ましいと思われる。そのような治療において、シトロボラム因子、葉酸誘導体またはロイコボリンなどの、非悪性腫瘍細胞を救出できる薬剤を用いることができる。そのような救出薬は、当業者によく知られている。救出薬は、細胞機能を調節する本発明の化合物の能力を妨げないものなどである。
【００９９】
方法および組成物を用いることができる特定の適用例は、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２，５１２，５７２号、第３，８９２，８０１号、第３，９８９，７０３号、第４，０５７，５４８号、第４，０６７，８６７号、第４，０７９，０５６号、第４，０８０，３２５号、第４，１３６，１０１号、第４，２２４，４４６号、第４，３０６，０６４号、第４，３７４，９８７号、第４，４２１，９１３号、第４，７６７，８５９号、第３，９８１，９８３号、第４，０４３，７５９号、第４，０９３，６０７号、第４，２７９，９９２号、第４，３７６，７６７号、第４，４０１，５９２号、第４，４８９，０６５号、第４，６２２，２１８号、第４，６２５，０１４号、第４，６３８，０４５号、第４，６７１，９５８号、第４，６９９，７８４号、第４，７８５，０８０号、第４，８１６，３９５号、第４，８８６，７８０号、第４，９１８，１６５号、第４，９２５，６６２号、第４，９３９，２４０号、第４，９８３，５８６号、第４，９９７，９１３号、第５，０２４，９９８号、第５，０２８，６９７号、第５，０３０，７１９号、第５，０５７，３１３号、第５，０５９，４１３号、第５，０８２，９２８号、第５，１０６，９５０号、第５，１０８，９８７号、第４，１０６，４８８号、第４，５５８，６９０号、第４，６６２，３５９号、第４，３９６，６０１号、第４，４９７，７９６号、第５，０４３，２７０号、第５，１６６，１４９号、第５，２９２，７３１号、第５，３５４，７５３号、第５，３８２，５８２号、第５，６９８，５５６号、第５，７２８，６９２号および第５，９５８，９２８号に記載されているものを含む。
【０１００】
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体抗体反応の発生
本明細書で述べる、その結合体を含むα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体は、抗菌抗体反応を誘発するのに、また抗がん細胞抗体反応を誘発するのに用いることができる。一般的に、免疫は、賦形剤を添加したまたは添加しない錠剤、固形、粉末状、液体、エアゾール剤形で、局所または全身的に、すなわち、経口、鼻内、鼻咽頭、非経口、経腸、胃、局所、経皮、皮下、筋肉内に組成物を投与することなどのあらゆる適切な経路による投与によって達成される。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に知られまたは明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０年）のような刊行物により詳細に記載されている。
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体および本明細書で述べる関連化合物（例えば、結合体）は、経口投与するとき、消化から保護すべきであることが認識される。これは一般的に、酸および酵素加水分解に対して抵抗性にするためにα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を組成物と複合体化することにより、あるいはリポソームなどの適切に抵抗性の担体に包装することにより達成される。目的とする化合物を消化から保護する手段は、当技術分野で知られている。
血清半減期を延長するために、注射する抗原性製剤は、カプセル封入、リポソームの内腔に導入、コロイドとして調製することもでき、あるいはペプチドの血清半減期の延長をもたらす他の従来の技術を用いることができる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９巻、４６７頁（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号に記述されているように、リポソームを調製するのに様々な方法が利用可能である。製剤は、混合物としての、または連続的な抗原性製剤の放出および投与のために放出制御または徐放性剤形で提供することもできる。
【０１０１】
組成物は、疾患およびその合併症の発現を予防または少なくとも部分的に阻止するために、適切な対象、例えば、ナイセリア疾患に罹患するリスクがある、またはｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原に存在するような）を有するがんを発現するリスクがある対象に投与する。これを達成するのに十分な量は、「治療上有効な量」と定義される。治療での使用で有効な量は、例えば、抗原組成、投与方法、ならびにいずれかまたはすべてが臨床医の判断により修正することができる、対象の体重および一般健康状態などの様々な対象に特有のパラメーターに依存する。
抗原組成物の単回または反復投与用量は、患者が必要とし、かつ耐えられる用量および頻度、投与経路に応じて投与することができる。一般的に、本開示の化合物が、免疫処置によって対象におけるポリシアル酸と有意に交差反応する検出可能な抗体が誘発されない（言いかえれば、宿主シアル酸に対する臨床的に意義がある自己抗体反応を誘発しない）という利点をもたらすことができる場合、免疫処置は、対象における免疫応答を誘発するように行うものであり、髄膜炎菌ならびに大腸菌Ｋ１に対して殺菌性の抗体の産生および／またはがん細胞の増殖を阻害する抗体の産生を含むことができる。
特定の実施形態において、本明細書で述べる抗原組成物を連続的に投与する。最初に、免疫原性的に有効な用量のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体（担体と結合させてもよく、賦形剤を含んでいても含まなくてもよい）を対象に投与する。初回量は、一般的に免疫応答（例えば、Ｂおよび／またはＴ細胞の活性化）を誘発するのに有効な量で投与する。最初の免疫処置に用いる量は、一般的に約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇ／７０ｋｇ患者、より一般的に約０．００１ｍｇ〜約０．２ｍｇ／７０ｋｇ患者、通常約０．００５ｍｇ〜約０．０１５ｍｇ／７０ｋｇ患者の範囲である。特に、抗原を体腔または臓器の内腔中などの隔離された部位（血流中ではない）に投与する場合、０．００１〜約１０ｍｇ／患者／日の用量を用いることができる。実質的により高い用量（例えば、１０〜１００ｍｇまたはそれ以上）が経口、鼻内または局所投与で可能である。
【０１０２】
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の第１の抗原組成物を投与した後に、対象が初回投与への曝露により初回免疫を受けた後、治療上有効な用量の第２抗原組成物（例えば、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体、場合によって複合体化され、賦形物を含むまたは含まない）を対象に投与する。追加抗原は、患者の反応および状態に応じて、初回免疫処置の数日、数週間または数ヵ月後に投与することができる。
所望の免疫応答の存在は、既知の方法（例えば、最初の免疫処置の前後に個体から血清を入手し、例えば、免疫沈降試験、またはＥＬＩＳＡ、または殺菌検定、またはウェスタンブロット、またはフローサイトメトリー分析、または同様なものにより、上記のような患者の状態の変化を示すことにより）および／または第２の注射に対する免疫応答が第２の注射に用いた組成物で始めて免疫処置（例えば、初回免疫）を受けた対照対象の免疫応答より高いことを示すことによって判断することができる。初回免疫および／または第１の抗原組成物に対する免疫応答の存在は、以前の経験に基づいて、免疫応答および／または初回免疫が起こるのに十分である初回免疫処置後の期間−例えば、２、４、６、１０または１４週間待つことによっても推定することもできる。第２の抗原組成物の追加抗原用量は、免疫原の性質および免疫処置の経路に応じて、一般的に約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇの抗原である。
特定の実施形態において、個体が初回免疫を受け、かつ／または第２の抗原組成物に対する免疫応答を開始した後に、治療上有効な用量の調製された第３の抗原組成物を対象に投与する。本明細書で開示した方法は、第４、第５または第６の抗原組成物を用いた第４、第５または第６またはそれ以上の追加免疫処置の適用も意図している。
【０１０３】
対象は、髄膜炎菌もしくは大腸菌Ｋ１またはｄｅＮＡｃＳＡエピトープ保有がんに対して免疫学的に感受性である可能性がある。免疫学的予防のため、α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を、疾患の症状の最初の徴候の前、または感染または疾患への可能なもしくは実際の曝露（例えば、ナイセリアもしくは大腸菌Ｋ１への曝露またはそれらによる感染による）の最初の徴候の時点に投与することができる。
受動免疫および他の抗体に基づく療法
さらに、本明細書で述べる方法を用いて産生させた抗α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体抗体は、例えば、哺乳類対象における髄膜炎菌媒介性または大腸菌Ｋ１媒介性疾患を治療または予防するための受動免疫療法を提供するために用いることができる。特に、本開示による脱Ｎ−アセチル化ＰＳまたはその結合体を用いて産生させた抗体は、髄膜炎菌または大腸菌Ｋ１疾患からの対象の受動的防護、またはがんの治療を可能にするように、対象への投与に適する医薬組成物で提供することができる。
より具体的には、本明細書で述べる方法により産生させ、髄膜炎菌または大腸菌Ｋ１エピトープを認識する免疫予防抗体は、感染または疾患が起こることを予防するために、または確定された疾患を有する患者における臨床的アウトカムを改善する（例えば、ショックのような合併症率の低下、死亡率の低下、または難聴などの罹患率の低下）ための療法として、対象（例えば、ヒト患者）に投与してナイセリア疾患に対する受動免疫を誘導することができる。抗体をがん療法を行うために投与する場合、抗体は、腫瘍の殺滅または除去をもたらすためにがん細胞を標的とする薬物、例えば、毒素（例えば、リシン）、放射性核種などに場合によって結合させることができる。
【０１０４】
診断
ｄｅＮＡｃＳＡエピトープと反応性の抗体は、細胞表面でアクセスできるｄｅＮＡｃＳＡエピトープ（例えば、脱Ｎ−アセチル化細胞表面ガングリオシドまたは複合糖質）を有するがん細胞を有するまたは有することが疑われる対象から得られた生物学的サンプル中のｄｅＮＡｃＳＡ抗原を、（参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１１／６４５２５５号およびＰＣＴ出願米国第２００６／０４８８５０号）に記載されているような免疫診断技術における抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を用いて検出するのに用いることができる。そのような抗体は、細胞表面でアクセスできるｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有する細菌、例えば、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含む多糖を有する細菌、例えば、ナイセリア属菌（例えば、髄膜炎菌、特に髄膜炎菌グループＢおよびＣ）、大腸菌Ｋ１を有するまたは有することが疑われる対象から得られた生物学的サンプル中のｄｅＮＡｃＳＡ抗原の検出にも用いることができる。本開示は、特に、分裂および非分裂細胞上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープを認識し、結合するそれらの能力をあるものとしてのがん細胞の検出の状況において、この目的に適するさらなる抗体を提供する。そのような診断は、本明細書に開示する療法および／または療法に対する反応のモニターを適用できる患者を特定するのに有用であり得る。さらに、そのような抗体は、抗体が宿主（例えば、哺乳類、特にヒト）ポリシアル酸に対する検出可能な結合をほとんどまたはまったく示さず、それにより、偽陽性結果のリスクの低下をもたらすような、抗原結合特性を有することができ、または有するように選択することができる。
簡単に説明すると、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体の抗原結合特異性は、この状況において、宿主由来のＰＳＡに対する検出可能な結合をほとんどまたはまったく伴わず、それにより偽陽性結果の発生を低減させて、サンプル中のがんまたは細菌細胞上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープの検出を促進するために利用することができる。そのような検出方法は、診断の状況において、抗体がｄｅＮＡｃＳＡエピトープおよび／またはＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原に特異的に結合する、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体に基づく療法に適する対象の特定、療法のモニタリング（例えば、療法に対する反応を追跡するため）などに用いることができる。
【０１０５】
適切な免疫診断技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ（撮像法）法を含むが、これらに必ずしも限定されない。方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏである場合、生物学的サンプルは、血液サンプル（全血、血清等を含む）、組織、全細胞（例えば、完全な細胞）および組織または細胞抽出物を含むが、これらに限定されない、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が存在する可能性があるサンプルであってよい。検定法は、競合、直接反応またはサンドイッチタイプ検定法などの様々な形をとり得る。具体例としての検定法は、ウェスタンブロット、凝集試験、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識および媒介免疫検定、ビオチン／アビジンタイプ検定、放射線免疫検定法、免疫電気泳動、免疫沈降などである。反応は、一般的に蛍光、化学発光、放射性、酵素標識もしくは色素分子などの検出可能な標識、あるいはサンプル中の抗原と抗体との複合体の形成またはそれと反応する抗体を検出する他の方法を含む。
検定法は、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から液相中の非結合抗体の分離を含むことができる。用いることができる固相支持体としては、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形の）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）、フッ化ポリビニリデン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどの基材が挙げられる。
固体支持体を用いる場合、固体支持体を通常最初に、成分が支持体に十分に固定化されるような適切な結合条件下で固相成分（例えば、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体）と反応させる。時として、支持体への固定化は、より良好な結合特性を有する、または抗体結合活性または特異性の有意な喪失を伴わずに支持体上の抗体の固定化を可能にするタンパク質に抗体を最初に結合させることによって増強することができる。適切な結合タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミンおよび当業者によく知られている他のタンパク質などの巨大分子を含むが、これらに限定されない。抗体を支持体に結合させるのに用いることができる他の分子は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体などである。ただし、抗体を固定化するのに用いる分子は、抗原に特異的に結合する抗体の能力に悪影響を及ぼさないこと。そのような分子およびこれらの分子を抗原に結合させる方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ  Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２年）、３巻、２〜１３頁、Ｈａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４年）、６巻、５６〜６３頁、ＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８７年）、３０巻、１１７〜１２４頁を参照のこと。
【０１０６】
固体支持体を固相成分と反応させた後、洗浄によってあらゆる非固定化固相成分を支持体から除去し、次いで、支持体結合成分をｄｅＮＡｃＳＡエピトープを含むことが疑われる生物学的サンプルと適切な結合条件下で接触させる。洗浄して非結合リガンドを除去した後、二次バインダー部分を適切な結合条件下で加える。ここで、二次バインダーは、結合リガンドと選択的に結合することができる。次いで、二次バインダーの存否を当技術分野でよく知られている技術を用いて検出することができる。
マイクロタイタープレートのウェルを本開示の抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体で被覆した、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原（例えば、脱Ｎ−アセチル化ガングリオシドなどのｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有する腫瘍抗原）を含む、または含むことが疑われる生物学的サンプルを被覆ウェルに加える。抗体を結合させるのに十分なインキュベーションの期間の後に、プレートを洗浄して非結合部分を除去し、検出できるように標識した二次結合分子を加える。二次結合分子を捕捉抗原と反応させ、プレートを洗浄し、二次結合分子の存否を当技術分野でよく知られている方法を用いて検出する。
所望の場合、生物学的サンプルからの結合ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の存否は、抗体リガンドに対する抗体を含む二次バインダーを用いて容易に検出することができる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼなどの検出可能な酵素標識に当業者に知られている方法を用いて容易に結合させることができる、多くの抗ウシ免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が当技術分野で知られている。適切な酵素基質を用いて検出可能なシグナルを発生させる。他の関連実施形態において、競合型ＥＬＩＳＡ法を当業者に知られている方法を用いて実施することができる。
【０１０７】
抗体とｄｅＮＡｃＳＡ抗原が沈降条件下で複合体を形成するような検定も溶液中で行うことができる。例えば、抗体は、直接化学的または間接的カップリング法などの当技術分野で知られているカップリング技術を用いて固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に結合させることができる。抗体被覆粒子を適切な結合条件下でｄｅＮＡｃＳＡ抗原を含むことが疑われる生物学的サンプルと接触させて、沈降させ、洗浄および／または遠心分離を用いてサンプルから分離することができる粒子−抗体−ｄｅＮＡｃＳＡ抗原複合体の凝集体の形成をもたらす。反応混合物を、上で述べた免疫診断法などの多くの標準的な方法のいずれかを用いて分析して、抗体−抗原複合体の存否を判定することができる。
診断検定に用いる試験サンプルは、血液サンプル（全血、血清などを含む）、組織、全細胞（例えば、完全な細胞）ならびに細胞を含む組織または細胞抽出物（例えば、組織、分離細胞など）、細胞溶解物（すなわち、非完全細胞を含むサンプル）を含むが、これらに限定されない、ｄｅＮＡｃＳＡ抗原が存在する可能性があるサンプルであってよく、各種類のサンプルは両方の種類の要素を含んでいてよい（例えば、細胞のサンプルは細胞溶解物を含んでいてよく、また逆の場合も同様である）。特にがん細胞の検出に関する実施形態のような、いくつかの実施形態において、完全な生細胞を含む、診断を受ける対象からのサンプルを用いて検定を行うことが望ましいと思われる。ｄｅＮＡｃＳＡ抗原の検出は、細胞の細胞外表面で評価することができ、また細胞分裂中にさらに評価することができる。
【０１０８】
診断検定は、ｉｎ  ｓｉｔｕでも行うことができる。例えば、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体を検出可能なように標識し、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープの細胞表面発現によって特徴づけられるがんを有することが疑われる対象に投与し、結合した検出可能標識抗体を当技術分野で利用可能な撮像法を用いて検出する。
本明細書で述べる診断検定は、対象が抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体に基づく療法を用いた療法が多かれ少なかれ適用可能ながんを有するかどうかを判断するため、ならびに対象における治療の経過をモニターするために用いることができる。これはまた、他の併用療法（例えば、（参照により本明細書に組み込まれている、米国出願番号第１１／６４５，２５５号およびＰＣＴ出願番号ＵＳ２００６／０４８８５０）に記載されているようなｄｅＮＡｃＳＡ抗原ワクチンおよび／または抗ｄｅＮＡｃＳＡ抗原抗体療法）の経過を評価するのに用いることができる。したがって、診断検定は、臨床医による療法および治療計画の選択を報知することができる。
方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏである場合、生物学的サンプルは、血液サンプル（全血、血清などを含む）、組織、全細胞（例えば、完全な細胞、すなわち透過化処理に供さなかった細胞）または細胞溶解物（例えば、組織サンプルの処理により得られるような）を含むが、これらに限定されない、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原が存在する可能性があるサンプルであってよい。例えば、検定は、組織学的組織サンプル中の細胞上のＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原の検出を伴うことがあり得る。例えば、組織サンプルは、固定することができ（例えば、ホルマリン処理により）、また支持体（例えば、パラフィンに）に包埋して、または凍結非固定組織として提供することができる。
【０１０９】
ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原は、抗体、通常、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２の抗原結合特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異的結合の検出によって検出できる。この実施形態において、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原は、細胞分裂中を含む、細胞周期のあらゆる段階において細胞表面上に存在する可能性がある。注目すべきことは、場合によって、細胞分裂中にＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を提示するがんが、細胞が休止している（すなわち、細胞分裂を受けない）ときに、より低いまたは検出できないレベルのＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を示す可能性があることである。しかし、下の実施例で例示するように、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原は、透過化試験細胞におけるＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を検出することによって、非分裂細胞において検出することができる。正常細胞における抗体染色のパターンと異なる、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２抗体（またはＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２の抗原結合特異性を有する抗体）による染色のパターンを示す試験がん細胞は、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原を示すがん細胞として特定される。したがって、そのようながんは、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２反応性抗原に特異的に結合する抗体（例えば、ｍＡｂＳＥＡＭ３および／またはｍＡｂＤＡ２）による療法が適用可能である。
米国出願番号第１１／６４５，２５５号およびＰＣＴ出願番号ＵＳ２００６／０４８８５０）に記載されている方法によりｄｅＮＡｃＳＡ抗原を用いた免疫処置により産生させた抗体を含む上述の検定試薬は、上述のような免疫検定を実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬とともにキットで提供することができる。キットはまた、用いる個々の免疫検定によって、適切なラベルおよび他の包装済み試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。上述のものなどの標準的免疫検定は、これらのキットを用いて実施することができる。
【０１１０】
キットおよびシステム
上述のように、方法を実施するのに用いることができるキットおよびシステムも提供する。例えば、方法を実施するためのキットおよびシステムは、抗体および／またはオリゴシアル酸誘導体を含む１つまたは複数の医薬製剤を含んでいてよい。したがって、特定の実施形態において、キットは、１つまたは複数の単位用量として存在する単一医薬組成物を含んでいてよい。さらに他の実施形態において、キットは、２つまたはそれ以上の別個の医薬組成物を含んでいてよい。
このように、キットは、キットの意図する用途によって、オリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体などの、本明細書で述べる組成物、検定またはスクリーニング用の関連する適切な細胞、抗ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ抗体などのうちの１つまたは複数のものを含み得る。キットの他の任意選択の成分としては、オリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体を投与するための、および／または診断検定を実施するための緩衝液などが挙げられる。キットの様々な成分が別個の容器中に存在していてよく、あるいは、所望の通りに特定の適合性のある成分が１つの容器中にあらかじめ混合されていてよい。
【０１１１】
キットは、上の成分に加えて、方法を実施するための指示書をさらに含んでいてよい。これらの指示書は、様々な形でキットに存在してよく、そのうちの１つまたは複数のものがキット中またはキット上に存在していてよい。これらの指示書が存在し得る１つの形態は、適切な媒体または基材、例えば、キットの包装中または包装上の添付文書等における、情報が印刷されている紙片上の印刷情報としてである。さらに他の手段は、情報が記録されたコンピュータで読取り可能な媒体、例えば、ディスケット、ＣＤ等であろう。存在し得るさらに他の手段は、除去されたサイト（ｒｅｍｏｖｅｄ  ｓｉｔｅ）の情報にアクセスするためにインターネットを介して用いることができるウェブサイトアドレスである。都合のよい手段がキットに存在していてよい。
特定の実施形態において、キットは、細胞増殖性疾患状態に罹患している宿主を治療するのに用いるために提供する。このキットは、オリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体を含む医薬組成物、ならびに対象におけるがん細胞の成長を阻害することにより、あるいは、例えば、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有するがん細胞に結合する抗体を誘発するために抗ｄｅＮＡｃＳＡ免疫応答をもたらすことにより、がん状態に苦しんでいる宿主を治療する方法における医薬組成物の効果的な使用に関する指示書を含む。そのような指示書は、適切な取扱特性、投与計画および投与方法などだけでなく、対象を脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープについて場合によってスクリーニングするための指示書をさらに含んでいてよい。この態様は、キットの施術者が、がんの種類および成長段階に対する治療のタイミングおよび期間を含む、オリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体による治療に対する対象の潜在的反応性を評価する助けとなり得る。したがって、他の実施形態において、キットは、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２などの、がん細胞の細胞外でアクセスできる表面上の脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを検出するための抗体または他の試薬をさらに含んでいてよい。他の実施形態において、キットは、発蛍光団などの検出可能な標識との結合体を含む１つまたは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む。
【０１１２】
他の特定の実施形態において、ｄｅＮＡｃＳＡエピトープ、例えば、細菌の多糖莢膜上のｄｅＮＡｃＳＡエピトープを有する細菌（例えば、ナイセリア属菌（例えば、髄膜炎菌、特にグループＢおよびＣ髄膜炎菌）、大腸菌Ｋ１）による感染の疾患または疾患の症状のリスクのあるまたは有する宿主の免疫処置用のキットを提供する。このキットは、オリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体を含む医薬組成物、ならびに細菌感染を有するまたはリスクのある宿主の免疫処置または治療における効果的使用に関する指示書を含む。そのような指示書は、適切な取扱特性、投与計画および投与方法などだけでなく、対象を脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープについて場合によってスクリーニングするための指示書をさらに含んでいてよい。この態様は、キットの施術者が、オリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体による免疫処置に対する対象の潜在的反応性を評価する助けとなり得る。したがって、他の実施形態において、キットは、ＳＥＡＭ３および／またはＤＡ２などの、がん細胞の細胞外でアクセスできる表面上の脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを検出するための抗体または他の試薬をさらに含んでいてよい。
本明細書で用いている「システム」という用語は、方法を実施する目的のためにまとめられている単一または異なる組成物中に存在するオリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体ならびに１つまたは複数の第２の治療薬の集合を意味する。例えば、まとめられ、対象に併用投与される別個に得られたオリゴシアル酸誘導体および／またはそれに対して特異的な抗体ならびに化学療法剤形は、本開示によるシステムである。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきではない。
本明細書に記載する実施例および実施形態は、例示目的のためのものにすぎず、それに照らしての様々な修正または変更は、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付する特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、これによって、すべての目的のためにそれらの全体として参照により組み込まれている。
【０１１４】
（実施例１）
α（２→８）Ｎ−アセチルノイラミン酸オリゴ糖（ＯＳ）の調製
大腸菌Ｋ１菌の莢膜から分離されたＰＳＡであるコロミン酸（１００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｉｓ、ＭＯ）を５ｍｌの２０ｍＭ  ＨＣｌに溶解し、５０℃で２時間加熱した。室温に冷却した後、２Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを８〜９に上昇させた。溶液を水中で透析し（１ｋＤａカットオフチューブ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから入手したＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ）、凍結乾燥した。
【０１１５】
（実施例２）
オリゴ糖の水素化ホウ素ナトリウム処理
実施例１からの凍結乾燥ＯＳ（１００ｍｇ）を５ｍｌの水中で１０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と合わせ、室温で一夜放置した。数時間にわたって、溶液のｐＨは約８．５から約１０に上昇する。実施例１で上述したように、反応混合物を水中で透析し、凍結乾燥した。得られたＯＳ抗原は、約３３％のノイラミン酸残基を含み、約２〜２０の重合度を有する鎖の混合物を含むと判断された。
【０１１６】
（実施例３）
水素化ホウ素ナトリウム処理オリゴ糖の分析
実施例２の水素化ホウ素ナトリウム処理ＯＳを、５ｍｌのＨｉＴｒａｐＱ  ＦＦ（商標）陰イオン交換カラムを取り付けたＡｋｔａ（商標）ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上のイオン交換クロマトグラフィーにより分離した。２０ｍｇのＯＳを０．５ｍｌの２０ｍＭビス−トリス緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ８に溶解し、カラムに注入した。２０ｍＭビス−トリス緩衝液中０Ｍ〜０．５Ｍ勾配の硫酸ナトリウムを用いてＯＳをカラムから溶出させた。各１ｍｌ画分中のシアル酸および脱Ｎ−アセチルシアル酸の量を下の実施例６で述べるレゾルシノール定量法により測定した。また、Ｎ−プロピオニルＮｍＢ多糖ドデシルアミンに対するＳＥＡＭ３の結合を阻害する各画分の能力を下の実施例５で述べるように阻害ＥＬＩＳＡにより測定した。
結果を図１に示すグラフに要約する。カラムにより保持された本質的にすべてのＯＳがシアル酸および脱Ｎ−アセチルシアル酸を含んでいた。比は、低い塩濃度で溶出する短いオリゴ糖については約３：１であり、より高い塩濃度で溶出するより長い多糖については１０：１またはそれ以上であった。また、シアル酸と脱Ｎ−アセチルシアル酸の混合物を含むすべての画分がＳＥＡＭ３結合を阻害した。
【０１１７】
水中で透析し、凍結乾燥した後、各画分は１ｍｇまたはそれ以下のＯＳを含んでいた。選択した画分を過剰量のエキソノイラミニダーゼＳＩＡＬＩＤＡＳＥＡ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）で処理したところ、ＯＳの量は減少せず、ＳＥＡＭ３結合を阻害するＯＳの能力も影響を受けなかった。エキソノイラミニダーゼは脱Ｎ−アセチル残基を有する非還元端で終わるＰＳＡ（すなわち、ノイラミン酸）を分解することができないので、結果から、水素化ホウ素ナトリウム処理に起因する脱Ｎ−アセチル化は完全でないにしても、少なくとも一部はＯＳの非還元端で起こっていることが示唆される。
水素化ホウ素とＯＳとの反応によって生成した水素化ホウ素、ボランまたはホウ酸塩がホウ素−ＯＳ複合体の形成をもたらす可能性もある。しかし、ＳＥＡＭ３結合の良好な阻害剤であるＯＳ誘導体のいくつかのサンプルをアゾメチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）比色分析（Ｚｅｎｋｉら、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ’  Ｊ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９８９年、３３４巻、２３８頁）および誘導結合プラズマ質量分析（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮにより実施された）によりホウ素の存在について試験した。１％未満のモル分率に相当する量を検出することができた。
ＯＳ画分をパルスアンペロメトリー検出による高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＣ−ＰＡＤ）によりさらに分析して、各画分中のＯＳの長さを測定した。選択した画分の結果を図２に示す。ＳＥＡＭ３結合を依然として阻害することができた最短のＯＳを有する画分は、２〜６、主として４〜６の重合度（Ｄｐ）の混合物を含んでいた画分２９であった（図２）。
【０１１８】
（実施例４）
Ｎ−プロピオニルＮｍＢＰＳのドデシルアミン誘導体の調製
Ｇｒａｎｏｆｆら（Ｇｒａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８年、１６０巻、５０２８頁）により記載された通り調製された過ヨウ素酸塩で酸化した２０ｍｇのＮ−プロピオニルＮｍＢ多糖（Ｎ−ＰｒＮｍＢＰＳ）を水（５ｍｌ）中で５μｌのドデシルアミン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）と混合した。２Ｍ  ＨＣｌでｐＨを８に調整し、混合物を３時間攪拌した。水素化シアノホウ素ナトリウム（５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、混合物を室温で２４時間攪拌し、次いで、水中で３〜５日間透析して、過剰のドデシルアミンを除去した。ドデシルアミン抗原（ＰＢＳ緩衝液中約１ｍｇ／ｍｌ）を４℃で保存した。
【０１１９】
（実施例５）
ＳＥＡＭ３阻害剤アッセイ
上の実施例４のドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢ誘導体をＰＢＳ緩衝液で１：２００に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩＨＢ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）のウェル当たり１００μｌを加えて、ＳＥＡＭ３結合の阻害剤の試験用のＥＬＩＳＡプレートを調製した。プレートを検定に用いる前に４℃で一夜保存した。プレートをＰＢＳ緩衝液（５×）で洗浄し、１％（重量／容積）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ブロッキング緩衝液）を用いて室温で１時間ブロックした。阻害剤をプレート上でブロッキング緩衝液で希釈し、次いで、ＳＥＡＭ３をブロッキング緩衝液に加えた（ウェル当たり合計１００μｌ）。プレートを４℃で一夜インキュベートした後、プレートをＰＢＳ緩衝液（５×）で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈したウサギ抗マウス−アルカリホスファターゼ結合抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を加えた。さらに１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄し（５×）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９中ｐ−ニトロフェニルリン酸基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって、結合抗体を検出した。室温で６０分間のインキュベーションの後の４０５ｎｍでの吸光度をＢｉｏＲａｄモデル５５０マイクロタイタープレート・リーダー（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて測定した。
【０１２０】
（実施例６）
ＰＳＡ中のシアル酸およびノイラミン酸の定量
ＰＳＡ誘導体保存溶液またはカラム画分中のシアル酸および脱Ｎ−アセチルシアル酸の濃度を以下のように修正したＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍレゾルシノール反応（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  Ｌ．（１９５７年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２４巻、６０４頁）により測定した。レゾルシノール作業試薬は、９．７５ｍｌの水、０．２５ｍｌの０．１ＭＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌレゾルシノール水溶液および８０ｍｌの濃ＨＣｌを混合して調製した。レゾルシノール作業試薬（３００μｌ）をポリプロピレン製の深ウェル（２ｍｌ）マイクロタイタープレート中でシアル酸もしくは脱Ｎ−アセチルシアル酸サンプル水溶液（５０μｇまでのシアル酸）または標準保存水溶液（３００μｌ）と合わせた。プレートをプレートカバーで密封し、沸騰水浴中で３０分間加熱した。室温に冷却した後、イソアミルアルコール（６００μｌ）を加え、ピペットで混合した。相を分離し、上のイソアミルアルコール層を除去して清浄なマイクロタイタープレートに移した。２５０μｌのイソアミルアルコール抽出液および下の水溶液を別個にポリスチレン製のマイクロタイタープレートに移し、４９５ｎｍおよび５８０ｎｍでの吸光度を測定した。
それぞれの標準曲線と比較してＮ−アセチルシアル酸の量を５８０ｎｍでのイソアミルアルコール画分の吸光度から求め、脱Ｎ−アセチルシアル酸の量を４９５ｎｍでの水性画分の吸光度から求めた。シアル酸標準中で起こる脱Ｎ−アセチル化の量を測定することにより、検定の酸加水分解段階中に起こる脱Ｎ−アセチル化の量について脱Ｎ−アセチルシアル酸の量を補正した。
【０１２１】
（実施例７）
ＳＥＡＭ３との反応性のためのオリゴ糖の最小長の決定
抗体を誘発することを意図し、ＳＥＡＭ３と同様な特異性を有するワクチンを調製するために、ＳＥＡＭ３と反応性である最小のα（２→８）ノイラミン酸ＯＳ長を決定することが必要である。より長いＰＳＡは、他のヒトＰＳＡ抗原と反応性である抗体を誘発する能力を有する。ＳＥＡＭ３によって認識される最小長のＯＳを決定するために、Ｎ−アセチルノイラミン酸モノマー、α（２→８）結合二量体、三量体および四量体（各１０ｍｇ、ＥＹ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）を１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムと水中で上述のように合わせた。透析および凍結乾燥の後に、各オリゴマーを、Ｎ−ＰｒＮｍＢＰＳ−ドデシルアミンに対するＳＥＡＭ３の結合を阻害する能力についてＥＬＩＳＡにより試験した。結果を表１に要約する。無処理対照ＯＳ（すなわち、水素化ホウ素ナトリウムで処理しなかったＯＳ）のいずれもＳＥＡＭ３結合を阻害することはできなかった。表１に示すように、四量体と同様に短い水素化ホウ素処理オリゴ糖がはるかに長い名目多糖抗原Ｎ−ＰｒＮｍＢＰＳの活性のすべてを示している。
【０１２２】
【表１】
2015057391.tif 000002
【０１２３】
（実施例８）
ＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンの調製
上述のように調製した水素化ホウ素ナトリウム処理ＯＳ（２０ｍｇ）を過ヨウ素酸ナトリウム（６μモルまたは１０残基ごとに１当量）で２ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５中で１時間酸化した。エチレングリコール（１００μｌの１０％（容積／容積）水溶液）を加えて残りの過ヨウ素酸塩を破壊し、溶液を水中で透析した。ＯＳ（１０ｍｇ）を５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中で５ｍｇの破傷風トキソイド（Ｂｉｏ  Ｖｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）と合わせた。溶液を褐色ガラス製Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中で室温で一夜攪拌した。翌日、５ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、混合物の攪拌を２日間続けた。反応混合物をＰＢＳ緩衝液中で透析した（１０から１４ｋＤａカットオフ膜）。ワクチン製剤を滅菌ろ過（０．２２μ）し、分割し、使用時まで−８０℃で保存した。ワクチン溶液は、レゾルシノール検定により測定された２．４ｍｇ／ｍｌシアル酸および１．２ｍｇ／ｍｌ脱Ｎ−アセチルシアル酸ならびにＢＣＡ検定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定された１．５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含んでいた。ＯＳ抗原が破傷風トキソイドに共有結合していたことを示すために、ワクチンの一部を４％〜１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ウェスタンブロットによりＳＥＡＭ３との反応性について試験した。結合ＳＥＡＭ３は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ）に結合させたウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体およびＷｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ（登録商標）化学発光試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて検出した。図３に示すように、ＳＥＡＭ３は、ゲルの上部に流動した高分子量破傷風トキソイド誘導体に結合している。破傷風トキソイド誘導体は、本明細書では「ＯＳ−破傷風トキソイド」結合体と呼ぶ。
【０１２４】
（実施例９）
ＣＤ１マウスにおける免疫原性の評価
上で調製したＯＳ−破傷風トキソイド結合体を用いてＣＤ１マウスにおける免疫原性を次のように評価した。１０匹の雌ＣＤ１マウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の群を、５０％０．９％食塩液／５０％フロイント完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）乳剤中２μｇまたは１０μｇの総（すなわち、Ｎ−アセチルおよび脱Ｎ−アセチル）シアル酸ＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンでｉｐ注射により免疫処置した。初回投与の１０日後に下顎下静脈のランセットにより血液サンプルを採取し、ＯＳ−破傷風トキソイド結合体について上で述べたように調製したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させたＯＳ（「ＤｅＮＡｃ−ＢＳＡ」と呼ぶ）を用いてＥＬＩＳＡにより試験した。初回投与の４週間後に不完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２回目の投与を行った。２回目の投与の１０日後に、試験のために血液サンプルをマウスから採取した。
図４に、実施例１４で述べたようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に結合させたＯＳを用いてＥＬＩＳＡにより測定した各群の平均力価を示す。２μｇおよび１０μｇ用量に対する免疫応答は同様であり、一次投与量と追加投与量の間に約１００倍増大した。結果から、ワクチンは高度に免疫原性であり、抗原特異的抗体反応を誘発することがわかる。
【０１２５】
（実施例１０）
髄膜炎菌グループＢ菌を用いた２回目投与後の抗血清の機能的活性の評価
ＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンによる免疫処置により誘発された抗体がＮｍＢ菌上のヒト補体成分の沈着を活性化する能力をＷｅｌｓｃｈら（Ｗｅｌｓｃｈら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ、２００３年、１８８巻、１７３０頁）により記載されたように測定した。簡単に説明すると、ＮｍＢ菌株ＮＭＢを０．３％グルコースを含むＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地中で０．６のＯＤ６２０ｎｍまで増殖させた。細胞をペレットとし、１％（重量／容積）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むダルベッコＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）（Ｄ−ＢＳＡ）で洗浄し、最初の増殖培地の半分の容積のＤ−ＢＳＡに再懸濁した。細菌（３０μｌ）を、２μｇまたは１０μｇで免疫処置したマウスのプールした抗血清と合わせ、Ｄ−ＢＳＡで１：２０または１：２００に希釈した。ＮＭＢに対する抗体の非存在について試験したドナーからのヒト補体を２００μｌの総容積中５％（容積／容積）の濃度まで加えた。時折攪拌しながら室温で３０分間反応を継続させた。細胞をペレットとし、２００μｌのＤ−ＢＳＡで洗浄し、ＦＩＴＣ−結合ヒツジ抗ヒトＣ３ｃ抗体（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）をＤ−ＢＳＡに加えた。時折攪拌しながら氷上で３０分間インキュベートした後、細胞をペレットとし、０．５％（重量／容積）のホルムアルデヒドを含む滅菌ろ過済みＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により分析した。結果を図５に示す。
【０１２６】
細胞表面上の補体成分の沈着は、細胞の蛍光を増加させ、蛍光ピークのグラフの右方への移動によって示される。抗体の活性化は、活性補体のみを含む細胞または熱不活性化補体を含む抗血清の蛍光の欠如によって示される。フローサイトメトリーからの細菌をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）蛍光顕微鏡を用いた鏡検によりさらに分析した。図６に、ＦＩＴＣ−結合ヒツジ抗ヒトＣ３ｃ抗体で染色したＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンの１０μの追加投与により免疫処置したＣＤ１マウスからの１：２００に希釈した補体およびプール抗血清とともにインキュベートした後の細菌細胞の顕微鏡写真（２００×）を示す。この細胞のクラスターにおいて、多数の高度に蛍光性の双球菌が認められる。高レベルの蛍光は、細胞の表面に結合した溶菌およびオプソニン食作用を媒介する補体因子の存在を示すものである。これに対して、陰性対照（活性補体のみを含む細胞または熱不活性化補体を含む抗血清）では蛍光性細胞は認められなかった。ＮｍＢ細菌の細胞表面上の補体因子沈着の活性化は、ＮｍＢによって引き起こされる疾患からの防護と相関する（Ｗｅｌｓｃｈら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ、２００３年、１８８巻、１７３０頁）。
ワクチンにより誘発される抗体がＮｍＢによって引き起こされる疾患を防御する能力を評価することへの別のアプローチは、抗血清がヒト血液中でｅｘ  ｖｉｖｏでＮｍＢを溶解またはその成長を阻害するかどうかを判断することである。この実験において、抗血清（１０μｇのＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンで免疫処置したＣＤ１マウスからのプールした抗血清）および試験細菌（上述のようにＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地中で新たに増殖させた約１０００ＣＦＵのＮｍＢ菌株ＮＺ９８／２５４）を、滅菌ガラスバイアルに入れた試験菌株に対する抗体を欠くドナーから新たに得られた血液中で合わせた。血液は、トロンビン阻害剤ヒルジン（５０ｍｇ／ｍｌ、採取血液１ｍｌ当たり１μｌ、Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標）、Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ、ＮＪ）を注射針に入れてドナーから採取した。混合物の分割試料および希釈分割試料をチョコレート寒天プレート（Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）上で平板培養して、実験開始時と１時間および２時間目にＣＦＵ／ｍｌを測定する。髄膜炎菌血症のｅｘ  ｖｉｖｏヒト血液モデル中の抗血清の試験結果を図７にグラフとして示す。
【０１２７】
抗体が非存在であるか、または５０μｇ／ｍｌの陰性対照ｍＡｂ抗ポーリンＰ１．２が存在する場合、約１５００ＣＦＵの最初の接種が１時間目に約７０００ＣＦＵに、２時間後に約６００００ＣＦＵに増加する。しかし、２μｇ／ｍｌの陽性対照ｍＡｂ抗ポーリンＰ１．２が存在する場合、すべての細菌が殺滅される。同様に、試験ワクチン抗血清の１：２５および１：２００希釈物は、１０倍の対照と比較して生菌数の減少をもたらす。時間０および１時間目のＣＦＵ／ｍｌ値は陰性対照反応とほぼ同じであるが、２時間後には細菌の増殖は認められなかった（約７０００ＣＦＵ／ｍｌ）。結果から、抗体はヒト血液中の細菌の生存能を低下させるヒト血液に存在する防護メカニズム（補体媒介性溶菌および／またはオプソニン食作用）を活性化することがわかる。したがって、本明細書で述べたワクチンによって誘発される抗体は、ＮｍＢによって引き起こされる疾患を防御する能力を有する。
【０１２８】
（実施例１１）
ジャーカットＴ細胞白血病細胞株により発現されるＰＳＡ誘導体に対するワクチン誘発抗体の結合
ＳＥＡＭ３は、ジャーカットＴ細胞白血病細胞株により発現されるノイラミン酸を含むＰＳＡ抗原に結合する（参照により本明細書に組み込まれている、米国出願番号第１１／６４５，２５５号およびＰＣＴ出願番号第ＵＳ２００６／０４８８５０号）。ＯＳ−結合体ワクチンによって誘発される抗体の結合を測定するために、ジャーカット細胞を１０００×ｇで５分間遠心分離し、氷冷１％（容積／容積）ホルムアルデヒドで固定した。２０分後に、細胞を遠心分離（上のように）によりペレットとし、３％（容積／容積）ヤギ血清のブロッキング溶液中で１時間インキュベートした。ブロッキング後、２μｇの総シアル酸ＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンの２回の投与により免疫処置したＣＤ１マウスからのプールした血清を加え、４℃で一夜インキュベートした。細胞をペレット化により２回洗浄し、氷冷ＰＢＳに再懸濁した。二次抗体（ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ）２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を細胞とともに暗所で４℃で少なくとも１時間インキュベートした。さらに一連の遠心分離および洗浄（３回）の後にＧｕａｖａ  ＥａｓｔＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）により結合を分析した。対照サンプルは、ベースライン蛍光を発生させるのに用いたアイソタイプ適合（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｍａｔｃｈｅｄ）無関連抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で処理した。ジャーカット細胞結合実験の結果を図８に示す。
【０１２９】
抗体の細胞への結合は、より高い蛍光へのシフト（ヒストグラムの右方への移動）によって示される。５％未満の細胞が、陰性対照の無関連アイソタイプ適合ＩｇＧ２ｂｍＡｂとの結合について陽性である。陽性対照ｍＡｂであるＳＥＭ３の結合はより高い蛍光へのわずかなシフトをもたらし（平均蛍光２１０ＡＵ）、１２％の細胞が結合について陽性である。抗原は主として細胞分裂中に細胞の表面上に発現するので、一部分の細胞のみが陽性である。これに対して、１：２０に希釈したＯＳ−破傷風トキソイド結合体の２μｇの投与による追加投与後にプールした抗血清からの抗体の結合は、蛍光のより大きい増加（４５０ＡＵ）をもたらし、３５％の細胞が陽性である。したがって、ＯＳ−破傷風トキソイド結合体ワクチンは、ジャーカットＴ細胞白血病細胞により発現されるノイラミン酸含有抗原と反応性である。
【０１３０】
（実施例１２）
ＤｅＮＡｃ、ＮＰｒＳｉａおよびＴｃＡｃワクチン抗原の調製
脱Ｎ−アセチルポリα（２→８）ノイラミン酸（ＤｅＮＡｃ）ＰＳＡ。コロミン酸（１００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ）を水（８．８ｍｌ）に懸濁した。ＮａＯＨ（１．８ｍｌの５０％溶液；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を２Ｍの最終ＮａＯＨ濃度まで加え、溶液を９０℃〜１００℃に２時間加熱した。溶液を室温に冷却した後、２Ｍ  ＨＣｌを加えてｐＨを８に調整した。遠心分離により沈殿を除去し、上清溶液を４Ｌの水中で２回透析し（１ｋＤａ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ＊７透析膜；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、凍結乾燥した。得られたＤｅＮＡｃ抗原は、約９８％のノイラミン酸残基（すなわち、脱Ｎ−アセチルノイラミン酸または「Ｎｅｕ」）を含むことが確認され、約２〜２０の重合度を有する鎖の混合物を含んでいる。
Ｎ−トリクロロアセチル（ＴｃＡｃ）ＰＳＡ。ＤｅＮＡｃＰＳＡ（５０ｍｇ）を水（５ｍｌ）に懸濁し、２Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを８〜９に調整した。塩化トリクロロアセチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．１ｍｌずつを５回に分けて１時間にわたり攪拌溶液に加えた。２Ｍ  ＮａＯＨを加えてｐＨを８と９の間に維持した。反応混合物を上述のように水中で透析し、凍結乾燥した。得られたＴｃＡｃ抗原は、約６３％のノイラミン酸残基を含むことが確認され、約２〜２０の重合度を有する鎖の混合物を含んでいる。
【０１３１】
Ｎ−プロピオニル（ＮＰｒ）ＰＳＡおよびシアル酸処理Ｎ−プロピオニル（ＮＰｒＳｉａ）ＰＳＡ。ＮＰｒＰＳＡは、無水プロピオン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を酸塩化物の代わりに用いたことを除いて、ＴｃＡｃＰＳＡについて述べたように調製した。得られたＮＰｒ抗原は、約２１％のノイラミン酸残基を含むことが確認され、約３０の重合度を有する鎖の混合物を含んでいる。
エキソノイラミニダーゼは、非還元端にノイラミン酸を含むＰＳＡを分解することができないか、またははるかに緩やかに分解する（Ｔ．ＢｈａｎｄａｒｉおよびＧ．Ｍｏｅ、未公表）。したがって、ノイラミン酸における非還元端で終わる分子の割合を増加させるために、ＮＰｒＰＳＡの一部（２０ｍｇ）をエキソノイラミニダーゼＳＩＡＬＩＤＡＳＥ  Ａ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）でさらに処理した。多糖を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７に溶解したＳＩＡＬＩＤＡＳＥ  Ａ（１０μｌの１Ｕ／ｍｌ保存液、Ｐｒｏｚｙｍｅ）とともに３７℃で２日間インキュベートした。反応混合物を上述のように水中で透析し、凍結乾燥した。得られたＮＰｒＳｉａ抗原は、約７％のノイラミン酸残基を含むことが確認され、約２〜２０の重合度を有する鎖の混合物を含んでいる。
【０１３２】
（実施例１３）
破傷風トキソイド結合体（ＰＳ−ＴＴ）ワクチンの調製
ＤｅＮＡｃ、ＮＰｒ、ＮＰｒＳｉａおよびＴｃＡｃ抗原を、実施例８におけるように過ヨウ素酸塩で酸化し、破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させた。ＰＳ−ＴＴワクチン製剤（ＤｅＮＡｃ−ＴＴ、ＮＰｒ−ＴＴ、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＴｃＡｃ−ＴＴおよびＯＳ−ＴＴ）を滅菌ろ過（０．２２μ）し、分割し、使用時まで−８０℃で保存した。ワクチン溶液の組成を表２に要約する。ＮｅｕＮＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）およびＮｅｕ（脱Ｎ−アセチルノイラミン酸）を実施例６で述べたようにレゾルシノール検定により定量した。タンパク質濃度をＢＣＡ検定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定した。
抗原がＴＴに共有結合していたことを実証するため、また結合体ワクチンの非自己反応性ｍＡｂであるＳＥＡＭ２および３ならびに自己反応性ｍＡｂであるＳＥＡＭ１８との反応性（Ｇｒａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８年、１６０巻、５０２８頁）を比較するために、ワクチンの一部を４％〜１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ウェスタンブロットによりｍＡｂとの反応性について試験した。結合ｍＡｂは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）およびＷｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ（登録商標）化学発光試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて検出した。図９に示すように、ＳＥＡＭ２は、ＴｃＡｃ−ＴＴおよびＮＰｒ−ＴＴ結合体ワクチン（ゲルの上部に流動した高分子量誘導体）に結合し、ＳＥＡＭ３は、ＮＰｒ−ＴＴおよびＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ならびにＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンに結合し、ＳＥＡＭ１８は、ＮＰｒ−ＴＴ結合体ワクチンに結合する。ｍＡｂのいずれもＤｅＮＡｃ−ＴＴ結合体ワクチンに結合しなかった。
【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
（実施例１４）
ＣＤ１マウスにおけるＰＳ−ＴＴワクチンの免疫原性の評価
実施例１３で調製したＰＳ−ＴＴ結合体の免疫原性をＣＤ１マウスにおいて次のように評価した。１０匹の雌ＣＤ１マウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の群を、５０％０．９％食塩液／５０％フロイント完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）乳剤中２μｇまたは１０μｇの総（すなわち、Ｎ−アシルおよび脱Ｎ−アセチル）シアル酸−ＴＴ結合体ワクチンでｉｐ注射により免疫処置した。各回投与の１０日後に下顎下静脈のランセットにより血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡにより試験した。
２８日後に不完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて追加投与を行い、免疫処置の１０日後に得た抗血清の力価を評価した。一次免疫後５６日後に、各群を半分に分割した。各群の５匹のマウスに非複合体化ＰＳを、他の５匹には複合体化ＰＳを投与し、両方についてアジュバントは用いなかった。非複合体化ＰＳを投与したマウスの免疫応答が非常に弱かったので、一次免疫処置の１１２日後にアジュバントを含まない結合体の３回目の投与を行った。この第４の投与による抗血清を一貫して３−ＰＳと呼ぶ。ここで、３は３回目の免疫処置を示す。
【０１３５】
図１０にＥＬＩＳＡにより測定した各群の平均力価を示す。ＰＳ−ＴＴワクチンにより誘発された抗体の力価は、ＰＳ−破傷風トキソイド結合体（実施例８）について上で述べたのと同様に調製したＢＳＡに結合させたＰＳ（ＰＳ−ＢＳＡ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。最初に、各マウスからの抗血清を個別に試験したが、力価は当該群のすべてのマウスで同様であったので、各群の個々のマウスの抗血清をプールし、後続のすべての実験をプールした抗血清を用いて行った。ＥＬＩＳＡプレートは、各ＰＳ−ＢＳＡ結合体をＰＢＳで１：２００に希釈し、ウェル当たり１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩＨＢ）に加えて調製した。プレートは、使用前に４℃で一夜保存した。プレートをＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、１％（重量／容積）のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液（ブロッキング緩衝液）で室温で１時間ブロックした。抗血清を１：１００の希釈度でブロッキング緩衝液に加え、その後、連続３倍希釈を行った。４℃で一夜インキュベートした後、プレートをＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、ブロッキング緩衝液で１：３０００に希釈したウサギ抗マウス−アルカリホスファターゼ結合抗体（Ｚｙｍｅｄ）を加えた。さらに１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ緩衝液で洗浄し（５×）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９中１ｍｇ／ｍｌリン酸ｐ−ニトロフェニル基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることにより、結合抗体を検出した。室温で１時間インキュベートした後の４０５ｎｍでの吸光度をＢｉｏＲａｄモデル５５０マイクロタイタープレート・リーダーを用いて測定した。抗血清を均一抗原ＰＳ−ＢＳＡ結合体およびＤｅＮＡｃ−ＢＳＡに対して試験した。
【０１３６】
図１０（上のパネル）にＥＬＩＳＡにより測定した、各免疫処置後の均一抗原およびＤｅＮＡｃＰＳＡに対するプール抗血清の各群ごとの力価を示す。均一抗原に対する力価は、広く変化した。すべてのワクチンについて、１０μｇ用量により誘発された力価が２μｇ用量により誘発された力価より高かったが、２回目の投与後には増加しなかった。均一抗原に対する相対的力価は、両用量について、および一次免疫処置後のすべてにおいて一貫していた。均一抗原の免疫原性の減少する順序は、ＮＰｒＳｉａ＞ＤｅＮＡｃ＞ＯＳ＞ＴｃＡｃ、ＮＰｒであった。ＴｃＡｃ−ＴＴおよびＮＰｒ−ＴＴワクチンは、均一抗原に対する非常に低い力価を誘発し、これは追加投与後に増加しなかった（図１０）。
ＤｅＮＡｃ−ＢＳＡ抗原に対する各用量ごとのプールした抗血清の反応性もＥＬＩＳＡにより評価した。ＰＳ−ＴＴワクチンのすべてがＮｅｕ残基のいくらかの画分を含んでおり（表２）、５つのワクチンのすべてが、２回目の免疫処置後には増加しなかった（図１０）、ＤｅＮＡｃ−ＢＳＡに対する＞１００００を超える力価を誘発した（図１０、下のパネル）。各ＰＳ−ＴＴワクチンおよび各用量におけるＮｅｕの量は広い範囲にわたって変化した（約０．３μｇ／投与〜約１０μｇ／投与）が、両用量のすべてのワクチンがほぼ同じ大きさの抗ＤｅＮＡｃ力価を誘発した。ＥＬＩＳＡによればどの抗血清も非修飾ＰＳＡに対して反応性でなかった（力価＜１：５０）。結果から、すべての抗原のＮｅｕ成分が免疫原性であり、ＰＳ−ＴＴワクチンの免疫優性決定基であることが示唆される。
【０１３７】
（実施例１５）
髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）菌に対するＰＳ−ＴＴ抗血清の結合の評価
ＰＳ−ＴＴワクチンがＮｍＢに結合する抗体を誘発する能力をフローサイトメトリーにより試験した。ＮｍＢ菌株ＮＭＢを０．３％グルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地中で０．６のＯ．Ｄ．６２０まで増殖させた。細胞をペレットとし、洗浄し、ブロッキング緩衝液に最初の体積の８０％で再懸濁した。最終濃度が５０％再懸濁細菌、１０％抗血清および４０％ブロッキング緩衝液となるように、再懸濁した細菌を反応混合物に加えた。規則的に緩やかに攪拌しながら、混合物を４℃で２時間インキュベートした。細胞をペレットとし、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウス二次抗体のブロッキング緩衝液中１：３００希釈物１００μｌに再懸濁した。ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２およびＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）に対するＦＩＴＣ結合抗体を用いた。二次抗体を加えた後、規則的に緩やかに攪拌しながらチューブを４℃で１時間インキュベートした。細胞をペレットとし、新たに調製し、ろ過した０．５％ホルムアルデヒド（重量／容積）を含む４５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。サンプルを直ちにフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により分析した。図１１Ａに示すように、ＯＳ−ＴＴの２μｇ用量を除くすべてのＰＳ−ＴＴワクチンが３回目の投与後に菌株ＮＭＢに結合したＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を誘発した。結合は場合によって比較的不十分であるように思われたが、「模範」ｍＡｂであるＳＥＡＭ２および３も、細菌に非常に強く結合する自己反応性ｍＡｂであるＳＥＡＭ１２と比較して不十分である（図１１Ａ）。それにもかかわらず保護をもたらす２つのｍＡｂ（ＳＥＡＭ２および３）の見掛け上複雑な結合特性は、ｍＡｂによって認識される抗原の独特な特性と関連性がある。ＳＥＡＭ２および３は、非莢膜性である抗原を明らかに認識し、細菌の表面全体に高度に発現することも、均一に発現することもない。担体破傷風トキソイドタンパク質単独による免疫処置によっても、多反応性ＩｇＭ抗体が誘発されたが、ＮＭＢに結合することができるＩｇＧ抗体は誘発されなかった（図１１Ａ）。一般的に、１０μｇ用量のＰＳ−ＴＴ抗血清は、２μｇ用量の抗血清より細菌に強く結合した。例外はＮＰｒＳｉａ−ＴＴであり、パターンが逆であった。ＩｇＧ結合は１０μｇ用量の抗血清のほうが２μｇよりいくぶん強く、差はＩｇＭでより顕著であった。
【０１３８】
どのＩｇＧのサブクラスが細菌に結合するのかを確認するために、ＰＳ−ＴＴ抗血清の一部をさらに分析した。ＤｅＮＡｃ−ＴＴ抗血清について得られた代表的なデータを図１１Ｂに示す。ＩｇＧ１を除いて、すべての抗血清が細菌に結合したすべてのＩｇＧサブタイプの抗体を含んでいた。ＤｅＮＡｃ−ＴＴ（図示）は、ＩｇＧ１Ａｂを含んでいた唯一の抗血清であった。結合したＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３の量はほぼ同じであった。抗血清は５匹のマウスのそれぞれのすべてのプールしたサンプルであったので、プールすることによって覆い隠されたＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３Ａｂの存在量の個体差が存在していた可能性がある。上の結果は、ＰＳ−ＴＴワクチンのすべてが抗Ｎｅｕ含有ＰＳＡ抗体を誘発し、それらのすべてがグループＢ菌株ＮＭＢと反応性であったことを示すものである。
【０１３９】
（実施例１６）
髄膜炎菌グループＢ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｗ１３５菌に関するＰＳ−ＴＴ抗血清の機能活性の評価
補体タンパク質沈着の活性化。ＰＳ−ＴＴ結合体ワクチン抗血清による免疫処置によって誘発される抗体が髄膜炎菌グループＢ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｗ１３５菌におけるヒト補体成分の沈着を活性化する能力を実施例１０で述べたように測定した。結果を図１２に示す。
細胞表面上の補体成分の沈着は、細胞の蛍光を増加させ、蛍光ピークのグラフの右方への移動によって示される。抗体の活性化は、活性補体のみを含む細胞または熱不活性化補体を含む抗血清の蛍光の欠如によって示される。
結果から、すべての抗血清がＮｍＢ上への補体の沈着を強力に活性化し、異なる抗原または２μｇおよび１０μｇ用量によって誘発された抗血清の間に沈着した補体の量の差はほとんどなかったことがわかる（データは示さず）。補体活性化の一貫性は、抗ｄｅＮＡｃ力価に認められる類似性と一致している。すべての抗原が同等に有効であり、ＰＳの用量の増加によりワクチンの抗ＮｅｕＰＳＡ抗体反応が増大しなかったことが示唆される。
【０１４０】
最近、我々はＳＥＡＭ２、３および１８（Ｇｒａｎｏｆｆら、同上）抗体が血清グループＡ、Ｃ、Ｗ１３５ならびにＢの髄膜炎菌株に対して反応性であり、機能活性を有することを発見した（Ｆｌｉｔｔｅｒ、ＢＡおよびＭｏｅ、ＧＲ、未公表）。したがって、我々は、抗血清がすべての髄膜炎菌血清グループを代表する菌株における補体タンパク質の沈着を活性化する能力も測定した。少なくとも１つの抗血清プールがグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹまたはＷ１３５菌株における補体タンパク質沈着を活性化することができた。特に、２μｇまたは１０μｇ抗血清プールは、グループＡ、Ｂ、Ｃ、ＸおよびＹ菌株における補体タンパク質沈着を活性化したが、Ｗ１３５菌株における補体タンパク質沈着を活性化しなかった。ＮＰｒＳｉａ抗血清のみがグループＷ１３５菌株に対して活性を示した。対照破傷風トキソイドのみの抗血清の結果については、特にグループＣ、ＹおよびＷ１３５菌株について、抗血清が熱不活性化補体による非常に高いバックグラウンドシグナルを有していたので、解釈できなかった。これに対して、ＰＳ−ＴＴ結合体ワクチン誘発抗血清について認められた補体活性化活性のすべてが活性補体に依存していた。
【０１４１】
結果から、すべての髄膜炎菌株が莢膜グループに無関係にＮｅｕを含む可能性があるポリα（２→８）ＰＳＡ抗原を発現または外因的に獲得すること、また、髄膜炎菌の細胞表面上の補体因子の沈着の活性化が疾患の防御と相関している（Ｗｅｌｓｃｈら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ、２００３年、１８８巻、１７３０頁）ことから、抗ＮｅｕＰＳＡ抗体を誘発するワクチンはすべての髄膜炎菌グループ菌株によって引き起こされる疾患を防御する可能性があることが示唆される。
血清殺菌活性。髄膜炎菌グループＢ菌株ＮＭＢおよびグループＣ菌株４２４３に関する補体媒介性殺菌活性を次のように測定した。チョコレート寒天（Ｒｅｍｅｌ）上で一夜増殖させた後、髄膜炎菌のいくつかのコロニーをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中に播種し（約０．１のＡ６２０ｎｍから開始）、試験微生物を約０．６のＡ６２０ｎｍまで約２時間増殖させた。細菌をＤ−ＢＳＡで２回洗浄した後、約３００〜４００ＣＦＵを反応混合物に加えた。検定は、試験菌株に対する殺菌活性を欠くドナーのヒト補体を用いて（４０％までの補体）添加抗体の非存在下で行った。４０μＬの最終反応混合物は、２０％（容積／容積）補体、Ｄ−ＢＳＡ緩衝液で希釈した抗血清を含んでいた。チョコレート寒天（Ｒｅｍｅｌ）上で一夜増殖させた後に反応混合物中のＣＦＵ／ｍｌを測定した。殺菌力価または濃度は、時間０における１ｍｌ当たりの対照ＣＦＵと比較して、反応混合物中の細菌の６０分間のインキュベーションの後に１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の５０％の低下をもたらす血清希釈度と定義した。一般的に、陰性対照抗体および補体とともにインキュベートした細菌は、６０分間のインキュベーション中にＣＦＵ／ｍｌの１５０〜２００％の増加を示した。
【０１４２】
ＰＳ−ＴＴ抗血清はグループＢ細菌における補体タンパク質沈着を活性化することができたが、いずれの抗血清も補体の存在下で溶菌を媒介することはできなかった。このことの機構上の理由は不明であるが、同様な機能特性が防護的な非自己反応性ｍＡｂであるＳＥＡＭ３について認められる（Ｇｒａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８年、１６０巻、５０２８頁、Ｍｏｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２００５年、７３巻、２１２３頁）。これに対して、ＮＰｒ、ＤｅＮＡｃおよびＴｃＡｃに対する抗血清プール（すべてが２μｇ用量の３回目の注射後）は、グループＣ菌株に対する高い力価を示し、ワクチンにより誘発された抗体が、髄膜炎菌性疾患からの防護を保証するものである（Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９６９年、１２９巻、１３２７頁）補体依存性溶菌を媒介することを示している。
【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
幼若ラットにおける受動的防御。幼若（４〜６日）Ｗｉｓｔａｒラットを母動物から取り、各５匹のラットの群に無作為に分けた。各子動物に１％ＢＳＡを含む無菌ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で１：１０に希釈した１００μｌの抗血清を腹腔内投与し、次いで、チャレンジ細菌を準備している間にそれらの母動物に戻した。ＮｍＢ菌株Ｎ９８６またはＮｍＣ菌株４２４３を０．３％グルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中で０．６のＯ．Ｄ．６２０まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡに再懸濁し、１０４ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。各子ラットに、最終チャレンジ用量が約１０００ＣＦＵ／ラットとなるように、１００μｌの細菌を投与した。子動物をそれらの母動物に戻した。翌日、子動物をイソフルランで麻酔し、ヘパリン処理針を用いて心臓穿刺により血液を採取した。動物をＣＯ２酸素欠乏により安楽死させ、１００μｌ、１０μｌおよび１μｌの血液をチョコレート寒天（Ｒｅｍｅｌ）上で平板培養した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一夜インキュベートし、次いで、コロニーを数えた。
ＰＳ−ＴＴのいくつかは、受動的防御の幼若ラットモデルにおいてＮｍＢまたはＮｍＣ菌血症を防御または部分的に防御した（図１３）。防御は、ワクチン誘発抗血清の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌをＴＴ担体タンパク質単独により免疫処置したマウスの抗血清の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌを比較することによって計算した。ＰＳ−ＴＴ抗血清プールのうちの４つがＴＴ抗血清と異なっていた、菌株Ｍ９８６に対する受動的防御をもたらした。抗血清は、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ１０μｇ、ＤｅＮＡｃ−ＴＴ２μｇ（ｐ＜０．０５）、ＮＰｒ−ＴＴ２μｇおよびＯＳ−ＴＴ２μｇ（ｐ＜０．０１）を含んでいた。
【０１４５】
完全な有意差ではないが（ｐ＝０．０５２）、２μｇ用量は１０μｇ用量より防御性が高い傾向があった。反対のパターンを示したＮＰｒＳｉａ−ＴＴ抗血清を解析から除外するならば、２μｇ用量は１０μｇ用量より防御性が有意に高かった（ｐ＝０．０１３）。ＮＰｒＳｉａ−ＴＴは例外的な抗血清である可能性がある。それは１０μｇ用量が２μｇより細菌に強く結合する唯一のものであり、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴワクチン製剤は最も少ない量のノイラミン酸を含んでいた。ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ２μｇ用量製剤は、強い結合性および防御性抗体を誘発するのに十分なノイラミン酸残基を単に含んでいない可能性がある。他のＰＳ−ＴＴワクチンについては、２μｇ用量におけるＮｅｕの量は最大抗ＮｅｕＰＳ抗体反応を誘発するのに十分であると思われ、１０μｇ用量は追加のベネフィットをもたらさなかった。
髄膜炎菌血症のｅｘ  ｖｉｖｏヒト血液モデルにおける受動的防御。実施例１０で上述したように、ワクチンにより誘発される抗体がＮｍＢによって引き起こされる疾患を防御する能力を評価することへの別のアプローチは、抗血清がヒト血液中でｅｘ  ｖｉｖｏでＮｍＢを溶解またはその成長を阻害することができるかどうかを判断することである。抗血清（上の実施例１５で述べたように１０μｇのＰＳ−ＴＴ結合体ワクチンで免疫処置したＣＤ１マウスからのプールした抗血清）および試験細菌（上の実施例１５で述べたようにＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地中で新たに増殖させた約１０００ＣＦＵのＮｍＢ菌株ＮＺ９８／２５４）を、滅菌ガラスバイアルに入れた試験菌株に対する抗体を欠くドナーから新たに得られたヒト血液中で合わせ、実施例１５で述べたように調製して試験した。髄膜炎菌血症のｅｘ  ｖｉｖｏヒト血液モデルにおける抗血清の試験の結果を図１４にグラフとして示すが、実施例１５の結果と同様である。したがって、本明細書で述べるＰＳ−ＴＴワクチンにより誘発される抗体は、脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを発現する髄膜炎菌により引き起こされる疾患を防御するためのワクチンの適用を支持するものである。
【０１４６】
（実施例１７）
ジャーカットＴ細胞白血病細胞株によって発現されるＰＳＡ誘導体に対するワクチン誘発抗体の結合
実施例１３で調製したＰＳ−ＴＴ結合体ワクチンにより誘発される抗体の結合を測定するために、ブロックした後、２μｇの総シアル酸ＰＳ−ＴＴ結合体ワクチンの３回の投与により免疫処置したＣＤ１マウスのプールした抗血清を加え、４℃で一夜インキュベートしたことを除いて、実施例１１で述べたようにジャーカット細胞を試験した。ジャーカット細胞結合実験の結果を図１５に示す。細胞のみと比べてＴＴ陰性対照抗血清の少量の非特異的結合が存在するが、すべての抗血清プールが、標的細胞の蛍光の増加によって示されるように、ジャーカット細胞に対する強い結合を示した。したがって、結果は、ＰＳ−ＴＴ結合体ワクチンがジャーカットＴ細胞白血病細胞によって発現されるノイラミン酸含有抗原に対して反応性の抗体を誘発することを確認するものである。
【０１４７】
（実施例１８）
ジャーカットＴ細胞白血病細胞、ＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫およびＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫細胞上のワクチン誘発抗体による補体沈着の活性化
補体媒介性細胞毒性の活性化は、がん細胞の抗体依存性殺滅の重要なメカニズムである（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０００年、２９巻（１号増刊２）２頁）。したがって、ＰＳ−ＴＴ抗血清がＣＨＰ−１３４神経芽細胞腫、ジャーカットＴ細胞白血病およびＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫細胞上のヒト補体タンパク質の沈着を活性化する能力をフローサイトメトリーにより測定した。
細胞（ウェル当たり約１０５個）を平底９６ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）上で平板培養し、検定の前に増殖培地とともに一夜インキュベートした。細胞を、９６丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中に収集する前にトリプシン（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）または細胞分散試薬（ＣＤＲ、Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＣＨＰ−１３４）によりプレートから離脱させ（ジャーカット細胞は非付着性）、１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を、１：１０の希釈度のＰＳ−ＴＴもしくはＴＴ（陰性対照）抗血清（２μｇ用量）を含むまたは抗血清を含まない９５μｌの標準細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０増殖培地）に再懸濁した。がん細胞株に対して内因活性を有さないドナーからのヒト補体（５μｌ）を加え、混合した。室温で３０分経過後に、遠心分離（上）により細胞をペレットとし、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１：１００の希釈度のＦＩＴＣ結合ヒツジ抗ヒトＣ３ｃ抗体（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含むＰＢＳ緩衝液に懸濁した。室温で３０分間インキュベートした後、前のように細胞をペレットとし、洗浄し、最後に１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。Ｇｕａｖａ  ＥａｓｔＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞の相対蛍光を測定した。抗血清を含まない対照サンプルを用いてベースライン蛍光を確定した。
すべてのＰＳ−ＴＴ試験抗血清は、３種の細胞株すべてにおける補体タンパク質沈着を活性化することができたが、対照ＴＴ単独抗血清は活性化することができなかった。
【０１４８】
（実施例１９）
ジャーカットＴ細胞白血病細胞の生存能に対するワクチン誘発抗体の効果
培養中のヒトＴ細胞白血病ジャーカット細胞株の生存能に対するＰＳ−ＴＴ抗血清の効果を細胞生存能検定を用いて測定した。細胞を１：２０の希釈度の抗血清とともに２４時間インキュベートした。ジャーカット細胞は、丸底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で２×１０５細胞／ｍｌの濃度で、２００μｌ／ウェルとしてインキュベートした。次いで、プレートを１０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞をＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬に再懸濁し、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ検定法を用いてＧｕａｖａ  ＥａｓｔＣｙｔｅフローサイトメーターで読取りを行った（すべてＧｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）。
図１７に示すように、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴワクチンにより誘発された抗体は、ジャーカット細胞の生存能を低下させることができた。
【０１４９】
（実施例２０）
原発性ヒトがんに発現する抗原に結合するＴｃＡｃ−ＴＴワクチン誘発抗体の免疫組織化学的分析
がん細胞株は、クローン性であるが、細胞培養中で多数回継代培養されたときに変化を受けることがあり得る。したがって、ＰＳ−ＴＴワクチンにより誘発された抗体により認識された抗原も原発性ヒト腫瘍に存在することを示すことは重要である。また、免疫療法アプローチが有用であるためには、標的とする抗原が正常細胞において発現しないか、または著しく低いレベルで発現することが重要である。ＴｃＡｃ−ＴＴ抗血清は髄膜炎菌およびジャーカット細胞に対して最大の総合的機能活性を示したことから、正常およびがん組織に対する該抗血清の反応性を免疫組織化学（ＩＨＣ）により評価した。
【０１５０】
正常な脳、乳房、結腸、骨格筋、腎臓、肝臓、肺、膵臓、前立腺、皮膚、小腸、胃、卵巣および子宮ならびに同じ組織の悪性腫瘍を含む、２８の正常およびがん組織を含む凍結した非固定組織アレイをＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）から入手した。スライド標本をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、冷（−２０℃）アセトンで簡単に洗浄した。ＰＥＲＯＸＩＤＡＺＥＤ１（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）とともにインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼをブロックした後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、２．５％（容積／容積）の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）により３０分間ブロックした。ＤＡ  ＶＩＮＣＩ  ＧＲＥＥＮ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で希釈したＴＴ対照およびＴｃＡｃ−ＴＴ抗血清（２μｇ用量）を加え、スライド標本を湿潤チャンバー内で４℃で一夜インキュベートした。緩衝液による洗浄により非結合抗体を除去した。次いで、結合抗体をＡＥＣ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて製造業者の指示に従って検出した。さらに洗浄した後、マイアーのヘマトキシリンＱＳ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて核を対比染色した。最後に、スライド標本を水性封入剤（ＶＥＣＴＲＡＭＯＵＮＴ（商標）ＡＱ、Ｖｅｃｔｏｒ）で封入し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いて観察した。
ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴ抗血清は、正常組織に対して染色をまったく示さなかったか、または弱い染色を示し、ＴＴ抗血清は、腫瘍細胞のいずれとの反応性も示さなかった。しかし、ＴｃＡｃ−ＴＴ抗血清は、脳に転移した皮膚黒色腫ならびに膵臓、胃、卵巣および子宮の腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）、ならびに腎細胞癌の明らかな染色を示した。正常卵巣および卵巣腺癌のＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴ染色を比較した例を図１８に示す。結果から、ＴｃＡｃ−ＴＴワクチンにより誘発された抗体と反応性である抗原はいくつかの原発性ヒト腫瘍においてのみ、またはより高いレベルで発現するが、正常なヒト組織においては発現しないことがわかる。
【０１５１】
（実施例２１）
ＤｅＮＡｃ−ＴＴ結合体ワクチンを用いたモノクローナル抗体の製造
４〜６週齢の雌ＣＤ１マウスを実施例１４で述べたようにＤｅＮＡｃ−ＴＴワクチンを用いて免疫処置した。３回目の投与の３日後にマウスを屠殺し、５脾臓細胞対１骨髄腫細胞の比率で、脾臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。ＨＡＴ選択培地中で２週間インキュベートした後、ハイブリドーマ上清を、ＤｅＮＡｃ−ＢＳＡ誘導体を被覆したマイクロタイタープレート上で実施した（実施例９）、ＥＬＩＳＡにより抗体結合活性についてスクリーニングした。多数の陽性ウェル（２５０）が確認された。次いで、ＤｅＮＡｃ−ＢＳＡ陽性ウェルからの細胞培養上清を、実施例１８で述べたような上清中の抗体がジャーカット細胞上の補体の沈着を活性化する能力に基づく第２のスクリーニングに供した。最初の２５０のＤｅＮＡｃ−ＢＳＡ陽性ウェルのうちの１１が補体活性化についても陽性であった。１１のハイブリドーマのうちの５つを限界希釈により２回クローニングし、次いで、増殖させ、後に組織培養に用いるために凍結した。
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を用いて、モノクローナル抗体のサブクラスを決定した。選択したｍＡｂのうち、ＤＡ２と呼ぶ１つのＩｇＭ抗ＤｅＮＡｃｍＡｂを下で述べるすべての結合および機能試験に用いた。このモノクローナル抗体は、２ｍＭアルギニン、０．００２％トゥィーン２０、２４ｍＭショ糖を含む緩衝液、ｐＨ７（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）中の硫酸アンモニウム沈殿およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＨＷ−５５Ｆ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって組織培養から精製した。ＩｇＭを含む画分を合わせ、滅菌ろ過し、凍結乾燥し、使用時まで−８０℃で保存した。下の実施例２３で述べる実験に用いるために凍結乾燥ｍＡｂを最初の体積の１／１０の滅菌水に再懸濁した。ＤＡ２ｍＡＢは、隣接残基またはグリコシド結合に無関係に、非還元端ノイラミン酸残基に対して高度に特異的であることが認められた。
【０１５２】
（実施例２２）
ＤＡ２ＭＡｂをコードする核酸のクローニングおよび配列決定
抗原認識に関する分子的基礎を検討するために、ＤＡ２マウスｍＡｂの可変領域（Ｖ）遺伝子を以下のようにクローニングし、配列を決定した。
ＤＡ２発現マウスハイブリドーマ細胞株からの免疫グロブリン重および軽鎖の可変領域遺伝子を、縮重プライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、Ｗａｎｇら、（２０００年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３３巻、１６７〜７７頁により記載されたようにＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用い、大腸菌株ＸＬ−２Ｂｌｕｅを宿主として用いてクローニングした。ＬＢ−アンピシリンプレート上で選択した個々の形質転換細胞のプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って分離した。３クローンからのクローン化遺伝子をＤａｖｉｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）により配列決定した。
【０１５３】
ＤＡ２のｍＡｂヌクレオチド配列は、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  ＩＩ、ＣＮＲＳ、ＬＩＧＭ、ＩＧＨ、ＩＦＲ３、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）により開始され、調整された国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報システム（ＩＭＧＴ、インターネット上ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）のオンラインウェブ・ファシリティによるＩＧＭＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴおよびマウス免疫グロブリンヌクレオチド配列データベースを用いて分析した。
ＤＡ２重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、国際免疫遺伝学情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＭＧＴ）の定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、Ｄ５９３〜Ｄ５９７頁）により定義されたように示したフレームワーク（例えば、ＦＲ１−ＩＭＴＧにより表した）およびＣＤＲ領域とともに図１９および２０に示す。
【０１５４】
（実施例２３）
ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ２８の生存能に対するｍＡｂＤＡ２の効果
細胞の生存能に対するＤＡ２（１、０．５および０．２５μｇ／ｍｌ）および無関連ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）対照ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）の効果を測定するために、ｍＡｂを１００連で（ｉｎ  ｃｅｎｔｕｐｌｉｃａｔｅ）ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞とともに４８時間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。細胞生存能は、ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。簡単に述べると、細胞を組織培養プレートから剥がし、遠心分離により収集し、ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬に再懸濁した。細胞生存能は、生存、アポトーシスおよび死細胞に対するあらかじめ設定されたゲートを有するＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターでプログラムを用いて分析した。ＤＡ２は、試験したすべての濃度で無関連対照ｍＡｂと比較して生細胞の数を減少させ、アポトーシスおよび死細胞の数を増加させることが認められた（図２１）。示さなかったデータにおいて、ＤＡ２は血清グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＷ１３５の髄膜炎菌株の成長を阻害することができる。
したがって、異なる微細抗原特異性を有するが、非還元端にＮｅｕを含むＰＳ抗原を一般的に認識するＳＥＡＭ３およびＤＡ２は、両方ともＮｅｕ含有シアル酸抗原等を発現する髄膜炎菌およびがん細胞に対する機能活性を有する。
【０１５５】
髄膜炎菌血清グループＣのＰＳＡα（２→９）莢膜物質から調製したＯＳ誘導体が、ＤＡ２モノクローナル抗体によって認識される免疫優性Ｎｅｕエピトープを含むことも発見された。したがって、データは、新たなクラスのＯＳα（２→９）誘導体ワクチン（α（２→８）および（２→９）グリコシド結合の混合物を含む）は、ＯＳα（２→８）誘導体について述べたのと同じ方法で適用することができることを示している。
上の結果は、最も短いオリゴシアル酸またはオリゴ糖（ＯＳ）は２〜６、主として４〜６の重合度（Ｄｐ）の混合物を有し、四量体がはるかにより長い誘導体の活性のすべてを示すことを実証するものである。また結果は、これらの特徴を有するＯＳ誘導体から構成されるワクチンは、高度に免疫原性であり、（ｉ）ヒト血液中の細菌の生存能を低下させるヒト血液中に存在する防御メカニズム（補体媒介性溶菌および／またはオプソニン食作用）を活性化し、（ｉｉ）がん細胞により発現されるノイラミン酸含有抗原と反応性である抗原特異的抗体反応を誘発することも実証するものである。
【０１５６】
さらに、ＤｅＮＡｃ−ＴＴ、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＴｃＡｃ−ＴＴおよびＯＳ−ＴＴを含む定義されたＰＳ−ＴＴワクチンを製造し、特性を評価する方法を記述した。ＰＳ−ＴＴワクチンに対する抗血清の広範な特性評価により、非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を有する最小ＯＳワクチン誘導体が有効なワクチン活性に必要な最小限の特徴を含むという所見がさらに裏づけられている。驚くべきことに、ＴｃＡｃ−ＴＴワクチンは均一抗原に対する非常に低い力価を誘発したが、ＴｃＡｃ−ＴＴに対する抗血清は髄膜炎菌血清グループおよびがん細胞に対する広いスペクトルの活性を示した。さらに、約２〜２０の重合度（ｄｐ）、特に約２〜１０またはそれ以下のｄｐを有するＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＴｃＡｃ−ＴＴおよびＯＳ−ＴＴ結合体ワクチンならびに非結合抗血清は、ＮＰｒまたはドデシルアミンＮＰｒに対するＳＥＡＭ２（ＴｃＡｃ）またはＳＥＡＭ３（ＮＰｒＳｉａ−ＴＴおよびＯＳ−ＴＴ）の結合の阻害について約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を示すことが発見され、非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基を有するＯＳワクチン誘導体は有効なワクチン活性に必要な最小限の特徴を含むことがさらに示された。
ＰＳＡα（２→８）前駆体物質（髄膜炎菌血清グループＢまたは大腸菌Ｋ１から得られるような）から製造されるＯＳ誘導体に加えて、ＰＳＡα（２→９）材料（髄膜炎菌血清グループＣからのものなど）から得られるＯＳ誘導体が同様の特性を示し、α（２→９）グリコシド結合またはα（２→８）および（２→９）グリコシド結合の混合物を含む新たなクラスのＰＳ−ＴＴワクチンであることが裏づけられることも発見された。例えば、大腸菌Ｋ９２菌株から分離された莢膜多糖（Ｄｅｖｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、８８巻、７１７５号）。α（２→９）グリコシド結合を含むＰＳワクチンは、髄膜炎菌血清グループＣに対する適用に特別な利点を有する可能性がある。
【０１５７】
結果は、ＰＳ−ＴＴワクチンは一定の範囲の異なる活性を有するが、ＯＳ誘導体に存在する非還元端脱Ｎ−アセチルノイラミン酸残基成分は、（ｉ）ＰＳ−ＴＴ抗原のすべてに認められ、（ｉｉ）免疫原性であり、ＰＳ−ＴＴワクチンの免疫優性決定基であり、（ｉｉｉ）すべてのワクチンのＰＳ−ＴＴ抗血清が、これらの細菌によって引き起こされる疾患の防御の既知の相関物である、髄膜炎菌グループＢ、Ｃ、Ｘ、ＹおよびＷ１３５の細胞表面上の補体因子の沈着を活性化することができたことも実証するものである。さらに、ＰＳ−ＴＴ抗血清のすべてが種々のがん細胞上の補体タンパク質の沈着を活性化することができ、反応性抗原は、いくつかの原発性ヒト腫瘍においてのみまたはより高いレベルで発現したが、正常ヒト組織では発現しなかったことが実証された。最後に、非還元端Ｎｅｕ特異モノクローナル抗体ＤＡ２を分離し、配列決定し、増幅し、そして、ＳＥＡＭ抗体のいずれよりも高い親和力で免疫優性エピトープに結合し、また、試験したすべての濃度で無関連の対照ｍＡｂと比較して生存がん細胞の数を減少させ、アポトーシスおよび死細胞の数を増加させることが見いだされた。
上の結果および考察から、特に血清グループＢおよびＣの髄膜炎菌によって引き起こされる疾患に対する防御作用を示すＯＳ誘導体およびワクチンを製造することができることは明らかである。ＯＳ誘導体およびＤＡ２などのそれに対する産生抗体は、対象におけるがん細胞を検出すること、対象におけるがん細胞の成長を阻害すること、対象における抗体を誘発すること、がん細胞に対する抗体を誘発することなどに適用できることも明らかである。したがって、本明細書に開示した組成物および方法は、様々な種類の適用例に用いることができ、当技術分野に重要な貢献を果たす。
【０１５８】
前述の発明を明快な理解の目的のために実例および実施例により多少詳細に記述したが、一定の変更および修正は、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく行うことができることは本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
【０１５９】
例示的な実施形態
１．  分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法であって、
還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸前駆体を、前記非還元端を脱Ｎ−アセチル化するための条件下で水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を生成させる段階、ならびに
（ｉ）約２〜２０の重合度、および（ｉｉ）１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基およびエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を分離する段階を含み、
それにより前記分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を製造する方法。
２．  前記オリゴシアル酸誘導体の前記非還元端が脱Ｎ−アセチル化残基である、実施形態１に記載の方法。
３．  前記脱Ｎ−アセチル化残基がノイラミン酸である、実施形態２に記載の方法。
４．  前記オリゴシアル酸誘導体がＮ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む、実施形態１に記載の方法。
５．  前記Ｎ−アシル基がトリクロロアセチルである、実施形態１に記載の方法。
６．  前記オリゴシアル酸前駆体が、大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌血清グループＢおよび髄膜炎菌血清グループＣからなる群から選択される細菌から取得可能なポリシアル酸ポリマーの酸加水分解から取得可能な、実施形態１に記載の方法。
７．  前記オリゴシアル酸誘導体が２〜１０の重合度を有する、実施形態１に記載の方法。
８．  前記オリゴシアル酸誘導体がα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成されている、実施形態１に記載の方法。
９．  α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の前記混合物が長さがより短い鎖および３：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を有する、実施形態８に記載の方法。
１０．  α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸鎖の前記混合物が長さがより長い鎖および１０：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を有する、実施形態８に記載の方法。
１１．  第２の分子を前記分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に結合させる段階をさらに含み、前記第２の分子が保護基、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸および検出可能な標識からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
１２．  前記第２の分子が免疫調節剤である、実施形態１１に記載の方法。
１３．  免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、実施形態１２に記載の方法。
１４．  前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、実施形態１３に記載の方法。
１５．  前記分離オリゴシアル酸誘導体が、ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２の結合を約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で阻害することができる、実施形態１に記載の方法。
１６．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体をエキソノイラミニダーゼに曝露することにより、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を有するα（２→８）オリゴシアル酸誘導体を富化する段階をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１７．  実施形態１に記載の方法により製造される分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体。
１８．  分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が、それぞれ非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する可変鎖長のオリゴシアル酸誘導体の混合物としてなる、実施形態１の方法により製造される分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む組成物。
１９．  約２〜２０の重合度、ならびに還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含む、組成物。
２０．  前記オリゴシアル酸誘導体の前記非還元端が脱Ｎ−アセチル化残基である、実施形態１９に記載の組成物。
２１．  前記脱Ｎ−アセチル化残基がノイラミン酸である、実施形態１９に記載の組成物。
２２．  前記オリゴシアル酸誘導体がＮ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む、実施形態１９に記載の組成物。
２３．  前記分離オリゴシアル酸誘導体の前記還元端が還元されている、実施形態１９に記載の組成物。
２４．  前記オリゴシアル酸が、大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌血清グループＢおよび髄膜炎菌血清グループＣからなる群から選択される細菌から取得可能なポリシアル酸ポリマーから取得可能な、実施形態１９に記載の組成物。
２５．  前記オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０の重合度を有する、実施形態２４に記載の組成物。
２６．  前記オリゴシアル酸誘導体がオリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成されている、実施形態１９に記載の組成物。
２７．  オリゴシアル酸鎖の前記混合物が長さがより短い鎖および約３：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含む、実施形態２６に記載の組成物。
２８．  オリゴシアル酸鎖の前記混合物が長さがより長い鎖および約１０：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含む、実施形態２６に記載の組成物。
２９．  前記オリゴシアル酸誘導体が結合体を含む、実施形態１９に記載の組成物。
３０．  前記結合体が、保護基、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸および検出可能な標識からなる群から選択される１つまたは複数の第２の分子に結合した前記オリゴシアル酸誘導体を第１の分子として含む、実施形態２９に記載の組成物。
３１．  前記第２の分子が免疫調節剤である、実施形態３０に記載の組成物。
３２．  前記免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、実施形態３１に記載の組成物。
３３．  前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、実施形態３２に記載の組成物。
３４．  前記オリゴシアル酸誘導体が１つまたは複数の免疫原性賦形剤を含む製剤として構成されている、実施形態１９に記載の組成物。
３５．  前記オリゴシアル酸誘導体が、ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２の結合を約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で阻害することができる、実施形態１９に記載の組成物。
３６．  前記分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が、脱Ｎ−アセチル残基で富化された非還元端を有する可変鎖長のオリゴシアル酸誘導体の混合物としてなる、実施形態１９に記載の組成物。
３７．  １つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基が富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端を含むα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な分離抗体。
３８．  前記抗体が髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）およびグループＣ（ＮｍＣ）細菌の補体媒介溶菌およびオプソニン食作用の能力がある、実施形態３７に記載の分離抗体。
３９．  前記抗体が非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基に対して特異的である、実施形態３７に記載の分離抗体。
４０．  前記抗体が、図１９および２０に示すような軽および重鎖可変相補性決定領域ポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体である、実施形態３９に記載の分離抗体。
４１．  前記抗体が、図１９または２０に示す相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド配列から選択されるＣＤＲポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体である、実施形態３７に記載の分離抗体。
４２．  前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、実施形態４１に記載の分離抗体。
４３．  がんを有することが疑われる対象から得られる生物学的サンプルを、実施形態３７に記載の抗体と接触させる段階を含み、抗体の結合が対象におけるがん細胞の存在を示す、対象におけるがん細胞を検出する方法。
４４．  実施形態３７に記載の抗体を含む有効な量の薬学的に許容される製剤を対象に投与する段階を含み、前記投与が前記抗体に曝露させたがん細胞の生存能の低下を促進する、
対象におけるがん細胞の成長を阻害する方法。
４５．  脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを含む細菌に特異的に結合する、対象における抗体を誘発する方法であって、
約２〜２０の重合度ならびに還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与する段階を含み、前記非還元端が１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基について富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性があり、前記投与が細菌のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である、対象における抗体を誘発する方法。
４６．  細菌が髄膜炎菌グループＢ、Ｃまたは大腸菌Ｋ１である、実施形態４５に記載の方法。
４７．  対象における脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを含むがん細胞に対する抗体を誘発する方法であって、
約２〜２０の重合度ならびに還元端および非還元端を有するα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む免疫原性組成物を対象に投与する段階を含み、前記非還元端が１つまたは複数の脱Ｎ−アセチル化残基について富化され、エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性があり、前記投与が前記がん細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である、抗体を誘発する方法。
４８．  がんが黒色腫、リンパ腫または神経芽腫である、実施形態４７に記載の方法。
４９．  免疫原性組成物のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を水素化ホウ素ナトリウム還元による非還元端残基の選択的脱アセチル化により調製する、実施形態４７に記載の方法。
５０．  前記分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体がポリシアル酸誘導体の凝集体を含む、実施形態１９に記載の組成物。
５１．  前記凝集体が顕微鏡的粒子を含む、実施形態５０に記載の組成物。
５２．  １つまたは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を、凝集体を形成するように凝集条件下で混合する段階を含む、
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む凝集体を製造する方法。
５３．  凝集条件が加熱または凝集賦形剤の添加である、実施形態５２に記載の方法。
５４．  凝集賦形剤が水酸化アルミニウムである、実施形態５２に記載の方法。
５５．  （ｉ）約２〜２０の重合度、（ｉｉ）ドデシルアミンＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルＮｍＢポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２、ＳＥＡＭ３またはＤＡ２抗体の結合の阻害の約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０、（ｉｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物。
５６．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が１つまたは複数のＮ−トリクロロアセチルシアル酸残基を含む、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
５７．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が１つまたは複数のＮ−プロピオニルシアル酸残基を含む、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
５８．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０の重合度を有する、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
５９．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜６の重合度を有する、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
６０．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が二量体、三量体および四量体からなる群から選択される、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
６１．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が結合体を含む、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
６２．  前記結合体が、免疫調節剤を含む第２の分子に結合した前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を第１の分子として含む、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
６３．  前記免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、実施形態６２に記載のワクチン組成物。
６４．  前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、実施形態６３に記載のワクチン組成物。
６５．  前記オリゴシアル酸誘導体が、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＯＳ−ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴからなる群から選択されるα（２→８）オリゴシアル酸誘導体である、実施形態５５に記載のワクチン組成物。
６６．  （ｉ）約２〜２０の重合度、（ｉｉ）約５０％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量、および（ｉｉｉ）エキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある非還元端脱Ｎ−アセチル残基を有する分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物。
６７．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約８８％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量を有する、実施形態６６に記載のワクチン組成物。
６８．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０の重合度を有する、実施形態６６に記載のワクチン組成物。
６９．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜６の重合度を有する、実施形態６６に記載のワクチン組成物。
７０．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が二量体、三量体および四量体からなる群から選択される、実施形態６６に記載のワクチン組成物。
７１．  前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体ワクチンが結合体を含む、実施形態６６に記載のワクチン組成物。
７２．  前記結合体が、免疫調節剤を含む第２の分子に結合した前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を第１の分子として含む、実施形態６７に記載のワクチン組成物。
７３．  前記免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、実施形態７２に記載のワクチン組成物。
７４．  前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、実施形態７３に記載のワクチン組成物。
７５．  前記オリゴシアル酸誘導体がα（２→８）オリゴシアル酸誘導体ＤｅＮＡｃ−ＴＴである、実施形態７４に記載のワクチン組成物。
【図１】
2015057391.tif 000005
【図２】
2015057391.tif 000006
【図３】
2015057391.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015057391.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2015057391.tif 000016
【図１３】
2015057391.tif 000017
【図１４】
2015057391.tif 000018
【図１５】
2015057391.tif 000019
【図１６】
2015057391.tif 000020
【図１７】
2015057391.tif 000021
【図１８】
2015057391.tif 000022
【図１９】
2015057391.tif 000023
【図２０】
2015057391.tif 000024
【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月10日(2014.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の生成物を含む組成物であって、前記オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含む、組成物。
【請求項２】
前記オリゴシアル酸誘導体の前記非還元端が脱Ｎ−アセチル化残基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脱Ｎ−アセチル化残基がノイラミン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記オリゴシアル酸誘導体がＮ−アセチル以外の１つまたは複数のＮ−アシル基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記分離オリゴシアル酸誘導体の前記還元端が還元される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記オリゴシアル酸誘導体が、大腸菌Ｋ１、髄膜炎菌血清グループＢおよび髄膜炎菌血清グループＣからなる群から選択される細菌から取得可能なポリシアル酸ポリマーから取得可能なものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０の重合度を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴシアル酸誘導体の生成物がオリゴシアル酸鎖の分離混合物として構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
オリゴシアル酸鎖の前記混合物が長さがより短い鎖および約３：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
オリゴシアル酸鎖の前記混合物が長さがより長い鎖および約１０：１のシアル酸と脱Ｎ−アセチル化シアル酸との比を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オリゴシアル酸誘導体の生成物が結合体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記結合体が、保護基、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸および検出可能な標識からなる群から選択される１つまたは複数の第２の分子に結合した前記オリゴシアル酸誘導体を第１の分子として含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２の分子が免疫調節剤である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記オリゴシアル酸誘導体の生成物が１つまたは複数の免疫原性賦形剤を含む製剤として構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記オリゴシアル酸誘導体が、ドデシルアミンＮ−プロピオニル髄膜炎菌グループＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２又はＳＥＡＭ３モノクローナル抗体の結合を約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で阻害することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記オリゴシアル酸誘導体の生成物が、脱Ｎ−アセチル残基で富化された非還元端を有する可変鎖長のオリゴシアル酸誘導体の混合物として構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体に対して特異的な分離抗体であって、前記オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含む、抗体。
【請求項２０】
前記抗体が髄膜炎菌グループＢ（ＮｍＢ）およびグループＣ（ＮｍＣ）細菌の補体媒介溶菌およびオプソニン食作用の能力がある、請求項１９に記載の分離抗体。
【請求項２１】
前記抗体が非還元端脱Ｎ−アセチルシアル酸残基に対して特異的である、請求項１９に記載の分離抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、図１９および２０に示すような軽鎖および重鎖の可変相補性決定領域ポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の分離抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、図１９または２０に示す相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド配列から選択されるＣＤＲポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の分離抗体。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項２３に記載の分離抗体。
【請求項２５】
がんを有することが疑われる対象から得られる生物学的サンプルを、請求項１９に記載の抗体と接触させる工程を含み、抗体の結合が対象におけるがん細胞の存在を示す、対象におけるがん細胞を検出する方法。
【請求項２６】
対象におけるがん細胞の成長を阻害するための薬学的に許容される製剤であって、有効量の請求項１９に記載の抗体を含み、前記抗体ががん細胞の生存能の低下を促進する、
製剤。
【請求項２７】
脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを含む細菌に特異的に結合する抗体を、対象において誘発するための免疫原性組成物であって、
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含み、
前記オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含み、前記オリゴシアル酸誘導体が細菌のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である、組成物。
【請求項２８】
細菌が髄膜炎菌グループＢ、髄膜炎菌グループＣまたは大腸菌Ｋ１である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
対象における脱Ｎ−アセチル化シアル酸（ｄｅＮＡｃＳＡ）エピトープを含むがん細胞に対する抗体を誘発するための免疫原性組成物であって、
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含み、
前記オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含み、前記オリゴシアル酸誘導体が前記がん細胞のｄｅＮＡｃＳＡエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発するのに有効である、組成物。
【請求項３０】
がんが黒色腫、リンパ腫または神経芽腫である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
免疫原性組成物のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が水素化ホウ素ナトリウム還元による非還元端残基の選択的脱アセチル化により調製される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体の生成物がポリシアル酸誘導体の凝集体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記凝集体が顕微鏡的粒子を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含む凝集体を製造する方法であって、
１つまたは複数のα（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を、凝集体を形成するように凝集条件下で混合する工程を含み、
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含む、方法。
【請求項３５】
凝集条件が加熱または凝集賦形剤の添加である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
凝集賦形剤が水酸化アルミニウムである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物であって、
前記オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含み、（ｉｉｉ）ドデシルアミンＮ−プロピオニル髄膜炎菌グループＢポリシアル酸またはＮ−プロピオニルポリシアル酸に対するＳＥＡＭ２又はＳＥＡＭ３モノクローナル抗体の結合の阻害について約０．１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、ワクチン組成物。
【請求項３８】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が１つまたは複数のＮ−トリクロロアセチルシアル酸残基を含む、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が１つまたは複数のＮ−プロピオニルシアル酸残基を含む、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０の重合度を有する、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜６の重合度を有する、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が二量体、三量体および四量体からなる群から選択される、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が結合体である、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
前記結合体が、免疫調節剤を含む第２の分子に結合した前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を第１の分子として含む、請求項４３に記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
前記免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、請求項４４に記載のワクチン組成物。
【請求項４６】
前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４７】
前記オリゴシアル酸誘導体が、ＮＰｒＳｉａ−ＴＴ、ＯＳ−ＴＴおよびＴｃＡｃ−ＴＴからなる群から選択されるα（２→８）オリゴシアル酸誘導体である、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
分離α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を含むワクチン組成物であって、
前記オリゴシアル酸誘導体が、約２〜２０の重合度を有し、（ｉ）Ｎ−アセチルシアル酸残基および脱Ｎ−アセチルシアル酸残基の混合と（ｉｉ）還元端および非還元端を含み、前記非還元端がエキソノイラミニダーゼによる分解に対して抵抗性のある脱Ｎ−アセチル化残基を含み、（ｉｉｉ）約５０％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量を有する、ワクチン組成物。
【請求項４９】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約８８％〜９８％の脱Ｎ−アセチルシアル酸含量を有する、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５０】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜１０の重合度を有する、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が約２〜６の重合度を有する、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５２】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体が二量体、三量体および四量体からなる群から選択される、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５３】
前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体ワクチンが結合体である、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５４】
前記結合体が、免疫調節剤を含む第２の分子に結合した前記α（２→８）または（２→９）オリゴシアル酸誘導体を第１の分子として含む、請求項５３に記載のワクチン組成物。
【請求項５５】
前記免疫調節剤が毒素またはその誘導体である、請求項５４に記載のワクチン組成物。
【請求項５６】
前記毒素またはその誘導体が破傷風トキソイドである、請求項５５に記載のワクチン組成物。
【請求項５７】
前記オリゴシアル酸誘導体がα（２→８）オリゴシアル酸誘導体ＤｅＮＡｃ−ＴＴである、請求項５６に記載のワクチン組成物。