(57)【要約】      （修正有）【課題】調剤工程を経ることなく患者への投与に直接使用でき、長期間保存した場合に安定なポリエンマクロライド系抗生物質を生体に投与するための液状プレミックス製剤の提供。【解決手段】ポリエンマクロライド系抗生物質を生体に投与するための液状プレミックス製剤であって、（ａ）リポソームに封入されたポリエンマクロライド系抗生物質、（ｂ）ｐＨ調整剤、及び（ｃ）医薬的に許容される少なくとも１種以上の非電解質を含み、前記（ｂ）のｐＨ調整剤によりｐＨが６．０〜７．０に調整されたものである。ｐＨ調整剤が、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水から選ばれる少なくとも１種を含むものである。ポリエンマクロライド系抗生物質がアムホテリシンＢである。リポソームの粒子径が均一であり夾雑物を含まない。臨床現場で投与する際にフィルターろ過を経ずに使用できる製剤。【選択図】図３
2015010069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエンマクロライド系抗生物質を生体に投与するための液状プレミックス製剤であって、（ａ）リポソームに封入されたポリエンマクロライド系抗生物質、（ｂ）ｐＨ調整剤、及び（ｃ）医薬的に許容される少なくとも１種以上の非電解質を含み、前記（ｂ）のｐＨ調整剤によりｐＨが６．０〜７．０に調整されたものであることを特徴とするポリエンマクロライド系抗生物質の液状プレミックス製剤。
【請求項２】
ｐＨ調整剤が、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水から選ばれる少なくとも１種を含むものである請求項１に記載の液状プレミックス製剤。
【請求項３】
ポリエンマクロライド系抗生物質がアムホテリシンＢである請求項１又は請求項２に記載の液状プレミックス製剤。
【請求項４】
前記リポソームの粒子径が均一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の液状プレミックス製剤。
【請求項５】
前記液状プレミックス製剤は、夾雑物が低減されており、そのまま注射製剤として使用できることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の液状プレミックス製剤。
【請求項６】
注射液製剤として容器に収納されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の液状プレミックス製剤。
【請求項７】
ポリエンマクロライド系抗生物質を生体に投与するための液状プレミックス製剤の製造方法であって、（ａ）リポソームに封入されたポリエンマクロライド系抗生物質、（ｂ）ｐＨ調整剤、及び（ｃ）医薬的に許容される少なくとも１種以上の非電解質を懸濁した状態で、前記（ｂ）のｐＨ調整剤によりｐＨが６．０〜７．０に調整することを特徴とするポリエンマクロライド系抗生物質の液状プレミックス製剤の製造方法。
【請求項８】
前記ｐＨ調整剤によるｐＨ調整後、点滴用バッグに密封された状態で、高圧蒸気滅菌されることを特徴とする請求項７記載のポリエンマクロライド系抗生物質の液状プレミックス製剤の製造方法。
【請求項９】
前記リポソームに封入されたポリエンマクロライド系抗生物質は、凍結乾燥工程を経ずに調整されたものであることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の液状プレミックス製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエン系マクロライド抗生物質を封入したリポソームを主成分として含む、保存時の安定性の高いプレミックス製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アムホテリシンＢは、カンジダ属やアスペルギルス属に属する病原真菌に対し抗菌力を示す深在性真菌症薬として従来から用いられているポリエンマクロライド系抗生物質である。アムホテリシンＢは、感受性真菌の細胞膜成分であるエルゴステロールに結合することで膜障害を起こし、細胞膜成分の漏出を生じさせ、真菌を死滅させる。アムホテリシンＢは、ヒトの細胞膜中に存在するステロール類、例えばコレステロールにも結合し、膜透過性を乱し細胞溶解を生じさせるため、ヒトへの投与により、腎機能障害や肝機能異常といった副作用が生じることが問題となっていた。
【０００３】
こうした副作用を抑止するため、近年、アムホテリシンＢをリポソームと呼ばれる脂質小胞の脂質二分子膜中に封入した製剤であるAmbisome（登録商標、以下アムビゾームと表記することもある。）がアムホテリシンＢ製剤として広く使用されるようになっている。Ambisomeは、アムホテリシンＢの抗真菌作用を維持する一方で、患者への投与において、生体細胞に対する傷害性の低下や腎臓への分布量の低下など、副作用を軽減する効果が認められている。
【０００４】
アムホテリシンＢを含むリポソーム製剤について、例えば特許文献１には、１種以上のリン脂質とコレステロールとを含む微小単層小胞に封入されたポリエン抗真菌抗生物質を含み、前記小胞が低イオン強度の糖水溶液に懸濁されている全身性真菌感染症治療用注射可能組成物が開示されており、アムホテリシンＢを微小単層小胞であるリポソームに封入することで、抗真菌活性を維持しつつ、アムホテリシンＢの薬害を低減できることが示されている。また、特許文献２には、リポソーム製剤の製造において、ポリエン抗真菌抗生物質とホスファチジルグリセロールとの可溶性複合体を酸性有機溶媒中で形成させることにより、リポソーム製造時のアムホテリシンＢの溶解に用いる有機溶媒量を低減し、リポソーム形成に至るステップを簡素化できることが記載されている。
【０００５】
しかしながら、Ambisome は凍結乾燥製剤であるため、患者への投与前に薬液の調剤工程を必要とする。図１に示すように、調剤は、４つの工程からなり、投与に至るまでに５つのステップを踏むことになる。具体的には、凍結乾燥ケーキ状態のAmbisomeへの注射用水の添加（ステップ１）、混合（ステップ２）、溶け残りを除去するための５μｍフィルターでのろ過（ステップ３）、５％グルコース溶液への添加（ステップ４）、及び投与（ステップ５）が必要となる。一連の工程に関して評価した報告書では、調剤の工程、特に、ステップ３のろ過工程に煩雑さを訴える使用者が多く、煩雑さを訴える割合は９割近くであった。また、Ambisomeの使用頻度は、白血病患者の感染症予防もしくは治療において非常に高くなっているところ、フィルターろ過等の工程は、調製ミスを引き起こし、菌の混入リスクを高める原因になることが懸念されている（非特許文献１）。
【０００６】
Ambisomeが凍結乾燥品である理由は、水系連続相にサブミクロン以下のリポソームが分散すると水−油の関係から不安定な状態となり、懸濁液製剤とすることが難しいためとされている。この点、Ambisomeと同様にリポソーム製剤であるＤＯＸＩＬ（登録商標）は、懸濁液製剤であり、２０か月間の安定性が保証されている。Ambisomeが懸濁液の状態で不安定な理由は明らかではないものの、リポソームを構成するコレステロールがアムホテリシンＢと結合することで、安定性が低下するものと考えられている。こうした製剤の不安定性を考慮して、ステップ４において、５％グルコース溶液にAmbisomeを添加した後には、調製後６時間までに調整した懸濁液を使用しなければならないことが定められている。また、Ambisomeの「医薬品インタビューフォーム」においては、ステップ４に用いる溶解液について、「生理食塩水等の電解質溶液を使用しない」ことが定められている。生理食塩水を配合することで、懸濁液に濁りが生じ、リポソームの分散性が低下することが確認されているためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−１５４７５号公報
【特許文献２】特許第２９５８７７４号公報
【０００８】
【非特許文献１】ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ １３０（３）, ４５７―４６１, ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、調剤工程を経ることなく患者への投与に直接使用でき、長期間保存した場合に安定なポリエンマクロライド系抗生物質を生体に投与するための液状プレミックス製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来はポリエンマクロライド系抗生物質を封入したリポソームを含む水性懸濁液の安定性を低下させるとされていた電解質に着目し、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ｐＨ調整剤として、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水から選ばれる少なくとも１種を用い、当該懸濁液のｐＨを６．０〜７．０の範囲に調整することで、長期保存した場合の懸濁液の安定性が改善されることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、ポリエンマクロライド系抗生物質を生体に投与するためのプレミックス製剤であって、（ａ）リポソームに封入されたポリエンマクロライド系抗生物質、（ｂ）ｐＨ調整剤、及び（ｃ）医薬的に許容される少なくとも１種以上の非電解質を含み、前記（ｂ）のｐＨ調整剤によりｐＨが６．０〜７．０に調整されたものであることを特徴とするポリエンマクロライド系抗生物質のプレミックス製剤を提供するものである。
【００１２】
プレミックス製剤は、現場での調剤を必要としない製剤である。図４（本製剤の投与までの流れ）に示すように製剤をすぐに投与可能なready-to-use可能な形として製剤(プレミックス製剤)を提供し、投与までの工程（例えば図１に示す５つのステップ）をなくす製剤であり、現行の調製方法でおこなった製剤よりも安定性を高めたプレミックス製剤である。
ここで、投与は、例えば静脈注射であり、ソフトバッグ等のバッグ、プラボトル、スタンディングパウチやバイアルとしてすぐに使用可能な形態で提供する。
注射液製剤は、注射針を用いて皮内、皮下の組織又は血管内などに直接投与する液状の医薬品製剤である。
【００１３】
本発明で使用する容器を形成する材料としては、合成樹脂を用いることができる。バイアルの場合はガラスであっても良い。ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル等を用いることができる。さらにオレフィン系エラストマーやスチレン系エラストマー等の熱可塑性エラストマー、環状オレフィン系樹脂などを配合することができる。また、これらの材料を組み合わせて多層容器とすることができる。
【００１４】
本製剤の保存条件は特に限定されないが、１〜３０℃、より好ましくは１〜２０℃、さらに好ましくは１〜１５℃である。
【００１５】
水性懸濁液は、水系溶媒（水を含む溶媒）にリポソームが分散している状態の液体をいう。本発明に係る液状プレミックス製剤は、水性懸濁液として提供される。
本発明の液状プレミックス製剤の製造方法は、水性懸濁液を得るまでの工程とその後の工程とに分けることができる。水性懸濁液を得るまでの工程は、例えば、脂質均一化工程、水和工程、整粒化工程、そして必要なら膜修飾工程とからなる。水性懸濁液を得てからの工程は、主に無菌化工程である。
水和工程において水和に用いる液は、水性緩衝液（水を含む緩衝液）である。ここにいう緩衝液は、ｐＨ緩衝液であり、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などである。後述するｐＨ調整剤と同一のものを用いても良いし、異なるものを用いることもできる。
水性懸濁液の最終的なｐＨ調整は、ｐＨ調整剤を用いる。ｐＨ調整剤として、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水のうちから選ばれる少なくとも一種を用いることができる。
非電解質とは、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グルコース、フルクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどの糖質類があげられる。中でも糖質類は幅広く用いられていることから好適である。
本発明は、添加物をさらに含むものであってもよい。このような添加物の例として、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤、前述した生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。
添加物は、上記の中から適宜選択され、あるいはそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
リポソームは、リン脂質二重膜で形成される閉鎖小胞であり、膜を隔てて、閉鎖空間内の内水相と外水相とが存在する懸濁液の状態で存在する。
リポソームの膜構造は、脂質二重膜の１枚層からなるユニラメラ小胞（Unilamellar Vesicle）および多重ラメラ小胞（Multilamellar Vesicle，ＭＬＶ）、またユニラメラ小胞としてＳＵＶ（Small Unilamellar Vesicle）、ＬＵＶ（Large Unilamellar Vesicle）などが知られている。本発明では、膜構造は特に制限されない。
【００１７】
本明細書にあっては、膜材と膜成分との用語を使い分ける。
膜材は、リポソームを形成する材料であり、主な膜材は、リン脂質である。リン脂質は、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基と、リン酸基より構成される親水性基とをもつ両親媒性物質である。リン脂質としては、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどのグリセロリン酸；スフィンゴミエリン（ＳＭ）などのスフィンゴリン脂質；カルジオリピンなどの天然または合成のジホスファチジルリン脂質およびこれらの誘導体；これらの水素添加物たとえば水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）などを挙げることができる。リン脂質は単一種または複数種組合せであってもよい。
【００１８】
リン脂質は、主膜材としての観点から、封入された薬物が、保存時に、または血液などの生体中で容易に漏出しないようにするため、相転移点が生体内温度（３５〜３７℃）より高い主膜材を用いることが望ましい。主膜材の相転移点は、４０℃以上であることが好ましい。このような相転移点をもつリン脂質として、上記のうちでも、ＨＳＰＣなどの水素添加リン脂質、ＳＭ、ホスファチジルグリセロールなどが好ましい。
【００１９】
リポソームを形成する膜材として、主膜材のリン脂質のほかに、リン酸を含まない脂質（他の膜脂質）を含むことができる。他の脂質としては、脂肪酸などが挙げられる。
【００２０】
リポソーム製剤を構成するものとして、上述の膜材、そして封入される薬物以外にもいくつかの成分を含み得る。それらの成分のことを、本明細書では、便宜上、膜材以外の膜成分、又は単に膜成分と呼ぶこととする。
膜成分としては、たとえば、膜安定化剤、酸化防止剤などを必要に応じて含むことができる。
膜安定化剤としては、たとえば膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、グリセロール、スクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、たとえばアスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが、本発明ではいずれも使用できる。使用される安定化剤および／または酸化防止剤は、剤型に応じて上記の中から適宜選択されるが、これらに限定されるものではない。このような安定化剤および酸化防止剤はそれぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
【００２１】
リポソーム膜成分の脂質というときには、主膜材のリン脂質、他の膜材としての脂質および上記膜安定化剤であるステロールなどの脂質、さらには後述の膜修飾剤に含まれる脂質など、薬物以外の脂質をすべて含む意味で用いられる。
このような膜成分の脂質全量を１００ｍｏｌ％とするとき、リン脂質は、通常２０〜１００ｍｏｌ％であり、好ましくは４０〜１００ｍｏｌ％であり、他の脂質は、通常０〜８０ｍｏｌ％であり、好ましくは０〜６０ｍｏｌ％である。
【００２２】
膜修飾剤（又は膜修飾成分）は、例えばリポソーム製剤を人体中の目的組織まで届ける目的で、膜の表面を修飾する成分として用いられる。たとえば親水性高分子、および他の表面修飾剤が挙げられる。例えば、リポソームを生成させた後、整粒化工程後に添加することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ポリエンマクロライド系抗生物質、特にアムホテリシンＢを封入したリポソーム製剤を含む懸濁液を安定した状態で長期間保存することができるため、当該リポソームを含む懸濁液状のプレミックス製剤を提供することができる。
また、夾雑物が少なく、投与時にフィルターろ過不要なプレミックス製剤とすることができる。
目的とする粒子径のみを有する均一なリポソーム製剤を得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】乾燥凍結製剤を使用する際のプロセスを示す図である。
【図２】凍結乾燥による粒子径変化の測定結果を示すグラフである。
【図３】保存安定性（加水分解物生成挙動）についての実験結果を示すグラフである。
【図４】本発明に係るプレミックス製剤の使用の際のプロセスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のプレミックス製剤は、ｐＨ調整剤を用いてポリエンマクロライド系抗生物質を封入したリポソームの懸濁液をｐＨ６．０〜７．０に調整し、非電解質を加えたものである。（ａ）リポソームに封入されたポリエンマクロライド系抗生物質、（ｂ）ｐＨ調整剤、及び（ｃ）医薬的に許容される少なくとも１種以上の非電解質液を含み、前記（ｂ）のｐＨ調整剤によりｐＨが６．０〜７．０に調整されている。
ポリエンマクロライド系抗生物質としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチンなどが挙げられる。前記ｐＨ調整剤は、特に制限されないが酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水から選ばれる少なくとも１種を用いることができる。
以下、ポリエンマクロライド系抗生物質、特にアムホテリシンＢを封入したリポソーム製剤の製造プロセスについて説明し、その調整方法について述べる。凍結乾燥の是非についての知見を得るための実験（２ｎｄピークの有無）について説明し、最後に懸濁液をｐＨ調整して長期間保存すること（実施例１）、オートクレーブ滅菌の影響（実施例２）について説明する。
既に触れたように懸濁液を得るまでの工程は、例えば、脂質均一化工程、水和工程、整粒化工程、（そして必要ならば膜修飾工程）からなる。そして、懸濁液を得た後は無菌化工程がなされる。
【００２６】
《脂質均一化工程：アムホテリシンＢの可溶性複合体、脂質複合体粉末を形成する》
両親媒性薬物であるアムホテリシンＢをリポソームに導入するために、従来は、まずメタノールのような大量の揮発性の有機溶媒に溶かし、脂質混合物を添加し、有機溶媒を混合物から除去して脂質−アムホテリシンＢフィルムを形成することがなされ、溶媒の除去を例えば、丸底フラスコ中で乾燥するまで蒸発させることによって行っていた。また、透析を用いる別の方法もとられていた。
特許文献２に記載された方法では、大量の溶媒の蒸発工程または透析工程をなくすために、親油性の電荷複合体を形成する。本発明のプレミックス製剤には、この方法を適用することができる。この複合体の形成について、特許文献２の該当箇所を要約すると次の通りである。
可溶性複合体を、ｐＨ約1.0〜3.0に酸性化したクロロホルムとメタノールの溶液中溶解する間にプロトン化されたジステアロイルホスファチジルグリセロールとアムホテリシンＢとの間で形成することができる。アムホテリシンＢ−リン脂質複合体は、酸性化したクロロホルムとメタノールの少量に溶けているとき、ホスファチジルコリンとコレステロールと混合し得、制御した条件下で再現性よくスプレー乾燥することが可能で、その結果脂質粉末を生じる。
この脂質複合体粉末は、リポソーム調製のための出発物質であり、大量の流動性黄色粉末として得ることができる。
【００２７】
《水和工程》
リポソームは、この脂質複合体粉末の適量を水性緩衝液（水を含む緩衝液）で、約６５℃の温度で水和することにより形成できる。
前述したように、水性緩衝液は、ｐＨ緩衝液が用いられる。このｐＨ緩衝液は、本発明の特徴であるｐＨ調整剤と兼用して用いることもできる。また、別のｐＨ緩衝液を選択して用いることも可能である。リポソームが調整された後に、溶液を交換することが可能だからである。溶液のｐＨは最終的に６．０〜７．０になるように制御することができる。
水性緩衝液には、グルコースもしくはラクトースのような上述した糖類を本発明の非電解質として配合することができ、さらに本発明で許容される添加物をさらに添加してもよい。この糖類、添加物の添加は、水和工程の段階で加えてもよいし、最終製剤を調整するまでのいずれかの段階で加えてもよい。
【００２８】
《整粒化工程》
リポソームはそれから剪断力の適用を受けることにより整粒化される（整粒化工程）。例えば、超音波処理、ホモジェナイズ、凍結融解またはデタージェント溶液を脂質から透析により除くことにより形成することができる。
整粒化工程によりアムホテリシンＢのすべてがリポソーム画分に含まれるようになる。
【００２９】
《凍結乾燥》
本発明においては、必要な工程ではないが、上述の整粒化工程の後に、適当な条件下でバイアル中で凍結乾燥を行なうと、乾燥した黄色いケーキもしくはプラグの物質が形成される。その後、バイアルに水を入れて固形のケーキを溶かすと、注射用に適したアムホテリシンＢリポソームの懸濁液を形成できる。
この凍結乾燥工程を経ずに、アムホテリシンＢリポソームの懸濁液を形成することもできる。本発明のプレミックス製剤にあっては、中間工程としての凍結乾燥工程は、なくてもよいものである。むしろこの凍結乾燥工程は、粗大粒子が発生し、夾雑物の原因となることが、次に述べる実験により明らかとなった。したがって、凍結乾燥工程を用いる場合には、この点に留意する必要がある。すなわち、プレミックス製剤中のリポソームは、リポソームの安定性の観点から凍結乾燥製剤でないものが好ましい。
本発明に係るプレミックス製剤の最終製品の形態は、特に制限されないが、リポソームが懸濁液としてｐＨ調整剤、非電解質液と混合されて提供されるものであって、臨床現場における調剤行為を不要とするものである。
【００３０】
《凍結乾燥による粒子径変化についての実験》
本発明者らは、アムビゾーム（アムビゾーム点滴静注用５０ｍｇ、大日本住友製薬株式会社製）が凍結乾燥によりどのような影響を生じるかをその粒子径測定により調べた。ここでその実験について述べる。比較例１、調整例１、調整例２を表１に従い調製した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
調製した試料につき、粒子径を測定した結果を以下の表２に示した。比較例１について測定したのは、その調整直後の測定である。調整例１は、比較例１と同じものについて室温下で２日間保存した後の測定をしたものである。調整例２は、比較例１と同様に調整したAmbisomeの注射用水分散液のろ過液を２日間かけて凍結乾燥し、凍結乾燥した試料（凍結乾燥ケーキ）に注射用水を加え分散させたのち、５％グルコース溶液を３ｍＬ加えたものについて、測定したものである。
粒子径測定方法は、試料100μLを水3mLに分散し、測定用試料とする。この液につき、Zetasizer Nano ZS90（Malvern社製）を用いて測定する。この測定装置は、0.3ｎｍ〜５μｍまでの直径について、動的光散乱法による測定が可能である。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
表２に結果を示したように、プレミックスを想定した調製例1では、初期値である比較例1と同等の粒子径を示し、かつ、メインピーク以外の粒子径ピークは認められなかった。しかし、凍結乾燥を実施した調製例2では、粒子径の増加とメインピーク以外の粒子ピーク(２ｎｄピーク)が検出された。この２ｎｄピークの粒子径は、４〜５μm付近に認められ、凍結乾燥により粗大粒子が発生することが明らかである。調整例１には、この２ｎｄピークが見られず、調整例２に２ｎｄピークが見られたことは、その原因が二日間経過したことにあるのではなく、凍結乾燥したことにあることがわかる。
【００３５】
調整例２についての測定結果のグラフを図２に示す。図２は、片対数グラフであり、横軸が粒子径であり対数目盛である。縦軸が散乱強度（%）である。図２に見られるように、メインピークが１００ｎｍ付近に見られ正規分布に近いきれいな分布をしている。そして、４〜５μｍ付近に２ｎｄピークが見られる。
本願にあっては、リポソームの粒子径が均一であるとは、リポソームの粒子径測定をするときに、メインピークのみが検出され、２ｎｄピークがないことを意味するものとする。この意味においてリポソームの粒子径が均一であるリポソーム製剤（注射製剤）は、２ｎｄピークによる粗大粒子を含まないので、医療現場において、調剤をすることなくそのまま用いることができる。
【００３６】
凍結乾燥製剤は液体製剤と比べ安定性に優れていることがすでに知られている。従って、安定性に課題を抱える製剤では、凍結乾燥製剤が最善である。一般的な凍結乾燥製剤は、溶解液を添加することにより容易に溶解し、さらにその溶解状態は、目視にて確認できることから、溶解後にフィルターろ過といった操作は不要である。
リポソーム製剤においても、同様に凍結乾燥により原薬およびリポソームを構成する脂質は、液体製剤と比較して安定性が高いと推測される。しかし、凍結乾燥リポソーム製剤を溶解液に分散させた場合、リポソームは微粒子製剤であり、溶液は懸濁状態であるため、分散状態を確認するのは困難である。さらに、溶解液添加後にリポソームの粒子径の増加と粗大粒子が発生することがこの実験により示された。リポソーム製剤にとってリポソームの粒子径は重要パラメータの一つであるとともに、粗大粒子の発生により予期しない副作用を及ぼす可能性がある。従って、Ambisomeのような凍結乾燥製剤では、粗大粒子の投与リスクを抑えるために、フィルターが必要な部材であることが示唆される。
【００３７】
《懸濁液を得てから後の工程について》
無菌化工程は、リポソーム形成工程後に滅菌する工程である。滅菌の方法は特に限定されず、たとえば、ろ過滅菌、高圧蒸気滅菌法、乾式加熱滅菌法、エチレンオキサイドガス滅菌法、放射線（たとえば、電子線、ｘ線、γ線など）滅菌法、オゾン水による滅菌法、過酸化水素水を用いる滅菌法を用いることができる。
高圧蒸気滅菌法を用いる場合には、例えば次の手順による。
上記工程を経た製剤が、医薬的に許容される少なくとも１種以上の非電解質を含み、ｐＨ調整剤が、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水から選ばれる少なくとも１種を含み、ｐＨが６．０〜７．０に調整されたものとして、より好ましくはｐＨ６．３〜６．７に調整されたものとして、例えばポリプロピレン樹脂にて作製された点滴用バッグに密封された状態で、例えば、オートクレーブを用いて２ａｔｍ、１２１℃で２０分間、高圧蒸気滅菌される。
このように、点滴用バッグに密封された最終製剤は、脂質の安定性および粒子径など物理化学的安定性などの観点から、室温（一般的に２１℃〜２５℃）、好ましくは０〜８℃での冷蔵で保存することができる。
なお、酸化防止の観点からは、最終製剤は窒素充填包装とすることが望ましい。さらに、ガス透過性を有する容器に収納し、脱酸素剤とともにガスバリア性を有する包材で密封包装しても良い。
【００３８】
《望ましい製法について》
ここまで述べたように、本発明のプレミックス製剤は、水性懸濁液を得てから最終的なｐＨ調整を、ｐＨ６．０〜７．０好ましくは、ｐＨ６．３〜６．７にすることが特徴の一つである。懸濁液を得るための方法は、いくつかあるうちの一例を上述した。水和法を用いる場合の水和液としてｐＨ緩衝液を用いることができること、そしてその水和液と本発明のｐＨ調整剤として用いるｐＨ緩衝液とを兼用することが可能であること、異なるものとすることも可能である。いずれにしても、水和の段階からあるいは、最終的な水性懸濁液を調整する段階において、ｐＨ調整剤を用いて、所望のｐＨを得ることは本発明の技術的思想の範囲内である。
【００３９】
凍結乾燥工程を経ていない製造方法が好ましいことについても既に述べた。凍結乾燥工程を経て製造した場合には、粗大粒子の発生（４〜５μｍの２ｎｄピーク）により所望の大きさの均一な粒子にならないからである。凍結乾燥工程を経ない場合には、この粗大粒子の発生がない。本明細書にあっては「夾雑物が低減される」とは、この２ｎｄピークがなく、一つのピークをもつ分布をもつことを意味する。
また、「粒子径が均一なものである」とは、本明細書にあっては、所望の粒子径に近いものであることを意味する。
【００４０】
上述のｐＨ調整をして長期保存することにより得られるリポソーム粒子の均一性保持については、実施例１、実施例２の実験データを参照しつつ後述するが、上述のｐＨ調整により長期間（２か月間）にわたって粒子径が均一な状態で維持できる。
【００４１】
次に実施例、試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。本発明はこれらの実施例、試験例に限定されるものではない。
《実施例１》
本実施例において、pH4.0/10mM酢酸緩衝液は、酢酸ナトリウム三水和物 1.36gを水に溶解し1000mLとした後、酢酸を加えてpH 4.0とする。
1mM酢酸緩衝液は、pH4.0/10mM酢酸緩衝液 50mLをとり、水を加えて50mLとする。
pH4.5酢酸緩衝液は、酢酸ナトリウム三水和物1.7gをはかり、水を加えて1000mLとした後、酢酸を加えてpH 4.5とする。
アムホテリシンＢの定量方法は、水で希釈した試料1mLにアセトニトリル4mL、1mM酢酸緩衝液を加えた後、メタノールを加えて10mLとし、測定用試料とする。
別に、アムホテリシンＢ 16mgを量りとり、DMSO 4mLを加え、溶解させた後、さらにメタノールを加えて50mLとし、標準原液とする。この液をメタノールで希釈し、40-160mg/mLのアムホテリシンＢ標準溶液を調製する。さらに、これら標準溶液1mLをとり、アセトニトリル4mL、1mM酢酸緩衝液1mLを加えた後、メタノールで10mLとした液を検量線用標準液とする。
【００４２】
測定用試料および検量線用標準液につき、下記のHPLC条件に従い、測定を実施する。試料中のアムホテリシンＢ濃度は、希釈率を考慮し、検量線式より算出する。
HPLC条件は、次の通りである。
カラム: ODSカラム (4.6 x 150mm, GL science社製)
カラム温度: 40℃
流速: アムホテリシンＢの保持時間が10分付近となるように調整
測定波長: 383nm
脂質定量方法
脂質定量は、非特許参照文献(Biochim. Biophys, Acta 2012, 1818(11), 2801-2807)の方法に従い、測定を実施した。
ｐＨ測定方法は、ｐＨメーターを用いて測定する。
【００４３】
《保存安定性（加水分解物生成挙動）について》
以下の表３に従い調製した。調製した製剤を25℃/60%RHで保存安定性について検証した。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
その結果、アムホテリシンＢ濃度、粒子径およびpHに大きな影響はみとめられなかった。その一方で、pHを調製していない調製例３は、pHを調製した調製例４と比較して、脂質類の含量低下ならびに脂質加水分解物生成率が明らかに増加することが明らかなった。ここで脂質加水分解物は、lyso-form  （リゾ体）とも呼ばれるものであり、リン脂質の脂質部分が切れてしまったものである。試験結果を表４及び図３に示す。
図３は、保存安定性（加水分解物生成挙動）についての実験結果を示すグラフである。図３において横軸は保存期間を示す時間軸であって、単位は週（week）である。縦軸は脂質加水分解物の生成率を示している。上述したように、脂質加水分解物は、リポソームの主膜材であるリン脂質の脂質部分が切れてできたものであるから、少ない方が好ましい。調整例３では、８週間（２か月）経過後には、脂質加水分解物が４０％近く生成された。しかし、調整例４では、８週間経過後における脂質加水分解物の生成は１０％程度に抑えられた。
このことは、ｐＨを６．５に調整することで、リン脂質の分解が抑制されたことを示している。
なお、ここで用いたｐＨ調整剤は、水酸化ナトリウムである。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
現在のAmbisome製剤は、5%グルコースに混合後6時間以内に使用することとなっている。この理由は、おそらく本実験で示したように脂質の分解によるものと考えられる。この脂質分解は、pHを調製することによって制御可能であると考えられる。しかし、無菌性の観点から現場でのpH調整は困難である。
臨床現場において、医療過誤の観点から簡便かつ安全に使用できる薬剤が望まれているのは言うまでもない。特に、凍結乾燥製剤は、現場での調剤が要求されるため、簡便な調工程が望まれる。凍結乾燥製剤の多くは、溶液状態での安定性に課題を有している。
Ambisomeの調製工程は、図1に示したように多くのステップを含むものであり、さらに、5%グルコース液中での安定性が悪いこと、さらに、5%グルコース液以外で希釈すると製剤の品質に影響があることが知られている。
こうした観点から安定性がよく、すでに投与濃度として調製され、製剤 (プレミックス製剤)として提供することにより医療現場における調剤業務負担軽減および希釈液間違えにより医療過誤の低減に寄与できると考えられる。
【００４８】
《実施例２》
《AC滅菌による影響》
次に、オートクレーブ（ＡＣ）滅菌による影響について実験した。
以下の表５に従い、調製を行った。調整例７では、ｐＨ調整剤として実施例１と同じものを用いた。
【００４９】
【表５】
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【００５０】
以下の結果に示すように、オートクレーブ滅菌していない調製例5に対して、pHを調製していない調製例6は明らかな粒子径低下とリゾ体生成率の増加が認められた。その一方で、pHを6.5に調製した調製例7は、リゾ体生成率の若干の増加が認められるものの、そのほかの測定結果は、調製例5と同等であった。本実施例の結果より、pH6.5にすることにより脂質の安定性だけでなく、粒子の安定性にも大きく影響することが明らかとなった。
すなわち、本発明によるｐＨ調整は、リポソームの脂質の安定性を保持することに役立つのみならず、リポソームの粒子径が均一のままで長期間にわたって維持できる効果をもたらす。
【００５１】
【表６】
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【００５２】
上述したように臨床現場における調製工程は、菌の混入リスクが高まる。医療現場で可能である滅菌工程としては、乾熱滅菌、0.22μｍによるフィルター滅菌、オートクレーブ滅菌である。リポソーム製剤が熱に弱い微粒子製剤であることに基づく。しかし、現場でリポソーム製剤のフィルター滅菌することにより、リポソーム粒子の分布等が変わり、品質に大きく影響する可能性がある。さらには、リポソームに熱を加えることによるリン脂質の分解や、リポソーム粒子径が変化する可能性がある。このようにリポソーム製剤の特性を考慮するといずれの滅菌方法も採用し難い。
【００５３】
上述したように、Ambisomeの調製工程は、4つのステップを経て調剤がなされた上で投与されるが、投与に至るまでに、フィルターろ過が必要であったり、調剤中に菌の混入リスクが高くなるという観点を鑑みるとプレミックス化、つまり、図４に示すように開封後すぐに投与できる製剤が望まれている。しかし、現状の製剤でも現場で投与に供するステップまで調製し、保存することは理論的には可能であるが、リン脂質の安定性の観点、無菌の維持、無菌化処理の観点から市販のAmbisome製剤では困難である。しかし、医療現場ですぐに利用できる製剤を提供すること、その提供製剤は、安定性や無菌性について十分に考えられた処方あるいは設計をすることで現在課題となっている医療現場における煩雑さ、菌混入リスクを解消することが可能であり、医療現場の負担軽減になると考えられる。
【００５４】
《本発明の作用》
現在販売されているAmbisome製剤は、5%グルコースに混合後6時間以内に使用することとなっている。この理由は、本発明の実験で明らかとなったように脂質の分解によるものと考えられる。この脂質分解は、pHを調製することによって制御可能であることが、本発明により明らかとなった。しかし、無菌性の観点から臨床現場におけるpH調整は困難である。
臨床現場において、医療過誤を防止する必要から簡便かつ安全に使用できる薬剤が望まれているのは言うまでもない。特に、凍結乾燥製剤は、現場での調剤が要求されるため、簡便な調剤工程が望まれる。凍結乾燥製剤の多くは、溶液状態での安定性に課題を有している。
Ambisomeの調製工程は、図１に示したように多岐にわたり、さらに、5%グルコース液中での安定性が悪いこと、さらに、5%グルコース液以外で希釈すると製剤の品質に影響があることが知られている。
こうした観点から安定性がよく、すでに投与濃度として調製され、製剤 (プレミックス製剤)として提供することにより医療現場における調剤業務負担軽減および希釈液間違えにより医療過誤の低減に寄与できる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、プレミックス製剤に利用可能である。また、その製造方法のみならず、その保存方法にも同様に利用可能なものである。すなわち、上述のAmbisomeの凍結乾燥製剤を臨床現場に代わって調剤する調剤サービスを業として提供する業務を行う者がいる場合に、その者が調剤後の薬剤を保存する行為もまた、本発明に係るプレミックス製剤を製造している行為と同視できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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