(57)【要約】【課題】糖タンパク質のＮ型糖鎖修飾可能部位に実際にＮ型糖鎖が付加している部位を検出する方法と、その部位においてＮ型糖鎖の付加状態を測定する方法を提供する。【解決手段】Ｎ型糖鎖が付加した糖タンパク質を、ペプチドＮグリカナーゼによって脱Ｎ型糖鎖処理をしたのちに、ペプチドＮグリカナーゼによってＡｓｎ残基からＡｓｐ残基に変化したＮ型糖鎖修飾可能部位を、Ａｓｐ残基を認識するエンド型ペプチド分解酵素で処理し、得られたペプチド断片の質量を検出することによって、Ｎ型糖鎖修飾可能部位に実際にＮ型糖鎖が付加している部位を検出する。また検出の際のシグナル強度から、その部位において、Ｎ型糖鎖が付加している割合状態を測定する。【選択図】    図１
2015142555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質において、Ｎ型糖鎖が付加している部位及び／又は付加していない部位を検出する方法であって、
（Ａ）Ｎ型糖鎖修飾された糖タンパク質からＮ型糖鎖を除去すると共に、Ｎ型糖鎖が付加していたアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に変化させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた糖タンパク質を、アスパラギン残基またはアスパラギン酸残基特異的に加水分解してペプチド断片化する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたペプチド断片を検出する工程、並びに
（Ｄ）当初のＮ型糖鎖修飾された糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質を工程（Ｂ）と同様に加水分解して得られるペプチド断片と比べて、
・工程（Ｃ）で検出されたペプチド断片中には異なるペプチド断片が存在し、かつその異なるペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位又はそれに隣接するアミノ酸残基を含んでいると推定される場合には、そのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していたと判定する、及び／又は
・工程（Ｃ）で検出されたペプチド断片中には同一のペプチド断片が存在し、かつその同一のペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位を含んでいると推定される場合には、そのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していなかったと判定する
工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（Ａ）が、デアミダーゼ活性を有するペプチドＮグリカナーゼ酵素を用いて行うものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デアミダーゼ活性を有するペプチドＮグリカナーゼ酵素が、ペプチドＮグリカナーゼ酵素ＦまたはペプチドＮグリカナーゼ酵素Ａである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（Ｂ）が、アスパラギン酸残基を特異的に認識して働くエンド型ペプチド分解酵素を用いて行うものである請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
アスパラギン酸残基を特異的に認識して働くエンド型ペプチド分解酵素が、Ａｓｐ−ＮまたはＧｌｕ−Ｃである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（Ｃ）が、質量分析計を使用して検出するものである、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載の方法により、糖タンパク質にＮ型糖鎖が付加している部位を検出し、検出の際のシグナル強度からＮ型糖鎖が付加している割合を測定する方法。
【請求項８】
複数の試料に対して、請求項１〜７いずれかに記載の方法によりＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定し、その結果を比較することを特徴とする、Ｎ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合が変化する糖タンパク質を検出する方法。
【請求項９】
請求項８の方法により検出された糖タンパク質であり、かつ疾患患者から得られた試料では、健常人から得られた試料と比べてＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合が異なることを特徴とする糖タンパク質。
【請求項１０】
試料中の請求項９に記載の糖タンパク質において、Ｎ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定することを特徴とする、疾患の検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜７いずれかに記載の方法によって、医薬品中の糖タンパク質においてＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質において、Ｎ型糖鎖が結合している部位又はその割合の測定方法に関するものである。より詳しくは、糖タンパク質のＮ型糖鎖修飾可能部位において、実際にＮ型糖鎖が付加している部位を検出する方法に関するものである。また糖タンパク質のあるＮ型糖鎖修飾可能部位において、その部位におけるＮ型糖鎖の付加状態が分子によって異なる場合、即ち不均一である場合に、その部位におけるＮ型糖鎖の付加の程度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質のＮ型糖鎖が結合する部位は、遺伝的にコードされたアミノ酸配列から予測することが可能であり、そのアミノ酸をＮ型糖鎖修飾可能部位と呼ぶ。即ち、ＡｓｎＸａａＳｅｒ又はＡｓｎＸａａＴｈｒ（Ｘａａはプロリン以外のアミノ酸を示す。以下、両者を併せて“ＮＸＳ／Ｔ”と表記する）という３アミノ酸の配列の最初のアスパラギン残基（以下“Ａｓｎ残基”と表記する）がＮ型糖鎖修飾可能部位であり、分泌タンパク質や膜タンパク質のようにＥＲ移行シグナル配列を持つタンパク質がこの部位を持つ場合、Ｎ型糖鎖修飾を受けている可能性がある。しかしながら、糖タンパク質の全てのＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加しているわけではなく、また同一の糖タンパク質の同一のＮ型糖鎖修飾可能部位であっても、分子によってＮ型糖鎖の付加の状態（有無）は異なり、Ｎ型糖鎖付加状態はタンパク質の立体構造や、発現する細胞種などに依存していると考えられている。
【０００３】
これまでに、Ｎ型糖鎖修飾可能部位に実際にＮ型糖鎖が付加している部位（以下“被Ｎ型糖鎖修飾部位”と表記する場合もある）を調べる方法は複数報告されており、様々な糖タンパク質の被Ｎ型糖鎖修飾部位が決定されている。
【０００４】
非特許文献１では、ＨＩＶの構造タンパク質であるｇｐ１２０の２次構造を決定する中で、Ｎ型糖鎖修飾可能部位におけるＮ型糖鎖修飾および結合しているＮ型糖鎖の構造の推定を行っている。その方法は、還元アルキル化したｇｐ１２０糖タンパク質を、デアミダーゼ活性を有するペプチドＮグリカナーゼ  Ｆ（以下、ＰＮＧａｓｅ  Ｆとする）またはエンド型ペプチド分解酵素の１つであるＥｎｄｏＨによって脱糖鎖処理し、さらにトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ等で消化して、逆相クロマトグラフィーにより分離して得られたクロマトグラムを、脱糖鎖していない糖タンパク質をトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ等で消化して得られたクロマトグラムと比較し、溶出時間が長くなったペプチドは、付加していたＮ型糖鎖が除去されたと判断する、即ちそのペプチドにはＮ型糖鎖が付加していたと判断する方法である。しかしながら非特許文献１には、ｇｐ１２０糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質をＡｓｐ−Ｎ等で消化し、得られたペプチド断片と比較することについては開示・示唆されていない。
【０００５】
また非特許文献２では、糖タンパク質を断片化した後に、レクチンによって糖鎖修飾ペプチドを回収し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで脱糖鎖処理を行い、ＬＣ／ＭＳで測定している。しかしながら、糖タンパク質をＡｓｎ残基又はアスパラキン酸残基（以下、Ａｓｐ残基とする）特異的に加水分解することについては、何ら開示・示唆はない。
【０００６】
また非特許文献３では、実際にＮ型糖鎖が付加している部位を決定する方法として、デアミダーゼ活性を有するＰＮＧａｓｅＦで糖タンパク質を脱糖鎖処理する際に、Ａｓｎ残基のアミノ基が除去され、その結果、Ａｓｐ残基に変化することを利用した方法が示されている。具体的には、糖タンパク質をＰＮＧａｓｅ  Ｆにより脱Ｎ型糖鎖処理し、続いてトリプシンなどのペプチド分解酵素によって断片化したペプチド断片が、Ｎ型糖鎖修飾可能部位を含み、かつ、その部位にＮ型糖鎖が結合していた場合には、その断片の質量が理論値よりも１ダルトン増加することを指標に決定するという方法である。しかしながら、非特許文献３の方法は、Ａｓｎ残基又はＡｓｐ残基を特異的に加水分解する酵素は使用していない。またこの方法は、Ｎ型糖鎖修飾可能部位におけるＮ型糖鎖付加状態が均一の場合には、実際にＮ型糖鎖が付加している部位を決定するのに有効な方法である。しかしながら、Ｎ型糖鎖修飾が不均一な場合には、得られるペプチド断片が当初のＡｓｎ残基を有する場合と、Ａｓｐ残基に変化した場合の、質量が１ダルトン違いの２つの断片が検出されることになる。実際の測定では、天然の同位体元素の影響を考慮する必要があり、１ダルトン違いの２つの質量が検出された場合、天然の同位体元素による質量の差なのか、Ａｓｎ残基とＡｓｐ残基の質量差に由来する１ダルトン違いであるのかを明確に判別することは非常に困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９０、２６５、１０３７３−１０３８２
【非特許文献２】Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３、２１、６６７−６７２
【非特許文献３】Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０１０、９１、２４６３−２４７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、糖タンパク質上のＮ型糖鎖が結合している部位を決定する手法を提供することにあり、さらには、分子によって糖鎖付加状態が不均一であっても、その付加状態を検出することが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、以下の通りである。
（１）糖タンパク質において、Ｎ型糖鎖が付加している部位及び／又は付加していない部位を検出する方法であって、
（Ａ）Ｎ型糖鎖修飾された糖タンパク質からＮ型糖鎖を除去すると共に、Ｎ型糖鎖が付加していたアスパラギン残基をアスパラギン酸残基に変化させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた糖タンパク質を、アスパラギン残基またはアスパラギン酸残基特異的に加水分解してペプチド断片化する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたペプチド断片を検出する工程、並びに
（Ｄ）当初のＮ型糖鎖修飾された糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質を工程（Ｂ）と同様に加水分解して得られるペプチド断片と比べて、
・工程（Ｃ）で検出されたペプチド断片中には異なるペプチド断片が存在し、かつその異なるペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位又はそれに隣接するアミノ酸残基を含んでいると推定される場合には、そのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していたと判定する、及び／又は
・工程（Ｃ）で検出されたペプチド断片中には同一のペプチド断片が存在し、かつその同一のペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位を含んでいると推定される場合には、そのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していなかったと判定する
工程、
を含むことを特徴とする方法。
（２）工程（Ａ）が、デアミダーゼ活性を有するペプチドＮグリカナーゼ酵素を用いて行うものである、（１）に記載の方法。
（３）デアミダーゼ活性を有するペプチドＮグリカナーゼ酵素が、ペプチドＮグリカナーゼ酵素ＦまたはペプチドＮグリカナーゼ酵素Ａである、（２）に記載の方法。
（４）工程（Ｂ）が、アスパラギン酸残基を特異的に認識して働くエンド型ペプチド分解酵素を用いて行うものである（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）アスパラギン酸残基を特異的に認識して働くエンド型ペプチド分解酵素が、Ａｓｐ−ＮまたはＧｌｕ−Ｃである（４）に記載の方法。
（６）工程（Ｃ）が、質量分析計を使用して検出するものである、（１）〜（５）いずれかに記載の方法。
（７）上述の（１）〜（６）いずれかに記載の方法により、糖タンパク質にＮ型糖鎖が付加している部位を検出し、検出の際のシグナル強度からＮ型糖鎖が付加している割合を測定する方法。
（８）複数の試料に対して、（１）〜（７）いずれかに記載の方法によりＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定し、その結果を比較することを特徴とする、Ｎ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合が変化する糖タンパク質を検出する方法。
（９）上述の（８）の方法により検出された糖タンパク質であり、かつ疾患患者から得られた試料では、健常人から得られた試料と比べてＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合が異なることを特徴とする糖タンパク質。
（１０）試料中の上述の（９）に記載の糖タンパク質において、Ｎ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定することを特徴とする、疾患の検出方法。
（１１）上述の（１）〜（７）いずれかに記載の方法によって、医薬品中の糖タンパク質においてＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定する方法。
【００１０】
以下に本発明を更に詳細に説明する。はじめに、糖タンパク質において実際にＮ型糖鎖が付加している部位を検出する方法について説明する。
【００１１】
本発明において、対象となる糖タンパク質としては特に限定されるものではない。糖タンパク質のジスルフィド結合は工程（Ａ）に先立って、還元されていることが好ましく、還元され露出されたチオール基は、工程（Ｂ）のペプチド断片化処理前にアルキル化などの保護処理をされたものであることが好ましい。本発明において、試料としては特に限定はないが、電気泳動やカラム操作等の結果、他の糖タンパク質から分離された状態であることが好ましい。また、糖タンパク質を含有する医薬品も試料とすることができる。なお、対象とする糖タンパク質が試料中で他の糖タンパク質との混合状態にある場合には、そのまま工程（Ａ）を行い、次いで工程（Ｂ）のペプチド断片化処理前、即ち工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に、電気泳動やカラム操作等を行い、他のタンパク質から分離した後、対象とするタンパク質に対して工程（Ｂ）を行うことも好ましい方法である。
【００１２】
本発明において、工程（Ａ）で、Ｎ型糖鎖修飾された糖タンパク質からＮ型糖鎖を除去すると共に、Ｎ型糖鎖が付加していたＡｓｎ残基をＡｓｐ残基に変化させる。これは、糖タンパク質からＮ型糖鎖を除去する際に、Ｎ型糖鎖が結合していたＡｓｎ残基に由来するアミノ基をも除去することを意味する。その結果、Ａｓｎ残基はＡｓｐ残基に変化するというものである。この工程（Ａ）を行う方法としては特に限定されないが、好ましくはデアミダーゼ活性を有するペプチドＮグリカナーゼ酵素を使用する方法が挙げられる。デアミダーゼ活性をもつペプチドＮグリカナーゼ酵素は、Ｎ型糖鎖が結合していたＡｓｎ残基から、Ｎ型糖鎖を除去する際に、Ｎ型糖鎖に直接結合していたアミノ基をも除去する作用が有り、結果的にＮ型糖鎖が結合していたＡｓｎ残基はＡｓｐ残基へと変化する。デアミダーゼ活性をもつペプチドＮグリカナーゼ酵素としては特に限定されないが、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ペプチドＮグリカナーゼＡ等が挙げられ、最も好ましくはＰＮＧａｓｅ  Ｆである。
【００１３】
次に工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で得られた糖タンパク質をＡｓｎ残基またはＡｓｐ残基特異的に加水分解し、ペプチド断片化する。この時、Ｎ型糖鎖が結合していたＮ型糖鎖修飾可能部位では、当初のアミノ酸残基であるＡｓｎ残基からＡｓｐ残基に変化しているため、Ａｓｎ残基またはＡｓｐ残基特異的に加水分解することにより、当初の糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質を同様に加水分解して得られるペプチド断片と比較して、異なるペプチド断片が生じることになる。Ａｓｎ残基又はＡｓｐ残基特異的に加水分解する方法としては特に限定されないが、好ましくはＡｓｎ残基又はＡｓｐ残基を特異的に認識して働くエンド型ペプチド分解酵素による加水分解である。特に、Ａｓｐ残基を特異的に認識して働くエンド型ペプチド分解酵素による加水分解が好ましく、Ａｓｐ−ＮやＧｌｕ−Ｃ等が用いられる。
【００１４】
工程（Ｂ）では、その後の分析を容易にするために、更に異なる特異性を有するエンド型ペプチド分解酵素を１つ以上用いて処理をしてもよい。ここで使用する酵素の種類は、分析するタンパク質もしくはペプチドの配列情報に基づいて決定すればよく、Ａｓｐ残基、Ａｓｎ残基を認識する酵素以外であることが好ましい。このエンド型ペプチド分解酵素としては、特に限定されないが、具体的にはトリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃなどが挙げられる。このような酵素で処理することにより、より短いペプチド断片が得られるようになり、次の工程（Ｃ）で検出が容易となる場合がある。
【００１５】
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）で得られたペプチド断片を検出する。その方法としては、特に限定はされないが、質量によって検出することが好ましく、具体的には質量分析計によって、生成したペプチド断片の質量を測定する方法が望ましい。この場合、その質量からペプチド断片を構成するアミノ酸を推定することができ、また、糖タンパク質のアミノ酸配列が公知であれば、その配列のどこに由来するペプチドであるかを推定することもできる。また、ここで検出された特定の質量を有するペプチド断片に対して、さらにイオン化してアミノ酸組成を分析する方法によってペプチド配列を同定する手法であるタンデム質量分析法を行うことにより、エンド型ペプチド分解酵素によって断片化されたペプチドのアミノ酸配列を決定してペプチド断片を同定することも可能である。
【００１６】
工程（Ｄ）では、当初のＮ型糖鎖修飾された糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質を工程（Ｂ）と同様に加水分解処理して得られるペプチド断片（Ｉ）と比較して、工程（Ｃ）で検出されたペプチド断片（ＩＩ）には異なる断片が存在し、かつその異なるペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位又はそれに隣接するアミノ酸残基を含んでいると推定される場合には、そのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していたと判定する。及び／又は、当初のＮ型糖鎖修飾された糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質を工程（Ｂ）と同様に加水分解処理して得られるペプチド断片（Ｉ）と比較して、工程（Ｃ）で検出されたペプチド断片（ＩＩ）には同一の断片が存在し、かつその同一のペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位を含んでいると推定される場合には、そのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していなかったと判定する。
【００１７】
このとき、当初のＮ型糖鎖修飾された糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質とは、その糖タンパク質の遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列ということもでき、これは糖鎖を有しないものである。そのようなタンパク質を工程（Ｂ）と同様に加水分解して得られるペプチド断片（Ｉ）と比べるとは、実際に工程（Ｂ）と同様に加水分解を行い、得られたペプチド断片と比較してもよいが、そのようなタンパク質のアミノ酸配列が公知であれば、その配列から加水分解される箇所を推定し、得られるペプチド断片を推定してそれと比較してもよい。
【００１８】
以上説明した本発明の方法について、図１にその概要を示す。図１では、説明の簡略化のために、工程（Ａ）でＰＮＧａｓｅ  Ｆを、工程（Ｂ）でＡｓｐ−Ｎを用いた場合を例にして示した。なお図１の配列で、Ｘはプロリン以外のアミノ酸を示す。まず、Ｎ型糖鎖修飾された糖タンパク質（当初の配列）は、２ヶ所のＮ型糖鎖修飾可能部位を有するが、そのうち１ヶ所のみ糖鎖が付加している。これを工程（Ａ）：ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理すると、Ｎ型糖鎖が除去されると共に、糖鎖が付加していたＡｓｎはＡｓｐに変化するが、糖鎖が付加していないＡｓｎはＡｓｎのまま残る。次いでこれを工程（Ｂ）：Ａｓｐ−Ｎで処理すると、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理によってＡｓｎがＡｓｐに変化した部分と当初から存在していたＡｓｐのＮ末端側でＡｓｐ−Ｎ酵素による切断がおきる。その結果、４つのペプチド断片（ｐｅｐＡ，ｐｅｐＢ，ｐｅｐＣ’，ｐｅｐ（Ｄ＋Ｅ））［へプチド断片（ＩＩ）に相当］が検出される。一方、当初のＮ型糖鎖修飾された糖タンパク質と同じアミノ酸配列を有するが糖鎖を有しないタンパク質をＡｓｎ−Ｎで処理した場合には、３つのペプチド断片（ｐｅｐＡ，ｐｅｐ（Ｂ＋Ｃ），ｐｅｐ（Ｄ＋Ｅ））［ペプチド断片（Ｉ）に相当］が検出される。この両者を比較して、ペプチド断片（ＩＩ）に相当するものには異なる断片（ｐｅｐＢ，ｐｅｐＣ’）が存在し、かつその異なるペプチド断片がＮ型糖鎖修飾可能部位又はそれに隣接するアミノ酸残基を含んでいるとペプチド断片の質量から推定されるため、そのＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加していたと判定する。
【００１９】
また本発明の方法によれば、あるＮ型糖鎖修飾可能部位においてＮ型糖鎖付加状態が不均一であっても、Ｎ型糖鎖が付加していたＮ型糖鎖修飾可能部位に由来するペプチド断片と、Ｎ型糖鎖が付加していなかったＮ型糖鎖修飾可能部位に由来するペプチド断片とを、明確に区別することが可能である。そのため、検出対象の糖タンパク質のＮ型糖鎖付加状態が均一でなくても、Ｎ型糖鎖が付加していた部位を検出することができる。
【００２０】
また本発明では、上述の方法により糖タンパク質にＮ型糖鎖が付加している部位を検出し、そのシグナル強度からＮ型糖鎖が付加している割合を測定することもできる。
【００２１】
また複数の試料に対して、上述のようなＮ型糖鎖が付加している部位または付加の割合を測定し、その結果を比較することにより、Ｎ型糖鎖が付加している部位または付加の割合が変化する糖タンパク質を検出することができる。
【００２２】
そしてこのようなＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合が変化する糖タンパク質であって、疾患患者から得られた試料と健常人から得られた試料ではＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合が異なるものは、疾患を検出する上で重要な情報である疾患マーカーとなりうる。このような疾患マーカーを発見する方法としては、図９に例示したような方法が挙げられる。図９では、試料に対してまず工程（Ａ）としてＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理を行う。その後、タンパク質を２次元電気泳動で分離し、分析対象とするタンパク質を抽出する（ここでは分析タンパク質＃１〜４）。その後、各分析タンパク質に対して工程（Ｂ）としてＡｓｐ−Ｎ消化を行う。そして得られたペプチド断片に対して工程（Ｃ）で質量分析を行うことによりペプチド断片を検出し、次いで工程（Ｄ）で分析タンパク質のＮ型糖鎖修飾可能部位の糖鎖の付加の有無を判定する。このとき、工程（Ｃ）（Ｄ）では、タンパク質データベースの情報に基づき分析タンパク質の同定やＮ型糖鎖修飾可能部位を含むペプチド断片の探索が行われる。最終的に、各分析タンパク質の各糖鎖修飾可能部位での糖鎖付加率を求める。なお工程（Ｃ）と工程（Ｄ）は、質量分析器の操作ソフトウェアーパッケージや、質量分析結果の解析ソフトウエアパッケージの機能として組み込むことも可能である。このような方法を疾患患者から得られた試料と健常人から得られた試料に対して行い、両者で差異がみられたものが疾患マーカーの候補となりうる。
【００２３】
よって、試料中に存在するそのような疾患マーカーのＮ型糖鎖修飾可能部位において、実際にＮ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定することにより、疾患を検出することができる。このような疾患マーカーを検出する方法としては、特に限定されないが、前述のような質量分析計を使用した方法のほかに、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法などに代表される免疫学的手法が一例として挙げられる。試料としては、血液、血清、血漿、尿などをあげることができる。
【００２４】
また前述のような本発明の方法を用いることにより、医薬品中の糖タンパク質のＮ型糖鎖修飾可能部位において、Ｎ型糖鎖が付加している部位又は付加の割合を測定することができる。例えば、抗体医薬の主成分である抗体、インターフェロンβ、エリスロポエチンなどのように、糖タンパク質が主成分であって糖鎖の有無が薬効に影響を与える医薬品においては、タンパク質への糖鎖付加状態が均一であることが求められている。本発明の方法によれば、このような医薬品の品質管理などを行うこともできる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、Ｎ型糖鎖修飾可能部位において、Ｎ型糖鎖が実際に付加している部位を検出することができ、またＮ型糖鎖が付加している割合を測定することができる。また本発明によれば、Ｎ型糖鎖の付加が不均一であっても、このような検出・測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の検出方法の一例を示した図である。
【図２】遺伝子配列情報から推定されるリボヌクレアーゼ  １（以下、ＲＮａｓｅ  １とする）のアミノ酸配列と、３カ所のＮ型糖鎖修飾可能部位を示した図である。
【図３】ＣＨＯ細胞で発現した組換え体ヒトＲＮａｓｅ  １とそのＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離結果を示す図である。
【図４】実施例１の質量分析の結果のうち、ＲＮａｓｅ  １由来のペプチド断片を抽出して示した図である。
【図５】実施例１において、Ｎ型糖鎖修飾可能部位であるＡｓｎ３４、Ａｓｎ７６、又はＡｓｎ８８を含むペプチドに由来する断片の検出の有無を、ＲＮａｓｅ  １の全長配列の上に示した図である。
【図６】実施例１における糖鎖修飾可能部位における糖鎖修飾の有無と、検出されるペプチドの関係を模式的に表した図である。
【図７】実施例２の質量分析結果のうち、ＲＮａｓｅ  １由来のペプチド断片を抽出して示した図である。
【図８】実施例２において、Ｎ型糖鎖修飾可能部位であるＡｓｎ３４、Ａｓｎ７６、又はＡｓｎ８８を含むペプチドに由来する断片の検出の有無を、ＲＮａｓｅ  １の全長配列の上に示した図である。
【図９】本発明の実施形態の一例を示した図である。
【図１０】実施例３において、大腸菌で発現したヒトインターフェロンガンマとそのＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離結果を示す図である。
【図１１】実施例３において、哺乳動物細胞ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現したヒトインターフェロンガンマとそのＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離結果を示す図である。
【実施例】
【００２７】
実施例１  Ａｓｐ−Ｎ消化によるＮ型糖鎖付加部位の検出
分析に用いた組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ  １は、常法に従ってチャイニーズハムスター卵巣由来培養細胞株（以下、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）にヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ  １全長遺伝子（配列番号１）を導入し、培地中に分泌した組換えタンパク質をアフィニティー精製することで得られたものを使用した。詳しく説明すると、ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ  １をコードする遺伝子配列（配列番号１）をｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃＨｉｓベクター（ライフテクノロジー社）に挿入した哺乳動物細胞用発現ベクターを作製した。作製した哺乳動物細胞用発現プラスミドは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ライフテクノロジー社）を用いて遺伝子導入し、培地中に分泌してきたヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ  １を抗ＲＮａｓｅ  １抗体を固定化したアフィニティーカラムを使用して、精製した。
【００２８】
ＲＮａｓｅ  １は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、そのうちＮ型糖鎖が付加する可能性がある配列（ＮＸＳ／Ｔ）は図２の下線で示した３カ所あり、Ｎ型糖鎖は３４、７６、８８番目のＡｓｎ残基（以下それぞれ“Ａｓｎ３４”，“Ａｓｎ７６”、“Ａｓｎ８８”と表記する）に結合可能である。使用したＣＨＯ細胞に発現した組換え体ＲＮａｓｅ  １は、国際公開第２０１３／１８７３７１号パンフレットに記載の方法により、Ａｓｎ８８における糖鎖の付加割合は全Ａｓｎ８８の８％であることを確認した。この試料においてＮ型糖鎖が実際に付加している部位、および全てのＮ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖の付加程度を測定した。
【００２９】
前述の組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ  １は、電気泳動上では図３左レーン；ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（−）に示した通り複数の分子量に分離された。
【００３０】
一方、２０μｇの組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ  １を還元変性した後に、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社）で処理することにより、糖鎖を除去したものは、電気泳動上ではアミノ酸配列から推定される分子量とほぼ一致する１５ｋＤａのバンドとなる（図３、右レーン；ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（＋））ことから、前述の複数の分子量はＮ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖付加量の違いによるものであると確認できた。
【００３１】
その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離した後に、ＰＶＤＦ膜に常法に従って転写した。転写されたＰＶＤＦ膜は、超純水中で洗浄した後にクマジーブリリアントブルーＲ２５０を含む溶液によって染色され、糖鎖を除去された組換え体ＲＮａｓｅ  １に相当する部分を切り出し、質量分析のために処理を行った。切り出されたＰＶＤＦ膜は、エンド型ペプチド分解酵素Ａｓｐ−Ｎを含むトリスバッファー（ｐＨ８．０）に加え、３７℃で２０時間処理した。サンプル溶液は、ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８（ミリポア社）処理し、マトリクス溶液に溶出し、プレートにスポットした。自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用したペプチドマスフィンガープリント法による質量分析を実施した（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ、アプライドバイオシステム社）。
【００３２】
表１の左側に、遺伝子配列から推定されるＲＮａｓｅ  １の配列（配列番号２）をＡｓｐ−Ｎで加水分解した際に生成するペプチド断片とその理論質量を示した。また表１の右側に、全てのＮ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加しているＲＮａｓｅ  １から、ＰＮＧａｓｅ  ＦによってＮ型糖鎖を除去することにより、全てのＮ型糖鎖修飾可能部位のＡｓｎ残基、即ち３４位、７６位、８８位のＡｓｎ残基がＡｓｐ残基に変化した配列（配列番号３）を、Ａｓｐ−Ｎで加水分解した際に生成するペプチド断片とその理論質量を示す。理論質量は、全てのアミノ酸残基が化学的修飾を受けていないものとして計算した値を示した。またペプチド断片のうち、質量分析によってＲＮａｓｅ  １由来のペプチド断片と帰属ができたものを検出の欄に○、帰属できなかったものを×と表記した。
【００３３】
【表１】
2015142555.tif 000003
【００３４】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆで糖鎖が除去された場合に、糖鎖が付加していたＡｓｎ残基は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆのデアミダーゼ活性によってＡｓｐ残基に変化する。従って、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで糖鎖が除去された糖タンパク質は、元々糖鎖が付加していたアミノ酸残基のＮ末端側でＡｓｐ−Ｎによって加水分解を受ける。一方、元々糖鎖が付加していなかったＡｓｎ残基ではＡｓｐ残基に変化することがなく、Ａｓｎ残基のままであるため、Ａｓｐ−Ｎによって加水分解を受けない。このように、Ｎ型糖鎖修飾可能部位は、糖鎖付加の有無によって断片化のされ方が異なる。
【００３５】
表２に、表１に記載されたペプチド断片のうち、実際に検出されたペプチド断片の質量と、アミノ酸の修飾を考慮した時に推定されるアミノ酸配列を示した。
【００３６】
【表２】
2015142555.tif 000004
【００３７】
図４に質量分析のスペクトルデータを示す。ＲＮａｓｅ  １に由来する複数のペプチド配列が検出された。図中、小枠内は、ｍ／ｚが２０００から３５００の範囲を拡大した図であり、ＲＮａｓｅ  １由来のペプチドのうち、Ａｓｎ７６に隣接するペプチド断片（５３−７５）及びＡｓｎ７６を含むペプチド断片（５３−８２）の質量（ｍ／ｚ：２６６３．１４９９、３４３３．４７７１）のピークにアミノ酸番号を記載した。
【００３８】
図５に、ＲＮａｓｅ  １から生成されるペプチド断片のうち、Ｎ型糖鎖修飾可能部位を含む部分に関して、検出された断片と検出されなかった断片をＲＮａｓｅ  １のペプチド配列上に図示した。実線が検出されたペプチド断片、破線が検出されなかったペプチド断片を示し、それぞれアミノ酸番号を線の下部に示した。
【００３９】
表１に示すように、Ａｓｎ３４を含む配列に由来する断片では、糖鎖が結合していたことを示す断片１６−３３（ＤＳＳＰＳＳＳＳＴＹＣＮＱＭＭＲＲＲ）［配列番号９］及び３４−５２（ＤＭＴＱＧＲＣＫＰＶＮＴＦＶＨＥＰＬＶ）［配列番号１０］に相当する質量のペプチドが検出され、結合していなかったことを示す断片は検出されなかった。Ａｓｎ７６を含む配列に由来する断片では、糖鎖が結合していたことを示す断片のうち、５３−７５（ＤＶＱＮＶＣＦＱＥＫＶＴＣＫＮＧＱＧＮＣＹＫＳ）［配列番号１１］は検出されたものの、７６−８２（ＤＳＳＭＨＩＴ）［配列番号１２］は検出されなかった。また糖鎖が結合していなかったことを示す断片５３−８２（ＤＶＱＮＶＣＦＱＥＫＶＴＣＫＮＧＱＧＮＣＹＫＳＮＳＳＭＨＩＴ）［配列番号６］も検出された。Ａｓｎ８８を含む配列に由来する断片では、糖鎖が結合していたことを示す断片８３−８７（ＤＣＲＬＴ）［配列番号１３］のみが検出され、８８−１２０（ＤＧＳＲＹＰＮＣＡＹＲＴＳＰＫＥＲＨＩＩＶＡＣＥＧＳＰＹＶＰＶＨＦ）［配列番号１４］は検出されなかった。また糖鎖が結合していなかったことを示す断片８３−１２０（ＤＣＲＬＴＮＧＳＲＹＰＮＣＡＹＲＴＳＰＫＥＲＨＩＩＶＡＣＥＧＳＰＹＶＰＶＨＦ）［配列番号７］も検出されなかった。
【００４０】
検出されなかった断片のうち、Ａｓｎ８８を含む断片であるアミノ酸番号８８−１２０は、対となる糖鎖が結合していたことを示す断片８３−８７が検出されていることから、存在はしていたものの、比較的分子サイズが大きい分子であるため、測定機器の限界で検出されなかったと考えられる。この断片はアミノ酸の修飾を考慮しない場合の理論質量が３７４８．８１１１であり、この質量より大きい断片は測定機器の限界で検出されないと考えられる。よって、アミノ酸番号１６−５２（理論質量：４２４３．９６７５）、アミノ酸番号８３−１２０（理論質量：４３３６．０９６０）に相当するペプチド断片は検出されなかったが、これらは理論質量がそれよりも大きい分子であり、もともと存在しなかったのか、又は存在はしていたものの測定機器の限界で検出できなかったのかは確認できなかった。なおアミノ酸番号７６−８２は、バックグラウンドが高い領域にあり検出されなかった。
【００４１】
このように、Ａｓｎ３４、Ａｓｎ７６、Ａｓｎ８８は、それぞれ糖鎖が付加している分子が存在することが明らかとなった。また糖鎖が付加していない分子に関しては、Ａｓｎ７６に糖鎖が付加していない分子が存在することが明らかとなったが、Ａｓｎ３４とＡｓｎ８８については確認できなかった。
【００４２】
また図３に示したように、ＣＨＯ細胞に発現した組換え体ＲＮａｓｅ  １は糖鎖付加状態の異なる分子種が複数あることが示唆されていたが、上記の分析方法によって、糖鎖の付加状態の一部が明らかになった。即ち、ＲＮａｓｅ  １のＡｓｎ７６を含む配列に由来するものとして２種類の異なる質量のペプチド断片が検出されたことから、図６に示したように、Ｎ型糖鎖修飾可能部位Ａｓｎ７６においては、糖鎖が付加しているものと付加していないものの混合状態であることが質量分析によって確認できた。
【００４３】
実施例２  Ａｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃ処理したＲＮａｓｅ  １の被Ｎ型糖鎖修飾部位の決定
実施例１で使用したＣＨＯ細胞で発現したＲＮａｓｅ  １を、常法に従ってカルバミドメチル化した試料（カルバミドメチル化ＲＮａｓｅ  １）を分析試料とし、エンド型ペプチド分解酵素Ａｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃでペプチドに断片化したものを質量分析計で分析した。以下に、分析手順を記載する。カルバミドメチル化ＲＮａｓｅ  １は、実施例１と同様にＰＮＧａｓｅ  Ｆによって脱糖鎖処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離し、ＰＶＤＦ膜に常法に従って転写した。転写されたＰＶＤＦ膜は、超純水中で洗浄した後にクマジーブリリアントブルーＲ２５０を含む溶液によって染色され、糖鎖を除去された組換え体ＲＮａｓｅ  １に相当する部分を切り出し、質量分析のために処理を行った。切り出されたＰＶＤＦ膜は、エンド型ペプチド分解酵素Ｌｙｓ−Ｃを含むトリスバッファー（ｐＨ８．０）に加え、３７℃で２０時間処理した後に、エンド型ペプチド分解酵素Ａｓｐ−Ｎを加えてさらに３７℃で２０時間処理した。サンプル溶液は、ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８（ミリポア社）処理し、マトリクス溶液に溶出、プレートにスポットした。自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用したペプチドマスフィンガープリント法による質量分析を実施した（ＡＸＩＭＡ−ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ、島津製作所、測定範囲：ｍ／ｚ  ８００−４０００）。
【００４４】
表３の左側に、遺伝子配列から推定されるＲＮａｓｅ  １をＡｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃで加水分解した際に生成するペプチド断片とその理論質量を示し、右側に、全てのＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加している場合のＲＮａｓｅ  １をＰＮＧａｓｅ  Ｆによって糖鎖除去後にＡｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃで加水分解した際に生成するペプチド断片とその理論質量を示す。理論質量は、全てのアミノ酸残基が化学的修飾を受けていないものとして計算した値を示した。ペプチド断片のうち、質量分析によってＲＮａｓｅ  １由来のペプチド断片と帰属ができたものを検出の欄に○、帰属できなかったものを×と表記した。
【００４５】
【表３】
2015142555.tif 000005
【００４６】
表４に、実際に検出されたペプチド断片の質量とアミノ酸の修飾を考慮した時に推定されるアミノ酸配列を示した。
【００４７】
【表４】
2015142555.tif 000006
【００４８】
なお表４のアミノ酸番号２−１５（配列番号２７）、７−１３（配列番号２４）、７−１５（配列番号２５）、６７−８２（配列番号２６）は、表３に記載されていないペプチド断片であるが、これはエンド型ペプチダーゼＡｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃによる加水分解が完全には進行しなかったことにより生成したと推測される。
【００４９】
実施例１に記載した通り、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで糖鎖が除去された場合に、糖鎖が付加していたＡｓｎ残基は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆのデアミダーゼ活性によってＡｓｐ残基に変化する。従って、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで糖鎖が除去された糖タンパク質は、元々糖鎖が付加していたＡｓｎ残基がＡｓｐ残基となり、そのＮ末端側でＡｓｐ−Ｎによって分解を受ける。一方、元々糖鎖が付加していなかったＡｓｎ残基ではＡｓｐ残基に変化しないので、Ａｓｐ−Ｎによる加水分解を受けない。また、Ｌｙｓ−ＣはＣ末端側にプロリン残基が結合している場合を除いて、リジン残基のＣ末端側のペプチド結合を加水分解する酵素であるので、糖鎖結合可能部位周辺でのペプチド断片化には関与しない。よって、Ａｓｐ−Ｎばかりでなく、Ｌｙｓ−Ｃをも使用した場合にも、Ｎ型糖鎖修飾可能部位を含む断片は、糖鎖付加の有無によって断片化のされ方が異なる。さらに、Ａｓｐ−Ｎだけで処理した場合よりもＡｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃで処理した方が検出されるペプチド断片が短くなることが期待され、実施例１のように測定機器の性能上検出できなかった断片も測定可能になると考えられる。
【００５０】
図７に、質量分析のスペクトルデータを示す。ＲＮａｓｅ  １に由来する複数のペプチドが検出された。図中、小枠内は、ｍ／ｚが１５００から２５００の範囲を拡大した図であり、ＲＮａｓｅ  １由来のペプチドのうち、Ａｓｎ８８を含むペプチド断片８８−１０２の質量（ｍ／ｚ：１７１４．８６００、１７７１．８９００）及び８３−１０２の質量（ｍ／ｚ：２３０１．２８００、２４１６．３６００）のピークにアミノ酸番号を記載した。
【００５１】
表３から明らかなように、Ａｓｎ３４、Ａｓｎ８８は、それぞれ糖鎖が付加している分子が存在することが明らかとなった。またＡｓｎ７６については、糖鎖が付加していることを示す断片であるアミノ酸番号７６−８２［配列番号１２］は、バックグラウンドが高い領域にあり検出できなかった。一方、糖鎖が付加していない分子に関しては、Ａｓｎ３４を含む断片（アミノ酸番号１６−５２）は理論質量（４２４３．９６７５）が質量分析計の測定限界（４０００）より大きいため、存在はしていたものの測定機器の限界で検出できなかったのか、又はもともと存在していなかったのかは確認できなかった。Ａｓｎ７６については、表４に示すようにエンド型ペプチダーゼＬｙｓ−Ｃによる加水分解が完全には進行しなかったことにより生成したと推測されるアミノ酸番号６７−８２に相当する断片が検出されていることから、糖鎖が付加していない分子が存在することが明らかとなった。また、Ａｓｎ８８を含む断片としてアミノ酸番号８３−１０２が検出されていることから、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していない分子が存在することが明らかとなった。
【００５２】
また図８に、ＲＮａｓｅ  １から生成されるペプチド断片のうち、Ｎ型糖鎖修飾可能部位を含む部分に関して、検出された断片と検出されなかった断片をＲＮａｓｅ  １のペプチド配列上に図示した。実線が検出されたペプチド断片、破線が検出されなかったペプチド断片を示し、それぞれアミノ酸番号を線の下部に示した。
【００５３】
実施例１の場合では、ＲＮａｓｅ  １のＡｓｎ８８に糖鎖が付加していなかった場合に生成される８３−１２０番目のペプチド断片（ＤＣＲＬＴＮＧＳＲＹＰＮＣＡＹＲＴＳＰＫＥＲＨＩＩＶＡＣＥＧＳＰＹＶＰＶＨＦ）［配列番号７］と、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していた場合に生成されるペプチド断片のうち８８−１２０番目のペプチド断片（ＤＧＳＲＹＰＮＣＡＹＲＴＳＰＫＥＲＨＩＩＶＡＣＥＧＳＰＹＶＰＶＨＦ）［配列番号１４］を検出することができなかった。これに対し実施例２では、Ａｓｐ−ＮとＬｙｓ−Ｃで消化することにより、得られるペプチド断片が低分子量化したため、ＲＮａｓｅ  １のＡｓｎ８８に糖鎖が付加していなかった場合に生成されるアミノ酸番号８３−１０２番目のペプチド断片（ＤＣＲＬＴＮＧＳＲＹＰＮＣＡＹＲＴＳＰＫ）［配列番号２１］と、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していた場合に生成される８８−１０２番目のペプチド断片（ＤＧＳＲＹＰＮＣＡＹＲＴＳＰＫ）［配列番号２３］を検出することができた。実施例２では、８８番目のアスパラギン残基又はそれが変化したＡｓｐ残基を含むペプチド断片が８３−１０２番目と、８８−１０２番目の２種類検出されていることから、試料として使用したＣＨＯ細胞に発現させた組換え体ＲＮａｓｅ  １には、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加した状態のＲＮａｓｅ  １と、糖鎖が付加していない状態のＲＮａｓｅ  １が混在することが確認された。
【００５４】
このように、Ａｓｐ残基を認識する酵素だけでなく、Ａｓｐ残基又はＡｓｎ残基を認識しない別のエンド型ペプチド分解酵素をも用いることで、より明確にペプチド断片を検出することができる。
【００５５】
実施例１と２の結果から、ＣＨＯ細胞に発現した組換え体ＲＮａｓｅ  １は、Ａｓｎ７６とＡｓｎ８８においてＮ型糖鎖の付加状態が混在していることが明らかとなった。
【００５６】
実施例３  ヒトインターフェロンガンマの糖鎖付加状態の解析
抗ウイルス薬や抗がん剤として医薬品としても利用されているヒトインターフェロンガンマ（配列番号２８）は、アミノ酸配列から推定されるＮ型糖鎖修飾可能部位が２箇所存在する（Ａｓｎ２５，Ａｓｎ９７）。
【００５７】
研究用試薬として市販されている、大腸菌発現系で発現した組み換え体ヒトインターフェロンガンマ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ、カタログ番号３００−０２）と、ＣＨＯ細胞発現系で発現した組み換え体ヒトインターフェロンガンマ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．カタログ番号１１７２５−ＨＮＡＳ）をそれぞれ入手し、大腸菌発現組み換え体を糖鎖未修飾ヒトインターフェロンガンマ、ＣＨＯ細胞発現組み換え体を糖鎖修飾ヒトインターフェロンガンマとして、Ｎ型糖鎖修飾部位での糖鎖付加の有無を解析した。
【００５８】
大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果
大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマ  ２マイクログラムを、常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で分離した後にＣＢＢ染色した結果を図１０に示す。大腸菌発現系では組み換え体タンパク質は糖鎖修飾を受けていないため、約１６ｋＤａに一本のバンドとして検出される（レーン１）。この試料をＰＮＧａｓｅＦで処理しても、処理前のタンパク質と同じ位置にバンドが得られた（レーン２）。
【００５９】
一方、２０μｇの大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離した後に、ＰＶＤＦ膜に常法に従って転写した。転写されたＰＶＤＦ膜は、超純水中で洗浄した後にクマジーブリリアントブルーＲ２５０を含む溶液によって染色され、大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマに相当する１６ｋＤａのバンド部分を切り出し、質量分析の試料とした。切り出されたＰＶＤＦ膜は、エンド型ペプチド分解酵素Ａｓｐ−Ｎを含むトリスバファー（ｐＨ８．０）に加え、３７°Ｃで２０時間処理した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、ＨＰＬＣ装置（ＡＤＶＡＮＣＥ  ＵＨＰＬＣ  ＳＹＳＴＥＭ，Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でサンプル溶液を分離後、接続した質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて分析を実施した。
【００６０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、１９６３．０１Ｄａと、１６１８．８０Ｄａ、１５０３．７８Ｄａ、１４３０．６６Ｄａの質量をもつペプチドが検出された（表５）。さらにそれぞれのピークについて、タンデムＭＳ法によって内部配列を決定したところ、それぞれの質量を示すペプチドが、配列番号２８に示した配列のアミノ酸番号２４−４０、６２−７５、６３−７５、９０−１０１に相当するペプチドであることを確認した。
【００６１】
【表５】
2015142555.tif 000007
【００６２】
次に、２０μｇの大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマを、ＰＮＧａｓｅＦで処理した試料について、上記と同じ方法でエンド型ペプチド分解酵素Ａｓｐ−Ｎで処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した（表６）。
【００６３】
【表６】
2015142555.tif 000008
【００６４】
表５，６から明らかなように、表５（ＰＮＧａｓｅＦ未処理大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマを分析した結果）に示したペプチド断片は、表６でも検出された。特にＮ型糖鎖修飾可能部位を含むペプチド断片である、配列番号２８のアミノ酸番号２４−４０、９０−１０１に相当するペプチドについては、表５および表６の結果が完全に一致した。よって、大腸菌発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマは、Ｎ型糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していなかったと判定することができる。この結果は、大腸菌で発現させた組み換え体には糖鎖が付加しないという事実と一致する。またこの結果は、糖鎖が付加していないＡｓｎはＰＮＧａｓｅＦ処理の過程でＡｓｐに変換されることはないことを示し、仮に部分的にＮ型糖鎖修飾を受けた糖タンパク質をＰＮＧａｓｅＦ処理した場合でも、糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位のＡｓｎ残基はＡｓｐ残基に変換されることがなく、本発明で提示する一連の方法によってＮ型糖鎖が付加したＡｓｎとＮ型糖鎖が付加していないＡｓｎを区別することが可能であることを示している。
【００６５】
ＣＨＯ細胞発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果
ＣＨＯ細胞発現系組み換え体ヒトインターフェロンガンマは、Ｎ型糖鎖修飾を受けているため、ＰＮＧａｓｅＦによる脱糖鎖処理をしない場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではＮ型糖鎖の質量分だけ高分子に分子量がシフトした複数のバンド、約１４ｋＤａと約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａが検出された（図１１）。この試料をＰＮＧａｓｅＦで処理すると約１７ｋＤａ、約２０ｋＤａのバンドが消失し約１４ｋＤａのバンドに収束するため、約１７ｋＤａのバンドは２つの糖鎖修飾可能部位の内どちらか一方だけに糖鎖が付加したもの、約２０ｋＤａのバンドが２つの糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加したものであると考えられる。即ち、分析した試料には一部の糖鎖修飾可能部位に糖鎖が付加していないものが混合した状態であることが確認された。
【００６６】
ＰＮＧａｓｅＦで処理した約１０μｇのＣＨＯ細胞発現組み換え体ヒトインターフェロンガンマを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離した後に、ＰＶＤＦ膜に常法に従って転写した。転写されたＰＶＤＦ膜は、超純水中で洗浄した後にクマジーブリリアントブルーＲ２５０を含む溶液によって染色され、糖鎖を除去された組み換え体ヒトインターフェロンガンマに相当する１４ｋＤａのバンド部分を切り出し、質量分析のために処理を行った。切り出されたＰＶＤＦ膜は、エンド型ペプチド分解酵素ＡｓｐーＮを含むトリスバファー（ｐＨ８．０）に加え、３７°Ｃで２０時間処理し、得られた試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を接続した、ＨＰＬＣ装置（ＡＤＶＡＮＣＥ  ＵＨＰＬＣ  ＳＹＳＴＥＭ，Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でサンプル溶液を分離して分析を実施した。
【００６７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、１９６３．９９Ｄａ、１６１８．８１Ｄａ、１５０３．７８Ｄａ、１７７０．９２Ｄａ、８６６．４０Ｄａ、１４３０．６６Ｄａ、１３１５．６３Ｄａの質量をもつペプチドが検出された（表７）。さらに検出されたそれぞれの質量をもつペプチド断片について、タンデムＭＳ法によって内部アミノ酸配列を決定したところ、それぞれの質量を示すペプチドが、配列番号２８に示した配列のアミノ酸番号２４−４０、６２−７５、６３−７５、７６−８９、９０−９６、９０−１０１、９１−１０１に相当するペプチドであることを確認した。配列番号２８の６２−７５、６３−７５、７６−８９に相当するペプチド断片はＮ型糖鎖修飾可能部位を内部に持たないので、工程（Ａ）によってアミノ酸配列に変化を受けない断片である。この断片のアミノ酸配列が、既に報告されているヒトインターフェロンガンマのアミノ酸配列と一致したことから、分析試料がヒトインターフェロンガンマであることが確認された。Ｎ型糖鎖修飾可能部位（Ａｓｎ２５）を含むペプチドは、１９６３．９９Ｄａの断片が検出された。このペプチド断片は、タンデム質量分析によってＤＤＧＴＬＦＬＧＩＬＫＮＷＫＥＥＳ（配列番号２９）であることが確認された。このペプチドのＮ末端側配列はＡｓｐＡｓｐという配列で、２つ目のＡｓｐはＮ型糖鎖修飾可能部位（Ａｓｎ２５）に由来するアミノ酸である。このペプチド断片（配列番号２９）は、糖鎖を有しないヒトインターフェロンガンマを同様に加水分解して得られるペプチド断片と比べて異なるものであり、Ｎ型糖鎖修飾可能部位（２５位）を含んでいるため、Ｎ型糖鎖修飾可能部位Ａｓｐ２５には糖鎖が付加していたと判定することができる。
【００６８】
なお本実施例のようにＡｓｐＡｓｎという配列のＡｓｎに糖鎖が付加している場合は、工程ＢにＡｓｐ−Ｎを使用しても完全に消化できないという現象が見られたが、糖鎖付加の有無の判定は行うことができる。このような現象が見られた場合は、リン酸バッファー（ｐＨ  ７．８）においてＡｓｐ部分を認識しそのＣ末端側でペプチドを分解することが知られているエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを利用することで、完全に消化することも可能である。
【００６９】
一方、Ｎ型糖鎖修飾可能部位（Ａｓｎ９７）を含む又はそれに隣接するペプチドは、８６６．４０Ｄａと１４３０．６６Ｄａ、１３１５．６３Ｄａの３断片が検出された。配列番号２８の９０−９６に相当する８６６．４０Ｄａのペプチド断片が検出されたが、これは糖鎖を有しないヒトインターフェロンガンマを同様にＡｓｐ−Ｎで加水分解して得られるペプチド断片と比べて、異なるペプチド断片であり、かつＮ型糖鎖修飾可能部位（９７位）に隣接するアミノ酸残基を含んでいるので、配列番号２８の９７番目のＡｓｎ残基にＮ型糖鎖が付加していたと判定することができる。一方で、配列番号２８の９０−１０１と９１−１０１に相当する１４３０．６６Ｄａと１３１５．６３Ｄａの質量をもつペプチド断片が検出されたが、これは糖鎖を有しないヒトインターフェロンガンマを同様にＡｓｐ−Ｎで加水分解して得られるペプチド断片と比べて、同一のペプチド断片であり、かつＮ型糖鎖修飾可能部位（９７位）を含んでいるので、配列番号２８の９７番目のＡｓｎ残基にＮ型糖鎖が付加していないと判定することができる。これら２つの結果から、ＣＨＯ細胞発現系組み換え体ヒトインターフェロンガンマの９７番目のＡｓｎ残基には、糖鎖付加しているものと糖鎖が付加していないものの両方が存在することが確認できた。このことは、図１１において、ＰＮＧａｓｅＦによる脱糖鎖処理をしない試料（レーン２）が複数の分子量のバンドを示したことと一致した。
【００７０】
【表７】
2015142555.tif 000009
【図１】
2015142555.tif 000010
【図２】
2015142555.tif 000011
【図３】
2015142555.tif 000012
【図４】
2015142555.tif 000013
【図５】
2015142555.tif 000014
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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