(57)【要約】      （修正有）【課題】満腹ホルモンのコレシストキニンの放出因子を分解するトリプシンの活性を阻害するポリペプチドの提供。【解決手段】ジャガイモから得られた特定のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチドであって、阻害されるプロテアーゼがトリプシンあり、摂取したときに満腹感を引き起こし、食欲抑制作用、ダイエット作用を有する組成物として利用できると共に、トリプシンに起因するショックやストレス等の症状、多臓器不全、膵炎等の治療に使用することができるペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１乃至６のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１乃至６のいずれか１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチド若しくはそのアミド体又はその塩。
【請求項３】
プロテアーゼ阻害活性を有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド、又は請求項２に記載のポリペプチド若しくはそのアミド体又はその塩。
【請求項４】
プロテアーゼが、トリプシンであることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、そのアミド体又はその塩に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ナス科ナス属植物であるジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）は、塊茎が食用として利用されている。近年、ジャガイモは満腹作用を持つ食品として広く知られており、ジャガイモを含む３８種の食品について、摂取後の満腹感を測定した結果、ジャガイモが最も高い満腹感を与えたとの報告がある。
【０００３】
満腹感を引き起こす経路の一つとして、満腹ホルモンのコレシストキニン（ＣＣＫ）の作用が知られている。該経路は、腸管内に存在するＣＣＫ放出因子が、上部小腸に存在するＣＣＫ産生細胞に作用することで、ＣＣＫ産生細胞からＣＣＫが血中に分泌され、ＣＣＫが脳に作用することで満腹感を引き起こすものである。
一方、空腹状態では、膵臓から分泌されるプロテアーゼの１種であるトリプシンにより、腸管内のＣＣＫ放出因子が分解されることにより、血中にＣＣＫが分泌されず、満腹感が引き起こされない。
そのため、トリプシンの活性を阻害することで、満腹感を得る引き起こすことができ、トリプシン阻害活性を示すものとして、ジャガイモが知られている（特許文献１）。
しかし、ジャガイモに含まれるトリプシン阻害活性を有する成分は解明されておらず、特定が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５０８４９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下、本発明は、トリプシン阻害活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、従来単離されていなかった、ジャガイモに含まれるトリプシン阻害活性を有する成分を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、トリプシン阻害活性を有するポリペプチド（以下、ＴＩポリペプチドと記す）の単離と特定に成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号１乃至６のいずれか１のアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドに関する。
本発明は、プロテアーゼ阻害活性を有することを特徴とする前記ポリペプチドに関する。
本発明は、配列番号１乃至６のいずれか１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つ、プロテアーゼ阻害活性を有することを特徴とするポリペプチド若しくはそのアミド体又はその塩に関する。
本発明で阻害されるプロテアーゼがトリプシンであることを特徴とする前記ポリペプチドに関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチドに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のポリペプチドは、配列番号１乃至６のいずれかのアミノ酸配列からなり、プロテアーゼ阻害活性、特にトリプシン阻害活性を有するので、摂取したときに満腹感を引き起こし、食欲抑制作用、ダイエット作用を有する組成物として利用できる。また、トリプシンに起因するショックやストレス等の症状、多臓器不全、膵炎等の治療に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、後述の実施形態の記載により限定されるものではなく、特許請求の範囲における記載の範囲内で種々の変更が可能である。
【００１０】
本発明のポリペプチドは、配列番号１乃至６のいずれかのアミノ酸配列からなる、若しくは、該アミノ酸配列の約５０％以上の同一性を有するものであれば良い。そのため、人工的に合成したペプチドでも良く、動物や植物等の生物を原料として精製したものでも良い。
本発明のポリペプチドの原料としては、ナス科ナス属植物のジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、より好ましくはジャガイモの抽出物、更に好ましくはジャガイモ塊茎の抽出物が選択される。
ジャガイモの抽出物としては、特に限定されず、従来公知の方法で得られる抽出物を使用することができる。例えば、ジャガイモに当業者が通常用いる抽出溶媒や溶媒の混合物等を加え、必要に応じて加温して抽出する方法等が挙げられる。
抽出に使用する溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記抽出溶媒として使用し得る溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール、無機酸等が挙げられる。これらの抽出溶媒の中でも、水、無機酸を用いることが好ましい。
【００１１】
本発明のポリペプチドの生産方法も特に限定されないが、好ましくは、ジャガイモ塊茎のデンプン抽出時に得られる上清を精製して得ることが好ましい。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、配列番号１乃至６のいずれか１のアミノ酸配列の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有することが好ましく、この条件を満たせば、該ポリペプチドのアミド体や塩等であっても良い。
また、本発明のポリペプチドは、分離・濃縮等の方法によって精製しても良い。精製方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を適宜使用することができる。分離方法としては、例えば、限外ろ過による分離、カラムクロマトグラフィー，ゲルろ過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによる分離、二次元電気泳動法による分離等を挙げることができ、濃縮方法としては、エバポレーター等を使用した蒸留等が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、必要に応じて、気流殺菌、高圧殺菌、加熱殺菌等の方法により、殺菌しても良い。
【００１３】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドそのものを使用しても良いが、その他の成分を配合した組成物としても良い。該組成物の形状は、特に限定されず、任意の形態とすることができる。経口組成物の場合、例えば、粉末状、粒状、顆粒状、錠剤状、棒状、板状、ブロック状、固形状、丸状、液状、飴状、ペースト状、クリーム状、ハードカプセルやソフトカプセルのようなカプセル状、カプレット状、タブレット状、ゲル状、ゼリー状、グミ状、ウエハース状、チュアブル状、シロップ状、スティック状等が挙げられる。組成物の形状が固体の形態である場合、水やお茶、牛乳等の溶媒と混合して懸濁又は溶解させ液状体として経口摂取することもでき、また、摂取する者の好み等に応じて、固体のまま経口摂取しても良い。
【００１４】
本発明のポリペプチドを含む組成物に配合される、その他の成分としては、特に制限はなく、必要に応じて、適宜配合されることが好ましい。他の成分としては、例えば、ビタミン類、ミネラル、α−リポ酸、レシチン、ポリフェノール、カロテノイド、キサンチン誘導体、脂肪酸、アミノ糖、オリゴ糖、ジャガイモ乾燥粉末、動植物抽出物、含硫化合物、糖アルコール、糖類、リグナン類等を配合しても良い。また、クエン酸、乳酸、グルコン酸、リンゴ等の酸味料、酸化チタン等の着色料、アラビアガム、キサンタンガム等の増粘剤、ソーマチン、還元麦芽糖等の甘味料、シェラック等の光沢剤、タルク、二酸化ケイ素、セルロース、ステアリン酸カルシウム等の製造用剤等を配合しても良いし、種々の賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、添加物等を配合しても良い。尚、他の成分の含有量は、本発明の経口組成物の形態等に応じて適宜選択することができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドを含む組成物には、トリプシン阻害活性を有するその他の有効成分を含んでも良い。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。なお、本発明の範囲が以下の実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００１７】
（実施例１）
以下の方法によって、ジャガイモの抽出物（株式会社東洋新薬製）からポリペプチドを分取した。
【００１８】
〔合成吸着剤による分取〕
まず、合成吸着剤ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０（三菱化学株式会社製）を充填したオープンカラムを準備し、ジャガイモ抽出物の水溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。
次に、０．２ｋｇ／ｃｍ２の圧力をかけながら、純水６００ｍＬ、２０％エタノール水溶液６００ｍＬ、８０％エタノール水溶液２５０ｍＬ、４％１Ｎ水酸化ナトリウム含有５０％プロパノール水溶液２５０ｍＬの順に通液し、各水溶液によって溶出されたＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの画分を分取した。
次いで、分取した画分Ａ乃至Ｄをエバポレーターによって濃縮し、その後凍結乾燥することで、合成吸着剤による画分乾燥物Ａ乃至Ｄを得た。
【００１９】
〔限外ろ過による分取〕
合成吸着剤による分取によって得られた画分乾燥物Ａ乃至Ｄにおいて、後述するトリプシン阻害活性率を測定した結果、阻害率の高かった画分Ｃの水溶液を遠心分離（３２２０Ｇ、４℃、１０分）した。ろ過膜上に残った１０ｋＤａ以上のポリペプチドを含む溶液（画分Ｅ）と１０ｋＤａ以下のポリペプチドを含むとろ液（画分Ｆ）に分取し、それぞれ凍結乾燥することで、限外ろ過による画分乾燥物Ｅ及びＦを得た。
【００２０】
〔ゲルろ過クロマトグラフィーによる分取〕
担体としてＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を充填したオープンカラムを使用した。限外ろ過による分取によって得られた画分乾燥物Ｅ及びＦにおいて、後述するトリプシン阻害活性率を測定した結果、阻害率の高かった画分Ｅの水溶液を遠心分離（３２２０ｇ，４℃，１０分）した後，上清を回収した。
この上清（５００μＬ）をカラムに注入後、０．４０ｋｇ／ｃｍ２の圧力をかけながら純水で溶出した。溶出液は溶出開始１．０ｍＬから９ｍＬを画分Ｇとし、１０ｍＬから２９ｍＬまでは５．０ｍＬずつ分取し，それぞれ画分Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋとした。そして最後に，溶出開始３０ｍＬから８９ｍＬを洗浄画分Ｌとして分取した。各画分は減圧下でロータリーエバポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥し、ゲルろ過クロマトグラフィーによる画分乾燥物Ｇ乃至Ｌを得た。
【００２１】
〔ＯＤＳカラムを使用したＨＰＬＣによる分取〕
ゲルろ過クロマトグラフィーで得られた画分Ｇ乃至Ｌにおいて、後述するトリプシン阻害活性率を測定した結果、阻害率の高かった画分Ｇ及びＨを２０％アセトニトリル含有１．０％トリフルオロ酢酸水溶液で溶解し，分取に用いた。
分取はＨＰＬＣの分析条件で行い、分析開始０→１０分、１０→１２．５分、１２．５→３０分をそれぞれ画分Ｍ，Ｎ，Ｏとして分取した。各画分は減圧条件下でロータリーエバポレーターを用いて濃縮した後，凍結乾燥し、ＯＤＳカラムを使用したＭ乃至Ｏ画分乾燥物を得た。
尚、カラムとして（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−II，ナカライテスク株式会社社製）、分析装置にＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（株式会社島津製作所製）を用いた。
【００２２】
〔画分乾燥物のトリプシン阻害活性の測定〕
まず、得られた画分乾燥物Ａ乃至Ｏを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解し，画分乾燥物溶液（０．３７５、０．７５、１．５、３．０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
次に、ＢＡＰＡ（Ｎα−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｄ，  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにジメチルスルホキシドに溶解し、１００ｍＭトリス塩酸含有１００ｍＭ塩化カルシウム２溶液（ｐＨ８．０）と５：９５で混合し基質溶液を調製した。また、ウシ膵臓由来トリプシン（８．０ｍｇ）を５．０ｍＭ塩酸含有５．０ｍＭ塩化カルシウム２溶液（５０ｍＬ）に溶解した酵素溶液を調製した。
次いで、９６穴マイクロプレートに４濃度の画分乾燥物溶液（１００μＬ）をそれぞれ注入した後、酵素溶液（１００μＬ）を注入した。該マイクロプレートを３７℃のインキュベーター内に１０分放置し、これを混合溶液とした。この混合溶液（２０μＬ）を新しいプレートに注入した後、基質溶液（１００μＬ）を注入し、３７℃のパーソナルインキュベーター内に１０分放置した後，１０％酢酸（ｖ／ｖ）水溶液（１００μＬ）を注入して反応を停止させた。
【００２３】
混合溶液の吸光度は波長４１５ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて測定した。上記の手順で測定したものを、画分乾燥物溶液を添加せずに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）のみを加えて測定したものをブランク、酵素溶液を加える直前に１０％酢酸（ｖ／ｖ）水溶液を注入したものをコントロール、画分乾燥物溶液を添加せずに５０ｍＭトリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）を加え，酵素溶液を加える直前に１０％酢酸（ｖ／ｖ）水溶液を注入したものをブランクのコントロールとした。
トリプシン阻害活性は，測定によって得られた各吸光度を次の式に代入して算出した。阻害率（％）＝〔１−（画分乾燥物−コントロール）／（ブランク−ブランクのコントロール）〕×１００。画分乾燥物，コントロール，ブランク，ブランクのコントロールは、吸光度の値を示す。
算出された阻害率をｙ軸，画分乾燥物溶液の希釈倍率をｘ軸として検量線を作成し，検量線の式ｙ＝ａｘ＋ｂの式から，得られるトリプシンを５０％阻害する濃度をトリプシン活性５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）としてＩＣ５０＝（５０−ｂ）／ａの式から算出した。以上の操作を３回繰り返した。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
2015211663.tif 000002
【００２５】
トリプシン阻害活性率の測定結果、合成吸着剤を使用した分取によって得られた画分乾燥物Ａ乃至Ｄでは、画分Ｃのトリプシン阻害活性が高く、ＩＣ５０＝１１．１μｇ／ｍＬであった。
限外ろ過を使用した分取によって得られた画分乾燥物Ｅ及びＦでは、画分Ｅのトリプシン阻害活性が高く、ＩＣ５０＝１４．７μｇ／ｍＬであった。
また、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用した分取によって得られた画分乾燥物Ｇ乃至Ｌでは、画分Ｇ及びＨのトリプシン阻害活性が高く、画分ＧがＩＣ５０＝１６．７μｇ／ｍＬ、画分ＨがＩＣ５０＝８．７μｇ／ｍＬであった。
ＯＤＳカラムを使用した分取によって得られた画分乾燥物Ｍ乃至Ｏでは、画分Ｎ（１０〜１２．５分）のトリプシン阻害活性が高く、ＩＣ５０＝４．１μｇ／ｍＬであった。
尚、ジャガイモ抽出物そのもののトリプシン阻害活性も同様の方法で測定したところ、ＩＣ５０＝５５．９μｇ／ｍＬであったことから、トリプシン阻害活性が高い画分を分取し精製した、画分Ｎは、ジャガイモ抽出物そのものに比べて約１３倍のトリプシン阻害活性率を有することが分かった。
【００２６】
このことから、複数の分取方法を組合せ、ジャガイモ抽出物を精製することで、トリプシン阻害活性率の高いポリペプチドが得られることが分かった。
【００２７】
（実施例２）
＜ポリペプチドの分離＞
〔二次元電気泳動による分離〕
実施例１のＯＤＳカラムを使用したＨＰＬＣによる分取によって得られた画分のうち、最もトリプシン阻害活性の高かった画分Ｎ（１０〜１２．５分）に二次元電気泳動を行い、ポリペプチドを分離し、分離されたゲル状のポリペプチドを銀染色した。尚、二次元電気泳動は、１次元目に等電点電気泳動、二次元目にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。結果、画分Ｎから８種のポリペプチドが分離された。また、その分子量は１４ｋＤａ〜１８ｋＤａであった。
【００２８】
（実施例３）
＜アミノ酸配列の特定１＞
〔ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）によるアミノ酸配列の特定〕
実施例２で得られた８種のポリペプチドにつき、ＰＭＦ法によるアミノ酸配列の特定を行った。
【００２９】
まず、脱銀染色液（３０ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液と１００ｍＭチオ硫酸ナトリウム水溶液の１：１混合液）準備した。準備した実施例２で単離したポリペプチドの二次元電気泳動ゲルと混合して３分間振とうし、純水で洗浄することにより無色のゲルを得た。
次に、洗浄したゲルを２．０ｍｇ／ｍＬの炭酸水素アンモニウム水溶液で還元し、アルキル化した後、牛由来トリプシン又は牛由来キモトリプシンによって分解し、トリプシン消化物、キモトリプシン消化物を得た。
次いで、得られたトリプシン消化物及びキモトリプシン消化物につき、ＬＣ−ＭＳ（ウォータズ社製）を用いて分析により、ポリペプチドの断片情報を得た。得られた断片情報を、ＳｗｉｓｓＰｏｒｔデータベースに収録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列のデータと照合し、実施例２で得られた８種のポリペプチドのアミノ酸配列を推定した。尚、ＬＣ−ＭＳ分析の条件は、表２の通りである。
【００３０】
【表２】
2015211663.tif 000003
【００３１】
結果、８種のポリペプチドの断片情報から、配列番号７乃至１２のアミノ酸配列からなる既知のジャガイモ由来ポリペプチド６種（（１）proteinase inhibitor type II P303 51 precursor，（２）proteinase inhibitor type II K precursor IIK PC，（３）proteinase inhibitor type II precursor，（４）proteinase inhibitor type II CM7 precursor，（５）wound induced proteinase inhibitor II precursor，（６）proteinase inhibitor II OS Solanum tuberosum PE2SV1））が推定された。尚、実施例３で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列の適合率は、前記（１）乃至（６）のポリペプチドのアミノ酸配列に対し、３３．１〜８７．１％であった。
【００３２】
（実施例４）
＜アミノ酸配列の特定２＞
〔エドマン分解によるアミノ酸配列の特定〕
実施例１のＯＤＳカラムを使用したＨＰＬＣによる分取によって得られた画分Ｎに二次元電気泳動を行い、分離されたポリペプチドの中で１５ｋＤａ付近にあるポリペプチドについて、エドマン分解により、Ｎ末端から２０番目までアミノ酸配列を分析した。
結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2015211663.tif 000004
【００３４】
結果、ジャガイモ抽出物中から分離したトリプシン阻害活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１乃至６のアミノ酸配列であることが同定された。このポリペプチドは、実施例３で推定された既知のジャガイモ由来ポリペプチド６種において、Ｎ末端のアミノ酸配列の一部が欠落したものであることが分かった。
実施例３で推定された既知のジャガイモ由来ポリペプチド６種において、Ｎ末端のアミノ酸配列が欠落したものは報告されておらず、実施例４により同定されたポリペプチドは、なＴＩポリペプチドであることが分かった。また、該ＴＩポリペプチドの理論質量は１１〜１４ｋＤａであった。
【００３５】
実施例３及び実施例４の結果から、同定されたＴＩポリペプチドのアミノ酸配列において、実施例３及び４の結果から解析されたアミノ酸配列の適合率を表４に示す。
【００３６】
【表４】
2015211663.tif 000005
【００３７】
以上のことから、ジャガイモ抽出物には、のＴＩポリペプチド（ポリペプチド）が含有されており、ジャガイモ抽出物を精製することで、よりトリプシン阻害活性の高いＴＩポリペプチドが得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、トリプシン阻害活性を有するポリペプチドを提供することができる。
【配列表】
2015211663000001.app