(57)【要約】      （修正有）【課題】1個以上のスブチリシン変異種を含む組成物及びこれらの変異種と組成物を使用する方法を提供する。【解決手段】各種置換の組み合わせのうちの一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、当該置換が特定の配列で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。洗濯並びに動物飼料及び食品加工用組成物物飼料としての用途に適したスブチリシン変異種。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にあ
る、スブチリシン変異種。
2015211671.tif 000029
2015211671.tif 000030
Y217Q及びN-62Q-N123G-Y217Q。
【請求項２】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
2015211671.tif 000031
Y217E、及びG97M-G128A-Y217N。
【請求項３】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
2015211671.tif 000032
2015211671.tif 000033
及びS24R-P40E-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-S162K-Q206E-Q213L-P239R-N240K-
T242R
【請求項４】
置換G97A/G128A/Y217Qを含むスブチリシン変異種であって、さらに請求項３の一以上の変異を含み、かつ当該位置は配列番号１のBPN’スブチリシンの位置に対応するものである、スブチリシン変異種。
【請求項５】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
2015211671.tif 000034
2015211671.tif 000035
N117S-S132N-P239V、S125A-S132N-P239V、N76D-D120H-K213N-M222Q。
【請求項６】
置換G97A/G128A/Y217Qを含むスブリチリシン変異種であって、さらに請求項５の一以上の変異を含み、かつ当該位置は配列番号１のBPN’スブチリシンの位置に対応するものである、スブチリシン変異種。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかの請求項に規定されたスブチリシン変異種をコードする単離された核酸。
【請求項８】
請求項７の前記核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項６の前記発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１−７のいずれかの請求項に規定された一以上のスブチリシンを含む洗浄剤組成物。
【請求項１１】
請求項１０の洗浄剤組成物であって、前記洗浄剤組成物は洗濯洗剤である、洗浄剤組成物。
【請求項１２】
請求項１１の洗濯洗剤であって、前記洗濯洗剤は重質液体洗濯洗剤である洗濯洗剤。
【請求項１３】
請求項１０の洗浄剤組成物であって、前記洗浄剤組成物は、皿用洗剤である洗浄剤組成物。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれかの請求項の洗浄剤組成物であって、さらに、ヘミセルラーゼ、パーオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ及びアミラーゼ、又はそれらの混合物なる群から選択された一以上の追加の酵素又は酵素誘導体を含む、洗浄剤組成物。
【請求項１５】
請求項１０の洗浄剤組成物であって、さらに一以上の安定剤を含む洗浄剤組成物。
【請求項１６】
0.0001重量パーセント以上の、請求項１−７のいずれかの請求項の一以上のスブチリシン変異種を含み、任意に一以上の適した添加成分を含む洗浄剤組成物。
【請求項１７】
洗浄の方法であって、前記方法は、
a) 請求項10-16のいずれかの請求項の洗浄剤組成物と、表面及び/又は布を含む物品と接触させる段階、と
b) 任意に前記の表面又は物品を洗浄し及び/又は濯ぐ段階
を含むものである、洗浄の方法。
【請求項１８】
請求項１−７のいずれかの請求項の一以上のスブチリシン変異種を含む動物飼料。
【請求項１９】
請求項１−７のいずれかの請求項の一以上のスブチリシン変異種を含む食品加工用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スブチリシン変異種と、本明細書に記載された少なくとも1個のスブチリシン変異種を含有する組成物、及びこれらの変異種と組成物を使用する方法を与える。特に、本発明は洗濯用の洗浄剤に適したプロテアーゼ変異種を提供する。
【背景技術】
【０００２】
セリンプロテアーゼは広い範囲の特異性と生物学的機能を有する広い種類の酵素を含むカルボニルヒドロラーゼのサブグループである。主に洗浄と飼料用途で有用であるため多くの研究がこのスブチリシンについて行われた。さらに種々の用途でのこれらの酵素の機能に悪影響を及ぼすことのある悪条件（例えば、酸化剤、キレート剤、温度及び/又はpHの極端な条件への暴露）、について研究が集中された。しかし、依然、これらの悪条件に耐えかつ、本技術分野で現在知られている活性を保持し又は、これを上回る改善がされた活性を有することができる酵素系が、本技術分野で求められている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明はスブチリシン変異種及び本明細書に記載された1個以上のスブチリシン変異種を含有する組成物及びこれらの変異種と組成物を使用する方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、洗濯洗浄用途に適したプロテアーゼ変異種を提供する。
【０００４】
本発明は以下の置換の組のうち少なくとも1組を含有する単離されたスブチリシン変異種を提供する。G97A-G128A-Y217Q、G97A-L126A-G128A、G97A-L126A-G128A-Y217Q、
2015211671.tif 000002
2015211671.tif 000003
M124V-Y217Q及びN62Q-N123G-Y217Q、ここでこの置換は配列番号第１に記載されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置で行われている。
【０００５】
本発明は、また以下の置換の組の少なくとも1個を含有する単離されたスブチリシン変異種も提供する。G97N-G128A-Y217M、G97G-G128S-Y217E、G97A-G128A-Y217Q、
2015211671.tif 000004
Y217T、G97M-G128A-Y217E、及びG97A-M128A-Y217N、ここで当該置換は配列番号第１に規定されたBPN’スブチリシンの位置に等価の位置で行われる。
【０００６】
本発明は、さらに以下の置換の組の少なくとも1個を含有する単離されたスブチリシン変異種を提供する。S24R-S87D-Q206E、P40E-A144K-K213L、N61E-P129E-S159K、S87D-S162K-K265N、S87D-T242R-Q275E、N61E-Q103E-N240K、S87D-T242R-K265N、N62R-K265N-Q275E
2015211671.tif 000005
2015211671.tif 000006
P239R-N240K-T242R、ここで、前記置換は配列番号１に規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置で行われている。
【０００７】
本発明はまた、置換G97A/G128A/Y217Qと、さらに上記の置換の組の少なくとも1個を含み、この位置は配列番号１のBPN’スブチリシンに相当する位置である、スブチリシン変異種も提供する。
【０００８】
本発明は、さらに以下の置換の組の少なくとも1個の組を含む単離されたスブチリシン変異種を提供する。：
2015211671.tif 000007
2015211671.tif 000008
2015211671.tif 000009
ここで、前記置換は、配列番号１に規定されるBPN’スブチリシンの位置に等価の位置で行われる。
【０００９】
本発明はまた、置換G97A/G128A/Y217Qと、さらに上記の置換の組の少なくとも1個を含み、この置換の位置は配列番号１のBPN’スブチリシンの位置に相当するものである、スブチリシン変異種も提供する。
【００１０】
本発明はまた、本明細書に規定された変異スブチリンの組をコードする単離された核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、及びこれらの発現ベクターを含む宿主細胞も与える。
【００１１】
本発明は、さらに本明細書に与えられたスブチリシン変異種の少なくとも1個を含む洗浄剤組成物を提供する。いくつかの実施態様では、洗浄剤組成物は洗濯洗剤である。いくつかの実施態様では、洗濯洗剤は重質液体洗濯洗剤である。いくつかの別の実施態様では、この洗浄剤組成物は皿洗い用洗剤である。いくつかのさらに別の実施態様では、この洗浄剤組成物は堅い表面の洗浄剤組成物である。いくつかの別の実施態様では、この洗浄剤組成物は、ヘミセルラーゼ、パーオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ及びアミラーゼ、またはそれらの混合物からなる群から選択された、さらに1以上の追加の酵素または酵素誘導体を含む。いくつかの実施態様では、この洗浄剤組成物は、さらに少なくとも1個の安定剤を含む。いくつかの別の実施態様では、この洗浄剤組成物は、少なくとも0.0001重量パーセントの、本明細書に記載された少なくとも1個のスブチリシン変異種と、任意に適した添加成分を含む。
【００１２】
本発明はまた、表面又は布を含む物品を本明細書に記載された洗浄剤組成物と接触させる段階、及び、任意にその表面又は物品を洗浄及び/又は濯ぐ段階を含む、洗浄法も与える。
【００１３】
本発明は、さらに、本明細書に記載された、少なくとも1個のスブチリシン変異種を含む動物飼料を提供する。本発明は、また、本明細書に記載された少なくとも1個のスブチリシン変異種を含む食品加工組成物も提供する。
発明の説明
【００１４】
本発明は、本明細書に記載された、スブチリシン変異種と少なくとも1個の変異スブチリシンを含む組成物と、これら変異種と組成物を使用する方法を与える。特に、本発明は洗濯洗浄剤用途に適したプロテアーゼ変異種を与える。
【００１５】
いくつかの実施態様では、本発明は、ポリペプチドの分解又は合成が望ましい場合である、洗浄剤組成物、飼料成分、繊維加工、皮革仕上げ、穀物加工、肉加工、食品加工、タンパク質加水分解物の調製、消化剤、殺菌剤組成物、静菌剤組成物、静菌類剤組成物、及びヒトの衛生用製品（例．口腔内の洗浄、髪の手入れ及び/又は肌の手入れ）等、種々の商業用途を有する変異スブチリシンを製造する手段を与える。
【００１６】
本発明は、さらに現在使用されているスブチリシンプロテアーゼに匹敵する又は上回る洗浄機能を有する酵素組成物を与える。いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書に記載された少なくとも1個のスブチリシン変異種を含む洗浄剤組成物を与える。いくつかの実施態様では、この洗浄剤組成物は洗濯洗剤である。いくつかの実施態様では、この洗濯洗剤は冷水用洗剤、低pH洗剤、又はコンパクト洗剤である。別の実施態様では、本発明は、表面及び/又は布を含む物品を、少なくとも1個のスブチリシン変異種を含有する洗浄剤組成物と接触させる段階を含む洗浄方法を提供する。
洗浄剤組成物
【００１７】
本発明の洗浄剤組成物は、例えば、洗濯用途で使用されることが有利である。実際、低温溶液で効果が大きい、独特な長所のため、本発明の酵素は洗濯用途に理想的である。さらに、本発明の酵素は顆粒と液体組成物の両方で使用できる。
【００１８】
本発明のプロテアーゼ変異種は、また洗濯洗浄用添加剤にも使用される。いくつかの実施態様では、低温洗浄溶液での洗浄に用いられる。添加物は、最も単純な形では、一以上のプロテアーゼでも良い。いくつかの実施態様では、添加剤は洗浄処理に加えるための投与形態で包装されている。いかなる適した単回投与形態もまた本発明に関して使用できる。これには、丸薬、錠剤、ゲルキャップ、又は予め秤量された粉末又は液体のような他の単回投与単位を含むがこれらに限定されることはない。いくつかの実施態様では、充填剤又は担体物質がこのような組成物の量を増やすために含まれる。適した充填剤又は担体物質は、種々の硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩、及びタルク、クレー等を含むがこれらに限定されない。液体組成物に適した充填剤又は担体物質は、水又はポリオールとジオール等の低分子量の一級及び二級アルコールを含むが、これらに限定されない。そのようなアルコールの例は、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、組成物は、約5%から約90%でそのような物質を含む。酸性の充填剤はpHを下げるために使用される。また、洗浄添加剤は以下により詳細に述べられるような添加物を含む。
【００１９】
本発明の洗浄剤組成物と洗浄剤添加物は、本明細書に記載された、有効量の少なくとも1個のプロテアーゼ変異種を、それのみで、又は他のプロテアーゼ及び/又は追加の酵素と組合わせて必要とする。酵素の必要とされる量は、本発明の1以上のプロテアーゼ変異種を添加することにより達成される。典型的には、本洗浄剤組成物は、少なくとも約0.0001重量パーセント、約0.0001から約１、約0.001から約0.5、または、さらに約0.01から約0.1重量パーセントの少なくとも1個の本発明のプロテアーゼ変異種を含む。
【００２０】
本明細書の洗浄剤組成物は、水における洗浄での使用において、洗浄水が約5.0から約11.5、又は約7.5から約10.5のpHを有するように、通常調合される。液体製品の処方は通常、約3.0から約9.0、または約3から約5の原液のpHを有するように通常調製される。顆粒洗濯製品は、通常、約9から約11のpHを有するように通常調合される。推奨される使用水準でpHを制御する技術は緩衝剤、アルカリ、酸等の使用を含み、本技術分野の技術者に良く知られている。
【００２１】
適した低いpHの洗浄剤組成物は、約３から約５の原液のpHを有し、典型的には、このようなpH環境で加水分解する界面活性剤を含まない。そのような界面活性剤は、少なくとも1個のエチレンオキシド部分、又はさらに約１から約16モルのエチレンオキシドを含む、アルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を含む。このような洗浄剤組成物は、普通十分な量のpH調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン又は塩酸を含み、このような洗浄剤組成物に約3から約５の原液でのpHを与える。このような組成物は、通常、一以上の酸に安定な酵素を含む。いくつかの実施態様では、本組成物は、液体であり、他の実施態様では、それらは固体である。このような液体の組成物のpHは、通常、原液のpHとして測定される。このような固体組成物のpHは、前記組成物の10%の固体の溶液として測定され、ここで溶媒は蒸留水である。これらの実施態様では、全てのpH測定は20℃で行われる。
【００２２】
いくつかの実施態様では、プロテアーゼ変異種が顆粒組成物又は液体中で使用される場合、プロテアーゼ変異種が、貯蔵中に顆粒組成物の他の成分からプロテアーゼ変異種を保護するようにカプセル化された粒子の形態であることが望ましい。加えて、カプセル化は、洗浄過程でプロテアーゼ変異種の利用能を制御する手段でもある。いくつかの実施態様では、カプセル化は、プロテアーゼ変異種及び/又は追加した酵素の性能を向上させる。この点で、本発明のプロテアーゼ変異種は、本技術分野で知られているいずれかの適当なカプセル化材でカプセル化される。いくつかの実施態様では、カプセル化材は、通常、本発明のプロテアーゼ変異種の触媒の少なくとも一部をカプセル化している。典型的には、カプセル化材は水溶性及び/又は水に分散する。いくつかの実施態様では、カプセル化材は0℃以上のガラス転移温度(Tg)を有する。ガラス転移温度はWO97/11151にさらに詳細に記載されている。カプセル化材は炭水化物、天然又は合成ガム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。カプセル化材が炭水化物のときは、通常これは、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの組み合わせから選択される。典型的には、カプセル化材は、デンプンである。適したデンプンは、EP0922499；US4,977,252；US5,354,559、及びUS5,935,826に述べられている。いくつかの実施態様では、カプセル化材は熱可塑性のプラスチック、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びそれらの混合物のようなプラスチックから作られる。使用される、市販されている微小球には、EXPANCEL（登録商標）(Stockviksverken,スウェーデン)、及びPM6545、PM6550、PM7220、PM7228、EXTENDOSPHERES（登録商標）、LUXSIL（登録商標）、Q-CEL（登録商標）及びSPHERICEL（登録商標）(PQ Corp.,Valley Forge, PA)として提供されるものを含む。
【００２３】
本明細書で記載されているとおり、本発明のプロテアーゼ変異種は、特に洗濯洗剤で使用される。これらの用途では酵素は、種々の環境からの攻撃に晒される。本発明のプロテアーゼ変異種は、種々の条件下でその安定性により、多くの現在使用されている酵素を上回る利点を与える。
【００２４】
実際、洗浄に使用されるプロテアーゼが晒される種々の洗浄条件があり、これには種々の洗剤処方、洗浄水量、洗浄水温度、洗浄時間等が含まれる。加えて、異なる地域で使用される洗剤調合剤は、洗浄水に異なる濃度の関連する成分を含んでいる。例えば、ヨーロッパの洗剤は、通常、洗浄水に約4500-5000ppmの洗剤を含むが、日本の洗剤は、通常、洗浄水に約667ppmの洗剤を含む。北アメリカ、特に合衆国では、洗剤は通常、洗浄水に約975ppmの洗剤成分を含む。
【００２５】
低い洗剤濃度系は、洗浄水に約800ppm未満の洗剤成分が含まれる洗剤を含む。日本の洗剤は、洗浄水に約667ppmの洗剤成分を含むので、通常、低洗剤濃度系であると考えられている。
【００２６】
中程度の洗剤濃度系は約800ppmと約2000ppmの間の洗剤成分が洗浄水に含まれる洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、洗浄水に約975ppmの洗剤成分を含むので、一般に中程度の洗剤濃度系であると考えられている。ブラジルは、通常、洗浄水に約1500ppmの洗剤成分を含む。
【００２７】
高洗剤濃度系は、約2000ppmより高い洗剤成分が洗浄水に含まれる洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、これらが洗浄水に約4500-5000ppmの洗剤を含むので、一般的に高洗剤濃度系であると考えられている。
【００２８】
ラテンアメリカの洗剤は、一般に高濃度の石鹸とリン酸塩の助剤を含む洗剤であり、ラテンアメリカで使用される洗剤の範囲は、洗浄水に1500ppmから6000ppmの洗剤成分が含まれるため、中及び高洗剤濃度系の両方に属す。先に述べたように、ブラジルは、通常、洗浄水に約1500ppmの洗剤成分が含まれる。しかし、他のラテンアメリカの国々に限らず、他の高濃度石鹸、リン酸塩助剤洗剤地域が、洗浄水に約6000ppmまでの洗剤成分を含む高洗剤濃度系を有することもある。
【００２９】
これまでの記載から、世界中の典型的な洗浄溶液における洗剤成分の濃度が、約800ppmより低い洗剤成分（「低洗剤濃度地域」）、（例えば、日本での約667ppm）から約800ppmと約2,000ppmの間（「中程度の洗剤濃度地域」）（例えば、米国での約975ppmとブラジルでの約1500ppm）、及び約2000ppmより高い濃度（「高洗剤濃度地域」）まで（例えば、ヨーロッパでの約4500ppmから約5000ppm及び、高濃度石鹸、リン酸助剤地域での約6000ppm）変わることが明らかである。
【００３０】
典型的な洗浄溶液の濃度は、実験的に決定される。例えば、米国では、通常の洗濯機は、約64.4Lの洗浄溶液を入れることができる。従って、約975ppmの洗剤濃度を洗浄溶液で得るためには、約62.79gの洗剤成分が64.4Lの洗浄溶液に加えられなければならない。この量は洗剤に付けられた計量カップを使用して消費者が洗浄水に入れる典型的な量である。
【００３１】
さらに別の例として、異なる地域は異なる洗浄温度を使用する。日本の洗浄水の温度は、通常、ヨーロッパで使用されているよりも低い。例えば、北アメリカと日本の洗浄水の温度は、通常、10℃と30℃の間（例えば約20℃）であり、ヨーロッパの洗浄水の温度は、通常30と60℃の間（例えば、約40℃）である。
【００３２】
さらに別の例として、異なる地域は通常、異なる水硬度を有する。水の硬度は、通常、1ガロン当たりの混合Ca2+/Mg2+のグレインで述べられる。硬度は、水に含まれるカルシウム(Ca2+)とマグネシウム(Mg2+)の量の尺度である。米国の殆どの水は硬水である。しかし、この硬度は幅がある。中程度の硬水(60-120ppm)から硬水（121-181ppm）は100万部分当たり60から181部分（ppmのU.S.ガロン当たりのグレインへの転換は、17.1でppmを割ってガロン当たりのグレインを求める。）の硬度物質を含む。
【表１】
2015211671.tif 000010
【００３３】
ヨーロッパの水の硬度は通常1ガロン当たり10.5グレインより高い（例えば10.5-20.0）混合Ca2+/Mg2+である（例えば、1ガロン当たり約15グレインの混合Ca2+/Mg2+）。北アメリカの水の硬度は、通常、日本の水の硬度よりも高いが、ヨーロッパの水の硬度より低い。例えば、北アメリカの水の硬度は3から10グレインの間、3-8グレイン又は約6グレインであり得る。日本の水の硬度は、通常、北アメリカの水の硬度より低く、普通、4未満、例えば1ガロン当たり3グレインの混合Ca2+/Mg2+である。
【００３４】
従って、いくつかの実施態様では、本発明は少なくとも1組の洗浄条件（例．水温、水の硬度、及び/又は洗剤濃度）で驚くべき洗浄機能を示すプロテアーゼ変異種を提供する。いくつかの実施態様では、本発明のプロテアーゼ変異種は、洗浄機能において、他のスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。いくつかの実施態様では、本発明のプロテアーゼ変異種は、現在、市販されているスブチリシンプロテアーゼと比較して増強された洗浄性能を示す。従って、本発明のいくつかの好ましい実施態様では、本明細書に記載されているプロテアーゼ変異種は、高い酸化安定性、高い熱安定性、及び/又は高いキレート剤安定性を示す。加えて、本発明のプロテアーゼ変異種は、洗剤を含まない洗浄剤組成物において、またも、それのみで、又は助剤や安定剤と組合わせて使用される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施態様では、洗浄剤組成物は、本組成物の重量の約0.00001%から約10%の水準で少なくとも1個の本発明のプロテアーゼ変異種を含み、残部（約99.999%から約90.0%）は、洗浄添加物を含む。本発明の他の局面では、本発明の洗浄剤組成物は、本組成物の重量の約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%の水準で少なくとも1個のプロテアーゼ変異種を含み、洗浄剤組成物の残部（例えば、重量で、約99.9999%から約90.0%、約99.999%から約98%、約99.995%から約99.5%）は、洗浄添加物を含む。
【００３６】
いくつかの実施態様では、好ましい洗浄剤組成物は、本明細書に記載された一以上のプロテアーゼ変異種に加えて、洗浄性能及び/又は布地を保護する利点を与える一以上の追加の酵素又は酵素誘導体を含む。そのような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例．ラッカーゼ）及び/又はマンナナーゼを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
いずれか他の適したプロテアーゼは、本発明の組成物で使用される。適したプロテアーゼは動物、植物又は微生物起源のものを含む。いくつかの特に好ましい実施態様では、微生物のプロテアーゼが使用される。いくつかの実施態様では、化学的に、遺伝学的に修飾された変異種が含まれる。いくつかの実施態様では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様のプロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルス（例．スブチリシン、レンツス、アミロリケファシエンス、スブチリシンカールスベルク(subtilisin Carlsberg)、スブチリシン309、スブチリシン147、及びスブチリシン168）由来のものを含む。追加の例は米国特許第RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936及び6,482,628に記載されたプロテアーゼ変異種を含み、これら全ては引用により本明細書に組み入れられる。追加のプロテアーゼの例は、トリプシン（ブタ又はウシ起源）とWO89/06270に記載されたフザリウムプロテアーゼ(Fusarium protease)を含むが、これらに限定されない。好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、MAXATASE（登録商標）、MAXACAL（商標）、MAXAPEM（商標）、OPTICLEAN（登録商標）、OPTIMASE（登録商標）、PROPERASE（登録商標）、PURAFECT（登録商標）及びPURAFECT(登録商標)OXP(Genencor);ALCALASE（登録商標）、SAVINASE（登録商標）、PRIMASE（登録商標）、DURAZYM（商標）、RELASE（登録商標）及びESPERASE（登録商標）(Novozymes);及びBLAP（商標）(Henkel Kommanditgesellschaft auf Akiten, ジュッセルドルフ、ドイツ)を含む。種々のプロテアーゼがWO95/23221、WO92/21760、及び米国特許第5,801,039号、第5,340,735号、第5,500,364号、第5,855,625号、US RE34,606、第5,955,340号、第5,700,676号、第6,312,936号、及び第6,482,628号及び種々の他の特許に述べられている。
【００３８】
加えて、いずれの適したリパーゼは本発明で使用できる。適したリパーゼは細菌又は菌類起源のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝子学的に修飾された変異体が本発明に含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ（例えば、EP258,068及びEP305216参照）、リズムコル・ミヘイリパーゼ(Rhizomucor miehei lipase)（例えば、EP238023参照）、カンジダリパーゼ(Candida lipase)、例えば、C.アンタークチカリパーゼ(C.antarctica lipase)（例えば、C.アンタークチカリパーゼA またはB；例えばEP214761参照）、シュードモナスリパーゼ、例えば、P. アルカリゲネス(P.alcaligenes)及びP.シュードアルカリゲネスリパーゼ（例えばEP218272参照）、P.セパシアリパーゼ（例えば、EP331376参照）、P.スツットゼリリパーゼ(P.stutzeri lipase)（例えば、GB1,372,034参照）、P.フルオレセンスリパーゼ(P.fluorescens lipase)、バシルスリパーゼ（例B.スブチリスリパーゼ[Dartoisら、Biochem.Biophys.Acta 1131:253-260[1993]]; B.ステアロテルモフィルスリパーゼ(B.stearothermophilus lipase)[例えばJP64/774992参照]；及びB.プミルスリパーゼ(B.pumilus lipase)[
例えばWO91/16422参照])を含む。
【００３９】
さらに、ペニシリウム・カメンベルティーリパーゼ(Penicillium camembertii lipase)（Yamaguchiら、Gene 103:61-67[1991]参照）、ジオトリクム・キャンディダムリパーゼ(Geotricum candidum lipase)(Schimadaら、J.Biochem.,106:383-388[1989]参照)、及び種々のリゾプスリパーゼ、例えば、R.デレマールリパーゼ（Hassら、Gene 109:117-113[1991]参照）、R・ニベウスリパーゼ(R.niveus lipase)（Kugimiyaら、Biosci.Biotech.Biochem. 56:716-719[1992]）及びR.オリゼリパーゼ(R.oryzae lipas)を含むがこれらに限定されない多くのクローン化されたリパーゼが、本発明のいくつかの実施態様で使用される。
【００４０】
シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)由来のクチナーゼ(cutinase) （WO88/09367参照）とフサリウム ソラニ ピシ(Fusarium solani pisi)由来のクチナーゼ（WO90/09446参照）を含むがこれに限定されないクチナーゼのような他のタイプの脂肪分解酵素も本発明のいくつかの実施態様で使用される。
【００４１】
追加の適したリパーゼは、M1 LIPASE（商標）、LUMA FAST（商標）及びLIPOMAX（商標）(Genencor)；LIPOLASE（登録商標）及びLIPOLASE（登録商標）ULTRA(Novozymes)；及びLIPASE P（商標）”Amano”(Amano Pharmaceutical Co.Ltd., 日本)のような市販されているリパーゼを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、本組成物の重量で約0.00001%から約10%の追加のリパーゼを含み、残部は洗浄剤添加物である。本発明の他の面では、本発明の洗浄剤組成物は、また本組成物の重量で約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のリパーゼも含有する。
【００４３】
アルカリ溶液での使用に適したいずれのアミラーゼ（アルファ及び/又はベータ）も本発明のいくつかの実施態様で使用される。適したアミラーゼは、細菌又は菌類起源のものを含むがこれらに限定されない。化学的に又は遺伝子学的に修飾された変異体がいくつかの実施態様に含まれる。本発明で使用されるアミラーゼは、B．リケニフォルミス（例えば、GB1,296,839参照）から得られたα-アミラーゼを含むが、これに限定されない。本発明で使用される市販のアミラーゼは、DURAMYL（登録商標）、TERMAMYL(登録商標)、FUNGAMYL（登録商標）及びBAN（商標）(Novozymes)及びRAPIDASE（登録商標）及びMAXAMYL（登録商標）P(Genencor)を含むがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明のいくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、さらに本組成物の重量で約0.00001%から約10%の追加のアミラーゼを含み、残部は洗浄剤添加物である。本発明の他の面では、本発明の洗浄剤組成物はまた、本組成物の重量で、約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%でアミラーゼを含有する。
【００４５】
いくつかのさらなる実施態様では、いずれの適したセルラーゼも本発明の洗浄剤組成物で使用される。適したセルラーゼは、細菌または菌類起源のものを含むがこれらに限定されない。化学的又は遺伝子学的に修飾された変異体はいくつかの実施態様に含まれる。適したセルラーゼは、フミコラインソレンスセルラーゼ（例えば米国特許第4,435,307参照）を含むがこれに限定されない。特に適したセルラーゼは、色を保護するセルラーゼである(例えば、EP0495257参照)。本発明で使用される市販のセルラーゼは、CELLUZYME（登録商標）(Novozymes)、及びKAC-500(B)（商標）(Kao Corporation)を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、セルラーゼは、Ｎ-末端部分が欠失された（例えば米国特許第5,874,276号参照）、成熟した野生型の、又は変異セルラーゼの一部又は断片の形で組み入れられる。いくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、さらに、この組成物の重量で約0.00001%から約10%の追加のセルラーゼを含み、残りは洗浄剤添加物である。本発明の他の面では、本発明の洗浄剤組成物は、また本組成物の重量の、約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のセルラーゼも含む。
【００４６】
洗剤組成物で使用に適したいずれのマンナナーゼも、また本発明で使用される。適したマンナナーゼは、細菌又は菌類起源のものを含むが、これらに限定されない。化学的に又は遺伝子学的に修飾された変異体がいくつかの実施態様に含まれる。本発明で使用される種々のマンナナーゼが知られている（例えば、米国特許第6,566,114号、米国特許第6,602,842号、及び米国特許第6,440,991号参照。これらは全て引用により本明細書に組み入れられる）。いくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、さらに組成物の重量で約0.00001%から約10%の水準で追加のマンナナーゼを含み、残部は洗浄剤添加物である。本発明の他の面では、本発明の洗浄剤組成物は、また本組成物の重量で約0.0001%から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%のマンナナーゼも含む。
【００４７】
いくつかの実施態様では、ペルオキシダーゼは、過酸化水素又はその発生源と組合わせて（例．過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）本発明の組成物の中で使用される。いくつかの他の実施態様では、オキシダーゼが、酸素と組合わせて使用される。両方のタイプの酵素は「溶液漂白」（つまり、複数の布地が洗浄液のなかでともに洗浄されるとき、染色された布地から染料が別の布地に移ることを防ぐため）のために使用され、好ましくは、増強剤（例えば、WO94/12621及びWO95/01426参照）と共に使用される。適したペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のものを含むが、これらに限定されない。化学的又は遺伝子学的に修飾された変異体がいくつかの実施態様に含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、組成物の重量の約0.00001%から約10%の水準の追加のパーオキシダーゼ及び/又はオキシダーゼを含み、残りは洗浄剤添加物である。本発明の他の面では、本発明の洗浄剤組成物は、また、本組成物の重量で約0.0001％から約10%、約0.001%から約5%、約0.001%から約2%、約0.005%から約0.5%の水準で、ペルオキシダーゼ及び/又はオキシダーゼ酵素も含む。
【００４８】
いくつかの実施態様では、ペルヒドロラーゼ（例えば、WO05/056782参照）を含むが、これに限定されない追加の酵素が使用される。加えて、いくつかの特に好ましい実施態様では、先に述べた酵素の混合物がこれに含まれ、特に１以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び/又は少なくとも１個のセルラーゼが含まれる。実際、これらの酵素の種々の混合物が、本発明で使用されることが意図されている。また、種々の水準のプロテアーゼ変異種と１以上の追加の酵素が、それぞれ約10%までで含まれ、洗浄剤組成物の残りは洗浄剤添加物である。洗浄剤添加物の具体的な選択は、洗浄を受ける表面、物品又は布地、及び使用中の洗浄条件に適した組成物の望ましい形態（例えば洗剤としての使用）を考慮することにより容易に行われる。
【００４９】
適した洗浄剤添加物の例は、界面活性剤、助剤、漂白剤、漂白活性剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、光学的漂白剤、汚れ遊離ポリマー、染料移動剤、分散剤、発泡抑制剤、染料、香料、色素、充填用塩、ヒドロトロープス、光活性化剤、蛍光剤、布地柔軟剤、加水分解性界面活性剤、保存剤、抗酸化剤、縮み防止剤、皺防止剤、殺菌剤、抗菌類剤、カラースペックルス(color speckles)、シルバーケア(silvercare)、変色防止剤及び/又は防錆剤、アルカリ源、溶剤、担体、処理助剤、色素、及びpH調整剤（米国特許第6,610,642号、第6,605,458号、第5,705,464号、第5,710,115号、第5,698,504号、第5,695,679号、第5,686,014号及び第5,646,101号参照。これら全ては引用により本明細書に組み入れられる。）具体的な洗浄剤組成物原料の実施態様は下記に詳細に挙げられている。本洗浄剤組成物中で、洗浄剤添加物質が本発明のプロテアーゼ変異種と適合しない実施態様では、２個の成分を併せることが適当になるまで、洗浄剤添加物質とプロテアーゼを分離しておく（つまり、互いに接触しないようにする）適当な方法が使用される。そのような分離法は、本技術分野で知られているいずれかの適当な方法（例．ゲルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離、など）を含む。
【００５０】
例として、本発明のプロテアーゼ変異種が使用されるいくつかの洗浄剤組成物は、以下にさらに詳細に述べられる。本発明の洗浄剤組成物が、洗濯機での使用に適した組成物として調合される実施態様では、本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも１個の界面活性剤と、少なくとも１個の助剤化合物、及び有機ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、発泡抑制剤、分散剤、石灰-石鹸分散剤(lime-soap dispersants)、汚れ懸濁及び再付着防止剤及び防錆剤から好ましくは選択される一以上の洗浄添加剤を含む。いくつかの実施態様では、洗濯組成物は、柔軟剤も含む（つまり、追加の洗浄添加物として）。本発明の組成物は、また固体又は液体の形態で洗剤添加物も使用する。そのような添加物は従来の洗剤組成物の性能を補い/又は増強することが意図され、洗浄プロセスの如何なる段階にも加えることができる。いくつかの実施態様では、本明細書の洗濯洗剤組成物の密度は約400から約1200g/リットルの範囲にあり、他の実施態様では、密度は20℃で測定して約500から約950g/リットルの範囲にある。
【００５１】
いくつかの実施態様では、米国特許第6,605,458号に記載されたような種々の洗浄剤組成物は、本発明のプロテアーゼ変異種と共に使用される。従って、いくつかの実施態様では、本発明の少なくとも１個のプロテアーゼ変異種を含有する本組成物は、コンパクト顆粒布地洗浄剤組成物であり、他の実施態様では、本組成物は染色された布地の洗濯に有用な顆粒布地洗浄剤組成物であり、さらに別の実施態様では、本組成物は、洗浄により柔軟化を行う顆粒布地洗浄剤組成物であり、他の実施態様では、本組成物は重質液体布地洗浄剤組成物である、いくつかの実施態様では、本発明の少なくとも１個のプロテアーゼ変異種を含有する組成物は米国特許第6,610,642号、第6,376,450号で述べられているような布地洗浄剤組成物である。加えて、本発明のプロテアーゼ変異種は、ヨーロッパ又は日本の洗浄条件下で特に効果的に使用される顆粒洗濯洗剤組成物で使用される（例えば米国特許第6,610,642号参照）。
【００５２】
本発明の洗浄剤組成物はいずれの適した形態にも調合され、調合者が選んだ何れの方法によっても調製される。これらの例は米国特許第5,879,584号、第5,691,297号、第5,574,005号、第5,565,422号、第5,516,448号、第5,489,392号及び第5,486,303号（全て、引用により本明細書に組み入れられる）に記載されているが、これらに限定はされない。低いpHの洗浄剤組成物が望ましい場合、そのような組成物のpHは、モノエタノールアミンのような物質又はHClのような酸性物質を加えることにより調整される。
【００５３】
本発明の目的に必須ではないが、この後に説明される添加物質の非限定的なリストは、本洗浄剤組成物での使用に適している。いくつかの実施態様では、これらの添加物質は、例えば、洗浄性能を補助又は向上させるため、洗浄を受ける物質の処理のため、又は香料、色素、染料等の場合のように洗浄剤組成物の美観等を修飾するため組み入れられる。そのような添加物質は、本発明のプロテアーゼ変異種に加えられると理解されている。これらの追加の添加成分の正確な性質とその組み入れの量は、組成物の物理的形態及びこれが使用される洗浄操作の性質により変わる。適した添加物質は、界面活性剤、助剤(builder)、キレート剤、染料転移防止剤、沈降助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素の安定剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白増強剤、過酸化水素、過酸化水素発生源、予め形成された過酸、ポリマー分散剤、クレーの汚れ除去/再付着防止剤、増白剤、発泡抑制剤、染料、香料、構造弾性化剤、柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられるが、これらに限定されない。下記の開示に加え、そのような他の添加物質の適した例と使用量は米国特許第5,576,282号、第6,306,812号及び第6,326,348号（これらは、引用により組み入れられる）に見出される。先に述べた添加成分は本発明の洗浄剤組成物の残部であっても良い。
【００５４】
いくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、界面活性剤が非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、それらの混合物から選択された、界面活性剤または界面活性剤系を含有する。
【００５５】
いくつかの実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、１以上の洗剤助剤又は助剤系を含有する。助剤はアルカリ金属、ポリリン酸のアンモニウム及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸のアルカリ金属塩、炭酸のアルカリ土類金属塩とアルカリ金属塩、アルミノシリケート助剤、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカーボキシレート、マレイン酸無水物とエチレン又はビニルメチルエーテルのコポリマー、1,3,5-トリヒドロキシベンゼン-2,4,6-トリスルホン酸、及びカルボキシメチロキシコハク酸、エチレンジアミン４酢酸及びニトリロトリ酢酸のようなポリ酢酸の種々のアルカリ金属、アンモニウム及び置換アンモニウムの塩及びメリチック酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン1,3,5-トリカルボン酸、カルボキシメチロキシコハク酸のようなポリカルボン酸及びそれらの可溶性の塩を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
いくつかの更なる実施態様では、本明細書に記載された洗浄剤組成物は、キレート剤を含む。適したキレート剤は銅、鉄、及び/又はマンガンのキレート剤及びそれらの混合物を含む。
【００５７】
いくつかのさらに別の実施態様では、本明細書に記載された洗浄剤組成物は、沈降助剤を含有する。適した沈降助剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸、ポリテレフタル酸のような汚れ遊離ポリマー、カオリナイト(Kaolinite)、モンモリロナイト、アタプルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト(halloysite)のようなクレー及びそれらの混合物を含む。
【００５８】
いくつかの追加の実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、また１以上の染料転移防止剤も含む。適したポリマー染料転移防止剤は、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンN-オキシドポリマー、N-ビニルピロリドンとN-ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンとポリビニルイミダゾールのコポリマー、又はそれらの混合物を含む。
【００５９】
いくつかのさらに追加の実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、また分散剤を含む。適した水溶性有機原料は、ホモ又はコポリマー性の酸又はその塩を含み、このポリカルボン酸は、炭素原子２個以下で互いに離れている少なくとも２個のカルボン酸基を含む。
【００６０】
いくつかの特に好ましい実施態様では、洗浄剤組成物は、洗浄性能及び/又は布地保護性を与える一以上の洗剤酵素を含む。適した酵素の例は、ヘミセルラーゼ、パーオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ及びアミラーゼ又はこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。典型的な組み合わせは、少なくとも１個のアミラーゼと組み合わされた、少なくとも１個のプロテアーゼ、少なくとも１個のリパーゼ、少なくとも１個のクチナーゼ、及び/又は少なくとも１個のセルラーゼ等の従来の利用できる酵素とのカクテルである。
【００６１】
いくつかのさらなる実施態様では、この洗浄剤組成物で使用される酵素は、いずれかの適した技術で安定化される。いくつかの実施態様では、ここで使用される酵素は、カルシウム及び/又はマグネシウムイオンを酵素に与える、最終組成物に含まれるカルシウム及び/又はマグネシウムイオンの水溶性の発生源の存在により安定化される。
【００６２】
いくつかのさらなる実施態様では、本発明の洗浄剤組成物は、触媒性の金属錯体を含む。金属含有漂白触媒の一つのタイプは、一定の漂白触媒活性をもつ遷移金属カチオン、例えば銅、鉄、チタン、ルテニウム、タンスステン、モリブデン、又はマンガンカチオン、漂白触媒活性を殆ど又は全くもたない予備の金属カチオン、例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン、及び触媒的及び予備的金属カチオンに対し一定の安定定数をもつ遮蔽剤、特に、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸、及びその水溶性の塩を含む触媒系である。そのような触媒は米国特許第4,430,243号に開示されている。
【００６３】
いくつかの実施態様では、本明細書の組成物はマンガン化合物により触媒される。そのような化合物と使用量は本技術分野で良く知られており、例えば、米国特許第5,576,282号で開示されたマンガンベースの触媒を含む。加えて、本明細書で有用なコバルト漂白触媒が知られており、例えば米国特許第5,597,936号、及び第5,595,967号について述べられている。そのようなコバルト触媒は、既知の方法で容易に調製され、例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号に記載されている。いくつかの実施態様では、本明細書に記載された組成物はまた適宜、巨大多環式の堅い配位子(つまり、”MRL”)の遷移金属錯体を含む。実用上（発明を限定するためにではない）、本明細書の組成物と洗浄プロセスは、水性の洗浄媒体に少なくとも１億分の１のオーダーで、活性なMRL種を与えるように調整でき、約0.005ppmから約25ppm、より好ましくは、約0.05ppmから約10ppm、さらにより好ましくは、約0.1ppmから約5ppmのMRLを洗浄液に与える。この遷移金属漂白触媒での好ましい遷移金属は、マンガン、鉄、クロムを含む。ここで好ましいMRLは5,12-ジエチル-1,5,8,12-テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンのような架橋体である、特別なタイプの超剛性配位子である。適した遷移金属MRLは、例えば、WO00/332601と米国特許第6,225,464号で記載されているような、既知の手順で容易に合成される。
【００６４】
上記のように、本発明の洗浄剤組成物は、いずれの適した形態にも調合され、調合者が選んだ何れの製造方法によっても調合され、これの限定されない例は、米国特許第5,879,584号、第5,691,297号、第5,574,005号、第5,569,645号、第5,516,448号、第5,489,392号及び第5,486,303号に記載され、これらの全ては引用により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
本明細書に開示された洗浄剤組成物は、洗浄を受ける場所（例．表面、食器類又は布地）で使用される。通常、その場所の少なくとも一部が、稀釈されずに又は洗浄液で稀釈された本洗浄剤組成物の実施態様と接触し、その場所が任意に、洗浄及び/又は濯ぎを受ける。本発明の目的のため、「洗浄」は、磨き上げること、及び機械的に撹拌することを含むが、これに限定されない。いくつかの実施態様では、洗浄剤組成物は、通常、溶液中に約500ppmから約15,000ppmの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は通常、約5℃から約90℃の範囲であり、その場所が布地を含むとき、水と布地の質量比は、通常約1:1から約30:1である。
定義
【００６６】
別に記載されている場合を除き、本発明の実施は、分子生物学、タンパク質工学、微生物学、及び組換えDNAで普通に使用される従来の技術で、本技術分野の技術の範囲内にあるものを含む。このような技術は本技術分野の技術者に知られ、多くの教科書や参考書に述べられている（例えば、Sambrookら、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,第２版(Cold Spring Harbor)、[1989]）；及びAusubelら”Current Protocols in Molecular Biology[1987]参照）。本明細書に述べられた全ての特許、特許出願、論文及び刊行物は、上記及び下記の両方で、引用により本明細書に明示的に組み入れられる。
【００６７】
本明細書で別に記載されている場合を除き、本明細書で使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の普通の技術者に普通に理解されているものと同一の意味を有する。これらの用語の定義を与える、本技術分野の者に利用できかつ知られている種々の辞書がある。本明細書で記載されている方法、材料に類似の又は同等のいかなる方法や材料も本発明の実施で使用できるが、好ましい方法と材料は、本明細書に述べられている。従って、直ぐ後に定義される用語は、明細書を全体として参照することにより、より十分に述べられる。また、本明細書で使用する場合、単数表記は、文脈から明らかに別に解釈する場合を除き、複数をも含む。数値の範囲はこの範囲を限る数字を含む。別に示されている場合を除き、核酸は左から右に5’から3’方向に記載される。アミノ酸配列はアミノ基からカルボン酸基の向きへ左から右へ書かれる。記載された特定の方法論、プロトコール、及び試薬は、これらが本技術分野の技術者により使用される状況により変わりうるので、この発明が記載された特定のものに限定されないことを理解するべきである。
【００６８】
別に記載されている場合を除き、本発明の実施は、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、及びタンパク質の配列決定からなる、従来の技術を用いる。これら全ては、本技術分野の技術者の技術の範囲内にある。
【００６９】
さらに、本明細書の表題は、全体的に明細書を参照して得られた発明の種々の面又は実施態様を限定するものではない。従って、直ぐ後に定義される用語は、全体として明細書を参照することにより、より十分に定義される。それにもかかわらず、発明の理解を容易にするため、多くの用語を以下に定義する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「プロテアーゼ」と「タンパク質分解活性」はペプチド又はペプチド結合をもつ基質を加水分解する性能を示すタンパク質又はペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定する多くの良く知られた手順がある(Fiechter（編）、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[1988]のKalisz, “Microbial Proteinases”)。例えば、タンパク質分解活性は、市販の基質を加水分解するそれぞれのプロテアーゼの性能を分析する比較定量法により確認されても良い。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性の分析において有用な基質の例は、ジメチルカゼイン(Sigma C-9801)、ウシコラーゲン(sigma C-9879)、ウシエラスチン(Sigma E-1625)、及びウシケラチン(ICN Biomedical 902111)を含むが、これらに限定されない。これらの基質を利用する比色定量は、本技術分野で良く知られている（WO99/34011:及び米国特許第6,376,450号参照、両者は引用により本明細書に組み入れられる）。pNA定量（例えば Del Marら、Anal.Biochem.,  99:316-320[1979]）も、またグラジエント溶出の間に収集される分画の活性酵素濃度を決定するときに使用される。この定量は、この酵素が可溶性の合成基質、スクシニル-アラニン-アラニン-プロリン-フェニルアラニン-ｐ−ニトロアニンリド(sAAPF-pNA)を加水分解する時のp-ニトロアニリンが遊離される速度を測定する。加水分解反応から生じる黄色の発生速度は分光光度計で410nmで測定され、活性な酵素の濃度に比例する。加えて、280nmでの吸光度測定は総タンパク質濃度を決定するために使用できる。活性酵素/総タンパク質量の比は、酵素純度を与える。
【００７１】
本明細書で使用する場合、本技術分野の技術者に知られているように、「バチルス属」とは、「バチルス」という属に属する全ての種（B.スブチリス、B.リケニフォルミス、B.レンツス、B.ブレビス、B.ステアロテルモフィルス、B.アルカロフィルス、B.アミロリケファシエンス、B.クラウシ、B.ハロデュランス、B.メガテリウム、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.ラウツス、及びB.スリンギエンシスを含むが、これらに限定されない）を含む。バシルス属は、分類学上の区分を継続して受けていることは知られている。従って、この属は、B.ステアロテルモフィルス（現在、”Geobacillus stearothermophilus ”と命名されている）のような生物を含むが、これに限定されない再分類された種を含むことが意図されている。酸素存在下での耐久性内生胞子の生成はバチルス属を定義付ける特徴であると考えられているが、この特徴は最近命名された、アリシクロバシルス(Alicyclobacillus)、アンフィバシルス(Amphibacillus)、アネウリニバシルス(Aneurinibacillus)、アノキシバシルス(Anoxybacillus)、ブレビバシルス(Brevibacillus)、フィロバシルス(Filobacillus)、グラシリバシルス(Gracilibacillus)、ハロバシルス(Halobacillus)、ペニバシルス(Paenibacillus)、サリバシルス(Salibacillus)、テルモバシルス(Thermobacillus)、ウレイバシルス(Ureibacillus)及びビルジバシルス(Virgibacillus)にもあてはまる。
【００７２】
用語「ポリヌクレオチド」と「核酸」は、本明細書で相互に入れ替えて使用されるが、いずれかの長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド重合体をいう。これらの用語は、単一、二重又は三重鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、又はプリンとピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された非天然の、又は誘導されたヌクレオチド塩基含むが、これらに限定されない。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、EST、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたDNA、いずれかの配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマー。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含み、例えば、メチル化されたヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、ウラシル、フルオロリボースとチオエートのような他の糖と連結基(linking groups)及び、ヌクレオチドの分岐を含む。他の実施態様では、ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「DNA構造体」と「形質転換DNA」は、相互に入れ替えて使用され、宿主細胞又は生物に配列を導入するために使用されるDNAをいう。このDNAは、PCR又は本技術分野の技術者に知られているいずれか他の適当な技術により生体外(in vitro)で作成されても良い。特に好ましい実施態様では、このDNA構造体は、目的の配列（例．導入される配列として）を含む。いくつかの実施態様では、この配列は調整因子（例．プロモーター等）のような追加因子と機能的に連結している。このDNA構造体は、さらに選択マーカーを含む。これは、さらに、相同性ボックスにより挟まれた導入される配列を含む。さらなる実施態様では形質転換DNAは、末端に加えられた他の非相同性配列（例．スタッファー配列又はフランクス）を含む。いくつかの実施態様では、導入される配列の末端は、閉じており、形質転換DNAは、閉じた円環を形成している。この形質転換配列は野生型、変異体又は修飾を受け得る。いくつかの実施態様では、このDNA構造体は宿主細胞の染色体と相同性の配列を含む。他の実施態様では、このDNA構造体は非相同性の配列を含む。DNA構造体が生体外で作成されると、1) これは、宿主細胞の好ましい目的配列へ異種の配列を挿入し、及び/又は2)宿主細胞の染色体のある領域を変異させ（つまり、異種の配列で固有の配列を置き換える）、3)目標とする遺伝子を欠失させ、及び/又は4)宿主に複製するプラスミドを導入する、ために使用される。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」と「発現ベクター」は、目標細胞の中で特定の核酸の転写を行わせる一連の特定の核酸因子を伴う、組換えにより又は合成により作成された核酸構造体をいう。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウィルス、又は核酸の断片に導入できる。通常は、発現ベクターの組換発現カセットの部分はとりわけ、転写を受ける核酸配列とプロモーターを含む。好ましい実施態様では、発現ベクターは宿主細胞で異種のDNA断片を組み入れ、発現する性能を有する。多くの原核及び真核発現ベクターは、市販されている。適当な発現ベクターの選択は、本技術分野の技術者の知識の範囲内にある。用語「発現カセット」は、本明細書では、「DNA構造体」及びその文法的な等価物と相互に交換して使用される。適当な発現ベクターの選択は、本技術分野の技術者の知識の範囲内にある。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は１以上のタイプの細胞に核酸を導入するように設計されたポリヌクレオチド構造体をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を含む。いくつかの実施態様では、このポリヌクレオチド構造体は、適当な宿主でDNAの発現を行わせることができる適当な先行配列（例えば、分泌用など）と機能的に連結しているプロテアーゼ（例．前駆体又は成熟プロテアーゼ）をコードするDNA配列を含む。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用される環状の二重鎖(ds)のDNA構造体をいい、いくつかの真核細胞又は原核細胞内で染色体外の自己複製を行う遺伝因子を形成するか、又は宿主の染色体へ組み込まれる。
【００７７】
本明細書で、細胞へ核酸配列を導入する場面で使用される場合、用語「導入された」は、核酸配列を細胞へ移すために適したいずれかの方法をいう。導入のそのような方法は、プロトプラスト融合、感染(transfection)、形質転換、接合、及び形質導入を含むが、これらに限定されない（例えば、Hardwoodら（編）Bacillus、Plenum Publishing Corp., pages 57-72[1989]、Ferrariらの”Genetics”参照）。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「形質転換された」及び「安定に形質転換された」は、固有でない（異種の）ポリヌクレオチド配列をそのゲノムに組み入れている、又は、これを少なくとも二世代の間エピソーム様のプラスミドとして維持する細胞をいう。
【００７９】
核酸が別の核酸配列と機能的な関係を有するように配置された場合、「機能的に連結している」。例えば、分泌リーダーをコードするDNA（つまり、シグナルペプチド）は、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNAと機能的に連結している。プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列と機能的に連結している。または、リボゾーム結合部位が翻訳を促すように配置されている場合、リボゾームの結合部位はコーディング配列と機能的に連結している。一般に、「機能的に連結した」とは、連結されているDNA配列が連続し、分泌リーダーの場合、連続し、読み取り相(reading phase)に存在する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。機能的な連結は、都合の良い制限部位での連結反応(ligation)により達成される。そのような部位が存在しないときは、合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーが、従来の方法に従い用いられる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例．DNA切片）及び、コーディング領域の前と後の領域と、個々のコーディング切片（エキソン）の間にある介在配列（イントロン）をともに含む。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「相同遺伝子」は、異なっているが、普通関連する種由来の、互いに対応し、かつ互いに同一又は非常に類似である一組の遺伝子をいう。この用語は、種の分化により分離された遺伝子（つまり、新しい種の出現）（例．オーソロガス遺伝子）と遺伝子の重複（例．パラロガス遺伝子）により分離された遺伝子を含む。
【００８２】
本明細書で使用する場合、タンパク質が、同一の配列及び同一の位相幾何学的な結合もった同一の主要二次構造を有する場合、タンパク質は共通する「折リたたみ」を有するとして定義される。同一の折りたたみをもつ異なるタンパク質は、大きさとコンフォーメーションで異なる二次構造とターン領域の周辺要素を有することが多い。いくつかの場合では、これらの異なる周辺領域は、その構造の半分を含んでも良い。同一の折りたたみに分類されるタンパク質群が、必ずしも共通した進化の起源をもつとは限らない（例．ある充填配列や分子鎖の位相幾何を好むタンパク質の物理学と化学から生じる構造的な類似性）。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「相同性」とは配列の類似性又は同一性であり、同一性が好ましいことをいう。この相同性は本技術分野で知られている標準的技術（例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482[1981];Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.,48:443[1970];Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444[1988];the Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, Madison, WI)のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTAのようなプログラム;及びDevereux らのNucl.Acid Res, 12:387-395[1984]）を用いて決定されている。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「類似配列」は、遺伝子の機能が野生型のスブチリシンプロテアーゼに基く遺伝子と本質的に同一である場合のものである。加えて、類似遺伝子は野生型スブチリシンプロテアーゼの配列と少なくとも約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は約100%の配列同一性を含む。または、類似配列は、B・アミロリケファシエンス スブチリシンプロテアーゼ領域で見られる遺伝子の約70から約100%の配列を有する。別の実施態様では、先の性質の一より多くがこの配列に存在する。類似の配列は配列の位置合わせの既知の方法により決定される。普通に使用されている位置合わせの方法は、BLASTである。しかし、上記と下記に示されているように、配列の位置合わせで使用される他の方法もある。
【００８５】
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、進行的な一組毎の位置合わせを用いて、一群の関連する配列から複数の配列の位置合わせを行う。位置合わせを行うために使用される類似度による関連付け(the clustering relationships)を示すツリーをプロットすることもできる。PILEUPはFengとDoolittleの進行的位置合わせの方法の単純化したものを用いる(Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360[1987])。この方法はHiggins とSharp により述べられたものと類似している。(Higgins and Sharp, CABIOS 5;151-153[1989])。有用なPILEUPパラメーターは、3.00のデフォルトギャップウェイト(default gap weight)、0.10のデフォルトギャップレングスウェイト(default gap length weight)、及びウェイテドエンドギャップ(weighted end gap)を含む。
【００８６】
有用なアルゴリズムの別の例は、BLASTアルゴリズムであり、Altschulらにより述べられている(AltschulらJ.Mol.Biol.,215:403-410,[1990];及びKarlinら、Proc.Natl. Acad.Sci. USA 90:5873-5787[1993]))。特に有用なBLASTプログラムは、WU-BLAST-2プログラムである（Altschulら、Meth. Enzymol., 266:460-480[1996]参照）。WU-BLAST-2はいくつかのサーチパラメーターを使用し、これらの殆どは初期値に設定される。この調整可能なパラメーターは、以下の値により設定される。：オーバーラップスパン(overlap span) = 1、オーバーラップフラクション(overlap fraction) = 0.125、ワードスレッシュホールド(word threshold(T) )=11。HSP SとHSP S2パラメーターは動的な値であり、それに対して目的の配列がサーチされている特定のデータベースの組成と特定のデータベースの組成により、プログラム自身により決定される。しかし、この値は感度を上げるために調整されても良い。A%のアミノ酸配列の同一性値(identity value)は、位置合わせされた領域における「長い方」の配列の残基の総数で一致した同一の残基の数を割ることで決定される。この「長い方」の配列は、位置合わせされた領域で最も多くの残基をもつものである(位置合わせのスコアを最大にするためWU-Blast-2により導入されたギャップは無視される)。
【００８７】
従って、「パーセント(%)核酸配列の同一性」は、開始配列（つまり、目的配列）のヌクレオチド残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。好ましい方法は、初期値に設定された、WU-BLAST-2セットのBLASTNモジュールを、初期値で利用し、オーバーラップスパンとオーバーラップフラクションは、それぞれ1と0.125に設定する。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「組換え」は細胞又はベクターをいう場合をふくみ、これらは、異種の核酸配列の導入により修飾されたもの、またはそのように修飾された細胞から生じた細胞である。従って、例えば組換え細胞は、意図的な人の介入の結果、発現する又は全く発現できない状態となり、この細胞の天然（非組換え）体では同一の形態では見出だされない遺伝子、または、組み換えがされていなければ、発現することが異常である天然の遺伝子を発現する。
核酸の「組換え」及び「組換え」核酸の生成は、組み合わせがキメラの遺伝子を生じる、一般的に２以上の核酸断片の組み合わせである。
【００８９】
いくつかの好ましい実施態様では、変異DNA配列は少なくとも１つのコドンで位置飽和変異(site saturation mutagenesis)により生成される。別の好ましい実施態様では、位置飽和変異は２以上のコドンに行われる。さらに別の実施態様では、変異DNA配列は、野生型の配列と、約50%より高く、約55%より高く、約60%より高く、約65%より高く、約70%より高く、約75%より高く、約80%より高く、約85%より高く、約90%より高く、約95%より高く、または約98%より高い相同性をもつ。別の実施態様では、変異DNAは、例えば、照射、ニトロソグアニジン等のいずれか既知の変異誘導の手順を使い、生体内で生成される。目的のDNA配列は、次に単離され、本明細書で与えられた方法で使用される。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「増幅」と「遺伝子増幅」は特定のDNA配列が不均等に複製され、その結果、増幅された遺伝子がゲノムに当初存在したよりも多くのコピー数で存在するようになる方法をいう。いくつかの実施態様では、医薬品（例．阻害できる酵素の阻害剤）の存在下での増殖により細胞を選別することは、医薬品の存在下で増殖に必要な遺伝子産生物をコードする内因性の遺伝子を増幅、又は、この遺伝子産生物をコードする外来の（つまり、導入された）配列を増幅する結果、或いは両者となる。
【００９１】
「増幅」は、鋳型の特異性を含む核酸の複製の特別な場合である。これは、非特異的な鋳型の複製（つまり、鋳型に依存はするが、しかし特定の鋳型には依存しない複製）と対照的である。鋳型の特異性は、ここでは複製の正確性（つまり、適当なポリヌクレオチド配列の合成）やヌクレオチド（リボ-又はデオキシリボ-）の特異性と区別される。鋳型特異性は、「目標」の特異性により記述されることが多い。目標配列は、これらを他の核酸から選択するため求められるという意味で「目標」である。増幅技術は、主にこの選択ために設計されてきた。
【００９２】
本明細書で使用する場合、精製された制限酵素による切断による場合のように天然に発生するか、又は合成的に製造されるかに係らず、用語「プライマー」はオリゴヌクレオチドで、核酸分子鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（つまり、ヌクレオチドと、DNAポリメラーゼのような誘導剤の存在と適当な温度とpH）におかれた場合、合成の開始点として作用できるものである。このプライマーは、増幅において最大の効率を達成するため一本鎖であることが好ましい。しかし、二重鎖でも良い。二重鎖である場合、このプライマーは、伸長した生成物を調製するために使用される前に、まずその分子鎖を分離するために処理されるべきである。好ましくは、このプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このプライマーは誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を開始するために十分に長くなければならない。このプライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源及び使用する方法等の多くの因子により決まる。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「プローブ」は、オリゴヌクレオチド（つまり、ヌクレオチドの配列）をいい、精製された制限酵素による切断のように天然に生じるもの、または合成、組換え又はPCRによる増幅ものでも良く、目的の別のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できるものである。プローブは一本鎖又は二重鎖でも良い。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で使用されるいずれのプローブも、何れかの「レポーター分子」により標識され、その結果、酵素（例．ELISA及び酵素による組織化学的測定法）、蛍光、放射性活性及び発光系を含むがこれらに限定されない、いづれかの検出系で検出可能である。本発明をいずれか特定の検出系又は標識に限定することは意図していない。
【００９４】
本明細書で使用する場合、用語「目標」がポリメラーゼ連鎖反応に関して使用されるときは、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーで結合される核酸領域をいう。従って、「目標」は、他の核酸配列から分別されることが求められる。「セグメント」は目標配列の中の、ある核酸領域として定義される。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)は米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,965,188号（これは引用により本明細書に組み入れられる）の方法をいい、クローニングまたは精製せずに遺伝子DNAの混合物内で目標配列のセグメントの濃度を高くする方法を含む。目標配列を増幅するこの方法は、欲する目標配列を含むDNA混合物に大過剰の２本のオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いてDNAポリメラーゼの存在下で、加熱サイクルを正確に進行させることからなる。この２本のプライマーは二重鎖の目標配列のそれぞれの分子鎖と相補的である。増幅を行うために、この混合物が、変性され、プライマーが次に目標分子内の相補的な配列へアニーリングされる。アニーリングの後、このプライマーは新しい一組の相補的な分子鎖を形成するようにポリメラーゼにより伸長される。高濃度の、欲する目標配列の増幅されたセグメントを得るために、変性、プライマーのアニリーングとポリメラーゼによる伸長のステップを、何度も繰り返すことができる（つまり、変性、アニーリング及び伸長は１「サイクル」を構成する；多くの「サイクル」を繰り返すことができる）。欲する目標配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いの相対的な位置により決まる。そのため、この長さは、制御可能なパラメーターである。本法は繰り返して行うことから、本法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（今後、”PCR”という。）といわれる。目標配列の欲する増幅されたセグメントが混合物において主要な配列（濃度に関して）になるので、これらは「PCR増幅された」といわれる。
【００９６】
本明細書で使用する場合、用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型及び増幅酵素以外の増幅に要する試薬（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、緩衝液等）をいう。通常は、増幅試薬は他の反応成分とともに投入され、１つの反応容器（試験管、マイクロウェル等）に入れられる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「RT-PCR」は、RNA配列の複製と増幅をいう。この方法では、逆転写がPCRと組み合わされ、米国特許第5,322,770号に述べられているように、熱に安定なポリメラーゼが使用される１酵素を使用する手順を最も良く使用する。RT-PCRでは、RNAの鋳型がこのポリメラーゼの逆転写酵素活性によりcDNAに変換され、次にこのポリメラーゼの重合活性を用いて増幅される（他のPCR法のように）。
【００９８】
本明細書で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」と「制限酵素」は細菌の酵素をいい、これらのそれぞれは、特定のヌクレオチド配列で、又はその近傍で二重鎖のDNAを切断する。「制限部位」は、所与の制限エンドヌクレアーゼにより識別され、切断された核酸配列をいい、DNA断片の挿入部位になることが多い。本発明のある実施態様では、制限部位は選択マーカー及びDNA構造体の5’及び3’末端に入れられるように操作される。
【００９９】
「相同的組換え」は、同一又はほぼ同一の核酸配列の部位で、２つのDNA分子又は一組の染色体の間でDNA断片が交換されることを意味する。好ましい実施態様では、染色体への組み入れは、相同的組換である。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、ペプチド又はタンパク質配列又はそれらの一部をいう。用語、「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は相互に変えて使用される。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「目的のタンパク質」と「目的のポリペプチド」は、欲する及び/又は測定されるタンパク質/ポリペプチドをいう。いくつかの実施態様では、目的のタンパク質は、細胞内で発現され、他の実施態様では、分泌されるポリペプチドである。特に好ましい実施態様では、これらの酵素は本発明のセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施態様では、目的のタンパク質はシグナルペプチド（つまり、分泌されるタンパク質のアミノ基-末端から伸長する）に融合した分泌されるポリペプチドである。殆ど全ての分泌されるタンパク質は、目的の位置への移動(targeting)と前駆体タンパク質が膜を通過する際に重要な役割を果たすアミノ基末端からの伸長鎖を使用する。この伸長鎖は膜を通過する間又はその直後にシグナルペプチダーゼにより、タンパク質の分解により取り除かれる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドがその自然の状態で、又は本技術分野の技術者に知られた方法により操作された場合に、転写及び/又は翻訳されRNA、ポリペプチド又はそれらの断片が産生され得るときは、ポリヌクレオチドは、RNA又はポリペプチドを「コードする」といわれる。そのような核酸のアンチセンス鎖もこの配列をコードするといわれる。本技術分野で知られているように、DNAはRNAポリメラーゼにより転写され、RNAを産生できる。しかし、RNAは逆転写酵素により逆転写され、DNAを産生できる。従ってDNAはRNAをコードすることができ、逆もまた成り立つ。
【０１０３】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明のDNAを含む発現ベクターに適した宿主をいう。
【０１０４】
酵素が、その野生の細胞で発現される水準より高い水準で、細胞内で発現される場合、酵素は宿主細胞で「過剰発現」されている。
【０１０５】
用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は、本明細書では相互に変換して使用される。生化学命名に関するIUPAC‐IUB合同委員会（JCBN） に従い定義されるアミノ酸の３-文字コードが、本開示全体で使用される。遺伝子コードの縮重によりポリペプチドは一より多くのヌクレオチド配列でコードされ得ることも理解されるべきである。
【０１０６】
「前駆配列」はプロテアーゼの分泌に必要であるシグナル配列と成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。この前駆配列の切断により成熟活性プロテアーゼが生成する。
【０１０７】
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟体又は前駆体の分泌に関与するヌクレオチド及び/又はアミノ酸のいずれかの配列をいう。シグナル配列のこの定義は、機能的な定義であり、タンパク質遺伝子のN-末端部分によりコードされる全てこれらのアミノ酸配列を含みことが意図され、このアミノ酸配列は、タンパク質の分泌に関与する。これらは、全てではないが、タンパク質のN-末端部分又は前駆体タンパク質のN-末端部分に結合することが多い。このシグナル配列は、内因性又は外来性である。このシグナル配列は、タンパク質（例．プロテアーゼ）と組み合わされているのが正常であり、別の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子に由来しても良い。外来性のシグナル配列の一例は、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)スブチリシンのシグナル配列の最初の７個のアミノ酸を含み、これはバシルス・レンツス(Bacillus lentus)(ATCC21536)由来のスブチリシンのシグナル配列の残部に結合している。
【０１０８】
用語「ハイブリッドシグナル配列」は、配列の一部が発現宿主から得られ、発現される遺伝子のシグナル配列に結合したシグナル配列をいう。いくつかの実施態様では、合成された配列が使用される。
【０１０９】
用語、タンパク質又はペプチドの「成熟」形は、タンパク質又はペプチドの最終の機能的形態をいう。例えば、本発明のBPN’スブチリシンプロテアーゼの成熟形は少なくとも、以下に記載された、配列番号１の１−２７５の位置の残基と同一のアミノ酸配列を含む。
2015211671.tif 000011
【０１１０】
用語、タンパク質又はペプチドの「前駆体」型は、このタンパク質のアミノ基又はカルボニル末端に機能的に連結された前駆配列をもつタンパク質の成熟形をいう。この前駆体は、また前駆配列のアミノ基末端に、機能的に連結している「シグナル」配列を有しても良い。この前駆体は、翻訳後の活性に関与する追加のポリヌクレオチドも有してよい（例．これから開裂されてタンパク質又はペプチドの成熟形を遊離するポリヌクレオチド）。
【０１１１】
「天然に生じる酵素」は、天然に見出されるものと同一の修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素をいう。天然に生じる酵素は固有の酵素を含み、これらの酵素は特定の微生物内で、自然に発現され又は見出される。
【０１１２】
用語「から生じる」と「から得られる」は、問題の生物の株により産生される、又は産生され得るプロテアーゼをいうだけではなく、そのような株から単離されたDNA配列によりコードされ、そのようなDNA配列を含む宿主で産生されるプロテアーゼをいう。加えて、この用語は、合成及び/又は c DNA起源のDNA配列によりコードされ、かつ問題のプロテアーゼを同定する特徴を備えたプロテアーゼをいう。
【０１１３】
この定義の範囲内にある「誘導体」は、一般的に野生型の、天然の又は親の形態に観察される特徴的なタンパク質分解活性を、野生型の、天然の又は親の形態と類似する目的に有用である程度に保持する。セリンプロテアーゼの機能的誘導体は、本発明のセリンプロテアーゼの一般的特徴を有する、自然に生じる、合成的に調製される、又は組換により産生されるペプチド又はペプチド断片を含む。
【０１１４】
用語「機能的誘導体」は、セリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的特徴を有する核酸の誘導体をいう。本発明のセリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的誘導体は、天然の、合成により又は組換により調製される核酸又は断片を含み、本発明に特徴的であるセリンプロテアーゼをコードする。本発明のセリンプロテアーゼをコードする野生型の核酸は、本技術分野で知られている遺伝子コードの縮重に基づく、天然の対立遺伝子と相同体を含む。
【０１１５】
２個の核酸又はポリペプチド配列について用語「同一の」は、以下の配列比較又は分析のアルゴリズムの一つを用いて測定するとき、最大の対応があるように位置合わせされたときに、同一である２つの配列中の残基をいう。
【０１１６】
用語「最適の位置合わせ」は、最高のパーセントの同一性スコアを与える位置合わせをいう。
【０１１７】
２個のアミノ酸、ポリヌクレオチド及び/又は遺伝子配列（適当な場合）に関して、「パーセント配列同一性」、「パーセントアミノ酸配列同一性」、「パーセント遺伝子配列同一性」及び/又は「パーセント核酸/ポリヌクレオチド配列同一性」は、配列が最適に位置合わせされるときに、２個の配列で同一である残基のパーセントをいう。従って、80%のアミノ酸配列同一性は、２つの最適に位置合わせされたポリペプチド配列中のアミノ酸の80%が同一であることをいう。
【０１１８】
２個の核酸又はポリペプチドに関し「実質的に同一」という語句は、例えば、標準的パラメーターを用いたプログラム又はアルゴリズム(例．BLAST，ALIGN，CLUSTAL)を用いて対照配列と比較したとき、少なくとも約70%同一、好ましくは少なくとも約75%同一、好ましくは少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98%、及び好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。２個のポリペプチドが実質的同一である一つの証拠は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応性があることである。通常、保存的なアミノ酸の置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。従って、２個のペプチドが、保存的置換のみにより異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に同一である別の証拠は、厳格な条件（例．中程度から高度な厳格性の範囲内）で、２個の分子が互いにハイブリッド形成することである。
【０１１９】
本明細書で、語句「等価」は、中程度から最大の厳格な条件下で、目的のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成できるポリヌクレオチドによりコードされたセリンプロテアーゼ酵素をいう。例えば、等価であるとは、等価の成熟セリンプロテアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列をもつ成熟スブチリシンプロテアーゼと、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、及び/又は少なくとも約99%の配列の同一性を含むことを意味する。
【０１２０】
用語「単離された」又は「精製された」は、元あった環境（例．自然に生じる場合、自然環境）から取り出された物質をいう。例えば、自然の、又は野生型の生物内に存在するよりも高い又は低い濃度で組成物に含まれるとき、又は自然の又は野生の生物から発現されたときには普通には存在しない成分と組み合わされて組成物に含まれるとき、その物質は「単離された」といわれる。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されていない。しかし、自然系で共に存在する物質のいくつか又は全てから分離されている同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されている。いくつかの実施態様では、そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、及び/又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、組成物の一部であり、そして、そのベクター又は組成物がその自然環境の一部でない点で依然、単離されている。
好ましい実施態様では、電気泳動のゲル又はブロットで本質的に一本のバンドを生じる場合、核酸またはタンパク質は精製されているといわれる。
【０１２１】
DNA配列について使用されるとき、用語「単離された」は、その天然の遺伝子の環境から取り出され、そのため他の外来の又は欲しないコード配列を含まず、そして遺伝子学的に操作されたタンパク質産生系内での使用に適した形態にある、DNA配列をいう。そのような単離された分子は、その自然環境から分離された分子であり、cDNAと遺伝子クローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は、それが普通組み合わされている他の遺伝子を含まない。しかし、プロモーターとターミネーターのような、天然の5’と3’の非翻訳領域を含んでも良い。組み合わされた領域の特定は、本技術分野の普通の技術者には明らかであろう（例．Dynan and Tijan, Nature 316:774-78[1985]）。用語「単離されたDNA配列」は、また「クローン化されたDNA配列」とも呼ばれる。
【０１２２】
用語「単離された」は、タンパク質に関して使用されるとき、その天然の環境以外の条件で見出されるタンパク質をいう。好ましい形態では、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同性のタンパク質を実質的に含まない。単離されたタンパク質は、SDS-PAGEで決定する場合、約10%より純度が高く、好ましくは約20%より純度が高く、さらにより好ましくは約30%より純度が高い。本発明のさらに別の面は、SDS-PAGEで決定したとき、高度に精製された（つまり、約40%よりも純度が高く、約60%よりも純度が高く、約80%よりも純度が高く、約90%よりも純度が高く、約95%よりも純度が高く、約97%よりも純度が高く、及びさらに約99%よりも純度が高い）タンパク質を含む。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、「コンビナトリアル変異誘発」は、開始配列の変異体のライブラリーが作成される方法をいう。これらのライブラリーでは、変異体は、一つの予め決めた変異の組から選択された１又は数個の変異を含む。加えて、本法は予め決めた変異の組に属さない無作為な変異を導入する手段を提供する。いくつかの実施態様では、本法は2000年10月26日に出願された、米国特許出願第09/699,250（引用により、本明細書に組み入れる）に記載された方法を含む。別の実施態様では、コンビナトリアル変異誘発法は、市販のキット（例．QuikChange（登録商標）Multisite、Stratagene、San Diego、CA）を含む。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、用語「変異体のライブラリー」は、そのゲノムの大部分で同一であるが、一以上の遺伝子の異なる相同体を含む細胞群をいう。そのようなライブラリーは、例えば、改良された性質をもつ遺伝子又はオペロンを同定するために、使用できる。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、用語「開始遺伝子」は、本発明を使用して改良され及び/又は変更される予定の目的タンパク質をコードする目的遺伝子である。
【０１２６】
本発明で使用される場合、用語「複数配列の位置合わせ」(MSA)は、アルゴリズム（例．Clustal W）を使用して位置合わせされた開始遺伝子の複数の相同体の配列をいう。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、用語「共通配列」と「標準配列」は、目的とする特定のタンパク質又は配列の全ての変異体と比較する対象となる原型のアミノ酸配列をいう。この用語は、目的のDNA配列に含まれることが最も多いヌクレオチドを規定する配列をもいう。遺伝子の各位置について、共通配列はMSAのその位置で最も多く出現するアミノ酸を与える。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「共通変異誘発」は開始遺伝子の配列と共通配列の違いをいう。共通変異誘発は、開始遺伝子の配列とMSAから得られる共通配列の比較により同定される。いくつかの実施態様では、共通変異誘発が開始遺伝子に導入され、その結果、開始配列は共通配列により類似するようになる。共通変異誘発は、また開始遺伝子のアミノ酸を、開始遺伝子のそのアミノ酸の出現頻度と比較して、その位置でMSAにおいて、より頻繁に見出されるアミノ酸に変える、アミノ酸の変更も含む。従って、この用語、共通変異誘発は、開始遺伝子のアミノ酸をMSAでそのアミノ酸よりも頻繁に出現するアミノ酸と置換する全ての単一のアミノ酸の変換を含む。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、用語「増強されたコンビナトリアル共通変異誘発ライブラリー」は、先に行ったCCM変異誘発とスクリーニングから得られるスクリーニング及び/又は配列決定の結果に基きデザインされ、構築されたCCMライブラリーをいう。いくつかの実施態様では、増強されたCCMライブラリーは、先行のCCMの初期の選別を受けたものの配列に基く。別の実施態様では、増強されたCCMは、先行の変異誘発とスクリーニングの初期の選別で頻繁に観察された変異誘発が優先されるように設計される。いくつかの好ましい実施態様では、これは、性能を低下させる変異誘発をコードするプライマーを除くことにより、又は、先に作成したCCMライブラリーで使用された他のプライマーと比較して、性能を増強する変異をコードするプライマーの濃度を高めることにより達成される。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、用語「性能低下変異誘発」は、スクリーニングを受けていないコンビナトリアル共通変異誘発ライブラリーと比較したとき、スクリーニングの結果の選択された変異の中でより低い頻度で見出される、コンビナトリアル共通変異誘発ライブラリー中の変異をいう。好ましい実施態様では、このスクリーニング法は「性能低下変異誘発」を含む変異を、除きまたはその頻度を下げる。
【０１３１】
本明細書で使用されるとき、用語「機能測定」は、タンパク質の活性を示す測定を言う。特に好ましい実施態様では、この用語は、あるタンパク質がその通常の性能で機能する能力について分析される測定系をいう。例えば、酵素の場合、機能測定は、反応の触媒において酵素の効率を決定することを含む。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、用語「目標の性質」は、変えられるべき開始遺伝子の性質をいう。本発明はいずれかの特定の目標の性質に限ることは意図していない。しかし、いくつかの好ましい実施態様では、目標性質は遺伝子産生物の安定性（例．変性、タンパク質分解反応又は他の分解性因子に対する抵抗性）であり、他の実施態様では、産生宿主における産生の水準が変えられる。実際、開始遺伝子のいずれの性質も本発明で使用することを意図している。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、核酸について述べる場合、用語「性質」又はそれと文法的に等価な語句は、選びうる又は検出され得る核酸の何れかの特徴又は性質をいう。これらの性質は、ポリペプチドへの結合に影響する性質、特定の核酸を含む細胞に与えられる性質、遺伝子の転写に影響する性質（例．プロモーターの強度、プロモーターの認識、プロモーターの調節、エンハンサーの機能）、RNA処理（例．RNAスプライシング、RNA安定性、RNAコンホメーション、及び転写後の修飾）に影響する性質、翻訳に影響する性質（例．量、調節、mRNAのリボゾームタンパク質への結合、翻訳後の修飾）を含むが、これらに限定されない。例えば、核酸の転写因子、ポリメラーゼの結合部位、調節因子等は、望ましい特性を生じさせるため、望ましくない特性を特定するために変えられても良い。
【０１３４】
ポリペプチド（タンパク質を含む）に関して述べる場合に、用語「性質」又は文法的なその等価物は、本明細書で使用する場合、選ばれ又は検出されえるポリペプチドのいずれかの特性又は性質をいう。これらの性質は、酸化的安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、pH活性プロファイル、タンパク質分解に対する抵抗性、KM、kcat, kcat/kM比率、タンパク質の折りたたみ、免疫反応性、配位子に結合する性能、受容体に結合する性能、分泌を受ける性能、細胞の表面に提示される性能、オリゴマー化する性能、シグナルを伝える性能、細胞増殖を刺激する性能、細胞増殖を抑制する性能、アポトーシスを誘導する性能、リン酸化又はグルコース化により修飾される性能、及び/又は疾病等を治療する性能などを含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
用語「修飾された配列」と「修飾された遺伝子」は、自然に生じる核酸配列の欠失、挿入、又は中断を含む配列をいうため、本明細書で相互に変えて使用される。いくつかの好ましい実施態様では、修飾された発現産生物は、短縮したタンパク質である（例．この修飾が、配列の欠失又は中断であるとき）。いくつかの特に好ましい実施態様では、短縮したタンパク質は、生化学的活性を保持している。別の実施態様では、修飾された配列の発現産生物は、伸長されたタンパク質である（例．核酸配列への挿入を含む修飾）。いくつかの実施態様では、挿入は、短縮されたタンパク質を生じる（例．挿入が停止コドンの形成につながる場合）。従って、挿入は、発現産生物として短縮された又は伸長されたタンパク質になる。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「変異配列」と「変異遺伝子」は相互に変えて使用され、宿主細胞の野生型配列で少なくとも１個のコドンで発生する変異を持つ配列をいう。変異配列の発現産生物は、野生型と比較して変化したアミノ酸配列をもつタンパク質である。この発現産生物は性能が変わることもある（例．酵素活性の増強）。
【０１３７】
用語「変異誘発プライマー」又は「変異誘発オリゴヌクレオチド」（本明細書では互いに変えて使用される。）は鋳型配列の一部に相当し、かつこれとハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチド組成物をいうことを意図している。変異誘発プライマーに関して、このプライマーは正確に鋳型核酸と適合する訳ではないが、このプライマーでの不適合は、核酸ライブラリーに目的の変異を導入するために使用される。本明細書で使用する場合、「非変異誘導プライマー」又は「非変異誘導オリゴヌクレオチド」は、鋳型核酸と正確に適合するオリゴヌクレオチドの組成物をいう。本発明の一実施態様では、変異誘導プライマーのみが使用される。本発明の別の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド混合物において、変異誘導プライマーが導入される少なくとも１つの領域について、非変異誘導プライマーも含まれるように設計される。変異誘導プライマーと、変異誘導プライマーの少なくとも一つに対応する非変異誘導プライマーとの混合物を加えることにより、種々のコンビナトリアル変異誘導パターンを表す核酸ライブラリーを調製することが可能である。例えば、変異核酸ライブラリーに属するいくつかの核酸がある位置でその前駆体配列を保持し、変異核酸ライブラリーの他の核酸がその位置で変異があることが望ましいときは、非変異プライマーにより、所定の残基について、その核酸ライブラリー内で特定の数の非変異核酸を得ることができる。本発明の方法は、一般的に長さが10-50塩基、より好ましくは15-45塩基である変異及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかし、目標の変異誘導の結果を得るために、10塩基より短い又は50塩基より長いプライマーを用いることが必要かもしれない。対応する変異誘導及び非変異誘導プライマーに関し、対応するオリゴヌクレオチドの長さが同一であることは必要ではなく、変異が誘導される領域で重なっていれば良い。プライマーは本発明に従い予め定めた比率で加えられる。例えば、作成されるライブラリーが相当数の特定の変異を有し、同一の、または異なる位置で少ない数の異なる変異を有することが望ましい場合、加えるプライマーの量を調整することにより、好ましい広がりをもつライブラリーを作ることが可能である。または、非変異プライマーをより少なく又は多く加えることにより、変異核酸ライブラリーに対応する変異が産生される頻度を調整することが可能である。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、用語「連続的変異」は、同じオリゴヌヌクレオチドプライマー内にある変異を言う。例えば、連続的変異は互いに隣接または近くにあっても良い。しかしそれらは同じプライマーにより、得られる変異体の鋳型へ導入されるだろう。
【０１３９】
用語「野生型配列」又は「野生型遺伝子」は、宿主細胞で、固有に又は自然に生じる配列をさすため本明細書で相互に変えて使用される。いくつかの実施態様では、野生型配列は、タンパク質工学プロジェクトの開始点である目的配列をいう。この野生型配列は相同又は異種タンパク質をコードする。相同タンパク質は、ヒトの介入なしで宿主細胞が産生するものである。異種タンパク質は、ヒトの介入がなければ宿主細胞が産生しないものである。別に記載されているのではない場合、アミノ酸の位置番号は、配列番号１の成熟バチルス・アミロリケファシエンススブチリシン配列に割り当てられる番号をいう。しかし、本発明は、この特定のスブチリシンの変異誘発には限定されず、バチルス・アミロリケファシエンススブチリシンのある特定の残基と「等価」である位置でアミノ酸残基を含む前駆体プロテアーゼにも及ぶ。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「プロテアーゼ変異種」、「スブチリシン変異種」、「スブチリシンプロテアーゼ変異種」はタンパク質工学の開始点として使用される、野生型スブチリシン又は親プロテアーゼ（例．スブチリシン）と類似するプロテアーゼをさすときに使用される。これらの変異種は、機能は野生型又は他の親と似ているが、それらのアミノ酸配列に変異を有し、野生型又は親プロテアーゼ（例．スブチリシン）と配列が異なっている。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、用語「修飾」と「変異誘発」は、アミノ酸配列における何れかの変化をいう。この用語は、目的のアミノ酸配列（例．スブチリシン配列）の置換、欠失、挿入、及び/またはアミノ酸側鎖による置換を含むことを意図している。この用語は目的のアミノ酸配列（例．スブチリシン配列）の化学的修飾を含むことも意図している。
【０１４２】
用語「酸化に安定な」とは、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスの間の条件下、例えば、漂白剤又は酸化剤に晒される、又は接触する間に、所与の時間、特定の水準の酵素活性を保持する、本発明のプロテアーゼをいう。いくつかの実施態様では、このプロテアーゼは、所与の時間、例えば、少なくとも約1分、約3分、約5分、約8分、約12分、約16分、約20分等の所定の時間、漂白剤又は酸化剤と接触した後、少なくとも約50%、約60%、約70%、約75%、約75%、約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%のタンパク質分解活性を保持している。いくつかの実施態様では、安定性は、実施例で述べられているように測定される。
【０１４３】
用語「キレート剤に安定な」とは、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスの条件下所与の時間、例えば、キレート剤に晒され、又は接触される間、特定の酵素活性を保持する本発明のプロテアーゼをいう。いくつかの実施態様では、このプロテアーゼは、キレート剤と所与の時間、例えば、少なくとも約10分、約20分、約40分、約60分、約100分等の所定の時間、キレート剤と接触した後、少なくとも約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%のタンパク質分解活性を保持する。いくつかの実施態様では、キレート剤の安定性は実施例で述べられているように測定される。
【０１４４】
用語「熱に安定な」は、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスの条件下、所与の時間、例えば、変化した温度に晒される時間、特定の温度に晒された後、特定の水準の酵素活性を保持する本発明のプロテアーゼをいう。変化した温度は上昇したまたは低下した温度を含む。いくつかの実施態様では、プロテアーゼは、所与の時間、例えば、少なくとも約60分、約120分、約180分、約240分、約300分などの間、変化した温度に晒された後、少なくとも約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%のタンパク質分解活性を保持する。いくつかの実施態様では、熱的安定性は、実施例で記載されたように決定される。
【０１４５】
酸化、キレート剤、熱及び/又はpHに安定なプロテアーゼに関し用語「増強された安定性」は、他のセリンプロテアーゼ(例．スブチリシンプロテアーゼ)及び/又は野生型酵素と比較したとき、長期にわたるより高く保持されたタンパク質分解活性をいう。
【０１４６】
酸化、キレート剤、熱及び/又はpHに安定なプロテアーゼに関し用語「低下した安定性」は、他のセリンプロテアーゼ（例．スブチリシンプロテアーゼ）及び/又は野生型酵素と比較したとき、長期間保持される、より低いタンパク質分解活性をいう。
【０１４７】
用語「洗浄活性」は、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他のプロセスの条件下、このプロテアーゼにより達成される洗浄性能をいう。いくつかの実施態様では、洗浄性能は、標準的洗浄条件に汚れを晒した後、種々のクロマトグラフィーによる、分光光度計による、又は他の定量的測定方法により決定される、酵素に敏感な汚れ、例えば、草、血液、ミルク、卵のタンパク質に関する種々の洗浄測定の使用により決定される。測定法の例は、しかし、実施例に記載されているこれらの方法のほか、WO99/34011及び米国特許第6,605,458号（両者は、引用により、本明細書に組み入れられる）に記載されている測定法を含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、「洗浄剤組成物」と「洗浄剤調合剤」は布地、皿、コンタクトレンズ、他の固体物、髪（シャンプー）、皮膚（石鹸とクリーム）、歯（口腔洗浄、練り歯磨き）などのような洗浄を受ける物品からの、好ましくない化合物を除くときに使用する組成物をいう。この用語は、組成物が、その中で使用されるペルヒドロラーゼや他の酵素と適合している限り、目的とする洗浄剤組成物のタイプとその製品の形態（例．液体、ゲル、顆粒又はスプレー組成物）について選ばれたいずれの材料/化合物も含む。洗浄剤組成物の材料の具体的選択は、洗浄を受ける表面、物品又は布地、及び使用時の洗浄条件に適した組成物の望む形態を考慮して容易に行われる。
【０１４９】
この用語は、さらに、表面の洗浄、漂白、消毒及び/又は滅菌に適したいずれの組成物をもさす。この用語は、洗剤剤組成物（例．液体、及び/又は固体洗濯洗剤及び繊細な布地の洗剤、ガラス、木、陶器及び金属のカウンター表面及び窓のような、堅い表面の洗浄調合剤、カーペットクリーナー、オーブンクリーナー、布地のフレッシュナー(fabric fresheners)、布地柔軟剤及び織物と洗濯予備部分洗浄剤(laundry pre-spotters)、及び皿洗浄剤）を含むが、これに限定されないことが意図されている。
【０１５０】
実際、用語「洗浄剤組成物」は、本明細書で使用される場合、別に記載がある場合を除き、顆粒又は粉末形態の全用途用、または重質洗浄剤、特に洗浄洗剤;液体、ゲル又は糊状の全用途用洗浄剤、特にいわゆる重質液体(HDL)タイプ;液体の繊細な布地用洗剤;強力な皿用洗浄剤又は軽質皿用洗浄剤、特に高発泡性のもの; 種々の錠剤、顆粒、液体及び家庭用及び業務用の濯ぎ促進用タイプを含む自動皿洗い器用洗剤; 抗菌性手洗いタイプ、洗浄バー、口腔洗浄剤、義歯洗浄剤、自動車又はカーペットシャンプー、浴室洗浄剤を含む液体洗浄兼殺菌剤;髪のシャンプー、ヘアリンス;シャワーゲル(shower gels)及びフォームバス(foam bath)と金属クリーナー;及び、漂白添加物と「ステインスティック(stain-stick)」又は前処理タイプのような洗浄補助剤を含む。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、「洗剤剤組成物」と「洗剤調合剤」は、固体対象物の洗浄媒体の中で使用する予定である混合物を指すときに使用される。いくつかの好ましい実施態様では、この用語は、布地及び/又は衣服を洗濯することを指すときに使用される。（例.「洗濯洗剤」）別の実施態様では、この用語は、他の洗剤、例えば、皿、刃物類などの洗浄に使用されるもの（例．「皿洗い洗剤」）をさす。本発明をいずれか特定の洗剤処方又は組成物に限定する意図はない。実際、ペルヒドロラーゼに加えて、この用語は界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、助剤、漂白剤、漂白活性化剤、青み剤(bluing agents)及び蛍光染料、凝結(caking)防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、溶解剤を含む洗剤を含むことが意図されている。
【０１５２】
プロテアーゼに関して用語「洗浄有効量」は、特定の洗浄剤組成物中で希望の水準の酵素活性を達成する、以上に述べたプロテアーゼの量をいう。そのような有効量は本技術分野の普通の技術者により容易に確かめられ、使用する特定のプロテアーゼ、洗浄用途、洗浄剤組成物の具体的組成、液体又は固体（例．顆粒、バー）組成物が求められているか否かのような、多くの因子に基づく。
【０１５３】
用語「洗浄添加物質」は、本明細書で使用する場合、特定のタイプの目的の洗浄剤組成物、製品の形態（例．液体、顆粒、粉末、バー、糊、スプレー、錠剤、ゲル；又は泡状組成物）について選ばれたいずれかの液体、固体又は気体の物質をいう。これらの物質は、また、その組成物において使用されたプロテアーゼ酵素に適合することが好ましい。いくつかの実施態様では、顆粒の組成物は、「コンパクト」な形態であるが、他の実施態様では、この液体組成物は、「濃縮」形態である。
【０１５４】
洗浄活性に関して、用語「増強された性能」は、標準的洗浄サイクル及び/又は複数の洗浄サイクルの後に通常の評価により決定される、卵、牛乳、草又は血液のようなある酵素が活性を及ぼす汚れについて増加した又は大きくなった洗浄活性をいう。
【０１５５】
洗浄活性に関して、用語「減少した性能」は、標準的洗浄サイクルの後通常の評価によりにより決定される、卵、牛乳、草又は血液のようなある酵素が活性を及ぼす汚れについて減少又は小さくなった洗浄活性をいう。
【０１５６】
洗浄活性について、用語「比較性能」は、OPTIMASE（商標）プロテアーゼ(Genencor)、PURAFECT（商標）プロテアーゼ製品(Genencor)、SAVINASE（商標）プロテアーゼ(Novozymes)、BPN’-変異種（米国特許第Re34,606号参照）、RELASE（商標）、DURAZYME（商標）、EVERLASE（商標）、KANNASE（商標）プロテアーゼ(Novozymes)、MAXACAL（商標）、MAXAPEM（商標）、PROPERASE（商標）プロテアーゼ（Genencor;米国特許第Re34,606号、米国特許第5,700,676号；第5,955,340号；第6,312,936号；第6,482,628号も参照せよ）、及びB.レンツスプロテアーゼ変異種製品（例．WO92/21760、WO95/23221及び/又はWO97/07770に記載されているもの）を含むが、これらに限定されない比較スブチリシンプロテアーゼ（例．市販のプロテアーゼ）の洗浄活性の少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%をいう。スブチリシンプロテアーゼ変異種の例は、BPN’の76、101、103、104、120、159、167、170、194、195、217、232、235、236、245、248、及び/又は252の位置と等価の残基の位置で置換又は欠失を有するものを含むが、それらに限定されない。洗浄性能は、標準的洗浄サイクル条件の後、通常の分光光度的又は分析学的方法により決定される草、血液、牛乳のような酵素の活性が働く汚れに関する種々の洗浄測定において、本発明のプロテアーゼを、これらのスブチリシンプロテアーゼと比較することにより決定できる。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、「布地洗浄剤組成物」は、洗濯添加剤組成物及び汚れた布地（例．布、リネン、及び他の織物）の浸漬及び/又は前処理で使用するために適した組成物を含む手洗い及び洗濯機用洗剤組成物を含む。
【０１５８】
本明細書の洗浄剤組成物の「コンパクト」形態は密度に最も良く反映されている。そして組成に関しては無機充填塩（inorganic filler salt）の量に反映されている。無機充填塩は、粉末形の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物では、充填塩は、相当量で含まれている、典型的には、総組成物の重量の約17%から約35%で含まれている。それに対し、コンパクト組成物では、この充填塩は、総組成物の約15%を超えない量で含まれている。いくつかの実施態様では、この充填塩は約10%を超えない量で、又は、より好ましくは、組成物の重量で約5%を超えない量で含まれる。いくつかの実施態様では、この無機充填塩は、硫酸化合物と塩化物のアルカリ金属とアルカリ土類金属塩から選ばれる。好ましい充填塩は硫酸ナトリウムである。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、用語「界面活性剤」は、界面活性化の性質を有すると本技術分野で一般的に認識されている何れかの組成物をいう。界面活性剤は、一般的にアニオン性、カチオン性、非イオン性及び両性化合物を含み、これらは、本明細書でさらに述べられる。
実験
【０１６０】
本発明は、以下の実施例でさらに詳細に述べられるが、実施例により特許を請求した発明の範囲を限定する意図は全くない。以下の実施例は特許を請求した発明を説明するために提供されているが、これを限定するものではない。
【０１６１】
以下の実施例では、以下の略号が使用される。：PI（プロテナーゼ阻害剤）、ppm（百万分の一部）；M（モル）；ｍM（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nM（ナノモル）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；gm（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；pg（ピコグラム）；L（リットル）； ml及びmL（ミリリットル）；μl及びμL（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；Ｕ（単位）；V（ボルト）；MW（分子量）；sec（秒）；min(s)（分）；h及びhr（時間）；℃（度、摂氏）；QS（十分な量）；ND（行われず）；NA（適用されず）；rpm（毎分回転数）；H2O（水）；d H2O（脱イオン水）；HCl（塩酸）；aa（アミノ酸）；bp（塩基対）；kb（キロ塩基対）；kD（キロダルトン）；cDNA（コピー又は相補的DNA）；DNA（デオキシリボ核酸）；ssDNA（一本鎖DNA）；dsDNA（二重鎖DNA）；dNTP（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；RNA（リボ核酸）；MgCl2（塩化マグネシウム）；NaCl（塩化ナトリウム）；w/v（重量対容量）；v/v（容量対容量）；g（重量）；OD（光学濃度）；Dulbecco’s phosphate buffered solution(DPBS)、SOC(2% Bacto-トリプトン, 0.5% Bacto 酵母抽出物、10mM NaCl、2.5mM KCl)；Terrific Broth（TB；12g/l Bacto トリプトン、24g/lグリセロール、2.31g/l KH2PO4、及び12.54g/l K2HPO4）；OD280（280nmにおける光学濃度）；OD600（600nmにおける光学濃度）；A405(405nmにおける吸光度)；Vmax（酵素触媒反応の最大初期速度）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；PBS（リン酸塩で緩衝化された食塩水[150mM NaCl、10mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2]）；PBST（PBS+0.25%TWEEN（登録商標）20）；PEG（ポリエチレングリコール）；PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）；RT-PCR（逆転写PCR）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；HEPES（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸]）；HBS（HEPES 緩衝化食塩水）；Tris-HCl（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩）；Tricine（N-[トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル]-グリシン）；CHES（2-(N-シクロ-ヘキシルアミノ)エタン-スルホン酸塩）；TAPS（3-{[トリス-（ヒドロキシメチル）-メチル]-アミノ}-プロパンスルホン酸）；CAPS（3-(シクロ-ヘキシルアミノ)-プロパンースルホン酸）；DMSO（ジメチルスルホキシド）；DTT（1,4-ジチオ-DL-スレイトール）；SA（シナピン酸(s,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシシンナミック酸)；TCA（トリクロロ酢酸）；Glut and GSH（還元されたグルタチオン）；GSSG（酸化されたグルタチオン）；TCEP（トリス[2-カルボキシエチル]ホスフィン）；Ci（キュリー）；mCi（ミリキュリー）；μCi（マイクロキュリー）；HPLC（高圧液体クロマトグラフィー）；RP-HPLC（逆相高圧液体クロマトグラフィー）；TLC（薄層クロマトグラフィー）；MALDI-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法‐飛行時間質量分析）；Ts（トシル）；Bn（ベンジル）；Ph（フェニル）；Ms（メシル）；Et（エチル）；Me（メチル）；Taq（テルムス・アクアチクス(Thermus aquaticus)DNAポリメラーゼ）；Klenow(DNAポリメラーゼ I 大きい(Klenow)断片)；EGTA（エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’-四酢酸）；EDTA（エチレンジアミン四酢酸）；bla（β-ラクタマーゼ又はアンピシリン-抵抗性遺伝子）；HDL（高密度液体）；MJ Research（MJ リサーチ、Reno, NV）；Baseclear(Baseclear BV, Inc., Leiden, オランダ)；PerSeptive(PerSeptive Biosystems、Framingham, MA)；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan, San Jose, CA)；Argo（Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ）；Seitz EKS(SeitsSchenk Filtersystemns GmbH, Bad Kreuznach, ドイツ)；Pall(Pall Corp., East Hills, NY)；Spectrum(Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA)；Molecular Structure（Molecular Structure Corp., Woodlands, TX）；Accelrys(Accelrys, Inc., San Diego, CA)；Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, カナダ)；New Brunswick（New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ)；CFT（試験材料センター、Vlaardingen、オランダ）；Test Fabrics(Test Fabrics,Inc., West Pittiston, PA)、Procter & Gamble（Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH）；GE Healthcare(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, 連合王国)；OXOID(Oxoid、Basingstoke、Hampshire、連合王国)；Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bary, Co., Wicklow, アイルランド)；Finnzymes(Finnzymes Oy, Epsoo, フィンランド)；Kelco(CP Kelco, Wilmington, DE)；Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); NEN(NEN Life Science Products, Boston, MA);Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal(Dynal, Oslo, Norway);Bio-Synthesis(Bio-Synthesis, Lewisville, TX); ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD);Gibco/BRL(Gibco/BRL, Grand Island, NY);Sigma(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)；NCBI(国立バイオテクノロジー情報センター)；Applied Biosystems(Applied Biosystems, Foster City, CA)；BD Biosciences and/or Clontech（BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA）；Operon Technologies(Operon Technologies, Inc., Alameda, CA)；MWG Biotech(MWG Biotech, High Point, NC)；Oligos Etc(Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR)；Bachem(Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA)；Difco(Difco Laboratories, Detroit, MI)；Mediatech(Mediatech, Herndon, VA；Santa Cruz(Santa Crutz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA);Oxoid(Oxoid Inc., Ogdensburg, NY)；Worthington(Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)、GIBCO BRL又はGibco BRL(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD);Millipore(Millipore, Billerica, MA)；Bio-Rad(Bio-Rad, Hercules,CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp., San Diego, CA)；NEB（New England Biolabs, Ipswich、MA）；Sigma(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)；Pierce(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)；Takara(Takara Bio Inc. Otsu, 日本)；Roche(Hoffmann-La Roche, Basel,スイス)；EM Science(EM Science, Gibbstown、NJ)；Qiagen(Qiagen, Inc., Valencia, CA)；Biodesign(Biodesign Intl., Saco, Maine)；Aptagen(Aptagen, Inc., Herndon, VA)；Sorvall(Sorvall brand, Kendro laboratrory Productsより、Asheville, NC)；United States Testing(United States Testing Co., Hoboken, NJ)；Molecular Devices(Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA)；R&D Systems(R&D Systems, Minneapolis, MN)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)；R&D Systems(R&D Systems, Minneapolis, MN)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems,La Jolla, CA)；Marsh(Marsh Biosciences, Rochester, NY)；Geneart(Geneart GmbH, Regensburg、ドイツ)；DNA2.0(DNA 2.0, Menlo Park, CA)；Gene Oracle(Gene Oracle, Mountain View, CA)；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)；Biacore(Biacore, Inc., Piscataway, NJ)；Pepro Tech(Pepro Tech, Rocky Hill, NJ)；SynPep（SynPep，Dublin，CA）；New Objective(New Objective barnd;Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ)；Waters(Waters,Inc., Milford, MA)；Matrix Science(Matrix Science, Boston, MA)；Dionex(Dionex, Corp., Sunnyvale, CA)；Monsanto(Monsanto Co., St. Louis, MO)；Wintershall(Wintershall AG, Kassel,ドイツ)；BASF(BASF Co.,Florham Park, NJ)；Huntsman(Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT)；Enichem(Enichem Iberica, Barcelona, スペイン)；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG, Buchs、スイス)；Gist-Brocades(Gist-Brocades、NV、Delft、オランダ)；Dow Corning(Dow Corning Corp., Midland, MI)；及びMicrosoft(Microsoft, Inc., Redmond, WA)
【発明を実施するための形態】
【０１６２】
実施例１
以下の実施例では、理解しやすいよう以下に記載したような、種々の測定法が使用された。以下に記載した試験手順からと異なる点は実施例に記載されている。
A. 96-ウェルマイクロタイタープレートにおけるタンパク質含量決定の為のTCA測定法
【０１６３】
この測定法は、BPN’（例．対照プロテアーゼ）とBPN’変異種について、230rpmで振とうし、かつ湿度を与えられた空気供給をしながら33℃で3-4日培養されたマイクロタイタープレートから得られた、ろ過を受けた培養上澄み液を用いて始められた。新しい96ウェルの平底のマイクロタイタープレート(MTP)がこの測定に用いられた。最初に、100μL/ウェルで0.25N HClが各ウェルに入れられた。次に、50μLのろ過を受けた液体培地が加えられた。「ブランク」値を取る為、405nmにおける光散乱/吸収（プレートリーダーで5秒の混合モードを用いる）が、次に決定された。この試験について、100μL/ウェルの15%(w/v)のトリクロロ酢酸(TCA)がこのプレートに入れられ、室温で5と30分の間で定温反応された。405nmにおける光散乱/吸収（プレートリーダーで5秒混合モードを使用する）が、次に決定された。
【０１６４】
使用した装置はBiomek FX Robot(Beckman Coulter)とSpectraMAX 340型(Molecular Devices)MTPリーダー；このMTPは、9017型 (Costar)のものであった。
【０１６５】
サンプル中のタンパク質含量の相対的な量を得るためにTCAと共に測定した測定値からブランク値（TCA含まず）を差し引くことにより計算が行われた。必要な場合、検量線が既知の変換係数で、クローンのAAPF測定によってTCA測定値を校正することにより作成できる。しかし、このTCAによる測定結果は、1ml当たり50から500個のタンパク質のタンパク質濃度(protein per ml)(ppm)に関し線型であり、良好な性能の変異種を選ぶため、酵素性能に対し直接にプロットできる。サンプル中の濁度/光散乱の増大は、培地上澄液における沈殿しうるタンパク質の総量と相関している。
B. 96ウェルのマイクロタイタープレートにおけるAAPFプロテアーゼ測定
【０１６６】
本発明のプロテアーゼとその変異種のプロテアーゼ活性を決定するために、N-サクシニル-L-アラニル-L-アラニル-L-プロリル-L-フェニル-p-ニトロアニリド(suc-AAPF-pNA)の加水分解が測定された。使用された試液は：0.005%のTWEEN（登録商標）-80（トリス稀釈緩衝液）を含む100mM トリス/HCl緩衝液、pH8.6；10mMCaCl2と0.005% TWEEN（登録商標）-80(トリス/Ca 緩衝液)を含む、100mM トリス緩衝液、pH8.6；及びDMSO中の160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液）(Sigma：S-7388)であった。suc-AAPF-pNA 試験液を調製するため、1mlのsuc-AAPF-pNA 原液が、100mlのトリス/Ca緩衝液に加えられ、少なくとも10秒間、良く混合された。この測定法は、各ウェルに10μlの稀釈プロテアーゼ溶液を加え、その後、直ぐに190μlの1mg/ml suc-AAPF-pNA試験液を加えることにより行われた。この溶液は5秒間混合され、キネティックモード(5分間に20回測定)における吸光度の変化が、25℃で、MTPリーダーで410nmで測定された。プロテアーゼの活性はAU（活性＝ΔODmin-1ml-1）で表された。
C. 界面活性剤及びキレート剤安定性測定
【０１６７】
LASとLAS/EDTA安定性は、LASとLAS/EDTAそれぞれの存在下で試験プロテアーゼを定温反応した後に、AAPF測定を用いて決定された残留活性の関数として、測定された。
LAS 安定性測定法
試薬
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩(=LAS)：Sigma D-2525
TWEEN（登録商標）-80：Sigma P-8074
トリス 緩衝液（遊離酸）：Sigma T-1378；6.35gを約960mlの水に溶解する；pHを4NHClで8.2に調整する。トリスの最終濃度は52.5mMである。
LAS原液：MQ水に10.5%のLAS溶液を調製する。（＝100ml MQ当たり10.5g）
トリス緩衝液-100mM/pH8.6 (100mM トリス/0.005%Tween（登録商標）-80)
トリス-Ca緩衝液,pH 8.6(100mM トリス/10mM CaCl2/0.005% Tween（登録商標）-80)
ハードウェア
平底MTP(Costar No.9017)
Biomek FX
ASYS マルチピペッター
Spectramax MTP リーダー
iEMS 培養装置/振とう機
Innova 4330 培養装置/振とう機
Biohit マルチチャンネルピペット
BMG サーモスター振とう機
【０１６８】
0.063%LAS溶液が52.5mMトリス緩衝液pH8.2で調製された。suc-AAPF-pNA試液は、1mlの100mg/ml suc-AAPF-pNA原液（DMSO中)を100ml(100mM)のトリス緩衝液、pH8.6へ加えて調製された。上澄み液を稀釈するため、平底のプレートに稀釈緩衝液が入れられ、上澄み液の一部が加えられ、良く混合された。稀釈率は、培養プレートのプロテアーゼ対照サンプルの濃度(AAPF活性)により変わる。望ましいタンパク質濃度は80ppmであった。
【０１６９】
10μlの稀釈上澄み液が190μl、 0.063%LAS緩衝液/ウェルに加えられた。MTPは、テープで覆われ、数秒振とうされ、恒温器(Innova 4230)に入れられ、45℃で、60分間、200rpmの振とうを受けた。初期活性（t=10分）が、定温反応10分後、各ウェルの10μlの混合液を190μlのsuc-AAPF-pNA試液を含む新しいMTPに移すことにより決定された。これらの溶液は、十分に混合され、AAPＦ活性が、次にMTPリーダー（25℃、5分で20回の測定）を使用して測定された。
【０１７０】
最終活性(t=60分)は60分の定温反応の後、培養プレートからの別の10μlの溶液を取り出して決定された。AAPF活性は上記のようにして決定された。サンプルの安定性は、以下のようにして残留及び初期AAPF活性の比を計算することにより決定された。
残留活性(%)=[t-60値]x 100/[t-10値]
LAS/EDTA安定性測定法
【０１７１】
代表的なアニオン性界面活性剤(LAS＝直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(DOBS))とEDTA２ナトリウム塩の存在下で、一定の条件下で定温反応の後、プロテアーゼの安定性が測定され、AAPF測定法を使用して残留活性が決定された。使用された試薬はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩(DOBS、Sigma No.D-2525)、TWEEN（登録商標）-80(Sigma No.P-8074)、EDTA２ナトリウム塩(Siegfried Handel No. 164599-02)、HEPES(Sigma No. H-7523)、非攻撃性(unstress buffer)緩衝液：50mM HEPES(11.9g/l)+0.005% TWEEN(登録商標)-80、pH8.0、攻撃性緩衝液(stress buffer)：50mM HEPES（11.9g/l）、0.1%(w/v)DOBS(1g/l)、10mM EDTA（3.36g/l）、pH8.0、対照プロテアーゼ及び200-400μg/mlのタンパク質を含むプロテアーゼ変異種培養上澄み液である。使用された装置は、稀釈プレートとしてV-又はU-底MTP（各々Greiner 651101及び650161）、非攻撃性緩衝液及びLAS/EDTA緩衝液にF-底MTP(Corning 9017)及びsuc-AAPF-pNA用プレート、Biomek FX(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384 MTP リーダー(Molecular Devices)、iEMSインキュベーター/振とう機(1mm 振幅)(Thermo Electron Corporation)、密封テープ；Nunc(236366)であった。
【０１７２】
iEMS定温反応器/振とう機(Thermo/Labsystems)が29℃でセットされた。培養液上澄み液が非攻撃性緩衝液を含むプレートで稀釈され、〜25ppm（マスター稀釈プレート）とされた。マスター稀釈プレートからの20μlのサンプルが180μlの非攻撃性緩衝液を含むプレートに加えられ、最終定温反応濃度、2.5ppmとされた。内容物が混合され、室温に保たれ、AAPF測定がこのプレートで行われた。マスター希釈プレートからの20μlのサンプルは180μlの攻撃性緩衝液(50mMHEPES(11.9g/l)、0.1%(w/v)DOBS(1g/l)、10mM EDTA(3.36g/l)、pH8.0)を含むプレートにも加えられた。この溶液は混合され、すぐに29℃iEMS振とう機に入れられ30分、400rpmで振とうされた。30分の定温反応の後、AAPF測定が攻撃性緩衝液を含むプレートで行われた。サンプルの安定性は以下のようにして、残留及び初期AAPF活性の比率を計算することにより決定された。
：残留活性(%)=[mOD.min-1攻撃性緩衝液]ｘ100/[mOD. min-1非攻撃性緩衝液]
D. 洗浄性能試験
【０１７３】
プロテアーゼ変異種の汚れ除去性能は市販の洗剤の中で決定された。市販の洗剤処方の熱による不活性化はいずれかのタンパク質成分の酵素的活性を破壊するが、非酵素的成分の性質は保持する。従って、本法は本発明の酵素変異種を試験する際に使用する、市販洗剤の調製に適していた。
微小布見本
【０１７４】
1/4インチの直径の微小布見本を注文しCFT(Vlaardingen, オランダ)により納入された。96-ウェルのMTPの各ウェルに1枚又は2枚の微小布見本が垂直に置かれ、全表面が外部に晒された（つまり、ウェルの底に平に置かれたのではない）。
BMI微小布見本試験
【０１７５】
0.25インチの直径の血液、牛乳及びインク(BMI)を含む微小布見本は、CFTから得られた。この見本は切る前に、布地(EMPA 116)は水で洗浄された。1枚の微小布見本が、全表面を外部に晒すように96-ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに垂直に置かれた（つまり、ウェルの底に平に置かれたのではない）。望ましい洗剤溶液が、本明細書で述べるようにして調製された。Thermomixerを25℃に平衡にした後、190μlの洗剤溶液が、微小布見本を含む、MTPの各ウェルに加えられた。この混合物に10μlの稀釈酵素溶液が、最終酵素濃度が1μg/mlであるように加えられた（BCA測定法で決定される。）このMTPをテープでシールし、1400rpmで撹拌しながら恒温器に30分置いた。適当な条件で定温反応させた後、各ウェルから100μlの溶液が新しいMTPへ移された。100μl溶液/ウェルを含むこの新しいMTPはMTP SpectraMax 測定装置を使って、405nmで測定された。ブランク対照サンプルと2枚の微小布見本と洗剤を含み、酵素は含まないサンプルも測定された。
「予洗浄済み」布見本
【０１７６】
このタイプの微小布見本は、周囲温度で20分間、脱イオン水で予洗浄を受けた。予洗浄段階の後、この布見本はペーパータオルの上に置かれ、乾燥された。風乾された見本は次に、押し出しプレス機で1/4インチの丸いダイを使用して押し出された。その後、全表面が外部に晒されるように96-ウェルのMTPの各ウェルに2枚の微小布見本が垂直に入れられた。（つまり、ウェルの底に平に置かれたのではない。）
洗剤
【０１７７】
北米(NA)及び西ヨーロッパ(WE)の重質液体洗濯(HDL)洗剤について、加熱による不活性化が、95℃で2時間、水浴中で秤量した液体洗剤（ガラス製ビンに入った）おいて行われた。この洗剤はその地方のスーパーマーケットから購入した。加熱されていない洗剤と加熱された洗剤の両方が、洗剤を溶かして5分以内に測定され、不活性化されたパーセントを正確に求めた。酵素活性はAAPF法で試験された。
【０１７８】
加熱不活性化洗剤における酵素活性の試験用に、洗剤の試液が加熱不活性化原液から調製された。適量の水の硬度(6pg)と緩衝剤がこの洗剤溶液に加えられ所望の条件とされた。この溶液はビンをボルテックスにかけ又は反転させることにより混合された。
酵素と装置
【０１７９】
対照セリンプロテアーゼ変異種のサンプルは、MTPプレートで培養され、ろ過された液体培地から得られた。使用されたこの装置はBiomek FX Robot(Beckman Coulter)、SpectralMAX MTP Reader(340型；Molecular Devices)、iEMS恒温器/振とう器(Themo/Labsystems)；F-底 MTPs(定温反応の後、反応プレートを測定するためのCostar 9017型)；及びV-底 MTPs（上澄液の予備稀釈に使用するGreiner 651101）である。本測定では、このプロテアーゼは基質を加水分解し、基質から色素と不溶性の粒子を遊離する。従って、濁る速度が酵素活性の尺度となる。
【０１８０】
対照セリンプロテアーゼとその変異種の、微小布見本における汚れ除去性能は、市販の加熱不活性化洗剤の中で、MTPの中で決定された。使用した試薬は、5mM HEPES、pH8.0又は5mM MOPS、pH7緩衝液、中間的な水の硬度について3:1Ca:Mg(CaCl2:MgCl2・６H2O)；6pgp(grains per gallon)に稀釈された１ガロン当たり15000グレインの原液、1プレート当たり２枚のBMI(血液/牛乳/インク)の布見本：CFTで処理されたEMPA-116BMI綿製布見本：１ウェル当たり２枚の予めすすぎを受け、切り出された布見本、及びプロテアーゼ活性の欠失が確認された不活性化されたTIDE（登録商標）２XCold （既製品の洗剤）であった。
【表２】
2015211671.tif 000012
【０１８１】
恒温器は所期の温度(16℃又は32℃)に設定された。〜10ppm酵素のマスター稀釈プレートから10μLのサンプルが、190μLの先にあげた試験用洗剤溶液と共にBMIの2枚が入ったプレートに加えられた。測定プレートの液量が変異種について最終濃度が0.5ppmとなるように調節された。これらのプレートは直ぐにiEMS恒温器へ移され、所定の温度で1400rpmで撹拌されながら30分間、一定温度に維持された。定温保持後、100μLの上澄液が新しい96ウェルのプレートへ移され、405nm及び/又は600nmにおいて、MTP測定装置で吸光度が測定された。1又は２枚の微小布見本と洗剤を含むが、プロテアーゼサンプルを含まない、対照のウェルもまた測定を受けた。405nmでの測定は、より高い値を与え、色素の除去を示し、600nmでの測定は濁度及び洗浄を示す。
全微小布見本法について汚れ除去活性の計算
【０１８２】
得られた吸光度はブランクサンプル（酵素を含まない基質）の値で補正され、加水分解活性の尺度を与えた。各サンプル（変異種）について性能指数が計算された。性能指数は変異種の性能（実測値）と標準酵素の性能（理論値）を同一のタンパク質濃度において比較する。加えて、理論値は、標準酵素のラングミュアーの式の変数を使って計算できる。
E. プロテアーゼとその変異種の相対的な特異的活性
【０１８３】
プロテアーゼ変異種を識別するために、相対的な特異的活性が、基質としてsuc-AAPF-pNAを使用して計算され、これにより、変異種と野生型又は標準プロテアーゼの比較と順位付けを行うことができる。suc-AAPF-pNA基質に対する特異的活性は、先に述べられた測定法を使用して、各サンプルについて測定されたTCA-値によりタンパク質分解活性を除することで決定された。この値を使用して、相対的な特異的活性が計算された（変異種の特異的活性/対照プロテアーゼの特異的活性）。
F．性能指数
【０１８４】
性能指数は、同一のタンパク質濃度における、変異種（実測値）と標準又は対照プロテアーゼ（理論値）の性能を比較するものである。加えて、この理論値は標準プロテアーゼの結合曲線（つまり、ラングミュアーの式）の変数を使用して、計算できる。1より大きい(PI>１)性能指数(PI)は、標準（例、野生型）と比較したときより良い変異種であることを示し、１のPI(PI=1)は、標準と同じ性能をもつ変異種を示し、１より小さいPI(PI<１)は標準よりも性能が低い変異種を示す。従って、このPIは、ある環境下での使用には望ましくない変異種と、使用が望ましい変異種(winners)を示す。
実施例２
BPN’の多変異ライブラリー(MML)変異種の汚れ除去性能
【０１８５】
BPN’多変異ライブラリー（又はコンビナトリアルライブラリー）が、BPN’を親タンパク質として使用して、Geneart又はDNA2.0により作られた。培養上澄み液のタンパク質濃度は実施例１で述べられたようにTCA沈殿により決定された。変異種の汚れ除去性能はEMPA116布見本（BMI汚れ、CFT）を、pH8/16℃、pH7/16℃及びpH8/32℃で、実施例１で述べられた方法を使用して、但し以下の改変を加えて洗濯して試験された。使用された試験洗剤は加熱不活性化されたTIDE（登録商標）２X Cold洗剤（Procter & Gamble)であり、実施例１で述べられたように調製された。市販の洗剤処方の加熱不活性化は、いずれかのタンパク質成分の固有の酵素活性を破壊するが、一方、非酵素成分の性質は保持する。
【０１８６】
洗剤の熱不活性化は、予め秤量された液体洗剤（ガラス瓶中）を95℃で2時間水浴に浸けることで行われた。この洗剤は地方のスーパーマーケットから購入された。加熱されない洗剤と加熱された洗剤の両者は、不活性化されたパーセントを正確に決定するためにこの洗剤を溶解させて5分以内に測定された。酵素活性はAAPF測定法で試験された。BPN’変異種の機能性は機能指数(Pi)（つまり、変異体の性能の親BPN’に対する割合）として定量化された。結果は表2-1に示される。1以上のBMI汚れ除去性能試験で0.5以上のPiを示し、かつ/またはTCA沈殿を示すBPN’変異種は、改善された洗浄性能又は発現を示している。0.05以下の性能指数は、0.05としこの表に太字のイタリックで示されている。TCAタンパク質性能指数が0.05以下であるある全ての変異種について、全ての値は0.05に固定されている。
【表３】
2015211671.tif 000013
2015211671.tif 000014
2015211671.tif 000015
2015211671.tif 000016
【０１８７】
実施例３
97-128-217位における飽和ライブラリーと追加の変異
BPN’（親）の97-128-217の位置の飽和変異誘導ライブラリーがDNA 2.0により製造された。培養上澄液のタンパク質濃度が実施例１に述べられているようにTCA沈殿により決定された。変異種の汚れ除去性能は、実施例２で述べられているように、実施例１で述べられた方法を用いて、pH8/16℃でEMPA116布見本(BMI 汚れ、CFT)に洗剤を使用して試験された。酵素活性は、実施例１で述べられたAAPF試験により試験された。BPN’変異種の機能は性能指数(Pi)（つまり、FNAと比較した変異種の性能の比）として定量化された。結果は表3-1に示されている。BMI汚れ除去性能試験及び/又はTCA沈殿に関し0.5以上のPi値を示すBPN’変異種は、改善された洗浄上の利点及び/又は発現を示した。
【表４】
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実施例４
【０１８８】
変異種の追加のライブラリーデザインと汚れ除去性能
追加のBPN’多変異体ライブラリーは、親分子としてBPN’:G97A-G128A-Y217Qタンパク質を用いて、GeneartまたはGene Oracleにより製造された。汚れの除去活性を決定するために行われた実験結果（EMPA116布見本（BMI汚れ、CFT Vlaardingen）（BMI pH8、BMI pH7、BMI 32℃）を使用して、洗濯において汚れ除去性能を決定するための微小布見本試験）、TCA沈殿によるタンパク質量決定、及びBPN’変異種のLAS/EDTA安定性（目的とする性質の試験）は、表4-1、4-2、4-3及び4-4に示されている。
【０１８９】
この結果は汚れ除去性能試験の以下の変更とともに、実施例１で述べられる方法を用いて得られた。この使用された試験洗剤は、加熱不活性化されたTIDE（登録商標）２X Cold 洗剤（Procter & Gamble, Cincinnati, OH, 米国）であった。
【０１９０】
この結果は、実施例1に記載された方法を用いて、汚れ除去性能試験に以下の変更を加えて得られた。使用された試験洗剤は加熱不活性化されたTIDE（登録商標）2X Cold 洗剤(Procter & Gamble, Cincinnati, OH、米国)であった。
【０１９１】
市販の洗剤処方の加熱不活性化は、非酵素成分の性質を維持しながら、いずれかのタンパク質成分の固有の酵素活性を不活性化する。洗剤の加熱不活性化は、予め量った液体洗剤（ガラス瓶にいれた）を95℃で２時間水浴に入れることで達成された。この洗剤は地方のスーパーマーケットから買った。加熱されていない洗剤と加熱された洗剤の両者は、洗剤を溶解して５分以内に測定され、不活性化されたパーセントを正確に決定できた。酵素活性はAAPF測定法で試験された。本明細書をとおして述べられているように、BPN’変異種の機能性は、性能指数（Pi）として定量化さたが、これは親タンパク質BPN’: G97A-G128A-Y217Qに対する変異種の性能の比率である。BMI汚れ除去性能について0.5以上のPi及び/またはTCA沈殿を示すBPN’: G97A-G128A-Y217Qの変異種は改善された洗浄性及び/又は発現を示した。0.05以下の性能指数は0.05に固定され、表に太字のイタリックスで示されている。
【表５】
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【０１９２】
BPN’多変異ライブラリーのLAS/EDTA安定性が試験され、BPN’:G97A  -G128A-Y217Qと比較された。LAS/EDTA試験は実施例１のLAS安定性試験で述べられているように実施された。ただし、攻撃性緩衝液(stress buffer)は、0.1%LAS+10mM EDTAを含み、攻撃性プレートは40℃で30分間、定温保存された。BPN’変異種の機能性は、性能指数(Pi)として定量化され、これは親タンパク質BPN’: G97A-G128A-Y217Qに対する変異種の性能の割合である。結果は、表4-2に示されている。
【表６】
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【０１９３】
BPN’３重変異体のLAS/EDTA安定性が試験され、BPN’-Y217Lと比較された。LAS/EDTA測定法は実施例１の「LAS 安定性測定法」で述べられているとおりに実施された。ただし、攻撃性緩衝液は、0.1%LAS+10mM EDTAを含み、攻撃性プレートは35℃で25分間、定温保存された。BPN’変異種の機能性は性能指数(Pi)として定量化され、これは親タンパク質BPN’-Y217Lに対する変異体の性能の割合である。結果は表4-3に示されている。
【表７】
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【０１９４】
本明細書に述べられた全ての特許と刊行物は本発明が属する技術分野の技術者の水準を示す。本技術分野の技術者は、本発明が、目的を遂行し、明示的に述べられた結果と利点及び本発明に内在的な結果と利点を得るに良く適していることを容易に理解できる。本明細書に述べられた組成物と方法は好ましい実施態様の代表、例であって、本発明の範囲を限定することは意図されていない。種々の置換と変更が、本発明の範囲と本質を逸脱することなく本明細書に開示された発明に行うことができることは、本技術分野の技術者には容易に理解できる。
【０１９５】
本明細書に説明された発明は、適宜、本明細書に具体的に開示されていない、いずれかの要素、制限を欠いても実施できる。使用された用語と表現は記述のために使用され、制限のためではない。そのような用語や表現の使用により、明示され、記述された特徴と同等のものの何れか、又はその一部を除く意図はない。しかし、請求項の発明の範囲内で種々の変更が可能であることは認められる。従って、本発明は好ましい実施態様と任意の特徴により具体的に開示されたが、本明細書に開示された概念の変更は本技術分野の技術者によりなし得、またそのような変更は本明細書で定義された本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１９６】
本発明は本明細書で広く、微生物の属について述べられた。開示された属の範囲内のより小さい範囲の種、属の下位の群もまた本発明の一部である。これは、除く事項が本明細書で具体的に述べられていても、いなくても、属からいずれかの下位の事項を除く但し書き又は限定を有する発明の属に関する記述も含む。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年5月18日(2015.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、
G97A-G128A-Y217Q, G97A-L126A-G128A, G97A-L126A-G128A-Y217Q, G97A-L126A-Y217Q, G97A-M124V-G128A, G97A-M124V-G128A-Y217Q, G97A-M124V-L126A, G97A-M124V-L126A-G128A, G97A-M124V-L126A-Y217Q, G97A-M124V-Y217Q, G97A-N123G-G128A, G97A-N123G-G128A-Y217Q, G97A-N123G-L126A, G97A-N123G-L126A-G128A, G97A-N123G-L126A-Y217Q, G97A-N123G-M124V, G97A-N123G-M124V-G128A, G97A-N123G-M124V-L126A, G97A-N123G-M124V-Y217Q, G97A-N123G-Y217Q, L126A-G128A-Y217Q, L96T-G128A-Y217Q, L96T-G97A-G128A, L96T-G97A-G128A-Y217Q, L96T-G97A-L126A, L96T-G97A-L126A-G128A, L96T-G97A-L126A-Y217Q, L96T-G97A-M124V, L96T-G97A-M124V-G128A, L96T-G97A-M124V-L126A, L96T-G97A-M124V-Y217Q, L96T-G97A-N123G, L96T-G97A-N123G-G128A, L96T-G97A-N123G-L126A, L96T-G97A-N123G-M124V, L96T-G97A-N123G-Y217Q, L96T-G97A-Y217Q, L96T-L126A-G128A, L96T-L126A-G128A-Y217Q, L96T-L126A-Y217Q, L96T-M124V-G128A, L96T-M124V-G128A-Y217Q, L96T-M124V-L126A, L96T-M124V-L126A-G128A, L96T-M124V-L126A-Y217Q, L96T-M124V-Y217Q, L96T-N123G-G128A, L96T-N123G-G128A-Y217Q, L96T-N123G-L126A, L96T-N123G-L126A-G128A, L96T-N123G-L126A-Y217Q, L96T-N123G-M124V, L96T-N123G-M124V-G128A, L96T-N123G-M124V-L126A, L96T-N123G-M124V-Y217Q, L96T-N123G-Y217Q, M124V-G128A-Y217Q, M124V-L126A-G128A, M124V-L126A-G128A-Y217Q, M124V-L126A-Y217Q, N123G-G128A-Y217Q, N123G-L126A-G128A, N123G-L126A-G128A-Y217Q, N123G-L126A-Y217Q, N123G-M124V-G128A, N123G-M124V-G128A-Y217Q, N123G-M124V-L126A, N123G-M124V-L126A-G128A, N123G-M124V-L126A-Y217Q, N123G-M124V-Y217Q, N62Q-G128A-Y217Q, N62Q-G97A-G128A, N62Q-G97A-G128A-Y217Q, N62Q-G97A-L126A, N62Q-G97A-L126A-G128A, N62Q-G97A-L126A-Y217Q, N62Q-G97A-M124V, N62Q-G97A-M124V-G128A, N62Q-G97A-M124V-L126A, N62Q-G97A-M124V-Y217Q, N62Q-G97A-N123G, N62Q-G97A-N123G-G128A, N62Q-G97A-N123G-L126A, N62Q-G97A-N123G-M124V, N62Q-G97A-N123G-Y217Q, N62Q-G97A-Y217Q, N62Q-L126A-G128A, N62Q-L126A-G128A-Y217Q, N62Q-L126A-Y217Q, N62Q-L96T-G128A, N62Q-L96T-G128A-Y217Q, N62Q-L96T-G97A, N62Q-L96T-G97A-G128A, N62Q-L96T-G97A-L126A, N62Q-L96T-G97A-M124V, N62Q-L96T-G97A-N123G, N62Q-L96T-G97A-Y217Q, N62Q-L96T-L126A, N62Q-L96T-L126A-G128A, N62Q-L96T-L126A-Y217Q, N62Q-L96T-M124V, N62Q-L96T-M124V-G128A, N62Q-L96T-M124V-L126A, N62Q-L96T-M124V-Y217Q, N62Q-L96T-N123G, N62Q-L96T-N123G-G128A, N62Q-L96T-N123G-L126A, N62Q-L96T-N123G-M124V, N62Q-L96T-N123G-Y217Q, N62Q-L96T-Y217Q, N62Q-M124V-G128A, N62Q-M124V-G128A-Y217Q, N62Q-M124V-L126A, N62Q-M124V-L126A-G128A, N62Q-M124V-L126A-Y217Q, N62Q-M124V-Y217Q, N62Q-N123G-G128A, N62Q-N123G-G128A-Y217Q, N62Q-N123G-L126A, N62Q-N123G-L126A-G128A, N62Q-N123G-L126A-Y217Q, N62Q-N123G-M124V, N62Q-N123G-M124V-G128A, N62Q-N123G-M124V-L126A, N62Q-N123G-M124V-Y217Q, および N62Q-N123G-Y217Q、当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
【請求項２】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、
G97N-G128A-Y217M, G97G-G128S-Y217E, G97A-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y217E, G97A-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q, G97M-G128G-Y217M, G97G-G128S-Y217Q, G97S-G128S-Y217Q, G97G-G128A-Y217Q, G97S-G128A-Y217E, G97A-G128S-Y217L, G97A-G128A-Y217N, G97Q-G128S-Y217L, G97A-G128A-Y217M, G97A-G128A-Y217S, G97D-G128A-Y217Q, G97M-G128S-Y217Q, G97Q-G128G-Y217D-S87Y, G97S-G128A-Y217N, G97A-G128S-Y217T, G97D-G128S-Y217E, G97D-G128A-Y217L, G97G-G128S-Y217E-S78P-A272T, G97T-G128S-Y217D, G97D-G128A-Y217I, G97Q-G128S-Y217Q, G97G-G128A-Y217D, G97Q-G128A-Y217N, G97S-G128A-Y217M, G97S-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y217M, G97E-G128S-Y217M, G97S-G128P-Y217Q, G97T-G128S-Y217Q, G97D-G128S-Y217Q-A73T, G97E-G128S-Y217N, G97G-G128A-Y217I, G97Q-G128A-Y217D, G97Q-G128S-Y217M, G97R-G128T-Y217Q-S162P, G97S-G128S-Y217D, G97T-G128P-Y217I, G97Q-G128G-Y217E, G97C-G128G-Y217N, G97D-G128S-Y217H, G97M-G128S-Y217L, G97M-G128S-Y217N, G97S-G128S-Y217E, G97M-G128S-Y217I, G97A-G128P-Y217A, G97R-G128S-Y217D, G97D-G128A-Y217D, G97V-G128G-Y217D, G97V-G128G-Y217E, G97A-G128G-Y217T, G97G-G128N-Y217L, G97D-G128A-Y217T, G97M-G128A-Y217E, およびG97M-G128A-Y217N,
当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
【請求項３】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、
S24R-S87D-Q206E, P40E-A144K-K213L, N61E-P129E-S159K, S87D-S162K-K265N, S87D-T242R-Q275E, N61E-Q103E-N240K, S87D-T242R-K265N, N62R-K265N-Q275E, P129E-S145D-N240K, P129E-P239R-K265N, Q103E-P129E-T242R, P40E-N61E-S87D-S162K-T242R, S24R-N62R-S87D-S145D-K265N, P40E-N62R-S87D-Q103E-S162K, S24R-P40E-S145D-S159K-K213L, S24R-S87D-A144K-K265N-Q275E, N61E-P129E-S162K-K213L-N240K, N61E-S145D-S162K-K213L-T242R, S87D-A144K-S145D-S159K-Q275E, S24R-P129E-Q206E-N240K-K265N, N61E-Q103E-A144K-K213L-T242R, N62R-S159K-Q206E-K265N-Q275E, S24R-Q103E-P129E-N240K-K265N, N61E-Q103E-P129E-P239R-N240K, P129E-S145D-N240K-T242R-K265N, Q103E-S162K-Q206E-K213L-P239R, P40E-N61E-N62R-S87D-S159K-S162K-K265N, S24R-P40E-N61E-A144K-Q206E-K213L-T242R, P40E-N61E-S87D-P129E-S159K-S162K-T242R, P40E-N62R-S87D-S145D-S159K-S162K-Q275E, P40E-N62R-S87D-Q103E-A144K-S159K-Q275E, P40E-N62R-S87D-S159K-S162K-K265N-Q275E, P40E-N61E-P129E-A144K-S162K-K213L-N240K, P40E-N61E-Q103E-A144K-S159K-S162K-Q275E, P40E-N61E-Q103E-S159K-S162K-K213L-P239R, P40E-N61E-Q103E-S159K-S162K-K213L-N240K, N62R-S87D-P129E-S145D-S159K-S162K-Q275E, S24R-N61E-Q103E-P129E-K213L-N240K-T242R, P40E-N62R-S145D-S159K-S162K-Q206E-Q275E, N62R-S87D-S145D-S159K-S162K-K265N-Q275E, N61E-S87D-Q103E-S159K-S162K-K213L-T242R, S24R-N61E-Q103E-P129E-Q206E-P239R-N240K, S24R-N62R-P129E-S145D-P239R-K265N-Q275E, S24R-N62R-P129E-Q206E-N240K-K265N-Q275E, P40E-S145D-S159K-S162K-K213L-P239R-Q275E, N61E-Q103E-A144K-Q206E-K213L-N240K-T242R, S24R-Q103E-P129E-S145D-P239R-N240K-K265N, N61E-Q103E-P129E-K213L-P239R-N240K-T242R, N61E-Q103E-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61E-S87D-Q103E-S159K-S162K-K213L-N240K, N61E-N62R-S87D-Q103E-S159K-S162K-K213L-T242R-Q275E, P40E-N62R-S87D-S145D-S159K-S162K-N240K-K265N-Q275E, N62R-S87D-S145D-S159K-S162K-K213L-N240K-K265N-Q275E, S24R-N61E-Q103E-P129E-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61E-Q103E-P129E-S145D-P239R-N240K-T242R-K265N, N61E-S87D-Q103E-P129E-S159K-S162K-K213L-N240K-T242R, P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-Q103E-P129E-S145D-Q206E-P239R-N240K-T242R-K265N, N61E-Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-K213L-P239R-N240K-T242R-K265N, S24R-P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-S145D-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, P40E-N61E-S87D-Q103E-S145D-S159K-S162K-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-P40E-N61E-Q103E-P129E-S162K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61E-Q103E-P129E-A144K-S145D-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, P40E-N61E-Q103E-P129E-A144K-S162K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R, S24R-N61E-Q103E-P129E-A144K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R-K265N, および S24R-P40E-N61E-S87D-Q103E-P129E-A144K-S162K-Q206E-K213L-P239R-N240K-T242R,
当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
【請求項４】
置換G97A/G128A/Y217Qを含むスブチリシン変異種であって、さらに請求項３の一以上の変異を含み、かつ当該位置は配列番号１のBPN’スブチリシンの位置に対応するものである、スブチリシン変異種。
【請求項５】
以下の置換の組み合わせのうち一以上を含む単離されたスブチリシン変異種であって、
S53G-F58G, S53G-S78N, S53G-Y104N, S53G-I111V, S53G-A114G, S53G-N117S, S53G-S125A, S53G-S132N, S53G-P239V, F58G-S78N, F58G-Y104N, F58G-I111V, F58G-A114G, F58G-N117S, F58G-S125A, F58G-S132N, F58G-P239V, S78N-Y104N, S78N-I111V, S78N-A114G, S78N-N117S, S78N-S125A, S78N-S132N, S78N-P239V, Y104N-I111V, Y104N-A114G, Y104N-N117S, Y104N-S125A, Y104N-S132N, Y104N-P239V, I111V-A114G, I111V-N117S, I111V-S125A, I111V-S132N, I111V-P239V, A114G-N117S, A114G-S125A, A114G-S132N, A114G-P239V, N117S-S125A, N117S-S132N, N117S-P239V, S125A-S132N, S125A-P239V, S132N-P239V, S53G-F58G-S78N, S53G-F58G-Y104N, S53G-F58G-I111V, S53G-F58G-A114G, S53G-F58G-N117S, S53G-F58G-S125A, S53G-F58G-S132N, S53G-F58G-P239V, S53G-S78N-Y104N, S53G-S78N-I111V, S53G-S78N-A114G, S53G-S78N-N117S, S53G-S78N-S125A, S53G-S78N-S132N, S53G-S78N-P239V, S53G-Y104N-I111V, S53G-Y104N-A114G, S53G-Y104N-N117S, S53G-Y104N-S125A, S53G-Y104N-S132N, S53G-Y104N-P239V, S53G-I111V-A114G, S53G-I111V-N117S, S53G-I111V-S125A, S53G-I111V-S132N, S53G-I111V-P239V, S53G-A114G-N117S, S53G-A114G-S125A, S53G-A114G-S132N, S53G-A114G-P239V, S53G-N117S-S125A, S53G-N117S-S132N, S53G-N117S-P239V, S53G-S125A-S132N, S53G-S125A-P239V, S53G-S132N-P239V, F58G-S78N-Y104N, F58G-S78N-I111V, F58G-S78N-A114G, F58G-S78N-N117S, F58G-S78N-S125A, F58G-S78N-S132N, F58G-S78N-P239V, F58G-Y104N-I111V, F58G-Y104N-A114G, F58G-Y104N-N117S, F58G-Y104N-S125A, F58G-Y104N-S132N, F58G-Y104N-P239V, F58G-I111V-A114G, F58G-I111V-N117S, F58G-I111V-S125A, F58G-I111V-S132N, F58G-I111V-P239V, F58G-A114G-N117S, F58G-A114G-S125A, F58G-A114G-S132N, F58G-A114G-P239V, F58G-N117S-S125A, F58G-N117S-S132N, F58G-N117S-P239V, F58G-S125A-S132N, F58G-S125A-P239V, F58G-S132N-P239V, S78N-Y104N-I111V, S78N-Y104N-A114G, S78N-Y104N-N117S, S78N-Y104N-S125A, S78N-Y104N-S132N, S78N-Y104N-P239V, S78N-I111V-A114G, S78N-I111V-N117S, S78N-I111V-S125A, S78N-I111V-S132N, S78N-I111V-P239V, S78N-A114G-N117S, S78N-A114G-S125A, S78N-A114G-S132N, S78N-A114G-P239V, S78N-N117S-S125A, S78N-N117S-S132N, S78N-N117S-P239V, S78N-S125A-S132N, S78N-S125A-P239V, S78N-S132N-P239V, Y104N-I111V-A114G, Y104N-I111V-N117S, Y104N-I111V-S125A, Y104N-I111V-S132N, Y104N-I111V-P239V, Y104N-A114G-N117S, Y104N-A114G-S125A, Y104N-A114G-S132N, Y104N-A114G-P239V, Y104N-N117S-S125A, Y104N-N117S-S132N, Y104N-N117S-P239V, Y104N-S125A-S132N, Y104N-S125A-P239V, Y104N-S132N-P239V, I111V-A114G-N117S, I111V-A114G-S125A, I111V-A114G-S132N, I111V-A114G-P239V, I111V-N117S-S125A, I111V-N117S-S132N, I111V-N117S-P239V, I111V-S125A-S132N, I111V-S125A-P239V, I111V-S132N-P239V, A114G-N117S-S125A, A114G-N117S-S132N, A114G-N117S-P239V, A114G-S125A-S132N, A114G-S125A-P239V, A114G-S132N-P239V, N117S-S125A-S132N, N117S-S125A-P239V, N117S-S132N-P239V, S125A-S132N-P239V, N76D-D120H-K213N-M222Q,
当該置換が配列番号１で規定されたBPN’スブチリシンの位置と等価の位置にある、スブチリシン変異種。
【請求項６】
置換G97A/G128A/Y217Qを含むスブリチリシン変異種であって、さらに請求項５の一以上の変異を含み、かつ当該位置は配列番号１のBPN’スブチリシンの位置に対応するものである、スブチリシン変異種。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかの請求項に規定されたスブチリシン変異種をコードする単離された核酸。
【請求項８】
請求項７の前記核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８の前記発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
洗浄の方法であって、前記方法は、
a) 請求項１−７のいずれか一項に記載のスブチリシン変異種と、表面及び/又は布を含む物品と接触させる段階、と
b) 任意に前記の表面又は物品を洗浄し及び/又は濯ぐ段階
を含むものである、洗浄の方法。
【請求項１１】
請求項１−７のいずれか一項に記載の一以上のスブチリシン変異種を含む動物飼料。
【請求項１２】
請求項１−７のいずれか一項に記載の一以上のスブチリシン変異種を含む食品加工用組成物。