(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍グレード分類と癌の予後診断の提供。【解決手段】グレード分類、癌再発の予後診断、内分泌療法、化学療法、又は放射線療法による治療に対する対象の応答性の予測のための、遺伝子発現プロフィール、すなわち遺伝子Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の遺伝子発現プロフィールの同定と使用。さらに、エストロゲン受容体陰性乳癌患者の治療法を決定する方法、該患者の腫瘍グレードを決定する方法、及び上記遺伝子の発現プロフィールを使用する方法を含む。【選択図】図１
2015057055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｕｂ１Ｂの発現レベルについて、癌に罹った対象からの癌細胞の試料をアッセイすることを含む方法であって、発現レベルが、
癌をグレードＩ又はグレードIII腫瘍に対応するとして分類するか、又は
癌再発の可能性の予後を有するとして対象を同定するか、又は
内分泌療法、化学療法、又は放射線療法による治療に対する対象の応答性を予測する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アッセイがＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルを測定することをさらに含む請求項１に記載の方法であって、すべての５つの遺伝子の発現レベルが、
癌をグレードＩ又はグレードIII腫瘍に対応するとして分類するか、又は
癌再発の可能性の予後を有するとして対象を同定するか、又は
内分泌療法、化学療法、又は放射線療法による治療に対する対象の応答性を予測する、
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
前記アッセイが試料からＲＮＡを調製することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡがＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アッセイがアレイを使用することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記試料は、前記対象から取り出された組織から分離される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲ８（逆転写−ＰＣＲ）、又はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が乳癌であり、そして前記試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象の応答性が、
タモキシフェン、選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＳＥＲＤ）、又はアロマターゼインヒビター（ＡＩ）；
又は
タモキシフェンに対するアロマターゼインヒビター；又は
内分泌抵抗性乳癌を標的とするインヒビター；又は
５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、及びシクロホスファミドと組合せたパクリタキセル、による治療に対する対象の応答性を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料におけるＨ：Ｉ比についてアッセイすることをさらに含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が非浸潤性乳管癌（又はＤＣＩＳ）であり、そして前記癌再発が局所的再発を含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
癌患者の治療法を決定する方法であって、該方法が、
Ｂｕｂ１Ｂの発現レベルについて、該患者からの癌細胞の試料をアッセイする工程であって、ここで発現レベルが、
癌をグレードＩ又はグレードIII腫瘍に対応するとして分類するか、又は
癌再発の可能性の予後を有するとして対象を同定する工程；及び
そのような腫瘍もしくは予後を有する患者について治療法を選択する工程
を含む方法。
【請求項１３】
前記測定が、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルを測定することをさらに含む請求項１２に記載の方法であって、すべての５つの遺伝子の発現レベルが、
癌をグレードＩ又はグレードIII腫瘍に対応するとして分類するか、又は
癌再発の可能性の予後を有するとして対象を同定する、
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記癌がグレードIII腫瘍に相当し、そして前記治療法が手術と化学療法及び／又は放射線療法を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療法が放射線療法を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料中のＨ：Ｉ比についてアッセイすることをさらに含む請求項１２、１３、１４、又は１５に記載の方法であって、該アッセイの結果が、該対象を癌再発の低リスク、中間リスク、又は高リスクとして分類することを特徴とする方法。
【請求項１７】
良性の腫瘍を有するとして診断された対象の腫瘍グレードを測定する方法であって、該対象からの乳房細胞の試料を、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについてアッセイすることを含み、ここで該発現レベルがグレードＩ又はグレードIII腫瘍と相関していることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
ＤＣＩＳを有するとして診断された対象の腫瘍グレードを測定する方法であって、該対象からの乳癌細胞の試料を、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについてアッセイすることを含み、ここで該発現レベルがグレードＩ又はグレードIII腫瘍と相関していることを特徴とする、方法。
【請求項１９】
癌に罹った対象からの癌細胞の試料を、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについてアッセイすることを含む方法であって、すべての５つの遺伝子の発現レベルが、タモキシフェン又は別のＳＥＲＭと比較して、アロマターゼインヒビターによる治療に対する対象の応答性を予測することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は米国仮特許出願第６０／９７０，５２９号（２００７年９月６日出願）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
開示の分野
本開示は、癌と臨床的関連のある遺伝子発現プロフィール又はパターンの同定と使用に関する。特に本開示は、一部は腫瘍グレードと相関して発現される遺伝子の本体に基づく。遺伝子発現のレベルは、ある患者の腫瘍グレードを決定し、臨床転帰を予測し、従って患者の予後を予測することができる分子指数を構成する。癌の分子的グレード分類は場合により、癌とその予後を診断するための第２の分子指数と組合せて使用してもよい。
【０００３】
遺伝子発現プロフィールは、核酸発現、タンパク質発現、もしくは他の発現フォーマットに埋め込まれていても、癌に罹った対象の臨床転帰を予測し、癌の再発を予測し、及び／又は転移癌の発生を予測するのに使用される。このプロフィールはまた、癌細胞と組織の研究及び／又は診断に、ならびに対象の予後の研究にも使用される。診断又は予後診断について使用される時、このプロフィールは、余命、癌再発、及び／又は癌転移の可能性に基づいて、癌の治療法を決定するのに使用される。
【背景技術】
【０００４】
開示の背景
ゲノムの発現プロフィーリング研究により、乳癌の予後遺伝子シグネチャ（signature、特徴）の「小さな洪水」が発生している。重要な問題は、これらのシグネチャが予後スペース中で重複するかどうか、及びこれらのいくつかを組合せることがより正確な予後診断を与えるかどうかである。ある比較試験では、異なる患者コホート（群）と方法を使用して開発された４つのシグネチャ（固有のサブタイプ、７０遺伝子シグネチャ、創傷応答シグネチャ、及び再発スコア）が、低リスク群と高リスク群への異なる患者の分類によく一致することが見いだされた。さらにこれらのシグネチャの組合せが予測の正確性に大きな改善を与えることはなく、これらのシグネチャによりつながった予後情報スペースが極めて重複していることを示唆している。
【０００５】
腫瘍グレードの予後的重要性は確立されている（ClanfroccaM. Goldstein LJ Oncologist 9:606-16, 2004）。癌の予後診断のための種々の分子指数がすでに報告されている。
例としては、９７腫瘍グレード関連遺伝子（これは予後診断性が強いことが証明されている）（Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al. J Natl Cancer Inst 98:262-72, 2006）；７０遺伝子シグネチャ（van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al. Nature 415:530-6, 2002）；及びOncotype DX21遺伝子再発スコアアルゴリズム（Paik S, Shak S, Tang G, et al N Engl J Med 351:2817-26, 2004）に基づくゲノムグレード指数（ＧＧＩ）がある。
【０００６】
９７遺伝子腫瘍グレードシグネチャは、独立したコホートで７０遺伝子シグネチャと再発スコアアルゴリズムに匹敵することが報告され、これらのシグネチャの予後診断能力のほとんどは、細胞増殖に関連する遺伝子に由来すると仮定されている。
【０００７】
上記シグネチャの比較は、腫瘍グレード関連遺伝子がこれらのシグネチャの共通要素であることを示唆している（例えば、Sotiriou C, Wirapati P, Loi S. et al J Natl Cancer Inst 98:262-72, 2006; Desmedt C, Sotiriou C Cell Cycle 5:2198-202, 2006; Loi S, Haibe-Kains B, Desmedt C, et al J Clin Oncol 25:1239-46, 2007; 及びSotiriou C, Piccart MJ Nat Rev Cancer 7:545-53, 2007を参照）。
【０００８】
さらに最近は、腫瘍発生ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／低乳癌細胞を正常な乳房上皮と比較することにより得られる１８６遺伝子「侵襲性遺伝子シグネチャ」（ＩＧＳ）が、増殖ベースの予後スペースを超えて拡張されると提唱されている。しかし注意深い観察は、ＩＧＳが腫瘍グレードシグネチャと高度に相関（ｒ＝０．８１）するため、これもまたその予後診断能力を増殖関連遺伝子から得ていることを示唆している。
【０００９】
予後診断における腫瘍グレードの重要性と、その発現レベルが腫瘍グレードと増殖とに高度に相関する数百の遺伝子の存在を考慮すると、多数の一見明確な予後シグネチャが開発できることは驚くべきことではないかも知れない。さらにこれらの遺伝子の予後診断の強固さと重複は、数個の遺伝子を含むはるかに単純なアッセイで充分かも知れないことを示唆する。例えば、予後診断にはＣＧＩの９７個の遺伝子のうちのほんの一部しか必要でないことが認められている。独立した試験で、Ivshina et al.はまた、２６４遺伝子腫瘍グレードシグネチャがコンピュータで６遺伝子に低減できることを証明した（Ivshina AV, George J, Senko O, et al: 組織学的グレードの遺伝子再分類は乳癌の新しい臨床的サブタイプを明確に説明する、Cancer Res 66:10292-301, 2006）。
【００１０】
本明細書における文献の引用は、これらが関連技術であると認めることを反映していると理解してはならない。さらにこれらの引用は、関連する開示の検索を示すものではない。文献の日付又は内容に関するすべての記載は、入手できる情報に基づいており、これらの正確性又は正しさを認めているものではない。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、一部は、腫瘍グレードと相関する腫瘍細胞の遺伝子発現レベルの発見と測定に基づく。同定された遺伝子の発現レベルの腫瘍グレードシグネチャとしての使用以外に、発現レベルは予後情報（例えば癌再発）や予測情報（例えばある治療法に対する応答性）を与えるために使用される。
【００１２】
本開示により同定される１つの遺伝子は、Ｂｕｂ１Ｂをコードする。すなわち本開示の第１の態様において、腫瘍グレードを研究又は測定し、予後情報を提供し、及び／又は臨床的応答性の予測を与えるためのＢｕｂ１Ｂ遺伝子発現の使用についての、組成物と方法が記載される。ある場合には、グレードＩ、グレードIII、又は中間グレードの腫瘍の診断に対応するという診断に達するために、対象からの腫瘍細胞を用いて測定が行われる。
本開示で使用される細胞の非限定例には、対象から新たに単離されたもの、単離後凍結されたもの、及び固定及び／又は包埋されたもの（例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ））がある。ある実施態様において細胞は乳房細胞、例えば乳癌細胞である。
【００１３】
第２の態様において、腫瘍グレードを測定し、予後情報を提供し、及び／又は臨床的応答性の予測を提供するための４つの他の遺伝子発現レベルの使用のための、組成物と方法が開示される。これらの追加の遺伝子は、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２をコードする。すなわち本開示は一部は、その発現レベルが癌に罹った対象の腫瘍グレードの決定と、対象の予後及び予測測定を提供するのに有用な５つの遺伝子の発見に基づく。
【００１４】
これらの５つの遺伝子の各発現レベルは、追加の情報を与えるための研究もしくは測定で単独で使用されるが、本開示の第３の態様は、５つの開示された遺伝子の任意の組合せの使用を含む。すなわちある実施態様において、Ｂｕｂ１Ｂと、これらの追加の４つの遺伝子の任意の１つ、２つ、もしくは３つの発現レベルの組合せが使用される。同様にＣＥＮＰＡと、Ｂｕｂ１Ｂ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、もしくはＲＲＭ２の任意の１つ、２つ、もしくは３つの発現レベルの組合せ；ＮＥＫ２と、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＲＡＣＧＡＰ１、もしくはＲＲＭ２の任意の１つ、２つ、もしくは３つの発現レベルの組合せ；ＲＡＣＧＡＰ１と、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、もしくはＲＲＭ２の任意の１つ、２つ、もしくは３つの発現レベルの組合せ；ＲＲＭ２と、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、もしくはＲＡＣＧＡＰ１の任意の１つ、２つ、もしくは３つの発現レベルの組合せが使用される。
【００１５】
ある実施態様においてすべての５つの発現レベルの組合せが、５遺伝子腫瘍グレードシグネチャ（又は分子グレード指数）として開示される。この指数、すなわちＭＧＩは、２つの独立したコホートにおける９７遺伝子ＣＧＩに匹敵する性能で腫瘍グレードを再現し臨床転帰を予測することができる。ＭＧＩはまた、癌再発及び／又は生存転帰の予後診断因子として機能する。
【００１６】
さらなる態様において本開示は、癌の第２の分子指数と組合せた５遺伝子ＭＧＩの使用を含む。ある実施態様においてこの組合せは、第２の分子指数とすべての５つの開示した遺伝子との組合せである。別の実施態様においてこの組合せは、本明細書の５つの開示した遺伝子のうちの１、２、３、又は４つとの組合せである。ある場合には第２の分子指数は、２つの遺伝子ＨｏｘＢ１３とＩＬ１７ＢＲの発現レベルに基づくものである。特にＨｏｘＢ１３発現とＩＬ１７ＢＲ発現の２遺伝子比（又は、ＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比）は、第２の分子指数として使用される（ＵＳ２００５／０２３９０７９Ａ１号；ＵＳ２００５／０２３９０８３Ａ１号；及びＵＳ２００６／０１５４２６７Ａ１号を参照）。別の実施態様において第２の指数は、ＨｏｘＢ１３発現対ＣＨＤＨ発現の２遺伝子比でもよい。
【００１７】
ＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ（Ｈ：Ｉ）比は、標準的予後診断因子を超える臨床転帰の予測のための新規バイオマーカーの研究に基づいて発見された。腫瘍ステージとグレードについて、癌が再発した患者とそうでないものとを並べた。単純なＨ：Ｉ比が、アジュバントタモキシフェン療法を受けているエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳癌患者で癌再発を予測するのに適していることがわかった。以後の研究（Ma XJ, Hilsenbeck SG, Wang W, et al J Clin Oncol 24:4611-9, 2006; Goetz MP, Suman VJ, Ingle JN, et al Clin Cancer Res 12:2080-7, 2006; Jerevall PL, Brommesson S, Strand C, et al Breast Cancer Res Treat, 2007;and Jansen MP, Sieruwerts AM, Look MP, et al J Clin Oncol 25:662-8, 2007）はさらに、後向き研究との無作為臨床治験の両方で、この比が予後診断的（腫瘍の悪性度の指標）であり、及びタモキシフェン効果（すなわち、タモキシフェン応答／抵抗性）に対して予測的であることが証明された。
【００１８】
リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、開示された５遺伝子ＭＧＩとＨ：Ｉ比の両方を分析すると、この組合せは、いずれか単独よりも再発リスクの優れた層別を与えることがわかった。これは、Ｈ：Ｉ比が腫瘍グレードに依存しないことを示すため、予想外の発見である。従って２つの指数の組合せは、癌に関連する独立したパラメータを効率的に分析することにより、癌診断を改善し、その予後のより正確な決定を可能にする。
【００１９】
別の実施態様において、開示された５遺伝子シグネチャ中の１つ又はそれ以上の遺伝子の発現は、癌の予後診断のために他の遺伝子もしくは他の分子指数と組合せて使用される。非限定例には、９７腫瘍グレード関連遺伝子（Sotiriou et al.、前述）とこれらの９７遺伝子内の遺伝子のサブセット；MammaPrint ７０遺伝子シグネチャ（van't Veer et al.、前述）とこれらの７０遺伝子内のサブセット；Oncotype DX ２１遺伝子再発スコアアルゴリズム（Paik et al.、前述）とこれらの２１遺伝子内の遺伝子のサブセット；及びVeridex ７６遺伝子アッセイ（Wang et al. Lancet, 365 (9460):671-679, 2005）とこれらの７６遺伝子内の遺伝子のサブセット、に基づくゲノムグレード指数（ＧＧＩ）がある。他の場合には、開示された５遺伝子腫瘍グレードシグネチャの１つ又はそれ以上の発現が、増殖表現型と相関して発現される１つ又はそれ以上の遺伝子の発現レベルと組合せて使用される。ある場合には、増殖表現型と相関して発現される遺伝子は、上記した９７、７０、２１、及び７６遺伝子内にある。増殖表現型と相関して発現される遺伝子の非限定例には、Ｋｉ−６７、ＳＴＫ１５、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、及びＭＹＢＬ２がある。従って、癌の予後診断のための又は臨床転帰の予測因子として、５ＭＧＩ遺伝子のうちの任意の１、２、３、又は４つの発現レベルは、他の遺伝子もしくは分子指数とともに使用される。もちろんＭＧＩとしてのすべての５つの遺伝子の発現レベルは、上記の及び後述の追加の遺伝子又は別の指数と組合せて使用してもよい。さらにＭＧＩ遺伝子の１つ、一部、又はすべての発現レベルと他の遺伝子の組合せもまた、上記のＨ：Ｉ比と、及び後述の臨床転帰の予後診断因子又は予測因子として、さらに組合わされる。
【００２０】
本開示の実施態様は、ＭＧＩ遺伝子の１つ、一部、又はすべての発現を、随時上記の１つ又はそれ以上の追加の遺伝子とともに、及び随時予後診断因子もしくは治療結果の予測因子としてＨ：Ｉ比と組合せて、測定する方法を含む。かかるアッセイ法は、予後診断価値及び予測価値についてＥＲ＋対象を層別するのに使用される。予後診断因子として層別は、非限定例として、腫瘍悪性度と相関するか又はこれを示す発現レベルの差に基づく。予測因子として層別は、化学療法応答性（又は感受性）及び／又は非応答性（又は抵抗性）と相関し、従ってこれを示す発現レベルの差に基づき、これはまた化学療法効果の予測因子とも見なされる。非限定例として、層別（発現レベルに基づく）は、内分泌抵抗性（例えば、非限定例としてタモキシフェンに対する抵抗性）を予測するために、及び／又は内分泌抵抗性乳癌を標的とするインヒビターからの効果の予測のために、使用される。かかるインヒビターの非限定例には、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ）、Ｐ１３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ）、ＡＫＴファミリーセリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ヒトのＡｋｔ１、Ａｋｔ２、及びＡｋｔ３を含むメンバー）、及び／又はＥＧＦＲ（表皮増殖因子受容体；ヒトのＨＥＲ１）を標的とするものがある。遺伝子発現の検出はもちろん、本明細書に記載の任意の適切な細胞含有試料で行われる。
【００２１】
本開示のさらに別の実施態様において、腫瘍グレード非依存性Ｈ：Ｉ比は、癌予後診断のための異なる分子指数と組合せて使用される（１つ、一部、又はすべてのＭＧＩ遺伝子の代わりに）。かかる指数の非限定例には、９７腫瘍グレード関連遺伝子（Sotiriou et al.、前述）とこれらの９７遺伝子内の遺伝子のサブセット；MammaPrint ７０遺伝子シグネチャ（van't Veer et al.、前述）とこれらの７０遺伝子内のサブセット；Oncotype DX ２１遺伝子再発スコアアルゴリズム（Paik et al.、前述）とこれらの２１遺伝子内の遺伝子のサブセット；及びVeridex ７６遺伝子アッセイ（Wang et al. Lancet, 365 (9460):671-679, 2005）とこれらの７６遺伝子内に遺伝子のサブセット、に基づくゲノムグレード指数（ＧＧＩ）がある。他の場合には、Ｈ：Ｉ比は、増殖表現型と相関して発現される１つ又はそれ以上の遺伝子の発現レベルと組合せて使用される。ある場合には増殖表現型と相関して発現される遺伝子は、上記した９７、７０、２１、及び７６遺伝子のセット内にある。増殖表現型と相関して発現される遺伝子の非限定例には、Ｋｉ−６７遺伝子、ＳＴＫ１５、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、及びＭＹＢＬ２である。
【００２２】
従ってある実施態様において、本開示は、１つ又はそれ以上の追加の遺伝子（Ｋｉ−６７、ＳＴＫ１５、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、及びＭＹＢＬ２から選択される１つ又はそれ以上）の発現レベルと組合せたＨ：Ｉ比の発現について測定することを含む。このアッセイ法は、予後診断価値及び予測価値のためにＥＲ＋対象を層別するのに使用される。予後診断として、層別は、非限定例として腫瘍悪性度と相関する、従ってこれを示す発現レベルの差に基づく。予測因子として層別は、化学療法応答性（又は感受性）及び／又は非応答性（又は抵抗性）と相関し、従ってこれを示す発現レベルの差に基づき、これはまた化学療法効果の予測因子とも見なされる。非限定例として、層別（発現レベルに基づく）は、内分泌抵抗性を予測するために、及び／又は内分泌抵抗性乳癌を標的とするインヒビターからの効果の予測のために、使用される。かかるインヒビターの非限定例には、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ）、Ｐ１３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ）、ＡＫＴファミリーセリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ヒトのＡｋｔ１、Ａｋｔ２、及びＡｋｔ３を含むメンバー）、及び／又はＥＧＦＲ（表皮増殖因子受容体；ヒトのＨＥＲ１）を標的とするものがある。遺伝子発現の検出は、本明細書に記載の任意の適切な細胞含有試料で行われる。
【００２３】
さらなる態様において、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子の発現が、臨床転帰の予後診断因子もしくは予測因子として、又は良性乳房疾患を有する対象（例えば、本発明の開示の非存在下で良性の乳房疾患を有すると診断される対象）の腫瘍グレードを測定するために、使用される。良性の乳房疾患の重要な役割は、Hartmann et al. (N. Engl. J. Med., 2005, 353:3)により議論されている。良性の乳房疾患の非限定例には、非増殖性病変、異型性の無い増殖性病変、および異型過形成の病理検査知見がある。
【００２４】
良性の乳房疾患の診断後に乳癌が起きることが観察されているため、良性の乳房疾患の一部の症例には乳癌の前駆体（例えば、異型性の無い病変、又は異型過形成）が存在していると推測されている。従って本開示は、対象の乳房細胞（例えば、良性の乳房疾患を診断するのに使用される病理検査試料からの細胞）中の腫瘍グレードを決定するための方法を含む。この方法は、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについて、対象の乳房細胞試料を測定することを含んでよく、ここで該発現レベルは、グレードＩ又はグレードIII腫瘍と、又は中間グレードの腫瘍と相関する。あるいはこの方法は、グレードＩ、グレードIII、又は中間グレードの腫瘍細胞の存在可能性を測定するために、任意の１つの遺伝子までこれらの５つの遺伝子の任意のサブセットについて測定することを含んでよい。ある実施態様において細胞は、異型性の無い病変
又は異型過形成の存在を診断するために使用される試料からでもよい。
【００２５】
もちろん本開示はさらに、対象が乳癌の以後の進展のリスクがあるかどうかを調べるために、良性の乳房疾患の対象からの試料のＭＧＩとＨ：Ｉ比を使用することを含む。あるいは本開示は、乳癌進展のリスクを調べるための試料を用いて、Ｈ：Ｉ比のみの使用を提供する。
【００２６】
さらなる態様において、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子の発現は、非浸潤性乳管癌（又はＤＣＩＳ）を有する対象の腫瘍グレードを測定するために、臨床転帰の予後診断因子又は予測因子として使用される。すなわち本開示は、ＤＣＩＳに罹患しているか又は持っている疑いがある対象の乳房細胞の腫瘍グレードを測定するための方法を含む。細胞は、対象のＤＣＩＳを診断するのに使用される病理検査試料からの細胞でもよい。この方法は、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについて、対象の乳癌細胞の試料を測定することを含んでよく、ここで該発現レベルは、臨床転帰の予後診断因子もしくは予測因子として使用されるか、又はグレードＩもしくはグレードIII腫瘍、又はさらに中間グレードと相関する。あるいは、この方法は、グレードＩ、グレードIII、又は中間グレードの腫瘍細胞の存在を測定するために、臨床転帰の予後診断因子又は予測因子として、これらの５つの遺伝子のサブセットについて、任意の１つの遺伝子まで測定することを含んでよい。
【００２７】
別の態様において本開示は、ＤＣＩＳの癌の局所的再発の予後診断因子として使用されるＢｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子の発現を検出するための、組成物と方法を含む。ある実施態様において、発現レベルに基づく方法は、ＤＣＩＳの対象からの乳癌細胞含有試料について有利に使用される。非限定例として、細胞は、対象の癌を診断するのに使用される手術前病理検査試料からのものでもよい。そのような対象について、標準的治療は手術であり、ＤＣＩＳを除去するために根治的乳房切除術より乳房温存手術が好ましい。この後にしばしば、術後放射線療法が行われ、場合により内分泌療法［例えば、タモキシフェン、選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＳＥＲＤ）、又はアロマターゼインヒビター（ＡＩ）による治療］、及び／又は化学療法による治療が行われる。しかし癌再発の可能性に対応するためのこのプロトコールは、癌再発を引き起こさない多くの対象で過剰治療を招き、癌再発の場合には失敗を招く。
【００２８】
従って本開示は、これらの５つすべての遺伝子の発現を検出することを含み、ここで高ＭＧＩ発現は、乳房温存手術及び以後の放射線療法及び／又は内分泌療法又は化学療法の失敗により、対象の局所的癌再発の可能性が上昇している指標である。別の実施態様においてこのような方法は、高ＭＧＩ発現の代替指標としてＨ：Ｉ比の検出を利用する。もちろん本開示は、ＤＣＩＳの治療後の局所的癌再発の可能性の上昇の指標として、高ＭＧＩとＨ：Ｉ比の検出を組合せる方法を含む。あるいは本方法は、ＤＣＩＳの治療後の局所的癌再発の可能性の上昇の指標として、随時Ｈ：Ｉ比と組合せて、５つのＭＧＩ遺伝子の任意のサブセットについて任意の１つの遺伝子まで測定することを含んでよい。
【００２９】
この方法はさらに、対象が局所的癌再発を経験する可能性があるか又は無いかを同定することを含み、場合によりさらに、予測される転帰に対応するために対象の治療法を調整することを含む。非限定例として、随時術後療法の縮小（例えば、放射線照射の省略、及び／又は内分泌療法もしくは化学療法の省略）を伴う乳房温存手術の適切性を確認するために又はこれを選択するために、再発の可能性の低さの測定が行われる。別の非限定例として、術後療法（例えば、放射線照射、及び／又は内分泌療法もしくは化学療法）を伴う根治的乳房切除術の適切性を確認するために又はこれを選択するために、再発の可能性の高さの測定が行われる。
【００３０】
さらに別の態様において本開示は、臨床転帰の予後診断因子又は予測因子として、又は早期乳癌の一次療法についての2005 St. Gallen専門家合意（Goldhirsch et al. Ann. Oncol., 2005, 16:1569-1583参照）に基づいて評価中の対象の腫瘍グレードを測定するために、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子（又はすべての５つの遺伝子）の使用を含む。すなわち本開示は、鑑別診断と専門家合意に基づく選択の一環として、対象の乳房細胞中の１つ、一部、又はすべてのＭＧＩ遺伝子の発現を評価するための方法を含む。開示された方法で使用される合意の一部の非限定例には、早期乳癌のアジュバント全身性療法の選択のためのアルゴリズム；内分泌療法に対する応答性もしくは非応答性、又は不明確な内分泌応答性；及び結節状態がある。もちろん全体として合意中の本開示の１つ又はそれ以上の態様を含めることも企図される。別の実施態様において、低及び高リスク群の分類を確認するために、ならびに少なくとも一部の中間リスク群の対象を低又は高リスク遺伝子に分けるために、分子遺伝子発現プロフィーリングの開示された方法が使用される。
【００３１】
ある場合には、癌を有すると診断された更年期前又は更年期後の女性について治療を選択又は排除するために、開示された方法が使用される。更年期前の女性は、約３５才未満の女性を含む。これらの対象において、高ＭＧＩ発現は癌再発の指標である。従って本開示は、更年期前対象の乳癌、例えばＤＣＩＳの場合の乳癌の再発の予後診断因子として、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを使用することを含む。場合によりＨ：Ｉ比も測定され、ＭＨＣクラスＩ遺伝子と組合せて使用される。本方法は、これらの遺伝子の発現について、対象からの乳癌細胞含有試料を測定することを含む。非限定例として細胞は、対象の癌を診断するのに使用される手術前病理検査試料からのものでもよい。他の場合には方法は、例としてこれらの遺伝子の５つすべての発現を使用することを含み、ここで高ＭＧＩ発現は、更年期前対象の癌再発の可能性の上昇の指標である。
【００３２】
この方法は、更年期前対象が癌再発を経験する可能性があるか又は無いかを同定することを含み、場合によりさらに、予測される転帰に対応するために対象の治療法を調整することを含む。非限定例として、随時術後療法の縮小（例えば、放射線照射の省略、及び／又は内分泌療法もしくは化学療法の省略）を伴う乳房温存手術の適切性を確認するために又はこれを選択するために、再発の可能性の低さの測定が行われる。別の非限定例として、術後療法（例えば、放射線照射、及び／又は内分泌療法もしくは化学療法）を伴う根治的乳房切除術の適切性を確認するために又はこれを選択するために、再発の可能性の高さの測定が行われる。
【００３３】
他の場合には、本方法は、治療法、例えば内分泌療法、化学療法、放射線療法、又はこれらの組合せの選択を補助するために使用される。ある実施態様において本開示は、内分泌療法の有効性の予測因子として、５つのＭＧＩ遺伝子の１つ又はそれ以上、又はこれらの５つすべての発現レベルを測定するための組成物と方法を含む。ある場合には、予測因子は、ＳＥＲＭ、例えばタモキシフェン、又はＳＥＲＤに対する応答性又は非応答性でもよい。これは、対象からの乳癌細胞含有試料の測定が高ＭＧＩを証明する場合を含み、タモキシフェンに対する非応答性の可能性を示す。別の場合には予測因子は、別の型に対するある型の内分泌療法の有効性についてである。これは、タモキシフェン又は他のＳＥＲＭもしくはＳＥＲＤと比較してアロマターゼインヒビター（ＡＩ）に対するより大きな応答性の指標として、ＭＧＩ遺伝子の１つ、一部、又はすべての発現レベルを測定する方法を含む。この方法は、タモキシフェンよりＡＩに対してより大きな応答性の可能性を示す、１つ又はすべての５つの遺伝子の発現における高ＭＧＩの同定を含む。ＡＩの非限定例には、非ステロイドインヒビター（例えばレトロゾール及びアナストロゾール）及び不可逆的ステロイドインヒビター（例えばエクセメスタン）がある。
【００３４】
さらに別の場合に本開示は、化学療法転帰の予測因子として、５つのＭＧＩ遺伝子の１つ又はそれ以上又はこれらの５つすべての発現レベルを使用するための組成物と方法を含む。場合によりＨ：Ｉ比も測定され、ＭＧＩ遺伝子との組合せで使用される。遺伝子の発現レベルは、非限定例として、化学療法、例えばパクリタキセル／ＦＡＣ（パクリタキセルの次に５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、及びシクロホスファミド）又はタキソール又はアントラサイクリン療法に対する化学感受性を予測するために使用される。従って本開示は、これらの遺伝子の５つすべての発現を検出することを含み、ここで高ＭＧＩ発現は、化学療法、非限定例としてパクリタキセル／ＦＡＣによる例えば術後（手術的介入後）治療に対する完全な病理的応答（ｐＣＲ）の可能性が上昇した指標である。非限定例として、対象の癌を診断するのに使用される手術前の細胞含有試料から癌細胞の発現が検出される。あるいはこの方法は、５つのＭＧＩ遺伝子の任意のサブセットについて任意の１つの遺伝子まで測定することを含んでよい。
【００３５】
この方法はさらに、対象がｐＣＲを経験する可能性があるか又は無いかを同定することを含み、場合によりさらに、予測される転帰に対応するために対象の治療法を調整することを含む。非限定例として、化学療法、例えばパクリタキセル／ＦＡＣによる治療の適切性を確認するために又はこれを選択するために、ｐＣＲの可能性の低さの測定が行われる。別の非限定例として、化学療法を省略（例えばパクリタキセル／ＦＡＣの省略）して、他の治療法（例えば、放射線照射のような術後療法を含む根治的乳房切除）を採用することの適切性を確認するために又はこれを選択するために、ｐＣＲの可能性の高さの測定が行われる。
【００３６】
本開示はさらに、放射線治療に対する癌の応答性（感受性）の予測因子として、５つのＭＧＩ遺伝子の１つ又はそれ以上又はこれらの５つすべての発現レベルを使用するための、組成物と方法を含む。場合によりＨ：Ｉ比も測定され、ＭＧＩ遺伝子との組合せで使用される。すなわち高ＭＧＩ発現は、放射線治療（例えば術後介入）に対して乳癌患者が応答するかどうかを予測するために使用される。従って本開示は、これらの遺伝子の５つすべての発現を検出することを含み、ここで高ＭＧＩ発現は、放射線治療に対する術後感受性の指標である。非限定例として癌細胞は、対象の癌を診断するのに使用される手術前の病理検査試料からのものでもよい。あるいはこの方法は、放射線療法に対する応答性の予測因子として、５つのＭＧＩ遺伝子の任意のサブセットについて任意の１つの遺伝子まで
測定することを含んでよい。
【００３７】
この方法はさらに、対象が、手術的介入後の放射線療法に応答するかどうかを同定することを含み、場合によりさらに、予測される転帰に対応するために対象の治療法を調整することを含む。非限定例として、放射線療法の適切性を確認するために又はこれを選択するために、術後放射線照射に対する応答性（感受性）の可能性が測定される。別の非限定例として、放射線療法を省略して随時化学療法を採用することの適切性を確認するために又はこれを選択するために、術後放射線照射に対する応答性（感受性）の可能性の低さの測定が行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】パートＡは、非管理主成分分析（unsupervised principle component analysis）により、５遺伝子発現パターンを単一の指標スコア（分子グレード指数又はＭＧＩ）へ組合せることを例示する。ＭＧＩは腫瘍グレードと強く相関する。図１のパートＢは、完全なデータセットのＭＧＩのモデルベースのクラスタリング（clustering）を例示し、自然のカットオフがほぼ０である二峰性分布を与える。このカットポイントは、グレード１とグレード３の腫瘍のほとんどを正確に分類し（８９％の全体的正確性）、グレード２腫瘍を２群に層別した（それぞれ低ＭＧＩ遺伝子と高ＭＧＩ群で５９％と４１％）。グレード２腫瘍対象からの１２年を超える生存確率データを、図１のパートＣ中でＭＧＩ値≦０とＭＧＩ値＞０に基づいてプロットして、ＭＧＩの予後診断能力を示した。
【図２】腫瘍グレード及び臨床転帰との相関についての、ＭＧＩとＧＧＩの比較を示す。パートＡ〜Ｃは、Uppsalaコホートにおける５遺伝子発現パターンとＧＧＩとの比較を示し、パートＤ〜Ｆは、Stockholmコホートに対応する。パートＡとＤは、グレード１腫瘍とグレード３腫瘍を区別するための、ＭＧＩとＧＧＩの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析である。パートＢ〜Ｆは、ＭＧＩ又はＧＧＩ状態（高対低）に従う乳癌特異的死滅の確率を示す、Kaplan-Meier生存曲線を示す。
【図３】TRANSBIGコホートにおける７６遺伝子予後シグネチャ又はＭＧＩのKaplan-Meier生存曲線を示す。パートＡとＢはすべての患者についてである。パートＣとＤは、ＥＲ＋腫瘍グレード１又は２サブグループに対応する。
【図４】ＭＧＨコホートにおけるRT-PCR TaqMan（登録商標）アッセイにより測定されたＭＧＩを示す。パートＡは、ＭＧＩと腫瘍グレードとの相関を示す。パートＢ〜Ｄは、すべての患者（パートＢ）、リンパ節転移陰性患者（パートＣ）、又はリンパ節転移陽性患者（パートＤ）を使用する、ＭＧＩに従う遠隔転移の無い生存のKaplan-Meier解析を示す。
【図５】ＭＧＩ（パートＡ）、Ｈ：Ｉ比（パートＢ）、又はＭＧＨコホートにおけるＭＧＩとＨ：Ｉ比を組合せて作成した３群（低−、中間−、及び高−リスク）（パートＣ）、又はOxfordコホートにおける同じ３つのリスク群の、遠隔転移の無い生存のKaplan-Meier解析を示す。
【図５Ｅ】表１のコホートのＭＧＩとＨ：Ｉ比との相互作用を示す。コホートのリンパ節転移陰性の内分泌療法治療患者、又は内分泌療法＋化学療法治療患者（ｎ＝９３）を、ＭＧＩとＨ：Ｉ比間の相互作用について解析した。ＭＧＩは高ＨＯＸＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ患者の遠隔転移を予測するのに最も確実であり、同様にＨ：Ｉ比は高ＭＧＩ患者で最も確実であった。
【図６】表１のコホートのリンパ節転移陰性の内分泌療法治療患者の、Ｈ：Ｉ比及びＭＧＩと、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２発現（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した）との相関を示す。Ｘ軸は、Ｈ：Ｉ比、ＭＧＩ又はこれらの組合せにより規定される群。Ｙ軸は、記載のＥＲ、ＰＲ、又はＨＥＲ２の相対的発現レベル。
【図７】最後のコホートにおけるＭＧＩとＨ：Ｉ比との相互作用を示す。表１のコホートと同様に、ＭＧＩとＨ：Ｉ比は互いに追加の予後情報を与える。両方の指数で高値を有する腫瘍は、１つのみの高い指数を有するものより、はるかに悪い転帰を引き起こした。
【図８】St. Gallenプロトコールで中間の及び低リスク集団を、高リスク、中間リスク、及び低リスク集団に、より正確に同定するためのＭＧＩの適用を示す。
【図９】ＭＧＩ値２．１の仮定の結果と、５年以内に癌再発が１９％のリスクとのその相関を示す。
【図１０】臨床的治療によるか又はその治療が無い場合のＭＧＩによる患者層別のKaplan-Meier曲線解析を示す。パネルＡは、全身性治療を受けなかった患者の結果を示す。パネルＢは、内分泌療法のみを受けた患者の結果を示す。ＨＲ＝一変量Cox回帰分析からの障害比、そしてｐ値はlog順位検定からである。
【図１１】化学療法に対する感受性についてのＭＧＩの予測能力を示す。
【図１２】更年期前又は更年期後状態によるＭＧＩによる患者層別のKaplan-Meier曲    線解析を示す。パネルＡは、更年期後女性（年齢≧５０）の結果を示す。パネルＢは、更年期前女性（年齢＜５０）の結果を示す。ＨＲ＝一変量Cox回帰分析からの障害比、そしてｐ値はlog順位検定からである。
【００３９】
使用される用語の定義：
遺伝子発現「パターン」又は「プロフィール」又は「シグネチャ」は、以下を区別するとができることに関連している、２つまたはそれ以上の臨床転帰、癌転帰、癌再発、及／又は生存転帰の間の、１つ又はそれ以上の遺伝子の相対的発現を意味する。ある場合、転帰は乳癌の転帰である。
【００４０】
「遺伝子」は、本質がＲＮＡであってもタンパク質性であって、個別の生成物をコードするポリヌクレオチドである。２つ以上のポリヌクレオチドが１つの個別の生成物をコードすることができることは理解されたい。この用語は、同じ生成物をコードする遺伝子、又は染色体位置および正常な有糸分裂中の組換え能力に基づき機能的に関連する（機能の獲得、喪失、調節を含む）その類似体の、対立遺伝子と多型体を含む。
【００４１】
用語「相関する」又は「相関」又はその同等語は、１つ又はそれ以上の遺伝子の発現と、本明細書に記載の方法の使用により同定される１つ又はそれ以上の状態の排除に対する細胞の生理的状態との関連を意味する。遺伝子は高レベルでも又は低レベルでも発現されるが、それでも１つ又はそれ以上の癌状態又は転帰と相関している。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）のポリマー型である。この用語は、分子の一次構造のみに言及する。すなわちこの用語は、２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。これはまた、当該分野で公知の標識物、「キャップ」、類似体による１つ又はそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、及び非荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）のようなヌクレオチド間修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾型を含む公知のタイプの修飾を含む。
【００４３】
用語「増幅する」は、広い意味で、増幅産物の作成がＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に行われることを意味するために使用される。本明細書において「増幅」は一般に、所望の配列、特に試料の配列の複数のコピーを作成するプロセスを意味する。「複数のコピー」は少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は必ずしも、鋳型配列との完全な配列相補性又は同一性を意味しない。
【００４４】
対応するとは、核酸分子が別の核酸分子と多量の配列同一性を共有することを意味する。多量とは、少なくとも９５％、一般的に少なくとも９８％、さらに一般的少なくとも９９％を意味し、配列同一性は、Altschul, S.F.ら、1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して（公表されたデフォールト設定を使用して、すなわちパラメータｗ＝４、ｔ＝１７）決定される。ｍＲＮＡを増幅する方法は一般に当該分野で公知であり、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、米国特許出願第１０／０６２，８５７号（２００１年１０月２５日出願）、ならびに米国仮特許出願第６０／２９８，８４７号（２００１年６月１５日出願）、及び６０／２５７，８０１号（２０００年１２月２２日出願）（これらのすべては参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたものがある。使用される別の方法は、定量ＰＣＲ（又はＱ−ＰＣＲ）である。あるいはＲＮＡは、当該分野で公知の方法により対応するｃＤＮＡとして直接標識される。
【００４５】
「マイクロアレイ」は、好ましくは個別の領域の線状又は２次元アレイであり、それぞれが固体支持体（特に限定されないがガラス、プラスチック、又は合成膜）の表面上に形成された一定の領域を有する。マイクロアレイ上の個別の領域の密度は、単一の固相支持体の表面上で検出される固定化ポリヌクレオチドの総数により決定され、好ましくは少なくとも約５０／cm2、さらに好ましくは少なくとも約１００／cm2、さらに好ましくは少なくとも約５００／cm2であるが、好ましくは約１，０００／cm2未満である。好ましくはアレイは、全部で約５００未満、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、又は約３０００の固定化ポリヌクレオチドを含む。本明細書においてＤＮＡマイクロアレイは、試料からの増幅もしくはクローン化ポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに使用されるチップもしくは他の表面上に置かれた、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのアレイである。アレイ中のプライマーの各特定の群の位置がわかっているため、試料ポリヌクレオチドの本体は、マイクロアレイ中の特定の位置への結合に基づいて決定することができる。
【００４６】
本開示は、過剰発現又は過小発現される遺伝子の同定に依存するため、本開示の１つの実施態様は、同定の遺伝子配列にユニークなポリヌクレオチドへの、試料のｍＲＮＡ又はその増幅もしくはクローン化したもののハイブリダイゼーションにより、発現を測定することを含む。このタイプの好適なポリヌクレオチドは、他の遺伝子配列中では見つからない少なくとも約２０、少なくとも約２２、少なくとも約２４、少なくとも約２６、少なくとも約２８、少なくとも約３０、又は少なくとも約３２の連続した塩基対の遺伝子配列を含有する。前文において用語「約」は、記載の数値からの１の増加又は減少を意味する。さらに好適なものは、他の遺伝子配列中では見つからない少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、又は少なくとも約４００塩基対の遺伝子配列のポリヌクレオチドである。前文で使用される用語「約」は、記載の数値からの１０％の増加又は減少を意味する。このようなポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載の遺伝子の配列又はそのユニークな部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブと呼ばれる。好ましくは配列は、遺伝子にコードされるｍＲＮＡ配列、かかるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列、及び／又はこのような配列の増幅物である。本開示の好適な実施態様において、ポリヌクレオチドプローブは、アレイ上、他の装置上、又はプローブを局在化する個々のスポット上に固定化される。
【００４７】
本開示の別の実施態様において、開示された配列のすべてまたは一部は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びその変法、例えば特に限定されないが、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びリアルタイムＰＣＲ、場合によりリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのような方法により増幅され検出される。このような方法は、開示された配列の一部に相補的な１つまたは２つのプライマーを利用し、ここでプライマーは核酸合成をプライムするのに使用される。新たに合成された核酸は随時標識され、直接検出され、又は本開示のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより検出される。この新たに合成された核酸は、そのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、本開示のポリヌクレオチド（配列を含有する）と接触される。
【００４８】
あるいは、及び本開示の別の実施態様において遺伝子発現は、該細胞試料中の個々の遺伝子産物（タンパク質）の１つ又はそれ以上のエピトープに特異的な１つ又はそれ以上の抗体の使用により、目的の細胞試料中で発現されたタンパク質の分析により測定される。
このような抗体は好ましくは標識されて、遺伝子産物への結合後の容易な検出を可能にする。
【００４９】
用語「標識物」は、標識分子の存在を示す検出可能なシグナルを生成できる組成物を意味する。適切な標識物には、ラジオアイソトープ、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光成分、磁性粒子、生物発光成分などがある。従って標識物は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的手段により検出可能な任意の組成物である。
【００５０】
用語「支持体」は、ビーズ、粒子、ディップスティック、ファイバー、フィルター、膜、及びシランもしくはケイ酸塩支持体（例えばガラススライド）のような通常の支持体を意味する。
【００５１】
本明細書において「癌組織試料：又は「癌細胞試料」は、対応する癌に罹った個体から単離した組織の細胞含有試料を意味する。試料は、手術（例えば生検）により取り出された物質由来でもよい。このような試料は（培養細胞に対して）初代単離物であり、当該分野で認識されている任意の適切な手段により採取される。ある実施態様において「試料」は、特に限定されないが、研磨微細針吸引を含む非侵襲的方法により採取される。
【００５２】
「乳房組織試料」又は「乳房細胞試料」は、乳癌に罹っていることが疑われるか又は発症するリスクのある個体から単離された乳房組織もしくは液体の試料を意味する。このような試料は（培養細胞に対して）初代単離物であり、特に限定されないが、管洗浄、微細針吸引、針生検、米国特許第６，３２８，７０９号に記載された器具や方法、又は当該分野で認識されている任意の他の適切な手段を含む任意の非侵襲的方法により採取される。あるいは「試料」は、特に限定されないが、外科的生検を含む侵襲的方法により採取してもよい。
【００５３】
「発現」及び「遺伝子発現」は、核酸物質の転写及び／又は翻訳を含む。もちろんこの用語は、記載があれば、核酸の転写にのみ関するように限定される。
【００５４】
本明細書において用語「含む（comprising）」及びその同種の用語は、包括的な意味で使用される。すなわち用語「含む（including）」及びその同種の用語と同等である。
【００５５】
ある事象（例えばハイブリダイゼーション、鎖の伸長など）が起きることを「可能にする」条件、又はある事象が起きるのに「適した」条件は、そのような事象が起きることを妨害しない条件である。すなわちこれらの条件は、その事象を可能にする増強する、促進する、又は誘導する。当該分野で公知であり本明細書に記載のそのような条件は、例えばヌクレオチド配列の性質、温度、及び緩衝液条件に依存する。これらの条件はまた、どの事象（例えばハイブリダイゼーション、切断、鎖の伸長又は転写）が所望であるかに依存する。
【００５６】
本明細書において配列の「変異」は、参照配列と比較して、目的の本明細書に開示の遺伝子配列の配列変化を意味する。配列の変異には、置換、欠失、又は挿入などによる、単一ヌクレオチド変化、又は配列中の２つ以上のヌクレオチドの変化を含む。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）はまた、本明細書において配列変異である。本開示は、遺伝子発現の相対的レベルに基づくため、本明細書に開示の遺伝子の非コード領域の変異もまた、本開示の実施において測定される。
【００５７】
「検出」は、遺伝子発現及びその変化の直接及び間接的検出を含む任意の検出手段を含む。例えば「検出可能に少ない」生成物が直接または間接に観察されることがあり、この用語は任意の低下（検出可能なシグナルの欠如を含む）を示す。同様に「検出可能に多い」生成物は、直接にまたは間接に観察されても、任意の上昇を意味する。
【００５８】
開示された配列の発現の上昇及び低下は、正常な細胞中の発現に対してパーセント変化又は倍変化に基づいて、以下の用語で定義される。上昇は、正常な細胞中の発現レベルに対して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、又は２００％の上昇でもよい。あるいは倍数上昇は、正常な細胞中の発現レベルに対して、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０倍の上昇でもよい。低下は、正常な細胞中の発現レベルに対して、１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、９９、又は１００％の低下でもよい。
【００５９】
特に明記しない場合は、本明細書においてすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００６０】
総論
本開示において、データ主導及び情報主導のアプローチにより、５遺伝子腫瘍グレードシグネチャ（ＭＧＩ）が開発され、強固なＲＴ−ＰＣＲアッセイで実施された。ＭＧＩの１つの重要な特徴は、その計算が臨床転帰について行われる複雑な重み付けを含まないことである。その代わりにこれは、腫瘍グレードの分子的相関物であり、ここからその予後診断能力を得る（いわゆる「ボトムアップ」アプローチ）。組織学的腫瘍グレードに対するＭＧＩの利点は２つある。第１にＣＧＩと同様に、これはグレード２腫瘍をグレード１様又はグレード３様に分類し、病理的腫瘍グレード分類の曖昧さのほとんどを排除する。第２に、ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイは臨床検査室で標準化できるため、これはまた主観を排除し、病理的分類に伴う観察者間／内の変動を排除する。
【００６１】
開示された結果はまた、ＭＧＩの予後診断正確性が、Ｈ：Ｉ比を考慮することによっても増強され、その逆も真であることを示し、患者を３つのリスク群に層別する簡単なアルゴリズムであることを示唆する。Ｈ：Ｉ比はＭＧＩと異なり、エストロゲンシグナル伝達に関連するという観察結果により示唆されるように、ＭＧＩとＨ：Ｉ比は、乳癌における２つの異なる予後診断モジュールのようである。
【００６２】
これらの予後診断能力以外に、ＭＧＩとＨ：Ｉ比はまた、それぞれ化学療法や内分泌療法の治療効果の予測因子候補である。高腫瘍グレード又は分裂指数は、リンパ節転移陰性の乳癌患者の化学療法の効果を予測する。同様に再発スコアアルゴリズムにおける遺伝子の増殖群は、ＥＲ＋リンパ節転移陰性患者における化学療法の効果を予測することが証明されている。実際高ＭＧＩは、術前パクリタキセルと次に５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、及びシクロホスファミドで治療されたＥＲ＋乳癌患者における完全な病理的応答を予測する。
【００６３】
２つの最近のＨ：Ｉ比研究は、エストロゲンやプロゲステロン受容体を超える内分泌応答性の新規バイオマーカーとしての可能性を証明した。再発性乳癌の研究では、低Ｈ：Ｉは一次タモキシフェン療法に対する応答に強く関連していた。同様に２年間と５年間のタモキシフェン療法を比較する前向き無作為試験からの腫瘍試料の分析では、低ＨＯＸＢ１３又は低Ｈ：Ｉ比は、長期タモキシフェン療法の効果を有意に予測した。これらの結果は、エストロゲンがＨＯＸＢ１３を負に制御し、ＩＬ１７ＢＲ発現を正に制御するという観察結果と一致する。すなわちＥＲ＋腫瘍では、高ＨＯＸＢ１３又はＨ：Ｉ比は、機能不全エストロゲンシグナル伝達のマーカーと見なすことができる。
【００６４】
ＭＧＩとＨ：Ｉ比の二重の役割は、早期乳癌の治療法選択のための最近（２００５）のSt. Gallen合意ガイドラインの文脈に特に関係する。St. Gallenガイドラインは、ＥＲ＋リンパ節転移陰性乳癌患者を低リスク群と中間リスク群に分類し、大部分は後者に分類される。重要な治療法決定は、中間リスク群の患者の一部について化学療法を控えるかどうかであり、これは２つの新しい前向き臨床治験の対象とされている問題である。本明細書に記載の表１のコホートでは、St. Gallenガイドラインを適用すると、８６％の患者が中間リスク群に分類され、これは、ＭＧＩとＨ：Ｉ比を使用して低（４３％）、中間（２６％）、又は高（３１％）リスクに分類することができた。
【００６５】
低リスク患者の優れた無病生存確率は、彼らが毒性の高い化学療法を受けなくても予後を悪くしない可能性があり、一方高リスク群にはより強力な化学療法処方もしくは新しい治療薬が加えるべきであることを示唆する。従ってＭＧＩとＨ：Ｉ比及びその各予測能力に基づくリスクの層別が既存のガイドラインに加えて、現在の治療法のリスク−効果比のバランスを改良できるであろう。
【００６６】
すなわち本開示は、ＥＲ＋乳癌の強力予後診断因子として、認証されたＭＧＩを含む。さらにＭＧＩとＨ：Ｉ比は一緒になって、それぞれ単独よりも正確な予後情報を提供することができる。これらの２つのバイオマーカーを使用して、転帰の悪い患者のサブセットを同定することは、高ＭＧＩと高Ｈ：Ｉ比の両方を用いて癌患者を標的とする臨床治験の計画を促進する。
【００６７】
ＭＧＩ
特定の腫瘍グレードに相関して発現される開示された遺伝子は、互いに、特定の予後又は臨床転帰を有する可能性のある対象を同定する能力に寄与する遺伝子にのみに、遺伝子発現分析を集中させる能力を提供する。癌細胞中の他の遺伝子の発現は、これらの区別についての情報を与えることができず、従ってあまりこれらの補助にならないであろう。
【００６８】
本開示の実施において遺伝子の発現レベルを測定するために、当該分野で公知の任意の方法が使用される。ある実施態様では、本明細書で同定され開示される遺伝子にハイブリダイズするＲＮＡの検出に基づく発現が使用される。これは、任意のＲＮＡ検出法又は当該分野で同等であると認識されている増幅＋検出法、例えば特に限定されないが、逆転写ＰＣＲ、米国特許出願第１０／０６２，８５７号（２００１年１０月２５日出願）、ならびに米国仮特許出願第６０／２９８，８４７号（２００１年６月１５日出願）、及び６０／２５７，８０１号（２０００年１２月２２日出願）に開示された方法、及びＲＮＡ安定化もしくは不安定化配列の有無を検出する方法により、容易に行われる。
【００６９】
あるいはＤＮＡ状態の検出に基づく発現が使用される。メチル化されか又は欠失しているとして同定された遺伝子のＤＮＡの検出は、発現が低下している遺伝子について使用される。これは、当該分野で公知の方法に基づくＰＣＲ（特に限定されないがＱ−ＰＣＲを含む）により容易に行われる。逆に増幅されているとして同定された遺伝子のＤＮＡの検出は、特定の乳癌転帰に相関して発現が上昇している遺伝子について使用される。これは、ＰＣＲベースの、当該分野で公知の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ（ＦＩＳＨ）及び染色体インサイチューハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）により容易に行われる。
【００７０】
タンパク質レベルもしくは活性の存在、上昇、又は低下の検出に基づく発現もまた使用される。検出は、タンパク質の検出について当該分野で公知であり適切であると認識されている免疫組織化学試験（ＩＨＣ）、血液（特に分泌されたタンパク質について）、抗体（タンパク質に対する自己抗体を含む）、剥離細胞（癌から）、質量スペクトル、及び画像（標識リガンドの使用を含む）、に基づく方法により行われる。抗体に基づく方法と画像に基づく方法は、非侵襲的方法（例えば、管洗浄又は微細針吸引）により得られた細胞（ここで癌細胞の起源は不明である）の使用による癌の測定後の腫瘍の局在化に、さらに有用である。標識抗体又はリガンドは、患者内の癌を局在化するのに使用される。
【００７１】
発現を測定するのに核酸ベースのアッセイを使用する１つの実施態様は、固体支持体（特に限定されないが、当該分野で公知のアレイとしての固体基質、ビーズ、又はビーズに基づく方法を含む）上で同定される遺伝子の１つ又はそれ以上の配列の固定化により行われる。あるいは当該分野で公知の溶液ベースの発現アッセイも使用される。
【００７２】
固定化された遺伝子は、ポリヌクレオチドが、遺伝子に対応するＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズすることができるように、遺伝子にユニークな又は特異的なポリヌクレオチドの形でもよい。これらのポリヌクレオチドは、遺伝子に対応するＤＮＡ又はＲＮＡとのハイブリダイゼーションが影響を受けないように、場合により妨害（例えば、ミスマッチ又は挿入された非相補的塩基対による）が最小である完全長の遺伝子又は遺伝子の短い配列（配列の５’末端又は３’末端からの欠失により、当該分野で公知の完全長配列より１ヌクレオチド短いものまで）でもよい。ある場合には、使用されるポリヌクレオチドは遺伝子の３’末端からであり、例えば遺伝子又は発現される配列のポリアデニル化シグナル又はポリアデニル化部位から約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１００、又は約５０ヌクレオチド以内である。ポリヌクレオチドに変異が存在してもハイブリダイゼーションにより検出可能なシグナルが生成されるなら、開示された遺伝子と比較して変異を含有するポリヌクレオチドも使用される。
【００７３】
試料の対象（例えば、そこから試料が得られる患者）の転帰が不明な癌細胞又は乳房細胞から調製される核酸試料の状態を測定するために、又は試料の対象にすでに割り当てられている転帰の確認のために、固定化遺伝子が使用される。本開示を特に限定するものではないが、このような細胞はＥＲ＋乳癌患者由来でもよい。固定化ポリヌクレオチドは、試料から得られる対応する核酸分子に、適切な条件下で特異的にハイブリダイズするのに充分であることのみが必要である。
【００７４】
本開示は、一部は臨床転帰と腫瘍グレードの、遺伝子発現ベースの予後診断因子及び予測因子の発見に基づき、例えばＦＦＰＥ組織、凍結試料、又は新鮮な試料からの癌試料を利用する。これらの遺伝子の発現レベルは、本明細書に記載の腫瘍グレードと臨床転帰に相関し、ならびに対象の予後を決定する。同定された遺伝子は、細胞サイクル中で役割を有し、以下のように報告されたピーク発現を有する：
【００７５】
遺伝子          発現ピーク    細胞サイクル中の役割
ＢＵＢ１Ｂ      Ｇ２／Ｍ      分裂紡錘体集合チェックポイント
ＣＥＮＰＡ      Ｇ２／Ｍ      動原体の集合
ＮＥＫ２        Ｇ２／Ｍ      動原体の複製
ＲＡＣＧＡＰ１  未測定        細胞質分裂の開始
ＲＲＭ２        Ｓ            ＤＮＡ複製
【００７６】
これらの遺伝子の配列はすでに報告されており、この分野で解析されている。例えばヒトＢＵＢ１Ｂ遺伝子はUnigene Ｈｓ．６３１６９９により同定され、これは、２００７年９月６日に２７３個の対応する配列により解析された。
【００７７】
またこの日に、ヒトＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２遺伝子が、それぞれＨｓ．１５９４（１２９個の対応配列を用いて）、Ｈｓ．１５３７０４（２２１個の対応配列を用いて）、Ｈｓ．６９６３１９（３４９個の対応配列を用いて）、及びＨｓ．２２６３９０（１３４８個の対応配列を用いて）により同定される。Unigene識別子のそれぞれに対応する配列は、本発明にあたかも完全に記載され、当業者により適切であるとして本開示で使用されているように、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７８】
Unigene Ｈｓ．６３１６９９により同定される１２個の代表的ＢＵＢ１Ｂ  ｍＲＮＡ配列のうちの２つは、配列リストに開示される；Ｈｓ．１５９４により同定される１１個の代表的ＣＥＮＰＡ  ｍＲＮＡ配列のうちの２つは、配列リストに開示される；Ｈｓ．１５７０４により同定される１７個の代表的ＮＥＫ２  ｍＲＮＡ配列のうちの２つは、配列リストに開示される；Ｈｓ．６９６３１９により同定される１５個の代表的ＲＡＣＧＡＰ１  ｍＲＮＡ配列のうちの２つは、配列リストに開示される；Ｈｓ．２２６３９０により同定される２４個の代表的ＲＲＭ２  ｍＲＮＡ配列のうちの２つは、配列リストに開示される。リストに開示される配列は、開示された発明の実施を限定するものではないが、開示された遺伝子である配列に関する分野の重要な情報証拠として提供される。さらに当業者は、これらの遺伝子のそれぞれについて２つまたはそれ以上の公知の配列を整列させて、これらの遺伝子のそれぞれを同定する領域として同一性又は保存された変化の領域を同定することができる。
【００７９】
同じ遺伝子の配列はまた、他の動物種から同定され解析されている。すなわち当業者は、他の動物の遺伝子に対して開示された遺伝子の同定法を明らかに理解している。当業者はまた、異なる動物源からの開示された遺伝子の公知の配列を随時比較して、保存された領域と、他の遺伝子に比較してこれらの遺伝子にユニークな配列とを同定してもよい。
【００８０】
同様に本明細書に記載のＳＴＫ１５、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、及びＭＹＢＬ２の使用は、これらの遺伝子と、当業者に公知のこれらの遺伝子のそれぞれの代表的配列についての以前の報告により支持される。
【００８１】
当業者には理解されるように、上記の対応する配列のいくつかは、開示された配列の独自性には寄与しない３’ポリＡ（又は相補鎖上のポリＴ）ストレッチを含まない。従ってこの開示は、３’ポリＡ（又はポリＴ）ストレッチが欠如した配列を用いて行われる。開示された配列の独自性は、開示された遺伝子の核酸中にのみ見つかる配列の一部又はすべて（遺伝子の３’非翻訳部分に存在するユニークな配列を含む）を意味する。本開示の実施に好適なユニークな配列は、ユニークな配列が、一部の個体中に存在する多型に対して特異的であるより、種々の個体中の発現を検出するのに有用であるように、３つのセットのそれぞれについてコンセンサス配列に寄与するものである。あるいは個体又は亜集団にユニークな配列が使用される。好適なユニークな配列は、好ましくは本明細書の開示のポリヌクレオチドの長さの配列である。
【００８２】
本開示の実施において上記配列の（上昇又は低下した）発現レベルを測定するために、当該分野で公知の任意の方法が使用される。本開示のある実施態様において、上記配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズするＲＮＡの検出に基づく発現が使用される。これは、ＲＮＡ検出法又は当該分野で同等であると認識されている増幅＋検出法、例えば特に限定されないが、逆転写ＰＣＲ、米国特許出願第１０／０６２，８５７号（標題「核酸増幅」、２００１年１０月２５日出願）、ならびに米国仮特許出願第６０／２９８，８４７号（２００１年６月１５日出願）、及び６０／２５７，８０１号（２０００年１２月２２日出願）に開示された方法、米国特許第６，２９１，１７０号に開示された方法、及び定量的ＰＣＲにより容易に行われる。上昇したＲＮＡ安定性（発現上昇が観察される）又は低下したＲＮＡ安定性（発現低下が観察される）を同定するための方法も使用される。これらの方法は、遺伝子の配列を含むｍＲＮＡの安定性を上昇又は低下させる配列の検出を含む。これらの方法はまた、上昇したｍＲＮＡ分解の検出も含む。
【００８３】
本開示のある実施態様において、上記開示配列の３’非翻訳領域及び／又は非コード領域中に存在する配列を有するポリヌクレオチドは、癌細胞又は乳房細胞中の遺伝子配列の発現レベルを検出するのに使用される。そのようなポリヌクレオチドは、上記開示配列のコード領域の３’部分に存在する配列を随時含有する。コード領域及び３’非コード領域からの配列の組合せを含むポリヌクレオチドは好ましくは、異種配列が介在することなく連続的に配置された配列を有する。
【００８４】
あるいは本開示は、癌細胞又は乳房細胞中の遺伝子配列の５’非翻訳領域及び／又は非コード領域中に存在する配列を有するポリヌクレオチドを用いて、これらの発現レベルを検出するために行われる。そのようなポリヌクレオチドは、コード領域の５’部分に存在する配列を随時含有する。コード領域及び５’非コード領域からの配列の組合せを含むポリヌクレオチドは好ましくは、異種配列が介在することなく連続的に配置された配列を有する。本開示はまた、開示された遺伝子配列のコード領域中に存在する配列を用いて行われる。
【００８５】
非限定性のポリヌクレオチドは、少なくとも約２０、少なくとも約２２、少なくとも約２４、少なくとも約２６、少なくとも約２８、少なくとも約３０、少なくとも約３２、少なくとも約３４、少なくとも約３６、少なくとも約３８、少なくとも約４０、少なくとも約４２、少なくとも約４４、又は少なくとも約４６個の連続ヌクレオチドの３’又は５’非翻訳領域及び／又は非コード領域からの配列を含む。前文において用語「約」は、記載の数値からの１の増加又は減少を意味する。さらに好適なものは、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、又は少なくとも約４００個の連続ヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドである。前文において用語「約」は、記載の数値からの１０％の上昇又は減少を意味する。
【００８６】
本開示のポリヌクレオチド中に存在する上記コード領域の３’末端又は５’末端からの配列は、これらがコード領域の長さにより自然に限定される場合を除いて、上記したものと同じ長さである。コード領域の３’末端は、コード領域の３’側の半分までの配列を含んでよい。逆に、コード領域の５’末端は、コード領域の５’側の半分までの配列を含んでよい。もちろん上記配列又はコード領域、及びこれらの一部を含むポリヌクレオチドは、これらを完全に使用することができる。
【００８７】
３’非翻訳領域及び／又は非コード領域からの配列とコード領域の関連する３’末端とを組合せたポリヌクレオチドは、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、又は少なくとも約４００個の連続ヌクレオチドでもよい。好ましくは使用されるポリヌクレオチドは、遺伝子の３’末端からであり、例えば遺伝子又は発現される配列のポリアデニル化シグナル又はポリアデニル化部位から、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１００、又は約５０ヌクレオチド以内である。開示された遺伝子の配列に対して変異を含むポリヌクレオチドもまた、変異が存在しても、ハイブリダイゼーションが検出可能なシグナルを生成することができるなら、使用可能である。
【００８８】
本開示の別の実施態様において、上記開示配列の５’末端及び／又は３’末端からのヌクレオチドの欠失を含むポリヌクレオチドが使用される。欠失は、好ましくは、５’末端及び／又は３’末端から、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０、１５０〜１７５、又は１７５〜２００ヌクレオチドであるが、欠失の程度は、開示された配列の長さと、発現レベルの検出のためにポリヌクレオチドを使用できる必要性により当然限定される。
【００８９】
上記の開示された配列の３’末端からの本開示の他のポリヌクレオチドには、定量的ＰＣＲのためのプライマー及び随時のプローブのポリヌクレオチドがある。ある実施態様においてプライマーとプローブは、遺伝子又は発現される配列のポリアデニル化シグナル又はポリアデニル化部位から、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２５０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、又は約５０ヌクレオチド未満の領域を増幅するものである。
【００９０】
本開示のさらに別の実施態様において、３’末端を含む上記開示配列の一部を含むポリヌクレオチドが使用される。このようなポリヌクレオチドは、開示配列の３’末端から、少なくとも又は約５０、少なくとも又は約１００、少なくとも又は約１５０、少なくとも又は約２００、少なくとも又は約２５０、少なくとも又は約３００、少なくとも又は約３５０、又は少なくとも又は約４００個の連続ヌクレオチドを含有する。
【００９１】
本開示はまた、乳房細胞中の遺伝子発現を検出するのに使用されるポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドは、上記遺伝子中に存在する配列からなるより短いポリヌクレオチドを、自然には組合せでは存在しない異種配列と組合せて含んでよい。非限定例には、クローニングベクターからの、又は本明細書に記載の標識プローブもしくはプライマーを調製するのに使用される制限断片中に存在する短い配列を含む。
【００９２】
方法
本明細書において本開示は、その発現が癌に関する予後情報を提供するのに使用できる遺伝子の本体を含む。特にこれらの遺伝子の発現レベルは、乳癌に関連して使用される。ある方法において遺伝子発現プロフィールは、良好な又は悪い癌再発及び／又は生存転帰を有する患者と相関する（従って、患者を区別できる）。別の実施態様において本開示は、患者からの癌細胞試料中の遺伝子発現を遺伝子発現プロフィールと比較して、介入の無い場合の患者の臨床転帰もしくは治療転帰、又は自然の生物学的転帰を決定する方法を含む。本開示のこれらの実施態様は、患者があるタイプの治療法から利益を受ける可能性があるか、又は患者が別のタイプの治療法が有益であるかを予測する能力についての重要なまだ満たされていない診断ニーズを満たすのに有利に使用される。例えば低いＨ：Ｉ比は、一次タモキシフェン療法への応答と強く関連している。２年間対５年間のタモキシフェン療法を比較する前向き無作為臨床治験からの腫瘍試料の分析は、低ＨＯＸＢ１３又は低ＨＯＸＢ１３：ＩＬ１７ＢＲは、長期タモキシフェン療法からの効果を有意に予測する。
【００９３】
同様にグレードＩ対グレードIIIの腫瘍の存在を予測するＭＧＩの能力は、関連分野の臨床家が、これらの２つのグレードの癌に適切な治療法を選択することを可能にする。ＭＧＩは、他の手段により行われたグレードＩとグレードIII分類を確認するのみでなく、これはＨ：Ｉ比と組合せて、他の方法により不正確に分類されていた腫瘍を低リスク、中間リスク、又は高リスクとして正確に分類することができる。これは図８に示され、ここで、2005 St. Gallenプロトコールに基づく層別は、開示されたＭＧＩとＨ：Ｉ比の使用により大きく補正される。
【００９４】
従って本開示は、癌細胞を有する患者集団から、予後が良好な患者の亜集団又は予後が悪い患者の亜集団に属するとして、患者を同定する方法を含む。予後の良好な亜集団は、グレードＩ腫瘍を有するとして同定される対象と同様であることと比較して、予後の悪い患者の亜集団は、グレードIII腫瘍を有するとして同定される対象と同様である。もちろん開示された方法はその応用において必ずしも完全ではなく、ある患者はグレードＩとグレードIIIの間の「中間の」腫瘍グレードを有するとして同定されるであろう。この場合、熟練した医師は対象を適切に治療するであろう。
【００９５】
しかし本開示は、グレードＩ、中間、又はグレードIIIの腫瘍を有する患者の同定のための非主観的手段を与え、この同定は、熟練医師が患者の利益になるように使用することができる。重要なことは、開示された方法は、他の方法による「中間」グレードの腫瘍をグレードＩ又はグレードIII状態に分類することができることである。これは、（「中間」グレード腫瘍を有するとして治療されていた）対応する患者亜集団にとって大きな利益である。すなわちある実施態様において、「中間」グレード分類の数を減少させる方法が、開示された５遺伝子ＭＧＩの使用により提供される。
【００９６】
すなわち本開示は、本明細書に開示の発現パターンを測定することにより、予後及び／又は生存転帰を測定する方法を含む。従って癌患者の予後及び／又は治療法を決定するのに以前は主観的解釈が使用されていたが、本開示は、客観的遺伝子発現パターンを与え、これは、単独で又は主観的基準と組合せて使用されて、患者の転帰（生存及び癌再発を含む）のより正確な評価を与える。ある場合にこの測定は、Ｂｕｂ１Ｂの発現レベルの検出を含む（ここで発現レベルはグレードＩ又はグレードIII腫瘍と相関する）。
【００９７】
開示された遺伝子は、腫瘍グレード及び臨床転帰と相関するとして同定され、従ってその発現レベルは、患者の治療プロトコールの決定に関係する。従ってある実施態様において本開示は、本明細書に記載の発現レベルについて患者からの癌細胞試料を測定して腫瘍グレードを決定し、かかるグレードの腫瘍を有する患者の治療法を選択することにより、該患者の予後を決定することにより、癌患者の治療法を決定する方法を提供する。ある場合にはこの測定は、Ｂｕｂ１Ｂの発現レベルの検出を含む（ここで発現レベルはグレードＩ又はグレードIII腫瘍と相関する）。
【００９８】
ある実施態様のセットで本開示の方法は、Ｂｕｂ１Ｂの発現レベルについて癌に罹った対象からの癌細胞試料を測定することを含み、ここで発現レベルは、癌をグレードＩ又はグレードIII腫瘍に対応するとして分類するか、又は対象を、癌再発の可能性の予後を有するとして同定するか、内分泌療法、化学療法、又は放射線療法に対する対象の応答性を予測する。この測定は、本明細書に記載の又は当業者に公知の適切な手段で、遺伝子の発現レベルを測定又は検出又は決定することを含む。多くの場合、癌は乳癌であり、対象はヒト患者である。さらに癌細胞は、腫瘍及び／又はリンパ節転移陰性（癌についてリンパ節転移陰性）もしくはリンパ節転移陽性（癌についてリンパ節転移陽性）の対象からのものでもよい。
【００９９】
もちろん本方法は、ＭＧＩの他の４つの遺伝子の１つ又はそれ以上の発現の測定とともに行われ、ここで組合せて使用される遺伝子の発現レベルは、本方法により提供されるように分類、同定、又は予測に使用される。発現レベルの必要なレベルは、使用される遺伝子について本明細書に記載の方法により同定されるものでもよい。さらに測定は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で又は本明細書に記載の他の分析法で随時使用される試料からのＲＮＡの調製を含む。ＰＣＲ法は、随時ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）でも定量的ＰＣＲ（例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）でもよい。あるいは測定は、関連分野で公知のアレイ（例えばマイクロアレイ）の使用により行われる。場合により癌細胞の試料は、該対象から取り出されたか又は得られた組織から分離される。本明細書において種々のタイプの試料が使用され、非限定例としてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料がある。本明細書において本方法は、本明細書に開示の試料中のＨ：Ｉ比（ＨＯＸＢ１３とＩＬ１７ＢＲ発現レベルの比）を測定又は決定することを含む。
【０１００】
非限定例においてＭＧＩのすべての５つの遺伝子が測定され、本明細書に記載のように、ＭＧＩについて「高リスク」（カットオフより上）である値に対応する発現レベルを検出するのに、又はＭＧＩについて「低リスク」（カットオフより下）である値に対応する発現レベルを検出するのに使用される。ある場合には、ＭＧＩカットオフ閾値は０（ゼロ）であり、ここで、発現レベルの測定値は０（ゼロ）で標準偏差が１に標準化される。別の実施態様においてカットオフは、ちょうどもしくはほぼ０．０５、ちょうどもしくはほぼ０．１０、ちょうどもしくはほぼ０．１５、ちょうどもしくはほぼ０．２０、ちょうどもしくはほぼ０．２５、ちょうどもしくはほぼ−０．０５、ちょうどもしくはほぼ−０．１０、ちょうどもしくはほぼ−０．１５、ちょうどもしくはほぼ−０．２０、ちょうどもしくはほぼ−０．２５、ちょうどもしくはほぼ−０．３０、ちょうどもしくはほぼ−０．３５、ちょうどもしくはほぼ−０．４０、ちょうどもしくはほぼ−０．４５、ちょうどもしくはほぼ−０．５０、ちょうどもしくはほぼ−０．５５、ちょうどもしくはほぼ−０．６０、ちょうどもしくはほぼ−０．６５、ちょうどもしくはほぼ−０．７０、ちょうどもしくはほぼ−０．８０、ちょうどもしくはほぼ−０．８５、ちょうどもしくはほぼ−０．９０、ちょうどもしくはほぼ−０．９５、ちょうどもしくはほぼ−１．０、ちょうどもしくはほぼ−１．１、ちょうどもしくはほぼ−１．２、ちょうどもしくはほぼ−１．３、ちょうどもしくはほぼ−１．４、ちょうどもしくはほぼ−１．５、ちょうどもしくはほぼ−１．６、ちょうどもしくはほぼ−１．７、ちょうどもしくはほぼ−１．８、ちょうどもしくはほぼ−１．９、又はちょうどもしくはほぼ−２．０、又はそれ以下でもよい。Ｈ：Ｉ比について、その測定は本明細書で参照されるMa et al. (2004)とMa et al. (2006)に記載されたように行われる。例えば０．０６の値は、試料が「高リスク」（＞０．０６）、又は「低リスク」（≦０．０６）Ｈ：Ｉ比を有するかどうかを測定するのに使用される。
【０１０１】
閾値又はカットオフの０（ゼロ）をすべての５つの遺伝子のＭＧＩについての非限定例として使用することにより、開示された方法は、ある試料について２つの測定結果を与える：０（ゼロ）より大きい値に対応する「高リスクＭＧＩ」と値≦０に対応する「低リスクＭＧＩ」。「高リスクＭＧＩ」は「高リスク」癌（乳癌を含む）を示し、これは当該分野で公知の方法と基準により規定されるグレードIIIの癌と同様である。「低リスクＭＧＩ」は「低リスク」癌（乳癌を含む）を示し、これは当該分野で公知の方法と基準により規定されるグレードＩの癌と同様である。
【０１０２】
２つの群への癌の層別又は分類は、図１のパネルＣと図４のパネルＢに示され、ここで「高リスクＭＧＩ」により同定されるリスクレベルは、癌再発の可能性が高いこと（例えば、癌転移、又は乳癌の再発を含む遠隔転移）を示す。多くの実施態様において、タモキシフェン又は他の内分泌療法が有るか無いかの治療に関係なく、この再発のリスクは存在する。本明細書に開示の実施態様において、再発はＤＣＩＳの局所的再発でもよい。「低リスクＭＧＩ」により同定されるリスクレベルは、癌再発の可能性が低いこと（乳癌再発の可能性が低いことを含む）を示す。多くの実施態様において、タモキシフェンが有るか無いかの治療に関係なく、この低下リスクは存在する。再発リスク又は再発の可能性の無いことは、経時的なリスクと見なされる（例えば、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年又はそれ以上の期間）。従ってＭＧＩにより与えられるリスク評価は、対象について癌再発及び／又は生存転帰の予後診断指標として使用される。
【０１０３】
本開示はさらに、本明細書に記載の方法により測定される再発リスクに対して、ＭＧＩ値に基づく経時的な再発の測定を含む。図９は、ＭＧＩ値２．１の非限定例と、５年以内の癌再発の１９％リスクの指標を示す。この図はさらに、再発リスクがＭＧＩの値に関連すること、及び閾値又はカットオフ値として０（ゼロ）の選択は、他の値も使用されるため、非限定的であることを示す。
【０１０４】
Ｈ：Ｉ比と組合せると、４つの可能なアッセイ結果は以下の通りである：
１）「高リスクＭＧＩ」と「高リスクＨ：Ｉ」、これは「高リスクＭＧＩ」単独のように「高リスク」と見なされる；
２）「高リスクＭＧＩ」と「低リスクＨ：Ｉ」、これは癌再発の「中間リスク」と同様と見なされる；  ３）「低リスクＭＧＩ」と「高リスクＨ：Ｉ」、これは「低リスクＭＧＩ」単独のよう
に「低リスク」と見なされる；及び
４）「低リスクＭＧＩ」と「低リスクＨ：Ｉ」、これは「低リスクＭＧＩ」単独のように「低リスク」と同様と見なされる；
【０１０５】
従ってＭＧＩとＨ：Ｉの組合せは、その腫瘍生物学が異なり、異なる患者転帰を引き起こすことが観察されている３つの異なるサブタイプを同定する。例えば患者が利益を受けるであろうという予測に基づいて、腫瘍患者を内分泌療法（例えば非限定例としてタモキシフェン）で治療するのに、中間リスクが使用される。これに対して「高リスクＭＧＩ」及び「高リスクＨ：Ｉ」の患者は、内分泌単独療法から利益を受ける可能性は低い。従ってこの評価は、リスクの単純な連続ではない。この評価は、治療法選択にあたって有用な基礎となる生物学を特定するため、熟練臨床家の助けになる。治療法を選択するために臨床家は、患者が高リスク（すなわち高／高）である時、この患者が内分泌単独療法により利益を受けない可能性があることを知ることは必須情報であると、決定できる。これは臨床家が、より積極的な治療を考慮及び／又は選択又は適用することを可能にするか、又はこの患者が内分泌単独療法に抵抗性の腫瘍を標的とする試験に参加することを示唆する。図５のパネルＣとＤは、異なる患者集団中のこれらの３つのリスク群の応用を証明する。あるいは、これらのＭＧＩとＨ：Ｉ測定値の可能な組合せは、上記したＭＧＩ単独の使用と同じように指標として使用される。
【０１０６】
タモキシフェンによる治療にもかかわらず再発のリスクを示すＭＧＩの能力はまた、図１０のパネルＡとＢに示され、ここで「高リスク」ＭＧＩは、単独療法としてのタモキシフェンによる治療にもかかわらず再発の指標として使用される。もちろんＭＧＩとＨ：Ｉ測定値の組合せも、この目的に使用される。本開示はさらに、本明細書に記載の内分泌抵抗性癌を標的とするインヒビターに対する応答性を予測するために、ＭＧＩ単独、Ｈ：Ｉ単独、又はＭＧＩとＨ：Ｉとの組合せの使用を含む。内分泌療法に対する非応答性と、開示されたインヒビターに対する応答性の可能な指標は、開示方法により測定される予後診断及び予測指標に基づく治療法を選択するための方法である、本開示の別の態様と組合せてもよい。従って上記した「高リスクＭＧＩ」、「高リスク」Ｈ：Ｉ、又はＭＧＩとＨ：Ｉ測定値の組合せにおいて、本開示の実施態様は、タモキシフェン又は他の型の内分泌療法に対する応答性を改善するためのインヒビターで対象を選択し随時治療することをさらに含む方法を含む。ある場合には本方法は、タモキシフェン又は他の型の内分泌療法による治療をさらに含む。内分泌抵抗性癌を標的とするインヒビターに対する応答性に関連する上記記載はまた、本明細書に記載のＨ：Ｉ比単独について測定する場合にも適用される。
【０１０７】
本開示はさらに、他の型の内分泌療法（例えば、ＳＥＲＭ、ＳＥＲＤ、又はＡＩによる治療）に対する非応答性の指標として、随時Ｈ：Ｉ測定とともに「高リスク」ＭＧＩについて測定することを含む。もちろん本開示はまた、タモキシフェン及び他のＳＥＲＭならびにＳＥＲＤ又はＡＩに対する応答性の指標として、随時Ｈ：Ｉ測定とともに「低リスク」ＭＧＩについて測定することを含む。
【０１０８】
内分泌療法に対してこれらの可能な予測はまた、本明細書に開示の治療法を選択する方法に関連して使用される。例えば方法は、内分泌療法ではない化学療法及び／又は放射線療法（ここで応答の欠如が予測される）のような他の治療法を含んでよい。逆にこの方法は、応答が予測される場合、内分泌療法の選択を含む。
【０１０９】
さらなる実施態様において、「高リスク」ＭＧＩ、「高リスク」Ｈ：Ｉ、又はＭＧＩとＨ：Ｉ値の組合せについてのアッセイはまた、内分泌療法内の相対的応答性（例えば、ＳＥＲＭと比較してＡＩによる治療に対する良好な応答性）の指標として使用される。非限定例として、「高リスク」ＭＧＩ値は、タモキシフェンと比較してＡＩ（例えば、レトロゾール）に対する応答性の指標として使用される。もちろん本開示はさらに、このような予測に基づくＡＩによる治療法を選択する方法を含む。
【０１１０】
内分泌療法以外に、ＭＧＩ単独、Ｈ：Ｉ単独、又はＭＧＩとＨ：Ｉ測定値の組合せはまた、化学療法に対する非応答性を示すのに使用される。図１１に示すように、「高リスク」ＭＧＩは、非限定例としてパクリタキセル、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、及びシクロホスファミドを用いる化学療法に対する抵抗性を予測する。もちろん本開示はさらに、単独療法として化学療法を選択しないで、非限定例として他の治療法（例えば放射線療法）を選択する方法を含む。
【０１１１】
内分泌療法や化学療法以外に、本開示は、放射線治療に対する癌の応答性の予測因子として、ＭＧＩ単独、Ｈ：Ｉ単独、又はＭＧＩとＨ：Ｉ測定値の組合せを含む。「高リスク」ＭＧＩは、例えば手術介入後の放射線療法に対して癌患者が応答性であることを予測するのに使用される。この方法はさらに、手術介入後の放射線療法に対して対象が応答性である可能性があるか又は可能性が無いことを同定することを含む。もちろん本開示はさらに、その応答性の予測に基づいて、放射線療法を選択する方法を含む。
【０１１２】
本開示はさらに、更年期前女性及び更年期後女性の臨床的応答性の予後診断因子又は予測因子として、ＭＧＩ単独、Ｈ：Ｉ単独、又はＭＧＩとＨ：Ｉ測定値の組合せを測定する方法を含む。図１２は、生存転帰に基づいて両方の群の女性を層別する「高リスク」ＭＧＩの能力を示す。更年期後女性は年齢≧５０才の女性として定義され、更年期前女性は５０才未満の女性として定義される。両方の群において「高リスク」ＭＧＩは、「低リスク」ＭＧＩに対して経時的に癌再発の可能性が上昇した指標である。もちろん本開示はさらに、女性の試料から測定されたＭＧＩ値、Ｈ：Ｉ値、又は両方の値の組合せに基づいて、更年期前及び更年期後女性について適切な治療法を選択しない方法を含む。
【０１１３】
さらに一般的には、癌患者の治療法を決定する方法は、上記のＭＧＩについて測定することから始まる。測定された値は、グレードＩもしくはグレードIII腫瘍に対応して癌を分類するか、又は癌再発の可能性の予後を有するとして、又は本明細書に記載の治療法に対する応答性もしくは非応答性を有するとして対象を同定するのに使用される。従ってこの方法は、そのような腫瘍又はそのような予後、又はそのような応答性もしくは非応答性を有する患者について、治療法を選択することを含む。ある場合には、予後が悪く、及び／又は他の治療法に非応答性であるため、選択される治療法は、手術、及び化学療法、及び／又は放射線療法を含むことがある。
【０１１４】
本開示のさらなる実施態様は、良性遺伝子を有すると診断された対象の腫瘍グレード又は癌リスクを決定する方法を含む。この方法は、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについて、対象からの乳房細胞の試料を測定することを含み、ここで該発現レベルは、グレードＩもしくはグレードIII腫瘍又は癌の「高リスク」もしくは「低リスク」と相関する。この方法の実施態様は、発現レベルに基づいてＭＧＩ値を測定すること、及び場合によりこれを使用して対象の治療法を選択することを含む。
【０１１５】
別の実施態様において本開示は、ＤＣＩＳを有するとして診断された対象の腫瘍グレード又は局所的癌再発のリスクを決定する方法を含む。この方法は、Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の発現レベルについて、対象からの乳房細胞試料を測定することを含み、ここで該発現レベルは、グレードＩもしくはグレードIII腫瘍又は局所的癌再発の「高リスク」もしくは「低リスク」と相関する。
【０１１６】
上記の一部は、ＭＧＩのすべての５つの遺伝子を組合せて使用することで説明されているが、本開示は特に、開示方法の実施において５つの中からの５つ未満の個々の遺伝子の使用を含む。さらに、ＭＧＩもしくはＨ：Ｉ比の１つ又はそれ以上の遺伝子とともに他の遺伝子を上記に含めることも、明示的に開示される。同様に、ＭＧＩ遺伝子について、全体にもしくは一部に他の指数の置換を含むＨ：Ｉの使用も明示的に開示される。
【０１１７】
従ってＭＧＩの５つの遺伝子は、分子的発現表現型を腫瘍グレード及び／又は癌転帰と正確に相関させる能力を上昇させるために、高い正確度で単独で又は組合せで使用される。この相関は、本明細書に開示された癌再発及び／又は生存転帰の決定を分子的に提供する方法である。相関遺伝子は、細胞と組織の分類：診断及び／又は予後の決定；及び治療法の決定及び／又は修正において、追加的に使用される。
【０１１８】
鑑別能力は、関連するとして個々の遺伝子の発現の同定により付与されるのであって、実際の発現レベルを測定するのに使用されるアッセイの方によってではない。アッセイは、「トランスクリプトーム（transcriptome）」（ゲノム中の遺伝子の転写部分）又は「プロテオーム（proteome）」（ゲノム中の発現された遺伝子の翻訳部分）中の遺伝子の発現を定量的又は定性的に反映する限り、同定される個々の遺伝子の同定性特徴を利用する。同定性特徴には、特に限定されないが、エンコード（ＤＮＡ）又は発現（ＲＮＡ）するのに使用されるユニークな核酸配列、該遺伝子もしくはこれに特異的なエピトープ、又は該遺伝子にコードされるタンパク質の活性がある。かならず必要なものは、癌転帰と、発現アッセイで使用される適切な細胞含有試料とを区別するのに必要な遺伝子の本体である。
【０１１９】
同様に細胞含有試料の性質は限定されず、本開示の方法では、新鮮な組織、新たに凍結された組織、及び固定組織（例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）が使用される。
【０１２０】
ある実施態様において本開示は、単一の細胞、又は混入細胞から分離、単離もしくは精製された（単純な生検によって可能なものより）均一な細胞集団からの、全体的又はほぼ全体的遺伝子発現を分析することによる、遺伝子発現パターンの同定を提供する。無数の遺伝子の発現は、異なる患者からの細胞間でならびに同じ患者試料からの細胞間で変動するため、遺伝子発現のレベルは、患者の細胞でもしくは患者間でその発現が比較的一定である１つ又はそれ以上の「対照」もしくは「標準化」遺伝子と比較して測定される。
【０１２１】
別の態様において本開示は、個々の発現パターンによって作成されるモデルにより同定される遺伝子の発現を検出するための、物理的及び方法論的手段を含む。これらの手段は、遺伝子の発現を基礎となるＤＮＡ鋳型、遺伝子を発現するための中間体としてのＲＮＡ、又は遺伝子により発現されるタンパク質生成物の１つ又はそれ以上の側面を測定することに関する。
【０１２２】
本開示により与えられる１つの利点は、患者の癌再発及び／又は生存転帰を同定するための、同定される遺伝子又はその遺伝子発現の以後の解析に影響を与える可能性のある、混入した非癌細胞（例えば、浸潤性リンパ球又は他の免疫系細胞）が存在しないことである。遺伝子発現パターンを測定するのに多くのタイプの細胞を含む生検が使用される場合、このような混入が存在する。
【０１２３】
本開示は、主にヒトの癌（例えば乳癌）について説明されるが、動物の癌について実施してもよい。本開示の適用のための好適な動物は、哺乳動物、特に農業応用に重要な哺乳動物（例えば、特に限定されないが、ウシ、ヒツジ、ウマ、及び他の「家畜動物」）、癌の動物モデル、及びヒトのペット動物（例えば、特に限定されないが、イヌやネコ）である。
本開示により提供される方法はまた、全体又は一部を自動化してもよい。
【０１２４】
キット
本開示の方法で使用される材料は、理想的には公知の方法で作成されるキットの調製に適したものである。すなわち本開示は、腫瘍のグレード分類又は癌転帰の測定用に開示された遺伝子の発現を検出するための物質を含むキットを提供する。このようなキットは、本開示の方法での使用に関する、同定的記載、又は標識物、又は説明書とともに、随時薬剤を含む。このようなキットは、本方法で使用される種々の試薬（典型的には濃縮物の形で）、例えばあらかじめ調製されたマイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、及びｒＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び本開示の１つ又はそれ以上のプライマー複合体（例えば、ＲＮＡポリメラーゼと反応性のプロモーターに結合した適切な長さのポリ（Ｔ）又はランダムプライマー）の１つ又はそれ以上をそれぞれ有する容器を含んでよい。典型的には説明書のセットも含まれる。
【０１２５】
本開示を一般的に説明し、これは以下の例を参照することによってより容易に理解できるが、これらは例示目的であり、特に明記しない場合は、決して本開示を限定するものではない。
【実施例１】
【０１２６】
総論
患者と腫瘍試料
公のすでに公表されているマイクロアレイデータセット（受け入れ番号ＧＳＥ３４９４、ＧＳＥ１４５６）をGene Expression Omnibus (GEO, http://ncbi.nih.gov/geo)からダウンロードした。ＧＳＥ３４９４（Uppsalaコホート）は、１９８７年〜１９８９年までUppsala County, Swedenで行われた集団ベースのコホートからの２５１人の患者からなり、彼らは、受けているアジュバント全身性療法において不均一であった（未治療、又は内分泌療法及び／又は化学療法で治療された）。Miller LD,Smeds J,George J, et al Proc. Natl. Acad.Sci. USA 102:13550-5,2005を参照。臨床転帰データ（乳癌特異的死亡）は、平均追跡調査が１０年の２３６人の患者から得られた。ＧＳＥ１４５６（Stockholmコホート）は、１９９４年〜１９９６年にKarolinska Hospital, Stockholm Swedenで行われた、１５９人の乳癌患者の同様のシリーズからなる。ＧＳＥ３４９４とＧＳＥ１４５６ともに、Affymetrix U133AとU133Bアレイ（Affymetrix, Santa Clara,CA）で分析した凍結腫瘍試料からの遺伝子発現データを含む。
【０１２７】
２３９人の患者の第２のコホートは、後ろ向き症例コホート計画（Pawitan Y, Bjohle J, Amler L, et al Breast Cancer Res 7:R953-64, 2005）を使用し、１９９１年〜１９９９年にマサチューセッツ総合病院（Massachusetts Genera Hospital）で治療されたエストロゲン受容体陽性乳癌の６８３人のステージＩ〜ステージIII患者から得られた。臨床的追跡調査データは、腫瘍記録と病院の記録から得られた。症例はすべて、追跡調査中に遠隔転移を発症した患者であり、対照は、最後の追跡調査で無病のままであった患者からランダムに選択され、対照対症例の比は２：１であった。さらに対照は、アジュバント療法と診断の時点について、症例と頻度一致させた。約８０％の症例と対照について、両方の臨床転帰データと、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍ブロックはうまく受領された。
【０１２８】
最後のコホートは、７９の症例と１６０の対照からなり、その患者と腫瘍の特徴を表１に要約した。この試験は、地域の治験審査委員会（Institutional Review Boards）により認可された。この最後のコホートは、既に記載されているOxfordシリーズの８４からなった（Loi S, Haibe-Kains B, Desmedt C, et al:ゲノムグレードによるエストロゲン受容体陽性乳癌における臨床的に明確な分子サブタイプの定義、J Clin Oncol 25:1239-46,2007）。すべての患者はエストロゲン受容体陽性乳癌を有し、リンパ節転移陰性であり、腫瘍アジュバント単独療法で治療された。この試験は、あらかじめ単離された凍結腫瘍試料からの総ＲＮＡの一部を使用した。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
Ｈ／ＩとＭＧＩのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＨＯＸＢ１３とＩＬ１７ＢＲのプライマーとプローブ配列、ならびに対照遺伝子ＥＳＲ１、ＰＧＲ、ＣＨＤＨ、ＡＣＴＢ、ＨＭＢＳ、ＳＤＨＡ、及びＵＢＣを、既に記載されているように使用した（Ma XJ, Hilsenbeck SG, Wang W, et al J Clin Oncol 24:4611-9, 2006）。５つの分子グレード遺伝子（ＢＵＢ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２）ならびにＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）のプライマーとプローブ配列は、Primer Express（ABI）を使用して調製した。
【０１３１】
各ＦＦＰＥ試料について、２つの７μm組織切片をＲＮＡ抽出に使用した。腫瘍含量を濃縮するために肉眼的切開を行った。既に記載されているように（Ma et al.,同上）、ABI 7900HT装置（Applied Biosystems, Inc.）を使用してＲＮＡ抽出、逆転写、及びTaqMan RT-PCRを行った。サイクリング閾値数（ＣＴ）は、４つの参照遺伝子（ＡＣＴＢ、ＨＭＢＳ、ＳＤＨＡ、及びＵＢＣ）についての平均ＣＴに標準化した。これらの遺伝子の使用は、これらの遺伝子と当業者に公知のこれらの遺伝子のそれぞれの代表的配列に関する以前の報告により支持される。標準化されたＣＴを取って、相対的遺伝子発現レベルとした。
【０１３２】
Ｈ／Ｉ、ＭＧＩ、及びＧＧＩの計算
一般に及びＭＧＩについて、開示された遺伝子の発現レベルを組合せて、臨床転帰の強い予後診断因子及び予測因子として機能する単一の指数を作成することが好ましい。この指数は、使用される遺伝子の発現レベルの要約であり、主成分解析から決定される係数を使用して、２つ以上の開示された遺伝子を組合せて単一の指数にまとめる。この係数は、代表的データセット全体の各遺伝子の発現レベルの標準偏差、および各試料中の各遺伝子の発現値のような因子により決定される。代表的データセットは、本明細書に開示された参照遺伝子の平均発現値に基づいて品質管理される。例えば、１。
【０１３３】
言い換えると、及びＭＧＩについて、マイクロアレイ又はＲＴ−ＰＣＲからの５つの遺伝子の標準化発現レベルが、各データセット内の試料全体に平均０で標準偏差１に標準化され、次に一次主成分を使用して主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、試料について１つの指数にまとめた。各データセット内の一次発現データの標準化は、異なるプラットフォーム（マイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲ）と試料のタイプ（凍結及びＦＦＰＥ）を考慮するのに必要であった。その結果及びスケール化パラメータに従って、指数を規定する発現値の要約の式が作成される。次に、データセット全体の遺伝子の発現レベルの平均、標準誤差、及び標準偏差（信頼区間を有する）に基づいて、スケール化パラメータの精度を試験することができる。従ってこの指数の式の作成は、データセット、参照遺伝子、及びＭＧＩの遺伝子に依存する。
【０１３４】
ＨＯＸＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比は、既に記載されているように（Ma et al.,同上）ＨＯＸＢ１３とＩＬ１７ＢＲとの標準化発現レベルの差として計算された。表１のコホートを標準化するために使用されるＨＯＸＢ１３とＩＬ１７ＢＲの平均と標準偏差は、エストロゲン受容体陽性リンパ節転移陰性乳癌患者の別の集団ベースのコホートからの１９０のＦＦＰＥ組織切片の解析から得られた。
【０１３５】
各遺伝子と各試料について二重測定の値を平均するまえに、ＭＧＩについて明らかに異常な生ＣT値を除去した。次に、各遺伝子について平均した生ＣT値を、４つの参照遺伝子（ＡＣＴＢ、ＨＭＢＳ、ＳＤＨＡ、及びＵＢＣ）の平均したＣT値により標準化した。５つの遺伝子についての標準化発現レベル（ΔＣT）を組合せて、試料当たり１つの指数として、これはあらかじめ決められたカットオフ値（例えば０）と比較することができる（ここで高ＭＧＩはカットオフより大きく、低ＭＧＩはカットオフより小さい）。
【０１３６】
ゲノムグレード指数（ＧＧＩ）は、９７個の遺伝子を示す１２８個のAffymetrixプローブセットを使用してマイクロアレイデータから計算し、既に記載されているように（Sotiriou et al., 前述）、グレードＩ腫瘍について平均が−１でグレードIII腫瘍について＋１になるように、各データセット内でスケール化した。
【０１３７】
カットポイントと統計解析
Ｈ／Ｉカットポイント：アジュバントタモキシフェンで治療した患者を、再発の低リスクと高リスクに層別するために、すでに規定したＨＯＸＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比についてカットポイント０．０６を、この試験に直接適用した。
【０１３８】
ＭＧＩカットポイント：ＭＧＩの計算とカットポイントは、臨床転帰データを使用せずに規定し、代わりに自然のカットポイントを使用した。Uppsalaコホート中のＭＧＩの初期の解析は、平均（０）をカットポイントとして使用してグレードＩとグレードIIIの良好な区別を示し、ＭＧＩのＭＣＬベースのクラスタリングもまた、自然のカットポイントが約０の二峰性分布を示した。このカットポイントはさらに、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析により支持された。
【０１３９】
ゲノムグレード指数（ＧＧＩ）：ＧＧＩは、既に記載されているように（Sotiriou et al.,前述）、カットポイント０で二分された。
【０１４０】
統計解析：対数順位検定を用いるKaplan-Meier解析とCox比例障害回帰を行って、遺伝
子発現指数と臨床転帰の関連を評価した。多変量Cox回帰モデルを使用して、既知の予後診断因子について調整後、遺伝子発現指数の予後診断能力を評価した。
【０１４１】
比例障害（ＰＨ）推定を、スケール化Schoenfeld 残差によりチェックした。ＰＨ推定に一致しない変数を、層別によりモデル内で調整した。表１のコホートの症例コホート計画を説明するために、我々は加重Kaplan-Meier解析とCox回帰モデルを、症例コホート計画を扱うための変更を加えて使用した（Ｒ（www.r-project.org）の調査パッケージで実施されたように１９、２０参照）。Cox回帰モデル中の二分されたＭＧＩとＨ：Ｉ比の相互作用を検定するために、表１のコホートでWald統計量を使用し、最後のコホートで確率比検定を使用した。
【０１４２】
連続変数とカテゴリー要因との相関を、２水準を超える要因についてのノンパラメトリック２試料Wilcoxon検定又はkruskal-Wallis検定を使用して調べた。
すべての統計解析は、Ｒ統計環境で行った。すべての有意検定は両側検定で、ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【実施例２】
【０１４３】
乳癌患者のＭＧＩの予後診断性能
乳癌患者中の臨床転帰を予測するＭＧＩの能力を、公に利用可能なマイクロアレイデータセットを使用して調べた。まずＭＧＩを、２つの独立したデータセット中の既に記載された９７遺伝子ゲノムグレード指数（ＧＧＩ）と比較した。ＲＯＣ解析は、グレードＩ腫瘍とグレードIII腫瘍の区別においてＭＧＩとＧＧＩが同等であることを示した（図２）。Kaplan-Meier解析では、カットポイント０で二分したＭＧＩは、両方のデータセットで患者を、有意に異なる乳癌死亡リスクを有する２つのサブグループに分類し、生存曲線と障害比（ＨＲ）は、ＧＧＩにより作成されたものに匹敵した（図２）。すなわちこれらの結果は、５遺伝子指数が、はるかに多い複雑な９７遺伝子シグネチャの予後診断性能を再現できることを証明した。ＭＧＩはＧＧＩからは完全に独立して開発されたが、５つの遺伝子の内の４つ（ＢＵＢ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２）は９７遺伝子シグネチャ中であり、第５の遺伝子（ＮＥＫ２）は、ＧＧＩに含まれる１１２のグレードIII関連プローブからわずかに２位下であることが指摘されている。
【０１４４】
次に、Rotterdam７６遺伝子予後診断シグネチャを検証するために行われたTRANSBIG試験でＭＧＩを調べた（Desmedt C, Piette F, Loi S, et al: TRANSBIG多施設独立検証シリーズのリンパ節転移陰性乳癌患者の７６遺伝子予後診断シグネチャの強い時間依存性、Clin Cancer Res 13:3207-14, 2007）。これは、ＭＧＩと他の検証予後診断シグネチャとを公平に比較することを可能にした。全コホートで、ＭＧＩについてカットポイント０を適用することは、異なるリスクの遠隔転移を有する２つの患者群を与え（ＨＲ＝２．３、９５％ＣＩ  １．２〜４．２、ｐ＝０．００６４）、ここで７６遺伝子シグネチャによるリスク層別はほんのわずかに有意であった（ｐ＝０．０４６）。図３を参照。
【０１４５】
さらに、ＥＲ＋グレードＩもしくは２サブセット（ｎ＝９７）のリスク層別がより困難な患者群では、ＭＧＩは、より再発リスクが有意に高い患者のサブグループ（ＨＲ＝３．３，９５％ＣＩ  １．３〜８．４、ｐ＝０．００８５）を同定し、７６遺伝子シグネチャはこれをできなかった（ＨＲ＝１．４，ｐ＝０．５７）。
【０１４６】
まとめると、全部で６０８人の患者の３つの大きなマイクロアレイデータセットでは、ＭＧＩは、はるかに多い複雑なシグネチャと同等の又はこれを超える強い予後診断因子として一貫して機能した。
【実施例３】
【０１４７】
ＭＧＩのＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発と検証
５ＭＧＩ遺伝子のプライマーとプローブを、TaqManリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイフォーマットのために設計した（表２）。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
マイクロアレイベースのプラットフォームと比較して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは定量において、特にホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料からの部分的に分解されたＲＮＡ試料（Cronin M, Pho M, Dutta D, et al:長期保存パラフィン包埋組織における遺伝子発現の測定：９２遺伝子逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応アッセイの開発と性能、Am J Pathol 164:35-42,2004）（これは臨床の場で最も一般的なタイプの試料である）の分析においてより高い精度を与えた。
【０１５０】
ＲＴ−ＰＣＲベースのＭＧＩアッセイを検証するために、後ろ向き症例コホート試験を行った。症例は、１９９１年〜１９９９年にマサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital）で治療されたが、追跡調査中に遠隔転移を発症した患者であり、対照は同じ期間にクリニックに入り、最後の追跡調査で無病のままであった患者からランダムに選択された（上記表１参照）。患者は、全身性療法無し、ホルモン療法、化学療法の標準的治療により治療した。ＭＧＩの治療法非依存性の予後診断有用性を調べるために、対照は全身治療に関する。
【０１５１】
上記で解析したマイクロアレイデータセットと同様に、ＲＴ−ＰＣＲベースのＭＧＩもまた、上記と同じカットポイントの０を使用して、グレードＩ腫瘍とグレードIII腫瘍を正確に区別した（８６％の正確度）。Kaplan-Meier解析は、高ＭＧＩが、リンパ結節状態に無関係に遠隔転移の高リスクと有意に関連していることを示した（図４、パートＢ〜Ｄ）。腫瘍サイズ、腫瘍グレード、リンパ節転移状態、全身性治療について調整された多変量Cox回帰モデルでは、ＭＧＩは障害比４．７（２．１〜１０．８）で高度に有意なままであった（表３）。
【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
従ってＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＭＧＩは、腫瘍グレードとの高い相関と、全部の独立したコホートでの強固な予後診断性能を維持した。
【実施例４】
【０１５４】
ＭＧＩとＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲの相補的予後診断的価値  ＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ比が、ＭＧＩに追加の予後診断的情報を与えるかどうか、そしてその逆があるかどうかを証明するために、我々は、リンパ節転移陰性の内分泌療法治療患者において両方の指数を解析した（ｎ＝９３）。この比率はリンパ節転移陽性患者では予後診断的でないことが証明されており、これはこのコホートでも確認された。この
患者群では、ＭＧＩとＨ：Ｉ比はそれぞれ、遠隔転移のリスクに強く関連していた（図５、パートＡとＢ）。
【０１５５】
両方をまとめて考慮すると、腫瘍が高いＨ：Ｉを有する時のみ、ＭＧＩは患者を低リスク群と高リスク群に層別するのに非常に有効であり、同様にＨ：Ｉ比は、高ＭＧＩを有する腫瘍の患者を層別する時のみ有効であった（図５Ｅ）が、これらの２つの指数の相互作用の正式な検定では、有意に達しなかった（ｐ＝０．０９）。従ってＭＧＩとこの比率を組合せて、患者を３つのリスク群に層別した（低リスク＝両方の指数が低いか又はＨ：Ｉのみ高い；中間リスク＝ＭＧＩのみ高い；高リスク＝両方が高い、それぞれ患者の４８％、２４％、２８％を占める）。
【０１５６】
これらの３群のKaplan-Meier解析は、高ＭＧＩとＨ：Ｉは一緒に、高リスク群の非常に悪い転帰を予測することを示した（障害比対低リスク群＝４０．２、９５％ＣＩ  ５．０〜３２２．６）。これは図５のパートＣに例示される。１０年間遠隔転移の無い生存確率のKaplan-Meier推定値は、低リスク群、中間リスク群、高リスク群についてそれぞれ９８％（９６〜１００％）、８７％（７７〜９９％）、及び６０％（４７〜７８％）であった。さらに多変量Cox回帰モデルで全身性療法と標準的予後診断因子（年齢、腫瘍サイズ、及びグレード）について調整した後は、組合せ指数は統計的に有意性が高いまま（表４）であり、ＭＧＩとＨ：Ｉの組合せの強い独立した予後診断的価値を証明している。
【０１５７】
【表４】
2015057055.tif 000006
【０１５８】
ＭＧＩとＨ：Ｉ比の組合せの予後診断力をさらに証明するために、我々はこれらの２つの指数を、別々の独立したコホートで、アジュバントタモキシフェン療法で均一に治療された８４人のＥＲ＋リンパ節転移陰性患者について調べた（最後のコホート）。これらの２つの指数に上記と同じカットポイントと同じ組合せアルゴリズムを適用後、低リスク群、中間リスク群、及び高リスク群は、患者のそれぞれ４４％、２４％、及び３２％からなり、表１のコホートで見られる比率と一致した。再度Kaplan-Meier解析は、両方の指数が高い腫瘍を有する高リスク群が最も悪い転帰を有し（ＨＲ対低リスク群＝７．９（２．２〜２８．２）（図５Ｄ）、確率比検定は、これらの２つの指数の統計的に有意な相互作用を示した（ｐ＝０．０３６）。
【０１５９】
これらをまとめると、２つの独立したコホートで、ＭＧＩとＨ：Ｉ比は、互いに追加の予後診断情報を与え、両方の指数を組合せると、内分泌療法にもかかわらず非常に悪い転帰を有する患者のサブセット（約３０％）を同定するのに特に有効であり、これらの患者において追加の療法の必要性を示していた。
【実施例５】
【０１６０】
ＨｏｘＢ１３：ＩＬ１７ＢＲ及びＭＧＩとＥＲ及びＰＲ発現との示差的相関
ＨＯＸＢ１３とＩＬ１７ＢＲは両方ともエストロゲン受容体に制御される。ＥＲ＋乳癌細胞株ではエストロゲンにより、ＨＯＸＢ１３発現は抑制されるが、ＩＬ１７ＢＲ発現は刺激される（Zuncai W, Dahiya S, Provencher H, et al:予後診断バイオマーカーＨＯＸＢ１３、ＩＬ１７ＢＲ、及びＣＨＤＨは乳癌においてエストロゲンにより制御される、Clin Cancer Res, 2007）。すなわちＭＧＩにおける５遺伝子の発現を、エストロゲンシグナル伝達による同様の制御可能性について試験した。上記で分析したＥＲ＋リンパ節転移陰性の内分泌療法治療患者群（ここで高Ｈ：Ｉは低ＰＲ発現と強く相関した）において、ＭＧＩはＥＲ又はＰＲ  ｍＲＮＡ発現ともあまり関連しなかった（図６）。
【０１６１】
上記したようにＨ：Ｉ比とＭＧＩを組合せて作成した３つのリスク群において、高リスク群は低ＰＲ発現に関連した。興味深いことに高リスク群はまた、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍について特に強化された（図６）。これは高ＨＥＲ２発現を有する７つの腫瘍のうちの６つを含有した（０をカットオフとして使用して、フィッシャーの正確度検定ｐ＝０．００１）。従って高リスク群は、ＰＲ発現が低下しＨＥＲ２発現が上昇した（両方とも内分泌療法抵抗性のマーカー）腫瘍を有した（Shou J, Massarweh S, Osborne CK, et al:タモキシフェン耐性の機構：ＥＲ／ＨＥＲ２陽性乳癌におけるエストロゲン受容体−ＨＥＲ２／ｎｅｕクロストークの上昇、J Natl Cancer Inst 96:926-35,2004）。これは、内分泌療法にもかかわらず、その悪い転帰と一致する。これらの結果はまた、Ｈ：Ｉ比とＭＧＩが明確な生物学的経路である可能性を示唆し、これは一緒に使用した時の、腫瘍悪性度の決定における有用性を説明する。
【実施例６】
【０１６２】
ＭＧＩはｐＣＲと有意に関連している
術前にパクリタキセル、次に５−ＦＵ、ドキソルビシン、及びシクロホスファミド（パクリタキセル／ＦＡＣ）（乳癌で一般的に使用される治療法）で治療された８２人のＥＲ＋患者からの腫瘍試料を使用して、化学療法への感受性に対するＭＧＩの相関を調べた。８２人のＥＲ＋患者のうちの７人（８．５％）は、完全な病理的応答（ｐＣＲ）を有し、すべての７人の患者は高ＭＧＩを有した。低ＭＧＩを有する腫瘍（約５５％）は、対応する患者中でｐＣＲは無かった。図９を参照。高ＭＧＩ腫瘍の約２０％はｐＣＲを有し、２．３倍の強化及び１００％の陽性予測値であった。
【０１６３】
従って高ＭＧＩは、ＥＲ＋腫瘍中の病理的に完全な応答（ｐＣＲ）と有意に関連している（ｐ＝０．００５３）．ＭＧＩは、どの腫瘍が化学療法に対して感受性であるか又は抵抗性であるかの可能性を示す。この結果は、ＭＧＩとOncotype DXが、術前状況で化学療法応答性を予測するのに同様の性能を有することを示す（Chang, J. et al. 「ホルマリン固定パラフィン包埋コア生検における遺伝子発現パターンは、乳癌患者のドセタキセル化学療法感受性を予測する」、Breast Cancer Research and Treatment 10. 1007/s10549-007-9590,
2007）
【０１６４】
文献
1. Ma XJ, Wang Z, Ryan PD, et al Cancer Cell 5:607-16, 2004 
2. Ma XJ, Hilsenbeck SG, Wang W, et al J Clin Oncol 24:4611-9, 2006 
3. Goetz MP, Suman VJ, Ingle JN, et al Clin Cancer Res 12:2080-7, 2006 
4. Jerevall PL, Brommesson S, Strand C, et al Breast Cancer Res Treat, 2007 
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7. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al J Natl Cancer Inst 98:262-72, 2006 
8. van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al Nature 415:530-6, 2002 
9. Paik S, Shak S, Tang G, et al N Engl J Med 351:2817-26, 2004 
10. Desmedt C, Sotiriou CCeIl Cycle 5:2198-202, 2006 
11. Loi S, Haibe-Kains B, Desmedt C, et al J Clin Oncol 25:1239-46, 2007 
12. Sotiriou C, Piccart MJ Nat Rev Cancer 7:545-53, 2007 
13. Miller LD, Smeds J, George J, et al Proc Natl Acad Sci USA 102:13550-5, 200514. Pawitan Y, Bjohle J, Amler L, et al Breast Cancer Res 7:R953-64, 2005 15. Rundle AG, Vineis P, Ahsan H. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 14:1899-907, 2005 
16. Ma XJ, Salunga R, Tuggle JT, et al: Proc Natl Acad Sci USA 100:5974- 9, 2003
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【０１６５】
特許、特許出願、及び刊行物を含む本明細書で引用したすべての文献は、すでに具体的に取り込まれているか否かに拘わらず、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
本発明の主題を詳細に説明したため、当業者は、過度に実験をすることなく、本開示の精神と範囲から逸脱することなく、広範囲の同等のパラメータ、濃度、及び条件内で、本発明を実施できるであろう。
【０１６７】
本開示をその具体例について説明したが、これはさらなる変更が可能であることは理解されるであろう。本出願は一般的に開示の原理に従って、本開示が関係する分野内の公知の又は慣習内であり、本明細書に記載の基本的な特徴に適用されるような本開示からの逸脱を含む、本開示の変更態様、使用、又は本開示の適用を含むことを企図する。
【０１６８】
【表５】
2015057055.tif 000007
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月16日(2014.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イン  ビトロの乳癌の細胞が、化学療法に対して敏感である高い可能性を有する患者に由来するかどうかを決定する方法であって、
乳癌細胞における、ＲＡＣＧＡＰ１（ラック ＧＴＰ酵素 活性化プロテイン１ 染色体位置 12p13.2-p13.1）、ＣＥＮＰＡ（セントロメア プロテインＡ (17kD), 染色体位置 2p24-p21）、ＲＲＭ２（リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２ ポリペプチド, 染色体位置 2p25-p24）及びＮＥＫ２（ＮＩＭＡ(never in mitosis gene a)関連キナーゼ、染色体位置1q32.2-q41）の遺伝子の発現レベルをアッセイするステップ；
当該遺伝子の発現を、化学療法に敏感であった患者からの癌細胞における、前記遺伝子の発現と比較するステップ；そして、
当該比較に基づき、前記細胞が、化学療法に対する感受性を有している可能性の高い患者に由来するかどうかを決定するステップ；
ここで、もし、前記患者に由来する細胞における前記遺伝子の発現が参照患者に由来する前記遺伝子の発現より減じていなければ、前記細胞は、化学療法に敏感である可能性の高い患者に由来し、そして、もし、前記患者に由来する細胞における前記遺伝子の発現が、前記参照試料における前記遺伝子の発現より減じていれば、前記細胞は、化学療法に敏感である可能性が低い患者に由来する
を含む方法。
【請求項２】
乳癌のデータセットを解析する方法であって、
イン  ビトロの乳癌細胞の試料を、Ｂｕｂ１Ｂ、及び、少なくともＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２の２つの発現レベルについてアッセイし、そして、発現レベルを単一の指標として合計するステップ；
乳癌の細胞からの指標を、化学療法に敏感であった患者からの癌細胞からの指標と比較するステップ；そして、
前記乳癌細胞の前記指標が、敏感であった患者あるいは敏感ではなかった患者の癌細胞の前記指標といずれにより類似しているかを決定することにより、前記乳癌の細胞が、前記処置に敏感である患者に由来するか否かを予測するステップ；
ここで、敏感であった患者からの癌細胞の前記指標は、敏感ではなかった患者からの癌細胞の前記指標より低いものである
を含む方法。
【請求項３】
発現レベルは、細胞中のｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成によってアッセイされる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｍＲＮＡは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アッセイが、アレイによる遺伝子発現の決定を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
９７より少ない遺伝子の発現レベルが決定され、そして、単一の指標として合計される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｂｕｂ１Ｂ、ＣＥＮＰＡ、ＮＥＫ２、ＲＡＣＧＡＰ１、及びＲＲＭ２がアッセイされる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が非浸潤性乳管癌である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料中のＨｏｘＢ１３発現とＩＬ１７ＢＲ発現の比（Ｈ：Ｉ比）についてアッセイすることをさらに含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌再発が局所的再発を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記局所的再発が非浸潤性乳管癌である請求項１１に記載の方法。
【外国語明細書】
2015057055000001.pdf