(57)【要約】      （修正有）【課題】β２アドレナリン受容体に対する作動薬であるクレンブテロールの検出に利用可能な核酸分子の提供。【解決手段】下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾塩基を含む、クレンブテロールに結合する核酸分子。（ａ）特定の塩基配列からなる少なくともいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチド。（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド。（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド。【選択図】図１
2015062364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含むことを特徴とする、クレンブテロールに結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１〜５の塩基配列の少なくともいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドにおいて、全チミンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドにおいて、シトシンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドにおいて、全シトシンが、前記修飾塩基であり、前記修飾塩基が、修飾シトシンである、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、クレンブテロール検出試薬。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、クレンブテロール検出キット。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子とサンプルとを接触させ、前記サンプル中のクレンブテロールと前記核酸分子との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とするクレンブテロール検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレンブテロールに結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレンブテロールは、β２アドレナリン受容体に対する作動薬であり、平滑筋の弛緩作用があることから、動物の呼吸器疾患の治療薬および子宮筋弛緩薬として承認されている。他方、クレンブテロールは、家畜に投与することで肉量を増やせることから、家畜の飼育において、違法に使用されることがある。この場合、投与されたクレンブテロールは、前記家畜の肉や内臓等に蓄積されるため、前記家畜の肉や内臓等を摂取したヒトが、クレンブテロールによる中毒症状を起こすことが報告されている。
【０００３】
クレンブテロールの検出には、液体クロマトグラフ質量分析機を用いた方法が知られているが（非特許文献１）、例えば、家畜から採取したサンプルについて前処理を行う必要があるため、手間がかかるという問題がある。また、抗体を用いてクレンブテロールを検出する方法も考えられるが、クレンブテロールは低分子化合物であるため、抗体の取得が困難という問題がある。また、抗体が取得できても、抗体はタンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい（特許文献１）。
【０００４】
このような問題から、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。しかしながら、これまでにクレンブテロールに対する核酸分子は報告されていないことから、クレンブテロールの検出に利用可能な核酸分子の提供が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１３／０６５３１４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C．  Crescenzi,  S．  Bayoudh,  P．  A．  G．  Cormack,  T．  Klein,  and  K．  Ensing、「Determination  of  Clenbuterol  in  Bovine  Liver  by  Combining  Matrix  Solid-Phase  Dispersion  and  Molecularly  Imprinted  Solid-Phase  Extraction  Followed  by  Liquid  Chromatography/Electrospray  Ion  Trap  Multiple-Stage  Mass  Spectrometry」、Anal．  Chem．、  2001、  73、2171-2177頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、クレンブテロールの検出に利用可能な核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明の核酸分子は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１〜５の塩基配列の少なくともいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド
【０００９】
本発明のクレンブテロール検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明のクレンブテロール検出キットは、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明のクレンブテロール検出方法は、前記本発明の核酸分子とサンプルとを接触させ、前記サンプル中のクレンブテロールと前記核酸分子との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸分子は、クレンブテロールに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、クレンブテロールとの結合の有無によって、クレンブテロールを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるクレンブテロールの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例１において、アプタマーとクレンブテロールとの結合能を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２において、アプタマーとクレンブテロール、サルブタモール、ラクトパミンおよびメタミドホスとの結合能を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例３において、クレンブテロールによる阻害率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜核酸分子＞
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾塩基を含むことを特徴とするクレンブテロールに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１〜５の塩基配列の少なくともいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、クレンブテロールに結合するポリヌクレオチド
【００１５】
本発明において、「クレンブテロールに結合する」とは、例えば、前記クレンブテロールに対する結合能を有している、または、前記クレンブテロールに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記クレンブテロールとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface  Plasmon  resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名  BioRad社）が使用できる。
【００１６】
クレンブテロールは、下記式（１）で表わされる。前記クレンブテロールは、例えば、異性体、塩、水和物、溶媒和物等の誘導体でもよい。以下、前記クレンブテロールに関する記載は、前記誘導体に援用できる。
【化１】
2015062364.tif 000003
【００１７】
本発明の核酸分子において、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
【００１８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
【００１９】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１〜５の塩基配列の少なくともいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２０】
配列番号１
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGACAGAAAGTGTGGATTTTATTTGGATCATACACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
配列番号２
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGTGACAGCACATCATTTGAGTTGGCATGTCTCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
配列番号３
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGTATGCCGGTCAAAGCATATTTCCATATTTGCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
配列番号４
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGGGACGCACTCTATTCTAATATCCAGCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
配列番号５
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGGCAGGTAGCAACTCTATTCTAATATACAGACACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
【００２１】
配列番号４および５において、例えば、下記配列番号６の塩基配列が、保存領域である。
【００２２】
配列番号６
5’-ctctattctaatat-3’
【００２３】
前記（ｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、クレンブテロールに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２４】
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００２５】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００２６】
前記（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記保存領域を有することが好ましい。
【００２７】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２〜２０であり、より好ましくは２〜１０であり、より好ましくは、２または３である。
【００２８】
前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜２０塩基長であり、より好ましくは３〜１２塩基長であり、さらに好ましくは５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００２９】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００３０】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００３１】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００３２】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは７３塩基長または７８塩基長であり、その上限は、例えば、９１塩基長であり、好ましくは７３塩基長または７８塩基長である。
【００３３】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１〜２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００３４】
前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾塩基を含む。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００３５】
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（２）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（３）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【化２】
2015062364.tif 000004
【化３】
2015062364.tif 000005
【００３６】
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
【００３７】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられる。
【００３８】
前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられる。
【００３９】
前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン等があげられる。
【００４０】
前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
【００４１】
前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。
【００４２】
前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００４３】
前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、１個以上であればよく、その上限は、特に制限されない。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜２０個、最も好ましくは２０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００４４】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
【００４５】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、１個以上であればよく、その上限は、特に制限されない。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜４０個、好ましくは５〜３５個、より好ましくは８〜３０個、さらに好ましくは１０〜２５個、特に好ましくは１３〜２２個、最も好ましくは１７個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
【００４６】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００４７】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾ウラシルの場合、前記修飾ウラシルの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾ウラシルに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの個数は、１個以上であればよく、その上限は、特に制限されない。前記修飾ウラシルは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜４０個、好ましくは５〜３５個、より好ましくは８〜３０個、さらに好ましくは１０〜２５個、特に好ましくは１３〜２２個、最も好ましくは１７個であり、また、全てのチミンが、前記修飾ウラシルでもよい。
【００４８】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの割合は、特に制限されない。前記修飾ウラシルの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾ウラシルの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００４９】
前記修飾チミンと前記修飾ウラシルの個数の例示は、例えば、両者をあわせた個数であってもよい。
【００５０】
前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾シトシンの場合、前記修飾シトシンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然シトシンは、前記修飾シトシンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの個数は、１個以上であればよく、その上限は、特に制限されない。前記修飾シトシンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜４０個、好ましくは５〜３０個、より好ましくは５〜２０個、さらに好ましくは８〜１９個、特に好ましくは８〜１３個、最も好ましくは１２個であり、また、全てのシトシンが、前記修飾シトシンでもよい。
【００５１】
前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの割合は、特に制限されない。前記修飾シトシンの割合は、前記天然シトシンの個数と前記修飾シトシンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
【００５２】
前記修飾塩基が、前記修飾アデニンまたは前記修飾グアニンの場合、前記修飾シトシンの個数および割合の説明において、「シトシン」および「修飾シトシン」を、それぞれ「アデニン」および「修飾アデニン」または「グアニン」および「修飾グアニン」に読み替えて援用できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然アデニンは、前記修飾アデニンに置換でき、例えば、天然グアニンは、前記修飾グアニンに置換できる。
【００５３】
本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００５４】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００５５】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００５６】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個、最も好ましくは１〜３０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００５７】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個、最も好ましくは１〜３０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１〜９１個、１〜７８個または１〜７３個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００５８】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００５９】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長であり、好ましくは１〜５０塩基長であり、より好ましくは１〜２５塩基長、さらに好ましくは１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００６０】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００６１】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
【００６２】
本発明の核酸分子は、前述のように、前記クレンブテロールに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記クレンブテロールへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記クレンブテロールに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００６３】
本発明の核酸分子によれば、例えば、前記クレンブテロールを検出でき、これによって、前記クレンブテロールを検出できる。前記クレンブテロールの検出方法は、特に制限されず、前記クレンブテロールと前記核酸分子との結合を検出することによって、行える。
【００６４】
＜検出方法＞
本発明のクレンブテロール検出方法は、前記本発明の核酸分子とサンプルとを接触させ、前記サンプル中のクレンブテロールと前記核酸分子との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
【００６５】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、クレンブテロールに特異的に結合することから、例えば、クレンブテロールと前記核酸分子との結合を検出することによって、サンプル中のクレンブテロールを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、サンプル中のクレンブテロールの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
【００６６】
本発明において、前記サンプルは、特に制限されない。前記サンプルは、例えば、生体由来、飲食品由来、環境由来等のサンプルがあげられる。前記生体は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ等の非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物の生体があげられる。前記生体由来のサンプルは、例えば、排泄物、体液、皮膚、肉、粘膜、体毛等があげられる。前記飲食品由来のサンプルは、例えば、飲料、食品、食品原料等があげられる。前記環境由来のサンプルは、例えば、生物、水、土壌、大気等があげられる。前記水サンプルは、例えば、地下水、河川水、海水、生活排水等があげられる。また、前記環境由来のサンプルは、例えば、食品加工場、調理場等における付着物があげられる。
【００６７】
前記サンプルは、例えば、液体サンプルでもよいし、固体サンプルでもよい。前記固体サンプルの場合、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体と混合して、液体サンプルとして使用することが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、培地等があげられる。
【００６８】
前記検出工程は、例えば、前記サンプルと前記核酸分子とを接触させて、前記サンプル中のクレンブテロールと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記クレンブテロールと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記サンプル中のクレンブテロールの有無または量を分析する工程を含む。
【００６９】
前記接触工程において、前記サンプルと前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記サンプルと前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００７０】
前記接触工程において、前記サンプルと前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分であり、好ましくは３０〜６０分である。
【００７１】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記サンプルと接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００７２】
前記結合検出工程は、前述のように、前記サンプル中のクレンブテロールと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記サンプル中のクレンブテロールの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記サンプル中のクレンブテロールの量を分析（定量）できる。
【００７３】
前記クレンブテロールと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。
【００７４】
そして、前記クレンブテロールと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記サンプル中にクレンブテロールは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記サンプル中にクレンブテロールが存在すると判断できる。また、予め、クレンブテロールの濃度と、結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記サンプル中のクレンブテロールの濃度を分析することもできる。
【００７５】
＜検出試薬およびキット＞
本発明の検出試薬は、前述のように、クレンブテロール検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、前記クレンブテロールの検出等を行うことができる。
【００７６】
本発明の検出キットは、前述のように、クレンブテロール検出キットであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記クレンブテロールの検出等を容易に行うことができる。
【００７７】
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
【００７８】
本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
【００７９】
＜検出デバイス＞
本発明の検出デバイスは、クレンブテロールの検出デバイスであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出デバイスは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出デバイスを使用すれば、前述のように、例えば、前記クレンブテロールの検出等を行うことができる。
【００８０】
本発明の検出デバイスは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体の種類および前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の検出デバイスの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
【実施例】
【００８１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００８２】
［実施例１］
各アプタマーについて、クレンブテロールに対する結合能を間接的に確認した。
【００８３】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。下記ポリヌクレオチドの合成において、アプタマー１−５の下線を付した領域は、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位がメチル化された５’−メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基を使用し、また、アプタマー１は、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基を、さらに、アプタマー２−５は、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基を使用し、合成した。
アプタマー１：CLE124R6B__c5bio  （配列番号１）
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGACAGAAAGTGTGGATTTTATTTGGATCATACACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
アプタマー２：CLE124R8Tm1_m2_c5bio  （配列番号２）
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGTGACAGCACATCATTTGAGTTGGCATGTCTCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
アプタマー３：CLE124R8Tm1_m3_c5bio  （配列番号３）
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGTATGCCGGTCAAAGCATATTTCCATATTTGCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
アプタマー４：CLE124T_1R6_m2_c5bio  （配列番号４）
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGGGACGCACTCTATTCTAATATCCAGCACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
アプタマー５：CLE124T_1R6_m3_c5bio  （配列番号５）
5’-GGTAAGTAGCCCTCCCTGAAATGGCAGGTAGCAACTCTATTCTAATATACAGACACTAGCACGGCAATCTGGTTTAAG-3’
【００８４】
また、４０塩基長のランダム配列（Ｎ）４０を含む配列番号７で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡを複数含むＤＮＡライブラリーを、ネガティブコントロールとした。下記配列において、「Ｎ」は、デオキシリボヌクレオチド残基であり、その核酸は、アデニン、グアニン、シトシンおよび／またはチミンとした。
ネガティブコントロール（配列番号７）
CCTGCACCCAGTGTCCC-(N)40-GACGGAGAGGAGGACGG
【００８５】
前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
【００８６】
（２）クレンブテロール試料
クレンブテロールのアミノ基をビオチン化し、ビオチン化クレンブテロールを作製した。４０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液中で、２μｍｏｌ／Ｌの前記ビオチン化クレンブテロールと５００ｎｍｏｌ／Ｌのストレプトアビジン（ＳＡ、シグマ社製）とを混合し、ビオチン化クレンブテロールのビオチンとＳＡとを結合させたものを試料とした。この試料を以下のＳＰＲに使用した。
【００８７】
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON  XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
【００８８】
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名  ProteOn  NLC  Sensor  Chip、BioRad社）を、前記ProteON  XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記希釈試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。
【００８９】
前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
【００９０】
そして、前記試料のインジェクション開始を０秒として、１１５秒〜１２５秒におけるＲＵの平均値（ＲＵ１１５−２２５）と、３５５〜３６５秒におけるＲＵの平均値（ＲＵ３５５−３６５）とを求めた。また、前記ビオチン化ポリｄＴに前記ポリｄＡ付加アプタマーを結合させた時におけるＲＵ値（ＲＵｉｍｍｏｂ）とＲＵ１１５−２２５との比（ＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂ）またはＲＵｉｍｍｏｂとＲＵ３５５−３６５との比（ＲＵ３５５−３６５／ＲＵｉｍｍｏｂ）を求めた。コントロールは、前記試料に代え、５００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ＳＡをインジェクションした以外は、同様にして、ＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂおよびＲＵ３５５−３６５／ＲＵｉｍｍｏｂを求めた。また、ＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂおよびＲＵ３５５−３６５／ＲＵｉｍｍｏｂから、レスポンスカーブフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を求めた
【００９１】
ＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂおよびＲＵ３５５−３６５／ＲＵｉｍｍｏｂの結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示し、解離定数の結果を表１に示す。図１（Ａ）は、ＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂを示すグラフであり、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、ＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂを示す。図１（Ｂ）は、ＲＵ３５５−３６５／ＲＵｉｍｍｏｂを示すグラフであり、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、ＲＵ３５５−３６５／ＲＵｉｍｍｏｂを示す。
【００９２】
図１（Ａ）に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、コントロール（ＳＡ）に対しては結合能を示さないのに対し、クレンブテロールに対して高いＲＵ１１５−２２５／ＲＵｉｍｍｏｂを示し、クレンブテロールへの優れた結合能が確認された。また、図１（Ｂ）に示すように、いずれのアプタマーも図１（Ａ）の結果と比較して著しい低下はみられず、洗浄後も結合が維持されることがわかった。これに対して、ネガティブコントロールは、クレンブテロールに結合しなかった。また、表１に示すように、実施例のアプタマーとビオチン化クレンブテロール−ＳＡ複合体との解離定数は、１８．６−３７８ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であった。これらの結果から、実施例のアプタマーは、優れた結合能でクレンブテロールに結合できることがわかった。
【００９３】
【表１】
2015062364.tif 000006
【００９４】
［実施例２］
各アプタマーについて、クレンブテロールに対する特異性を間接的に確認した。
【００９５】
クレンブテロール、サルブタモール、ラクトパミンおよびメタミドホスのアミノ基をそれぞれビオチン化し、ビオチン化クレンブテロール、ビオチン化サルブタモール、ビオチン化ラクトパミンおよびビオチン化メタミドホスを作製した。前記ビオチン化クレンブテロール、前記ビオチン化サルブタモール、前記ビオチン化ラクトパミンまたは前記ビオチン化メタミドホスと前記ＳＡとを結合させたものを試料として使用し、ＳＰＲバッファーを２５μＬ／ｍｉｎでインジェクションし、２５０〜２６０秒におけるＲＵの平均値（ＲＵ２５０−２６０）を求めた以外は、前記実施例１と同様にして、各サンプルにおけるＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂを求めた。
【００９６】
この結果を図２に示す。図２は、ＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂを示すグラフであり、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、ＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂを示す。
【００９７】
図２に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、サルブタモール、ラクトパミンおよびメタミドホスに対して、ネガティブコントロールより低いＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂを示し、これらに結合しないことがわかった。これに対して、実施例のいずれのアプタマーも、クレンブテロールに対して優れた結合能を示した。これらの結果から、実施例のアプタマーは、優れた結合能でかつ特異的にクレンブテロールに結合できることがわかった。
【００９８】
［実施例３］
前記ビオチン化クレンブテロールと前記ＳＡとの複合体に、未修飾のクレンブテロール単体を添加した場合、アプタマーが、前記クレンブテロール単体に結合するならば、アプタマーと前記複合体との結合は、競合により阻害される。そこで、各アプタマーについて、前記クレンブテロール単体に対する結合能を競合法により確認した。
【００９９】
前記実施例１と同様にして、前記ビオチン化クレンブテロールと前記ＳＡとを結合させた。前記結合後、さらに０、０．０２、０．２、２または２０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように前記クレンブテロール単体を添加し、試料とした以外は、前記実施例１と同様にして、２５０〜２６０秒におけるＲＵの平均値（ＲＵ２５０−２６０）を求め、ＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂを算出した。そして、０ｍｍｏｌ／Ｌの前記クレンブテロール単体を含む前記試料のＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂを１００％とし、各クレンブテロール単体の濃度におけるＲＵ２５０−２６０／ＲＵｉｍｍｏｂの減少率を求め、これを阻害率（％）とした。また、前記クレンブテロール単体の濃度および前記阻害率に基づき、各アプタマーに対するクレンブテロールの阻害率のＩＣ５０（ＣＬＥ  ＩＣ５０）を求めた。
【０１００】
阻害率（％）の結果を図３に示し、阻害率のＩＣ５０の結果を表２に示す。図３は、阻害率を示すグラフであり、横軸は、クレンブテロール単体の濃度を示し、縦軸は、阻害率（％）を示す。図３に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、前記試料中の前記クレンブテロール単体の濃度の上昇に伴い阻害率が上昇した。また、表２に示すように、実施例の各アプタマーに対するクレンブテロールの阻害率のＩＣ５０は、１．３−６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であった。これらの結果は、前記複合体に前記クレンブテロール単体を添加することで、実施例のアプタマーと前記複合体との結合が、前記クレンブテロール単体の競合により阻害されることを示している。このことから、実施例のアプタマーは、前記クレンブテロール単体に結合できることがわかった。
【０１０１】
【表２】
2015062364.tif 000007
【０１０２】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明の核酸分子は、クレンブテロールに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、クレンブテロールとの結合によって、クレンブテロールを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるクレンブテロールの検出に、極めて有用なツールとなる。
【図１】
2015062364.tif 000008
【図２】
2015062364.tif 000009
【図３】
2015062364.tif 000010
【配列表】
2015062364000001.app