(57)【要約】      （修正有）【課題】核磁気共鳴技法および他の用途のためのエマルジョンを生成するための組成物ならびに方法を提供する。【解決手段】組成物およびエマルジョンを産生する方法を提供する。本開示のエマルジョンは、ＭＲＩを用いた炎症の検出および細胞追跡に使用することができる。インビボでの標識化、検出および細胞数定量の方法を提供する。本開示のエマルジョンは、人工血液代用物として使用することができる。ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、乳化剤、界面活性剤共混合物、および添加剤を含む水性組成物を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年５月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１２６，３０５号および２００８年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１３２，４２０号の出願日の利益を主張する。これらの出願の全教示は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（背景）
多くの生物学的プロセスは、細胞の集団によって実施される。たとえば免疫系の細胞は、血流から炎症または感染範囲に補充されて、罹患部位での免疫細胞の蓄積が生じる。免疫細胞の著しい浸潤は、自己免疫疾患、癌および感染症に罹患した組織に発生することが多い。同様に、移植片拒絶反応は、移植組織に侵入して破壊する宿主免疫細胞に媒介される。骨髄から生じる幹細胞が血流を通じて移動して、損傷組織の再生を補助するという証拠も強まりつつある。
【０００３】
さらに、生物学的療法の最も即時に有望な領域は、新興の細胞療法の分野を含む。細胞療法は、体外、すなわちエキソビボで選択、増殖、および薬理学的に処置された治療細胞の投与によるヒト疾患の処置として広く定義されている。これらの細胞は、患者に（自己細胞）、他のヒトに（同種細胞）、他の生物に（異種細胞）、または不死化株化細胞に由来し得る。
【０００４】
細胞が究極の治療系となるのは、複雑な機能を実施するその能力と、周囲組織または宿主生物における変化に対するその応答性のためである。細胞療法の最も単純な方式では、細胞を単離して、エキソビボで量を増殖させて、患者にインプラントして、疾患機構に直接対処する可溶性因子を産生および分泌させることができる。細胞は、組織、臓器、または免疫応答の再構成などの複雑な課題も、体内の特異的部位に復帰して、循環から退出して、特異的組織中に一体化または新たな組織に分化するその能力に基づいて達成することができる。他の細胞療法も、腫瘍致死または転移処置（たとえば免疫療法）のためにプログラムすることができる。
【０００５】
動的細胞集合は重大な疾患で役割を果たすが、インビボでの細胞の位置および動きを監視するための現在の技術は、きわめて限定されている。通例、細胞の動きは、組織生検の組織学的分析によって得られる「スナップショット」においてのみ監視される。しかし、組織の試料採取のプロセスは、細胞の挙動を変化させることが多く、特定の組織または臓器から採取できる生検の数は、ごく限られている。インビトロアッセイおよびエキソビボの単離組織による細胞の動きを研究することで、多少の進歩がもたらされている。生物の非侵襲性分析のための既存の装置は、現在、生細胞の追跡に不適切である。光ベースの撮像技術、たとえば生物発光（たとえばルシフェラーゼ）技術が深部構造を描出するのに無効であることが多いのは、大半の哺乳動物組織が光学的に不透明なためである。放射活性標識プローブを使用する陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）技術は、高感度である。しかしＰＥＴ装置は、分解能が数ミリメートルに限定されていることが多く、組織および臓器の微細な詳細を分解することができない。さらに標識細胞は、代表的なＰＥＴ放射性同位体の半減期を超える期間では検出不可能であり、一般にＰＥＴは長期の研究には有用でない。細胞プロセスを根本的に理解するために、特異的細胞型のインビボでの集団動態を描出および定量する新たな方法を開発する必要がある。
【０００６】
磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）は、非侵襲性であり、光学的に不透明な対象内の観察を可能にして、軟組織間に合理的に高い空間分解能にてコントラストを与えるため、幅広く使用されている臨床診断ツールである。従来のＭＲＩは、ほとんど解剖学的構造を描出することだけに注目しており、いずれかの特定の細胞型に対する特異性は有していない。従来のＭＲＩで使用される「プローブ」は、移動する水分子中に遍在するプロトン（１Ｈ）である。生体対象の細胞特異的撮像を容易にするために、新たなクラスの外因性ＭＲＩプローブまたは試薬が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
ある態様において、本出願は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、乳化剤、界面活性剤共混合物、および添加剤を含む水性組成物を開示する。ある実施形態において、界面活性剤共混合物は７０ｍｏｌ％のレシチン、２８ｍｏｌ％のコレステロールおよび２ｍｏｌ％のＤＰＰＥを含む。ある実施形態において、添加剤はプロピレングリコールである。ある実施形態において、乳化剤は非イオン性可溶化剤でもある。ある実施形態において、乳化剤はグリセロールポリエチレングリコールリシノレエート（ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）を含む。
【０００８】
ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを２０％〜５０％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを２５％〜３５％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３０％〜４０％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５％〜３６％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５．６％ｗ／ｖで含む。
【０００９】
ある実施形態において、組成物は乳化剤を１％〜１０％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物は乳化剤を１％〜５％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物は乳化剤を３％ｗ／ｖで含む。
【００１０】
ある実施形態において、組成物はプロピレングリコールを１％〜１０％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はプロピレングリコールを１％〜５％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はプロピレングリコールを２％ｗ／ｖで含む。ある実施形態において、組成物はレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を１％〜１０％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を１％〜５％ｗ／ｖの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を２％ｗ／ｖで含む。
【００１１】
ある態様において、本出願は、３５．６％ｗ／ｖのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、３．０％ｗ／ｖの乳化剤、２．０％ｗ／ｖの、レシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物、ならびに２．０％ｗ／ｖの、プロピレングリコールである添加剤を含む水性組成物を開示する。ある実施形態において、乳化剤は非イオン性可溶化剤でもある。ある実施形態において、乳化剤はグリセロールポリエチレングリコールリシノレエートを含む。
【００１２】
ある態様において、本出願は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびブロックコポリマーを含む水性組成物を開示し、ここで組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを１０％〜２０％ｗ／ｗの範囲で含み、組成物はブロックコポリマーを０．１％〜２．０％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、ブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドを含むトリブロックコポリマーである。あるこのような実施形態において、ブロックコポリマーは、ＰＥＯを８０％の含有率で含むポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマーである。
【００１３】
ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを１２％〜１７％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを１５％ｗ／ｗで含む。ある実施形態において、組成物はブロックコポリマーを０．１％〜１．０％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、組成物はブロックコポリマーを０．６％ｗ／ｗで含む。
【００１４】
ある態様において、本出願は、１５％ｗ／ｗのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよび０．６％ｗ／ｗのブロックコポリマーを含む水性組成物を開示する。ある実施形態において、ブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドを含むトリブロックコポリマーである。あるこのような実施形態において、ブロックコポリマーは、ＰＥＯを８０％の含有率で含むポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマーである。
【００１５】
ある実施形態において、組成物はさらに、硫酸プロタミンを０．０１％〜１．０％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、組成物は硫酸プロタミンを０．０１％〜０．５％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、組成物は硫酸プロタミンを０．０１％〜０．１％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、組成物は硫酸プロタミンを０．０４％ｗ／ｗで含む。
【００１６】
ある態様において、本出願は、本明細書に記載する実施形態のいずれか１つの組成物を含むエマルジョンを開示する。ある実施形態において、エマルジョンは、直径２００ｎＭ未満の平均液滴径を有する。ある実施形態において、エマルジョンは、４℃〜３７℃の範囲の温度で安定である。ある実施形態において、エマルジョンは、０．１〜０．２の多分散指数を有する。
【００１７】
ある態様において、本出願は、高エネルギー方法を含む、本出願のエマルジョンを調製する方法を開示する。ある実施形態において、高エネルギー方法はマイクロフルイダイゼーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｉｚａｔｉｏｎ）である。ある実施形態において、高エネルギー方法は超音波処理である。
【００１８】
ある態様において、本出願は、細胞に標識する方法を開示し、方法は、フルオロカーボン造影試薬が細胞と結合するような条件下で、エキソビボで細胞に本出願のエマルジョンを接触させるステップを含む。
【００１９】
ある態様において、本出願は、対象内の細胞を検出する方法を開示し、方法は：ａ）対象に本出願のエマルジョンによって標識された細胞を投与するステップと；ｂ）対象の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより対象内の標識細胞を検出するステップとを含む。
【００２０】
ある態様において、本出願は、移植レシピエント内の移植細胞を検出する方法を開示し、方法は：ａ）移植レシピエントに、その少なくとも一部が本出願のエマルジョンによって標識された移植用細胞を投与するステップと；ｂ）対象の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより標識細胞を検出するステップとを含む。
【００２１】
ある態様において、本出願は、インビボで細胞数を定量する方法を開示し、方法は：ａ）対象に本出願のエマルジョンによって標識された細胞を投与するステップと；ｂ）対象の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより対象内の標識細胞を検出するステップと；ｃ）関心領域（ＲＯＩ）内の標識細胞の数を定量するステップとを含む。
【００２２】
ある態様において、本出願は、インビボで白血球数を定量する方法を開示し、方法は：ａ）対象に本出願のエマルジョンを投与するステップと；ｂ）対象から末梢血の試料を溢出させて（ｅｘｔｒａｖｅｓａｔｉｎｇ）、白血球の有効細胞ローディングを測定するステップと；ｃ）対象の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより対象内の標識細胞を検出するステップと；ｄ）関心領域（ＲＯＩ）内の標識細胞の数を定量するステップとを含む。ある実施形態において、細胞ローディングを測定する前に細胞の集団を試料から選別して、前記細胞の割合を使用してＲＯＩ内のその集団の標識細胞の数を定量する。
【００２３】
ある態様において、本出願は、細胞を標識する方法を開示し、方法は、フルオロカーボン造影試薬が細胞と結合するような条件下で、細胞にインビボで本出願のエマルジョンを接触させるステップを含む。
【００２４】
ある態様において、本出願は、対象内の細胞を検出する方法を開示し、方法は：ａ）対象に本出願のエマルジョンを投与するステップと；ｂ）対象の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより対象内の標識細胞を検出するステップとを含む。
【００２５】
ある態様において、本出願は、組織における酸素の分圧を測定する方法を開示し、方法は、フルオロカーボン造影試薬が組織と結合するような条件下で、組織にインビボで本出願のエマルジョンを接触させるステップを含む。
【００２６】
ある態様において、本出願は、組織における血管透過性の上昇を検出する方法を開示し、方法は、フルオロカーボン造影試薬が組織と結合するような条件下で、インビボで組織に本出願のエマルジョンを接触させるステップを含む。
【００２７】
ある態様において、本出願は、対象への投与のための標識細胞製剤を開示し、製剤は：ａ）細胞と；ｂ）細胞と結合した本出願のエマルジョンとを含む。
【００２８】
本発明は、本発明の上述の態様および実施形態のいずれの組合せも検討する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、乳化剤、界面活性剤共混合物、および添加剤を含む水性組成物。
（項目２）
前記乳化剤が非イオン性可溶化剤でもある、項目１に記載の水性組成物。
（項目３）
前記乳化剤がグリセロールポリエチレングリコールリシノレエートを含む、項目１に記載の水性組成物。
（項目４）
前記界面活性剤共混合物が７０ｍｏｌ％のレシチン、２８ｍｏｌ％のコレステロールおよび２ｍｏｌ％のＤＰＰＥを含む、項目１に記載の水性組成物。
（項目５）
前記添加剤がプロピレングリコールである、項目１〜４のいずれかに記載の水性組成物。
（項目６）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを２０％〜５０％ｗ／ｖの範囲で含む、項目１〜５のいずれかに記載の水性組成物。
（項目７）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを２５％〜３５％ｗ／ｖの範囲で含む、項目６に記載の組成物。
（項目８）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３０％〜４０％ｗ／ｖの範囲で含む、項目６に記載の組成物。
（項目９）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５％〜３６％ｗ／ｖの範囲で含む、項目６に記載の組成物。
（項目１０）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５．６％ｗ／ｖで含む、項目６に記載の組成物。
（項目１１）
前記乳化剤を１％〜１０％ｗ／ｖの範囲で含む、項目１〜５のいずれかに記載の水性組成物。
（項目１２）
前記乳化剤を１％〜５％ｗ／ｖの範囲で含む、項目１１に記載の水性組成物。
（項目１３）
前記乳化剤を３％ｗ／ｖで含む、項目１１に記載の水性組成物。
（項目１４）
プロピレングリコールを１％〜１０％ｗ／ｖの範囲で含む、項目５に記載の水性組成物。
（項目１５）
プロピレングリコールを１％〜５％ｗ／ｖの範囲で含む、項目５に記載の水性組成物。
（項目１６）
プロピレングリコールを２％ｗ／ｖで含む、項目５に記載の水性組成物。
（項目１７）
レシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む前記界面活性剤共混合物を１％〜１０％ｗ／ｖの範囲で含む、項目４に記載の水性組成物。
（項目１８）
レシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む前記界面活性剤共混合物を１％〜５％ｗ／ｖの範囲で含む、項目４に記載の水性組成物。
（項目１９）
レシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む前記界面活性剤共混合物を２％ｗ／ｖで含む、項目４に記載の水性組成物。
（項目２０）
３５．６％ｗ／ｖのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテル、３．０％ｗ／ｖの乳化剤、２．０％ｗ／ｖの、レシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物、ならびに２．０％ｗ／ｖの、プロピレングリコールである添加剤を含む水性組成物。
（項目２１）
３５．６％ｗ／ｖのＰＦＰＥオキシド、３．０％ｗ／ｖの乳化剤、２．０％ｗ／ｖの、レシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物、ならびに２．０％ｗ／ｖの、プロピレングリコールである添加剤を含む水性組成物。
（項目２２）
前記乳化剤が非イオン性可溶化剤でもある、項目２０または２１に記載の水性組成物。
（項目２３）
前記乳化剤がグリセロールポリエチレングリコールリシノレエートを含む、項目２０または２１に記載の水性組成物。
（項目２４）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルおよびブロックコポリマーを含む水性組成物であって、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを１０％〜２０％ｗ／ｗの範囲で含み、該ブロックコポリマーを０．１％〜２．０％ｗ／ｗの範囲で含む、水性組成物。
（項目２５）
前記ブロックコポリマーが、ＰＥＯを８０％の含有率で含むポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリ−ブロックコポリマーである、項目２４に記載の水性組成物。
（項目２６）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを１２％〜１７％ｗ／ｗの範囲で含む、項目２４に記載の水性組成物。
（項目２７）
ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを１５％ｗ／ｗで含む、項目２４に記載の水性組成物。
（項目２８）
前記ブロックコポリマーを０．１％〜１．０％ｗ／ｗの範囲で含む、項目２４に記載の水性組成物。
（項目２９）
前記ブロックコポリマーを０．６％ｗ／ｗで含む、項目２４に記載の水性組成物。
（項目３０）
１５％ｗ／ｗのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルおよび０．６％ｗ／ｗのブロックコポリマーを含む水性組成物。
（項目３１）
前記ブロックコポリマーが、ＰＥＯを８０％の含有率で含むポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリ−ブロックコポリマーである、項目３０に記載の水性組成物。
（項目３２）
硫酸プロタミンを０．０１％〜１．０％ｗ／ｗの範囲でさらに含む、項目２４〜３１のいずれかに記載の水性組成物。
（項目３３）
硫酸プロタミンを０．０１％〜０．５％ｗ／ｗの範囲で含む、項目３２に記載の水性組成物。
（項目３４）
硫酸プロタミンを０．０１％〜０．１％ｗ／ｗの範囲で含む、項目３２に記載の水性組成物。
（項目３５）
硫酸プロタミンを０．０４％ｗ／ｗで含む、項目３２に記載の水性組成物。
（項目３６）
項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物を含むエマルジョン。
（項目３７）
直径２００ｎＭ未満の平均液滴径を有する、項目３６に記載のエマルジョン。
（項目３８）
４℃〜３７℃の範囲の温度で安定である、項目３６に記載のエマルジョン。
（項目３９）
０．１〜０．２の多分散指数を有する、項目３６に記載のエマルジョン。
（項目４０）
高エネルギー方法を含む、項目３６〜３９のいずれか一項に記載のエマルジョンを調製する方法。
（項目４１）
前記高エネルギー方法がマイクロフルイダイゼーションである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記高エネルギー方法が超音波処理である、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
細胞を標識する方法であって、フルオロカーボン造影試薬が該細胞と結合するような条件下で、該細胞をエキソビボで項目３６に記載のエマルジョンと接触させるステップを含む方法。
（項目４４）
被験体内の細胞を検出する方法であって：
ａ）該被験体に項目３６に記載のエマルジョンで標識した細胞を投与するステップと；
ｂ）該被験体の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより該被験体内の標識細胞を検出するステップと；
を含む方法。
（項目４５）
移植レシピエント内の移植細胞を検出する方法であって：
ａ）移植レシピエントに、その少なくとも一部が項目３６に記載のエマルジョンによって標識された移植用細胞を投与するステップと；
ｂ）該被験体の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより標識細胞を検出するステップと；
を含む方法。
（項目４６）
インビボで細胞数を定量する方法であって：
ａ）被験体に項目３６に記載のエマルジョンで標識した細胞を投与するステップと；
ｂ）該被験体の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより該被験体内の標識細胞を検出するステップと；
ｃ）関心領域（ＲＯＩ）内の標識細胞の数を定量するステップと；
を含む方法。
（項目４７）
インビボで白血球数を定量する方法であって：
ａ）被験体に項目３６に記載のエマルジョンを投与するステップと；
ｂ）該被験体からの末梢血の試料を溢出させて、白血球の有効細胞ローディングを測定するステップと；
ｃ）該被験体の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより該被験体内の標識細胞を検出するステップと；
ｄ）関心領域（ＲＯＩ）内の標識細胞の数を定量するステップと；
を含む方法。
（項目４８）
細胞ローディングを測定する前に細胞の集団を試料から選別して、該細胞の割合を使用して、ＲＯＩ内のその集団の標識細胞の数を定量する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
細胞を標識する方法であって、フルオロカーボン造影試薬が該細胞と結合するような条件下で、該細胞をインビボで項目３６に記載のエマルジョンと接触させるステップを含む方法。
（項目５０）
被験体内の細胞を検出する方法であって：
ａ）該被験体に項目３６に記載のエマルジョンを投与するステップと；
ｂ）該被験体の少なくとも一部を核磁気共鳴技法によって検査して、それにより該被験体内の標識細胞を検出するステップと；
を含む方法。
（項目５１）
組織における酸素の分圧を測定する方法であって、フルオロカーボン造影試薬が該組織と結合するような条件下で、該組織をインビボで項目３６に記載のエマルジョンと接触させるステップを含む方法。
（項目５２）
組織における血管透過性の上昇を検出する方法であって、フルオロカーボン造影試薬が該組織と結合するような条件下で、該組織をインビボで項目３６に記載のエマルジョンと接触させるステップを含む方法。
（項目５３）
組織における炎症を検出する方法であって、フルオロカーボン造影試薬が該組織と結合するような条件下で、該組織をインビボで項目３６に記載のエマルジョンと接触させるステップを含む方法。
（項目５４）
被験体への投与のための標識細胞製剤であって：
ａ）細胞と；
ｂ）該細胞と結合した項目３６に記載のエマルジョンと；
を含む製剤。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを含有し、クレモホールＥＬで乳化させたエマルジョン３について収集したデータを示す。Ａ）動的光散乱（ＤＬＳ）を測定して、エマルジョン液滴径分布を示した。Ｂ）標準貯蔵温度５℃での長期安定性（６カ月）を評価した。これらのデータは、時間に対して測定した平均直径および多分散性を示す（単位はどちらもｎｍ）。Ｃ）エマルジョンの血清安定性を、血清存在下での直径および多分散性をＤＬＳで測定することによって評価した。データはｎ＝３の独立した測定の平均であり、平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。
【図２】図２は、蛍光染料によって標識したナノエマルジョン３から収集したデータを示す。Ａ）水中での、およびエマルジョンに結合した、染料濃度に対する蛍光強度依存性どちらも測定した。Ｂ）水中での、およびエマルジョンに結合した、ＤｉＩの蛍光放出スペクトルを得た。
【図３】図３は、蛍光染料ＤｉＩで標識した（点線）および未標識（実線）のナノエマルジョン３の液滴径の比較を示す。
【図４】図４は、ナノエマルジョン３の細胞毒性およびＲＡＷ細胞での摂取量を示す。Ａ）細胞を異なる用量のナノエマルジョン３に３および２４時間暴露させて、細胞生存率を細胞カウントによって評価した。Ｂ）１８時間の暴露の後に１９Ｆ  ＮＭＲによってペレット化ＲＡＷ細胞への摂取を測定した。データは、ｎ＝３の細胞ペレットの平均を表し、エラーバーは±ＳＤである。
【図５】図５は、製剤３標識ＲＡＷ細胞の代表的な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを示す。トリフルオロ酢酸を化学シフト−７６．００ｐｐｍの内部標準として使用したのに対して、標識細胞は−９２．９０ｐｐｍに示されている。
【図６】図６は、製剤３標識ＲＡＷ細胞でのサイトカイン産生を示す。製剤３で標識したＲａｗ細胞を平板培養して（１×１０６細胞／ｍｌ）、２５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに暴露させた。２４時間後に細胞上清を収集して、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファの存在を試験した。サイトカイン測定値をＥＬＩＳＡによって決定した。データは、２つの独立した実験の平均であり、平均±ＳＤとして示す。
【図７】図７は、製剤１日後および３４２日後のナノエマルジョン５の平均液滴径を示す（それぞれ実線および点線）。データは、ナノエマルジョン５の長期安定性、小粒径および狭い粒径分布を示す。
【図８】図８は、マウスへ静脈内注射した製剤３および５の血中クリアランス時間を示す。２つの製剤は、比較可能な血中半減期を有する。動物のコホート（ｎ＝５）から注射後の別の時点に採取した連続血液試料の平均データは、１９Ｆ  ＮＭＲを使用して測定した。
【図９】図９は、ナノエマルジョン３を使用する炎症モデルにおける代表的なインビボ１９Ｆ／１Ｈ  ＭＲＩデータを示す。１９Ｆデータ（疑似カラー）は、移植前に完全フロイントアジュバントに浸漬した、外科的にインプラントされたスポンジを取り巻く炎症細胞が非常に局在化して蓄積していることを示す。１Ｈ画像（グレースケール）によって、この麻酔マウスの解剖学的バックグラウンドが与えられている。
【図１０】図１０は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットの脊髄の下方への炎症プロフィールの定量を示す。ＥＡＥの臨床徴候（ステージ２）を示す動物にナノエマルジョン３の静脈内注射を投与し、４８時間後にラットを殺処分して、脊髄の無傷の固定セグメントの高分解能１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを使用して炎症をアッセイした。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な説明）
１．概要
ある態様において、本開示は、細胞をエキソビボで核磁気共鳴造影試薬、たとえばフルオロカーボン造影試薬で標識して、インビボまたはエキソビボで標識細胞を定量するための新規方法および試薬を提供する。標識細胞は、本明細書に記載する方法に従って１９Ｆ核磁気共鳴技法（たとえばＭＲＩ／ＭＲＳ）によって検出および定量され得る。１９Ｆ核磁気共鳴技法が生体系にとって優れた撮像ツールであるのは、内因性バックグラウンドシグナルが存在しないためである。フッ素は生物中に存在するとしても、非常に低いレベルで存在し、一般に液体状態核磁気共鳴技法によって検出可能な化学形ではない。これは、微細な解剖学的詳細の描出を提供しながら、特異的な細胞集団の選択的検出ができない、従来の１Ｈ  ＭＲＩとは全く異なる。本明細書で開示するある方法によって、生存対象における標識細胞の分布を描出するための体の全体または一部のスクリーニングが可能となる。１９Ｆ核磁気共鳴によって検出された標識細胞の正確な解剖学的位置は、たとえば解剖学的詳細を与える１Ｈ  ＭＲＩ画像の重畳によって決定され得る。好ましい実施形態において、１Ｈ画像は、確実に登録するために１９Ｆ画像と同じ撮像セッションの間に（対象を移動させずに）に取得される。さらに、本明細書で開示する核磁気共鳴技法は、組織試料、切除した臓器および細胞培養物の場合などの、エキソビボの状況で効果的に利用され得る。本明細書で開示する撮像技術は、多数の生物学的および医学的問題に利用され得る。
【００３１】
ある態様において、本発明の方法は、細胞をエキソビボで１９Ｆ造影試薬で標識するステップと、標識細胞を対象に投与するステップと、対象内の標識細胞を検出するステップとを含み得る。標識される細胞は、粗細胞画分もしくは組織試料であり得るか、または細胞は標識前に培養する、および／または濃縮を受けさせてもよい。たとえば、標識前に蛍光活性細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、特定の細胞型を選択してもよい。興味のあり得る各種の異なる細胞型のための他の分取または選択濃縮方法が当分野で公知である。標識される細胞型はまた、造影試薬の性質によって制御され得る。たとえば、造影試薬の単純なコロイド状懸濁物は、食作用活性によって細胞により迅速に摂取される傾向があるだろう。別の例として、造影試薬は、細胞の特定の集団への造影試薬の選択的標的化を促進する標的部分と共に製剤され得るか、または標的部分に共有結合され得る。造影試薬は、下でさらに説明する。標識後、細胞はただちに投与され得るか、またはこのような細胞の使用目的に不適合ではない任意の方法で、貯蔵、さらに培養、精製、濃縮、分離もしくは処理され得る。
【００３２】
ある態様において、標識細胞は治療目的で投与されるであろう。本明細書に記載する技術は、インビボまたはその他の所望の環境における、たとえば組織外植片としての細胞治療薬の輸送を監視するために使用され得る。骨髄細胞移植は、癌の切除療法のレシピエントで長年に渡って幅広く使用されている。各種の精製された細胞集団、たとえば造血幹細胞が濃縮された細胞集団も、骨髄の代わりに使用されている；たとえば細胞は、臍帯血または末梢血から収集され得る。幹細胞は血流に入った後、一般に骨髄に移動して、そこで新たな白血球細胞、赤血球細胞、および血小板の産生を開始する。この生着は通常、移植の約２〜４週間以内に生じる。伝統的に、生着は血球数を検査することによって頻繁に監視され、免疫機能の完全な回復には一般に、数カ月（自家移植のレシピエントの場合）から数年（同種または同系移植を受ける患者の場合）を要する。骨髄吸引による細胞試料採取は、移植細胞の機能に関する情報をさらに提供することができる。これらの監視技法は、移植される細胞（またはこのような細胞のある少量の画分）のエキソビボ標識によって増強することができ、それゆえ核磁気共鳴技法による移植細胞の位置および運動の非侵襲的監視が可能となる。骨髄非破壊的同種移植（すなわち強度減弱移植）は、いくつかの種類の癌を処置するのに有効であろう同様の細胞療法である。一般にこの技法は、より低い用量の放射線および／または化学療法薬ならびに制限された対宿主性移植片病（任意の残留する宿主癌細胞に対する移植片による免疫細胞の作用）に依存して、十分な抗癌活性はもちろんのこと、患者の造血系を回復するための移植細胞の造血潜在力を提供する。伝統的な切除移植片と同様に、本発明の技法を使用して、骨髄非破壊的同種移植の移植細胞の位置および運動を監視することができる。
【００３３】
細胞治療薬も、治療用タンパク質の送達で使用するために開発されている。一実施形態において、細胞を単離して、エキソビボで量的に増殖させて、次にインプラントして、局所的に（たとえば酵素、サイトカイン、および神経伝達物質）または離れて（たとえばホルモンおよび成長調節因子）のどちらかで活性であり得る可溶性因子を産生および分泌することができる。細胞は、体内の特異的部位に復帰して、循環から退出して、周囲の組織中に一体化または分化して損傷組織を置き換えるその能力に基づいて、複雑な治療目的、たとえば組織、臓器、または免疫応答の再構築を達成するためにも患者に投与され得る。幹細胞療法も、神経障害、特に細胞死を特徴とする神経障害（たとえばパーキンソン病、脳卒中および外傷によって引き起こされた脳傷害）、心血管障害（たとえば心筋梗塞）、筋再生（たとえば悪液質または他の消耗性障害に罹患している患者において）、糖尿病における膵臓再生、肝臓再生などを含む無数の疾患に対して提案されている。各例において、細胞、またはそのサブ集団は、投与前に造影試薬によってエキソビボで標識することができ、それゆえインビボでこれらの細胞を監視することができる。核磁気共鳴技法によるインビボ監視は、たとえば投与した細胞の生存能力を評価するために有用であり得る。医師は、投与後に患者で標識細胞が検出される程度に応じて、投薬スケジュールを調整することができる。インビボ監視は、治療細胞が所望の位置に局在化したか否かを判定するのにも有用であり得る。一般に、インビボでの治療細胞の数および／または生存率と同様に、インビボでの治療細胞の移動挙動と治療結果との相関を調査することも可能であろう。このような相関が確立されているとき、治療細胞のインビボ撮像は、患者に利益となるであろう適切な投薬量、投与様式およびさらなる治療介入を選択するのに有用であり得る予後指標としても使用し得る。本発明のある撮像上の進歩によって、広範囲の細胞治療方法に利益がもたらされるのは、これらの撮像方法によって、治療細胞がインビボの所望の標的に送達されたか否か、送達時点、送達場所を検出できるためである。さらに、標識細胞の検出は、特定の臓器または組織などのＲＯＩにおける標識細胞の定量によって向上され得る。
【００３４】
本明細書で開示する技術の利用の一例は、樹状細胞（ＤＣ）の追跡である。ＤＣは、最も効率的な抗原提示細胞であることが公知であり、未変性Ｔ細胞を刺激して免疫応答を開始させる能力を有する。ＤＣは体内での免疫応答の最も強力な刺激物質であるため、ＤＣは患者の免疫系に対する腫瘍の「視感度」を向上させる可能な治療手法に相当する。ＤＣは、開発中の腫瘍ワクチンの焦点である。各種の方法を使用して樹状細胞が腫瘍抗原にエキソビボで露出され、その後、学習した樹状細胞を再注入して、Ｔ細胞媒介腫瘍致死の発生を刺激する。ＷＯ２００５０７２７８０に示された、本開示の実施形態をＤＣおよび他の細胞型の標識および追跡に利用するデータは、参照により本明細書に組み入れられている。
【００３５】
ＤＣに加えて、他の細胞型によって、癌および糖尿病などの他の疾患での免疫療法への可能性が示されているが、その進歩は、動物およびヒトへの移植後にその運動が観察できないことを含む多くの因子によって阻まれてきた。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、収集され、エキソビボで処置されて、移植されたときに、移転性腫瘍細胞を死滅させる能力を示した。エキソビボで処置され、移植されて癌免疫を促進するさらなる細胞型は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球、および活性化キラー単球を含む。病原性細胞を攻撃する白血球であるＴ細胞の移植によって、臨床試験が開始されている膵臓癌を含む多様な癌に対する、ならびに多発性硬化症およびＨＩＶ感染に対する見込みが示されている。
【００３６】
ある態様において、標識細胞は非治療目的で対象に投与される。たとえば細胞は、エキソビボで標識され、対象に投与され、次に標識細胞が検出されることができ、標識細胞はインビボでの未標識細胞と同様に挙動して、したがって内因性細胞集団の挙動を監視するために使用され得ることが期待される。監視は、細胞の運動を追跡する目的で、特に移動性が高いことが公知である細胞、たとえば免疫系の細胞、多くの種類の幹細胞および血行性（ｂｌｏｏｄ  ｂｏｒｎ）細胞の場合に使用され得る。監視は、インプラント部位での非移動性細胞の生存能力および付着力を追跡する目的でも使用され得る。筋肉、肝臓、膵臓、腎臓、脳または皮膚などの多くの組織の細胞は、比較的静止している傾向があるが、標識の消失は、高い死亡率、低い付着力、または他の情報を示し得る。最新の細胞培養および分取技法によって、各種の幹細胞型、免疫細胞型、および他の血液細胞型を含む、実質的にいずれの所望の細胞集団の選択的貯蔵および標識も可能となる。たとえば細胞表面マーカーを使用して、混合された細胞集合を分取して興味のある集団を精製することができる。ＷＯ２００５０７２７８０およびＵＳ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．６０／７９２００３に記載するように（そのどちらもその全体が参照により本明細書に組み入れられている）、Ｔ細胞および樹状細胞の両方がエキソビボで標識されて、インビボで検出され得る。
【００３７】
一例として、標識免疫細胞は、患者内の免疫細胞の運動の検出可能な代理として使用され得る。免疫細胞は、癌およびアテローム性プラーク形成と同様に、炎症および自己免疫障害の宿主に関与して、そのマーカーである。一般的な方法として、免疫細胞の補充を含む任意のプロセスは、患者に標識免疫細胞を投与することによって、患者において検出され得る。特定の範囲での標識の蓄積によって、体のその部分で発生している免疫応答の程度の指標が与えられる。伝統的に、このような種類の研究には、生存対象と不適合である組織学的技法が含まれる。本開示のある方法によって、ヒト疾患の処置のための治療方法の開発が促進され得る。免疫細胞の選択された集団を非侵襲的、放射性同位体を用いずに追跡する能力は、多発性硬化症、糖尿病、臓器移植拒絶の監視、および癌などの基礎および臨床免疫学の多くの領域に影響を及ぼすことができる。たとえば腫瘍は、免疫細胞によって高度に浸潤されることが多い。標識細胞は対象内で撮像されて、腫瘍の位置を明らかにすることができ、いくつかの例では、非侵襲的検出スクリーンとして有用であり得る。大半の早期癌は消耗性の化学療法剤に頼ることなく外科手術によってただちに処置されるため、癌の早期検出は重大問題であった。同様に、他の炎症性疾患の進行は、患者における免疫細胞の動力学を追跡することによって監視され得る。免疫抑制療法の有効性も同様に評価され得る。臓器移植レシピエントの例では、レシピエントに、移植を受ける前に標識免疫細胞の用量を投与することができる。移植での免疫細胞の蓄積のインビボ監視は次に、拒絶の早期警告徴候として用いることができる。移植の場合、本明細書で開示する方法は、代わりの生検が臓器拒絶のリスクを上昇させることが周知であるため、特に所望である。
【００３８】
さらなる一例として、骨髄細胞移植、または末梢血幹細胞移植で使用するための細胞は、本明細書に記載するようにエキソビボで標識して、投与して、核磁気共鳴技法によってインビボで監視され得る。このような監視は、レシピエント骨空洞におけるドナー細胞の生着はもちろんのこと、レシピエントにおける標識細胞の生存率および運動を評価するために使用され得る。医師は、レシピエントにおけるドナー細胞の輸送に関する情報を、処置の有望な成功または失敗の早期徴候として使用することができる。この種類の早期検出によって、医師はそれに従って移植後の治療計画を調整することができる。検出技術を利用することができる別の細胞癌治療法は、同種骨髄非破壊的、または強度減弱移植である。この処置は、癌細胞を破壊する移植片対腫瘍効果を上昇させるために、ドナーリンパ球注入によって使用され得る。ここで移植細胞の集団全体、または一部を注入前に標識することができる。次に核磁気共鳴技法を使用して、処置の有効性を示すことができる、体内で細胞が通る場所を決定できる。拒絶を最小限にするために同種細胞の用量を制限するのが望ましいことが多いので、細胞の輸送パターンを使用して用量が測定され得る。上の癌療法では、治療有効性を有すると考えられる移植細胞（たとえばＣＤ３４＋幹細胞またはＴ細胞）の１つ以上のサブ集団に選択的に標識することが所望であり得る。
【００３９】
さらなる例として、血管形成などの新たな組織の形成に関与する細胞を標識して、対象に投与し、検出して組織形成のホットスポットを確認することができる。たとえば平滑筋細胞および／または内皮前駆細胞は標識され、血流中に導入され得る。このような細胞は、血管形成活性の部位に蓄積することが予想される。血管形成活性は、月経周期、妊娠初期、動脈閉塞に応答した側副血管形成、腫瘍発達および創傷治癒などの生理学的および病理学的イベントに関連付けられ得る。同様に、細胞挙動を監視するために、線維芽細胞などの創傷治癒に関連する細胞を標識して、全身的にまたは損傷が疑われる部位に投与することができる。
【００４０】
たとえば、心臓療法のための製剤を含む、標識した心筋細胞系統細胞凝集体またはそれから誘導された細胞を含有する薬剤または送達デバイスが、ヒトまたは動物の体の処置のために提供され得る。心筋細胞系統細胞は、心臓組織の収縮および／またはペースメーカー活性を再構成または補助する方法において患者に投与され得る（本明細書にその全体が組み入れられている、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００６００４０３８９、２００５０１１２１０４、２００５０２４４３８４を参照）。
【００４１】
本発明により、標識された心筋細胞系統細胞を使用して、疾患または変性によって損傷を受けた横紋心筋を再生または修復する。標識された心筋細胞系統細胞は、レシピエントの健常組織と一体化して、死んだまたは損傷を受けた細胞の機能を元に戻し、それにより心筋を全体として再生する。心筋は通常、修復能力を持たない。標識された心筋細胞系統細胞はたとえば、いくつかの主要な徴候：（ｉ）虚血性心臓インプラント、（ｉｉ）鬱血性心不全患者のための療法、（ｉｉｉ）冠動脈バイパスグラフトを受けている患者のためのさらなる疾患の予防、（ｉｖ）伝導性組織再生、（ｖ）血管平滑筋再生、および（ｖｉ）弁再生のために心筋再生で使用される。
【００４２】
細胞の投与は、多様な処置によって心臓に向けることができる。局所投与が好ましい。間葉系幹細胞は、好ましい順に：自家、同種、または異種を含む、一連の供給源によることができる。この態様に対して、以下を含む複数の実施形態がある。本発明によって、これらの細胞の進行をインビボで監視することができる。
【００４３】
心筋細胞系統細胞は、心筋細胞前駆細胞、または分化心筋細胞であり得る。分化心筋細胞は、心房または心室型であり得る、始原心筋細胞、結節性（ペースメーカー）心筋細胞；伝導心筋細胞；および作用性（収縮性）心筋細胞の１つ以上を含む。ある実施形態において、細胞は、衛星細胞などの筋肉前駆細胞を含有する筋肉試料（または他の試料）に由来する（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５０２４４３８４）。ある実施形態において、細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００５０１１２１０４を参照）。
【００４４】
「心筋細胞前駆体」は、（脱分化または再プログラミングを伴わずに）心筋細胞を含む子孫を生じることができる細胞として定義される。このような前駆体は、制限なく、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、筋節ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、ベータ１−アドレナリン受容体（ベータ１−ＡＲ）、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ−２ファミリ、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロブリン、または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）を含む、系統に特有なマーカーを発現し得る。
【００４５】
ある例において、細胞は興味のある生体部位または構造と完全に関連付けられていることが判明しているので、標識細胞をこのような組織の描出を補助する目的のためのみに投与することができる。上述のように、免疫細胞は特徴的に腫瘍に浸潤する。したがって、標識免疫細胞は、腫瘍を描出する目的のために投与され得る。
【００４６】
本明細書で開示する技術は、ヒト疾患の動物モデルの研究に利用され得る。疾患の各種の動物モデルは、１つ以上の細胞集団の動力学または生存の変化を証明し得る。このような細胞集団を標識して、動物に投与し、監視することができる。たとえば、糖尿病ＮＯＤマウスモデルの膵臓への免疫細胞の浸潤が監視され得る。動物モデルの他の例は：実験的アレルギー性脳脊髄炎（多発性硬化症モデル）、神経膠肉腫腫瘍モデル、および臓器移植拒絶を含む。これらのモデルにおいて免疫細胞の表現型で定義された集合を追跡することによって、疾患病因の態様を解明して、治療薬による細胞輸送への影響を監視することができる。本方法はたとえば、動物モデルで所望の効果を有する薬物をスクリーニングするために使用され得る。薬物スクリーニングアッセイは、標識細胞を動物に投与するステップと、試験剤の存在下にて細胞をインビボで検出するステップとを含み得る。試験剤の存在と相関する細胞挙動の変化は、治療効果を示し得る。このような変化は、たとえば、試験剤による処置前および後の同じ動物、または別個の未処置動物を含む、好適な参照との比較によって検出され得る。試験剤に加えて、方法は運動計画、損傷、遺伝子変化などの試験条件の効果を評価するために使用され得る。一例として、自己免疫疾患の処置のための薬物は、免疫細胞が罹患組織に蓄積する傾向を低下させるであろうことが予想される。定常状態評価に加えて、本明細書で開示する方法は、細胞の動態特性、たとえば細胞が特定の部位に到着する速度および部位でのシグナル持続時間を評価するために使用され得る。薬物スクリーニングアッセイは、厳密に定義された細胞集団、たとえば各種の障害に関与するある群の免疫細胞のインビボ監視と組合せたときに特に強力であり得る。たとえば標識された細胞毒性Ｔ細胞の監視は、移植拒絶を予防するのに有用であり得る薬物を同定するのに特に有用であり得る。インビボで細胞を監視する能力によって、たとえば産生された各種のトランスジェニックまたはそうでなければ他のミュータントマウスを含む、本質的にいずれの実験動物の分析にも利用され得る強力なアッセイが提供される。
【００４７】
複数のグループが、ＭＲＩ造影剤を使用する免疫細胞の標識化および描出を研究してきた。他の研究者らは、ＭＲＩ造影剤を使用して、幹細胞および神経細胞前駆体などの細胞型を標識している。これらの研究の大部分によって、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）剤の包含によって細胞が磁気的に区別可能となる。他の種類の金属イオン、特にカドリニウムおよびマンガンを包含する造影剤によって標識された細胞も使用されてきた。これらの金属イオンベース剤を利用する研究では、化合物は直接撮像されない；代わりに、周囲の水に対する間接的な効果が観察される。薬剤の存在によって、化合物に近接した水の緩和時間（Ｔ１、Ｔ２、またはＴ２＊）が短縮する傾向にある；これらの効果は、緩和時間重み付け画像で検出することができる。たとえばＳＰＩＯ剤は、付近の可動水分子が遭遇する磁場を局所的に摂動させて、次にＴ１、Ｔ２、またはＴ２＊を調節することによって、従来の１Ｈ画像にコントラストを与える。本明細書に記載する方法が金属イオンベース造影剤を使用するすべての方法と明確に異なるのは、造影試薬中の１９Ｆ核からのシグナルが直接検出され、場合により撮像され得るためである。
【００４８】
金属イオンベース造影剤を使用して標識細胞を検出することに固有の欠点は、標識細胞を含有すると考えられる領域におけるグレースケールコントラストの微細な変化を解釈することが必要な状況でよくある欠点だということである。組織に存在する高濃度の移動する水のからの高い１Ｈバックグランドシグナルによって、標識細胞を含有する領域を明確に識別することが困難になり得る；このことは、標識された細胞分布が経験的に知られていない場合に、特に問題となる。「スナップショット」画像の結果は、標識細胞が特異的組織に存在するか否かに関して不明瞭であることが多い。このことは、肝臓または脾臓などの、解剖学的（Ｔ２またはＴ２＊重み付け）画像では本質的に暗色に見える担鉄臓器でＳＰＩＯ標識細胞を検出しようとするときに、特に悩ましい問題である。標識細胞が蓄積したことを検証するために、数時間の期間にわたる特定の臓器の経時的な画像強度変化の検出に頼る必要がある。さらに、金属イオンベース造影剤を使用する関心領域におけるインビボでの標識細胞の定量には問題があり、一般に、緩和時間重み付けＭＲＩを使用して、または定量的緩和時間ＭＲＩマップを使用することによる、これを行うための簡単で信頼性の高い方法はない。
【００４９】
ある実施形態において、本出願の組成物は、１９Ｆ−ＭＲ分光法（ＭＲＳ）、撮像（ＭＲＩ）、および分光撮像（ＭＲＳＩ）に用途が見出され得る。
【００５０】
本出願の別の態様において、本出願のエマルジョンは、常在するマクロファージおよび単球のインサイチュー標識化に使用され得る。本出願において、エマルジョンのボーラスは、直接、静脈内（ｉｖ）注射される。ここでエマルジョンは、安全なｉｖ注射のために、適切に緩衝される（たとえば生理学的に安全なｐＨ、容量オスモル濃度（ｏｓｍａｌｉｔｙ）など）。注射後、エマルジョン液滴は常在する食作用細胞、たとえば好中球、マクロファージおよび単球によって血液から除去される。これらの標識細胞は、体内の炎症性イベントに関与する。十分な数のこれらのインサイチュー標識細胞が部位に蓄積したとき、標識細胞は１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳを使用してインビボで、または切除されて（生検、剖検組織）検出可能になる。（インビボまたはエキソビボで測定した）組織中に存在する１９Ｆ核の絶対数または１９Ｆシグナルの量は、存在する炎症の程度または範囲に直接相関している。ある実施形態において、１９Ｆシグナルは、炎症診断薬、定量的バイオマーカーまたは炎症指標である。
【００５１】
ある実施形態において、エマルジョンボーラスがｉｖ注射されると、エマルジョン液滴は腫瘍まで移動する、常在の食細胞によって取り込まれる。腫瘍における１９Ｆの検出は、腫瘍の位置はもちろんのこと、そのマクロファージまたは炎症活性の分布および範囲も識別する診断ツールである。さらに、エマルジョンの主成分であるペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルは、酸素を配位または結合することが公知である。当分野では、この分子が酸素の存在下で、酸素の局所部分圧（ｐＯ２）に線形的に比例する量によって短縮された、その１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２およびＴ２＊）を有することが公知である。特に、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルの１９Ｆスピン格子緩和時間（Ｔ１）は、ｐＯ２に非常に感受性である（Ｃ．Ｈ．Ｓｏｔａｋら、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．２９，１８８（１９９３））。それゆえ腫瘍中の間質性およびマクロファージ包含ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルのＴ１測定値を使用して、多様な癌治療薬の効力の感受性マーカーであり得るｐＯ２を測定することができる。ある実施形態において、本出願のエマルジョンを使用して、低酸素症または高酸素症がアッセイされ得る。ある実施形態において、組織のｐＯ２感知は、組織中へのエマルジョンの直接注射によって実現される。
【００５２】
本出願のエマルジョンを使用して、炎症が存在する広範囲の病変および疾患を検出することができる。あるこのような実施形態において、疾患は、癌、心血管疾患、炎症性腸疾患、自己免疫疾患（たとえば多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、狼瘡、クローン病、視神経炎など）、臓器移植拒絶、感染性疾患、ならびに外傷性脳および脊髄損傷から成る群より選択される。
【００５３】
ある実施形態において、本出願のエマルジョンを使用して、肝臓の病変がその臓器でのエマルジョン分布の１９Ｆ画像によって撮像され得る。ｉｖ注射される本出願のエマルジョンは、肝臓によって除去され、肝細胞によって取り込まれ得る。肝臓の病変によって、エマルジョン取り込みおよび１９Ｆ画像強度の異常で不均一な分布が生じ得る。
【００５４】
本出願のさらなる態様において、本出願のエマルジョンは、組織酸素添加のプローブとして使用され得る。ある実施形態において、本出願のエマルジョンは、１９Ｆ  ＭＲＳ／ＭＲＩを使用する組織のｐＯ２のセンサとして作用することができる。ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルは酸素を配位して、それによりその１９Ｆ  Ｔ１値を数倍変化させる。それゆえ、（たとえばＴ１Ｉの画像マップを使用する）ＭＲＳまたはＭＲＩのどちらかによる１９Ｆ  Ｔ１の測定値によって、ｐＯ２の定量的測定値が与えられる。（Ｔａｙｌｏｒ  Ｊ，ａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｃ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ５３：２２７−２３３，１９８８；Ｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．；Ｒｏｄｂｕｍｒｕｎｇ，Ｗ．；Ａｎｔｉｃｈ，Ｐ．Ｐ．ＮＭＲ  Ｂｉｏｍｅｄ  ９：１２５−１３４；１９９６；Ｌａｕｋｅｍｐｅｒ−Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ，Ｓ．；Ｓｃｈｏｌｚ，Ａ．；Ｂｕｒｇｅｒ，Ｋ．；Ｈｅｕｓｓｅｌ，Ｃ．Ｐ．；Ｓｃｈｍｉｔｔｎｅｒ，Ｍ．；Ｗｅｉｌｅｒ，Ｎ．；Ｍａｒｋｓｔａｌｌｅｒ，Ｋ．；Ｅｂｅｒｌｅ，Ｂ．；Ｋａｕｃｚｏｒ，Ｈ．Ｕ．；Ｑｕｉｎｔｅｌ，Ｍ．；Ｔｈｅｌｅｎ，Ｍ．；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｗ．Ｇ．Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ  ４７：８２−８９；２００２；およびＫｉｍ，Ｊ．Ｇ．；Ｚｈａｏ，Ｄ．；Ｓｏｎｇ，Ｙ．；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ，Ａ．；Ｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．；Ｌｉｕ，Ｈ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ８：５３−６２；２００３を参照；そのすべては参照により本明細書に組み入れられている）。
【００５５】
本出願の別の態様において、本出願のエマルジョンは、たとえば腫瘍などの血管透過性の高い領域に蓄積する。ある実施形態において、本出願のエマルジョンを使用すると、組織の灌流をアッセイすること、組織中の血液量を決定する可能性を与えること、選択的に緩和時間を短縮するまたは血液密度を低下させること、および血管透過性を図で描出することができる。ある実施形態において、本出願のエマルジョンは、悪性腫瘍の特異的診断、細胞増殖抑制、消炎または血管療法における早期療法管理、（たとえば心筋における）潅流不良領域の早期検出、血管疾患での血管造影、ならびに無菌性または感染性炎症の検出および診断に使用され得る。
【００５６】
本出願のまた別の態様において、本出願のエマルジョンは、人工酸素担体または人工血液代用物として使用され得る（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００４００５７９０６、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４８３８，２７４および５，７８５，９５０ならびにＷＯ  ９６／４００５７を参照、そのすべては参照により本明細書に組み入れられている）。ある実施形態において、エマルジョンはインビボまたはエキソビボで使用され得る。本開示のエマルジョンは、単位体積当りの酸素、二酸化炭素、および空気を含む大量のガスにエマルジョンを溶解させることができる。したがって、フルオロカーボン（ＦＣ）およびペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）は、酸素が臓器および組織に供給されねばならない用途で担体として使用され得る。
【００５７】
それゆえ、本明細書に開示する方法および組成物は、医学および生物学の分野で非常に必要とされるツールを提供する。
【００５８】
２．エマルジョン
主題の方法で使用される造影試薬は、フルオロカーボン、すなわち少なくとも１個の炭素−フッ素結合を含む分子である。本明細書で開示する造影試薬は、１９Ｆ原子のために、１９Ｆ  ＭＲＩおよび他の核磁気共鳴技法、たとえばＭＲＳ技法によって検出され得る。ある好ましい実施形態において、フルオロカーボン造影試薬は、以下の特性：１）細胞毒性の低下；２）単純であり、化学シフトアーチファクトを最小化するために、単一の狭い共鳴を理想的に有する、１９Ｆ  ＮＭＲスペクトル；３）各分子中に多数のＮＭＲ同等フッ素原子を有し、高感度；４）食作用細胞に限定されず、多くの細胞型の効率的な標識を可能にするように製剤される；の１つ以上を有するであろう。好ましくは、造影試薬は、炭素に結合された複数のフッ素、たとえば炭素に結合された５個を超える、１０個を超える、１５個を超えるまたは２０個を超えるフッ素を含む。好ましくは、フッ素の少なくとも４個の、少なくとも８個の、少なくとも１２個のまたは少なくとも１６個がほぼ同等のＮＭＲ化学シフトを有する。
【００５９】
培養物中の細胞の標識化には、造影試薬は、少なくとも３つの様式：１）任意の共有または他の結合会合の形成を伴わずに、標的細胞によって内部移行またはそうでなければ吸収される造影試薬；２）標的細胞に共有付着する造影試薬；および３）標的細胞に存在する分子に結合する、抗体またはリガンドなどの分子にカップリングされた造影試薬；の１つ以上で使用することができる。
【００６０】
第１の種類の造影試薬は、細胞によって取り込まれ、好ましくは実質的な期間にわたって劣化せずに細胞中に保持され、たとえば少なくとも１時間の、少なくとも４時間の、少なくとも約１日の、少なくとも約３日の、または約１週間もの細胞中の半減期を有する、ペルフルオロクラウンエーテルおよび他のペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）を含む。明白な理由で、造影試薬が普通の細胞機能を妨害せず、または標識化に使用した濃度で細胞毒性を示さないことが好ましい。本明細書で示すように、ペルフルオロポリエーテルは、標識細胞に対して低い毒性効果を示す。
【００６１】
第２の種類の造影試薬は、細胞表面の求核部位、たとえば露出されたチオール、アミノ、および／またはヒドロキシ基と反応する求電子化合物を含む。したがって、造影試薬、たとえばマレイミド、ヨウ化アルキル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステル）、アシルスクシンイミドなどは細胞表面との共有結合を形成することができる。タンパク質カップリングで使用される他の技法は、細胞表面タンパク質への造影試薬のカップリングに適応させることができる。このようなカップリングのさらなる手法については、Ｍｅａｎｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：２−１２を参照。
【００６２】
第３の種類の造影試薬は、第２の種類の造影試薬を、細胞自体ではなく、細胞標的リガンドまたは抗体である官能性部分と反応させることによって調製することができる。興味のある用途のために、好適なリガンドおよび抗体を選択することができる。たとえば造血細胞を選択的に標的とするリガンドは、本明細書に記載するように造影試薬によって標識して、注射などによって患者に投与することができる。
【００６３】
代わりに、造影試薬を無差別内部移行ペプチド、たとえばアンテペナペディアタンパク質、ＨＩＶトランス活性化（ＴＡＴ）タンパク質、マストパラン、メリチン、ボンボリチン、デルタヘモリシン、パルダキシン、緑膿菌外毒素Ａ、クラスリン、ジフテリア毒素、Ｃ９補体タンパク質、またはこれらのいずれかの断片にカップリングすることができる。この無差別分子によってエキソビボで処置された細胞は、造影試薬を吸収するであろう。このような標識細胞が動物、たとえば哺乳動物中にインプラントされる場合、造影試薬を使用して核磁気共鳴技法によって移植細胞を描出および／または追跡することができる。
【００６４】
一実施形態において、内部移行ペプチドは、ドロソフィラ・アンテペナペディア・タンパク質、またはそのホモログに由来する。ホメオタンパク質アンテペナペディアの６０アミノ酸長ホメオドメインは、生体膜を通じて転位することが示されており、それがカップリングされた異種ポリペプチドの転位を促進することができる。たとえばＤｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１０４４４−１０４５０；およびＰｅｒｅｚら（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０２：７１７−７２２を参照。このタンパク質の１６アミノ酸長という短い断片が内部移行を促進するのに十分であることが示されている。Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８１８８−１８１９３を参照。
【００６５】
内部移行ペプチドの別の例は、ＨＩＶトランス活性化（ＴＡＴ）タンパク質である。このタンパク質は、４個のドメインに分割されるように思われる（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３５５１−３５６１）。精製ＴＡＴタンパク質は、組織培養物中で細胞によって取り込まれ（Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３）、ペプチド、たとえばＴＡＴの残基３７−６２に対応する断片は、インビトロで細胞によって迅速に取り込まれる（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８）。高塩基性領域は、内部移行および内部移行部分の核への標的化を媒介する（Ｒｕｂｅｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８）。高塩基性領域に存在する配列を含むペプチドまたは類似体は、フッ素化造影試薬にコンジュゲートされて、内部移行およびこれらの試薬の細胞内環境への標的化を補助することができる。
【００６６】
本発明は、造影試薬を含む新規組成物を提供する。たとえば、本発明は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、乳化剤、界面活性剤共混合物、および添加剤を含む水性組成物を提供する。ある実施形態において、界面活性剤共混合物は、レシチン（すなわちリポイド卵ホスファチジルコリン）、コレステロールおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を含む。あるこのような実施形態において、界面活性剤共混合物は、７０ｍｏｌ％のレシチン；２８ｍｏｌ％のコレステロール；および２ｍｏｌ％のＤＰＰＩを含む。ある実施形態において、添加剤はプロピレングリコールである。
【００６７】
本明細書で使用するように、「ＰＦＰＥオキシド」という用語は、ペルフルオロポリ（エチレングリコール）ジアルキルエーテル（たとえばＥｘｆｌｕｏｒ  Ｉｎｃ．，ＴＸから購入可能）を指し、
【００６８】
【化１】
2015062693.tif 000002
式中、Ｒｆは、１９Ｆ  ＮＭＲ分析に基づいて２：１の比のＣＦ３およびＣＦ２ＣＦ３である。
【００６９】
ある実施形態において、乳化剤は非イオン性可溶化剤でもある。ある実施形態において、乳化剤はグリセロールポリエチレングリコールリシノレエートを含む。あるこのような実施形態において、乳化剤は、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、遊離ポリエチレングリコール、およびエトキシ化グリセロールをさらに含む。ある実施形態において、乳化剤は、ヒマシ油およびエチレンオキシドを１：３５のモル比で反応させることによって調製される。例示的な乳化剤は、ＢＡＳＦコーポレーションから入手可能であり、クレモホール（登録商標）ＥＬという商品名で販売されている。
【００７０】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを２０％〜５０％ｗ／ｖの、たとえば２５％〜４５％ｗ／ｖの、たとえば３０％〜４０％ｗ／ｖの範囲で、たとえば３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％ｗ／ｖで含む。あるこのような実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５％〜３６％ｗ／ｖの範囲で、たとえば３５．１％、３５．２％、３５．３％、３５．４％、３５．５％、３５．６％、３５．７％、３５．８％、または３５．９％ｗ／ｖで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５．６％ｗ／ｖで含む。
【００７１】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、クレモホール（登録商標）ＥＬを１％〜１０％ｗ／ｖの、たとえば１％〜５％ｗ／ｖの範囲で、たとえば１％、２％、３％、４％、または５％ｗ／ｖで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、クレモホール（登録商標）ＥＬを３％ｗ／ｖで含む。
【００７２】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、およびプロピレングリコールを含む水性組成物は、プロピレングリコールを１％〜１０％ｗ／ｖの、たとえば１％〜５％ｗ／ｖの範囲で、たとえば１％、２％、３％、４％、または５％ｗ／ｖで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、およびプロピレングリコールを含む水性組成物は、プロピレングリコールを２％ｗ／ｖで含む。
【００７３】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、添加剤（たとえばプロピレングリコール）、およびレシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を含む水性組成物は、レシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を１％  〜１０％ｗ／ｖの、たとえば１％〜５％ｗ／ｖの範囲で、たとえば１％、２％、３％、４％、または５％ｗ／ｖで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、添加剤（たとえばプロピレングリコール）、およびレシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を含む水性組成物は、レシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を２％ｗ／ｖで含む。
【００７４】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）  を含む水性組成物は、ポリエチルアミンをさらに含む。あるこのような実施形態において、水性組成物は、ポリエチルアミンを０．０１％〜５．０％ｗ／ｗの範囲で含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、添加剤（たとえばプロピレングリコール）、およびポリエチルアミンを含む水性組成物は、硫酸プロタミンをさらに含む。あるこのような実施形態において、水性組成物は、硫酸プロタミンを０．０１％〜５．０％ｗ／ｗの範囲で含む。
【００７５】
ある実施形態において、本発明は、３５．６％ｗ／ｖのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、３．０％ｗ／ｖのクレモホール（登録商標）ＥＬ、２．０％ｗ／ｖの界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および２．０％ｗ／ｖの添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物を提供する。
【００７６】
エマルジョンおよびナノエマルジョンという用語は本出願で使用するように、別途特に指摘しない限り、同等である。ある実施形態において、エマルジョンは、ポリエチレンおよびポリプロピレングリコールのブロックコポリマーをさらに含み得る。ある実施形態において、エマルジョンは、プルロニック（商標）をさらに含み得る。非イオン性プルロニック（商標）界面活性剤、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）／ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ブロック（ＡＢＡ型）、（ＰＥＯ／ＰＰＯ／ＰＥＯ）ブロックコポリマーは、広範囲の親水性／疎水性をＰＥＯ／ＰＰＯ比の関数として示すので、ＰＬＡなどのポリマーを含む異なる相分離形態はもちろんのこと、マトリクスの異なる水和度が得られることが期待できる。特に水和は、エステル主鎖の加水分解によるポリマー分解を判断するのに重要な役割を果たす。これらのポリマー界面活性剤は、インビボで最小限の毒性を示し、そのいくつかは、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる１９８９  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ；Ａｔｔｗｏｏｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２６，２５（１９８５）；およびＫｒｅｚａｎｏｓｋｉに対するＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，１８８，３７３に記載されているように臨床使用されている。これらの物質は、ＢＡＳＦコーポレーションから入手可能である。ある実施形態において、本発明のエマルジョンは、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドを含むトリブロックコポリマーをさらに含む。
【００７７】
ある実施形態において、本発明のエマルジョンは、ＰＥＯを８０％の含有率で含む、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のトリブロックコポリマーを含む。あるこのような実施形態において、トリブロックコポリマーの親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値は２９であり、ここでＨＬＢ値は以下の式から計算できる：
【００７８】
【数１】
2015062693.tif 000003
式中、ｎはポリマーのＰＥＯセグメント中の反復単位の数を表し、ｍはポリマーのＰＰＯセグメント中の反復単位の数を表す。例示的なトリブロックコポリマーは、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能であり、プルロニック（商標）Ｆ６８の商品名で販売されている。
【００７９】
本発明は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物をさらに提供する。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５またはＰＦＰＥオキシドエーテルを１０％〜２０％ｗ／ｗの、たとえば１２％〜１７％ｗ／ｗの範囲で、たとえば１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、または１７％ｗ／ｗで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを１５％ｗ／ｗで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、プルロニック（商標）Ｆ６８を０．１％〜２．０％ｗ／ｗの、たとえば０．１％〜１．０％ｗ／ｗの範囲で、たとえば０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１．０％ｗ／ｗで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、プルロニック（商標）Ｆ６８を０．６％ｗ／ｗで含む。
【００８０】
ある実施形態において、本発明は、１５％ｗ／ｗのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよび０．６％ｗ／ｗのプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物を提供する。
【００８１】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、硫酸プロタミンをさらに含む。あるこのような実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、プルロニック（商標）Ｆ６８、および硫酸プロタミンを含む水性組成物は、硫酸プロタミンを０．０１％〜１．０％ｗ／ｗの、たとえば０．０１％〜０．５％ｗ／ｗの、たとえば０．０１％〜０．１０％ｗ／ｗの範囲で、たとえば０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１０％ｗ／ｗで含む。ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、プルロニック（商標）Ｆ６８、および硫酸プロタミンを含む水性組成物は、硫酸プロタミンを０．０４％ｗ／ｗで含む。
【００８２】
ある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、ポリエチルアミンをさらに含む。ある実施形態において、本発明は、１５％ｗ／ｗのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、０．６％ｗ／ｗのプルロニック（商標）Ｆ６８および０．０４％ｗ／ｗの硫酸プロタミンを含む水性組成物を提供する。
【００８３】
本発明は、細胞による取り込みに好適である、上述のような本発明の組成物の製剤も提供する。たとえば、本発明の組成物は、エマルジョンとして製剤され得る。一例として、本発明は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物、および添加剤を含む水性組成物を含むエマルジョンを提供する。ある実施形態において、界面活性剤共混合物は、レシチン、コレステロールおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を含む。あるこのような実施形態において、界面活性剤共混合物は、７０ｍｏｌ％のレシチン；２８ｍｏｌ％のコレステロール；および２ｍｏｌ％のＤＰＰＩを含む。ある実施形態において、添加剤はプロピレングリコールである。
【００８４】
上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを２０％〜５０％ｗ／ｖの、たとえば２５％〜４５％ｗ／ｖの、たとえば３０％〜４０％ｗ／ｖの範囲で、たとえば３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％ｗ／ｖで含む。上述のエマルジョンのあるこのような実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５％〜３６％ｗ／ｖの範囲で、たとえば３５．１％、３５．２％、３５．３％、３５．４％、３５．５％、３５．６％、３５．７％、３５．８％、または３５．９％ｗ／ｖで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを３５．６％ｗ／ｖで含む。
【００８５】
上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、クレモホール（登録商標）ＥＬを１％〜１０％ｗ／ｖの、たとえば１％〜５％ｗ／ｖの範囲で、たとえば１％、２％、３％、４％、または５％ｗ／ｖで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、および添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物は、クレモホール（登録商標）ＥＬを３％ｗ／ｖで含む。
【００８６】
上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、およびプロピレングリコールを含む水性組成物は、プロピレングリコールを１％〜１０％ｗ／ｖの、たとえば１％〜５％ｗ／ｖの範囲で、たとえば１％、２％、３％、４％、または５％ｗ／ｖで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）、およびプロピレングリコールを含む水性組成物は、プロピレングリコールを２％ｗ／ｖで含む。
【００８７】
上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、添加剤（たとえばプロピレングリコール）、ならびにレシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を含む水性組成物は、レシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を１％〜１０％ｗ／ｖの、たとえば１％〜５％ｗ／ｖの範囲で、たとえば１％、２％、３％、４％、または５％ｗ／ｖで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、クレモホール（登録商標）ＥＬ、添加剤（たとえばプロピレングリコール）、ならびにレシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を含む水性組成物は、レシチン、コレステロール、およびＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を２％ｗ／ｖで含む。
【００８８】
ある実施形態において、本発明は、３５．６％ｗ／ｖのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、３．０％ｗ／ｖのクレモホール（登録商標）ＥＬ、２．０％ｗ／ｖの界面活性剤共混合物（たとえばレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥを含む）および２．０％ｗ／ｖの添加剤（たとえばプロピレングリコール）を含む水性組成物を含むエマルジョン提供する。
【００８９】
本発明は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物を含むエマルジョンをさらに提供する。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを１０％〜２０％ｗ／ｗの、たとえば１２％〜１７％ｗ／ｗの範囲で、たとえば１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、または１７％ｗ／ｗで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを１５％ｗ／ｗで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、プルロニック（商標）Ｆ６８を０．１％〜２．０％ｗ／ｗの、たとえば０．１％〜１．０％ｗ／ｗの範囲で、たとえば０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１．０％ｗ／ｗで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、プルロニック（商標）Ｆ６８を０．６％ｗ／ｗで含む。
【００９０】
ある実施形態において、本発明は、１５％ｗ／ｗのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよび０．６％ｗ／ｗのプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物を含むエマルジョンを提供する。
【００９１】
上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドおよびプルロニック（商標）Ｆ６８を含む水性組成物は、硫酸プロタミンをさらに含む。上述のエマルジョンのあるこのような実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、プルロニック（商標）Ｆ６８、および硫酸プロタミンを含む水性組成物は、硫酸プロタミンを０．０１％〜１．０％ｗ／ｗの、たとえば０．０１％〜０．５％ｗ／ｗの、たとえば０．０１％〜０．１０％ｗ／ｗの範囲で、たとえば０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１０％ｗ／ｗで含む。上述のエマルジョンのある実施形態において、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、プルロニック（商標）Ｆ６８、および硫酸プロタミンを含む水性組成物は、硫酸プロタミンを０．０４％ｗ／ｗで含む。
【００９２】
ある実施形態において、本発明は、１５％ｗ／ｗのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド、０．６％ｗ／ｗのプルロニック（商標）Ｆ６８、および０．０４％ｗ／ｗの硫酸プロタミンを含む水性組成物を含むエマルジョンを提供する。
【００９３】
ある実施形態において、本発明の組成物およびエマルジョンは、ヒマシ油をエチレンオキシドと１：３５のモル比で反応させることによって生成した、ポリエチレングリコールリシノレエートを含む非イオン性可溶化剤および乳化剤である、クレモホール（登録商標）ＥＬを含む。この物質は、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。
【００９４】
ある実施形態において、エマルジョンは脂質をさらに含み得る。脂質をさらに含む本発明のエマルジョンのある実施形態において、脂質はＤＭＰＣである。脂質をさらに含む本発明のエマルジョンのある実施形態において、エマルジョンはプルロニック（商標）をさらに含む。ある実施形態において、プルロニック（商標）はＦ６８である。
【００９５】
ある実施形態において、エマルジョンはポリエチルアミンをさらに含み得る。
【００９６】
ある実施形態において、エマルジョンは硫酸プロタミンをさらに含み得る。硫酸プロタミンをさらに含む本発明のエマルジョンのある実施形態において、エマルジョンはプルロニック（商標）をさらに含む。ある実施形態において、プルロニック（商標）はＦ６８である。ある実施形態において、本発明のエマルジョンは硫酸プロタミンをさらに含む。
【００９７】
本発明のエマルジョンは好ましくは、十分な細胞取り込みを可能にする液滴径の分布を有するであろう。ある実施形態において、均一な液滴径が好都合であり得る。液滴径の所望の程度の均一性は、用途に応じて変化し得る。ある実施形態においては、エマルジョンは、直径５００ｎｍ未満の、または４００ｎｍ未満の、または３００ｎｍ未満の、または２００ｎｍ未満の平均液滴径を有する。場合により、液滴の２５％、または５０％、または７５％またはそれ以上が選択された範囲に含まれるであろう。液滴径は、たとえば光散乱技法によって、またはＥＭ顕微鏡写真を使用してエマルジョン液滴を描出することによって評価され得る。大半の幹細胞などの比較的少ない量の細胞質を有するある細胞型において、エマルジョンは、直径２００ｎｍ未満の、または１００ｎｍ未満の、または５０ｎｍ未満の平均液滴径を有する。
【００９８】
ある実施形態において、小さい液滴径が好都合である。ある実施形態において、小さい液滴径によって、エマルジョンがｉｖ注射される用途では循環時間が延長する。ある実施形態において、液滴は循環によって細胞から分離可能（ｓｅｐｅｒａｂｌｅ）である。ある実施形態において、小さい液滴径によってエキソビボ細胞標識化が促進される。ある実施形態において、小さい液滴径によって均一標識化が促進される。
【００９９】
細胞中で使用するためのエマルジョンは、好ましくは、広範囲の温度で安定であるべきである。ある実施形態において、エマルジョンは、体温（ヒトでは３７℃）および４℃または室温（２０〜２５℃）などの貯蔵温度にて安定であろう。たとえばエマルジョンを２〜１０℃の範囲の低温で、たとえば４℃で貯蔵して、次にエマルジョンを室温（たとえば１８〜２８℃、さらに通例は２０〜２５℃）に加温することがしばしば所望であろう。細胞の標識化後に、エマルジョンは約３７℃の温度にされるであろう。したがって、好ましいエマルジョンは、冷蔵温度から体温までに及ぶ温度にて、所望の範囲の液滴径を維持するであろう。ある実施形態において、エマルジョンは、４℃〜３７℃の範囲の温度で安定である。
【０１００】
ある実施形態において、エマルジョンは、０．１〜０．２の多分散指数を有する。
【０１０１】
エマルジョンの特性は、造影試薬自体の特性、使用する界面活性剤および／または溶媒の性質、ならびに処理装置の種類（たとえば超音波処理装置、マイクロフルイダイザ、ホモジナイザなど）によって主に制御され得る。あるＰＦＰＥ分子によってエマルジョンを形成する方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，３３０，６８１および４，９９０，２８３で広範囲に記載されている。高濃度水溶液中の多価アルコールおよびサッカライドなどのポリヒドロキシル化化合物の連続相が有効であり得る。以下の多価アルコールおよびサッカライド：グリセロール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、グルコース、フルクトース、サッカロース、マルチトール、グリセロール（ジグリセロールまたはビス（２，３−ジ−ヒドロキシプロピル）エーテルのダイマー化合物、糖などの固体水溶性ポリヒドロキシル化化合物ならびにトリグリセロールおよびテトラグリセロールなどのグリセロール縮合生成物は、特に有効であることが判明している。エマルジョンへの分散は、カチオン性、アニオン性、両性および非イオン性界面活性剤を含む従来の界面活性剤の存在下で実施され得る。好適な界面活性剤の例は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸塩（スルホコハク酸半エステル）、ココアンホカルボキシグリシン酸、セチルリン酸カリウム、ナトリウムアルキル−ポリオキシエチレン−エーテルカルボン酸、塩化カリウムベンザルコニウム、アルキルアミドプロピルベタイン、セチル−ステアリルエトキシ化アルコール、およびソルビタン−エトキシレート（２０）−モノ−オレエート（トウィーン２０）を含む。所望の液滴径および安定性を有するエマルジョンを与える造影試薬の混合物の予測を試みるために熱力学式が使用され得るが、各種の混合物を実際に試験することが最も有効であることが一般に受け入れられている。混合物の乳化は簡単かつ迅速であり、高速で広範囲の組合せを試験して本明細書で開示する方法で使用するのに好適なエマルジョンを生成する混合物を識別することができる。
【０１０２】
エキソビボ標識化を含む用途では、好ましいエマルジョンは、対象細胞による造影試薬の取り込みを促進するように設計される。界面活性剤は、大量のペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドを水相中に輸送する安定なエマルジョンを形成するように設計され得る。さらに界面活性剤は、考えられる最も短いインキュベーション時間でエマルジョン液滴の細胞内送達を促進する特性を有し得る。ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシドの細胞内ローディングの向上によって、標識細胞に対する感度が改善される。さらに培養時間を最短にすることは、初代細胞培養物を扱うときに重要であり得る。細胞内取り込みの効率は、細胞型に依存する。たとえばマクロファージおよび一部の樹状細胞は、ほぼすべての微粒子もエンドサイトーシスによって取り込むが、興味のある他の細胞型は、ごく弱い食作用を示し得る。どちらの場合も、エマルジョン液滴の表面が培養物中での細胞取り込みを促進する特性を有するように（すなわち「自己送達」エマルジョン液滴）界面活性剤を設計することによって、取り込み効率を実質的に上昇させることができる（Ｊａｎｊｉｃら、ＪＡＣＳ，２００８，１３０（９），２８３２−２８４１およびＵＳ  Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ６１／０６２，７１０、その両方はその全体が参照により組み入れられている）。エマルジョン液滴表面は、適切な界面活性剤設計によって、親油性、または場合によりカチオン性特性を有するようにすることができる。たとえば界面活性剤は、細胞表面に結合または細胞表面と融合する傾向があり、それによりエマルジョン液滴取り込みを促進する、脂質、たとえばカチオン性または中性脂質、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むことができる。エマルジョン液滴表面は、ポリアミンなどの細胞送達シグナルも包含し得る。例は、ポリアミン、たとえばポリエチレンイミンまたは硫酸プロタミンが処理中にエマルジョン液滴の界面活性剤層に包含されたエマルジョンを含む。
【０１０３】
ある実施形態において、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するためのコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。このような系の調製および使用は、当分野で周知である。好適なカチオン性脂質は、以下に記載されており、その全体が本明細書に組み入れられている：Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７，ＰＮＡＳ  ８４，７４１３−７４１７；Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８９７，３５５）、（Ｒｏｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２７９，８３３；Ｅｐｐａｎｄら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２８３，１８５；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３３４，７６１；Ｎａｎｔｚら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５２７，９２８；Ｂａｉｌｅｙら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５５２，１５５；Ｊｅｓｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５７８，４７５）。他の手法は、細胞中、または特異的細胞表面分子を標的とする抗体中への進入を促進する、界面活性剤ペプチド（たとえばオリゴ−Ａｒｇ９およびＴＡＴ様ペプチド）への包含を含む。さらにある実施形態において、細胞取り込みを促進するために、硫酸プロタミンなどの小型カチオン性タンパク質を界面活性剤に包含させることができる。硫酸プロタミンは細胞に対して非毒性であり、へパリン拮抗薬としてのヒトでの使用でＦＤＡに承認されている。ある実施形態において、巨大分子複合体、ナノカプセル剤、ミクロスフェア、およびビーズなどのコロイド分散系が使用される。さらなるトランスフェクション剤を使用することによって、または細胞の電気穿孔を使用することによってなどの、乳化フルオロカーボンの取り込みを促進する他の手法が本明細書に記載されている。
【０１０４】
好ましい実施形態において、エマルジョンは、取り込み促進試薬を添加されることなく、「自己送達」特性を有する。前記エマルジョンは、好ましくは安定であり、数カ月または数年の期間の有効期間を有する。
【０１０５】
界面活性剤および取り込み促進試薬は排他的な群を意味するものではなく、いくつかの場合では、それらが重複し得ることが理解される。
３．細胞および標識化
本明細書に記載する方法は、原核および真核細胞の両方を含む広範囲の細胞、ならびに好ましくは哺乳動物細胞と共に使用され得る。細胞調製の技術は、細胞培養、クローニング、核移植、遺伝子組み換えおよびカプセル封入を含む。
【０１０６】
好適な哺乳動物細胞の一部のリストは：血液細胞、筋芽細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、心筋細胞（およびその前駆体）、軟骨細胞（軟骨細胞）、樹状細胞、胎児神経組織、線維芽細胞、肝細胞（肝臓細胞）、膵臓の島細胞、角化細胞（皮膚細胞）および幹細胞を含む。ある好ましい実施形態において、使用される細胞は、免疫細胞の分画された集団である。免疫細胞の認識されている分集団は、リンパ球、たとえばＢリンパ球（Ｆｃ受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９＋、ＣＤ２１＋）、ｈＥＬｅｒ  Ｔリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−）、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１６＋）、単球、好中球およびマクロファージを含む単核食細胞、および樹状細胞を含む。興味のあり得る他の細胞型は、好酸球および好塩基球を含む。
【０１０７】
細胞は、自系（すなわち同じ固体に由来する）または同系（すなわち遺伝的に同一の固体、たとえば同系同腹仔または一卵性双生児に由来する）であり得るが、同種細胞（すなわち同じ種の遺伝的に異なる固体に由来する細胞）も検討される。あまり好ましくはないが、異種（すなわちレシピエントとは異なる種に由来する）細胞、たとえばトランスジェニックブタによる細胞も投与され得る。ドナー細胞が異種であるとき、細胞を同じ目内の、さらに好ましくは同じ上科または科内の種の個体から得ることが好ましい（たとえばレシピエントがヒトであるとき、細胞が霊長類、さらに好ましくは上科のホミノイデアのメンバに由来することが好ましい）。
【０１０８】
細胞は、医学的および倫理的に適切である場合、出生前（たとえば胎芽または胎児）、乳児（たとえばヒトの出生から約３歳まで）、小児（たとえばヒトの約３歳から約１３歳まで）、思春期（たとえばヒトの約１３歳から約１８歳まで）、若年成人（たとえばヒトの約１８歳から約３５歳まで）、成人（ヒトの約３５歳から約５５歳まで）または高齢者（たとえばヒトの約５５歳およびそれ以上の年齢）を含む、ドナー個体の任意の発生段階から取得され得る。
【０１０９】
多くの実施形態において、細胞は、試薬が細胞によって取り込まれるように、造影試薬のエマルジョンと接触させることによって標識される。食作用性細胞および非食作用性細胞のどちらも、このよな方法によって標識され得る。たとえばＷＯ２００５０７２７８０に示されているように、樹状細胞（食作用性）および神経膠肉腫細胞（非食作用性）はどちらも、細胞を造影試薬のエマルジョンと接触することによって標識することができる。
【０１１０】
ある態様において、本発明の方法は、細胞をインビボで１９Ｆ造影試薬によって標識することと、対象にて標識細胞を検出することを含み得る。標識される細胞は、食作用活性などの細胞の特異的な特性によって決定され得る。標識される細胞は、造影試薬の投与経路によって制御され得る。標識される細胞型は、造影試薬の性質によって制御され得る。たとえば、造影試薬の単純なコロイド状懸濁物は、食作用活性によって細胞により迅速に摂取される傾向があるだろう。別の例として、造影試薬は、細胞の特定の集団への造影試薬の選択的標的化を促進する標的部分と共に製剤され得るか、または標的部分に共有結合され得る。ある実施形態において、造影試薬はペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを含む。
【０１１１】
ある実施形態において、標識される細胞は、幹細胞である。幹細胞療法は、高線量放射線および／または化学療法剤を用いる癌治療のための除去レジメンの一部として通常使用される。除去レジメンは一般に、例えば、末梢血、臍帯血または骨髄から採取され得るような、造血幹細胞、または造血幹細胞を含有する細胞の集団を使用する。この種類の細胞、またはその一部は、適切な位置での生存および生着を監視するために、標識およびインビボで追跡され得る。他の種類の幹細胞は、広範囲の障害のための治療剤として魅力を増している。  
【０１１２】
一例として、細胞は、マウス胚性幹細胞、または別のモデル動物によるＥＳ細胞であり得る。このような細胞の標識化は、場合により、胚性幹細胞治療薬を開発するための前臨床研究プログラムの一部として、マウスに投与されたこのような細胞の運命を追跡するのに有用であり得る。マウス胚性幹細胞の例は：Ｍ．Ｑｉｕら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９，  ２５２３（１９９５）に記載されているＪＭ１  ＥＳ細胞株、およびＧ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５，１５１３（１９９１）に記載されたＲＯＳＡ株、およびＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１９０，９１０に記載されたマウスＥＳ細胞を含む。多くの他のマウスＥＳ系統は、ジャクソンラボラトリーズ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手できる。ヒト胚性幹細胞の例は、以下の供給者：Ａｒｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＣｙＴｈｅｒａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ、ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｍａｒｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．−Ｍａｒｉａ  Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｔａｔａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ、Ｐｏｃｈｏｎ  ＣＨＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、Ｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ、ＲｅＮｅｕｒｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎを通じて入手可能なものを含む。さらに胚性幹細胞の例は、以下の米国特許および公開特許出願：６，２４５，５６６；６，２００，８０６；６，０９０，６２２；６，３３１，４０６；６，０９０，６２２；５，８４３，７８０；２００２００４５２５９；２００２００６８０４５に記載されている。好ましい実施形態において、ヒトＥＳ細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって提供され、ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．にてアクセス可能な承認株化細胞のリストより選択される。ある好ましい実施形態において、胚性幹細胞株は、Ｄｒ．Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手したＷＡ０９株ならびにどちらも現在、ＮＩＨに登録されているＵＣ０１およびＵＣ０６株を含む群より選択される。
【０１１３】
ある実施形態において、開示した方法で使用するための幹細胞は、神経および神経内分泌起源の幹細胞、たとえば中枢神経系（たとえばＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．６，４６８，７９４；６，０４０，１８０；５，７５３，５０６；５，７６６，９４８）、神経堤（たとえばＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５８９，３７６；５，８２４，４８９を参照）、嗅球または末梢神経組織（たとえばＰｕｂｌｉｓｈｅｄ  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００３０００３５７４；２００２０１２３１４３；２００２００１６００２およびＧｒｉｔｔｉら、２００２  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２（２）：４３７−４５を参照）、脊髄（たとえばＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．６，３６１，９９６、５，８５１，８３２を参照）または神経内分泌系統、たとえば副腎、下垂体または腸のある部分（たとえばＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．６，１７１，６１０およびＫｉｍｕｒａら、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８９６１−６７に記載されているＰＣ１２細胞を参照）による幹細胞である。好ましい実施形態において、神経幹細胞は、末梢組織または容易に治癒する組織から得られ、それにより移植のための自系細胞集合が提供される。
【０１１４】
造血または間葉性幹細胞は、ある開示した方法で使用され得る。最近の研究は、ただちに単離される骨髄由来造血（ＨＳＣ）および間葉性幹細胞（ＭＳＣ）が以前に認識されたよりも広範な分化可能性を有することを示唆している。精製ＨＳＣは、血液中のすべての細胞を生成するだけではなく肝細胞のような内胚葉に通常由来する細胞へと発生することもできる（Ｋｒａｕｓｅら、２００１，Ｃｅｌｌ  １０５：３６９−７７；Ｌａｇａｓｓｅら、２０００  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：１２２９−３４）。同様に、末梢血および臍帯血によるＨＳＣは、有用な一連の発生可能性を与えることが期待されている。ＭＳＣは、同様に多能性であると思われ、たとえば神経細胞マーカーを発現可能な子孫を産生する（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：  １４３−７；Ｚｈａｏら、２００２  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７４：１１−２０）。造血幹細胞の例は、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，７１４，６８０；５，０６１，６２０；５，４３７，９９４；５，９１４，１０８；５，９２５，５６７；５，７６３，１９７；５，７５０，３９７；５，７１６，８２７；５，６４３，７４１；５，０６１，６２０に記載されているものを含む。間葉性幹細胞の例は、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，４８６，３５９；５，８２７，７３５；５，９４２，２２５；５，９７２，７０３に記載されているもの、ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｓ．ＷＯ  ００／５３７９５；ＷＯ  ００／０２６５４；ＷＯ  ９８／２０９０７に記載されているもの、およびＰｉｔｔｅｎｇｅｒらおよびＺｈａｏら、同上に記載されているものを含む。
【０１１５】
幹細胞株は好ましくは、哺乳動物、たとえばげっ歯類（たとえばマウスまたはラット）、霊長類（たとえばサル、チンパンジーまたはヒト）、ブタ、および反芻動物（たとえばウシ、ヒツジおよびヤギ）に、ならびに特にヒトに由来する。ある実施形態において、幹細胞は、自系源またはＨＬＡ型適合源に由来する。たとえば、幹細胞を膵臓ホルモン産生細胞が必要な対象（たとえばインスリン産生細胞が必要な糖尿病患者）から採取し、培養して自系インスリン産生細胞を生成させることができる。他の幹細胞源、たとえば筋肉組織による幹細胞、皮膚による幹細胞（真皮または表皮）および脂肪による幹細胞は、対象から容易に採取される。
【０１１６】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒトに投与するための細胞は、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）または他国の同等の監督官庁が制定したｇｏｏｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに適合すべきである。このような細胞株を開発する方法は、ドナー検査、ならびに非ヒト細胞および生成物への暴露を回避することを含み得る。
【０１１７】
ドナー（場合により患者がドナーである）に由来する細胞は、送達される細胞の目的によって指示されるように、未分画または分画細胞として投与され得る。細胞は、投与前にある細胞型を濃縮するために分画され得る。分画の方法は当分野で周知であり、一般に正の選択（すなわち特定の特性に基づく細胞の保持）および負の選択（すなわち特定の特性に基づく細胞の除去）の両方を含む。当業者に明らかになるように、正および負の選択に使用される特定の特性（たとえば表面マーカー）は、所望の細胞集団に依存するであろう。細胞の選択／濃縮に使用する方法は、免疫親和性技術または密度遠心分離法を含み得る。免疫親和性技術は、当分野で周知であるように、多様な形を取り得るが、一般に、ある種類の分離技術と組合せて抗体または抗体誘導体を利用する。分離技術は一般に、抗体に結合された細胞および抗体に結合されていない細胞の物理的分離を引き起こすが、いくつかの例において、抗体に結合された細胞を致死させる分離技術が負の選択に使用され得る。
【０１１８】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、パニング、免疫磁気分離、免疫親和性クロマトグラフィー、抗体媒介補体結合、抗毒素、密度勾配分離などを含む、任意の好適な免疫親和性技術が、使用される選択した細胞の選択／濃縮に利用され得る。免疫親和性プロセスでの処理後に、所望の細胞（正の選択の場合には、免疫親和性試薬によって結合された細胞、および負の選択の場合には免疫親和性試薬によって結合されていない細胞）を収集して、さらなる回数の免疫親和性選択／濃縮を行うか、または患者への投与のために貯蔵するかのどちらかである。
【０１１９】
免疫親和性選択／濃縮は通例、所望の細胞型を含む細胞の調製物を抗体または抗体由来親和性試薬（たとえば所与の表面マーカーに対して特異的な抗体）によってインキュベートして、次に結合した親和性試薬を利用して、抗体が結合している細胞に有利または不利な選択のどちらかを行うことによって実施される。選択プロセスは一般に、単一の細胞を含有する液滴を結合親和性試薬の存在または非存在に応じて異なる容器に導入すること（ＦＡＣＳ）によって、固相基質に（直接または間接的に）結合された抗体を利用すること（パニング、免疫親和性クロマトグラフィー）によって、または磁場を利用して親和性試薬を介して磁性液滴に結合した細胞を収集すること（免疫磁性分離）によって達成できるような、物理的分離を含む。代わりに、親和性試薬に結合された細胞に細胞毒性傷害を指示する親和性試薬を使用して、望ましくない細胞を調製物から除去することができる。細胞毒性傷害は、親和性試薬（たとえば補体結合）によって活性化され得るか、または親和性試薬（たとえばリシンＢ鎖などの抗毒素）によって標的細胞に局在化され得る。
【０１２０】
本明細書で開示する方法は細胞のインビボ監視に頻繁に使用されることが予想されるが、方法が培養物中、組織試料または他のエキソビボ細胞物質中の細胞の監視にとって等しく有効であることに注目すべきである。治療用途のために、細胞は患者への投与のための調製中の所望のステップで標識され得る。
【０１２１】
多様な方法を使用して、細胞を造影試薬で標識することができる。一般に細胞は、造影試薬が細胞と結合されるように、造影試薬と接触して配置されるであろう。条件は、細胞生存能力を維持するために設計された標準細胞培養条件であることが多い。「結合した」という用語は、インビボまたはインビトロにかかわらず、造影試薬が細胞位置に関する有用な情報を提供できるような十分な時間にわたって、造影試薬および細胞を物理的に十分に接近させておく任意の方式を含むことを意図する。造影試薬は細胞内で、たとえば食作用または界面活性剤に媒介された細胞への進入後に、細胞内に配置され得る。免疫細胞、たとえば樹状細胞、マクロファージおよびＴ細胞は高い食作用を示すことが多く、本明細書または他の研究で示されたデータによって、このような細胞、および他の食作用細胞型がただちに標識されることが証明されている。他の細胞型、たとえば幹細胞も食作用活性とは無関係に標識され得る。造影試薬は、細胞膜中に挿入され得るか、または細胞の細胞外成分に共有もしくは非共有結合され得る。たとえば本明細書に記載するある直鎖フルオロカーボンを誘導体化して、１個以上の標的部分に結合することができる。標的部分は、造影試薬の標識される細胞との結合を促進するために選択されるであろう。標的部分は、細胞膜中へのフルオロカーボンの非特異的挿入を引き起こすために（たとえば疎水性アミノ酸配列またはパルミトイル部分もしくはミリストイル部分などの他の疎水性部分）または細胞中への非特異的進入を促進するために設計され得る。標的部分は、受容体リガンドの場合と同様に、細胞表面成分に結合し得る。標的部分は特異的結合対のメンバであり得て、パートナーは細胞表面成分である。標的部分は、たとえば受容体のリガンド、または抗体、たとえば免疫グロブリンの可変部分を含むモノクローナルもしくはポリクローナル抗体もしくは各種のポリペプチド結合剤（たとえばＦｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体、ヒト化抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ）のいずれかであり得る。ある実施形態において、フルオロカーボン造影試薬は、ペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを含む。
【０１２２】
フルオロカーボンエマルジョンによる細胞標識化は、細胞中での送達を補助するトランスフェクション剤を使用することによっても促進することができる。トランスフェクション剤は、カチオン性脂質、カチオン性リポソーム、ポリカチオンなどから成ることが多い。トランスフェクション剤は、フルオロカーボンエマルジョン標識剤と事前に混合することによって、エマルジョン液滴と結合するようになるか、またはエマルジョン液滴をコーティングする。次にトランスフェクション剤で処理したエマルジョン液滴を培養した細胞に添加して、細胞が標識されるようにインキュベートする。一般的なトランスフェクション剤は、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）ＦｕＧｅｎｅ、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、およびポリ−Ｌ−リジンを含む。多くの種類のプロタミンなどの小型タンパク質も、トランスフェクション剤として使用できる。大半の脊椎動物の精子の核中の主要なＤＮＡ結合タンパク質であるプロタミンは、体細胞核の５％未満の量のＤＮＡを包んでいる。プロタミンは、アルギニンが豊富であり、強塩基性である低分子量の単純タンパク質である。市販のプロタミンは、サケまたは他のある種の魚の精子に由来している。「プロタミン」という用語は、本明細書で使用するように、低分子量でカチオン性の、アルギニンが豊富なポリペプチドを指す。プロタミン分子は通例、約２０〜約２００アミノ酸を含み、通常、少なくとも２０％、５０％または７０％のアルギニンを含有することを特徴とする。プロタミンは、１個以上の対イオンを用いて、硫酸塩、リン酸塩および塩化物などの塩として製剤されることが多い。
【０１２３】
本出願で提供するデータは、プロタミン（たとえば硫酸プロタミン）がＰＦＰＥフルオロカーボンエマルジョン液滴を培養された細胞に送達するのに非常に有効であることを示す。好適な硫酸プロタミンは、多様な源（たとえばサケ、ニシン、マスなど）に由来して、各種のグレードおよび形（たとえばＵＳＰ、グレードＩＩ、ＩＩＩ、Ｘなど）であり、ヒストンまたは任意の組み換え誘導体を含んでも含まなくてもよい。トランスフェクション剤として使用され得る他のプロタミン溶液の例は、リン酸プロタミン、塩化プロタミン、硫酸プロタミン−２、硫酸プロタミン−３、硫酸プロタミン−１０、およびプロタミン遊離塩基を含む。
【０１２４】
本出願で提供されるデータは、自己送達型ナノエマルジョンがフルオロカーボン造影試薬（たとえばペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルまたはＰＦＰＥオキシド）によって調製され、プルロニック（商標）界面活性剤を場合により硫酸プロタミンと共に、またはクレモホール（登録商標）ＥＬを乳化剤と共に、および添加剤を含むことを示している。細胞とある自己送達型ナノエマルジョンとの単純な同時インキュベーションによって、トランスフェクション試薬を必要とせずに、撮像のために十分な細胞標識化が提供される。
【０１２５】
細胞が治療レジメンで使用される場合、各種の方法が、注射および細胞を各種臓器にインプラントするための特殊器具の使用を含む細胞の送達に使用されている。本発明は、いずれかの特定の送達方法に拘束されない。標識細胞は、細胞が特定部位に直接送達されるか、または全身的に送達されるかにかかわらず監視され得る。たとえば標識ＤＣは、組織への直接の局所インプラントまたは静脈内注射のどちらかの後に正しく撮像され、Ｔ細胞は腹腔内注射の後に撮像された。細胞は、対象への注射またはインプラントによる導入を容易にする送達器具中に挿入され得る。このような送達器具は、レシピエント対象の体内に細胞および流体を注入するためのチューブ、たとえばカテーテルを含み得る。好ましい実施形態において、チューブは針、たとえばシリンジをさらに有し、これを通じて本開示の細胞を対象中の所望の位置に導入することができる。細胞は送達のために、多様な異なる形で調製され得る。たとえば細胞は、このような送達器具に含有されるときに、溶液もしくはゲル中に懸濁され得るか、または支持マトリクスに包埋され得る。細胞は、本開示の細胞がその中で生存可能である製薬的に許容される担体または希釈剤と混合され得る。製薬的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒を含む。このような担体および希釈剤の使用は当分野で周知である。溶液は好ましくは滅菌され、流動性である。好ましくは、溶液は製造および貯蔵条件下で安定であり、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を受けずに保存される。本開示の溶液は、滅菌濾過の後に、製薬的に許容される担体または希釈剤中に本明細書に記載するような細胞を、そして必要に応じて上に挙げた他の成分を包含することによって調製され得る。
【０１２６】
４．核磁気共鳴技法
本明細書に記載するように、核磁気共鳴技法を使用して、標識細胞の集団を検出することができる。「検出する」という用語は、特に核磁気共鳴技法によって、標識分子または細胞の存在または非存在を確認するいずれの試みも含む。「検出する」という用語は、定量的測定および２または３次元画像生成を含む、より高度な測定を含むことも意図する。たとえばＭＲＩを使用して、このような細胞の画像が生成され得る。多くの例において、標識細胞は生存対象に投与され得る。細胞の投与後に、対象のある部分、または対象全体をＭＲＩによって検査してＭＲＩデータセットを生成してもよい。他の例では、エマルジョンを直接ｉｖ注射して、次に対象を１時点またはそれ以上で撮像する。「データセット」は、本用語が本明細書で使用されるように、対象物質の磁気共鳴プロービング中に収集された生データ、取得パラメータはもちろんのこと、生データから処理、変換または抽出された情報も含むことを意図する。生データは、自由誘導減衰、スピンエコー、刺激エコー、および／または勾配エコーを含む、ＭＲＩ／ＭＲＳによって取得した過渡シグナルを含む。処理情報の例は、対象物質の２次元または３次元画像表現を含む。処理情報は、強度画像、実数および虚数画像成分はもちろんのこと、関連付けられた位相マップ画像も含み得る。抽出情報の別の例は、対象物質中の撮像試薬または１９Ｆシグナルの量または濃度を表現するスコアである。対象物質中の１９Ｆシグナル、およびインプラント前の細胞当りの造影試薬の平均量の校正（エキソビボ標識化の場合）を使用することによって、対象物質中の細胞の絶対数を概算することができる。対象物質に存在する１９Ｆシグナルの量は、多くの方法で表現または計算することができる；たとえば関心領域（ＲＯＩ）での１９Ｆシグナルの平均シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を測定および使用して、標識細胞の存在量が計算され得る。ある実施形態において、１９Ｆシグナルの平均強度、または画像単位もしくはボクセル単位の総和を使用して、標識細胞の存在量が計算され得る。この種類のデータは、対象の単一の領域、たとえば脾臓または標識細胞に特に関連性のある別の臓器にて収集され得る。標識細胞は、対象以外の状況で検査され得る。培養物中で標識細胞を検査することが所望であり得る。ある実施形態において、標識細胞を組織試料または組織培養物内にて添加または産生することができ、したがって標識細胞はこのような状況でも撮像され得る。たとえば移植される臓器、組織または他の細胞物質を造影試薬と接触させて、このような移植物の対象へのインプラント前に標識細胞を産生することができる。
【０１２７】
一般に、本開示の標識剤は、従来のＭＲＩ検出システムで使用するために設計されている。ＭＲＩを最も一般的に実施する際には、対象物質中に含有される移動する水の分子中の水素核（プロトン、１Ｈ）が観察される。本明細書で開示する標識を検出するためには、代わりの核１９Ｆを検出する。１９Ｆ  ＭＲＩは、１Ｈと比較してごくわずかに低い固有感度を有する；相対感度は約０．８３である。どちらも＋１／２の核スピンを有する。１９Ｆの天然同位体存在量は１００％であり、１Ｈの９９．９８５％に匹敵する。検出および画像形成の背後にある物理的原理は、１Ｈおよび１９Ｆ  ＭＲＩの両方で同じである。対象物質を大型静止磁場に置く。場は、１Ｈまたは１９Ｆ核に関連付けられた磁気モーメントを場方向に沿って整列させる傾向がある。核はラーモア周波数のパルス化高周波（ＲＦ）放射によって平衡状態から撹乱され、ラーモア周波数は、核がエネルギーを共鳴して吸収する磁場強度に比例する特徴的な周波数である。ＲＦを除去するときに、核は受信器アンテナで過渡電圧を誘導する；この過渡電圧は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）シグナルを構成する。空間的情報は、大型静止場に重ねられた磁場勾配の選択的印加によって、ＮＭＲシグナルの周波数および／または位相の両方でコードされる。過渡電圧は一般にデジタル化され、次にこれらのシグナルをたとえばコンピュータによって処理して、画像を得ることができる。
【０１２８】
一定の磁場強度での１９Ｆのラーモア周波数は、１Ｈと比較してわずかにやや低い（〜６％）。それゆえ１９Ｆデータの取得に、従来のＭＲＩスキャナのハードウェアおよびソフトウェアの両方を適応させることは容易である。１９Ｆ検出は、異なる種類の磁気共鳴スキャン、たとえばＭＲＩ、ＭＲＳまたは他の技法と組合せられ得る。通例、１Ｈ  ＭＲＩ画像を取得して１９Ｆ画像と比較することが所望であろう。生物または他の生体組織において、プロトンＭＲＩによって対象物質の画像が提供され、１９Ｆ画像で検出された標識細胞の解剖学的状況を定義することができる。本開示の好ましい実施形態において、同じセッションの間に、１９Ｆおよび１Ｈの両方についてデータが収集される；２つのデータセットがより確実に、空間的に位置合せされるように、これらの取得中に対象は移動されない。通常、１９Ｆおよび１Ｈデータセットはどちらかの順序で順次取得される。１９Ｆおよび１Ｈラーモア周波数から電気的に同調可能であるＲＦコイル（すなわちアンテナ）を架設することができる。これらの２つの周波数の間の同調は、手動（たとえば電気機械可変コンデンサまたはインダクタによって）、またはアクティブ電子回路によって電気的に実施することができる。代わりに、ＭＲＩ装置のハードウェアおよび／またはソフトウェアの適切な改良によって、どちらのデータセットも同時に取得して、たとえば撮像時間を短縮することができる。１９Ｆおよび１Ｈデータセットの同時取得には、１９Ｆおよび１Ｈラーモア周波数に同時に電気的に同調できるＲＦコイルまたはアンテナ（すなわち２重同調コイル）が必要である。代わりにＲＦコイルは、両方のラーモア周波数（すなわち１９Ｆおよび１Ｈ）を範囲に含む１つの広域同調電気共鳴を備えた「ブロードバンド」であってもよい。他の撮像技法、たとえば蛍光検出が１９Ｆ  ＭＲＩと組合され得る。このことは、フルオロカーボン造影試薬が蛍光部分によって誘導体化されている場合に特に所望であろう。他の実施形態において、１９Ｆ  ＭＲＩスキャンは、本明細書に記載するような２重モデル放射性１８Ｆ／１９Ｆフルオロカーボン標識化試薬を使用することによって、同じ対象または患者においてＰＥＴスキャンと組合され得る。
【０１２９】
ＭＲＩ検査は、当分野で公知の任意の好適な方法に従って実施され得る。多くの異なる種類のＭＲＩパルスシーケンス、またはデータ収集を調整するためにＭＲＩ装置によって使用される命令のセット、およびシグナル処理技法（たとえばフーリエ変換および投影復元法）は、画像データの収集および処理のために長年にわたって開発されてきた（たとえばＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９を参照）。本開示の試薬および方法は、いずれの特定の撮像パルスシーケンスまたは生ＮＭＲシグナルの処理方法に拘束されない。たとえば本開示に適用できるＭＲＩ方法は、スピンエコー、刺激エコー、勾配エコー、自由誘導減衰ベース撮像、およびその任意の組合せを広範に含む。ｋ空間の２本以上のラインまたはｋ空間の大型セグメントが各励起シグナルから取得される高速撮像技法も、１９Ｆ（または１Ｈ）データを取得するのに非常に好適である。高速撮像技法の例は、高速スピンエコー手法（たとえばＦＳＥ、ターボＳＥ、ＴＳＥ、ＲＡＲＥ、またはＨＡＳＴＥ）、エコープラナー撮像（ＥＰＩ）、勾配エコーおよびスピンエコー併用技法（たとえばＧＲＡＳＥ）、スパイラル撮像、およびバースト撮像を含む。新規および改良パルスシーケンスおよびシグナル処理方法の開発は、絶えず進化している分野であり、当業者は、その解剖学的状況で１９Ｆ標識細胞を撮像する複数の方法を考案することができる。
【０１３０】
核磁気共鳴技法の別の例として、ＭＲＳを使用して、局在組織または臓器におけるフルオロカーボン標識細胞の存在を検出することができる。通常、ＭＲＳ方法は、従来のＭＲＩスキャナで実施される。局在関心体積（ＶＯＩ）は、従来の解剖学的１Ｈ  ＭＲＩスキャン内で定義されることが多い。次に、ＶＯＩ内で観察される１９Ｆ  ＮＭＲシグナルの大きさは、標識細胞の数、および／または組織または臓器に存在する細胞当りのＰＦＰＥの平均濃度と直接関連付けられる。はるかに大型の対象内のＶＯＩを隔離する方法は、当分野で周知である（たとえばＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ
１９９９）。例は、ＶＯＩ付近の局在ＲＦ表面コイル、表面スポイリング、表面コイルＢ１勾配方法、スライス選択的Ｂ０勾配技法、ＳＴＥＡＭ、ＰＲＥＳＳ、画像選択的インビボ分光法（ＩＳＩＳ）、および磁気共鳴分光撮像（ＭＲＳＩ）の使用を含む。ＭＲＳの新規および改良パルスシーケンスおよびシグナル処理方法の開発は、絶えず進化しており、当業者は、ＶＯＩ内のフルオロカーボン標識細胞から生じる１９Ｆ  ＮＭＲシグナルを検出する複数の方法を考案することができる。
【０１３１】
ある場合において、対象物質は、動物またはヒトから生検または剖検された組織の、固定またはそうでなければ保存された試料である。次に対象物質に従来の高分解能の１次元または多次元液体状態１９Ｆ  ＮＭＲを受けさせて、試料中に存在するフッ素の量を定量する。フッ素含有量は、対象物質（ｍａｔｅｒａｌ）試料中の標識細胞の数に直接関連付けられる。常在する食細胞（たとえば単球、マクロファージ、好中球、肝臓の細胞）の上述のようなフッ素エマルジョンによるインサイチュー標識化（たとえばナノエマルジョン３を使用する）の場合、試料中で測定された１９Ｆの量は、組織中に存在するこれらの食細胞の数に正比例する。このようにして、組織学的または他の破壊的で時間のかかる技法を使用することを必要とせずに、無傷組織の炎症の相対量をアッセイすることができる。ある実施形態において、組織の１９Ｆ含有量を分析するために、１次元１９Ｆ  ＮＭＲを使用する。ある実施形態において、細胞標識化エマルジョンの組成物と異なる化学シフトを有する１９Ｆスピンの数が既知である試料に、１９Ｆ参照化合物を添加する（下を参照）。ある実施形態において、エマルジョンピークおよび参照ピーク下の相対積分面積を使用して、組織試料中に存在するフッ素の絶対数を計算することができる。ある実施形態において、組織試料の重量もこの計算に含めて組織試料の平均フッ素密度を抽出することができ、このパラメータは、炎症の定量的指数、すなわち「炎症指数」と見なすことができる。
【０１３２】
ある実施形態において、本開示は、インビボでの、またはＲＯＩ内の対象物質中の標識細胞の数を定量する方法を提供する。ＲＯＩは、対象中のすべての標識細胞、または膵臓などの特異的臓器、リンパ節などの特異的組織、もしくは任意の領域における、または検出可能なＭＲＩ／ＭＲＳ  １９Ｆシグナルを示す１個以上のボクセルの標識細胞を含み得る。ＲＯＩは、特定の実験の範囲を超えた別の未定義の面積であり得る。標識細胞が対象物質中またはインビボで定量され得る方法は、本明細書に記載するようにいくつかある。
【０１３３】
エキソビボ標識化の場合、特定の細胞集団のインプラント前に１９Ｆ標識試薬の平均「細胞用量」を校正することは、対象物質または患者における定量的細胞決定の前提条件であることが多い。異なる細胞型が有するインビトロで標識化剤を取り込む固有の能力が異なり、それゆえ標識化剤の細胞用量も変わることが予想される。さらに、異なる源（たとえば異なる患者）から取得した同じ型の異なる細胞は、標識化剤に対して異なる親和性を有し得る。それゆえ細胞用量の校正が必要であり得る。この校正を使用して最初に標識化プロトコル（すなわちインキュベーション条件、細胞が標識化フルオロカーボンエマルジョンでインキュベートされる期間、標識化の間の培地中のフルオロカーボンエマルジョンの濃度など）を修正して、撮像される対象で標識細胞を実際に使用する前にある範囲の細胞用量を実現することができる。代わりに、標識化条件およびプロトコルを固定して、撮像される対象での次の定量のために細胞１個当りの標識１９Ｆの平均値を測定することができる。ある実施形態において、標識細胞集団の細胞１個当りの１９Ｆ分子の平均数（Ｆ’ｓ）は、対象または患者への細胞の投与前に、インビトロで測定（すなわち校正）される。ある実施形態において、標識細胞集団の細胞１個当りの１９Ｆ分子の平均数（Ｆ’ｓ）は、特定の種類の細胞の試験集団にて校正され、必ずしも患者向けであるというわけではないが、標識化剤の細胞用量を校正するために、特定の標識化プロトコルまたは条件セットの結果として使用される；場合により、細胞用量の値は次に、同じ標識化プロトコルを使用して、細胞の同じ集団型での今後の標識化およびインビボ撮像実験で使用される。
【０１３４】
標識化剤の細胞用量は、多様な定量的技法を使用して、インビトロでアッセイすることができる。たとえば、標識細胞の数が既知である細胞ペレット、細胞懸濁物、または細胞溶解物から得た１次元（１Ｄ）１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを使用することができる。このスペクトルから、細胞と結合した標識化試薬から発生した１９Ｆスペクトルの積分面積またはその一部を計算することができる。Ｓｃｅｌｌｓとして示される、１９Ｆスペクトルの積分面積は細胞ペレット、懸濁物、または溶解物中の１９Ｆの総量に正比例する。１９Ｆ核の絶対数を測定するために、測定したＳｃｅｌｌｓは１９Ｆ標準に正規化され得る。１９Ｆ標準はたとえば、フルオロケミカルの体積および濃度が既知である溶液であることが可能であり、ここでＦｓｔａｎとして示される、標準中の１９Ｆ核の総数を計算することができる。好適なフルオロケミカル参照は理想的には、好ましくは単一狭幅共鳴と、場合により標識化フルオロカーボンとは著しく異なる１９Ｆ化学シフトとを持つ、単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを有する（たとえばトリフルオロ酢酸、すなわちＴＦＡ）。１９Ｆ標準は、測定中の標識細胞物質と同じＮＭＲチューブに、別のチューブに入れることができるか、または場合により、同じＮＭＲ装置を使用して別の実験で測定することができる。次に、Ｓｓｔａｎで示される、１９Ｆ標準によるスペクトルの積分面積を測定することができる。続いて、Ｆｃで示される、標識細胞１個当りの１９Ｆの平均数は、たとえば式を使用して計算することができる：
【０１３５】
【数２】
2015062693.tif 000004
式中、Ｎｃｅｌｌｓは、インビトロ試験試料に含有される標識細胞の数である。１９Ｆおよび他の核のための定量的ＮＭＲ方法は当分野で周知であり、当業者は、上述の細胞用量校正手順の多くの変形を考案することができる。１９Ｆ  ＮＭＲ以外に標識化試薬の細胞用量をアッセイするために使用できる他の定量的方法がある。たとえば試薬は、蛍光によって、発光によって、光学的に、または放射線によって標識され得る（たとえば参照によりその全体が本明細書に組み入れられているＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００７−０２５８８８６を参照）。
【０１３６】
同様に、エマルジョンのｉｖ注射後に循環している食細胞のインサイチュー細胞標識化の場合、有効な細胞標識化を測定するために、上述の方法を使用して、対象からの末梢血の一部を溢出させて（ｅｘｔｒａｖｅｓａｔｅ）、白血球の有効細胞ローディングを測定することができる。さらに、どの細胞集団がインサイチューで標識されたかをより良好に定義するために、各種の細胞選別または濃縮技法の１つ以上を使用して、ローディング測定（上述）の前に食細胞（たとえばマクロファージ）を選別することができる。測定した細胞標識化パラメータを次に使用して、組織中に存在する見かけの炎症細胞の数を本明細書に記載する磁気共鳴方法を用いて計算することができる。
【０１３７】
１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットから標識細胞の正確な定量および／または相対炎症スコアを抽出するために、さらなる校正および標準が使用され得る。たとえば、標識細胞を含有する対象物質の実際の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳスキャンの間に、校正外部１９Ｆ参照（すなわちファントム）を使用することができる。校正したファントムの画像強度は、たとえば対象物質または患者を検査する際に、１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットを分析して１９Ｆ核の数の絶対標準を証明するときに使用される。校正したファントムを使用して、撮像される特定の対象をロードした特定のＭＲＩ／ＭＲＳシステムの感度を正規化する。１９Ｆ参照はたとえば、１９Ｆ核の濃度が既知である溶液を含有する１個以上の容器であり得る。好ましい実施形態において、溶液は希釈濃度の乳化フルオロカーボン標識化試薬を含有する。場合により、溶液は、たとえば好適な溶媒で希釈された非乳化フルオロカーボン標識化試薬、ゲル、または液体を含有する。場合により、溶液は、好ましくは単一の狭幅ＮＭＲ共鳴を持つ、理想的には単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを備えた別のフルオロケミカル（たとえばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはトリフルオロアセトアミド（ＴＦＭ）および他のフッ化酸、トリフルオロトルエンまたはトリフルオロエタノール）から成ることが可能である。好ましい実施形態において、参照溶液のＴ１およびＴ２値は、標識化試薬のＴ１およびＴ２値と同様である。場合により、溶液はペルフルオロカーボン標識細胞、またはその溶解物を含むことができる。非細胞参照は、貯蔵時間がより長いという利点を有する。場合により、溶液はゲルの形をとることができる。溶液を含有する容器は、好ましくは密封可能であり、多様な形態を取ることができる；好ましい容器形態は、楕円形、円筒形、球形、および平行六面体形を含む。１９Ｆ参照溶液を含有する１個以上の容器を対象物質の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳの間に使用することができる。複数の１９Ｆ参照（すなわち容器）が使用される場合、それらは同じ１９Ｆ濃度または異なる濃度を含有することが可能であり、異なる濃度を含有する場合、それらは理想的には段階的濃度のフルオロケミカルを含有する。校正した１９Ｆ参照の容器の配置は好ましくは、データ取得の前に撮像される対象もしくは患者の外部または対象もしくは患者に沿って、または場合により対象もしくは患者の内部に配置できる。好ましい実施形態において、参照は、１９Ｆ  ＭＲＩを使用して、対象と共に同じ画像視野（ＦＯＶ）内に撮像される。場合により、１９Ｆ  ＭＲＳデータは、対象データセットと連続的または並列のどちらかで、参照中に取得される。場合により、参照からのデータは、別のスキャンで取得したＭＲＩ／ＭＲＳを使用して取得される。場合により、外部参照は、各１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳ検査で対象と共にスキャンされないが、ＭＲＩ／ＭＲＳを使用して取得した参照１９Ｆシグナル強度の値はむしろ、比較可能な対象またはシミュレートされた対象のスキャンから使用される。所与の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳスキャンでは、校正された１９Ｆ標準は、１ボクセル単位またはそれ以上でサンプリングされ得る。ボクセルによって生成された観察可能な１９Ｆ強度は、溶液（またはゲル）中のフルオロケミカルの濃度およびボクセル体積に比例し得る。１９Ｆ  ＭＲＩスキャンでは、参照標準が多くのボクセルで構成されることが多い。参照標準の１個、複数またはすべてのボクセルの平均強度が計算されることが多い。場合により、平均画像強度は、参照標準の１９Ｆ画像内で定義されたＲＯＩに対して計算される。場合により、参照標準容器の物理学的形態は、観察された１９Ｆシグナル強度の定義に寄与する；たとえば、１９Ｆ参照溶液を含有する体積コンパートメントは、ボクセル体積よりも小さい。他の実施形態において、校正された外部参照は、検出可能な１Ｈの数が既知である、１Ｈシグナル強度を持つ溶液に依存している；この場合、対象物質の１９Ｆシグナルの感度は、１Ｈ校正標準の参照である。理想的には、１Ｈ校正参照の溶液またはゲル（上述のように容器に含有された）によって、単一の狭幅ＮＭＲ共鳴を持つ、単純な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが生じる（たとえばＨ２Ｏ、またはＨ２Ｏ−Ｄ２Ｏの混合物）。１Ｈ標準参照の使用は、核が異なる以外は、１９Ｆ参照について上述した他の多くの点で同じである。場合により、校正した参照標準は、その他の任意のＭＲＩ／ＭＲＳ活性核を含有する。いくつかの実施形態において、参照は、１Ｈ  ＭＲＩ／ＭＲＳによって検出された内部臓器または組織であり、データは生であるか、または正規化され得る。他の実施形態において、参照は、対象と共にスキャンされない標準であるが、患者の体重または体腔のサイズなどの関連因子によって校正される。
【０１３８】
１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットからの２個以上の主要パラメータをコンピュータにより操作または組合せすることによって、本明細書に記載するようにＲＯＩ中の標識細胞の数および／または炎症の相対量を計算することができる。たとえばパラメータの主要セットは：（ｉ）インビトロで測定された標識化剤の細胞用量（すなわちＦｃ）；（ｉｉ）標識細胞投与後に１回以上の時点で対象にて取得された、インビボ１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセット；（ｉｉｉ）ボクセル体積；（ｉｖ）平面内ボクセル面積（すなわち画像画素の面積）；（ｖ）場合により、１９Ｆ参照標準からのＭＲＩ／ＭＲＳデータセット；（ｖｉ）場合により、対象物質中の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータの測定されたジョンソンノイズ；（ｖｉｉ）場合により、対象物質中の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットの１個以上のボクセルの測定されたシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）；（ｖｉｉｉ）場合により、参照標準からの１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットの１個以上のボクセルの測定されたＳＮＲ；（ｉｘ）場合により、対象物質の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２、およびＴ２＊）；（ｘ）場合により、参照標準の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（Ｔ１、Ｔ２、およびＴ２＊）を含み得る（たとえばＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９を参照）。当業者は、特に１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットから、インサイチューの標識細胞数を定量するために使用できる、他のパラメータ、上のセットの組合せ、またはその派生を誘導することができる。ある実施形態において、主要パラメータの上のセットを使用して、測定した標識細胞数の精度または信頼性の定量的または統計的尺度を誘導することができる。
【０１３９】
主要パラメータ（上のｉ〜ｘ）、これらの任意のサブセット、またはその組合せもしくは近似値のいずれかを組合せて、Ｎｃで示される、対象物質中で１９Ｆ  ＭＲＩによって参照された標識細胞の有効数を概算するための多くの方法がある。たとえば、
【０１４０】
【数３】
2015062693.tif 000005
という形の式を使用できる。式中：Ｎｃ＝ＲＯＩ中の標識細胞の総数；［ＦＲ］＝校正した１９Ｆ参照溶液（またはゲル）中の１９Ｆの濃度；ｖ＝ボクセル体積；ＩＲ＝ＭＲＩ／ＭＲＳスキャンによって取得して、１以上のボクセルで平均した、校正１９Ｆ参照の平均強度；Ｆｃ＝インビトロで測定した標識化剤の平均１９Ｆ細胞用量；ＮＲＯＩ＝標識細胞を含有するＲＯＩ中のボクセルの数；Ｉｃ（ｉ）＝標識細胞を含有するＲＯＩ中のｉ番目のボクセルの画像強度；ｉ＝標識細胞を含有するＲＯＩ中のボクセルの無単位指数。
【０１４１】
１９ＦデータセットからＮｃを概算する多くの方法もある。たとえば、
【０１４２】
【数４】
2015062693.tif 000006
を使用可能であり、式中、Ｉｃａｖｇは、標識細胞を含有するＲＯＩの平均強度である（すなわちＮＲＯＩボクセルの平均強度）。別の例として、
【０１４３】
【数５】
2015062693.tif 000007
を使用可能であり、式中、Ｖｃは、標識細胞を含有するＲＯＩの総体積である。さらなる例として、
【０１４４】
【数６】
2015062693.tif 000008
を使用可能であり、式中、ＶＲは、１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳにおける参照の有効体積であり、ＮＲは、ＶＲ中の１９Ｆ核の数である。上の式のすべてにおいて、各種の強度（すなわちＩＲ、Ｉｃａｖｇ、Ｉｃ（ｉ））を画像ノイズに正規化することができ、それゆえ上の式は、特定の領域の適切なＳＮＲ値によって等しく表現できることに注意する。それゆえ標識細胞の数、Ｎｃを概算する多くの方法があり、これらの基本的な式の多くの同様な形を基本的な数学的操作によって誘導することができるが、すべて（ｉ−ｘ）によって示される入力パラメータに含有される同じ基本的内容に依存している。さらに、ＲＯＩ中の標識細胞の定量は、絶対数または有効細胞数によって表現する必要はない。ＲＯＩ中の細胞の量を示す、他の定量的指数を誘導することができる。たとえば比Ｉｃａｖｇ／ＩＲ、またはＲＯＩおよび参照で観察された平均ＳＮＲ値の比を計算することができる；これらすべては、上の式および／またはパラメータのサブセットに含まれる。
【０１４５】
細胞数および関連する指数の上の分析は、フルオロカーボン標識の１９Ｆ  ＮＭＲ緩和時間（すなわち特にＴ１および／またはＴ２）が校正した１９Ｆ参照標準中の物質とほぼ同じであることを前提としていることに注意する。緩和時間が比較できない場合、当業者は、Ｔ１およびＴ２で表される、使用されている特定の撮像プロトコルの公知のＭＲＩ強度の等式を使用することによって、これをただちに補正することができる。
【０１４６】
場合により、対象物質の１９Ｆ  ＭＲＩデータセットに、（上述のような）実際の細胞定量計算を実施する前に、後処理を受けさせることができる。たとえば後処理アルゴリズムは、１９Ｆデータセットを「ノイズ除去」することを含み得る。このことはたとえば、画像の閾値を定めて低強度ノイズを遮断することによって実施できる；これには低い値がゼロに設定されるように、画像強度を再設計することが含まれる。ＭＲＩ強度画像では、ランダムなジョンソンノイズが明らかであり、画像ＦＯＶに均一に分布していることが多い。低レベル画像強度を閾値外とすることができるため、真のシグナルを含有しない（すなわち１９Ｆおよび／または１Ｈがない）ことが既知の領域がゼロのまたは非常にゼロに近い強度を有すると思われることが、当分野で周知である。このプロセスは、その場限りの方式で（すなわち「手動で」または目視検査によって）、またはコンピュータアルゴリズムによって実施できる。他の実施形態において、データセットのノイズ除去は、他のアルゴリズムを使用すること、たとえばウェーブレット分析を使用することによって実現することができ、多くの方法が画像ノイズ除去の分野で公知である。以下の参考文献はその全体が本明細書に組み入れられている：Ｋｈａｒｅ，Ａ．ら、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＷＡＶＥＬＥＴＳ  ＭＵＬＴＩＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，３（４）：４７７−４９６  ＤＥＣ  ２００５；Ｃｒｕｚ−Ｅｎｒｉｑｕｅｚ，Ｈ．ら、ＩＭＡＧＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＡＮＤ  ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ，３６５６：２４７−２５４  ２００５；Ａｗａｔｅ，ＳＰ．ら、ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＩＮ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ，ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ，３５６５：６７７−６８８  ２００５；Ｇａｎｅｓａｎ，Ｒ．ら、ＩＩＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ，３６（９）：７８７−８０６  ＳＥＰ  ２００４；Ｓｃｈｅｕｎｄｅｒｓ，Ｐ．，ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＩＭＡＧＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，１３（４）：４７５−４８３  ＡＰＲ  ２００４；Ｇｈｕｇｒｅ，ＮＲ．，ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＭＡＧＩＮＧ，２１（８）：９１３−９２１  ＯＣＴ２００３；Ｂａｏ，Ｐ．ら、ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ，２２（９）：１０８９−１０９９  ＳＥＰ  ２００３；Ｗｕ，ＺＱ．ら、ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ，３９（７）：６０３−６０５  ＡＰＲ  ３  ２００３；ＬａＣｏｎｔｅ，ＳＭ．ら、ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，４４（５）：７４６−７５７  ＮＯＶ  ２０００；Ｌａｉｎｅ，ＡＦ．，ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，２：５１１−５５０  ２０００；Ｚａｒｏｕｂｉ，Ｓ．ら、ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ  ＩＭＡＧＩＮＧ，１８（１）：５９−６８  ＪＡＮ  ２０００；Ｎｏｗａｋ，ＲＤ．，ＩＥＥＥ  ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ  ＯＮ  ＩＭＡＧＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，８（１０）：１４０８−１４１９  ＯＣＴ  １９９９；およびＨｅａｌｙ，ＤＭ．ら、���ＮＮＡＬＳ  ＯＦ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，２３（５）：６３７−６６５  ＳＥＰ−ＯＣＴ  １９９５。
【０１４７】
定量の前後に１９Ｆ  ＭＲＩデータセットに適用できる他の種類の後処理アルゴリズム、たとえばゼロ充填（Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｙ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ  Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）および各種の画像内挿、ノイズ除去、および画像平滑化アルゴリズム（たとえばＴｈｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｒｕｓｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ／ＩＥＥＥ  Ｐｒｅｓｓを参照）が当分野で公知である。
【０１４８】
ある実施形態において、主要パラメータ（ｉ〜ｘ）の上のセットを使用して、測定した標識細胞または関連する指数の精度または信頼性の定量的または統計的尺度を誘導することができる。１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳデータセットはＲＯＩ内でＳＮＲ制限を受けることが多く、それゆえ測定値の信頼性または精度の測定基準を計算することが有用であることが多い。ＭＲＩおよび生物医学型画像の統計的分析ための多くの方法が当分野で公知である。請求された実施形態は、これらの公知の方法を含むと理解される。
【０１４９】
５．製薬的製剤および使用
本出願のエマルジョンの投与方法は、当業者に周知である。所望の活性を実現するために、エマルジョンは多様な単位投薬形で投与することができる。用量は、特定のエマルジョンによって変わるであろう。用量も投与方式、患者の全身の健康状況、状態、サイズ、および年齢に応じて変化するであろう。
【０１５０】
ある実施形態において、エマルジョンの投与は、静脈内経路によって、たとえば注射による静脈内輸液を介して実施され得る。ある実施形態において、他の投与経路が使用され得る。注射に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に記載されている。このような製剤は、滅菌性および非発熱性でなければならず、一般に製薬的に有効な担体、たとえば生理食塩水、緩衝（たとえばリン酸緩衝）生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース／生理食塩水、グルコース溶液などを含むであろう。製剤は、製薬的に許容される補助物質、浸透圧調整剤、湿潤剤、殺菌剤、保存料、安定剤などを必要に応じて含有し得る。ある実施形態において、静脈内投与に好適な緩衝剤を使用して、エマルジョン安定性を補助する。ある実施形態において、グリコールを使用して、エマルジョンの安定性を補助する。
【０１５１】
ある実施形態において、エマルジョンの投与は、非経口経路によって、通例、関節内もしくは静脈内注射（たとえば静脈内輸液）または筋肉内注射などの注射を介して実施され得る。他の投与経路、たとえば経口（ｐ．ｏ．）は、投与される特定のエマルジョンにとって所望であり、実行可能であれば使用され得る。
【０１５２】
湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムはもちろんのこと、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料および抗酸化剤も、本出願の製薬組成物に存在することができる。
【０１５３】
ある実施形態において、主題エマルジョンの製剤は、内毒素および／または関連する発熱性物質を実質的に含まない、発熱物質を含まない製剤である。内毒素は、微生物内部に閉じ込められ、微生物が破壊または致死したときに放出される毒素を含む。発熱性物質は、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘発性の熱安定性物質（糖タンパク質）も含む。これらの物質のどちらも、ヒトに投与された場合に発熱、低血圧およびショックを引き起こすことがある。潜在的に有害な影響のために、少量の内毒素でも静脈内投与される製薬溶液から除去することが好都合である。Ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物利用では１時間の期間中に体重１キログラム当り、５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。
【０１５４】
主題のエマルジョンの製剤は、経口、食事、局所、非経口（たとえば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、眼科用（たとえば局所または眼内）、吸入（たとえば気管支内、鼻内または経口吸入、鼻内滴剤）、経直腸、および／または膣内投与に好適な製剤を含む。他の好適な投与方法は、再装薬式または生分解性デバイスおよび制御放出ポリマーデバイスも含むことができる。ステントは特に、本出願の薬剤と混合した制御放出ポリマーによってコーティングされ得る。本開示の製薬組成物は、他の薬剤との併用療法の一部として（同じ製剤または別個の製剤のどちらかで）投与することもできる。
【０１５５】
治療的に有効である製剤の量は、標準臨床技法によって決定することができる。さらに、場合によりインビトロアッセイを使用して、最適な投薬量範囲の確認に役立てることができる。製剤で使用される正確な用量も、投薬経路に依存するであろう。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系より得た用量応答曲線から外挿され得る。投与される組成物の投薬量は、標準用量応答試験と併せて必要以上の実験を行わずに、当業者が決定することができる。これらの決定を行う際に検討される関連状況は、治療される１つ以上の状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む。たとえば患者の実際の体重を使用して、投与される製剤の用量がミリリットル（ｍＬ）で計算され得る。「理想」体重への下方調整は行われ得ない。このような状況で、適切な用量は、以下の式：用量（ｍＬ）＝［患者体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）／薬物濃度（ｍｇ／ｍＬ）］によって計算され得る。
【０１５６】
本開示の治療剤は、多様な単位投薬形で投与することができ、その投薬量は、投与されている特定の治療剤のサイズ、効力、およびインビボ半減期によって変化するであろう。
【０１５７】
インサイチュー利用の場合、エマルジョンは、エマルジョンの排除前に食細胞に取り込み可能とするために、最適な薬物動態特性を有するように製剤され得る。
【０１５８】
本開示の治療剤の用量は、投与方式、エマルジョンの特定の用途、患者の全身の健康状況、状態、サイズ、および年齢、ならびに処方する医師の判断に応じても変化するであろう。
【０１５９】
本出願の製剤は、包装材料ならびにエマルジョンおよび投与方式に応じて適切な製薬的に許容される担体を含む製薬薬剤を含む製造品として流通させることができる。本開示の製薬用製剤および使用は、本出願の利用のための任意の公知の組成物と組合され得る。
【０１６０】
６．コンピュータ方法
標識細胞を定量する方法は通例、このような定量を目的として設計されたソフトウェアを動作させ得るコンピュータを活用して実施されるであろう。このようなソフトウェアは、スタンドアロンプログラムであり得るか、または他のソフトウェア、たとえばＭＲＩ画像処理ソフトウェアに組み込まれ得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００７−０２５３９１０を参照）。
【０１６１】
本開示は、本出願のある態様および実施形態を単に例証する目的で含まれており、本開示を限定することを意図しない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１６２】
別途指摘しない限り、以下に示すナノエマルジョンはすべて、酸素検知および細胞追跡のために血液代用物としてエマルジョンの製剤に使用される、当分野で周知のフルオロカーボンである、ペルフルオロ−１５−クラウンエーテルを用いて調製される（その全体が参照により本明細書に組み入れられている、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，８３８，２７４および５，７８５，９５０を参照）。以下の実施例で、我々は、ペルフルオロ−１５−クラウン５エーテルを用いて安定なナノエマルジョンを製剤する新規手法を紹介した。他の新規製剤は、エマルジョンを各種の細胞型の中に「自己送達可能」にする各種の共乳化剤を包含する。本明細書に記載する新規エマルジョン製剤は、特に、インビボ利用に好都合であるナノエマルジョン液滴径の縮小（１１０ｎｍもの小ささ）に関して、従来技術のエマルジョンを超える明らかな改良点を示している。紹介したナノエマルジョンは、単分散（ＰＤＩ＜０．１）として調製され、血清の存在下および体温にて格別な安定性を示す。さらなる新規性は、「自己送達型」特性を達成するための硫酸プロタミンまたは他の共界面活性剤の導入および格別に小さい液滴径および高いインビボ安定性を達成するためのクレモホールＥＬの使用にある。
【０１６３】
紹介したナノエマルジョンはすべて、マイクロフルイダイゼーションを使用して０．５〜１リットルのスケールで調製される。エマルジョンは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して、液滴径および多分散性について動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。エマルジョンの外観を目視で評価した。ナノエマルジョンは血清安定性、ｐＨおよび容量オスモル濃度について試験した。さらに、インビボ実験の有効性が証明されている。
【０１６４】
血清実験はすべて、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．）の存在下のＤＭＥＭ（ダルベッコ変法必須培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）培地中で実施した。
【０１６５】
省略形
ｗ／ｗ    重量／重量比
ＲＴ    室温
ＰＤＩ    多分散指数
ＷＦＩ    注射用水（滅菌）
ＰＳＡ    液滴径分析
ＭＦ    マイクロフルイダイザ
物質
ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル：ＥｘＦｌｕｏｒ，Ｉｎｃ．Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ，ＴＸ．
硫酸プロタミン：Ｓｉｇｍａ  Ｐ３３６９ロット番号０２２Ｋ１２２０１  ＣＡＳ＃  ５３５９７−２５−４  ＵＳＰ試験に適合
プルロニックＦ６８：ＢＡＳＦ（ルトロールＦ６８／ポロキサマー１８８）ＵＳＰ／ＮＦグレード
注射用水：Ｂｒａｕｎ（滅菌／発熱物質を含まない）
コレステロール：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｐｈ  Ｅｕｒ；１４６０６
ＤＰＰＥ：  Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓによるジパルミトイルホスファチジルエタノール：１６：０  ＰＥ  ８５０７０５Ｐ
レシチン（Ｅｇｇ  ＰＣ）：リポイド卵ホスファチジルコリン
クレモホールＥＬＰ：ＢＡＳＦ  １０２０５１０４  ＵＳＰ／ＮＦ  グレード
プロピレングリコール：Ｆａｇｒｏｎ  ＢＶ  １７６９４７  Ｐｈ  Ｅｕｒグレード。
【０１６６】
硫酸プロタミンを含むおよび含まないペルフルオロ−１５−クラウン５エーテル／Ｆ６８
【０１６７】
【表１】
2015062693.tif 000009
手順：
高濃度プレエマルジョンを最初に調製して、滅菌水で希釈して必要な最終濃度に到達させて、最後にＭＦによって処理して、許容される液滴径（＜２００ｎｍ）および多分散性（＜０．１５）のエマルジョンを得た。乳化剤および添加剤を使用直前に滅菌水に溶解させた。プルロニックＦ６８溶液を水で１００ｍｇ／ｍｌに、硫酸プロタミンで２０ｍｇ／ｍＬに調製した。高濃度プレエマルジョンは、必要な液体すべて（ペルフルオロ−１５−クラウン５エーテル油、Ｆ６８溶液および硫酸プロタミン溶液）を回転剪断機（直径２５ｍｍのｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘシャフトを使用）で１３５００ｒｐｍにて２．５分間処理することによって調製した。この最初の混合物を次に、必要な最終濃度まで希釈して、回転剪断機によって１分間再処理した。プレエマルジョンは、Ｍ−１１０Ｓマイクロフルイダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、ＭＦによってただちに処理した。マイクロフルイダイゼーション処理の間の液圧は＞１８５００ｐｓｉであり５〜８回別々に通過させること（サイクル）によって小さい液滴径が達成された。ナノエマルジョンを濾過によって滅菌した。生成物は、フィルタホルダ（ＰＡＬＬ，Ｉｎｃ．）内の４７ｍｍ  ＰＦＲ（ＰＴＦＥ、０．２２μｍ）ディスクを使用して濾過した。２〜８ｍｌ／分の低流を使用して濾過を正常に実現した。
【０１６８】
エマルジョンを目視検査して、ＤＬＳによる液滴径および多分散性測定を受けさせた。すべての試料はＤＬＳ測定前に、ＷＦＩで希釈して、１％ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルの最終濃度に到達させた。
【０１６９】
結果
【０１７０】
【表２】
2015062693.tif 000010
どちらの製剤でも、５℃および室温での貯蔵時には３ヶ月間にわたって、液滴径は＜２００ｎｍ、多分散性は＜０．２であった。
【０１７１】
クレモホールＥＬを含むペルフルオロ−１５−クラウン５エーテルナノエマルジョン（製剤３）
現在公知の脂質ベースナノエマルジョンを超える安定性上昇および液滴径縮小のために、ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルの新たな製剤を設計した。この新たな製剤は、クレモホール（登録商標）ＥＬ（ＢＡＳＦ）をフルオロカーボンの乳化剤として最初に利用する。クレモホールＥＬは非イオン性可溶化剤であり、主成分は、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルと共に疎水性部分となるグリセロール−ポリエチレングリコールリシノレエートであり；より小型の親水性成分は、ポリエチレングリコールおよびエトキシ化グリセロールから成る。脂質成分は、ナノエマルジョン液滴のリポソームコート中に混和されるが、ＰＥＧによって立体安定化が確保される。得られたナノエマルジョン液滴は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルコア、リポソームコーティング、およびクレモホールＥＬのＰＥＧ部分によって立体的に安定化された表面を有する。立体安定化によって、有効期限およびインビボでのナノエマルジョン安定性が著しく改善された。クレモホールＥＬをエマルジョン製剤に導入することによって実現された改善点を証明するために、以前に報告された手順に従って（ＷＯ２００６０９６４９９）従来技術の製剤（エマルジョン４）を、新たな製剤（エマルジョン３）と並行して調製した。２つのエマルジョンを比較して、結果を下に示す。どちらのエマルジョンも２５０ｍＬスケールで調製した。
【０１７２】
【表３】
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手順：
要約すると、リポソームをリポソーム成分の超音波処理によって調製した。高濃度プレエマルジョンを、ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル／乳化剤１および添加剤を添加することによって調製した；続いて、バッチを最終濃度まで注射用水で希釈して、ＭＦを使用して最終油液滴径まで処理した。
【０１７３】
さらに詳細には、リポソーム成分のレシチン、コレステロールおよびＤＰＰＥをクロロホルムに溶解させて、回転蒸発によって乾燥させてフィルムにした。次に脂質を超音波処理によってＷＦＩ中に分散させた。得られた懸濁物にアルゴン（気体）を通気して、密閉し、使用するまで５℃にて遮光して貯蔵した。クレモホール（登録商標）ＥＬ（またはベニバナ油）、ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル、プロピレングリコール、およびリポソームを含むすべての成分を最初に、少量の水と合せた。この初期高濃度混合物は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルを６０％ｗ／ｗ有していた。混合物を回転剪断機（ｔｕｒｒａｘ）によって１２５００ｒｐｍにて２分間処理して、得られた高濃度プレエマルジョンをＷＦＩで最終濃度までさらに希釈して、再度１２５００ｒｐｍにて１分間処理した。プレエマルジョンは安定でなかったため、それゆえ＞１８５００ｐｓｉの圧にてＭＦで５〜８回慎重に通過させること（サイクル）によってマイクロフルイダイゼーションによってただちに処理した。最終エマルジョン生成物は、後述するように安定であった。
【０１７４】
製剤５は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルを重量で直鎖ＰＦＰＥに置き換えて、製剤３について上述したような手順を使用して調製した。この置き換えは、直鎖ＰＦＰＥとペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルとの間の比重量および粘度が同様であるため実施可能であった。製剤５中のＰＦＰＥオキシドの量は、製剤３中のペルフルオロ−１５−クラウン５エーテルの重量による量と等しく、同等の１９Ｆスピン／ナノエマルジョン液滴をより多数得られるという利点があった。界面活性剤共混合物、クレモホールＥＬおよび添加剤の量は、製剤３で上述した量と同じであった。簡潔には、クレモホール（登録商標）ＥＬ（またはベニバナ油）、直鎖ＰＦＰＥ，プロピレングリコール、およびリポソームを最初に、少量の水と合せた。この初期高濃度混合物は、直鎖ＰＦＰＥを６０％ｗ／ｗ含んでいた。混合物を回転剪断機（ｔｕｒｒａｘ）によって１２５００ｒｐｍにて２分間処理して、得られた高濃度プレエマルジョンをＷＦＩで最終濃度までさらに希釈して、再度１２５００ｒｐｍにて１分間処理した。プレエマルジョンは安定であり、＞１８５００ｐｓｉの圧にてＭＦで５〜８回慎重に通過させること（サイクル）によってマイクロフルイダイゼーションによってただちに処理した。図７は、第１日および第３４２日における製剤５のＤＬＳによる液滴径測定を示す。これらのデータによって、４℃での貯蔵時のこの製剤が格別に安定性であることが示された。
【０１７５】
結果：
製剤３エマルジョンの有効期間安定性：
エマルジョン３は続いてＤＬＳを受けて、合計６カ月超にわたって脱安定化の徴候について目視検査された。製剤３の安定性データのまとめを図１に示す。製剤３は、目視検査時には不透明で乳白色に見えた；大規模な液滴、凝集体、沈殿または相分離は、追跡中に見られなかった。重要なことに、製剤３エマルジョンの液滴径は、試験を行った他のすべてのエマルジョンと比較すると小さく、最も重要なことには、液滴径およびＰＤＩは、製剤４と比較して劇的に縮小した（ＷＯ２００６０９６４９９）。比較結果を表４に示す。クレモホールＥＬの導入によって、同じ製造条件下でベニバナ油を用いて調製した製剤４と比較して、製剤３の液滴径を劇的に縮小した。
【０１７６】
【表４】
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５℃および２５℃のどちらにおいても、液滴径のわずかな増大（２ヶ月後に５℃にて１７％、２５℃にて３２％まで）が最初に検出された。液滴径のわずかな縮小によって、追跡の最初の２カ月の間に、オストワルド熟成が考えられることを示された。３ヶ月の時点で、径は約１５０ｎｍに安定して、ＰＤＩは低いままであった（＜０．１５）。液滴の膨潤は停止して、ナノエマルジョンはその外観に変化がなく、さらなる追跡の間、安定なままであった。エマルジョン３を血清存在下で、時間ゼロおよび６カ月の２つの時点で試験した。各時点において、ナノエマルジョン液滴径およびＰＤＩは、３７℃での３時間のインキュベーション後に血清存在下での著しい変化を示さなかった（表６）。
【０１７７】
【表５】
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【０１７８】
【表６】
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ベニバナ油を用いた製剤４を、先に報告した方法を使用して製剤３と並行して調製した（ＷＯ２００６０９６４９９）。このエマルジョンの液滴径、ＰＤＩおよび血清安定性を、クレモホールＥＬを利用する製剤３（上記）と比較した。製剤４の液滴径は、製剤１、２、または３と比較して、実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉｏｎａｌｌｙ）大きかった（表４および７）。液滴径は、５℃にてわずか１週間後に、約２５％増大した（表７）。２週間の期間の後、液滴径は見かけのプラトー値に達した（表７）。多分散性はかなり上昇し、このことは製剤３では見られなかった。表８は、製剤４の血清安定性を示す。
【０１７９】
【表７】
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【０１８０】
【表８】
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製剤５エマルジョンの有効期間安定性：
製剤５のエマルジョンは続いてＤＬＳを受けて、合計１１カ月にわたって脱安定化の徴候について目視検査された。上述のように、図７は、粒径およびＰＤＩが４〜８℃での貯蔵時に３４２日後（＞１１カ月）に不変のままであることを示す。
【０１８１】
製剤３への蛍光染料の包含
製剤３の有用性をさらに証明するために、蛍光染料を処理後の製剤３の脂質層に包含させた。この添加によって、１９Ｆ磁気共鳴および各種の蛍光方法（たとえばフローサイトメトリー、組織学、ＦＡＣｓ分析、蛍光顕微鏡など）の両方によって検出できる、「デュアルモダリティ」剤が生成された。幅広く市販されている親油性染料（たとえばジアルキルカルボシアニン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用した。たとえば水に溶解せず、脂質の疎水性環境でなければ実質的に蛍光を示さない蛍光染料であるＤｉＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。ＤｉＩを製剤３のリポソームコーティング中に包含させた。蛍光試験によって、製剤のリポソーム部分の中で染料の安定な蛍光が示された（図２）。染料は、エマルジョン脂質コアと結合しない限り、明らかに非蛍光性であった。染料は、低い水溶性のために、ナノエマルジョンと結合したままであり、水または細胞培地での希釈時にその蛍光を維持した。蛍光染料の包含は、図３に示すように製剤３の、液滴径または多分散性に影響せず、血清安定性に影響しなかった。染料は、細胞へのナノエマルジョン取り込みにも負の影響を持っていなかった（データを示さず）。硫酸プロタミンおよびポリエチルアミンを用いた製剤３および５  ナノエマルジョン３および５は、硫酸プロタミンおよびポリエチルアミンを用いて製剤して、非食細胞への取り込みを改善することもできる。これらのポリアミンは、プレエマルジョン中に包含されて、上述のようにＭＦ処理後にエマルジョン界面活性剤層に混入する。ポリアミンの量は、最適な細胞標識化を実現するように最適化されるであろう。（参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、ＷＯ２００９／００９１０５を参照）。
【０１８２】
蛍光ＰＦＰＥを添加した製剤３および５
蛍光ブレンドＰＦＰＥアミド（ＦＢＰＡ）は最近、共有コンジュゲート蛍光染料（たとえばボディピー、ＦＩＴＣまたはアレクサ６４７）を含有することが記載されている。これらの蛍光コンジュゲートＰＦＰＥ油は、ナノエマルジョンプロセスの間に独自のフルオロカーボン単相として挙動する［詳細については、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｊａｎｊｉｃら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００８  Ｍａｒ  ５；１３０（９）：２８３２−４１を参照］。蛍光性の製剤３および５は、ＦＢＰＡを用いて調製され得る。製剤３では、１０％ｖ／ｖのペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルをＦＢＰＡで置き換えることができる。結果として、製剤５では、１０％ｖ／ｖのＰＦＰＥオキシドをＦＢＰＡで置き換える。油を慎重に共にブレンドして独自のフルオロカーボン相を得て、次に製剤３および製剤５で記載したようなナノエマルジョン調製手順を受けさせる。界面活性剤共混合物ではなく蛍光染料によって標識されているフルオロカーボン相の利点は、何倍にもなる。第１に、これらの新たな製剤中の蛍光染料は、処理を通じて、細胞標識化の間、そしておそらくインビボで、ナノエマルジョン液滴のフルオロカーボンコア内に残存する。第２に、蛍光シグナルは標識組織または細胞からの１９Ｆ  ＮＭＲシグナルに正比例し［Ｊａｎｊｉｃら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００８  Ｍａｒ  ５；１３０（９）：２８３２−４１］、それゆえ２つの撮像または検出様式（すなわち磁気共鳴および蛍光）での細胞（または組織）間に標識化の差異はない。
【０１８３】
製剤３の生物学的評価
製剤３は、図１に示すように、優れた安定性および非常に小さい液滴径（＜１５０ｎｍ）を低い多分散性（＜０．１５）と共に示す。ナノエマルジョンを細胞培養条件下でのインビトロと、げっ歯類への注射時のインビボの両方で安定である。ここで我々は、細胞取り込み、毒性プロフィール、ならびに表現型および活性変化についての標識細胞の評価を含む、製剤３のより詳細な評価を示す。
【０１８４】
販売者の説明書に従って培養したＲＡＷ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓｓ，ＶＡ）を製剤３の異なる濃度に３時間および２４時間暴露して、直接細胞カウントによって細胞毒性を推定した。最小毒性は、適用された最大用量にて、暴露２４時間後に観察された（図４Ａ）。ＲＡＷ細胞への製剤３の取り込みは、上述のように細胞ペレット中で１９Ｆ  ＮＭＲによって測定され、明らかな用量依存性を示した（図４Ｂ）。図５は、製剤３標識ＲＡＷ細胞の代表的な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルを示す。１８時間の同時インキュベーションの後、トランスフェクション試薬を用いずに、食作用性ＲＡＷ細胞に十分な取り込みが行われた。非食作用性細胞への取り込みを促進するために、硫酸プロタミンおよびポリエチルアミンを、（上記の）製剤２で記載したように、製剤３中に包含させた。
【０１８５】
製剤３の細胞標識化は、ＲＡＷ細胞のサイトカイン産生能力に何の影響もなかった（図６）。細胞をＬＰＳで２４時間活性化してから、製剤３に１８時間暴露させて、洗浄し、次に２４時間培養した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファのレベルを含むサイトカイン産生を測定した。これらの試験により、製剤３によって標識した細胞はインビボでのその活性に何の影響もないことが示された。
【０１８６】
げっ歯類で製剤３および５のインビボ血中クリアランス時間を測定した（図８）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（メス、６週齢）に所与の製剤のボーラス０．５ｍＬを１回、尾静脈に注射した。注射時に、これらの動物では有害事象は見られなかった。次に血液の少量の一定分量（ａｌｌｏｑｕｏｔｓ）を各動物から一連の固定時点に採取した。各製剤にＮ＝５マウスの試料サイズを使用した。各血液試料の１９Ｆ含有量は、１９Ｆ  ＮＭＲを使用してアッセイした；各血液試料の既知の体積を、上述のように校正フッ素参照溶液（ＴＦＡ）によってスパイクして、毛細管に入れ、血液体積当りの１９Ｆの量を時間に対して計算した（図８）。全体として、製剤３および５はどちらも、同様の長い血液半減期を有していた（＞１４時間、図８）。
【０１８７】
全体として、上述の製剤のいくつか（たとえば製剤３および５）は、無傷組織標本における炎症定量の日常的な作業を迅速化するために開発された。インサイチュー標識化実験の場合、炎症は２つの方法、従来の高分解能ＮＭＲによって、またはＭＲＩを使用することによってアッセイできる。どちらの方法においても、食作用性炎症細胞（たとえば単球／マクロファージ／好中球）内に含有される、１９Ｆ核の組織における存在量を検出する。最も標準的なＮＭＲ装置は、１９Ｆを日常的に検出できる。ＮＭＲは、組織試料中の白血球浸潤の程度を定量する高感度で費用効率の高い手法を提供する。この手法によって、時間集約的な病理学的染色と、続いての顕微鏡による細胞定量の必要が排除される。任意の固定ステップを除いて、特殊な組織調製は不要である。さらに、ＮＭＲの使用によって、組織学的試料採取での潜在的な偏りおよび誤差がなくなり、より小さく、より高い品質のデータセットが得られる。切除組織のＮＭＲ分析は非破壊的であり、それゆえＮＭＲの後に同じ組織に組織学的および生化学的分析を受けさせることができる。
【０１８８】
これらのエマルジョンのインビボ有効性の代表的な利用例として、製剤３を使用して、スポンジ肉芽腫モデルにおける炎症をインビボＭＲＩを用いて検出した。ＰＶＳスポンジディスクを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に浸漬して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背側へ皮下インプラントした。術後第４日に、製剤３の静脈内注射（０．５ｍＬ）を１回投与した。麻酔したマウスを第５日の７Ｔに撮像した。図９は、１Ｈ／１９Ｆ融合画像を示し、１９Ｆは疑似カラーになっている。データは、スポンジ周囲で製剤３によって標識したマクロファージの濃度が高いことを示す（アスタリスク）。少量の１９Ｆは、製剤の主要なクリアランス経路である肝臓にも見られる（図９）。「Ｒ」は、動物の胴体に沿った希釈１９Ｆ参照毛細管である。生理食塩水に浸漬したスポンジを用いた対照動物は、製剤３投与後に負の１９Ｆシグナルを示した。これらのデータ例は、製剤３の炎症への高い特異性を示す。
【０１８９】
上述の製剤の有用性のさらなる例として、製剤３を使用して、多発性硬化症、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のげっ歯類モデルの脊髄（ＳＣ）における炎症プロフィールを測定した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合した同系脊髄ホモジネートから成る尾基部への皮下接種１回を使用して、ＤＡラットでＥＡＥモデルを産生した。臨床ステージ−２  ＥＡＥラットに製剤３（０．５ｍＬ）を静脈内注射して、４８時間後に、従来の１９Ｆ  ＮＭＲ分光法を４７０ＭＨｚにて使用して、ＳＣの無傷の固定分節で炎症をアッセイした（図１０）。図１０において、炎症指数は、組織重量当りの１９Ｆ核の数として計算された、背側での各脊髄椎骨の炎症密度を表す。最低の製剤３取り込みを示す、ＣＦＡを投与したが、ＳＣホモジネートを投与しなかった対象動物も示されている。表示したデータは、ｎ＝３動物の平均結果である。この例では、ＳＣによる全体の調製および分析時間は約６時間であって、従来の組織学的分析に比較してほぼ１桁の短縮となった。
【０１９０】
製剤３および５の有用性について、他の多くの最近のインビボ実験例がある。たとえばＫｌｕｇら（参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃３１７２，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．１７，２００９）は、製剤５を使用してマウスモデルでの急性および慢性炎症を描出できることを証明した。これらの研究者らは、ＴＮＦ−αの局所耳注射で調製したＣ５７ＢＬ／６マウスおよびアテローム性プラーク形成のモデルであるａｐｏＥ−／−マウスの両方を使用した。製剤５の静脈内注射１回の後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＴＮＦ−α注射部位でのＭＲＩによって１９Ｆを検出することができ、ａｐｏＥ−／−マウスでは、１９Ｆは、これらの動物におけるプラークの一般的な部位である、腕頭動脈（ｂｒａｃｈｉｏｃｅｐｈａｔｉｃ）弓で検出することができた。
【０１９１】
他の研究では、Ｈｉｔｃｈｅｎｓら（参照によりその全体が組み入れられている、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃９３２，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．１７，２００９）は、製剤３を使用して固形臓器移植片拒絶を描出した。ＤＡラットからの心臓／肺または腎臓のどちらかをＢＮラット株に移植した。どちらの場合も、ＤＡからＢＮへの移植は、急性拒絶を経験する実験的同種移植モデルとして役立つ。移植の数日後、製剤３の注射１回をこれらの動物に静脈内送達して、次に動物に１９Ｆ／１Ｈ  ＭＲＩを２４時間後に受けさせた。インビボ１９Ｆデータは、炎症細胞の拒絶臓器中への浸潤を明らかに示したが、対象（非拒絶）臓器では示さなかった。組織学的研究の検証により、１９Ｆシグナルが浸潤マクロファージから発生することが確認された。
【０１９２】
他の研究者ら（参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｂａｓｓｅ−Ｌｕｓｅｂｒｉｎｋら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃８０７，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．１７，２００９）は、皮質梗塞のマウスモデルで製剤３および５の両方を使用した。梗塞動物にどちらかの製剤のＩＰ注射を投与して、顕著な局在化１９Ｆ  ＭＲＩシグナルを虚血性皮質病変への推定されるマクロファージ浸潤から観察した。著者らは、製剤３および５でそれぞれ使用したペルフルオロ−１５−クラウン−５エーテルと直鎖ＰＦＰＥとの間の小さい化学シフト（〜１ｐｐｍ）が分光的にインビボで分解されて、異なる時点で注射されたエマルジョン、それゆえ炎症細胞の病変中への各種の波動を明らかにできたことをさらに示した。従来の空間局在化化学シフト撮像（ＣＳＩ）を使用して、著者らは異なる時点で注射された両方の製剤のインビボ脳分布を同時に検出および分解することができた。
【０１９３】
参照による組み入れ
本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、個別の刊行物または特許がそれぞれ参照により組み入れられることが具体的および個別に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。矛盾のある場合には、本出願が、本明細書のいずれの定義も含めて優先するであろう。
【０１９４】
均等物
本発明の詳細な実施形態は、本明細書で明示的に開示されているが、上の明細書は例示的であり、制限的ではない。本発明の多くの変形が、本明細書および下の請求項を検討したときに、当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、請求項と共に均等物のその全範囲を、および明細書と共にそのような変形を参照して決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
2015062693000001.pdf