(57)【要約】      （修正有）【課題】多孔質マトリックス上に固定された基質、とりわけキナーゼ基質のアレイを使用する化合物の薬理学的プロファイリング方法を提供する。【解決手段】多孔質マトリックス上に固定された基質の第一及び第二のプロファイルを得る方法であって、前記方法が、（１）癌細胞株などから細胞ライセートを得る段階、（２）１０ないし０．１μｍのフィルターで濾過して細胞ライセートを得る段階、（３）キナーゼ阻害剤存在下で、前記細胞ライセートと基質の第一のアレイを接触させてアレイの応答を測定する段階、（４）キナーゼ阻害剤非存在下で、前記細胞ライセートを基質の第二のアレイト接触させてアレイの応答を測定する段階、並びに段階（４）のアレイ基質応答に対する段階（３）のアレイ基質応答の比として薬理プロファイルを得る段階を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質マトリックス上に固定された基質の第一および第二のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法であって、前記方法が以下の段階；
（ｉ）癌細胞株；初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株；ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から細胞ライセートを調製する段階；
（ｉｉ）前記細胞ライセートを１０ないし０．１マイクロメートル範囲のフィルターで濾過して濾過した細胞ライセートを得る段階；
（ｉｉｉ）キナーゼ阻害剤の存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第一の画分と基質の前記第一のアレイを接触させる段階、および前記第一のアレイの応答を測定する段階
（ｉｖ）キナーゼ阻害剤の非存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第二の画分と基質の前記第二のアレイを接触させる段階、および前記第二のアレイの応答を測定する段階；ならびに
段階（ｉｖ）のアレイ基質応答に対する段階（ｉｉｉ）のアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る段階
を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
前記基質がホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ハプテンおよびアプタマーよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質がキナーゼ基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基質がペプチドキナーゼ基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が配列番号１ないし３３７のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２種のペプチドキナーゼ基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基質が配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記基質が配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
細胞ライセートが、癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製される、先行する請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
基質のアレイの応答が検出可能なシグナルを使用して測定され、前記シグナルが基質のアレイとのサンプルの相互作用から生じる、先行する請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サンプルに対する基質のアレイの応答が検出可能に標識した抗体を使用して測定される、請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
基質のアレイの応答が蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
キナーゼ阻害剤について細胞、組織、器官若しくは温血動物の処理における応答体と非応答体の識別を可能にするための先行する請求項のいずれか１つに記載の方法により決定される薬理学的プロファイルの使用。
【請求項１５】
試験されるべきキナーゼ阻害剤がＭＩＫＩ１、６０５およびエルロチニブよりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬理学的プロファイルが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項１４若しくは１５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１７】
薬理学的プロファイルが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項１４若しくは１５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１８】
薬理学的プロファイルが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項１４若しくは１５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１９】
薬理学的プロファイルが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項１４若しくは１５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２０】
４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）；またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；
（ｖｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｖｉｉ）ＭＴＫＩ１の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｖｉｉｉ）ＭＴＫＩ１の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｘ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｘ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、
８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体が、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【請求項２１】
応答体が、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）、エルロチニブ若しくは６０５；またはそれらの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体が、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【請求項２６】
応答体が、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）、エルロチニブ若しくは６０５、またはそれらの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【請求項３１】
応答体が、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
６−｛ジフルオロ−［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］−メチル｝−キノリン（化合物６０５）またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；
（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｉｉ）６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体が、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【請求項３６】
応答体が、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
基質のアレイの応答が抗真菌剤を含まない溶液中で、具体的にはアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して測定される、請求項１ないし１３、２０ないし３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１ないし３３７のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドを含んでなる基質のアレイであるが、但し、前記アレイが配列番号１〜１４０のペプチドキナーゼ基質よりならない、上記アレイ。
【請求項４２】
配列番号１ないし３３７のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項４１に記載の基質のアレイ。
【請求項４３】
配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項４１に記載の基質のアレイ。
【請求項４４】
配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項４１に記載の基質のアレイ。
【請求項４５】
配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項４１に記載の基質のアレイ。
【請求項４６】
配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項４１に記載の基質のアレイ。
【請求項４７】
（ｉ）正常および腫瘍組織を包含する癌患者生検から細胞ライセートを調製する段階、
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤の存在下で、段階（ｉ）の細胞ライセートの画分と請求項３３ないし３８のいずれかに記載の基質の第一のアレイを接触させる段階；
（ｉｉｉ）キナーゼ阻害剤の非存在下で、段階（ｉ）の細胞ライセートの画分と基質の前記第一のアレイに同一の基質の第二のアレイを接触させる段階；および
基質の第二のアレイの応答に対する基質の第一のアレイの応答の比として患者の薬理学的プロファイルを得る段階（前記薬理学的プロファイルは可能なキナーゼ阻害剤応答を予測する）
を含んでなる、癌の処置における患者での可能なキナーゼ阻害剤応答の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質マトリックス上に固定された基質、とりわけキナーゼ基質のアレイを使用する化合物の薬理学的プロファイリング方法に関する。より具体的には、薬物応答の予測において、すなわち、試験されるべき化合物での細胞、組織、器官若しくは温血動物の処理における応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と非応答体（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の識別を可能にするために、および化合物の区別において有用な方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
薬物発見および開発の費用は増大しつつある一方、新薬承認の速度は減少している。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ一次スクリーニングツールでの大きな技術的進歩と対照的に、完全に集成された生存する系に特徴的な複雑な生化学的ネットワークにおける剤の作用を確立するために利用可能なツールの制限された進歩のみが存在する。ゲノム学およびプロテオミクス技術における最近の進歩は、高度に生物学的に複雑なサンプル中の遺伝子転写およびタンパク質発現の変動をタンパク質レベルで解析することを可能にするツールを提供することにより、この課題を取り扱うことを開始した。例えば、ゲノムおよびプロテオミクスのシグネチャは、例えば、腫瘍浸潤（非特許文献１）を包含する癌の病理学（非特許文献２）のようなある範囲の生理学的および病理学的過程の分子機構への洞察を提供した。
【０００３】
しかしながら、複雑な生物学的系における剤の作用のこれらの確立方法の一般的応用は、これらの方法が細胞過程におけるそれらの役割を推定するためにタンパク質の豊富さの変化に頼りそして従ってタンパク質の機能のダイナミクスの間接的推定値のみを提供することを考えることにより妨げられる。事実、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−小分子相互作用を包含するいくつかの重要な形態の転写後調節がタンパク質機能を決定し、そして遺伝子発現シグネチャに直接反映される場合も若しくはされない場合もある。この問題を扱うため、活性部位に向けられたプローブを利用して複雑なプロテオーム中の酵素ファミリーの機能状態を直接プロファイリングする、活性に基づくタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）と称される化学的プロテオミクス戦略が出現した（非特許文献３；非特許文献４）。単なる豊富さよりむしろ共有される機能特性に基づきプロテオームの画分を捕捉する化学的プローブの開発により、ＡＢＰＰは、他の大スケールプロファイリング方法が利用できない生体分子空隙の部分に応答指令信号を送る。全部の主要な分類のプロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼおよび酸化還元酵素を包含する１２以上の酵素分類が現在ＡＢＰＰにより取扱可能である。多数の細胞および動物モデルへのＡＢＰＰの応用は、癌、マラリアおよび代謝障害を包含するある範囲の疾患と関連する酵素活性の同定において成功した。ＡＢＰＰ分子はまた、特徴付けられていない機能の酵素を包含する疾患関連酵素の選択的阻害剤の生成も容易にする。要するに、ＡＢＰＰは、酵素スーパーファミリーのどのメンバーが特定の生理学的若しくは病理学的過程に関連するかを解明しかつ同時にこれらのタンパク質の機能を試験するための選択的化学試薬の創製を容易にする、強力な仮説生成技術エンジンを構成する。
【０００４】
ヒトゲノムは、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）を１つ若しくは別の方法で利用する２，０００種ほどのタンパク質を包含し、そしてこれらの５００種ほどは、配列および構造が保存された触媒ドメインを共有するがしかしそれらの触媒作用がどのように調節されるかが顕著に異なるプロテインキナーゼ、すなわちプロテインチロシンおよびプロテインセリン／トレオニンキナーゼをコードする。これらの酵素による基質リン酸化は、細胞のシグナル伝達を組織化しかつ全般に生化学的過程を調節する自然の優勢な分子的方法である。従って、細胞タンパク質の異常なリン酸化が疾患の特質であること、ならびに、癌
、糖尿病、炎症および関節炎のような多くの疾患状態での治療的介入のための薬物としてのキナーゼ阻害剤の使用に増大しつつある興味が存在することは驚くべきでない。従って、キナーゼプロテオームに応答指令信号を送るための多数のＡＢＰＰのアプローチが開発されたことは理解できる。一方法において、キナーゼ基質を蛍光標識し、そしてリン酸誘発性の蛍光変化が細胞ライセートおよび生存細胞双方でのプロテインキナーゼ活性のリアルタイム可視化を可能にする（非特許文献５）。別の方法において、ペプチド基質のリン酸化は蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して測定する（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００５】
タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）はＡＴＰからポリペプチド中のチロシン残基へのリン酸の移動を触媒する酵素である。ヒトゲノムは、細胞の増殖、生存、分化および移動性を調節する約９０種の機能的ＰＴＫを含有する。ＰＴＫファミリーの多くのメンバーが過去２５年にわたり癌遺伝子として同定された。より最近、チロシンキナーゼ活性の阻害が癌を処置するための重要な新たな一経路となった。イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）はフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を伴う患者を処置するために非常に有効な薬物であり；イマチニブは、Ｐｈ転座の結果として、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子によりコードされる遺伝子産物ＢＣＲ−ＡＢＬの構成的チロシンキナーゼ活性を阻害する。イマチニブはまた胃腸腫瘍（ＧＩＳＴ）のための処置としても有効である。根底にある機構は、ＧＩＳＴはしばしば受容体チロシンキナーゼｃＫＩＴ若しくはＰＤＧＦＲα（その双方もまたイマチニブにより阻害される）の過剰活性化の結果であることである。しかしながら、イマチニブ処置と関連する重要な一問題は、ＣＭＬおよびＧＩＳＴ双方において長期の処置に際しての耐性の発生である。２種の他の承認された分子、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ））およびゲフィニチブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ））はＥＧＦＲ受容体を主に標的とするチロシンキナーゼ阻害剤である。エルロチニブおよびゲフィニチブの臨床的有効性はこれまでのところイマチニブほど印象的でない。すなわち、選択されない非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者集団におけるエルロチニブおよびゲフィニチブの奏功率は１０と２０％の間である。加えて、獲得耐性がＥＧＦＲ阻害剤での処置の間に頻繁かつ迅速に発生する。これゆえに、処置の間の出現する耐性の早期の検出、およびキナーゼ阻害剤に応答することがありそうである薬物ナイーブな患者のそうでない者からの層別化が、患者を該問題を救うことができ、そして無益の治療を受ける貴重な時間（および代替処置を時宜を得て受ける機会を提供する）は、患者および償還機関にとって金を節約することができ、そしてより限定されたしかし十分に定義された患者集団での薬物の承認の機会を増大させることができる。加えて、薬物の臨床開発の間、これらの層別化ツールを、ありそうな応答体のとりわけ大きな部分で適応症について精査するのに使用し得る。
【０００６】
こうした予測ツールのいくつかの例が開発され、そしていくつかは臨床で使用されている。Ｈｅｒ２の細胞外ドメインに向けられたモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ））は、Ｈｅｒ２を過剰発現する転移性乳癌患者にのみ投与される。ＥＧＦＲ中の突然変異を活性化することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび診察室の双方でＥＧＦＲ阻害剤に対する極めて鋭敏な感受性と相関した。逆に、ＥＧＦＲ中の二次的突然変異はエルロチニブおよび／若しくはゲフィニチブに対する獲得耐性と関連付けられており；同様に、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃＫＩＴおよびＰＤＧＲαのキナーゼドメイン中の突然変異はイマチニブに対する耐性と関連付けられている。また、構成的過剰活性ＲＡＳのようなＲＴＫ非依存性シグナル伝達を見込む受容体チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード中の重要な下流の分子、および不活性化若しくは欠失されたＰＴＥＮ（ＰＩ３ホスファターゼ）中の突然変異は、ときにＲＴＫ阻害剤に対する応答と逆相関する。ゲノム全体のプロファイリング技術の出現、および、多くのキナーゼ阻害剤が複数の標的を有しかつ処置の有効性に決定的に重要な関連標的が常に明確であるわけではないという認識により扇動されて、応答体および非応答体の不偏の層別化方法が示唆された。これらの方法の最
も喧伝されたものは遺伝子発現シグネチャの使用である。こうした場合、数種の応答体の全ゲノムの発現プロファイル（処置前）を数種の非応答体のものと比較し、そして該２群間で差別的に発現される遺伝子を使用して未知の症例の見込みを予測し得る。この方法の決定的に重要な一欠点は、それがキナーゼ阻害剤の作用機序に直接関係せず、そしてこれゆえにサンプルの応答性を評価するための間接的パラメータに頼ることである。さらに、この方法（および大部分の他の応答予測方法）は未処置サンプル中のパラメータ（この場合は遺伝子発現）のみに基づく。結果として、これらの方法は腫瘍の不均一性およびサンプルの質に非常に感受性である。
【０００７】
ＡＢＰＰのアプローチは、所定の薬物若しくは投与計画に対する患者応答を決定することの目的を伴い、化合物を薬理学的にプロファイリングするのにとりわけ有用であることが今や見出された。とりわけ腫瘍学において、ＡＢＰＰの使用は、癌細胞株、異種移植腫瘍若しくは癌患者生検から調製した細胞ライセート中で治療薬に対する応答を予測し得る「指紋」を提供するのに有用と判明した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｕｐｔａ，Ｇ．Ｐ．ら  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．７０：１４９−５８（２００５）
【非特許文献２】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．、Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０（８）、７８９−９９（２００４）
【非特許文献３】Ｊｅｓｓａｎｉ，Ｎ．、Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｆｅｂ；８（１）：５４−９（２００４）
【非特許文献４】Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．Ａｕｇ；１０６（８）：３２７９−３０１（２００６）
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ，ＣＡ．ら  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９７（１−２）：３９−５１（２００４）
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｂｅｕｎｉｎｇｅｎ，Ｒ．ら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：１９３１−１９３３（２００１）
【非特許文献７】Ｓｃｈｕｌｌｅｒ  Ａ．ら、１１ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（８−１０  Ａｕｇ  ２００６）、米国マサチューセッツ州ボストン
【発明の概要】
【０００９】
発明の目的
本発明の目的は、キナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルの提供方法を提供することである。
【００１０】
さらなる一目的は、特定のキナーゼ阻害剤に対する患者応答を確実に予測するための前記方法の使用を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、キナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを提供するためのツールを提供することである。
【００１２】
発明の概要
本発明は、多孔質マトリックス上に固定された基質の第一および第二のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法に関し、前記方法は後の；
（ｉ）癌細胞株；初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株；ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から細胞ライセートを調製する段階；
（ｉｉ）前記細胞ライセートを１０ないし０．１マイクロメートル範囲のフィルターで濾
過して濾過した細胞ライセートを得る段階；
（ｉｉｉ）キナーゼ阻害剤の存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第一の画分と基質の前記第一のアレイを接触させる段階、および前記第一のアレイの応答を測定する段階
（ｉｖ）キナーゼ阻害剤の非存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第二の画分と基質の前記第二のアレイを接触させる段階、および前記第二のアレイの応答を測定する段階；ならびに
段階（ｉｖ）のアレイ基質応答に対する段階（ｉｉｉ）のアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る段階
を含んでなる。
【００１３】
好ましくは、前記基質はホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ハプテンおよびアプタマーよりなる群から選択される。
【００１４】
より好ましくは前記基質はキナーゼ基質である。
【００１５】
有利には、前記基質はペプチドキナーゼ基質である。
【００１６】
好ましい一態様において、前記基質は、配列番号１ないし３３７をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２種のペプチドキナーゼ基質である。有利には、前記基質は、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質；配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８をもつペプチドキナーゼ基質；配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドキナーゼ基質；若しくは配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドキナーゼ基質のいずれかよりなる。
【００１７】
本発明の方法において、細胞ライセートは好ましくは癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製する。
【００１８】
基質のアレイの応答を検出可能なシグナルを使用して測定することが好ましく、前記シグナルは、有利には検出可能に標識した抗体を使用する、より有利には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用する基質のアレイとのサンプルの相互作用から生じる。
【００１９】
本発明の別の局面は、キナーゼ阻害剤について細胞、組織、器官若しくは温血動物の処理における応答体と非応答体の識別を可能にするための本発明の方法により決定される薬理学的プロファイルの使用を包含する。
【００２０】
好ましくは、試験されるべきキナーゼ阻害剤はＭＴＫＩ１、６０５およびエルロチニブよりなる群から選択される。
【００２１】
薬理学的プロファイルが配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項１４若しくは１５のいずれか１つに記載の使用。
【００２２】
薬理学的プロファイルが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７
、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質；配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８をもつペプチドキナーゼ基質；配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドキナーゼ基質；若しくは配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドキナーゼ基質のいずれかから選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項１４若しくは１５のいずれか１つに記載の使用。
【００２３】
本発明はまた、４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）；またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩；あるいはエルロチニブ若しくは化合物６０５での処置に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法にも関し、前記方法は、
前記細胞株および／若しくは腫瘍からサンプルを提供すること；
ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体は、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定する。
【００２４】
応答体は、好ましくは、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定する。
【００２５】
好ましくは、基質のアレイは、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなり；とりわけ、基質のアレイは、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質を含んでなり；より具体的には、基質のアレイは、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質よりなる。
【００２６】
上の方法において、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１０
０、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群は、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群；配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群；若しくは配列番号５、１０，３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群で置き換え得る。
【００２７】
本発明のいずれの方法においても、基質のアレイの応答は、好ましくは、抗真菌剤を含まない溶液中で、具体的にはアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して測定する。
【００２８】
本発明の方法において、６０％、７０％、好ましくは８０％、または有利には９０％若しくはそれ以上の全体的正確さを得ることができる。
【００２９】
本発明の別の態様は、配列番号１ないし３３７をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドを含んでなる基質のアレイに関するが、但し、前記アレイは配列番号１〜１４０をもつペプチドキナーゼ基質よりならない。
【００３０】
基質の前記アレイは、配列番号１ないし３３７をもつペプチドキナーゼ基質、若しくは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドキナーゼ基質、若しくは配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８をもつペプチドキナーゼ基質、若しくは配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドキナーゼ基質、若しくは配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドキナーゼ基質よりなることができる。
【００３１】
本発明の別の局面は：
（ｉ）正常および腫瘍組織を包含する癌患者生検から細胞ライセートを調製する段階、
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤の存在下で、段階（ｉ）の細胞ライセートの画分と本発明の基質の第一のアレイを接触させる段階；
（ｉｉｉ）キナーゼ阻害剤の非存在下で、段階（ｉ）の細胞ライセート画分と基質の前記第一のアレイに同一の基質の第二のアレイを接触させる段階；および
基質の第二のアレイの応答に対する基質の第一のアレイの応答の比として前記患者の薬理学的プロファイルを得る段階（前記薬理学的プロファイルは可能なキナーゼ阻害剤応答を予測する）
を含んでなる、癌の処置における患者での可能なキナーゼ阻害剤応答の予測方法に関する。
【００３２】
本発明は以下の図面および実施例でさらに解明されることができ、それらは請求の範囲により与えられる保護の範囲に制限しないとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２５５からの未処理に対する処理したライセート中の検出可能なペプチドのリン酸化の初期速度の比。左から右へ：ＤＭＳＯ、ラパチニブ／Ｔｙｋｅｒｂ、ＭＴＫＩ１／ＭＴＫＩ、ゲフィニチブ／イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）、エルロチニブ／タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）、ＺＤ６４７４／ザクチマ（ｚａｃｔｉｍａ）。スケール：白＝１（阻害なし）；黒＝０．１（１０倍阻害）。
【図２】未処理に対する処理したＤＵ１４５サンプル中のリン酸化の初期速度の比。すなわち、左３プロファイルはＤＭＳＯ（外左レーン）、ＭＴＫＩ１（第二のレーン）若しくはヒストンデアセチラーゼ阻害剤（第三のレーン）での細胞処理に由来し；最も右の３レーンはＤＭＳＯ（第一のレーン）、ＭＴＫＩ１（第二のレーン）およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤（第三のレーン）での未処理のＤＵ１４５細胞のライセート処理に由来する。スケール：白＝１（阻害なし）；黒＝０．１（１０倍阻害）。
【図３】ＭＴＫＩ若しくはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度に対する溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度の比；スケール：白＝１（阻害なし）；黒＝０．２５（４倍阻害）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な記述
本発明は、細胞株若しくは腫瘍サンプルから調製したライセート中の小分子化合物によるチロシンキナーゼ活性の阻害の測定方法を記述する。重要なことに、本方法はキナーゼ阻害剤の関連する作用機序を直接測定し、そして、応答状態と相関するパラメータは相対尺度（すなわち、化合物の非存在および存在下でのキナーゼ活性の比）である。２７細胞株で８２％という全体的正確さを伴い、これらのリンペプチドプロファイルに基づき応答体細胞株を非応答体細胞株と識別し得ることが多標的キナーゼ阻害剤ＭＴＫＩ−１について示される。これらのペプチドをリン酸化するキナーゼは該阻害剤の作用機序に緊密に関連する。加えて、異種移植腫瘍ライセートにおいて若しくは類似のキナーゼ阻害剤についてもまた、同一ペプチドの多くが応答体を非応答体と識別し得ることが示され、この技術が患者層別化に応用可能であるはずであることを示す。
【００３５】
一態様において、本発明は、多孔質マトリックス上に固定された基質のアレイを使用する化合物の薬理学的プロファイリング方法を提供し、前記方法は；
（ｉ）未処理サンプル若しくは試験されるべき化合物で前処理したサンプルいずれかと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉ）未処理サンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｉｉｉ）前処理したサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
（ｉｖ）段階（ｉｉ）および段階（ｉｉｉ）でのアレイの応答の差違として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
【００３６】
本明細書で使用されるところの基質は、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ハプテンおよびアプタマーを包含することを意味している。とりわけ、使用される基質すなわちキナーゼ基質、より具体的にはペプチドキナーゼ基質、なおより具体的には表１のペプチドキナーゼ基質、最も具体的には表１のペプチドキナーゼ基質の最低２、６、１２、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０若しくは１３０ペプチドを使用すること。なおさらなる一態様において、基質のアレイは配列番号４、１９、２４、６９、１１３、１１４、１３６および１３８をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなり；より具体的には、基質のアレイは配列番号４、１９、２４、６９、１１３、１１４、１３６および１３８をもつペプチドよりなる。
【００３７】
代替のさらなる一態様において、基質のアレイは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９およ
び１３３をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなり、より具体的には、基質のアレイは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドよりなる。
【００３８】
別の代替のさらなる態様において、基質のアレイは配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなり、より具体的には、基質のアレイは配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドよりなる。
【００３９】
【表１】
2015006189.tif 000002
【００４０】
【表２】
2015006189.tif 000003
【００４１】
【表３】
2015006189.tif 000004
【００４２】
【表４】
2015006189.tif 000005
【００４３】
【表５】
2015006189.tif 000006
【００４４】
代替の一態様において、使用される基質はキナーゼ基質、より具体的にはペプチドキナーゼ基質、なおより具体的には表２のペプチドキナーゼ基質、最も具体的には表２のペプチドキナーゼ基質の最低２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、１８０、２００、２２０若しくは２４０ペプチドを使用してである。なおさらなる一態様において、基質のアレイは配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなり；なおより具体的には、基質のアレイは、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドよりなる。
【００４５】
【表６】
2015006189.tif 000007
【００４６】
【表７】
2015006189.tif 000008
【００４７】
【表８】
2015006189.tif 000009
【００４８】
【表９】
2015006189.tif 000010
【００４９】
【表１０】
2015006189.tif 000011
【００５０】
【表１１】
2015006189.tif 000012
【００５１】
【表１２】
2015006189.tif 000013
【００５２】
【表１３】
2015006189.tif 000014
【００５３】
【表１４】
2015006189.tif 000015
【００５４】
本明細書で使用されるところのペプチド基質は後に続くとおり命名される；
該ヒトタンパク質のＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリ名＿完全長タンパク質内の該ペプチドの開始位置＿完全長タンパク質内の終止位置＿リン酸化され得るチロシン若しくはセリンの位置
【００５５】
本明細書で使用されるところの多孔質マトリックスは、例えばＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ０１／１９５１７号に記述されるような当該技術分野で公知であるところの配向された貫通型チャンネル（ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ−ｇｏｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌ）を有するいずれの素材でもあり得、そして典型的には金属酸化物、ガラス、酸化ケイ素若しくはセルロースから作成される。特定の一態様において、多孔質素材は、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、酸化スズ、酸化アルミニウム、酸化チタンおよびタリウムよりなる群から選択される金属酸化物から作成され；より具体的な一態様において金属酸化物は酸化アルミニウムよりなる。
【００５６】
本発明の方法で使用されるサンプルは、原則として、例えば血液、尿、唾液、組織生検若しくは剖検材料のようないかなる生物学的サンプル、およびその後はとりわけそれらの細胞ライセートであり得るが、しかし、典型的には、癌細胞株；初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株；ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から調製される細胞ライセートよりなるとみられる。本発明の一態様において、細胞ライセートは癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製する。
【００５７】
サンプルの好ましい前処理方法は試験されるべき特定の化合物および使用されるサンプルの型に依存するであろうことが認識されるであろう。最適の方法は慣習的方法を使用してかつ本明細書に示される情報を考慮して当業者により容易に決定し得る。例えば、細胞ライセートの処理において、試験されるべき化合物を細胞ライセートに直接添加することができ；ヒト以外の動物モデルにおいては、試験されるべき化合物は、場合によっては付加塩の形態でおよび／若しくは投与に望ましい製剤の形態に依存して多様な形態をとりうる製薬学的に許容できる担体と緊密な混合状態で組合せた特定の化合物の治療上有効な量で典型的に投与することができる。これらの製薬学的組成物は、望ましくは、好ましくは経口、経皮若しくは非経口投与のような全身投与；または吸入、鼻スプレー、点眼薬を介するか若しくはクリーム剤、ゲル剤、シャンプー剤などを介するような局所投与に適する単位投与剤形にある。最適の投与方法および順序ならびに投薬量および投与計画は、当業者によりおよび下の実施例により詳細に提供されるとおり容易に決定し得る。
【００５８】
本発明の方法を使用してキナーゼ阻害剤を薬理学的にプロファイリングする本発明の態様において、試験されるべき化合物の存在下で基質のアレイを前処理したサンプルと接触させる。従って、多孔質マトリックス上に固定された基質のアレイを使用してキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法を提供することが本発明の一目的であり、前記方法は；
（ｉ）キナーゼ阻害剤の存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤の非存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）段階（ｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｉｉｉ）および段階（ｉｖ）でのアレイの応答の差違として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
【００５９】
基質のアレイの応答は検出可能なシグナルを使用して測定し、前記シグナルは基質のアレイとのサンプルの相互作用から生じる。上で挙げられたとおり、基質のアレイとのサンプルの相互作用の測定において、シグナルは検出可能に標識された基質の物理若しくは化学特性の変化の結果、または間接的には基質に結合することが可能な検出可能に標識された分子との基質の相互作用の結果のいずれかである。後者について、目的の基質に特異的に結合する分子（例えば抗体若しくはポリヌクレオチドプローブ）を、原子（例えば放射核種）、分子（例えばフルオレセイン）、または物理若しくは化学特性により該分子の存在を示す複合体を含有することによって検出可能に標識し得る。分子は、それが基質に作用して検出可能な原子、分子若しくは他の複合体を生じる「レポーター」分子（例えば酵素のような生体分子）に共有結合若しくは別の方法で会合される場合にもまた検出可能に標識しうる。
【００６０】
本発明での使用に適する検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免役化学的、電気的、光学的若しくは化学的手段により検出可能ないかなる組成物も包含する。本発明で有用な標識は、標識アビジン若しくはストレプトアビジン複合物での染色のためのビオチン、磁性ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓの）、蛍光色素（例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、リサミン、フィコエリトリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオルＸ（ＦｌｕｏｒＸ）［Ａｍｅｒｓｈａｍ］、ＳｙＢＲグリーンＩおよびＩＩ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ］など）、放射標識（例えば3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ若しくは32Ｐ）、酵素（例えば加水分解酵素、とりわけアルカリホスファターゼのようなホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、若しくは酸化還元酵素、とりわけワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼなど）、基質、補助因子、阻害剤、化学発光基、色素生産剤、ならびにコロイ
ド状金または着色硝子若しくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）製ビーズのような比色標識を包含する。こうした標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を包含する。
【００６１】
こうした標識の検出手段は当業者に公知である。従って、例えば化学発光および放射活性標識を写真フィルム若しくはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、また、蛍光マーカーは発射される光を検出するための光検出器を使用して検出しうる（例えば蛍光標示式細胞分取でのような）。酵素標識は、典型的に、酵素に基質を提供すること、および該基質に対する該酵素の作用により産生される着色反応生成物を検出することにより検出する。比色標識は着色標識を単純に可視化することにより検出する。従って、例えば標識が放射活性標識である場合、検出のための手段はシンチレーションカウンター、オートラジオグラフィーでのような写真フィルム、若しくは貯蔵蛍光体画像化（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ）を包含する。標識が蛍光標識である場合、それは、光の適切な波長で蛍光色素を励起すること、および結果として生じる蛍光を検出することにより検出されうる。蛍光は視覚的に、写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）若しくは光電子増倍管のような電子的検出器の使用によりなどで検出しうる。同様に、酵素標識は、適切な基質を酵素に提供すること、および結果として生じる反応生成物を検出することにより検出しうる。また、単純な比色標識は標識に関連する色を観察することにより検出しうる。蛍光共鳴エネルギー転移が未標識リガンドの結合を検出するように適合されており、それはアレイで有用でありうる。
【００６２】
本発明の特定の一態様において、サンプルに対する基質のアレイの応答は、検出可能に標識した抗体；より具体的には蛍光標識した抗体を使用して測定する。基質がキナーゼ基質よりなる本発明の態様において、基質のアレイの応答は蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して測定する。下の実施例でより詳細に概説されるとおり、蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体の使用は基質活性のリアルタイム測定を可能にし、そして従ってアレイの活性を初期キナーゼ速度として表すことの可能性を提供する。本態様において、薬理学的プロファイルは、未処理サンプルに対するアレイ基質応答に対する（前）処理されたサンプルに対するアレイ基質応答の比として測定される。
【００６３】
これゆえに、特定の一態様において、本発明は多孔質マトリックス上に固定された基質のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法を提供し、前記方法は；
（ｉ）キナーゼ阻害剤の存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤の非存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）段階（ｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｉｖ）でのアレイ基質応答に対する段階（ｉｉｉ）でのアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
【００６４】
本態様のさらなる一局面および本発明の態様のいずれかにおいて；
−サンプルはいずれかの生物学的サンプル（上記）から得ることができる細胞ライセート、とりわけ、癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製した細胞ライセートよりなる。
−基質のアレイは、キナーゼ基質、とりわけペプチドキナーゼ基質よりなり、より具体的には表１のペプチドキナーゼ基質の最低２、６、１２、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０若しくは１４０ペプチドを含んでなる。なおさら
なる一態様において、基質のアレイは、配列番号４、１９、２４、６９、１１３、１１４、１３６および１３８をもつペプチドよりなる群、若しくは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドよりなる群、若しくは配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８をもつペプチドよりなる群、若しくは配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなる。あるいは、基質のアレイは、キナーゼ基質、より具体的にはペプチドキナーゼ基質、なおより具体的には表２のペプチドキナーゼ基質よりなり、最も具体的には表２のペプチドキナーゼ基質の最低２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、１８０、２００、２２０若しくは２４０ペプチドを使用する。なおさらなる一態様において、基質のアレイ基質のアレイは配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドよりなる。
−基質のアレイの応答は抗体、とりわけ蛍光標識した抗体、より具体的には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して；最も具体的には商業的に入手可能なＰＹ２０−ＦＩＴＣ抗体を使用して測定する。サンプル中のアゾール若しくはアジドのような抗真菌化合物の存在がアレイ応答に影響し得ることが観察されており、従って、特定の一態様において、基質のアレイの応答は、上の態様のいずれにおいても、抗真菌剤を含まない溶液中で、とりわけアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して行う。
−サンプルは多孔質マトリックス上でのインキュベーション前に、すなわち段階（ｉ）および（ｉｉ）双方でのサンプルとの基質アレイの接触の前に濾過する。サンプルの濾過は、例えば限定されるものでないが再生セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ガラス、アノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）若しくはテフロン（ｔｅｆｌｏｎ）から作成されたフィルターメンブレンを挙げることができる技術既知の手順を使用して行い、典型的には、濾過範囲は多孔質マトリックスの配向された貫通型チャンネルに一致すべきであり、そして例えば１０ないし０．１マイクロメートル範囲にある。とりわけ、無機０．２マイクロメートルフィルターを使用して、より具体的には下の実施例に提供されるところのアノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）０．２マイクロメートルフィルターを使用して。
−段階（ｉ）で使用される細胞ライセートはキナーゼ阻害剤とプレインキュベートする。細胞ライセートの好ましいプレインキュベーション方法は試験されるべき特定の化合物および使用される細胞ライセートの型に依存するであろうことが認識されるであろう。最適の方法は慣習的方法を使用して当業者により容易に決定し得るが、しかし典型的には、適切な緩衝液、例えばリン酸およびプロテアーゼ阻害剤を含有するＭ−ＰＥＲ緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ）中で試験されるべき化合物と細胞ライセートを３０分〜６０分の範囲の期間インキュベートすることよりなるとみられる。
【００６５】
再度、インキュベーションは典型的に氷上で行う。
【００６６】
これゆえに、さらなる一態様において、本発明は、多孔質マトリックス上に固定された基質のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法を提供し、前記方法は；
（ｉ）癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製した細胞ライセートを得；
（ｉｉ）１０ないし０．１マイクロメートル範囲のフィルターで細胞ライセートを濾過し；
（ｉｉｉ）前記細胞ライセートの画分を試験されるべきキナーゼ阻害剤とインキュベート
し；
（ｉｖ）試験されるべきキナーゼ阻害剤の存在下で、段階（ｉｉｉ）のインキュベートした画分と基質のアレイを接触させ；
（ｖ）試験されるべきキナーゼの非存在下で、キナーゼ阻害剤とインキュベートしなかった細胞ライセートの画分と基質のアレイを接触させ；
（ｖｉ）段階（ｉｖ）での前記アレイの応答を測定し；
（ｖｉｉ）段階（ｖ）での前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）でのアレイ基質応答に対する段階（ｉｖ）でのアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
【００６７】
本態様、および本発明の態様のいずれかにおいて、以下のさらなる制限の１つ若しくはそれ以上が当てはまることがある；
−基質のアレイは、キナーゼ基質、とりわけペプチドキナーゼ基質よりなり、より具体的には表１のペプチドキナーゼ基質の最低２、６、１２、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０若しくは１４０ペプチドを含んでなる。なおさらなる一態様において、基質のアレイは、配列番号４、１９、２４、６９、１１３、１１４、１３６および１３８をもつペプチドよりなる群；１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８よりなる群、１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３よりなる群、若しくは５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなる。あるいは、基質のアレイは、キナーゼ基質、より具体的にはペプチドキナーゼ基質、なおより具体的には表２のペプチドキナーゼ基質よりなり、最も具体的には表２のペプチドキナーゼ基質の最低２、６、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、１８０、２００、２２０若しくは２４０ペプチドを使用する。なおさらなる一態様において、基質のアレイは、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドよりなる。
−基質のアレイの応答は、抗体、とりわけ蛍光標識した抗体、より具体的には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して；最も具体的には商業的に入手可能なＰＹ２０−ＦＩＴＣ抗体を使用して測定する。サンプル中のアゾール若しくはアジドのような抗真菌化合物の存在がアレイ応答に影響し得ることが観察されており、従って、特定の一態様において、基質のアレイの応答は、上の態様のいずれにおいても、抗真菌剤を含まない溶液中で、とりわけアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して行う。
−サンプルの濾過は、例えば限定されるものでないが再生セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ガラス、アノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）若しくはテフロン（ｔｅｆｌｏｎ）から作成されたフィルターメンブレンを挙げることができる技術既知の手順を使用して行い、典型的には、濾過範囲は多孔質マトリックスの配向された貫通型チャンネルに一致すべきであり、そして例えば１０ないし０．１マイクロメートル範囲にある。とりわけ、無機０．２マイクロメートルフィルターを使用して、より具体的には下の実施例で提供されるところのアノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）０．２マイクロメートルフィルターを使用して。
【００６８】
別の態様において、本発明は、試験されるべき化合物での細胞、組織、器官若しくは温血動物の処理における応答体と非応答体の識別を可能にするための本発明の方法を使用して決定される薬理学的プロファイルの使用を提供する。とりわけ、試験されるべき化合物
での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍との応答体の識別を可能にするため。
【００６９】
下の実施例で概説されるとおり、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ２００４／１０７６５号に多標的キナーゼ阻害剤（ＭＴＫＩ）として記述される下の大環状キナゾリン誘導体（Ｉ）の一分類での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍との応答体の識別を可能にする、表１の基質アレイ上の本明細書で「分子シグネチャ」若しくは「指紋」ともまた称される基質の特定の組の同定を提供することもまた、本発明の一目的であった。
【００７０】
【化１】
2015006189.tif 000016
【００７１】
とりわけ、式（Ｉ）の化合物［ここで；
ＺはＮＨを表し；
Ｙは−Ｃ3-9アルキル−、−Ｃ1-5アルキル−ＮＲ13−Ｃ1-5アルキル−、−Ｃ1-5アルキル−ＮＲ14−ＣＯ−Ｃ1-5アルキル−、−Ｃ1-3アルキル−ＮＨ−ＣＯ−Ｈｅｔ20−、若しくは−Ｈｅｔ22−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−Ｃ1-3アルキル−を表し；
Ｘ1はＯ若しくは−Ｏ−Ｃ1-2アルキル−を表し；
Ｘ2は直接結合、−Ｃ1-2アルキル−、Ｏ、−Ｏ−Ｃ1-2アルキル−、ＮＲ12若しくはＮＲ12−Ｃ1-2アルキル−を表し；
Ｒ1は水素、シアノ、ハロ若しくはヒドロキシ、好ましくはハロを表し；
Ｒ2は水素、シアノ、ハロ若しくはヒドロキシを表し；
Ｒ3は水素を表し；
Ｒ4はＣ1-4アルキルオキシ−を表し；
Ｒ12は水素若しくはＣ1-4アルキル−を表し；
Ｒ13は水素若しくはＣ1-4アルキルを表し；
Ｒ14は水素若しくはＣ1-4アルキルを表し；
Ｈｅｔ20はピロリジニル、ピペラジニル若しくはピペリジニルを表し；および
Ｈｅｔ22はピロリジニル、ピペラジニル若しくはピペリジニルを表す］
での処置に対して。
【００７２】
とりわけ、
４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ１）；またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩
【００７３】
【化２】
2015006189.tif 000017
【００７４】
での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍との応答体の識別を可能にするため。
【００７５】
前述の定義および下で使用されるところの、
−ハロはフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードに包括的なものであり；
−Ｃ1-2アルキルはメチル若しくはエチルを定義し；
−Ｃ1-3アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピルなどのような１から３個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖飽和炭化水素基を定義し；
−Ｃ1-4アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、１−メチルエチル、２−メチルプロピル、２，２−ジメチルエチルなどのような１から４個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖の飽和炭化水素基を定義し；
−Ｃ1-5アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルエチルなどのような１から５個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖飽和炭化水素基を定義し；
−Ｃ3-9アルキルは、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルなどのような３から９個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖飽和炭化水素基を定義し；
−Ｃ1-4アルキルオキシは、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、１−メチルエチルオキシ、２−メチルプロピルオキシなどのような直鎖若しくは分枝状飽和炭化水素基を定義し；
−「ＣＯ」という用語はカルボニル基を指す。
【００７６】
上で挙げられたところの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩は、ＭＴＫＩ  １が形成することが可能である治療上活性の非毒性の酸および非毒性の塩基の付加塩を含んでなることを意味している。塩基の特性は、前記塩基の形態を適切な酸で処理することによりそれらの製薬学的に許容できる酸付加塩に転化し得る。適切な酸は、例えば、ハロ水素酸、例えば塩酸若しくは臭化水素酸；硫酸；硝酸；リン酸および類似の酸のような無機酸；または例えば酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸（すなわちブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サイクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸および類似の酸のような有機酸を含んでなる。
【００７７】
酸の特性は、前記酸の形態を適する有機若しくは無機塩基で処理することによりそれらの製薬学的に許容できる塩基付加塩に転化しうる。適切な塩基塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基との塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、ならびに例えばアルギニン、リシンなどのようなアミノ酸との塩を含んでなる。
【００７８】
酸若しくは塩基付加塩という用語は、ＭＴＫＩ  １が形成することが可能である水和物および溶媒付加形態もまた含んでなる。こうした形態の例は例えば水和物、アルコール和
物などである。
【００７９】
表１の基質とともに本発明の薬理学的プロファイリング方法（上記）を使用して、ＭＴＫＩ１の「分子シグネチャ」が、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることが見出された。
【００８０】
表２の基質とともに本発明の薬理学的プロファイリング方法（上記）を使用して、ＭＴＫＩ１の「分子シグネチャ」が、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることが見出された。
【００８１】
従って、４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）；またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍との応答体の識別を可能にする方法を提供することが、本発明の一目的であり；前記方法は；
（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からサンプルを得ること；
（ｉｉ）ＭＴＫＩ１の存在下に基質のアレイを前記サンプルと接触させること；
（ｉｉｉ）ＭＴＫＩ１の非存在下に基質のアレイを前記サンプルと接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号４、１９、２４、６９、１１３、１１４、１３６および１３８をもつペプチドよりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体は配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドから選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される。
【００８２】
本態様において、以下のさらなる制限の１つ若しくはそれ以上が当てはまることがある；
−基質のアレイは、マトリックス、より具体的には、例えば限定されるものでないが、例えばＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ０１／１９５１７号に記述されるような当該技術分野で公知であるところの配向された貫通型チャンネルを有するいずれかの素材を挙げることができる多孔質マトリックス上に固定され、そして典型的には金属酸化物、ガラス、酸化ケイ素若しくはセルロースから作成される。特定の一態様において、多孔質素材は、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、酸化スズ、酸化アルミニウム、酸化チタンおよびタリウムよりなる群から選択される金属酸化物から作成され；より具体的な一態様において金属酸化物は酸化アルミニウムよりなり；
−サンプルは、原則として例えば血液、尿、唾液、組織生検若しくは剖検材料のようないずれかの生物学的サンプル、およびその後とりわけそれらの細胞ライセートであり得るが、しかし、典型的には、癌細胞株；初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株、；ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から調製した細胞ライセートよりなるとみられる。本発明の一態様において、細胞ライセートは、癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製し；
−基質のアレイは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドよりなる群から選択される最低３、４、５、６若しくは７ペプチドを含んでなり；とりわけ、基質のアレイは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドを含んでなり；より具体的には、基質のアレイは配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドよりなり；
−基質のアレイの応答は検出可能なシグナルを使用して測定し、前記シグナルは基質のアレイとサンプルの相互作用から生じる。上で挙げられたとおり、基質のアレイとのサンプルの相互作用の測定において、シグナルは検出可能に標識された基質の物理若しくは化学特性の変化の結果、または、間接的に、基質に結合することが可能な検出可能に標識された分子と基質の相互作用の結果のいずれかである。なおさらなる一態様において、基質のアレイの応答は、抗体、具体的には蛍光標識した抗体、より具体的には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して、最も具体的には商業的に入手可能なＰＹ２０−ＦＩＴＣ抗体を使用して測定する。サンプル中のアゾール若しくはアジドのような抗真菌化合物の存在がアレイ応答に影響し得ることが観察され、従って特定の一態様において、基質のアレイの応答は、上の態様のいずれにおいても、抗真菌剤を含まない溶液中で、とりわけアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して測定する。
−応答体は、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３をもつペプチドから選択されるペプチドの最低３種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される。
【００８３】
前述の方法は、場合によっては以下の付加的な段階の１つ若しくはそれ以上を含み得る；
−サンプルの画分を基質のアレイへのその適用前にＭＴＫＩ１とプレインキュベートする付加的な一段階。
−サンプルを基質のアレイへのそれらの適用前に濾過する付加的な一段階。サンプルの濾過は、例えば限定されるものでないが再生セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ガラス、アノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）若しくはテフロン（ｔｅｆｌｏｎ）から作成されるフィルターメンブレンを挙げることができる技術既知の手順を使用して行い、典型的には、濾過範囲は多孔質マトリックスの配向された貫通型チャンネルに一致すべきであり、そして例えば１０ないし０．１マイクロメートル範囲にある。とりわけ、無機０．２マイクロメートルフィルターを使用して、より具体的には下の実施例で提供されるところのアノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）０．２マイクロメートルフィルターを使用して。
【実施例】
【００８４】
実験データおよび実施例
材料および方法：
薬物応答の予測および化合物の区別でのＰＡＭＣＨＩＰの使用。
チロシンペプチドＰＡＭＣＨＩＰ９６を使用するＰＡＭＧＥＮＥ技術は、９６ウェルプレートの３次元多孔質ウェルにスポットした１４４種のチロシンペプチドのリン酸化の動的検出を可能にする（ｗｗｗ．ｐａｍｇｅｎｅ．ｃｏｍ）。この技術を使用して、精製したキナーゼの活性およびそれらに対するキナーゼ阻害剤の影響を測定し得る。ホスホチロシンペプチドは、蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体の混合物を使用して検出する。ペプチドのリン酸化は、蛍光抗体に結合したリンペプチドのＣＣＤカメラ検出を可能にするためのポンピング機構（ｐｕｍｐｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によりアッセイの間の数秒間反応混合物を除去することの可能性によりリアルタイムで追跡し得る。これらの連続的
データ点（定量化スポット画像）が各個々のペプチドの反応速度曲線を生成し、そして各個々のペプチドに関連する初期速度および終点の計算を見込む。
【００８５】
この技術を、未処理および化合物で処理したライセート（癌細胞株、異種移植腫瘍および患者生検、腫瘍ならびに正常組織から調製したライセートは全部使用し得る）、ならびに処理および未処理の細胞株でのチロシンキナーゼ活性のプロファイリングを可能にするように改変した。これらのプロファイルの使用は、非応答体細胞株および腫瘍から化合物応答体を層別化すること、ならびにそれらの標的選択性およびＡＴＰ競合性に基づくチロシンキナーゼ阻害剤の識別、ならびにキナーゼ活性に対するキナーゼ以外の阻害剤（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のような）の間接的影響の特徴付けにおいて示された。
【００８６】
培養細胞ライセート
必要な場合は化合物で処理した、Ｔ１７５フラスコ中適切な培地中で培養した細胞は、７０〜９０％培養密度で収集する。
【００８７】
培地を除去し、０．１ｍＭ  ＮａＶＯ4を含有する１０ｍｌ氷冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、そしてホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（ＨＡＬＴ、ＰＩＥＲＣＥ）を含有する１ｍｌのＭ−ＰＥＲ緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ）で溶解する。細胞を掻き取ることにより収集しそして１２  ０００×ｇで１０分間遠心分離する。上清ライセートを０．２マイクロメートルフィルター（Ａｎｏｔｏｐ  ０．２μｍアノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）フィルター；Ｗｈａｔｍａｎｎ）で濾過する。ライセートを液体窒素中で急速凍結しかつ−８０℃で保存する。
【００８８】
腫瘍および組織ライセート
１００ｍｇの凍結腫瘍若しくは組織ブロックまたは切片を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（ＨＡＬＴ、ＰＩＥＲＣＥ）を含有する１ｍｌのＭ−ＰＥＲ緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ）に溶解する。該懸濁液はＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸブレンダー（ＩＫＡ  ｗｅｒｋｅ）を使用して混合しそして１２  ０００×ｇで１０分間２回遠心分離する。上清ライセートを０．２マイクロメートルフィルター（Ａｎｏｔｏｐ  ０．２μｍアノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）フィルター；Ｗｈａｔｍａｎｎ）を通して濾過する。ライセートを液体窒素中で急速凍結しかつ−８０℃で保存する。
【００８９】
ＰＡＭＣＨＩＰ手順
ＰＡＭＣＨＩＰ実験の直前に総タンパク質含量をライセート中で定量し、そしてライセートをＭ−ＰＥＲホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（ＨＡＬＴ、ＰＩＥＲＣＥ）を含む総容量２００μｌ中１ｍｇ／ｍｌに希釈する。１０μｇの全ライセート（１０μｌに対応する）をＰＡＭＣＨＩＰ９６のウェルあたりに使用することができる。
【００９０】
全部の２００μｌライセートに１０単位のベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加し、そしてライセートを氷上で３０分間さらにインキュベートし、そして次に１２  ０００×ｇで１０分間遠心分離する。上清をその後水で適切な濃度に希釈した化合物若しくはＤＭＳＯで１：１希釈し、そしてライセートを氷上で正確に６０分さらにインキュベートする。その間、ＰＡＭＣＨＩＰ９６チロシンペプチドチップ（ＰＡＭＧＥＮＥ）を、ＰＡＭＳＴＡＴＩＯＮ９６（ＰＡＭＧＥＮＥ）の標準設定を使用して２％ＢＳＡ（０．２μｍアノポア（ａｎｏｐｏｒｅ）フィルターを通し濾過する；Ｗｈａｔｍａｎｎ）でブロッキングする。
【００９１】
キナーゼ緩衝液の組成は後に続くとおりである。すなわち、１×ＡＢＬ緩衝液（ＮＥＢ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ  ＮＥＢストックから）、１００μＭ  ＡＴＰ（１×ＡＢＬ緩衝液に溶解かつ希釈する）、５μｇ／ｍｌ  ＰＹ２０−ＦＩＴＣ（
ＥｘＡｌｐｈａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、アジドを含まない調製物）。２倍濃縮したキナーゼ緩衝液を氷上で冷却して調製し、ＤＭＳＯ若しくは化合物を適切なように添加し、そして該溶液を（化合物で処理した）氷冷ライセートに１：１添加し、そして直ちにチロシンペプチドＰＡＭＣＨＩＰ９６に適用する。アッセイは標準手順に従いＰＡＭＳＴＡＴＩＯＮ９６で実施する。すなわち、プレートの負荷後に溶液をウェルに１回ポンピングし、最初の曝露を読み取り（１５０ｍ秒）、そしてその後動的読み取りプログラム（５分ごとに１５０ｍ秒間読み取る）を６０分間実施する。ライセートを各条件について６個の技術的複製物で実験し；複製物はチップの垂直ストリップ効果を回避するために常に相互の隣に水平に適用する。
【００９２】
データ解析
処理。
データ（スポット画像）はＥＶＯＬＶＥ  ＰＡＭＧＲＩＤソフトウェア（ＰＡＭＧＥＮＥ）を使用してさらに定量化しかつペプチド同一性と結び付ける。定量化データをその後、アッセイの最初の３０分に適用したＶｉｎｉｐ２曲線当てはめアルゴリズムを使用するＣｕｒｖｅＦｉｔＨＴソフトウェア（ＰＡＭＧＥＮＥ）を使用して曲線に当てはめ；初期速度を最初の動的時間点読み取りで得る。全部のその後のデータ解析は、ソフトウェアパッケージＯｍｎｉｖｉｚおよびＲ（Ｉｈａｋａ，Ｒ．とＧｅｎｔｌｅｍｅｎ，Ｒ．（１９９６）Ｒ：ａ  ｌａｎｇｕａｔｅ  ｆｏｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｇｒａｐｈ．Ｓｔａｔ．、５、２９９−３１４）を使用して初期速度（Ｖｉｎｉ）で行った。
【００９３】
差別的に阻害されるペプチドについての試験。
０．１以下のＶｉｎｉを０．１により置き換えた後、正規化を扱うため全部のＶｉｎｉをｌｏｇ２変換した。その後、Ｖｉｎｉの化合物に誘発される低下が応答するおよび応答しない腫瘍の間で有意に異なったかどうかを検定した。この検定は、技術的変動（すなわち複製物間の変動）および生物学的変動（すなわち多様な応答するおよび応答しない細胞株若しくは腫瘍間の変動）双方の組み込みを可能にする混合モデル（Ｌｉｔｔｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．、Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｇ．Ａ．、Ｓｔｒｏｕｐ，Ｗ．Ｗ．、Ｗｏｌｆｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｄ．１９９６．ＳＡＳ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ．ノースカロライナ州カリー；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を使用し、各ペプチドについて個別に行った。ＶｉｎｉおよびＶｉｎｉに対する処理効果の細胞株若しくは腫瘍間の変動を、応答状態に入れ子にした（ｎｅｓｔｅｄ）細胞株若しくは腫瘍あたりの無作為の妨害および無作為の化合物効果ごとにそれぞれモデル化した。応答するおよび応答しない細胞株若しくは腫瘍の間のＶｉｎｉの化合物に誘発される低下の差違を、化合物処理と応答状態（双方とも固定効果としてモデル化した）の間の交互作用により検定した。この交互作用の検定のｐ値は疑陽性発見比率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）手順（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．とＨｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．１９９５．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊ．Ｒｏｙ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．Ｂ、５７（１）：２８９−３００）を使用して多重検定について補正して、いわゆるｑ値をもたらした。
【実施例１】
【００９４】
ＭＴＫＩについての２７細胞株パネルでのシグネチャペプチドの生成。
Ｐａｍｃｈｉｐペプチドアレイが多標的キナーゼ阻害剤ＭＴＫＩに対する細胞株の応答を予測するための有用なツールであるかどうかを試験した。ＭＴＫＩは、広範に変動するＩＣ50でｉｎ  ｖｉｔｒｏである範囲の細胞株の増殖を阻害する。多彩な癌細胞型を表すこれら２７種の細胞株から調製したライセートを、各条件につき６複製物で５μＭ  ＭＴＫＩの非存在若しくは存在下でペプチドアレイ上でプロファイリングした。このパネル中
で、１３細胞株は応答体細胞株（ＩＣ50＜３μＭ；細胞株は実施例１で増大するＩＣ５０に従って配列する）と定義された一方、１４細胞株は「非応答体」細胞株（ＩＣ50＞１０μＭ）と分類される。中間細胞株、および高度に変動するＩＣ50測定値を伴う細胞株は解析から省いた。該実験は変異体ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒを過剰発現する高度に応答性のＨ３２５５肺癌細胞株を包含した。この変異体バリアントは、ＥＧＦＲの活性コンホメーションに結合するＡＴＰ競合化合物であるＭＴＫＩに高度に応答性である（エルロチニブおよびゲフィニチブに類似）。従って、ライセートキナーゼ活性のＭＴＫＩにより誘導される最も顕著な変化をこの高度に応答性の細胞株について観察し得る。
【００９５】
ＭＴＫＩによるリン酸化の阻害がライセートを調製した細胞株の応答状態と良好に相関するペプチドを同定するために、統計学的混合モデルを設定し、複製物間の変動性を考慮に入れて非応答体ライセートと比較して応答体細胞ライセートでＭＴＫＩ処理後に変化することが最もありそうであるペプチドを同定した（統計学的検定のより詳細な記述については材料および方法の節を参照されたい）。非応答体に対し応答体でＭＴＫＩ処理により変化することが最もありそうである１６ペプチドを、０．０１のカットオフｐ値を使用して実施例１に列挙する（この統計学的解析での多数の反復測定値の補正はこのｐ値が０．１というｑ値に変わることを示す）。所定のライセート中のこれらのペプチドのリン酸化の阻害がＭＴＫＩに対する対応する細胞株の応答と実際に相関することを具体的に説明するために、以下のカットオフを選んで応答体および非応答体を分類した。すなわち、該１６ペプチドの一覧からの最少で４ペプチドは、応答体として分類するために０．８（２０％阻害）未満の比で阻害されなければならない。全２７細胞株にこの規則を適用することは８２％の全体的な分類の正確さ（７８％の感度および８６％の特異度を伴う）を示す。興味深いことに、非応答体として誤って予測される３種の応答体からの２種（Ｃｏｌｏ６９９およびＨ２００９）は全１３応答体の最高のＩＣ５０を有する（すなわちこれらは「境界」応答体である）。これら２０ペプチドの分類ツールとしての使用は必要とされる感度および特異度に従って最適化し得ることに注意されたい。
【００９６】
ＭＴＫＩの存在下でのペプチドリン酸化の初期速度に対する溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度の比により表される結果を表３ＡないしＤに示し；’ＮａＮはＤＭＳＯの存在下で検出可能なリン酸化が存在しないことを示す。
【００９７】
感受性若しくは特異度を特定の必要性（例えば疑陽性若しくはあるいは偽陰性を可能な限り多く除外するため）に適合させるために、当業者は、例えば応答体予測比を変更することにより該予測統計学を容易に適合させ得る。
【００９８】
【表１５】
2015006189.tif 000018
【００９９】
【表１６】
2015006189.tif 000019
【０１００】
【表１７】
2015006189.tif 000020
【０１０１】
【表１８】
2015006189.tif 000021
【０１０２】
Ｒ＝ＭＴＫＩに対する応答体
ＮＲ＝ＭＴＫＩに対する非応答体
応答体は最少で４ペプチドが比＜０．８（太字で示される）を有する場合に予測される
全体的な予測の正確さ：：８２％（２２／２７）
感度（実際の応答体の数に対する予測された応答体の数）：７８％（１０／１３）
特異度（実際の非応答体の数に対する予測された非応答体の数）：８６％（１２／１４）
【実施例２】
【０１０３】
ＭＴＫＩについての異種移植腫瘍中でのシグネチャペプチドの生成。
類似のアプローチが応答体および非応答体腫瘍の分類を見込むかどうかを探求するため、上と同一の戦略を１２種の異なる異種移植腫瘍に適用し、それらはヒト癌細胞株からヌード免疫無防備状態マウスで皮下に増殖させた。これらの腫瘍は６種の応答性腫瘍および６種の非応答性腫瘍に分割し得る。応答性腫瘍は、Ｈ３２５５、Ａ４３１およびＨ３２２腫瘍の突然の腫瘍退縮からＤＵ１４５、ＳＵＭ１４９およびＢＴ４７４の腫瘍増殖の強力な阻害までの範囲にわたるｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＴＫＩに対するそれらの応答性に従って配置する。非応答性腫瘍（Ｈ４６０およびＨ４４１、ＨＴ２９、ＰＣ３、ＳＫＯＶ３、Ｈ
１７０３）は全部ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＴＫＩに非応答性である。均質化した凍結腫瘍ブロックからライセートを作成し、そして前のとおり５μＭ  ＭＴＫＩの非存在若しくは存在下で分析した。全体に、大部分のペプチドのリン酸化速度は、対応する細胞株に比較して腫瘍ライセート中で有意により速かった。にもかかわらず、ペプチドリン酸化プロファイルの阻害は、リン酸化の阻害がＭＴＫＩに対する腫瘍の応答性と相関したペプチドのサブセットが存在することを示した。統計学的検定をこのデータ組に適用し（２７細胞株についての前と同様）、そして応答体と非応答体を最良に識別する２１ペプチドを表４ＡおよびＢに示す。この組に使用したカットオフｐ値は０．１である。応答体と非応答体腫瘍を識別するためのこれらのペプチドのｐ値は、腫瘍の数（１２）が実施例１の細胞株の数（２７）よりはるかにより小さいために細胞株について得られたものより有意により小さいことに注意されたい。この腫瘍シグネチャ組のペプチドの７種が１６ペプチドの細胞株シグネチャ組（実施例１）でもまた見出され、同一の活性のいくつかの阻害がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の阻害と比較してｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖を低下させるのに決定的に重要であることを示すが、しかしまたｉｎ  ｖｉｖｏの情況での他のキナーゼの重要性も示すことに注意されたい。重要なことに、多くのシグネチャペプチドについて、阻害の程度はＭＴＫＩに対する腫瘍の応答性と相関した。
【０１０４】
ＭＴＫＩの存在下でのペプチドリン酸化の初期速度に対する溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度の比により表される結果を表４Ａ〜Ｂに示し；’ＮａＮはＤＭＳＯの存在下で検出可能なリン酸化が存在しないことを示す。
【０１０５】
該感度若しくは特異度を特定の必要性（例えば、疑陽性若しくはあるいは偽陰性を可能な限り多く除外すること）に適合させるために、当業者は、例えば応答体予測比を変更することにより予測統計学を容易に適合させ得る。
【０１０６】
【表１９】
2015006189.tif 000022
【０１０７】
【表２０】
2015006189.tif 000023
【０１０８】
Ｒ＝ＭＴＫＩに対する応答体
ＮＲ＝ＭＴＫＩに対する非応答体
応答体は最少で７ペプチドが比＜０．８（太字で示される）を有する場合に予測される。全体的な予測の正確さ：９／１２（７５％）
感度（実際の応答体の数に対する予測された応答体の数）：４／６（６７％）
特異度（実際の非応答体の数に対する予測された非応答体の数）：５／６（８３％）
【実施例３】
【０１０９】
ヒト凍結組織および腫瘍サンプル。
異種移植腫瘍ライセートについてと同一のアプローチをヒト組織（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘから購入した凍結組織）に適用した。急速凍結肺腫瘍および正常のマッチさせた組織を試験した。全部のサンプルが確実なシグナルを生じたこと、および異なる腫瘍がＭＴＫＩ１処理に対する異なる応答をもたらしたことが見出され、この技術が一般に凍結ヒト組織に応用可能でありかつＭＴＫＩ１若しくは他のチロシンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍（および他組織）の応答を予測しうることを示唆する。
【実施例４】
【０１１０】
化合物の区別
ＰＡＭＣＨＩＰＳは化合物をプロファイリングおよび区別するのにもまた使用し得る。５種のチロシンキナーゼ阻害剤（左から右へ：ＤＭＳＯ、ラパチニブ／Ｔｙｋｅｒｂ、ＭＴＫＩ１／ＭＴＫＩ、ゲフィニチブ／イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）、エルロチニブ／タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）、ＺＤ６４７４（ザクチマ（ｚａｃｔｉｍａ））は応答性細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２５５から調製したライセート中で異なる阻害プロファイルをもたらす。同様に、化合物を区別するためにより少なく応答性の細胞株からプロファイルが生成されている。結果を図１に表す。
【０１１１】
化合物で処理した細胞からライセートを調製する場合にキナーゼ以外の阻害剤もまたＰＡＭＣＨＩＰプロファイルに顕著な影響を有し得ることが見出された。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤若しくはＭＴＫＩ１いずれかをＤＵ−１４５前立腺癌細胞に５μＭで２０時間適用する一例を示す。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の確実な効果が細胞処理後にＰＡＭＣＨＩＰプロファイルで観察される一方、ライセートをヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理する場合に影響はほとんど見ることができず、この化合物が細胞の情況でキナーゼを間接的に阻害するという考えと矛盾しない。これは、いかなる化合物も細胞に適用される場合にＰＡＭＣＨＩＰＳを使用して潜在的にプロファイリングし得ることを具体的に説明する。結果を図２に表す。
【実施例５】
【０１１２】
新規２５６ペプチドアレイの設計−ＭＴＫＩについての異種移植腫瘍中でのシグネチャペプチドの生成。
標準の１４０ペプチドアレイの特異度および従って応答体と非応答体を識別するペプチド組の能力を向上させるため、２５６ペプチドの新規組を選択した。以下の戦略を使用した。すなわち、第一にホスホチロシンペプチドを質量分析（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓと共同で）により２種の癌細胞株ＤＵ１４５およびＮＣＩ−Ｎ８７のライセートで同定した。これは９３７種のリンペプチドを生じ、それらの多くは以前に決して記述されなかった。とりわけ興味深い６３種のペプチド、すなわち既知の自己リン酸化部位若しくは該９３７ペプチド中で実際より少なく見積もられたチロシンキナーゼの他の基質を追加した。これら１０００ペプチドの全部をその後ＳＰＯＴ方法論（ＪＰＴ、独国ベルリンによる迅速な費用効率のよいペプチド合成手順）を使用して合成し、そして７種の異なる１４４ペプチドアレイにスポットした。これらのアレイをＭＴＫＩの非存在および存在下で３２種の異なる細胞株および腫瘍のライセートとインキュベートした。（ａ）ライセートの最低１種での検出可能性、（ｂ）ライセート全体での差別的リン酸化速度、および（ｃ）多様なライセート中でのＭＴＫＩによる差別的阻害に基づき、これらのペプチドから１９４ペプチドを選択した。加えて、以前の実験で有用と見出された標準の１４０ペプチドアレイから６２ペプチドを追加した（実施例１ないし４でのもののような）。選択した２５６ペプチドをその後ＪＰＴにより標準的高品質手順を使用して合成し（特注合成）、そしてＰａｍｇｅｎｅにより単一アレイとしてスポットした。この新たなアレイ（２５６ペプチド）を使用して、ＭＴＫＩの非存在若しくは存在下で前のとおり１２種の異種移植腫瘍ライセートをプロファイリングした。前と同一の混合モデル統計学的解析を使用して、非応答体に対し応答体腫瘍を識別するペプチドを選択した。そ
の解析の結果を表５に示す（Ｐ値＜０．１を伴う２８ペプチド）。ＭＴＫＩによるこれらのペプチドの多くの阻害の倍数（ｆｏｌｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、１４０ペプチドアレイから選択されるペプチドに比較してより高く（実施例２を参照されたい）、これらのペプチドが実際にある種のＭＴＫＩ標的キナーゼに対しより選択的であることを示す。最も重要には、予測の正確さは該１４０ペプチド組由来のペプチド組に比較して大きく改善され、上述されたペプチド選択戦略の有用性を具体的に説明する。
【０１１３】
結果を表５ＡおよびＢに示す。
【０１１４】
ＭＴＫＩの存在下でのペプチドリン酸化の初期速度に対する溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度の比；’ＮａＮはＤＭＳＯの存在下で検出可能なリン酸化が存在しないことを示す
【０１１５】
【表２１】
2015006189.tif 000024
【０１１６】
【表２２】
2015006189.tif 000025
【０１１７】
【表２３】
2015006189.tif 000026
【０１１８】
【表２４】
2015006189.tif 000027
【０１１９】
【表２５】
2015006189.tif 000028
【０１２０】
Ｒ＝ＭＴＫＩに対する応答体
ＮＲ＝ＭＴＫＩに対する非応答体
応答体は最少で１４ペプチドが比＜０．７（太字で示される）を有する場合に予測される。
全体的正確さ：１００％
【実施例６】
【０１２１】
ＭＴＫＩ由来シグネチャペプチドはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ）のような他のＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するのにもまた使用し得る。
タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ；ＯＳＩ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなＭＴＫＩに関係する他のＥＧＦＲ阻害剤もまたこの応答予測方法論に従うかどうかを試験するため、９細胞株をＭＴＫＩ若しくはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（双方の場合で５μＭ）の存在下でプロファイリングした。小さな差違がＭＴＫＩおよびタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）プロファイルで検出可能である（例えば、ＭＴＫＩはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）に比較してＥＧＦＲ  ｌ８５８Ｒに対するより低いＩＣ５０と一致してＨ３２５５に対しわずかにより強力であり；ＭＴＫＩは、ＭＴＫＩがタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）より良好な阻害剤であるＨｅｒ２により主に駆動される細胞株Ｎ８７に対してもまたより強力であり；他方、タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）は未知の理由からＭＴＫＩに比較してＧＴＬ１６ライセートで付加的な活性を有する）とは言え、全体としてＭＴＫＩとタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）の間で阻害パターンに顕著な類似が存在する（図３を参照されたい）。以前に得られたＭＴＫＩ予測ペプチドの値を表６ＡないしＣに具体的に説明する。これらのペプチドに基づき、タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）に対する応答もまたＭＴＫＩについてと同一の正確さを伴い（ならびにＨ２００９およびＭＯＬＴ４の場合は同一の誤った予測を伴い）予測し得る。これらの結果は、ＭＴＫＩに対する応答と相関する１６ペプチドがありそうにはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ）若しくはイレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（ゲフィニチブ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）のような他のＥＧＦＲ阻害剤に対する応答もまた予測することを具体的に説明する。
【０１２２】
ＭＴＫＩ若しくはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度に対する溶媒（ＤＭＳＯ）の存在下でのペプチドリン酸化の初期速度の比；’ＮａＮはＤＭＳＯの存在下で検出可能なリン酸化が存在しないことを示す。
【０１２３】
【表２６】
2015006189.tif 000029
【０１２４】
【表２７】
2015006189.tif 000030
【０１２５】
【表２８】
2015006189.tif 000031
【０１２６】
応答体は最少で４ペプチドが＜０．８の場合に予測される
ＭＴＫＩ：正確さ：７８％（７／９）；感度：８６％（６／７）；特異度：５０％（１／２）
タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）：正確さ：７８％（７／９）；感度：８６％（６／７）；特異度：５０％（１／２）
【実施例７】
【０１２７】
細胞ライセート中のｃＭｅｔの阻害は特定のペプチド組に相関し得る。
Ｐａｍｇｅｎｅからの現在利用可能な１４０種のチロシンペプチドのアレイが上述されたもの以外のキナーゼ活性もまた検出することができるかどうかを検査するため、別の化合物を同じ方法論を使用してプロファイリングし：；これはｃＭＥＴ受容体チロシンキナーゼの完璧に選択的な阻害剤であり（ＵＳ２００７  ０２０３１３６  Ａ１を参照されたい）、そして式：
【０１２８】
【化３】
2015006189.tif 000032
【０１２９】
をもつ。同様に、ＨＧＦ誘発性コロニー形成におけるｃＭＥＴ阻害剤６０５に対する変動する応答性をもつある範囲の細胞株をプロファイリングした（この場合、１μＭの化合物が応答体細胞ライセート中のペプチドリン酸化の有意の阻害に十分であった）。実施例７に示されるとおり、６０５によるペプチドリン酸化阻害の明確な差違を非応答体ライセートに対し応答体ライセートで同定し得た。ｃＭｅｔシグネチャペプチド組はｃＭｅｔに対する最も近いホモログＲｏｎ由来の２種のペプチドを特徴とすることに注意されたい。６０５は１μＭで精製Ｒｏｎキナーゼを全く阻害しない。しかしながら、これらのＲｏｎ部位はｃＭｅｔによるリン酸化の標的であることが示されている（Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９、４０４１−３０４９）。６０５シグネチャペプチドは、ＭＴＫＩと６０５の間のキナーゼ特異性のいかなる重なりの非存在と一致して、ＭＴＫＩシグネチャペプチド組と重なりを全く示さない。これらのデータは、２つの型のチロシンキナーゼ阻害剤すなわち多標的ＥＧＦＲ阻害剤ＭＴＫＩ（およびタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ））ならびに選択的ｃＭＥＴ阻害剤６０５について特定のペプチドを同定し得、サンプルライセート中のリン酸化速度の化合物に媒介されるその阻害が、本明細書に記述される方法論を使用して該化合物に対するこれらのサンプルの実際の生物学的応答を予測することを具体的に説明する。
【０１３０】
結果を表７ＡないしＣに示す。
【０１３１】
【表２９】
2015006189.tif 000033
【０１３２】
【表３０】
2015006189.tif 000034
【０１３３】
【表３１】
2015006189.tif 000035
【０１３４】
Ｒ＝ｃＭＥＴに対する応答体
ＮＲ＝ｃＭＥＴに対する非応答体
応答体は最少で７ペプチドが比＜０．８（太字で示される）を有する場合に予測される。全体的な予測の正確さ：１２／１３（９２％）
感度（実際の応答体の数に対する予測された応答体の数）：６／６（１００％）
特異度（実際の非応答体の数に対する予測された非応答体の数）：７／８（８８％）
【０１３５】
前述の明細は具体的説明の目的上提供される実施例を伴い本発明の原理を教示する一方、本発明の実務は以下の請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内にあるところの通常の変形、翻案、および／若しくは改変の全部を包含することが理解されるであろう。
【０１３６】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【０１３７】
１．多孔質マトリックス上に固定された基質の第一および第二のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法であって、前記方法が以下の段階；
（ｉ）癌細胞株；初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株；ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から細胞ライセートを調製する段階；
（ｉｉ）前記細胞ライセートを１０ないし０．１マイクロメートル範囲のフィルターで濾過して濾過した細胞ライセートを得る段階；
（ｉｉｉ）キナーゼ阻害剤の存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第一の画分と基質の前記第一のアレイを接触させる段階、および前記第一のアレイの応答を測定する段階
（ｉｖ）キナーゼ阻害剤の非存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第二の画分と基質の前記第二のアレイを接触させる段階、および前記第二のアレイの応答を測定する段階；ならびに
段階（ｉｖ）のアレイ基質応答に対する段階（ｉｉｉ）のアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る段階
を含んでなる、上記方法。
【０１３８】
２．前記基質がホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ハプテンおよびアプタマーよりなる群から選択される、１．に記載の方法。
【０１３９】
３．前記基質がキナーゼ基質である、１．に記載の方法。
【０１４０】
４．前記基質がペプチドキナーゼ基質である、１．に記載の方法。
【０１４１】
５．前記基質が配列番号１ないし３３７のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２種のペプチドキナーゼ基質である、１．に記載の方法。
【０１４２】
６．前記基質が配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる、５．に記載の方法。
【０１４３】
７．前記基質が配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、５．に記載の方法。
【０１４４】
８．前記基質が配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、５．に記載の方法。
【０１４５】
９．前記基質が配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、５．に記載の方法。
【０１４６】
１０．細胞ライセートが、癌細胞株；異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製される、先行する１．ないし９．のいずれかに記載の方法。
【０１４７】
１１．基質のアレイの応答が検出可能なシグナルを使用して測定され、前記シグナルが基質のアレイとのサンプルの相互作用から生じる、先行する１．ないし１０．のいずれかに記載の方法。
【０１４８】
１２．サンプルに対する基質のアレイの応答が検出可能に標識した抗体を使用して測定される、１．ないし１１．のいずれか１つに記載の方法。
【０１４９】
１３．基質のアレイの応答が蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して測定される、１２．に記載の方法。
【０１５０】
１４．キナーゼ阻害剤について細胞、組織、器官若しくは温血動物の処理における応答体と非応答体の識別を可能にするための先行する項のいずれか１つに記載の方法により決定される薬理学的プロファイルの使用。
【０１５１】
１５．試験されるべきキナーゼ阻害剤がＭＩＫＩ１、６０５およびエルロチニブよりなる群から選択される、１４．に記載の方法。
【０１５２】
１６．薬理学的プロファイルが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、１４．若しくは１５．のいずれか１つに記載の使用。
【０１５３】
１７．薬理学的プロファイルが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、１４．若しくは１５．のいずれか１つに記載の使用。
【０１５４】
１８．薬理学的プロファイルが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、１４．若しくは１５．のいずれか１つに記載の使用。
【０１５５】
１９．薬理学的プロファイルが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質から選択される最低２ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、１４．若しくは１５．のいずれか１つに記載の使用。
【０１５６】
２０．４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）；またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；
（ｖｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｖｉｉ）ＭＴＫＩ１の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｖｉｉｉ）ＭＴＫＩ１の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｘ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｘ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体が、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【０１５７】
２１．応答体が、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、２０．に記載の方法。
【０１５８】
２２．基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなり；とりわけ、基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質を含んでなり；より具体的には、基質のアレイが、配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる、２０．に記載の方法。
【０１５９】
２３．４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）、エルロチニブ若しくは６０５；またはそれらの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体が、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【０１６０】
２４．応答体が、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応
答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、２３．に記載の方法。
【０１６１】
２５．基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなり；とりわけ、基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質を含んでなり；より具体的には、基質のアレイが、配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、２３．に記載の方法。
【０１６２】
２６．４，６−エタンジイリデンピリミド［４，５−ｂ］［６，１，１２］ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、１７−ブロモ−８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１９−オクタヒドロ−２０−メトキシ−１３−メチル−（ＭＴＫＩ  １）、エルロチニブ若しくは６０５、またはそれらの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）ＭＴＫＩ１、エルロチニブ若しくは６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【０１６３】
２７．応答体が、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、２６．に記載の方法。
【０１６４】
２８．基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなり；とりわけ、基質のアレイが、配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質を含んでなり、より具体的には、基質のアレイが、配列番号１
４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、２６．に記載の方法。
【０１６５】
２９．；またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が；
（ｉ）前記細胞株および／若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること；
（ｉｉ）６０５の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｉｉ）６０５の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること；
（ｉｖ）段階（ｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；
（ｖ）段階（ｉｉｉ）でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し；ならびに
段階（ｖ）に対する段階（ｉｖ）でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり；基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低２ペプチドを含んでなることを特徴とし；ならびに、応答体が、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（比＜１．０）として同定される、上記方法。
【０１６６】
３０．応答体が、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低２種に対する応答における阻害（最低＜０．８０の比）として同定される、２６．に記載の方法。
【０１６７】
３１．基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低３ペプチドを含んでなり；とりわけ、基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質を含んでなり、より具体的には、基質のアレイが、配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、２６．に記載の方法。
【０１６８】
３２．基質のアレイの応答が抗真菌剤を含まない溶液中で、具体的にはアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して測定される、１．ないし１３．、２０．ないし３１．のいずれかに記載の方法。
【０１６９】
３３．配列番号１ないし３３７のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドを含んでなる基質のアレイであるが、但し、前記アレイが配列番号１〜１４０のペプチドキナーゼ基質よりならない、上記アレイ。
【０１７０】
３４．配列番号１ないし３３７のペプチドキナーゼ基質よりなる、３３．に記載の基質のアレイ。
【０１７１】
３５．配列番号１５、１６、２２、３４、６２、８３、８６、８７、１００、１０５、１０８、１１０、１１３、１２５、１２９および１３３のペプチドキナーゼ基質よりなる、
３３．に記載の基質のアレイ。
【０１７２】
３６．配列番号１５、１６、２１、２３、３８、４２、５３、６２、６９、７７、８３、８６、９１、９４、１０３、１１２、１１４、１２９、１３３、１３６および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、３３．に記載の基質のアレイ。
【０１７３】
３７．配列番号１４２、２、１６３、１７３、１７７、１９０、１６１、１９７、２０７、２０８、２１３、２４１、７３、２５２、２５５、２５８、２６２、７９、８７、２６６、８６、２６９、９５、２９６、３０３、３０５、３０８および１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、３３．に記載の基質のアレイ。
【０１７４】
３８．配列番号５、１０、３８、３０、５４、５７、６８、７２、７３、７４、８２、９１、９８、９９、１０２、１０４、１１０、１３５、１１８、１１９、７１、１３８のペプチドキナーゼ基質よりなる、３３．に記載の基質のアレイ。
【０１７５】
３９．
（ｉ）正常および腫瘍組織を包含する癌患者生検から細胞ライセートを調製する段階、
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤の存在下で、段階（ｉ）の細胞ライセートの画分と３３．ないし３８．のいずれかに記載の基質の第一のアレイを接触させる段階；
（ｉｉｉ）キナーゼ阻害剤の非存在下で、段階（ｉ）の細胞ライセートの画分と基質の前記第一のアレイに同一の基質の第二のアレイを接触させる段階；および
基質の第二のアレイの応答に対する基質の第一のアレイの応答の比として患者の薬理学的プロファイルを得る段階（前記薬理学的プロファイルは可能なキナーゼ阻害剤応答を予測する）
を含んでなる、癌の処置における患者での可能なキナーゼ阻害剤応答の予測方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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