(57)【要約】【課題】  ES細胞を利用する必要なく哺乳類に広く適用可能な技術であって、ゲノム上の特定配列を標的として特定遺伝子を改変する技術（ZFN等のゲノム編集技術）を、極めて簡便な手法のみで利用可能とする技術を、開発することを課題とする。【解決手段】  前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類の受精卵を、特定配列を有するmRNAのペア分子を含む溶液に浸漬し、第1電気パルスの総電力量を所定範囲にして3段階方式の矩形波多重パルスを与えて電気穿孔処理を行うことにより、哺乳類の任意の標的遺伝子を効率良く改変する技術を提供する。【選択図】  図５
2015070825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(A)に記載の受精卵を、下記(B)に記載の核酸分子を含む溶液に浸漬し、；前記溶液に1回又は2回以上の下記(C)に記載の矩形波電気パルスを、電力量の合計が0.2〜7.5J/100μLになるように与え、；次いで下記(D)に記載の矩形波電気パルスを2回以上与え、；次いで下記(E)に記載の矩形波電気パルスを2回以上与えること、；を特徴とする、哺乳類の遺伝子改変方法。
(A): 前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類（ヒトを除く）の受精卵。
(B): ゲノムDNAの任意の領域に対して、配列特異的にエンドヌクレアーゼ活性を発揮するように機能するRNA。
(C): 1パルスの電圧が375V/cm以上である矩形波電気パルス。
(D): 1パルスの電圧が250V/cm以下であり且つ1パルスの電力量が0.01〜3.6J/100μLである矩形波電気パルス。
(E): 上記(D)に記載の電気パルスとは逆の極性の矩形波電気パルスであって、1パルスの電圧が250V/cm以下であり且つ1パルスの電力量が0.01〜3.6J/100μLである矩形波電気パルス。
【請求項２】
前記(B)に記載の核酸分子が、下記(b1)に記載の核酸分子及び下記(b2)に記載の核酸分子である、請求項1に記載の方法。
(b1): 配列特異的DNA結合ドメイン, 及び, 下記(b2)に記載の制限酵素活性ドメインと二量体を形成した場合に制限酵素活性を発揮するドメイン, を有するタンパク質をコードしたmRNA。
(b2): 上記(b1)に記載のタンパク質が結合するゲノムDNA領域端の近傍領域であり且つその相補鎖に結合する配列特異的DNA結合ドメイン, 及び, 上記(b1)に記載の制限酵素活性ドメインと二量体を形成した場合に制限酵素活性を発揮するドメイン, を有するタンパク質をコードしたmRNA。
【請求項３】
前記(B)に記載の核酸分子が、下記(b3)に記載の核酸分子及び下記(b4)に記載の核酸分子である、請求項1に記載の方法。
(b3): ゲノムDNAの任意の塩基配列の相補配列, 及び, 下記(b4)に記載のタンパク質と特異的に結合する配列, を有するGuide RNA。
(b4): 上記(b3)に記載のGuide RNAと特異的に結合した場合にエンドヌクレアーゼ活性を発揮するタンパク質をコードしたmRNA。
【請求項４】
前記電気穿孔を行った後、得られた受精卵を2〜16細胞期胚まで培地中で培養し、その後、前記哺乳類と同種又は近縁種の雌の卵管又は子宮に移植して産子を得ることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が、エキソヌクレアーゼ1（Exo1）をコードしたmRNAをさらに含むものである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類が齧歯目に属する種類であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
上記(D)に記載の矩形波電気パルスを与える回数が5回以上であり、且つ、上記(E)に記載の矩形波電気パルスを与える回数が5回以上である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子改変が、遺伝子の破壊による機能の欠失又は抑制を伴うものである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、遺伝子改変された哺乳類個体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類の受精卵を、特定のRNA分子を含む溶液に浸漬し、第1電気パルスの総電力量を所定範囲にして3段階方式の矩形波多重パルスを与えて電気穿孔処理を行うことにより、哺乳類の任意の標的遺伝子を効率良く改変する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、哺乳類に遺伝子改変を行うためには、ES細胞を用いることが必要であったため、ES細胞株が利用可能なマウス等の一部の動物を除いては、遺伝子改変個体を作出することが極めて困難な状況にあった。しかし、近年、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、ターレン（TALEN）、クリスパー（CRISPR）等を利用した新しい遺伝子改変技術の登場により、ES細胞を用いることなく、胚操作のみにより哺乳類動物のゲノム編集を容易に行うことが可能となってきた（例えば非特許文献1〜4等 参照）。
当該ZFN等を利用した技術は、ゲノム上の特定配列を標的として、ヌクレアーゼの作用によって、特定遺伝子の破壊や相同組換えを可能とする画期的な技術である。また、当該技術により、ES細胞の系が確立されていないあらゆる動物に対しても、標的配列の遺伝子改変（ゲノム編集）を容易に行うことが可能となる。
【０００３】
しかしながら、ZFN等のゲノム編集技術を利用するためには、受精卵への核酸導入操作が必要となる。当該核酸導入操作としては、通常は顕微注入法（マイクロインジェクション）によって行われ、特別な装置（マイクロマニュピュレーター）が必要となる。即ち、従来法によりZFN等のゲノム編集技術を行うには、費用の点での課題が指摘されている。
また、顕微注入法を行うには、熟練した技術を有する人員が必要となり、実験者によっては再現性が低いという問題が指摘されている。
【０００４】
このように、ZFN等のゲノム編集技術を哺乳類に利用するためには、費用及び技術的な課題が存在するため、誰もが即座に施用可能であり且つ高効率で哺乳類のゲノム編集を実現可能な技術が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】真下知士 : 新しい遺伝子改変技術「ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）」. : 生物と化学、日本農芸化学会編、p220-222 (2011)
【非特許文献２】真下知士、芹川忠夫 : ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN） : 細胞工学 vol.31 (3) p296-301 (2012)
【非特許文献３】ゲノム編集革命（監修：山本卓、野地澄晴） : 細胞工学 vol.32 (5) (2013)
【非特許文献４】Ryan M. Walsh and Konrad Hochedlinger, PNAS, vol.110, no.39, 15514-15515 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ES細胞を利用する必要なく哺乳類に広く適用可能な技術であって、ゲノム上の特定配列を標的として特定遺伝子を改変する技術（ZFN等のゲノム編集技術）を、極めて簡便な手法のみで利用可能とする技術を、開発することを課題とする。
また、本発明は、特定の哺乳類の種類に限定されることなく、高効率且つ再現性良く、哺乳類の遺伝子改変個体を作出可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類の受精卵を、特定のRNA分子を含む溶液に浸漬した後、；高電圧で短時間の矩形波電気パルス（第1電気パルス）の総電力量を所定範囲条件になるようにして与え、次いで低電圧で長時間の矩形波電気パルス（第2電気パルス）を2回以上与え、次いで、前記第2電気パルスとは逆の極性の低電圧で長時間の矩形波電気パルス（第3電気パルス）を2回以上与える電気穿孔処理（3段階方式矩形波多重パルス：図1,2 参照）を行うことによって、；標的とする所望の哺乳類遺伝子を効率良く改変できることを見出した。
【０００８】
特に本発明者らは、これらの条件において、「受精卵として前核期にある哺乳類のものを用いること」、「受精卵として透明帯を有した状態のものを用いること」、「核酸分子種として特定配列を有するRNA分子を用いること」、「エレクトロポレーションの電気条件として、電気パルス条件が所定条件にある3段階方式矩形波多重パルスを与えること」が、特に重要な技術的特徴であることを見出した。
また、本発明者らは、当該技術は、特定の哺乳類種類に限定されることなく、哺乳類全般に対して幅広く適用可能な技術であることを見出した。
【０００９】
なお、従来技術においては、‘受精卵’に‘エレクトロポレーション’を行うことによって哺乳類の遺伝子改変個体（遺伝子導入によりゲノム編集された個体）を作出する例は報告されていない。例えば、Joanna B.Grabarek et al., Genesis 32 p269-276 (2002)、及び、Hui Peng et al., PLOS ONE vol.7 (8) e43748 p1-13 (2012) には、受精卵にDNAやdsRNAを導入する例が報告されているが、これらの文献は導入した核酸の‘一時的な’遺伝子発現を報告する文献に過ぎない。
その理由としては、従来のエレクトロポレーションでは、「減衰波方式（エクスポネンシャル方式）」を採用する出力装置からの電気パルスを1回与える方法が良く用いられているため（例えば、Shimogawara, K. et al., Genetics 148 p1821-1828 (1998) 参照）、遺伝子導入効率が低すぎる問題が考えられる。
また、上記Joanna B.Grabarek et al.、及び、Hui Peng et al.では、電気パルス処理によるDNA等の導入効率を向上させる目的で、遺伝子導入の障壁となっている受精卵の透明帯を酸性タイロード液で除去する処理を行っている。しかし、透明帯の除去又は菲薄化した受精卵を偽妊娠した雌の卵管に移植した場合、当該受精卵が産子まで正常発育する効率が著しく低下する問題が存在する。即ち、遺伝子導入効率を向上させる処理を行うことにより、逆に正常発育が阻害されるという問題が存在する。
【００１０】
また、哺乳類細胞（培養細胞等）に対するエレクトロポレーション技術としては、2種類の電気パルスを与えることにより哺乳類細胞に効率良く遺伝子導入する方法が開示されている（Sukharev S.I. et al., Biophys. J. 63 p1320-1327 (1992) 参照）。しかし、当該方法においても、受精卵に対して十分な導入効率を実現するためには、透明帯の除去又は菲薄化が必要となる課題は改善されていない。
【００１１】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
即ち、［請求項1］に係る発明は、下記(A)に記載の受精卵を、下記(B)に記載の核酸分子を含む溶液に浸漬し、；前記溶液に1回又は2回以上の下記(C)に記載の矩形波電気パルスを、電力量の合計が0.2〜7.5J/100μLになるように与え、；次いで下記(D)に記載の矩形波電気パルスを2回以上与え、；次いで下記(E)に記載の矩形波電気パルスを2回以上与えること、；を特徴とする、哺乳類の遺伝子改変方法に関するものである。
(A): 前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類（ヒトを除く）の受精卵。
(B): ゲノムDNAの任意の領域に対して、配列特異的にエンドヌクレアーゼ活性を発揮するように機能するRNA。
(C): 1パルスの電圧が375V/cm以上である矩形波電気パルス。
(D): 1パルスの電圧が250V/cm以下であり且つ1パルスの電力量が0.01〜3.6J/100μLである矩形波電気パルス。
(E): 上記(D)に記載の電気パルスとは逆の極性の矩形波電気パルスであって、1パルスの電圧が250V/cm以下であり且つ1パルスの電力量が0.01〜3.6J/100μLである矩形波電気パルス。
また、［請求項2］に係る発明は、前記(B)に記載の核酸分子が、下記(b1)に記載の核酸分子及び下記(b2)に記載の核酸分子である、請求項1に記載の方法に関するものである。
(b1): 配列特異的DNA結合ドメイン, 及び, 下記(b2)に記載の制限酵素活性ドメインと二量体を形成した場合に制限酵素活性を発揮するドメイン, を有するタンパク質をコードしたmRNA。
(b2): 上記(b1)に記載のタンパク質が結合するゲノムDNA領域端の近傍領域であり且つその相補鎖に結合する配列特異的DNA結合ドメイン, 及び, 上記(b1)に記載の制限酵素活性ドメインと二量体を形成した場合に制限酵素活性を発揮するドメイン, を有するタンパク質をコードしたmRNA。
また、［請求項3］に係る発明は、前記(B)に記載の核酸分子が、下記(b3)に記載の核酸分子及び下記(b4)に記載の核酸分子である、請求項1に記載の方法に関するものである。
(b3): ゲノムDNAの任意の塩基配列の相補配列, 及び, 下記(b4)に記載のタンパク質と特異的に結合する配列, を有するGuide RNA。
(b4): 上記(b3)に記載のGuide RNAと特異的に結合した場合にエンドヌクレアーゼ活性を発揮するタンパク質をコードしたmRNA。
また、［請求項4］に係る発明は、前記電気穿孔を行った後、得られた受精卵を2〜16細胞期胚まで培地中で培養し、その後、前記哺乳類と同種又は近縁種の雌の卵管又は子宮に移植して産子を得ることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法に関するものである。
また、［請求項5］に係る発明は、前記溶液が、エキソヌクレアーゼ1（Exo1）をコードしたmRNAをさらに含むものである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法に関するものである。
また、［請求項6］に係る発明は、前記哺乳類が齧歯目に属する種類であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法に関するものである。
また、［請求項7］に係る発明は、上記(D)に記載の矩形波電気パルスを与える回数が5回以上であり、且つ、上記(E)に記載の矩形波電気パルスを与える回数が5回以上である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法に関するものである。
また、［請求項8］に係る発明は、前記遺伝子改変が、遺伝子の破壊による機能の欠失又は抑制を伴うものである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法に関するものである。
また、［請求項9］に係る発明は、請求項1〜8のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、遺伝子改変された哺乳類個体の作出方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、ES細胞を利用する必要なく哺乳類に広く適用可能な技術であって、ゲノム上の特定配列を標的として特定遺伝子を改変する技術（ZFN等のゲノム編集技術）を、極めて簡便な手法のみで利用することを可能とする。
また、本発明は、特定の哺乳類の種類に限定されることなく、高効率且つ再現性良く、哺乳類の遺伝子改変個体を作出することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】3段階方式矩形波多重パルスを与える電気穿孔処理の概念を示した図である。縦軸は電圧(V)、横軸は時間(m秒)を示す。図中の「Pp」はPoring Pulse、「Tp」はTransfer Pulseを示す。
【図２】3段階方式矩形波多重パルスを与える電気穿孔処理により、受精卵内にmRNAが導入されるメカニズムを示した概念図である。図中の「Pp」はPoring Pulse、「Tp」はTransfer Pulseを示す。左図: Poring Pulseにより透明帯及び細胞膜に微小孔が形成されることを示す概念図。中図: Transfer Pulse 1により、mRNAが受精卵の細胞質内に移行することを示す概念図。右図: Transfer Pulse 2（極性を変えたパルス）により、さらにmRNAが受精卵の細胞質内に移行することを示す概念図。
【図３】実施例で用いた電気パルス発生装置を撮影した写真像である。(A): シャーレ白金プレート電極を装着したガラスチャンバー。(B): 電気パルス発生装置であるNEPA21(登録商標)本体。
【図４】試験例1において、テトラメチルローダミンラベルデキストリンを導入した受精卵を撮影した写真像図である。上段: 顕微鏡を用いて明視野にて撮影した写真像図である。下段: 蛍光顕微鏡を用いて撮影した写真像図である。
【図５】試験例5において、Il2rg遺伝子を標的とするZFN mRNAを導入して作出されたノックアウトラットを撮影した写真像図である。左：Il2rg遺伝子ノックアウトラット。右：野生型ラット（F344/Stm系統）。
【図６】試験例5において、Il2rg遺伝子の第2エクソン付近の特定領域を標的とするように設計されたZFNの概念図。
【図７】試験例6において、Il2rg遺伝子の第2エクソンの特定領域を標的とするように設計されたTALENの概念図。
【図８】試験例7において、Thy遺伝子の特定領域を標的とするように設計されたCRISPR-Cas9システムの概念図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。
本発明は、前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類の受精卵を、特定のRNA分子を含む溶液に浸漬し、第1電気パルスの総電力量を所定範囲にして3段階方式の矩形波多重パルスを与えて電気穿孔処理を行うことにより、哺乳類の任意の標的遺伝子を効率良く改変する技術に関する。
【００１５】
［遺伝子導入対象の受精卵］
本発明の遺伝子改変技術は、「前核期にある透明帯を有した状態の哺乳類の受精卵」を用いることを必須とする技術である。
【００１６】
・前核期
当該遺伝子導入対象である受精卵は、「前核期（前核期胚の状態）」にあることが必要である。ここで‘前核期’とは、精子の核が卵子の細胞質内に取り込まれてはいるが、卵の核と精子の核の融合がまだ起こっていない受精卵の状態を指す。受精卵が前核期にあるかどうかの判断は、顕微観察により行うことが可能である。
前核期受精卵の採取法としては、例えば、過排卵処理した雌個体とその同種の雄個体とを交配させた場合、交配の翌日に採取することができる。また、交配を行わずに採取した未受精卵に対して、精子を顕微授精することによって、人工的に前核期受精卵を得ることも可能である。
【００１７】
本発明では、前核期の受精卵に対して、遺伝子導入を行うことによって、個体全体の細胞が均一に遺伝子改変された動物を得ることが可能となる。
それに対して、前核期を過ぎた受精卵に対して遺伝子導入を行った場合、遺伝子導入された細胞と遺伝子導入されない細胞が混ざったキメラ個体になる確率が、著しく高まるため好ましくない。また、未受精卵に遺伝子導入を行った場合、正常発生が起こりにくくなり好ましくない。
【００１８】
・透明帯
当該遺伝子導入対象である受精卵は、「透明帯を有した状態」であることが必要である。ここで‘透明帯’(Zona Pellucida)とは、糖タンパク質のマトリックス構造であって、哺乳類の卵母細胞や受精卵を被覆して保護する外層を指すものである。
有胎盤性哺乳類の初期発生では、受精後の初期胚は、当該構造に物理的に保護されて胚盤胞まで生育することが必要である。この点、透明帯は、哺乳類の初期胚が正常に生育するために、重要な働きを担っている組織であると認められる。
なお、胚盤胞に成長した後の胚は、透明帯を飛び出して子宮壁に着床するハッチング過程を経て、胎盤が形成される。
【００１９】
本発明の遺伝子改変技術では、透明帯（遺伝子導入の障壁となる組織）を有した状態の受精卵に対して、直接エレクトロポレーションを行うことを必須とする技術である。また、当該技術では、透明帯の保護機能によって、遺伝子導入後の受精卵を雌の卵管に移植し、産子まで正常に発育させることが可能となる。
ここで、「透明帯を有する受精卵」とは、透明帯で被覆された状態の受精卵を指すものである。透明帯の状態としては、採取した受精卵（又は未受精卵）をそのまま液体培地等で保管したものであることが望ましい。
また、採取した受精卵に対して卵丘細胞の除去処理（ヒアルロニダーゼ処理など）を行った場合であっても、透明帯の除去又は菲薄化は起こらず、初期胚の保護機能には影響がない。そのため、本発明では、卵丘細胞の除去処理を行った受精卵についても、好適に用いることができる。
【００２０】
それに対して、酸性タイロード処理等を行って‘透明帯を除去又は菲薄化した受精卵’は、当該受精卵を雌の卵管に移植しても、当該受精卵が産子まで正常に発育させることが著しく困難となる。そのため、‘透明帯を除去又は菲薄化した受精卵’を用いる態様については、本発明の範囲から除外される。
なお、従来のエレクトロポレーション法では、透明帯を除去又は菲薄化する処理（遺伝子導入の障壁を取り除く処理）が必須であるため、正常生育した産子を得ることが著しく困難となる課題を内在している。本発明は、当該課題に対して、有効な解決手段を提供する発明であると認められる。
【００２１】
・哺乳類
哺乳類の初期発生（特に桑実胚までの初期発生）は、哺乳類の全ての種類において、共通した構造及び制御機構により発生が進行する。そのため、本発明に係る遺伝子改変技術は、原理的には、哺乳類の全ての種類に対して施用可能な技術と認められる。但し、倫理上の観点から、本発明の技術をヒト（Homo sapiens）の受精卵に対しては適用すべきではない。
【００２２】
ここで、‘哺乳類’（Mammalia：哺乳綱）とは、爬虫類の一群から分岐した単系統の動物群であって、乳房にある乳腺から分泌する体液（乳）により授乳で仔を育てる行動様式を示す一群を指す。多くの種類では、体表が角質層に由来する体毛で覆われている。現生種としては、単孔類、有袋類、及び有胎盤類が存在するが、大多数の現生種は有胎盤類に属する。
【００２３】
ここで、‘単孔類’（原獣類）とは、卵生の生殖様式を示す哺乳類の一群を指す。三畳紀後期に出現した単系統の分類群と考えられている。当該分類群としては、現生のものとしては単孔目（カモノハシなど）のみが存在する。
また、‘有袋類’（後獣類）とは、胎盤が不完全で、育児嚢によって仔を育てる行動様式を示す一群を指す。白亜紀後期に出現した単系統の分類群と考えられている。当該分類群としては、オポッサム目、ミクロビオテリウム目、フクロネコ目、バンティクート目、フクロモグラ目、カンガルー目（カンガルー, ワラビー, コアラなど）、などを挙げることができる。
また、‘有胎盤類’（真獣類）とは、母体の子宮に胎盤を形成して出産により仔を産む繁殖様式を示す一群を指す。白亜紀後期に出現した単系統の動物群と考えられている。当該分類群としては、長脚目（ハネジネズミなど）、テンレック目（テンレック, キンモグラなど）、管歯目（ツチブタなど）、岩狸目（ハイラックスなど）、長鼻目（ゾウなど）、海牛目（ジュゴンなど）、被甲目（アルマジロなど）、有毛目（ナマケモノ, アリクイなど）、登木目（ツパイなど）、皮翼目（ヒヨケザルなど）、霊長目（キツネザル, サル, ガラゴ, ゴリラ, チンパンジーなど）、兎形目（ウサギ, ナキウサギなど）、齧歯目（ネズミ, ラット, リス, ヤマアラシ, ヌートリアなど）、ハリネズミ目（ハリネズミなど）、トガリネズミ目（モグラなど）、鯨目（クジラ, イルカなど）、偶蹄目（ラクダ, イノシシ, キリン, シカ, ウシ, ヤギ, カバなど）、有鱗目（センザンコウなど）、食肉目（ネコ, トラ, ライオン, イヌ, オオカミ, イタチ, タヌキ, キツネ, クマ, アザラシなど）、奇蹄目（ウマ, サイ, バクなど）、翼手目（コウモリなど）などを挙げることができる。
【００２４】
本発明の技術は、上記哺乳類のうち、前核期受精卵を得ることが可能な種類であって、且つ、雌の胎内への移植により生育が可能な種類であれば、如何なる種類についても適用可能な技術である。
例えば、初期胚を雌の卵管又は子宮に移植して着床させ、妊娠により産子を得ることが可能な技術が確立されている種類であれば、如何なる種類についても適用可能な技術である。また、胚操作によって産子を得ることができない種類についても、近縁種の雌への移植によって妊娠が可能であれば、本発明の技術が適用可能である。
【００２５】
当該技術は、特にマウス、ラット、サル等の実験動物、；ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等の家畜、；ゾウ、トラ、クジラなど絶滅の恐れがある野生動物に対して、有用な技術となることが期待される。特に、ヒトの疾患解明という点では、齧歯目、霊長目の動物に対して有用な技術となることが期待される。
【００２６】
［導入対象の核酸分子］
本発明では、上記受精卵に対して所定の核酸分子を導入することを必須とする技術である。ここで、‘所定の核酸分子’とは、「任意のゲノムDNA領域に対して、配列特異的にエンドヌクレアーゼ活性を発揮するように機能するRNA分子」を指すものである。また、‘任意のゲノムDNA領域’とは、遺伝子内のエクソンやイントロンだけでなく、転写因子のターゲットとなる調節領域（広義には遺伝子に含まれる領域）、スペーサー領域などを含むゲノム全体の領域を指す。
【００２７】
・ZFN等をコードしたmRNAペア
当該RNA分子として具体的には、下記(1)及び(2)に記載の2種類のペアとなるmRNAを挙げることができる。
ここで、2種類のmRNAのうちの1つとしては、具体的には、(1)「配列特異的DNA結合ドメイン, 及び, 下記(2)に記載の制限酵素活性ドメインと二量体を形成した場合に制限酵素活性を発揮するドメイン, を有するタンパク質をコードしたmRNA」を指すものである。
また、ペアとなるもう1つのmRNAとしては、具体的には、(2)「上記(1)に記載のタンパク質が結合するゲノムDNA領域端の近傍領域であり且つその相補鎖に結合する配列特異的DNA結合ドメイン, 及び, 上記(1)に記載の制限酵素活性ドメインと二量体を形成した場合に制限酵素活性を発揮するドメイン, を有するタンパク質をコードしたmRNA」を指すものである。
【００２８】
当該mRNAがコードするタンパク質は、標的とする任意のDNA領域を切断する人工タンパク質である。当該人工タンパク質は、「配列特異的DNA結合ドメイン」と「制限酵素活性ドメイン」を有するタンパク質であって、当該両ドメイン間が‘直接’又は‘アダプターとなる領域を介して’結合されてなるタンパク質である。
【００２９】
ここで、‘配列特異的DNA結合ドメイン’とは、標的とする任意のDNA配列と特異的に結合するタンパク質の領域を指すものである。
当該配列特異的DNA結合ドメインとしては、具体的には、Zinc Finger Proteins（ZFPs）、Transcription Activator-Like Effectors（TALEs）、などを挙げることができる。
ZFPsは、特異的な3塩基配列を認識するZinc Finger ユニットを、複数重合した構造を有し、3の倍数のDNA配列を認識し結合するドメインである。ZFPsを含む当該人工タンパク質は、Zinc Finger Nuclease (ZFN)と呼ばれている（図6 参照）。
また、TALEsは、4種類の塩基（A,T,G,C）のいずれかを認識して結合する4種類のユニットを重合させてなるドメインである。TALEsを含む当該人工タンパク質は、Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)と呼ばれている（図7 参照）。
【００３０】
これらのDNA結合ドメインでは、ペプチドユニットの組み合わせによって、任意の塩基配列と配列特異的に結合可能なDNA結合ドメインをデザインすることが可能となる。特に、TALEsは、mRNA調製用の発現プラスミドの設計が容易であり好適に用いることができる。
【００３１】
当該DNA結合ドメインが認識結合する塩基配列長としては、8〜50bp程度、好ましくは10〜45bp、より好ましくは13〜40bp、さらに好ましくは14〜30bp、特に好ましくは15〜25bp、一層好ましくは15〜21bp、を挙げることができる。認識配列長が短すぎる場合、配列特異性が低下しミスマッチ結合が増加してしまい望ましくない。認識配列長が長すぎる場合、ペプチドをコードするmRNAが高分子化して導入効率が低下してしまい好ましくない。
【００３２】
なお、当該技術においては、上記(1)と(2)のDNA結合ドメインは、制限酵素活性ユニットの認識配列を挟む位置に結合し、且つ、上記(1)と(2)の制限酵素活性ドメインが二量体を形成できる位置に結合するようにデザインする必要がある。
【００３３】
また、当該技術においては、「上記(2)に記載の配列特異的DNA結合ドメイン」は、上記(1)に記載のタンパク質が結合するDNA領域端の近傍領域であり且つその相補鎖に結合するものであることが必要となる。
ここで、‘近傍’とは、上記(1)と(2)のタンパク質がDNAに結合した場合に、両者の制限酵素活性を有するドメインが二量体を形成できる一定間隔離れた位置を意味する。このような位置としては、例えば、上記(1)と(2)のタンパク質が結合するDNA領域の端どうしが、4〜50bp程度の一定間隔離れた位置であることが望ましい。
【００３４】
当該技術における「制限酵素活性ドメイン」とは、上記(1)及び(2)に記載の制限酵素活性ドメインどうしが二量体を形成した場合にのみ、制限酵素活性を発揮する領域を指すものである。即ち、当該制限酵素活性ドメインは、単独では活性を発揮しないが、二量体を形成した場合にのみ配列特異的なエンドヌクレアーゼ活性を発揮する。
当該ドメインとして、二型制限酵素活性を発揮するものであることが好ましい。具体的には、FokＩやFokＩ変異体などを用いることが好適である。なお、FokＩ変異体とは、FokＩのアミノ酸配列に置換、欠失、挿入、及び／又は付加（末端への付加）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。具体的には、FokＩのアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、FokＩと同等又はそれ以上の機能を有するタンパク質を指すものである。
【００３５】
当該mRNAの長さとしては、0.3kb以上、好ましくは0.5kb以上、より好ましくは0.8kb以上、さらに好ましくは1kb以上となることが通常である。また、mRNAが長すぎて高分子化する場合、受精卵への導入効率が低下し好適でない。例えば5kb以下、好ましくは4kb以下、より好ましくは3kb以下であることが望ましい。
【００３６】
受精卵に導入された上記各mRNAは、細胞のタンパク質合成系で翻訳されて人工タンパク質が合成される。受精卵内で産生された(1)に記載の人工タンパク質と(2)に記載の人工タンパク質は、標的領域にある切断部位を挟む位置でゲノムDNAに結合し、当該DNAを切断する。
なお、本発明の技術においては、核酸分子としてDNA（具体的にはプラスミドDNA）を用いた場合には、所望の遺伝子改変個体を得ることができない。例えば、後述する試験例でプラスミドDNAの導入例を示したが、正常に生育した遺伝子改変個体を作出することはできない。その理由は、受精卵の転写系が十分に機能しにくく、翻訳産物である人工タンパク質が十分に産生されにくいためと考えられる。
【００３７】
・CRISPR-Cas9システム用のRNA
また、本発明の技術において導入対象となるRNAとしては、CRISPR-Cas9システムを構成する下記(3)に記載のGuide RNA, および, 下記(4)に記載のmRNA, を挙げることができる。
なお、ここで‘CRISPR’とは、Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeatsのアクロニムを指す用語であり、原核生物においてファージやプラスミドに対する獲得免疫機構として機能するDNA領域を指す。
【００３８】
CRISPR-Cas9システムを構成する当該Guide RNAとして具体的には、(3)「ゲノムDNAの任意の塩基配列の相補配列, 及び, 下記(4)に記載のタンパク質と特異的に結合する配列, を有するGuide RNA」を指すものである。
当該Guide RNAは、任意のゲノムDNA領域内に設計された任意の塩基配列に対する‘相補配列’を有するRNA分子である。当該Guide RNAは、当該相補配列により5'側（好ましくは5'端）を構成されてなることが好適である。当該相補配列が標的のゲノム配列とハイブリダイズすることによって、当該Guide RNAは、ゲノムDNAに対して配列特異的に結合することが可能となる。
【００３９】
ここで、当該相補配列がハイブリダイズする‘任意の塩基配列’としては、PAM配列（Cas9の認識配列）の直上の塩基配列であることが好適である。特には、‘任意の塩基配列’の3'端とPAM配列の5'端とが隣接していることが好適である。また、ミスマッチ結合を避けるために、ゲノムDNA中に類似配列がないことを考慮して、配列をデザインすることが重要となる。
また、当該任意の塩基配列としては、15〜40bp、好ましくは15〜30bp、より好ましくは15〜25bp、さらに好ましくは18〜22bp、特に好ましくは20bp付近であることが望ましい。配列が短すぎる場合、ミスマッチ結合が起こりやすくなり好適でない。
【００４０】
また、当該Guide RNAは、上記相補配列の3'側に、上記(3)に記載のタンパク質と特異的に結合する配列を含むものとなる。当該特異的結合は、特定のRNA配列及び特定のRNA立体構造によって、実現されるものと推測される。
当該Guide RNAの3'側の特定RNA配列としては、例えば、CRISPRのcrRNA:tracrRNAにおいて上記相補配列の3'側を構成するRNA配列（配列番号8 参照）、又は、その類似配列を挙げることができる。
ここで、crRNA:tracrRNAの類似配列としては、配列番号8の塩基配列に置換、欠失、挿入、及び／又は付加（末端への付加）を有する塩基配列からなるRNA配列を指すものである。具体的には、配列番号8の塩基配列に対して、80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、一層好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列を含むRNA配列であって、配列番号8のcrRNA:tracrRNAと同等又はそれ以上の機能を有するRNA配列を指すものである。
【００４１】
CRISPR-Cas9システムを構成する当該mRNAとして具体的には、(4)「上記(3)に記載のGuide RNAと特異的に結合した場合にエンドヌクレアーゼ活性を発揮するタンパク質をコードしたmRNA」を指すものである。
当該mRNAがコードするタンパク質は、Guide RNAに特異的に結合することによって、任意の標的DNA配列を切断するタンパク質である。当該タンパク質としては具体的には、Cas9 nuclease又はその類似タンパク質を挙げることができる。
Cas9 nucleaseは、Proto-spacer Adjacent Motif（PAM）とよばれる特定の塩基配列を認識し、その上流である標的配列内のDNAを切断する活性（エンドヌクレアーゼ活性）を発揮するタンパク質である（図8 参照）。なお、PAM配列は、Cas9 nucleaseが由来するバクテリアの種類によって異なる配列となる場合がある。例えば、Streptococcus pygenesに由来するCas9 nuclease (SpCas9)の場合、「NGG」というPAM配列が認識される。また、S.thermophilesに由来するCas9 nuclease (StCas9)の場合、「NNAGAAW」というPAM配列が認識される。また、「NNNNGATT」というPAM配列を認識するCas9の一種も報告されている。
【００４２】
また、Cas9 nucleaseの類似タンパク質としては、SpCas9 (S.pygenesに由来するCas9 nuclease) 又は StCas9 (S.thermophilesに由来するCas9 nuclease) のアミノ酸配列に対して、置換、欠失、挿入、及び／又は付加（末端への付加）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。具体的には、SpCas9又はStCas9のアミノ酸配列に対して、80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、一層好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、SpCas9又はStCas9と同等又はそれ以上の機能を有するタンパク質を指すものである。人工的に作成したCas9変異タンパク質もここに含まれる。
【００４３】
受精卵に導入された(4)に記載のmRNAは、細胞のタンパク質合成系で翻訳されて、当該mRNAにコードされたタンパク質が合成される。当該(4)に記載のタンパク質は、標的とするゲノムDNA配列に結合した(3)に記載のGuide RNAと結合し、PAM配列の上流にある標的配列内のDNAを切断する活性を発揮する（図8 参照）。
なお、本発明の技術においては、核酸分子としてDNA（具体的にはプラスミドDNA）を用いた場合には、所望の遺伝子改変個体を得ることができない。その理由は、受精卵の転写系が十分に機能しにくく、翻訳産物であるタンパク質が十分に産生されにくいためと考えられる。
【００４４】
・エキソヌクレアーゼ1（Exo1）
当該技術においては、上記RNA分子とは別途に、「エキソヌクレアーゼ1（Exo1）をコードしたmRNA」を共導入することが望ましい。当該Exo1 mRNAを共導入させることによって、上記標的遺伝子の組換え効率を大幅に向上させることが可能となるためである。
【００４５】
［電気穿孔処理］
本発明では、上記受精卵を、核酸分子を含む溶液に浸漬し、所定の電気パルス条件を充足するような3段階方式矩形波多重パルスを与える処理（電気穿孔処理）を行うことを必須とする技術である。
【００４６】
・装置
当該電気穿孔処理を行うためには、後述する所定の電気パルス条件を充足する3段階方式矩形波多重パルスを出力可能な装置であれば、如何なる装置をも用いることができる。
例えば、ネッパジーン社の電気パルス出力装置「NEPA21(登録商標)」を好適に用いることができる。当該装置は、一回の処理ごとに電気抵抗値や電流値を計測する機能を有するため、電気条件の設定を詳細に行うことが可能となる。また、多重電気パルスを与える際において、電気パルスごとに電気極性を切り替える機能が備わっている。
なお、従来のスクエアーパルス式電気パルス出力装置の使用方法を工夫して電気穿孔を行うことも可能ではあるが、装置の機能の制約がある点で、電気穿孔時の電力量を求めることができないため好適ではない。
【００４７】
・エレクトロポレーションバッファー
当該電気穿孔処理は、前記核酸分子を溶解した溶液を調製し、当該溶液に電気パルスを与えて通電するようにして行う。
ここで、溶液（エレクトロポレーションバッファー）としては、リン酸バッファー（PBS）等の緩衝液や、通常の受精卵用の培地を用いることができる。即ち、特殊なエレクトロポレーションバッファーを購入したり調製したりする必要がない。
【００４８】
溶液に含有させる核酸分子の濃度としては、各RNAが0.5ng/μL以上、好ましくは1ng/μL以上、より好ましくは2ng/μL以上、さらに好ましくは5ng/μL以上、特に好ましくは10ng/μL以上、一層好ましくは20ng/μL以上、より一層好ましくは30ng/μL以上、さらに一層好ましくは40ng/μL以上が好適である。核酸濃度が低すぎる場合、遺伝子導入効率が低くなり好ましくない。
上限としては、各mRNAが2000ng/μL以下、好ましくは1500ng/μL以下、より好ましくは1000ng/μL以下、さらに好ましくは750ng/μL以下、特に好ましくは500ng/μL以下、一層好ましくは400ng/μL以下であることが好適である。核酸濃度が高すぎる場合、受精卵の生存率が下がり、結果として得られる産子数が低下してしまい好ましくない。
【００４９】
なお、2種類のRNAを添加する際のRNAの濃度比としては、mol比に換算して1：0.1〜1：10、好ましくは1：0.2〜1：8、より好ましくは1：0.4〜1：6、さらに好ましくは1：0.6〜1：1.4、特に好ましくは1：0.8〜1：1.2、一層好ましくは1：1付近、となるように調整することが好適である。
【００５０】
なお、当該溶液は、抗生物質が含まれないものであることが望ましい。抗生物質が溶液中に存在する場合、電気穿孔処理により抗生物質が細胞に取り込まれてしまい、細胞の生存率が低下するためである。
さらに、当該溶液は、血清も含まれないものであることが望ましい。血清が溶液中に存在する場合、電気穿孔処理時に血清が前記核酸分子の細胞への取り込みを阻害し、導入効率が低下するためである。なお、低濃度（例えば1％以下、好ましくは0.5％以下）であれば血清の含有は許容される範囲である。
【００５１】
・電極
当該電気穿孔処理は、電気パルス出力装置に接続されている電極を用いて行う。電極の種類としては、原理的には如何なるものを用いることもできるが、具体的にはシャーレプレート電極、チャンバー電極、針電極、ピンセット電極、キュベット電極などを用いることができる。これらの電極のうち、具体的にはシャーレプレート電極、チャンバー電極等を用いることが好適である。電極としては、通常の規格のものを用いることができるが、例えば、電極間の距離（gap）が、2〜50mm、好ましくは5〜25mmのものを用いることが可能である。
【００５２】
当該電気穿孔処理は、当該電極を‘前記核酸分子を溶解した溶液’に浸漬した状態にし、上記受精卵を当該溶液に浸漬して静置状態にし、電気パルスを与えることにより行う。具体的には、上記受精卵を当該電極の＋極と−極の間に浸漬して静置状態にし、電気パルスを与えることにより行うことが望ましい。受精卵は、電極間を結ぶ線に対して、複数個が重なり合わないようにして、平行に並べて静置することが望ましい。
【００５３】
・電気パルス処理
前記電気パルス出力装置から出力された電気パルスは、電極間に静置した受精卵に通電される。
なお、当該電気穿孔処理を行う際には、室温（例えば、10〜35℃程度）で行うことが好適である。また、電極の金属部分への水滴付着を防止するために、氷冷は行わない方がよい。
【００５４】
［電気パルス条件］
本発明は、前記受精卵を静置した核酸分子を含む溶液に対して、所定条件での高電圧で短時間の矩形波電気パルス（第1電気パルス）を与え、次いで低電圧で長時間の矩形波電気パルス（第2電気パルス）を2回以上与え、次いで、前記第2電気パルスとは逆の極性の低電圧で長時間の矩形波電気パルス（第3電気パルス）を2回以上与えて、3段階方式矩形波多重パルスによる電気穿孔（エレクトロポレーション）を行う方法である（例えば、図1,2 参照）。
【００５５】
本発明における第1〜3電気パルスは、‘電圧’と‘電力量’の両方が、後述する特定の範囲にあることを要する。
ここでの電圧は、前記電極間の幅の単位cmあたりにかかる電圧Vを表す値である。例えば、5mm gapの電極を用いて300V/cmの電圧をかけるためにはでは、150Vの電圧をかければよい。また、ここでの電力量(W)とは、前記溶液100μLあたりにかかる電力量（エネルギー量）を表す値である。例えば、抵抗50Ωの溶液100μLに、パルス幅5m秒の時間(T)で150Vの電圧(V)をかけた場合、3Aの電流(I)が発生する。この場合、当該溶液100μLあたりにかかる電力量（W=VIT）は2.25Jとなる。
【００５６】
また、本発明の電気パルスは、‘矩形波’での電気パルスを与えることを要する。‘減衰波’の電気パルスでは、本発明で達成される高い遺伝子導入効率を実現することができない。
【００５７】
・第1電気パルス：Poring Pulse (Pp)
本発明における電気穿孔処理では、所定条件での高電圧で短時間の矩形波電気パルス（第1電気パルス：Poring Pulse）を与えることを必須とする技術である。当該第1電気パルスを与えることによって、透明帯に損傷程度の少ない小孔が空けられる。
なお、通常の動物細胞に対するエレクトロポレーション法（従来法）では、第1電気パルスの電圧を高くすることで、核酸分子（DNA等）が細胞内に導入されるという知見があるが、受精卵では、単に電圧を上げただけでは実用的なレベルでの遺伝子導入を達成することができない。その原因としては、透明帯の損傷がひどい場合には、電気穿孔処理した受精卵の生存率が著しく低下したり、初期胚の正常生育が著しく阻害されてしまうためと考えられる。
【００５８】
当該第1電気パルスでは、少なくとも375V/cm以上（5mm gap 電極の場合で187.5V以上）の電圧をかけることが必要である。好ましくは400V/cm以上、より好ましくは450V/cm以上、さらに好ましくは500V/cm以上の電圧をかけることが望ましい。電圧が低すぎる場合、透明帯に小孔を空けることができないため好ましくない。
なお、当該第1電気パルスの電圧値の上限としては、後述する総電力量の条件が充足される限り特に制限なく与えることができる。透明帯の損傷程度は、主に‘総電力量（エネルギー量）’の値に依存するためである。なお、敢えて上限値を挙げるとすると、例えば、4500V/cm以下、好ましくは3750V/cm以下、より好ましくは2500V/cm以下、さらに好ましくは1500V/cm以下を挙げることができる。
当該総電力量条件は、透明帯に核酸の取り込みに好適な小孔を空けつつ、透明帯や細胞膜の損傷を抑える条件に相当する。
【００５９】
当該第1電気パルスは、‘総電力量’が所定の範囲にあることが必須となる。ここで総電力量とは、上記電圧値以上の電気パルスの電力量の合計値を示す値である。例えば、750V/cm以上の電気パルスを2回与えた場合には、当該2回の電気パルスの電力量の合計値が、総電力量の値となる。
当該総電力量としては、0.2J/100μL以上であることが必須となる。総電力量が低すぎる場合、十分な遺伝子導入効率を達成することができない。総電力量の下限としては、好ましくは0.286J/100μL以上、より好ましくは0.3J/100μL以上、さらに好ましくは0.4J/100μL以上、特に好ましくは0.5J/100μL以上、一層好ましくは0.535J/100μL以上、より一層好ましくは0.558J/100μL以上、を挙げることができる。
また、当該総電力量の上限としては、7.5J/100μL以下であることが必須となる。総電力量が高すぎる場合、透明帯や細胞膜の損傷が大きくなり生存率が低下するため好ましくない。総電力量の上限としては、好ましくは7.317J/100μL以下、より好ましくは7.3J/100μL以下、さらに好ましくは7J/100μL以下、特に好ましくは6.5J/100μL以下、一層好ましくは6J/100μL以下、より一層好ましくは5.5J/100μL以下、さらに一層好ましくは5J/100μL以下、特に一層好ましくは4.5J/100μL以下、もっと一層好ましくは4.3J/100μL以下、もっとより一層好ましくは4.255J/100μL以下、を挙げることができる。
当該総電力量条件は、透明帯に核酸の取り込みに好適な小孔を空けつつ、透明帯や細胞膜の損傷を抑える条件に相当する。
【００６０】
なお、第1電気パルスを与える回数としては、総電力量が上記範囲であれば特に回数の制限なく与えることができる。例えば、前記電力量の範囲の電気パルスを1回で与えてもよいし、2回以上に分けて与えてもよい。具体的には2〜20回を挙げることができる。回数を分けることで、透明帯損傷のダメージが若干低減される効果が期待される。好ましくは3回以上、より好ましくは4回以上を挙げることができる。回数の上限としては特に制約はないが、好ましくは15回以下、より好ましくは10回以下、さらに好ましくは5回以下を挙げることができる。
なお、当該複数回パルスを与える場合のパルス間の間隔としては、例えば200m秒以下、好ましくは100m秒以下、より好ましくは75m秒以下、さらに好ましくは50m秒以下を挙げることができる。
【００６１】
また、本発明においては、第1電気パルスのパルス幅及び減衰率は、電力量を決定する要因ではあるが、遺伝子導入効率や生存率と直接相関する関係を示さない。
【００６２】
・第2電気パルス：Transfer Pulse 1 (Tp1)
本発明における電気穿孔処理では、前記第1電気パルスを与えた後（最後の第1電気パルス出力後）、所定条件での低電圧で長時間の矩形波電気パルス（第2電気パルス：Transfer Pulse 1）を与えることを必須とする技術である。当該第2電気パルスにより、核酸分子が前記小孔（第1電気パルスにより形成された透明帯の孔）から細胞内に効率的に取り込まれるからである。なお、当該第2電気パルスは、エネルギー量の低い低電力量のパルスであるため、受精卵に損傷を与える懸念がない。
【００６３】
なお、第2電気パルスの電気極性は、第1電気パルスと同じ電気極性（電極の向きが同じ）であっても逆の極性（電極の向きが逆）であっても良いが、好ましくは同じ極性の電気パルスであることが望ましい。
【００６４】
当該第2電気パルスでは、250V/cm以下（5mm gap電極の場合で125V以下）の条件にて電圧をかけることが必要である。好ましくは、240V/cm以下、より好ましくは、225V/cm以下、さらに好ましくは、200V/cm以下、特に好ましくは、175V/cm以下、もっと好ましくは、150V/cm以下、一層好ましくは、125V/cm以下、で電圧をかけることが望ましい。電圧が高すぎる場合、透明帯の損傷が増大し生存率が低下してしまい好適でない。
なお、当該第2電気パルスの電圧値の下限としては、後述する1パルスあたりの電力量の条件が充足される限り特に制限なく与えることができるが、敢えて下限値を挙げるとすると、例えば、15V/cm以上、好ましくは20V/cm以上、より好ましくは25V/cm以上、さらに好ましくは30V/cm以上、特に好ましくは35V/cm以上、を挙げることができる。
【００６５】
当該第2電気パルスは、‘1パルスあたりの電力量’が所定の範囲にあることが必須となる。当該電力量としては、0.01J/100μL以上であることが必須となる。当該電力量が低すぎる場合、十分な遺伝子導入効率を達成することができない。当該電力量の下限としては、好ましくは0.012J/100μL以上、より好ましくは0.02J/100μL以上、さらに好ましくは0.03J/100μL以上、特に好ましくは0.034J/100μL以上、一層好ましくは0.04J/100μL以上、より一層好ましくは0.05J/100μL以上、さらに一層好ましくは0.06J/100μL以上、特に一層好ましくは0.07J/100μL以上、もっと一層好ましくは0.08J/100μL以上、よりもっと一層好ましくは0.1J/100μL以上、を挙げることができる。
また、当該電力量の上限としては、3.6J/100μL以下であることが必須となる。当該電力量が高すぎる場合、透明帯の損傷が増大し生存率が低下するため好ましくない。当該電力量の上限としては、好ましくは3.571J/100μL以下、より好ましくは3J/100μL以下、さらに好ましくは2.5J/100μL以下、特に好ましくは2.286J/100μL以下、一層好ましくは2J/100μL以下、より一層好ましくは1.75J/100μL以下、さらに一層好ましくは1.5J/100μL以下、特に一層好ましくは1.25J/100μL以下、もっと一層好ましくは1J/100μL以下、よりもっと一層好ましくは0.8J/100μL以下、さらにもっと一層好ましくは0.7J/100μL以下、特にもっと一層好ましくは0.679J/100μL以下、よりさらにもっと一層好ましくは0.6J/100μL以下、特にさらにもっと一層好ましくは0.556J/100μL以下、を挙げることができる。
【００６６】
本発明においては、当該第2電気パルスを2回以上の回数にて与えることを要する技術である。当該回数としては、好ましくは3回以上、より好ましくは4回以上、さらに好ましくは5回以上、特に好ましくは6回以上、一層好ましくは7回以上、より一層好ましくは8回以上、さらに一層好ましくは9回以上、特に一層好ましくは10回以上が好適である。当該第2電気パルスの回数を多くすることによって、前記小孔からの核酸分子の取り込みを何度も行わせることができるため、導入効率を向上させることが可能となる。
回数の上限としては、特に制限はないが、例えば30回以下、好ましくは25回以下、より好ましくは20回以下を挙げることができる。これ以上に回数を増やしたとしても、効率向上があまり期待できない。
なお、当該複数回パルスを与える場合のパルス間の間隔としては、例えば200m秒以下、好ましくは100m秒以下、より好ましくは75m秒以下、さらに好ましくは50m秒以下を挙げることができる。
【００６７】
また、本発明においては、第2電気パルスのパルス幅及び減衰率は、電力量を決定する要因ではあるが、遺伝子導入効率や生存率と直接相関する関係を示さない。
【００６８】
・第3電気パルス：Transfer Pulse 2 (Tp2)
本発明における電気穿孔処理では、前記第2電気パルスを与えた後（最後の第2電気パルス出力後）、前記第2電気パルスとは逆の電気極性（電極の向きが逆）である所定条件での低電圧で長時間の矩形波電気パルス（第2電気パルス：Transfer Pulse 2）を与えることを必須とする技術である。
当該第3電気パルスにより、第2電気パルスにより核酸分子の細胞への取り込み終わった後においても、さらに核酸分子を取り込ませることが可能となる。即ち、導入効率を大幅に向上させることが可能となる。なお、当該第3電気パルスも、第2電気パルスと同様に、エネルギー量の低い低電力量のパルスであるため、受精卵に損傷を与える懸念がない電気パルスである。
【００６９】
当該第3電気パルスは、電気極性が逆である点を除けば、前記第2電気パルスと同条件の電気パルスである。即ち、第3電気パルスの各種電気条件としては、上記第2電気パルスに記載の条件と同条件を採用することができる。
【００７０】
・性質の異なる電気パルス間のパルス間隔
上記Pp, Tp1, 及びTp2は、それぞれ電気パルスの性質が異なる電気パルスであるが、パルス間の間隔としては、通常のパルス間隔を採用することができる。特に制限はないが、例えば200m秒以下、好ましくは100m秒以下、より好ましくは75m秒以下、さらに好ましくは50m秒以下を挙げることができる。
【００７１】
［受精卵の移植］
上記電気穿孔処理を行った受精卵は、初期胚まで人工的に培養し、その後、雌の胎内（卵管又は子宮）に移植することによって、当該雌の子宮内で生育させることが可能となる。ここで、初期胚の培養は、2〜16細胞期胚、好ましくは2〜8細胞期胚、より好ましくは2〜4細胞期胚、さらに好ましくは2細胞期胚まで行うことが好ましい。当該培養での発生が進み過ぎた場合、正常の産子まで生育する個体が減少してしまい好ましくない。
【００７２】
移植先の親となる雌としては、受精卵を採取した個体（ドナー）そのものを用いることもできるが、ドナーと同種の別個体の雌を用いることが好適である。なお、齧歯類の場合、偽妊娠処理（去勢した雄との交配処理）を行うことが必要となる場合がある。
また、胚移植による妊娠技術が確立していない種類であっても、近縁種の雌により妊娠が可能であれば、これにより産子を得ることも可能である。
なお、移植前に受精卵の透明帯を除去した場合、産子の出生率が著しく低下してしまい好ましくない。
【００７３】
妊娠後、当該雌を自然分娩（単孔類の場合は産卵）させることによって、正常に生育した産子を得ることができる。ここで得られる産子には、上記所望のゲノムDNA上の遺伝子が改変された個体が高い確率で含まれる。即ち、哺乳類の遺伝子改変個体を効率良く得ることができる。
【００７４】
［遺伝子改変個体］
当該技術によって得られた産子は、ゲノムDNAにおける任意の領域のみが改変された個体となる。即ち、任意の標的遺伝子（又は任意のスペーサー領域）を改変した個体を得ることが可能となる。
産子が遺伝子改変された個体（又はスペーサー領域の改変がされた個体）であるかどうかの判定は、血液からゲノムDNAを抽出して、標的配列を挟んだプライマーを用いたPCRを行い、(i)電気泳動によって増幅断片長さを調べる又は(ii)シークエンスによって配列を読むことによって、簡便に判定することができる。
【００７５】
本発明の技術では、受精卵への上記RNA分子の導入により、上記RNA分子の機能によってゲノムDNAの標的領域内の配列が特異的に切断された後、内在性酵素によって切断箇所が修復される。この際に欠失変異や挿入変異が起こり、当該得られた産子は、標的遺伝子がノックアウトされた個体となる。
本発明では、当該原理によって、標的とするゲノムDNA領域の機能を破壊し、遺伝子の機能が欠失した個体, 又は, 抑制された個体を得ることが可能となる。
【００７６】
また、本発明では、当該技術と相同組換えを利用して、人為的に相同組換えを誘起して、標的遺伝子に機能改変を行うことが可能となる。即ち、ノックイン個体を得ることが可能となる。
この場合、上記電子穿孔処理を行う際に、上記RNAとは別途に、「切断部位を含む標的領域の相同配列であって所望の塩基置換等の変異を伴うDNA配列」を有するDNA断片、を共導入することが必要となる。
当該処理によって得られる産子では、人工的な相同組換えにより、標的遺伝子が機能改変された個体が含まれるものとなる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
また、以下の表中において、Transfer Pulseの極性を表す「＋」の記号は、Poring Pulseと同じ極性の電気パルスを示す記号として用いた。また、「−」の記号は、Poring Pulseと逆の極性の電気パルスを与えたことを示す記号として用いた。
また、以下の表中において、電気パルスの電圧値（V）は、1cmあたりの値（V/cm）に換算して示した。また、エネルギー値（J）は、100μLあたりの値（J/100μL）に換算して示した。
【００７８】
［試験例1（検討例）］『透明帯を有したままの前核期受精卵に対する化合物導入試験』
透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、矩形波3ステップ法によるエレクトロポレーションを行うことによって、外来性の化合物導入が可能かを検討した。
【００７９】
(1)「受精卵の採取」
ラットF344/Stm系統（NBRP-Rat, Kyoto, Japan）の成熟した雌（8〜16週齢）に対して、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG, あすか製薬）を150 IU/体重kgにて注射し、その48時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG, あすか製薬）を75 IU/体重にて注射し、過排卵を誘起した。
当該雌を同系統の雄（11週齢）と同居交配させ、翌日に前核期受精卵を採取し、ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を剥離した。回収後の当該受精卵は、修正クレブス-リンガー溶液中に保管した。
なお、ラットの飼育管理は、温度条件：24±2℃、湿度条件：50±10％、光条件：明期7時〜19時にて行った。
【００８０】
(2)「電気パルス処理」
ガラスチャンバー上のシャーレ白金プレート電極（CUY520P5, 5mm gap, L10×W5×H5mmm, ネッパジーン社製）の間に、2mg/mLテトラメチルローダミンラベルデキストリンを含むリン酸緩衝液（PBS）100μLを注入し、当該リン酸緩衝液で充填された金属プレート電極の間に、上記回収した前核期受精卵を一列に静置した（図3(A) 参照）。ここで、当該前核期受精卵は、透明帯除去及び菲薄化処理を行わず、採取した状態のまま用いた。
なお、テトラローダミンラベルデキストリンは、分子量3kDaの蛍光物質であり、Life Technoloties Co.製のものを用いた。
【００８１】
当該金属プレートに、矩形波電気パルスの発生が可能な電気パルス発生装置（NEPA21(登録商標), ネッパジーン社製）を接続し（図3(B) 参照）、Poring Pulse (Pp)、Transfer Pulse 1 (Tp1)、Transfer Pulse (Tp2)の3種類の矩形波電気パルスを順に与える3ステップ式多重パルス電気穿孔法（図1 参照）による電気パルス処理を行った。電気パルスの各条件は、表1に示す条件にて行った。なお、一連の操作は、水滴付着を防止するため、室温条件にて行った。
【００８２】
一方、対照として、シャーレ白金プレート電極の間に、テトラメチルローダミンラベルデキストリンを含まない通常のリン酸緩衝液（PBS）100μLを注入して、同様にして電気パルス処理を行った。
【００８３】
(3)「蛍光顕微鏡での観察」
電気処理後の受精卵について蛍光顕微鏡（Olympus Co., Tokyo, Japan）を用いて520〜550nmフィルターを用いて励起光541 nmを与え、580nmの透過フィルターを用いて蛍光572 nmを検出しその写真像図を撮影した。結果を図4に示した。
【００８４】
(4)「結果」
その結果、透明帯を有する受精卵に対して、表1に記載の電気条件にて高電圧短時間の電気パルスを与えた後、低電圧長時間の電気パルスの極性を切り替えて与えることによって、受精卵の細胞質全体からテトラメチルローダミン蛍光が検出されることが示された（試験1-1〜1-3）。
この結果から、3段階での矩形波多重パルス法によるエレクトロポレーションを行うことによって、透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、外来性の化合物を効率良く導入できることが示された。
【００８５】
【表１】
2015070825.tif 000003
【００８６】
［試験例2（検討例）］『Poring Pulseの条件検討』
矩形波電気パルスを与えるにあたり、Poring Pulseの電気条件の検討を行った。なお、当該電気条件の検討には、試料として貴重な受精卵でなく培養細胞を用いて行った。
【００８７】
(1)「細胞溶液の調製」
Hela細胞（ヒト子宮頸癌細胞の株化細胞の付着細胞）を培養し、液体培地を除去した後、0.02％EDTA-PBS溶液で2回以上洗浄し、トリプシン処理を行って付着状態の細胞を剥離させた。細胞が剥がれることを確認した後、ES液体培地（血清及び抗生物質を含まないもの, 日水製薬製）を加え、遠心して上清の除くことでトリプシンを除去した後、細胞を再度ES液体培地に懸濁させた。
当該細胞液50μLを採取してヘモサイトメーターにて細胞数を計測した後、再度遠心（1,000rpm, 5min）して残りの上清を除いた。回収した細胞に再度ES液体培地を加えて懸濁して、細胞溶液を調製した。
【００８８】
(2)「DNA溶液の調製」
大腸菌を用いてpCMV-EGFPプラスミドを増幅し、プラスミド抽出キットを用いてプラスミドDNAを調製した。
【００８９】
(3)「電気パルス処理」
2mL容エッペンチューブに、細胞溶液とDNA溶液とを常温にて泡立てることなく良く混合して、最終細胞濃度1×10７細胞/mL、最終DNA濃度100μg/mLの懸濁液を調製した。当該溶液100μLを2mm gapキュベット（EC-002S NEPAキュベット電極 40〜400μL容, ネッパジーン(株)）に充填した。
【００９０】
当該キュベットを、矩形波電気パルスの発生が可能な電気パルス発生装置（NEPA21(登録商標), ネッパジーン(株)のキュベット電極用チャンバー（CU500, ネッパジーン(株)）に装着し、Poring Pulse (Pp)、Transfer Pulse (Tp)の2種類の矩形波電気パルスを順に与える多重パルス電気穿孔法による電気パルス処理を行った。電気パルスの各条件は、表2に示す条件にて行った。なお、一連の操作は、水滴付着を防止するため、室温条件にて行った。
【００９１】
(4)「形質転換効率の評価」
電気パルス処理後1分以内に、当該細胞液を、血清および抗生物質入りのMEM培地をキュベットに注入し、液全量をスポイトで回収し、血清及び抗生物質入りのMEM培地を充填した培養プレート中に加えて、37℃, 炭酸ガス濃度5％条件にて培養した。
また、対照として、電気パルス処理を行わない細胞について、同様に培養した。
【００９２】
電気パルス処理から24時間後（GFPの発現ピーク前であるが、細胞増殖が起こる前）に、トリパンブルー染色して光学顕微鏡で明視野にて細胞数をカウントして、対照と比較することで生存率を算出した。
また、蛍光顕微鏡（励起光490nm, 検出蛍光510nm）を用いてGFPが発現している細胞数をカウントし、明視野でのカウント数と比較することで導入率を算出した。
当該算出した生存率及び導入率の数値から、各電気パルス条件における形質転換効率を評価した。
【００９３】
(5)「結果」
表2-Aの結果が示すように、Poring Pulseのパルス幅を調整して総エネルギー量をほぼ一定に調整した条件において、Poring Pulseの電圧を250〜750V/cmの範囲で与えた場合、375V/cm以上の電圧を与えたサンプルで導入率が高い値を示すことが示された（試験2A-1〜2A-5）。また、当該電気条件範囲では、生存率も高い値となることが示された。
【００９４】
また、表2-Bの結果が示すように、Poring Pulseのパルス幅を調整して総エネルギー量をほぼ一定に調整した条件において、Poring Pulseの電圧を500〜4500V/cmという幅広い範囲で与えた場合、いずれのサンプルにおいても、電気処理後の細胞の生存率が劇的に高い値となることが示された（試験2B-1〜2B-9）。当該電気条件範囲では、導入率も著しく高い値となることが示された。なお、特に、4500V/cmという極めて高電圧条件においても、生存率は良好であることが示された。
【００９５】
これらの知見から、矩形波電気パルスによる遺伝子導入により生存率及び導入効率の両方が高い結果を得るためには、Poring Pulseの電圧値の下限を375V/cm以上にすることが好適であると示唆された。また、Poring Pulseのエネルギー量が所定範囲にさえあれば、Poring Pulseの電圧値の上限は、生存率及び導入効率に特に影響を与えないことが示唆された。
【００９６】
【表２−Ａ】
2015070825.tif 000004
【００９７】
【表２−Ｂ】
2015070825.tif 000005
【００９８】
［試験例3（検討例）］『Poring Pulseの条件検討』
矩形波電気パルスを与えるにあたり、Poring Pulseの電気条件の検討を行った。なお、当該電気条件の検討には、試料として貴重な受精卵でなく培養細胞を用いて行った。
【００９９】
(1)「細胞溶液及びDNA溶液の調製」
試験例2(1)に記載の方法と同様にしてHela細胞の懸濁溶液を調製し、細胞溶液とした。また、試験例2(2)に記載の方法と同様にしてpCMV-EGFPプラスミド溶液を調製し、DNA溶液とした。
【０１００】
(2)「電気パルス処理」
試験例2(3)に記載の方法と同様にして、細胞/DNA懸濁液（Hela細胞：1×10７細胞/mL、pCMV-EGFP：100μg/mL）を調製し当該溶液100μLを2mm gapキュベットに充填した。
調製した試料ごとに、表3に示す電気条件にて電気パルス処理を行った。当該処理に用いた機器や基本的操作は、試験例2(3)に記載の方法と同様にして行った。
【０１０１】
(3)「形質転換効率の評価」
試験例2(4)に記載の方法と同様にして、生存率と導入効率を算出し形質転換効率を評価した。
【０１０２】
(4)「結果」
表3-Aの結果が示すように、Poring Pulseの電圧を一定に調整した条件において、Poring Pulseの総エネルギー量が0.080〜2.298 J/100μLになるように電気パルスを与えた場合、当該総エネルギー量が0.286 J/100μL以上になるように電気パルスを与えたサンプルでは、導入率が劇的に高い値となることが示された（試験3A-3〜3A-11）。当該電気条件範囲では、生存率も高い値となることが示された。また、特に0.535 J/100μL以上のサンプルでは、導入率が70％以上の高い値となることが示された（試験3A-4〜3A-11）。
なお、Poring Pulseの‘1パルス’あたりのエネルギー量及びパルス幅の値は、導入率及び生存率のいずれとも相関関係を示さなかった。
【０１０３】
また、表3-Bの結果が示すように、Poring Pulseの電圧を一定に調整した条件において、Poring Pulseの総エネルギー量を2.5〜7.317 J/100μLになるように電気パルスを与えた場合、生存率が高い値となることが示された（試験3B-1〜3B-3）。当該電気条件範囲では、導入率も著しく高い値となることが示された。なお、7.317 J/100μLという高い総エネルギー量のパルスを与えた場合でも、生存率は良好であった。
【０１０４】
これらの知見から、矩形波電気パルスによる遺伝子導入により生存率及び導入効率の両方が高い結果を得るためには、Poring Pulseの‘合計’のエネルギー量（総エネルギー量）の下限を0.286 J/100μL以上、好ましくは0.535 J/100μL以上、にすることが好適であることが示唆された。また、当該値の上限としては、7.317 J/100μL以下とすることで、生存率及び導入率が良好となることが示唆された。
【０１０５】
【表３−Ａ】
2015070825.tif 000006
【０１０６】
【表３−Ｂ】
2015070825.tif 000007
【０１０７】
［試験例4（検討例）］『Transfer Pulseの条件検討』
矩形波電気パルスを与えるにあたり、Transfer Pulseの電気条件の検討を行った。なお、当該電気条件の検討には、試料として貴重な受精卵でなく培養細胞を用いて行った。
【０１０８】
(1)「細胞溶液及びDNA溶液の調製」
試験例2(1)に記載の方法と同様にしてHela細胞の懸濁溶液を調製し、細胞溶液とした。また、試験例2(2)に記載の方法と同様にしてpCMV-EGFPプラスミド溶液を調製し、DNA溶液とした。
【０１０９】
(2)「電気パルス処理」
試験例2(3)に記載の方法と同様にして、細胞/DNA懸濁液（Hela細胞：1×10７細胞/mL、pCMV-EGFP：100μg/mL）を調製し当該溶液100μLを2mm gapキュベットに充填した。
調製した試料ごとに、表4に示す電気条件にて電気パルス処理を行った。当該処理に用いた機器や基本的操作は、試験例2(3)に記載の方法と同様にして行った。
【０１１０】
(3)「形質転換効率の評価」
試験例2(4)に記載の方法と同様にして、生存率と導入効率を算出し形質転換効率を評価した。
【０１１１】
(4)「結果」
表4-Aの結果が示すように、1パルスあたりのTransfer Pulseエネルギー量を0.012〜0.588 J/100μLになるように電気パルスを与えたサンプルでは、生存率が高い値となることが示された（試験4A-1〜4A-4）。当該電気条件範囲では、導入率も高い値となることが示された。また、特に0.07 J/100μL以上のサンプルでは、生存率が80％以上の高い値となることが示された（試験4A-3〜4A-4）。
【０１１２】
また、表4-Bの結果が示すように、1パルスあたりのTransfer Pulseエネルギー量を0.135〜3.571 J/100μLになるように電気パルスを与えたサンプルにおいても、生存率が高い値となることが示された（試験4B-1〜4B-7）。当該電気条件範囲では、導入率も著しく高い値となることが示された。また、特に0.679 J/100μL以下のサンプルでは、生存率が80％以上の高い値となることが示された（試験4B-1〜4A-4）。
なお、Transfer Pulseに関しては、合計エネルギー量を35.714 J/100μLという極めて高い値で与えた場合においても、生存率が良好であったことから、Transfer Pulseの‘合計’のエネルギーの上限値は、生存率と相関を示さないことが示唆された。
【０１１３】
これらの知見から、矩形波電気パルスによる遺伝子導入により生存率及び導入効率の両方が高い結果を得るためには、Transfer Pulseの‘1パルス’あたりのエネルギー量の下限を0.012 J/100μL以上にすることが好適であることが示唆された。また、当該‘1パルス’あたりのエネルギー量の上限としては、3.571 J/100μL以下、特に1.250 J/100μL以下、さらには0.679 J/100μL以下とすることで、生存率及び導入率が良好となることが示唆された。
【０１１４】
【表４−Ａ】
2015070825.tif 000008
【０１１５】
【表４−Ｂ】
2015070825.tif 000009
【０１１６】
［試験例5（実施例）］『ZFN mRNA導入による組換え体作出試験』
透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、矩形波3ステップ法によるエレクトロポレーションを行うことによって、ZFNをコードするmRNA導入により組換え体の作出が可能かを検討した。なお、標的遺伝子としては、X染色体上にあるIl2rg遺伝子を採用した。
【０１１７】
(1)「mRNAの調製」
ラットインターロイキン2受容体γ鎖遺伝子（Il2rg：免疫不全症の原因遺伝子）を標的とするZFNプラスミドのペア（ZFN Left及びZFN Right）を合成した（Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA）。当該ZFNのペアは、Il2rg遺伝子の第2エクソン付近の特定配列（ZFN Left：配列番号2、ZFN Right：配列番号3）と結合するように設計されたものである（図6 参照）。なお、ZFN Leftの結合配列は、Il2rg遺伝子の配列に対する相補鎖配列である。
当該コンストラクトを有する各プラスミドDNAをラット繊維芽細胞に導入し、Surveyor assay（Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA）を行って、ZENの配列特異的ヌクレアーゼ活性によりIl2rg遺伝子に変異が入ることを確認した。
【０１１８】
次いで、当該プラスミドに対して、MessageMax (TM) T7 mRNA transcription kit（Cambio, Cambridge, UK）を用いてin vitro転写を行い、次いでA-Plus (TM) Poly(A) polymerase tailing kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)を用いて3'端のポリアデニル化処理を行った。
得られた各mRNA（約1kb）をMEGAClear (TM) kit (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)を用いて精製した。各40ng/μL（計80ng/μL）の濃度になるようにPBS中に溶解し、Il2rg遺伝子を標的とするZFN mRNA溶液を調製した。
【０１１９】
(2)「受精卵の採取」
試験例1(1)に記載の方法と同様にして、ラットF344/Stm系統の前核期受精卵を採取し、修正クレブス-リンガー溶液中に保管した。
【０１２０】
(3)「電気パルス処理」
ガラスチャンバー上のシャーレ白金プレート電極（CUY520P5, 5mm gap, L10×W5×H5mmm, ネッパジーン社製）の間に、上記mRNAを各40ng/μLで含むリン酸緩衝液（PBS）100μLを注入し、当該リン酸緩衝液で充填された金属プレート電極の間に、上記回収した前核期受精卵を一列に静置した（図3(A) 参照）。ここで、当該前核期受精卵は、透明帯除去及び菲薄化処理を行わず、採取した状態のまま用いた。
【０１２１】
当該金属プレートに、矩形波電気パルスの発生が可能な電気パルス発生装置（NEPA21(登録商標), ネッパジーン社製）を接続し（図3(B) 参照）、Poring Pulse (Pp)、Transfer Pulse 1 (Tp1)、Transfer Pulse (Tp2)の3種類の矩形波電気パルスを順に与える3ステップ式多重パルス電気穿孔法（図1,2 参照）による電気パルス処理を行った。電気パルスの各条件は、表5-Aに示す条件にて行った。なお、一連の操作は、水滴付着を防止するため、室温条件にて行った。
【０１２２】
一方、対照として、マイクロマニュピュレーターを用いた顕微注入（マイクロインジェクション法）により上記各mRNAを受精卵へ導入した。なお、インジェクション操作は、常法に従って行い、上記mRNAを各10 ng/μLで含むPBSを約2pL導入した。
【０１２３】
(4)「受精卵の移植」
上記導入処理後の受精卵は、修正クレブス-リンガー溶液中で37℃, 5％CO２及び95％空気の条件下において2細胞期胚まで培養した。2細胞期胚の数をカウントし、供試卵数に対する2細胞期胚の数の割合（％）を算出した。
得られた2細胞期胚を、ラットJcl:Wistar系統（CLEA Japan Inc.）の偽妊娠雌（前日に去勢した雄と交配した個体）の卵管内に移植した。移植後21日後に自然分娩にて産子を得た。供試卵数に対する産子数の割合（％）を算出した。
【０１２４】
(5)「産子の遺伝子変異の解析」
生育した産子から血液を採取してFTAカードに付着させて保存した。当該FTAカード（ワットマン社製）からゲノムDNAを抽出し、前記Il2rg遺伝子上に設計した変異箇所を挟む領域をPCR反応にて増幅した。得られたPCR産物のシークエンス解析を行って、産子のゲノムDNAにおけるIl2rg遺伝子変異の有無を解析した。産子全個体に対する変異産子個体の割合を算出した。
【０１２５】
(6)「結果」
表5-Bの結果が示すように、透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、Poring Pulseの総エネルギー量を0.298〜1.062 J/100μLに調整して矩形波3ステップ法での電気パルス処理を行うことによって、ZFNをコードするmRNAを効率良く導入して、ZFNの配列特異的ヌクレアーゼ活性を利用した遺伝子組み換えマウス（Il2rg遺伝子のノックアウトラット）を効率良く作成できることが示された（図5 参照）。
【０１２６】
具体的には、当該電気パルス処理後の受精卵の生存率（2細胞期胚産出率、産子産出率）は、顕微注入法と同程度又はそれ以上の効率となることが示された（試験5-1〜5-3）。特に、Poring Pulseの総エネルギー量を0.298〜0.629 J/100μLに調整した場合、産子の産出率（生存率）は顕微注入法の2.4〜3.1倍という高い値となった（試験5-1〜5-2）。
当該生存率が高い理由は、透明帯除去及び菲薄化処理を行っていないことに加えて、Poring Pulseの総エネルギー量が好適範囲であることによって、受精卵のダメージが少ないためと推測された。
【０１２７】
また、得られた産子の遺伝子変異率は、顕微注入法と同程度又はそれ以上の効率であった。特に、Poring Pulseの総エネルギー量を0.629〜1.062 J/100μLに調整した場合、変異率は顕微注入法の約2.2倍という高い値となった。
【０１２８】
【表５−Ａ】
2015070825.tif 000010
【０１２９】
【表５−Ｂ】
2015070825.tif 000011
【０１３０】
［試験例6（実施例）］『TALEN mRNA導入による組換え体作出試験』
透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、矩形波3ステップ法によるエレクトロポレーションを行うことによって、TALENをコードするmRNA導入により組換え体の作出が可能かを検討した。なお、標的遺伝子としては、X染色体上にあるIl2rg遺伝子を採用した。
【０１３１】
(1)「mRNAの調製」
ラットインターロイキン2受容体γ鎖遺伝子（Il2rg：免疫不全症の原因遺伝子）をコードしたTALENプラスミドのペア（TALEN Left及びTALEN Right）を合成した。当該TANENのペアは、Il2rg遺伝子の第2エクソンの特定配列（TALEN Left：配列番号5、TALEN Right：配列番号6）と結合するように設計されたものである（図7 参照）。なお、TALEN Rightの結合配列は、Il2rg遺伝子の配列に対する相補鎖配列である。
当該コンストラクトを有する各プラスミドDNAをラット繊維芽細胞に導入し、Surveyor assay（Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA）を行って、TALENの配列特異的ヌクレアーゼ活性によりIl2rg遺伝子に変異が入ることを確認した。
【０１３２】
次いで、当該プラスミドに対して、MessageMax (TM) T7 mRNA transcription kit（Cambio, Cambridge, UK）を用いてin vitro転写を行い、次いでA-Plus (TM) Poly(A) polymerase tailing kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)を用いて3'端のポリアデニル化処理を行った。
得られた各mRNA（約3kb）を、MEGAClear (TM) kit (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)を用いて精製した。各40ng/μL（計80ng/μL）の濃度になるようにPBS中に溶解し、Il2rg遺伝子を標的とするZFN mRNA溶液を調製した。
【０１３３】
(2)「受精卵の採取」
試験例1(1)に記載の方法と同様にして、ラットF344/Stm系統の前核期受精卵を採取し、修正クレブス-リンガー溶液中に保管した。
【０１３４】
(3)「電気パルス処理」
試験例5(3)に記載の方法と同様にして、ガラスチャンバー上のシャーレ白金プレート電極の間に、上記mRNAを各40ng/μLで含むリン酸緩衝液（PBS）100μLを注入し、当該リン酸緩衝液で充填された金属プレート電極の間に、上記回収した前核期受精卵を一列に静置した。ここで、当該前核期受精卵は、透明帯除去及び菲薄化処理を行わず、採取した状態のまま用いた。
当該金属プレートに、矩形波電気パルスの発生が可能な電気パルス発生装置を接続し表6に示すPoring Pulseの総エネルギー量での電気パルス処理を行った。また、当該処理に用いた機器、基本的操作、及びその他の電気条件は、試験例5(3)に記載の方法と同様にして行った。
【０１３５】
(4)「受精卵の移植」
試験例5(4)に記載の方法と同様にして、供試卵数に対する2細胞期胚の数の割合（％）および供試卵数に対する産子数の割合（％）を算出した。その後、得られた2細胞期胚を、偽妊娠雌の卵管内に移植して自然分娩にて産子を得た。供試卵数に対する産子数の割合（％）を算出した。なお、当該処理の基本的操作は、試験例5(4)に記載の方法と同様にして行った。
【０１３６】
(5)「産子の遺伝子変異の解析」
試験例5(5)に記載の方法と同様にして、産子全個体に対するIl2rg遺伝子変異個体の割合を算出した。なお、当該解析の基本的操作は、試験例5(5)に記載の方法と同様にして行った。
【０１３７】
(6)「結果」
表6の結果が示すように、透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、Poring Pulseの総エネルギー量を0.629〜1.062 J/100μLに調整して矩形波3ステップ法での電気パルス処理を行うことによって、TALENをコードするmRNAを効率良く導入して、TALENによる配列特異的ヌクレアーゼ活性を利用した遺伝子組み換えラットを効率良く作成できることが示された。
【０１３８】
具体的には、当該電気パルス処理後の受精卵の生存率（2細胞期胚産出率、産子産出率）が高い値となることが示された（試験6-1〜6-2）。特に、Poring Pulseの総エネルギー量を0.629 J/100μLに調整した時に、約半数（44％）という非常に多くの受精卵が産子にまで生育した（試験6-1）。
【０１３９】
また、当該得られた産子からは、標的配列に遺伝子変異を有する個体が得られることが示された（試験6-1〜6-2）。特に、Poring Pulseの総エネルギー量を1.062 J/100μLに調整した場合に、高い変異率となることが示された（試験6-2）。
なお、当該TALEN mRNAを導入して得られた産子の遺伝子変異率は、実施例5におけるZFNs mRNAの導入例よりも低い値であった。これは、TALENの導入mRNAが長鎖（ZFN mRNAの約3倍）であるため、細胞質内に移行し難いためと推測された。
【０１４０】
【表６】
2015070825.tif 000012
【０１４１】
［試験例7（実施例）］『CRISPR-Cas9システムを利用した組換え体作出試験』
透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、矩形波3ステップ法によるエレクトロポレーションを行うことによって、Cas9 mRNA及びGuide RNAを導入したCRISPRシステムにより、組換え体の作出が可能かを検討した。なお、標的遺伝子としては、チロシナーゼ遺伝子を採用した。
【０１４２】
(1)「RNAの調製」
ラットチロシナーゼ遺伝子（Thy：メラニン合成に関与し欠損するとアルビノとなる）を標的とするGuide RNAをオリゴ合成により調製した。当該Guide RNAの5'側20bpは、Thy遺伝子上の標的配列（配列番号7）の相補鎖に対して結合するように設計されたものである（図8 参照）。また、当該Guide RNAの3'側は、立体構造を形成してCas9ヌクレアーゼと特異的に結合する配列（配列番号8: crRNA:tracrRNA）である。
【０１４３】
Guide RNAを組み込んだ発現ベクターに対して、MEGAshortscript (TM) T7 kit (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA) を用いて転写を行った。また、Cas9ヌクレアーゼ（SpCas9）を組み込んだ発現ベクターに対して、MessageMax (TM) T7 mRNA transcription kit（Cambio, Cambridge, UK）を用いてin vitro転写を行い、次いでA-Plus (TM) Poly(A) polymerase tailing kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)を用いて3'端のポリアデニル化処理を行った。
得られたGuide RNA およびCas9 mRNAをMEGAClear (TM) kit (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)を用いて精製した。
【０１４４】
得られたGuide RNA 192ng/μLおよびCas9 mRNA 312ng/μLになるようにPBS中に溶解し、Thy遺伝子を標的とするCRISPR-Cas9システム用のRNA溶液を調製した。
【０１４５】
(2)「受精卵の採取」
ラットDA/Slc系統の前核期受精卵を採取し、修正クレブス-リンガー溶液中に保管した。当該処理の基本的操作は、試験例1(1)に記載の方法と同様にして行った。
【０１４６】
(3)「電気パルス処理」
試験例5(3)に記載の方法と同様にして、ガラスチャンバー上のシャーレ白金プレート電極の間に、上記各RNA（Guide RNA 192ng/μLおよびCas9 mRNA 312ng/μL）を含むリン酸緩衝液（PBS）100μLを注入し、当該リン酸緩衝液で充填された金属プレート電極の間に、上記回収した前核期受精卵を一列に静置した。ここで、当該前核期受精卵は、透明帯除去及び菲薄化処理を行わず、採取した状態のまま用いた。
当該金属プレートに、矩形波電気パルスの発生が可能な電気パルス発生装置を接続し表7に示すPoring Pulseの総エネルギー量での電気パルス処理を行った。また、当該処理に用いた機器、基本的操作、及びその他の電気条件は、試験例5(3)に記載の方法と同様にして行った。
【０１４７】
(4)「受精卵の移植」
試験例5(4)に記載の方法と同様にして、供試卵数に対する2細胞期胚の数の割合（％）および供試卵数に対する産子数の割合（％）を算出した。
【０１４８】
(5)「胚の遺伝子変異の解析」
2細胞期胚の全個体に対するThy遺伝子変異個体の割合を算出した。なお、当該解析の基本的操作は、試験例5(5)に記載の方法と同様にして行った。
【０１４９】
(6)「結果」
表7の結果が示すように、透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、Poring Pulseの総エネルギー量を1.062 J/100μLに調整して矩形波3ステップ法での電気パルス処理を行うことによって、Guide RNAおよびCas9 mRNAを導入して、標的配列に遺伝子変異を有する初期胚が得られることが示された（試験7-1）。
この結果から、当該エレクトロポレーション法及びCRISPR-Cas9システムを利用して、遺伝子組み換えラットを作成できることが示唆された。
【０１５０】
【表７】
2015070825.tif 000013
【０１５１】
［試験例8（実施例）］『遺伝形質の継代試験』
上記作出したIl2rg遺伝子変異体について、導入した遺伝形質が継代して次世代に伝わるかを確認した。
【０１５２】
(1)「ジャームライントランスミッション解析」
表8に示した遺伝子型のIl2rg遺伝子変異ラット（試験例5(4)でZFN mRNAを導入して作出したIl2rg遺伝子変異個体）を選抜した。ここで、表において、‘G0Δ’又は‘F1Δ’は、X染色体上のIl2rg遺伝子に変異があることを示す。また、Δの右の数値は、欠失塩基数を示す。また、‘＋’は正常なＸ染色体を、‘Ｙ’はY染色体を示す。
【０１５３】
当該変異個体それぞれについて、F344/Stm系統の野生型と自然交配させて産子を得、遺伝子変異個体の割合を算出した。遺伝子変異の有無の確認は、試験例5(5)に記載の方法と同様にして行った。
【０１５４】
(2)「結果」
表8の結果が示すように、雄のIl2rg遺伝子変異個体である変異体8-1（G0Δ13/Y）, 又は, 変異体8-2（G0Δ7/Y）を、雌の野生型（+/+）と交配して得た子世代については、雌の全てがIl2rg遺伝子変異体になった。また、これらの子世代の雄は、全て野生型となった。
また、雌のIl2rg遺伝子変異個体である変異体8-3（F1Δ13/+）を、雄の野生型（Y/+）と交配して得た子世代については、雄と雌の両方ともその約半数がIl2rg遺伝子変異体になった。
これらの結果から、ZFN mRNAを導入して作出したIl2rg遺伝子変異個体の遺伝子形質（ゲノム上の変異）は、子世代に継代されることが示された。
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
［試験例9（比較例）］『受精卵に対するDNA導入試験』
透明帯を有したままの前核期受精卵に対して、矩形波3ステップ法によるエレクトロポレーションを行うにあたり、プラスミドDNAを導入しての組換え体の作出が可能かを検証した。
【０１５７】
(1)「プラスミドDNAの調製」
EmGFP(Pc DNA6.2)plasmid（Invitrogen社）のプラスミド溶液を調製し、DNA溶液とした。プラスミド調製の基本操作は、試験例2(2)に記載の方法と同様にして行った。
【０１５８】
(2)「電気パルス処理」
試験例5(3)に記載の方法と同様にして、ガラスチャンバー上のシャーレ白金プレート電極の間に、上記プラスミドDNAを表9に示す濃度で含むリン酸緩衝液（PBS）100μLを注入し、当該リン酸緩衝液で充填された金属プレート電極の間に、上記回収した前核期受精卵を一列に静置した。ここで、当該前核期受精卵は、透明帯除去及び菲薄化処理を行わず、採取した状態のまま用いた。
当該金属プレートに、矩形波電気パルスの発生が可能な電気パルス発生装置を接続し表9に示すPoring Pulseの総エネルギー量での電気パルス処理を行った。また、当該処理に用いた機器、基本的操作、及びその他の電気条件は、試験例5(3)に記載の方法と同様にして行った。
【０１５９】
(3)「受精卵の移植」
試験例5(4)に記載の方法と同様にして、供試卵数に対する2細胞期胚の数の割合（％）および供試卵数に対する産子数の割合（％）を算出した。なお、当該処理の基本的操作は、試験例5(4)に記載の方法と同様にして行った。
【０１６０】
(4)「産子の遺伝子変異の解析」
産子を毛刈りし、励起光490nmを照射して表皮の細胞が蛍光を発するかどうかを調べることで、産子全個体に対するGFP蛍光陽性個体の割合を算出した。
【０１６１】
(5)「結果」
表9の結果が示すように、導入核酸の分子種としてプラスミドDNAを用いた場合、上記試験例で決定した至適電気条件で電気パルス処理を行っても、遺伝子組み換え個体を全く作成することができなかった。
当該結果及び試験例5〜7の結果から、透明帯を有した状態の‘受精卵’に対して、矩形波3ステップ法でのエレクトロポレーションによる遺伝子組み換えを行うためには、核酸分子種として‘RNA’を用いることが好適であると考えられた。
【０１６２】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明の遺伝子改変技術により、ゲノム上の標的配列の遺伝子を改変する技術（ZFN等のゲノム編集技術）を利用する上で特定の哺乳類の種類に限定されることなくなり、高効率且つ再現性良く、哺乳類の遺伝子改変個体を作出することが可能となる。
これにより、本発明に係る技術は、遺伝子機能の解析や疾患のメカニズム解明に大きく貢献する技術となることが期待される。
なお、本願発明者らは、本発明の技術を「TAKE法」（the Technique for Animal Knockout system by Electroporation 法）と命名した。」
【符号の説明】
【０１６４】
１：  電極
２：  前核期受精卵
３：  卵由来の核
４：  精子由来の核
５：  透明帯
６：  Poring Pulseにより形成された微小孔
７：  mRNA
【０１６５】
１１：  シャーレ白金プレート電極を装着したガラスチャンバー
１２：  シャーレ白金プレート電極
１３：  実体顕微鏡
１４：  電気パルス発生装置
【０１６６】
２１：  Il2rg遺伝子ノックアウトラット
２２：  野生型ラット（F344/Stm系統）
【０１６７】
３１：  Il2rg遺伝子に設計したZFN leftの結合配列（相補鎖配列）
３２：  Zinc Finger Proteins（配列特異的DNA結合ドメイン）
３３：  FokＩ（制限酵素活性ドメイン）
３４：  Il2rg遺伝子に設計したZFN rightの結合配列（遺伝子配列）
３５：  Zinc Finger Proteins（配列特異的DNA結合ドメイン）
３６：  FokＩ（制限酵素活性ドメイン）
【０１６８】
４１：  Il2rg遺伝子に設計したTALEN leftの結合配列（遺伝子配列）
４２：  Transcription Activator-Like Effectors（配列特異的DNA結合ドメイン）
４３：  FokＩ（制限酵素活性ドメイン）
４４：  Il2rg遺伝子に設計したTALEN rightの結合配列（相補鎖配列）
４５：  Transcription Activator-Like Effectors（配列特異的DNA結合ドメイン）
４６：  FokＩ（制限酵素活性ドメイン）
【０１６９】
５１：  Thy遺伝子のゲノムDNA
５２：  Thy遺伝子に設計したCRISPR-Cas9システムのGuide RNA認識配列。
５３：  Protospacer Adaptor Motif (PAM)
５４：  Guide RNA (crRNA:tracrRNA)
５５：  Cas9 nuclease
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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