(57)【要約】【課題】一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の医薬組成物を提供する。【解決手段】一態様において、ＦＧＦ４（Fibroblast growth factor 4）遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ４（Fibroblast growth factor 4）遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍は、食道癌である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗ＦＧＦ４抗体が、ＦＧＦ４に特異性を有する中和抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、
対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合に請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されると前記対象を分類すること、又は、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅していない場合に請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されないと前記対象を分類することを含む、方法。
【請求項５】
ＦＧＦ４遺伝子増幅レベルの検出が、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される方法によって行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍組織又は腫瘍細胞が、対象の食道から採取されたものである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される方法によりＦＧＦ４遺伝子増幅レベルの検出を行うための試薬及びＦＧＦ４遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチドを備える、請求項４から６のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４  ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４  ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の医薬組成物、該医薬組成物の効果予測方法、それに用いるキット、該医薬組成物の使用、並びに、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制及び／又は治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害薬の治療的投与が有効であるか有効でないかの予測が、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の増加、チロシンキナーゼ受容体型受容体（ＨＥＲ２）のコピー数の増加を検出することで可能になることを開示する。
【０００３】
特許文献２は、多標的キナーゼ阻害剤であって癌分子標的治療薬であるソラフェニブの治療効果の予測が、ＦＧＦ３遺伝子のコピー数の増加を検出することで可能になることを開示する。
【０００４】
特許文献３は、α−アクチニン−４遺伝子のコピー数の増加が、癌の存在を示しうることを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−５８００号公報
【特許文献２】特開２０１２−２４９６３３号公報
【特許文献３】特開２００９−１００７３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の医薬組成物を提供する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、該医薬組成物の効果予測方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【０００８】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合に本開示にかかる医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されると前記対象を分類すること、又は、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅していない場合に本開示にかかる医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されないと前記対象を分類することを含む方法に関する。
【０００９】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合にＦＧＦ４タンパク質の発現を抑制又は機能阻害する物質を有効成分とする医薬組成物を前記対象に投与することを含む、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、１９４例の食道癌標本のＦＧＦ４遺伝子のコピー数を測定した結果の一例を示すグラフである。横軸が標本サンプルでコピー数の順に配置されている。縦軸が測定されたコピー数である。
【図２】図２は、大腸癌の細胞株ＷｉＤｒにＦＧＦ４遺伝子を導入してＦＧＦ４タンパク質を過剰発現させた培養した場合細胞株（ＷｉＤｒ／ＦＧＦ４）の腫瘍の大きさを経時的に測定した結果の一例を示すグラフである。コントロールは、ＥＧＦＰ遺伝子を導入した（ＷｉＤｒ／ＥＧＦＰ）である。
【図３】図３は、肺癌の細胞株Ａ５４９にＦＧＦ４遺伝子を導入してＦＧＦ４タンパク質を過剰発現させた培養した場合細胞株（Ａ５４９／ＦＧＦ４）の腫瘍の大きさを経時的に測定した結果の一例を示すグラフである。コントロールは、ＥＧＦＰ遺伝子を導入した（Ａ５４９／ＥＧＦＰ）である。
【図４】図４は、食道癌の細胞株ＫＹＳＥ−２７０にＦＧＦ４遺伝子を導入してＦＧＦ４タンパク質を過剰発現させた培養した場合細胞株（ＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４）の腫瘍の大きさを経時的に測定した結果の一例を示すグラフである。コントロールは、ＥＧＦＰ遺伝子を導入した（ＫＹＳＥ−２７０／ＥＧＦＰ）である。
【図５】図５は、マウスに移植したＦＧＦ４過剰発現食道癌細胞株ＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４に対する抗ＦＧＦ４抗体の効果を確認した結果の一例を示すグラフである。コントロールとして、抗ＦＧＦ４抗体に換えてヤギのポリクローナルＩｇＧを使用した。図５左図は、縦軸が腫瘍の大きさ（ｍｍ3）であり、横軸が培養時間（日）である。図５右図は、縦軸がマウスの体重（ｇ）であり、横軸が培養時間（日）である。
【図６】図６は、マウスに移植したＦＧＦ４過剰発現肺癌細胞株Ａ５４９／ＦＧＦ４に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果を確認した結果の一例を示すグラフである。コントロールは、ＦＧＦＲ阻害剤を投与しない例である。縦軸が腫瘍の大きさ（ｍｍ3）であり、横軸が培養時間（日）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、腫瘍や癌の中には、ＦＧＦ４遺伝子のコピー数が増幅しているものがあること、そして、そのようなＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍に対して、ＦＧＦ４タンパク質の発現を抑制又は機能阻害する物質を有効成分とする医薬組成物が抗腫瘍効果を有するという知見に基づく。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、食道癌の約４０％においてＦＧＦ４遺伝子のコピー数の増幅が起っているという知見に基づく。
【００１２】
したがって、本開示は一態様において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、ＦＧＦ４タンパク質の発現を抑制又は機能阻害する物質を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【００１３】
［対象の腫瘍］
本開示にかかる医薬組成物の対象となる腫瘍は、一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４（Fibroblast growth factor 4）遺伝子のコピー数が増幅した腫瘍（以下、「ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍」ともいう。）である。ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍は、各種癌に存在しうる。例えば、食道癌の約４０％がＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍である。また、例えば、膀胱癌の約１０％、頭頸部扁平上皮癌の約３５％の腫瘍サンプルでＦＧＦ４遺伝子の増幅が見られるという報告がある。本開示にかかる医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍に対して抗腫瘍効果を発揮しうる。本開示にかかる医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍を有する個体の改善、進行抑制、及び／又は、治療に使用できる。本開示の一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍は、食道癌である。
【００１４】
［コピー数の検出］
したがって、本開示にかかる医薬組成物の有効性は、対象の腫瘍のＦＧＦ４遺伝子のコピー数の増幅の有無を調べることで判定することができる。よって、本開示はその他の態様において、対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合に本開示にかかる医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されると前記対象を分類すること、又は、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅していない場合に本開示にかかる医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されないと前記対象を分類することを含む方法（以下、「本開示にかかる分類方法」ともいう。）に関する。本開示にかかる分類方法の対象としては、一又は複数の実施形態において、ヒト、又は、ヒト以外の哺乳類などが挙げられる。
【００１５】
ＦＧＦ４遺伝子のコピー数の増幅の有無は、一又は複数の実施形態において、従来行われる方法、又は、今後開発される方法が使用できる。ＦＧＦ４遺伝子のコピー数の増幅の有無は、一又は複数の実施形態において、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、又は、リアルタイム定量ＰＣＲによって行うことができる。本開示の一又は複数の実施形態において、ＦＧＦ４遺伝子のコピー数が増加しているとは、対象腫瘍のＦＧＦ４遺伝子のコピー数が、正常細胞のコントロール遺伝子のコピー数よりも多いことをいう。
【００１６】
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による遺伝子コピー数の増幅は、一又は複数の実施形態において、以下のようにして検出／測定することができる。
ＦＩＳＨ法は、蛍光物質を利用して特定遺伝子の断片DNA（プローブ）を染色体や核DNAとハイブリダイズさせ、その遺伝子の増減（欠失や増幅）や染色対中の位置（マッピング）を調べる方法である。したがって、目的とする遺伝子の配列に特異的なプローブで細胞を染色し、シグナルの多寡に応じて、コピー数の増減を測定できる。また、“https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/keyword/234.html”及び“Hepatology. 2013 Apr;57(4):1407-15. FGF3/FGF4 amplification and multiple lung metastases in responders to sorafenib in hepatocellular carcinoma.”を参照できる。
【００１７】
次世代シーケンサーによる遺伝子コピー数の増幅は、一又は複数の実施形態において、以下のようにして検出／測定することができる。
次世代シーケンサーは従来のサンガー法と違い、数千万から数億のDNA断片に対して大量並列に処理できる。したがって、腫瘍サンプルとコントロールサンプルからのDNAをシーケンスし、目的遺伝子のカバー率を比較することで、目的遺伝子のコピー数の増減を推定できる。また、“PLoS One. 2013; 8(5): e64271. Targeted Sequencing of Cancer-Related Genes in Colorectal Cancer Using Next-Generation Sequencing”及び“Clin Cancer Res. 2013 May 15;19(10):2668-76. Relapsed classic E-cadherin (CDH1)-mutated invasive lobular breast cancer shows a high frequency of HER2 (ERBB2) gene mutations.”を参照できる。
【００１８】
ＤＮＡチップによる遺伝子コピー数の増幅は、一又は複数の実施形態において、以下のようにして検出／測定することができる。
すなわち、多数のDNA断片をアレイ化したスライドグラス（DNAチップ）を用いてＣＧＨ（comparative genomic hybridization）解析法を行う。それぞれ異なる蛍光色素でラベルした腫瘍サンプルならびにコントロールサンプルを、DNAチップ上のDNA断片とハイブリダイズさせる。それぞれのサンプル由来の蛍光シグナルの強度比をもとにアレイ化されたDNA断片に相当する領域の腫瘍DNAのコピー数を定量化する。また、“http://www.cghtmd.jp/CGHDatabase/about/about_high.jsp”及び“Hepatology. 2013 Apr;57(4):1407-15. FGF3/FGF4 amplification and multiple lung metastases in responders to sorafenib in hepatocellular carcinoma.”を参照できる。
【００１９】
リアルタイム定量ＰＣＲによる遺伝子コピー数の増幅は以下のようにして検出／測定することができる。
すなわち、サンプルのDNAをテンプレートとし、標的遺伝子に特異的プライマー用いてPCR反応により標的となる遺伝子の部位を増幅する。増幅反応をリアルタイムに検出し、一定量までの増幅にかかるPCRのサイクル数をコントロールサンプルと腫瘍サンプルで比較して、その差に応じて、コピー数を算出する。また、“http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_062368.pdf”及び“Hepatology. 2013 Apr;57(4):1407-15. FGF3/FGF4 amplification and multiple lung metastases in responders to sorafenib in hepatocellular carcinoma.”を参照できる。
【００２０】
［有効成分］
本開示にかかる医薬組成物の有効成分は、ＦＧＦ４タンパク質の発現を抑制する物質又は機能阻害する物質である。本開示にかかる医薬組成物の有効成分は、一又は複数の実施形態において、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００２１】
抗ＦＧＦ４抗体は、医薬組成物の抗腫瘍効果を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、中和活性を有し、又は、高い中和活性を有する。抗ＦＧＦ４抗体は、一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体である。また、抗ＦＧＦ４抗体は、一又は複数の実施形態において、抗体断片の形態であってもよいし、糖鎖で修飾されていてもよい。
【００２２】
ＦＧＦ受容体は、ＦＧＦ４タンパク質の受容体である。よって、ＦＧＦ受容体阻害剤は本開示にかかる医薬組成物の有効成分として使用されうる。ＦＧＦ受容体阻害剤としては、従来公知及び今後開発されるものが使用できる。
【００２３】
ＦＧＦ４遺伝子のｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）やｓｈＲＮＡ（small hairpin）も本開示にかかる医薬組成物の有効成分として使用できる。当業者であれば、定法に従って適切なＦＧＦ４遺伝子のｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを設計及び製造できる。
【００２４】
本開示において「医薬組成物」は、一又は複数の実施形態において、周知の製剤技術を適用し、投与形態に適した剤形とすることができる。その投与形態としては、これらに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤等の剤形による経口投与が挙げられる。或いは、注射剤、液剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、点眼剤等の剤形による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、これらに限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造されうる。
【００２５】
本開示にかかる医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、治療効果を有する他の有効成分を含まず、或いは、さらに１又は複数の有効成分を含有する。
【００２６】
前記賦形剤としては、これらに限定されないがデンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。前記コーティング剤としては、これらに限定されないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。前記結合剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。前記崩壊剤としては、これらに限定されないが、前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。前記安定化剤としては、これらに限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。前記矯味矯臭剤としては、これらに限定されないが、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
【００２７】
また、液剤の製造には、溶媒として、これらに限定されないが、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができ、必要に応じて界面活性剤又は乳化剤等も使用できる。前記界面活性剤又は乳化剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００２８】
本開示にかかる医薬組成物の使用方法は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分の体内濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、有効成分に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
【００２９】
［方法及び使用］
本開示は、一態様において、本開示にかかる医薬組成物を製造するための、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの使用に関する。また、本開示は、一態様において、本開示にかかる医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法に関する。また、本開示は、一態様において、対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合にＦＧＦ４タンパク質の発現を抑制又は機能阻害する物質を有効成分とする医薬組成物を前記対象に投与することを含む、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法に関する。さらに、本開示は、上述したＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法における、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの使用、若しくは、本開示にかかる医薬組成物の使用に関する。
【００３０】
［キット］
本開示は、その他の態様において、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される方法によりＦＧＦ４遺伝子増幅レベルの検出を行うための試薬、及び、  蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される方法によりＦＧＦ４遺伝子増幅レベルの検出を行うための試薬及びＦＧＦ４遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチドを備えるキットに関する。
【００３１】
本開示は、さらに以下の一又は複数の実施形態に関する。
［１］  ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物。
［２］  ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍は、食道癌である［１］に記載の医薬組成物。
［３］  抗ＦＧＦ４抗体が、ＦＧＦ４に特異性を有する中和抗体である［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］  対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、
対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合に［１］から［３］のいずれかに記載の医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されると前記対象を分類すること、又は、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅していない場合に［１］から［３］のいずれかに記載の医薬組成物の治療的投与の有効性が予測されないと前記対象を分類することを含む、方法。
［５］  ＦＧＦ４遺伝子増幅レベルの検出が、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される方法によって行われる［４］記載の方法。
［６］  前記腫瘍組織又は腫瘍細胞が、対象の食道から採取されたものである［４］又は［５］に記載の方法。
［７］  蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される方法によりＦＧＦ４遺伝子増幅レベルの検出を行うための試薬及びＦＧＦ４遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチドを備える［４］から［６］のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
［８］  ［１］から［３］のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの使用。
［９］  ［１］から［３］のいずれかに記載の医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法。
［１０］  ［９］のＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法における、抗ＦＧＦ４抗体、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＦＧＦ４ｓｉＲＮＡ、及びＦＧＦ４ｓｈＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの使用。
［１１］  対象の腫瘍組織試料又は腫瘍細胞試料におけるＦＧＦ４遺伝子の遺伝子増幅レベルを検出すること、及び、対象のＦＧＦ４遺伝子が増幅している場合にＦＧＦ４タンパク質の発現を抑制又は機能阻害する物質を有効成分とする医薬組成物を前記対象に投与することを含む、ＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法。
［１２］  ［１１］  記載のＦＧＦ４遺伝子増幅腫瘍の改善、進行抑制、及び／又は、治療方法における［１］から［３］のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【００３２】
以下、実施例及び比較例に基づいて説明するが、本開示はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［食道癌手術標本のＦＧＦ４遺伝子コピー数解析］
１９４例の食道癌手術標本においてＦＧＦ４遺伝子のコピー数解析を行った。
（標本）
被験試料として、手術時切除凍結標本又はＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）標本である食道癌（ＥＳＣＣ：食道扁平上皮癌）の標本を使用した。
（コピー数アッセイ）
食道癌標本からＤＮＡを抽出し、TaqMan Copy Number Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてコピー数アッセイを行った。用いたプライマーのＩＤは、HS01235235_cn（Forward: 5'- GAG CAG CAA GGG CAA GCTCTA -3'、Reverse：5'- ACC TTC ATG GTG GGCGAC A -3'）である。また、ＴＥＲＴローカスを内部コントロールとした（Forward: 5'- GCA CCG TCA AGGCTG AGA AC -3'、Reverse：5'- ATG GTG GTGAAG ACG CCA GT -3'）。また、Human Genomic DNA (Clontech) を正常コントロールとして使用した。その結果を図１に示す。
【００３４】
図１は、１９４例の食道癌標本のＦＧＦ４遺伝子のコピー数を測定した結果の一例を示すグラフである。横軸が標本サンプルでコピー数の順に配置されている。縦軸が測定されたコピー数である。同図に示すとおり、食道癌標本の約４０％においてＦＧＦ４遺伝子のコピー数が５以上を示した。なお、同じ食道癌標本をＣＧＨ（comparative genomic hybridization）解析法及びＦＩＳＨで解析した場合も、ＦＧＦ４遺伝子の増幅が同様の傾向で認められた（データ示さず）。なお、ＣＧＨ法は、商品名：Oncoscanを用いて行い、ＦＩＳＨは、ヒトゲノムクローンライブラリ（GSP Laboratory, Kawasaki, Japan）から得たプローブを使用した。
【００３５】
［ＦＧＦ４過剰発現株の作製］
大腸癌の細胞株ＷｉＤｒ、肺癌の細胞株Ａ５４９、及び、食道癌の細胞株ＫＹＳＥ−２７０に、それぞれ、ＦＧＦ４遺伝子を導入してＦＧＦ４タンパク質を過剰発現する細胞株を作製した。作製されたＦＧＦ４ 過剰発現株を、それぞれ、ＷｉＤｒ／ＦＧＦ４、Ａ５４９／ＦＧＦ４、及び、ＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４とする。
一方、これらのコントロールとして、ＥＧＦＰ遺伝子が導入されＥＧＦＰタンパク質が過剰発現される細胞株ＷｉＤｒ／ＥＧＦＰ、Ａ５４９／ＥＧＦＰ、及び、ＫＹＳＥ−２７０／ＥＧＦＰを作製した。
（腫瘍形成能の評価）
作製したＦＧＦ４過剰発現株の腫瘍形成能を調べた。具体的には、約５×１０6個の細胞をマウスの皮下に移植し、培養後６，１０，１１，１３，１５，１８，２１日目、又は、４，７，１１，１４，１８，２１日目で腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさはノギスで測定した。その結果を図２〜４に示す。
【００３６】
図２は、大腸癌の細胞株ＷｉＤｒにＦＧＦ４遺伝子を導入して過剰発現させた培養した場合細胞株（ＷｉＤｒ／ＦＧＦ４）の腫瘍の大きさを経時的に測定した結果の一例を示すグラフである。図３は、肺癌の細胞株Ａ５４９にＦＧＦ４遺伝子を導入して過剰発現させた培養した場合細胞株（Ａ５４９／ＦＧＦ４）の腫瘍の大きさを経時的に測定した結果の一例を示すグラフである。図４は、食道癌の細胞株ＫＹＳＥ−２７０にＦＧＦ４遺伝子を導入して過剰発現させた培養した場合細胞株（ＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４）の腫瘍の大きさを経時的に測定した結果の一例を示すグラフである。いずれの場合も、ＥＧＦＰ遺伝子を導入したコントロールに対して有意な腫瘍形成能の亢進が認められた。また、これらの結果は、ＦＧＦ４遺伝子が発がん遺伝子として機能（oncogenic activity）を発揮しうることを示す。
【００３７】
［抗ＦＧＦ４抗体のin vivoにおけるＦＧＦ４過剰発現腫瘍に対する効果］
ＦＧＦ４過剰発現腫瘍に対する抗ＦＧＦ４抗体の効果をin vivoで確認した。
抗ＦＧＦ４抗体として、市販品（商品名：AB-235-NA）を使用した。なお、この抗体のＦＧＦ４中和能は、ＩＣ50＝１０〜２０μｇ／ｍｌであった（データ示さず）。
ＦＧＦ４過剰発現食道癌細胞株ＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４を移植した担がんマウスモデルを作製した。具体的には、ＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４細胞をヌードマウスの皮下に移植してマウスモデルを作製した。マウスを４匹ずつ２群に分け、コントロール群にはヤギのポリクローナルＩｇＧを、もう一方の群には抗ＦＧＦ４抗体をマウスの腹腔内に投与した（５mg/kg、２回／週、２週間）。数日おきに腫瘍径と体重を測定した。
【００３８】
図５は、マウスに移植したＫＹＳＥ−２７０／ＦＧＦ４の腫瘍に対する抗ＦＧＦ４抗体の効果を確認した結果の一例を示すグラフである。図５左図は、縦軸が腫瘍の大きさ（ｍｍ3）であり、横軸が培養時間（日）である。図５右図は、縦軸がマウスの体重（ｇ）であり、横軸が培養時間（日）である。図５左図に示すとおり、抗ＦＧＦ４抗体に有意な抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ＝０．７）が認められた。また、図５右図に示す通り、抗ＦＧＦ４抗体を投与しても、マウスの体重の減少は認められなかった。
【００３９】
［ＦＧＦＲ阻害剤のin vivoにおけるＦＧＦ４過剰発現腫瘍に対する効果］
ＦＧＦ４過剰発現腫瘍に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果をin vivoで確認した。
ＦＧＦＲ阻害剤として、市販品（商品名：PD173074）を使用した。なお、このPD173074は、ＦＧＦＲのシグナル経路を阻害する（データ示さず）。
ＦＧＦ４過剰発現肺癌細胞株Ａ５４９／ＦＧＦ４を移植した担がんマウスモデルを作製した。この担がんマウスモデルに、前記ＦＧＦＲ阻害剤を５０mg/kg、７回／週の腹腔内投与を１週間行った。コントロールとして、ＦＧＦＲ阻害剤に換えてＤＭＳＯを使用した。その結果を図６に示す。
【００４０】
図６は、マウスに移植したＦＧＦ４過剰発現肺癌細胞株Ａ５４９／ＦＧＦ４に対するＦＧＦＲ阻害剤の効果を確認した結果の一例を示すグラフである。縦軸が腫瘍の大きさ（ｍｍ3）であり、横軸が培養時間（日）である。同図に示すとおり、ＦＧＦＲ阻害剤は有意な抗腫瘍活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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