(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌薬物の卵巣に対する新たな毒性試験方法の提供。【解決手段】４週齢以上の雌性ラットに、被検抗癌薬物を４〜６日間連続投与し、卵巣における顆粒膜細胞の壊死の有無を観察することを特徴とする、被検抗癌薬物の卵巣に対する毒性試験方法であって、当該被検抗癌薬物の総投与量が、同被検抗癌薬物の２〜４週間連続投与亜急性毒性試験における最大耐用量の総投与量の０．３〜１．５倍量である毒性試験方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４週齢以上の雌性ラットに、被検抗癌薬物を４〜６日間連続投与し、卵巣における顆粒膜細胞の壊死の有無を観察することを特徴とする、被検抗癌薬物の卵巣に対する毒性試験方法であって、当該被検抗癌薬物の総投与量が、同被検抗癌薬物の２〜４週間連続投与亜急性毒性試験における最大耐用量の総投与量の０．３〜１．５倍量である毒性試験方法。
【請求項２】
卵巣における顆粒膜細胞の壊死を伴う中型又は大型の閉鎖卵胞の有無を観察するものである請求項１記載の毒性試験方法。
【請求項３】
ラットが、Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラットである請求項１又は２記載の毒性試験方法。
【請求項４】
ラットが、４〜１０週齢の雌性ラットである請求項１〜３のいずれかに記載の毒性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌薬物の卵巣に対する新たな毒性試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣は、配偶子の供給を行う生殖器官であると同時に、ステロイドホルモンを分泌する内分泌器官として、生体の様々な機能調節を行っている。これらのことから、種々の薬物の卵巣に対する毒性の評価は、重要である。通常薬物の卵巣に対する毒性試験は、ラット等を使用して２〜４週間連続投与の亜急性毒性試験、３〜６ヶ月間連続投与の慢性毒性試験において、病理組織学的検査によって行なわれる。
【０００３】
抗癌薬物については、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド（ＣＰＡ）及びブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）の１４日間および２８日間反復投与において、閉鎖卵胞の増加、小型および大型卵胞の減少あるいは黄体の減少が認められることが報告されている（非特許文献１〜４）。また、ＣＰＡが投与された卵胞では、顆粒膜細胞のアポートシスが認められることが報告されている（非特許文献５、６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Toxicol Suci. 34:SP1-SP22, 2009
【非特許文献２】J. Toxicol Suci. 34:SP65-SP72, 2009
【非特許文献３】J. Toxicol Suci. 34:SP73-SP81, 2009
【非特許文献４】J. Toxicol Suci. 34:SP83-SP89, 2009
【非特許文献５】Reprod. Toxicol. 4:121-125, 1990
【非特許文献６】Free Radic. Biol. Med. 36:1366-1377, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の抗癌薬物の卵巣に対する作用は、２〜４週間連続投与により、閉鎖卵胞の増加が認められるものの、その病理組織学的変化は顆粒膜細胞のアポトーシスであり、卵巣に対する重篤な副作用を生じるものなのか否かは不明であった。
従って、本発明の課題は、抗癌薬物が、卵巣に対して与える毒性を短期間に評価できる試験方法を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、雌性ラットに対して、抗癌薬物を、亜急性毒性試験における最大耐用量の総投与量の０．３〜１．５倍量を４〜６日間という短期間で投与して卵巣の病理学的検査を行った結果、顆粒膜細胞のアポトーシスではなく、従来全く報告されていなかった顆粒膜細胞の壊死を伴う閉鎖卵胞の増加が認められ、壊死を伴うことから卵巣に対して少なからず悪影響を及ぼす毒性を生じることを見出し、本試験方法が抗癌薬物の卵巣に対する毒性試験方法として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕４週齢以上の雌性ラットに、被検抗癌薬物を４〜６日間連続投与し、卵巣における顆粒膜細胞の壊死の有無を観察することを特徴とする、被検抗癌薬物の卵巣に対する毒性試験方法であって、当該被検抗癌薬物の総投与量が、同被検抗癌薬物の２〜４週間連続投与亜急性毒性試験における最大耐用量の総投与量の０．３〜１．５倍量である毒性試験方法。
〔２〕卵巣における顆粒膜細胞の壊死を伴う中型又は大型の閉鎖卵胞の有無を観察するものである〔１〕記載の毒性試験方法。
〔３〕ラットが、Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラットである〔１〕又は〔２〕記載の毒性試験方法。
〔４〕ラットが、４〜１０週齢の雌性ラットである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の毒性試験方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の試験方法によれば、短期間のうちに、顆粒膜細胞の壊死を伴う中型又は大型の閉鎖卵胞の増加を観察することにより、アポトーシスではない壊死性の毒性を評価することができる。従って、短期間に抗癌薬物の卵巣に対する影響、例えば顆粒膜細胞の壊死に伴う卵子の成熟不全による不妊の可能性の有無等を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各抗癌薬物投与群の卵巣のＨＥ免疫染色結果を示す図である。矢頭は、中型および大型の閉鎖卵胞が増加したことを示す。
【図２】５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＣＤＤＰ投与群で増加した中型および大型の閉鎖卵胞において、顆粒膜細胞が壊死していることを示すＨＥ染色結果である。
【図３】各薬物投与群の卵巣のＴＵＮＥＬ染色結果（小型の卵胞）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の毒性試験に用いる動物は、４週齢以上の雌性ラットである。卵巣が排卵機能を有する週齢であるのが好ましいためである。さらに４〜１０週齢の雌性ラットが好ましく、さらに６〜１０週齢の雌性ラットが好ましい。また、ラットとしてはＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラットが好ましい。
【００１２】
被検薬物は、抗癌薬物であるのが好ましい。抗癌薬物の場合、前記非特許文献１〜６に記載のように、顆粒膜細胞のアポトーシスを伴う閉鎖卵胞の増加は報告されているが、顆粒膜細胞の壊死は報告されていない。抗癌薬物のうち、細胞障害性抗癌薬物が好ましく、白金製剤（ＣＤＤＰ等）あるいは代謝拮抗薬（５−ＦＵ等）がより好ましい。
【００１３】
被検薬物の４〜６日間の総投与量は、２〜４週間連続投与亜急性毒性試験の最大耐用量の総投与量の０．３〜１．５倍量が好ましい。この投与量はラット等の亜急性毒性試験において決定することができるが、マウスの薬効試験等（例えば、マウスの亜急性毒性試験等）から類推して決定してもよい。
例えば、ＣＤＤＰ、ＣＰＡの２〜４週間連続投与亜急性毒性試験の最大耐用量の総投与量は、それぞれ１４〜２８mg/kg、２８０〜５６０mg/kgである（非特許文献３、４）。従って、後述の実施例１におけるＣＤＤＰの４日間総投与量（２０mg/kg）は前記最大耐用量の総投与量の約０．７１〜１．４３倍であり、同実施例１におけるＣＰＡの４日間総投与量（２００mg/kg）は前記最大耐用量の総投与量の約０．３６〜０．７１倍である。
【００１４】
被検薬物の投与期間は、４〜６日間で十分であるが、特に４日間が好ましい。この投与期間は、亜急性毒性試験の投与期間よりも短く、短期間で卵巣に対する毒性を判定することができる。
【００１５】
被検薬物の投与手段は、用いる被検薬物の臨床投与ルートと同じであることが望ましい。例えば、臨床で経口投与する薬物であれば、経口投与すべきである。臨床で静脈内投与する薬物であれば、静脈内投与すべきである。また、投与回数は特に限定されないが、例えば、１日あたり１回が好ましい。
【００１６】
被検薬物投与終了の翌日に、卵巣を摘出し、病理組織学的検査を行い、卵巣における顆粒膜細胞の壊死の有無を観察する。具体的には、卵巣をホルマリン固定し、パラフィン包埋後、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）して顕微鏡観察する。また、小型卵胞については、ＴＵＮＥＬ染色し、卵胞を評価する。
より詳細には、卵巣における顆粒膜細胞の壊死を伴う中型又は大型の閉鎖卵胞の有無（特に増加の有無）を観察する。
非特許文献１〜６に記載のように、従来の亜急性毒性試験においては、顆粒膜細胞のアポトーシスを伴う閉鎖卵胞の増加は報告されているが、顆粒膜細胞の壊死を伴う閉鎖卵胞の増加は報告されていない。
【００１７】
顆粒膜細胞の壊死が認められる場合は、卵巣への毒性があることが明らかであり、本発明方法によれば、短期間で卵巣細胞への毒性、例えば顆粒膜細胞の壊死に伴う卵子の成熟不全による不妊の可能性の有無等が評価可能である。
すなわち、本発明は、顆粒膜細胞の壊死を伴う閉鎖卵胞の増加という新規な所見の有無を観察することを特徴とする、抗癌薬物の卵巣に対する新たな毒性試験方法を提供するものである。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されない。
【００１９】
実施例１
（方法）
６週齢および１０週齢のＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系雌性ラットに、５−ＦＵ、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、アドリアマイシン（ＡＤＭ）、ＣＤＤＰおよびＣＰＡを４日間反復投与した。投与方法は、全て尾静脈内投与とした。投与終了翌日に、全例から卵巣を摘出し、１０％緩衝ホルマリン液で５日間固定し、切出しを行った。さらに１日再固定後、パラフィン包埋し、ＨＥ染色標本を作製して光顕的に観察した。なお、卵巣についてはＴＵＮＥＬ染色標本も作製し、Pedersenらの分類に従って卵胞を小型、中型および大型に分類して評価した。
試験群構成は、表１のとおりである。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
（結果）
５−ＦＵ投与群、ＡＤＭ投与群、ＣＤＤＰ投与群およびＣＰＡ投与群において、卵巣における閉鎖卵胞の増加が６週齢および１０週齢の動物に認められた。
【００２２】
ＶＣＲ投与群以外の群において、卵巣に中型および大型の閉鎖卵胞の増加が認められた（図１）。そして、ＣＤＤＰおよび５−ＦＵで認められた閉鎖卵胞では、顕著な顆粒膜細胞の壊死が認められた（図２）。なお、すべての薬物投与群で小型の卵胞には明らかな変化は認められなかった（図３）。
すなわち、本実施例１において、卵巣における顆粒膜細胞の壊死を伴う中型又は大型の閉鎖卵胞が認められたＣＤＤＰおよび５−ＦＵについては、卵巣に対する毒性（例えば顆粒膜細胞の壊死に伴う卵子の成熟不全による不妊等）を有する可能性が高いと評価された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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