(57)【要約】【課題】培養操作中の意図しないタイミングで細胞シートが剥離することがなく、所望のタイミングでのみ細胞シートを基材から剥離させることができる、細胞シートの作製方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る細胞シートの作製方法は、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と、前記刺激応答性ポリマーを含む領域１０に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０とにわたる表面において細胞１を培養する工程と、培養後に、前記刺激応答性ポリマーを含む領域１０の表面における細胞１ａと、前記細胞接着性の領域２０の表面における細胞１ｂとを分離する工程と、刺激を加えることにより、前記刺激応答性ポリマーを含む領域１０の表面から前記細胞１ａを細胞シートとして剥離する工程とを含むことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記刺激応答性ポリマーを含む領域に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域とにわたる表面において細胞を培養する工程と、
培養後に、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面における細胞と、前記細胞接着性の領域の表面における細胞とを分離する工程と、
刺激を加えることにより、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面から前記細胞を細胞シートとして剥離する工程と
を含む、細胞シートの作製方法。
【請求項２】
前記分離する工程において、前記細胞接着性の領域の表面における細胞は、前記細胞接着性の領域の表面に接着した状態で前記刺激応答性ポリマーを含む領域における細胞と分離される、請求項１に記載の細胞シートの作製方法。
【請求項３】
前記刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記細胞接着性の領域との間が切断可能に構成され、前記分離する工程が、それら領域の間を切断することにより行われる、請求項２に記載の細胞シートの作製方法。
【請求項４】
前記細胞接着性の領域が、剥離可能な粘着剤を介して前記刺激応答性ポリマーを含む領域の上に固定され、前記分離する工程が、前記細胞接着性の領域を剥離することにより行われる、請求項２に記載の細胞シートの作製方法。
【請求項５】
前記分離する工程が、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面に細胞を残したまま、前記細胞接着性の領域の表面における細胞を除去することにより行われる、請求項１に記載の細胞シートの作製方法。
【請求項６】
細胞シートの端部が細胞接着性の領域の表面に接着し、前記細胞シートにおける前記細胞接着性の領域の表面に接着していない部分には張力が加わった状態で輸送される、細胞シートの輸送方法であって、
前記状態が、刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記刺激応答性ポリマーを含む領域に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域とにわたる表面において細胞を培養し、培養後に、刺激を加えることにより、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面から前記細胞を細胞シートとして剥離することによって得られる、前記細胞シートの輸送方法。
【請求項７】
前記刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記細胞接着性の領域との間が切断可能に構成され、それら領域の間を切断することにより、前記細胞を細胞シートとして剥離する、請求項６に記載の細胞シートの輸送方法。
【請求項８】
輸送後に、前記細胞シートの端部における、前記細胞接着性の領域の表面に接着した部分を切り離す、請求項６又は７に記載の細胞シートの輸送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート状の細胞組織体（細胞シート）の作製方法、及び細胞シートの輸送方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養支持体上に播種し、細胞シートを形成することは一般に広く行われている。細胞シートの剥離を容易にする目的で、細胞接着面に温度応答性ポリマー等の層を設け、細胞の剥離を促進させる技術も開発されており、異物をほとんど含まない細胞シートの回収が可能である。
【０００３】
例えば、（特許文献１）には、水に対する上限臨界溶解温度又は下限臨界溶解温度が８０〜０℃の範囲にあるポリマーもしくはコポリマーで表面を被覆した細胞培養支持体材料が開示されている。この支持体材料で細胞を培養し、培養終了後に環境温度を変化させると支持体表面の親水性、疎水性のバランスが変化し、増殖細胞が剥離するため、等張液等で洗浄することによって目的の細胞シートを回収することができる。
【０００４】
しかし、臨界溶解温度は室温近傍（例えば、２０℃）であることが多く、その場合には細胞シートは室温で剥離するため、例えば培養液の交換といった培養中に行う操作によって、意図しないタイミングで細胞シートが剥離してしまう恐れがあった。
【０００５】
また、細胞シートは極めて薄く、一般に取扱いが困難である。このような細胞シートを、輸送等するために使用する種々の支持体が知られている。例えば、（特許文献２）には、ヒアルロン酸やコラーゲン等を含む膜状もしくはゲル状のキャリアによって培養細胞シートを保持する技術が開示されている。また、（特許文献３）には、細胞培養基材上の培養細胞を剥離させ、その後、その剥離させた培養細胞を再び付着させるためのフィブリンゲル等の細胞接着性タンパク質からなる細胞付着部を有する培養細胞移動治具が開示されている。
【０００６】
しかし、上記従来の技術では、細胞シートとキャリアとを密着させる工程が必要となり、手順が煩雑になるという問題があった。また、キャリアの材質によっては、水の表面張力程度の力で細胞シートを保持することとなるために、細胞シートに皺が発生したり、細胞シートが収縮したりする恐れがあった。さらに、細胞シートがキャリアから脱落する恐れもあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２４３９８号公報
【特許文献３】特許第４４８６３５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、培養操作中の意図しないタイミングで細胞シートが剥離することがなく、所望のタイミングでのみ細胞シートを基材から剥離させることができる、細胞シートの作製方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、細胞シートとキャリアとを密着させる工程が不要であり、また、輸送中に細胞シートに皺や収縮が発生せず、細胞シートがキャリアから脱落することもない、細胞シートの輸送方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、刺激応答性の領域に隣接する位置に、刺激応答性を持たない領域を形成しておき、それらの領域の表面で細胞を培養し、細胞シートを剥離させる際に、両領域の表面における細胞を互いに切り離すことによって上記課題を解決できることを見出し、発明を完成した。
【００１１】
また、本発明者らは、細胞シートの端部を細胞接着性の領域の表面に接着させ、端部以外の部分（例えば細胞シートの中央部）は細胞シートのみが存在する状態で輸送することにより、上記課題を解決できることを見出し、発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【００１２】
（１）刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記刺激応答性ポリマーを含む領域に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域とにわたる表面において細胞を培養する工程と、
培養後に、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面における細胞と、前記細胞接着性の領域の表面における細胞とを分離する工程と、
刺激を加えることにより、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面から前記細胞を細胞シートとして剥離する工程と
を含む、細胞シートの作製方法。
（２）前記分離する工程において、前記細胞接着性の領域の表面における細胞は、前記細胞接着性の領域の表面に接着した状態で前記刺激応答性ポリマーを含む領域における細胞と分離される、上記（１）に記載の細胞シートの作製方法。
（３）前記刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記細胞接着性の領域との間が切断可能に構成され、前記分離する工程が、それら領域の間を切断することにより行われる、上記（２）に記載の細胞シートの作製方法。
（４）前記細胞接着性の領域が、剥離可能な粘着剤を介して前記刺激応答性ポリマーを含む領域の上に固定され、前記分離する工程が、前記細胞接着性の領域を剥離することにより行われる、上記（２）に記載の細胞シートの作製方法。
（５）前記分離する工程が、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面に細胞を残したまま、前記細胞接着性の領域の表面における細胞を除去することにより行われる、上記（１）に記載の細胞シートの作製方法。
（６）細胞シートの端部が細胞接着性の領域の表面に接着し、前記細胞シートにおける前記細胞接着性の領域の表面に接着していない部分には張力が加わった状態で輸送される、細胞シートの輸送方法であって、
前記状態が、刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記刺激応答性ポリマーを含む領域に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域とにわたる表面において細胞を培養し、培養後に、刺激を加えることにより、前記刺激応答性ポリマーを含む領域の表面から前記細胞を細胞シートとして剥離することによって得られる、前記細胞シートの輸送方法。
（７）前記刺激応答性ポリマーを含む領域と、前記細胞接着性の領域との間が切断可能に構成され、それら領域の間を切断することにより、前記細胞を細胞シートとして剥離する、上記（６）に記載の細胞シートの輸送方法。
（８）輸送後に、前記細胞シートの端部における、前記細胞接着性の領域の表面に接着した部分を切り離す、上記（６）又は（７）に記載の細胞シートの輸送方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の細胞シートの作製方法によれば、意図しないタイミングで細胞シートが剥離することが防止され、温度を変化させる等の刺激を加えて剥離させる時点まで、細胞シートが確実に保持される。
【００１４】
また、本発明の細胞シートの輸送方法によれば、細胞接着性の領域によって細胞シートの端部が保持され、輸送中に細胞シートに皺や収縮を生ずることが抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の細胞シートの作製方法の第一の実施形態を模式的に示す断面図である。
【図２】本発明の細胞シートの作製方法の第二の実施形態を模式的に示す断面図である。
【図３】本発明の細胞シートの作製方法の第三の実施形態を模式的に示す断面図である。
【図４】本発明の細胞シートの輸送方法の一実施形態を模式的に示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面に基づき、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る細胞シートの作製方法の第一の実施形態について、図１に基づき説明する。
【００１７】
（１）細胞培養工程
細胞培養工程は、図１に示すように、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と、その刺激応答性ポリマーを含む領域１０に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０とにわたる表面において細胞１を培養する工程である。なお、ここで「刺激応答性を有しない」とは、後の工程で加えられる刺激に対し、その性状が刺激応答性ポリマーを含む領域１０のようには変化せず、必要な細胞接着性を失わないことをいう。したがって、任意の刺激に対して何ら応答性を示さない場合のみならず、刺激応答性を有するが刺激応答性ポリマーを含む領域１０に比べると応答性の度合いが小さい場合や、刺激応答性を有するが刺激応答性ポリマーを含む領域１０とは応答性を示す刺激の種類が異なる場合をも包含するものである。
【００１８】
また、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０とは隣接していれば良く、それぞれの領域の平面視形状は特に限定されるものではない。好適な例として、円や四角形状の刺激応答性ポリマーを含む領域１０の周囲を取り囲むように細胞接着性の領域２０が位置する場合（その場合の断面図は図１の通りである）を挙げることができる。あるいは、刺激応答性ポリマーを含む領域１０の周囲の一部のみが細胞接着性の領域２０に隣接する場合、刺激応答性ポリマーを含む領域１０の範囲内に複数の細胞接着性の領域２０が散在する場合等、種々の形態を採用し得る。
【００１９】
図１の刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０は、例えば、細胞接着性の材質からなるシャーレ等の細胞培養容器の底面の一部に、刺激応答性ポリマーを含む層を塗布等によって形成し、その層が存在する部分を「刺激応答性ポリマーを含む領域１０」とし、層が存在しない部分を「細胞接着性の領域２０」とすることによって構成することができる。しかし通常は、図１に示すように、刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０を後の工程において互いに切り離す必要があることから、培養容器の底面に刺激応答性ポリマーを含む領域１０を直接形成するのではなく、フィルム状、板状等の形状からなる細胞接着性の基材の表面の一部に、刺激応答性ポリマーを含む層を塗布等により形成した機能性基材を別途作製し、その機能性基材を細胞培養容器の底面上に粘着剤や接着剤等を介して固定することが好ましい。その場合、機能性基材の表面のうち、刺激応答性ポリマーを含む層が形成された領域が「刺激応答性ポリマーを含む領域１０」となり、表面におけるその他の部分が「細胞接着性の領域２０」となる。細胞培養終了後、機能性基材は細胞培養容器の底面から剥離することができる。なお、図１では、シャーレ等の細胞培養容器は図示を省略しており、刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０からなる機能性基材を別途作製し、その機能性基材の表面上で細胞を培養する場合について示している。
【００２０】
刺激応答性ポリマーを含む領域１０を形成するための基材は、所定の構造を有している限り、フィルムであっても良いし、板状体であっても良い。フィルム状の基材は、好ましくはロール状に巻き取り可能な可撓性を有するものである。
【００２１】
基材の材料は特に限定されないが、基材における刺激応答性ポリマーを含む領域１０以外の部分を細胞接着性の領域２０として利用する場合は、基材の材質は細胞接着性であることを要する。具体例としては、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等）に代表される有機材料等を挙げることができる。
【００２２】
基材の表面には、図示しないが、培養容器に固定するための接着剤又は粘着剤を含む粘着層が設けられる。接着剤及び粘着剤としては、基材と培養容器とを接合可能なものであれば特に限定されないが、具体的には接着剤としてはポリアクリル酸エステル系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、ポリエステル系接着剤、ポリアミド系接着剤、ポリイミド系接着剤、エポキシ系接着剤、ポリウレタン系接着剤、メタクリル系接着剤、ゴム系接着剤、シリコーン系接着剤、無機系接着剤等の接着剤等が例示でき、粘着剤としてはアクリル系粘着剤や、ウレタン系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ゴム系粘着剤が例示できる。これらの接着剤又は粘着剤が、基材上に塗布されて、粘着層が形成される。
【００２３】
なお、粘着層における、基材が設けられている側とは反対側の表面には、さらに剥離シートを備えていても良い。剥離シートを剥離した後に、培養容器の底面等に機能性基材を固定することができる。
【００２４】
機能性基材は、基材に、刺激応答性ポリマーを含む層を適当な方法により形成することによって製造することができる。基材と刺激応答性ポリマーを含む層との間には、必要に応じて１つ以上の他の層（例えば後述するプライマー層）が存在していても良い。また、基材における、刺激応答性ポリマーを含む層が形成される側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００２５】
刺激応答性ポリマーを含む層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とすると良く、特に１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。この層が存在する領域が、「刺激応答性ポリマーを含む領域１０」として機能することとなる。
【００２６】
刺激応答性ポリマーを含む層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等を挙げることができる。特に、温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましく用いられる。
【００２７】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時点の温度では細胞非接着性を示すものを用いると良い。例えば、温度応答性ポリマーとしては、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いると良い。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いると良い。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００２８】
好適な温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられるがこれに限定されるものではない。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。
【００２９】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（もしくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用して良い。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。
【００３０】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー類をさらに加えて共重合して良い。さらに本発明で使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明で使用するポリマーと他のポリマーとの混合物を用いても良い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００３１】
ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは、作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。
【００３２】
刺激応答性ポリマーを含む層、すなわち刺激応答性ポリマーを含む領域１０は、重合により目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００３３】
また通常は、上述のように、基材表面における刺激応答性ポリマーを含む層が存在する部分以外の部分を、細胞接着性の領域２０として利用することができるが、基材の細胞接着性が十分でない場合等には、必要に応じて、基材の表面に細胞接着性の樹脂等を含む層をさらに形成し、その層が存在する部分を細胞接着性の領域２０としても良い。
【００３４】
あるいは、別の実施形態として、当初は細胞非接着性を有し、それを酸化及び／又は分解することによって細胞接着性に変化させ、その変化させた部分を細胞接着性の領域２０とすることもできる。そのような細胞接着性に変化し得る層として、Ｃ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合等の炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性の層が挙げられる。具体的には、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリメタクリル酸及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類等を挙げることができる。酸化及び／又は分解処理の方法としては、上記の親水性の層を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。この実施形態は、紫外線照射等によってパターン状に細胞接着性の領域２０を形成する場合に有利である。部分的に酸化及び／又は分解処理を行う場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりすると良い。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化及び／又は分解処理を施しても良い。
【００３５】
本発明に用いられる細胞としては接着性細胞であれば特に限定されない。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞等の内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞等の神経細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、あるいは、それらを何代か継代させたものでも良い。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、分化が終了した細胞のいずれであっても良い。また、細胞は単一種を培養しても良いし二種以上の細胞を共培養しても良い。
【００３６】
目的の細胞を含む試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理等を行っておくことが好ましい。
【００３７】
刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０にわたる表面への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養等の通常の培養方法を採用することができる。
【００３８】
上記のように予備培養した細胞を、刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０にわたる表面へ播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。
【００３９】
播種した細胞１は、刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０にわたる表面に接着させ、培養して細胞シートを形成する。細胞の培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えても良い。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることもできる。
【００４０】
（２）分離工程
次に、細胞培養後、図１に示すように、刺激応答性ポリマーを含む領域１０の表面における細胞１ａと、細胞接着性の領域２０の表面における細胞１ｂとを分離する。この第一の実施形態では、細胞１を細胞１ａ及び細胞１ｂに分離する工程は、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞接着性の領域２０との間で、機能性基材をその表面上の細胞１とともに切断することによって行われる。すなわち、細胞接着性の領域２０の表面における細胞１ｂは、細胞接着性の領域２０の表面に接着した状態で、刺激応答性ポリマーを含む領域１０の表面における細胞１ａと分離されることとなる。切断箇所は、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞接着性の領域２０との境目（界面）であることが好ましいが、境目から刺激応答性ポリマーを含む領域１０側に若干寄っていても良い。また、機能性基材において、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞接着性の領域２０との間は、ハーフカットやミシン目を形成する等して切断しやすいように予め加工されていることが好ましい。
【００４１】
細胞１を細胞１ａ及び細胞１ｂに分離する前は、細胞１は、刺激応答性ポリマーを含む領域１０に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０の表面に少なくとも接着しているため、仮に、培養液等の交換等の際に刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞１との間が意図せず剥離することがあったとしても、細胞１からなる細胞シート全体は剥離せず、基材上に確実に保持することができる。
【００４２】
（３）剥離工程
上記のように細胞１を細胞１ａ及び細胞１ｂに分離した後、刺激応答性ポリマーを含む領域に刺激を加えて表面を細胞非接着性に変化させ、細胞１ａを細胞シートとして剥離、回収する。例えば、温度応答性ポリマーの場合には、下限臨界温度以下の温度に制御することにより、表面を細胞非接着性に変化させることができる。剥離は、ピペッティング操作等の物理的な操作によって行うことができる。
【００４３】
続いて、本発明に係る細胞シートの作製方法の第二の実施形態について、図２に基づき説明する。この実施形態では、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０が、剥離可能な粘着剤（図示せず）を介して刺激応答性ポリマーを含む領域１０の上に固定されている。ここで、刺激応答性ポリマーを含む領域１０、及び細胞接着性の領域２０の構成は、上記第一の実施形態と同様である。また、細胞接着性の領域２０と刺激応答性ポリマーを含む領域１０との間の粘着剤は、第一の実施形態において基材を培養容器の底面に固定する際に使用する粘着剤と同様のものを使用することができる。
【００４４】
また、第二の実施形態における刺激応答性ポリマーを含む領域１０は、第一の実施形態と同様に、培養容器とは別途用意するフィルム状又は板状の基材の表面に刺激応答性ポリマーを含む層を形成したものであっても良いが、培養容器の底面に刺激応答性ポリマーを含む層を直接形成して、その層が存在する部分を刺激応答性ポリマーを含む領域１０としても良い（すなわち、この場合は図２における刺激応答性ポリマーを含む領域１０は、培養容器の底面の一部である）。
【００４５】
培養容器の底面に刺激応答性ポリマーを含む層を形成する場合、その培養容器を構成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、及びガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。
【００４６】
第二の実施形態においては、図２に示すように、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０の領域とにわたる表面において細胞を培養し、培養後、細胞接着性の領域２０に相当する部分を刺激応答性ポリマーを含む領域１０から細胞１ｂとともに剥離する。その後、刺激応答性ポリマーを含む領域１０に対して刺激を加えることによって表面を細胞非接着性に変化させ、細胞１ａからなる細胞シートを剥離、回収することができる。細胞１を細胞１ａ及び細胞１ｂへ分離する直前までは、細胞シートは刺激応答性ポリマーを含む領域１０に隣接する細胞接着性の領域２０に接着することにより確実に保持されるため、細胞シートが意図しないタイミングで剥離することがない。
【００４７】
次に、本発明に係る細胞シートの作製方法の第三の実施形態について、図３に基づき説明する。この実施形態では、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０とにわたる表面において細胞１を培養した後、刺激応答性ポリマーを含む領域１０の表面に細胞１ａを残したまま、細胞接着性の領域２０の表面における細胞１ｂを除去する。その後、刺激応答性ポリマーを含む領域１０に刺激を加えて表面を細胞非接着性に変化させることにより、細胞１ａからなる目的の細胞シートを剥離、回収することができる。刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０のそれぞれの構成は、上記第一の実施形態と同様である。また、刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０は、培養容器とは別途に用意され培養容器の底面に固定されるフィルム状又は板状の機能性基材の一部であっても、あるいは培養容器の底面に直接形成される領域であっても、いずれでも良い。細胞１ｂの除去は、任意の手段を用いて行うことができ、例えば、細胞１ａと細胞１ｂの間をカッター等で切断した後、細胞１ｂをキャリアに接着させることによって除去することができる。切断位置は、細胞１ａと細胞１ｂとの境目であることが好ましいが、境目よりも若干細胞１ａ寄りの位置を切断しても良い。
【００４８】
第三の実施形態では、細胞１を細胞１ａ及び細胞１ｂへ分離する直前まで、細胞シートは刺激応答性ポリマーを含む領域１０に隣接する細胞接着性の領域２０に接着することにより確実に保持されるため、培養液の交換等の際に細胞シートが意図しないタイミングで剥離することがない。
【００４９】
次に、本発明に係る細胞シートの輸送方法について、図４に基づき説明する。図４の右に示すように、本発明に係る細胞シートの輸送方法では、作製した細胞シートを輸送する際に、従来のような細胞シートと密着させるキャリアを使用せず、細胞１からなる細胞シートの端部を、細胞接着性の領域２０の表面に接着させた状態で輸送する。ここで、細胞接着性の領域２０の表面に接着させる「端部」は、細胞シートの周端部の全体であっても良く、周端部の一部であっても良い。このとき、細胞シートにおける細胞接着性の領域２０の表面に接着していない部分（例えば細胞シートの周端部の全体を接着させる場合には、細胞シートの中心部）は、細胞シートのみが張られた状態となる。従来は、湿潤状態のキャリアを密着させる等するため、細胞シートに皺や収縮が発生する場合があったが、本発明ではキャリアを使用しないため、上記のような皺や収縮の発生を防止することができる。また、細胞接着性の領域２０により細胞シートの端部が保持され、細胞接着性の領域２０自身の形状を維持する力によって、細胞シートにおける細胞接着性の領域の表面に接着していない部分には張力が加わるため、皺や収縮の発生を効果的に抑制することができる。また、細胞シートを取り扱う際には、細胞１と細胞接着性の領域２０とが接着した部分をピンセット等で把持することができるため、細胞シートの中心部に何らダメージを与えることなく取り扱うことが可能となり好ましい。
【００５０】
輸送後、例えば細胞シートを移植等に使用する段階では、細胞シートの端部における、細胞接着性の領域２０の表面に接着した部分を切り離し、細胞シート単独からなる組織体を得ることができる。切り離す手段は、カッター等による切り出し等、種々の手段を用いることができる。
【００５１】
細胞１からなる細胞シートの端部が細胞接着性の領域２０の表面に接着した状態は、適宜方法により実現することができる。図４の例では、まず、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と、その刺激応答性ポリマーを含む領域１０に隣接する、刺激応答性を有しない細胞接着性の領域２０とにわたる表面において細胞１を培養することによって細胞シートを形成する。そして、細胞培養後に、刺激を加えることにより、刺激応答性ポリマーを含む領域１０の表面から細胞１を細胞シートとして剥離する（すなわち、細胞シートに密着している刺激応答性ポリマーを含む領域１０を剥離除去する）ことによって行うことができる。ここで、刺激応答性ポリマーを含む領域１０及び細胞接着性の領域２０は、通常はフィルム状又は板状の基材において形成され、それぞれの構成は、上述の細胞シートの作製方法についての第一の実施形態と同様である。
【００５２】
刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞１からなる細胞シートとの剥離が容易に行えるように、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞接着性の領域２０との間は切断可能に構成されることが好ましい。例えば、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞接着性の領域２０との間に、ハーフカットやミシン目を予め形成する等して切断しやすいように加工しておくことが好ましい。切断箇所は、刺激応答性ポリマーを含む領域１０と細胞接着性の領域２０との境目であることが好ましいが、境目から刺激応答性ポリマーを含む領域１０側に若干寄っていても良い。
【符号の説明】
【００５３】
１    細胞
１ａ  細胞
１ｂ  細胞
１０  温度応答性ポリマーを含む領域
２０  細胞接着性の領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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