(57)【要約】【課題】バックグラウンドの増大を防ぎつつ、蛍光の出射角のずれによる検出精度の低下を抑制することができる、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置を提供すること。【解決手段】光透過性の側壁に囲まれ、液体を保持している液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する。前記回折格子に、前記側壁と前記液溜部に保持された液体との界面を通して励起光を照射する。前記蛍光物質から放出された蛍光を、前記液溜部に保持された液体と前記側壁との界面を通して検出して蛍光シグナルを得る。【選択図】図１
2015111063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
光透過性の側壁に囲まれ、液体を保持している液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する工程と、
前記回折格子に、前記側壁と前記液溜部に保持された液体との界面を通して励起光を照射する工程と、
前記蛍光物質から放出された蛍光を、前記液溜部に保持された液体と前記側壁との界面を通して検出して蛍光シグナルを得る工程と、
を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【請求項２】
前記励起光の光軸を含む前記液溜部の深さ方向の断面において、前記液溜部に保持された液体の深さｈは、以下の式（１）を満たす、請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【数１】
2015111063.tif 000021
［上記式（１）において、ｔは、前記液溜部の底部の水平方向の大きさである。θは、前記回折格子に対する励起光の入射角である。］
【請求項３】
光透過性の側壁に囲まれ、液体を保持している液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記回折格子に、前記側壁と前記液溜部に保持された液体との界面を通して励起光を照射する光照射部と、
前記蛍光物質から放出された蛍光を、前記液溜部に保持された液体と前記側壁との界面を通して検出する光検出部と、
を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項４】
前記光照射部および前記光検出部を含む前記液溜部の深さ方向の断面において、前記液溜部に保持された液体の深さｈは、以下の式（１）を満たす、請求項３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【数２】
2015111063.tif 000022
［上記式（１）において、ｔは、前記液溜部の底部の水平方向の大きさである。θは、前記回折格子に対する励起光の入射角である。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。
【０００３】
被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で光を金属膜に照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む試料液を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。
【０００４】
ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを使用する（特許文献１参照）。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。
【０００５】
これに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（特許文献２参照）。ＧＣ−ＳＰＦＳでは、回折格子を形成された金属膜を使用する。この方法では、回折格子に励起光を照射することで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光は全方向に出射されるのに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光は特定の方向に指向性を持って出射されることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１５８３６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的に、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、励起光照射時に回折格子上に液体が存在しており、励起光はこの液体を通して回折格子に照射される。このような状況において、液体の上部を外部に開放すると、メニスカスにより液体の表面に傾きが生じる。このように液体の表面に傾きが生じると、励起光の入射角および蛍光の出射角にずれが生じてしまい、光検出部に適切に蛍光が到達できず、被検出物質の検出に失敗してしまうおそれがある。蛍光の出射角のずれに対応するためにレンズなどを用いて光検出部の検出範囲を拡げることも考えられるが、バックグラウンドの低減の観点からはレンズなどの使用は好ましくない。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置であって、バックグラウンドの増大を防ぎつつ、蛍光の出射角のずれによる検出精度の低下を抑制することができる測定方法および測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、液体の表面（液体と空気の界面）を介さずに励起光を照射し、蛍光を検出することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。
【００１１】
［１］被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、光透過性の側壁に囲まれ、液体を保持している液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する工程と、前記回折格子に、前記側壁と前記液溜部に保持された液体との界面を通して励起光を照射する工程と、前記蛍光物質から放出された蛍光を、前記液溜部に保持された液体と前記側壁との界面を通して検出して蛍光シグナルを得る工程と、を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
［２］前記励起光の光軸を含む前記液溜部の深さ方向の断面において、前記液溜部に保持された液体の深さｈは、以下の式（１）を満たす、［１］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【数１】
2015111063.tif 000003
［上記式（１）において、ｔは、前記液溜部の底部の水平方向の大きさである。θは、前記回折格子に対する励起光の入射角である。］
【００１２】
また、本発明は、以下の表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。
【００１３】
［３］光透過性の側壁に囲まれ、液体を保持している液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記回折格子に、前記側壁と前記液溜部に保持された液体との界面を通して励起光を照射する光照射部と、前記蛍光物質から放出された蛍光を、前記液溜部に保持された液体と前記側壁との界面を通して検出する光検出部と、を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
［４］前記光照射部および前記光検出部を含む前記液溜部の深さ方向の断面において、前記液溜部に保持された液体の深さｈは、以下の式（１）を満たす、［３］に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【数２】
2015111063.tif 000004
［上記式（１）において、ｔは、前記液溜部の底部の水平方向の大きさである。θは、前記回折格子に対する励起光の入射角である。］
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置において、被検出物質をより高感度かつ高精度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置およびチップの構成を示す模式図である。
【図２】図２Ａ，Ｂは、回折格子の斜視図である。
【図３】金属膜に対する励起光の入射角を説明するための断面模式図である。
【図４】実施の形態１に係るチップにおける励起光および蛍光の光路を示す断面模式図である。
【図５】実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の動作を示すフローチャートである。
【図６】実施の形態２に係るチップの構成ならびに励起光および蛍光の光路を示す断面模式図である。
【図７】図７Ａは、金属膜に対する励起光の入射角と励起光の反射率との関係（シミュレーション結果）を示すグラフである。図７Ｂは、励起光を液体の表面を通して回折格子に照射した場合の、金属膜に対する励起光の入射角と励起光の反射光の強度との関係（実測値）を示すグラフである。図７Ｃは、励起光を液体の表面を通して回折格子に照射した場合の、測定回数と蛍光の強度（実測値）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１７】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下「ＳＰＦＳ装置」という）１００およびチップ２００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、光源１１０、コリメートレンズ１２０、励起光フィルター１３０、蛍光フィルター１４０、光検出部１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー（不図示）にチップ２００を装着した状態で使用される。そこで、チップ２００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。
【００１８】
チップ２００は、基板２１０と、回折格子２３０を含む金属膜２２０と、液体を保持するための液溜部２５０を形成する側壁２４０とを有する。金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。回折格子２３０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子２３０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図１では、捕捉体および被検出物質を省略している。チップ２００は、好ましくは、各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【００１９】
基板２１０は、金属膜２２０および側壁２４０の支持部材である。基板２１０の材料は、金属膜２２０および側壁２４０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２１０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
【００２０】
金属膜２２０は、液溜部２５０の底部に位置するように基板２１０上に配置されている。前述のとおり、金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。金属膜２２０に光を照射すると、金属膜２２０中に生じる表面プラズモンと、回折格子２３０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じる。金属膜２２０の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜２２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜２２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜２２０の厚みは、特に限定されない。たとえば、金属膜２２０の厚みは、３０〜７０ｎｍ程度である。
【００２１】
回折格子２３０は、金属膜２２０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子２３０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２３０は、図２Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図２Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図２Ａに示される１次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図２Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２３０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子のピッチは、ＳＰＲを発生させる観点から、１００〜２０００ｎｍの範囲が好ましい。なお、本明細書において、「回折格子のピッチ」とは、図２Ａ，Ｂに示されるように、凸部の配列方向における凸部の中心間距離Λをいう。
【００２２】
回折格子２３０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板２１０の上に金属膜２２０を形成した後、金属膜２２０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板２１０の上に、金属膜２２０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２３０を含む金属膜２２０を形成することができる。
【００２３】
回折格子２３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。たとえば、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。
【００２４】
捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子２３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ膜」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭ膜の例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子２３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。
【００２５】
図３に示されるように、励起光αは、所定の入射角θで回折格子２３０に照射される。照射領域では、金属膜２２０で生じた表面プラズモンと、回折格子２３０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。前述のとおり、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。図３に示されるように、蛍光βの出射角は２θで近似される。
【００２６】
側壁２４０は、金属膜２２０を取り囲むように基板２１０上に配置されている。側壁２４０は、金属膜２２０上に液体３１０を保持するための液溜部２５０を形成する。液溜部２５０の開口部は開放されているため、液溜部２５０内の液体３１０の表面は外部に露出される。したがって、液溜部２５０内の液体３１０の表面は、メニスカスを形成する。この後説明するように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出時におけるメニスカスの影響を回避するために、側壁２４０を通して励起光αを回折格子２３０に照射し、側壁２４０を通して蛍光βを検出する（図１参照）。したがって、側壁２４０は、励起光αおよび蛍光βの波長について光透過性を有する材料で形成される。
【００２７】
側壁２４０の材料は、励起光αおよび蛍光βの波長について光透過性を有し、かつ金属膜２２０上に液体３１０を保持できるものであれば特に限定されない。側壁２４０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。側壁２４０の材料としては、アクリル樹脂などの光学プラスチック、または光学ガラスが好ましい。なお、側壁２４０は、基板２１０と一体成形されていてもよい。
【００２８】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、光源１１０、コリメートレンズ１２０、励起光フィルター１３０、蛍光フィルター１４０、光検出部１５０および制御部１６０を有する。
【００２９】
光源１１０、コリメートレンズ１２０および励起光フィルター１３０は、励起光照射ユニット（光照射部）を構成する。励起光照射ユニットは、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、チップ２００の金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。また、励起光照射ユニットは、金属膜２２０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子２３０で生じるように、金属膜２２０に対するＰ波のみを回折格子２３０に向けて出射する。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光照射ユニットは、チップ２００の側壁２４０と液溜部２５０内の液体３１０との界面を通るように励起光αを回折格子２３０に照射する。
【００３０】
励起光照射ユニットは、励起光αの光軸が、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（図２Ａ，Ｂにおけるｘ軸方向）に沿うように、励起光αを回折格子２３０に照射する。したがって、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に垂直な軸（液溜部２５０の高さ方向の軸）をｙ軸とした場合、励起光αの光軸はｘｙ平面に平行である（図１参照）。
【００３１】
光源１１０は、チップ２００の回折格子２３０に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。光源１１０の種類は、蛍光物質を励起できる波長（例えば４００〜１０００ｎｍ）の光を出射できれば特に限定されない。光源１１０の例には、レーザーダイオード、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。
【００３２】
コリメートレンズ１２０は、光源１１０から出射された励起光αをコリメートする。光源１１０から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である場合がある。このため、金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように、光源１１０は所定の姿勢で保持される。
【００３３】
励起光フィルター１３０は、例えば、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターを含み、光源１１０から出射された励起光αを整波する。光源１１０からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、光源１１０からの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、光源１１０からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、光源１１０からの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルター１３０は、金属膜２２０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
【００３４】
金属膜２２０（回折格子２３０）に対する励起光αの入射角θ（図３参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角θは、回折格子２３０のピッチΛや励起光αの波長、金属膜２２０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。たとえば、励起光αの入射角θは、以下の式（２）を満たすように設定される。
【数３】
2015111063.tif 000005
ｋ０：励起光αの波数＝２π／（λ０／ｎ）
λ０：真空中の励起光αの波長
ｎ：回折格子２３０上の媒質（液溜部２５０内の液体３１０）の屈折率
θ：励起光αの回折格子２３０に対する入射角
ｍ：整数
Λ：回折格子２３０のピッチ
【００３５】
ここで、ｋｓｐは、２種類の媒質の界面（金属膜２２０と液溜部２５０内の液体３１０との界面）において励起されるプラズモンの波数であり、以下の式（３）のように定義される。
【数４】
2015111063.tif 000006
ω：励起光αの角周波数
ｃ：光速度
ε１：回折格子２３０上の媒質（液溜部２５０内の液体３１０）の誘電率＝ｎ２
ε２：回折格子２３０を構成する媒質（金属）の誘電率
【００３６】
励起光αの最適な入射角θは、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで入射角θを調整する第１角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、励起光照射ユニットまたはチップ２００を回転させればよい。
【００３７】
蛍光フィルター１４０および光検出部１５０は、蛍光検出ユニットを構成する。蛍光検出ユニットは、励起光照射ユニットに対して、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０に対して垂直な直線を挟むように配置されている。蛍光検出ユニットは、回折格子２３０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。蛍光検出ユニットは、光検出部１５０の検出範囲を拡げるために集光レンズをさらに有していてもよいが、バックグラウンドの低減の観点からは集光レンズを含まない方が好ましい。
【００３８】
蛍光フィルター１４０は、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、光検出部１５０に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、光検出部１５０に到達する光の光量を調整したりする。
【００３９】
光検出部１５０は、金属膜２２０上の蛍光像を検出する。たとえば、光検出部１５０は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光検出部１５０は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。
【００４０】
金属膜２２０の垂線に対する蛍光検出ユニットの光軸の角度は、回折格子２３０（反応場）から放出され、側壁２４０を透過した蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出ユニットの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニットの光軸の角度を調整する第２角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２角度調整部は、蛍光検出ユニットの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、蛍光検出ユニットまたはチップ２００を回転させればよい。
【００４１】
制御部１６０は、励起光照射ユニット（光源１１０）、蛍光検出ユニット（光検出部１５０）、励起光照射ユニットおよび蛍光検出ユニットの角度調整部（第１角度調整部および第２角度調整部）の動作を制御する。また、制御部１６０は、光検出部１５０からの出力信号（蛍光シグナル）を解析することにより、被検出物質の存在またはその量を分析する。制御部１６０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
【００４２】
図４は、実施の形態１に係るチップ２００の構成、ならびに励起光αおよび蛍光βの光路を示す断面模式図である。ここでは、側壁２４０の外面と内面とが平行であるとする。
【００４３】
図４において、θ１は、励起光αが外部の媒質（例えば空気）から側壁２４０に入射したときの励起光αの入射角である。θ２は、励起光αが外部の媒質から側壁２４０に入射したときの励起光αの屈折角である。θ２は、励起光αが側壁２４０から液体３１０（例えば緩衝液）に入射したときの励起光αの入射角でもある。θ３は、励起光αが側壁２４０から液体３１０（例えば緩衝液）に入射したときの励起光αの屈折角である。金属膜２２０に対する励起光αの入射角θとθ３との和は、９０°である。
【００４４】
θ４は、蛍光βが液体３１０から側壁２４０に入射したときの蛍光βの入射角である。前述のとおり、金属膜２２０に対する蛍光βの出射角は、２θで近似できる。したがって、θ４と２θとの和は、９０°である。θ５は、蛍光βが液体３１０から側壁２４０に入射したときの蛍光βの屈折角である。θ５は、蛍光βが側壁２４０から外部の媒質に入射したときの蛍光βの入射角でもある。θ６は、蛍光βが側壁２４０から外部の媒質に入射したときの蛍光βの屈折角である。
【００４５】
なお、励起光αの波長や、回折格子２３０のピッチΛ、金属膜２２０に対する励起光αの入射角θ、外部の媒質の屈折率ｎ１および誘電率、側壁２４０の屈折率ｎ１および誘電率、液体３１０の屈折率ｎ２および誘電率などは、蛍光検出時に使用する液体３１０の種類や、蛍光物質の種類、蛍光検出時の雰囲気などに応じて従属的に決まる。
【００４６】
スネルの法則より、以下の式（４）〜式（７）が成立する。ここで、ｎ１は、外部の媒質の屈折率である。ｎ２は、側壁２４０の屈折率である。ｎ３は、液体３１０の屈折率である。
【数５】
2015111063.tif 000007
【数６】
2015111063.tif 000008
【数７】
2015111063.tif 000009
【数８】
2015111063.tif 000010
【００４７】
また、適切に蛍光βを検出するためには、各屈折点において全反射しないことが必要である。したがって、以下の式（８）および式（９）が成立するように、側壁２４０の屈折率ｎ２、側壁２４０の形状および液体３１０の屈折率ｎ３が選択される。
【数９】
2015111063.tif 000011
【数１０】
2015111063.tif 000012
【００４８】
また、励起光αが側壁２４０と液体３１０との界面を通過するためには、以下の式（１０）を満たすように液体３１０の深さｈが選択される。式（１０）の左辺は、図４におけるｈ１に相当する。すなわち、式（１０）は、励起光αが側壁２４０から液体３１０に入射する点が、液体３１０の表面よりも低い位置にあることを特定している。なお、側壁２４０の高さが液体３１０の深さｈよりも高いことは当然である。一方、蛍光βが液体３１０と側壁２４０との界面を通過するためには、以下の式（１１）を満たすように液体３１０の深さが選択される。式（１０）を満たせば式（１１）も満たされるため、以下の式（１０）を満たすように液体３１０の深さを選択すればよい。
【数１１】
2015111063.tif 000013
【数１２】
2015111063.tif 000014
上記式（１０）および式（１１）において、ｔは、液溜部２５０の底部の水平方向の大きさである。θは、金属膜２２０に対する励起光αの入射角である。
【００４９】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図５は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０（回折格子２３０）上に固定化されている。
【００５０】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置にチップ２００を設置する。また、チップ２００の金属膜２２０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜２２０上を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５１】
次いで、チップ２００の液溜部２５０に試料液を導入して、試料液中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。試料液中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、液溜部２５０内を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。
【００５２】
試料液は、検体を含む水系の液体である。たとえば、試料液は、液状の検体や、液状の検体を緩衝液などの液体で希釈した希釈液である。試料液は、界面活性剤などを含んでいてもよい。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
【００５３】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を液溜部２５０に導入して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。この後、液溜部２５０内を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去する。なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を液溜部２５０に導入してもよい。また、液溜部２５０に検体と蛍光標識液を同時に導入してもよい。いずれの場合であっても、液溜部２５０に導入された試料液は、緩衝液などの別の液体に置換される。
【００５４】
次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βの強度を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１６０は、光源１１０に励起光αを出射させる。同時に、制御部１６０は、光検出部１５０に蛍光βの強度を検出させる。光検出部１５０は、測定結果を制御部１６０に出力する。このとき、図１に示されるように、励起光照射ユニット（光照射部）は、液溜部２５０に保持された液体３１０の表面（メニスカス）を通さずに、側壁２４０と液体３１０との界面を通して回折格子２３０に励起光αを照射する。また、光検出部１５０は、蛍光物質から放出された蛍光βを、液体３１０の表面（メニスカス）を通さずに、液体３１０と側壁２４０との界面を通して検出する。
【００５５】
最後に、制御部１６０は、光検出部１５０からの出力信号（蛍光シグナル）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ５０）。
【００５６】
以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
【００５７】
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、液体３１０の表面（メニスカス）を通さずに、側壁２４０と液体３１０との界面を通して励起光αを照射し、液体３１０と側壁２４０との界面を通して蛍光βを検出する。側壁２４０と液体３１０との界面の形状は変化しないため、このようにすることで、メニスカスに起因する蛍光βの出射角のずれを低減することができる（実施の形態２のシミュレーション結果も参照）。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００によれば、被検出物質を高感度かつ高精度に検出することができる。
【００５８】
［実施の形態２］
実施の形態１では、側壁２４０の外周面で励起光αを側壁２４０に入射させる例について説明した。実施の形態２では、側壁２４０の上面で励起光αを側壁２４０に入射させる例について説明する。
【００５９】
図６は、実施の形態２に係るチップ２００の構成、ならびに励起光αおよび蛍光βの光路を示す断面模式図である。ここでは、側壁２４０の外面と内面とが平行であり、側壁２４０の上面と基板２１０の上面とが平行であるものとする。図６に示されるように、本実施の形態では、チップ２００の側壁２４０の上面で励起光αを入射させる。入射した励起光αは、側壁２４０と液体３１０との界面を通り、回折格子２３０に到達する。
【００６０】
図６において、θ１は、励起光αが外部の媒質（例えば空気）から側壁２４０に入射したときの励起光αの入射角である。θ２は、励起光αが側壁２４０から液体３１０（例えば緩衝液）に入射したときの励起光αの入射角である。θは、金属膜２２０に対する励起光αの入射角である。前述のとおり、金属膜２２０に対する蛍光βの出射角は、２θで近似できる。
【００６１】
θ３は、蛍光βが液体３１０から側壁２４０に入射したときの蛍光βの屈折角である。θ３は、蛍光βが側壁２４０から外部の媒質に入射したときの蛍光βの入射角でもある。θ４は、蛍光βが側壁２４０から外部の媒質に入射したときの蛍光βの屈折角である。
【００６２】
スネルの法則より、以下の式（１２）〜式（１５）が成立する。ここで、ｎ１は、外部の媒質の屈折率である。ｎ２は、側壁２４０の屈折率である。ｎ３は、液体３１０の屈折率である。
【数１３】
2015111063.tif 000015
【数１４】
2015111063.tif 000016
【数１５】
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【数１６】
2015111063.tif 000018
【００６３】
図７Ａは、金属膜２２０に対する励起光αの入射角θと励起光αの反射率との関係（シミュレーション結果）を示すグラフである。このシミュレーションは、以下の条件でＲＣＷＡ法を用いて行った。金属膜２３０は、金薄膜とした。金薄膜には、図２Ａに示される形状の回折格子２３０（ピッチΛ：３００ｎｍ）が形成されている。励起光αの波長は、６３７ｎｍとした。液体３１０は、水とした。
【００６４】
図７Ａに示されるグラフから、この条件では入射角が約２６°（２６.２°）のときに励起光αの反射率が最も低下し、最も効率よくＳＰＲが生じることがわかる。
【００６５】
ここで、外部の媒質（空気）の屈折率ｎ１が１であり、側壁２４０（光学樹脂）の屈折率ｎ２が１.５２５であり、液体３１０（水）の屈折率ｎ３が１.３３であり、θ＝２６°であると仮定する。この場合は、上記式（１２）〜式（１５）を解くことで、θ１＝６５.１°、θ２＝５７°、θ３＝３２.５°、θ４＝５５°と求めることができる。
【００６６】
また、図６において、液溜部２５０の底部の水平方向の大きさｔが５ｍｍであると仮定する。この場合は、上記式（１０）より、液体３１０の深さｈは、８.７ｍｍを超えなければならない。したがって、側壁２４０の高さｈ２も、８.７ｍｍを超えている必要がある。この８.７ｍｍという数値は、図６におけるｈ１に相当する。
【００６７】
また、図６におけるｔ２の大きさは、以下の式（１６）で求められる。したがって、側壁２４０の厚みｔ１は、以下の式（１７）を満たすように設定される。
【数１７】
2015111063.tif 000019
【数１８】
2015111063.tif 000020
【００６８】
図７Ｂは、図６に示されるチップ２００（回折格子２３０のピッチΛ：４００ｎｍ、液溜部２５０の径ｔ：１０ｍｍ）を使用して、励起光α（波長：６３３ｎｍ）を液体３１０の表面（メニスカス）を通して回折格子２３０に照射した場合の、金属膜２２０に対する励起光αの入射角θと励起光αの反射光の強度との関係（実測値）を示すグラフである。この実験では、同一のチップを用いて５回反射光の強度を測定した。測定ごとに、液溜部２５０内の液体３１０を除去し、改めて液溜部２５０内に液体３１０を提供した。
【００６９】
図７Ｂに示されるグラフから、同じ条件で測定を行っているにも関わらず、励起光αの反射光強度が最も低下する入射角（共鳴角）が、測定ごとに７.２°〜７.８°とばらついていることがわかる。これは、液溜部２５０内に液体３１０を提供する度に、液体３１０の表面形状（メニスカス）が変化し、回折格子２３０に対する励起光αの入射角が変化しているためと考えられる。
【００７０】
図７Ｃは、図６に示されるチップ２００（回折格子２３０のピッチΛ：４００ｎｍ、液溜部２５０の径ｔ：１０ｍｍ）を使用して、励起光α（波長：６３７ｎｍ）を液体３１０の表面（メニスカス）を通して回折格子２３０に照射し、液体３１０と側壁２４０との界面を通して蛍光βを検出した場合の、蛍光βの強度（実測値）を示すグラフである。この実験では、同一のチップを用いて５回蛍光βの強度を測定した。測定ごとに、液溜部２５０内の液体３１０（ＴＢＳ−Ｔ）を除去し、改めて液溜部２５０内に液体３１０（ＴＢＳ−Ｔ）を提供した。また、回折格子２３０の表面に蛍光標識された被検出物質を結合させる代わりに、回折格子２３０の表面にＳＡＭ膜を形成し、その上に蛍光色素（アロフィコシアニン）を固定化した。
【００７１】
図７Ｃに示されるグラフから、同じ条件で測定を行っているにも関わらず、蛍光βの強度が、測定ごとに１１１９〜１１９１カウント／秒とばらついてことがわかる。これは、液溜部２５０内に液体３１０を提供する度に、液体３１０の表面形状（メニスカス）が変化し、回折格子２３０に対する励起光αの入射角が変化しているためと考えられる。
【００７２】
図７Ｂ，図７Ｃに示されるように、液体３１０の表面（メニスカス）を通して励起光αを回折格子２３０に照射すると、測定の度に励起光αの入射角が変化し、検出される蛍光βの強度も大きくばらつくため、定量的な検出を行うことはできない。
【００７３】
これに対し、実施の形態１，２に係るＳＰＦＳ装置１００では、液体３１０の表面（メニスカス）を通さずに励起光αを回折格子２３０に照射するため、測定の度に励起光αの入射角が変化することはなく、検出される蛍光βの強度も安定する。このため、実施の形態１，２に係るＳＰＦＳ装置１００は、定量的な検出を行うことができる。
【００７４】
本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様の効果を奏する。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
【符号の説明】
【００７６】
１００  表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０  光源
１２０  コリメートレンズ
１３０  励起光フィルター
１４０  蛍光フィルター
１５０  光検出部
１６０  制御部
２００  チップ
２１０  基板
２２０  金属膜
２３０  回折格子
２４０  側壁
２５０  液溜部
３１０  液体
α  励起光
β  蛍光
【図１】
2015111063.tif 000023
【図２】
2015111063.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015111063.tif 000027
【図６】
2015111063.tif 000028
【図７】
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