(57)【要約】      （修正有）【課題】アカントアメーバ（・シスト）についての生死を容易且つ確実に定量できる試験方法などを提供する。【解決手段】（１）栄養体アメーバの餌となる物質を添加した増殖用の固形培地上でアカントアメーバを増殖させ、前記餌の減少による飼育条件の悪化に伴い、全てのアカントアメーバをシスト形態とさせることで、シストを存在させたシスト培地を作成するシスト培地作成工程、（２）被験物質を含有した試験液中に、前記シスト培地を浸漬する暴露工程、（３）前記暴露工程を経たシスト培地を栄養寒天培地上に載置して培養することで、シスト形態から栄養体アメーバを誘導する栄養体誘導工程、及び（４）前記栄養体誘導工程の実施から一定時間の経過後、シスト形態から栄養体アメーバとなったことを示す脱シスト跡の個数である脱シスト数と、シスト形態のままの未脱シストの個数である未脱シスト数とを計数し、脱シスト率を算出する評価工程を備えた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アカントアメーバ（・シスト）についての生死を容易且つ確実に定量できる方法であって、
（１）栄養体アメーバの餌となる物質を添加した増殖用の固形培地上でアカントアメーバを増殖させ、前記餌の減少による飼育条件の悪化に伴い、全てのアカントアメーバをシスト形態とさせることで、シストを存在させたシスト培地を作成するシスト培地作成工程、
（２）被験物質を含有した試験液中に、前記シスト培地を浸漬する暴露工程、
（３）前記暴露工程を経たシスト培地を栄養寒天培地上に載置して培養することで、シスト形態から栄養体アメーバを誘導する栄養体誘導工程、及び
（４）前記栄養体誘導工程の実施から一定時間の経過後、シスト形態から栄養体アメーバとなったことを示す脱シスト跡の個数である脱シスト数と、依然としてシスト形態のままの未脱シストの個数である未脱シスト数とを計数し、脱シスト率を算出する評価工程を備えたことを特徴とするアカントアメーバについての試験方法。
【請求項２】
前記固形培地が、寒天培地、ソフトコンタクトレンズ、シリコーンハイドロゲルレンズ、ハードコンタクトレンズからなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載のアカントアメーバについての試験方法。
【請求項３】
アカントアメーバのシストに対して抗菌性を示す薬剤であって、請求項１または２に記載の試験方法によって選択されたことを特徴とする抗シスト薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アカントアメーバ（・シスト）の生死判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンタクトレンズの普及に伴い、アカントアメーバによる角膜感染症が増加している。アカントアメーバは土壌や環境水中に広く生息する小型の自由生活性アメーバであり、生育条件の良いときは栄養体となり、運動性を有し、分裂増殖を行う。栄養体は膜の透過性が高いため、薬剤にも高い感受性を有する。一方、生育条件が悪化すると、アカントアメーバは二重壁を有するシストとなる。シスト化したアメーバは耐乾性、耐熱性、耐薬品性を有し、各種治療に抵抗する。また、シスト化すると、空気中を散布・拡散しながら環境の変化を待ち、良好な環境に至ったときに、脱シストして栄養体となる。
【０００３】
アカントアメーバが角膜に侵入すると、アメーバは角膜上皮内で増殖するが、炎症反応が起こるとシスト化して反応から逃れ、炎症が静まると再び栄養体となって増殖すると考えられている（国民生活センター報告）。アカントアメーバの感染経路として、ソフトコンタクトレンズを介した感染が疑われており、その理由として、ソフトコンタクトレンズの不完全な消毒、使用者のコンプライアンスの問題などが挙げられている。ソフトコンタクトレンズ用消毒剤の消毒効果試験において、細菌および真菌については、ISO/FDIS 14729（Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lens）が定法として知られている。しかしながら、アメーバに対する試験法は定まっていない。
【０００４】
アメーバに対する消毒効果試験について、多くの研究者はISO14729を参照としている。簡単に説明すると、アメーバを消毒液と一定時間接触させた後、その生存率を算出するという方法である。しかし、静置接触させるためにアメーバが沈殿してしまうため、消毒液の効果が正しく評価されているか不明である。また、ISO14729は細菌や真菌など、容易に生死が判定できる生物に対して考案されているため、シスト化したアメーバに対して判定することは難しく、評価の際には脱シストしたことを確認する必要がある。更に、脱シストしたアメーバは分裂増殖するため、定量的な評価をすることは困難となる。
このような状況に鑑み、アカントアメーバに特化した測定方法が開発されている（特許文献１）。この技術では、２種以上のアカントアメーバに特異的に反応するＩｇＭ型モノクローナル抗体を使用することで、栄養体のアメーバを迅速・的確に検出するものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１０５７５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アカントアメーバによる角膜炎の特徴としては、ソフトコンタクトレンズによる被害が多いという点が挙げられる。ソフトコンタクトレンズは、未装着時に消毒液によって消毒されているが、この消毒液は、細菌・真菌に対する消毒性を備えているものの、アメーバ用には設計されていない。特に、シスト形態のアメーバに対しては、効率的な殺菌剤が存在しない。
このように、アカントアメーバに対しては、消毒効果試験方法が定まっていないため、より簡便で正しく評価できる方法の構築が必要とされていた。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、シスト形態のアカントアメーバについて、効果的な消毒剤を評価できる試験方法などを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するための発明に係るアカントアメーバについての試験方法は、（１）栄養体アメーバの餌となる物質を添加した増殖用の固形培地上でアカントアメーバを増殖させ、前記餌の減少による飼育条件の悪化に伴い、全てのアカントアメーバをシスト形態とさせることで、シストを存在させたシスト培地を作成するシスト培地作成工程、（２）被験物質を含有した試験液中に、前記シスト培地を浸漬する暴露工程、（３）前記暴露工程を経たシスト培地を栄養寒天培地上に載置して培養することで、シスト形態から栄養体アメーバを誘導する栄養体誘導工程、及び（４）前記栄養体誘導工程の実施から一定時間の経過後、シスト形態から栄養体アメーバとなったことを示す脱シスト跡の個数である脱シスト数と、依然としてシスト形態のままの未脱シストの個数である未脱シスト数とを計数し、脱シスト率を算出する評価工程を備えたことを特徴とする。
【０００８】
「固形培地」とは、アカントアメーバの培養に使用する固体の物質を意味する。このような固形培地としては、寒天培地、ソフトコンタクトレンズ（非含水タイプ、含水タイプ、シリコーンハイドロゲルタイプ）、ハードコンタクトレンズ、酸素透過性ハードコンタクトレンズなどを用いることができる。
「アメーバの餌」としては、生物の生体（バクテリアなど）、生物の乾燥物、人工栄養物などを用いることができる。なお、アメーバの餌が多すぎる場合には、アカントアメーバが、シストとならない場合があり得るので、適宜に増減して好ましい条件を設定する。固形培地として、寒天培地を用いる場合には、適当量のバクテリアを寒天培地上に塗布することが好ましい。
【０００９】
「脱シスト」とは、シストから栄養体に変化したシストを意味する。脱シストした跡を観察すると、（栄養体は同定できないが）シストの抜け殻として観察される。
「未脱シスト」とは、栄養体に変化できなかったシストを意味する。未脱シストを観察すると、抜け殻ではなくシストのままであり、死滅して栄養体アメーバになれなかったことが分かる。
「脱シスト率」とは、観察された全シスト数（脱シスト数＋未脱シスト数）のうち、生存していた数（脱シスト数）を意味する。百分率として表すときには、「１００×脱シスト数／（未脱シスト数＋脱シスト数）」にて算出できる。
また、本発明に係る第二の発明は、上記試験方法を実施するための試験用キットであって、シスト培地と、試験液を調製するための基礎緩衝液と、暴露工程に使用する多穴プレートとを備えたことを特徴とする。
また、本発明に係る第三の発明は、上記試験方法によって選択されたことを特徴とするアカントアメーバのシストに対して抗菌性を示す抗シスト薬剤であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、シストから脱シストして栄養体となるアカントアメーバについて、シストに対して殺菌効果を示すか否かを検討する被験物質を定量的に評価できる。こうして、ソフトコンタクレンズ消毒剤を含む薬剤の効果を、実際的な使用条件に近い状態で、より簡単な装置構成で評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】シスト培地作成工程において、バクテリアを塗布した寒天培地上に、アカントアメーバを載置する様子を示す図である。
【図２】シスト培地作成工程において、アカントアメーバが栄養体からシストとなる様子を観察した顕微鏡写真図である。（Ａ）培養開始後、２０時間程度において、栄養体が増加している様子、（Ｂ）培養開始後、１週間程度において、シストが形成されていく様子、（Ｃ）培養開始後、２週間程度において、ほぼ全部のアメーバがシストとなった様子をそれぞれ示す写真図である。
【図３】暴露工程の様子を示す写真図である。（Ａ）シャーレに形成したシスト培地を適当な大きさ（約1cm×1cm）に切り出す様子、（Ｂ）切り出したシスト培地を拡大して写した様子、（Ｃ）多穴プレートの各ウエルに試験液を添加しておき、切り出したシスト培地を加える様子、（Ｄ）上記（Ｃ）のシスト培地を拡大して写した様子をそれぞれ示す写真図である。
【図４】シスト培地を浸漬した様子を示す写真図である（矢印の先端には、シスト培地が認められる）。
【図５】栄養体誘導工程を実施後、25℃、20時間培養した後、評価工程においてアメーバの様子を観察したときの顕微鏡写真図である。（Ａ）浸漬工程において、試験液として生理食塩水（陰性対照）を用いたときの様子、（Ｂ）浸漬工程において、試験液としてシストに効果がある薬剤を用いたときの様子をそれぞれ示す写真図である。なお、図中において、丸印「○」は、脱シスト（殻の痕跡）を示し、星印「☆」は、未脱シストを示す。
【図６】試験例１の結果を示す棒グラフである。
【図７】試験例２の結果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施できる。
＜アカントアメーバについての試験方法＞
１．シスト培地作成工程
固形培地としては、寒天培地、ソフトコンタクトレンズ（非含水タイプ、含水タイプ、シリコーンハイドロゲルタイプ）、ハードコンタクトレンズ、酸素透過性ハードコンタクトレンズなど、様々なものを用いることができる。ここでは、寒天培地を用いる場合について説明する。寒天培地としては、一般にバクテリアなどの培養に使用するもの（約1.5%の寒天濃度で固形化させた培地）を用いることができる。本発明に使用されるシスト培地としては、アカントアメーバがシストを形成する場所（培地表面、或いは表面近傍）を用いれば済むので、表面積が大きいシャーレを用いた寒天培地を使用することが好ましい。寒天培地の製造については、通常の方法に従って行う。
栄養体アメーバの餌としては、バクテリア（大腸菌など）を寒天培地表面に適量だけ塗布する。
【００１３】
図１に示すように、シャーレ１内にバクテリアを塗布した寒天培地２を形成しておき、アカントアメーバを載置する。載置するアメーバとしては、栄養体またはシスト培地のいずれでも良い。実験時には、常に栄養体を維持しておくことは手間が掛かるので、シスト培地としたものを用いることが好ましい。図１には、予め保存しておいたシスト寒天３を複数個埋め込んだスポンジ４をアカントアメーバとして用いる様子を示している。
【００１４】
図２に示すように、寒天培地を適当な条件下（温度20℃〜40℃（好ましくは20℃〜30℃））で培養すると、栄養体が増殖する（図２（Ａ））。栄養体が増殖して餌が減少すると、飼育条件の悪化に伴い、アカントアメーバはシストに変化していく（条件にも依るが、培養開始から約5日間〜約10日間程度。図２（Ｂ））。最終的には、全てのアカントアメーバは、シストとなる（条件にも依るが、培養開始から約10日間〜約3週間程度。図２（Ｃ））。こうして、シストを存在させたシスト培地を作成できる。
なお、シャーレを用いてシスト培地を作成したときには、そのままの状態で保存できる。また、次の暴露工程に使用する際の都合を考慮すると、シスト寒天（の表面）を適当な大きさ（例えば、約0.5cm〜1.5cm×0.5cm〜1.5cmの四角形状の底面を持つ六面体）に切り出しておくことが好ましい（図３（Ａ）、（Ｂ）を参照）。
【００１５】
２．暴露工程
暴露工程に際しては、シスト寒天の大きさ、試験液の容量、被験物質数などの条件に鑑み、多穴プレート（例えば、12穴、24穴、48穴）を用いることが好ましい。被験物質を含有した試験液中に、適当な大きさに切り出したシスト寒天を浸漬する（図３（Ｃ）、（Ｄ）、及び図４を参照）。浸漬時間としては、被験物質の性質・濃度、温度などの条件にも依るが、数時間〜数十時間程度（1,2,4,6,8,12,24,48時間程度）浸漬できる。
なお、暴露工程を経た後には、被験物質を洗い流すために、シスト寒天を洗浄することが好ましい（培地洗浄工程）。
【００１６】
３．栄養体誘導工程
次いで、シスト寒天を栄養寒天培地上に載置して培養する。栄養寒天培地としては、シスト培地作成工程に使用した寒天培地の他に、栄養成分を増加させた寒天培地（好ましくは安定した合成培地）などを使用できる。適当な条件下で培養する（例えば、20℃〜40℃（好ましくは20℃〜30℃））、約15時間〜24時間程度）ことにより、栄養寒天培地の栄養組成が適切であれば、死亡していないシストは、ほぼ100％の割合で脱シストが誘導され、栄養体となる。
【００１７】
４．評価工程
栄養体誘導工程を経た後、拡大鏡（顕微鏡など）を用いて、培地上の脱シスト数（シストから栄養体アメーバとなった脱シスト跡の数）と、未脱シスト数（シスト形態のままのシスト数）とを計数する。未脱シストのものは、シストが盛り上がり、陰影が明瞭である一方、脱シストすると、内容物が脱離して、陰影が不明瞭となり、いわゆる殻の状態となる（図５を参照）。このため、未脱シストと脱シストとを見分けることは容易に行える。図５中において、丸印「○」は、脱シスト（殻の痕跡）、星印「☆」は、未脱シストをそれぞれ示している。
脱シスト数と未脱シスト数から脱シスト率を百分率として算出し［100×脱シスト数／（脱シスト数＋未脱シスト数）］、被験物質の効果を比較する。
【００１８】
次に、実施例を説明することで、本発明を更に詳細に説明する。
＜試験例１  パロモマイシン硫酸塩及び塩酸ポリヘキサニドの効果＞
上記試験方法に従い、暴露工程における被験物質として、パロモマイシン硫酸塩（PS）及び塩酸ポリヘキサニド（PH）を用い、シストに及ぼす効果について調べた。
被験物質として、PS 0.01% + PH 10ppm, PS 0.01% + PH 100ppm, PS 0.01%, PS 0.1%, PH 10ppm, PH 100ppm及び PH 1000ppm をそれぞれ用いた。各被験物質は、KCM溶液（KCl 0.7g, CaCl2 0.8g, MgSO4・7H2O 0.8gを精製水に溶解して1000mLとし、HEPES-KOHでpH7.0に調製したもの）に溶解し、試験液とした。なお、陰性対照（nothing）として、KCM溶液を用いた。
予め調製しておいたシスト寒天（約1cm×1cm）を使用し、暴露工程において、シスト寒天を各試験液中に24時間浸漬した後、栄養体誘導工程（25℃、20時間）を実施し、未脱シストと脱シストとを計数した。各データから、脱シスト率（％）を求めた。
結果を図６に示した。図より明らかなように、PSのみでは0.1%でシストの殺菌効果（脱シスト率：11%）が認められた。また、PHのみでは、10ppmから殺菌効果が認められ（脱シスト率：75%）、1000ppmでは完全に脱シストが抑制された（脱シスト率：0%）。また、PSとPHとを併用すると、相乗的な効果が認められた。
【００１９】
＜試験例２  市販のコンタクトレンズ洗浄液の効果＞
上記試験方法に従い、暴露工程における被験物質として、市販のコンタクトレンズ洗浄液を用い、シストに及ぼす効果について調べた。
被験物質として、４種類のコンタクトレンズ洗浄液（それぞれsample A〜sample Dとした）を使用し、コンタクトレンズ洗浄時の濃度として、試験液とした。なお、陰性対照（control）として、KCM溶液を用い、陽性対照として、パロモマイシン0.1%（PS 0.1%）を用いた。
予め調製しておいたシスト寒天（約1cm×1cm）を使用し、暴露工程において、シスト寒天を各試験液中に2.5時間浸漬した後、栄養体誘導工程（25℃、20時間）を実施し、未脱シストと脱シストとを計数した。各データから、脱シスト率（％）を求めた。
結果を図７に示した。図より明らかなように、sample A〜sample Cには、ほとんどシストに対する殺菌効果が認められなかった。sample Dは、完全に脱シストが抑制された（脱シスト率：0%）。これは、sample Dは、過酸化水素3.2W/V%消毒液を添加し、中和剤と共に使用するタイプのものであったためであると考えられた。
【００２０】
このように本実施形態によれば、シストから脱シストして栄養体となるアカントアメーバについて、シストに対して殺菌効果を示すか否かを検討する被験物質を定量的に評価できた。こうして、ソフトコンタクレンズ消毒剤を含む薬剤の効果を、実際的な使用条件に近い状態で、より簡単な装置構成で評価できる評価方法を提供できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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