(57)【要約】【課題】ヒト多能性幹細胞からヒトメラノサイト細胞群を効率的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、メラノサイトの分化誘導を促進する方法であって、ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で培養することを含んでおり、培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする方法が提供される。【選択図】図７
2015146803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトの分化誘導を促進する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で培養することを含んでおり、
培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
表皮誘導を刺激する成分は、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、ＧＦＤ−６、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、およびＦＧＦ−２よりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
表皮誘導を刺激する成分としてＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせを用いることを特徴とする、
方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、アスコルビン酸、およびレチノイン酸よりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分として、アスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせを使用することを特徴とする、
方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
ヒト人工多能性幹細胞は、ヒト血液Ｔ細胞から誘導されたものである、
方法。
【請求項８】
メラノサイトの欠乏に起因する疾患を治療するための細胞製剤であって、
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法で得られたメラノサイト細胞群を含む、
細胞製剤。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞製剤であって、
メラノサイトの欠乏に起因する疾患は、尋常性白斑、遺伝性対側性色素異常症および白皮症よりなる群から選択されるいずれかの疾患である、
細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトの分化誘導を促進する方法、および前記方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群を含む細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚、毛根の色を決定する最も重要な因子はメラニンと呼ばれる色素性物質である。メラニンは、皮膚では表皮基底層と毛根に存在するメラノサイトといわれる色素産生細胞により産生される。このメラニンの産生が異常に抑制されたり、メラノサイトが消失したりすると、尋常性白斑や、遺伝性対側性色素異常症、および白皮症といった遺伝性色素異常症が発症する。
【０００３】
例えば尋常性白斑症は我が国において１００〜２００万人が罹患していると推計される進行性の色素脱失症である。現在、本疾患の治療は、ステロイド療法や光化学療法により行われており、ある程度の成果が得られているが、予後不良であることが多く、難治性疾患とされている。
【０００４】
一方で近年、未分化な細胞（幹細胞）の分化を誘導することで、損傷した組織の補填を図る再生医療（細胞医療）の研究が進められている。例えば、Ｙａｍａｎａｋａらによって樹立された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（特許文献１、非特許文献１および２）を利用した再生医療は、受精卵を破壊しないため倫理的問題が少ないばかりか、患者由来の細胞から樹立することができることから、自己細胞を供給源とすることで拒絶反応の問題も回避することができる。
【０００５】
現在までに、ヒト人工多能性幹細胞からメラノサイトの分化を誘導するいくつかの方法が報告されている。これらの方法は、一般的に、ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分とケラチノサイト分化を刺激する成分とを含む培養培地で培養することを含んでいる。
【０００６】
例えば特許文献２は、表皮誘導を刺激する成分としてＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７およびＧＦＤ−６から選択される成分を用い、ケラチノサイト分化を刺激する成分としてアスコルビン酸とレチノイン酸の組み合わせを使用する方法を開示している。
【０００７】
非特許文献３は、表皮誘導を刺激する成分としてＷｎｔ３ａ、ＦＧＦ−２およびＳＣＦの組み合わせを用い、ケラチノサイト分化を刺激する成分としてＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３およびアスコルビン酸の組み合わせを使用する方法を開示している。
【０００８】
非特許文献４は、表皮誘導を刺激する成分としてＥＧＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせを使用し、ケラチノサイト分化を刺激する成分としてアスコルビン酸を使用する方法を開示している。
【０００９】
またマウス細胞における研究では、色素細胞の分化に幹細胞因子（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）および骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）−４が使用されたこと（非特許文献５）、表皮誘導後のケラチノサイトへの分化にレチノイン酸、活性型ビタミンＤ３が使用されたことが報告されている（非特許文献６および７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０６９６６６
【特許文献２】特表２０１３−５２０１６３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．
【非特許文献３】Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１１  Ｖｏｌｕｍｅ  ６  Ｉｓｓｕｅ  １：１−１０
【非特許文献４】Ｎｉｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ６，２０１１，Ｖｏｌ．１０８，ｎｏ．３６：１４８６１−１４８６６
【非特許文献５】Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２００８），Ｖｏｌｕｍｅ  １２８，Ｎｏ．３：１２２０−１２２６
【非特許文献６】Ｗａｔａｂｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１８，Ｎｏ．１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２：３５−４２
【非特許文献７】Ｗａｔａｂｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１９，Ｎｏ．３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２：５８３−５８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これまでに報告されているヒトメラノサイトの分化誘導方法は、いずれもメラノサイトの分化までに長期（例えば少なくとも４０日以上）の培養が必要であった。さらに、これらの方法で分化誘導されるヒトメラノサイトの細胞集団は、メラノサイトの分化効率は高くなく、また、ヒト正常メラノサイトとの相同性が低いという問題があった。したがって、ヒトへの臨床用途に適したメラノサイトを効率的に分化誘導する方法に関するニーズが依然として存在する。
【００１３】
本発明は、ヒト多能性幹細胞からヒトメラノサイト細胞群を効率的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、ヒト多能性幹細胞を、表皮分化を刺激する成分とケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で分化誘導培養する際に、これまで使用実績のない活性型ビタミンＤ３を培養系に添加することにより、従来の方に比較して、はるかに短期間でメラノサイト細胞群を取得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
したがって、本発明は、一実施態様において、メラノサイトの分化誘導を促進する方法であって、ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で培養することを含んでおり、培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする方法に関する。
【００１６】
本発明の一実施態様において、表皮誘導を刺激する成分は、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、ＧＦＤ−６、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、およびＦＧＦ−２よりなる群から選択される少なくとも１種であることができる。一態様において、表皮誘導を刺激する成分は、ＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせであることが好ましい。
【００１７】
本発明の一実施態様において、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、アスコルビン酸、およびレチノイン酸よりなる群から選択される少なくとも１種であることができる。一態様において、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、アスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせであることが好ましい。
【００１８】
本発明の一実施態様において、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞であることができる。好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞は、ヒト血液Ｔ細胞から誘導されたものである。
【００１９】
本発明はまた、メラノサイトの欠乏に起因する疾患を治療するための細胞製剤であって、本発明の方法により得られたメラノサイト細胞群を含む細胞製剤に関する。一実施形態において、メラノサイトの欠乏に起因する疾患は、尋常性白斑症、遺伝性対側性色素異常症および白皮症よりなる群から選択されるいずれかの疾患であることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ヒト多能性幹細胞から、メラノサイトを効率的に誘導する方法が提供される。
本発明によれば、さらに、ヒト多能性幹細胞から、臨床用途に適したメラノサイト細胞群を効率的に取得する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、メラノサイトの分化誘導に使用したヒト多能性幹細胞における、幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４（Ａ）、ＴＲＡ−１−６０（Ｂ）およびＴＲＡ−１−８１（Ｃ）についての免疫染色の結果を示す。
【図２】図２は、メラノサイトの分化誘導に使用したヒト多能性幹細胞における、幹細胞マーカーであるＤＤＰＡ４、ＥＳＧ１、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＴＥＲＴ、およびＺＩＣ３についてのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図３】図３は、メラノサイト分化誘導培養後１日目、４日目および１９日目の培養細胞を示す。
【図４】図４は、分化誘導培養後１９日目の細胞における、メラノサイトマーカーであるＳ１００についての免疫染色の結果を示す。
【図５】図５は、分化誘導培養後１９日目の細胞における、メラノサイトマーカーであるエンドセリンレセプターについての免疫染色の結果を示す。
【図６】図６は、分化誘導培養後１９日目の細胞で行ったＤＯＰＡ反応の結果を示す。
【図７】図７は、分化誘導培養後１９日目の細胞におけるチロシナーゼ活性を示す。
【図８】図８は、活性型ビタミンＤ３の非存在下（Ａ）および存在下（Ｂ）での分化培養２８日目の細胞で行ったＤＯＰＡ反応の結果を示す。
【図９】図９は、変化する濃度の活性型ビタミンＤ３の存在下で培養した際のヒトメラノブラストの増殖結果を示す。
【図１０】図１０は、変化する濃度の活性型ビタミンＤ３の存在下でヒトメラノブラストを培養した際のチロシナーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３の非存在下（Ａ）および存在下（Ｂ）で培養したヒトメラノブラストで行ったＤＯＰＡ反応の結果を示す。
【図１２】図１２は、１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３の非存在下（Ａ）および存在下（Ｂ）で培養したヒトメラノブラストにおけるＭｅｌａｎｏｓｏｍｅの形態の比較を示す。
【図１３】図１３は、変化する濃度の活性型ビタミンＤ３の存在下で培養したヒトメラノブラストにおけるＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ  Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ヒトメラノサイトの分化誘導を促進する方法（以下、単に「本発明の方法」とも称する）に関する。具体的に、本発明は、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下でメラノサイトの分化誘導培養を行う際に、培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする、ヒトメラノサイトの分化誘導を促進する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群の臨床応用に関する。
【００２３】
１．多能性幹細胞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、胎盤を除くすべての細胞に分化する能力を有する分化多能性を有し、かつ、増殖能をも有する幹細胞である。そのような幹細胞の具体例には、以下のものに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ；核移植ＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが含まれる。
【００２４】
ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ＧＳ細胞、ＥＧ細胞およびｉＰＳ細胞は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により樹立された細胞を使用することができ、特に制限されない。
【００２５】
ＥＳ細胞は、マウスやヒトおよびサルなどの霊長類由来の細胞で樹立されたことが報告されており（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９；  Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓ．  Ｍａｒｓｈａｌｌ  （１９９８），Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ３８：１３３−１６５）、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５などに記載される方法に従って樹立および維持されたＥＳ細胞を本発明に使用することができる。
【００２６】
ＧＳ胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能である。ＧＳ細胞は、例えば竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁に記載される方法に従って樹立および維持することができる。
【００２７】
ＥＧ細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立することができる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
【００２８】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の再プログラミング因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、分化多能性と自己複製による増殖能とを有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６）。再プログラミング因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子またはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えばＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４；ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣ；ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣ；ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧ；ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＬＩＮ２８；ＯＣＴ３／４およびＫＬＦ４などの組み合わせを含む。
【００２９】
これらの因子は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソームを利用する手法、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。本発明の一実施態様において、再プログラミング因子の導入に使用されるウイルスベクターはセンダイウイルスである。センダイウイルスはＲＮＡをゲノムするが、レトロウイルスとは異なり、ＲＮＡのまま細胞質に留まり、そこで複製、転写および翻訳が行われる。したがって、センダイウイルスの使用は、ウイルス由来遺伝子のゲノムへの挿入がなく、癌化のリスクを低く抑えることができるという利点を有している。
【００３０】
ベクターには、再プログラミング因子が発現可能なように、プロモーター、エンハンサーなどの制御配列を含むことができる。また、必要に応じて、再プログラミング因子が導入された細胞を選別するための、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
【００３１】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地、ＰＳＧ、ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはＳＣＦを含有するＥＳ細胞培養用培地、例えばマウスＥＳ細胞培養用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒトおよびサル）ＥＳ細胞用培地、リプロセル、京都、日本）などが含まれ、これらを適宜混合して使用することができる。また、これらの培養培地は、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜補充して使用することができる。
【００３２】
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地上で細胞と再プログラミング因子（ＤＮＡまたはタンパク質）を接触させて約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上に蒔き直し、細胞と再プログラミング因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０〜約４５日またはそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００３３】
あるいは、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００３４】
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、再プログラミング化に使用する細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
【００３５】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子などの遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、マーカー遺伝子を発現する細胞を検出することができる。マーカー遺伝子が発光酵素遺伝子である場合は、発光基質を加えることによってマーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
【００３６】
本発明において、多能性幹細胞は、ヒト体細胞から誘導されたヒト多能性幹細胞であり、好ましくは、ヒト血液Ｔ細胞から誘導されたヒト多能性幹細胞である。また本発明の一実施態様において、多能性幹細胞は、分化誘導されたメラノサイトによって治療されるべき対象から取得された細胞から誘導されたものである。
【００３７】
２．活性型ビタミンＤ３
本発明の方法は、ヒト多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導系に、活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする。活性型ビタミンＤ３は、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールとも称するホルモン活性を有する脂溶性ビタミンである。本発明の方法において、活性型ビタミンＤ３は、主に、ケラチノサイトへの最終分化を促進すると考えられ、これによりヒト多能性幹細胞からメラノサイトへの分化期間を大幅に短縮することができる。具体的に、本発明の方法によれば、ヒト多能性幹細胞からの分化誘導開始後、例えば、４０日未満、好ましくは３５日未満、より好ましくは３０日未満、より好ましくは２５日未満、そして最も好ましくは２０日未満で、メラノサイトへの分化を実現することができる。
【００３８】
本発明の方法において、使用される活性型ビタミンＤ３の濃度は、併用する他の成分の数および種類に応じて変化する場合があるが、１０−７Ｍ〜１０−５Ｍの範囲とすることができる。本発明の一実施態様において、活性型ビタミンＤ３の使用濃度は１０−６Ｍである。なお、活性型ビタミンＤ３は、分化誘導開始後に培養系に添加してもよいし、培養系に予め含有されていてもよい。活性型ビタミンＤ３を分化誘導開始後に培養系に添加する場合、メラノサイトへの分化期間短縮の観点から、分化誘導開始後数日以内、例えば５日以内、あるいは１０日以内に添加することが好ましい。
【００３９】
３．メラノサイトへの分化を誘導する成分
本発明の方法において、メラノサイトへの分化誘導には、表皮誘導を刺激する成分、およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分が使用される。
【００４０】
本発明の方法に使用される表皮誘導を刺激する成分は、特に制限されず、当業者に公知の成分のいずれかを用いることができる。そのような成分として、これに限定されるものではないが、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、受容体制御型Ｓｍａｄタンパク質（例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７）、ＴＧＦ−βファミリーのリガンド（例えば成長および分化因子６；ＧＦＤ−６）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｗｎｔ３ａ、繊維芽細胞増殖因子（例えばＦＧＦ−２）などを挙げることができる。前記成分は表皮誘導を刺激する成分として単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
本発明の一実施態様においては、表皮誘導を刺激する成分として、ＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせが使用される。なお、天然ＢＭＰ−４アミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ７２２７８下で提供される。
【００４２】
表皮誘導を刺激する成分の使用濃度は、選択した成分の種類、組み合わせ等に応じて変化する場合があり、当業者は適宜適切な濃度を選択することができる。例えば、表皮誘導を刺激する成分としてＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせが使用される場合には、使用されるＳＣＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間で変化し、本発明の一実施態様において、ＳＣＦの使用濃度は２０ｎｇ／ｍｌである。またこの場合に使用されるＢＭＰ−４の使用濃度は、１０ｎＭ〜５０ｎＭの間で変化し、本発明の一実施態様において、ＢＭＰ−４の使用濃度は２０ｎＭである。
【００４３】
本発明の方法に使用されるケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、特に制限されず、当業者に公知の成分のいずれかを用いることができる。そのような成分として、これに限定されるものではないが、例えばＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、アスコルビン酸、レチノイン酸などを挙げることができる。前記成分はケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分として単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【００４４】
本発明の一実施態様においては、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分として、アスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせが使用される。なお、本発明において、レチノイン酸には、二重結合がすべてトランス型であるＡｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（トレチノイン）も包含される。
【００４５】
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の使用濃度は、選択した成分の種類、組み合わせ等に応じて変化する場合があり、当業者は適宜適切な濃度を選択することができる。例えば、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分としてアスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせが使用される場合には、使用されるアスコルビン酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの間で変化し、本発明の一実施態様において、アスコルビン酸の使用濃度は０．３ｍＭである。またこの場合に使用されるレチノイン酸の使用濃度は、１０−７Ｍ〜１０−５Ｍの範囲で変化し、本発明の一実施態様において、レチノイン酸の使用濃度は１０−６Ｍである。
【００４６】
４．ヒト多能性幹細胞の維持
一般的に、幹細胞の培養（前培養）において、未分化状態を保つためにフィーダー細胞が使用される。本発明の方法において、フィーダー細胞は必ずしも必要ないが、フィーダー細胞を存在させることも可能である。
【００４７】
フィーダー細胞としては、例えば胎仔線維芽細胞、ストローマ細胞などが挙げられる。胎仔線維芽細胞には、例えばＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）、ＳＴＯ細胞（マウス胎仔線維芽細胞株）、ＳＮＬ細胞（ＳＴＯ細胞のサブクローン；例えばＳＮＬ  ７６／７細胞）などが含まれる。また、ストローマ細胞には、例えばＰＡ６細胞（マウスストローマ細胞株（理研ＢＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（日本）））、ＭＳ−５細胞（Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１７：１４５−５３（１９８９））、ＯＰ９細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６５：１０９８−１１０１（１９９４））などが挙げられる。
【００４８】
５．メラノサイトの分化誘導培養
分化誘導培地は、基礎培地に表皮誘導を刺激する成分とケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分とを補充することにより調製することができる。活性型ビタミンＤ３は、このようにして調製される分化誘導培地に予め含有させてもよいし、分化誘導開始後に添加してもよい。基礎培地としては、ヒト表皮細胞培養用の任意の培地、例えばＭｅｄｉｕｍ  ２５４（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。
【００４９】
培地はまた、必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ノックアウト血清リプレースメント、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメントなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、ならびに、脂質、アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。
【００５０】
分化誘導培地の例は、後述の実施例に記載されるような、表皮分化を刺激する成分としてのＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせと、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分としてのアスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせとが補充されたＭｅｄｉｕｍ  ２５４に対して、さらに活性型ビタミンＤ３が補充されたものである。
【００５１】
本発明の方法において、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導に際して、これらの細胞を、例えばＣｈａｍｂｅｒｓ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：４８５，２００９に記載の方法を用いて培養する。
【００５２】
本発明の一実施態様において、ヒト多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導は、上記分化培地を用いて、フィーダー細胞の存在下で培養することによって行うことができる。フィーダー細胞は、例えば上に例示されるようなＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）、ＳＴＯ細胞（マウス胎仔線維芽細胞株）、ＰＡ６細胞（マウスストローマ細胞株（理研ＢＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（日本）））、ＳＮＬ細胞（ＳＴＯ細胞のサブクローン；例えばＳＮＬ  ７６／７細胞など）などを使用することができる。本発明の一実施態様において、フィーダー細胞はマウス胎児繊維芽細胞である。またフィーダー細胞を使用する場合、一般に、細胞増殖を停止させるためにマイトマイシンＣ処理が行われる。
【００５３】
培養開始時のヒト多能性幹細胞の培地中の密度は特に制限されないが、例えば約５０〜２００細胞／ｍｌとすることができる。
【００５４】
培養の具体例は、非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養（例えば、分散培養、凝集浮遊培養など）、または接着条件下での二次元培養、例えば平板培養、あるいは、三次元培養後に二次元培養を行うという連続的な組み合わせ培養、などを包含する。通常、フィーダー細胞の存在下で分化誘導する場合には、二次元培養を使用することができ、フィーダー細胞の非存在下で分化誘導する場合には、三次元培養を使用することができる。
【００５５】
細胞接着性の培養器では、細胞との接着性を向上させる目的で、その表面を、細胞支持物質、例えばコラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）などの物質でコーティングすることができる。
【００５６】
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養期間は、分化誘導開始から４０日未満とすべきである。本発明の一実施態様において、培養期間は、３５日未満であり、より好ましくは３０日未満であり、より好ましくは２５日未満であり、そして最も好ましくは２０日未満である。
【００５７】
６．メラノサイト細胞群
本発明はまた、上記方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群を提供する。本発明の方法によって取得できるメラノサイト細胞群は、従来の分化誘導方法に比較して極めて短期間で調製することができる。また、本発明の方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群は、メラノサイトの成熟度、すなわち低い未分化細胞残存率、ヒトメラノサイトとの高い相同性等の点で優れたものであり得る。
【００５８】
メラノサイトの成熟度は、例えば遺伝子発現プロファイルの取得によるヒトメラノサイトとの相同性評価、およびＦＡＣＳまたはＲＴ−ＰＣＲを使用した、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連タンパク（Ｔｒｐ−１、Ｔｒｐ−２／ＤＯＰＡクロムトウトメラーゼ；Ｄｃｔ）、チロシンキナーゼ（Ｋｉｔ）、チロシナーゼ、エンドセリンＢレセプター、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）などの色素細胞マーカーの発現レベルを確認することによって評価することができる。
【００５９】
７．医療への応用
本発明のメラノサイト細胞群は、メラノサイトが欠乏した表皮組織の正常化のために有効に使用し得る。したがって、この細胞群は、メラノサイト欠乏に起因する任意の疾患の治療用細胞になり得る。
【００６０】
そのような疾患の例としては、尋常性白斑、遺伝性対側性色素異常症や白皮症などの遺伝性色素異常症が挙げられる。
【００６１】
メラノサイト細胞群を治療のために用いる場合、メラノサイト細胞を単離するかまたはその純度を高めることが望ましい。このために、例えばフローサイトメトリー法などが挙げられる。フローサイトメトリー法は、非常に細い流液中に細胞粒子を高速度で流し、レーザー光を照射して、粒子が発生する蛍光（細胞が予め蛍光標識された場合）、散乱光などの光を測定するものであり、セルソーターを備えると、目的の細胞を選別・分離することができる。細胞の蛍光標識は、神経前駆細胞に特異的な抗体（蛍光標識化）、例えば抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体、によって行うことができる。また、抗癌剤含有培地での処理によって、未分化細胞を除去することができる。抗癌剤の例は、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、メトトレキセートなどである。
【００６２】
上記のようにして単離または純度が高められたメラノサイト細胞群は、皮膚疾患部位へ直接移植してもよいし、皮膚疾患治療のための細胞製剤として製剤化してもよい。
【００６３】
本発明の細胞製剤は、細胞の維持および増殖を補助する成分や他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。
【００６４】
細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
【００６５】
本発明の細胞製剤に使用することができる医薬的に許容しうる担体として、これに限定されるものではないが、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等が挙げられる。
【００６６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
１．ヒトｉＰＳ細胞
メラノサイトの分化誘導培養に使用した細胞は、東京慈恵会医科大学から提供されたものを使用した。この細胞は、４種類の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣが導入されたセンダイウイルスを血液内Ｔリンパ球に遺伝子導入（リプログラミング）に用いることによって樹立されたものである。
上記細胞について、下記のとおり免疫染色およびＲＴ−ＰＣＲを用いて、幹細胞（未分化）マーカーの発現を確認した。
【００６８】
免疫染色
免疫染色法で、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１細胞表面抗原の発現を検証した。
【００６９】
ＣＳＴジャパン株式会社の「免疫蛍光染色プロトコール（メタノール透過処理）」に従って、ｉＰＳ細胞の免疫染色を行った。一次抗体は、ＳｔｅｍＬｉｔｅ（商標）Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃：９６５６）に含まれるもの（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を用いた。また二次抗体としてＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｈｏｓｔ；Ｇｏａｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｔ＃：Ａ１１００１）を用いた。
【００７０】
その結果、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１細胞表面抗原の発現を示す蛍光が確認された（図１）。
【００７１】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを用いて幹細胞マーカーＤＤＰＡ４、ＥＳＧ１、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＴＥＲＴ、およびＺＩＣ３の発現を確認した。
【００７２】
全ＲＮＡ抽出は、ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製品プロトコールに従って行った。抽出後、ＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行い、ＰＣＲ反応は、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動により分析した（図２）。
【００７３】
図２から明らかなとおり、本細胞抽出物において、幹細胞マーカーＤＤＰＡ４、ＥＳＧ１、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＴＥＲＴ、およびＺＩＣ３についての発現を確認することができた。
【００７４】
以上の結果に基づき、この細胞をメラノサイトの分化誘導に使用するヒトｉＰＳ細胞として以下の培養実験に用いた。
【００７５】
２．ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ  Ｄ６４２１）、１０％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（１００Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．２５％ＰＳＧ（１００Ｘ）、２５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ５５ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を含むｉＰＳ細胞培養用培地を用い、マウス胎児繊維芽細胞上で維持した。すなわち、マイトマイシンＣ処理済みマウス胎児線維芽細胞上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、ｉＰＳ細胞培養用培地中、３７℃、５％ＣＯ２，２０％Ｏ２の雰囲気下で維持した。原則として毎日培地交換を行い、コロニーが十分に大きくなった際には継代を行った。
【００７６】
３．分化誘導培養
ｉＰＳ細胞のマトリゲル上への継代
メラノサイトへの分化誘導を実施するにあたり、無フィーダー培養とするため、マトリゲル上にｉＰＳ細胞を継代した。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（基底膜マトリックス）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＭＥＭ−Ｆ１２で３０倍に希釈し、これを２ｍＬずつ６０ｍｍ  ｄｉｓｈ加え、３７℃で１時間コーティングした。継代可能となったｉＰＳ細胞コロニーの育っているｄｉｓｈを、ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したｉＰＳ細胞培養用培地で１時間以上Ｐｒｅ―ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎし、通常の継代と同様にｉＰＳ細胞のコロニーを剥がした。剥がしたコロニーを１５ｍＬ遠心ｔｕｂｅに回収し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離した。上清を除き、ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したｉＰＳ細胞培養用培地に懸濁した。これを予めゼラチンコートした６０ｍｍ  ｄｉｓｈに播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で２時間培養した。この間に、フィーダー細胞のＭＥＦは接着するが、ｉＰＳ細胞のコロニーは接着しなかった。２時間後、上清ごとｉＰＳ細のコロニーを１５ｍＬ遠心ｔｕｂｅに回収し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離した。遠心分離後、予め調製したＭＥＦ―Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍにコロニーを懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングした６０ｍｍ  ｄｉｓｈに播種した。播種後の６０ｍｍ  ｄｉｓｈあたりのコロニー数は２０前後であった。その後、３７℃、５％ＣＯ2で１晩培養した。
【００７７】
ｉＰＳ細胞の分化誘導培養
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（基底膜マトリックス）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上への継代翌日、コロニーが接着しているのを確認してから、上記組成の培地に培地交換を行った。次いで、ヒトｉＰＳ細胞（５０〜２００細胞／ｍＬ）をＭＥＦ−Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍに懸濁下で播種し、Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ２５４（ＧＩＢＣＯ）、Ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２（ＧＩＢＣＯ）、２０ｎＭ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＢＭＰ４（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、０．３ｍＭ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ，Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０−７Ｍ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  （Ｓｉｇｍａ）を含む分化誘導培地に、１０−７Ｍ  活性型ビタミンＤ３（１，２５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）（Ｅｎｚｏ）をさらに加え、培地交換を行った。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、接着での培養によるものであった。
培養後１日目、４日目および１９日目の培養細胞の写真図を図３に示す。
【００７８】
３．分化誘導細胞の検証
分化誘導後の細胞について、免疫染色法によりメラノサイトマーカーであるＳ１００、およびエンドセリンレセプター（ＥＤＮＢ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現を評価した。また、細胞によるメラニン産生を、ＤＯＰＡ反応およびチロシナーゼ活性を測定することによって確認した。
【００７９】
免疫染色法
分化誘導開始後、１９日が経過した細胞をコラーゲンコート済み８ｗｅｌｌチャンバースライド(ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎカルチャースライド、Ｃａｔ. Ｎｏ. ３５４６３０)上に１．８ｘ１０×４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。
９５％アルコールで細胞を固定し、一次抗体として抗Ｓ‐１００抗体(ＤＡＫＯ)および抗エンドセリンＢ受容体抗体（ａｂｃａｍ，１３５６１１）を用いて免疫染色を行った。二次抗体としてＨＲＰ標識抗体（Ｇｏａｔ  ｐＡｂ  ｔｏ  Ｒｂ  ＩｇＧ（ＨＰＲ），ａｂｃａｍ９７０５１）を用い、ＤＡＢ（３，３’‐ＤｉａｍｉｎｏＢｅｎｚｉｄｉｎｅ）にて発色させた。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した。ネガティブコントロールとして一次抗体を添加せず染色を行い、評価に用いた。画像撮影はＢＩＯＲＥＶＯ (ＫＥＹＥＮＣＥ)にて撮影した（図４および５）。
【００８０】
図４および図５から分かるとおり、メラノサイトマーカーであるＳ１００タンパク質、エンドリンレセプターの存在を示す染色が観察された。
【００８１】
ＤＯＰＡ反応
分化誘導開始後、１９日が経過した細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈ上で２％パラホルムアルデヒドｉｎ  ＰＢＳ（−）で室温、１５分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．１Ｍ  リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中の０．１％ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃にて５時間反応させた。反応液は反応開始より２．５時間の時点で１度交換した。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した。画像撮影はＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影した（図６）。図６から分かるとおり、チロシナーゼとＤＯＰＡの反応に由来する染色を観察することができた。
【００８２】
チロシナーゼ活性の測定
分化誘導開始後、２５日が経過した細胞を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎを組成とする抽出Ｂｕｆｆｅｒで回収し、チロシナーゼ活性の測定を行った。活性測定にはコロニーが１５〜２０個程度育った６０ｍｍ  ｄｉｓｈを1枚用いた。抽出Ｂｕｆｆｅｒ  １５０μＬを６０ｍｍ  ｄｉｓｈに加え、４℃にて３時間可溶化した。３時間経過後、１．５ｍＬ  ｔｕｂｅに細胞溶解液を回収し、タッチミキサーでよく混和した。この細胞溶解液２０μＬをとり、チロシナーゼ活性測定に用いた。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに細胞溶解液２０μＬ、４％Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１００ｍＭ  リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．１）からなるＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ溶液（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ  ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）６０μＬ、５ｍＭ  Ｌ―ＤＯＰＡ溶液（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）４０μＬをそれぞれ加え、３７℃にて３０分間反応させた。呈色反応後、４９２ｎｍでの吸光度をｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで測定し、チロシナーゼ活性を評価した（図７）。陰性コントロールとして細胞溶解液の代わりに抽出Ｂｕｆｆｅｒを加えた系を用いた。
図７から明らかなとおり、分化誘導開始後２５日目の細胞において、チロシナーゼ活性の存在が有意に認められた。
【００８３】
このように、上に示した分化誘導培養によれば、分化誘導開始後１９日目には、メラノサイトの分化マーカーの発現が確認され、分化誘導開始後２５日目には、メラニン生成能が確認された。従来の方法がメラノサイトの分化誘導に少なくとも４０日以上要していたことに鑑みれば、この結果は驚くべきことである。
【００８４】
４．活性型ビタミンＤ３のメラノサイト分化誘導に及ぼす影響
活性型ビタミンＤ３のメラノサイトの分化誘導に及ぼす影響をさらに評価するために、以下の試験を実施した。
【００８５】
ＤＯＰＡ反応
活性型ビタミンＤ３の有無による分化誘導効率を比較するために、上記３．の分化誘導培養において、活性型ビタミンＤ３（１０−７Ｍ）の有無の点でのみ異なる２つの培養条件で分化誘導した細胞におけるＤＯＰＡ反応を比較した。すなわち、分化誘導開始後、２８日が経過した細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈ上で２％パラホルムアルデヒドｉｎ  ＰＢＳ（−）で室温、１５分間固定し、固定後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．１Ｍ  リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中の０．１％ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃にて５時間反応させた。反応液は反応開始より２．５時間の時点で１度交換した。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した（図８）。
図８の結果が示す通り、活性型ビタミンＤ３を添加して分化誘導を行った場合の方が、ＤＯＰＡ反応陽性の細胞の割合が多いことが確認された。
【００８６】
活性型ビタミンＤ３の濃度検討
メラノサイト分化培養における活性型ビタミンＤ３の適切な濃度を検証するために、活性型ビタミンＤ３の存在下でのメラノサイト前駆体であるヒトメラノブラストを用いた培養試験を行った。
【００８７】
（試験１）
９６ウェルプレートに２０００個のヒトメラノブラスト（放射線医学総合研究所、広部知久博士から提供された）を播種し、ヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦ（Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、１０μｇ／ｍＬ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ  Ｎ６，２−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）中で培養し、翌日に活性型ビタミンＤ３を１０−10Ｍ〜１０−7Ｍの各濃度で培養し、５日後にＡｌａｍａｒｂｌｕｅｄｙｅ（Ｔｒｅｋ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎc）で４時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を計測した。
図９に示す結果から、ヒトメラノブラストは、活性型ビタミンＤ３の存在に起因して、増殖が阻害される一方で培養細胞が適切に維持されることが確認された。細胞の分化と増殖とが同時には起こらないことに鑑みれば、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、少なくとも上記の濃度範囲において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを示している。
【００８８】
（試験２）
９６ウェルプレートに５０００個のヒトメラノブラスト（放射線医学総合研究所、広部知久博士から提供された）を播種し、ヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦ（Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、１０μｇ／ｍＬ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ  Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）中、活性型ビタミンＤ３を１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍの各濃度で７２時間培養し、チロシナーゼ活性の測定をした。
すなわち、細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄後、抽出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）／１％  ＮＰ−４０／０．０１％  ＳＤＳ／１００μＭ  ＰＭＳＦ／１μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を２０μＬ／ｗｅｌｌ加え、冷蔵庫で３時間可溶化する。細胞を可溶化後、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ／１００ｍＭ  リン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｌｉｎｏｎｅ  ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）を６０μＬ／ｗｅｌｌ、５ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡを４０μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃にて３０−６０ｍｉｎ反応させる。４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。
図１０に示す結果から、ヒトメラノブラストのチロシナーゼ活性は、活性型ビタミンＤ３の濃度に依存して増加することが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
【００８９】
（試験３）
ヒトメラノブラストを６０ｍｍ  ｄｉｓｈに播種し、１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３を添加して５日間培養し、ＤＯＰＡ反応を１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３を添加しなかった場合と比較した。なお、本培養には、以下の組成を有するヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦを用いた：Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、１０μｇ／ｍＬ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ  Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）
細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈ上で、ＰＢＳ（−）中の２％パラホルムアルデヒドで室温下、１５分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．１Ｍ  リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中の０．１％ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃にて５時間反応させた。反応液は途中で２度交換した。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した。画像撮影はＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影した（図１１）。
図１１から、活性型ビタミンＤ３を加えて培養を行ったヒトメラノブラストにおいて、ＤＯＰＡ反応に陽性の割合がより多いことが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、１０−５Ｍの濃度において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
【００９０】
（試験４）
ヒトメラノブラストを１００ｍｍ  ｄｉｓｈに播種し、１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３を添加して５日間培養し、電子顕微鏡を用いて、Ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅの形態を、活性型ビタミンＤ３を添加しなかった場合と比較した（図１２）。なお、本培養には、以下の組成を有するヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦを用いた：Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、１０μｇ／ｍＬ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ  Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）
図１２から、活性型ビタミンＤ３を加えて培養したヒトメラノブラストの方が、Ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅの発達段階が進んでいることが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、１０−５Ｍの濃度において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
【００９１】
（試験５）
ヒトメラノブラストを６０ｍｍ  ｄｉｓｈに播種し、ヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦ（Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、１０μｇ／ｍＬ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ  Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ  Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ  ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）中、活性型ビタミンＤ３を１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍの各濃度で添加して５日間培養し、抗Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ  Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体（Ａｂｄａｍ）を用いてウェスタンブロットを行った（図１３）。
図１３から、ヒトメラノブラストのＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ  Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現は、ビタミンＤ３の濃度依存的に増加することが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍの濃度範囲において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
【００９２】
以上の通り、メラノサイトの分化誘導方法において、これまでに使用実績のなかった活性型ビタミンＤ３を培養系に含有させることで、従来のメラノサイトの分化誘導方法と比較して、はるかに短期間または効率的にメラノサイトを分化誘導できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の方法によれば、従来のヒトメラノサイト分化誘導方法と比較して、極めて短期間で、多能性幹細胞からヒトメラノサイトの分化を誘導することができる。
【００９４】
こうして分化誘導されたヒトメラノサイト細胞群は、高いメラノサイト成熟度を有し得るため、尋常性色素斑、遺伝性対側性色素症、白皮症など、メラノサイトの欠乏に起因する疾患を含む様々な疾患への利用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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