(57)【要約】【課題】、両親媒性色素を大量に安定に保持することができるリポソーム粒子の作製。【解決手段】ｐＨによって親疎水性が変化する両親媒性シアニン系色素をリン脂質の構成成分、特に好ましくはホスホコリンとの複合体を形成し、ｐＨ勾配法によってリポソームに内包させる。【選択図】図１
2015081230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素含有粒子の製造方法であって、
両親媒性色素とリン脂質とを有する色素複合体を形成させる工程と、
前記色素複合体と粒子とを混合し、前記粒子内と前記粒子外とのｐＨの差を設けるにより、前記両親媒性色素を前記粒子に内包させる工程と、を有することを特徴とする、色素含有粒子の製造方法。
【請求項２】
前記粒子がリポソームであることを特徴とする請求項１に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項３】
前記リン脂質はツィッターイオン部位を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項４】
前記両親媒性色素と前記リン脂質とのモル比率が、両親媒性色素：リン脂質＝１：２乃至２：１となるように前記色素複合体を形成する工程を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項５】
前記色素含有粒子の流体力学的平均粒子径は光散乱法で測定して１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項６】
前記両親媒性色素がＩＣＧであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項７】
前記リン脂質がホスホコリンあるいはホスホコリンを部分構造として含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項８】
前記色素含有粒子の表面にＰＥＧ鎖を付加する工程を有することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項９】
前記リン脂質がリン酸ジエステル結合を有することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法。
【請求項１０】
光イメージングに用いられることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法で作製した色素含有粒子。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１項に記載の色素含有粒子の製造方法で作製した色素含有粒子と、前記色素含有粒子を分散する分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素複合体を利用したｐＨ勾配法、および色素内包リポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非侵襲的に診断ができるイメージング方法として、蛍光イメージング法や光音響イメージング法が注目されている。
【０００３】
蛍光イメージング法は蛍光色素に光を照射し、色素が発する蛍光を検出する方法で、各種イメージングに広く用いられている。光音響イメージング法は、光を照射された測定対象の分子が放出する熱が起こす体積膨張により生じる音響波の強度と音響波の発生位置を検出することで、測定対象の画像を得る方法である。蛍光イメージング法や光音響イメージング法において、測定対象部位からの蛍光の大きさや音響波の強度を大きくするための造影剤として色素を用いることができる。
【０００４】
このような造影剤においては、信号強度（蛍光や音響波の強度）を有効に増幅するために、光を吸収することで蛍光または音響波を発する色素を粒子、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等（以下、単に粒子という場合は、特に言及される場合を除き、これらの総称を意味する）に集積することにより、色素密度を上げて、照射エネルギーの吸収効率を上げることが望まれる。
【０００５】
光を吸収することで蛍光または音響波を発することが知られている色素として、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下、ＩＣＧと略すことがある）を挙げられる。なお、本明細書において、ＩＣＧとはシアニン骨格を有し、下記に示される構造を有する化合物を指す。
【化１】
2015081230.tif 000003
ただし、対イオンはＮａ＋でなくともよく、Ｈ＋あるいはＫ＋でもよい。またヨウ化ナトリウムＮａＩを添加してもよい。
【０００６】
一般的に色素は分子量が低く、造影剤として用いるには、血中滞留性が低いという課題があった。ＩＣＧのような両親媒性色素は肝代謝され易く、水溶性の色素は腎排泄され易い場合が多い。
【０００７】
そこで、血中滞留性を高め、腫瘍滞留性を向上させる目的で、よりサイズの大きい腫瘍造影剤が望まれていた。ＩＣＧを含み、よりサイズの大きな粒子として、非特許文献１には、ポリビニルアルコール（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：ＰＶＡ）を界面活性剤にしてエマルジョン溶媒拡散法によって得たＩＣＧ含有乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ：以下ＰＬＧＡと略すことがある）粒子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２２００４５号公報
【特許文献２】特許第２８８２６０７号公報
【特許文献３】特表２００６−５０９７６９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】”Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈｏｔｏ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  ｔｈｅｒｍａｌ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４，ＰＰ．２９−３８，２００４
【非特許文献２】”Ｊ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ２２０，ＰＰ．３８５−３９２，１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１および非特許文献１に開示されたＩＣＧを含有する粒子には、リポソーム内に充填できる色素量に限界があり、造影剤粒子のＩＣＧ含有率が低く、必要な造影感度を得るためには、ＩＣＧ含有粒子を大量に投与することになり、患者に過度の負担を与えるという問題があった。
【００１１】
水和分散法においては有機溶媒に溶解し溶媒除去したリン脂質フィルムをＩＣＧ水溶液と共に超音波撹拌することによりＩＣＧ水溶液を内包するリポソームを形成できるが、かかる方法で作製された、例えば粒径７０ｎｍ前後のリポソームでは、その体積、乾燥重量より求めた内水相体積は０．５ｖｏｌ％前後しかない。したがって、飽和濃度に近いＩＣＧ水溶液を使って水和分散し限外ろ過や遠心などで濃縮したとしても造影剤全体のＩＣＧモル吸光係数εは１０＾８オーダーでああった。
【００１２】
上記の他に、バンガム法と呼ばれるリポソーム作製方法がある。この方法では、リン脂質クロロホルム溶液にＩＣＧメタノール溶液を混和溶解した後、溶媒除去したＩＣＧを含むリン脂質フィルムをバッファ水溶液と共に超音波撹拌することによりＩＣＧをリン脂質内に含むリポソームを形成できる。しかし、バンガム法で製作された、粒径７０ｎｍ前後のリポソームでも、その体積、乾燥重量より求めたリポソーム脂質膜の体積は１ｖｏｌ％前後しかなく、造影剤全体のＩＣＧモル吸光係数εは１０＾８オーダーである。よってＩＣＧ含有率が優れたＩＣＧ含有粒子が求められていた。
そこで本発明は、両親媒性色素を大量に安定に保持することができるリポソーム粒子の作製を課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、両親媒性色素、例えばＩＣＧを外水相から内水相へと輸送して、内水相ＩＣＧ濃度を高めるトランスメンブレン法の一種であるｐＨ勾配法に基づいて、色素含有粒子を作製した。
【００１４】
ｐＨ勾配法はドキソルビシンをリポソーム内に高効率で内包する技術として知られる（特許文献２）。ｐＨ勾配法で作製されたドキソルビシン内包リポソームとして、ドキシル（商標）が知られる。ｐＨ勾配法によるドキシルの作製では、ドキソルビシンがｐＨ４．０で水溶性のイオン型となり、ｐＨ７．５で脂溶性の分子型となることを利用している。すなわち、あらかじめｐＨ４．０の内水相をもつリポソームを調製し、後に外水相をｐＨ７．５に置換することによりリポソーム内外にｐＨ勾配を形成させる。ドキソルビシンを添加すると、ｐＨ７．５環境下であるため、ドキソルビシンは脂溶性となりリポソームのリン脂質２重膜を透過し始める。リポソーム内部はｐＨ４．０であるから、透過した分子型ドキソルビシンはイオン型に戻り、内水相に閉じ込められる。すなわち、リポソーム内外でのｐＨ勾配がドライビングフォースとなり、リポソームの外側に存在したドキソルビシンがリポソーム内に濃縮される。ドキシルにおいてリン脂質として水素添加大豆ホスファチジルコリン（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  Ｓｏｙ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：ＨＳＰＣと略す）が用いられている。
【００１５】
一方、ＩＣＧはＪ会合体、Ｈ会合体などの会合体を形成することが知られる。会合体はそれ自体が造影の妨害とはなるわけではないが、会合することによってＩＣＧ単量体に由来する７８０ｎｍの吸収が減ずるため、造影剤中の会合体の形成は抑制することが好ましい。
【００１６】
ＩＣＧの水溶液は６０℃以上に加熱すると、Ｊ会合体の形成がはじまり、Ｊ会合体の形成が始まると、核ができ、更なるＪ会合体の形成を促進することが知られる（非特許文献２では６５℃を基準に２０℃、４５℃、８０℃、９０℃に加熱した例を示す）。ｐＨ勾配法を含む従来のリポソーム作製法においては、高濃度ＩＣＧ水溶液（非特許文献２によれば１．５ｍＭ以上）をリン脂質の相転移温度である６０℃以上に加熱した状態で作製するため、Ｊ会合体が形成される。
【００１７】
シアニン色素ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ（１，１０−ｄｉｅｔｈｙｌ−２，２０−ｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ；ＩＵＰＡＣ：１−ｅｔｈｙｌ−２−［（１−ｅｔｈｙｌ−２（１Ｈ）−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ  以下、ＰＩＣ）は、ツィッターイオン（Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎ）部位を有するリン脂質２重膜の表面に色素がカチオン−π電子結合様式で結合し、さらにリン脂質の配向性をテンプレートとして色素が会合状態を取るため、特にリン脂質共存下においてＪ会合体を形成しやすいと考えられている。
【００１８】
上記の結合様式は、両親媒性色素であるＩＣＧでも同様と推察され、従来のｐＨ勾配法によって、ＩＣＧをリポソームに導入しようとすれば、リポソームに内包されることなく、リン脂質２重膜の表面に吸着すると考えられる。
【００１９】
本発明に係る粒子は、両親媒性色素（例えばＩＣＧ）とホスホコリンあるいはホスホコリンを部分構造として有するリン脂質とから成る色素複合体を形成することで、会合体の形成を抑制し、両親媒性色素をリン脂質２重膜表面に吸着することなく、より効率的に両親媒性色素を内包する。
【００２０】
なお、本明細書中において、ホスホコリンをＰＣ、ＩＣＧとホスホコリンとの複合体をＩＣＧ−ＰＣなどと省略表記する場合がある。ＩＣＧとＰＣを混合した際のモル比に応じて、ＩＣＧ−１ＰＣ（モル比が１：１），ＩＣＧ−２ＰＣ（モル比が１：２）などと表記する場合もある。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の粒子は、ｐＨ勾配法によって両親媒性色素を効率的に内包する。また、両親媒性色素を色素複合体とすることで、色素が粒子表面に吸着したり、会合状態を形成することを防ぎ、２重膜を通過してリポソームに大量に内包させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（ａ）本発明の一実施形態における粒子の例である。（ｂ）本発明の一実施形態における別の粒子の例である。
【図２】ＩＣＧ水溶液ならびにＩＣＧ会合体の吸収スペクトルである。
【図３】（ａ）シアニン色素の会合状態における励起子相互作用を示す模式図である。（ｂ）シアニン色素にリン脂質部分構造が結合した複合体が立体障害によって励起子相互作用が抑制されることを示す模式図である。
【図４】（ａ）実施例１においてＩＣＧ７．５μＭと各種化合物１５．０μＭから成る複合体あるいは混合物を測定光路長１０ｍｍで吸光度測定したスペクトルを示す図である。（ｂ）実施例１においてＩＣＧ７７．５μＭ各種化合物１５５μＭから成る色素複合体あるいは混合物を測定光路長１ｍｍで吸光度測定したスペクトルを示す図である。（ｃ）実施例１においてＩＣＧ７７．４μＭ各種化合物７７．４μＭから成る色素複合体あるいは混合物を測定光路長１ｍｍで吸光度測定したスペクトルを示す図である。（ａ）（ｂ）（ｃ）において、いずれも、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は任意であるが同一ＩＣＧ濃度における吸光度を示す。化合物の番号は表２に対応している。
【図５】（ａ）実施例２−２におけるＩＣＧ７７．４μＭとホスホコリン１５５μＭから成る色素複合体のｐＨ７およびｐＨ３におけるオクタノール／水分配係数の測定例である。（ｂ）実施例２−２におけるＩＣＧ７７．４μＭとホスホコリン７７．４μＭから成る色素複合体のｐＨ７およびｐＨ３におけるオクタノール／水分配係数の測定例である。（ｃ）実施例２−２におけるＩＣＧ７７．４μＭのｐＨ７およびｐＨ３におけるオクタノール／水分配係数の測定例である。
【図６】（ａ）実施例３で得たリポソームの吸収スペクトルを示す。ＩＣＧモノマーの存在を示している。（ｂ）比較例１で得たリポソームの吸収スペクトルを示す。ＩＣＧＪ会合体の存在を示している。（ｃ）比較例２で得たリポソームの吸収スペクトルを示す。ＩＣＧモノマーの存在を示している。
【図７】（ａ）実施例２−１におけるＩＣＧとホスホコリン複合体であるＩＣＧ−２ＰＣとＩＣＧのスペクトルを示す。（ｂ）実施例２−１におけるＩＣＧとホスホコリン複合体であるＩＣＧ−１ＰＣとＩＣＧのスペクトルを示す。
【図８】（ａ）実施例３−１における空リポソームの粒径分布を示す。（ｂ）実施例３−４におけるｐＨ勾配色素内包リポソームの粒径分布を示す。（ｃ）比較例１のｐＨ勾配色素内包リポソームの粒径分布を示す。
【図９】比較例３のＩＣＧ７７．４μＭ＋ホスホコリン３１０μＭの複合体の水／オクタノール分配を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一実施形態は色素含有粒子の製造方法であって、
両親媒性色素とリン脂質とを有する色素複合体を形成させる工程と、
前記色素複合体と粒子とを混合し、前記粒子内と前記粒子外とのｐＨの差を設けることにより、前記両親媒性色素を前記粒子に内包させる工程と、を有することを特徴とする、色素含有粒子の製造方法を提供する。
前記粒子内と前記粒子外とのｐＨの差を設けるとは、ｐＨ勾配法を用いることを含む。ｐH勾配法については後述する。
【００２４】
また、上記の色素含有粒子の製造方法において、粒子がリポソームであることを特徴とすることができる。
【００２５】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、該リン脂質はツィッターイオン部位を有することを特徴とすることができる。
【００２６】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、色素とリン脂質とのモル比率が色素：リン脂質＝１：２乃至２：１となるように色素複合体を形成することを特徴とすることができる。
【００２７】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、色素含有粒子の流体力学的平均粒子径は光散乱法で測定して１０００ｎｍ以下であることを特徴とすることができる。
【００２８】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、両親媒性色素がＩＣＧであることを特徴とすることができる。
【００２９】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、該リン脂質がホスホコリンあるいはホスホコリンを部分構造として含むことを特徴とすることができる。
【００３０】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、粒子表面にＰＥＧ鎖を付加することを特徴とすることができる。
【００３１】
上記の色素含有粒子の製造方法において、さらに、該リン脂質がリン酸ジエステル結合を有することを特徴とすることができる。
【００３２】
本発明の第二の実施形態は、光イメージングに用いられることを特徴とする上記の色素含有粒子の製造方法で作製した色素含有粒子を提供する。光イメージングは、光音響イメージングを含む。
【００３３】
前記色素含有粒子においては、脂質は二重膜を形成していることを特徴とすることができる。
【００３４】
本発明の第三の実施形態は、上記の色素含有粒子の製造方法で作製した色素含有粒子と、前記粒子を分散する分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用の造影剤を提供する。
【００３５】
以下、本発明の実施形態についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限られない。
【００３６】
（両親媒性色素）
本実施形態の両親媒性色素は、特定のｐＨ領域において疎水的・脂溶性な分子構造となることが特徴である。
【００３７】
ＩＣＧはｐＨ７の中性領域においてオクタノール相／水相の分配係数が低く水相に存在しやすいが、ｐＨ３の酸性領域においてオクタノール相／水相の分配係数が高くなり、脂溶性の分子構造であることが後述の実験によって確認されている。
【００３８】
本実施形態における両親媒性色素としては、特に限定はないが、シアニン色素であってスルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、カルボン酸塩、リン酸、リン酸塩などの極性基を有するものが好ましい。
【００３９】
両親媒性色素の最も好ましい例として、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を挙げられるが、その他にも、Ｃｙ５（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ５．５（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ７（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＮＫ−１８４１（日本感光色素  ＣＡＳ＃：６４２８５−３６−５）、Ｓ０５２４  （ＦＥＷ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨｖ  ＣＡＳ＃：６４２８５−３６−５）、ＮＫ−１９６７（日本感光色素ＣＡＳ＃：６４２８５−３５−４）、Ｓ０１２１（ＦＥＷ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ    ＣＡＳ  ＃  ：  １１５９７０−６６−６）、Ｓ０５２３（ＦＥＷ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ    ＣＡＳ＃：１２０７６８−４４−７）、ＳＦ６４（Ｏｍｏｃｉａｎｉｎｅ）などが挙げられ、シアニン色素以外でもＶｉｖｏＴａｇ６８０は本実施形態の方法に用いられる。
【００４０】
（Ｈ会合体形成とＩＣＧ複合体形成との関係について）
ＩＣＧは高濃度の条件下においてＨ会合体（Ｈ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することが知られている。
ＩＣＧ単量体（モノマー）の最大吸収波長λｍａｘは７８０ｎｍ付近にあり、高濃度ではＩＣＧ同士が励起子相互作用により最大吸収波長が短波長７００ｎｍへシフトすることでＨ会合体の形成が確認できる。
Ｈ会合体はＩＣＧ分子の励起子が相互作用を及ぼす距離まで近接した時にスペクトルシフトを起こすため、高濃度になるほどＨ会合体を形成しやすい。一方、ＩＣＧに立体障害となる分子が結合した複合体の場合にはＨ会合体の形成が抑制される。
【００４１】
（Ｊ会合体）
ＩＣＧは特定の条件下においてＪ会合体（Ｊ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することが知られている。Ｊ会合体は、数ｎｍ乃至数μｍの平均粒径を有する多量体であり、単量体に比べて、吸収極大波長が長波長側に大きくシフトし、その吸収帯が鋭くなることが知られている。ＩＣＧのＪ会合体は、ＩＣＧの多量体構造物である会合体のうち、吸収波長がずれて、８８０ｎｍ乃至９１０ｎｍに吸光度の極大をもつものと定義する。
【００４２】
Ｊ会合体およびＨ会合体が存在するとＩＣＧ単量体に由来する７８０ｎｍの吸収が減ずるため抑制することが感度の点で好ましい。
【００４３】
本実施形態の両親媒性色素複合体はｐＨ勾配法における両親媒性色素のリン脂質２重膜の透過性を改善するためのものであるが、同時に、両親媒性色素同士の会合を立体的に障害し両親媒性色素の会合を抑制する。特に、Ｊ会合体は平均粒径が大きくなるためリン脂質２重膜を透過するのが困難であるため、両親媒性色素複合体を形成し、会合を抑制することは、ＩＣＧのリポソーム内包の効率も上げていると推測される。
【００４４】
本実施形態では、できあがったリポソームに含まれる色素が会合状態か、非会合状態か、は重要ではない。以下に示す実施例では、本実施形態にかかる粒子において、Ｈ会合体の形成が抑制されていることからＩＣＧが複合体を形成していることを証明し、ｐＨ勾配工程時にＪ会合体の形成が抑制されていることからＩＣＧ複合体がリポソーム表面に吸着せずＩＣＧが内包されていることを証明する。
【００４５】
（リン脂質）
リン脂質とは、構造中にリン酸エステル部位をもつ脂質の総称である。なお、リン脂質は、色素複合体を形成するために用いられるが、色素未含有粒子にもリン脂質は含まれる場合がある。
【００４６】
本実施形態において、色素複合体を形成するためのリン脂質の好ましい例として、ツィッターイオン部位を有するリン脂質をあげられる。
【００４７】
後述するように、実施例１では、８種類のリン脂質、あるいはその他の化合物をＩＣＧと複合体を形成しようとしたところ、ＩＣＧとホスホコリンは複合体を形成しているが、その他７種類の化合物は単なる混合物を形成していると思われた。したがって、複合体を形成するリン脂質はホスホコリン、あるいはホスホコリンを部分構造として有するリン脂質が好ましい。
【００４８】
ツィッターイオン部位を有するリン脂質とは、脂質のうちその構造の一部に、陽イオンの部分構造と陰イオンの部分構造を有する脂質のことを言う。このような脂質の例としては、ホスホコリンの他、ホスホコリンを一部の構造に含むリン脂質を挙げられ、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。
【００４９】
また、ツィッターイオン部位を有するリン脂質は、さらにリン酸ジエステル結合を有してもよく、その例として、１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ）、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＰＰＥ）、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＭＰＥ）、１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＬＰＥ）、１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）、１，２−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＬｏＰＥ）、１，２−Ｄｉｅｒｕｃｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＥＰＥ）、１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＳＰＣ）、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ）、１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＭＰＣ）、１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＬＰＣ）、１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＯＰＣ）、１，２−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＬｏＰＣ）などが挙げられる。
【００５０】
本実施形態におけるリン脂質としては、他にも、水素添加大豆ホスファチジルコリン（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  Ｓｏｙ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＨＳＰＣと略す）等を使用することができる。
【００５１】
また、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンの例としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン及びジアシルホスファチジルセリンなどが挙げられる。
【００５２】
（粒子）
本明細書において、粒子とは、色素含有、未含有を問わない。なお、色素未含有粒子とは、色素複合体あるいは色素を内包する前の粒子を指す。また、色素未含有粒子であっても、色素、両親媒性色素を含んでいてもよい。
粒子は、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等を挙げられ、特に好ましくはリポソームである。両親媒性色素を含む粒子は、両親媒性色素以外にツィッターイオン部位を有するリン脂質を含んでいる。
また、粒子表面には界面活性剤が存在していてもよい。
本実施形態の粒子の例として、図１（ａ）に示すようなＩＣＧ１と添加物としてのリン脂質２からなる粒子や、図１（ｂ）に示すようなＩＣＧ１を含むリポソーム３の表面に界面活性剤やポリエチレングリコールなどの表面改質剤４を含む粒子等が挙げられる。
【００５３】
（粒径）
粒子の粒径は特に限定されることはない。ただし、造影剤、特に腫瘍用の造影剤として用いる場合、流体力学的平均粒子径を１０００ｎｍ以下とすることで、血管から腫瘍への取り込みやすさと腫瘍での滞留性を高めることが可能となる。
粒径が１０００ｎｍ以下の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、腫瘍血管の透過性亢進と腫瘍内滞留）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、蛍光や光音響といった各種画像形成モダリティを用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒径が１０００ｎｍを超えると、腫瘍への効率的な取り込みが期待できない。そのため、粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下とすることが好ましい。粒径は２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
粒径は電子顕微鏡観察や動的光散乱法に基づく粒径測定法により測定することができる。動的光散乱法に基づいて粒径を測定する場合、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定する。
後述する細孔フィルターによってろ過したり、後述するｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ法を用いたり、リポソーム等の粒子に含ませたりすることで、このような好ましいサイズの粒子を作成することができる。
【００５４】
本実施形態に係るツィッターイオン部位を有するリン脂質としては、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリンのうち少なくともいずれか一方であることが特に好ましい。
【００５５】
（リポソーム）  
本明細書において、リポソームとは、色素含有、未含有のいずれも指すが、本段落では色素未含有のリポソームについて説明する。
リポソームとは、脂質、糖脂質、リン脂質、ステロール、あるいはそれらの組み合わせにより構成される単層リポソーム及び多重層リポソームを指す。また、なお、単層リポソームとはリン脂質２重膜から構成され、多重層リポソームは２重膜が複数層となっているものを意味する。
【００５６】
なお、ｐＨ勾配法では、一般的には、単層リポソームのリン脂質２重膜を通過できれば、多重層リポソームの２重膜も通過できる。
【００５７】
リポソームの脂質は、異なる脂質の混合物から構成されていてもよく、また脂質の誘導体、たとえばポリエチレングリコール結合リン脂質なども使用することができる。リポソームの調製方法は、従来公知の方法を利用でき、適宜選択して望ましい物性のリポソームを得ることができる。脂質の種類や量などは、リポソームの用途に応じて適宜選択することができる。例えば、脂質量や比率、脂質の荷電を考慮することで、リポソームの粒径や表面電位を制御することができる。
【００５８】
リポソームに含まれるリン脂質の例としては、中性リン脂質を挙げることができ、中性リポソームの例として、大豆あるいは卵黄レシチン、リゾレシチン、またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体である。その他にも、半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンも挙げられる。また、合成された、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）などが挙げられる。
【００５９】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリドなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などが挙げられる。
【００６０】
上記以外にも、リポソーム膜構成分子として、必要に応じ他の分子を加えることもできる。例として、膜安定化剤として作用するコレステロール類、エチレングリコールなどのグリコール類、デキストランなどの糖類、電荷制御のために添加されるリン酸ジアルキルエステル類、ステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
【００６１】
（リポソームへのＩＣＧの内包）
リポソーム内に内包されるＩＣＧは水溶性物質であり、典型的にはリポソームの内水相に内包される。しかし、ＩＣＧはリン脂質との親和性を有していることやＩＣＧ同士の多量体化を起こしやすいことから、リポソーム膜表面や脂質二重膜内の局在も起こりえる。本実施形態では上記３通りの場合、すなわち、「リポソーム内水相への内包」、「リポソームの膜内への局在」ならびに「リポソーム表面への局在」のうち、「リポソーム内水相への内包」を改善する。なお、粒子がＩＣＧを含有するとは、上記のいずれも指す。
【００６２】
（界面活性剤）
粒子の形成には界面活性剤が用いられる場合がある。界面活性剤としては、特に限定されることはなく、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。上記本実施形態における界面活性剤に使用する非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ８５等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ７６、Ｂｒｉｊ９８、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｉｇｅｐｏｌ  ＣＯ５３０、Ｉｇｅｐｏｌ  ＣＯ６３０、Ｉｇｅｐｏｌ  ＣＯ７２０並びにＩｇｅｐｏｌ  ＣＯ７３０等を挙げることができる。
【００６３】
また、アニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００６４】
また、カチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００６５】
また、界面活性剤に使用する高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール及びゼラチン等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールの市販品としては、プルロニックＦ６８（シグマアルドリッチジャパン社製）、プルロニックＦ１２７（シグマアルドリッチジャパン社製）などが挙げられる。
【００６６】
また、界面活性剤に使用するリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はＰＥＧ鎖を含むものであってもよい。
【００６７】
（ポリエチレングリコール）
腫瘍へのパッシブターゲティングの原理として提唱されているＥＰＲ効果を生じさせるためには、高い血中滞留性を有することが造影剤には求められる。ポリエチレングリコールは血中タンパク質との相互作用を抑制することで肝臓などの細網内皮系細胞に貪食され難くなり、粒子の血中滞留性を向上させることができるため、本実施形態の粒子へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の導入は非常に有益である。
【００６８】
ポリエチレングリコールの分子量や粒子への導入率を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。その分子量が５００から２０００００のポリエチレングリコールの使用が好ましく、特に２０００から１０００００が好適である、また粒子へのポリエチレングリコール導入率は、該粒子を構成する脂質に対して０．００１〜５０モル％、好ましくは０．０１〜３０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。
【００６９】
粒子へのポリエチレングリコール導入方法は、公知の技術を利用することができる。好ましい例としては、粒子を被覆するリン脂質類の中に、予めポリエチレングリコール結合リン脂質などを含めて粒子を作製する方法である。ポリエチレングリコール結合リン脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミンのポリエチレングリコール誘導体、たとえばジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）などがある。
【００７０】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありＰＥＧ鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、化学式２で示される１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ）、化学式３で示されるＰｏｌｙ（ｏｘｙ−１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ），α−［７−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｘｉｄｏ−１３−ｏｘｏ−１０−［（１−ｏｘｏｏｃｔａｄｅｃｙｌ）ｏｘｙ］−６，８，１２−ｔｒｉｏｘａ−３−ａｚａ−７−ｐｈｏｓｐｈａｔｒｉａｃｏｎｔ−１−ｙｌ］−ω−ｍｅｔｈｏｘｙ−  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）、化学式４で示されるＮ−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、化学式５示される３−（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、化学式６で示されるＮ−（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）等のリン脂質を挙げることができる。なお、化学式２乃至６において、ｎは５以上５００以下の整数である。
【００７１】
【化２】
2015081230.tif 000004
【００７２】
【化３】
2015081230.tif 000005
【００７３】
【化４】
2015081230.tif 000006
【００７４】
【化５】
2015081230.tif 000007
【００７５】
【化６】
2015081230.tif 000008
【００７６】
なお、本実施形態において用いる界面活性剤は１種類に限定されることはなく、２種類又はそれ以上の種類の界面活性剤を同時に用いてもよい。
【００７７】
（捕捉分子）
本発明の一実施形態おいて、上記の粒子の一部に、捕捉分子を固定化することにより、標的部位を特異的に標識することができる。
捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。
捕捉分子が化学結合された粒子を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。例えば、捕捉分子として腫瘍に特異的に結合する物質を採用すれば、腫瘍の特異的検出が可能となる。また捕捉分子として、特定の疾病部位の周辺に多く存在するタンパク質や酵素などの生体物質に特異的に結合する物質を用いれば、その疾病を特異的に検出することが可能である。なお、本実施形態に係る粒子によれば、捕捉分子を持たない場合でも、ＥＰＲ効果によって腫瘍を検出することは可能である。
【００７８】
（捕捉分子の固定化）
粒子に捕捉分子を固定化する方法としては、用いる捕捉分子の種類にもよるが、含有粒子に捕捉分子を化学結合させることができる限り、いかなる公知の方法をも使用することができる。例えば、前記した界面活性剤が有する官能基と捕捉分子の官能基とを反応させて化学結合する方法等を使用することができる。
例えば、界面活性剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、アミノ基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は、グリシン、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
また、界面活性剤がマレイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、チオール基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のマレイミド基は、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、又は末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
また、界面活性剤がアミノ基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子のアミノ基と反応させ、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等を反応させて未反応のアミノ基の活性をブロックすることが好ましい。あるいは、界面活性剤のアミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子を固定化しても良い。
【００７９】
（粒子の製造方法）
本実施形態に係る粒子の製造方法は、色素を含まない色素未含有粒子を調製するステップと、粒子に色素を内包させるステップを含む。その一例をいかに述べる。
【００８０】
（リポソームの調製方法）
リポソームは、公知のリポソーム製造方法により調製することができる。公知の技術としては、Ｂａｎｇｈａｍ  （Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、  １３、  ２３８（１９６５））らの方法、その変法（特開昭５２−１１４０１３号公報、特開昭５９−１７３１３３号公報、特開平２−１３９０２９号公報、特開平７−２４１４８７号公報）、超音波処理法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、９４、  １３６７（１９８０））、エタノール注入法（Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、  ６６、  ６２１（１９７５））、コール酸（界面活性剤）法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、  ４５５、  ３２２（１９７６））、凍結融解法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、  ２１２、  １８６（１９８１））、逆相蒸発法（Ｐｒｏ．  Ｎ．  Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ、  ７５、  ４１９４（１９７８））、ならびに市販のキットを用いた方法などが挙げられ、これら公知の方法により調製される色素未含有リポソーム（空リポソーム）に色素未含有粒子調製後にＩＣＧを内包化させることができる。
【００８１】
本実施形態のリポソームの製造方法の好ましい例は、Ｂａｎｇｈａｍらにより報告されたリポソーム作製方法に従うものである。すなわち、リン脂質などのリポソームの原料を有機溶媒に溶解、混合して、有機溶媒を減圧下で除去して脂質を乾固させ、これを水系媒体で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させるものである。その後、リポソーム溶液を加温あるいは超音波処理することもできる。
【００８２】
（色素複合体）
色素複合体は、両親媒性色素と、リン脂質を、１：２乃至２：１（モル比）となるように溶解して、適宜加熱等を行うことにより、得ることができる。
以下、本発明の実施例に示すＩＣＧとホスホコリンの複合体の一例を示すと、蒸留水を逆浸透膜に通して精製した水１ｍｌに、ＩＣＧ６ｍｇ  （７．７４μモル  ｍ．ｗ．  ７７５  ）およびＩＣＧに対して１倍のモル比のホスホコリン２．０４ｍｇ  （７．７４μモル  ｍ．ｗ．  ２６３）  を添加し６０℃３０分間加熱した後、室温まで徐冷し、ＩＣＧ−ＰＣを得た。このようにして得られたＩＣＧ−ＰＣ中のＩＣＧ濃度は７．７４ｍＭである。  ＩＣＧ複合体をｐＨ３のクエン酸酸性緩衝液（ＩＣＧ濃度＝１．５ｍＭ）を調製し、この複合体水溶液を外水相として、その後の内包に用いられた。
【００８３】
（従来の色素含有粒子）
以下、ｐＨ勾配法によるＩＣＧ（複合体を形成していない）の粒子への内包を例にとって述べる。
リン脂質などのリポソームの原料を有機溶媒に溶解、混合し、有機溶媒を減圧下で除去して溶質を乾固させる。これを中性緩衝液で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させることにより、リポソーム内部に中性緩衝液を含むリポソームを調製する。その後、リポソーム外側の緩衝液を酸性緩衝液に置換することにより、リポソーム内側が中性、外側が酸性のｐＨ勾配を持ったリポソーム分散液を調製する。
このリポソーム分散液に酸性緩衝液に溶解したＩＣＧ溶液を添加し、原料リン脂質の転移温度以上で３０分間加温撹拌することによりＪ会合体化したＩＣＧがリポソームに内包されてしまう。
ＩＣＧを酸性緩衝液であるｐＨ３のクエン酸バッファ中で６０℃加熱するとＪ会合体化することが原因である。
ｐＨ勾配を利用した薬剤のリポソームへの内包方法は特許文献３に記載されており、塩基性薬剤のリポソーム内への内包に有効である。しかしＩＣＧは酸性薬剤であるため、この文献とは逆のｐＨ勾配をもつリポソームを調製した。この条件でＩＣＧを内包させたところ、内包されたＩＣＧがほとんどＪ会合体化することがわかった。
Ｊ会合体化は反応速度論で説明することができ、反応速度には濃度と反応温度および触媒がパラメータとなる。
すなわち、ＩＣＧのＪ会合体化はＩＣＧ濃度と加熱温度およびリン脂質やクエン酸や水素イオンなどが正触媒として機能すると思われる。なお、尿素はＪ会合体化を抑制するため負触媒として機能すると考えることもできる。
【００８４】
（本実施形態の色素含有粒子）
本願発明者らは、上記の公知のｐＨ勾配法に、さらに改良を加え、色素、あるいは色素複合体を高濃度に粒子内に内包することに成功した。なお、本明細書では、色素含有粒子といった場合、粒子内で、色素が複合体として存在するか否かは問わない。ＩＣＧ含有粒子（あるいはリポソーム）といった場合も、同様に、ＩＣＧが複合体として存在するか、否かは問わない。
【００８５】
以下、本実施形態のＩＣＧ含有リポソームの作製方法について述べる。
ＩＣＧ複合体の内包化は上記したリポソーム外側の緩衝液を本実施形態の酸性緩衝液に置換してリポソーム内側が中性、外側が酸性のｐＨ勾配を持ったリポソーム分散液に、上記ＩＣＧ複合体水溶液を添加し６０℃で３０分以上加熱撹拌する。
上述したように、本実施形態のＩＣＧ複合体とすることで、リポソームを構成するリン脂質へのＩＣＧの結合を抑制し、リン脂質膜２重膜を透過すると考えることができる。
このようにしてＩＣＧが内包されたリポソームを遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過などにより精製することで本発明の実施形態に係るリポソームが調製される。
本実施形態のＩＣＧを内包するリポソームの調製において、重要なポイントとして、色素を複合体とした他に、ＩＣＧを内包させるためにＩＣＧを高濃度で存在させたこと、かつ加温によりリポソーム相転移を促進したことのふたつを挙げることができる。
溶液中のＩＣＧの濃度は少なくとも０．１ｍＭ以上、好ましくは１．０ｍＭ以上であり、加温は少なくとも２０℃、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは６５℃以上である。しかし、９０℃では色素の分解が促進されることから、好ましい加温温度範囲は、３７℃から６５℃である。
【００８６】
（造影剤）
本実施形態に係る粒子はＩＣＧを含んでおり、近赤外光を吸収して蛍光又は音響波を発することができるため、蛍光イメージング又は光音響イメージングといった光イメージング用の造影剤として用いることができる。また、ＩＣＧは緑色に着色しているため、目視で検出するための造影剤としても使用できる。
【００８７】
本明細書において「造影剤」とは、主に、検体内にあって観察したい組織や分子とその周囲の組織や分子とのコントラスト差を生じさせ、当該観察したい組織や分子の形態情報あるいは位置情報の検出感度を向上させることができる物質と定義する。ここで「蛍光イメージング」や「光音響イメージング」とは、上記の組織や分子を蛍光検出装置あるいは光音響信号検出機装置などによって、イメージングすることを意味する。
【００８８】
本実施形態に係る造影剤は、本実施形態に係る粒子及び前記粒子が分散された分散媒を有する。分散媒は、本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。また、造影剤は、食塩やグルコースなどの薬理上許容できる添加物を有していても良い。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００８９】
（蛍光イメージング法）
本実施形態に係る造影剤は、蛍光イメージング法に用いることもできる。本実施形態に係る造影剤を用いた蛍光イメージング法は、本実施形態に係る造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与する工程と、前記検体もしくは前記検体から得られる試料に光を照射する工程と、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記粒子由来物質の蛍光を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする。
【００９０】
本実施形態に係る造影剤を用いた蛍光イメージング法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、実験動物やペット等、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記粒子の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長域の光を照射する。
【００９１】
市販の蛍光イメージング装置ＩＶＩＳ  （ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍなど）を用い、ＩＣＧフィルターを使ってイメージングができる。
上述したように、光イメージング装置はこの波長範囲を使うよう設計されているものが多く、ＩＶＩＳもＩＣＧ単量体の吸収波長７８０ｎｍには対応している（フィルタセット４のＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｐａｓｓｂａｎｄ７０５−７８０ｎｍ）。
【００９２】
【表１】
2015081230.tif 000009
【００９３】
また、ＩＶＩＳ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍのスペックシートによればＱｕａｎｔｕｍ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙは＞８５％  ａｔ  ５００７００ｎｍ，＞３０％  ａｔ  ４００９００ｎｍであることが知られている。
【００９４】
本実施形態に係る光音響イメージング法において、照射される光の波長は使用するレーザー光源により選択することが可能である。本実施形態に係る蛍光イメージング法においては、効率良く音響信号を取得するために、生体内における光の吸収、拡散の影響が少ない「生体の窓」と呼ばれる６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの、近赤外光領域の波長の光を照射することが好ましい。
【００９５】
本実施形態に係る造影剤からの蛍光を蛍光検出器で検出し、電気信号に変換する。この蛍光検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさを計算することができる。例えば、造影剤が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記粒子由来物質が存在すると推定され、又は、前記検体より得られた試料に前記粒子由来の物質が存在すると推定することができる。
【００９６】
本実施形態に係る造影剤を検体に投与した場合、リンパ節、特にがん原発巣からリンパ管に流入したがん細胞が最初に到達するセンチネルリンパ節を好適に検出することできる。この場合、腫瘍内あるいは腫瘍周辺にリンパ節用造影剤を注射し、注射後の適切な時間に造影剤の検出を行う。
【００９７】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る造影剤は、光音響イメージング法に用いることができる。なお、本明細書において、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本実施形態に係る造影剤を用いた光音響イメージング法は、本実施形態に係る造影剤を検体もしくは前記検体から得られる試料に投与する工程と、前記検体もしくは前記検体から得られる試料にパルス光を照射する工程と、前記検体内もしくは前記検体から得られる試料内に存在する前記粒子由来物質の光音響信号を測定する工程と、を少なくとも有することを特徴とする。
【００９８】
本実施形態に係る造影剤を用いた光音響イメージング法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る造影剤を検体に投与し、あるいは前記検体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、前記検体とは、実験動物やペット等、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、前記検体中もしくは検体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片、細胞、細胞溶解物などを挙げることができる。前記粒子の投与あるいは添加後、前記検体等に対し近赤外波長域のレーザーパルス光を照射する。
【００９９】
本実施形態に係る光音響イメージング法において、照射される光の波長は使用するレーザー光源により選択することが可能である。本実施形態に係る光音響イメージング法においては、効率良く音響信号を取得するために、生体内における光の吸収、拡散の影響が少ない「生体の窓」と呼ばれる６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの近赤外光領域の波長の光、特に７００ｎｍ乃至９００ｎｍの波長の光を照射することが好ましい。
【０１００】
本実施形態に係る造影剤からの光音響信号（音響波）を、音響波検出器、例えば圧電トランスデューサで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の内の吸収体の位置や大きさ、あるいはモル吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。例えば、造影剤が基準とする閾値以上で検出されれば、その検体に前記粒子由来物質が存在すると推定され、又は、前記検体より得られた試料に前記粒子由来の物質が存在すると推定することができる。
【０１０１】
本実施形態に係る造影剤を検体に投与した場合、リンパ節、特にがん原発巣からリンパ管に流入したがん細胞が最初に到達するセンチネルリンパ節を好適に検出することできる。この場合、腫瘍内あるいは腫瘍周辺にリンパ節用造影剤を注射し、注射後の適切な時間に造影剤の検出を行う。
【０１０２】
本実施形態では、色素の漏出を抑制することで、色素の集積による消光を起こさせ、照射されたパルス光のエネルギーが蛍光発光に用いられることを防ぎ、より多くの熱エネルギーに変換することができる。そのため、より効率的に音響信号を取得することが可能となる。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例で色素含有粒子を作製する際に用いる具体的な試薬や反応条件を挙げているが、これらの試薬や反応条件は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
なお、本明細書中において、ホスホコリンをＰＣ、ＩＣＧとホスホコリンとの複合体をＩＣＧ−ＰＣなどと省略表記する場合がある。
【０１０４】
実施例１
（Ｈ会合体形成とＩＣＧ複合体形成との関係について）
ＩＣＧは高濃度の条件下においてＨ会合体（Ｈ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することが知られている。
ＩＣＧ単量体（モノマー）の最大吸収波長λｍａｘは７８０ｎｍ付近にあり、高濃度ではＩＣＧ同士が励起子相互作用により最大吸収波長が短波長７００ｎｍへシフトすることでＨ会合体の形成が確認できる。
Ｈ会合体はＩＣＧ分子の励起子が相互作用を及ぼす距離まで近接した時にスペクトルシフトを起こすため、高濃度になるほどＨ会合体を形成しやすい。一方、ＩＣＧに立体障害となる分子が結合した複合体の場合にはＨ会合体の形成が抑制される。
【０１０５】
図２はＩＣＧによく見られるスペクトルを重ねて表示したもので、７８０ｎｍ付近にあるピーク１はモノマー分子によるもの、７００ｎｍ付近にあるピーク２はＨ会合体によるもの、９００ｎｍ付近にあるピーク３はＪ会合体によるものである。
図３（ａ）はＨ会合体でよくみられる励起子相互作用を模式的に示した図である。色素分子が平行配置された状態において、励起子相互作用の強さＥｅｘｉｔｉｏｎは｜μ｜２（１−３ｃｏｓ２θ）／ｒ３で与えられる。ただし、遷移モーメントをμ、遷移モーメント間の距離をｒ、角度をθとする。
図３（ｂ）は色素分子にリン脂質等が結合した複合体を模式的に示した図である。
【０１０６】
上述したように励起子相互作用の強さは距離ｒの３乗で弱くなるため、立体障害があって会合が抑制されれば図２における７００ｎｍのＨ会合体による吸収スペクトルのシフトに変化がある。また、色素のモル吸光係数εは複合体を形成すると摂動を受けて変化することが知られている。
【０１０７】
本実施形態において、複合体の形成はＩＣＧの吸収スペクトルシフトおよびモル吸光係数によって評価した。
【０１０８】
表２に記載の１番から８番までの、８種類のリン脂質、あるいはその他の化合物をＩＣＧに対して１倍ならびに２倍のモル比で添加し６０℃３０分間加熱した後、室温まで徐冷した後、以下のＩＣＧ濃度となるよう水溶媒で希釈して吸収スペクトル測定を実施し、色素複合体の形成を評価した。（０番は代表的なツィッターイオン部位を有するリン脂質であるＤＳＰＣ）
【０１０９】
【表２】
2015081230.tif 000010
【０１１０】
図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ＩＣＧ単独、あるいは、ＩＣＧと８種類の化合物を混合したときのスペクトルを示す。横軸は波長（ｎｍ）で、縦軸は任意であるが各図において同一ＩＣＧ濃度における吸光度を示す。図４（ａ）はＩＣＧ濃度が７．７４μＭ濃度で８種類のリン脂質が１５．５μＭのとき光路長１０ｍｍの光学セルを用いて測定したスペクトルを示す。図４（ｂ）はＩＣＧ濃度が７７．４μＭで８種類のリン脂質が１５５μＭ濃度のとき光路長１ｍｍの光学セルを用いて測定したスペクトルを示す。図４（ｃ）はＩＣＧ濃度が７７．４μＭで８種類のリン脂質が７７．４μＭ濃度のとき光路長１ｍｍの光学セルを用いて測定したスペクトルを示す。
【０１１１】
全８種類の化合物ともＩＣＧ７．７４μＭ濃度のときにはモノマーに由来する７８０ｎｍに最大吸収波長を示しているが、ＩＣＧ７７．４μＭの高濃度のときにホスホコリンを除く７種類の化合物、およびＩＣＧのみの場合は７００ｎｍに最大吸収波長がシフトしている。一方、ホスホコリンとＩＣＧの系は７００ｎｍより７８０ｎｍの吸収ピークの方が大きく、Ｈ会合体の形成が抑制されていると言える。
【０１１２】
この抑制効果はＩＣＧ１モルに対して２モル（ＩＣＧ−２ＰＣ）（図４（ｂ））の方が１モル（ＩＣＧ−１ＰＣ）（図４（ｃ））より顕著であるが、図４（ｃ）においてホスホコリン以外は効果が認められず、ホスホコリンはＩＣＧ１モルに対して２モル以下、例えばＩＣＧと等モルでも効果が認められた。
【０１１３】
また、ホスホコリンを除く７種類の化合物はＩＣＧのみと同じ濃度で同じ吸収強度、すなわち同じモル吸収係数である。ホスホコリンとＩＣＧの系は低濃度でも高濃度でもＩＣＧのみより吸収強度が低くモル吸収係数に変化があることから複合体を形成していると言える。
【０１１４】
実施例２
（ＩＣＧ−ＰＣのオクタノール／水分配）
実施例２−１
（ＩＣＧ複合体の作製）
両親媒性色素の例としてインドシアニングリーンとホスホコリンとの複合体ＩＣＧ−ＰＣを例に色素複合体の調製方法を示す。
蒸留水を逆浸透膜に通して精製した水（以下、ミリＱ水）１ｍｌに、インドシアニングリーン（以下ＩＣＧ、日本公定書協会製）６ｍｇ  （７．７４μモル  ｍ．ｗ．  ７７５  ）およびＩＣＧに対して２倍のモル比のホスホコリンクロリドナトリウム水和物（以下ＰＣ、東京化成工業製）４．０８ｍｇ  （１５．５μモル  ｍ．ｗ．  ２６３）  を添加し６０℃３０分間加熱した後、室温まで徐冷し、ＩＣＧ−２ＰＣを得た。
また、ミリＱ水１ｍｌにＩＣＧ６ｍｇ  （７．７４μモル）およびＩＣＧに対して１倍のモル比のＰＣ  ２．０４ｍｇ  （７．７４μモル）を上記同様の操作でＩＣＧ−１ＰＣを得た。
ＩＣＧ−２ＰＣおよびＩＣＧ−１ＰＣともにＩＣＧ濃度は７．７４ｍＭである。
ＩＣＧ−２ＰＣおよびＩＣＧ−１ＰＣをミリＱ水で希釈してＩＣＧ濃度を７７．４μＭとした溶液のスペクトル（点線）と、７７．４μＭのインドシアニングリーンのスペクトル（実線）を図７（ａ）および図７（ｂ）に示す。
【０１１５】
実施例２−２
（ＩＣＧ複合体のｐＨ３およびｐＨ７におけるオクタノール／水分配）
実施例２−１で作製したＩＣＧ−２ＰＣをミリＱ水で希釈してＩＣＧ濃度を７７．４μＭとしたｐＨ７の水溶液０．５ｍｌを１−オクタノール（ｎ−オクタノール）０．５ｍｌと撹拌混合した後に静置し２相に分離させ、オクタノール相／水相へのＩＣＧ色素のｐＨ７における分配を観察した。
次に、実施例２−１で作製したＩＣＧ−２ＰＣを後述の実施例３のＢ溶液で希釈してＩＣＧ濃度を７７．４μＭとしたｐＨ３の水溶液０．５ｍｌを１−オクタノール（ｎ−オクタノール）０．５ｍｌと撹拌混合した後に静置し２相に分離させ、オクタノール相／水相へのＩＣＧ色素のｐＨ３における分配を観察した。
図５（ａ）はＩＣＧ７７．４μＭ＋ホスホコリン１５５μＭの複合体（ＩＣＧ−２ＰＣ）の水／オクタノール分配
（ｂ）はＩＣＧ７７．４μＭ＋ホスホコリン７７．４μＭの複合体（ＩＣＧ−１ＰＣ）の水／オクタノール分配
（ｃ）はＩＣＧ７７．４μＭの水／オクタノール分配を示す。
【０１１６】
図５（ａ）から明らかなように、ｐＨ７においてＩＣＧ−２ＰＣ（ただし複合体ではなく単独のＩＣＧとなっているものも含まれる）は水相に多く油相にも少し溶解している。一方、ｐＨ３においてＩＣＧ−２ＰＣ（同様に単独のＩＣＧを含む）は油相に多く溶解している。
このことは、ｐＨ３の外水相環境に置かれたＩＣＧ−２ＰＣ（もしくはＩＣＧ）は疎水性となりリン脂質２重膜を通過して内水相まで移動できることを示している。
さらに、内水相まで移動するとｐＨ７の環境であるためＩＣＧは水相に溶解しやすくなり逆方向へ移動しにくい。よって外水相ｐＨ３で内水相ｐＨ７のｐＨ勾配によってＩＣＧはリポソーム内に濃縮内包される。
これは図５（ｂ）に示したＩＣＧ−１ＰＣでも同様であった。
また、図５（ｃ）に示したようにＩＣＧだけでもｐＨ３においてオクタノール相へ移行することが確認できた。よって、内水相に存在するのはＩＣＧ−２ＰＣであるか、ＩＣＧのみであるかの区別はつかない。
しかし、比較例１で明らかなようにＩＣＧのみではリポソーム表面でリン脂質に結合し内水相に内包できないが、ＰＣがＩＣＧのリン脂質への結合を抑制していることは明らかである。
【０１１７】
実施例３
（ｐＨ勾配法によるＩＣＧを内包したリポソームの調製）
実施例３−１
（色素未含有リポソーム（空リポソーム）の調製）
表３に示した内水相（Ａ溶液）、外水相（Ｂ溶液）の濃度となる空リポソーム分散液を調製した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８０８０、日本油脂製）、コレステロール（和光純薬製）、ジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、日本油脂製）をそれぞれ重量比で３：１：１に秤量した。３種の脂質の合計量１０２ｍｇあたりメタノール・クロロホルム（１：１）溶液２ｍｌに溶解し、３７℃で１時間撹拌した後、溶媒留去し、さらに室温で一晩、真空乾燥した。得られた脂質乾固物（３種の脂質の合計量１０２ｍｇにつき）に表１２に示したＡ溶液を１０ｍｌ添加し、３７℃で１時間撹拌した。そして６０℃で３０分間、バス型超音波装置（３周波超音波洗浄器  ＶＳ−１００ＩＩＩ、アズワン製）により超音波処理（２８ｋＨｚ６０秒→４５ｋＨｚ６０秒→１００ｋＨｚ３秒のサイクルで照射）した後、ポアーサイズ０．２２μｍ膜を通過させた。
【０１１８】
通過した空リポソーム分散液の外水相を限外ろ過（撹拌式セル、限外ろ過膜３００ＫＤａ、ミリポア製）により表３に示したＢ溶液に置換した後、濃縮し、ＤＳＰＣとコレステロールの合計脂質濃度を４０ｍｇ／ｍＬに調整した。ＤＳＰＣとコレステロールの定量は市販定量キット（リン脂質Ｃテストワコー、コレステロールＥ−テストワコー、和光純薬製）で行った。
【表３】
2015081230.tif 000011
Ａ溶液はＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピぺラジニル］−エタンスルホン酸、インビトロジェン製）濃度１０ｍＭに１０ｍＭ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７．３にｐＨ調製した緩衝液である。
Ｂ溶液はクエン酸一水和物（ナカライテスク製）とクエン酸三ナトリウム二水和物（ナカライテスク製）を溶解しｐＨ３．０に調製したクエン酸緩衝液であり、濃度は１０ｍＭとした。
粒径分布測定結果を図８（ａ）に示した。
【０１１９】
実施例３−２
（空リポソームへのＩＣＧ−２ＰＣの内包・精製）
実施例２−１で作製したＩＣＧ−２ＰＣを実施例３−１のＢ溶液に溶解し、ＩＣＧ濃度、６ｍｇ／ｍｌとなるＩＣＧ−２ＰＣ溶液を作製した。上記、空リポソーム１にＩＣＧ−２ＰＣ溶液を添加し、以下の条件でＩＣＧ内包処理したリポソームを調製した。
ＩＣＧ溶液及び空リポソーム分散液を６０℃の恒温槽中に置いて１５分加温した。
２．５ｍＬの空リポソーム分散液に２．５ｍＬのＩＣＧ溶液を添加し、６０℃で３０分撹拌した。
回収したリポソーム分散液に空リポソーム１の外水相Ｂ溶液を注入しながら限外ろ過（限外ろ過膜３００ＫＤａ）処理し、遊離のＩＣＧを除去し精製した。精製後、液量をおよそ４ｍｌに濃縮し回収した。
【０１２０】
実施例３−３
（吸収スペクトル測定）
実施例３−２で得られたＩＣＧ内包化処理リポソームをＢ液で希釈し、波長５００〜９５０ｎｍ間の吸光度を測定し、リポソーム中の色素を確認した。結果を図６（ａ）に示した。
【０１２１】
実施例３−４
（粒径測定）
実施例３−２で得られたＩＣＧ内包化処理リポソームの粒径をＤＬＳ（ゼータサイザーナノ、マルバーン社製）で測定した。結果を図８（ｂ）に示した。ＩＣＧ内包リポソームは１００ｎｍ前後の粒径として調製できることが分かった。
【０１２２】
比較例１
（ホスホコリンを添加せずにＩＣＧ内包にｐＨ勾配法を適用した場合）
比較例１−１
実施例３−１において作製した空リポソームを用いた。
比較例１−２
（ｐＨ勾配を利用したリポソームへの内包  （２）ＩＣＧの内包・精製）
インドシアニングリーン（ＩＣＧ、日本公定書協会製）１５ｍｇを実施例３−１  表３記載のＢ溶液  ｐＨ３クエン酸バッファ溶液２．５ｍＬに溶解し、ＩＣＧ濃度６ｍｇ／ｍｌとなるＩＣＧ溶液２．５ｍＬを作製した。
このＩＣＧ溶液及び実施例３−１において作製した空リポソーム分散液２．５ｍＬを６０℃の恒温槽中に置いて１５分加温した。６０℃に加温した空リポソーム分散液に同じく６０℃に加温したＩＣＧ溶液を添加し、６０℃で３０分撹拌しＩＣＧ内包処理したリポソームを調製した。
回収したリポソーム分散液に外水相Ｂ溶液を注入しながら限外ろ過（限外ろ過膜３００ＫＤａ）処理し、遊離のＩＣＧを除去し精製した。精製後、液量をおよそ４ｍｌに濃縮し回収した。
実施例３−２と同様に吸収スペクトルを測定し、結果を図６（ｂ）に示した。また、同様に粒径分布測定を行い、結果を図８（ｃ）に示した。
【０１２３】
比較例２
（ホスホコリンを添加せずにＩＣＧ内包にｐＨ勾配なしの場合）
比較例２−１
従来のバンガム法によってＩＣＧをリポソームに内包させた。
本比較例において、外水相は内水相Ａ溶液と同じであってｐＨ勾配は生じていない。
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８０８０、日本油脂製）、コレステロール（和光純薬製）、ジステアロイルホスファチルジルエタノールアミンポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、日本油脂製）をそれぞれ重量比で３：１：１に秤量した。３種の脂質の合計量１０２ｍｇあたりメタノール・クロロホルム（１：１）溶液２ｍｌに溶解し、６ｍｇ／ｍｌのＩＣＧを添加した。３７℃で１時間撹拌した後、溶媒留去し、さらに室温で一晩、真空乾燥した。得られた脂質乾固物（３種の脂質の合計量１０２ｍｇにつき）に表１２に示したＡ溶液を２．５ｍｌ添加し、３７℃で１時間撹拌した。そして６０℃で３０分間、バス型超音波装置（３周波超音波洗浄器  ＶＳ−１００ＩＩＩ、アズワン製）により超音波処理（２８ｋＨｚ６０秒→４５ｋＨｚ６０秒→１００ｋＨｚ３秒のサイクルで照射）した後、ポアーサイズ０．２２μｍ膜を通過させた。
回収したリポソーム分散液に内水相Ａ溶液を注入しながら限外ろ過（限外ろ過膜３００ＫＤａ）処理し、遊離のＩＣＧを除去し精製した。精製後、液量をおよそ４ｍｌに濃縮し回収した。
ＤＳＰＣとコレステロールの定量は市販定量キット（リン脂質Ｃテストワコー、コレステロールＥ−テストワコー、和光純薬製）で行った。
実施例３−２と同様に吸収スペクトルを測定した結果を図６（ｃ）に示した。
【０１２４】
（実施例３、比較例１、比較例２で作製したリポソームの分析結果比較）
前記表４に実施例３と比較例１、および比較例２で作製したリポソームの分析結果を表４にまとめた。
表４中（１）分析結果（ＩＣＧ量／乾燥重量、ＩＣＧ量／脂質量、ＩＣＧ回収率など）から、実施例３で作製されたＩＣＧ−２ＰＣ内包は、（３）比較例（比較例２）に示した従来のバンガム法で作製したリポソームより内包されている色素が高濃度であることは明らかである。
【０１２５】
表４ではｐＨ勾配ありはｐＨ勾配なしに比較して３〜４倍の濃縮効果が得られている。
また、（２）比較例（比較例１）に示した従来のＩＣＧを使ったｐＨ勾配法においてはＩＣＧ内包率が高く見積もられているが、このＩＣＧはリポソームのリン脂質表面に吸着していて通常の精製工程では分離できないが、造影剤として投与した場合には生体内アルブミンと結合して無効な成分となっているため、造影効果が悪いという欠点があった。（データ不開示）。
【０１２６】
【表４】
2015081230.tif 000012
【０１２７】
比較例３
（ＩＣＧ１モルに対してホスホコリン４モル添加した場合）
ＩＣＧに対して過剰にホスホコリンを添加した場合、すなわち、ＩＣＧ７７．４μＭ＋ホスホコリン３１０μＭを混合した場合、余剰のホスホコリンを除去しなければ図９に示したように水溶性であるホスホコリンの作用によってＩＣＧが水相へ移行しやすくなっていた。よって、ＩＣＧ１モルに対して４モルのホスホコリンは余剰であり、ＩＣＧ１モルに対して２モルのホスホコリンが上限として好ましい。
【０１２８】
実施例４
（光音響信号の測定）
実施例３で得たＩＣＧ−２ＰＣ内包リポソームの光音響信号の強度を測定した。比較例としてＩＣＧ水溶液も同様に測定した。光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプルに照射し、サンプルから光音響信号を圧電素子を用いて検出し，高速プリアンプで増幅後，デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザ（Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７８０ｎｍ、エネルギー密度は１２ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は２０ナノ秒、パルス繰返しは１０Ｈｚの条件とした。超音波トランスデューサとしては、型式Ｖ３０３（Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ社製）を用いた。中心帯域は１ＭＨｚ、エレメントサイズはφ０．５、測定距離は２５ｍｍ（Ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓ）、アンプは＋３０ｄＢ（超音波プリアンプ  Ｍｏｄｅｌ  ５６８２  オリンパス社製）の条件である。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。溶媒は水を用いた。計測器は、ＤＰＯ４１０４（テクトロニクス社製）を用いて、トリガー：光音響光をフォトダイオードで検出、Ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：１２８回（１２８パルス）平均の条件で測定を行った。
波長は７８０ｎｍにおける光音響信号測定の結果、本実施例３の粒子はＩＣＧ水溶液に比較して、１．７倍の光音響信号を発生することが分かった。
【図２】
2015081230.tif 000013
【図８】
2015081230.tif 000014
【図１】
2015081230.tif 000015
【図３】
2015081230.tif 000016
【図４】
2015081230.tif 000017
【図５】
2015081230.tif 000018
【図６】
2015081230.tif 000019
【図７】
2015081230.tif 000020
【図９】
2015081230.tif 000021