(57)【要約】【課題】グルタミン酸の非存在下であってもグリセリンを唯一の炭素源としてポリ−ガンマ−グルタミン酸の高生産が可能な微生物、及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の高生産が可能なポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法を提供する。【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４、又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物、及び前記微生物を培養してポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産するポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４、又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物。
【請求項２】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２で特定される微生物が配列番号７で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で特定される微生物が配列番号８で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３で特定される微生物が配列番号９で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４で特定される微生物が配列番号１０で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物が配列番号１１で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する、
請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記微生物が、グルタミン酸の非存在下、グリセリンを唯一の炭素源として含む培地で培養してポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物が下記表１記載の菌学的性質を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【表１】
2015070834.tif 000015
【請求項５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で特定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物を培養してポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法。
【請求項７】
グリセリンを炭素源として含む培地を用いて前記微生物を培養する、請求項６に記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法。
【請求項８】
グルタミン酸を含まず、グリセリンを唯一の炭素源として含む培地を用いて前記微生物を培養する、請求項６又は７に記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法、及びこれに用いる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−ガンマ−グルタミン酸（以下、本明細書において「ＰＧＡ」ともいう）は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基とα位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。また、ＰＧＡはγ−ポリグルタミン酸と呼称される場合もある。ＰＧＡは、納豆菌（Bacillus subtilis  var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から近年新たな高分子素材として注目されている。
【０００３】
ＰＧＡを産生する微生物としては、納豆菌を含む一部のBacillus属細菌とその近縁種、さらに好塩古細菌ナトリアルバ・エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）などが挙げられる（非特許文献１参照）。また、これらＰＧＡ生産菌には、ＰＧＡの生産性に対するグルタミン酸依存性が異なる微生物があることが知られている（非特許文献２参照）。すなわち、ＰＧＡ生産においてグルタミン酸を必要とする微生物と、グルタミン酸を必要としない微生物が存在するとされる。
【０００４】
従来の知見によれば、枯草菌（Bacillus subtilis）TAM-4株は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、サッカロース、ラクトース、マルトース、キシロース、グリセリンをそれぞれ唯一の炭素源としてグルタミン酸非依存的にＰＧＡを生産することが記載されている（非特許文献２参照）。しかしながら、前記炭素源のうちグリセリンを用いた条件では、枯草菌TAM-4株のＰＧＡの生産能力は０．６ｇ／Ｌ／４日である。そのため、枯草菌TAM-4株のＰＧＡ生産性は工業的な観点からは充分な生産量を達成していないと考えられる。
また、非特許文献３によれば、グルタミン酸非依存的にＰＧＡを生産するバシラス・リシェニフォルミス（Bacillus licheniformis）A35株は、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、キシロースをそれぞれ唯一の炭素源としてＰＧＡを生産する。しかし、グリセリンを唯一の炭素源とする条件では、バシラス・リシェニフォルミスA35株はＰＧＡを生産しないことが記載されている。
また、非特許文献２において、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株はグルタミン酸依存的にＰＧＡを生産すると記載されている。一方で、非特許文献４においては、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株はグルタミン酸非依存的にＰＧＡを生産することが記載されている。しかし非特許文献４には、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株がグリセリンを唯一の炭素源としてＰＧＡを生産することは確かめられていない。またさらに、非特許文献５において、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株はグリセリンを唯一の炭素源として、ＰＧＡを生産しないことが記載されている。
【０００５】
一方で、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株の変異株であるバシラス・リシェニフォルミスWBL-3株は、グリセリンを唯一の炭素源とする条件で、８.９ｇ／Ｌ／４日のＰＧＡ生産性を有することが、非特許文献６に記載されている。
【０００６】
このように、従来知見によれば、グリセリンを唯一の炭素源として、グルタミン酸非依存的に効率よくＰＧＡを生産する微生物に関する情報は不明確である。さらには、グリセリンを唯一の炭素源として、グルタミン酸非依存的に効率よくＰＧＡを生産する野生株はほとんど知られていない。
【０００７】
グルタミン酸は、バイオマスを原料とする発酵法により生産することができ、食品素材又は飼料として利用されている。このようなグルタミン酸を原料に使用せず、有用な高分子素材であるＰＧＡが効率よく生産できる微生物は、食糧との競合を避けるといった視点、あるいは工業的にみた生産コストの視点からも有益であると考えられる。
またさらに、近年グリセリンは、バイオ燃料などの製造時に生じる副産物として、その有効利用が望まれている。そこで、これらグリセリンを唯一の炭素源として、グルタミン酸非依存的に効率よくＰＧＡを生産する微生物が見出せれば、産業的にみて利用価値が高いと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ashiuchi，M.，et  al.，Appl．Microbiol．Biotechnol.，2002，vol．59，p．9-14
【非特許文献２】Ito，Y.，et  al.，Biosci．Biotec．Biochem.，1996，vol．60，p．1239-1242
【非特許文献３】Cheng，C.，et  al.，Agric．Biol．Chem.，1989，vol．53，p．2369-2375
【非特許文献４】Birrer，G．A.，et  al.，Int．J．Biol．Macromol.，1994，vol．16，p．265-275
【非特許文献５】Birrer，G．A.，et  al.，，Polym．Mater．Sci．Eng.，1992，vol．67，p．134-136
【非特許文献６】Guocheng  Du，et  al.，Process  Biochemistry，2005，vol．40，p．2143-2147
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＰＧＡ生産能に優れる、野生型の微生物を提供することを課題とする。
また本発明は、グルタミン酸の非存在下であっても、グリセリンを唯一の炭素源としてＰＧＡの高生産が可能な、野生型の微生物を提供することを課題とする。
また本発明は、ＰＧＡの高生産が可能な、ＰＧＡの生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、グルタミン酸の非存在下であっても、グリセリンを唯一の炭素源としてＰＧＡの高生産が可能な野生型の微生物を見出した。
本発明はこの知見に基づき完成されたものである。
【００１１】
本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４、又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物に関する。
また本発明は、前記微生物を培養してＰＧＡを生産する、ＰＧＡの生産方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微生物は、ＰＧＡ生産能を有する従来の野生型の微生物と比較してＰＧＡ生産能に優れる。
また本発明の微生物は、グルタミン酸の非存在下であっても、グリセリンを唯一の炭素源としてＰＧＡの高生産が可能である。
さらに前記微生物を用いる本発明のＰＧＡの生産方法は、ＰＧＡの高生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「野生型の微生物」とは、自然界より分離又は単離した微生物であり、人工的変異処理や人工的遺伝子組換え操作を施していない状態の微生物を意味する。
【００１４】
本発明の微生物は、ＰＧＡ生産能を有する従来の野生型の微生物と比較してＰＧＡ生産能に優れる、野生型の微生物である。また本発明の微生物は、グルタミン酸の非存在下であっても、グリセリンを唯一の炭素源としてＰＧＡの高生産が可能な、野生型の微生物である。
さらに前記微生物を用いる本発明のＰＧＡの生産方法は、ＰＧＡの高生産を可能とする。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
本発明の微生物のうち、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２で寄託された。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で寄託された。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３で寄託された。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４で寄託された。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で、それぞれ寄託された。
これら本発明の微生物はいずれも野生型の微生物である。さらに、これら本発明の微生物はいずれも、分類学上バシラス・リシェニフォルミスに分類される。
【００１６】
次に、本発明の微生物が有する１６Ｓ  ｒＤＮＡについて説明する。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株は、配列番号７で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株は、配列番号７で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株は、配列番号７で示される塩基配列において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個、の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株は、配列番号８で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株は、配列番号８で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株は、配列番号８で示される塩基配列において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６ＳｒＤＮＡを有する。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株は、配列番号９で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株は、配列番号９で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株は、配列番号９で示される塩基配列において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株は、配列番号１０で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株は、配列番号１０で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株は、配列番号１０で示される塩基配列において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。
バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は、配列番号１１で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は、配列番号１１で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。あるいはバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は、配列番号１１で示される塩基配列において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する。
ここで本発明において、塩基配列の相同性は、公開されたデータベースＮＣＩＭＢ（National  Center  for  Biotechnology  Information、http://www.ncbi.nlm.gov/）のメニュー”Nucleotide”内の”ＢＬＡＳＴ”のなかにある”Basic  BLAST”を用い算出できる。あるいは、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（遺伝子情報処理ソフトウェア、ゼネティックス社製）のホモロジー解析プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ（ｋ-ｔｕｐｌｅ）を６として解析を行うことにより塩基配列の相同性を算出することもできる。
【００１７】
なお、配列番号７で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列との間で、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（遺伝子情報処理ソフトウェア、ゼネティックス社製）のホモロジー解析プログラムにより塩基配列の相同性を算出した。その結果、配列番号７で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列との間で、相同性は１００％であった。この結果は、配列番号７で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡと、配列番号８で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡは、実質的に同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡであることを示している。
【００１８】
次に、本発明の微生物の菌学的性質について説明する。
本発明の微生物はそれぞれ、下記表１に示す菌学的性質を有する。
【００１９】
【表１】
2015070834.tif 000002
【００２０】
表１に示すように、本発明の微生物は共通の性質として、ダルシトール非資化性の性質を有する。よって、本発明の微生物は、菌学的性質としてダルシトール資化性を有さないことが好ましい。
さらに表１に示すように、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株とバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株は、表１に記載の菌学的性質について実質的に同じ性質を有する。
【００２１】
本発明の微生物は、グルタミン酸の非存在下、グリセリンを唯一の炭素源として含む培地で培養してＰＧＡを生産する。具体的には、培養条件にもよるが、下記に示す組成の７．５％グリセリン−Ｍ培地又は１０％グリセリン−Ｍ培地を用いて前記微生物を培養したとき、培地１Ｌ当たり１．２ｇ／４日以上、好ましくは３．０ｇ／４日以上、より好ましくは４．０ｇ／４日以上、さらに好ましくは６．０ｇ／４日以上、のＰＧＡの生産能を有する野生型の微生物である。
以下に、７．５％グリセリン−Ｍ培地及び１０％グリセリン−Ｍ培地を下記表２及び３に示す。
【００２２】
【表２】
2015070834.tif 000003
【００２３】
【表３】
2015070834.tif 000004
【００２４】
本発明の微生物は、培養条件にもよるが、培地中のグリセリンが高濃度に存在する条件、すなわち、標準的な基準株（例えば、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株など）では生育の抑制が認められるような環境においても、生育が抑制されにくい。すなわち本発明の微生物は、グリセリン高濃度条件下において、基準株よりも生育度が高いことが好ましい。
具体的には、グリセリン含有量が１５％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養した場合、基準株（例えば、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株）の生育度を１００％としたときの本発明の微生物の生育度は１１５％以上、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、であることが好ましい。あるいは、グリセリン含有量が２０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養した場合、基準株（例えば、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株）の生育度を１００％としたときの本発明の微生物の生育度は１２０％以上、好ましくは２００％以上、より好ましくは２８０％以上、であることが好ましい。
また、グリセリン含有量が１５％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの本発明の微生物の生育度が、グリセリン含有量が１０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの生育度の８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％以上、さらに好ましくは１２０％以上、であることが好ましい。あるいは、グリセリン含有量が２０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの本発明の微生物の生育度が、グリセリン含有量が１０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの生育度の３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５５％以上、特に好ましくは７０％以上、であることが好ましい。
なお、本明細書において「生育度」は、培養後の培養液の吸光度（ＯＤ600）を測定することで相対的に算出できる。
【００２５】
本発明の微生物は、通常の方法により単離、取得した。
具体的には、グリセリンを唯一の炭素源として含む培地を用いて、グルタミン酸の非存在下で培養し、他の微生物と比較してＰＧＡの生産量が高い野生型の微生物を選択し、単離、取得した。
【００２６】
前述したように、非特許文献６に記載されているバシラス・リシェニフォルミスWBL-3株は、８.９ｇ／Ｌ／４日という高いＰＧＡ生産性を有する。しかしバシラス・リシェニフォルミスWBL-3株は野生型の微生物ではなく変異型の微生物であり、本発明の野生型の微生物はバシラス・リシェニフォルミスWBL-3株とは異なる。
具体的に説明すると、バシラス・リシェニフォルミスWBL-3株はバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株の変異株であり、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株に対してＨｅ−Ｎｅレーザー照射を行っている。
【００２７】
本発明のＰＧＡの生産方法は、前述した本発明の微生物を用いてＰＧＡの生産を行う。
前述したように、本発明の微生物は、従来の野生型の微生物と比較してＰＧＡ生産能に優れる。したがって本発明のＰＧＡの生産方法によれば、ＰＧＡの高生産が可能である。
また本発明の微生物は、グルタミン酸の非存在下であっても、グリセリンを唯一の炭素源としてＰＧＡの高生産が可能である。前述したように、グルタミン酸は食料の原料として広く用いられている。したがって本発明のＰＧＡの生産方法によれば、食糧生産と競合せず、低コストでのＰＧＡの高生産を可能とする。
【００２８】
本発明の微生物を用いてＰＧＡを生産する際には、適切な培地において本発明の微生物を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。
培地としては、グリセリン、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、マンノース、ガラクトース、シュークロース、デンプンなどの糖類を、ＰＧＡを生産するための炭素源として含む培地を使用することができる。また、クエン酸、酢酸などの各種有機酸又はその塩、並びにグルタミン酸又はその塩などを、ＰＧＡを生産するための炭素源として含む培地を使用することができる。本発明のＰＧＡの生産方法において、ＰＧＡを生産するための炭素源としては、前記炭素源のうち１種を用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。本発明のＰＧＡの生産方法において、グリセリンを炭素源として含む培地、グルタミン酸を含まずグリセリンを唯一の炭素源とする培地、グリセリンを主な炭素源とし、有機酸、グルタミン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を補助的な炭素源とする培地、などを好ましく用いることができる。ここで、「主な炭素源」及び「補助的な炭素源」とは培地中の各炭素源の含有量の大小を示すものである。
本発明のＰＧＡの生産方法で用いる培地には、必要により、各種大豆タンパクなどの天然物、アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムや尿素などの窒素源などを含有させてもよい。さらに本発明のＰＧＡの生産方法で用いる培地には、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩などの無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩などを含有させてもよい。また、本発明のＰＧＡの生産方法で用いる培地は、合成培地でもよいし天然培地でもよい。
【００２９】
本発明の微生物は、グルタミン酸の非存在下であってもグリセリンを炭素源としてＰＧＡの高生産が可能である。従って、グルタミン酸を含まずグリセリンを炭素源として含む培地、又はグリセリンを唯一の炭素源として含む培地で本発明の微生物を培養してＰＧＡを生産することが、生産コストの観点から好ましい。
ＰＧＡの生産に用いるグリセリンは、市販品であってもよく、バイオ燃料などの製造時に副産物として生じるグリセリンであってもよい。副産物として生じるグリセリンを用いることで、余剰物質処理にかかるエネルギー低減、廃棄による環境汚染の低減といった副次的な効果が得られ、環境負荷の低減にもつながる。さらに、副産物として生じるグリセリンは安価に購入できるので、生産コストの観点からも好ましい。
【００３０】
本発明のＰＧＡの生産方法において、ＰＧＡを生産するための炭素源としてグリセリンを用いる場合、培地中のグリセリン含有量は、使用する微生物種に応じて適宜選択することができる。具体的には、１％（ｗ／ｖ）以上が好ましく、５％（ｗ／ｖ）以上がより好ましく、１０％（ｗ／ｖ）以上がよりさらに好ましく、３０％（ｗ／ｖ）以下が好ましく、２０％（ｗ／ｖ）以下がより好ましい。
【００３１】
前記微生物の培養条件は、使用する微生物等に応じて適宜選択することができる。具体的には、至適温度は、好ましくは２０℃以上（好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上）、５０℃以下（好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下）である。至適ｐＨは、好ましくは５以上（好ましくは５．５以上、より好ましくは６．５以上）、８以下（好ましくは７．５以下、より好ましくは７以下）である。また、培養日数は、種菌接種後、１日以上（好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上）である。培養方法に特に制限はないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。
【００３２】
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた微生物菌体を除去する必要がある。菌体を除去する方法としては、遠心分離による方法、精密ろ過や限外ろ過膜を用いる方法、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法などが挙げられる。本発明では上記方法を適宜組み合わせて用いることも可能である。
また、培地からのＰＧＡの回収方法についても特に制限はなく、生産された物質を単離、回収する際に通常用いられる方法で行うことができる。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法などにより目的のＰＧＡを単離、回収することができる。
【００３３】
本発明により生産されたＰＧＡは、化粧品、医薬品、食品、水質浄化剤、保水材料、増粘剤などの様々な用途に使用することができる。特に、本発明の微生物のＰＧＡの生産性は他の微生物と比較して優れているので、ＰＧＡの生産コストを大幅に低減することができる。
【００３４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下微生物、及びＰＧＡの生産方法を開示する。
【００３５】
＜１＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４、又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物。
＜２＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２で特定される微生物が、配列番号７で示される塩基配列、又は配列番号７で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列、若しくは配列番号７において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で特定される微生物が、配列番号８で示される塩基配列、又は配列番号８で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列、若しくは配列番号８において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３で特定される微生物が、配列番号９で示される塩基配列、又は配列番号９で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列、若しくは配列番号９において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４で特定される微生物が、配列番号１０で示される塩基配列、又は配列番号１０で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列、若しくは配列番号１０において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物が、配列番号１１で示される塩基配列、又は配列番号１１で示される塩基配列と９９.５％以上、好ましくは９９.８％以上、の相同性を有する塩基配列、若しくは配列番号１１において１〜１４個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜３個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する、
前記＜１＞項に記載の微生物。
＜３＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２で特定される微生物が配列番号７で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で特定される微生物が配列番号８で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３で特定される微生物が配列番号９で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４で特定される微生物が配列番号１０で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有し、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で特定される微生物が配列番号１１で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の微生物。
＜４＞配列番号７で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡと、配列番号８で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡが、実質的に同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡである、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜５＞前記微生物がバシラス・リシェニフォルミスである、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜６＞前記微生物が野生型の微生物である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜７＞前記微生物がそれぞれ前記表１に記載の菌学的性質を有する、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜８＞前記微生物がそれぞれダルシトール非資化性の性質を有する、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の微生物。
＜９＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２で特定される微生物と受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で特定される微生物が互いに、前記表１に記載の菌学的性質について実質的に同じ性質を有する、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１０＞前記微生物が、グルタミン酸の非存在下、グリセリンを唯一の炭素源として含む培地で培養してＰＧＡを生産する、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１１＞前記７．５％グリセリン−Ｍ培地又は１０％グリセリン−Ｍ培地を用いて前記微生物を培養したとき、培地１Ｌ当たりの前記微生物のＰＧＡの生産能が１．２ｇ／４日以上、好ましくは３．０ｇ／４日以上、より好ましくは４．０ｇ／４日以上、さらに好ましくは６．０ｇ／４日以上、である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１２＞グリセリン含有量が１５％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養した場合、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株の生育度を１００％としたときの前記微生物の生育度が１１５％以上、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１３＞グリセリン含有量が２０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養した場合、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株の生育度を１００％としたときの前記微生物の生育度が１２０％以上、好ましくは２００％以上、より好ましくは２８０％以上、である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１４＞グリセリン含有量が１５％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの前記微生物の生育度が、グリセリン含有量が１０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの生育度の８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％以上、さらに好ましくは１２０％以上、である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１５＞グリセリン含有量が２０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの前記微生物の生育度が、グリセリン含有量が１０％（ｗ／ｖ）の培地を用いて培養したときの生育度の３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５５％以上、特に好ましくは７０％以上、である、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の微生物。
＜１６＞受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で特定される、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の微生物。
【００３６】
＜１７＞前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の微生物を培養してＰＧＡを生産する、ＰＧＡの生産方法。
＜１８＞グリセリンを炭素源として含む培地を用いて前記微生物を培養する、前記＜１７＞項に記載のＰＧＡの生産方法。
＜１９＞グリセリンを主な炭素源とし、有機酸、グルタミン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を補助的な炭素源とする培地を用いて前記微生物を培養する、前記＜１７＞又は＜１８＞項に記載のＰＧＡの生産方法。
＜２０＞グルタミン酸を含まず、グリセリンを唯一の炭素源として含む培地を用いて前記微生物を培養する、前記＜１７＞又は＜１８＞項に記載のＰＧＡの生産方法。
＜２１＞ＰＧＡを生産するための培地中の炭素源としてグリセリンを用いる場合、培地中のグリセリン含有量が１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下、である、前記＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載のＰＧＡの生産方法。
＜２２＞培地に含まれる前記グリセリンが、バイオ燃料などの製造時に副産物として生じるグリセリンである、前記＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項に記載のＰＧＡの生産方法。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。また、製造元を記載しない試薬には、一般に入手可能な試薬を使用することができる。
【００３８】
試験例１  微生物の取得
予め滅菌した４．０ｍＬの０．８５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液に国内各地で収集した土壌試料及び食品試料を添加し、攪拌、混合した後、８０℃にて３０分間加熱処理を行い、試料原液を調製した。この試料原液を、同様の塩化ナトリウム水溶液を用いて、１０-2倍、１０-4倍に希釈した試料希釈液を調製した。続いて、ＬＢ寒天培地（培地組成：１．０％（ｗ／ｖ）Bacto  trypton（Becton，Dickinson  and  Company）、０．５％（ｗ／ｖ）Yeast  extract（Becton，Dickinson  and  Company）、１．０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）及びMargaritis寒天培地（培地組成：３．８２％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム１水和物、１．０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、３．０６％（ｗ／ｖ）クエン酸３ナトリウム２水和物、２．０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％（ｗ／ｖ）塩化鉄６水和物、０．０２％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム７水和物、０．００３％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン４−５水和物、０．１％（ｗ／ｖ）リン酸水素２カリウム、０．１％（ｗ／ｖ）リン酸水素２ナトリウム１２水和物、０．００００５％（ｗ／ｖ）ビオチン、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に、前記試料原液及び試料希釈液を２００μＬずつ塗沫した後、３０℃にて２〜４日間培養した。恒温で培養した後、寒天培地上に出現したコロニーを選抜した。さらに、菌株純化のため、選抜したコロニーを土壌試料及び食品試料の塗沫に用いた同組成の寒天培地に白金耳に画線塗沫し、３０℃にて２〜４日間培養した。寒天培地上で単一コロニーとして生育した菌体を白金耳にて採取し、これらを２０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含有するＬＢ培地（培地組成：１．０％（ｗ／ｖ）Bacto  trypton（Becton，Dickinson  and  Company）、０．５％（ｗ／ｖ）Yeast  extract（Becton，Dickinson  and  Company）、１．０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）に懸濁した後、−８０℃にて凍結保存した。
【００３９】
実施例１
試験例１で選抜した微生物の−８０℃保存試料をＬＢ寒天培地上に画線塗沫し、３０℃にて一晩静置培養した。得られた単一コロニーを非特許文献２記載のＧＢ培地（培地組成：１．０％（ｗ／ｖ）極東ペプトン（極東製薬工業）、１．０％（ｗ／ｖ）プレメディア  普通ブイヨン培地（極東製薬工業）、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム（和光純薬工業）、ｐＨ７．０に調整）５ｍＬに接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて１８〜２４時間振とう培養を行った。さらに７．５％グリセリン−Ｍ培地（培地組成：７．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、１．８％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、０．１５％（ｗ／ｖ）リン酸水素２カリウム、０．０３５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン５水和物、３．０％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム）３０ｍＬに前記培養液０．６ｍＬ（２％（ｖ／ｖ））を接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行った。その後、各菌株のＰＧＡ生産性を測定した。
各菌株のＰＧＡ生産性の結果を表４に示す。
【００４０】
【表４】
2015070834.tif 000005
【００４１】
表４に示すように、非特許文献２と同様の実験条件下で培養を行った結果、公知のバシラス・サブチリスTAM-4株と比較して、本発明の微生物は高いＰＧＡ生産性を示すことを確認した。
また、公知の菌株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945ａ基準株においても、非特許文献５に記載の内容に反して、グリセリンを唯一の炭素源として、グルタミン酸非依存的にＰＧＡ生産することを新たに確認した。
【００４２】
実施例２
試験例１で選抜した他の微生物を含め、下記表５に示す微生物を、ＬＢ寒天培地上に画線塗沫し、３０℃にて一晩静置培養した。得られた単一コロニーをＬＢ培地５ｍＬに接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて１８〜２４時間振とう培養を行った。さらに７．５％グリセリン−Ｍ培地３０ｍＬに前記培養液０．６ｍＬ（２％（ｖ／ｖ））を接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行った。その後、各菌株のＰＧＡ生産性を測定した。
各菌株のＰＧＡ生産性の結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】
2015070834.tif 000006
【００４４】
表５に示すように、非特許文献２の実験条件に対して種培地組成の変更、及び培養条件の変更により、本発明の微生物はより高いＰＧＡ生産性を示すことを確認した。
また、培養条件を至適化することで、公知菌株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a基準株と比べ、本発明の微生物は、グリセリンを唯一の炭素源として、グルタミン酸非依存的に効率のよいＰＧＡの生産が可能であることを確認した。
【００４５】
実施例３
試験例１で選抜した微生物をＬＢ寒天培地上に画線塗沫し、３０℃にて一晩静置培養した。得られた単一コロニーをＬＢ培地５ｍＬと１０％グリセリン−Ｍ培地（培地組成：１０％（ｗ／ｖ）グリセリン、１．８％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、０．１５％（ｗ／ｖ）リン酸水素２カリウム、０．０３５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン５水和物、３％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム）の混合培地（ＬＢ培地：Ｍ培地＝２：８、以下「ＬＭ培地」とする）に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて１８〜２４時間振とう培養を行った。さらにこの培養液をＯＤ600が約０．１になるよう、前記培養液を１０％グリセリン−Ｍ培地３０ｍＬに接種し、３０℃、２１０ｒｐｍで５日間、振盪培養を行った。その後、各菌株のＰＧＡ生産性を測定した。
各菌株のＰＧＡ生産性の結果を表６に示す。
【００４６】
【表６】
2015070834.tif 000007
【００４７】
表６に示すように、本発明の微生物、特にバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株は、グリセリン濃度などの培養条件を最適化することでさらに高いＰＧＡ生産性を示すことを確認した。
【００４８】
実施例４
試験例１で選抜した微生物をＬＢ寒天培地上に画線塗沫し、３０℃にて一晩静置培養した。得られた単一コロニーをＬＢ培地５ｍＬに接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて１８〜２４時間振とう培養を行った。さらにＧＣ−Ｅ培地（培地組成：８％（ｗ／ｖ）グリセリン、１．８４％（ｗ／ｖ）クエン酸３ナトリウム２水和物、０．７％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）リン酸水素２カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水和物、０．０１４８％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン５水和物、０．０１５％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム２水和物、０．０００１７％（ｗ／ｖ）硫酸亜鉛７水和物、０．００００４３％（ｗ／ｖ）硫酸銅１水和物、０．０００００６％（ｗ／ｖ）塩化コバルト６水和物、０．０００７３％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム７水和物、０．０００００６％（ｗ／ｖ）モリブデン酸ナトリウム２水和物）３０ｍＬに前記培養液０．６ｍＬ（２％（ｖ／ｖ））を接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行った。その後、各菌株のＰＧＡ生産性を測定した。
各菌株のＰＧＡ生産性の結果を表７に示す。
【００４９】
【表７】
2015070834.tif 000008
【００５０】
表７に示すように、グリセリンを主な炭素源とし、有機酸を補助的な炭素源として含む培地を用いて本発明の微生物を培養した場合においても、本発明の微生物はＰＧＡの高生産が可能であった。
【００５１】
実施例５
試験例１で選抜した微生物をＬＢ寒天培地上に画線塗沫し、３０℃にて一晩静置培養した。得られた単一コロニーをＬＢ培地５ｍＬに接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて１８〜２４時間振とう培養を行った。さらにＧＣＭ−Ｅ培地（培地組成：８％（ｗ／ｖ）グリセリン、１．８４％（ｗ／ｖ）クエン酸３ナトリウム２水和物、２．５４％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム１水和物、０．７％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）リン酸水素２カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水和物、０．０１４８％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン５水和物、０．０１５％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム２水和物、０．０００１７％（ｗ／ｖ）硫酸亜鉛７水和物、０．００００４３％（ｗ／ｖ）硫酸銅１水和物、０．０００００６％（ｗ／ｖ）塩化コバルト６水和物、０．０００７３％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム７水和物、０．０００００６％（ｗ／ｖ）モリブデン酸ナトリウム２水和物）３０ｍＬに前記培養液０．６ｍＬ（２％（ｖ／ｖ））を接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行った。その後、各菌株のＰＧＡ生産性を測定した。
各菌株のＰＧＡ生産性の結果を表８に示す。
【００５２】
【表８】
2015070834.tif 000009
【００５３】
表８に示すように、グリセリンを主な炭素源とし、有機酸及びグルタミン酸を補助的な炭素源として含む培地を用いて本発明の微生物を培養した場合においても、本発明の微生物はＰＧＡの高生産が可能であった。
【００５４】
試験例２  微生物の生育度の測定
試験例１で選抜した微生物をＬＢ寒天培地上に画線塗沫し、３０℃にて一晩静置培養した。得られた単一コロニーをＬＢ培地５ｍＬに接種し、３０℃、２５０ｒｐｍにて１８〜２４時間振とう培養を行った。さらに１０％、１５％、２０％のグリセリンを含有するＭ／ＭＯＰＳ培地（培地組成：１０．０〜２０．０％（ｗ／ｖ）グリセリン、１．８％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、０．１５％（ｗ／ｖ）リン酸水素２カリウム、０．０３５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン５水和物、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（モノホリノプロパンスルホン酸、ｐＨ７．０））５ｍＬに前記培養液０．０５ｍＬ（１％（ｖ／ｖ））を接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで４日間、振盪培養を行った。
基準株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株を１０％グリセリン−Ｍ／ＭＯＰＳ培地で培養した場合の生育度（ＯＤ600）を１００とし、各菌株の生育度を相対値で測定した。その結果を表９に示した。また、各グリセリン濃度における前記基準株の生育度を１００として、１５％及び２０％グリセリン濃度それぞれにおける生育度の相対値で測定した。その結果を表９のカッコ内に示した。
【００５５】
【表９】
2015070834.tif 000010
【００５６】
表９に示すように、基準株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株は、高濃度グリセリン条件では生育度が大きく低下した。これに対し、本発明の微生物は高濃度グリセリン条件における生育度の低下が少なかった。
さらに、本発明の微生物において、グリセリン１５％における生育度がグリセリン１０％における生育度の９０％以上であるか、もしくは９０％以下であっても、グリセリン２０％における生育度がグリセリン１０％における生育度の５０％以上であることが特徴的であった。すなわちこれらの性質は、グルタミン酸の非存在下であってもグリセリンを唯一の炭素源として高いＰＧＡ生産性を示す株の、共通の特徴である可能性が示唆された。
また、基準株のバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株に比較し、グリセリン濃度１０％〜２０％を含む培地における本発明の微生物の生育度が高いことが共通の特徴である可能性が示唆された。具体的には、グリセリン濃度１０％〜２０％を含む培地における本発明の微生物の生育度が基準株と比較して、109％以上であることが、特徴であった。
【００５７】
試験例３  菌学的諸性質
前記バシラス・リシェニフォルミスの各菌株（ＫＳＭ−ＰＧ１２１株、ＫＳＭ−ＰＧ１１５株、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株、及びＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株）の菌学的性質の検討を行った。その結果を表１０に示す。
【００５８】
【表１０】
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【００５９】
糖からの酸及びガスの生成に関して、特定の糖類に対する資化性が、試験例１で選抜した菌株と公知菌株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a基準株との間で相違することが確認された。
具体的には、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株及びＫＳＭ−ＰＧ１２１株は、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ラムノース、ダルシトール、Ｄ−メリビオース、イヌリン、Ｄ−ラフィノース及びグルコン酸に対する資化性を有さず、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a基準株と相違している。
また、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３３、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３６及びＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は、ダルシトール、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＤ−ラクトースに対する資化性を有さず、基準株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株と相違している。
また、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株は、Ｄ−メリビオース及びＤ−ツラノースに対する資化性を有さず、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a基準株と相違している。
さらに、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は、Ｌ−ソルボース及びゲンチオビオースに対する資化性を有さず、基準株であるバシラス・リシェニフォルミスATCC9945a株と相違している。
【００６０】
表１０に示すように、バシラス・リシェニフォルミスATCC9945a基準株はダルシトール資化性を有する。これに対して、試験例１で選抜した菌株は、共通してダルシトール資化性を有さず、グルタミン酸の非存在下であってもグリセリンを唯一の炭素源として高いＰＧＡ生産性を示す株の、共通の特徴である可能性が示唆された。
【００６１】
さらに表１０に示すように、バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株とバシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株は、表１０に示す菌学的性質について実質的に同じ性質を有する。これらの菌学的性質は、グルタミン酸を含まずグリセリンを唯一の炭素源として含む培地を用いて培養した場合、特に高いＰＧＡ生産性を示すバシラス・リシェニフォルミスの特徴である可能性が示唆された。
【００６２】
試験例４  各菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の解析
前記バシラス・リシェニフォルミスの各菌株（ＫＳＭ−ＰＧ１１５株、ＫＳＭ−ＰＧ１２１株、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株、及びＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株）について、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列による菌学的同定を行った。
凍結保存菌体を１ｍＭ  ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）にて３０倍希釈したものをＰＣＲ反応の鋳型とし、表１１に示す塩基配列のプライマー27f及び1525rを使用してＰＣＲ反応を行い、１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域の全長ＤＮＡ断片を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間、鋳型ＤＮＡを変性させた後、９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間を１サイクルとして３０サイクル行い、さらに７２℃で２分間恒温した。得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域約１．５ｋｂのＤＮＡ断片について、表１１に示す塩基配列の、プライマー27f、f2L(-)、926f、rE1L、r2L'、及び1525rをそれぞれシークエンス用プライマーとして用い、ＤＮＡ塩基配列の解析を行った。尚、シークエンス解析試料の調製には、BigDye  Terminator  v3.1  Cycle  Sequencing  Kit（Life  Technologies）を用い、添付プロトコールに従い試料調製を行った。解析前の試料精製には、Montage  SEQ96  Sequencing  Reaction  Cleanp  kit（Merck  Millipore）を使用した。
【００６３】
【表１１】
2015070834.tif 000012
【００６４】
調製したシークエンス試料は、ＤＮＡシークエンサー（商品名：ABI  3130xl  Genetic  Analyzer、Life  Technologies）を用いて配列解析を行い、塩基配列を決定した。バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１２１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示す。バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＰＧ１１５株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号８に示す。バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示す。バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に示す。バシラス・リシェニフォルミスＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示す。
【００６５】
得られた各塩基配列をＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（遺伝子情報処理ソフトウェア、ゼネティックス社製）を用いて１断片化した。なお、配列番号７で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列との間で、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（遺伝子情報処理ソフトウェア、ゼネティックス社製）のホモロジー解析プログラムを用いて塩基配列の相同性を算出した。その結果、配列番号７で示される塩基配列と配列番号８は塩基配列で示される塩基配列との間で、相同性は１００％であった。この結果より、配列番号７で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡと、配列番号８で示される塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡは、実質的に同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡであり、ＫＳＭ−ＰＧ１２１株及びＫＳＭ−ＰＧ１１５株は同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡを有することが認められた。
【００６６】
配列の相同性検索は、公開データベースＮＣＩＭＢ（National  Center  for  Biotechnology  Information、http://www.ncbi.nlm.gov/）のメニュー”Nucleotide”内の”ＢＬＡＳＴ”のなかにある”Basic  BLAST”を用い、ＢＬＡＳＴプログラムから”nucleotide  blast”を選択した。検索対象のデータベースに”Reference  genomic  sequences（refseq_genomics）、選択プログラムに”Highly  similar  sequences（megablast）”を指定し、各塩基配列の相同性検索結果を基に近縁種の推定を行った。その結果を表１２に示す。
【００６７】
【表１２】
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【００６８】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果、前記菌株の全てがバシラス・リシェニフォルミス  ATCC14580株と最も相同性の高い１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を有していることが明らかとなった。
従って、前記菌株は菌学的性質と併せ、バシラス・リシェニフォルミスに類縁の安全性の高い微生物株であると判断した。
なお、バシラス・リシェニフォルミス  ＫＳＭ−ＰＧ１２１株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５２で寄託された。また、バシラス・リシェニフォルミス  ＫＳＭ−ＰＧ１１５株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５１で寄託された。また、バシラス・リシェニフォルミス  ＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株は、２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５３で寄託された。また、バシラス・リシェニフォルミス  ＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５４で寄託された。また、バシラス・リシェニフォルミス  ＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株は２０１３年２月２８日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５５５で寄託された。
【００６９】
試験例５  培養液上清試料中の高分子物質の同定
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（機種名：ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ、日立工機）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれる高分子物質について同定を行った。
分析対象となる上清試料０．５〜１．０ｍＬをスクリューキャップ付き試験管（商品名：ＳＴ−１５Ｓ、日本電子理化硝子）に採取し、この上清試料に対して２倍容のエタノールを新たに加えた。タッチミキサーで攪拌、混合した試料を４℃で一晩恒温放置した。その後、４℃、３，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（機種名：ｈｉｍａｃＣＦ７Ｄ２、日立工機）に供し、沈殿画分を回収した。続いて、沈澱画分を０．５ｍＬの１％ＮａＣｌ溶液に再度溶解し、２倍容のエタノールを添加し、生成した沈澱画分を上記同様の遠心分離条件にて回収した。回収した沈殿生成物は遠心エバポレーター（機種名：ＣＶＥ−２００Ｄ、ＥＹＥＬＡ）にて乾固させ、回収した固形分の重量を測定した。この乾固試料を蒸留水０．５ｍＬにて再度溶解させ、これに０．５ｍＬの濃塩酸を加え攪拌後、窒素封入し、１０５〜１１０℃にて１６時間加熱処理を行った。加熱処理後、ドラフト内で窒素気流下で塩酸及び水分を留去し（約６時間）、得られた乾固物を加水分解試料とした。
なお、ＰＧＡ標品として市販ＰＧＡ（分子量８８０ｋ、明治フードマテリア）、加水分解試料の対照として、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ及びＤ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ（和光純薬工業社製）を使用した。
【００７０】
続いて、得られた加水分解試料を適宜希釈して、全自動アミノ酸分析装置（機種名：Ｌ−８９００、日立ハイテクノロジーズ）にて試料中の各種アミノ酸分析、及びグルタミン酸の定量を行った。また、Ｌ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油）を用い、キット添付のプロトコール記載の方法に準じ、Ｌ−グルタミン酸量の測定を行った。全自動アミノ酸分析装置による測定では、光学活性異性体（Ｄ／Ｌ）の総量を定量結果として得た。これよりＬ−グルタミン酸測定キットにて得られた定量結果を差し引いた差分をＤ−グルタミン酸量とした。これらの結果を表１３に示す。
【００７１】
【表１３】
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【００７２】
上記方法により、グルタミン酸以外のアミノ酸はほとんど検出されなかったことから、培養上清中高分子物質をＰＧＡと判断した。
さらに、バシラス・リシェニフォルミスの各菌株（ＫＳＭ−ＰＧ１１５株、ＫＳＭ−ＰＧ１２１株、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３３株、ＫＳＭ−ＦＦＡ０３６株、及びＫＳＭ−ＦＦＡ０３９株）が生産したＰＧＡのＤ：Ｌ比は、これまでに報告されている、バシラス・リシェニフォルミスが生産したＰＧＡのＤ：Ｌ比と近い値であった。
【００７３】
試験例６  ＰＧＡの定量法
実施例１〜５で調製したＰＧＡの定量は、下記に示す方法により行った。
実施例１〜５にて実施した評価培養の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（機種名：ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ、日立工機）に供し、培養液上清試料を調製した。この上清試料を０．１Ｍ硫酸ナトリウムにて適宜希釈し、MULTI  SCREEN  MNHV４５（MILLIPORE製、０．４５μｍデュラポア膜）を用いて不溶物を除くための前処理を行った。この調製試料をＨＰＬＣ分析試料とし、ゲルろ過カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行った。分析カラムには、TSKGel  G4000PWXL及びTSKGel  G6000PWXL（商品名、東ソー）を用いた。溶離液は、０．１Ｍ硫酸ナトリウムを使用し、流速を１．０ｍＬ／分、カラム温度を５０℃、ＵＶ検出波長を２１０ｎｍとした。尚、濃度検定には、分子量８８万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて作成した検量線を用いた。
【配列表】
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