(57)【要約】【課題】  ペプチド型Ｈｙｐの血中移行性が高い、コラーゲン含有経口摂取用組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  水溶性コラーゲンペプチドと、テアフラビン類及び／又はエピカテキンが複合化して形成される、水不溶性複合体。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性コラーゲンペプチドと、テアフラビン類及び／又はエピカテキンが複合化して形成される、水不溶性複合体。
【請求項２】
前記水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、前記テアフラビン類を０．０００５−０．０９質量部、及び／又は前記エピカテキンを０．０００１−０．０３質量部混合することで形成される、請求項１に記載の水不溶性複合体。
【請求項３】
前記水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、前記テアフラビン類を０．０００８−０．０１質量部、及び／又は前記エピカテキンを０．０００２−０．００５質量部混合することで形成される、請求項２に記載の水不溶性複合体。
【請求項４】
請求項１−３のいずれかに記載の水不溶性複合体が配合された飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンペプチドとカテキン類の複合体、さらに詳しくは、ペプチド型コラーゲンの血中移行性が高い、経口摂取用コラーゲンペプチド・カテキン類複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨、軟骨等を構成するタンパク質の１種で、多細胞生物の細胞外基質（細胞外マトリックス）の主成分である。ヒトには複数のコラーゲン遺伝子があり、３０種類以上のコラーゲンタンパク質が同定されている。そのうち、生体内に最も多量に存在するのはＩ型コラーゲンで、約１，０００個のアミノ酸からなるポリペプチド鎖が３本（２本のα１鎖と１本のα２鎖、らせん状に会合してコラーゲン線維と呼ばれる線維状構造を形成している。当該コラーゲン線維の分子量は約３０万（＝約１０万×３本）で、水に難溶である（非特許文献１）。
【０００３】
コラーゲンのアミノ酸組成及び配列には顕著な特徴があり、グリシン（Ｇｌｙ）が約３０％、プロリン（Ｐｒｏ）とヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が合わせて約２１％、アラニンが約１１％を占め、“Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙはそれぞれ任意のアミノ酸）”が約３３０回繰り返している。前記ヒドロキシプロリン（以降、Ｈｙｐと略記することがある）はコラーゲンに特徴的なアミノ酸で、コラーゲン及びコラーゲン加水分解物（すなわち、コラーゲンペプチド）を同定・定量する際の指標として古くから用いられている（非特許文献１）。
【０００４】
食物として摂取されたタンパク質は、通常、胃でペプシンによってポリペプチドにまで分化され、その後十二指腸でトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ等、さらに、小腸でアミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ等の作用によって遊離アミノ酸にまで分解された後、小腸上皮細胞膜上に存在するアミノ酸トランスポーターを通って吸収されて血中に移行する。また、トリペプチド及びジペプチドの状態でも、当該上皮細胞膜上に存在するペプチドトランスポーターを通って血中移行し得ることが知られている。
【０００５】
前述したようにコラーゲン線維は水に難溶で消化されにくいため、食品市場では、コラーゲン線維を熱変性によって部分加水分解したゼラチンや、酵素処理によってさらに低分子化したコラーゲンペプチドが広く流通している。特に、コラーゲンペプチドについては、経口摂取による関節痛の緩和、骨密度の増加、紫外線照射による肌ダメージ（角質水分量の低下、表皮の過形成、真皮コラーゲンの減少等）の軽減等の効用が報告されており（非特許文献１）、健康食品としての期待が高まっている。
【０００６】
ヒトがコラーゲンペプチドを経口摂取すると、ほとんどはアミノ酸として吸収されるが、摂取後１−２時間後にＨｙｐ含有トリペプチド及び／又はジペプチド（以降、ペプチド型Ｈｙｐと呼ぶ場合がある）が血中に検出されることから、一部はトリ／ジペプチドの状態で吸収されることがわかっている（非特許文献２）。そして、最近の研究により、これらのペプチド型Ｈｙｐが、種々の細胞に対して有益な生理活性を発揮することが明らかにされつつある。
例えば、血中ペプチド型Ｈｙｐの代表であるＰｒｏ−Ｈｙｐジペプチドは、培養下のマウス皮膚片に投与すると、該皮膚片内の線維芽細胞の遊走能及び増殖能を促進することや（非特許文献２）、ヒト初代繊維芽細胞に対し、ヒアルロン酸合成酵素２の発現を亢進して細胞増殖を促進すること（非特許文献３）が報告されている。また、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、マウス軟骨前駆細胞株に作用して石灰化を阻害し得ることや（非特許文献４）、マウス骨芽細胞様細胞株に作用して骨芽細胞への分化を誘導し得ること（非特許文献５）も報告されている。
これらの研究結果から、コラーゲン又はコラーゲンペプチドの経口摂取によって得られる効用の多くは、主に血中移行したペプチド型Ｈｙｐに依るものと考えられている。
【０００７】
しかしながら、ペプチド型Ｈｙｐを経口摂取しても通常アミノ酸にまで完全に分解されるため、ペプチド型Ｈｙｐのまま吸収されることはほとんどない。よって、ペプチド型Ｈｙｐとして吸収するにはコラーゲンペプチドとして経口摂取する必要があるが、ごく一部しかペプチド型Ｈｙｐとして吸収されないため、当該効用を十分に得るには大量のコラーゲンペプチドを飲食しなくてはならないという問題があった。
【０００８】
この問題に対し、特許文献１では、主にパパインを用いて分子量５００以上２０００以下にまで消化したコラーゲンペプチドを経口摂取することにより、血中移行するペプチド型Ｈｙｐ量が有意に増加することを報告している。当該コラーゲンペプチドは、Ｎ末から２番目のアミノ酸においてハイドロキシプロリンの占める割合が２−２０モル％、３番目のアミノ酸においてグリシンの占める割合が２０−５０モル％で、且つ、分子量が５００−２０００であるために、消化管内での各種消化酵素への暴露時間が適切となり、ジペプチド／トリペプチドの状態のものが増えて前記効果が達成される旨が説明されている。
しかしながら、当該コラーゲンペプチドの調整は容易ではないうえに、飲食物の消化にかかる時間は種々の要因（摂取物の脂質含量、個人差、体調等）によって変動するという問題があった。
【０００９】
このような事情から、経口摂取したコラーゲンペプチドのうち、血中移行するペプチド型Ｈｙｐを簡便に増やすことができる新たな方法が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１２５９１０号
【特許文献２】特開２００８−１４８５８７
【特許文献３】特許第４６５３０５２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】小山洋一、皮革科学、第５６巻、第７１−７９頁、２０１０年
【非特許文献２】Iwai  K.,  et  al,  J.  Agric.  Food  Chem.,  53:6531-6536,  2005
【非特許文献３】Shigemura  Y.,  et  al,  J.  Agric.  Food  Chem.,  57:444-449,  2009
【非特許文献４】Ohara  H.,  et  al,  J.  Dermatol.,  37:330-338,  2010
【非特許文献５】Nakatani  S.,  et  al,  Osteoarthritis  Cartilage,  17:1620-1627,  2009
【非特許文献６】Kimura  Y.,  et  al,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.,  in press,  2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は前記従来技術が抱える問題を鑑みてなされたものであり、ペプチド型Ｈｙｐの血中移行性が高い、コラーゲン含有経口摂取用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために本発明者が鋭意検討を行った結果、コラーゲンペプチドを紅茶に混合して摂取すると、水や他飲料に混合して摂取した場合よりも、血中移行するペプチド型Ｈｙｐ量が大幅に増加することを見出した。そして、紅茶に含まれるテアフラビン類及び／又はエピカテキンがコラーゲンペプチドと複合体を形成し、該複合体の状態ではコラーゲンペプチドが消化酵素によって完全加水分解されにくくなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
さらに、前記水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、前記テアフラビン類を０．０００５−０．００９質量部、及び／又は前記エピカテキンを０．０００１−０．０３質量部混合した場合に、前記消化耐性を有する複合体が効率良く形成されることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］  水溶性コラーゲンペプチドと、テアフラビン類及び／又はエピカテキンが複合化して形成される、水不溶性複合体。
［２］  前記水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、前記テアフラビン類を０．０００５−０．０９質量部、及び／又は前記エピカテキンを０．０００１−０．０３質量部混合することで形成される、前記［１］に記載の水不溶性複合体
［３］  前記水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、前記テアフラビン類を０．０００８−０．０１質量部、及び／又は前記エピカテキンを０．０００２−０．００５質量部混合することで形成される、前記［２］に記載の水不溶性複合体。
［４］  前記［１］−［３］のいずれかに記載の水不溶性複合体が配合された飲食品。
【００１５】
なお、コラーゲンペプチドとカテキン類を含む飲料はこれまでも報告されているが、その多くは濁りや沈殿を呈さず、水不溶性の複合体は含まないと考えられる。濁りや沈殿は美観や食感を損なうものとして、多くの飲料において敬遠されるからである（例として、特許文献２、３）。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、経口摂取後にペプチド型Ｈｙｐの血中移行性に優れるコラーゲンペプチド・カテキン類複合体、ならびに該複合体を含有する飲食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】コラーゲンペプチドを各種飲料に混合して経口摂取した場合の、血中ペプチド型Ｈｙｐ濃度の経時変化を表すグラフである。各ドットは５人の被験者から得られた値の平均値を表す。
【図２】コラーゲンペプチドを各種飲料に混合して摂取した場合の、血中ペプチド型ＨｙｐのＡＵＣを表す。
【図３】コラーゲンペプチドを各種飲料に混合して摂取した場合の、血中遊離型ＨｙｐのＡＵＣを表す。
【図４】コラーゲンペプチドを各種飲料に混合して摂取した場合の、血中総ＨｙｐのＡＵＣを表す。
【図５】１００％紅茶抽出液と種々の濃度のコラーゲンペプチド水溶液を、１：１の質量比で混合した混合液の濁度を表すグラフである。
【図６】コラーゲンペプチドを、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌとなるように、種々の濃度の紅茶抽出液に混合した混合液の濁度を表すグラフである。
【図７】コラーゲンペプチドと紅茶飲料を混合して生じる沈殿の成分を、逆相クロマトグラフィーで解析した結果である。Ａ：コラーゲンペプチドと混合する前の紅茶成分、Ｂ：コラーゲンペプチドと共沈しなかった紅茶成分、Ｃ：コラーゲンペプチドと共沈した成分の解析結果（ＨＰＬＣチャート）を示す。
【図８】コラーゲンペプチドとテアフラビン類又はエピカテキンとの複合体に対し、人工消化を行い、生じた遊離型Ｈｙｐ量を測定した結果を表す。
【図９】コラーゲンペプチドの乾燥粉末と紅茶抽出液の乾燥粉末を各々人工口胃液に溶解し、その後両溶解液を混合した混合液の濁度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。なお、本書では、“水溶性”とは“２５℃の水に溶解して沈殿を生じない”ことを指す。よって、“水不溶性”とは、“２５℃の水に溶解せずに沈殿を生じる”ことを指す。また、本書では、ハイフンを用いて数値範囲を表す場合、該ハイフンの前後の数値を含むものとする。例えば、“平均分子量３０００−５０００”という記載は、“平均分子量３０００以上５０００以下”の意である。
【００１９】
＜コラーゲンペプチド＞
本発明に用いることができるコラーゲンペプチドは、コラーゲン又はゼラチンを加水分解して水溶性となったペプチドの集合物である。当該コラーゲンは、牛、豚等の哺乳動物、鶏等の鳥類、又は鮫等の魚類由来のいずれでもよく、特に限定されない。また、前記加水分解は、酸処理による加水分解、プロテアーゼによる加水分解のいずれであってもよいが、酸処理による場合には部分加水分解であることが好ましい。この目的に好適に用いることができるプロテアーゼとしては、エンドペプチダーゼが好ましく、例として、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、コラゲナーゼ等が挙げられる。
本発明には、前記加水分解処理によって平均分子量が７０００以下となったコラーゲンペプチドを好適に用いることができ、好適には１０００−６５００、さらに好適には２１００−６０００、最も好適には３０００−５０００となったコラーゲンペプチドである。なお、前記平均分子量は数平均分子量であることが好ましく、さらに好ましくはゲルクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法によって測定された数平均分子量である。
【００２０】
＜テアフラビン類及びエピカテキン＞
テアフラビン類及びエピカテキンは、いずれもカテキン類と呼ばれる茶ポリフェノールである。エピカテキン（CAS番号:490-46-0、分子量290.3、ＥＣと略記される）が生茶葉（特に、Cemellia  sinensisの葉）に元来含まれるカテキン類であるのに対し、テアフラビン類は、紅茶用茶葉を製造する工程（すなわち、発酵工程）等で茶カテキン類が酸化重合して生じるカテキン類である。
紅茶に含まれる代表的なテアフラビン類としては、テアフラビン（CAS番号:4670-05-7、分子量：564.5、ＴＦ１と略記される）、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（CAS番号:30462-34-1、分子量：716.6、ＴＦ２Ａと略記される）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（CAS番号:28543-07-9、分子量：716.6）、テアフラビン−３、３’−Ｏ−ジガレート（CAS番号:30462-35-2、分子量：868.7、ＴＦ３と略記される）が挙げられる。本発明にはこれらのテアフラビン類のいずれをも用いることができる。
なお、生茶葉に元来含まれるカテキン類（エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキン、ガロカテキンガレート、カテキンガレート、ガロカテキン、カテキン）は、通常茶カテキンと呼ばれている。
【００２１】
＜コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体＞
本発明では、ペプチド型Ｈｙｐの血中移行性の高い“コラーゲン含有経口摂取用組成物”として、前記水溶性コラーゲンペプチドに、前記テアフラビン類及び／又はエピカテキンが結合して水不溶性となった複合体を提供する。なお、本書における複合体とは、２種類以上の物質が非共有結合を介して結合することで形成される会合体を指し、当該複合体を形成する反応を複合化と呼んでいる。
【００２２】
本発明に係るコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体は、前記水溶性コラーゲンペプチドを、テアフラビン類及び／又はエピカテキンを含む水性溶媒に添加して混合することで、簡便に製造することができる。当該水性溶媒は、ｐＨ３．０−８．５、好ましくは、ｐＨ４．０−８．０、さらに好ましくは、ｐＨ５．０−７．５、最も好ましくは、ｐＨ６．０−７．０の水性溶媒であることが好ましい。ｐＨが３．０よりも低いと、コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体の形成率が低下する場合があり、また、ｐＨが８．５を超えると、テアフラビン類及びエピカテキンが変性する場合があるからである。前記コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの混合は、室温程度（具体的には、１０−３０℃、好ましくは１５−２５℃、最も好ましくは２０℃付近）で行うことができる。なお、当該水性溶媒は、他のカテキン類を含んでいてもよく、また、コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体形成を阻害しない範囲内で種々の成分を含むことができる。
【００２３】
本発明に係るコラーゲンペプチド・テアフラビン類複合体は、前記水性溶媒中で、水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、テアフラビン類が約０．０００５−０．０９質量部、好ましくは約０．０００８−０．０１質量部、より好ましくは約０．００１−０．００７質量部となるように混合することで、効率良く製造することができる。なお、前記テアフラビン類の質量は、ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂ、及びＴＦ３から選ばれる１種類以上のテアフラビン類の総量を指す。
また、本発明に係るコラーゲンペプチド・エピカテキン複合体は、前記水性溶媒中で、
水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、エピカテキンが約０．０００１−０．０３質量部、好ましくは約０．０００２−０．００５質量部、より好ましくは約０．０００５−０．００２質量部となるように混合することで、効率良く製造することができる。
テアフラビン類とエピカテキンは、競合することなく、互いの存在下でコラーゲンペプチドに結合して、水不溶性で且つ消化耐性を有する複合体を形成することができる。
【００２４】
本発明に好適に用いることができる前記水性溶媒として、紅茶抽出液が挙げられる。本発明に用いることができる紅茶用茶葉の種類は特に限定されることはなく、また、該抽出液は汎用の方法で製造することができる。
紅茶抽出液を用いてコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体を製造する場合には、目安として、汎用の方法で製造した紅茶抽出液（テアフラビン類及びエピカテキン含有量の総和が約０．０５−０．１５ｍｇ／ｍｌ程度）に対し、コラーゲンペプチドの終濃度が約１−１３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２．５−１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５−９０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０−８０ｍｇ／ｍｌとなるように添加・混合するとよい。
【００２５】
前記水性溶媒中で形成させたコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体は、当該溶液を５，０００−１０，０００×ｇ、好ましくは８，０００−１０，０００×ｇ程度の遠心力で遠心することで、当該複合体を沈殿として容易に回収することができる。その後、汎用の方法を用いて（例として、スプレードライ法、凍結乾燥法等）乾燥粉末化してもよく、乾燥粉末の状態では室温で長期保存可能である。
【００２６】
＜血中ペプチド型Ｈｙｐ＞
前述したように、ヒトがコラーゲン、ゼラチン、又はコラーゲンペプチドを経口摂取すると、Ｈｙｐ含有ジペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ）、及び／又はＨｙｐ含有トリペプチド（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）が血中に検出される（非特許文献２）。本発明における血中ペプチド型Ｈｙｐとは、これらのＨｙｐ含有ジペプチド及びトリペプチドのことであり、特に好ましくはＰｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、最も好ましくはＰｒｏ−Ｈｙｐである。なお、本発明におけるＨｙｐ（ヒドロキシプロリン）とは、Ｌ−プロリンの４位が水酸化された化合物（４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸）を指す。
【００２７】
“血中ペプチド型Ｈｙｐ量（すなわち、血中移行したペプチド型Ｈｙｐ量）”は、“血中総Ｈｙｐ量”から“血中遊離型Ｈｙｐ量”を引いた値として求めることができる。
“血中遊離型Ｈｙｐ量”とは“血中にアミノ酸単体として存在するＨｙｐ量”のことで、“アミノ酸として吸収されたＨｙｐ量”と同義である。当業者に周知の方法（例として、非特許文献２記載の方法）を用いて測定することができ、例えば、エタノールで除タンパクした血漿サンプル（エタノール可溶性画分）をサイズ排除クロマトグラフィーで分画して得られるアミノ酸画分に対し、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）処理を行って各アミノ酸をフェニルチオカルバミル誘導体（ＰＴＣ−Ｈｙｐ）に変換した後、逆相クロマトグラフィーを行ってＰＴＣ−Ｈｙｐ量を定量化してもよい。
“血中総Ｈｙｐ量”は、“血中に検出されるＨｙｐ及びＨｙｐ含有ペプチドの総量”で、“アミノ酸又はペプチドとして吸収されたＨｙｐ量”と同義である。当業者に周知の方法（例として、Sato  K.,  et  al,  J.  Agric.  Food  Chem.,  40:806-810,  1992）を用いて測定することができ、例えば、エタノールで除タンパクした血漿サンプルを塩酸で加水分解後、ＰＩＴＣ処理・逆相カラムクロマトグラフィーを行い、ＰＴＣ−Ｈｙｐ量として定量化してもよい。
【００２８】
＜コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体を配合した飲食品＞
本発明により、前記コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体を配合した種々の飲食品が提供される。当該複合体は、経口摂取後のペプチド型Ｈｙｐの血中移行性に優れるため（等量の非複合化コラーゲンペプチドを経口摂取した場合の約２倍）、該複合体を配合した飲食品を経口摂取することにより、従来よりも少ないコラーゲンペプチド摂取量（約半量）で、関節痛の緩和、骨密度の増加、紫外線照射による肌ダメージ（角質水分量の低下、表皮の過形成、真皮コラーゲンの減少等）の軽減等の効用が得られることが期待される。
【００２９】
本発明に係るコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体の飲食品における態様には、当該複合体が飲食品そのものである場合と、飲食品を製造する際の原料あるいは中間製品である場合とが含まれる。
【００３０】
本発明に係るコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体を配合する飲食品の形態は、固形状、半固形状（ゼリー・ゲル状）、液状のいずれであってもよい。当該飲料としては、例えば、茶系飲料、コーヒー飲料、炭酸飲料、果汁飲料、ミネラルウォーター、豆乳飲料、野菜飲料、スポーツ飲料、乳飲料等が例示される。また、当該食品としては、菓子類、乳製品、麺類、水産・畜産加工食品、油脂・油脂加工品等が好適な例として挙げられる。
【００３１】
本発明の飲食品におけるコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンとの複合体の配合量は、その生理作用や薬理作用が発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量を考慮すると、通常、成人１日当たりの摂取量が１００−１０，０００ｍｇ、好ましくは５００−６，０００ｍｇ、より好ましくは１，０００−３，０００ｍｇ程度であることが望ましい。例えば、固形状食品の場合には１−９０質量％、飲料等の液状食品の場合には０．１−２０質量％程度とすることができる。
本発明に係る飲食品には、コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンの結合を阻害しない範囲内で、通常飲食品に汎用される成分を適宜配合することができる。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例により本発明の範囲が限定されるものではない。まず、最初に、下記試験例１−５で用いた主な手法について説明する。なお、以下の試験例では、試料の遠心操作はすべて室温（約２０℃）で行った。
【００３３】
[手法１：コラーゲンペプチド水溶液の調整方法]
コラーゲンペプチド（豚皮由来コラーゲン加水分解物の乾燥粉末、平均分子量３０００−５０００、株式会社ニッピ製）を、所定濃度になるように水に溶解したものを用いた。
【００３４】
[手法２：紅茶又は緑茶抽出液の調整方法]
市販の紅茶用茶葉（紅茶用茶葉Ａ：リプトン  イエローラベル  ティーバッグ（ユニリーバ・ジャパン株式会社製）、紅茶用茶葉Ｂ：日東紅茶  Ｄａｙ＆Ｄａｙ（三井農林株式会社製））、又は緑茶用茶葉（お〜いお茶（株式会社伊藤園製））２．１ｇを約９０℃の湯１８０ｍｌに添加し、攪拌しながら３分間抽出を行った後、ろ過して上清を得た。本願実施例においてコラーゲンペプチドと混合した”溶媒”、”飲料”、”抽出液”は、すべて当該方法によって得られた”上清”のことである。コラーゲンペプチドと混合する場合には、当該上清を室温（２５℃）にまで冷ましてから所定の濃度のコラーゲンペプチド水溶液と混合した。
なお、本書では、“紅茶”、“緑茶”は各々“紅茶飲料”、“緑茶飲料”を意味し、これらの飲料の原料となる茶葉は“紅茶用茶葉”、“緑茶用茶葉”と称して区別している。
【００３５】
[手法３：血中ペプチド型Ｈｙｐ、遊離型Ｈｙｐ、及び総Ｈｙｐの測定方法]
エタノールで除タンパクした血漿サンプル（エタノール可溶性画分）をサイズ排除クロマトグラフィーで分画し（カラム：Superdex  Peptide  10/300GL(GEヘルスケア株式会社製)、ペプチド及びアミノ酸を含む画分を得た。当該画分を塩酸加水分解（減圧下１５０℃  １時間）し、ＰＩＴＣ処理した後に逆相クロマトグラフィー（カラム：LiChroCART  250-4（Merck株式会社製））を行い、ＰＴＣ−Ｈｙｐ量（＝血中総Ｈｙｐ量）を測定した。また、前記ペプチド及びアミノ酸を含む画分に対し、塩酸加水分解を行わずにＰＩＴＣ処理・逆相クロマトグラフィーを行うことで、ＰＴＣ−Ｈｙｐ量（＝血中遊離型Ｈｙｐ量）を測定した。前記”血中総Ｈｙｐ量”から前記”血中遊離型Ｈｙｐ量”を引いた値を、”血中ペプチド型Ｈｙｐ量”とした。
【００３６】
[手法４：水溶液中の遊離型Ｈｙｐ、及び総Ｈｙｐの測定方法]
水溶液に３倍量（v/v）のエタノールを添加し、遠心（１０，０００×ｇ、１５分）を行って上清を得た。該上清に対し、塩酸加水分解（減圧下１５０℃  １時間）を行い、ＰＩＴＣ処理した後に逆相クロマトグラフィー（カラム：LiChroCART  250-4（Merck株式会社製））を行うことで、ＰＴＣ−Ｈｙｐ量（＝血中総Ｈｙｐ量）を測定した。また、前記上清に対し、塩酸加水分解を行わずにＰＩＴＣ処理・逆相クロマトグラフィーを行うことで、ＰＴＣ−Ｈｙｐ量（＝遊離型Ｈｙｐ量）を測定した。
【００３７】
［試験例１：コラーゲンペプチドを溶解する溶媒の検討］
本発明者は、ヒトがコラーゲンペプチドを経口摂取した場合に吸収されるペプチド型Ｈｙｐ量を増加させるために、コラーゲンペプチドの摂取方法を入念に検討した。その結果、コラーゲンペプチドを添加する溶媒によって、血中ペプチド型Ｈｙｐ量が大きく変わることを見出した。
コラーゲンペプチドを、終濃度が２５ｍｇ／ｍｌとなるように６種類の溶媒（水、牛乳、紅茶、緑茶、コーヒー、又は飲むヨーグルト）に添加して混合し（各２００ｍｌ、飲むヨーグルトのみ、牛乳とタンパク量を合わせるために２２０ｍｌ）、５人の被験者に経口摂取してもらった。摂取前（０時間）、及び摂取後（０．５、１、２、４、６、８時間後）に前記被験者から血液を採取し、前記手法３に従って血中総Ｈｙｐ量、遊離型Ｈｙｐ量、及び血中ペプチド型Ｈｙｐ量を測定・算出した。当該血中ペプチド型Ｈｙｐ量を図１に示す。
【００３８】
図１に示されるように、コラーゲンペプチドを水（比較例１）に添加して摂取した場合には、摂取から約１時間後にかけて血中ペプチド型Ｈｙｐ量が増加し、その後急激に減少することがわかる。これに対し、コラーゲンペプチドを紅茶（実施例１）又はコーヒー（比較例２）に添加した場合には、水に添加して摂取した場合よりも血中ペプチド型Ｈｙｐ量の増加が早く、且つ、その後の減少が緩やかであった。一方、コラーゲンペプチドを緑茶（比較例３）、牛乳（比較例４）、又は飲むヨーグルト（比較例５）に添加した場合にはこのような効果は見られず、むしろ牛乳に添加した場合には、血中ペプチド型Ｈｙｐの増加が非常に遅くなる結果となった。
【００３９】
図１のグラフから、血中移行したペプチド型ＨｙｐのＡＵＣ（血中薬物濃度−時間曲線下面積）を算出した結果を図２に示す。同様に、血中遊離型Ｈｙｐ、血中総ＨｙｐについてＡＵＣを計算した結果をそれぞれ図３、図４に示す。図２より、コラーゲンペプチドを紅茶に添加・混合して経口摂取すると、水に添加・混合して経口摂取した場合と比べて、血中移行するペプチド型Ｈｙｐ量が約２倍に増加することが明らかとなった。
【００４０】
血中総ＨｙｐのＡＵＣ値（図４）は、小腸で吸収された“コラーゲンペプチド由来アミノ酸、ジペプチド、及びトリペプチドの総量”を表す値である。紅茶、コーヒー、牛乳、緑茶を溶媒とした場合の血中総ＨｙｐのＡＵＣ値は、水を溶媒とした場合の該値と有意差がないことから、これらの溶媒にコラーゲンペプチドを添加して摂取した場合に小腸で吸収される“コラーゲンペプチド由来アミノ酸、ジペプチド、及びトリペプチドの総量”に極端な差はないと考えられる。にも関わらず、紅茶を溶媒とした場合には、血中遊離型Ｈｙｐ量が有意に減少し（図３）、血中ペプチド型Ｈｙｐ量が有意に増加する結果となった（図２）。よって、これらの結果より、コラーゲンペプチドを紅茶に混合して経口摂取すると、水や他の飲料に混合して摂取した場合よりも、小腸において（アミノ酸にまで加水分解されずに）ジペプチド又はトリペプチドの状態のものの割合が高くなる可能性が示唆された。
【００４１】
［試験例２：コラーゲンペプチド添加による溶媒の濁度変化］
コラーゲンペプチドを紅茶に混合すると消化されにくくなる理由について、検討することにした。試験例１では、コラーゲンペプチドを水、緑茶、コーヒーに混合しても顕著な濁りは生じないが、紅茶に混合すると顕著に濁ることが観察された（牛乳と飲むヨーグルトについては不明）。そこで、この濁りについて詳しく調べることにした。
【００４２】
前記紅茶用茶葉Ａ、Ｂ、又は前記緑茶用茶葉の抽出液と、種々の濃度のコラーゲンペプチド水溶液（０−２００ｍｇ／ｍｌ）を、質量比１：１で混合して６００ｎｍの吸光度（すなわち、濁度）を測定した。結果を図５に示す。
【００４３】
興味深いことに、紅茶にコラーゲンペプチドを混合すると、該ペプチド量の増加に伴って濁度が急激に上昇するが、２０ｍｇ／ｍｌ（終濃度）で最大値となり、さらに該ペプチド量を増やすと濁度は減少に転じる結果となった（図５、実施例２、３）。すなわち、当該濁度の上昇は、高分子物質の濃度上昇による非特異的な凝集反応によるものではなく、コラーゲンペプチドと特定の紅茶成分間での比較的特異性のある反応に基づくものである可能性が示唆された。そこで、コラーゲンペプチドの量を２０ｍｇ／ｍｌ（終濃度）に固定して紅茶の終濃度を１００％から０％まで変化させたところ、図６に示されるようなシグモイドカーブが得られた（実施例４、５）。なお、終濃度が１００％の試験は、１００％の紅茶抽出液にコラーゲン乾燥粉末を直接添加して行った。
これらの結果から、コラーゲンペプチドは、紅茶中の特定の成分と反応して水不溶性の複合体を形成し得ることが示唆された。
なお、コラーゲンペプチドを緑茶に混合した場合には、該ペプチドの終濃度が０−１００ｍｇ／ｍｌの広い範囲において、濁度の実質的な上昇は認められなかった（図５の比較例６、図６の比較例７）。
【００４４】
［試験例３：コラーゲンペプチドと複合体を形成する紅茶成分の同定］
次に、コラーゲンペプチドが結合する紅茶成分の同定を試みた。
前記紅茶Ａ（２００ｍｌ）にコラーゲンペプチド（５ｇ）を添加して混合後、遠心（１０，０００×ｇ、１０分間）を行って上清と沈殿に分離した（実施例６）。前記コラーゲンペプチド添加前の紅茶Ａ（図７Ａ）、前記遠心後の上清（図７Ｂ）、及び、前記遠心後の沈殿をＳＤＳで可溶化した溶液（図７Ｃ）に対し、逆相クロマトグラフィー（カラム：Cosmosil  5C18-AR-II（ナカライテスク株式会社製）、移動相：０．１％ギ酸含有アセトニトリル、検出：２１５ｎｍ、２８０ｎｍ）を行って各溶液中に含まれる成分を分析した。各溶液の逆相クロマトグラフィーのＨＰＬＣチャートを図７Ａ−Ｃに示す。図７Ａは、紅茶に含まれる成分、図７Ｂは、紅茶成分のうち、コラーゲンペプチドと共沈しなかった成分、図７Ｃは、紅茶成分のうち、コラーゲンペプチドと共沈した成分を表している。
さらに、前記紅茶Ａ、紅茶Ｂ，緑茶（いずれもコラーゲンペプチド非添加）について、代表的なポリフェノールの含有量を解析した結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
図７Ａ及び表１より、紅茶には、［１］カフェインと、［２］エピカテキン、［３］エキガロカテキンガレート、［４］エピカテキンガレートといった茶カテキン類が多く含まれ、［５］テアフラビン（ＴＦ１）、［６］テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ａ）、［７］テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（ＴＦ２Ｂ）、及び［８］テアフラビン−３、３’−Ｏ−ジガレート（ＴＦ３）といったテアフラビン類はカフェイン及び茶カテキン類よりもかなり少ないことがわかる。そして、図７Ｂより、前記［１］、［３］、及び［４］は前記沈殿を除去した上清中にほぼ残存するが、［２］エピカテキンとテアフラビン類（［５］−［８］）は、前記上清から消失することが示された。さらに、図７Ｃより、前記上清から消失した成分［２］、［５］−［８］は、ほぼ全てコラーゲンと共沈していたことが明らかとなった。
なお、前記［１］、［３］、及び［４］の一部もコラーゲンと共沈し得ることが示されたが（図７Ｃ）、これらはいずれも、通常紅茶よりも緑茶に多く含まれる成分である。コラーゲンペプチドを緑茶に混合しても濁度が上昇しないことから（図５、６）、これらの成分（カフェイン、エキガロカテキンガレート、及びエピカテキンガレート）がコラーゲンペプチドに結合しても、水不溶性の複合体は形成されないと考えられる。
【００４７】
以上より、紅茶中に含まれるテアフラビン類（ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂ、及びＴＦ３）及び／又はエピカテキンが、コラーゲンペプチドと結合して水不溶性の複合体を形成することが明らかとなった。
【００４８】
なお、前記図５では、紅茶５０質量％水溶液中でコラーゲンペプチドの終濃度が５−６５ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０−４０ｍｇ／ｍｌの場合に、水不溶性の複合体が十分量形成されて濁度が顕著に上昇した。表１より、紅茶５０質量％水溶液１ｍｌ中にはテアフラビン類が約０．０３２ｍｇ−０．０３３ｍｇ（平均：０．０３２ｍｇ）含まれることから、紅茶にコラーゲンペプチドを混合して水不溶性のコラーゲンペプチド・テアフラビン複合体を得るには、テアフラビン類１質量部に対してコラーゲンペプチドを約１５０−２０００質量部、好ましくはテアフラビン類１質量部に対してコラーゲンペプチドを約３００−１２００質量部の範囲内で混合すると、前記複合体が効率良く形成されることが明らかとなった。当該混合比は、水溶性のコラーゲンペプチド１質量部あたりに換算すると、テアフラビン類が約０．０００５−０．００７０、好ましくは、０．０００８−０．００３３質量部である。
【００４９】
同様に、紅茶５０質量％水溶液１ｍｌ中には、エピカテキンが約０．００５ｍｇ−０．０１４ｍｇ（平均：０．０１０ｍｇ）含まれることから、紅茶にコラーゲンペプチドを混合して水不溶性のコラーゲンペプチド・エピカテキン複合体を得るには、エピカテキン１質量部に対してコラーゲンペプチドを約５００−６５００質量部、好ましくはエピカテキン１質量部に対してコラーゲンペプチドを約１０００−４０００質量部の範囲内で混合すると、前記複合体が効率良く形成されることが示された。当該混合比は、水溶性のコラーゲンペプチド１質量部あたりに換算すると、エピカテキンが約０．０００１−０．００２０、好ましくは、０．０００２−０．００１０質量部である。
【００５０】
［試験例４：テアフラビン類及びエピカテキンのコラーゲンペプチドとの複合体形成能］
次に、テアフラビン類及びエピカテキンが、各々単独でコラーゲンペプチドと水不溶性の複合体を形成できるかどうか、検討した。
各テアフラビン類及びエピカテキンの１ｍｇ／ｍｌ水溶液、ならびに、コラーゲンペプチド水溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）を調製し、下記の含有量になるように室温で混合した。なお、本願試験例には、以下の試薬を用いた。
＜テアフラビン類とエピカテキン＞
ＴＦ１：テアフラビン、ＴＦ２Ａ：テアフラビン−３−ガレート、ＴＦ２Ｂ：テアフラビン−３’−ガレート、ＴＦ３：テアフラビン−３、３’−ジガレート（いずれも和光純薬工業株式会社製）
エピカテキン：(-)-Epicatechin（Sigma-Aldrich社製）
【００５１】
＜反応液１ｍｌ中＞
・ＴＦ１（約０．１１３ｍｇ）、ＴＦ２Ａ（約０．１４３ｍｇ）、ＴＦ２Ｂ（約０．１４３ｍｇ）、ＴＦ３（約０．１７４ｍｇ）、又はエピカテキン（約０．０５８ｍｇ）
０．２μｍｏｌ
・コラーゲンペプチド                                      ２ｍｇ又は１０ｍｇ
・精製水                                                      残量
混合後、遠心を行って（８，０００×ｇ、１５分）上清と沈殿に分離した。当該上清に対し、前記手法４に従って総Ｈｙｐ量を測定した（＝“上清中の総Ｈｙｐ量”）。前記反応に用いたコラーゲンペプチド量（２ｍｇ又は１０ｍｇ）から前記“上清中の総Ｈｙｐ量”を引いた値を、“複合体中の総Ｈｙｐ量”として算出した。各々の総Ｈｙｐ量を割合（％）で表した結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
表２より、前記テアフラビン類及びエピカテキンのいずれもが、単独で効率良くコラーゲンペプチドと結合して水不溶性の複合体を形成できることが確認された（実施例７−１１）。特にＴＦ２Ｂ（実施例１０）及びＴＦ３（実施例１１）はコラーゲンペプチドとの複合体形成能が高く、これらのテアフラビン類の存在下では９０％以上のコラーゲンペプチドが水不溶性複合体を形成することが示された。
【００５４】
さらに、上記結果より、前記各カテキン類に対し、ごく微量のコラーゲンペプチドを添加・混合するだけで、当該カテキン類とコラーゲンからなる水不溶性の複合体が形成されることが確認された。上記反応に用いた各カテキン類とコラーゲンペプチドの質量比は、コラーゲンペプチド１ｍｇに対し、ＴＦ１が約０．０１１３ｍｇ又は０．０５６５ｍｇ、ＴＦ２Ａ／ＴＦ２Ｂが約０．０１４３ｍｇ又は０．０７１６ｍｇ、ＴＦ３が約０．０１７４ｍｇ又は０．０８７０ｍｇ、エピカテキンが約０．００５８ｍｇ又は０．０２９０ｍｇである。よって、コラーゲンペプチド１質量部に対し、各テアフラビン類を約０．０９０ｍｇまで、エピカテキンを約０．０３０ｍｇまで混合しても、水不溶性の複合体が得られることが確認された。
【００５５】
上記試験例４（表２）及び試験例２（図５）の結果より、水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、テアフラビン類が（テアフラビン類総量として）約０．０００５−０．０９質量部、好ましくは約０．０００８−０．０１質量部、より好ましくは約０．００１−０．００７質量部となるように混合すると、水不溶性のコラーゲンペプチド・テアフラビン複合体が効率良く形成されることが明らかとなった。
同様に、水溶性コラーゲンペプチド１質量部に対し、エピカテキンが約０．０００１−０．０３質量部、好ましくは約０．０００２−０．００５質量部、より好ましくは約０．０００５−０．００２質量部となるように混合すると、水不溶性のコラーゲンペプチド・エピカテキン複合体が効率良く形成されることが示された。
【００５６】
［試験例５：コラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキン複合体の消化耐性］
試験例１−４の結果より、コラーゲンペプチドはテアフラビン類及び／又はエピカテキンと複合体を形成することにより、消化されにくくなる可能性が示唆される。そこで、当該複合体の消化耐性について検討した。
【００５７】
試験例４と同じ手法を用いて、テアフラビン類（ＴＦ１、ＴＦ２Ａ、ＴＦ２Ｂ、又はＴＦ３）あるいはエピカテキン各１ｍｇと、コラーゲンペプチド２．５ｍｇを混合し、複合体を形成させた。また、コラーゲンペプチドのみを含む溶液を陰性コントロールとした。これらの溶液に、パンクレアチン（パンクレアチン（和光純薬工業株式会社製）、５．２−９．２Ｕ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine  Aminopeptidase,  microsomal  from  porcine  kidney（Sigma-Aldrich社製）、２．８Ｕ）、及びカルボキシペプチダーゼ（Carboxypeptidase  A  from  bovine  pancreas（Sigma-Aldrich社製）、１７．８Ｕ）を添加し、１Ｍ  トリスバッファー（ｐＨ８．０）中で３７℃で４８時間インキュベートすることにより、コラーゲンペプチドの消化を行った（反応系の容量：３００μｌ）。当該反応系は、十二指腸及び小腸でのタンパク質の消化を模倣した人工消化系である。なお、通常、飲食物が約１−６時間で十二指腸及び小腸を通過することを考慮すると、当該人工消化系はかなり厳しい条件下での消化反応といえる。
前記インキュベーション後、前記反応液を遠心して（１０，０００×ｇ、１５分）前記複合体を沈殿として除去し、上清を回収した。当該上清に含まれる遊離型Ｈｙｐ量を、前記手法４に従って測定した。結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
表３より、コラーゲンペプチドをテアフラビン類又はエピカテキンと複合体形成させてから人工消化すると、コラーゲンペプチド単独で人工消化した場合と比べて、上清に回収される遊離型Ｈｙｐ量（すなわち、アミノ酸にまで加水分解されたコラーゲンペプチド量）が約４４．３−７０．９％にまで減少することが明らかとなった。前述したように、前記人工消化反応は非常に厳しい消化反応であることから、コラーゲンペプチドとテアフラビン類又はエピカテキンとの複合体は、（特に、十二指腸及び小腸での）消化に対して強い耐性を有していることが示された。
【００６０】
よって、コラーゲンペプチドは、テアフラビン類及び／又はエピカテキンと水不溶性の複合体を形成することにより、十二指腸及び膵液中の消化酵素で消化されにくくなり、アミノ酸にまで完全に分解されるものが減少することが示された。
【００６１】
さらに、本発明者は、コラーゲンペプチドとテアフラビン類は人工胃液中では複合体を効率良く形成できないため、予め複合体を形成させてから経口摂取する必要があることを確認している。
紅茶Ａ抽出液の凍結乾燥粉末（フリーズドライパウダー）とコラーゲンペプチドの乾燥粉末を、それぞれ人工胃液（０．２％ＮａＣｌ水溶液、ｐＨ１．２）に溶解した溶液を調整した。それぞれを、紅茶抽出液に換算した終濃度が５０質量％、コラーゲンペプチドの終濃度が０−１００ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、該混合液の濁度（６００ｎｍの吸光度）を測定した。すなわち、本願試験例２の解析（図５）において、溶媒を”水”から”人工胃液”に変えて行った試験である。結果を図８に示すが、図５と異なり、濁度の上昇が非常に少なく（最高値を比較しても図５の５分の１程度）、人工胃液中ではコラーゲンペプチドと紅茶成分は効率良く複合体を形成できないことが示された。
【００６２】
以上、試験例１−５の結果より、水溶性コラーゲンペプチドは、テアフラビン類及び／又はエピカテキンと水不溶性の複合体を形成し、該複合体を経口摂取すると、血中移行するペプチド型Ｈｙｐ量が顕著に増加することが示された。
【００６３】
以下に、本発明に係るコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンの複合体を配合した飲食品の実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の配合量はいずれも質量％を表す。
【００６４】
以下に、本発明に係るコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンの複合体を配合した飲食品の実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の配合量はいずれも質量％を表す。
【００６５】
［実施例１７：野菜ジュース］
＜処方＞
成分                                                              配合量
（１）コラーゲンペプチド                                            ０．４
（ＩＸＯＳ  ＨＤＬ−５０Ｆ、平均分子量５０００、新田ゼラチン株式会社製）
（２）紅茶抽出液                                                  １０．０
（３）野菜搾り汁                                                  ７０．０
（４）リンゴ５倍濃縮果汁                                            ５．０
（５）レモン３倍濃縮果汁                                            ２．０
（６）アスコルビン酸ナトリウム                                      ０．０５
（７）精製水                                                        残余  
合計                                                          １００．０
＜製法＞
成分（１）を１０ｍｌの（７）に溶解した後、（２）と混合した。当該混合液に、（７）の残量と（３）−（６）を混合して野菜ジュースを得た。
【００６６】
［実施例１８：錠剤］
＜処方＞
成分                                                              配合量
（１）コラーゲンペプチド・テアフラビン複合体
実施例６で得た沈殿の乾燥粉末                              １０．０
（２）乳糖                                                      ７５．０
（５）アスコルビン酸ナトリウム                                  １０．０
（６）乾燥コーンスターチ                                          ３．０
（７）タルク                                                      １．８
（８）ステアリン酸ナトリウム                                      ０．２
合計                                                        １００．０
＜製法＞
成分（１）−（８）を均一に混合した混合物を単発式打錠機を用いて打錠し、直径５ｍｍ、質量１５ｍｇの錠剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明に係るコラーゲンペプチドとテアフラビン類及び／又はエピカテキンの複合体は、製造が容易なうえに、安定に長期保存できるため、飲食品の原料としての価値が非常に高いものである。当該複合体を配合することで、コラーゲンの薬理効果を担う“ペプチド型Ｈｙｐ”の吸収性に優れる飲食品を、簡便に製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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