(57)【要約】【課題】コラーゲン生成促進効果を効率的に十分に高めることができるコラーゲン生成促進剤並びにそれを用いた美容・化粧品及びサプリメントを提供すること。【解決手段】β１，３Ｄグルカンを含有するβグルカンを有してなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β１，３Ｄグルカンを含有するβグルカンを有してなることを特徴とするコラーゲン生成促進剤。
【請求項２】
前記βグルカンに占める前記β１，３Ｄグルカンの割合が５０パーセント以上であることを特徴とする請求項１に記載のコラーゲン生成促進剤。
【請求項３】
前記β１，３Ｄグルカンとともに、豚由来コラーゲンとＢＣＡＡとグルタミンを有することを特徴とする請求項１又は２に記載のコラーゲン生成促進剤。
【請求項４】
前記β１，３Ｄグルカンとともに、還元型コエンザイムＱ１０を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン生成促進剤。
【請求項５】
前記β１，３Ｄグルカンとともに、アスコルビン酸、又はアスコルビン酸カルシウム等に類似する成分を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン生成促進剤。
【請求項６】
前記β１，３Ｄグルカンが、ハナビラタケ由来であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のコラーゲン生成促進剤。
【請求項７】
前記β１，３Ｄグルカンが、ハナビラタケの胞子由来であることを特徴とする請求項６に記載のコラーゲン生成促進剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲン生成促進剤を用いた美容・化粧品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のコラーゲン生成促進剤を用いたサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン生成促進剤並びにそれを用いた美容・化粧品及びサプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、生体内に存在するたんぱく質の一種で、皮膚に最も多く存在する。体外部から取り入れる場合は、高分子物質であるため、保水効果が強く、また、アレルギーを誘発しない（感作が無い）ため、美容・化粧品の素材として注目されている。服用する場合は、小腸で消化・吸収され、アミノ酸に分解されて再び体内でコラーゲンを生成する元になる。
【０００３】
コラーゲンは、生体内の線維芽細胞で生成されるが、紫外線ダメージや酸化すること等で劣化する。劣化したコラーゲンは本来の機能を失うため、新陳代謝作用により、体内の分解酵素によってアミノ酸に分解される。そして、分解された一部のアミノ酸から新しいコラーゲンが生成される。このコラーゲンの生成と分解とが繰り返されることで、肌質は保たれる。
ところで、コラーゲン生成力は、加齢やストレス等により劣化する。コラーゲン生成力が劣化すると、肌が弾力性を失いシワが生じ易くなる。張りがありシワのない瑞々しい肌質を保つには、コラーゲン生成力を活性化する必要がある。
従来、コラーゲン生成を促進するコラーゲン生成促進剤としては、例えば、次の特許文献１に記載のシロキクラゲ科キノコの抽出物を含有したものが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１３１５５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１に記載のものにおいては、シロキクラゲ科キノコの抽出物のうちのコラーゲン生成促進に寄与する成分については特定がなされておらず、特定された成分によるコラーゲン生成促進に至るメカニズムまでは解明されていない。このため、従来は、コラーゲン生成促進効果を効率的に十分に高めることのできるコラーゲン促進剤は存在しなかった。また、肌質の改善には、コラーゲンなど肌を構成する物質を食すことで体内に取り込み、体内のコラーゲン生成能力により合成する方法があるが、この方法は体内のコラーゲン生成能力は個体差や加齢、外部環境の変化などの要因により安定化しない。その他に、電磁波を身体に照射する「ＧＦＲ治療」といわれる方法があるが、この方法は短期間改善するだけで長期間の維持が出来ない。
【０００６】
本発明は、従来の課題に鑑みてなされたものであり、コラーゲン生成促進効果を効率的に十分に高めることができるコラーゲン生成促進剤並びにそれを用いた美容・化粧品及びサプリメントを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するため、本発明によるコラーゲン生成促進剤は、β１，３Ｄグルカンを含有するβグルカンを有してなることを特徴としている。
【０００８】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、前記βグルカンに占めるβ１，３Ｄグルカンの割合が５０パーセント以上であるのが好ましい。
【０００９】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、前記β１，３Ｄグルカンとともに、豚由来コラーゲンとＢＣＡＡとグルタミンを有するのが好ましい。
【００１０】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、前記β１，３Ｄグルカンとともに、還元型コエンザイムＱ１０を有するのが好ましい。
【００１１】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、前記β１，３Ｄグルカンとともに、アスコルビン酸、又はアスコルビン酸カルシウム等に類似する成分を有するのが好ましい。
【００１２】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、前記β１，３Ｄグルカンが、ハナビラタケ由来であるのが好ましい。
【００１３】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、前記β１，３Ｄグルカンが、ハナビラタケの胞子由来であるのが好ましい。
【００１４】
また、本発明による美容・化粧品は、上記本発明のいずれかのコラーゲン生成促進剤を用いたことを特徴としている。
【００１５】
また、本発明によるサプリメントは、上記本発明のいずれかのコラーゲン生成促進剤を用いたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、コラーゲン生成促進効果を効率的に十分に高めることができるコラーゲン生成促進剤並びにそれを用いた美容・化粧品及びサプリメントが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】人間の肌（皮膚）の構造を模式的に示す説明図である。
【図２】実施例１の試験結果として、ハナビラタケ抽出液の濃度に対するNO産生量を示すグラフである。
【図３】実施例２の試験結果として、ハナビラタケ抽出液の濃度に対するマクロファージの貪食率を示すグラフである。
【図４】実施例２の試験結果として、マクロファージの貪食作用により細胞内に取り込まれた、IgGコートビーズの様子を示す写真であり、(a)は陰性対照区でのビーズの様子を示す写真、(b)はハナビラタケ抽出液の濃度が500ppmのときのIgGコートビーズの様子を示す写真、(c)は陽性対照区でのIgGコートビーズの様子を示す写真である。
【図５】実施例３の試験結果として、ハナビラタケ抽出液の濃度に対するフィブロネクチン産生量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施形態の説明に先立ち、本発明を想到するに至った過程及び本発明の作用効果を説明する。
本件出願人は、コラーゲン生成の仕組みについて考察・検討を重ねた結果、人肌成分であるコラーゲン生成の仕組みは免疫機能（作用）に大きく関与していること、及びコラーゲンとβグルカンが免疫機能を活性化できるという仮説のもとに、コラーゲン生成のメカニズムを解明する試みを経て本発明に想到するに至った。本件出願人はハナビラタケの大量生産に関与しているが、そのときにハナビラタケ胞子が肌についたときに、肌質改善が顕著に確認できたことより、何らかの作用があると確信し研究を行った。胞子量により、肌に炎症が確認できたが、この原因が過剰な免疫的な作用であることを確認し、ハナビラタケ胞子成分が免疫に作用し、同胞子の外郭は純粋なβ１，３Ｄグルカンに少量のβ１，６Ｄグルカンにより構成されていることを確認し、その成分と免疫との関係を研究してきた。
【００１９】
高齢化とともに肌は劣化していくが、その劣化の判断基準となるのがシワの数である。一般に、肌質が良いこと（シワが少ないこと）が、若さを実感できる基準となっており、肌質を改善することは、美容における重要な要素となっている。
【００２０】
ところで、シワには大別して、「小ジワ」と「加齢シワ（深いもの）」の２種類がある。
小ジワの原因は、肌外壁の角質層の表面が乾くことによって、角質層が剥がれやすくなって隙間ができ、その隙間から肌内にある水分が蒸発し、肌が硬くなって乾燥肌になることによる。
小ジワは、水分を肌に与えることで改善されるため、パックや化粧水などで簡単に対処できるが、持続性は低い。
【００２１】
一方、加齢等による深いシワ改善は、一般に、治療を伴い改善が難しいものと認識されている。
加齢シワの原因としては、コラーゲン劣化（加齢による新陳代謝低下と紫外線破壊）が大きく関与していることが知られている。
【００２２】
人間の肌（皮膚）は、図１に示すように、上から角質、表皮、真皮、皮下組織の大きく４層に分かれている。そのうち９５％を真皮が占め、その真皮の約７０％（水分を除いた乾燥重量）がコラーゲンといわれている。
表皮は、上から角質層、顆粒層、有棘層、基底層の４部に分かれ、基底層では絶えず表皮細胞が分裂している。新しく生まれた細胞は次々と押し上げられ、ほぼ２週間で角質層に達し、角質細胞となって２週間ほど留まり、最後には垢となって、はがれ落ちていく。
【００２３】
コラーゲンは、３本の鎖状の繊維が「らせん状」に絡まった特殊な構造をしたタンパク質の一種であり、バネのように伸び縮みすることにより、肌のツヤと張りを保つ作用を有する。また、コラーゲンは、他のタンパク質とは異なり、アミノ酸の組成が特殊であり「ヒドロキシプロリン」というアミノ酸をたくさん含んでいる。さらに、コラーゲンは、通常のタンパク質に存在している身体に悪影響のある「感作（アレルギーなど抗原抗体反応で、ある抗原に対し敏感な状態にすること）」が無く、アレルゲンにならない特殊なタンパク質であり、生物の体を構成するのに適している。
【００２４】
近年、美容において、コラーゲンを摂取することが主流になっている。摂取されたコラーゲンは小腸でアミノ酸に分解され腸管から吸収される。肌質の悪い女性においては、コラーゲンの吸収を目的として、超低分子化されたコラーゲンや、コラーゲンより分解されたアミノ酸ペプチドの服用が人気になっている。
コラーゲンは、タンパク質をベースにアミノ酸がくっついて合成されるが、そのベースとなるアミノ酸合成を促進するには、ＢＣＡＡ（バリン・ロイシン・イソロイシンの総称）＋グルタミンという成分がその再生成において特に重要である。
ＢＣＡＡなどの成分は、豚由来のコラーゲン等と共に服用することで効果が上がる。高分子であっても豚由来が良いのはコラーゲンが人体に近い成分のためであり、魚由来の超低分子コラーゲンよりも人体になじみやすく肌質改善効果が期待できる。
肌のコラーゲンは、体内に吸収されたアミノ酸等を原料として合成される。
【００２５】
コラーゲンは、主に真皮層にある線維芽細胞（せんいがさいぼう）で生成されるが、コラーゲンベースの栄養素を服用しただけでは生成されない。線維芽細胞における、小腸より吸収したアミノ酸を合成するためのコラーゲンをつくる能力（線維芽細胞の活性化）が重要となる。
また、コラーゲンは、線維芽細胞で生成される一方で、自らが酸化などにより劣化するとコラーゲンとしての機能を維持できない。そして、劣化したコラーゲンは新陳代謝作用によりコラゲナーゼなどの分解酵素によってアミノ酸に分解される。他方で、新陳代謝作用により再度新しいコラーゲンが合成される。
このコラーゲンの生成と分解が正常に繰り返されることで肌質が保たれ、肌は常に健康で張りのある、みずみずしい状態を保つことができる。
【００２６】
一方、加齢に伴い新陳代謝が衰え、それにより線維芽細胞のコラーゲンの生成力が鈍ってくる。その結果、新しく生成されるコラーゲンが少なくなるとともに、古くて機能しないコラーゲンが多くなって肌の劣化に繋がる。コラーゲンが老化などにより劣化すると、水分量が減少し固くなる。本来は古くなったコラーゲンは酵素等により分解されるが加齢により代謝機能は衰え、古く硬いコラーゲンが多くなる。硬いコラーゲンは弾力性を失い、肌質を悪化させる。
このように、加齢により新陳代謝が劣化するとコラーゲン生成機能が衰退（老化）し、生成と分解のバランスを崩し、優良なコラーゲン不足（生成能力低下）に陥る。その結果、肌のコラーゲンは衰退し表皮を支える弾力を失い、表皮が陥没して深いシワが発生・増加する。
【００２７】
また、シワを増やす別要因として紫外線問題（コラーゲンや細胞の破壊）がある。
シワの原因として日焼けは有名であるが、これは紫外線（肌への物理的ストレス）である長波長ＵＶＡ、中波長ＵＶＢが作用する。
紫外線をブロックするものとしてはＵＶカット化粧品があるが、ＵＶカット化粧品はコラーゲンの破壊を抑える効果を有するだけであって、コラーゲンの生成には関与しないため、シワ防止でありシワ改善効果は得られない。
【００２８】
肌は表面の基底膜にIV型コラーゲン、深層部の真皮にはI型コラーゲンが存在して肌を支えており、これらのコラーゲンにより肌の張りが保たれる。
紫外線は、肌にあたると炎症反応を引き起こしてしまうため、その場所に「分解酵素」が沢山作られる。代謝機能により分解酵素が多くなるのは、細胞が紫外線によってダメージを受けるため、酵素により分解し老廃物として血管から体外に排出しなければならないためである。この分解酵素は、コラーゲンまでも切断して消滅させてしまい、結果的にコラーゲン量が減りシワが発生するだけでなく、前述のように古く硬いコラーゲンが多くなっていると、その老廃物（肌質をさらに悪化させるもの）は硬いコラーゲンに遮られ血管に排出できず体内にとどまってしまうという悪循環になる。
若齢者は、コラーゲンを再生成できる力が高い（４０歳以上加齢者の２倍以上ある）ため、このようなダメージや傷等を修復できるが、高齢者は、ダメージや傷等を修復することが難しい。
【００２９】
従来、コラーゲン生成能力を高める仕組みは明確には解明されていない。
しかるに、本件出願人は、検討を繰り返した結果、コラーゲン生成能力を高める仕組みとして、コラーゲン生成の仕組みは免疫機能（作用）に大きく関与しており、コラーゲンとβグルカンが免疫機能に作用し活性化することが、当該コラーゲンの生成促進につながるという仮説（推測）を立てるに至った。
【００３０】
新陳代謝には免疫細胞であるマクロファージが深く関与していることが確認されている。
人体には外敵や異物から身体を守る力「免疫力」が備わっている。免疫力の中心となって働いているのが白血球という細胞である。白血球は血液の血球部分の３％を占めていて、血流に乗り全身を循環している。白血球の一種である単球は、血管の外に出るとマクロファージというアメーバ状の細胞に変身し、必要な時は細胞分裂して数を増やす。
【００３１】
マクロファージは、細菌などの害を及ぼす外敵だけでなく、劣化し死んだ細胞や老廃物を食べて体内の掃除をし、身体を正常に保つ役割を果たす。このため、マクロファージは、肌の新陳代謝にも深く関係している。
真皮層のマクロファージが活性化すると、そこからサイトカインと言われる物質が放出される。そして、サイトカインが肌の中の線維芽細胞を活性化させ、線維芽細胞が肌の張りを保つ材料のコラーゲンを生成する。また、マクロファージは上皮成長因子（ＥＧＦ）の分泌促進も確認されており、肌細胞の成長と増殖に関与している。
【００３２】
白血球は、大別して顆粒球・リンパ球・単球の３種類に分かれ、複雑なネットワークの中で高度な働きをしている。
身体のどこかで何か異変が起こると、まずマクロファージが自己外の敵（＝人体に有害な異物）と認識したもの（細菌など）を飲みこみ分解・自爆し体を守る。
肌（皮膚）が老化する最大の原因は、コラーゲンの新陳代謝の衰えと言われている。コラーゲンが古くなると、柔軟性がなくなり、水分を保つ場所も狭められる。
マクロファージは新陳代謝に関与し、線維芽細胞にコラーゲンを生成する指令（作用）を出す。また、生成されたコラーゲンがマクロファージを活性化することも確認されており、相乗的に関係している。
【００３３】
京都大医用高分子研究センターの研究発表によれば、コラーゲンはマクロファージを百倍程度も活性化することが、実験（癌細胞にマクロファージを攻撃させる際、コラーゲンを加えるとマクロファージはコラーゲンを取り入れて活動が急激に上昇する）により証明されている。
体を構成する細胞自体は、その活動のために酸素や栄養素を補充し、老廃物の排除を行う必要があり、そのために細胞近くに毛細血管が存在する。
マクロファージは、その血管中を移動（血管中では白血球）したり、細胞の間に入り込んだり（アメーバ状に変化）して存在し、異物進入やダメージを監視する。
そして、マクロファージが細胞領域に進入してくる異物を感知すると、異物を追い出そうとする免疫反応として創傷治療の働きをするマクロファージを運ぶために毛細血管がその場所に伸びてくる。
【００３４】
また、紫外線防御のためにはメラニン（色素として美白を損なう要因になる）が働くが、シミやシワの原因となる死滅したメラニンを異物とみなして取り除くこともマクロファージの免疫反応による作用である。その結果、コラーゲン生成促進に加え、強い美白効果（本来の美白成分は副作用が強く問題であるが、マクロファージによる美白作用は人体が持つ本来の機能であり副作用が無い）が得られる。
【００３５】
このように、マクロファージの活性化は、コラーゲン生産や肌質の改善にとって重要である。
しかるに、本件出願人は、マクロファージを活性化するためには、マクロファージに自己外（敵）を認識させることが重要であり、自己外（敵）の一つとしてβ１，３Ｄグルカンを作用させることが重要であると着想するに至った。
【００３６】
体内に入ったβ１，３Ｄグルカンが細網内皮系の免疫細胞（組織球もしくは表皮内大食細胞を含む）を刺激できることが、判明している。特に、免疫応答システムの最初の段階で活躍する免疫細胞であるマクロファージとのβ１，３Ｄグルカンの接触が、免疫細胞の活性化に重要な機能を果たすものと考えられる。
【００３７】
人体に悪影響を与える病原菌等の有害な菌類の表面はβ１，３、１，６Ｄグルカンで構成されている場合が多い。この成分は小腸などの神経細胞や免疫細胞により自然免疫情報として管理されている。
そして、このβ１，３Ｄグルカンを自己外の敵として判断し、攻撃・排除の対象とするためのレセプタ（約７割は小腸に集中、ＴＬＲ２等の受容体に該当）がそれらの免疫機能をもつ細胞に存在し監視・反応をする。特に、肌部に関する免疫機能は、マクロファージが大きく受け持っている。
【００３８】
マクロファージの細胞表面には、β１，３、１，６Ｄグルカン（特にβ１，３Ｄ型）に結合する受容体（ＴＬＲ２等）が存在し、この受容体はβ１，３、１，６Ｄグルカンレセプタと呼ばれている。
β１，３、１，６Ｄグルカンがマクロファージのレセプタに接触すると細胞内情報伝達系が活性化されて、マクロファージは活性化モードに入るが、その時にβ１，３Ｄグルカンが特に関与が大きいことが確認されている。
活性化されたマクロファージは、異物を捕食する能力が高まるとともに免疫機能の活性化が具現化する。
【００３９】
β１，３、１，６Ｄグルカンを肌に塗ると、β１，３、１，６Ｄグルカンは高分子であるにもかかわらず、肌内部に浸透していく。これは、肌に付いたβ１，３、１，６Ｄグルカンは、皮膚に沢山存在している汗口や毛根等を経由して奥の外皮内部に入り込むことによるものと推測される。そして、汗口の奥にあるエクリンとよばれるエリアや毛根の深層部には毛細血管が集中しており、そこに多くのマクロファージが存在している。もしくは、針（槍）状の形をしている水溶性β１，３、１，６Ｄグルカンは細胞よりも硬いため、角質を突き破り細胞に浸透する。β１，３、１，６Ｄグルカンが進入・浸透した細胞の近くにはマクロファージが存在している。
【００４０】
肌に浸透したβ１，３、１，６Ｄグルカンは、マクロファージのレセプタに反応し、免疫反応作用を起こす。
そして、免疫反応作用を起こした場所にはさらに多くのマクロファージが集まり、マクロファージの働きにより線維芽細胞が活性化し、細胞の修復等のために多くのコラーゲンやエラスチン、ヒアルロン酸等が増殖する。
これは免疫反応作用からくるコラーゲン生成作用であり、コラーゲンは破壊された肌を修復するだけではなく、マクロファージの活動自体を活発化させる。
このように、免疫反応作用が起こるときに、コラーゲンが生成できる。従って、コラーゲンを生成させるためには免疫反応を起こすことが重要となる。
【００４１】
ところで、純粋なβ１，３、１，６Ｄグルカンは無害であって異物の外郭として認識されているにしか過ぎなかった。β１，３、１，６Ｄグルカンの高分子多糖類は非常に固く菌を守る防御性能が高いこともあり、有害な菌類はこのβ１，３、１，６Ｄグルカンを成分とした外壁を持っていることも判明している。
【００４２】
しかるに、本件出願人は、このβ１，３、１，６Ｄグルカンが生物の外壁のバリア機能を通過し内部に進入しうるのではないかと考えた。
例えば、病原菌等の有害な菌類は、呼吸器官や消化器官、皮膚などを介して細胞内に進入する。このため、β１，３、１，６Ｄグルカンも、細胞内（もしくはその周辺）へ進入するための硬い外壁として備えているものと考えられる。そのため、生物の自然免疫はβ１，３、１，６Ｄグルカンを感知すると有害な菌類の進入と判断し、免疫活性の行動に移り、それを排除しようとする動きをするものと考えられる。
また、エネルギーや栄養素を自己外に依存する菌類の生い立ちからみて、細胞内に入り込む硬い外壁は有効である。菌類などは、自己外の生物（細胞）に寄生しないとエネルギーや栄養素を自ら作れないため、その生物の細胞内に入り込み栄養素やエネルギーを奪う必要がある。
その際に菌類の硬い外壁（β１，３、１，６Ｄグルカン）は、比較的軟らかい生物の外壁（表皮等）を押し分け、あるいは突き破るのに適している。その場合、針（槍）状の形状を持つ水溶性βグルカンが適している。これは菌類の内部（細胞内）に多く存在するが、菌が細胞に接触したとき、その細胞に進入していくときに使われる有効な成分であると認識できる。
【００４３】
また、紫外線によりコラーゲンや細胞組織などが損傷を受ける場合もマクロファージが反応する。
マクロファージは、そのダメージを認識すると修復のためにすぐに集まってきて細胞間のコミュニケーション因子を出す。これにより、線維芽細胞から筋線維芽細胞が作られる。これがタンパク質の一種であるコラーゲンやヒアルロン酸等の肌主要成分を作って肉芽組織となり、徐々に傷部分を補修して行く。
このようなマクロファージの活性化の作用は、肌質を改善しシミやシワの除去にも繋がり美白効果も得られる。
【００４４】
しかるに、本件出願人は、β１，３、１，６Ｄグルカンを肌に浸透させて肌内のマクロファージを活性化し、コラーゲン生成促進とメラニンの除去を行うことにより、シワを改善することを着想した。また、βグルカンは高分子の構造より大量の水分子を絡めているが、水分子を絡めたまま細胞に突き刺さったり浸透していくことにより、肌内部、もしくは肌表面に強力な保湿作用を与える。保湿作用はコラーゲンとともに肌質の改善に繋がるため、相乗効果となる。また、細胞に突き刺さりダメージを認識したマクロファージは、その場所に集まりやすくなる。最終的には角質層も正常になり、保湿力が向上する結果となり、乾燥肌・肌荒れ等の問題が解決される。なお、βグルカンが肌に浸透するという論文が海外に存在するが、その論文は保湿に限定したものでありコラーゲン生成についての記載はない。これに対し、本件出願人は保湿作用についても細胞に突き刺さるタイプのβグルカンを発見した。このタイプのβグルカンは、保湿状態で肌にささり、他のヒアルロン酸などの保湿物質と違い、簡単にはがれない。従来、βグルカンが肌質を改善するという報告がいくつかあるが、その仕組みについてコラーゲン生成促進や免疫が関与していると説明されているものは存在しない。
【００４５】
また、コラーゲンの減少の他の原因として、女性ホルモンの減少があると言われている。
免疫系は神経系によって制御されている。交感神経、副交感神経などの自律神経は、ノルアドレナインやアセチルコリンといった神経伝達物質を介して免疫反応に大きな影響を与える。逆に、免疫系マクロファージはサイトカインという液性因子を使って神経系に影響を与え、女性ホルモンを調整していることが確認されている。
コラーゲンは女性肌に多く潤いを与える基本的な成分であり、女性ホルモンのエストロゲンは肌との関係が深く、エストロゲンが多いとコラーゲンも活発に生成されるが、これに免疫系が作用していると考えられる。
【００４６】
女性ホルモンの一つであるエストロゲンは、高濃度では自然免疫を担う細胞からの炎症性サイトカインの産生を抑えたり、ＩＦＮ−γやＩＬ−１７などを産生するＴリンパ球の働きを抑制したり、免疫応答を抑える働きのある制御性Ｔ細胞を誘導して炎症を抑制する方向に働く。
細胞性の免疫反応による炎症を抑制する一方、抗体産生については促進する。
また、免疫系はホルモンのバランスを最適に調整していると言われる。
【００４７】
従来、化粧品分野において提供されているシワ改善のための成分は、成分がシワのある肌に入って炎症を誘導し、細胞を腫らせることにより膨らみ、見た目はシワが無くなるものが多い。また、その他のシワ改善方法として、電磁波を身体に照射する「ＧＦＲ治療」がといわれる方法がある。これは、コラーゲンを電磁波による熱処理で収縮させ、肌を引き締めることで表皮のシワを無くす治療である。しかし何れも根本的なシワ改善にはならず、一時的な改善のみであり、さらに肌への悪影響が懸念される。肌質の改善の方法としては、コラーゲンの構成成分をサプリメントなどから補給する方法が主流となっているが、分解されたコラーゲンを生成する能力が衰えている場合、有効な手段にはならない。
肌質の改善には、上述した免疫活動が絶対条件になるものと考えられ、免疫活動の誘導にはβ１，３、１，６Ｄグルカンが必要と考えられる。
【００４８】
本件出願人は、上記のような考察を経て、β１，３、１，６Ｄグルカン（服用もしくは肌に塗る）が免疫に作用し、その結果としてコラーゲン生成が促進（相乗効果が出て有効）されるまでのメカニズムを着想した。
【００４９】
このメカニズムは次の通りである。
(1)β１，３、１，６Ｄグルカンが高分子（１００万分子前後）で肌に浸透できる分子量（５００前後）をはるかに超えているため、本来は浸透することができないにもかかわらず肌に浸透していく。
(2)体内に入ったβ１，３、１，６Ｄグルカンはマクロファージ等の免疫細胞のレセプタに反応し様々な免疫作用を誘導（例えば、ＮＫ細胞の活性化）する。
(3)マクロファージの免疫作用により線維芽細胞にコラーゲン等の肌成分を生成する指令（作用）が出て、線維芽細胞によるコラーゲン生成が促進される。
(4)なお、マクロファージを活性化するためには、次の物質をβ１，３、１，６Ｄグルカンと合わせて用いるとより一層の効果が期待できる。
・豚由来コラーゲンとＢＣＡＡ＋グルタミン。これらは、コラーゲンが一度分解してアミノ酸になり吸収・再生成させるときのベースや促進剤となる。
・ＣｏＱ１０（この場合、還元型コエンザイムＱ１０）。これは、マクロファージや繊維芽細胞を活性化し、免疫力を活性化しコラーゲン生成に作用する。
・アスコルビン酸カルシウム（体内では短時間しか効かない水溶性ビタミンＣを、難易水溶性にして長時間効きを持続したもので、コラーゲン生成時における線維芽細胞の酸化を防止するために必要）。ビタミンＣはコラーゲンを体内で合成する際に必要である。コラーゲンを作っているアミノ酸のヒドロキシリジンとヒドロキシプロリンは、リジンとプロリンがビタミンＣによって水酸化されることにより作られる。また、細胞はその時に酸素等を使ってエネルギーをつくり細胞活動を維持するが、これにより活性酸素が発生、ビタミンＣは不飽和脂肪酸が過酸化脂質に酸化されるのを防ぐ働きがあり、細胞の老化を防ぐことからも有効である。
【００５０】
上述のような考察過程を得て着想した本発明のコラーゲン生成促進剤は、β１，３Ｄグルカンを含有するβグルカンを有してなる。
βグルカンのうち、特にβ１，３Ｄグルカンは、免疫に作用し免疫を正常化することが様々な研究で知られている。このため、コラーゲン生成促進剤としてβ１，３Ｄグルカンを含有するβグルカンを含有して構成すれば、当該コラーゲン生成促進剤を肌等に使用することにより免疫細胞であるマクロファージ等が活性化され、線維芽細胞によるコラーゲン生成が促進される。
なお、より好ましくは、β１，３Ｄグルカンに少量のβ１，６Ｄグルカンが入っていると効果が高くなる場合がある。
β１，３Ｄグルカンは水溶性と非水溶性の２種類があるが、水溶性のものは菌類等の細胞内などにある糖鎖（分子）の絡みが非常に少なく針（槍）のように直線的な形状のタイプで化粧品など外部から塗るものに有用である。非水溶性のものは菌類等の細胞壁などにあり、互いの糖鎖が複雑に絡み合っているもので、小腸の免疫細胞レセプタに対しての作用が顕著で適しているため、サプリメントなどにより服用するものに有用である。本発明のコラーゲン生成促進剤においては、その水溶性と非水溶性のβ１，３Ｄグルカンを分離して夫々純度を高めた素材を提供することも可能である。
また、水溶性β１，３Ｄグルカンは保水性も特殊性を有している。通常のヒアルロン酸などの保水成分は、肌表面にくっつくだけで、時間とともにはがれるが、水溶性βグルカンは水分子が絡まっている状態で、その形状が直線的であり、細胞につきささり抜けにくいため、βグルカンが絡めている水分子が肌と一体化するような感じになり簡単にはがれないという大きな効果が確認できる。
なお、保湿（水分子を保持、保水と同様）力は高分子であるほど優れている。保湿が優れるヒアルロン酸は数万〜数百万分子量で、βグルカンも同等の分子量となり保湿性が高い。しかし、これらの高分子は皮膚表面を通過することは出来ない。通過できる分子量は５００前後と言われているが、アトピーの治療に使われるステロイド外用薬分子量は、大体５００位で、低分子のものは皮膚内に浸透できる。しかし、高分子であっても、水溶性βグルカンのように固くて針（槍）状形式のものは細胞を突き破り浸透するものと考えられる。
【００５１】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、βグルカンに占めるβ１，３Ｄグルカンの割合が５０パーセント以上であるのが好ましい。
β１，３Ｄグルカンは、マクロファージ等の免疫細胞のレセプタに作用する効果が大きい。このため、βグルカンに占めるβ１，３Ｄグルカンの割合を５０パーセント以上にすれば、十分なコラーゲン生成促進効果が得られる。
なお、好ましくは、本発明のコラーゲン生成促進剤におけるβ１，３、１，６Ｄグルカンの比率は、７：３前後とするのが望ましい。
【００５２】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、β１，３Ｄグルカンとともに、豚由来コラーゲンとＢＣＡＡとグルタミンを有するのが好ましい。
このようにすれば、豚由来コラーゲンや、ＢＣＡＡとグルタミンが、線維芽細胞がコラーゲンを生成する際のベースや促進剤となり、コラーゲン生成がより一層促進される。
より詳しくは、豚由来コラーゲンを服用することで、消化酵素などにより分解されたアミノ酸（３つのアミノ酸が結合し、２つのペプチド結合しているトリペプチドと呼ばれるものが重要）がコラーゲン再生成のベースになる。ＢＣＡＡはバリン・ロイシン・イソロイシンの３種類のアミノ酸を意味し、グルタミンを加える４種類のアミノ酸がコラーゲンの新陳代謝に深く関係していることが解明されてきている。
なお、豚由来コラーゲンとＢＣＡＡ＋グルタミンは、服用が効率的で望ましいが、これらを直接肌に塗りこんだ場合も有効であると考えられる。その理由は、荒れた肌の角質は破損しているが、そこから吸収できる分子量と想定されるため、その破損した近辺でのコラーゲン生成に効果が期待できるためである。この場合、当該吸収を効率的に行うため、これらの成分を低分子化（酵素処理等）して使用することも効果的である。
このように、本発明のコラーゲン生成促進剤においてβ１，３Ｄグルカンとともに有する成分としての、豚由来コラーゲン＋ＢＣＡＡ＋グルタミンは、肌を形成する成分として有効であるが、本発明のコラーゲン生成促進剤においてβ１，３Ｄグルカンとともに有する成分としては、さらに、これらに加えて、肌構成物であるヒアルロン酸＋エラスチン＋セラミド等やその合成をサポートするケイ素（シリカやケイ酸などのケイ素化合物を含む）や亜鉛、ヘム鉄等のミネラル類およびその化合物を有するとより好ましく、同様に当該吸収を効率的に行うため、これらの成分を低分子化（酵素処理等）して使用することも効果的である。
【００５３】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、β１，３Ｄグルカンとともに、還元型コエンザイムＱ１０を有するのが好ましい。
還元型コエンザイムＱ１０は、マクロファージを活性化させる。マクロファージが活性化すると、そこからサイトカインと言われる物質が放出され線維芽細胞を活性化させる。その結果、線維芽細胞によるコラーゲン生成がより一層促進される。
【００５４】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、β１，３Ｄグルカンとともに、アスコルビン酸、又はアスコルビン酸カルシウム等に類似する成分として、アスコルビン酸カルシウム等に類似する作用がある抗酸化物質を有するのが好ましい。
このようにすれば、アスコルビン酸カルシウム等がコラーゲンの生成を助け、その酸化を防止し、コラーゲンの劣化を阻止できる。
アスコルビン酸カルシウム等に類似する作用がある抗酸化物質としては、例えば、プラセンタやビタミンＥ（その他のビタミン含む），ポリフェノール類等がある。
プラセンタは抗酸化以外の作用として、”古くなって弱った細胞や怪我などでダメージを受けた細胞から新しい細胞を作り出すための細胞分裂を制御する「細胞増殖因子」”であり、本発明におけるコラーゲンを生成する重要な役割をなす「繊維芽細胞」を活性化させることができる性質を有する。細胞分裂が必要な細胞の表面には受容体（レセプタ）と呼ばれる鍵穴が現れるが、プラセンタ成長因子は、その鍵穴から細胞にアクセスし、細胞に対して細胞分裂が適切に行われるのに必要な情報を伝達する。その情報を受け取ると、当該細胞は分裂し、新しい元気な細胞を作り出すことになる。
なお、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、β１，３Ｄグルカンとともに有する、豚由来コラーゲン、ＢＣＡＡとグルタミン、還元型コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸カルシウム類は、β１，３Ｄグルカンと一体に服用可能な構成、β１，３Ｄグルカンとは別体に服用可能な構成のいずれでも良い。当該βグルカンは水溶性、非水溶性ともに有効であるが、水溶性は肌に塗りこむ化粧品に使用することが効果的である。水溶性のため、化粧品に溶け込むことも有効である。非水溶性はサプリメントなどにより服用し、小腸の免疫細胞に作用させることが効果的となる。共に免疫機能が活性化し、コラーゲン生成促進につながる。体内の免疫機能が広範囲に活性化することで、皮膚以外にも体内の様々な箇所（関節器官等）でコラーゲンが生成される。
【００５５】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、β１，３Ｄグルカンが、ハナビラタケ由来であるのが好ましい。ハナビラタケには水溶性β１，３Ｄグルカンと非水溶性β１，３Ｄグルカンの双方を有している。そして、乾燥処理の前に双方を分離する技術も確立されている。
βグルカンは食物繊維にも似た糖鎖の高分子物質であり、キノコ、黒酵母、パン酵母に多く存在する。しかるに、乾燥したβグルカンは水や油に溶け難いため、化粧・美容品素材として溶液に混ぜることが難しい。
パン酵母由来のものは、細胞壁を覆うマンナン質のたんぱく質、脂質の除去に高い技術や、特殊な抽出精製技術が必要であり、生産が難しい。かつ、高度な生成は特許により守られていることより、簡単に生産することはできない。また、黒酵母由来のものは、βグルカンの含有量が少量であり、特に有効成分のβ１，３Ｄ結合は殆ど無く、抽出効率が悪い。高濃度のβグルカンに生成する場合、非常に高額なコストが必要となり、非効率である。
また、中国において漢方薬として知られる冬虫夏草（チベット産のコウモリガ寄生物）もβ１，３Ｄグルカンを多く含有しているという分析結果があるが、需要過剰で非常に高価（ハナビラタケの１００倍以上）であるため、コラーゲン生成促進剤におけるβ１，３Ｄグルカンに冬虫夏草由来のものを用いると、コスト高となってしまう。
一方、ハナビラタケ由来のものは、β１，３Ｄグルカンの含有量が食材の中で最も多く、抽出においても比較的容易で効率が高い。また、ハナビラタケはキノコであり、そのまま粉砕・加水して液体状態のままβグルカンを抽出することによってβグルカンを水に溶けた状態（水溶性βグルカン）で分離し得ることができるため、化粧・美容品素材として混ぜ易い。その残渣となる非水溶性βグルカンは、サプリメントとして服用することで小腸の免疫細胞レセプタに反応し免疫活性を行うが、残渣であるため比較的安価に供給できるメリットがある。また、ハナビラタケ由来のものは、冬虫夏草由来のものに比べてコストを抑えることができる。
【００５６】
また、本発明のコラーゲン生成促進剤においては、β１，３Ｄグルカンが、ハナビラタケの胞子由来であるのが好ましい。
ハナビラタケの胞子の外殻は、β１，３Ｄグルカンの成分が非常に高い。このため、ハナビラタケの胞子からβ１，３Ｄグルカンを抽出、もしくは胞子をそのまま肌表面に使用することで、効率的にβ１，３Ｄグルカンの成分の高いコラーゲン生成促進剤が得られる。当該胞子はハナビラタケ洗浄時の水溶液や生産施設における空調フィルタより比較的簡単に収集することができる。
【００５７】
そして、上記本発明のコラーゲン生成促進剤を用いた美容・化粧品やサプリメントを製造する。これにより、体の外部、内部からコラーゲン生成促進剤を摂取して、コラーゲン生成促進効果を得ることができる。
なお、上記本発明のコラーゲン生成促進剤を美容・化粧品に用いる場合のβ１，３Ｄグルカンは、水溶性タイプが望ましい。水溶性タイプは糖鎖分子構造が直線的で硬いため、針（槍）のような性質は比較的柔らかい皮膚細胞を突き刺して通過、もしくは同細胞壁の間を通過したり、汗口や毛根などに入り込み、皮膚の深層部に到達する。細胞内にβグルカンが刺さったり入り込むことで、二次的にβグルカン自体が絡み持っている水分子を肌に強く固定し維持（保湿性の改善）することもできる。皮膚を突き刺す硬さがあるため、皮膚にすり込むことで効果が倍増する。美顔パックでも有効であるが、化粧品クリームや同ゲルなどにβグルカンを加えることで、それを肌に塗りこむと即時に高い保湿性を感じることができる。
また、上記本発明のコラーゲン生成促進剤をサプリメントに用いる場合のβ１，３Ｄグルカンは、非水溶性のβグルカンが望ましい。これは有害な菌類の外郭と同成分同形に近く、水溶性よりも大きい分子量であることより小腸に絡みやすいため、小腸のレセプタに作用しやすいからである。非水溶性のβグルカンのような高分子体については、小腸のヒダに菌類が絡まったり突き刺さり作用していることが、顕微写真などで確認されているが、非水溶性のβグルカンも同様に小腸に絡まったり突き刺さるなどして小腸を刺激することになる。サプリメントは錠剤形式より、粉末や顆粒、濃縮エキスの形が望ましい。
さらに、本発明のコラーゲン生成促進剤は、ハナビラタケの成分であるβ１，３Ｄグルカンを水溶性と非水溶性とに分離加工し、各々の効果に応じて美容・化粧品、サプリメントに用途を使い分けることが望ましい。
【００５８】
β１，３Ｄグルカンを肌に塗り、肌質が改善することは、保湿計測器や肌質チェックを行う機器などを活用することにより実証可能である。
なお、β１，３Ｄグルカンが肌に浸透する効果は、肌に塗って、顕微鏡等の画像撮影装置で動画撮影したり、ＩＰＳ細胞を用いて実証可能である。
また、β１，３Ｄグルカンがマクロファージに作用し、コラーゲンを生成させることは、生理食塩水・マクロファージ・アミノ酸等の入った溶液に、ＩＰＳ等の皮膚細胞やβ１，３Ｄグルカンを加えて、マクロファージの運動量が増えることや、その際にコラーゲンが生成されていることを確認することで実証可能である。
また、β１，３ＤグルカンにＢＣＡＡ、グルタミン、還元型コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸カルシウム等を加えることで、さらにコラーゲン生成促進効果が上がることも同様に実証可能である。
【００５９】
本発明の実施例として、以下の一連の試験を行った。
まず、ハナビラタケ抽出液がマクロファージを活性化させることを検証するための試験として、NO産生量測定試験（実施例１）、マクロファージの貪食能測定試験（実施例２）を行い、次いで、マクロファージが活性化した環境下でのハナビラタケ抽出液による、コラーゲン接着に関与するフィブロネクチンの産生量測定試験（実施例３）を行い、これらの試験結果からハナビラタケ抽出液のコラーゲン生成促進作用を検証した。
【００６０】
実施例１（ハナビラタケ抽出液によるマクロファージ活性能力（NO産生）の測定評価）
体外からの細菌や微生物などの侵入を防ぐための免疫システムにおいてマクロファージは中心的な役割を担っていることが知られている。このため、マクロファージの活性化は免疫機能強化のための重要な因子であるといえる。ところで、マクロファージは活性化されるにしたがいNO（一酸化窒素）産生量を増大することが知られている。
実施例１では、ハナビラタケ抽出液によるマクロファージ活性化能力について、マクロファージ様細胞Raw264.7からのNO産生量を測定することにより評価した。
【００６１】
細胞培養
検体にハナビラタケ抽出液を用い、マウス由来マクロファージ様細胞Raw264.7(Riken Cell Bankより入手)を、96Well細胞培養用プレートに5×104cells/wellとなるように、RPMI1640培地(Gibco,10％FBS含有)で懸濁調整して播種し、24時間培養した(37℃、5％CO2)。
次いで、任意濃度の検体溶液を含む新鮮なRPIM1640培地（FBS不含有）に交換し、再び一晩培養した。なお、コントロール区は、検体を含まない培地のみとし、陽性対照区は、LPS溶液(Sigma,L2880,Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)を、10μL/well添加した区とした。
その後、培養上澄みを回収し、次のNO産生量測定操作に供した。なお、細胞生存率は、Cell counting kit(同仁化学)溶液を用い、マイクロプレートリーダー(BioTek社,SYNERGY HT)にて測定した。
【００６２】
NO産生量測定
回収した培養上澄み75μLを新しい96Wellプレートに移し、各ウェルにGriess試薬を75μLずつ添加しプレートシェーカーにて攪拌混合した後、室温で10分間静置した。同時に任意濃度に調製した亜硝酸ナトリウム溶液(0〜100μM)75μLをプレートに添加し、同様にしてGriess試薬を添加して室温で10分間静置した。その後、各ウェルの550nmの吸光度を測定してNO産生量を算出した。なお、NO産生量は、NOの酸化物である亜硝酸イオン濃度を測定することにより求めた。
【００６３】
図２にNO産生量の測定結果、表１に細胞生存率の結果を夫々示す。
【表１】
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図２に示すように、ハナビラタケ抽出液は、NO産生量を増加させた。この結果より、ハナビラタケ抽出液にはマクロファージを活性化させる能力があることが確認された。
【００６４】
実施例２（ハナビラタケ抽出液のマクロファージ貪食能活性化作用の測定評価）
実施例２では、マクロファージの貪食能を指標とし、ハナビラタケ抽出液のマクロファージ活性化能力について、マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1に対する貪食率を算出することにより評価した。
【００６５】
細胞培養及び細胞毒性の検討
検体にハナビラタケ抽出液を用い、マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1(Riken Cell Bank より入手)を、RPMI培地(10％FBS含有)に懸濁して96well細胞培養用マイクロプレートに播種し、セミコンフルエント程度となるまで培養を行った。
次いで、予めハナビラタケ抽出液の凍結乾燥粉末を任意濃度となるようにRPMI培地(FBS不含)に溶解して調製しておいた検体添加培地と交換し、24時間再び培養を行った。なお、陰性対照区(コントロール)には検体不含有のRPMI培地(FBS不含有)を用いて同様の操作を行った。
その後、培養上澄みを吸引除去し、新鮮なRPMI培地(FBS不含有)を加え、CO2インキュベーター内に静置した後、Cell counting kit（同仁化学）を用いて各試験区における細胞生存率を測定した。
上記測定結果より、本試験ではハナビラタケ抽出液が十分に細胞毒性を示さない濃度として500ppmを上限濃度として採用することとした。
【００６６】
貪食能の検討
J774.1細胞を5×105cells/mLとなるようにRPMI培地(10%FBS含有)に懸濁調製し、96well細胞培養用マイクロプレートに100μL/wellで播種し、2時間インキュベート(5%CO2,37℃)した。
次いで、予め調製しておいた任意濃度の検体含有培地(10%FBS含有)を100μL/wellで添加し、24時間培養を行った。なお、陰性対照区(コントロール)には検体不含のRPMI培地(10%FBS含有)を加えた。また陽性対照区として、LPS(Sigma,L2880,Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5)を500ng/mLとなるように溶解したRPMI培地(10%FBS含有)を加えた。
次いで、マクロファージの貪食対象としての、蛍光標識されたウサギIgG(免疫グロブリンＧ)でコートされたラテックスビーズ(Cayman chemical社製，phagocytosis assay kit)溶液を調製し、10μL/wellとなるよう添加し、再び24時間培養を行った。
その後、プレート遠心分離機により遠心分離後（1500rpm,3min）、各ウェルより上澄みを吸引除去し、新鮮なRPMI培地(FBS不含)を200μL/wellで添加して、各試験区における貪食作用により細胞内に取り込まれたビーズを蛍光顕微鏡により観察した。
次いで、各ウェルより上澄みを除き、10%TritonX-100含有PBS溶液を150μL/wellで加え、プレートシェーカーにより3分間撹拌した後、蛍光マイクロプレートリーダーにより細胞内に取り込まれたビーズ量を測定し（励起485nm、蛍光528nm）、コントロール比として各検体の貪食率を算出した。
【００６７】
図３にハナビラタケ抽出液のマクロファージ貪食能活性化作用、図４に細胞内に取り込まれたビーズを撮影した様子を夫々示す。
図３に示すように、ハナビラタケ抽出液は、濃度依存的にマクロファージの貪食率を向上させ、貪食の程度は濃度500ppmにおいてLPSと同等の効果であることが明らかとなった。また、図４(b)に示すように、ハナビラタケ抽出液を添加した区での蛍光ビーズを貪食した様子が観察されたことからも、ハナビラタケ抽出液には、マクロファージを活性化させる能力があることが確認された。
活性化されたマクロファージは種々のサイトカインを放出し、生体内の他細胞に働きかけることが知られている。この時放出されるサイトカインの一部であるFGFやTGFは肌の健康を維持するためには重要なファクターであることから、ハナビラタケ抽出液は肌の健やかさを取り戻すために有効であることが推察される。
【００６８】
実施例３（ハナビラタケ抽出液のフィブロネクチン産生作用の測定評価）
フィブロネクチンは、繊維芽細胞とコラーゲン繊維の接着に関与することが知られている。
実施例３では、ハナビラタケ抽出液のフィブロネクチン産生作用を、ヒト繊維芽細胞からの産生量を測定することにより評価し、評価結果に基づきハナビラタケ抽出液のコラーゲン生成促進について検証した。
【００６９】
検体にハナビラタケ抽出液を用い、ヒト乳幼児由来繊維芽細胞NB1RGB(Riken Cell Bankより入手)を、1×104cells/wellとなるように、MEM-α培地に懸濁し、96well細胞培養用プレートに播種して、増殖因子を含む培地と含まない培地とについて、37℃、5％CO２下で24時間培養した。なお、増殖因子を含む場合は、2％ウシ胎児血清(FBS）、10ng/mlヒト上皮成長因子(hEGF)、3ng/mlヒト繊維芽細胞増殖因子(hFGF-B)、1μg/mlハイドロコーチゾン、10μg/mlヘパリンを含有させた。一方、増殖因子を含まない場合は、10％ウシ胎児血清(FBS)のみを含有させた。
細胞がセミコンフルエント程度の状態になっていることを顕微鏡観察により確認した後、任意濃度の検体溶液を含むMEM-α培地(FBS不含有)に交換し、さらに、48時間培養した。なお、コントロール区は、検体を含まない培地のみとし、陽性対照区は、アスコルビン酸(Asc,和光製薬)を25μg/ml添加した区とした。
48時間後、培養上澄みを回収し、フィブロネクチン含有量をELISA測定キット（タカラバイオ）にて定量し、細胞生存率で除算することにより、コントロールに対する細胞あたりのフィブロネクチン産生量を算出した。
なお、細胞生存率は、次の手順で求めた。培養上澄みを回収した後の細胞培養プレートをPBSで洗浄した後、再び新しいMEM-α培地を100μL/wellとなるように添加し、37℃、5％CO2で1時間静置した。その後、細胞生存率を測定するためにCell counting kit(同仁化学)溶液を10μL/wellで添加し、37℃、5％CO2で2時間静置した。その後、マイクロプレートリーダー(BioTek社,SYNERGY HT)にて各ウェルの波長450nmの吸光度を測定し、コントロール区と比較することにより細胞生存率を算出した。
【００７０】
図５にフィブロネクチン産生量、表２に細胞生存率を夫々示す。
【表２】
2015071588.tif 000003
図５に示すように、ハナビラタケ抽出液は、有意にフィブロネクチンの産生量を増加させた。この結果より、ハナビラタケ抽出液は、上皮成長因子EGF、繊維芽細胞増殖因子FGFの存在下で、フィブロネクチンの産生を促進することが明らかとなった。
なお、後述するマクロファージを利用したハナビラタケ抽出液の評価（実施例２、実施例３）において、NO産生促進作用、貪食作用が確認され、マクロファージ抽出液がマクロファージを活性化させることが確認されている。
一般に、マクロファージは、上皮成長因子EGF、繊維芽細胞増殖因子FGFを産生することが知られている。
本実施例の試験においては、EGFとFGFの共存下でハナビラタケ抽出液を繊維芽細胞に作用させ、その結果、これらサイトカインの存在下でハナビラタケ抽出液が、有意にフィブロネクチンを産生することが確認された。
【００７１】
上記結果から、次のことが推察できる。
１．ハナビラタケ抽出液は、マクロファージを活性化させ、免疫賦活作用とともにFGFやTGFのサイトカインを誘発させる。
２．ハナビラタケ抽出液は、マクロファージを誘発したサイトカインの存在下において、繊維芽細胞に働きかけてフィブロネクチンの生産を増加させる。
３．フィブロネクチンは接着因子として繊維芽細胞とコラーゲンとの接着に関与し、コラーゲンの立体構造維持を助ける。このことから、フィブロネクチン産生促進作用を有するハナビラタケ抽出液は、コラーゲンの生成を促進し、肌のハリや弾力改善の補助に寄与することが推察できる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のコラーゲン生成促進剤並びにそれを用いた美容・化粧品及びサプリメントは、美容・化粧品・サプリメントを始めとして、コラーゲン生成の促進が必要とされるあらゆる分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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