(57)【要約】【課題】脂肪生成の抑制におけるカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示すること。【解決手段】本発明は、肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において除脂肪体重を増進するための、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって、除脂肪体重の増加の効果をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
【請求項２】
肥満哺乳動物の体重を減少させるための医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
【請求項３】
肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための、全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
【請求項４】
哺乳動物における肥満症を治療するための、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
【請求項５】
ヒト以外の哺乳動物において除脂肪体重を増進するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって除脂肪体重の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
【請求項６】
ヒト以外の肥満哺乳動物の体重を減少させる方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む方法。
【請求項７】
ヒト以外の肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量のカレビンＡを経口投与して全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらすステップを含む方法。
【請求項８】
ヒト以外の哺乳動物における肥満症を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１月１０日に出願された同時係属中の米国特許第１３／３４７０７１号の一部継続特許出願であり、米国特許第１３／３４７０７１号は、２０１１年１月１０日に出願された仮出願第６１４３１１４７号の非仮出願である。本出願は、２０１１年１月１０日に出願された仮出願第６１４３１１４７号に基づく優先権を有する。
本発明は一般に、肥満管理のための薬物に関する。より詳細には本発明は、カレビンＡの抗肥満能力に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は先進国における最も優勢な栄養障害であり、発展途上国において増大している問題である。肥満は世界規模の流行病および体重過多として記載され、肥満状態の個体（２５以上のＢＭＩ）は、様々な身体の慢性疾患、ならびにうつ病、摂食障害および自尊心の低下などの心理的問題に関するリスクが高い。肥満は、心臓血管疾患、糖尿病、骨関節炎、閉塞性睡眠時無呼吸および癌のような様々な疾患と関係がある。ＷＨＯは、肥満が、世界中の予防可能な死の上位１０個の原因のうちの１つであると考えている。
肥満では、脂肪生成のプロセスを介した新たな脂肪細胞(fat cell)（脂肪細胞(adipocytes)）の生成および／または細胞ごとの増加した量の細胞質トリグリセリドの沈着のため、脂肪組織塊が増大する。内部で生成した脂肪液滴が１つの大きな塊に合体すると、脂肪細胞が発生する。最終的に、皮膚真皮下での脂肪生成の増強および脂肪細胞の塊の蓄積のために、セルライトが生じる。
脂肪生成の研究は、ヒトにおけるこのプロセスの操作が、肥満および糖尿病の負担の軽減をもたらし得るという希望と共に進んでいる。分子レベルでは、レプチン、アディポネクチン、ＴＮＦ−αなどの幾つかのマーカーが、肥満の治療において標的化されている。
この障害を治療するための薬剤は利用可能であるが、肥満およびその関連する社会経済的結果の管理を手助けするための安全で自然な手法が、絶えず必要とされ探索されている。
カレビンＡは、β−アミロイド外傷から神経細胞を保護すること（Park SY et al,J Nat Prod.2002 September;65(9):1227-31）、薬剤耐性ヒト胃癌細胞においてアポトーシスを誘導し、ＭＡＰＫファミリーの活性を制御することが知られている（Li Y et al,Eur J Pharmacol.2008 Sep4;591(1-3):252-8）。Zeng Y et al.(Chem Pharm Bull (Tokyo)2007 June;55(6):940-3)は、２つの新たなカレビン誘導体、４’’−（４’’’−ヒドロキシフェニル−３’’’−メトキシ）−２’’−オキソ−３’’−ブテニル−３−（４’−ヒドロキシフェニル）−プロペノエート、および４’’−（４’’’−ヒドロキシフェニル）−２’’−オキソ−３’’−ブテニル−３−（４’−ヒドロキシフェニル−３’−メトキシ）−プロペノエートを論じている。
本発明は、脂肪細胞(adipocytes)（脂肪細胞(fat cells)）の末期分化中の脂肪蓄積を予防するカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示する。本発明は、肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Park SY et al,J Nat Prod.2002 September;65(9):1227-31
【非特許文献２】Li Y et al,Eur J Pharmacol.2008 Sep4;591(1-3):252-8
【非特許文献３】Zeng Y et al.Chem Pharm Bull (Tokyo)2007 June;55(6):940-3
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の主な目的はカレビンＡの抗肥満能力を開示することである。
本発明は前述の主な目的を満たし、さらなる関連利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、脂肪生成の抑制におけるカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示する。本発明は、哺乳動物における肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。
本発明の他の特徴および利点は、例えば本発明の原理を例示する添付の図面と共に、以下のより詳細な記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】オイルレッド−Ｏ染色法によって試験した、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けた脂肪生成抑制率のグラフ表示である。
【図２】０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるレプチン生成の抑制率のグラフ表示である。Ｐ値*：＜０．０１；**：＜０．００１。
【図３】０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の増加率のグラフ表示である。Ｐ値*：＜０．０１。
【図４】０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるＴＮＦ−α発現の抑制率のグラフ表示である（Ｐ値*：＜０．０１；**：＜０．００１）。
【図５】０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるＩＬ−６発現の抑制率のグラフ表示である（Ｐ値*：＜０．０１）。
【図６】処置したスイス系アルビノマウス由来の血清におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現に対する、多用量のカレビンＡの影響のグラフ表示である。動物の数＝グループ当たり６匹。Ｐ値：*＜０．０１；**＜０．００１  スチューデントの「ｔ」検定。
【図７】処置したスイス系アルビノマウス由来の血清におけるＩＬ−６の発現に対する、多用量のカレビンＡの影響のグラフ表示である。動物の数＝グループ当たり６匹。Ｐ値：*＜０．０１；**＜０．００１  スチューデントの「ｔ」検定。
【図８】カレビンＡが、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化および脂肪生成を抑制することを示す図である。
【図９（Ａ）−（Ｂ）】それぞれ、実験群Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重に対する食餌補充の影響の写真およびグラフ表示である。
【図１０（Ａ）】高脂肪食（ＨＦＤ）供給Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける相対脂肪組織重量に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。
【図１０（Ｂ）】高脂肪食（ＨＦＤ）供給Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける相対脂肪組織重量に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。
【図１０（Ｃ）】高脂肪食（ＨＦＤ）供給Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける相対脂肪組織重量に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。
【図１１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清におけるレプチン発現に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。
【図１２】Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清におけるアディポネクチン発現に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、脂肪細胞(adipocytes)（脂肪細胞(fat cells)）の末期分化中の脂肪蓄積を予防するカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示する。本発明は、肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。
【０００８】
最も好ましい実施形態では、本発明は、脂肪生成を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する。言い換えると、本発明は、哺乳動物脂肪細胞の末期分化中の脂肪蓄積を予防する方法に関する（図１および８）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞におけるレプチン発現を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図２）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現を増加させる方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図３）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞における炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの発現を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図４）。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞における炎症誘発性サイトカインインターロイキン−６の発現を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図５）。
【０００９】
特定の実施形態では、本明細書で前に言及した脂肪細胞はヒト脂肪細胞である。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物における炎症誘発性サイトカインの肥満誘導性全身的発現を低減する方法であって、それを必要とする対象に有効量のカレビンＡを投与するステップを含む方法に関する。特定の実施形態では、本明細書のこの段落中で言及する炎症誘発性サイトカインは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を含む［図６および７］。
【００１０】
さらに他の最も好ましい実施形態では、本発明は、以下に関する。
１．体脂肪の過剰な蓄積のリスクがある哺乳動物における肥満管理の方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して脂肪生成抑制の効果をもたらすステップを含む方法。
２．体脂肪の過剰な蓄積のリスクがある哺乳動物における肥満管理でのカレビンＡの使用であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して脂肪生成抑制の効果をもたらすステップを含む使用。
３．体脂肪の過剰な蓄積のリスクがある哺乳動物において脂肪生成を抑制する方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充するステップを含む方法。
４．肥満哺乳動物の体重を減少させる方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む方法。
５．肥満哺乳動物の体重を減少させるための方法におけるカレビンＡの使用であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む使用。
６．肥満哺乳動物における全身アディポネクチン発現を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充するステップを含む方法。
７．肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量のカレビンＡを経口投与して全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらすステップを含む方法。
８．哺乳動物における肥満症を治療するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
９．哺乳動物において除脂肪体重を増進するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって除脂肪体重の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
さらに別の好ましい実施形態では、対象は哺乳動物である。
さらに別の好ましい実施形態では、対象はヒトである。
抗肥満分子としてのカレビンＡの潜在的治療価値は、本明細書において以下で解明する具体例によって理解することができる。
【実施例】
【００１１】
（例Ｉ）
カレビンＡの急性経口毒性
表Ｉは、カレビンＡの急性経口毒性に関して試験したパラメータを列挙する。
結果：
最大２週間の観察において経口で最大２０００ｍｇ／ｋｇまで、マウスにおいて死亡は観察されなかった。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
（例ＩＩ）
脂肪生成培養物のオイルレッド−Ｏ染色ならびにＥＬＩＳＡによるレプチン、アディポネクチン、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の評価
脂肪細胞の末期分化は、巨大細胞質小胞中の多量の脂質の蓄積を伴う。細胞培養における脂肪細胞分化を測定するための一般的なアッセイは、色素オイルレッド−Ｏ（ＯＲＯ）を用いたアッセイである。ＯＲＯは、脂肪細胞分化（脂肪生成）の信頼できる指標である、脂質可溶性の鮮やかな赤色の色素である。
【００１４】
原理：
オイルレッドＯ（ソルベントレッド２７、スーダンレッド５Ｂ、Ｃ．Ｉ．２６１２５、およびＣ26Ｈ24Ｎ4Ｏ）は、凍結切片上の中性トリグリセリドおよび脂質ならびにパラフィン切片上の幾つかのリポタンパク質の染色に使用する、リソクローム（脂溶性色素）ジアゾ色素である。それは５１８（３５９）ｎｍで最も吸収される赤色粉末の外見を有する。オイルレッドＯは、スーダン染色に使用する色素の１つである。同様の色素には、スーダンＩＩＩ、スーダンＩＶ、およびスーダンブラックＢがある。アルコール固定は脂質を除去するので、染色は新たなサンプルで実施しなければならない。それは一層深い赤色をもたらし、したがって染色状態が一層容易に見られるので、オイルレッドＯは大抵スーダンＩＩＩおよびスーダンＩＶの代用となる。
オイルレッドＯは油溶性色素である。油溶性色素は、組織／細胞中の脂質物質において、通常のヒドロアルコール（ｈｙｄｒｏ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ）色素溶媒より高い色素可溶性を示す。したがって、それは細胞を十分に染色する。
【００１５】
方法：
３Ｔ３−Ｌ１細胞、約６０×１０4個の細胞を４８〜７２時間接種して７０〜８０％の融合を得た。４８時間後、新たに調製した２００μｌのＡＩＭ（脂肪生成誘導培地）を加える。７２時間後、異なる濃度の試験化合物を含む２００μｌのＡＰＭ（脂肪生成進行培地）をウエルに加える。細胞は５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）中で４８時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡによるレプチン、アディポネクチン、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの評価用に、上清を回収し保存する。細胞は１００μｌの１０％ホルマリンを加えることによって固定し、ＯＲＯ染色を行う。ＯＤはマイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおいて読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、結果はＩＣ50値として表す。
脂肪生成の抑制率は以下のように計算する。
抑制率＝Ｃ−Ｔ／Ｔ*１００
上式でＣは分化／未分化細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、
Ｔはサンプル処置分化／未分化細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である。レプチン、アディポネクチン、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの評価は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのユーザーズマニュアルに従って行う。
［参考文献］
1. Wu Z, Xie Y, Morrison R F, Bucher NLR, Farmer SR 1998. PPAR γ induces the Insulin-dependent Glucose Transporter GLUT4 in the absence of C/EBP□ during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes. J Clin Invest. 101:22-32.
2. A pre-adipose 3T3 cell variant highly sensitive to adipogenic factors & to human growth hormone. L A Salazar-Olivo, F Castro-Munozledo & W Kuri-Harcuch. Department of Cell Biology, Centro de Investigation y de Estudios Avanzados del I.P.N., Mexico D.F., Mexico. Journal of Cell Science, 1995.Vol 108, Issue 5 2101-2107.
3. A Nuclear Receptor Atlas: 3T3-L1 Adipogenesis. Mingui Fu, Tingwan Sun, Angie L. Bookout, Micheal Downes, Ruth T. Yu, Ronald M. Evans and David J. Mangelsdorf. Molecular Endocrinology, 2005. 19 (10): 2437-2450.
4. “ Expression of a Constitutively Active Akt Ser/Thr Kinase in 3T3-L1 Adipocytes Stimulates Glucose Uptake and Glucose Transporter 4 Translocation, Aimee D Kohn et al,  J. Biol. Chem. 1996, 271:31372-31378.
【００１６】
結果：
図１は、オイルレッド−Ｏ染色法によって試験した、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けた、それぞれ３２．４３％、３８．５９％および３５．８％の脂肪生成抑制率を示す。
図２は、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でのカレビンＡによる、ヒト脂肪細胞におけるレプチン生成の抑制率を示す（それぞれ３４．９２％、４１．０４％および３９．４８％）。ヒト脂肪細胞においてレプチン生成を抑制する際のカレビンＡの影響、および肥満管理とのその関係の重要性は、以下の事実に由来する（Notes on Pathophysiology of the Endocrine System、Colorado State University）。
【００１７】
レプチンは、脂肪細胞中で主に発現されるタンパク質ホルモンである。レプチンは、体重、代謝および生殖機能の調節において重要な役割を有する。このタンパク質は肥満（ｏｂ）遺伝子によってコードされ、約１６ｋＤａの質量である。正常濃度において、レプチンの生物学的機能は、空腹、食欲、体温調節およびエネルギー代謝を制御する脳の視床下部中枢に対するその影響に主に帰属する。したがって、非肥満個体中のレプチンは、２つの重要なメカニズム（ｉ）摂食挙動を制御するニューロペプチドＹの抑制による可能性が最も高い、空腹および食物消費の低下、および（ｉｉ）体温の上昇、酸素の消費によるエネルギー消耗の増大、および脂肪組織塊の消失によって、体重減少をもたらす可能性がある。しかしながら、肥満または誘導型肥満の実験モデルの場合のレプチンの過剰な分泌は、視床下部中枢の機能の混乱をもたらし、肥満の対象は飽満状態に到達せず、栄養過剰状態に向かう傾向がある。したがって、肥満において過剰発現レベルのレプチンの有効な低減をもたらすことが不可避となり、図２中に示すように、カレビンＡはこの分野において有望である。
【００１８】
図３は、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でのカレビンＡによる、ヒト脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の増加率を示す（それぞれ２７．１２％、３４．０６％および３２．８％）。アディポネクチンは、ほぼ独占的に脂肪細胞によって産生されるサイトカインであり、やせた健常な個体によって非常に高レベルで発現される。他方で肥満個体は低レベルのこのアディポカインを発現し、冠動脈性心疾患（ＣＡＤ）、糖尿病および高血圧になりやすい。
［参考文献］
1. Tamar. R. Aprahamian and Flora Sam, “Adiponectin in Cardiovascular Inflammation and Obesity, Int J. Inflam. 2011; 2011: 376909;
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3. Iwashima Y, Katsuya T, Ishikawa K, et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension. 2004; 43(6):1318-1323;
4. Kumada M, Kihara S, Sumitsuji S, et al. Association of hypoadiponectinemia with coronary artery disease in men. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2003; 23(1):85-89 and
5. Lindsay R S, Funahashi T, Hanson R L, et al. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population. The Lancet. 2002; 360(9326):57-58.
【００１９】
カレビンＡはヒト脂肪細胞においてアディポネクチンのレベルを効率よく高めることが示され（図３）、したがって肥満管理の分野において有望である。
図４および５は、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でのカレビンＡによる、ＴＮＦ−α（それぞれ３６．０３％、４０．８１％および４５．４７％）ならびにＩＬ−６（それぞれ２１．３１％、３２．３７％および３１．７％）の抑制率を示す。Bastard JP et al,“Recent Advances in the relationship between obesity, inflammation and insulin resistance”,Eur Cytokine Netw.2006 March;17(1):4-12は、肥満が白色脂肪組織（ＷＡＴ）の低度の炎症と関係があることを例証する。この筆者は、肥満において、ＷＡＴは、ＷＡＴに影響を与えるだけでなく身体の他の全身器官にも影響を与える、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のような炎症誘発性分子の高い発現によって特徴付けられることも言及する。図４および５は、カレビンＡは脂肪細胞中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現を低減する際に有効であり、肥満において局所的および全身的炎症の影響を制御するのに有用な作用物質であり得ることを実証する。
【００２０】
（例ＩＩＩ）
カレビンＡによる全身的炎症の制御
本発明者らは、ネズミ好中球系において細胞内ＴＮＦおよび細胞外ＩＬ−１βを抑制するカレビンＡの能力を支持する、さらなる証拠も提示する（表ＩＩ、表ＩＩＩ）。好中球はヒストプラーク（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）勾配法によって単離し、リポ多糖（ＬＰＳ）での刺激後ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＮＦ−αを産生するそれらの能力に関して試験する。細胞は暗所でフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＴＮＦ−αと共にインキュベートし、滅菌ＰＢＳで洗浄した後、サンプルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤＬＳＲ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において直接得た。蛍光誘導はゲートの好中球集団（１０，０００事象）のＰＥ（ＦＬ１）パラメータで設定した。ロリプラムを１００μｇ／ｍｌで、この試験におけるＴＮＦ−αの標準抑制剤として使用した。蛍光補正、データ解析、およびデータ表示は、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実施した。
［参考文献］
1. Clara, B., R. C. Arancha, G. M. Andre's, P. Atanasio, A. Julia, and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-α-secreting cells using direct immunofluorescence surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264:77-87.
2. Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani, Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-α cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009, 1939-1943.
【００２１】
【表２】
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【００２２】
【表３】
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【００２３】
本発明者らは、処置したマウス（ｉｎ−ｖｉｖｏモデル）由来の血清における細胞外ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β［図６］およびＩＬ−６［図７］の発現を低減する、カレビンＡの能力に関する試験データも提示する。６〜８週齢のスイス系アルビノ雄マウスを、１２時間／１２時間の明暗サイクル下において２２±２℃に維持した。Brieva A,Guerrero A,Alonso-Lebrero J L and Pivel JP.2001によって記載された方法に従い、マウスには６日間段階的用量（ｗ／ｖ）での試験薬剤の経口治療、次に１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの静脈内注射を施した。イムノフェロン、天然源の糖複合体は、ＬＰＳ誘導型ＴＮＦ−α産生および炎症応答を抑制する。International Immunopharmacology 1,1979-1987。それぞれのグループ中６匹のマウスを使用し、実験は三連で実施した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の産生は、ＬＰＳ注射後９０分で、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により処置したマウス由来の血清において評価した。標準薬剤として３０ｍｇ／ｋｇでロリプラムを使用した。
【００２４】
図６および７は、カレビンＡはＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を低減する際に有効であることを実証し、したがってこの化合物が、肥満において局所的および全身的炎症の影響を制御するのに有用な作用物質であることを示す。
【００２５】
（例ＩＶ）
カレビンＡによる脂肪生成の抑制
細胞培養および脂肪細胞分化
アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入したマウス３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を、加湿５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃において、２ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００００単位のペニシリン／ｍＬおよび１０ｍｇストレプトマイシン／ｍＬ）および１０％コウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。簡単に言うと、細胞は２４ウエル（２×１０4／ｍＬ）または１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭを含む１０ｃｍ皿に接種して、完全に融合させた。（第０日として定義した）融合後２日で、１．７μＭのインスリン、０．５ｍＭの３−イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および１２．７μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含有する分化用培地（ＭＤＩ）中、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で２日間細胞をインキュベートした。次いでこの培地を、１０％ＦＢＳおよびインスリン（１．７μＭ）を含有しカレビンＡ有りまたは無しのＤＭＥＭに交換し、これは２日毎に交換した。培養培地におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終濃度は０．０５％未満であった。オイルレッド−Ｏ染色用に、細胞を８日後（第１０日）に採取した。
【００２６】
オイルレッド−Ｏ染色
分化の末期に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、６０分間１０％ホルマリンで固定し、室温において１時間０．５％オイルレッドＯイソプロパノール中で染色する。過剰なオイルレッドＯ色素は蒸留水で２回洗浄し、次いで乾燥させた。細胞内の染色された脂質滴は光学顕微鏡により目で見て確認し、倍率１００倍でデジタルカメラを用いて撮影した。脂質蓄積を定量化するため、染色された脂質滴はイソプロパノール中に溶かし、５２０ｎｍで吸光度を測定した。
【００２７】
図８は、カレビンＡが、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化および脂肪生成を抑制することを示す。オイルレッドＯで染色した３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化および写真撮影（上部および中部）。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞はＭＤＩ（ＩＢＭＸ、ＤＥＸ、およびインスリンを含むＤＭＥＭ）で２日間インキュベートし、インスリンを含有しそれぞれカレビンＡ（０、５、１０、１５、２０、２５および３０μＭ）有りまたは無しのＤＭＥＭに次いで８日間交換した。脂質含有物は２−プロパノールによりオイルレッドＯ染色細胞から抽出し、５２０ｎｍで分光光度計分析によって定量化した。
【００２８】
動物実験−試験Ｉ
５週齢のオスＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＢｉｏＬＡＳＣＯ実験動物センター（Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から購入し、制御雰囲気（５０％相対湿度で２５±１℃）において１２時間光期／１２時間暗期サイクルで収容した。馴化後１週間で、以下のように１２週間、通常食（ＮＤ、１５％が脂肪としてのエネルギー）、高脂肪食（ＨＦＤ；４０％が脂肪としてのエネルギー）、およびそれぞれ０．２５％または１％カレビンＡ（食餌１ｋｇ当たり２．５ｇまたは１０ｇのカレビンＡ）を補充したＨＦＤの、各々８匹の動物の４グループに動物をランダムに分けた（表Ｖ）。実験食はＰｕｒｉｎａ５００１食（ＬａｂＤｉｅｔ、ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から改変し、その組成は表ＩＶ中に列挙する。動物には、常時食餌と水を自由に与えた。食餌用カップには毎日新たな食餌を補給した。動物の食餌摂取は毎日モニタリングし、体重は毎週記録した。この試験で使用した全ての動物実験用プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＩＡＣＵＣ、ＮＫＭＵ）によって承認された。試験の最後に、全ての動物を一晩断食させ、ＣＯ2窒息によって屠殺した。血液サンプルを、生化学的分析用に心臓から回収した。肝臓、脾臓、腎臓および脂肪パッド（性腺周囲、腹膜後方および腸間膜脂肪）をすぐに除去し、重量測定し（表ＶＩ）写真撮影した。図９（Ａ）は、第１２週最後の各グループの代表的な写真を示す。体重は毎週モニタリングし、各グループの平均体重は平均±ＳＥとして表した。統計解析はスチューデントのｔ検定により行った。（＊）Ｐ＜０．０１、ＮＤグループと比較；（＃）Ｐ＜０．０１、ＨＦＤグループと比較。ＮＤは通常食でありＨＦＤは高脂肪食である（図９（Ｂ））。
【００２９】
図１０（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、性腺周囲脂肪、腹膜後方および腸間膜脂肪の写真、ならびに相対性腺周囲脂肪、腹膜後方および腸間膜脂肪重量の割合のグラフ表示も示す図である。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
【表５】
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ａ．材料および方法で記載したようにマウスには１２週間食餌を与え、体重は週２回モニタリングした。各グループの平均体重は平均±ＳＥとして表し（グループ当たりｎ＝８）、統計解析はスチューデントのｔ検定により行った。ＮＤは通常食でありＨＦＤは高脂肪食である。＊、Ｐ＜０．０１、および＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、ＮＤグループと比較。＃、Ｐ＜０．０１、および＃＃Ｐ＜０．００１、ＨＦＤグループと比較。
【００３２】
【表６】
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【００３３】
ａ．カレビンＡ（０．２５％および１％）補充有りまたは無しのＨＦＤを１２週間マウスに与えた。各グループのマウスを第１２週の最後に屠殺し、肝臓、脾臓、および腎臓を摘出し、写真撮影し、重量測定し記録した。データは平均±ＳＥとして表した（グループ当たりｎ＝８）。相対臓器重量は体重の割合として表す（肝臓重量／体重×１００）。ＮＤは通常食でありＨＦＤは高脂肪食である。
【００３４】
動物実験−試験２−肥満哺乳動物モデルにおける体重減少の実証
試験システムの詳細
【表７】
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【００３５】
試験性能
Ａ．管理
ａ．条件：標準的な実験室条件、適切で新鮮な空気供給（１時間当たり空気変化１２〜１５）による空気調節、室温２２±３℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間光期および１２時間暗期サイクルの下に動物を収容した。温度と相対湿度は１日１回記録する。
ｂ．収容：
ステンレススチール製シッパーチューブを備える水筒中にペレット食と飲料水を保持するための容器を有する、標準的なポリプロピレン製ケージ（サイズ：Ｌ２９０×Ｂ１４０×Ｈ１４０ｍｍ）およびステンレススチール製上部メッシュグリル中に個々の動物を収容した。滅菌済みの籾殻を床物質として与える。
ｃ．馴化：動物は５日間で実験室条件に馴化させ、毎日臨床兆候に関して観察した。
【００３６】
ｄ．食餌：馴化の間中Ｐｒａｎａｖ  Ａｇｒｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｓａｎｇｌｉ，Ｍａｈａｒａｓｔｒａにより製造されたＡＭＲＵＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄを自由に動物に与えた。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  Ｉｎｃ，ＵＳＡにより製造されＩｎｄｕｓ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ａｎｄｈｒａ  Ｐｒａｄｅｓｈ，ＩＮＤＩＡから得た、Ｏｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｉｅｔ  Ｄ１２４５０Ｂ食（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）およびＯｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｉｅｔ  Ｄ１２４９２高脂肪食（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）を、肥満の誘導および主要試験に使用した。
ｅ．水：滅菌済み飲料水を、馴化および肥満誘導期の間中自由に与えた。逆浸透膜装置に通した深井戸水を、ステンレススチール製シッパーチューブを備えるプラスチック製水筒中に与えた。
【００３７】
Ｂ．グループ分け
体重無作為化および階層化法により、馴化の最終日に動物のグループ分けを行った。使用した動物の体重変動が各グループの平均体重の±２０％を超えないように、動物のグループ分けを行った。
【００３８】
Ｃ．試験設計
動物は５グループ、すなわちそれぞれ１０匹の動物（５匹のオスと５匹のメス）からなるグループ１、２、３、４および５に分けた。グループ毎の動物のグループに関する詳細、用量および数／性別は表ＶＩＩ中に表す。
【００３９】
【表８】
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【００４０】
Ｄ．動物処置
ａ．用量体積：動物当たりの用量体積＝試験期間中全ての動物に関して体重１ｋｇ当たり１０ｍｌ
ｂ．肥満誘導：肥満の誘導中および主要試験中、Ｇ１対照グループの動物には１０ｋｃａｌ％の脂肪を含有する通常対照食Ｄ１２４５０Ｂを与え、Ｇ２〜Ｇ５グループの動物には６０ｋｃａｌ％の脂肪を含有する高脂肪食Ｄ１２４９２を与えた。
【００４１】
ｃ．主要試験：主要試験は肥満の誘導後に開始した。３用量のカレビンＡを、第２９日から毎日連続して２８日の間動物に投与した。食餌の供給は、肥満の誘導において実施したのと同様の形式で主要試験中続けた。Ｇ１対照およびＧ２高脂肪食対照グループの動物には０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を投与し、一方他のグループの動物には試験期間の第２９日から第５６日まで試験品を与えた。投与の用量体積は、個々の動物のその週の体重に従い維持した。試験の全体期間は６１日であった（馴化期５日＋肥満の誘導２８日＋主要試験２８日）。
【００４２】
統計解析：この試験から得た生データにコンピュータによる統計処理を施した。（添付表の形式での）コンピュータによるデータのプリントアウトは元の生データで確認した。確認後、体重に関するデータ、体重、血液学的および臨床化学的パラメータ、臓器重量に関するデータは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）およびダンネットの事後検定に施した。全ての解析および比較は９５％の信頼レベルで評価し（Ｐ＜０．０５）、以下で言及する報告中、Ｇ１とＧ３、Ｇ４、Ｇ５およびＧ６を比較した場合の上付き文字aによる表示によって、およびＧ２とＧ３、Ｇ４、Ｇ５およびＧ６を比較した場合の上付き文字bによる表示によって示した。＊：適用する場合統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）。
データは、以下の比較によって一元配置−ＡＮＯＶＡ統計解析に施した：
以下に表すように、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と、Ｇ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝およびＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝の比較：
【００４３】
【表９】
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以下に表すように、Ｇ２−（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食対照と、Ｇ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝およびＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝の比較：
【００４４】
【表１０】
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【００４５】
結果
体重：個々の動物の体重は第１日における受け入れ日、およびその後試験期間中週１回（±１日）記録した。
オスおよびメスの動物の毎週の体重の概要は、それぞれ表ＶＩＩＩ（ａ）／ＶＩＩＩ（ｂ）およびＩＸ（ａ）／ＩＸ（ｂ）中に表す。
【００４６】
【表１１】
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【００４７】
【表１２】
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【００４８】
【表１３】
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【００４９】
【表１４】
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【００５０】
オスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第１５日にＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差と関係があると考えた。
オスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第２２日および第２９日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
【００５１】
オスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第３６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
オスの動物では、Ｇ２グループ｛６０ｋｃａｌ％の脂肪含む｝高脂肪食対照｝と比較して、第３６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な減少があった。これらの変化は、試験品カレビンＡの投与の影響と関係があると考えた。
【００５２】
オスの動物では、Ｇ２グループ｛６０ｋｃａｌ％の脂肪含む｝高脂肪食対照｝と比較して、第４３日、第５０日および第５６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な減少があった。これらの変化は、試験品カレビンＡの投与に原因があると考えた。
【００５３】
メスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第１５日および第２２日にＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
メスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第２９日および第３６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
【００５４】
メスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第４３日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
メスの動物では、Ｇ２グループ｛６０ｋｃａｌ％の脂肪含む｝高脂肪食対照｝と比較して、第４３日、第５０日および第５６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な減少があった。これらの変化は、試験品カレビンＡの投与に原因があると考えた。
【００５５】
したがって、高脂肪食誘導型肥満状態のオスおよびメスＣ５７動物の体重減少において、体重１ｋｇ当たり５、１０および２０ｍｇの試験濃度で、カレビンＡは影響を有したと結論付けることができた。
さらに、試験期間の終了後（第５７日）、ガスチャンバー内で過剰なＣＯ2に曝すことにより動物を無痛屠殺し、臓器重量を記録した。全動物由来の脳、胸腺、肝臓、副腎、腎臓（対）、脾臓、心臓および卵巣／精巣（対）から必要に応じて任意の接着組織を摘出し、乾燥を避けるため可能な限り速やかに湿潤状態で重量を測った。一般に、オスとメスの間で臓器重量の統計学的に有意な差はなかったが、例えばオスグループの肝臓において、臓器特異的重量改善が観察可能であった（表Ｘ参照）。この結果は肝臓に関する表ＶＩにおける改善を確証する。Behnke,A.R.1953.Lean body mass.A.M.A.Arch.Int.Med.91,585は除脂肪体重増進の指標として肝臓を示すことができ、H.F.Kraybill et al,J ANIMSCI1954,13:548-555は、他の内臓臓器も同様に除脂肪体重増進の指標となり得ることを示す。毒性を示さない臓器重量の持続的増大の観点での統計学的有意性は、長期の試験期間にわたり大きなサンプルサイズ（より多数の試験動物）で得ることができる可能性が非常に高い。表ＶＩおよび表Ｘの結果は、脂肪生成を抑制し体重を減少するだけでなく除脂肪体重も増進する、カレビンＡの能力の予備的指標として解釈することができる。
【００５６】
【表１５】
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【００５７】
さらに、試験期間の終了時に、レプチンおよびアディポネクチンの全身発現を推定するため、エチレンジアミド四酢酸カリウム（Ｋ２−ＥＤＴＡ）抗凝血薬を含有するチューブ内に全動物から血液サンプルを回収した。血液サンプルは、微細なキャピラリーチューブの助力で適度なエーテル麻酔の下、眼窩後部神経穿刺法から無痛回収した。抗凝血薬を含まないチューブ内に回収した血液サンプルは１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離して、レプチンおよびアディポネクチンを推定するためＥＬＩＳＡ技法に施す血清を得た。肥満症におけるバイオマーカーとしてのレプチンおよびアディポネクチン発現の出現は段落００１７および００１８で十分論じている。カレビンＡは肥満哺乳動物の血清におけるレプチン発現の抑制に対してわずかな影響を示し（図１１）、肥満哺乳動物の血清レベルにおけるアディポネクチン発現を増加する際に有意な影響を示した（図１２）。低い全身アディポネクチンレベルは、ＩＩ型糖尿病のような病状の進行における予測因子として挙げられている（Chamukuttan Snehalatha et al,「Plasma Adiponectin Is an Independent Predictor of Type 2 Diabetes in Asian Indians」,Diabetes Care December 2003 vol.26 no.12 3226-3229）。肥満症の哺乳動物モデルにおける全身アディポネクチンレベルを有意に増加するカレビンＡの能力は、前記哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の発症の予防を助長する、その能力を示す。
【００５８】
好ましい実施形態を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明がそれに限定されないことは当業者によって明らかに理解される。そうではなくて、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と関連してのみ解釈される。
【００５９】
本発明は以下の実施形態：
１．哺乳動物において除脂肪体重を増進するための、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって、除脂肪体重の増加の効果をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
２．肥満哺乳動物の体重を減少させるための医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
３．肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための、全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
４．哺乳動物における肥満症を治療するための、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
５．ヒト以外の哺乳動物において除脂肪体重を増進するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充し、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって除脂肪体重の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
であってよい。
６．ヒト以外の肥満哺乳動物の体重を減少させるための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む方法。
７．ヒト以外の肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量のカレビンＡを経口投与して全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらすステップを含む方法。
８．ヒト以外の哺乳動物における肥満症を治療するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
【００６０】
本発明は、さらに以下の実施形態：
１．哺乳動物において除脂肪体重を増進するための、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって、除脂肪体重の増加の効果をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む医薬組成物。
２．肥満哺乳動物の体重を減少させるための医薬組成物であって、カレビンＡを含む、１記載の医薬組成物。
３．肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための、全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む、１記載の医薬組成物。
４．哺乳動物における肥満症を治療するための、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらす医薬組成物であって、カレビンＡを含む、１記載の医薬組成物。
５．ヒト以外の哺乳動物において除脂肪体重を増進するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充し、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって除脂肪体重の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
であってよい。
６．ヒト以外の肥満哺乳動物の体重を減少させるための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む、５記載の方法。
７．ヒト以外の肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量のカレビンＡを経口投与して全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらすステップを含む、５記載の方法。
８．ヒト以外の哺乳動物における肥満症を治療するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらすステップを含む、５記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０（Ｂ）】
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【図１０（Ｃ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図８】
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【図９（Ａ）−（Ｂ）】
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【図１０（Ａ）】
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【外国語明細書】
2015214529000001.pdf