(57)【要約】【課題】本発明は、哺乳動物の細胞内の遺伝子発現をインビボでイメージングするための組成物及び方法を提供することを目的とする。【解決手段】  レポーター遺伝子として、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子を用いる。該遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dを検出するトレーサーとして、hM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を用いる。【選択図】図１
2015071560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の細胞に導入した変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dを、インビボでイメージングするための組成物であって、
hM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、放射性同位体標識化ジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン誘導体である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、下記化合物を表す、請求項１又は２記載の組成物。
【化１】
2015071560.tif 000008
（R1及びR2は、それぞれ独立に、水素又はハロゲンを表し；R3は、水素又はC1-6アルキルを表し；かつR4は、=N-(C1-6アルキル)、又は=N+(O-)(C1-6アルキル)を表し、該化合物中の少なくとも１つの原子が、該原子の放射性同位体である。）。
【請求項４】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、[11C]クロザピン-N-オキシド又は[11C]クロザピンである、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞が、脳内の細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記脳内が、海馬領域内である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が、神経細胞である、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞が、iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
前記iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞が、神経細胞である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物の細胞に導入した外来遺伝子の発現をインビボでイメージングするための組成物であって、
該外来遺伝子に、レポーター遺伝子として、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が連結されており、
該レポーター遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物。
【請求項１１】
前記外来遺伝子が、治療遺伝子である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、放射性同位体標識化ジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン誘導体である、請求項１０又は１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、下記化合物を表す、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の組成物：
【化２】
2015071560.tif 000009
（R1及びR2は、それぞれ独立に、水素又はハロゲンを表し；R3は、水素又はC1-6アルキルを表し；かつR4は、=N-(C1-6アルキル)、又は=N+(O-)(C1-6アルキル)を表し、該化合物中の少なくとも１つの原子が、該原子の放射性同位体である。）。
【請求項１４】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、[11C]クロザピン-N-オキシド又は[11C]クロザピンである、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞が、脳内の細胞である、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
前記脳内が、海馬領域内である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞が、神経細胞である、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞が、iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞である、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
前記iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞が、神経細胞である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳動物に移植若しくは投与した細胞の生存、生着、分化及び/又は分布をインビボでイメージングするための組成物であって、
該細胞が、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子を、レポーター遺伝子として含み、
該レポーター遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物。
【請求項２１】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、放射性同位体標識化ジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン誘導体である、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、下記化合物を表す、請求項２０又は２１記載の組成物：
【化３】
2015071560.tif 000010
（R1及びR2は、それぞれ独立に、水素又はハロゲンを表し；R3は、水素又はC1-6アルキルを表し；かつR4は、=N-(C1-6アルキル)、又は=N+(O-)(C1-6アルキル)を表し、該化合物中の少なくとも１つの原子が、該原子の放射性同位体である。）。
【請求項２３】
前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体が、[11C]クロザピン-N-オキシド又は[11C]クロザピンである、請求項２０〜２２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞が、脳内の細胞である、請求項２０〜２３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２５】
前記脳内が、海馬領域内である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記細胞が、神経細胞である、請求項２０〜２５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２７】
前記細胞が、iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞である、請求項２０〜２３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２８】
前記iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞が、神経細胞である、請求項２７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現又は細胞分化をインビボでイメージングするための組成物に関する。特に、本発明は、哺乳動物の細胞に導入した遺伝子の発現をインビボでイメージングするための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療などにおいて、哺乳動物の細胞に導入した治療遺伝子の発現を確認する方法として、レポーター遺伝子とその遺伝子産物に特異的に結合するＰＥＴトレーサーとを用いる、ＰＥＴイメージング方法が知られている。
【０００３】
当該方法は、治療遺伝子の下流にレポーター遺伝子を結合させ、標的細胞に導入し、該レポーター遺伝子が発現した遺伝子産物をＰＥＴトレーサーで検出するというものである。治療遺伝子が発現すると同時にレポーター遺伝子も発現されるため、該レポーター遺伝子が発現した遺伝子産物を検出することにより、該治療遺伝子の発現部位、発現量、及び発現期間などを評価することができる。
【０００４】
しかしながら、従来の方法は、レポーター遺伝子産物として内在性の伝達物質やその受容体を用いるものであり、汎用性が高くないという問題があった。また、インビボイメージングのためには、レポーター遺伝子産物とそれを検出できるトレーサーとの組合せが重要である。すなわち、レポーター遺伝子産物は、細胞毒性がないこと及び組織若しくは個体レベルで検出ができることが要求される。また、当該レポーター遺伝子産物を検出できるトレーサーは、脳血液関門を通過できること及び体内から容易に排出できることなどが要求される。レポーター遺伝子産物及びそれを検出するトレーサーを用いた、有用なインビボイメージング方法は、現在まで確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vandeputte C  et al., A PET brain reporter gene system based on type 2 cannabinoid receptors. J Nucl Med. 2011 Jul;52(7):1102-9.
【非特許文献２】MacLaren DC, Toyokuni T, Cherry SR, Barrio JR, Phelps ME, Herschman HR, Gambhir SS. PET imaging of transgene expression. Biol Psychiatry. 2000 Sep 1;48(5):337-48. Review.
【非特許文献３】Armbruster BN et al., Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5163-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、哺乳動物の細胞内の遺伝子発現をインビボでイメージングするための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、インビボイメージングに用いることができる、レポーター遺伝子とその遺伝子発現産物に特異的に結合する放射性トレーサーとの組合せについて検討した。その結果、レポーター遺伝子として変異型ムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）をコードする遺伝子、及び変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子、及びトレーサーとしてジベンゾジアゼピン誘導体を見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、哺乳動物の細胞に導入した変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dを、インビボでイメージングするための組成物であって、
hM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、哺乳動物の細胞に導入した外来遺伝子の発現をインビボでイメージングするための組成物であって、
該外来遺伝子に、レポーター遺伝子として、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が連結されており、
該レポーター遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、哺乳動物に移植若しくは投与した細胞の生存、生着、分化及び/又は分布をインビボでイメージングするための組成物であって、
該細胞が、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子を、レポーター遺伝子として含み、
該レポーター遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dと特異的に結合する放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、生体への細胞移植や外来遺伝子導入などの成否をインビボで確認することができる。具体的には、本発明の組成物を用いて、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子に連結した外来遺伝子の発現の有無、発現部位、発現量、及び/又は発現期間を評価することができる。また、本発明の組成物を用いて、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を含む細胞の生存、生着、分化、及び/又は分布を評価することができる。
【００１２】
hM4D又はhM3Dは、[11C]クロザピン-N-オキシド又は[11C]クロザピンなどの放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体とのみ特異的に結合し、内在性の伝達物質とは結合しない。したがって、本発明の組成物を用いることにより、遺伝子発現の有無、発現部位、発現量、及び発現期間などを正確に評価することができる。
【００１３】
さらに、hM4Dは、神経活動抑制機能を有し、かつhM3Dは、神経活動増加機能を有するので、細胞内で発現したhM4D及び/又はhM3Dに結合するリガンドを用いて、哺乳動物の神経活動をコントロールすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】野生型マウス（雄性C57/B6; 5ヶ月齢）海馬領域にhM4D-iPS細胞を移植し、移植後40日の11C-CNOPETスキャン画像を示す。該画像は、30〜60分の平均放射能活性に基づいた再構成画像である。また、脳構造MR画像を重ねて表示している。
【図２】レンチウイルスベクターによりサル被殻(矢印)に発現させたhM4D受容体の11C-クロザピンによる生体可視化画像を示す。該画像は、30〜60分の平均放射能活性に基づいた再構成画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１．定義）
本願明細書中において、用語「レポーター遺伝子」とは、当業者により一般的に用いられる意味を有し、具体的には、ある遺伝子の発現の有無及び発現量等を知るために、その遺伝子に連結される別の遺伝子を意味する。ある遺伝子に連結されたレポーター遺伝子の発現の有無を検出することにより、その遺伝子の発現の有無の情報などを得ることができる。
【００１６】
本願明細書中において、用語「インビボイメージング」とは、当業者により一般的に用いられる意味を有し、観察する組織・臓器（可能であれば個体そのもの）を生かしたままの状態で、その中で活動する細胞・分子の生きた動態を可視化・画像化することを意味する。インビボイメージングは、個体や組織を生かした状態で観察できるため、生命現象を時間軸をもって、また本来の姿で解析できるという利点がある。例えば、「in vivoイメージング実験プロトコル  原理と導入のポイントから２光子顕微鏡の応用まで」（２０１３年１月１日第１刷発行、石井優編集、羊土社）を参照されたい。
【００１７】
本願明細書中において、用語「PET」は、ポジトロン断層法を意味する。また、本願明細書中において、用語「SPECT」は、単一光子放射断層撮影を意味する。
【００１８】
用語「ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体」及び「ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体」は、当業者に公知であり、それぞれ、ヒト由来の代謝調節型受容体のサブタイプM3及びM4を意味する。本明細書中において、「ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体」及び「ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体」を、それぞれ、「hM4」及び「hM3」とも記載する。
【００１９】
用語「変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体」及び「変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体」も、当業者に公知である。本明細書中において、「変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体」及び「変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体」を、それぞれ、「hM4D」及び「hM3D」とも記載する。
【００２０】
本願明細書中において、用語「哺乳動物」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物を含む。例えば、哺乳動物は、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル（マーモセット（例えば、コモンマーモセット）、アカゲザル又はカニクイザルなど）、イヌ、ネコ、又はミニブタなどである。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００２１】
本願明細書中において、用語「脳」とは、当業者により一般的に用いられる意味を有し、例えば、大脳、間脳、小脳、又は中脳である。より具体的には、大脳皮質、例えば、大脳辺縁皮質である。さらに具体的には、帯状回、扁桃体、海馬、中隔、脳弓、乳頭体、又は海馬傍回などである。
【００２２】
本明細書中において、用語「アルキル」とは、脂肪族飽和炭化水素の水素原子１個が失われて生じる1価の基を意味する。本明細書において、「アルキル」は、例えば、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は2〜6個の炭素原子を有することができる。本明細書において、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、及び2〜6個の炭素原子を有するアルキルを、それぞれ、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、及びC2-6アルキルとも示す。アルキルは、直鎖若しくは分枝状であってもよい。アルキルの例を挙げると、メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル及びその異性体、n-ヘキシル及びその異性体などがある。アルキルは、さらに適当な置換基によって置換されてもよい。
【００２３】
本明細書中において、用語「ハロゲン」とは、フルオロ（Ｆ）、クロロ（Ｃｌ）、ブロモ（Ｂｒ）及びヨード（Ｉ）を意味する。本明細書中において、用語「ハロゲン化アルキル」とは、少なくとも１つのハロゲンで置換されたアルキルを意味する。
【００２４】
本明細書中において、用語「アシル」とは、-CO-Ra（Raは、アルキルである。）を意味する。Raがメチルである場合、用語「アシル」は、「アセチル」ともいう。アシルは、さらに適当な置換基によって置換されてもよい。本明細書中において、用語「ハロゲン化アシル」とは、少なくとも１つのハロゲンで置換されたアシルを意味する。
【００２５】
本明細書中において、用語「医薬として許容し得る」とは、生体に対して無毒であることを意味する。用語「医薬として許容し得る塩」とは、無機酸若しくは無機塩基、又は有機酸若しくは有機塩基を含む、医薬として許容し得る無毒性の酸又は塩基から形成される無毒性の塩を意味する。医薬として許容し得る塩の例を挙げると、制限されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、マグネシウム、及び亜鉛などから形成される金属塩、又はアミン、リジン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）及びプロカインなどから形成される有機塩がある。また、医薬として許容し得る塩は、塩酸塩などの酸付加塩及び塩基付加塩を包含する。
【００２６】
（２．レポーター遺伝子及びその遺伝子産物）
本発明は、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）をコードする遺伝子、又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子をレポーター遺伝子として用いる。hM4Dをコードする遺伝子は、哺乳動物の細胞内において、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）を発現する。また、hM3Dをコードする遺伝子は、哺乳動物の細胞内において、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）を発現する。本発明において、hM4Dをコードする遺伝子とhM3Dをコードする遺伝子とは、別々に用いても、同時に用いてもよい。本発明において、hM4Dをコードする遺伝子のみを用いてもよい。本発明において、hM3Dをコードする遺伝子のみを用いてもよい。
【００２７】
変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）、及びhM4Dをコードする遺伝子は、当業者に公知である。hM4Dは、ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4）のアミノ酸配列（配列番号１）のうち、第１１３番目のチロシン（Tyr）がシステイン（Cys）に、及び第２０３番目のアラニン（Ala）がグリシン（Gly）に変異したアミノ酸配列を有する（配列番号２）。hM4Dをコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有する。hM4Dは、神経伝達物質などの内在性の伝達物質と結合しない。
【００２８】
変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）、及び該hM3Dをコードする遺伝子も、当業者に公知である。hM3Dは、ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3）のアミノ酸配列（配列番号４）のうち、第１４９番目のチロシン（Tyr）がシステイン（Cys）に、及び第２３９番目のアラニン（Ala）がグリシン（Gly）に変異したアミノ酸配列を有する（配列番号５）。hM3Dをコードする遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有する。hM3Dは、神経伝達物質などの内在性の伝達物質と結合しない。
【００２９】
当業者であれば、hM4D及びhM3Dの独自性、すなわち該タンパク質を特徴づける特異的なアミノ酸配列（例えば、モチーフ、ドメイン又はボックス配列など）などが保持されることを条件として、該タンパク質におけるアミノ酸配列の欠失、付加、変異又は置換が許容され得ることは理解されるであろう。そのような欠失、付加、変異又は置換の数は、hM4D及びhM3Dの独自性が保持されることを条件として、限定されない（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上）。一般的に、同じ性質を有するアミノ酸相互間での変異又は置換は、当該タンパク質の機能に全くあるいはほとんど影響を与えないので、該変異又は置換を含むタンパク質は、元のタンパク質と同等であるとみなすことができる。そのようなアミノ酸の性質としては、例えば以下のようなカテゴリーを挙げることができる：例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、ヒスチジン及びアルギニン）、疎水性（脂肪族）アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン）、含硫アミノ酸（メチオニン及びシステイン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、酸性アミノ酸アミド（アスパラギン及びグルタミン）、又は中性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミン）。また、hM4Dをコードする遺伝子及びhM3Dをコードする遺伝子の塩基配列は、コドン縮重を考慮して、適宜最適コドンと成るように塩基を変更することが可能である。
【００３０】
hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー及び/又はPoly(A)などを連結することができる。好ましくは、神経細胞に特異的に発現するThy-1-プロモーターを連結することができる。該プロモーター等は、当業者により適切に選択することができるであろう。好ましくは、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、上流にThy-1-プロモーター及び下流にSV40が連結されている。
【００３１】
hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、治療遺伝子などの外来遺伝子が連結されていてもよい。該外来遺伝子の例を挙げると、例えば、抗原遺伝子、サイトカイン遺伝子、癌抑制遺伝子、成長因子遺伝子、増殖因子遺伝子、自殺遺伝子、欠損遺伝子、受容体遺伝子、標識遺伝子、複製抑制遺伝子、腫瘍溶解性ウイルス遺伝子、転写因子遺伝子、細胞保護遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子などがある。好ましくは、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、外来遺伝子の下流に連結される。また、プロモーター及び/又はエンハンサーなどを外来遺伝子の上流に連結することができる。これらの遺伝子の連結方法は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３２】
（３．レポーター遺伝子を含む細胞）
hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、哺乳動物の細胞に導入される。該細胞は、哺乳動物から採取された細胞であってもよい。hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、哺乳動物の細胞の遺伝子に連結されてもよい。該遺伝子が導入された該細胞は、hM4D又はhM3Dを発現することができる。
【００３３】
hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子が導入される細胞は、特に制限されないが、好ましくは、脳内の細胞（脳細胞）、より好ましくは、海馬領域内の細胞である。一実施態様において、該細胞は、神経細胞（例えば、脳神経細胞）、脳細胞、皮膚細胞、心筋細胞、又は血管細胞である。他の実施態様において、該細胞は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）又は胚性幹細胞（ES細胞）である。また他の実施態様において、該細胞は、iPS細胞又はES細胞から分化誘導された細胞、例えば、神経細胞（例えば、脳神経細胞）、脳細胞、皮膚細胞、心筋細胞、又は血管細胞である。好ましくは、該iPS細胞又はES細胞は、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞該細胞である。
【００３４】
hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子の細胞への導入方法は、特に制限されず、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、マイクロインジェクション法又はトランスフェクション法などの方法により行うことができる。hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞に導入してもよい。該ベクターは、好ましくは、レンチウイルスベクター（Lenti-hSyn-hM4d-CFP）などのウイルスベクターである。また、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子をプラスミド又はファージに組み込んで、細胞に導入してもよい。
【００３５】
また、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を組み込んだ前記ベクターを、哺乳動物に投与することにより、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を、哺乳動物の細胞に導入することもできる。該投与は、特に制限されないが、非経口、腹腔内、静脈、頭部、経皮、又は筋肉内投与、或いは当業者に公知の他の手段により行うことができる。また、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を、哺乳動物の受精卵にインジェクションし、hM4D又はhM3Dを発現するトランスジェニック動物を作成することもできる。
【００３６】
哺乳動物から細胞を採取し、該細胞にhM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を導入後、該細胞を哺乳動物に移植若しくは投与することができる。該遺伝子を導入後、移植若しくは投与前に、該細胞を培養してもよい。移植される細胞は、細胞シートであってもよい。哺乳動物から採取した細胞を、iPS細胞に誘導後、該遺伝子を導入してもよい。該iPS細胞を、神経細胞などの特定の細胞に分化誘導してもよい。また、哺乳動物からES細胞を採取し、該遺伝子を導入してもよい。該ES細胞は、神経細胞などの特定の細胞に分化誘導してもよい。
【００３７】
該細胞の採取、移植、及び投与方法は、当業者に公知の方法であってよく、特に制限されない。該採取及び移植部位は、例えば、皮膚、血管、心筋、及び脳などがある。該投与は、非経口、腹腔内、静脈、頭部、経皮、又は筋肉内投与、或いは当業者に公知の他の手段により行うことができる。採取される哺乳動物と移植若しくは投与される哺乳動物は、同一であっても異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
【００３８】
該細胞において発現されたhM4D又はhM3Dは、下記に示す誘導体と特異的に結合することができる。したがって、下記に示す誘導体又は組成物を用いて、該細胞において発現されたhM4D又はhM3Dをインビボでイメージングすることができる。該イメージングにより、該細胞が正常に機能しているか否か、例えば、該細胞の生存、生着、分化及び/又は分布をインビボで評価することができる。hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、生きている細胞でのみ発現されるので、該遺伝子から発現されたhM4D又はhM3Dが検出された場合、該細胞が正常に機能していると判定することができる。
【００３９】
治療遺伝子などの外来遺伝子とhM4D又はhM3Dをコードする遺伝子とが連結されている場合、これらの遺伝子は共発現される。したがって、該hM4D又はhM3Dを検出することにより、同時に、該外来遺伝子の導入の成否、発現の有無、発現部位、及び発現期間などを評価することができる。また、該hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子は、該外来遺伝子と同じ量で発現される。したがって、該hM4D又はhM3Dの発現量を評価することにより、同時に、該外来遺伝子の発現量を評価することができる。
【００４０】
（４．ジベンゾジアゼピン誘導体、及び該誘導体を含む組成物）
本発明は、ジベンゾジアゼピン誘導体を含む組成物を提供する。該組成物は、任意に1つ以上の医薬として許容し得る担体を含むことができる。該ジベンゾジアゼピン誘導体は、hM4D及び/又はhM3Dに特異的に結合することができる。したがって、該ジベンゾジアゼピン誘導体は、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM4Dを検出し、イメージングすることができる。また、該ジベンゾジアゼピン誘導体は、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM3Dを検出し、イメージングすることができる。
【００４１】
また、該ジベンゾジアゼピン誘導体は、血液脳関門（BBB）を通過することができる。したがって、例えば、該誘導体又は該組成物を末梢血管から投与して、脳内において発現されたhM4D及び/又はhM3Dをインビボで検出することができる。さらに、該ジベンゾジアゼピン誘導体は、哺乳動物の体内から容易に排出され得る。したがって、該ジベンゾジアゼピン誘導体を用いることにより、哺乳動物に対し毒性なくイメージングすることができる。
【００４２】
該ジベンゾジアゼピン誘導体は、ジベンゾジアゼピン骨格を有する化合物を意味する。アゼピンには、1,2-アゼピン、1,3-アゼピン又は1,4-アゼピンがある。該ジベンゾジアゼピン誘導体は、好ましくは、ジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン誘導体である。該ジベンゾジアゼピン誘導体は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、非置換若しくは置換ピペラジン又は非置換若しくは置換ピペラジンN-オキシドからなる群から選択される１種以上の置換基で置換され得る。該置換基は、ジベンゾジアゼピン環上の置換可能な位置に存在し得る。好ましくは、該置換基は、ジアゼピン環上に存在し得る。さらに好ましくは、該置換基は、ジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン環の8位又は11位に存在し得る。
【００４３】
前記置換ピペラジン若しくは置換ピペラジンN-オキシドにおいて、置換基は、C1-6アルキル、ハロゲン化C1-6アルキル、C1-6アシル、又はハロゲン化C1-6アシルなどがある。該置換基は、ピペラジン若しくはピペラジンN-オキシド環上の窒素又は炭素原子上に存在し得る。好ましくは、該置換基は、ピペラジン若しくはピペラジンN-オキシド環上の窒素上に存在し得る。
【００４４】
一実施態様において、該ジベンゾジアゼピン誘導体は、放射性同位体標識化されている。放射性同位体標識方法は、当業者に一般的な方法でよく、特に制限されない。例えば、前記ジベンゾジアゼピン誘導体に、放射性同位体を含む基を結合することができる。また、例えば、前記ジベンゾジアゼピン誘導体の原子のうちいずれか１つ以上が該原子の放射性同位体である。該ジベンゾジアゼピン誘導体は、好ましくは、PET又はSPECTなどの核医学イメージング手段により検出可能な放射性同位体により標識される。該放射性同位体は、例えば、11C、18F、及び15Oなどがある。
【００４５】
該ジベンゾジアゼピン誘導体の具体例を挙げると、以下の構造を有する化合物又はその医薬として許容し得る塩がある。
【化１】
2015071560.tif 000003
式中、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素又はハロゲンを表し；R3は、水素又はC1-6アルキルを表し；かつR4は、=N-(C1-6アルキル)、又は=N+(O-)(C1-6アルキル)を表す。より好ましくは、R1は、クロロなどのハロゲンを表し；R2は、水素を表し；R3は、水素を表し；かつR4は、=N-(C1-6アルキル)、又は=N+(O-)(C1-6アルキル)を表す。ここで、=N+(O-)は、アミン-N-オキシドであることを意味する。
【００４６】
一実施態様において、該化合物中の少なくとも１つの原子が、該原子の放射性同位体である。好ましくは、該化合物のR4のアルキル基が、該原子の放射性同位体、例えば11Cである。他の実施態様において、該化合物に放射性同位体元素を含む置換基が導入される。該置換基は、例えば、[11C]メチル、[11C]メチル-C1-5アルキル、18F、及び18F-C1-6アルキルなどがある。該置換基は、該化合物の置換可能な位置に導入することができる。該置換基は、例えば、フェニル環上、Ｎ原子上、又はピペラジン環上に置換することができる。
【００４７】
具体的には、ジベンゾジアゼピン誘導体は、クロザピン-N-オキシド又はクロザピンである。具体的には、放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体は、[11C]クロザピン-N-オキシド又は[11C]クロザピンである。好ましくは、[11C]クロザピン-N-オキシド又は[11C]クロザピンは、ピペラジン環の窒素原子に結合したメチル基が、[11C]である。
【００４８】
本発明の組成物は、前記ジベンゾジアゼピン誘導体とともに、任意に1つ以上の医薬として許容し得る担体を含むことができる。該医薬として許容し得る担体は、前記ジベンゾジアゼピン誘導体を溶解し、液体剤形として提供できる溶媒であることが好ましい。該医薬として許容し得る担体の例を挙げると、特に制限されないが、例えば、水、生理的食塩水、注射用水、アルコール、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マクロゴール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンジル、リンゲル液、ゴマ油、トウモロコシ油、ダイズ油、又は硬化油若しくはオリーブ油などの油などがある。
【００４９】
本発明の組成物は、滅菌されていることが好ましい。滅菌は、当業者に公知の方法、例えば、バクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の添加、照射処理又は加熱処理などにより行うことができる。
【００５０】
該組成物中の前記放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体の標識割合は、哺乳動物において発現されたhM4D及び/又はhM3Dをインビボで検出することができる量であれば特に制限されない。例えば、標識割合は、約1〜約1000GBq/mol、好ましくは、約10〜約370GBq/molである。本発明の組成物は、哺乳動物に投与される。該投与は、特に制限されないが、経口、腹腔内、静脈、頭部、経皮、又は筋肉内投与、或いは当業者に公知の他の手段により行うことができる。
【００５１】
（５．キット）
本発明のキットは、前記ジベンゾジアゼピン誘導体、又は該誘導体を含む組成物を含有する。任意に、1つ以上の医薬として許容し得る担体を含んでもよい。医薬として許容し得る担体の例を挙げると、前記のものがある。また、該キットは、さらに、本発明のイメージング方法を記載した指示書、及び/又は前記ジベンゾジアゼピン誘導体を投与するための機器（例えば、注射器など）含んでもよい。
【００５２】
（６．インビボイメージング）
放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体又は該誘導体を含む組成物を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物の細胞で発現された変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM4D又はhM3Dをインビボで検出し、イメージングすることができる。
【００５３】
一実施態様において、本発明のインビボイメージング方法は、以下の工程を含むことができる：
(a) 変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子を、哺乳動物の細胞に導入する工程；
(b) 該哺乳動物に、放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体又は該誘導体を含む組成物を投与する工程；及び
(c) 該放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体をインビボで検出する工程である。
【００５４】
他の実施態様において、本発明のインビボイメージング方法は、以下の工程を含むことができる：
(a) 治療遺伝子などの外来遺伝子に連結された、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子を、哺乳動物の細胞に導入する工程； 
(b) 該哺乳動物に、放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体又は該誘導体を含む組成物を投与する工程；及び
(c) 該放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体をインビボで検出する工程である。
【００５５】
さらに他の実施態様において、本発明のインビボイメージング方法は、以下の工程を含むことができる：
(a) 哺乳動物から採取した細胞に、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）又は変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子を導入し、該細胞を哺乳動物に移植若しくは投与する工程；
(b) 該哺乳動物に、放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体又は該誘導体を含む組成物を投与する工程；及び
(c) 該放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体をインビボで検出する工程である。
【００５６】
放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体又は該誘導体を含む組成物の投与は、経口、非経口、腹腔内、静脈、経皮、筋肉内、直腸、舌下、粘膜、頭部又は経鼻投与、或いは当業者に公知の他の手段により行うことができる。好ましくは、静脈内投与、又は腹腔内投与である。
【００５７】
該イメージングは、ポジトロン断層法（PET）、及び単一光子放射断層撮影（SPECT）などにより行うことができる。ポジトロン断層法（PET）によりイメージングすることが好ましい。該イメージングにより、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子に連結した外来遺伝子の発現の有無、発現部位、発現量、及び/又は発現期間を評価することができる。また、該イメージングにより、hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子を含む細胞の生存、生着、分化、及び/又は分布を評価することができる。
【００５８】
（７．遺伝子治療及び細胞治療）
hM4D又はhM3Dをコードする遺伝子、及びその遺伝子発現産物に特異的に結合することができる放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体は、遺伝子治療や細胞治療などに使用することができる。
【００５９】
遺伝子治療は、通常、治療遺伝子の導入、該遺伝子の発現、及び発現タンパクによる治療作用という段階で行われる。しかし、その遺伝子治療の有効性は、最終段階の治療効果のみから判断するのは不十分である。治療遺伝子の導入と発現を確認した上で、治療効果を判断することが必要である。
【００６０】
治療遺伝子と連結したhM4D又はhM3Dをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として哺乳動物の細胞に導入し、治療遺伝子と共発現したhM4D又はhM3Dを、放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体により検出及びイメージングし、治療遺伝子の導入と発現を評価することができる。該レポーター遺伝子が発現したhM4D又はhM3Dを放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体により検出できた場合、該外来遺伝子も発現されていることを示している。また、該レポーター遺伝子の遺伝子産物（hM4D又はhM3D）は、治療遺伝子の遺伝子産物と同量産生されるため、hM4D又はhM3Dを検出することによって、治療遺伝子の発現量も評価することができる。
【００６１】
細胞治療とは、自己又は同種異系の細胞を移植若しくは投与して、損傷した組織又は器官を再生・修復する治療法である。細胞治療は、再生医療ともいう。細胞治療のためには、移植若しくは投与後に、該細胞が正常に機能しているか否か、例えば、細胞の生存、生着、分化及び/又は分布を判断する必要がある。
【００６２】
移植若しくは投与される細胞にhM4D又はhM3Dをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として導入し、該遺伝子が発現したhM4D又はhM3Dを、放射性同位体標識化ジベンゾジアゼピン誘導体により検出及びイメージングして、該移植若しくは投与された細胞が、正常に機能しているか否かを判断することができる。
【００６３】
（８．神経活動抑制又は神経活動増加）
変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）は、ジベンゾジアゼピン誘導体と特異的に結合し、神経活動を抑制することができる。また、変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）は、ジベンゾジアゼピン誘導体と特異的に結合し、神経活動を増加させることができる。該ジベンゾジアゼピン誘導体は、放射性同位体標識されていてもいなくてもよい。
【００６４】
したがって、本発明は、哺乳動物の細胞に導入した変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体（hM4D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM4Dを制御することにより、該哺乳動物の神経活動を抑制するための組成物であって、hM4Dと特異的に結合するジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物を提供する。また、本発明は、哺乳動物の細胞に導入した変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体（hM3D）をコードする遺伝子が発現して産生するhM3Dを制御することにより、該哺乳動物の神経活動を増加するための組成物であって、hM3Dと特異的に結合するジベンゾジアゼピン誘導体を含む、前記組成物を提供する。
【実施例】
【００６５】
（９．実施例）
以下に本発明の実施例を記載する。下記実施例は、本発明の特許請求の範囲に関する理解を深めるために記載しているものであり、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６６】
（実施例１）
変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM4受容体DREADD (hM4D)トランスジェニックマウス(hM4D-Tg)におけるhM4D受容体のインビボ可視化と神経活動の操作
【００６７】
（Tgマウスの作出）
ヒト野生型ムスカリン性アセチルコリンM4受容体(hM4)をコードする遺伝子配列の2カ所にポイント変異(Y113C/A203G)を導入した変異型受容体hM4Dの遺伝子をクローニングし、神経細胞特異的に発現するThy-1プロモーター、Poly(A)と連結し、発現ベクターを構築した。該発現ベクターからマイクロインジェクション用cDNAを切り出し、C57BL/6Jマウスの受精卵にインジェクションし、hM4Dが導入されたファウンダー(F0)マウスを得た。F0マウスと野生型マウスを交配して、F1マウスを作製し、hM4Dの発現が高いライン一つを選択し、このラインをhM4D-Tgとして、その後、解析に使用した。
【００６８】
（インビボイメージング）
hM4Dトランスジェニックマウス（hM4D-Tg）、及びそのNon-Tg同腹兄弟（C57BL/6J; オス3ヶ月齢）に、hM4D受容体に特異的に結合する放射性リガンド：11C-クロザピンN-オキシド（11C-CNO）を尾静脈から投与し、ダイナミックPETスキャン（90分）を行った。11C-CNOの集積を30〜60分の平均放射能活性について、前脳部と小脳部の比で算出した。表１に示すように、hM4D-Tgマウスで有意に高い集積を確認することができた。この結果は、hM4D受容体発現を可視化することができたことを示している。
【００６９】
【表１】
2015071560.tif 000004
【００７０】
（脳血流計測による神経活動の操作の評価）
hM4Dトランスジェニックマウス（hM4D-Tg）、及びそのNon-Tg同腹兄弟（C57BL/6J; オス3ヶ月齢）を麻酔下において、Arterial Spine Labeling（ASL）灌注MRIで脳血流を測定した。その後、クロザピンN-オキシド（CNO）（1mg/kg）を腹内投与し、30分後、再度ASL灌注MRIによる脳血流計測を行った。表２に示すように、hM4Dトランスジェニックマウスにおいて、CNO投与後に有意な前脳部血流の減少が認められ、CNOによる神経活動抑制効果を確認することができた。
【００７１】
【表２】
2015071560.tif 000005
【００７２】
（実施例２）
移植iPS細胞から分化した神経細胞の脳内インビボ可視化
野生型マウス（雄性C57/B6)の片方の海馬領域に、神経細胞特異的にhM4D受容体を発現するiPS細胞、又はコントロールとして神経細胞特異的に蛍光タンパクDsRedを発現するiPS細胞を移植した。40日後11C-CNO（36.36 MBq)を尾静脈から投与し、ダイナミックPETスキャン（90分)を行った。30〜60分の平均放射能活性を測定し、11C-CNO集積のiPS細胞の移植側／反対側の比を算出した。図１に示すように，iPS細胞注入部位（右矢印）の信号が、反対側部位（左矢印）に比べ有意に高く（表３）、iPS細胞の神経細胞分化が可視化できることが分かる。
【００７３】
【表３】
2015071560.tif 000006
【００７４】
（実施例３）
カニクイザルの脳内に発現させたhM4D受容体のイメージング
カニクイザル（オス／5kg），全身麻酔状態で頭部をステレオに固定し，事前に撮像したMRI画像から読影した右被殻中央部にハミルトンシリンジ（100l）を用いてhM4D受容体を神経細胞特異的に発現するレンチウイルスベクター(Lenti-hSyn-hM4d-CFP；30l)を１時間かけて注入．注入後82日後に、イソフルラン麻酔下でM4d受容体に親和性の高い放射性リガンド11C-クロザピン（337MBq）を静脈から投与しPETスキャン（90分）を行った。図２に示す通り注入部位である右被殻（矢印）に高い（発現のない反対側と比較して、1.17倍）11C-クロザピン集積が見られ、hM4D受容体の発現が確認できた。
【００７５】
（実施例４）
変異型ヒトムスカリン性アセチルコリンM3受容体DREADD (hM3D)トランスジェニックマウス(hM3D-Tg)におけるhM3D受容体のインビボ可視化
【００７６】
（Tgマウスの作出）
ヒト野生型ムスカリン性アセチルコリン受容体M3(hM3)の遺伝子配列の2カ所にポイント変異(Y149C/A239G)を導入し、hM3Dの遺伝子をクローニングし、神経細胞特異的に発現するThy-1プロモーター、Poly(A)と連結し、発現ベクターを構築した。発現ベクターからマイクロインジェクション用cDNAを切り出し、C57BL/6Jマウスの受精卵にインジェクションし、hM3Dが導入されたファウンダー(F0)マウスを得た。F0マウスと野生型マウスを交配して、F1マウスを作製し、hM3Dの発現が高いライン一つを選択し、このラインをhM3D-Tgとして、その後解析に使用した。
【００７７】
（インビボイメージング）
hM3Dトランスジェニックマウス(hM3D-Tg)及び野生型マウス(C57BL/6J)に11C-クロザピンを尾静脈から投与し、ダイナミックPETスキャン(90分)を行った。11C-クロザピンの集積を30〜60分の平均放射能活性について、前脳部と小脳部の比で算出すると、表3に示す通りhM3D-Tgマウスで高い集積が確認でき、hM3D受容体発現の可視化ができた。
【００７８】
【表４】
2015071560.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によって、生体への細胞移植や外来遺伝子導入などの成否をインビボで確認することができる。
【図１】
2015071560.tif 000011
【図２】
2015071560.tif 000012
【配列表】
2015071560000001.app