(57)【要約】【課題】ソトロンによるにおいを抑制する物質の提供。【解決手段】嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１のアンタゴニストを有効成分とする、ソトロンによるにおいの抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ソトロンによるにおいの抑制剤：
１−（２，３，４，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，６，８，８−テトラメチル−１Ｈ−３ａ，７−メタノアズレン−５−イル）−エタノン；
オキサシクロヘキサデセン−２−オン；
シトラール；
ω−６−ヘキサデセンラクトン；
２−ベンジリデンヘプタナール；
３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）プロパナール；
（５Ｅ）−３−メチルシクロペンタデセ−５−エン−１−オン；
１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，６，８，８−ヘキサメチル−２−ナフタレニル）−エタノン；
７−アセチル−１，２，３，４，５，６，７，８−オクタヒドロ−１，１，６，７−テトラメチル−ナフタレン；
ムスコン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソトロンによるにおいの抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の生活環境には、極性や分子量が異なる多数の悪臭分子が存在する。多様な悪臭分子を消臭するために、これまで様々な消臭方法が開発されてきた。一般的に消臭方法は、生物的方法、化学的方法、物理的方法、感覚的方法に大別される。悪臭分子の中で、極性の高い短鎖脂肪酸やアミン類については、化学的方法、すなわち中和反応による消臭が可能である。またチオールなどの硫黄化合物に関しては、物理的方法、すなわち吸着処理による消臭が可能である。しかし、従来の消臭法では対応できない悪臭分子が数多く残されている。また、吸着処理による消臭方法では、悪臭の再放出が起きやすいといった問題もある。さらにこれらの従来の方法では、目的とする悪臭以外のにおいも消されてしまう場合がある。これらの問題を克服できる消臭方法が求められている。
【０００３】
芳香剤を使用して別のにおいをより強く認識させることにより悪臭を消臭する方法も知られている。しかし、この方法では、芳香剤のにおいに対する不快感が生じることがある。さらに、香水や芳香剤などの他のにおいで悪臭をマスキングするためには、目的の悪臭物質に対して有効な消臭作用を示すにおい物質を探索しなければならない。従来、においの評価は、専門家による官能試験によって行われてきた。しかし官能試験には、においを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。したがって従来、消臭作用を示すにおい物質の探索は容易なことではなかった。
【０００４】
ヒト等の哺乳動物においては、嗅覚は、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体ににおい分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約３％にあたる。一般的に、嗅覚受容体とにおい分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は、構造の類似した複数のにおい分子を異なる親和性で受容することができ、一方で、個々のにおい分子は、複数の嗅覚受容体によって受容され得る。さらに、ある嗅覚受容体を活性化するにおい分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々のにおいの認識をもたらしている。
【０００５】
したがって、同じにおい分子が存在する場合でも、同時に他のにおい分子が存在すると、当該他のにおい分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識されるにおいが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによるにおいの変調は、香水や芳香剤等の別のにおいを付加することによる消臭方法と異なり、悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤のにおいによる不快感が生じることもないことから、好ましい消臭手段である。
【０００６】
皮膚タンニング剤（セルフタンニング剤またはサンレスタンニング剤とも称される）は、肌を着色する皮膚化粧料である。皮膚を褐色に変化させる成分としては、主にジヒドロキシアセトン（Dihydroxyacetone, DHA）が単独で、またはエリスルロース（Erythrulose）などとともに使用される。これらの成分は、皮膚の上層と反応し皮膚を褐色に着色する。この着色は、褐変反応によって進行すると考えられているが、その反応メカニズムの詳細についてはほとんど解明されていない。褐変反応は、食品化学の分野ではメイラード反応とも呼ばれ、アミノ酸やタンパク質等の含窒素化合物と還元糖とが重合することによって、メラノイジンと呼ばれる褐色の重合物を生成する反応を指す用語である。メイラード反応は、食品の加熱等によって起こる食品の着色や香気成分の生成に関与している。
【０００７】
３−ヒドロキシ−４，５−ジメチル−２（５Ｈ）−フラノン（ソトロン）は、「カレー様フレーバー」、「カラメル香」、「焦げた砂糖」、「焦げ」、「スパイシー」などと表現されるにおいを有することが知られている物質である（非特許文献１〜４）。ソトロンは、一般に高濃度では生薬的不快臭を有するオフフレーバーであるが、低濃度では糖蜜様芳香になる。ソトロンは、嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答を惹起することが報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】合成香料  化学と商品知識、２００５年、化学工業日報社
【非特許文献２】ACS Symp Ser., 2002, 836:108-123
【非特許文献３】生物工学会誌, 2006, 84(10):417
【非特許文献４】J. Agric. Food Chem., 1999, 47(8):3288-3291
【非特許文献５】PLoS Genet, 2012, 8(7):e1002821
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
市販の皮膚タンニング剤（セルフタンニング剤またはサンレスタンニング剤）を使用する際に、土臭い（Earthy）、砂糖の焦げたにおい（Burnt sugar）などと表現される独特の不快臭が伴うという問題が報告され（Ｄ．Ｍ．Ｈｉｎｄｅｎｌａｎｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ＆Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ  ｍａｇａｚｉｎｅ，２００８，Ｖｏｌ．１２３，Ｎｏ．７，ｐ６７−７４）、改善が求められていた。当該不快臭の原因について調べたところ、皮膚タンニング剤中に含まれるジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）よりメチルグリオキサールを経由して生成する３−ヒドロキシ−４，５−ジメチル−２（５Ｈ）−フラノン（ソトロン）が原因物質のひとつであることが解明された。このようなソトロンに起因する不快臭を抑えるために、ソトロンのにおいを制御することが求められている。
【００１０】
一方、ソトロンは、糖蜜様芳香を有し、飲食品用の香料などとして使用することができるが、においが強すぎると逆にオフフレーバーとして働く。ソトロンのにおいを適正な強度に調整して飲食品等の香気をより好ましいものとするために、ソトロンのにおいを制御することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、ソトロンに応答することが知られている嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答を抑制する物質が、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより、ソトロンによるにおいの認識を抑制することができることを見出した。
【００１２】
したがって、本発明は、下記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ソトロンによるにおいの抑制剤を提供する。
【表１】
2015081237.tif 000002
【発明の効果】
【００１３】
本発明により提供されるソトロンによるにおいの抑制剤によれば、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより、ソトロンによるにおいを選択的に消臭することができる。したがって、本発明により提供されるソトロンによるにおいの抑制剤は、従来の消臭剤や芳香剤を用いる消臭方法において生じていた芳香剤のにおいに基づく不快感等の問題を生じることがなく、ソトロンによるにおい、例えば、従来のセルフタンニング剤（あるいはサンレスタンニング剤とも称される）を使用した際に発生していた不快臭を消臭することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】嗅覚受容体のソトロンに対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す。
【図２】種々の濃度のソトロンに対する嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答。ｎ＝３、エラーバー＝±ＳＥ。
【図３】各種化合物のソトロン臭抑制効果の官能評価。ｎ＝３，エラーバー＝±ＳＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、においに関する用語「マスキング」とは、目的のにおいを認識させなくするかまたは認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、および感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的のにおいの原因となるにおい分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、におい分子の吸着および化学的分解）、目的のにおいが環境に放出されないようにするための手段（例えば、封じ込め）、香料や芳香剤などの別のにおいを添加して目的のにおいを認識しにくくする方法、などが挙げられる。
【００１６】
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的のにおいのにおい分子と他のにおい分子をともに適用することにより、当該他のにおい分子によって目的のにおい分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識されるにおいを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他のにおい分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的のにおいを別の強いにおいによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定のにおいをもたらすにおい分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該におい分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚されるにおいを変化させることができる。
【００１７】
本明細書において、「ソトロンによるにおい」とは、ソトロン（３−ヒドロキシ−４，５−ジメチル−５（２Ｈ）−フラノン）によりもたらされるにおいであり得る。本明細書における「ソトロンによるにおい」は、代表的には、カラメル香、焦げた砂糖のにおい、またはカレー様フレーバーなどとして表現され得る。また、本明細書における「ソトロンによるにおい」は、従来のセルフタンニング剤を皮膚に適用した際に発生する不快臭、より具体的には、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を含有する皮膚タンニング剤を皮膚に適用したときに発生する「砂糖の焦げたにおい（Burnt sugar）」などと表現される不快臭であり得る。
【００１８】
図１に示すとおり、本発明者は、多くの嗅覚受容体の中から嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１を、ソトロンに対して応答性を有する唯一の受容体として同定した。嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０８９７２８１として登録されている。ＯＲ８Ｄ１は、配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１９】
図２に示すとおり、ＯＲ８Ｄ１は、ソトロンに対して濃度依存的に応答する。したがって、ＯＲ８Ｄ１の応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより、個体の中枢におけるソトロンによるにおいの認識に変化を生じさせ、結果として、ソトロンによるにおいを選択的に抑制することができる。
【００２０】
したがって、一態様において、本発明は、嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答を抑制する物質を有効成分とする、ソトロンによるにおいの抑制剤を提供する。本発明のソトロンによるにおいの抑制剤は、ＯＲ８Ｄ１のアンタゴニスト（拮抗剤）として働く。言い換えれば、本発明のソトロンによるにおいの抑制剤は、ＯＲ８Ｄ１のアンタゴニストを有効成分とする。したがって、本発明のソトロンによるにおいの抑制剤は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより、個体の中枢におけるソトロンによるにおいの認識に変化を生じさせ、結果として、ソトロンによるにおいを抑制することができる。
【００２１】
本発明によるソトロンによるにおいの抑制剤の有効成分としては、下記化合物が挙げられる：
１−（２，３，４，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，６，８，８−テトラメチル−１Ｈ−３ａ，７−メタノアズレン−５−イル）−エタノン（アセチルセドレン）；
オキサシクロヘキサデセン−２−オン（ハバノリデ（登録商標））；
シトラール；
ω−６−ヘキサデセンラクトン（アンブレットリド）；
２−ベンジリデンヘプタナール（アミルシンナミックアルデヒド）；
３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）プロパナール（ブルゲオナール）；
（５Ｅ）−３−メチルシクロペンタデセ−５−エン−１−オン（ムスセノン（登録商標）デルタ）；
１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，６，８，８−ヘキサメチル−２−ナフタレニル）−エタノン（トナリド（登録商標））；
７−アセチル−１，２，３，４，５，６，７，８−オクタヒドロ−１，１，６，７−テトラメチル−ナフタレン（イソ・イー・スーパー）；
ムスコン。
【００２２】
上記化合物は、ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストである。当該ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンに対する嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答を、当該アンタゴニストが存在しない場合と比べて４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上阻害することができる。言い換えると、当該アンタゴニスト存在下におけるソトロンに対する嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答は、当該アンタゴニスト非存在下での当該受容体の応答の６０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは２５％以下に低減する。
【００２３】
上記ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストのうち、ソトロンによるにおいの抑制剤の有効成分として好ましいものとしては、１−（２，３，４，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，６，８，８−テトラメチル−１Ｈ−３ａ，７−メタノアズレン−５−イル）−エタノン（アセチルセドレン）が挙げられる。
【００２４】
本発明のソトロンによるにおいの抑制剤は、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する。例えば、本発明のソトロンによるにおいの抑制剤の有効成分は、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つ、例えばいずれか単独もしくはいずれか２つ以上の組み合わせであり得る。好ましくは、本発明のソトロンによるにおいの抑制剤は、上記ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つから本質的に構成される。
【００２５】
表３に示すとおり、上記ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンに対する嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１の応答を抑制する。当該化合物は、これまで香料素材として知られていたが、ソトロンに対する嗅覚受容体の応答をアンタゴナイズし、ソトロンによるにおいを選択的に抑制する機能があることは知られていなかった。
【００２６】
上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、いずれも市販のものを購入することができる（「合成香料  化学と商品知識」増補改訂版、印藤元一著、化学工業日報社、２００５年３月発行を参照）。例えば、Firmenich S.A.、Givaudan S.A.、International Flavors & Fragrances Inc.、高砂香料工業株式会社、花王株式会社などから入手することが可能である。
【００２７】
本発明の別の一態様において、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンによるにおい、例えば、カラメル香、焦げた砂糖のにおい、もしくはカレー様フレーバー、またはセルフタンニング剤を皮膚に適用した際もしくはジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を含有する製品を使用した際に発生する不快臭（例えば、砂糖の焦げたにおい）などを抑制するための有効成分として使用され得る。
【００２８】
一実施形態において、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンによるにおいを抑制するための化合物または組成物に、ソトロンによるにおいを抑制するための有効成分として含有され得る。あるいは、ソトロンによるにおいの抑制剤の製造のため、またはソトロンによるにおいを抑制するための化合物もしくは組成物の製造のために使用することができる。
【００２９】
一実施形態において、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンによるにおいの抑制が所望されるあらゆる化合物もしくは組成物において、またはソトロンによるにおいの抑制が所望されるあらゆる環境下において、ソトロンによるにおいの抑制のための有効成分として使用され得る。あるいは、当該ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンによるにおいの抑制のための有効成分として、ソトロンによるにおいの抑制が所望される化合物または組成物の製造のために使用することができる。ソトロンによるにおいの抑制が所望される化合物または組成物の例としては、皮膚タンニング剤（セルフタンニング剤またはサンレスタンニング剤とも称される）、例えば、発色剤としてジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を含有する皮膚タンニング剤および褐色反応を利用するその他の皮膚タンニング剤、ならびにその他のＤＨＡを含有する製品が挙げられる。また、ソトロンは飲食品中に含まれる香気成分であるが、その量が多くなると、逆にオフフレーバーとして働くことがある。したがって、ソトロンによるにおいの抑制が所望される化合物または組成物の別の例としては、高濃度のソトロンによるオフフレーバーを低減することが所望される飲食品やそれらを含有する組成物が挙げられる。
【００３０】
上記ソトロンによるにおいの抑制剤、およびソトロンによるにおいを抑制するための化合物または組成物は、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストに加えて、他の消臭効果を有する成分を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。当該消臭効果を有する他の成分としては、化学的または物理的な消臭効果を有する公知の消臭剤が何れも使用できるが、例えば、植物から抽出された消臭有効成分（例えば、緑茶抽出物）、有機酸、各種アミノ酸およびこれらの塩、グリオキサール、酸化剤、フラボノイド類、カテキン類、ポリフェノール類、活性炭やゼオライトなどの多孔性物質、シクロデキストリン類等の包接剤、光触媒、各種マスキング剤、などが挙げられる。さらに、上記抑制剤、およびソトロンによるにおいを抑制するための化合物または組成物は、消臭剤や防臭剤に一般的に添加される任意の成分を含んでいてもよい。
【００３１】
さらなる態様として、本発明は、ソトロンによるにおいと、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１のアンタゴニストとを共存させる工程を含む、ソトロンによるにおいの抑制方法を提供する。
【００３２】
一実施形態において、当該方法は、ソトロンによるにおいの存在下で、当該においの認識の抑制を必要とする個体、好ましくは嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによるソトロンによるにおいの認識の抑制を必要とする個体に、上記に挙げたＯＲ８Ｄ１アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つを適用して、ソトロンによるにおいと当該アンタゴニストとを共存させる。それによって、ＯＲ８Ｄ１と当該アンタゴニストが結合して、ソトロンに対するＯＲ８Ｄ１の応答が抑制されるので、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングが生じ、ソトロンによるにおいが抑制される。当該方法において好ましいＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、上述したソトロンによるにおいの抑制剤の場合と同様である。
【００３３】
上記本発明の方法において、上記個体は哺乳類であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。より詳細には、本発明の方法における、ソトロンによるにおいの認識の抑制を必要とする個体の例としては、皮膚タンニング剤（あるいは、セルフタンニング剤またはサンレスタンニング剤）、より具体的には例えば、発色剤としてジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を含有する皮膚タンニング剤もしくは褐色反応を利用するその他の皮膚タンニング剤を使用するヒト、その他のＤＨＡを含有する製品を使用するヒト、および飲食品からのソトロンによるにおいの低減を所望するヒトが挙げられる。
【００３４】
上記本発明の方法の一実施形態において、上記ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンを含有する化合物または組成物に配合される。これによって、当該化合物または組成物に含まれるソトロンに対する嗅覚受容体の応答を低下させ、個体におけるソトロンによるにおいの認識を抑制し、結果としてソトロンによるにおいを抑制する。また別の実施形態において、上記ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストは、ソトロンを生成する可能性のある化合物または組成物に配合される。これによって、当該化合物または組成物から生成されたソトロンに対する嗅覚受容体の応答を低下させ、個体におけるソトロンによるにおいの認識を抑制し、結果としてソトロンによるにおいを抑制する。ソトロンを生成する可能性のある化合物または組成物の例としては、皮膚タンニング剤、例えば、発色剤としてジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を含有する皮膚タンニング剤、褐色反応を利用するその他の皮膚タンニング剤、およびその他のＤＨＡを含む製品が挙げられる。
【００３５】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３６】
＜１＞上記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ソトロンによるにおいの抑制剤。
【００３７】
＜２＞ソトロンによるにおいの抑制のための、上記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【００３８】
＜３＞ソトロンによるにおいの抑制剤の製造のための、上記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【００３９】
＜４＞ソトロンによるにおいの抑制に使用するための、上記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物。
【００４０】
＜５＞ソトロンによるにおいと、上記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種とを共存させることを含む、ソトロンによるにおいの抑制方法。
【００４１】
＜６＞上記＜１＞〜＜５＞において、好ましくは、上記表１記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種は、１−（２，３，４，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，６，８，８−テトラメチル−１Ｈ−３ａ，７−メタノアズレン−５−イル）−エタノンである。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００４３】
実施例１  ソトロンに応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
【００４４】
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ヒト受容体輸送タンパク質、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ：５０２３４９１７）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込んだ。
【００４５】
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体４００種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表２に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μＬずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
【００４６】
【表２】
2015081237.tif 000003
【００４７】
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究でのソトロン応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製したソトロン（１ｍＭ）を含む溶液を７５μＬ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で２．５時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。ソトロンの刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、ソトロンの刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
【００４８】
５）結果
本実施例で４００種類の嗅覚受容体についてソトロン（１ｍＭ）に対する応答を測定した結果、ソトロンに応答することが既に報告されている（非特許文献１）嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１が、ソトロンに対して応答を示した。一方、他の嗅覚受容体はソトロンに対して応答しなかった（図１）。
【００４９】
実施例２  ソトロンに対するＯＲ８Ｄ１の濃度依存的応答
実施例１と同様の手順で、嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ：５０８９７２８１、配列番号２）をヒトＲＴＰ１ＳとともにＨＥＫ２９３細胞に発現させ、種々の濃度のソトロン（０、３、１０、３０、１００、３００、１０００、および３０００μＭ）に対する応答の濃度依存性を調べた。その結果、ＯＲ８Ｄ１は、ソトロンに対して濃度依存的な応答を示した（図２）。
【００５０】
実施例３  ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストの同定
２２８種類の試験物質について、嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１のソトロン応答に対するアンタゴニスト活性を調べた。
実施例２と同様の手順で、嗅覚受容体ＯＲ８Ｄ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞に、ソトロン（１００μＭ）と試験物質（１００μＭ）を添加して嗅覚受容体の応答を測定し、試験物質添加による受容体応答の変化を評価した。
試験物質による受容体応答の阻害率は、以下のとおり算出した。ソトロン単独での刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値（Ｘ）を、同じ受容体を導入しソトロン刺激を行わなかった細胞での発光値（Ｙ）で引き算し、ソトロン単独刺激による受容体活性（Ｘ−Ｙ）を求めた。同様に、ソトロンと試験物質の混合物での刺激による発光値（Ｚ）を、ソトロン刺激を行わない細胞での発光値（Ｙ）で引き算し、試験物質存在下での受容体活性（Ｚ−Ｙ）を求めた。以下の計算式により、ソトロン単独刺激による受容体活性（Ｘ−Ｙ）に対する、試験物質存在下での受容体活性（Ｚ−Ｙ）の低下率を算出し、試験物質による受容体応答阻害率を求めた。測定では、独立した実験を二連で複数回行い、各回の実験の平均値を得た。
阻害率（％）＝｛１−（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝×１００
その結果、１０種類の試験物質では、ＯＲ８Ｄ１のソトロン応答に対する阻害率が４０％以上になり（応答を６０％以下に抑制）、ＯＲ８Ｄ１に対するアンタゴニスト活性を有することが示された（表３）。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
実施例４  ＯＲ８Ｄ１アンタゴニストのソトロン臭抑制能の評価
実施例３で同定したＯＲ８Ｄ１に対するアンタゴニスト活性を有する試験物質のソトロン臭抑制能を、官能試験により確認した。
ソトロン（１％）を含む生地０．５ｇに香料０．５μＬを添加したものを嗅ぎ、香料を賦香していない生地に対するソトロン臭の強さを評価した。官能評価試験はパネラー３名で行い、ソトロン臭を強く感じる場合を１、ソトロン臭を全く感じない場合を５とし、評価を行った。
その結果、実施例３でＯＲ８Ｄ１のソトロン応答を抑制することが示された１０種類の試験物質は、全てソトロン臭を抑制した（図３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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