(57)【要約】【課題】水銀暴露を受けた細胞若しくは個体、又は水銀暴露を受け得る細胞若しくは個体において抗水銀作用を奏する抗水銀剤を提供する。【解決手段】本発明は、下記一般式（１）で表されるオレアナン系サポニン化合物又はオレアナン系サポニン化合物のアグリコンを有効成分として含有する抗水銀剤を提供する。［化１］2015134735.tif 000019［式（１）中、Ｘ１は、水素原子、−ＣＯＯＲ１、−ＯＲ１、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基等を表す。Ｘ２は、水素原子、−ＣＯＯＲ２、−ＯＲ２、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルコキシ基等を表す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。式（１）中、Ｘ１で表される基及びＸ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、炭素数１〜４のアルキル基等によって置換されていてもよい。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗水銀剤。
【化１】
2015134735.tif 000016
［式（１）中、Ｘ１は、水素原子、−ＣＯＯＲ１、−ＯＲ１、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基を表す。
Ｘ２は、水素原子、−ＣＯＯＲ２、−ＯＲ２、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基を表す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。
式（１）中、Ｘ１で表される基及びＸ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基によって置換されていてもよい。
Ｘ１がヒドロキシ基である場合、該ヒドロキシ基と分子内の他の−ＯＨとが一緒になってエーテル結合を形成し、５〜６員環を形成してもよい。］
【請求項２】
前記一般式（１）が、下記一般式（２）で表される化合物である請求項１に記載の抗水銀剤。
【化２】
2015134735.tif 000017
［式（２）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。式（２）中、Ｒ１及びＲ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基によって置換されていてもよい。］
【請求項３】
前記一般式（１）が、下記一般式（３）で表される化合物である請求項１又は２に記載の抗水銀剤。
【化３】
2015134735.tif 000018
［式（３）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基を表す。
式（３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、メチル基、メトキシ基、ヒドロキシメチル基、又はヒドロキシ基によって置換されていてもよい。］
【請求項４】
前記Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。前記Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、メチル基、メトキシ基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシ基、アセチル基、アセトキシ基又はメトキシカルボニル基を表す請求項３に記載の抗水銀剤。
【請求項５】
前記糖鎖基の糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、マンノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、フコース、ラムノース、アピオース、アラビノース、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選ばれるいずれか１種以上の糖であり、該糖鎖基単糖数が、１〜５個である請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗水銀剤。
【請求項６】
前記糖鎖基が、Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−ＧｌｃＡ−、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＡ−、Ｇｌｃ−Ｆｕｃ−、Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ−、Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ−、Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ（−Ｒｈａ）−、Ｘｙｌ−Ｒｈａ（−Ａｐｉ）−Ｆｕｃ−、又はＡｒａ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ（−Ａｐｉ）−Ｆｕｃ−である請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗水銀剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サポニン化合物又はサポニン化合物のアグリコンを有効成分として含有する抗水銀剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
水俣病の原因物質であるメチル水銀は毒性が強く、排出規制が厳しく行われている。しかしながら水銀は地殻由来の成分であり、環境中を循環しており、メチル水銀は食物連鎖を通してマグロなどの高次消費者に生物濃縮している。現在、我々はマグロをはじめとする食品から微量ながらも持続的にメチル水銀（ＭｅＨｇ）を摂取し、低濃度のメチル水銀が体内に蓄積されている。ＭｅＨｇは消化管、肺、皮膚のいずれの経路でも吸収率が高く、ヒトでの消化管吸収率は９５％以上である。吸収されたＭｅＨｇはシステインに結合するとメチオニンに類似した構造になり、血液‐脳関門や胎盤を通過して脳や胎児に蓄積することが報告されている。例えば、ＷＨＯが定める安全基準では、成人の毛髪水銀値が５０ｐｐｍまでとするべきと推奨されているが、マグロ等の水産物を多く摂取する習慣のある人々のなかでは、毛髪水銀値が５０ｐｐｍをはるかに超える場合があることが知られている。低濃度メチル水銀の長期間摂取によるヒトへの影響は解明されていないが、様々な影響が懸念されている。
非特許文献１には、チオールがＭｅＨｇと結合することが開示されている。ＭｅＨｇを解毒する作用を有する薬剤については、非特許文献２〜３に報告されている。しかし、ＭｅＨｇを解毒する薬剤についてはほとんど研究されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Simpthon RB, Association Constants of Methylmercury with Sulfhydryl and Other Bases., J. Am. Chem. Soc., 83, 4711-4717 (1961)
【非特許文献２】Carvalho MC, Franco JL, Ghizoni H, Kobus K, Nazari EM, Rocha JB, Nogueira CW, Dafre AL, Mueller YM, Farina M., Effects of 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid (DMPS) on methylmercury-induced locomotor deficits and cerebellar toxicity in mice., Toxicology, 239, 195-203 (2007)
【非特許文献３】Ballatori N, Lieberman MW, Wang W.N-Acetylcysteine as an Antidote in Methylmercury Poisoning, Environ. Health. Perspect. 106, 267-271 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、抗水銀作用を有する抗水銀剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ある種のサポニン化合物及びサポニン化合物のアグリコンが、細胞での水銀毒性軽減効果および臓器への水銀蓄積抑制効果を有することをを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する抗水銀剤を提供するものである。
【０００７】
［１］下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗水銀剤。
【０００８】
【化１】
2015134735.tif 000002
【０００９】
［式（１）中、Ｘ１は、水素原子、−ＣＯＯＲ１、−ＯＲ１、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基を表す。
Ｘ２は、水素原子、−ＣＯＯＲ２、−ＯＲ２、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基を表す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。
式（１）中、Ｘ１で表される基及びＸ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基によって置換されていてもよい。
Ｘ１がヒドロキシ基である場合、該ヒドロキシ基と分子内の他の−ＯＨとが一緒になってエーテル結合を形成し、５〜６員環を形成してもよい。］
［２］前記一般式（１）が、下記一般式（２）で表される化合物である前記［１］に記載の抗水銀剤。
【００１０】
【化２】
2015134735.tif 000003
【００１１】
［式（２）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。式（２）中、Ｒ１及びＲ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基によって置換されていてもよい。］
［３］前記一般式（１）が、下記一般式（３）で表される化合物である前記［１］又は［２］に記載の抗水銀剤。
【００１２】
【化３】
2015134735.tif 000004
【００１３】
［式（３）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基を表す。
式（３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、メチル基、メトキシ基、ヒドロキシメチル基、又はヒドロキシ基によって置換されていてもよい。］
［４］前記Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。前記Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、メチル基、メトキシ基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシ基、アセチル基、アセトキシ基又はメトキシカルボニル基を表す前記［３］に記載の抗水銀剤。
［５］前記糖鎖基の糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、マンノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、フコース、ラムノース、アピオース、アラビノース、及びＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選ばれるいずれか１種以上の糖であり、該糖鎖基単糖数が、１〜５個である前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の抗水銀剤。
［６］前記糖鎖基が、Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−ＧｌｃＡ−、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＡ−、Ｇｌｃ−Ｆｕｃ−、Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ−、Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ−、Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ（−Ｒｈａ）−、Ｘｙｌ−Ｒｈａ（−Ａｐｉ）−Ｆｕｃ−、又はＡｒａ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ（−Ａｐｉ）−Ｆｕｃ−である前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載の抗水銀剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗水銀剤は、その水銀毒性軽減効果及び水銀蓄積抑制効果により、水銀中毒の予防、軽減、又は治療に用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】試験例１における、サンプル化合物及びＭｅＨｇの投与スケジュールを説明する図である。
【図２】比較試験例における、ＭｅＨｇ毒性軽減試験の結果を示すグラフである。
【図３】試験例１（条件Ａ−１）における、ＭｅＨｇ毒性軽減試験の結果を示すグラフである。
【図４】試験例１（条件Ｃ）における、ＭｅＨｇ毒性軽減試験の結果を示すグラフである。
【図５】試験例１（条件Ｄ）における、ＭｅＨｇ毒性軽減試験の結果を示すグラフである。
【図６】試験例１（条件Ａ−２）における、ＭｅＨｇ毒性軽減試験の結果を示すグラフである。
【図７】試験例１（条件Ｂ）における、ＭｅＨｇ毒性軽減試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗水銀剤の作用対象とする水銀としては、金属水銀、Ｈｇ＋、Ｈｇ２＋、ＨｇＣｌ２等の無機水銀及び有機水銀のいずれも対象とする。有機水銀としては、メチル水銀、ジメチル水銀、フェニル水銀等を挙げることができ、なかでも毒性及び摂取機会の高さからメチル水銀を作用対象とすることが好ましい。
【００１７】
本発明の抗水銀剤は、オレアナン系サポニン化合物又はオレアナン系サポニン化合物のアグリコンである下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する。
【００１８】
【化４】
2015134735.tif 000005
【００１９】
［式（１）中、Ｘ１は、水素原子、−ＣＯＯＲ１、−ＯＲ１、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基を表す。Ｘ２は、水素原子、−ＣＯＯＲ２、−ＯＲ２、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基又は炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基を表す。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表す。
式（１）中、Ｘ１で表される基及びＸ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基によって置換されていてもよい。
Ｘ１がヒドロキシ基である場合、該ヒドロキシ基と分子内の他の−ＯＨとが一緒になってエーテル結合を形成し、５〜６員環を形成してもよい。］
【００２０】
前記ハロゲノ基のハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
前記炭素数１〜４のアルキル基としては、直鎖状でも分岐鎖状であってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。前記炭素数１〜４のアルコキシ基としては、直鎖状でも分岐鎖状であってもよく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基等が挙げられる。前記ヒドロキシアルキル基は、前記炭素数１〜４のアルキル基の一個又は複数個の水素原子がヒドロキシ基に置換した基が好ましく、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。
【００２１】
前記炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、前記炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基及び前記炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基におけるアルキル部分又はアルコキシ部分は、前記炭素数１〜４のアルキル基又は前記炭素数１〜４のアルコキシ基において説明したものを同様に挙げることができる。
前記アルキル基、アルコキシ基、及びヒドロキシアルキル基の炭素数は１〜４であり、１〜２が好ましい。前記アルキルカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、及びアルコキシカルボニル基の炭素数は２〜５であり、２〜３が好ましい。
【００２２】
前記一般式（１）中、Ｘ１が−ＣＯＯＲ１であり、Ｘ２が−ＯＲ２である場合、下記一般式（２）で表される化合物が挙げられる。
【００２３】
【化５】
2015134735.tif 000006
【００２４】
［式（２）中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（１）と同様である。式（２）中、Ｒ１及びＲ２で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基によって置換されていてもよい。］
【００２５】
前記一般式（２）で表される化合物としては、下記一般式（２−１）〜（２−４）が挙げられる。
【００２６】
【化６】
2015134735.tif 000007
【００２７】
［式中、Ｒｇは単糖を表し、ｎ及びｍは前記糖鎖基の単糖数を表す。］
【００２８】
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、１〜５の整数であり、１〜３の整数であることが好ましく、１〜２の整数であることがより好ましい。
【００２９】
本発明の抗水銀剤が有効成分として含有する化合物は、抗水銀活性の観点から、糖鎖基を有していることが好ましい。例えば、前記一般式（２）で表される化合物においてＲ１及び／又はＲ２が糖鎖基を表すことが好ましく、Ｒ１が糖鎖基を表す若しくはＲ１及びＲ２が糖鎖基を表すことがより好ましく、Ｒ１及びＲ２が糖鎖基を表すことがさらに好ましい。すなわち、前記一般式（２−１）〜（２−４）のうちでは、（２−２）、（２−３）、又は（２−４）で表される化合物が好ましく、（２−３）又は（２−４）で表される化合物がより好ましく、（２−４）で表される化合物がさらに好ましい。
【００３０】
また、前記一般式（１）で表される化合物は、下記一般式（３）で表される化合物であることが好ましい。
【００３１】
【化７】
2015134735.tif 000008
【００３２】
［式（３）中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（１）と同様である。Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、炭素数２〜５のアルキルカルボニル基、炭素数２〜５のアルキルカルボニルオキシ基又は炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基を表す。
式（３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５で表される基の水素原子以外の水素原子は、ハロゲノ基、メチル基、メトキシ基、ヒドロキシメチル基、又はヒドロキシ基によって置換されていてもよい。］
【００３３】
さらに前記一般式（３）で表される化合物は、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、又は置換基を有していてもよい糖鎖基を表し、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、メチル基、メトキシ基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、カルボキシ基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシ基、アセチル基、アセトキシ基又はメトキシカルボニル基であることがより好ましい。
なかでも、前記一般式（３）においてＲ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、又はアセチル基であることがさらに好ましい。
【００３４】
前記一般式（３）で表される化合物として、例えば、下記一般式（３−１）〜（３−３）で表される化合物が挙げられる。
【００３５】
【化８】
2015134735.tif 000009
【００３６】
［式中、Ｒ１及びＲ２は前記一般式（１）と同様である。］
【００３７】
前記Ｒ１及び／又はＲ２が、置換基を有していてもよい糖鎖基である場合、該糖鎖基の糖としては、特に制限されないが、なかでもグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、フルクトース（Ｆｒｕ）、キシロース（Ｘｙｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、フコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、アピオース（Ａｐｉ）、アラビノース（Ａｒａ）、及びＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる群より選ばれるいずれか1種以上の糖であることが好ましい。前記糖鎖基の単糖数は、抗水銀活性を損なわない範囲で適宜定めることができるが、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることがより好ましく、１〜２個であることがさらに好ましい。
【００３８】
前記糖鎖基の一例としてＧｌｃ−、Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−、Ｇｌｃ−ＧｌｃＡ−、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＡ−、Ｇｌｃ−Ｆｕｃ−、Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ−、Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ−、Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ−Ｆｕｃ（−Ｒｈａ）−、Ｘｙｌ−Ｒｈａ（−Ａｐｉ）−Ｆｕｃ−、Ａｒａ−Ｘｙｌ−Ｒｈａ（−Ａｐｉ）−Ｆｕｃ−を例示することができる。
【００３９】
前記Ｒ１及び／又はＲ２が、置換基を有していてもよい糖鎖基である場合、該置換基としては、ケイ皮酸およびその誘導体から１個以上の水素原子を除いた基、カフェー酸およびその誘導体から１個以上の水素原子を除いた基、没食子酸およびその誘導体から１個以上の水素原子を除いた基等を例示できる。
前記ケイ皮酸誘導体としては、２−ヒドロキシケイ皮酸、４-メトキシケイ皮酸、ｐ−メトキシケイ皮酸、３，４−ジメトキシケイ皮酸、３，４，５−トリメトキシケイ皮酸等が挙げられ、なかでも下記式（４−１）で表される３，４−ジメトキシケイ皮酸が好ましい。
【００４０】
【化９】
2015134735.tif 000010
【００４１】
以下に、前記一般式（３−１）で表される化合物の具体例を例示する。
【００４２】
【化１０】
2015134735.tif 000011
【００４３】
以下に、前記一般式（３−２）又は（３−３）で表される化合物の具体例を例示する。
【００４４】
【化１１】
2015134735.tif 000012
【００４５】
【化１２】
2015134735.tif 000013
【００４６】
本発明の抗水銀剤が抗水銀作用を奏するメカニズムについては、次のように考えられる。例えば、前記一般式（１）で表される化合物は、細胞内又は体内へと取り込まれた水銀の蓄積を抑制する作用を有することで、抗水銀作用を奏することが考えられる。蓄積抑制は、体外又は細胞外への排出促進の結果として表れている可能性もある。別の作用として、前記一般式（１）で表される化合物は、水銀の吸収抑制作用を有してい可能性が考えられる。吸収抑制は消化管の上皮細胞において示されるかもしれない。又は、前記一般式（１）で表される化合物は体内への吸収は妨げないが、臓器への水銀の移行抑制作用を有しているとも推測できる。
【００４７】
本発明の抗水銀剤は、前記一般式（１）で表される化合物のうち、１種類を含有していてもよく、２種類以上を含有していてもよい。また、本発明の抗水銀剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記に挙げた有効成分の他に他の成分を含んでいてもよく、例えば、従来公知の抗水銀作用を有する化合物であるＤＰＱ、Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐システイン（ＮＡＣ）、２，３‐ジメルカプト‐１‐プロパンスルホン酸（ＤＭＳＡ）等をさらに含んでもよい。
【００４８】
本発明の抗水銀剤における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００４９】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００５０】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤と併用してもよい。
【００５１】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００５２】
本発明の抗水銀剤の投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、非投与者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００５３】
例えば、投与量は抗水銀剤の血中濃度により定めてもよく、本発明の抗水銀剤の種類により抗水銀剤の血中濃度の好ましい値を適宜選択することが可能である。例えば、前記一般式（１）で表される化合物の血中濃度（モル比）を０．０１μＭ〜１０μＭ程度となるよう投与量を定めることが挙げられ、その種類により、前記一般式（１）で表される化合物の血中濃度（モル比）を０．０１μＭ〜０．１μＭ、０．１μＭ〜１μＭ、１μＭ〜１０μＭ、０．０１μＭ〜０．０７μＭ、０．１μＭ〜０．７μＭ、１μＭ〜７μＭ、等の濃度から適宜選択してもよい。又は、前記一般式（１）で表される化合物を一過的に投与する場合は、例えば、抗水銀剤の培養液中の濃度（モル比）が０．５μＭ〜５００μＭ程度となるよう投与してもよく、０．５μＭ〜５μＭ、５μＭ〜５０μＭ、５０μＭ〜５００μＭ、等の濃度から適宜選択してもよい。
【００５４】
若しくは、本発明の抗水銀剤の好ましい投与量は、水銀量に対して定めてもよい。この場合の水銀量とは、例えば臓器中の水銀蓄積量を基準とすることが挙げられ、前記一般式（１）で表される化合物の血中濃度を当該水銀量（モル比）の０．０１倍〜０．１倍、０．１倍〜１倍、１倍〜１０倍、０．０１倍〜０．０７倍、０．１倍〜０．７倍、１倍〜７倍、０．００５倍〜０．０５倍、０．０５倍〜０．５倍、０．５倍〜５倍、０．００３倍〜０．０３倍、０．０３倍〜０．３倍、０．３倍〜３倍、等の濃度から適宜選択してもよい。又は、前記一般式（１）で表される化合物を細胞等の微生物に一過的に投与する場合は、前記一般式（１）で表される化合物の培養液中の濃度を当該水銀量（モル比）の０．１倍〜２倍、２倍〜２０倍、２０倍〜２００倍等の濃度から適宜選択してもよい。
【００５５】
前記一般式（１）で表される化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、体重１ｋｇにおいて１日あたり、０．５ｍｇ〜１００ｍｇを投与することが好ましく、５ｍｇ〜７０ｍｇを投与することがより好ましく、１０ｍｇ〜５０ｍｇを投与することがさらに好ましい。
より具体的な前記一般式（１）で表される化合物の投与量は、例えば、体重１ｋｇにおいて１日あたり３０ｍｇ〜５０ｍｇを投与することが例示できる。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
前記式（３−１−１）で表される化合物であるＳＡ００１（入手元：東京化成株式会社製、製品番号：Ｏ ０３１７）を用い、前記式（３−１−２）で表される化合物であるＳＡ００２、前記式（３−１−４）で表される化合物であるＳＡ００３、前記式（３−１−３）で表される化合物であるＳＡ００５、及び前記式（３−１−５）で表される化合物であるＳＡ００６を合成した。
【００５８】
ＳＡ００２は、化合物Ａ、Ｃを経て以下の様に合成した。
（化合物Ａ）
3-O-triethylsilyl oleanolic acid (A)
一口50 mLナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
Oleanolic acid (21) (1.0 g, 2.19 mmol)を加え、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (15 mL)で溶解後、2,6-lutidine (2.59 mL)、TESOTf (2.48 mL)を加え、室温で2時間撹拌した。その後、反応液をエバポレーターで濃縮し、反応を停止した。
反応液にCHCl3 (30 mL) を加え、有機層をH2O (30 mL) で1回洗浄を行い、無水 Na2SO4 で乾燥した。その後、濾過し、エバポレーターで濃縮した後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 250 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 7 : 1) 中で6時間静置した。その後精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、白色固体物質 A (1.13 g, 1.97 mmol, 90%) を得た。
【００５９】
（化合物Ｂ）
2, 3, 4, 6-Tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl trichloroacetimidate (B)
一口100 mLナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
Penta-O-acetyl-β-D-glucopyranose (東京化成工業より購入、製品コード、P0028、1.0 g, 2.56 mmol)を加え、シリンジを用いて無水DMF (20 mL)で溶解後、hydrazine acetate (330 mg, 3.59 mmol)を加え室温で1時間撹拌した。その後、氷冷しながらH2O (30 mL)をゆっくり加えて反応を停止した。
反応液をAcOEt (60 mL)を用いて3回抽出し、有機層をH2O (60 mL)で5回、飽和NaCl水溶液 (60 mL)で1回洗浄し三角フラスコへ移した。無水Na2SO4を加え、乾燥後、一口100 mLナス型フラスコへ溶液を濾過し、エバポレーターで濃縮した。その後、マグネットを入れ、真空ポンプで乾燥し、粗生成物を得た。
前述の粗生成物とマグネットの入った一口100 mLナス型フラスコを、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
シリンジを用いて無水CH2Cl2 (20 mL)を加えて溶解後、Cl3CCN (3.10 mL, 30.7 mmol)、DBU (38.1 μL, 0.26 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。その後、エバポレーターで濃縮した。
得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, 展開溶媒 ; hexane : EtOAc = 4 : 1)で精製し、透明油状物質 B (2 steps, 64%)を得た。
【００６０】
（化合物Ｃ）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-O-triethylsilyl-, 2, 3, 4, 6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl ester (C)
一口10 mLナス型フラスコにマグネットとモレキュラーシーブス４オングストローム（MS4Å） (100 mg) を入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
グリコシルドナー B（化合物Ｂ） (47.1 mg, 0.0956 mmol)、グリコシルアクセプター A （化合物Ａ） (54.6 mg, 0.0956 mmol)を加えた後、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (1.75 mL) で溶解し、−40 ℃に冷却した。次にBF3・OEt2 (1.20 μL, 0.00956 mmol) を加え−40 ℃で1時間撹拌した。その後triethylamine (2.0 μL)を加えて室温に戻して反応を停止した。
反応液にAcOEt (10 mL)を用いてセライト濾過した後、エバポレーターで濃縮して、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 15 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 6 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、無色油状物質 C (62.7 mg, 0.0696 mmol, 73%) を得た。
【００６１】
（ＳＡ００２）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-hydroxy-,β-D-glucopyranosyloxy ester (SA002)
一口50 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコを熱し、フラスコ内部の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）  C（化合物Ｃ）(289 mg, 0.320 mmol) を加え、シリンジを用いて無水 MeOH (7.0 mL) を加えて室温で撹拌し、完全に溶かした。次に、 NaH (1.28 mg, 0.0320 mmol, 60% disp.) を加えた。 NaH を量るのに使用した薬さじ・薬包紙は直ちに水で洗浄した。室温下、1時間撹拌した後、エバポレーターで溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 80 g, 展開溶媒 ; CHCl3 : MeOH = 15 : 1) で精製した。エバポレーターで濃縮し、さらに真空ポンプで溶媒を留去する事により、白色固体物質 SA002 (208 mg, 0.337 mmol, quant.) を得た。
【００６２】
ＳＡ００３は、化合物Ｄ、Ｅを経て以下の様に合成した。
（化合物Ｄ）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-hydroxy-, 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl ester (D)
一口30 mLナス型フラスコにマグネットを入れ C（化合物Ｃ）(300 mg, 0.331 mmol) を加え、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。
次に、シリンジを用いてTBAF 1M THF溶液 (1.7 mL, 1.66 mmol) を加え、室温で14時間撹拌後、 飽和アンモニア水 (10 mL) を加えて反応を止めた。その後、反応液を分液漏斗に移し、CH2Cl2 (30 mL) で2回抽出を行い、有機層を炭酸水素ナトリウム水 (30 mL)で3回、brine (30 mL) で1回洗浄し、無水Na2SO4 で乾燥させた。その後、濾過し、エバポレーターで濃縮した後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 60 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 3 : 1 → 5 : 2 → 2 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、白色固体物質 D (176 mg, 0.224 mmol) を得た。
【００６３】
（化合物Ｅ）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-[(2, 3, 4, 6, -tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) oxy]-, 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl ester (E)
一口10 mLナス型フラスコにマグネットとMS4Å(200 mg) を入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。
グリコシルアクセプター D（化合物Ｄ） (86.9 mg, 0.104 mmol)、グリコシルドナー B （化合物Ｂ） (163 mg, 0.331 mmol) を加えた後、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (10 mL) で溶解させ、反応溶液を−40 ℃に冷却した。次にTMSOTf (2.00 μL, 1.17 μmol) を500 μLの無水CH2Cl2に溶解したものを滴下し、−40 ℃で10分間撹拌した。その後triethylamine (2.0 μL)を加えて室温に戻して反応を停止させた。
反応液にAcOEt (10 mL)を用いてセライト濾過した後、エバポレーターで濃縮して、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 20 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 3 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、白色固体物質 E (116 mg, 0.0975 mmol, 94%) を得た。
【００６４】
（ＳＡ００３）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-(β-D-glucopyranosyloxy)-, β-D-glucopyranosyl ester (SA003)
一口30 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコを熱し、フラスコ内部の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。
そのフラスコにE（化合物Ｅ）(47.9 mg, 0.0429 mmol) を加え、シリンジを用いて無水 MeOH (1.5 mL) を加えて室温で撹拌し、完全に溶解させた。次に、 NaH (85.8 μg, 2.15 μmol, 60% disp.) を加えた。 NaH を量るのに使用した薬さじ・薬包紙は直ちに水で洗浄した。室温下、15分間撹拌した後、水 5 mL で希釈した。続いて、反応液をDIAION（登録商標） HP-20 (15 cc)を用いて、H2O (100 mL)、H2O : MeOH = 1 : 1 (150 mL) で分画し、H2O : MeOH = 1 : 1画分をエバポレーターで濃縮し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をHPLC (YMC-Pack Pro C18, H2O : MeOH = 1 :9, flow rate = 8.0 mL/min, retention time ＝ 6.8 min)で精製し、エバポレーターで濃縮後、真空ポンプで溶媒を留去する事により、白色固体物質 SA003 (28.8 mg, 0.0369 mmol, 86%) を得た。
【００６５】
ＳＡ００５は、化合物Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍを経て以下の様に合成した。
（化合物Ｇ）
1, 2-Di-O-acetyl-3-O-(4-methoxybenzyl)-4, 6-O-(4-methoxybenzylidene)-α(and/or β)-D-glucopyranose (G)
一口500 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ F（化合物Ｆ） (3-O-(4-methoxybenzyl)-4, 6-O-(4-methoxybenzylidene)-D-glucal, 4.10 g, 10.7 mmol) を加え、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。
次に溶媒装置を用いて無水CH2Cl2 (100 mL) を加え、iodobenzene diacetate (4.12 g, 12.8 mmol) を加えた。−40 ℃で撹拌し、 BF3・OEt2(402 μL, 3.20 mmol) を加え、3時間撹拌後、 pyridine (50 mL)と Ac2O (50 mL) を加え、室温に戻し、17時間撹拌した。その後、0 ℃に氷冷し、H2O (100 mL) を加えて反応を停止させた。
次に反応液を AcOEt (200 mL) を用いて 1 回抽出した後、有機層を 飽和CuSO4 (80 mL) で1回、H2O (100 mL) で 5回、飽和NaCl水溶液 (100 mL) で 1 回洗浄を行い、無水 Na2SO4 で乾燥した。その後、濾過し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 250 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 2 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、白色固粉体物質 G (4.32 g, 8.60 mmol, 81%, α : β = 12 : 88) を得た。
【００６６】
（化合物Ｈ）
1, 2-Di-O-acetyl-3, 6-O-(4-methoxybenzyl)- α (and/or β)-D-glucopyranose (H)
一口500 mLナス型フラスコにマグネットを入れ G（化合物Ｇ）(5.29 g, 10.5 mmol) を加え真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
次に溶媒装置を用いて無水CH2Cl2 (130 mL)を加えて溶解し、別途調製したMS4Å(30 g) を加え、フラスコを氷冷して 0 ℃にした。（一口300 mLナス型フラスコにMS4Å(30 g)を入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。反応にはこのMS4Åを直前に調製し、使用した。）一方、一口200 mLナス型フラスコを真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。この100 mLナス型フラスコにSodium Cyanoborohydride (6.62 g, 105 mmol) を入れ、シリンジを用いて無水THF (45 mL) に溶解させながら、一口500 mLナス型フラスコ内に加えた。続いてシリンジを用いてTFA (16.1 mL, 211 mmol) をゆっくり滴下し、室温に戻して15時間撹拌した。
その後、CH2Cl2 を用いてセライト濾過し、濾液を 飽和NaHCO3水溶液 (90 mL) を用いて 3 回洗浄した後、 CH2Cl2 (100 mL) で 1 回抽出し、さらにH2O (100 mL) で 5回、飽和NaCl水溶液 (100 mL) 1 回洗浄し、無水 Na2SO4 で乾燥した。その後、濾過し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 250 g, 展開溶媒 ; toluene : AcOEt = 4 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、無色透明油状物質 H (2.32 g, 4.60 mmol, 44%, α : β= 7 : 93) を得た。
【００６７】
（化合物Ｉ）
1, 2-Di-O-acetyl-3, 6-O-(4-methoxybenzyl)-4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]- α(and/or β)-D-glucopyranose (I)
一口 200 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ H（化合物Ｈ） (980 mg, 1.94 mmol)を加え、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
次に溶媒装置を用いてCH2Cl2 (30 mL) と乾燥したMS4Å(3.1 g) を加え、フラスコを氷冷して 0 ℃にした。次に、3, 4-dimethoxycinnamic acid (607 mg, 2.91 mmol) とDCC (401 mg, 1.94 mmol) とDMAP (23.7 mg, 0.194 mmol) を加えた。なお、 DCC を扱う時は、ゴム手袋を着用した。続いて、反応温度を室温に戻し、 22 時間撹拌した。
その後、CH2Cl2 を用いてセライト濾過し、濾液を 5% aq. Na2CO3 (30 mL) で 2 回、 飽和NaCl水溶液 (30 mL) で 1 回洗浄した後、無水 Na2SO4 で乾燥した。その後、濾過し、エバポレーターで濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 2 : 1) で精製した。はじめに、hexane (1 L)を流した後に、展開溶媒を hexane : AcOEt = 2 : 1 に変更し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、黄色固粉体物質 I (1.37 g, 1.97 mmol, quant., α : β = 1 : 99) を得た。
【００６８】
（化合物Ｊ）
2-O-acetyl-3, 6-O-(4-methoxybenzyl)-4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]- α(and/or β)-D-glucopyranose (J)
一口100 mLナス型フラスコにマグネットを入れ I（化合物Ｉ） (335 mg, 0.482 mmol) を加え、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
次に、シリンジを用いて無水DMF (10 mL) を加え撹拌して完全に溶解した。続いてhydrazine acetate (2.4 mg, 0.0256 mmol) を加え、室温で1時間撹拌後、 0 ℃のH2O (10 mL) を加えて反応を止めた。その後、反応液を分液漏斗に移し、AcOEt (30 mL) で1回抽出を行い、有機層をH2O (20 mL)で3回、brine (20 mL) で1回洗浄し、無水Na2SO4 で乾燥させた。その後、濾過し、エバポレーターで濃縮した後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 1 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、無色油状物質 Ｊ (277 mg, 0.424 mmol, 88%, α : β = 73 : 27) を得た。
【００６９】
（化合物Ｋ）
2-O-acetyl-3, 6-O-(4-methoxybenzyl)-4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]-α(and/or β)-D-glucopyranosyl trichloroacetimidate (K)
一口50 mLナス型フラスコにマグネットを入れ J（化合物Ｊ） (261 mg, 0.400 mmol) を加え、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。
次に、シリンジを用いて 無水CH2Cl2 (8 mL) を入れ撹拌して完全に溶解し、Cl3CCN (485 μL, 4.80 mmol) 、DBU (8.0 μL, 0.0800 mmol) の順にシリンジで加え、室温で1時間半撹拌した。反応液をシリカゲル(10 g)とセライト(10 g)を詰めたカラム管でAcOEtを用いて素早く濾過し、反応を止め、エバポレーターで濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 30 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 2 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮後、さらに真空ポンプで溶媒を留去し、無色油状物質 K (302 mg, 0.0379 mmol, 95%, α : β = 93 : 7) を得た。
【００７０】
（化合物Ｌ）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-O-triethylsilyl-, 2-O-acetyl-, 3, 6-O-(4-methoxybenzyl)-,4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]-β-D-glucopyranosyl ester (L)
一口30 mLナス型フラスコにマグネットとMS4Å(1.0 g) を入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
グリコシルドナー A（化合物Ａ） (327 mg, 0.410 mmol)、グリコシルアクセプター K （化合物Ｋ） (234 mg, 0.410 mmol)を加えた後、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (5.0 mL) で溶解し、−40 ℃に冷却した。次にBF3・OEt2 (5.15 μL, 0.0410 mmol) を加え−40 ℃で30分間撹拌した。その後triethylamine(10.0 μL)を加えて室温に戻して反応を停止した。
反応液にAcOEt(10 mL)を用いてセライト濾過した後、エバポレーターで濃縮して、粗生成物を得た。得られた粗生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 4 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、無色油状物質 L (301 mg, 0.250 mmol, 61%) を得た。
【００７１】
（化合物Ｍ）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-hydroxy-, 3, 6-O-(4-methoxybenzyl)-,4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]-β-D-glucopyranosyl ester (M)
一口30 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコを熱し、フラスコ内部の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。
L（化合物Ｌ） (188 mg, 0.156 mmol) を加え、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (2.0 mL)、無水 MeOH (8.0 mL) を加えて室温で撹拌し、完全に溶かした。次に、 NaH (40 mg, 5.13 mmol, 60% disp.) を加えた。 NaH を量るのに使用した薬さじ・薬包紙は直ちに水で洗浄した。室温下、1.5時間撹拌した後、エバポレーターで溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 100 g, 展開溶媒 ; hexane : EtOAc = 3 : 1) で精製した。エバポレーターで濃縮し、さらに真空ポンプで溶媒を留去する事により、白色固体物質 M (106 mg, 0.101 mmol, 65%) を得た。
【００７２】
（ＳＡ００５）
Olean-12-en-28-oic acid, 3-hydroxy-, 4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]- β-D-glucopyranosyl ester (SA005)
一口30 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ M（化合物Ｍ） (82.0 mg, 0.0781 mmol) を加えた。続いてCH2Cl2 (7.40 mL)、H2O (0.411 mL) を加えて撹拌して完全に溶かし、DDQ (35.5 mg, 0.156 mmol) を加えて室温で17時間撹拌した。その後、無水Na2SO4を加え、反応を停止させた。
続いて、CH2Cl2 を用いてセライト濾過し、エバポレーターで溶媒を留去して粗生成物を得た。得られた粗生成物をprep. TLC (hexane : AcOEt = 1 : 3) 、HPLC (PEGASIL Silica SP100, hexane : AcOEt = 3 :2)で精製し、エバポレーターで濃縮後、真空ポンプで溶媒を留去する事により、白色固体物質 SA005 (22.1 mg, 0.0273 mmol, 35%) を得た。
【００７３】
ＳＡ００６は、化合物Ｎ、Ｏを経て以下の様に合成した。
（化合物Ｎ）
Olean-12-en-28-oic acid, 3β-D-pentaacetlyglucopyranosyl, tert-butyl-diphenylsiloxy ester (N) 
一口30 mLナス型フラスコにマグネットとMS4Å(200 mg) を入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
グリコシルドナー B (108mg, 0.221 mmol)、文献（Biao Yuら、Synlett 2004年、2巻、259-262）に従って調整したグリコシルアクセプター(100 mg, 0.147 mmol)を加えた後、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (2.0 mL) で溶解し、−40 ℃に冷却した。次にTMSOTf (266 μL, 0.0147 mmol) を加え−40 ℃で30分間撹拌した。その後triethylamine(10.0 μL)を加えて室温に戻して反応を停止した。
反応液にAcOEt(10 mL)を用いてセライト濾過した後、エバポレーターで濃縮して、粗生成物を得た。得られた粗生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 50 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 5 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、無色油状物質 N (139.3 mg, 0.136 mmol, 92%) を得た。
【００７４】
（化合物Ｏ）
3β-D-pentaacetylglucopyranosyl olean-12-en-28-oic acid (O)
一口30 mLナス型フラスコにマグネットを入れ N（化合物Ｎ） (134.1 mg, 0.131 mmol) を加え、真空ポンプで減圧してフラスコ内を窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
次に、シリンジを用いてTBAF 1M THF溶液 (1.3 mL, 1.31mmol) を加え、室温で14時間撹拌後、 飽和塩化アンモニア水 (1 mL) を加えて反応を止めた。その後、反応液を分液漏斗に移し、CH2Cl2 (10 mL) で2回抽出を行い、有機層を炭酸水素ナトリウム水 (10 mL)で3回、brine (10 mL) で1回洗浄し、無水Na2SO4 で乾燥させた。その後、濾過し、エバポレーターで濃縮した後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 20 g, 展開溶媒 ; hexane : AcOEt = 5 : 1 → 4 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、白色固体物質 O (26.3 mg, 0.033 mmol, 26%) を得た。
【００７５】
（ＳＡ００６）
3β-D-glucopyranosyl olean-12-en-28-oic acid (SA006) 
一口10 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコを熱し、フラスコ内部の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
そのフラスコにO（化合物Ｏ） (17.0 mg, 0.021 mmol) を加え、シリンジを用いて無水 MeOH (0.5 mL) を加えて室温で撹拌し、完全に溶解させた。次に、 NaH (85.8 μg, 2.15 μmol, 60% disp.) を加えた。 NaH を量るのに使用した薬さじ・薬包紙は直ちに水で洗浄した。室温下、2時間撹拌した後、水 5 mL で希釈した。続いて、反応液をDIAION（登録商標） HP-20 (10 cc)を用いて、H2O (50 mL)、H2O : MeOH = 1 : 1 (50 mL) で分画し、H2O : MeOH = 1 : 1画分をエバポレーターで濃縮し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をODSカラム （80% MeOH）で精製し、エバポレーターで濃縮後、真空ポンプで溶媒を留去する事により、白色固体物質 SA006 (2.84 mg, 4.59 μmol, 21%) を得た。
【００７６】
前記式（３−２−１）で表される化合物であるＳＡ００４をオンジ（Polygala senega）より単離した。
（ＳＡ００４）
ＳＡ００４の単離方法は以下の通りである。
Polygala senega (500 g, 栃本天海堂) を5等分し、それぞれを1 Lナス型フラスコに入れ、それぞれにMeOH (1 L) を加え室温で1週間、放置抽出した。その後、吸引濾過してエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥し、MeOH抽出物 (131.6 g) を得た。
P. Senega MeOH 抽出物 (3 g) を500 mLナス型フラスコ (1 neck) に入れ、1M aq. KOH (200 mL) を加えて4時間refluxし、その後、0 ℃に冷却した。続いて、反応液をDIAION（登録商標） HP-20 (200 cc) を用いて、H2O (300 mL)、50% MeOH (100 mL)、80% MeOH (100 mL)、MeOH (400 mL) で分画し、80% MeOH、MeOH画分を濃縮し、粗生成物を得た。得られた粗生成物をDIOLシリカカラムクロマトグラフィー (DIOLシリカ 50 cc, 展開溶媒 ; CHCl3 : MeOH = 10 : 1 → CHCl3 : MeOH = 5 : 1 → CHCl3 : MeOH = 3 : 1 → MeOH) で精製し、エバポレーターで濃縮した。50 mLナス型フラスコに移し変えて濃縮し、真空ポンプで溶媒を留去し、黄色固粉体物質SA004 (194 mg, 1.94% w/w : from Polygala senega) を得た。
【００７７】
前記ＳＡ００４を用い、前記式（３−２−２）で表される化合物であるＳＡ００７、及び前記式（３−３−１）で表される化合物であるＳＡ００８を合成した。
【００７８】
ＳＡ００７は、化合物Ｐ、Ｑを経て以下の様に合成した。
（化合物Ｐ）
Hepta -O-(Acetyl)-Tenuifolin (P)
一口30 mLナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
SA004 (150 mg, 0.220 mmol) を加え、シリンジを用いてpyridine (4 mL)で溶解後、Ac2O (207 μL, 2.20 mmol)、DMAP (2.69 mg, 0.0220 mmol) を加え、60 ℃で2時間撹拌した。反応終了後、水 10 mLを加え反応を停止した。
続いてAcOEt (20 mL) で抽出を行った後、有機層をCuSO4aq (15 mL) で1回、水 (15 mL)で3回、飽和食塩水 (15 mL) で1回洗浄を行い、無水 Na2SO4 で乾燥した。その後、濾過し、エバポレーターで濃縮した後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 30 g, 展開溶媒 ; CHCl3 : MeOH = 80 : 1 → 50 : 1) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、黄色固体物質 P (172 mg, 0.194 mmol, 88%) を得た。
【００７９】
（化合物Ｑ）
Olean-12-en-23, 28-dioic acid, 3-(β-D-glucopyranosyloxy)-2, 27-dihydroxy-3, 6-O-(4-methoxybenzyl)-,4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]-β-D-glucopyranosyl ester (Q) 
一口10 mLナス型フラスコを真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコの、フラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）この10 mLフラスコにグリコシルアクセプター P（化合物Ｐ） (80.8 mg, 0.0907 mmol)、グリコシルドナー K（化合物Ｋ） (72.3 mg, 0.0907 mmol) を加えた後、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (10 mL) に溶解させ、サンプル調製溶液とした。
一方、一口100 mLナス型フラスコを真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。この100 mLナス型フラスコにシリンジを用いて無水CH2Cl2 (50 mL)を入れ、TMSOTf (8.2 μL, 0.0454 mmol) を加えTMSOTf調製溶液とした。
調製したそれぞれの溶液を各10 mLずつ 10 mLのガスタイトシリンジに取り、マイクロフローリアクターに接続したテフロン（登録商標）製チューブ (長さ：試料導入部 48 cm, 反応溶液部 100 cn) に取り付けた。シリンジポンプを用いて、シリンジから同じ流量でテフロン（登録商標）製チューブへと溶液を流し、マイクロフローリアクター内で毎分0.2mL、−40 ℃で反応させた。その際、反応液をtriethylamine 100 μLをCH2Cl2 5 mLで薄めたtriethylamine溶液に直接滴下して反応を停止させた。流路混合時間は9.0 min, フロー終了時間は 100 minであった。
その後、反応液をエバポレーターで濃縮して、粗生成物 Q (115 mg, Q ; 64%) を得た。
【００８０】
（ＳＡ００７）
Olean-12-en-23, 28-dioic acid, 3-(β-D-glucopyranosyloxy)-2, 27-dihydroxy-4-O-[(E)-3, 4-dimethoxycinnamoyl]-β-D-glucopyranosyl ester (SA007)
一口30 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ Q （化合物Ｑ） (16.7 mg, crude) を加えた。続いてCH2Cl2 (1.9 mL)、H2O (0.11 mL) を加えて撹拌して完全に溶かし、DDQ (14.4 mg, 0.0636 mmol) を加えて室温で1時間撹拌した。その後、無水Na2SO4を加え、反応を停止させた。
続いて、CH2Cl2 を用いてセライト濾過し、エバポレーターで溶媒を留去して粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ODSシリカゲル 30 g, 展開溶媒 ; acetonitrile : H2O = 3 : 7) で精製し、エバポレーターで濃縮し、混合物として粗生成物 SA007 (16.2 mg, SA007 ; 47%)を得た。
【００８１】
ＳＡ００８は、化合物Ｒを経て以下の様に合成した。
（ＳＡ００８）
Olean-12-en-23, 28-dioic acid, 3-[(2, 3, 4, 6, -tetra- O-acetyl--β-D-glucopyranosyl) oxy] -2, 27-dihydroxy-, 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl ester (R) 
一口10 mLナス型フラスコを真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコの、フラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）この10 mLフラスコにグリコシルアクセプター P（化合物Ｐ） (71.0 mg, 0.0797 mmol)、グリコシルドナー D（化合物Ｄ） (78.5 mg, 0.159 mmol) を加えた後、シリンジを用いて無水CH2Cl2 (7.5 mL) に溶解させ、サンプル調製溶液とした。
一方、一口100 mLナス型フラスコを真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコ内の水分を完全に取り除き、フラスコが冷めたところで窒素置換した。この100 mLナス型フラスコにシリンジを用いて無水CH2Cl2 (75 mL)を入れ、TMSOTf (14.0 μL, 0.0797 mmol) を加えることでTMSOTf調製溶液とした。
調製したそれぞれの溶液を各7.5 mLずつ10 mLのガスタイトシリンジに取り、マイクロフローリアクターに接続したテフロン（登録商標）製チューブ (長さ：試料導入部 48 cm, 反応溶液部 100 cn) に取り付けた。シリンジポンプを用いて、シリンジから同じ流量でテフロン（登録商標）製チューブへと溶液を流し、マイクロフローリアクター内で毎分0.1mL、−40 ℃で反応させた。その際、反応液をtriethylamine 100 μLをCH2Cl2 3 mLで薄めたtriethylamine溶液に直接滴下して反応を停止させた。流路混合時間は4.5 min, フロー終了時間は 75 minであった。
その後、溶液をエバポレーターで濃縮して、粗生成物を得た。得られた粗生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ODSシリカゲル 40 g, 展開溶媒 ; MeOH : H2O = 3 : 2 →  7 : 3 →  4 : 1 ) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去し、黄色固体物質 R (64.7 mg, 0.0530 mmol, 66%) を得た。
【００８２】
（ＳＡ００８）
Olean-12-en-23, 28-dioic acid, 3-(β-D-glucopyranosyloxy-, 2-acetyl-, 27-hydroxy-β-D-glucopyranosyl ester (SA008)
一口10 mL ナス型フラスコにマグネットを入れ、真空ポンプで減圧しながらヒートガンでフラスコを熱し、フラスコ内部の水分を完全に取り除いた。フラスコが冷めたところで窒素置換した。（以下の反応は、全て窒素雰囲気下で行った。）
R（化合物Ｒ） (23.7 mg, 0.0194 mmol) を加え、シリンジを用いて無水 MeOH (0.5 mL) を加えて40 ℃で撹拌し、完全に溶かした。次に、 NaH (77.0 μg, 0.00194 mmol, 60% disp.) を加えた。 NaH を量るのに使用した薬さじ・薬包紙は直ちに水で洗浄した。40 ℃で24時間撹拌した後、水 5 mL で希釈した。続いて、反応液をDIAION（登録商標） HP-20 (15 cc)を用いて、H2O (100 mL)、MeOH (50 mL) で分画し、MeOH分画をエバポレーターで濃縮し、粗生成物を得た。得られた粗生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ODSシリカゲル 20 g, 展開溶媒 ; MeOH : H2O = 7 : 3 ) で精製し、エバポレーターで濃縮した。さらに、真空ポンプで溶媒を留去する事により、黄色固体物質 SA008 (12.8 mg, 0.0145 mmol, 74%) を得た。
【００８３】
《比較試験例：Ｃａｃｏ−２細胞での、抗酸化剤によるＭｅＨｇ毒性軽減試験》
ＭｅＨｇ毒性軽減効果を奏する物質として、抗酸化剤であるＤＰＱが知られている。そこでまず、ＤＰＱのＭｅＨｇ毒性軽減効果をヒト結腸癌由来細胞であるＣａｃｏ−２細胞を用いて確認した。さらに、抗酸化剤として知られるビタミンＣ（ＶＣ）、ビタミンＥ（ＶＥ）、ビタミンＫ１（ＶＫ１）、β‐カロテン、カテキン、クルクミン、及びレスベラトロールについても同様の試験を行った。
試験は、Caco-2細胞にＭｅＨｇと、既知の抗酸化剤とを添加し、数日間培養した後に、ＭＴＴ試験により細胞生存率を算出することにより行った。なお、試験条件は後述の条件Ａ−１である。
【００８４】
抗酸化剤によるＭｅＨｇ毒性軽減試験を行った結果を図２に示す。結果は、表中に記載の抗酸化剤の添加濃度ごとに示す。表の横軸は添加したＭｅＨｇの濃度を表す。表の縦軸はＭＴＴ試験により算出した細胞数を表し、コントロールであるＭｅＨｇ添加量が０μＭでサンプル化合物の添加量が０μＭの値を１００％とした相対値で示す。
【００８５】
図２に示されるように、従来ＭｅＨｇ毒性軽減が報告されているＤＰＱは、ＭｅＨｇ毒性軽効果を有することが示された。特に、ＭｅＨｇ：５μＭ、ＤＰＱ：１０μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された（Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ）。しかし、その他の抗酸化剤では、顕著なＭｅＨｇ毒性軽減効果は認められなかった。
【００８６】
《試験例１：Ｃａｃｏ−２細胞での、サポニン化合物によるＭｅＨｇ毒性軽減試験》
ヒト結腸癌由来細胞であるＣａｃｏ−２細胞を用いて試験を行った。試験は、Ｃａｃｏ−２細胞にＭｅＨｇと、サンプル化合物（ＳＡ００１〜ＳＡ００３及びＳＡ００５〜ＳＡ００８のいずれかの化合物）とを添加し、数日間培養した後に、ＭＴＴ試験により細胞生存率を算出することにより行った。試験は、細胞の培養状態、ＭｅＨｇとサンプル化合物との投与条件を変えた下記の計５条件により行った。
条件Ａ−１：浮遊、前投与・Ｗａｓｈなし
条件Ａ−２：接着、前投与・Ｗａｓｈなし
条件Ｂ    ：接着、前投与・Ｗａｓｈあり
条件Ｃ    ：浮遊、同時投与
条件Ｄ    ：浮遊、後投与・Ｗａｓｈなし
【００８７】
条件Ａ−１の試験は、以下のように行った。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、Ｃａｃｏ-２ 細胞を１．５× １０４  ｃｅｌｌｓ／1００μＬ／ｗｅｌｌ 密度となるよう播種した後、サンプル化合物を所定の終濃度となるよう添加して1時間培養した後、ＭｅＨｇを所定の終濃度となるよう添加して２４時間培養し、その後培地交換を行い、さらに２４時間培養し、ウェル内へとＭＴＴ試薬（ナカライテスク社、品番：２３５０６−８０）１０μＬを添加した後４時間培養を行い、ウェル内へとＭＴＴ可溶化液（ナカライテスク社、品番：２３５０６−８０）１００μＬを添加して、５７０ｎｍの吸光度を測定した。なお、前記培養は全て３７℃, ５．０％ ＣＯ２条件下で行った。
【００８８】
条件Ａ−２の試験は、Ｃａｃｏ-２ 細胞を播種した後、サンプル化合物を添加する前に２４時間培養を行い、細胞をウェルへと接着させた後にサンプル化合物を添加して行った以外は、前記条件Ａ−１と同様の方法により行った。
【００８９】
条件Ｂの試験は、サンプル化合物を添加して１時間培養後、ウェルをリン酸緩衝液により洗浄した後でＭｅＨｇを添加して行った以外は、前記条件Ａ−２と同様の方法により行った。
【００９０】
条件Ｃの試験は、Ｃａｃｏ-２細胞を播種したのちに、サンプル化合物及びＭｅＨｇを同時に添加して行った以外は、前記条件Ａ−１と同様の方法により行った。
【００９１】
条件Ｄの試験は、Ｃａｃｏ-２ 細胞を播種した後、ＭｅＨｇを添加して１時間培養した後、サンプル化合物を添加して培養した以外は、前記条件Ａ−１と同様の方法により行った。
【００９２】
条件Ａ〜ＤのＭｅＨｇとサンプル化合物との投与条件のタイミングを説明する図を図１に示す。
【００９３】
［試験例１−１：条件Ａ−１］
前記条件Ａ−１の方法でＭｅＨｇ毒性軽減試験を行った。結果を表中に記載のサンプル化合物の添加濃度ごとに示す。表の横軸は添加したＭｅＨｇの濃度を表す。表の縦軸はＭＴＴ試験により算出した細胞数を表し、コントロールであるＭｅＨｇ添加量が０μＭでサンプル化合物の添加量が０μＭの値を１００％とした相対値で示す。
【００９４】
本試験において、ＳＡ００３、ＳＡ００５、ＳＡ００６、ＳＡ００７、及びＳＡ００８のサンプル化合物がＭｅＨｇ毒性軽減効果を有することが示された。結果を図３に示す。特に、ＳＡ００３を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００３：０．０３２μＭ添加条件、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００３：０．３２μＭ添加条件、ＭｅＨｇ：５μＭ，ＳＡ００３：０．００３２μＭ添加条件、及びＭｅＨｇ：５μＭ，ＳＡ００３：０．３２μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。ＳＡ００６を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：２．５μＭ，ＳＡ００６：２．４２μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。ＳＡ００７を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：５μＭ，ＳＡ００７：０．０２４２μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。ＳＡ００８を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：５μＭ，ＳＡ００７：０．０２４２μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。ＳＡ００８を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：２．５μＭ，ＳＡ００８：０．２８３μＭ添加条件、及びＭｅＨｇ：２．５μＭ，ＳＡ００８：２．８３μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。
【００９５】
［試験例１−２：条件Ｃ］
前記条件Ｃの方法でＭｅＨｇ毒性軽減試験を行った。本試験においてＳＡ００１、ＳＡ００２、及びＳＡ００３のサンプル化合物が、ＭｅＨｇ毒性軽減効果を有することが示された。結果を図４に示す。特に、ＳＡ００２を用いた試験において、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００２：０．０４０４μＭ添加条件、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００２：４．０４μＭ添加条件で有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。
【００９６】
［試験例１−３：条件Ｄ］
前記条件Ｄの方法でＭｅＨｇ毒性軽減試験を行った。本試験において、ＳＡ００２、及びＳＡ００５のサンプル化合物が、ＭｅＨｇ毒性軽減効果を有することが判明した。結果を図５に示す。特に、ＳＡ００２を用いた試験において、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００２：０．０４０４μＭ添加条件で有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。
【００９７】
［試験例１−４：条件Ａ−２］
前記条件Ａ−２の方法でＭｅＨｇ毒性軽減試験を行った。本試験においてＳＡ００１、ＳＡ００３、ＳＡ００５、及びＳＡ００６のサンプル化合物が、ＭｅＨｇ毒性軽減効果を有することが示された。結果を図６に示す。特に、ＳＡ００６を用いた試験において、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００６：０．０２４２μＭ添加条件で有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。
【００９８】
［試験例１−５：条件Ｂ］
前記条件Ｂの方法でＭｅＨｇ毒性軽減試験を行った。本試験においてＳＡ００１、ＳＡ００２、ＳＡ００３、ＳＡ００５、及びＳＡ００６のサンプル化合物が、ＭｅＨｇ毒性軽減効果を有することが示された。結果を図７に示す。特に、ＳＡ００３を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００３：１μＭ添加条件で有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。ＳＡ００５を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００５：１μＭ添加条件、及びＭｅＨｇ：１μＭ，ＳＡ００５：１０μＭ添加条件で、有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。ＳＡ００６を用いた試験においては、ＭｅＨｇ：５μＭ，ＳＡ００６：１μＭ添加条件で有意なＭｅＨｇ毒性軽効果が示された。
【００９９】
以上の結果から、本試験に用いたサンプル化合物は優れたＭｅＨｇ毒性軽減効果を有することが示された。
また、上記条件Ｂにおいて得られた試験結果によれば、ＭｅＨｇ暴露よりも先にサンプル化合物を投与することでもＭｅＨｇ毒性軽減効果がみられたことから、特にＳＡ００１、ＳＡ００２、ＳＡ００３、ＳＡ００５、及びＳＡ００６のサンプル化合物が、ＭｅＨｇ中毒の予防効果を有することが示された。
【０１００】
《試験例２：マウスでの、サポニン化合物による抗ＭｅＨｇ効果試験》
試験例１において優れたＭｅＨｇ毒性軽効果を示したサポニン化合物のうち、特に優れたＭｅＨｇ毒性軽効果を示したＳＡ００３を選定し、マウスを用いたＭｅＨｇ毒性軽効果試験を行った。
【０１０１】
試験対象としては、ＮＣ／Ｎｇａマウス（オス）を用いた。表１に示される量のＭｅＨｇ、及び４０ｍｇ/ｋｇのＳＡ００３を１回分（１日分）としてマウスへ経口投与し、これを週に５回（週に５日）のペースで４週間行った。これをＳＡ００３投与群（ＳＡ００３［＋］群）とする。４０ｍｇ/ｋｇとは、マウス体重１ｋｇあたり４０ｍｇのＭｅＨｇをマウスに投与したことを示す。その後マウスを解剖し、肝臓及び腎臓の各臓器の重量の平均と、肝臓、及び腎臓の各臓器、並びにマウス体毛における総水銀蓄積量の平均を求めた（ｎ ＝ ４〜６）。また、比較試験として、表１に示される量のＭｅＨｇをマウスへ経口投与し、ＳＡ００３は投与しない条件でも試験を行った。これをＳＡ００３非投与群（ＳＡ００３［−］群）とする。
なお、本試験では、アトピー性皮膚炎モデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスを用い、さらに、試験に用いた全てのマウスにダニ抗原（ＤＡ、エル・エス・エル社製、品番：ＬＧ５４４９）を０．２ｍｇ/ｋｇを１回分（１日分）として、週に２回（週に２日）投与された条件の下、ＭｅＨｇ及びＳＡ００３のＭｅＨｇ毒性軽減に係る効果を検証したが、健常マウスを用いてダニ抗原の投与を行わなかった場合でも、本試験と同等の結果が得られると期待される。
【０１０２】
試験例２において測定された肝臓及び腎臓の重量を表１に示す。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
表１において示されるように、本試験においては、マウスの各臓器重量は、ＭｅＨｇの暴露濃度の違いによる有意な変化は見られなかった。
【０１０５】
試験例２において測定された肝臓、腎臓、及びマウス体毛での総水銀蓄積量を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
表２中の記号は、＊ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＭｅＨｇ（０ ｍｇ／ｋｇ）、＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＭｅＨｇ（０ ｍｇ／ｋｇ）、#ｐ＜０．０５ ｖｓ．ＳＡ００３［−］、##ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＳＡ００３［−］であることを示す。
【０１０８】
表２において示されるように、ＭｅＨｇおよびＳＡ００３を同時に経口投与した群のＭｅＨｇの臓器への蓄積は、ＭｅＨｇのみを経口投与した群に比べて低下した。なかでも、ＳＡ００３［＋］ＭｅＨｇ(０．０２ｍｇ／ｋｇ)群での肝臓及び腎臓中の総水銀濃度は、ＳＡ００３［−］ ＭｅＨｇ (０．０２ｍｇ／ｋｇ)群と比較して特に有意に低下していた。
従って、ＳＡ００３は、ＭｅＨｇの臓器への移行性を腸管からの吸収を抑制する、あるいは排出を促進することにより体内へのメチル水銀の蓄積性を低下させ、ＭｅＨｇを解毒する可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明の抗水銀剤は、優れた水銀毒性軽減効果および水銀蓄積抑制効果を有するため、水銀の摂取を原因とするあらゆる症状の治療、原因解明等に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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