(57)【要約】【課題】簡単な構成で、余剰の磁性粒子を除去する効率を向上できる洗浄装置を提供する。【解決手段】洗浄装置は、磁性材料からなり、容器に注入された磁性粒子を含む溶液を吸引する吸引ノズル３１と、吸引ノズル３１を磁化させる磁化部３３と、磁化部３３により吸引ノズル３１を磁化させることにより、溶液の液面近傍に位置する吸引ノズル３１の先端側に磁性粒子を収集する収集制御部５２と、溶液中において収集された磁性粒子を吸引ノズル３１に吸引させる吸引制御部５３とを備える。【選択図】図１
2015125032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性材料からなり、容器に注入された磁性粒子を含む溶液を吸引するノズルと、
前記ノズルを磁化させる磁化部と、
前記磁化部により前記ノズルを磁化させることにより、前記溶液の液面近傍に位置する前記ノズルの先端側に前記磁性粒子を収集する収集制御部と、
前記溶液中において収集された前記磁性粒子を前記ノズルに吸引させる吸引制御部と
を備えることを特徴とする洗浄装置。
【請求項２】
前記吸引制御部は、前記磁化部により前記ノズルの磁化を停止した状態で、前記溶液中において収集された前記磁性粒子を前記ノズルに吸引させることを特徴とする請求項１に記載の洗浄装置。
【請求項３】
磁性材料からなるノズルの先端が、容器に注入された磁性粒子を含む溶液の液面近傍となるように、前記ノズルを移動させるステップと、
前記ノズルを磁化させることにより、前記溶液中の前記ノズルの先端側に前記磁性粒子を収集するステップと、
前記溶液中において収集された前記磁性粒子を前記ノズルに吸引させるステップと
を含むことを特徴とする洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学検定等に用いられる容器を洗浄する洗浄装置及び洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析する免疫学的検定（immunoassay）が知られている。免疫検定法の一つとして、容器の内壁面に固定された第１抗体と試料液中の抗原とを反応させ、反応しなかった物質を除去した後、反応した抗原と磁性粒子で標識された第２抗体との反応量を定量する方法が提案されている。反応量は、磁性粒子に含有させた蛍光物質が発する光を検出することや磁性粒子の個数を直接計測することにより定量される。
【０００３】
このような方法では、標識された第２抗体が試料液中に存在するすべての抗原と反応した後、余剰の第２抗体を洗浄して除去する工程が必要である。抗原抗体反応による結合は、一般的に他の化学結合に比べて結合力が弱いため、強く洗浄すると結合した第２抗体まで洗い流してしまう。洗浄が不足する場合、反応量を正しく定量することが出来ず、測定誤差が大きくなってしまう。このため、溶液を容器から吸引、吐出した後、洗浄液を所定の流量で注入し、吸引する工程を例えば４回〜６回程度繰り返す必要がある。
【０００４】
一方、分注器により吸引した溶液中に含まれる磁性粒子を磁石により収集し、溶液のみを廃棄する方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−６２２２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の技術は、抗原抗体反応により容器に固定された磁性粒子を残すように構成されていない。容器に固定された磁性粒子に強い磁力をかけると、収集された他の磁性粒子により抗原抗体反応により固定された磁性粒子が引き剥がされる可能性が高い。
【０００７】
上記問題点を鑑み、本発明は、簡単な構成で、余剰の磁性粒子を除去する効率を向上できる洗浄装置及び洗浄方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、磁性材料からなり、容器に注入された磁性粒子を含む溶液を吸引するノズル（３１）と、ノズル（３１）を磁化させる磁化部（３３）と、磁化部（３３）によりノズルを磁化させることにより、溶液の液面近傍に位置するノズル（３１）の先端側に磁性粒子を収集する収集制御部（５２）と、溶液中において収集された磁性粒子をノズル（３１）に吸引させる吸引制御部（５３）とを備える洗浄装置であることを要旨とする。
【０００９】
本発明の第２の態様に係る洗浄装置は、第１の態様に係る洗浄装置において、吸引制御部（５３）が、磁化部によりノズル（３１）の磁化を停止した状態で、溶液中において収集された磁性粒子をノズルに吸引させることを特徴とする。
【００１０】
本発明の第３の態様は、磁性材料からなるノズルの先端が、容器に注入された磁性粒子を含む溶液の液面近傍となるように、ノズルを移動させるステップと、ノズルを磁化させることにより、溶液中のノズルの先端側に磁性粒子を収集するステップと、溶液中において収集された磁性粒子をノズルに吸引させるステップとを含む洗浄方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡単な構成で、余剰の磁性粒子を除去する効率を向上できる洗浄装置及び洗浄方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施の形態に係る洗浄装置を説明する模式的なブロック図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る洗浄装置に使用する基板を説明する平面図である。
【図３】（ａ）は、本発明の実施の形態に係る洗浄装置が備える磁化部を説明する平面図である。（ｂ）は、（ａ）のＡ−Ａ方向から見た断面図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る洗浄装置が備える吸引ノズル、吸引ヘッド及び磁化部を説明する正面図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る洗浄装置が備える磁化部の変形例を説明する正面図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る洗浄装置が備える磁化部の他の変形例を説明する正面図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る洗浄装置の分注制御部の制御による動作を説明する正面図である。
【図８】図７の部分拡大図である。
【図９】本発明の実施の形態に係る洗浄装置の分注制御部の制御による動作を説明する正面図である。
【図１０】図９の部分拡大図である。
【図１１】本発明の実施の形態に係る洗浄装置による洗浄方法を説明するフローチャートである。
【図１２】本発明の実施の形態に係る洗浄装置の収集制御部の制御による動作を説明する正面図である。
【図１３】図１２の部分拡大図である。
【図１４】本発明の実施の形態に係る洗浄装置の吸引制御部の制御による動作を説明する正面図である。
【図１５】図１４の部分拡大図である。
【図１６】本発明の他の実施の形態に係る洗浄装置に使用する基板を説明する平面図である。
【図１７】図１６のＢ−Ｂ方向から見た断面を示す部分拡大斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付し、重複する説明を省略している。また、以下に示す実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための基板や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成要素の形状、組成、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００１４】
（洗浄装置）
本発明の実施の形態に係る洗浄装置は、例えば、図１に示すように、基板１を保持するステージ２と、ノズルユニット３と、ステージ２及びノズルユニット３を相対的に移動させる駆動部４１と、制御部５とを備える分注装置により構成可能である。
【００１５】
基板１は、例えば、図２に示すように、上面を開口する複数のウェル１１が形成されたマイクロプレートである。基板１は、例えば、透明な樹脂材料からなる。基板１の複数のウェル１１は、試料の分析に用いる液体が所定量注入される容器として使用される。各ウェル１１は、例えば、直径６〜７ｍｍ程度、深さ１０ｍｍ程度の寸法を有する円柱状である。
【００１６】
ステージ２は、例えば矩形平板状であり、上面に、基板１が搭載される載置台２０を備える。載置台２０は、例えば矩形平板状であり、上面において基板１を固定する。ステージ２は、それぞれ上面に固定された試料保持部２１、磁性粒子保持部２２及び洗浄液保持部２３を備える。試料保持部２１は、生体試料を含む試料液ＳＳを保持する。磁性粒子保持部２２は、磁性粒子を含む緩衝液ＳＭを保持する。説明のため図を簡略化しているが、試料保持部２１及び磁性粒子保持部２２は、それぞれ、１つのウェル１１に注入される量に分割されて保持される。洗浄液保持部２３は、洗浄液ＳＣを保持する。
【００１７】
ノズルユニット３は、ウェル１１に注入された液体を吸引する吸引ノズル３１と、吸引ノズル３１を保持する吸引ヘッド３２と、吸引ノズル３１を磁化させる磁化部３３と、ウェル１１に液体を注入する分注ノズル３５と、分注ノズル３５を保持する分注ヘッド３６とを備える。
【００１８】
ノズルユニット３は、それぞれ、吸引ヘッド３２及び分注ヘッド３６を介して、先端が下方を向くように吸引ノズル３１及び分注ノズル３５を保持する。ノズルユニット３は、吸引ノズル３１及び分注ノズル３５を垂直方向に移動させる図示を省略したアクチュエータを備える。ノズルユニット３は、吸引ノズル３１及び分注ノズル３５のうち、使用するノズルを下側の使用位置に移動させ、使用しないノズルを上側の退避位置に移動させる。図１では、吸引ノズル３１が使用位置、分注ノズル３５が退避位置に移動されている例を示している。
【００１９】
吸引ノズル３１は、例えばＳＵＳ４３０等の磁性材料からなり、先端（下端）の外径が例えば１ｍｍ程度の円筒状である。磁化部３３は、ノズルユニット３からの駆動制御により、吸引ノズル３１の磁化の開始、停止及び磁力の制御をする。吸引ノズル３１は、磁化部３３により、延伸方向（上下方向）に磁束が発生し、両端側が互いに異極性となる。
【００２０】
例えば、磁化部３３は、図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、リング状の永久磁石からなる。吸引ノズル３１の他端側（上端側）は、磁化部３３と接触可能な外径を有する。吸引ヘッド３２は、図４に示すように、吸引ノズル３１の上端側と接続される延伸部３２１を備える。延伸部３２１は、吸引ヘッド３２の内部から突出するようにノズルユニット３に駆動されることにより、吸引ヘッド３２に固定された磁化部３３と吸引ノズル３１との間を開閉する。
【００２１】
磁化部３３は、吸引ノズル３１と接触することにより、吸引ノズル３１を磁化する。また、磁化部３３は、吸引ノズル３１の先端からの距離を調整されることにより、吸引ノズル３１の磁力を容易に調整することができる。
【００２２】
また、磁化部３３は、図５に示すように、２つの直方体状の永久磁石３３ａから構成されるようにしてもよい。２つの永久磁石３３ａは、それぞれ、図示を省略したアクチュエータにより、吸引ノズル３１の上端側の外側面との間を開閉される。永久磁石３３ａは、３以上であってもよく、それぞれ、接触面となる吸引ノズル３１の外側面に沿って湾曲するようにしてもよい。
【００２３】
また、磁化部３３は、図６に示すように、コイル３３ｂから構成されてもよい。コイル３３ｂは、吸引ノズル３１の上端側に巻回される。コイル３３ｂは、両端にノズルユニット３から直流電圧Ｅを印加されることにより通電される。吸引ノズル３１は、コイル３３ｂが通電されることにより磁化される。コイル３３ｂは、直流電圧Ｅを調整されることにより、吸引ノズル３１の磁力を調整することができる。
【００２４】
吸引ノズル３１は、吸引ヘッド３２と、チューブからなる流路とを介して吸引ポンプ４３に接続される。吸引ポンプ４３は、制御部５により駆動を制御される。吸引ポンプ４３により吸引ノズル３１の先端から吸引された液体は、廃液Ｗとして流路を介して廃液部２４に排出される。
【００２５】
分注ノズル３５は、分注ヘッド３６と、チューブからなる流路とを介して、分注ポンプ４２に接続される。分注ポンプ４２は、制御部５により駆動を制御される。分注ポンプ４２は、例えばシリンジポンプからなり、液体を所定量吸引し、基板１のウェル１１に吐出する。
【００２６】
駆動部４１は、ステージ２及びノズルユニット３に設置されたアクチュエータからなる。駆動部４１は、例えば、ステージ２を、ステージ２に平行なｘ軸方向に移動させ、ノズルユニット３を、ステージ２に平行でｘ軸方向に直交するｙ軸方向及びステージ２に垂直なｚ軸方向に移動させる。
【００２７】
制御部５は、主として分注ノズル３５に関する動作を制御する分注制御部５１と、主として吸引ノズル３１に関する動作を制御する収集制御部５２と及び吸引制御部５３とを論理構造として有する。制御部５は、本発明の実施の形態に係る洗浄装置が行う動作に必要な制御を行う。
【００２８】
分注制御部５１は、図７及び図８に示すように、分注ノズル３５が、検出対象である抗原７２を含む試料液ＳＳを、試料保持部２１から吸引し、基板１の各ウェル１１に注入するように、ノズルユニット３、駆動部４１及び分注ポンプ４２を制御する。ウェル１１の内壁面には、抗原７２と特異的に結合する抗体７１が予め固定されている。抗体７１は、疎水結合や共有結合などによりウェル１１に固定される。抗原７２は、ブラウン運動により試料液ＳＳ中を運動することで、ウェル１１と接触し、抗原抗体反応により、ウェル１１に固定された抗体７１に特異的に結合する。抗原７２と結合する抗体７１は、アビジン等の物質を介してウェル１１に固定しても良い。
【００２９】
複数のウェル１１に試料液ＳＳが所定量注入された後、分注制御部５１は、図９及び図１０に示すように、分注ノズル３５が、磁性粒子７３を含む緩衝液ＳＭを、磁性粒子保持部２２から吸引し、各ウェル１１に注入するように、ノズルユニット３、駆動部４１及び分注ポンプ４２を制御する。緩衝液ＳＭは、試料液ＳＳが残存するままウェル１１に注入されてもよく、抗体７１に結合した抗原７２を除く試料液ＳＳが除去された後に注入されてもよい。
【００３０】
磁性粒子７３は、表面に、抗原７２と特異的に結合する抗体が固定されている。振とうや磁気攪拌などにより、磁性粒子７３は、抗原抗体反応により、抗体７１と結合した抗原７２と特異的に結合する。
【００３１】
磁性粒子７３は、表面に固定された抗体が、抗体７１を介してウェル１１に固定された抗原７２と結合することにより、抗原７２を標識する。磁性粒子７３に固定された抗体と抗体７１とは、抗原７２と特異的に結合するもので、それぞれが別の部位と結合するものの組み合わせを選択する。また、複数の抗原が表面に発現している膜小胞等を検出する場合は、同じ抗体を組み合わせても良い。磁性粒子７３は、２種類の抗原７２を有する生体試料を標識することができる。磁性粒子７３は、例えば、内部にフェライト等の磁性材料を含む合成樹脂により略球形に形成される。磁性粒子７３の直径は、１μｍ以下であり、さらには、数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度が望ましい。
【００３２】
（洗浄方法）
以下、図１１に示すフローチャートを用いて、本発明の実施の形態に係る洗浄装置が備える収集制御部５２及び吸引制御部５３の処理の一例について説明する。図１２に示すように、各ウェル１１には、初期状態において、例えば試料液ＳＳ及び緩衝液ＳＭからなる溶液Ｔが注入されている。収集制御部５２及び吸引制御部５３は、ウェル１１に固定された抗原７２を標識した磁性粒子７３を除く磁性粒子７３をウェル１１から除去するように、ノズルユニット３、駆動部４１及び吸引ポンプ４３を制御する。
【００３３】
先ず、ステップＳ１において、収集制御部５２は、図１３に示すように、駆動部４１及びノズルユニット３を制御することにより、吸引ノズル３１の先端が、各ウェル１１に注入された溶液Ｔの液面Ｌ近傍となるように吸引ノズル３１を上方から下方に移動させる。吸引ノズル３１の先端は、液面Ｌ近傍であれば溶液Ｔに浸漬されてもよく、液面Ｌの上方に位置してもよい。
【００３４】
次に、ステップＳ２において、収集制御部５２は、ノズルユニット３を制御し、磁化部３３により吸引ノズル３１の磁化を開始する。収集制御部５２は、吸引ノズル３１を磁化させることにより、溶液Ｔ中の吸引ノズル３１の先端側に、ウェル１１に固定された抗原７２を標識した磁性粒子７３を除く磁性粒子７３を収集する。このため、ステップＳ１における「液面Ｌ近傍」とは、吸引ノズル３１の磁力が、ウェル１１に固定された抗原７２を標識した磁性粒子７３に影響を与えず、ウェル１１に固定された抗原７２を標識した磁性粒子７３を除く磁性粒子７３のみを収集する程度の位置を意味する。
【００３５】
次に、ステップＳ３において、各ウェル１１に固定された抗原７２を標識した磁性粒子７３を除く磁性粒子７３をすべて収集するように、吸引ノズル３１を磁化させた状態で一定時間静止させる。
【００３６】
次に、ステップＳ４において、吸引制御部５３は、ノズルユニット３を制御し、磁化部３３により吸引ノズル３１の磁化を停止する。吸引ノズル３１の磁化を停止することにより、吸引ノズル３１の内側に磁性粒子７３等が詰まることを防止することができる。
【００３７】
次に、ステップＳ５において、吸引制御部５３は、吸引ノズル３１の磁化を停止させた状態で、吸引ポンプ４３を駆動することにより、吸引ノズル３１の先端における吸引を開始する。
【００３８】
次に、ステップＳ６において、吸引制御部５３は、図１４に示すように、吸引ノズル３１の磁化を停止させ、吸引ノズル３１による吸引を継続した状態で、駆動部４１及びノズルユニット３を制御し、吸引ノズル３１を下方に移動させる。吸引ノズル３１は、図１５に示すように、吸引制御部５３の制御により、ステップＳ２〜Ｓ３において、溶液Ｔ中に収集された磁性粒子７３を溶液Ｔと共に吸引する。磁性粒子７３の吸引は、磁性粒子７３が溶液Ｔ中に収集された状態を維持しているうちに行われる。
【００３９】
次に、ステップＳ７において、吸引制御部５３は、吸引ポンプ４３の駆動を停止して吸引ノズル３１による吸引を停止させ、ノズルユニット３を制御することにより、吸引ノズル３１を退避位置まで上昇させる。
【００４０】
次に、ステップＳ８において、制御部５は、本発明の実施の形態に係る洗浄装置による磁性粒子７３の洗浄を終了するか否かを判定する。制御部５は、ステップＳ１〜Ｓ７の一連の処理が、予めユーザに設定された回数（例えば１〜２回程度）行われたか否かによりステップＳ８における判定を行う。
【００４１】
制御部５がステップＳ８において終了すると判定しない場合、分注制御部５１は、分注ノズル３５が、洗浄液保持部２３から洗浄液ＳＣを吸引し、各ウェル１１に注入するように、ノズルユニット３、駆動部４１及び分注ポンプ４２を制御し、ステップＳ１に処理を戻す。制御部５は、ステップＳ８において終了すると判定する場合、処理を終了する。
【００４２】
本発明の実施の形態に係る洗浄装置によれば、磁性材料からなる吸引ノズル３１を磁化させることにより、吸引ノズル３１の先端における外径に応じた狭い領域に磁界を発生させることができる。よって、本発明の実施の形態に係る洗浄装置は、ウェル１１に固定された抗原７２を抗原抗体反応により標識した磁性粒子７３を引き剥がすことなく、余剰の磁性粒子７３のみを効率よく短時間で収集、除去することができ、洗浄回数を低減することができる。
【００４３】
また、本発明の実施の形態に係る洗浄装置によれば、吸引ノズル３１を用いて磁性粒子７３を収集するため、磁性粒子７３の収集のための他の複雑な構造が不要であり、構成が簡単である。
【００４４】
また、本発明の実施の形態に係る洗浄装置によれば、ウェル１１に固定された抗体７１又は磁性粒子７３に固定された抗体と抗原７２との結合力（親和性）、溶液Ｔの深さ、ウェル１１の形状等に応じて、吸引ノズル３１の磁力が調整可能である。よって、本発明の実施の形態に係る洗浄装置は、標識に用いられる磁性粒子７３の結合状態が異なる場合であっても、簡単に余剰の磁性粒子７３のみを効率よく収集、除去することができる。
【００４５】
（その他の実施の形態）
上記のように、本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【００４６】
例えば、既に述べた実施の形態において、試料液ＳＳ、緩衝液ＳＭ等を注入する容器は、複数のウェル１１を有する基板１に限るものでなく、例えば、図１６及び図１７に示すように、上面にマット１５が配置されたディスク１２である基板１ａを容器として使用するようにしてもよい。
【００４７】
ディスク１２は、例えば、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）等の光ディスクと同等の寸法を有する。ディスク１２は、それぞれ、上面において内周側から外周側にスパイラル状に形成されることにより、半径方向に交互に形成された凹状のグルーブ１３及び凸状のランド１４を有する。マット１５は、例えばシリコーンゴム等からなる平板状であり、それぞれ上面から下面に貫通する複数の貫通孔１６を有する。複数の貫通孔１６は、それぞれ下端がディスク１２の上面に塞がれることにより、ウェル１７を構成する。グルーブ１３又はランド１４にのみ抗体が固定される場合、先ず、固定された抗体と検出対象である抗原とを反応させ、反応した抗原を磁性粒子により修飾する。この場合も、本発明の実施の形態に係る洗浄装置により、余剰の磁性粒子を効率よく除去することができる。磁性粒子により修飾された抗原は、レーザ光を用いた光ピックアップで高精度に検出可能となる。
【００４８】
また、既に述べた実施の形態において、洗浄液ＳＣは、分注ポンプ４２と分注ノズル３５とを接続する流路の間に、制御部５により各弁の駆動を制御される三方弁の２つの弁を接続し、残りの弁に接続された流路から吸引されるようにしてもよい。
【００４９】
また、既に述べた実施の形態において、吸引ノズル３１及び分注ノズル３５は、それぞれ、基板１のウェル１１の配列に応じて、複数配列されるようにしてもよい。この場合、ノズルユニット３は、複数配列された吸引ノズル３１及び分注ノズル３５を、ｚ軸方向を回転軸として回転させるようにしてもよい。
【００５０】
また、既に述べた実施の形態において、分注ノズル３５を省略し、吸引ノズル３１により、分注ノズル３５の動作を行うようにしてもよい。この場合、吸引ノズル３１に、分注ポンプ４２や三方弁を接続するようにしてもよい。
【００５１】
また、既に述べた実施の形態において、検出対象である抗原と、磁性粒子７３に固定された抗体との組み合わせは、他の組み合わせであってもよい。特異的に結合する組み合わせは、例えば、リガンドと受容体（タンパク質、レクチン、ホルモン等）との組み合わせ、互いに相補的な塩基配列を有する核酸の組み合わせ等であってもよい。
【００５２】
その他、上述の構成を相互に応用した構成等、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【符号の説明】
【００５３】
１，１ａ  基板
２  ステージ
３  ノズルユニット
５  制御部
１１，１７  ウェル（容器）
２０  載置台
２１  試料保持部
２２  磁性粒子保持部
２３  洗浄液保持部
２４  廃液部
３１  吸引ノズル（ノズル）
３２  吸引ヘッド
３３  磁化部
３３ａ  永久磁石
３３ｂ  コイル
３５  分注ノズル
３６  分注ヘッド
４１  駆動部
４２  分注ポンプ
４３  吸引ポンプ
５１  分注制御部
５２  収集制御部
５３  吸引制御部
７１  抗体
７２  抗原
７３  磁性粒子
【図１】
2015125032.tif 000003
【図２】
2015125032.tif 000004
【図３】
2015125032.tif 000005
【図４】
2015125032.tif 000006
【図５】
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【図６】
2015125032.tif 000008
【図７】
2015125032.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015125032.tif 000012
【図１１】
2015125032.tif 000013
【図１２】
2015125032.tif 000014
【図１３】
2015125032.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
2015125032.tif 000017
【図１６】
2015125032.tif 000018
【図１７】
2015125032.tif 000019