(57)【要約】【課題】    本発明の目的は、アクアポリン、特にアクアポリン３の産生を促進し、皮膚のみずみずしさを増す製剤を得ることである。【解決手段】  ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニンの混合物はアクアポリン、特にアクアポリン３の産生を促進することがわかり、皮膚のみずみずしさを増す製剤を得ることがでいることがわかった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニンを有効成分とするアクアポリン３産生促進剤。
【請求項２】
ピロリドンカルボン酸またはその塩を２０〜５０重量部、Ｌ−アルギニンを１０〜２０重量部、Ｌ−アスパラギン酸を５〜１５重量部、グリシンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−アラニンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−セリンを１．０〜３．０重量部、Ｌ−バリンを１．０〜２．０重量部、Ｌ−プロリンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−スレオニンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−イソロイシンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−ヒスチジンを０．１〜０．５重量部、Ｌ−フェニルアラニンを０．１〜０．５重量部配合した請求項１のアクアポリン３産生促進剤。
【請求項３】
さらに乳酸ナトリウムを配合した請求項１乃至請求項２のアクアポリン３産生促進剤。
【請求項４】
ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニンの合計量を１０重量部としたときに、乳酸ナトリウムの配合量が１〜５である請求項３のアクアポリン３産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクアポリン特にアクアポリン３の産生を促進し、皮膚を健全に保つ製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクアポリンとは細胞膜に存在する細孔を持ったタンパク質であり、水分子を選択的に透過させるが、イオンや他の物質は透過させない水チャネル（water channel）と呼ばれている。アクアポリンは普通4つの同一サブユニットで構成されており、それぞれのモノマーが水チャネルとして働いている。水分子はこのチャネルの細孔を通過する。この水チャネルが働くことで水の細胞膜透過性が上がっている。人間の多くの細胞、ある種のバクテリア、さらに植物のような有機生命体にとってこのような水分子を輸送するシステムが不可欠である。
ヒトでは、１３種類のアクアポリン（０〜１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてアクアポリン３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。
【０００３】
皮膚にはアクアポリンの中でもアクアポリン３が存在することが知られており、アクアポリン３の欠損マウスでは皮膚の水分量や弾力が顕著に低下することが報告されている。又、アクアポリン３欠損マウスでは傷の治りが遅延することも報告されている。このようにアクアポリンは、皮膚の水分や弾力を恒常的に維持することに不可欠であり、肌荒れ等の創傷を負った場合の回復能にも大きな影響を及ぼしていることからアクアポリンの産生を増強することで、様々な皮膚トラブルを改善できると考えられてきた。
天然物ではサフランの抽出物、ローヤルゼリー抽出物、ブッチャーズブルーム抽出物等がアクアポリン３産生促進剤として知られている。（特許文献１〜３）
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３４３８８２号公報
【特許文献２】特開２００９−１８４９５５号公報
【特許文献３】特開２００９−２３５０４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はアクアポリン、特にアクアポリン３の産生を促進し、皮膚を健全に保つ製剤を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、ピロリドンカルボン酸またはその塩、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−フェニルアラニンの混合物が本発明の課題を解決する手段として有効なことがわかった。
さらには以下の割合がアクアポリン３の産生を促進する効果が高いこともわかった。
ピロリドンカルボン酸またはその塩を２０〜５０重量部、Ｌ−アルギニンを１０〜２０重量部、Ｌ−アスパラギン酸を５〜１５重量部、グリシンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−アラニンを２．０〜５．０重量部、Ｌ−セリンを１．０〜３．０重量部、Ｌ−バリンを１．０〜２．０重量部、Ｌ−プロリンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−スレオニンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−イソロイシンを０．４〜１．２重量部、Ｌ−ヒスチジンを０．１〜０．５重量部、Ｌ−フェニルアラニンを０．１〜０．５重量。
さらに乳酸ナトリウムを配合することによって有効であることもわかった。
【０００７】
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
上記のアミノ酸の混合物を皮膚外用剤に０．０１〜６０重量％、好ましくは０．１〜５０重量％配合する。
【０００８】
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【０００９】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１０】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１１】
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【実施例】
【００１２】
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
実施例
ピロリドンカルボン酸ナトリウム            ３７．５重量部
ピロリドンカルボン酸                      １０．９重量部
Ｌ−アルギニン                            ２０．０重量部
Ｌ−アスパラギン酸                        １３．０重量部
グリシン                                    ３．２重量部
Ｌ−アラニン                                ３．０重量部
Ｌ−セリン                                  ２．０重量部
Ｌ−バリン                                  １．６重量部
Ｌ−プロリン                                １．０重量部
Ｌ−スレオニン                              １．０重量部
Ｌ−イソロイシン                            １．０重量部
Ｌ−ヒスチジン                              ０．４重量部
Ｌ−フェニルアラニン                        ０．４重量部
乳酸ナトリウム                            ３０．０重量部
精製水                                  １２５．０重量部
以上の原料を充分に撹拌して得られる水溶液。
【００１３】
確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
【００１４】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００１５】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
【００１６】
＜使用プライマー＞
ＡＱＰ３：フォワードプライマーがＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＡＴＣＴＧ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）の塩基配列とのセット
【００１７】
実施例を１．０％作用させて実験した結果を図１に示す。
結果を見ると、実施例は１．０％で作用させた場合、アクアポリン３の遺伝子発現量を約３．８倍に増加させることがわかった。
【００１８】
また実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、アクアポリン、特にアクアポリン３の産生を促進し、みずみずしい皮膚を得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例の終濃度１．０％での確認試験の結果で、アクアポリン３の遺伝子発現量変化を示す図である。  縦軸は実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図１】
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【配列表】
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