(57)【要約】【課題】  スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有し、かつ、様々な用途に加工性の優れたアプタマーを提供する。また、Ｃｒｙｊ２結合性アプタマーを含有するＣｒｙｊ２検出試薬、検出キット、除去材、および抑制剤を提供する。【解決手段】  スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマー。
【請求項２】
（ａ）５’−ＴＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２）、
５’−ＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＡ−３’（配列番号４）、
５’−ＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡ−３’（配列番号５）、
５’−ＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号６）、
５’−ＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＧＴ−３’（配列番号７）、
５’−ＧＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号８）、
５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号９）、
５’−ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＡＴＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）、
５’−ＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１１）、
５’−ＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＧＴ−３’（配列番号１２）、
５’−ＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴ−３’（配列番号１３）、
５’−ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）、
５’−ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１５）、
５’−ＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１６）、
５’−ＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１７）、
５’−ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１８）、
５’−ＡＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣ−３’（配列番号１９）、
５’−ＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＧ−３’（配列番号２０）、
５’−ＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＴ−３’（配列番号２１）、
５’−ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２２）、
５’−ＧＧＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２３）、
５’−ＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号２４）、
５’−ＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２５）、
５’−ＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２６）、
５’−ＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２７）、
５’−ＴＴＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＡ−３’（配列番号２８）、
５’−ＣＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号２９）、
５’−ＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号３０）、
５’−ＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３１）、
５’−ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴ−３’（配列番号３２）、
５’−ＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号３３）、
５’−ＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧ−３’（配列番号３４）、
５’−ＧＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴ−３’（配列番号３５）、および、
５’−ＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号３６）
からなる群から選択される塩基配列、または
（ｂ）配列番号１〜３６からなる群から選択される塩基配列において、１〜５個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列
を含む、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
一般式：
５’−ＡＧＧＧＡＡＡ−（Ｇ）ｎ−ＫＧＮＧＧＭＣ−３’
（ここで、ｎは３または４であり、Ｋは、ＧまたはＴであり、Ｍは、ＡまたはＣであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである）
に示される塩基配列を含み、全長が１８〜４５塩基である、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項４】
配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択される塩基配列を含む、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項５】
前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項６】
３’および／または５’末端が修飾されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸アプタマーから選択される１種以上の核酸アプタマーが２以上連結されてなる、核酸アプタマー多量体。
【請求項８】
前記核酸アプタマーがリンカーを介して連結されてなる、請求項７に記載の核酸アプタマー多量体。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、または、請求項７もしくは８に記載の核酸アプタマー多量体を含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、または、請求項７もしくは８に記載の核酸アプタマー多量体を含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出キット。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、または、請求項７もしくは８に記載の核酸アプタマー多量体を含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、または、請求項７もしくは８に記載の核酸アプタマー多量体を含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々なアレルギー性疾患が社会的に大きな問題になっている。これらのアレルギー性疾患は、花粉、ダニの死骸や糞、カビの胞子、ハウスダストなどから発生するアレルゲンを原因とするものであることが知られている。
【０００３】
日本では、春先の花粉症が、特に問題となっている。特に、スギ花粉症の有病率は全国平均で２６．５％に達し（非特許文献１）、スギ花粉症に係る直接・間接医療費は年間総額２，８６０億円になるとの推計がある（非特許文献２）。そのため、スギ花粉症対策は必須であり、スギ花粉症の予防と治療に向けて、様々な取組みが実施されている。
【０００４】
現在、花粉症の治療としては、抗ヒスタミン剤やステロイド剤の投与が主に行われている。しかし、これらの薬剤の投与は、症状の軽減を目的としたものであり、対症療法にすぎないため、花粉の飛散が終了するまで投薬を継続する必要がある。また、抗ヒスタミン剤の投与は、眠気の原因となり、ステロイド剤の連続投与も、副作用をもたらす可能性がある。一方、近年では、根本治療として、減感作療法も行われている。しかし、減感作療法においては、長期にわたる通院が必要であること、アナフィラキシーショックの危険性があることなどから、一般的な治療方法として定着していない。
【０００５】
花粉症の予防と治療には、花粉との接触を低減することが最も有効である。屋外に飛散する花粉については、マスクやメガネなどを着用し、花粉との接触を回避することが主な対策として行われている。しかし、マスクやメガネを常時着用することは、日常生活において大きな負担となる。さらに、マスクやメガネに吸着した花粉が屋内に持ち込まれ、再び飛散するという問題がある。花粉は、窓や換気口を閉めていても、衣服や洗濯物に付着して屋内に持ち込まれ、花粉症症状を引き起こすことが知られている（非特許文献３）。屋内に流入した花粉については、掃除機や空気清浄機による吸引除去が主な対策として行われている。しかし、近年の住宅は気密性が高いため、持ち込まれた花粉は屋内に蓄積しやすく、屋内の生活環境から花粉を十分に除去することは困難である。
【０００６】
近年では、花粉から放出されるアレルゲンのアレルゲン性を低減または除去するための方法が提案されている。例えば、ペクチンと核酸とを含む組成物にアレルゲン物質を吸着固定する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、この方法では、花粉アレルゲン以外にも種々の物質を吸着するため、極めて効率が悪い。花粉アレルゲンのみを特異的に補足する方法としては、例えば、花粉アレルゲンを免役したダチョウ由来の卵から得た抗体を用いて花粉アレルゲンのアレルゲン性を抑制する方法（特許文献２）や、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１に対して結合性のペプチドを用いてアレルゲンを捕集する方法（特許文献３）が提案されている。しかし、抗体を作製する場合には、多大な時間的・経済的コストがかかるという問題がある。また、結合性ペプチドを取得する場合には、良質なライブラリーの確保やスクリーニング工程における技術的困難性などが問題となる。さらに、抗体と結合性ペプチドのいずれも、乾燥や高温などの環境要因によって変性しやすいため、使用できる条件が限られるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４８５１１８５号公報
【特許文献２】特開２０１３−１６３６６２号公報
【特許文献３】特開２０１０−０７０４７７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｂａ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｎａｋａｅ，Ｋ．，  Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．８，  ｐｐ．２００１−２０１２，  ２００８
【非特許文献２】スギ花粉症克服に向けた総合研究（第１期平成９−１１年度）成果報告書、２０００年、科学技術庁研究開発局
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ａｌｌｅｒｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．１８（５），  ｐｐ．３８２−３８８，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
花粉症は、鼻粘膜や眼結膜に付着した花粉が水分を吸収、膨潤して破裂し、花粉内部からアレルゲンが放出されることによって起こる。アレルゲンが鼻などの粘膜に侵入すると、粘膜中に存在する樹状細胞などの抗原提示細胞に取り込まれ、断片化されたアレルゲンは、ＭＨＣ分子を介して抗原として細胞表面に提示される。抗原提示を認識したナイーブヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は活性化され、Ｔｈ２細胞へと分化し、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４などのインターロイキンにより、Ｂ細胞がアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生細胞へと分化する。産生されたアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は、肥満細胞や好塩基球の表面に存在するＩｇＥレセプターに結合する。その後、再びアレルゲンが侵入すると、アレルゲンがアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と結合し、ＩｇＥレセプターが凝集することにより、ヒスタミン、ロイコトリエンなどの物質が肥満細胞中の顆粒内から分泌され（脱顆粒反応）、アレルギー症状が引き起こされる。
【００１０】
スギ花粉から放出される主要なアレルゲンとしては、分子量４５〜５０ｋＤａのタンパク質、Ｓｕｇｉ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＢＰ）として単離精製されたＣｒｙｊ１と（Ｙａｓｕｅｄａ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．７１，  ｐｐ．７７−８６，  １９８３）、Ｃｒｙｊ１の精製過程で単離された、Ｃｒｙｊ１とは異なる抗原性を有する分子量３７ｋＤａのタンパク質であるＣｒｙｊ２が知られている（Ｔａｎｉａｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．２３９，  ｐｐ．３２９−３３２，  １９８８；  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ｖｏｌ．４５，  ｐｐ．３０９−３１２，  １９９０）。スギ花粉症患者の多くは、Ｃｒｙｊ１とＣｒｙｊ２のどちらに対しても反応性が高く、１４５名中１３４名（９２．４％）の血清において、Ｃｒｙｊ１とＣｒｙｊ２の両方に反応がみられ、６名（４．１％）がＣｒｙｊ１のみに、５名（３．４％）がＣｒｙｊ２のみに反応がみられた（１９９３年第４３回日本アレルギー学会、橋本ら、日獣大、予研、国立相模原病院、林原生化研）。このことから、Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２は、日本スギ花粉症の予防および治療において重要な分子であると考えられている。
【００１１】
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２のアレルゲン性を効率よく低減または除去するためになされたものであり、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有し、安定性が高く、かつ、様々な用途に加工性の優れた核酸アプタマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究の結果、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーを得ることに成功した。
【００１３】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーを提供するものである。
【００１４】
前記核酸アプタマーは、（ａ）５’−ＴＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号１）、５’−ＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２）、５’−ＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号３）、５’−ＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＡ−３’（配列番号４）、５’−ＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡ−３’（配列番号５）、５’−ＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号６）、５’−ＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＧＴ−３’（配列番号７）、５’−ＧＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号８）、５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号９）、５’−ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＡＴＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）、５’−ＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１１）、５’−ＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＧＴ−３’（配列番号１２）、５’−ＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＴ−３’（配列番号１３）、５’−ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１４）、５’−ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１５）、５’−ＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１６）、５’−ＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１７）、５’−ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１８）、５’−ＡＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣ−３’（配列番号１９）、５’−ＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＧ−３’（配列番号２０）、５’−ＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＴ−３’（配列番号２１）、５’−ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２２）、５’−ＧＧＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２３）、５’−ＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧ−３’（配列番号２４）、５’−ＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２５）、５’−ＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２６）、５’−ＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２７）、５’−ＴＴＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＡ−３’（配列番号２８）、５’−ＣＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号２９）、５’−ＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧ−３’（配列番号３０）、５’−ＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号３１）、５’−ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴ−３’（配列番号３２）、５’−ＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号３３）、５’−ＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧ−３’（配列番号３４）、５’−ＧＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴ−３’（配列番号３５）、および、５’−ＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号３６）からなる群から選択される塩基配列、または、（ｂ）配列番号１〜３６からなる群から選択される塩基配列において、１〜５個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列を含むことが好ましい。
【００１５】
または、前記核酸アプタマーは、一般式：５’−ＡＧＧＧＡＡＡ−（Ｇ）ｎ−ＫＧＮＧＧＭＣ−３’（ここで、ｎは３または４であり、Ｋは、ＧまたはＴであり、Ｍは、ＡまたはＣであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである）に示される塩基配列を含み、全長が１８〜４５塩基であることが好ましい。
【００１６】
または、前記核酸アプタマーは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択される塩基配列を含むことが好ましい。
【００１７】
前記核酸アプタマーは、ＤＮＡアプタマーであることが好ましい。
【００１８】
前記核酸アプタマーは、３’および／または５’末端が修飾されていることが好ましい。
【００１９】
前記核酸アプタマーを２以上連結して、核酸アプタマー多量体とすることが好ましい。
【００２０】
前記核酸アプタマーは、リンカーを介して連結することにより多量体とすることが好ましい。
【００２１】
また、本発明は、別の実施形態によれば、上記核酸アプタマーを含有するスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬、検出キット、除去材、および抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーは、既存の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等の結合能を有し、既存の抗Ｃｒｙｊ２抗体の代替物としての使用が可能である。また、核酸を原料としているため、（１）化学合成が容易であり、安価に大量に調製することが可能である、（２）アプタマー自身の抗原性が低く、安全性が高い、（３）室温条件下でも安定性が高く、生活環境において安定したＣｒｙｊ２結合能を確保することができる、といった点で抗体よりも優れている。
【００２３】
また、本発明に係るスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーを用いることにより、生活環境において安定して使用可能なＣｒｙｊ２検出試薬、検出キット、除去材、および抑制剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＳＥＬＥＸ法による各スクリーニングラウンドにおける、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有するＤＮＡアプタマーのドットブロットの結果を示す図である。
【図２】Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーＣＪ２−０１〜ＣＪ２−３６の配列整列を示す図である。
【図３】Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーＣＪ２−０１〜ＣＪ２−３６の配列解析結果を示す分子系統樹である。
【図４】Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーＣＪ２−０１＿ｐ〜ＣＪ２−３６＿ｐの、Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２に対する結合能を評価したドットブロットの結果を示す図である。
【図５】Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーによりＣｒｙｊ２を染色した、破裂スギ花粉の顕微鏡写真である。
【図６】デンプン粒を染色した破裂スギ花粉の顕微鏡写真である。
【図７】破裂スギ花粉の構造を示した図である。
【図８】Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーＣＪ２−０６＿ｐのＣｒｙｊ２に対する結合能と、市販の抗Ｃｒｙｊ２抗体のＣｒｙｊ２に対する結合能とを比較したドットブロットの結果を示す図である。
【図９】ビオチン標識ＣＪ２−０６のＣｒｙｊ２に対する結合能を評価したドットブロットの結果を示す図である。
【図１０】酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ法による、ビオチン標識ＣＪ２−０６のＣｒｙｊ２に対する飽和結合実験の結果を示したグラフである。
【図１１】図１０の結果に基づくスキャッチャード・プロット解析を示すグラフである。
【図１２】ビオチン標識ＣＪ２−０６によりＣｒｙｊ２を染色した、破裂スギ花粉の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２６】
本発明は、第一実施形態によれば、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーである。以降、本明細書では、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーを「Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマー」と記載する。
【００２７】
「核酸アプタマー」とは、高い親和性で標的分子と特異的に結合できるオリゴ核酸を意味する。オリゴ核酸の長さは、特に限定されないが、好ましくは１５〜１００塩基であり、より好ましくは１８〜４０塩基であり得る。核酸アプタマーは、短いものの方が容易かつ安価に製造でき、安定性も高いため、好ましい。しかし、核酸アプタマーの長さが１５塩基より短いと、Ｃｒｙｊ２に対する結合能を維持できなくなる場合がある。
【００２８】
アプタマーを構成する核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などであってよく、部分的にこれらの核酸を混合したものであってもよい。各核酸は、必要に応じてメチル基などにより修飾されていてもよい。なお、本明細書では、アプタマーを構成する核酸をＤＮＡとして説明するが、適宜、ＲＮＡなどの他の核酸に読み替えることができ、本発明はこれらの核酸をも包含する。また、その際、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は適宜置換され得る。
【００２９】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、好ましくは、配列番号１〜３６からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を含む。上記核酸アプタマーは、市販の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等またはそれ以上の、Ｃｒｙｊ２に対する高い結合親和性を有する。
【００３０】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、好ましくは、配列番号１〜３６からなる群から選択されるいずれかの塩基配列において、１〜５個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列を含む。一般に、標的分子に対する高い結合親和性を有する核酸アプタマーとして取得された配列については、変異を導入し、さらなる塩基配列の最適化を行うことが可能である。すなわち、配列番号１〜３６のいずれかの塩基配列を含むＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーについて、１〜数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加することにより最適化された核酸アプタマーも、市販の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等またはそれ以上の、Ｃｒｙｊ２に対する高い結合親和性を有することができる。核酸アプタマーの最適化は、遺伝的アルゴリズムに基づいて、例えば、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ法（Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．３３，  Ｎｏ．１２，  ｅ１０８，  ２００５）により行うことができる。最適化により置換、欠失、挿入または付加される塩基の数は、特に限定されないが、好ましくは５塩基以内、４塩基以内、３塩基以内であり、特に好ましくは２塩基または１塩基である。
【００３１】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、特に好ましくは、一般式：５’−ＡＧＧＧＡＡＡ−（Ｇ）ｎ−ＫＧＮＧＧＭＣ−３’（ここで、ｎは３または４であり、Ｋは、ＧまたはＴであり、Ｍは、ＡまたはＣであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである）に示される塩基配列を含み、全長が１８〜４５塩基である。上記核酸アプタマーは、市販の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等またはそれ以上の、Ｃｒｙｊ２に対する高い結合親和性および結合特異性を有する。
【００３２】
上記核酸アプタマーは、最も好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択されるいずれかの塩基配列を含む。上記核酸アプタマーは、市販の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等またはそれ以上の、Ｃｒｙｊ２に対する高い結合親和性および結合特異性を有する。
【００３３】
なお、本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、上記特定の塩基配列のみからなる核酸に限定されない。すなわち、上記特定の塩基配列を含み、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する限り、任意の塩基が付加された核酸であってよい。また、アプタマーを構成する核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどであってよく、部分的にこれらの核酸を混合したものであってもよい。また、各核酸は、必要に応じてメチル基などにより修飾されていてもよい。
【００３４】
本発明に係る核酸アプタマーは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法により取得することができる（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２４９，  ｐｐ．５０５−５１０，  １９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列を含む核酸ライブラリーから、標的分子と結合する核酸を選択し増幅するサイクルを複数回、例えば１〜２０回繰り返すことによって、標的分子と高い親和性で結合する核酸のみを選別する方法である。すなわち、本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２を標的分子としてＳＥＬＥＸ法を実施することにより取得することができる。
【００３５】
また、本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１を標的分子としてＳＥＬＥＸ法を実施することによっても取得することができる。Ｃｒｙｊ１を標的分子として取得された核酸アプタマーは、Ｃｒｙｊ１とＣｒｙｊ２の両方に対して高い結合能を有する。
【００３６】
上記標的分子として使用されるＣｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２には、市販の精製Ｃｒｙｊ１および精製Ｃｒｙｊ２の他、種々のスギ品種由来のイソ型、ならびにその断片および誘導体が含まれる。
【００３７】
ＳＥＬＥＸ法により取得した核酸アプタマーは、その塩基配列を決定した後、従来公知の種々の合成法によって調製することができる。例えば、核酸アプタマーは、化学合成法によって調製することができる。化学合成法は、同一の核酸アプタマーを大量に調製できる点で好ましい。
【００３８】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、好ましくはＤＮＡアプタマーである。ＤＮＡアプタマーは、室温で安定であるため、生活環境下でも安定した機能を確保することができる点で好ましい。
【００３９】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、３’末端と５’末端のいずれか一方またはそれらの両方が修飾されていてもよい。生活環境下での安定性を改善するためである。一般に、核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性は、核酸アプタマー立体構造によりもたらされるので、その立体構造が維持される限り、核酸アプタマーの末端に他の塩基配列や修飾物質が付加されていても、核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性は維持されることが周知である。末端修飾の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、フォスファチジルコリン、抗アレルギー薬などが挙げられる。また、上記修飾は、スペーサー配列を介して核酸アプタマーに対して結合されてもよい。スペーサー配列は任意の長さであり得るが、好ましくは３〜２０塩基であり得る。
【００４０】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、複数個を連結することにより多量体化されていてもよい。Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマー多量体は、同一のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーが複数個連結されたものであってもよいし、異なるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを複数個連結されたものであってもよい。核酸アプタマーを複数連結した多量体は、単一の核酸アプタマーよりも高い結合能を有するため、好ましい。連結されるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの数は、特に限定されないが、好ましくは２〜４個であり得る。
【００４１】
核酸アプタマー多量体は、公知の方法によって調製することができる。例えば、核酸アプタマー多量体は、アビジン／ビオチン結合を利用して調製することが可能である。核酸アプタマー多量体は、核酸アプタマー同士が直接連結されたものであってもよいし、リンカーを介して結合されたものであってもよい。リンカーは、任意の長さであり得るが、好ましくは５〜２０塩基であり得る。また、リンカーを構成する塩基は、特に限定されないが、好ましくはチミン（Ｔ）であり得る。
【００４２】
本実施形態のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して、既存の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等の結合親和性を有する。そのため、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２の検出、除去、抑制などの用途に有用である。
【００４３】
本発明は、第二実施形態によれば、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬である。本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬は、任意の標識物質を結合させたＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを含有する。ここでいう任意の標識物質とは、当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質であってよく、例えば、ビオチン、蛍光色素、発光物質、放射性同位元素、酵素、金コロイド、量子ドットなどが挙げられる。本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬は、さらにＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを担持させる任意の担体を含んでいてもよい。
【００４４】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬は、水性溶液、スプレー剤、エアゾール、ペースト、粉剤など、任意の剤型として製造することができる。また、所望により、緩衝剤、安定化剤、消臭剤、防カビ剤、殺菌剤などを添加してもよい。
【００４５】
Ｃｒｙｊ２検出試薬中に含有されるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの量は、その剤型、使用方法、使用場所などに応じて適宜決定することができるが、１ｎＭ〜２０μＭの濃度とすることが好ましい。
【００４６】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬は、例えば、酵素標識されたＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーや蛍光標識されたＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの水溶液として提供され得る。
【００４７】
本発明は、第三実施形態によれば、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出キットである。本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出キットは、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーと、検出に必要な任意の追加の試薬とを備える。例えば、Ｃｒｙｊ２検出キットは、抗Ｃｒｙｊ２抗体の代替として本発明に係るＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを含有する、イムノクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色、ドットブロットおよびウエスタンブロットなどのキットとして提供することができる。スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出キットは、さらに必要に応じて、試料を採取するための器具、アレルゲン検出反応に用いる容器、緩衝液、標準物質、使用説明書などを備えてもよい。
【００４８】
第二実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出試薬および第三実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２検出キットは、生活環境中に存在するスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２の検出に有用である。
【００４９】
本発明は、第四実施形態によれば、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材である。ここで、「除去」とは、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２をＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーに結合吸着させて、Ｃｒｙｊ２そのものを捕集して除去することのみならず、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを結合させることによってスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２を変性失活させて、Ｃｒｙｊ２のアレルゲン活性を除去することをも含む。その意味で、本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材は、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２変性剤、または、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２失活剤であり得る。
【００５０】
本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材は、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーと、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを担持させる担体とを含有する。Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを担持させる担体は、任意の担体であってよい。
【００５１】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材は、例えば洗浄剤やスプレー剤などの液剤として製造することができる。例えば、洗濯用、食器用、建物・車両用の洗剤、口腔洗浄剤、点鼻剤、目薬、化粧料などとして製品化される。また、噴霧剤として、生活環境（空間、壁、布団、衣服など）に付着したＣｒｙｊ２の除去に応用できる。
【００５２】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材を液剤として製造する場合には、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを、任意の液状担体と配合することにより製造される。また、所望により、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、消臭剤、防カビ剤、殺菌剤、香料などを添加してもよい。
【００５３】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材は、例えばフィルターやマスクなどの固形材として製造することができる。製品化の例としては、空気清浄機、扇風機、エアーコンディショナーなどの空調設備用のフィルターが挙げられる。
【００５４】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材を固形材として製造する場合には、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを、任意の固相担体に担持させることにより製造される。Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを担持させる固相担体としては、特に限定されないが、繊維が好ましい。繊維は、合成繊維または天然繊維であってよく、例えばナイロン、ポリエステル、ポリアミド、ポリアクリル、ポリプロピレン、レーヨン、木綿、木材パルプ、羊毛などが挙げられる。Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを固相担体に担持させる方法は、特に限定されないが、例えば浸漬処理、スプレー処理、吸尽加工などが挙げられる。
【００５５】
Ｃｒｙｊ２除去材中に含有されるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの量は、その形態に応じて適宜決定することができる。例えば、液剤として調製されるＣｒｙｊ２除去材に対しては、１ｎＭ〜２０μＭの範囲内で添加することが好ましい。また、固形材として調製されるＣｒｙｊ２除去材に対しては、５０μｇ／ｍ２〜５０ｍｇ／ｍ２の範囲内で担持させることが好ましい。
【００５６】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２除去材は、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２を捕捉吸着することにより、または、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２を変性失活させることにより、生活環境からスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２を効果的に除去するために有用である。
【００５７】
本発明は、第五実施形態によれば、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを含有する、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２抑制剤である。アレルゲン性の抑制について、抗体を標的としたＤＮＡアプタマーにより、抗原と抗体の結合を阻害したとの報告があることから（Ｌａｋａｍｐ，ＡＳ．  ａｎｄ  Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ，ＭＭ．，  Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ：７２０７９８，  ２０１１）、抗原に結合するＤＮＡアプタマーも同様に抗原と抗体の結合を阻害することが可能であることが理解される。すなわち、本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２抑制剤は、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーがスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２とＣｒｙｊ２特異的ＩｇＥとの結合を直接的または間接的に阻害することにより、Ｃｒｙｊ２のアレルゲン性を抑制するものである。
【００５８】
本実施形態によるスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２抑制剤は、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを有効成分として含有する。Ｃｒｙｊ２抑制剤は、有効成分のみから構成されていてもよいが、さらに任意の成分として、担体を含んでいてもよい。担体は、公知の医薬品用担体などであってよい。
【００５９】
Ｃｒｙｊ２抑制剤を製造するためには、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを必要に応じて上記公知の担体と組み合わせて製剤化すればよい。Ｃｒｙｊ２抑制剤において、有効成分であるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、各形態に応じた範囲で適切な投与量となるように含有されれば良い。Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、その投与量が、通常成人１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上となるように、Ｃｒｙｊ２抑制剤における含有量を調製することが好ましいが、かかる範囲には限定されず、患者の症状、年齢、性別などにより適宜調整されることが可能である。投与量の上限は、１日当たり、１ｍｇ／ｋｇ（体重）以下が好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）以下がより好ましい。
【００６０】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２抑制剤は、医薬品として製造することができる。この場合には、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを、薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより製造される。また、所望により、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などを加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤とすることができる。
【００６１】
Ｃｒｙｊ２抑制剤を経口用医薬品とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが利用される。また経口剤の調製にあたっては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、例えば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。
【００６２】
Ｃｒｙｊ２抑制剤を非経口用医薬品とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
【００６３】
さらに上記Ｃｒｙｊ２抑制剤には、所望により、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの薬学的に許容される添加物や他の治療薬を含有させることができる。
【００６４】
また、Ｃｒｙｊ２抑制剤の製剤化に際しては、安定化剤を配合することが好ましい。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。
【００６５】
製剤中に含有されるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの量は、各製剤の形態に応じて、前述した投与量となる量であればよい。
【００６６】
本実施形態のスギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２抑制剤は、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２とＣｒｙｊ２特異的ＩｇＥとの結合を直接的または間接的に阻害することにより、脱顆粒反応を抑制し、花粉症症状を抑制するために有用である。
【実施例】
【００６７】
以下に実施例を挙げ、本発明について更に説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００６８】
＜実施例１：ＳＥＬＥＸ法によるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーのスクリーニング＞
スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法により作製した。２４ｍｅｒのランダム化領域（Ｎ２４）と、両端に各３ｍｅｒのリンカー（ＴＴＴ）により連結された各１８ｍｅｒのプライマー領域を含む、一本鎖ＤＮＡライブラリー（５’−ＴＣＧＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴ−Ｎ２４−ＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＴＡ−３’：配列番号３７）を初期ライブラリーとして用いた（約１×１０１４クローン）。この一本鎖ＤＮＡライブラリーに、フォワード（Ｆｗ）プライマー（５’−ＴＣＧＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＣＴＡＣ−３’：配列番号３８）の相補鎖と、ビオチン標識リバース（Ｒｖ）プライマー（５’−ＴＡＣＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡＴＴＧＡＧ−３’：配列番号３９）とを混合し、９５℃で１０分間加熱し、３０分かけて２５℃まで冷却することにより、ＤＮＡ構造のフォールディングと、プライマー領域のブロックと、ライブラリーのビオチン標識を行った。ＤＮＡライブラリーは、その後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）（ＴＢＳＴ）に溶解した。
【００６９】
標的タンパク質として、精製スギ花粉抗原Ｃｒｙｊ１（林原生物化学研究所社製）または精製スギ花粉抗原Ｃｒｙｊ２（林原生物化学研究所社製）をニトロセルロース膜上に固定した後（１μｇ／スポット）、４％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含有するＴＢＳＴにより、室温で１時間ブロッキングした。その後、ニトロセルロース膜をＤＮＡライブラリー（濃度１μＭ）とともに室温で１時間インキュベーションした。次いで、ニトロセルロース膜をＴＢＳＴで５分間２回、１０分間１回の計３回洗浄した後、Ｃｒｙｊ１またはＣｒｙｊ２に結合したＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行った。回収したＤＮＡを、ＦｗプライマーおよびＲｖプライマー、ならびにＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより増幅した。増幅は、９８℃を１０秒（変性）、５９℃を１５秒（アニーリング）、６８℃を３０秒（伸長）の３ステップからなるサイクルを反復することにより行った。増幅されたＤＮＡを一本鎖化し、次のラウンドのスクリーニングライブラリーとして使用した。
【００７０】
上記工程を１ラウンドとして、Ｃｒｙｊ１については５回、Ｃｒｙｊ２については４回、スクリーニングラウンドを繰り返した。各スクリーニングラウンドにおけるライブラリー濃度およびＰＣＲサイクル数は以下の通りである。
【表１】
2015104340.tif 000002
【００７１】
ＤＮＡライブラリーのＣｒｙｊ１またはＣｒｙｊ２に対する親和性を、各スクリーニングラウンドにつき、ドットブロットにより確認した。上記手順によりＣｒｙｊ１またはＣｒｙｊ２を固定したニトロセルロース膜について、上記濃度のＤＮＡライブラリーとともにインキュベーションした。その後、ニトロセルロース膜をＴＢＳＴで５分間２回、１０分間１回の計３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ニュートラアビジン（サーモサイエンティフィック社製）／ＴＢＳＴとともに室温で１時間インキュベーションした。その後、ニトロセルロース膜をＴＢＳＴで５分間２回、１０分間１回の計３回洗浄し、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）ウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（ミリポア社製）により、結合したＤＮＡを可視化した。
【００７２】
結果を図１に示す。図１の上段は、Ｃｒｙｊ１を標的タンパク質としてスクリーニングを行った結果を示す。図１の下段は、Ｃｒｙｊ２を標的タンパク質としてスクリーニングを行った結果を示す。初期ライブラリーとともにインキュベーションしたニトロセルロース膜にはほとんどスポットが検出されないのに対し、スクリーニングラウンド回数を重ねたライブラリーとともにインキュベーションしたニトロセルロース膜には、強いスポットが検出された。この結果から、上記スクリーニングラウンドの反復によって、Ｃｒｙｊ１またはＣｒｙｊ２に対して結合能を有する核酸アプタマーが選別されたＤＮＡライブラリーが得られたことが示された。
【００７３】
＜実施例２：Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの配列解析＞
上記スクリーニングラウンドの反復を経て得られたＤＮＡライブラリーを、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲにより増幅し、増幅産物をＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）により精製した。精製されたＰＣＲ産物に対し、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＡテーリングを行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にＴＡクローニングした。得られたサブクローニングベクターにより、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αを培養し、生育したコロニーに対し、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、シークエンシング解析用の鋳型を調製し、ＤＮＡアプタマーの塩基配列を決定した。
【００７４】
Ｃｒｙｊ２を標的タンパク質として得られたＤＮＡアプタマーの塩基配列を表２に、Ｃｒｙｊ１を標的タンパク質として得られたＤＮＡアプタマーの塩基配列を表３に示す。
【表２】
2015104340.tif 000003
【表３】
2015104340.tif 000004
【００７５】
上記のＤＮＡアプタマーについて、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いてアラインメントを行い整列した結果を図２、アラインメントの結果から近隣結合法に基づいて作製した分子系統樹を図３に示す。これらのＤＮＡアプタマーのＣｒｙｊ１またはＣｒｙｊ２に対する結合能と、ＤＮＡアプタマーの構造的特徴との相関を明らかにするために、分子系統樹の全体をカバーするように、Ｎ２４領域配列としてＣＪ２−０１〜ＣＪ２−１７（配列番号１〜１７）を選択し（図２Ｂ、○で表示）、これらのＮ２４領域配列を有するＤＮＡアプタマーについて、Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２に対する結合能評価を行った。
【００７６】
＜実施例３：ドットブロットによるＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーの結合能評価＞
ＣＪ２−０１〜ＣＪ２−１７（配列番号１〜１７）のＮ２４領域配列を有するＤＮＡアプタマーについて、Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２に対する結合能を、ドットブロットにより評価した。ＤＮＡアプタマーは、実施例１と同様の手順により、フォールディング、プライマー領域のブロックおよびビオチン標識の導入を行うことにより調製した（ＣＪ２−０１＿ｐ〜ＣＪ２−１７＿ｐ）。Ｃｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２（各０．１μｇ／スポット）、ならびに陰性対照としてヒト血清（２．５μＬ／スポット）および３％ＢＳＡ（２．５μＬ／スポット）を、同一のニトロセルロース膜上に固定し、４％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含むＴＢＳＴにより、室温で１時間ブロッキングした。その後、上記調製したＤＮＡアプタマー（１００ｎＭ／ＴＢＳＴ）とともに室温で１時間インキュベーションした。その後、実施例１と同様の手順によって、化学発光により、各スポットに対するＤＮＡアプタマーの結合を可視化した。
【００７７】
結果を図４に示す。Ｃｒｙｊ２を標的タンパク質としてスクリーニングを実施して得たＤＮＡアプタマーであるＣＪ２−０１＿ｐ〜ＣＪ２−０８＿ｐはいずれもＣｒｙｊ２に結合し、このうち、ＣＪ２−０２＿ｐ、ＣＪ２−０４＿ｐ、ＣＪ２−０５＿ｐ、ＣＪ２−０６＿ｐおよびＣＪ２−０８＿ｐの５クローン（図２中、記号「＊」により表示）が、Ｃｒｙｊ２のみに特異的に結合することが明らかになった。Ｃｒｙｊ２のみに特異的に結合したこれらのアプタマーは、図３に示す分子系統樹において共通の分岐に属しており、以下の特徴的なコンセンサス配列：
５’−ＡＧＧＧＡＡＡ−（Ｇ）ｎ−ＫＧＮＧＧＭＣ−３’
（ここで、ｎは３または４であり、Ｋは、ＧまたはＴであり、Ｍは、ＡまたはＣであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである）を有することが明らかになった（表４）。
【表４】
2015104340.tif 000005
【００７８】
一方、Ｃｒｙｊ１を標的タンパク質としてスクリーニングを実施して得られたＤＮＡアプタマーであるＣＪ２−０９＿ｐ〜ＣＪ２−１７＿ｐは、いずれもＣｒｙｊ１に結合するが、Ｃｒｙｊ１よりもＣｒｙｊ２に対して強く結合することが示された。この結果から、Ｃｒｙｊ１を標的タンパク質としても、Ｃｒｙｊ２結合性ＤＮＡアプタマーを調製することが可能であることが示された。
【００７９】
＜実施例４：Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーによる破裂スギ花粉の染色＞
Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーが、破裂スギ花粉から放出されたＣｒｙｊ２に結合するかどうかを検証した。Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーとして、ＣＪ２−０１〜ＣＪ２−０８（配列番号１〜８）のＮ２４領域配列を有するＤＮＡアプタマーを選択し、実施例１と同様の手順により、フォールディング、プライマー領域のブロックおよびビオチン標識の導入を行うことにより調製した（ＣＪ２−０１＿ｐ〜ＣＪ２−０８＿ｐ）。また、陰性対照として、アプタマーのＮ２４領域配列をすべてチミンとしたもの（Ｔ２４）を、実施例１と同様の手順により、フォールディング、プライマー領域のブロックおよびビオチン標識の導入を行うことにより調製した（Ｔ２４＿ｐ）。
【００８０】
破裂スギ花粉標本は、以下の手順により作製した。スギ花粉をスライドグラス上に塗抹し、５μＬのＴＢＳバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて破裂させた後、室温で３０分乾燥させた。その後、９５％エタノール：酢酸（９９：１、ｖ／ｖ）にて氷上で１５分固定し、ＴＢＳで３回リンスした後、１％のＢＳＡ及び１００μｇ／ｍＬの超音波処理済サケ精子ＤＮＡを含有するＴＢＳにより、室温で１５分ブロッキングを行った。なお、超音波処理済サケ精子ＤＮＡは、９５℃で３分間加熱した後、使用するまで氷上で静置した。
【００８１】
ブロッキング後の破裂スギ花粉標本を、ＴＢＳで３回リンスした後、上記の調製したアプタマー（５μＭ）とともに室温で１時間インキュベーションした。その後、破裂スギ花粉標本を、ＴＢＳＴで５分間、３回洗浄し、５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ニュートラアビジン／ＴＢＳとともに室温で３０分間インキュベーションした。その後、ペルオキシダーゼ染色ＤＡＢキット（ナカライテスク社製）を用いて化学発色反応を行った。
【００８２】
また、破裂スギ花粉におけるＣｒｙｊ２の局在を示すための比較例として、破裂スギ花粉におけるデンプンの染色を行った。Ｃｒｙｊ２は、スギ花粉の細胞質内のデンプン粒に存在することが知られているため、デンプンを染色することにより、Ｃｒｙｊ２の局在を確認することができる。破裂スギ花粉におけるデンプンの染色は、上記と同様の条件で破裂および固定を行った花粉標本に、ヨウ素溶液（ヨウ化カリウム２ｇを１００ｍＬの超純水に溶解後、ヨウ素１ｇを溶解して調製）を滴下することにより行った。
【００８３】
破裂スギ花粉のＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーによる染色結果を図５に、破裂スギ花粉のデンプン粒の染色結果を図６に示す。また、破裂スギ花粉の構造を図７に示す。スギ花粉は、吸水すると、花粉粒（外壁に内壁１および内壁２が付着したもの）から、内壁３および内壁４が付着した原形質体が遊離する（図７（ａ））。さらに吸水が進むと、内壁４が膨張し（図７（ｂ））、内壁４が付着した原形質体が内壁３から放出される（図７（ｃ））。
【００８４】
図５に示すように、ＣＪ２−０１＿ｐ〜ＣＪ２−０８＿ｐのいずれのＣｒｙｊ２結合性核酸アプタマーによっても、破裂スギ花粉の原形質体および内壁３が染色された。デンプン粒も、同様に原形質体および内壁３に局在しており（図６）、この結果から、ＣＪ２−０１＿ｐ〜ＣＪ２−０８＿ｐのいずれのアプタマーも、破裂スギ花粉から放出されたＣｒｙｊ２を認識して結合できるものであることが明らかになった。
【００８５】
以下、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを代表して、実施例３において最も強いＣｒｙｊ２結合能を示したＣＪ２−０６（配列番号６）のアプタマーについて、詳細な結合能評価を実施した。
【００８６】
＜実施例５：ドットブロットによるＣＪ２−０６＿ｐの結合能評価＞
ＣＪ２−０６＿ｐと、市販の抗Ｃｒｙｊ２の抗体のＣｒｙｊ２に対する結合特異性を比較した。ＣＪ２−０６＿ｐおよび初期ライブラリーは、実施例１と同様の手順により、フォールディング、プライマー領域のブロックおよびビオチン標識の導入を行うことにより調製した。抗Ｃｒｙｊ２抗体として、抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体（林原生物化学研究所社製）および抗Ｃｒｙｊ２モノクローナル抗体（林原生物化学研究所社製）を使用した。陰性対照として、ウサギＩｇＧ（シグマ・アルドリッチ社製）およびマウスＩｇＧ（シグマ・アルドリッチ社製）を使用した。ブロック鎖として、Ｆｗプライマーの相補鎖およびＲｖプライマーを使用した。
【００８７】
標的タンパク質であるＣｒｙｊ２と、競合タンパク質であるＣｒｙｊ１を、同一のニトロセルロース膜上に固定し（各０．１μｇ／スポット）、２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行った。その後、上記調製したＣＪ２−０６＿ｐ（１００ｎＭ／ＴＢＳＴ）、初期ライブラリー（１００ｎＭ／ＴＢＳＴ）またはブロック鎖（１００ｎＭ／ＴＢＳＴ）とともに室温で１時間インキュベーションした。その後、実施例１と同様の手順によって、化学発光により、各スポットに対するＤＮＡアプタマーの結合を可視化した。
【００８８】
抗体については、上記の抗体を一次抗体として用い（５０ｎｇ／ｍＬ）、室温で１時間インキュベーションを行った。ＴＢＳＴで５分間、３回洗浄した後、抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体およびウサギＩｇＧに対してはＨＲＰ標識抗ウサギイムノグロブリン（ダコ・ジャパン社製）（１：２０００）を、抗Ｃｒｙｊ２モノクローナル抗体およびマウスＩｇＧに対してはＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン（ダコ・ジャパン社製）（１：１０００）を、それぞれ二次抗体として用い、室温で１時間インキュベーションを行った。その後、ＤＮＡアプタマーと同様に、化学発光により、各スポットに対する抗体の結合を可視化した。
【００８９】
結果を図８に示す。ＣＪ２−０６＿ｐのＣｒｙｊ２に対する検出感度は、市販の抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体よりも強く、市販の抗Ｃｒｙｊ２モノクローナル抗体と同等であった。また、ＣＪ２−０６＿ｐのＣｒｙｊ１に対する結合は、ほとんど検出されなかった。一方、市販の抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体では、Ｃｒｙｊ１に対する結合が明確なスポットとして検出されており、この結果から、ＣＪ２−０６＿ｐは、Ｃｒｙｊ２に対し、市販の抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体よりも優れた結合特異性を有するものであることが示された。
【００９０】
＜実施例６：ドットブロットによるビオチン標識ＣＪ２−０６の結合能評価＞
プライマー領域配列を有しない、Ｎ２４領域配列のみからなるアプタマーの結合能を評価するために、ＣＪ２−０６（配列番号６）の５’末端をビオチン化したアプタマー（Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６）を調製し、ドットブロットを行った。陽性対照としてＣＪ２−０６＿ｐ、陰性対照としてＴ２４＿ｐと、２４塩基のチミンからなる核酸の５’末端をビオチン化したもの（Ｂｉｏ−Ｔ２４）を使用した。ドットブロットは、実施例５と同様の手順および条件により行った。
【００９１】
結果を図９に示す。Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６も、ＣＪ２−０６＿ｐと同様にＣｒｙｊ２に対して結合するアプタマーであることが示された。
【００９２】
＜実施例７：酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ法によるＢｉｏ−ＣＪ２−０６の結合能評価＞
Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６のＣｒｙｊ２に対する結合能を、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）法により評価した。ＰＢＳ（−）により希釈したＣｒｙｊ２（濃度１０μｇ／ｍＬ）を、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩固定した。その後、各ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、続いて、１％ＢＳＡ／ＴＢＳを２００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６（１６〜２５０ｎＭ／ＴＢＳ）またはＢｉｏ−Ｔ２４（１６〜２５０ｎＭ／ＴＢＳ）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルをＴＢＳＴで５回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ニュートラアビジン／ＴＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間インキュベーションした。その後、各ウェルをＴＢＳＴで７回洗浄し、ＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、化学発光反応を行った。化学発光は、ＡＲＶＯ  ＭＸ  １４２０マルチラベルカウンター（パーキンエルマー社製）により測定した。同一試料に対する３重測定結果の平均値を１回の測定値とし、Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６については８回の測定値の平均値から、Ｂｉｏ−Ｔ２４については３回の測定の平均値から、スキャッチャード・プロットを作製し、解離定数（Ｋｄ）を算出した。
【００９３】
結果を図１０に示す。エラーバーは標準誤差を示す。ＣＪ２−０６の濃度に依存して化学発光シグナルが増加することが示された。図１０の結果に基づいて作製されたスキャッチャード・プロット（図１１）から、ＣＪ２−０６とＣｒｙｊ２の解離定数（Ｋｄ）は２２ｎＭと算出された。一般的な抗体のＫｄ値は数ｎＭ〜数百ｎＭ程度であることから、ＣＪ２−０６はＣｒｙｊ２に対し、抗体と同等の高い結合親和性を有するものであることが明らかになった。
【００９４】
＜Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６による破裂スギ花粉の染色＞
破裂スギ花粉から放出されたＣｒｙｊ２に対するＢｉｏ−ＣＪ２−０６の結合能を評価するために、破裂スギ花粉の染色を行った。破裂スギ花粉標本の調製および破裂スギ花粉の染色は、実施例４と同様の手順により行った。
【００９５】
また、比較例として、実施例５で使用した市販の抗Ｃｒｙｊ２モノクローナル抗体および抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体による染色を行った。陰性対照には、実施例５で使用したウサギＩｇＧおよびマウスＩｇＧを使用した。染色は、以下の手順により行った。破裂処理および固定処理後の破裂スギ花粉標本を、ＴＢＳで３回リンスした後、５％ヤギ血清および１％ＢＳＡを含有するＴＢＳにより、室温で１５分ブロッキングを行った。ブロッキング後の破裂スギ花粉標本を、ＴＢＳで３回リンスした後、上記の抗体を一次抗体として用い（２μｇ／ｍＬ）、室温で１時間インキュベーションを行った。ＴＢＳＴで５分間、３回洗浄した後、抗Ｃｒｙｊ２ポリクローナル抗体およびウサギＩｇＧに対してはＨＲＰ標識抗ウサギイムノグロブリン（１：５００）を、抗Ｃｒｙｊ２モノクローナル抗体およびマウスＩｇＧに対してはＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン（１：５００）を、それぞれ二次抗体として用い、室温で１時間インキュベーションを行った。その後、ＴＢＳＴで５分間、３回洗浄した後、ＤＮＡアプタマーと同様に、その後、ペルオキシダーゼ染色ＤＡＢキット（ナカライテスク社製）を用いて化学発色反応を行った。
【００９６】
結果を図１２に示す。Ｂｉｏ−ＣＪ２−０６も、ＣＪ２−０６＿ｐと同様に、市販の抗Ｃｒｙｊ２抗体と同等のＣｒｙｊ２検出感度を有するものであることが示された。
【００９７】
このように、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーは、Ｃｒｙｊ２に対し、一般的な抗体と同等以上の高い結合親和性を有しており、破裂スギ花粉から放出されるＣｒｙｊ２を捕捉できるものであることが確認された。また、Ｃｒｙｊ２結合性核酸アプタマーを使用することにより、生活環境での使用に適したＣｒｙｊ２検出試薬、検出キット、除去材、および抑制剤を提供することができることが示唆された。
【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【配列表】
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