(57)【要約】【課題】本開示は、タンパク質治療剤の製剤に関し、より詳しくは、ヒト成長ホルモンの製剤に関する。複合体型ヒト成長ホルモン結晶を含む製剤を記載する。【解決手段】本開示は、改善された安定性を有する結晶性ｈＧＨの製剤を提供する。さらに、本開示は、かかる製剤の調製方法を提供する。また、結晶性タンパク質用の無針注射システムを記載する。また、本開示において、被検体に無針（ジェット式）注射システムで投与され得る結晶性タンパク質製剤、およびかかる製剤の使用方法を記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルギニンでコートされた結晶性ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の懸濁液であって、該結晶性ｈＧＨの濃度が５〜１００ｍｇ／ｍＬであり、
（ａ）ｐＨ範囲６．１〜６．８を有する生物学的に適合性の緩衝液であって、酢酸塩、トリエタノールアミン、イミダゾール、リン酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、およびこれらの組み合わせより選択される緩衝塩を含む、前記緩衝液；
（ｂ）該生物学的に適合性の緩衝液中に懸濁させた場合に少なくとも６ヶ月間、該結晶性ｈＧＨの結晶化度を維持するのに十分な量の結晶化度促進剤；および
（ｃ）該懸濁液の総重量オスモル濃度が２７０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となるようにする張度調整剤
を含む、前記懸濁液。
【請求項２】
さらに保存料を含む、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記保存料がフェノールである、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項４】
前記フェノールが０．２〜０．３％ｗ／ｖの濃度である、請求項３に記載の懸濁液。
【請求項５】
さらに化学的安定剤を含む、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項６】
前記生物学的に適合性の緩衝液が１〜１５０ｍＭの範囲の緩衝塩濃度を有する、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項７】
前記生物学的に適合性の緩衝液がリン酸ナトリウムである、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項８】
前記結晶化度促進剤が酢酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項９】
前記結晶化度促進剤が１〜２５ｗ／ｖ％のＰＥＧを含む、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１０】
前記結晶化度促進剤がフェノールを含む、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１１】
前記張度調整剤が、中性塩、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、その作用緩衝ｐＨ範囲外の緩衝塩、その緩衝ｐＨ範囲外のｐＨ範囲内のアミノ酸の塩、グリシンナトリウム塩、ポリオール、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１２】
反復用量を収容する容器内に配置された、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１３】
単回用量を収容する容器内に配置された、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１４】
前記容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓である閉鎖部を含む、請求項１３に記載の懸濁液。
【請求項１５】
０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する容器内に配置された、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１６】
送達デバイス内に配置された、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１７】
ニードルフリー注射器内に配置された、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１８】
さらにヒアルロン酸を含む、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項１９】
請求項１において定義された成分（ａ）〜（ｃ）を合わせることを含む、ｈＧＨ懸濁液の作製方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の懸濁液を凍結乾燥することによって調製されたｈＧＨの凍結乾燥調製物。
【請求項２１】
再懸濁させた請求項２０に記載の凍結乾燥調製物。
【請求項２２】
請求項１に記載のｈＧＨ懸濁液または請求項２１に記載のｈＧＨ調製物、および
該懸濁液または調製物を患者に投与するための手段
を含む、ｈＧＨ懸濁液または調製物を患者に送達するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００６年１２月１８日に出願された米国特許出願第６０／８７０，６０５号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／８７０，６０５号の内容は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、タンパク質治療剤の製剤に関し、より詳しくは、ヒト成長ホルモンの製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ソマトトロピンあるいは成長ホルモン（「ＧＨ」）は、内分泌系の主要な腺である腺性下垂体によって脳内で合成および分泌される刺激ホルモンの一類型を構成する哺乳動物のタンパク質である。腺性下垂体によるＧＨおよび他の刺激性ホルモンの分泌により、体全体の他の内分泌腺および組織内の細胞の活性が調節される。具体的には、ＧＨは、下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞によって分泌され、肝臓および他の組織を刺激してＩＧＦ−１を合成および分泌する機能を果たす。ＩＧＦ−１は、細胞分裂を制御し、代謝プロセスを調節し、遊離状態で存在するか、またはＩＧＦＢＰ−１〜６で指定される６つの他のタンパク質の１つに結合するタンパク質である。この分泌プロセスそれ自体は、ソマトリベリン（ＧＨ放出を促進）およびソマトスタチン（ＧＨ放出を阻害）の作用に対抗することによりモジュレートされる。
【０００４】
ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）は、細胞および器官の成長の調節、ならびに加齢の種々の段階における生理学的機能において、重要なホルモンである。例えば、ｈＧＨの過剰産生により、小児における巨人症および成人における末端肥大症がもたらされ、一方、不充分な産生により、小児における小人症［非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３］、ターナー症候群（女性のみ）［非特許文献４；非特許文献５］および慢性腎不全［非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８］がもたらされる。成人では、ｈＧＨの欠乏により、タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル分および結合組織の代謝プロセスに影響が及ぼされ得、筋肉、骨または皮膚の萎縮がもたらされ得る［非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１］。成長不全を特徴とする他のｈＧＨ欠乏障害としては、ＡＩＤＳるいそう症候群［非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５］ならびにプラーダー‐ヴィリ症候群［非特許文献１６；非特許文献１７］が挙げられる。
【０００５】
これまで、ヒトにおけるｈＧＨの欠乏の治療レジメンは、主に、組換えＤＮＡ技術によって作製された精製ｈＧＨの皮下注射を中心としたものである。この治療剤は、カートリッジ内に液剤、または使用時に再構成が必要とされる凍結乾燥粉末剤のいずれかとしてパッケージングされる。注射の頻度は、治療される疾患および使用される市販の製剤に応じて異なる。
【０００６】
溶液中での該タンパク質の固有の不安定性により、ｈＧＨの迅速な送達経路として皮下投与の使用が必要とされる。この不安定性は、該タンパク質のアミノ酸配列内の特定の位置で重要な細胞内架橋が切断され、これにより、患者の細胞表面によって認識され、該表面と結合する必須の３次元構造が破壊されることに起因する。ｈＧＨの切断または分解の機構は、主に、溶解の際のメチオニン残基の酸化またはアスパラギン酸残基の脱アミド化によって組織化され、それにより該タンパク質が不活性となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｕｒａｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８５（１０），３６５３−３６６０（２０００）
【非特許文献２】Ｆｒｉｎｄｉｋら，Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１），１５−１９（１９９９）
【非特許文献３】Ｌｅｇｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８３（１０），３５１２−３５１６（１９９８）
【非特許文献４】Ｂｒａｍｓｗｉｇ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５（１），５−１３（２００１）
【非特許文献５】Ｐａｓｑｕｉｎｏら，Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（６），２６９−２７２（１９９６）
【非特許文献６】Ｃａｒｒｏｌｌら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１１（６），２３１−２３８（２０００）
【非特許文献７】Ｕｅｌａｎｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８７（６），２７６０−２７６３（２００２）
【非特許文献８】Ｓｉｍｐｓｏｎら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１−３３（２００２）
【非特許文献９】ＭｅｈｌｓおよびＨａａｓ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂ，Ｓ３１−Ｓ３７（２０００）
【非特許文献１０】Ｆｉｎｅら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３６（３），３７６−３８２（２０００）
【非特許文献１１】Ｍｏｔｏｙａｍａら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２（２），１６２−１６５（１９９８）
【非特許文献１２】Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，２１５−２２１（１９９６）
【非特許文献１３】Ｔｒｉｔｏｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０５（１），４４−５７（１９９８）
【非特許文献１４】Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２３（６），Ｓ２０２−Ｓ２０９（１９９９）
【非特許文献１５】ＴｏｒｒｅｓおよびＣａｄｍａｎ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１４（２），８３−９１（２０００）
【非特許文献１６】Ｒｉｔｚｅｎ，Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５−６），２０８（２００２）
【非特許文献１７】Ｅｉｈｏｌｚｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１５７（５），３６８−３７７（１９９８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本開示は、改善された安定性を有する結晶性ｈＧＨの製剤を提供する。さらに、本開示は、かかる製剤の調製方法およびかかる製剤を用いた治療方法を提供する。
【０００９】
また、本開示において、被検体に無針（ジェット式）注射システムで投与され得る結晶性タンパク質製剤、およびかかる製剤の使用方法を記載する。
【００１０】
ある態様において、本開示は、高分子電解質（好ましくは、ポリアルギニン）；複合体型組換えヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体（ｈＧＨ）結晶；緩衝液（例えば、塩緩衝液）；６０〜２００ｍＭのナトリウムイオン濃度範囲を有するナトリウム塩；および懸濁化剤の１種類以上、好ましくは全部を含むｈＧＨ調製物を提供する。
【００１１】
ある実施形態において、該懸濁化剤はポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ３３５０、６０００、または８０００）である。
【００１２】
ある実施形態では、該懸濁化剤が約２．５〜約２０％ｗ／ｖのポリエチレングリコールである。
【００１３】
ある実施形態において、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体は、所定の期間および／または所定の条件で安定である。ある実施形態では、該期間が少なくとも６、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２、または２４ヶ月である。
【００１４】
ある実施形態では、該期間は、少なくとも約１２、約１８、約２４、約３０または約３６ヶ月である。
【００１５】
ある実施形態において、該調製物のｐＨはｐＨ６〜７である。
【００１６】
ある実施形態では、該調製物がリン酸緩衝液を含み、該調製物のｐＨは６〜７のｐＨを有する。
【００１７】
ある実施形態では、該ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の濃度は約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。ある好ましい実施形態では、該濃度が約２０〜約３０ｍｇ／ｍｌである。
【００１８】
ある実施形態において、該ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶は、約２〜約１００μｍ（例えば約５〜約２０μｍ、例えば約３〜約１５μｍ）の粒径分布を有する。
【００１９】
ある実施形態では、ポリアルギニンに対するｈＧＨの比が約３〜約１５、例えば約５〜約８である。
【００２０】
ある実施形態において、該ｈＧＨ調製物は、シリンダー型のシリコーン処理された容器内の上部空間がないか、または１０ｍｍまでの上部空間を有する容器内に配置される。
【００２１】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は反復投与量を収容する容器内に配置される。
【００２２】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は単回投与量を収容する容器内に配置される。
【００２３】
ある実施形態では、該容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓またはゴム配合物４４３２のいずれかである閉鎖部を含む。
【００２４】
ある実施形態において、該ｈＧＨ調製物は０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する容器内に配置される。
【００２５】
ある実施形態において、該調製物は、送達デバイス、例えば、皮下注射に適したシリンジ（例えば、プレフィルドシリンジ）内に配置される。
【００２６】
ある実施形態では、該調製物は、２９ゲージ以下の針を有するシリンジ内に配置される。
【００２７】
ある実施形態では、該調製物はニードルフリー注射器内に配置される。
【００２８】
ある実施形態において、ｈＧＨは、約５〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１０〜約５０ｍｇ／ｌ、または約２０〜約３０ｍｇ／ｍｌで存在する。
【００２９】
ある実施形態では、該調製物はまた、抗菌剤、例えば、フェノールまたはｍ−クレゾールも含む。
【００３０】
ある実施形態では、該調製物はまた、ヒアルロン酸も含む。
【００３１】
ある実施形態において、該調製物は懸濁剤以外のポリマーを含まない。
【００３２】
ある実施形態では、該調製物はヒスチジン緩衝液を含まない。
【００３３】
ある実施形態において、該調製物はまた保存料も含む。好ましい実施形態において、保存料はフェノールまたはｍ−クレゾールである。より好ましい実施形態では、保存料がフェノールである。
【００３４】
ある態様において、本開示は、５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリアルギニン複合体型組換えヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体（ｈＧＨ）結晶；６．１〜６．８のｐＨのリン酸緩衝液；６０〜２００ｍＭの塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；２．５〜２０％のポリエチレングリコール、例えば、６０００または８０００を含み；１０ｍｍ以下の上部空間を有するシリコーン処理されたプレフィルドシリンジ内に；０．２〜１．０ｍｌの容量配置されたｈＧＨ調製物を特徴とする。
【００３５】
ある実施形態では、該シリンジが２９ゲージ以下の針を有する。
【００３６】
ある実施形態では、該調製物がニードルフリー注射器内に配置される。
【００３７】
ある態様において、本開示は、高分子電解質（例えば、ポリアルギニン（ａｇｉｎｉｎｅ））でコートされたｈＧＨ結晶の懸濁液であって、該結晶性ｈＧＨの濃度が５〜１００ｍｇ／ｍＬ、１０〜５０ｍｇ／ｍＬ、または２０〜３０ｍｇ／ｍＬである懸濁液；該複合体の結晶化度を好ましくはｐＨ範囲５．０〜８．０に維持する生物学的に適合性の緩衝液；前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤；および前記組成物の総重量オスモル濃度が２５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇとなるようにする張度調整剤の１種類以上、好ましくは全部を含むｈＧＨ調製物を含むｈＧＨ調製物を特徴とする。
【００３８】
ある実施形態において、該ｈＧＨ調製物は、保存料、例えばフェノールを含む。ある実施形態では、該フェノールが約０．２５％または約０．２〜約０．３％ｗ／ｖの濃度である。
【００３９】
ある実施形態において、該ｈＧＨ調製物は、化学的安定剤、例えば、メチオニンまたはＥＤＴＡを含む。
【００４０】
ある実施形態では、該生物学的に適合性の緩衝液が、約１〜約１５０ｍＭ、約２〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭの範囲の緩衝塩濃度を有する。
【００４１】
ある実施形態において、該緩衝塩は、酢酸塩、トリエタノールアミン、イミダゾール、リン酸塩、クエン酸塩およびＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む（からなる）群から選択される。他のある実施形態では、該緩衝塩は、リン酸塩、グリシン、ヒスチジン、クエン酸塩、酢酸塩およびＴｒｉｓを含む群から選択される。
【００４２】
ある実施形態において、該生物学的に適合性の緩衝液は、例えば、５．８〜７．０または６．０〜６．５のｐＨ範囲のリン酸ナトリウムである。
【００４３】
ある実施形態では、該生物学的に適合性の緩衝液が、リン酸ナトリウム緩衝液とクエン酸ナトリウム緩衝液（例えば、２ｍＭクエン酸Ｎａ塩と８ｍＭリン酸Ｎａ塩を含む）。
【００４４】
ある実施形態において、前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤は、酢酸Ｎａ塩、またはポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ３３５０〜ＰＥＧ８０００）を含む。
【００４５】
ある実施形態では、前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤は、約１〜約２５ｗ／ｖ％（例えば、約２〜約１０ｗ／ｖ％；または約４〜約６ｗ／ｖ％）のＰＥＧを含む。
【００４６】
ある実施形態では、前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤は、例えば、約０．１〜約０．５％ｗ／ｖの濃度のフェノールを含む。
【００４７】
ある実施形態では、張度調整剤が、中性塩（１種類または複数種）、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、その作用緩衝ｐＨ範囲外の緩衝塩、その緩衝ｐＨ範囲外のｐＨ範囲内のアミノ酸（１種類または複数種）の塩（１種類または複数種）、グリシンナトリウム塩、ポリオール（マンニトールまたはソルビトールなど）、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される。
【００４８】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は、反復投与量を収容する容器内に配置される。
【００４９】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は、単回投与量を収容する容器内に配置される。
【００５０】
ある実施形態では、該容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓またはゴム配合物４４３２のいずれかである閉鎖部を含む。
【００５１】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は、０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する容器内に配置される。
【００５２】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は、送達デバイス、例えば、皮下注射に適したシリンジ（例えば、プレフィルドシリンジ）内に配置される。
【００５３】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物は、ニードルフリー注射器内に配置される。
【００５４】
ある実施形態では、該ｈＧＨ調製物はヒアルロン酸を含む。
【００５５】
ある態様において、本開示は、本明細書に記載の調製物の成分を合わせることを含むｈＧＨ調製物の作製方法を特徴とする。例えば、合わせたものは、高分子電解質（好ましくは、ポリアルギニン）；複合体型組換えヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体（ｈＧＨ）結晶；緩衝液（例えば、塩緩衝液）；６０〜２００ｍＭのナトリウムイオン濃度範囲を有するナトリウム塩；および懸濁化剤の１種類以上、好ましくは全部を含むｈＧＨ調製物である。別の例として、５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリアルギニン複合体型組換えヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体（ｈＧＨ）結晶；６．１〜６．８のｐＨのリン酸緩衝液；６０〜２００ｍＭの塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；２．５〜２０％のポリエチレングリコール、例えば、６０００または８０００を合わせる。
【００５６】
ある態様において、本開示は、本明細書に記載の調製物の成分を容器内に０．２〜１．０ｍｌの充填容積まで配置することを含み、前記容器が、例えば１０ｍｍ以下の上部空間を有するシリンジであり、好ましくは患者への皮下注射に適した容器である、ｈＧＨ調製物のパッケージング方法を特徴とする。
【００５７】
ある態様において、本開示は、請求項１または請求項２６の調製物の成分を容器内に、０．２〜１．０ｍｌの反復用量を収容する充填容積まで配置することを含む、ｈＧＨ調製物のパッケージング方法を特徴とする。
【００５８】
ある態様において、本開示は、ｈＧＨ調製物を患者に送達する方法を特徴とする。該方法は、
本明細書に記載のｈＧＨ調製物を提供すること、および
例えば、注射によって、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日に１回以下で投与すること
を含む。
【００５９】
ある態様において、本開示は、ｈＧＨ調製物またはｈＧＨ調製物に関する情報を関係者に、例えば、流通業者、医師、薬局、病院、ＨＭＯ、卸売業者、小売業者、政府、患者または医療関連機関に提供する方法を特徴とする。該方法は、
該関係者に、本明細書に記載の調製物の成分を含むｈＧＨ調製物が所定の期間および／または所定の条件で安定であることを指示することを含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）。
【００６０】
ある実施形態において、該期間は、少なくとも６、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２、または２４ヶ月である。
【００６１】
ある実施形態では、該期間は、少なくとも１２、１８、２４、３０または３６ヶ月である。
【００６２】
ある実施形態において、該条件は温度、例えば２〜８℃である。
【００６３】
ある実施形態では、該条件は室温、例えば約２５℃である。
【００６４】
ある態様において、本開示は、標準、例えば、政府機関（例えば、ＦＤＡ）によって課された標準、例えば、公表明細もしくはラベル明細、または調合薬一覧（ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ）を満たす方法を特徴とする。該方法は、
ｈＧＨ調製物、例えば本明細書に記載のｈＧＨ調製物が所定の期間および／または所定の条件で安定であることのエビデンスを提供すること、または安定であると明示することを含む。
【００６５】
ある実施形態では、該期間は少なくとも６、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２、または２４ヶ月である。
【００６６】
ある実施形態では、該期間は少なくとも１２、１８、２４、３０または３６ヶ月である。
【００６７】
ある実施形態では、該条件は温度、例えば２〜８℃である。
【００６８】
ある実施形態では、該条件は室温、例えば約２５℃である。
【００６９】
ある態様において、本開示は、内部に結晶化タンパク質の調製物が配置されたニードルフリー注射器を特徴とする。
【００７０】
ある実施形態において、該調製物は結晶の溶液である。
【００７１】
ある実施形態において、該結晶は架橋されたものである。
【００７２】
ある実施形態では、該結晶は、高分子電解質（例えば、ポリアルギニン）との複合体型である。
【００７３】
ある実施形態では、該調製物はｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のものである。
【００７４】
ある実施形態では、該調製物は、本明細書に記載のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体調製物である。
【００７５】
ある実施形態では、該調製物はワクチンではない。
【００７６】
ある実施形態では、該調製物中の結晶は、注射器の送達オリフィスの直径の０．５、０．３３もしくは０．２５またはそれより小さい平均最大寸法を有する。
【００７７】
ある実施形態では、該調製物は、さらにヒアルロン酸を含む。
【００７８】
ある実施形態では、前記調製物中のタンパク質の濃度は約１００ｍｇ／ｍｌ未満であるか、または約２〜約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００７９】
ある態様において、本開示は、結晶化タンパク質調製物を被検体に送達する方法を特徴とする。該方法は、結晶化タンパク質調製物をニードルフリー注射器内に配置して供給すること、および該調製物を該被検体に注射することを含む。
【００８０】
ある実施形態において、該調製物は結晶の溶液である。
【００８１】
ある実施形態において、前記結晶は架橋されたものである。
【００８２】
ある実施形態では、該結晶は、高分子電解質（例えば、ポリアルギニン）との複合体型である。
【００８３】
ある実施形態では、該調製物は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のものである。
【００８４】
ある実施形態では、該調製物は、本明細書に記載のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体調製物である。
【００８５】
ある実施形態において、該調製物はワクチンではない。
【００８６】
ある実施形態において、前記調製物中の結晶は、注射器の送達オリフィスの直径の０．５、０．３３もしくは０．２５またはそれより小さい平均最大寸法を有する。
【００８７】
ある実施形態において、該調製物は、さらにヒアルロン酸を含む。
【００８８】
ある実施形態において、前記調製物中のタンパク質の濃度は約１００ｍｇ／ｍｌ未満であるか、または約２〜約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００８９】
ある態様において、本開示は、再懸濁させると、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体結晶の懸濁液（例えば、ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）、緩衝液、塩およびポリエチレングリコールを含む懸濁液をもたらすｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の凍結乾燥調製物を特徴とする。
【００９０】
ある実施形態において、該結晶の懸濁液は約２０〜約５０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
【００９１】
ある実施形態において、該緩衝液はＴｒｉｓを含む。
【００９２】
ある実施形態では、該緩衝液はリン酸塩を含む。ある実施形態では、緩衝液は、さらにＴｒｉｓまたはヒスチジンを含む。
【００９３】
ある実施形態において、該懸濁液のｐＨは約７〜約９である。
【００９４】
ある実施形態において、該塩は、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムを含む。ある実施形態において、該塩は約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの量で存在する。
【００９５】
ある実施形態において、該ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール３３５０、６０００または８０００を含む。ある実施形態において、該ポリエチレングリコールは約２．５％〜約１０％の量で存在する。
【００９６】
ある実施形態において、該懸濁液は、約２０〜約５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ結晶の懸濁液；Ｔｒｉｓまたはリン酸塩とＴｒｉｓもしくはヒスチジンいずれかとの併用緩衝液；約７〜約９のｐＨ；約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの量の塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；および約２．５％〜約１０％の量のポリエチレングリコール３３５０、６０００または８０００を含む。
【００９７】
ある実施形態において、該調製物はまた保存料も含む。ある実施形態において、保存料は、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、またはベンジルアルコール（例えば、好ましくは、フェノール、ｍ−クレゾール、またはクロロブタノール、より好ましくはフェノール）である。
【００９８】
ある実施形態において、該懸濁液は、シリコーン処理されたバイアルまたは表面コートされた容器閉鎖部内に配置される。
【００９９】
ある態様において、本開示は、凍結乾燥された結晶性ｈＧＨの作製方法を特徴とする。該方法は、
約−３０℃〜約１０℃の一次乾燥サイクル
を含む。
【０１００】
ある実施形態において、該方法は、さらに、約２０℃〜約４０℃の二次乾燥サイクルを含む。
【０１０１】
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載の方法によって作製される凍結乾燥された結晶性ｈＧＨ製剤を特徴とする。
【０１０２】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０３】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０４】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．２％のＨＡ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０５】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．２％のＨＡ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０６】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０７】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０８】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１０９】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１０】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１１】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１２】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１３】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１４】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１５】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１６】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１７】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１８】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１１９】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１２０】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１２１】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１２２】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１％のスクロース、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１２３】
ある態様において、本開示は、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１％のスクロース、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物を特徴とする。
【０１２４】
ある態様において、本開示は、再懸濁させた本明細書に記載の凍結乾燥物を特徴とする。
【０１２５】
ある態様において、本開示は、ｈＧＨ調製物を患者に送達する方法を特徴とする。該方法は、凍結乾燥された本明細書に記載のｈＧＨ調製物を提供すること、および
該調製物（例えば、該凍結乾燥物を再懸濁した後）を、例えば注射によって前記患者に、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日に１回以下で投与すること
を含む。
【０１２６】
特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、その定義を記載する本出願書類に支配される。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本開示の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。
【０１２７】
本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、その定義を記載する本明細書に支配される。また、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【０１２８】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の詳細説明に示す。本開示の他の特徴、目的および利点は、詳細説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
高分子電解質複合体型組換えヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体（ｈＧＨ）結晶；
塩緩衝液；
６０〜２００ｍＭのナトリウムイオン濃度範囲を有するナトリウム塩；および
懸濁化剤
の１種類以上を含むｈＧＨ調製物。
（項目２）
前記懸濁化剤がポリエチレングリコールである、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３）
前記懸濁化剤が２．５〜２０％ｗ／ｖのポリエチレングリコールである、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４）
前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体が所定の期間または所定の条件で安定である、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目５）
前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体が所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも６ヶ月である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体が所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも１２ヶ月である、項目４に記載の方法。
（項目７）
ｐＨがｐＨ６〜７である、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目８）
リン酸緩衝液を含み、ｐＨが６〜７のｐＨを有する、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目９）
ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の濃度が５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬである、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１０）
該ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶が約２〜約１００μｍの粒径分布を有する、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１１）
ポリアルギニンに対するｈＧＨの比が約３〜約１５である、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１２）
シリンダー型のシリコーン処理された容器内の上部空間がないか、または１０ｍｍまでの上部空間を有する容器内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１３）
前記容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓またはゴム配合物４４３２のいずれかである閉鎖部を含む、項目１２に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１４）
反復用量を収容する容器内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１５）
単回用量を収容する容器内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１６）
０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する容器内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１７）
送達デバイス内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１８）
２９ゲージ以下の針を有するシリンジ内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目１９）
ニードルフリー注射器内に配置された、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２０）
前記ｈＧＨが５〜１００ｍｇ／ｍｌで存在する、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２１）
さらに抗菌剤を含む、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２２）
さらにヒアルロン酸を含む、項目１に記載の調製物。
（項目２３）
前記調製物が懸濁剤以外のポリマーを含まない、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２４）
前記調製物がヒスチジン緩衝液を含まない、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２５）
さらに保存料を含む、項目１に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２６）
前記保存料がフェノールである、項目２５に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２７）
５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリアルギニン複合体型組換えヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体（ｈＧＨ）結晶；
６．１〜６．８のｐＨのリン酸緩衝液；
６０〜２００ｍＭの塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；
２．５〜２０％のポリエチレングリコール
を含み；
１０ｍｍ以下の上部空間を有するシリコーン処理されたプレフィルドシリンジ内に；
０．２〜１．０ｍｌの容量で、
配置されたｈＧＨ調製物。
（項目２８）
前記シリンジが２９ゲージ以下の針を有する、項目２７に記載のｈＧＨ調製物。
（項目２９）
ニードルフリー注射器内に配置された、項目２７に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３０）
高分子電解質でコートされたｈＧＨ結晶の懸濁液であって、該結晶性ｈＧＨの濃度が５〜１００ｍｇ／ｍＬである懸濁液；
前記複合体の結晶化度を、好ましくはｐＨ範囲５．０〜８．０に維持する生物学的に適合性の緩衝液；
前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤；および
前記組成物の総重量オスモル濃度が２５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となるようにする張度調整剤
の１種類以上を含むｈＧＨ調製物。
（項目３１）
さらに保存料を含む、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３２）
前記保存料がフェノールである、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３３）
前記フェノールが０．２〜０．３％ｗ／ｖの濃度である、項目３２に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３４）
さらに化学的安定剤を含む、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３５）
前記生物学的に適合性の緩衝液が１〜１５０ｍＭの範囲の緩衝塩濃度を有する、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３６）
前記緩衝塩が、酢酸塩、トリエタノールアミン、イミダゾール、リン酸塩、クエン酸塩およびＴｒｉｓ−ＨＣｌからなる群より選択される、項目３５に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３７）
前記生物学的に適合性の緩衝液がリン酸ナトリウムである、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３８）
前記生物学的に適合性の緩衝液がリン酸ナトリウム緩衝液とクエン酸ナトリウム緩衝液を含む、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目３９）
前記複合体の結晶化度を維持または増大させる前記結晶化度促進剤が酢酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールを含む、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４０）
前記複合体の結晶化度を維持または増大させる前記結晶化度促進剤が１〜２５ｗ／ｖ％のＰＥＧを含む、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４１）
前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤がフェノールを含む、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４２）
前記張度調整剤が、中性塩、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、その作用緩衝ｐＨ範囲外の緩衝塩、その緩衝ｐＨ範囲外のｐＨ範囲内のアミノ酸の塩、グリシンナトリウム塩、ポリオール、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４３）
反復用量を収容する容器内に配置された、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４４）
単回用量を収容する容器内に配置された、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４５）
前記容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓またはゴム配合物４４３２のいずれかである閉鎖部を含む、項目４４に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４６）
０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する容器内に配置された、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４７）
送達デバイス内に配置された、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４８）
ニードルフリー注射器内に配置された、項目３０に記載のｈＧＨ調製物。
（項目４９）
さらにヒアルロン酸を含む、項目３０に記載の調製物。
（項目５０）
項目１に記載の調製物の成分を合わせることを含む、ｈＧＨ調製物の作製方法。
（項目５１）
項目３０に記載の調製物の成分を合わせることを含む、ｈＧＨ調製物の作製方法。
（項目５２）
項目１または項目３０の調製物の成分を容器内に０．２〜１．０ｍｌの充填容積まで配置することを含み、前記容器がシリンジである、ｈＧＨ調製物のパッケージング方法。
（項目５３）
項目１または項目３０の調製物の成分を容器内に０．２〜１．０ｍｌの反復用量を収容する充填容積まで配置することを含む、ｈＧＨ調製物のパッケージング方法。
（項目５４）
項目１または項目３０のｈＧＨ調製物を提供すること、および該調製物を患者に投与することを含む、ｈＧＨ調製物を患者に送達する方法。
（項目５５）
関係者に、  項目１または項目３０の調製物の成分を含むｈＧＨ調製物が所定の期間または所定の条件で安定であることを指示することを含む、ｈＧＨ調製物またはｈＧＨ調製物に関する情報を関係者に提供する方法。
（項目５６）
該調製物が所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも６ヶ月である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
該調製物が所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも１２ヶ月である、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
該調製物が所定の条件で安定であり、前記条件が温度である、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
該調製物が所定の条件で安定であり、前記条件が室温である、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
ｈＧＨ調製物が所定の期間または所定の条件で安定であることのエビデンスを提供すること、または安定であると明示することを含む、標準を満たす方法。
（項目６１）
該調製物が所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも６ヶ月である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
該調製物が所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも１２ヶ月である、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
該調製物が所定の条件で安定であり、前記条件が温度である、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
該調製物が所定の条件で安定であり、前記条件が室温である、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
内部に結晶化タンパク質の調製物が配置されたニードルフリー注射器。
（項目６６）
前記調製物が結晶の溶液である、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目６７）
前記結晶は架橋されたものである、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目６８）
前記結晶が高分子電解質との複合体型である、項目６５に記載のニードルフリー注射器。（項目６９）
前記調製物がｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のものである、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目７０）
前記調製物が、項目１または項目３０のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体調製物である、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目７１）
前記調製物がワクチンではない、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目７２）
前記調製物中の結晶が、注射器の送達オリフィスの直径の０．５以下の平均最大寸法を有する、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目７３）
前記調製物が、さらにヒアルロン酸を含む、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目７４）
前記調製物中のタンパク質の濃度が約１００ｍｇ／ｍｌ未満である、項目６５に記載のニードルフリー注射器。
（項目７５）
結晶化タンパク質調製物をニードルフリー注射器内に配置して供給すること、および前記薬物を前記被検体に注射することを含む、結晶化タンパク質調製物を被検体に送達する方法。
（項目７６）
前記調製物が結晶の溶液である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記結晶は架橋されたものである、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記結晶が高分子電解質との複合体型である、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
前記調製物がｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体のものである、項目７５に記載の方法。
（項目８０）
前記調製物が、項目１または項目３０のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体調製物である、項目７５に記載の方法。
（項目８１）
前記調製物がワクチンではない、項目７５に記載の方法。
（項目８２）
前記調製物中の結晶が、注射器の送達オリフィスの直径の０．５以下の平均最大寸法を有する、項目７５に記載の方法。
（項目８３）
前記調製物が、さらにヒアルロン酸を含む、項目７５に記載の方法。
（項目８４）
前記調製物中のタンパク質の濃度が約１００ｍｇ／ｍｌ未満である、項目７５に記載の方法。
（項目８５）
再懸濁させると、
ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体結晶の懸濁液、
緩衝液、
塩および
ポリエチレングリコール
を含む懸濁液をもたらすｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の凍結乾燥調製物。
（項目８６）
該結晶の懸濁液が約２０〜約５０ｍｇ／ｍｌの量で存在する、項目８５に記載の調製物。（項目８７）
緩衝液がＴｒｉｓを含む、項目８５に記載の調製物。
（項目８８）
緩衝液がリン酸塩を含む、項目８７に記載の調製物。
（項目８９）
緩衝液が、さらにＴｒｉｓまたはヒスチジンを含む、項目８８に記載の調製物。
（項目９０）
該懸濁液のｐＨが約７〜約９である、項目８５に記載の調製物。
（項目９１）
前記塩が塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムを含む、項目８５に記載の調製物。
（項目９２）
前記塩が約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの量で存在する、項目９１に記載の調製物。
（項目９３）
前記ポリエチレングリコールが、ポリエチレングリコール３３５０、６０００または８０００を含む、項目８５に記載の調製物。
（項目９４）
前記ポリエチレングリコールが約２．５％〜約１０％の量で存在する、項目９３に記載の調製物。
（項目９５）
該懸濁液が、
約２０〜約５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ結晶の懸濁液；
Ｔｒｉｓまたはリン酸塩とＴｒｉｓもしくはヒスチジンいずれかとの併用緩衝液；
約７〜約９のｐＨ；
約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの量の塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；および
約２．５％〜約１０％の量のポリエチレングリコール３３５０、６０００または８０００
を含む、項目８５に記載の調製物。
（項目９６）
さらに保存料を含む、項目８５に記載の調製物。
（項目９７）
前記保存料がフェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、またはベンジルアルコールである、項目９６に記載の調製物。
（項目９８）
該懸濁液が、シリコーン処理されたバイアルまたは表面コートされた容器閉鎖部内に配置される、項目８５に記載の調製物。
（項目９９）
約−３０℃〜約１０℃の一次乾燥サイクル
を含む、凍結乾燥された結晶性ｈＧＨの作製方法。
（項目１００）
さらに、約２０℃〜約４０℃の二次乾燥サイクルを含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
項目９９に記載の方法によってもたらされる生産物。
（項目１０２）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０３）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０４）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．２％のＨＡ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０５）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、０．２％のＨＡ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０６）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０７）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０８）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１０９）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１０）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１１）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１２）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１３）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１４）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１５）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１６）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１７）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１８）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１１９）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１２０）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１２１）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１２２）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１％のスクロース、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１２３）
２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１％のスクロース、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
からなるｈＧＨの凍結乾燥調製物。
（項目１２４）
再懸濁させた項目８５に記載の凍結乾燥物。
（項目１２５）
項目８５または１２４に記載のｈＧＨ調製物を提供すること、および
患者に投与すること
を含む、ｈＧＨ調製物を患者に送達する方法。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ｐＨとＣＥＸによる分解のパーセンテージとの相関を示すグラフである：２５℃で３ヶ月のデータを相関に使用した。
【図２】ナトリウム塩を含有する製剤（高イオン強度）が、塩を含有しない製剤よりもＣＥＸによる分解が少ないことを示すグラフである。４０℃で１週間の安定性データ。
【図３】４０℃で２週間後の賦形剤スクリーニングでのＣＥＸによる分解のパーセンテージを示すグラフである。
【図４】ｐＨ６．８における種々の懸濁化剤でのＣＥＸによる分解（賦形剤）のパーセンテージを示すグラフである。製剤はすべて、以下の成分：リン酸塩、ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）を含むものとした。
【図５】ＣＥＸによる分解に対する塩の種と濃度の効果を示すグラフである。製剤はすべて、以下の成分リン酸塩とＰＥＧ６０００またはＰＥＧ８０００のいずれかを含むものとした。
【図６】ＰＥＧ濃度に対するＣＥＸによる分解のパーセンテージを示すグラフである（１０％のＰＥＧの結果は図示せず）。
【図７】回収されたｈＧＨの濃度比較を示す一連のグラフである。図７Ａは、反転処理に供された１ｍｌの送達容量で得られた結果を示す；図７Ｂは、旋回処理に供された１ｍｌの送達容量で得られた結果を示す；図７Ｃは、反転処理に供された０．２ｍｌの送達容量で得られた結果を示す；図７Ｄは、旋回処理に供された０．２ｍｌの送達容量で得られた結果を示す。
【図８】体重回復パーセンテージの比較を示す一連のグラフである。図８Ａは、反転処理に供された１ｍｌの送達容量で得られた結果を示す；図８Ｂは、旋回処理に供された１ｍｌの送達容量で得られた結果を示す；図８Ｃは、反転処理に供された０．２ｍｌの送達容量で得られた結果を示す；図８Ｄは、旋回処理に供された０．２ｍｌの送達容量で得られた結果を示す。
【図９】元々、結晶性凝集体を含まないＡＬＴＵ−２３８試料における、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００注射システムでの１回目の注射後および２回目の注射後の粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１０】ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００注射システムでの注射前、１回目の注射後および２回目の注射後のＨＡ−ＡＬＴＵ−２３８試料における粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１１Ａ】３０Ｇ×１／２インチ針が予め取り付けられたＢＤシリンジ、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システム、およびＶｅｔＪｅｔシステムによる注射前および注射後の、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ（２０μｍ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１１Ｂ】３０Ｇ×１／２インチ針が予め取り付けられたＢＤシリンジ、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システム、およびＶｅｔＪｅｔシステムによる注射前および注射後の、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ（２０μｍ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１２Ａ】３０Ｇ×１／２インチ針が予め取り付けられたＢＤシリンジ、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システムおよびＶｅｔＪｅｔシステムによる注射前および注射後の、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ（３０μｍ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１２Ｂ】３０Ｇ×１／２インチ針が予め取り付けられたＢＤシリンジ、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システムおよびＶｅｔＪｅｔシステムによる注射前および注射後の、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ（３０μｍ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１３Ａ】ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００、３０Ｇ×１／２インチ針が予め取り付けられたＢＤシリンジ、および２５Ｇ×５／８インチ針を有するシリンジでの注射前および注射後の、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ（８０μｍ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１３Ｂ】ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００、３０Ｇ×１／２インチ針が予め取り付けられたＢＤシリンジ、および２５Ｇ×５／８インチ針を有するシリンジでの注射前および注射後の、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ（８０μｍ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１４Ａ】ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００の使用、３０Ｇ×１／２インチ針、および２５Ｇ×５／８インチ針および１８Ｇ×１インチが予め取り付けられたＢＤシリンジによる注射前および注射後の、グルタリルアルカラーゼ（Ｇｌｕｔａｒｙｌ  Ａｌｃａｌａｓｅ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１４Ｂ】ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００の使用、３０Ｇ×１／２インチ針、および２５Ｇ×５／８インチ針および１８Ｇ×１インチが予め取り付けられたＢＤシリンジによる注射前および注射後の、グルタリルアルカラーゼ（Ｇｌｕｔａｒｙｌ  Ａｌｃａｌａｓｅ）試料の体積−（Ａ）および数−（Ｂ）に基づく粒径分布のオーバーレイを示すグラフである。
【図１５】上清み中の溶在ｈＧＨの量に対するＰＥＧ濃度の効果を示すグラフである。製剤基剤はｐＨ７．５のＴｒｉｓ緩衝液とした。
【図１６】種々の溶解（ｌｙｏ）サイクルによって作製した試料の粒径分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
詳細な説明
概論：結晶性ｈＧＨの安定性
経時的に、結晶性ｈＧＨの懸濁液では、可溶性タンパク質の凝集体が現れることがあり得、ｈＧＨが酸化、脱アミド化、化学分解および結晶形態の変化を受けることがあり得、ｈＧＨが溶液中に溶解することがあり得る。
【０１３１】
本開示は、安定性が増大した結晶性ｈＧＨの懸濁液、例えば、ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液を提供する。本明細書に記載の実施形態は、１つ以上の安定性の課題に対処するための１つ以上の手段を含む。
【０１３２】
一例として、結晶性ｈＧＨ製剤の安定性を増大させるために、種々の要素、例えば、タンパク質濃度、緩衝液の選択、塩の選択および濃度、ｐＨ、懸濁化剤の選択および濃度、保存容器の選択、保存料の選択および濃度、ならびに充填容積に対処されている。これらの要素の１つ、２つ、３つ、４つまたは全部が、対象のタンパク質の安定性を増大させるために改変または制御され得る。
【０１３３】
安定性が改善された結晶性ｈＧＨの液状懸濁液の一例として、該懸濁液は、以下の特性の１つ以上を有するものであり得る：約５〜５０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ結晶の懸濁液を含む；リン酸塩含有緩衝液を含む；約６．１〜約６．８のｐＨ範囲に含まれる；約６０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムを含む；約２．５％〜約２０％のポリエチレングリコール６０００または８０００を含む；約０．２〜約１ｍｌの充填容積で等分される；限定的な上部空間（例えば、上部空間なしから約１０ｍｍまでの上部空間）を有するシリコーン処理されたプレフィルドシリンジまたは限定的な上部空間を有する別のシリンダー型の容器もしくはデバイス内に配置される。
【０１３４】
一例として、本開示は、５±３℃（冷蔵）で１８〜２４ヶ月、および室温２５±２℃（使用時）条件で少なくとも１ヶ月安定である結晶性ｈＧＨの懸濁液の製剤を提供する。
【０１３５】
本明細書に記載の製剤、例えば、結晶性タンパク質（例えば、ポリＡｒｇ複合体型結晶性ｈＧＨ）を含有する液状製剤は、安定性が増大している。例えば、容器内に２〜８℃の温度で３、６、９、１２または２４ヶ月まで（あるいは、ある実施形態では、より長期）の期間保存すると、該組成物中のタンパク質は、保存前に有していた安定性の少なくとも５０、７５、８５、９０、９５または１００％を保持している（例えば、該タンパク質は、２５℃で３ヶ月間にわたって該安定性の約７７％を保持することができる）。安定性は、本明細書で用いる場合、タンパク質の構造（例えば、タンパク質構造の変化、例えば、タンパク質凝集もしくはタンパク質分解の最小化もしくは抑制）および／またはタンパク質の有効性、例えば治療有効性（例えば、体重の増加を引き起こす能力）などのパラメータを包含する。
【０１３６】
本明細書で用いる場合、用語「安定性増大」は、試験条件または一定の保存条件下での一定期間におけるタンパク質の脱アミド化、タンパク質の酸化、タンパク質の凝集、タンパク質の溶解、または治療有効性の量の減少（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の減少）をいう。
【０１３７】
ヒト成長ホルモン
用語「成長ホルモン（ＧＨ）」は、一般的に、哺乳動物の下垂体によって分泌される成長ホルモンをいう。網羅的列挙ではないが、哺乳動物の例としては、ヒト、類人猿、サル、ラット、ブタ、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラットおよびヤギが挙げられる。本開示の好ましい実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
【０１３８】
「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）」は、天然のヒト成長ホルモンに特徴的なアミノ酸配列、構造および機能を有するタンパク質を表す。本明細書で用いる場合、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）はまた、天然のヒト成長ホルモンの任意のアイソフォーム、例えば限定されないが、５、１７、２０、２２、２４、３６および４５ｋＤａの分子量を有するアイソフォーム（Ｈａｒｏら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８））を包含する。したがって、用語ｈＧＨには、１９１個のアミノ酸配列の天然のｈＧＨ、ソマトトロピンと、Ｎ末端メチオニンを含む１９２個のアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）およびソマトレム（米国特許第４，３４２，８３２号および同第５，６３３，３５２号）が包含される。ｈＧＨは、生物学的供給源からの単離および精製または組換えＤＮＡ法によって得られ得る。組換えＤＮＡ手法によって作製されたものである場合、ｈＧＨは、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）と表示する。Ｍｅｔ−ｈＧＨは、典型的には組換えＤＮＡ手法によって調製される。
【０１３９】
用語「ヒト成長ホルモン誘導体」は、ｈＧＨの１９１個のアミノ酸配列またはＭｅｔ−ｈＧＨの１９２個のアミノ酸配列のアミノ酸配列と、少なくとも約１％であって約２０％以下異なるタンパク質をいう。例えば、該誘導体は、ｈＧＨの１９１個のアミノ酸配列またはＭｅｔ−ｈＧＨの１９２個のアミノ酸配列と、約１％〜約２０％、約２％〜約１５％、または約５％〜約１０％異なるものであり得る。該タンパク質は、ｈＧＨの１９１個のアミノ酸配列またはＭｅｔ−ｈＧＨの１９２個のアミノ酸配列と、約１％、約２％、約３％、約４％、約５１％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％異なるものであり得る。該誘導体と１９１アミノ酸ｈＧＨまたは１９２アミノ酸Ｍｅｔ−ｈＧＨとのアミノ酸配列の違いは、１つ以上の置換（例えば、同類もしくは非同類置換）、欠失、付加（例えば、挿入もしくはアミノ−もしくはカルボキシ末端付加））、修飾、またはその組合せであり得る。ある実施形態において、該誘導体は、１９１アミノ酸ｈＧＨまたは１９２アミノ酸Ｍｅｔ−ｈＧＨのアミノ酸配列の生物学的活性、および／または化学的および／または物理的特性を維持している。同様に、ある実施形態では、誘導体を有する製剤（例えば、ポリＡｒｇ複合体型結晶性ｈＧＨ誘導体の製剤）は、１９１アミノ酸ｈＧＨまたは１９２アミノ酸Ｍｅｔ−ｈＧＨのアミノ酸配列を含む同様にして調製された製剤（例えば、ポリＡｒｇ複合体型結晶性ｈＧＨの製剤）の化学的および／または物理的特性を有するものである。
【０１４０】
本開示の種々の実施形態において、ヒト成長ホルモン誘導体は、ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨの有機カチオン、生物学的に合成されたｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質の置換、欠失および挿入バリアント、翻訳後修飾されたｈＧＨおよびＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質（例えば、脱アミド化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、凝集および酵素的切断反応［Ｈａｒｏら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８）］）、生物学的供給源由来の化学修飾されたｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨタンパク質、ポリペプチド類縁体、ならびにｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨのものと類似したアミノ酸配列を含む化学合成されたペプチドを含む。
【０１４１】
ｈＧＨまたはＭｅｔ−ｈＧＨを調製するために使用される方法としては、生物学的供給源からの単離、組換えＤＮＡ手法、合成化学的経路またはその組合せが挙げられる。これまでで、異なるＤＮＡ配列のｈＧＨをコードする遺伝子としては、ｈＧＨ−ＮおよびｈＧＨ−Ｖ  ［Ｈａｒｏら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７２０，３９−４７（１９９８）；Ｂｅｎｎａｎｉ−Ｂａｉｔｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，６４７−６５２（１９９５）］が挙げられる。
【０１４２】
用語「原子価」は、元素が他の元素と結合する能力と定義され、その原子の最外殻の電子の数によって決定され、その原子と結合する（または置き換える）ことができる水素原子（または任意の他の標準的な一価の元素）の数で表示される［Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｄ．およびＭｏｏｒｅ  Ｔ．Ｈ．編．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９８］。用語「一価のカチオン」および「二価のカチオン」は、それぞれ原子価状態１または２のいずれかを有する正の電荷を有するイオンをいう。カチオンは、種々の原子価状態を有し、天然で有機系または無機系のものであり得る。一価の無機カチオンの例としては、アンモニウム（ＮＨ４＋）ならびに周期表の第Ｉ族の元素（Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ３０、Ｃｓ＋、およびＦｒ＋）が挙げられ、二価の無機カチオンとしては、第ＩＩ族の元素（Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｍｏ２＋およびＲａ２＋）が挙げられる。
【０１４３】
「ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の有機カチオン結晶」は、有機カチオンの存在下で結晶化されたヒト成長ホルモンをいう。用語「有機カチオン」は、正の電荷を有する原子または炭素を含む原子の群をいう。有機カチオンの例としては、第４級アンモニウムカチオン、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、トリブチルメチルアンモニウム（ＴＢｕＭＡ）、プロカインアミドエトブロミド（ＰＡＥＢ）、アジドプロカインアミドメトイオダイド（ＡＰＭ）、ｄ−ツボクラリン、メトクリンベクロニウム、ロクロニウム、１−メチル−４−フェニルピリジニウム、コリンおよびＮ−（４，４−アキソ−ｎ−ペンチル）−２１−デオキシアジム−アリニウム（ＡＰＤＡ）が挙げられる。
【０１４４】
ｈＧＨは、凍結乾燥形態で市販されており、典型的には組換えＤＮＡ法で作製される。ｈＧＨの結晶化は、ｈＧＨの緩衝溶液を調製し、精製および／または脱塩し、溶液を透析および濃縮し、一価または二価のカチオンまたは塩を溶液に添加することにより行なわれ得る。後者の工程により、ｈＧＨに結合された有機または無機カチオンの形成がもたらされる。
【０１４５】
本開示の好ましい一実施形態は、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の一価のカチオン結晶に関する。より好ましい実施形態において、一価のカチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムからなる群より選択される。最も好ましい実施形態において、一価のカチオンはナトリウムである。最も好ましい実施形態において、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体は、ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体のモノマーまたはモノマー鎖１つあたり約１〜約５００個の一価のカチオン分子を含む。
【０１４６】
用語「一価のカチオンの塩」は、一価のイオンとイオン結合を形成する無機および有機両方の対イオンまたは分子を包含する。好ましい実施形態において、一価のカチオンの塩はナトリウム塩である。より好ましい実施形態では、ナトリウム塩が、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムからなる群より選択される。最も好ましい実施形態では、ナトリウム塩が酢酸ナトリウムである。
【０１４７】
好ましい一実施形態において、プロタミンと複合体形成された結晶性ｈＧＨまたは結晶性ｈＧＨ誘導体を提供する。同様に、別の好ましい実施形態では、ポリアルギニンと複合体形成された結晶性ｈＧＨまたは結晶性ｈＧＨ誘導体を提供する。
【０１４８】
長期作用性ｈＧＨを作製するため、ｈＧＨの結晶化および複合体形成のプロセスが開発され、この製剤は、臨床試験において制御放出プロフィールを示した（米国特許出願公報２００４−０２０９８０４号、ＷＯ２００４／０６０３１０、ＷＯ２００４／０６０９２０参照）。ポリアルギニン（ポリＡｒｇ）複合体形成により、制御放出プロフィールが改善される。この薬物送達方法により、患者はよりユーザーフレンドリーな治療選択肢を得られるため、ポリマーまたは融合タンパク質を使用することなく、注射がより少なくなるように設計されたものである。この結晶化技術の特異性は、上清み中に存在する遊離ｈＧＨが限定的であるため、可溶性凝集体の増加がほとんどまたは全く観察されないことである。
【０１４９】
例えば、ポリＡｒｇ結晶性ｈＧＨは、以下のようにして調製され得る。
【０１５０】
可溶性の組換えにより作製されたｈＧＨ（ｒｈＧＨ）の凍結バルク仕込み溶液を得る、例えば、大腸菌（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）または酵母（Ｌｕｃｋｙ  Ｇｏｌｄ）から得る。およそ３．５ｍｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）中１２ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨ）の解凍ｒｈＧＨ仕込み溶液を、１０ＤＧ−脱塩カラム（Ｂｉｏｒａｄにより供給）を用いて精製する。試料の負荷前、カラムを３０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄することにより、カラムを調整する。次いで、ｒｈＧＨ試料を負荷し、重力によってカラム内に導入させる。最初の３ｍｌの溶出液を廃棄した後、次いで、さらに５．０ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加する。４．５ｍｌの脱塩ｒｈＧＨが溶出され、収集する。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＭＷＣＯ  １０，０００）を３５００ｒｐｍで２０〜３０分用い、遠心分離による濃縮を行なう。ｈＧＨの濃度は、２８０ｎｍでの吸光度／０．８１３（１ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ  Ａ２８０＝０．８１３吸光度単位）で測定した場合、３０ｍｇ／ｍｌの範囲である。１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０％のＰＥＧ−６０００および１Ｍの酢酸Ｃａ塩をｒｈＧＨの３０ｍｇ／ｍｌストック調製物に、最終濃度が、１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０００および８５ｍＭの酢酸Ｃａ塩が得られるように添加することにより、結晶を成長させる。次いで、この溶液を静かに混合し、３３℃で１２〜１６時間インキュベートする。およそ２〜２５μｍの範囲の長さの針状結晶が得られる。上清みを抽出し、結晶を遠心分離してペレット化した後、結晶化収率を測定する。例えば、該収率は８５％より大きいものであり得る。また、結晶は、３３℃〜１５℃の温度でも形成され得るが、より長い結晶化時間が必要とされ、収率が低下する場合があり得る。結晶化後、収率を測定し、カルシウムｒｈＧＨ結晶を製剤化ビヒクル（例えば、５ｍＭ  ＣａＯＡｃ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６％ＰＥＧ−６０００、および４．２ｍｇ／ｍｌポリアルギニン）中に、最終濃度２１ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍｇ／ｍｌのカルシウムｒｈＧＨ結晶が得られるように再懸濁させる。ポリアルギニンに対するｒｈＧＨのタンパク質対添加剤比は、５：１（ｍｇ：ｍｇ）とした。この比は、ｒｈＧＨ：ポリアルギニンがおよそ１：０．５８７のモル比となるように計算する。上記のｒｈＧＨペレットを適切な母液中に均一に再懸濁させ、２〜８℃で一晩インキュベートした後、遠心分離し、濃縮ペレットを得る。上清みを除去し、ペレットは、イオン系添加剤を含まない同じ母液中に再懸濁させ、４℃で保存され得る。
【０１５１】
本開示のさらに好ましい実施形態は、プロタミンまたはポリアルギニンと複合体形成または共結晶化されたｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の一価または二価の結晶を含む。より好ましくは、該結晶は、プロタミンまたはポリアルギニンと複合体形成または共結晶化されたナトリウム結晶である。
【０１５２】
可溶性形態のｈＧＨは、さまざまな方法、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（Ｗｕら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５００，５９５−６０６（１９９０）；“Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｄｒｕｇｓ”，ＦＤＡ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，（１９８２））によって特徴付けられ得る。他方、結晶性形態のｈＧＨは、光学顕微鏡法およびＸ線回折によって特徴付けられ得る。一般に、結晶化の条件によって、タンパク質結晶の形状、すなわち、球状、針状、棒状、板状（六角形および四角形）、菱形、立方形、両錐形またはプリズム形からなる群より選択される形状が決定される。
【０１５３】
本開示によるｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、光学顕微鏡法で画像形成させると、棒状または針状形態構造を形成したものである。一実施形態において、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約０．１〜約２００μｍの長さの棒状体または針状体を形成したものである。好ましい実施形態において、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約３〜約１００μｍの長さの棒状体または針状体を形成したものである。より好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約１０〜約２５μｍの長さの棒状体または針状体を形成したものである。
【０１５４】
ＡＬＴＵ−２３８は、ポリ−Ｌ−アルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶が製剤化ビヒクル中に含まれた長期作用性（例えば、２９ゲージ以下の針による皮下投与後、ｈＧＨの１週間にわたる放出をもたらす）の既製の懸濁液である。ＡＬＴＵ−２３８製剤は、２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００  ｐＨ７．５であり、例えば、本明細書に記載の製剤の安定性を評価するための比較試験の標準として使用され得る。
【０１５５】
液状と凍結乾燥状態の２種類の製剤は、ｈＧＨ結晶と複合体形成されたポリ−Ｌ−アルギニンを用いて調製され得る。各々の説明を示す。
【０１５６】
液状懸濁剤製剤
製剤化ビヒクル
ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶を懸濁させるｐＨ、緩衝液、塩、懸濁化剤、ヒアルロン酸（「ＨＡ」）および／または保存料の配合物を「製剤化ビヒクル」と称することがあり得る。該ビヒクルの各成分は、個々に、または組合せで種々であり得、所望の特性、例えば安定性が増大した複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液がもたらされるように最適化され得る。
【０１５７】
ｐＨ
懸濁液のｐＨは、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼす主な因子であり得る。例えば、該懸濁液のｐＨは、ｈＧＨ複合体型結晶の脱アミド化と酸化に影響を及ぼし得る。ある実施形態において、約７．０または７．５（他の製剤化条件に応じて）より上のｐＨにより、タンパク質の（図１）と酸化の両方の増大が引き起こされ得る。脱アミド化は、例えば、カチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。酸化は、例えば、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。約５．５または約５．０より下のｐＨでは、例えば、該懸濁液の他の特性にもよるが、タンパク質の混濁がもたらされ得る。濁度は、例えば、３２０ｎｍで読み取りが行なわれるＵＶ吸光度によって測定され得る。
【０１５８】
ある実施形態において、該懸濁液のｐＨは約６〜約７．５である。好ましい実施形態では、該ｐＨは６．１〜６．８である。例えば、該ｐＨは、約６．１、約６．３、約６．５、または約６．８であり得る。
【０１５９】
候補ｐＨは、２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００を含有する候補ｐＨ値のポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば酸化または分解の割合として測定される候補ｐＨを有する該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、該懸濁液のｐＨが調整されていないこと以外は試験条件と類似した懸濁液であり得、例えば、標準のｐＨは７．５であり得る。試験品（候補ｐＨに調整された該懸濁液）と標準（ｐＨが調整されていない）懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、試験懸濁液の安定性が増大していること（例えば、酸化または脱アミド化の量がより少ないことで測定）により示され得る。別の標準は、該懸濁液が候補ｐＨの代わりに本明細書に記載の別のｐＨ、例えばｐＨ６．５を有すること以外は試験懸濁液と類似した懸濁液であり得る。好適性は、候補ｐＨの該懸濁液が安定性についてｐＨ６．５の該懸濁液と同等または、それよりも良好な効果を有することにより示され得る。
【０１６０】
緩衝液
懸濁液を作製するために使用される緩衝液は、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼす主な因子であり得る。例えば、該懸濁液の緩衝液は、ｈＧＨ複合体型結晶の懸濁液の結晶の大きさと濁度（例えば、不溶性凝集体による）に影響を及ぼし得る。濁度は、例えば、３２０ｎｍで読み取りが行なわれるＵＶ吸光度によって測定され得る。結晶の大きさは、例えば、顕微鏡法およびレーザー回折粒径計測器によって評価され得る。
【０１６１】
ある実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、またはＴｒｉｓ緩衝液であり得る。好ましい実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、またはＴｒｉｓ緩衝液である。より好ましい実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液である。また、緩衝液の濃度は種々であり得、例えば、緩衝液成分、例えば、リン酸塩、グリシン、ヒスチジン、クエン酸塩、酢酸塩、またはＴｒｉｓの濃度は、種々であり得る。
【０１６２】
候補緩衝液は、２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５の試験緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば混濁の量として測定される候補緩衝液中での該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、組成物の緩衝液が本明細書に記載の緩衝液であること以外は試験条件と類似した組成物であり得、例えば、標準の緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。試験品（試験緩衝液中の該懸濁液）と標準（リン酸緩衝液中の該懸濁液）の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、試験懸濁液の安定性が増大していること（例えば、混濁の量がより少ないことで測定）により示され得る。別の標準は、該懸濁液が候補緩衝液の代わりに別の本明細書に記載の緩衝液、例えばＴｒｉｓ緩衝液を有すること以外は試験懸濁液と類似した懸濁液であり得る。好適性は、候補緩衝液中の該懸濁液がリン酸緩衝液中の該懸濁液よりも、安定性に対して良好または同等な効果を有することにより示され得る。また、別の例として緩衝液の濃度が試験され得、例えば、試験濃度、例えば５０ｍＭのＴｒｉｓ中の懸濁液の安定性（例えば、混濁）が、本明細書に記載の標準濃度、例えば２５ｍＭのＴｒｉｓ中の懸濁液と比較され得る。好適性は、候補濃度の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有することにより示され得る。
【０１６３】
塩
懸濁液に使用される塩は、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼす主な因子であり得、例えば、該懸濁液中の塩の含有量は、脱アミド化速度および／または懸濁液中のｈＧＨ複合体型結晶のレベルに影響を及ぼし得る。一例として、塩の含有量が高い（例えば、イオン強度が増大する）ほど、もたらされ得る脱アミド化は少なくなる。脱アミド化は、例えば、カチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。
【０１６４】
ある実施形態において、塩は、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなどのナトリウム塩であり得る。好ましい実施形態では、塩化ナトリウムが該懸濁液に使用される。また、塩濃度は種々であり得、例えば、該濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、例えば約６０ｍＭ〜約２００ｍＭであり得る。
【０１６５】
候補緩衝液は、試験塩、２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば脱アミド化の量として測定される候補塩を有する該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、組成物の塩が本明細書に記載の塩であること以外は試験条件と類似した組成物であり得、例えば、標準の塩は塩化ナトリウムであり得る。試験品（試験塩を有する該懸濁液）と標準（塩化ナトリウムを有する該懸濁液）の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、試験懸濁液の安定性が増大していること（例えば、脱アミド化の量がより少ないことで測定）により示され得る。別の標準は、該懸濁液が候補塩の代わりに本明細書に記載の別の塩、例えば酢酸ナトリウムを有すること以外は試験懸濁液と類似した懸濁液であり得る。好適性は、候補塩を有する該懸濁液が酢酸ナトリウムを有する該懸濁液よりも、安定性に対して良好または同等な効果を有することにより示され得る。また、別の例として、所与の塩の濃度も試験され得、例えば、試験濃度、例えば２０ｍＭの塩化ナトリウムを有する懸濁液の安定性（例えば、脱アミド化）が、本明細書に記載の標準濃度、例えば６０ｍＭの塩化ナトリウムを有する懸濁液のものと比較され得る。好適性は、候補濃度の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有することにより示され得る。
【０１６６】
懸濁化剤
懸濁液に使用される懸濁化剤は、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼす主な因子であり得る。例えば、該懸濁液中の懸濁化剤は、化学分解速度および／または脱アミド化速度および／または懸濁液中のｈＧＨ複合体型結晶のレベルに影響を及ぼし得る。懸濁化剤がないか、または少量だと、該懸濁液のケーキングがもたらされ得る。化学分解は、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定され得る。脱アミド化は、例えば、カチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。
【０１６７】
ある実施形態において、懸濁化剤は、ポリエチレングリコール、マンニトール、グリシン、またはスクロースであり得る。好ましい実施形態では、懸濁化剤は、ポリエチレングリコール、マンニトール、またはグリシンであり得る。より好ましい実施形態では、懸濁化剤は、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ６０００またはＰＥＧ８０００などのポリエチレングリコールである。また、懸濁化剤の量は種々であり得、例えば、該量は約２．５％〜約２０％であり得る。
【０１６８】
候補懸濁化剤は、試験懸濁化剤、２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、１００ｍＭの酢酸ＮａをｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば脱アミド化の量として測定される候補懸濁化剤を有する該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、組成物の懸濁化剤が本明細書に記載の懸濁化剤であること以外は試験条件と類似した組成物であり得、例えば、標準はＰＥＧ８０００であり得る。試験品（試験懸濁化剤を有する該懸濁液）と標準（ＰＥＧ８０００を有する該懸濁液）の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、試験懸濁液の安定性が増大していること（例えば、脱アミド化の量がより少ないことで測定）により示され得る。別の標準は、該懸濁液が、候補懸濁化剤の代わりに本明細書に記載の別の懸濁化剤、例えばＰＥＧ６０００を有すること以外は試験懸濁液と類似した懸濁液であり得る。好適性は、候補懸濁化剤を有する該懸濁液がＰＥＧ６０００を有する該懸濁液よりも、安定性に対して良好または同等な効果を有することにより示され得る。また、別の例として、所与の懸濁化剤の濃度が試験され得、例えば、試験量、例えば２５％のＰＥＧを有する懸濁液の安定性（例えば、脱アミド化）が、本明細書に記載の標準濃度、例えば５％のＰＥＧを有する懸濁液のものと比較され得る。好適性は、候補量の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有することにより示され得る。
【０１６９】
ｈＧＨの濃度
懸濁液中のポリＡｒｇ複合体型結晶の濃度は、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼす別の因子であり得る。例えば、高濃度では、該懸濁液は粘稠性となり得る。タンパク質の安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、酸化のレベルまたは速度に関してアッセイされ得る。また、安定性は、カチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）により、脱アミド化のレベルまたは速度に関して測定され得る。
【０１７０】
ある実施形態において、該濃度は約５〜約５０ｍｇ／ｍｌであり得る。好ましい実施形態では、該濃度は約２０〜約３０ｍｇ／ｍｌである。
【０１７１】
候補濃度は、試験濃度のｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば脱アミド化の量として測定される候補濃度における該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、組成物の濃度が本明細書に記載の濃度、例えば約３５ｍｇ／ｍｌであること以外は試験条件と類似した組成物であり得る。試験品（試験濃度の該懸濁液）と標準（２５ｍｇ／ｍｌの該懸濁液）の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、候補濃度の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有すること（例えば、脱アミド化の量がより少ないことで測定）により示され得る。
【０１７２】
ｈＧＨ対ポリＡｒｇ比
懸濁液中の該複合体型結晶におけるポリＡｒｇに対するｈＧＨの比は、該結晶の安定性に影響を及ぼす別の因子であり得る。例えば、ポリＡｒｇに対するｈＧＨの比が小さいと、ポリＡｒｇに対するｈＧＨの比が大きい（例えば、比（ｒａｔｉｏｎ）が７）ときより分解レベルが高くなり得ることが考えられ得る。分解は、例えば逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって測定され得る。
【０１７３】
ある実施形態において、ポリＡｒｇに対するｈＧＨの比は約３〜約１５であり得る。好ましい実施形態では、該比は約７〜約１１である。
【０１７４】
候補比は、ポリＡｒｇに対するｈＧＨの比を改変させる試験量のポリＡｒｇ、２５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば酸化の量として測定される候補比の該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、組成物のポリＡｒｇに対するｈＧＨの比が本明細書に記載の比、例えば５である（すなわち、ポリＡｒｇが５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する）こと以外は試験条件と類似した組成物であり得る。試験品（試験比の該懸濁液）と標準（比が５の該懸濁液）の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、候補比の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有すること（例えば、酸化レベルがより低いことで測定）により示され得る。
【０１７５】
保存容器および容器の閉鎖部
懸濁液を保存するために使用する容器の選択および／または容器の閉鎖部の選択は、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼし得る。例えば、容器および／または閉鎖部の選択は、用量の一貫性または製剤の減損に影響を及ぼし得る。例えば、結晶は、バイアルのボトルネック部に蓄積されることがあり得、あるいは閉鎖部（例えば、閉鎖部の壁面上）に蓄積されることがあり得る。さらに、容器および／またはその閉鎖部の形状もまた、用量の一貫性に影響を及ぼし得る。用量の一貫性は、例えば、回収されたｈＧＨ濃縮物の量を測定することにより、または例えば試料の撹拌後の抽出可能重量を測定することにより測定され得る。
【０１７６】
ある実施形態では、種々の材質で作製されたバイアルおよびプレフィルドシリンジが使用され、例えば、シリコーン処理された、プラスチック（例えば、ＣＺ）レジン製、またはポリプロピレン製のバイアルが使用される。ある実施形態では、該閉鎖部は、テフロン（登録商標）コーティングされた栓（例えば、Ｄｉｅｋｙｏ  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ栓）またはゴム栓、例えばブチルゴム栓、例えばＷｅｓｔ  ４４３２／５０であり得る。好ましい実施形態では、シリコーン処理された容器、特に円筒状のシリコーン処理またはコーティングされた表面を有する容器が使用される。より好ましい実施形態では、シリコーン処理されたプレフィルドシリンジが使用される。好ましい実施形態では、テフロン（登録商標）またはブチルゴム栓が閉鎖部として使用される。
【０１７７】
候補容器は、２５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍｌのポリＡｒｇ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を、試験容器内に提供することにより試験され得る。例えば抽出可能重量の量として測定される候補容器内の該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、本明細書に記載の容器内、例えばプレフィルドシリンジに保存された組成物であり得る。候補容器内および標準容器内の該懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、候補容器内の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有すること（例えば、体重回復によって測定）により示され得る。
【０１７８】
候補容器閉鎖部は、同様にして評価され得る。
【０１７９】
上部空間
最後に、容器の上部空間もまたタンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。例えば、容器の閉鎖部の上部空間は、送達用量の一貫性に対して有意な影響を有し得る。
【０１８０】
ある実施形態において、ニードルステイクを有するプレフィルドシリンジは、ｈＧＨ複合体型結晶または任意のタンパク質結晶製剤のための限定的な死容積（２〜５μＬの範囲）があるため好ましい。プレフィルドシリンジにはボトルネックがない；また、上部空間はずっと小さく、栓の配置によって調整され得る；プランジャーにより、ほぼすべての結晶がシリンジバレル（死容積を除く）から押出され得る。他の容器、例えばバイアルもまた使用され得る。好ましい実施形態では、容器の閉鎖部内に存在する上部空間は最小限であるか、または存在しない。製造会社は、上部空間なしで材料を充填することがあり得る。限定的な上部空間は、用量の一貫性のため、タンパク質結晶に使用される容器の閉鎖部に好ましい。最も好ましい実施形態では、ニードルステイクおよび１０ｍｍ未満の上部空間を有するプレフィルドシリンジが、タンパク質結晶の非経口製剤に、より適している。
【０１８１】
保存料
保存料は、例えば抗菌性保存料が、反復用量医薬製剤の調製物に使用され得る。懸濁液状のポリＡｒｇ複合体型結晶製剤における保存料の任意選択的な添加およびその濃度は、ｈＧＨ複合体型結晶（ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の懸濁液）の安定性に影響を及ぼす因子であり得る。例えば、保存料の存在は、該複合体型ｈＧＨの安定性、結晶構造および／または有効性（例えば、放出プロフィール）に影響を及ぼし得る。結晶構造は、顕微鏡法によってアッセイされ得る。放出プロフィールは、製剤の上清み中のｈＧＨの濃度をアッセイすること、または製剤中の遊離ｈＧＨの割合を計算することにより測定され得る。
【０１８２】
ある実施形態において、保存料は、フェノール、メタ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール（ｃｌｏｒｏｂｕｔａｎｏｌ）であり得る。好ましい実施形態では、保存料がフェノールまたはｍ−クレゾールである。より好ましい実施形態では、保存料がフェノールである。また、保存料の量は種々であり得、例えば、該量は、好ましくは約０．１％〜約１％であり得る。
【０１８３】
候補保存料は、候補保存料、２５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば製剤の上清み中のｈＧＨの濃度として測定される候補保存料を有する該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、保存料を存在させないこと以外は試験条件と類似した組成物であり得る。試験品（製剤の上清み中に試験濃度のｈＧＨを有する該懸濁液）と標準（保存料を含まない該懸濁液）の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、候補保存料を有する該懸濁液が安定性に対して良好または同等な効果を有すること（例えば、上清み中のｈＧＨの量がより少ないことで測定）により示され得る。また、別の例として、所与の保存料の濃度が試験され得、例えば、試験量、例えば２％のフェノールを有する懸濁液の安定性が、本明細書に記載の標準濃度、例えば０．５％のフェノールを有する懸濁液と比較され得る。好適性は、該候補量の該懸濁液が安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有することにより示され得る。
【０１８４】
ヒアルロン酸
ヒアルロン酸（「ＨＡ」）もまた、本明細書に記載の製剤に含めることがあり得る。本開示においては、ＨＡとその塩の両方の使用が想定される。例えば、ＨＡにより、結晶の過剰な電荷が緩和され得、それにより、ＨＡを使用しない場合は複合体型ｈＧＨ結晶製剤の投与によって引きこされ得る注射部位での反応の可能性が低減され得る。他の利点としては、被検体（例えば、ヒト）への投与後の複合体型結晶の徐放プロフィールへの寄与、微細ゲージ（ｆｉｎｅ  ｇａｕｇｅｄ）（例えば、非常に微細なゲージ、例えば３０ゲージ）針での注射が可能、複合体の結晶化度および完全性の経時的な保持が挙げられ得る。ある実施形態では、ＨＡの使用により、ｈＧＨの放出プロフィールまたはインビボ有効性は改変されない。
【０１８５】
好ましい実施形態において、ＨＡを製剤中に、約０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．２％（ｗ／ｖ）の量で存在させる。
【０１８６】
ＨＡの候補濃度は、試験濃度のＨＡ、２５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００をｐＨ６．５のリン酸緩衝液中に含有するポリＡｒｇ複合体型結晶性ｒｈＧＨ懸濁液を提供することにより試験され得る。例えば溶解速度（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定）として測定される該候補濃度での該懸濁液の安定性を、所定の時点で、１つ以上の標準と比較する。例えば、好適な標準は、組成物のＨＡ濃度が本明細書に記載の濃度、例えば約０．２％（ｗ／ｖ）であること以外は試験条件と類似した組成物であり得る。試験品（試験濃度の該懸濁液）と標準（０．２％ＨＡの該懸濁液））の懸濁液の安定性を比較する。好適性は、標準と比べて、候補濃度の該懸濁液が、安定性について標準濃度の該懸濁液と同等またはそれよりも良好な効果を有すること（例えば、溶解速度の増大がないことによって測定）により示され得る。
【０１８７】
凍結乾燥製剤
ｈＧＨ結晶の凍結乾燥製剤
凍結乾燥されたｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体タンパク質製剤（例えば、ポリＡｒｇと複合体形成されたもの）（例えば、凍結乾燥調製物の再構成後）では、ｈＧＨ製剤の安定性が増大され得る。例えば、本明細書に記載の凍結乾燥製剤は、冷蔵温度または室温で約２４ヶ月以上の化学安定性が得られることが予測される。
【０１８８】
該製剤のの安定性に影響を及ぼし得る因子としては、緩衝液、ｐＨ、塩、懸濁化剤、保存料、および保存容器の選択が挙げられる。対象のタンパク質の安定性を増大させるために、これらの因子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは全部が改変または制御され得る。
【０１８９】
例えば、本明細書に記載のように、ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の凍結乾燥製剤は、好ましくは、以下：７〜９のｐＨ範囲の緩衝液（好ましくは、Ｔｒｉｓまたはヒスチジンとリン酸塩の組合せ）を用いて調製されていること、塩（好ましくは、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム）、および懸濁化剤（好ましくは、ポリエチレングリコール６０００または８０００）の１つ以上を含むものである。また、一部の製剤では、保存料が含まれる。このような製剤に適合する容器の閉鎖部系としては、シリコーン処理またはコーティングされたバイアル、例えば、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｉ型＋コーティングガラスバイアルが挙げられる。
【０１９０】
これらの成分および量は、凍結乾燥前の製剤に適したものであり、また、凍結乾燥ｈＧＨを再構成させた後の製剤に適したものである。例えば、所与の容量の凍結乾燥前の製剤は、所与の組成、例えば、２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５を有するものであり得る。凍結乾燥後の結晶を再構成するため、凍結乾燥前の製剤の容量に相当する容量の液体（例えば、生理食塩水または水、好ましくは水）を添加して凍結乾燥調製物を再構成する。同じ容量を使用したため、凍結乾燥後の調製物は、凍結乾燥前の製剤と同じまたは実質的に同じ組成を有する。調製物を再構成するためにどのような液体を使用したかに応じて、凍結乾燥後の調製物中にはさらなる成分が存在することがあり得る（例えば、水の代わりに生理食塩水を再構成に使用した場合、塩濃度が増大し得る）。任意選択で、再構成のために添加される液体の量は、該タンパク質結晶によって占められていた凍結乾燥前容量となるように調整され得る。したがって、凍結乾燥後の製剤の総容量が凍結乾燥前の総容量にする容量の液体が添加される。別の択一例として、再構成のために異なる（例えば、より少ない、またはより多い容量）の液体を用いて、製剤の成分を希釈（より多くの容量を使用した場合）、または濃縮（より少ない容量を使用した場合）することができる。
【０１９１】
これらの因子の最適化および好適性の決定は、上記のようにして行なわれ得る。
【０１９２】
一般的に、凍結乾燥（フリーズドライとしても知られる）は、傷みやすい物質を保存するするため、または該物質の移送をより簡便にするために典型的に使用される脱水プロセスである。フリーズドライは、物質を凍結させ、次いで周辺圧を下げ、充分な熱を加えて該物質内の凍結水を固相から気体に直接昇華させることによりなされる。製剤、例えばタンパク質またはタンパク質結晶を凍結乾燥させると、より安定となり得るか、またはその後の使用で水に溶解し易くなり得る。
【０１９３】
典型的な凍結乾燥の説明は以下のとおりである。完全な凍結乾燥プロセスには、凍結、一次乾燥、および二次乾燥の３つの段階がある。
【０１９４】
凍結：凍結プロセスは、物質を凍結することからなる。これは、多くの場合、物質をフリーズドライ用フラスコ内に入れ、このフラスコをドライアイスとメタノールの浴内、または液体窒素中で回転させることにより行なわれる。大規模では、凍結は、通常フリーズドライ機を用いて行なわれる。物質をその共融点より下の温度で凍結させることは重要である。共融点は、物質の固相と液相が共存し得る最低温度に存在するため、この点より下の温度での物質の凍結により、その後の工程で融解ではなく昇華が起こることが確実となる。
【０１９５】
一次乾燥：一次乾燥期の間は、圧力を下げ、充分な熱を物質に供給して水分を昇華させる。必要な熱の量は、分子の昇華潜熱の転化を用いて計算され得る。この最初の乾燥期で、物質中の水分の約９８％を昇華させる。熱を加えすぎると物質の構造が改変され得るため、この期は低速で行なわれ得る。
【０１９６】
この期では、圧力は、部分真空の適用により制御される。真空により昇華が加速され、意図的な乾燥プロセスとして有用となる。さらに、低温冷却器チャンバおよび／または冷却器プレートにより、水蒸気に再凝固のための表面（１つまたは複数）が提供される。この冷却器は、物質を凍結状態で維持する役割は果たさない。そうではなく、水蒸気が真空ポンプに達すること（これは、ポンプの性能を低下させ得る）を妨げる。冷却器の温度は、多くの場合、１０℃未満、例えば−３０℃または−５０℃、例えば、これらの温度より下の範囲である。
【０１９７】
二次乾燥：可動性の水分子は一次乾燥期で昇華されているため、二次乾燥期では、凍結プロセス中に吸着された水分子を昇華させることを目的とする。フリーズドライプロセスのこの部分は、物質の吸着等温線に支配される。この期では、温度を一次乾燥期よりもさらに高く上昇させ、水分子と凍結した物質間に形成されたいかなる物理化学的相互作用をも破壊させる。また、通常、この段階では昇華を促すために圧力を下げる。しかしながら、圧力上昇の恩恵を受ける製剤もある。
【０１９８】
フリーズドライプロセスの終了後、通常、窒素などの不活性ガスで真空を解除した後、該物質を密封する。
【０１９９】
フリーズドライ製剤の特性：湿分の再吸収を抑制するためにフリーズドライ物質を密封した場合、該物質は冷蔵せずに室温で保存され得、該プロセスにより、医薬品の貯蔵寿命を長くすることができる。
【０２００】
また、凍結乾燥により、高温を用いる他の脱水方法よりは少ないが、該物質への損傷がが引き起こされる。通常、凍結乾燥では、乾燥対象の物質の収縮または強化は引き起こされない。
【０２０１】
凍結乾燥製剤は、微小細孔が生じているため、ずっと速く容易に再水和（再構成）され得る。この細孔は、氷の結晶が昇華してその位置に隙間または細孔が残ったことにより生成したものである。これは、医薬用途に関する場合、特に重要である。
【０２０２】
解析方法
製剤の開発は、以下の特徴：種々の温度での保存安定性、用量の一貫性の関数としての容器と閉鎖部の適合性、付着の可能性、製剤の投与の容易さ、および容器の閉鎖部に対するロスによって評価され得る。安定性の試験方法およびその適用を以下の表１に示す。
【０２０３】
【表１】
2015214573.tif 000003
化学分解
アレニウスプロット反応速度論を使用し、短期安定性データ（例えば、５０℃、４０℃、３５℃、３０℃および２５℃などの高い保存温度でストレス負荷した試料から得られたもの）を用いて、２〜８℃での化学分解速度が予測され得る。２〜８℃の外挿データを用いて、提案貯蔵寿命または有効期限が確立され得る。
【０２０４】
アレニウスの安定性予測を用いて、候補製剤が試験され得る。アレニウスストレスモデルは、加速試験に使用される一般的な寿命ストレスに関連するものである。これは、刺激または加速可変量（脱アミド化、酸化など）が熱的なもの（すなわち、温度）である場合に広く使用されている。これは、スウェーデンの物理化学者スヴァンテ・アレニウスによって示されたアレニウス反応速度式から誘導される。５℃での分解速度は、いくつかの高温での安定性の結果を用いて予測され得る。例えば、Ｆｌｕｒｏｔｅｃｋ栓を有するプレフィルドシリンジ内のポリＡｒｇ（ｐＲ）複合体型結晶の試料を、２〜８℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃および５０℃で置く。既報のデータに基づき、アレニウスの式を適用して５℃での分解速度を予測する。その結果は、同じ方法によって解析された既知／標準ロットの実際の安定性と比較され得る。
【０２０５】
また、製剤は、溶解プロフィールアッセイにより、比較用の標準ｈＧＨ製剤を用いて試験され得る。
【０２０６】
以下は、結晶性ｈＧＨを含有する製剤を評価するために行なわれ得る解析方法の例である。
【０２０７】
ｈＧＨ含有量
ポリＡｒｇと複合体形成されたｈＧＨ結晶を含む懸濁液のｈＧＨ含有量は、ＵＶ分光測光法によって測定され得る。ポリＡｒｇと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液を５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．６に溶解させ、２８０ｎｍにおける吸光度を測定する。ＨＧＨの濃度は、測定された吸光度値に希釈率を乗算し、次いで、ｒｈＧＨの吸光係数０．７５ｍＬ・ｍｇ−１・ｃｍ−１で除算することにより計算される。
【０２０８】
濁度
ポリＡｒｇと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液の濁度は、ＵＶ分光測光法によって測定され得る。ポリＡｒｇと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液を５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．６に溶解させ、３２０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【０２０９】
粒径分布
粒径分布を値を求めると、ポリＡｒｇと複合体形成されたｈＧＨ結晶を含む懸濁液の製造プロセスの一貫性が評価され得る。粒径分布は、微小容量モジュールを備えたＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ、Ｆｌｏｒｉｄａ）を使用し、レーザー回折によって測定され得る。試料を、試料緩衝液または１×ＰＢＳまたは製剤化ビヒクル中に希釈し、８〜１２％の不透明性の機能範囲を得る。各試料を３連で解析し、フラウンホーファー光学モデルを用いてデータ解析を行なう。１０％（ｄｌ１０）、５０％（メジアン）および９０％（ｄｌ９０）の累積分布限界を表す容量を報告する。この試験方法は、製剤安定性試験でも同様に行なわれ得る（すなわち、保存時の粒子分布の変化の可能性を評価するため）。
【０２１０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ（酸化のパーセンテージ、およびポリ−Ｌ−アルギニン含有量）
これらの解析には、同じ移動相とカラムが使用され得る。ポリＬアルギニン（ポリＡｒｇ）定量のための方法は、２１４ｎｍで行なわれ得、ｈＧＨの定量は２８０ｎｍで行なわれ得る。ポリＬアルギニンおよびｈＧＨの量を用いて、上清みおよび総ポリ−Ｌ−アルギニン含有量に対する遊離ｈＧＨを計算し、報告する。ＨＧＨ／ポリＡｒｇ比（質量対質量）は、消散係数０．７５を用い、ＯＤ２８０から誘導される総ｈＧＨ濃度を用いて計算され得る。ポリ−Ｌ−アルギニンの定量は、ポリ−Ｌ−アルギニン標準の較正曲線を使用することにより行なわれ得る。試験試料中のポリＬ−アルギニンの濃度は、ポリ−Ｌ−アルギニン標準の線形回帰直線に基づいて測定され得る。Ｃ５  Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅカラム（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３μｍ粒径、３００Ａ細孔径）が使用され得る。ＨＰＬＣ解析用のｈＧＨ試料は、５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．６での溶解によって調製され得る。ｒｈＧＨの溶出は、１．０ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む水）および移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）で構成される移動相勾配を使用し、以下のとおりに行なわれる：９５％Ａ／５％Ｂで０〜２分間保持、２〜８分間で５０％Ａ／５０％Ｂに線形変更、８〜２０分間で３０％Ａ／７０％Ｂに線形変更、２０〜２２分間で１０％Ａ／９０％Ｂに線形変更、１０％Ａ／９０％Ｂで２２〜２５分間保持した後、初期条件９５％Ａ／５％Ｂに戻す。酸化型ｒｈＧＨのピーク面積を計算し、非酸化型ｒｈＧＨのものと比較する。純度を、ｒｈＧＨに関連するすべてのピークの総面積に対する酸化型のピークのピーク面積の割合として計算する。
【０２１１】
可溶性凝集体（高分子量の％）
ｒｈＧＨの高分子量の可溶性凝集体はｒｈＧＨモノマーから、サイズ排除ＨＰＬＣによって分離され得る。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ  ２０００（７．８ｍｍ内径×６０ｃｍ）カラムが使用され得る。ＨＰＬＣ解析用のｈＧＨ試料は、ｐＨ２．６の５０ｍＭグリシン緩衝液での溶解によって調製され得る。ｒｈＧＨの溶出は、０．４ｍＬ／分の流速で、６０ｍＭリン酸ナトリウム、３％イソプロパノール、ｐＨ７．０からなる移動相を用いて定組成的に行なわれる。ｒｈＧＨモノマーおよび凝集体の検出は、２８０ｎｍで行なわれる。凝集ｒｈＧＨのピーク面積を測定し、ｒｈＧＨモノマーピークのものと比較する。ｒｈＧＨのメインピークより前のピークはｒｈＧＨの凝集種である。凝集体の割合を、ｒｈＧＨタンパク質のすべてのピークの総面積に対する凝集体のピークのピーク面積の割合として計算する。
【０２１２】
脱アミド化および他の分解
脱アミド化型ｒｈＧＨのピークは非脱アミド化型ｒｈＧＨから、カチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって分離され得る。ＰｏｌｙＬＣ  ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ  Ａ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ、５μｍ、３００Å）カラムが使用され得る。ＨＰＬＣ解析用のｈＧＨ試料は、５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．６での溶解によって調製され得る。ｒｈＧＨの溶出は、１．０ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６）および移動相Ｂ（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ４．６）で構成される漸増塩濃度の移動相勾配を用いて、以下のとおりに行なわれる：１００％Ａ／０％Ｂで開始、０  ５分間で８０％Ａ／２０％Ｂに線形変更、５〜４０分間で４０％Ａ／６０％Ｂに線形変更、４〜４５分間で０％Ａ／１００％Ｂに線形変更、そして５分で初期条件（１００％Ａ）に戻す。脱アミド化型および非脱アミド化型ｒｈＧＨの検出は、２８０ｎｍで行なった。ストレス負荷試料におけるｒｈＧＨのメインピークより前のピークは、おそらく脱アミド化型および分解されたｒｈＧＨ種である。脱アミド化型ｒｈＧＨのピーク面積を計算し、非脱アミド化型ｒｈＧＨのものと比較する。純度を、ｒｈＧＨに関連するすべてのタンパク質ピークの総面積に対する分解された種のピークのピーク面積の割合として計算する。
【０２１３】
溶解プロフィール
ｈＧＨ結晶の溶解試験を開発し、適当な緩衝液中へのポリＬアルギニンコートｈＧＨ結晶の溶解が行なわれている際の関連パラメータをモニターする。溶解緩衝液として、クエン酸塩、ｐＨ５．０が使用され得る。複合体型ｈＧＨの溶解速度を、一定ｍｇのｈＧＨ結晶、クエン酸塩（ｐＨ５．０）媒体中、一定の攪拌速度および３７℃の条件下で測定する。最初に分散を行なった後、遠心分離により上清みを除去し、次いで生理学的条件と類似した新たな媒体を補給する。この手順を１５分毎に１時間まで繰り返し、次いで溶解速度を計算する。
【０２１４】
また、溶解速度はＵＶ吸光度またはＲＰ−ＨＰＬＣ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によっても測定され得る。
【０２１５】
生体活性およびｐＫプロフィール
インビボ評価に使用される種は、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ウィスターラット、下垂体を切除したもの）であり得る。処置群は、適合週用量レベルで結晶性ｈＧＨと市販のｈＧＨ製剤との同等性が測定されるように設計する。希釈した試験品を、脊椎の両側の胸腰領域にゆっくりと皮下注射する。針を脊椎から遠いところに指向し、中心（ｈｕｂ）まで挿入した後、いずれかの物質を注射した。注射部位は、注射を容易にする必要性に応じて、投与３日前および投与後に剃毛し、印をつける。用量はすべて、３００μＬ容シリンジ（ＢＤパーツ番号ＢＤ  ３２０４３８）に装着した３０ゲージ×８ｍｍの針を用いて投与する。シリンジ上に印が付けられた各単回単位は、１０μＬに相当する。懸濁液または溶液の均一性を確実にするため、希釈した対照および試験品を、シリンジ内に吸引する前に気泡が発生しないように注意深く反転させる。この実験は、下垂体を切除した雄ウィスターラットに投与した場合のｈＧＨ製剤の生体活性を比較するための方法を提供する。比較が行なわれる対象の対照ｈＧＨ製剤の選択は、一部、標準的なラット体重増加アッセイで既に確立された有効性に基づいて行なわれ得る。試験物質または対照物質を、下垂体を切除した雄ウィスターラット（９ラット／群）に皮下（ＳＣ）注射によって投与する。例えば、５．６ｍｇ／ｋｇの対照製剤および試験製剤の単回ＳＣ注射を受けた後の下垂体を切除したラットの成長が比較され得る。別の例として、０．８ｍｇ／ｋｇの市販の可溶性ｒｈＧＨ（例えば、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ）のＳＣ注射を毎日７日間（すなわち、５．６ｍｇ／ｋｇ／週）が、対照として使用され得る。投与開始前毎週および第−７日から（投与前の７日間）第８日の観察期間の最後まで毎日、体重を測定する。また、別個の試験におけるｐＫプロフィールアッセイでの血中ｈＧＨレベルの測定のための血液が採取され得る。血中ｈＧＨレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。
【０２１６】
医薬製剤
本明細書に記載の結晶性タンパク質製剤、例えば、ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶は、治療用途のため、例えば、ｈＧＨの不足または欠乏に苦しむ被検体を治療するための医薬製剤に製剤化され得る。
【０２１７】
ヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶は、任意の薬学的に許容され得る賦形剤と合わされ得る。本開示によれば、「薬学的に許容され得る賦形剤」は、医薬組成物に使用される充填剤または充填剤の組合せとしての機能を果たす賦形剤である。このカテゴリーに含まれる好ましい賦形剤は、１）アミノ酸（グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、プロリンなど）；２）糖質、例えば、単糖類（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボースなど）；３）二糖類（ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースなど）；４）多糖類（マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲンなど）；５）アルジトール（マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトールなど）；６）グルクロン酸、ガラクツロン酸；７）シクロデキストリン（メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；８）無機分子（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのリン酸塩、ホウ酸、炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムなど）；９）有機分子（アセテート、シトレート、アスコルベート、ラクテートなど）；１０）乳化剤または可溶化剤／安定化剤（アカシア、ジエタノールアミン、グリセリルモノステアレート、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体など）；ならびに１１）増粘試薬（寒天、アルギン酸およびその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその誘導体  プロピレンカーボネート、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールなど）である。また、かかる化合物の塩も使用され得る。さらに好ましい賦形剤の群には、スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、マンニトール、イノシトール、ナトリウムおよびカリウムの塩（酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩およびホウ酸塩など）、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリリシンならびにポリアルギニンが含まれる。
【０２１８】
本開示のある実施形態において、賦形剤は、アミノ酸、塩、アルコール、糖質、タンパク質、脂質、界面活性剤、ポリマー、ポリアミノ酸およびその混合物からなる群より選択される。ある好ましい実施形態では、賦形剤が、プロタミン、ポリビニルアルコール、シクロデキストリン、デキストラン、グルコン酸カルシウム、ポリアミノ酸（ポリアルギニンなど）、ポリリシンおよびポリグルタメート、ポリエチレングリコール、デンドリマー、ポリオルニチン（ｏｒｔｈｉｎｉｎｅ）、ポリエチレンイミン、キトサンおよびその混合物からなる群より選択される。より好ましい実施形態では、賦形剤が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリエチレングリコールおよびその混合物からなる群より選択される。
【０２１９】
また、本開示によるヒト成長ホルモンまたはヒト成長ホルモン誘導体の結晶は、治療剤に添加するとその作用が加速または改善される物質である担体または賦形剤と合わされ得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｗｅｂ．ｎｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｏｍｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのＴｈｅ  Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙを参照のこと）。担体または賦形剤の例としては、例えば、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩（ｓｌａｔ）、コロイド状シリカ、マグネシウム、三ケイ酸塩、セルロース系物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。ゲル基剤形態のための担体または賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックコポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックスアルコールが挙げられ得る。
【０２２０】
また他の好ましい実施形態において、賦形剤はプロタミンである。さらに、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶とプロタミンは、約５：１〜約１：１０（ｗ／ｗ）のｈＧＨ：プロタミン比で存在する。また、該比は、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。最も好ましくは、該比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）の範囲である。代替的な実施形態によれば、該比は約３：１〜約１：１０（ｗ／ｗ）である。他のある実施形態において、該比は約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）である。また、さらなる実施形態では、該比は約５：１（ｗ／ｗ）である。
【０２２１】
別の態様において、薬学的に許容され得る賦形剤は、ポリアミノ酸、例えば、ポリリシン、ポリアルギニンおよびポリグルタメートからなる群より選択される。好ましい実施形態では、賦形剤がポリリシンである。より好ましい実施形態では、ポリリシンが、約１，５００〜約８，０００ｋＤの分子量を有するものである。他のある実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶とポリリシンが約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）のｈＧＨ：ポリリシン比で存在する。また、該比は、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。最も好ましくは、該比は、約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）の範囲である。代替的な実施形態によれば、該比は約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、該比は約５：１（ｗ／ｗ）である。
【０２２２】
また他の好ましい実施形態において、賦形剤はポリアルギニンである。より好ましい実施形態では、ポリアルギニンは、約１５，０００〜約６０，０００ｋＤの分子量を有するものである。他のある実施形態において、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶とポリアルギニンは、約５：１〜約４０：１（ｗ／ｗ）のｈＧＨ：ポリアルギニン比で存在する。また、該比は、約１０：１〜約２０：１（ｗ／ｗ）の範囲であり得る。最も好ましくは、該比は、約１２：１〜約３：１（ｗ／ｗ）の範囲である。代替的な実施形態によれば、該比は約５：１〜約１：５０（ｗ／ｗ）である。他のある実施形態では、該比は約１２：１〜約１５：１（ｗ／ｗ）である。さらなる実施形態では、該比は約５：１（ｗ／ｗ）である。
【０２２３】
本開示の他の実施形態は、約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を含む注射用結晶性懸濁液を含む。該懸濁液は、易再懸濁可能性、低速沈降、および約７日間の時間作用（ｔｉｍｅ  ａｃｔｉｏｎ）プロフィールを特徴とする。これは、週に１回、３０ゲージシリンジを用いて８０％の有効負荷量レベルが提供されるように注射され得る。該懸濁液は、実質的に純粋であり、これは、パラメータ０．０２％凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣ）および２．３％の関連タンパク質（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に反映される。この純度は、冷蔵され条件下で少なくとも約４ヶ月維持される。
【０２２４】
本開示の他の実施形態は、個体に導入されると、従来の可溶性のｈＧＨまたはｈＧＨ製剤と比べて、遅延溶解挙動を有することを特徴とするｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶に関する。本開示によれば、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の溶解は、インビトロまたはインビボいずれかの溶解パラメータで特徴付けられる。例えば、インビトロ溶解は、逐次溶解プロセスにおいて、１５分あたりまたは洗浄工程１回あたりで得られた可溶性ｈＧＨの濃度として示される（最初に存在していたｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体結晶すべての総量またはｍｇに対するパーセンテージとして表示）。他の実施形態において、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、３７℃の温度で溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌおよび０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３）に曝露させ、該ｈＧＨの濃度またはｈＧＨ誘導体が溶液中に約２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在しているとき、洗浄工程１回あたりの前記結晶約２〜約１６％のインビトロ溶解速度を特徴とする。別の実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、逐次溶解プロセスの洗浄工程１回あたり前記結晶約０．０４〜約０．３２ｍｇのインビトロ溶解速度を特徴とする。他方、インビボ溶解は、哺乳動物へのｈＧＨの単回注射後の哺乳動物における経時的なｈＧＨの血清レベルによって示される。
【０２２５】
治療用途および投薬量
哺乳動物において、ＧＨは、組織を刺激してタンパク質ＩＧＦ−１を合成および分泌させ、このタンパク質は、次いで細胞分裂および代謝プロセスにある役割を果たす。当業者には認識されるように、血清ｈＧＨおよびＩＧＦ−１レベルは、多くの因子、例えば、生理学的および処置関連因子に依存する。かかる因子としては、限定されないが、生理学的因子、例えば、実年齢および骨年齢、性別、体重、発達段階（例えば、思春期の成長レベル）ならびに処置関連因子、例えば、用量、投与速度（動態）および投与経路など、ならびに患者の診断および病歴などが挙げられる。また、当業者には、種々の患者集団に対して種々のｈＧＨレベルおよびＩＧＦ−１レベルが、安全性と有効性の両方の観点から有益であり得ることが認識される。
【０２２６】
さまざまなｈＧＨの不足、疾患状態または症候群に苦しむ成人または小児は、本開示によるｈＧＨ結晶またはｈＧＨ誘導体結晶を用いたｈＧＨを体外からの送達する種々のレジメンによって処置され得る。例えば、内分泌科医は、小児に対して、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週の用量を用いて治療を開始し、処置の数週間または数ヶ月後、用量を約０．３ｍｇ／ｋｇ／週まで増大させ得、思春期の頃は、用量をさらに約０．７ｍｇ／ｋｇ／週まで増大させることがあり得る。また、当業者には認識されるように、ｈＧＨ送達を必要とする成人または小児に投与されるかかる体外送達ｈＧＨのレベルは、ｈＧＨの既存の生理学的レベルまたは濃度に依存する。
【０２２７】
成人または小児におけるｈＧＨの投薬レジメンは、多くの場合、ｍｇ／ｋｇまたは国際単位（ＩＵ／ｋｇ）で示される。かかるレジメンは、一般的に、１日または１週間のいずれかで、すなわち、ｍｇ／ｋｇ／日またはｍｇ／ｋｇ／週で計画される。かかる考慮事項を念頭におき、本開示の一実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与、例えば、３０ｋｇ小児に対して毎週約９ｍｇの単回投与により、投与後第１日目および第２日目に約１０ｎｇ／ｍｌより大きい、投与後第３日目および第４日目に約５ｎｇ／ｍｌより大きい、投与後第５日目〜第７日目に約０．３ｎｇ／ｍｌのインビボｈＧＨ血清濃度がもたらされる。あるいはまた、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、前記哺乳動物において、投与後約０．５時間〜約４０日間で、好ましくは投与後、約０．５時間〜約１０日間、７日間または１日のいずれかで、約０．３ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌのｈＧＨ、好ましくは約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌのｈＧＨ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのｈＧＨのインビボｈＧＨ血清濃度がもたらされる。同様に、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、前記哺乳動物において、投与後約０．５時間〜約４０日間で、好ましくは、投与後約１０日間、７日間または１日のいずれかで、約２ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより上、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより上、最も好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより上のインビボ血清濃度がもたらされる。本開示のより好ましい実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、哺乳動物において、約０．５時間〜約４０日間で、好ましくは、投与後約１０日間、７日間または１日のいずれかの期間で、約０．３ｎｇ／ｍｌより大きいｈＧＨのインビボ血清濃度がもたらされる。本開示の一実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の毎週の単回投与により、投与後第１日目および第２日目に約１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより大きい、投与後第３日目および第４日目に約５ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより大きい、投与後第５日目〜第７日目に約０．３ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより上のインビボｈＧＨ血清濃度がもたらされる。さらなる実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、投与後約０．５時間〜約１０日間で、約０．３ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨより大きいインビボ血清濃度がもたらされる。
【０２２８】
本開示の他の実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、投与後約１０時間〜約７２時間で５０ｎｇ／ｍｌより大きい、投与後約７２時間〜約１５日間、投与後好ましくは約１０日間で約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの、前記投与前のベースラインＩＧＦ−１レベルからのインビボでの血清ＩＧＦ−１上昇がもたらされる。あるいはまた、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、投与後約０．５時間〜約４０日間、好ましくは投与後約７日間で、約５ｎｇ／ｍｌ〜約２，５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌのインビボでの血清ＩＧＦ−１上昇がもたらされる。あるいはまた、本開示によるｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、投与後約０．５時間〜約４０日間、好ましくは投与後約７日間で約５０ｎｇ／ｍｌより上、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌより上のインビボでの血清ＩＧＦ−１上昇がもたらされ得る。本開示の一実施形態によれば、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物の単回投与により、投与後約１０時間〜約７２時間で約５０ｎｇ／ｍｌより大きい、投与後約７２時間〜約１５日間または投与後７２時間〜約１０日間で約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの、前記投与前のベースラインＩＧＦ−１レベルからのインビボでの血清ＩＧＦ−１上昇がもたらされる。
【０２２９】
本開示によれば、単回投与は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週のｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはかかる結晶を含む組成物と規定され、このとき、投与容量は０．１ｍｌ〜約１．５ｍｌである。例えば、小児の成長ホルモンの欠乏には、ｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはかかる結晶を含む組成物が約０．３ｍｇ／ｋｇ／週で、例えば、３０ｋｇの小児には約９ｍｇが投与され得る。ターナー症候群には、ｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体結晶またはかかる結晶を含む組成物が約０．３７５ｍｇ／ｋｇ／週で、例えば、３０ｋｇの小児には約１１．２５ｍｇが投与され得る。さらに、成人の成長ホルモンの欠乏には、ｈＧＨが約０．２ｍｇ／ｋｇ／週で、例えば、８０ｋｇの成人には約１６ｍｇが投与され得る。ＡＩＤＳるいそうには、ｈＧＨが６ｍｇ／日で、例えば４２ｍｇ／週で投与され得る。
【０２３０】
また他の実施形態において、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶またはかかる結晶を含む組成物は、哺乳動物において可溶性ｈＧＨのものと類似した相対バイオアベイラビリティを示す。本開示による結晶は、同じ経路（例えば、皮下または筋肉内注射）によって送達される可溶性ｈＧＨのものと比べて少なくとも５０％以上の相対バイオアベイラビリティを有し、ここで、バイオアベイラビリティは、前記可溶性ｈＧＨと前記結晶の総インビボｈＧＨ血清濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される。したがって、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、好都合なインビボ溶解速度を特徴とする。
【０２３１】
本開示は、さらに、ヒト成長ホルモンの欠乏もしくは不足と関連する障害、またはｈＧＨでの処置によって改善される障害を有する哺乳動物に、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を投与する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に、治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を投与する工程を含むものである。あるいはまた、該方法は、哺乳動物に、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を単独または賦形剤とともに含む組成物の有効量を投与する工程を含むものである。本開示によるｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶の種々の実施形態は、カルシウム結晶、一価の結晶、プロタミン結晶またはポリアルギニンｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶である。かかる結晶または該結晶を含む組成物は、約３日に１回、約週１回、約２週間に１回または約１ヶ月に１回の時間レジメンによって投与され得る。
【０２３２】
本開示により処置され得るｈＧＨの不足または欠乏に関連する障害としては、限定されないが、成人の成長ホルモンの欠乏、小児の成長ホルモンの欠乏、プラーダー‐ヴィリ症候群、ターナー症候群、短腸症候群、慢性腎不全、特発性低身長、小人症、下垂体機能低下性小人症、骨再生、女性の不妊症、胎内発育遅延、ＡＩＤＳ関連悪液質、クローン病、火傷、ならびに他の遺伝的および代謝性障害が挙げられる。本開示の一実施形態において、該障害は、小児の成長ホルモンの欠乏であり、処置すると、処置を受けている小児において、年間約７ｃｍ〜約１１ｃｍの成長速度がもたらされる。
【０２３３】
別の実施形態において、カルシウムのｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶が、哺乳動物において、骨治療の有用な補佐剤として、ならびにヒト成長ホルモンの欠乏の処置剤として供され得る。
【０２３４】
本開示はまた、前記哺乳動物に、治療有効量のｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶を投与する工程を含む、哺乳動物において体重増加を誘導するための方法を提供する。あるいはまた、かかる方法は、前記哺乳動物に、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶および賦形剤を含む組成物の治療有効量を投与する工程を含む。かかる方法の一実施形態において、下垂体を切除したラットにおいて誘導される体重増加は、週１回の注射による前記結晶の投与後で、約５％〜約４０％である。
【０２３５】
ｈＧＨの結晶、ｈＧＨ誘導体の結晶、またはこれらを単独もしくは賦形剤とともに含む組成物は、単独、または医薬調製物、治療用調製物もしくは予防用調製物の一部として投与され得る。これらは、任意の慣用的な投与経路、例えば、非経口、経口、肺経由、経鼻、耳経由、肛門経由、皮膚経由、眼経由、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜経由、舌下、皮下、経皮、局所、口腔または頭蓋内経路などによって投与され得る。
【０２３６】
一部のある実施形態において、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶、またはこれらを賦形剤とともに、もしくはなしで含む組成物（例えば、結晶性ｈＧＨの懸濁液を含有する製剤）は、経口経路または非経口経路によって投与される。好ましい実施形態では、ｈＧＨもしくはｈＧＨ誘導体の結晶、またはこれらを賦形剤とともに、もしくはなしで含む組成物は、皮下または筋肉内経路によって投与される。
【０２３７】
好ましい実施形態において、本開示の結晶または組成物は、２７以上のゲージを有する針を用いて、皮下経路により投与される。本開示の一実施形態において、針のゲージは３０であり得る。該結晶または組成物は、プレフィルドシリンジまたは定量（ｍｅｔａ  ｄｏｓｅ）注入ポンプで投与され得る。あるいはまた、これらは、ニードルフリー注射によって投与され得る。
【０２３８】
本開示により、哺乳動物内にｈＧＨの徐放が好都合に可能となる。一実施形態において、本開示による結晶または組成物は、約週１回投与される。別の実施形態では、本開示による結晶または組成物は、約２週間に１回投与される。また別の実施形態では、本開示による結晶または組成物は、約１ヶ月に１回投与される。当業者には、具体的な処置レジメンが、処置対象の疾患、処置される患者の年齢および体重、患者の全身的な体調ならびに処置担当医師の判断などの因子に依存することが認識される。
【０２３９】
キット
ポリＡｒｇ複合体型結晶性ｈＧＨを含有する製剤と、使用説明書と、任意選択で、該製剤を投与するためのデバイスとを含むキットもまた、本開示の一部である。製剤は、適当な容器内（例えば、バイアル、プレフィルドシリンジなど）に存在させ得る。使用説明書には、任意の形態、例えば、パンフレットもしくはシート、または使用説明書が得られるサイトへのワールドワイドウェブのアドレスが採用され得る。使用説明書には、例えば、保存および／または投与のための使用説明が含まれ得る。
【０２４０】
概論：結晶性タンパク質製剤のための無針注射システム
本開示は、さらに、被検体への投与のためのニードルフリー（ジェット式）注射器での使用のための治療用タンパク質の結晶性懸濁液の分野に関する。本開示はまた、無針（ｎｅｅｄｌｅｓｓ）注射に適した結晶性タンパク質製剤の調製方法を特徴とする。
【０２４１】
無針注射デバイスは、薬物投与の容易性を改善すること、注射回数を減らすこと、および場合によっては、注射時の痛みを軽減することにより、被検体のコンプライアンスを増大させることを補助する。一部のある態様において、結晶性タンパク質製剤は、可溶性製剤と比べて利点を有する。結晶化によりタンパク質の放出時間が延長され得、それにより投与頻度が低減され、場合によっては、被検体のコンプライアンスが増大する。一例として、結晶性インスリン製剤が利用可能である。結晶化技術を使用することによりインスリンの放出時間が延長され、それにより薬物の投与頻度が低減され、被検体のコンプライアンスを増大させることが可能となった。
【０２４２】
また、患者集団の約５〜１０％で針恐怖症が報告されているため、ニードルフリー選択肢により、結晶性薬物の被検体のコンプライアンスの増大が補助され得る。さらに、これは、被検体が、結晶性製剤（例えば、非経口製剤）の投与に対して多くの送達選択肢、例えば、ニードルフリー選択肢を有するのに有益であり得る。
【０２４３】
結晶性タンパク質製剤に関連するニードルフリー注射器の適用の別の例は、獣医学的市場である。ジェット式注射器との組合せで長期薬物放出をもたらす結晶性製剤を使用し、動物処置のコンプライアンスを改善することが可能である。コンプライアンスは、一部、投与頻度の低減、注射に要する時間の短縮、および注射時の痛みの軽減のため、増大され得る。ニードルフリージェット式注射器は、表皮を貫通させる皮下注射針の代わりに高圧の細い注射用液の噴出を使用する型の医療用注射シリンジである。これは、大きなシリンダーからの圧力ホース、または内臓型ガスカートリッジもしくは小シリンダーのいずれかにより、圧縮された空気またはガスによって動力供給される。マルチショット型のものもあり、ワンショット型のものもある。ニードルフリー注射システムは既知である。例としては、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００、ＶｅｔＪｅｔ、Ｖｉｔａｊｅｔ、ＪＥＴ２０００、ＭＩＴ−Ｖジェット式注射器、ＬｅｃｔｒａＪｅｔ、Ａｋｒａ  Ｄｅｒｍｏｊｅｔ、およびＭｅｄ−Ｅ−Ｊｅｔ注射器が挙げられる。
【０２４４】
ジェット式注射器、例えば、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒニードルフリー（ジェット式）注射システムを用いて、結晶性タンパク質製剤でのジェット式注射器の使用の実現可能性が試験され得る。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒのニードルフリー注射技術は、液状の適用薬物を高速で、皮膚に対して保持された小さなオリフィスに通すことにより機能を発揮する。これにより、微細な高圧の適用薬物の流れが生成され、これが皮膚を貫通し、下部組織内に適用薬物が沈着される。
【０２４５】
ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００：ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００は、２つの構成要素：手持ち型の再度使用可能なジェット式注射器と、滅菌された単回使用の使い捨てプラスチック製シリンジからなる。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００には、動力供給源として使い捨て二酸化炭素カートリッジが使用されている。この二酸化炭素ガスが、一貫した確実な圧力を使い捨てシリンジのプランジャーに供給し、それにより適用薬物が組織内に推進される。
【０２４６】
該システムの第２の構成要素であるＢｉｏＪｅｃｔｏｒ単回使用使い捨てシリンジは、プラスチック製でニードルフリーの可変用量シリンジからなる。シリンジ本体は透明であり、正確な充填のための目盛を有する。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒシリンジには５つの異なる種類があり、これらは各々、異なる注射深度または体格が意図される。
【０２４７】
ＶｅｔＪｅｔおよびＶｉｔａｊｅｔ：ＶｅｔＪｅｔは、獣医学的市場における使用のための改良型Ｖｉｔａｊｅｔである。ＶｅｔＪｅｔもまた携帯型注射器ユニットおよび使い捨てシリンジの２つの構成要素で構成されている。ＶｅｔＪｅｔはバネによって動力供給される。
【０２４８】
ニードルフリー注射器は、液状の非結晶性タンパク質製剤の投与に使用されている。結晶性タンパク質の懸濁液に対するニードルフリーデバイスの報告例がない考えられ得る理由は、タンパク質結晶が懸濁液中で微粒子状を呈し、これによりニードルフリーデバイスによる注射が困難となり得るため、または結晶性製剤に物理的変化が引き起こされ、それにより該製剤の治療作用が害され得るためである。
【０２４９】
ワクチンは、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）を用いて製剤化された抗原の懸濁液の例である。ニードルフリージェット式注射器は、ワクチンを投与するために使用されている。対照的に、結晶性タンパク質製剤は、ワクチン製剤と比べると、種々の作用様式、種々の目的、製剤の完全性に対する種々の要件、および種々の懸濁液特性を有する。
【０２５０】
可溶性で結晶性の治療用非経口製剤の投与の標準的なアプローチは、皮下注射針によるものである。注射時の痛みは、針のサイズおよび針が被検体の注射部位に保持される時間量に関係している。大きな針ゲージおよび注射時間の増大はともに、針によって引き起こされる注射部位の痛みの増大を伴う。ジェット式注射器は比較的小さいオリフィスサイズ（表２）を有し、注射時間が非常に短いため、注射時の痛みは、針注射システムと比べて有意に少ない。
【０２５１】
しかしながら、治療用懸濁液（例えば、結晶性タンパク質の懸濁液）でのニードルフリー（ジェット式）注射器の使用には、さらなる考慮事項が必要とされる。本明細書に記載のように、結晶性タンパク質懸濁製剤の送達のためのニードルフリー注射器の使用を評価した。３０〜１８ゲージのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ針を本試験での比較に使用した。Ｇ３０の針は標準壁であり、Ｇ２５、２１および１８の針は壁厚が薄いものであった。針の内径と外径の比較を表２に示す。
【０２５２】
【表２】
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結晶性懸濁液を投与できる可能性を、ニードルフリージェット式注射器を用いて評価した。ニードルフリー注射器に使用され得る結晶性懸濁液には制限がある。驚くべきことに、適切に製剤化および選択された結晶性懸濁液を含有する製剤は、ニードルフリー（ジェット式）注射システムを用いて投与され得ることが測定された。
【０２５３】
本開示の利点としては、
−  結晶性タンパク質懸濁製剤の投与のためのニードルフリー（ジェット式）注射デバイスの使用；
−  前記結晶性製剤の治療作用の保持；および
−  ニードルフリー（ジェット式）注射器使用時の注射時の痛みの軽減
が挙げられる。：
本明細書に示したように、無針注射器の使用可能性に影響を及ぼす因子としては、
−  結晶性タンパク質の沈降速度、および
−  粒子（すなわち、結晶）の大きさ
が挙げられる。
【０２５４】
例えば、結晶性タンパク質の沈降速度が高い場合、注射後、該タンパク質の一部が注射器内に残留し、被検体に送達されないことがあり得る。その結果、被検体には必要投薬量の該タンパク質が与えられないことがあり得る。該結晶の最大寸法が大きすぎる場合、例えば、オリフィスより大きいか、または場合によってはオリフィスの直径の１／３より大きい場合、該結晶がオリフィスに詰まることがあり得る、該結晶が注射モジュール内に良好に負荷されないことがあり得る、および／または該結晶がオリフィスの縁との相互作用によって損傷される（例えば、結晶の形態構造または大きさが変化する）ことがあり得る。
【０２５５】
一定の条件が満たされていれば、ニードルフリー注射を用いて結晶性タンパク質懸濁液を含有する任意の製剤が投与され得る。例えば、結晶性タンパク質懸濁液が低い沈降速度を有する場合、例えば、該タンパク質の大部分が被検体に送達され、注射器内に残留しない場合（例えば、シリンジ調製と被検体への投与との間に遅滞があった場合であっても、および／または注射器が保持される位置（例えば、上下逆さ、水平）とは無関係に）、該懸濁液は無針投与に適したものであり得る。
【０２５６】
同様に、該結晶の粒径がオリフィスより小さい場合、理想的には、該粒径（例えば、該粒子の最大寸法）がほぼオリフィスの直径の１／３またはそれ未満である場合、該結晶性タンパク質は、無針投与に適したものであり得る。
【０２５７】
結晶性タンパク質製剤が、例えば、沈降速度および／または該結晶の粒径の評価に基づいて、あるいは該結晶性タンパク質の投与に無針投与を使用する試行（例えば、試行の不成功）に基づいて無針投与に充分適していると思われない場合、例えば、該製剤が無針投与システムでの使用に適したものとなるようにｐＨ、緩衝液、塩濃度、懸濁化剤、保存料などを変えることにより、該製剤の特性を最適化することができる（例えば、許容され得ない量によって該タンパク質の有効性が低下することなく結晶の大きさが小さくなる、または沈降速度が低減される）。
【０２５８】
粒径
結晶性タンパク質の粒径は、例えば、レーザー回折（例えば、微小容量モジュールを備えたＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ、Ｆｌｏｒｉｄａ）を使用）によって測定され得る。粒径（例えば、最大寸法）がオリフィスサイズより小さい（例えば、約１／２より小さい）場合、特に、粒径がオリフィスの直径の約１／３より小さい場合、該製剤は、無針投与に適したものであり得る。
【０２５９】
所与の粒径を有する結晶性タンパク質の無針投与に対する好適性は、例えば、結晶性タンパク質製剤をニードルフリー注射器（例えば、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００）で注射し、最初の注射後および反復注射後の粒径を観察し、注射後の粒径を注射前の粒径と比較することにより試験され得る。粒径は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０粒径測定装置を用いて、注射前ならびに最初の注射後および反復注射後に測定され得る。データの解析には、フラウンホーファー光学モデルが使用され得る。粒径は顕微鏡観察により確認され得る。また、起こり得る結晶形態構造の変化を検出するためにも、顕微鏡観察が使用され得る。観察される粒径の変化がないか最小限であり、用量の大部分が注射器から送達される場合、該結晶性タンパク質は、無針投与に適したものであり得る。
【０２６０】
結晶性タンパク質がこの解析で充分な性能を発揮しない場合、すなわち、粒径がオリフィスより大きい場合、製剤化ビヒクルが最適化され得るか、または該結晶それ自体（例えば、結晶は薬剤（例えば、ポリカチオンもしくはポリアミノ酸例えば、ポリＡｒｇ）と複合体形成されたであり得るか、またはタンパク質に対する複合体化薬剤の比は種々であり得る）が、結晶の大きさに影響を及ぼすように最適化され得る。
【０２６１】
沈降速度
沈降速度は、結晶性タンパク質の無針投与に対する好適性に影響を及ぼし得る。沈降速度が高い場合、被検体に送達される用量は、一貫性がなくなることがあり得る。結晶性懸濁液の高い沈降速度は、用量調製および投与に必要とされる時間中にニードルフリーデバイス内で用量の再分布させる速度、例えば、水平位置でのデバイスの１時間の定温放置後、約９０％再分布させる速度と定義され得る。低い沈降速度は、実質的な用量の再分布なく用量の調製および投与を可能にする速度と定義され得る。一実施形態では、高い沈降速度は、水平位置でニードルフリーデバイスを定温放置すると、注射されるのが用量の９０％未満となる速度と定義され得る。一部のある実施形態では、低い沈降速度は、任意の位置での１時間を越える定温放置後、均一な用量（例えば、用量の再分布が最小限またはなし；例えば、約３５％未満、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％）を可能にする速度と定義され得る。
【０２６２】
例えば、沈降速度は間接的に測定され得る。一例として、懸濁液を３分間、水平、まっすぐ垂直または逆さまの位置に保持する。例えば、１０分または２０分の定温放置期間後、実質的な（例えば、約８０％）用量の再分布が観察または測定された場合、沈降速度が高いとみなす。別の例として、用量の再分布なく種々の位置で１時間定温放置される懸濁液は、低い沈降速度を有するとみなす。
【０２６３】
沈降速度に基づいた結晶性タンパク質の無針投与に対する好適性は、例えば、懸濁液をＢｉｏＪｅｃｔｏｒシリンジ内に負荷し、該懸濁液を負荷直後、または水平、まっすぐ垂直および逆さまの位置で１時間保持した後のいずれかで注射することにより評価され得る。保持する試料を、ジェット式注射器のシリンジ内への負荷直後に注射する試料と比較する。注射された該タンパク質の注射後の含有量と、シリンジ内部に残留している量と測定し、シリンジ内に負荷された該タンパク質を１００％とみなしてパーセンテージで表示する。すぐに注射された試料と注射前に保持された注射された試料との間で、用量分布に差が観察されないか、または微量である場合、該結晶性タンパク質は、無針投与に適したものであり得る。
【０２６４】
結晶性タンパク質がこの解析で充分な性能を発揮しない場合、すなわち、注射前に保持された試料について送達用量が徐々に減少する場合、製剤化ビヒクルが最適化され得るか、または該結晶それ自体（例えば、結晶は薬剤（例えば、ポリカチオンもしくはポリアミノ酸例えば、ポリＡｒｇ）と複合体形成され得るか、またはタンパク質に対する複合体化薬剤の比は種々であり得る）が、結晶の大きさまたは該タンパク質の濃度に影響を及ぼすように最適化され得る。
【０２６５】
使用方法
無針注射システムを用いて、結晶性タンパク質を含有する製剤が被検体に投与され得る。例えば、被検体は該結晶性タンパク質での処置を必要とする患者であり得、例えば、該結晶性タンパク質は結晶性ｈＧＨであり得、患者は、ｈＧＨの欠乏に苦しむ患者であり得る。用量および用量投与スケジュールは、さまざまな因子に基づいて決定される。かかる因子としては、限定されないが、生理学的因子、例えば、実年齢および骨年齢、性別、体重、発達段階（例えば、思春期の成長レベル）ならびに処置関連因子、例えば、用量、投与速度（動態）および投与経路など、ならびに患者の診断および病歴が挙げられる。
【０２６６】
キット
結晶性タンパク質を含有する製剤および無針投与における使用説明書、ならびに任意選択で無針投与のためのデバイスを含むキットもまた、本開示の一部である。製剤は、適当な容器内（例えば、バイアル、プレフィルドシリンジなど）に存在させ得る。使用説明書には、任意の形態、例えば、パンフレットもしくはシート、または使用説明書が得られるサイトへのワールドワイドウェブのアドレスが採用され得る。使用説明書には、例えば、保存および／または投与のための使用説明が含まれ得る。
【０２６７】
解析方法
結晶性タンパク質の無針投与に対する好適性の評価に使用され得る解析方法としては、以下のものが挙げられる。
【０２６８】
注射
結晶性製剤は、１Ｓ０２１シリンジを備えたＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システム、および０．００６２インチノズルシリンジＲｅｆ＃  Ｋ７０００、３０Ｇ×１／２インチ針（ＢＤパーツ番号  ３２８４６６）が予め装着されたＢＤ  ０．５ｃｃシリンジ、３０Ｇ×１／２インチ（ＢＤパーツ番号３０５１０６）、２５Ｇ×５／８インチ（ＢＤパーツ番号３０５１２２）、１８Ｇ×１．５インチ（ＢＤパーツ番号３０５１９６  ）（１ｍＬ容シリンジに対するルアーロック（ＢＤパーツ番号  ３０９６２８）が取り付けられている）を備えたＶｅｔＪｅｔシステムの使用を伴って注射される。０．２５ｍＬの試料を２連で試験する。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システムおよびＶｅｔＪｅｔシステムは、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒの推奨に従って使用する。
【０２６９】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）法を用いて純度を測定するためには、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ−２０００カラムを使用する。１０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍＬ濃度の試料をカラム内に注入する。泳動バッファーは、３％ＩＰＡおよび６０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で構成する。流速を０．６ｍＬ／分に設定し、泳動時間を３０分間とする。検出は２１４ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合（モノマー）は、ピーク面積に基づいて計算した。
【０２７０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣは、純度の試験に使用する。タンパク質の純度をＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて測定するためには、Ｃ５  Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ
Ｐｏｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３μｍ粒径、３０ｎｍ細孔径）を使用する。カラムのサーモスタット温度を３７℃に設定する。１０マイクロリットルの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、１．０ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ含有水）および移動相Ｂ（０．８％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から２．５分で５％Ｂから５０％Ｂに、次いで２．５分から１５．５分で５０％から７０％Ｂに、次いで１５．５分から１７分で７０％から９０％に変化させ、この直後に再度５％Ｂを確立させる。その後３分保持した後、次の泳動を開始する。検出は２１４ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０２７１】
ＳＣＸ−ＨＰＬＣ（強カチオン交換）クロマトグラフィー
ＳＣＸ−ＨＰＬＣ法は、安定性の試験において脱アミド化特異的測定のために使用する。ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法を用いてタンパク質の純度を測定するため、ＰｏｌｙＬＣ（ＮＥＳＴ  Ｇｒｏｕｐカタログ番号Ｐ０５４ＳＥ０５０３）カラムを使用した。カラムのサーモスタット温度を３０℃に設定した。２０マイクロリットルの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入した。溶出は、１ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６）および移動相Ｂ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６  ２５０ｍＭのＮａＣｌ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から５分で０％Ｂから２０％Ｂに、次いで５分から２５分で２０％から７０％Ｂに、次いで２５分から２５．１分で７０％から１００％に変化させ、１００％Ｂを２７分まで維持した後、２７．１分から再度０％Ｂを確立させた後、５分間置く。検出は、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分した。純度割合は、ピーク面積に基づいて計算した。
【０２７２】
粒径分布（ＰＳＤ）
ＰＳＤは、微小容量モジュールを備えたＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ、Ｆｌｏｒｉｄａ）を用いて、レーザー回折によって測定される。試料を試料緩衝液中に希釈し、８〜１２％の不透明性の機能範囲を得る。データ解析は、フラウンホーファー光学モデルを用いて行なう。１０％（ｄｌ１０）、５０％（メジアン）および９０％（ｄｌ９０）の累積分布限界を表す粒径（単位：μｍ）の割合を報告する。
【０２７３】
３−ｐＨ溶解試験
この試験は、タンパク質試料における溶解プロフィールの変化を評価するために使用する。
【０２７４】
粒子表面の変化
粒子表面の変化は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｚ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いて測定される。泳動バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５とした。ゼータ電位変換標準（Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）を用いて、機器（Ｍａｌｖｅｒｎカタログ番号ＤＴＳ  １０５０）を較正する。各試料に対し、１２μｌの結晶性アリコート（濃度１０〜３０ｍｇ／ｍｌ）を５８８μｌの泳動バッファーに添加し、室温で３回の測定値を得る。
【０２７５】
顕微鏡像
結晶性試験品の顕微鏡像を評価し、注射による試験品の関連する変化を検出する。
【実施例】
【０２７６】
実施例１
制御放出プロフィールを有する長期作用性ｈＧＨを作製するためのｈＧＨの結晶化および複合体形成のプロセスが開発されている（米国特許出願公開公報第２００４／０２０９８０４号）。ポリＡｒｇ複合体形成は、裸の（ｂａｒｅ）ｈＧＨ結晶が市販の日常注射製剤と同じ性能を示すため、制御放出プロフィールの寄与において重要である。ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶もしくはｈＧＨ誘導体、またはこれらをを含有する組成物もしくは製剤は、いくつかの利点、例えば、週１回の送達が可能であること、使用の準備ができた結晶性懸濁液形態であること、安全性、有効性、純度、安定性および一定期間にわたる注射針通過可能性を有する。該複合体型ｈＧＨ薬物の送達方法は、ポリマーまたは融合タンパク質を使用せず、注射を少なくするため、および被検体に対してよりユーザーフレンドリーな処置選択肢がもたらされるように設計される。この結晶化技術の特異性は、上清み中に存在する遊離ｈＧＨが限定的であるため、可溶性凝集体の増加が観察されないことである。
【０２７７】
ｐＨおよび緩衝液種の影響を評価するため、製剤開発の試験を行なった。その結果に基づき、次いで、賦形剤とイオン強度をスクリーニングした。許容され得る製剤の開発を、以下の特徴：種々の温度での保存安定性、用量の一貫性の関数としての容器と閉鎖部の適合性、付着の可能性、製剤の投与の容易さ、および容器の閉鎖部に対するロスによって評価した。安定性の試験方法およびその適用は表１に示している。
【０２７８】
ｐＲに対するｈＧＨの比、粒径分布などのいくつかの因子は、注射時の放出プロフィールにおいて重要であった。ＡＬＴＵ−２３８の安定性の際にこれらの因子における変化を試験した。また、改善した製剤は、既存の製剤と同等の放出プロフィールを示す必要があるため、溶解プロフィールアッセイを用いて制御放出プロフィールを評価した。
【０２７９】
開発期間中、最終薬物製剤の容器の閉鎖部の潜在的構成として、ガラス製バイアルとプレフィルドシリンジの両方を評価した。さらなる開発試験では、シリコーン処理されたものを、非ガラス製バイアルおよび／またはシリンジに対して評価した。
【０２８０】
０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの範囲の送達用量を含む一定のタンパク質充填濃度を評価した。
【０２８１】
アレニウスプロット反応速度論を使用し、短期安定性データ（例えば、５０℃、４０℃、３５℃、３０℃〜２５℃などの高い保存温度でストレス負荷した試料から得られたもの）を用いて、２〜８℃における化学分解速度を予測した。２〜８℃の外挿データを用いて、提案貯蔵寿命または有効期限を確立した。
【０２８２】
また、選択した製剤を、下垂体切除（ｈｙｐｏｘ）ラットモデルを用いて試験し、比較用の治験製剤を用いて制御放出プロフィールを評価した。
【０２８３】
本明細書に記載のように、複合体型ｈＧＨの好ましい液状懸濁タンパク質製剤は、６〜７のｐＨ範囲の緩衝液（好ましくは、リン酸塩）、塩（好ましくは、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム）、および懸濁化剤（好ましくはポリエチレングリコール６０００または８０００）を用いて調製される。このような製剤と適合する容器の閉鎖部系は、１０ｍｍ未満の上部空間を有するシリコーン処理されたプレフィルドシリンジ、または上部空間のないバイアルである。
【０２８４】
結果は、化学分解および結晶形態の変化がＡＬＴＵ−２３８の安定性に関する考慮事項であり、その程度は緩衝液種、イオン強度およびｐＨに影響されることを示す。ｐＨは、化学分解に対するｈＧＨ複合体型結晶の安定性に影響を及ぼす主な因子であり、ｐＨを＞７．０に増大させると脱アミド化が増大する。図示したように、ｐＨは、脱アミド化に対して有意な影響を及ぼす（図１）。好ましくは、ｐＨは、ｐＨ６．１〜７．２の範囲、より好ましくはｐＨ６．１〜６．８の範囲であるのがよい。
【０２８５】
表３は、グリシン緩衝液に溶解させた結晶のＯＤ３２０のデータを示し、不溶性凝集体が形成されたことを示す。ヒスチジンのｐＨ５．０および５．５試料は、溶解緩衝液の添加後、非常に混濁していた。この混濁は、０．４５μｍフィルターによって除去することができ、不溶性凝集体が形成されたことを示した。さらに、ｐＨ６．０、６．５および７．０のヒスチジン含有試料もまた、同じｐＨの他のリン酸緩衝液と比べて高いＯＤ３２０を有していた。これは、グリシン緩衝液中に溶解不可能な複合体型結晶をもたらす不溶性凝集体の存在または結晶形態の変化を示唆する。これらの結果もまた、リン酸塩が、同じｐＨ範囲のヒスチジンと比べて好ましい緩衝液であることを示す。ヒスチジンは、不溶結晶または不溶性凝集体のため、高レベルの光散乱には好ましくない。
【０２８６】
【表３−１】
2015214573.tif 000005
【０２８７】
【表３−２】
2015214573.tif 000006
これらのヒスチジンおよびクエン酸塩含有試料の結晶の大きさは、その他のものよりも小さく、これは、該結晶が溶解性であったことを示す。クエン酸緩衝液では高い可溶性が観察される（表４）。ｈＧＨ複合体型結晶の可溶性は、リン酸緩衝液中０．１ｍｇ／ｍＬ未満である。
【０２８８】
【表４】
2015214573.tif 000007
したがって、ヒスチジンおよびクエン酸塩は、好ましい緩衝液ではない。種々のｐＨのリン酸緩衝液におけるｈＧＨ複合体型結晶の可溶性は、０．１ｍｇ／ｍＬ未満であった。好ましい製剤には、ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体結晶に対してリン酸塩塩緩衝液種を使用する。
【０２８９】
図２は、イオン強度の影響を評価するための、ＮａＣｌの存在下、種々のｐＨ値でのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の安定性の結果を示す。この図は、イオン強度の増大が、脱アミド化速度に影響を及ぼすことを示す。高い塩含有量では、４０℃での保存後、脱アミド化および酸化のレベルが低いこと観察された。
【０２９０】
ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、既存の製剤に使用されている懸濁化剤である。ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、マンニトールおよびスクロースなどの択一的な懸濁化剤を比較した。また、脱アミド化速度または酸化に対するグリシンでの塩置換の影響を評価した。この試験では、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液を使用した。図３〜５に結果を示す。ＮａＣｌを含有する製剤は、脱アミド化の量が最も少ないようである。同じｐＨ６．８の種々の塩（酢酸ナトリウムもしくは塩化ナトリウム）または懸濁化剤（ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ６０００もしくはＰＥＧ８０００）について、化学分解に有意差は観察されない（図３〜５）。同じｐＨの試験製剤間では、酸化レベルに関して有意差は観察されなかった。
【０２９１】
一実施形態において、ｈＧＨ複合体型結晶に使用する好ましい塩は、酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムである。より好ましい実施形態において、ｈＧＨのポリＡｒｇ複合体型結晶に対する塩濃度は６０ｍＭ〜２００ｍＭのナトリウム塩である。
【０２９２】
また、ポリエチレングリコールの濃度範囲（２．５％、５％、１０％および２０％）が確立された。懸濁化剤を含まない場合、ケーキングの可能性が問題となり得る。図６は脱アミド化の結果を示すが、安定性における差は観察されない。また、試料はすべて、振らずに１分以内に再懸濁され得た。一実施形態において、ｈＧＨ複合体型結晶に使用する好ましいＰＥＧ濃度は２．５％〜２０％である。
【０２９３】
また、これらの実験により、該複合体型結晶に望ましいポリＡｒｇに対するｈＧＨの比が確立される。目標とすべき比は、種々のロットの複合体型タンパク質で３〜１１であった。ｈＧＨ／ポリＡｒｇ比が３では、高温において、７および１５の比のものよりも酸化レベルが有意に高くなる。試料にはすべて、Ｔｒｉｓ、酢酸ナトリウムおよびＰＥＧ６０００（ｐＨ７．５）を含有する同じ製剤を使用した。しかしながら、脱アミド化レベルに関して有意差は観察されなかった。
【０２９４】
インビトロ溶解プロフィールを、選択した時間点の試料において行ない、試験期間中の変化（あれば）を評価した。結果は、すべての試験ｈＧＨ／ポリＡｒｇ比間で溶解プロフィールに有意差はないことを示した（表５）。好ましいｈＧＨ／ｐＲ比は５〜１５である。
【０２９５】
【表５−１】
2015214573.tif 000008
【０２９６】
【表５−２】
2015214573.tif 000009
本開示によるｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、光学顕微鏡法およびＳＥＭで画像形成すると、輝いた棒状または針状の形態構造を形成している。一部のある実施形態において、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約０．１〜約２００μｍの長さの針状体を形成したものである。好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、約２〜約１００μｍの長さの針状体を形成したものである。より好ましい実施形態では、ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の結晶は、平均粒径分布の５０％が約２〜約２５μｍの長さの針状体を形成したものである。
【０２９７】
ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の濃度もまた規定された。５〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲のポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶の安定性データにより、安定性において観察される差はないことが示された。この結果に基づくと、上清み中の遊離ｈＧＨおよびポリＡｒｇは、すべての試験濃度で同等である。しかしながら、５０ｍｇ／ｍＬレベルでは、該懸濁液は非常に粘稠性であり、製剤を噴出させるのに、より多くの力が必要とされた。したがって、一部のある実施形態では、ｈＧＨ複合体型結晶の濃度は５〜５０ｍｇ／ｍＬである。好ましい実施形態では、該濃度は、２０〜３０ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶であるのがよい。
【０２９８】
ｈＧＨ結晶に対する容器の閉鎖部の選択は、用量の一貫性に重点が置かれた。シリコーン処理された種々の材質およびＣＺ樹脂で作製されたバイアルおよびプレフィルドシリンジを比較した。２つの異なる型の処理、反転または旋回を、それぞれバイアル／シリンジに、各構成に対して１日１回で１０回適用した。抽出可能重量およびＡＬＴＵ−２３８濃度を各時間点（第１日、第３日、第５日および第７日）で記録した。この撹拌試験によると、上部空間によりプレフィルドシリンジに対する製剤の減損は、バイアルよりもずっと少ない。図７Ａ〜７Ｄおよび８Ａ〜８Ｄに結果をまとめる。
【０２９９】
見てわかる結晶がバイアルのボトルネックに蓄積され、該結晶は容器の閉鎖部の壁面にも蓄積された。したがって、形状と容器の閉鎖部の上部空間の両方が送達用量の一貫性に影響を及ぼす。ニードルステイクを有するプレフィルドシリンジは、ｈＧＨ複合体型結晶または任意のタンパク質結晶製剤のための限定的な死容積（２〜５μＬの範囲）に最も理想的なようである。プレフィルドシリンジにはボトルネックがない；また、上部空間は、ずっと小さく、栓の配置によって制御され得る；プランジャーにより、ほぼすべての結晶がシリンジバレル（死容積を除く）から押出され得る。しかしながら、これは、容器の閉鎖部に上部空間を存在させない場合、解決され得る。一部の企業（例えば、Ｈｙａｕｒｏｎ））では、物質を上部空間なしで充填している。要するに、用量の一貫性のためには、タンパク質結晶に使用する容器の閉鎖部に上部空間がないか、または限定的であることが好ましい。プレフィルドシリンジ／ニードルステイクおよび１０ｍｍ未満の上部空間は、タンパク質結晶非経口製剤に、より好適である。
【０３００】
テフロン（登録商標）コーティングされた栓（すなわち、Ｄｉｅｋｙｏ  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ）および４４３２配合物の栓を、ｐＲ複合体型ｈＧＨ結晶閉鎖部として試験した。そのデータは、どちらの栓も、適合性に問題がないことを示す。
【０３０１】
また、ポリＡｒｇコーティングｈＧＨ結晶の充填容積、例えば０．２〜１．０ｍＬについても調べた。すべての試験充填容積間に差はない。ｈＧＨ複合体型結晶は、好ましくは０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する。
【０３０２】
リード（ｌｅａｄ）製剤を、アレニウス安定性予測のために特定した。アレニウスストレスモデル（または関係）は、刺激または加速可変量（例えば、脱アミド化、酸化など）が熱的なもの（すなわち、温度）である場合に広く使用されている。５℃での分解速度は、いくつかの高温での安定性の結果を用いて予測され得る。Ｆｌｕｒｏｔｅｃｋ栓を有するプレフィルドシリンジ内のポリＡｒｇ複合体型結晶の試料を、２〜８℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃および５０℃で置いた。既報のデータに基づき、アレニウスの式を適用して５℃での分解速度を予測した。その結果を、同じ方法によって解析した先のロットの実際の安定性と比較した。また、リード製剤のリアルタイム安定性を比較のために示した。５℃で２４ヶ月の保存後、ＡＬＴＵ−２３８ではＣＥＸによる約７％の分解増大が推定される（表６および７）。
【０３０３】
【表６】
2015214573.tif 000010
【０３０４】
【表７】
2015214573.tif 000011
本開示に基づいて製剤の溶解プロフィールを先の解析に使用されたものと、分散溶解プロフィールアッセイと下垂体切除ラット試験モデルの両方によって比較した。結果（表８）は、同等の溶解速度ならびにラットＰＤおよびＰＫプロフィールが得られたことを示す。したがって、本明細書において規定される製剤は、ヒト治療に対して週１回注射の制御放出プロフィールをもたらすものであり得る。
【０３０５】
【表８】
2015214573.tif 000012
下垂体を切除したラットモデルにおいて、既存の製剤と本発明のＡＬＴＵ−２３８製剤間で、ＰＤプロフィールに有意差は観察されなかった。この下垂体を切除したラットモデルにおいて、日常ｒｈＧＨ対照、既存の製剤および本発明の製剤間で、体重増加ならびにｐＫプロフィールに有意差は観察されなかった。平均体重変化は、それぞれ１８％、１８％および１６％であった。
【０３０６】
実施例２
５±３℃（冷蔵）で約１８〜約２４ヶ月および室温２５±２℃（使用時）条件で少なくとも１週間安定である目標のポリＡｒｇ複合体型結晶製剤性ｈＧＨの懸濁液を調製するための試験を行なった。
【０３０７】
ｈＧＨ分子の安定性と系の安定性の両方を考慮した。分子の不安定性としては、化学分解と凝集が挙げられる。系の安定性は、１週間の放出プロフィールに対する安定性、ならびに該懸濁液（結晶凝集、沈降および表面吸着）の安定性をもたらすものであるのがよい。
【０３０８】
一連の解析方法を用いて、複合体型ｈＧＨ製剤における分解を試験した。化学安定性またはｈＧＨ関連不純物の形成を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＩＥＸ−ＨＰＬＣアッセイによりモニターした。凝集は、ＳＥ−ＨＰＬＣアッセイを用いてモニターした。粒径分布の変化を、レーザー光散乱技術を用いて試験した。懸濁液の外観の変化を目視により観察した。
【０３０９】
対照安定性の測定値は、５つの代表的なバッチの既存の製剤に基づくものとした。例えば、化学安定性に関して、既存の製剤の安定性は、２〜８℃で８〜１２ヶ月および室温で１〜３ヶ月である。
【０３１０】
凝集に関して、計画される安定性は、２〜８℃で３年超および室温で１〜３年である。この既存の懸濁液は、粒径分布、外観および沈降に関して、２年の観察期間にわたって安定である。
【０３１１】
ｈＧＨ分子における化学不安定性としては、脱アミド化、スクシンイミド中間体の形成、酸化、およびクリッピングが挙げられ得る。本明細書に記載の最適化により、複合体型ｈＧＨ製剤中のｈＧＨの化学安定性の増大が補助される。
【０３１２】
ｈＧＨの分解は、プロセス誘導型分解および／または製剤誘導型分解であり得る。製剤誘導型分解は、準最適製剤化ビヒクル組成物の使用ならびにビヒクルの成分および特徴（ｐＨ、緩衝液、塩、懸濁化剤、保存料、およびこれらの成分に由来する混入物など）の結果であり得る。
【０３１３】
これらの試験の際、ポリアルギニンでコーティングされた結晶性ｈＧＨの懸濁液中のｈＧＨの安定性に影響を及ぼす条件を試験した。ｈＧＨの安定性の増大を可能にする製剤化ビヒクルを特定した。その製剤は、治療作用に関して既存の製剤と同様であった。
【０３１４】
製剤中のｈＧＨの化学安定性に対するｐＨおよび緩衝液の組成の影響を試験するための実験を行なった。ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶を、表９に列挙した製剤化ビヒクル中に再懸濁させた。試料中のｈＧＨ濃度は２５ｍｇ／ｍＬとし、ポリアルギニン含有量は約５ｍｇ／ｍｌとした。試料は５±３℃〜２５±２℃条件で保存した。
【０３１５】
【表９】
2015214573.tif 000013
試験の開始時、対照試料の純度を測定した（表１０）。室温で１ヶ月保存後、逆相（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびアニオン交換（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）ＨＰＬＣで試料を解析した（ＩＥＸ−ＨＰＬＣの結果を表１０に示す）。
【０３１６】
【表１０】
2015214573.tif 000014
【０３１７】
【表１１】
2015214573.tif 000015
驚いたことに、ＲＰ−ＨＰＬＣ安定性データに基づくと、緩衝液成分は、製剤の化学安定性に影響を及ぼした。驚くべきことに、ヒスチジン緩衝液は、製剤において有意に高速の化学分解を引き起こすことがわかった。したがって、緩衝液成分は、ＲＰ−ＨＰＬＣでの解析によると、ｈＧＨの化学分解に対して強く影響する。調べた試験条件の緩衝液の範囲では、至適ｐＨは７．５であり、この値を外れるいずれの側でも安定性は低下した。
【０３１８】
興味深いことに、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによれば、脱アミド化は、製剤化ビヒクルのｐＨに強く影響される。ｐＨが大きいと脱アミド化が促進される。ｐＨを下げると、脱アミド化速度は有意に低下した（表１１）。
【０３１９】
この実施例のデータに基づき、複合体型ｈＧＨ製剤における全体的なｈＧＨの化学分解は、緩衝液成分、製剤化ビヒクルの組成およびｐＨに影響されることがわかった。ｈＧＨ製剤の他のパラメータを維持したままｈＧＨタンパク質の化学安定性の増大を得るため、このデータに基づいて、さらなるスクリーニングを行ない、これらのパラメータを確認した。
【０３２０】
改善された安定性の製剤をスクリーニングするため、さらなる製剤化ビヒクルを試験した（表１２〜１６）。ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶を製剤化ビヒクル中に再懸濁し、ｈＧＨ濃度を２５ｍｇ／ｍＬとした。試料を５±３℃〜２５±２℃条件で保存した後、安定性を試験した。
【０３２１】
【表１２】
2015214573.tif 000016
【０３２２】
【表１３−１】
2015214573.tif 000017
【０３２３】
【表１３−２】
2015214573.tif 000018
【０３２４】
【表１４】
2015214573.tif 000019
【０３２５】
【表１５−１】
2015214573.tif 000020
【０３２６】
【表１５−２】
2015214573.tif 000021
【０３２７】
【表１６】
2015214573.tif 000022
１ヶ月および３ヶ月の時間点の安定性結果の基づき、好ましい安定性製剤を特定した（表１７）。また、好ましい安定性製剤の選択は、結晶化度、ポリＡｒｇ含有量および溶解特性に基づいて行なった。
【０３２８】
【表１７】
2015214573.tif 000023
６ヶ月の時点で、試料を、解析対象の冷蔵条件および室温条件で保存した（表１９および２０）。純度を、対照製剤と同一の組成を示す対照試料０２と比較した。時間０の対照試料の純度の結果を表１８に示す。
【０３２９】
【表１８】
2015214573.tif 000024
【０３３０】
【表１９】
2015214573.tif 000025
【０３３１】
【表２０】
2015214573.tif 000026
最適製剤の分解速度の推定の方法論および選択：分解速度を用いて製剤同士を比較し、最適安定性製剤を特定した。分解速度は、ｈＧＨ関連物質の蓄積速度として示す。速度は、時間０と６ヶ月の分解生成物の含有量の差を、冷蔵条件で保存した月数（この場合は６ヶ月）で除算したものとして計算する。
【０３３２】
不純物の割合は、それぞれのＨＰＬＣクロマトグラムのメインピーク以外のすべてのピークの含有量として求める。脱アミド化以外の化学分解はＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した。脱アミド化は、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによって測定した。
【０３３３】
分解速度は、所与の時点（６ヶ月）と試験開始時の試料中の分解生成物の含有量の差を、観察期間（６ヶ月）で除算したものとして計算した。化学分解速度は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＩＥＸ−ＨＰＬＣで得られた分解速度を合わせることにより示した。最も小さい分解速度を有する製剤が最適製剤である。試料における５±３℃で６ヶ月保存した分解速度を表２１に示す。
【０３３４】
【表２１】
2015214573.tif 000027
安定性を比較するため、従来の既存バッチの純度を測定し（表２２）、分解速度を計算した（表２３）。従来バッチにおける分解速度を、対照試料と当該新規製剤と比較した。
【０３３５】
【表２２】
2015214573.tif 000028
【０３３６】
【表２３】
2015214573.tif 000029
驚くべきことに、最適化された製剤における分解速度は、対照試料および従来バッチのものよりも有意に低かった。本スクリーニングにおいて、分解速度が大きく低減されたいくつかの製剤が特定された。２つの好ましい安定性が改善された製剤：＃１３（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ＭＭのＮａＡｃ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．５）および＃５５−０１Ｎ（１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．２５％のフェノール、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．０）が特定された。
【０３３７】
室温での分解速度の推定
室温での当該新規製剤の安定性の解析により、同じ改善された安定性製剤＃５５−０１Ｎが得られた（表２４）。冷蔵保存条件で最適と特定された他の製剤は、室温で保存した場合も対照製剤よりも良好な安定性を有した。
【０３３８】
【表２４】
2015214573.tif 000030
化学安定性の改善をもたらす当該新規製剤化ビヒクルが、どのようにしてポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液におけるｈＧＨ凝集に影響を及ぼすかを調べるための実験を行なった。ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶を、最適化した安定性製剤化ビヒクル中に再懸濁させた。試料を５±３℃で保存した後、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて凝集を試験した。
【０３３９】
【表２５】
2015214573.tif 000031
驚いたことに、当該新規製剤化ビヒクルでは、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液において、凝集体形成速度が増大しなかった。実際、一部の最適化された安定性製剤では、凝集ｈＧＨ形成速度が、対照試料と比べて２倍低下した（表２５）。
【０３４０】
インビボ結果：下垂体を切除したラットでの試験
これらの実験は、最適化された安定性製剤ビヒクルにおけるポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の治療作用が、対照製剤のｈＧＨ放出プロフィールと同等であるか否かを調べるために行なった。下垂体を切除した雄ウィスターラットにおいて、対照ロットと最適化された安定性製剤ロット番号２９９−３５−０６（１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．２５％のフェノール、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．０）間で、治療作用に有意差は観察されなかった。
【０３４１】
標準的なラット体重増加アッセイにおける有効性の確認は、ｈＧＨ製剤の臨床的開発および商品開発のための重要な工程である。試験物質または対照物質を、下垂体を切除した雄ウィスターラット（９ラット／群）にＳＣ（皮下）注射により投与した。この試験では、５．６ｍｇ／ｋｇの単回用量および反復用量の対照および当該新規製剤の単回ＳＣ注射、または０．８ｍｇ／ｋｇの市販の可溶性ｒｈＧＨ（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ）の毎日のＳＣ注射を７日間（すなわち、５．６ｍｇ／ｋｇ／週）受けた後の、下垂体を切除したラットの成長を比較した。投与開始前および第−７日から毎日（投与前の７日間）第８日の観察期間の最後まで毎日、体重を毎週測定した。この下垂体を切除したラットモデルにおいて、日常ｒｈＧＨ注射製剤、対照、および最適化された安定性製剤間で、体重増加に有意差は観察されなかった。平均体重変化は、それぞれ１８±３％、１８±２％、および１６±４％であった。
【０３４２】
結論
これらの試験により、製剤化ビヒクル中にポリアルギニンでコーティングされたｈＧＨ結晶含む懸濁液用の製剤化ビヒクルが特定された。該製剤は、
ａ）安定性の改善をもたらす
ｂ）該複合体において対照製剤と同等の結晶化度を維持する
ｃ）２９以下のゲージ針での投与を可能にする
このような製剤は、以下のものを提供する
ａ）高分子電解質でコートされたｈＧＨ結晶の懸濁液、ここで、該結晶性ｈＧＨの濃度は、
５〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲、より好ましくは２０〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【０３４３】
ｂ）５．０〜８．０の範囲ｐＨでｈＧＨ複合体の結晶化度を維持する生物学的に適合性の緩衝液で構成された製剤化ビヒクル中の懸濁液。緩衝塩濃度は、濃度１〜１５０ｍＭの範囲である。好ましくは、２〜５０ｍＭ；より好ましくは１０ｍＭ濃度である。緩衝塩の例としては、酢酸塩、トリエタノールアミン、イミダゾール、リン酸塩、クエン酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが挙げられる。好ましい緩衝液は、５．８〜７．０、好ましくは６．０〜６．５のｐＨ範囲のリン酸ナトリウムである。緩衝液の組合せ、例えば、リン酸ナトリウムとクエン酸ナトリウムの緩衝液、例えば、２ｍＭのクエン酸Ｎａ塩と８ｍＭのリン酸Ｎａ塩が使用され得る。
【０３４４】
ｃ）ｈＧＨ複合体の結晶化度を維持または増大させる成分。一例（ａｓ  ｅｘａｍｐｌｅ）は中性塩、例えば、酢酸Ｎａまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０〜ＰＥＧ８０００）などである。好ましいＰＥＧ濃度は、１〜２５ｗ／ｖ％、より好ましくは２〜１０ｗ／ｖ％；より好ましくは４〜６ｗ／ｖ％の範囲である。フェノールは、０．１〜０．５％の濃度で使用され得る。
【０３４５】
ｄ）組成物の総重量オスモル濃度が、２５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２７０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは２８０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲となるようにする張度調整剤。例としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの中性塩が挙げられる。作用緩衝ｐＨ範囲外の緩衝塩も中性塩として使用され得る。好ましい塩は、酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムである。アミノ酸の塩も、緩衝ｐＨ範囲外のｐＨ範囲で中性塩として使用され得る。好ましいアミノ酸の塩は、グリシンナトリウム塩である。マンニトール、ソルビトールなどのポリオールもまた、張度調整剤として使用され得る。ポリエチレングリコールも張度調整剤として使用され得る。
【０３４６】
ｅ）任意選択で、約０．２５％ｗ／ｖの濃度の保存料、例えばフェノール。好ましいフェノール濃度範囲は０．２〜０．３％である。
【０３４７】
ｆ）任意選択で、前記製剤の化学安定性を増大させる成分、例えば、メチオニン、ＥＤＴＡなど。
【０３４８】
リード製剤化ビヒクルの具体例：
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＡｃ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．５
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、０．２５％のフェノール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００  ｐＨ６．０
１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、０．２５％のフェノール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
３０ｍＭのトリエタノールアミン、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００  ｐＨ６．８
２５ｍＭのトリエタノールアミン、１０ｍＭのメチオニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、２％のＰＥＧ３３５０  ｐＨ６．８
２５ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％のＰＥＧ６０００  ｐＨ６．５
潜在的に有益な製剤化ビヒクルの具体例：
２ｍＭのクエン酸Ｎａ塩、８ｍＭのリン酸Ｎａ塩、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％のフェノール  ｐＨ６．０
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭのグリシン、０．３％のフェノール、ｐＨ６．０
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．３％のフェノール、ｐＨ６．０
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ塩、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．０
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．０
１０ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．５
２ｍＭのクエン酸Ｎａ塩、８ｍＭのリン酸Ｎａ塩、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％のフェノール  ｐＨ５．４
１０ｍＭのリン酸Ｎａ塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ３３５０  ｐＨ６．０
１０ｍＭのクエン酸Ｎａ塩、８０ｍＭのＮａ  グリシン、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００  ｐＨ５．４
１０ｍＭの酢酸Ｎａ塩、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００  ｐＨ５．６
前記製剤の調製：プロトコル
（１）ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍｇ／ｍｌの作製（Ｇｏｖａｒｄｈａｎら，２００４：ＷＯ２００４／０６０３１０）
（２）工程１生成物の遠心分離、３，５０００ｒｐｍ、１５分、４℃
（３）上清みの除去、容量記録
（４）同容量の製剤化ビヒクルの添加
（５）ペレットの再懸濁
（６）工程３を反復、次いで、再懸濁時に所望のｈＧＨ濃度が得られる容量の製剤化ビヒクルの添加、再懸濁
（７）最終懸濁液を２〜８℃で保存
試料を低ｐＨ勾配ＲＰ−ＨＰＬＣ法により解析し、化学分解をモニターして脱アミド化を排除する；脱アミド化は、カチオン交換ＨＰＬＣの使用により検出する；最後に、化学分解を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＩＥＸ−ＨＰＬＣで得られた不純物数を合わせることにより示す。ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて凝集をモニターする。遊離ポリアルギニンに対する結合ポリアルギニンの比を、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定された上清み中に存在する総ポリアルギニン濃度に基づいて計算する。結晶化度は、ＲＰ−ＨＰＬＣ較正により、製剤の結晶性相中のｈＧＨ濃度に対する上清み中のｈＧＨ濃度の比として求める。
【０３４９】
ＨＰＬＣ解析用の試料調製：ＲＰ−、ＩＥＸ−およびＳＥ−ＨＰＬＣ解析を行なうために、結晶を溶解させる。結晶を遠心分離し、上清みを除去する；結晶性ペレットをｐＨ２．８の酢酸水溶液に、２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように溶解させる。２分間の定温放置後、溶液を、１２０００ｒｐｍで４分間遠心分離する。次いで、ＨＰＬＣを用いて試料を解析する。
【０３５０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ：ＲＰ−ＨＰＬＣは、ＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いてｈＧＨの純度を調べるために使用する。Ｃ５  Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３μｍ粒径、３０ｎｍ細孔径）を使用する。カラムのサーモスタット温度を３７℃に設定する。１０μＬの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、１．０ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ含有水）および移動相Ｂ（０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から２．５分で５％Ｂから５０％Ｂに、次いで２．５分から１５．５分で５０％から７０％Ｂに、次いで１５．５分から１７分で７０％から９０％に変化させる。この直後、再度５％Ｂを確立させ、その後３分保持する。検出は２１４ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０３５１】
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ弱アニオン交換クロマトグラフィー：ＷＡＸ−ｈＧＨ法は、特に時間点０での安定性の試験における脱アミド化を測定するために使用する。ＷＡＸ法を用いてｈＧＨの純度を測定するためには、ＰｏｌｙＭＡ  ＷＡＸ（Ｓｕｐｅｌｃｏカタログ番号５９６０２−Ｕ）を使用する。カラムのサーモスタット温度を３７℃に設定する。５μＬの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、０．５ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）および移動相Ｂ（５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０  ５００ｍＭのＮａＣｌ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から３０分で５％Ｂから３０％Ｂに、次いで３０分から４０分で３０％から５０％Ｂに、次いで４０分から４２分で５０％から９５％に変化させ、４５分まで９５％Ｂで維持した後、再度５０％Ｂを確立させ、その後３分保持する。検出は、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０３５２】
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ強カチオン交換クロマトグラフィー：ＳＣＸ−ｈＧＨ法は、安定性の試験において脱アミド化特異的に使用する。ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法を用いてｈＧＨの純度を測定するためには、ＰｏｌｙＬＣ（ＮＥＳＴ  Ｇｒｏｕｐカタログ番号Ｐ０５４ＳＥ０５０３）を使用する。カラムのサーモスタット温度を３０℃に設定する。２０μＬの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、１ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６）および移動相Ｂ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６  ２５０ｍＭのＮａＣｌ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から５分で０％Ｂから２０％Ｂに、次いで５分から２５分で２０％〜７０％Ｂに、次いで２５分から２５．１分で７０％から１００％に変化させ、１００％Ｂを２７分まで維持した後、２７．１分から再度０％Ｂを確立させた後、５分間置く。検出は、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０３５３】
ＳＥ−ＨＰＬＣ：試料中の凝集体の含有量を測定するために使用する。ＳＥ−ＨＰＬＣ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ−２０００カラムを使用する。１０μｌの２ｍｇ／ｍＬ濃度の試料をカラム内に注入する。泳動バッファーは、３％ＩＰＡおよび６０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で構成する。流速を０．６ｍＬ／分に設定し、泳動時間を３０分間とする。検出は２１４ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０３５４】
結晶化度：結晶化度は、試料中の総ｈＧＨ濃度に対する上清み中のｈＧＨ濃度（ＲＰ−ＨＰＬＣ較正に基づいたもの）の比として計算する。
【０３５５】
【数１】
2015214573.tif 000032
遊離ポリアルギニンに対する結合ポリアルギニンの比：比は、ＲＰ−ＨＰＬＣで測定された（ポリアルギニン較正に基づいて）上清み中に存在する総ポリアルギニン濃度に基づいて計算する。
【０３５６】
【数２】
2015214573.tif 000033
外観：  試験品の外観を目視評価し、試験品の関連する変化を検出する。
【０３５７】
実施例３
本開示は、高分子電解質と複合体形成されたｈＧＨ結晶の徐放性反復用量懸濁液の分野に関する。
【０３５８】
ヒト成長ホルモンの一部の液状製剤は、反復用量製剤である。これは、反復投与用の単一のバイアルにおける製剤の使用を可能にする抗菌性保存料を含むものである。ｈＧＨ液剤はまた、ｈＧＨの反復投与を可能にする抗菌性保存料を入れたカートリッジ内に充填され得る。反復用量であるにもかかわらず、これらの液状製剤は、薬理学的効果を得るのに投与の必要が１日１回であることは、言及に値する。これは、ｈＧＨが徐放製剤（例えば、週１回注射製剤）として製剤化され得る場合、患者、特に小児に大いに有益である。また、これは、週１回製剤の反復用量製剤が市場で入手可能である場合でも、患者に大いに有益である。抗菌性保存料の添加は、反復用量医薬製剤の調製に既知の方法である。
【０３５９】
高分子電解質をｈＧＨ結晶と複合体形成させることは（例えば、２９Ｇ針により投与）、ｈＧＨ放出を５〜６日間持続させるのにインビボで有効であり、ＩＧＦ−１の上昇を刺激して少なくとも７日間ベースライン値より上にすることが示されている。
【０３６０】
このような試験では、ｈＧＨ製剤の化学安定性を増大させるために行なわれ、ポリアルギニンと複合体形成された結晶性ｈＧＨを、洗浄剤、塩および抗菌性保存料も含有するクエン酸ナトリウム含有緩衝溶液またはリン酸ナトリウム緩衝液に懸濁させた。
【０３６１】
驚くべきことに、抗菌性保存料の添加は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨの結晶化度に対して有害な影響を与えない；結晶化度は懸濁液中で維持された。
【０３６２】
興味深いことに、クエン酸緩衝液により、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液において、遊離（可溶性）ｈＧＨ含有量の増加がもたらされた。これは、放出プロフィールの有意な短縮がもたらされ得る製剤中への結晶溶解の表示である。対照的に、リン酸緩衝液の添加では、製剤中の遊離ｈＧＨの含有量は増加せず、後に、インビボ動物試験で、複合体型ｈＧＨの既知製剤の放出プロフィールとの同等性が確認された。
【０３６３】
実験の別の部分では、ポリアルギニンと複合体形成されていないｈＧＨ（裸の結晶）を種々の緩衝溶液に投入した。これらの結晶は、前記製剤に易可溶性であった。この実験により、裸のｈＧＨ結晶では、ここで試験した反復用量製剤化ビヒクル中で結晶化度が維持され得ないことが示された。対照的に、ポリアルギニンと複合体形成されたｒｈＧＨ結晶は、種々の抗菌性保存料を用いた反復用量製剤の目的に使用され得た。
【０３６４】
この実験は、抗菌性保存料フェノールの添加が、製剤中の遊離ｈＧＨの含有量に影響を及ぼすか否かを評価するために行なった。対照として既知（対照）製剤を試験した。さらに３種類の試料を、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶のペレットを、塩を含む、界面活性剤およびフェノールを含むまたは含まないクエン酸緩衝液系製剤化ビヒクルに再懸濁させることにより調製した。
【０３６５】
【表２６】
2015214573.tif 000034
この試験の結果により、フェノールの添加は、対照製剤と、界面活性剤および塩を含有するクエン酸緩衝液系溶液の両方において、遊離ｈＧＨの含有量に対して有害効果をもたらさないことが示された（表２６）。驚くべきことに、フェノール含有製剤で示された、懸濁液中の遊離ｈＧＨの濃度は低く、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）含有製剤で示された懸濁液中の遊離ｈＧＨの濃度は高かった。
【０３６６】
この実験は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液中の遊離ｈＧＨの含有量に対するクエン酸塩およびリン酸緩衝液の影響を評価するために行なった。対照として、既知ｈＧＨ（対照）製剤を使用した。さらに２種類の試料を、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶のペレットを、界面活性剤、塩およびフェノールも含むクエン酸緩衝液系製剤化ビヒクルまたはリン酸緩衝液系製剤化ビヒクルに再懸濁させることにより、調製した。
【０３６７】
【表２７】
2015214573.tif 000035
この実験の結果により、対照製剤は、遊離（可溶性）ｈＧＨの含有量が非常に微量であることが示された。これは、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の完全性を示す（表２７）。驚くべきことに、遊離（可溶性）ｈＧＨの含有量は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶をクエン酸系緩衝液に移すと高くなり、これは、ｈＧＨ結晶の一部溶解を示す。この結晶溶解により、インビボｈＧＨ放出プロフィールの有意な短縮がもたらされ得る。対照的に、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶をリン酸系緩衝液に移すと、遊離（可溶性）ｈＧＨの含有量は、クエン酸系緩衝液の場合よりも１桁小さくなった。したがって、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶用の製剤化ビヒクルとしてのリン酸系緩衝液の使用は、対照製剤で見られる週１回放出プロフィールの維持に関して利点をもたらし得る。
【０３６８】
懸濁液中のポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の結晶化度が維持され得る反復用量製剤は、好ましくは、リン酸緩衝液、保存料としてフェノール、および張度調整成分を含むものである。
【０３６９】
ポリアルギニンと複合体形成されていないｈＧＨ結晶（すなわち、裸のｈＧＨ結晶）の懸濁液中の遊離ｈＧＨの含有量に対するクエン酸緩衝液およびリン酸緩衝液の影響を示すための実験を行なった。対照として、既存の（対照）複合体型ｈＧＨ製剤の基準製剤化ビヒクルを使用した。さらに２種類の試料を、裸の結晶のペレットを、界面活性剤、塩およびフェノールも含有するクエン酸またはリン酸緩衝液系製剤化ビヒクルに再懸濁することにより調製した。
【０３７０】
【表２８】
2015214573.tif 000036
この実験の結果により、対照基準製剤化ビヒクルは、裸のｈＧＨ結晶を一部溶解させることが示された（表２８）。驚くべきことに、裸のｈＧＨ結晶は、界面活性剤、塩および保存料も含むクエン酸系またはリン酸系緩衝液に易可溶性であった。製剤中への結晶の溶解により、インビボｈＧＨ放出プロフィールの有意な短縮がもたらされ得る。
【０３７１】
次の実験は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の対照製剤化ビヒクルまたはリン酸ナトリウム低ｐＨ製剤化ビヒクルでの懸濁液中の遊離ｈＧＨおよびポリアルギニンの含有量に対する、種々の濃度の種々の保存料の影響を示すために行なった。対照として、保存料の添加なしの製剤化ビヒクルを使用した。試料の上清み中の遊離ｈＧＨおよびポリアルギニンの含有量を、室温で１ヶ月間定温放置後に解析した。
【０３７２】
【表２９−１】
2015214573.tif 000037
【０３７３】
【表２９−２】
2015214573.tif 000038
【０３７４】
【表３０−１】
2015214573.tif 000039
【０３７５】
【表３０−２】
2015214573.tif 000040
この実験の結果により、抗菌性保存料の添加は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の１０ｍＭのＮａＨＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．０製剤化ビヒクルでの懸濁液中の遊離ｈＧＨおよびポリアルギニンの量を有意に変化させないことが示された（表２９および３０）。１．５％のベンジルアルコールおよび０．５％のクロロブタノール（ｃｌｏｒｏｂｕｔａｎｏｌ）を対照製剤化ビヒクルに添加した実施例では、上清み中の遊離ポリアルギニンの量の増加が観察された。しかしながら、この遊離ポリアルギニンの増加によって、遊離ｈＧＨ濃度の増大は引き起こされなかった。
【０３７６】
この実験は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の対照製剤化ビヒクルおよびリン酸ナトリウム低ｐＨ製剤化ビヒクルでの懸濁液中のｈＧＨの化学安定性に対する、種々の濃度の種々の保存料の影響を示すために行なった。対照として、保存料の添加なしの対照ビヒクルおよびリン酸ナトリウム低ｐＨ製剤化ビヒクルを使用した。ｈＧＨ分解生成物の含有量の増加を、室温で１ヶ月間定温放置後に解析した。
【０３７７】
【表３１−１】
2015214573.tif 000041
【０３７８】
【表３１−２】
2015214573.tif 000042
【０３７９】
【表３１−３】
2015214573.tif 000043
【０３８０】
【表３２】
2015214573.tif 000044
驚くべきことに、抗菌性保存料の添加により、１０ｍＭのＮａＨＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．０製剤化ビヒクルで、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の懸濁液中のｈＧＨの化学安定性が増大され得る（表３１および３２）。この改善は、クロロブタノールの場合ほど顕著ではなかった。また、基準ＡＬＴＵ−２３８製剤へのへの０．５％のクロロブタノールの添加により、ｈＧＨの化学安定性が低下した。したがって、クロロブタノールは、複合体型ｈＧＨを含有する製剤での使用に好ましい抗菌性保存料ではない。
【０３８１】
この実験は、種々の製剤化ビヒクル中のポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の形態構造に対する抗菌性保存料の影響を評価するために行なった。対照として、保存料の添加なしの対照ビヒクルおよびおよびリン酸ナトリウム低ｐＨ製剤化ビヒクルを使用した。室温で１ヶ月間定温放置後に、顕微鏡観察を行なった。抗菌性保存料無含有で０．５％のフェノールと０．３％のメタ−クレゾールを含む対照製剤化ビヒクル（右）の懸濁液中のポリアルギニンでコーティングされたｈＧＨ結晶の顕微鏡像を調べた。また、抗菌性保存料無含有で０．２％のフェノールと０．２％のメタ−クレゾールを含む低ｐＨリン酸系製剤化ビヒクル（１０ｍＭのＮａＨＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ６．０）の懸濁液中のポリアルギニンでコーティングされたｈＧＨ結晶の顕微鏡像も調べた。
【０３８２】
驚くべきことに（Ｓｕｒｐｒｉｓｎｇｌｙ）、抗菌性保存料の添加は、ポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の形態構造に対して有害な影響を及ぼさなかった。
【０３８３】
インビボ結果：下垂体を切除したラットでの試験
この実験は、反復用量製剤化ビヒクル（保存料を含む）でのポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の放出プロフィールが、単回用量の対照ｈＧＨ製剤のｈＧＨ放出プロフィールと同等であるか否かを評価するために行なった。下垂体を切除した雄ウィスターラットにおいて、保存料なしの対照緩衝液中の複合体型ｈＧＨの単回用量製剤と、フェノールを含む対照緩衝液中の複合体型ｈＧＨの反復用量製剤間で、薬力学的プロフィールに有意差は観察されなかった。
【０３８４】
標準的なラット体重増加アッセイにおける有効性の確認は、ｈＧＨ製剤の臨床的開発および商品開発のための重要な工程である。試験物質または対照物質を、下垂体を切除した雄ウィスターラット（９ラット／群）にＳＣ（皮下）注射により投与した。この試験では、５．６ｍｇ／ｋｇの単回用量および反復用量の対照緩衝液中（保存料を含む）のｈＧＨ製剤の単回ＳＣ注射、または０．８ｍｇ／ｋｇの市販の可溶性ｒｈＧＨ（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ）の毎日のＳＣ注射を７日間（すなわち、５．６ｍｇ／ｋｇ／週）受けた後の、下垂体を切除したラットの成長を比較した。投与開始前および第−７日から毎日（投与前の７日間）第８日の観察期間の最後まで毎日、体重を毎週測定した。この下垂体を切除したラットモデルにおいて、日常ｒｈＧＨ対照、単回用量製剤および反復用量製剤間で、体重増加に有意差は観察されなかった。平均体重変化は、それぞれ１８±３％、１８±２％、および１６±４％であった。
【０３８５】
インビボ結果：下垂体を切除したラットでの試験
この実験は、反復用量製剤化ビヒクル（保存料を含む）でのポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の放出プロフィールが、単回用量の対照ｈＧＨ製剤のｈＧＨ放出プロフィールと同等であるか否かを評価するために行なった。下垂体を切除した雄ウィスターラットにおいて、保存料なしの対照緩衝液中の複合体型ｈＧＨの単回用量製剤と、フェノールを含む対照緩衝液中の複合体型ｈＧＨの反復用量製剤間で、ＰＤプロフィールに有意差は観察されなかった。試験物質または対照物質を、下垂体を切除した雄ウィスターラット（９ラット／群）にＳＣ（皮下）注射により投与した。この試験では、５．６ｍｇ／ｋｇの単回用量および反復用量の製剤を受けた後の、下垂体を切除したラットの成長を比較した。
【０３８６】
投与開始前および第−７日から毎日（投与前の７日間）第８日の観察期間の最後まで毎日、体重を毎週測定した。この下垂体を切除したラットモデルにおいて、単回用量製剤と反復用量製剤間で、体重増加に有意差は観察されなかった。平均体重変化は、それぞれ１５±２％および１６±１％（平均±ＳＥ）であった。
【０３８７】
前記製剤の調製：プロトコル：
（１）ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍｇ／ｍｌの作製
（Ｇｏｖａｒｄｈａｎら，２００４−ＷＯ２００４／０６０３１０）
（２）工程１生成物の遠心分離、３，５０００ｒｐｍ、１５分、４℃
（３）上清みの除去、容量記録
（４）同容量の反復用量製剤化ビヒクルの添加
（５）ペレットの再懸濁
（６）工程３を反復、次いで、
再懸濁時に所望のｈＧＨ濃度が得られる容量の製剤化ビヒクルの添加、再懸濁
（７）最終懸濁液を２〜８℃で保存
解析方法
ＲＰ−ＨＰＬＣは、脱アミド化ｈＧＨ以外のすべてのｈＧＨ関連不純物を検出するために使用され（脱アミド化はＩＥＸ−ＨＰＬＣの使用により測定される、下記参照）、Ｃ５
Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３ｕｍ粒径、３０ｎｍ細孔径）において行なわれる。サーモスタットの温度は３７℃である。溶出は、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ）および移動相Ｂ（０．１％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から２．５分で５％Ｂから５０％Ｂに、次いで２．５分から１５．５分で５０％から７０％Ｂに、次いで１．５分で７０％から９０％に変化させ、この直後に再度５％Ｂを確立させる。その後３分保持した後、次の泳動を開始する。流速は１．０ｍｌ／分である。注入容量は、２ｍｇ／ｍｌ濃度のｈＧＨ試料で１０μｌである。検出は２１４ｎｍで行なう。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０３８８】
ＩＥＸ−ＨＰＬＣは、脱アミド化特異的アッセイとして使用する。ｈＧＨの純度を測定するためには、ＰｏｌｙＬＣ（ＮＥＳＴ  Ｇｒｏｕｐカタログ番号Ｐ０５４ＳＥ０５０３）を使用する。カラムのサーモスタット温度を３０℃に設定する。２０μＬの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、１ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６）および移動相Ｂ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６  ２５０ｍＭのＮａＣｌ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から５分で０％Ｂから２０％Ｂに、次いで５分から２５分で２０％〜７０％Ｂに、次いで２５分から２５．１分で７０％から１００％に変化させ、１００％Ｂを２７分まで維持した後、２７．１分から再度０％Ｂを確立させた後、５分間置く。検出は２８０ｎｍで行なう。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０３８９】
実施例４
これらの実験は、ニードルフリー（ジェット式）注射器での投与での使用のための治療用タンパク質の結晶性懸濁液の分野に関する。液状可溶性製剤の医薬品の投与には、種々のデバイス、例えばニードルフリー（ジェット式）注射器デバイスを使用する。このようなデバイスは、薬物投与の容易性を改善すること、注射回数を減らすこと、および場合によっては、注射時の痛みを軽減することにより、患者のコンプライアンスの増大を補助する。
【０３９０】
結晶性タンパク質製剤は、可溶性製剤と比べて利点を有するものであり得る。さらに多くの結晶性薬物を使用する場合、ニードルフリー選択肢により患者のコンプライアンスが増大され得る。しかしながら、結晶性インスリン懸濁液に対してニードルフリー送達選択肢は利用可能でない。患者集団の約５〜１０％で針恐怖症が報告されている。患者が、ニードルフリー選択肢を含む結晶性非経口製剤の投与のための多くの送達可能性を持てることは有益であり得る。
【０３９１】
結晶性タンパク質製剤に関連するジェット式注射器の考えられ得る別の適用は、獣医学的市場である。例えばジェット式注射器との組合せでの結晶性製剤の使用により、長期薬物放出がもたらされ得、例えば、投与頻度の低減、注射に要する時間の短縮、および注射時の痛みの軽減の結果、動物処置のコンプライアンスが改善され得る。
【０３９２】
ニードルフリー注射器は、液状治療用タンパク質製剤の投与における使用のためのものである。結晶性タンパク質に対するニードルフリーデバイスの報告例がない考えられ得る理由は、タンパク質結晶が懸濁液（ｆｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）中で微粒子状を呈し、これによりニードルフリーデバイスによる注射が不可能となり得るため、または結晶性製剤に物理的変化が引き起こされ、前記製剤の治療作用が害され得るためである。
【０３９３】
可溶性で結晶性の治療用非経口製剤の投与の標準的なアプローチは、皮下注射針の使用である。注射時の痛みは、針のサイズおよび針が患者の注射部位に保持される時間量に関係する。針ゲージが大きく注射時間が増大すると、針によって引き起こされる注射部位での痛みが増大する。ジェット式注射器はオリフィスサイズが比較的小さく（表２）、注射時間が非常に短いため、注射時の痛みは、針注射システムと比べて有意に少ない。ニードルフリー（ジェット式）注射器の使用は、製剤に対してさらなる要件を課す。
【０３９４】
本明細書では、結晶性タンパク質懸濁製剤に対するニードルフリー注射器の影響を、針注射システムと比較した。３０〜１８ゲージのＢＤ針を本試験での比較器として使用した。Ｇ３０の針は標準壁であり、Ｇ２５、２１および１８の針は壁厚が薄いものであった。針の内径と外径の比較を表２に示している。
【０３９５】
ＢｉｏＪｅｃｔｏｒニードルフリー（ジェット式）注射システムを用いて、結晶性タンパク質製剤でのジェット式注射器の使用の実現可能性を試験した。
【０３９６】
ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００：Ｂ−２０００は、２つの構成要素：手持ち型の再度使用可能なジェット式注射器と、滅菌された単回使用の使い捨てプラスチック製シリンジからなる。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００注射器には、動力供給源として使い捨て二酸化炭素カートリッジが使用されている。この二酸化炭素ガスが、一貫した確実な圧力を使い捨てシリンジのプランジャーに供給し、それにより適用薬物が組織内に推進される。
【０３９７】
該システムの第２の構成要素であるＢｉｏＪｅｃｔｏｒ単回使用使い捨てシリンジは、プラスチック製でニードルフリーの可変用量シリンジからなる。シリンジ本体は透明であり、正確な充填のための目盛を有する。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒシリンジには５つの異なる種類があり、これらは各々、異なる注射深度または体格が意図される。
【０３９８】
ＶｅｔＪｅｔおよびＶｉｔａｊｅｔ：ＶｅｔＪｅｔは、獣医学的市場における使用のための改良型Ｖｉｔａｊｅｔである。ＶｅｔＪｅｔもまた２つの構成要素携帯型注射器ユニットおよび使い捨てシリンジで構成されている。ＶｅｔＪｅｔはバネによって動力供給される。
【０３９９】
結晶性懸濁液を投与できる可能性を、ニードルフリージェット式注射器を用いて評価した。ニードルフリー注射器に使用され得る結晶性懸濁液に対する制限を特定した。しかしながら、適切に製剤化および選択された結晶性製剤は、ニードルフリー（ジェット式）注射システムを用いて投与され得る。
【０４００】
結晶性タンパク質製剤でのニードルフリー注射器の使用の実現可能性を試験するため、ポリアルギニンでコーティングされたｈＧＨ結晶の懸濁液を、２５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ、５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭの酢酸Ｎａ、５％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００  ｐＨ７．５を含有する緩衝溶液（ＡＬＴＵ−２３８）とし、０．２％のヒアルロン酸（ＨＡ）を含有する同様の製剤（ＨＡ−ＡＬＴＵ−２３８）もまた使用した。また、本発明者らは、可溶性の市販のｈＧＨ製剤に対するニードルフリーシステムおよび針系システムを用いた注射の影響を比較した（表３３参照）。
【０４０１】
【表３３】
2015214573.tif 000045
ニードルフリーシステムならびに針系注射システムを用いて注射した場合での、種々の結晶の大きさおよび種々のタンパク質濃度（表３４参照）を有するモデルタンパク質の結晶性懸濁液の特性もまた調べた。
【０４０２】
【表３４】
2015214573.tif 000046
この実験は、結晶性ＡＬＴＵ−２３８懸濁液におけるｈＧＨの凝集および化学純度に対する種々の注射システムの影響を試験するために行なった。注射は３連で行なった。注射後、結晶を溶解させ、可溶性ｈＧＨを、凝集（ＳＥ−ＨＰＬＣにより解析）ならびに化学分解（ＲＰ−ＨＰＬＣおよび脱アミド化特異的ＩＥＸ−ＨＰＬＣにより解析）に関して解析した。
【０４０３】
【表３５】
2015214573.tif 000047
３０Ｇ×１／２インチ針、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００またはＶｅｔＪｅｔ注射システムの使用により注射した対照試料および試験試料において、モノマーまたはｈＧＨ関連物質の含有量に有意差はなかった（表３５）。これらのデータは、試験対象注射システムのいずれかを使用した結果、分子レベルでの剪断の影響は測定されなかったという結論を裏付ける。
【０４０４】
結晶性ｈＧＨの懸濁液に対する剪断応力の考えられ得る影響を試験するため、注射前および注射後の試料を、結晶性ｈＧＨの懸濁液の上清み中の遊離ｈＧＨおよびポリアルギニンの含有量について解析した。対照懸濁液ＡＬＴＵ−２３８は、ポリアルギニンでコーティングまたはポリアルギニンと複合体形成されたｈＧＨ結晶の製剤化ビヒクルでの既知懸濁液である。剪断応力により、前記製剤の放出特性が変化し得る。ＡＬＴＵ−２３８は、典型的な範囲の遊離ｈＧＨおよびポリアルギニンを含む。これらのパラメータの変化は、懸濁液中の結晶に対する前記注射システムの有害な影響の表示であり得、ｈＧＨ放出プロフィールに影響を及ぼし得る。注射は３連で行なった。対照試料ならびに種々の注射システムを使用した後の試料の上清みを、ｈＧＨおよびポリアルギニンの含有量について解析した。３回の連続操作の遊離ｈＧＨおよびポリアルギニンの平均含有量を表３６に示す。
【０４０５】
【表３６】
2015214573.tif 000048
３０Ｇ×１／２インチ針、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００またはＶｅｔＪｅｔ注射システムの使用の結果、遊離ｈＧＨまたはポリアルギニンの含有量の増加は観察されなかった。これらのデータは、試験した注射システムが結晶性ｈＧＨの懸濁液に有害な影響を及ぼさないことを示す。
【０４０６】
複合体型ｈＧＨ結晶製剤の溶解プロフィールに対する種々の注射システムの影響を試験するため、注射後のＡＬＴＵ−２３８対照試料およびＡＬＴＵ−２３８試料を３−ｐＨ溶解試験での溶解について解析した。注射は２連で行なった。２回の連続操作の平均を表３７に示す。
【０４０７】
【表３７】
2015214573.tif 000049
対照試料と、３０Ｇ×１／２インチ針、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００またはＶｅｔＪｅｔ注射システムで注射した試料間で、ｈＧＨ溶解に有意差は見られなかった（表３７）。これらのデータは、ＡＬＴＵ−２３８の投与のためのニードルフリー（ジェット式）注射器の使用の実現可能性を裏付ける。
【０４０８】
粒子の表面電荷に対する種々の注射システムの影響を示すための実験を行なった。ＡＬＴＵ−２３８試料におけるゼータ電位を、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００注射器での注射後に試験した。１回目の注射後、試料を収集し、反復して注射した。
【０４０９】
【表３８】
2015214573.tif 000050
注射前の元の試料と比べて、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００での１回目および反復注射後の粒子の表面電荷に有意な変化はなかった（表３８）。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００での注射は、ＡＬＴＵ−２３８製剤におけるゼータ電位を変化させない。
【０４１０】
この実験では、結晶性ｈＧＨの懸濁液（ＡＬＴＵ−２３８）の粒径に対するＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００ジェット式注射の影響を調べた。粒径は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０粒径測定装置を用いて、注射前ならびに１回目および反復注射後に測定した。フラウンホーファー光学モデルを用いてデータを解析した。起こり得る結晶形態構造の変化の検出には、顕微鏡観察を使用した。
【０４１１】
【表３９】
2015214573.tif 000051
注射前の元の試料と比べて、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００での１回目および反復注射後、粒径に有意な変化はなかった（表３９；図９）。これらの数値は、顕微鏡観察と整合する。
【０４１２】
いずれかの注射システムでのＡＬＴＵ−２３８の注射後、粒径の縮小または結晶形態構造の変化は観察されなかった。同様に、反復注射後でも変化は観察されなかった。
【０４１３】
ポリアルギニンでコーティングされたｈＧＨ結晶のヒアルロン酸を含有する製剤化ビヒクルでの懸濁液ＨＡ−ＡＬＴＵ−２３８を使用し、この結晶性タンパク質懸濁製剤でのジェット式注射器の使用の実現可能性を試験した。この実験では、ｈＧＨ凝集に対する種々の注射システムの影響を調べた。注射は２連で行なった。注射後、結晶を溶解させ、可溶性ｈＧＨを凝集についてＳＥ−ＨＰＬＣによって解析した。
【０４１４】
【表４０】
2015214573.tif 000052
対照ＨＡ−ＡＬＴＵ−２３８試料、および３０Ｇ×１／２インチ針、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００またはＶｅｔＪｅｔ注射システムの使用により注射された試料において、モノマーｈＧＨ含有量に有意差はなかった（表４０）。これらのデータは、試験対象注射システムのいずれかを使用した結果、分子レベルでの剪断の影響は測定されなかったという結論を裏付ける。
【０４１５】
この実験では、結晶性ｈＧＨの懸濁液（ＨＡ−ＡＬＴＵ−２３８）の粒径に対するＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００ジェット式注射の影響。粒径は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０粒径測定装置を用いて、注射前ならびに１回目の注射後および反復注射後に測定した。フラウンホーファー光学モデルを用いてデータを解析した。起こり得る結晶形態構造の変化の検出には、顕微鏡観察を使用した。
【０４１６】
【表４１−１】
2015214573.tif 000053
【０４１７】
【表４１−２】
2015214573.tif 000054
注射前の試料との比較に使用した注射システムすべてついて、１回目および反復注射後に試料の粒径に有意な変化はなかった（表４１）。図１０も参照のこと。これらの数値は顕微鏡観察と整合する。ＡＬＴＵ−２３８製剤について、同様の観察結果が得られた。
【０４１８】
ＨＡ−ＡＬＴＵ−２３８試料を注射に使用した場合、粒径の縮小または結晶形態構造の変化は観察されなかった。反復注射後、元々結晶性凝集体を含まない試料で観察された粒径と比べて、さらなる粒径の縮小はなかった。これらのデータは、結晶性タンパク質懸濁製剤の投与のためのニードルフリー注射器の使用の実現可能性を示す。
【０４１９】
可溶性ｈＧＨ製剤に対するジェット式注射器の影響を試験するため、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ
ＡＱ試料を使用した。３０Ｇ×１／２針による注射前または注射後のＮｕｔｒｏｐｉｎ
ＡＱ試料では、微粒状物質の形成は観察されなかった。しかしながら、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００およびＶｅｔＪｅｔ注射器での注射後のＮｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ試料では微粒状物質の形成が観察された。この微粒状物質は、おそらくジェット式注射器の使用の結果形成されたものである。これらのデータは、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ製剤がニードルフリー注射システムには適切でないかもしれないことを示し、タンパク質製剤に対するニードルフリー注射器の良好な使用には適切な製剤開発が必要とされ得るという考えを確証するものである。
【０４２０】
ＡＬＴＵ−２３８は、ポリアルギニンでコーティングされたｈＧＨ結晶の懸濁液である。該結晶は、約１０〜２０μｍの長さおよび約１〜２μｍの厚みの針状形態を有する。該懸濁液自体は安定である。先の試験では、結晶の有意な沈降は少なくとも６ヶ月の保存期間の間、観察されなかった。しかしながら、結晶が高速で沈降する傾向がある一例として、市販のインスリン懸濁製剤がある。
【０４２１】
本明細書における試験の範囲を拡張するため、結晶が種々の大きさおよび／または形態構造および／または沈降特性を有する他の結晶性タンパク質懸濁液の特性に対するジェット式注射システムの影響を調べた。市販のインスリンＨｕｍｕｌｉｎ  Ｕｌｔｒａ製剤をＢｉｏＪｅｃｔｏｒシリンジに負荷し、水平、まっすぐ垂直または逆さまの位置に３分間保持した後、注射した。これらの保持試料を、製剤をジェット式注射器のシリンジに負荷したほぼ直後に注射された試料と比較した。注射後、注射分中のインスリンの量とシリンジ内部に残留した量を測定し、シリンジ内に負荷された物質を１００％とみなしてパーセンテージで表示した。
【０４２２】
【表４２】
2015214573.tif 000055
直後に注射した試料では、用量の９０％が送達された。注射を遅延させ、注射器を水平位置に保持した場合、送達された用量は、シリンジへの負荷分の２９％と低かった（表４２）。これは、患者には深刻な危険を伴い得る。ジェット式注射器の使用は、このインスリン製剤の投与には推奨されない。インスリン懸濁製剤は、高い結晶沈降速度を有する結晶性タンパク質製剤の一例である。ジェット注射器は、高い沈降速度を有する結晶性タンパク質懸濁液での使用には不適切であり得る。
【０４２３】
同じ実験を、ＡＬＴＵ−２３８製剤を用いて行なった。製剤をＢｉｏＪｅｃｔｏｒのシリンジ内に負荷し、水平、まっすぐ垂直または逆さまの位置に１時間保持した後、注射した。これらの保持試料を、製剤をジェット式注射器のシリンジに負荷したほぼ直後に注射された試料と比較した。注射後、注射分中のｈＧＨの量とシリンジ内部に残留した量を測定し、シリンジ内に負荷された物質を１００％とみなしてパーセンテージで表示した。
【０４２４】
【表４３】
2015214573.tif 000056
インスリンを試験した実施例とは異なり、直後に注射したＡＬＴＵ−２３８試料と、注射前に保持した試料間で、用量分布に差は観察されかった（表４３）。ＡＬＴＵ−２３８で使用した保持時間は有意に長かった。
【０４２５】
ＡＬＴＵ−２３８製剤中の結晶性ｈＧＨの凝集および化学純度に対するジェット式注射システムの有害な影響は観察されなかった。さらに、ジェット式注射システムの使用の結果、粒径、形態構造、粒子の表面電荷および放出特性は変化しなかった。
【０４２６】
本試験の範囲を拡張するため、結晶が種々の大きさ、形態構造および沈降特性を有する他のモデル結晶性タンパク質懸濁液の特性に対するジェット式注射システムの影響を調べた。この実験では、小粒径六角形Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  Ｃｅｐａｃｉａ（「ＢＣ」）Ｌｉｐａｓｅ結晶の懸濁液に対するジェット式注射システムの影響を調べた。注射前および注射後のＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ結晶について、懸濁液中の結晶の大きさまたは形態構造の視覚による顕微鏡的変化は観察されなかった。
【０４２７】
【表４４】
2015214573.tif 000057
試験対象注射システムのいずれかの使用の結果、ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅの粒径（表４４、図１１Ａおよび１１Ｂ）または形態構造に影響はないようであった。ジェット式注射システムは、結晶が約２０マイクロメートルのメジアン粒径を有する六角形である場合、結晶性タンパク質懸濁製剤の注射に使用され得る。
【０４２８】
次に、結晶が大粒径および六角形の形態構造を有する他のモデル結晶性タンパク質懸濁液の特性に対するジェット式注射システムの影響を調べた。この実験では、約３０μｍの中粒径を有する六角形ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ結晶の懸濁液に対するジェット式注射システムの影響を調べた。注射の際に結晶形態構造の変化は検出されず、体積基準分布に有意な変化は検出されなかった（表４５）。
【０４２９】
【表４５】
2015214573.tif 000058
ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００またはＶｅｔＪｅｔニードルフリー（ジェット式）注射システムによるＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ結晶の注射の結果、数基準粒径分布に有意な減少が観察された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。これは、おそらく３０Ｇ針ではなくジェット式システムの使用により多数の小粒子が生成したことによるものである。試料はすべて容易に注射されたが、ジェット式注射システムの使用により小粒径粒子の量が増加する結果、製剤の放出プロフィールが変化し得ることは考慮すべきである。
【０４３０】
結晶がさらに大きく六角形の形態構造を有する他のモデル結晶性タンパク質懸濁液の特性に対するジェット式注射システムの影響を調べた。この実験では、約８０μｍの中粒径を有する大きな結晶を有するひし形の３次元ＢＣ−Ｌｉｐａｓｅ結晶の懸濁液に対するジェット式注射システムの影響を調べた。
【０４３１】
【表４６】
2015214573.tif 000059
試料を注射モジュール内に吸引しようとすると、有意な濾過が観察された。試料は、プランジャー側から注射モジュール内に負荷した。試料をＶｅｔＪｅｔシステム内に負荷することは、デバイス設計の特異性のため可能ではなかった。
【０４３２】
粒径が注射デバイスのオリフィスサイズに近い場合、結晶性試料は、注射モジュール内に負荷され得ないか、または注射デバイスのオリフィスとの相互作用による破壊を受け得るかのいずれかである。３０Ｇ針の場合、その濾過効果のため、結晶の大きさの有意な縮小が観察された。該結晶性懸濁液は内外を通過できる最も小さい針ゲージは２５ゲージシリンジであった。この場合であっても、剪断応力により、小さい結晶性の残屑の形成がもたらされた（表４６、図１３Ａおよび１３Ｂ）。したがって、ジェット式注射器で使用可能であるためには、懸濁液中の結晶の最大寸法は、ジェット式注射器のオリフィスの直径の少なくとも約３倍小さい大きさを有するものであるのがよい。
【０４３３】
他の実験では、結晶性グルタリルアルカラーゼのモデル懸濁液でのジェット式注射器の使用の実現可能性を調べた。この細長い両錐型結晶は、最大寸法約１５０μｍの大きさを有し、断面の大きさは約３０μｍである。
【０４３４】
【表４７】
2015214573.tif 000060
試料を注射モジュール内に吸引しようとすると、有意な濾過が観察された。試料は、１８Ｇ針を使用した場合のみ、自由にシリンジ内吸引された。試料は、プランジャー側から注射モジュール内に負荷した（１８Ｇ針の例を含まない）。試料をＶｅｔＪｅｔシステム内に負荷することは、デバイス設計の特異性のため可能（ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ）ではなかった。結晶性グルタリルアルカラーゼ懸濁液では、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ
２０００を使用すると、注射時間の増加が観察された。ジェット式注射器および微細ゲージ針の使用後、試料中に結晶性の残屑の蓄積が観察された。
【０４３５】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ２３０での測定時、粒径において有意な変化が測定されなかったにもかかわらず（表４７）、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００ニードルフリー注射システムおよび３０Ｇ針によるグルタリルアルカラーゼ結晶注射の結果、数基準粒径分布に有意な減少（図１４Ａおよび１４Ｂ）が観察された。これは、注射にジェット式システムまたは３０Ｇ針を使用した場合の結晶の破壊によって説明され得る。粒径が注射デバイスのオリフィスサイズに近い場合、結晶性試料は、注射モジュール内に負荷され得ないか、または注射デバイスのオリフィス壁との相互作用による破壊を受け得るかのいずれかである。針の直径を大きくするほど、観察される結晶の破壊は少なくなった。
【０４３６】
方法プロトコル
注射：結晶性製剤は、１Ｓ０２１シリンジを備えたＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システム、および０．００６２インチノズルシリンジＲｅｆ＃  Ｋ７０００、３０Ｇ×１／２インチ針（ＢＤパーツ番号  ３２８４６６）が予め装着されたＢＤ  ０．５ｃｃシリンジ、３０Ｇ×１／２インチ（ＢＤパーツ番号３０５１０６）、２５Ｇ×５／８インチ（ＢＤパーツ番号３０５１２２）、１８Ｇ×１．５インチ（ＢＤパーツ番号  ３０５１９６）（１ｍＬ容シリンジに対するルアーロック（ＢＤパーツ番号  ３０９６２８）が取り付けられている）を備えたＶｅｔＪｅｔシステムを用いて注射される。０．２５ｍＬの試料を２連で試験する。ＢｉｏＪｅｃｔｏｒ  ２０００システムおよびＶｅｔＪｅｔシステムは、ＢｉｏＪｅｃｔｏｒの推奨に従って使用する。
【０４３７】
ＳＥ−ＨＰＬＣ：ＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いて純度を測定するためには、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ−２０００カラムを使用する。１０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍＬ濃度の試料をカラム内に注入する。泳動バッファーは、３％ＩＰＡおよび６０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で構成する。流速を０．６ｍＬ／分に設定し、泳動時間を３０分間とする。検出は２１４ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合（モノマー）は、ピーク面積に基づいて計算した。
【０４３８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ：ＲＰ−ＨＰＬＣは、純度の試験に使用する。ｈＧＨの純度をＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いて測定するためには、Ｃ５  Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍ×４．６ｍｍ、３μｍ粒径、３０ｎｍ細孔径）を使用する。カラムのサーモスタット温度を３７℃に設定する。１０マイクロリットルの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、１．０ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ含有水）および移動相Ｂ（０．８％ＴＦＡ含有ＭｅＣＮ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から２．５分で５％Ｂから５０％Ｂに、次いで２．５分から１５．５分で５０％から７０％Ｂに、次いで１５．５分から１７分で７０％から９０％に変化させ、この直後に再度５％Ｂを確立させる。その後３分保持した後、次の泳動を開始する。検出は２１４ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合をピーク面積に基づいて計算する。
【０４３９】
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ（強カチオン交換）クロマトグラフィー：ＳＣＸ−ｈＧＨは、安定性の試験において脱アミド化特異的に使用する。ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法を用いてｈＧＨの純度を測定するため、ＰｏｌｙＬＣ（ＮＥＳＴ  Ｇｒｏｕｐカタログ番号Ｐ０５４ＳＥ０５０３）カラムを使用する。カラムのサーモスタット温度を３０℃に設定する。２０マイクロリットルの試料を２ｍｇ／ｍＬ濃度で注入する。溶出は、１ｍＬ／分の流速で、移動相Ａ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６）および移動相Ｂ（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．６  ２５０ｍＭのＮａＣｌ）によって提示される勾配系を用いて行なわれる。勾配系は、０分から５分で０％Ｂから２０％Ｂに、次いで５分から２５分で２０％から７０％Ｂに、次いで２５分から２５．１分で７０％から１００％に変化させ、１００％Ｂを２７分まで維持した後、２７．１分から再度０％Ｂを確立させた後、５分間置く。検出は、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで行なう。得られたクロマトグラムを手作業で積分する。純度割合は、ピーク面積に基づいて計算する。
【０４４０】
粒径分布（ＰＳＤ）：粒径分布は、微小容量モジュールを備えたＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ
２３０  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ、Ｆｌｏｒｉｄａ）を用いて、レーザー回折によって測定される。試料を試料緩衝液（結晶性タンパク質３用の製剤化ビヒクル）中に希釈し、８〜１２％の不透明性の機能範囲を得る。データ解析は、フラウンホーファー光学モデルを用いて行なう。１０％（ｄｌ１０）、５０％（メジアン）および９０％（ｄｌ９０）の累積分布限界を表す粒径（単位：μｍ）の割合を報告する。
【０４４１】
３−ｐＨ溶解試験：３−ｐＨ溶解試験は、ＡＬＴＵ−２３８試料における溶解プロフィールの変化を評価するために使用する。
【０４４２】
粒子表面の変化：粒子表面の変化は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｚ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いて測定される。泳動バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５とする。ゼータ電位変換標準（Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）を用いて、機器（Ｍａｌｖｅｒｎカタログ番号ＤＴＳ  １０５０）を較正する。各試料に対し、１２μｌの結晶性アリコート（濃度１０〜３０ｍｇ／ｍｌ）を５８８μｌの泳動バッファーに添加し、室温で３回の測定値を得る。
【０４４３】
顕微鏡像：結晶性試験品の外観を顕微鏡によって評価し、注射による試験品の関連する変化を検出する。
【０４４４】
実施例５
ＡＬＴＵ−２３８は、長期作用性のポリアルギニン（ポリＡｒｇ）コート結晶性ヒト成長ホルモン（ソマトロピン）である。さらなる開発として、凍結乾燥形態および再構成凍結乾燥製剤を開発した。再構成凍結乾燥製剤では、再懸濁後、２〜８℃で２４ヶ月以上の化学安定性が得られることが予測される。
【０４４５】
ｈＧＨまたはｈＧＨ誘導体の例示的な凍結乾燥製剤は、
１．約２０〜約５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ結晶の懸濁液
２．緩衝液として、Ｔｒｉｓまたはリン酸塩とＴｒｉｓもしくはヒスチジンいずれかとの併用緩衝液
３．７〜９のｐＨ範囲
４．塩：５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム
５．懸濁化剤およびケーキング剤として、２．５％〜１０％の範囲のポリエチレングリコール６０００または８０００
６．シリコーン処理されたバイアルまたはコーティングされたバイアル、例えば、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｉ型＋ガラス製バイアル、または表面コートされた容器の閉鎖部
７．溶解サイクルパラメータとして、−５０℃〜−６０℃の凍結貯蔵温度、−３０℃〜１０℃の一次乾燥貯蔵温度、および２０℃〜４０℃の二次乾燥
を含む。
【０４４６】
これらの成分および量は、凍結乾燥前の製剤に適したものであり、また、凍結乾燥ｈＧＨを再構成させた後の製剤にも適したものである。
【０４４７】
表４８に列挙した試験方法の１つ以上を用いて、再構成凍結乾燥形態の製剤の安定性が評価される。該試験方法を実施するための詳細は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載している。
【０４４８】
【表４８】
2015214573.tif 000061
最初の凍結乾燥試験では、上清み中の溶存ｈＧＨ、および凍結乾燥時の安定性に対する賦形剤の影響を評価した。製剤基剤はｐＨ７．５のＴｒｉｓ緩衝液とした。種々の濃度のＰＥＧ；糖質（スクロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトース）；ならびに塩を有する製剤および塩を有しない製剤を試験した。上清み中の遊離ｈＧＨは、結晶の完全性の表示である。したがって、制御放出プロフィールが凍結乾燥後に変化しないことを確認するため、上清み中の溶存ｈＧＨの量をモニターした。凍結乾燥前の（ｐｒｅｌｙｏ）試料の上清み中の溶存ｈＧＨ濃度の結果を図１５に示す。これは、ＰＥＧ濃度が結晶の可溶性に対して影響を及ぼすことを示し、ＰＥＧのパーセンテージが少ないほど、上清み中により多くの結晶が溶解する。この図に示した実験では、製剤基剤はＰＨ７．５のＴｒｉｓ緩衝液とした。また、ＰＥＧを含まない試料は、上清み中、最大量の溶存ｈＧＨを有する。
【０４４９】
水中においてＡＬＴＵ−２３８は、密でない粉末の外観を有し、凍結乾燥後、ケークの出現はなかった。それ以外、すべての試料は、バイアルの縁ではわずかに収縮していたが妥当なケーキ形成を示した。再構成させると、いずれの賦形剤も含なまいポリＡｒｇ複合体型結晶は、懸濁化剤がないためバイアルの底部に沈降した。糖質（マンニトール、スクロース、ソルビトールまたはラクトースなど）を含有する製剤は、再構成させると直ちに懸濁されたが１５分間以内に沈降し、これは、凍結乾燥後の沈降速度の差を示す。出発材料またはｐｒｅｌｙｏ懸濁液は、ほとんどが、小さい棒形状の結晶の２〜２０μｍの小クラスターであった。しかしながら、凍結乾燥後の一部の製剤では、結晶の大きさが有意に大きくなっているようである。凍結乾燥の前および後で調べた製剤は、Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中に２５ｍｇ／ｍＬのＡｌｔｕ−２３８；Ｔｒｉｓ、５％ラクトース、ｐＨ７．５中に２５ｍｇ／ｍＬの複合体型結晶；またはＴｒｉｓ、酢酸ナトリウムおよび５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５中に２５ｍｇ／ｍＬの複合体型結晶を含むものであった。結果は、５％のＰＥＧを含有する製剤では、凍結乾燥後に結晶形態構造が維持されたことを示す。
【０４５０】
ｐｒｅｌｙｏ懸濁液の目標ｈＧＨ／ｐＲ比は５〜７．５であった。しかしながら、ｐｒｅｌｙｏ懸濁液のｈＧＨ／ポリＡｒｇ比は、１％のＰＥＧまたは糖質を含有する製剤では、ずっと大きかった（約２０）。これは、これらの製剤におけるポリＡｒｇコーティングの減損を示し、おそらく結晶の溶解に起因している。このことは、ｐｒｅｌｙｏ懸濁液について上清み中のｈＧＨ濃度も高いことによって確認された。また、溶解後の結晶は、１％のＰＥＧまたは糖質を含む試料では５％のＰＥＧを含むものよりも塊状物であり、この場合も、これはポリＡｒｇの減損を示し、結晶同士の付着、したがって形態構造の変化をもたらす。したがって、ＰＥＧの濃度は、溶解プロセス中のＡＬＴＵ−２３８の安定化に重要である。
【０４５１】
また、再構成溶解試料のｐＨは、Ｔｒｉｓを含有する製剤では、溶解プロセス後、ｐＨ７．５から８．２へと高い方にシフトする。その原因を特定するため、これらの試験製剤の凍結／解凍試験を、ＦＴＳ凍結乾燥機において、溶解サイクルとして同じ凍結速度ｌ℃／分を用いて行なった。次いで、すべての試料を室温で解凍した。結果は、ｐＨシフトがｐＨ単位あたり約０．０５〜０．０９のみであることを示した。したがって、ｐＨ変化を誘導したのは乾燥プロセスであった。
【０４５２】
製剤を改善するため、以下の試験は、緩衝液種の選択および緩衝液濃度を中心として行なった。Ｔｒｉｓ含有ｐｒｅｌｙｏ懸濁液では、ＴｒｉｓがこのｐＨで最大緩衝能を有するため；および／または再構成させると、緩衝液成分の１つとしてリン酸塩を添加によりリン酸塩がｐＨ７．５で緩衝し得るため、ｐＨを約８まで上げた。ヒスチジンを第２の緩衝液として選択する考えは、凍結乾燥プロセス中、リン酸塩の存在のためｐＨが低い方にシフトし過ぎ、結晶溶解がもたらされるのを抑制するためであった。０．２ｍＬおよび１．０ｍＬの薬物製剤を送達するのに、２つの充填容積：０．５ｍＬおよび１．２ｍＬを評価した。本発明者らの目的が達成され得る３つの緩衝液系を、Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；ヒスチジン（リン酸塩を有する）ｐＨ７．５において製剤化した。興味深い観察結果の１つは、Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６において製剤化した試料で、ｐＨが８．０に低下したことであり、これにより、複合体型ｈＧＨ結晶の最適緩衝液範囲は８あたりであるばずという説が確認された。これらのすべての結果に基づき、ｐＨ８のＴｒｉｓを用いた緩衝液；ならびにヒスチジンとリン酸塩またはＴｒｉｓ／リン酸塩を含有する２つの緩衝液組合せを、ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶に選択する。
【０４５３】
選択した製剤を安定性について試験し、種々の保存期間後にｐＨ測定値を得た。初期のｐＨシフト以外、保存期間中にｐＨの変化はなかった。
【０４５４】
インビトロ分散溶解速度を試験したが、保存の際、有意な変化は観察されない；溶解速度は、臨床試験ロットと同等であった。
【０４５５】
また、２．５％、５％、および１０％ならびに２．５％〜１０％の範囲のポリエチレングリコール濃度も確立された。試料はすべて、１分以内に再懸濁され得た。２〜８℃または４０℃で３ヶ月後、これらの製剤において酸化、脱アミド化、凝集、または溶存ｈＧＨに差は観察されなかった。
【０４５６】
また、２０〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲のｈＧＨ濃度のポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶では、再構成の際、安定性に差は観察されなかった。この結果に基づくと、上清み中の遊離ｈＧＨおよび分散溶解プロフィールは、すべての試験濃度で同等である。また、化学安定性プロフィールに差はない。
【０４５７】
溶解サイクルは、Ｔｒｉｓ、酢酸ナトリウムおよびＰＥＧ６０００（ｐＨ７．５）製剤を用いて最適化された。種々の溶解パラメータを試験した。ＰＥＧ含有試料の凍結ＤＳＣサーモグラムは、−２０℃あたりで起こった熱事象を示し、これはＰＥＧに起因するものである。ＰＥＧによる問題を回避するため、製剤温度に対して＜−２０℃を、溶解サイクル開発での一次乾燥温度の選択の目標とした。表４９に示されるように、−６０℃または−５０℃の凍結温度および−３０〜１０℃の一次乾燥貯蔵温度範囲では、最終溶解製剤はすべて、バイアルの縁ではわずかに収縮していたが平滑な表面を有する妥当なケーキ形成を示した。種々の溶解サイクルでの溶解ケークのケーク外観に差は観察されない。また、測定された製剤温度はすべて、所望のとおり−２０℃より低かった。
【０４５８】
【表４９】
2015214573.tif 000062
粒径分布を解析した。粒径分布を図１６に示す。試験した全サイクルで、粒径分布に差はなかった。
【０４５９】
要するに、本明細書の実施形態で規定する溶解サイクルは、
ａ．凍結速度  １℃／分
ｂ．−５０℃〜−６０℃で凍結
ｃ．一次乾燥貯蔵温度範囲  −３０℃〜１０℃
ｄ．二次乾燥貯蔵温度  ２０℃〜４０℃
である。
【０４６０】
リード製剤の一例の安定性の結果を以下の表にまとめる。データはすべて、これらの２つのサイクルで作製した試料と比較した場合、同等である。
【０４６１】
種々の容器の閉鎖部もまた、溶解製剤で比較した。ポリＡｒｇコーティング結晶は、シリコーン油および表面コートがないと、ガラス製バイアルに急速に容易に付着する。この結晶は、シリコーン処理されていないバイアルの容易に付着し、この付着により、反復用量製剤は劣化する。したがって、ポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶のための容器の閉鎖部は、シリコーン処理されたもの、または表面コートされたを有するバイアル（Ｉ型＋コーティングされたバイアルなど）である必要がある。
【０４６２】
保存料を含有する希釈剤を用いて再構成させた場合、再構成製剤は反復用量製剤として使用され得る。反復用量製剤の利点は、患者にとって使い易さが助長される、バイアル内容物が完全に使用可能となることにより無駄が低減され、それにより有意な節約がもたらされることである。
【０４６３】
一般に使用されている４種類の保存料：フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、およびベンジルアルコールを、複合体型ｈＧＨ結晶での好適性について試験した。Ｔｒｉｓ、酢酸ナトリウム、およびＰＥＧを含有する溶解製剤を、これらの保存料のうちの１種類を含む水で再構成させ、再構成試料の安定性を解析した。バイアルはすべて、１０秒以内に再構成／再懸濁され得、ベンジルアルコールを含む試料で塊状物が多かったこと以外、結晶形態構造の変化は見られなかった。
【０４６４】
保存料を含有するこれらの再構成懸濁液の安定性を解析した。結果は、再構成懸濁液はすべて、２〜８℃で少なくとも１ヶ月間安定であることを示す。したがって、ｍ−クレゾール、フェノールまたはクロロブタノールは、溶解製剤での保存料として使用され得る。
【０４６５】
本発明のいくつかの実施形態を説明した。とはいうものの、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変形が行なわれ得ることは理解される。したがって、他の実施形態も添付の特許請求の範囲に包含される。
【０４６６】
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕高分子電解質複合体型組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結晶；
５．４〜７．０のｐＨ範囲の塩緩衝液であって、トリエタノールアミン、イミダゾール、グリシン、ヒスチジン、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、およびＴｒｉｓ、またはそれらの組合せを含む、塩緩衝液；
６０〜２００ｍＭのナトリウムイオン濃度範囲を有するナトリウム塩；
懸濁化剤、化学的安定剤、界面活性剤、および保存料、
を含むｈＧＨ調製物。
〔２〕前記懸濁化剤がポリエチレングリコールである、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３〕前記懸濁化剤が２．５〜２０％ｗ／ｖのポリエチレングリコールである、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔４〕前記ｈＧＨが６ヶ月から２４ヶ月の間の所定の期間または２℃〜８℃の間の所定の温度で安定である、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔５〕前記ｈＧＨが所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも６ヶ月である、前記〔４〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔６〕前記ｈＧＨが所定の期間安定であり、前記期間が少なくとも１２ヶ月である、前記〔４〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔７〕ｐＨがｐＨ６〜７である、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔８〕リン酸緩衝液を含み、ｐＨが６〜７のｐＨを有する、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔９〕ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶の濃度が５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬである、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１０〕前記ポリアルギニン複合体型ｈＧＨ結晶が２〜１００μｍの粒径分布を有する、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１１〕ポリアルギニンに対するｈＧＨの比が３〜１５である、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１２〕シリンダー型のシリコーン処理された容器内の上部空間がないか、または１０ｍｍまでの上部空間を有する容器内に配置された、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１３〕前記容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓である閉鎖部を含む、前記〔１２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１４〕前記ｈＧＨが５〜１００ｍｇ／ｍｌで存在する、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１５〕さらに抗菌剤を含む、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１６〕さらにヒアルロン酸を含む、前記〔１〕に記載の調製物。
〔１７〕前記調製物が懸濁剤以外のポリマーを含まない、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１８〕前記調製物がヒスチジン緩衝液を含まない、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔１９〕さらに保存料を含む、前記〔１〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２０〕前記保存料がフェノールである、前記〔１９〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２１〕５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリアルギニン複合体型組換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結晶；
６．１〜６．８のｐＨのリン酸緩衝液；
６０〜２００ｍＭの塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；
２．５〜２０％のポリエチレングリコール
を含み；
１０ｍｍ以下の上部空間を有するシリコーン処理されたプレフィルドシリンジ内に；
０．２〜１．０ｍｌの容量で、
配置されたｈＧＨ調製物。
〔２２〕高分子電解質でコートされたｈＧＨ結晶の懸濁液であって、該結晶性ｈＧＨの濃度が５〜１００ｍｇ／ｍＬである懸濁液；
前記複合体の結晶化度を、ｐＨ範囲５．０〜８．０で維持する生物学的に適合性の緩衝液；
前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤；および
前記組成物の総重量オスモル濃度が２５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となるようにする張度調整剤
を含むｈＧＨ調製物。
〔２３〕さらに保存料を含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２４〕前記保存料がフェノールである、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２５〕前記フェノールが０．２〜０．３％ｗ／ｖの濃度である、前記〔２４〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２６〕さらに化学的安定剤を含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２７〕前記生物学的に適合性の緩衝液が１〜１５０ｍＭの範囲の緩衝塩濃度を有する、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２８〕前記緩衝塩が、酢酸塩、トリエタノールアミン、イミダゾール、リン酸塩、クエン酸塩およびＴｒｉｓ−ＨＣｌからなる群より選択される、前記〔２７〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔２９〕前記生物学的に適合性の緩衝液がリン酸ナトリウムである、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３０〕前記生物学的に適合性の緩衝液がリン酸ナトリウム緩衝液とクエン酸ナトリウム緩衝液を含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３１〕前記複合体の結晶化度を維持または増大させる前記結晶化度促進剤が酢酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールを含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３２〕前記複合体の結晶化度を維持または増大させる前記結晶化度促進剤が１〜２５ｗ／ｖ％のＰＥＧを含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３３〕前記複合体の結晶化度を維持または増大させる結晶化度促進剤がフェノールを含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３４〕前記張度調整剤が、中性塩、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、その作用緩衝ｐＨ範囲外の緩衝塩、その緩衝ｐＨ範囲外のｐＨ範囲内のアミノ酸の塩、グリシンナトリウム塩、ポリオール、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３５〕反復用量を収容する容器内に配置された、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３６〕単回用量を収容する容器内に配置された、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３７〕前記容器が、テフロン（登録商標）コートされた栓である閉鎖部を含む、前記〔３６〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３８〕０．２ｍＬ〜１．０ｍＬの充填容積を有する容器内に配置された、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔３９〕送達デバイス内に配置された、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔４０〕ニードルフリー注射器内に配置された、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔４１〕さらにヒアルロン酸を含む、前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物。
〔４２〕前記〔１〕に記載の調製物の成分を合わせることを含む、ｈＧＨ調製物の作製方法。
〔４３〕前記〔２２〕に記載の調製物の成分を合わせることを含む、ｈＧＨ調製物の作製方法。
〔４４〕前記〔１〕または前記〔２２〕の調製物の成分を容器内に０．２〜１．０ｍｌの充填容積まで配置することを含み、前記容器がシリンジである、ｈＧＨ調製物のパッケージング方法。
〔４５〕前記〔１〕または前記〔２２〕の調製物の成分を容器内に０．２〜１．０ｍｌの反復用量を収容する充填容積まで配置することを含む、ｈＧＨ調製物のパッケージング方法。
〔４６〕前記〔１〕または前記〔２２〕のｈＧＨ調製物、および該調製物を患者に投与するための手段を含む、ｈＧＨ調製物を患者に送達するためのシステム。
〔４７〕内部に前記〔１〕または前記〔２２〕に記載のｈＧＨ調製物である結晶化タンパク質の調製物が配置されたニードルフリー注射器。
〔４８〕再懸濁させると、
ｈＧＨ結晶の懸濁液、
５．４〜７．０のｐＨ範囲の緩衝液であって、トリエタノールアミン、イミダゾール、グリシン、ヒスチジン、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、およびＴｒｉｓ、またはそれらの組合せを含む、緩衝液；
６０〜２００ｍＭのナトリウムイオン濃度範囲を有するナトリウム塩；
ポリエチレングリコール、化学的安定剤、界面活性剤、および保存料、
を含む懸濁液をもたらすｈＧＨの凍結乾燥調製物。
〔４９〕前記結晶の懸濁液が２０〜５０ｍｇ／ｍｌの量で存在する、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔５０〕緩衝液がＴｒｉｓを含む、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔５１〕緩衝液がリン酸塩を含む、前記〔５０〕に記載の調製物。
〔５２〕緩衝液が、さらにＴｒｉｓまたはヒスチジンを含む、前記〔５１〕に記載の調製物。
〔５３〕該懸濁液のｐＨが７〜９である、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔５４〕前記塩が塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムを含む、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔５５〕前記塩が５０ｍＭ〜１００ｍＭの量で存在する、前記〔５４〕に記載の調製物。
〔５６〕前記ポリエチレングリコールが、ポリエチレングリコール３３５０、６０００または８０００を含む、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔５７〕前記ポリエチレングリコールが２．５％〜１０％の量で存在する、前記〔５６〕に記載の調製物。
〔５８〕前記懸濁液が、
２０〜５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ結晶の懸濁液；
７〜９のｐＨのＴｒｉｓまたはリン酸塩とＴｒｉｓもしくはヒスチジンいずれかとの併用緩衝液；
５０ｍＭ〜１００ｍＭの量の塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム；および
２．５％〜１０％の量のポリエチレングリコール３３５０、６０００または８０００
を含む、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔５９〕さらに保存料を含む、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔６０〕前記保存料がフェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、またはベンジルアルコールである、前記〔５９〕に記載の調製物。
〔６１〕前記懸濁液が、シリコーン処理されたバイアルまたは表面コートされた容器閉鎖部内に配置される、前記〔４８〕に記載の調製物。
〔６２〕−３０℃〜１０℃の一次乾燥サイクル
を含む、凍結乾燥された結晶性ｈＧＨの作製方法。
〔６３〕さらに、２０℃〜４０℃の二次乾燥サイクルを含む、前記〔６２〕に記載の方法。
〔６４〕前記〔６２〕に記載の方法によってもたらされる生産物。
〔６５〕２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
〔６６〕２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
〔６７〕２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、５％のＰＥＧ３３５０、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
〔６８〕２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．０
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
〔６９〕２５ｍｇ／ｍＬのポリＡｒｇ複合体型ｈＧＨ結晶、２５ｍＭのｔｒｉｓ、１％のスクロース、５％のＰＥＧ６０００、ｐＨ７．５
を含むｈＧＨの凍結乾燥調製物。
〔７０〕再懸濁させた前記〔４８〕に記載の凍結乾燥物。
〔７１〕前記〔４８〕または〔７０〕に記載のｈＧＨ調製物、および
該調製物を患者に投与するための手段
を含む、ｈＧＨ調製物を患者に送達するためのシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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