(57)【要約】【課題】固体状の油脂類を含む基質から、ソフォロリピッドを効率よく製造することのできる方法の提供。【解決手段】次の成分（Ａ）及び（Ｂ）：（Ａ）固体状の油脂類（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤及び／又は（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤を含有する培地にて、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いて発酵によりソフォロリピッドを得る工程を含む、ソフォロリピッドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の成分（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）固体状の油脂類
（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤及び／又は（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤
を含有する培地にて、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いて発酵によりソフォロリピッドを得る工程を含む、ソフォロリピッドの製造方法。
【請求項２】
培地中の成分（Ｂ）の含有量が０．００１〜０．３％（ｗ/ｖ）である請求項１記載のソフォロリピッドの製造方法。
【請求項３】
成分（Ａ）が炭素数１２〜２４の脂肪酸のアルキルエステルである請求項１又は２記載のソフォロリピッドの製造方法。
【請求項４】
成分（Ａ）の融点が、２５〜５５℃である請求項１〜３のいずれか１項記載のソフォロリピッドの製造方法。
【請求項５】
ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いる反応が休止菌体反応である請求項１〜４のいずれか１項記載のソフォロリピッドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソフォロリピッドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母等の微生物が生産する両親媒性物質はバイオサーファクタント（生物界面活性剤）と呼ばれ、環境適合性と機能性を兼ね備えた材料として、食品、化粧品、ライフサイエンス、環境・エネルギー分野等での応用が研究されている。
なかでもソフォロリピッドは、現在産業利用されている代表的なバイオサーファクタントの一つである。
【０００３】
ソフォロリピッドは、炭化水素や油脂類等の油性物質を基質として、比較的高い生産量で発酵生産されることが知られている。特に、炭素源基質として糖と油脂類を組み合わせると、効率良くソフォロリピッドが発酵生産されることが知られている。
ソフォロリピッドの発酵生産に利用される油脂類としては、動植物性の油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル等が用いられ、例えば、特許文献１には、カンジダ属酵母を、糖と植物油に加えてオレイン酸等の遊離脂肪酸を混合した培地で培養して、高収量かつ高収率でソフォロリピッドを発酵生産する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−４５１９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記従来技術のように、ソフォロリピッドの炭素源基質は、ソフォロリピッドの生産性を鑑みて液状の油脂類を用いるのが一般的であり、培養温度よりも融点が高い固体油脂等は、微生物の資化性が低いため好適に利用することは難しいとされていた。これまでに、培養温度下で固体状の油脂類を利用してソフォロリピッドを高効率で生産したとの報告はない。
したがって、本発明は、固体状の油脂類を含む基質から、ソフォロリピッドを効率よく製造することのできる方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、固体状の油脂類と特定の界面活性剤を組み合わせることにより、固体状の油脂類の資化性が向上して発酵が進行し、極めて効率よくソフォロリピッドへ変換されることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の成分（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）固体状の油脂類
（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤及び／又は（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤
を含有する培地にて、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いて発酵によりソフォロリピッドを得る工程を含む、ソフォロリピッドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、固体状の油脂類を含む基質を用いて、ソフォロリピッドを効率よく製造することができる。従って、ソフォロリピッドの生産に際し、より安価な、又は新たな炭素源の利用が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のソフォロリピッドの製造方法は、次の成分（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）固体状の油脂類
（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤及び／又は（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤
を含有する培地にて、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いて発酵によりソフォロリピッドを得る工程を含むものである。
【００１０】
ソフォロリピッドは、ソフォロースとヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。ソフォロースは、グルコースがβ−１，２結合した二糖類であり、ヒドロキシ脂肪酸は、ω位、或いはω−１位にヒドロキシ基を有する脂肪酸である。ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸部分は、特に限定されないが、炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましい。また、ソフォロースは、ヒドロキシ基が一部アセチル化したものも含む。
ソフォロリピッドは、ヒドロキシ脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型と分子内のソフォロースと結合したラクトン型に大別され、一般的に発酵生産では酸型とラクトン型の混合物として得られることが知られている。
【００１１】
本発明で用いられるソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物は、基質からソフォロリピッドを生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であればよく、例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する微生物が挙げられる。
カンジダ属に属する微生物としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ等が挙げられる。なかでも、ソフォロリピッド生産性の点から、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａが好ましい。
【００１２】
本発明で用いられる培地は、成分（Ａ）固体状の油脂類を含有する。
ここで、固体状の油脂類とは、培養温度で固体又は半固体の油脂類である。このような油脂類としては、例えば、動植物性油脂、脂肪酸、脂肪酸エステルが挙げられ、これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
動植物性油脂としては、パーム油、パームオレイン、パームステアリン、やし油、パーム核油、カカオ脂、サル脂、シア脂等の植物性油脂、ラード、牛脂、バター脂等の動物性油脂、それらのエステル交換油、水素添加油もしくは分別油等が挙げられる。また、大豆油、綿実油、魚油等の液状油の水素添加により固体状としたものも包含される。
【００１３】
脂肪酸としては、炭素数１０〜３０の脂肪酸が好ましく、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシリ酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸等の飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノエライジン酸、プニカ酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。
また、脂肪酸エステルとしては、前記脂肪酸と１価から３価のアルコールとのエステルが挙げられ、例えば、ラウリン酸オクタデシル、ミリスチン酸テトラデシル、パルミチン酸ドデシル、ステアリン酸メチル、ステアリン酸エチル、ステアリン酸プロピル、ステアリン酸オクチル、アラキジン酸メチル、アラキジン酸エチル等が挙げられる。
固体状の油脂類の中でも、単一脂肪酸組成のソフォロリピッドを得られる点から、脂肪酸エステルが好ましく、飽和脂肪酸のエステルがより好ましい。脂肪酸エステルは、更に炭素数１２〜２４、好ましくは１６〜２２、より好ましくは１６〜１８の脂肪酸のアルキルエステルが好ましく、更にパルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、ステアリン酸エチルが好ましい。脂肪酸のアルキルエステルの融点としては、２５〜５５℃が好ましく、更に好ましくは２８〜４５℃、より好ましくは３２〜４０℃である。
【００１４】
培地中の（Ａ）固体状の油脂類の初発の含有量は、特に制限されないが、効率的なソフォロリピッドの生産の点から、１％（ｗ／ｖ）以上、更に５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、また、２０％（ｗ／ｖ）以下、更に１５％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。また、１〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましく、更に５〜２０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明で用いられる培地は、成分（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤及び／又は（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤を含有する。
ここで、ＨＬＢ（親水性−親油性のバランス、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−Ｌｙｐｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｌａｎｃｅ）は、界面活性剤の全分子量に占める親水基部分の分子量を示すものである。非イオン界面活性剤のＨＬＢは、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）の式により求められる。なお、２種以上の非イオン界面活性剤から構成される場合のＨＬＢは、次式のように、各非イオン界面活性剤のＨＬＢ値をその配合質量比率に基づいて相加算平均したものである。
混合ＨＬＢ＝Σ（ＨＬＢｘ×Ｗｘ）／ΣＷｘ
（式中、ＨＬＢｘは、非イオン界面活性剤ＸのＨＬＢ値を示し、Ｗｘは、ＨＬＢｘの値を有する非イオン界面活性剤Ｘの質量（ｇ）を示す。）
【００１６】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
エチレンオキサイド鎖を持つ非イオン界面活性剤を用いる場合、エチレンオキサイド付加モル数は、好ましくは４〜２５０であり、より好ましくは２０〜１６０であり、さらに好ましくは２０〜８０である。また、非イオン界面活性剤の脂肪酸部分及びアルキル部分の炭素数は、好ましくは８〜２４であり、より好ましくは１２〜２２である。
【００１７】
成分（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤は、効率的なソフォロリピッドの生産の点から、ＨＬＢが１．２以上、更に１．５以上、更に１．８以上のものが好ましく、また、６以下、更に４．３以下、更に４以下のものが好ましい。また、好ましくはＨＬＢが１．２以上、７以下、より好ましくはＨＬＢが１．２以上、６以下、更に好ましくはＨＬＢが１．５以上、４以下である。また、（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤の種類としては、ソルビタン脂肪酸エステルが好ましい。また、ソルビタン脂肪酸エステルの中でもソルビタントリ脂肪酸エステルが好ましく、更には、ソルビタントリオレエートが好ましい。
【００１８】
また、成分（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤は、効率的なソフォロリピッドの生産の点から、ＨＬＢが１４以上、１８以下のものが好ましい。より好ましくはＨＬＢが１４以上、１７以下である。非イオン界面活性剤の種類としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが好ましい。中でも、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが好ましい。
【００１９】
培地中の成分（Ｂ）の初発の含有量は、効率的なソフォロリピッドの生産の点から、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に０．０２％（ｗ／ｖ）以上、更に０．０４％（ｗ／ｖ）以上、更に０．０５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、また培地の泡量の点から、０．３％（ｗ／ｖ）以下、更に０．２％（ｗ／ｖ）以下、更に０．１５％（ｗ／ｖ）以下、更に０．１２％（ｗ／ｖ）以下、更に０．１％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。また、０．００１〜０．３％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは０．０２〜０．２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０４〜０．１５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０４〜０．１２％（ｗ／ｖ）である。
なお、「成分（Ｂ）の含有量」は、成分（ｂ１）と（ｂ２）のうち一方を含む場合はその一方の含有量であり、成分（ｂ１）と（ｂ２）の両方を含む場合はその合計量である。
【００２０】
本発明で用いられる培地には、成分（Ａ）、（Ｂ）の他に、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を適宜用いることができる。また、従来公知の培地を用いることができ、例えば、ＹＭ培地等の市販の固体培地又は液体培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、糖類（グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等）、油脂類（大豆油、ナタネ油、魚油等の液状油、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸等の脂肪酸又はそのエステル等）、酢酸等の資化しうる有機酸、エタノール等のアルコール類等が挙げられる。なかでも、増殖の点から、糖、更にグルコースを含有するのが好ましい。
培地中の初発の炭素源の含有量は、増殖の点から、１〜１５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、無機・有機アンモニウム塩、尿素、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
【００２１】
本発明において、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いて発酵によりソフォロリピッドを得る工程では、該微生物が増殖する条件下で培養しつつソフォロリピッドを発酵生産させてもよく、また、休止菌体の状態、すなわち該微生物の生育を止めた状態で培養し、ソフォロリピッドを発酵生産させてもよい。増殖に必要とする時間の点からは、休止菌体の状態でソフォロリピッドを発酵生産させることが好ましい。
休止菌体を用いる場合、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物の濃度は６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６０）として、１０〜２００が好ましい。また、休止菌体反応を行う時間としては５０〜２００時間が好ましい。
【００２２】
培養条件としては、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物がソフォロリピッドを発酵生産する条件であればよい。
培養方法は、好気的条件下が好ましく、通気攪拌培養、振盪培養等の一般的な方法を適用することができる。
培養温度は、使用する微生物が生育する範囲であれば特に制限されないが、通常、２０〜３３℃が好ましく、２５〜３０℃がより好ましく、更に２８〜３０℃が好ましい。このとき培養液の初発ｐＨ（３０℃）は２〜７が好ましく、３〜６がより好ましい。
【００２３】
培養液のｐＨを調整する緩衝剤としては、例えば、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸又はその塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸又はその塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２４】
このような培養により、培地中にソフォロリピッドが蓄積するので、培養終了後、適当な分離・精製手段により培地からソフォロリピッドを採取することができる。
例えば、酢酸エチル等を用いた溶剤抽出後、分別沈殿、液液分配、カラムクロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフ等を単独或いは組み合わせて用いることによりソフォロリピッドを取得することができる。
【００２５】
本発明によれば、１５〜５０％の変換率で基質からソフォロリピッドを製造することができる。
ソフォロリピッド変換率とは、培養液１Ｌに含まれるソフォロリピッド生産モル量を、ソフォロリピッドの発酵生産にあたり培地に仕込んだ油脂類基質（初期仕込み油脂類基質）の脂肪酸換算のモル量で割った値である。ソフォロリピッド変換率の算出方法の詳細は実施例に記載した。
【００２６】
本発明により得られるソフォロリピッドは、界面活性剤、化粧品基材、各種中間体の原料等としての利用が期待される。
【００２７】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の製造方法を開示する。
【００２８】
＜１＞次の成分（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）固体状の油脂類
（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤及び／又は（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤
を含有する培地にて、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いて発酵によりソフォロリピッドを得る工程を含む、ソフォロリピッドの製造方法。
【００２９】
＜２＞（Ａ）固体状の油脂類が、好ましくは固体状の動植物性油脂、脂肪酸及び脂肪酸エステルから選ばれる１種又は２種以上である＜１＞に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜３＞固体状の動植物性油脂が、好ましくはパーム油、パームオレイン、パームステアリン、やし油、パーム核油、カカオ脂、サル脂、シア脂、ラード、牛脂、バター脂、又はそれらのエステル交換油、水素添加油もしくは分別油であり、固体状の脂肪酸が、好ましくはカプリン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシリ酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノエライジン酸、又はプニカ酸であり、固体状の脂肪酸エステルが、好ましくはラウリン酸オクタデシル、ミリスチン酸テトラデシル、パルミチン酸ドデシル、ステアリン酸メチル、ステアリン酸エチル、ステアリン酸プロピル、ステアリン酸オクチル、アラキジン酸メチル、又はアラキジン酸エチルである＜２＞に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜４＞（Ａ）固体状の油脂類が、好ましくは炭素数１２〜２４、より好ましくは炭素数１６〜２２、更に好ましくは炭素数１６〜１８の脂肪酸のアルキルエステルであり、更に好ましくはパルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、又はステアリン酸エチルである＜１＞に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜５＞（Ａ）固体状の油脂類の融点が、好ましくは２５〜５５℃、より好ましくは２８〜４５℃、更に好ましくは３２〜４０℃である＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜６＞培地中の（Ａ）固体状の油脂類の含有量が、好ましくは１％（ｗ/ｖ）以上、より好ましくは５％（ｗ/ｖ）以上であり、また、好ましくは２０％（ｗ/ｖ）以下であり、また、好ましくは１〜２０％（ｗ/ｖ）、より好ましくは５〜２０％（ｗ/ｖ）である＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜７＞（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤が、好ましくはＨＬＢが１．２以上、より好ましくはＨＬＢが１．５以上、より好ましくはＨＬＢが１．８以上であり、また、好ましくはＨＬＢが６以下、より好ましくは４．３以下、より好ましくはＨＬＢが４以下であり、また、好ましくはＨＬＢが１．２〜７、より好ましくはＨＬＢが１．２〜６、更に好ましくはＨＬＢが１．５〜４の非イオン界面活性剤である＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜８＞（Ｂ）（ｂ１）ＨＬＢが１〜７の非イオン界面活性剤が、好ましくはソルビタン脂肪酸エステル、より好ましくはソルビタントリ脂肪酸エステル、更に好ましくはソルビタントリオレエートである＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜９＞（Ｂ）（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤が、好ましくはＨＬＢが１４以上であり、また、好ましくはＨＬＢが１７以下であり、また、好ましくはＨＬＢが１４〜１８、より好ましくはＨＬＢが１４〜１７の非イオン界面活性剤である＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜１０＞（Ｂ）（ｂ２）ＨＬＢが１２〜１８の非イオン界面活性剤が、好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、より好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである＜１＞〜＜９＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜１１＞培地中の成分（Ｂ）の含有量が、好ましくは０．００１％（ｗ/ｖ）以上、より好ましくは０．０２％（ｗ/ｖ）以上、更に好ましくは０．０４％（ｗ/ｖ）以上、更に好ましくは０．０５％（ｗ/ｖ）以上であり、また、好ましくは０．３％（ｗ/ｖ）以下、より好ましくは０．２％（ｗ/ｖ）以下、更に好ましくは０．１５％（ｗ/ｖ）以下、更に好ましくは０．１２％（ｗ/ｖ）以下、更に好ましくは０．１％（ｗ/ｖ）以下であり、また、好ましくは０．００１〜０．３％（ｗ/ｖ）、より好ましくは０．０２〜０．２％（ｗ/ｖ）、更に好ましくは０．０４〜０．１５％（ｗ/ｖ）、更に好ましくは０．０４〜０．１２％（ｗ/ｖ）である＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜１２＞培地が、好ましくは糖、より好ましくはグルコースを含有する＜１＞〜＜１１＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜１３＞ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いる反応が、好ましくは休止菌体反応である＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜１４＞ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物が、好ましくはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する微生物であり、より好ましくはＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、又はＣａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａであり、更に好ましくはＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａである＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例及び比較例において、「％」は「％（ｗ／ｖ）」を意味する。
【００３１】
〔ソフォロリピッドの分析〕
培養液１０ｍＬをサンプリングし、ヘキサン１０ｍＬで２回洗浄した後、酢酸エチル１０ｍＬで２回抽出し回収を行った。その後、溶媒を留去し、酢酸エチル画分の回収を行った。回収した酢酸エチル画分の乾燥重量をソフォロリピッド生産量として計算を行った。
【００３２】
〔ソフォロリピッド変換率の算出〕
ソフォロリピッド変換率は次式により算出した。
変換率（％）＝（培養液１Ｌに含まれるソフォロリピッドモル量）／（初期仕込み油脂類基質の脂肪酸換算のモル量）×１００
【００３３】
〔培養方法〕
１．プレート培養
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株を用いた。
グルコース１％、酵母エキス１％、トリプトン１％、寒天１．５％を含む寒天培地のシャーレに種菌を１白金耳植菌し、温度３０℃で２日間培養を行った。
【００３４】
２．前培養
グルコース１％、酵母エキス１％、トリプトン１％を含む培養液１００ｍＬを坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分高温で滅菌を行った。冷却後、プレートから１白金耳、植菌を行い、温度３０℃、撹拌回転数１２０ｒ／ｍｉｎの条件にて２日間撹拌培養を行った。
【００３５】
３．本培養
グルコース１０％、酵母エキス２％、尿素１．２％を含む培養液をｐＨ５．０に調整し、１．２Ｌにメスアップした。培養液を全容２Ｌのジャーファーメンターにて滅菌後に、前培養液２４ｍＬ植菌し、温度３０℃、撹拌回転数６００ｒ／ｍｉｎ、通気速度（通気量）０．６Ｌ／分の条件にて４８時間撹拌培養を行った。
【００３６】
４．菌の回収
本培養で得られた培養液を６，０００ｒ／ｍｉｎ、２０分間の遠心分離を行い、菌体を回収する操作を２回繰り返した。回収した菌体を用いて休止菌体反応を行った。
【００３７】
実施例１
ステアリン酸エチル（融点３６℃）１０％、グルコース１０％、ソルビタントリオレエート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｏ３０Ｖ、ＨＬＢ＝１．８）０．１％、２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ４．０を試験管に１０ｍＬ入れ、１２１℃、２０分高温で滅菌を行った。冷却後に回収した休止菌体をＯＤ６６０ｎｍが３０になるように培地に投入し、温度３０℃、撹拌回転数２４０ｒ／ｍｉｎの条件で１４４時間培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ４５．９％であった。
【００３８】
実施例２
ソルビタントリオレエートに代えて、ソルビタンモノオレエート（レオドールＳＰ−Ｏ１０Ｖ、ＨＬＢ＝４．３）を用いた以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ３７．２％であった。
【００３９】
実施例３
ソルビタントリオレエートに代えて、ソルビタンモノパルミテート（エマゾール（登録商標）Ｐ−１０Ｖ、ＨＬＢ＝６．７）を用いた以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ１７．６％であった。
【００４０】
実施例４
ソルビタントリオレエートに代えて、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（レオドールＴＷ−Ｌ１２０、ＨＬＢ＝１６．７）を用いた以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ３２．７％であった。
【００４１】
実施例５
ソルビタントリオレエートの量を０．０５％とした以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ４６．２％であった。
【００４２】
実施例６
ソルビタントリオレエートの量を０．０３％とした以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ４３．８％であった。
【００４３】
実施例７
ソルビタントリオレエートの量を０．０１％とした以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ４１．８％であった。
【００４４】
比較例１
ソルビタントリオレエートを添加せずに培養した以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ９．８％であった。
【００４５】
比較例２
ソルビタントリオレエートに代えて、ソルビタンモノラウレート（エマゾールＬ−１０Ｖ、ＨＬＢ＝８．６）を用いた以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ４．６％であった。
【００４６】
比較例３
ソルビタントリオレエートに代えて、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（レオドールＴＷ−Ｏ３２０Ｖ、ＨＬＢ＝１１．０）を用いた以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ８．５％であった。
各実施例、比較例の条件と結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2015104381.tif 000002
【００４８】
表１に示すように、固体状の油脂類と特定の界面活性剤を組み合わせることにより、高い変換率でソフォロリピッドが得られることが確認された。また、界面活性剤の添加は、特定の範囲の濃度が特に有効であることが確認された。
【００４９】
参考例１
ステアリン酸ブチル（融点２７．５℃）１０％、グルコース１０％、２０ｍＭリン酸バッファーｐＨ４．０を試験管に１０ｍＬ入れ、１２１℃、２０分高温で滅菌を行った。冷却後に前記〔培養方法〕の４．菌の回収で回収した休止菌体をＯＤ６６０ｎｍが３０になるように培地に投入し、温度３０℃、撹拌回転数２４０ｒ／ｍｉｎの条件で１４４時間培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ３５．９％であった。
【００５０】
参考例２
培地にソルビタントリオレエート（レオドールＳＰ−Ｏ３０Ｖ、ＨＬＢ＝１．８）０．１％を添加して培養した以外は参考例１と同様に培養を行った。
培養後、ソフォロリピッド変換率を求めたところ３１．８％であった。
このように、一般的な液状の油脂類を基質として用いた場合には、ソフォロリピッド変換率に対する非イオン界面活性剤の添加効果は認められなかった。