(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを十分な活性を有する形態で、簡易で大量に製造でき、さらには多数のアミノ酸置換体のライブラリを構築することが容易な発現システムを提供することである。【解決手段】  本発明は、ゲノム中もしくは天然株が有するプラスミド中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損している宿主菌、および、前記ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現システムおよび該発現システムを用いた[ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法などに関する。【選択図】  図３
2015104373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中もしくは天然株が有するプラスミド中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損している宿主菌、および、前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現システム。
【請求項２】
［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼが、膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）である、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群が、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来である、請求項１または２に記載の発現システム。
【請求項４】
宿主菌が、ラルストニア・ユートロファである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項５】
宿主菌の、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺからなる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項６】
宿主菌のｈｏｘＫおよびｈｏｘＧが欠損している、請求項５に記載の発現システム。
【請求項７】
宿主菌が、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターを２つ有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項８】
［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）である、請求項７に記載の発現システム。
【請求項９】
ベクターのプロモーターが、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）、改変ＳＨプロモーター１（配列番号１０に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター７（配列番号１１に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター８（配列番号１２に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）または改変ＳＨプロモーター９（配列番号１３に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）である、請求項８に記載の発現システム。
【請求項１０】
ベクターの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写量と宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群のｍＲＮＡの転写量との比が、４：１〜１：１５である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項１１】
ベクターの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写量と宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群のｍＲＮＡの転写量との比が、１：２〜１：３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項１２】
宿主菌の１６ｓｒＲＮＡの転写量を１００としたときに、ベクターの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写量、および宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群のｍＲＮＡの転写量がともに０．５以上である、請求項１０または１１に記載の発現システム。
【請求項１３】
ベクターが、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）またはｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項１４】
ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、ｈｏｘＫおよびｈｏｘＧが欠損しているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）。
【請求項１５】
ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）またはｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）である発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の発現システムを用いた、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１７】
[ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法であって、
（１）ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺからなる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損しているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）を調製する工程、
（２）前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを調製する工程、
を含み、前記（１）で調製したラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）に、前記（２）で調製したベクターを導入した場合に、ベクターのｍＲＮＡの転写量と宿主菌の遺伝子群のｍＲＮＡの転写量との比が、４：１〜１：１５となるように、宿主菌のプロモーターおよび／またはベクターのプロモーターを改変されていることを特徴とする、前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現システムに関し、特に、活性を有する［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを大量に製造するための発現システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
水素分子は化石燃料に代わるクリーンな次世代のエネルギーキャリアとして注目されていることから、水素分子の生成能と分解能を有するヒドロゲナーゼもまた大きな注目を集めている。特に、ヒドロゲナーゼの水素分子分解能は、燃料電池の白金電極の代替や、燃料電池の安全性を確保するための水素センサーにも応用できる。このような応用例の１つとして、遺伝子操作によりギ酸デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼの酵素群を高発現させた微生物を用いて水素を供給する燃料電池などが検討されている（特許文献１：特許第３７６４８６２号公報）。
【０００３】
ヒドロゲナーゼは、フェレドキシンなどの電子伝達蛋白質やＮＡＤＨなどの電子供与分子から電子を受け取り、プロトンを還元して水素分子を生成する反応（２Ｈ＋＋２ｅ−→Ｈ２）と、水素分子をプロトンと電子に分解し（Ｈ２→２Ｈ＋＋ｅ−）、電子（還元力）を電子伝達蛋白質やＮＡＤ＋に渡す反応を触媒する酵素である。ヒドロゲナーゼは、触媒中心である金属イオン錯体の違いによって、概ね、（１）２つの鉄イオンからなる二核錯体を有する［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ、（２）ニッケルと鉄イオンのヘテロ二核錯体を有する［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ、（３）鉄含有補助因子を含む［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼの３つに分類することができる。
【０００４】
［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの主な生理的役割は、生体内の余剰電子を水素分子として放出することであり、触媒中心である鉄硫黄クラスター［４Ｆｅ−４Ｓ］は電子伝達蛋白質から鉄二核錯体への電子伝達を仲介する役割を担っている。これまで、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを藍藻類（特許文献２：特開平１１−２５３１６６号公報）や緑藻（特許文献３：特表２００８−５３１０５５号公報）において発現させる試みがなされてきたが、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼは酸素分子と直ちに反応し、不可逆的に不活化されるため、実用性に乏しいものであった。
【０００５】
［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼは、生理的役割として、主に水素分子の取り込みを行っており、４次構造としては、触媒中心であるニッケル−鉄錯体を有するラージサブユニットと、電子伝達ユニットである３つの鉄硫黄クラスター（［４Ｆｅ−４Ｓ］もしくは［３Ｆｅ−４Ｓ］）を持つスモールサブユニットからなるヘテロダイマーを基本構造とする。また一方で、膜結合ドメインやＮＡＤ＋還元機能を有するジアホラーゼドメインなどを有するマルチドメインを形成しているヒドロゲナーゼも知られている。一般に［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼは、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼと比較して酸素分子に対する耐性は高いとされ、酸素分子と反応して活性を失っても、還元的雰囲気下で再活化される例が報告されている。
【０００６】
［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現させる試みも数多く報告されている。
特許文献４（特表２０１０−５３５４７１号公報）および非特許文献１（Roussetら（1998））は、硫酸還元菌由来の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの宿主ベクター系に関する文献であるが、これらの文献においては、硫酸還元菌由来の［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターに挿入し、硫酸還元菌のヒドロゲナーゼ欠失株に導入することで、組換え［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させたとされている。これらの発現系において、宿主として用いられる硫酸還元菌は嫌気性細菌であるため培養が容易ではなく、増殖が遅いため、実用化することは相当困難である。
【０００７】
非特許文献２（Kimら(2010)）および非特許文献３（Kimら(2011)）は、リコンビナント蛋白質の発現にもっともよく使用されている大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１株を宿主とした［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ発現系を報告している。大腸菌由来の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（hydrogenase-1）遺伝子を用いた場合（非特許文献２）およびHydrogenovibrio marinus由来の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合（非特許文献３）のいずれもリコンビナント［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの精製を行うことができたが、その水素発生における比活性は極めて低いものであった。
【０００８】
非特許文献４（Yonemotoら(2013)）は、Alteromonas macleodii由来［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子や翻訳後修飾関連遺伝子を有するプラスミド（〜２０ｋｂｐ）を大腸菌内に導入し、活性型ヒドロゲナーゼを発現させることを報告している。同文献の発現系においては、導入するプラスミドのサイズが大きく、形質転換効率が低いなどの問題が生じる虞があり、簡易に用い得る発現システムとはいえない。
【０００９】
非特許文献５（Sunら(2010)）は、大腸菌ＭＷ１００１株を宿主として、高熱菌であるPyrococcus furiosus由来ＮＡＤ＋還元［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの異種発現について報告している。同報告では、ヒドロゲナーゼ遺伝子と翻訳後修飾に必要な多数の遺伝子を５つのプラスミドに分乗させて、それぞれ大腸菌に導入している。また、非特許文献６（Schiffelsら(2013)）は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を宿主として、Ralstonia eutropha（R. eutropha）由来ＮＡＤ＋還元［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの異種発現について報告している。同報告では、ＮＡＤＰ依存型［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを構成する５つのサブユニットをコードする遺伝子を挿入したプラスミドと、翻訳後修飾に必要な多数の遺伝子を挿入したプラスミドを、一つの細胞に導入している。これらの非特許文献において構築された共発現系は、構築した複数のプラスミドを菌体に導入する必要性や、プラスミドの脱落の問題などがあり、必ずしも簡便な安定的手段とはいえない。
【００１０】
非特許文献７（Schubertら（2007））は、Ralstonia eutropha由来の膜結合型［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼ遺伝子群を組み込んだベクターをRalstonia eutrophaのヒドロゲナーゼ遺伝子欠失株に導入することで、組換え［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させたことが報告されている。同文献の発現システムにおいて導入するプラスミドのサイズは、極めて大きく、形質転換効率が低いなどの問題が生じる虞があり、簡易に用い得る発現システムとはいえない。
【００１１】
近年、最も精力的に研究されている水素細菌は、前記非特許文献６および７においても用いられているRalstonia eutrophaである。Ralstonia eutrophaは、それぞれ生理学的役割も４次元構造も異なる３種類の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（（１）ＮＡＤ＋還元ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、（２）膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）、（３）水素センサーヒドロゲナーゼ（ＲＨ））が存在している。これらのヒドロゲナーゼは、４５０ｋｂｐのメガプラスミドｐＨＧ１にコードされている。
ＮＡＤ＋還元ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）は細胞質に局在し、ヒドロゲナーゼサブユニットであるＨｏｘＹおよびＨｏｘＨと、ＮＡＤ＋還元（ジアフォラーゼ活性）サブユニットであるＨｏｘＦ、ＨｏｘＵおよびＨｏｘＩから形成されている。ＳＨは、ＮＡＤＨを必要とするバイオプロセスにおいて、水素分子によるＮＡＤＨ再生系触媒や、水素センサーへの応用が期待されている。
【００１２】
膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）は、ヒドロゲナーゼサブユニットであるＨｏｘＫおよびＨｏｘＧと、キノン還元能を有する膜結合サブユニットであるＨｏｘＺから成る。ＨｏｘＺを除いた可溶性ＭＢＨは、ＰＳＩや光触媒、電極と組み合わせた水素生産や、燃料電池への応用が期待されている。
水素分子センシングを担う水素センサーヒドロゲナーゼ（ＲＨ）は、ヒドロゲナーゼサブユニットであるＨｏｘＢおよびＨｏｘＣと、キナーゼサブユニットであるＨｏｘＪから成る。ＲＨは、水素センサーへの応用が期待されている。それぞれ、比較的高い酸素耐性（高い再活性化速度）を有しているものの、酸素分子存在下では活性が大きく低下することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第３７６４８６２号公報
【特許文献２】特開平１１−２５３１６６号公報
【特許文献３】特表２００８−５３１０５５号公報
【特許文献４】特表２０１０−５３５４７１号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】M. Rousset et al., "New shuttle vectors for the introduction of cloned DNA in Desulfovibrio.", Plasmid (1998), vol.39, pp.114-122.
【非特許文献２】J. YH. Kim et al., "Production of biohydrogen by recombinant expression of [NiFe]-hydrogenase 1 in Escherichia coli", Microbial Cell Factories, (2010), vol.9, pp.54-63.
【非特許文献３】J. YH. Kim et al., "Production of biohydrogen by heterologous expression of oxygen-tolerant Hydrogenovibrio marinus [NiFe]-hydrogenase in Escherichia coli.", Journal of Biotechnology (2011), vol. 155(3), pp.312-319.
【非特許文献４】I. T. Yonemoto et al., "Dual organism design cycle reveals small subunit substitutions that improve [NiFe] hydrogenase hydrogen evolution.", Journal of Biological Engineering (2013), vol.7, pp.17-27.
【非特許文献５】J. Sun et al., "Heterologous Expression and Maturation of an NADP-Dependent [NiFe]-Hydrogenase: A Key Enzyme in Biofuel Production", PLoS ONE (2010), vol.5(5), e10526.
【非特許文献６】J. Schiffels et al., "An Innovative Cloning Platform Enables Large-Scale Production and Maturation of an Oxygen-Tolerant [NiFe]-Hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli" PLoS ONE (2013), Vol.8(7), e68812.
【非特許文献７】T. Schubert et al., "Chaperones specific for the membrane-bound [NiFe]-hydrogenase interact with the Tat signal peptide of the small subunit precursor in Ralstonia eutropha H16", Molecular Microbiology, (2007), vol.66, pp.453-467.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため、研究を重ねる中で、従来のヒドロゲナーゼ発現系において、相同組み換え法によって宿主を改変する方法（図１（ａ））では、変異体の作製や単離に長時間がかかる上に、多数の変異体を同時に調製することができないこと、ヒドロゲナーゼ遺伝子をクローニングしたプラスミドを宿主に導入する方法（図１（ｂ））では、プラスミドのサイズが大きいため（巨大プラスミド）、宿主への変異導入が困難で、形質転換の効率も低く、発現量が低いという問題に直面した。また、酸素耐性の改善などを目的として、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼのアミノ酸置換を行うことが考えられるところ、これまで適切な宿主ベクター系が構築されていないことや、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼが典型的には図２に示すような遺伝子群によって発現し、特有の複雑な翻訳後修飾を経て活性型となることが十分な活性を有する［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼやそのアミノ酸置換体が実現できないことの大きな原因であることに着目し、さらに研究を進めた。
【００１６】
本発明者らは、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するプラスミドを［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ欠損宿主に導入し、宿主側のアクセサリー遺伝子とプラスミドの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の転写量を調節することによって（図３）、実用に耐えうる十分な活性を有する［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを大量に製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の課題は、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを十分な活性を有する形態で、簡易で大量に製造でき、さらには多数のアミノ酸置換体のライブラリを構築することが容易な発現システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］  ゲノム中もしくは天然株が有するプラスミド中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損している宿主菌、および、前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現システム。
［２］  ［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼが、膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）である、前記［１］に記載の発現システム。
［３］  ［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群が、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来である、前記［１］または［２］に記載の発現システム。
［４］  宿主菌が、ラルストニア・ユートロファである、前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の発現システム。
［５］  宿主菌の、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺからなる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損している、前記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の発現システム。
［６］  宿主菌のｈｏｘＫおよびｈｏｘＧが欠損している、前記［５］に記載の発現システム。
［７］  宿主菌が、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターを２つ有する、前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の発現システム。
［８］  ［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）である、前記［７］に記載の発現システム。
［９］  ベクターのプロモーターが、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）、改変ＳＨプロモーター１（配列番号１０に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター７（配列番号１１に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター８（配列番号１２に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）または改変ＳＨプロモーター９（配列番号１３に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）である、前記［８］に記載の発現システム。
［１０］  ベクターの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写量と宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群のｍＲＮＡの転写量との比が、４：１〜１：１５である、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の発現システム。
［１１］  ベクターの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写量と宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群のｍＲＮＡの転写量との比が、１：２〜１：３である、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の発現システム。
［１２］  宿主菌の１６ｓｒＲＮＡの転写量を１００としたときに、ベクターの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写量、および宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群のｍＲＮＡの転写量がともに０．５以上である、［１０］または［１１］に記載の発現システム。
［１３］  ベクターが、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）またはｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）である、前記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の発現システム。
［１４］  ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、ｈｏｘＫおよびｈｏｘＧが欠損しているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）。
［１５］  ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）またはｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）である発現ベクター。
［１６］  前記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の発現システムを用いた、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法。
［１７］  [ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法であって、
（１）ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺからなる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損しているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）を調製する工程、
（２）前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを調製する工程、
を含み、前記（１）で調製したラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）に、前記（２）で調製したベクターを導入した場合に、ベクターのｍＲＮＡの転写量と宿主菌の遺伝子群のｍＲＮＡの転写量との比が、４：１〜１：１５となるように、宿主菌のプロモーターおよび／またはベクターのプロモーターが改変されていることを特徴とする、前記製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現システムによれば、十分な比活性有する［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼが、短期間で大量に得ることができる。とくに、宿主に導入するプラスミドのサイズを小さくすることができるため、電気穿孔法などによる形質転換効率が高く、簡便かつ短期間に発現システムを構築し、プラスミドの脱落の問題などが生じ難く、安定的に発現システムを維持することができる。また、遺伝子操作が容易であり、例えば、ランダムライブラリなどの多数のアミノ酸置換体のライブラリを構築することが容易にできる。かかるライブラリなどを用いることによって、有用な［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ変異体の探索などが迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１（ａ）は、従来の相同組み換えによるヒドロゲナーゼ発現系を示す概念図である。図１（ｂ）は、従来の大型広宿主域ベクターによる宿主ベクター系によるヒドロゲナーゼ発現系を示す概念図である。
【図２】図２は、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ発現システムの一態様を示す概念図である。
【図４】図４は、プラスミドベクターｐＢＨＲ１（ＭｏＢｉＴｅｃ社（MoBiTec GmbH））のベクターマップを示した図である。
【図５】図５は、本発明の一態様である変異ＳＨプロモーターの塩基配列のアライメントである。上から順に、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）、改変ＳＨプロモーター１（配列番号１０に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター７（配列番号１１に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター８（配列番号１２に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター９（配列番号１３に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）である。
【図６】図６は、本発明のプラスミド（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）と宿主菌株（ＨＭＵ１、ＨＭＵ２、ＨＭＵ３）を組み合わせた発現系の一部に関し、大気下でのＦＮＧ（−）培地の培地におけるヒドロゲナーゼ活性を吸光度変化速度で表したグラフである。
【図７】図７は、本発明のプラスミド（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）と宿主菌株（ＨＭＵ１、ＨＭＵ２、ＨＭＵ３）を組み合わせた発現系の一部に関し、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下でのＦＮ（−）培地におけるヒドロゲナーゼ活性を吸光度変化速度で表したグラフである。
【図８】図８は、本発明のプラスミド（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）と宿主菌株（ＨＭＵ１、ＨＭＵ２、ＨＭＵ３）を組み合わせた発現系の一部に関し、活性染色したＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの電気泳動図である。
【図９】図９は、本発明のプラスミド（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）と宿主菌株（ＨＭＵ１、ＨＭＵ２、ＨＭＵ３）を組み合わせた発現系の一部に関し、大気下でのＦＮＧ（−）培地の培地における、ｈｏｘＫおよびｈｏｘＭの転写量相対値（１６ｒｓＲＮＡの転写量を１００とした値）を示すグラフである。なお、グラフ中の、ＤＳＨは、可溶性ヒドロゲナーゼＳＨ遺伝子の破壊株を示す。
【図１０】図１０は、本発明のプラスミド（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）と宿主菌株（ＨＭＵ１、ＨＭＵ２、ＨＭＵ３）を組み合わせた発現系の一部に関し、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下でのＦＮ（−）培地におけるにおける、ｈｏｘＫおよびｈｏｘＭの転写量相対値（１６ｒｓＲＮＡの転写量を１００とした値）を示すグラフである。なお、グラフ中の、ＤＳＨは、可溶性ヒドロゲナーゼＳＨ遺伝子の破壊株を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現システムは、ゲノム中もしくは天然株が有するプラスミド中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損している宿主菌、および、前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む。［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼとしては、特に限定されず、ＮＡＤ＋還元ヒドロゲナーゼ（ＳＨ）、膜結合型ヒドロゲナーゼ（membrane-bound hydrogenase：ＭＢＨ）、水素センサーヒドロゲナーゼ（ＲＨ）が挙げられるが、エネルギー効率がよく、水素生産や燃料電池への応用が容易であるとの観点から、膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）が好ましい。
【００２１】
本発明に用いることができる宿主菌は、特に限定されないが、蛋白質の発現に汎用され、培養技術や精製技術が確立されているものが好適である。このような宿主菌としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ロドコッカス(Rhodococcus)、枯草菌（Bacillus subtilis）、ラクトバシラス属 (Lactobacillus)、シアノバクテリア（Cyanobacteria）などが挙げられるが、増殖性が高く、取扱いが容易であって、大量に発現することができる大腸菌およびラルストニア・ユートロファが好ましく、ヒドロゲナーゼ成熟の観点からは、ラルストニア・ユートロファが特に好ましい。
【００２２】
本発明に係る［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群（gene cluster）としては、ゲノム中もしくは天然株が有するプラスミド中に存在し得る。いずれのヒドロゲナーゼ遺伝子群においても、大別して、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子（構造蛋白質をコードする遺伝子）、ヒドロゲナーゼの翻訳後修飾に関連する遺伝子、触媒中心の合成や挿入に関連する遺伝子、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現制御に関連する遺伝子などが存在する。本発明に係る［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群は、典型的には、図２に示す構造を有する。
【００２３】
本発明に係る［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群の由来は、典型的には発現に用いる宿主菌に由来するが、例えば、外来の遺伝子群を宿主菌に導入したものを用いることも可能である。ラルストニア・ユートロファ由来であることが好ましい。
【００２４】
本発明の宿主においては、ゲノム中および／または天然株が有するプラスミド中に存在する［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群のうち、少なくとも１つの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損している。プラスミドの脱落防止などの観点から、ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させるのが好ましい。［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損している場所は、特に限定されるものではないが、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺからなる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部を欠損させるのが好ましい。ここで「欠損」とは、例えば、当該遺伝子の全部または一部を欠失させることによって、当該遺伝子がコードするポリペプチドの機能を失わせることをいう。本発明において、宿主の欠損する領域は、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺの全てであってもよいが、得られるヒドロゲナーゼの酸素耐性や活性の強さの観点から、ｈｏｘＫおよびｈｏｘＧが欠損していることが好ましい。
【００２５】
本発明の宿主菌において、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群（gene cluster）のプロモーターは、適宜、転写量を調節するために調製され得る。例えば、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群の野生型のプロモーターを２つまたは３つ以上組み合わせて用いること、すなわち、元来有していた１つのプロモーターに１つまたは２つ以上のプロモーターを付加することによって、または外来のプロモーターを組み込むことによって転写量を調節することができる。また、該野生型のプロモーターの塩基配列において、１つまたは２つ以上の塩基が欠失、置換、付加されることによって、プロモーターとしての機能を損なうことなく、転写量を調節することができる。プロモーターの由来は、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群の転写量を調節できるものであれば、特に限定されず、宿主由来のプロモーターに限らず、宿主に由来しない外来のプロモーターであってもよい。
【００２６】
本発明の宿主菌において用いることができる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターは、具体的には、例えば、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）である。
【００２７】
ベクターのプロモーターもまた、宿主菌において用いることができる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターと同様に、ベクターの転写量を調節できるものであれば、特に限定されないが、例えば、R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）（配列番号１に記載の塩基配列の１９５番目〜２６２目番）である。さらに、かかるＳＨプロモーターを改変した、改変ＳＨプロモーター１（配列番号１０に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター７（配列番号１１に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）、改変ＳＨプロモーター８（配列番号１２に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）または改変ＳＨプロモーター９（配列番号１３に記載の塩基配列の４８９７番目〜４９６４番目）であってもよい。
【００２８】
本発明の発現システムにおいて、宿主菌の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子群の転写量は、ベクターの転写量と概ね同等であるか、やや多い方が好ましい傾向にある。したがって、ベクターの転写量と宿主菌の遺伝子群の転写量との比は、典型的には、４：１〜１：１５であってもよく、好ましくは、４：１〜１：５であり、特に好ましくは、１：２〜１：３である。ベクターの転写量が多いと触媒中心であるニッケル−鉄錯体が適切に高次構造に取り込まれない傾向がある。
【００２９】
また、上記の比率において、１６ｒｓＲＮＡを１００としたときに、ベクター側の転写量は、０．５以上であり、好ましくは、収量の観点から、３以上であるが、上限は細胞生育阻害の観点から、２０である。なお、ベクター側の転写量は、ｈｏｘＫなどのベクター上の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定することで決定することができる。また、宿主側の転写量は、０．５以上であり、好ましくは、収量の観点から、５以上であるが、上限は、細胞生育阻害の観点から２０である。なお、宿主側の転写量は、ｈｏｘＭなどの宿主上の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定することで決定することができる。
【００３０】
本発明の発現システムに用いるのに好適なベクターは、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）またはｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）などであり、特に好ましくは、ＦＮＧ(-)培地を用いた大気下での培養においては、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）であり、ＦＮ（−）培地を用いた水素：酸素：二酸化炭素（８：１：１）混合気体雰囲気下での培養においては、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）である。
【００３１】
また本発明は、前記の発現システムに用いることができる、ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、ｈｏｘＫおよびｈｏｘＧが欠損しているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、並びに、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）またはｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）である発現ベクターを提供する。
【００３２】
さらに本発明は、前記の発現システムを用いた、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法を提供する。
さらにまた本発明は、[ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの製造方法であって、
（１）ゲノム中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺからなる［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損しているラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）を調製する工程、
（２）前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを調製する工程、
を含み、前記（１）で調製したラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）に、前記（２）で調製したベクターを導入した場合に、ベクターの転写量と宿主菌の遺伝子群の転写量との比が、４：１〜１：１５となるように、宿主菌のプロモーターおよび／またはベクターのプロモーターが改変されていることを特徴とする、前記製造方法を提供する。
【００３３】
本発明は、一態様において、[ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを製造するための、ゲノム中もしくは天然株が有するプラスミド中の［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現するための遺伝子群において、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損している宿主菌、および、前記欠損した［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、［ＮｉＦｅ］ヒドロゲナーゼの発現キットを提供する。当該キットには、[ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを製造するための使用説明書を同梱することができる。
【００３４】
本発明は、一態様において、宿主菌を培養する培地を選択することによって、発現システムの効率化を行うことができる。培地は、宿主菌を培養できるものから選択し得るが、例えば、ＬＢ、ＳＯＣ、ＦＮ（＋）、ＦＮ（−）、ＦＮＧ（＋）およびＦＮＧ（−）などを用いることができる。ここで培養は、例えば、大気下、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下などで行うことができる。特に好ましい培養条件は、ベクターの転写量と宿主菌の遺伝子群の転写量との比が好適な値になることで決定され得る。
また、本発明の一態様において、例えば、アミノ酸置換体などの各種変異体を含むヒドロゲナーゼライブラリーの作成に使用することができる。
以下、本発明について、さらに詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
１．プラスミドコンストラクションの作製
（ａ）ＭＢＨ遺伝子導入用ベクターの作製
ｐＢＨＲ１は、ＭｏＢｉＴｅｃ社（MoBiTec GmbH）から購入した。ｐＢＨＲ１のマップを図４に示す。ｐＢＨＲ１へのＭＢＨ遺伝子とプロモーターの組み込みは、以下のとおり行った。
まず、Ralstonia eutropha（R. eutropha）ＳＨプロモーター領域をコードする遺伝子断片は、R. eutrophaから抽出したｐＨＧ１を鋳型とし、SH_promoter_Draプライマー（配列番号２４）およびSH_promoter_Ncoプライマー（配列番号２５）を用いたＰＣＲによって増幅し、制限酵素ＤｒａＩおよびＮｃｏＩで切断した（断片１、配列番号１）。続いて、ＤｒａＩおよびＮｃｏＩで切断したｐＢＨＲ１を調製し、ＤＮＡリガーゼを用いて、前記断片１と連結することで、プラスミドｐＢＨＲ−ＳＨｐｒｏ（配列番号２）を得た。
【００３６】
R. eutropha ＭＢＨ遺伝子（ｈｏｘＫおよびｈｏｘＧ）を、MBH_Nco_forプライマー（配列番号２６）およびMBH_BstB_rvプライマー（配列番号２７）を用いてｐＨＧ１から増幅し、制限酵素ＮｃｏＩで切断し、リン酸化反応を行った（断片２、配列番号３）。また、ｐＢＨＲ−ＳＨｐｒｏを鋳型として、pBHR4080_rvプライマー（配列番号２８）およびSH-promter_Ncoプライマー（配列番号２９）を用いてインバースＰＣＲを行い、制限酵素ＮｃｏＩで切断し、その後リン酸化反応を行った（断片３、配列番号４）。断片２と断片３は、ＤＮＡリガーゼを用いて連結して、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨ（配列番号５）を得た。
【００３７】
ｐＢＨＲ−ＭＢＨ上のｈｏｘＫのＣ末端に、ストレプタグ（Strep(II)-tag）（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys：配列番号４８）を付加するために、hoxG_stプライマー（配列番号３０）およびhoxK_st_rvプライマー（配列番号３１）でインバースＰＣＲを行い、リン酸化反応を行った後に連結し、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ（配列番号６）を完成させた。
【００３８】
ランダム変異を導入したＳＨプロモーターは、SH_promoter_Draプライマー（配列番号２４）およびSH_pro_random_rvプライマー（配列番号３２）を用いて、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔから増幅した断片４（配列番号７）と、SH_pro_10プライマー（配列番号３３）およびSH_promoter_Ncoプライマー（配列番号２５）を用いてｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔから増幅した断片５（配列番号８）を、プライマーレスＰＣＲで連結して作製した。ランダム変異導入ＳＨプロモーター断片（配列番号９）は、ＤｒａＩおよびＮｃｏＩで切断後、同じ制限酵素で切断したｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔに挿入した。その結果、プラスミドｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１（配列番号１０）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７（配列番号１１）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８（配列番号１２）、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９（配列番号１３）を得た。
各プラスミドのプロモーター領域における変異は、図５に示すとおりである。
【００３９】
２．宿主相同組換え用ベクターの作製
相同組み換え用自殺ベクターｐＲＬＭＵは、ｐＲＬ２７１（GeneBank ACCESSION:L05081、米国、ミシガン州立大学Wolk教授から譲渡を受けた）のエリスロマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を、テトラサイリン耐性遺伝子に交換することで作製した。
ｈｏｘＫ−ｈｏｘＧ遺伝子破壊用自殺ベクターｐＲＬＭＵ０１は、以下のように作製した。
まず、pHG_hoxK_pRLプライマー（配列番号３４）およびpHG_hoxK_Zrvプライマー（配列番号３５）を用いて、ｈｏｘＫ配列の一部（断片６、配列番号１４）をｐＨＧ１から増幅した。また、pHG_hoxZ_Kプライマー（配列番号３６）およびpHG_hoxL_pRL_rvプライマー（配列番号３７）を用いて、ｈｏｘＺを含む配列（断片７、配列番号１５）をｐＨＧ１から増幅した。断片６および断片７は、ＳａｃＩおよびＰｓｔＩで処理したｐＲＬＭＵと混合して、In-fusion kit（タカラバイオ株式会社）を用いて連結することで、ｐＲＬＭＵ０１（配列番号１６）を得た。
【００４０】
ｈｏｘＫ−ｈｏｘＧ遺伝子破壊およびＳＨプロモーター導入用自殺ベクターｐＲＬＭＵ０２は、以下のように作製した。
pHG_hoxK_pRLプライマー（配列番号３４）およびpHG_hoxK_SHrvプライマー（配列番号３８）を用いて、ｐＨＧ１からｈｏｘＫ配列の一部（断片８、配列番号１７）を増幅した。pHG_pSH_Kプライマー（配列番号３９）およびpHG_SHpro_Zrvプライマー（配列番号４０）を用いて、ｐＨＧ１からＳＨプロモーター配列を含む配列（断片９、配列番号１８）を増幅した。pHG_hoxZ_SHプライマー（配列番号４１）およびpHG_hoxL_pRL_rvプライマー（配列番号３７）を用いて、ｐＨＧ１からｈｏｘＺを含む配列（断片１０、配列番号１９）を増幅した。断片８および断片９、断片１０は、ＳａｃＩおよびＰｓｔＩで処理したｐＲＬＭＵと混合して、In-fusion kit（タカラバイオ株式会社）を用いて連結することで、ｐＲＬＭＵ０２（配列番号２０）を得た。
【００４１】
ｈｏｘＫ−ｈｏｘＧ−ｈｏｘＺ遺伝子破壊およびＳＨプロモーター導入用自殺ベクターｐＲＬＭＵ０３は、以下のように作製した。
pHG_hoxK_pRLプライマー（配列番号３４）およびpHG_hoxK_SHrvプライマー（配列番号３８）を用いて、ｐＨＧ１から断片８（ｈｏｘＫ配列の一部、配列番号１７）を増幅した。pHG_pSH_Kプライマー（配列番号３９）およびpHG_SHpro_Mrvプライマー（配列番号４２）を用いて、ｐＨＧ１からＳＨプロモーター配列を含む配列（断片１１、配列番号２１）を増幅した。pHG_hoxM_SHプライマー（配列番号４３）およびpHG_hoxL_pRL_rvプライマー（配列番号３７）を用いて、ｈｏｘＺの下流に位置するｈｏｘＭを含む配列（断片１２、配列番号２２）を増幅した。断片８および断片１１、断片１２は、ＳａｃＩおよびＰｓｔＩで処理したｐＲＬＭＵと混合して、In-fusion kit（タカラバイオ株式会社）を用いて連結することで、ｐＲＬＭＵ０３を得た（配列番号２３）。
【００４２】
配列番号１〜２３に示す塩基配列の主な特徴について以下に示す。
［配列番号１］（ｐＨＧ１からのＳＨプロモーター）１番目〜６番目：ＤｒａＩ認識部位／１９５番目〜２６２番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／２８０番目〜２８５番目：ＮｃｏＩ認識部位。
［配列番号２］（ｐＢＨＲ−ＳＨｐｒｏ）６０３番目〜８８７番目：配列番号１と同じ塩基配列。
［配列番号３］（ｐＨＧ１からのｈｏｘＫ＋ｈｏｘＧ）１番目〜１０８３番目：ｈｏｘＫ／１１２２番目〜２９９６番目：ｈｏｘＧ／２９９７番目〜３００２番目：ＢｓｐＴ認識部位。
［配列番号４］（ｐＢＨＲ−ＳＨｐｒｏからのインバースＰＣＲ）１番目〜１６番目：pBHR4080_rvプライマー／４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／４９８２番目〜４９８７番目：ＮｃｏＩ認識部位。
【００４３】
［配列番号５］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨ）４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／４９８５番目〜６０６７番目：ｈｏｘＫ／６１０６番目〜７９８０番目：ｈｏｘＧ。
［配列番号６］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ）４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／４９８５番目〜６１００番目：ｈｏｘＫ／６０６５番目〜６０９７番目：ストレプタグ／６１４６番目〜８０２０番目：ｈｏｘＧ。
［配列番号７］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔからの変異ＳＨプロモーター）４番目〜９番目：ＤｒａＩ認識部位／１９８番目〜２３６番目：変異ＳＨプロモーター／２００番目（変異）：ｃ→ｈ／２０３番目（変異）：ａ→ｗ／２０７番目（変異）：ｇ→ｖ／２０８番目（変異）：ｇ→ｖ／２１９番目（変異）：ｇ→ｖ／２２３番目（変異）：ｔ→ｎ。
【００４４】
［配列番号８］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔからの変異ＳＨプロモーター）１番目〜４２番目：変異ＳＨプロモーター／６０番目〜６５番目：ＮｃｏＩ認識部位。
［配列番号９］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔからの変異ＳＨプロモーター）１番目〜６番目：ＤｒａＩ認識部位／１９５番目〜２６２番目：変異ＳＨプロモーター／１９７番目（変異）：ｃ→ｈ／２００番目（変異）：ａ→ｗ／２０４番目（変異）：ｇ→ｖ／２０５番目（変異）：ｇ→ｖ／２１６番目（変異）：ｇ→ｖ／２２０番目（変異）：ｔ→ｎ／２８０番目〜２８５番目：ＮｃｏＩ認識部位。
［配列番号１０］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−１）４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：改変ＳＨプロモーター１／４９０６番目（変異）：ｇ→ａ／４９１８番目（変異）：ｇ→ｃ／４９２２番目（変異）：ｔ→ｃ／４９３６番目（変異）：ｇ→ａ／４９５９番目（変異）：ｃ→ｔ／４９８５番目〜６１００番目：ｈｏｘＫ／６０６５番目〜６０９７番目：ストレプタグ／６１４６番目〜８０２０番目：ｈｏｘＧ。
【００４５】
なお、各塩基を示す記号は、ＩＵＰＡＣ（International Union of Pure and Applied Chemistry）に従った。例えば、ｗはアデニンまたはチミンを、ｒはアデニンまたはグアニンを、ｍはアデニンまたはシトシンを、ｋはチミンまたはグアニンを、ｙはチミンまたはシトシンを、ｓはグアニンまたはシトシンを、ｈはアデニン、シトシンンまたはチミンを、ｂはグアニン、シトシンまたはチミンを、ｖはアデニン、グアニンまたはシトシンを、ｄはアデニン、グアニンまたはチミンを、ｎはアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンをそれぞれ表す。
【００４６】
［配列番号１１］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７）４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：改変ＳＨプロモーター７／４９０７番目（変異）：ｇ→ａ／４９１８番目（変異）：ｇ→ａ／４９２２番目（変異）：ｔ→ｃ／４９８５番目〜６１００番目：ｈｏｘＫ／６０６５番目〜６０９７番目：ストレプタグ／６１４６番目〜８０２０番目：ｈｏｘＧ。
［配列番号１２］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８）４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：改変ＳＨプロモーター８／４９０２番目（変異）：ａ→ｔ／４９０７番目（変異）：ｇ→ｃ／４９２２番目（変異）：ｔ→ｃ／４９３６番目（変異）：ｇ→ａ／４９８５番目〜６１００番目：ｈｏｘＫ／６０６５番目〜６０９７番目：ストレプタグ／６１４６番目〜８０２０番目：ｈｏｘＧ。
【００４７】
［配列番号１３］（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）４７０３番目〜４７０８番目：ＤｒａＩ認識部位／４８９７番目〜４９６４番目：改変ＳＨプロモーター９／４９０６番目（変異）：ｃ→ｇ／４９０７番目（変異）：ｃ→ｇ／４９１８番目（変異）：ｇ→ａ／４９２２番目（変異）：ｔ→ｃ／４９３６番目（変異）：ｇ→ａ／４９８５番目〜６１００番目：ｈｏｘＫ／６０６５番目〜６０９７番目：ストレプタグ／６１４６番目〜８０２０番目：ｈｏｘＧ。
［配列番号１４］（ｐＨＧ１からのｈｏｘＫの一部）１番目〜４４番目：pHG_hoxK_pRLプライマー／２１番目〜５６６番目：ｈｏｘＫの一部／５４８番目〜５７３番目：pHG_hoxK_Zrvプライマー。
［配列番号１５］（ｐＨＧ１からのｈｏｘＺ）１番目〜２６番目：pHG_hoxZ_Kプライマー／７７番目〜８１１番目：ｈｏｘＺ／１２０１番目〜１８０９番目：ｈｏｘＭ／１８２８番目〜１８６５番目：pHG_hoxL_pRL_rvプライマー。
【００４８】
［配列番号１６］（ｐＲＬＭＵ−０１）１番目〜４１番目：pHG_hoxK_pRLプライマー／２１番目〜５６６番目：ｈｏｘＫの一部／５５９番目〜５７３番目：in fusionサイト／６３５番目〜１３６９番目：ｈｏｘＺ／１７５９番目〜２３６７番目：ｈｏｘＭ／２３８６番目〜２４２３番目：pHG_hoxL_pRL_rvプライマー。
［配列番号１７］（ｐＨＧ１からのｈｏｘＫの一部）１番目〜４４番目：pHG_hoxK_pRLプライマー／２１番目〜５６６番目：ｈｏｘＫの一部／５４８番目〜５７４番目：pHG_hoxK_SHrvプライマー。
［配列番号１８］（ｐＨＧ１からのＳＨプロモーター）１番目〜２６番目：pHG_pSH_Kプライマー／２２３番目〜２９０番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／２９４番目〜３１５番目：pHG_SHpro_Zrvプライマー。
［配列番号１９］（ｐＨＧ１からのｈｏｘＺ）１番目〜４１番目：pHG_hoxZ_SHプライマー／７７番目〜８１１番目：ｈｏｘＺ／１２０１番目〜１８０９番目：ｈｏｘＭ／１８２８番目〜１８６５番目：pHG_hoxL_pRL_rvプライマー。
【００４９】
［配列番号２０］（ｐＲＬＭＵ−０２）１番目〜４４番目：pHG_hoxK_pRLプライマー／２１番目〜５６６番目：ｈｏｘＫの一部／５５９番目〜５７４番目：in fusionサイト／７８１番目〜８４８番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／８５９番目〜８７４番目：in fusionサイト／９３６番目〜１６７０番目：ｈｏｘＺ／２０６０番目〜２６６８番目：ｈｏｘＭ／２６８７番目〜２７２４番目：pHG_hoxL_pRL_rvプライマー。
［配列番号２１］（ｐＨＧ１からのＳＨプロモーター）１番目〜２６番目：pHG_pSH_Kプライマー／２９番目〜３４番目：ＤｒａＩ認識部位／２２３番目〜２９０番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／２９４番目〜３２１番目：pHG_SHpro_Mrvプライマー。
【００５０】
［配列番号２２］（ｐＨＧ１からのｈｏｘＺの一部）１番目〜２６番目：pHG_hoxM_SHプライマー／５番目〜６１３番目：ｈｏｘＭ／６３２番目〜６６９番目：pHG_hoxL_pRL_rvプライマー。
［配列番号２３］（ｐＲＬＭＵ−０３）１番目〜４４番目：pHG_hoxK_pRLプライマー／２１番目〜５６６番目：ｈｏｘＫの一部／５５９番目〜５７４番目：in fusionサイト／７８１番目〜８４８番目：R. eutropha由来のヒドロゲナーゼＳＨプロモーター（天然型）／８５９番目〜８７４番目：in fusionサイト／８６８番目〜１４７６番目：ｈｏｘＭ／１４９５番目〜１５３２番目：pHG_hoxL_pRL_rvプライマー。
【００５１】
なお、ｐＲＬＭＵ０１、ｐＲＬＭＵ０２およびｐＲＬＭＵ０３の作製に用いた各プライマーの塩基配列は、次表のとおりである。
【表１】
2015104373.tif 000003
【００５２】
３．培地の調製
ＬＢ寒天培地は、ＬＢ培地（ナカライテスク株式会社）１２．５ｇ、寒天末（ナカライテスク株式会社）７．５ｇ、イオン交換水５００ｍｌを混合し、オートクレーブ後、シャーレに分注して、固化させるという操作によって調製した。
ＬＢ培地（液体）は、ＬＢ培地（ナカライテスク株式会社）２０ｇとイオン交換水１０００ｍｌを混合し、オートクレーブすることで作製した。
ＳＯＣ培地（液体）は、Bacto Tryptone ２０ｇ、Yeast Extract ５ｇ、５Ｍ ＮａＣｌ ２ｍｌ、２Ｍ ＫＣｌ １．２５ｍｌおよびイオン交換水９９０ｍｌを混合し、オートクレーブ後、さらに２Ｍ Mg solution（１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＋１Ｍ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を１０ｍｌおよび２Ｍグルコース溶液１０ｍｌを加えて、調製した。
【００５３】
ＦＮ（＋）、ＦＮ（−）、ＦＮＧ（＋）、およびＦＮＧ（−）の調製には、以下のストック液を用いた。
・１０ｘ Ｈ１６ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（ナカライテスク株式会社）９０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４（ナカライテスク株式会社）１５ｇをイオン交換水に溶解し、ｐＨを７に調節した後に、イオン交換水を加えて容量を１０００ｍｌに合わせた。
・ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ｓｔｏｃｋ：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ナカライテスク株式会社）２０ｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解させた後に、ポアサイズ０．２μｍのフィルターに通した。
・ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ｓｔｏｃｋ：ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（ナカライテスク株式会社）０．５ｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解させた後に、ポアサイズ０．２μｍのフィルターに通した。
・ＮＨ４Ｃｌ ｓｔｏｃｋ：ＮＨ４Ｃｌ（ナカライテスク株式会社）２０ｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解させた後に、ポアサイズ０．２μｍのフィルターに通した。
・ＣａＣｌ２ ｓｔｏｃｋ：ＣａＣｌ２（ナカライテスク株式会社）１ｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解させた後に、ポアサイズ０．２μｍのフィルターに通した。
・ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ｓｔｏｃｋ：ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ナカライテスク株式会社）２３．７７ｇをイオン交換水１００ｍｌに溶解させた後に、ポアサイズ０．２μｍのフィルターに通した。
【００５４】
ＦＮ（＋）は、１０ｘ Ｈ１６ ｂｕｆｆｅｒ ５０ｍｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ｓｔｏｃｋ ０．５ｍｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ｓｔｏｃｋ ０．５ｍｌ、ＮＨ４Ｃｌ ｓｔｏｃｋ ５ｍｌ、ＣａＣｌ２ ｓｔｏｃｋ ０．５ｍｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ｓｔｏｃｋ ０．４ｍｌを混合後、イオン交換水を加えて容量を２５０ｍｌに合わせてオートクレーブした後に、ポアサイズ０．２μｍのフィルターに通した４０％Ｆｒｕｃｔｏｓｅ（ナカライテスク株式会社）５ｍｌを添加して、調製した。
ＦＮ（−）は、４０％Ｆｒｕｃｔｏｓｅを添加しない以外は、ＦＮ（＋）と同様に作製した。
【００５５】
ＦＮＧ（＋）は、４０％Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ５ｍｌを添加する代わりに、４０％Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ２．５ｍｌと４０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ナカライテスク株式会社）２．５ｍｌを添加する以外は、ＦＮ（＋）と同様に作製した。
ＦＮＧ（−）は、４０％Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ５ｍｌを添加する代わりに、４０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｍｌを添加する以外は、ＦＮ（＋）と同様に作製した。
【００５６】
４．R. eutropha ＭＢＨ遺伝子破壊株の作製
ＭＢＨの構造遺伝子であるｈｏｘＫ遺伝子とｈｏｘＧ遺伝子を破壊したR. eutropha（ＨＭＵ１株）を作製するために、ｈｏｘＫ−ｈｏｘＧ遺伝子破壊用自殺ベクターｐＲＬＭＵ０１を以下のように、ＨＦ５７４株に導入した。
【００５７】
まず、大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）をｐＲＬＭＵ０１で形質転換した大腸菌Ｓ１７−１株を、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含んだＬＢ培地で一晩３７℃で培養した。また、ＨＦ５７４株をＮＢ培地で一晩３７℃で培養した。それぞれを回収した後、ＦＮ（＋）で洗浄し、混合後、ＬＢ寒天培地にスポットして、一晩培養した。その後、混合菌体を寒天培地上からかきとり、ＦＮ（＋）液体培地に懸濁し、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含んだＦＮ（＋）寒天培地に播種した。２日間、３７℃で培養後、出現したコロニーを１５％スクロース入りのＬＢ寒天培地にさらに植菌した。約２日間３７℃で培養後、出現したいくつかのコロニーの遺伝子解析の結果、設計とおりの配列を有することが確認できたクローンをＨＭＵ１株とした。
【００５８】
なお、R. eutropha ＳＨ遺伝子破壊株ＨＦ５７４（掲載論文： J BiolInorg Chem (2002) 7,897-908）およびR. eutrophaへの接合によるプラスミド導入に用いた大腸菌Ｓ１７株（掲載論文： J BiolInorg Chem (2002) 7,897-908）、American Type Culture Collection (ATCC)：４７０５５）は、ドイツ・フンボルト大学Friedrich教授から譲渡を受けた。ＳＨ遺伝子破壊株ＨＦ５７４は、膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）を有していることからこれをポジティブコントロール（ＤＳＨ）として使用した。
【００５９】
ｐＲＬＭＵ０１に代えてｐＲＬＭＵ０２を用いた以外は、ＨＭＵ１株の作製と同様に、ｈｏｘＫ遺伝子とｈｏｘＧ遺伝子を破壊し、ＳＨプロモーターを付加したR. eutropha（ＨＭＵ２株）を作製し、単離した。
ｐＲＬＭＵ０１に代えてｐＲＬＭＵ０３を用いた以外は、ＨＭＵ１株の作製と同様に、ｈｏｘＫ、ｈｏｘＧおよびｈｏｘＺ遺伝子を破壊し、ＳＨプロモーターを付加したR. eutropha（ＨＭＵ３株）を作製し、単離した。
【００６０】
作製したR. eutropha ＭＢＨ遺伝子破壊株ＨＭＵ１〜３株は、次表のとおりである。
【表２】
2015104373.tif 000004
【００６１】
５．ｐＢＲ−ＭＢＨｓｔによるR. eutropha ＭＢＨ遺伝子破壊株の形質転換
R. eutropha ＭＢＨ遺伝子破壊株（ＨＭＵ１〜３株）のエレクトロコンピテントセルを以下のように作製した。
まず、３ｍｌのＦＮＧ（＋）培地にＨＭＵ１〜３株を植菌し、３７℃で培養した。１２時間後、２ｍｌの培養液を４８ｍｌの新しいＦＮＧ（＋）培地に加えてさらに、３０℃で培養した。２時間後、４℃で遠心分離を行うことで菌体を回収し、よく冷やした滅菌済０．３Ｍスクロースでよく洗浄した。最終的に、６００ｎｍのＯＤが５になるように、よく冷やした滅菌済０．３Ｍスクロースで希釈し、分注後、使用するまで−８０℃で保存した。
【００６２】
R. eutropha ＭＢＨ遺伝子破壊株（ＨＭＵ１〜３株）のエレクトロコンピテントセルは、氷上で融解した後に、プラスミド溶液（１００μｇ／ｍｌ以上、１μｌ）を加えて、２５００Ｖの電圧で電気パルスを加え、直ちにＳＯＣ培地に懸濁し、３０℃で１時間インキュベートし、２００μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだＦＮ（＋）寒天培地に播種した。その結果、約２日間３７℃で培養することで、形質転換体を得た。
【００６３】
６．形質転換体の培養
形質転換体は、まず５０ｍｌの２００μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだＦＮＧ（＋）培地に植菌し、３７℃で大気下で培養した。続いて、それぞれをＦＮＧ（−）培地もしくはＦＮ（−）培地で培地交換し、６００ｎｍのＯＤが３になるように、濃度を調節した。ＦＮＧ（−）培地については、大気条件下もしくは水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下で３０℃で培養を行った。ＦＮ（−）培地については、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下で３０℃で培養を行った。それぞれ、６００ｎｍのＯＤが約９に達した時点で、菌体を回収した。
【００６４】
７．転写量の定量
ヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｈｏｘＫ）とヒドロゲナーゼアクセサリー遺伝子（ｈｏｘＭ）の転写量は、菌体から抽出したＲＮＡサンプルを逆転写することで調製したｃＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲによって、定量した。
菌体からＲＮＡ抽出は、以下のように作製した試薬を用いて行った。
・変性バッファー：１４６．５ｍｌイオン交換水に、１２５ｇグアニジンチオシアネート、８．８ｍｌ ０．７５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１３．２ｍｌ １０％サルコシル（sarcosyl）を加え、６０℃に温めて溶解させて調製した。
・トリゾール溶液：１０ｍｌ 変性バッファー、０．０７ｍｌ ２−メルカプトエタノール、１ｍｌ ２Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍｌ水飽和フェノールを混合して、調製した。
【００６５】
菌体からＲＮＡ抽出は、以下のような手順で行った。
まず、菌体サンプル（スパシュラ小一杯）を、１ｍｌトリゾール溶液でよく懸濁した。続いて、１００μｌクロロホルム／イソアミルアルコール４９：１混合液を加えてよく懸濁し、氷上で１５分間静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った後に、上層の水層を新しい１．５ｍｌチューブに回収した。水層に等量のイソプロパノール約５００μｌを加え、室温で１０分静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った後に、上清を捨て、沈殿物に５００μｌ ７５％エタノールを加えて、ボルテックスを行った。４℃ １５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後に、上清を捨て、５〜１０分間自然乾燥させた。沈殿物を５０μｌ ＤＥＰＣ処理水を加えて溶解させて、使用時まで−８０℃で保存した。
【００６６】
ＲＮＡサンプルの逆転写反応は、ReverTra Ace（東洋紡株式会社）のを用いて行った。
リアルタイムＰＣＲは、反応試薬にTHUNDERBIRD Probe qPCR Mix（東洋紡株式会社）を用い、リアルタイムＰＣＲ装置にThermal Cycler Dice Real Time System（タカラバイオ株式会社）を用いて行った。ｈｏｘＫ増幅用プライマーは、pHG_hoxK_RT_PCR_F3 （CCATTATCTCCTGGGGTTCC（配列番号４４））およびpHG_hoxK_RT_PCR_R3（CCTTGATAATCGGCTTGTCG（配列番号４５））、ｈｏｘＭ増幅用プライマーは、pHG_hoxM_RT_PCR_F1（CAGGTATGCCTGGTCGACGG（配列番号４６））およびpHG_hoxM_RT_PCR_R1（GGCCATAGTCGATCGCATCG（配列番号４７））を用いた。
【００６７】
８．ヒドロゲナーゼ活性測定
ヒドロゲナーゼ活性は、細胞破砕液中のヒドロゲナーゼ活性による水素依存的ベンジルビオローゲン還元速度、またはＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分離した細胞破砕液の活性染色により評価した。活性染色は、目視により優れた方から◎、○、△、×の４段階で評価した。なお、−は、測定未実施を表す。
ベンジルビオローゲン還元測定は、以下のとおり行った。
菌体ペレット４０ｍｇを１ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．６）に懸濁し、ＭＩＳＯＮＩＸ社（Misonix, Inc.）の超音波破砕機Microson XL2000を用いて、１２Ｗで４０秒間細胞を破壊した。その一方で、吸光度測定用セルに、２ｍｌの反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．５ｍＭベンジルビオローゲン）を入れ、水素ガスを２０分間以上バブリングし、そこに１０μｌの細胞破砕液を投入し、UV-1800 UV SPECTROPHOTOMETER（株式会社島津製作所）で、６０４ｎｍ波長で吸光度変化を測定した。
【００６８】
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥと活性染色は、以下のとおり行った。
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲルは、４．５ｍｌイオン交換水、３．８ｍｌ ３０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ナカライテスク株式会社）、２．８ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１１ｍｌ １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を混合し、テトラメチルエチレンジアミンと過硫酸アンモニウムで重合を開始させて作製した。泳動バッファーは、３ｇトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１４．４ｇグリシン、１ｍｌ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をイオン交換水に溶解させ、ｐＨを８．３に調節後、容量を１Ｌに合わせて、調製した。電気泳動は、ゲル一枚につき２０ｍＡの定電流で、４℃のコールドルーム内で行った。泳動後は、ゲルを活性染色液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭベンジルビオローゲン、２ｍＭニトロブルーテトラゾリウム（NiroBlue tetrazolium）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に浸して、水素ガス雰囲気下に数時間置くことで、ヒドロゲナーゼの活性によるニトロブルーテトラゾリウムの還元と色素沈着によって形成されたバンドを写真撮影した。
【００６９】
９．活性評価および転写量比較
＜活性評価＞
プラスミド（ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−７、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−８、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９）と宿主（ＨＭＵ１、ＨＭＵ２、ＨＭＵ３）を組み合わせた発現系において、３種類の培養条件（大気下でのＦＮＧ（−）培地、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下でのＦＮ（−）培地におけるヒドロゲナーゼ活性を比較した。
【００７０】
大気下でのＦＮＧ（−）培地を用いた培養では、ＨＭＵ１とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９、ＨＭＵ２とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、およびＨＭＵ３とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔの組み合わせにおいて、有意なヒドロゲナーゼ活性が観測された（図６）。
また、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下でのＦＮＧ（−）培地を用いた培養では、ＨＭＵ１とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ＨＭＵ２とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、およびＨＭＵ３とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔの組み合わせにおいて、有意なヒドロゲナーゼ活性が観測された。
また、水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下でのＦＮ（−）培地を用いた培養では、ＨＭＵ１とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、およびＨＭＵ２とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔの組み合わせにおいて、有意なヒドロゲナーゼ活性が観測された（図７）。
【００７１】
上記ベンジルビオローゲン還元測定を行った後、さらにいくつかは、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ後の活性染色（図８）をおこなった。ＨＭＵ１とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ−９、ＨＭＵ２とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔの組み合わせを、大気下でＦＮＧ（−）培地を用いて培養した場合、並びに、ＨＭＵ１とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔ、ＨＭＵ２とｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔの組み合わせを水素：酸素：二酸化炭素＝８：１：１の混合気体下でＦＮ（−）培地を用いて培養した場合に、有意なヒドロゲナーゼ活性が観測された。
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲルの活性染色によるヒドロゲナーゼ活性評価では、ＨＭＵ３株を用いた場合、ｐＢＨＲ−ＭＢＨｓｔとの組み合わせを大気下でＦＮＧ（−）培地を用いて培養した場合においてのみ、わずかな活性が観察された。ＨＭＵ３株は、R. eutropha ＭＢＨの膜結合ドメインであるＨｏｘＺ蛋白質を欠如しているために、蛋白質の安定性が低下し、電気泳動の間に変性したと考えられる。
【００７２】
＜転写量比較＞
リアルタイムＰＣＲによるプラスミド由来ヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｈｏｘＫ）と、ヒドロゲナーゼアクセサリー遺伝子の一つであり宿主ｐＨＧ１由来のｈｏｘＭの転写量比較を図１０〜１２に示す。それぞれの値は、１６ｒｓＲＮＡの転写量を１００とした場合の相対量をあらわす。
【００７３】
培養条件、活性染色の結果、および転写量の結果をまとめると、次表のとおりであった。なお、転写量は、ｍＲＮＡのコピー数を指しており、宿主菌の１６ｓｒＲＮＡを１００としたときの値を示している。
【表３】
2015104373.tif 000005
【００７４】
活性評価の結果と合わせて考察すると、ヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｈｏｘＫ）とアクセサリー遺伝子の転写量（ｈｏｘＭ）の比率を適切に調節することが、十分な活性を有するヒドロゲナーゼ発現につながることが明らかとなった。つまり、ヒドロゲナーゼ構造遺伝子ばかりが発現すると、発現したヒドロゲナーゼは未成熟なままであり、十分な活性を有さないこととなる。これに対し、アクセサリー遺伝子の転写量も適切に調節することで、十分な活性を有するヒドロゲナーゼを大量に得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ、とくに膜結合型ヒドロゲナーゼ（ＭＢＨ）は、ＰＳＩや光触媒、電極と組み合わせた水素生産や、燃料電池への応用が期待されているものの、ランダムライブラリ作製可能な宿主ベクター系による発現系がこれまで報告されていなかった。本発明によると、宿主として、ＳＨとＭＢＨ遺伝子を破壊したR. eutrophaを用い、ベクターとして、ＭＢＨ遺伝子（ｈｏｘＫおよびｈｏｘＧ）を挿入したプラスミドｐＢＨＲ１に用いることで、初めてランダムライブラリ作製可能な発現系を構築できる。ｐＢＨＲ１は、比較的小型な広宿主域ベクター（〜５ｋｂｐ）であり、ＭＢＨ遺伝子を含めても８ｋｂｐというサイズであるために、遺伝子操作が容易である。また、電気穿孔法によって効率的な形質転換が可能であるために。このことから、ランダムライブラリ作製期間を２〜３日程度に大きく短縮することができる。よって、本発明によって、ヒドロゲナーゼの水素生産技術や燃料電池への応用研究を大きく前進させることができる。
【図１】
2015104373.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015104373.tif 000012
【図８】
2015104373.tif 000013
【図９】
2015104373.tif 000014
【図１０】
2015104373.tif 000015
【配列表】
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