(57)【要約】【課題】高い変換率で目的のジオール化合物を変換、生成することが可能なジオール化合物の製造方法及びジオール化合物の製造装置を提供する。【解決手段】本発明に係るジオール化合物の製造方法によれば、微生物変換を用いて目的のジオール化合物を高い変換率で変換、生成することができる。また、固定化菌体を用いた本発明に係るジオール化合物の製造方法によれば、目的のジオール化合物を高い変換率で変換、生成することができることに加え、固定化菌体と生成液とを簡単に分離することができる。特に本発明に係るジオール化合物の製造装置８０ａ、８０ｂによれば、固定化菌体１０を所定のカラム３０に収容し、このカラム３０内に原料溶液を循環もしくは通過させることで目的化合物の変換を連続的且つ効率的に行うことができる。これにより、目的化合物を大量に取得することができる。【選択図】図１
2015006138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス属に属する変換菌を用いて式（１）で表すケイ皮酸誘導体を式（２）で表すジオール化合物に変換するジオール化合物の製造方法であって、
【化１】
2015006138.tif 000009
【化２】
2015006138.tif 000010
（式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、フェニル基を示し、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、アミノ基、ニトロ基を示す。）
前記変換菌を固定化し固定化菌体とするステップと、
所定の培養液中で前記固定化菌体と前記式（１）で表すケイ皮酸誘導体とを接触させることで、前記変換菌による微生物変換により前記ケイ皮酸誘導体の側鎖部分を増炭素し前記式（２）で表すジオール化合物に変換するステップと、
前記固定化菌体を分離するステップと、
を有することを特徴とするジオール化合物の製造方法。
【請求項２】
変換菌の固定化を前記変換菌が通過しない有機薄膜で包括することで行うことを特徴とする請求項１記載のジオール化合物の製造方法。
【請求項３】
サッカロミセス属に属する変換菌を用いて式（３）で表すケイ皮酸誘導体を式（４）で表すジオール化合物に変換するジオール化合物の製造方法であって、
【化３】
2015006138.tif 000011
【化４】
2015006138.tif 000012
（式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、フェニル基を示し、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、アミノ基、ニトロ基を示す。）
前記変換菌と所定の濃度のアセトアルデヒド溶液と前記式（３）で表すケイ皮酸誘導体とを混合し、所定の濃度のアセトアルデヒド存在下で前記変換菌と前記ケイ皮酸誘導体とを接触させることで、前記変換菌による微生物変換により前記ケイ皮酸誘導体の側鎖部分を増炭素し前記式（４）で表すジオール化合物に変換することを特徴とするジオール化合物の製造方法。
【請求項４】
前記ジオール化合物が式（５）に示す光学活性な（２Ｓ，３Ｒ）ジオール化合物であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のジオール化合物の製造方法。
【化５】
2015006138.tif 000013
（式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、フェニル基を示し、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、アミノ基、ニトロ基を示す。）
【請求項５】
変換菌が出芽酵母であり、ケイ皮酸誘導体がシンナムアルデヒドであり、（２Ｓ，３Ｒ）ジオール化合物が（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン２，３−ジオールであることを特徴とする請求項４記載のジオール化合物の製造方法。
【請求項６】
固定化菌体をカラムに収容し、
前記カラムに前記式（１）で表すケイ皮酸誘導体を含む溶液を循環もしくは通過させることで前記式（２）で表すジオール化合物に変換することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のジオール化合物の製造方法。
【請求項７】
請求項６記載のジオール化合物の製造方法に用いる製造装置であって、
固定化菌体が収容されたカラムと、
前記式（１）で表すケイ皮酸誘導体を含む溶液を貯留し、前記カラムと液送管で繋がれたリザーバと、
前記リザーバ内の溶液を前記カラムに液送するポンプと、を有し、
前記溶液を、前記カラムと前記リザーバ間で循環させる、もしくは前記カラムを通過させることで、前記式（２）で表すジオール化合物に変換させることを特徴とするジオール化合物の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サッカロミセス属に属する微生物の微生物変換を用いてケイ皮酸誘導体からジオール化合物を製造するジオール化合物の製造方法及びジオール化合物の製造装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ケイ皮酸およびその類縁化合物は主に植物に含まれ、その多様性と多面的な生理活性から古くより食生活や医療に活用されてきた。また、近年ではケイ皮酸誘導体をはじめフェノール性化合物の抗酸化作用が注目されている。
【０００３】
また、微生物変換とは、微生物菌体またはその生成物に原料化合物を接触させ、目的の化合物に変換する方法であり、水酸化をはじめ還元、加水分解、スルホン酸化、グリコシル化など多くの反応が可能であることが知られている。また、この微生物変換は、常温常圧、中性付近で反応が進行することが多いため、人工的な化学合成手法に比べ環境負荷が小さいという利点を有している。また、人工的な化学合成手法では、例えば旋光性が（２Ｓ，３Ｒ）のジオ−ル化合物を生成したい場合であっても、これのジアステレオマー（光学異性体）である（２Ｓ，３Ｓ）ジオ−ル化合物、（２Ｒ，３Ｓ）ジオ−ル化合物、（２Ｒ，３Ｒ）ジオ−ル化合物も同時に生成される。しかしながら、微生物変換は化学合成手法に比べて、原料化合物の特定の部位を変換する部位特異性や立体特異性に優れ、目的の旋光性の化合物のみを生成できるという利点を有している。また、反応に際して保護基が不要であるという利点を有している。
【０００４】
ここで、下記［非特許文献１］には、サッカロミセス属に属する出芽酵母（Saccharomyces  cerevisiae）が、わずかではあるがシンナムアルデヒドおよびその類縁化合物を増炭素し、ジオール化合物である光学活性な（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルに変換する例が記載されている。この２つの不斉炭素をもつ（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルは、医薬品等の原料として用いる光学活性化合物の原材料として期待される化合物の一つである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】C. Fuganti and P.Grasselli, Chemistry and Industry, １７巻、９８３頁（１９７７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、［非特許文献１］の変換手法では、目的化合物以外の還元体や多くの副生成物が生じるため、目的化合物である（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルの収率がわずか１０％程度であり、変換率が低いという問題点がある。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、高い変換率で目的のジオール化合物を変換、生成することが可能なジオール化合物の製造方法及びジオール化合物の製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）サッカロミセス属に属する変換菌を用いて式（６）で表すケイ皮酸誘導体を式（７）で表すジオール化合物に変換するジオール化合物の製造方法であって、
【化６】
2015006138.tif 000003
【化７】
2015006138.tif 000004
（式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、フェニル基を示し、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、アミノ基、ニトロ基を示す。）
前記変換菌を固定化し固定化菌体とするステップと、
所定の培養液中で前記固定化菌体と前記式（６）で表すケイ皮酸誘導体とを接触させることで、前記変換菌による微生物変換により前記ケイ皮酸誘導体の側鎖部分を増炭素し前記式（７）で表すジオール化合物に変換するステップと、
前記固定化菌体を分離するステップと、
を有することを特徴とするジオール化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（２）変換菌の固定化を前記変換菌が通過しない有機薄膜で包括することで行うことを特徴とする上記（１）に記載のジオール化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（３）サッカロミセス属に属する変換菌を用いて式（６）で表すケイ皮酸誘導体を式（７）で表すジオール化合物に変換するジオール化合物の製造方法であって、
前記変換菌と所定の濃度のアセトアルデヒド溶液と前記式（６）で表すケイ皮酸誘導体とを混合し、所定の濃度のアセトアルデヒド存在下で前記変換菌と前記ケイ皮酸誘導体とを接触させることで、前記変換菌による微生物変換により前記ケイ皮酸誘導体の側鎖部分を増炭素し前記式（７）で表すジオール化合物に変換することを特徴とするジオール化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（４）前記ジオール化合物が式（８）に示す光学活性な（２Ｓ，３Ｒ）ジオール化合物であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のジオール化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
【化８】
2015006138.tif 000005
（式中Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、フェニル基を示し、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、メチル基、アルキル基、アミノ基、ニトロ基を示す。）
（５）変換菌が出芽酵母であり、ケイ皮酸誘導体がシンナムアルデヒドであり、（２Ｓ，３Ｒ）ジオール化合物が（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン２，３−ジオールであることを特徴とする上記（４）記載のジオール化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（６）固定化菌体１０をカラム３０に収容し、
前記カラム３０に前記式（６）で表すケイ皮酸誘導体を含む溶液を循環もしくは通過させることで前記式（７）で表すジオール化合物に変換することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のジオール化合物の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
（７）上記（６）記載のジオール化合物の製造方法に用いる製造装置であって、
固定化菌体１０が収容されたカラム３０と、
前記式（６）で表すケイ皮酸誘導体を含む溶液を貯留し、前記カラム３０と液送管２０ａで繋がれたリザーバ３２と、
前記リザーバ３２内の溶液を前記カラム３０に液送するポンプ３４と、を有し、
前記溶液を、前記カラム３０と前記リザーバ３２間で循環させる、もしくは前記カラム３０を通過させることで、前記式（７）で表すジオール化合物に変換させることを特徴とするジオール化合物の製造装置８０ａ、８０ｂを提供することにより、上記課題を解決する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るジオール化合物の製造方法は、微生物変換を用いて目的のジオール化合物を高い変換率で変換、生成することができる。また、固定化菌体を用いた本発明に係るジオール化合物の製造方法及びジオール化合物の製造装置は、目的のジオール化合物を高い変換率で変換、生成できるとともに、変換菌と生成液とを容易に分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明に係るジオール化合物の製造方法のフローチャートである。
【図２】実施例１及び比較例１における生成物の相対比率の変化を示すグラフである。
【図３】本発明に係るジオール化合物の製造装置を示す図である。
【図４】実施例４及び実施例５における生成物の相対比率の変化を示すグラフである。
【図５】本発明に係るジオール化合物の製造方法の他の実施の形態のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るジオール化合物の製造方法及びジオール化合物の製造装置の実施の形態について図面に基づいて説明する。本発明に係るジオール化合物の製造方法は、図１のフローチャートに示すように、先ず、所定のサッカロミセス属（genus  Saccharomyces）の微生物菌体（以後、変換菌とする。）を所定の培地で培養する（ステップＳ１００：培養工程）。尚、本願発明で使用する変換菌は［化６］の式で示すケイ皮酸誘導体を［化７］の式で示すジオール化合物に変換しうるサッカロミセス属の微生物菌体すべてを包含するものとする。
【００１２】
培養工程における変換菌の培養は例えば以下のようにして行う。先ず、所定の糖類（炭素源）を含有する培地に変換菌を植菌する。このときの培地には通常の微生物が利用可能な栄養物を含有するものを用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グルクロン酸、ガラクトース、マンノース、シュクロース、マルトース、乳糖、デンプン、グリセリン、水飴、糖蜜、大豆油等が利用可能である。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、肉粉、魚粉、肉エキス、ペプトン、コーンステイープリカー、乾燥酵母、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩等が利用可能である。その他、必要に応じて、食塩、塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸塩等の無機塩や、変換菌の発育を助けるとともに変換酵素の生産を促進する添加物、例えば酵母エキスや麦芽エキス等を適宜配合しても良い。
【００１３】
変換菌の培養は好気的条件の下、培養温度２０℃〜４０℃、好適には２３℃〜３０℃、最適には２８℃で所定の期間行う。変換菌の培養期間は培養条件、培養装置等により異なるが、変換菌による変換酵素の生産能が高い時期がよく、通常は変換菌の培養開始から１日〜５日経過した時点が好ましい。この培養期間中、変換菌は増殖しながら変換酵素を生成、蓄積する。
【００１４】
次に、培養した変換菌を固定化し固定化菌体とする（ステップＳ１０２：固定化工程）。変換菌の固定化は変換菌が通過しない有機薄膜で変換菌を包括して行うことが特に好ましい。
【００１５】
ここで、有機薄膜で変換菌を包括する固定化手法の一例を示す。尚、固定化手法は特にこれに限定されるわけでは無く、変換菌を何らかの担体に共有結合やイオン結合または吸着を用いて固定化する手法や、光架橋樹脂を用いた架橋反応で変換菌を担体に固定する手法など、周知の固定化手法を用いることができる。また、以下の例では変換菌を包括する有機薄膜にアルギン酸カルシウムを用いたが、変換菌を包括する有機薄膜は特にアルギン酸カルシウムに限定されず、薄膜カプセルを形成可能な周知の有機化合物を用いることができる。
【００１６】
変換菌を有機薄膜で包括して固定化する場合、先ず、変換菌を培地ごと遠心分離し、上清液をデカンテーションによって除去する。これにより、高濃度の変換菌培養液を得る。この変換菌培養液には培地を再度添加し、変換菌を培地ごと固定化することが好ましい。この際、添加する培地は少なくとも糖類を含有していれば良く、よって培養時の培地を用いても良いし、その他の培地を調製して用いても良い。
【００１７】
次に、この変換菌培養液にアルギン酸ナトリウム溶液を加え、十分に混合する。次に、所定の濃度の塩化カルシウム溶液を用意し、この塩化カルシウム溶液をマグネチックスターラーでゆっくりと撹拌しながら、アルギン酸ナトリウムを添加した変換菌培養液を一滴ずつ滴下する。これにより、変換菌培養液中のアルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムとが反応し、変換菌培養液を包括するようにアルギン酸カルシウム薄膜が形成される。これにより、滴下した培養液中の変換菌はアルギン酸カルシウム薄膜のカプセルによって包括され固定化される。上記の手法により固定化された固定化菌体は網や笊、フィルタ、濾紙等の物理的手法によって回収され、滅菌蒸留水等で洗浄される。尚、アルギン酸カルシウムの薄膜は変換菌を透過させず、原料化合物及び生成物を透過させる性質を有する。
【００１８】
次に、固定化菌体を糖類を含有する培地に入れ、この培地に［化６］の式で示すケイ皮酸誘導体（以後、原料化合物とする。）を添加する。原料化合物の添加量は、培地に対して０．０１％〜０．５％、好ましくは０．０２５％〜０．２％である。尚、本願中の％は基本的にｇ／１００ｍＬとする。
【００１９】
次に、原料化合物を添加した培地で固定化菌体の培養を行う。固定化菌体の培養は、好気的条件下で培養工程と同様の培養温度で行なう。培養期間は固定化菌体の量、培養設備、原料化合物の量等により変化するが、概ね原料化合物の添加から１日〜８日程度である。この培養期間中にも固定化菌体中の変換菌は変換酵素を生成する。また、変換菌が生成した変換酵素は原料化合物と接触し、原料化合物の特定の側鎖部分に新たな炭素鎖を導入（増炭素）して［化７］に示す目的のジオール化合物に変換する（ステップＳ１０４：変換工程）。尚、原料化合物は変換菌の内部に取り込まれ、変換菌内部で微生物変換され、その後、変換菌から排出されるものと推測される。
【００２０】
次に、目的のジオール化合物（以後、目的化合物とする。）を含む生成液と固定化菌体とを分離する。この分離は笊やフィルタ、濾紙等の物理的手法で簡単に行うことができる（ステップＳ１０６：分離工程）。尚、ここでの生成液には目的化合物の他、培地及び原料化合物の残渣、副生成物等が含まれている。
【００２１】
分離された生成液は例えば次のようにして目的化合物に対する分離、精製が行われる。先ず、生成液を濾過し、得られた濾液を酢酸エチル、ヘキサン、ｎ−ブタノールのような水と混和しにくい有機溶媒で抽出する。次に、抽出液から溶媒を除去し、粗生成物を得る。次に、得られた粗生成物をシリカゲル、アルミナ、合成吸着樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付し、適切な溶離剤で溶出することで目的化合物を分離、精製する。尚、上記の分離、精製手法は一例であり、これ以外の周知の分離、精製技術を使用しても良い。
【実施例１】
【００２２】
Ｄ−グルコース２０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％のＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ−Ｐｅｐｔｏｎ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）改変培地８０ｍＬの入った三角フラスコ（５００ｍＬ）２本に出芽酵母（S. cerevisiae）を植菌した。これを、２８℃、２１０ｒｐｍの条件で３日間振とう培養した。この培養液を３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離した後、上清をデカンテーションにより除去した。
【００２３】
次に、デカンテーションした変換菌培養液（培養菌体）約１．５ｇに対して、ＹＰＤ改変培地を１．５ｍＬ入れ、さらに濃度１．５％のアルギン酸ナトリウム溶液を９ｍＬ加え十分に混合した。次に、濃度５％の塩化カルシウム溶液を用意しマグネチックスターラーでゆっくりと撹拌しながら、上記の変換菌培養液を一滴ずつ滴下した。これにより、変換菌培養液を包括するようにアルギン酸カルシウム薄膜が形成され、アルギン酸カルシウム薄膜のカプセルによって包括された固定化菌体を得た。次に、網杓子を用いて固定化菌体を回収し、滅菌蒸留水で十分に洗浄した。
【００２４】
次に、原料化合物として[化９]に示すシンナムアルデヒドを４０ｍｇ含有したＹＰＤ改変培地８０ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに入れ、さらに上記の固定化菌体を投入した。そして、２８℃、２１０ｒｐｍの条件で振とう培養した。
【化９】
2015006138.tif 000006
【００２５】
この培養液（生成液）を１時間、３時間、６時間、１０時間、２２時間、３２時間後に４ｍＬサンプリングし、サンプリング液の上清を等量の酢酸エチルで抽出し、エバポレーターで濃縮した。そして、濃縮物を少量のエタノールで溶解し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（展開溶媒：酢酸エチル＋ヘキサン（３：７））および逆相分配高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相：水＋アセトニトリル（８０：２０）、検出器：ＵＶ２８０ｎｍ）により生成液中の生成物の確認とその相対比率の測定を行った。また、最終的な生成物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより粗精製し、生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００２６】
先ず、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定の結果、[実施例１]における最終的な生成物は５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルであることが確認された。また、この５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルの旋光度を測定したところ、ここでの目的化合物である[化１０]に示す（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルの値［α］Ｄ＝＋１６．４°（ｃ１．０５、エタノール）と一致した。
【化１０】
2015006138.tif 000007
【００２７】
次に、図２（ａ）に[実施例１]の各サンプリング液中の原料化合物、目的化合物、副生成物の相対比率のグラフを示す。ここで、図２及び後述の図４中の黒丸印は目的化合物（ｐｒｏｄｕｃｔ）である５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ル（旋光度の測定から（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルと確認されている）の相対比率（％）である。また、黒四角印は原料化合物（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるシンナムアルデヒドの相対比率（％）である。また、白丸印は主に[化１１]に示す３−フェニル−１−プロパノールで構成された副生成物（ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔ）の相対比率（％）である。
【化１１】
2015006138.tif 000008
【００２８】
図２（ａ）より、[実施例１]によって得られる生成液は、時間経過とともに目的化合物の相対比率が増加し、３２時間後でほぼ９９％となった。このとき、原料化合物はほぼ０％であり、副生成物は約１％であった。
【００２９】
［比較例１］
[実施例１]と同様にして、出芽酵母（S. cerevisiae）を培養、デカンテーションした。次に、原料化合物としてのシンナムアルデヒドを４０ｍｇ含有したＹＰＤ改変培地８０ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに入れ、さらに固定化していない上記変換菌を[実施例１]と同量投入した。そして、２８℃、２１０ｒｐｍの条件で振とう培養した。この培養液を[実施例１]と同様１時間、３時間、６時間、１０時間、２２時間、３２時間後に４ｍＬサンプリングし、各サンプル液に対し[実施例１]と同様の手法により生成物の確認とその相対比率の測定を行った。
【００３０】
ここで、図２（ｂ）に[比較例１]の各サンプリング液中の原料化合物、目的化合物、副生成物の相対比率のグラフを示す。図２（ｂ）より、変換菌を固定化していない[比較例１]によって得られる生成液は、原料化合物が培養後約１時間でほぼ副生成物に変換され、目的化合物にはほとんど変換されなかった。
【００３１】
これらのことから、固定化菌体を用いた本発明に係るジオール化合物の製造方法は、従来の微生物変換手法と比較して、高い変換率で原料化合物を目的化合物に変換することが確認された。尚、本願発明者は所定の濃度のアセトアルデヒド溶液中で未固定の変換菌と原料化合物とを接触させた場合、変換菌が固定化菌体と同様、高い変換率で原料化合物を目的化合物に変換することを見出した。このことから、変換菌は所定の濃度のアセトアルデヒドの存在下において、目的化合物への変換を盛んに行うものと推測される。そして、固定化菌体では変換菌が糖類をアルコールに替えるときに生成するアセトアルデヒドがカプセル内に蓄積することで上記環境が形成され、目的化合物への高い変換率が得られるものと推測される。
【００３２】
次に、[実施例１]で使用した固定化菌体を回収し、これに１０ｍｇのシンナムアルデヒドを含むＹＰＤ改変培地を２０ｍＬ再度添加した。そして、[実施例１]と同一の条件で３日間振とう培養した。この培養液を[実施例１]と同様に抽出、濃縮し、目的化合物の有無及び相対比率を確認した。さらにもう一度同様の作業を行い、目的化合物の有無及び相対比率を確認した。その結果、目的化合物への変換率はそれぞれ７３％、８７％であった。このことから、固定化菌体は再利用が可能であることが確認された。
【実施例２】
【００３３】
原料化合物を２−ブロモシンナムアルデヒドに替えた以外は[実施例１]と同様にして目的化合物の変換、生成を行った。その結果、[実施例１]と同様に目的化合物（（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ル）の生成が確認された。
【実施例３】
【００３４】
原料化合物を２−メチルシンナムアルデヒドに替えた以外は[実施例１]と同様にして目的化合物の変換、生成を行った。その結果、[実施例１]と同様に目的化合物（（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ル）の生成が確認された。
【００３５】
このことから、シンナムアルデヒド以外のケイ皮酸誘導体によっても目的化合物の変換が可能であることが確認された。尚、原料化合物として使用可能な上記以外のケイ皮酸誘導体としては、例えば、シンナミルアルコール、シンナム酸、シンナム酸メチルエステル、シンナム酸エチルエステルおよびそれらの２−メチル置換体、２−ハロゲン置換体等が挙げられる。
【００３６】
次に、固定化菌体を用いたジオール化合物の製造方法の好適な製造方法及び製造装置を説明する。図３（ａ）、図３（ｂ）は本発明に係るジオール化合物の好適な製造装置８０ａ、８０ｂを示す図である。図３（ａ）、図３（ｂ）に示す本発明に係るジオール化合物の製造装置８０ａ、８０ｂは、微生物変換によって目的化合物を生成する所謂バイオリアクタであり、固定化菌体１０が収容されたカラム３０と、このカラム３０と液送管２０ａで繋がれ原料化合物を含む溶液（以後、原料溶液とする。）を貯留するリザーバ３２と、このリザーバ３２内の原料溶液をカラム３０に液送するポンプ３４と、を有している。尚、図３（ａ）は原料溶液がカラム３０とリザーバ３２間を循環することで目的化合物を変換、生成するジオール化合物の製造装置８０ａであり、図３（ｂ）は原料溶液がカラム３０を通過することで目的化合物を変換、生成するジオール化合物の製造装置８０ｂである。
【００３７】
カラム３０に収容する固定化菌体１０は、前述の培養工程（ステップＳ１００）、固定化工程（ステップＳ１０２）により作製される。また、カラム３０にはガラス、ステンレスまたはその他の金属製のものを用いることができる。尚、固定化菌体１０を素焼きの板やシラス土壌を焼成した多孔性のガラス素材（ＳＰＧ）で構成された収容体もしくは半透性の膜内に充填し、これをカラム３０内に収容するようにしても良い。この構成によれば、カラム３０内への固定化菌体１０の収容と回収をさらに容易に行うことができる。
【００３８】
リザーバ３２内に貯留する原料溶液は、原料化合物と少なくとも糖類を含む培地とが混合された溶液であり、原料化合物を０．０５％〜０．２％の濃度で含む培地溶液またはグルコース溶液を用いることが好ましい。
【００３９】
そして、図３（ａ）に示す循環型のジオール化合物の製造装置８０ａでは、原料溶液はポンプ３４によってリザーバ３２内から液送管２０ａを通ってカラム３０に液送される。カラム３０に液送された原料溶液は、カラム３０内及び、液送管２０ｂを通ってリザーバ３２内に吐出され、ポンプ３４によって再度カラム３０へ液送される。原料溶液の流速はカラム３０の大きさ等によって異なるが、概ね０．３ｍＬ／ｍｉｎ〜２ｍＬ／ｍｉｎ程度とすることが好ましい。
【００４０】
そして、原料溶液がカラム３０内を通過する際、原料溶液中の原料化合物と固定化菌体１０とが接触し、原料化合物の目的化合物への微生物変換が行われる。これにより、原料溶液中の原料化合物が減少するとともに目的化合物が増加する。目的化合物への変換に十分な時間、原料溶液の循環が行われるとポンプ３４は停止し、リザーバ３２内から変換後の原料溶液（生成液）が回収される。回収された生成液は、目的化合物に対する分離、精製が行われ、これにより目的化合物が取得される。また、リザーバ３２には、再度原料溶液が投入され、原料溶液の循環による目的化合物の変換が再度繰り返し行われる。
【００４１】
また、図３（ｂ）に示す液送型のジオール化合物の製造装置８０ｂでは、リザーバ３２内の原料溶液はポンプ３４によって液送管２０ａを通ってカラム３０内に液送され、その後、液送管２０ｂを通って回収槽３６に吐出される。そして、原料溶液がカラム３０内を通過する際、原料化合物と固定化菌体１０とが接触し、原料化合物の目的化合物への微生物変換が行われる。また、回収槽３６に吐出された生成液は回収され、目的化合物に対する分離、精製が行われる。尚、液送型のジオール化合物の製造装置８０ｂでは、カラム３０を大型化もしくは十分な長さに伸長する、もしくは、原料溶液の流速を低速もしくは所定の時間間隔で間欠的に行うことで、原料溶液を微生物変換に要する十分な時間、カラム３０内に停留させることが好ましい。
【００４２】
この図３に示すジオール化合物の製造装置８０ａ、８０ｂでは、固定化菌体１０を所定のカラム３０に収容し、このカラム３０内に原料溶液を循環もしくは通過させることで原料化合物を目的化合物に変換する。このため、目的化合物の変換を連続的に行うことが可能となり、目的化合物の変換、生成を大量且つ効率的に行うことができる。
【実施例４】
【００４３】
［実施例１］と同様にして固定化菌体１０を取得した。次に、多孔質（孔径約５μｍ）のＳＰＧ製の円筒容器内に固定化菌体１０を充填した。次に、循環型のジオール化合物の製造装置８０ａのカラム３０（内径９ｍｍ、長さ１２５ｍｍ、ステンレス製）内に、固定化菌体１０を充填した円筒容器を収容した。次に、１／２ＹＰＤ改変培地２５０ｍＬに原料化合物としてのシンナムアルデヒドを１２５ｍｇ（培地に対して０．０５％）乃至は３７５ｍｇ（培地に対して０．１５％）加え原料溶液とし、これをリザーバ３２に貯留した。次に、ポンプ３４を稼働させリザーバ３２内の原料溶液を流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで７２時間循環した。この循環液を、０時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間後においてサンプリングし、各サンプル液中の生成物の確認とその相対比率の測定を行った。その結果を図４（ａ）に示す。
【００４４】
図４（ａ）から、原料化合物であるシンナムアルデヒドは時間経過とともに徐々に減少し、これに伴って目的化合物が増加し、４８時間後において目的化合物の相対量が原料化合物の相対量を上回った。尚、６０時間後における最終的な原料化合物の変換率は８１％であり、副生成物は[実施例１]同様わずかであった。
【実施例５】
【００４５】
［実施例１］と同様にして固定化菌体１０を取得した。この時の固定化菌体１０の粒径は約２ｍｍとした。次に、多孔質のＳＰＧ製の円筒容器内にこの固定化菌体１０を充填した（充填率約７０％）。これを、循環型のジオール化合物の製造装置８０ａのカラム３０内に収容した。次に、１／２ＹＰＤ改変培地１００ｍＬに原料化合物としてのシンナムアルデヒドを培地に対して０．０５％加え原料溶液とし、リザーバ３２に貯留した。次に、ポンプ３４を稼働させリザーバ３２内の原料溶液を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで３６時間循環した。この循環液を、０時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間後においてサンプリングし、各サンプル液中の生成物の確認とその相対比率の測定を行った。その結果を図４（ｂ）に示す。
【００４６】
図４（ｂ）から、原料化合物は３６時間後にほぼ全て目的化合物に変換され、その変換率は９４％であった。そして、投入した５０ｍｇのシンナムアルデヒド（原料化合物）に対し、６３ｍｇの目的化合物が取得された。尚、副生成物は[実施例１]同様わずかであった。
【００４７】
さらに、［実施例５］の実施後に、リザーバ３２内の原料溶液（生成液を含む）が１００ｍＬになるよう１／２ＹＰＤ改変培地を補充し、さらに原料化合物としてのシンナムアルデヒドを１２５ｍｇ（原料溶液（生成液を含む）に対して０．０５％）添加した。次に、リザーバ３２内の原料溶液を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで２４時間循環した。そして、この循環液を所定の時間間隔でサンプリングし、各サンプル液の生成物の相対比率の測定を行った。その後、この作業を連続して２回（合計３回）行った。その結果、原料溶液の追加投入から約２４時間後で追加投入された原料化合物はほぼ全て目的化合物に変換された。そして、生成液中の目的化合物の濃度は追加投入の分上昇した。
【００４８】
従来の微生物変換においては、原料化合物を一般的に０．０２５％〜０．２％程度しか添加できず目的化合物が高濃度に含有する生成液を取得することは困難であった。しかしながら、本発明に係るジオール化合物の製造方法では、上記のように原料化合物を所定の時間間隔で継続して添加することで目的化合物を高濃度に含有する生成液を取得可能であることが確認された。これにより、精製効率が向上し目的化合物をさらに効率的に取得することが可能となった。
【００４９】
次に、本発明に係るジオール化合物の製造方法の他の実施の形態を図５のフローチャートを用いて説明する。尚、ここで示すジオール化合物の製造方法の他の実施の形態は、アセトアルデヒドを添加した溶液中において目的化合物の変換、生成を行うものである。
【００５０】
本発明に係るジオール化合物の製造方法の他の実施の形態は、先ず、前述の固定化菌体を用いた実施の形態と同様に変換菌の培養を行う（ステップＳ２００：培養工程）。尚、変換菌の培養方法、培養条件、培地等は固定化菌体を用いた実施の形態と同様である。
【００５１】
次に、培養した変換菌と所定の濃度のアセトアルデヒド溶液と原料化合物を含む培地とを混合し、ここで変換菌の培養を行う。このときの、変換菌の培養も基本的に前述の固定化菌体を用いた実施の形態の変換工程と同様である（ステップＳ２０４：変換工程）。この変換工程において、変換菌と原料化合物とは所定の濃度のアセトアルデヒドの存在下で接触する。前述のように変換菌は所定の濃度のアセトアルデヒドの存在下で原料化合物を目的化合物へ高効率で変換する。
【００５２】
次に、生成液と変換菌とを分離する。この変換菌の分離は遠心分離等の周知の分離手法を用いる（ステップＳ２０６：分離工程）。分離された生成液は固定化菌体を用いた実施の形態と同様に目的化合物に対する分離、精製が行われる。
【実施例６】
【００５３】
Ｄ−グルコース５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％のＹＰＤ改変培地２０ｍＬを１００ｍＬの三角フラスコに分注して滅菌した。この培地に変換菌である出芽酵母を植菌し、２８℃で２日間培養を行った。
【００５４】
次に、この培養液を遠心分離して変換菌菌体を沈降させ、これにより得られた変換菌にＤ−グルコース２０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％のＹＰＤ改変培地２０ｍＬと、原料化合物であるシンナムアルデヒド０．１％と、アセトアルデヒド０．００５％〜０．２％を添加した。次に、この溶液中で変換菌を２８℃で２〜３日間培養し、原料化合物の目的化合物への変換を行った。変換後、変換菌を遠心分離により分離し、得られた生成液中の生成物の確認とその相対比率の測定を行った。その結果、アセトアルデヒドの添加量が０．０２５％のときに目的化合物への変換率が８０％以上であることが確認された。
【００５５】
以上のように、本発明に係るジオール化合物の製造方法によれば、微生物変換を用いて目的のジオール化合物を高い変換率で変換、生成することができる。また、固定化菌体を用いた本発明に係るジオール化合物の製造方法によれば、目的のジオール化合物を高い変換率で変換、生成することができることに加え、固定化菌体と生成液とを簡単に分離することができる。また、固定化菌体は再利用が可能であるとともに、原料化合物を適時追加投入することで、目的化合物を高濃度に含有する生成液を得ることができる。特に本発明に係るジオール化合物の製造装置８０ａ、８０ｂによれば、固定化菌体１０を所定のカラム３０に収容し、このカラム３０内に原料溶液を循環もしくは通過させることで目的化合物の変換を連続的且つ効率的に行うことができる。これにより、目的化合物を大量に取得することができる。
【００５６】
尚、本例では目的化合物として（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルの変換、生成を例に説明を行ったが、変換菌及び原料化合物を適宜選択することで、他のジオール化合物の変換、生成も行うことができる。さらに、変換菌、原料化合物を適宜選択することで、旋光性の異なる他のジオール化合物、即ち、（２Ｓ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルにおける（２Ｓ，３Ｓ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ル、（２Ｒ，３Ｓ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ル、（２Ｒ，３Ｒ）−５−フェニル４−ペンテン−２，３−ジオ−ルを選択的に変換、生成することができる。
【００５７】
また、上記のジオール化合物の製造方法及びジオール化合物の製造装置８０ａ、８０ｂは一例であり、培養条件、培地組成、装置構成はこれに限定されるわけではない。さらに、本発明は本発明の要旨を逸脱しない範囲で変更して実施することが可能である。
【符号の説明】
【００５８】
１０    固定化菌体
２０ａ  液送管
３０    カラム
３２    リザーバ
３４    ポンプ
８０ａ、８０ｂ  ジオール化合物の製造装置
【図１】
2015006138.tif 000014
【図２】
2015006138.tif 000015
【図３】
2015006138.tif 000016
【図４】
2015006138.tif 000017
【図５】
2015006138.tif 000018