(57)【要約】      （修正有）【課題】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための組成物、方法およびキットの提供。【解決手段】キャプシドポリペプチド、外皮ポリペプチド及びエンベロープポリペプチドより選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物。最低１種のアジュバント若しくは該アジュバントをコードする核酸を更に含む組成物。【選択図】図１
2015134767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が
最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は被験体に投与された時に該細胞に対する免疫応答を誘発する、
上記方法。
【請求項２】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
製薬学的に許容できる組成物が、被験体におけるＣＭＶと関連する癌を予防若しくは処置するのに十分な予防的若しくは治療的有効量で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
最低１種のＣＭＶ抗原が、キャプシドポリペプチド、外皮ポリペプチドおよびエンベロープポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
最低１種のＣＭＶ抗原が、リンタンパク質ｕｎｉｑｕｅ  ｌｏｎｇ  ８３（ｐｐＵＬ８３；ｐｐ６５として知られる）、糖タンパク質ＵＬ５５（ｇｐＵＬ５５；ｇＢとして知られる）、ＵＬ１２３前初期１（ＩＥ１）タンパク質、ＵＬ１２２  ＩＥ２タンパク質、ＵＬ１１１Ａ（ｍｔｒＩＩとして知られる）、ＵＳ２８、ｐｐＵＬ３２、ｐｐＵＬ６５、ｐｐＵＬ８０ａ、ｐｐＵＬ８２、ｐｐＵＬ９８ａ、ｐｐＵＬ９９、ｇｐＵＬ４（ｇｐ４８として知られる）、ｇｐＵＬ１６、ｇｐＵＬ１８（ＭＨＣとして知られる）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨとして知られる）、ｇｐＵＬ１００、ｇｐＵＬ１１０（ｇＭとして知られる）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬとして知られる）、ｐＵＬ４６、ｐＵＬ４８、ｐＵＬ５６、ｐＵＬ８６（ＭＣＰとして知られる）、糖タンパク質ｕｎｉｑｕｅ  ｓｈｏｒｔ  １０（ｇｐＵＳ１０）、ｇｐＵＳ１１、糖タンパク質複合体ＩＩ（ｇｃＩＩ）、ｇｐ６５およびｇｐ９３よりなる群から選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該最低１種のＣＭＶ抗原が全ＣＭＶ抗原、全不活化ＣＭＶウイルス若しくはそれらの画分である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
製薬学的に許容できる組成物が、最低１種のアジュバント若しくは該アジュバントをコードする核酸をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−αおよびＭ−ＣＳＦよりなる群から選択されるサイトカインである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アジュバントが、フロイントの不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ  ５１）若しくはコリネバクテリウム  グラヌロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）Ｐ４０を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物であって、該製薬学的に許容できる組成物が、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、上記組成物。
【請求項１３】
生理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤をさらに含んでなる、請求項１２に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１２に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１５】
アジュバントがサイトカインである、請求項１４に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１６】
アジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−αおよびＭ−ＣＳＦよりなる群から選択されるサイトカインである、請求項１４に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１７】
アジュバントが、フロイントの不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ  ５１）若しくはコリネバクテリウム  グラヌロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）Ｐ４０を含んでなる、請求項１４に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１８】
予防的若しくは治療的有効量の請求項１２−１７のいずれか１つに記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１９】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が、
有効量の抗原提示細胞、Ｔリンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞およびＴリンパ球は感作有効量の最低１種のＣＭＶ抗原でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作されており、抗原提示細胞、Ｔリンパ球若しくは双方の有効量は該ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、
上記方法。
【請求項２０】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該抗原提示細胞若しくはＴリンパ球が自己である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
抗原提示細胞の作成方法であって、該方法が
最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させることを含んでなり、該抗原提示細胞が該最低１種のＣＭＶ抗原を提示する、
上記方法。
【請求項２３】
最低１種のＣＭＶ抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と接触された抗原提示細胞を含んでなる組成物。
【請求項２４】
リンパ球の作成方法であって、該方法が
ａ）最低１種のＣＭＶ抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と
抗原提示細胞を接触させること；および
ｂ）リンパ球を製造するのに十分な条件下で、段階ａ）の抗原提示細胞とリンパ球を接触させることを含んでなり、該リンパ球はＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能である、
上記方法。
【請求項２５】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リンパ球がＴリンパ球である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なＴリンパ球を製造するのに十分な条件下で抗原提示細胞と接触されたＴリンパ球を含んでなる組成物であって、該抗原提示細胞は、最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と接触されている、上記組成物。
【請求項２８】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
被験体での癌の処置若しくは重症度の低下方法であって、該方法が
請求項２３若しくは２８に記載の組成物の治療的若しくは予防的有効量を被験体に投与すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項３０】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が、
最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸をｅｘ  ｖｉｖｏで負荷された樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は被験体に投与された時にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、
を含んでなる、上記方法。
【請求項３１】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞の処置方法であって、該方法は、治療的若しくは予防的有効量の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与して該被験体での該細胞の増殖若しくは広がりを低減若しくは阻害することを含んでなり、該組成物は
ａ）最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）抗ＣＭＶ抗体；
ｃ）該最低１種のＣＭＶ抗原を提示する抗原提示細胞、該ＣＭＶ抗原に対しプライミングされたリンパ球、若しくは双方；または
ｄ）それらの組合せ
を含んでなる、上記方法。
【請求項３３】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞およびリンパ球は感作有効量の最低１種のＣＭＶ抗原でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作されており、抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方の有効量がＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、
上記方法。
【請求項３５】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方が自己である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞の処置方法であって、該方法が、有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞は、最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下で該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触されており、該リンパ球が、該最低１種のＣＭＶ抗原を提示する抗原提示細胞と接触されている、上記方法。
【請求項３８】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
リンパ球がＴリンパ球である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が、
抗ＣＭＶ抗体を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項４１】
細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体が毒性部分に結合され、それにより該抗体が細胞傷害性容量の該毒性部分を細胞に効果的に送達する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
毒性部分が放射性同位元素であり、それにより抗体が細胞傷害性線量を微粒子放射線として細胞に効果的に送達する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を含んでなるキットであって、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、上記キット。
【請求項４５】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
化学療法剤をさらに含んでなる、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることをさらに含んでなる請求項１、１９、３０、３２、３４、３７、４０のいずれか１つに記載の方法であって、増幅することは第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低
一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満である、上記方法。
【請求項４８】
アンプリコンが長さ２００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
増幅する段階が、検出可能な標識を含んでなる核酸プローブを提供することをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
第一のプライマーが配列番号６７に示されるところの第一のプライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号６８に示されるところの第二のプライマー配列を含んでなり、プローブが配列番号６９に示されるところのプローブ配列を有する、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交差引用
本出願は、３５  ＵＳＣ  §１１９の下で、２００８年６月２０日に出願された米国仮出願第６１／０７４，５８２号明細書（そっくりそのまま引用することより本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の利権
米国政府は、国立保健研究所、国立癌研究所、および国立神経疾患・卒中研究所（Ｎａｔｉｏａｎｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ）からの助成金（脳癌におけるＮＩＮＤＳ  ＳＰＯＲＥ（ＮＩＮＤＳ  ＳＰＯＲＥ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）Ｐ５０−ＣＡ１−０８７６；ＮＣＩ悪性神経膠腫の樹状細胞免疫療法（ＮＣＩ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａ）Ｒ０１  ＣＡ  ９７２２２）を介して本出願にある種の利権を有する。
【０００３】
本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための組成物、方法およびキットに関する。本発明はまた、ＣＭＶを測定するための方法、組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００４】
癌の処置方法は化学療法剤、放射線治療および外科手術の使用を包含する。多数の腫瘍抗原の同定が細胞に基づく治療の開発での試みにつながった。いくつかの方法は、腫瘍抗原、すなわち非腫瘍細胞に関して腫瘍細胞で優先的に発現されるポリペプチドを最初に同定することに頼っている。例えば、数種のヒト腫瘍抗原が黒色腫患者から単離され、同定されかつ特徴付けられている。
【０００５】
ＣＭＶはβ−ヘルペスウイルスである。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）はヒト集団で固有であり、また、該ウイルスは免疫無防備状態宿主でを除き通常は臨床的疾患を引き起こさないことが報告されている。数種のヒトヘルペスウイルスがリンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌およびカポジ肉腫を包含する多数のヒト悪性病変に関与している。最近、無傷のウイルスのＨＣＭＶ抗原の発現および検出が数種の腫瘍で起こることが報告された。
【０００６】
外科手術、放射線照射および化学療法を包含する攻撃的な多様式治療にもかかわらず、癌を伴う患者の予後は比較的不良なままである。さらに、癌に対する慣習的治療の非特異的な性質は、しばしば、周囲の正常および全身の組織に対する無能力にする損傷をもたらす。従って、癌細胞を標的とする有効な診断ならびに治療および予防戦略の開発に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
［発明の要約］
一局面において、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する。該方法は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する。
【０００８】
別の局面において，本発明は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原
をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を提供し、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
【０００９】
いくつかの局面において、予防的若しくは治療的有効量の製薬学的組成物が本発明により提供され、該製薬学的に許容できる組成物は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
【００１０】
他の局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は
有効量の抗原提示細胞、Ｔリンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することであって、該抗原提示細胞およびＴリンパ球は、感作有効量（ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）の最低１種のＣＭＶ抗原でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作されており、抗原提示細胞、Ｔリンパ球若しくは双方の有効量は、該ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、
を含んでなる。
【００１１】
一局面において、本発明は抗原提示細胞の作成方法を提供し、該方法は、最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させることを含んでなり、該抗原提示細胞が該最低１種のＣＭＶ抗原を提示する。
【００１２】
なおさらなる一局面において、本発明は、最低１種のＣＭＶ抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と接触された抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。
【００１３】
いくつかの局面において、本発明はリンパ球の作成方法を提供し、該方法は、
ａ）最低１種のＣＭＶ抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させること；および
ｂ）リンパ球を産生するのに十分な条件下で段階ａ）の抗原提示細胞とリンパ球を接触させることであって、該リンパ球はＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能である、
を含んでなる。
【００１４】
他の局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なＴリンパ球を産生するのに十分な条件下で抗原提示細胞と接触されたＴリンパ球を含んでなる組成物を提供し、該抗原提示細胞は、最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と接触されている。
【００１５】
一局面において、被験体における癌の処置方法若しくはその重症度の低減方法が本発明により提供される。該方法は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なＴリンパ球を産生するのに十分な条件下で抗原提示細胞と接触されたＴリンパ球を含んでなる組成物の治療的若しくは予防的有効量を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞は、最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と接触されている。
【００１６】
別の局面において、本発明はＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する。該方法は、
最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸をｅｘ  ｖｉｖｏで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することであって、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、
を含んでなる。
【００１７】
いくつかの局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞の処置方法を提供し、該方法は、被験体における細胞の増殖若しくは広がりを低減若しくは阻害するために治療的若しくは予防的有効量の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該組成物は、
ａ）最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）抗ＣＭＶ抗体；
ｃ）最低１種のＣＭＶ抗原を提示する抗原提示細胞、該ＣＭＶ抗原に対しプライミングされたリンパ球、若しくは双方；または
ｄ）それらの組合せ
を含んでなる。
【００１８】
他の局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することであって、該抗原提示細胞およびリンパ球は、感作有効量の最低１種のＣＭＶ抗原でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作されており、抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方の有効量は、該ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、
を含んでなる。
【００１９】
一局面において、本発明はＣＭＶ抗原を発現する細胞の処置方法を提供し、該方法は、有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞は、最低１種のＣＭＶ抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下で、該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触されており、該リンパ球は、該最低１種のＣＭＶ抗原を提示する抗原提示細胞と接触されている。
【００２０】
別の局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
抗ＣＭＶ抗体を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与すること
を含んでなる。
【００２１】
多様な他の局面において、本発明は、被験体中のＣＭＶ核酸、好ましくは血液若しくは他の生物学的液体中のＣＭＶ  ＤＮＡを測定する、例えば被験体から得られる血液のサンプル中の無症候性ウイルス血症を決定するための組成物および方法を提供する。従って、該組成物および方法は、例えば、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症する素因となる細胞型と関連する疾患若しくは状態の予防的かつ／若しくは治療的処置のような、本明細書に記述される方法を包含する多様な診断および／若しくは治療処置（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）および処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を補完する診断、モニタリングおよび予後試験／アッセイを提供する。
【００２２】
他の局面において、本発明は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を含んでなるキットを提供し、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（Ａ）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）タンパク質の免疫組織化学的検出を示し：（ａ）陰性対照（一次抗体なし；対物レンズ１０倍）；（ｂ）抗平滑筋アクチン（マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ；１０倍）；（ｃ）抗ＨＣＭＶ  ＩＥ１（マウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ、１０倍）で染色された多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）試料１；（ｄ）抗ＩＥ１染色のより高倍率は、陽性の腫瘍細胞および内皮細胞しかし陰性のリンパ球および血管内膜を示す（２０倍）；（ｅ）血管周囲腫瘍細胞の染色しかし壊死領域の検出の欠如を示す抗ＨＣＭＶ  ＩＥ１で染色されたＧＢＭ試料２（１０倍）；（ｆ）抗ＩＥ１  ｍＡｂで染色された血管周囲腫瘍細胞（２０倍）；（ｇおよびｈ）ＧＢＭ試料全体に散乱した腫瘍細胞の核および核周囲染色を示す、抗ＨＣＭＶ  ｐｐ６５  ｍＡｂで染色されたＧＢＭ試料３（それぞれ１０倍および２０倍）；（ｉおよびｊ）抗平滑筋アクチンｍＡｂで染色されたＣＭＶに感染した肺（１０倍）；（ｋ）抗ＨＣＶ  ＩＥ１で染色されたＣＭＶに感染した肺（２０倍）；（ｌ）抗ＨＣＭＶ  ｐｐ６５  ｍＡｂで染色されたＣＭＶに感染した肺（２０倍）；ならびに（Ｂ）一致させたＧＢＭおよび正常脳中のＨＣＭＶ検出。正常脳および腫瘍の領域を含有する２種のＧＢＭ試料からの代表的組織化学的切片を、アイソタイプ対照抗体（患者１、左列）若しくは抗ＨＣＭＶ  ｐｐ６５（患者１腫瘍、中列；患者２、右列）を使用して検出のため染色した。ＨＣＭＶ  ｐｐ６５抗体に対する反応性の中心領域が腫瘍に関与する領域全体で観察されたが、しかし正常脳はＨＣＭＶ特異的抗体に対する免疫反応性を欠いた（ＩＥ１染色は腫瘍中のＩＥ１のより偏在性検出（示されない）と同一の知見を示した）。全部の写真は４０倍対物拡大で撮影した。
【図２】悪性神経膠腫試料中のＨＣＭＶのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検出を示す。レーン１：１００ｂｐラダー、レーン２−Ｅ：ＭＧ試料；レーン４：ＭＧサンプル４＋１００ｂｐラダー；レーンＦ：陰性対照（ＤＮＡ鋳型なし）。
【図３】ＣＭＶについて血清陽性および血清陰性である被験体での自己リンパ球移植（ＡＬＴ）を伴う若しくは伴わない治療的ＴＭＺ誘発性リンパ球減少症からの回復の間のＣＭＶ  ｐｐ６５−ＬＡＭＰ  ＲＮＡを負荷したＤＣを使用する新たに診断されたＧＢＭを伴う被験体のワクチン接種プロトコルの図解を示す。
【図４】ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣで処置した新たに診断されたＧＢＭを伴う患者の腫瘍増殖停止期間を示すグラフである。ＧＢＭを伴う１３例の患者を、ＣＭＶ  ｐｐ６５を標的とするＤＣワクチンで処置した。腫瘍増殖停止期間は既存対照被験者と比較して好都合である（Ｐ＝０．０００８）。
【図５】ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣワクチンで処置したＧＢＭを伴う患者の全体生存を示すグラフである。
【図６】ＧＢＭを伴う３３歳女性被験体のｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣワクチン接種の間のほぼ完全なＸ線検査応答を示す磁気共鳴画像（ＭＲＩ）である。
【図７】ＣＭＶ  ｐｐ６５に対する多機能Ｔ細胞応答の分析を示す。ＣＭＶ血清陽性ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド混合物でｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、そしてＨＩＶワクチン試験ネットワークの免疫学的モニタリング中央検査室（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）で、検証済みの１１色多色フローサイトメトリー分析を使用して分析した。機能的およびブール型ゲーティングソフトウェアを使用して多機能Ｔ細胞（複数のサイトカインを分泌しかつグランザイム活性化マーカーＣＤ１０７ａを表示する）の比率を決定した。多機能免疫応答は、ＨＩＶ感染を伴う進行者（ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒ）を非進行者（ｎｏｎ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒ）から識別することが示されており、また、特定の１サイトカインを分泌する細胞の絶対数若しくはパーセンテージよりもウイルス感染の免疫保護とより良好に相関した。
【図８】ｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己樹状細胞を用いるワクチン接種を受領する新たに診断されたＧＢＭを伴う患者でのｐｐ６５抗体応答の増大を示すグラフである。左の図は、組換えｐｐ６５タンパク質で被覆されたビーズへのｐｐ６５特異的モノクローナル抗体の標準曲線結合を示す。右図は、組換えｐｐ６５で被覆されたビーズへの患者の血清の希釈中に存在する抗体の特異的結合を示す。ワクチン前血清は、低力価のｐｐ６５特異的抗体、およびワクチン＃５で増大する力価（抗ヒトＩｇＧ蛍光抗体での検出後の平均倍数増大（ｍｅａｎ  ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）（ＭＦＩ）として示される）、ならびにワクチン＃９によるさらなる増大を含有する。さらに、これらの応答はテモゾロミドの周期の間に誘導され、同時の化学療法投与の間の強力な体液性応答を誘発する能力を示す。
【図９】ｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己樹状細胞でのワクチン接種を受領する新たに診断されたＧＢＭを伴う患者での遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答の増大を示す棒グラフである。ｐｐ６５および対照抗原（破傷風およびカンジダ）に対しワクチン接種前および後に陽性のＤＴＨ応答（１０ｍｍ2以上）を示す患者の比率を左に示し；ならびに、ワクチン接種の前および後の皮膚紅斑の面積を右に示す。さらに、これらの応答はテモゾロミドの周期の間に誘発され、同時の化学療法投与の間の細胞性ＤＴＨ応答を誘発する能力を示す。
【図１０】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）プロファイルである。ＰＢＭＣからの非接着細胞を、抗ＣＤ３被覆プレートを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで７２時間刺激し、そして収集し、洗浄し、そして下の実施例１０および１１に記述されるとおり緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）若しくはＣＸＣケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）をコードするＲＮＡ（１０6細胞あたり２μｇのＲＮＡ）で電気穿孔した。細胞を培地（ＡＩＭ−Ｖ培地、２％ＡＢ血清、ｈＩＬ−２［１００Ｕ／ｍｌ］）中で４８時間培養し、洗浄し、そしてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＣＸＣＲ２特異的モノクローナル抗体の投与およびフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現およびＣＸＣＲ２について分析した。上：ＧＦＰ（上左）およびＣＸＣＲ２（上右）の未トランスフェクトＴ細胞発現。下：ＧＦＰ  ＲＮＡでの電気穿孔後のＧＦＰ発現（下左）およびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでの電気穿孔後のＣＸＣＲ２発現（下右）。本実験は類似の結果を伴い２回反復した。
【図１１】ＦＡＣＳプロファイルである。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ｐｐ６５ペプチド（Ｎ９Ｖ）でパルスした自己ＤＣで７日間刺激し、収集し、そしてＧＦＰ  ＲＮＡで電気穿孔した。４８時間後にＧＦＰ発現をＮ９Ｖ四量体陽性およびＮ９Ｖ四量体陰性ＣＤ８＋  Ｔ細胞で検査した。左：芽球様リンパ球（Ｒ１；上）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｒ２；下）上でのゲーティング。中：対照ＲＮＡ（ＣＸＣＲ２）でトランスフェクトした細胞でのＧＦＰ発現なし。右：四量体染色（リンパ球（Ｒ１）およびＣＤ８＋細胞（Ｒ２）でゲートされる）（下右）により示されるところのｐｐ６５特異的Ｔ細胞からほぼ完全になる、２４．５７％のＣＤ８＋  Ｔ細胞でのＧＦＰ発現（上右）。
【図１２】ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージおよびＦＡＣＳプロファイルを示すグラフである。（Ａ）ＤＣで刺激されたＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞でのＧＦＰ発現のキネティクス。ＰＢＭＣを、下の実施例１０および１１に記述されるところのｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己ＤＣでｉｎ  ｖｉｔｒｏで１１日間刺激した。細胞を収集しかつＧＦＰ  ＲＮＡ（２μｇ／１０６細胞）でトランスフェクトした。四量体陽性（ＨＬＡ−Ａ２Ｂ）および四量体陰性細胞でのＧＦＰ発現を、電気穿孔２４時間後に開始して評価しかつ電気穿孔後第７日までモニターした。（Ｂ）分取したＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の増殖。ＰＢＭＣは材料および方法に記述されるとおりｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己ＤＣでｉｎ  ｖｉｔｒｏで１１日間刺激した。細胞を収集しかつＧＦＰ  ＲＮＡ（２μｇ／１０6細胞）でトランスフェクトした。４８時間後に細胞をＧＦＰ発現（ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−）に基づきフローサイトメトリーにより分取し、そして高用量のＩＬ−２を含む培地に戻し入れた。細胞の増殖をトリパンブルー染色および３〜４日ごとの細胞のアリコートの計数により評価した。本実験を別のドナーからのＰＢＭＣを用いて反復し、類似の結果を伴った。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ７拘束性ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の四量体分析。四量体の一団を使用して、四量体により検出可能なｐｐ６５に対する１種類以上のハプロタイプ拘束性Ｔ細胞反応性を伴う患者を同定した。左：ＧＦＰ−画分中のＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ７  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の頻度。右：ＧＦＰ画分中の四量体陽性細胞の頻度。（Ｄ）ＲＮＡ電気穿孔によるＣＭＶ抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の単離。ｐｐ６５  ＲＮＡでパルスしたＤＣで刺激したＰＢＭＣを前述されたとおり生成し、そしてＤＣ刺激後第１１日にＧＦＰ  ＲＮＡで電気穿孔した。細胞をＧＦＰ＋およびＧＦＰ−画分に分取し、そして４８時間後に抗原なし、ＳＥＢ（１Ｂｇ／ｍｌ）若しくはＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド混合物（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）への曝露後のＩＦＮ−Ｂ産生について細胞内サイトカインフローサイトメトリーにより分析した。左：ＧＦＰ−ＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＩＦＮ−Ｂの発現。右：ＧＦＰ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＩＦＮ−Ｂ。
【図１３】ＦＡＣＳプロファイルである。ＲＮＡ電気穿孔後のｐｐ６５特異的Ｔ細胞中のＣＸＣＲ２の選択的発現。ＰＢＭＣを、実施例１０および１１に記述されるとおりｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己ＤＣでｉｎ  ｖｉｔｒｏで１１日間刺激した。細胞を収集しかつＣＸＣＲ２  ＲＮＡ（２μｇ／１０6細胞）でトランスフェクトした。４８時間後に細胞を収集し、そして四量体陽性（ＨＬＡ−Ａ２拘束性ドナー）および四量体陰性ＣＤ８＋細胞でのＣＸＣＲ２発現について分析した。ＣＸＣＲ２の活性化されたＣＤ８＋  Ｔ細胞中の基礎発現はおよそ１０％であった（データは示されない）。結果は、ＲＮＡ電気穿孔が、四量体陽性細胞の４９．１％での発現を伴い、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のみで増大されたＣＸＣＲ２発現をもたらした一方、基礎を上回る発現の増大はＤＣ刺激後四量体陰性細胞で観察されなかったことを示した。
【図１４】グラフである。（Ａ）ＣＸＣＲ２およびＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞のＩＬ−８へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性。ＰＢＭＣを、実施例１０および１１に記述されるとおり固定した抗ＣＤ３抗体媒介性刺激を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化した。細胞を収集しかつＣＸＣＲ２若しくはＧＦＰ  ＲＮＡ（２μｇ／１０6細胞）でトランスフェクトした。４８時間後に細胞を収集し、計数し、そして実施例１０および１１に記述されるとおりフィルターチャンバー培養プレートに三重で入れた。増大する濃度のＩＬ−８に応答しての未トランスフェクト、ＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクト、およびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の移動を、下チャンバー中の示される濃度のＩＬ−８の存在下で４５分の培養後に評価した。結果は、未トランスフェクトおよびＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞に比較してのＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の高められた走化性応答を示した（＊ｐ＜０．０５；ｔ検定）。本実験を数回反復し同一の結果を伴った。（Ｂ）ＣＸＣＲ２およびＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞のＧＲＯ−αへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性。細胞は、フィルターチャンバープレートの下チャンバー中の増大する濃度のＧＲＯ−αに対して上述されたとおりアッセイした。ＣＸＣＲ２でトランスフェクトしたＴ細胞はＧＲＯ−αに応答して有意に増大された走化性活性を表した一方、ＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクト、および未トランスフェクトのＴ細胞はＧＲＯ−αに応答しての移動の有意の変化を示さなかった（＊ｐ＜０．０５；ｔ検定）。（Ｃ）ＣＸＣＲ２およびＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞のＵＬ１４６へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性。細胞は、フィルターチャンバープレートの下チャンバー中の増大する濃度のＣＭＶに分泌されるケモカインＵＬ１４６に対して上述されたとおりアッセイした。ＣＸＣＲ２でトランスフェクトしたＴ細胞はＵＬ１４６に応答して顕著に増大された走化性活性を表した一方、ＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクト、および未トランスフェクトのＴ細胞はＵＬ１４６に応答しての移動の変化を示さなかった（＊＊ｐ＜０．０１；ｔ検定）。
【図１５】グラフおよびＦＡＣＳプロファイルである。（Ａ）ＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の腹腔中への移動。ＰＢＭＣを、下の実施例１０および１１に記述されるとおりｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己ＤＣでｉｎ  ｖｉｔｒｏで１１日間刺激した。細胞を収集しかつＣＸＣＲ２  ＲＮＡ（２Ｂｇ／１０６細胞）でトランスフェクトした。４８時間後に、未トランスフェクトおよびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞を収集し、そしてＣＦＳＥ（未トランスフェクト細胞について１μＭ、およびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞について１０ＢＭ）でＰＢＳ中５分間示差的に標識し、洗浄し、混合し、そしてＳＣＩＤマウスに静脈内注入した（マウスあたり２×１０7細胞、群あたりｎ＝３）。マウスに、ＰＢＳのみ、若しくはＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのケモカイン（ＧＲＯ−α、ＩＬ−８若しくはＵＬ１４６）を、Ｔ細胞の注入後２４時間、８時間ごとに腹腔内注入した。殺した後に腹腔洗浄によりリンパ球を収集しかつ遠心分離し、そして未トランスフェクトおよびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞の相対的蓄積をフローサイトメトリー分析により評価した。ＰＢＳ処置動物のＣＦＳＥhigh細胞（ＣＸＣ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞）およびＣＦＳＥlow細胞（未トランスフェクトＴ細胞）の蓄積を、サイトカイン処置動物の細胞の蓄積との比較のための基礎として使用した。データはＰＢＳ処置動物と比較しての倍数変化として表す。（Ｂ）ＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞のＣＮＳへの移動。ＰＢＭＣは、実施例１０および１１に記述されるとおりｐｐ６５  ｍＲＮＡでパルスした自己ＤＣでｉｎ  ｖｉｔｒｏで１１日間刺激した。細胞を収集しかつＣＸＣＲ２  ＲＮＡ（２μｇ／１０6細胞）でトランスフェクトした。４８時間後に、未トランスフェクト、およびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞を収集しかつＣＦＳＥ（５μＭ）でＰＢＳ中５分間標識し、洗浄し、そしてＳＣＩＤマウスに静脈内注入した（マウスあたり１×１０7細胞、群あたりｎ＝３）。麻酔したマウスにその後、右頭頂葉を介してＣＭＶのケモカインＵＬ１４６（５μｌ  ＰＢＳ中１μｇ）を、および左頭頂葉を介してＰＢＳのみを注入した。右および左頭頂葉でのＣＦＳＥ標識細胞の蓄積を６時間後に大脳半球の切開および頭頂葉からの単細胞消化調製後にフローサイトメトリーにより評価した。ＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞を注入したマウスの代表的フローサイトメトリードットプロットは、ＣＸＣＲ２リガンドＵＬ１４６を注入した右頭頂葉内のリンパ球のより多い蓄積を示す。（Ｃ）ＣＸＣＲ２でトランスフェクトしたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ移動。右（ＵＬ１４６注入）および左（ＰＢＳ注入）頭頂葉内のＴ細胞の蓄積をフローサイトメトリーにより評価し、そして１００，０００事象あたりのヒトＴ細胞をプロットした。結果は、ＵＬ１４６に応答してのＣＮＳ内のＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の有意の蓄積を示した一方、未トランスフェクトＴ細胞はいかなる優先的蓄積も表さなかった（＊ｐ＜０．０５；ｔ検定）。
【図１６】ＧＢＭを伴う患者の末梢血および腫瘍からのＣＭＶ  ｇＢ（ＵＬ５５）ＤＮＡの増幅を示す電気泳動ゲルである。Ａ：レーン１：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーン２−１２：腫瘍の初回切除時点で採取された新たに診断されたＧＢＭを伴う１１例の患者からの末梢血サンプルは、１１例の患者のうち６例でウイルスＤＮＡの強い検出、および１１例の患者のうち３例で適切な大きさの弱いバンドを示す。Ｂ：レーン１：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーン２−Ｆ：高悪性度星状細胞腫を伴う１４例の患者（１１例ＧＢＭ、３例ＡＡ）からのＧＢＭ腫瘍サンプルは、１４例の患者のうち１１例で適切な大きさの明瞭なバンドを示す。レーン４は、増幅されたバンドとの整列のため１００ｂｐ  ＤＮＡラダーをサンプルと混合している。
【図１７】ＧＢＭ患者血清からのＨＣＭＶ  ｇｐ６４リアルタイムＰＣＲの融解曲線グラフである。
【図１８】ＧＢＭ患者血清からのＨＣＭＶ  ｇｐ６４リアルタイムＰＣＲのＰＣＲ増幅周期グラフである。
【図１９】配列相同性を示す。２２種の新たに切除したＧＢＭ試料からの増幅されたｇＢ（ＵＬ５５）ＤＮＡを、デュークＤＮＡ配列決定中核施設（Ｄｕｋｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施されたＤＮＡ配列決定により評価した。配列アライメントはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して実施した。同定されたＣＭＶ株に対する相同性をＮＣＢＩ  ＤＮＡデータベースのＢＬＡＳＴにより評価した。サンプル間の配列変動の領域を青色で示し、ヌクレオチドの差違を白色で強調している。黄色は全２２種の試料全体の保存された同一性を示す。白色および青色は配列変動の領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［発明の詳細な記述］
発明者は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞を、例えばワクチンを必要とする免疫療法を包含するＣＭＶ特異的免疫学的技術を使用して標的とし得ることを発見した。本発明は、限定されるものでないがＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する診断薬および治療薬のための組成物、方法およびキットの開発に応用可能である。
【００２５】
Ｉ．定義
「免疫応答」という用語は、本明細書で、抗原若しくは抗原決定基に対する免疫系によるいかなる応答も指す。例示的免疫応答は、体液性免疫応答（例えば抗原特異的抗体（中和若しくは別のもの）の産生）および細胞媒介性免疫応答（例えばリンパ球増殖）を包含する。
【００２６】
ＩＩ．方法および組成物
一局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する。該方法は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を該被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する。
【００２７】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞はいかなる種類の細胞でもあり得る。該細胞は、癌細胞、前癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発生する素因となる細胞型を特徴とすることができる。癌は、限定されるものでないが脳癌（例えば神経膠腫）、肺癌、肝癌、子宮頚癌、軟組織肉腫、内分泌腫瘍、造血癌、黒色腫、膀胱癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸癌および卵巣癌を挙げることができる。癌は良性若しくは悪性もまた特徴とし得る。一態様において、癌は高悪性度神経膠腫である。別の態様において、高悪性度神経膠腫は多形神経膠芽腫、未分化星状細胞腫若しくは乏突起神経膠腫である。
【００２８】
一般に、免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答若しくは双方を包含し得る。例えば、ＭＨＣ  ＩＩタンパク質が関わる免疫学的経路若しくは直接Ｂ細胞刺激による抗原提示は体液性応答を生じ得；また、ＭＨＣ  Ｉタンパク質が関わる経路により提示される抗原は免疫系の細胞アームを誘導し得る。
【００２９】
体液性応答は、製薬学的に許容できる組成物を受領する被験体からの血清サンプル中の抗体レベルの標準的イムノアッセイにより測定し得る。細胞性免疫応答はＴ細胞が関わる応答であり、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで測定し得る。例えば、一般的細胞性免疫応答は、製薬学的に許容できる組成物の投与後適切な時点で被験体からサンプリングした細胞（例えば末梢血白血球（ＰＢＬ））中のＴ細胞増殖活性として測定し得る。例えばＰＢＭＣの刺激物質との適切な時間のインキュベーション後に［3Ｈ］チミジン取り込みを測定し得る。増殖しているＴ細胞のサブセットはフローサイトメトリーを使用して測定し得る。Ｔ細胞の細胞傷害性（ＣＴｈ）もまた測定し得る。
【００３０】
一態様において、誘発される免疫応答は、腫瘍性疾患若しくはそれに伴う症状、具体的にはＣＭＶに関連する癌の予防的若しくは治療的処置に十分である。従って、製薬学的に許容できる組成物の有益な影響は、一般に少なくとも部分的に免疫媒介性であることがで
きるとは言え、免疫応答は、本明細書に記述される組成物および方法が本発明の範囲内にあるために確実に示される必要はない。
【００３１】
ヒトおよびヒト以外の脊椎動物の双方に投与することを本発明の範囲内で企図している。獣医学の応用もまた企図している。一般に、被験体は免疫応答を誘発し得るいかなる生存生物体でもある。被験体の例は、限定されるものでないが、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を挙げることができる。
【００３２】
被験体は腫瘍性疾患（例えば腫瘍）を有し得るか、若しくは腫瘍性疾患を発症する危険にさらされていることができるかのいずれかである。被験体は、臨床基準、例えば臨床で測定可能な腫瘍を表す進行腫瘍性疾患若しくは高腫瘍負荷を伴うものを特徴とし得る。臨床で測定可能な腫瘍は（例えば触診、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、Ｘ線により）腫瘍体積に基づき検出し得るものである。従って、例えば、本発明の製薬学的に許容できる組成物は、それらの状態を緩和するという目的を伴い進行疾患を伴う被験体に投与し得る。好ましくは、腫瘍体積の減少は本発明の製薬学的に許容できる組成物を投与することの結果として発生するが、しかしいかなる臨床的改善も利益を構成する。臨床的改善は、例えば低下された危険性若しくは進行速度、または腫瘍の病理学的意義の低下を包含する。
【００３３】
別の例として、被験体は、癌の病歴を有しかつ別の治療様式に応答性であったものであり得る。該他の治療は、例えば外科的切除、放射線治療、化学療法、およびそれにより該他の治療の結果として被験体が臨床で測定可能な腫瘍を呈しない他の様式の免疫療法を包含していたかもしれない。しかしながら、該被験体は元の腫瘍部位の近くで若しくは転移によるかのいずれかで癌の再発若しくは進行の危険にさらされていることが決定されるものであり得る。こうした被験体は高リスクおよび低リスク被験体とさらに分類し得る。該細分は初期治療の前若しくは後に観察される特徴に基づき行い得る。これらの特徴は臨床の技術分野で既知であり、そして各異なる癌について適して定義されている。高リスクサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織に侵襲したか若しくはリンパ節の関与を示すものである。従って、例えば、本発明の製薬学的に許容できる組成物は、主に再発に対する予防的措置として抗癌応答を誘発するため被験者に投与し得る。好ましくは、該組成物を投与することは癌の再発を遅らせるか、若しくは、より好ましくは再発のリスクを低減する（すなわち治癒率を向上させる）。こうしたパラメータは他の患者集団および他の治療様式と比較して決定し得る。
【００３４】
該製薬学的に許容できる組成物は適切であるいずれの時点でも投与し得る。例えば、該投与することは、腫瘍負荷を有する被験体の伝統的治療の前若しくは間に実施し得、そして該腫瘍が臨床で検出不可能になった後に継続し得る。該投与することは再発の徴候を示す被験体でもまた継続し得る。
【００３５】
該製薬学的に許容できる組成物は、治療的若しくは予防的有効量で投与し得、該製薬学的に許容できる組成物は、単独でまたは１種若しくはそれ以上の他の抗原と組合せのいずれかで最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる。本発明の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することは、既知の手順を使用して、および所望の効果を達成するのに十分な投薬量でかつ時間実施し得る。例えば、該製薬学的に許容できる組成物の治療的若しくは予防的有効量は、被験体の齢、性および重量のような因子に従って変動し得る。投与計画は、治療若しくは予防効果を提供する免疫応答を包含する所望の免疫応答を誘発するように当業者により調節し得る。
【００３６】
該製薬学的に許容できる組成物は、いずれかの適する部位、例えば原発腫瘍に遠位若しくは近位である部位で被験体に投与し得る。投与経路は、非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻内、静脈内（留置カテーテルを介してを包含する）、輸入リンパ管を介して、
若しくは処置される腫瘍性疾患および被験体の状態を鑑みて適するいずれかの他の経路によることができる。好ましくは、用量は、それが免疫応答または腫瘍性疾患および／若しくはそれに伴う症状の予防的若しくは治療的処置を誘発する場合は、所望の応答をもたらす際に有効な量および時間で投与することができる。
【００３７】
該製薬学的に許容できる組成物は、被験体で免疫応答をまた誘発する治療を包含する他の治療の後、それに先行して、若しくはそれと同時期に与えることができる。例えば、被験体は、化学療法（例えばテモゾロミドのようなアルキル化剤により）、放射線治療、および他の形態の免疫療法により事前に若しくは同時に処置してもよく、こうした他の治療は、好ましくは、本発明の組成物の免疫原性を妨害しないような方法で提供される。
【００３８】
投与することは、医療提供者（例えば医師、獣医師）により適正に時刻を設定することができ、そして、被験体の臨床状態、投与することの目的、および／またはまた企図している若しくは投与されている他の治療に依存し得る。いくつかの態様において、初回用量を投与し得、そして被験体を免疫学的若しくは臨床いずれかの応答、好ましくは双方についてモニターし得る。免疫学的モニタリングの適する手段は、レスポンダーとして患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および刺激物質として腫瘍細胞を使用することを包含する。免疫学的反応は投与の部位の遅延性炎症反応によってもまた決定し得る。初回用量後の１若しくはそれ以上の用量を、所望の効果が達成されるまで適切なように、典型的には月１回、月２回、若しくは好ましくは週１回与えることができる。その後、付加的な追加免疫若しくは維持用量を、必要とされるとおり、具体的には免疫学的若しくは臨床的利益が低下したようである場合に与えることができる。
【００３９】
Ａ．ＣＭＶ抗原
一態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原は、ＣＭＶ遺伝子によりコードされるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントである。上で示されたとおり、本明細書で使用されるところの「ＣＭＶ」という用語は、動物、例えばヒトおよびサルのような哺乳動物を感染させるウイルスのいかなる株も包含する。ヒトを感染させるＣＭＶの株は典型的にヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）と呼称される。ＨＣＭＶからのＯＲＦおよび／若しくはそれらの対応するポリペプチドは、例えばＣｈｅｅら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：１２５（１９９０）およびＳｐａｅｔｅら、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：３２８７（１９９４）（それらのそれぞれはこうしたポリペプチドおよびそれらの命名法のそれらの教示について引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されるところの命名法を使用して言及することができる。ＣＭＶからのこうしたリーディングフレームおよびポリペプチドへの言及は、いずれかの天然に存在するＣＭＶ株中の配列、およびこうした株に対する突然変異ならびにスプライスバリアントを包含する多様な株で見出される対応する配列および位置ホモログ（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ）もまた言及することができる。
【００４０】
限定されるものでないが、ＨＣＭＶ  ＡＤ１６９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）＃  ＶＲ  ５３８）、ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ  ９７７）、ＨＣＭＶ  Ｄａｖｉｓ（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ  ８０７）、ＨＣＭＶ  Ｔｏｌｅｄｏ（Ｑｕｉｎｎａｎら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１０１：４７８−８３（１９８４））、サルＣＭＶ  Ｒｈ６８．１（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ  ６７７）、サルＣＭＶ  ＣＳＧ（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ  ７０６）、ラットＣＭＶ  Ｐｒｉｓｃｏｔｔ（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ  ９９１）、およびマウスＣＭＶ  Ｓｍｉｔｈ（ＡＴＣＣ＃  ＶＲ  １３９９）を挙げることができる多様な株のＣＭＶの遺伝子配列ならびにＯＲＦおよびコードされるポリペプチドが当該技術分野で既知である。別の一例として、ＨＣＭＶ
ＡＤ１６９株の遺伝子およびポリペプチド配列情報はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＫ０００３９４．２およびＸ１７４０３．１（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用するこ
とにより本明細書に組み込まれる）によってもまた記述されている。また、１種のＣＭＶ株（例えばＨＣＭＶ  ＡＤ１６９株）に対応する既知の配列情報を使用して、別のＣＭＶ株の遺伝子およびポリペプチドの配列情報を決定し得る。例えば、共通の進化起源、構造／機能を共有しかつその産物が最低約２０％のアミノ酸配列同一性、具体的には約２０ないし約１００％、約３０ないし約９０％、約４０ないし約８０％、約５０ないし約７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を包含するホモログを決定し得る。ホモログは、ＢＬＡＳＴのようなコンピュータプログラムを使用する相互との核酸若しくはアミノ酸配列の比較のような当該技術分野で既知の方法により、または配列間の予め決定された量のミスマッチを検出するよう設計されている緊縮性下のハイブリダイゼーションにより同定し得る。また、ホモログに基づく配列情報を、特定の１単離物を単離しかつ例えばプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してその配列を特徴付けるのに使用し得る。
【００４１】
いくつかの態様において、最低１種のＣＭＶ抗原は、ＨＣＭＶ遺伝子若しくはそのホモログのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントである。一態様において、該ポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントは、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＫ０００３９４．２若しくはＸ１７４０３．１により示されるＣＭＶ株に対応する遺伝子によりコードされる。
【００４２】
他の態様において、最低１種のＣＭＶ抗原は、リンタンパク質ｕｎｉｑｕｅ  ｌｏｎｇ
８３（ｐｐＵＬ８３；ｐｐ６５として知られる）、糖タンパク質ＵＬ５５（ｇｐＵＬ５５；ｇＢとして知られる）、ＵＬ１２３前初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）１（ＩＥ１）タンパク質、ＵＬ１２２  ＩＥ２タンパク質、ＵＬ１１１Ａ（ｍｔｒＩＩとして知られる）、ＵＳ２８、ｐｐＵＬ３２、ｐｐＵＬ６５、ｐｐＵＬ８０ａ、ｐｐＵＬ８２、ｐｐＵＬ９８ａ、ｐｐＵＬ９９、ｇｐＵＬ４（ｇｐ４８として知られる）、ｇｐＵＬ１６、ｇｐＵＬ１８（ＭＨＣとして知られる）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨとして知られる）、ｇｐＵＬ１００、ｇｐＵＬ１１０（ｇＭとして知られる）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬとして知られる）、ｐＵＬ４６、ｐＵＬ４８、ｐＵＬ５６、ｐＵＬ８６（ＭＣＰとして知られる）、糖タンパク質ｕｎｉｑｕｅ  ｓｈｏｒｔ  １０（ｇｐＵＳ１０）、ｇｐＵＳ１１、糖タンパク質複合体（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）ＩＩ（ｇｃＩＩ）、ｇｐ６５およびｇｐ９３よりなる群から選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する。
【００４３】
一態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原はＣＭＶの同一抗原若しくは異なる抗原からの１個若しくはそれ以上のエピトープに対応するアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの態様において、該１個若しくはそれ以上のエピトープは単一ＭＨＣクラスＩハプロタイプに拘束される若しくは拘束されないことを特徴とし得る。他の態様において、該１個若しくはそれ以上のエピトープは、人種的起源若しくは民族性に関係なく一般集団の最低約５％、具体的には一般集団の最低約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００％の適用範囲を提供するのに十分な数のＭＨＣクラスＩ分子に特異的である。当業者は、ＨＬＡ特異性実験を使用して、いずれかの所定の集団の適用範囲を提供するのに必要とされる個々のＨＣＭＶ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープの数を決定するための立場に容易にあることができる。場合によっては、該１個若しくはそれ以上のエピトープは、ＨＬＡスーパータイプ特異性をさらに表し、かつ／または被験体におけるＴヘルパー機能を助長するのに十分な１個若しくはそれ以上のＣＤ４＋決定基を含んでなる。
【００４４】
ＣＭＶエピトープの例は、限定されるものでないが、Ｔｒｉｖｅｄｉら、Ｂｌｏｏｄ，１０５：２７９３（２００５）および米国特許出願公開第２００５／００１９３４４号明細書（それらのそれぞれはＣＭＶエピトープのそれらの教示について引用することにより
本明細書に組み込まれる）により記述されるところのアミノ酸配列を含んでなるペプチドを挙げることができる。一態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原は、配列番号１、２若しくは３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド若しくはその抗原フラグメントである。
【００４５】
別の態様において、該最低１種の抗原はドミナントＨＬＡアレルにより拘束されている１個若しくはそれ以上のＣＭＶ  ＣＴＬエピトープを含んでなる。例えば、ワクチン戦略は、例えば複数のペプチドを混合することにより、または、あるいは、組換え若しくは合成ポリエピトープポリペプチドを構築するために融合し得る最小ＣＴＬエピトープを使用することにより、ＣＭＶで誘発されるＣＴＬ応答により認識されることが既知の免疫優性エピトープを模倣する合成ペプチドの製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を用いるＣＤ８＋
Ｔ細胞レパートリーの生成を必要とし得る。また、潜在性抗原からのＣＴＬエピトープに基づくワクチン設計は、ＣＭＶで形質転換された潜伏感染細胞に向けることができ、ならびに、ＣＭＶウイルスで誘発される状態に対するそれらの増大された感受性によりＣＭＶ血清陰性移植レシピエントでもまた使用し得る。
【００４６】
他の態様において、該最低１種の抗原はペプチドのプールに対応する。一態様において、該ペプチドのプールは最低約８ｍｅｒのアミノ酸配列、具体的には約８ｍｅｒないし約３０ｍｅｒ、約９ｍｅｒないし約２５ｍｅｒ、約１０ｍｅｒないし約２０ｍｅｒ、約１１ｍｅｒないし約１８ｍｅｒ、約１２ｍｅｒないし約１６ｍｅｒ、および約１３ｍｅｒないし約１５ｍｅｒを含んでなり、該ペプチドの配列は最低約６アミノ酸のオーバーラップ、具体的には約６ないし約２０、約７ないし約１９、約８ないし約１８、約９ないし約１７、約１０ないし約１６、および約１１ないし約１４アミノ酸のオーバーラップを有し、ペプチドの該プールは、ＨＣＭＶタンパク質の最低約１０％、具体的にはＨＣＭＶタンパク質の約１０ないし約１００％、約２０ないし約９０％、約３０ないし約８０％、約４０ないし約７０％、および約５０ないし約６０％を包括する。
【００４７】
一態様において、該ＨＣＭＶタンパク質はＩＥ−１タンパク質（例えばＨＣＭＶ株ＡＤ１６９のＩＥ−１タンパク質；例えばＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１３２０２（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）である。別の態様において、ＨＣＭＶタンパク質はｐｐ６５タンパク質（例えばＨＣＭＶ株ＡＤ１６９のｐｐ６５タンパク質；例えばＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０６７２５（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）である。
【００４８】
他の態様において、該ペプチドのプールは、１種若しくはそれ以上のＨＣＭＶタンパク質の完全な若しくは実質的に完全な配列を包括する１１アミノ酸のオーバーラップの１５ｍｅｒアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの態様において、該１種若しくはそれ以上のＨＣＭＶタンパク質はＩＥ−１タンパク質若しくはｐｐ６５タンパク質である。例えば、いくつかの態様において、ペプチドの該プールはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒTM  ＣＭＶ  ｐｐ６５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、独国グラードバッハ）若しくはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒTM  ＣＭＶ  ＩＥ−１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、独国グラードバッハ）を含んでなる。
【００４９】
いくつかの態様において、ペプチドエピトープの使用は現在の優良医薬品製造基準（ｃＧＭＰ）等級の製品を製造することをより容易にし得る。従って、いくつかの態様において、本発明はペプチドの該プールを含んでなる免疫原性組成物を提供する。
【００５０】
従って、いくつかの局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する細胞性免疫応答を誘発することが可能な１種若しくはそれ以上の免疫学的に活性のペプチドおよびそれらの機能的バリアントを提供する。例えば、該細胞は、癌細胞、前癌細胞、若し
くはＣＭＶと関連する癌を発症する素因となる細胞型を特徴とし得る。いくつかの態様において、該ペプチドは該細胞を認識しかつ溶解するようヒトＣＴＬに指図することが可能である。こうした免疫学的に活性のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と関連して、潜伏若しくは活動性ＨＣＭＶ感染を有する個体のＣＴＬにより認識され得る。
【００５１】
こうしたペプチド（１種若しくは複数）（例えばペプチドの該プール）は、場合によってはアジュバントを含むペプチド（１種若しくは複数）またはリポペプチド（１種若しくは複数）ワクチンの形態で投与しうる。いくつかの態様において、該ペプチド（１種若しくは複数）は、それらの表面上に該プールのペプチドを提示するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理された自己若しくは同種の抗原提示細胞若しくは樹状細胞の投与を介する細胞ワクチンの形態で投与しうる。別の態様において、Ｔ細胞を個体から取り出しかつｉｎ  ｖｉｔｒｏで該ペプチド（１種若しくは複数）で処理し得、該生じるＣＴＬを該被験体に自己若しくは同種再注入する。多様な他の態様において、本発明のペプチド（１種若しくは複数）は、ポリヌクレオチドワクチンの形態で被験体に若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞にもまた投与することができ、適切な発現制御配列の制御下にペプチドフラグメント（１種若しくは複数）をコードするＤＮＡを含有するプラスミド若しくは工作されたウイルスベクターのような１種若しくはそれ以上の適する遺伝子移入ベクターを、被験体に若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞に投与する。
【００５２】
ペプチドのプールは、例えばＫｉｅｃｋｅｒら、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：５２３−３６（２２０４）（ペプチドのプール、およびＴ細胞を刺激するためにペプチドのプールを使用することのその教示について引用することにより本明細書に組み込まれる）により開示されている。
【００５３】
該最低１種のＣＭＶ抗原は当該技術分野で既知の技術を使用する慣例の実験によってもまた決定し得る。例えば、免疫系により認識される特定の１ＣＭＶ株の抗原決定基をクローン化し得、そしてライブラリーおよび発現ベクターを使用して特徴付け得る。例として、ＤＮＡのランダムフラグメントをＨＣＭＶ  ＤＮＡのコスミドライブラリーから生成し得る。多様な長さ、例えば長さ約５０ないし６００ｂｐのフラグメントを選択しかつオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）発現ベクターにクローン化して、ウイルスゲノム全体若しくは定義される小領域のいずれかを表すＯＲＦライブラリーを創製し得る。クローンを単離し、そして、レポーター例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ分子に結合されたＣＭＶ配列によりコードされる抗原ペプチドよりなる融合タンパク質の合成について免疫学的にスクリーニングする。動物で生じられた抗ＣＭＶ血清ならびにヒト過免疫グロブリンをコロニースクリーニングに使用し得る。異なる組の抗原融合タンパク質は異なる抗血清により認識され得る。免疫血清との強い反応を示すクローンをＣＭＶゲノム上でマッピングし得、そしてＣＭＶ挿入物の配列を決定し得る。融合タンパク質に対する抗体を、対応するＣＭＶタンパク質を同定するためにマウス若しくはウサギで生じさせ得る。
【００５４】
他の態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原は、１種若しくはそれ以上のシグナル配列、例えば、限定されるものでないがｇｐ９６小胞体標的化ペプチドシグナル配列、ＬＡＭＰ−１リソソーム標的化ペプチドシグナル配列などをさらに含んでなる。シグナル配列は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの抗原プロセシングおよび提示を高めることができ、ならびに他の標的化特性を提供し得る。他の態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原は、担体タンパク質（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に複合し得るか、若しくは核酸コーディング配列の組換えにより融合タンパク質として合成し得る。
【００５５】
下でさらに具体的に説明されるとおり、該製薬学的に許容できる組成物は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含み得る。
【００５６】
Ａ．核酸
一般に、被験体は核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物をいずれかの非経口経路により接種し得る。例えば、被験体は、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、吸入若しくは筋肉内経路により、または遺伝子銃を使用する微粒子銃により接種し得る。好ましくは、筋組織がポリヌクレオチドの送達および発現の部位となり得る。１用量のポリヌクレオチドを、例えば投与を長期にわたり延長するために複数および／若しくは反復注入により筋中に投与し得る。従って、筋細胞に該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを注入し得、そして発現される抗原は、主要組織適合複合体の抗原の状況で筋細胞により提示されて、該最低１種のＣＭＶ抗原に対する免疫応答を誘発し得る。
【００５７】
表皮は、例えば直接注入若しくは微粒子銃いずれかによるポリヌクレオチドの送達および発現のための別の有用な部位であり得る。１用量のポリヌクレオチドを、例えば投与することを長期にわたり延長するために複数注入若しくは照射により表皮中に投与し得る。例えば、皮膚細胞に該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを注入し得、そして、発現される抗原は、主要組織適合複合体の抗原の状況で皮膚細胞により提示されて、該最低１種のＣＭＶ抗原に対する免疫応答を誘発し得る。
【００５８】
被験体は粘膜経路によってもまた接種し得る。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド含有点鼻薬、吸入薬、坐剤、ミクロスフェア被包化ポリヌクレオチドを包含する多様な方法により、若しくはポリヌクレオチド被覆金粒子を用いる照射により、粘膜表面に投与し得る。例えば、最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を呼吸器粘膜表面に投与し得る。
【００５９】
注入のための生理的食塩水若しくは微粒子銃のための金粒子のようないかなる適切な生理学的に適合性の媒体も、被験体にポリヌクレオチドを導入するのに適する。
【００６０】
１．ＲＮＡ
いくつかの態様において、該製薬学的に許容できる組成物は最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなり、該核酸はＲＮＡである。ＲＮＡは、該最低１種のＣＭＶ抗原を提供するアミノ酸鎖の細胞内合成を導くための翻訳可能なＲＮＡ鋳型を含んでなる。該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするＲＮＡはまたｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写、例えば逆転写されてｃＤＮＡを産生することもまたでき、このｃＤＮＡをその後、所望の場合はＰＣＲにより増幅し得、そしてその後該ｃＤＮＡをクローン化することを伴い若しくは伴わずにｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し得る。該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするＲＮＡの多数の製造方法が当業者に利用可能である。従って、例えば、慣習的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写技術および細菌ポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されるＲＮＡを製造し得るか、若しくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されるＲＮＡを、該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするクローン化されたＤＮＡ配列から合成し得る。
【００６１】
２．ＤＮＡ
別の態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸は、該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含んでなる。例えば、該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするＤＮＡオープンリーディングフレームを有する発現ベクターを含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与し得る。
【００６２】
該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを含んでなるゲノムＤＮＡフラグメントおよび／若しくはｃＤＮＡを本発明の方法で使用し得る。ｃＤＮＡは、当業者に既知の技術を使用して、該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする上述されたＲＮＡから製造し得る。所望の場合は、ＤＮＡを例えば物理的断片化により、若しくは好ましくは酵素切断すなわち制限エンドヌクレアーゼの使用により断片化し得る。断片化法は
当業者に公知であり、そして大きさおよび組成の異なるフラグメントを得るために（例えば多様な制限エンドヌクレアーゼ若しくは組合せおよび消化時間の使用により）変動させ得る。該最低１種のＣＭＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮＡ若しくはそれらのフラグメントは、当該技術分野で既知の方法および試薬により発現ベクターにクローン化し得る。
【００６３】
選択可能なマーカー（例えばアンピシリン）、ならびに好ましくは複製起点（例えばｏｒｉ）および適するプロモーターを有する標準的クローニングベクターを使用し得る。細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））若しくは他の適する宿主をその後該ベクターで形質転換し得、そして形質転換体を標準的手順により培養し得かつプラスミドＤＮＡをクロマトグラフィー若しくは有機分離のような方法により単離し得る。例えば、該オープンリーディングフレームにより発現される該最低１種のＣＭＶ抗原をＭＨＣ  Ｉ若しくはＩＩに向けることができる部位にクローン化するためのプラスミドが利用可能である。免疫応答を誘発するのに使用される発現ベクターおよびそれの使用方法は、米国特許出願公開第２００４０２４１１４０号明細書（免疫応答を誘発するのに使用される発現ベクターおよびそれの使用方法のその教示について本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００６４】
細胞（例えば筋細胞、樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、マクロファージなど）により取り込まれる場合、ＤＮＡ分子は細胞中で染色体外分子として存在し得かつ／若しくは染色体に組込み得る。ＤＮＡは、別個の遺伝子材料として留まることができるプラスミドの形態で細胞に導入し得る。あるいは、染色体に組込み得る直鎖状ＤＮＡを細胞に導入し得る。場合によっては、ＤＮＡを細胞に導入する場合に、染色体へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を添加し得る。
【００６５】
従って、好ましくは、ＤＮＡはオープンリーディングフレームの発現に必要な調節エレメントを包含する。こうしたエレメントは、例えばプロモーター、開始コドン、終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを包含し得る。加えてエンハンサーを包含し得る。当該技術分野で既知であるとおり、これらのエレメントは、好ましくは、該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする配列に作動可能に連結されている。それらが投与されるはずである被験体の種で作動可能である調節エレメントを好ましくは選択する。コーディング配列とインフレームの開始コドンおよび終止コドンが好ましくは包含される。
【００６６】
プロモーターの例は、限定されるものでないが、ＳＶ４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーターを挙げることができる。適するポリアデニル化シグナルの例は、限定されるものでないがＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルを挙げることができる。
【００６７】
ＤＮＡ発現に必要とされる調節エレメントに加え、他のエレメントもまたＤＮＡ分子に包含しうる。こうした付加的なエレメントはエンハンサーを包含する。エンハンサーは上述されたプロモーターを包含する。好ましいエンハンサー／プロモーターは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのもののようなウイルスエンハンサーを包含する。
【００６８】
場合によっては、該ＤＮＡは担体若しくは送達ベクターに作動可能に組み込み得る。有用な送達ベクターは、限定されるものでないが、生物分解可能なマイクロカプセル、免疫
刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）若しくはリポソーム、およびウイルス若しくは細菌のような遺伝子的に工作された弱毒化生存担体を挙げることができる。
【００６９】
いくつかの態様において、ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス鶏痘、ＡＶポックス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）および他の組換えウイルスのようなウイルスベクターである。例えば、ワクシニアウイルスベクターは樹状細胞を感染させるのに使用し得る。
【００７０】
従って、該最低１種のＣＭＶ抗原若しくはその免疫原性フラグメントをコードするベクターを、ウイルスベクターを使用して、若しくはＤＮＡの直接導入により、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入し得る。標的化された組織での発現は、ウイルスベクター若しくは受容体リガンドを用いて、または組織特異的プロモーターを使用することにより、あるいは双方でのように、該トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化することにより遂げることができる。
【００７１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏ標的化およびワクチン接種処置に普遍的に使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡに基づくベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターの構築および使用方法は当該技術分野で既知である（例えば、ＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９９０，１９９２を参照されたい）。好ましくはウイルスベクターは複製欠損である。すなわちそれらは標的細胞中で自律的に複製することが不可能である。好ましくは複製欠損ウイルスは最小ウイルス（ｍｉｎｉｍａｌ  ｖｉｒｕｓ）である。すなわち、それは、ウイルス粒子を産生するためゲノムを被包化するのに必要であるそのゲノムの配列のみを保持する。
【００７２】
ＤＮＡウイルスベクターは、限定されるものでないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルスなどを挙げることができる弱毒化若しくは欠損ＤＮＡウイルスを包含する。特定のベクターの例は、限定されるものでないが欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０，１９９１；国際特許公開第ＷＯ  ９４／２１８０７号明細書、１９９４年９月２９日公開；国際特許公開第ＷＯ  ９２／０５２６３号明細書、１９９４年４月２日公開）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２；Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０，１９９３もまた参照されたい）により記述されるベクターのような弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１，１９８７；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８，１９８９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６，１９８８）を挙げることができる。ウイルスベクターは商業的にもまた入手可能である。
【００７３】
場合によっては、該ＤＮＡは細胞による遺伝子材料の取り込みを改善する試薬とともにもまた提供し得る。例えば、該ＤＮＡは、安息香酸エステル、アニリド、アミジンおよびウレタンよりなる群から選択される取り込み促進剤試薬とともに処方若しくは投与し得る。
【００７４】
Ｂ．樹状細胞
当業者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞（ＤＣ）を生成する能力もまた、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の誘発戦略としての該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸でのＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏ負荷およびＤＣワクチン
の投与のために本発明により使用し得ることを認識するであろう。前臨床研究は、ＤＣが新規の強力な活性化因子でありかつＢおよびＴリンパ球で応答を復活させることを示している。
【００７５】
いくつかの態様において、本発明はＣＭＶを発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸をｅｘ  ｖｉｖｏで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する。
【００７６】
従って、本発明のＣＭＶ抗原でプライミングされた抗原提示細胞、およびこれらの抗原提示細胞を用いて生成されるＣＭＶ抗原特異的Ｔリンパ球を、予防的若しくは治療的応用のための免疫調節組成物中で有効成分として使用し得る。下述されるとおり、いくつかの態様において、本発明の抗原でプライミングされた抗原提示細胞を、被験体への養子移入のための細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（例えばＣＤ８＋若しくはＣＤ４＋  ＣＴＬ）を生成するのに使用し得る。
【００７７】
Ｃ．組成物
他の局面において、本発明は、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を提供する。該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発し得る。本発明の製薬学的に許容できる組成物は、腫瘍性疾患若しくはその症状の予防的若しくは治療的処置のため、とりわけ被験体におけるＣＭＶが関連する癌（例えば腫瘍）を予防若しくは処置するためのワクチン組成物として有用であり得る。
【００７８】
いくつかの態様において、該製薬学的に許容できる組成物は生理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤をさらに含んでなる。処方および投与技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版にもまた見出し得る。
【００７９】
当該技術分野で既知の製薬学的に許容できる担体は、限定されるものでないが滅菌水、生理的食塩水、グルコース、右旋糖若しくは緩衝溶液を挙げることができる。希釈剤、安定剤（例えば糖およびアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度を高める添加物などのような剤。好ましくは、媒体若しくは担体は最小限の副作用を生じるか若しくは副作用を生じないことができる。
【００８０】
他の態様において、該製薬学的に許容できる組成物は生理学的に許容できるアジュバントをさらに含んでなる。好ましくは、使用されるアジュバントは増大された免疫原性を提供する。アジュバントは抗原の徐放を提供するものであり得る（例えばアジュバントはリポソームであり得る）か、若しくは、それはそれ自体で免疫原性でありそれにより抗原と相乗的に機能するアジュバントであり得る。例えば、アジュバントは、既知のアジュバント、または核酸の取り込みを促進するか、免疫系細胞を投与の部位に動員するか、若しくは応答するリンパ系細胞の免疫活性化を助長する他の物質であり得る。アジュバントは、限定されるものでないが、免疫調節分子（例えばサイトカイン）、油および水乳剤、水酸化アルミニウム、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Ｂａｃｔｏ−Ａｄｊｕｖａｎｔ、ポリアミノ酸およびアミノ酸のコポリマーのような合成ポリマー、サポニン、パラフィン油ならびにムラミルジペプチドを挙げることができる。
【００８１】
一態様において、アジュバントは免疫調節分子である。例えば、免疫調節分子は、組換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、若しくは免疫刺激剤、またはサイトカイン、ケ
モカイン若しくは免疫学的応答を高めるよう設計された免疫調節剤をコードする核酸であり得る。
【００８２】
免疫調節性サイトカインの例は、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−２０）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ−３リガンド、ｇＩｐ１０、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｒａｎｔｅｓ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ならびに前述のいずれかの機能的フラグメントを包含する。ケモカイン受容体、すなわちＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ若しくはＣＸ３Ｃケモカイン受容体に結合するいかなる免疫調節性ケモカインもまた本発明の文脈で使用し得る。ケモカインの例は、限定されるものでないが、Ｍｉｐ１α、Ｍｉｐ−１β、Ｍｉｐ−３α（Ｌａｒｃ）、Ｍｉｐ−３β、Ｒａｎｔｅｓ、Ｈｃｃ−１、Ｍｐｉｆ−１、Ｍｐｉｆ−２、Ｍｃｐ−１、Ｍｃｐ−２、Ｍｃｐ−３、Ｍｃｐ−４、Ｍｃｐ−５、エオタキシン、Ｔａｒｃ、Ｅｌｃ、Ｉ３０９、ＩＬ−８、Ｇｃｐ−２  Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、Ｎａｐ−２、Ｅｎａ−７８、Ｇｃｐ−２、Ｉｐ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−Ｔａｃ、Ｓｄｆ−１およびＢｃａ−１（Ｂｌｃ）、ならびに前述のいずれかの機能的フラグメントを挙げることができる。
【００８３】
別の態様において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−αおよびＭ−ＣＳＦよりなる群から選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、アジュバントはフロイントの不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ  ５１）若しくはコリネバクテリウム  グラヌロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）Ｐ４０より構成される。
【００８４】
当業者は、これらのアジュバントのいくつかがベクターから発現され得ないことを認識することができ、この場合、該アジュバントは、使用される場合に同時に若しくはいずれかの順序で連続して投与し得る。
【００８５】
当業者は、本発明の方法および組成物が併用療法の一部として、例えば、限定されるものでないが化学療法剤、免疫療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗ウイルス剤およびホルモン剤を挙げることができる１種若しくはそれ以上の他の剤を含んでなる方法および／若しくは組成物として使用し得ることを知っている。
【００８６】
抗ウイルス剤の例は、限定されるものでないが、ガンシクロビル（例えばＣＹＴＯＶＥＮＥ(R)）、バルガンシクロビル（例えばＶａｌｃｙｔｅ(R)）、ホスカルネット（例えばＦＯＳＣＡＶＩＲ(R)）、シドフォビル（例えばＶＩＳＴＩＤＥ(R)、ＨＰＭＰＣ）、アデフォビル（例えば、ＰＭＥＡ、ＰＲＥＶＥＯＮ(R)、ＨＥＰＳＥＲＡ(R)）、アシクロビル（例えばＺＯＶＩＲＡＸ(R)）、バラシクロビル（例えばＶＡＬＴＲＥＸTM、ＺＥＬＩＴＲＥＸTM）、ポリアニオン、およびタンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えばビス−インドリルマレイド（ｂｉｓ−ｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｄｅ））を挙げることができる。一態様において、本発明の組成物および方法と組合せで使用される抗ウイルス剤は、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、シドフォビル若しくはホスカルネットである。
【００８７】
他の態様において、該１種若しくはそれ以上の他の剤は、好ましくはＣＭＶ抗原発現を高めることにより、好ましくは潜伏感染細胞、好ましくは神経膠腫細胞中のＣＭＶ抗原発現を高めることにより、ＣＭＶ抗原発現を遂げる。一態様において、該１種若しくはそれ以上の剤は、レチノイン酸（ＲＡ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ  １Ｈ）および免
疫抑制剤（例えばシクロホスファミド、シクロスポリン）よりなる群から選択される。別の態様において、照射および／若しくは免疫除去が本発明の組成物および方法とともに提供される。
【００８８】
多様な態様において、該１種若しくはそれ以上の他の剤は、例えば“Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９５，Ｗ．Ｏ．Ｆｏｙｅ編に記述されるとろこの天然に存在する若しくは合成の化学療法剤であり得る。
【００８９】
一態様において、化学療法剤は、場合によっては製薬学的に許容できる塩の形態の、水和物および／若しくは溶媒和物の形態の、ならびに場合によっては個々の光学異性体、個々の鏡像異性体の混合物若しくはそれらのラセミ化合物の形態の、バタラニブ、ＳＵ  １１２４８若しくはＡＺＤ−６４７４のような小分子受容体アンタゴニスト、ゲフィニチブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３若しくはＨｅｒｃｅｐｔｉｎのようなＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ２アンタゴニスト、ベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブのような抗体、シスプラチン、オキザリプラチン若しくはカルボプラチンのようなＤＮＡアルキル化薬、ドキソルビシン若しくはエピルビシンのようなアントラサイクリン、５−ＦＵ、ペメトレキセド、ゲムシタビン若しくはカペシタビンのような代謝拮抗剤、イリノテカン若しくはトポテカンのようなカンプトテシン、パクリタキセル若しくはドセタキセルのような抗癌剤、エトポシド若しくはテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤、またはセレコキシブ若しくはロフェコキシブのような抗炎症剤よりなる群から選択される。
【００９０】
別の態様において、化学療法剤は、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ−５４１６、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ＳＵ−１４８１３、ＡＺＤ−６４７４、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７６３２、ＣＥＰ−７０５５、ＡＧ−０１３７３６、ＩＭ−８４２若しくはＧＷ−７８６０３４のような小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ゲフィニチブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３若しくはＧＷ−２０１６のような二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト、イレッサ（ｉｒｅｓｓａ）（ＺＤ−１８３９）、タルセバ（ｔａｒｃｅｖａ）（ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２若しくはハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のようなＥＧＦＲアンタゴニスト、ＢＡＹ−４３−９００６若しくはＢＡＹ−５７−９００６のようなマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−６−｛［４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ｝−７−（（Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）キナゾリン若しくは４−［（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）アミノ］−６−｛［４−（ホモモルホリン−４−イル）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ｝−７−［（Ｓ）−（テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ］−キナゾリンのようなキナゾリン誘導体、またはそれらの製薬学的に許容できる塩、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、ＡｖａｓｔｉｎTM（ベバシズマブ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、アービタックス（ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｃ−２２５）、ＤＣ−１０１、ＥＭＤ−７２０００、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、イマニチブのような合成小分子に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト、ＶＥＧＦｔｒａｐのような融合タンパク質であるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、メルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、テトラプラチン（ｔｅｔｒａｐｌａｔｉｎ）、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシルのようなアルキル化剤若しくは白金化合物、メクロレタミンのようなナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソ
ルビシン（ドキシル（ｄｏｘｉｌ））、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシン若しくはそれらの誘導体、ネトロプシン、ピベンジモール、マイトマイシン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、プロパミジン若しくはスチルバミジンのようなフタラニリド（ｐｈｔａｌａｎｉｌｉｄｅ）、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレア若しくはその誘導体、シタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフール／ウラシル、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキセート、ペントスタチン、ヒドロキシウレアのようなピリミジン若しくはプリンアナログまたはヌクレオシド二リン酸還元酵素の阻害剤若しくはアンタゴニスト、あるいは葉酸、フレオマイシン、ブレオマイシンまたはそれらの誘導体若しくは塩、ＣＨＰＰ、ＢＺＰＰ、ＭＴＰＰ、ＢＡＰＰ、リブロマイシン、アクリジン若しくはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン（ａｄｒａｍｙｃｉｎ）、イリノテカン（カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ））若しくはトポテカンのようなカンプトテシン、アムサクリン若しくはそのアナログ、三環性カルボキサミド、ＳＡＨＡ、ＭＤ−２７５、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、ＬＡＱ８２４若しくはバルプロ酸のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤、パクリタキセル（タキソール（ｔａｘｏｌ））、ドセタキセル若しくはタキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）のような植物からの抗癌剤、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン若しくはビノレルビンのようなビンカアルカロイド、コルヒチンのようなトロポロンアルカロイド若しくはその誘導体、マイタンシン、アンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）若しくはリゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）のようなマクロライド、ホモプシン（ｐｈｏｍｏｐｓｉｎ）若しくはドラスタチンのような抗有糸分裂ペプチド、エトポシド若しくはテニポシド、ステガナシンのようなエピポドフィロトキシン若しくはポドフィロトキシンの誘導体、コンブレタスタチン若しくはアンフェチニル（ａｍｐｈｅｔｉｎｉｌｅ）のような抗有糸分裂カルバメート誘導体、プロカルバジン、ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤、アスパラギナーゼ、ペグ化アスパラギナーゼ（ペグアスアパルガーゼ）のような酵素、または、チミジンホスホリラーゼ阻害剤、エストラムスチン（Ｔ−６６）若しくはメゲストロールのようなゲスターゲン若しくはエストロゲン、フルタミド、カソデックス（ｃａｓｏｄｅｘ）、アナンドロン（ａｎａｎｄｒｏｎ）若しくはシプロテロン酢酸塩のような抗アンドロゲン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、ホルメスタン若しくはレトロゾールのようなアロマターゼ阻害剤、リュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリン若しくはトリプトレリンのようなＧＮｒＨアナログ、タモキシフェン若しくはそのクエン酸塩、ドロロキシフェン、トリオキシフェン、ラロキシフェンまたはジンドキシフェン（ｚｉｎｄｏｘｉｆｅｎｅ）のような抗エストロゲン、ＩＣＩ
１６４，３８４若しくはＩＣＩ  １８２，７８０のような１７β−エストラジオールの誘導体、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ファドロゾール、フィナステリド、ケトコナゾール、リュープロリドのようなＬＨ−ＲＨアンタゴニスト、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメサゾン、ブデノシド、フルオコルトロン若しくはトリアムシノロンのようなステロイド、インターフェロンβのようなインターフェロン、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−１２のようなインターロイキン、エタネルセプトのような抗ＴＮＦα抗体、サリドマイド、そのＲおよびＳ鏡像異性体ならびにその誘導体すなわちレビミド（ｒｅｖｉｍｉｄ）（ＣＣ−５０１３）のような免疫調節薬、ロイコトリエンアンタゴニスト、マイトマイシンＣ、ＢＭＹ−４２３５５、ＡＺＱ若しくはＥＯ−９のようなアジリドキノン（ａｚｉｒｉｄｏｑｕｉｎｏｎｅ）、ミソニダゾール、ＮＬＰ−１若しくはＮＬＡ−１のような２−ニトロイミダゾール、ニトロアクリジン、ニトロキノリン、ニトロピラゾロアクリジン、ＲＳＵ−１０６９若しくはＲＢ−６１４５、ＣＢ−１９５４のような「二重機能」ニトロ芳香族、ニトロミン（ｎｉｔｒｏｍｉｎ）のようなナイトロジェンマスタードのＮ−オキシド、ナイトロジェンマスタードの金属錯体、抗ＣＤ３若しくは抗ＣＤ２５抗体、耐性誘導剤、ミノドロン酸若しくはその誘導体（ＹＭ−５２９、Ｏｎｏ−５９２０、ＹＨ−５２９）、ゾレドロン酸一水和物、イバンドロン酸ナトリウム水和
物若しくはクロドロン酸二ナトリウムのようなビホスホネート若しくはその誘導体、メトロニダゾール、ミソニダゾール、ベンズニダゾール若しくはニモラゾールのようなニトロイミダゾール、ＲＳＵ−１０６９のようなニトロアリール化合物、ＳＲ−４２３３のようなニトロキシル若しくはＮ−オキシド、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジンのようなハロゲン化ピリミジンアナログ、ＷＲ−２７２  １のようなチオホスフェート、ポルフィマー、フォトフリン（ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）のような光化学的に活性化される薬物、ベンゾポルフィリン誘導体、フェオホルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）誘導体、メロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎ）５４０（ＭＣ−５４０）若しくはスズエチオポルプリン（ｅｔｉｏｐｏｒｐｕｒｉｎ）、オブリメルセンのようなａｎｔ−ｔｅｍｐｌａｔｅ若しくはアンチセンスＲＮＡ若しくはＤＮＡ、アセチルサリチル酸、メサラジン、イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、チアプロフェン酸、フルプロフェン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ゾメピラク、ナブメトン、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、アルクロフェナク、ブロムフェナク、イブフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、フェンチアザク、クリダナク、エトドラク、オクスピナク（ｏｘｐｉｎａｃ）、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサル、ピロキシカム、テノキシカム、ロモキシカム、ニメスリド、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブのような非ステロイド性炎症薬、若しくは非ステロイド性炎症薬の製薬学的に許容できる塩、細胞傷害性抗生物質、アポリズマブ若しくは１Ｄ０９Ｃ３のような癌細胞の表面分子を標的とする抗体、ＴＩＭＰ−１若しくはＴＩＭＰ−２のようなメタロプロテイナーゼの阻害剤、亜鉛、Ｐ５３およびＲｂのような癌遺伝子の阻害剤、ランタニドの複素環錯体のような希土類元素の錯体、ＰＵＶＡのような光化学治療剤、転写因子複合体ＥＳＸ／ＤＲＩＰ１３０／Ｓｕｒ−２の阻害剤、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０調節物質ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７−アリルアミノゲルダナマイシンすなわち１７−ＡＡＧのようなＨＥＲ−２発現の阻害剤、あるいは、ＩＭ−８４２、テトラチオモリブデン酸、スクアラミン、コムブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）Ａ４、ＴＮＰ−４７０、マリマスタット、ネオバスタット（ｎｅｏｖａｓｔａｔ）、ビカルタミド、アバレリックス、オレゴボマブ、ミツモマブ、ＴＬＫ−２８６、アレムツズマブ、イブリツモマブ、テモゾロミド、デニロイキンジフチトクス、アルデスロイキン、ダカルバジン、フロクスウリジン、プリカマイシン、ミトタン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェンおよびテストラクトンから選択される治療薬よりなる群から選択される。好ましい化合物は、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ−５４１６、ＳＵ−���６６８、ＳＵ−１１２４８、ＳＵ−１４８１３、ＡＺＤ−６４７４のような小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＣＩ−１０３３若しくはＧＷ−２０１６のようなＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト、イレッサ（ｉｒｅｓｓａ）（ゲフィニチブ、ＺＤ−１８３９）、タルセバ（ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２若しくはハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のようなＥＧＦＲアンタゴニスト、ＢＡＹ−４３−９００６若しくはＢＡＹ−５７−９００６のようなマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、アービタックス（ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｃ−２２５）、ＤＣ−１０１、ＥＭＤ−７２０００、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、イマニチブ、メルファラン、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、サトラプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル（ｄｏｘｉｌ））、エピルビシン、イダルビシンのようなアルキル化剤若しくは白金化合物、シタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフール／ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサートのようなピリミジン若しくはプリンアナログまたはヌクレオシド二リン酸還元酵素のアンタゴニスト若し
くは阻害剤、パクリタキセル（タキソール（ｔａｘｏｌ））若しくはドセタキ
セルのような抗癌剤、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン若しくはビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ドラスタチンのような抗有糸分裂ペプチド、エトポシド若しくはテニポシドのようなエピポドフィロトキシン若しくはポドフィロトキシンの誘導体、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブのような非ステロイド性炎症薬、アポリズマブ若しくはＩＤ０９Ｃ３のような癌細胞の表面分子を標的とする抗体、または熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０調節物質ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７−アリルアミノゲルダナマイシンすなわち１７−ＡＡＧを包含する。
【００９１】
別の態様において、化学療法剤は、チューブリンと相互作用する若しくはそれを結合する化合物、合成小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、小分子増殖因子受容体アンタゴニスト、ＥＧＦ受容体および／若しくはＶＥＧＦ受容体および／若しくはインテグリン受容体、または合成小分子に分類されないいずれかの他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体の阻害剤、ＥＧＦ受容体および／若しくはＶＥＧＦ受容体および／若しくはインテグリン受容体または融合タンパク質であるいずれかの他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体に向けられる阻害剤、核酸と相互作用しかつアルキル化剤若しくは白金化合物に分類される化合物、核酸と相互作用しかつアントラサイクリン、ＤＮＡ挿入剤、若しくはＤＮＡ副溝結合化合物を包含するＤＮＡ架橋剤に分類される化合物、代謝拮抗剤、天然に存在する、半合成性若しくは合成のブレオマイシン型抗生物質、ＤＮＡ転写酵素の阻害剤、ならびにとりわけトポイソメラーゼＩ若しくはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、クロマチン修飾剤、有糸分裂阻害剤、抗有糸分裂剤、細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ホルモン阻害剤、ステロイド生合成の阻害剤、ステロイド、サイトカイン、低酸素選択的細胞毒、サイトカイン、リンホカインの阻害剤、サイトカインに向けられる抗体、経口および非経口耐性誘導剤、支持剤（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、化学的放射線増感剤および保護剤、光化学的に活性化される薬物、場合によっては修飾若しくは複合されている合成ポリ若しくはオリゴヌクレオチド、非ステロイド性抗炎症薬、細胞傷害性抗生物質、癌細胞の表面分子を標的とする抗体、増殖因子若しくはそれらの受容体を標的とする抗体、メタロプロテイナーゼの阻害剤、金属、癌遺伝子の阻害剤、遺伝子転写またはＲＮＡ転写若しくはタンパク質発現の阻害剤、希土類元素の錯体、ならびに光化学治療剤よりなる群から選択される。
【００９２】
他の態様において、化学療法剤は、パクリタキセル（タキソール（ｔａｘｏｌ））、ドセタキセル、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン若しくはビノレルブンのようなビンカアルカロイド、メルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシルのようなアルキル化剤若しくは白金化合物、メクロレタミンのようなナイトロジェンマスタード、サリドマイド、そのＲおよびＳ鏡像異性体ならびにその誘導体すなわちレビミド（ｒｅｖｉｍｉｄ）（ＣＣ−５０１３）のような免疫調節剤、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル（ｄｏｘｉｌ））、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシン若しくはその誘導体、ネトロプシン、ピベンジモール、マイトマイシン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、プロパミジン若しくはスチルバミジンのようなフタラニリド（ｐｈｔａｌａｎｉｌｉｄｅ）、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレア若しくはその誘導体、シタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキサート、ペントスタチン、ヒドロキシウレアのようなピリミジン若しくはプリンアナログまたはヌクレオシド二
リン酸還元酵素のアンタゴニスト若しくは阻害剤、あるいは葉酸、アクリジン若しくはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン（ａｄｒａｍｙｃｉｎ）、イリノテカン（カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ））若しくはトポテカンのようなカンプトテシン、アムサクリン若しくはそのアナログ、三環性カルボキサミド、ＳＡＨＡ、ＭＤ−２７５、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、ＬＡＱ８２４、若しくはバルプロ酸のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ−５４１６、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ＳＵ−１４８１３、ＡＺＤ−６４７４、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７６３２、ＣＥＰ−７０５５、ＡＧ−０１３７３６、ＩＭ−８４２若しくはＧＷ−７８６０３４のような小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＢＡＹ−４３−９００６若しくはＢＡＹ−５７−９００６のようなマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、ゲフィニチブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３若しくはＧＷ−２０１６のような二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト、イレッサ（ｉｒｅｓｓａ）（ＺＤ−１８３９）、タルセバ（ｔａｒｃｅｖａ）（ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２若しくはハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のようなＥＧＦＲアンタゴニスト、４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−６−｛［−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブト−エン−１−イル］アミノ｝−７−（（Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）−キナゾリン若しくは４−［（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）アミノ］−６−｛［４−（ホモモルホリン−４−イル）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル］アミノ｝−７−［（Ｓ）−（テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ］−キナゾリンのようなキナゾリン誘導体、またはその製薬学的に許容できる塩、転写因子複合体ＥＳＸ／ＤＲＩＰ１３０／Ｓｕｒ−２の阻害剤、熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０調節物質ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７−アリルアミノゲルダナマイシンすなわち１７−ＡＡＧのようなＨＥＲ−２発現の阻害剤、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、ＡｖａｓｔｉｎTM（ベバシズマブ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、アービタックス（ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｃ−２２５）、ＤＣ−１０１、ＥＭＤ−７２０００、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、イマチニブのような合成小分子に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト、ならびにアポリズマブ若しくは１Ｄ０９Ｃ３のような癌細胞の表面分子を標的とする抗体よりなる群から選択される。
【００９３】
いくつかの他の態様において、化学療法剤は、１種若しくはそれ以上のＡＢＣトランスポーターにより媒介されるヒアルロナンの輸送を低下させる化合物、またはＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）阻害剤分子若しくは阻害剤ペプチドのような薬物輸送阻害剤、ＭＲＰ１阻害剤、ＡＢＣトランスポーターに向けられかつそれを阻害することが可能な抗体、１種若しくはそれ以上のＡＢＣトランスポーターに向けられるアンチセンスオリゴマー、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはアプタマーである。本発明のＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）阻害剤分子の例は、ゾスキダル（ＬＹ  ３３５９７３）、その塩（とりわけ三塩化物塩）、ならびにその多形、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）Ａ（シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）としてもまた知られる）、ベラパミル若しくはそのＲ異性体、タモキシフェン、キニジン、ｄ−αトコフェリルポリエチレングリコール１０００サクシネート、ＶＸ−７１０、ＰＳＣ８３３、フェノチアジン、ＧＦ１２０９１８（ＩＩ）、ＳＤＺ  ＰＳＣ  ８３３、ＴＭＢＹ、ＭＳ−０７３、Ｓ−９７８８、ＳＤＺ  ２８０−４４６、ＸＲ（９０５１）ならびにこれらの機能的誘導体、アナログおよび異性体である。
【００９４】
Ｄ．養子免疫療法
他の局面において、該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸は、例えば、免疫調節組成物中の有効成分としての使用のためのＣＭＶ抗原でプライミングされた抗原提示細胞および／若しくはこれらの抗原提示細胞を用いて生成されるＣＭＶ抗原特異的Ｔリンパ球を提供するための組成物および方法、ならびにＣＭＶ抗原を発現する細胞に向けられる予防若しくは治療的応用のための方法もまた提供し得る。
【００９５】
従って、一局面において、本発明は、
最低１種のＣＭＶ抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させること
による、ＣＭＶ抗原でプライミングされた抗原提示細胞の作成方法を提供する。該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸は上述されるとおりである。
【００９６】
該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸は、抗原提示細胞を含んでなる均一な、実質的に均一な若しくは不均一な組成物と接触し得る。例えば、該組成物は、全血、新鮮血、若しくは、限定されるものでないが末梢血単核細胞、全血のバフィーコート画分、濃縮赤血球、照射血、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球、ナチュラルキラー細胞およびナチュラルキラーＴ細胞を挙げることができるそれらの画分を限定されるものでないが包含し得る。場合によっては、抗原提示細胞の前駆細胞を使用する場合、該前駆細胞が抗原提示細胞に分化するのに十分な適する培養条件下で該前駆細胞を培養し得る。好ましくは、該抗原提示細胞（若しくは場合によっては前駆細胞）は、単球、マクロファージ、骨髄球系統の細胞、Ｂ細胞、樹状細胞若しくはランゲルハンス細胞から選択される。
【００９７】
抗原提示細胞との接触に置かれるべき最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸の量は、慣例の実験により当業者により決定され得る。一般に、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の調節のためにプロセシングされた形態の抗原を細胞が提示するのに十分な時間、該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸と接触される。一態様において、抗原提示細胞を、該最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸の存在下で約１週未満、具体的には約１分ないし約４８時間、約２分ないし約３６時間、約３分ないし約２４時間、約４分ないし約１２時間、約６分ないし約８時間、約８分ないし約６時間、約１０分ないし約５時間、約１５分ないし約４時間、約２０分ないし約３時間、約３０分ないし約２時間、および約４０分ないし約１時間インキュベートする。抗原提示細胞が該抗原をプロセシングしかつ提示するのに必要な時間および抗原若しくは該抗原をコードする核酸の量は、例えば、接触の後に洗浄期間、および読み取り系例えば抗原反応性Ｔ細胞への曝露が起こるパルスチェイス法を使用して決定し得る。
【００９８】
典型的には、抗原提示細胞がその表面上に抗原を提示するのに必要な時間の長さは、使用される抗原若しくは抗原の形態（例えばペプチド対コーディングポリヌクレオチド）、その用量、および使用される抗原提示細胞、ならびに抗原負荷が始められる条件を包含する多数の因子に依存して変動し得る。これらのパラメータは慣例の手順を使用して当業者により決定され得る。抗原提示細胞のプライミングの効率は、Ｔ細胞の細胞傷害活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイすること、若しくはＣＴＬの標的として抗原提示細胞を使用することにより決定し得る。抗原提示細胞の表面上の抗原の存在を検出し得る他の方法もまた本発明により企図している。
【００９９】
抗原提示細胞の内因性プロセシング経路への抗原の多数の送達方法が既知である。こうした方法は、限定されるものでないが、ｐＨ感受性リポソームを必要とする方法、強力なアジュバントへの抗原の結合、アポトーシス細胞送達、樹状細胞上へ細胞をパルス（ｐｕｌｓｅ）すること、抗原を含んでなる組換えキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）を樹状細胞株のＭＨＣクラスＩプロセシング経路に送達することを挙げることができる。
【０１００】
一態様において、可溶化ＣＭＶ抗原を抗原提示細胞とともにインキュベートする。他の
態様において、該最低１種のＣＭＶ抗原を細胞溶解素に結合して、ＭＨＣクラスＩ経路への送達のための抗原提示細胞のサイトゾル中への該抗原の移動を高め得る。例示細胞溶解素は、サポニン含有免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）のようなサポニン化合物、ポア形成毒素（例えばαトキシン）、ならびにリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）およびパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯ）のようなグラム陽性細菌の天然の細胞溶解素を包含する。
【０１０１】
別の例として、他の態様において、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞およびマクロファージを当該技術分野で既知の方法により単離し得、そして、ＣＭＶ抗原をコードする核酸をＡＰＣに導入するための当該技術分野で既知の方法によりポリヌクレオチドでトランスフェクトし得る。トランスフェクション試薬および方法（例えばＳｕｐｅｒＦｅｃｔ(R)）もまた商業的に入手可能である。例えば、ＣＭＶ抗原をコードするＲＮＡを適する媒体（例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭ(R)）中で提供し得、そしてＡＰＣとの接触前に脂質（例えば陽イオン性脂質）と組合せ得る。脂質の制限しない例は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥTM、ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥおよびＣＨＯＬ／ＤＯＰＥを包含する。生じるポリヌクレオチド−脂質複合体をその後ＡＰＣと接触させ得る。あるいは、ポリヌクレオチドを、電気穿孔法若しくはリン酸カルシウムトランスフェクションのような技術を使用してＡＰＣに導入し得る。ポリヌクレオチドを負荷したＡＰＣをその後、ｉｎ
ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）増殖を刺激するのに使用し得る。一態様において、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させたＣＴＬを養子免疫療法の方法で被験体に投与する。ポリヌクレオチドを負荷した抗原提示細胞のＣＴＬ応答を刺激する能力は、既知の方法により、例えば標的細胞を溶解するエフェクター細胞の能力をアッセイすることにより測定し得る。例えばＲＮＡを負荷した抗原提示細胞を使用する方法および組成物は、Ｎａｉｒらへの米国特許第６，３０６，３８８号明細書（ＲＮＡを負荷したＡＰＣの生成および使用方法のその教示について引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【０１０２】
別の局面において、本発明は、最低１種のＣＭＶ抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下で最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触された抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。
【０１０３】
別の局面において、本発明は、最低１種のＣＭＶ抗原に特異的なリンパ球の製造方法を提供する。該方法は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なＣＭＶ抗原特異的リンパ球を産生するのに十分な条件下で、上述された抗原提示細胞とリンパ球を接触されることを含んでなる。従って、該抗原提示細胞は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を包含するリンパ球を提供するのにもまた使用し得る。
【０１０４】
一態様において、Ｔリンパ球の調製物を、抗原提示細胞により提示される最低１種のＣＭＶ抗原に対しＴリンパ球をプライミングするために、ある期間、好ましくは最低約２４時間、上述された抗原提示細胞と接触させる。
【０１０５】
例えば、別の態様において、抗原提示細胞の１集団を、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原を含んでなる核酸と一緒に末梢血Ｔリンパ球の不均一な集団と共培養し得る。該細胞は、ある期間、および、ＣＭＶ抗原若しくはそれらのプロセシングされた形態が該抗原提示細胞により提示されかつ該抗原提示細胞がＣＭＶ抗原を発現する細胞に応答するようＴリンパ球の１集団をプライミングするのに十分な条件下で共培養し得る。従って、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に応答するようプライミングされているＴリンパ球およびＢリンパ球を製造し得る。
【０１０６】
本明細書に記述されるとおり、免疫応答を表すようにリンパ球を誘導する能力は、限定されるものでないが、ＣＭＶ抗原特異的細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の標的として例えばＣＭＶ抗原特異的抗原提示細胞を使用してＴリンパ球の細胞溶解活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すること；ＣＭＶ抗原特異的Ｔリンパ球増殖をアッセイすること；およびＣＭＶ抗原を発現する細胞に対するＢ細胞応答を例えばＥＬＩＳＡ法を使用して測定することを挙げることができるいずれかの方法により決定し得る。
【０１０７】
Ｔリンパ球は末梢血、脾およびリンパ節のようないずれかの適する供給源から得ることができる。Ｔリンパ球は、粗調製物として、または、限定されるものでないが抗体を使用する免疫磁気若しくはフローサイトメトリー技術を必要とする方法を挙げることができる標準的技術により得ることができる部分的に精製された若しくは実質的に精製された調製物として使用し得る。
【０１０８】
ＣＭＶ抗原を発現する細胞の特異的認識のために遺伝子的に改変された細胞（例えばそれらの表面上に細胞特異的抗体を発現するよう遺伝子的に工作されたＴ細胞）もまた本発明の範囲内で企図している。いくつかの態様において、抗原特異的Ｔ細胞を、１種若しくはそれ以上の異種遺伝子、例えばマーカー遺伝子、または遺伝子産物が特定の表現型若しくは機能をを高め得るか若しくは抗原特異的Ｔ細胞に賦与し得る遺伝子を発現するように、当該技術分野で既知の遺伝子移入技術により改変する。従って、例えば、抗原でパルスした樹状細胞に応答する活性化Ｔ細胞内でマーカー遺伝子を発現させ得、そして抗原特異的Ｔ細胞の選択的濃縮および改変を見込み得る。別の例として、抗原特異的Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで受容体のリガンドに向けて移動させるため受容体（例えばケモカイン受容体）を発現するように改変し得る。
【０１０９】
他の局面において、本発明は上述された抗原提示細胞若しくはリンパ球、ならびに製薬学的に許容できる担体および／若しくは希釈剤を含んでなる組成物を提供する。いくつかの態様において、該組成物は上述されたところのアジュバントをさらに含んでなる。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答の誘発方法を提供し、該方法は、免疫応答を誘発するのに十分な有効量の上述された抗原提示細胞若しくはリンパ球を被験体に投与することを含んでなる。いくつかの態様において、本発明は、ＣＭＶと関連する腫瘍性疾患若しくは症状の処置若しくは予防方法を提供し、該方法は、有効量の上述された抗原提示細胞若しくはリンパ球を被験体に投与することを含んでなる。一態様において、該抗原提示細胞若しくは該リンパ球は好ましくは注入により全身に投与される。あるいは、例えば組織中に直接注入を介して、好ましくはデポー若しくは徐放製剤で全身よりはむしろ局所に投与し得る。さらに、標的化ドラッグデリバリーリステム、例えば組織特異的抗体で被覆されているリポソーム中で投与し得る。該リポソームは組織に向けられかつ該組織により選択的に取り込まれることができる。別の態様において、本発明は、好ましくは癌を処置若しくは予防するための、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための医薬品の製造における該抗原提示細胞若しくは該リンパ球の使用を提供する。
【０１１１】
従って、本発明の抗原でプライミングされた抗原提示細胞およびこれらの抗原提示細胞を用いて生成される抗原特異的Ｔリンパ球を、癌の予防的若しくは治療的応用のための免疫調節組成物中の有効成分として使用し得る。いくつかの態様において、本発明のＣＭＶ抗原でプライミングされた抗原提示細胞を、被験体への養子移入のためのＣＤ８＋  ＣＴＬ、ＣＤ４＋  ＣＴＬおよび／若しくはＢリンパ球を生成するのに使用し得る。従って、例えば、ＣＭＶ抗原特異的ＣＴＬを、神経膠種のような悪性腫瘍で苦しめられている被験体で治療目的上養子移入し得る。
【０１１２】
上述された抗原提示細胞および／若しくはリンパ球は、免疫応答を誘発するため、とりわけＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するために、単独で若しくは組合せでのいずれかで被験体に投与し得る。こうした細胞に基づく組成物は、従って癌を処置若しくは予防するのに有用である。該細胞は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する所望の免疫応答を誘発するいずれかの様式により被験体に導入し得る。さらに、該抗原提示細胞および／若しくはリンパ球は、該被験体（すなわち自己細胞）または該被験体とＭＨＣが適合する若しくは不適合である異なる被験体（すなわち同種）に由来し得る。注入部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、静脈内若しくはリンパ系内から選択し得る。
【０１１３】
該抗原提示細胞およびリンパ球の単回若しくは複数回投与は、医療提供者（例えば医師）により選択されている細胞数および処置を用いて実施し得る。好ましくは、該抗原提示細胞および／若しくはリンパ球は製薬学的に許容できる担体中で投与される。適する担体は、細胞が増殖された増殖培地、若しくはリン酸緩衝生理的食塩水のようないずれかの適する緩衝媒体であり得る。該細胞は単独で若しくは他の治療薬とともにの補助療法として投与し得る。
【０１１４】
従って、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞、好ましくはＣＭＶに関連する癌細胞の処置および／若しくは予防方法を企図しており、該方法は、こうした処置若しくは予防の必要な被験体に治療的／予防的有効量の本明細書に記述される組成物を投与することを含んでなる。
【０１１５】
処方および投与技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン、最新版に見出し得る。適する経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜若しくは腸投与；筋肉内、皮下、髄内注入、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内若しくは眼内注入を包含する非経口送達を包含し得る。注入のために、本発明の治療的／予防的組成物は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液若しくは生理学的食塩水緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液中で処方し得る。
【０１１６】
Ｆ．抗体
本発明の組成物は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞を標的とする抗体を生じさせるのにもまた使用し得る。従って、他の局面において、本発明の組成物および方法は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する１種若しくはそれ以上の抗体を提供し、こうした抗体それら自身は、例えば、受動免疫若しくはエフェクターの標的特異的送達のような多くの用途、ならびに免疫学的結合に基づく診断試験およびキットのための用途を有する。従って、いくつかの態様において、本発明は治療的および／若しくは診断的応用で使用し得るＣＭＶに関連する癌細胞特異的抗体を提供する。
【０１１７】
本発明の抗体はスクリーニング若しくは診断の応用で使用し得る。本発明の抗体はｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ診断目的上貴重である。例えば、該抗体は、ウエスタンブロット、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、間接的免疫蛍光顕微鏡検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）などで使用し得る。一態様において、本発明はＣＭＶ抗原を発現する細胞の免疫学的決定方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されるところの最低１種の抗体と該細胞を接触させることを含んでなる。
【０１１８】
例えば、該抗体は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞の検出についてアッセイするための診断薬として使用し得る。本発明の抗体は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対するそれらの結合親和性を考えれば、診断薬としてとりわけ適するはずである。本質的に、細胞（例えば癌細胞）を含んでなるサンプルを、免疫学的相互作用が発生することを可能にするのに十分
な時間、抗体とともにインキュベートすることができる。当業者はこれらの基礎的手順に多くの変形が存在することを認識するであろう。これらの変形は、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈殿、凝集、補体固定および免疫蛍光を包含する。好ましくは、主題の抗体は抗体−細胞免疫複合体の検出を可能にするよう標識することができる。さらに、本発明の抗体は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出および定量のため、若しくは他の細胞の精製の一段階として混合された細胞の１集団からこうした細胞を殺しかつ排除するためにもまた有用である。
【０１１９】
抗体の標識されたバージョンの作成において使用される標識は、放射標識および蛍光色素のような直接検出されうる部分、ならびに検出されるために反応若しくは誘導体化されなければならない酵素のような部分を包含する。放射標識は、限定されるものでないが99Ｔｃ、203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、111Ｉｎ、113mＩｎ、97Ｒｕ、62Ｃｕ、641Ｃｕ、52Ｆｅ、52mＭｎ、51Ｃｒ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、169Ｅｒ、121Ｓｎ、127Ｔｅ、142Ｐｒ、143Ｐｒ、198Ａｕ、199Ａｕ、161Ｔｂ、109Ｐｄ、165Ｄｙ、149Ｐｍ、151Ｐｍ、153Ｓｍ、157Ｇｄ、159Ｇｄ、166Ｈｏ、172Ｔｍ、169Ｙｂ、175Ｙｂ、177Ｌｕ、105Ｒｈおよび111Ａｇを挙げることができる。放射標識は現在利用可能な計数手順のいずれによっても検出し得る。
【０１２０】
酵素標識は、現在利用されている比色、分光測光、蛍光分光測光若しくは気体定量技術のいずれによっても検出し得る。酵素は、カルボジイミド、過ヨウ素酸、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子を用いて抗体と結合する。これらの手順で使用し得る多くの酵素が既知でありかつ利用し得る。例は、ペリオキシダーゼ（ｐｅｒｉｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース酸化酵素およびペルオキシダーゼ、ガラクトース酸化酵素およびペルオキシダーゼ、ならびに酸ホスファターゼである。使用しうる蛍光物質は、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリア（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、ならびにグルコース−６−リン酸脱水素酵素を包含する。抗体は既知の方法によりこうした標識で標識しうる。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、ビス−ジアゾ化ベンザジン（ｂｅｎｚａｄｉｎｅ）などのようなカップリング剤を使用して、上述された蛍光、化学発光および酵素標識で抗体を標識しうる。多様な標識技術が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９７４），３２Ｂ，１０３；Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９７３），２８４，３７６２；およびＢｏｌｔｏｎとＨｕｎｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，（１９７３），１３３，５２９に記述されている。
【０１２１】
該抗体および標識された抗体は、被験体でＣＭＶ抗原を発現する細胞の存在を検出するため、または該被験体でのこうした細胞若しくは癌の状態をモニターするために、多様な免疫画像化若しくはイムノアッセイ手順で使用しうる。ＣＭＶ抗原を発現する細胞の状態をモニターするのに使用される場合、定量的イムノアッセイ手順を使用し得る。例えば、こうしたモニタリングアッセイを定期的に実施しかつ該結果を比較する場合、被験者の腫瘍負荷が増大したか若しくは減少したかに関する決定を行うことができ、該腫瘍はＣＭＶ関連腫瘍である。使用しうる一般的アッセイ技術は直接および間接アッセイを包含する。
【０１２２】
例えば、治療的応用の場合、疾患の進行に関与する標的を阻害する、若しくは標的細胞の細胞傷害死をもたらすために該抗体を使用し得る。また、こうした治療的抗体は、シグナル伝達経路を阻害、若しくは抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害などを誘発し得る。
【０１２３】
本発明の抗体は、従って、エフェクターに一過性に若しくは永続的に結合され得（それによりハイブリッド分子若しくはキメラ部分を形成する）かつそのエフェクターを特定の１標的細胞（例えば癌細胞）に向けるのに使用し得るがその必要はない、効果的標的化部分を提供する。
【０１２４】
該エフェクター分子は、標的細胞に特異的に輸送されるはずである分子若しくは分子の群を指す。エフェクター分子は、典型的に、標的細胞に送達されるはずである特徴的活性を有する。エフェクター分子は、限定されるものでないが細胞毒、標識、放射性核種（例えば211Ａｔ）、リガンド、抗体、薬物、リポソーム、エピトープ標識などを挙げることができる。好ましいエフェクターは、細胞毒（例えばシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ゲロニン、リシン、アブリン、ジフテリア毒素など）、本明細書に記述されるところの免疫調節物質、または細胞傷害性の薬物若しくはプロドラッグを包含し、この場合ハイブリッド分子は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞にサイトトキシンの標的を特異的に定める強力な細胞死滅剤として作用しうる。
【０１２５】
エフェクターのさらなる例は、限定されるものでないが、グランザイム、ルシフェラーゼ、血管内皮増殖因子、β−ラクタマーゼ、Ｔｒ−ａｐｏ−１、Ａｎｇ  ＩＩ、ＴＡＴ、アルキル化剤、ダウノマイシン、アドリアマイシン、クロラムブシル、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート）、モダシン（ｍｏｄａｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍａｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア  オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトコイン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｏｉｎ）、フェノマイシンおよびエノマイシンを挙げることができる。
【０１２６】
なお他の態様において、エフェクターは、薬物（例えばドキソルビシン、ビンブラスチン、タキソール（ｔａｘｏｌ）のような抗癌剤若しくは本明細書に記述される他の化学療法剤）を被包化するリポソーム、免疫系の成分による結合された細胞の認識を刺激する抗原、および免疫系の成分を特異的に結合しかつＣＭＶ抗原を発現する細胞にそれらを向ける抗体、などを包含し得る。
【０１２７】
他の適するエフェクター分子は、薬理学的剤、若しくは多様な薬理学的剤を含有する被包化系を包含する。従って、ハイブリッド分子の標的化分子は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に直接送達されるはずである薬物に直接結合しうる。こうした薬物は当業者に公知であり、そして限定されるものでないがドキソルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチセンス分子、本明細書に記述される多様な他の化学療法剤などを挙げることができる。
【０１２８】
あるいは、エフェクター分子は、薬物、核酸（例えばアンチセンス核酸）、若しくは循環系への直接曝露から好ましくは遮蔽されている別の治療的部分のような治療的組成物を含有するウイルスキャプシド、リポソーム若しくはミセルのような被包化系でありうる。抗体に結合されるリポソームの製造方法は当業者に公知である。例えば米国特許第４，９５７，７３５号明細書；Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．ら（１９８５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２８：３４１−３６５を参照されたい。
【０１２９】
Ｇ．ＣＭＶ核酸の測定
他の態様において、本発明は、被験体中のＣＭＶ核酸、好ましくは血液若しくは他の生物学的液体中のＣＭＶ  ＤＮＡを測定するための、例えば被験体から得られる血液のサン
プル中の無症候性ウイルス血症を決定するための組成物および方法を提供する。従って、多様な態様において、該組成物および方法は、例えば、前癌細胞、癌細胞、若しくはＣＭＶと関連する癌を発症する素因となる細胞型と関連する疾患若しくは状態の予防的および／若しくは治療的処置のような本明細書に記述される方法を包含する多様な診断および／若しくは治療的処置（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）および処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を企図している有効な診断、モニタリングおよび予後試験／アッセイを提供する。
【０１３０】
例として、同種骨髄移植（ａＢＭＴ）を受けるヒト患者でのＣＭＶ再活性化の決定、およびいくつかの場合には、現在使用されている臨床で承認されている診断的ＣＭＶ  ＰＣＲアッセイと比較して約６週先行するウイルス再活性化の検出において信頼できる増幅方法が提供される。本明細書に提供される実施例によってもまた具体的に説明されるとおり、外科的に切除されたＧＢＭ試料からのＣＭＶ  ＤＮＡを、例えばＨＣＭＶゲノム中のｇＢ遺伝子の可変領域（領域８２８０１−８４１８０、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１３４７）にわたるＰＣＲ増幅およびその後のＤＮＡ配列決定を使用して分析し得る。
【０１３１】
一態様において、本発明は被験体中のＣＭＶ核酸の測定方法を提供し、該方法は、（ａ）生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満であり；ならびに（ｂ）アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在が被験体中のＣＭＶ核酸を暗示する、を含んでなる。
【０１３２】
いくつかの態様において、該アンプリコンは長さが約１０００ｂｐを超えない、具体的には、長さが約９００ｂｐを超えない、約８００ｂｐを超えない、約７００ｂｐを超えない、約６００ｂｐを超えない、約５００ｂｐを超えない、約４００ｂｐを超えない、約３００ｂｐを超えない、約２００ｂｐを超えない、約１５０ｂｐを超えない、約１００ｂｐを超えない、約９０ｂｐを超えない、約８０ｂｐを超えない、約７０ｂｐを超えない、約６０ｂｐを超えない、約５０ｂｐを超えない、および約４０ｂｐを超えない。いくつかの態様において、該アンプリコンは長さが２００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満である。
【０１３３】
プライマー対およびそれらの対応する標的遺伝子の制限しない例を表１および２に示す。
【０１３４】
【表１−１】
2015134767.tif 000003
【０１３５】
【表１−２】
2015134767.tif 000004
【０１３６】
【表２−１】
2015134767.tif 000005
【０１３７】
【表２−２】
2015134767.tif 000006
【０１３８】
【表２−３】
2015134767.tif 000007
【０１３９】
一態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、ｇＢの一領域（例えばＵＬ５５）若しくはＭＩＥ遺伝子に対応するアンプリコンを提供するのに十分である。しかしながら、ＣＭＶ核酸のいずれかの領域に対応するアンプリコンを提供し得るいかなるプライマー対もまた本発明の範囲内にある。いくつかの態様において、本発明の使用のためのプライマーは配列番号８〜６３に示されるところのヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１４０】
別の態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号８により示されるところの第一プライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号９により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。他の態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号１０により示されるところの第一プライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号１１により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。
【０１４１】
別の態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号１６により示されるところの第一プライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号１７により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。一態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号３４により示されるところの第一のプライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号３５により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。
【０１４２】
他の態様において、本発明は被験体中のＣＭＶ核酸の測定方法を提供し、該方法は、（ａ）生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることを含んでなり、増幅することは、表２に示されるところの最低一対のプライマーおよび最低１種の対応するプローブと該核酸分子を接触させることを含んでなる。一態様において、該プライマー対は配列番号６７および６８として示される配列を有し；ならびに対応するプローブは配列番号６９として示される配列を有する。
【０１４３】
いくつかの態様において、被験体中のＣＭＶ核酸の測定方法は、生物学的サンプルを急速凍結にかけることをさらに含んでなる。急速凍結法は当該技術分野で公知であり、そして、例えば液体窒素若しくはアルコール／ドライアイス（例えばＭｅＯＨ／ドライアイス）中で急速凍結することを包含する多様な試薬および技術を使用して実施し得る。
【０１４４】
好ましくは、方法は急速凍結の段階後に核酸を濃縮することをさらに含んでなる。一態様において、濃縮する段階は、核酸を沈殿させること、次いで急速凍結の段階を含んでなる。別の態様において、沈殿させることは核酸をアルコールと接触させること（例えばＥｔＯＨ沈殿）を含んでなる。
【０１４５】
なおさらなる態様において、アンプリコンの存在を決定する段階は、アンプリコンのいずれかの適する検出方法、例えば、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのもの最低１０倍の検出感度を有することを特徴とする検出方法により実施する。
【０１４６】
他の局面において、本発明は細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
（ａ）被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満であり；
（ｂ）アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在は該被験体中のＣＭＶ核酸を暗示し；ならびに
（ｃ）最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を該被験体に投与することであって、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する
を含んでなる。段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は上述されるとおりである。
【０１４７】
別の局面において、本発明は細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
（ａ）被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満であり；
（ｂ）アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在は該被験体中のＣＭＶ核酸を暗示し；ならびに
（ｃ）有効量の抗原提示細胞、Ｔリンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を該被験体に投与することであって、該抗原提示細胞およびＴリンパ球は感作有効量の最低１種のＣＭＶ抗原でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作されており、抗原提示細胞、Ｔリンパ球若しくは双方の該有効量は、該ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、を含んでなる。
【０１４８】
一局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞の増殖若しくは広がりの低減若しくは阻害方法を提供し、該方法は、
（ａ）被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満であり；
（ｂ）アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在は該被験体中のＣＭＶ核酸を暗示し；ならびに
（ｃ）治療的若しくは予防的有効量の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与して該被験体での該細胞の増殖若しくは広がりを低減若しくは阻害すること
を含んでなる。段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は上述されるとおりである。
【０１４９】
なおさらなる局面において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞を有する被験体を処
置することの治療的有効性のモニタリング方法を提供し、該方法は、
（ａ）該被験体からの第一の生物学的サンプル中でＣＭＶ核酸の第一の量を測定することであって、測定することは、該生物学的サンプルからの核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることを含んでなり、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満であり、該アンプリコンの存在が該被験体中のＣＭＶ核酸を暗示し；
（ｂ）被験体を処置すること；
（ｃ）適する期間の後に、該処置された被験体から得た第二のサンプル中のＣＭＶ核酸の第二の量を測定すること；ならびに
（ｄ）第一の量を第二の量と比較することであって、該第一の量と該第二の量の間の差違は該処置の有効性を暗示する、
を含んでなる。
【０１５０】
いくつかの態様において、段階（ｂ）の処置することは、治療若しくは予防量の上述されたところの製薬学的組成物を被験体に投与することを含んでなる。
【０１５１】
他の態様において、本発明は、ＣＭＶ抗原を発現する細胞に対する活性を有する製薬学的剤を決定することに向けられるアッセイを提供し、該方法は、
（ａ）被験体からの第一の生物学的サンプル中でＣＭＶ核酸の第一の量を測定することであって、測定することは、該生物学的サンプルからの核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることを含んでなり、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約１０００塩基対（ｂｐ）若しくはそれ未満であり、該アンプリコンの存在が該被験体中のＣＭＶ核酸を暗示し；
（ｂ）該被験体を該製薬学的剤で処置すること；
（ｃ）適する期間の後に、処置された被験体から得た第二のサンプル中のＣＭＶ核酸の第二の量を測定すること；ならびに
（ｄ）第一の量を第二の量と比較することであって、該製薬学的剤は、該第二の量が該第一の量未満である場合に該細胞に対する活性を有する、
を含んでなる。
【０１５２】
ＩＩＩ．キット
本発明の組成物は単位投薬量若しくはキットの形態で供給し得る。キットは、個別の容器中で提供される製薬学的に許容できる組成物若しくはそのワクチンの多様な成分、ならびに化学療法剤を包含する多様な他の有効成分若しくは剤を含み得る。例えば、該容器は、キットの他の成分と一緒に組合せられる場合に単位投薬量若しくは複数剤形の製薬学的に許容できる組成物を構成するような、最低１種のＣＭＶ抗原若しくは該最低１種のＣＭＶ抗原をコードする核酸を個別に含み得る。好ましいキットは、少なくとも、個別の容器中に、抗原（例えば最低１種のＣＭＶ抗原若しくはそれらをコードする核酸）の供給源；および１種若しくはそれ以上のアジュバント（例えばサイトカイン）を含んでなる。該キットは、生理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤を別個の容器中にさらに含み得る。場合によっては、該キットはナノ粒子若しくはトランスフェクション試薬のような送達剤をさらに含み得る。本発明の包装された組成物およびキットは、貯蔵、調製および投与のための説明書もまた包含し得る。本発明の１種若しくはそれ以上の核酸プライマーは、場合によっては、好ましくは１個若しくはそれ以上の個別の容器中で提供されて該キットに包含される。
【０１５３】
本発明は実施例によってより詳細に具体的に説明されることができるが、しかし本発明は該実施例に制限されないことに注意されるべきである。
【０１５４】
実施例
【実施例１】
【０１５５】
ＨＣＭＶタンパク質は悪性神経膠腫中で発現される
ＨＣＭＶタンパク質が悪性神経膠種（ＭＧ）中で発現されたかどうか決定するため、われわれの脳腫瘍バンクから選択した４５個のＧＢＭ試料からのパラフィン切片を免疫組織化学（ＩＨＣ）により検査した。
【０１５６】
ヒトＧＢＭ、乏突起神経膠腫、髄膜腫、上衣腫および正常脳の外科的試料をパラフィンブロック中で得た（施設内審査委員会［ＩＲＢ］の承認を伴う）。腫瘍試料は、診断にのみ基づいてデューク組織バンク（Ｄｕｋｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ）のプレストン・ロバート・ティッシュ脳腫瘍センター（Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｔｉｓｃｈ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から要求した。神経病理医により確認された合計４５のＧＢＭ症例を選択した（３６例の原発性ＧＢＭおよび９例の再発性ＧＢＭ）。該群は５１歳の年齢の中央値を伴う２６例の男性および１９例の女性よりなった。試料を薄片にし（６μｍ）かつ内因性ペルオキシダーゼについて阻害し（３％Ｈ２Ｏ２、１２分間）、そしてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の添加前にＦｃ受容体阻害剤とともにインキュベートした（２０℃で１０分；Ｉｎｎｏｖｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州リッチモンド）。ＩＨＣは、以下のｍＡｂ、すなわち抗ＩＥ１−７２（２５倍；ＢｉｏＧｅｎｅｘ）、抗ｐｐ６５（３０倍；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、英国ニューカッスル・アポン・タイン）および抗平滑筋アクチン（１５倍；ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を用いる３段階のワサビペルオキシダーゼ検出系（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、米国カリフォルニア州サンラモン；Ｄａｋｏ、米国カリフォルニア州カーピンテリア；およびＩｎｎｏｖｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。抗体パラメータ（例えば後固定、回収およびインキュベーション時間）は、色素源としてＤＡＢ（Ｉｎｎｏｖｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して各ｍＡｂについて確立した。新たに切除されたＧＢＭ試料から１４ないし２１日間樹立した初代神経膠腫培養物を固定し、そして冷メタノールを使用して透過処理し、次いで１０％中性緩衝ホルマリンで１０分間後固定した。非特異的結合の阻害を、ビオチンブロックおよびアビジンブロック（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）ならびにＦＣ受容体阻害（Ｉｎｎｏｖｅｘ）を使用して実施した。アイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）、ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）、ｐｐ２８抗体（Ｖｉｒｕｓｙｓ、米国メリーランド州サイクスビル）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ；Ｖｉｒｕｓｙｓ）およびＨＩＶ  ｐ１７（Ｖｉｒｏｇｅｎ、米国メリーランド州ウォータータウン）を使用する一次抗体とのインキュベーションを４℃で２時間若しくは一夜実施し（１μｇ／ｍｌ抗体濃度）、そしてＢｉｏＧｅｎｅｘの３段階ワサビ検出系を使用して検出を実施した。
【０１５７】
検出はＨＣＭＶにコードされる抗原ＩＥ１−７２に特異的なｍＡｂを使用して実施した。ＩＥ１−７２の免疫反応性はＩＨＣにより検査される４５種の試料のうち４２種（９５％）で検出された。強い核および細胞質染色が腫瘍細胞およびときに内皮細胞で同様に検出された（図１）。しかしながら、浸潤リンパ球および周囲の正常脳領域はＩＥ１−７２抗体に対する免疫反応性を欠いた。ＨＣＭＶの特異的検出をさらに確認するため、４５症例の３３例をＨＣＭＶマトリックスタンパク質ｐｐ６５に特異的なｍＡｂに対する反応性について検査した。３３症例の３０例（９１％）は腫瘍細胞中でｐｐ６５について免疫反応性であったが、しかし隣接する正常脳領域ではそうでなかった。ｐｐ６５の反応性は全般として腫瘍細胞中のＩＥ１−７２検出より少なく偏在性であったが、しかし検査した全試料中の腫瘍細胞の大多数はｐｐ６５抗体に対する免疫反応性を表した（図１；表３）。
【０１５８】
【表３】
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【０１５９】
腫瘍細胞中の非特異的検出の可能性を除外するため、ＩＨＣを、アイソタイプおよび濃度を一致させた対照ｍＡｂを用いて腫瘍切片で実施した。ＨＣＭＶ特異的ｍＡｂと同一濃度で使用したアイソタイプを一致させた対照抗体は、腫瘍細胞内で免疫反応性を示さず、ならびに、平滑筋アクチンに対するアイソタイプを一致させたｍＡｂは、腫瘍および正常脳切片内の血管に対する反応性を示した（図１Ａ）が、しかし腫瘍細胞との反応性は示さなかった。髄膜腫（ｎ＝５）、上衣腫（ｎ＝５）および乏突起神経膠腫（ｎ＝５）の検査結果は、ＩＥ１モノクローナル抗体を用いて乏突起神経膠腫の単一症例で観察された限局性内皮染色を除き、ＩＥ１およびｐｐ６５の検出について陰性であった（表３）。
【実施例２】
【０１６０】
悪性神経膠腫試料中のＨＣＭＶのＰＣＲ検出
図２に示されるとおり、１１／１３の高悪性度ＭＧ（９／１１ＧＢＭＳ、２／２ＡＡｓ）でのｇＢのＰＣＲ増幅を実施した。４０周期のＰＣＲをｇＢ特異的プライマーを使用して実施して１２２ｂｐの産物を増幅した。ＨＣＭＶ  ｇＢは３２種の陽性サンプルの１７種で配列確認された。
【実施例３】
【０１６１】
ＣＭＶ抗原は前悪性病変中に存在する
前悪性結腸直腸ポリープの約７５％以上および結腸の腺癌の約８０％以上での（しかし隣接する非腫瘍性結腸生検サンプルではない）ＣＭＶ  ＩＥ１およびｐｐ６５タンパク質の存在が示されている（例えばＨａｒｋｉｎｓら、Ｌａｎｃｅｔ，３６０：１５５７（２００２）を参照されたい）。さらに、低悪性度神経膠腫（頻繁に高悪性度病変に進行する）の約４８％でのＣＭＶの存在が示されている（例えばＳｃｈｅｕｒｅｒら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｉｏｍａｓ，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，２００８年３月２０日電子出版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい）。従って、本発明の組成物および方法は、前腫瘍性、低悪性度および／若しくは前悪性病変ならびに腫瘍性疾患への進行を予防若しくは処置するためにもまた提供され得る。
【実施例４】
【０１６２】
自己ＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏ生成
白血球アフェレーシス生成物（ＬＰ）バッグの内容物を１Ｌ滅菌コーニング（ｃｏｒｎｉｎｇ）瓶に入れ、そして等量のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を添加してＬＰを希釈した。遠心管を使用して、２０ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅTM（Ｓｉｇｍａ  ＃１０７７−１）を３０ｍＬの希釈したＬＰで穏やかに覆い、その後１３００×ｇで２５分間回転した。界面（管あたり１界面）を取り出し；ＰＢＳを５０ｍＬまで添加し；そして細胞を５００×ｇで室温（ＲＴ）で５分間ペレットにした。上清をデカンテーションし、そしてペレットを５０ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁し、その後上のとおりペレットにした。上清をデカンテーションし、そして２個のペレットを５０ｍＬ  ＰＢＳ中で合わせ、その後上のとおりペレットにした。再度、上清をデカンテーションし、そして２個のペレットを５０ｍＬ
ＰＢＳ中で合わせ、その後上のとおりペレットにした。細胞の全部が１本の管に合わせられるまで、ペレットを合わせかつＰＢＳで洗浄した。
【０１６３】
トリパンブルー排除を実施して、血球計算器の助けを借りてを介して生存および死細胞の数を決定した。細胞を、２％ヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＃ＨＰ１０２２）を含むＡＩＭ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃８７０１１２ｄｋ）に１ｍＬあたり２×１０8で再懸濁した。２％ＨＡＢＳを含有する２９ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地および１ｍＬのＰＢＭＣ細胞懸濁液をＴ−１５０細胞培養フラスコに添加した。全部の細胞培養フラスコを３７℃、５％ＣＯ2の単一の専用加湿インキュベーターに２時間入れて単球前駆細胞を接着させた。接着期間の後に、非接着細胞を除去し、そして残存する単層をＰＢＳで１回洗浄した。接着細胞に、８００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および５００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２０４−ＩＬ／ＣＦ）を補充したフラスコあたり３０ｍｌのＡＩＭ−Ｖを補給し、そして３７℃、５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中で７日間インキュベートした。
【０１６４】
７日の培養期間後に接着性ＤＣを冷ＰＢＳで洗浄した。１０ｍｌの無酵素解離緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５０−０１６）を添加し、そしてＤＣを４℃で１０分間インキュベートした。接着性ＤＣの残りをフラスコから洗い流し、そして以前に収集したＤＣと合わせ、その後５００×ｇで４℃で１０分間ペレットにした。冷ＰＢＳでの１回の洗浄後に、細胞を数および生存率について確認した。
【実施例５】
【０１６５】
樹状細胞のＲＮＡ負荷および成熟
上述されたとおり生成させた樹状細胞を、１ｍＬのＶｉａＳｐａｎ（Ｂｅｌｚｅｒ  ＵＷ−ＣＳＳ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、デラウェア州ウィルミントン）あたり２．５×１０7細胞で再懸濁した。２００μＬの懸濁液をその後、１０μｇのｐｐ６５  ＲＮＡと一緒にキュベット（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＃１６５−２０８６）に入れ、そして細胞を３００ボルトで５００マイクロ秒間電気穿孔した（ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  ＃ＥＣＭ８３０）。およそ１×１０8の電気穿孔した細胞を、８００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および５００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２０４−ＩＬ／ＣＦ）を補充した５０ｍＬのＡＩＭ  Ｖを含有するＴ２２５フラスコに移し、その後３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、成熟化サイトカインを含む適切な量の培地を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２１０−ＴＡ／ＣＦ）；１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２０１−ＬＢ／ＣＦ）；および１０００単位／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２０８−ＩＬ／ＣＦ）の成熟化カクテル中のサイトカインの最終濃度まで添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ2で一夜インキュベートした。
【０１６６】
成熟期間の終了時に、上清を取り出しかつ氷上の冷却した５０ｍｌコニカルチューブに入れた。残存する単層を氷冷ＰＢＳで洗浄し；上清と合わせ；その後４℃で５００×ｇで５分間ペレットにした。ペレットを１０ｍｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁しかつ氷上に保った。１０ないし２０ｍｌの無酵素解離緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５０−０１６）を添加しかつ細胞を４℃に保ち、そして細胞剥離の進行を５分ごとにモニターした。フラスコを１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、解離緩衝液からの細胞と合わせ、そして５００×ｇを使用してペレットにした。細胞を他の細胞と合わせ、そして５０ｍｌに合わせかつ計数した。
【実施例６】
【０１６７】
ワクチン接種のための樹状細胞の調製
５０ｍＬコニカル遠心管および２５ｍｌのＰＢＳ中の成熟抗原負荷樹状細胞をゆっくりと添加し、その後細胞を２２℃で２００×ｇで５分間ペレットにした。細胞を１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして２ｍｌピペットを使用して懸濁液のサンプル１００μｌを取り出し、そして細胞を上述されたとおり血球計算器およびトリパンブルーを使用して計数した。細胞は処理する前に７０％以上が生存可能であることが確認された。細胞を２２℃で５００×ｇで５分間ペレットにし、そして０．９％塩化ナトリウム中５×１０4細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を２５Ｇ  ５／８ゲージ針を伴う１ｃｃシリンジに負荷した。サンプルは投与前にグラム染色および内毒素試験に送った。
【実施例７】
【０１６８】
ＣＭＶ  ｐｐ６５−ＬＡＭＰ  ＲＮＡを負荷したＤＣを使用する新たに診断されたＧＢＭを伴う被験体のワクチン接種
新たに診断されたＧＢＭを伴う２５例の患者（各ランダム化群で３例以上のＣＭＶ血清陽性患者を含む）を切除６週以内に登録する。１用量レベルのＤＣ（２×１０7）および１用量レベルのＡＬＴ（３×１０7／ｋｇ）のみ評価する。その後の試験で用量を増加することの決定は、この試験で得られる安全性および免疫学的応答の分析に依存する。患者は死亡まで追跡する。該試験は、いずれかの群のいずれか２例の患者が薬物関連のグレードＩＶ若しくは無関係のグレードＩＩＩの毒性を経験する場合に中止する。全患者がＡＬＴおよびＤＣの生成のためのＰＢＬの収集のため切除後に白血球アフェレーシスを受ける。図３はワクチン接種プロトコルを図解する。
【０１６９】
患者は放射線治療（ＲＴ）および７５ｍｇ／ｍ2／日という標準標的化用量の同時のＴＭＺを受領する。放射の間に進行性疾患を伴いかつワクチン接種の時点で生理学的レベルより上のステロイド補充に依存し、ＴＭＺに耐えることが不可能であり、ならびにそのＤＣ若しくはＰＢＬが放出基準に合致することに失敗する患者は置き換える。残存する患者はその後、ＲＴを完了した３±１週後に２００ｍｇ／ｍ2／日という標準標的化用量のＴＭＺの最初のサイクルを５日間受領し、そしてＡＬＴを受領するか若しくはＤＣワクチン＃１と同時に受領しないようにランダム化する。ＤＣは皮内に投与し、そして双方の鼠径部領域に等しく分割する。ワクチン＃２および＃３は２週間隔で発生する。全患者は、基礎抗原特異的細胞性および体液性免疫応答の特異的評価を含む免疫学的モニタリングならびさらなるＤＣ生成のため、ワクチン＃３の４±２週後に再度白血球アフェレーシスを受ける。患者はその後、ＲＴ後に５±１週ごとに合計６周期のその後のＴＭＺサイクルとともに毎月ワクチン接種する。ＴＭＺは第１〜５日に投与し、ＤＣは第２１±７日に投与する。ＤＣワクチン接種はＴＭＺ周期が終了した後に継続する。
【０１７０】
患者は、いずれかの他の処方された抗腫瘍療法を受領することを伴わずに２か月に１回画像撮影し、そして進行までワクチン接種を継続する。患者は、ワクチン接種を継続することが必要とされる場合はＤＣの生成のため追加の白血球アフェレーシスを受ける。ワク
チン＃４で、患者を鼠径部部位の多様な皮膚準備（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）にランダム化し、そしてＤＣ移動に対する多様な皮膚準備の影響を比較するために111Ｉｎ標識ＤＣを受領する。進行が発生する場合に、患者は、ＤＣ移動に対する異なるワクチン接種部位の影響を比較するため、鼠径部領域および顎角部（ａｎｇｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｗ）に両側で111Ｉｎ標識ＤＣを用いる最後の皮内ワクチン接種を受領する。これらの患者の標準治療の一部として、腫瘍進行に際し、参加者は定位生検若しくは切除を受けてもよい。これは研究処置でないため同意は別個に得る。しかしながら、組織が得られる場合、それを使用して腫瘍進行を組織学的に確認しかつ腫瘍部位の免疫学的細胞浸潤およびｐｐ６５抗原エスケープを評価する。
【０１７１】
試験の組み入れ基準は、年齢１８歳超；いずれかの軸方向面で最大径１ｃｍ未満の切除後ＣＴ若しくはＭＲＩ上の残存Ｘ線撮影コントラスト増強を伴う、登録前６週以内の決定的切除を伴うＧＢＭ（ＷＨＯグレードＩＶ）：ならびに８０％超のカルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）およびＩ〜ＩＶのＣｕｒｒａｎグループ・ステータスを包含する。
【０１７２】
試験の除外基準は、ワクチン接種前のいずれかの時点での髄軟膜若しくは多中心性疾患のＸ線検査若しくは細胞学的エビデンス；ステロイド、ＲＴ若しくはＴＭＺ以外の以前の慣習的抗腫瘍療法；試験期間の妊娠若しくは授乳の必要性（陰性のβ−ＨＣＧ試験が必要とされる）；最初のワクチン接種の時点で生理学的レベルより上の継続的コルチコステロイドの要件；処置を必要とする活動性感染症若しくは原因不明の発熱性（１０１．５°Ｆ超）疾患；既知の免疫抑制性疾患若しくはヒト免疫不全ウイルス感染症；重度の心若しくは肺疾患のような不安定性若しくは重篤な併発性の医学的状態を伴う患者；ＴＭＺに対しアレルギー性、若しくはリンパ球減少以外の理由でＴＭＺに耐えることが不可能；または以前の鼠径部リンパ節郭清を伴う患者を包含する。
【０１７３】
研究的である例示的処置は；ＤＣおよびＡＬＴでの生成のための白血球アフェレーシス；抗原を負荷したＤＣでの皮内免疫化；ＡＬＴ；111Ｉｎ標識抗原を負荷したＤＣでの皮内免疫化およびＳＰＥＣＴスキャン；ならびに標準的リコール抗原ならびに抗原を負荷したおよびナイーブなＤＣでのＤＴＨ試験を包含する。
【０１７４】
標準的治療活動とみなされるプロトコル関連の活動は、外照射療法；テモゾロミド（ＴＭＺ）；ＭＲＩ；および再発時の生検を包含する。
【０１７５】
患者は、注入反応を予防するためのベナドリル（Ｂｅｎａｄｒｙｌ）２５〜５０ｍｇおよび６５０ｍｇのタイレノール（Ｔｙｌｅｎｏｌ）での前投薬後に（あなたの静脈中に留置されたカテーテルを通して）彼ら自身のリンパ球を静脈内で受領する。輸血は重量および受領される細胞の数に依存して４５ないし９０分にわたり受領される。感染症の危険性の確率は、小さい注入容量（２箇所を超える皮内部位の間で分割される１ｍＬ）およびＤＣが各注入の前に無菌性について厳格に試験されるという事実を考えれば比較的低い。実験室でのＤＣの潜在的汚染による感染の危険性は、バイオセイフティー品質保証および試験により最小化される。全部の細胞培養物はヒト細胞の処理専用の中核組織培養施設で無菌条件下で取り扱う。患者への注入前に、ＤＣは、チグリコレート（ｔｈｉｇｌｙｃｏｌａｔｅ）ブロス、トリプティックソイ血液寒天、および阻害性サブロー寒天での無菌性試験に合格する。注入後、患者を感染症のいかなる徴候および症状についても試験の経過を通してモニターする。活動性の感染症が疑われる場合は、患者を培養しかつ適切な抗生物質で処置する。
【０１７６】
患者のＤＣは相関試験のため111Ｉｎで放射標識する。患者および医療スタッフへの放射線曝露は提案される用量で最少であり、そしてデンバーのような高い標高の都市で１３
日間生活すること、またはニューヨーク若しくはロサンゼルスから４回飛行機で飛行することにほぼ等しい。従って特別な放射線予防措置は取られない。ＳＰＥＣＴ画像を分析のために得る。
【０１７７】
ＭＲＩの間、患者に造影剤を投与する。該剤は脳の強調ＭＲＩスキャンを得るために慣例に投与される。該剤は静脈を通して投与し、そしてＩＶカテーテルの留置を必要とする。カテーテル留置は、該剤が活発に送達される時間、カテーテルが静脈中に留まることを除き、採血することに同様である。
【実施例８】
【０１７８】
腫瘍増殖停止期間（ＴＴＰ）はＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣで処置される新たに診断されたＧＢＭを伴う患者について増加する
ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いる７日培養により白血球アフェレーシスからｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した。ＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成のため、ＰＢＭＣを白血球アフェレーシスにより得そして細胞処理施設に輸送した。白血球アフェレーシスのための十分な静脈アクセスを伴わない患者については、一時的静脈内カテーテルを挿入した。
【０１７９】
ＤＣを生成するための７日インキュベーションの終了時に、マイコプラスマ試験のため培地のサンプルを採取し、そして細胞をその後収集しかつｐｐ６５−ＬＡＭＰ  ｍＲＮＡ（百万ＤＣあたり２マイクログラムのＲＮＡ）で電気穿孔した。ＤＣを、成熟化のため、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４＋ＴＮＦ−α＋ＩＬ−６＋ＩＬ−１βを含むＡＩＭ  Ｖ培地を含むフラスコに３７℃、５％ＣＯ2で１８〜２０時間置いた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして、１℃／分の速度の制御された速度の冷凍庫中で９０％自己ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、バージニア州ウィンチェスター  ２２６０２）、１０％ＤＭＳＯおよび５％グルコース中５×１０6細胞／ｍＬで凍結させた。ＤＣをその後必要とされるまで−１３５℃で保存した。凍結した後に細胞のアリコートを融解し、そして好気性および嫌気性細菌培養（１×１０6ＤＣ）ならびに真菌培養（１×１０6ＤＣ）のため送付した。
【０１８０】
各ワクチン接種のため、ＤＣを３７℃で迅速に融解し、ＰＢＳで３回洗浄し、生存率を評価しかつ計数した。進めるために７０％以上の細胞生存率を得た。細胞濃度を４×１０7細胞／ｍＬに調節し、そしてＤＣを保存剤を含まない生理的食塩水に再懸濁しかつ２７ゲージ針を伴う無菌ツベルクリンシリンジに入れた。
【０１８１】
全部のＤＣ調製物について、細胞のサンプルをグラム染色および内毒素試験のため投与前に送付した。ＤＣワクチン接種は、内毒素試験に合格し（５．０Ｅ．Ｕ．／ｋｇ未満）かつグラム染色が陰性となるまで与えなかった。細胞のアリコートは好気性および嫌気性細菌培養（１×１０6ＤＣ）ならびに真菌培養（１×１０6ＤＣ）のためにもまた送付した。
【０１８２】
自己ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣを使用するフェーズＩ／ＩＩ臨床試験を開始した。この試験は、肉眼的全摘出（９５％超）、次いで標準的外照射療法（６０Ｇｙ）および同時のＴＭＺ（７５ｍｇ／ｍ2／日）を６週間、次いで月５日のＴＭＺ（１５０〜２００ｍｇ／ｍ2／日）を６周期受けた、新たに診断されたＧＢＭを伴う２１患者を登録した。５例の患者は放射線照射中に進行しそしてプロトコルに従って（ｏｎ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ）処置しなかった。２例の患者は救済使用でプロトコルに従わず（ｏｆｆ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ）処置した。外科的切除後かつＴＭＺの開始前に収集した白血球アフェレーシスを使用してＤＣを生成し、そしてｐｐ６５  ＲＮＡで電気穿孔した自己ＤＣ（２×１０7ＤＣ
ｉ．ｄ．）を、最初のＴＭＺ周期後最初の３用量について２週ごと、およびその後月１回各周期の第２１日に投与した。患者を腫瘍進行についてＭＲＩ（２か月ごと）によりモ
ニターし、また、血液を免疫学的モニタリングのため毎月収集した。対照は、ＭＤアンダーソン（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ）データベース由来のＡＴＴＡＣ試験に登録した患者と同一の適格性基準と年齢、予後因子を一致させている。
【０１８３】
結果を図４に示す。２１か月の経過観察で、１６例の患者の１３例が、１２．５か月のＴＴＰ中央値を伴い生存しており（範囲  手術後７．６か月ないし２か月）、また、全体生存中央値は達成されていないがしかし２０．１か月より長く、これは既存対照被験者と比較して高度に好都合である（例えばＳｔｕｐｐら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：９８７（２００５）を参照されたい；フェーズＩＩＩのＴＭＺ／ＸＲＴ＋アジュバントＴＭＺのＴＴＰ中央値は７．１か月、および、生存中央値は１４．６か月である）。
【実施例９】
【０１８４】
全体生存はＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣワクチンで処置したＧＭＢ患者について増大する
同時の連日のＴＭＺ（７５ｍｇ／ｍ2／日）を伴うＲＴの完了後に、患者を、ＤＣワクチン接種のみを受領するもの、および最初のＤＣワクチン接種と一緒にＡＬＴを受領するものにランダム化した。ランダム化はＣＭＶ血清学の状態により層別化し、そして、割り当ては、乱数発生器を使用して試験統計学者により準備された連続的な封止された封筒のプールから行った。ＤＣワクチン接種は最初の５日周期（第１〜５日）のＴＭＺ（２００ｍｇ／ｍ2）と一緒に開始した。ＴＭＺ周期の第２１±２日に、双方の患者群が、２×１０7のｐｐ６５−ＬＡＭＰ  ｍＲＮＡを負荷した成熟ＤＣを用いる合計３回の免疫化のため、２週ごとに皮内免疫化を受領した。各免疫化は双方の鼠径部領域に等しく分割した。側あたり総容量２００μＬを皮内に送達した（ＳＯＰ−ＪＨＳ−ＨＤＣ−ＣＬ−０１２  “Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ
Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（樹状細胞の皮内投与手順）”）。該手順の詳細は適切な形態で記録した（ＦＯＲＭ−ＪＨＳ−ＨＤＣ−ＣＬ−０１２）。注入は１．５インチ２５ゲージ針を使用して実施した。患者は、いずれかの副作用の発生について免疫化後３０分ないし１時間診察室でモニターした。該免疫化処置は、二次救命処置（ＡＣＬＳ）コースを終了した看護師若しくは医師により監督された。重度のアレルギー反応の場合にはこれらの免疫化を実施する場合にすぐ近傍で心蘇生カートが利用可能であった。初期の３回のワクチンは各２±１週間隔で投与した。
【０１８５】
第３のワクチン後、患者は免疫学的モニタリングおよびＤＣ生成のため４時間の白血球アフェレーシスを受けた。その後、患者を５±１週ごとに送達したＴＭＺの各周期の第２１±２日に免疫化した。従って、放射線照射とともに投与した同時のＴＭＺ（７５ｍｇ／ｍ2／日）に加え、合計６追加周期のＴＭＺ（２００ｍｇ／ｍ2／第１〜５日）を投与した。
【０１８６】
ＴＭＺ周期が進行を伴わずに終了した場合は、ＤＣワクチン接種を、いずれの追加の処方される抗腫瘍療法も伴わない臨床的若しくはＸ線検査的進行まで５±１週ごとに継続した。その期間、患者を、各来院時の慣例の身体および神経学的検査ならびにＭＭＳＥ試験、ならびに８±４週ごとの造影剤で強調したＣＴ若しくはＭＲＩで臨床的にモニターした。末梢血を各来院時に良好な免疫学的モニタリングとして得た。
【０１８７】
フェーズＩＩランダム化プロスペクティブ臨床試験を、ｐｐ６５−ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞（ＤＣ）を使用して、新たに診断されたＧＢＭを伴う患者で、免疫優性のＣＭＶ外皮タンパク質ｐｐ６５の免疫原性およびそれに標的化すること有効性を評価するために開始した。切除および同時のＴＭＺ（７５ｍｇ／ｍ2／日）を伴う放射線照射後に、患者は皮内ワクチン接種と同時のＴＭＺ（２００ｍｇ／ｍ2）のその後の毎月の周期を受領し、そしてワクチン接種前にＡＬＴ（３×１０7／ｋｇ）を受領するようランダ
ム化した。被験者は腫瘍進行のエビデンスが存在するまでワクチン接種を受領した。
【０１８８】
結果を図５に示す。２１例の患者が同意した。５例が放射線治療中に進行した。ワクチン関連の報告可能な重篤な有害事象（ＳＡＥ）は存在しなかった。しかしながら、ＴＭＺ療法は第一のＴＭＺ周期後に患者の７０％でグレード３のリンパ球減少（５００細胞／ｍＬ）を誘発した。ＴＭＺ後に、免疫抑制性調節性Ｔ細胞（ＴReg）（ＣＤ４+ＣＤ２５++ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ１２７-ＦＯＸＰ３+）レベルが、５．２％（３．３−７．５）から１１．８％（６．９−１３．８）に増大した（Ｐ＝０．０００４；両側ｔ検定）。１例のほぼ完全奏功が観察された。ＰＦＳの中央値は１２．５か月（ＣＩ95；１０．０、∞）であった。ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣワクチンで処置されたＧＢＭを伴う患者の全体生存は好ましい。６ＰＦＳ（１００％；１３患者の１３例）、１２か月生存（９２．３％；１３患者の１２例）および１５か月生存（９０％；１０患者の９例）は、同様の診断を伴う患者に好都合に匹敵する（例えば、Ｔｅｍｏｄａｒ(R)（６３．７週）（Ｓｔｕｐｐら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３５２：９８７（２００５）；およびＧｌｉａｄｅｌTM（５９．６週）（Ｗｅｓｔｐｈａｌら、Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．，５：７９−８８（２００３）を参照されたい）。全体中央値生存は１９．７か月以上である。図６に示されるとおり、ＧＢＭを伴う３３歳女性は、自己リンパ球移植と組み合わせたＣＭＶ  ｐｐ６５  ＲＮＡを負荷したＤＣワクチンに対するほぼ完全なＸ線検査の応答を有した。ＭＲＩは強調病変の減少、正中偏位の是正および神経学的症状の解消を示した。この患者はＧＢＭの初回外科切除後２１か月で健在なままであった。
【０１８９】
ＣＭＶ特異的多機能細胞性および体液性免疫応答の予備結果は、ＧＢＭを伴う患者がＣＭＶ特異的免疫不全を有することを示す（図７〜９）。
【実施例１０】
【０１９０】
抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞はＣＭＶ  ｐｐ６５抗原でパルスしたＤＣに応答してバルク培養物から分離し得る
抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のポリクローナル集団を同定かつ単離するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＲＮＡ電気穿孔法を、ＣＭＶの完全長ｐｐ６５抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで刺激したＴ細胞で実施した。
【０１９１】
樹状細胞生成、ペプチドおよびＲＮＡでの抗原負荷ならびに樹状細胞の成熟化：
これらの実験で使用した全部の細胞材料は、正常志願者、および悪性神経膠腫を伴う患者から、デューク大学施設内審査委員会の承認の下でインフォームド・コンセントを与えられた後に得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を白血球アフェレーシスにより得、そして３７℃でＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で１時間インキュベートしてプラスチックへの接着を可能にし、そしてその後、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（８００単位／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００単位／ｍｌ）を補充したＡＩＭ−Ｖ培地中で６日間培養した。未熟樹状細胞を第６日に収集し、洗浄しかつ２．５×１０7／ｍｌでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。ＤＣ培養物からの上清を後の使用のための馴化培地として取っておいた。細胞を２ｍｍキュベット中で電気穿孔した。すなわち、方形波形発生器（ＥＣＭ  ８３０  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ；ＢＴＸ、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓの一部門、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して３００Ｖで５００μ秒間、２００μｌのＤＣ（５×１０6細胞）。ＤＣは１０6細胞あたり２．５μｇのＲＮＡで電気穿孔した。細胞を馴化樹状細胞増殖培地および新鮮培地の１：１組合せを含有する６０ｍｍ組織培養ペトリ皿に移した。細胞を、ＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）、腫瘍壊死因子−α（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１５０ｎｇ／ｍｌ）およびプロスタグランジンＥ2（１μｇ／ｍｌ）で一夜成熟させた。ＩＬ−４、腫瘍壊死因子−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（
ミネソタ州ミネアポリス）から得；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はデューク大学メディカルセンター（ノースカロライナ州ダラム）の薬局からであり、そしてプロスタグランジンＥ2はＰｈａｒｍａｃｉａ（独国エルランゲン）からであった。ペプチド刺激のため、成熟樹状細胞を洗浄し、そして、１０μｇ／ｍｌ濃度のＨＬＡ−Ａ２拘束性免疫原性ヒトサイトメガロウイルスｐｐ６５ペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ｐｐ６５465-503）（配列番号１０９）（ＡｎａＳｐｅｃ、カリフォルニア州サンノゼ）を含む１：１の馴化培地および新鮮培地に再懸濁した。
【０１９２】
ｐｐ６５ペプチド若しくはｍＲＮＡでの樹状細胞のパルスおよびＴ細胞の活性化：
ＤＣはＨＬＡ−Ａ２+の正常志願者および悪性神経膠腫を伴う患者から生成し、そしてＡＩＭ−Ｖ培地−２％ヒトＡＢ血清中でｐｐ６５ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３時間パルスした。ｐｐ６５をコードするｍＲＮＡを負荷するため、ＤＣを洗浄し、そして電気穿孔のためＯｐｔｉ−ＭＥＭに再懸濁した。１×１０6ＤＣあたり完全長ＨＣＭＶ
ｐｐ６５をコードするｍＲＮＡ２マイクログラムをＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０で電気穿孔した。ＤＣを４５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地で１回洗浄し、そして自己レスポンダーリンパ球を１：１０の比（ＤＣ：Ｔ細胞）で添加した。容量を２×１０6細胞／ｍｌに調節し、そして５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中３７℃で細胞をインキュベートした。３日後に、２％プールヒトＡＢ血清およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）を含む等量のＡＩＭ−Ｖ培地を添加し、そして細胞を１ｍｌ／ウェルの容量で２４ウェルプレートに移した。その後、２〜３日ごとに細胞を増殖について評価しかつ１×１０6細胞／ｍｌに調節した。ｐｐ６５でパルスしたＤＣとの共培養の８ないし１１日後にＴ細胞を収集し、そしてＧＦＰをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した。あるいは、Ｔ細胞を、固定した抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ラリタン）を使用するポリクローナル刺激により刺激した（Ｔ−１５０フラスコ中リン酸緩衝生理的食塩水［ＰＢＳ］中２μｇ／ｍｌで一夜）。細胞をＣＤ３被覆プレート中２％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中でプレーティングし（１０6細胞／ｍｌ）、そして収集する前に３ないし５日間培養した。
【０１９３】
Ｔリンパ球の供給源：
非接着性（ＮＡ）細胞を、デューク大学施設内審査委員会の承認の下、情報を与えられた患者の同意が与えられた後に、悪性神経膠腫を伴う患者および正常志願者からのＰＢＭＣから生成した。末梢血からの単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配分離（ＬＳＭ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、オハイオ州ソロン）により単離した。
【０１９４】
ＤＣでパルスしたｐｐ６５ペプチドで刺激したＴ細胞のＧＦＰでの電気穿孔：
ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、以前に記述された（Ｚｈａｏら、Ｂｌｏｏｄ、１０２：４１３７（２００３））とおりＰＧＥＭ４Ｚ／ＧＦＰ／Ａ６４ベクター（Ｅ．Ｇｉｌｂｏａ、デューク大学メディカルセンターより恵与された）から製造した。ｐｐ６５ペプチドでパルスしたＤＣを使用して、上述されたとおり自己Ｔ細胞を刺激した。細胞を１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培地中に保ちかつ３７℃で７日間インキュベートした。電気穿孔のため、０．２ｍｌの細胞懸濁液（５×１０6）を１０μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＧＦＰ  ｍＲＮＡと混合した。該混合物を、電気穿孔装置を使用して０．４ｃｍキュベット（ＥｑｕｉＢｉｏ；ＰＥＱＬＡＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、独国エルランゲン）中３００Ｖおよび１５０Ｍｆで電気穿孔した。電気穿孔後に細胞を２％ヒトＡＢ血清を補充した新鮮ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養しかつ一夜インキュベートした。電気穿孔の２４時間後に細胞を収集し、そしてＣＤ８およびＨＬＡ−Ａ２四量体陽性について染色しかつフローサイトメトリーにより分析した。
【０１９５】
分取したＴ細胞の増殖：
上述されたと同一の刺激および電気穿孔法を使用して、ＧＦＰ陽性および陰性のＴ細胞
をトランスフェクション２４時間後にＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で分取した。細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充したＡＩＭ−Ｖ培地に入れて増殖を可能にした。生存細胞を、第０、７、１０、１４および１７日に光学顕微鏡検査およびトリパンブルー色素排除を使用して計数した。
【０１９６】
抗ＣＤ３で活性化したＴ細胞でのＧＦＰ発現：
電気穿孔４８〜９６時間前の固定した抗ＣＤ３抗体でのＴ細胞の刺激は、フローサイトメトリーにより分析されるとおりＴ細胞の６０〜７０％で高レベルのＧＦＰ発現をもたらした（図１０Ａ）。
【０１９７】
ＧＦＰのＲＮＡ電気穿孔を使用するＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の選択：
効率的なＲＮＡトランスフェクションのためのＴ細胞活性化の要件は、大量の刺激されたＰＢＭＣ培養物内の抗原特異的Ｔ細胞の同定を見込むことができる。抗原特異的Ｔ細胞でのＲＮＡ電気穿孔の効率を測定するため、ＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ｐｐ６５ペプチドでパルスした自己ＤＣで７日間刺激した。第７日の刺激した培養物をＧＦＰ  ＲＮＡで電気穿孔し、そして、ＧＦＰの発現をＨＬＡ−Ａ２  ｐｐ６５四量体を使用して抗原特異的および非特異的Ｔ細胞で検査した。前方および側方散乱ゲーティングは、芽球様の形態の活性化されたリンパ球細胞を示した（図１１、上左）。ＧＦＰ発現は全ＣＤ８＋  Ｔ細胞のおよそ２５％で示され（図１１、上右）、また、四量体分析は、発現がｐｐ６５特異的Ｔ細胞にほぼ独占的に制限されたことを示した（図１１、下右）。ＧＦＰタンパク質を発現するＴ細胞のうち、９７％が四量体染色によりｐｐ６５特異的と同定された。さらに、全四量体陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の９８％以上がＧＦＰタンパク質を発現し、ＲＮＡトランスフェクションが、抗原で刺激されたＴ細胞に制限されたことのみならず（優れた特異性を示す；９７．４０％）、しかしこの方法はまた関連するレスポンダーＴ細胞の全部を効率的に同定した（抗原特異的Ｔ細胞を同定するための高感度を示す；全部の関連細胞を同定するための８９．７７％の感受性）ことも示した。これらの結果は、９３．１０±５．８７％という抗原特異的Ｔ細胞のトランスフェクションの平均特異度および８６．４５±８．４５％のＧＦＰ発現による全部の四量体陽性Ｔ細胞を検出することの感受性を伴い、３回の反復実験で確認された。ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）中で培養した、ＤＣで刺激したＴ細胞でのＧＦＰ発現は、５〜７日間持続することが見出され（図１２Ａ）、急速に増殖するＴ細胞中でタンパク質を一過性に発現する能力を示す。
【０１９８】
ＧＦＰのＲＮＡ電気穿孔を使用するＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞の濃縮および増殖：
ＣＭＶ抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のポリクローナル集団を同定かつ単離するため、ＧＦＰ  ＲＮＡ電気穿孔を、完全長ｐｐ６５抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトしたＤＣで刺激したＴ細胞で実施した。ｐｐ６５  ＲＮＡでパルスしたＤＣでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の１１日後に、ＨＬＡ−Ａ２陽性患者（ｎ＝３）からのＰＢＭＣをＧＦＰ  ＲＮＡで電気穿孔し、そしてＲＮＡ発現のキネティクスをフローサイトメトリーにより評価した（図１２Ａ）。遺伝子発現は４８時間でピークに達することおよびトランスフェクション後第７日までに基礎まで減少することが見出された。従って、反復実験でＴ細胞をＤＣ刺激後第１１日に電気穿孔し、そして４８時間後にＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）およびＧＦＰ陰性（ＧＦＰ−）Ｔ細胞をフローサイトメトリー細胞分取により分離した。分取した細胞を、ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮について四量体分析およびサイトカインフローサイトメトリーにより分析した。等しい数のＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞をＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を含有する培地に戻し入れ、そして増殖を分取後第７、１０、１４および１７日に評価した。興味深いことに、ＧＦＰ＋  Ｔ細胞のみが、ＩＬ−２とともに培養した場合にさらなる増殖が可能であり、ＲＮＡ電気穿孔が、ＲＮＡでパルスしたＤＣでの刺激後にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのさらなる増殖が可能なＴ細胞をアネルギー性すな
わち不活性化されたＴ細胞から効率的に分離し得ることを示す（図３Ｂ）。ＧＦＰ発現が増殖するＴ細胞をアネルギー性細胞から単純に分離していたかどうかを決定するため、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−の分取した細胞を、臨床スケールのＴ細胞増殖（１０００倍増殖）を１４日以内に生成するのに適する迅速増殖プロトコル（ＲＥＰ）で、同種フィーダー細胞（一致させていない正常ドナーからのＰＢＭＣ）、抗ＣＤ３および高用量ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）よりなるポリクローナル増殖プラットフォームでもまた刺激した。該ＲＥＰプロトコルを使用して、ＧＦＰ−およびＧＦＰ＋双方のＴ細胞が効率的に増殖され、ＲＮＡトランスフェクションの能力は機能的Ｔ細胞を非機能的Ｔ細胞から分離しないが、しかしむしろ、抗原でパルスした樹状細胞との共培養の間に有糸分裂細胞周期に入るのに十分な活性化を受領したＴ細胞を同定することを示す。
【０１９９】
検査した３例の患者のサンプルの１種が、ＲＮＡでパルスしたＤＣでの刺激後にＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ７拘束性の双方のｐｐ６５特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を示した。ＲＮＡ電気穿孔および分取後に、ＧＦＰ＋画分はＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞の９５％およびＨＬＡ−Ｂ７拘束性Ｔ細胞の９８％を含有し、ＧＦＰ＋画分内の抗原特異的Ｔ細胞の２０ないし５０倍濃縮を表し、かつ、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のほぼ全部の効率的な同定および分離を示す（図１２Ｃ）。同様の結果が、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ｐｐ６５  Ｔ細胞反応性のみを示した２例の他の患者で得られた。ＣＭＶ抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞について濃縮する能力を決定するため、未刺激、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激、若しくはＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド混合物で刺激したＴ細胞画分を用いてサイトカインフローサイトメトリーを実施した。陽性対照（ＳＥＢ刺激Ｔ細胞）は、ＣＤ４＋
Ｔ細胞の１３．６９％がＧＦＰ陰性画分でＩＦＮ−γを分泌し、また、ＧＦＰ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の２２．４９％がＩＦＮ−γを分泌したことを示し、双方の画分がスーパー抗原に応答することが可能な機能的エフェクターＣＤ４＋  Ｔ細胞を含有したことを確認した。しかしながら、ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＣＭＶペプチド混合物に応答してのＩＦＮ−γ分泌はＧＦＰ＋画分に制限され、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の１４．１５％が、ＧＦＰ−画分中のＣＤ４＋  Ｔ細胞の０．３１％と比較してサイトカインを分泌した（図１２Ｄ）。
【０２００】
該結果は、ｐｐ６５でパルスしたＤＣで刺激したＴ細胞の分離後のＧＦＰ＋画分内での抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の４５倍濃縮を示し、また、濃縮のための、バルクＰＢＭＣ培養物内の抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞の効果的同定方法を示した。さらに、抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞のポリクローナル集団を同定かつ濃縮する能力は、養子免疫療法での使用のための広範な抗原認識およびエフェクター機能をもつＴ細胞の集団の生成方法を提供する。
【実施例１１】
【０２０１】
抗原特異的Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで受容体特異的ケモカインに移動するように改変し得る
樹状細胞生成、ペプチドおよびＲＮＡでの抗原負荷、樹状細胞の成熟化、ｐｐ６５ペプチド若しくはｍＲＮＡでの樹状細胞のパルス、Ｔリンパ球の供給源、ならびにＴ細胞の活性化を、ＤＣでパルスしたｐｐ６５ペプチドで刺激したＴ細胞の電気穿孔にＣＸＣＲ２  ｍＲＮＡを使用したことを除き、上の実施例７で記述されたとおり実施した。ＣＸＣＲ２
ｍＲＮＡはｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター（ミズーリＳ＆Ｔ  ｃＤＮＡ資源センター（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ミズーリ科学技術大学（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ミズーリ州ローラ）から製造し、そしてＰｓｐ７３−ｓｐｈ／Ａ６４ベクター（またＥ．Ｇｉｌｂｏａにより恵与される）（Ｎａｉｒら、Ｂｌｏｏｄ、１０２：９６４（２００３））中で発現させた。
【０２０２】
細胞移動アッセイのため、活性化したリンパ球（５×１０5細胞）を６ウェルフィルタ
ーチャンバープレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）の上チャンバーに三重で入れた。サイトカインを含有しない、または多様な濃度のＩＬ−８、ＧＲＯ−α若しくはＵＬ１４６を含有する培地を下チャンバーに入れ、そして細胞を３７℃で４５分ないし１時間インキュベートした。下チャンバーの培地を収集し、そして細胞を遠心分離しかつ５０ｍｌの培地に再懸濁し、そしてトリパン色素排除により計数した。腹腔中へのｉｎ  ｖｉｖｏ移動のアッセイのため、未改変の若しくはＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴリンパ球を、ＰＢＳ中１μＭ（未トランスフェクト）および１０μＭ（ＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクト）のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で５分間示差的に標識し、洗浄し、そしてレシピエントのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ハドソン）にマウスあたり１０7細胞で静脈内注入した。１ｍｌのＰＢＳ中１マイクログラムのケモカイン（ＩＬ−８、ＵＬ１４６若しくはＧＲＯ−α）をＴ細胞の注入後２４時間、８時間ごとに腹腔内注入した。マウスを殺し、３ｍｌのＰＢＳでの腹腔洗浄によりリンパ球を収集し、そして細胞を遠心分離により濃縮した。細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、そして未トランスフェクト（ＣＦＳＥlow）およびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトした（ＣＦＳＥhigh）細胞の蓄積をフローサイトメトリーにより評価した。Ｔ細胞集団の相対的蓄積を、ケモカイン注入に対する応答の比較のための基礎としてＰＢＳで処置した動物での蓄積を使用することにより決定した。ＣＮＳへのｉｎ
ｖｉｖｏ移動アッセイのため、５μｌのＰＢＳ中１μｇのＵＬ１４６を、定位フレームを使用して全身麻酔下のマウスの右頭頂葉に注入し、また、５μｌのＰＢＳを左頭頂葉に注入した。ＣＦＳＥ（５μＭ）標識した未トランスフェクト若しくはＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞を、マウスあたり１０7細胞でレシピエントマウスに注入した。６時間後にマウスを殺し、そして脳を収集しかつ右および左頭頂葉に切開した。単細胞消化物を、３７℃で３０分間の刻んだ組織のコラゲナーゼ消化（ＲＰＭＩ中１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）により調製した。左および右頭頂葉の単細胞懸濁液を、注入したリンパ球の蓄積についてＣＦＳＥ標識細胞のフローサイトメトリー分析により評価し；１００，０００事象を収集し、そして浸潤Ｔ細胞の総数をＣＦＳＥ陽性細胞のフローサイトメトリー計数により決定した。
【０２０３】
抗原特異的Ｔ細胞でのＣＸＣＲ２  ｍＲＮＡの発現：
ｐｐ６５でパルスしたＤＣで刺激したＴ細胞へのケモカイン受容体ＣＸＣＲ２  ＲＮＡ電気穿孔後のＣＸＣＲ２の発現によるＴ細胞の移動機能を調節する能力を検査した。ＣＸＣＲ２発現を、ＣＸＣＲ２特異的抗体およびフローサイトメトリーを使用して四量体陽性対四量体陰性ＣＤ８＋  Ｔ細胞でモニターした。刺激されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の１０〜１５％が基礎でそれらの表面上にＣＸＣＲ２を発現し（図１０Ｂ）、また、ＣＸＣＲ２  ＲＮＡトランスフェクション後に、ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞のおよそ５０％がそれらの表面上にＣＸＣＲ２を発現した（図１３）。四量体陰性Ｔ細胞は対照的にバックグラウンド（１０．９％）より上のＣＸＣＲ２発現を表さず、ＲＮＡ電気穿孔後の抗原特異的Ｔ細胞でのケモカイン受容体の選択的発現を示す。
【０２０４】
ＣＸＣＲ２  ＲＮＡで改変したＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの高められた走化性機能：
ＣＸＣＲ２特異的リガンドＩＬ−８、ＧＲＯ−αおよびＵＬ１４６に応答してのトランスウェル移動アッセイで、未改変、ＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトした、およびＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の走化性機能もまた検査した（図１４Ａ−Ｃ）。ＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞は、未改変若しくはＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞に比較して全３種のリガンドに対する用量応答性の高められた走化性応答を表した。多数の腫瘍内で高レベルで分泌されるＩＬ−８、およびヒトサイトメガロウイルスにより産生されるケモカインかつＣＸＣＲ２に限定的な唯一のリガンドＵＬ１４６への走化性応答は、ＣＸＣＲ２で改変したＴ細胞で３００〜５００％以
上増大した。
【０２０５】
ＣＸＣＲ２  ＲＮＡで改変したＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの高められた移動：
活性化されたＴ細胞へのＣＸＣＲ２  ＲＮＡのトランスフェクションがｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞移動を助長し得るかどうかを決定するため、ＣＸＣＲ２特異的ケモカインを注入したＳＣＩＤマウスの腹腔およびＣＮＳへのＲＮＡで改変したＴ細胞の移動を評価した。マウスに、示差的にＣＦＳＥ標識した未トランスフェクト若しくはＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞の注入後２４時間、８時間ごとにケモカイン（１μｇ／ｍｌ）を腹腔内注入した。マウスを殺しかつ細胞を腹腔洗浄により収集し、そして、ＣＸＣＲ２でトランスフェクトしたおよび未トランスフェクトのＴ細胞の蓄積を、ヒトＣＤ４５＋細胞でゲーティングすることおよびＣＦＳＥhigh細胞（ＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクト）に対するＣＦＳＥlow（未トランスフェクト）の相対的蓄積を評価することによりフローサイトメトリーにより分析した。ケモカインを注入したマウスでのＴ細胞の相対的蓄積をＰＢＳを注入したマウスと比較し、そして図１５Ａに示す。結果は、ＵＬ１４６およびＩＬ−８に応答してのＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞の蓄積を示す。最大の走化性応答はＵＬ１４６に対してであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の知見と一致した。このｉｎ  ｖｉｖｏアッセイではＧＲＯ−αに応答しての有意の蓄積は観察されなかった。
【０２０６】
ＣＸＣＲ２  ＲＮＡ改変が、ＵＬ１４６に応答してのＣＮＳ内でのＴ細胞の蓄積につながり得たかどうかもまた検査した。免疫不全マウスに、定位フレームのガイド下に左前頭頂葉にＰＢＳの、若しくは右前頭頂葉へのＩＬ１４６（１μｇ）の単回注入を投与した。ＣＦＳＥ標識した未トランスフェクト若しくはＣＸＣＲ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたＴ細胞を静脈内注入し、そして注入６時間後に左および右大脳半球を収集し、単細胞消化物を調製し、そしてＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の検出をフローサイトメトリーにより評価した。図１５Ｂに示されるとおり、ＣＸＣＲ２  ＲＮＡで改変したＴ細胞は、ＰＢＳを注入した半球に比較してＵＬ１４６を注入した半球の高められた浸潤を表した一方、未トランスフェクトＴ細胞はいずれの半球の浸潤にも有意の差違を表さなかった。ありそうには頭蓋内注入により確立されるケモカインの一過性勾配に二次的な、ＣＸＣＲ２  ＲＮＡで改変したＴ細胞の後の時点での優先的蓄積は観察されなかった。
【０２０７】
これらの結果は、ＣＸＣＲ２  ＲＮＡで改変したＴ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏで高められた走化性機能を表すこと、ならびにＴ細胞のＲＮＡに基づく改変を使用して抗原特異的Ｔ細胞を選択的に同定かつ改変し得ることを示した。
【０２０８】
従って、未トランスフェクトＴ細胞集団からトランスフェクトしたＴ細胞集団を同定かつ分離しならびにそれらの移動機能を改変するのに使用し得るメッセンジャーＲＮＡコーディング遺伝子の電気穿孔を使用する遺伝子移入技術を利用した。ＧＦＰをマーカー遺伝子の一例として使用して、ＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞がｐｐ６５でパルスしたＤＣで刺激した培養物から容易に同定かつ分離され、そしてそのＲＮＡトランスフェクションを使用して抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞を同時に単離し得る。抗原特異的Ｔ細胞の核酸媒介性トランスフェクションは、目的のケモカイン受容体若しくは他の表面受容体の電気穿孔法およびトランスフェクトされた受容体の発現に基づく細胞の単離のような単一戦略により抗原特異的Ｔ細胞の純度を同時に高めかつそれらの機能を改変することが可能であることにおいて特定の利点を有する。ＣＸＣＲ２のようなＴ細胞の機能を調節し得るタンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば抗原特異的刺激プラットフォーム、次いでＲＮＡ電気穿孔を使用して、目的の特異性をもつＴ細胞に優先的に標的化し得る。ケモカイン受容体のような炎症、ウイルス感染若しくは腫瘍進行の部位へのＴ細胞の移動を高める遺伝子は、養子移入されるリンパ球の有効性をその発現が大きく高めうる一分類のタンパク質を表す。ＣＸＣＲ２は通常Ｔリンパ球の小画分でのみ発現され、そしてＩＬ
−８、ＧＲＯ−αおよびＵＬ１４６への走化性を媒介し、後者はＣＭＶ抗原特異的ケモカインである。ＩＬ−８は、炎症の部位で増大されならびに神経膠腫および他の腫瘍内で劇的に高められることが示されている。ＧＲＯ−αは、黒色腫、胃腸癌および悪性神経膠腫を包含する多数の悪性病変で発現が増大されている。神経膠腫でのその発現は腫瘍のグレードと相関し、侵襲性高悪性度病変を見つけ出すことにおいて有用なエフェクターＧＲＯ−αへの走化性機能をもつＴ細胞を与える。ＵＬ１４６はＣＸＣＲ２に対する特異性をもつＣＭＶにより合成されるケモカインである。ＵＬ１４６媒介性の化学誘引によるウイルス感染部位へのＣＸＣＲ２を発現するＣＭＶ抗原特異的Ｔ細胞の局在化は、免疫療法の有効性を高め得る。
【０２０９】
加えて、これらの研究は少なくとも、ケモカイン受容体若しくは他の走化性受容体をコードするＲＮＡを使用してＴ細胞を例えば治療目的の部位に局在化し得ることを示す。これは、ＣＮＳが循環する免疫細胞の制限された正常な輸送を表すため、脳腫瘍の標的化でとりわけ有用である。とりわけ、このアプローチは抗原特異的エフェクターＴ細胞を、優先的増殖のため腫瘍増殖、ウイルス感染の部位若しくはワクチン部位に向けることもまたできる。
【実施例１２】
【０２１０】
定性的ＣＭＶ検出
定性的ＣＭＶ検出方法を開発するため、１０種の異なるＣＭＶ遺伝子におよぶ２９種の異なるＰＣＲプライマー（表１）を、新たに診断されたＧＢＭを伴う患者からの血液サンプルの拡大されたコホート（新たに診断されたＧＢＭを伴う４５例の患者からの２２３種の連続的血液サンプル）中のＣＭＶ  ＤＮＡを検出することについて評価した。
【０２１１】
正常志願者（健康志願者（ｎ＝１１）について年齢中央値４２歳および外科的対照患者（ｎ＝６）について年齢４６歳）、新たに診断されたＧＢＭを伴う患者（年齢中央値５２．５歳（ｎ＝４５））ならびに同種骨髄移植を受ける患者（年齢中央値（ｎ＝５））からの末梢血を、デューク大学施設内審査委員会に従って収集した。全血を低温チューブに分注しかつ液体窒素中で急速凍結し、そしてＤＮＡ抽出まで−１３０℃で保存した。血漿および血清を、ヘパリン処理若しくはヘパリン未処理血液の２０００ｇで２０分間の丁寧な遠心分離により収集し、そして液体窒素中低温チューブ中で急速凍結しかつＤＮＡ抽出まで−１３０℃で保存した。腫瘍は、新たに診断されたＧＢＭを伴う患者からのインフォームド・コンセント後の外科手術の間に収集し、刻み、そして液体窒素中で急速凍結した。試料をＤＮＡ抽出まで−１３０℃で保存した。ＤＮＡは、ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ系（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して、刻んだ組織１０ｍｇから抽出した。
【０２１２】
ＤＮＡを、ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ系（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用い、ＧＢＭ腫瘍試料およびヒト血液または血漿若しくは血清から抽出した。陽性対照サンプルについて、血清陰性志願者からの全血、血清若しくは血漿に既知濃度のＣＭＶ定量済ウイルスＤＮＡ  ＡＤ１６９株（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号０８−９２５−０００）、メリーランド州コロンビア）を添加した。ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキットからの溶解溶液を、溶液ＴＤ−Ａを溶液ＴＤ−Ｂと１：９の比で混合することにより作成した。ＤＮＡ抽出のため、サンプル容量に対する溶解溶液の多様な比を評価し、そして５０μＬの溶解溶液ＴＤ−Ａ／Ｂをサンプルあたり１０μＬの血液（血清若しくは血漿または腫瘍組織）に添加し、ピペットで出し入れすること若しくはチューブを叩く／回転することにより十分に混合し、そして短時間回転した。サンプルを、サンプルが溶解溶液により均一に溶解されるまで蒸発による喪失を予防するためにキャップをきつく締めたことを確認して、９５℃で１５〜３０分間インキュベ
ートした。５０μＬの溶液ＴＤ−Ｃを各サンプルに添加し、十分に混合しかつ微小遠心機で高速で１分間回転しそして上清を収集した。１１μＬの５Ｍ  ＮａＡＣ若しくは３Ｍ  ＮＨ4ＡＣ（溶解したサンプル容量の１０倍容量）および２２０μＬの１００％アルコール（ＥｔＯＨ、サンプル容量の２容量）をＤＮＡを沈殿するため上清に添加した。ＤＮＡペレットをその後微小遠心機中最高速度（約１４，０００ｒｐｍ）で最低１０分間遠心分離し、そして７０％ＥｔＯＨで２回洗浄しかつ１０μＬのヌクレアーゼを含まない水若しくはＴＥ緩衝液で再構成した。全ＤＮＡ抽出は、ＰＣＲ反応を実施した分子生物学実験室と別個の実験室で実施した。２〜５μＬの各サンプル（２〜５μＬの全血、血漿若しくは血清から抽出したＤＮＡに同等）をＣＭＶ検出のためのＰＣＲ反応に添加した。
【０２１３】
定性的ＰＣＲ検出は、製造元の説明書に従ってＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ系（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）およびゲル電気泳動による可視化を使用して実施した。１０種のＣＭＶ遺伝子におよぶ２９種の異なるプライマーを、刊行された文献から選択したか、若しくはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ９ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で設計しかつＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）により合成した。２〜５μＬのサンプル（全血、血清若しくは血漿）または腫瘍組織から抽出したＤＮＡを各５０μＬのＰＣＲ反応に慎重に添加した。ＣＭＶ血清陰性ドナーからのサンプルおよびＤＮアーゼを含まない水をＰＣＲ陰性対照として同時に使用した。ＰＣＲは、９４℃１５分間、９４℃４０秒間、１分間アニーリング温度、および７２℃１分間の４０周期でｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で実施し、そして７２℃１０分間の伸長で終了した。ＰＣＲ産物を、１×ＴＢＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）中ポリアクリミドゲルのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｐｒｅｃａｓｔ  １０％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（カタログ番号３４５−００５３）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）での電気泳動により可視化し、そしてＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号Ｓ１１４９４）、カリフォルニア州カールズバッド）で染色した。ＣＭＶ  ＤＮＡ検出の確認のため、数種の増幅されたＤＮＡバンドを製造元のプロトコルに従ってＱＩＡＥＸＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）でゲルから単離し、そしてデューク大学総合癌センターＤＮＡ配列決定施設（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で配列決定した。配列同一性を、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴを使用して分析し、および試料のアライメント分析をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ
Ａｄｖａｎｃｅ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して実施した。
【０２１４】
表１に示されるとおり、ＧＢＭを伴う患者の末梢血サンプル中のＣＭＶウイルス血症の検出率は、ＰＣＲアッセイに利用されたプライマーに依存して１２％から７３．５％までの範囲にわたった。ｇＢ遺伝子（例えばＢ−ｉ１ｉ２）内のプライマーはＧＢＭを伴う患者の末梢血中のＣＭＶの検出に最も感受性であることが見出された。対照レーン（水のみ）でウイルスＤＮＡは検出されず、また、正常志願者の末梢血は数回の反復アッセイに際してウイルスＤＮＡの検出について陰性であった（１１名のＣＭＶ血清陽性志願者を包含する１７サンプルのうち０；ｐ＝８．４×１０-10；フィッシャーの正確確率検定）。２２３種の血液サンプルの拡大されたコホートでのＣＭＶの検出率（２２３サンプルのうち１６４種の陽性）は、２０種の陽性血液サンプルの１６種という初期の知見と有意に異ならなかった（ｐ＝０．６０３；フィッシャーの正確確率検定）（データは示されない）。
【０２１５】
ＣＭＶ検出率に対するアンプリコンの大きさの影響を評価するため、全プライマーについてのＧＢＭを伴う患者の血液中のＣＭＶの全体検出率を、ＳｐｅａｒｍａｎとＰｅａｒｓｏｎの相関係数分析によりアンプリコンの大きさ単独に基づき比較した。２００ｂｐ若
しくはそれ未満のアンプリコンを生じるよう設計されたプライマーは、ＣＭＶの検出のより低い閾値およびより信頼できるアンプリコンを有することもまた見出された（表１）。例えば、プライマーｇＢ  Ｅ１Ｅ２（アンプリコンの大きさ２６８）、ｇＢｉ１ｉ２（アンプリコンの大きさ１４４）およびｇＢｉ３ｉ４（アンプリコンの大きさ１２２）は全部ｇＢ遺伝子内のＤＮＡの同一領域にわたり、そしてプライマー組の間の距離によってのみ異なる。より小さいアンプリコンがより高い検出率を示したという観察が、他のＣＭＶ遺伝子中のプライマーで同様になされた。アンプリコンの大きさと検出率の間の逆相関が、評価された遺伝子に独立に検討された２９種のプライマーについて示された。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数（ｒ＝−０．３７６２２）およびＳｐｅａｒｍａｎ相関係数（ｒ＝−０．４１５２３は双方とも有意であった（それぞれｐ＝０．０４４３および０．０２５１）。これらの結果は、ＧＢＭを伴う患者の末梢血中のＣＭＶ  ＤＮＡの検出率におけるプライマー選択とアンプリコンの大きさの顕著な影響を示す。
【０２１６】
ＤＮＡ精製を伴わないサンプルから直接のＰＣＲ増幅の影響を検討するため、ＢｌｏｏｄＲｅａｄｙTMキット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を、全血および腫瘍組織からのＤＮＡの直接増幅についてＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTMキット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）と比較した。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡ抽出後の細胞ライセートから直接、若しくは細胞ライセート中内に存在する他の有機分子からのＤＮＡの精製後に実施し得る。
【０２１７】
ヒト組織を手術直後に氷上に保存し、そして半時間未満以内に１０ｍｇの大きさに刻み、その後液体窒素中で急速凍結し、そして使用するまで−１３７℃で保存した。患者若しくは正常の血液をチューブあたり１０μｌ分注し、そして液体窒素中で急速凍結しかつ使用するまで−１３７℃で保存した。
【０２１８】
ゲノムＤＮＡ調製：ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM  ＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲキット（カタログ番号Ｌ００１９５；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用した。すなわち、１．緩衝液ＴＤ−Ａ、ＴＤ−ＢおよびＴＤ−Ｃを室温で融解しかつ融解した後氷上に置き；２．各サンプルについて５μｌのＴＤ−Ａおよび４５μｌのＴＤ−Ｂ（１：９の比）を混合し、そして回転してサンプルあたり５０μｌの溶解溶液（ＴＤ−Ａ／Ｂ）を生じ；３．５０μｌの溶解溶液ＴＤ−Ａ／Ｂを各サンプル１０ｍｇの組織または１０μｌの血液（血清若しくは血漿）に添加し、そしてピペットで出し入れすること若しくはチューブを叩く／回転することにより十分に混合し；４．サンプルの完全な溶解が発生するまでサンプルを６５℃で最低１０分間インキュベートし；５．チューブをインキュベーションから取り出し、各チューブに５０μｌのＴＤ−Ｃを添加しかつ十分に混合し；６．サンプルを約１４，０００ｒｐｍで最低１分間回転し；７．上清（ゲノムＤＮＡ抽出液）を４℃で保存するか、若しくはＰＣＲ増幅に進み；８．サンプルあたり２０μｌのＰＣＲで１．５μｌのゲノムＤＮＡ抽出液を使用した。
【０２１９】
ＰＣＲ増幅：
Ａ．定性的評価：ＰＣＲ増幅は、ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM  ＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲキット（カタログ番号Ｌ００１９５；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）若しくはＨｏｔＭａｓｔｅｒTM  Ｔａｑ  ＰＣＲ系（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、ニュージャージー州ウェストベリー）を用いて実施した。
【０２２０】
前混合溶液を表４に示す。
【０２２１】
【表４】
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【０２２２】
表４に示される１８．５μｌの前混合に１．５μｌのゲノムＤＮＡ溶液を添加してチューブあたり２０μｌのＰＣＲ溶液を生じた。ＰＣＲチューブをＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ミルピタス）に入れ、そして後に続くとおり、すなわち９４℃５分間の１周期（変性）；および、９４℃４０秒間（変性）／６０℃４０秒間（アニーリング）／７２℃４０秒間（伸長）の４０周期／７２℃１０分間の１周期（伸長）循環した。
【０２２３】
Ｂ．定量的測定：ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（リアルタイムのための２×混合物、Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１７０−８８８０）若しくはｉＱ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（リアルタイムのための２×ＳｕｐｅｒＭｉｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１７０−８８６０）を用いるリアルタイムＰＣＲ増幅：
前混合溶液を表５に示す。
【０２２４】
【表５】
2015134767.tif 000010
【０２２５】
表５に示される前混合３７μｌに３μｌのゲノムＤＮＡを添加して４０μｌのＰＣＲ溶液を生じた。該ＰＣＲ溶液をＢｙｒｏａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒに入れ、そして後に続くとおり、すなわち９５℃３分間の１周期（変性）；および９４℃３０秒間（変性）／６０℃３０秒間（アニーリング）／７２℃３０秒間（伸長）の４０周期／７２℃１０分間の１周期（伸長）循環した。
【０２２６】
増幅後、リアルタイムＰＣＲ産物を標準曲線で分析し、そしてデータをハウスキーピン
グ遺伝子で正規化した。
【０２２７】
ＰＣＲ産物検出：ＴＢＥ中のＣｒｉｔｅｒｉｏｎTM  Ｐｒｅｃａｓｔ１０％ゲル（２６ウェル、１５μｌ／ウェル）（カタログ番号３４５−００５３；ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を、本質的に後に続くとおり使用した。すなわち、１×ＴＢＥ緩衝液を充填線まで電気泳動チャンバーに添加した。２．５μｌのＤＮＡ負荷緩衝液をサンプルあたり１０μｌのＰＣＲ産物と混合して１２．５μｌのアリコートを生じた。１．５μｌのＥＺ  ＤＮＡ分子量標準（１００ｂｐ  ＭＷ、ＢｉｏＲａｄカタログ番号１７０−８３５２、０．０５μｇ／ｍｌ、５００μｌ）をゲルの最初のウェルに添加した。ＰＣＲ産物の１２．５μｌのアリコートをウェル２〜２６に添加した。ゲルを１２０ボルト数で室温（ＲＴ）で２時間泳動した。電気泳動を終了し、そして各ゲルを２５ｍｌの１×ＴＢＥ中染色緩衝液（ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅカタログ番号５１１４９４）中に移した。ゲルをＲＴで１５分間染色した。異なる露出時間を使用してゲルの写真を撮影して記録しかつＰＣＲ産物を分析した。各正しい大きさのＰＣＲ産物をその後ゲルから切り出し、そしてＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出した。抽出されたＤＮＡをその後配列決定した。
【０２２８】
図１６に示されるとおり、ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTMキットは全血および腫瘍サンプル双方から明瞭かつ明確な増幅可能なバンドを提供するために確実であった。また、小サンプル容量（１０〜２０μＬ）でＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTMキットを使用するＰＣＲ結果を、２種の商業的ＤＮＡ精製キット、すなわち、ＤＮＡ抽出により多量のサンプル容量（０．２ｍｌないし１．０ｍｌの全血、血清若しくは血漿）を必要とするＤＮｅａｓｙ(R)（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）およびＧｅｎｔｒａ(R)ＰｕｒｅＧｅｎｅ(R)（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）と比較した。より多量のサンプル容量からＤＮＡを精製することに比較してＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTMキットを使用した場合にウイルスＤＮＡ検出の下限の差違は見出されず（示されない）、より単純かつより迅速な直接ＤＮＡ抽出法が等しく効果的であり、そしてとりわけサンプル容量が制限する場合に好ましいとみられる。ＧＢＭ患者血清からのＨＣＭＶ  ｇｐ６４リアルタイムＰＣＲの融解曲線グラフを図１７に示し、また、ＧＢＭ患者血清からのＨＣＭＶ  ｇｐ６４リアルタイムＰＣＲのＰＣＲ増幅周期グラフを図１８に示す。
【０２２９】
さらに、組織溶解緩衝液に対するサンプルの比を、１：５、１：０および１：２０のサンプル：緩衝液比を使用して比較し、そして３４種の既知の陽性サンプルでｇＢプライマー組（Ｂ−ｉ１ｉ２；表１）を使用するＣＭＶ  ＤＮＡのＰＣＲ検出により評価した。表６に示されるとおり、５に対し１の緩衝液に対するサンプルの比が適切な大きさ（１２２ｂｐ）の強い明瞭なバンドでの検出を示した一方、他の比はバンドシグナルの低下された強度を示したか若しくは非特異的バンドの検出をもたらしたかのいずれかであった。
【０２３０】
【表６】
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【０２３１】
全部の場合で、優勢なバンドはｇＢ遺伝子産物に対応した。さらに、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）は、臭化エチジウム染色に比較してウイルスＤＮＡバンドの高められた可視化を示した（示されない）。１：５という比を全部のその後の分析に選んた。
【０２３２】
本明細書に記述される単一段階プロトコル内のサンプルからのゲノムＤＮＡ抽出の間にウイルスＤＮＡの損失は存在せず、そして、とりわけ、これはサンプル中の低レベルのウイルスＤＮＡを検出してそれにより貴重な患者サンプルを節約するために非常に重要である。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTM  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ系を、ウイルスＤＮＡが溶解緩衝液（ＴＤ−Ａ／Ｂ）中に完全に放出されることを確実にするために全部の血液、血清および組織に使用した。従って、われわれは、ウイルスＤＮＡ損失を得ずかつＰＣＲに対する阻害剤を制限することが可能であった。さらに、ＰＣＲプライマーを、高い遺伝子特異性をもつより小さいアンプリコン（２００ｂｐ未満）を作成し、ならびに、高いヒトゲノム含量内のより効率的かつ感受性のＰＣＲアンプリコンについてヒトゲノムへの架橋なくかつおよびＰＣＲに対する阻害剤を除去するための精製がないように設計した。該ＰＣＲ条件は非常に低レベルの標的ＤＮＡで遺伝子特異的産物を増幅した。検出感度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に臭化エチジウムで染色された慣習的アガロースゲルに比較して最低１０倍増大した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色およびディジタル写真を全部一緒に最適化し、それによりウイルスＤＮＡ若しくはＮＥＳＴ  ＰＣＲを検出するための遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションのために分離されたＰＣＲ産物をアガロースゲルからメンブレンに転写することを回避した。
【実施例１３】
【０２３３】
定量的ＣＭＶ検出
患者サンプル中のＣＭＶ  ＤＮＡレベルを特異的に測定するための定量的ＰＣＲアッセイを提供するため、１５種の遺伝子特異的プライマーおよびプローブの組合せ（表２）を、リアルタイムＰＣＲを使用して、陽性対照標準としてＣＭＶ全ゲノムＤＮＡを添加した全血中のＣＭＶ  ＤＮＡコピー数を定量化することについて評価した。
【０２３４】
リアルタイムＰＣＲ検出は、以下の製造元の説明書に従うことによりＴａｑＭａｎ(R)Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）で実施した。５種のＣＭＶ遺伝子におよぶ１５種の異なる遺伝子特異的プライマーおよびプローブ組を、実験室で、刊行された文献から選んだか若しくはＰｒｉｍｅｒ  ３．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて設計し、そしてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）により合成した。２〜５μｌのサンプル（全血、血清若しくは血漿）からのＤＮＡを各５０μｌのＰＣＲ反応に添加した。ＰＣＲは、指定されたアニーリング温度で、製造元の標準的プロトコルに従うことにより７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）で実施した。コピー数は、ＣＭＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ
Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡからの標準曲線に基づきＳＤＳ  ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）で分析した。
【０２３５】
表２に示されるとおり、ｇＢプライマー／プローブ組ｇＢ２１／２２／２３は、ゲノムＣＭＶ  ＤＮＡの限界希釈を使用してのＣＭＶ標準の検出の最低の閾値、ＧＢＭを伴う患者からの末梢血試料で最高頻度のＣＭＶ  ＤＮＡ検出、ならびに、評価したプローブおよびプライマー組の最も早い対数増幅周期（Ｃｔ値）を表した。
【０２３６】
評価した１５種のプライマー／プローブの組合せ間で有意に異なるＣｔ値が存在し、Ｃｔ値は３１．５から３８．１までの範囲にわたった。これは、血液中の同一の濃度のＣＭ
Ｖ  ＤＮＡ標準の検出での多様なプライマー／プローブの感度の１００倍を超える差違を示す。プライマー／プローブ組間の感度の差違は、限界濃度のＣＭＶ標準のより少なく感受性のプローブの組合せを使用して偽陰性を、およびＧＢＭを伴う患者からの血液サンプル中でもまた偽陰性をもたらした（表２）。
【実施例１４】
【０２３７】
同種骨髄移植を受ける患者におけるウイルス再活性化の検出
実施例１２および１３に記述される定性的および／若しくは定量的ＰＣＲ法をさらに検査するため、同種骨髄移植（ａＢＭＴ）を受けた後のウイルス再活性化について連続的にモニターされている患者でのＣＭＶウイルス血症の検出を評価した。
【０２３８】
ａＢＭＴ後に５例の患者から連続して得た３０種の血清サンプルを、本発明の定性的および定量的ＰＣＲアッセイを使用して、ならびにＣＭＶ  ＵＬ５４被検体特異的試薬（ＡＳＲ）試験（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ、インジアナ州インジアナポリス）を使用してデューク臨床微生物学検査室でもまた評価した。該試験検査室はＡＳＲ試験の結果に対し盲検化され、そして患者サンプルをゲル電気泳動分析後の定性的実験室ＰＣＲアッセイによりそれらが陽性であるか陰性であるかに関して評価し、また、血液１ｍｌあたりのコピー数でのウイルス負荷量を定量的実験室ＰＣＲアッセイを使用して測定した。
【０２３９】
デューク大学メディカルセンターの臨床微生物学検査室により実施されたＡＳＲ試験によるＣＭＶ  ＤＮＡの検出、ならびに定性的および定量的ＰＣＲ試験を表７に示す。
【０２４０】
【表７】
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【０２４１】
陽性の結果はゲル電気泳動後のＤＮＡバンドの単離およびＤＮＡ配列決定により確認し、われわれのＰＣＲ試験による擬陽性がないことを示した。分析後、ＡＳＲ試験によるこれらの患者の臨床診断評価からの結果を盲検解除した。該ＰＣＲ試験は、臨床微生物学検査室により実施されたＲｏｃｈｅ  ＣＭＶ  ＵＬ５４  ＡＳＲ  ｑＰＣＲ試験により陽性と思われるＣＭＶウイルス血症の全症例で陽性であり、本発明のＰＣＲ試験による偽陰性がないことを示す。しかしながら、本発明のＰＣＲ試験は、臨床診断試験によるウイルス再活性化の検出前に数種の患者サンプルでウイルスＤＮＡを検出した（表７）。いくつかの症例において、ウイルス血症は該臨床診断アッセイによる最初の陽性の結果の６週前に検出された。これらの結果は、増幅されたバンドのＤＮＡ配列決定により真の陽性と確認され、そしてＮＣＢＩ  ＤＮＡデータベースを使用してＣＭＶと同定された。
【０２４２】
これらの結果は、本発明の実験室ＰＣＲ法が、ＣＭＶ  ＤＮＡの検出について正確であ
りかつＲｏｃｈｅ  ＵＬ５４  ＡＳＰアッセイの検出の閾値より下であるａＢＭＴを受ける患者におけるウイルス再活性化を検出することが可能であることを示す。これらの結果は、ＣＭＶ  ＤＮＡのより容易、迅速かつより感受性の検出アッセイ検出としてのこのアッセイの利用性を強調し、また、ＣＭＶ疾患の危険にさらされている患者の予防的モニタリング、ならびに検出が論争の的になっている悪性病変およびアテローム硬化症のような疾患とのＣＭＶの関連を研究するための本アッセイの使用を検証するためのさらなる研究を保証する。
【実施例１５】
【０２４３】
ＧＢＭ腫瘍試料からのｇＢ（ＵＬ５５）ＤＮＡの配列決定はウイルス遺伝子型を同定する
ＧＢＭ腫瘍と関連するウイルス株の同一性を、ｇＢ（ＵＬ５５）遺伝子の株可変領域のＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定により検討した。２２種の外科的に切除されたＧＢＭ試料からのＣＭＶ  ｇＢ  ＤＮＡをｇＢｉ１ｉ２プライマー組を使用して増幅し、ＤＮＡをゲル電気泳動により分析し、そして増幅されたバンドを切り出しかつＤＮＡ配列決定にかけた。ＤＮＡ配列を配列同一性についてＮＣＢＩ  ＤＮＡデータベースを使用して検索し、そして全ＤＮＡがＣＭＶ  ｇＢに一致した。株の同一性およびｇＢファミリーをＤＮＡ配列同一性についてのＮＣＢＩデータベースの検査により決定した。最高程度の相同性をもつ株（１種若しくは複数）を表８に列挙する。
【０２４４】
【表８】
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【０２４５】
ＧＢＭ試料からのウイルスＤＮＡの配列アライメントは、臨床単離物間の１７％までのＤＮＡ配列変動を含むＧＢＭ試料からの独特なウイルス単離物を示した（図１９；および
表８）。増幅されたウイルスＤＮＡ  ｇＢ配列のＮＣＢＩデータベース内のｇＢ遺伝子配列との比較もまた実施し、そしてｇＢ遺伝子型に対する最高程度の相同性を表８に列挙する。１種以上のｇＢ遺伝子型に対する同一程度の相同性が示された場合は、該ウイルス株の同一性を使用してｇＢ遺伝子型を決定した。数種の単離物はＣＭＶの１種以上の株との同一程度の相同性を有し、そして従って列挙した。ＧＢＭ試料からの株は、ＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ（ｇＢアイソタイプ１）、Ｎ１（ｇＢアイソタイプ１）、Ｔｏｗｎｅ（ｇＢアイソタイプ１）、ＡＤ１６９（ｇＢアイソタイプ２）およびＮ１２（ｇＢアイソタイプ２）株と相同であることが見出され、別個のウイルス単離物が腫瘍試料中で検出されたこと、およびまたＧＢＭ腫瘍がＣＭＶウイルスのｇＢ１およびｇＢ２ファミリー遺伝子型による感染に対し許容性であることも示す。観察されたｇＢ遺伝子型の分布はＢ１  １６／２２（７２．７％）；ｇＢ  ６／２２（２７．３％）であった。
【０２４６】
これらの結果は、少なくとも、ＧＢＭ試料がｇＢ１遺伝子型のＣＭＶ株によりより頻繁に感染されていることを示す。数種の患者腫瘍サンプルを、凍結保存した全血若しくは腫瘍試料からのＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅およびｇＢアンプリコンのＤＮＡ配列決定で開始して数か月間隔で再分析し、そして同一ウイルス配列が得られ、これらのサンプルでのウイルス同定の正確さを示す。
【０２４７】
ＣＭＶと多様な疾患状態の間の関連の一貫した検出は論争の的になっており、病変領域内のウイルスＤＮＡおよびタンパク質の存在について報告する多様な研究室による対立する知見を伴う。上の実施例は、外科的に切除されたＧＢＭ試料中で検出するＣＭＶの２２種の臨床株のＰＣＲに基づくアッセイおよび株の同一性を記述する。本発明のＣＭＶの確実な検出のためのＣＭＶ  ＰＣＲ試験の開発はまた、とりわけ神経膠腫の発生および進行でＣＭＶが演じている役割への研究も容易にする。ＧＢＭ腫瘍は、Ｂ１タイプウイルスの優勢を伴いｇＢ１およびｇＢ２遺伝子型が一致する株により感染されていることが見出された。ｇＢ１遺伝子型は、米国での臨床的ＣＭＶ感染症で見出される最も優勢なウイルスファミリーであるが、しかし、ｇＢ３若しくはｇＢ４遺伝子型の最高程度の相同性が一致する臨床株を伴ういかなる検出も欠如していることは、悪性神経膠腫のＣＭＶ感染に対する制限された向性が存在しうることを示唆している。
【０２４８】
腫瘍試料内のウイルスＤＮＡの検出は、ヒトパピローマウイルス関連の子宮頚癌の場合のような関連が十分に確立されている腫瘍中であってもささいな問題ではなく、そして、検出はしばしば標準的ＰＣＲアッセイによる感度の限界若しくはそれより下であり得る。上で示されたとおり、新たに診断されたＧＢＭを伴う患者の血液および腫瘍中の低レベルのウイルスＤＮＡの検出を高めた数種のパラメータが決定された。
【０２４９】
ｇＢ遺伝子内のＤＮＡの同一領域におよびかつプライマー組間の距離によってのみ異なるプライマーが、ウイルスＤＮＡの検出のアンプリコンの大きさに依存する頻度を示した。この領域内で最小のアンプリコンの大きさを有するｇＢｉ１ｉ２およびｇＢ−ｉ３ｉ４は最高検出率もまた示し、偽陰性の結果がより大きいＤＮＡフラグメントの非効率的な増幅によることができ、およびウイルスＤＮＡが制限しうる場合にサンプル内のウイルスＤＮＡの非存在によらないことができることを示す。１１種の異なる遺伝子におよぶ２９種の独立に由来するＣＭＶプライマー組の分析は、アンプリコンの大きさとＣＭＶ  ＤＮＡの検出率の間の逆相関を示した。これらの結果は、制限する量のウイルスＤＮＡの他者による偽陰性のＰＣＲ検出が、無効な抽出および増幅条件によることができ、および必ずしも決定的であると思われ得ないことを示唆している。さらに、抽出および増幅条件はウイルスＤＮＡ検出における偽陰性の結果を説明し得る。
【０２５０】
増幅された産物の大多数をＤＮＡ配列決定により確認し、そして全部の場合でＣＭＶ特異的ＤＮＡが増幅された。また、ウイルスＤＮＡをサンプルからより効率的に放出するた
め、血液を液体窒素中で急速凍結し、その後、溶解緩衝液の添加後にＴｉｓｓｕｅＤｉｒｅｃｔTMキットによる６５℃という示唆される温度より高温（９５℃）でインキュベートした。ＤＮＡを濃縮しかつ粗サンプル抽出液中にしばしば存在するＰＣＲ阻害剤を排除するために、ＤＮＡ抽出後にＥｔＯＨ沈殿段階もまた組み込んだ。定性的ＰＣＲについては、ポリアクリルアミドゲルおよびＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色の組合せが、臭化エチジウムで染色した慣習的アガロースゲルに比較して最低１０倍のＰＣＲ検出感度を増大させた。この増大された感度は、ネステッドＰＣＲ、若しくはブロットされたＤＮＡの遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションのようなより強力なプロトコルの使用を伴わずに検出を可能にした。このアッセイは、サンプルの反復分析および制限しうる患者サンプルの保存を可能にする小容量の試料（１０〜２０μＬ）を利用することが可能であるという付加的な利点を有する。さらに、骨髄移植を受ける患者での評価は、該アッセイが現在利用可能な診断的ＰＣＲ試験よりも免疫抑制患者でのウイルス再活性化のより早期の検出が可能であることを示した。
【０２５１】
ＣＭＶは、癌、アテローム硬化症および炎症性腸疾患を包含する多数の疾患過程で関連および可能な病因の役割を有する。これらの疾患と関連するＣＭＶの検出は、しかしながら研究者の研究室間でかなり異なる。少量の血液および組織試料を利用し得る比較的単純かつ高められた増幅検出法は、こうした疾患過程とのＣＭＶの関連のより確実な決定を見込むことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年2月27日(2015.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｐ６５ＣＭＶ抗原若しくは該ｐｐ６５ＣＭＶ抗原をコードする核酸、または、
抗原提示細胞およびＴリンパ球が感作有効量のｐｐ６５ＣＭＶ抗原でｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作されている、有効量の該抗原提示細胞、該Ｔリンパ球若しくは双方、
を含んでなる製薬学的に許容できる組成物であって、
該製薬学的に許容できる組成物が、ＣＭＶ抗原を発現する癌細胞に対する免疫応答を誘発するためのものである、上記組成物。
【請求項２】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項３】
アジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−α、Ｍ−ＣＳＦ、フロイントの不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ  ５１）およびコリネバクテリウム  グラヌロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）Ｐ４０よりなる群から選択される、請求項２に記載の製薬学的に許容できる組成物。
【請求項４】
癌細胞が、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）である、請求項１−３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
組成物が、ｐｐ６５抗原をコードするＲＮＡを含んでなる抗原提示細胞を含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置を必要とする患者における多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置のための薬剤の製造のための、ｐｐ６５抗原をコードするＲＮＡを含んでなる抗原提示細胞を含んでなる組成物の使用。