(57)【要約】    【課題】光合成関連蛋白質の結晶を観察しながら選別するための効率的な方法および装置を提供する。    【解決手段】可視領域と赤外領域とを含む光源の透過照明下において、光合成関連蛋白質の結晶を含む溶液中の結晶表面の状態を赤外線対応カメラの映像で観察する工程と、任意の結晶を肉眼で立体視しながら抗凍結剤溶液中に取り分ける工程と、前記抗凍結剤溶液の濃度を調整する濃度調整工程と、調整された抗凍結剤溶液中の結晶を赤外線対応カメラの映像で観察しながらＸ線回折測定に用いる結晶を決定する選別工程と、決定された結晶試料を肉眼で立体視しながら前記抗凍結剤溶液から取り出す工程とを備える光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用結晶試料の選別方法。【選択図】図１３
2015071576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可視領域と赤外領域とを含む光源の透過照明下において、光合成関連蛋白質の結晶を含む溶液中の結晶表面の状態を赤外線対応カメラの映像で観察する工程と、
任意の結晶を肉眼で立体視しながら抗凍結剤溶液中に取り分ける工程と、
前記抗凍結剤溶液の濃度を調整する濃度調整工程と、
調整された抗凍結剤溶液中の結晶を赤外線対応カメラの映像で観察しながらＸ線回折測定に用いる結晶を決定する選別工程と、
決定された結晶試料を肉眼で立体視しながら前記抗凍結剤溶液から取り出す工程とを備える光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用結晶試料の選別方法。
【請求項２】
前記光源は、波長500ｎｍ〜549ｎｍの可視領域と波長800ｎｍ以上の赤外領域とを含む請求項１に記載の選別方法。
【請求項３】
光源から照射され前記結晶を経た光をビームスプリッタで分離することにより前記赤外線対応カメラの映像を得ると同時に肉眼での立体視を行う請求項１または２に記載の選別方法。
【請求項４】
前記光合成関連蛋白質が、光化学系II蛋白質である請求項１〜３の何れか一つに記載の選別方法。
【請求項５】
光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用の結晶試料の選別に用いる観察装置であって、
波長500ｎｍ〜549ｎｍの可視領域と波長800ｎｍ以上の赤外領域とを含む光源と、
光源から出射され前記結晶試料を経た光を赤外線撮影用の光路と目視立体観察用の光路へ分離して導くビームスプリッタと、
赤外線撮影用の光路の終端に配置されて結晶試料の映像信号を出力する赤外線対応カメラと、
目視立体観察用の光路の終端に配置される一対の対眼レンズとを備える観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、クロロフィル分子を含む光合成関連蛋白質の結晶内部の観察および操作方法並びにそれに用いる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、光合成関連蛋白質結晶の構造解析が注目されている。光合成は、光エネルギーを使って水を分解し酸素と水素イオンと電子とを生成する「明反応」と明反応の産生物をもらって二酸化炭素から糖質を合成する「暗反応」からなる。
光合成により酸素を発生する酸素発生型光合成生物は、光化学反応の色素分子としてクロロフィル（その中でもクロロフィルａ）を必ず有しており、蛋白質との複合体を形成している。このクロロフィルを含んだ蛋白質複合体を、この明細書において光合成関連蛋白質と呼ぶ。光合成関連蛋白質は、光合成において触媒として機能するものである。特に、光化学系II蛋白質(photosystem IIあるいはPSIIともいう)という蛋白質複合体が、明反応における水の分解に深く係わっている。
【０００３】
PSIIは、構造的に水分子が入り込む「通路」の部分と、その通路の先にあって水を分解する「触媒中心」と呼ばれる部分とを有している。通路に水分子が入り込むと、PSIIは、光のエネルギーを利用して水を分解する。反応を終えると再びもとの立体構造に戻る。
【０００４】
PSIIの触媒中心の立体構造の変化の詳細を知ることができれば、その構造を参考にしてPSIIの触媒作用をもつ化合物を人工的に作り出せる可能性がある。即ち、人工的に水から酸素と電子（電気エネルギー）を生成する人工光合成が実現できる。
【０００５】
しかし、人工光合成に至る過程は容易ではなく今日も挑戦が続けられている。光合成関連蛋白質の反応機構や、関与する大小の蛋白質の構造、機能については依然として不明な点が多い（例えば、特許文献１の「発明の属する技術分野」欄参照）。蛋白質の構造を調べるには、十分な量のタンパク質を調製し精製して、乱れのない結晶にする必要がある。PSIIは、少なくとも15個のタンパク質からなる巨大なタンパク質複合体で扱いが極めて難しい（例えば、特許文献２の「発明の属する技術分野」欄参照）。
【０００６】
研究者たちは、PSIIのきれいな結晶をつくることに苦労を重ねてきた。2009年にはそれまでに比べて格段に良質な結晶が得られた。幸いにもこの時点で、世界トップレベルの大型放射光施設であるSPring-8が既に稼働しており、その放射光施設において前述の結晶のＸ線回折測定による構造解析が行われた。その結果、PSIIの鮮明な立体構造が判明し（例えば、非特許文献１参照）、PSIIの触媒中心を人工的に合成するための有益な情報が得られた。これらの成果を踏まえ、今日では人工光合成の実現に向けた期待が高まっている。しかし、光合成の全てのメカニズムが解明された訳ではなく、今なお研究者らの努力が続いている。
【０００７】
光合成関連蛋白質結晶のＸ線回折測定による構造解析は、試料の結晶にＸ線を照射することにより生じる散乱Ｘ線の回折パターンに基づいて分子構造を特定する。もし、試料の表面に窪みや亀裂があったり、微小結晶が貼付いていたりすると、散乱Ｘ線に分離不可能なノイズが重畳される。そのような試料では高精度の構造解析が行えない。光合成関連蛋白質結晶のＸ線回折測定は、小型のＸ線発生装置に留まらず前述のように特別な放射光施設を用いて行うことが多い。特に放射光施設では、限られた時間内に行う必要があるところ、ノイズの少ない試料を適切に選別することは効率的な研究に不可欠な要素である。
【０００８】
クロロフィルは、緑色の物質であるがそれが凝集した光合成関連蛋白質の結晶は光を吸収して漆黒になる。その結晶を試料としてＸ線回折測定を行う。蛋白質の結晶は水分含有量が多く寒天状のものであるが、その表面に窪みがあったり、亀裂が生じたり、微小結晶が付着していたりする場合がある。このような試料に不適な結晶と、試料に適した結晶を選別することが必要であるが、結晶が漆黒であるためにその状態が観察しにくく、選別（品質の評価）が難しかった。例えば、前述のPSIIは光合成関連蛋白質の一種であるが、光受容体として色素分子クロロフィルａをPSII内におよそ70分子有しており光を吸収する。他の光合成関連蛋白質も同様である。例えば、光化学系Ｉ蛋白質、シトクロムｂ6ｆ複合体あるいは集光性色素アンテナ蛋白質複合体などの結晶も大量のクロロフィル分子を含む。
【０００９】
また、蛋白質は水分含有量が多いため、結晶構造を保持させるために例えば水を含む溶液に結晶を浸漬させて観察を行う。ただし、蛋白質の結晶構造を破壊しないものであれば溶液の成分は特に限定されない。溶液の成分の例として、蛋白質を安定に保つためのトリス塩酸、リン酸、グッドバッファーなどのpH緩衝液、溶解度を保つための塩化ナトリウムや塩化マグネシウムなどの塩溶液、酸化分解を防ぐためのジチオトレイトールなどの還元剤やエチレンジアミン四酢酸塩などのキレート剤を含む溶液が挙げられる。
溶液中で、蛋白質は単一分子が別個に存在するのではなく種々の分子が混ざり合って凝集することが多い。その中にPSIIの結晶化したものが存在する場合、溶液中にクロロフィル分子が含まれているために光が透過あるいは反射されず、溶液中に存在する結晶の位置や外観が分かり難い。
【００１０】
光を吸収する光合成関連蛋白質の結晶の一般的な観察手法として、従来は透過光による輪郭の観察、または、落射照明による試料表面の観察が行われていた。その他、低分子塩結晶との判別や沈殿物に埋もれて不可視な状態の蛋白質結晶に対して紫外光を照射することで、蛋白質に含まれるチロシンなどの芳香族アミノ畿による紫外線吸収を利用した蛋白質結晶の存在確認を行う装置が知られている（例えば、Formulatrix社製のＵＶ蛋白結晶化観察装置、製品名MUVIX）。さらに、トリプトファンの紫外線吸収による蛍光を利用した装置が知られている（例えば、Molecular Dimensions社製、製品名X-taLight100）。
【００１１】
クロロフィルのうち、クロロフィルａは分光特性として波長420ｎｍ（ナノメートル）と700ｎｍ付近に吸収帯を有している。さらに、例えば前述のPSIIでは波長450ｎｍ付近に吸収帯を持つβ‐カロテノイドを補酵素として含む。それらの吸収帯に挟まれた波長520ｎｍ付近と700ｎｍ以長では光吸収が起こりにくいことが知られている（図１５および出典の非特許文献２参照）。よって、波長520ｎｍ付近の光はクロロフィルによる光化学反応が比較的起こりにくく、光合成関連蛋白質の安全光として利用される。しかし、波長520ｎｍ付近は可視光領域であるため、濃密な結晶試料の場合、その帯域の光はほとんど透過せず、輪郭観察しか行えない。
【００１２】
波長約800ｎｍ〜１ｍｍの赤外線領域の光（赤外光）は透過性が強く、例えば半導体チップを非破壊で観察するために、赤外線を光源に用いた顕微鏡が市販されている。さらに、光源として可視光と赤外線とが切替え可能な顕微鏡が知られている（例えば、特許文献３参照）。ただし、特許文献３では受光した赤外線は分光分析に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平１１−１２３０９６号公報
【特許文献２】特開２０００−３４４７９７号公報
【特許文献３】特開平５−８０２５６号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Umena Y, Kawakami K, Shen JR, Kamiya N. Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II at a resolution of 1.9 A. Nature. 473, 55-60, (2011), doi:10.1038/nature09913. Epub 2011 Apr 17. PubMed PMID: 21499260.
【非特許文献２】Prof. Wim Vermass、“An Introduction to Photosynthesis and Its Applications” 、[online]、Arizona State University、[平成25年10月3日検索]、インターネット＜URL：http://bioenergy.asu.edu/photosyn/education/photointro.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
Ｘ線回折測定用の試料を評価するには、可視光による輪郭の観察だけでは不十分である。
また、蛋白質結晶は含水率が高いため、結晶構造を保持させるためには水溶液中に保持して観察を行う。その場合、落射照明では液面から反射が起こり視認し難い。さらに、水溶液中では様々な方向に結晶面が向いているが、落射照明ではそれらの方向の違いにより散乱の具合が異なり、見え方が大きく異なる。よって、落射照明は試料の評価および選別の用途に適さない。
【００１６】
溶液中の蛋白質結晶の存在確認のみで足りるならば紫外光の照射もあり得る。しかし、溶液中の蛋白質結晶を選別して取り分けるにはある程度の期間に渡って結晶を両眼で立体視して操作（マニュピレーション）を行う必要がある。その間に紫外光が操作者の眼に炎症を引き起こし、場合によっては失明に至らせる危険がある。さらに、蛋白質を構成するペプチド鎖の破壊に繋がる可能性があり、試料へのダメージが懸念される。また、紫外光によって芳香族アミノ酸が蛍光発光するため、結晶内部の詳細な様子は認識することが難しい。よって、紫外光は試料の評価および選別の用途に適さない。
この発明は、以上のような事情を考慮してなされたものであって、光合成関連蛋白質の結晶を観察しながら選別するための効率的な方法およびそれに用いる装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この発明は、可視領域と赤外領域とを含む光源の透過照明下において、光合成関連蛋白質の結晶を含む溶液中の結晶表面の状態を赤外線対応カメラの映像で観察する工程と、任意の結晶を肉眼で立体視しながら抗凍結剤溶液中に取り分ける工程と、前記抗凍結剤溶液の濃度を調整する濃度調整工程と、調整された抗凍結剤溶液中の結晶を赤外線対応カメラの映像で観察しながらＸ線回折測定に用いる結晶を決定する選別工程と、決定された結晶試料を肉眼で立体視しながら前記抗凍結剤溶液から取り出す工程とを備える光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用結晶試料の選別方法を提供する。
【００１８】
さらにこの発明は、光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用の結晶試料の選別に用いる観察装置であって、波長500ｎｍ〜549ｎｍの可視領域と波長800ｎｍ以上の赤外領域とを含む光源と、光源から出射され前記結晶試料を経た光を赤外線撮影用の光路と目視立体観察用の光路へ分離して導くビームスプリッタと、赤外線撮影用の光路の終端に配置されて結晶試料の映像信号を出力する赤外線対応カメラと、目視立体観察用の光路の終端に配置される一対の対眼レンズとを備える観察装置を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
この発明による選別方法は、光合成関連蛋白質の結晶を赤外線対応カメラの映像で観察すると共に肉眼で立体視しながら前記結晶を操作できるので、透過性の強い赤外光成分により結晶内部の様子を観察し、かつ、前記結晶に対するマニュピレーションを肉眼で立体視しながら迅速に行うことが可能である。
また、この発明による観察装置は、光合成関連蛋白質の結晶を赤外線対応カメラの映像で観察すると共に肉眼で立体視しながら前記結晶を操作できるので、この発明の選別方法に適用することによって効率的な選別が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】この発明の実施形態に適用可能な結晶化プレートの外観例を示す説明図である。
【図２】この発明の実施形態に適用可能なクライオループの外観例を示す説明図である。
【図３】この発明に係る蛋白質結晶をクライオループですくい取る様子を示す説明図である。（ａ）は実体顕微鏡により目視観察される結晶の例、（ｂ）は目視観察の様子である。
【図４】この発明の実施形態で用いるＸ線発生装置と低温窒素ガス吹きつけ装置の外観例を示す説明図である。
【図５】この発明に係る蛋白質結晶を瞬間凍結させる様子を示す説明図である。
【図６】この発明に係る蛋白質結晶のＸ線回折パターンの一例を示す説明図である。
【図７】この発明に係るＸ線回折測定の様子を模式的に説明する説明図である。
【図８】この発明において、光合成関連蛋白質の観察および試料の選別に好適な観察装置の第１の構成例を示す説明図である。
【図９】この発明の実施形態に適用可能な白色ハロゲン光源の分光特性例を示すグラフである。
【図１０】この発明の実施形態で用いるバンドパスフィルターの分光特性例を示すグラフである。
【図１１】この発明において、光合成関連蛋白質の観察および試料の選別に好適な観察装置の第２の構成例を示す説明図である。
【図１２】この発明の実施形態に適用可能な赤外LED光源の分光特性例を示すグラフである。
【図１３】この発明の実施形態に係る観察装置を用いて行った第１の観察例を示す説明図である。
【図１４】この発明の実施形態に係る観察装置を用いて行った第２の観察例を示す説明図である。
【図１５】公知の光化学系II蛋白質が有する色素分子の吸収スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面を用いてこの発明をさらに詳述する。なお、以下の説明は、すべての点で例示であって、この発明を限定するものと解されるべきではない。
≪光合成関連蛋白質の観察と試料の選別≫
光合成関連蛋白質の立体構造を決定するためにＸ線回折測定による構造解析が行われる。Ｘ線回折測定は、光合成関連蛋白質の結晶にＸ線を照射して得られる散乱Ｘ線の回折パターンをコンピュータで解析し、結晶の原子座標を決定する。近年、放射光として高輝度、即ち高エネルギーのＸ線源が利用可能になり、不安定な膜蛋白質や高分子量の蛋白質の結晶構造が決定されるようになった。
【００２２】
しかし、高エネルギーのＸ線が結晶に吸収されると、化学結合の崩壊やラジカルが発生し蛋白質分子間の相互作用を破壊する現象が起こる。これをＸ線損傷とも呼ぶ。そのため、絶対温度で100K以下の低温下に試料を保持して原子団の運動を抑制し、これによってＸ線損傷を抑えながらＸ線回折パターンを測定する。
【００２３】
蛋白質結晶の体積の内30〜90%は水が占めている。水がゼロ℃（約273K）以下に冷却されると六方晶の氷が成長し蛋白質を破壊する。そこで、氷の核形成を抑制するグリセロールやポリエチレングリコールなどのアルコール類、高濃度の塩、スクロースなどの糖類などの抗凍結剤に結晶を浸漬し、低温窒素ガス吹きつけ装置により急速凍結する。これによって、氷の発生を抑制し蛋白質結晶内の水をガラス状に凍結することができる。即ち、試料の蛋白質結晶を観察に適した状態に凍結し、Ｘ線回折測定を行うことができる。
【００２４】
なお、蛋白質を冷却する場合に水分子が氷の結晶となるのを防ぐ抗凍結剤は、従来から検討されている。抗凍結剤を結晶化母液に加えその中にタンパク質結晶を浸す操作を行う事により、水はアモルファス状で凍結される。
【００２５】
以下、蛋白質結晶を凍結してＸ線回折測定用の試料を得るまでの作業手順の詳細を記述する。
手順１：仮選別
溶液に浸漬させた蛋白質結晶を溶液と共に結晶化プレートのウェル部に注入する。図１は、この発明の実施形態において適用可能な結晶化プレートの一例を示すものであり、Jana Bioscience社製のGreiner Terasaki Plateの外観である（同社のウェブページより）。その結晶化プレートを実体顕微鏡のステージに載せ、赤外線対応カメラの映像と顕微鏡による目視の観察を行う。光源として、赤外線領域（波長800ｎｍ〜１ｍｍ）および可視光領域のうちクロロフィルによる光吸収が比較的起こりにくい波長520ｎｍ付近（500〜549ｎｍ）の安全光を同時に照射する。赤外光は赤外線対応カメラを用いてタンパク結晶の状態を示す鮮明な映像を得るためであり、安全光は目視による立体観察および操作を行うためである。
【００２６】
まず、赤外線対応カメラの顕微鏡映像に基づいて、蛋白質結晶の選定を行う。選定の基準は、結晶の最小直径が0.5〜1.0mm程度であるか（即ち、種々の方向において十分な大きさの結晶か）、単一結晶であるか、外見に亀裂や窪みがないかといったものである。この基準に基づいてＸ線回折測定に適した試料かどうかを判断する。
【００２７】
手順２：抗凍結剤への浸漬
実体顕微鏡下で目視観察（立体視）を行いながら、Ｘ線回折測定の試料に好適な結晶が析出していると判断したら、ナイロン製のワイヤループ部を有するクライオループを用いて結晶をすくい取る操作を手作業で行う(図３参照）。なお、図２はこの発明の実施形態において適用可能なクライオループの外観例を示すである（写真はHampton research社のウェブページより）。また、図３（ａ）は実体顕微鏡により目視観察される結晶の例であり、図３（ｂ）は目視観察の様子である。クライオループは、低温結晶化の際に結晶を保持、凍結、固定するナイロン製のループである。すくい取った結晶（以下、仮試料と呼ぶ）を、50-100μl（マイクロリットル）の抗凍結剤の溶液を入れたホールスライドガラスに結晶を静かに移して取り分ける。なお、ホールスライドガラスは、血液検査、細菌や組織の培養あるいは凝集反応用として市販されているものを用いることができる。
【００２８】
手順３：仮試料の抗凍結剤への浸漬
ホールスライドガラスを実体顕微鏡のステージに載せ、赤外線対応カメラの顕微鏡映像を観察しながら抗凍結溶液の浸漬により結晶が割れることがないか、もしくは溶けることがないかを確認する。
【００２９】
手順４：抗凍結剤の高濃度化
安定な抗凍結溶液条件から徐々に抗凍結能が十分に発揮される濃度まで、高濃度の溶液を添加と交換を繰り返しつつ、予め定められた濃度まで徐々に上昇させる。赤外線対応カメラの顕微鏡映像を観察しながら抗凍結溶液の高濃度化により結晶（仮試料）が割れることがないか、もしくは溶けることがないかを確認する。
【００３０】
手順５：本選別
赤外線対応カメラの顕微鏡映像を観察しながら抗凍結溶液に浸漬した仮試料のうち損傷の少ないものを選択し、実体顕微鏡下で目視観察（立体視）を行いながら、選択された仮試料をクライオループですくい取ってＸ線発生装置に設けられた所定の位置に配置して試料とする(図３参照)。その試料を、−180℃の低温窒素ガス吹きつけ装置で瞬間凍結させる。
図４はこの発明の実施形態で用いるＸ線発生装置と低温窒素ガス吹きつけ装置の外観例を示す説明図であり、図５はこの発明に係る蛋白質結晶を瞬間凍結させる様子を示す説明図である。
抗凍結溶液が好適な状態であれば、ガラス状の透明な状態で試料が凍結される。好適な状態で凍結された試料であれば、Ｘ線回折測定を行ったときに氷の結晶の回折パターンが現れない。氷の結晶の回折パターンが現れると結晶試料の回折パターンにノイズ成分として重畳される。
【００３１】
図６は、この実施形態に係る蛋白質結晶のＸ線回折パターンの一例を示す説明図である。（ａ）は、氷の結晶によるノイズ成分を含む回折パターンであり、（ｂ）は、好適な状態で凍結された試料の回折パターンである。
【００３２】
手順６：
Ｘ線を照射しながら凍結した試料を回転させ、必要な方位の全てについてＸ線回折パターンを収集する。そして、Ｘ線回折測定に必要な回折強度データの収集を行う。図７は、この発明に係るＸ線回折測定の様子を模式的に説明する説明図である（放射光施設Spring-8のウェブページより）。図７に示すように、結晶にＸ線を当てると回折現象が起こり、Ｘ線がいろいろな方向に曲がる。その結果、背後の感光板に点の模様ができる。このようにして得られた感光板上の点の模様をコンピュータによって解析し、蛋白質の立体構造を特定する。
上述の手順のうち、特に手順１および３での赤外線対応カメラによる顕微鏡映像を用いた結晶の観察、手順２で結晶化プレート中の結晶を立体視しながら行うマニュピレーションおよび手順５で抗凍結溶液中の仮試料を立体視しながら行うマニュピレーションは、以下に述べる観察装置を用いることで効率よく作業を行うことが可能である。
【００３３】
≪光合成関連蛋白質の好適な観察装置≫
続いて、光合成関連蛋白質の観察および試料の選別を行うのに好適な観察装置の構成例を説明する。
（第１の構成例）
図８は、この発明において、光合成関連蛋白質の観察および試料の選別に好適な観察装置の構成例を示す説明図である。図８に示すように、観察装置１１は、実体顕微鏡部２１、バンドパスフィルター２５、結晶化容器２７、白色ハロゲン光源２３、赤外線対応カメラ３１および画像処理コンピュータ３３を備える。実体顕微鏡部２１は、集光レンズ２１ａ、反射ミラー２１ｂ、ステージ２１ｃ、対物レンズ２１ｄ、ビームスプリッタ２９および対眼レンズ２１ｅを含む。
【００３４】
白色ハロゲン光源２３から照射した光は、集光レンズ２１ａ、反射ミラー２１ｂ、バンドパスフィルター２５を経てステージ２１ｃ上の結晶化容器２７に至る。即ち、透過照明により結晶の観察を行う。結晶化容器２７に収容された結晶を透過した光は、対物レンズ２１ｄを経てビームスプリッタ２９で２方向に分割される。
そのうちの１方向に進む光は、対眼レンズ２１ｅを経て目視観察を行う観察者４１ｂの両眼に届く。図８は実体顕微鏡部２１の光路を簡略化して示しているが、観察者４１ｂは結晶化容器２７内の結晶を両眼で立体視できる。
【００３５】
ビームスプリッタ２９により分割されたもう一方向の光は、赤外線対応カメラ３１が有するイメージセンサに至る。イメージセンサからの画像信号は画像処理コンピュータ３３に入力されて画像処理が行われ、画像処理コンピュータ３３が有する表示装置に出力される。観察者は、表示装置に写される結晶のカメラ映像を観察できる（観察者４１ａ）。なお、この実施例においてカメラ映像は平面的である。
【００３６】
観察装置１１に適用可能な機材の一例を挙げる。発明者が試料の選別に用いた機材である。
白色ハロゲン光源２３として、顕微鏡に備え付けられている株式会社ニコン製の透過照明スタンド、製品型名C-DSDSに付属の６ボルト３０ワットのハロゲン光源を用いた。図９に、白色ハロゲン光源の分光特性の一例を示す。図９に示すように、光源のピーク波長は赤外領域の850ｎｍであるが、波長520ｎｍ付近の成分もある程度含まれている。よって、赤外線対応カメラの映像による観察と同時に、目視による立体観察が可能である。
【００３７】
実体顕微鏡部２１として、株式会社ニコン製システム実体顕微鏡、製品型名SMZ1000を一部改造して用いた。即ち、製品の光路に内蔵されている赤外線カットフィルターを除去し、ビームスプリッタ２９を装着した。なお、照明装置としては前述のニコン社製透過照明スタンド、製品型名C-DSDSを用いた。
【００３８】
赤外線対応カメラ３１として、株式会社アートレイ製NIR（近赤外線）USBカメラ、製品型名ARTCAM-130MI-NIR-WOMを用いた。イメージセンサとして130万画素のCMOSセンサーを備えており、波長850ｎｍでの量子効率は20％以下である。
【００３９】
バンドパスフィルター２５として、日本真空光学株式会社製の全誘電体干渉フィルター、製品型名DIF-BPFを用いた。観察に用いたのは、中心波長が525ｎｍ、半値幅が９ｎｍの特性を有するものであるが、上記仕様の範囲であれば安全光といえるのでこの発明に係るバンドパスフィルターとして用いることができる。阻止域は720ｎｍ以下でそれより長波長側の赤外領域を透過する。
【００４０】
図１０に、バンドパスフィルターとして用いたDIF-BPFの分光特性を示す。図１０に示すように、バンドパスフィルターは、赤外LED光源のピーク波長である850ｎｍ付近を含む波長730ｎｍ以上の赤外光領域と、安全光である波長525nm付近の光を透過させる。波長525nm付近では、光化学系II蛋白質の持つ色素分子のクロロフィルaおよびβ‐カロテノイドがその前後の波長域に比べて光吸収を起こしにくい。
【００４１】
図８の観察装置１１は、安全光および赤外光を利用することで結晶の輪郭だけでなく内部状況を観察できる。また、落射照明のように液面に光が反射されたり散乱の具合によって見え方が異なったりしない。また、紫外光のように観察者や蛋白質構造にダメージを与える危険性が少なく、装置の価格が安価に抑えられる。
【００４２】
（第２の構成例）
図１１は、光合成関連蛋白質の観察および試料の選別に好適な観察装置の第２の構成例を示す説明図である。図１１の構成においては第１の構成例で用いたものと同様の白色ハロゲン光源２３ｂに加え、結晶内部をより鮮明に観察する場合に好適な赤外線光源としての赤外LED光源２３ａを備えている。赤外LED光源２３ａと白色ハロゲン光源２３ｂとは回転軸３５を中心に回動することによって切替可能に配置されている。その他は、バンドパスフィルター２５を含めて第１の構成例と同様である。
【００４３】
図１２に、赤外LED光源２３ａの分光特性の一例を示す。図１２に示すように、光源のピーク波長は可視領域の600〜700ｎｍであり、520ｎｍ付近の成分の光を含まない。よって、赤外LED光源２３ａを用いた場合は目視による立体観察はできない。
【００４４】
しかし、赤外光を利用することで結晶の輪郭だけでなく内部状況を透過して観察できる。濁った溶液や光が透過しにくい部位の観察も容易に行うことができる。また、紫外光のように観察者や蛋白質構造にダメージを与える危険性が少なく、紫外光の光源を用いる場合に比べて装置の価格が安価に抑えられる。
さらにまた、可視光領域および溶液に熱を発生させる数千nm以上の中、遠赤外領域の光を含まないので、可視光による光合成関連蛋白質の反応を抑えた観察および溶液試料の温度上昇を抑えた観察が可能である。
【００４５】
光源に赤外LED光源２３ａを用いる場合、白色ハロゲン光源２３ｂに比べると結晶操作の利便性は落ちる。
図１１の観察装置１１は、結晶観察と結晶操作の場面に応じて光源を切替えることが可能である。そこで、例えば前述の作業手順において、手順１で蛋白結晶の選定を行うときは赤外LED光源２３ａを用いて観察を行い、手順２で結晶をすくい取る操作のときは白色ハロゲン光源２３ｂを用い、続く手順３、４で結晶を観察するときは赤外LED光源２３ａを用い、最後の手順５で結晶をすくい取る操作は白色ハロゲン光源２３ｂを用いるといったように好適な光源に切替えることが可能である。
【００４６】
以上のように、この発明によれば、これまで結晶性の問題を回折実験のみで行われてきた蛋白質の評価が容易にできる。
また、基質などを含む溶液に浸漬したときの結晶への影響を観察することができ、基質濃度、pH、塩濃度など最適な溶液条件を特定することができる。よって、回折実験までの試行錯誤の時簡を減らすことができる。引いては、研究時間と資金の節約に繋がり、重要な蛋白質構造を素早く報告できるようになることが期待される。
【００４７】
なお、第２の構成例で光源を切替える構造は図１１に示す他に種々の態様が考えられる。変形例として、赤外LED光源２３ａと白色ハロゲン光源２３ｂとを同一のスライド可能なシャーシーに取り付けて両者を切替えるようにしてもよい。あるいは、両者が照射する光を光路上で合成して切替え可能とし観察を行うように構成してもよい。
【００４８】
≪観察例≫
図１３は、この発明の実施形態に係る観察装置を用いて行った第１の観察例を示す説明図である。試料はPSIIの結晶である。（ａ）は安全光による目視観察の例であり、（ｂ）は、赤外光下の赤外線対応カメラでの実体顕微鏡写真である。
【００４９】
詳細には、（ａ）は、可視光域のみに感度を持つ通常のカメラ（具体的にはマイクロネット株式会社製の1/3インチCMOSカメラ（製品名  セナマール）、300万画素、USBモニター付）でPSIIの結晶を撮影した画像である。ただし、試料保護のためバンドパスフィルター２５を用いた安全光下での観察例である。
（ｂ）は、光源に赤外線LED光源２３ａを用い、赤外線対応カメラ３１で（ａ）と同一のPSIIの結晶を撮影した画像である。なお、白色ハロゲン光源２３ｂを用い、バンドパスフィルター２５を装着した状態で赤外線対応カメラ３１から画像が得られるが、赤外線LED光源２３ａに比べて赤外光成分の照射強度が低いため鮮明さで劣る。
【００５０】
（ｂ）の画像で、特に矢印１〜３を付した箇所は（ａ）で確認することができなかった窪み（矢印１）や傷（矢印２）が確認できる。さらに、（ａ）では輪郭しか観察できなかった集合状態の結晶（矢印３）から個別の結晶を選択できるようになった。
この実施形態によれば、Ｘ線回折測定用の試料として、傷などにより回折斑点の乱れを起こさない好適な結晶を観察して選別することができる。また、集合体結晶から分析に適した単結晶を分けて回収することができる。
【００５１】
図１４は、この発明の実施形態に係る観察装置を用いて行った第２の観察例を示す説明図である。溶液中のPSIIの結晶の観察例である。
（ａ）は通常カメラの実体顕微鏡写真を波長525ｎｍの安全光下での目視観察の例であり、（ｂ）は、赤外光下の赤外線対応カメラの実体顕微鏡写真である。
【００５２】
詳細には、（ａ）は、光源に白色ハロゲン光源２３ｂを用い、可視光域のみに感度を持つ通常のカメラでPSIIの結晶を撮影した画像である。ただし、試料保護のためバンドパスフィルター２５を用いた安全光での観察例である。
（ｂ）は、光源に赤外線LED光源２３ａを用い、バンドパスフィルター２５を装着し、赤外線対応カメラ３１で（ａ）と同一のPSIIの結晶を撮影した画像である。
【００５３】
（ａ）では、結晶化していないPSII蛋白質により溶液に濁りがあるために光が散乱して溶液内部の観察が困難である。
それに対し（ｂ）は、（ａ）で確認できなかったPSII蛋白質の単結晶が容器内の壁面に析出していることが確認される（矢印を付した箇所を参照）。
【００５４】
以上に述べたように、
（i）この発明による光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用結晶試料の選別方法は、可視領域と赤外領域とを含む光源の透過照明下において、光合成関連蛋白質の結晶を含む溶液中の結晶表面の状態を赤外線対応カメラの映像で観察する工程と、任意の結晶を肉眼で立体視しながら抗凍結剤溶液中に取り分ける工程と、前記抗凍結剤溶液の濃度を調整する濃度調整工程と、調整された抗凍結剤溶液中の結晶を赤外線対応カメラの映像で観察しながらＸ線回折測定に用いる結晶を決定する選別工程と、決定された結晶試料を肉眼で立体視しながら前記抗凍結剤溶液から取り出す工程とを備えることを特徴とする。
【００５５】
さらに、この発明の好ましい態様について説明する。
（ii）前記光源は、波長500ｎｍ〜549ｎｍの可視領域と波長800ｎｍ以上の赤外領域とを含んでいてもよい。
このようにすれば、光合成関連蛋白質が含むクロロフィルによる光化学反応が起こりにくい波長500ｎｍ〜549ｎｍの可視領域と波長800ｎｍ以上の赤外領域とを用いることができるので、光合成関連蛋白質にダメージや影響を与えずに選別が行える。
【００５６】
（iii）前記仮決め工程における観察は、結晶が予め定められた範囲の大きさを有し、かつ傷、窪みおよび微少結晶の貼付きがないかを観察するものであってもよい。
このようにすれば、透過性の強い赤外光成分により結晶の様子を観察して傷、窪みや微少結晶の貼付きがない結晶を正確かつ迅速に仮決めすることができる。よって、
【００５７】
（iv）前記濃度調整工程は、予め定められた濃度まで前記抗凍結剤溶液の濃度を上昇させる行程であってもよい。
このようにすれば、透過性の強い赤外光成分により結晶の様子を観察しながら、Ｘ線回折測定の凍結処理時に氷の発生を十分抑制できる程度まで抗凍結剤溶液の濃度を上昇させることができる。
【００５８】
（v）前記選別工程における観察は、結晶が予め定められた範囲の大きさを有し、かつ傷、窪みおよび微少結晶の貼付きがないかを観察するものであってもよい。
このようにすれば、透過性の強い赤外光成分により結晶の様子を観察して傷、窪みや微少結晶の貼付きがない結晶を正確かつ迅速に決定できる。
【００５９】
（vi）光源から照射され前記結晶を経た光をビームスプリッタで分離することにより前記赤外線対応カメラの映像を得ると同時に肉眼での立体視を行うようにしてもよい。
このようにすれば、前記結晶を経た光をビームスプリッタで二分し、赤外線対応カメラの映像による観察と目視による立体観察とを実質的に並行して行うことができる。
【００６０】
（vii）前記光合成関連蛋白質が、光化学系II蛋白質であってもよい。
【００６１】
（viii）この発明による光合成関連蛋白質のＸ線回折測定用の結晶試料の選別に用いる観察装置は、波長500ｎｍ〜549ｎｍの可視領域と波長800ｎｍ以上の赤外領域とを含む光源と、光源から出射され前記結晶試料を経た光を赤外線撮影用の光路と目視立体観察用の光路へ分離して導くビームスプリッタと、赤外線撮影用の光路の終端に配置されて結晶試料の映像信号を出力する赤外線対応カメラと、目視立体観察用の光路の終端に配置される一対の対眼レンズとを備えることを特徴とする。
【００６２】
この発明の好ましい態様には、上述した複数の態様のうちの何れかを組み合わせたものも含まれる。
前述した実施の形態の他にも、この発明について種々の変形例があり得る。それらの変形例は、この発明の範囲に属さないと解されるべきものではない。この発明には、請求の範囲と均等の意味および前記範囲内でのすべての変形とが含まれるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
光合成物質として、クロロフィルを光化学反応の色素分子として有する酸素発生型光合成生物と、クロロフィルと類似のバクテリオクロロフィルを光化学反応の色素分子として持つ無酸素型光合成生物とが知られている。
前者の酸素発生型光合成生物は、原核生物（細菌）であるシアノバクテリアのみならず、真核生物（細菌以外の生物）に属する紅藻、緑藻、その他の高等生物が存在する。それらはいずれも、緑色の色素であるクロロフィルａを有する点で共通する。その他、クロロフィルａが吸収できない波長帯を吸収するクロロフィルｂ、ｃ、ｄ等の補助色素をさらに持つものも存在する。これら酸素発生型光合成生物はいずれも水を酸化分解して酸素を発生する。
後者の無酸素型光合成生物としては、原核生物のヘリオバクテリア、紅色細菌、緑色硫黄細菌が知られている。それらは、いずれも水を還元剤として利用しないため酸素を発生しない。
【００６４】
この発明は、主に前者の酸素発生型光合成生物に関連する。酸素発生型光合成生物においては、クロロフィルが蛋白質と複合体（光合成関連蛋白質）を形成している。ただし、無酸素型光合成生物由来の光合成関連蛋白質にも適用が可能である。バクテリオクロロフィルは700-800nm付近に極大光吸収波長があるが、赤外線対応カメラとハロゲン光源およびバンドパスフィルターの長波長領域の透過光が800-900nmにも十分に対応するため、同様の測定が可能である。また、バクテリオクロロフィルにおいても525nm付近の光吸収は低いため安全光として用いることができる。
酸素発生型光合成生物は、光合成関連蛋白質を有している。光合成関連蛋白質は、酸素発生型光合成生物の膜などを構成している。光合成関連蛋白質は、アンテナ蛋白質、反応中心およびシトクロム蛋白質に分類される。
アンテナ蛋白質は、さらにフィコビリソームとそれ以外の光捕集蛋白質複合体に分類される。フィコビリソームは、シアノバクテリアと紅藻類とに含まれるアンテナ蛋白質であって、フィコシアニンを色素として持つ。フィコビリソーム以外の光捕集蛋白質複合体は、クロロフィルで構成されLHCIとLHCIIの２種類が存在する。
【００６５】
反応中心は、光化学系Iと光化学系IIに分類される。光化学系Iは、シアノバクテリアとほぼ同じ構成を有するが、シアノバクテリアの蛋白質が３量体であるのに対して高等植物の光化学系Iは蛋白質が単量体である。なお、単量体とは、多量体の構成単位となる蛋白質であり、同一の蛋白質である単量体が会合して多量体を形成する。３量体は３つの単量体が会合して形成される多量体である。光化学系IIは、光化学系Iと構成がほぼ同じだが、表在性のサブユニットが異なる。
シトクロム蛋白質は、酸素発生型光合成膜にある膜貫通蛋白質複合体であり、光化学系Iと光化学系IIの間で電子を遣り取りする。クロロフィルよりもヘム分子を多く持っている。
【００６６】
本発明によれば、光合成関連蛋白質の結晶の内部状態を観察しながら選別する操作を効率よく行うことができる。よって、人工光合成実現のキーである光合成関連蛋白質の構造解析に大きく寄与する。
本発明の有用性は極めて高いといえる。
【符号の説明】
【００６７】
１１：観察装置、    ２１：実体顕微鏡部、    ２１ａ：集光レンズ、    ２１ｂ：反射ミラー、    ２１ｃ：ステージ、    ２１ｄ：対物レンズ、    ２１ｅ：対眼レンズ、    ２３ａ：赤外LED光源、    ２３、２３ｂ：白色ハロゲン光源、    ２５：バンドパスフィルター、    ２７：結晶化容器、    ２９：ビームスプリッタ、    ３１：赤外線対応カメラ、    ３３：画像処理コンピュータ、    ３５：回転軸、    ４１ａ、４１ｂ：観察者
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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