(57)【要約】【課題】特定の生体組織に限定されないタンパク質を使用して免疫組織染色を容易に行う方法を提供する。【解決手段】タンパク質の濃度測定方法は、基板面にタンパク質を付着させる付着工程と、酵素で標識した抗体を基板面に付着したタンパク質と結合させる結合工程と、基板面における抗体と発色基質とを反応させる発色反応工程と、発色基質による発色に基づいて基板面におけるタンパク質の濃度を測定する測定工程と、を有する。【選択図】図１
2015111095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の対象面にタンパク質を付着させる付着工程と、
酵素で標識した抗体を前記対象面に付着した前記タンパク質と結合させる結合工程と、
前記対象面における前記抗体と発色基質とを反応させる発色反応工程と、
前記発色基質による発色に基づいて前記対象面における前記タンパク質の濃度を測定す
る測定工程と、を有することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の測定方法において、
前記抗体は前記対象面に定着されていることを特徴とする測定方法。
【請求項３】
請求項１乃至２のいずれかに記載の測定方法において、
前記タンパク質はアルブミンであることを特徴とする測定方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の測定方法において、
前記付着工程で前記タンパク質を付着させる領域を前記基板の前記対象面に設定する設
定工程を有することを特徴とする測定方法。
【請求項５】
基板の対象面に第１の抗体を定着させる定着工程と、
前記対象面に定着した前記第１の抗体にタンパク質を付着させる付着工程と、
酵素で標識した第２の抗体を前記対象面に付着した前記タンパク質と結合させる結合工
程と、
前記対象面における前記第２の抗体と発色基質とを反応させる発色反応工程と、
前記発色基質による発色に基づいて前記対象面における前記タンパク質の濃度を測定す
る測定工程と、を有することを特徴とする測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の測定方法において、
前記タンパク質はアルブミンであることを特徴とする測定方法。
【請求項７】
前記付着工程、前記結合工程、前記発色反応工程のうち、少なくとも１つの工程では、
電界撹拌法を用い、前記タンパク質と溶媒とを含む溶液を撹拌することを特徴とする請求
項５または６に記載の測定方法。
【請求項８】
前記電界撹拌法は、互いに対向する、上電極と、前記溶液が液滴として滴下された基板
が載置される下電極との間に電界を発生させ、前記電界によるクーロン力で前記液滴を撹
拌する方法であって、
前記第１の抗体または前記第２の抗体が前記液滴中でマイナスに帯電している場合、
前記下電極に印加される電位の極性をマイナスとすることを特徴とする請求項７に記載
の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織内の特定タンパク質の発現や局在を明らかにすべく、特定タンパク質などの分
子を認識して結合する抗体を用いて、組織標本中の抗原を検出する手法である免疫組織染
色法が知られている。また、試料中に含まれる抗体や抗原の濃度を検出・定量する方法と
して、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ：Enzyme Linked Immuno Solvent Assay）が知ら
れている。
このような免疫組織染色法では、特異性の高い抗体を用いて特定タンパク質を検出する
ために、非常に高精度な診断を行うことができるが、対象とする組織の抽出から、標本へ
の固定、洗浄、ブロッキング、一次抗体による抗原抗体反応、二次抗体による抗原抗体反
応、発色液による発色等の一連の工程に多くの時間を所要する。従って、下記特許文献１
に示すように、試料の撹拌を効率的に行うことで抗原の検出に所要する時間の短縮を図り
、手術中における病理判断を可能にすべく迅速な手法に関して種々の技術開発が行われて
いる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１３５９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、抗原検出の迅速化を図るための技術を開発する場合、試料としてヒト等
の生体組織を使う必要があるが、そのような生体組織を扱うに当たっての必要な資格や、
生体組織を確保するために要する高額なコスト等の制約条件が多く、開発した技術の効果
を容易に検証することは困難であった。
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、特定の生体組織に限定されないタ
ンパク質を使用して免疫組織染色を容易に行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の
形態又は適用例として実現することが可能である。
【０００６】
［適用例１］
本適用例にかかる測定方法は、基板の対象面にタンパク質を付着させる付着工程と、酵
素で標識した抗体を前記対象面に付着した前記タンパク質と結合させる結合工程と、前記
対象面における前記抗体と発色基質とを反応させる発色反応工程と、前記発色基質による
発色に基づいて前記対象面における前記タンパク質の濃度を測定する測定工程と、を有す
ることを特徴とする。
【０００７】
このような方法によれば、対象面に付着させたタンパク質と、酵素で標識した抗体と、
を結合させ、発色基質を接触させて反応（発色）させた後、発色に基づいて対象面におけ
るタンパク質の濃度を測定することで、タンパク質に対する免疫組織染色を容易に行うこ
とができる。
【０００８】
［適用例２］
上記適用例にかかる測定方法において、前記抗体は前記対象面に定着されていることを
特徴とする。
【０００９】
［適用例３］
上記適用例にかかる測定方法において、前記タンパク質はアルブミンであっても良い。
【００１０】
［適用例４］
上記適用例にかかる測定方法において、前記付着工程で前記タンパク質を付着させる領
域を前記基板の前記対象面に設定する設定工程を有することが好ましい。
【００１１】
このような方法によれば、タンパク質を付着させる基板の領域を適切に設定できる。
【００１２】
［適用例５］
本適用例にかかる測定方法は、基板の対象面に第１の抗体を定着させる定着工程と、前
記対象面に定着した前記第１の抗体にタンパク質を付着させる付着工程と、酵素で標識し
た第２の抗体を前記対象面に付着した前記タンパク質と結合させる結合工程と、前記対象
面における前記第２の抗体と発色基質とを反応させる発色反応工程と、前記発色基質によ
る発色に基づいて前記対象面における前記タンパク質の濃度を測定する測定工程と、を有
することを特徴とする。
【００１３】
このような方法によれば、対象面に付着させたタンパク質と、酵素で標識した抗体と、
を結合させ、発色基質を接触させて反応（発色）させた後、発色に基づいて対象面におけ
るタンパク質の濃度を測定することで、タンパク質に対する免疫組織染色を容易に行うこ
とができる。
【００１４】
［適用例６］
上記適用例にかかる測定方法において、前記タンパク質はアルブミンであっても良い。
【００１５】
［適用例７］
上記適用例にかかる測定方法において、前記付着工程、前記結合工程、前記発色反応工
程のうち、少なくとも１つの工程では、電界撹拌法を用い、前記タンパク質と溶媒とを含
む溶液を撹拌することが好ましい。
【００１６】
このような方法によれば、反応のために上記溶液を放置する静置法に比べて、電界撹拌
法を用いることにより、反応時間を短縮することができる。
【００１７】
［適用例８］
上記適用例にかかる測定方法において、前記電界撹拌法は、互いに対向する、上電極と
、前記溶液が液滴として滴下された基板が載置される下電極との間に電界を発生させ、前
記電界によるクーロン力で前記液滴を撹拌する方法であって、前記第１の抗体または前記
第２の抗体が前記液滴中でマイナスに帯電している場合、前記下電極に印加される電位の
極性をマイナスとすることが好ましい。
【００１８】
このような方法によれば、第１の抗体または第２の抗体と下電極との間に斥力が働くの
で、引力が働いた場合に比べて非特異的な反応が起こり難くなるため、より適正な染色あ
るいは発色の結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態１に係る抗原抗体反応を検出する方法の工程を示す図。
【図２】撥水円の捺印工程を説明する図。
【図３】サンドイッチ法による抗原抗体反応を説明する図。
【図４】実施形態１における発色の濃度と吸光度の関係を示す図。
【図５】実施形態１におけるアルブミン濃度に応じた発色の違いを示す図。
【図６】サンドイッチ法と直接法の違いを説明する図。
【図７】実施形態２に係る抗原抗体反応を検出する方法の工程を示す図。
【図８】直接法による抗原抗体反応を説明する図。
【図９】実施形態２における発色の濃度と吸光度の関係を示す図。
【図１０】実施形態２におけるアルブミン濃度に応じた発色の違いを示す図。
【図１１】実施形態３における抗原抗体反応を検出する方法の工程を示す図。
【図１２】実施形態３におけるアルブミン濃度に応じた発色の違いを示す図。
【図１３】実施形態３における発色の濃度と吸光度の関係を示す図。
【図１４】実施形態４に係る電界撹拌装置の機械的及び電気的な構成を示すブロック図。
【図１５】（ａ）〜（ｃ）は実施形態４に係る電界撹拌法を説明する図。
【図１６】実施形態４における抗原抗体反応を検出する方法の工程を示す図。
【図１７】実施形態４における静置法および電界撹拌法での発色の違いを示す図。
【図１８】実施形態４における静置法および電界撹拌法での発色の濃度の違いを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。
【００２１】
（実施形態１）
図１は、本実施形態１に係る抗原抗体反応を検出する方法（測定方法）の工程を示す図
である。本実施形態１では、ＥＬＩＳＡの一方法であるスライドグラスを用いたサンドイ
ッチ法を採用する。尚、サンドイッチ法は、同一タンパク質を捕獲抗体と一次抗体の２種
類の抗体を用いて検出するため、夾雑物からどれだけ正確に区別できるかを示す特異性を
高くできることが知られている。
図１に示すように、最初に、撥水円３００の捺印工程（設定工程）を実行する。撥水円
３００の捺印工程は、図２に示すように、実験者が撥水性ペン１００を使用し、通常のガ
ラス製のスライドグラスのような親水性基板２００の一方の面（対象面）に対して適切な
大きさの撥水円３００（例えば、直径２０ｍｍ）を定める。尚、撥水円３００の捺印工程
の所要時間は１分程度である。
次に、抗体の固相工程を実行する。尚、以降の工程については図３も参照して説明する
。抗体の固相工程は、図３における抗体定着工程に相当する。本実施形態１では６０分の
静置を行う。本実施形態１において、定着させる抗体（捕獲抗体）は、抗ウシ血清アルブ
ミン抗体（ＩｇＧ）を採用している。
【００２２】
次に、１分の洗浄工程を実行した後、ブロッキング工程を実行する。ブロッキング工程
は、非特異的な結合を阻止するために有益であり、例えば、血清やスキムミルク、ゼラチ
ン等を採用できる。本実施形態１では３０分の静置を行う。
次に、１分の洗浄工程を実行した後、一次抗体反応工程（定着工程）を実行する。本実
施形態１では、抗原としてタンパク質であるアルブミン濃度を０〜８００ｎｇ／ｍｌ（ミ
リリットル）に調整したものを採用する。アルブミンは牛等の脊椎動物の血液に含まれる
血清アルブミンを採用したが、アルブミンには限定されない。例えば、炎症サイトカイン
やインシュリンも採用できる。
また、一次抗体（第１の抗体）として、例えば、抗原に特異的に結合する抗体を採用で
きる。尚、アルブミン濃度に応じて、後述する発色反応における発色濃度を調整できる。
本実施形態１では６０分の静置を行う。尚、一次抗体反応工程は、図３における抗原抗体
（一次抗体）反応に相当する。この一次抗体反応工程により、固相表面には、固相―捕獲
抗体―抗原―一次抗体の複合体が形成される。
【００２３】
次に、１分の洗浄工程を実行し、一次抗体反応工程で非反応の抗原や一次抗体を除去す
る。
次に、酵素で標識済みの二次抗体（第２の抗体）を作用させるべく二次抗体反応工程（
結合工程）を実行する。二次抗体としては、例えば、酵素を標識した抗原に特異的に結合
する抗体（酵素としてはペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等）を採用できる
。本実施形態１では、二次抗体反応工程において６０分の静置を行う。尚、二次抗体反応
工程は、図３における抗原抗体（二次抗体）反応に相当する。
次に、１分の洗浄工程を実行し、余分な二次抗体を除去した後、発色反応工程（接触工
程）を実行する。本実施形態１では、図３に示すように、例えば、ＴＭＢ（酵素が、アル
カリフォスファターゼであればＮＢＴ）のような発色基質を含む発色試薬を滴下して、二
次抗体とＴＭＢとを反応（発色）させた後、例えば、０．１８Ｍ・Ｈ2ＳＯ4のような反応
停止液を滴下する。滴下量は何れも１２０μｌ（マイクロリットル）である。本実施形態
１では発色反応工程の所要時間は１５分程度である。
以上の一連の工程を実行するのに２３０分を所要する。尚、発色状況は顕微鏡等により
目視で観察する（測定工程）。図４は本実施形態１における発色の濃度と吸光度の関係を
示し、図５はアルブミン濃度に応じた発色の違いを示す写真である。図４および図５より
、アルブミン濃度が高くなるに従い、吸光度も上昇し発色の強度が変化していることから
、アルブミンを使用したサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの有効性を確認できる。
【００２４】
なお、図４における吸光度は、ＴＭＢ（3,3’，5,5’−Tetramethyl  benzidine）の吸
収波長４５０ｎｍにおける吸光度であり、以下の数式で与えられる。
吸光度（Ａｂｓ４５０）＝ｌｏｇ（Ｉ0／Ｉ）
Ｉ0は入射光の強度、Ｉは透過光の強度である。つまり透過率の逆数の対数が吸光度で
ある。以降、発色基質としてＴＭＢを用いた場合の吸光度はＡｂｓ４５０と表記する。
【００２５】
以上述べた実施形態１によれば、以下のような効果を奏する。
（１）アルブミンは取り扱うための資格が不要であって、生体組織として低コストのタ
ンパク質であることから、このアルブミンを使用して抗原検出反応を行うことで、抗原検
出反応の迅速化を目指す技術開発の検証が容易になり、医療の発展に寄与できる。
（２）撥水円３００の大きさは実験者が適宜設定できるため、反応に使用する溶液量に
対して制限が生じることを回避できる。
（３）スライドグラスは親水性を有する普通のガラス基板を使用できるため、従来のよ
うな高価なたんぱく質マイクロアレイや、培養細胞が予め貼り付けられたスライドグラス
を使用する場合と比較して安価に実験できる。
【００２６】
（実施形態２）
次に、本発明の実施形態２について、図６〜図１０を参照して説明する。尚、以下の説
明では、既に説明した部分と同じ部分については、同一名称を付してその説明を省略する
。
実施形態１では、ＥＬＩＳＡのサンドイッチ法を採用したが、本実施形態２ではスライ
ドグラスを用いた直接法を採用する。
図６は、サンドイッチ法と直接法の違いを説明する図である。サンドイッチ法では、一
次抗体反応工程により複合体を形成し、形成した複合体と二次抗体とで二次抗体反応工程
を実行したが、直接法では、抗原に対して二次抗体を直接に作用させる。従って、一次抗
体反応工程を省くことから、サンドイッチ法と比較して所要時間を短縮できることが知ら
れている。
図７は、スライドグラスを用いた直接法により抗原抗体反応を検出する方法の工程を示
す図である。また、工程を図示した図８も適宜参照する。
【００２７】
最初に、撥水円３００の捺印工程を実行する。撥水円３００の捺印工程は、実施形態１
と同様に、親水性基板２００に対して撥水性ペン１００で直径２０ｍｍの撥水円３００を
定める。尚、撥水円３００の捺印工程の所要時間は１分程度である。
次に、抗原の固相工程を実行する。抗原の固相工程は、図８における抗原定着工程（付
着工程）に相当する。本実施形態２では、抗原としてアルブミンを採用し、アルブミンを
撥水円３００に付着させた後、６０分の静置を行う。
次に、１分の洗浄工程を実行した後、ブロッキング工程を実行する。本実施形態２では
３０分の静置を行う。
次に、１分の洗浄工程を実行した後、抗原としてタンパク質であるアルブミン濃度を０
〜２００μｇ／ｍｌに調整したものを、酵素で標識した二次抗体に作用させるべく二次抗
体反応工程（結合工程）を実行する。本実施形態２では、二次抗体反応工程において６０
分の静置を行う。尚、二次抗体反応工程は、図８における抗原抗体反応に相当する。
【００２８】
次に、１分の洗浄工程を実行し、余分な二次抗体を除去した後、発色反応工程を実行す
る。本実施形態２では、図８に示すように、発色試薬を滴下して発色させた後、反応停止
液を滴下する。滴下量は何れも１２０μｌである。本実施形態２では発色反応工程の所要
時間は１５分程度である。
以上の一連の工程を実行するのに１６９分を要し、サンドイッチ法と比較して所要時間
が６１分短縮できる。尚、発色状況は顕微鏡等により目視で観察できる。図９は本実施形
態２における発色の濃度と吸光度の関係を示し、図１０はアルブミン濃度に応じた発色の
違いを示す写真である。図９および図１０より、アルブミン濃度が高くなるに従い、吸光
度も上昇し発色の強度が変化していることから、アルブミンを使用した直接法によるＥＬ
ＩＳＡの有効性を確認できる。
【００２９】
以上述べた実施形態２は実施形態１で述べた効果と同様な効果を奏することに加え、抗
原抗体反応の所要時間を短縮させることができる。
【００３０】
（実施形態３）
次に、本発明の実施形態３について、図１１〜図１３を参照して説明する。
実施形態２ではスライドグラスを用いた直接法を採用し、抗体の固相工程および二次抗
体反応工程において６０分の静置を行ったが、本実施形態３では、それぞれの静置時間を
短縮した。
図１１は、実施形態３におけるスライドグラスを用いた直接法により抗原抗体反応を検
出する方法の工程を示す図である。尚、図１１においては、撥水円３００の捺印工程を略
したが、実施形態２と同様に実行する。
撥水円３００の捺印工程の後、図１１に示すように、抗原の固相工程を実行する。本実
施形態３では３０分の静置を行う。
次に、１分の洗浄工程を実行した後、ブロッキング工程を実行する。本実施形態３では
３０分の静置を行う。
【００３１】
次に、１分の洗浄工程を実行した後、抗原としてタンパク質であるアルブミン濃度を０
〜２００μｇ／ｍｌに調整したものを二次抗体に作用させるべく二次抗体反応工程を実行
する。本実施形態３では、二次抗体反応工程において３０分の静置を行う。
次に、１分の洗浄工程を実行し、余分な二次抗体を除去した後、発色反応工程を実行す
る。発色反応工程では、発色試薬を滴下して発色させた後、反応停止液を滴下する。滴下
量は何れも１２０μｌである。本実施形態３では発色反応工程の所要時間は１５分程度で
ある。
以上の一連の工程を実行するのに１０８分を要し、実施形態２と比較して所要時間が略
６０分短縮できる。尚、発色状況は顕微鏡等により目視で観察できる。図１２はアルブミ
ン濃度に応じた発色の違いを示す写真であり、図１３は本実施形態３における発色の濃度
と吸光度の関係を示す。図１２および図１３より、アルブミン濃度が高くなるに従い、吸
光度も上昇し発色の強度が変化していることから、アルブミンを使用して所要時間を短縮
した直接法によるＥＬＩＳＡの有効性を確認できる。
【００３２】
以上述べた実施形態３は実施形態１で述べた効果と同様な効果を奏することに加え、抗
原抗体反応の所要時間を実施形態２よりも更に短縮させることができる。
【００３３】
（実施形態４）
次に、本発明の実施形態４について、図１４〜図１８を参照して説明する。実施形態１
〜実施形態３では、二次抗体反応工程において静置する静置法を採用したが、本実施形態
４では、電界撹拌法を採用する。
図１４は実施形態に係る電界撹拌装置の機械的及び電気的な構成を示すブロック図であ
る。図１４に示すように、電界撹拌装置１は、下電極１０と、上電極２０と、下電極１０
を上下方向に昇降させる昇降機構５０と、支持部３０を介して上電極２０を前後方向に移
動させる移動機構６０と、下電極１０と上電極２０とに電気的に接続され、電界を生じさ
せるための電圧を生成する電源装置４０と、これらの構成を統括的に制御する制御部７０
と、を備えている。
【００３４】
下電極１０の上面（電極面）には、基板Ｗが載置される。基板Ｗは、絶縁性の材料から
なり、例えばガラス基板やプラスチック基板を用いることができる。本実施形態では、Ｅ
ＬＩＳＡで電界撹拌装置１を用いる例を示すことから、基板Ｗは顕微鏡用スライドガラス
が用いられている。基板Ｗには試薬などの液体が滴下される。以降、基板Ｗに滴下された
少量の液体を液滴Ｓと呼ぶ。
【００３５】
昇降機構５０は、例えば、下電極１０を下方から支持するシリンダーと、シリンダーに
取り付けられたボールネジと、ボールネジを回転させるステップモーターとを含んで構成
される。
【００３６】
移動機構６０は、例えば、支持部３０に対して前後方向に取り付けられたシリンダーと
、シリンダーに取り付けられたボールネジと、ボールネジを回転させるステップモーター
とを含んで構成される。
【００３７】
電源装置４０は、例えば、周波数を可変可能であって、交流電圧を発生する電圧発生部
と、電圧発生部で発生した交流電圧を所望の電位に昇圧する昇圧部とを含んで構成される
。
【００３８】
制御部７０は、演算部７１と、記憶部７２とを含んで構成される。演算部７１は、例え
ばＣＰＵやＭＰＵなどの小型演算回路である。記憶部７２は、例えばＲＯＭやＲＡＭなど
であり、制御プログラムやデータテーブルを記憶したり、制御プログラムを展開するため
の記憶領域を提供したりする。制御部７０は、記憶部７２に記憶された制御プログラムを
演算部７１が実行することによって、電界撹拌装置１の各構成要素（電源装置４０、昇降
機構５０、移動機構６０など）を制御する。
【００３９】
次に、図１５を参照して、電界撹拌装置１を用いた電界撹拌法について説明する。図１
５は実施形態４に係る電界撹拌法を説明する図である。
【００４０】
図１５（ａ）に示すように、撥水処理が施された基板Ｗ上に試薬などの液体を滴下して
液滴Ｓを形成すると、液滴Ｓは基板Ｗ上において盛り上がる。盛り上がった液滴Ｓの基板
Ｗ上における高さｈは、主に、液滴Ｓの容量と、液滴Ｓの粘度と、液滴Ｓの表面張力と、
液滴Ｓが接している基板Ｗの表面の界面張力とにより決定される。特に、液滴Ｓの粘度は
、温度に依存するので、作業環境における温度管理は重要なファクターとなる。一方で試
薬などの液体は少量の滴下や撹拌、化学反応などの用法を考慮して、一般的には低粘度（
例えば５ｃｐｓ以下）の状態となっている。液滴Ｓの粘度が高い場合には、粘度を低下さ
せるために液滴Ｓを加温する例えばヒーターなどを基板Ｗが載置される下電極１０を含む
構造体に組み込むようにすればよい。
【００４１】
なお、基板Ｗに滴下される液滴Ｓの容量は、検体の大きさや試薬の濃度などによるが、
一般的には５０μｌ（マイクロリットル）〜６００μｌである。
【００４２】
次に、液滴Ｓが形成された基板Ｗを下電極１０上に載置する。あるいは、下電極１０上
に基板Ｗを載置した後に試薬を滴下し液滴Ｓを形成してもよい。このとき、下電極１０は
上下方向における原点位置にある。原点位置は、電界撹拌装置１に通電して、電源スイッ
チを入れる（ＯＮにする）と、制御部７０が昇降機構５０を駆動させて原点位置を確認し
、毎回リセットする制御プログラムが採用されている。
【００４３】
次に、制御部７０は、移動機構６０を駆動させ、前後方向において上電極２０を後退し
ていた位置から、下電極１０と対向する位置に移動させる。下電極１０と上電極２０とが
所定の位置で対向すると、制御部７０は昇降機構５０を駆動させ、上下方向において互い
に対向する電極面の距離が所定の距離Ｄ１となるように、下電極１０を上電極２０に向か
って上昇させる。
【００４４】
次に、所定の距離Ｄ１で対向配置された下電極１０と上電極２０とに電源装置４０から
それぞれ電位を与えて交流電界を生じさせる。図１５（ｂ）に示すように、交流電界によ
って液滴Ｓの頂部が引き上げられる方向にクーロン力が働くと、液滴Ｓは変形して高さが
増大する。また、交流電界によって液滴Ｓの頂部が引き上げられる方向のクーロン力が働
かなくなる、あるいは液滴Ｓの頂部が引き下げられる方向にクーロン力が働くと、図１５
（ｃ）に示すように、液滴Ｓは初期の盛り上がった状態から潰れた状態となり、液滴Ｓの
高さは減少する。このようにして液滴Ｓを変形（振動）させることにより液滴Ｓを撹拌す
る。電界撹拌装置１を用いる電界撹拌法は、少量の液滴Ｓを非接触で撹拌することが可能
である。
【００４５】
下電極１０と上電極２０との間の所定の距離Ｄ１は、撹拌によって変化する液滴Ｓの高
さの変化量Δｈを考慮する必要がある。液滴Ｓが上述したクーロン力によって変形して液
滴Ｓの頂部が上電極２０に触れると、撹拌が阻害される。撹拌を効果的に行うには、液滴
Ｓの高さの変化量Δｈを最大化することが好ましいが、変化量Δｈを最大化すると、液滴
Ｓが上電極２０に触れないように、上記所定の距離Ｄ１を大きくする必要がある。上記所
定の距離Ｄ１を大きくすることは、下電極１０と上電極２０との間に生じさせる電界の強
さが小さくなる方向に働く。電界の強さが小さくなることはクーロン力が小さくなること
に他ならない。クーロン力が小さくなれば液滴Ｓの変化量Δｈが小さくなる方向に働いて
しまう。また、前述したように、液滴Ｓの初期的な高さｈは、主に液滴Ｓの容量と、表面
張力とにより影響を受けることから、試薬などの液体の種類や液滴Ｓの容量に応じて、予
め撹拌試験を行って好ましい撹拌条件を選定しておく。撹拌条件としては、電極間距離、
電極間に与える電圧、交流電界（交流電圧）の周波数などが挙げられる。試薬などの液体
の種類や液滴Ｓの容量に応じた撹拌条件は、データテーブルとして制御部７０の記憶部７
２に格納される。
尚、電界撹拌法は、例えば、特開２０１０−１１９３８８号公報に記載されているよう
に、液滴Ｓに交流電界を印加して液滴Ｓを振動させることにより抗原抗体反応を加速させ
る方法であり、抗原抗体反応の所要時間を短縮する効果があることが知られている。
図１６は、電界撹拌法の効果を確認すべく、スライドグラスを用いた直接法による静置
法により抗原抗体反応を検出する方法の工程を示す図である。
最初に、静置法および電界撹拌法において、撥水円３００の捺印工程を実行する。撥水
円３００の捺印工程の所要時間は何れの方法も１分程度である。
【００４６】
次に、抗原の固相工程を実行し、静置法および電界撹拌法において３０分の静置を行う
。
次に、１分の洗浄工程を実行した後、ブロッキング工程を実行する。ブロッキング工程
では、静置法および電界撹拌法において３０分の静置を行う。
次に、１分の洗浄工程を実行した後、抗原としてタンパク質であるアルブミン濃度を０
〜２００μｇ／ｍｌに調整したものを二次抗体に作用させるべく二次抗体反応工程を実行
する。
ここで、静置法においては１０分の静置を行う。他方で、電界撹拌法においては１０分
の電界撹拌を行う。
【００４７】
次に、１分の洗浄工程を実行し、余分な二次抗体を除去した後、発色反応工程を実行す
る。発色反応工程の所要時間は、静置法および電界撹拌法において１５分程度である。
以上の一連の工程を実行するのに、静置法および電界撹拌法においておよそ９０分を要
した。尚、発色状況は顕微鏡等により目視で観察できる。図１７は、静置法および電界撹
拌法において発色の違いを示す写真であり、図１８は、静置法および電界撹拌法における
発色の濃度の違いを示す図である。
図１７および図１８に示すように、電界撹拌を行うことで発色強度が増加すると言える
。従って、実施形態４は実施形態１で述べた効果と同様な効果を奏することに加え、抗原
抗体反応において電界撹拌法を採用することで、抗原抗体反応の迅速化を更に図ることが
確認できる。電界撹拌法を採用する工程は、二次抗体反応工程（結合工程）に限らず、抗
原の固相工程（付着工程）、ブロッキング工程、発色反応工程にも採用することができる
。
【００４８】
なお、電界撹拌法において、液滴Ｓが、抗体を含む試薬である場合は、下電極１０に印
加される電位の極性がマイナスであることが好ましい。具体的には、抗体は、電荷を持っ
ているが、その極性は液滴Ｓにおける溶媒のｐＨに依存する。抗体の極性が変わる溶媒の
ｐＨの値を等電点といい、溶媒のｐＨが等電点より小さければ、抗体はプラス（正極性）
に帯電する。溶媒のｐＨが等電点よりも大きければ、抗体はマイナスに帯電する。免疫組
織染色やＥＬＩＳＡの上記工程で用いられる溶媒のｐＨの値は、一般的に６．８〜８．０
程度であることから、抗体はマイナス（負極性）に帯電することになる。
【００４９】
免疫組織染色における染色の濃さ、ＥＬＩＳＡにおける発色強度は、抗原抗体反応の量
に依存するが、反応にはネガティブコントロール（抗原もしくは抗体を持たない試料を入
れておくことが望ましい。その理由は、試験後に得られた結果が抗原抗体反応に由来する
ものなのか、あるいは、抗原抗体反応以外の非特異的な反応に由来するものなのか判断す
るためである。一方で、ネガティブコントロールを導入した場合、電界撹拌法において、
下電極１０に与えられる電位の極性がプラス（正極性）であると、下電極１０と抗体との
引力によって、上記非特異的な反応が増えてしまうおそれがある。下電極１０に与えられ
る電位の極性をマイナス（負極性）とすれば、下電極１０と抗体との間には斥力が働くた
め上記非特異的な反応が起こり難くなると考えられる。つまり、ネガティブコントロール
が導入された免疫組織染色やＥＬＩＳＡにおいて、非特異的な反応が抑制され、より適正
な試験結果が得られることとなる。
【００５０】
各実施形態における各構成、およびそれらの組み合わせは一例であり、本発明の趣旨か
ら逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換およびその他の変更が可能である。また
、本発明は実施形態では限定されるものではなく、クレームの範囲によってのみ限定され
る。
【符号の説明】
【００５１】
１００…撥水性ペン、２００…親水性基板、３００…撥水円。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図５】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１７】
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