(57)【要約】      （修正有）【課題】標的ＲＮＡの活性を変化させるためのオリゴヌクレオチドの提供。【解決手段】標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）中のマイクロＲＮＡ標的部位と結合するオリゴヌクレオチドであり、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの分解を媒介すること、または標的ＲＮＡのＲＮＡｉを媒介すること、またはマイクロＲＮＡによる標的ＲＮＡの調節を阻止することができるオリゴヌクレオチド。例えばマイクロＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用を調べたり治療法を開発したりするための研究ツールとして、マイクロＲＮＡ標的部位を同定する方法、マイクロＲＮＡ標的部位を確認する方法、標的ＲＮＡの活性を調節する方法等利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロＲＮＡの種配列に対応するガイド配列が含まれたアンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドであって、マイクロＲＮＡではなく、マイクロＲＮＡの完全な配列に対応する配列も含んでいないオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡがヒトのマイクロＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列と塩基対を作ることのできる配列からなるグループの中から選択した配列を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記アンチセンス配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列を含んでいて、
ａ．Ａは、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、ＡまたはＩとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、Ａ、Ｕ、Ｔのいずれかとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ａ．Ａは、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、ＡまたはＩとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、ＡまたはＵとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ａ．Ａは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、Ｉとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、Ａ、Ｕ、Ｔのいずれかとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ａ．Ａは、Ｃ、Ｕ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、Ｉとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、ＡまたはＵとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ａ．Ａは、ＧまたはＩとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、ＩまたはＡとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、Ａ、Ｕ、Ｔのいずれかとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、ＣまたはＴとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ａ．ＡはＧとだけ交換可能であり、
ｂ．ＧはＡとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、ＴまたはＵとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、ＣまたはＴとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ＵはＴとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
追加の２つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
追加の１つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
任意の塩基で交換してもよい追加の位置がない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アンチセンス配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記アンチセンス配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中から選択した配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記アンチセンス配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１２〜１７、位置１２〜１６、位置１３〜１７、位置１３〜１６からなるグループの中から選択した第２の配列をさらに含んでいて、前記ガイド配列とその第２の配列が同じ配列番号に由来する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記アンチセンス配列が、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列と相補的な連続した塩基列を含んでいて、その連続した塩基列の選択が、６０塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３９塩基未満、３８塩基未満、３７塩基未満、３６塩基未満、３５塩基未満、３４塩基未満、３３塩基未満、３２塩基未満、３１塩基未満、３０塩基未満、２９塩基未満、２８塩基未満、２７塩基未満、２６塩基未満、２５塩基未満、２４塩基未満、２３塩基未満、２２塩基未満、２１塩基未満、２０塩基未満、１９塩基未満、１８塩基未満、１７塩基未満、１６塩基未満、１５塩基未満、１４塩基未満、１３塩基未満、１２塩基未満、１１塩基未満、１０塩基未満、９塩基未満、８塩基未満、７塩基未満、６０塩基超、５０塩基超、４０塩基超、３９塩基超、３８塩基超、３７塩基超、３６塩基超、３５塩基超、３４塩基超、３３塩基超、３２塩基超、３１塩基超、３０塩基超、２９塩基超、２８塩基超、２７塩基超、２６塩基超、２５塩基超、２４塩基超、２３塩基超、２２塩基超、２１塩基超、２０塩基超、１９塩基超、１８塩基超、１７塩基超、１６塩基超、１５塩基超、１４塩基超、１３塩基超、１２塩基超、１１塩基超、１０塩基超、９塩基超、８塩基超、７塩基超、６塩基超、５塩基超からなるグループの中からなされる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記アンチセンス配列が、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列と相補的な連続した塩基列を含んでいて、その連続した塩基列の選択が、１０〜２５塩基、１２〜２４塩基、連続した１４〜２２塩基、１５〜２２塩基、１５〜２０塩基からなるグループの中からなされる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
対応するマイクロＲＮＡとの％一致の選択が、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満からなるグループの中からなされる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、このオリゴヌクレオチドに含まれる前記ガイド配列の位置の選択が、位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９からなるグループの中からなされ、その位置は、そのガイド配列の最初の塩基およびこのオリゴヌクレオチドの最初の塩基から５’から３’の方向に向かって数えられる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
長さの選択が、６０塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３９塩基未満、３８塩基未満、３７塩基未満、３６塩基未満、３５塩基未満、３４塩基未満、３３塩基未満、３２塩基未満、３１塩基未満、３０塩基未満、２９塩基未満、２８塩基未満、２７塩基未満、２６塩基未満、２５塩基未満、２４塩基未満、２３塩基未満、２２塩基未満、２１塩基未満、２０塩基未満、１９塩基未満、１８塩基未満、１７塩基未満、１６塩基未満、１５塩基未満、１４塩基未満、１３塩基未満、１２塩基未満、１１塩基未満、１０塩基未満、９塩基未満、８塩基未満、７塩基未満、６０塩基超、５０塩基超、４０塩基超、３９塩基超、３８塩基超、３７塩基超、３６塩基超、３５塩基超、３４塩基超、３３塩基超、３２塩基超、３１塩基超、３０塩基超、２９塩基超、２８塩基超、２７塩基超、２６塩基超、２５塩基超、２４塩基超、２３塩基超、２２塩基超、２１塩基超、２０塩基超、１９塩基超、１８塩基超、１７塩基超、１６塩基超、１５塩基超、１４塩基超、１３塩基超、１２塩基超、１１塩基超、１０塩基超、９塩基超、８塩基超、７塩基超、６塩基超、５塩基超からなるグループの中からなされる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
長さの選択が、１０〜２５塩基、１２〜２４塩基、１４〜２２塩基、１５〜２２塩基、１５〜２０塩基からなるグループの中からなされる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
ＲＮアーゼＨによる前記標的ＲＮＡの開裂を誘導できる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
ギャップマー、エンドマー、ヘッドマーのいずれかである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
ＲＮアーゼＨによる前記標的ＲＮＡの開裂を誘導できない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基からなるグループの中から選択した長さを超える非修飾ＤＮＡ列を含まない、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
ＲＮＡｉ機械をリクルートできる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
ＲＮＡｉ機械をリクルートできない、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
特定の標的ＲＮＡにおいてＲＮＡｉ機械の活性を阻止できる、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
特定の標的ＲＮＡにおいてマイクロＲＮＡの調節活性を阻止できる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記標的ＲＮＡの正の調節因子である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記標的ＲＮＡの負の調節因子である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
相補的な配列に対する親和性を大きくするヌクレオチド・モノマー、または親和性を大きくする修飾を含む、または、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
生体安定性および／または生物学的利用能を大きくするホスホロチオネート結合などの修飾を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
ＩＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＬＮＡユニット、２’位が置換されたユニットのいずれか、または特定の塩基対を形成できる他のヌクレオチド・ユニットを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
２’位が置換されたヌクレオチド・ユニットおよび／または骨格の修飾を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
１個以上のＬＮＡユニットと、２’位が置換された１個以上のユニットとからなる繰り返しパターンを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
ＲＮＡユニットをまったく含まない、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ＤＮＡユニットをまったく含まない、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
モルホリノ・ユニットおよび／またはＬＮＡユニットをまったく含まない、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
普遍塩基を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記ガイド配列が、３’側と５’側の一方または両方に隣接している、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記ガイド配列と前記第２の配列に挟まれた塩基が普遍塩基である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ガイド配列の一部でも前記第２の配列の一部でもないあらゆる塩基が普遍塩基である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
相補的なオリゴヌクレオチドと塩基対を形成しないか、相補的なオリゴヌクレオチドと対になる塩基とともに用いることが想定されていない、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
相補的なオリゴヌクレオチドと塩基対を形成する、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記マイクロＲＮＡの配列の選択が、配列番号１〜７２３からなるグループの中からなされる、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
前記標的ＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは標的ウイルスＲＮＡである、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
標的ＲＮＡの活性を変化させるため、
ａ．標的ＲＮＡを含む系を用意するステップと、
ｂ．請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを導入するステップと、
ｃ．そのことによって標的ＲＮＡの活性を変化させるステップを含む方法。
【請求項５０】
前記標的ＲＮＡにおいてマイクロＲＮＡの活性を阻止し、そのことによってその標的ＲＮＡの活性を調節する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡを開裂を誘導し、そのことによってその標的ＲＮＡの活性を調節する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記系が、細胞抽出液または細胞である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
生体内、生体外、試験管内のいずれかで実施する、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチド調節因子を確認または同定する方法である、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的を確認する方法である、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
ａ．マイクロＲＮＡによって調節される標的ＲＮＡの標的配列として、マイクロＲＮＡによる調節に関与する標的ＲＮＡの標的配列を用意するステップと、
ｂ．その標的配列と相補的な少なくとも６塩基からなる塩基列を含むオリゴヌクレオチド配列を設計するステップと、
ｃ．ステップｂのオリゴヌクレオチド配列を合成することにより、標的ＲＮＡの活性の候補調節因子であるステップｂのオリゴヌクレオチドを用意するステップを含む方法。
【請求項５８】
ａ．前記標的ＲＮＡの活性を調べるためのレポータ系を用意するステップと、
ｂ．請求項５７のステップｃのオリゴヌクレオチドの存在下で前記標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｃ．請求項５７のステップｃのオリゴヌクレオチドの不在下で前記標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｄ．ステップｂとｃにおける活性レベルを比較することにより、オリゴヌクレオチドが実際にＲＮＡの活性を調節できるかどうか、および／またはＲＮＡの潜在的な標的配列が実際に標的配列であるかどうかを確認するステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記活性が遺伝子の発現である、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的ＲＮＡの標的配列が、マイクロＲＮＡの種配列と相補的な配列を含む、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的ＲＮＡの標的配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と塩基対を形成できる配列からなるグループの中から選択した配列を含む、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的ＲＮＡの標的配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と塩基対を形成できる配列からなるグループの中から選択した配列を含む、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的ＲＮＡの標的配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中から選択した配列と塩基対を形成できる配列からなるグループの中から選択した配列を含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記標的ＲＮＡの標的配列が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１２〜１７、位置１２〜１６、位置１３〜１７、位置１３〜１６からなるグループの中から選択した第２の配列をさらに含んでいて、前記ガイド配列とその第２の配列が同じ配列番号に由来する、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項５７〜６４のいずれか１項に記載の方法において、前記標的ＲＮＡの標的配列が確認されておらず、この方法が、標的配列を確認する方法である方法。
【請求項６６】
請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の方法において前記標的ＲＮＡの標的配列が確認されており、この方法が、その標的ＲＮＡの活性を調節できるオリゴヌクレオチドを提供する手段である方法である方法。
【請求項６７】
前記標的ＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡの配列を用意し、そのマイクロＲＮＡの種配列を利用して、前記標的配列の反種配列と、前記オリゴヌクレオチドのガイド配列を決定する、請求項５７〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記マイクロＲＮＡの種配列の選択が、そのマイクロＲＮＡの５’末端から数えて配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置１〜５、位置１〜４、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置２〜５からなるグループの中からなされる、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記マイクロＲＮＡの種配列の選択が、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中からなされる、請求項５７〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記標的ＲＮＡが、標的ｍＲＮＡまたは標的ウイルスＲＮＡである、請求項５７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記オリゴヌクレオチドが、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドである、請求項５７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ａ．標的ｍＲＮＡを発現させるためのレポータ系を用意するステップと、
ｂ．その標的ｍＲＮＡの一部と相補的なオリゴヌクレオチドを用意するステップと、
ｃ．ステップｂのオリゴヌクレオチドの存在下でその標的ｍＲＮＡの発現を調べるステップと、
ｄ．ステップｂのオリゴヌクレオチドの不在下でその標的ｍＲＮＡの発現を調べるステップと、
ｅ．ステップｃとｄにおける活性レベルを比較することにより、そのオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの発現に影響を与えるかどうかを確認するステップを含む方法。
【請求項７３】
前記ｍＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列を同定する手段である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ｍＲＮＡの活性を調節できるオリゴヌクレオチドを同定する手段である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
それぞれのオリゴヌクレオチドが前記標的ＲＮＡの一部と相補的であるような一連のオリゴヌクレオチドを用意し、その一連のオリゴヌクレオチドが、前記標的ＲＮＡの特定の標的領域の５０％超を全体としてカバーするようにし、その一連のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドについて活性を調べる、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的ＲＮＡの標的領域がｍＲＮＡの３’ＵＴＲである、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
活性なオリゴヌクレオチドの配列を用い、前記標的領域のオリゴヌクレオチド感受性領域を特定する、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
オリゴヌクレオチド感受性領域の配列を用い、最適化された配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを設計する、請求項７２〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
オリゴヌクレオチド感受性領域の配列を用い、標的ＲＮＡを調節できる可能性のある候補マイクロＲＮＡを同定する、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
ｃ．オリゴヌクレオチド感受性領域の配列を用意するステップと、
ｄ．そのオリゴヌクレオチド感受性領域の配列においてマイクロＲＮＡと相補的な配列を検索し、前記標的ＲＮＡを調節する可能性がある候補マイクロＲＮＡを同定するステップをさらに含む、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的ＲＮＡを調節する可能性があるとして同定された候補マイクロＲＮＡの活性を第２のテストで確認し、その標的ＲＮＡの活性を実際に調節するマイクロＲＮＡを同定する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２のテストが、
ａ．前記標的ＲＮＡの活性を調べるためのレポータ系を用意するステップと、
ｂ．前記マイクロＲＮＡと相補的で前記候補マイクロＲＮＡの活性を抑制できるアンチミール−オリゴヌクレオチドを用意するステップと、
ｃ．ステップｂのアンチミール−オリゴヌクレオチドの存在下で前記標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｄ．ステップｂのアンチミール−オリゴヌクレオチドの不在下で前記標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｅ．ステップｃとｄにおける活性レベルを比較することにより、同定された候補マイクロＲＮＡ調節因子が実際に前記標的ＲＮＡの活性なマイクロＲＮＡ調節因子であるかどうかを確認するステップを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ａ．前記標的ＲＮＡに向かうオリゴヌクレオチドの存在下でその標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｂ．ステップａのオリゴヌクレオチドと、前記アンチミール−オリゴヌクレオチドが同時に存在している状態でその標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｃ．前記オリゴヌクレオチド感受性領域において前記マイクロＲＮＡの活性を阻止することにより、前記オリゴヌクレオチドが機能するかどうかを確認するステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
カバー率の選択が、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、１００％からなるグループの中からなされる、請求項７２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
カバー率が１００％であり、前記オリゴヌクレオチドの配列同士に重複がある、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
特定のオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチドと５’末端側が５０％重複し、３’末端側が５０％重複５０％重複している、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記オリゴヌクレオチドが、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドである、請求項７２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８９】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項８８の医薬組成物を、それを必要とする人に投与する操作を含む治療法。
【請求項９０】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを利用した医薬品。
【請求項９１】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを利用し、がん、ウイルス感染症、免疫疾患、心臓血管疾患を治療するための薬を調製する方法。
【請求項９２】
請求項１〜９１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを記述する情報の伝達を含む方法。
【請求項９３】
前記伝達が電子的伝達である、請求項９２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ＲＮＡの活性に影響を与えるのに使用できるオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
このようなオリゴヌクレオチドの第１世代は、標的ｍＲＮＡの活性に影響を与えることを想定したアンチセンス・オリゴヌクレオチドであった。このようなオリゴヌクレオチドが興味深い１つの理由は、特定の塩基対が形成されるために実現できる申し分なくかつ予測可能な特異性を持つ可能性があることにある。言い換えるならば、理論上は、所定の核酸（例えばｍＲＮＡ）に対して非常に特異的なオリゴヌクレオチドが非常に簡単に設計される。
【０００３】
しかしアンチセンス・ターゲティングにすべての配列は利用できないことと、例えば二次構造またはタンパク質の結合が理由でアクセスしやすさが変化する可能性のあることがわかった。
【０００４】
さらに、塩基が単純に対になるだけでは所定の標的ｍＲＮＡの調節を実現するのに十分ではないこと、すなわち所定の標的ｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドがその標的ｍＲＮＡの活性に必ずしも影響を与えないことがわかった。そのオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡのオープン・リーディング・フレームを標的とする場合には、例えば翻訳中に翻訳装置が単純にそのオリゴヌクレオチドを置き換える可能性がある。したがってそのオリゴヌクレオチドの調節活性を改善すると考えられる手段が開発された。
【０００５】
例えばＲＮアーゼＨによる標的ｍＲＮＡの開裂を活性化するオリゴヌクレオチドが開発された。このようなオリゴヌクレオチドの潜在的な１つの欠点は、想定する標的ｍＲＮＡ以外のＲＮＡの開裂を媒介する可能性、すなわち標的外の効果を生じさせる可能性である。それでもＲＮアーゼＨによる開裂を通じて作用するオリゴヌクレオチドが、さまざまな疾患を治療するために臨床試験されている。
【０００６】
最近の研究により、真核細胞（哺乳動物の細胞を含む）が、特異性決定因子としてＲＮＡを利用した複雑な遺伝子調節系（この明細書ではＲＮＡｉ機械とも呼ぶ）を有することがわかった。この系は、興味の対象である細胞の中に導入して標的ＲＮＡの活性を調節できるいわゆるｓｉＲＮＡによって始動させることができる。現在、標的ＲＮＡ（特に標的ｍＲＮＡ）を特異的に調節するためにｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉ機械を始動させようと多大な努力がなされている。この方法は、新しい治療法を開発する上で非常に有望であると見なされている。以下にやはり概略を示すように、この方法の１つの大きな利点は、ｓｉＲＮＡの特異性がｓｉＲＮＡのガイド鎖と標的ＲＮＡの間の相補性の程度にあること、すなわち標的の特異性を制御できることである。しかしｓｉＲＮＡは当初考えられていたよりは特異性が小さい可能性のあることがわかった。当初は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と完全に相補的な列を含む標的ＲＮＡだけが影響を受ける、すなわちＲＮＡｉ機械の標的になると考えられた。新たな研究は、ｓｉＲＮＡが実際に大きな標的外効果を生じさせること、すなわち想定外の標的の調節がなされることを示している。現在は、こうした標的外効果は、マイクロＲＮＡとして作用するｓｉＲＮＡから生じる、あるいはむしろｓｉＲＮＡのガイド鎖から生じると考えられている。
【０００７】
マイクロＲＮＡは、内在性ＲＮＡ分子の１つのクラスとして最近発見されたものであり、ｓｉＲＮＡとして、ＲＮＡｉ機械を通じて機能する。現在は、約５００個のヒト・マイクロＲＮＡが発見されており、この数は急速に増えている。今や、全ヒト遺伝子の１／３超をマイクロＲＮＡによって調節できると考えられている。したがってマイクロＲＮＡそれ自身を用いて標的ＲＮＡの活性を調節できるため、例えば治療法として利用できる。
【０００８】
しかし以下にも説明するように、マイクロＲＮＡは一般に２つ以上の標的ＲＮＡに作用する。すなわちマイクロＲＮＡは非特異的である。したがってマイクロＲＮＡを細胞に導入したり、マイクロＲＮＡのレベルを調節したりすると、２つ以上の標的ＲＮＡの活性に影響が及び、その結果として望まない標的外効果が生じる可能性がある。
【０００９】
最近の１つのアプローチとして、マイクロＲＮＡの活性を抑制して標的ＲＮＡの活性を調節することが進められている。マイクロＲＮＡは、相補的なオリゴヌクレオチド（アンチミール（ａｎｔｉｍｉｒ）、アンタゴミール（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）と名づけられている）を用いて抑制することができる。マイクロＲＮＡそれ自身は非特異的であるため、アンチミールまたはアンタゴミールも非特異的であり、２つ以上の標的ＲＮＡの活性に影響を及ぼすであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
詳細な説明
以前の出願（デンマーク国で２００６年１１月２３日に出願された特許出願２００６  ０１５４３と２００６  ０１５４４、アメリカ合衆国特許第６，８８８，０９４号、アメリカ合衆国で２００７年２月４日に出願された特許出願６０／８８８，０９５）では、発明のオリゴヌクレオチドを指すのにＸミール（Ｘｍｉｒ）という用語を使用した。本出願では、本発明のオリゴヌクレオチドという用語のほうをＸミールという用語よりも好んで用いる。しかしＸミールという用語を用いるときには、本発明のオリゴヌクレオチドを意味している。
【００１１】
したがってこの明細書では、Ｘミールという用語は、以下の実施態様と請求項でさらに明確にする本発明のオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１２】
この明細書で言及するすべての参考文献は、参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。
【００１３】
本発明の１つの態様において説明するいろいろな特徴は、他の態様にも同様に当てはまると理解すべきである。
【００１４】
定義
“標的ＲＮＡの活性を調節できるオリゴヌクレオチド”は、特別な活性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、活性なオリゴヌクレオチドとも呼ぶ。
【００１５】
“調節する”、“変化させる”という用語は、この明細書では同じ意味で用いる。
【００１６】
“標的ｍＲＮＡの活性を調節できる可能性のあるオリゴヌクレオチド”は、活性が実験的にまだ確認されていないオリゴヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、候補調節因子とも呼ぶことができる。
【００１７】
単にオリゴヌクレオチドというときには、そのオリゴヌクレオチドは、“標的ｍＲＮＡの活性を調節できるオリゴヌクレオチド”と“標的ｍＲＮＡの活性を調節できる可能性のあるオリゴヌクレオチド”の一方または両方が可能である。
【００１８】
“標的ＲＮＡ”に言及するときには、本発明のオリゴヌクレオチドの標的を意味する。一般に、本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基対の形成を通じて標的ＲＮＡと相互作用することができる。
【００１９】
標的ＲＮＡとしてあらゆるＲＮＡが可能である。標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ（ウイルスのゲノムＲＮＡ）であることが好ましい。
【００２０】
“標的ｍＲＮＡの活性”に言及するときには、一般に、標的ｍＲＮＡの活性の発現、すなわちタンパク質またはペプチドへの翻訳を意味する。したがって標的ｍＲＮＡの活性の調節に、ｍＲＮＡの分解および／または翻訳調節が含まれる。調節には、ｍＲＮＡの細胞内輸送に影響を及ぼすことも含まれる。本発明の好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの発現を調節することができる。別の好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの分解を媒介（し、その結果、標的ｍＲＮＡの発現も調節）することができる。活性には複製も含めることができる。
【００２１】
標的ｍＲＮＡがウイルスＲＮＡである場合には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ウイルスの複製に影響を与えるか、ウイルスの増殖を妨げることができる。
【００２２】
この明細書では、調節は、正の調節または負の調節が可能である。すなわち調節因子（例えばオリゴヌクレオチドまたはマイクロＲＮＡ）が、標的（例えば標的ｍＲＮＡ）の活性を増大させるか、標的の活性を低下させることができる。
【００２３】
“ＲＮＡの標的配列”に言及するときには、ＲＮＡ中でマイクロＲＮＡを用いた調節に関与する領域またはマイクロＲＮＡの調節に必要な領域を意味する。“標的領域”と“標的配列”という用語は同じ意味で用いる。
【００２４】
理論に囚われないとすると、この領域には、マイクロＲＮＡを用いて標的ＲＮＡを調節している間にマイクロＲＮＡと直接相互作用する塩基が含まれると考えられる。好ましい一実施態様では、標的配列は、標的ＲＮＡ中でマイクロＲＮＡを用いた調節に必要な領域である。このような領域はレポータ系を用いて明らかにすることができる。その場合、標的配列を明らかにするため、標的ＲＮＡを系統的に欠失させてその活性を調べる。標的領域を明らかにする上で、標的領域に点突然変異を導入する効果を評価することも重要である。
【００２５】
この明細書の記述からわかるように、本発明のオリゴヌクレオチドも、標的ＲＮＡ中でマイクロＲＮＡを用いた調節に必要な領域を明らかにするのに使用できる。標的配列は、アンチ種配列を含んでいる。このアンチ種配列は、マイクロＲＮＡの種配列と相補的であるとともに、本発明のオリゴヌクレオチドのガイド配列とも相補的である。アンチ種配列に突然変異を導入すると、一般にマイクロＲＮＡを用いた調節に影響が及ぶため、所定の位置がマイクロＲＮＡを用いた調節に関与することを確認するのに使用できる。
【００２６】
この明細書では、マイクロＲＮＡという用語は、従来技術で一般に用いられているのと同じ意味を持つ。すなわちマイクロＲＮＡという用語は、ヌクレオチドの典型的な数が１８〜２２個で標的ｍＲＮＡの活性を調節できる小さな非翻訳ＲＮＡを意味する。マイクロＲＮＡは、一般に、プリ−マイクロＲＮＡのプロセシングで短くすることによりプレ−マイクロＲＮＡと呼ばれるステム−ループ構造にし、最終的に成熟ｍｉＲＮＡにする。プレ−マイクロＲＮＡのステムの両方の鎖を処理して成熟マイクロＲＮＡにすることができる。
【００２７】
ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）は、既知のマイクロＲＮＡを集めたものである。マイクロＲＮＡの予想される標的と既知の標的もこのサイトに見いだすことができる。
【００２８】
この明細書では、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）という用語は、従来技術で一般に用いられているのと同じ意味を持つ。すなわちｓｉＲＮＡという用語は、二本鎖ＲＮＡ複合体であって、鎖の典型的な長さが１８〜２２個のヌクレオチドであるものを意味する。この複合体は３’末端が突出していることが非常にしばしばある。
【００２９】
この明細書でＲＮＡｉ機械に言及するときには、ｓｉＲＮＡとマイクロＲＮＡの活性に必要な細胞要素、またはＲＮＡｉ経路に必要な細胞要素を意味する。ＲＮＡｉ機械の主要な要素は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）である。
【００３０】
この明細書では、ＲＮＡユニットは、ＲＮＡポリマーを作り上げるモノマーである。したがってＲＮＡユニットは、ＲＮＡモノマーまたはＲＮＡヌクレオチドとも呼ばれる。同様に、ＤＮＡユニットは、ＤＮＡポリマーを作り上げるモノマーの１つであり、ＤＮＡユニットは、ＤＮＡモノマーまたはＤＮＡヌクレオチドとも呼ばれる。
【００３１】
塩基に言及するときには、ヌクレオチドの塩基を意味する。塩基として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＩＮＡ、ＬＮＡ、または他の核酸の一部や、特定の塩基対を形成できる核酸の一部が可能である。塩基として、ＰＮＡ（ペプチド核酸）の一部も可能である。いくつかの実施態様では、塩基は普遍塩基が可能である。
【００３２】
ある配列の長さに言及するとき、ユニットの数または塩基の数を意味することができる。
【００３３】
相補的な配列に言及するとき、ＧはＣと対になり、ＡはＴおよびＵと対になり、逆も同様である。好ましい一実施態様では、ＧはＵとも対になり、逆も同様で、いわゆるゆらぎ塩基対を形成する。別の好ましい一実施態様では、イノシン（Ｉ）という塩基をマイクロＲＮＡまたは本発明のオリゴヌクレオチドに含めることができる。Ｉは、Ａ、Ｃ、Ｕと塩基対を形成する。さらに別の好ましい一実施態様では、普遍塩基を用いることができる。普遍塩基は、一般に、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｕ、Ｔと塩基対を形成することができる。普遍塩基は、他方の鎖上の対向する塩基と水素結合を形成しないことがしばしばある。さらに別の好ましい一実施態様では、相補的な配列は、ワトソン−クリック塩基対だけからなる連続配列を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
第１の態様では、本発明により、標的ＲＮＡの活性を変化させるのに有用なオリゴヌクレオチドが提供される。好ましい一実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域を標的とする。本発明の別の１つの態様は、標的ＲＮＡの活性を変化させる方法である。さらに別の態様は、本発明のオリゴヌクレオチドを提供すること、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域を同定すること、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域を確認すること、所定の標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ調節因子を同定することに関する。
【００３５】
本発明により、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域を標的とするオリゴヌクレオチドが提供される。一実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域にアクセスしやすいことを利用する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機械を標的ＲＮＡへとリクルートして標的ＲＮＡの翻訳抑制または開裂を媒介することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨをリクルートして標的ＲＮＡの開裂を媒介することもできる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡによる標的ＲＮＡの調節を阻止することによって標的ＲＮＡの活性を変化させることができる。本発明により、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的を提供する方法、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域を確認する方法、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて標的ＲＮＡの活性を変化させる方法も提供される。
【００３６】
第１の態様  −  生物活性のあるオリゴヌクレオチド
第１の態様では、本発明により、マイクロＲＮＡの種配列に対応するガイド配列が含まれたアンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドであって、マイクロＲＮＡではなく、マイクロＲＮＡの完全な配列に対応する配列も含んでいないオリゴヌクレオチドが提供される。
【００３７】
このようなオリゴヌクレオチドは興味深い。なぜなら標的ＲＮＡ中でマイクロＲＮＡを用いた標的ＲＮＡの調節に関与する標的領域を標的とするのに使用できるからである。理論に囚われないとすると、この標的領域は、標的ＲＮＡの他の領域よりもアクセスしやすいために（マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、他の核酸と）相互作用すると考えられる。なぜならこの標的領域は、マイクロＲＮＡとの相互作用のために開発したから、または内在性マイクロＲＮＡはよりアクセスしやすい標的領域を選択するからである。
【００３８】
上の見方を支持する材料は、本特許出願の優先日後に発表された仕事から得られる。１つの刊行物は、マイクロＲＮＡによる抑制の効果に対する標的二次構造の効果を調べている（Ｌｏｎｇ，  Ｄ．、２００７年）。その結果は、少なくともセンチュウとショウジョウバエにおけるマイクロＲＮＡを用いた調節に関しては、マイクロＲＮＡによる標的の認識に対する標的構造の強力な効果を示している。著者は、たいていのｍｉＲＮＡ−標的相互作用において標的二次構造がアクセスしやすさにおそらく寄与していると示唆している。
【００３９】
別の研究は、マイクロＲＮＡが標的を認識する際に標的部位へのアクセスしやすさがどのような役割を果たすかを系統的に調べている（Ｋｅｒｔｅｓｚ，  Ｍ．、２００７年）。著者は、標的へのアクセスしやすさを低下させる突然変異が、マイクロＲＮＡを媒介とした翻訳抑制を著しく減らすことを証明した。さらに、著者は、ハエ、センチュウ、マウス、ヒトのあらゆる３’ＵＴＲに関し、標的へのアクセスしやすさをゲノム・レベルで分析した。彼らは、これら４種類の生物すべてのマイクロＲＮＡの種配列が、非常にアクセスしやすい領域への著しい選択性を示すことを見いだし、標的へのアクセスしやすさがマイクロＲＮＡの機能における極めて重要な因子であることを指摘している。
【００４０】
われわれは、標的へのアクセスしやすさは、標的二次構造と、他の因子（例えばＲＮＡ結合タンパク質）による閉塞との組み合わせによって大半が決まるであろうことを指摘する。
【００４１】
例えば本発明の一実施態様では、標的領域は、例えばＲＮアーゼＨによって誘導されるオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡが標的とすることができる。オリゴヌクレオチドとしては、例えばＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの開裂を誘導する１０量体が可能である。オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡに作用を及ぼすことを阻止することもできる。これらのさまざまな実施態様について以下に大まかに説明する。
【００４２】
（本発明のオリゴヌクレオチドの）ガイド配列と（マイクロＲＮＡの）種配列の文脈では、“対応する”という用語は、種配列とガイド配列が同じ配列と塩基対を形成できることを意味する。すなわちガイド配列と種配列は必ずしも同じである必要はないが、同じ配列（例えば標的ＲＮＡのアンチ種配列）と塩基対を形成することができる。
【００４３】
“マイクロＲＮＡ配列の完全な配列に対応する配列”という表現は、例えばマイクロＲＮＡの前駆体、またはマイクロＲＮＡをコードしているＤＮＡ分子をカバーすることを想定している。ＤＮＡ分子としては、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼがマイクロＲＮＡを転写するためのＰＣＲ産物が可能である。このような分子は本発明の範囲には含まれず、自然に生じるマイクロＲＮＡも同様である。
【００４４】
出所
本発明の方法で用いる標的ＲＮＡは、動物または植物を起源とすることが好ましい。標的ＲＮＡは、哺乳動物を起源とすることがより好ましい。標的ＲＮＡは、ヒトを起源とすることが最も好ましい。標的ＲＮＡは、ウイルスを起源としていてもよく、ヒトに感染するウイルスが起源であることが好ましい。好ましい一実施態様では、ヒト標的ＲＮＡという用語に、ヒトに感染するウイルスのウイルス標的ＲＮＡも含まれる。
【００４５】
本発明の方法で用いるマイクロＲＮＡも、動物または植物を起源とすることが好ましい。マイクロＲＮＡは、哺乳動物を起源とすることがより好ましい。マイクロＲＮＡは、ヒトを起源とすることが最も好ましい。本発明の方法で用いるマイクロＲＮＡは、ウイルスを起源としていてもよい。マイクロＲＮＡがウイルスを起源とする場合には、ヒトに感染するウイルス（例えばＨＳＶ−１のｍｉｒ−ＬＡＴ）が起源であることが好ましい。好ましい一実施態様では、ヒト・マイクロＲＮＡという用語に、ヒトに感染するウイルスのウイルス・マイクロＲＮＡも含まれる。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒト・マイクロＲＮＡ、すなわちヒトに感染するウイルスからのマイクロＲＮＡの種配列に対応するガイド配列を含んでいることが非常に好ましい。
【００４７】
好ましい一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列と塩基対を作ることのできる配列からなるグループの中から選択した配列を含んでいる。
【００４８】
好ましい一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列とは塩基対を作れるが、上記の位置のどちらかの側に隣接するヌクレオチドとは連続した塩基対を形成できない配列からなるグループの中から選択した配列を含んでいる。
【００４９】
相補的な配列という用語は上に定義した。“塩基対を形成できる”という表現は、相補的な配列という用語に関係する。すなわち第１の配列が、その第１の配列と相補的な第２の配列と塩基対を形成できる。
【００５０】
別の好ましい一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列と塩基対を形成できる配列からなるグループの中から選択したアンチセンス配列からなる。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基対を形成する規則によって定義することもできる。例えば別の好ましい一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列は、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列を含んでいて、
ａ．Ａは、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、ＡまたはＩとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、Ａ、Ｕ、Ｔのいずれかとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００５２】
交換規則は、以下の考察に基づいている：マイクロＲＮＡのＡは、標的ＲＮＡのＵまたはＩと塩基対を形成できる。標的ＲＮＡのＵとＩは、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｃ、Ｕ、Ｔのいずれかと塩基対を形成できる。他の塩基についても同様である。
【００５３】
さらに、マイクロＲＮＡにおいてＡからＩへの変更を行なうと、マイクロＲＮＡのサイレンシング標的が変わることがわかった（Ｋａｗａｈａｒａ，  Ｙ．、２００７年）。したがっていくつかの実施態様では、マイクロＲＮＡのＡをＩで置き換えることができる。
【００５４】
標的ＲＮＡもＡから変えられたＩを含むことができる。
【００５５】
さらに、すべての実施態様ではなくいくつかの実施態様では、マイクロＲＮＡ−標的ＲＮＡ相互作用のためにＧ：Ｕ塩基対を受容できる。
【００５６】
規則を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2015146814.tif 000002
【００５８】
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と他の突然変異を説明するため、任意の塩基と交換できる追加の位置が含まれる。さらに、マイクロＲＮＡと相互作用するいくつかの標的配列は、相互作用するそのマイクロＲＮＡと完全に相補的でなくてもよい。すなわちマイクロＲＮＡの種配列と標的ＲＮＡのアンチセンス配列の間に形成される複合体にミスマッチが存在していてもよい。
【００５９】
例えば別の好ましい一実施態様では、
ａ．Ａは、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、ＡまたはＩとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、ＡまたはＵとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６０】
さらに別の好ましい一実施態様では、
ａ．Ａは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、Ｉとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、Ａ、Ｕ、Ｔのいずれかとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６１】
さらに別の好ましい一実施態様では、
ａ．Ａは、Ｃ、Ｕ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、Ｉとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、ＡまたはＵとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｉのいずれかとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６２】
さらに別の好ましい一実施態様では、
ａ．Ａは、ＧまたはＩとだけ交換可能であり、
ｂ．Ｇは、ＩまたはＡとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、Ａ、Ｕ、Ｔのいずれかとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、ＣまたはＴとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６３】
さらに別の好ましい一実施態様では、
ａ．ＡはＧとだけ交換可能であり、
ｂ．ＧはＡとだけ交換可能であり、
ｃ．Ｃは、ＴまたはＵとだけ交換可能であり、
ｄ．Ｕは、ＣまたはＴとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６４】
さらに別の好ましい一実施態様では、ＵはＴとだけ交換可能であり、
追加の３つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６５】
さらに別の好ましい一実施態様では、追加の２つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６６】
さらに別の好ましい一実施態様では、追加の１つの位置が任意の塩基で交換されていてもよい。
【００６７】
さらに別の好ましい一実施態様では、任意の塩基で交換してもよい追加の位置がない。
【００６８】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１個または２個の付加または欠失をさらに含んでいてもよい。より好ましいのは、１個の付加／置換であり、最も好ましいのは、０個の付加／置換である。付加と欠失は、マイクロＲＮＡと標的ＲＮＡの間の複合体がバルジを含んでいる場合に関係する。マイクロＲＮＡ上の１個のヌクレオチドがふくらんでいる場合には、これは本発明のオリゴヌクレオチドの欠失を意味する。標的ＲＮＡ上の１個のヌクレオチドがふくらんでいる場合には、これは本発明のオリゴヌクレオチドの付加を意味する。
【００６９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択したガイド配列を含むアンチセンス配列を含んでいることがより一層好ましい。ただし、上に概略を説明した交換規則が、このグループ、すなわちさまざまな実施態様にも適用されるものとする。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中から選択したガイド配列を含むアンチセンス配列を含んでいることが最も好ましい。ただし、上に概略を説明した交換規則が、このグループ、すなわちさまざまな実施態様にも適用されるものとする。
【００７１】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの上記の位置のどちらかの側に隣接するヌクレオチドを含んでいない。すなわち配列番号１〜７２３いずれかの上記の位置のどれかに隣接する位置は、本発明のオリゴヌクレオチドの対応する隣接位置と同じではない。
【００７２】
さらに別の好ましい一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中から選択したガイド配列を含むアンチセンス配列を含んでいる。ただし、上に概略を説明した交換規則が、このグループ、すなわちさまざまな実施態様にも適用されるものとする。
【００７３】
第２の配列
別の好ましい一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列は、配列番号１〜７２３いずれかの位置１２〜１７、位置１２〜１６、位置１３〜１７、位置１３〜１６からなるグループの中から選択した第２の配列をさらに含んでいる。ただしガイド配列と第２の配列は同じ配列番号に由来し、上に概略を説明した交換規則が、このグループ、すなわちさまざまな実施態様にも適用されるものとする。
【００７４】
連続した塩基列
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列と相補的な連続した塩基列を含むアンチセンス配列を含んでいて、その連続した塩基列の選択が、６０塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３９塩基未満、３８塩基未満、３７塩基未満、３６塩基未満、３５塩基未満、３４塩基未満、３３塩基未満、３２塩基未満、３１塩基未満、３０塩基未満、２９塩基未満、２８塩基未満、２７塩基未満、２６塩基未満、２５塩基未満、２４塩基未満、２３塩基未満、２２塩基未満、２１塩基未満、２０塩基未満、１９塩基未満、１８塩基未満、１７塩基未満、１６塩基未満、１５塩基未満、１４塩基未満、１３塩基未満、１２塩基未満、１１塩基未満、１０塩基未満、９塩基未満、８塩基未満、７塩基未満、６０塩基超、５０塩基超、４０塩基超、３９塩基超、３８塩基超、３７塩基超、３６塩基超、３５塩基超、３４塩基超、３３塩基超、３２塩基超、３１塩基超、３０塩基超、２９塩基超、２８塩基超、２７塩基超、２６塩基超、２５塩基超、２４塩基超、２３塩基超、２２塩基超、２１塩基超、２０塩基超、１９塩基超、１８塩基超、１７塩基超、１６塩基超、１５塩基超、１４塩基超、１３塩基超、１２塩基超、１１塩基超、１０塩基超、９塩基超、８塩基超、７塩基超、６塩基超、５塩基超からなるグループの中からなされることが好ましい。
【００７５】
連続した塩基列は、本発明のオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡの間に形成される二重鎖にすべての塩基が合致する中断されていない塩基配列を意味するものとする。すなわち二重鎖の中にはバルジがないことが好ましく、配列は相補的であることが好ましい（上記の相補的な配列の定義を参照）。最も好ましいのは、本発明のオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡの標的領域の間の完全なワトソン−クリック二重鎖である。
【００７６】
連続したと連続的という用語は、同じ意味で用いる。
【００７７】
別の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列と相補的な連続した塩基列を含むアンチセンス配列を含んでおり、その連続した塩基列の選択は、１０〜１４塩基、１２〜１６塩基、１４〜１８塩基、１６〜２０塩基、１０〜２５塩基、１２〜２４塩基、１４〜２２塩基、１５〜２２塩基、１５〜２０塩基からなるグループの中からなされる。
【００７８】
より好ましいのは、連続した塩基列が８〜２５塩基であることである。
【００７９】
最も好ましいのは、連続した塩基列が１０〜２０塩基であることである。
【００８０】
オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中でマイクロＲＮＡと同じ領域と相互作用できることが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドの１つの利点は、標的ＲＮＡの露出した領域を標的とすることである（上の説明を参照）。このようなオリゴヌクレオチドの別の利点は、マイクロＲＮＡ標的をマスクするのに使用できるため、標的ＲＮＡを標的とする（内在性）マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡと相互作用して標的ＲＮＡに効果を及ぼすのが阻止されることである。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、対応するマイクロＲＮＡとの一致の程度を、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満からなるグループの中から選択した値にすることができる。一致の程度に言及するときには、程度は、マイクロＲＮＡと本発明のオリゴヌクレオチドのうちの短いほうの分子の全長にわたってカウントする。本発明のオリゴヌクレオチドのガイド配列とマイクロＲＮＡの種配列をアラインメントに使用する。例えばマイクロＲＮＡが２０塩基であり、オリゴヌクレオチドが１４塩基であり、一致する位置の数が１２である場合には、一致の程度は１２／１４＝８６％となる。マイクロＲＮＡが２０塩基であり、オリゴヌクレオチドが２０塩基であり、一致する位置の数が１０である場合には、一致の程度は１０／２０＝５０％となる。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチド内のガイド配列の位置の選択は、位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９からなるグループの中からなされることが好ましく、その位置は、そのガイド配列の最初の塩基およびこのオリゴヌクレオチドの最初の塩基から５’から３’の方向に向かって数えられる。
【００８３】
位置は、位置１、位置２、位置３、位置４、位置５からなるグループの中から選択することがより好ましい。
【００８４】
すでに述べたように、ガイド配列は、この明細書の別の箇所で定義したマイクロＲＮＡの種配列に対応する。
【００８５】
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、さまざまな目的に合わせて調節することができる。標的ＲＮＡとの相互作用をより強くすることは、オリゴヌクレオチドをより長くすることによってと、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列と相補的な塩基列をより長くすることによって実現できる。それに対して長さを短くすると、送達と生物学的利用能を改善することができる。長さが短くなるとオリゴヌクレオチドのＴｍ値（融点）が低下するであろう。しかしオリゴヌクレオチドの濃度を大きくしてそれに対抗することができる。親和性を大きくするヌクレオチドと、親和性を大きくする修飾も利用できる。
【００８６】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドの長さの選択は、６０塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３９塩基未満、３８塩基未満、３７塩基未満、３６塩基未満、３５塩基未満、３４塩基未満、３３塩基未満、３２塩基未満、３１塩基未満、３０塩基未満、２９塩基未満、２８塩基未満、２７塩基未満、２６塩基未満、２５塩基未満、２４塩基未満、２３塩基未満、２２塩基未満、２１塩基未満、２０塩基未満、１９塩基未満、１８塩基未満、１７塩基未満、１６塩基未満、１５塩基未満、１４塩基未満、１３塩基未満、１２塩基未満、１１塩基未満、１０塩基未満、９塩基未満、８塩基未満、７塩基未満、６０塩基超、５０塩基超、４０塩基超、３９塩基超、３８塩基超、３７塩基超、３６塩基超、３５塩基超、３４塩基超、３３塩基超、３２塩基超、３１塩基超、３０塩基超、２９塩基超、２８塩基超、２７塩基超、２６塩基超、２５塩基超、２４塩基超、２３塩基超、２２塩基超、２１塩基超、２０塩基超、１９塩基超、１８塩基超、１７塩基超、１６塩基超、１５塩基超、１４塩基超、１３塩基超、１２塩基超、１１塩基超、１０塩基超、９塩基超、８塩基超、７塩基超、６塩基超、５塩基超からなるグループの中からなされる。
【００８７】
別の好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドの長さの選択は、１０〜１４塩基、１２〜１６塩基、１４〜１８塩基、１６〜２０塩基、１０〜２５塩基、１２〜２４塩基、１４〜２２塩基、１５〜２２塩基、１５〜２０塩基からなるグループの中からなされる。
【００８８】
より好ましいのは、長さが８〜２５塩基になっていることである。
【００８９】
最も好ましいのは、長さが１０〜２０塩基になっていることである。
【００９０】
本発明の好ましい一実施態様では、マイクロＲＮＡは、配列番号１〜７２３からなるグループの中から選択した配列を持つ。
【００９１】
好ましいマイクロＲＮＡは、表２にもリストにしてある。すでに言及した優先権出願の配列リストの番号を変更したことと、追加の配列を付け加えてあることに注意されたい。
【００９２】
【表２Ａ】
2015146814.tif 000003
【００９３】
【表２Ｂ】
2015146814.tif 000004
【００９４】
【表２Ｃ】
2015146814.tif 000005
【００９５】
【表２Ｄ】
2015146814.tif 000006
【００９６】
【表２Ｅ】
2015146814.tif 000007
【００９７】
【表２Ｆ】
2015146814.tif 000008
【００９８】
【表２Ｇ】
2015146814.tif 000009
【００９９】
【表２Ｈ】
2015146814.tif 000010
【０１００】
【表２Ｉ】
2015146814.tif 000011
【０１０１】
【表２Ｊ】
2015146814.tif 000012
【０１０２】
【表２Ｋ】
2015146814.tif 000013
【０１０３】
【表２Ｌ】
2015146814.tif 000014
【０１０４】
【表２Ｍ】
2015146814.tif 000015
【０１０５】
【表２Ｎ】
2015146814.tif 000016
【０１０６】
【表２Ｏ】
2015146814.tif 000017
【０１０７】
【表２Ｐ】
2015146814.tif 000018
【０１０８】
【表２Ｑ】
2015146814.tif 000019
【０１０９】
【表２Ｒ】
2015146814.tif 000020
【０１１０】
さらに別の一実施態様では、マイクロＲＮＡの種配列の選択は、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中からなされる。
【０１１１】
より好ましい一実施態様では、マイクロＲＮＡの種配列の選択は、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中からなされる。
【０１１２】
非常に好ましい一実施態様では、マイクロＲＮＡの種配列の選択は、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中からなされる。
【０１１３】
本発明のオリゴヌクレオチドの活性
以下の説明からわかるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、さまざまな用途と利点を有する。
【０１１４】
ＲＮアーゼＨによる開裂
一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの標的領域にアクセスできることを利用する。この実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる標的の開裂を活性化することができる。オリゴヌクレオチドは、標的へのアクセスしやすさが改善されているため、そのオリゴヌクレオチドが短くて例えば１０塩基であるとか、ほんのガイド配列である場合でさえ、標的ＲＮＡの活性に選択的に影響を与えるであろう。すなわち他の場所の相補的な領域は、よりアクセスしにくいため標的にされない。そのような領域は、例えばＲＮＡ二次構造に埋もれているか、タンパク質の結合に関与するためアクセスできない可能性がある。
【０１１５】
ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分である。ＲＮアーゼＨの活性化にとって必要な構造は当業者によく知られている。このメカニズムは、例えばいわゆるギャップマーを用いた従来のアンチセンス調節を実現するのに非常にしばしば利用される。ギャップマーは、デオキシ糖を有する中央領域（ギャップ）と、修飾された側部とを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。ギャップマーは、生体安定性を改善するためにホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を含んでいることが非常にしばしばあり、側部は、やはり生体安定性（すなわち核酸を溶解させる攻撃に対する抵抗力）を改善する例えば２−Ｏ−修飾を含んでいる。側部は、相補的な核酸と塩基対を形成するギャップマーの融点を高くする修飾も含むことができる。ヘッドマーとエンドマーの構造も文献に記載されている。
【０１１６】
別の好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの開裂を誘導することができない。当業者であれば、ＲＮアーゼＨによる開裂の条件をよく知っているであろうし、ＲＮアーゼＨを活性化させるオリゴヌクレオチド、または活性化させないオリゴヌクレオチドを設計できるであろう。
【０１１７】
例えば好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基からなるグループの中から選択した長さを超える非修飾ＤＮＡ列を含んでいない。最も好ましいのは、非修飾ＤＮＡ列の長さが３塩基を超えないことである。
【０１１８】
別の好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡモノマーをまったく含んでいない。
【０１１９】
ＲＮＡｉ機械のリクルート
ＲＮＡｉ機械は、ＲＮＡによってガイドされる洗練された遺伝子調節系である。例えばマイクロＲＮＡがＲＮＡｉ機械を標的ｍＲＮＡへと向かわせ、標的ｍＲＮＡの活性に影響を与える。ＲＮＡｉ機械は、ｍＲＮＡの翻訳に直接影響を与えること、または標的ｍＲＮＡの安定性に影響を与えること、すなわち標的ｍＲＮＡの直接的な分解を媒介することができる。理論に囚われないとすると、マイクロＲＮＡと標的ｍＲＮＡの間の相補性の程度が、標的ｍＲＮＡが翻訳調節されたり分解されたりするかどうかのカギとなる１つの要素であると考えられる。
【０１２０】
内在性マイクロＲＮＡは、前駆ステム−ループのプロセシングによっていわゆるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）に組み込まれる。このプロセスの詳細についてはまだほとんどわかっていない。
【０１２１】
細胞ＲＮＡｉ機械は、ｓｉＲＮＡと呼ばれる合成二本鎖ＲＮＡ複合体を細胞内に導入して細胞のｍＲＮＡの活性に影響を与えるのに広く用いられてきた。上述のように、ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖と、相補的なガイド鎖とを含む短い二本鎖ＲＮＡ複合体である。ｓｉＲＮＡのガイド鎖はＲＩＳＣ複合体に組み込まれ、その後、ＲＩＳＣ複合体が、ガイド鎖と相補的な配列を含むｍＲＮＡの活性に影響を与えることができる。したがってｓｉＲＮＡは、あらゆるｍＲＮＡを効果的かつ特異的に標的とすることができると考えられる化合物の新しい１つのクラスである。したがってｓｉＲＮＡは、治療法の新しい１つのクラスになる可能性があると見なされている。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡとマイクロＲＮＡに共通する１つの特徴は、細胞ＲＮＡｉ複合体をリクルートして標的ＲＮＡの活性に影響を及ぼすことである。
【０１２３】
一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機械をリクルートできるため、ＲＮＡｉ機械を標的ＲＮＡに向かわせることができる。すると標的ＲＮＡの開裂、または標的ＲＮＡの翻訳抑制が起こる可能性がある。すなわちこのオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴヌクレオチドと一般に２０〜２２塩基の長さにわたってハイブリダイズし、の３’末端が１〜３塩基突出していることが非常にしばしばある。ｓｉＲＮＡは、名称からわかるように、主としてＲＮＡモノマーからなるが、いくつかの位置で修飾（例えば２’−Ｏ−修飾）が許容される。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドは、天然のマイクロＲＮＡと同じではなくてもマイクロＲＮＡとして機能することもできる。オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡとしても機能するとき、主としてＲＮＡモノマーからなるが、いくつかの位置で修飾が許容される。オリゴヌクレオチドは、成熟した内在性マイクロＲＮＡ、またはプレ−マイクロＲＮＡ（ステム内にバルジを有するステム−ループ）と同様の構造を持つことができ、ダイサーによって処理されて成熟したマイクロＲＮＡになる。
【０１２５】
天然のマイクロＲＮＡが一般に多数の標的ＲＮＡを調節している場合、マイクロＲＮＡとして機能する本発明のオリゴヌクレオチドは、数個の標的ＲＮＡ、または１個の標的ＲＮＡだけを調節するように設計できる。オリゴヌクレオチドの非特異性は、オリゴヌクレオチドが１個または数個の標的だけを標的とするように設計することによって調節できる。普遍塩基を用いることにより、オリゴヌクレオチドが非特異的であるような設計にすることもできる。普遍塩基については、以下においてより詳しく説明する。非特異性は、オリゴヌクレオチドの長さを短くすることによって導入することもできる。
【０１２６】
重要なことだが、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機械をリクルートできるときでも、標的ＲＮＡの標的領域へのアクセスしやすさを利用することができる。
【０１２７】
ブロックミール（ｂｌｏｃｋｍｉｒ）
別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉ機械をリクルートできない。この実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡにおいてＲＮＡｉ機械の活性化を阻止できることが好ましい。上述のように、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの標的配列を封鎖することによってそのようにできるため、ＲＮＡｉ機械はオリゴヌクレオチドと塩基対を形成し、標的配列を認識しないであろう。この活性を持つ本発明のオリゴヌクレオチドは、ブロックミールと呼ぶこともできる。
【０１２８】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡにおいてマイクロＲＮＡの調節活性を阻止することができる。マイクロＲＮＡは内在性マイクロＲＮＡであることが好ましい。
【０１２９】
本特許出願の優先日の後に、所定のｍＲＮＡにおいてマイクロＲＮＡの調節活性を阻止できるオリゴヌクレオチドの例が２つのグループによって発表された。
【０１３０】
第１の刊行物（Ｘｉａｏ，  Ｊ．、２００７年）では、マイクロＲＮＡをマスクするアンチセンスＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）と名づけられたオリゴヌクレオチドを用い、ＨＣＮ２とＨＣＮ４に対するｍｉｒ−１の調節活性と、ＨＣＮ２に対するｍｉｒ−１３３の調節活性が阻止された。マイクロＲＮＡをマスクするアンチセンスＯＤＮは、培養した新生ラットの心室細胞を用いた免疫ブロッティングと、ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎臓細胞系を用いたルシフェラーゼ・アッセイから、遺伝子特異的にＨＣＮ２とＨＣＮ４のタンパク質レベルを増大させることが観察された。すなわちブロックミールの作用メカニズムが確認された。言い換えるならば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおいてマイクロＲＮＡの標的部位と結合するオリゴヌクレオチドは、哺乳動物（ラットとヒト）の細胞においてマイクロＲＮＡを用いたｍＲＮＡの調節を阻止できることが証明された。
【０１３１】
しかしＸｉａｏらの２００７年の仕事におけるブロックミールの設計では、いくつかの問題点がそのままにされていた。マイクロＲＮＡをマスクするアンチセンスＯＤＮは、両端に５個のＬＮＡモノマーを有するデオキシヌクレオチドで構成されていた。したがってオリゴヌクレオチドの中央部は、明らかに、１２個の長さの非修飾デオキシヌクレオチドで構成されていた。このような構造は、一般にＲＮアーゼＨを活性化させ、標的ＲＮＡの分解を媒介することが予想される。
【０１３２】
第２の刊行物（Ｃｈｏｉ，  Ｗ．Ｙ．、２００７年）では、ミノカサゴにおいて（標的保護物と名づけられた）ブロックミールを用いて特定のｍＲＮＡの調節が阻止された。より詳細には、著者は、スクウィントｍＲＮＡとレフティｍＲＮＡに含まれるミノカサゴのｍｉｒ−４３０標的部位と完全に相補的な２５ユニットからなるモルホリノ・オリゴヌクレオチドを用い、ｍｉｒ−４３０による標的ＲＮＡ（スクウィントとレフティ）の調節を阻止した。したがって著者は、Ｘｉａｏらとは異なる生物においてブロックミール法を確認し、しかも異なる化学物質を使用できることも確認したことになる。
【０１３３】
われわれは、ブロックミールの活性の本質が、マイクロＲＮＡ標的部位への結合であることと、これが、さまざまな化合物を用いてさまざまな生物の体内で実現できることを指摘する。
【０１３４】
本特許出願の優先日の後に発表された別の報告では、ヒトＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの認識と開裂に関する分子的基礎が研究された（Ａｍｅｒｅｓ，  Ｓ．Ｌ．、２００７年）。著者らは、標的へのアクセスしやすさが、試験管内と生体内でのＲＩＳＣを媒介とした開裂を決定していることを見いだした。彼らは特に、ｓｉＲＮＡ標的部位と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて標的へのアクセスを阻止した。すなわちそのオリゴヌクレオチドは、完全に相補的なｓｉＲＮＡによって調節されるｓｉＲＮＡ標的部位がこのオリゴヌクレオチドの標的となることを除き、本発明のブロックミールの機能的類似体と見ることができる。興味深いことに、著者らは、（アフィニティ精製したヒトＲＩＳＣを用いた開裂率からわかるように）ｓｉＲＮＡの３’部位にアニーリングする領域内の２１個のｎｔ標的配列のうちの３個または６個のｎｔをブロックしても調節に影響がないことを見いだした。逆に、ｓｉＲＮＡの５’部位にアニーリングする領域内の標的部位の５個のｎｔをブロックすると、（開裂からわかるように）調節がはなはだしく損なわれ、２個のｎｔをブロックするだけでさえ調節が損なわれた。
【０１３５】
本発明のブロックミールに戻ると、マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡの正の調節因子である場合には、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの負の調節因子になろう。
【０１３６】
マイクロＲＮＡは、標的ＲＮＡの負の調節因子であることが非常にしばしばある。したがって別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの正の調節因子である。これは、従来のアンチセンス・オリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡが負の調節因子として一般に機能するのとは逆である。
【０１３７】
好ましい一実施態様では、本発明のブロックミールはＤＮＡである。なぜならＲＮＡｉ機械によって認識されず、その結果としてマイクロＲＮＡとしてもｓｉＲＮＡとしても機能しないからである。ＤＮＡユニットを修飾してＲＮアーゼＨの活性化を阻止することが好ましい。あるいは連続したＤＮＡユニットが５個未満存在しているようにする（例えば連続した４個未満のＤＮＡユニット、連続した３個未満のＤＮＡユニット）。
【０１３８】
さらに別の一実施態様では、ブロックミールはＤＮＡユニットをまったく含んでいない。
【０１３９】
さらに別の一実施態様では、ブロックミールはＲＮＡユニットをまったく含んでいない。
【０１４０】
別の一実施態様では、ブロックミールは、５ユニット、６ユニット、７ユニット、８ユニット、９ユニット、１０ユニット、１１ユニット、１２ユニット、１３ユニット、１４ユニット、１５ユニット、１６ユニット、１７ユニット、１８ユニット、１９ユニット、２０ユニット、２１ユニット、２２ユニットからなるグループの中から選択した長さを超える長さのＲＮＡユニットを含んでいない。
【０１４１】
一実施態様では、オリゴヌクレオチドを化学的に修飾し、ＲＮＡｉ機械をリクルートできないようにしてある。好ましい修飾として、２’−Ｏ−修飾（例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−Ｆ）がある。共役したＲＮＡも好ましい。例えばコレステロール部分と共役したＲＮＡの場合には、コレステロールは、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機械をリクルートするのを阻止することと、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能を改善することの両方が可能である。コレステロール部分は、オリゴヌクレオチドのガイド配列内で、またはオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端でモノマーと共役することができる。さらに別の修飾をあとで説明する。
【０１４２】
さらに別の一実施態様では、ブロックミールは、ＤＮＡユニットとＲＮＡユニットの混合物を含んでいて、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの活性化を阻止すると同時に、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機械をリクルートすることを阻止している。例えばＤＮＡユニットの後にＲＮＡユニットを続け、その後に再びＤＮＡユニットを続け、その後も同様にすることができる。さらに、好ましい一実施態様では、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合がユニット同士を接続してオリゴヌクレオチドの生体安定性を向上させることができる。ＤＮＡユニットとＲＮＡユニットの両方を修飾することができる。ＲＮＡユニットの２’−Ｏ−位置を修飾することが好ましい（２’−Ｏ−メチル、ＬＮＡなど）。
【０１４３】
さらに別の一実施態様では、オリゴヌクレオチド（ブロックミール）は、ＤＮＡユニットとＲＮＡユニットの混合物を含んでいて、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの活性化を阻止すると同時に、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機械をリクルートするのを阻止している。ただしＤＮＡユニットとＲＮＡユニットはブロックとして含まれる。ブロックは、長さを２ユニット、３ユニット、４ユニット、５ユニット、６ユニットいずれかにすることができ、異なる長さのユニットは、同じオリゴヌクレオチドで構成することができる。ＤＮＡユニットとＲＮＡユニットの両方を修飾することができる。ＲＮＡユニットの２’−Ｏ−位置を修飾することが好ましい（２’−Ｏ−メチル、ＬＮＡなど）。
【０１４４】
好ましい一実施態様では、ＬＮＡユニット、ＩＮＡユニット、モルホリノ・ユニットからなるグループの中から選択したユニットもオリゴヌクレオチドの中に含まれる。好ましい別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡユニットと、２’−Ｏ−メチルを有するＲＮＡユニットとの混合物を含んでいる。このようなミックスマーは、ヒト免疫不全ウイルスのタイプ１  Ｔａｔ依存性トランス活性化とＨＩＶ−１感染力の立体妨害阻害剤として使用されてきた。
【０１４５】
さらに別の一実施態様では、ブロックミールは、２’−Ｏ−メチルで修飾されたユニット、ＬＮＡユニット、ＰＮＡユニット、ＩＮＡユニット、モルホリノ・ユニットからなるグループの中から選択したユニットだけで構成される。一実施態様では、これらユニットが混合されるのに対し、別の一実施態様では、ブロックミールはこれらユニットのうちの１つだけで構成される。
【０１４６】
さらに別の一実施態様では、ブロックミールは、２つ以上の標的ＲＮＡと結合できるように設計されている。非特異性は、普遍塩基を用いてブロックミールに組み込まれるように設計できる。ブロックミールの長さを短くしても、非特異性が強化される。したがって一実施態様では、ブロックミールは、マイクロＲＮＡの種配列に対応するガイド配列だけで構成することができる。この実施態様では、親和性を増大させる修飾を利用することが好ましく、オリゴヌクレオチドを２’Ｏの位置で例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−フルオロ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）を用いて十分に修飾すること、またはヌクレオチドをロックすることができる（ＬＮＡ）。
【０１４７】
標的外効果
たいていの実施態様では、ブロックミールの標的外結合は、ほとんど、またはまったく効果をもたらさないであろう。それとは逆に、アンチミールも、ｓｉＲＮＡとマイクロＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉも、ＲＮアーゼＨが媒介するアンチセンスの調節も、標的外効果を生じさせることができる。ブロックミールは、マイクロＲＮＡ標的領域に結合する場合にだけ効果を持ち、そのことによってマイクロＲＮＡによる標的ＲＮＡの調節を阻止する。
【０１４８】
そこで好ましい一実施態様では、ブロックミールは、アンチミールを用いた標的ｍＲＮＡの活性調節と比べて標的外効果が少なくなるであろう。
【０１４９】
本発明の文脈では、アンチミールは、マイクロＲＮＡと塩基対を形成することによってマイクロＲＮＡの活性を抑制できるオリゴヌクレオチドである。たいていのマイクロＲＮＡは非特異的であるため、すなわち２つ以上の標的を調節するため、特定のマイクロＲＮＡを調節すると２つ以上の標的ｍＲＮＡの活性に影響が及ぶであろう。したがって特定の１つの標的ｍＲＮＡの活性だけを調節することを望む場合には、他の標的ｍＲＮＡの調節は、アンチミールの標的外効果と呼ぶことができる。
【０１５０】
標的ｍＲＮＡの活性に影響を与えたり、標的ｍＲＮＡの活性を調節したりするのに、アンチミールの代わりに非特異的な（外来性）マイクロＲＮＡを用いても、明らかに標的外効果が得られるであろう。
【０１５１】
さらに、所定のマイクロＲＮＡの標的のレパートリーは細胞が異なると異なる可能性があるため、アンチミールは異なる細胞で異なる標的外効果をもたらす可能性がある。非特異的なマイクロＲＮＡを用いた調節も同様である。ブロックミールは、標的ＲＮＡがマイクロＲＮＡによって調節される特定の細胞内でだけ効果を有するであろう。したがってブロックミールは、細胞特異的マイクロＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用を標的とすることができる。特定のマイクロＲＮＡ：ｍＲＮＡ相互作用を持たない細胞の中にブロックミールが入る場合には、ブロックミールはほとんど、またはまったく効果を持たない。
【０１５２】
ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖とガイド鎖を含む二本鎖ＲＮＡ複合体であり、そのＲＮＡ複合体のガイド鎖と相補的な標的ＲＮＡの分解を媒介する。ｓｉＲＮＡはしばしば標的外効果を有することが今や認識されている。なぜならガイド鎖として機能する鎖はマイクロＲＮＡとしても機能できるからである。すなわちｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と完全には相補的でない標的ｍＲＮＡの調節を媒介することができる。
【０１５３】
例えば一実施態様では、本発明のブロックミールは、同じ標的ｍＲＮＡに向かうｓｉＲＮＡと比べて標的外効果が少なくなるであろう。
【０１５４】
別の好ましい一実施態様では、ブロックミールは、標的ｍＲＮＡを調節するのに従来のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた場合と比べてやはり標的外効果が少なくなるであろう。
【０１５５】
従来のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの開裂を媒介するように設計されることがしばしばある。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡとＤＮＡの二重鎖を開裂させる。
【０１５６】
したがってそのようなアンチセンス・オリゴヌクレオチドが想定外のｍＲＮＡと塩基対を形成する場合には、このｍＲＮＡはＲＮアーゼＨを用いた開裂によって不活性化され、標的外効果が生じることになる。
【０１５７】
結論として、本発明のブロックミールは、マイクロＲＮＡによる標的ＲＮＡの調節を阻止することによってＲＮＡの活性に影響を及ぼすという点が特徴的である。したがって本発明のブロックミールは、従来のアンチセンス・オリゴヌクレオチド、アンチミール、マイクロＲＮＡとｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡｉを媒介とした調節のいずれと比べても標的外効果が少なくなるであろう。
【０１５８】
短いブロックミールを設計するときに考慮すべき１つのことは、明らかに、トランスクリプトームが、ブロックミールと完全に相補的な２つ以上の部位を含んでいることである。しかし上に概略を示したように、ブロックミールは、標的配列がマイクロＲＮＡを用いた調節の標的配列でもある場合には標的ＲＮＡにだけ影響を及ぼすであろう。したがって非常に短いブロックミールでさえ、ほとんど、またはまったく標的外効果を持たない可能性がある。したがってブロックミールは、意図的に多数の部位を標的とするように設計できる。その場合にブロックミールは、よりアクセスしやすいマイクロＲＮＡ標的部位に選択的に結合する。したがってブロックミールは、マイクロＲＮＡが標的ＲＮＡに結合するのを阻止する場合にだけ効果を持つであろう。
【０１５９】
化学
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、相補的な配列に対する親和性を増大させるヌクレオチド・モノマー、すなわち親和性を増大させる修飾を含んでいる。これは特に短いオリゴヌクレオチドに関係し、例えば１０〜１５塩基の長さ、それどころか１０塩基未満の長さ（例えばマイクロＲＮＡの種配列に対応するほんのガイド配列の長さ）という非常に短い活性なオリゴヌクレオチドを生成させることができる。
【０１６０】
相補的な配列に対する親和性を増大させるヌクレオチド・ユニットとして、例えばＬＮＡ（ロックされた核酸）ユニット、ＰＮＡ（ペプチド核酸）ユニット、ＩＮＡ（挿入核酸）ユニットが可能である。２−Ｏ−位置が修飾されたＲＮＡユニット（例えば２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−フルオロ−ＲＮＡ）も相補的な配列に対する親和性を増大させる。それと同時に、このような修飾によってオリゴヌクレオチドは細胞ヌクレアーゼにとってより劣った基質になるため、オリゴヌクレオチドの生体安定性も向上することがしばしばある。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドは、生体安定性および／または生物学的利用能を向上させる修飾（例えばホスホロチオエート結合）も含むことができる。オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート化されていてもよいし、一部だけがホスホロチオエート化されていてもよい。
【０１６２】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡユニットと、２’−位置が置換された１つ以上のユニットとからなる繰り返しパターンを含んでいる。ＯＭｅ／ＬＮＡミックスマーは、タンパク質−ＲＮＡ相互作用によって調節される遺伝子の発現の立体妨害阻害剤として用いられる強力な試薬であることがわかっている。したがって標的ＲＮＡにおいて本発明のオリゴヌクレオチドを用いてマイクロＲＮＡの活性を阻止する場合には、ＯＭｅ／ＬＮＡミックスマー構造を用いることができる。ギャップマー構造も利用できるが、オリゴヌクレオチドをブロックミールとして機能させることを想定している場合には、ＲＮアーゼＨを誘導できないことが好ましい。
【０１６３】
一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡユニットをまったく含んでいない。数個のＲＮＡユニットを用いて、またはＲＮＡユニットを用いずに、オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機械をリクルートできるようにすることを阻止できる。化学的修飾によっても同じことが可能である。
【０１６４】
別の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡユニットをまったく含んでいない。
【０１６５】
さらに別の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノ・ユニットおよび／またはＬＮＡユニットをまったく含んでいない。
【０１６６】
さらに別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、生体安定性を大きくする修飾を含んでいる。修飾として、相補的な配列に対する親和性を増大させるための上述のヌクレオチド・ユニットが可能である。
【０１６７】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、相補的な配列に対する親和性を増大させる多数のヌクレオチド・ユニットを含んでおり、その数は、１ユニット、２ユニット、３ユニット、４ユニット、５ユニット、６ユニット、７ユニット、８ユニット、９ユニット、１０ユニット、１１ユニット、１２ユニット、１３ユニット、１４ユニット、１５ユニット、１６ユニット、１７ユニット、１８ユニット、１９ユニット、２０ユニット、２１ユニット、２２ユニットからなるグループの中から選択される。
【０１６８】
好ましい一実施態様では、相補的な配列に対する親和性を増大させるヌクレオチド・ユニットは、オリゴヌクレオチドの側部に位置する。例えばオリゴヌクレオチドが１０個のＬＮＡユニットを含んでいる場合には、５個を５’末端に位置させ、残りの５個を３’末端に位置させることができる。
【０１６９】
さらに別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、生物学的利用能を大きくする修飾を含んでいる。細胞送達を改善する修飾が特に好ましい。
【０１７０】
非特異性と特異性
さらに別の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むことができる。このようなヌクレオチドは、いわゆる普遍塩基を含んでいる。普遍塩基は、ワトソン−クリック二重螺旋にフィットして任意の塩基と向かい合うことを特徴とする。したがってこのようなヌクレオチドを用い、本発明のオリゴヌクレオチドで非特異性をある程度実現できる。例えばこれは、オリゴヌクレオチドが特定の２つのｍＲＮＡを標的とする場合に利用できる。
【０１７１】
好ましい一実施態様では、特定のマイクロＲＮＡの大半の標的またはすべての標的を標的とすることが望ましい可能性がある。そのような場合には、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの種配列に対応するガイド配列と、天然の塩基からなる１つまたは２つのブロックとを含むことができる。天然の塩基からなるブロックのサイズを調節し、標的配列に対する適度の親和性を実現することができる。
【０１７２】
さらに別の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、３−ニトロピロール、５−ニトロピロール、３−メチルイソカルボスチリル、５−メチルイソカルボスチリルからなるグループの中から選択した普遍塩基を含んでいる。
【０１７３】
一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’側と５’側の一方または両方に普遍塩基が隣接したガイド配列を含むことができる。このようなオリゴヌクレオチドを用いてマイクロＲＮＡの非特異性を真似ることで、マイクロＲＮＡの多数の標的ＲＮＡ、それどころかすべての標的ＲＮＡにおいてマイクロＲＮＡの活性を阻止することができる。マイクロＲＮＡの標的ＲＮＡの一部だけを標的とするオリゴヌクレオチドを設計するのに普遍塩基と例えばイノシンの組み合わせも利用できる。
【０１７４】
一実施態様では、ガイド配列と第２の配列の間の塩基は普遍塩基である。
【０１７５】
別の一実施態様では、ガイド配列の一部でも第２の配列の一部でもないあらゆる塩基は普遍塩基である。
【０１７６】
普遍塩基は、オリゴヌクレオチドの融点を低くする傾向がある。そのため親和性を増大させる修飾またはユニット（例えばＬＮＡユニット、または２’−Ｏ−メチル基）を組み込むことによってこの低下に対抗することが好ましい。
【０１７７】
一本鎖と二本鎖
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴヌクレオチドと塩基対を形成しないこと、または相補的なオリゴヌクレオチドと対を形成する塩基とともに用いることが想定されていないことが好ましい。すなわち本発明のオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡと容易に相互作用するため一本鎖でなければならず、いくつかの実施態様では、ＲＮＡｉ機械のリクルートを阻止することもできねばならない。
【０１７８】
別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴヌクレオチドと塩基対を形成する。いくつかの状況では、オリゴヌクレオチドを相補的なオリゴヌクレオチドと塩基対にし、細胞内への輸送および／または細胞内輸送を容易にすることが望ましい可能性がある。生体内の輸送も容易になる可能性がある。さらに、生体安定性にプラスの影響がある可能性がある。相補的なオリゴヌクレオチドとの塩基対は、オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡとして機能する場合にも利用できよう。オリゴヌクレオチドが外来性ｍｉＲＮＡとして機能する場合には、オリゴヌクレオチドをステム−ループ構造にすることができる。
【０１７９】
別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが標的細胞に入ったときにＲＮアーゼＨによって分解されるＲＮＡ分子と塩基対を形成する。このようにして、オリゴヌクレオチドはその場で解放される。好ましい一実施態様では、相補的なオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドと同じタイプではない。例えばオリゴヌクレオチドがＲＮＡである場合には、相補的なオリゴヌクレオチドはＲＮＡではない。
【０１８０】
送達
当業者には、オリゴヌクレオチドを送達するさまざまな方法が知られている。例えばオリゴヌクレオチドをマイクロ粒子またはナノ粒子にすることができる。リポソームが送達媒体として頻繁に用いられており、さまざまなリポソーム送達系が存在している。リポソームは、例えばカチオン性脂質または中性脂質を含むことができる。リポソームのサイズはさまざまな用途に応じて変えることができ、他の成分がリポソームの中に、またはリポソームの表面に含まれていてもよい。キトサン・ナノ粒子が、プラスミドとｓｉＲＮＡをさまざまな細胞、その中でも特に一次細胞に送達するのに利用されてきた。したがってキトサン・ナノ粒子も本発明のオリゴヌクレオチドを送達するのに利用できる。送達用の他のポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、シクロデキストリン、アテロコラーゲン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（ラクティック−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドを上記のカチオン性ペプチドと共役させて細胞内への輸送を容易にすることができる。
【０１８１】
第２の態様  −  標的ＲＮＡの活性を変化させる方法
本発明の第２の態様は、標的ＲＮＡの活性を変化させるため、
ａ．標的ＲＮＡを含む系を用意するステップと、
ｂ．その標的ＲＮＡの標的領域と相補的なアンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを用意するステップと、
ｃ．ステップｂのオリゴヌクレオチドをステップａの系に導入するステップと、
ｄ．そのことによって標的ＲＮＡの活性を変化させるステップを含む方法である。
【０１８２】
オリゴヌクレオチドは、本発明の第１の態様のさまざまな実施態様において説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【０１８３】
さらに、標的ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドのガイド配列と相補的なアンチ種配列を含んでいることが好ましい。
【０１８４】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡにおいてマイクロＲＮＡの活性を阻止し、そのことによって標的ＲＮＡの活性を変化させる。すなわちオリゴヌクレオチドは、第１の態様で説明したブロックミールである。
【０１８５】
別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの開裂を誘導し、そのことによって標的ＲＮＡの活性を調節する。
【０１８６】
さらに別の一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機械を標的ＲＮＡへとリクルートする。ＲＮＡｉ機械をリクルートすると、標的ＲＮＡの翻訳抑制、または標的ＲＮＡの分解を起こすことができる。
【０１８７】
系は、細胞抽出液または細胞であることが好ましい。この方法は、生体内、生体外、試験管内で実施することができる。
【０１８８】
一実施態様では、この方法は、オリゴヌクレオチドの活性を確認する方法、すなわちオリゴヌクレオチドが実際に標的ＲＮＡの活性を変化させうるかどうか、そしてそれがどの程度であるかを確認する方法である。このような方法は、例えば治療法を開発するために活性が最適なオリゴヌクレオチドを同定しようとする場合に利用できる。このようなテストでは、一般に長さと化学的性質が異なるさまざまなオリゴヌクレオチドがテストされる。
【０１８９】
別の一実施態様では、この方法は、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的を同定または確認する方法である。マイクロＲＮＡが所定の標的ＲＮＡを調節すると仮定されていることが非常にしばしばあり、その場合には、第２の態様の方法は、標的ＲＮＡがマイクロＲＮＡによって実際に調節されるかどうかを確認する方法である。したがってこの方法は、標的ＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡを同定するステップをさらに含むことができる。これが可能なのは、標的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡの種配列と相補的なアンチ種配列を含んでいなければならないからである。
【０１９０】
第３の態様  −  生物活性のあるオリゴヌクレオチドの供給
本発明の第３の態様は、
ａ．標的ＲＮＡ中にあってマイクロＲＮＡの調節に関係する配列である（所定の）標的配列を用意するステップと、
ｂ．標的配列と相補的な少なくとも６個の塩基からなる連続した塩基列（アンチセンス配列）を含むオリゴヌクレオチド配列を設計するステップと、
ｃ．標的ＲＮＡの活性の候補調節因子であるステップｂのオリゴヌクレオチド配列を合成するステップを含む方法である。
【０１９１】
好ましい一実施態様では、この方法は、生物活性のあるオリゴヌクレオチドを供給する方法である。
【０１９２】
連続した塩基列は、標的ＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡの種配列に対応するガイド配列を含んでいることが好ましい。
【０１９３】
この方法は、
ａ．標的ＲＮＡの活性を調べるためのレポータ系を用意するステップと、
ｂ．候補調節因子の存在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｃ．候補調節因子の不在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｄ．ステップｂとｃの活性レベルを比較することにより、オリゴヌクレオチドが実際にＲＮＡの活性を調節できるかどうか、および／またはＲＮＡの潜在的な標的配列が実際に標的配列であるかどうかを確認するステップをさらに含んでいることが好ましい。
【０１９４】
さらに別の好ましい一実施態様では、この方法は、負の対照として標的ＲＮＡ中のどの領域とも相補的ではないオリゴヌクレオチドの存在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップをさらに含んでいる。関係する別の一実施態様では、負の対照は、対照として機能するオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドである。さらに別の一実施態様では、負の対照は、標的ＲＮＡの標的領域の一部ではない領域と相補的である。オリゴヌクレオチドとその負の対照は、同じタイプ（すなわちＲＮＡ、混合したＲＮＡとＤＮＡ）であり、同じ修飾とヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡ、ＩＮＡ）を含んでいることが好ましい。
【０１９５】
標的ＲＮＡの活性は発現であることが好ましく、標的ＲＮＡはｍＲＮＡであることが好ましい。
【０１９６】
したがって標的ＲＮＡの活性を調節できる可能性のあるオリゴヌクレオチド（候補調節因子）が最初に同定され、その後、レポータ系を用いてこれらオリゴヌクレオチドの活性が調べられ、例えばオリゴヌクレオチドが実際に望む活性を有するかどうか、すなわち標的ＲＮＡの活性を調節できるかどうかが確認される。
【０１９７】
本発明の第３の態様によるオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【０１９８】
標的ＲＮＡの活性は遺伝子の発現であることが好ましく、標的ＲＮＡはｍＲＮＡであることが好ましい。標的ＲＮＡは、ウイルスのゲノムＲＮＡであってもよく、活性は例えば複製であってもよい。
【０１９９】
所定の標的配列は、学術論文や、確認されたマイクロＲＮＡのデータベースから得ることができる。
【０２００】
レポータ系
発現を調べるためのレポータ系としては、標的ＲＮＡの活性の指標を読み出すことのできる任意の系が可能である。例えば遺伝子構造体を含む細胞が可能である。その場合、標的ＲＮＡは別のレポータ遺伝子と融合されている。
【０２０１】
好ましい一実施態様では、標的ＲＮＡの標的配列は、ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に存在する。その場合、標的ｍＲＮＡの残部を含める必要なしに３’ＵＴＲをレポータ遺伝子と融合させることができる。
【０２０２】
レポータ遺伝子としては、例えばルシフェラーゼ遺伝子またはＧＦＰ遺伝子が可能である。このようなレポータ系は当業者によく知られている。
【０２０３】
レポータ系は、内在性標的ｍＲＮＡを含む細胞でもよかろう。このような一実施態様では、標的ｍＲＮＡの活性（発現）は、そのｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を標的とする抗体を用いたイムノブロッティングによって調べることができる。標的ｍＲＮＡの活性を調べるのに２Ｄ−ゲル分析またはタンパク質チップも使用できる。
【０２０４】
マイクロアレイ、ノーザン・ブロット、リアル・タイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲとしても知られる）を利用してｍＲＮＡのレベルに対するあらゆる効果を調べることができる。このようなレポータ系も当業者によく知られている。
【０２０５】
種配列とアンチ種配列の利用
好ましい一実施態様では、第３の態様による方法は、標的ＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡの配列を用意するステップと、マイクロＲＮＡのその種配列を利用して標的配列のアンチ種配列を明らかにするステップをさらに含んでいる。
【０２０６】
標的ｍＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡの配列は、例えば学術論文やデータベースから得ることができる。マイクロＲＮＡの配列を集めたそのような１つのデータベースは、いわゆるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）である。好ましい一実施態様では、マイクロＲＮＡの配列は、マイクロＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの調節を記載している学術論文から得られる。別の一実施態様では、標的ｍＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡがどのようなものであるかは学術論文から得られ、その後、マイクロＲＮＡの配列はデータベースから得られる。このような情報は、第３の態様による方法の出発点であることがしばしばある。
【０２０７】
マイクロＲＮＡの種配列は、一般に、マイクロＲＮＡの５’末端に存在する。種配列は興味深い。なぜなら種配列は、特定のマイクロＲＮＡによって調節される標的ｍＲＮＡを予測する重要な配列であると考えられるからである。すなわち種配列は、標的ｍＲＮＡ上の相補的な領域と塩基対を形成すると考えられる。標的ｍＲＮＡのこのような相補的な領域は、この明細書では、アンチ種領域またはアンチ種配列とも呼ぶ。残念なことに、種配列は、標的ｍＲＮＡを予測するには短すぎることがしばしばある。すなわち１個の細胞のトランスクリプトームにはあまりに多くのアンチ種配列が存在する。したがって所定のマイクロＲＮＡによって調節される標的ｍＲＮＡを同定するにはまだ多くの課題があり、これまでのところ理論的予測よりも実験的検証に依存している。
【０２０８】
それにもかかわらず、どのｍＲＮＡがどのマイクロＲＮＡによって調節されるかを明らかにすることに関してますます進歩しており、本発明の１つの目的は、そのような知識を利用して第３の態様による方法を実施し、本発明のオリゴヌクレオチドを設計して提供することである。
【０２０９】
好ましい一実施態様では、標的ｍＲＮＡの標的領域は３’ＵＴＲに含まれており、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜２０、位置１〜１９、位置１〜１８、位置１〜１７、位置１〜１６、位置１〜１５、位置１〜１４、位置１〜１３、位置１〜１２、位置１〜１１、位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜２０、位置２〜１９、位置２〜１８、位置２〜１７、位置２〜１６、位置２〜１５、位置２〜１４、位置２〜１３、位置２〜１２、位置２〜１１、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜２０、位置３〜１９、位置３〜１８、位置３〜１７、位置３〜１６、位置３〜１５、位置３〜１４、位置３〜１３、位置３〜１２、位置３〜１１、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列を含んでいる。
【０２１０】
より好ましい一実施態様では、標的ｍＲＮＡの標的領域は３’ＵＴＲに含まれており、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜１０、位置１〜９、位置１〜８、位置１〜７、位置１〜６、位置２〜１０、位置２〜９、位置２〜８、位置２〜７、位置２〜６、位置３〜１０、位置３〜９からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列を含んでいる。
【０２１１】
非常に好ましい一実施態様では、標的ｍＲＮＡの標的領域は３’ＵＴＲに含まれており、配列番号１〜７２３いずれかの位置１〜８、位置１〜７、位置２〜８、位置２〜７からなるグループの中から選択した配列と相補的な配列を含んでいる。
【０２１２】
第４の態様  −  標的領域、そのマイクロＲＮＡ調節因子、本発明のオリゴヌクレオチドの同定
第４の態様では、本発明により、
ａ．標的ＲＮＡの活性を調べるためのレポータ系を用意するステップと、
ｂ．その標的ＲＮＡの一部と相補的なオリゴヌクレオチドを用意するステップと、
ｃ．ステップｂのオリゴヌクレオチドの存在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｄ．ステップｂのオリゴヌクレオチドの不在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｅ．ステップｃとｄの活性レベルを比較することにより、そのオリゴヌクレオチドがＲＮＡの活性に影響を及ぼすかどうかを確認するステップと、
ｆ．そのことにより、標的ＲＮＡの活性を調節できる活性なオリゴヌクレオチドを同定する、および／またはＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列を同定するステップを含む方法が提供される。
【０２１３】
レポータ系は、すぐ前の態様で説明した。
【０２１４】
本発明のオリゴヌクレオチドの１つの目的は、マイクロＲＮＡが、その特定のマイクロＲＮＡの標的である少なくとも１つの標的ｍＲＮＡにアクセスすることを阻止せねばならないことである。したがって標的ｍＲＮＡと相互作用するオリゴヌクレオチドの長さに応じ、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡが標的配列と塩基対を形成することを阻止する。言い換えるならば、マイクロＲＮＡはもはやＲＮＡｉ機械を標的ＲＮＡへとガイドできず、標的ｍＲＮＡに影響を与えることもできない。
【０２１５】
好ましい一実施態様では、標的ＲＮＡの標的領域は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（３’非翻訳領域）である。
【０２１６】
別の一実施態様では、標的ｍＲＮＡの標的領域は、３’ＵＴＲに含まれる。
【０２１７】
別の一実施態様では、この方法は、ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列を同定する方法である。すなわち所定のｍＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的は、例えば第４の態様による方法を用いて同定することができる。
【０２１８】
さらに別の一実施態様では、この方法は、ＲＮＡの活性を調節できるオリゴヌクレオチドを同定する方法である。
【０２１９】
この方法は、それぞれのオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの一部と相補的であるような一連のオリゴヌクレオチドを用意し、その一連のオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの特定の標的領域の５０％超を全体としてカバーするようにし、その一連のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドについて（標的ＲＮＡの活性の調節に関する）活性を調べるステップをさらに含んでいる。
【０２２０】
活性なオリゴヌクレオチドの配列を用いて標的領域のオリゴヌクレオチド感受性領域を特定することが好ましい。さらに、オリゴヌクレオチド感受性領域の配列を用いて最適化された配列（すなわち最適化された活性）を持つ１つ以上のオリゴヌクレオチドを設計することが好ましい。
【０２２１】
別の一実施態様では、活性なオリゴヌクレオチドの配列の先頭を切断し、再び活性を調べることで、例えばｍＲＮＡの調節因子として機能するであろうオリゴヌクレオチドの最小長を特定する。
【０２２２】
この明細書に記載してあるように、オリゴヌクレオチド感受性領域は、ＲＮＡ中にあって、１つのオリゴヌクレオチドと塩基対を形成したときにそのＲＮＡの活性に影響を与える１つの領域である。一般に、オリゴヌクレオチド感受性領域と塩基対を形成するオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡがＲＮＡの活性を調節することを阻止するであろう。
【０２２３】
好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチド感受性領域の配列を用い、標的ＲＮＡを調節できる可能性のある候補マイクロＲＮＡを同定する。したがってこの方法は、所定の標的ＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡを確認する方法である。
【０２２４】
特定のｍＲＮＡを調節するマイクロＲＮＡの同定はさまざまな理由で興味深い。第１に、いかにしてＲＮＡｉ機械が特定のｍＲＮＡ標的へとリクルートされるかの見通しが得られ、この情報を用いてＲＮＡｉ機械を１つ以上の治療標的（例えば疾患に関与するタンパク質をコードしているｍＲＮＡ）に向けることができる。第２に、特定のｍＲＮＡを、そのｍＲＮＡの活性を調節するマイクロＲＮＡの活性を抑制するアンチミール・オリゴヌクレオチドによる調節の標的とすることができる。どのｍＲＮＡが特定のマイクロＲＮＡによって調節されるか、またはどのマイクロＲＮＡが特定のｍＲＮＡを調節するかを明らかにすることは、現在、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡに関係する最も重要な問題ではないとしても、最も重要な問題の１つである。
【０２２５】
本発明の１つの目的は、マイクロＲＮＡとｍＲＮＡの間のこのような調節関係を提供することである。
【０２２６】
候補マイクロＲＮＡの同定には、
ａ．オリゴヌクレオチド感受性領域の配列を用意するステップと、
ｂ．オリゴヌクレオチド感受性領域の配列中でマイクロＲＮＡと相補的な部分を検索し、標的ＲＮＡを調節できる可能性のある候補マイクロＲＮＡを同定するステップが含まれていることが好ましい。
【０２２７】
相補性を検索するとき、種配列が特に重要であり、オリゴヌクレオチド感受性領域でアンチ種配列を最初に検索することが好ましい。
【０２２８】
好ましい一実施態様では、標的ＲＮＡを調節できる可能性のある同定された候補マイクロＲＮＡの活性が第２のテストで確認され、標的ＲＮＡの活性を実際に調節するマイクロＲＮＡが同定される。
【０２２９】
第２のテストには、
ａ．標的ＲＮＡの活性を調べるためのレポータ系を用意するステップと
ｂ．マイクロＲＮＡと相補的な部分を含んでいて候補マイクロＲＮＡの活性を抑制できるアンチミール−オリゴヌクレオチドを用意するステップと、
ｃ．ステップｂのアンチミール−オリゴヌクレオチドの存在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｄ．ステップｂのアンチミール−オリゴヌクレオチドの不在下で標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｅ．ステップｃとｄの活性レベルを比較することにより、同定された候補マイクロＲＮＡ調節因子が実際に標的ＲＮＡの活性なマイクロＲＮＡ調節因子であるかどうかを確認するステップが含まれていることが好ましい。
【０２３０】
好ましい一実施態様では、第２のテストは、負の対照としてマイクロＲＮＡと相補的な領域を含まないオリゴヌクレオチドの存在下で標的ＲＮＡの発現を調べるステップをさらに含んでいる。
【０２３１】
この方法は、
ａ．標的ＲＮＡに向かうオリゴヌクレオチドの存在下でその標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｂ．ステップａのオリゴヌクレオチドとアンチミール−オリゴヌクレオチドの同時存在下でその標的ＲＮＡの活性を調べるステップと、
ｃ．そのことにより、オリゴヌクレオチド感受性領域においてマイクロＲＮＡの活性を阻止することでオリゴヌクレオチドが機能するかどうかを確認するステップをさらに含んでいることが好ましい。
【０２３２】
例えばアンチミールが存在しているときに標的ＲＮＡの活性に対するオリゴヌクレオチドの影響が少なくなったり、なかったりする場合には、これは、そのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド感受性領域においてマイクロＲＮＡの活性を阻止することで機能することを意味する。
【０２３３】
好ましい一実施態様では、カバー率の選択は、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、１００％からなるグループの中からなされる。
【０２３４】
カバー率に関しては、可能性のある一連のオリゴヌクレオチドによってカバーできる標的領域の一部を意味する。言い換えるならば、標的領域のうちで、可能性のある一連のオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下で標的領域に付加されると塩基対を形成するであろう部分である。
【０２３５】
別の好ましい一実施態様では、カバー率は１００％であり、オリゴヌクレオチド同士は配列中に重複がある。
【０２３６】
さらに別の好ましい一実施態様では、特別なオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの５’末端側が５０％重複し、３’末端側が５０％重複している。したがって標的領域の所定のあらゆる配列は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドによってカバーされる。このような設定は、オリゴヌクレオチド感受性領域を特定する上で有利であろう。
【０２３７】
標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡであることが好ましい。標的ＲＮＡがｍＲＮＡである場合には、標的ｍＲＮＡの活性は遺伝子の発現であることが好ましい。
【０２３８】
標的ＲＮＡが標的ｍＲＮＡである場合には、標的領域は、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの中にあることが好ましい。
【０２３９】
第４の態様の好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、本発明の第１の態様で説明したオリゴヌクレオチドである。
【０２４０】
医薬組成物と治療
本発明の第５の態様は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物である。当業者であれば上の説明からわかるように、このオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと同様にして治療に用いることができる。なぜならｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の発現に特異的に影響を与えるのに使用できるからである。
【０２４１】
本発明の第６の態様は、本発明のオリゴヌクレオチド、または本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の有効量を、それを必要としている人に投与する操作を含む治療法である。
【０２４２】
本発明の第７の態様は、薬として用いる本発明のオリゴヌクレオチドである。
【０２４３】
本発明の第８の態様は、本発明のオリゴヌクレオチドを用い、がん、ウイルス感染症、心臓血管疾患、免疫疾患を治療する薬を調製する方法である。
【０２４４】
がんとして、グリアブラストーマ、乳がん、直結腸がん、肝臓がんが可能である。
【０２４５】
ウイルス感染症として、ＨＩＶ感染症、Ｃ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、ＣＭＶ感染症、ＨＳＶ感染症が可能である。
【０２４６】
免疫疾患として、乾癬や湿疹が可能である。
【０２４７】
心臓血管疾患は、高い血中コレステロールを下げることによって治療できる。
【０２４８】
本発明の第９の態様は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて標的ＲＮＡの活性を変化させる方法である。
【０２４９】
伝達方法
本発明の第１０の態様は、本発明のオリゴヌクレオチドを記述する情報、または本発明によって提供されるオリゴヌクレオチド感受性領域を記述する情報、または本発明によって提供される標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的領域を記述する情報を伝達する操作を含む方法である。この情報は、標的ｍＲＮＡの活性を調節できる可能性のあるオリゴヌクレオチド、または標的ｍＲＮＡの活性を調節できるオリゴヌクレオチドを記述することができる。
【０２５０】
第１０の態様の好ましい一実施態様では、伝達は電子的伝達である。
【０２５１】
【化１】
2015146814.tif 000021
【実施例】
【０２５２】
実施例１
糖尿病を治療するためのブロックミール
ｍｉｒ−３７５が膵島のインスリン分泌の調節因子であることと、ミオトロフィン（Ｍｔｐｎ）がｍｉｒ−３７５を用いた調節の標的であることが証明されている（Ｐｏｙ，  Ｍ．Ｎ．、２００４年）。さらに、ｓｉＲＮＡを用いたＭｔｐｎの抑制は、グルコースでシミュレーションしたインスリン分泌とエキソサイトーシスに対するｍｉｒ−３７５の効果に似ていることがわかっている。したがって著者は、ｍｉｒ−３７５がインスリン分泌の調節因子であり、糖尿病を治療するための新規な医薬標的になる可能性があると結論した。
【０２５３】
われわれはここに、Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおいてｍｉｒ−３７５によるＭｔｐｎの活性調節を抑制することでＭｔｐｎの発現を調節できるブロックミールを提示する。
【０２５４】
標的ＲＮＡの関連部分は以下の通りである。
【０２５５】
【化２】
2015146814.tif 000022
【０２５６】
アンチ種配列を太字で示してある。標的ＲＮＡのこの標的領域は、例えば標的ＲＮＡでアンチ種配列を検索することによって同定できる。あるいは標的領域は、インターネット上で入手できる適切なデータベース（ｗｗｗ．ｐｉｃｔａｒ．ｃｏｍ、標的スキャン）を用いて見いだすこともできる。明らかに、情報は、実験から、または学術論文（例えばＰｏｙ他）からも入手できる。
【０２５７】
ｍｉｒ−３７５の配列は以下の通りである。
【０２５８】
【化３】
2015146814.tif 000023
【０２５９】
種配列をアンチ種配列と対にすると、例えば以下の相互作用が生じる。
【０２６０】
【化４】
2015146814.tif 000024
【０２６１】
全体的な相補性がほとんどないことがわかる。
【０２６２】
ブロックミール：
【０２６３】
ｍｉｒ−３７５による調節を抑制することによってＭｔｐｎの発現を調節できるブロックミールは、塩基対の形成において標的領域のアンチ種配列を封鎖できるはず、すなわちアンチ種配列を隠せるはずである。
【０２６４】
そこでＭｔｐｎのブロックミール（下側の鎖の３’−５’方向）が標的配列（上側の鎖の５’−３’方向）と塩基対を形成する例をここに示す。
【０２６５】
【化５】
2015146814.tif 000025
【０２６６】
【化６】
2015146814.tif 000026
【０２６７】
上記の設計のブロックミールは、従来技術で知られている方法を利用して合成できる。この明細書に記載してあるように、ブロックミールは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＩＮＡとして、または混合したモノマーを用いて合成できる。
【０２６８】
明らかに、ＵモノマーをＴモノマーと交換しても塩基対を形成することが相変わらず可能である。Ｇ−Ｃ塩基対もＧ−Ｕゆらぎ塩基対で置き換えることができる。
【０２６９】
Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡを標的とする上記の設計のさまざまなブロックミールを合成する方法は、オリゴヌクレオチド合成の分野の当業者にはよく知られている。特に好ましい実施態様が、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０２７０】
ブロックミールを例えばコレステロールと共役させることも当業者の一般的な知識に含まれる。
【０２７１】
実施例２
単純ヘルペス・ウイルス感染症を治療するためのブロックミール
最近、単純ヘルペス・ウイルス−１が、このウイルスが潜伏感染を確立することを可能にするマイクロＲＮＡをコードしていることが証明された（Ｇｕｐｔａ，  Ａ．、２００６年）。ｍｉｒ−ＬＡＴと名づけたマイクロＲＮＡがＴＧＦ−βとＳＭＡＤ３を調節し、そのことによって細胞がアポトーシスする能力に影響を与えることが見いだされた。アポトーシスは、感染した細胞の自己破壊してウイルスの子孫が生成されるのを阻止する通常のプロセスである。したがってＴＧＦ−βとＳＭＡＤ３の発現に対するｍｉｒ−ＬＡＴの調節活性を阻止できると有用である。
【０２７２】
ＴＧＦ−β  ｍＲＮＡの標的領域の配列は以下の通りである。
【０２７３】
【化７】
2015146814.tif 000027
【０２７４】
ｍｉｒ−ＬＡＴの配列は以下の通りである。
【０２７５】
【化８】
2015146814.tif 000028
【０２７６】
したがって以下の複合体を形成できる。
【０２７７】
【化９】
2015146814.tif 000029
【０２７８】
すぐ前の実施例と同様にして一連のブロックミールを設計することができる。下側の鎖は、３’−５’方向で示したブロックミールであり、上側の鎖は、ＴＧＦ−β  ｍＲＮＡの標的領域である。
【０２７９】
【化１０】
2015146814.tif 000030
【０２８０】
【化１１】
2015146814.tif 000031
【０２８１】
このような配列のさまざまな実施態様の合成は、当業者の能力範囲である。特に好ましい実施態様が、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０２８２】
実施例３
Ｍｔｐｎの発現を調節するオリゴヌクレオチドの同定
【０２８３】
この方法をいかにして実施できるかの単なる一例を以下に示す。湿式実験は実際には行なわなかった。
【０２８４】
以下の配列は、Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡの予想標的配列の一部である。
【０２８５】
【化１２】
2015146814.tif 000032
【０２８６】
この領域について５０％重なる一連の可能性のあるブロックミールを設計する。可能性のあるブロックミールをイタリックで示してあり、Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡの参照配列と、相補的な鎖とを比較のために示してある。
【０２８７】
【化１３】
2015146814.tif 000033
【０２８８】
このようにして１１個のブロックミールを設計した。次にこれらを、例えばホスホロチオエート結合を有する２−Ｏ−修飾したオリゴヌクレオチドとして合成した。Ｍｔｐｎ  ｍＲＮＡを標的とする上記の設計のさまざまなブロックミールを合成する方法は、オリゴヌクレオチド合成の分野の当業者にはよく知られている。特に好ましい実施態様が、本発明の詳細な説明に記載されている。
【０２８９】
ブロックミールを例えばコレステロールと共役させることも当業者の一般的な知識に含まれる。
【０２９０】
次に標的配列をレポータ遺伝子と融合させる。レポータ遺伝子の発現は検出することができる。この実施例では、レポータ遺伝子はｅＧＦＰである。次にレポータ遺伝子をヒーラ細胞にトランスフェクトし、設計した１１個のブロックミールのそれぞれをトランスフェクトした後にｅＧＦＰの発現をモニタする。
【０２９１】
結果：
標的領域の５’末端と相補的なブロックミールから数えたときのブロックミール７〜９だけが、ｅＧＦＰの発現に影響を与える。ブロックミール７は、ｅＧＦＰの発現をわずかに増大させるのに対し、ブロックミール８と９はより劇的な効果を有する。
【０２９２】
このようにしてＭｔｐｎ  ｍＲＮＡの発現に影響を与えることのできるオリゴヌクレオチドを同定した。
【０２９３】
この結果から、ブロックミール７〜９によってカバーされる領域が、マイクロＲＮＡによる調節のための標的であることがわかる。さらに、この結果から、ブロックミール８と９によってカバーされる領域が、マイクロＲＮＡによる調節にとって非常に重要であることがわかる。ブロックミール８と９の両方によってカバーされる領域は、マイクロＲＮＡの種配列と相互作用する領域を含んでいる可能性、またはマイクロＲＮＡの種配列と相互作用する領域を部分的に含んでいる可能性がある。
【０２９４】
次に、ブロックミール８と９によってカバーされる領域（ＡＡＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＡ）でマイクロＲＮＡに対する相補性を検索する。
【０２９５】
より詳細には、この領域で、マイクロＲＮＡの種配列に対する相補性を検索する。この検索によってヒトｍｉｒ−３７５が同定される。
【０２９６】
このマイクロＲＮＡが実際にＭｔｐｎ  ｍＲＮＡの活性を調節しているかどうかは、ｍｉｒ−３７５の活性をアンチミールを用いて抑制することによって確認できる。
【０２９７】
ｍｉｒ−３７５の配列は以下の通りである。
【０２９８】
【化１４】
2015146814.tif 000034
【０２９９】
このようにして相補的な配列を持つ抑制性アンチミールが合成される。
【０３００】
ｍｉｒ−３７５−アンチミール：
【０３０１】
【化１５】
2015146814.tif 000035
【０３０２】
先頭部が切断されたアンチミールも生成される。
【０３０３】
【化１６】
2015146814.tif 000036
【０３０４】
アンチミールは、例えばホスホロチオエート結合を有する２−修飾したオリゴヌクレオチドとして合成される。次に、レポータ系を利用し、ｍｉｒ−３７５によるＭｔｐｎ  ｍＲＮＡの調節をこれらアンチミールが阻止できるかどうかをテストする。結果から、ｍｉｒ−３７５が実際にＭｔｐｎ  ｍＲＮＡの発現を調節していることがわかる。
【配列表】
2015146814000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月10日(2015.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロＲＮＡの種配列と同じ配列と塩基対を作ることのできるガイド配列が含まれたアンチセンス配列を含む、４０塩基未満の長さを有する、ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨ開裂を誘導できず、およびＲＮＡｉ機構をリクルートできないオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡがヒトのマイクロＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記マイクロＲＮＡの種配列が、該マイクロＲＮＡの５’末端から数えて位置２〜６である、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記アンチセンス配列が、標的ＲＮＡのマイクロＲＮＡ標的配列と相補的な連続した塩基列を含んでいて、その連続した塩基列の選択が、１０〜２５塩基、１２〜２４塩基、連続した１４〜２２塩基、１５〜２２塩基、１５〜２０塩基からなるグループの中からなされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡ標的配列がｍＲＮＡの３’ＵＴＲに存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
対応するマイクロＲＮＡとの％一致の選択が、９９％未満である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基からなるグループの中から選択した長さを超える非修飾ＤＮＡ列を含まない、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
１つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
完全にホスホロチオエート化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ＲＮＡユニットをまったく含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ＤＮＡユニットをまったく含まない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【外国語明細書】
2015146814000001.pdf