(57)【要約】【課題】トランスフェリンファミリータンパク質を簡便、シンプルに、かつ高感度、正確に検出する、安価な装置および方法を提供すること。【解決手段】紙基材；紙基材上に形成された疎水性バリアにより規定される感知領域；感知領域に固定化された少なくとも１種のランタノイドイオンを含む、トランスフェリンファミリータンパク質検出装置。トランスフェリンファミリータンパク質を含む試料の感知領域との接触；感知領域中に生成した信号の検出を含む、トランスフェリンファミリータンパク質の検出方法。 【選択図】図1
2015052584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
紙基材；
該紙基材上に形成された疎水性バリアにより規定される感知領域；及び
該感知領域上に固定化された少なくとも１種のランタノイドイオン
を含む、トランスフェリンファミリータンパク質の検出装置。
【請求項２】
前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されている、請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記疎水性バリアは、紫外線硬化疎水性インクのインクジェット印刷により形成される請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
前記ランタノイドイオンが、La(III)、Eu(III)、Tb(III)及びYb(III)から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記ランタノイドイオンがTb(III)である請求項４記載の装置。
【請求項６】
前記紙基材上に固定化された、少なくとも１種のアルカリ土類金属炭酸水素塩をさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記アルカリ土類金属炭酸水素塩が、LiHCO3, NaHCO3及びKHCO3から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項６記載の装置。
【請求項８】
前記トランスフェリンファミリータンパク質を含む試料と、請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記装置の前記感知領域とを接触させ；そして、該感知領域中に生成した信号を検出することを含む、トランスフェリンファミリータンパク質の検出方法。
【請求項９】
前記装置が、前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されており、前記試料は前記サンプリング領域に適用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記信号が蛍光である請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスフェリンファミリータンパク質が、血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン及びメラノトランスフェリンから成る群より選ばれる請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスフェリンファミリータンパク質が、ラクトフェリンである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が体液である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液が、全血、血漿、血清、尿、唾液、初乳及び涙液から成る群より選ばれる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項６記載の前記装置を用い、前記試料の適用後に前記少なくとも１種のアルカリ土類金属炭酸水素塩が前記少なくとも１種のランタノイドイオンと接触する請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフェリンファミリータンパク質検出の装置および方法に関する。より具体的には、本発明は認識物質およびその他の検査物質が紙基材に配置あるいは固定化された、トランスフェリンファミリータンパク質の検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体液は臨床診断に有用な情報が豊富である。例えば、血液は最も一般的な試料であり、グルコース、コレステロール、酵素、電解質など様々なバイオマーカーが含まれる。一方でヒト涙液は、眼病に関連する眼の様々な機能的あるいは組織学的異常を反映する[1]、見過ごされがちであるが容易に採取可能なバイオマーカーである。涙液膜は眼の外側から順に、油層、水溶性タンパク質を含む液層、ムチン層の三つから構成される。したがってヒト涙液は、水分、タンパク質、酵素、電解質、脂質など様々な物質の混合物である。その中でも、涙液のプロテオミクスは、近年研究が盛んな分野である[2, 3]。涙液タンパク質は眼表面の保護や涙液成分の調節において重要な役割を担うため、涙液タンパク質の分泌異常はドライアイ[4]、円錐角膜[5]、シェーグレン症候群[6]などの眼病の原因となりうる。現在のところ、涙液タンパク質は500種類以上知られている[7]。それらの中には、疾患において濃度が上昇ないし低下するものがある[8]。特に、涙液に比較的高濃度で存在する糖タンパク質であるラクトフェリンの減少は角膜上皮の深い関連があり[9]、ラクトフェリンの涙液濃度を知ることは、シェーグレン症候群や他の生理的障害の診断に寄与する。シェーグレン症候群は、眼や口腔の乾燥など症状を呈する、深刻な慢性自己免疫疾患である。シェーグレン症候群の初期診断は、現在のところ自覚症状や他覚所見、フルオレセインやローズベンガルによる生体染色、シルマー試験紙による涙液量の測定によって行われている。疑わしい所見の場合、より侵襲的な口唇腺や涙腺の生体組織検査、唾液腺の造影検査が必要となる。シルマー試験紙は、非侵襲性や簡便性、迅速性から長くにわたり広く利用されてきたが、臨床的状況を確実に反映するものではなく、「大まかな検査」と見なされることも少なくない[8]。したがって、ラクトフェリンの涙液濃度測定は、より信頼性の高い眼病検査のための新たなアプローチとして期待される。
【０００３】
ラクトフェリンを定量する従来法としては、ELISA法（enzyme linked immunosorbent assay）[10]、放射状免疫拡散法（Lactoplate）[11]、固相免疫比色測定法（Lactocard）[12]、2D-nanoLC-nanoESI-MS/MS[4]やSELDI-TOF-MS[13]と組み合わせたiTRAQ（isobaric tag for relative and absolute quantitation）技術が挙げられる。しかしこれら全ての方法には、多くの体積のサンプルが必要であること、所要時間が長いこと、装置やランニングコストが高いこと、多段階の操作が必要であることなど、何らかの欠点が存在する。これらの問題に対処すべく、KarnsとHerrはマイクロガラスチップ上における電気泳動を利用した均一系イムノアッセイを開発し、5秒以内に1 μL以下の涙液に含まれるラクトフェリン濃度を測定することに成功した[2]。しかしながら、ラクトフェリンを認識するために必要なモノクローナル抗体が使用されることによる高価なデバイス作製コスト、シグナル検出に高度な機器（蛍光顕微鏡、冷却CCDカメラなど）が必要であることは、解決されるべき問題である。
【０００４】
上に述べた問題の解決方法としては、紙装置の使用が挙げられる。紙装置、その中でも特にマイクロ流体ペーパー分析デバイス（microfluidic paper-based analytical devices, μPADs）は、2007年にWhitesidesらによって開発されて以来[14]、有用な分析プラットフォームとして非常に注目を集めてきた。μPADsは分析装置として、（１）材料コストが安い、（２）軽量、（３）焼却により安全に廃棄できる、（４）必要な試料体積が小さい、（５）外部電源が不要、などの特長を有する。紙本来の特性から、μPADsは安価な原料から作ることができ軽量であるため、手に入りやすく、持ち運びが容易である。また紙をベースとすることにより、簡単かつ安全な廃棄が可能となる。使用後のμPADsを焼却することで有害物質（病原体、アレルゲンなど）を処分できるため、臨床検査において体液などの生体サンプルによって汚染された、プラスチックのマイクロプレートやマイクロチップと比べてより衛生的に廃棄ができる。少ない体積の試料が分析できることは、μPADsのさらなる利点である。μPADsは、比較的少量しか採取できない試料、例えば涙液、唾液、新生児の尿、針を刺した指先から出る一滴の血液でも分析することができる[15]。最後に、紙のセルロース繊維のネットワークに由来する微孔構造により、試料は毛細管力で流れるため、ポンプなどの外部電源が不要となる。総括すると、μPADsは扱いやすく、使用が簡便で、特に量が限られた試料（例：体液）に適した分析装置であり、これまでに様々な応用（例：血液検査、食品安全評価、浮遊金属分析）が報告されてきた[16-18]。2008年に我々の研究グループは、インクジェットプリント技術を用いて生化学分析のためのμPADを開発した（特許文献1）[19]（非特許文献1）。現在のところ、インクジェットプリント技術は、μPADsを一通り作製できる唯一の標準的技術である[20]（非特許文献2）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2012/160857 A1
【０００６】
【非特許文献１】Abe, K.; Suzuki, K.; Citterio, D., Anal. Chem., 2008, 80, 6928-6934
【非特許文献２】Maejima, K.; Tomikawa S.; Suzuki, K; Citterio, D., RSC Adv., 2013, 3, 9258-9263
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、トランスフェリンファミリータンパク質を簡便、シンプルに、かつ高感度、高精度に検出できる、安価な装置および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明は次のものを提供する：
1.  紙基材；
該紙基材上に形成された疎水性バリアにより規定される感知領域；及び
該感知領域上に固定化された少なくとも１種のランタノイドイオン
を含む、トランスフェリンファミリータンパク質の検出装置。
2.  前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されている、１記載の装置。
3.  前記疎水性バリアは、紫外線硬化疎水性インクのインクジェット印刷により形成される１又は２記載の装置。
4.  前記ランタノイドイオンが、La(III)、Eu(III)、Tb(III)及びYb(III)から成る群より選ばれる少なくとも１種である１〜３のいずれか１項に記載の装置。
5.  前記ランタノイドイオンがTb(III)である４記載の装置。
6.  前記紙基材上に固定化された、少なくとも１種のアルカリ土類金属炭酸水素塩をさらに含む１〜５のいずれか１項に記載の装置。
7.  前記アルカリ土類金属炭酸水素塩が、LiHCO3, NaHCO3及びKHCO3から成る群より選ばれる少なくとも１種である６記載の装置。
8.  前記トランスフェリンファミリータンパク質を含む試料と、１〜７のいずれか１項に記載の前記装置の前記感知領域とを接触させ；そして、該感知領域中に生成した信号を検出することを含む、トランスフェリンファミリータンパク質の検出方法。
9.  前記装置が、前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されており、前記試料は前記サンプリング領域に適用される、８記載の方法。
10.  前記信号が蛍光である８又は９記載の方法。
11.  前記トランスフェリンファミリータンパク質が、血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン及びメラノトランスフェリンから成る群より選ばれる８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12.  前記トランスフェリンファミリータンパク質が、ラクトフェリンである１１記載の方法。
13.  前記試料が体液である８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14.  前記体液が、全血、血漿、血清、尿、唾液、初乳及び涙液から成る群より選ばれる１３記載の方法。
15.  ６記載の前記装置を用い、前記試料の適用後に前記少なくとも１種のアルカリ土類金属炭酸水素塩が前記少なくとも１種のランタノイドイオンと接触する８記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、トランスフェリンファミリータンパク質を簡便、シンプルに、かつ高感度、高精度に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】a) マイクロ流体構造がパターニングされた紙基材の概略図；b) 少なくとも一つのサンプリング領域と少なくとも一つの感知領域を含み、それらが互いにマイクロ流路で連結されているマイクロ流体ペーパー分析デバイス（μPAD）の概略図。黒線は説明のためだけに示された疎水性バリアである。
【図２】インクジェット印刷による紙装置の作製と試料の適用を示す模式図。
【図３】a) トランスフェリンファミリータンパク質検出用μPADの概略と寸法；b) トランスフェリンファミリータンパク質検出用μPADを作製するための具体的な実験条件を表す模式図；c) μPADのマイクロ流体構造を示す写真（赤色着色剤溶液を適用することで親水性のマイクロ流体構造を可視化した）。
【図４】μPADsの蛍光信号を観測するために使用される装置；a) 装置の写真、b) 概略図。
【図５】ヒトラクトフェリンを含む100 μM TbCl3溶液（50 mM HEPESバッファー、2.5 mM NaHCO3、pH 7.4）の蛍光発光スペクトル；励起波長290 nm。
【図６】a) μPADを用いて作成したラクトフェリンの検量線；b) ラクトフェリンを適用後、紫外線（波長254 nm）を照射して撮影された感知領域の画像。「Green」の値はRGB表色系における「G」の数値を表す。
【図７】μPADsの選択性：a) 涙液の主成分それぞれ単独に対する応答；b) ラクトフェリンにいずれか一つの涙液主成分を混合した時の応答（ラクトフェリン以外の全ての成分に関しては、表1に示された中での最高濃度（範囲の上限値）を使用し、ラクトフェリンに関しては、平均値である1.84 mg/mLを使用した）。
【図８】μPADを用いて作成したトランスフェリンの検量線。「Green」の値はRGB表色系における「G」の数値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、トランスフェリンファミリータンパク質検出の装置および方法に関する。より具体的には、本発明は認識物質およびその他の検査物質が紙基材に配置あるいは固定化された、トランスフェリンファミリータンパク質検出の装置に関する。認識物質およびその他の検査物質は、インクジェット印刷で紙基材に配置されることが、発明の実施として好ましい。特に本発明に関わる認識物質は、ランタノイドイオン（本文では一般にLnイオンと略記する）である。好ましくは、ランタノイドイオンはLa(III)、Eu(III)、Tb(III)、Yb(III)を含む群から選ばれ、最も好ましいランタノイドイオンはTb(III)である。なお、ここではLn(III)およびLn3+の表記は同一のものを示すと理解されるべきである。これらのイオンは個々に使用することが可能であり、二つ以上のイオンを組み合わせて使用することも可能である。ランタノイドイオンの紙基材への配置の際は、3価の塩が適当であり、好ましくはハロゲン塩LnX3であり、Xはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素のいずれかのハロゲンを示す。インクジェット印刷によるランタノイドイオンの配置の際は、それに相当するハロゲン塩LnX3は、好ましくは添加物、例えばアセチレングリコールないしpHバッファー成分を含む、ないし添加物を含まない水溶液として使用される。好ましくは、ハロゲン塩LnX3のpH緩衝液であり、好ましくはその濃度は0.5 mmol/Lから10 mmol/Lであり、好ましくは濃度10-20%（v/v）のエチレングリコールを添加物として含む。最も好ましくは、15%（v/v）のエチレングリコールを含む1 mmol/LのTbCl3のpH緩衝液である。特に本発明に関わるその他の検査物質は、LiHCO3、NaHCO3、KHCO3を含むアルカリ土類金属炭酸水素塩である。前記アルカリ土類金属炭酸水素塩としては、NaHCO3が最も好ましい。アルカリ土類金属炭酸水素塩は、ランタノイドイオンとトランスフェリンファミリータンパク質の錯体、例えばTb(III)とラクトフェリンの錯体、の形成を促進する機能を持つ物質として働く。これらのアルカリ土類金属炭酸水素は個々に使用することが可能であり、また二つ以上のイオンを組み合わせて使用することも可能である。アルカリ土類金属炭酸水素の固定化の際には、ランタノイドイオンとともに固定化することが可能であり、また検出過程において前記アルカリ土類金属炭酸水素が少なくとも一つの前記ランタノイドイオンと接触するように、少なくとも一つの前記ランタノイドイオンと異なる領域に固定化することも可能である。したがって、例えば、アルカリ土類金属炭酸水素はサンプリング領域ないし以下に示すマイクロ流路の少なくとも一方に固定化することが可能である。
【００１２】
本発明は、トランスフェリンファミリータンパク質の検出（定量化を含む）を目標とする。トランスフェリンファミリータンパク質は、鉄に結合することが知られている分子から成り、血清トランスフェリン（ないし単にトランスフェリンと称される）、オボトランスフェリン、ラクトフェリン（ラクトフェリンとも称される）、メラノトランスフェリン（MTF）が含まれる。多くのトランスフェリンファミリーメンバーは、およそ340のアミノ酸から成るローブを二つ（NとC）持つ。本発明において特に着目されるのは、トランスフェリンとラクトフェリンであり、ラクトフェリンは本発明において最も重要な目標物質である。
【００１３】
トランスフェリンファミリータンパク質は、様々な生体液に利用される紙装置により検出することができ、その生体液には全血、血漿、血清、尿、唾液、初乳、涙液が含まれる。本発明の紙装置は、具体的には涙液のトランスフェリンファミリータンパク質の検出に役立ち、さらに具体的には涙液のラクトフェリンの検出に役立つ。本発明において特に着目される紙装置の形態は、マイクロ流体構造がパターニングされた紙装置、先に既に述べたいわゆるマイクロ流体ペーパー分析デバイス（microfluidic paper-based analytical devices、μPADsと略される）である。一般にマイクロ流体構造のパターンは、紙基材を厚さ方向に貫いて形成される疎水性バリアによって得られる。これらのバリアは、マイクロ流体構造のパターンの輪郭を形成する。疎水性バリアは、水性系液体に対して不浸透性を示す。紙基材において規定された親水性領域は、サンプリング領域、感知領域、マイクロ流路などとして機能する。マイクロ流体構造がパターニングされた紙装置を得る方法の一つは、インクジェット印刷による紫外線硬化疎水性インクの印刷であり、例えばここに明示的に引用を示した、我々のグループにより以前に報告された方法[20, 21]（特許文献1）である。典型的なμPAD（Fig. 1）は、少なくとも一つのサンプリング領域と少なくとも一つの感知領域を含み、それらは互いにマイクロ流路によって連結される。マイクロ流路の幅は、一般的には0.1から2 mmの間であり、好ましくは0.5から1.5 mm、最も好ましくは1 mmである。しかしながら、本発明における他の実施においては、サンプリング領域と感知領域は同一でも良い。後者の形式の紙装置においては、マイクロ流路は不要である。この場合、試料を適用する領域（サンプリング領域）と信号を生成する領域（感知領域）は同一である。μPADの設計および寸法としては、図1に示すように試料適用と検出のための二つの正方形領域が、真っ直ぐなマイクロ流路で連結されたものが好ましい。
【００１４】
トランスフェリンファミリータンパク質、好ましくはラクトフェリンないしトランスフェリン、さらに好ましくはラクトフェリン、を含む少量の生体液（一般的には0.5から50 μL、好ましくは1から10 μL、さらに好ましくは1から5 μL、最も好ましくは2から4 μL）をサンプリング領域に適用することにより、物理的に観測可能な信号が感知領域に生成される。サンプリング領域と感知領域が互いにマイクロ流路によって連結されたμPADにおいては、サンプリング領域に適用された試料は、サンプリング領域から感知領域へ流れる。試料は紙の微孔構造に起因する毛細管力によって流れる。物理的に観測可能な信号には、色変化（紙装置表面の吸光度や反射の変化）や、蛍光発光強度の変化が含まれる。
【００１５】
実施の一つにおいては、本発明は生体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙液など）に含まれるトランスフェリンファミリータンパク質（例えば、ラクトフェリン、トランスフェリンなど）の、蛍光発光強度を用いた紙装置による検出に関するものであり、紙装置には認識物質やその他の検査物質がインクジェット印刷により配置されている。係るデバイスの一般的な作製方法を図2に示す。好ましい実施においては、本発明は蛍光発光強度を検出に用い、インクジェット印刷により作製された紙装置による、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンの検出に関する。最も好ましい実施においては、本発明は蛍光発光強度を検出に用い、インクジェット印刷により作製されたマイクロ流体ペーパー分析デバイス（μPAD）による、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンの検出に関する。この場合、インクジェット印刷はマイクロ流体構造のパターニングおよび検査物質、認識物質の配置の双方に使用される。紙装置において物理的に観測可能な信号として好ましいのは、蛍光発光強度である。この蛍光発光は、認識物質（例えば、Tb3+などのランタノイドイオン）と生体液に存在するトランスフェリンファミリータンパク質によって形成された錯体から生ずる。好ましい実施においては、蛍光発光は紙装置に認識物質として配置されたTb(III)と涙液に存在するトランスフェリンファミリータンパク質であるラクトフェリンによって形成された錯体から生ずる。
【００１６】
本発明における装置は紙を用いて作られる。本発明における紙基材として好ましいのは、セルロース繊維から作られる濾紙である。タンパク質（ラクトフェリンやトランスフェリンなどの、トランスフェリンファミリーメンバーを含む）の中には、ランタノイドイオン（ランタン、テルビウム、ユウロピウム、イッテルビウムなど）の存在下において蛍光を発するものがあることが報告されている。ラクトフェリン―テルビウム錯体はpHに依存した蛍光を放つこと、また生理的pH（7.4）においては安定した緑色蛍光を放つことが知られている[22]。μPADの感知領域にインクジェットプリントされたテルビウム塩（例えば、TbCl3）の溶液は、μPADのサンプリング領域に適用された試料に含まれるラクトフェリンの濃度に依存した強度の蛍光を放つ。μPADを外部光源により励起し、μPADの放つ蛍光の強度を、例えばデジタル色彩明度（例としてはR、G、B値）などの形式で観測することで、試料に含まれるラクトフェリンの濃度を定量することができる。本方法により、ラクトフェリンを比色分析によって（簡便）、抗体を使用することなく（安価）、20分以内に（迅速）分析することができる。達成された検出限界は、ラクトフェリンを定量するための従来の分析法ほど低濃度ではないが、涙液、特にヒト涙液に含まれるヒトラクトフェリンの異常濃度を検出するには充分低い濃度である。
【実施例】
【００１７】
■具体的な実験条件に関する説明
材料。
塩化テルビウム六水和物（TbCl3・6H2O）およびヒトラクトフェリンはシグマアルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州）より購入した。1, 10-デカンジオールジアクリレートは東京化成工業（東京、日本）より購入した。N-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）は同仁化学研究所（熊本、日本）より購入した。水酸化ナトリウムおよびポリビニルアルコールは関東化学（東京、日本）より購入した。ヒトラクトフェリンELISAキットはメルク（サンディエゴ、米国）より購入した。ヒト血清トランスフェリンおよびその他全ての試薬は和光純薬工業（大阪、日本）より購入した。全ての溶液は18 MΩのミリQ水を使い調製した。
【００１８】
溶液の蛍光スペクトルの観測は、分光光度計（SPEX Fluorolog-NIR, 堀場製作所）を用いて行った。マイクロ流路の印刷は、改造などを施さないEPSON PX-105インクジェットプリンター（エプソン、諏訪、日本）を用いて行った。ラクトフェリン検出のための試薬（認識物質およびその他の検査物質）は、10 pLカートリッジ（DMC-11610）を装着したピエゾ方式のマテリアルプリンターであるダイマティクスDMP 2831（ダイマティクス富士フイルム、サンタクララ、米国）を用いて行った。ペーパーデバイス、特にμPADの放つ蛍光発光シグナルの記録は、UVハンドランプ（フナコシ、東京、日本）、520 nmのロングパスフィルター（シグマ光機、東京、日本）を装着したデジタルカメラDMC-FZ50（パナソニック、大阪、日本）を用いて行った。
【００１９】
溶液の蛍光スペクトルの観測。
蛍光スペクトルは、濃度0から1 mg/mLのラクトフェリンの他、100 μMのTbCl3（認識物質）および2.5 mMのNaHCO3（その他の検査物質）を溶解させたHEPES緩衝液（pH 7.4、50 mM）から測定した。ラクトフェリン―テルビウム錯体の形成を促進する炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）の代わりに、他の炭酸水素塩、例えば炭酸水素カリウム（KHCO3）を使用することもできる。試料溶液は290 nmのキセノンランプにより励起し、蛍光スペクトルは440から720 nmの範囲で観測し、この際、励起光の遮断のために420 nmのロングパスフィルター（シグマ光機、東京、日本）を併用した。励起および発光のスリット幅は4.5 nmで固定し、シグナルは励起光から90°回転した方向より測定した。
【００２０】
紙装置の作製。
μPADのマイクロ流体構造のパターンは、インクジェットプリンターと紫外線硬化疎水性インクを用い、我々のグループが以前に報告した方法[20, 21]とほぼ同様に印刷した。円形に切り抜いたA4コピー用紙に円形のNo. 5Cの濾紙を貼り付け、紫外線硬化疎水性インクを充填したEPSONインクジェットプリンターに給紙した。紙の表面には、パワーポイント（マイクロソフト）で描いたマイクロ流体構造のパターンを印刷した。紫外線硬化疎水性インクが紙内部へ必要以上に浸透するのを防ぐため、印刷後に濾紙を10℃の冷却プレートの上に乗せ、紫外線硬化疎水性インクを重合するために紫外線を15分間照射した。紙の裏面には、表面のパターニングされた部分を完全に覆うように紫外線硬化疎水性インクを印刷し、冷却および10分間の紫外線照射を行った。次に、マイクロ流体構造がパターニングされた紙に、ラクトフェリン検出のための物質（認識物質およびその他の検査物質）を印刷した。μPADおよびその作製の模式図を図3に示す。まず、15%（v/v）のエチレングリコールを含む1 mMのTbCl3のHEPES緩衝液（pH 7.4、50 mM）を、感知領域に8回印刷した。続いて、ブロッキング処理のため、μPADsを0.5wt%のポリビニルアルコールのHEPES緩衝液（pH 7.4、50 mM）に5分間浸漬し、37℃にて20分間乾燥させた。最後に、25 mMのNaHCO3のHEPES緩衝液（pH 7.4、50 mM）を、サンプリング領域に12回印刷した。テルビウムおよびNaHCO3の最適な印刷回数は実験的に検討され、上述の回数が最適であると判断した（テルビウムは4-12回、NaHCO3は10-15回の範囲でそれぞれ検討を行った）。
【００２１】
溶液におけるラクトフェリンの蛍光検出。
本発明では、試料中ラクトフェリン濃度はラクトフェリン―テルビウム錯体の放つ緑色蛍光を用いて定量した。テルビウムと結合したラクトフェリンは、pHに依存した強度の蛍光（λmax = 548 nm）を放つことが報告されている[22]。一定量のラクトフェリンおよびテルビウムを含む溶液の蛍光発光強度は、pH6から7にかけて鋭い増加を示し、およそpH7.2において最大に達する。したがって、一定のpHにおいてラクトフェリン―テルビウム錯体の発する蛍光発光強度を観測することにより試料中ラクトフェリンを定量することができる。
【００２２】
紙装置によるラクトフェリン検出およびデータの定量的解析
ヒトラクトフェリン濃度を定量的に調べるために、2.5 μLの試料をサンプリング領域に適用した。この発明全体を通し、検量操作や検出を行う際、紙装置に適用する試料体積およびpHは、それぞれ2.5 μL、pH7.4が最適であった。完全に乾燥させたのち、μPADを暗室内で二つのUVハンドランプ（λex = 254 nm）の間に置き、520 nmのロングパスフィルターを装着したデジタルカメラを用いて、発せられる緑色蛍光を撮影した。フィルターは、紙基材に反射されたUVハンドランプの励起光を遮断するために用いた。撮影された画像は、解像度240 dpiのJPEG形式にて保存し、感知領域における緑色強度の数値（RGB表色系において0-255）を、画像解析ソフトImage J（国立衛生研究所）により定量した。蛍光発光信号を撮影するための実験装置は図4に示した。
【００２３】
ヒト涙液の分析。
ヒト涙液試料は、使い捨てのポリエチレンピペット（アズワン、大阪、日本）を使い当研究室の5人の健常な提供者から採取し、加圧滅菌器で処理したProtein LoBindチューブ（エッペンドルフ）内で4℃にて保存し、3日以内に使用した。開発したμPADsによるラクトフェリン濃度分析のため、希釈されていない涙液をサンプリング領域にマイクロピペットで適用した。比較のため、同一の涙液試料に含まれるラクトフェリン濃度をELISAキットによっても定量した。この際、ヒト涙液試料は使用前に、加圧滅菌器で処理したProtein LoBindチューブ内で、ELISAキット付属のサンプル希釈用緩衝液を使用して105倍に希釈した。これは、ELISAキットの応答濃度領域が5-50 ng/mLであるのに対し、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンの平均的な濃度はおよそ2 mg/mLであることに因る。
【００２４】
紙装置によるトランスフェリン検出
ヒトトランスフェリン濃度を定量的に調べるために、2.5 μLの試料をサンプリング領域に適用した。完全に乾燥させたのち、μPADを暗室内で二つのUVハンドランプ（λex = 254 nm）の間に置き、520 nmのロングパスフィルターを装着したデジタルカメラを用いて、放たれる緑色蛍光を撮影した。フィルターは、紙基材に反射されたUVハンドランプの励起光を遮断するために用いた。撮影された画像は、解像度240 dpiのJPEG形式にて保存し、感知領域における緑色強度の数値（RGB表色系において0-255）を、画像解析ソフトImage J（国立衛生研究所）により定量した。蛍光発光信号を撮影するための実験装置は図4に示した。
【００２５】
■結果と検討
ラクトフェリン濃度に対する蛍光発光強度の依存性
ラクトフェリン―テルビウム錯体の放つ蛍光発光強度のpH依存性は報告されているが[22]、ラクトフェリン濃度に対する依存性はこれまでに検討されていない。したがってまず概念実証のため、濃度0から1 mg/mLのラクトフェリンと2.5 mMのNaHCO3を含む、100 μMのTbCl3溶液の放つ蛍光を調べた。発明全体を通し、試薬をHEPES緩衝液（50 mM）に溶解することでpHを7.4に固定し、ヒト涙液の生理的pHに合わせた。ラクトフェリン―テルビウム錯体の蛍光発光スペクトル（図5）から、強度は試料のラクトフェリン濃度に依存することが明らかになった。図5に示されるテルビウム特有の発光スペクトルは549 nmで極大となるため、観測される蛍光発光は緑色を示す。
【００２６】
μPADにおける蛍光応答を確認するため、HEPES緩衝液に溶解した濃度0.1から4 mg/mLのヒトラクトフェリン試料をサンプリング領域に適用した。図6aに検量線を示す。ラクトフェリン濃度と、デジタルカメラで撮影した感知領域における緑色強度の間には良い相関が見られた（図6b）。蛍光発光強度の増加は、目視によっても簡単に確認することができた。注意すべき点は、μPADsは使い捨ての分析装置であることである。このため、検量線の全てのデータ点は別々のμPADを用いて測定された結果である。3つの測定結果における小さなエラーバー（標準偏差1s）は、インクジェット印刷により作製された装置が再現性に優れることを示す。
【００２７】
サンプリング領域のHCO3-アニオンは、感知領域で見られるラクトフェリン―テルビウム錯体の放つ蛍光発光強度の増強に重要であることがわかった（データは示されていない）。この結論は、テルビウムがラクトフェリンに結合する際、カルボン酸塩アニオンが重要な役割を果たすという報告[23]と一致する。シグモイド関数のフィッティングカーブにおいて、ブランクの標準偏差の3倍（3σ）として算出された検出限界（limit of detection, LOD）である0.30 mg/mLは、健常者の涙液に含まれるラクトフェリン濃度の下限値（0.63 mg/mL）[24]を下回った。したがって、開発したμPADを用いれば、ヒト涙液ラクトフェリン濃度の異常を検出することが可能である。
【００２８】
μPADsを実試料に応用する前に、想定されうるヒト涙液の主成分による妨害について調べた（表1）。μPADsの選択性を評価するため、各涙液成分が表1に示した濃度で、単一で存在する場合と、ラクトフェリンに混合された場合の蛍光応答を調べた。それぞれの結果を図7a、7bに示す。縦軸は感知領域の緑色強度からブランク（ラクトフェリンを含まないHEPES緩衝液）の信号を差し引いた結果を表す。図7aから、ラクトフェリン以外の涙液主成分は有意な蛍光応答を示さないことがわかった。さらに、他の成分が共存しても、感知領域に存在するTb3+に対するラクトフェリンの結合が阻害されないことも示された（図7b）。
【００２９】
最後に、実試料の分析と開発した方法の正確性の評価を行った。開発したμPADsを用いてヒト涙液試料に含まれるラクトフェリン濃度を定量し、ELISA法による結果と比較した。μPADsによる分析では、希釈されていない涙液をサンプリング領域に適用し、ELISA法による分析では、涙液をELISAキット付属のサンプル希釈用緩衝液で105倍に希釈した。表2に示す結果から、μPADsで全てのサンプルを6%以内の誤差率で正確に分析できたことが示された。μPADsによる分析結果の中で、試料5に見られる比較的大きな標準偏差は、ラクトフェリン濃度がμPADsの応答濃度領域の上限付近であることに起因する。試料5をHEPES緩衝液で2倍に希釈した場合の分析結果は1.74 ± 0.11 mg/mLとなり、標準偏差が大きく減少することが確認された。
【００３０】
マイクロ流体構造がパターニングされた同一の紙装置を、ヒトトランスフェリンの分析に適用した。検量線を図8に示す。
【００３１】
結論
紙基材を使用することで、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンを定量するための、抗体を必要とせず、安価で、使用が簡便、迅速な検出装置を初めて開発することに成功した。信号を得るまでに数時間におよぶ多くのピペッティングや洗浄、インキュベーションなどの操作を要するELISA法と異なり、μPADsによる分析で必要となる操作はマイクロピペッターによる試料の適用のみである。試料を適用してから、目視でも確認可能な蛍光信号を撮影するまでにかかる時間は15分以内である。簡便な操作手順や低い材料コストから、開発されたμPADsは、知識や技術のない人材でも涙液ラクトフェリンを定量することができる有用な装置として期待される。
【００３２】
【表１】
2015052584.tif 000003
【００３３】
【表２】
2015052584.tif 000004
【００３４】
■参考文献
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[21] Maejima, K.; Suzuki, K.; Citterio, D., PCT patent application WO 2012/160857
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【図１】
2015052584.tif 000005
【図２】
2015052584.tif 000006
【図３】
2015052584.tif 000007
【図４】
2015052584.tif 000008
【図５】
2015052584.tif 000009
【図６】
2015052584.tif 000010
【図７】
2015052584.tif 000011
【図８】
2015052584.tif 000012
【外国語明細書】
【発明の名称】      Detection of Transferrin-Family Proteins Using Paper Devices
【技術分野】
【０００１】
This invention relates to devices and methods for the detection of transferrin-family proteins. More specifically, the present invention is related to devices for the detection of transferrin-family proteins in which recognition compounds and optionally other assay compounds are deposited or immobilized onto a paper substrate.
【背景技術】
【０００２】
Biological fluids contain much information helpful for medical diagnoses. For instance, blood is one of the most common specimen and contains various biomarkers such as glucose, cholesterol, enzymes and electrolytes. Meanwhile, human tear fluid is often overlooked but reflects various functional and histological eye disorders related to ocular diseases [1] and can be collected easily. Tear film consists of three layers: the outer lipid layer, the aqueous layer with water-soluble proteins, and the inner mucin layer. Thus human tear fluid is a mixture of various components such as water, proteins, enzymes, electrolytes and lipids. Among those, proteomics of tear fluid has become an active area of research recently [2, 3]. Proteins in tears have a key role in the preservation of ocular surface and the adjustment of tear components, and therefore, disorders of tear protein secretion can be a cause of several diseases such as dry eye [4], keratoconus [5], and Sjogren's syndrome [6]. Proteins found in tear fluid so far amount to more than 500 [7]. It has been reported that some of them show increased or lowered concentration levels in the case of certain diseases [8]. Especially, the down regulation of lactoferrin (Lf), a type of glycoprotein existing in human tear fluid at high concentrations, is deeply linked to the corneal epithelium [9] and the determination of lactoferrin concentrations in tear fluid contributes to the diagnosis of Sjogren's syndrome, among other physiological disorders. Sjogren's syndrome is a serious systemic chronic autoimmune disorder that causes symptoms like dry eye and dry mouth. Current first diagnosis of Sjogren's syndrome mainly relies on subjective symptoms, objective opinions, vital staining tests using fluorescein or rose bengal, and the measurement of tear volume with the Schirmer test strip. In the case of suspicious findings, a more invasive labial or lacrimal gland biopsy and contrast study of the salivary gland are necessary. Although the Schirmer test is used since long time and widely because of its noninvasive nature, simplicity and rapidity, it does not sufficiently reflect the clinical situation, as it is often regarded as a "rough" method [8]. Therefore, the monitoring of lactoferrin concentration levels in tear fluid is a prospective alternative approach for the more reliable diagnosis of ocular disorders.
【０００３】
The conventional method of lactoferrin determination relies on ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) [10], radial immunodiffusion assay (Lactoplate) [11], colorimetric solid phase immunoassay (Lactocard) [12], iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation) technology combined with 2D-nanoLC-nanoESI-MS/MS [4], and SELDI-TOF-MS [13]. All of these existing methods have certain disadvantages, such as the requirement of large sample volumes, time-consuming procedures, high equipment costs and running costs, and the necessity to perform multiple procedure steps. To overcome some of these drawbacks, Karns and Herr have recently developed a homogeneous electrophoretic immunoassay on a microfluidic glass chip, which enabled quantification of lactofferin from less than 1 μL of human tear fluid within 5 s [2].However, the high device fabrication costs owing to the use of monoclonal anti-Lf antibody for Lf capture, and the requirement for sophisticated high-tech instruments for signal detection (e.g. fluorescence microscope, cooled CCD camera) remain serious issues.
【０００４】
A solution to the problems discussed above is to use a paper device. Paper devices, and in particular microfluidic paper-based analytical devices (μPADs) have gained significant attention as attractive analytical platforms since their introduction by the Whitesides group in 2007 [14]. μPADs have several advantages as analytical devices: (i)use of low-cost materials, (ii) light weight, (iii) safely disposable by incineration, (iv)only low sample volume required, (v) and no requirement of external power, among others. Owing to the intrinsic properties of paper, μPADs can be made of cheap raw materials and are lightweight. Those advantages result in good accessibility and transportation of μPADs. Paper also allows easy and safe disposability. Compared to plastic microplates or microchips contaminated with biological substances such as body fluids in a diagnostic test, the incineration of used μPADs enables a sanitary way of disposal, which eliminates hazardous substances (e.g. pathogen, allergens). The fact that only low sample volumes are required is a further advantage of μPADs. μPADs enable the analysis of samples, which are only available in relatively limited amounts, such as for example tear fluid, saliva, urine from newborn infants, or a drop of blood from a finger prick [15]. Finally, the sample flow is driven by capillary forces due to the microporous structure of the cellulose fiber network of paper, and therefore, eliminates the need of pumps. In summary, μPADs are easy to handle and user-friendly analytical tools particularly suitable for samples (e.g. body fluids) available at only limited volumes, and various applications (e.g. blood test, food safety evaluation, and airborne metal analysis) have been reported so far [16-18]. In 2008, an inkjet-printed μPAD for biochemical sensing has been developed for the first time by our group (Patent Document 1) [19] (Non-patent Document 1). So far, inkjet printing is the only standard technology capable of fabricating entire μPADs [20] (Non-patent Document 2).
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】  WO 2012/160857 A1
【０００６】
【非特許文献１】  Abe, K.; Suzuki, K.; Citterio, D., Anal. Chem., 2008, 80, 6928-6934
【非特許文献２】  Maejima, K.; Tomikawa, S.; Suzuki, K.; Citterio, D., RSC Adv., 2013, 3,9258-9263
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
An object of this invention is to provide a device and a method for detecting transferrin-family proteins, by which the transferrin-family proteins can be detected easily, simply and at a low-cost, and yet with a high sensitivity and precision.
【課題を解決するための手段】
【０００８】
This invention provides the following:
1.     A device for detecting a transferrin-family protein, said device comprising:
a paper substrate;
a sensing area defined by a hydrophobic barrier formed on said paper substrate; and
at least one type of lanthanide ion immobilized on said sensing area.
2.     The device of Item 1, further comprising a sampling area and a microfluidic channel which are defined by said hydrophobic barrier, said sensing area and said sampling area being connected through said microfluidic channel.
3.     The device of Item 1 or 2, wherein said hydrophobic barrier is formed by inkjet printing of a UV-curable hydrophobic ink.
4.     The device of any one of Items 1 to 3, wherein said lanthanide ion is at least one selected from the group consisting of La(III), Eu(III), Tb(III) and Yb(III).
5.     The device of Item 4, wherein said lanthanide ion is Tb(III).
6.     The device of any one of Items 1 to 5, further comprising at least one alkaline earth metal bicarbonate salt immobilized on said paper substrate.
7.     The device of Item 6, wherein said alkaline earth metal bicarbonate salt is at least one selected from the group consisting of LiHCO3, NaHCO3 and KHCO3.
8.     A method of detecting a transferrin-family protein, said method comprising contacting a sample containing said transferrin-family protein with the sensing area of said device of any one of Items 1 to 7; and detecting the signal generated in said sensing area.
9.     The method of Item 8, wherein said device further comprising a sampling area and a microfluidic channel which are defined by said hydrophobic barrier, said sensing area and said sampling area being connected through said microfluidic channel, and wherein said sample is applied to said sampling area.
10.     The method of Item 8 or 9, wherein said signal is fluorescence.
11.     The method of any one of Items 8 to 10, wherein said transferrin-family protein is selected from the group consisting of serum transferrin, ovotransferrin, lactoferrin and melanotransferrin.
12.     The method of Item 11, wherein said transferrin-family protein is lactoferrin.
13.     The method of any one of Items 8 to 12, wherein said sample is a body fluid.
14.     The method of Item 13, wherein said body fluid is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, saliva, colostrum and tear fluid.
15.     The method of Item 8 wherein said device of Item 6 is used and wherein said at least one alkaline earth metal bicarbonate salt contacts said at least one type of lanthanide ion after application of said sample.
【発明の効果】
【０００９】
By this invention, the transferrin-family proteins can be detected easily,  simply and at a low-cost, and yet with a high sensitivity and precision.
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】
a) Schematic outline of a microfluidically patterned paper substrate; b) Schematic outline of a microfluidic paper-based analytical device (μPAD) with at least one sampling area and at least one sensing area, the two of them being connected to each other by a microfluidic flow channel. The black lines indicate the hydrophobic barriers and are shown for illustrative purposes only.
【図２】
Schematic illustration of the fabrication and sample application of a paper device by inkjet printing.
【図３】
a) Outline and dimensions of a μPAD for the detection of transferrin-family proteins; b) Schematic illustration of specific experimental conditions for fabricating a μPAD for the detection of transferrin-family proteins; c) photograph showing the microfluidic structure of the μPAD (the hydrophilic microfluidic pattern has been made visible by the application of red food colorant).
【図４】
Setup used for fluorescence signal capture from μPADs: a) photograph of the system; b) schematic view.
【図５】
Fluorescence emission spectra of 100 μM TbCl3 in the presence of human lactoferrin (50 mM HEPES buffer, 2.5 mM NaHCO3, pH 7.4); exc. 290 nm.
【図６】
a) μPAD calibration curve for human lactoferrin; b) photographs of sensing areas after application of lactoferrin taken under UV light irradiation (λ = 254 nm). The "Green" value represents the "G" color value as measured on the RGB-scale.
【図７】
Selectivity of μPADs: a) response to each single major constituent of tear fluid; b) response to lactoferrin in the presence of other constituents (for all constituents other than lactoferrin, the highest concentrations (upper limits of ranges)shown in Table 1 were used for selectivity evaluation; in the case of lactoferrin, a mean concentration of 1.84 mg/mL was used).
【図８】
μPAD calibration curve for human transferrin. The "G" value represents the color value as measured on the RGB-scale.
【発明を実施するための形態】
【００１１】
This invention relates to devices and methods for the detection of transferrin-family proteins. More specifically, the present invention is related to devices for the detection of transferrin-family proteins in which recognition compounds and optionally other assay compounds are deposited or immobilized onto a paper substrate. In a preferred embodiment of the invention, the recognition compounds and optionally other assay compounds are deposited on the paper substrate by inkjet printing. Recognition compounds particularly relevant to the present invention are lanthanide ions, generally abbreviated as Ln-ions in this text. Preferred lanthanide ions are selected from the list comprising La(III), Eu(III), Tb(III), and Yb(III), with Tb(III) being the most preferred lanthanide ion. It is noted here that the notations Ln(III) and Ln3+are understood to be identical. These ions may be employed individually, or two or more of them may be used in combination.  For the deposition of lanthanide ions onto the paper substrate, the form of their trivalent salts is most suitable, with halogenide salts LnX3being preferred, where X represents a halogen selected from the list of fluorine, chlorine, bromine, or iodine. The most preferred halogenide salt is terbium trichloride (TbCl3). For the deposition of the lanthanide ion by inkjet printing, the corresponding halogenide salt LnX3ispreferably used as an aqueous solution with or without optional additives such acethylene glycol, or pH-buffer components. Preferred is a pH-buffered aqueous solution of the halogenide salt LnX3at a concentration of, preferably, from 0.5 mmol/L to 10 mmol/L, with 10-20% (v/v) of ethylene glycol as additive. Most preferred is a pH-buffered solution of 1 mmol/L TbCl3with 15% (v/v) of ethylene glycol. Optional other assay compounds particularly relevant for the present invention are alkaline earth metal bicarbonate salts, comprising LiHCO3, NaHCO3, and KHCO3. The most preferred of said bicarbonate salts is NaHCO3. Alkaline earth metal bicarbonate salts serve the function of promoting the formation of complexes between the lanthanide ion and the transferrin-family protein, for example the complex between Tb(III) and lactoferrin.  These alkaline earth metal bicarbonates may be used individually, or two or more of them may be used in combination.  When the alkaline earth metal bicarbonate is immobilized, the alkaline earth metal bicarbonate may be immobilized together with the lanthanide ion, or immobilized on a site different from the site on which said at least one lanthanide ion is immobilized such that said alkaline earth metal bicarbonate salt contacts said at least one lanthanide ion during the detection process.  Thus, for example, the alkaline earth metal bicarbonate may be immobilized on the sampling area and/or the microfluidic channel hereinbelow described.
【００１２】
The present invention targets the detection (this includes the quantification) of transferrin-family proteins. Proteins of the transferrin-family comprise molecules known to bind iron, including serum transferrin (also simply called transferrin), ovotransferrin, lactoferrin (also known as lactotransferrin), and melanotransferrin(MTF). Most transferrin-family members contain two lobes (N and C) of around 340amino acids. Of particular interest for the present invention are transferrin and lactoferrin, with lactoferrin being the most important target compound for the present invention.
【００１３】
The transferrin-family proteins can be detected with paper devices applied to various biological fluids, comprising whole blood, plasma, serum, urine, saliva, colostrum and tear fluid. The paper devices of the present invention are particularly useful for the detection of transferrin-family proteins in tear fluid, and more particularly for the detection of lactoferrin in tear fluid. A form of paper devices of particular interest for the present invention are microfluidically patterned paper devices, so-called microfluidic paper-based analytical devices (abbreviated as μPADs), which have already been introduced further above. In general, a microfluidic pattern is obtained by the formation of hydrophobic barriers reaching throughout the thickness of the paper substrate. These barriers form the outline of the microfluidic pattern. The hydrophobic barriers are impermeable to aqueous liquids. The enclosed hydrophilic areas of the paper substrate provide the function of sampling area, sensing area and microfluidic channel, among others. One method to obtain a microfluidically patterned paper device is the printing of a UV-curable hydrophobic ink with an inkjet printer for example according to a method similar to the one previously reported by our group [20, 21](Patent Document 1), which references are explicitly included herein. A typical μPAD (Fig. 1) comprises at least one sampling area and at least one sensing area, the two of them being connected to each other by a microfluidic flow channel. The width of the microfluidic flow channel is typically between 0.1 and 2 mm, preferably between 0.5 and 1.5 mm, and most preferred 1 mm. However, in another embodiment of the present invention, the sampling area and the sensing area can be identical. In the latter type of paper device, no microfluidic flow channel is required. The places of sample application (sampling area) and of signal detection (sensing area) are identical in this case. A preferred layout and dimension for a μPAD consists of two square areas for sensing and sampling connected by a straight microfluidic flow channel as shown in Figure 1.
【００１４】
The application of a small amount of a sample of a biological fluid (commonly between 0.5 and 50 μL, preferably between 1 and 10 μL, more preferred between 1 and 5μL, and most preferred between 2 and 4 μL) containing a transferrin-family protein, preferably lactoferrin or transferrin and more preferably lactoferrin to the sampling area, gives rise to a physically measurable signal in the sensing area. In the case of a μPAD, where the sampling area and the sensing area are connected to each other by a microfluidic flow channel, the sample applied to the sampling area is flowing from the sampling area to the sensing area. This flow is driven by capillary forces, due to the microporous nature of paper. Physically measurable signals comprise color changes(changes in the absorbance or reflection of the paper device surface) and changes in the fluorescence emission intensity.
【００１５】
In one embodiment, this invention relates to the fluorescence emission intensity based detection of a transferrin-family protein (e.g. lactoferrin, transferrin, etc.) in a body fluid (e.g. blood, serum, plasma, urine, saliva, tear fluid, etc.) with a paper device, wherein the recognition compounds or other assay compounds are deposited on the paper substrate by inkjet printing. A general method of fabricating such a device is shown in Figure 2. In a preferred embodiment, this invention relates to the detection of lactoferrin in human tear fluid with an inkjet-printed paper device based on fluorescence emission intensity detection. In the most preferred embodiment, this invention relates to the detection of lactoferrin in human tear fluid with an inkjet-printed microfluidically patterned paper device (μPAD) based on fluorescence emission intensity detection. In this case, inkjet printing is applied for both the patterning of the microfluidic structure and the deposition of sensing reagents. A preferred physically measurable signal on the paper device is the fluorescence emission intensity. This fluorescence emission originates from the complex formed between the recognition compound (e.g. lanthanide ion such as Tb3+) and the transferrin-family protein present in the body fluid. In a preferred embodiment, the fluorescence emission originates from a complex formed between Tb(III) cations deposited on the paper device as the recognition compound and lactoferrin as the transferrin-family protein present in tear fluid.
【００１６】
The devices of the present invention are made from paper. A preferred paper substrate for the present invention is filter paper made of cellulose fibers. It has been reported that some proteins (including members of the transferrin-family such as lactoferrin and transferrin) emit fluorescence in the presence of lanthanide ions (such as lanthanum, terbium, europium, ytterbium).Lactoferrin-terbium complexes are known to show pH-dependent fluorescence, and emit stable green fluorescence at physiological pH values (7.4) [22]. A solution of a terbium salt (e.g. TbCl3) inkjet printed onto the sensing area of a μPAD emits fluorescence with an intensity dependent on the concentration of lactoferrin in the samples applied on the sampling area of a μPAD. By observing the intensity of the fluorescence emitted from the μPAD, for example in the form of a digital color value (e.g. R, G, or B value), upon excitation of the μPAD with an external light source, the concentration of lactoferrin in sample can be quantified. This method allows for analyzing lactoferrin based oncolorimetric assays (simple) without using antibodies (low-cost) in 20 min (rapid).Although the achieved detection limits are not as low as in the case of conventional Lf quantification methods, they are sufficiently low for the detection of abnormal human lactoferrin concentration levels in tear fluid, and in human tear fluid in particular.
【実施例】
【００１７】
■Description of Specific Experiments
Materials. 
Terbium chloride hexahydrate (TbCl3・6H2O) and human lactoferrin were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 1,10-decanediol diacrylate was purchased from TCI (Tokyo, Japan). N-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid (HEPES) was purchased from Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan). Sodium hydroxide and poly(vinyl alcohol) were purchased from Kanto Chemical (Tokyo, Japan).The human lactoferrin ELISA kit was purchased from EMD Chemicals, Inc. (San Diego, USA). Human serum transferrin and all other chemical reagents were purchased from Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan). All solutions were prepared in 18MΩ Milli-Q water.
【００１８】
Fluorescence spectra measured in solution were obtained with a spectrophotometer(SPEX Fluorolog-NIR, HORIBA). Printing of the microchannel was performed on an unmodified EPSON PX-105 inkjet printer (Epson, Suwa, Japan). All reagents(recognition compounds and other assay compounds) for lactoferrin detection were deposited with a piezoelectric Dimatix DMP 2831 (Dimatix-Fujifilm Inc., Santa Clara, USA) material printer with a 10 pL cartridge (DMC-11610). For capturing fluorescence emission signals from the paper devices and μPADs in particular, UV hand lamps(Funakoshi, Tokyo, Japan), a DMC-FZ50 digital camera (Panasonic, Osaka, Japan)with a 520 nm long pass filter (Sigma Koki Co., Ltd, Tokyo, Japan) were used.
【００１９】
Fluorescence Emission Measurements in Solution. 
Fluorescence emission spectra were collected from 0 to 1 mg/ml lactoferrin solutions in the presence of 100 μMTbCl3(recognition compound) and 2.5 mM NaHCO3(other assay compound) in HEPES buffered solutions (pH 7.4, 50 mM). Sodium bicarbonate (NaHCO3) promoting the formation of lactoferrin-terbium complexes can be substituted by other bicarbonate salts, such as potassium bicarbonate (KHCO3). The sample solution was excited by using a xenon lamp at 290 nm and the emission spectra were recorded from 440 nm to720 nm in the presence of a 420 nm long pass filter (Sigma Koki Co., Ltd, Tokyo, Japan)for the excitation light cutoff. The excitation and emission slit widths were fixed at 4.5nm and the signal was collected from an angle of 90 degrees.
【００２０】
Paper Device Fabrication. 
Microfluidic patterns for μPADs were printed with an inkjet printer and a UV-curable ink according to a method similar to the one previously reported by our group [20, 21]. A circular No. 5C filter paper attached onto roundly cut A4 copy paper was fed into the EPSON inkjet printer filled with the UV-curable ink. On the topside of the paper, a microfluidic pattern drawn with PowerPoint (Microsoft) was printed. To stop the UV curable ink from permeating too far into the paper, the filter paper was placed on a 10℃ cooling plate after printing, and exposed to the UV light source during 15 min for polymerization. On the backside of the paper, the UV-curable ink was deposited in a way covering the entire area patterned on the topside, followed by cooling and exposure 10 min to the UV source. Next, the reagents for lactoferrin detection (recognition compounds and other assay compounds) were deposited onto the microfluidically patterned paper. A schematic illustration of the μPAD and its fabrication are shown in Figure 3. First 8 printing layers of 1 mM TbCl3in HEPES buffered (pH 7.4, 50 mM) solution containing 15% (v/v)of ethylene glycol were deposited into the sensing area. Next, the μPADs were soaked in0.5 wt% poly(vinyl alcohol) solution in HEPES buffered solution (pH 7.4, 50 mM) for blocking during 5 min, followed by drying for 20 min at 37℃. At last, 12 printing layers of 25 mM NaHCO3in HEPES buffered solution (pH 7.4, 50 mM) solution were deposited into the sampling area. The optimal number of printing layers for terbium and forNaHCO3was empirically investigated and the above mentioned number was found to be most suitable (tested number of printing layers: 4-12 layers for terbium, 11-15 layers for NaHCO3).
【００２１】
Fluorescence Detection of Lactoferrin in Solution. 
In this work, the lactoferrin concentration in samples is measured by using the green fluorescence emitted from lactoferrin-terbium complexes. It has been reported that terbium bound lactoferrin shows pH-dependent fluorescence (λmax = 548 nm) [22]. The fluorescence intensity of solutions of with a fixed lactoferrin and terbium concentration shows a sharp increase between pH 6 and 7, and reaches a maximum around pH 7.2. Therefore, observing the intensity of the green fluorescence from lactoferrin-terbium complexes at constant pH allows the quantification of lactoferrin in samples.
【００２２】
Detection of Lactoferrin with a Paper Device and Quantitative Data Processing. 
To obtain quantitative information about human lactoferrin concentration levels, 2.5 μL of sample was pipetted onto the sampling area. Throughout this work, the optimum sample volume applied to the paper device and the optimum pH of all solutions used for calibrating and sensing were 2.5 μL and pH 7.4, respectively. After drying completely, the μPAD was placed between two UV hand lamps (λex = 254 nm) in a dark box, and the emitted green fluorescence intensity was imaged by using a digital camera equipped with a 520 nm long pass filter. The filter was used to cut off the excitation light reflected by the paper substrate. The captured images were stored in JPEG format at 240 dpi and the green intensity (on the 0-255 RGB color scale) at the sensing area was measured using the image processing software Image J (National Institutes of Health). The experimental setup used for fluorescence emission signal capture is shown in Figure 4.
【００２３】
Human Tear Fluid Analysis. 
Human tear samples were collected from 5healthy volunteers in our laboratory with disposable polyethylene pipettes (AS ONE, Osaka, Japan) and stored in autoclaved Protein LoBind tubes (Eppendorf) at 4℃ until use and no longer than 3 days. For analysis of the lactoferrin concentration by the developed μPADs, undiluted human tear fluid was deposited into the sampling area by using a micropipette. For comparison purposes, the lactoferrin concentrations of the same tear fluid samples were also measured by the ELISA kit. In this case, human tear fluid samples were diluted 105-fold with the sample diluting buffer provided in the kit in autoclaved Protein LoBind tubes before use. This is because the dynamic response range of the ELISA kit was 5-50 ng/ml while the average lactoferrin concentration inhuman tear fluid is around 2 mg/ml.
【００２４】
Detection of Transferrin with a Paper Device. 
To obtain quantitative information about human transferrin concentration levels, 2.5 μL of sample was pipetted onto the sampling area. After drying completely, the μPAD was placed between two UV hand lamps (λex = 254 nm) in a dark box, and the emitted green fluorescence intensity was imaged by using a digital camera equipped with a 520 nm long pass filter. The filter was used to cut off the excitation light reflected by the paper substrate. The captured images were stored in JPEG format at 240 dpi and the green intensity (on the0-255 RGB color scale) at the sensing area was measured using the image processing software Image J (National Institutes of Health). The experimental setup used for fluorescence emission signal capture is shown in Figure 4.
【００２５】
■RESULTS AND DISCUSSION
Dependence of Fluorescence Intensity on Lactoferrin Concentration.
The pH-dependence of fluorescence intensity emitted from Lf-terbium complexes has been reported [22], yet the dependence on Lf concentration has not been investigated, so far. Thus fluorescence emission of 100 μM TbCl3solutions in the presence of several concentrations of human Lf (0 to 1 mg/ml) and 2.5 mM NaHCO3was investigated as proof of concept experiment at first. The pH was fixed at 7.4 by dissolving reagents in HEPES buffered solutions (50 mM) throughout this work in order to coordinate with physiological pH of human tear fluid. Fluorescence emission spectra of Lf-Tb solutions(Figure 5) clearly demonstrate that the intensity depends on Lf concentration in sample. Characteristic shape of terbium emission spectra found in Figure 5 reaches maximum at 549 nm, so the observed fluorescence emission shows a green color.
【００２６】
To confirm the fluorescence response on μPADs, human lactoferrin samples at concentrations of 0.1 to 4 mg/ml in HEPES buffer have been applied onto the sampling area. Figure 6a shows a typical calibration curve. A good correlation was observed between the lactoferrin concentration and the green intensity in the sensing area recorded by means of a digital camera (Fig. 6b). The increase of the fluorescence intensity was also readily observable by the naked eye. It should be noted that the μPADs are single-use analytical devices. For this reason, every data point in the calibration curve (Fig. 6a) has been measured with a separate μPAD. The small error bars (standard deviation 1 s) observed for three replicate measurements are an indication for the excellent manufacturing reproducibility of the devices using the inkjet printing method.
【００２７】
The presence of the HCO3-anion in the sampling area has been found to have a significant enhancing effect on the fluorescence emission intensity of thelactoferrin-Tb3+complex observed in the sensing area (data not shown). This finding is consistent with a report on the important role played by the carboxylate anion in the binding of Tb3+to lactoferrin [23]. The limit of detection (LOD), calculated as 0.30 mg/ml based on a sigmoidal curve fit and three times the standard deviation (3σ) of the intensity of a blank sample, is below the lower limit of lactoferrin concentrations found in tear fluid of healthy humans (0.63 mg/ml) [24]. Therefore, the developed μPAD allows for the detection of lactoferrin concentration disorders in human tear fluid.
【００２８】
Before the application of μPADs to real samples, the possible interference of other primary constituents of human tear fluid (Table 1) was investigated. To evaluate the selectivity of the μPADs, the fluorescence response was recorded in the presence of single constituents and in mixtures of lactoferrin with a further primary constituent at concentrations as shown in Table 1. The results are shown in Figures 7a and 7b, respectively. The vertical axis shows the green intensity recorded in the sensing area after subtraction of the blank (HEPES buffered lactoferrin-free solution) signal. Figure7a indicates that none of the major tear constituents except for lactoferrin induces a significant fluorescence response. Furthermore, it has been confirmed that the presence of other constituents does not block the binding of lactoferrrin to Tb3+in the sensing area (Fig. 7b).
【００２９】
Finally, an analysis of real samples and evaluation of the method accuracy was performed. The developed μPADs were used to determine the lactoferrin concentrations in human tear samples and the results were compared to those obtained by ELISA. In the case of μPADs, undiluted tears were deposited into the sampling area, while for ELISA measurements, tears were diluted 105-fold with the sample diluting buffer provided in the ELISA kit. As the results in Table 2 demonstrate, all samples were accurately analyzed with μPADs within 6 % error compared to the ELISA method. The relatively large standard deviation observed in the case of sample 5 analyzed by μPADs is due to its concentration being at the upper limit of the dynamic response range of the μPAD. A second analysis of the sample after two-fold dilution with HEPES buffer resulted in a value of 1.74 ± 0.11 mg/ml, which shows a significantly lower standard deviation.
【００３０】
An identical microfluidically patterned paper device was applied to the analysis of human transferrin. The corresponding calibration curve is shown in Figure 8.
【００３１】
Conclusion
Low-cost, user-friendly, and rapid sensing devices for tear fluid lactoferrin measurements without the need to use antibodies were successfully fabricated by using paper substrates for the first time. In contrast to the ELISA assay requiring several hours of multiple pipetting, washing and incubation steps before the actual signal acquisition, the only procedure required in the μPAD is the sample application by a micropipette. The time between sample application and photographic recording of the visible fluorescence signal is below 15 min. The simple operation procedure and the low material costs of the μPADs make them promising devices for quantification of tear fluid lactoferrin, usable by non-trained personnel.
【００３２】
【表１】
Table 1: Concentration ranges of primary constituents of human tear fluid
2015052584.tif 000013
【００３３】
【表２】
2015052584.tif 000014
【００３４】
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[24] Flanagan, J. L.; Willcox, M. D. P., Biochimie, 2009, 91, 35-43
【請求項１】
A device for detecting a transferrin-family protein, said device comprising:
a paper substrate;
a sensing area defined by a hydrophobic barrier formed on said paper substrate; and
at least one type of lanthanide ion immobilized on said sensing area.
【請求項２】
The device of claim 1, further comprising a sampling area and a microfluidic channel which are defined by said hydrophobic barrier, said sensing area and said sampling area being connected through said microfluidic channel.
【請求項３】
The device of claim 1 or 2, wherein said hydrophobic barrier is formed by inkjet printing of a UV-curable hydrophobic ink.
【請求項４】
The device of any one of claims 1 to 3, wherein said lanthanide ion is at least one selected from the group consisting of La(III), Eu(III), Tb(III) and Yb(III).
【請求項５】
The device of claim 4, wherein said lanthanide ion is Tb(III).
【請求項６】
The device of any one of claims 1 to 5, further comprising at least one alkaline earth metal bicarbonate salt immobilized on said paper substrate.
【請求項７】
The device of claim 6, wherein said alkaline earth metal bicarbonate salt is at least one selected from the group consisting of LiHCO3, NaHCO3 and KHCO3.
【請求項８】
A method of detecting a transferrin-family protein, said method comprising contacting a sample containing said transferrin-family proteinwith the sensing area of said device of any one of claims 1 to 7; and detecting the signal generated in said sensing area.
【請求項９】
The method of claim 8, wherein said device further comprising a sampling area and a microfluidic channel which are defined by said hydrophobic barrier, said sensing area and said sampling area being connected through said microfluidic channel, and wherein said sample is applied to said sampling area.
【請求項１０】
The method of claim 8 or 9, wherein said signal is fluorescence.
【請求項１１】
The method of any one of claims 8 to 10, wherein said transferrin-family protein is selected from the group consisting of serum transferrin,ovotransferrin, lactoferrin and melanotransferrin.
【請求項１２】
The method of claim 11, wherein said transferrin-family protein islactoferrin.
【請求項１３】
The method of any one of claims 8 to 12, wherein said sample is a body fluid.
【請求項１４】
The method of claim 13, wherein said body fluid is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, saliva,colostrum and tear fluid.
【請求項１５】
The method of claim 8 wherein said device of claim 6 is used and wherein said at least one alkaline earth metal bicarbonate salt contacts said at least one type of lanthanide ionafter application of said sample.
【要約】
【課題】To provide a device and a method for detecting transferrin-family proteins, by which the transferrin-family proteins can be detected easily, simply and at a low-cost, and yet with a high sensitivity and precision.
【解決手段】The device for detecting a transferrin-family protein comprises: a paper substrate; a sensing area defined by a hydrophobic barrier formed on the paper substrate; and at least one type of lanthanide ion immobilized on the sensing area. The method of detecting a transferrin-family protein comprises a sample containing the transferrin-family protein with the sensing area of the device; and detecting the signal generated in the sensing area.
【選択図】Fig. 1
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015052584.tif 000020
【図７】
2015052584.tif 000021
【図８】
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