(57)【要約】【課題】本発明は、交感神経遮断薬を使用して哺乳類動物がエンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）脳炎に感染した後カテコールアミンを大量に放出することを抑制する方法であって、さらに具体的に言うと、動物モデルにおいてＥＶ７１脳炎によって引き起こる心肺損傷を反転させることにある。【解決手段】本発明は、初期段階において、適量の交感神経遮断薬をエンテロウイルス７１型に模擬感染したラットに投与することで、ラット体内においてカテコールアミンが急速且つ過剰に放出されることを緩和することから、通常ＥＶ７１によって引き起こる心不全及び肺水腫を防ぎ、且つラットの生存率を増加させている。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
適量の交感神経遮断薬をエンテロウイルス７１型脳炎に模擬感染した哺乳類動物することを特徴とするヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項２】
交感神経遮断薬が、ヘキサメトニウムであることを特徴とする請求項１に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項３】
ヘキサメトニウムの投与量が、およそ１０〜３０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項２に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項４】
ヘキサメトニウムの投与量が、およそ２５ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項２に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項５】
ヘキサメトニウムの投与は、エンテロウイルス７１型の感染の初期段階に行うことを特徴とする請求項２に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項６】
ヘキサメトニウムの投与は、エンテロウイルス７１型の感染後０〜６時間以内に行うことを特徴とする請求項２に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項７】
哺乳類動物は、げっ歯目動物を包含することを特徴とする請求項１に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【請求項８】
哺乳類動物は、霊長目動物を包含することを特徴とする請求項１に記載のヘキサメトニウム等の交感神経遮断薬をエンテロウイルス重症患者に用いる治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、交感神経遮断薬を使用して哺乳類動物がエンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）脳炎に感染した後カテコールアミンを大量に放出することを抑制する方法であって、特にヘキサメトニウムを使用して動物モデルにおいてＥＶ７１に感染したことによって引き起こる心肺損傷を逆転させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘキサメトニウム（ｈｅｘａｍｅｔｈｏｎｉｕｍｓ）は、交感神経遮断薬であって、通常は、慢性高血圧や末梢神経系の異常等の治療に用いられている。また、ヘキサメトニウムは、例えば、特許文献１で動物飼料組成物内にヘキサメトニウムを成長促進剤として用いることを開示しているように、動物の成長促進剤としても使用されている。しかし、現在のところ、ヘキサメトニウムを哺乳類動物のエンテロウイルスの治療に用いることに関する研究報告はない。
【０００３】
また、エンテロウイルス７１型の感染において、心不全及び肺水腫を突発的に進展する脳幹脳炎は数時間以内に突然死を引き起こしてしまう。しかし、現在のところ、初期的な指標及び治療によって予期せぬ爆発的進行をモニタリング或いは防止することができない。
【０００４】
エンテロウイルス脳炎は、比較的好ましい予後を有しているが、エンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）を起因とするものは例外である。ＥＶ７１は、すでに多くの臨床症状を伴い、殆どの患者は、四〜六日以内に回復するものの、場合によっては、小児を主として、例えば、急性脳幹脳炎等の深刻な神経合併症を引き起こすことがある。脳幹脳炎、即ち、ｂｒａｉｎ  ｓｔｅｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓは、主要な神経合併症であって、且つすでに報告された死亡例の全てにおいて現れている。
【０００５】
致命的なＥＶ７１感染患者の核磁気共鳴画像のスペクトル（ＭＲＩｓ）では、孤束核（ＮＴＳ）エリア内の深刻な破壊的病変を表している。死亡した患者は、短期間で発熱し、非代償性の呼吸困難となり、且つ肺水腫が現れた後の数時間以内に突然死している。
【０００６】
ＥＶ７１感染の死後の研究では、細胞壊死を伴う髄質と橋に対する甚大な損傷が明らかになった。ＥＶ７１抗原に用いる免疫蛍光染色は、神経細胞において陽性を呈していたが、ＥＶ７１抗原が心肺組織における免疫蛍光染色は、陰性を呈していた。カテコールアミン心筋症の病変と符合し合う凝固性筋細胞溶解（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｖｅ  ｍｙｏｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）及び筋繊維症も心室サンプル内で発見され、且つ肺臓は深刻なうっ血性出血を呈していた。
【０００７】
致命的なＥＶ７１感染において、高血圧、高濃度な血漿カテコールアミン及び過剰な末梢血管の収縮によって引き起こる心不全及び神経原性肺水腫（ＮＰＥ）を包括する極端な交感神経嵐（ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  ｓｔｏｒｍ）を叙述した。
【０００８】
臨床上において、胸部Ｘ線は心拡大を現さずに、神経性心臓損傷患者に相似したものを現していた。致命的なＥＶ７１脳炎の神経性心臓損傷及びＮＰＥは、ＮＴＳエリアの破壊によって起こるものであると考えられている。
【０００９】
また、隣接する心筋細胞の間の正常な収縮機能を行う細胞、細胞間結合及び肺血管内における内皮細胞通信からすると、コネキシン４３（ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ４３）は最も重要なギャップ結合タンパク質である。心臓において、コネキシン４３で形成する通路は、虚血/再灌流障害に関与しており、これらの大部分の遮断は、虚血性心筋の拘縮を緩和させることができる。急性肺損傷において、コネキシン４３媒介のギャップ結合は、炎症信号を肺毛細血管床に散布している。劇症ＥＶ７１感染において、高交感神経嵐、心不全及びＮＰＥの脳幹脳炎が急速に発展することは、悪い予後の指標である。また、現在のＮＰＥの治療は、主に支持性に過ぎない。つまり、ＮＰＥを防ぐための初期的な指標、スクリーニングツール及び有効的な措置は、劇症ＥＶ７１感染において不足している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第３３９７９９０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的の一つは、交感神経遮断薬を使用して哺乳類動物がエンテロウイルス７１型脳炎に感染した後カテコールアミンを大量に放出することを抑制することにある。
【００１２】
本発明の目的の一つは、ヘキサメトニウムを使用して哺乳類動物がエンテロウイルス７１型脳炎に感染して引き起こる心肺損傷を治療することにある。
【００１３】
本発明の目的の一つは、ヘキサメトニウムを使用して動物モデルにおいてＥＶ７１脳炎によって引き起こる心肺損傷を反転させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
初期段階において、適量の交感神経遮断薬をエンテロウイルス７１型に模擬感染したラットに投与することで、ラット体内においてカテコールアミンが急速且つ過剰に放出されることを緩和することから、通常ＥＶ７１によって引き起こる心不全及び肺水腫を防ぎ、且つラットの生存率を増加させている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ヘキサメトニウム治療  ｖｓ．  プラセボの自然経過とカテコールアミンの変化とを示すグラフである。
【図１Ｂ】ヘキサメトニウム治療  ｖｓ．  プラセボの自然経過とカテコールアミンの変化とを示すグラフである。
【図１Ｃ】ヘキサメトニウム治療  ｖｓ．  プラセボの自然経過とカテコールアミンの変化とを示すグラフである。
【図１Ｄ】ヘキサメトニウム治療  ｖｓ．  プラセボの自然経過とカテコールアミンの変化とを示すグラフである。
【図１Ｅ】ヘキサメトニウム治療  ｖｓ．  プラセボの自然経過とカテコールアミンの変化とを示すグラフである。
【図２Ａ】ラットが６−ＯＨＤＡ病変を誘発した後及び薬を投与後の心臓の代表的な例を示す写真である。
【図２Ｂ】図２Ａのラットの心臓を乳頭筋上における横断面を示す断面写真である。
【図２Ｃ】ラットの心臓の短軸像及びＭモードを示す心エコー図である。
【図２Ｄ】ラットの心臓の短軸像及びＭモードを示す心エコー図である。
【図２Ｅ】ラットがヘキサメトニウム治療を受けた三時間後の、急速且つ過剰に増加した駆出率（ＥＦ）、弛緩時の心室中隔厚（ＩＶＳｄ）、弛緩時のＬＶ後壁厚（ＬＶＰＷｄ）を示すグラフである。
【図２Ｆ】ラットがヘキサメトニウム治療を受けた三時間後の、急速且つ過剰に増加した駆出率（ＥＦ）、弛緩時の心室中隔厚（ＩＶＳｄ）、弛緩時のＬＶ後壁厚（ＬＶＰＷｄ）を示すグラフである。
【図２Ｇ】ラットがヘキサメトニウム治療を受けた三時間後の、急速且つ過剰に増加した駆出率（ＥＦ）、弛緩時の心室中隔厚（ＩＶＳｄ）、弛緩時のＬＶ後壁厚（ＬＶＰＷｄ）を示すグラフである。
【図２Ｈ】ラットがヘキサメトニウム治療を受けた三時間後の、急速且つ過剰に増加した駆出率（ＥＦ）、弛緩時の心室中隔厚（ＩＶＳｄ）、弛緩時のＬＶ後壁厚（ＬＶＰＷｄ）を示すグラフである。
【図３Ａ】ラット心筋のヘマトキシリン・エオジン染色の代表的な例であって、心筋繊維が縦断面における組織学的変化を示す写真である。
【図３Ｂ】ラットが心臓トロポニンＴにおける免疫組織化学及び免疫蛍光分析を示す写真である。
【図３Ｃ】ラットのギャップ結合タンパク質コネキシン４３の定性分析を示す写真である。
【図３Ｄ】ラット心臓筋肉の断面上にあるコネキシン４３の免疫細胞化学的な検出を示す代表的な写真である。
【図３Ｅ】病変を誘発した後のラットのトロポニンＴ、脳性ナトリウム利尿ペプチド及びコネキシン４３の過剰発現が増加し、ヘキサメトニウム治療後の３〜６時間以内に低下したことを示すグラフである。
【図３Ｆ】病変を誘発した後のラットのトロポニンＴ、脳性ナトリウム利尿ペプチド及びコネキシン４３の過剰発現が増加し、ヘキサメトニウム治療後の３〜６時間以内に低下したことを示すグラフである。
【図３Ｇ】病変を誘発した後のラットのトロポニンＴ、脳性ナトリウム利尿ペプチド及びコネキシン４３の過剰発現が増加し、ヘキサメトニウム治療後の３〜６時間以内に低下したことを示すグラフである。
【図４Ａ】ラットの肺被検体の代表的な例を示す写真である。
【図４Ｂ】本発明に係るラットの肺の湿乾重量比を示すグラフである。
【図４Ｃ】本発明に係るラットのＮＴＳ病変後の肺体重量比を示すグラフである。
【図５Ａ】ラットが６−ＯＨＤＡ病変を誘発した後の肺の組織切片における組織学的変化を示す写真である。
【図５Ｂ】ラットが６−ＯＨＤＡ病変を誘発した後の肺の組織切片における組織学的変化を示す写真である。
【図５Ｃ】ラットが６−ＯＨＤＡ病変を誘発した後の肺の組織切片における組織学的変化を示す写真である。
【図５Ｄ】ラットが６−ＯＨＤＡ病変を誘発した後及び薬を投与後の浸潤細胞の増減を示すグラフである。
【図５Ｅ】ラットが６−ＯＨＤＡ病変を誘発した後及び薬を投与後のコネキシン４３の増減を示すグラフである。
【図６】致命的なエンテロウイルス７１型脳炎の推定機序を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
初期段階において、臨床上よく用いられる交感神経遮断薬のヘキサメトニウムを適量に用い、致命的なエンテロウイルス７１型に模擬感染したラットの脳幹病変モデルにおける致命的な心肺損傷を治療することで、ラットの致命的な心肺損傷を確実に逆転することができることを発見した。
【００１７】
心肺損害が誘発されたラットは、通常７時間以内に死亡するため、薬の投与時間は脳幹が病変してから１０分後とし、ヘキサメトニウムの投与は、およそ２５ｍｇ／ｋｇとしている。
【００１８】
本発明において、げっ歯目のスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを動物モデルとしているが、当該技術の分野における通常の知識を有する者であれば分かるとおり、例えば、ブタ等の偶蹄目やチンパンジー等の霊長目といったその他に適する哺乳類動物を動物モデルとすることもできるが、これに限定するものではない。
【００１９】
以下において、本発明に係る実験の基本的原理を説明する。
【００２０】
実験の基本的原理
如何なる理論に限定されたくないものの、本発明において、ＥＶ７１は、カテコールアミンの過剰発現誘発し、致命的な心筋病変及び出血性肺水腫を引き起こすということを仮設する。本発明の目標は、致命的なＥＶ７１脳炎に模擬感染したラットモデルを使用し、臨床応用上における薬物介入により心肺損傷に対する変化を理解することにある。これには、三つの具体的な目標があり、一つ目は、脳幹病変のラットを確立し、致命的なＥＶ７１脳炎によって引き起こる急性高血圧、心不全、肺水腫及び数時間以内に死亡するということを模擬すること、二つ目は、ＮＴＳ病変したラットの時系列的心肺機能の変化及び組織変化を研究すること、三つ目は、交感神経遮断の薬物治療によって、神経性心肺損害を防ぎ且つ生存時間を増やすことができるか否かを評価することである。
【００２１】
動物と実験計画
まず、例えば、台湾国家科学委員会附属の飼育施設より２７０〜３６０グラム重のオスのスプラーグドーリーラットを入手し、飼育室で飼育する。
【００２２】
上述の三つの具体的な目標に基づき、三組の実験を計画する。一組目の実験は、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）をＮＴＳに微量注入することで、急性神経性高血圧及び出血性肺水腫を引き起こしてラットモデルを確立し、血圧（ＢＰ）及び心拍数（ＨＲ）の動向を記録する。これを、媒体（０．８％のアスコルビン酸を含む生理食塩水）に溶解する６−ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ，３０μｇ）を両側からＮＴＳに注入する介入グループと、等容量の媒体の注射のみを受ける制御グループと二つのラットのグループ（各グループ内ｎ＝６）に分けて研究を行う。各グループのラットにウレタン（１ｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を使用して麻酔を行い、発振器回路に接続し、大腿静脈を介してＢＰ及びＨＲを記録する。ＮＴＳの微量注入に関しては、ラットに麻酔を施し、立体固定フレームに固定した後、髄質の背面を露出する。機能的にＮＴＳを識別するために、ガラス管にＬ−グルタミン酸（０．１５４ｎｍｏｌ／６０ｎｌ）を充填している。Ｌ−グルタミン酸をＮＴＳに微量注入した後、ＢＰ及びＨＲの具体的な低下（≧−３５ｍｍＨｇ及−５０ｂｐｍ）を示した。
【００２３】
一組目のラットモデルを確立した後、二組目の実験では、いくつかの分析のための時点を確認することを目的する。ラットのＮＴＳが病変する前に、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を使用して麻酔を施す。手術、即ちＮＴＳ病変を行った後、傷口を塞ぎ、ラットを立体固定フレームから外し、さらなる観察を行う。各ラットは、ケージに安置され、３０分以内に意識を回復し、自由に行動する。これ等ラットは、異なる時点（０、３、６時間）において犠牲死（介入グループ及び制御グループ、各グループともにｎ＝６）させ、血液、脳、心臓及び肺から組織病理学的及び生化学的に分析を行う。犠牲死させる前に、心エコー検査を行い、左心室（ＬＶ）壁厚及び心臓機能を検査する。
【００２４】
三組目の実験における介入治療グループ及び制御治療グループは、ＮＴＳ病変が発生した十分後の時点において、大腿静脈を介して交感神経遮断薬であるヘキサメトニウム（Ｓｉｇｍａ）（２５ｍｇ／ｋｇ，ｉｖ）を注入し、ＢＰ及びＨＲの動向（各グループともにｎ＝６）を記録し、ラットは、０、３、６及び１２時間の時点において犠牲死（各グループともにｎ＝６）させ、二組目のラットの実験で説明したようにパラメータを分析する。
【００２５】
ラットを開腹し、下大静脈から採血を行う。全ての血液サンプルをマイクロチューブに収集し、直ちに氷浴に置く。その後、サンプルは、４℃、１００００ｒｍｐで２０分間遠心分離を行う。血漿成分を分離除去し、エピネフリン及びノルエピネフリン成分の分析が終わるまで（四週間以内）、−８０度で保存する。なお分析に行われる酵素免疫測定法は、Ｌａｂｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｔｉｋａ  Ｎｏｒｄ−Ｍｅｄｉｃｏｒｐ社によって高感度定量測定が行われる。
【００２６】
肺水腫及び組織病理学
採血後のラットを犠牲死させ、胸部を切開して肺と心臓とを取り出し、その後、頭蓋骨を開いてＮＴＳ組織を取り出す。肺内に蓄積する液体を推定するため、二つの肺の湿重量を計量した後、８０℃のオーブンの中で二日間乾燥し、さらに肺の乾重量を計量する。肺の総重量／体重×１００及び湿重量と乾重量との比によって、肺水腫の程度を示すために用いる値を求める。
【００２７】
ヘマトキシリン・エオジン染色からすると、採血した後、ラットの脳、心臓及び肺は直ちに切除する。これ等を生理食塩水ですすぎ、血液或いは脂肪組織を取除き、水分を濾紙で軽く吸い取った後、１０％のホルマリンに５日間置き、パラフィンに包埋して４μｍ厚の切片に切断し、ヘマトキシリン・エオジンで染色する。
【００２８】
パラフィンを１時間、７０℃のオーブンで溶かした後、切片上に免疫組織化学的な分析（心臓組織内のトロポニンＴ及び脳性ナトリウム利尿ペプチドと、肺組織内の好中球と、心肺組織内のコネキシン４３との検定）を行う。
【００２９】
切片からパラフィンを取除きクエン酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ，  ｐＨ  ６．０）においてマイクロ波処理を行い、３％のヤギ血清でブロッキングを行い、抗心筋型トロポニンＴ抗体（１：２００；Ａｂｃａｍ）と、抗ミオシンＶＩＩａ因子抗体（ａｎｔｉ−ｍｙｏｓｉｎ  ＶＩＩａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（１：２００；Ａｂｃａｍ）と、抗脳性ナトリウム利尿ペプチドポリクローナル抗体（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）と、抗好中球エラスターゼ抗体（１：４００；Ａｂｃａｍ）と、抗コネキシン４３／ＧＪＡ１抗体（１：２００；Ａｂｃａｍ）とを使用し、４℃で一晩培養する。次に、室温下において、ビオチン化した二次抗体（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して切片を一時間培養し、さらにＡＢタンパク質複合体（１：１００）内で３０分培養する。切片は、ＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で可視化し、ヘマトキシリンで対比染色を行う。その後、電荷結合素子カメラを搭載した顕微鏡で撮影する。
【００３０】
心エコー検査
ラットを固定し、その胸部を剃毛し、１０ＭＨｚのフェーズドアレイトランスデューサを備える市販の装置（Ｖｉｖｉｄ  ７，ＧＥ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，Ｈｏｒｔｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、心エコー検査を行う。全ての記録をデジタル化し、二次元シネループとして保存し、カスタマイズされた専門のリサーチソフトウェア（Ｅｃｈｏ  ＰＡＣ，ＧＥ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，Ｈｏｒｔｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して分析する。乳頭筋の水平内にある深さ２ｃｍ箇所の傍胸骨短軸像から二次元的に導引されたＭモードの記録を取得する。Ｍモードのトレーシングは、速度２００ｍｍ／ｓで記録する。アメリカ心エコー図学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ）の方法を利用して測定を行い、パラメータは、Ｍモードのトレーシングにおいてデジタル化して測定され、五つの連続的な心周期から平均を求める。
【００３１】
統計的分析
グループデータは、平均値＋／−ＳＥＭを表す。同じグループにおいて、一方向にＡＮＯＶＡ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を繰返し実施し、複数の時点上におけるＢＰ（或いはＨＲ）の平均差を評価する。二組目の実験における三つの介入／制御グループ間（０、３及び６時間）のパラメータの平均差、及び三組目の実験における四つの介入治療／制御治療グループ間（０、３、６及び１２時間）のものは、Ｔｕｋｅｙ法による一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価する。また、スチューデントのｔ検定を用いて同じ犠牲死させた時点の二グループ（二組目の介入グループ  ｖｓ．  三組目の介入治療グループ）を比較する。Ｐ＜０．０５は、統計的顕著性を有するとみなされる。
【００３２】
実験結果
実施例１
ヘキサメトニウム治療  ｖｓ．  プラセボの自然経過とカテコールアミンの変化とを示す図１Ａ〜図１Ｅを参照する。図１Ａにあるとおり、ラットのＮＴＳに６−ＯＨＤＡ病変が起こった後、急性高血圧が発生し、且つラットは７時間以内に突然死（ｎ＝６）している。図１Ｂにあるとおり、ヘキサメトニウムを投与した後急性高血圧が反転している。全てのラットは、少なくとも１４時間（ｎ＝６）生存している。図１Ｃにあるとおり、６−ＯＨＤＡによって平均血圧（ＭＢＰ）が顕著且つ急速に上昇することが、ヘキサメトニウムを受けて反転していることが明白である。図１Ｄ及び図１Ｅも同じように、６−ＯＨＤＡがＮＴＳを破壊した後、エピネフリン及びノルエピネフリンの血清レベルが急速に上昇するが、ヘキサメトニウム治療後の三時間以内に顕著に低下している（各グループともにｎ＝６）。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊と、Ｐ＜０．０５及び＊＊と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の０ｈｒ．＋と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の３ｈｒ．▲≠▼と、Ｐ＜０．０５及び▲≠▼▲≠▼と、Ｐ＜０．００１  ６−ＯＨＤＡ  ｖｓ．  ６−ＯＨＤＡ＋ヘキサメトニウムとを示している。
【００３３】
この実施例において、ＮＴＳ両側が６−ＯＨＤＡ病変にり患したラットは、７時間以内に死亡している。ラットは、うめき声を伴う呼吸困難が現れ、ＮＴＳが病変した２〜３時間後より胸骨上切痕及び肋骨下エリアに吸気性陥没が発生しており、これ等の症状は徐々に悪化して死亡に至っている。死亡する以前、ラットの鼻孔内にピンク色の泡状流体があった。しかし、６−ＯＨＤＡ＋ヘキサメトニウムを受けたラットは、１４時間以上生存し、ＮＴＳが病変した１４時間後より顕著な呼吸困難が現れた。
【００３４】
６−ＯＨＤＡに病変したラットのＢＰ及びＨＲの記録（図１Ａ及び図１Ｃ）では、ＮＴＳは、６−ＯＨＤＡを両側に微量注入してから５分以内に高血圧定常期に達し、小さな拡張期血圧のドリフトを伴い、脈圧は上昇した後低下している。この急性高血圧の期間、ＨＲには顕著な変化はない。その後の２或いは３時間後は、血圧が基線レベルまで徐々に低下し、ラットは急速に７時間以内に死亡し、また死亡する以前にＢＰが急速に低下している。次に、１０分後にヘキサメトニウムを投与した６−ＯＨＤＡに病変したラット（図１Ｂ及び図１Ｃ）において、６−ＯＨＤＡが誘発した高血圧は、基線レベル以下まで直ちに急速な反転を発生し、脈圧低下及びＨＲ低下を伴っている。ＢＰは、基線レベルまで徐々に回復し、３時間経過後、正常な脈圧を有し、顕著なＨＲ低下は見られない。制御グループにおいて、ＢＰ及びＨＲは顕著な変化は見られない。制御治療グループにおいて、ヘキサメトニウムを投与した後平均血圧が顕著に低下し、脈圧の低下に伴い、基線まで回復し、ＨＲは、顕著な変化は見られない。ＨＥ染色法によるラットの脳組織学からすると、６−ＯＨＤＡを両側に微量注入下したＮＴＳは、ＮＴＳが広範囲にわたって壊死し、両側の神経が損傷している。しかし、制御グループにおいて、媒体によって両側に微量注入したＮＴＳは、両側のＮＴＳが壊死していなかった。
【００３５】
６−ＯＨＤＡに病変したラットの三時間後のエピネフリン及びノルエピネフリンレベル（図１Ｄ及び図１Ｅ）は、急速且つ過剰に基線レベルを上回り、その上このハイレベルを６時間維持し続けた。６−ＯＨＤＡグループと６−ＯＨＤＡ＋ヘキサメトニウムグループとの間の６時間におけるエピネフリン及びノルエピネフリンレベルには、顕著な差異が見られないものの、ヘキサメトニウム治療は、エピネフリン及びノルエピネフリンの増加分を三時間で減弱した。
【００３６】
実施例２
心臓部分において、心臓被検体には顕著な変化はない（図２Ａ）ものの、心臓の横断面において、６−ＯＨＤＡに病変してから３時間及び６時間後、ＬＶ壁厚が増加（図２Ｂ）している。心エコーの二次元短軸像（図２Ｃ）及びＭモード画像（図２Ｄ）は、ヘキサメトニウム治療によって６−ＯＨＤＡに病変してから３時間後及び６時間後の心拍出量（ＣＯ）の低下（図２Ｅ）を防ぐことが示されている。ヘキサメトニウム治療を行った３時間後には、左心室の駆出率（ＥＦ）（図２Ｆ）、弛緩時の心室中隔厚及び弛緩時のＬＶ後壁厚（図２Ｇ及び図２Ｈ）が急速に増加し、反転或いは減弱を受けている。また、ヘキサメトニウム治療を行った３時間後及び６時間後には、心臓の拡張及び収縮時のＬＶ内部の大きさは小さくなり、反転或いは減弱を受けている。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊と、Ｐ＜０．０５及び＊＊と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の０ｈｒ．＋と、Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  各グループ別の３ｈｒ．▲≠▼と、Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  各グループ別の６ｈｒ．§と、Ｐ＜０．０５及び§§と、Ｐ＜０．００１  ６−ＯＨＤＡ  ｖｓ．  ６−ＯＨＤＡ＋Ｈとを示している。
【００３７】
実施例３
ヘキサメトニウム治療（＋Ｈ）  ｖｓ．  プラセボの心臓サンプルの病理学的変化を示す図３Ａ〜図３Ｇを参照する。図３Ａにあるとおり、ヘマトキシリン・エオジン染色の代表的な例である。６−ＯＨＤＡグループは、３時間後及び６時間後において、不規則波形繊維が増加するとともに、細胞質のエオジン嗜好性の増加及び収縮帯の壊死があるが、ヘキサメトニウム治療によってこれを防いでいる（各グループともにｎ＝６）。図３Ｂ及び図３Ｅにあるとおり、心臓トロポニンＴの代表的な例である。抗体共染色（ｃｏｓｔａｉｎｅｄ）の心筋切開面でトロポニンＴに向かって対抗する抗体（緑）と、細胞核をＤＡＰＩによって染色されたもの（青）が示されている。６−ＯＨＤＡグループは、６時間後において、トロポニンＴの発現が増加するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを低下している（各グループともにｎ＝４）。図３Ｃにあるとおり、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の代表的な例である。６−ＯＨＤＡグループは、３時間後及び６時間後において、細胞質内のＢＮＰ染色が増加するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを低下している（各グループともにｎ＝６）。図３Ｄにあるとおり、ラット心臓筋肉の断面上にあるコネキシン４３の免疫細胞化学的な検出を示す代表的な例である。６−ＯＨＤＡグループは、３時間後及び６時間後において、介在板及び隣接する心筋繊維の間にあるコネキシン４３が増加及び過剰発現するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを低下している（各グループともにｎ＝６）。図３Ｆ及び図３Ｇにあるとおり、ラット心臓内生体位のＢＮＰの定量分析及びコネキシン４３の発現細胞を示している。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の０ｈｒ．＋と、Ｐ＜０．０５及び＋＋と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の３ｈｒ．▲≠▼と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の６ｈｒ．§と、Ｐ＜０．０５及び§§と、Ｐ＜０．００１  ６−ＯＨＤＡ  ｖｓ．  ６−ＯＨＤＡ＋ヘキサメトニウムとを示している。
【００３８】
なお、心筋繊維が縦断面における組織学的変化（図３Ａ）について、不規則波形繊維の外観、細胞質のエオジン嗜好性の増加及び収縮帯の壊死が６−ＯＨＤＡグループにある３時間後及び６時間後の細胞高収縮状態に反映するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを防いでいる。心臓トロポニンＴにおける免疫組織化学及び免疫蛍光分析（図３Ｂ）と、脳性ナトリウム利尿ペプチド（図３Ｃ）と、コネキシン４３間のギャップ結合タンパク質の生体位定性分析図３Ｄとにおいて、６−ＯＨＤＡ病変によって引き起こるトロポニンＴ、脳性ナトリウム利尿ペプチド及びコネキシン４３の過剰発現が増加し、ヘキサメトニウム治療後の３〜６時間以内に低下している（図３Ｅ〜図３Ｇ）。
【００３９】
実施例４
ヘキサメトニウム治療（＋Ｈ）  ｖｓ．  プラセボの出血性肺水腫の変化を示す図４Ａ〜図４Ｃを参照する。図４Ａにあるとおり、ラットの肺被検体の代表的な例である。６−ＯＨＤＡ病変を有するラットは、３時間後及び６時間後において、軽度及び重度な肺うっ血を誘発するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを防いでいる（各グループともにｎ＝６）。図４Ｂ及び図４Ｃにあるとおり、６−ＯＨＤＡグループにおける肺の湿乾重量比（Ｗ／Ｄ）及び肺体重量比（ＢＷ）は６時間後に増加するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを防いでいる（各グループともにｎ＝６）。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別と、＋Ｐ＜０．０５  ６−ＯＨＤＡ  ｖｓ．  ６−ＯＨＤＡ＋Ｈとを示している。
【００４０】
肺被検体（図４Ａ）、肺の湿乾重量比（図４Ｂ）及びＮＴＳ病変後の肺体重量比（図４Ｃ）に基づくと、３時間後、軽度の肺うっ血はあるものの、肺水腫は起こっていない。しかし、ラットが６−ＯＨＤＡに病変した後、６時間以内に重度の出血性肺水腫に発展している。６−ＯＨＤＡ病変によって６時間後に引き起こる肺水腫は、ヘキサメトニウム治療によって反転している。
【００４１】
実施例５
ヘキサメトニウム治療（＋Ｈ）  ｖｓ．  プラセボの肺サンプルの病理学的変化を示す図５Ａ〜図５Ｅを参照する。図５Ａにあるとおり、ヘマトキシリン・エオジン染色の代表的な例である。６−ＯＨＤＡグループにおいて、赤血球細胞は３時間後浸潤して増加し、６時間後には透明膜を形成するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを防いでいる（各グループともにｎ＝６）。図５Ｂにあるとおり、多形核好中球（ＰＭＮ）の代表的な例である。６−ＯＨＤＡグループにおいて、ＰＭＮは６時間後浸潤して増加するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを減弱している（各グループともにｎ＝６）。図５Ｃにあるとおり、コネキシン４３の代表的な例である。６−ＯＨＤＡグループは、３時間後及び６時間後において、細胞膜の界面上に強烈な陽性のコネキシン４３の発現が増加するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを減弱している（各グループともにｎ＝６）。図５Ｄ及び図５Ｅにあるとおり、生体位にあるＰＭＮ及びコネキシン４３の発現細胞の定量分析を示している。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の０ｈｒ．＋と、Ｐ＜０．０５及び＋＋と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の３ｈｒ．▲≠▼と、Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  各グループ別の６ｈｒ．§と、Ｐ＜０．０５及び§§と、Ｐ＜０．００１  ６−ＯＨＤＡ  ｖｓ．  ６−ＯＨＤＡ＋Ｈとを示している。
【００４２】
なお、肺の組織切片における組織学的変化（図５Ａ）について、肺の間質にある細胞の浸潤及び赤血球の増加によって外観が悪化し、３時間後及び６時間後には透明膜を形成するが、ヘキサメトニウム治療によってこれを減弱或いは防止している。免疫組織化学染色によって、浸潤した細胞が好中球（図５Ｂ及び図５Ｄ）であることを発見した。６−ＯＨＤＡを誘発したコネキシン４３は増加するが、キサメトニウム治療後、時間とともに低下していく（図５Ｃ及び図５Ｅ）。
【００４３】
まとめ
本発明において、６−ＯＨＤＡによってＮＴＳの病変を誘発したラットは、急性高血圧を経ると、病変が発生して十分以内にエピネフリン及びノルエピネフリンが大量に血清内に放出されることが分かった（図示されていない）。カテコールアミンは死亡するまで継続的に高い数値を保っていた。６−ＯＨＤＡに病変してから３時間以内に低ＣＯを有する重度の心不全を発見し、最終的に７時間以内に重度の出血性肺水腫によるＬＶ不全を引き起こして死亡した。一連の６−ＯＨＤＡが誘発するＮＴＳの病変は、致命的なＥＶ７１脳炎に類似しており、ＮＴＳエリアを破壊するものと考えられる。臨床上において、脳幹脳炎を伴うＥＶ７１感染は、数時間以内に突発的且つ重度に、心不全、ＮＰＥ及び死亡を進展するハイリスク指標である。また、劇症ＥＶ７１を伴うＮＰＥは、ＬＶ不全に関連すると考えられる。
【００４４】
このＮＴＳの病変を伴うラットモデルにおいて、６−ＯＨＤＡ＋ヘキサメトニウムグループの６時間後のエピネフリン及びノルエピネフリンの血清レベルは、６−ＯＨＤＡグループと殆ど変らないものの、心肺損傷に関してこれを防いでいる（ＣＯの保持及び出血性肺水腫の防止）。初期段階のヘキサメトニウム治療は、３時間以内に血液中のエピネフリンとノルエピネフリンの濃度を低下し、心臓及び肺のさらなる損傷を防ぐため、カテコールアミンの高い循環効果を減弱している。つまり、急速且つ過剰且つ持続性である高濃度のカテコールアミンは、急性心不全及び肺水腫を招くものとなる。しかし、はじめから低濃度のカテコールアミンを受けていれば、その後の高濃度のカテコールアミンによって起こるさらなる心肺損傷を防ぐことができる。この発見は、カテコールアミンの注入用量を多くすることによって、迅速且つ突発的に重度の肺水腫及び出血が引き起こるという先行する研究に類似している。だが、カテコールアミンをゆっくり注入することによって、肺の変化の程度を比較的軽度なものとすることができる。そのため、交感神経嵐がゆっくりと生成される場合、血行動態変化は急速且つ劇的に変化することはなく、心血管系を調整することができるようになっている。これは、研究対象であるコネキシン４３の発現に反映されている。６−ＯＨＤＡに病変した後、コネキシン４３の発現は、心臓及び肺において増加し、この増加はヘキサメトニウム治療によって反転している。
【００４５】
また、仮説として、致命的なエンテロウイルス７１型脳炎の推定機序を立てた（図６）。ＮＴＳは大量のカテコールアミンを含有する神経によって支配され、これ等神経の軸索は、カテコールアミンを合成及び放出している。ＥＶ７１がＮＴＳエリアを激しく攻撃した場合、ＮＴＳは髄質内にある自律神経の活動を調節することができなくなり、次第に自律制御の調節ができなくなる。ＮＴＳの多大なる破壊は、顕著な交感神経活動の増加を引き起こし、大量のエピネフリンとノルエピネフリンが血液中に流れ込み、その結果、抵抗血管、心臓及び肺を損傷させている。交感神経の過剰な活性及びカテコールアミンの毒性は、末梢血管の収縮、心筋細胞の壊死及び肺毛細血管の透過性の増大を引き起こすことで、致命的な出血性肺水腫を引き起こしている。
【００４６】
動物モデルにおいて、ＥＶ７１は、接種後、胃腸管より拡散し、逆行性軸索輸送又は血流経路を介してラットの脳幹に蓄積している。脳幹において、ＥＶ７１はＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１及びスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２の受容体に結合することができる。この二つの受容体は、ウイルスの付着及び浸入を容易にし、炎症性サイトカインを誘発して血液脳関門を破壊するため、ウイルスの侵入を可能にしている。しかし、ＥＶ７１が他のウイルスよりもＮＴＳ神経を標的とする傾向が大きい理由は解明されておらず、依然としてさらなる研究が必要としている。
【００４７】
感染性疾患の疾患経過からすると、高血圧、心不全及びＮＰＥという症状はごく稀である。ＮＴＳの病変に関するすべての疾患に応用が可能なようにしているが、現在のところ、台湾（１９９８年以降）及び世界のその他の地域において流行する劇症ＥＶ７１は、ＮＴＳを破壊するという疾患経過と一致している。初期段階において、ＥＶ７１に感染した後ＮＰＥ合併症に進展するという深刻な病例を識別することは、ＥＶ７１のワクチンを発明する前に着手しなければならない最も重要な措置である。
【００４８】
劇症ＥＶ７１脳炎のトランスレーショナルリサーチのため、本発明では、致命的なＥＶ７１脳炎を模倣するラットモデルにおける脳幹脳炎、心筋症、及び神経性肺水腫間の交互関係を説明している。急性高血圧は初期段階の指標、心エコー検査は有効なモニタリングツールとし、交感神経遮断薬の投与を脳幹病変における心不全及び神経性肺水腫の予防措置とすることで、カテコールアミンの高い循環効果を減弱している。
【００４９】
最後に、致命的なエンテロウイルス７１型脳炎の推定機序を示す図６を参照すると、孤束核（ＮＴＳ）が激しいエンテロウイルス７１型の損害を受けた場合、節前神経の活性化、交感神経の出力の活性化及び大量のエピネフリンとノルエピネフリンの急速な放出の活性化が過剰に増加している。交感神経の過剰な活性及びカテコールアミンの毒性は、末梢血管の収縮と、深刻な心臓の損傷及び不全と、肺循環の負荷とを引き起こし、最終的には致命的な出血性肺水腫を引き起こしている。ＮＴＳが破壊した後、節前遮断薬（ヘキサメトニウム）で早期に治療すると、エピネフリン及びノルエピネフリンの急速且つ過剰な放出を減弱するため、致命的な心不全及び肺水腫の発生を防ぐことができる。
【００５０】
以上のことから、ヘキサメトニウムをＥＶ７１型脳炎に模擬感染させた動物モデルに投与することは、致命的心肺損害を確実に反転し、且つ死亡率を低減するため、本発明は新規性及び進歩性を備えている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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