(57)【要約】      （修正有）【課題】ファージポリメラーゼ及び溶原性宿主菌株の使用を伴うことなく、改善された発現制御及び改善されたタンパク質発現レベルを与えることができるタンパク質発現系の提供。【解決手段】完全パリンドロームオペレーター配列に基づくタンパク質発現系であって、（ａ）プロモーター；及び（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列を含む；該プロモーターがＴ７ではないタンパク質発現系。亦、タンパク質の製造方法であって、（ａ）プロモーター；（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列；及び（ｃ）タンパク質のための発現カセットを含む；該プロモーターがＴ７ではない発現系を含む方法。【選択図】図１８
2015006193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全パリンドロームオペレーター配列に基づくタンパク質発現系であって、
（ａ）プロモーター；および
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列
を含む；該プロモーターがＴ７ではないことを特徴とするタンパク質発現系。
【請求項２】
プラスミドであって、
（ａ）プロモーター；および
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列
を含む；該プロモーターがＴ７ではないことを特徴とするプラスミド。
【請求項３】
タンパク質のための発現カセットを更に含む、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
プラスミドが、自律複製性プラスミドである、請求項２または請求項３に記載のプラスミド。
【請求項５】
プラスミドが、組込みプラスミドである、請求項２または請求項３に記載のプラスミド。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
タンパク質の製造方法であって、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列；および
（ｃ）タンパク質のための発現カセット
を含む；該プロモーターがＴ７ではないことを特徴とする発現系を発現することを含む方法。
【請求項８】
プロモーターが、宿主細胞ポリメラーゼプロモーターである、請求項１〜７のいずれかに記載の発現系、プラスミド、宿主細胞または方法。
【請求項９】
プロモーターが、大腸菌（Ｅ．coli）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、請求項８に記載の発現系、プラスミド、宿主細胞または方法。
【請求項１０】
プロモーターが、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、λｐＬ、λｐＲ、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡまたはｒｒｎＢである、請求項１〜７のいずれかに記載の発現系、プラスミド、宿主細胞または方法。
【請求項１１】
オペレーター系が、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎである、請求項１〜１０のいずれかに記載の発現系、プラスミド、宿主細胞または方法。
【請求項１２】
二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、好ましくは、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している、請求項１〜１１のいずれかに記載の発現系、プラスミド、宿主細胞または方法。
【請求項１３】
オペレーター配列が、８５〜１５０塩基対間隔、好ましくは、９０〜１２６塩基対間隔、そして最も好ましくは、９１または９２塩基対間隔を置く、請求項１２に記載の発現系、プラスミド、宿主細胞または方法。
【請求項１４】
タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項３に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）該タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項１５】
宿主細胞が、Ｅ．coli である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
プラスミドが、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のプラスミドである、請求項１４および請求項１５両方に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リコンビナントポリペプチドの微生物発現に適する発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ７に基づく完全パリンドロームオペレーター配列に基づくタンパク質発現系は、米国特許第６，５３７，７７９号により知られている。Ｔ７に基づく系は、Ｔ７系の操作が、必要なファージポリメラーゼを発現するλＤＥ３プロファージを大腸菌（Escherichia coli）宿主菌株中に挿入して、溶原性宿主菌株を生じることによって一般的に与えられるファージポリメラーゼを必要とするという欠点を有する。そのファージポリメラーゼは、ファージポリメラーゼの遺伝子（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を有する特殊なλ形質導入ファージでの感染によって細胞へと送達することもできる。λＤＥ３プロファージは、溶菌ファージ粒子を形成するプロファージの切除に必要な遺伝的要素を欠いている。しかしながら、λＤＥ３溶原性宿主菌株は、ファージ粒子を放出すること、したがって、発酵プラントにおいて望ましくない感染を引き起こすことが分かった。実際に、λＤＥ３菌株の使用は、ある種の発酵プラント作業者によって認められていない。
【０００３】
誘導前の異種タンパク質の発現は、若干の異種タンパク質が、全体の生産性を減少させる宿主細胞成長およびプラスミド安定性に有害な作用を有するという理由で望ましくない。これを免れるために、Ｔ７に基づく発現系は、概して、異種タンパク質の発現を二つのレベルで制御する。第一に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを生じるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子発現の誘導は、Ｔ７プロモーターからの発現を推進するのに必要とされる。第二に、Ｔ７プロモーターそれ自体も、誘導される必要がある。これは、Ｔ７に基づく発現系を操作する複雑さを増加させる。
【０００４】
目的のタンパク質のための発現系／発酵法の選択および最適化を、主に経験的な方法とする、いろいろな制御様式および誘導様式での極めて多数の異種タンパク質発現系が存在する。これは、時間の浪費であり且つ望ましくない。したがって、ファージポリメラーゼおよび溶原性宿主菌株の使用を伴うことなく、改善された発現制御および改善されたタンパク質発現レベルを与えることができる系が要求される。更に、原核細胞、更には、哺乳動物および酵母の細胞などの真核細胞において、誘導性異種発現を与えることができる系が要求される。
【発明の開示】
【０００５】
本発明により、完全パリンドロームオペレーター配列に基づくタンパク質発現系であって、
（ａ）プロモーター；および
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列
を含む；そのプロモーターがＴ７ではないことを特徴とするタンパク質発現系を提供する。
【０００６】
本発明の発現系に用いることができるプロモーターは、一般的には、宿主ＲＮＡポリメラーゼに基づくプロモーター系、好ましくは、大腸菌（Ｅ．coli）ＲＮＡポリメラーゼに基づくプロモーター系である。用いることができるプロモーターの例には、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、λｐＬ、λｐＲ、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡおよびｒｒｎＢが含まれる。
【０００７】
本発明による発現系に用いることができるオペレーター配列には、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄ
ｅｏおよびｇｌｎが含まれる。一つまたはそれを超える完全パリンドロームオペレーター配列を用いることができる。多くの好ましい態様において、二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用いるが、最も好都合には、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している。二つのオペレーター系を用いる場合、それらオペレーター配列は、好ましくは、プロモーターの制御を最大にするように間隔を置く。多くの態様において、その間隔は、８５〜１５０塩基対間隔、好ましくは、９０〜１２６塩基対間隔、そして最も好ましくは、９１または９２塩基対間隔である。ある種の態様において、オペレーター配列は、転写出発点と重なる。
【０００８】
オペレーター系は、一般的には、適当なリプレッサー配列と一緒に用いられるということは理解されるであろう。リプレッサー配列は、リプレッサータンパク質を生じ、例えば、ｌａｃオペレーターを用いた場合、ｌａｃＩ遺伝子配列を生じる。他のｌａｃリプレッサー配列を用いてもよく、例えば、ｌａｃＩＱ配列は、ｌａｃリプレッサータンパク質のレベルを増加させるのに用いることができる。リプレッサー配列は、宿主細胞ゲノムによってまたは追加の適合性プラスミドを用いることによって与えることもできる。
【０００９】
発現系は、宿主細胞ゲノム中に組み込むことができるが、好ましくは、プラスミドなどの染色体外要素内に含まれる。或いは、発現系は、ファージまたはウイルスベクター中に包含されてよく、これらは、宿主細胞系中に発現系を送達するのに用いることができる。プラスミドまたは発現ベクターは、当該技術分野において知られている方法によって組み立てることができる。プラスミドは、典型的に、一つまたはそれを超える次のもの：選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性を与える配列；ｃｅｒ安定性配列；および発現カセットを更に含む。その発現系は、所望のタンパク質の分泌が必要とされる場合、シグナル配列を包含してもよい。
【００１０】
発現は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、イソブチル−Ｃ−ガラクトシド（ＩＢＣＧ）のようなＩＰＴＧ類似体、ラクトースまたはメリビオースなどの誘導物質の追加によって誘導することができる。他の誘導物質を用いることができるが、それは、他のところに一層十分に記載されている（例えば、The Operon, eds Miller and Renznikoff (1978) を参照されたい）。誘導物質は、個々に、または組合せ
で用いることができる。適当なプラスミドまたは発現ベクターの構築は、当科学者に明らかであろう。
【００１１】
本発明の発現系は、宿主細胞において、特に、微生物においてタンパク質を発現させるのに用いることができる。本明細書中で用いられる「タンパク質」は、概して、約１０を超えるアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。宿主細胞は、原核生物または真核生物であってよい。原核細胞の例には、細菌細胞、例えば、Ｅ．coli、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、霊菌（Serratia marsescens）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を含めたグラム陰性細菌細胞；および枯草菌（Bacillus subtilis）を含めたグラム陽性細菌細胞が含まれる。真核細胞の例には、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌ
ラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵
母が含まれる。用いることができる哺乳動物宿主細胞には、ヒト胚性腎およびＰＥＲＣ．６細胞などのヒト細胞系；ＮＳ０細胞などのネズミ細胞系；そして具体的には、乳児ハムスター腎細胞などのハムスター細胞系、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれる。糸状菌、植物、昆虫、両生類の細胞または卵巣種のものなどの他の真核宿主細胞も、用いることができる。好ましい宿主細胞は、細菌、具体的には、腸内細菌（enterobacteriacae）、好ましくは、Ｅ．coli、特に、そのＢまたはＫ１２菌株である。
【００１２】
本発明の発現系は、一般的には、プラスミドの形で用いられ、そしてプロモーターおよび完全パリンドロームオペレーター配列を含むプラスミドであって、そのプロモーターがＴ７ではないプラスミドは、本発明の別の側面を形成する。それらプラスミドは、自律複製性プラスミドまたは組込みプラスミドであってよい。
【００１３】
本発明の発現系は、好都合には、タンパク質、特に、リコンビナントタンパク質の製造に、リコンビナント細胞を培養することによって用いられる。タンパク質の発現について、プロモーターおよびオペレーター配列は、発現されるタンパク質をコードしているＤＮＡに機能的に連結しているということは理解されるであろう。
【００１４】
したがって、本発明は、更に、タンパク質の製造方法であって、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列；および
（ｃ）タンパク質のための発現カセット
を含む；プロモーターがＴ７ではないことを特徴とする発現系を発現することを含む方法を提供する。
【００１５】
所望ならば、同じであってよいしまたは異なっていてよい一つまたはそれを超えるプロモーター、オペレーター配列および発現カセットが存在してよい。
その発現系は、用いられる細胞について当該技術分野において周知の方法によって発現される。好ましい発現方法は、リコンビナント細胞を増殖培地中で、特に、発酵によって培養後、発現されたタンパク質を回収することを包含する。「増殖培地」という用語は、リコンビナント細胞を成長させるのに用いられる栄養培地を意味する。多くの態様において、栄養素溶液を用いる。与えられたリコンビナント細胞に適する増殖培地は、当該技術分野において周知である。
【００１６】
本発明を、次の実施例によって、制限を伴うことなく詳しく説明する。
【実施例】
【００１７】
１．ｐＡＶＥ系列ベクターの生成
ｐＡＶＥ０１１、ｐＡＶＥ０１２およびｐＡＶＥ０１３ベクター
ｐＡＶＥ０１１の生成用の出発ベクターは、ＵＳ６，５３７，７７９号に記載のように製造されたｐＺＴ７＃２．０であった。ｐＺＴ７＃２．０は、ｐＡＴ１５３ベクター主鎖、ｃｅｒ安定性配列、ｔｅｔＡ／Ｒ、目的の遺伝子の上流の単一天然ｌａｃオペレーター配列および上流Ｔ４転写ターミネーターを有する。Ｔ７Ａ３プロモーターおよび二重完全パリンドロームｌａｃオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００１８】
リンカー１２．１は、オリゴヌクレオチド１および２．１：
【００１９】
【化１】
2015006193.tif 000003
【００２０】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、そのリンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０１２と称した。
【００２１】
次に、Ｔ７Ａ３プロモーターカセットを、プラスミドｐＡＶＥ０１２に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド３および４：
【００２２】
【化２】
2015006193.tif 000004
【００２３】
をアニーリングすることによってｐＡＶＥ０１２中にクローン化し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０１１と称した。
【００２４】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０１３を生じた。ｐＡＶＥ０１３のプラスミド地図を、図１８に示す。これは、オペレーターおよびプロモーターの配置と、構築に用いられる制限酵素部位を示している。オペレーターは、双方とも完全パリンドロームｌａｃオペレーターである。ＲＢＳは、リボソーム結合部位である。そのベクターは、ｐＡＴ１５３ベクター主鎖、ｃｅｒ安定性配列、誘導性テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＡ／Ｒ）および上流Ｔ４転写ターミネーターを包含する。
【００２５】
ｐＡＶＥ０３８およびｐＡＶＥ０４１ベクター
ｐＡＶＥ０３８の生成用の出発ベクターは、ＵＳ６，５３７，７７９号に記載のように
製造されたｐＺＴ７＃２．０であった。ｔａｃプロモーターおよび単一天然ｌａｃオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００２６】
リンカー１１１２は、オリゴヌクレオチド１１および１２：
【００２７】
【化３】
2015006193.tif 000005
【００２８】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、そのリンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０３８と称した。
【００２９】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０４１を生じた。
ｐＡＶＥ０３７およびｐＡＶＥ０４０ベクター
ｐＡＶＥ０３７の生成用の出発ベクターは、ＵＳ６，５３７，７７９号に記載のように製造されたｐＺＴ７＃２．０であった。ｔａｃプロモーターおよび単一完全パリンドロームｌａｃオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００３０】
リンカー１３１４は、オリゴヌクレオチド１３および１４：
【００３１】
【化４】
2015006193.tif 000006
【００３２】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、そのリンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿
主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０３７と称した。
【００３３】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０４０を生じた。
ｐＡＶＥ０２８およびｐＡＶＥ０３０ベクター
ｐＡＶＥ０２８の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０１２であった。Ｔ７Ａ３プロモーターカセットを、プラスミドｐＡＶＥ０１２に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド５および６：
【００３４】
【化５】
2015006193.tif 000007
【００３５】
をアニーリングすることによってｐＡＶＥ０１２中にクローン化し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０２８と称した。
【００３６】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０３０を生じた。
ｐＡＶＥ００７およびｐＡＶＥ０３１ベクター
ｐＡＶＥ００７の生成用の出発ベクターは、ＵＳ６，５３７，７７９号に記載のように製造されたｐＺＴ７＃２．０であった。Ｔ７Ａ３プロモーターおよび単一完全パリンドロームｌａｃオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００３７】
Ｔ７Ａ３プロモーターを含有するリンカーは、オリゴヌクレオチド３および４：
【００３８】
【化６】
2015006193.tif 000008
【００３９】
から製造した。
オリゴヌクレオチド３および４を、アニーリングした後、形成されたリンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ００７と称した。
【００４０】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０３１を生じた。
ｐＡＶＥ０２９およびｐＡＶＥ０２７ベクター
ｐＡＶＥ０２９の生成用の出発ベクターは、ＵＳ６，５３７，７７９号に十分に記載のように製造されたｐＺＴ７＃２．０であった。λｐＬプロモーターおよび単一完全パリンドロームｌａｃオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００４１】
リンカー７８は、オリゴヌクレオチド７および８：
【００４２】
【化７】
2015006193.tif 000009
【００４３】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、リンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、ＮｃｏＩを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０２９と称した。
【００４４】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてク
ローン化して、ｐＡＶＥ０２７を生じた。
ｐＡＶＥ０４３およびｐＡＶＥ０４４ベクター
ｐＡＶＥ０４３の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０１２であった。ｔａｃプロモーターカセットを、プラスミドｐＡＶＥ０１２に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド１７および１８：
【００４５】
【化８】
2015006193.tif 000010
【００４６】
をアニーリングすることによってｐＡＶＥ０１２中にクローン化し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０４３と称した。
【００４７】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０４４を生じた。
ｐＡＶＥ０３４およびｐＡＶＥ０３５ベクター
ｐＡＶＥ０３４の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０１２であった。λｐＬプロモーターカセットを、プラスミドｐＡＶＥ０１２に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド９および１０：
【００４８】
【化９】
2015006193.tif 000011
【００４９】
をアニーリングすることによってｐＡＶＥ０１２中にクローン化し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０３４と称した。
【００５０】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてク
ローン化して、ｐＡＶＥ０３５を生じた。
ｐＡＶＥ０２０およびｐＡＶＥ０２１ベクター
ｐＡＶＥ０２０の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０１２であった。λｐＬプロモーターカセットを、プラスミドｐＡＶＥ０１２に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド７および８：
【００５１】
【化１０】
2015006193.tif 000012
【００５２】
をアニーリングすることによってｐＡＶＥ０１２中にクローン化し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０２０と称した。
【００５３】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化して、ｐＡＶＥ０２１を生じた。
ｐＡＶＥ０１６およびｐＡＶＥ０１７ベクター
ｐＡＶＥ０１６の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０１２であった。ｔａｃプロモーターカセットを、プラスミドｐＡＶＥ０１２に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド１５および１６：
【００５４】
【化１１】
2015006193.tif 000013
【００５５】
をアニーリングすることによってｐＡＶＥ０１２中にクローン化し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０１６と称した。
【００５６】
ヒトＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてク
ローン化して、ｐＡＶＥ０１７を生じた。
ｐＡＶＥ０４９ベクター
ｐＡＶＥ０４９の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０１７であった。ｔａｃプロモーターカセットは、変化しなかった。二つのオペレーター間の９１〜１２４塩基対間隔を増加させるために、ＥｃｏＲＩリンカーをクローン化した。これは、オリゴヌクレオチド１９および２０：
【００５７】
【化１２】
2015006193.tif 000014
【００５８】
から製造した。
初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０４９と称した。
【００５９】
ｐＡＶＥ０４６ベクター
分泌ベクターｐＡＶＥ０４６の生成用の出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２７であった。Ｄ１．３Ｆａｂ発現カセット（図１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１７）を、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０４６と称した。
【００６０】
【表１】
2015006193.tif 000015
【００６１】
２．リコンビナント菌株の生成
Ｅ．coli 菌株Ｗ３１１０（American Type Culture Collection よりＡＴＣＣ２７３２５として入手可能）およびＢＬ２１（ＥＭＤ Biosciences Inc, San Diego, USA より入
手可能）を、エレクトロポレーションにより、下の表２に記載のプラスミドで形質転換した。得られたリコンビナント菌株を精製し、グリセロール貯蔵液中において−８０℃で維持した。
【００６２】
【表２】
2015006193.tif 000016
【００６３】
比較例１
Ｔ７Ａ３プロモーターを含むが、いずれのオペレーターも不含のプラスミドの生成用の出発ベクターは、ｐＺＴ７＃２．０であった。Ｔ７Ａ３プロモーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００６４】
リンカー２１２２は、オリゴヌクレオチド２１および２２：
【００６５】
【化１３】
2015006193.tif 000017
【００６６】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、リンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。２２クローンを、制限消化物およびシークエンス法によってスクリーニングした。
【００６７】
正しいＴ７Ａ３プロモーター配列と一致したクローンは無かった（全て、配列中に突然変異を含有した）。これは、この強力な構成的プロモーターを含有するプラスミドの構築に問題があるということを示唆している。
【００６８】
比較例２
単一天然Ｌａｃオペレーター配列の制御下のＴ７Ａ３プロモーターを含むプラスミドの生成用の出発ベクターは、ｐＺＴ７＃２．０であった。Ｔ７Ａ３プロモーターおよび天然Ｌａｃオペレーター（ＬａｃＯ）配列を、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。
【００６９】
リンカー２３２４は、オリゴヌクレオチド２３および２４：
【００７０】
【化１４】
2015006193.tif 000018
【００７１】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、リンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。９４クローンを、制限消化およびシークエンス法によってスクリーニングした。再度、正しい配列と一致したクローンは無かった。しかしながら、一つのクローンは、ほぼ無傷な配列を有することが判明した。このクローンは、その配列中の約−３７位に追加の「Ｇ」を含有した。予想される配列は、この領域中に−ＧＧ−を含有するので、その突然変異の正確な位置を指定することは難しい。ヒトＴＮＦα遺伝子を、ほぼ無傷な配列を有するプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化した。クローニング宿主菌株ＸＬ−Blue ＭＲ（Stratagene）から２０コロ
ニーをスクリーニングした。一つは、（上記の追加の「Ｇ」以外に）突然変異不含の陽性クローンであった。このプラスミドを、生産宿主（ＡＴＣＣ２７３２５）中に形質転換し、そしてそのプラスミドを再度配列決定した。
【００７２】
これは、そのプラスミドが、Ｔ７Ａ３プロモーターおよびヒトＴＮＦα双方の配列中に著しい突然変異を含有したことを示し、Ｔ７Ａ３プロモーターの使用が、天然ｌａｃオペレーター配列の制御下でさえも、プラスミド不安定性を生じるということを示した。
【００７３】
実施例３
ＣＬＤ０３２バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２個の２５０ｍｌエルレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、一方のフラスコを、０．０
５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、もう一方のフラスコは、基底発現を監視するために未誘導のままにした。インキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表３に要約する。
【００７４】
【表３】
2015006193.tif 000019
【００７５】
総合すると、比較例１および２および実施例３に示されたデータは、強力なＴ７Ａ３プロモーターの有効な制御が、驚くべきことに、単一完全パリンドロームオペレーター配列を用いて達成されたということを示している。これは、単一天然オペレーターの使用（比較例２）が、安定なリコンビナント生産菌株が樹立されることを可能にする十分な基底制御を与えなかったとすると、全く予想外であった。高生産物蓄積レベルは、誘導について比較的低濃度の誘導物質を用いて、単一完全パリンドローム制御系で達成された。基底発現（誘導物質の不存在下）は認められたが、それは、有意に延長されたインキュベーション（２４時間）後にのみ明らかであった。
【００７６】
実施例４
ＣＬＤ０１８バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
その種培養物を、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌの種培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．０５ｍＭおよび１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導した。フラスコは、未誘導のままにもし、そしてそれらフラスコのインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表４に要約する。
【００７７】
【表４】
2015006193.tif 000020
【００７８】
このデータは、強力なＴ７Ａ３プロモーターの更なる制御が、９１ｂｐ間隔を置いた二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用いて実現されうるということを示した。基底発現（誘導物質の不存在下）は、単一完全パリンドロームオペレーターを用いて達成されたものから対照抑制へと有意に減少した。二重完全パリンドローム配列を用いて達成された基底発現の制御は、基底発現の制御に二つの異なった制御要素を必要とするＵＳ６，５３７，７７９号のＴ７系と比較した場合、予想外であった。この実施例において、基底発現の制御は、Ｅ．coli ＲＮＡポリメラーゼの高バックグラウンドにおいて達成した。
【００７９】
実施例５
ＣＬＤ０２６バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導した。フラスコは、未誘導のままにもし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表５に要約する。
【００８０】
【表５】
2015006193.tif 000021
【００８１】
それら結果は、二つの完全パリンドロームオペレーター配列の間隔を（９１〜９２ｂｐへと）１ｂｐだけ変更することが、達成された最終蓄積レベルおよび基底発現双方の点で、性能に悪影響を与えることはなかったということを示した。予想外にも、ＩＰＴＧ濃度を（０．０５ｍＭ〜０．００５ｍＭへと）１０倍減少させることは、誘導された生産性を有意に減少させることはなかった。
【００８２】
実施例６
ＣＬＤ０４２およびＣＬＤ０４３バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。各々１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、別々に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した各々２ｘ５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。これらを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこれら培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに別々に接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導した。各々の菌株培養物が入っているフラスコは、未誘導のままにもし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。２０時間インキュベーション後のＣＬＤ０４２およびＣＬＤ０４３の未誘導培養物中のｈＴＮＦαの基底蓄積レベルを、試料採取された細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット分析（抗ｈＴＮＦα抗体を用いた）によって比較した。それらブロットを走査し、データを規格化して、比較を可能にした。それら結果を、下の表６に要約する。
【００８３】
【表６】
2015006193.tif 000022
【００８４】
それら結果は、単一完全パリンドロームオペレーター配列を用いて、ｔａｃプロモーター系の誘導された生産性に悪影響を与えることなく、基底発現（誘導物質の不存在下）を４倍減少させることができるということを示した。
【００８５】
実施例７
ＣＬＤ０１９バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、それらフラスコを、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導した。フラスコは、未誘導のままにもし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、図２に示す。
【００８６】
図２に示されたデータは、ｔａｃプロモーターと二重完全パリンドロームオペレーター配列との組合せが、誘導に用いられるＩＰＴＧの濃度によって発現測度を直接的にモジュレーションすることができる系をもたらすということを示した。このような系を利用して、異種タンパク質の発現をモジュレーションする、例えば、可溶性形のタンパク質の蓄積を最大にする、またはリコンビナント細胞の増殖および生産性への異種タンパク質分泌が有することがありうる有害な作用の問題を回避することができる。
【００８７】
実施例８
ＣＬＤ０３０バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．０５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、他のフラスコは未誘導のままにし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表７に要約する。
【００８８】
【表７】
2015006193.tif 000023
【００８９】
表７に示されたデータは、極めて強力なλｐＬプロモーターの制御が、驚くべきことに、単一完全パリンドロームオペレーター配列を用いて達成することができるということを明らかに示している。高生産物蓄積レベルは、単一完全パリンドローム制御系を用いて達成することができる。
【００９０】
実施例９
ＣＬＤ０２１およびＣＬＤ０３８バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。各々１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、別々に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。これらを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、もう一つのフラスコは、未誘導のままにし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積は、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット分析（抗ｈＴＮＦα抗体を用いた）を用いて決定した。そのデータを、表８に要約する。ＣＬＤ０３８菌株についてのウェスタンブロット分析を、図３に示す。
【００９１】
【表８】
2015006193.tif 000024
【００９２】
これら結果は、９１ｂｐかまたは９２ｂｐ間隔を有する二重完全パリンドロームオペレーター配列とλｐＬプロモーターとの組合せが、極めて堅固な抑制を生じたということを示した。ウェスタンブロットは、標的タンパク質の基底発現が検出されなかったことを示している。誘導時に、低レベル発現レベルを達成した。これら結果は、λｐＬプロモーターが、極めて強力なプロモーターであるとすると、全く予想外であった。このような系は、例えば、宿主細胞に高毒性のタンパク質の発現を支配するのに用いることができる。それは、制御された発現が、例えば、膜タンパク質の発現および挿入に好都合である場合に用いることができる。
【００９３】
実施例１０
ＣＬＤ０２８およびＣＬＤ０３５バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。各々１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、別々に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した各々２ｘ５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。これらを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこれら培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに別々に接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そしてインキュベーションを上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表９に要約する。
【００９４】
【表９】
2015006193.tif 000025
【００９５】
これらデータは、前の実施例４および５に示されたデータと総合して、Ｅ．coli Ｋ−
１２およびＢ双方の菌株を用いることができるということを示した。
実施例１１
発酵接種材料は、下記の菌株について各々２００μｌのグリセロール貯蔵液を、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足した２００ｍＬの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）が入っている２．０Ｌバッフル付きシェークフラスコに加えることによって増大させた。接種材料は、シェーカー・インキュベーター中、３７℃において２５０ｒｐｍの撹拌で１２時間増殖させた。２００ｍｌのシェークフラスコ接種材料を用いて、１０Ｌのバッチ増殖培地が入っている１５Ｌ作業容量発酵装置に接種した。発酵は、下記の操作条件下で行った。温度は、３７℃で制御し、そして３５％（ｗ／ｖ）水酸化アンモニウムの自動添加によって、ｐＨを６．８で制御した。溶存酸素張力（dissolved oxygen tension）（ｄＯＴ）設定点は、３０％の空気飽和とし、発酵装置撹拌機速度の２５０ｒｐｍ最小値〜１５００ｒｐｍ最大値までの自動調整、および入口ガス流への酸素の自動補給によって制御した。発酵装置容器への空気流量は、最後まで１０Ｌ／分であった。発酵装置中の圧力は、５０〜２００ｍｂａｒで維持した。
【００９６】
発酵は、バッチ様式で、炭素源（すなわち、グリセロール）が消耗するまで行ったが、それは、接種後約１０時間に認められ且つｄＯＴの鋭敏な上昇を特徴とした。バッチ供給発酵は、炭素源排出地点において、１Ｌの培地につき１１ｇ／時のグリセロール供給量で供給されるグリセロール／塩化マグネシウムの添加によって開始した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがＯＤ６００＝５０〜６０に達したら、０．５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧの添加によって行った。バッチ供給相は、誘導後１２時間続けた。試料を採取して、採取時のバイオマスレベル（ＯＤ６００）およびｈＴＮＦα蓄積（％ＴＣＰ）／ｈＴＮＦαタイター（ｇ／Ｌ）を決定した（Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）。
【００９７】
バッチ増殖培地の組成を、表１０に与える。
【００９８】
【表１０】
2015006193.tif 000026
【００９９】
供給されるグリセロール／塩化マグネシウムの組成を、表１１に与える。
【０１００】
【表１１】
2015006193.tif 000027
【０１０１】
それら結果を、表１２に要約する。ＣＬＤ３０菌株のｈＴＮＦα生産性プロフィールを、図４に示す。
【０１０２】
【表１２】
2015006193.tif 000028
【０１０３】
データは、明らかに、異種タンパク質の製造のためのそれら系の有用性を示している。高生産物タイターは、単純で包括的な未最適化発酵・誘導法を用いて達成した。図４に例示される生産性プロフィールによって示されるようなプラスミドｐＡＶＥ０２７の制御特性は、異種タンパク質、具体的には、分泌を最大にするように発現の制御を必要とするタンパク質の生産を最大にするのに利用することができる。
【０１０４】
実施例１２
ＣＬＤ０５０バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．０５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、別のフラスコは未誘導のままにし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表１３に要約する。
【０１０５】
【表１３】
2015006193.tif 000029
【０１０６】
驚くべきことに、二重完全パリンドロームオペレーター配列は、その間隔を増加させた場合に作用した。二重完全パリンドロームの間隔を変更して、例えば、他のプロモーター
の有効な制御を達成することができる。
【０１０７】
実施例１３
ＣＬＤ０４８バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）
、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。そのフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そしてインキュベーションを、上記の条件下で更に２時間続けた。次に、細胞と、残留細胞不含増殖培地を採取した。採取された細胞に、浸透圧ショック細胞分画を更に行って、可溶性Ｅ．coli ペリプラ
ズム画分に分配されたタンパク質を含有する細胞画分を単離した。可溶性ペリプラズム抽出物および残留増殖培地中の生物学的に活性なＤ１．３Ｆａｂの蓄積は、精製された活性Ｄ１．３Ｆａｂで作成された標準曲線に関するＥＬＩＳＡ検定において、リゾチーム（lysoszyme）（抗原）へのＤ１．３Ｆａｂの結合を決定することによって算定した。Ｅ．coli のペリプラズム中および残留増殖培地中（ペリプラズムから増殖培地への物質の漏出による）の生物学的に活性なＤ１．３Ｆａｂの蓄積を、表１４に示す。ペリプラズムおよび残留増殖培地中のＤ１．３Ｆａｂの蓄積を、１単位のバイオマス（ＯＤ６００）につき培養物１リットル当たりのμｇ活性物質として規格化した。
【０１０８】
【表１４】
2015006193.tif 000030
【０１０９】
異種タンパク質、具体的には、複雑なジスルフィド結合形成を必要とするタンパク質の高レベル分泌を可能にするようにこの系によって与えられる制御の有用性は、明らかに、Ｅ．coli ペリプラズム中の生物学的に活性なＤ１．３Ｆａｂの高レベルの分泌および蓄積
によって例示される。更に、バッチ供給発酵（例えば、前の実施例１１または下の実施例１４に記載の）を用いて、このようなタンパク質を高収率で製造することができる方法は、当業者に明らかであろう。
【０１１０】
実施例１４
実施例１１に記載の発酵法を、ＣＬＤ０４８を用いて繰り返した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがＯＤ６００＝約５０に達したら、０．１５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧの添加によって行った。バッチ供給相は、誘導後３５〜４５時間続けた。次に、細胞と、残留細胞不含増殖培地を採取した。採取された細胞に、浸透圧ショック細胞分画を更に行って、可溶性Ｅ．coli ペリプラズム画分に分配されたタンパク質を含有する細胞画分を
単離した。可溶性ペリプラズム抽出物および残留増殖培地中の生物学的に活性なＤ１．３Ｆａｂの蓄積は、精製された活性Ｄ１．３Ｆａｂで作成された標準曲線に関するＥＬＩＳＡ検定において、リゾチーム（lysoszyme）（抗原）へのＤ１．３Ｆａｂの結合を決定す
ることによって算定した。ペリプラズムおよび残留増殖培地中のＤ１．３Ｆａｂの蓄積を、「培養物１リットル当たりのｍｇ活性物質」として規格化した。
【０１１１】
Ｅ．coli のペリプラズム中および残留増殖培地中（ペリプラズムから増殖培地への物
質の漏出による）の生物学的に活性なＤ１．３Ｆａｂの蓄積を、表１５に示す。
【０１１２】
【表１５】
2015006193.tif 000031
【０１１３】
生物学的に活性なＤ１．３Ｆａｂの高レベル分泌は、発現系を用いて示す。
実施例１５
合成二重特異性単一鎖四価ダイアボディー（diabody）（ｂｓｃｔＤｂ）を設計したが
、それは、Ｄ１．３からの可変軽領域および可変重領域（抗リゾチーム）と、Ａ５Ｂ７（抗ＣＥＡ（癌胎児性抗原））を、単一ポリペプチド鎖上で連結していた。この分子のＤＮＡ配列を、図５に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２２）。これを、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＡＶＥ４６中にＮｄｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてクローン化した。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０７８と称した。ｐＡＶＥ０７８を、Ｅ．coli Ｗ３１１０中に形質転換して、ＣＬＤ０７３を製造し、それを精製し、グリセロ
ール貯蔵液中において−８０℃で維持した。
【０１１４】
ＣＬＤ００７３バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）およびグルコース（１ｇ／Ｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid
）、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した
。これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２個の２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、０．５ｍＭかまたは０．１ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧで誘導し、そしてインキュベーションを、上記の条件下で更に２０時間続けた。次に、細胞と、残留細胞不含増殖培地を採取した。採取された細胞に、浸透圧ショック細胞分画を更に行って、可溶性Ｅ．coli ペリプラズム画分に分配されたタ
ンパク質を含有する細胞画分を単離した。ペリプラズム抽出物および残留増殖培地中の生物学的に活性なＤ１．３−Ａ５Ｂ７  ｂｓｃｔＤｂの発現、分泌、フォールディングおよび蓄積は、競合的ＥＬＩＳＡ検定においてＣＥＡ（抗原）への抗ＣＥＡ単クローン性抗体の結合の阻害を決定することによって、および競合的ＥＬＩＳＡ検定においてリゾチーム（抗原）への抗リゾチームＦａｂ抗体フラグメントの結合によって算定した。
【０１１５】
得られたデータは、Ｄ１．３−Ａ５Ｂ７  ｂｓｃｔＤｂの大部分が、誘導の最後に残留増殖培地中に分配されたこと（ペリプラズムからの漏出）を示した。このデータ（競合的ＥＬＩＳＡ検定におけるｂｓｃｔＤｂの結合）を、表１６に示す。得られたデータは、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導された培養物からの残留増殖培地試料が、競合ＥＬＩＳＡ検定
において抗ＣＥＡおよび抗リゾチーム双方の抗体の結合を競合的に阻害するということを示している。０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導された培養物からの残留増殖培地試料は、低下した阻害レベルを示して、この試料中の生物学的に活性なＤ１．３−Ａ５Ｂ７  ｂｓｃｔＤｂの一層低い蓄積レベルを示している。
【０１１６】
【表１６】
2015006193.tif 000032
【０１１７】
新しい発現系を用いると、Ｅ．coli を用いて生じることが困難であった複雑な多重鎖
異種タンパク質を生じることが可能である。これは、生物学的に活性な形の二重特異性単一鎖四価ダイアボディーが、新しい発現系を用いてＥ．coli 中で生じることができると
いうことを示すことによって例示された。これは、更に、発現系の有用性を例示している。
【０１１８】
実施例１６
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−３Ｃプロテイナーゼ融合（ＧＳＴ−３Ｃ）遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＡＶＥ０１１中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化した。インサートの配列を、図６に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３）。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０５２と称した。ｐＡＶＥ０５２を、Ｅ．coli ＢＬ２１中に形質転換して、ＣＬＤ０５４を製造し、それを精製し
、グリセロール貯蔵液中において−８０℃で維持した。
【０１１９】
ヒトインターフェロンα２（ＩＦＮα２）遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＡＶＥ０１１中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化した。インサートの配列を、図７に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４）。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０５８と称した。ｐＡＶＥ０５８を、Ｅ．coli Ｗ３１１０中に形質
転換して、ＣＬＤ０５９を製造し、それを精製し、グリセロール貯蔵液中において−８０℃で維持した。
【０１２０】
ヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子は、Ｅ．coli 中の発現に最適化されたコドン
であったが、それを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＡＶＥ０１１中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化した。インサートの配列を、図８に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２５）。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０６１と称した。ｐＡＶＥ０６１を、Ｅ．coli Ｗ３１１０中に形質転換して、ＣＬＤ０６０を製造し
、それを精製し、グリセロール貯蔵液中において−８０℃で維持した。
【０１２１】
ＣＬＤ０５４、ＣＬＤ０５９およびＣＬＤ０６０を用いたバッチ供給発酵を、実施例１
１に記載の培地および方法条件を用いて行った。発酵は、表１９に記載のように３０℃または３７℃で維持した。発酵は、バッチ様式で、炭素源（すなわち、グリセロール）が消耗するまで行った。バッチ供給発酵は、この時点で、グリセロール（７１４ｇ／Ｌ）および硫酸マグネシウム（３０ｇ／Ｌ）を含有する供給材料の添加によって開始した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがＯＤ６００＝５０〜６０に達したら、ＩＰＴＧの添加によって行った。用いられるＩＰＴＧ濃度を、表１７に記載する。バッチ供給相は、誘導後１２〜１５時間続けた。試料を、発酵の間中採取して、バイオマスレベル（ＯＤ６００）およびタンパク質生産物を決定した（（ＧＳＴ−３Ｃ、ＩＦＮα２およびＥＰＯ）タイター（ｇ／Ｌ）、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて）。
【０１２２】
【表１７】
2015006193.tif 000033
【０１２３】
表１７に示されたデータは、更に、広範囲の異種タンパク質の製造のためのそれら系の有用性を示す。高生産物タイターは、誘導に用いられたＩＰＴＧ濃度のみの操作と共役した単純で包括的な発酵法を用いて達成する。これは、治療的に有用な異種タンパク質の方法開発時刻表を縮小するのに特に有益である。
【０１２４】
実施例１７
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）からのＬ−２−ハロアルカノエートデハロゲナーゼ（ｈａｄＬ）遺伝子を、ＰＣＲを用いて遺伝子操作されたＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ部位を用いてクローン化した。その遺伝子配列を、図９に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２６）。プラスミドｐＡＶＥ０１１を、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで消化し、バンドをゲル抽出した。ｈａｄＬ遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてｈａｄＬ遺伝子を、ゲル抽出し且つｐＡＶＥ０１１に連結して、ｐＡＶＥ０７５を生じた。シュードモナス・サバスタノイ（Pseudomonas savastanoi）複製起点を、ＰＣＲを用いて、プラスミドｐＣＮ６０（ＡＴＣＣ７７１０１；Nieto C, et al. (1990) Gene 87: 145-149）から
コピーした。
【０１２５】
用いられたプライマーは、次であった。
【０１２６】
【化１５】
2015006193.tif 000034
【０１２７】
そのＰＣＲ産物を、最初に、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１（Invitrogen）中に、次に、ＢｇｌII消化によってｐＡＶＥ０７５中にクローン化した。得られたプラスミドｐＡＶＥ０８６を、Pseudomonas putida ＮＣＩＭＢ１２０１８中にエレクトロポレーションに
よって形質転換して、ＣＬＤ０７５を製造し、それを精製し、グリセロール貯蔵液中において−８０℃で維持した。ＣＬＤ０７５バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）、１０
ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。これを
、オービタルシェーカー中において３０℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２個の２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに別々に接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、一つのフラスコを、０．５ｍＭの最終濃度へのＩＰＴＧで誘導し、もう一つのフラスコは、未誘導のままにして、基底発現を監視した。インキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のＨａｄＬタンパク質の蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ＨａｄＬの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。
【０１２８】
ＨａｄＬタンパク質の発現および蓄積を、図１０に示す。そのデータは、Ｔ７Ａ３：ＤＰＰＳ９１発現系が、別の原核生物宿主系において機能したことを示している。驚くべきことに、その発現系は、Pseudomonas putida において、宿主系としてＥ．coli を用いた場合に認められるのと同じ効率で行った。基底発現は、誘導物質の不存在下における２３時間インキュベーション後でも検出されなかった。高レベルのタンパク質発現および蓄積は、Pseudomonas putida において、ＩＰＴＧを用いた誘導後に達成した。
【０１２９】
実施例１８
Pseudomonas putida ＣＬＤ０７５を用いたバッチ供給発酵を、実施例１１に記載の包
括的なＥ．coli 培地および方法条件を用いて行った。発酵は、３０℃およびｐＨ７．０
で維持した（２５％水酸化アンモニウムおよび１０％リン酸で制御される）。発酵は、バッチ様式で、炭素源（すなわち、グリセロール）が消耗するまで行った。バッチ供給発酵は、この時点で、グリセロール（７１４ｇ／Ｌ）および硫酸マグネシウム（３０ｇ／Ｌ）を含有する供給材料の添加によって開始した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがＯＤ６００＝５０に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によって行った。バッチ供給相は、誘導後１２〜１５時間続けた。試料を、発酵の間中採取して、バイオマスレベル（ＯＤ６００）およびＨａｄＬタンパク質蓄積（（％ＴＣＰ）試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）を決定した。誘導後のＣＬＤ０７５の増殖およびＨａｄＬタンパク質の発現／蓄積を、図１１に示す。
【０１３０】
高レベルのタンパク質発現および蓄積（＞４０％ＴＣＰ）は、Pseudomonas putida に
おいて発現系を用いて、Ｅ．coli で用いるために設計された包括的な増殖培地を用いる
だけで達成した。
【０１３１】
実施例１９
合成Ｇａｌリプレッサー遺伝子（Ｅ．coli）を、（ＥＰ０５０２６３７号に記載の）ベクターｐＺｅｎ０４２中に、ＰｓｔＩ部位中へのＰｓｔＩフラグメントとしてクローン化した。クローンは、時計回りおよび反時計回り双方の配向のＧａｌリプレッサー遺伝子で識別した。反時計回り配向のクローンを選択して、ｐＡＶＥ０７１を生じた。
【０１３２】
Ｇａｌプロモーターおよびオペレーター配列の構築は、ＵＳ６，５３７，７７９号に記載のように製造されたプラスミドｐＺＴ７＃２．０中で開始した。ｐＺＴ７＃２．０は、ｐＡＴ１５３ベクター主鎖、ｃｅｒ安定性配列、ｔｅｔＡ／Ｒ、目的の遺伝子の上流の単一天然ｌａｃオペレーター配列および上流Ｔ４転写ターミネーターを有する。天然Ｇａｌオペレーター配列を修飾して、完全パリンドロームオペレーター配列を生じた。これを、上記のプラスミド中に、合成リンカーを用いてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によってクローン化した。リンカーＧａｌＢは、オリゴヌクレオチドＧａｌＢ１およびＧａｌＢ２：
【０１３３】
【化１６】
2015006193.tif 000035
【０１３４】
をアニーリングすることによって製造した。
次に、そのリンカーを、プラスミドｐＺＴ７＃２．０に連結し、そしてクローニング宿主菌株ＸＬ−１ Blue ＭＲ（Stratagene）中にＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、ＡｇｅＩを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。ｈＴＮＦα遺伝子を、このプラスミド中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてクローン化した。
【０１３５】
ｈＴＮＦα遺伝子および部分Ｇａｌ完全パリンドロームオペレーター配列を、ＸｍａＩおよびＭｓｃＩで消化し、そしてＸｍｎＩおよびＸｍａＩで消化されたｐＡＶＥ０７１中に連結することによってクローン化した。クローンは、ｈＴＮＦα遺伝子の存在について、制限消化によってスクリーニングした。
【０１３６】
上流完全パリンドロームＧａｌオペレーターおよびＧａｌプロモーターを、各々、このプラスミド中に、合成リンカーを用いてＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ部位によってクローン化した。リンカーＧａｌＡは、オリゴヌクレオチドＧａｌＡ１およびＧａｌＡ２：
【０１３７】
【化１７】
2015006193.tif 000036
【０１３８】
をアニーリングすることによって製造した。
リンカーの存在は、ＭｆｅＩでの消化で検出し、シークエンス法によって確認した。このプラスミドを、Ｅ．coli 菌株Ｗ３１１０中に形質転換して、ＣＬＤ０８５を生じ、そ
れを精製し、グリセロール貯蔵液中において−８０℃で維持した。
【０１３９】
ＣＬＤ０８５バイアルを、−８０℃フリーザーから取り出し、融解させた。１０μｌの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補足した５ｍｌの Luria Broth（ＬＢ；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Oxoid）、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Oxoid）および５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）中に接種した。これを、オービタルシェーカー中において３７℃で１６時間インキュベートした。次に、５００μｌのこの培養物を用いて、５０ｍｌの Luria Broth（上記の組成）が入っている２５０ｍｌ Erlenmeyer フラスコに接種した。そのフラスコを、オービタルシェーカー中において３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は、ＯＤ６００＝０．５〜０．７まで監視した。この時点で、フラスコを、１０．０ｍＭの最終濃度へのガラクトースで誘導した。インキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のｈＴＮＦαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルは、試料採取された細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の（抗ｈＴＮＦα抗体を用いた）ウェスタンブロット分析を用いて決定した。そのデータを、図１７に示す。これは、完全パリンドロームｇａｌオペレーター配列を、ｇａｌリプレッサー遺伝子と組み合わせて用いることが、誘導物質の不存在下におけるｇａｌプロモーターの極めて堅固な抑制をもたらすが、驚くべきことに、誘導物質ガラクトースを加えた場合に、誘導能力がなお維持されているということを示している。
【０１４０】
実施例２０
非組込み酵母ベクターを、次のように構築した。
（１）ＸｈｏＩで消化されたｐＣＲ２．１（Invitrogen）中へのＸｈｏＩフラグメントとしてのクローン配列１（Saccharomyces cerevisiae ＣＹＣ１プロモーターの下流のＥ
．coli ＬａｃＩ）。クローン配列１を、図１５に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３５）。
【０１４１】
（２）プラスミド２を生じるように工程１で構築された、ＨｉｎｄIIIで消化されたプ
ラスミド中へのＨｉｎｄIIIフラグメント（ＰＣＲで製造される）としてのクローン配列
２（Saccharomyces cerevisiae ＭＦ−α１遺伝子プロモーターであって、ＭＦ−α１プ
ロモーター領域の両側に完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列を含むものと、タンパク質エラフィン（elafin）の遺伝子配列であって、下流に位置するＣ末端ｃ−ｍｙｃ標識（エラフィン−ｃｍｙｃ）を含むものから成る）。クローン配列２を、図１６に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３６）。
【０１４２】
（３）ＬＥＵ２（選択マーカー遺伝子）および酵母２μ複製起点を含有する、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）からのＳｐｅＩフラグメントを、ＳｐｅＩで消化されたプラスミド２中にクローン化して、ｐＡＶＥ０９１を生じる。
【０１４３】
ｐＡＶＥ０９１プラスミドＤＮＡを、Saccharomyces cerevisiae ＸＳ９５−６Ｃ（Ａ
ＴＣＣ２０４６８８）中にエレクトロポレーションによって形質転換し、そして陽性コロニーを、ロイシン不含の酵母脱落培地（yeast drop-out medium）上で選択した（Kaiser C, Michaelis S and Mitchel A (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Manual, 1994)）。エラフィン−ｃｍｙｃタンパク質発現を決定するシェークフラスコ増殖研究を、同じ培地を用いて行った。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。クローンを、約３のＯＤへと増殖させ、そして０．５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導した。インキュベーションを、上記の条件下で更に１６時間続け、その間に、増殖培地中へのエラフィン−ｃｍｙｃタンパク質の分泌と増殖の測定用に試料を採取した。残留増殖培地中へのエラフィン−ｃｍｙｃの分泌は、Wiedow O, et al, J Biol Chem. (1990) 265(25):14791-5 に記載のように、
エラスターゼ阻害酵素検定を用いて決定した。４時間のＩＰＴＧ誘導後、増殖培地中に３０ｍｇ／Ｌの活性エラフィンタンパク質が存在した。これは、本発明の発現系が、酵母において有効であることを示している。
【０１４４】
実施例２１
二重完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列に隣接した構成的ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを含有するＤＮＡフラグメントを合成した。これを、発現ベクター中にクローン化したところ、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質を発現した。得られたプラスミドを、ｐＡＶＥ０８１と称したが、それは、ｐＣＭＶ−Script（Stratagene）に由来し、そしてＮｄｅＩ／ＮｈｅＩフラグメント上の二重完全パリンドロームｌａｃオペレーター配列に隣接したｈＣＭＶプロモーターを、ベクターの多重クローニング部位中のＩｇＧ  ＦｃＤＮＡ配列と一緒に含有する。ｈＣＭＶプロモーターおよび二重完全パリンドロームｌａｃオペレーターのＤＮＡ配列を、図１２に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３３）。ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質のＤＮＡ配列を、図１３に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３４）。ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質を発現するｐＡＶＥ０８１およびｌａｃリプレッサーを発現するｐＣＭＶｌａｃＩ（Stratagene）の一時的コトランスフェクションを、当該技術分野において十分に記載されているように行って、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質が、ＩＰＴＧ誘導性ｈＣＭＶプロモーター・二重完全パリンドロームｌａｃオペレーター発現系の制御下で発現されうるか否かを決定した。
【０１４５】
２ｍｌのチャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）（血清不含培地中の
懸濁増殖に適応したＣＨＯ細胞系ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２）懸濁培養物を、１．５ｘ１０５個／ｍｌの生菌数で、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加えた。次に、それら６ウェル組織培養プレートを、給湿３７℃インキュベーター中において５％ＣＯ２で一晩（１６時間）インキュベート後、トランスフェクション配合物を、等量のｐＣＭＶｌａｃＩ（Stratagene）ＤＮＡを含む２μｇのｐＡＶＥ０８１  ＤＮＡ、６μｌのトランスフェクション試薬および９４μｌの増殖培地を１ウェルに付き含有して調製した。１００μｌのトランスフェクション配合物を、ＣＨＯ細胞が入っている各々のウェルに加えた。次に、それら６ウェル組織培養プレートを、給湿３７℃インキュベーター中において５％ＣＯ２でインキュベートした。増殖培地中へのＩｇＧ  Ｆｃタンパク質の発現／分泌レベルを決定するために、一組のウェル（２日目）を、５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導し、別の組のウェルを未誘導のままにした。３日目に、ＩＰＴＧで誘導された組のウェルおよび未誘導のままのものから試料採取した（ＩＰＴＧ誘導後および未誘導）。ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質のＣＨＯ細胞による増殖培地中への発現および分泌は、当該技術分野において十分に確立されているＥＬＩＳＡによって決定した。得られたデータを、図１４に示す。
【０１４６】
そのデータは、明らかに、発現系の幅広い有用性を示している。その発現系は、ｈＣＭＶプロモーターのような、哺乳動物細胞の系と一緒に典型的に用いられる強力な構成的プロモーターを制御して、哺乳動物細胞中において制御可能な誘導性方式でタンパク質を発現するのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１】
2015006193.tif 000037
【図２】
2015006193.tif 000038
【図３】
2015006193.tif 000039
【図４】
2015006193.tif 000040
【図５】
2015006193.tif 000041
【図６】
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【図７】
2015006193.tif 000043
【図８】
2015006193.tif 000044
【図９】
2015006193.tif 000045
【図１０】
2015006193.tif 000046
【図１１】
2015006193.tif 000047
【図１２】
2015006193.tif 000048
【図１３】
2015006193.tif 000049
【図１４】
2015006193.tif 000050
【図１５】
2015006193.tif 000051
【図１６】
2015006193.tif 000052
【図１７】
2015006193.tif 000053
【図１８】
2015006193.tif 000054
【配列表】
2015006193000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月18日(2014.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）酵母において有効なプロモーター；および
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列
を含む、完全パリンドロームオペレーター配列に基づくタンパク質発現系。
【請求項２】
オペレーター配列が、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎである、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している、請求項１および請求項２のいずれかに記載の発現系。
【請求項４】
オペレーター配列が、８５〜１５０塩基対間隔を置く、請求項３に記載の発現系。
【請求項５】
（ａ）酵母において有効なプロモーター；および
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列
を含む、ベクタ−。
【請求項６】
タンパク質のための発現カセットを更に含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
ベクタ−が、自律複製性プラスミドである、請求項５または請求項６に記載のベクタ−。
【請求項８】
ベクタ−が、組込みプラスミドである、請求項５または請求項６に記載のベクタ−。
【請求項９】
オペレーター配列が、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎである、請求項５〜８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
オペレーター配列が、８５〜１５０塩基対間隔を置く、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された酵母宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、または、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
タンパク質の製造方法であって、
（ａ）酵母において有効なプロモーター；
（ｂ）完全パリンドロームオペレーター配列；および
（ｃ）タンパク質のための発現カセット
を含む発現系を発現することを含む方法。
【請求項１５】
発現カセットがリコンビナントタンパク質のための発現カセットである、請求項１４に記載のリコンビナントタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
オペレーター配列が、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎである、請求項１４および請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
オペレーター配列が、８５〜１５０塩基対間隔を置く、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項６に記載のベクターで形質転換された酵母を培養し；そして
（ｂ）該タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項２０】
酵母が、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、または、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ベクターが、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏまたはｇｌｎからなる群より選択されるオペレーターを含む、請求項１９および請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ベクターが二つの完全パリンドロームオペレーター配列を含み、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ベクターが、８５〜１５０塩基対間隔を置くオペレーター配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の発現系により調製されたタンパク質をヒトに投与することを含む、ヒトの治療方法。
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月18日(2014.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
【図１】図１は、Ｄ１．３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１７）を示す。
【図２】図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定したｈＴＮＦαの蓄積レベルを示す。
【図３】図３は、ＣＬＤ０３８菌株についてのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図４】図４は、ＣＬＤ３０菌株のｈＴＮＦα生産性プロフィールを示す。
【図５】図５は、Ｄ１．３−Ａ５Ｂ７二重特異的単一鎖四価ダイアボディー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２２）配列を示す。
【図６】図６は、ＧＳＴ−３Ｃ融合配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３）を示す。
【図７】図７は、ヒトインターフェロンα２配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２４）を示す。
【図８】図８は、ヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２５）を示す。
【図９】図９は、Ｌ−２−ハロアルカノエートデハロゲナーゼ（ｈａｄＬ）配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２６）を示す。
【図１０】図１０は、ＨａｄＬタンパク質の発現および蓄積を示す。
【図１１】図１１は、誘導後のＣＬＤ０７５の増殖およびＨａｄＬタンパク質の発現／蓄積を示す。
【図１２】図１２は、ｈＣＭＶプロモーターおよびｌａｃオペレーター配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３３）を示す。
【図１３】図１３は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３４）を示す。
【図１４】図１４は、ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質のＣＨＯ細胞による増殖培地中への発現および分泌を示す。
【図１５】図１５は、実施例２０に用いられるクローン配列１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３５）を示す。
【図１６】図１６は、実施例２０に用いられるクローン配列２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３６）を示す。
【図１７】図１７は、ウェスタンブロット分析を用いて決定したｈＴＮＦαの蓄積レベルを示す。
【図１８】図１８は、ｐＡＶＥ０１３のプラスミド地図を示す。