(57)【要約】【課題】培養中の被観察物を高倍率で観察する。【解決手段】培養液に浸漬された被観察物を観察対象として顕微鏡により観察する観察方法であって、培養液に接触した対物レンズを滅菌する滅菌段階を備える。上記観察方法において、滅菌段階は、流水、オゾンガス、エチレンオキシドガス、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、フッ酸、紫外線、ガンマ線および電子線の少なくともひとつに対して対物レンズを暴露する段階を含んでもよい。また、上記観察方法において、滅菌段階は、対物レンズを保持するレボルバを回転させて、対物レンズを観察対象から遠ざける段階を含んでもよい。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液に浸漬された被観察物を観察対象として顕微鏡により観察する観察方法であって、前記培養液に接触した対物レンズを滅菌する滅菌段階を備える観察方法。
【請求項２】
前記滅菌段階は、オゾンガス、エチレンオキシドガス、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、フッ酸、紫外線、ガンマ線および電子線の少なくともひとつに対して前記対物レンズを暴露する段階を含む請求項１に記載の観察方法。
【請求項３】
前記滅菌段階は、前記対物レンズを保持するレボルバを回転させて、前記対物レンズを観察対象から遠ざける段階を含む請求項１または請求項２に記載の観察方法。
【請求項４】
前記滅菌段階は、前記対物レンズを滅菌する前に前記顕微鏡から取り外す段階を更に含む請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項５】
前記滅菌段階は、取り外した前記対物レンズを収容したケース内で滅菌する段階を更に含む請求項４に記載の観察方法。
【請求項６】
前記対物レンズを、前記培養液に浸漬する前に滅菌する他の滅菌段階を更に有する請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項７】
前記対物レンズを洗浄する段階を更に含む請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項８】
前記洗浄する段階は、前記対物レンズを、流水に晒す段階を含む請求項７に記載の観察方法。
【請求項９】
培養液に浸漬された被観察物を観察対象として、前記培養液に対物レンズを浸漬して観察する顕微鏡であって、前記培養液に接触した前記対物レンズを滅菌する滅菌部を備える顕微鏡。
【請求項１０】
前記滅菌部は、前記対物レンズを、オゾンガス、エチレンオキシドガス、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、フッ酸、紫外線、ガンマ線および電子線の少なくともひとつに暴露する請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記滅菌部は、回転することにより保持した前記対物レンズを前記観察対象から遠ざけるレボルバを有する請求項９または請求項１０に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記滅菌部は、前記レボルバに対して前記対物レンズを脱着して交換する脱着機構を更に備える請求項１１に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記滅菌部は、前記レボルバから取り外した前記対物レンズを収容して滅菌するケースを更に備える請求項１１または請求項１２に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察方法および顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養中の細胞、組織等の被観察物を、顕微鏡により観察する場合がある（例えば、特許文献１参照）。
［特許文献１］  特開２０１３−１３８６９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
高倍率で観察する場合には、被観察物が浸漬された培養液に対物レンズを浸漬させる。このため、対物レンズを媒介して、観察サンプルが汚染される虞がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１態様においては、培養液に浸漬された被観察物を観察対象として顕微鏡により観察する観察方法であって、培養液に接触した対物レンズを滅菌する滅菌段階を備える観察方法が提供される。
【０００５】
本発明の第２態様においては、培養液に浸漬された被観察物を観察対象として、培養液に対物レンズを浸漬して観察する顕微鏡であって、培養液に接触した対物レンズを滅菌する滅菌部を備える顕微鏡が提供される。
【０００６】
上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションも発明となり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】レーザ顕微鏡１００の模式図である。
【図２】レーザ顕微鏡１００の原理を説明する模式図である。
【図３】培養容器２００の模式的断面図である。
【図４】観察手順を示す流れ図である。
【図５】観察手順の一部を示す模式的断面図である。
【図６】観察手順の一部を示す模式的断面図である。
【図７】レボルバ１７０の模式的断面図である。
【図８】観察手順の一部を示す模式的断面図である。
【図９】観察手順の一部を示す模式的断面図である。
【図１０】観察手順の一部を示す模式的断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、下記の実施形態は特許請求の範囲に係る発明を限定するものではない。実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【０００９】
図１は、細胞観察に使用できるレーザ顕微鏡１００の構造を示す模式図である。レーザ顕微鏡１００は、ステージ１１０、レーザ装置１２０、走査系１３０、光学系１４０、検出系１５０および制御系１６０を備える。
【００１０】
レーザ顕微鏡１００は、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱）、ＳＲＳ（誘導ラマン散乱）等の非線形光学効果を利用して、培養した細胞、組織および微生物等を生かしたまま観察することができる。また、レーザ顕微鏡１００は、位相差顕微鏡としても使用できる。
【００１１】
レーザ顕微鏡１００において、ステージ１１０は、レーザ顕微鏡１００により観察されるサンプル１１２を支持する。ステージ１１０に支持されたサンプル１１２に対しては、一方の面（図示の例では図中下面）からレーザ光が照射される。また、ステージ１１０に対して、レーザ光が照射される側とは反対の側から射出されるＣＡＲＳ光を検出して観察画像が形成される。
【００１２】
レーザ装置１２０は、複数のレーザ光源１２２、１２４と、コンバイナ１２６とを有する。レーザ光源１２２、１２４は、ＣＡＲＳ光検出による観察に用いられるパルスレーザを発生する。また、レーザ光源１２２、１２４が発生するパルスレーザは、互いに異なる波長λＰ、λＳを有する。
【００１３】
レーザ光源１２２、１２４としては、例えば、モードロックピコ秒Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、モードロックピコ秒イットリビウムレーザー等を用いることができる。なお、レーザ光源１２２、１２４の一方を、他方のレーザ光源１２２、１２４が発生したパルスレーザの波長を変換する光パラメトリック発振器に置き換えてもよい。
【００１４】
レーザ光源１２２、１２４により発生した２波長のピコ秒パルスのうち、短い方の波長λＰを有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるポンプ光として利用される。また、レーザ光源１２２、１２４の発生するピコ秒パルスのうち、長い方の波長λＳ有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるストークス光として利用される。
【００１５】
コンバイナ１２６は、複数のレーザ光源１２２、１２４が発生したレーザ光を統合して単一の光路上に照射光として射出する。これにより、ポンプ光とストークス光とを併せた照射光をサンプル１１２に照射してＣＡＲＳ光を発生させることができる。
【００１６】
なお、レーザ装置１２０には、レーザ光源１２２、１２４が発生するポンプ光とストークス光とを同期させる目的で遅延光路を設けてもよい。遅延光路は、互いの間隔を変更できる複数の反射鏡により形成できる。また、レーザ装置１２０においては、フォトニック結晶ファイバを用いてストークス光を広帯域化してもよい。
【００１７】
レーザ顕微鏡１００において、走査系１３０は、ガルバノスキャナ１３２およびスキャンレンズ１３４を有する。ガルバノスキャナ１３２は、互いに向きが異なる２軸の周りを揺動する反射鏡を備え、入射した照射光の光路を、光軸と交差する方向に二次元的に変位させる。スキャンレンズ１３４は、ガルバノスキャナ１３２から射出された照射光を、予め定められた一次像面１３６上に合焦させる。これにより、レーザ装置１２０から射出された照射光でサンプル１１２の観察領域を走査させ、予め定められた広さを有する観察領域に照射光を照射できる。
【００１８】
光学系１４０は、ステージ１１０に対して検出系１５０側に配された対物レンズ１４２と、ステージ１１０に対してレーザ装置１２０側に配された下側の対物レンズ１４４およびコンデンサレンズ１４６とを有する。下側の対物レンズ１４４は、サンプル１１２に向かって照射される照射光を、サンプル１１２における観察領域内で合焦させる。また、一対の対物レンズ１４２、１４４は、互いに同じ開口数（ＮＡ）を有する。
【００１９】
光学系１４０の入射端側において、レーザ装置１２０と対物レンズ１４２との間の照射光の光路上には、反射鏡１４８が配される。反射鏡１４８は、照射光の光路を折り曲げて、レーザ顕微鏡１００の構造物が過剰に高くなることを防止する。反射鏡１４８としては、全反射プリズムではなく、入射光を表面で反射させる金属鏡を用いてもよい。光学系１４０から射出された光の伝搬光路には検出系１５０が配される。
【００２０】
検出系１５０は、集光レンズ１５２、リレーレンズ１５４、光電子増倍管１５６およびダイクロイックミラー１５８を有して、サンプル１１２から射出されたＣＡＲＳ光の検出に用いられる。ダイクロイックミラー１５８は、サンプル１１２から射出された光からＣＡＲＳ光を分岐させて、集光レンズ１５２およびリレーレンズ１５４を通じて光電子増倍管１５６に導入する。よって、ＣＡＲＳ光は、光量を低下することなく、光電子増倍管１５６に効率よく受光される。
【００２１】
制御系１６０は、制御部１６２、キーボード１６４、マウス１６６および表示部１６８を有する。制御部１６２は、汎用パーソナルコンピュータに後述する制御手順を実行させるプログラムを実装することにより形成できる。
【００２２】
キーボード１６４およびマウス１６６は、制御部１６２に接続され、制御部１６２にユーザの指示を入力する場合に操作される。表示部１６８は、キーボード１６４およびマウス１６６によるユーザの操作に対してフィードバックを返すと共に、制御部１６２が生成した画像または文字列をユーザに向かって表示する。
【００２３】
また、制御部１６２は、レーザ装置１２０、検出系１５０および走査系１３０の各々に接続され、それぞれの動作を制御する。また、検出系１５０の検出結果に基づいて、表示部１６８に表示する画像を生成する。また、制御部１６２は、検出系１５０の検出結果に基づいて、サンプル１１２の状態を判定する。
【００２４】
更に、制御系１６０は、ユーザから受け付けた指示に応じて、レーザ顕微鏡１００全体の動作を制御する。また、制御系１６０は、検出系１５０の検出結果に基づいて観察画像を生成する。また、制御系１６０は、サンプル１１２の状態を反映した判定結果を示す文字列または符号を併せて出力してもよい。
【００２５】
図２は、レーザ顕微鏡１００において、被観察物がＣＡＲＳ光を発生するＣＡＲＳ過程を説明する模式図である。ＣＡＲＳ過程は、互いに異なる光周波数ω１、ω２を有するポンプ光およびストークス光の二つのレーザ光を含む励起光を被観察物に照射して、ポンプ光の光周波数ω１とストークス光の光周波数ω２との差［ω１−ω２］が、被観察物に含まれる分子の固有振動の角振動数ω０と一致した場合に発生する。
【００２６】
ＣＡＲＳ過程により、被観察物に含まれる特定の分子構造の振動モードが励振されると、分子振動が光周波数ω３を有する第３のレーザ光であるプローブ光と相互作用することにより、三次の非線形分極に由来するＣＡＲＳ光がラマン散乱光として発生する。
【００２７】
更に、ポンプ光はプローブ光としても利用できるので、［ω１＝ω３］という条件の下で、ＣＡＲＳ光が発生する。被観察物において発生するＣＡＲＳ光は、［ωＣＡＲＳ＝ω１−ω２＋ω３］を満たす光周波数を有する。よって、被観察物から射出されたＣＡＲＳ光を検出することにより、被観察物に含まれる特定の分子構造、例えば官能基の存在を検出できる。また、照射光を被観察物に照射する位置を変えながら繰り返しＣＡＲＳ光を検出することにより、被観察物における特定の分子構造の分布を画像化することができる。
【００２８】
ＣＡＲＳ光は自発ラマン散乱光等に比べると光強度が高いので、光電気変換素子を用いた場合に短時間で検出できる。よって、検出に要する時間が単に短くなるばかりではなく、ビデオレートでの観察もできる。これにより、特定分子構造の分布だけではなく、分布の変化も検出することができる。また、被観察物に照射する照射光の帯域を、生細胞に与えるダメージが少ない赤外帯域とすることにより、被観察物の生細胞を生かしたまま観察することができる。
【００２９】
更に、非線形効果により生じるＣＡＲＳ光は、下側の対物レンズ１４４により照射光が絞り込まれた極めて狭い領域において発生する。このため、ＣＡＲＳ光検出の対象となる領域は、照射光の光軸に交差する方向と、光軸と平行な方向の両方に関して狭い領域となる。よって、ＣＡＲＳ光による被観察物の観察は、立体的に高い解像度を有する。
【００３０】
よって、赤外帯域または近赤外帯域の照射光を用いて、観察平面を被観察物の内部に形成してもよい。また、観察平面を、被観察物の深さ方向に順次移動させることにより、特定の分子構造の三次元的な分布を反映した画像を生成することもできる。
【００３１】
また更に、被観察物の特定の位置に照射する照射光の光周波数を変化させることにより、当該照射位置から射出されたラマン散乱光の周波数分布を示すスペクトル画像が得られる。また、照射光の光路に対して交差する方向に被観察物を移動させながら照射光を繰り返し照射することにより、上側の対物レンズ１４２の焦点を含む観察平面における特定の分子の分布を画像化して検出画像を生成できる。
【００３２】
図３は、レーザ顕微鏡１００におけるサンプル１１２の模式的断面図である。ここで、レーザ顕微鏡１００の被観察物になる細胞シート１１１は、培養容器２００に収容された状態で、サンプル１１２としてステージ１１０に置かれる。
【００３３】
なお、細胞シート１１１は、被検者から採取した細胞を培養して作成された、シート状をなす細胞組織を意味する。培養された細胞シートは、細胞が生きている状態のまま被検者の生体組織に付着させさて使用される。このため、培養の過程で培養量、細胞生存率等を検査する場合も、細胞シート１１１の細菌等による汚染は厳重に防止される。
【００３４】
レーザ顕微鏡１００において、ステージ１１０には、ステージ１１０上に置かれた培養容器２００の底面を露出させる観察窓１１４が設けられる。これにより、ステージ１１０に置かれた培養容器２００は、底面側からも、上面側からも観察することができる状態になる。また、ステージ１１０に置かれた培養容器２００に対しては、底面側からも、上面側からも励起光を照射できる。
【００３５】
培養容器２００は、保持部２１０および透過部２２０を有する。保持部２１０は、樹脂により形成された短い円筒形の形状を有する。保持部２１０は、円筒形の側壁を形成して、下端面においてステージ１１０の上面に接する。保持部２１０の下面中央は、開口部２１２を形成する。
【００３６】
透過部２２０は、保持部２１０により保持され、保持部２１０の開口部２１２を液密に封止して、培養容器２００の底面を形成する。これにより、培養容器２００は、培養液２４０を漏らすことなく収容できる。また、透過部２２０により形成された培養容器２００の底面は光学的に高度に透明になる。
【００３７】
なお、保持部２１０は、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂により形成できる。透過部２２０は、例えば、カバーガラス等の透明な無機材料により形成できる。
【００３８】
培養容器２００において、透過部２２０の上面、即ち、培養容器２００の内側の底面には、温度応答性ポリマー層２３０が付着している。温度応答性ポリマー層２３０は、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドにより形成できる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、３０度前後の温度を境として水和力が変化する。よって、細胞シート１１１を、酵素処理等によるダメージを与えることなく、培養容器２００の底面に固定または開放できる。
【００３９】
なお、温度応答性ポリマー層２３０の材料はポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドに限られるわけではなく、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−（またはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体およびビニルエーテル誘導体のいずれか、または、２種以上を組み合わせて使用できる。また、上記以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、ポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。更に、所与の温度応答性を喪失しない範囲で架橋させて使用することもできる。
【００４０】
上記のような培養容器２００において、細胞シート１１１は、培養液２４０に浸漬され、温度応答性ポリマー層２３０により底面に固定された状態で観察される。培養容器２００の底面を形成する透過部２２０は透明なので、細胞シート１１１を培養容器２００に収容、固定したまま励起光を照射できる。
【００４１】
図４は、培養容器２００に固定された細胞シート１１１を観察する場合の手順を示す流れ図である。レーザ顕微鏡１００により細胞シート１１１を観察する場合は、まず、使用するレーザ顕微鏡１００の対物レンズ１４２を滅菌する（ステップＳ１０１）。
【００４２】
細胞シート１１１等の生きた細胞は、それ自体が汚染により劣化する上に、最終的に人体に接触させるので、汚染は厳しく戒められる。よって、細胞シート１１１を浸漬させた培養液２４０に接触する対物レンズ１４２は、培養液２４０に触れる前の段階で滅菌される。ここで、滅菌とは、例えば、１０−６以上のＤ値を達成することを無菌性保証水準として実行される。
【００４３】
対物レンズ１４２の滅菌は、オゾンガス、エチレンオキシドガス、ホルムアルデヒドガス、過酸化水素、亜塩素酸ナトリウム、フッ酸、紫外線、ガンマ線および電子線の少なくともひとつに対して暴露することにより実行する。ガスに暴露することにより対物レンズ１４２を滅菌する場合は、気密に閉鎖された環境において対物レンズ１４２をガスに暴露して、ガスが外部に漏れることを防止することが好ましい。また、ガス、液体等の薬剤による滅菌の後は、対物レンズ１４２に残留した薬剤の成分を取り除く処理も併せて実行することが好ましい。
【００４４】
また、その他の滅菌方法として、超音波、加圧水蒸気、界面活性剤、有機溶剤を用いた滅菌がある。
【００４５】
なお、滅菌処理においては、対物レンズ１４２に付着していた全ての微生物が同時に死滅するわけではなく、滅菌処理過程の継続時間に対して生存数が対数的に減少する。よって、処理時間を含む滅菌処理の処理条件については、事前に実行した微生物モニタリング等により予め決定しておくことが好ましい。
【００４６】
また、滅菌処理をする場合には、上記のようなガス、薬品、放射線等への暴露に先立って、流水等による洗浄処理を実行して、対物レンズ１４２に対する付着物を取り除いておくことが好ましい。これにより、対物レンズ１４２を効率よく滅菌することができる。
【００４７】
再び図４を参照すると、レーザ顕微鏡１００による細胞シート１１１の観察においては、滅菌処理済みの対物レンズ１４２を上昇させて、ステージ１１０の上面から十分に遠ざけた状態で、サンプル１１２をステージ１１０に置き（ステップＳ１０２）、対物レンズ１４２に対向させる。
【００４８】
図５は、ステージ１１０にサンプル１１２を置いた状態を示す模式的断面図である。被観察物としての細胞シート１１１を収容した培養容器２００は、レーザ顕微鏡１００のステージ１１０に置かれる。ここで、培養容器２００の保持部２１０の下面がステージ１１０の上面に密着して、培養容器２００内の細胞シート１１１は、ステージ１１０と平行に、水平に固定される。培養容器２００の内部において、細胞シート１１１は培養液２４０に浸漬されている。
【００４９】
なお、下側の対物レンズ１４４と培養容器２００の透過部２２０との間隙を充填する水１４３は、培養容器２００をステージ１１０に置く前に、予め対物レンズ１４４の上端に保持させておいてもよい。また、水１４３は、培養容器２００をステージ１１０に置いた後に、対物レンズ１４４と透過部２２０との間隙に注いでもよい。
【００５０】
ステージ１１０に置かれたサンプル１１２に対して、レーザ顕微鏡１００の下側の対物レンズ１４４は、観察窓１１４を通じて、培養容器２００の底面をなす透過部２２０下面に接近する。これにより、対物レンズ１４４を、被観察物である細胞シート１１１に対して十分に接近させることができる。
【００５１】
また、レーザ顕微鏡１００において、対物レンズ１４４と透過部２２０との間は、空気よりも屈折率が大きな水１４３等により充填することができる。これにより対物レンズ１４４の開口数（ＮＡ）を、空気中で使用する場合よりも大きくすることができる。
【００５２】
なお、レーザ顕微鏡１００においては、下側の対物レンズ１４４と細胞シート１１１との間に温度応答性ポリマー層２３０が介在することを考慮して、細胞シート１１１を観察する場合に照射するレーザ光の波長を、温度応答性ポリマー層２３０を透過しやすいことを条件として選択してもよい。
【００５３】
あるいは、温度応答性ポリマー層２３０の材料を選択できる場合は、照射するレーザ光の波長に対して透明なものを選択してもよい。また、培養容器２００において、下側の対物レンズ１４４と細胞シート１１１とに挟まれる領域の温度応答性ポリマー層２３０を予め取り除いておいてもよい。
【００５４】
再び図４を参照すると、次に、対物レンズ１４２を下降させて、対物レンズ１４２の下端を培養液２４０に浸漬させる（ステップＳ１０３）。図６は、レーザ顕微鏡１００においてサンプル１１２を観察している状態を示す模式的断面図である。
【００５５】
図示のように、対物レンズ１４２の下端を培養液２４０に浸漬させることにより、対物レンズ１４２を細胞シート１１１に対して十分に接近させることができる。
【００５６】
また、上側の対物レンズ１４２を、観察対象である細胞シート１１１に対して、下側の対物レンズ１４４と、光学的に略対称な位置におくことができる。こうして、レーザ顕微鏡１００により、細胞シート１１１のアーチファクトの少ない高倍率画像を観察できる（ステップＳ１０４）。
【００５７】
なお、細胞シート１１１を観察する場合には、対物レンズ１４２が細胞シート１１１に直接に接触することは避けることが好ましい。よって、本実施例では、対物レンズ１４２が細胞シート１１１に接触することを防止するための接触防止手段が設けられている。
【００５８】
接触防止手段は、細胞シート１１１と対物レンズ１４２との間隔を測定する測定部を備える。測定部は、細胞シート１１１の上面の位置情報と、対物レンズ１４２の位置情報とに基づいて、細胞シート１１１と対物レンズ１４２との間隔を算出する。対物レンズ１４２の位置は、例えばエンコーダのような位置計測器により計測する。
【００５９】
対物レンズ１４２の位置が固定され、培養容器２００を保持するステージが１１０が移動する場合は、ステージの位置から細胞シート１１１の位置を算出する。細胞シート１１１の位置は、細胞シート１１１の厚さから算出する。この場合、細胞シート１１１の厚さ情報は、例えば、細胞シート１１１を製造する製造装置から取得する。
【００６０】
細胞シート１１１と対物レンズ１４２との間隔が所定の値に達したときに、対物レンズ１４２の下降量を、細胞シート１１１に接触しない範囲に制限する制限部が設けられている。また、間隔が所定の値を超えたとき、または、細胞シート１１１に接触する範囲まで対物レンズ１４２が下降した場合に、音、光、映像等による警報を発生する警告部が設けられている。
【００６１】
サンプル１１２によって細胞シート１１１の厚さが異なる等、観察する細胞シート１１１の表面の位置が確定できていない場合は、細胞シート１１１の表面位置を非接触で検出するセンサ、例えばレーザ測距計をレーザ顕微鏡１００に設けてもよい。レーザ顕微鏡１００は、当該センサの検出結果に応じて対物レンズ１４２の下降量を制限してもよい。
【００６２】
または、光学的仕様の異なる複数の対物レンズ１４２を設け、積層数に応じた焦点深度を有する対物レンズ１４２に交換する機構を設ける。この場合、交換することをユーザに示す表示部を設け、交換を勧めてもよい。
【００６３】
更に、観察する細胞シート１１１が、積層された複数の細胞シート１１１を含む場合は、積層数に応じて対物レンズ１４２の下降範囲を変更してもよい。細胞シート１１１の積層数は、例えばバーコードのようにレーザ顕微鏡１００で自動的に検出できる形式で培養容器２００に表示してもよい。
【００６４】
観察が終了すると、対物レンズ１４２を上昇させて（ステップＳ１０５）、図５に示したように、対物レンズ１４２とステージ１１０との間を拡げて培養容器２００をステージ１１０から回収する（ステップＳ１０６）。こうして、ひとつのサンプル１１２に対する観察が終了すると、ステップＳ１０３において培養液２４０に浸漬された対物レンズ１４２を滅菌する（ステップＳ１０７）。ステップＳ１０７における滅菌は、ステップＳ１０１における滅菌と同じ方法でもよい。
【００６５】
次の観察手順として、観察すべき他のサンプル１１２が存在するか否かを調べる（ステップＳ１０８）。観察すべき他のサンプル１１２が存在していないことが判った場合は（ステップＳ１０８：ＮＯ）、観察手順を終了する。一方、次に観察するサンプル１１２が存在することが判った場合は（ステップＳ１０８：ＹＥＳ）、サンプル１１２の次の観察までの時間的な間隔が、予め定めた閾値を超えるか否かを調べる（ステップＳ１０９）。
【００６６】
サンプル１１２の次の観察を実行するまでの時間的な間隔が短い場合は（ステップＳ１０９：ＮＯ）、次の観察までの間に対物レンズ１４２が汚染される可能性が低いと判断して、対物レンズ１４２を再び滅菌することなく、サンプル１１２をステージ１１０に置いて（ステップＳ１０２）、次の観察を開始する。また、次の観察までの時間的な間隔が長い場合は（ステップＳ１０９：ＹＥＳ）、その間に対物レンズ１４２が汚染される可能性があると判断して、対物レンズ１４２を滅菌した後に（ステップＳ１０１）、サンプル１１２をステージ１１０に置いて（ステップＳ１０２）次の観察を開始する。
【００６７】
こうして、対物レンズ１４２に付着した培養液２４０を媒介して、サンプル１１２が他のサンプル１１２により汚染されることが防止される。なお、上記ステップＳ１０９において参照される時間的間隔の閾値は、レーザ顕微鏡１００が置かれた環境、サンプル１１２に対して要求される無菌補償レベル等に応じて決定される。
【００６８】
例えば、レーザ顕微鏡１００が無菌ボックスに収容された状態で使用されている場合は、対物レンズ１４２が雰囲気により汚染される可能性は低い。よって、時間的間隔に対して設定される閾値は長くなる。一方、サンプル１１２に対して要求される無菌補償レベルが高い場合は、汚染の可能性を極力排除すべく、時間的間隔の閾値は短く設定される。
【００６９】
図７は、レーザ顕微鏡１００が複数の対物レンズ１４２を備える例であり、複数の対物レンズ１４２のうち、一つの対物レンズ１４２が使用されている間に、他の対物レンズ１４２の滅菌作業を行う例である。複数の対物レンズ１４２は、被観察物を観察する観察位置と、対物レンズ１４２の滅菌が行われる滅菌位置との間で移動可能に設けられている。
【００７０】
図７の例では、レーザ顕微鏡１００は、複数の対物レンズ１４２を支持するレボルバ１７０を備える。レーザ顕微鏡１００において、対物レンズ１４２は、レボルバ１７０に保持される。ただし、図７においては、対物レンズ１４２の各々における光学部品の図示を省略している。
【００７１】
レボルバ１７０は、複数の対物レンズ１４２を保持しつつ、光学系１４０の光軸Ｑに対して傾斜した回転軸１７２を介して、レボルバベース１７４から支持される。回転軸１７２は、垂直な光軸Ｑに対して４５度の角度をなす傾きを有する。これにより、レボルバ１７０に支持された対物レンズ１４２のうちのひとつは、垂直な光軸Ｑに沿ってレボルバベース１７４を貫通して設けられた光路１７６と連通して、レーザ顕微鏡１００におけるサンプル１１２の観察に使用される。
【００７２】
レボルバ１７０に支持された他の対物レンズ１４２は、光軸Ｑに対して側方に変位して、サンプル１１２から遠ざかった位置で、略水平な状態になる。これにより、ひとつの対物レンズ１４２をレーザ顕微鏡１００による観察に使用しつつ、観察に用いられていない他の対物レンズ１４２を、レボルバ１７０に取り付けたまま滅菌することができる。
【００７３】
なお、図中には、レボルバ１７０が支持する一対の対物レンズ１４２が示されるが、レボルバ１７０が更に多くの対物レンズ１４２を保持してもよいことはもちろんである。また、レボルバ１７０の大きさおよび回転軸１７２の傾きも図示の例に限定されるわけではない。
【００７４】
図８は、一方の対物レンズ１４２を滅菌する方法の一例を説明する模式的断面図である。サンプル１１２の観察に使用された後、レボルバ１７０を回転させることによりサンプル１１２から遠ざけられた対物レンズ１４２に対して、まず、箱状の滅菌室１８０を側方から光軸Ｑに向かって接近させる。やがて、対物レンズ１４２の先端は、滅菌室１８０の側壁に設けられた挿通穴１８２を通じて滅菌室１８０の内部に挿入される。
【００７５】
対物レンズ１４２の先端を挿入した滅菌室１８０の内部には、流入口１８４から流出口１８６に向かって、オゾンガス等の滅菌用のガスを流通させる。これにより、観察する場合に培養液２４０に浸漬された対物レンズ１４２の先端を滅菌できる。こうして滅菌された対物レンズ１４２は、滅菌室１８０を側方に退避させた後に、レボルバ１７０を回転させることにより、再び、サンプル１１２の観察に使用できる。
【００７６】
なお、滅菌室１８０には、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、フッ酸等の溶液を流通させて対物レンズ１４２を滅菌してもよい。ただし、滅菌に液体を使用した場合は、続いて、滅菌室１８０に滅菌した乾燥空気等を流通させる等して対物レンズ１４２を乾燥させることが好ましい。
【００７７】
更に、滅菌室１８０内において、紫外線、ガンマ線および電子線等を対物レンズ１４２に対して照射してもよい。この場合、滅菌室１８０の壁面は、ガンマ線等が外部に漏洩することを防止する遮蔽材として利用される。
【００７８】
更に、レーザ顕微鏡１００による観察においては、細胞シート１１１を観察した後の滅菌に先立って、滅菌室１８０において対物レンズ１４２を洗浄する段階を設けてもよい。この洗浄により、対物レンズ１４２に対する付着物を取り除き、滅菌の効率と効果を向上させることができる。
【００７９】
なお、洗浄は、手洗い洗浄、浸漬系洗浄、超音波洗浄、ジェット系洗浄等から選択できるが、対物レンズ１４２は光学機器なので、熱水洗浄、蒸気洗浄等のように温度変化が大きい洗浄方法は好ましくない。対物レンズ１４２の洗浄には、純水、蒸留水、処理水（精製水）等を使用できる。更に、パイロジェン等の薬剤を用いて洗浄することにより、滅菌処理も兼ねることができる。
【００８０】
また、レーザ顕微鏡１００による観察においては、滅菌後に、滅菌に用いた薬剤の残留物を除去する目的で対物レンズ１４２を洗浄してもよい。これにより、滅菌に用いた薬剤が、次に観察する細胞シート１１１およびその培養液２４０にダメージを与えることを防止できる。
【００８１】
この場合の洗浄には、電界質を含まない純水、蒸留水、処理水（精製水）等を用いることが好ましい。また、残存する電界質を除去する目的で、ＲＯ水を用いて洗浄してもよい。更に、洗浄後は、雰囲気から付着した細菌の増殖を防止する目的で、即座に乾燥させることが好ましい。
【００８２】
上記のような滅菌室１８０は、レーザ顕微鏡１００の一部として設けてもよい。また、滅菌室１８０は、独立した滅菌装置として、レーザ顕微鏡１００と併せて使用してもよい。更に、レーザ顕微鏡１００を工業的な用途で用いる場合には、観察対象となるサンプル１１２を交換する毎に、レボルバ１７０を回転させて対物レンズ１４２を滅菌する動作を自動的に実行する機能をレーザ顕微鏡１００自体に設けてもよい。
【００８３】
この場合、レーザ顕微鏡１００は、観察が終了すること若しくは終了したことを検出する検出部と、検出部の検出結果に基づいてレボルバ１７０を駆動する駆動部と、滅菌室１８０を対物レンズ１４２に向けて移動させる移動部とを備える。移動部は、駆動部に同期して滅菌室１８０を移動させてもよく、上記した対物レンズ１４２が滅菌位置に移動したことを検出してから滅菌室１８０を移動させてもよい。
【００８４】
また、レーザ顕微鏡１００は、対物レンズ１４２が滅菌室１８０内に挿入された場合に、例えば、対物レンズ１４２の先端の位置、滅菌室１８０の挿通穴１８２の密閉度等を検知することにより、対物レンズ１４２が適切に洗浄および滅菌が行われる状態におかれたか否かを検出する挿入検出部を備え、挿入検出部の検出結果に基づいて、洗浄および滅菌を開始してもよい。
【００８５】
図９は、レボルバ１７０の模式的断面図である。図示の例においては、レボルバ１７０に保持された複数の対物レンズ１４２は、個々に、レボルバ１７０に対して着脱できる。よって、細胞シート１１１の観察後にレボルバ１７０を回転させて、サンプル１１２から遠ざけた対物レンズ１４２を、レボルバ１７０から取り外すことができる。すなわち、複数の対物レンズ１４２は、被観察物を観察する観察位置と、対物レンズ１４２の着脱が行われる着脱位置との間で移動可能に設けられている。
【００８６】
図１０は、取り外した対物レンズ１４２を滅菌する場合に用いる滅菌ケース１９０の模式的断面図である。滅菌ケース１９０は、レボルバ１７０の近傍に配され、レボルバ１７０から取り外された対物レンズ１４２は、即座に滅菌ケース１９０に収容される。
【００８７】
滅菌ケース１９０は、開閉できる開閉蓋１９２を有する。よって、開閉蓋１９２を開放することにより、対物レンズ１４２を滅菌ケースの内部に収容できる。また、対物レンズ１４２を収容した状態で開閉蓋１９２を綴じることにより、対物レンズ１４２を滅菌ケース１９０内に気密に封止できる。
【００８８】
対物レンズ１４２を収容した滅菌ケース１９０には、滅菌室１８０の場合と同様に、流入口１９４および流出口１９６を通じてオゾンガス等の滅菌用のガスを流通させる。これにより、観察する場合に培養液２４０に浸漬された対物レンズ１４２の先端を滅菌できる。また、滅菌ケース１９０は、対物レンズ１４２を滅菌する場合に気密に封止することができる。よって、エチレンオキシドガスのように、対人毒性を有するが滅菌効果が高い滅菌ガスを用いることができる。
【００８９】
また、滅菌ケース１９０には、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、フッ酸等の溶液を流通させて対物レンズ１４２を滅菌してもよい。更に、パイロジェン等の洗浄用薬剤を用いてもよい。ただし、滅菌に液体を使用した場合に、滅菌ケース１９０に滅菌した乾燥空気等を流通させる等して対物レンズ１４２を乾燥させることが好ましい。
【００９０】
更に、滅菌ケース１９０内において、紫外線、ガンマ線および電子線等を対物レンズ１４２に対して照射して滅菌してもよい。この場合、滅菌ケース１９０の壁面は、ガンマ線等が外部に漏洩することを防止する遮蔽材として利用される。
【００９１】
上記のような滅菌ケース１９０は、レーザ顕微鏡１００の一部として設けてもよい。また、滅菌ケース１９０を独立した滅菌装置として用意して、レーザ顕微鏡１００と併せて使用してもよい。
【００９２】
なお、対物レンズ１４２をレボルバ１７０から取り外して滅菌する場合も、滅菌に先立って、滅菌ケース１９０において対物レンズ１４２を洗浄してもよい。この洗浄により、対物レンズ１４２に対する付着物を取り除き、滅菌の効率と効果を向上させることができる。
【００９３】
洗浄は、手洗い洗浄、浸漬系洗浄、超音波洗浄、ジェット系洗浄等から選択できるが、対物レンズ１４２は光学機器なので、熱水洗浄、蒸気洗浄等のように温度変化が大きい洗浄方法は好ましくない。対物レンズ１４２の洗浄には、純水、蒸留水、処理水（精製水）等を使用できる。更に、パイロジェン等の薬剤を用いて洗浄することにより、滅菌処理の一部を兼ねることができる。
【００９４】
また、滅菌後に、滅菌に用いた薬剤の残留物を除去する目的で対物レンズ１４２を洗浄してもよい。これにより、滅菌に用いた薬剤が、次に観察する細胞シート１１１およびその培養液２４０にダメージを与えることを防止できる。
【００９５】
この場合の洗浄には、電界質を含まない純水、蒸留水、処理水（精製水）等を用いることが好ましい。また、残存する電界質を除去する目的で、ＲＯ水を用いて洗浄してもよい。更に、洗浄後は、雰囲気から付着した細菌の増殖を防止する目的で、洗浄後の対物レンズ１４２は即座に乾燥させることが好ましい。
【００９６】
こうして滅菌された対物レンズ１４２は、無菌ボックス内で保存して次の使用に備えてもよい。また、レーザ顕微鏡１００による細胞シート１１１の観察が継続している場合は、再びレボルバ１７０に取り付けてもよい。
【００９７】
レーザ顕微鏡１００を工業的な用途で用いる場合には、観察対象となるサンプル１１２を交換する毎に、レボルバ１７０を回転させ、対物レンズ１４２をレボルバ１７０から取り外して、滅菌した対物レンズ１４２と交換する一連の動作を自動的に実行する設備を設けてもよい。
【００９８】
この場合、レーザ顕微鏡１００は、レボルバ１７０への対物レンズ１４２の着脱を行う着脱機構と、着脱機構により取り外された対物レンズ１４２を滅菌ケース１９０に搬送する搬送部とを備える。着脱機構は、例えば、着脱位置にある対物レンズ１４２を把持してレボルバ１７０から取り外す取り外し部を有する。滅菌作業後、搬送部は滅菌された対物レンズ１４２をレボルバ１７０に搬送し、着脱機構によりレボルバ１７０に取り付けられる。対物レンズ１４２が取り付けられるレボルバ１７０の位置は、元々取り付けられていた位置と同じでも異なっていてもよい。この着脱工程および滅菌工程は、他の対物レンズ１４２により観察が行われている間に行ってもよい。
【００９９】
また、既に滅菌された複数の対物レンズ１４２を収容する収容ケースを設け、着脱機構により対物レンズ１４２が取り外された後、収容ケースから新たな対物レンズ１４２を取り出して搬送部によりレボルバ１７０に搬送し、その対物レンズ１４２をレボルバ１７０に着脱機構により取り付けてもよい。滅菌ケース１９０で滅菌された対物レンズ１４２は、滅菌後に収容ケースに収容されてもよく、滅菌後にレボルバ１７０に直接搬送されて取り付けられてもよい。
【０１００】
なお、上記の例では、レーザ顕微鏡１００にレボルバ１７０を設けて、対物レンズ１４２をステージ１１０から遠ざけた状態で滅菌する場合について説明した。しかしながら、例えば、レボルバ１７０なしに固定された対物レンズ１４２を備えたレーザ顕微鏡１００において、例えば、培養容器２００に収容された細胞シート１１１を観察した後、培養容器２００に相当する容器に滅菌用の薬剤を入れてステージ１１０に置き、当該容器の薬剤に対物レンズ１４２を浸漬することにより滅菌してもよい。
【０１０１】
本実施例では、被観察物として細胞シートを用いた例を示したが、これに代えて、シート状をなさない細胞、例えば皮膚の断片のような組織、細菌のような微生物等の観察に、本発明を用いることができる。細胞の種類も、人工多機能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を用いてもよい。
【０１０２】
以上、実施の形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【０１０３】
特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
【符号の説明】
【０１０４】
１００  レーザ顕微鏡、１１０  ステージ、１１１  細胞シート、１１２  サンプル、１１４  観察窓、１２０  レーザ装置、１２２、１２４  レーザ光源、１２６  コンバイナ、１３０  走査系、１３２  ガルバノスキャナ、１３４  スキャンレンズ、１３６  一次像面、１４０  光学系、１４２、１４４  対物レンズ、１４３  水、１４６  コンデンサレンズ、１４８  反射鏡、１５０  検出系、１５２  集光レンズ、１５４  リレーレンズ、１５６  光電子増倍管、１５８  ダイクロイックミラー、１６０  制御系、１６２  制御部、１６４  キーボード、１６６  マウス、１６８  表示部、１７０  レボルバ、１７２  回転軸、１７４  レボルバベース、１７６  光路、１８０  滅菌室、１８２  挿通穴、１８４、１９４  流入口、１８６、１９６  流出口、１９０  滅菌ケース、１９２  開閉蓋、２００  培養容器、２１０  保持部、２１２  開口部、２２０  透過部、２３０  温度応答性ポリマー層、２４０  培養液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015081974.tif 000009
【図８】
2015081974.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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