(57)【要約】【課題】標的物質に対する高い結合効率を有する複合標識粒子を提供する。【解決手段】粒子の表面に連結物質と結合性物質とをその順で有し、当該結合性物質は標的物質に対する結合性を示す反応部位を有する複合標識粒子であって、前記結合性物質の反応部位が粒子から放射状に離れる方向に延びて配向してなり、前記連結物質と結合性物質とが当該結合性物質側の連結部位で連結された構造を有する複合標識粒子。【選択図】図１
2015052595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の表面に連結物質と結合性物質とをその順で有し、当該結合性物質は標的物質に対する結合性を示す反応部位を有する複合標識粒子であって、前記結合性物質の反応部位が粒子から放射状に離れる方向に延びて配向してなり、前記連結物質と結合性物質とが当該結合性物質側の連結部位で連結された構造を有する複合標識粒子。
【請求項２】
前記連結物質および結合性物質との組合せが下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される請求項１に記載の複合標識粒子。
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結合性物質                  ／        連結物質
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（ｉ）        Ｈｉｓタグ導入物質          ／    抗Ｈｉｓタグ抗体
（ｉｉ）      一次抗体                    ／    二次抗体
（ｉｉｉ）    ビオチン導入物質            ／    アビジン
（ｉｖ）      アビジン導入物質            ／    ビオチン
（ｖ）        ビオチン導入物質            ／    ストレプトアビジン
（ｖｉ）      ストレプトアビジン導入物質  ／    ビオチン
（ｖｉｉ）    ＦＬＡＧタグ導入物質        ／    抗ＦＬＡＧタグ抗体
（ｖｉｉｉ）  フルオレセイン導入物質      ／    抗フルオレセイン抗体
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【請求項３】
前記Ｈｉｓタグ含有物質がＨｉｓタグを有する融合タンパク質である請求項２に記載の複合標識粒子。
【請求項４】
前記結合性物質の標識粒子上の付与密度が０．００１〜０．１個／ｎｍ２である請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
【請求項５】
前記標識粒子の平均粒径が２０〜５００ｎｍである請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
【請求項６】
前記標識粒子がシリカ粒子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
【請求項７】
前記標識粒子の表面にはチオール基が存在し、当該チオール基を介して前記連結物質が導入された請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
【請求項８】
前記連結物質がマレイミドリンカーを介して前記標識粒子に導入された請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
【請求項９】
イムノクロマトグラフィーに用いられ、前記標的物質の検出を行う請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の複合標識粒子を用いて標的物質を特異的に捕捉し、標的物質を捕捉した複合標識粒子を検出することで標的物質検出の判定及び／又は標的物質の定量を行う標的物質の検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合標識粒子を含有してなるコロイド液。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合標識粒子を含有してなる標識試薬。
【請求項１３】
標識粒子の表面に連結物質を導入する工程、当該連結物質を介して結合性物質を導入する工程を有する複合標識粒子の製造方法であって、前記結合性物質は標的物質に対する結合性を示す反応部位を有する複合標識粒子の製造方法。
【請求項１４】
前記連結物質および結合性物質との組合せが下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される請求項１３に記載の複合標識粒子の製造方法。
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結合性物質                  ／        連結物質
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（ｉ）        Ｈｉｓタグ導入物質          ／    抗Ｈｉｓタグ抗体
（ｉｉ）      一次抗体                    ／    二次抗体
（ｉｉｉ）    ビオチン導入物質            ／    アビジン
（ｉｖ）      アビジン導入物質            ／    ビオチン
（ｖ）        ビオチン導入物質            ／    ストレプトアビジン
（ｖｉ）      ストレプトアビジン導入物質  ／    ビオチン
（ｖｉｉ）    ＦＬＡＧタグ導入物質        ／    抗ＦＬＡＧタグ抗体
（ｖｉｉｉ）  フルオレセイン導入物質      ／    抗フルオレセイン抗体
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【請求項１５】
前記標識粒子に対して前記連結物質を０．００１〜０．１個／ｎｍ２で導入する請求項１３または１４に記載の複合標識粒子の製造方法。
【請求項１６】
前記連結物質と結合性物質とを当該結合性物質の連結部位を介して連結する請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合標識粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合標識粒子、これを用いた標的物質の検出方法、コロイド液および標識試薬、ならびに複合標識粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の抗原などの微量物質を検出する手法としてラテラルフロー型のイムノクロマトグラフィーによる検査法がある。この方法では、検体液に含まれる被検物質（標的物質）を標識粒子に捕捉させ、多孔質支持体を毛細管現象により移動させる。そして、多孔質支持体に例えば線状に固定された捕捉物質と接触させることによって、前記被検物質を濃縮し、捕捉物質が固定されたラインを発色させる。この発色によって被検物質の有無を判定することができる。かかるイムノクロマトグラフィーの特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、イムノクロマトグラフィーは妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
【０００３】
本出願人は、上記イムノクロマトグラフィーにおいて、蛍光シリカ粒子を利用した技術を中心に技術開発を進めてきた（下記特許文献１，２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８５６６号パンフレット
【特許文献２】特開２０１０−０１４６３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、さらなる新たな技術開発の方向性として、イムノクロマトグラフィーにおける試薬材料の標的物質に対する結合効率に着目した。これを高めることにより、一定量の試薬ないし標識材料に、より多くの標的物質を捕捉させることができ、テストラインにおける標識物質の集積を効果的に促すことができると考えた。そうすれば、テストライン上で鮮明な発色ないし蛍光を得ることができ、正確な診断および判定につなげることができる。また、標識材料の結合効率を高めることができれば、標識物質（生体分子等）の適用量を減らして、製造コストを低減することもできる。
すなわち、本発明は、標的物質に対する高い結合効率を有する複合標識粒子、これを用いた標的物質の検出方法、コロイド液および標識試薬、ならびに複合標識粒子の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題は、下記の手段により解決された。
〔１〕粒子の表面に連結物質と結合性物質とをその順で有し、当該結合性物質は標的物質に対する結合性を示す反応部位を有する複合標識粒子であって、前記結合性物質の反応部位が粒子から放射状に離れる方向に延びて配向してなり、前記連結物質と結合性物質とが当該結合性物質側の連結部位で連結された構造を有する複合標識粒子。
〔２〕前記連結物質および結合性物質との組合せが下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される〔１〕に記載の複合標識粒子。
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結合性物質                  ／        連結物質
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（ｉ）        Ｈｉｓタグ導入物質          ／    抗Ｈｉｓタグ抗体
（ｉｉ）      一次抗体                    ／    二次抗体
（ｉｉｉ）    ビオチン導入物質            ／    アビジン
（ｉｖ）      アビジン導入物質            ／    ビオチン
（ｖ）        ビオチン導入物質            ／    ストレプトアビジン
（ｖｉ）      ストレプトアビジン導入物質  ／    ビオチン
（ｖｉｉ）    ＦＬＡＧタグ導入物質        ／    抗ＦＬＡＧタグ抗体
（ｖｉｉｉ）  フルオレセイン導入物質      ／    抗フルオレセイン抗体
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〔３〕前記Ｈｉｓタグ含有物質がＨｉｓタグを有する融合タンパク質である〔２〕に記載の複合標識粒子。
〔４〕前記結合性物質の標識粒子上の付与密度が０．００１〜０．１個／ｎｍ２である〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
〔５〕前記標識粒子の平均粒径が２０〜５００ｎｍである〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
〔６〕前記標識粒子がシリカ粒子である〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
〔７〕前記標識粒子の表面にはチオール基が存在し、当該チオール基を介して前記連結物質が導入された〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
〔８〕前記連結物質がマレイミドリンカーを介して前記標識粒子に導入された〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
〔９〕イムノクロマトグラフィーに用いられ、前記標的物質の検出を行う〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子。
〔１０〕〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の複合標識粒子を用いて標的物質を特異的に捕捉し、標的物質を捕捉した複合標識粒子を検出することで標的物質検出の判定及び／又は標的物質の定量を行う標的物質の検出方法。
〔１１〕〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子を含有してなるコロイド液。
〔１２〕〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子を含有してなる標識試薬。
〔１３〕標識粒子の表面に連結物質を導入する工程、当該連結物質を介して結合性物質を導入する工程を有する複合標識粒子の製造方法であって、前記結合性物質は標的物質に対する結合性を示す反応部位を有する複合標識粒子の製造方法。
〔１４〕前記連結物質および結合性物質との組合せが下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択される〔１３〕に記載の複合標識粒子の製造方法。
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結合性物質                  ／        連結物質
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（ｉ）        Ｈｉｓタグ導入物質          ／    抗Ｈｉｓタグ抗体
（ｉｉ）      一次抗体                    ／    二次抗体
（ｉｉｉ）    ビオチン導入物質            ／    アビジン
（ｉｖ）      アビジン導入物質            ／    ビオチン
（ｖ）        ビオチン導入物質            ／    ストレプトアビジン
（ｖｉ）      ストレプトアビジン導入物質  ／    ビオチン
（ｖｉｉ）    ＦＬＡＧタグ導入物質        ／    抗ＦＬＡＧタグ抗体
（ｖｉｉｉ）  フルオレセイン導入物質      ／    抗フルオレセイン抗体
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〔１５〕前記標識粒子に対して前記連結物質を０．００１〜０．１個／ｎｍ２で導入する〔１３〕または〔１４〕に記載の複合標識粒子の製造方法。
〔１６〕前記連結物質と結合性物質とを当該結合性物質の連結部位を介して連結する〔１３〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の複合標識粒子の製造方法。
本明細書において粒子の表面に有するとは、対象物が表面に接して存在していても、他の材料を介在して存在していてもよい意味である。また、その順で有しとは、複数の対象物が連続して存在していても、他の材料を介在して存在していても良い意味である。ただし、本発明においては、連結物質と結合性物質とが他の材料を介在せずに連結されていることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の複合標識粒子は、標的物質に対する高い結合効率を有し、イムノクロマトグラフィー等の試験において、標的物質の精度の高い検出および測定を可能とする。また、標識材料の適用量を減らすことによりコストの低減にも資するものである。
本発明の標的物質の検出方法、コロイド液および標識試薬は、前記の複合標識粒子を含有し、その高い標的物質との結合効率に基づく優れた効果を発揮する。
本発明の複合標識粒子の製造方法によれば、上記の複合標識粒子を好適に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の好ましい実施形態に係る複合標識粒子の製造過程を示す説明図である。
【図２】本発明の好ましい実施形態としての長尺試験体を模式的に示す分解斜視図である。
【図３】本発明の好ましい実施形態としての標識粒子の試験領域ないし参照領域での固定状態を模式的に示す説明図である。
【図４】本発明の別の好ましい実施形態としての標識粒子の試験領域ないし参照領域での固定状態を模式的に示す説明図である。
【図５】本発明のさらに別の好ましい実施形態としての標識粒子の試験領域ないし参照領域での固定状態を模式的に示す説明図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の複合標識粒子は、その表面に、連結物質と結合性物質（これを「被連結物質」ということがある）とを有する。ここで、本発明において結合性物質とは、標的物質と結合性を有する反応部位と、連結物質との結合性を有する連結部位からなるか、あるいは反応部位と連結部位が一体化したものからなる。以下、本発明の構成について、図面を参照しながら、その好ましい実施形態を中心に詳述する。
【００１０】
［複合標識粒子］
図１は、本発明の好ましい実施形態に係る複合標識粒子の製造過程を示す説明図である。同図に示したとおり、本実施形態の複合標識粒子２は、標識粒子２ａ、この表面に付与された抗Ｈｉｓタグ抗体（連結物質）２ｂ、そこに導入されたＨｉｓタグ含有タンパク質［融合タンパク質］（結合性物質）２１で構成されている。このＨｉｓタグ含有タンパク質２１は、Ｈｉｓタグ２ｃ（連結部位）とタンパク質（反応部位）２ｄとで構成されている。Ｈｉｓタグ２ｃの部分は、タンパク質２ｄと抗Ｈｉｓタグ抗体２ｂとをつなぐ役割を担い、両者の間に介在する。タンパク質２ｄは反応部位としてはたらき、標的物質（抗体等）と結合等してこれを捕捉する機能をもつ。
【００１１】
複合標識粒子２の製造方法は特に限定されず、例えば、（Ｉ）標識粒子２ａに連結物質（抗Ｈｉｓタグ抗体２ｂ）を導入し、次いで、結合性物質（Ｈｉｓタグ含有タンパク質２１）を導入する方法、あるいは（ＩＩ）連結物質（抗Ｈｉｓタグ抗体２ｂ）と結合性物質（Ｈｉｓタグ含有タンパク質２１）とを連結しておき、これを標識粒子２ａに結合させる方法とが挙げられる。本発明においては、方法（Ｉ）が好ましい（図１参照）。これにより、Ｈｉｓタグ含有タンパク質２１が倒れこまずに配向し、標識粒子２ａから外方に向けて放射状に延びる形態がより確実に得られる。このような配向形態により、Ｈｉｓタグ含有タンパク質２１の反応部位であるタンパク質２ｄの部分が粒子からより離れて突出し、効果的な標的物質との反応性が付与される。その結果、後述する標的物質との結合効率において、より高い性能が得られることとなる。なお、連結物質（抗Ｈｉｓタグ抗体）の導入工程と結合性物質（Ｈｉｓタグ含有タンパク質）の導入工程との間、あるいは、これらを有する連結鎖を調製する工程と標識粒子に導入する工程との間には、別の工程が介在されていてもよい。
【００１２】
結合性物質２１と連結物質２ｂと標識粒子２ａとは通常の手法により固定化されればよい。例えば、連結物質の導入については、次に述べるように、標識粒子としてシリカ微粒子を用いて、そこにチオール基を導入し、リンカーを介して各抗体を導入する方法が挙げられる。
【００１３】
（チオール基の導入）
シリカ微粒子表面へのチオール基の導入は通常の方法により得ることができ、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）や、国際公開第２００７／０７４７２２（Ａ１）号パンフレットに記載される方法を採用することができる。具体的には、標識としての色素を含有するシリカ微粒子を水とエタノールの混合溶媒に分散させ、チオール基を有するシラン化合物（３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン等）とアンモニア水とを添加して攪拌する方法が挙げられる。上記の水とエタノールの混合溶媒は、水／エタノールの体積比で１／１０〜１／１とすることが好ましい。また、機能成分含有シリカ微粒子の最終濃度は０．１〜２質量％とすることが好ましく、添加するチオール基を有するシラン化合物の量は、シリカ微粒子１ｇに対して、０．２ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌとすることが好ましい。また、アンモニア水の添加は、２８％アンモニア水を、アンモニア濃度が０．２〜２質量％になるように加えることが好ましい。
【００１４】
あるいは、機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る工程、及び上記工程で得られた分散液に、チオール基を有するオルガノアルコキシシランとテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を添加して、シリカのコア粒子にシェル層を形成させる工程を介して製造してもよい。この方法では、シリカ微粒子の調製からチオール基の導入を連続的に行うことができるため作業時間と労力を低減できるため好ましい。
【００１５】
シリカ微粒子表面のチオール基の量（チオール導入率）は、元素分析で硫黄元素の量を分析することで測定することができる。シリカ微粒子における硫黄元素の濃度は、チオール基を有するシリカ微粒子の重量に対して１００ｐｐｍ（質量基準）以上が好ましく、２００ｐｐｍ（質量基準）以上がより好ましい。上限は、１０，０００ｐｐｍ（質量基準）以下であることが好ましく、５，０００ｐｐｍ（質量基準）以下であることがより好ましく、２，０００ｐｐｍ（質量基準）以下であることがさらに好ましい。硫黄元素の濃度が前記下限値未満では、リンカー分子を介して結合する生体分子の量が少なく、標識試薬として十分に機能しにくい。また、硫黄元素の濃度が上記上限値超では、粒子表面に存在するチオール基の量が多すぎて、シリカ微粒子表面の疎水性が高まり、疎水性相互作用による非特異的な吸着の増加、及び粒子の分散性の低下が生じやすい。
なお、このチオール導入率は、後述する連結物質の導入率及び結合性物質の導入率と対応する。したがって、このチオール導入率は、結合性物質の反応部位の占有率の指標であるとして評価することができる。
【００１６】
上記の硫黄元素の濃度は、燃焼法により測定することができる。具体的には、Ｎｉカプセル等の金属カプセルにシリカ微粒子を５〜５０μｇ入れ、燃焼させて生じる二酸化硫黄（ＳＯ２）の量を定量することで硫黄元素の量（チオール導入率）を測定することができる。この結果より、硫黄元素の質量をシリカ微粒子の質量で除した値（ｐｐｍ）をチオール導入率とする。
【００１７】
（リンカー）
リンカー分子は、分子内にマレイミド基と、アミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基とを有する分子であることが好ましく、マレイミド基と、アミノ基、カルボキシル基又は活性エステル基とが、飽和炭化水素、不飽和炭化水素及び／又は芳香族炭化水素を介して連結している分子であることがより好ましい。分子内にマレイミド基とカルボキシル基を有するリンカー分子としては、例えば、マレイミド酢酸、４−マレイミド酪酸、５−マレイミド吉草酸、マレイミドカプロン酸、３−マレイミド安息香酸などが挙げられる。分子内にマレイミドと活性エステル基を有する分子としては、例えば、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドや４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミドなどが挙げられる。アミノ基を有するリンカーとしては、Ｎ−（４−アミノフェニル）マレイミド等が挙げられる。リンカー分子の分子量は特に制限はないが、１５０〜５０００Ｄａであることが好ましい。
【００１８】
本実施形態の製造方法においては、上記リンカー分子のマレイミド基と、シリカ微粒子の表面に導入されたチオール基との間にチオエーテル結合を形成させ、リンカー分子が結合したシリカ微粒子を得ることができる（下記スキーム参照）。
【００１９】
【化１】
2015052595.tif 000003
【００２０】
本実施形態において、上記のマレイミド基とチオール基との反応は、非プロトン性溶媒中で行うことができる。プロトン性溶媒を用いると、マレイミド基が溶媒分子と反応し、その結果チオール基との反応性が低下することがある。上記非プロトン性溶媒は、シリカ微粒子が分散しうるものが好ましく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドや、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。この反応においては、チオール基を有するシリカ微粒子の非プロトン性溶媒中における濃度は０．０５〜２質量％とすることが好ましい。チオール基を有するシリカ微粒子１ｍｇに対し０．１〜５ｍｇのリンカー分子を反応させることが好ましい。反応温度は０〜６０℃であることが好ましく、０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は５分以上が好ましく、５〜１２０分であることがより好ましい。
【００２１】
（連結物質の導入）
上記のように調製した、リンカー分子が結合したシリカ微粒子のリンカー部分に生体分子を結合させることで、生体分子が結合したシリカ微粒子が製造される。上記のスキームでは生体分子として抗体を導入する例を示しており、そのカルボキシル末端とリンカー分子が有するアミノ基とを結合させて、両者をアミド結合で連結している。
【００２２】
なお上記では、標識粒子の表面修飾（アクセプター）としてチオール基を導入し、アミノ基を有するマレイミドリンカーを用いる例を示したが、本発明はこれに限定して解釈されるものではない。その他のアクセプターとしては、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基、ＳＣＮ基、エポキシ基、ＣＮＯ基が挙げられる。その他のリンカーとしては、先に示した例示化合物を広く利用することができる。
【００２３】
（連結物質）
・抗Ｈｉｓタグ抗体
連結物質として用いられる抗Ｈｉｓタグ抗体は特に限定されず、この種の検査等に一般的に使用されるものを利用することができる。市販品としては、例えば株式会社医学生物学研究所製のＰＭ０３２  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｐＡｂ、ＰＭ０３２−８  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｐＡｂ−Ａｇａｒｏｓｅ、Ｄ２９１−３  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ、Ｄ２９１−３Ｓ  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ、Ｄ２９１−６  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｄ２９１−７  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−ＨＲＰ−ＤｉｒｅｃＴ、Ｄ２９１−８  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ａｇａｒｏｓｅ、Ｄ２９１−９  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ、Ｄ２９１−１０  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｄ２９１−Ａ４８  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、Ｄ２９１−Ａ５９  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４、Ｄ２９１−Ａ６４  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７、Ｍ０８９−３  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ、Ｍ１３６−３  Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂなどが挙げられる（ｈｔｔｐ：／／ｒｕｏ．ｍｂｌ．ｃｏ．ｊｐ／ｄｔｌ／Ａ／ＰＭ０３２／参照）。その他、７１１８４  Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｌａｔｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ９６−ｗｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  （Ｍｅｒｃｋ）、Ｐｒｏｆｉｎｉａ  抗  Ｈｉｓ  抗体，  １本  （Ｂｉｏ  Ｒａｄ）、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ，  ｃｌｏｎｅ  ４Ｄ１１，  ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ６  （Ｒｏｃｈｅ）などが挙げられる。
【００２４】
・抗ＦＬＡＧ抗体等
抗ＦＬＡＧ抗体としては、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製の  ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ１  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ（Ｆ３０４０）、ＦＬＡＧ抗体用二次抗体としては、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ａ９９１７）、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，  Ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｄ  Ｒａｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａ３６８２）等が挙げられる。
【００２５】
・抗フルオレセイン抗体
抗フルオレセインモノクローナル抗体としては、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のクローンＢ１３−ＤＥ１，マウスＩｇＧ１（１４２６３２０）、ＡＰ標識抗フルオレセイン、ポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメントとしては、同社製のＡｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ，  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓヒツジ由来（１４２６３３８）が挙げられる。
【００２６】
・アビジン等
アビジンは例えば和光純薬工業株式会社製の中性アビジン，卵白由来（０１５−２４２３１、０１１−２４２３３）、キノコ由来アビジン様タンパク質：タマビジン類  Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（２０９−１８２６１、２０５−１８２６３、２０３−１８２６４）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２−ＲＥＶ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（２０３−１７４０１、２０９−１９４０３）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２−ＬＰＩ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（２０２−１９３５１、２０８−１９３５３）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２−ＨＯＴ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（２０９−１９３６１、２０５−１９３６３）が挙げられる。ストレプトアビジンは例えば和光純薬工業株式会社製のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，  ＴｙｐｅＩＩ（１９２−１１６４４，１９４−１１６４３，１９８−１１６４１）が挙げられる。その他、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の２１１２２  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）  ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ、２１１２５  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）  ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎなどが挙げられる。
【００２７】
・二次抗体等
ここで二次抗体としては、抗体と結合性を有する一次抗体とホストの異なる抗体が挙げられる。例えば一次抗体のホストがマウスＩｇＧである場合、二次抗体としてはマウスＩｇＧと結合性を有するウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ヒト、ウマ、ブタ、ニワトリ、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ等をホストとする抗体が使用可能である。
【００２８】
なお、上記の実施形態では、連結物質を１つ用いる例のみを説明したが、２つ以上の連結物質を用いて、３段以上に連結した反応性連結鎖２２の構造としてもよい。
【００２９】
（結合性物質）
結合性物質として用いることができるＨｉｓタグやＦＬＡＧタグを含有する生体物質（例えば融合タンパク質）は、この種の製品に適用される一般的な生化学的な合成法を適用することにより適宜調製することができる。Ｈｉｓタグ含有タンパク質について言うと、通常はヒスチジン６残基からなるタグ（６ｘＨｉｓタグ）を目的の抗体タンパク質のＮ末端やＣ末端に付加されている。どちらの末端に導入するかは適宜選定されればよい。Ｈｉｓタグをタンパク質内に付加する方法は主に２つが挙げられる。なかでも、Ｈｉｓタグを末端に付加するようなベクターにタンパク質を挿入するのが簡単な方法である。Ｈｉｓタグは短いため、ヒスチジンをコードするコドン（ＣＡＴとＣＡＣ）が連続した配列を含むようなプライマーを用意し、それを使ってＰＣＲを行うことでタンパク質にＨｉｓタグを付加することができる。６個のＨｉｓタグを付加するためのプライマー設計としては、ヒスチジン６残基をコードする１８塩基を開始コドン直後または終止コドン直前に置くことが挙げられる。その隣に目的のタンパク質に特異的な配列を付けることができる。より具体的な手順として言うと、タンパク質のＣ末端にＨｉｓタグを融合するベクターに、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入する。次いで、タグを含んだプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的のタンパク質のＮ末端にタグを融合することができる。なお、ＦＬＡＧタグについても、同様にこれをコードするコドンの配列を含むプライマーを利用して目的のタンパク質を得ることができる。Ｈｉｓタグ抗体や、Ｈｉｓタグタンパク質の合成については、例えば、国際公開第２００３／０４４１９８号パンフレット、国際公開第２００５／０２２１５６号パンフレットを参考にすることができる。
また、Ｈｉｓタグタンパク質は、市販品を入手して使用することも可能である。多くのリコンビナントタンパク質はＨｉｓタグが付与されており、これらのリコンビナントタンパク質を利用できる。例えば、Ｈ１Ｎ１／ＨＡ１（１８−３４４），  Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ，  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ−Ｈ１Ｎ１（Ｈｕｍａｎ），  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＡＴＧｅｎ社製、商品コード：ＡＴＧＰ１４８４）、Ｈ５Ｎ１／ＨＡ（１７−３３８），  Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ，  ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ（Ｈ５Ｎ１），  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＡＴＧｅｎ社製、商品コード：ＡＴＧＰ１４９７）などがある。
【００３０】
その他、結合性物質の連結部位としてビオチンやフルオレセインを用いる場合には、化学的な手法あるいは上記と同様の生化学的な手法により、反応部位（所定の抗体やタンパク質等）に導入してもよい。
ビオチンを連結部位に用いる方法としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基で修飾されたビオチンを反応部位の有するアミノ基に結合させて行う方法や、マレイミド基またはイソシアネート基で修飾されたビオチンを反応部位のチオール基に結合させて行う方法がある。
ストレプトアビジンを連結部位に用いる方法としては、例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３５，  ２８５−２８８（２００４）に記載のように、目的タンパク質とストレプトアビジンをコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し、発現させることにとって作製することができる。また、市販のキットであるＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）  ／  Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）システム（ＩＢＡ社製）を用いて作製してもよい。
【００３１】
連結部位として利用できるものは上記に限られず、この種の用途に利用されているものを適宜利用することができる。上述したものを含めて言うと、例えば、Ｈｉｓ−タグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ−タグ、マルトース結合タンパク質−タグ、抗原ペプチド−タグ等を挙げることができる。抗原ペプチド−タグとは、抗体が存在するペプチドをタグとするものであり、例えば、Ｈｉｓ−タグ、Ｈｉｓ  Ｇ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｃ−ｍｙｃ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＢＰＶ−１−タグ、ｃｌ−タグ、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＮＳｌ（８１）−タグ、ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）−タグ、ＩＲＳ−タグ、ＬｅｘＡ−タグ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−タグ、Ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ−タグ、ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ  Ａｎｔｉｇｅｎ−タグ、Ｐａｒａｍｏｘｙｖｉｒｕｓ  ＳＶ５−タグ、Ｘｐｒｅｓｓ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ等を挙げることができる。
【００３２】
（結合性物質の導入）
結合性物質として例えばＨｉｓタグ含有タンパク質を用いる場合、微粒子側には抗Ｈｉｓタグ抗体が導入されているので、両者を常法により接触させることで、Ｈｉｓタグ含有タンパク質を導入することができる。これは先にＨｉｓタグ含有タンパク質と抗Ｈｉｓタグ抗体とを先に結合させておく場合についても同様である。両者の接触は媒体中で行われることが好ましく、例えば水系溶媒中でその反応を行う例が挙げられる。その他の結合性物質についても同様であり、連結物質と反応する環境で両者を接触させることで、その連結を促すことができる。このときの反応温度は特に制限されないが、室温（約２５℃）で反応を行う例が挙げられる。
【００３３】
本実施形態に係る複合標識粒子は、図１に示したような放射状に延びる反応性連結鎖２２（２ｂ、２ｃ、２ｄ）を有する。敢えて、連結物質２ｂ自体を標的物質の捕捉部位とせず、そこから結合性物質（被連結物質）を介して反応部位２ｄを延ばすことで、末端に反応部位を有する反応性連結鎖２２が外方に向け的確に配向する。これにより、上述のように、反応部位の活性点が標識粒子側に倒れこまず、より確実にその外方に向くため、標的物質と反応しやすくなり、的確にこれを捕捉する。その結果、例えば連結物質２ｂを反応部位として用いるようなものに比し、高い標的物質との結合効率が実現されたものと解される。
【００３４】
結合性物質の導入密度は限定されないが、０．００１個／ｎｍ２以上であることが好ましく、０．０１個／ｎｍ２以上であることがより好ましい。上限としては、０．５個／ｎｍ２以下であることが好ましく、０．１個／ｎｍ２以下であることがより好ましい。
結合性物質の導入密度は、特に断らない限り、下記の方法で測定した値を言うものとする。
＜導入密度の測定方法＞
結合性物質の導入密度としては、タンパク定量法を用いることができる。すなわち、被検物質が結合したシリカ粒子のコロイドのタンパク濃度を測定し、結合性物質の分子量からシリカ粒子に結合している結合性物質の個数を算出し、シリカ粒子の表面積で割ることで導入密度が算出できる。
シリカ粒子の表面積は、以下の方法で算出できる。
シリカ粒子のＳＥＭ画像を測定し、１００個の粒子の直径をＳＥＭ画像から求め、シリカ粒子１００個当たりの粒子の表面積の和と体積の和を算出する。
次に、サンプルに含まれるシリカ粒子の量を計算し、上述の１００個のシリカ粒子から求めたシリカ粒子の体積の和の値からサンプルに含まれるシリカ粒子の個数を算出し、得られた個数から、上記の粒子１００個当たりの表面積の値からシリカ粒子の表面積を算出する。
タンパク定量の方法としては一般的な手法を用いることができ、例えばＢＳＡ法やＢｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法を用いることができる。
【００３５】
前記連結物質と結合性物質との組合せは、下記組合せ（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）から選択されることが好ましい。
［表１］
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
結合性物質                  ／        連結物質
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
（ｉ）        Ｈｉｓタグ導入物質          ／    抗Ｈｉｓタグ抗体
（ｉｉ）      一次抗体                    ／    二次抗体
（ｉｉｉ）    ビオチン導入物質            ／    アビジン
（ｉｖ）      アビジン導入物質            ／    ビオチン
（ｖ）        ビオチン導入物質            ／    ストレプトアビジン
（ｖｉ）      ストレプトアビジン導入物質  ／    ビオチン
（ｖｉｉ）    ＦＬＡＧタグ導入物質        ／    抗ＦＬＡＧタグ抗体
（ｖｉｉｉ）  フルオレセイン導入物質      ／    抗フルオレセイン抗体
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
前記連結物質（第１物質）と結合性物質（第２物質）とは、それぞれに逆にしたものを連結物質または結合性物質として用いてもよい。ただし、本発明においては、表中の連結物質および結合性物質の区別が好ましい。なお、本明細書において、「導入物質」とは当該物質そのものでも、その物質が他の物質に導入されたものであってもよい。
【００３６】
本発明においては、結合性物質に反応部位と連結部位とを有するものを用いるかあるいはそれを一体化したものを用いることが好ましい。このようにすることで、反応部位と連結部位の距離を離すことができ、反応部位の反応性が向上する利点がある。かかる観点から、上記組合せのうち、なかでも、（ｉ）、（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）が好ましい。
【００３７】
図３は、本発明の好ましい実施形態として、前記の組合せ（ｉ）に係る複合標識粒子（標識体）を模式的に示したものである。本実施形態においては、標識粒子２ａに連結物質２ｂとなる抗Ｈｉｓタグ抗体が導入されている。そこに、さらにＨｉｓタグ２ｃを有するタンパク質２ｄ（結合性物質２１）が導入され、反応性連結鎖２２を有する複合標識粒子２が構成されている。この実施形態における被検物質１は抗体である。
図４は、本発明の別の好ましい実施形態として、前記の組合せ（ｉｉ）に係る複合標識粒子（標識体）を模式的に示したものである。本実施形態においては、標識粒子２ａに連結物質２ｂとなる二次抗体（抗ＩｇＧ抗体）が導入されている。そこに、さらに結合性物質２１となる一次抗体（抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体）が導入され、反応性連結鎖２２を有する複合標識粒子２が構成されている。この実施形態における被検物質１はタンパク質である。
図５は、本発明のさらに別の好ましい実施形態として、前記の組合せ（ｖｉ）に係る複合標識粒子（標識体）を模式的に示したものである。本実施形態においては、標識粒子２ａに連結物質２ｂとなるストレプトアビジンが導入されている。そこに、さらに結合性物質２１となる一次抗体が導入され、反応性連結鎖２２を有する複合標識粒子２が構成されている。このとき結合性物質２１は、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（反応部位）２ｄにビオチン（連結部位）２ｃが導入された構造を有する。この実施形態における被検物質１はタンパク質である。
【００３８】
［テストストリップ（試験片）］
本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ（試験片）は、下記の部材が相互に毛細管現象が生じるように直列連結していることが好ましい。
・サンプルパッド８ａ
・コンジュゲートパッド８ｂ（標識体を含浸し乾燥して得られる部材）
・メンブレン（抗体固定化メンブレン）８ｃ
・吸収パッド８ｄ
【００３９】
本実施形態においては、図２に示したように、上述した試験領域と参照領域とを有するメンブレン８ｃを具備するテストストリップ１０が筐体上部６ａと筐体下部６ｂとで挟持内包され、長尺試験体１００をなしている。筐体上部６ａには、検出開口部６１と検体導入開口部６２とが設けられている。蛍光観察においては、この検出開口部６１を介して、照射光を内部のテストストリップ１０に送り、そこで発せられる蛍光を集光し検出・観測することができる。一方、検体導入開口部６２を介して検体液Ｓをテストストリップ１０に供給し測定試験を行うことができる。本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ１０は、上述のように、サンプルパッド８ａ、コンジュゲートパッド８ｂ、抗体固定化メンブレン８ｃ、吸収パッド８ｄを具備してなる。さらに、上記各構成部材は、粘着剤付きバッキングシート（図示せず）により裏打ちされていることが好ましい。
【００４０】
（標的物質）
本発明において、検出、定量の対象としての標的物質１は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。本発明において、標的物質１を含有する試料としては特に制限はないが、尿、血液などの液体試料が挙げられる。
【００４１】
（サンプルパッド）
サンプルパッド８ａは標的物質を含むサンプルを滴下する構成部材である。その材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００４２】
（コンジュゲートパッド）
コンジュゲートパッド８ｂは標識試薬シリカ微粒子（標識体）２，３が含浸された構成部材である。そして、サンプルパッド８ａから毛細管現象により移動してきた試料に含まれる標的物質が抗原抗体反応等の特異的分子認識反応で、前記標識試薬シリカ微粒子（標識体）によって捕捉され、標識される部分である。
コンジュゲートパッド８ｂにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの前記標識試薬シリカ微粒子（標識体）の含有量は特に制限はないが１μｇ〜１００μｇが好ましい。含浸方法としては、前記標識試薬シリカ微粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
【００４３】
（抗体固定化メンブレン）
前記抗体固定化メンブレン８ｃにおける抗体固定化部に、標的物質の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定するための標的物質捕捉用抗体が固定化されたテストラインｎｔを設ける。抗体固定化メンブレン８ｃには、標識試薬シリカ微粒子を捕捉するための抗体が固定化されたコントロールラインｎｒを含むことが好ましい。
メンブレン８ｃはシリカ微粒子（標識体）２，３により標識された標的物質１が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体−標的物質−シリカ微粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる抗体固定化部（判定部）を有する。前記メンブレンにおける前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００４４】
前記抗体固定化部（試験領域）ｎｔにおける抗体固定化量は特に制限されないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの０．５μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記抗体固定化メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
メンブレン８ｃには、さらに参照領域ｎｒがあり、そこには標的物質が捕捉されていない標識粒子（標識体）３が捕捉される。これにより、テスト領域ｎｔでの蛍光・吸光と対比して、標的物質への有無や量を固定することができる。この機能を果たすために、試験用標識体２はシリカ微粒子２ａと反応性連結鎖２２とからなる。反応性連結鎖２２の反応部位２ｄは標的物質との結合性を有する。一方、参照用標識体３はシリカ微粒子３ａと参照用結合性物３ｂとからなる。参照用捕結合性物質は、標的物質へとの結合性はなく、参照用捕捉性物質との結合性を有する（図３参照）。
【００４５】
（吸収パッド）
吸収パッド８ｄは、毛細管現象でメンブレンを移動してきた検体Ｓ（標的物質）及び標識試薬シリカ微粒子（標識体）２，３を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００４６】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられる部材が使用できるが、サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましく、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
【００４７】
［技術用語の意味］
本明細書で用いる技術用語の意味を確認すると、標的物質１（図中の符号を併せて示すが、これにより限定して解釈されるものではない。）はラテラルフロー法による検出対象となる物質であり、検体中の被検物質と同義である。結合性物質２１，３ｂはそれぞれ前記標的物質及び捕捉性物質に対する結合能を有する物質であり、好ましくは生体分子を含むものである。結合性物質が導入された標識粒子２ａ，３ａを標識体（複合標識粒子）２，３と呼ぶ。ただし、広義には、標識粒子という用語を標識体（複合標識粒子）を含む意味で用いることがある。一方、試験領域でメンブレンに固定され、標的物質１を介して標識体２を捕捉するものが試験用捕捉性物質４である。他方、参照領域でメンブレンに固定されたものが参照用捕捉性物質５であり、これに標識体３が標的物質１を介さずに捕捉される。
なお、本明細書において物質とは、化合物ないし化学合成された分子などを意味するほか、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含し、人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。広義には生体細胞や微生物（細菌等）、ウィルス、あるいはタンパク質や単一化合物の複合体をも包含する意味である。また、結合ないし連結とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、結合ないし連結とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合・連結してもよい意味である。
【００４８】
・検体
本実施形態に適用される検体Ｓとしては、特に制限はないが、ヒトや動物の血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等に代表される臨床検体、液体飲料、半固形食品、固形食品等に代表される食品検体、土壌、河川、海水等の自然界からのサンプリング検体、工場内の生産ラインやクリーンルームのふき取り検体、エアーサンプラーによるサンプリング検体等に代表される環境サンプリング検体等が挙げられる。検体は液体としてそのまま用いることもできるし、半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
【００４９】
・結合性物質等
本実施形態において試験用の結合性物質２１を含む反応性連結鎖２２（図３〜５）は上記標識粒子２ａと一体化して用いる（標識体２）。反応性連結鎖２２についてはすでに詳しく述べたとおりである。なお、図３〜５では反応性連結鎖２２を１本だけ示しているが、これは簡略化して示したものであり、通常は図１のように標識粒子表面に多数の連結鎖があることが好ましい。
【００５０】
本実施形態においては、さらに参照用の結合性物質３ｂを用いる。この参照用結合性物質３ｂは、後述する参照用の捕捉性物質５と結合性を有する。そして、標識粒子３ａと参照用結合性物質３ｂとは一体化され参照用の標識体３をなしている。したがって、この標識体３がメンブレンを移行していく過程で、捕捉性物質５に捕捉される。標識粒子３ａと結合性物質３ｂとの結合一体化の態様あるいは結合性物質３ｂの好ましい物質の種類は、前記生体分子が挙げられる。ただし、この参照用結合性物質３ｂは試験用の捕捉性物質４や標的物質とは結合性をもたないことが好ましい。一方、上記試験用の反応性連結鎖２２は参照用の捕捉性物質５と結合性を有していてもよいが、その結合性を有さないことがより好ましい。
【００５１】
・試験用捕捉性物質
本実施形態に用いられるメンブレンは、上記のメンブレンの材料に試験用捕捉性物質４が固定化されている。この捕捉性物質４は、前記標識粒子２ａと反応性連結鎖２２と前記標的物質１とを含む複合体を捕捉するよう、標的物質１への結合能を有する（図３等参照）。捕捉性物質４が上記のような結合能を有することで、標識体２と標的物質１とからなる複合体を捕捉することが可能になる。その結果、標識体２による蛍光を発するあるいは吸光により着色するラインが試験領域ｎｔに形成される。
【００５２】
・参照用捕捉性物質
本実施形態においては、メンブレンの参照領域ｎｒに参照用捕捉性物質５が固定されている。これは、標的物質１を介さずに、直接、参照用の結合性物質３ｂと結合するものである。したがって、移行してくる検体液Ｓに混合されて標的物質１と結合していない標識体３が移行してくると、これを直接捕捉する（図２参照）。その結果、標識体３による吸光ないし蛍光を呈するラインが参照領域ｎｒに形成される。参照用捕捉性物質５は特に限定されないが、結合性物質と結合能を有する生体分子が挙げられ、具体的には抗体等が挙げられる。
【００５３】
この参照領域の参照用捕捉性物質５と試験用反応性連結鎖２２が結合性を有していてもよい。その場合、試験用の標識粒子２ａが参照領域ｎｒに捕捉されることとなる。つまり、参照領域に標識粒子３ａと標識粒子２ａとがともに捕捉された状態となるが、その場合にも、参照領域の標識粒子の着色・蛍光状態を視認することができる。一方で、試験領域には標的物質を伴った蛍光性の標識体２が捕捉されているため、通常の使用において支障はない。
【００５４】
・素材
本実施形態の平面試験片（テストストリップ）１０に採用しうる各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられる通常の部材が使用できる。サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしては、例えば、Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましい。メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましい。吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。前記粘着剤付きバッキングシートを用いる場合には、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
【００５５】
・標識粒子のコンジュゲートパッドへの導入
本実施形態のイムノクロマトグラフィーにおいては、前記コンジュゲートパッドに、前記標識体として、結合性物質を結合させた着色粒子または蛍光微粒子を導入しておくことが好ましい。コンジュゲートパッドにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの前記標識粒子の含有量は特に制限ないが２０μｇ／ｃｍ２〜２ｍｇ／ｃｍ２が好ましく、２０〜２００μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。含有量が多すぎると、１粒子当りの検体結合数が低下し、検出感度が低下する。含有させる方法としては、前記標識粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。このとき着色粒子または蛍光微粒子を含有させ、一旦乾燥させた後、蛍光微粒子または着色粒子を含有させてもよく、予め着色粒子と蛍光微粒子を混合し、この混合コロイドを含有させてもよい。
【００５６】
［標識粒子］
標識粒子の構成材料としては、この種の試験に適用されるものを適宜使用することができるが、例えば、蛍光・吸光シリカ粒子や蛍光・吸光ラテックス粒子、半導体微粒子、金コロイド粒子などを用いることができる。本発明においては、特に蛍光シリカ粒子を用いることが好ましい。
シリカ粒子は表面が親水性であり、タンパク質の吸着が少ない。したがって、連結物質を結合するに際し、共有結合で一定の配向性を持って結合させることができ、確実に結合性物質と結合する部位を粒子の外側に向けることが可能である。そのため、結合性物質の結合効率が一層向上する。他方、ラテックス粒子や半導体ナノ粒子、金コロイド粒子は連結物質を吸着で結合させるため、結合性物質との結合部位を効率的に外側に向けにくい場合がある。したがって、シリカ粒子を用いる実施形態において、本発明で得られる効果を相対的に高めることができる。
また、蛍光シリカ粒子は検出に蛍光を用いるが、蛍光観察は着色を目視観察するのに比べて一般的にＳ／Ｎ比が高い。そのため、わずかなノイズがあってもの支障なく検出を行うことができる。この利点は、本発明による精度の向上の効果により一層顕著に現われるため、蛍光シリカ粒子を用いる実施形態が本発明において極めて有利である。
【００５７】
・蛍光シリカ粒子
蛍光シリカ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意の調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法が挙げられる。本発明においては、国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等が挙げられる。
【００５８】
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
【００５９】
前記シランカップリング剤としてＡＰＳ、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
【００６０】
【化２】
2015052595.tif 000004
【００６１】
前記活性基を有する又は付加した前記機能性化合物の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）、下記式でそれぞれ表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル又はＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
【００６２】
【化３】
2015052595.tif 000005
【００６３】
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
【００６４】
前記縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
【００６５】
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
【００６６】
前記シリカ粒子の表面に吸着又は結合させる生体分子（結合性物質）としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質又はペプチドが挙げられる。ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
【００６７】
蛍光シリカ粒子の平均粒径（一次粒子の平均粒径）が１ｎｍ〜１μｍであることが好ましく、２０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましく、３０ｎｍ〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。
本発明において、前記平均粒径（一次粒子の平均粒径）は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から標識試薬シリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した標識試薬シリカ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子の平均粒径である。
【００６８】
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合標識粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
【００６９】
蛍光シリカ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましく、粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
【００７０】
・ラテックス粒子
本発明においては、その効果が顕著であることから、上記のシリカ微粒子を適用することが好ましいが、これに替え、あるいはこれに加え、標識粒子としてラテックス粒子を用いてもよい。ラテックス粒子としては、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スルホン酸共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなる合成高分子粒子を挙げることができる。また、ラテックス粒子の着色方法としては、特開２０００−１７８３０９、特開平１０−４８２１５号、特開平８−２６９２０７号、特開平６−３０６１０８号などに記載の方法で行うことができる。なお、この種の粒子に対する蛍光物質（標識物質）の固定化は、適宜定法により行うことができる。例えば、特表２００５−５３４９０７、特開２０１０−１５６６４２、特開２０１０−１５６６４０などを参照することができる。商品化されている蛍光ラテックス粒子としては、Ｌｕｍｉｎｅｘ社  製品名ｘＭＡＰ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＣＯＯＨ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｔａｃｈｉｓｏｆｔ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ／ｌｉｎｅｕｐ／ｌｕｍｉｎｅｘ／ａｂｏｕｔ／ｂｅａｄ．ｈｔｍｌｈｔｔｐ：／／ｈｉｔａｃｈｉｓｏｆｔ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｄｆ／ｔｈｅ＿ｌｕｍｉｎｅｘ＿ｌａｂｍａｐ＿ｓｙｓｔｅｍ．ｐｄｆ）が知られている。
【００７１】
・半導体粒子等
標識体には半導体粒子を適用してもよい。半導体粒子の材質は特に制限されないが、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ２、ＷＯ３、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅが好ましく例示される。例えば、特許第３８９７２８５号公報等に記載の半導体微粒子を用いることができる。前記半導体微粒子は、チオール化合物の−ＳＨ基が半導体微粒子の表面のＳ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐ、Ａｓ、Ｎ等の原子と置換することにより表面修飾することができる。前記金粒子、前記金属微粒子としては、特開２００３−２６６３８明細書等に記載の金コロイド粒子及び金属コロイド粒子を用いることができる。前記金属コロイド粒子の具体例としては、白金、銅、酸化鉄等の金属コロイド粒子が挙げられる。前記無機結晶としては、酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ２Ｏ３）、酸化銀（Ｉ）（Ａｇ２Ｏ）、酸化スズ（ＩＶ）（ＳｎＯ２）、酸化チタン（ＩＶ）（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等が挙げられる。例えば、特開２００５−７６０６４公報に記載の無機結晶を用いることができる。
【００７２】
・吸光係数
標識剤が吸光微粒子を有してなる場合、可視光を吸収し着色して視認できるものであることが好ましい。そのモル吸光係数εが５×１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子であることが好ましく、モル吸光係数εが５×１０７Ｍ−１ｃｍ−１〜１×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１であることがより好ましい。
【００７３】
ここで、モル吸光係数εは下記ランベルト−ベールの式から算出することができる。
Ａ＝Ｌｏｇ１０（Ｉ０／Ｉ）＝εｂｐ＝ａｓｂｐ’
［Ａ：吸光度、Ｉ：透過光の強度、Ｉ０：入射光の強度、ε：モル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）、ｂ：光路長（ｃｍ）、ｐ：標識粒子（着色粒子及び蛍光微粒子の混合分散液を含む。）の濃度（Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））、ａｓ：比吸光度、ｐ’：標識粒子（着色粒子及び蛍光微粒子の混合分散液を含む。）の濃度（ｇ／ｌ）］
【００７４】
上記濃度ｐ’（ｇ／ｌ）は、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた質量を決定して得られた値である。一方、上記濃度ｐ（ｍｏｌ／ｌ）は、標識粒子の大きさをＴＥＭ写真から求め、一粒子の体積を決定し、粒子の密度（例えばシリカ粒子の場合は２．３ｇ／ｃｍ３）から一粒子の質量を決定し、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた標識粒子の質量からモル数を決定して得られた値である。本発明において、「標識粒子のモル吸光係数ε」とは、標識粒子分散液について吸光度を測定し、前記ランベルト−ベールの式に適用することにより得られた、前記分散液中における標識粒子のモル吸光係数εをいう。標識粒子の吸光度、吸光スペクトル及びεは、任意の吸光光度計ないしはプレートリーダーを用いて、水分散液、エタノール分散液、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド分散液等の分散液として測定できる。
【００７５】
吸光微粒子の表面修飾や結合性物質（連結鎖）の導入に係る実施形態は前記蛍光微粒子と同様である。
【００７６】
［検出方法］
イムノクロマトグラフィーは、通常、毛細管現象等を利用して移動する標識試薬シリカ微粒子（標識体）２，３を利用して、判定部で前記粒子を集積させ、判定を行う検出方法である。例えばイムノクロマトグラフィーやマイクロ流路チップ等を利用して行うことが好ましい。このとき、標識試薬シリカ微粒子はラテラルフロー用標識体として好適に用いることができる。さらに、本発明の標的物質の検出方法において、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーを利用して標的物質を検出することが好ましい。
【００７７】
前記テストストリップの作製法としては、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
【００７８】
前記イムノクロマトグラフィー用蛍光検出システムとしては、蛍光色素を有する標識体、抗体固定化メンブレンを有してなるテストストリップ、並びに励起光源からなることが好ましい。
前記蛍光検出システムにおいて、前記標識体が発する蛍光を目視等によって検出する観点から、前記励起光源が、波長２００ｎｍ〜４００ｎｍの励起光を発することが好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ及びキセノンランプが挙げられる。本発明においては、特にレーザダイオードまたは発光ダイオードから照射した励起光を用いることが好ましい。
また、前記蛍光検出システムは、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましく、さらに、蛍光のみを目視等で検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えていることがさらに好ましい。
前記蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから標的物質の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。
【００７９】
前記励起光の波長は、３００ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましい。前記蛍光の波長は目視で認識できる波長が好ましく、３５０ｎｍ〜８００ｎｍであることが好ましい。また、目視で観察した時に高い視感度が得られることから、５３０ｎｍ〜５８０ｎｍであることがより好ましい。このとき、励起光の波長は、上記の波長帯域の蛍光を効率的に生成させるために、５００ｎｍ〜５５０ｎｍであることが好ましい。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態に係るテストストリップは、手技の習熟していない一般需要者でも操作し易くし、かつＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）の観点から、テストストリップの検出ラインを目視にて観察する観察窓のプラスチック材料等でハウジング（ケーシング）されていることが好ましい。例えば、特開２０００−３５６６３８等に記載されているハウジング等が挙げられる。
ここで、ＰＯＣＴとは、患者にできる限り近い場所で診断するための検査をいう。従来は採取した血液、尿、患部組織などの検体は、病院の中央検査室や専門の検査センターに送られデータを出すので、診断の確定までに時間がかかっていた（例えば、１日以上）。ＰＯＣＴによれば、瞬時に提供される検査情報をもとに迅速かつ的確な治療ができる。このことから、病院での緊急検査や手術中の検査が可能になるので、最近、医療現場でニーズが高い。
【００８１】
以上、イムノクロマト法について述べたが、本発明はイムノクロマト法に限らず、粒子表面に連結物質を介して結合性物質を有し、標的物質に対する結合性を利用する粒子であれば適用可能であり、各種免疫学的検査（免疫アッセイ）等に使用可能である。例えば、一般的な免疫学的検査法である、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）等の標識粒子に用いることが可能である。
さらに、抗体または抗原を結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原または抗体との抗原抗体反応によって粒子を凝集させる検査方法である免疫凝集法、抗体または抗原を結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原または抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰を分光光度計で計測して検体に含まれる抗原量を測定する検査方法である免疫比濁法、抗体または抗原を結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原または抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物を形成させ、その複合物の分散液に光をあて散乱した光を測定することで、検体に含まれる抗原または抗体を定量する免疫比ろう法、抗体または抗原を結合した粒子及び酵素標識抗体を測定物質と反応させ、粒子−測定物質−酵素標識抗体の複合体を形成し、未反応物を除去後、発光試薬を添加し、その発光量を測定して検出対象物を定量する検査方法であるＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）などに利用できる。
その他にも、フローサイトメトリーにおける標識粒子や、バイオチップ等における標識粒子としても用いることができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１）
（シリカ微粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）３．１ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．２μＬのＡＰＳ（信越シリコーン社製）を加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。得られた５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ微粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光分子含有シリカ微粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径約２７０ｎｍの蛍光分子を含有するシリカ微粒子１．６５ｇを得た（収率約９４％）。
【００８４】
（チオール基の導入）
上記で得た粒子２０ｍｇを水／エタノール＝１／４の混合液１ｍＬに分散させた。これにメルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）（和光純薬株式会社製）を２０μＬ加えた。続いて２８％アンモニア水５０μＬを加え、室温で４時間混合した。反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ微粒子に蒸留水を１ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、チオール基を有する蛍光分子含有シリカ微粒子の分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された蛍光分子を含有するシリカ微粒子（シリカ微粒子Ａ）を得た。
【００８５】
（硫黄元素の元素分析）
上記のシリカ微粒子Ａ  ２０ｍｇを用いて元素分析を行った。その結果、硫黄元素の含有率は、該粒子の全質量に対して３７４ｐｐｍ（質量基準）であった。
【００８６】
［実施例１］  標識タンパクの製造（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いた結合）
・連結物質（抗Ｈｉｓタグ抗体）の導入
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μｌに、ＤＭＦ４６０μｌを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μｌ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μｌ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水７４．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．０）１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μｌ、１９．２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μｌを加え混合した。これに抗Ｈｉｓタグ抗体（１．０ｍｇ／ｍｌ、ＭＢＬ社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作でさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりのタンパク質の結合量は、９．７ｍｇであった。
【００８７】
・結合性物質（Ａ型インフルエンザリコンビナントタンパク質）の導入
続いて上記コロイドにＨｉｓタグが導入されたＡ型インフルエンザリコンビナントタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。続いて１０％ＢＳＡを１０μｌ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μｌ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させ、Ｈｉｓタグ含有Ａ型インフルエンザリコンビナントタンパク質が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイド（以下、本発明のコロイド１と呼ぶ。）を得た。粒子上の反応性連結鎖の構造は図３の模式図を参照。
【００８８】
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりのタンパク質の結合量は、１８．８ｍｇであった。Ａ型インフルエンザリコンビナントタンパク質の結合量は、本測定で得られた結合量から抗体の結合量を引いた値であるから、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり９．１ｍｇと見積もられた。
上記タンパク質定量法による測定結果と、本実施例で用いたシリカナノ粒子の表面積の測定結果とから見積もられる結合性物質の導入密度は、０．００６４個／ｎｍ２であった。
【００８９】
［比較例１］    標識タンパクの製造（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いない結合）
・結合性物質（Ａ型インフルエンザリコンビナントタンパク質）の直接導入
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μｌに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μｌ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水７４．６μｌを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．０）１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μｌ、１９．２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μｌを加え混合した。これにＨｉｓタグが導入されたＡ型インフルエンザリコンビナントタンパク質（１．０ｍｇ／ｍｌ、Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作でさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、９．６ｍｇであった。
【００９０】
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μｌ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μｌ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイド（以下、比較例のコロイド１と呼ぶ。）を得た。
【００９１】
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりのタンパク質の結合量は、１８．８ｍｇであった。Ａ型インフルエンザ核タンパク質リコンビナントの結合量は、本測定で得られた結合量から抗体の結合量を引いた値であるから、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり９．２ｍｇと見積もられた。
【００９２】
［試験例１］  イムノクロマト法試験
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製）
抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約６ｍｍの位置に、抗Ａ型インフルエンザ抗体検出用テストラインとして、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）を１ｍｇ／ｍｌ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μｌ／ｃｍの塗布量で幅約１ｍｍで塗布した。
【００９３】
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ２４５、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）１ｍｇ／ｍｌを０．７５μｌ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は４ｍｍとした。
前記抗体固定化メンブレン、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立てた。なお、メンブレンはＡ型インフルエンザ用テストラインがサンプルパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。
【００９４】
（検出装置）
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管（ＰＭＴ）で受光する機構を有する。
【００９５】
（抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体の迅速判定）
表２に示す組成で、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）の溶液を調製した。続いて同混合液１００μｌと、本発明のコロイド１（２．５ｍｇ／ｍｌ）１μｌの混合液をテストストリップのサンプルパッド部分に滴下した。比較例のコロイド１についても同様に試験を実施した。１５分後、上記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。結果を表２に示す。
【００９６】
【表２】
2015052595.tif 000006
＊１  抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体
【００９７】
表２に示すように、実施例１の方法と比較例１の方法でＡ型インフルエンザ核タンパク質リコンビナントを修飾した粒子を比較すると、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が含まれないサンプル（０μｇ／ｍｌ）では比較例１のコロイドに比べて実施例１のコロイドはテストライン強度が抑えられ、非特異的な吸着がより少ないことがわかった。これは反応部位以外の部分が非特異的な吸着に寄与しており、実施例１では反応部位が粒子から放射状に離れる方向に向いたことで、反応部位以外の部分の露出が抑えられ、吸着が抑制されたためと考えられる。一方、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が含まれるサンプル（５μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）では、比較例１のコロイドに比べて実施例１のコロイドはテストライン強度が大幅に高められていた。この結果から、本発明（実施例）の複合標識粒子では、被検物質（抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体）の結合効率が高まっていることが分かる。
【００９８】
［実施例２］  標識抗体の製造（二次抗体を用いた結合）
・連結物質（二次抗体・・・ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体）の導入
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μｌを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μｌ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水７４．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．０）１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μｌ、１９．２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μｌを加え混合した。これにヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ポリクローナル抗体、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作でさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、１０．３ｍｇであった。
【００９９】
・結合性物質（一次抗体・・・抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体）の導入
続いて上記コロイドに１ｍｇ／ｍｌの抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。続いて１０％ＢＳＡを１０μｌ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイド（以下、本発明のコロイド２と呼ぶ。）を得た。粒子上の反応性連結鎖の構造は図４の模式図を参照。
【０１００】
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりのタンパク質の結合量は、２０．４ｍｇであった。インフルエンザ核タンパク質抗体の結合量は、本測定で得られた結合量から抗体の結合量を引いた値であるから、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり１０．１ｍｇと見積もられた。
上記タンパク質定量法による測定結果と、本実施例で用いたシリカナノ粒子の表面積の測定結果とから見積もられる結合性物質の導入密度は、０．０２９個／ｎｍ２であった。
【０１０１】
［比較例２］    標識抗体の製造（二次抗体を用いない結合）
・結合性物質（一次抗体・・・抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体）の直接導入
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μｌに、ＤＭＦ４６０μｌを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．０）１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μｌを加え混合した。これに１ｍｇ／ｍＬの抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作でさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、１０．３ｍｇであった。
【０１０２】
続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μｌ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイド（以下、比較例のコロイド２と呼ぶ。）を得た。
【０１０３】
［試験例２］  イムノクロマト法試験
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製）
抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約６ｍｍの位置に、Ａ型インフルエンザ核タンパク質検出用テストラインとして、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ２４５、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を１ｍｇ／ｍｌ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μｌ／ｃｍの塗布量で幅約１ｍｍで塗布した。
【０１０４】
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）１ｍｇ／ｍｌを０．７５μｌ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は４ｍｍとした。
前記抗体固定化メンブレン、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立てた。なお、メンブレンはＡ型インフルエンザ用テストラインがサンプルパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。
【０１０５】
（検出装置）
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管（ＰＭＴ）で受光する機構を有する。
【０１０６】
（抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体の迅速判定）
表２に示す組成で、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）の溶液を調製した。続いて同混合液１００μｌと、本発明のコロイド２（２．５ｍｇ／ｍｌ）１μｌの混合液をテストストリップのサンプルパッド部分に滴下した。本発明のコロイド３および比較例のコロイド２についても同様に試験を実施した。１５分後、上記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。結果を表３に示す。
【０１０７】
【表３】
2015052595.tif 000007
＊１  Ａ型インフルエンザ核タンパク質
【０１０８】
表３に示すように、実施例２、実施例３の方法と比較例２の方法で抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体を修飾した粒子を比較すると、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が含まれないサンプル（０μｇ／ｍｌ）では比較例２のコロイドに比べて実施例２、実施例３のコロイドはテストライン強度が抑えられ、非特異的な吸着がより少ないことがわかった。一方、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が含まれるサンプル（２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）では、比較例２のコロイドに比べて実施例２および実施例３のコロイドはテストライン強度が大幅に高められていた。この結果から、本発明（実施例２，３）の複合標識粒子では、被検物質（Ａ型インフルエンザ核タンパク質）の結合効率が高まっていることが分かる。
【０１０９】
以上の結果より、本発明の複合標識粒子は、標的物質に対する高い結合効率を有し、イムノクロマトグラフィー等の試験において、標的物質の精度の高い検出および測定を可能とするものであることが分かる。
【０１１０】
［実施例３］  標識抗体の製造（ストレプトアビジンを用いた結合）
・連結物質（ストレプトアビジン）の導入
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μｌに、ＤＭＦ４６０μｌを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μｌ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μｌ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子としてＮ−（４−アミノフェニル）マレイミドを１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水７４．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）（ｐＨ６．０）１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）  ２３０．４μｌ、１９．２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μｌを加え混合した。これにストレプトアビジン（１．０ｍｇ／ｍｌ、和光純薬社製）を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作でさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりのタンパク質の結合量は、５．１ｍｇであった。
【０１１１】
・ビオチンの導入
５ｍｇ／ｍＬの抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）２００．０μｌにリン酸バッファーを２５０μＬと、１ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社製）を５０μＬ加え、２５℃で３０分反応させた。その後、限外濾過により未反応のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを除去し、ビオチンが結合した抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（以下、ビオチン化抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体）を得た。
【０１１２】
・結合性物質（ビオチン・・・抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体）の導入
続いて上記のストレプトアビジンを結合した粒子コロイドに１ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体を２０．０μｌ加え、室温で１時間混合した。続いて１０％ＢＳＡを１０μｌ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μｌ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（品番ＩｎＡ１０８、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子Ａが分散したコロイド（以下、本発明のコロイド３と呼ぶ。）を得た。粒子上の反応性連結鎖の構造は図５の模式図を参照。
【０１１３】
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりのタンパク質の結合量は、１１．８ｍｇであった。インフルエンザ核タンパク質抗体の結合量は、本測定で得られた結合量から抗体の結合量を引いた値であるから、蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり６．７ｍｇと見積もられた。
上記タンパク質定量法による測定結果と、本実施例で用いたシリカナノ粒子の表面積の測定結果とから見積もられる結合性物質の導入密度は、０．０１９個／ｎｍ２であった。
【０１１４】
得られた蛍光分子含有シリカナノ粒子（複合標識体）を前記実施例２と同様にして、Ａ型インフルエンザ核タンパク質の検出に用いた。その結果、実施例２と同様に良好な検出能力（結合効率）が発揮されることを確認した。これらの結果から、本発明の複合標識粒子においては、さまざまな種類の材料を用いて好適な結合連結鎖を構成することができることが分かる。
【符号の説明】
【０１１５】
１  標的物質（被検物質）
２  標識体（複合標識粒子）
２ａ  標識粒子
２ｂ  連結物質
２ｃ  連結部位
２ｄ  反応部位
２１  結合性物質
２２  結合性連結鎖
３  標識体
３ａ  標識粒子
３ｂ  参照用結合性物質
４  試験用捕捉性物質
５  参照用捕捉性物質
６  筐体
６１  検出開口部
６２  検体導入開口部
６ａ  筐体上部
６ｂ  筐体下部
８ａ  サンプルパッド
８ｂ  コンジュゲートパッド
８ｃ  メンブレン
８ｄ  吸収パッド
１０  テストストリップ
１００  長尺試験体
ｎｒ  参照領域
ｎｔ  試験領域
Ｌ  ラテラルフロー方向
Ｓ  検体
【図１】
2015052595.tif 000008
【図２】
2015052595.tif 000009
【図３】
2015052595.tif 000010
【図４】
2015052595.tif 000011
【図５】
2015052595.tif 000012