(57)【要約】【課題】本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９９（シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６）及びＤＳＭ２６２００（シュードモナス属微生物Ｎ−１２８）として寄託されているシュードモナス属微生物に関する。また、本発明は、中鎖ＰＨＡ及び長鎖ＰＨＡの製造方法であって、炭素源を含む培地内において前記微生物を培養し、ＰＨＡを前記微生物から単離することを含む方法に関する。【解決手段】前記微生物は、ＰＨＡを高収量で効率的に生成することができる。また、本発明の微生物は、不飽和脂肪酸を得られるＰＨＡに取り込む貴重な能力を有する。従って、本発明の微生物によれば、ＰＨＡを製造後に変性又は架橋させることができ、ＰＨＡを新たな用途・分野において使用することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９９（シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６）又はＤＳＭ２６２００（シュードモナス属微生物Ｎ−１２８）として寄託されているシュードモナス属微生物。
【請求項２】
中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法であって、
炭素源の存在下で適当な培地内において、ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９９（シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６）又はＤＳＭ２６２００（シュードモナス属微生物Ｎ−１２８）として寄託されているシュードモナス属微生物を培養し、
前記ＰＨＡを前記微生物から単離することを含む方法。
【請求項３】
前記培地がＥ２培地である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記炭素源が、好ましくは１以上の不飽和部分を含み、少なくとも１種の炭素原子数が４〜２０の脂肪酸を含むか、または好ましくは１以上の不飽和部分を含み、炭素原子数が８〜１８の脂肪酸を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地中の前記培地に溶解した全気体に対する酸素分圧（ｐＯ２）を約２５〜４５％に維持する、または好ましくは約３０％に維持する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地には、好ましくは約１０〜５０ｍＭの範囲、特に約１５〜４０ｍＭの範囲のアンモニウムモル濃度で、窒素がアンモニウム塩として存在する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法はフラスコ振盪法又は回分法であり、前記培地中の炭素／窒素（Ｃ／Ｎ）比が、９：１〜７０：１の範囲、好ましくは１５：１〜５０：１の範囲である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養の開始時に、好ましくは前記培地中の炭素源濃度が５〜６０ｍＭ、特に１０〜４０ｍＭの範囲となるように前記炭素源を一括添加する、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
初期回分段階後に前記炭素源を半回分式で前記培地に添加して炭素源量を指数的に増加させ、好ましくは約０．０５〜０．１５ｈ−１の範囲、より好ましくは約０．０８〜０．１２ｈ−１の範囲の比増殖速度μｓｅｔとする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記回分段階において、好ましくは前記培地中の炭素源濃度を２〜３０ｍＭ、より好ましくは５〜１５ｍＭの範囲とするように前記炭素源を培地に添加した後、前記炭素源が完全に消費される時間、好ましくは８〜１６時間にわたって前記培養を維持する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
炭素原子数が３〜８のケトン、好ましくはアセトンによる抽出によって前記ＰＨＡを単離する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
６０℃以下、好ましくは２０〜４０℃の温度における抽出によって前記ＰＨＡを単離する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られるＰＨＡであって、好ましくは１０％超の不飽和部分を含むＰＨＡ。
【請求項１４】
請求項１に記載の微生物の、中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における使用。
【請求項１５】
遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）に寄託番号ＪＮ６５１４２０（ｐｈａＣ１）又はＪＮ２１６８８５（ｐｈａＣ２）として寄託されているＰＨＡ合成酵素、その類似体又はそれらの混合物の、ＰＨＡ、好ましくは炭素−炭素二重結合及び／又は芳香族部分を含むＰＨＡの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（ＰＨＡ））の生合成に関する。本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓにＤＳＭ２６１９９（シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６）及びＤＳＭ２６２００（シュードモナス属微生物Ｎ−１２８）として寄託されているシュードモナス属の野生型微生物に関する。上記微生物は、ＰＨＡの製造方法において非常に有用であることが判明している。上記微生物は遺伝子改変されておらず、飽和及び不飽和脂肪酸やグリセリン等の安価で持続可能な各種原料から、中鎖ＰＨＡ／長鎖ＰＨＡを非常に効率的に生成することができる。上記微生物は、バイオリアクタ内において、酸素を追加供給することなく、適度な撹拌条件下であっても、バイオマス及びＰＨＡを効率的に生成することができる。使用する基質によっては、得られるＰＨＡは不飽和部分（最大１７％以上）を含み、ＰＨＡの特性及び／又は合成後の機能化の範囲を大きく広げることができる。また、本発明は、中鎖ＰＨＡ及び／又は長鎖ＰＨＡの製造方法における上記微生物の使用並びにそのような方法によって得られるＰＨＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＨＡは、再生可能資源から製造される生分解性・生体適合性熱可塑性材料（ポリマー）（３−ヒドロキシ脂肪酸のポリエステル）であり、広範な工業及び生物医学的用途を有する（非特許文献１）。ＰＨＡは様々な微生物によって合成され、従来の石油化学系プラスチックの代替として使用することにより、プラスチック廃棄物の有害性から環境を保護できる可能性を有するため、広く研究されている。
【０００３】
ＰＨＡは、側鎖長及び生合成経路の違いによって２つのグループに分けることができる。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル酸単位のホモポリマーであるＰＨＢ等の短い側鎖を有するＰＨＡは結晶性熱可塑性物質であり、長い側鎖を有するＰＨＡはより高い弾性を有する。前者は約９０年前から知られている（非特許文献２）が、後者の材料は比較的最近発見された（非特許文献３）。ただし、それ以前に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単位と、より長い側鎖を有し、炭素原子数が５〜１６の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位を含む、微生物起源のＰＨＡが同定されていた（非特許文献４）。（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と、炭素原子数が５〜１６の１種以上の長側鎖ヒドロキシル酸単位のコポリマーを生成する多くの微生物が確認されている（非特許文献５〜１１及び特許文献１）。これらのコポリマーは、ＰＨＢ−ｃｏ−ＨＸ（Ｘは、炭素原子数が６以上の３−ヒドロキシアルカノエート、アルカノエート又はアルケノエートである）と呼ばれる。特定の二成分コポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である（非特許文献１２及び１３及び特許文献２）。
【０００４】
ＰＨＡは、生分解性熱可塑性物質及びバイオポリマーのための再生可能資源としての利用可能性を有するために広く研究され、商業的に開発・販売されている（非特許文献１４）が、ＰＨＡの製造コストは従来の石油化学系プラスチックよりもはるかに高く、ＰＨＡのより広範な使用への大きな障害となっている（非特許文献１５）。上述したように、多くの微生物（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ  ｃｏｌｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ等）がＰＨＡを生成する。公知の全てのＰＨＡ生成微生物は細胞内でＰＨＡを生成し、ＰＨＡ顆粒内にＰＨＡを蓄積する（非特許文献１６）。ＰＨＡの製造が石油化学系プラスチックと比較して高価で不利なものとなる大きな要因は、ＰＨＡを高い収量で生成し、ＰＨＡが蓄積された微生物の細胞から生成したＰＨＡを回収することが困難であることである。ＰＨＡの総製造コストを減少させるために、一般的にｉ）適切な溶媒、ｉｉ）ＰＨＡの次亜塩素酸塩抽出及び／又はｉｉｉ）非ＰＨＡ細胞物質の消化による細胞破壊（非特許文献１７）を目的とする、効率的な回収方法の開発が必要であると考えられていた。
【０００５】
工業規模では、利用可能な微生物は比較的少量のＰＨＡを生成するため、これらの微生物によるＰＨＡの製造は経済的に現実的ではない。公知の方法は、ＰＨＡの製造時に大量の水を必要とすると共に、ＰＨＡの回収のために大量の化学試薬及び／又は酵素を必要とする。これらは、製造コストを減少させるための障害となっている。従って、ＰＨＡを製造するための代替的な方法の提供が至急必要とされている。
【０００６】
近年では、微生物により多くのＰＨＡを生成させるためにＰＨＡ生成微生物の遺伝子改変を行う方法が開発されている。特許文献３には、遺伝子をノックアウトすることで遺伝子改変が行われ、ＰＨＡ生成のための中間体にＰＨＡ合成酵素に対して競合的に作用する微生物が開示されている。この微生物により、中間体に作用するＰＨＡ合成酵素を妨げる酵素（微生物）を枯渇させることによって、中間体をＰＨＡに転化させることが可能となる。
【０００７】
別の方法として、野生型ではＰＨＡを生成することができない大腸菌等の微生物にＰＨＡ合成酵素を導入する方法が知られている（非特許文献１８）。この方法では、大腸菌ＬＳ１２９８株においてデカノエートを炭素源として使用した場合に、最大で細胞乾燥重量（ＣＤＷ）の約１５％のＰＨＡの蓄積が観察されている。
【０００８】
さらに別の方法では、ＰＨＡデポリメラーゼ遺伝子のノックアウトによってＰＨＡの生成量を増加させており、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０を用いた場合のＰＨＡの収量は約４ｇ／Ｌ（ＣＤＷ）であり、最大でＣＤＷの８０％となっている（非特許文献１９）。
【０００９】
しかしながら、これらの微生物によるＰＨＡの生成量は、ＰＨＡの生成に必要な資源と比較して依然として相対的に少ない。また、遺伝子改変された微生物の使用を制限している国もあり、これらの微生物の使用において問題が生じる。これらの国では、特に、ＰＨＡを高い収量で生成できる野生型の（遺伝子改変されていない）微生物が有利である。
【００１０】
ＰＨＡを生成するほとんどの微生物は、ＰＨＡの生成のための炭素源として飽和脂肪酸しか使用することができない。炭素原子数が６〜約２０の分子鎖長を有する直鎖飽和脂肪酸等の通常の基質から生成するＰＨＡは、通常、−３０〜−５０℃の範囲のポリマーのガラス転移温度を有する。そのため、得られるＰＨＡの有用性は、このようなガラス転移温度に適した用途に制限される。ＰＨＡに取り込むために、対応する微生物に使用することができる基質の範囲を広げることができれば、そのような微生物を使用して得られるＰＨＡの特性を大きく多様化することができる。また、生成後の変性を可能とする官能基をＰＨＡに導入することができれば、そのような微生物を使用して得られるＰＨＡ生成物の特性を大きく多様化することができる。例えば、ＰＨＡに存在する不飽和炭素−炭素二重結合は得られる材料における反応中心となり、アクリレートやその他のビニルモノマー等の従来の不飽和モノマーの結合や架橋といった変性及び機能化に使用することができる。これにより、ＰＨＡを使用してエラストマー材料又は耐衝撃改良剤等を製造することができ、石油化学系プラスチックを生物学的過程で生成されるＰＨＡを少なくとも部分的に置き換えることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，８７６，３３１号
【特許文献２】米国特許第５，２９２，８６０号
【特許文献３】欧州特許出願公開第１  ９１３  １３５  Ａ１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｐｅｏｐｌｅｓ，  １９９６，  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ．  ２６：  ３８−４４
【非特許文献２】Ｌｅｍｏｉｇｎｅ  ＆  Ｒｏｕｋｈｅｌｍａｎ，  １９２５，  Ａｎｎ．  Ｄｅｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  ５２７−５３６
【非特許文献３】ｄｅＳｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５４：  ８７０−８７８
【非特許文献４】Ｗａｌｌｅｎ  ＆  Ｒｏｈｗｅｄｅｒ，  １９７４，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：  ５７６−５７９
【非特許文献５】Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ  ＆  Ｗｉｅｓｅ，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３７：  ６９１−６９７
【非特許文献６】Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３６：  ５０７−５１４
【非特許文献７】Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９４，  ４０：  ７１０−７１６
【非特許文献８】Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  １６：  １１５−１１９
【非特許文献９】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４２：  ９０１−９０９
【非特許文献１０】Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４５：  ３６３−３７０
【非特許文献１１】Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４６：  ２６１−２６７
【非特許文献１２】Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  １１：  ４９−５５
【非特許文献１３】Ａｍｏｓ  ＆  ＭｃＩｎｅｒｅｙ，  １９９１，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５５：  １０３−１０６
【非特許文献１４】Ｈｒａｂａｋ，  １９９２，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  １０３：  ２５１−２５６
【非特許文献１５】Ｃｈｏｉ  ＆  Ｌｅｅ，  １９９７，  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．  １７：  ３３５−３４２
【非特許文献１６】Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ，  １９９１，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ｐｐ．  １２３−２１３
【非特許文献１７】Ｌｅｅ，  １９９６，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ４９：  １−１４
【非特許文献１８】Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １５７：  １５５−１６２
【非特許文献１９】Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎ．  １００：  ２２６５−２２７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上述した課題に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ、３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツ）にＤＳＭ２６１９９（シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６）及びＤＳＭ２６２００（シュードモナス属微生物Ｎ−１２８）として寄託されているシュードモナス属の遺伝子改変されていない（野生型）微生物を提供する。
本発明のシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６及びＮ−１２８は、基質として原油（１％）及びオリーブ油（１％）を使用して、炭化水素、ディーゼル及び石油で汚染された異なる土の集積培養物から単離した。５００ｍＬ振盪フラスコ内において、基質としてのオレイン酸で増殖させた場合に、上記微生物は、最大６ｇ／Ｌ及び２．４ｇ／Ｌ（約４０重量％のＰＨＡ蓄積）という良好なバイオマス及びＰＨＡの収量を示した。
【００１５】
また、本発明は、中鎖ＰＨＡ及び／又は長鎖ＰＨＡの製造方法であって、炭素源の存在下で適当な培地内において、ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９９（シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６）又はＤＳＭ２６２００（シュードモナス属微生物Ｎ−１２８）として寄託されているシュードモナス属の微生物を培養し、前記微生物から前記ＰＨＡを単離することを含む方法に関する。
【００１６】
また、本発明の別の態様は、前記方法によって得られ、好ましくは不飽和部分を含むＰＨＡ並びに中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における上記微生物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】オレイン酸を基質として使用したシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の回分発酵時のバイオマス及びＰＨＡの生成速度プロファイル及びアンモニウム消費量を示す。数値は２回の測定の平均値である。ｔ＝１００分において、上側の曲線：ＣＤＷ（ｇ／Ｌ）；中央の曲線：ＰＨＡ（ｇ／Ｌ）；下側の曲線：アンモニウム濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【図２】半回分発酵時のオレイン酸及びＭｇＳＯ４の流加速度を示す。
【図３】半回分発酵時のオレイン酸及びアンモニウムの消費量を示す。培地内のオレイン酸濃度はＨＰＬＣ分析によって測定した。
【図４】オレイン酸を炭素源として使用したシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の半回分発酵における増殖、バイオマス及びＰＨＡの生成を示す。数値は２回の測定の平均値である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において使用する「中鎖ＰＨＡ」とは、炭素原子数が５〜１３のヒドロキシル酸単位（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位）を意味する。「長鎖ＰＨＡ」とは、１モノマーあたり少なくとも１４個の炭素原子を含むＰＨＡを意味する。
【００１９】
本願発明者は、研究過程において、本発明の発酵用の培地が微生物のＰＨＡ生産性に大きな影響を与えることを見出した。複数の産生培地を試験した結果、０．１％酵母抽出物で変性したＭＭ培地（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：  ７０８４−７０９０を参照）に、炭素源としてオレイン酸（１％）を添加した培地で、微生物としてシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６を培養した場合にＰＨＡ生産性が最も低かった。
同一の条件において、シュードモナス属微生物Ｎ−１２８を培養した場合にはＰＨＡ収量は妥当なものだった。シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の場合には、Ｃ−Ｙ培地（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６０：  １２４５−１２５４）を使用した場合に有意に高い収量が得られ、この培地中の窒素の量を２倍にすると収量がさらに増加した。
従って、本発明を実施する際には、ＭＭ培地＋０．１％酵母抽出物を使用するよりも、Ｃ−Ｙ培地内においてシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６を生育させることが好ましい。
シュードモナス属微生物Ｎ−１２８の場合には、Ｃ−Ｙ培地を使用した場合の収量はＭＭ培地＋０．１％酵母抽出物を使用した場合よりも低かったが、Ｃ−Ｙ培地中の窒素濃度を２倍にするとＰＨＡ収量は増加し、同等量のＰＨＡが得られた。従って、シュードモナス属微生物Ｎ−１２８の場合には、Ｃ−Ｙ培地中の窒素含有量をＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．に記載された窒素含有量の約２倍にすることが好ましい。
シュードモナス属微生物Ｎ−１２８及びＩＰＢ−Ｂ２６では、Ｅ２培地（Ｖｏｇｅｌ  ＆  Ｂｏｒｎｅｒ，  １９５６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２１８：  ９７−１０６を参照）によって最も良い結果が得られた。５００ｍＬフラスコ内において、Ｅ２培地を使用し、１００ｍＬで３０℃、２００ｒｐｍで培養した場合に、いずれの微生物においても約２ｇ／ＬのＰＨＡ収量及び５．１ｇ／Ｌを超える細胞乾燥重量（ＣＤＷ）が得られた。従って、本発明を実施する際には、発酵用の培地としてＥ２培地を使用することが好ましい。
【００２０】
本発明の方法において、ＰＨＡの製造のために使用する炭素源は特に限定されない。本発明の方法では、ＰＨＡの製造のために通常使用される炭素源を本発明の微生物と共に使用することができ、例えば、グリセリン、糖、ピルビン酸エステル、炭素原子数が４〜２０の脂肪酸、特に好ましくは炭素原子数が８〜１８の脂肪酸等の従来の脂肪酸を使用することができる。
なお、脂肪酸を炭素源として使用した場合に最も高い収量（ｇ／Ｌ）のＰＨＡが得られている。従って、本発明の好ましい方法では、少なくとも１種の炭素原子数が４〜２０の脂肪酸、好ましくは炭素原子数が８〜１８の脂肪酸を含む炭素源を使用する。本発明において使用する好ましい飽和脂肪酸は、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステリアン酸及びアラキン酸である。
【００２１】
また、本発明の微生物は、オレイン酸や１０−ウンデセン酸等の不飽和脂肪酸を基質として使用することができる。従って、本発明の実施形態では、炭素源として１以上の不飽和部分、好ましくは１つの不飽和部分を含む脂肪酸を炭素源として使用することが好ましい。
代表的な不飽和脂肪酸として、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエノン酸及びウンデセン酸が挙げられる。本発明において使用する最も好ましい不飽和脂肪酸はオレイン酸である。
【００２２】
本発明の方法がフラスコ振盪法又は回分法である場合には、培地中の炭素／窒素（Ｃ／Ｎ）比は、約９：１〜７０：１の範囲であることが好ましく、さらに約１５：１〜５０：１の範囲であることが好ましい。Ｃ／Ｎ比が９：１未満又は７０：１を超える場合には、通常はＣ／Ｎ比が好ましい範囲である場合と比較してＰＨＡ収量が低かった。
【００２３】
本発明の一実施形態では、炭素源は、培養の開始時に培養混合物に一括添加する。炭素源を例えば２回（培養開始時と培養中）に分けて添加した場合には、炭素源を一括添加した場合と比較してＰＨＡの収量（ｇ／Ｌ、重量％）が低かった。
【００２４】
フラスコ振盪法又は回分法を使用する場合には、炭素源は、培養混合物中の炭素源の濃度が約１〜６０ｍＭの範囲、特に約１０〜４０ｍＭの範囲となるように培養混合物に添加することが好ましい。培養混合物中の炭素源の濃度が１ｍＭ未満となるように炭素源を添加した場合には、炭素源の濃度を上記範囲として発酵させた場合と比較してＰＨＡの収量が低かった。炭素源の濃度が６０ｍＭを超えると、培養環境が微生物に対して毒性となり、増殖に悪影響を与える。
【００２５】
本発明の方法のさらなる重要なパラメータは培地中の窒素含有量である。すなわち、窒素は微生物のための重要な栄養分であり、ＰＨＡの生成には炭素が過剰であり、例えば窒素が不足する条件が通常有利である。本発明の好ましい方法では、硫酸アンモニウム又は水酸化アンモニウム等のアンモニウム塩を窒素源として使用する。
【００２６】
培地中のアンモニウム濃度は、約１０〜６０ｍＭの範囲であることが好ましく、特に約１５〜４０ｍＭの範囲であることが好ましい。なお、微生物の増殖とＰＨＡの生成に最も大きな影響を与えるのは窒素源の実際の濃度ではなく、Ｃ／Ｎ比である。
【００２７】
微生物は酸素を消費してカルボン酸を３−ヒドロキシカルボン酸に転化させるため、発酵中の酸素濃度も本発明において重要である。本発明を実施する際には、培地中の酸素分圧（ｐＯ２）を約２５〜４５％にすることが好ましく、約３０％に維持することがより好ましい。なお、％はモル％であり、酸素分圧は培地に溶解した気体の全量に基づいて算出する。
【００２８】
本発明では、培養時間は特に限定されない。当業者には明らかなように、培養の間、ＰＨＡの生成量はある段階で最大に達し、その後ＰＨＡ含有量は低下するか、変化しない。当業者は、微生物においてＰＨＡの蓄積量が最大となる時間を容易に決定することができると思われる。
半回分法においては、通常は約４０時間経過後であって約１００時間経過前にＰＨＡ蓄積量が最大に達した。従って、培養は４０〜９６時間行うことが好ましく、４５〜６０時間行うことがより好ましく、約４８時間行うことが最も好ましい。
【００２９】
本発明の微生物において、ＰＨＡ生成のための最適な温度は約３０℃である。従って、本発明の方法は、約１５〜４５℃で行うことが好ましく、約２０〜４０℃の温度で行うことがより好ましい。
【００３０】
本発明の一実施形態では、上述した回分法とは異なり、発酵開始後に指数的に増加する量の炭素を添加する半回分法によって培地に炭素源を供給する。指数的に増加する炭素量の算出からのパラメータは以下の式に基づいて算出した。
【００３１】
【数１】
2015006182.tif 000002
【００３２】
式中、Ｆ（ｔ）は培養時の炭素源の流量であり、Ｖ０は培養物の量であり、Ｙｘ／ｓはバイオマスの収量であり、Ｘ０は回分培養後の初期バイオマスであり、μｓｅｔは所望の比増殖速度であり、Ｓ０は供給材料中の基質濃度である。
【００３３】
本発明の方法におけるμｓｅｔは、約０．０５〜０．１５ｈ−１の範囲であることが好ましく、約０．０８〜０．１２ｈ−１の範囲であることがより好ましい。
【００３４】
上述した半回分法により、バイオマス及びＰＨＡの収量を大きく増加させると共に、最大収量に達するまでの発酵時間を大きく減少させることができる。これによって約４０〜４８時間で発酵時の最適なＰＨＡ濃度を１０倍増加させることが達成できた。これは、従来の回分処理（上記を参照）に対して大きな利点である。
【００３５】
上述した方法では、指数的に増加する量の炭素源を添加する前に、炭素源を培地に添加した後、炭素源が完全に消費される時間にわたって培養物を維持する回分段階によって発酵を開始させることが好ましい。本発明を実施する際には、初期回分段階は約８〜２４時間行うことが好ましく、より好ましくは８〜１２時間行うことが適当である。
【００３６】
半回分法では、炭素源の初期添加において、培地中の炭素源濃度を約２〜３０ｍＭの範囲とすることが好ましく、約５〜１５ｍＭの範囲とすることがより好ましい。この範囲は、指数的な流加の工程を開始する前に最適な初期培養が行われるように決定したものである。
【００３７】
回分法又は半回分法における発酵混合物の撹拌速度は、酸素分圧（ｐＯ２）を上記範囲に維持するために十分な撹拌速度であれば特に限定されない。適当な撹拌速度は発酵条件に応じて異なるが、通常は約２００〜１４００ｒｐｍの範囲である。
【００３８】
予期せぬことに、本発明の微生物は、最初に形成された複数のＰＨＡ顆粒を発酵時に単一の顆粒に融合させることが判明した。
【００３９】
ＰＨＡを微生物から単離する際には、非塩素化溶媒、好ましくは炭素原子数が３〜８のケトンでＰＨＡを抽出することが好ましい。非塩素化溶媒には、クロロホルム及やジクロロメタン等の従来の塩素化溶媒と比較して、廃棄物処理の手間及びコストを大きく減少できるという利点がある。本発明の実施において使用できるケトンとしては、アセトン、２−メチルエチルケトン、ジエチルケトン、２−メチルプロピルケトン等が挙げられる。ＰＨＡの単離に使用するために最も好ましいケトンはアセトンである。
【００４０】
ＰＨＡは、約６０℃未満で抽出することが好ましく、約２０〜４０℃の温度で抽出することがより好ましい。予期せぬことに、本発明の微生物を上記の温度範囲で抽出することによって、より高い温度で抽出した場合と実質的に同一の収量が得られることが判明した。これは、単一のＰＨＡ顆粒の形成並びに発酵過程の終了時に観察される微生物の細胞壁の崩壊の直接的な結果であると考えられる。
従って、本発明の微生物では、従来の微生物の発酵における複数の顆粒と比較してＰＨＡが溶媒に容易に接触する。また、約０．５〜５時間の抽出後に、実質的に同一の収量の抽出されたＰＨＡを得ることができた。従って、溶媒による抽出は、約１〜３時間行えばよく、約１時間行うことがより好ましい。
【００４１】
本発明の別の態様は、上述した方法によって得られるＰＨＡに関する。上述した方法では、１７モル％以下の不飽和部分を含むカルボン酸を取り込むことを含むことが好ましい。
【００４２】
また、本発明の別の態様は、中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における上述した微生物の使用に関する。上記方法の好適な実施形態は、上述した中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法に関して上述した好適な実施形態と同じである。
【００４３】
また、本発明の別の態様は、遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）に寄託番号ＪＮ６５１４２０（ｐｈａＣ１）又はＪＮ２１６８８５（ｐｈａＣ２）として寄託されているＰＨＡ合成酵素又はその類似体の、ＰＨＡの製造のための使用に関する。ＰＨＡ合成酵素又はその類似体は、単独又は混合物として使用することができる。
本発明における「類似体」とは、ＰＨＡ合成酵素と少なくとも約８０％の配列相同性を有し、より好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性、最も好ましくは少なくとも約９８％の配列相同性を有するものであって、適切な条件下でＰＨＡを効率的に合成することができる点においてＰＨＡ合成酵素と同等な特性を有するペプチド又はタンパク質を意味する。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明についてさらに説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
実施例１
【００４６】
ＰＨＡの製造に最適な培地を選択するために、オレイン酸（１％）を炭素源として含む１００ｍＬの培地を入れた５００ｍＬフラスコ内において、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６及びシュードモナス属微生物Ｎ−１２８を３０℃で２００ｒｐｍの撹拌下においてそれぞれ培養した。７２時間の培養後、細胞を分析のために採取した。以下の培地について試験を行った。
１．Ｅ２培地（Ｖｏｇｅｌ  ＆  Ｂｏｒｎｅｒ，  １９５６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２１８：  ９７−１０６）
２．ＭＭ培地＋０．１％酵母抽出物（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：  ７０８４−７０９０）
３．通常又は２倍の窒素濃度（０．６６ｇ／Ｌ又は１．３２ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を有するＣ−Ｙ培地（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６０：  ３２４５−３２５４）。
【００４７】
結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
2015006182.tif 000003
【００４９】
Ｎ−１２８及びＩＰＢ−Ｂ２６は各培地内で増殖した。ＭＭ＋０．１％酵母抽出物を発酵培地として使用した場合、ＰＨＡ生成量はＩＰＢ−Ｂ２６の方が少なかった。なお、Ｃ−Ｙ培地を使用した場合は、ＩＰＢ−Ｂ２６のＰＨＡ蓄積は５４重量％だった。しかしながら、各微生物について、Ｃ−Ｙ培地を使用した場合のバイオマス生成量は、他の２種類の培地（Ｅ２及びＭＭ＋０．１％酵母抽出物）を使用した場合よりも少なかった。Ｃ−Ｙ培地中のアンモニウム濃度を２倍に増加させた場合に、シュードモナス属微生物Ｎ−１２８の場合にはバイオマス生成量を３．６４ｇ／Ｌ（ＰＨＡ蓄積：約４８重量％）に増加させ、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の場合にはバイオマス生成量を５．０３ｇ／Ｌ（ＰＨＡ蓄積：約４１重量％）に増加させることができた。
【００５０】
通常、Ｃ−Ｙ（２Ｎ）培地及びＥ２培地を使用した場合には、ＰＨＡの収量は最も高くなった。ただし、ＰＨＡの収量は同等だったが、バイオマス生成量はＥ２培地を使用した場合に有意に増加した。従って、Ｅ２培地が好ましい培地であると考えられた。
【００５１】
実施例２
【００５２】
炭素源をオレイン酸（１％）からオクタン酸（２０ｍＭ）、グリセリン（３％）又は粗製グリセリン（３％）に変更した以外は、実施例１と同様にシュードモナス属微生物Ｎ−１２８及びＩＰＢ−Ｂ２６を培養した（培地：Ｅ２培地）。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2015006182.tif 000004
【００５４】
グリセリン及び粗製グリセリンは各微生物に対して良好な基質であったが、オレイン酸を使用した場合に得られたＰＨＡ収量は有意に高かった。
【００５５】
実施例３
【００５６】
オレイン酸及びグリセリンを基質として得られたＰＨＡポリマーを精製し、ＮＭＲ及びＧＣＭＳによって分析した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2015006182.tif 000005
【００５８】
オレイン酸を使用して得られた２種類のＰＨＡのうち、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６によって生成されたＰＨＡは、シュードモナス属微生物Ｎ−１２８によって生成されたＰＨＡと比較して広範なモノマー組成を有しており、炭素原子数が４〜１４の範囲のモノマーを含んでいた。予期せぬことに、炭素原子数が奇数である３−ヒドロキシ吉草酸（３ＯＨＣ５）が含まれていた。オレイン酸を使用して得られたＰＨＡは、３ＯＨＣ６（約５モル％）、３ＯＨＣ８（２７〜３２モル％）、３ＯＨＣ１０（２７〜３２モル％）、３ＯＨＣ１２（９〜１２モル％）及び３ＯＨＣ１４：１（１０〜１４モル％）を含んでいた（なお、１４：１は総炭素原子数が１４であり、二重結合の数が１であることを意味する）。
【００５９】
グリセリンを使用して得られたＰＨＡは、オレイン酸を使用して得られたＰＨＡと比較して不飽和モノマー３ＯＨＣ１２：１及び３ＯＨＣ１４：１の含有量が特に異なっていた。主要なモノマー単位は、オレイン酸を使用して得られたＰＨＡと同様に３ＯＨＣ８（２２．１モル％）と３ＯＨＣ１０（４２．９モル％）だった。一方、３ＯＨＣ１２：１モノマー含有量（１２モル％以下）は増加し、３ＯＨＣ１４：１モノマー含有量（２モル％）は減少した。
【００６０】
グリセリンを使用してシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６を培養すると、有意に低い分子量分布を有するが、同様な多分散指数を有するＰＨＡポリマーが得られた（表４を参照）。
【００６１】
【表４】
2015006182.tif 000006
【００６２】
得られたポリマーの熱的特性を表５に示す。
【００６３】
【表５】
2015006182.tif 000007
【００６４】
各ポリマーは、モノマー組成は異なるが、同様なガラス転移温度（−４８℃以下）及び約２９７〜３００℃の分解温度を有しており（表５）、炭素原子数が５未満の短鎖モノマーの存在はポリマーの熱的挙動に影響を与えていないことを示唆している。
【００６５】
実施例４
【００６６】
オレイン酸を使用したシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の回分発酵
Ｅ２培地内において、１０ｇ／Ｌのオレイン酸を基質として使用してシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６を培養した。撹拌速度は４００ｒｐｍに設定し、温度は３０℃に設定し、空気流量は１Ｌ／分に設定し、ｐＯ２（酸素分圧）は３０％に固定し、カスケード制御によって維持した。
【００６７】
播種直後に細胞増殖が開始した。ｐＯ２は最初の４時間で６０％減少したにもかかわらず、増殖速度は低下し、培養時間が３０時間に達する前に撹拌によってｐＯ２を調節しなければならなかった。これは、代謝活性が最大であったことを示している。図１は、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の回分発酵時におけるバイオマス及びＰＨＡの生成速度プロファイル、及びアンモニウム消費量を示す（数値は２回の測定の平均値である）。増殖及びＰＨＡ生成曲線によれば、培養時間が３０時間から４３時間の時にバイオマス及びＰＨＡの生成速度は最大となっている（図１を参照）。
【００６８】
培養時間が４３時間となった時にＰＨＡ蓄積量は最大（４３重量％）に達し、その後１１０時間までほぼ一定（４０〜４３重量％）に推移していた。気泡形成の問題は検出されなかった。
【００６９】
最も高いバイオマス及びＰＨＡの収量は培養を５０時間行った時に得られた（それぞれ５．５ｇ／Ｌ及び２．４ｇ／Ｌ）。ＰＨＡの蓄積は最大で４３重量％だった（図１）。上清のＨＰＬＣ分析結果では、発酵の終了時点において基質が完全に消費されていなかったことを示しているが、アンモニウムは、ＰＨＡの最高収量に関連して３６時間の培養後に完全に枯渇した。
【００７０】
７０時間の培養後、ＰＨＡの蓄積をさらに増加させるために０．５％オレイン酸を添加したが、基質は消費されず、ＰＨＡの蓄積の変化は検出されなかった。
【００７１】
実施例５
オレイン酸を使用したシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の半回分発酵
【００７２】
微生物−基質の比増殖速度（μ）及びバイオマス転化収率（Ｙｘ／ｓ）は、指数的な流加の設計のために以下の式に従って算出されるパラメータである。
【００７３】
【数２】
2015006182.tif 000008
【００７４】
式中、Ｆ（ｔ）は培養時の炭素源の流量であり、Ｖ０は培養物の量（３Ｌ）であり、Ｙｘ／ｓはバイオマスの収量であり、Ｘ０は回分培養後の初期バイオマスであり、μｓｅｔは所望の比成長速度である。
【００７５】
３ｇ／Ｌのオレイン酸を含むＥ２培地内において、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６を培養した（撹拌速度：４００ｒｐｍ、空気流量：３Ｌ／分、ｐＯ２：カスケード制御を使用して３０％に固定）。動力学的パラメータは以下の通りである：μｓｅｔ：０．１ｈ−１、Ｓｏ：２．６７ｇ／Ｌ、ＹＸ／Ｓ：０．８９ｇ／ｇ。１２時間の初期発酵では３．０ｇ／Ｌのオレイン酸を使用して回分培養を行い、その後２４時間の指数的な流加を行い、最終段階では１ｇ／Ｌ／ｈのオレイン酸を流加した。指数的な流加時には、ｐＨｓｔａｔ制御装置を使用してアンモニウムをＮＨ４ＯＨ（１４％ｖ／ｖ）として添加した。さらに、Ｍｇ２＋を０．０３３ｇ  ＭｇＳＯ４／１ｇ  オレイン酸の比率で添加した（図２）。
【００７６】
撹拌速度を上昇させると、細胞は直ちに成長を開始した。１２時間の初期培養によって炭素源は完全に消費され（図３）、その後の２４時間にわたって指数的な流加を行った。
【００７７】
培養時には撹拌速度を８００〜１０００ｒｐｍに維持し、最も成長する段階（２４〜４０時間の培養時）で撹拌速度を上昇させた。３８時間の培養後、指数的な流加及びアンモニウムの添加を停止し、３ｇ／Ｌのオレイン酸を添加した後、１０時間の直線的な流加を行った。直線的な流加後、ＨＰＬＣ分析において、炭素源及び窒素源は完全に消費されておらず、培養時間が６８時間となるまで発酵を行った。６８時間の培養によって炭素源及び窒素源は完全に消費された（図３）。しかしながら、４４時間から６８時間の間にバイオマス及びポリマー生成量の有意な変化は観察されなかった（表６及び図４）。
【００７８】
最も高いバイオマス及びＰＨＡの収量は発酵を４８時間行った時に得られた（それぞれ４６．２ｇ／Ｌ及び２５．３ｇ／Ｌ）。指数的な流加時には主にバイオマスが生成され、最大のＰＨＡ蓄積は直線的な流加の終了時に生じ、４８時間の培養後のＰＨＡ蓄積は５５重量％となった（表６及び図４）。
【００７９】
【表６】
2015006182.tif 000009
【００８０】
発酵過程において酸素の需要が低いこと（図３の履歴プロットを参照）は、特に発酵の最終段階においてシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６によって得られた高い細胞密度（ＯＤ５５０ｎｍ：２５０）を考慮すると顕著である。実際に、ｐＯ２は空気流と撹拌によって完全に制御されていた。気泡形成は、指数的な流加の最終段階で３ｍＬの消泡剤を添加することによって制御することができた。
【００８１】
表７に回分法（実施例４）と半回分法の比較を示す。
【００８２】
【表７】
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【００８３】
シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６は、半回分法を使用して５Ｌバイオリアクタにおける発酵にアップスケールすることができ、４８時間培養後のバイオマス及びＰＨＡの生成量はそれぞれ４６．１ｇ／Ｌ及び２５．３ｇ／Ｌだった。上記収量は初期培養と比較して１０倍に増加しており、環境株であるシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ｂ２６の発酵過程におけるＰＨＡ生成持続性を示唆している。
【００８４】
得られたポリマーのモノマー組成をＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳ分析によって決定した。ポリマーは、Ｃ４：０（０．５モル％）、Ｃ６：０（５．２モル％）、Ｃ８：０（３８．７モル％）、Ｃ１０：０（２９．３モル％）、Ｃ１２：０（１４．６モル％）、Ｃ１４：０（０．８モル％）及びＣ１４：１（１０．９モル％）をモノマー単位として含んでいた。Ｃ４：０単位は含有量が少ない（０．５モル％）ため、ＮＭＲ分析によって検出することができなかったが、ＧＣ−ＭＳ分析によって確認された。得られたモノマー組成は、フラスコ実験において上述した微生物と基質の組み合わせについて報告されているモノマー組成と同様だった。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
2015006182.tif 000014
【外国語明細書】
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