(57)【要約】 【課題】  生活習慣病やメタボリックシンドロームの予防または改善に有用なＰＰＡＲα活性物質を産生する微生物の抽出成分としてＰＰＡＲα活性物質を得ること。【解決手段】  本発明のＰＰＡＲαリガンド活性物質は、カロチノイド色素を産生する酵母から抽出したカロチノイド色素を含む抽出物を有効成分とする。更には、前記抽出物が、生活習慣病改善剤の成分として、食品、飲料、医薬品、サプリメントの原料に利用可能である。カロチノイド色素を産生する酵母としては、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母又はＰｈａｆｆｉａ属の酵母が上げられる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロチノイド色素を産生する酵母から抽出したカロチノイド色素を含む抽出物を有効成分とするＰＰＡＲαリガンド活性物質。
【請求項２】
前記酵母が、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母又はＰｈａｆｆｉａ属の酵母であることを特徴とする請求項１に記載のＰＰＡＲαリガンド活性物質。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲαリガンド活性物質を含む生活習慣病改善剤。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲαリガンド活性物質を産生する酵母が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０であるＰＰＡＲαリガンド活性物質産生酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲαにリガンド作用する物質を産生する酵母、前記酵母から抽出されＰＰＡＲ活性化能を有する抽出物及び前記抽出物を成分とする生活習慣病の予防または改善用の生活習慣病改善剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームは、内臓脂肪症候群、代謝症候群、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、死の四重奏とも呼ばれる複合生活習慣病であり、内臓脂肪型肥満に高血糖、高血圧、脂質異常のうちいずれか２つ以上を併せもった状態のことであり、脂肪摂取量が増加することにより内臓脂肪型肥満をきたし、動脈硬化を進行させ、心臓病や脳卒中といった動脈硬化性疾患発症の相対的危険度が増すため、その改善対策の必要性が増している。
【０００３】
核内受容体ＰＰＡＲα（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α；ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体α）は、脂質代謝に関連する遺伝子発現の制御にかかわっていることが知られている。
ＰＰＡＲαに対してリガンドが作用することにより、脂質代謝に関連する遺伝子の発動が起き、結果として、脂質代謝の活性化・亢進がおきるので、ＰＰＡＲαは脂質代謝異常などの疾病の治療薬のターゲットとしてなっている。
【０００４】
酵母は、ビール醸造などで発生する酵母菌体を乾燥酵母としてサプリメントとして利用されている。酵母に乳酸菌培養物およびカビ培養物を組み合わせた内臓脂肪蓄積防止のための組成物が、特許文献１に開示されている。しかし、どのような作用により内臓脂肪蓄積の防止が起きるかの開示はされていない。
【０００５】
また、特許文献２には、脂肪減少促進剤として、動物の乳から分離したラクトフェリンあるいは植物（トマト、イネ、タバコ）から生産されたラクトフェリンあるいは遺伝子組み換えによって得られたラクトフェリンに、コショウやトウガラシなどの血行促進が期待される成分を混合し、それらに混ぜて、腸にて溶解する剤として、ビール酵母細胞壁が例示されているが、どのような作用により内臓脂肪蓄積の防止が起きるかの開示はされていない。
【０００６】
特許文献３には、セレンで強化された出芽酵母属からの酵母または酵母エキスを組成の一部とする脂質代謝を制御するための組成物が開示されている。総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃおよびトリグリセリドの比率制御を行った組成物を摂取させることにより、脂質代謝の一般的作用のリバランスおよび再刺激を起こし、脂質消費の刺激を起こすことによりメタボリックシンドロームの治療または予防に適用できるとしている。しかし、酵母は、栄養サプリメントの組成として添加されているのであって、積極的な脂質代謝の作用をもたらすものではない。
【０００７】
温州ミカン等の柑橘類に含まれているβクリプトキサンチンは、果実の黄色の色素化合物であるが、ＰＰＡＲγへの作用が確認され、メタボリックシンドローム対策のサプリメントとして利用できることが開示されている（特許文献４）。ＰＰＡＲγは、脂質代謝を直接制御するＰＰＡＲαとは作用が異なり、脂肪細胞の分裂増殖などによるインスリン応答性の向上によって、２型糖尿病におけるインスリン抵抗性の改善に関係する。
【０００８】
柑橘類に含まれるクリプトキサンチンの他に、植物に含有するＰＰＡＲに作用する成分は、ホップに含まれるイソフムロンやブドウなどに含まれるレスベラトロールなどの成分が知られており、ＰＰＡＲに作用するサプリメントは、それら植物からの抽出操作により得られるものであるが、植物の収穫量や時期や不作豊作などの原料供給による変動が大きく、また、収穫物のロッド差も大きいので、安定な供給生産には向かない。一方、産業的に安定供給が可能なビタミン類やグルタミン酸のように発酵生産で供給できる技術は、報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−９９５３９号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２１９０９号公報
【特許文献３】特表２０１１−５０１６６７号公報
【特許文献４】特開２０１２−２１４４８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、生活習慣病やメタボリックシンドロームの予防または改善に有用な成分を産生する微生物を見出し、かつ、発酵生産で供給することが可能である成分の抽出物であって、これを含有する医薬品および飲食品等の生活習慣病改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＰＰＡＲ活性物質について鋭意研究を重ねた結果、特定の酵母がＰＰＡＲαにリガンド作用する物質を産生することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の構成からなることを特徴とする。
【００１２】
〔１〕  カロチノイド色素を産生する酵母から抽出したカロチノイド色素を含む抽出物を有効成分とするＰＰＡＲαリガンド活性物質。
〔２〕  前記酵母が、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母又はＰｈａｆｆｉａ属の酵母であることを特徴とする前記〔１〕に記載のＰＰＡＲαリガンド活性物質。
〔３〕  前記〔１〕又は前記〔２〕に記載のＰＰＡＲαリガンド活性物質を含む生活習慣病改善剤。
〔４〕  前記〔１〕又は前記〔２〕に記載のＰＰＡＲαリガンド活性物質を産生する酵母が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０であるＰＰＡＲαリガンド活性物質産生酵母。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、抗メタボリックシンドローム対策や生活習慣病の予防や改善のための成分を提供でき、その成分を生かしたサプリメントなどの生活習慣病改善剤を提供できる。
さらに、その生活習慣病やメタボリックシンドロームの予防または改善に有用な成分は当該発明の酵母を用いて発酵培養することにより生産することができ、農作物のように天候や病虫害などによる影響を受けることなく、安定に生産供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施例において、実施例の酵母抽出物及び比較例のパン酵母抽出物のＰＰＡＲαリガンド活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のＰＰＡＲαリガンド活性物質は、カロチノイド色素を産生する酵母から抽出したカロチノイド色素を含む抽出物である。
【００１６】
カロチノイド色素を産生する酵母は、カロチノイド色素を産生しその酵母の脂溶性の抽出物がＰＰＡＲにリガンド作用すれば、その種類はどのようなものであっても良いが、一般的にはＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母又はＰｈａｆｆｉａ属の酵母の中からカロチノイド色素を産生しＰＰＡＲ活性を有する酵母が選択される。
【００１７】
より具体的には、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属である、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０の酵母がカロチノイド色素を産生しＰＰＡＲ活性を有する酵母として用いられる。
【００１８】
本発明の酵母が産生するカロチノイド色素は、カロチノイド系の化合物であって、アセチルＣｏＡから出発してイソペンテニルピロリン酸やゲラニルピロリン酸を経由し、リコペンやβカロテンやクリプトキサンチンやアスタキサンチン等の色素群であり、酵母の脂溶性の抽出物には、前記色素が含まれている。
【００１９】
本発明のＰＰＡＲαリガンド活性物質は、前記酵母から脂溶性の溶媒を用いて抽出操作を行い、カロチノイド色素を含むＰＰＡＲαにリガンド作用するＰＰＡＲαリガンド活性物質含有抽出物を得ることができる。
【００２０】
そして、本発明のカロチノイド色素を産生する酵母は、培養して増殖させて供給することができる。
【００２１】
本発明の酵母の培養には、培養液組成として、パン酵母などの一般的な酵母培養培地組成でよく、例示すると、培地１Ｌ中にグルコース１０ｇ、およびポリペプトン５ｇ、および酵母エキス３ｇ、およびモルトエキス３ｇを含んで滅菌処理されたものでよいが、本発明の酵母が増殖する組成であれば制限されるものではない。
【００２２】
培地組成以外の本発明の酵母の培養の条件は、特に制限されることはないが、培養対象の酵母株の生育に適した温度域で設定すればよく、また、培養期間、ばっ気の有無、培地の撹拌、培地のＰＨ、培養途中での培地への栄養成分の添加操作などの条件も培養対象の酵母株の生育に適した条件を設定すればよい。
【００２３】
培養後の酵母の回収は、遠心分離操作による回収でもよいし、濾過処理による回収でもよい。
【００２４】
培養後回収した酵母から脂溶性の溶媒を用いて抽出操作を行い、ＰＰＡＲαにリガンド作用するＰＰＡＲαリガンド活性物質含有抽出物を得ることができる。
【００２５】
前記抽出物を得るには、培養した酵母細胞やその乾燥物や凍結乾燥物や凍結物を用いて抽出操作をしてもよく、より好ましくは、それらの破砕処理物を用いて抽出操作をするのが良い。
【００２６】
破砕処理は、フレンチプレスのような加圧解放処理による破砕処理や超音波付与による破砕処理やボールミル粉砕処理やビーズ粉砕処理や、冷凍粉砕処理などの処理が適用できる。あるいは、酵母細胞壁を溶解する酵素処理を行ってもよい。
【００２７】
培養後回収した酵母から抽出物を抽出するのに用いられる脂溶性の溶媒は、疎水性の有機溶媒が用いられる。疎水性の有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルムなどのアルキルハライド、ヘキサンなどの炭化水素類、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類等が挙げられる。これら単独で用いてもよく、あるいは、複数を組み合わせて混合して用いてもよい。
【００２８】
抽出操作後に、減圧濃縮・減圧蒸留操作などを行い、有機溶剤を除去して、抽出物を回収して利用する。エタノールなど食品として利用可能な有機溶剤であれば、有機溶剤中に溶解した抽出物をそのまま利用することも可能である。
【００２９】
抽出物は、着色しておりカロチノイド色素を含みＰＰＡＲαにリガンド作用するＰＰＡＲαリガンド活性物質を含んでいる。
【００３０】
ＰＰＡＲαリガンド活性物質の測定は、レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイによる方法やコアクチベーターとＰＰＡＲα抗体を用いたＥＬＩＳＡ法があり、本発明ではルシフェラーゼアッセイによりＰＰＡＲαリガンド活性物質の測定を実施した。
【００３１】
抽出物は、ＰＰＡＲαリガンド活性物質を含有しているので、液状、粉末、顆粒、タブレット、カプセル等の形状に加工して生活習慣病改善剤とすることができる。前記の生活習慣病改善剤は、医薬品またはサプリメントまたは食品または飲料として提供できる。
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【実施例】
【００３３】
〔実施例１〕
色素産生の酵母は、柑橘樹木の栽培畑土壌を分離源として、特開２００５−１３７２８８号公報に記載の方法により分離操作を行った。
分離源土壌を滅菌蒸留水に懸濁、細孔径５μｍの濾過フィルターでろ過処理して、懸濁液中に浮遊する土壌粒子などを除外した後、ジェットディスペンサーで、予め２％グルコースを含有する無機塩培地（硫酸アンモニウム２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．０１５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／ｌ、リン酸水素ナトリウム１２水和物１４．３ｇ／ｌ、リン酸水素カリウム５．４ｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水和物２ｍｇ／ｌ、モリブデン酸アンモニウム４水和物０．１５ｍｇ／ｌ、硫酸銅５水和物０．２ｍｇ／ｌ、塩化コバルト０．４ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン５水和物１．５ｍｇ／ｌ  ）を分注した分離プレートに、１液滴中１微生物細胞となるように分注した。３０℃に加温し、２４時間インキュベーションを行った。
上記の操作を行い、ピンク色に呈色しながら増殖を示す微生物試料を取り出した。
【００３４】
ピンク色の色素を含有する微生物の種属を同定するために、色素産生微生物の１８ＳリボソームＤＮＡの塩基配列を解析した。２か所の１８ＳリボソームＤＮＡ遺伝子配列のユニバーサル領域を塩基配列としたＤＮＡオリゴマーを用いて、ＰＣＲ増幅法を用いて、色素産生微生物の１８ＳリボソームＤＮＡを得て、そのＤＮＡ試料を鋳型として、ＤＮＡ塩基配列分析を行った。配列表１に１８ＳリボソームＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を示す。
データベースを用いた解析の結果、色素産生微生物は、色素産生酵母でありＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母であることがわかった。
【００３５】
〔実施例２〕
ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ブドウ糖１０ｇを１Ｌに含むｐＨ６．２のＹＭ培地を用いて、ピンク色の呈色を示したＲｈｏｄｏｔｒｕｌａ属酵母を一晩、液体培養して微生物を増殖させ、１ｍＬ培地あたり約１０の９乗細胞の培養液を得た。
得られた培養液１ｍＬの遠心操作を行い、酵母を菌体試料として回収し、細胞に内在する色素物の抽出調製を行った。回収した酵母菌体試料にクロロホルムメタノール（２：１）混合溶媒１００μＬを添加して、ガラスビーズ存在下で、激しく振盪して、酵母細胞を破砕するとともに、抽出溶媒中にピンク色色素成分を抽出した。抽出した色素成分の濃度は
１ｍｇ／ｍＬであった。
【００３６】
〔実施例３〕
実施例２で抽出した色素物を用いて、ＰＰＡＲリガンド活性を評価した。ＣＶ‐１細胞（雄性アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞）を、１０ｃｍディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。培地には、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０ｍｇ／ｍＬペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＣＯ社）を用いた。つぎに、リポフェクトアミンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＭ−ｈＰＰＡＲαとｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃとを、培養したＣＶ−１細胞にトランスフェクションした。なお、前記ｐＭ−ｈＰＰＡＲαは、ＧＡＬ４結合ドメインとヒトＰＰＡＲαリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質を発現するためのベクターであり、前記ｐ４×ＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子上流に、４コピーのＧＡＬ４結合ドメインのための上流活性化配列（ＵＡＳ）とチミジンキナーゼ遺伝子プロモータとを含むレポーター・プラスミドである。前記トランスフェクションを行った細胞を約２４時間培養し、ついで、前記細胞の培地を、対照物質としてＤＭＳＯ、測定物質として前記色素物を含む培地に変え、さらに２４時間培養した。前記色素物を含む培地は、培地に１０μｇ／ｍＬになるように加えることにより調製した。培養後、前記細胞を溶解し、デュアル・ルシフェラーゼレポータージーンアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＰＰＡＲリガンド活性は、対照物質のルシフェラーゼ活性値を１００とした際の相対値とし、図１に記載した。
【００３７】
〔比較例１〕
ポリペプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ブドウ糖２０ｇを１Ｌに含むＹＰＤ培地を用いて、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（オリエンタル酵母社製）を一晩、液体培養して菌体を増殖させ、１ｍｌ培地あたり約１０の９乗細胞の培養液を得た。得られた培養液１ｍＬの遠心操作を行い、酵母を菌体試料として回収し、細胞に内在する物質の抽出調製を行った。回収した酵母菌体試料にクロロホルムメタノール（２：１）混合溶媒１００μＬを添加して、ガラスビーズ存在下で、激しく振盪して、酵母細胞を破砕するとともに、抽出溶媒中に細胞内成分を抽出した。抽出した成分について実施例３に示す方法により１０μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、ＰＰＡＲαリガンドアッセイを実施した。
【００３８】
図１からわかるように、色素産生酵母抽出物によりＰＰＡＲα活性は８倍増加するが、パン酵母抽出物はＰＰＡＲα活性を増加せず、ＰＰＡＲαリガンド活性があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上のように、本発明の酵母から抽出した抽出物は、ＰＰＡＲ活性を有し、抗メタボリックシンドローム対策に有効な成分として、食品、飲料、医薬品、サプリメントに利用できる。また、容易に酵母を培養し、かつ、その酵母から色素物を回収することができるので、安定して、食品、飲料、医薬品、サプリメントのための原料抽出物を供給生産することができる。
本発明のＰＰＡＲ活性化効果を有する抽出物は、例えば、インスリン抵抗性、高インスリン血症、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および肥満などの疾病の予防若しくは改善のための医薬、サプリメント、機能性食品および食品添加物として使用できる。なお、これらは、人に限られず、その他動物にも有効である。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１は、色素産生微生物（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０の酵母）の１８ＳリボソームＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を示す。
【図１】
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【配列表】
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