(57)【要約】【課題】リン酸化ペプチド又は糖鎖を、高感度で、且つイオン化の際の不安定部位の脱離を抑制して（すなわち、分子量関連イオンの高いイオン強度、及び不安定部位の脱離したその他のイオン種に対する高い相対イオン強度で）質量分析する方法を提供する。【解決手段】３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を液体マトリックスとして用いる、リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。前記液体マトリックスは、３−アミノキノリンとｐ−クマル酸とを、例えば、５：１〜２０：１のモル比で含む。リン酸アンモニウムを添加剤として用いてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を液体マトリックスとして用いる、リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。
【請求項２】
前記液体マトリックスは、３−アミノキノリンとｐ−クマル酸とを５：１〜２０：１のモル比で含む、請求項１に記載のリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。
【請求項３】
リン酸アンモニウムを添加剤として用いる、請求項１又は２に記載のリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、製薬、及びライフサイエンス分野に属する。本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より詳しくは、本発明は、特定のイオン液体マトリックスを用いるリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特開２００８−２６１８２４号公報（特許文献１）に、アミン（１，１，３，３−テトラメチルグアニジン）のイオンとｐ−クマル酸のイオンとを含むイオン液体（ＴＭＧ／ＣＡ）をマトリックスとして用い、糖鎖を分析対象としたＭＡＬＤＩ質量分析を行うことが記載されている。
【０００３】
特開２００９−２５７８４４号公報には、ペプチド用液体マトリックスである３−ＡＱ／ＣＨＣＡ（３−アミノキノリンイオンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸とを含むイオン液体）と、糖鎖用液体マトリックスであるＴＭＧ／ＣＡ（１，１，３，３−テトラメチルグアニジンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体）とを互いに混合して調製した混合液体マトリックスを用い、ペプチドと糖鎖との混合試料又はペプチドと糖ペプチドとの混合試料を分析対象としたＭＡＬＤＩ質量分析を行うことが記載されている。より具体的には、ターゲットプレート上に前記の混合液体マトリックスと前記の混合試料との混合液滴を調製し、溶媒を除去するとともに、３−ＡＱ／ＣＨＣＡとＴＭＧ／ＣＡとが分離して局在化した質量分析用スポットを形成し、スポットの中心部に局在したエリアにおいては３−ＡＱ／ＣＨＣＡによってイオン化されたペプチドを検出する一方、同じスポットの別の箇所である辺縁部に局在したエリアにおいてはＴＭＧ／ＣＡによってイオン化された糖鎖又は糖ペプチドを検出することが記載されている。
【０００４】
Rapid Commun. Mass Spectrom., 2012, Vol. 26, pp. 2454-2460には、液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＨＣＡ（３−アミノキノリンイオン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いてリン酸化ペプチドの高感度分析の最適化を行い、２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリックスとして用いた従来法に比べ、１０倍〜１０，０００倍の感度向上を達成したことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２６１８２４号公報
【特許文献２】特開２００９−２５７８４４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rapid Commun. Mass Spectrom., 2012, Vol. 26, pp. 2454-2460
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析において、従来の方法では、イオン化の際に不安定部位の脱離が起こりやすく、そのため、分析感度が不十分であるという問題がある。すなわち、検出したい分子量関連イオンのイオン強度が低いか、あるいは、たとえ分子量関連イオンのイオン強度がある程度高くても、分子量関連イオンのイオン強度がその他のイオン種（不安定部位の脱離したイオン種）のイオン強度に対して相対的に小さく、分子量関連イオンを検出することができなという問題がある。そのため、リン酸化ペプチド又は糖鎖を、不安定部位の脱離を抑制して、且つ高感度で質量分析する方法が望まれている。
【０００８】
本発明の目的は、リン酸化ペプチド又は糖鎖を、高感度で、且つイオン化の際の不安定部位の脱離を抑制して（すなわち、分子量関連イオンの高いイオン強度、及び不安定部位の脱離したその他のイオン種に対する高い相対イオン強度で）質量分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、マトリックスとして３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を用いることにより上記本発明の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  ３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を液体マトリックスとして用いる、リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。リン酸化ペプチドには、リン酸化タンパク質も含まれる。糖鎖には、糖ペプチド、及び糖タンパク質は含まれない。
【００１１】
（２）  前記液体マトリックスは、３−アミノキノリンとｐ−クマル酸とを５：１〜２０：１のモル比で含む、上記（１）に記載のリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。
【００１２】
（３）  リン酸アンモニウムを添加剤として用いる、上記（１）又は（２）に記載のリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法。
【００１３】
・  リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析のマトリックスとして用いられる、３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体からなる質量分析用液体マトリックス。リン酸化ペプチドには、リン酸化タンパク質も含まれる。糖鎖には、糖ペプチド、及び糖タンパク質は含まれない。
【００１４】
・  ３−アミノキノリンとｐ−クマル酸とを５：１〜２０：１のモル比で含む、上記のリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析用液体マトリックス。
【００１５】
・  さらに、リン酸アンモニウムを添加剤として含む、上記のリン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析用液体マトリックス。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において、質量分析のマトリックスとして３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を用いる。そのことにより、リン酸化ペプチドのイオン化において、不安定部位であるリン酸基の脱落を抑制することができる。その結果、検出したい分子量関連イオンを高感度で、且つ、従来法に比べて、リン酸基の脱落したその他のイオン種に対してより高い相対的イオン強度で検出することができる。また、糖鎖のイオン化において、不安定部位であるシアル酸などの酸性糖及び中性糖の脱落を抑制することができる。その結果、検出したい分子量関連イオンを高感度で、且つ、従来法に比べて、不安定部位の脱落したその他のイオン種に対してより高い相対的イオン強度で検出することができる。このようにして、本発明により、リン酸化ペプチド又は糖鎖を、イオン化の際の不安定部位の脱離を抑制して、且つ高感度（分子量関連イオンの高いイオン強度、及び不安定部位の脱離したその他のイオン種に対するより高められた相対イオン強度）で分析することができる質量分析法が提供される。また、本発明により、リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析のマトリックスとして用いられる、３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体からなる質量分析用液体マトリックスが提供される。本発明は、特にＭＡＬＤＩ質量分析法に向けられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）実施例１における液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを用いた場合、（Ｂ）比較例１における３−ＡＱ／ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合、（Ｃ）比較例１における２，５−ＤＨＢをマトリックスとして用いた場合のリン酸化ペプチドβ-casein 1-25の10 fmol/μL濃度のポジティブモ−ドでのマススペクトルを示す。横軸は質量／電荷（ｍ／ｚ）、縦軸はイオンの相対強度（％Ｉｎｔ．）を表す。
【図２】（Ａ）実施例２における液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを用いた場合、（Ｂ）比較例２における３−ＡＱ／ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合、（Ｃ）比較例２における２，５−ＤＨＢをマトリックスとして用いた場合の糖鎖A2 glycanの100 fmol/μL濃度のポジティブモ−ド（上段）、ネガティブモ−ド（下段）でのマススペクトルを示す。横軸は質量／電荷（ｍ／ｚ）、縦軸はイオンの相対強度（％Ｉｎｔ．）を表す。
【図３】（Ａ）実施例２における液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを用いた場合、（Ｂ）比較例２における３−ＡＱ／ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合、（Ｃ）比較例２における２，５−ＤＨＢをマトリックスとして用いた場合の糖鎖NA4 glycan の100 fmol/μL濃度のポジティブモ−ドでのマススペクトルを示す。横軸は質量／電荷（ｍ／ｚ）、縦軸はイオンの相対強度（％Ｉｎｔ．）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［液体マトリックス］
本発明は、３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を液体マトリックスとして用いる、リン酸化ペプチド又は糖鎖の質量分析法である。本明細書において、イオン液体とは、室温で液体の状態で存在し、その実態は塩である物質をいう。例えば、イオン液体としては、アミンのイオンと酸性基含有物質のイオンとからなるものが挙げられる。本発明において、液体マトリックスとして、３−アミノキノリン（３−ＡＱ）イオンとｐ−クマル酸イオン（ＣＡ）とを含むイオン液体（３−ＡＱ/ＣＡ）を用いる。
【００１９】
［質量分析対象］
本発明において、質量分析対象は、リン酸化ペプチド、又は糖鎖である。リン酸化ペプチドには、リン酸化タンパク質も含まれる。糖鎖には、糖ペプチド、及び糖タンパク質は含まれない。
【００２０】
リン酸化ペプチド（又はリン酸化タンパク質）は、特に限定されることなく、例えば、セリン、トレオニン、及びチロシン残基のヒドロキシ基のうちの一部又は全部がリン酸エステルを形成しているペプチド（又はタンパク質）が挙げられる。また、リン酸化ペプチド（又はリン酸化タンパク質）には、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、リシンの一部又は全部がリン酸エステルを形成しているペプチド（又はタンパク質）も含まれる。ペプチド（又はタンパク質）のセリン、トレオニン、及びチロシン残基のヒドロキシ基のうちの一部又は全部がリン酸化されることによって、その機能が変化する場合がある。また、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、リシンの一部又は全部がリン酸化されることによって、その機能が変化する場合がある。
【００２１】
リン酸化ペプチド（又はリン酸化タンパク質）のイオン化において、リン酸基の脱落が起こりやすい。従って、リン酸化ペプチド（又はリン酸化タンパク質）の質量分析において、リン酸基の脱落を抑制して、検出したい分子量関連イオンを高感度で、且つ、リン酸基の脱落したその他のイオン種に対してより高い相対的イオン強度で検出することが重要である。本発明においては、質量分析のマトリックスとして３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を用いる。そのことにより、リン酸化ペプチドのイオン化において、リン酸基の脱落を抑制することができる。その結果、検出したい分子量関連イオンを高感度で、且つリン酸基の脱落したその他のイオン種に対してより高い相対的イオン強度で検出することができる。もちろん、検出したい分子量関連イオンを高Ｓ／Ｎ比で検出することができる。また、本発明の質量分析対象としてのリン酸化ペプチド（又はリン酸化タンパク質）には、側鎖が人工的に修飾されリン酸化されたペプチド（又はタンパク質）も含まれる。
【００２２】
糖鎖の種類は限定されることはない。糖鎖（特にシアロ糖鎖、硫酸化糖鎖などの酸性糖鎖）のイオン化において、酸性部位（シアル酸などの酸性糖、硫酸基など）の脱落が起こりやすい。あるいは、中性糖の脱落も起こりやすい。従って、糖鎖の質量分析において、シアル酸などの酸性糖、硫酸基などの酸性部位、あるいは中性糖の脱落を抑制して、検出したい分子量関連イオンを高感度で、且つ、糖あるいは部位の脱落したその他のイオン種に対してより高い相対的イオン強度で検出することが重要である。本発明においては、質量分析のマトリックスとして３−アミノキノリンイオンとｐ−クマル酸イオンとを含むイオン液体を用いる。そのことにより、糖鎖のイオン化において、シアル酸などの酸性糖（あるいは酸性糖の硫酸基などの酸性部位）、あるいは中性糖の脱落を抑制することができる。その結果、検出したい分子量関連イオンを高感度で、且つ糖あるいは部位の脱落したその他のイオン種に対してより高い相対的イオン強度で検出することができる。もちろん、検出したい分子量関連イオンを高Ｓ／Ｎ比で検出することができる。このように、本発明の質量分析法は、酸性糖及び／又は中性糖を含む糖の測定により好適に用いられる。酸性糖としては、硫酸基やカルボキシル基などの酸性基を有する糖であればよく、一例としてシアル酸が挙げられる。
【００２３】
［液体マトリックスの調製］
液体マトリックスの調製方法としては特に限定されるものではない。具体的な調製方法としては従来からのイオン液体の調製法に準じることができる。例えば、もっとも簡便な調製法の一つとしては、イオン液体を構成するアミンイオンの由来元となるアミン類（具体的には３−アミノキノリン）と、酸性基含有物質イオンの由来元となる酸物質（具体的にはｐ−クマル酸）とを混合して反応させる方法が挙げられる。
【００２４】
【化１】
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【００２５】
双方の物質を反応させるためには、ｐ−クマル酸を３−アミノキノリンに加えても良いし、３−アミノキノリンをｐ−クマル酸に加えてもよい。双方の物質の反応は、溶媒中で行うことができる。そのため、３−アミノキノリン及びｐ−クマル酸の少なくとも一方を予め溶液として調製して、ｐ−クマル酸を３−アミノキノリン溶液に加えてもよいし、３−アミノキノリンをｐ−クマル酸溶液に加えてもよい。或いは、溶媒に３−アミノキノリン及びｐ−クマル酸を同時に加えてもよい。双方の物質の混合は、常温下で行うことができる。
【００２６】
互いに反応させるべき３−アミノキノリンとｐ−クマル酸との比は、特に限定されないが、例えば、３−アミノキノリンとｐ−クマル酸とを、５：１〜２０：１のモル比で混合することができる。Ｓ／Ｎ比を考慮した場合、７：１〜９：１のモル比で混合することがより好ましい場合がある。溶媒中どのような濃度で双方の物質を反応させるかについては、当業者が適宜決定すればよい。
【００２７】
溶媒中で反応させた場合は、反応後、溶媒を除去することができる。溶媒の除去は、留去、好ましくは減圧下における留去によって行うことができる。溶媒の除去を行った後、液状の物質をイオン液体として得ることができる。一方、反応に用いた溶媒を、マトリックス溶媒（後述）としても用いることができる場合は、溶媒を除去しなくともよい。
【００２８】
通常試薬として販売されているｐ−クマル酸は、厳密に測定すると純度が９６％程度であることが多い。本発明においては、通常試薬として販売されているｐ−クマル酸を精製するなどにより、９９％以上、好ましくは９９．８％以上の純度を有するものを用いることが、分析感度向上の観点から好ましい。市販のｐ−クマル酸を精製して用いる場合、精製方法としては特に限定されず、当業者が適宜精製方法を選択することができる。例えば、蒸留、再結晶などによって精製を行うことができる。ｐ−クマル酸の純度の測定方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や、核磁気共鳴（ＮＭＲ）などが挙げられる。
【００２９】
［質量分析用スポットの形成］
本発明の液体マトリックスの使用においては、質量分析用プレート上に、液体マトリックスと質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）とを含む混合溶液の液滴が形成され、溶媒が除去される（蒸発する）ことによって、レーザーが照射されるべき質量分析用スポットが形成される。
【００３０】
液体マトリックスと質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）とは、最終的に質量分析用プレート上で液滴を形成した時点で混合溶液の態様になっていればよい。液体マトリックスと質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）とを含む混合溶液の液滴は、プレミックス（pre-mix）法又はオンターゲットミックス（on-target mix）法によって調製することができる。
【００３１】
プレミックス法は、液体マトリックスと質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）とを含む混合溶液を予め調製し、その混合溶液を質量分析用プレート上に滴下することによって、混合溶液の液滴を得る方法である。混合溶液は、液体マトリックス溶液と質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）溶液とを混合することによって得ることができる。それぞれの溶液は、例えば同体積にて混合することができる。
【００３２】
一方、オンターゲットミックス法は、液体マトリックス溶液と質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）溶液とを別々に調製し、それぞれを質量分析用プレート上の同じ位置に重ねて滴下することによって、混合溶液の液滴を得る方法である。
【００３３】
マトリックスのための溶媒としては、従来より用いられてきた溶媒を特に限定することなく用いることができる。例えば、アセトニトリル、メタノ−ル、エタノ−ルなどの有機溶剤を水中に含む水溶液が用いられうる。この水溶液中の有機溶剤の濃度は、例えば１０〜９０体積％、好ましくは３０〜８０体積％、更に好ましくは３３〜７５体積％、一例として５０体積％程度である。
【００３４】
質量分析対象のための溶媒としては、従来より用いられてきた溶媒を特に限定することなく用いることができる。例えば、水、又はアセトニトリル、メタノ−ル、エタノ−ルなどの有機溶剤を水中に含む水溶液が用いられうる。この水溶液中の有機溶剤の濃度は、例えば１０〜９０体積％、好ましくは３０〜８０体積％、更に好ましくは３３〜７５体積％、一例として５０体積％程度である。
【００３５】
液体マトリックスと質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）との混合溶液の液滴中に含まれる液体マトリックスの量は、例えば、１ｎｍｏｌ〜１０μｍｏｌ／μＬ、好ましくは１０ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌ／μＬでありうる。一方、混合溶液の液滴中に含まれる質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）の量は特に限定されないが、例えば、混合液滴１個あたり１ａｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌとなるような量で許容される。
【００３６】
本発明において、液体マトリックスには、リン酸アンモニウムを添加剤として含ませることが、分析感度向上の観点から好ましい。リン酸アンモニウムは、最終的に液体マトリックスと混合されればよく、例えば上記のマトリックス溶媒に溶解させて用いることができる。リン酸アンモニウムは、液体マトリックスと質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）との混合溶液の液滴中、例えば０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、一例として１ｍＭ程度の濃度で含まれるように用いられるとよい。
【００３７】
なお、１個の質量分析用スポットを得るために使用する混合溶液の液滴は、例えば０．１〜１０μＬ、好ましくは０．５〜１．５μＬ、具体例としては０．５μＬ程度あるいは１μＬ程度の体積とすることができる。
【００３８】
質量分析用プレートとしては、通常ＭＡＬＤＩ質量分析に使用されるステンレス鋼ターゲットプレートなどや、化学的或いは物理的に表面処理がなされたターゲットプレートなど、さまざまなものを使用することができる。好ましくは、混合溶液から溶媒を効率的に除去し且つ良好な液体マトリックス−質量分析対象（リン酸化ペプチド、又は糖鎖）混合質量分析用スポットを得るために、中心部が親水性、辺縁部が疎水性となるように化学的表面処理されたウェルが形成されているものを用いることが好ましい。また、研磨処理や鏡面仕上げなど、処理プレート表面の表面粗さを所望の程度にする物理的表面処理がなされたものを用いることが好ましい。
【００３９】
［質量分析装置］
本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４１】
３−ＡＱ：３−アミノキノリン
ＣＡ：ｐ−クマル酸イオン
ＣＨＣＡ：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸
２，５−ＤＨＢ：２，５−ジヒドロ安息香酸
【００４２】
［実施例１：３−ＡＱ／ＣＡを用いたリン酸化ペプチド分析］
（１）  ３−ＡＱ 100nmol/μL、 及び2mMリン酸アンモニウムを50(v/v)%アセトニトリル(ACN)水溶液中に含む３−ＡＱ溶液と、ＣＡ 100nmol/μL、及び 2mMリン酸アンモニウムを50%(v/v)アセトニトリル(ACN)水溶液中に含むＣＡ溶液とを9:1(v/v)で混合した。その後、混合溶液を2mMリン酸アンモニウムを含む50%(v/v)アセトニトリル(ACN)水溶液で10倍希釈し、３−ＡＱ／ＣＡマトリックス溶液を作成した。
（２）  市販リン酸化ペプチド：β-casein 33-48及びβ-casein 1-25の0.02〜2000 fmol/μL の50%(v/v)ACN水溶液を、同溶媒の段階希釈によりそれぞれ作成した。
（３）  （１）の３−ＡＱ／ＣＡマトリックス溶液と、（２）のペプチド試料溶液を0.5 μLずつ、MALDI濃縮プレ−ト(μFocus MALDI plateTM 、Hudson Surface Technology, Inc. USA)上に滴下した。（on-target mix法）
（４）  AXIMA Resonence (Shimadzu/Kratos, UK)のmid/high massモード, ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００４３】
［比較例１：３−ＡＱ／ＣＨＣＡ又は２，５−ＤＨＢを用いたリン酸化ペプチド分析］
（１）  ２，５−ＤＨＢ (Laser Bio) 5 mg/0.5mLを50%(v/v)ACN水溶液中に含むＤＨＢ溶液を作成した。
また、３−ＡＱ(20 mg)を、ＣＨＣＡ(10 mg)を600μLの50%(v/v)ACN水溶液に溶解して得られたＣＨＣＡ溶液150 μLに溶解し、これを2mMリン酸アンモニウム50%(v/v)ACN水溶液で10倍希釈し、３−ＡＱ／ＣＨＣＡ溶液を作成した。 
（２）  市販リン酸化ペプチド：β-casein 33-48及びβ-casein 1-25の0.02〜2000 fmol/μL の50%(v/v)ACN水溶液を、同溶媒の段階希釈によりそれぞれ作成した。
（３）  （１）の２，５−ＤＨＢ溶液又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡ溶液と、（２）のペプチド試料溶液を0.5 μLずつ、MALDI濃縮プレ−ト(μFocus MALDI plateTM 、Hudson Surface Technology, Inc. USA)上に滴下した。（on-target mix法）
（４）  AXIMA Resonence (Shimadzu/Kratos, UK)のmid/high massモード, ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００４４】
なお、市販リン酸化ペプチド：β-casein 33-48及びβ-casein 1-25 （いずれも、Sigma-Aldrich製）は、上掲したRapid Commun. Mass Spectrom., 2012, Vol. 26, pp. 2454-2460 のTable 1に記載されているとおりである。pSは、リン酸化されたセリン残基を表す。
【００４５】
ウシβ-casein 33-48：Phosphorylation sites 1 (S35)
Sequence:  FQ-pS-EEQQQTEDELQDK  （配列番号１）
【００４６】
ウシβ-casein 1-25：：Phosphorylation sites 4 (S15, S17, S18, S19)
Sequence:  RELEELNVPGEIVE-pS-L-pS-pS-pS-EESITR  （配列番号２）
【００４７】
【表１】
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【００４８】
表１に、マトリックスとして３−ＡＱ／ＣＡ、３−ＡＱ／ＣＨＣＡ、２，５−ＤＨＢを用いた場合について、リン酸化ペプチド：β-casein 33-48又はβ-casein 1-25の分子量関連イオン［Ｍ＋Ｈ］+   （ポジティブモ−ド）、又は［Ｍ−Ｈ］- （ネガティブモ−ド）の検出限界を示す。表１に示すように、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを使用することによって、ポジティブとネガティブの両モ−ドで検出限界が１〜１／１０となり、すなわち、感度が１〜１０倍向上した。
【００４９】
図１に、（Ａ）３−ＡＱ／ＣＡ、（Ｂ）３−ＡＱ／ＣＨＣＡ、（Ｃ）２，５−ＤＨＢを用いた場合の、リン酸化ペプチドβ-casein 1-25の10 fmol/μL濃度のポジティブモ−ドでのマススペクトルを示す。図１（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）から、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを使用することによって、β-casein 1-25の分子量関連イオン［Ｍ＋Ｈ］+  が、［Ｍ−Ｈ2ＰＯ4＋Ｈ］+ 、［Ｍ−2Ｈ2ＰＯ4＋Ｈ］+ 等のその他のイオン種に対して相対的に高いイオン強度で、高いＳ／Ｎ比で観測された。すなわち、３−ＡＱ／ＣＡは、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、イオン化に際してリン酸基の脱離を抑制し、より高い感度での測定結果を与えた。
【００５０】
なお、３−ＡＱ／ＣＡを用いると、３−ＡＱ／ＣＨＣＡと同等かそれ以上の高感度測定が行えたことから、多段階ＭＳのより高い感度の測定も可能である。
【００５１】
［実施例２：３−ＡＱ／ＣＡを用いた糖鎖分析］
（１）  ３−ＡＱ100nmol/μL、 及び2mMリン酸アンモニウムを50(v/v)%アセトニトリル(ACN)水溶液中に含む３−ＡＱ溶液と、ＣＡ 100nmol/μL、及び 2mMリン酸アンモニウムを50%(v/v)アセトニトリル(ACN)水溶液中に含むＣＡ溶液とを9:1(v/v)で混合した。その後、混合溶液を2mMリン酸アンモニウムを含む50%(v/v)アセトニトリル(ACN)水溶液で10倍希釈し、３−ＡＱ／ＣＡマトリックス溶液を作成した。
（２）  市販PA化糖鎖NA2 glycan、NA4 glycan、A1 glycan、A2 glycan（いずれも、Takara Bio Inc.製）について、0.04〜4000 fmol/μL 水溶液を、同溶媒の段階希釈によりそれぞれ作成した。
（３）  （１）の３−ＡＱ／ＣＡマトリックス溶液と、（２）の糖鎖試料溶液を1:1(v/v)で混合した(pre-mix法)。
（４）  （３）の試料／マトリックス混合溶液を、MALDI濃縮プレ−ト(μFocus MALDI plateTM 、Hudson Surface Technology, Inc. USA)上に0.5μLずつ滴下した。
（５）  AXIMA Resonence (Shimadzu/Kratos, UK)のmid massモード, ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００５２】
［比較例２：３−ＡＱ／ＣＨＣＡ又は２，５−ＤＨＢを用いた糖鎖分析］
（１）  ２，５−ＤＨＢ(Laser Bio) 5 mg/0.5mLを50%(v/v)ACN水溶液中に含むＤＨＢ溶液を作成した。
また、３−ＡＱ (20 mg)を、ＣＨＣＡ(10 mg)を600μLの50%(v/v)ACN水溶液に溶解して得られたＣＨＣＡ溶液150 μLに溶解し、これを2mMリン酸アンモニウム50%(v/v)ACN水溶液で10倍希釈し、３−ＡＱ／ＣＨＣＡ溶液を作成した。 
（２）  市販PA化糖鎖NA2 glycan、NA4 glycan、A1 glycan、A2 glycan（いずれも、Takara Bio Inc.製）について、0.04〜4000 fmol/μL 水溶液を、同溶媒の段階希釈によりそれぞれ作成した。
（３）  （１）の２，５−ＤＨＢ溶液又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡ溶液と、（２）の糖鎖試料溶液を1:1(v/v)で混合した(pre-mix法)。
（４）  （３）の試料／マトリックス混合溶液を、MALDI濃縮プレ−ト(μFocus MALDI plateTM 、Hudson Surface Technology, Inc. USA)上に0.5μLずつ滴下した。
（５）  AXIMA Resonence (Shimadzu/Kratos, UK)のmid massモード, ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
表２に、マトリックスとして３−ＡＱ／ＣＡ、３−ＡＱ／ＣＨＣＡ、２，５−ＤＨＢを用いた場合について、PA化糖鎖NA2 glycan、NA4 glycan、A1 glycan、A2 glycan の分子量関連イオン［Ｍ＋Ｈ］+  （ポジティブモ−ド）、又は［Ｍ−Ｈ］- （ネガティブモ−ド）の検出限界を示す。表２に示すように、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを使用することによって、ポジティブとネガティブの両モ−ドで検出限界が１〜１／１０００となり、すなわち、感度が１〜１０００倍向上した。
【００５５】
図２に、（Ａ）３−ＡＱ／ＣＡ、（Ｂ）３−ＡＱ／ＣＨＣＡ、（Ｃ）２，５−ＤＨＢを用いた場合の、A2 glycan の100 fmol/μL濃度のポジティブモ−ド（上段）、ネガティブモ−ド（下段）でのマススペクトルを示す。図２中において、”ＮＡＮＡ”はシアル酸を表している。図２（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）から、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを使用することによって、A2 glycanの分子量関連イオン［Ｍ＋Ｈ］+  （ポジティブモ−ド）、及び［Ｍ−Ｈ］-  （ネガティブモ−ド）がより明確に、高いＳ／Ｎ比で観測された。
【００５６】
すなわち、例えば、ネガティブモ−ドにおけるマススペクトルを見れば、３−ＡＱ／ＣＡを使用した場合に、シアル酸脱離イオン［Ｍ−ＮＡＮＡ−Ｈ］- に対して、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］-   の最も高い相対的イオン強度が得られた。
【００５７】
このように、３−ＡＱ／ＣＡは、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、イオン化に際して酸性糖シアル酸の脱離を抑制した。
【００５８】
図３に、（Ａ）３−ＡＱ／ＣＡ、（Ｂ）３−ＡＱ／ＣＨＣＡ、（Ｃ）２，５−ＤＨＢを用いた場合の、NA4 glycan の100 fmol/μL濃度のポジティブモ−ドでのマススペクトルを示す。図３（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）から、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、液体マトリックス３−ＡＱ／ＣＡを使用することによって、NA4 glycan の分子量関連イオン［Ｍ＋Ｈ］+  （ポジティブモ−ド）が、糖鎖の脱離したその他のイオン種に対して相対的に高いイオン強度で、高いＳ／Ｎ比で観測された。すなわち、３−ＡＱ／ＣＡは、２，５−ＤＨＢ又は３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いた場合に比べ、イオン化に際して中性糖の脱離を抑制した。
【００５９】
なお、３−ＡＱ／ＣＡを用いると、３−ＡＱ／ＣＨＣＡと同等かそれ以上の高感度測定が行えたことから、多段階ＭＳのより高い感度の測定も可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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