(57)【要約】【課題】細胞シートを培養する際に、生体模倣組織である細胞シートの細胞状態（増殖、重層化、分化）を非侵襲的に評価する方法を提供することである。【解決手段】細胞シートの培養上清を用いてアミノ酸分析を実施し、５種アミノ酸(Ile，Val，Ser，Leu，Ala)のいずれかの濃度変化をモニタリングすることにより細胞状態を判定することを特徴とする。【選択図】図１
2015006134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動培養ユニットとアミノ酸分析ユニットとを備え、
前記自動培養ユニットは、
細胞シートを培養する培養容器と、
前記培養容器に導入した培地を前記アミノ酸分析ユニットへ送液する流路と、を有し、
前記アミノ酸分析ユニットは、
前記自動培養ユニットから送液された培地に含有される所定のアミノ酸の濃度を測定する検出部と、
前記測定したアミノ酸の濃度を記憶する記憶部と、
前記記憶部に記憶された前記アミノ酸の少なくとも一つの濃度の変化を基にして、前記細胞シートの細胞状態を判定する判定部と、を有し、
前記所定のアミノ酸には、Ile，Val，Ser，Leu，Alaの５種類のアミノ酸を用い、
前記アミノ酸の濃度の変化は、複数回に亘って前記検出部で経時的に測定され前記記憶部に記憶されたアミノ酸濃度に基づき算出される
ことを特徴とする自動分析装置。
【請求項２】
前記自動培養ユニットにおいて、
前記培養容器中の培地を廃液ボトルへ排出する第１流路と、
前記培養容器中の培地を前記アミノ酸分析ユニットへ送液する第２流路と、
前記第１流路と前記第２流路とのいずれかに培地を振り分けて送液する分岐部と、を有し、
前記分岐部における培地の振り分けは制御部により制御される
ことを特徴とする請求項１に記載の自動分析装置。
【請求項３】
前記記憶部に予め閾値を設定し、
前記判定部は、前記記憶部に記憶されたアミノ酸濃度に基づいてアミノ酸濃度の変化量を算出し、算出された前記変化量に基づいて、
培養中に細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される細胞状態を密集状態と定義した場合に、
前記密集状態以前において、前記５種類のアミノ酸群のうちのIle，Val，Ser，Leuのいずれかのアミノ酸濃度が減少し、その減少量が前記閾値以上である場合、もしくは前記５種類のアミノ酸群のうちのAlaのアミノ酸濃度が増加し、その増加量が前記閾値以上である場合に、細胞増殖が順調に進行していると判定する
ことを特徴とする請求項１に記載の自動分析装置。
【請求項４】
前記判定部は、前記記憶部に記憶されたアミノ酸濃度に基づいてアミノ酸濃度の変化量を算出し、算出された前記変化量に基づいて、
培養中に細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される細胞状態を密集状態と定義した場合に、
前記密集状態以後において、前記５種類のアミノ酸群のうちのIle，Val，Ser，Leuのいずれかのアミノ酸濃度の変化量が、初期状態から前記密集状態までのアミノ酸濃度の変化量と比較して小さい場合、もしくは前記５種類のアミノ酸群のうちのAlaのアミノ酸濃度の変化量が、初期状態から前記密集状態までのアミノ酸濃度の変化量と比較して、大きい、または同じである場合に、前記細胞シートの重層化の開始タイミングおよび細胞重層化が順調に進行していると判定する
ことを特徴とする請求項１に記載の自動分析装置。
【請求項５】
前記記憶部に予め閾値を設定し、
前記判定部は、前記記憶部に記憶されたアミノ酸濃度に基づいてアミノ酸濃度の変化量を算出し、算出された前記変化量に基づいて、
培養中に細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される細胞状態を密集状態と定義した場合に、
前記密集状態以前においてAlaのアミノ酸濃度が増加し、前記密集状態以後において、Alaのアミノ酸濃度が減少し、前記アミノ酸濃度の増加量及び減少量が前記閾値以上である場合に、前記細胞シートの細胞分化が順調に進行していると判定する
ことを特徴とする請求項１に記載の自動分析装置。
【請求項６】
Ile，Val，Ser，Leu，Alaから構成される５種類のアミノ酸群を用いて、培養上清のアミノ酸分析により細胞シートの細胞状態を判定することを特徴とする細胞状態判定方法。
【請求項７】
前記５種類のアミノ酸群の少なくとも一つのアミノ酸濃度変化をモニタリングすることにより細胞の増殖、重層化、分化の状態を判定することを特徴とする請求項６に記載の細胞状態判定方法。
【請求項８】
前記検出部において、
培養中に細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される細胞状態を密集状態と定義した場合に、
前記密集状態以前において、前記５種類のアミノ酸群のうちのIle，Val，Ser，Leuのいずれかのアミノ酸濃度が減少し、その減少量が予め設定した閾値以上である場合、もしくは前記５種類のアミノ酸群のうちのAlaのアミノ酸濃度が増加し、その増加量が予め設定した閾値以上である場合に、細胞増殖が順調に進行していると判定する
ことを特徴とする請求項６に記載の細胞状態判定方法。
【請求項９】
培養中に細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される細胞状態を密集状態と定義した場合に、
前記密集状態以後において、前記５種類のアミノ酸群のうちのIle，Val，Ser，Leuのいずれかのアミノ酸濃度の変化量が、初期状態から前記密集状態までのアミノ酸濃度の変化量と比較して小さい場合、もしくは前記５種類のアミノ酸群のうちのAlaのアミノ酸濃度の変化量が、初期状態から前記密集状態までのアミノ酸濃度の変化量と比較して、大きい、または同じである場合に、前記細胞シートの重層化の開始タイミングおよび細胞重層化が順調に進行していると判定する
ことを特徴とする請求項６に記載の細胞状態判定方法。
【請求項１０】
培養中に細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される細胞状態を密集状態と定義した場合に、
前記密集状態以前においてAlaのアミノ酸濃度が増加し、前記密集状態以後において、Alaのアミノ酸濃度が減少し、前記アミノ酸濃度の増加量及び減少量が予め設定した閾値以上である場合に、前記細胞シートの細胞分化が順調に進行していると判定する
ことを特徴とする請求項６に記載の細胞状態判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞シートの細胞状態の判定方法、及びそれを用いた自動分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞から作製した組織を損傷部位に移植することにより、損傷した組織や器官の再生や機能の回復を実現する再生医療が近年注目されている。中でも生体模倣組織である細胞シートの移植は、細胞が単体で存在する細胞溶液と比較した場合に治癒効果がより高いことが知られており、ヒト表皮細胞シートは製品化され重度のやけど治療に使用されるなど細胞シートの臨床応用が進んでいる。現在この細胞シートに関して残された課題のひとつに細胞シートの細胞状態の非侵襲的評価方法の確立がある。細胞シートは細胞を播種後に以下のステップ１から３の段階を経て生体模倣組織となる。
ステップ１：培養表面に細胞が接着する。ステップ２：培養表面一面に細胞が単層に増殖し基底層となる。ステップ３：細胞が２層以上に重層化し、さらに２層目以上の細胞が分化する。
【０００３】
現状では移植に用いられる細胞シートの品質は、培養中の位相差顕微鏡による観察、および移植用細胞シートと同時に同条件で作製された評価用細胞シートに対する組織染色などの侵襲的評価によって検証されているが、これらの方法には課題がある。位相差顕微鏡による細胞観察は非侵襲的であり細胞培養中に随時実施されている一方、細胞シート表層の観察のみに対応しており、ステップ２以降の重層化した細胞シートを評価することはできない。また評価用細胞シートに対して実施されている組織染色評価は、ステップ２以降の重層化や分化の程度を評価可能であるが、細胞シートを固定するため侵襲的手法であり移植用シートそのものを評価することはできない。これらの課題を解決する非侵襲的モニタリング技術の確立は、移植用細胞シートの細胞状態を直接的に評価可能にすることにより移植用再生組織の品質向上に貢献するといえる。
【０００４】
これまでにいくつかの文献において非侵襲的な細胞評価手法が述べられている。例えば特許文献１では、胚、卵、カリオプラスト、幹細胞、幹細胞前駆体の細胞を対象として、その生育力を培地中のアミノ酸濃度を指標に判断し、健康な胚と停止中の胚を区別する手法を提案している。これは人工授精の際に健康な胚を選択して母体へ戻すことを目的としており、これができれば母体に戻す胚を１つに限定することが可能になり多胎生妊娠を減少させられるとしている。また特許文献２では、細胞シートを対象として培地中のグルコースとアンモニアの濃度の比から重層化の時期を判別し、適切なタイミングで培養を終了させることを可能にするとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００３−５２０４７号公報
【特許文献２】特開２００４−２１５５８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１が対象としている細胞は細胞シートと異なり、細胞シート特有の培養段階を経ない。そのため、文献に示された手法では細胞シートを評価する際に不可欠となる細胞の増殖、重層化、分化のタイミングと程度を評価することができない。また、特許文献２は細胞シートの重層化を対象としているが、この手法においては細胞シートの分化を評価することができない。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、生体模倣組織である細胞シートの細胞状態（増殖、重層化、分化）を非侵襲的に評価することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明に係る自動分析装置は、以下の特徴を有する。
（１）自動培養ユニットとアミノ酸分析ユニットとを備え、自動培養ユニットは、細胞シートを培養する培養容器と、培養容器に導入した培地をアミノ酸分析ユニットへ送液する流路とを有し、アミノ酸分析ユニットは、自動培養ユニットから送液された培地に含有される所定のアミノ酸の濃度を測定する検出部と、測定したアミノ酸の濃度を記憶する記憶部と、記憶部に記憶されたアミノ酸の少なくとも一つの濃度の変化を基にして、細胞シートの細胞状態を判定する判定部とを有し、所定のアミノ酸には、Ile，Val，Ser，Leu，Alaの５種類のアミノ酸を用い、アミノ酸の濃度の変化は、複数回に亘って検出部で経時的に測定され記憶部に記憶されたアミノ酸濃度に基づき算出されることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る細胞状態判定方法は、以下の特徴を有する。
（２）Ile，Val，Ser，Leu，Alaから構成される５種類のアミノ酸群を用いて、培養上清のアミノ酸分析により細胞シートの細胞状態を判定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体模倣組織である細胞シートの細胞状態（増殖、重層化、分化）を非侵襲的に評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培養上清中アミノ酸分析を組み込んだ自動分析装置の図である。
【図２】細胞ロットにおける細胞シートの細胞状態（増殖、重層化、分化）の違いを示す図である。
【図３Ａ】培養上清中アミノ酸濃度(Ile、Val、Ser、Leu、Ala)の経時変化を示す図である。
【図３Ｂ】培養上清中アミノ酸濃度(Asp、Glu、Met、Trp、Thr)の経時変化を示す図である。
【図３Ｃ】培養上清中アミノ酸濃度(Lys、Arg、Phe、His、Cys)の経時変化を示す図である。
【図３Ｄ】培養上清中アミノ酸濃度(Orn、Gly、Tyr、GluNH2、NH3)の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
先ず、本発明の実施形態について以下に説明する。
【００１３】
本発明は、上記課題に示す状況に鑑みてなされたものであり、細胞シートの培養上清を用いてアミノ酸分析を実施し、５種アミノ酸(Ile、Val、Ser、Leu、Ala)のいずれかの濃度変化をモニタリングすることにより細胞シートの増殖、重層化、分化の状態を判定する方法を提供する。アミノ酸は細胞の代謝物のひとつであり、細胞の状態が変化するのに伴い代謝が変化することから細胞シートの作製過程や細胞状態に依存してアミノ酸代謝量も変化し、これが培養上清中のアミノ酸濃度に反映される。
【００１４】
培養中に培養上清をサンプリングし、上清中のアミノ酸分析を実施する。測定サンプルには培地交換のタイミングで交換前の上清を用いても、少量であれば培地交換以外のタイミングで採取した上清を用いてもよい。培養上清中のアミノ酸分析手法は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が検出精度などから有力だが、ＨＰＬＣに限らずアミノ酸を定量可能な方法であれば質量分析法（ＭＳ）などのいずれの方法を用いてもよい。本手法によれば、廃棄する培地を用いて評価するため従来の培養過程を変更することなく容易にモニタリング実施が可能である。アミノ酸濃度は、細胞状態に依存して変化することから、その濃度や濃度変化量を測定することにより細胞シートの増殖、分化、重層化の過程が順調か否か判定できる。
【００１５】
また、この細胞状態の判定法は自動化可能であり、さらに自動培養装置に組み込むことも可能である。その場合には自動培養装置の培地交換ポートに分岐を設けて培養中のサンプルから培養上清を採取し、自動培養装置に持たせたアミノ酸分析装置に送液し分析するにより達成できる。
【００１６】
さらなる本発明の特徴は、以下の実施例によって明らかになるものである。
【実施例１】
【００１７】
以下に、本実施例に係る自動分析装置の構成および動作について述べる。
【００１８】
図１は、自動培養ユニット１００及びアミノ酸分析ユニット２００から構成される自動分析装置を示す。自動培養ユニット１００には、細胞培養機能が組み込まれ、アミノ酸分析ユニット２００には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が組み込まれている。
【００１９】
先ず、自動培養ユニット１００の構成について説明する。自動培養ユニット１００は、培地ボトル１、培地供給流路２、培養容器３、廃液流路４、廃液ボトル５、及び培養上清分析行き流路６、さらに、温度・湿度コントロール部２０、制御部２１から構成される。培養容器３は、通常、複数個が装備され、廃液流路４は、流路の途中に分岐点が設けられ、その分岐点には制御弁（図示せず）が設けられている。この制御弁により、一方は廃液ボトル５へ繋がるように切り替え、他方はアミノ酸分析ユニット２００へ繋がるように切り替える。温度・湿度コントロール部２０は、自動培養ユニット１００、または培養容器３の温度、及び湿度を所望の値に保持し、制御部２１は、温度・湿度コントロール部２０を制御し、培地を廃液流路４、または培養上清分析行き流路６への切り替えの制御などを行う。なお、温度・湿度コントロール部２０や制御部２１に電気的に接続される結線の図示は省略している。
【００２０】
次に、自動培養ユニット１００における動作について説明する。
培地は、培地ボトル１から培地供給流路２を通って培養容器３へ供給され細胞培養に用いられる。培地交換時に廃液となる古い培地は培養容器３から廃液流路４を通って廃液ボトル５へ廃棄されるが、培養上清の一部は廃液流路４から分岐された培養上清分析行き流路６を通ってアミノ酸分析ユニット２００へ運ばれ上清中のアミノ酸濃度が分析される。アミノ酸濃度から細胞状態を判定する際にはあらかじめ求めておいた細胞状態とアミノ酸濃度の相関を用いる。
【００２１】
アミノ酸分析ユニット２００の構成、及び動作について説明する。
アミノ酸分析ユニット２００は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、判定部３０、及び記憶部３１から構成されている。ＨＰＬＣには、分析用カラム７、検出部９などが装備されている。検出部９の検出器としては、質量分析器（図示せず）、あるいは分光分析器などを用いることができる。分光分析器を用いる場合は、光学系８を用いる。
なお、判定部３０や記憶部３１に電気的に接続される結線の図示は省略している。
【００２２】
自動培養ユニット１００の培養上清分析行き流路６を通ってアミノ酸分析ユニット２００へ運ばれた培地は、ＨＰＬＣ中の分析用カラム７へ導入され、分析用カラム中を通過する培地の濃度を検出部９により検出し、上清中のアミノ酸濃度が分析される。
【００２３】
検出部９により測定されたアミノ酸濃度は、一旦、記憶部３１に記憶される。通常、アミノ酸濃度の測定は、培養開始後、所定の間隔（日単位）を置いてなされる培地交換ごとに行われる。培地交換時点のアミノ酸濃度の測定は、培養が完了するまで、複数回に亘って行われる。
【００２４】
判定部３０では、記憶部３１に記憶された複数のアミノ酸濃度のデータを基にして、アミノ酸濃度の変化量を算出する。算出された変化量や培地交換日は、記憶部３１に記憶される。判定部３０は、記憶部に記憶された培地交換日や変化量のデータを基にして、アミノ酸の濃度の経時的変化を求める。
【００２５】
一方、記憶部３１には予め閾値を記憶させておく。この閾値は、アミノ酸の濃度変化が、有意差ある変化量であるか判定する基準値とするためのものである。
【００２６】
判定部３０は、以上に述べたアミノ酸の濃度の経時的変化、変化量、閾値を用いて、
細胞シートの細胞状態、すなわち増殖、重層化、分化が順調に進行しているか、異常が発生し正常な細胞が成長していないかの判定を行う。
【００２７】
本発明に係る自動分析装置は、実施例２で述べる細胞状態判定方法を基にして細胞シートの細胞状態の判定を実行する。
【実施例２】
【００２８】
≪細胞シートの培養≫
まず、本発明が対象とする細胞シートが正常に作製されるまでの培養段階を以下に示す。
表皮細胞は播種された後、２４時間程度で培養表面に接着する。
接着した細胞は、その後数日程度で密集状態まで平面状に増殖し、この１層目が細胞シートの基底層となる。
その後は、細胞が層状に増殖して重層化すると共に、２層目以上の細胞が分化することにより、１−２週間程度の期間を経て生体ヒト表皮細胞と類似した細胞シートとなる。
【００２９】
以下に、「密集状態」とは、上記（２）に示すように、細胞が平面状に増殖し、細胞シートの基底層が形成される状態を指すものとする。
また、「細胞状態」とは、特に、細胞シートにおける細胞の増殖、重層化、分化の状態を指すものとする。
【００３０】
なお、生体表皮細胞は層構造であり、下から基底層、有棘層、顆粒層、角化層から成り、細胞シートにおいても分化が進行すると有棘層、顆粒層の形成が見られる。細胞シートの評価法は、培養中は位相差顕微鏡による評価、培養後は組織染色による評価が一般的である。位相差顕微鏡による細胞シートの観察においては、培養表面上に存在する細胞の数や形状を確認する。この手法においては細胞増殖が正常かどうかを非侵襲的に判断可能であるが、培養中期以降もしくは終了時点における細胞シートの重層化や分化を判断することができない。
【００３１】
また、細胞シートの組織染色評価においては、組織を固定し作製した切片をヘマトキシリンエオシン染色または免疫染色によって染色し、細胞シートの重層化や分化を確認する。この手法においては、培養終了後の細胞シートの重層化や分化の程度を判断可能であるが、組織の固定や染色が必要となるため侵襲的手法であり、培養中に実施することや評価した細胞シートを移植に用いることができない。
【００３２】
≪ヒト表皮細胞シート培養時の培養上清アミノ酸モニタリング≫
同じ培養条件で培養した際に細胞状態が異なるヒト表皮細胞シートを３ロット（それぞれ、ロットＡ、Ｂ、Ｃと呼ぶことにする）を用意し、各ロットを以下の条件で培養した。培養上清モニタリングを実施し、培養上清中のアミノ酸濃度と細胞状態との相関を確認した。なお、それぞれの細胞シートの細胞状態は、従来の細胞シート評価法である培養中の位相差顕微鏡像および培養後の組織切片染色像から判断した。
【００３３】
≪実験条件≫
実験条件の詳細は、以下の通りである。
培養容器として、物質透過膜により上下２層に分離された構造のインサートを用いた。上層にはヒト表皮細胞とKeratinocyte Culture Medium（以後、ＫＣＭ培地と呼ぶ）を、下層にはＫＣＭ培地を入れ、細胞に下方からも栄養分が与えられる条件で培養した。上層に播種密度2.5×104  cells/cm2となるように調整したヒト表皮細胞を播種し、播種後は37 ℃、CO2  5 %のインキュベータで培養した。培養開始後、４日、７日、９日、１１日、１３日、１４日、１５日後に上層、下層ともに全量培地交換を行い１６日間培養した。培地交換時に古い培地を回収し培養上清中の成分について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて４１種のアミノ酸類(P-Ser、Tau、PEA、Urea、Asp、Thr、Ser、AspNH2、Glu、GluNH2、Sar、a-AAA、Gly、Ala、Cit、a-ABA、Val、Cys、Met、Cysthi、Ile、Leu、Tyr、Phe、b-Ala、b-AiBA、g-ABA、Trp、EOHNH2、NH3、Hylys、Orn、Lys、1Mehis、His、3Mehis、Ans、Car、Arg、Hypr、Pro）の定量分析を実施した。
【００３４】
なお、培養に用いない培地のみを同条件でインキュベートし回収したサンプルもコントロールとして用意し、測定誤差の検証に用いた。
【００３５】
≪実験結果≫
実験結果は、図２に示す通りである。本図に示すように、細胞のロット（ロットＡ、Ｂ、Ｃ）によって細胞シートの増殖、重層化、分化に示す差異が見られた。
【００３６】
ロットＡは、７日間で密集状態まで増殖を示した。重層化に関しては、３層程度を示した。また、分化に関しては、基底層、有棘層、顆粒層の各層に分化した。
【００３７】
ロットＢは、９日間で密集状態まで増殖を示した。重層化に関しては、３層程度を示した。また、分化に関しては、基底層、有棘層の各層に分化した。
【００３８】
上記各ロットの詳細を説明する。ロットＡおよびロットＢは、以下の過程を辿って細胞シートが作製された。細胞が培養表面に接着後、密集状態まで単層で増殖し、その後細胞ひとつひとつの大きさが見かけ上小さくなり、密集状態から２−３日して敷石状の細胞が観察されるようになり、その後は培養日数が経っても顕微鏡像に変化が見られなかった。ロットＡとロットＢには細胞増殖速度に違いが見られ、ロットＢの場合にはロットＡと比較してシート作製に２日程度の遅れが見られ、ロットＡでは培養７日目に密集状態になったのに対し、ロットＢでは培養９日目に密集状態になった。
【００３９】
ロットＣは、培養４日目時点で、培養表面に接着している細胞が極端に少なく、その後培養日数が経っても接着細胞の増殖が悪く細胞シートの作製には至らなかった。従って、図２に示すように、ロットＣの結果は、増殖は不良であり、重層化も不良で、分化は基底層のみとなった。
【００４０】
≪４１種類のアミノ酸≫
これらの３ロット（ロットＡ、Ｂ、Ｃ）の細胞培養上清およびコントロールの培地について、４１種のアミノ酸類(P-Ser、Tau、PEA、Urea、Asp、Thr、Ser、AspNH2、Glu、GluNH2、Sar、a-AAA、Gly、Ala、Cit、a-ABA、Val、Cys、Met、Cysthi、Ile、Leu、Tyr、Phe、 b-Ala、b-AiBA、g-ABA、Trp、EOHNH2、NH3、Hylys、Orn、Lys、1Mehis、His、3Mehis、Ans、Car、Arg、Hypr、Pro)の定量解析を実施した結果を以下に示す。なお、本定量解析では、アミノ酸濃度の変化を観察している。
【００４１】
アミノ酸濃度は、ロット、つまり細胞状態によって異なる挙動を示した。アミノ酸は細胞の代謝物のひとつであり、細胞の状態が変化するのに伴い代謝が変化することからアミノ酸代謝量も変化し、培養上清中のアミノ酸濃度に反映されるためである。
【００４２】
分析された４１種のアミノ酸のうち、２１種類(P-Ser、Tau、PEA、Urea、AspNH2、Sar、a-AAA、Cit、a-ABA、Cysthi、b-Ala、b-AiBA、g-ABA、EOHNH2、Hylys、1Mehis、3Mehis、Ans、Car、Hypr、Pro）のアミノ酸類は、すべてのサンプルに共通して検出されなかった。
【００４３】
一方、４１種のアミノ酸のうち、残りの２０種類に関しては、アミノ酸が検出された。
従って、以下において残りの２０種類のアミノ酸に関して考察する。図３Ａ〜３Ｄに、その２０種類のアミノ酸に関して培養上清中のアミノ酸濃度の経時変化を示す。
【００４４】
≪１５種類のアミノ酸≫
ところで、検出された２０種類のアミノ酸類のうち、１５種類(Asp、Thr、Glu、GluNH2、Gly、Cys、Met、Tyr、Phe、Trp、NH3、Orn、Lys、His、Arg)については、細胞培養前後の変化量が、培養に用いない培地のみを上記１５種類のアミノ酸と同条件でインキュベートし回収したサンプルから求めた濃度変化量が測定誤差以下であり、また細胞の密集状態を観察できなかった（図３Ｂ〜３Ｄを参照）。そのため、この１５種類のアミノ酸類は、培養上清分析に適していないと判断した。
【００４５】
因みに、上記の結果の判定に用いたアミノ酸ごとの測定誤差は、以下の通りである。
それぞれのコントロールとして測定した培養に用いない培地中のアミノ酸分析における測定誤差[nmol/20μl]は、Asp:0.36、Thr:0.63、Glu:1.76、GluNH2:7.32、Gly:0.26、Cys:0.16、 Met:0.18、Tyr0.29、Phe:0.40、Trp:0.07、NH35.90、Orn:0.09、Lys:0.62、His:0.19、Arg:0.5６であった。
【００４６】
以上の結果から、２０種類から１５種類を差し引いた５種類のアミノ酸について以下に考察する。
【００４７】
≪５種類のアミノ酸≫
上記選別により残された５種類のアミノ酸(Ser、Ala、Val、Ile、Leu）が細胞状態判定に適切な変化を示した。
なお、培地中のアミノ酸分析における測定誤差[nmol/20μl]は、Ser:0.36、Ala:0.33、Val:0.11、Ile:0.51、Leu:0.20であった。
【００４８】
以下に、図３Ａ〜３Ｄに５種類のアミノ酸についての詳細な結果を示す。
これらの図は、培地交換日（4、7、9、11、13、14、15日）における培養上清中のアミノ酸濃度[nmol/20μl]を示す。ここで、図中の水平方向の基準線は、培養前の初期値を示している。従って、その基準線に対して測定点が上にある場合には、代謝により細胞へ取り込まれたアミノ酸よりも、細胞から分泌されたアミノ酸の方が多いことを意味する。一方、測定点が基準線に対して下にある場合には逆の現象、すなわち細胞から分泌よりもアミノ酸の取り込みが多いことを意味する。
【００４９】
なお、上述した培地交換日には、全量の培地を新しいものに置き換えているため、培地交換の度に培養上清中のアミノ酸濃度は培養前の初期値に戻っていると考えられる。
【００５０】
また、培養上清回収の間隔が不規則であることから、図で示したアミノ酸濃度は、それぞれ１日分の変化量に換算した値を用いている。例えば、培養日数７日目の図は、培養日数７日目時点では連続培養日数が４日目以降の３日間のため、７日目に回収された培養上清における初期値に対するアミノ酸変化量を連続培養日数３で割った値をもとにアミノ酸濃度を換算して示している。また、培養日数１３日目以降は、毎日培地交換を実施している（連続培養日数が１日）ため、その日に回収された培養上清における初期値に対するアミノ酸変化量をそのまま用いてアミノ酸濃度を示している。
【００５１】
図３Ａにおいて、垂直方向の基準線は、細胞が密集状態になった時点を示している。また、５種類のアミノ酸のうち４種類、具体的にはIle、Val、Ser、Leuは、測定点が基準線に対して下回っているので、細胞への取り込み量が分泌量を上回っている。一方、５種類のアミノ酸のうちの１種類、Alaのみは測定点が基準線に対して上回っているので、分泌量が取り込み量を上回っていることを示す。
【００５２】
なお、ロットＡおよびロットＢでは明らかなアミノ酸濃度変化が見られたが、ロットＣではこれに比べ変化量が著しく小さかった。
また、培養前期においては、ロットＡ、ロットＢは共にIle、Val、Ser、Leuの経時的な分泌量の増加が見られ、Alaの経時的な取り込み量の増加が見られた。しかし、培養後期以降は一部変化の傾向が異なった。ここで、培養前期は、細胞が密集状態となった時点より前を指し、培養後期は、細胞が密集状態となった時点より後を指す。
【００５３】
これを解釈すると以下のことが分かる。
【００５４】
≪細胞増殖の判定≫
細胞増殖については、密集状態になる以前の細胞増殖過程が順調であるかを５種類のアミノ酸（Ile、Val、Ser、Leu、Ala）のいずれかのアミノ酸濃度により判定可能である。
図３Ａに示すように、ロットＡとＢは順調に増殖し、一方、ロットＣは増殖不良であった。このときの５種類の各アミノ酸の濃度変化について述べる。
【００５５】
（１）Ileは、ロットＡとロットＢでは経時的に濃度が顕著に減少し、密集状態の時点の値を初期値と比較すると１．６４ [nmol/20μl] 以上の変化があった。しかし、ロットＣにおいては変化が小さく、培養中の初期値からの変化量はどの時点においても０．６６ [nmol/20μl] 以下であった。
【００５６】
（２）Valは、ロットＡとロットＢでは経時的に濃度が顕著に減少し、密集状態の時点の値を初期値と比較すると１．２４ [nmol/20μl] 以上の変化があった。しかし、ロットＣにおいては変化が小さく培養中の初期値からの変化量はどの時点においても０．３３ [nmol/20μl] 以下であった。
【００５７】
（３）Serは、ロットＡとロットＢでは経時的に濃度が顕著に減少し、密集状態の時点の値を初期値と比較すると１．４８ [nmol/20μl] 以上の変化があった。しかし、ロットＣにおいては変化が小さく培養中の初期値からの変化量はどの時点においても０．２４ [nmol/20μl] 以下であった。
【００５８】
（４）Leuは、ロットＡとロットＢでは経時的に濃度が顕著に減少し、密集状態の時点の値を初期値と比較すると１．９１ [nmol/20μl]以上の変化があった。しかし、ロットＣにおいては変化が小さく培養中の初期値からの変化量はどの時点においても０．７１ [nmol/20μl] 以下であった。
【００５９】
（５）Alaは、ロットＡとロットＢでは経時的に濃度が顕著に増加し、密集状態の時点の値を初期値と比較すると１．７７ [nmol/20μl] 以上の変化があった。しかし、ロットＣにおいては変化が小さく培養中の初期値からの変化量はどの時点においても０．４３ [nmol/20μl] 以下であった。
【００６０】
よって、細胞増殖についてはSer、Leu、Val、Ileのいずれかの濃度減少もしくはAla濃度増加が閾値以上であるかどうかで細胞の増殖が順調か否か判定できる。
【００６１】
なお、この判定は、密集状態時点と初期時点におけるそれぞれのアミノ酸濃度の変化量が予め設定した閾値よりも大きい場合は、変化量に有意差があると判定し、細胞の増殖が順調であるとする。一方、閾値よりも小さい場合は、細胞の増殖が順調でないと判定する。
【００６２】
この閾値には、細胞増殖を行う対象ごとに予め実験データ等に基づき適正値として選択された値を使用する。
【００６３】
≪細胞重層化の判定≫
細胞重層化については、重層化開始のタイミングおよび細胞重層化過程が順調であるかをIle、Val、Ser、Leu、Alaのいずれかのアミノ酸濃度により判定可能である。ロットＡとＢは順調に重層化し、ロットＣは重層化不良であったが、このときロットＡおよびＢにおいては、いずれのアミノ酸についても細胞増殖時に見られる濃度変化が密集状態を境に増殖時に見られる濃度変化が著しく減少、もしくは逆転した。一方、ロットＣは、アミノ酸濃度に変化がほとんど見られなかった。
【００６４】
よって、細胞重層化についてはIle、Val、Ser、Leu、Alaのいずれかのアミノ酸濃度変化量が初期状態から密集状態前までのアミノ酸濃度変化量と比較して著しく減少、もしくは逆転するタイミングで開始していることで判定できる。このような変化量が見られる場合には、重層化が進行していると判定できる。
【００６５】
≪細胞分化の判定≫
細胞分化については、細胞分化過程が順調であるかをAlaの濃度により判定可能である。ロットＡは、顆粒層まで分化したのに対し、ロットＢは、有棘層までに留まり顆粒層まで分化しなかった。しかし、このときロットＡは、密集状態後にAla濃度が経時的に減少したのに対し、ロットＢは、密集状態後の濃度変化が乏しい。１６日目のAla濃度は、ロットＡは２．１５ [nmol/20μl]であったのに対し、ロットＢは５．１３ [nmol/20μl]でありロットＡの方が２．９８ [nmol/20μl] 低かった。
【００６６】
よって、細胞分化についてはAla濃度変化の傾向と濃度減少が閾値以上であるかどうかで順調か否か判定できる。また、他のIle、Val、Ser、Leu、についてもAlaほど顕著ではないが同様に、ロットＡでは密集状態後にロットＢでは見られない濃度変化の逆転が見られ、同様に細胞分化の指標となりうる。
【符号の説明】
【００６７】
１…培地ボトル、
２…培地供給流路、
３…培養容器、
４…廃液流路、
５…廃液ボトル、
６…培養上清分析行き流路、
７…分析用カラム、
８…光学系、
９…検出部、
２０…温度・湿度コントロール部、
２１…制御部、
３０…判定部、
３１…記憶部
３１…培地供給流路、
３２…廃液流路、
３３…培養上清分析行き流路。
１００…自動培養ユニット、
２００…アミノ酸分析ユニット。
【図１】
2015006134.tif 000003
【図２】
2015006134.tif 000004
【図３Ａ】
2015006134.tif 000005
【図３Ｂ】
2015006134.tif 000006
【図３Ｃ】
2015006134.tif 000007
【図３Ｄ】
2015006134.tif 000008