(57)【要約】【課題】従来技術と比較して、粒子の単分散状態を長期間維持することが可能な粒子の単分散状態維持方法と、その方法を用いて得た単分散粒子を利用した分析対象物の検出方法とを提供する。【解決手段】本発明に係る粒子の単分散状態維持方法は、分散媒１２に単分散粒子１４が分散した分散液１０を、単分散粒子１４を支持可能な支持体２０に浸潤させた後に支持体２０を乾燥させて支持体２０を保存し、単分散粒子１４の使用時に、保存した支持体２０を分散媒３２に浸漬させて、支持体２０に支持された単分散粒子１４を分散媒３２に溶出させるものである。【選択図】  図１
2015102337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の分散媒に単分散粒子が分散した分散液を、前記単分散粒子を支持可能な支持体に浸潤させた後に前記支持体を乾燥させて前記支持体を保存し、前記単分散粒子の使用時に前記保存した支持体を第２の分散媒に浸漬させて、前記支持体に支持された前記単分散粒子を前記第２の分散媒に溶出させることを特徴とする粒子の単分散状態維持方法。
【請求項２】
前記単分散粒子は、単体、化合物、混合物のいずれか１つで形成されており、且つ乾燥及び固化が可能なものであることを特徴とする請求項１に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項３】
前記単分散粒子は、金属コロイド粒子、蛍光色素内包粒子、可視色素内包粒子の少なくとも１つからなるものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項４】
前記金属コロイド粒子は、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、鉄コロイド粒子、アルミニウムコロイド粒子、白金コロイド粒子の少なくとも１つからなるものであることを特徴とする請求項３に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項５】
前記支持体は、繊維性または多孔性であるとともに、無機材料または有機材料で形成されたものであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項６】
前記支持体は、シリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、ゼオライトのいずれか１つで形成されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項７】
前記第１の分散媒は、糖類、界面活性剤、ポリマーの少なくとも１つを含んでいることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項８】
前記蛍光色素内包粒子は、蛍光色素と磁性体とを内包していることを特徴とする請求項３に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項９】
前記蛍光色素は、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価又は三価の鉄、三価また四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄化合物、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（以上、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（以上、Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上、ＧＥヘルスケア社製）の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素であることを特徴とする請求項８に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項１０】
前記蛍光色素内包粒子は、ポリマー、ゲル、ヒドロゲル、ガラス担体、基質の少なくとも１つに埋設または重合されていることを特徴とする請求項３、請求項８、請求項９のいずれか一項に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項１１】
前記単分散粒子の表面には、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つと物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する標識物が設けられていることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の粒子の単分散状態維持方法。
【請求項１２】
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の粒子の単分散状態維持方法を用いて得た単分散粒子と、分析対象物とを反応させることを特徴とする分析対象物の検出方法。
【請求項１３】
前記単分散粒子の表面に設けた前記標識物と、前記標識物と物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する前記分析対象物とを反応させることを特徴とする請求項１２に記載の分析対象物の検出方法。
【請求項１４】
前記分析対象物は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載の分析対象物の検出方法。
【請求項１５】
前記単分散粒子と反応した前記分析対象物の分量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定することを特徴とする請求項１２から請求項１４のいずれか一項に記載の分析対象物の検出方法。
【請求項１６】
前記単分散粒子の表面に設けた前記標識物を核酸分子とし、前記核酸分子と反応した前記分析対象物を、１以上の配列の増幅、転写、標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼーション、翻訳、ライゲーションが酵素反応として行われる方法、転写因子検出におけるプルダウン法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定することを特徴とする請求項１３に記載の分析対象物の検出方法。
【請求項１７】
前記核酸分子は、オリゴヌクレオチド、目的遺伝子に対応するＤＮＡ、タンパク質に結合するＤＮＡ、目的遺伝子に対応するＲＮＡ、終止コドンを欠くｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ用２本鎖ＲＮＡの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１６に記載の分析対象物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子の単分散状態維持方法及び分析対象物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、数ｎｍ〜１μｍ程度の微小粒子は、様々な分野に応用されており、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒等に用いられる多孔質シリカ粒子、ゼオライト粒子や、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子や、導電材料に使われる金属ナノ粒子や、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子等、微小粒子の材質及び用途は多岐にわたる。このような微小粒子の応用は、様々な分野で期待されており、例えば生化学、新規材料、電子素子、発光表示素子、印刷、医療などの分野でその研究が盛んになりつつある。
【０００３】
例えば、医療の分野では、臨床検査で用いられる、免疫反応を利用した測定方法（以下、「免疫学的測定方法」ともいう。）に微小粒子が応用されている。この免疫学的測定方法には、例えば、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などの多くの方法がある。その中でも、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないホモジニアス系であるため、測定の自動化や短時間での測定に適している。特に、粒子径が５〜１００ｎｍの金コロイド粒子は、ラテックス凝集法で通常用いられるラテックス粒子よりも粒子径が小さいため、より微量物質の測定に適している。
【０００４】
金コロイド粒子を用いた微量物質の測定に係る技術としては、例えば、特許文献１又は特許文献２に記載されたものがある。特許文献１には、被測定物質と、その被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子とを溶液中で反応させ、反応開始後の吸光度変化を６１０〜８００ｎｍの範囲で測定する技術が記載されている。また、特許文献２には、検体とハプテン結合蛋白質を含有する第１試薬とを混合し、その混合液に抗ハプテン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合し、その後、抗ハプテン結合蛋白質と抗ハプテン抗体結合金コロイドとの免疫反応凝集による吸光度変化を５００〜５８０ｎｍの範囲で測定する技術が記載されている。
【０００５】
液体（分散媒）中に分散された粒子は、粒子表面に分子が結合していると、その分子の影響により粒子間で凝集が起こりやすくなる。特に、微小粒子に分類されるナノスケールの粒子（所謂、ナノ粒子）は、粒子表面の影響を顕著に受ける。凝集した粒子は、粒子径が変わるために目的とする用途に適さなくなる可能性がある。この点に関し、例えば特許文献３に記載された方法のように、超音波処理によって、凝集した粒子を単分散させ、その粒子を一次粒子として使用する方法がある。より詳しくは、特許文献３に記載された方法のように、凝集ナノ粒子液に周波数の異なる２つ以上の超音波を印加して、凝集したナノ粒子を微細分散化する方法がある。
【０００６】
また、凝集を起こさせない工夫として、例えば特許文献４に記載された方法のように、シリカナノ粒子の表面にホスホリルコリン基を含むコポリマーを付着させる方法がある。より詳しくは、特許文献４に記載された方法のように、シリカ粒子の表面に生体分子及びホスホリルコリン基を含むコポリマーを吸着又は結合させ、生体分子を、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質及びペプチドからなる群から選ばれた少なくとも１種とする方法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２８３２５０号公報
【特許文献２】特開２００４−３２５１９２号公報
【特許文献３】特開２００６−３１２１３０号公報
【特許文献４】特開２０１１−２５２８１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献３に記載の方法では、凝集した粒子を確実に再分散させることができるものの、再分散させるための専用の装置と、再分散に係る作業工程とが別途必要となる。このため、作業が煩雑になるとともに、再分散させた粒子において粒径分布の再現性の低下を招く恐れがある。このため、特許文献３に記載の方法は、上記免疫学的測定方法を用いた定量性を求める試験に適さないことがある。
【０００９】
また、特許文献４に記載の方法では、粒子組成（粒子の素材）がシリカに限定されているため、多種にわたる上記免疫学的測定方法に対応できない恐れがある。
以上のように、従来技術には、粒子の単分散状態を長期間維持することは困難であるといった課題がある。
本発明は、上記事情を鑑み、従来技術と比較して、粒子の単分散状態を長期間維持することが可能な粒子の単分散状態維持方法と、その方法を用いて得た単分散粒子を利用した分析対象物の検出方法とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、第１の分散媒に単分散粒子が分散した分散液を、前記単分散粒子を支持可能な支持体に浸潤させた後に前記支持体を乾燥させて前記支持体を保存し、前記単分散粒子の使用時に前記保存した支持体を第２の分散媒に浸漬させて、前記支持体に支持された前記単分散粒子を前記第２の分散媒に溶出させることを特徴とする粒子の単分散状態維持方法である。
【００１１】
また、上記単分散状態維持方法において、前記単分散粒子は、単体、化合物、混合物のいずれか１つで形成されており、且つ乾燥及び固化が可能なものであることとしてもよい。
また、上記単分散状態維持方法において、前記単分散粒子は、金属コロイド粒子、蛍光色素内包粒子、可視色素内包粒子の少なくとも１つからなるものであることとしてもよい。
【００１２】
また、上記単分散状態維持方法において、前記金属コロイド粒子は、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、鉄コロイド粒子、アルミニウムコロイド粒子、白金コロイド粒子の少なくとも１つからなるものであることとしてもよい。
また、上記単分散状態維持方法において、前記支持体は、繊維性または多孔性であるとともに、無機材料または有機材料で形成されたものであることとしてもよい。
【００１３】
また、上記単分散状態維持方法において、前記支持体は、シリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、ゼオライトのいずれか１つで形成されていることとしてもよい。
また、上記単分散状態維持方法において、前記第１の分散媒は、糖類、界面活性剤、ポリマーの少なくとも１つを含んでいる緩衝剤としてもよい。
また、上記単分散状態維持方法において、前記蛍光色素内包粒子は、蛍光色素と磁性体とを内包していることとしてもよい。
【００１４】
また、上記単分散状態維持方法において、前記蛍光色素は、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価又は三価の鉄、三価また四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄化合物、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（以上、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（以上、Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上、ＧＥヘルスケア社製）の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素であることとしてもよい。
【００１５】
また、上記単分散状態維持方法において、前記蛍光色素内包粒子は、ポリマー、ゲル、ヒドロゲル、ガラス担体、基質の少なくとも１つに埋設または重合されていることとしてもよい。
また、上記単分散状態維持方法において、前記単分散粒子の表面には、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つと物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する標識物が設けられていることとしてもよい。
【００１６】
本発明の別の態様は、上記記載の粒子の単分散状態維持方法を用いて得た単分散粒子と、分析対象物とを反応させることを特徴とする分析対象物の検出方法である。
また、上記検出方法において、前記単分散粒子の表面に設けた前記標識物と、前記標識物と物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する前記分析対象物とを反応させることとしてもよい。
【００１７】
また、上記検出方法において、前記分析対象物は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つであることとしてもよい。
また、上記検出方法において、前記単分散粒子と反応した前記分析対象物の分量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定することとしてもよい。
【００１８】
また、上記検出方法において、前記単分散粒子の表面に設けた前記標識物を核酸分子とし、前記核酸分子と反応した前記分析対象物を、１以上の配列の増幅、転写、標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼーション、翻訳、ライゲーションが酵素反応として行われる方法、転写因子検出におけるプルダウン法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定することとしてもよい。
また、上記検出方法において、前記核酸分子は、オリゴヌクレオチド、目的遺伝子に対応するＤＮＡ、タンパク質に結合するＤＮＡ、目的遺伝子に対応するＲＮＡ、終止コドンを欠くｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ用２本鎖ＲＮＡの少なくとも１つであることとしてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の一態様によれば、支持体に単分散粒子を支持することができる。そして、単分散粒子を使用する際に、その単分散粒子が支持された支持体を第２の分散媒に溶出することで、単分散状態を維持した粒子を得ることができる。このため、本発明の一態様であれば、従来技術と比較して、粒子の単分散状態を長期間維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法の工程を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る分析対象物の検出方法の工程を模式的に示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法を用いなかった場合の粒子の粒度分布測定の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法を用いなかった場合の粒子を超音波処理し、粒度分布を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法を用いた場合の粒子の粒度分布測定の結果を示す図である。
【図６】乾燥前後における単分散粒子を用いた測定の蛍光強度測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法と、その方法で単分散状態を維持して得た単分散粒子を利用した分析対象物の検出方法について説明する。初めに粒子の単分散状態維持方法について説明し、次に分析対象物の検出方法について説明する。
＜粒子の単分散状態維持方法＞
図１は、本実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法の工程を模式的に示す図である。本実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法は、図１に示すように、分散媒（第１の分散媒）１２に単分散粒子１４が分散した分散液１０を、単分散粒子１４を支持可能な支持体２０に塗布して浸潤させる工程（浸潤工程）と、支持体２０を乾燥させて支持体２０に浸潤させた分散媒１２の水分を除去する工程（乾燥工程）と、単分散粒子１４の使用時に乾燥させて保存しておいた支持体２０を分散媒（第２の分散媒）３２に浸漬させて、支持体２０に支持された単分散粒子１４を分散媒３２に溶出させる工程（溶出工程）とを有している。以下、これらの工程の詳細について説明する。なお、本実施形態で「単分散粒子」とは、大きさ（粒子径）が均一で、且つ分散性の良好な粒子を意味する。
【００２２】
（浸潤工程）
本実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法では、まず、図１（ａ）に示すように、分散媒１２に単分散粒子１４が分散した分散液１０を、単分散粒子１４を支持可能な支持体２０に塗布して浸潤させる。分散液１０を浸潤させた後は、支持体２０をスポンジ様の台に静置する。なお、図１（ｂ）は、分散液１０を支持体２０全体に浸潤させた状態を示している。
支持体２０は、単分散粒子１４を支持可能なものであればよく、例えば繊維性または多孔性であるとともに、無機材料または有機材料で形成されたものである。以下、具体例を挙げて説明する。
【００２３】
支持体２０に用いられる繊維性の材料（繊維素材）としては、例えば、合成繊維（ポリエステル繊維、ポリエチレンテレフタレート繊維、ポリアミド繊維、ポリカーボネート繊維、ポリイミド繊維、ポリエーテルエーテルケトン繊維、ポリエーテルスルホン繊維、ポリフェニレンスルフィド繊維、ポリアセタール繊維、フェノール樹脂繊維、ポリアリレート繊維、液晶ポリマー繊維等）、半合成繊維（セルロースアセテート等のセルロースエステル繊維等）、天然繊維（セルロース繊維、綿、麻、岩綿、羊毛繊維等）、無機繊維（炭素繊維、炭化ケイ素繊維、ガラス繊維、石英繊維、シリカ−アルミナ繊維等）が挙げられる。なお、これらの材料を単独で又は二種以上組み合わせて用いてもよい。また、上述の材料の中でも、単分散粒子１４の溶出効率をより高めるためには、ガラス繊維又は石英繊維で支持体２０を形成することがより好ましい。
【００２４】
支持体２０に用いられる多孔性の材料（多孔質素材）としては、例えば、カオリン、焼成クレー、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、硫酸バリウム、アルミナ、酸化チタン、タルク、雲母粉、シリカ等を挙げることができる。なお、支持体２０の材料については、公知のものであればこれらの例に限定されない。上述の材料の中でも、単分散粒子１４の溶出効率をより高めるためには、シリカゲル又はゼオライトで支持体２０を形成することが好ましい。
【００２５】
支持体２０の形状は、特に制限されるものではなく、例えば、ペレット状、粒状、ハニカム状、平板状である。これらの形状の中でも、支持体２０の乾燥を均一に行うことができる平板状が最も好ましい。
支持体２０に浸潤させる分散液１０は、図１（ａ）に示すように、単分散粒子１４と、その単分散粒子１４を分散させる分散媒１２とを含んでいる。
【００２６】
単分散粒子１４は、単体、化合物、混合物のいずれか１つで形成されており、且つ乾燥及び固化が可能なものである。より具体的には、単分散粒子１４は、金属コロイド粒子、蛍光色素内包粒子、可視色素内包粒子の少なくとも１つからなるものである。また、上述の金属コロイド粒子は、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、鉄コロイド粒子、アルミニウムコロイド粒子、白金コロイド粒子の少なくとも１つからなるものである。
【００２７】
上述の蛍光色素内包粒子は、蛍光色素と磁性体とを内包している。また、蛍光色素内包粒子に内包された蛍光色素は、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価又は三価の鉄、三価又は四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価又は三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄化合物、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（以上、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（以上、Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上、ＧＥヘルスケア社製）の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素である。また、蛍光色素内包粒子は、ポリマー、ゲル、ヒドロゲル、ガラス担体、基質の少なくとも１つに埋設または重合されている。
【００２８】
単分散粒子１４の表面には、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つと物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する標識物１６が設けられている。
また、単分散粒子１４の粒子径は、１０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下の範囲内であることが好ましい。
【００２９】
なお、単分散粒子１４は、上述した単分散粒子以外にも、例えば、色素未内包の粒子や着色粒子であってもよい。また、単分散粒子１４の材料は、上述した材料以外にも、例えば、シリカ粒子、ラテックス粒子、半導体ナノ粒子、金粒子、金属ナノ粒子、無機結晶粒子等であってもよい。
分散媒１２は、緩衝剤として、糖類、界面活性剤、ポリマーの少なくとも１つを含んでいる。これらの緩衝剤を分散媒１２に含ませることで、支持体２０の乾燥時に単分散粒子１４の凝集を防ぐと同時に、支持体２０を分散媒３２に浸漬させた際に支持体２０から単分散粒子１４を容易に溶出させることができる。
【００３０】
分散媒１２に含まれる糖類としては、例えば、トレハロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、ラクトース、マルトシルトレハロース、デキストリン、デンプン、プルラン等が挙げられる。また、糖類には単糖類、少糖類、多糖類があるが、本実施形態に係る糖類としては、単糖類、少糖類が特に好ましい。また、分散液１０における糖類の終濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）以上５％（ｗ／ｖ）以下の範囲内であることが望ましい。
【００３１】
分散媒１２に含まれるポリマーは、親水性又は両親媒性のものであればよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ−１，３−ジオキソラン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリアミノ酸、タンパク質、特にポリエチレングリコールが好ましい。なお、ポリエチレングリコールの分子量は、３００以上２０，０００以下の範囲内であることが好ましい。分散液１０におけるポリマーの終濃度は、０．０１％以上０．２５％以下の範囲内であることが望ましい。
【００３２】
分散媒１２に含まれる界面活性剤としては、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、スクロースモノコレート、β−Ｄ−フラクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエート、β−Ｄ−フラクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノデカノエート、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸等が挙げられる。なお、これらの界面活性剤を１種又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
上述の分散液１０を支持体２０に塗布して浸潤させる方法としては、例えば、含浸法、スプレー法、メイヤーバー方式、グラビア方式、マイクログラビア方式、ダイ方式、ブレード方式、マイクロロッド方式、エアナイフ方式、カーテン方式、スライド方式、ロール方式等の公知の塗布方法を挙げることができる。
【００３４】
（乾燥工程）
上述の浸潤工程後、分散液１０を浸潤させた支持体２０を乾燥させる。より詳しくは、図１（ｃ）に示すように、支持体２０に浸潤させた分散媒１２の水分を支持体２０から除去する（蒸発させる）。支持体２０を乾燥させる方法としては、公知の技術を用いることができる。より具体的には、分散液１０を浸潤させた支持体２０が乗った台を、乾燥剤を備えた真空デシケータ内に静置し、油回転真空ポンプで真空デシケータ内を減圧することで、支持体２０を減圧乾燥する。この際、支持体２０を乗せる台としてプラスチックやガラス等の平板ではなく、スポンジ様の台を利用すると、浸潤させた支持体２０の周辺環境の通気性が増して、より均一に乾燥が行われる。こうすることで、減圧乾燥した支持体２０の内部に粒子を単分散状態で存在（維持）させることができる。換言すると、単分散粒子１４を凝集させることなく支持体２０に支持することができる。
以上のようにして、単分散粒子１４を保存する。
【００３５】
（溶出工程）
上述の乾燥工程後、単分散粒子１４の使用時に単分散粒子１４を含んだ支持体２０を分散媒３２に浸漬させる。より詳しくは、図１（ｄ）に示すように、単分散粒子１４を使用する際に、乾燥させた支持体２０を分散媒３２に浸漬させて撹拌することで、支持体２０に支持されていた単分散粒子１４を分散媒３２に溶出させる。最後に、図１（ｅ）に示すように、分散媒３２中から支持体２０を取り出す。こうして、単分散粒子１４が分散媒３２中に分散した分散液３０を得る。
なお、分散媒１２と分散媒３２とは、同じ種類の分散媒であっても異なる種類の分散媒でもよい。
以上の工程を経て、本実施形態に係る粒子の単分散状態維持方法は終了する。
【００３６】
（使用例）
上述の粒子の単分散状態維持方法を用いて得た単分散粒子１４を利用した試薬又は試料を製造する。こうして製造した試薬又は試料は、例えば、化学分析、実験、試験研究、検査、治療に供されるものである。
（効果）
（１）以上のように、上記単分散状態維持方法では、分散媒１２に単分散粒子１４が分散した分散液１０を、単分散粒子１４を支持可能な支持体２０に浸潤させた後に支持体２０を乾燥させて支持体２０を保存し、単分散粒子１４の使用時に、保存した支持体２０を分散媒３２に浸漬させて、支持体２０に支持された単分散粒子１４を分散媒３２に溶出させている。
【００３７】
この構成であれば、単分散粒子１４は支持体２０で支持されるので、単分散粒子１４を凝集させることなく単分散状態を維持することができる。そして、単分散粒子１４を使用する際に、その単分散粒子１４を支持体２０から分散媒３２に溶出させることで、単分散粒子１４を得ることができる。このため、本実施形態であれば、従来技術と比較して、粒子の単分散状態を長期間維持することができる。
【００３８】
さらに、本実施形態であれば、即使用可能な形態であり、且つ単分散粒子１４の表面活性を保持できるので、粒子を使用する様々な測定において単分散粒子１４の利用が可能となる。また、本実施形態であれば、粒子の凝集による測定誤差を防げることができるので、安定性及び再現性を高めた測定が可能となる。また、本実施形態であれば、分散処理が不必要となるため、操作の簡便化、作業時間の短縮、作業効率の向上が可能となる。
【００３９】
（２）また、上記単分散状態維持方法では、単分散粒子１４は、単体、化合物、混合物のいずれか１つで形成されており、且つ乾燥及び固化が可能なものである。
この構成であれば、単分散粒子１４の物理的強度や化学的強度が増すため、分散液１０を浸潤させた支持体２０を十分に乾燥させても単分散粒子１４の特性は変化しにくい。このため、分析等に使用可能な単分散粒子１４の維持期間をより長くすることができる。
【００４０】
（３）また、上記単分散状態維持方法では、単分散粒子１４は、金属コロイド粒子、蛍光色素内包粒子、可視色素内包粒子の少なくとも１つからなるものである。
この構成であれば、単分散粒子１４を光学的に識別することができるので、単分散粒子１４を用いて分析対象物を検出する場合に、分析対象物の検出が容易となる。
【００４１】
（４）また、上記単分散状態維持方法では、金属コロイド粒子は、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、鉄コロイド粒子、アルミニウムコロイド粒子、白金コロイド粒子の少なくとも１つからなるものである。
この構成であれば、単分散粒子１４の材料となる物質の入手が容易となるため、単分散粒子１４の製造コストを低減することができる。
【００４２】
（５）また、上記単分散状態維持方法では、支持体２０は、繊維性または多孔性であるとともに、無機材料または有機材料で形成されたものである。
この構成であれば、支持体２０の内部に適度な空間をあるため、支持体２０に単分散粒子１４を効率よく分散させることができる。
（６）また、上記単分散状態維持方法では、支持体２０は、シリカゲル、ガラス繊維、石英繊維、ゼオライトのいずれか１つで形成されている。
この構成であれば、支持体２０の材料となる物質の入手が容易となるため、支持体２０の製造コストを低減することができる。
【００４３】
（７）また、上記単分散状態維持方法では、分散媒１２は、糖類、界面活性剤、ポリマーの少なくとも１つを含んでいる。
この構成であれば、支持体２０に分散された単分散粒子１４を効率よく分散媒３２に溶出させることができる。
（８）また、上記単分散状態維持方法では、蛍光色素内包粒子は、蛍光色素と磁性体とを有機ポリマーで内包している。
この構成であれば、蛍光色素内包粒子の蛍光強度を高めることができるので、単分散粒子１４として蛍光色素内包粒子を用いて分析対象物を検出する場合に、分析対象物の検出が容易となる。
【００４４】
（９）また、上記単分散状態維持方法では、蛍光色素内包粒子に内包される蛍光色素は、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価又は三価の鉄、三価また四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄化合物、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（以上、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（以上、Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上、ＧＥヘルスケア社製）の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素である。
この構成であれば、蛍光色素内包粒子の蛍光強度をより高めることができるので、単分散粒子１４として蛍光色素内包粒子を用いて分析対象物を検出する場合に、分析対象物の検出がより容易となる。
【００４５】
（１０）また、上記単分散状態維持方法では、蛍光色素内包粒子は、ポリマー、ゲル、ヒドロゲル、ガラス担体、基質の少なくとも１つに埋設または重合されている。
この構成であれば、蛍光色素内包粒子の物理的強度や化学的強度を高めることができるので、単分散粒子１４として蛍光色素内包粒子を用いて分析対象物を検出する場合に、蛍光色素内包粒子の取り扱いが容易となる。
【００４６】
（１１）また、上記単分散状態維持方法では、単分散粒子１４の表面には、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つと物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する標識物が設けられている。
この構成であれば、単分散粒子１４の表面には標識物１６が設けられているので、単分散粒子１４を用いて分析対象物を検出する場合に、分析可能な対象物の種類を増やすことできる。
【００４７】
＜分析対象物の検出方法＞
図２は、本発明の実施形態に係る分析対象物の検出方法の工程を模式的に示す図である。図２に示すように、本実施形態に係る分析対象物の検出方法は、上述した粒子の単分散状態維持方法を用いて得た単分散粒子と、分析対象物とを反応させることで、分析対象物を検出する方法である。以下、本発明の実施形態に係る分析対象物の検出方法の一例を、図２を参照しつつ簡単に説明する。
【００４８】
図２（ａ）は、標識物４２がプレート４０に固定されている状態を示す図である。
まず、図２（ｂ）に示すように、この標識物４２と分析対象物５０とを反応させる。なお、この分析対象物５０は、標識物４２と物理的、化学的、または生物学的な親和性を有するものである。
次に、図２（ｃ）に示すように、単分散粒子１４の表面に設けた標識物１６と分析対象物５０とを反応させる。なお、この単分散粒子１４は、上述した粒子の単分散状態維持方法で得た単分散粒子１４である。こうして、プレート４０に固定された単分散粒子１４を検出することで、間接的に分析対象物５０を検出する。なお、標識物１６は、分析対象物５０と物理的、化学的、または生物学的な親和性を有するものである。
【００４９】
本実施形態に係る分析対象物５０は、例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つである。また、上述の核酸分子は、オリゴヌクレオチド、目的遺伝子に対応するＤＮＡ、タンパク質に結合するＤＮＡ、目的遺伝子に対応するＲＮＡ、終止コドンを欠くｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ用２本鎖ＲＮＡの少なくとも１つである。
【００５０】
なお、分析対象物５０は、上記以外にも、脂質、炭水化物、タンパク質を選択することができ、特に、代謝産物、ホルモン、ウイルス、微生物、細胞から選択することが好ましい。
単分散粒子１４と反応した分析対象物５０の分量は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定することができる。なお、上記測定に使用する生体試料としては、液状のものを使用する。例えば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液もしくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水及び腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、又は臍帯血を使用することが特に好ましい。
【００５１】
（使用例）
上述の分析対象物の検出方法は、例えば、化学分析、実験、試験研究、検査、治療に利用されるものである。
（効果）
（１）以上のように、上記検出方法は、上述の粒子の単分散状態維持方法を用いて得た単分散粒子と、分析対象物とを反応させている。
この構成であれば、長期間保存した単分散粒子を用いつつ、簡便かつ迅速に安定性及び再現性を高めた分析対象物の検出ができる。
【００５２】
（２）また、上記検出方法であれば、単分散粒子１４の表面に設けた標識物１６と、標識物１６と物理的、化学的、または生物学的な親和性を有する分析対象物５０とを反応させている。
この構成であれば、分析対象物５０を特異的に測定できる。
（３）また、上記検出方法であれば、分析対象物５０は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、核酸分子の少なくとも１つである。
この構成であれば、多種多様な物質を分析可能対象物とすることができる。
【００５３】
（４）また、上記検出方法であれば、単分散粒子１４と反応した分析対象物５０の分量を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定している。
この構成であれば、汎用の測定手法を使用することができるので、分析対象物５０の検出に係るコストを低減することができる。
【００５４】
（５）また、上記検出方法であれば、単分散粒子１４の表面に設けた標識物１６を核酸分子とし、核酸分子と反応した分析対象物５０を、１以上の配列の増幅、転写、標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼーション、翻訳、ライゲーションが酵素反応として行われる方法、転写因子検出におけるプルダウン法の群から選ばれる１つ以上の方法を用いて測定している。
この構成であれば、分析対象物５０の検出・測定のみならず、遺伝子の発現解析や転写因子回収作業等、多段階工程にも利用ができる。
以下、本発明に係る粒子の単分散状態維持方法と、その方法を用いて得た単分散粒子を利用した分析対象物の検出方法とを実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（１）単分散粒子について
本実施例では、国際公開第２０１０−０２９７３９号パンフレットに開示された蛍光色素化合物含有磁性体を有する粒子（以下、単に「蛍光色素内包粒子」ともいう。）を単分散粒子１４として用いた。この単分散粒子１４は、蛍光物質に対して親和性を有すポリマー層と、そのポリマー層内に配された磁性体とを有している。このポリマー層としては、例えば、ポリスチレンやポリグリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ）、またはこれらの共重合体等が挙げられる。このようなポリマー層を用いることにより、例えばポリＧＭＡのエポキシ基などの官能基（粒子表面官能基）などを通じて他の物質との結合ができるため、生理活性物質をポリマー層に選択的に結合させることが可能となる。
【００５６】
本実施例では、この粒子表面官能基がカルボキシル基であるものを準備し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用いてタンパク質である抗体を粒子表面に結合させた。より詳しくは、マウスモノクローナル抗体の抗ＰＳＡ抗体５Ａ６（商品名、ＨｙＴｅｓｔ社）を使用した。また、上記粒子１ｍｇを含む反応溶液に抗体１００μｇを添加し反応・結合させたものを抗体標識粒子とした。こうして、本実施例に係る単分散粒子１４として抗体標識粒子を作製した。なお、この単分散粒子１４の粒子径（直径）は、約２００ｎｍであった。
【００５７】
（２）乾燥粒子が保持された支持体の作製方法について
まず、１．５ｍｌエッペンチューブに、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．０５％ＰＥＧ（分子量：２０，０００）、３．５％スクロースを含んだ分散媒１２に、上記（１）で作製した単分散粒子１４を混合し、２８ｋＨｚで３０秒間超音波処理を行った。こうして、上記粒子が単分散した分散液１０を得た。
【００５８】
次に、計９００μｌの分散液１０を支持体２０である１０ｍｍ×１５０ｍｍのガラスファイバーパッド（ｇｌａｓｓ  ｆｗｉｂｅｒ  Ｐａｄ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に滴下して浸潤させた。
最後に、分散液１０を浸潤させたガラスファイバーパッドを、真空減圧ポンプを使用して減圧した環境下で１８時間乾燥させた。こうして、本実施例に係る乾燥粒子保持支持体（乾燥粒子が保持された支持体）を作製した。
【００５９】
（３）粒子凝集の確認
上記（２）で得た分散液１０を１．５ｍｌエッペンチューブに入れて、４℃の環境下で静置保存した。静置から２８日間経過した粒子の粒子径を粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２１００、島津製作所製）により測定した。こうして測定した粒度分布を図３に示す。また、２８日間経過した粒子を超音波処理し、測定した粒子の粒度分布を図４に示す。なお、図３、図４において、横軸は粒子径（μｍ）、縦軸は頻度（％）である。
【００６０】
（４）乾燥粒子が保持された支持体からの粒子溶出及び溶出粒子の粒子径の確認
支持体２０に乾燥保持された粒子の粒子径を把握するため、２８日間保存した乾燥粒子保持支持体から粒子を溶出させ、粒子径を測定した。より詳しくは、上記（２）で作製した乾燥粒子保持支持体を２８日間保存した後に、その支持体を１０ｍｍ×５ｍｍに裁断して得た断片８枚を、１．５ｍｌエッペンチューブに入れた０．５ｍｌの超純水に浸漬し、その後ボルテックスミキサーで３０秒間攪拌した。こうして溶出させた粒子の溶出液中での粒子径を粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２１００、島津製作所製）により測定した。測定した粒子の粒度分布を図５に示す。なお、図５において、横軸は粒子径（μｍ）、縦軸は頻度（％）である。
なお、上述の粒度分布測定の測定範囲は、測定性能上、３０ｎｍ以上１０００μｍ以下の範囲のみとした。
【００６１】
（５）粒子径の比較
上記（３）及び（４）の測定結果を比較すると、液中保存した粒子は、図３に示すように、直径３００〜４５０ｎｍの粒子が４０％程度存在しているが、残りの６０％は１μｍ以上の粒子であり、様々な粒子径が混在していると考えられる。液中保存した粒子を超音波処理して粒子径を測定した結果を図４に示す。１６０〜３６５ｎｍの範囲内に粒子径が分布しており、本来２００ｎｍの粒子であることを踏まえると、図４に示された１６０〜３６５ｎｍの粒子径分布は、測定に用いられた粒子（平均粒径２００ｎｍ）自身が有する粒子径分布に起因するものと考えられる。乾燥粒子が保持された支持体２０から溶出された粒子は、図５に示すように、２００〜５００ｎｍの範囲内に粒子径が分布しており、液中保存より単分散状態が維持されていると考えられる。以上のことから、単分散粒子１４を保存するには、支持体２０を利用することが効果的であることが判明した。
【００６２】
（実施例２）
支持体２０から溶出させた単分散粒子１４である蛍光色素内包粒子の表面上に結合した抗体（標識物１６）と、抗原（分析対象物５０）との反応性を確認した。乾燥粒子保持支持体から溶出した蛍光色素内包粒子（以下、「乾燥後粒子」ともいう。）と分散媒１２中で保存した蛍光色素内包粒子（以下、「乾燥前粒子」ともいう。）とを用い、蛍光色素内包粒子の抗体と親和性のある抗原との反応効率を比較測定した。測定方法は、９６ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（以下、単に「プレート」ともいう。）に抗体を固相化し、既知濃度の抗原を添加・反応後、抗体結合粒子（抗体を表面に備えた蛍光色素内包粒子）を添加・反応させた。プレートに捕捉された蛍光色素内包粒子の蛍光色素を検出することにより、蛍光色素内包粒子上の抗体と、抗原との反応性を測定した。詳細は以下の通りである。
【００６３】
まず、粒子表面に結合した抗ＰＳＡ抗体（５Ａ６）とは異なるエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体の抗ＰＳＡ抗体１Ｈ１２（ＨｙＴｅｓｔ社）１μｇ／ｍｌを、９６ｗｅｌｌ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏａｐ（商品名、Ｎｕｎｃ社）に１ｗｅｌｌあたり５０μｌ添加し、４℃の環境下で１８時間固相化した。次に、上記抗体を固相化したプレートを界面活性剤入り溶液にて洗浄し、Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ溶液にて室温でブロッキングした。ブロッキング後、界面活性剤入り溶液にて洗浄した。抗原濃度０、０．１６、０．８、４、２０ｎｇ／ｍｌに調製したＰＳＡ溶液を、１ｗｅｌｌあたり５０μｌ添加し、２５℃の環境下で１時間反応させた。次に、そのプレートを界面活性剤入り溶液にて洗浄し、乾燥前粒子と乾燥後粒子とをそれぞれ含んだ濃度１μｇ／ｍｌの分散液を、１ｗｅｌｌに対し５０μｌ添加し、それぞれ２５℃の環境下で１時間反応させた。
【００６４】
反応後、プレートを界面活性剤入り溶液にて洗浄し、乾燥前粒子と乾燥後粒子の蛍光強度を蛍光測定リーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）でそれぞれ測定した。こうして測定した結果を図６に示す。なお、乾燥前粒子は、液中保存した粒子に超音波処理を施して単分散させたものを使用した。また、乾燥後粒子（溶出粒子）は、乾燥粒子が支持された支持体を１０ｍｍ×５ｍｍに裁断して得た断片８枚を、１．５ｍｌエッペンチューブに入れた０．５ｍｌの超純水に浸漬し、ボルテックスミキサーで３０秒間攪拌することで得た。
【００６５】
図６に示すように、各抗原濃度に対する蛍光強度は、乾燥前粒子と乾燥後粒子とで略同じであった。この結果から、乾燥粒子が支持された支持体から溶出した粒子（乾燥後粒子）は、液中保存した粒子（乾燥前粒子）と同程度の抗原認識能を保持しており、且つ同程度の抗原濃度依存性を有することが確認できた。
なお、上述の実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【符号の説明】
【００６６】
１０  分散液
１２  分散媒
１４  単分散粒子
１６  標識物
２０  支持体
３０  分散液
３２  分散媒
４０  プレート
４２  標識物
５０  分析対象物
【図１】
2015102337.tif 000003
【図２】
2015102337.tif 000004
【図３】
2015102337.tif 000005
【図４】
2015102337.tif 000006
【図５】
2015102337.tif 000007
【図６】
2015102337.tif 000008