(57)【要約】【課題】従来に比べ高精度な生体組織の識別を行う。【解決手段】生体組織切片に関連付けられる二次元分布を有するスペクトルを測定し、該二次元測定スペクトルから生体組織画像を取得する際に、画像領域を複数の小ブロックに分割した上で、測定スペクトルとそれぞれの領域に対応する識別器を利用して生体組織画像を再構成する。【選択図】図１０
2015052581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織の中に分布する物質に関連付けられる測定スペクトルに基づき、信号処理装置を用いて、生体組織画像を再構成する方法であって、
前記生体組織の中の各点における前記測定スペクトルを画像領域について格納するステップ、
画像領域を複数の小ブロックに分割するステップ、
それぞれの小ブロックの前記測定スペクトルの１つまたは複数のピークを選定するステップ、
それぞれの前記小ブロックに対応する識別器を取得するステップ、及び
選定された前記ピーク及び対応する前記識別器に基づいて、前記小ブロック毎に生体組織画像を取得するステップを含むことを特徴とする生体組織画像の再構成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の生体組織画像の再構成方法であって、前記複数の小ブロック毎に取得された識別条件から、それらの回帰分析により画像領域に適用する識別器を生成した上で、それを前記測定スペクトルに適用することにより画像領域における生体組織画像を生成することを特徴とする生体組織画像の再構成方法。
【請求項３】
請求項１に記載の生体組織画像の再構成方法であって、前記複数の小ブロック毎に取得された生体組織画像を統合し、画像領域における生体組織画像を生成することを特徴とする生体組織画像の再構成方法。
【請求項４】
前記測定スペクトルについての学習データを利用して前記識別器を生成することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の生体組織画像の再構成方法。
【請求項５】
前記測定スペクトルの１つまたは複数のピークを選定するステップにおいて、群間分散と群内分散の比で定義されるマハラノビス距離を用いて、識別に用いるピークを決定する請求項１乃至３のいずれか一項に記載の生体組織画像の再構成方法。
【請求項６】
前記測定スペクトルが、紫外、可視、赤外域の分光スペクトル、ラマン分光スペクトル、及び質量スペクトルのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の生体組織画像の再構成方法。
【請求項７】
前記生体組織が生体病理組織であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の生体組織画像の再構成方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法を用いて生体組織画像を再構成することを特徴とする生体組織画像の取得装置。
【請求項９】
請求項８に記載の生体組織画像の取得装置を利用して、病理診断の際に疾患部位を表示する画像表示装置。
【請求項１０】
生体組織の中に分布する物質に関連付けられる測定スペクトルに基づいて、信号処理装置を用いて、生体組織画像を再構成する方法であって、
前記生体組織についての前記測定スペクトルを取得するステップ、
前記測定スペクトルのピーク成分の分布情報から得られる形態情報を取得するステップ、
識別器を取得するステップ、及び
前記生体組織についての前記測定スペクトルと前記測定スペクトルのピーク成分の分布情報から得られる形態情報との両方について、識別器を適用して、生体組織画像を取得するステップからなることを特徴とする生体組織画像の再構成方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の生体組織画像の再構成方法において、識別器を生成する際及び生体組織画像を再構成する際に、測定スペクトル及びその分布情報から取得される高次局所自己相関の両方を利用することを特徴とする生体組織画像の再構成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織画像の再構成方法および装置に関し、とりわけ生体組織の中に分布する物質に関連付けられる測定スペクトルデータから生体組織画像を再構成する方法および装置に関するものである。また、本発明は、そうして取得した生体組織画像を用いて病理診断の際に疾患部位を明示的に表示する画像表示装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、病理診断、すなわち生体組織を対象に顕微鏡等で観察を行い、病変の有無や病変の種類について診断することが行われている。病理診断においては、観察対象である生体組織に関連付けられる構成物質や含有物質の可視化が求められる。これまでのところ、病理診断においては、免疫染色法（免染）を用いて特異抗原タンパク質を染色する手法が主に用いられている。乳がんを例に挙げれば、ホルモン療法の判断基準となるＥＲ（ホルモン依存性腫瘍に発現するエストロゲンレセプター）や、ハーセプチン投与の判断基準となるＨＥＲ２（進行の速いがんに見られる膜タンパク質）が免染により可視化される。しかしながら免染には、抗体の持つ不安定性や、抗原抗体反応効率の制御の難しさに起因する再現性不良の問題がある。また今後、このような機能診断のニーズが高まった場合、例えば数十種以上の構成物質や含有物質を検出する必要が生じた場合、現在の免染では対応できなくなるという問題がある。
【０００３】
また、前記構成物質や含有物質等の生体組織の中に分布する物質の可視化は組織レベルでは不十分で、細胞レベルで求められる場合がある。たとえば、がん幹細胞に関する研究においては、腫瘍組織の一部の分画のみが免疫不全マウスへの異種移植後に腫瘍を形成することが明らかになったことから、腫瘍組織の成長が腫瘍幹細胞の分化や自己再生の能力に依存していると理解されつつある。このような検討においては、組織全体ではなく、組織中における個々の細胞の構成物質や含有物質の発現分布を観察することが必要となる。
【０００４】
なお、上記の「細胞レベル」とは、少なくとも一つ一つの細胞を識別できるレベルを意味する。細胞の径は概ね１０μｍから２０μｍの範囲（ただし神経細胞などの大きなものは約５０μｍ）にある。したがって、細胞レベルの二次元分布像を取得するには空間分解能が１０μｍ以下であることが必要であり、好ましくは５μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下、さらに好ましくは１μｍ以下であるべきである。空間分解能は、例えばナイフエッジの試料の線分析結果から決定することができる。すなわち、空間分解能は「試料の境界付近における当該物質に起因する信号強度がそれぞれ２０％、８０％となる二点間の距離」という一般的な定義に基づいて決定される。
【０００５】
以上のように、病理診断においては、疾患部位または生体病理組織に関連付けられる構成物質や含有物質を、細胞レベルで網羅的に可視化することが求められる。疾患部位或いは生体病理組織は、例えば、腫瘍組織等をいう。斯かる可視化する方法としては、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）をはじめとする二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）が候補として挙げられている。測定スペクトルとして、質量スペクトルが用いられる。更に、ラマン分光法も候補として挙げられている。測定スペクトルとして、紫外、可視、赤外域の分光スペクトルが用いられる。これらの測定法では、空間内の各点における情報を高い空間分解能で得ることができる。すなわち、測定対象としての物質に関連付けられる測定スペクトルの各ピーク値の空間分布情報が得られることから、当該測定スペクトルに関連付けられる生体組織中の物質についての空間分布を求めることができる。
【０００６】
ＳＩＭＳ法は、試料に一次イオンビームを照射し、試料から分離された二次イオンを検出することにより、試料上の各点の質量スペクトルを得る方法である。例えば、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにおいては、二次イオンの飛行時間が、イオンの質量ｍと電荷ｚに依存していることを利用して、当該二次イオンを同定し、それにより試料上の各点の質量スペクトルを得ることができる。
【０００７】
ラマン分光法は、光源として単色光であるレーザー光を物質に照射して、発生したラマン散乱光を分光器、もしくは干渉計で検出することでラマンスペクトルを取得する。ラマン散乱光の振動数と入射光の振動数の差（ラマンシフト）は物質の構造に特有の値をとることから、測定対象物固有のラマンスペクトルを取得することができる。
【０００８】
従来、測定スペクトルデータから生体情報を取得するには、予め機械学習により識別器を生成し、これを試料の測定スペクトルデータに適用していた（特許文献１）。一方、病理診断では生体組織画像が必須であることから、測定スペクトル画像（スペクトル情報）と光学画像（形態情報）とを重ね合わせて画像表示を行うことも試みられていた（特許文献２）。なお、ここで機械学習とは、以前に取得されたデータを経験的に学習し、新たに取得したデータについて学習結果を基に解釈する手法である。また、識別器とは、以前に取得されたデータと生体情報との関係を経験的に学習することにより生成される判断基準情報である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−７１９５３号公報
【特許文献２】特開２０１０−８５２１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来、機械学習により生成した識別器を適用して診断を行う例は、特許文献１にも記載される。その診断を行う対象は、１つ（空間上の１点または試料全体に対する）の測定スペクトルデータであり、測定スペクトルの空間分布から生体組織画像を取得することは想定されていなかった。また、測定スペクトル画像（スペクトル情報）と、光学画像（形態情報）を重ね合わせている例はあるものの、スペクトル情報と形態情報の両方の情報について機械学習（識別器）を適用して生体組織画像を取得する例はなかった。すなわち、生体組織を対象に、空間分布を有するスペクトルを測定した結果から、がんの有無等に関する診断結果を表示する精度の高い生体組織画像を再構成する方法が開示されていなかった。
【００１１】
また、測定スペクトルが空間分布を有する場合には、データを測定する位置、例えば画像中央部と周辺部では、データの特性が異なるため、データを測定する位置に応じて、それに適した識別器を適用する必要がある。しかしながら、従来、そうした状況を想定した方法は開示されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの視点によると、生体組織の中に分布する物質に関連付けられる測定スペクトルに基づき、信号処理装置を用いて、生体組織画像を再構成する方法であって、前記生体組織中の各点における前記測定スペクトルを画像領域について格納するステップ、画像領域を複数の小ブロックに分割するステップ、それぞれの小ブロックの該測定スペクトルの１つまたは複数のピークを選定するステップ、それぞれの前記小ブロックに対応する識別器を取得するステップ、及び前記小ブロック毎に、対応する識別器に基づいて、生体組織画像を取得するステップからなることを特徴とする生体組織画像の再構成方法が提供される。
本発明の別の視点によると、生体組織の中に分布する物質に関連付けられる測定スペクトルに基づいて、信号処理装置を用いて、生体組織画像を再構成する方法であって、前記生体組織についての前記測定スペクトルを取得するステップ、前記測定スペクトルのピーク成分の分布情報から得られる形態情報を取得するステップ、識別器を取得するステップ、及び前記生体組織についての前記測定スペクトルと前記測定スペクトルのピーク成分の分布情報から得られる形態情報との両方について、識別器を適用して、生体組織画像を取得するステップからなることを特徴とする生体組織画像の再構成方法が提供される。
上記本発明の方法により取得した生体組織画像は、病理診断等に用いることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、測定スペクトルの空間分布を測定し、その測定スペクトル情報とピーク成分の分布情報から得られる形態情報との両方を用いて、機械学習を適用して生体組織画像を再構成することができる。更に、その際に測定スペクトルの測定位置等の違いにより、データの特性が変化し識別条件が変化する場合においても、適切な識別条件を適用し生体組織画像を再構成することができる。それにより、従来に比べ高精度な生体組織の識別が可能となるため、病理診断等への応用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明を搭載した装置の模式図である。
【図２】二次元平面内で強度分布を有するスペクトル信号の模式図である。
【図３】スペクトルのピーク成分の概念図である。
【図４】本発明のフローチャートである。
【図５】本発明のブロックの判別分析を用いた機械学習のフローチャートである。
【図６】画像ブロックの判別分析の模式図である。
【図７】群間分散と群内分散の比を最大化する射影軸を模式的に示した図である。
【図８】条件の異なるデータにより交絡が生じている状態を模式的に示す図である。
【図９】ブロックの判別分析により回帰モデルを決定するプロセスを示す模式図である。
【図１０】本発明の一連のプロセスを模式的に示した図である。
【図１１】本発明の第１の実施例の適用過程を示す図である。
【図１２】異なる画像のブロックでは判別条件が異なることを示す図である。
【図１３】データの交絡が生じていることを示す図である。
【図１４】本発明の第１の実施例において、回帰分析の適用結果を示す図である。
【図１５】本発明の第１の実施例の適用効果を示す図である。
【図１６】マハラノビス距離が相対的に小さい場合と大きい場合とを示す模式図である。
【図１７】本発明の第２の実施例で示した装置の模式図である。
【図１８】本発明の第２の実施例で用いた分光画像とスペクトルを示す図である。
【図１９】本発明の第２の実施例において、特徴量選別の効果を示す図である。
【図２０】本発明の第２の実施例において、判別分析を行った結果を示す図である。
【図２１】本発明の第２の実施例において、本発明の結果を示す図である。
【図２２】高次局所自己相関（ＨＬＡＣ）の概念を示す模式図である。
【図２３】本発明の第２の実施例において、多次元的情報利用の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、フローチャートと図面とを参照しながら具体的に説明する。なお、以下の具体例は本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる具体的形態に限定されるものではない。本発明は、空間内に組成分布を持つ試料について測定を行うものであり、該空間内の各点の位置情報及び各点の位置に対応して、生体組織、或いは疾患部位に含まれる生体病理組織の中に分布する物質に関連付けられる測定スペクトル情報を得るものであれば、いかなる測定方法によって得た結果にも適用可能である。
【００１６】
図４に示すのは、本発明における画像再構成のフローチャートである。以下においては、このフローチャートの順に、図面を参照しながら説明する。
【００１７】
図４の工程Ｓ１０１においては、画像再構成に用いるピークを選定する。ここでピークとは、図３（ａ）の様な測定スペクトル（例えば質量スペクトル）の場合には、その信号強度のピークを意味する。一方、測定スペクトルとして、紫外、可視、赤外域の分光スペクトルを用いた分光法或いはラマン分光スペクトルを用いたラマン分光法がある。斯かる分光法を用いた場合の測定スペクトルは図３（ｂ）に示す測定信号となる。この場合には、それを離散化した図３（ｃ）に示す信号強度が、信号強度のピークとなる。次に、工程Ｓ１０２においては、データの規格化・デジタル化を行う。工程Ｓ１０３においては、規格化・デジタル化したデータから、スペクトルを測定した各点の空間内の位置及びその空間内の各点の測定スペクトル（ピーク成分）からなる多次元データを生成する。
【００１８】
図２に示すのは、空間上の各点において測定した測定スペクトルの強度分布を示す模式図である。例えば、信号を取得する空間として、二次元平面を考えると、情報は三次元のデータとなる。この三次元データを生成する際の三次元空間の各点を座標（Ｘ、Ｙ、Ｚ）で表現する。成分Ｘ及びＹは測定スペクトル信号を得た二次元空間（ＸＹ平面）上の座標であって図２の（ａ）に対応する。成分ＺはＸＹ平面上の各点における測定スペクトル信号であって図２の（ｂ）に対応する。従って、成分Ｘ及びＹには、信号を測定した点のＸ座標及びＹ座標が格納されており、Ｚには各ピーク成分の強度に対応する測定信号の値が格納されていることになる。
【００１９】
図４の工程Ｓ１０４においては、生成した識別器によって、信号の識別を行い、画像を出力する。この識別器の生成には、例えば機械学習を用いることができる。この機械学習においては、既に取得されたデータ（これを学習データという）から、測定データと生体組織に関する情報とを結びつける判断基準を生成する。
【００２０】
図５に示すのは、識別器を生成するためのフローチャートである。以下においては、このフローチャートの順に、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
図５の工程Ｓ２０１においては、画像再構成に用いるピークを選定する。次に、工程Ｓ２０２においては、画像データのブロック化を行う。ここでブロック化とは、画像領域を複数の小ブロック毎に分割することである。工程Ｓ２０３においては、各ブロック化したデータから各ブロック毎に、例えば機械学習によって識別器を生成する。機械学習の手法としては、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別法や、ＳＶＭ（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）、或いは決定木もしくはそのアンサンブル平均を考えたランダムフォレスト法等を用いることができる。工程Ｓ２０４においては、各画像ブロックで得た識別条件の回帰分析によって、画像領域の全領域に適用可能な識別モデルを生成する。なお、この工程を省略し、各画像ブロック毎に生成した識別器を用いて、各画像ブロック毎に生体組織画像を再構成してから、それらを補間処理等によって統合することによって画像領域における生体組織画像を生成してもよい。以下では、教師付き機械学習の一例として、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別法を用いた場合について説明する。なお、以下において判別分析とは、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別を意味し、判別条件とは、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別を適用することによって取得した識別条件のことを意味する。
対象とする画像領域は取得される全画像領域であっても良いし、部分的に選択された画像領域であっても良い。部分的に選択される画像領域を対象とする場合、例えば取得された全画像領域において外周部分などの非対象とする画像領域を予め設定しておき、これを除して画像領域を設定してもよい。
【００２２】
図６は、判別分析によって、スペクトルデータから複数の群を分離・識別するプロセスを示している。図６の（ａ）の白枠は、学習データとして使用するスペクトルデータを取得する領域を表している。図６（ｂ）は、使用するスペクトルデータの模式図である。学習対象となる各スペクトルには、例えば、ガン組織は１、正常組織は０という様に、生体組織の識別番号（ラベル）が付随する。図６（ｃ）は、判別分析によって、スペクトルデータから取得した特徴量を特徴空間（識別空間）に射影し、最適な境界線を決定する様子を模式的に示している。ここで特徴空間とは、データの属性を識別するために特徴量を射影する空間であり、特徴量とは、元のデータから生成される識別に適した量である。この場合の特徴量としては、規格化されたピーク強度等を考えることができる。
【００２３】
図７は、射影軸への射影成分の群間分散と群内分散の様子を模式的に示している。図７（ｂ）は、各群の重心間距離に対応する群間分散を示しており式（１）で与えられる。
【数１】
2015052581.tif 000003
また、図７（ｃ）は、各群内での分散に相当する群内分散を示しており式（２）で与えられる。
【数２】
2015052581.tif 000004
上記ベクトルwは、下記式（３）に示す係数ベクトルを意味している。上記ベクトルx1x2は、下記式（４）に示す各群の標本平均ベクトルを意味している。上記行列S1S2は、下記式（５）に示す各群の標本分散共分散行列を意味している。それぞれ、特徴空間が二次元の場合の表式である。また、n1n2は、各群のデータの数である。
【数３】
2015052581.tif 000005
【数４】
2015052581.tif 000006
【数５】
2015052581.tif 000007
Ｆｉｓｈｅｒの線形判別は、その軸への射影成分の群間分散と群内分散の比を最大化する様な軸を決定するものであり、その様な軸は、式（６）で与えられる。式（６）において、ｘは特徴空間内の座標であり、Ｈ（ｘ）の符号が変化する位置が両群を区別する境界となる。
【数６】
2015052581.tif 000008
図７（ａ）は、判別分析で決定される識別軸を模式的に示している。
【００２４】
図８は、複数の異なる画像ブロック内のデータを使って判別分析を行う際に、交絡が生じる様子を模式的に示したものである。交絡とは、異なる性質のデータを用いることによって、データの混濁が生じる現象である。図８（ａ）の白枠は、データを使用する画像内のブロックを示している。図８（ｂ）はそれに対応するスペクトルデータを、図８（ｃ）は、それらのデータを特徴空間に射影した際に交絡によるデータの混濁が発生する様子を模式的に示している。
【００２５】
図９は、データの局所管理によって、各画像ブロックごとの判別条件（式（６）から決定される）を取得し、それらを回帰分析することによって、画像領域に適用可能な識別モデルを取得する様子を模式的に示している。ここでデータの局所管理とは、データの交絡が生じない程度に、データを分割することを意味している。図９（ａ）の白枠は、データを使用する画像内のブロックを示している。図９（ｂ）は、それぞれの画像ブロックに対して判別分析を適用する様子を示している。図９（ｃ）は、判別条件の回帰分析を行う様子を示している。この様に、交絡が生じない程度の適切な画像ブロックサイズに画像を分割する。それぞれのブロックの判別分析から取得した判別条件の回帰分析により、画像領域に適切に適用可能な識別モデルを構築する。それによって、データの交絡を防ぎつつ適切な判別分析を行うことが可能になる。なお、最適な画像ブロックサイズは、例えば、式（７）で与えられる様な統計的検定や、学習データの誤判別率等を用いて決定することができる。
【数７】
2015052581.tif 000009
ここで、式（７）中のσ1σ2は、各群の標本分散を意味している。また、z0は検定値であり、この値が一定値以上（例えば、1.96以上）になる様にブロックサイズを決定する。
【００２６】
図１０は、図４及び図５のフローチャートで示した、一連のプロセスを模式的に示している。図１０の（ａ）においては、機械学習と回帰分析により識別モデルを生成し、図１０の（ｂ）においては新規に測定したデータを入力する。そして、図１０の（ｃ）においては、再構成画像として、例えば、生体組織分布の分布画像（機械学習の結果得られる）を取得する。
【００２７】
なお、機械学習と識別に利用するデータは、空間各点におけるスペクトルデータだけでなくてもよく、例えば、空間各点におけるスペクトルデータと各スペクトル成分の分布情報（形態情報）との両方を利用してもよい。
この場合、例えば注目するピクセルの周辺エリアを切り出し、その領域が形成するパターンに着目する。例えば、信号を取得する空間として、二次元平面を考えると、機械学習と識別に利用するデータは、平面内の分布情報とスペクトル情報との合計で三次元の構造をしたデータとなる（以下、これを多次元的情報と呼ぶ）。
【００２８】
この、多次元的情報を用いた場合の、機械学習と識別の手順は、前述したスペクトルデータを用いた場合と本質的には同様である。但し、この場合には、データそのものを識別に用いるベクトル（以下これを特徴ベクトルと呼ぶ）に用いるのではなく、そのパターンを記述するのに適切な特徴量を複数取得した上で、それを特徴ベクトルとし、機械学習及び識別処理に用いることもできる。特徴量の代表的例としては、体積や曲率、空間勾配、ＨＬＡＣ（高次局所自己相関）等がある。ここで、Ｎ次の高次自己相関関数は、対象画像をf(r)とすると、変位方向(a1,a2,…,aN)に対して式（８）で定義される。
【数８】
2015052581.tif 000010
そして高次局所自己相関関数は、変位方向を参照点rの局所領域（例えば、参照点rの周囲の３×３画素）に限定したものとして定義される。図２２に０次と１次の場合の参照パターンを示す。濃灰色の画素が自己相関を計算する際の参照中心点となる。
【００２９】
また、機械学習に用いる特徴量を事前に選別することも可能である。この場合、例えば各特徴量を特徴空間に射影して得られる、各群の群間分散と群内分散との比で定義されるマハラノビス距離を算出して、識別に用いる特徴量を選別すればよい。マハラノビス距離が小さいということは比較例で示すと、図１６（ａ）の様な場合に相当し、マハラノビス距離が大きいということは、図１６（ｂ）の様な場合に相当する。マハラノビス距離が大きければ、識別がより容易になるため、注目する各群間のマハラノビス距離が大きくなる様な特徴量を優先的に選別することもできる。
【００３０】
本発明は、上記の具体的形態を実行する装置によって実現することができる。図１は、本発明を搭載した装置全体の構成の一例を示している。１は基板上の試料を、２は信号の検出器を示している。また、３は取得した信号に対して上記の処理を行なう信号処理装置を、４は信号処理結果を画面に表示する画像表示装置を示している。
ＴＯＦ−ＳＩＭＳを例に、より具体的に述べると、一次イオン（不図示）を試料１に照射することにより生成する二次イオン（図１では点線で表示）を検出器２で計測し、電気信号に変換したものを信号処理装置３に送る構成となっている。なお、一次イオン種に制限はなく、また、検出器としては一次元の検出器だけでなく、二次元の半導体検出器なども使用することができる。さらに、一次イオンの代わりにレーザーを用いることもでき、試料ステージのスキャンを組み合わせることもできる。計測データは、試料１のＸＹ平面の座標点に質量スペクトルが格納された三次元のデータ構造となっている。なお、積算を行った場合、計測データは四次元となるが、積算データは三次元となり、同様の処理が可能となる。
また、図１７においても、本発明を搭載した装置構成の一例を示している。１１は光源を、１２は光学系を示している。また、１は測定する試料を、１４は試料を配置するステージを、２は信号の検出器を示している。また、３は取得した信号に対して上記した処理を行なう信号処理装置を、４は信号処理結果を画面に表示する画像表示装置を示している。
図１７では、透過配置の計測系を示したが、反射配置にすることも可能である。また、光源としては、紫外線、可視光線、赤外線などを使用することができ、検出器も単一の検出器、ライン状の検出器、二次元の検出器など、種類は問わない。さらに、干渉計を組み合わせ、フーリエ変換やラプラス変換によりスペクトルを取得する方法であってもよく、試料ステージのスキャンを組み合わせることもできる。計測データは、試料１のＸＹ平面の座標点に分光スペクトルが格納された三次元のデータ構造となっている。なお、積算を行った場合、計測データは四次元となるが、積算データは三次元となり、同様の処理が可能となる。
また図１７は、コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS、Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）や誘導ラマン散乱（SRS、Stimulated Raman Scattering）などの非線形分光も包含する。
さらに、試料の特定の一断面（一定の厚さを持ったもの）の座標点に分光スペクトルが格納される構成であれば、本発明の特徴である（検出器以降の信号を扱う）信号処理装置と画像出力装置を適用することもできる。具体的にはX線、テラヘルツ波、電磁波などを用いた二次元分光スペクトル計測系にも適用可能である。
【実施例１】
【００３１】
以下、本発明の実施例１について説明する。本実施例においては、ＩＯＮ−ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ５型装置（商品名）を用い、トリプシン消化処理を施したＨＥＲ２タンパク質の発現レベル２＋の組織切片（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ社製）に対して、以下の条件でＳＩＭＳ測定を行った。
一次イオン：２５ｋＶ  Ｂｉ＋、０．６ｐＡ（パルス電流値）、マクロラスター・スキャンモード
一次イオンのパルス周波数：５ｋＨｚ（２００μｓ／ショット）
一次イオンパルス幅：約０．８ｎｓ
一次イオンビーム直径：約０．８μｍ
測定範囲：４ｍｍ  ×  ４ｍｍ
二次イオンの測定画素数：２５６×２５６
積算時間：１画素５１２ｓｈｏｔｓ，  １回スキャン（約１５０分）
二次イオンの検出モード：正イオン
【００３２】
得られたＳＩＭＳデータには、測定画素ごとに位置を示すＸＹ座標情報と、１ショットにおける質量スペクトルが記録されている。例えば、測定画素ごとに、ＨＥＲ２タンパク質の消化断片の一つにナトリウム原子が１つ吸着した質量数に該当するピーク（ｍ／ｚ＝７２０．３５）や、各生体組織に起因するピーク成分の情報がスペクトルデータとして含まれている。
【００３３】
図１１の（ａ）は、ＨＥＲ２タンパク質の発現レベル２＋の組織切片（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ社製）に対して、ＨＥＲ２タンパク質の免疫染色を行い、これを光学顕微鏡で観察したものである。図１１の（ａ）では、ＨＥＲ２タンパク質の発現が多いところほど白く表示されている。また、ＳＩＭＳ測定に供した試料と、免疫染色を行った試料は、同一病変組織（パラフィンブロック）から切出した隣接切片であり、同一ではない。
【００３４】
図１１の（ｂ）は、図１１（ａ）の白枠で囲んだ画像ブロック内で測定されたスペクトルを示したものである。図１１の（ｃ）は、図１１（ｂ）のスペクトルから、二つのピーク成分（対応するｍ／ｚの値は、それぞれ、６９２．３５と１１０１．５である）を選択し、判別分析を行った結果を示している。図１１の（ｃ）では、異なる群同士が、明確に分離できていることがわかる。
【００３５】
図１２の（ａ）の白枠は複数の画像ブロックを示している。図１２の（ｂ）はそれぞれの画像ブロックのスペクトルデータに対して判別分析を行った結果を示している。図１２の（ｂ）では、画像ブロックの位置によってデータの特性が変化し、それに応じて判別条件も変化していることがわかる。
【００３６】
図１３の（ａ）の白枠は図１２の（ａ）の複数の画像ブロックを合併してできた画像ブロックを示している。図１３の（ｂ）は図１３の（ａ）の白枠内のデータを特徴空間にプロットした結果を示している。図１３の（ｂ）の白枠内では、異なる群同士のデータが混濁する、いわゆる交絡が生じていることがわかる。
【００３７】
図１４の（ａ）は、画像領域を画像ブロックに分割した結果を示している。図１４の（ｂ）は、複数の画像ブロックに対して判別分析を行い、その結果から判別条件の回帰分析を行った結果を示している。この回帰分析の結果から、画像領域に適用可能な識別モデルを生成する。
【００３８】
図１５の（ａ）は、単一の画像ブロックの判別分析によって得られた判別条件を画像領域に適用し画像再構成した結果を示している。また、図１５の（ｂ）は本発明のブロック化判別分析を画像領域に適用し画像再構成した結果を示している。白枠内を、リファレンスとなる図１１（ａ）を参照し比較すればわかる様に、本発明によって、より高精度な生体組織画像を取得することができる。
【実施例２】
【００３９】
以下、本発明の実施例２について説明する。以下の実施例においては、誘導ラマン散乱を用いた顕微鏡を用いてマウス肝臓組織の測定を行った。光源として用いるＴｉＳレーザーのパワーは１１１ｍＷ、Ｙｂファイバーレーザーの強度は対物レンズに入射前で１２７ｍＷであった。試料のマウス肝臓組織は、ホルマリン固定処理し、１００マイクロメートルの厚さに薄切化した。組織切片はガラス中にＰＢＳバッファーとともに包埋された状態で計測を行った。計測範囲は１６０マイクロメートル四方であり、１０回の計測データを積算した。画像データは５００ピクセル四方であり、計測時間は３０秒であった。
【００４０】
得られた分光画像データには、測定画素ごとに位置を示すＸＹ座標情報と、各座標におけるスペクトル情報が記録されている。例えば、測定画素ごとに、試料を構成する組織の成分に起因するピーク成分の情報がスペクトルデータとして含まれている。また、スペクトルデータのサンプリング間隔は１カイザー（１ｃｍ−１）で測定を行った。
【００４１】
図１８（ａ）は、肝臓組織を測定した結果を測定した全スペクトル域について信号を合算して画像化したものである。図１８（ｂ）は、細胞核、細胞質、赤血球に対応する部分のスペクトルをピックアップしてグラフ化したものであり、横軸が波数に対応し（グラフ数値は波数を区別するためのインデックスであり、以下ではこのインデックスを参照する）、縦軸が信号強度に対応している。図１８（ｂ）に示している様に、組織ごとに異なるスペクトル信号が得られていることがわかる。
【００４２】
図１９（ａ）は、細胞核（群１）と細胞質（群２）との間のマハラノビス距離を、各波数ごとに算出したものである。インデックスが７〜８の場合に、マハラノビス距離が大きくなっていることがわかる。図１９（ｂ）は、インデックス７と８に対応するスペクトル強度を特徴量とし、学習データの一部を２次元の特徴空間にプロットしたものである。群１と群２は、明らかに区別できていることがわかる。図１９（ｃ）は、細胞質（群２）と赤血球（群３）との間のマハラノビス距離を、各波数ごとに算出したものである。インデックスが１５〜１７の場合に、マハラノビス距離が大きくなっていることがわかる。図１９（ｄ）は、同様にインデックス１５と１６に対応するスペクトル強度を特徴量とし、学習データの一部を２次元の特徴空間にプロットしたものである。群２と群３は、明らかに区別できていることがわかる。一方で、群１と群２は、区別しにくくなっていることがわかる。この様な場合には、各群間の識別に適した特徴量を全て利用した上で、それを特徴空間に射影すればよい。この場合には、例えば、インデックス７、８、…、及び１５、１６、…に対応するスペクトル強度を特徴量とし、それを多次元の特徴空間に射影し、各群の識別を行えばよい。
【００４３】
図２０は、細胞核（群１）、細胞質（群２）、赤血球（群３）のそれぞれに対応する学習データを用いて、インデックス８とインデックス１５に対応するスペクトル強度を２次元空間にプロットし、判別分析を行った結果である。各群同士が明確に分離できていることがわかる。
【００４４】
図２１は、前述した判別分析の結果に基づき、細胞核と細胞質と赤血球の識別を行い画像再構成を行ったものである。各組織が適切に識別され、色分けされていることがわかる。この様に、本発明によって、無染色で生体組織内の構造を識別することができる。
【００４５】
図２３（ａ）は、特徴量としてスペクトル強度のみを用いて識別処理を行った結果を、図２３（ｂ）は、特徴量としてスペクトル強度及びその分布から算出される０次と１次のＨＬＡCを特徴量として利用して識別処理を行った結果を示している。図２３（ａ）に比べ図２３（ｂ）では、各組織内構造の輪郭がより明確に描画されていることがわかる。この様に多次元的情報の利用により、生体組織内構造の輪郭をより明確に描画することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、病理診断をより効果的に支援するツールとして利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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