(57)【要約】      （修正有）【課題】大量生産が可能であり、経口摂取で安全性が高く、現代の食文化において馴染みのあるものを処理して得られた抗血栓組成物を提供する。【解決手段】血栓溶解活性を有し、醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供される麹菌の処理物を有効成分として含有する抗血栓組成物。該麹菌は、アスペルギルス・オリゼーまたはアスペルギルス・ソーヤであることが好ましい。該麹菌の培養は固体培養であり、固体培養時の水分量を４０〜６５％とすることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解活性を有し、醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供される麹菌の処理物を有効成分として含有する抗血栓組成物。
【請求項２】
前記麹菌が、アスペルギルス・オリゼーまたはアスペルギルス・ソーヤである請求項１に記載の抗血栓組成物。
【請求項３】
前記麹菌の培養を固体培養とした請求項１または２に記載の抗血栓組成物。
【請求項４】
前記固体培養時の水分量を４０〜６５％とした請求項３に記載の抗血栓組成物。
【請求項５】
前記麹菌の処理物が乾燥粉末である請求項１〜４の何れか一項に記載の抗血栓組成物。
【請求項６】
医薬上許容される添加剤を含有する請求項１〜５の何れか一項に記載の抗血栓組成物。
【請求項７】
経口投与される請求項１〜６の何れか一項に記載の抗血栓組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓溶解活性を有する抗血栓組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、主に血管壁が傷害されることにより血管内の血液が塊を形成したものであり、血小板やフィブリンがその形成に関与している。血栓は、通常、血管壁の傷害された部位が修復されるまで当該部位を保護して止血を行う。形成された血栓は、傷害された血管壁の部位が修復され、止血が完了すれば線溶作用によって溶解する。しかし、この線溶作用が働かずに血栓が肥厚し血管を塞ぐことにより、血栓が出来た下流の部位で組織の懐死や梗塞が引き起こされる血栓症の原因となる。
【０００３】
血栓を原因とする血栓症は、例えば脳梗塞、動脈血栓症、静脈血栓症、静脈血栓症、心筋梗塞、静脈血栓症などが知られている。例えば心筋梗塞は突然死の原因となることが多いため、血栓症の発症を予防することが重要である。
【０００４】
血栓の溶解は、フィブリンやフィブリノーゲンを分解するプラスミンが関与している。プラスミンは通常、前駆体であるプラスミノーゲンの形で血漿に含まれており、プラスミノーゲン活性化因子によって活性化される。
【０００５】
臨床においては、脳梗塞、心筋梗塞等の血栓症の治療には、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）や、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）等が使用されている。ｔＰＡやｕＰＡは高価であり、投与は注射によって行われる。
【０００６】
一方、血栓溶解活性を有する組成物で、例えば経口投与で日常的に摂取できる態様であれば、手軽に血栓症の発症を予防することができると考えられる。例えば特許文献１には、ミミズ（例えばアカミミズ〔Lumbricus rubellus〕）の乾燥粉末を血栓症治療剤として経口投与したことが記載されている。
【０００７】
血栓溶解に有効な活性物質は、ミミズの体壁、消化管、血管、腹神経索、隔膜などの組織や、血液、消化液、体腔液などの体液に多く含まれ、活性物質の化学成分は、ペプチド、糖質ペプチド、金属ペプチド、低分子量タンパク分解酵素、核酸、核酸様物質、糖質、脂質のいずれかであると考えられることが記載されている。
【０００８】
ミミズの乾燥粉末は、このような活性物質の薬理作用を損なわず、かつ当該活性物質のインヒビターが失活する条件下でミミズ生体の粉末化を行うことにより製造される。当該乾燥粉末は、経口投与用の剤形として、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤（粉剤）、コーティング剤、糖衣剤、乳剤などに製剤される。
【０００９】
当該ミミズ乾燥粉末の投与により、フィブリンが溶解すると同時に、血液凝固能力の増大、線溶作用の著しい低下などに起因する血管壁の代謝障害や血栓症の症状が改善されていることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３０３７３５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
経口投与で日常的に摂取できる組成物としては、安価で入手でき、安全性が高く、例えばカプセル化した薬剤や、顆粒状の食品の態様とすればよい。しかし、現代の食文化においてミミズは馴染みが薄いため、当該組成物がミミズ由来であると、消費者によっては、経口摂取するには少なからず抵抗があると考えられる。
【００１２】
従って、本発明の目的は、大量生産が可能であり、経口摂取で安全性が高く、現代の食文化において馴染みのあるものを処理して得られた抗血栓組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、以下の［１］〜［７］に示す発明を提供する。
［１］血栓溶解活性を有し、醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供される麹菌の処理物を有効成分として含有する抗血栓組成物。
［２］前記麹菌が、アスペルギルス・オリゼーまたはアスペルギルス・ソーヤである上記［１］に記載の抗血栓組成物。
［３］前記麹菌の培養を固体培養とした上記［１］または［２］に記載の抗血栓組成物。［４］前記固体培養時の水分量を４０〜６５％とした上記［３］に記載の抗血栓組成物。［５］前記麹菌の処理物が乾燥粉末である上記［１］〜［４］の何れか一項に記載の抗血栓組成物。
［６］医薬上許容される添加剤を含有する上記［１］〜［５］の何れか一項に記載の抗血栓組成物。
［７］経口投与される上記［１］〜［６］の何れか一項に記載の抗血栓組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗血栓組成物は、血栓溶解活性を有する。血栓溶解活性は、血栓に対する線溶作用を有するものであり、具体的には、フィブリンやフィブリノーゲンを分解するプラスミン活性を活性化して血栓を溶解する能力である。後述の実施例においては、本発明の麹菌の処理物をin vivo投与することで、濃度依存的に有意な血栓重量低下効果が確認され
ている。そのため、本発明の抗血栓組成物は、血栓性疾患に対して、優れた予防、改善及び治療効果が期待できる。
【００１５】
また、本発明の抗血栓組成物は、血栓溶解作用を有するうえ、現代の食文化において馴染みがあり、食経験のある醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供される麹菌の処理物（麹菌または麹を処理することによって得られる）を有効成分として含むものであり、安全性が高く、かつ抵抗感なく経口摂取することができる。本発明の抗血栓組成物は、上述した一般的な食品の製造に供される麹菌を由来としており、入手および培養などの取り扱いが容易であるため、大量生産を容易に行うことができる。麹菌としては、特にアスペルギルス・オリゼーまたはアスペルギルス・ソーヤが好適に利用できる。
【００１６】
後述の実施例３に示したように、麹菌の培養を固体培養とすることで、顕著にプラスミン様総活性が高い麹菌の処理物が得られるものと認められた。さらに、後述の実施例４に示したように、固体培養時の水分量を４０〜６５％とすることで、顕著に高いプラスミン様活性を有するものと認められた。
【００１７】
また、有効成分として含まれる当該麹菌の処理物は、高温処理や凍結乾燥処理をした後でも血栓溶解活性を保持することから、医薬品・食品・飼料などの加工処理に適している。この麹菌の処理物を乾燥粉末とすることで、取り扱いが容易で流通し易くなり、用途に応じて、カプセル剤や錠剤などの種々の形態に加工し易い態様となる。さらに、麹菌の処理物は、添加しても食品自体の食味や風味に影響を殆ど与えないため、種々の食品に添加して継続的に長期に亘って摂取することができる。
また、本発明の抗血栓組成物は、医薬上許容される様々な添加剤を含有することで、種々の態様で医薬品・食品・飼料等として供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】麹の製造方法を示す流れ図である。
【図２】麹菌の処理物の製造方法を示す流れ図である。
【図３】合成基質法によってプラスミン様活性を評価した結果を示したグラフである。
【図４】固体培養乾燥粉末および液体培養乾燥粉末のプラスミン様総活性を比較したグラフである。
【図５】植菌時のフスマ中の水分量を種々変更してプラスミン様活性の評価を行った結果を示したグラフである。
【図６】本発明の抗血栓組成物をin vivo投与した後の血栓重量低下効果を確認した結果の写真図である。
【図７】実施例６において各群のＦＤＰ量を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明の抗血栓組成物は、血栓溶解活性を有し、醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供される麹菌の処理物を有効成分として含有する。
【００２０】
麹菌は、醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供されるものであれば公知の麹菌を使用することができる。このような麹菌は、例えば、蒸煮した穀類、豆類、イモ類などの原料を醗酵し、デンプンをブドウ糖に分解する性質、或いは、タンパク質をアミノ酸に分解する性質を有する糸状菌であればよい。当該糸状菌は、具体的にはアスペルギルス属に属する糸状菌であり、より具体的には、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）またはアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）などが挙げられる。
【００２１】
血栓溶解活性を有するアスペルギルス・オリゼーとしては、例えば、醤油製造用として株式会社菱六より供される「醤油旭菌」、「醤油エナジー」、「亀甲菌」等が挙げられ、味噌製造用として株式会社菱六より供される「ＳＲ１０８」、「改良長白菌」、「長白菌」、「米用新菌」、「米赤用菌」、「金山寺」、「麦赤」および株式会社樋口松之介商店より供される「白菊」、「白もやし」、「米麹用特別品」、「別撰味噌用」等が挙げられ、日本酒製造用として株式会社菱六より供される「Ａ−２７」、「白夜」、「瑞穂」等が挙げられ、味醂製造用として株式会社菱六より供される「ミリン」、「ミリンライト」等が挙げられる。
また、血栓溶解活性を有するアスペルギルス・ソーヤとしては、例えば、醤油製造用として、株式会社菱六より供される「ソーヤ」等が挙げられる。
【００２２】
本発明においては、上述した菌株の変異株又は派生株であってもよく、血栓溶解活性を有する限り使用することができる。
【００２３】
本発明において使用する麹菌は、当該麹菌の固体培養に通常用いられる蒸煮した原料を使用して、適当な条件下で固体培養することにより調製することができる。原料としては、穀物として米、麦（大麦、小麦、ライ麦及びオート麦）など、豆類として大豆など、イモ類としてサツマイモなど、当該麹菌が効率よく生育する原料であればどのような原料でも用いることができる。これら原料は単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
培養後、得られた麹菌培養物をそのまま使用してもよいし、さらに必要に応じて遠心分離などによる粗精製、濾過等による固液分離、滅菌操作などを行ってもよい。本発明の抗血栓組成物に使用する麹菌は、生菌体、死菌体、湿潤菌体、乾燥菌体の何れであってもよい。また、麹菌は、２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。
【００２５】
本発明においては、上述のように調製された麹菌を用いて、醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの通常の製造工程に従って製麹することにより得られる麹を用いて、麹菌の処理物を得ることが可能である。例えば、公知の手法により加水（加水工程）して加圧蒸煮（殺菌工程）した穀物原料に上述のように調製した麹菌を種麹として接種（植菌工程）して十分に攪拌混合し、約２０〜４５℃の範囲で送風、攪拌、静置を繰り返して培養（培養工程）し、麹を得ることができる（図１）。
【００２６】
穀物原料としては、全植物体を使用してもよいし、その植物の花、茎、葉、種子、根、胚芽、糠、フスマなどの各部位を使用してもよい。特に、搗精した麦、麦胚芽及び麦フスマ、精米した米及び米胚芽を単独で又は適宜組み合わせて使用するとよい。穀物原料は、蒸煮処理や、粉砕・破砕処理を行うことによって、効率的に製麹することができるが、そのまま製麹に使用してもよい。加水工程では、穀物原料の水分量が４０〜６５％、好ましくは４５〜６５％、さらに好ましくは４５〜５５％程度となるように加水を行えばよい。また、殺菌工程では、公知の条件（例えば１２１℃、１０分）で加圧蒸煮すればよい。
【００２７】
種麹として使用する麹菌は、例えば胞子形態、上述した麹菌培養物の形態、これらを凍結乾燥した形態などを使用することができるが、このような態様に限定されるものではない。
【００２８】
製麹は、麹菌と穀物原料とを接触させることで行うことができる（固体培養）。植菌工程において穀物原料と接触させる麹菌の量は、通常、穀物原料に対して乾燥麹菌粉末が０．００１〜１０質量％程度となるようにするのがよいが、これに限定されるものではない。培養工程において、製麹を行う際の温度、ｐＨ、時間などは公知の条件で行えばよく、例えば２０〜５０℃、ｐＨ５〜８程度で１〜１０日間かけて行うとよい。培養工程の後、例えば通風乾燥などによって培養物を４０〜４５℃程度で１日程度乾燥させる（乾燥工程）。
【００２９】
本発明において、麹菌の処理物は、以下のようにして得ることができる（図２）。当該麹菌の処理物は、麹菌または麹を処理することによって得られる。
【００３０】
まず、麹菌または麹を、適当な水性溶媒又は有機溶媒を用いて抽出することによって抽出液を得ることができる（抽出工程）。このとき抽出方法としては、水性溶媒又は有機溶媒を抽出溶媒として用いる方法であれば公知の手法で行うことができる。例えば、上記の麹菌若しくは麹を、水性（例えば水）又は有機溶媒（例えばメタノール、エタノール）中に浸漬、攪拌又は還流することにより、抽出液を得ることができる。麹菌または麹に加える溶媒の量は、５〜２０倍程度とするのがよい。抽出工程では、溶媒を加えた麹菌または麹に対して加熱処理を行う。加熱処理は、例えば３０分〜３時間にわたり、例えば２５〜３５℃で加熱する。
【００３１】
加熱処理後の中間処理物は、公知の手法によって固液分離する（濾過工程）。当該手法は、スクリューデカンタ、遠心分離機、圧搾ろ過機、フィルタープレスなどを用いて固液分離する態様であれば、特に限定されるものではない。固液分離後の中間処理物は、適切な濃度になるまで濃縮するとよい（濃縮工程）。この濃縮は、例えば煮沸濃縮、真空濃縮、凍結濃縮、膜濃縮などの公知の手法を用いるとよい。
【００３２】
濃縮後の中間処理物に対して除菌処理を行う（除菌工程）。当該除菌処理は、例えば濾過滅菌、放射性殺菌（γ線殺菌など）、加熱式殺菌、加圧式殺菌などの公知の滅菌処理を行うとよい。
【００３３】
滅菌処理後の中間処理物に対して噴霧乾燥処理を行う（噴霧乾燥工程）。当該噴霧乾燥処理では、得られた中間処理物を気体中に噴霧して急速に乾燥させ、乾燥粉末を製造する。乾燥粉体を製造する手法は、噴霧乾燥の他、ドラム乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。このとき、必要に応じて通常用いられるデキストリンなどの賦形剤を添加してもよい。また、乾燥後に例えば粉砕機を使用して粉末化してもよい。
【００３４】
乾燥粉末化した麹菌の処理物は、公知の手法によって篩処理および除鉄処理を行うとよい（篩・除鉄工程）。篩処理に使用する篩サイズは、例えば４０〜５０メッシュとし、除鉄処理は、処理される乾燥粉体が、均一に磁化スクリーンを通過して除鉄処理されるようにすればよい。
【００３５】
麹菌の処理物は、上述した各工程の全てを行って得られたものとしてもよいし、各工程の一部、例えば抽出工程および濾過工程のみを行って得られたものとしてもよい。
【００３６】
このようにして製造された麹菌の処理物（乾燥粉末）は、そのまま経口摂取してもよいし、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤（粉剤）、コーティング剤、糖衣剤、乳剤、液剤、シロップ剤などに製剤して経口摂取してもよい。本発明の麹菌の処理物は、製剤の際には、医薬上、薬理的に許容される添加剤と混合してもよい。
【００３７】
当該添加剤としては、例えば、乳糖・白糖・マニトール・ブドウ糖・デンプン・ソルビトール等の賦形剤、デンプン・ゼラチン・アラビアゴム・ブドウ糖・白糖・ソルビトール・マニトール等の結合剤、ステアリン酸・硬化油・ステアリン酸マグネシウム・ステアリン酸カルシウム等の滑沢剤、バレイショデンプン等の崩壊剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、ポリエチレングリコール等の安定剤、ラウリル硫酸ナトリウム・ソルビタンモノ脂肪酸エステル等の界面活性剤、ベンジルアルコール・パラオキシ安息香酸エチル・安息香酸・メチルパラベン・プロピルパラベン等の保存剤、ステビア・アスパルテーム等の甘味料、コハク酸、リンゴ酸等の酸味剤、植物油・動物油脂等の各種油脂、ロイヤルゼリー・人参等の生薬、グルタミン・システイン・ロイシン・アルギニン等のアミノ酸、エチレングリコール・ポリエチレングリコール・プロピレングリコール・グリセリン等の多価アルコール、寒天・ゼラチン・キサンタンガム・カゼイン・グルテン・澱粉・デキストリン等の天然高分子、ビタミンＣ・ビタミンＢ群等のビタミン、カルシウム・マグネシウム・亜鉛・鉄等のミネラル、マンナン・ペクチン・ヘミセルロース等の食物繊維、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、呈味成分、芳香剤、着色料、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の抗血栓組成物は、製剤の際に、有効成分である麹菌の処理物を、通常は０．１〜９９質量％、好ましくは５〜８０質量％程度含有するようにすればよい。
【００３９】
本発明の抗血栓組成物は血栓溶解活性を有するため、当該抗血栓組成物を有効成分として含有する医薬組成物又は機能性食品として、血栓症の予防又は治療のために用いることができる。即ち、本発明の抗血栓組成物を、投与対象であるヒトや動物に適量を摂取させることで、血栓症の発症を予防、改善及び治療することができる。
【００４０】
本明細書における「血栓溶解活性」とは、血栓に対する線溶作用を有するものであり、具体的には、フィブリンやフィブリノーゲンを分解するプラスミン活性を活性化して血栓を溶解する能力のことを指す。この血栓溶解活性の評価は、例えばフィブリンプレート法や合成基質法等によって行うことができる。
フィブリンプレート法は、フィブリンプレートにサンプルを滴下して溶解したフィブリンの溶解窓の直径を測定し、血栓溶解活性を評価するものである。
合成基質法は、プラスミン合成基質に対する分解能を、発色性をもつｐＮＡ量を測定してプラスミン様活性を評価するものである。
【００４１】
本発明の抗血栓組成物の摂取量は、投与対象であるヒトや動物の年齢、体重、摂取経路、摂取回数、血栓症の症状により異なり、種々の量を設定することができる。また、本発明の抗血栓組成物は、他の医薬、治療又は予防法等と併用してもよい。
【００４２】
本発明の抗血栓組成物は、血栓溶解作用を有するうえ、現代の食文化において馴染みがあり、食経験のある醤油、味噌、日本酒、味醂のいずれかの製造用に供される麹菌又は麹の処理物を有効成分として含むものであり、安全性が高く、かつ抵抗感なく経口摂取することができる。また、有効成分として含まれる当該麹菌の処理物は、高温処理や凍結乾燥処理をした後でも血栓溶解活性を保持することから、食品などの加工処理に適している。さらに、添加しても食品自体の食味や風味に影響を殆ど与えないため、種々の食品に添加して継続的に摂取することができる。
【００４３】
上述したように、本発明の抗血栓組成物は、当該抗血栓組成物を有効成分として含有する医薬組成物又は機能性食品として供するのが好ましい。特に機能性食品の態様であれば、日常的に経口摂取できるため、手軽に血栓症の発症を予防することができると考えられる。
【００４４】
当該機能性食品とは、例えば、特定保健用食品（体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含み、特定の効能が認められる食品）、栄養機能食品（栄養成分の補給・補完のために利用する食品）、健康補助食品、栄養補助食品などの態様で供されるものを指す。このような機能性食品であれば、広く市場に流通しており、容易かつ安価に入手ができる。当該機能性食品に含まれる本発明の抗血栓組成物の割合は、当業者が適宜設定すればよい。
【実施例】
【００４５】
〔実施例１〕
本発明の実施例について説明する。
以下のようにして麹菌を穀物原料に植菌して麹を調製した（図１）。
当該穀物原料としてフスマ（小麦）を使用した。フスマ中の水分量が５０％となるようにフスマへの加水を行った（加水工程）。加水したフスマに対して１２１℃、１０分間の条件にて加圧蒸煮を行った（殺菌工程）。フスマ重量に対して種麹（アスペルギルス・オリゼー「醤油エナジー」）０．０１％を植菌した（植菌工程）。植菌後、品温が３０℃以下となるように温度を調製し、かつ、フスマの水分量が２５％以上となるように調製しながら、３日間の培養を行った（培養工程）。培養工程の後、通風乾燥機によって培養物を４０℃で２４時間の乾燥を行った（乾燥工程）。
【００４６】
このようにして製造したフスマ麹に対して、以下の処理を行って麹菌の処理物を得た（図２）。
まず、フスマ麹に対して１０倍量の水を加えて、３０℃±２℃となるようにして２時間の抽出を行った（抽出工程）。抽出液に対して、公知のスクリューデカンタ、遠心分離機、圧搾ろ過機、フィルタープレスを用いて固液分離した（濾過工程）。固液分離後の中間処理物は、ＵＦ精製膜（１０Ｋ：ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社製）を用いて濃縮した（濃縮工程）。濃縮後の中間処理物に対して、０．２μｍのフィルター（３Ｍ：Purification株式会社製）を用いて除菌処理を行った（除菌工程）。滅菌処理後の中間処理物に対してデキストリンを添加し、噴霧乾燥処理を行った（噴霧乾燥工程）。乾燥粉末化した麹菌の処理物は、４５メッシュサイズの篩（興和株式会社製）を用いて篩処理を行い、さらに９０００ガウスの磁化スクリーン（マグネットプラン社製）を使用して除鉄処理を行い（篩・除鉄工程）、麹菌の処理物（乾燥粉末）を得た。
【００４７】
〔実施例２〕
合成基質法によってプラスミン様活性を評価した。プラスミン様活性の評価は、実施例１で使用したアスペルギルス・オリゼー「醤油エナジー」と他の１８種のアスペルギルス・オリゼー（本発明例１〜１９）、および、１種のアスペルギルス・ソーヤ（本発明例２０）の処理物を使用した（表１）。本実施例における麹菌の処理物は、抽出工程および濾過工程を行って得られたものとした。
【００４８】
他の１８種のアスペルギルス・オリゼーは、「醤油旭菌」、「亀甲菌」、「ＳＲ１０８」、「改良長白菌」、「長白菌」、「米用新菌」、「米赤用菌」、「金山寺」、「麦赤」、「白菊」、「白もやし」、「米麹用特別品」、「別撰味噌用」、「Ａ−２７」、「白夜」、「瑞穂」、「ミリン」、「ミリンライト」を使用した。また、１種のアスペルギルス・ソーヤは「ソーヤ」を使用した。
【００４９】
一方、比較例として、焼酎製造用に供される麹菌として、株式会社菱六より供されるアスペルギルス・カワチ（Aspergillus Kawachi）の「焼酎用白麹」（比較例１）およびア
スペルギルス・アワモリ（Aspergillus Awamori）の「クロ」（比較例２）を使用した。
焼酎製造用に供される麹菌は、例えば蒸煮した大麦や米などの穀類などの固体原料を醗酵し、糖質からクエン酸を産生する糸状菌を指す。これら比較例の麹菌の処理物も本発明例と同様に、抽出工程および濾過工程を行って得られたものとした。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
プラスミン合成基質は、Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡとし、プラスミン基質（Ｓ−２２５１試薬：積水メディカル株式会社製）を用いた。基質溶液はＳ−２２５１試薬を２．５ｍＭになるようＤＭＳＯで調整した。サンプルは０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて適当な濃度で抽出した。９６穴プレートに０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）９０μＬ、蒸留水５４μＬ、基質溶液１８μＬを入れ、サンプル１８μＬを入れた後に、３７℃の条件下で２分間毎に２０分間まで、波長４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。ｐＮＡを１分間あたりに１ｎｍｏｌ産生する酵素量を１Ｕとし、プラスミン様活性を評価した。
【００５２】
この結果、比較例１「焼酎用白麹」および比較例２「クロ」以外の麹菌（本発明例１〜２０）においてプラスミン様活性（血栓溶解活性）が確認された（図３）。プラスミン様活性は、特にアスペルギルス・オリゼーの「醤油旭菌」および「醤油エナジー」（５００Ｕ／ｇ程度）、アスペルギルス・ソーヤの「ソーヤ」（６５０Ｕ／ｇ以上）において高い活性を有し、このうち、アスペルギルス・ソーヤの「ソーヤ」において最も高い活性を有するものと認められた。
【００５３】
〔実施例３〕
実施例１において、穀物原料としてフスマを使用して種麹（アスペルギルス・オリゼー「醤油エナジー」）の固体培養を行って得られた麹菌の処理物のプラスミン様活性を評価した。これに対して、当該種麹の液体培養を行った場合に得られた麹菌の処理物のプラスミン様活性を評価し、これらを比較した。
【００５４】
固体培養では、使用するフスマ１００ｇに対して種麹１ｇを植菌し、培養期間を２日とする以外は、実施例１の手法に準じて行った。得られたフスマ麹に対して１０倍量の水を加えて抽出し、その後凍結乾燥機（ＦＤＵ−２１００：東京理化器械株式会社製）を用いて４８時間の凍結乾燥を行い、固体培養乾燥粉末（麹菌の処理物）を得た。
【００５５】
液体培養では、培地は、potato dextrose broth（以下、ＰＤＢと称する：Difco社製）を用いた。ＰＤＢ２．４ｇに水１００ｍＬを加えて滅菌した培地に、種麹１ｇを植菌して３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液は定性ろ紙（Ｎｏ．２：アドバンテック東洋株式会社製）を用いて吸引濾過し、得られた水溶性画分を固体培養の場合と同様の条件で凍結乾燥を行い、液体培養乾燥粉末（麹菌の処理物）を得た。
【００５６】
プラスミン様活性の評価は、実施例２の手法に準じて行った。図４に固体培養乾燥粉末および液体培養乾燥粉末のプラスミン様総活性を比較した結果を示した。プラスミン様総活性は、各乾燥粉末の収量及びプラスミン様活性から算出した。尚、プラスミン様総活性は、液体培養乾燥粉末の総活性を１とした場合の相対値として示した。
【００５７】
この結果、液体培養乾燥粉末に比べて固体培養乾燥粉末の方が８５０倍のプラスミン様総活性を有することが判明した。よって、液体培養乾燥粉末より固体培養乾燥粉末の方が、顕著にプラスミン様総活性が高いものと認められた。
【００５８】
〔実施例４〕
実施例１では、植菌時のフスマ中の水分量を５０％としたが、この水分量を種々変更してプラスミン様活性の評価を行った。
【００５９】
植菌時のフスマの水分量を３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％に調整したフスマに対し、フスマ量の０．０１％の種麹を植菌し、３０℃にて３日間の培養を行った。図５に、得られたそれぞれの麹菌の処理物のプラスミン様活性を比較した結果を示した。尚、プラスミン様活性は、水分量３５％時の活性を１とした場合の相対値として示した。
【００６０】
この結果、フスマの水分量が４０〜６５％の場合において、水分量３５％時の活性に比べて１．５倍以上のプラスミン様活性を有することが判明した。また当該水分量が４５〜６５％の場合において、水分量３５％時の活性に比べて２倍以上のプラスミン様活性を有することが判明した。さらに当該水分量が４５〜５５％の場合において、水分量３５％時の活性に比べて３〜５倍程度のプラスミン様活性を有することが判明した。よって、植菌時のフスマの水分量を４０〜６５％、好ましくは４５〜６５％、さらに好ましくは４５〜５５％とすれば、顕著に高いプラスミン様活性を有するものと認められた。
【００６１】
〔実施例５〕
アスペルギルス・オリゼーの「醤油エナジー」（本発明例２）の処理物（乾燥粉末）において、in vivo試験を行った。In vivo試験は、ＳＤラット（雄、８Ｗ）を用いて、麹菌の処理物（乾燥粉末）および水（コントロール）を各群１０匹に７日間連続投与することにより行った。
【００６２】
具体的には、麹菌の処理物（乾燥粉末）１０ｍｇ/ｋｇ、液量５ｍＬ/ｋｇを投与した群（実施例４−１）、麹菌の処理物（乾燥粉末）５０ｍｇ/ｋｇ、液量５ｍＬ/ｋｇを投与した群（実施例４−２）、水（液量５ｍＬ/ｋｇ）を投与した群（比較例４−１）を設定し
た。
【００６３】
各群において１日１回の投与を７日間実施し、最終の投与をＡＶシャント作製の１時間前に実施した。ＡＶシャントは、ＳＤラットの麻酔下において、絹糸を留置したポリエチレンチューブを頸動脈（ＡＶ）に接続することにより作製した。ＡＶシャントの作製後、２０分間血液を循環させ、２０分後に血流を遮断して直ちにポリエチレンチューブ内の絹糸を取り出し、絹糸に付着したフィブリン血栓の湿重量を測定した。血栓重量は、測定値から予め計測しておいた絹糸の重量を差し引きして求めた。
【００６４】
ＡＶシャント作製後、２０分間血液を循環させて付着した血栓の写真を図６に示した。血栓重量を求めた結果、実施例４−１（１０ｍｇ/ｋｇ投与群）では６１．７ｍｇ、実施
例４−２（５０ｍｇ/ｋｇ投与群）では４６．４ｍｇ、比較例４−１（水投与群）では８
９．３ｍｇであった。コントロールである比較例４−１の血栓重量を１００％とすれば、実施例４−１は６９％、実施例４−２では５２％となり、本発明の麹菌の処理物を含有する抗血栓組成物をin vivo投与することで、濃度依存的に有意な血栓重量低下効果が確認
された。そのため、本発明の抗血栓組成物は、血栓性疾患に対して、優れた予防、改善及び治療効果が期待できる。
【００６５】
〔実施例６〕
アスペルギルス・オリゼーの「醤油エナジー」（本発明例２）の処理物（乾燥粉末）において、ヒト臨床試験を行った。ヒト臨床試験の被験者は、年齢５０歳以上で、ＬＤＬコレステロールが１００ｍｇ／ｄＬ以上もしくは中性脂肪が１５０ｍｇ／ｄＬ以上の、血栓症リスクの高い男女１９名を対象とした。被験者を、年齢、ＬＤＬコレステロール値および中性脂肪値が同様になるように３群に分けた。３群の内訳は、麹菌の処理物（本発明例２）の高用量摂取群（３００ｍｇ／日、７名）、麹菌の処理物（本発明例２）の低用量摂取群（１００ｍｇ／日、６名）およびデキストリン摂取群（コントロール、３００ｍｇ／日、６名）とした。麹菌の処理物の摂取量（ｍｇ）は、添加剤などを含まない麹菌の処理物のみの量を示している。
【００６６】
各群において、それぞれの被験サンプルを２１日間毎日連続摂取させた。具体的には、１日の摂取量の半量の各被験サンプルを詰めたハードカプセルを、朝、夕に１粒ずつ摂取させた。試験はダブルブラインドで実施した。
【００６７】
各群において、臨床試験開始前（０日目）、開始後２１日目に採血を行い、血中のＦＤＰ量を測定した。ＦＤＰはフィブリノーゲン及びフィブリンの分解産物であり、線溶マーカーとして知られ、プラスミンによってフィブリノーゲンが分解されたフィブリノーゲン分解産物と、プラスミンによってフィブリンが分解されたフィブリン分解産物を含む。ＦＤＰの上昇は線溶亢進、即ち抗血栓効果を示すものとされる。
【００６８】
各群のＦＤＰ量を測定した結果を表２および図７に示した。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
この結果、デキストリン摂取群（コントロール）は、摂取前と比較して摂取２１日目においてもＦＤＰ量の増加は認められなかった。一方、低用量摂取群（１００ｍｇ／日）は、摂取前のＦＤＰ量が１．３７μｇ／ｍＬであるのに対し、摂取２１日目に１．６５μｇ／ｍＬと増加が認められた（約１．２倍の増加）。さらに、高用量摂取群（３００ｍｇ／日）は、摂取前のＦＤＰ量が１．３６μｇ／ｍＬであるのに対し、摂取２１日目に２．６９μｇ／ｍＬと大幅な増加が認められた（約２倍の増加）。
【００７１】
このことから、本発明例の麹菌の処理物（本発明例２）を摂取することにより、摂取量依存的にＦＤＰ量の上昇が認められ、本発明例の麹菌の処理物は抗血栓効果を有することが確認された。
【００７２】
このように本発明例の麹菌の処理物の摂取量依存的にＦＤＰ量の上昇が認められることから、上述した低用量摂取群（１００ｍｇ／日）より少ない量（例えば２５ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日）であっても抗血栓効果を有すると期待される。また、上述した高用量摂取群（３００ｍｇ／日）より多い量（例えば４００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日）であっても、当然抗血栓効果を有すると期待される。
【００７３】
このとき、本発明例の麹菌の処理物の総摂取量を基準にして、摂取量および摂取期間を設定することが可能である。例えば、上述した低用量摂取群（１００ｍｇ／日）を２１日間試験すれば、本発明例の麹菌の処理物の総摂取量は２１００ｍｇとなり、高用量摂取群（３００ｍｇ／日）を２１日間試験すれば、本発明例の麹菌の処理物の総摂取量は６３００ｍｇとなる。
例えば低用量摂取群において一日当たりの摂取量を５０ｍｇに減らしたい場合、４２日間の摂取を行うと総摂取量は２１００ｍｇとなり、この場合の麹菌の処理物の総摂取量は低用量摂取群（１００ｍｇ／日）の場合と同様となる。同様に、総摂取量が６３００ｍｇとなるように摂取期間を設定してもよい。
【００７４】
即ち、一日当たりの摂取量および摂取期間は、被験者の症状、嗜好およびコスト等に応じて適宜設定することができる。この場合、例えば一日当たりの摂取量を２５〜６００ｍｇ、好ましくは５０〜５００ｍｇ、さらに好ましくは１００〜３００ｍｇと設定するのがよい。
【００７５】
尚、上述した結果は、本発明例２に限らず、本発明の他の麹菌の処理物（本発明例１、３〜２０）においても同様である（データは示さない）。
【００７６】
ここで、麹菌の処理物の低用量摂取群および高用量摂取群において、摂取前と比較して、摂取２１日目の血液一般検査ならびに血液生化学検査項目の測定を行ったところ、測定値は顕著な変動が見られず、試験期間を通しての有害事象の発現は認められなかった（データは示さない）。
【００７７】
以上より、本発明例の麹菌の処理物は、安全で抗血栓効果を有する機能性素材として有用であるものと認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、血栓溶解活性を有する抗血栓組成物として利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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