(57)【要約】    【課題】  比較的十分に精製されたβ−グルカンを簡便に得ることができる、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法を提供することを課題としている。    【解決手段】  β−グルカンを含有する微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施すことによって、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−グルカンを含有する微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施すことによって、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法。
【請求項２】
前記微細藻類と前記塩素系酸化剤と水とを含みｐＨが１０以上１２以下である混合液中で前記酸化処理を施す請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
前記微細藻類が、ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類である請求項１又は２に記載の分離方法。
【請求項４】
前記塩素系酸化剤が、次亜塩素酸塩である請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法としては、例えば、β−グルカンを含有する微細藻類と、界面活性剤と、水とを混合することによって、界面活性剤の界面活性作用を利用して、微細藻類からβ−グルカンを分離する方法が知られている。
【０００３】
この種の分離方法としては、例えば、β−グルカンとしてのパラミロン粒子を含有する微細藻類と水とを含む混合液に、超音波を照射することによって微細藻類の細胞膜を溶解させたうえで、パラミロン粒子を含有する沈殿物に生物分解性の界面活性剤を添加し、更に超音波を照射する方法が知られている（特許文献１）。
【０００４】
斯かる分離方法によれば、微細藻類の細胞膜などを超音波によって溶解させることにより、細胞膜の内部に蓄えられたパラミロン粒子を細胞内から取り出すことができる。また、残存する細胞膜などを生物分解性の界面活性剤によって取り除き、パラミロン粒子を液中で沈殿させることができる。これにより、微細藻類からβ−グルカンとしてのパラミロンを分離することができる。
【０００５】
しかしながら、斯かる分離方法においては、細胞膜を破壊して溶解させるために強力な超音波を必要とするため、例えば、装置が大型化し、操作が必ずしも簡便なものとならない。また、分離されたβ−グルカンにも界面活性剤が付着していることから、比較的十分に精製されたβ−グルカンを得るためには、水などによる洗浄を繰り返すことによって、β−グルカンから界面活性剤を取り除く必要がある。従って、斯かる分離方法においては、比較的十分に精製されたβ−グルカンを簡便に得ることができないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５２９５３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題点等に鑑み、比較的十分に精製されたβ−グルカンを簡便に得ることができる、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく、本発明に係る微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法は、β−グルカンを含有する微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施すことによって、微細藻類からβ−グルカンを分離することを特徴とする。
【０００９】
上記構成からなる分離方法においては、塩素系酸化剤による酸化処理によって、微細藻類の細胞膜を少なくとも酸化分解させることができる。一方で、β−グルカンは、β結合を有する化合物であることから、塩素系酸化剤による酸化処理によっても酸化分解されにくい。これにより、細胞膜を酸化分解し、細胞内からβ−グルカンを取り出すことができる。従って、細胞を構成していた細胞膜などと、β−グルカンとを簡便に分離させることができる。しかも、塩素系酸化剤がβ−グルカンに残存しにくいことから、分離されたβ−グルカンの精製度は、比較的十分なものとなる。このように、上記構成からなる分離方法によれば、比較的十分に精製されたβ−グルカンを簡便に得ることができる。
【００１０】
本発明に係る分離方法においては、前記微細藻類と前記塩素系酸化剤と水とを含みｐＨが１０以上１２以下である混合液中で前記酸化処理を施すことが好ましい。
前記混合液のｐＨが１０以上１２以下であることにより、微細藻類の細胞膜をより確実に酸化分解させつつ、β−グルカンが酸化分解されることをより確実に抑制することができる。従って、より十分に精製されたβ−グルカンを簡便に得ることができる。
【００１１】
本発明に係る分離方法においては、前記微細藻類が、ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類であることが好ましい。
【００１２】
本発明に係る分離方法においては、前記塩素系酸化剤が、次亜塩素酸塩であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法は、比較的十分に精製されたβ−グルカンを簡便に得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酸化処理工程にて、所定時間の酸化処理を施した後の様子を顕微鏡によって観察した写真。
【図２】酸化処理工程にて、所定時間の酸化処理を施した後の様子を顕微鏡によって観察した写真。
【図３】酸化処理工程にて、所定時間の酸化処理を施した後の様子を顕微鏡によって観察した写真。
【図４】酸化処理工程にて、所定時間の酸化処理を施した後の様子を顕微鏡によって観察した写真。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明に係る、微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法の一実施形態について、詳しく説明する。
【００１６】
本実施形態の分離方法は、β−グルカンを含有する微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施すことによって、微細藻類からβ−グルカンを分離するものである。
詳しくは、本実施形態の分離方法は、前記微細藻類と前記塩素系酸化剤と水とを含む混合液中で、前記酸化処理を施すものである。
【００１７】
本実施形態の分離方法は、微細藻類からβ−グルカンを分離するために、例えば、培養されることによって細胞内にβ−グルカンが蓄えられた微細藻類を水に分散させた分散液を調製する分散工程と、分散液と塩素系酸化剤とを混合し微細藻類と塩素系酸化剤と水とを混合した混合液中で微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施す酸化処理工程と、酸化処理工程後に固体としてのβ−グルカンと液体とを分離してβ−グルカンを精製する精製工程とを備える。
【００１８】
前記分散工程では、一般的な培養方法によって培養された微細藻類であって、細胞内にβ−グルカンが蓄えられた微細藻類を水に分散させる。
【００１９】
前記培養方法としては、一般的な方法が採用される。該培養方法としては、例えば、従属栄養培養方法、光独立栄養培養方法、又は、光従属栄養培養方法などが挙げられる。
従属栄養培養方法においては、微細藻類に光合成をさせず、炭素源を栄養素として利用させながら微細藻類を増殖させる。
光独立栄養培養方法においては、光合成によって二酸化炭素からのみ炭化水素や糖類などを合成させつつ、微細藻類を増殖させる。
光従属栄養培養においては、微細藻類に光合成させつつ炭素源を栄養素として利用させながら増殖させる。
【００２０】
前記β−グルカンは、複数のグルコースがβ−１，３−結合によって互いに結合してなる化合物である。
前記β−グルカンは、結合力が強いβ−１，３−結合を有する化合物であるため、塩素系酸化剤による酸化分解を受けにくい。
前記β−グルカンは、微細藻類に含まれる成分の１つである。前記β−グルカンは、例えば、微細藻類の貯蔵栄養分として細胞の細胞質中に粒子状となって蓄えられている。
【００２１】
具体的には、β−グルカンとしては、後述するユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類の細胞質に蓄えられるパラミロンが挙げられる。
【００２２】
前記微細藻類は、昆布やワカメと異なり、通常、単細胞性である。また、通常、大きさが概ね数マイクロメートルから数十マイクロメートルの微小な藻類である。
前記微細藻類は、通常、光合成能力を有する。
【００２３】
前記微細藻類としては、ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類が好ましい。
【００２４】
前記ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類としては、例えば、Euglena gracilis、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、又は、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。
具体的には、前記ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類としては、例えば、Euglena gracilis  ＮＩＥＳ−４８株（独立行政法人国立環境研究所  微生物系統保存施設より入手可能）が挙げられる。この株など、ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類は、ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類の株を保管する機関から、容易に入手することができる。
【００２５】
前記ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類は、培養されることによって、細胞質にβ−グルカンとしてのパラミロンを蓄える。従って、本実施形態の分離方法においては、微細藻類としてユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類が採用された場合には、β−グルカンとしてのパラミロンを微細藻類から分離することとなる。
【００２６】
前記分散液としては、例えば、微細藻類が培養液中で培養された後の分散液をそのまま用いることができる。また、前記分散液としては、例えば、微細藻類が培養液中で培養された後に培養液を取り除き、培養後の微細藻類を水に分散させた分散液を用いることができる。
前記分散液は、微細藻類以外にも、通常、培養前に配合された培養成分、又は、微細藻類が増殖に伴って産生した代謝成分などを含み得る。
【００２７】
前記分散工程においては、分散液として、上記のごとく、培養液を取り除き培養後の微細藻類を水に分散させた分散液を採用することが好ましい。即ち、培養後の微細藻類を水で洗浄した微細藻類を含む分散液を採用することが好ましい。
後に詳述する酸化処理工程前に、純水や水道水などを用いて、培養後の微細藻類を洗浄しておくことによって、酸化処理工程時に用いた塩素系酸化剤（次亜塩素酸塩など）が培養液の培地成分等と反応し、無駄に消費されることを抑制できる。また、得られるβ-グルカン（パラミロン）に、培養液の培地成分等が付着することも抑制できる。
【００２８】
前記分散工程では、培養液の培地成分にもよるが、通常、分散液のｐＨが酸性である。即ち、通常、分散液のｐＨが７未満である。なお、上記のごとく、培養後の微細藻類を純水等によって洗浄した場合、分散液のｐＨが中性付近となる。
【００２９】
前記分散工程では、分散液中の微細藻類の濃度が１ｇ/Ｌ〜１００ｇ/Ｌであることが好ましく、５ｇ/Ｌ〜５０ｇ/Ｌであることがより好ましい。微細藻類の濃度が１ｇ/Ｌ以上であることにより、酸化処理工程にて、塩素系酸化剤を、より無駄なく効率的に微細藻類へ作用させることができるという利点がある。また、微細藻類の濃度が１００ｇ/Ｌ以下であることにより、塩素系酸化剤（次亜塩素酸塩など）が、濃度が低い分、より確実に微細藻類と接触できるという利点がある。
【００３０】
前記酸化処理工程では、分散液と塩素系酸化剤とを混合した混合液中にて、微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施す。
具体的には、前記酸化処理工程では、例えば、分散液に塩素系酸化剤を所定量添加し、添加後の混合液を撹拌することによって、微細藻類に対して塩素系酸化剤により酸化処理を施す。酸化処理によって、例えば、微細藻類の細胞壁が分解して溶解する。
前記酸化処理工程は、通常、室温にて実施する。
【００３１】
前記塩素系酸化剤は、分子中に塩素原子を含む酸化性の化合物であり、微細藻類を構成する物質と反応することにより、自らが還元される化合物である。
前記塩素系酸化剤としては、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸などが挙げられる。
また、前記塩素系酸化剤は、塩の態様であってもよい。即ち、塩素系酸化剤としては、さらに、次亜塩素酸塩、亜塩素酸塩、塩素酸塩、過塩素酸塩などが挙げられる。
塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。
また、前記塩素系酸化剤は、ジクロロイソシアヌール酸、ジクロロイソシアヌール酸ナトリウム、ジクロロイソシアヌール酸カリウム、トリジクロロイソシアヌール酸など、水中で次亜塩素酸又は亜塩素酸を発生しうるものであってもよい。
【００３２】
前記塩素系酸化剤としては、より酸化力に優れる点、及び、より水溶性に優れる点で、次亜塩素酸塩が好ましく、次亜塩素酸ナトリウム及び次亜塩素酸カリウムからなる群より選択された少なくとも１種がより好ましい。
【００３３】
前記酸化処理工程では、ｐＨが１０以上、更にはｐＨ１０．５以上である混合液中で酸化処理を施すことが好ましい。
前記酸化処理工程において混合液のｐＨが１０以上であることにより、塩素系酸化剤の酸化力がより大きくなることから、より確実に微細藻類に酸化処理を施すことができるという利点がある。混合液のｐＨが１０．５以上であることで、より確実に酸化処理を施すことができる。
また、前記酸化処理工程では、ｐＨが１３以下である混合液中で酸化処理を施すことが好ましく、ｐＨが１２以下である混合液中で酸化処理を施すことがより好ましい。
前記酸化処理工程において混合液のｐＨが１３以下であることにより、塩素系酸化剤の酸化力によって、β−グルカンが分解されることをより確実に抑制できるという利点がある。
【００３４】
前記混合液のｐＨは、例えば、混合液に添加する塩素系酸化剤の量を増やすことによって、高めることができる。また、例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどを混合液に添加することによって、高めることができる。
【００３５】
前記酸化処理工程では、酸化処理の開始時（即ち、分散液と塩素系酸化剤とを混合してから３０秒後）に、混合液のｐＨが１１以上、更には１１．５以上であることが好ましく、一方、混合液のｐＨが１３以下であることが好ましく、混合液のｐＨが１２以下であることがより好ましい。酸化処理工程では、酸化処理の進行に伴って、通常、ｐＨが低下していく。
【００３６】
前記酸化処理工程では、酸化処理の開始時のｐＨよりも、ｐＨが少なくとも１．０低下するように酸化処理を行うことが好ましい。一方、前記酸化処理工程では、通常、酸化処理の開始時のｐＨよりも、ｐＨが１．５低下するように酸化処理を行えば、十分な酸化処理を行うことができる。
【００３７】
前記酸化処理工程では、酸化処理の開始時に、混合液の有効塩素濃度（Ｃｌ２に換算した濃度）が、０．０５％以上１％以下であることが好ましく、０．０５％以上０．５％以下であることがより好ましい。酸化処理の開始時における混合液の有効塩素濃度が、上記の範囲であることにより、β−グルカンの酸化分解を防ぎつつ、より確実に微細藻類に酸化処理を施すことができるという利点がある。
【００３８】
前記酸化処理工程で用いる分散液（塩素系酸化剤と混合する前の液）としては、通常、微細藻類を取り除いた後のＴＯＣ濃度が０．５〜２．０ｇ／Ｌとなる分散液を採用する。
また、前記酸化処理工程で用いる分散液としては、塩素系酸化剤と混合する前のバイオマス濃度が、１０〜３０ｇ／Ｌである分散液を、通常、採用する。
なお、バイオマス濃度とは、乾燥物に換算した濃度である。
【００３９】
前記酸化処理工程では、酸化処理の時間（分散液と塩素系酸化剤とを混合してからの経過時間）が、１〜１２０分間であることが好ましく、５〜３０分間であることがより好ましい。酸化処理の時間が１分間以上であることにより、塩素系酸化剤による細胞壁の溶解をより十分に起こさせることができる。酸化処理の時間が１２０分間以下であることにより、塩素系酸化剤と微細藻類との間の反応をより確実に起こすことができ、塩素系酸化剤が別の反応に使用されることを抑制できる。
【００４０】
前記酸化処理工程では、酸化処理の時間が所定時間経過したときに、顕微鏡等を用いて微細藻類の細胞壁の溶解状況を確認することができる。そして、細胞壁の溶解状況に応じて、塩素系酸化剤をさらに混合液に添加することができる。この場合、塩素系酸化剤を添加するたびに、混合液のｐＨが１０〜１２となるように、塩素系酸化剤の添加量を調整することが好ましい。
【００４１】
前記酸化処理工程では、微細藻類と塩素系酸化剤とを混合した混合液が、さらに、界面活性剤などを含んでいていてもよい。
【００４２】
前記精製工程では、酸化処理工程後の酸化処理液に含まれる固体としてのβ−グルカンと液体とを、一般的な固液分離方法によって分離する。そして、分離されたβ−グルカンを得る。
【００４３】
前記固液分離方法としては、例えば、重力沈殿法、遠心分離法、濾過法などが採用される。
【００４４】
前記沈殿法としては、例えば、一般的な沈殿槽において酸化処理液を静置する方法などが採用される。
前記遠心分離法としては、例えば、酸化処理液に、２，０００ｇ以上の重力を２分間以上与える方法などが採用される。
前記濾過法としては、例えば、濾過膜を用いた膜濾過法、濾紙などを用いた吸引濾過法などが採用される。
【００４５】
前記精製工程では、固液分離方法によって得られたβ−グルカンを、さらに洗浄することができる。
具体的には、前記精製工程では、例えば、分離されたβ−グルカンと水とを混合し、混合したものに対して、上記と同様な固液分離方法を繰り返し行うことによって、β−グルカンを洗浄することができる。
【００４６】
本実施形態の分離方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の分離方法に限定されるものではない。
また、一般の分離方法において用いられる種々の態様を、本発明の効果を損ねない範囲において、採用することができる。
【実施例】
【００４７】
まず、微細藻類の培養を下記のようにして行った。
（微細藻類の培養）
微細藻類：ユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類（NIES-48株）
培養条件：
・培養液の組成（培地組成）
ＡＦ−６組成の微量栄養素
−国立環境研究所  微生物系統保存施設  ホームページに開示
２５ｇ／Ｌのグルコース
５ｇ／Ｌの酵母エキス
残部は水
・培養温度：２７〜２９℃で制御
・培養時間：６日間
培養後の培養液：
・ＴＯＣ濃度  約１ｇ／Ｌ
・バイオマス濃度  約１７ｇ／Ｌ
【００４８】
そして、培養後の微細藻類を用いて、下記のようにして、それぞれ酸化処理工程を行った。ただし、１０分間、３０分間、６０分間、１２０分間、３００分間、及び、１３２０分間の酸化処理の後、混合液の様子を光学顕微鏡によって観察した。
塩素系酸化剤：次亜塩素酸ナトリウム  
有効塩素濃度が６％の次亜塩素酸ナトリウム含有水溶液を用いた。
【００４９】
（実施例１）
上記培養後の培養液と、上記の次亜塩素酸ナトリウム含有水溶液とを混合して混合液を調製し、混合液の有効塩素濃度（Ｃｌ２に換算した濃度）を０．０６％として、混合液を撹拌しながら、酸化処理工程を行った。酸化処理開始時（撹拌混合を開始して３０秒後）の混合液のｐＨは、７．９０であった。
【００５０】
（実施例２）
有効塩素濃度が０．３％となるように、混合液に塩素系酸化剤を配合した点以外は、実施例１と同様にして酸化処理工程を行った。酸化処理開始時（撹拌混合を開始して３０秒後）の混合液のｐＨは、１１．７４であった。
【００５１】
（実施例３）
上記培養後の培養液を、遠心分離（３５００ｇ、４℃、５分間）によって、固液分離し、上澄み液を取り除き、上澄み液と同量の純水を加えた分散液を調製した。その後、実施例１と同様にして、有効塩素濃度０．０６％の混合液にて、酸化処理工程を行った。酸化処理開始時（撹拌混合を開始して３０秒後）の混合液のｐＨは、１１．１５であった。
【００５２】
（実施例４）
実施例３と同様にして培養液の上澄み液を取り除き、純水で分散させた微細藻類を用いた。さらに、有効塩素濃度を０．３％とした点以外は、実施例１と同様にして酸化処理工程を行った。酸化処理開始時（撹拌混合を開始して３０秒後）の混合液のｐＨは、１１．９２であった。
【００５３】
実施例２及び実施例４における酸化処理１０分後の混合液の様子を図１に示す。
実施例１及び実施例３における酸化処理６０分後の混合液の様子を図２に示す。
実施例１及び実施例３における酸化処理１２０分後の混合液の様子を図３に示す。
実施例１及び実施例３における酸化処理１３２０分後（２２時間）後の混合液の様子を図４に示す。
また、各実施例における、酸化処理工程中の混合液のｐＨ変化を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2015214623.tif 000002
【００５５】
図１〜図４において観察される粒子状のものは、微細藻類の細胞中に含まれていたパラミロン顆粒である。
図１〜図４から把握されるように、酸化処理工程を行うことにより、微細藻類の細胞中に含まれていた、βグルカンとしての粒子状のパラミロンを、簡便に得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の微細藻類からβ−グルカンを分離する分離方法は、例えば、微細藻類がユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類である場合に、β−グルカンとしてのパラミロンを得るために好適に使用できる。詳しくは、本発明の分離方法は、培養によって細胞内にパラミロンを蓄えたユーグレナ（Euglena）属に属する微細藻類から、パラミロンを分離し、得られたパラミロンを、健康食品、医薬品、飼料、化成品、又は燃料等の用途で利用するために好適に使用され得る。
【図１】
2015214623.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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