(57)【要約】【課題】  微生物検査カセットを用いて蛍光フローサイトメトリー法により微生物等の検査を行う微生物等の検査方法及び検査装置において、一つの微生物検査カセット内で一般微生物と特定微生物を検出することが可能な微生物等の検査方法及び検査装置を提供する。【解決手段】  蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置において、微生物検査カセット内に一般微生物と特定微生物をそれぞれ蛍光色素により染色する別々の染色槽を設け、染色した一般微生物と特定微生物のそれぞれに励起光を別々に照射して発した蛍光を検出することにより一般微生物と特定微生物を検出する。【選択図】  図１
2015019586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を蛍光色素により染色した検体を保持する検体容器と前記検体容器からの検体を流して励起光が照射される微生物検出用流路とを備えた微生物検査カセットを用いて蛍光フローサイトメトリー法により微生物等の検出を行う微生物等の検査方法において、
前記微生物検査カセットは、一般微生物検出用の蛍光色素により染色した一般微生物を含む検体を保持する一般微生物用検体容器と、特定微生物検出用の蛍光色素により染色した特定微生物を含む検体を保持する特定微生物用検体容器とを備え、
前記一般微生物用検体容器と前記特定微生物用検体容器からのそれぞれの検体に対して前記微生物検出用流路において励起光を別々に照射して発した蛍光を検出することにより前記一般微生物と前記特定微生物を検出することを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物等の検査方法において、
前記一般微生物用検体容器と前記特定微生物用検体容器は、それぞれ蛍光色素を収容した染色槽であり、
前記特定微生物検出用の蛍光色素として前記特定微生物と結合する蛍光標識抗体と膜透過性の核酸染色色素および膜不透過性の核酸染色色素を用いて前記特定微生物用検体容器において前記特定微生物を染色する工程と、
前記一般微生物検出用の蛍光色素として2種類の膜透過性の核酸染色色素および1種類の膜不透過性の核酸染色色素を用いて前記一般微生物用検体容器において前記一般微生物を染色する工程とを有することを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項３】
請求項２に記載の微生物等の検査方法において、
前記特定微生物検出用の蛍光色素における前記膜透過性の核酸染色色素および膜不透過性の核酸染色色素は、前記一般微生物検出用の蛍光色素における前記膜透過性の核酸染色色素の一方の膜透過性の核酸染色色素および前記膜不透過性の核酸染色色素とそれぞれ同じであり、
前記特定微生物検出用の蛍光色素における前記蛍光標識抗体の蛍光波長と前記一般微生物の蛍光色素における前記膜透過性の核酸染色色素の他方の膜透過性の核酸染色色素の蛍光波長が実質的に同一であることを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項４】
請求項３に記載の微生物等の検査方法において、
前記微生物検出用流路は前記微生物検査カセットに一つ設けられており、
前記特定微生物用検体容器からの検体を前記微生物検出用流路に流して前記特定微生物を検出する工程を、前記一般微生物用検体容器からの検体を前記微生物検出用流路に流して前記一般微生物を検出する工程の前に行うことを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項５】
請求項１に記載の微生物等の検査方法において、
前記微生物検出用流路は前記微生物検査カセットに一つ設けられており、
前記特定微生物用検体容器からの検体を前記微生物検出用流路に流して前記特定微生物を検出する工程を、前記一般微生物用検体容器からの検体を前記微生物検出用流路に流して前記一般微生物を検出する工程の前に行うことを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項６】
特定微生物検出用の蛍光標識抗体と膜透過性の核酸染色色素および膜不透過性の核酸染色色素が保持される特定微生物検出用検体容器、一般微生物検出用の2種類の膜透過性の核酸染色色素および1種類の膜不透過性の核酸染色色素が保持される一般微生物検出用検体容器、微生物検出用流路、前記特定微生物検出用検体容器と前記微生物検出用流路、および前記一般微生物検出用検体容器と前記微生物検出用流路をそれぞれ接続する流路を備えた微生物検査カセットと、
前記微生物検査カセットが装着され、前記微生物検査カセットを移動させるステージと、
前記微生物検査カセットと接続され、前記特定微生物検出用検体容器から染色した検体を前記微生物検出用流路に搬送する圧力および、前記一般微生物検出用検体容器から染色した検体を前記微生物検出用流路に搬送する圧力を供給する圧力供給装置と、
前記微生物検出用流路に励起光を照射する光源、前記微生物検出用流路を流れる検出液からの蛍光を検出して電気信号に変換する光検出器を有する検出装置と、を有することを特徴とする微生物等の検査装置。
【請求項７】
蛍光色素と混合した検体液に励起光を照射して蛍光を検出することにより前記検体液に含まれる微生物等を電気信号として検出する微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットであって、
特定微生物検出用の蛍光標識抗体と膜透過性の核酸染色色素および膜不透過性の核酸染色色素が保持される特定微生物検出用検体容器と、
一般微生物検出用の2種類の膜透過性の核酸染色色素および1種類の膜不透過性の核酸染色色素が保持される一般微生物検出用検体容器と、
前記励起光が照射される微生物検出用流路と、
前記特定微生物検出用検体容器と前記微生物検出用流路、および前記一般微生物検出用検体容器と前記微生物検出用流路をそれぞれ接続する流路とを備えたことを特徴とする微生物検査カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定微生物等の検査方法及び検査装置にかかり、特に、蛍光サイトメトリー法を用いた微生物等の検査方法及び検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生微生物数計測を行う微生物数測定装置には、蛍光フローサイトメトリー法がある。蛍光フローサイトメトリー法は、蛍光色素によって染色した検体を含む流体が、小さな径の流路を通過するとき、検体を一個ずつ直接計測する粒子計測方法である。
【０００３】
蛍光フローサイトメトリー法としては、例えば、特許文献1に記載されたものがある。特許文献1では、蛍光スペクトルが異なる二種類の生菌用蛍光色素により微生物を染色し、微生物から発せられる発光スペクトルが異なる二つの蛍光を検出することにより微生物を計測している。
【０００４】
また、特定微生物（Ｏ−１５７）を磁気ビーズによって濃縮した後、蛍光フローサイトメトリー法により計測する特定微生物の検査方法が特許文献２に記載されている。特許文献２では、磁気ビーズで捕獲した特定微生物に対して蛍光標識抗体を反応させ、蛍光標識した特定微生物を蛍光フローサイトメトリー法により計測する手法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−９２１０４号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
食品の衛生検査（菌数計測）においては迅速化が求められる。特許文献１に記載のように、予め染色色素を収容した微生物検査チップ（微生物検査カセット）を用いて蛍光フローサイトメトリー法による菌数計測を行うことにより、簡便にかつ迅速に菌数計測を行うことができる。ところで、菌数計測では、種類を問わない生微生物（以下、一般微生物とする）の計測に加えて、Ｏ−１５７などの特定微生物の計測も行われる。一般微生物と特定微生物を一度に計測できれば、すなわち、一つの微生物検査カセット内で計測できれば、食品の衛生検査の迅速化が図られる。しかし、特許文献１や２を含め、従来、蛍光フローサイトメトリー法においては、一つの微生物検査カセット内で、一般微生物と特定微生物を併せて検出することについては考慮されていない。
【０００７】
本発明の目的は、微生物検査カセットを用いて蛍光フローサイトメトリー法により微生物等の検査を行う微生物等の検査方法及び検査装置において、一つの微生物検査カセット内で一般微生物と特定微生物を検出することが可能な微生物等の検査方法及び検査装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置において、微生物検査カセット内に一般微生物と特定微生物をそれぞれ蛍光色素により染色する別々の染色槽（検体容器）を設け、染色した一般微生物と特定微生物のそれぞれに励起光を別々に照射して発した蛍光を検出することにより一般微生物と特定微生物を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、蛍光フローサイトメトリー法による微生物検査において、一つの微生物検査カセット内で一般微生物と特定微生物を検出することができ、したがって、迅速に一般微生物と特定微生物を検出することが可能となる。
【００１０】
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施例である微生物等の検査方法を示すフロー図である。
【図２】生微生物と色素群を判別するアルゴリズムを示す図である。
【図３】本発明の一実施例である微生物等の検査装置の概略構成を示す図である。
【図４Ａ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットにおける微生物検出用流路を含む断面例を示す図である。
【図４Ｂ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットにおける微生物検出用流路を含む分解構造例を示す図である。
【図５】本発明の微生物等の検査装置を用いた分析工程の一例を説明する図である。
【図６】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの概略構成の一例を示す図である。
【図７Ａ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの流体ハンドリングの一部を示す図である。
【図７Ｂ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの流体ハンドリングの一部を示す図である。
【図７Ｃ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの流体ハンドリングの一部を示す図である。
【図７Ｄ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの流体ハンドリングの一部を示す図である。
【図７Ｅ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの流体ハンドリングの一部を示す図である。
【図７Ｆ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの流体ハンドリングの一部を示す図である。
【図８】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの概略構成の別の実施例を示す図である。
【図９】蛍光波長のオーバーラップを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施の形態同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能である。
【００１３】
なお、本発明は、微生物の検査の他に細胞の検査にも同様に適用可能であり、従って、本明細書及び特許請求の範囲において、「微生物等」とは「微生物及び／又は細胞」を意味する。そして、説明を簡単にするために、「微生物等」を単に「微生物」と表記する場合がある。
【００１４】
先ず、本発明に至る経緯について説明する。
【００１５】
一般微生物（種類を問わない生微生物）と特定微生物（Ｏ−１５７など）を併せて検出するためには、各測定対象を染色する蛍光色素が必要であるため、自ずと蛍光色素の種類が増える。従来の微生物検査カセットでは、一般微生物と特定微生物を分けることなく染色槽で染色することになるため、蛍光色素の種類が増えると、蛍光色素由来のノイズが増えること、また蛍光のオーバーラップが生じやすくなることなどにより、測定精度の低下を招く。よって、蛍光波長の種類を最小限とするのが望ましいが、必要最小限の蛍光波長の組合せにすると、一般微生物と特定微生物との判別が困難となる。
【００１６】
そこで、本発明では、微生物検査カセット内に一般微生物と特定微生物をそれぞれ蛍光色素により染色する別々の染色槽（検体容器）を設け、染色した一般微生物と特定微生物のそれぞれに励起光を別々に照射して発した蛍光を検出することにより一般微生物と特定微生物を検出するようにしたものである。このように微生物検査カセット内において染色および励起光照射を別々に行うようにすることにより、必要最小限の蛍光波長の組合せとしても、一般微生物と特定微生物との判別が容易に行える。
【００１７】
以下、図面を参照して詳細に説明する。
【００１８】
（Ａ）一般微生物と特定微生物を併せて検出する方法  
図１に本発明の一実施例である一般微生物と特定微生物の検査方法の手順を示す。まず、食品を滅菌水に懸濁して作製した検体を2つにわけ、検体中の一般微生物と特定微生物を別々の染色槽においてそれぞれ蛍光染色する。具体的には、一般微生物の染色には、膜透過性の核酸染色色素と、膜不透過性の核酸染色色素を使用する。膜透過性の核酸染色色素は、生菌と死菌いずれも染色する。一方、膜不透過性の核酸染色色素は、細胞膜が損傷している死菌のみを染色する。このように、膜透過性と膜不透過性の核酸染色色素を使用することで、生菌と死菌の判別をすることができる。
【００１９】
検体中の特定微生物の染色には、蛍光色素で標識した抗体(以下、蛍光標識抗体)を使用する。この蛍光標識抗体は、ターゲットとする特定微生物の抗原と特異的に結合するものであれば、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。これにより、蛍光標識抗体は特定微生物にのみ結合する。
【００２０】
次に、特定微生物用の染色を行った検体に励起光を照射して、蛍光染色された特定微生物の蛍光検出を行う。そして最後に、一般微生物用の染色を行った検体に励起光を照射して、蛍光染色された一般微生物の蛍光検出を行う。すなわち、染色した一般微生物と特定微生物のそれぞれに励起光を別々に照射して発した蛍光を検出することにより一般微生物と特定微生物を検出する。
【００２１】
詳細は後述するが、特定微生物検出用の検体と一般微生物検出用の検体を同一の流路に順番に送液するのが望ましい。検体中に含まれる数は一般的に特定微生物の方が少ない。特定微生物の検体を先に流路へ流すことで、流路に一般微生物による汚れが生じていない状態での特定微生物数の測定が可能となり、特定微生物を精度よく測定することができる。
【００２２】
図1の手順を用いて、最小限の蛍光波長の組合せにより、微生物の生死判別および微生物と蛍光色素群とを判別するアルゴリズムを図2に示す。
【００２３】
使用する蛍光色素は、蛍光標識抗体（A）、2種類の膜透過性の核酸染色色素（B）、（D）そして膜不透過性の核酸染色色素（C）である。ここで4種類の蛍光色素に対応する蛍光波長を4種類とした場合、可視光領域での4波長の裾野が図9に示すように重なり合う（オーバーラップ）するため、検出した蛍光の判別が困難となる。そこでこの蛍光のオーバーラップを抑制するために、使用する蛍光波長は3種類としている。そして、蛍光標識抗体（A）と膜透過性の核酸染色色素（B）との蛍光波長を同一としている。ここで同一とは実質的に同一であることを意味する。検出装置側の構成にもよるが、例えば、ピーク強度が±10nm程度の相違は許容される。
【００２４】
特定微生物の染色には、蛍光標識抗体（A）、膜不透過性の核酸染色色素（C）そして膜透過性の核酸染色色素（D）の3種類を使用する。特定生微生物には、蛍光標識抗体（A）が特異的に結合し、さらに膜透過性の核酸染色色素（D）が細胞膜内部の核酸を染色する。特定死微生物には、細胞膜の損傷箇所から膜不透過性の核酸染色色素（C）が入り込み、計３種類の染色色素により染まる。このように、特定微生物の生死判別が可能となる。
【００２５】
一般微生物の染色には、2種類の膜透過性の核酸染色色素（B）、（D）そして膜不透過性の核酸染色色素（C）の3種類を使用する。一般生微生物には、膜透過性の核酸染色色素（B）および（D）が細胞膜内部の核酸を染色する。一般死微生物には、細胞膜の損傷箇所から膜不透過性の核酸染色色素（C）が入り込み、計３種類の染色色素により染まる。このように、一般微生物の生死判別が可能となる。
【００２６】
蛍光色素（A）〜（D）はそれぞれ単独で自家蛍光を有するが、一般微生物や特定微生物は複数の蛍光を同時に発するので、微生物と蛍光色素との判別が可能となる。
【００２７】
このように、染色メカニズムの異なる蛍光色素、すなわち蛍光標識抗体と膜透過性の核酸染色色素を組み合わせることで、微生物と蛍光色素群との判別を可能にしている。さらに、膜不透過性の核酸染色色素を組み合わせることにより微生物の生死判別を可能にしている。
【００２８】
ただし、蛍光標識抗体（A）と膜透過性の核酸染色色素（B）との蛍光波長が同一であるため、流路に特定微生物検出用の検体と一般微生物検出用の検体とを同時に流した場合、一般微生物と特定微生物を判別することが困難となる。そこで、図1に示したように、特定微生物検出用の検体と一般微生物検出用の検体を流路に順番に送液することで、蛍光波長を3種類に抑えつつ、特定微生物と一般微生物を判別することができるようにしている。
【００２９】
本実施例によれば、蛍光フローサイトメトリー法による生微生物の検査法において、蛍光波長を3種類に抑えることで蛍光波長のオーバーラップを抑制し、一般生微生物と特定生微生物を併せて精度よく検出することができる。
【００３０】
（Ｂ）微生物検査装置の全体構成例  
以下に、微生物検査カセットを用いた蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置に本発明を適用した実施例を詳細に説明する。本実施例では、特定微生物検出用の検体と一般微生物検出用の検体を別の容器（染色槽）で染色し、かつ同一の流路に特定微生物検出用の検体と一般微生物検出用の検体を順番に送液することを特徴とする。
【００３１】
図３に、本発明の一実施例に係る微生物検査装置１の構成図を示す。微生物検査装置１は、基本的には、微生物検査カセット１０と、圧力供給装置１４と、Ｘ−Ｙ可動ステージ（ホルダー）１２５と、検出装置１１と、システム装置１８と、出力装置１９で構成されている。
【００３２】
微生物検査カセット１０は、検体や試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備える。圧力供給装置１４は、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査カセット１０と連結したチップ連結管１４４１〜１４４５を介して、微生物検査カセット１０内の検体の搬送を制御する。Ｘ−Ｙ可動ステージ（ホルダー）１２５は、微生物検査カセット１０を保持し、微生物検査カセット１０の位置を調整する。検出装置１１は、微生物検査カセット１０内の微生物に励起光を照射し、微生物からの散乱光及び蛍光を電気信号に変換する。これらの詳細については後述する。
【００３３】
微生物検査装置１に連結したシステム装置１８は、圧力供給装置１４に対する制御信号の出力と、検出装置１１から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置１８に接続された出力装置１９に表示される。
【００３４】
圧力供給装置１４は、レギュレータ１４１１付のエアポンプ１４１およびレギュレータ１４１２付のエアポンプ１４２を有する。エアポンプ１４１とエアポンプ１４２は異なる圧力を設定することができる。エアポンプ１４１およびエアポンプ１４２と微生物検査カセット１０の各通気口１５９１〜１５９５（図６）は、チップ連結管１４４１〜１４４５によって接続されている。チップ連結管１４４１〜１４４５には、バルブ１４２１〜１４２５がそれぞれ設けられている。バルブ１４２１〜１４２５を開閉することにより、微生物検査カセット１０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査カセット１０の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査カセット１０内における検体や試薬の搬送を実現する。この圧力制御による微生物検査カセット１０内における検体や試薬の搬送は、特開２００８−１５７８２９号公報に詳述されている。
【００３５】
微生物検査カセット１０は、基本的には、特定微生物検出用検体容器１５２と、一般微生物検出用検体容器１５３と、微生物検出部１７と、検出液廃棄容器１５６と、送液用流路１５７２〜１５７５（図６）と、通気用流路１５８１〜１５８５（図６）とで構成されており、１回の検査で使い切りの使い捨てカセットである。特定微生物検出用検体容器１５２と一般微生物検出用検体容器１５３は、特定微生物と一般微生物をそれぞれ蛍光色素により染色する別々の染色槽を構成する。特定微生物検出用検体容器１５２は、特定微生物検出用色素１５２２を保持し、検体中の特定微生物と特定微生物検出用色素を混合して反応させる。一般微生物検出用検体容器１５３は、一般微生物検出用色素１５３２を保持し、検体中の一般微生物と一般微生物検出用色素を混合して反応させる。微生物検出部１７は、励起光源１１１１、１１１２からの励起光１１３が照射され、微生物を観測するための微生物検出用流路１７３を内部に備えている。検出液廃棄容器１５６には、微生物検出用流路１７３を通過した検出液が廃棄される。
【００３６】
送液用流路１５７２〜１５７４は、特定微生物検出用検体容器１５２と微生物検出用流路１７３、および一般微生物検出用検体容器１５３と微生物検出用流路１７３を連結し、検体が流動する。通気用流路１５８１〜１５８５は、検体を気圧により流動させるため圧力供給装置１４と各容器を接続する。
【００３７】
検出装置１１は、励起光源１１１１、１１１２と、散乱光検出部と、蛍光検出部１２０１〜１２０３とで構成される。このうち、散乱光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの散乱光１２４を検出するための散乱光検出器１２３と、励起光源１１２からの励起光１１３が散乱光検出器１２３に直接入射することを防ぐための遮光板１２２とから構成される。一方、蛍光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの蛍光１２１を集光し、平行光にする対物レンズ１１４と、励起光１１３を微生物検出部１７の方向に反射する一方で蛍光１２１は透過するダイクロイックミラー１１２と、平行光を集光させるための集光レンズ１１８１、１１８２と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール１１９と、蛍光１２１の一部波長を反射し、残りの波長を透過するダイクロックミラー１１５１、１１５２と、蛍光１２１の一部波長を通過するバンドパスフィルタ１１７１〜１１７３と、バンドパスフィルタ１１７１〜１１７３を通過した光を検出する光検出器１２０１〜１２０３とで構成される。なお、照射部及び検出部は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には微生物検出用流路１７３を焦点の位置に調整できるように構成されている。
【００３８】
検出装置１１は、励起光源１１１２から出力された励起光１１３を微生物検出用流路１７３に照射し、微生物検出用流路１７３から生じる散乱光の光量と微生物検出部１７から生じる蛍光の光量をそれぞれ検出することにより、Ｘ−Ｙステージ１２５の可動位置と各光量との関係をプロファイルとして取得する。また、検出装置１１は、取得されたプロファイルに基づいてＸ−Ｙ可動ステージ１２５を可動制御し、微生物検査カセット１０（具体的には、微生物検出用流路１７３）を検出に適した位置に合わせる。即ち、散乱光検出部で検出される散乱光の光量が最大となる微生物検出用流路の位置を励起光の光軸と一致させ、蛍光検出部で検出される蛍光量が最大となる微生物検出用流路の位置に励起光の焦点を一致させる。この位置合わせについては特開２０１０−２５６２７８号公報に詳述されている。位置合わせについては、他の方法、例えば、特開２００９−２８１７５３号公報に記載の方法を用いても良い。この場合、微生物検査カセットに位置合わせ用試薬等の保持容器や溶液用流路、通気用流路等を設ける。
【００３９】
なお、本実施例では励起光源は２つであるが、蛍光色素の種類に応じて励起光源の数量を変更する場合がある。また、本実施例では蛍光検出部は３つであるが、蛍光色素の種類に応じて蛍光検出部の数量を変更する場合がある。
【００４０】
（Ｃ）微生物検査カセットの微生物検出部の構造例  
図４Ａ及び図４Ｂを用い、微生物検査カセット１０のうち微生物検出部１７の構造を説明する。図４Ａは、微生物検査カセット１０の本体１５と微生物検出部１７の接合部の断面図を示す。図４Ｂは、微生物検出部１７の分解斜視図を示す。
【００４１】
なお、本体１５と微生物検出部１７はそれぞれ別工程で作製され、それぞれを接合する。まず、微生物検出部１７の製造方法を説明する。微生物検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材１７２には溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には貫通孔１７４１、１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。この貼り合わせにより微生物検出部１７が形成される。流路部材１７２の溝１７３１とカバー部材１７１によって微生物検出用流路１７３が構成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１、１７５１によって、微生物検出用流路入口１７４と微生物検出用流路出口１７５が構成される。
【００４２】
一方、本体１５に形成された微生物検出部上流流路１５７４は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。同様に、微生物検出部下流流路１５７５は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。微生物検出部上流流路１５７４の開口は、微生物検出用流路入口１７４に接続され、微生物検出部下流流路１５７５の開口は、微生物検出用流路出口１７５に接続されている。
【００４３】
本体１５には検出用窓枠部１６１が形成されている。検出用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検出用窓枠部１６１は、微生物検出部上流流路１５７４の開口と微生物検出部下流流路１５７５の開口の間に形成されている。製造された微生物検出部１７は、前述したように、本体１５に装着される。図４Ａに示すように、本体１５の検出用窓枠部１６１の上に微生物検出用流路１７３が配置されるように、微生物検出部１７を装着する。
【００４４】
本実施例の場合、微生物検出用流路１７３の背後に、本体１５の貫通孔又は貫通溝である検出用窓枠部１６１が設けられる。従って、励起光１１３は、微生物検出部１７のみを照射し、本体１５を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体１５からの反射光や自家蛍光は発生しない。微生物検出用流路１７３を通過した励起光１１３が、本体１５に照射されないためには、検出用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１１３の放射方向に沿って増加することが好ましい。
【００４５】
カバー部材１７１の厚さは、例えば０．０１μｍ〜１ｍｍとする。流路部材１７２の厚さは、例えば０．０１μｍ〜１ｍｍとする。微生物検出用流路１７３の断面形状は、例えば正方形、長方形、台形に形成する。微生物検出用流路１７３の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。微生物検出用流路１７３の断面の一辺は、例えば１μｍ〜１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましい。微生物検出用流路１７３に照射する励起光１１３の光軸は、微生物検出用流路１７３の方向ベクトルに対して垂直になる。
【００４６】
微生物検出部１７を構成する材料について説明する。微生物検査カセット１０はディスポーザブルである。すなわち、使用後、微生物検出部１７は本体１５と共に廃棄する。そのため、微生物検出部１７に用いる材料は、安価でなければならない。微生物検出部１７に用いる材料は、蛍光計測に好適なように、光学特性に優れている必要がある。すなわち、自家蛍光が低く、光透過性、面精度、屈折率などに優れていることが望ましい。微生物からの蛍光の検出を阻害しないためには、微生物検出部１７自身が発生する自家蛍光量が、微生物からの蛍光量に比べて十分小さいことが好ましい。
【００４７】
微生物検出部１７の表面に、曲面、凹凸等が存在すると、表面における光の屈折、又は、乱反射により微生物計測用流路１７３に照射される励起光１１３の光量が変動する。そのため、検出される蛍光量も変動し、計測精度が低下する。そのため、微生物検出部１７の表面は、所望の平面度を有する必要がある。微生物検出部１７は、凹凸が０．１ｍｍ以下の平面度を有することが好ましい。
【００４８】
このような条件を考慮すると、微生物検出部１７に用いる材料には、ガラス、石英、ポリメタクリル酸メチルエステル（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト等が考えられる。微生物検出部１７は、これらの物質から選択された１種類以上の物質から形成される。
【００４９】
カバー部材１７１は単なる平板であるが、流路部材１７２は平板に溝及び貫通孔を形成したものである。従って、流路部材１７２は、微細加工が容易で、且つ、加工費が安価な材料によって形成される。ガラス、及び、石英は、光学特性が優れているが、微細加工が容易でない。すなわち、微細加工を行うと、加工費が高くなる。
【００５０】
そこで、この形態例の場合、カバー部材１７１をガラス又は石英によって構成し、流路部材１７２をポリメタクリル酸メチルエステル、ポリジメチルシロキサン、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトによって構成する。なお好ましくは、流路部材１７２をポリジメチルシロキサンによって構成する。この場合、カバー部材１７１と流路部材１７２の接合には、ポリジメチルシロキサンの自己接着性を利用する。
【００５１】
微生物検出部１７の自家蛍光量は、材料ばかりでなく、微生物検出部の厚さ寸法にも依存する。自家蛍光量を少なくするには、微生物検出部の厚さ寸法を小さくすれば良い。微生物検出部１７の厚さが小さいほど、微生物検出部１７から発生する自家蛍光量は少なくなる。しかしながら、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さ寸法を小さくすると、製造が困難になり、平面度が悪化する。必要な平面度を保ち、微生物の蛍光の検出を阻害しないように自家蛍光量を抑制するには、これらの部品の厚さ寸法は、所定の範囲に制限するする必要がある。
【００５２】
ガラス、石英、ポリジメチルシロキサンの自家蛍光量はほぼ同等である。そこで、カバー部材１７１をガラス又は石英によって製造する場合、その厚さは、例えば０．０５ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。流路部材１７２を、ポリジメチルシロキサンによって製造する場合、その厚さは例えば０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。
【００５３】
また、カバー部材１７１及び流路部材１７２を、シクロオレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルエステル、ポリエチレンテレフタラート、又は、ポリカーボネイトによって製造しても良い。この場合、ガラス、又は、石英によってカバー部材１７１を製造し、ポリジメチルシロキサンによって流路部材１７２を製造する場合より、単位体積当たりの自家蛍光量が約３倍以上増加する。そのため、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さは例えば０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下が好ましい。
【００５４】
（Ｄ）計測方法（検査方法）例  
以下、上述の微生物検査装置１を用いて、食品由来の検体中の生微生物数を計測する場合の実施例を説明する。図５に、微生物検査カセット１０を用いた特定生微生物数計測の工程をフローチャートで示す。また、図６に、微生物検査カセット１０の概略斜視図を示す。さらに、図７Ａ〜図７Ｆに、微生物検査カセット１０の流体ハンドリングのプロファイルを示す。
【００５５】
微生物検査カセット１０は、上述したように、特定微生物検出用検体容器１５２と、一般微生物検出用検体容器１５３と、微生物検出部１７と、検出液廃棄容器１５６と、送液用流路１５７２〜１５７５と、通気用流路１５８１〜１５８５とを備える。また、圧力供給装置１４と各通気用流路１５８１〜１５８５とを接続する通気口１５９１〜１５９５が設けられている。
【００５６】
送液用流路１５７２〜１５７５、通気口１５９１〜１５９５及び通気用流路１５８１〜１５８５は連結する容器の名称から、特定微生物検出用検体容器−微生物検出部間流路１５７２、一般微生物検出用検体容器−微生物検出部間流路１５７３、微生物検出部上流流路１５７４、微生物検出部下流流路１５７５、特定微生物検出用検体容器混合用通気口１５９１、特定微生物検出用検体容器通気口１５９２、一般微生物検出用検体容器通気口１５９３、一般微生物検出用検体容器混合用通気口１５９４、検出液廃棄容器通気口１５９５、特定微生物検出用検体容器混合用通気流路１５８１、特定微生物検出用検体容器通気流路１５８２、一般微生物検出用検体容器通気流路１５８３、一般微生物検出用検体容器混合用通気流路１５８４、検出液廃棄容器通気流路１５８５とする。
【００５７】
図５，図６及び図７Ａ〜図７Ｆを用いて、測定のフローの一例を述べる。なお、図７Ａ〜図７Ｆにおいて、通気口１５９１〜１５９５の図示における白抜きは開放を示し、黒塗りは閉止を示す。また、図７Ａ〜図７Ｆにおいて、矢印における白抜きと網掛けは網掛けの矢印の方の圧力が高いことを示す。
【００５８】
まず、検査する食品に対し質量比９倍の滅菌水を加え、ストマッキング処理を行って検体を作成する（Ｓ９００）。
【００５９】
次に、ストマッキング処理した検体を2つにわけ、微生物検査カセット１０の特定微生物検出用検体容器１５２に特定微生物検出用検体１５２１を、一般微生物検出用検体容器１５３に一般微生物検出用検体１５３１をそれぞれ注入する（Ｓ９０１、図７Ａ）。なお、微生物検査カセット１０の構造がやや複雑になるが、検体を注入する検体注入容器を特定微生物検出用検体容器と一般微生物検出用検体容器の上流に設け、検体注入容器から検体を特定微生物検出用検体容器と一般微生物検出用検体容器にそれぞれ送液することも可能である。
【００６０】
微生物検査カセット１０を用いた生微生物数測定は、図５に示すように、微生物検査カセット１０を微生物検査装置(分析装置)１にセットした状態で開始される（Ｓ９０２）。測定工程は、微生物検査カセット１０の位置合わせを行う位置あわせ工程（Ｓ９０５）と、検体中の特定微生物に蛍光色素を添加して染色する染色工程（Ｓ９０３）と、検体中の一般微生物に蛍光色素を添加して染色する染色工程（Ｓ９０４）と特定生微生物数を測定する計測工程（Ｓ９０６）と、一般生微生物数を測定する計測工程（Ｓ９０７）より構成される。
【００６１】
位置あわせ工程（Ｓ９０５）と染色工程（Ｓ９０３およびＳ９０４）は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程（Ｓ９０６およびＳ９０７）を行う。
【００６２】
染色工程について説明する。染色工程は、検体中の特定微生物に蛍光色素を添加して染色する染色工程（Ｓ９０３）と、検体中の一般微生物に蛍光色素を添加して染色する染色工程（Ｓ９０４）を別個に行う。これらの染色工程の順序は任意である。但し、バブリング操作による混合が終了した段階で、他方の染色工程を開始する。
【００６３】
まず、特定微生物の染色工程（Ｓ９０３、図７Ｂ）について述べる。特定微生物検出用検体容器混合用通気口１５９１に連通するバルブ１４２１と、特定微生物検出用検体容器通気口１５９２に連通するバルブ１４２２を開き、特定微生物検出用検体容器混合用通気口１５９１を介して特定微生物検出用検体容器１５２に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。特定微生物検出用検体容器１５２には、特定微生物検出用色素１５２２が予め保持されており、検体中の特定微生物が特定微生物検出用色素１５２２とバブリングにより混合され、染色される（Ｓ９０３）。染色時間は、例えば５〜３０分である。なお、染色中は、微生物検査カセット１０の温度（２５〜４０℃）と一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。
【００６４】
特定微生物検出用色素１５２２として、特定微生物の抗原のみに結合する蛍光標識抗体と、膜不透過性の死微生物色素と、膜透過性の全微生物色素の３種類を混合したものを用いる。
【００６５】
蛍光標識抗体は、ターゲットとする特定微生物の抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体乃至ポリクローナル抗体に対して、蛍光色素を標識したものであり、特に限定されるものではない。ここでは、青色蛍光標識抗体、例えば、Ｄｙｌｉｇｈｔ（ダイライト）４０５や、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（アレクサフロー）４０５を使用する。
【００６６】
死微生物色素には、例えば、死微生物用シアニン系蛍光色素（濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）、ＰＩ（プロピディウムイオダイド）（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＥＢ（エチジウムイオダイド）（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）を使用する。全微生物色素には、例えば、全微生物用シアニン系蛍光色素（濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）、ＬＤＳ７５１（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＤＡＰＩ（４'、６−ヂアミジン−２'−フェニルインドール）（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＨＯＥＣＨＳＴ３４５８０（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）などを使用する。ここでは、死微生物色素として死微生物用シアニン系橙蛍光色素を使用し、全微生物色素としてＬＤＳ７５１を使用する。色素溶媒にはＤＭＳＯ（ジメチルスルオキシド）、エタノール類、水などを使用する。なお、濃度の単位のＭはmol/Lの意味である。検体中の特定生微生物は、蛍光標識抗体と全微生物色素の２色で染色される。一方、検体中の特定死微生物は、蛍光標識抗体と死微生物色素と全微生物色素の３色で染色される。
【００６７】
次に、一般微生物の染色工程（Ｓ９０４、図７Ｃ）について述べる。なお、一般微生物の染色工程（Ｓ９０４）は、特定微生物の染色工程（Ｓ９０３）におけるバブリング操作終了後は並行して行うことができる。まず、一般微生物検出用検体容器混合用通気口１５９４に連通するバルブ１４２４と、一般微生物検出用検体容器通気口１５９３に連通するバルブ１４２３を開き、一般微生物検出用検体容器混合用通気口１５９４を介して一般微生物検出用検体容器１５３に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。一般微生物検出用検体容器１５３には、一般微生物検出用色素１５３２が予め保持されており、検体中の一般微生物が一般微生物検出用色素１５３２とバブリングにより混合され、染色される（Ｓ９０４）。染色時間は、例えば５〜３０分である。
【００６８】
一般微生物検出用色素１５３２として、膜不透過性の死微生物色素と、膜透過性の全微生物色素２種類の、計３種類を混合したものを用いる。ここでは、死微生物色素として死微生物用シアニン系橙蛍光色素を使用し、全微生物色素としてＬＤＳ７５１およびシアニン系青色蛍光色素を使用する。前述のように、一般微生物検出用のシアニン系青色蛍光色素と特定微生物検出用の青色蛍光標識抗体の蛍光波長を同一（青色波長）にすることで、蛍光色素由来のノイズの低減、また蛍光のオーバーラップを抑制している。
【００６９】
検体中の一般生微生物は、全微生物色素の２色で染色される。一方、検体中の一般死微生物は、死微生物色素と全微生物色素の２色、計３色で染色される。
【００７０】
上記の前処理工程と並行して、微生物検査カセット１０の位置あわせが実行される（Ｓ９０５）。
【００７１】
以上の動作が終了すると、計測工程となる。まず、特定微生物検出用検体容器通気口１５９２に連通するバルブ１４２２と、一般微生物検出用検体容器混合用通気口１５９４に連通するバルブ１４２４と、検出液廃棄容器通気口１５９５に連通するバルブ１４２５を開く。次に、特定微生物検出用検体容器通気口１５９２を介して特定微生物検出用検体容器１５２に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。これにより、検体と特定微生物検出用色素１５２２との混合液が微生物検出用流路１７３に移動され、検体中の特定生微生物が蛍光フローサイトメトリー法により計測される（Ｓ９０６、図７Ｄ）。微生物検出用流路１７３を通過した検体と特定微生物検出用色素１５２２との混合液は検出液廃棄容器１５６に廃棄される。なお、検体と特定微生物検出用色素１５２２との混合液が一般微生物検出用検体容器１５３に流入するのを防ぐため、一般微生物検出用検体容器混合用通気口１５９４に対して圧力供給装置１４からの圧力を加える。圧力供給装置１４は２つのレギュレータ（１４１１、１４１２）と２つのエアポンプ（１４１、１４２）を備えており、送液用と流入防止用の異なる圧力を設定することができる。送液用の圧力は流入防止用の圧力よりも大きい。
【００７２】
図３に示す検査装置の場合、紙面垂直方向より、励起光１１３が照射される。このため、微生物を染色した色素からの蛍光と、微生物による散乱光が生じる。検出装置１１は、特定生微生物については蛍光標識抗体と全微生物色素の２色の蛍光を検出し、特定死微生物については、蛍光標識抗体と死微生物色素と全微生物色素の３色の蛍光を検出する。このため、特定生微生物と特定死微生物とを判別して計数することが可能になる。また、散乱光の光量は微生物の大きさにより変わるため、微生物の大きさの判別も可能になる。
【００７３】
特定微生物の計測終了後、特定微生物検出用検体容器通気口１５９２に連通するバルブ１４２２と、一般微生物検出用検体容器混合用通気口１５９４に連通するバルブ１４２４を閉じ、特定微生物検出用検体容器混合用通気口１５９１に連通するバルブ１４２１と、一般微生物検出用検体容器通気口１５９３に連通するバルブ１４２３を開く。次に、一般微生物検出用検体容器通気口１５９３を介して一般微生物検出用検体容器１５３に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。これにより、検体と一般微生物検出用色素１５３２との混合液が微生物検出用流路１７３に移動され、検体中の特定生微生物が蛍光フローサイトメトリー法により計測される（Ｓ９０７、図７Ｅ）。この時、検体と一般微生物検出用色素１５３２との混合液が特定一般微生物検出用検体容器１５２に流入するのを防ぐため、特定微生物検出用検体容器混合用通気口１５９１に対して圧力供給装置１４からの流入防止用の圧力を加える。上記のフローにより測定が終了し、使い終わった微生物検査カセットは廃棄する（Ｓ９０８、図７Ｆ）。
【００７４】
従来技術（特許文献1）では、一般微生物と特定微生物を検出するために、一般微生物と特定微生物をそれぞれ検出する試薬を内蔵した２種類のカセットを用意する必要がある。各対象の測定ごとにカセットを入れ替える手間が煩雑であり、さらに測定時間に加えてカセットの光学的な焦点併せをする時間がプラスされるために、時間を要することとなる。しかしながら本実施例によれば、上述の測定フローにより、一つの使い捨てのカセットのみで一般微生物と特定微生物を併せて検出することができるため、簡便かつ迅速な計測を提供することができる。
【００７５】
なお、上述の実施例では微生物検出用流路１７３が一つであり、同一の検出流路に一般微生物と特定微生物を順番に流すことで、一般微生物と特定微生物を必要最小限の蛍光波長の組合せにより判別しているが、図８に示すように、微生物検出用流路を２つ設けてもよい。
【００７６】
すなわち、特定微生物検出用検体容器１５２の下流に微生物検出用流路１７３を、一般微生物検出用検体容器１５３の下流に微生物検出用流路１７４を設けることで、特定微生物と一般微生物を並列で流すことができる。カセットの構造および装置側の光学系が複雑（光軸移動などが必要）になるが、この場合においても、染色した一般微生物と特定微生物のそれぞれに励起光を別々に照射して発した蛍光を検出することにより一般微生物と特定微生物を検出することができる。さらに、測定を並列処理することで時間短縮を図ることができる。
【００７７】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加，削除，置換をすることが可能である。
【００７８】
例えば、微生物検査カセットについては、微生物検査カセット１０に検体を注入する前に、予め検体と蛍光色素をカセット外部で混合しておけば、検体と蛍光色素をバブリング混合するための通気用流路や通気口等を削除できる。
【００７９】
また、測定する特定微生物が複数種類の場合、微生物検査カセットに複数種類の特定微生物用の染色槽を別々に設けることにより、一つの微生物検査カセットで複数種類の特定微生物と一般微生物を検出することができる。
【符号の説明】
【００８０】
１…微生物検査装置、１０…微生物検査カセット、１１…検出装置、１４…圧力供給装置、１７…微生物検出部、１８…システム装置、１９…出力装置、１１１１…短波長励起光源、１１１２…長波長励起光源、１１１３…励起光合成用ダイクロイックミラー、１１２…ダイクロイックミラー、１１３…励起光、１１４…対物レンズ、１１５１…短波長蛍光分離用ダイクロイックミラー、１１５２…中波長蛍光分離用ダイクロイックミラー、１１７１…短波長バンドパスフィルタ、１１７２…中波長バンドパスフィルタ、１１７３…長波長バンドパスフィルタ、１１８１、１１８２…集光レンズ、１１９…ピンホール、１２０…光検出器、１２０１…短波長用光検出器、１２０２…中波長用光検出器、１２０３…長波長用光検出器、１２１…蛍光、１２４…散乱光、１２５…Ｘ−Ｙ可動ステージ、１４１…エアポンプＡ、１４２…エアポンプＢ、１４１１…レギュレータＡ、１４１２…レギュレータＢ、１５２…特定微生物検出用検体容器、１５２１…特定微生物検出用検体、１５２２…特定微生物検出用色素、１５３…一般微生物検出用検体容器、１５３１…一般微生物検出用検体、１５３２…一般微生物検出用色素、１５６…検出液廃棄容器、１５７２〜１５７５…送液用流路、１５８１〜１５８５…通気用流路、１６１…検出用窓部、１７３…微生物検出用流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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