(57)【要約】【課題】Ｂ細胞表面抗原ＢＣＭＡに結合する抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識し、ナイーブＢ細胞、プラズマ細胞、および／または記憶Ｂ細胞に結合する抗体を提供する。本発明は、ナイーブＢ細胞、プラズマ細胞、および記憶Ｂ細胞を枯渇させるための方法と、リンパ腫および自己免疫疾患を含むＢ細胞関連疾患を治療するための方法と、をさらに提供する。本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、以下のＢ細胞サブセットのうちの１つ以上を標的とするように使用することができる：プラズマ細胞、記憶Ｂ細胞、およびナイーブＢ細胞。【選択図】図５
2015187164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出された配列表を含み、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。２０１０年３月１０日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、０８２０１０１０．ｔｘｔと名前が付けられ、７０，６５７バイトのサイズである。
【０００２】
本発明は、Ｂ細胞表面抗原ＢＣＭＡに結合する抗体に関する。本発明はまた、種々のＢ細胞サブタイプを検出するため、枯渇させるため、またさもなければ操作するための、これらの抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ細胞は、適応体液性免疫、および抗原を特異的に認識する抗体の産生において大きな役割を果たすリンパ球である。Ｂ細胞の３つのサブクラスは、ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、およびプラズマ細胞である。ゲノムライブラリから２つまたは３つのＤＮＡセグメントが選択され、抗体可変ドメインのコンビナトリアルアレイを作製するために組み換えられるＶＤＪ組換えのプロセスと、Ｂ細胞の異なる系列によってコードされる可変ドメインがさらに変化した超変異とにより、異なる標的に対する特異性を有する抗体を産生する最大１０９個の異なるＢ細胞系列が生じる。Ｂ細胞は、そのＢ細胞によって作られる抗体に結合する抗原に対して特異的であると言われている。Ｂ細胞は、一般に、それらの特異的抗原（Ａｇ）への曝露によって刺激される。ナイーブＢ細胞は、それらの特異的抗原にまだ曝露されていない。そのような曝露（例えば、感染の間）は、Ｂ細胞の増殖および姉妹クローンの発生をもたらす。姉妹クローンは、大量の抗体を産生するプラズマ細胞に発達することができる。プラズマ細胞は、寿命が短いか、または骨髄内に移動して、そこで長期間存続することができるかのいずれかである。Ａｇに曝露されたＢ細胞の姉妹クローンはまた、記憶Ｂ細胞に発達することもでき、特異的抗原に再曝露されるまで静止状態となる。記憶Ｂ細胞は、分化してプラズマ細胞およびさらなる記憶Ｂ細胞の両方を産生することによって、抗原への再曝露に迅速に応答する。記憶Ｂ細胞には、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）、およびダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）が含まれる。
【０００４】
いくつかの重大な疾患には、Ｂ細胞が関与している。Ｂ細胞の悪性転換は、例えば、多発性骨髄腫およびホジキンリンパ腫等のいくつかのリンパ腫を含む癌を引き起こす。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むいくつかの自己免疫疾患にもまた、Ｂ細胞が関与している。Ｂ細胞が関与する癌および自己免疫疾患の両方とも、Ｂ細胞が過成長し、かつ／または、身体の部分を不適切に攻撃することから、機能獲得の状態であると考えることができる。そのような疾病をコントロールすることが可能なストラテジーは、病的Ｂ細胞を標的とする抗体を使用することである。
【０００５】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＴＮＦＲＳＦ１７およびＣＤ２６９としても知られる）は、形質芽細胞（すなわち、プラズマ細胞の前駆体）およびプラズマ細胞の表面上に発現されることが分かっているタンパク質であり、生存を刺激すると考えられている。したがって、それは、Ｂ細胞関連疾患の潜在的な標的であることを意味する。ＢＣＭＡは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、ＴＮＦファミリーのリガンドであるＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬに結合する（Ｋａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｃｕｒｒ  Ｄｉｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ８：２０６−２４２において考察される）。ＢＣＭＡは、大抵のＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーに見られるＩ型膜タンパク質と関連するシグナルペプチドを含まないため、ＩＩＩ型膜タンパク質である。
【０００６】
ＢＣＭＡ  ＲＮＡは、脾臓、リンパ節、胸線、副腎、および肝臓で検出されており、多くのＢ細胞株の分析は、成熟するとＢＣＭＡ  ｍＲＮＡレベルが増加することを示した。ヒトＢＣＭＡタンパク質は、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、特にプラズマ細胞の、種々のサブタイプ上で検出されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ
１７：７７９−７８８、Ｄａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ
１７９：７２７６−７２８６、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｂｌｏｏｄ  １０５：４３９０−４３９８、Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２：２８６−２９７）。独立した研究機関が血液および／または扁桃腺のＢ細胞サブセットを調べたところ、ナイーブまたは記憶Ｂ細胞上ではＢＣＭＡ発現を検出することができないことが分かった（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｉｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：７７９−７８８、Ｄａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：７２７６−７２８６、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｂｌｏｏｄ  １０９：７２９−７３９）。胚中心Ｂ細胞の表面上でＢＣＭＡタンパク質を検出する試みは、矛盾する結果を示した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：７７９−７８８、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｂｌｏｏｄ  １０９：７２９−７３９）。
【０００７】
ＢＣＭＡの作用機序は、完全には理解されていない。ＢＣＭＡに対する機能遺伝子を欠損するように遺伝子操作されたマウスは、正常なリンパ器官および細胞集団、ならびにほぼ正常に機能する免疫系を有する（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｌａｍ（２００１），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：４０６７−４０７４、Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：２１１１−２１１４）。これらのマウスにおいてこれまで定義されている唯一の欠陥は、寿命の長い骨髄（ＢＭ）プラズマ細胞の生存率が低いことである（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９：９１−９８）。したがって、ＢＣＭＡは、少なくともマウス系において、ＢＭに存在するプラズマ細胞に、ＢＡＦＦもしくはＡＰＲＩＬのいずれかまたは両方が媒介する生存シグナルを提供している可能性がある。実際に、ＢＣＭＡを介するシグナル伝達は、Ｂ細胞の生存、増殖、および成熟に関与する（Ｌｉｔｉｎｓｋｉｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：８２２−８２９、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  （２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：６９３−６９５、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１７７８９−１７７９４、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：３２６８−３２７９）ＮＦ−κＢ経路を活性化する（Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：１３２２−１３３０）。悪性ヒト細胞に伴う結果は、通常、ＢＣＭＡと細胞生存との間の関係と一致している。原発性多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、ＭＭ細胞株（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３：６８９−６９４）、ならびにホジキンリンパ腫由来のホジキンおよびリード・シュテルンベルク（ＨＲＳ）細胞（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｂｌｏｏｄ  １０９：７２９−７３９、Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｂｌｏｏｄ  １０４：２２４７−２２５３）は、ＢＣＭＡを発現することが明らかになっている。ＢＡＦＦおよび／またはＡＰＲＩＬを加えることにより、これらの悪性細胞に生存シグナルを提供することがさらに分かっているが、ＢＣＭＡがこの効果に主に寄与しているかは不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
異なるＢ細胞サブセットが、異なるＢ細胞関連状態に関係していると考えられるため、１つ以上のＢ細胞サブセットを特異的に標的とする薬剤の必要性が存在する。いくつかのＢ細胞の表面上におけるＢＣＭＡの発現は、それらの細胞が特異的に標的とされ得るマーカーを提供する。１つ以上のＢ細胞サブセットのマーカーとしてＢＣＭＡを利用するためには、ＢＣＭＡに特異的に結合する薬剤と、どのＢ細胞サブセットがそれらのＢＣＭＡ特異的薬剤によって結合されるかの判定の必要性が存在する。本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、以下のＢ細胞サブセットのうちの１つ以上を標的とするように使用することができる：プラズマ細胞、記憶Ｂ細胞、およびナイーブＢ細胞。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、単離された抗体。
（項目２）
前記抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３にＣＤＲを含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される前記少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号５に由来し、前記抗体は、配列番号６のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号６のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号６のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインをさらに含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
重鎖可変ドメインは、配列番号５を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号６を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
項目５に記載の抗体と同じエピトープに結合する、単離された抗体。
（項目７）
配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、
ａ．  配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７から選択される配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または
ｂ．  前記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は前記可変ドメインと同一である、項目（ａ）に記載の可変ドメインの変異体、
を含む、抗体。
（項目８）
前記配列は、配列番号５であり、前記抗体は、
ｃ．  配列番号６のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号６のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号６のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または
ｄ．  前記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は前記可変ドメインと同一である、項目（ｃ）に記載の可変ドメインの変異体、
をさらに含む、項目７に記載の抗体。
（項目９）
配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、配列番号２、配列番号１２、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、抗体。
（項目１０）
前記抗体は、配列番号２、配列番号１２、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む、項目９に記載の抗体。
（項目１１）
前記抗体は、配列番号２、配列番号１２、配列番号６、または配列番号８からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３にＣＤＲを含む、項目１０に記載の抗体。
（項目１２）
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体である、項目１〜１１のいずれかに記載の抗体。
（項目１３）
項目１〜１１のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
（項目１４）
項目１〜１１のいずれかに記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目１５）
配列番号９に結合し、項目１〜１１のいずれかに記載の抗体の抗原結合部位、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片を含む、ポリペプチド。
（項目１６）
項目１５に記載の抗原結合部位、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片を産生する、ハイブリドーマ。
（項目１７）
項目１５に記載の抗原結合部位、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目１８）
プラズマ細胞を枯渇させる方法であって、項目１〜１１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
（項目１９）
Ｂ細胞関連疾患を治療する方法であって、項目１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
（項目２０）
前記Ｂ細胞関連疾患は、プラズマ細胞腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、風土病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、節外性粘膜内リンパ組織リンパ腫、結節性単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾臓リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、肺Ｂ細胞血管中心性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、悪性度不明のＢ細胞、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ球増殖性疾患、免疫調節性疾患、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞性アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性γグロブリン血症である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｂ細胞関連疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｂ細胞関連疾患は、プラズマ細胞悪性腫瘍である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記プラズマ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｂ細胞関連疾患は、自己免疫疾患である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｂ細胞関連疾患は、関節リウマチである、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記Ｂ細胞関連疾患は、特発性血小板減少性紫斑病、または重症筋無力症、または自己免疫性溶血性貧血である、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）を投与することをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
少なくとも１つの自己抗体のレベルを減少させる方法であって、項目１〜１１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
（項目３０）
配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７から選択される配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変ドメインを含む、抗体。
（項目３１）
前記配列は、配列番号５であり、前記抗体は、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変領域をさらに含む、項目３０に記載の抗体。
【０００９】
【表１−１】
2015187164.tif 000003
【００１０】
【表１−２】
2015187164.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ＢＣＭＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上の抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの結合を示す。ストレプトアビジン−ＰＥで可視化したビオチンコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの結合を、ＢＣＭＡ−ＣＨＯ安定細胞株（Ａ）および対照である非トランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）上でフローサイトメトリーによって測定した。影付き領域は、アイソタイプ対照ｍＡｂによる細胞の染色を表す。
【図１Ｂ】ＢＣＭＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上の抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの結合を示す。ストレプトアビジン−ＰＥで可視化したビオチンコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの結合を、ＢＣＭＡ−ＣＨＯ安定細胞株（Ａ）および対照である非トランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）上でフローサイトメトリーによって測定した。影付き領域は、アイソタイプ対照ｍＡｂによる細胞の染色を表す。
【図１Ｃ】ＢＣＭＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上の抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの結合を示す。ストレプトアビジン−ＰＥで可視化したビオチンコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの結合を、ＢＣＭＡ−ＣＨＯ安定細胞株（Ａ）および対照である非トランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｂ）上でフローサイトメトリーによって測定した。影付き領域は、アイソタイプ対照ｍＡｂによる細胞の染色を表す。
【図２Ａ】Ｂ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、ヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに対する反応性について評価した。可視化は、図１の通りであった。影付き領域は、アイソタイプ対照Ａｂによる染色を表す。Ｂ細胞サブセットは、プラズマ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＤ−）（Ａ）、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｂ）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）（Ｃ）、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｄ）、およびナイーブＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋）（Ｅ）であった。
【図２Ｂ】Ｂ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、ヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに対する反応性について評価した。可視化は、図１の通りであった。影付き領域は、アイソタイプ対照Ａｂによる染色を表す。Ｂ細胞サブセットは、プラズマ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＤ−）（Ａ）、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｂ）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）（Ｃ）、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｄ）、およびナイーブＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋）（Ｅ）であった。
【図２Ｃ】Ｂ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、ヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに対する反応性について評価した。可視化は、図１の通りであった。影付き領域は、アイソタイプ対照Ａｂによる染色を表す。Ｂ細胞サブセットは、プラズマ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＤ−）（Ａ）、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｂ）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）（Ｃ）、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｄ）、およびナイーブＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋）（Ｅ）であった。
【図２Ｄ】Ｂ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、ヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに対する反応性について評価した。可視化は、図１の通りであった。影付き領域は、アイソタイプ対照Ａｂによる染色を表す。Ｂ細胞サブセットは、プラズマ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＤ−）（Ａ）、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｂ）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）（Ｃ）、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｄ）、およびナイーブＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋）（Ｅ）であった。
【図２Ｅ】Ｂ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、ヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに対する反応性について評価した。可視化は、図１の通りであった。影付き領域は、アイソタイプ対照Ａｂによる染色を表す。Ｂ細胞サブセットは、プラズマ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＤ−）（Ａ）、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｂ）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）（Ｃ）、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｄ）、およびナイーブＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋）（Ｅ）であった。
【図２Ｆ】Ｂ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、ヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに対する反応性について評価した。可視化は、図１の通りであった。影付き領域は、アイソタイプ対照Ａｂによる染色を表す。Ｂ細胞サブセットは、プラズマ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＤ−）（Ａ）、スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｂ）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ＋）（Ｃ）、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＣＤ３８ｌｏｗＩｇＤ−）（Ｄ）、およびナイーブＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋）（Ｅ）であった。
【図３Ａ】健常な個体およびＳＬＥに罹患する個体から単離されたＢ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、健常ボランティアおよびＳＬＥ患者由来のヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｃ１２Ａ３．２およびＡ７Ｄ１２．２に対する反応性について評価した。Ｂ細胞サブセットは図２の通りであった。可視化は、図１の通りであった。
【図３Ｂ】健常な個体およびＳＬＥに罹患する個体から単離されたＢ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、健常ボランティアおよびＳＬＥ患者由来のヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｃ１２Ａ３．２およびＡ７Ｄ１２．２に対する反応性について評価した。Ｂ細胞サブセットは図２の通りであった。可視化は、図１の通りであった。
【図３Ｃ】健常な個体およびＳＬＥに罹患する個体から単離されたＢ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、健常ボランティアおよびＳＬＥ患者由来のヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｃ１２Ａ３．２およびＡ７Ｄ１２．２に対する反応性について評価した。Ｂ細胞サブセットは図２の通りであった。可視化は、図１の通りであった。
【図３Ｄ】健常な個体およびＳＬＥに罹患する個体から単離されたＢ細胞サブセットに対する抗ＢＣＭＡ結合を示す。フローサイトメトリーによって、健常ボランティアおよびＳＬＥ患者由来のヒト末梢血中のＢ細胞サブセットを、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｃ１２Ａ３．２およびＡ７Ｄ１２．２に対する反応性について評価した。Ｂ細胞サブセットは図２の通りであった。可視化は、図１の通りであった。
【図４】ＨＳＣ／ＮＳＧマウスから単離されたヒトＣＤ４５＋脾細胞区画内のヒトプラズマ細胞のフローサイトメトリー染色を示す。脾臓プラズマ細胞を、抗ＢＣＭＡ抗体Ａ７Ｄ１２．２（左パネル、太線）およびＣ１２Ａ３．２（右パネル、太線）、またはアイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ１  Ａｂで（両パネル内の細線）、それぞれ染色した。
【図５】抗ＢＣＭＡ抗体（ｃｈＣ１２Ａ３．２もしくはｃｈＣ１３Ｆ１２．１）またはヒトＩｇＧ１対照で処理したＨＳＣ／ＮＳＧマウスから単離されたヒトＣＤ４５＋脾細胞区画内のプラズマ細胞（ＰＣ）に対するフローサイトメトリー染色を示す。抗ＢＣＭＡ  ＡｂまたはＨＩｇＧ１対照を、週２回２週間マウスに腹腔内注入した。＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＝０．００６６。
【図６】抗ＢＣＭＡ抗体（ｃｈＣ１１Ｄ５．１もしくはｃｈＡ７Ｄ１２．２）またはヒトＩｇＧ１対照で処理したＨＳＣ／ＮＳＧマウスから単離されたヒトＣＤ４５＋脾細胞区画内のプラズマ細胞（ＰＣ）に対するフローサイトメトリー染色を示す。抗ＢＣＭＡ  ＡｂまたはＨＩｇＧ１対照を、週２回２週間マウスに腹腔内注入した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ＢＣＭＡおよびその特定のエピトープに結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、プラズマ細胞、記憶Ｂ細胞、およびナイーブＢ細胞等の、Ｂ細胞の１つ以上のサブセットに結合する。本発明はまた、Ｂ細胞、またはプラズマ細胞、記憶Ｂ細胞、およびナイーブＢ細胞を含むＢ細胞のサブセットを枯渇させる方法も提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号９に結合し、かつプラズマ細胞に結合する、単離された抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号９に結合し、かつ記憶Ｂ細胞に結合する、単離された抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号９に結合し、かつナイーブＢ細胞に結合する、単離された抗体を提供する。
【００１３】
Ｌｅｇａｃｙ  Ｂｉｏｇｅｎ（６）で作製されるクローンＣ４Ｅ２．２（ハムスターＩｇＧ）、クローンＶＩＣＫＹ−１（ラットＩｇＧ１）（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、また、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡより６Ｄ１０としても販売される）、およびクローン３３５００４（ラットＩｇＧ２ａ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む特定の抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂは、本発明の範囲外である。
Ａ．抗体
本発明は、配列番号９に特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、Ｂ細胞、または、プラズマ細胞、記憶Ｂ細胞（スイッチ、非スイッチ、およびダブルネガティブを含む）、ならびに／もしくはナイーブＢ細胞を含む、そのサブクラスの表面に結合する抗体も提供する。本明細書で使用される用語「抗体」は、同じ抗原に結合する全長免疫グロブリンおよび抗体断片の両方を含む。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片であり、配列番号９のタンパク質に特異的に結合する能力を保有する。
【００１４】
一部、本発明は、抗体Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、およびＣ１３Ｆ１２．１を提供する。これらの各々は、マウスモノクローナル抗体である。Ａ７Ｄ１２．２は、マウスの「種々の」サブグループの重鎖、配列番号１である重鎖可変ドメイン配列、サブグループＩκ軽鎖、および配列番号２である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１５】
Ｃ１１Ｄ５．３は、サブグループＩＩ（Ａ）の重鎖、配列番号３である重鎖可変ドメイン配列、マウスサブグループＩＩＩκ軽鎖、ならびに配列番号４、配列番号１１、および配列番号１２から選択される軽鎖可変ドメイン配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｃ１１Ｄ５．３の軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号１２である。
【００１６】
Ｃ１２Ａ３．２は、サブグループＩＩ（Ａ）の重鎖、配列番号５である重鎖可変ドメイン配列、マウスサブグループＩＩＩκ軽鎖、および配列番号６である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１７】
Ｃ１３Ｆ１２．１は、サブグループＩＩ（Ａ）の重鎖、配列番号７である重鎖可変ドメイン配列、マウスサブグループＩＩＩκ軽鎖、および配列番号８である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１８】
配列番号９のタンパク質に特異的な一本鎖抗体を産生するための技術は、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号に記載される技術から適応されてもよい。また、方法は、ＢＣＭＡタンパク質、またはその誘導体、断片、類似体、もしくは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ効果的な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリの構築に適応されてもよい（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）。非ヒト抗体をヒト化するための多数の技術が当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、第６，６３２，９２７号、または第５，６４８，２３７号を参照のこと（これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＣＭＡタンパク質に対するイディオタイプを含有する抗体断片は、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスフィルド架橋を減少させることによって作製されるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することよって作製されるＦａｂ断片、ならびに（ｉｖ）Ｆｖ断片を含むが、これらに限定されない多様な技術のうちのいずれかによって産生されてもよい。
【００１９】
また、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作ることができるヒトおよび非ヒト部分の両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体等の組換え抗ＢＣＭＡ抗体は、本発明の範囲内である。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第７，１１２，４２１号、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３、またはＬｉｕ  ｅｔ  ａｉ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３に記載されるような組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。
【００２０】
本発明の抗体のうちのいくつかは、マウスモノクローナル抗体Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、およびＣ１３Ｆ１２．１のキメラ形態である。いくつかの実施形態において、Ａ７Ｄ１２．２のキメラ形態は、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１４を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１１Ｄ５．３のキメラ形態は、配列番号１５を含む重鎖と、配列番号１６および配列番号１７から選択される配列、好ましくは配列番号１７を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１２Ａ３．２のキメラ形態は、配列番号１８を含む重鎖と、配列番号１９を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１３Ｆ１２．１のキメラ形態は、配列番号２０を含む重鎖と、配列番号２１を含む軽鎖とを含む。
【００２１】
本発明の抗体のうちのいくつかは、マウスモノクローナル抗体Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、およびＣ１３Ｆ１２．１のヒト化形態である。いくつかの実施形態において、Ｃ１１Ｄ５．３のヒト化形態は、配列番号２２〜２４から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号２５〜２９から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む重鎖可変ドメイン配列とを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１２Ａ３．２のヒト化形態は、配列番号３０〜３３から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号３４〜３８から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む重鎖可変ドメイン配列とを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１３Ｆ１２．１のヒト化形態は、配列番号３９〜４２から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号４３〜４７から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む重鎖可変ドメイン配列とを含む。
Ｂ．抗体可変ドメイン配列
本発明の抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の重鎖可変ドメイン配列を含んでもよい。重鎖可変ドメイン配列は、本質的に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７からなってもよい。
【００２２】
本発明の抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１２の軽鎖可変ドメイン配列を含んでもよい。軽鎖可変ドメイン配列は、本質的に、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１２からなってもよい。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である配列を含む可変ドメイン配列も提供する。本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、および配列番号１２から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である配列を含む可変ドメイン配列も提供する。本発明はまた、配列番号１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列と、配列番号２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列とを含む抗体も提供する。本発明は、配列番号３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列と、配列番号４、配列番号１１、または配列番号１２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列とを含む抗体を含む。本発明は、配列番号５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列と、配列番号６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列とを含む抗体を含む。本発明は、配列番号７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列と、配列番号８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列とを含む抗体を含む。
【００２４】
本発明は、特定の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体を提供する。表２は、配列番号１〜８、１１、および１２までのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸の座標を定義する。
【００２５】
【表２】
2015187164.tif 000005
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義を使用して名前を付けた（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ
（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２１４−２１８）。本明細書で使用する場合、「対応するＣＤＲ」は、可変ドメインのアミノ酸配列内の最も類似する位置に存在するＣＤＲを意味する。
【００２６】
本発明の抗体の重鎖可変ドメインは、ＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つが、配列番号１の対応するＣＤＲと同一であるように、配列番号３の対応するＣＤＲと同一であるように、配列番号５の対応するＣＤＲと同一であるように、または配列番号７の対応するＣＤＲと同一であるように、ＣＤＲを含んでもよい。本発明の抗体の軽鎖可変ドメインは、ＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つが、配列番号２の対応するＣＤＲと同一であるように、配列番号４の対応するＣＤＲと同一であるように、配列番号６の対応するＣＤＲと同一であるように、配列番号８の対応するＣＤＲと同一であるように、配列番号１１の対応するＣＤＲと同一であるように、または配列番号１２の対応するＣＤＲと同一であるように、ＣＤＲを含んでもよい。
【００２７】
重鎖可変ドメインは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７のうちの１つの対応するＣＤＲの各々と同一のＣＤＲを含んでもよいが、上記ＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換が行われている。特定の実施形態において、重鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に関連する合計１２個のアミノ酸置換を有してもよい。他の実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインＣＤＲは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に関連する最大１０個、最大８個、最大５個、または最大３個の置換を有してもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインＣＤＲは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の重鎖可変ドメインＣＤＲと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、配列番号７のＣＤＲ２は、配列番号４６のＣＤＲ２（すなわち、アミノ酸５０〜６６）によって置き換えられる。例えば、本発明の抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号７のＣＤＲ１およびＣＤＲ３と、配列番号４６のＣＤＲ２とを含んでもよい。本発明の抗体の重鎖可変ドメインはまた、配列番号７のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ならびに配列番号４６のＣＤＲ２と、合わせて少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域も含んでもよい。
【００２９】
軽鎖可変ドメインは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１２のうちの１つの対応するＣＤＲと同一のＣＤＲを含んでもよいが、上記ＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換がある。特定の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１２のうちの１つの対応するＣＤＲと同一のＣＤＲを含むが、上記ＣＤＲ領域において、最大１２個、最大１０個、最大８個、最大５個、または最大３個のアミノ酸置換がある。いくつかの実施形態において、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインＣＤＲは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１２の軽鎖可変ドメインＣＤＲと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ領域における置換は保存的置換である。
Ｃ．エピトープ：抗体結合特異性
本発明はまた、特定のエピトープに結合する抗体も提供する。一対の抗体が同じエピトープに結合するかどうかは、実施例４に記載されるような交差ブロック実験に基づいて判定される。交差ブロックプロファイルは、表３の７つの抗体について定義される。この開示の目的のために、実施例４に記載される手順に従って、それぞれ一方がＢＣＭＡに対する他方の結合を少なくとも９０％減少させた（すなわち、それらが相互に交差ブロックした）場合に、その２つの抗体は同じエピトープに結合すると見なされる。同様に、実施例４に記載されるように互いの結合を少なくとも９０％減少させない抗体は、異なるエピトープに結合すると見なされる。特定の可変ドメインを有する抗体の交差ブロックプロファイルを表３に列挙する。異なるエピトープに結合する一対の抗体（上で定義したように）は「ｄ」で記す。
【００３１】
【表３】
2015187164.tif 000006
本発明は、抗体Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、またはＣ１３Ｆ１２．１と同じエピトープに結合する抗体をさらに包含する。本発明はまた、Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、または１３Ｆ１２．１のプロファイルと一致する交差ブロックプロファイルを有する抗体も提供する。例えば、上記提供された定義に従うと、Ｃ１１Ｄ５．３と同じプロファイルを有する抗体は、Ｃ１２Ａ３．２およびＣ１３Ｆ１２．１と比較すると同じエピトープに結合するが、Ａ７Ｄ１２．２、３３５００４、Ｃ４Ｅ２、およびＶｉｃｋｙ−１と比較すると異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、配列番号９のタンパク質の結合から、Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、またはＣ１３Ｆ１２．１のうちの１つ以上を少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％相互に交差ブロックする。交差ブロックの程度は、実施例４に記載される手順に従って測定される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、ＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態において、抗体は、配列番号９のアミノ酸１〜５２、１〜５１、１〜４１、または８〜４１に結合する。
【００３３】
本発明はまた、１つ以上の特定の細胞の種類に結合する抗ＢＣＭＡ抗体も提供する。本発明の抗体または抗体断片は、以下のうちの１つ以上に結合することができる：プラズマ細胞、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、もしくはＢＣＭＡ（配列番号９）を発現する細胞、それと類似するタンパク質、その細胞外ドメイン、またはその細胞外ドメインと類似するポリペプチド。
Ｄ．方法
本発明は、様々な種類の細胞を枯渇させる方法を提供する。方法は、上述したような本発明の抗体を投与することを含む。本発明の方法によって枯渇され得る細胞の種類は、プラズマ細胞、ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞（スイッチ、非スイッチ、およびダブルネガティブを含む）、Ｂ細胞に由来するリンパ腫細胞、およびＢＣＭＡを発現する細胞、それと類似するタンパク質、その細胞外ドメイン、またはその細胞外ドメインと類似するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。細胞は、上述したカテゴリのうちの１つより多くに属してもよい。抗体媒介による細胞枯渇方法の例については、「Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ２０」、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｅ．Ｒｅｆｆ，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．４３５−４４５，Ｊａｎ．１５，１９９４を参照のこと。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、上記列挙した細胞型のうちの１つ以上の数を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、および少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、プラズマ細胞の数を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、スイッチ記憶Ｂ細胞の数を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、非スイッチ記憶Ｂ細胞の数を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、ダブルネガティブ記憶Ｂ細胞の数を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、ナイーブＢ細胞の数を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させる。
【００３５】
本発明はまた、本発明の抗体を投与することを含む、血清免疫グロブリンレベルを減少させる方法も提供させる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、血清ＩｇＭレベルを減少させる。特定の実施形態において、本発明の抗体を用いた処理は、血清ＩｇＭレベルを、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも６５％減少させる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、血清ＩｇＧレベルを減少させる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３のうちの一方または両方のレベルを減少させる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、ＩｇＧ２のレベルを、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％減少させる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、ＩｇＧ３のレベルを、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少させる。いくつかの実施形態において、そのような方法は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＭのレベルを減少させる。
【００３６】
本発明はまた、本発明の抗体を投与することを含む、少なくとも１つの自己抗体のレベルを減少させる方法も提供する。いくつかの実施形態において、そのような方法は、１つ以上の自己抗体のレベルを、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、および少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、Ｂ細胞媒介による状態、疾患を治療または予防または遅延する方法を提供する。本発明は、そのような治療または予防または遅延が所望される対象に、該対象における腫瘍形成状態または免疫調節状態を治療、予防、または遅延するために十分な量で本発明の抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。他の実施形態において、対象はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体の投与は、対象においてＢＣＭＡ媒介によるシグナル伝達をブロックし、細胞死、細胞増殖の阻害、減少、または停止のうちの１つ以上をもたらし得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、Ｂ細胞リンパ腫を「標的とする」ためにＢＣＭＡを使用する。本質的に、そのような標的化は、以下のように一般化することができる：Ｂ細胞のＢＣＭＡ表面抗原に特異的な本発明の抗体または抗体断片は、例えば、対象に注射され、（表面上は）正常Ｂ細胞および悪性Ｂ細胞の両方のＢＣＭＡ細胞表面抗原に特異的に結合し、この結合が腫瘍性Ｂ細胞の破壊および／または枯渇を引き起こす。さらに、癌細胞および／または腫瘍を破壊する可能性を有する化学薬品または放射性標識は、薬剤が、例えば腫瘍性Ｂ細胞等の標的となるＢ細胞に特異的に「送達される」ように、本発明の抗体または抗体断片にコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、化学薬品または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体または抗体断片を投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされてない抗体または抗体断片を投与することを含む。
【００３９】
Ｂ細胞関連疾患は、不適切なＢ細胞の活性およびＢ細胞リンパ腫に関与する自己免疫疾患を含むが、これに限定されない。Ｂ細胞リンパ腫は、多発性骨髄腫、プラズマ細胞腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、風土病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、節外性粘膜内リンパ組織リンパ腫、結節性単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾臓リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、肺Ｂ細胞血管中心性リンパ腫、および小リンパ球性リンパ腫を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体または抗体断片はまた、癌細胞がＢＣＭＡを発現する癌を治療するためにも使用することができる。Ｂ細胞関連疾患は、さらに、例えば、リンパ腫様肉芽腫症および移植後リンパ球増殖性疾患等の、悪性度不明のＢ細胞増殖を含む。
【００４０】
本発明の抗体または抗体断片を使用して診断、治療、予防、または遅延される状態は、さらに免疫調節性疾患でもあり得る。これらの疾患は、例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、および急速進行性糸球体腎炎等の、本来自己免疫性である疾患を含む。本発明の抗体または抗体断片はまた、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞性アミロイドーシス、および意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）等のプラズマ細胞疾患における用途も有する。
【００４１】
本発明の抗体または抗体断片を使用する組成物および治療方法は、望ましくないＢＣＭＡを発現する細胞増殖と関連するいずれの状態にも使用することができる。
【００４２】
本発明の抗体は、ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）としても知られる米国特許第５，７３６，１３７号の抗体Ｃ２Ｂ８と併せて投与することもできる。いくつかの実施形態において、そのような併用投与は、複数のＢ細胞サブタイプの増殖を枯渇させるかまたは阻害する。
【００４３】
本発明は、Ｂ細胞またはＢ細胞サブタイプの表面上のマーカーの存在、不在、または量の決定等の、Ｂ細胞の表現型をアッセイするための本発明の抗体の使用をさらに提供する。例えば、本発明の抗体は、ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、ＩｇＤ＋記憶Ｂ細胞、ＩｇＤ−記憶Ｂ細胞、もしくはダブルネガティブ記憶Ｂ細胞の表面上で、ＳＬＥまたは別のＢ細胞に関連する状態に関係するマーカーの存在を測定するために使用されてもよい。
Ｅ．薬学的組成物
本発明の抗体は、投与に好適な薬学的組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、通常、抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、医薬品の投与に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、希釈剤等を含むことが意図される。好適な担体は、当該技術分野における標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、フィンガー溶液、液ストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含む。不揮発性油等のリポソームおよび非水性ビヒクルもまた使用され得る。薬学的活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が抗体と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。追加の活性化合物もまた、組成物に取り込むことができる。
【００４４】
本発明の抗体を含む薬学的組成物は、企図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例は、非経口的投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、および直腸投与を含む。非経口の皮内または皮下用途に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポロエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸または酸性亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧を調節するための薬剤。ｐＨは、塩化水素または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【００４５】
注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（ここでは水溶性）または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して、好適な担体は、生理食塩液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液地亜ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール等）、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【００４６】
滅菌注射可能溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせとともに、適当な溶媒中で必要な量の本発明の抗体を組み込み、続いて、濾過滅菌することによって、調製され得る。一般的に、分散液は、基本的な分散媒と、上で列挙される成分から必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に抗体を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、予め滅菌濾過したその溶液から、抗体および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【００４７】
一実施形態において、抗体は、移植片およびマイクロカプセル化された送達系を含む徐放性処方物等の、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護する担体を用いて調製される。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーが使用されてもよい。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。さらに、本発明の抗体または抗体断片は、リポソーム懸濁物が、特定の抗体が結合するＢ細胞またはそのサブクラスを標的とするために使用されてもよい。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【００４８】
非経口組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で処方されてもよい。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療される対象に対する単位投薬量として好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の抗体を含有する。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果によって決定され、かつ直接依存する。
【００４９】
本発明の抗体を含む薬学的組成物は、投与のための説明書とともに、容器、包装、またはディスペンサーに含めることができる。
Ｆ．例示的実施形態のリスト
１．配列番号９に結合し、かつ記憶Ｂ細胞に結合する、単離された抗体。
２．抗体がプラズマ細胞にも結合する、実施形態１に記載の抗体。
３．抗体がナイーブＢ細胞にも結合する、実施形態１に記載の抗体。
４．抗体がナイーブＢ細胞およびプラズマ細胞にも結合する、実施形態１に記載の抗体。５．ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、およびプラズマ細胞を枯渇させる方法であって、配列番号９に結合し、かつナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、およびプラズマ細胞に結合する抗体を投与することを含む、方法。
６．記憶Ｂ細胞を枯渇させる方法であって、配列番号９に結合し、かつ記憶Ｂ細胞に結合する抗体を投与することを含む、方法。
７．配列番号９に結合し、かつナイーブＢ細胞に結合する、単離された抗体。
８．抗体がプラズマ細胞に結合する、実施形態７に記載の抗体。
９．ナイーブＢ細胞を枯渇させる方法であって、配列番号９に結合し、かつナイーブＢ細胞に結合する抗体を投与することを含む、方法。
１０．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、抗体。１１．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む、抗体。
１２．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、抗体。
１３．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号１に由来し、抗体は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４と同一のＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸５０〜５６と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号２のアミノ酸８９〜９７と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
１４．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号３に由来し、抗体は、配列番号１２のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号１２のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
１５．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号５に由来し、抗体は、配列番号６のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号６のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号６のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
１６．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７に由来し、抗体は、配列番号８のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号８のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号８のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
１７．実施形態１０に記載の抗体であって、重鎖可変ドメインは配列番号１を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号２を含む、抗体。
１８．実施形態１０に記載の抗体であって、重鎖可変ドメインは配列番号３を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号１２を含む、抗体。
１９．実施形態１０に記載の抗体であって、重鎖可変ドメインは配列番号５を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号６を含む、抗体。
２０．実施形態１０に記載の抗体であって、重鎖可変ドメインは配列番号７を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号８を含む、抗体。
２１．実施形態１７に記載の抗体と同じエピトープに結合する、単離された抗体。
２２．実施形態１８〜２０のいずれかに記載の抗体と同じエピトープに結合する、単離された抗体。
２３．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、
ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号７から選択される配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または、
ｂ．上記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は上記可変ドメインと同一である、項目（ａ）に記載の可変ドメインの変異体、
を含む、抗体。
２４．実施形態５３に記載の抗体であって、配列は配列番号１であり、抗体は、
ｃ．配列番号２のアミノ酸２４〜３４と同一のＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸５０〜５６と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号２のアミノ酸８９〜９７と同一のＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または、
ｄ．上記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は上記可変ドメインと同一である、項目（ｃ）に記載の可変ドメインの変異体、
をさらに含む、抗体。
２５．実施形態５３に記載の抗体であって、配列は配列番号３であり、抗体は、
ｃ．配列番号１２のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または、
ｄ．上記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は上記可変ドメインと同一である、項目（ｃ）に記載の可変ドメインの変異体、
をさらに含む、抗体。
２６．実施形態５３に記載の抗体であって、配列は配列番号５であり、抗体は、
ｃ．配列番号６のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号６のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号６のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または、
ｄ．上記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は上記可変ドメインと同一である、項目（ｃ）に記載の可変ドメインの変異体、
をさらに含む、抗体。
２７．実施形態５３に記載の抗体であって、配列は配列番号であり、抗体は、
ｃ．配列番号８のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号８のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号８のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む、可変ドメイン、または、
ｄ．上記ＣＤＲ領域にある合計最大１０個のアミノ酸置換を除いて、その他は上記可変ドメインと同一である、項目（ｃ）に記載の可変ドメインの変異体、
をさらに含む、抗体。
２８．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、抗体。
２９．実施形態２８に記載の抗体であって、配列番号２、配列番号１２、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含む、抗体。
３０．実施形態２８に記載の抗体であって、配列番号２、配列番号１２、配列番号６、または配列番号８からなる群から選択されるタンパク質配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３にＣＤＲを含む、抗体。
３１．実施形態１〜４、７、８、１０〜２１、または２３〜３０のいずれかに記載の抗体であって、キメラ抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体である、抗体。
３２．実施形態１〜４、７、８、１０〜２１、または２３〜３０のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
３３． 実施形態１〜４、７、８、１０〜２１、または２３〜３０のいずれかに記載
の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
３４．配列番号９に結合し、実施形態１〜４、７、８、１０〜２１、または２３〜３０のいずれかに記載の抗体の抗原結合部位、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片を含む、ポリペプチド。
３５．実施形態３３に記載の抗原結合部位、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片を産生する、ハイブリドーマ。
３６．実施形態３３に記載の抗原結合部位、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
３７．プラズマ細胞を枯渇させる方法であって、実施形態１〜４、８、または１０〜３１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
３８．Ｂ細胞関連疾患を治療する方法であって、実施形態１〜４、８、または１０〜３１のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
３９．実施形態３８に記載の方法であって、Ｂ細胞関連疾患は、プラズマ細胞腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫、風土病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、節外性粘膜内リンパ組織リンパ腫、結節性単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾臓リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、肺Ｂ細胞血管中心性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、悪性度不明のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ球増殖性疾患等、免疫調節性疾患、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞性アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性γグロブリン血症である、方法
４０．実施形態３８に記載の方法であって、Ｂ細胞関連疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍である、方法。
４１．実施形態３８に記載の方法であって、Ｂ細胞関連疾患は、プラズマ細胞悪性腫瘍である、方法。
４２． 実施形態４１に記載の方法であって、プラズマ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄
腫である、方法。
４３． 実施形態３８に記載の方法であって、Ｂ細胞関連疾患は、自己免疫疾患であ
る、方法。
４４．実施形態４３に記載の方法であって、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスである、方法。
４５．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号１に由来し、抗体は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４と同一のＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸５０〜５６と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号２のアミノ酸８９〜９７と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも２つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
４６．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号１に由来し、抗体は、配列番号２のアミノ酸２４〜３４と同一のＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸５０〜５６と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号２のアミノ酸８９〜９７と同一のＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
４７．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号３に由来し、抗体は、配列番号１２のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号１２のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも２つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
４８．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号３に由来し、抗体は、配列番号１２のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号１２のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
４９．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号５に由来し、抗体は、配列番号６のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号６のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号６のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも２つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
５０．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号５に由来し、抗体は、配列番号６のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号６のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号６のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
５１．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７に由来し、抗体は、配列番号８のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号８のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、または配列番号８のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域のうちの少なくとも２つを含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
５２．実施形態１０に記載の抗体であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号７に由来し、抗体は、配列番号８のアミノ酸２４〜３８と同一のＣＤＲ１領域、配列番号８のアミノ酸５４〜６０と同一のＣＤＲ２領域、および配列番号８のアミノ酸９３〜１０１と同一のＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
５３．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
５４．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
５５．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
５６．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
５７．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
５８．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
５９．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
６０．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲとを含む、抗体。
６１．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６２．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６３．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６４．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６５．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６６．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６７．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６８．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲとを含む、抗体。
６９．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７０．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７１．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７２．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３から選択される少なくとも２つのＣＤＲと、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７３．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７４．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７５．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７６．実施形態１０に記載の抗体であって、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲと、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３であるＣＤＲとを含む、抗体。
７７．実施形態１７に記載の抗体を、少なくとも８０％相互に交差ブロックする、単離された抗体。
７８．実施形態１８〜２０に記載の抗体のうちの少なくとも１つを、少なくとも８０％相互に交差ブロックする、単離された抗体。
７９．実施形態１８に記載の抗体と同じエピトープに結合する、単離された抗体。
８０．実施形態１９に記載の抗体と同じエピトープに結合する、単離された抗体。
８１．実施形態２０に記載の抗体と同じエピトープに結合する、単離された抗体。
８２． 少なくとも１つの自己抗体のレベルを減少させる方法であって、実施形態１
〜４、８、および１０〜３１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
８３．血清ＩｇＭレベルを減少させる方法であって、実施形態１〜４、８、および１０〜３１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
８４．血清ＩｇＧレベルを減少させる方法であって、実施形態１〜４、８、および１０〜３１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
８５．血清ＩｇＧ２レベルを減少させる方法であって、実施形態１〜４、８、および１０〜３１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
８６．血清ＩｇＧ３レベルを減少させる方法であって、実施形態１〜４、８、および１０〜３１のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、方法。
８７．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７から選択される配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変ドメインを含む、抗体。
８８．実施形態８７に記載の抗体であって、配列は配列番号１であり、抗体は、配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
８９．実施形態８７に記載の抗体であって、配列は配列番号３であり、抗体は、配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
９０．実施形態８７に記載の抗体であって、配列は配列番号５であり、抗体は、配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
９１．実施形態８７に記載の抗体であって、配列は配列番号７であり、抗体は、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域と、合わせて少なくとも９５％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む可変ドメインをさらに含む、抗体。
９２．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、配列番号２２〜２４から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号２５〜２９から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変ドメイン配列とを含む、抗体。
９３．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、配列番号３０〜３３から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号３４〜３８から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、抗体。
９４．配列番号９のポリペプチドに結合する単離された抗体であって、配列番号３９〜４２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号４３〜４７から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、抗体。
９５．Ｂ細胞関連疾患は、関節リウマチである、実施形態３９に記載の方法。
９６．Ｂ細胞関連疾患は、特発性血小板減少性紫斑病、または重症筋無力症、または自己免疫性溶血性貧血である、実施形態３９に記載の方法。
９７．ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）を投与することをさらに含む、実施形態３７に記載の方法。
９８．ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）を投与することをさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
【実施例】
【００５０】
実施例１．抗ヒトＢＣＭＡモノクローナル抗体の作製およびビオチンコンジュゲーション
ＣＦＡ中のＢＣＭＡ−Ｆｃ／ＫＬＨコンジュゲートタンパク質でメスＲＢＦマウスを腹腔内免疫し、その後、ＩＦＡを用いて定期的な間隔でさらに免疫化することにより抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製したが、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９９８），Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹの方法の後、ＦＬ６５３骨髄腫細胞株に脾細胞を融合する前に、最後の追加免疫にはＩＦＡの代わりにＲＩＢＩを使用した。簡潔に述べると、最後の追加免疫の３日後にマウスから単離した脾細胞を２回洗浄し、２回洗浄した対数期ＦＬ６５３骨髄腫細胞と７：１の比率で混合した。細胞混合物を４通りに分割してペレット化し、ＰＥＧ中３７℃で１分間インキュベートし、その間、細胞を穏やかに再懸濁させ、その後、１０ｍｌの冷却ＤＭＥＭを注意深く加えた。細胞を混合し、ペレット化して、ＡＡＴハイブリドーマ成長選択培地に再懸濁した。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって、細胞上清をＢＣＭＡ特異的反応性についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてＢＣＭＡに陽性かつＦｃ特異性に陰性を示し、ＢＣＭＡトランスフェクト細胞に陽性を示し、偽トランスフェクト細胞に陰性を示したクローンを拡張してサブクローン化した。４つのＢＣＭＡ特異的クローンをさらなる評価のために選択した：Ｃ１１Ｄ５．３（ＩｇＧ１）、Ｃ１２Ａ３．２（ＩｇＧ１）、Ｃ１３Ｆ１２．１（ＩｇＧ１）、およびＡ７Ｄ１２．２（ＩｇＧ２ｂ）。製造業者の推奨（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に従ってキットを使用し、後に記載されるＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ実験で使用するために、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂにビオチンをコンジュゲートした。
【００５１】
実施例２．マウス抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂ可変領域のクローン化
製造業者の推奨プロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し、マウスハイブリドーマ細胞から全細胞ＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡのプライミングのためのランダム六量体を使用して、全細胞ＲＮＡから重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。インタクトなシグナル配列を有するマウス免疫グロブリン可変ドメインのＰＣＲ増幅のために、複数マウス免疫グロブリン遺伝子ファミリーのシグナル配列にハイブリダイズした縮重フォワードプライマーと、マウス定常領域の５’末端に特異的な単一のリバースプライマーとのカクテルを使用した。製造業者の推奨プロトコルに従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅミックスを使用して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに、それらのＴＯＰＯクローニングキットを使用して、製造業者の推奨プロトコルに従ってサブクローン化した。複数の独立したサブクローン由来のインサートを配列決定して、コンセンサス配列を確立した。推定された成熟免疫グロブリンのＮ末端は、ハイブリドーマからのエドマン分解によって特定されたものと一致していた。特異的なサブグループへの割当ては、Ｋａｂａｔデータベースからのコンセンサス免疫グロブリンの可変ドメイン配列を使用したＢＬＡＳＴ解析に基づくものであった（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ  （２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２１４−２１８）。Ｋａｂａｔの定義を使用してＣＤＲの名前を付けた（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ  （２０００），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ  ２８：２１４−２１８）。
【００５２】
実施例３．安定したＢＣＭＡ発現ＣＨＯ細胞株の開発と抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂの評価
ＢＣＭＡに対する特異的な結合を検証するために、安定したＢＣＭＡ発現ＣＨＯ細胞株上で抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂをスクリーニングした。安定したＢＣＭＡ発現ＣＨＯ細胞株を、以前に記載された方法を使用して作製した（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７７：１４１−１５５）。簡潔に述べると、Ｆｕｇｅｎｅ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を欠損するＤＧ４４チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞約１５０万個を、ヒトＢＣＭＡ遺伝子を含有する４μｇのＰＶ９０プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション後、６ウェル培養皿で細胞を培養した。トランスフェクションから２４時間後、成長培地をα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％透析血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に変更し、細胞をプールし、３つのＴ−７５組織培養フラスコに分割して、コンフルエンスになるまで成長させた。トランスフェクションから７日後、再び細胞をプールし、５つのＴ２２５組織培養フラスコに分割して、コンフルエンスになるまで成長させた。
【００５３】
トランスフェクションから１４日後、細胞をＣ４Ｅ２．２  Ａｂ（６）でインキュベートし、ＢＣＭＡ＋細胞のために選別した。これらの細胞を培養物中で成長させ、９６ウェルプレート中に選別された陽性細胞とともに２回目の選別を行った。クローンを拡張し、クローンＣ４Ｅ２．２を使用してＢＣＭＡの発現について評価した。
【００５４】
トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞を対照として用いて、最も高い発現を示すクローンを使用して新しい抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂを評価した。簡潔に述べると、５％正常マウス血清を含むＦＡＣＳ緩衝液でＢＣＭＡ−ＣＨＯ細胞を前処理し、非特異的結合部位をブロックした。７つの抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ―Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２、Ｃ１３Ｆ１２．１およびＡ７Ｄ１２．２、ならびに市販の抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｃ４Ｅ２．２（Ｌｅｇａｃｙ  Ｂｉｏｇｅｎ）、ＶＩＣＫＹ−１（Ａｌｅｘｉｓ）、および３３５００４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）―そしてアイソタイプ対照抗体を、氷上で３０分間、１μｇ／ｍｌで細胞とともに別個にインキュベートし、洗浄した。ビオチンをコンジュゲートしたアイソタイプ対照Ａｂｓは以下の通りであった：マウスＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１３−４７１４−８５）、マウスＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１３−４７３２−８５）、ハムスターＩｇＧ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５３９７０）、ラットＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１３−４３２１−８２）。陽性染色を可視化するために、氷上で３０分間ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を細胞に加え、その後、細胞を洗浄し、０．８％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にかけ、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。結果を図１に示す。
【００５５】
７つ全ての抗体が、ＢＣＭＡを発現する細胞の特異的認識を示した。Ｃ１１Ｄ５．３は、対照ｍＡｂと比較して、陰性対照細胞に対する若干高めの基底結合（ｂａｓａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を示し、他の６つの抗体の陰性対照細胞に対する基底結合は、対照Ａｂの結合と類似していた。
【００５６】
実施例４．交差ブロックＥＬＩＳＡによる抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂエピトープ重複の分析
各抗体間のエピトープ重複の有無を判定するために、実施例３でテストした７つの抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂを交差ブロックアッセイにおいて評価した。Ｃｏｒｎｉｎｇ社製９６ウェルのフラットボトムプレートを炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＦｃとともに４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、２μｇ／ｍｌのヒトＢＣＭＡ−Ｆｃ（配列番号１０）とともに３７℃で１時間インキュベートし、再び洗浄し、非特異的結合部位をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）で３０分間３７℃でブロックした。次いで、３通りのウェルを、各個別の実験で使用した単一のビオチンコンジュゲート抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂの濃度の１０倍の濃度で、各コンジュゲート抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂクローンとともにブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ブロッキング緩衝液中の単一のビオチンコンジュゲート抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂクローンを、最大シグナルの８０％を得るための所定濃度（ＥＣ８０）で全てのウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートし、その後ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液で３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、基質ＴＭＢとともにインキュベートして陽性反応を可視化した。２Ｎ硫酸を加えて酵素反応を停止し、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５７】
ビオチンコンジュゲート抗体の各種について、非コンジュゲート抗体とコンジュゲート抗体が（コンジュゲートされたビオチンの有無を除いて）同じである対照の読み取り値をバックグラウンドレベルとした、すなわち、その抗体に対する各実験の読み取り値からこの対照からの吸光度を差し引いた。いくつかの場合において、このバックグラウンドの減算によって、僅かに負の値がもたらされる。標識化抗体は、それ自体によってよりも、異なる非コンジュゲート抗体によって、若干より効果的にブロックされた可能性はあるが、これらの僅かな負の値もまた、実験のばらつきによるものであるかもしれない。次いで、陽性対照値の百分率として結果を表した、すなわち、競合する非コンジュゲート抗体の非存在下において、ビオチンコンジュゲート抗体のためにバックグラウンドを調整した吸光度の読み取り値である。
【００５８】
抗体が、それぞれ互いの結合を（上記のように計算された割合に従って）陽性対照値の２０％未満まで減少させた場合に、その抗体は同じエピトープまたは非常に密接に重複したエピトープに結合すると見なした。抗体がこの条件を満たさない場合、それらは少なくとも部分的に異なるエピトープを有すると見なした。表３は、どの抗体が少なくとも部分的に異なるエピトープを有するかを示す。
【００５９】
実施例５．ヒト末梢血細胞に対する抗体結合のフローサイトメトリー分析
同意を得た健常ボランティアから血液を採取し、製造業者の推奨に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を遠心分離により濃縮した。使用前に、ＰＢＳ中でＰＢＭＣを十分に洗浄した。５％正常マウス血清を含有するＦＡＣＳ緩衝液で細胞を前処理し、非特異的結合部位をブロックした。特異的Ｂ細胞およびプラズマ細胞マーカーを標的とする、フルオロフォアをコンジュゲートした以下のモノクローナル抗体を使用した：抗ＣＤ１９−ＰＥ−Ｃｙ５、抗ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２７−ＡＰＣ、抗ＣＤ３８−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用してビオチンコンジュゲート抗ＢＣＭＡ
ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を可視化した。実施例３のようなアイソタイプ対照ｍＡｂの結合も測定した。
【００６０】
どの抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂも、健常ボランティア由来のナイーブＢ細胞を染色せず（図２Ｅ）、強度は異なるものの、全てがプラズマ細胞を染色した（図２Ａ）。クローンＡ７Ｄ１２．２のみが、３つ全ての記憶Ｂ細胞サブセットのある割合を染色した（図２Ｂ〜Ｄ）。
【００６１】
実施例６．健常な個体およびＳＬＥに罹患する個体のＢ細胞に対する抗体結合の比較
同意を得た健常ボランティアおよびＳＬＥ患者から血液を採取し、実施例５のようにプロセスした。図３は、健常ボランティアおよび代表的なＳＬＥ患者に由来する試料間の比較を示す。抗体Ａ７Ｄ１２．２は、健常ボランティアおよびＳＬＥ患者の両方に由来するプラズマ細胞に結合した（図３Ａ）。正常な試料においてではなく、ＳＬＥ試料において、Ａ７Ｄ１２．２抗体がナイーブＢ細胞に結合した（図３Ｅ）。Ａ７Ｄ１２．２抗体の、記憶Ｂ細胞（図３Ｂ−Ｄ）、特にダブルネガティブ記憶Ｂ細胞（図３Ｄ）に対する結合が、ＳＬＥ試料において増加した。
【００６２】
実施例７．キメラ抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂを産生する細胞株の作製
Ｄｈｆｒを欠損する、インスリン非依存型のチャイニーズハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯ−ＤＧ４４−Ｉを使用して、抗ＢＣＭＡ野生型細胞株を構築した。トランスフェクションの前に、ヌクレオシドを含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地で宿主細胞を培養した。
【００６３】
表４に列挙した成熟重鎖および軽鎖配列をコードする発現プラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって、キメラ抗体を産生した。
【００６４】
【表４】
2015187164.tif 000007
カチオン性脂質（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ）法を使用して、キメラ抗ＢＣＭＡ発現プラスミドをＣＨＯ宿主細胞株ＤＧ４４−Ｉにトランスフェクトした。簡潔に述べると、ヌクレオシドを含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地をウェル当たり３ｍＬ含有する６ウェルプレートのうち、２つのウェルの各々に、１×１０６のＤＧ４４−Ｉ細胞を播種した。４μｇのプラスミドＤＮＡ（重鎖２μｇ、軽鎖２μｇ）を、２００μＬのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地に室温で希釈した。１６μＬのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）試薬を加え、約１５分間ＤＮＡとの複合体を形成させた。細胞を含有する各ウェルに、複合ＤＮＡ混合物１００μＬを加えた。３日後、トランスフェクトした細胞を合わせ、ジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４００μｇ／ｍＬを含有する、ヌクレオシドを含まないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地２０ｍＬを含有するＴ−７５フラスコに移した。細胞を生存率について監視し、それに応じてスケールアップした。細胞がスケールアップされると、それらを生産培地に適応させた。安定した集団からの個々の細胞をＦＡＣＳで選別することにより、クローン細胞株を得た。
【００６５】
キメラ重鎖および軽鎖で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４−Ｉ細胞をＣＨＯＭ３９培地で発酵させ、収集し、遠心分離によって細胞を除去した。プロテインＡ高速カラムを通過させる前に、除去された培地のｐＨを調整した。１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で抗体を溶出させ、１０％（ｖ／ｖ）の２Ｍグリシン（ｐＨ８．９）を使用してｐＨ７．０に中和し、回収した抗体溶液を、エンドトキシンを含まない条件下でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。精製タンパク質を−８０℃に維持した。
【００６６】
実施例８．抗ＢＣＭＡ媒介によるインビトロでの死滅
細胞および細胞培養
ＪＪＮ−３ヒトプラズマ細胞腫細胞（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５４１）を、４０％ダルベッコＭＥＭ、４０％イスコブＭＤＭ、２０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンからなる培養培地で培養した。Ｕ２６６ヒトプラズマ細胞腫細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １９６）を、ＲＰＭＩ  １６４０、１５％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンからなる培養培地で培養した。全ての細胞は、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した。Ｆｉｃｏｌｌ-Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた密度遠心分離によって、同意を得た正常な健常ドナーからの末梢血単核細胞を単離した。
インビトロ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイ
アッセイ希釈剤は、ＲＰＭＩ  １６４０、１％ＢＳＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンであった。ヒトプラズマ細胞腫細胞株ＪＪＮ−３およびＵ２６６を洗浄し、０．４×１０６細胞／ｍＬまでアッセイ希釈剤に再懸濁した。各細胞懸濁液５０μＬを、９６ウェルのＵボトムマイクロタイタープレートに３通りに播種した。連続的に希釈したキメラ抗ＢＣＭＡ抗体５０μＬ（実施例７で記載したようにｃｈＣ１２Ａ３．２、ｃｈＣ１３Ｆ１２．１、ｃｈＣ１１Ｄ５．３、およびｃｈＡ７Ｄ１２．２）ならびに対照ヒトＩｇＧ１（ＨＩｇＧ１：Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、細胞株を含有するウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。エフェクター：標的の比率が２５：１になるように、５０μＬのＰＢＭＣ（５００，０００）を加え、さらに４時間、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートした。プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清１００μＬを９６フラットボトムのマイクロウェルプレートに移した。溶解細胞から放出される乳酸脱水素酵素（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＬＤＨ）、Ｎｏ．１１  ６４４  ７９３  ００１  Ｒｏｃｈｅ）の量を測定することによって、細胞溶解レベルを判定した。ＬＤＨキット反応混合物１００μＬを、製造業者の指示に従って１００μＬの上清に最長で３０分間加えた。４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照は、標的細胞のみ（自発性ＬＤＨ放出）、アッセイ希釈剤中に２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む標的細胞のみ（最大ＬＤＨ放出）、標的細胞を含むかまたは含まないエフェクター細胞、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を含んだ。
結果
ヒトＢＣＭＡ＋プラズマ細胞腫細胞株Ｕ２６６を用いて、キメラ抗ＢＣＭＡ抗体がＡＤＣＣを介して死滅させる能力をテストした。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用した。表５に示すように、キメラｍＡｂ  Ｃ１２Ａ３．２およびＣ１３Ｆ１２．１は、ＨＩｇＧ１対照に関連して著しいＡＤＣＣ活性を示した。キメラクローンＡ７Ｄ１２．２およびＣ１１Ｄ５．３もまたＡＤＣＣを媒介したが、Ｃ１２Ａ３．２およびＣ１３Ｆ１２．１よりも低い程度であった。
【００６７】
【表５】
2015187164.tif 000008
標的細胞として第２のＢＣＭＡ＋プラズマ細胞腫細胞株ＪＪＮ−３を使用して、ＡＤＣＣアッセイも行った。表６に示すように、キメラＣ１２Ａ３．２、Ｃ１３Ｆ１２．１、およびＡ７Ｄ１２．２もまた、ＪＪＮ−３細胞のＡＤＣＣを媒介した。
【００６８】
【表６】
2015187164.tif 000009
エフェクター細胞として濃縮したヒトＮＫ細胞を使用することは、ｃｈＣ１２Ａ３．２、ｃｈＣ１３Ｆ１２．１、またはｃｈＡ７Ｄ１２．２の死滅を改善する結果にはならなかった。むしろ、ＮＫによる死滅の割合はＰＢＭＣと比較して減少しており、Ｕ２６６およびＪＪＮ３を標的細胞として用いたＡＤＣＣアッセイにおいて、ＮＫ細胞はｃｈＣ１２Ａ３．２、ｃｈＣ１３Ｆ１２．１、またはｃｈＡ７Ｄ１２．２のエフェクター細胞ではないことを示唆している（データは表示せず）。ｃｈＣ１２Ａ３．２、ｃｈＣ１３Ｆ１２．１、またはｃｈＡ７Ｄ１２．２の脱フコシル変異体の産生は、これらのｍＡｂの活性を向上しなかった（データは表示せず）。
【００６９】
実施例９．抗ＢＣＭＡ媒介によるインビボでの細胞枯渇
ヒト化（ＨＳＣ／ＮＳＧ）マウスの確立
ＨＳＣ／ＮＳＧマウスは、免疫系が機能的なヒト細胞型からなるため、ヒトタンパク質標的に特異的な生物学的試薬をインビボでテストするための有用なツールを提供する（Ｂｒｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）。以前に記載されたようにヒト化マウスを作製した（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５：Ｕｎｉｔ  １５．２１．ＰＭＩＤ：１８４９１２９４）。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）からＮＯＤ／ＳＣＩＤ／共通γ鎖欠損マウス（ＮＳＧマウス）購入した。マウスは、アイソレーターケージ内で、特殊な病原体フリーの条件下に維持して繁殖させた。繁殖ペアを確立し、雌親を妊娠および出産について監視した。２〜６日齢の仔マウスを使用してヒト化マウスを作製した。１３７Ｃｓ照射器からの１Ｇｙ（１００ラド）の線量で仔マウスを軽く照射した。臍帯血に由来する約５０，０００個のＣＤ３４＋ＣＤ３幹細胞（ＨＳＣ）（Ａｌｌ  Ｃｅｌｌ  ＬＬＣ：ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａから購入）を仔マウスの眼窩内に迅速に注射し、次いで雌親に戻した。２１日目に仔マウスを離乳させ、性別ごとに、同腹仔のうちの一匹と一緒にケージに入れた。３ヶ月齢から開始して、マウスを顔面静脈からヘパリン処理したチューブ内に出血させ、フローサイトメトリーによって全血をヒト細胞の存在について分析した。簡潔に述べると、１００μｌの全血をｍＡｂ抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ３−ＰＥ、抗ヒトＣＤ１９−ＰｅｒＣｐ、および抗マウスＣＤ４５−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のカクテルで染色した。１０％以上がヒトＣＤ３＋であり、残りはヒトＢ細胞および他のヒト造血細胞である全血中に、少なくとも２０％のヒトＣＤ４５＋細胞を有する場合に、マウスのヒト化に成功したと見なした。ヒト化が安定していることを確認するために、時折マウスを出血させて分析し、試験に登録する２週間前にルーチン的に分析した。
【００７０】
フローサイトメトリー
ヒト幹細胞でヒト化したＮＳＧ（ＨＳＣ／ＮＳＧ）マウスにおいてプラズマ細胞（ＰＣ）を同定するために、コラゲナーゼで消化した脾臓をフローサイトメトリー分析に供した。ヒト細胞系列およびヒトＢ細胞マーカーを標的とするｍＡｂのカクテルとともに細胞をインキュベートした。パネルは、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ１９、抗ヒトＣＤ２７、抗ヒトＩｇＤ、および抗ヒトＣＤ３８からなっていた。特異的な細胞集団を排除するために使用した２つのマーカーは、抗マウスＣＤ４５および抗ヒトＣＤ３であった。ＰＣとして同定された細胞は、ヒトＣＤ４５＋、ヒトＣＤ１９＋、ヒトＣＤ３−、ヒトＣＤ２７＋、ヒトＩｇＤ−、およびヒトＣＤ３８  ｂｒｉｇｈｔであった。ＢＣＭＡ＋細胞を同定するために、ビオチンをコンジュゲートした抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂ、Ｃ１２Ａ３．２、およびＡ７Ｄ１２．２を使用した。
【００７１】
インビボ細胞枯渇アッセイ
５〜６月齢のＨＳＣ／ＮＳＧマウスにキメラ抗ＢＣＭＡ  ｍＡを腹腔内投与し、反応性を示さないヒトＩｇＧ１（Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を陰性対照として使用した。血液を採取し、ヒトＩｇアイソフォームレベルの分析のために血清を調製した。試験の終りに脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を調製し、ＲＢＣを溶解させて、ＰＢＳ／５％ＦＣＳで細胞を３回洗浄し、細胞数を測定した。フローサイトメトリーにより、Ｔ系列細胞、Ｂ系列細胞、およびプラズマ細胞について細胞を評価した。
【００７２】
血清ヒトＩｇアイソタイプの評価
製造業者のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡフォーマット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）およびヒト免疫グロブリンアイソタイピングキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの血清レベルをそれぞれ測定した。
【００７３】
結果
５〜６月齢のＨＳＣ／ＮＳＧマウスの分析により、評価した多様な細胞サブセットのうち、ＢＣＭＡ＋細胞はＢ細胞系列にのみ見られたことが明らかになった。Ｂ細胞系列内では、ＢＣＭＡが脾臓ＰＣ（ヒトＣＤ１９＋、ヒトＣＤ２７＋、ＩｇＤ−、ＣＤ３８  ｂｒｉｇｈｔ）（図４）上のみに見られたが、ナイーブＢ細胞（ヒトＣＤ１９＋、ヒトＣＤ２７−、ＩｇＤ＋）、非スイッチ記憶Ｂ細胞（ヒトＣＤ１９＋、ヒトＣＤ２７＋、ヒトＩｇＤ＋）、またはスイッチ記憶Ｂ細胞（ヒトＣＤ１９＋、ヒトＣＤ２７＋、ヒトＩｇＤ−）上には見られなかった（データは表示せず）。
【００７４】
キメラ抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂがヒトＰＣを枯渇させる能力を評価するために、種々の量のキメラ抗ヒトＢＣＭＡクローンｃｈＡＣ１１Ｄ５．３、ｃｈＣ１２Ａ３．２、ｃｈＣ１３Ｆ１２．１、およびｃｈＡ７Ｄ１２．２（実施例７）を、週２回２週間、ＨＳＣ／ＮＳＧマウスに腹腔内投与し、その後、脾臓ＰＣの存在を判定した。ＨＩｇＧ１で処理した対照群からの脾臓ＰＣを、Ａ７Ｄ１２．２およびＣ１２Ａ３．２クローンを使用してＢＣＭＡの発現について分析したところ、細胞表面ＢＣＭＡを発現することが確認された（データは表示せず）。上述したフローサイトメトリーのパラメータを使用してＰＣを同定し、フローサイトメトリーのドットプロットから合計細胞数を決定した（合計ヒト細胞数の割合として算出した）。ナイーブヒトＢ細胞、非スイッチ記憶ヒトＢ細胞、およびスイッチ記憶ヒトＢ細胞の数も決定した。
【００７５】
ｃｈＣ１２Ａ３．２（Ｎ＝５）を用いた処理は、２００μｇおよび２０μｇの用量レベルで、対照のＨＩｇＧで処理したマウス（Ｎ＝５）と比較して統計的に有意な９３％および９５％の減少をそれぞれ脾臓ＰＣ数にもたらし、また２μｇの用量も、統計的に有意ではないものの、著しい減少（３２％）を示した。ｃｈＣ１３Ｆ１２．１（Ｎ＝５）を用いた処理は、２００μｇおよび２０μｇの用量レベルで、統計的に有意な８８％および５１％の減少をそれぞれ脾臓ＰＣ数にもたらした（図５）。ｃｈＣ１２Ａ３．２およびｃｈＣ１３Ｆ１２．１では、他のＢ細胞サブセットまたはＴ細胞の数に対する影響は観察されなかった（データは表示せず）。
【００７６】
２００μｇのｃｈＣ１１Ｄ５．１（Ｎ＝２）またはｃｈＡ７Ｄ１２．２（Ｎ＝１）を用いた処理は、ＨＩｇＧで処理した対照マウス（Ｎ＝５）と比較して、脾臓内ヒトＰＣに８９％および９７％の低下をそれぞれもたらした（図６）。ｃｈＡ７Ｄ１２．１による処理もまた、ＨＩｇＧで処理したマウスと比較して、脾臓のヒトスイッチ記憶Ｂ細胞数に２．６倍の減少をもたらした（ＨＩｇＧおよびｃｈＡ７Ｄ１２．１で、それぞれ５７５ＰＣ／１０５ＨｕＣＤ４５＋細胞：２１７ＰＣ／１０５ＨｕＣＤ４５＋細胞）。未処理ヒト化マウスのスイッチ記憶Ｂ細胞表面にはＢＣＭＡが検出できなかったが、フローサイトメトリーによるとＢＣＭＡのレベルは検出限界未満であるものの、Ａｂ媒介による死滅をもたらすのに十分であったと考えられる。
【００７７】
ヒトＰＣの枯渇が、上述したＨＳＣ／ＮＳＧマウスにおける血清ヒトＩｇレベルに与える影響を判定するために、ヒトＩｇサブセットを分析した。これらの試験で使用したキメラ抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂは、ヒトＩｇＧ１アイソフォームのものであり、したがって、ヒトＩｇＧ１レベルを正確に評価することができなかった。いくつかの実験コホートにおいて、対照処理マウスは、非常に僅かな不定量のアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＡおよびＩｇＥを示した（データは表示せず）。表７に示すように、ｃｈＣ１２Ａ３．２およびｃｈＣ１３Ｆ１２．１の両方が、特に高い用量レベルで、血清ヒトＩｇＭの著しい減少をもたらした。キメラＣ１２Ａ３．２は、２００、２０、および２μｇの用量レベルで、それぞれ、ＩｇＭに６３％、６２％、および３０％の減少をもたらした。キメラＣ１３Ｆ１２．１は、２００、２０、および２μｇの用量レベルで、それぞれ、ＩｇＭに５２％、４２％、および３２％の減少をもたらした。
【００７８】
【表７】
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別の実験において、マウスにｃｈＣ１２Ａ３．２（Ｎ＝１４）またはＨＩｇＧ１対照を投与したところ（Ｎ＝９）、対照マウスが、容易に検出可能なＩｇＧ２およびＩｇＧ３アイソタイプ、ならびにＩｇＭを示した。キメラＣ１２Ａ３．２で処理したマウスは、図５で見られるのと同様の脾臓プラズマ細胞の有意な枯渇を示した（データは表示せず）。表８に示すように、ｃｈＣ１２Ａ３．２を投与したマウスは、ＨＩｇＧで処理した対照マウスと比較して、血清ＩｇＧ２およびＩｇＭレベルの有意な減少を示した。キメラＣ１２Ａ３．２で処理したマウスもまた、血清ＩｇＧ３における著しい減少を示したが、対照マウスと比較すると、その差異は統計的優位性には達しなかった（表８）。
【００７９】
【表８】
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本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例を提供するものであって、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本明細書によって包含されることを容易に認識するであろう。本開示で引用される全ての刊行物および特許は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれた内容が本明細書と矛盾するかまたは不一致である場合は、本明細書がそのようないかなる内容にも優先する。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを容認するものではない。
【００８０】
別途記載のない限り、特許請求の範囲を含む本明細書において使用される成分の量、反応条件等を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されたい。したがって、別途反対の記載のない限り、数字のパラメータは近似値であり、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る。少なくとも、また、特許請求の範囲に対する均等の原則を制限するものではないが、各数字のパラメータは、有効桁および通常の端数計算法に照らして解釈されるべきである。
【００８１】
別途記載のない限り、一連の要素の前にくる用語「少なくとも」は、一連のあらゆる要素を指すと理解されたい。当業者は、本明細書に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、認識するか、または単なる日常の実験を用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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