(57)【要約】【課題】核酸の損傷の程度の評価方法を提供する。【解決手段】分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることと、を含む、核酸の損傷の程度の評価方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、前記複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、
前記調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた前記鋳型核酸配列から、前記複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、
前記分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、前記分解作用による前記鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることと、
を含む、核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項２】
前記損傷の程度を求めることにおいて、前記複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差に基づいて、前記鋳型核酸配列の損傷の程度を求める、請求項１に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項３】
前記生成効率が、前記増幅産物が所定の量生成される時の前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を表す、閾値サイクル値で表される、請求項１又は２に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項４】
前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記閾値サイクル値の増加率を求める、請求項３に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項５】
前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増加率が高いほど、前記損傷の程度が大きいと評価する、請求項４に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、リアルタイムＰＣＲである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、デジタルＰＣＲである、請求項１又は２に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項８】
前記生成効率が、前記ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施した際に前記増幅産物が生成する確率、もしくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を所定の回数実施した際に前記増幅産物が生成する回数で表される、請求項７に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項９】
前記生成効率が、増幅が観察されたウェルの数又は当該増幅が観察されたウェルの数に基づく数値で表される、請求項７又は８に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１０】
前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記生成効率の減少率を求める、請求項８又は９に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、温度条件である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの配列である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの濃度である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１４】
前記鋳型核酸配列が、植物に特異的な核酸配列の少なくとも一部である、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１５】
前記鋳型核酸配列が、１８ＳｒＲＮＡをコードする核酸配列の少なくとも一部である、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１６】
前記鋳型核酸配列が、動物に特異的な核酸配列の少なくとも一部である、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
【請求項１７】
分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、前記複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、
前記調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、食品から採取した分解作用を受けた前記鋳型核酸配列から、前記複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、
前記分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、前記食品の加工の程度を求めることと、
を含む、食品の加工の程度の評価方法。
【請求項１８】
前記食品の加工の程度を求めることにおいて、前記複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差に基づいて、前記食品の加工の程度を求める、請求項１７に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項１９】
前記生成効率が、前記増幅産物が所定の量生成される時の前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を表す、閾値サイクル値で表される、請求項１７又は１８に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２０】
前記食品の加工の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記閾値サイクル値の増加率を求める、請求項１９に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２１】
前記食品の加工の程度を求めることにおいて、前記増加率が高いほど、前記食品の加工の程度が大きいと評価する、請求項２０に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２２】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、リアルタイムＰＣＲである、請求項１７ないし２１のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、デジタルＰＣＲである、請求項１７又は１８に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２４】
前記生成効率が、前記ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施した際に前記増幅産物が生成する確率、もしくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を所定の回数実施した際に前記増幅産物が生成する回数で表される、請求項２３に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２５】
前記生成効率が、増幅が観察されたウェルの数又は当該増幅が観察されたウェルの数に基づく数値で表される、請求項２３又は２４に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２６】
前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記生成効率の減少率を求める、請求項２４又は２５に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、温度条件である、請求項１７ないし２６のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの配列である、請求項１７ないし２６のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項２９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの濃度である、請求項１７ないし２６のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項３０】
前記鋳型核酸配列が、植物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部である、請求項１７ないし２９のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項３１】
前記鋳型核酸配列が、１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部である、請求項１７ないし３０のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項３２】
前記鋳型核酸配列が、動物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部である、請求項１７ないし２９のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項３３】
前記求められた食品の加工の程度に基づき、前記食品に対して、遺伝子組換え作物検出試験を行うか否かを決定することを更に含む、請求項１７ないし３２のいずれか１項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
【請求項３４】
分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、前記複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、
前記調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた前記鋳型核酸配列から、前記複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、
前記分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることと、
を含む、核酸の定量方法。
【請求項３５】
分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることにおいて、前記複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差に基づいて、分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量の程度を求める、請求項３４に記載の核酸の定量方法。
【請求項３６】
前記生成効率が、前記増幅産物が所定の量生成される時の前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を表す、閾値サイクル値で表される、請求項３４又は３５に記載の核酸の定量方法。
【請求項３７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、リアルタイムＰＣＲである、請求項３４ないし３６のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項３８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、デジタルＰＣＲである、請求項３４又は３５に記載の核酸の定量方法。
【請求項３９】
前記生成効率が、前記ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施した際に前記増幅産物が生成する確率、もしくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を所定の回数実施した際に前記増幅産物が生成する回数で表される、請求項３８に記載の核酸の定量方法。
【請求項４０】
前記生成効率が、増幅が観察されたウェルの数又は当該増幅が観察されたウェルの数に基づく数値で表される、請求項３８又は３９に記載の核酸の定量方法。
【請求項４１】
分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることが、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、前記分解作用を受けた鋳型核酸配列のうち、未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合を算出することを含む、請求項３４ないし４０のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項４２】
分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることが、前記分解作用を受けた鋳型核酸配列の量を測定することを更に含む、請求項４１に記載の核酸の定量方法。
【請求項４３】
分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることが、前記測定された分解作用を受けた鋳型核酸配列の量を、前記未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合で除することにより、分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を算出することを更に含む、請求項４２に記載の核酸の定量方法。
【請求項４４】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、温度条件である、請求項３４ないし４３のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項４５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの配列である、請求項３４ないし４３のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項４６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの濃度である、請求項３４ないし４３のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項４７】
前記鋳型核酸配列が、植物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部である、請求項３４ないし４６のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項４８】
前記鋳型核酸配列が、１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部である、請求項３４ないし４７のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項４９】
前記鋳型核酸配列が、動物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部である、請求項３４ないし４６のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【請求項５０】
前記鋳型核酸配列が、生物種に特異的な内在性遺伝子配列の少なくとも一部である、請求項３４ないし４６のいずれか１項に記載の核酸の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子技術に関し、特に核酸の損傷の程度の評価方法、食品の加工の程度の評価方法、及び核酸の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品分野において、遺伝子組換え作物が食品に混入したか否かを検査する定性試験及び定量試験には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）検査が多く利用されている。一方、食品が加工されるに従って、熱、ｐＨ変化、及び物理的な力等によって、ＤＮＡは断片化することが知られている（例えば、非特許文献１ないし３参照。）。また、食品が加工されることによって、ＤＮＡが断片化すること、遺伝子組換えの定量値に誤差が生じることも確認されている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００３】
しかし、ＤＮＡ等の核酸の断片化等の損傷の程度を評価するのは容易ではない。大豆及びトウモロコシ加工食品中のゲノムＤＮＡを定量ＰＣＲ法で定量し、ＤＮＡの分解度を測定している例はある（例えば、非特許文献５、６参照。）。しかし、非特許文献５、６に開示された方法では、ＤＮＡ分解度の評価のために各検出ＤＮＡ領域についての検量線に基づいて未処理試料と加工試料のＤＮＡ量を定量し、その結果から計算しなければならず、同文献中には、ＤＮＡの断片化程度を簡便に数値化する方法は開示されていない。また、非特許文献５、６には、大豆、トウモロコシに特異的な配列を検出するプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲ法の条件しか開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nicolas Gryson., Anal. Bioanal. Chem. 2010; 396, 2003-2022
【非特許文献２】Yoshimura, T et al., J.Agric. Food chem. 2005, 53, 2052-2059
【非特許文献３】Nakamura, K et al., Jpn. J. Food Chem. Safety. 2010, 17(2), 123-129
【非特許文献４】Yoshimura, T et al., J.Agric. Food chem. 2005, 53, 2060-2069
【非特許文献５】Sarah R Murray et al., J. Sci. Food Agric. 2009, 89, 1137-1144
【非特許文献６】Sarah R Murray et al., J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 2231-2239
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
核酸の損傷の程度を容易に評価可能な方法が求められている。そこで、本発明は、核酸の損傷の程度の評価方法、並びに核酸の損傷の程度の評価方法を応用した食品の加工の程度の評価方法及び核酸の定量方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、（ａ）分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、（ｂ）調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、（ｃ）分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用による鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることと、を含む、核酸の損傷の程度の評価方法が提供される。
【０００７】
また、本発明の態様によれば、（ａ）分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、（ｂ）調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、食品から採取した分解作用を受けた鋳型核酸配列から、複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、（ｃ）分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、食品の加工の程度を求めることと、を含む、食品の加工の程度の評価方法が提供される。
【０００８】
さらに、本発明の態様によれば、（ａ）分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、（ｂ）調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、（ｃ）分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用を受ける前の鋳型核酸配列の量を求めることと、を含む、核酸の定量方法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、核酸の損傷の程度の評価方法、食品の加工の程度の評価方法、及び核酸の定量方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例に係るＰＣＲの条件が調整された場合の増幅曲線のグラフである。
【図２】本発明の参考例に係るＰＣＲの条件が調整されなかった場合の増幅曲線のグラフである。
【図３】本発明の実施例に係る１００ｂｐの増幅産物を得るためのプライマーペアの植物特異性を示す増幅曲線のグラフである。
【図４】本発明の実施例に係る２００ｂｐの増幅産物を得るためのプライマーペアの植物特異性を示す増幅曲線のグラフである。
【図５】本発明の実施例に係る４００ｂｐの増幅産物を得るためのプライマーペアの植物特異性を示す増幅曲線のグラフである。
【図６】本発明の実施例に係る８００ｂｐの増幅産物を得るためのプライマーペアの植物特異性を示す増幅曲線のグラフである。
【図７】本発明の実施例に係る鋳型ＤＮＡの濃度を５段階に振った場合の増幅曲線のグラフである。
【図８】本発明の実施例に係る鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例に係る未加熱のコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図１０】本発明の実施例に係る１５分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図１１】本発明の実施例に係る３０分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図１２】本発明の実施例に係る６０分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図１３】本発明の実施例に係る１２０分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図１４】本発明の実施例に係る未加熱のコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施例に係る１５分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例に係る３０分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図１７】本発明の実施例に係る６０分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図１８】本発明の実施例に係る１２０分加熱されたコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図１９】本発明の実施例に係る未加熱の大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図２０】本発明の実施例に係る１５分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図２１】本発明の実施例に係る３０分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図２２】本発明の実施例に係る６０分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図２３】本発明の実施例に係る１２０分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図２４】本発明の実施例に係る未加熱の大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図２５】本発明の実施例に係る１５分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図２６】本発明の実施例に係る３０分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図２７】本発明の実施例に係る６０分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図２８】本発明の実施例に係る１２０分加熱された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図２９】本発明の実施例に係る未加熱のトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図３０】本発明の実施例に係る１５分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図３１】本発明の実施例に係る３０分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図３２】本発明の実施例に係る６０分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図３３】本発明の実施例に係る１２０分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線のグラフである。
【図３４】本発明の実施例に係る未加熱のトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図３５】本発明の実施例に係る１５分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図３６】本発明の実施例に係る３０分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図３７】本発明の実施例に係る６０分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図３８】本発明の実施例に係る１２０分加熱されたトウモロコシから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、の関係を示すグラフである。
【図３９】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４０】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４１】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４２】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４３】本発明の実施例に係るコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４４】本発明の実施例に係るコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４５】本発明の実施例に係るコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４６】本発明の実施例に係るコムギから抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合のデジタルＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４７】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合にプライマー濃度を振った場合の増幅曲線を示すグラフである。
【図４８】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合に１１８ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、４１２ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、が重なった場合を示すグラフである。
【図４９】本発明の実施例に係る大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度を振った場合の増幅曲線を示すグラフである。
【図５０】本発明の実施例に係る１１０℃で加圧加熱処理された大豆から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合の増幅曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明の実施の形態を説明する。ただし、以下の実施の形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
【００１２】
（第１の実施の形態）
第１の実施の形態に係る核酸の損傷の程度の評価方法は、分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ＰＣＲの条件を調整することと、調整されたＰＣＲの条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、ＰＣＲの条件を調整した時と同じ複数のプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用による鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることと、を含む。
【００１３】
鋳型核酸配列としては、任意の核酸配列が使用可能である。分解作用とは、加熱による分解作用、酵素による分解作用、酸による分解作用、アルカリによる分解作用、物理的な力による分解作用、及び菌等の微生物による発酵等による分解作用等を含む。分解作用を受けていない鋳型核酸配列とは、例えば、実質的に断片化されていない核酸配列である。鋳型核酸配列は、例えば、植物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部である。植物のＤＮＡの断片化を評価する際には、例えば、１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列内の植物特異的配列を設定することができる。１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子はゲノムＤＮＡあたりのコピー数が多く、ＤＮＡの断片化が進んだサンプルにおいても比較的検出が容易であるため、高加工度品への適用も可能である。あるいは、鋳型核酸配列は、動物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部であってもよい。さらに、鋳型核酸配列は、生物種に特異的な内在性遺伝子配列の少なくとも一部であってもよい。ＰＣＲは、例えば、リアルタイムＰＣＲ、もしくは、デジタルＰＣＲを用いることができる。
【００１４】
複数の異なるプライマーペアのそれぞれの配列は、増幅産物の配列長が異なるよう、設定される。例えば、複数の異なるプライマーペアにおいては、フォワードプライマーが共通し、リバースプライマーが異なっている。例えば、１００ｂｐの増幅産物が得られる第１のプライマーペア、２００ｂｐの増幅産物が得られる第２のプライマーペア、４００ｂｐの増幅産物が得られる第３のプライマーペア、及び８００ｂｐの増幅産物が得られる第４のプライマーペアが用意される。ただし、増幅産物の配列長は、これらに限定されない。
【００１５】
増幅産物の生成効率とは、ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである場合、例えば、増幅産物が所定の量生成される時のＰＣＲのサイクル数を表す、閾値サイクル（Ｃｔ）値で表される。ＰＣＲの条件を調整することとは、例えば、温度条件を調整すること、反応時間を調整すること、複数のプライマーペアのそれぞれの配列を調整すること、及び複数のプライマーペアのそれぞれの濃度を調整することの少なくとも一つを指す。ＰＣＲの条件を調整して複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになると、例えば、グラフの横軸にＰＣＲのサイクル数、縦軸に増幅産物の生成量（プローブの蛍光強度）をとって得られる複数の増幅産物のそれぞれの増幅曲線が、実質的に同じになる。
【００１６】
また、増幅産物の生成効率とは、ＰＣＲがデジタルＰＣＲである場合、ＰＣＲを複数回実施した際に増幅産物が生成する確率、もしくは、ＰＣＲを所定の回数実施した際に増幅産物が生成する回数で表される。より具体的には、増幅産物の生成効率とは、ＰＣＲプレート上の複数のウェルで所定のＰＣＲを行い、増幅産物が観察されたウェルの数（以下、「陽性ウェルの数」ともいう。）で表される。さらには、増幅産物の生成効率とは、デジタルＰＣＲ実施後の陽性ウェルの数又は割合をポアソン分布モデルに適合させて解析して算出したコピー数で表される。ＰＣＲの条件を調整することとは、例えば、温度条件を調整すること、反応時間を調整すること、複数のプライマーペアのそれぞれの配列を調整すること、及び複数のプライマーペアのそれぞれの濃度を調整することの少なくとも一つを指す。ＰＣＲの条件を調整して複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになると、例えば、ＰＣＲを複数回実施したうち、増幅産物が生じた確率、もしくは、ＰＣＲを所定の回数実施した際に増幅産物が生じた回数が、実質的に同じになる。より具体的には、複数のウェルでＰＣＲを行い、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の異なるプライマー毎に陽性ウェルの数が、実質的に同じになる。さらには、陽性ウェルの数又は割合をポアソン分布モデルに適合させて解析して算出されるコピー数等の、陽性ウェルの数に基づく数値が、実質的に同じになる。
【００１７】
なお、リアルタイムＰＣＲとデジタルＰＣＲは、測定対象ＤＮＡの濃度域や増幅産物の測定方法に違いがあるものの、ＤＮＡ増幅の原理においては共通しており、いずれにおいても、配列長が短い方が増幅しやすく、配列長が長い方が増幅しにくい傾向にある。したがって、上述したように、ＰＣＲの条件を調整しない限りは、配列長の短い増幅産物の生成効率と、配列長の長い増幅産物の生成効率と、は、実質的に異なる傾向にある。
【００１８】
分解作用を受けた鋳型核酸配列においては、例えば、少なくとも部分的に断片化された核酸配列が混在する。ここで、鋳型核酸配列が分解作用を受けた場合、例えば、鋳型核酸配列の短い部分配列と、鋳型核酸配列の長い部分配列と、を比較すると、短い部分配列の方が分解作用の影響を受けにくく、断片化されずに残存する確率が高くなる傾向にある。また、長い部分配列の方が分解作用の影響を受けやすく、断片化されずに残存する確率が低くなる傾向にある。
【００１９】
鋳型核酸配列が分解作用を受けていない場合に、配列長が異なる複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ＰＣＲの条件を調整しても、鋳型核酸配列が分解作用を受けると、断片化されずに残存する確率が高い短い部分配列から複製される増幅産物と比較して、断片化されずに残存する確率が低い長い部分配列から複製される増幅産物は、生成効率が悪くなる傾向にある。そのため、配列長が異なる複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が異なってくる。具体的には、リアルタイムＰＣＲにおいては、配列長が短い増幅産物のＣｔ値と比較して、配列長が長い増幅産物のＣｔ値が大きくなる傾向にある。また、デジタルＰＣＲにおいては、配列長が短い増幅産物が確認されるウェルの数又はコピー数と比較して、配列長が長い増幅産物が確認されるウェルの数又はコピー数が減少する傾向にある。
【００２０】
さらに、鋳型核酸配列の損傷の程度が大きくなるほど、配列長が短い増幅産物の生成効率と、配列長が長い増幅産物の生成効率と、の差は大きくなる。したがって、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された、配列長が異なる複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることが可能となる。
【００２１】
鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることにおいて、例えば、リアルタイムＰＣＲの場合、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸にＣｔ値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似する。得られた一次関数の正の傾きは、配列長に対するＣｔ値の増加率を表している。配列長に対するＣｔ値の増加率が低いほど、鋳型核酸配列の損傷の程度は小さく、配列長に対するＣｔ値の増加率が高いほど、鋳型核酸配列の損傷の程度は大きい。よって、得られた一次関数の傾きに基づいて、鋳型核酸配列の損傷の程度を求めてもよい。
【００２２】
また、デジタルＰＣＲの場合、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸に増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の対数値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似する。得られた一次関数の負の傾きは、配列長に対する、増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の減少率を表している。配列長に対する増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の減少率が小さいほど、鋳型核酸配列の損傷の程度は小さく、配列長に対する増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の減少率が大きいほど、鋳型核酸配列の損傷の程度は大きい。よって、デジタルＰＣＲの場合においても、得られた一次関数の傾きに基づいて、鋳型核酸配列の損傷の程度を求めてもよい。
【００２３】
（第２の実施の形態）
第２の実施の形態に係る食品の加工の程度の評価方法は、分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ＰＣＲで、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ＰＣＲの条件を調整することと、調整されたＰＣＲの条件の下、食品から採取した分解作用を受けた鋳型核酸配列から、ＰＣＲの条件を調整した時と同じ複数のプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、食品の加工の程度を求めることと、を含む。
【００２４】
鋳型核酸配列としては、任意の核酸配列が使用可能である。分解作用を受けていない鋳型核酸配列とは、例えば、食品として加工される前の植物及び動物等に含まれる核酸配列であり、実質的に断片化されていない核酸配列である。鋳型核酸配列は、例えば、植物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部である。植物のＤＮＡの断片化を評価する際には、例えば、１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列内の植物特異的配列を設定することができる。１８ＳｒＲＮＡはコピー数が多く、ＤＮＡの断片化が進んだサンプルにおいても検出可能であるため、高加工度品への適用が可能である。あるいは、鋳型核酸配列は、動物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部であってもよい。さらに、鋳型核酸配列は、生物種に特異的な内在性遺伝子配列の少なくとも一部であってもよい。ＰＣＲは、例えば、リアルタイムＰＣＲ、もしくは、デジタルＰＣＲを用いることができる。
【００２５】
複数の異なるプライマーペア、増幅産物の生成効率、及びＰＣＲの条件の調整等については、第１の実施の形態と同様であるため、説明を省略する。
【００２６】
食品から採取した分解作用を受けた鋳型核酸配列においては、少なくとも部分的に断片化された核酸配列が混在する。ここで、食品が加工された場合、例えば、食品に含まれる鋳型核酸配列の短い部分配列と、長い部分配列と、を比較すると、短い部分配列の方が分解作用の影響を受けにくく、断片化されずに残存する確率が高くなる傾向にある。また、長い部分配列の方が分解作用の影響を受けやすく、断片化されずに残存する確率が低くなる傾向にある。
【００２７】
鋳型核酸配列が分解作用を受けていない場合に、配列長が異なる複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ＰＣＲの条件を調整しても、食品加工により鋳型核酸配列が分解作用を受けると、断片化されずに残存する確率が高い短い部分配列から複製される増幅産物と比較して、断片化されずに残存する確率が低い長い部分配列から複製される増幅産物は、生成効率が悪くなる傾向にある。そのため、鋳型核酸配列が含まれていた食品が加工されると、それぞれ配列長が異なる複数の増幅産物のそれぞれの生成効率は異なってくる。具体的には、ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである場合、配列長が短い増幅産物のＣｔ値と比較して、配列長が長い増幅産物のＣｔ値が大きくなる傾向にある。また、デジタルＰＣＲにおいては、配列長が短い増幅産物が確認されるウェルの数又はコピー数と比較して、配列長が長い増幅産物が確認されるウェルの数又はコピー数が減少する傾向にある。
【００２８】
さらに、食品の加工の程度が大きく、鋳型核酸配列の損傷の程度が大きくなるほど、配列長が短い増幅産物の生成効率と、配列長が長い増幅産物の生成効率と、の差は大きくなる。したがって、食品から採取した分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された、配列長が異なる複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、食品の加工の程度を求めることが可能となる。
【００２９】
食品の加工の程度を求めることにおいて、例えば、リアルタイムＰＣＲの場合、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸にＣｔ値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似する。得られた一次関数の正の傾きは、配列長に対するＣｔ値の増加率を表している。配列長に対するＣｔ値の増加率が低いほど、食品の加工の程度は小さく、配列長に対するＣｔ値の増加率が高いほど、食品の加工の程度は大きい。よって、得られた一次関数の傾きに基づいて、食品の加工の程度を求めてもよい。
【００３０】
また、デジタルＰＣＲの場合、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸に増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の対数値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似する。得られた一次関数の負の傾きは、配列長に対する増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の減少率を表している。配列長に対する増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の減少率が小さいほど、食品の加工の程度は小さく、配列長に対する増幅が確認されたウェルの数又はコピー数の減少率が大きいほど、食品の加工の程度は大きい。よって、デジタルＰＣＲの場合においても、得られた一次関数の傾きに基づいて、食品の加工の程度を求めてもよい。
【００３１】
なお、食品がパンであり、コムギの加工の程度を求めたい場合、１８ＳｒＲＮＡ等の植物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部を鋳型核酸配列として選択することにより、酵母の影響を排除することが可能となる。あるいは、食品が納豆であり、大豆の加工の程度を求めたい場合も、植物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部を鋳型核酸配列として選択することにより、納豆菌の影響を排除することが可能となる。さらに、食品が肉類と野菜類とを含んでおり、肉類の加工の程度を求めたい場合も、動物に特異的なＤＮＡ配列の少なくとも一部を鋳型核酸配列として選択することにより、野菜類の影響を排除することが可能となる。
【００３２】
また、求められた食品の加工の程度に基づき、食品に対して、遺伝子組換え作物検出試験を行うか否かを決定してもよい。食品の加工度が進むほど、遺伝子組換え作物検出試験の精度は低下する。したがって、例えば、求められた加工の程度が所定の程度を下回る場合は、遺伝子組換え作物検出試験を行うと決定し、求められた加工の程度が所定の程度を上回る場合は、遺伝子組換え作物検出試験を行わないと決定してもよい。
【００３３】
（第３の実施の形態）
第３の実施の形態に係る核酸の定量方法は、分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ＰＣＲで、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、ＰＣＲの条件を調整することと、調整されたＰＣＲの条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、ＰＣＲの条件を調整した時と同じ複数のプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用を受ける前の鋳型核酸配列の量を求めることと、を含む。
【００３４】
分解作用、鋳型核酸配列、プライマーペア、及びＰＣＲの条件等については、第１及び第２の実施の形態と同様であるので、説明は省略する。
【００３５】
分解作用を受ける前の鋳型核酸配列の量を求めることにおいては、例えば、分解作用を受けた鋳型核酸配列から増幅された複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差を求める。生成効率は、ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである場合、例えばＣｔ値で表される。この場合、分解作用を受けた鋳型核酸配列から増幅された複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物のＣｔ値と、長い配列長の増幅産物のＣｔ値と、の差を求める。さらに、Ｃｔ値の差に基づいて、分解作用を受ける前の鋳型核酸配列のうち、分解作用を受けた後も未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合を算出する。
【００３６】
また、生成効率は、ＰＣＲがデジタルＰＣＲである場合、ＰＣＲを複数回実施した際に増幅産物が生成する確率、もしくは、ＰＣＲを所定の回数実施した際に増幅産物が生成する回数で表される。より具体的には、生成効率は、ＰＣＲプレート上の複数のウェルで所定のＰＣＲを行い、増幅産物が観察されたウェルの数又はコピー数で表される。分解作用を受けた鋳型核酸配列から増幅された複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物が確認されたウェルの数又はコピー数と、長い配列長の増幅産物が確認されたウェルの数又はコピー数と、の比を求める。さらに、ウェルの数又はコピー数の差に基づいて、分解作用を受ける前の鋳型核酸配列のうち、分解作用を受けた後も未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合を算出する。
【００３７】
ここで、分解作用を受けた鋳型核酸配列の量を測定する。分解作用を受けた鋳型核酸配列の量の測定は、公知の方法により実施可能である。さらに、分解作用を受けた鋳型核酸配列の測定された量を、未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合で除することにより、分解作用を受ける前の鋳型核酸配列の量を算出する。第３の実施の形態に係る核酸の定量方法によれば、加工される前の食品の入手が困難である場合であっても、食品から抽出した鋳型核酸配列の量と、配列長の異なる増幅産物の生成効率の差と、に基づいて、加工される前の食品に含まれる鋳型核酸配列の量を見積もることが可能となる。
【００３８】
（実施例）
以下に本発明の実施の形態を説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
（鋳型ＤＮＡ溶液の調製）
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、分解作用を受けていないコムギ１８ＳｒＲＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ０４９０４０）をプラスミドＤＮＡに導入した。得られた組換えプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶを用いて切断し、分解作用を受けていない１８ＳｒＲＮＡ遺伝子が挿入された直鎖状組換えプラスミドＤＮＡを含む鋳型ＤＮＡ溶液を調製した。
【００３９】
（リアルタイムＰＣＲの条件の調整）
表１に記載の４つのプライマーペアと、蛍光標識核酸プローブと、を用意した。４つのプライマーペアは、配列番号１の共通するフォワードプライマーを有する。また、第１のプライマーペアは配列番号２のリバースプライマーを有し、第２のプライマーペアは配列番号３のリバースプライマーを有し、第３のプライマーペアは配列番号４のリバースプライマーを有し、第４のプライマーペアは配列番号５のリバースプライマーを有する。
【００４０】
第１のプライマーペアにより、鋳型ＤＮＡから配列長が約１００ｂｐの増幅産物が得られる。第２のプライマーペアにより、鋳型ＤＮＡから配列長が約２００ｂｐの増幅産物が得られる。第３のプライマーペアにより、鋳型ＤＮＡから配列長が約４００ｂｐの増幅産物が得られる。第４のプライマーペアにより、鋳型ＤＮＡから配列長が約８００ｂｐの増幅産物が得られる。なお、実際の配列長は、３’−オーバーハングにより、計算上の配列長から僅かに変化する。配列番号６の蛍光標識核酸プローブは、５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で修飾し、３’末端をカルボキシメチルテトラローダミン（ＴＡＭＲＡ）で修飾して合成した。
【表１】
2015035977.tif 000003
【００４１】
次に、５μＬのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１μＬの濃度が２μｍｏｌ／Ｌであるフォワードプライマー溶液、１μＬのリバースプライマー溶液、１μＬの濃度が２μｍｏｌ／Ｌである蛍光標識核酸プローブ、及び１μＬの滅菌水を十分に混合して、９μＬの反応液を、第１ないし第４のプライマーペアのそれぞれに対して調製した。なお、リバースプライマーが配列番号２の場合、リバースプライマーの濃度を０．５μｍｏｌ／Ｌとした。リバースプライマーが配列番号３の場合、リバースプライマーの濃度を０．２５μｍｏｌ／Ｌとした。リバースプライマーが配列番号４の場合、リバースプライマーの濃度を０．７μｍｏｌ／Ｌとした。リバースプライマーが配列番号５の場合、リバースプライマーの濃度を２．０μｍｏｌ／Ｌとした。リバースプライマーのそれぞれの濃度は、増幅産物のそれぞれのＣｔ値が実質的に同じになるよう、上記の値に調整された。その後、反応液に、濃度が１０7コピー／μＬの鋳型プラスミド溶液１μＬを添加して、反応液の全量を１０μＬに調整した。
【００４２】
次に、調製された４つの反応液のそれぞれを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲにおいて、反応液を５０℃で２分間保持後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で１５秒保持、６０℃で１５秒保持、及び７２℃で２分保持を１サイクルとして、４５サイクルの反復を実施した。なお、リアルタイムＰＣＲの温度条件及び反応時間は、増幅産物のそれぞれのＣｔ値が実質的に同じになるよう、上記の値に調整された。その結果、グラフの横軸にリアルタイムＰＣＲのサイクル数、縦軸に増幅産物の生成量を表すプローブの蛍光強度をとって得られる、配列長が約１００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約２００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約４００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物の増幅曲線が、図１に示すように、実質的に同じになった。また、増幅曲線の蛍光強度の閾値を０．２５６に設定した場合のＣｔ値も、１９．８９〜２０．３４と、実質的に同じになった。なお、Ｃｔ値を求めるための蛍光強度の閾値は任意に設定可能である。
【００４３】
参考例として、ＰＣＲの条件を調整しなかった場合は、図２に示すように、配列長が約１００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約２００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約４００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物の増幅曲線は、一致しなかった。
【００４４】
（プライマーペアの特異性の確認）
上記の１０μＬの反応液の鋳型プラスミドに代えて、動物由来のＤＮＡ、酵母由来のＤＮＡ、及び微生物由来のＤＮＡをそれぞれ２０ｎｇ加えた反応液を調製した。これらの非植物由来のＤＮＡを加えた以外は上記の調整されたＰＣＲの条件を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。その結果、図３ないし図６に示すように、植物由来の鋳型ＤＮＡのみが増幅されて、増幅産物が増幅曲線としてグラフに現れた。動物由来のＤＮＡ、酵母由来のＤＮＡ、及び微生物由来のＤＮＡは増幅されず、増幅曲線は現れなかった。したがって、表１に示す第１ないし第４のプライマーペアのいずれもが、動物由来のＤＮＡ、酵母由来のＤＮＡ、及び微生物由来のＤＮＡと交差しないことが確認された。
【００４５】
（鋳型ＤＮＡの濃度の影響）
上記の１０μＬの反応液において、鋳型ＤＮＡ溶液における鋳型ＤＮＡのコピー数を５種類に分けた反応液を用意した。鋳型ＤＮＡのコピー数以外は上記の調整されたＰＣＲの条件を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。その結果、図７に示すように、鋳型ＤＮＡ溶液における鋳型ＤＮＡのコピー数がいずれであっても、配列長が約１００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約２００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約４００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物の増幅曲線が、実質的に同じになった。また、図８に示すように、鋳型ＤＮＡのコピー数が減少するにつれて、Ｃｔ値が高くなる傾向にあったが、鋳型ＤＮＡのコピー数が同一である場合は、配列長が約１００ｂｐの増幅産物のＣｔ値、配列長が約２００ｂｐの増幅産物のＣｔ値、配列長が約４００ｂｐの増幅産物のＣｔ値、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物のＣｔ値が、実質的に同じになった。したがって、鋳型ＤＮＡの広い濃度範囲において、増幅産物の配列長による生成効率の違いが生じないことが確認された。
【００４６】
（コムギの加工度の評価）
コムギ粒７ｇをマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕し、コムギ粉砕物を得た。加熱していないコムギ粉砕物から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けていないＤＮＡを抽出した。また、１２０℃で１５分、３０分、６０分、及び１２０分加熱したコムギ粉砕物のそれぞれから、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けたＤＮＡを抽出した。その後、コムギ粉砕物から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた以外は、上記の調整されたＰＣＲの条件を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【００４７】
その結果、図９に示すように、コムギ粉砕物が加熱されていない場合、配列長が約１００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約２００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約４００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物の増幅曲線が、実質的に同じになった。しかし、図１０ないし図１３に示すように、コムギ粉砕物が加熱された場合、加熱時間が長くなるにつれて、配列長が短い増幅産物と比較して、配列長が長い増幅産物の生成効率が低下し、増幅曲線の違いが大きくなっていった。
【００４８】
また、図１４ないし図１８に示すように、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸に増幅曲線の蛍光強度の閾値を０．２５６に設定した場合のＣｔ値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似した。いずれも決定係数Ｒ2は良好であった。得られた一次関数の傾きは、配列長に対するＣｔ値の増加率を表している。コムギが加熱により加工された場合、増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、は相関しており、加熱時間が長くなるほど、配列長に対するＣｔ値の増加率が大きくなる傾向にあることが示された。加熱時間が長くなるほど、ＤＮＡの損傷の程度は大きくなる。したがって、配列長に対するＣｔ値の増加率が低い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が小さく、コムギの加工の程度も小さいと評価可能であり、配列長に対するＣｔ値の増加率が高い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が大きく、コムギの加工の程度も大きいと評価可能であることが示された。
【００４９】
（大豆の加工度の評価）
大豆粒７ｇをマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕し、大豆粉砕物を得た。加熱していない大豆粉砕物から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けていないＤＮＡを抽出した。また、１６０℃で１５分、３０分、６０分、及び１２０分加熱した大豆粉砕物のそれぞれから、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けたＤＮＡを抽出した。その後、大豆粉砕物から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた以外は、上記の調整されたＰＣＲの条件を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【００５０】
その結果、図１９に示すように、大豆粉砕物が加熱されていない場合、配列長が約１００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約２００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約４００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物の増幅曲線が、実質的に同じになった。しかし、図２０ないし図２３に示すように、大豆粉砕物が加熱された場合、加熱時間が長くなるにつれて、配列長が短い増幅産物と比較して、配列長が長い増幅産物の生成効率が低下し、増幅曲線の違いが大きくなっていった。
【００５１】
また、図２４ないし図２８に示すように、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸に増幅曲線の蛍光強度の閾値を０．２５６に設定した場合のＣｔ値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似した。いずれも決定係数Ｒ2は良好であった。得られた一次関数の傾きは、配列長に対するＣｔ値の増加率を表している。大豆が加熱により加工された場合、増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、は相関しており、加熱時間が長くなるほど、配列長に対するＣｔ値の増加率が大きくなる傾向にあることが示された。加熱時間が長くなるほど、ＤＮＡの損傷の程度は大きくなる。したがって、配列長に対するＣｔ値の増加率が低い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が小さく、大豆の加工の程度も小さいと評価可能であり、配列長に対するＣｔ値の増加率が高い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が大きく、大豆の加工の程度も大きいと評価可能であることが示された。
【００５２】
（トウモロコシの加工度の評価）
トウモロコシ粒７ｇをマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕し、トウモロコシ粉砕物を得た。加熱していないトウモロコシ粉砕物から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けていないＤＮＡを抽出した。また、１４０℃で１５分、３０分、６０分、及び１２０分加熱したトウモロコシ粉砕物のそれぞれからも、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けたＤＮＡを抽出した。その後、トウモロコシ粉砕物から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた以外は、上記の調整されたＰＣＲの条件を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【００５３】
その結果、図２９に示すように、トウモロコシ粉砕物が加熱されていない場合、配列長が約１００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約２００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、配列長が約４００ｂｐの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約８００ｂｐの増幅産物の増幅曲線が、実質的に同じになった。しかし、図３０ないし図３３に示すように、トウモロコシ粉砕物が加熱された場合、加熱時間が長くなるにつれて、配列長が短い増幅産物と比較して、配列長が長い増幅産物の生成効率が低下し、増幅曲線の違いが大きくなっていった。
【００５４】
また、図３４ないし図３８に示すように、グラフの横軸に増幅産物の配列長、縦軸に増幅曲線の蛍光強度の閾値を０．２５６に設定した場合のＣｔ値をとってプロットし、プロットを最小二乗法によって一次関数に近似した。いずれも決定係数Ｒ2は良好であった。得られた一次関数の傾きは、配列長に対するＣｔ値の増加率を表している。トウモロコシが加熱により加工された場合、増幅産物の配列長と、Ｃｔ値と、は相関しており、加熱時間が長くなるほど、配列長に対するＣｔ値の増加率が大きくなる傾向にあることが示された。加熱時間が長くなるほど、ＤＮＡの損傷の程度は大きくなる。したがって、配列長に対するＣｔ値の増加率が低い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が小さく、トウモロコシの加工の程度も小さいと評価可能であり、配列長に対するＣｔ値の増加率が高い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が大きく、トウモロコシの加工の程度も大きいと評価可能であることが示された。
【００５５】
（食品の加工度の評価）
コムギ、大豆、及びトウモロコシの結果から、種によらず、配列長に対するＣｔ値の増加率が低い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が小さく、食品の加工の程度も小さいと評価可能であり、配列長に対するＣｔ値の増加率が高い場合は、ＤＮＡの損傷の程度が大きく、食品の加工の程度も大きいと評価可能であることが示された。
【００５６】
（加工度の数値化）
コムギを例にとり、食品の加工度を、以下のように定義し、算出した。加熱等の加工されたコムギから抽出された鋳型ＤＮＡ中の１００ｂｐのある部分配列が断片化せずに残存している確率をａ（０≦ａ≦１）とすると、鋳型ＤＮＡ中の１００ｂｐ当たりの分解率は（１−ａ）で表される。この１００ｂｐ当たりの分解率（１−ａ）は、コムギの加熱による加工度と相関するから、（１−ａ）をコムギの加工度と定義した。図１４ないし図１８に示した近似一次関数のそれぞれの傾きをｋ、ＰＣＲの１サイクルあたりの増幅率をｂとすると、１００ｂｐあたりのＣｔ値の差（増加量）は１００ｋであり、ＰＣＲ後の鋳型ＤＮＡ中のある部分配列のコピー数ＮWLに対して、配列長が１００ｂｐ短いある部分配列のコピー数ＮWSの比ＮWS／ＮWLはｂ100kである。この場合、鋳型ＤＮＡ中の１００ｂｐのある部分配列が断片化せずに残存している確率ａは、１／（ｂ100k）であり、１００ｂｐ当たりの分解率（１−ａ）、すなわち、コムギの加工度（１−ａ）は、１−１／（ｂ100k）である。
【００５７】
理想的なＰＣＲでは、１サイクルあたりの増幅率ｂは２である。この場合、図１４ないし図１８に示した近似一次関数のそれぞれの傾きをｋから導かれるコムギの加工度（１−ａ）は、表２に示すとおりであった。
【表２】
2015035977.tif 000004
【００５８】
このように複数のリアルタイムＰＣＲの結果を用いることにより、鋳型ＤＮＡの断片化の程度を数値化し、かつ、鋳型ＤＮＡを抽出した食品の加工度を表すことも可能となることが示された。なお、ＰＣＲの１サイクルあたりの増幅率ｂは、使用するプライマーペアにおいて、サンプルの段階希釈系列でリアルタイムＰＣＲを実施し、検量線を作成した上で、定法に従ってその傾きから決定してもよい。
【００５９】
（遺伝子組換え作物検出試験への応用）
遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）混入食品として、モンサント社のラウンドアップレディー大豆（ＲＲＳ）が１％混入している大豆サンプルを用意した（ＩＲＭＭより購入。Ｃｏｄｅ：ＥＲＭ−ＢＦ４１０ＤＫ）。次に、未加熱の大豆サンプルから、鋳型ＤＮＡを抽出した。また、１６０℃で、１５分、３０分、６０分、及び１２０分加熱した大豆サンプルのそれぞれからも、鋳型ＤＮＡを抽出した。その後、上記の方法と同様に、加工度を算出したところ、表３に示すとおりであった。例えば、ＧＭＯ検出試験を行う場合には、偽陰性が５％未満であること要求され、これは、２１回試験を行い、２０回以上、ＧＭＯを検出できることに相当する。表３に示すように、加工度０．５までは、２１回中２１回、ＲＲＳを検出できたが、加工度０．７５では、２１回中、ＲＲＳを検出できたのは１６回だけであった。よって、加工度が０．５以下であれば、正確にＲＲＳの検出試験を行えることが示された。
【００６０】
【表３】
2015035977.tif 000005
食品が遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）を含有しているか否かを検査する場合、食品の加工が進むと正確な検査が行えない場合がある。しかし、食品の加工の程度は明らかではないため、検査が可能かどうかの判断ができなかった。これに対し、事前に食品の加工度を知ることで、正確な検査実施の可否が判断できるようになり、検査を行える食品の対象を広げられる可能性が示された。
【００６１】
（デジタルＰＣＲの利用例１）
未加工の大豆をマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕し、大豆粉砕物を得た。加熱していない大豆粉砕物から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けていないＤＮＡを抽出した。その後、抽出したＤＮＡを希釈した後、鋳型ＤＮＡとし、大豆内在性遺伝子であるレクチン遺伝子（Ｌｅ１）を標的として、表４に示す第Ｄ１及び第Ｄ２のプライマーペア、並びにプローブを用いてデジタルＰＣＲを行った。
【表４】
2015035977.tif 000006
【００６２】
第Ｄ１のプライマーペアは、フォワードプライマーとして配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとして配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、を備え、レクチン遺伝子（Ｌｅ１）の異なる２箇所にハイブリダイズし、ＰＣＲにより塩基対数１１８ｂｐの増幅産物を生じさせる。また、第Ｄ２のプライマーペアは、フォワードプライマーとして配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとして配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、を備え、レクチン遺伝子（Ｌｅ１）の異なる２箇所にハイブリダイズし、ＰＣＲにより塩基対数２８６ｂｐの増幅産物を生じさせる。プローブは、配列番号１０の塩基配列を有する。
【００６３】
次に、２．５μＬのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．５μＬの濃度が５μｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマー、０．５μＬの濃度が５μｍｏｌ／Ｌのリバースプライマー溶液、０．５μＬの濃度が２μｍｏｌ／Ｌである蛍光標識核酸プローブ、０．５μＬの鋳型ＤＮＡを十分に混合して、滅菌水で５μＬに調整した。この反応液を９６ウェルＰＣＲプレートの全ウェルに添加した。鋳型ＤＮＡには、加熱による分解作用を受けていない大豆由来ＤＮＡを２ｐｇ／μＬに希釈したものを用いた。これにより、一つのウェルに鋳型ＤＮＡが実質的に１コピー以下しか存在しないようにした。プライマーペアは第Ｄ１のものと第Ｄ２のものの２種類を用いた。リアルタイムＰＣＲ装置で、反応液を５０℃で２分間保持後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で１５秒保持、６０℃で１５秒保持、及び７２℃で２分保持を１サイクルとして、５０サイクルの反復を実施した。図３９に示すように第Ｄ１のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数１１８ｂｐの増幅産物が９６ウェル中１回目は２６ウェル、２回目は２４ウェル、３回目は２７ウェルで確認された。一方、図４０に示すように第Ｄ２のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数２８６ｂｐの増幅産物が生じたウェルの数は、９６ウェル中、１回目は２２ウェル、２回目は３０ウェル、３回目は２９ウェルであった。両増幅産物が得られた回数及び割合は、ｔ検定の結果、有意差はなく、実質的に同じと判断された。よって、これを調整されたＰＣＲの条件とした。
【００６４】
調整されたＰＣＲの条件の下、鋳型ＤＮＡ溶液に９５℃１５分の加熱処理を加えてから、同様の分析を行った。図４１に示すように第Ｄ１のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数１１８ｂｐの増幅産物は、９６ウェル中１回目は１２ウェル、２回目は１２ウェル、３回目は１６ウェルで確認された。一方、図４２に示すように第Ｄ２のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数２８６ｂｐの増幅産物は、９６ウェル中、１回目は３ウェル、２回目は３ウェル、３回目は４ウェルでのみ確認された。塩基対数１１８ｂｐの増幅産物と塩基対数２８６ｂｐの増幅産物が得られた回数及び割合には、有意な差が確認された。断片化を受けたＤＮＡを分析した場合に、増幅長が長いほど、生成効率が低下する現象は、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値を生成効率として分析を行った結果と合致している。このことから、ＰＣＲとしてデジタルＰＣＲを用い、ＰＣＲで増幅産物が確認される回数もしくは割合を生成効率とした場合でも、ＤＮＡの断片化の程度を評価することが可能であることが明らかとなった。
【００６５】
（デジタルＰＣＲの利用例２）
未加工のコムギをマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕し、コムギ粉砕物を得た。加熱していないコムギ粉砕物から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けていないＤＮＡを抽出した。その後、抽出したＤＮＡを希釈した後、鋳型ＤＮＡとし、１８ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列内の植物特異的配列を標的として、表１に示した第１及び第２のプライマーペア、並びにプローブを用いてデジタルＰＣＲを行った。
【００６６】
次に、２．５μＬのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．５μＬの濃度が２μｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマー、０．５μＬの濃度が２μｍｏｌ／Ｌのリバースプライマー溶液、０．５μＬの濃度が２μｍｏｌ／Ｌである蛍光標識核酸プローブ、０．５μＬの鋳型ＤＮＡを十分に混合して、滅菌水で５μＬに調整した。この反応液を９６ウェルＰＣＲプレートの全ウェルに添加した。鋳型ＤＮＡには、加熱による分解作用を受けていないコムギ由来ＤＮＡを２．５×１０-3ｐｇ／μＬに希釈したものを用いた。これにより、一つのウェルに鋳型ＤＮＡが実質的に１コピー以下しか存在しないようにした。プライマーペアは第１のものと第２のものの２種類を用いた。リアルタイムＰＣＲ装置で、反応液を５０℃で２分間保持後、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で１５秒保持、６０℃で１５秒保持、及び７２℃で２分保持を１サイクルとして、５０サイクルの反復を実施した。図４３に示すように第１のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数約１００ｂｐの増幅産物が９６ウェル中１回目は１６ウェル、２回目は１６ウェル、３回目は２０ウェルで確認された。一方、図４４に示すように第２のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数約２００ｂｐの増幅産物が生じたウェルの数は、９６ウェル中、１回目は１６ウェル、２回目は２１ウェル、３回目は１２ウェルであった。両増幅産物が得られた回数及び割合は、ｔ検定の結果、有意差はなく、実質的に同じと判断された。よって、これを調整されたＰＣＲの条件とした。なお、このようにＰＣＲの条件を調整しなかった場合は、両増幅産物が得られた回数及び割合は、有意差があった。
【００６７】
調整されたＰＣＲの条件の下、鋳型ＤＮＡ溶液に９５℃１５分の加熱処理を加えてから、同様の分析を行った。図４５に示すように第１のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数約１００ｂｐの増幅産物は、９６ウェル中１回目は１１ウェル、２回目は９ウェル、３回目は１１ウェルで確認された。一方、図４６に示すように第２のプライマーペアを用いた測定を３回実施したところ、塩基対数約２００ｂｐの増幅産物は、９６ウェル中、１回目は４ウェル、２回目は１ウェル、３回目は５ウェルでのみ確認された。塩基対数約１００ｂｐの増幅産物と塩基対数約２００ｂｐの増幅産物が得られた回数及び割合には、有意な差が確認された。コムギ由来のＤＮＡにおいても、断片化を受けたＤＮＡを分析した場合に、増幅長が長いほど、生成効率が低下する現象は、リアルタイムＰＣＲのＣｔ値を生成効率として分析を行った結果と合致している。このことから、ＰＣＲとしてデジタルＰＣＲを用い、ＰＣＲで増幅産物が確認される回数もしくは割合を生成効率とした場合でも、ＤＮＡの断片化の程度を評価することが可能であることが明らかとなった。
【００６８】
（加工前のＤＮＡ数の推定）
大豆粉をマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕し、大豆粉砕物を得た。加熱していない大豆粉砕物から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けていないＤＮＡを抽出した。その後、抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、大豆内在性遺伝子であるレクチン遺伝子（Ｌｅ１）を標的として、表５に示す第５及び第６のプライマーペア、並びにプローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
【表５】
2015035977.tif 000007
【００６９】
第５のプライマーペアは、フォワードプライマーとして配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとして配列番号８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、を備え、レクチン遺伝子（Ｌｅ１）の異なる２箇所にハイブリダイズし、リアルタイムＰＣＲにより塩基対数１１８ｂｐの増幅産物を生じさせる。また、第６のプライマーペアは、フォワードプライマーとして配列番号７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとして配列番号９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、を備え、レクチン遺伝子（Ｌｅ１）の異なる２箇所にハイブリダイズし、リアルタイムＰＣＲにより塩基対数４１２ｂｐの増幅産物を生じさせる。プローブは、配列番号１０の塩基配列を有する。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲの際、図４７に示すように、第５のプライマーペアのリバースプライマーの濃度を０．０４μｍｏｌ／Ｌ、０．０２μｍｏｌ／Ｌ、０．０１μｍｏｌ／Ｌ、及び０．００５μｍｏｌ／Ｌに振ったところ、０．０４μｍｏｌ／Ｌのときに、図４８に示すように、塩基対数１１８ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、塩基対数４１２ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、が実質的に重なり、Ｃｔ値が実質的に同じになった。よって、これを調整されたＰＣＲの条件とした。
【００７１】
調整されたＰＣＲの条件の下、鋳型ＤＮＡ溶液の濃度を、１倍、１／１０倍、１／１００倍、及び１／１０００倍に振って、リアルタイムＰＣＲを実施した。その結果、図４９に示すように、鋳型ＤＮＡの濃度が減少するにつれて、Ｃｔ値が高くなる傾向にあったが、各濃度においては、塩基対数１１８ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、塩基対数４１２ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、が実質的に重なり、Ｃｔ値が実質的に同じになった。したがって、鋳型ＤＮＡの広い濃度範囲において、増幅産物の配列長による生成効率の違いが生じないことが確認された。
【００７２】
次に、１１０℃で５分加圧加熱処理した大豆粉砕物からも、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて、加熱による分解作用を受けたＤＮＡを抽出した。その後、第５及び第６のプライマーペアを用い、上記の調整されたＰＣＲの条件の下、リアルタイムＰＣＲを実施した。その結果、図５０に示すように、塩基対数１１８ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、塩基対数４１２ｂｐの増幅産物の増幅曲線と、が重ならなくなり、Ｃｔ値の差が５．１８あった。
【００７３】
公知の手法を用いて、段階的に希釈したプラスミドを用いて検量線を作成し、加圧加熱処理されなかった大豆粉砕物から抽出されたＬｅ１のコピー数を求めたところ、５３，４１７であった。また、同様に、加圧加熱処理された大豆粉砕物から抽出されたＬｅ１のコピー数を求めたところ、１９，０２８であった。
【００７４】
ここで、食品から抽出された鋳型ＤＮＡの長い部分配列のコピー数をＮSL、食品から抽出された鋳型ＤＮＡの短い部分配列のコピー数をＮSS、食品から抽出された鋳型ＤＮＡが加工により断片化せずに残存している確率をｄ、長い部分配列の配列長をＬL、短い部分配列の配列長をＬS、ＰＣＲの１サイクルあたりの増幅率をｂ、短い部分配列と長い部分配列の増幅産物のＣｔ値の差をΔＣｔとすると、下記（１）式及び（２）式が成立する。
ＮSL＝ＮSS×ｄ＾（ＬL／ＬS）    ・・・（１）
ＮSL＝ＮSS÷ｂ＾ΔＣｔ          ・・・（２）
【００７５】
（１）式及び（２）式のＬLに４１２、ＬSに１１８、ｂに２、ΔＣｔに５．１８を代入すると、下記（３）式及び（４）式が得られる。
ＮSL＝ＮSS×ｄ＾（４１２／１１８）      ・・・（３）
ＮSL＝ＮSS÷２＾５．１８                ・・・（４）
（３）式及び（４）式の連立方程式を解くと、加圧加熱処理された大豆粉砕物から抽出されたＬｅ１が断片化せずに残存している確率ｄは、０．３６であった。
【００７６】
上述したように、加熱された大豆粉砕物から抽出されたＬｅ１のコピー数は１９，０２８であったから、加熱されなかった大豆粉砕物から抽出されたＬｅ１のコピー数は、下記（５）式より５２，８５５と見積もられた。
１９，０２８÷０．３６＝５２，８５５    ・・・（５）
上述したように、公知の手法により求められた加熱されなかった大豆粉砕物から抽出されたＬｅ１のコピー数は、５３，４１７であったため、見積もられたコピー数の精度は高かった。したがって、加工される前の食品の入手が困難である場合であっても、加工した食品から抽出したＤＮＡに含まれる鋳型核酸配列の量と、増幅産物のＣｔ値の差と、に基づいて、加工される前の食品に含まれる鋳型核酸配列の量を見積もることが可能であることが示された。
【図１】
2015035977.tif 000008
【図２】
2015035977.tif 000009
【図３】
2015035977.tif 000010
【図４】
2015035977.tif 000011
【図５】
2015035977.tif 000012
【図６】
2015035977.tif 000013
【図７】
2015035977.tif 000014
【図８】
2015035977.tif 000015
【図９】
2015035977.tif 000016
【図１０】
2015035977.tif 000017
【図１１】
2015035977.tif 000018
【図１２】
2015035977.tif 000019
【図１３】
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【図１４】
2015035977.tif 000021
【図１５】
2015035977.tif 000022
【図１６】
2015035977.tif 000023
【図１７】
2015035977.tif 000024
【図１８】
2015035977.tif 000025
【図１９】
2015035977.tif 000026
【図２０】
2015035977.tif 000027
【図２１】
2015035977.tif 000028
【図２２】
2015035977.tif 000029
【図２３】
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【図２４】
2015035977.tif 000031
【図２５】
2015035977.tif 000032
【図２６】
2015035977.tif 000033
【図２７】
2015035977.tif 000034
【図２８】
2015035977.tif 000035
【図２９】
2015035977.tif 000036
【図３０】
2015035977.tif 000037
【図３１】
2015035977.tif 000038
【図３２】
2015035977.tif 000039
【図３３】
2015035977.tif 000040
【図３４】
2015035977.tif 000041
【図３５】
2015035977.tif 000042
【図３６】
2015035977.tif 000043
【図３７】
2015035977.tif 000044
【図３８】
2015035977.tif 000045
【図３９】
2015035977.tif 000046
【図４０】
2015035977.tif 000047
【図４１】
2015035977.tif 000048
【図４２】
2015035977.tif 000049
【図４３】
2015035977.tif 000050
【図４４】
2015035977.tif 000051
【図４５】
2015035977.tif 000052
【図４６】
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【図４７】
2015035977.tif 000054
【図４８】
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【図４９】
2015035977.tif 000056
【図５０】
2015035977.tif 000057
【配列表】
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