(57)【要約】【課題】本発明は、新規かつ安全性が高い関節炎予防または改善剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明により、１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）を有効成分として含有する、あるいは有効成分としての１４−ＤＨＥを含有する麹菌発酵エキスを含む、関節炎予防または改善剤が提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として１４−デヒドロエルゴステロールまたはそれを含有する麹菌発酵エキスを含む、関節炎予防または改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の関節炎予防または改善剤を含有する食品または動物飼料、あるいはそれらに用いる添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）またはそれを含有する麹菌発酵エキスを含む、関節炎予防または改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチや変形性関節症などによる関節炎に悩まされる患者数は非常に多く、関節炎の予防法や改善法の開発が今なお求められている。例えば、リウマチ性関節炎の治療には、非ステロイド性消炎鎮痛剤、ステロイド剤、抗リウマチ剤および免疫抑制剤などが一般的に用いられるが、それらの薬剤には胃腸障害、肝機能障害および易感染性といった副作用が伴うことが知られている。そのような重篤な副作用を伴わず安全性が高い関節炎予防または改善剤の提供が望まれている。
【０００３】
一方、本件出願人は、以前、穀類植物由来材料の麹菌発酵物に１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）が含まれること、ならびにそれが免疫疾患の予防または治療に有用であること、およびヘリコバクター菌、病原性大腸菌および歯周病菌などの細菌感染に起因する炎症に対して抗炎症作用を有することを見出している（特許文献１および２）。しかし、１４−ＤＨＥがｉｎ ｖｉｔｒｏで抗炎症作用を有すること、マウス多発性硬化症モデルにおいて１４−ＤＨＥを腹腔内投与すると発症率を低下させたり発症を遅延させたりする効果を有すること、およびマウスにおけるヘリコバクター菌感染性胃炎モデルにおいて麹菌発酵エキスを胃内投与することによりＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を抑制することは確認されたが、１４−ＤＨＥが関節炎の予防または改善に有効であるかは具体的には確認されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１０−１５０８６７号公報
【特許文献２】特開２０１３−２２７２５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規かつ安全性が高い関節炎予防または改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、１４−ＤＨＥを含有する麹菌発酵エキスが関節炎の発症および増悪の抑制に非常に有効であることを見出した。本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）有効成分として１４−デヒドロエルゴステロールまたはそれを含有する麹菌発酵エキスを含む、関節炎予防または改善剤。
（２）（１）に記載の関節炎予防または改善剤を含有する食品または動物飼料、あるいはそれらに用いる添加物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の関節炎予防または改善剤によれば、従来の関節炎治療薬よりも安全性が高い関節炎の予防法または改善法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例で調製した麹エキスのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】マウスを用いた１４−ＤＨＥ投与試験のスケジュールを説明する図である。
【図３】関節炎発症率の推移を示すグラフである。
【図４】関節炎スコアの推移を示すグラフである。
【図５】ＤＣ細胞表面タンパク質分子の発現量を示すグラフである。
【図６】ＣＤ４およびＣＤ８陽性のＴ細胞における細胞内産生サイトカインの量を示すグラフである。
【図７】血中の総ＩｇＧ量を測定した結果を示すグラフである。
【図８】二次免疫後一週間後のＴｙｐｅＩＩコラーゲン特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ量を測定した結果を示すグラフである。
【図９】マウス後肢の関節組織の切片の観察像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明における麹菌発酵エキス（以下、麹エキスとも称する）とは、麹菌が原料を発酵させることにより産出した発酵物の抽出物であり、１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）を含有することを特徴とする。１４−ＤＨＥは、下記の構造式で表される化合物であり、下記に記載したような物理化学的特性を有する。１４−ＤＨＥは公知の化合物であるが、その生理活性については、上記の特許文献１において免疫調節作用が報告されるまでは知られていなかった。特に関節炎を予防しまたは改善する作用を有することはこれまで知られていない。
（構造式）
【００１０】
【化１】
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【００１１】
（物理化学的特性）
（１）分子量：394.63
（２）分子式：C28H42O(高分解能APCI-Orbitrap法による観測値:m/z 395.33057(M+H)+)、理論値395.33139
（３）溶剤に対する溶解性：水に不溶、エタノールに難溶、クロロホルムに易溶
（４）紫外吸収スペクトル(MeCN)：391nm
（５）1H-NMR(CD3OD)： 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9
Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H,m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m),1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m),1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m),1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz).
（６）13C-NMR(CD3OD)：149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s),120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s).
【００１２】
本発明の麹菌発酵エキスの調製に用いる麹菌は、１４−ＤＨＥを産生することができるものであれば特に限定されないが、例えば、黒麹菌（アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー）、黄麹菌（アスペルギルス・オリゼー）、紅麹菌（モナスカス・アンカ）、醤油用麹菌（アスペルギルス・ソーヤ）、白麹菌（アスペルギルス・カワチ）、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）などが挙げられる。特に、アスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌である麹菌は１４−ＤＨＥ高産生であるため好ましい。本発明で用いる麹菌としては、とりわけ狭義の黒麹菌であるアスペルギルス・アワモリおよびアスペルギルス・ニガー、ならびに狭義の白麹菌であるアスペルギルス・カワチ、さらにこれらの菌種から誘導された亜種が好ましい。これらの麹菌の種麹は、秋田今野社、樋口もやし社、日本醸造工業社などから入手することができる。
【００１３】
上記の麹菌を用いて発酵させるための原料としては、穀類植物に由来する材料が１４−ＤＨＥ高生産のために好ましい。穀類植物としては、植物分類表においてイネ科に分類されるすべての植物、具体的にはイネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、アワ、ヒエ、トウモロコシなどが挙げられる。なかでも、イネ、オオムギ、コムギおよびライムギが好ましい。発酵原料とする材料としては、上記のような穀類植物の種子が特に好ましく、さらにそれらを発芽させた麦芽（特に大麦麦芽）や発芽玄米なども好ましい。あるいは、それらの種子の外皮、例えば、穀類種子全粒粉、穀類植物のフスマ、米糠なども発酵原料として好ましい。
【００１４】
麹菌を用いた発酵は、原料に麹菌を接種して培養する当業者に公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、従来の蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法などを挙げることができる。また、固体原料に麹菌を接種して培養するのみならず、原料成分を水などの溶媒に溶解させた液体原料（液体培地）に麹菌を接種して培養して発酵を行ってもよい。
【００１５】
麹菌発酵エキスは、発酵により得られた発酵物を適切な溶媒を用い、一般的な手法により抽出することにより得ることができる。溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタンなどが挙げられる。中でもエタノール、メタノール、酢酸エチル、およびヘキサンが好ましい。これらの溶媒は２種類以上を混合して用いてもよく、また２種類以上の有機溶媒を用いて２段階以上の溶媒抽出工程を行なってもよい。あるいは、そのような有機溶媒に代えて、またはそれらと組み合わせて、食用油脂を抽出溶媒として用いることができる。食用油脂は、好ましくは植物性油脂であり、例えば大豆油、ナタネ油、オリーブ油、パーム油、ゴマ油、コーン油、サフラワー油、綿実油、ピーナッツオイル、グレープシードオイル、えごま油、つばき油、亜麻仁油などが挙げられる。
【００１６】
麹菌発酵エキスには、有効成分としての１４−ＤＨＥに加えて、その他の成分も含まれていてもよい。麹菌発酵エキスに含まれ得るその他の成分としては、アミノ酸、ジペプチドやトリペプチドなどのオリゴペプチド、セラミド、エルゴステロール、γ−オリザノールが挙げられる。そのような成分が１４−ＤＨＥと相乗的に作用し、関節炎の予防または改善作用に寄与している可能性も考えられる。
【００１７】
本発明の関節炎予防または改善剤は、種々の関節炎の発症および既に発症している関節炎の増悪を抑制する作用を有する。本明細書でいう関節炎には、クラミジア関節炎、慢性吸収性関節炎、腸疾患性関節炎、淋菌性関節炎、痛風関節炎、ジャクー関節炎、若年性関節炎、ライム関節炎、アルカプトン尿性関節炎、化膿性関節炎、変形性関節症による関節炎、肩関節周囲炎（いわゆる五十肩）、過度の運動負荷による関節炎、リウマチ性関節炎などが含まれる。本発明の関節炎予防または改善剤は、特にリウマチ性関節炎に有効である。
【００１８】
本発明の関節炎予防または改善剤は、その剤形は特に限定されないが、経口投与用の剤型とすることが利便性向上のために好ましい。本発明の関節炎予防または改善剤は、経口投与によってその関節炎予防または改善作用を奏することができる。経口投与剤型は、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、溶液剤、懸濁化剤、乳濁化剤、ゲル化剤などの経口投与に適するいずれの剤型も選択可能である。製剤化にあたっては、有効成分である麹菌発酵エキスまたは１４−ＤＨＥに加えて、担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、増量剤、着色剤、香味剤、甘味料、安定化剤、保存料などの公知の成分を用いてもよい。
【００１９】
本発明の関節炎予防または改善剤は、食品または動物飼料に加えてそれらに関節炎予防または改善機能を付与するための添加物として用いることができる。従って、本発明は別の側面において、上述の関節炎予防または改善剤を含有する食品または動物飼料用添加物、ならびにそれを含有する食品または動物飼料に関する。
【００２０】
本発明において言及する食品としては、例えばパン類、菓子類、クッキー、ビスケット、チューインガム、シリアルバーなどの穀類加工品、牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム、チーズ等の乳製品類、炭酸飲料、清涼飲料、果汁入り飲料（オレンジジュース、リンゴジュース、グレープフルーツジュースなどの果汁入り飲料）、スポーツドリンク、茶、紅茶、コーヒーなどの飲料、ソース、ドレッシング、調味料、惣菜、加工食品などが挙げられる。一般的な食品に本発明の添加物を加えることにより、それらを摂取したヒトの健康に資する健康食品、機能性食品または特定保健用食品とすることができる。
【００２１】
本発明において言及する動物飼料としては、ウシ、ブタおよびヒツジなどの家畜動物用の飼料、イヌやネコなどの愛玩動物用の飼料、ならびにマウスやラットなどの実験動物用の飼料が挙げられる。
【００２２】
また本発明の関節炎予防または改善剤は、サプリメント、すなわち栄養補助食品として提供することができる。従って、本発明は別の側面において、上述の関節炎予防または改善剤を含有するサプリメントに関する。
【００２３】
本発明はまた、別の側面において、１４−デヒドロエルゴステロールを有効成分として含有する、関節炎予防または治療用医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の関節炎予防または改善剤およびそれを含むサプリメント、食品または動物飼料、ならびに関節炎予防または治療用医薬組成物は、その作用を十分奏するためには、含有される１４−ＤＨＥの重量に換算して、１日あたり０．０１ｍｇ／体重ｋｇ以上、特に１ｍｇ／体重ｋｇ以上の量でヒトまたは動物に摂取させる、あるいは投与することが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（１）麹エキスの調製
白麹（Aspergillus kawachii NBRC4308）をポテトデキストロース寒天培地（Difco、ＢＤ社）に植菌し、２５℃で７日間静置培養した。０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０を含む麦芽エキス培地（Difco Malt Extract Broth、ＢＤ社）に胞子を形成した菌体を懸濁し、フィルター濾過を行なったものを胞子溶液とした。オートクレーブ滅菌後の麦芽エキス培地５０ｍＬを容量２００ｍＬのバッフル付三角フラスコに入れ、そこに１．０×１０５胞子／ｍＬの濃度になるように胞子溶液を添加し、３０℃、１２０ｒｐｍで２０時間振盪培養を行ったものを前培養液とした。
【００２７】
次に５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社）に麦芽エキス培地３．５Ｌを張り、オートクレーブ滅菌処理した後、前培養液の全量５０ｍＬを添加し、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で９６時間培養を行なった。その後、培養した菌体を回収し、エタノールにて一晩浸漬後、ボルテックスで１分間攪拌を行い、遠心分離して得た上清をドライアップしたものを麹エキスとした。
【００２８】
（２）麹エキス中の１４−ＤＨＥの確認
上記（１）で得られた麹エキスをエタノールで１０ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いでエタノール／アセトニトリルで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、さらに０．２２μｍ径のＰＴＦＥ膜で濾過したものをＨＰＬＣサンプルとした。これをDevelosil C30-UG-3（１０×２５０ｍｍ、野村化学社）を用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル／イソプロパノール＝９９／１）に供して分析した。麹エキス中の１４−ＤＨＥピークを確認し、麹エキス１ｍｇ中に１４−ＤＨＥが２５μｇ含まれることを確認した（図１）。
【００２９】
（３）実験動物
１７匹のＤＢＡ／１Ｊマウス（雄、７週齢、チャールスリバー社より購入）に対し、ＩＩ型コラーゲン（コスモバイオ社）１５０μｇをＣＦＡ４００μｇと混合してエマルジョン化したものをスコア検定開始２１日前（第−２１日目、一次免疫）およびスコア検定開始日（第０日目、二次免疫）に皮内投与して関節炎を誘導した。
【００３０】
（４）実験条件
マウスを対照群８匹と麹エキス混餌食群９匹に分け、麹エキス混餌食群にはスコア検定開始２１日前である一次免疫開始日（第−２１日目）から第１８日目までの毎日、麹エキスを１０ｍｇ（１４−ＤＨＥ含有量２５０μｇ）／匹／日とした飼料により混餌投与した（図２）。
【００３１】
（５）関節炎スコア
各マウスの４本の足のそれぞれを下記の基準に基づいて観察し、４本の足のスコアの合計を算出した。スコアが１以上となったときに関節炎を発症したと判断した。
スコア０：正常
スコア１：四肢の指など小関節が１本のみ膨張発赤
スコア２：小関節２つ以上、あるいは手首・足首など大きな関節が膨張発赤
スコア３：手や足全体が発赤膨張
スコア４：手や足の膨張が最大限に達している
【００３２】
（６）解剖と炎症状態の解析
マウスを二次免疫後第１８日目に安楽殺し、採血を行い、後肢の関節と鼠径リンパ節を摘出した。後肢の関節については、１０％中性ホルマリン緩衝液を用いて固定し、脱灰作業を行なった後、パラフィン切片を作製し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。鼠径リンパ節については、コラゲナーゼＩＶ（ＳＩＧＭＡ社）およびＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で反応後、７０μｍ滅菌フィルター（ＢＤ社）で濾過し、リンパ球を調製した。調製したリンパ球をＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）およびイオノマイシンを含有するLeukocyte activation cocktail（ＢＤ社）で４時間、３７℃にて処理し、BD Cytofix/Cyoperm kit（ＢＤ社）を用いてＣＤ４およびＣＤ８陽性のＴ細胞の細胞内産生サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ）を検出した。また、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂ陽性細胞をミエロイド樹状細胞とし、その細胞表面タンパク質分子（ＭＨＣ−ＩＩおよびＣＤ８６）の発現量をフローサイトメーターで測定した。さらに、二次免疫開始日から第７日目と解剖時（第１８日目）に採血を行い、血中のＩｇＧ量を測定した。ＥＬＩＳＡキットはMouse IgG ELISA Quantitation Set、Mouse IgG1 ELISA Quantitation Set、およびMouse IgG2a ELISA Quantitation Set（いずれもBethyl Laboratories社）を用いた。
【００３３】
（７）実験結果
図３は関節炎発症率の推移を示すグラフであり、図４は関節炎スコアの推移を示すグラフである。対照群では二次免疫後６日目で発症が始まり、それから１週間でほぼ完全に発症した。一方、麹エキス投与群では二次免疫後５日目で発症が始まったが、それから１週間経過しても発症率は８０％に満たなかった。また、対照群では臨床スコアが最高で８．９まで上昇したが、麹エキス投与群ではスコア７．４までしか病状が進行しなかった。
【００３４】
図５は、細胞表面タンパク質分子の発現量を示すグラフである。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃ陽性のミエロイド樹状細胞について、麹エキスの摂取により細胞表面タンパク質分子であるＭＨＣ−ＩＩの発現が減少傾向にあった。また、ＣＤ８６についても減少がみられた。
【００３５】
図６は、ＣＤ４およびＣＤ８陽性のＴ細胞における細胞内産生サイトカインの量を示すグラフである。麹エキスを摂取することにより、鼠径リンパ節に局在するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８陽性キラーＴ細胞が産生するＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γを抑制する傾向にあった。
【００３６】
図７は、血中の総ＩｇＧ量を測定した結果を示すグラフである。麹エキス投与群では、二次免疫後７日目において総ＩｇＧ量が有意に低下していた。図８は、二次免疫後一週間後のＴｙｐｅＩＩコラーゲン特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ量を測定した結果を示すグラフである。麹エキス投与群では、ＩｇＧ１の量が有意に減少し、総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａについても減少傾向にあった。
【００３７】
図９は、後肢の関節組織の切片の観察像である。対照サンプルでは膝蓋骨の局所においてパンヌス形成（図中＊印および矢印で示した箇所）や炎症性細胞の浸潤がみられたが、麹エキス投与群のサンプルではそれらの抑制が認められた。
【００３８】
以上の結果から、麹エキスは生体内、特に関節における慢性炎症および抗原特異的な炎症反応を緩和し、関節炎を予防または改善する作用を有していることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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