(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質−磁性粒子複合体及び該複合体の製造方法の提供。【解決手段】細菌中で結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質及び磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質を共発現させる共発現工程であって、第１の融合タンパク質の発現が細菌のペリプラズムへと誘導され、第２の融合タンパク質の発現が細菌の細胞質へと誘導される工程と、第１及び第２の融合タンパク質を生産するのに充分な条件下で細菌を培養する培養工程と、細菌の細胞膜を破壊することによりジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される工程、を含むグラム陰性磁性細菌におけるタンパク質−磁性粒子複合体の製造方法。【選択図】図１
2015187083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性磁性細菌における、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
（ｉ）前記細菌中で、
（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質、及び
（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質
を共発現させる共発現工程であって、前記第１の融合タンパク質の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、前記第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される工程と；
（ｉｉ）前記第１及び第２の融合タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程と；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程であって、前記ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される工程と；
を含む、製造方法。
【請求項２】
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）の前記複合体を前記破壊された細胞から単離する単離工程を更に含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記複合体から、前記ジスルフィド結合タンパク質を回収する回収工程を更に含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記結合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記結合パートナータンパク質がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のタンパク質ＡのＺＺドメインである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記ジスルフィド結合したタンパク質が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質が、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ由来のＭｍｓ１３である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
磁性粒子と；
磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質と；
第１の結合タンパク質と、該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質と；
第２の結合タンパク質と、該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質と；
を含んだ、タンパク質と磁性粒子との複合体であって、
前記第１の目的タンパク質は、前記第１の結合タンパク質と前記第１の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化され、
前記第２の目的タンパク質は、前記第２の結合タンパク質と前記第２の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化されている、複合体。
【請求項９】
前記第１の目的タンパク質及び前記第２の目的タンパク質のうち一方のタンパク質の機能は、他方のタンパク質の存在により発現し、
前記足場タンパク質が、当該第１及び第２の結合パートナーを連結するペプチドリンカーを更に含む、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
グラム陰性磁性細菌における、複数タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
（ｉ）前記細菌中で、
（ａ）第１の結合タンパク質と該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質、及び、第２の結合タンパク質と該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質と、
（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質と
を共発現させる共発現工程と；
（ｉｉ）前記第１及び第２の目的タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程であって、前記第１及び第２の目的タンパク質と磁性粒子との複合体が形成される工程と；
を含む、製造方法。
【請求項１１】
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程と；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉ）で形成された前記複合体を、前記工程（ｉｉｉ）で破壊された細胞から単離する単離工程と；
を更に含む、請求項１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質−磁性粒子複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性粒子は、磁石により簡単に分離及び誘導することができ、且つ、それらの操作を比較的簡便に自動化できるため、近年、医療及び環境等の分野における応用が期待されている。例えば、医療分野における応用として、磁性粒子の表面上に、抗原又は抗体のような機能性タンパク質又はペプチド（以下、「タンパク質」と総称する）を固定化した複合体（以下、「タンパク質−磁性粒子複合体」という）を使用して、抗原抗体反応により、抗体又は抗原を検出する技術が提案されている（特許文献１〜３）。抗体又は抗原と反応した複合体は、磁気的に分離することができる。
【０００３】
このようなタンパク質−磁性粒子複合体は、目的のタンパク質と磁性粒子とをそれぞれ別の系で産生し、該タンパク質を該磁性粒子上に固定化することによって調製されていた。例えば、目的のタンパク質は、大腸菌や酵母等の細菌を用いて産生し、他方、磁性粒子は、菌体内で磁性細菌粒子（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（以下、「ＢａｃＭＰｓ」という））を生産する磁性細菌を用いて産生し、そして、該タンパク質を、多官能化合物や架橋剤等を用いた化学的処理によって該磁性粒子上に固定化することにより、タンパク質−磁性粒子複合体を形成していた。具体的には、表面をアミノ基またはカルボキシル基で修飾した磁性粒子と、タンパク質とを架橋剤存在下で混合することによって、タンパク質を磁性粒子表面の脂質二重膜に固定化できることが報告されている（特許文献２及び３）。しかし、このような手法は機能性タンパク質のアミノ基やカルボキシル基をランダムに担体上に固定化することから、該タンパク質の変性や失活を招く。更に、固定化には、多くのタンパク質が必要となることに加え、操作も煩雑となる。
【０００４】
また、遺伝子工学的手法を用いて、磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）表面の脂質二重膜に局在するアンカータンパク質をコードする遺伝子に、目的の機能性タンパク質（ここでは、抗体）と結合親和性を有するタンパク質（ここでは、抗体結合ドメイン）をコードする遺伝子を融合させて作製したプラスミドを利用する方法も提案されている（特許文献４）。該プラスミドを磁性細菌に導入して得られた形質転換体を用いて培養して、アンカータンパク質と前記抗体結合ドメインとをディスプレイした磁性細菌粒子を得る。そして、菌体から該磁性細菌粒子を単離し、当該粒子に抗体を含んだ溶液を添加することにより、抗体を前記磁性粒子上に固定化することができる。しかし、この手法も前記複合体を得るまでに煩雑な操作を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２９４８９３５号公報
【特許文献２】特開平５−２０９８８４号公報
【特許文献３】特開平５−０９９９２６号公報
【特許文献４】特許第５１１９３９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、組み換えタンパク質−磁性粒子複合体の用途の拡大に伴い、様々な機能性分子で磁性粒子を修飾することにより、該複合体を多機能化及び高機能化することが求められている。また、煩雑な操作を必要とすることなく、タンパク質−磁性粒子複合体を製造するための方法の開発も求められている。
従って、本発明が解決しようとする課題は、新規且つ有用なタンパク質−磁性粒子複合体を提供すること、及び、煩雑な操作を必要とすることなく該複合体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
グラム陰性磁性細菌であるＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１は、鎖状に配列したナノサイズのＢａｃＭＰｓを細胞質で生産する。例えば、免疫学的検定、リガンド−受容体相互作用又は細胞分離等、遺伝子組み換えＢａｃＭＰｓの種々の適用が、目的タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に発現させることにより証明されてきたが、還元的環境であるグラム陰性磁性細菌の細胞質ではジスルフィド結合が形成されないため、適切なフォールディングのために分子内ジスルフィド結合の形成が必要であるタンパク質（以下、「ジスルフィド結合タンパク質」という）を、機能を保持した状態でＢａｃＭＰｓ上に発現させることが難しかった。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ジスルフィド結合タンパク質を、酸化的環境であるペリプラズム内で発現させ、ジスルフィド結合タンパク質のドッキングパートナーであるタンパク質を、細胞質内で発現させる二重発現系を構築した。細菌培養後、細胞を破砕し、磁性細菌粒子とジスルフィド結合タンパク質とを前記ドッキングパートナーを介してドッキングさせることで、ＢａｃＭＰｓ上にジスルフィド結合タンパク質を機能的に発現した複合体を製造することができる。この方法によれば、ジスルフィド結合タンパク質と、そのドッキングパートナーであるタンパク質とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでドッキングさせることにより複合体を形成することができるため、本明細書において「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法」と称する。
【０００８】
即ち、本発明の第１の側面は、
（１）グラム陰性磁性細菌における、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
（ｉ）前記細菌中で、
（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質、及び
（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質
を共発現させる共発現工程であって、前記第１の融合タンパク質の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、前記第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される工程と；
（ｉｉ）前記第１及び第２の融合タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程と；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する工程であって、前記ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される細胞膜破壊工程と；
を含む、製造方法である。
【０００９】
ここで、「タンパク質」の語には、タンパク質だけでなくペプチドも含まれるものとする。「ジスルフィド結合タンパク質」とは、分子中にジスルフィド結合を少なくとも１つ含むタンパク質をいう。また、「結合タンパク質」及び「結合パートナータンパク質」とは、互いに結合親和力を有し、特異的に結合を形成することのできるタンパク質同士をいう。更に、「磁性細菌粒子」とは、磁性細菌によって生成される磁性粒子をいい、本明細書では「ＢａｃＭＰｓ」とも称される。「磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質」とは、磁性細菌粒子に結合又は一体化することのできるタンパク質をいい、磁性細菌のオルガネラに本来備わっているタンパク質であっても、遺伝子工学的手法により磁性細菌粒子に結合又は一体化されるタンパク質であってもよい。
【００１０】
また、本発明の一態様は、
（２）前記工程（ｉｉｉ）の前記複合体を前記破壊した細胞から単離する単離工程（ｉｖ）を更に含む、上記（１）に記載の製造方法である。
【００１１】
更に、本発明の好ましい態様は、
（３）前記複合体から、前記ジスルフィド結合タンパク質を回収する回収工程を更に含む、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；
（４）前記結合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法；
（５）前記結合パートナータンパク質がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のタンパク質ＡのＺＺドメインである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法；
（６）前記ジスルフィド結合したタンパク質が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法；及び
（７）前記磁性細菌粒子へ結合又は一体化され得るタンパク質が、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ由来のＭｍｓ１３である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法
である。
【００１２】
先述の通り、タンパク質−磁性粒子複合体の用途の拡大に伴い、多機能化及び高機能化が求められており、様々な機能性分子で磁性粒子を修飾する試みがなされている。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオルガネラへの機能性タンパク質の固定化において、ペプチドリンカーを介して複数のタンパク質を融合し単一の融合タンパク質として発現することで、複数のタンパク質を固定化する方法がある。しかし、構造の複雑なタンパク質の融合や、複数のタンパク質の融合によって、凝集塊の形成、ミスフォールディング及びプロテアーゼによる分解が誘発される可能性がある。それ故、上記のような問題を伴うことなく、複数の機能性タンパク質を効率的にオルガネラへ固定化する技術が求められていた。
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、タンパク質発現ホストに前記磁性細菌Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏで複数の目的タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に固定化する技術を確立した。この手法によれば、足場タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に局在させると同時に、複数の目的タンパク質をそれぞれ、該足場タンパク質（結合パートナータンパク質）に結合可能なタグタンパク質（結合タンパク質）と融合した融合タンパク質として共発現させることで、複数の目的タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に固定化することができる。該手法は、複数の目的タンパク質と、足場タンパク質とをｉｎ  ｖｉｖｏでドッキングさせることにより複合体を形成するため、本明細書では「ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法」と称する。
【００１４】
即ち、本発明の第２の側面は、
（８）磁性粒子と；
磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質と；
第１の結合タンパク質と、該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質と；
第２の結合タンパク質と、該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質と；
を含んだ、タンパク質と磁性粒子との複合体であって、
前記第１の目的タンパク質は、前記第１の結合タンパク質と前記第１の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化され、
前記第２の目的タンパク質は、前記第２の結合タンパク質と前記第２の結合パートナータンパク質との結合を介して前記磁性粒子上に固定化されている、複合体。
【００１５】
ここで、「第１の結合タンパク質」及び「第１の結合パートナータンパク質」は、親和力によって互いに結合を形成することができ、「第２の結合タンパク質」及び「第２の結合パートナータンパク質」も同様の関係を有する。
【００１６】
また、本発明の好ましい態様は、
（９）前記第１の目的タンパク質及び前記第２の目的タンパク質のうち一方のタンパク質の機能が、他方のタンパク質の存在により発現する、上記（８）に記載の複合体である。
【００１７】
また、本発明の別の側面は、
（１０）グラム陰性磁性細菌における、複数タンパク質と磁性粒子との複合体の製造方法であって、
（ｉ）前記細菌中で、
（ａ）第１の結合タンパク質と該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質、
（ｂ）第２の結合タンパク質と該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質、及び
（ｃ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質を共発現させる共発現工程と；
（ｉｉ）前記第１及び第２の目的タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する培養工程であって、前記第１及び第２の目的タンパク質と該磁性細菌粒子との複合体が形成される工程と；
を含む、製造方法である。
本発明の好ましい態様は、
（１１）（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する細胞膜破壊工程と；
（ｉｖ）前記工程（ｉｉ）で形成された前記複合体を、前記工程（ｉｉｉ）で破壊された細胞から単離する単離工程と；
を更に含む、（１０）に記載の製造方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、新規且つ有用なタンパク質−磁性粒子複合体が提供される。また、煩雑な操作を必要とすることなく該複合体を製造する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一態様に係るＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法を示す。（Ａ）目的のジスルフィド結合タンパク質はペリプラズムに移動し、一方、結合タンパク質は細胞質のＢａｃＭＰｓ上に発現する。ジスルフィド結合タンパク質は、細胞溶解液からＢａｃＭＰｓを磁気的に分離する間に、ＢａｃＭＰｓ上の結合タンパク質にドッキングする。（Ｂ）発現ベクター。ここで示される融合遺伝子の全てが、Ｍ．Ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のｍｍｓ１６プロモーターの下で発現される。
【図２】ＩｇＧ結合アッセイを示す。細胞溶解前にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ｄｏｎｋｅｙ  ＩｇＧをＭｍｓ１３ＺＺ形質転換体又はＭ．Ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１野生型に添加した。ＢａｃＭＰｓを抽出し、ＩｇＧ−ＡＰのＭｍｓ１３−ＺＺへの結合を化学発光により検出した。
【図３】ＺＺ−ＢａｃＭＰｓ上へのｓｃＦｖ−Ｆｃ結合の経時変化を示す。ＢａｃＭＰｓを、細胞破壊の０、１０、３０及び６０分後に細胞の溶解液から磁気的に回収した。その後、マウス抗ＦＬＡＧ抗体及びｄｏｎｋｅｙ抗マウスＩｇＧ−ＡＰを使用して、ＢａｃＭＰｓから抽出した膜タンパク質をウェスタンブロットに供した。
【図４】還元条件（（Ａ））及び非還元条件（（Ｂ）及び（Ｃ））下で調製されたＭｍｓ１３−ＺＺ、Ｍｍｓ１３−ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−Ｆｃのウェスタンブロット分析を示す。（Ａ）及び（Ｂ）：ｓｃＦｖ融合タンパク質を抗ＦＬＡＧ  ＩｇＧ−ＡＰによって、Ｍｍｓ１３−ＺＺをｄｏｎｋｅｙ抗マウスＩｇＧ−ＡＰによって検出した。（Ｃ）：Ｍｍｓ１３−ＺＺ及びｓｃＦｖ融合タンパク質を、ウサギ抗ヒトλ軽鎖ポリクローナル抗体とＡＰ結合抗ウサギＩｇＧとによって検出した。「Ｍｍｓ１３−ＺＺ」は、ｐＵＭ１３ＺＺに含まれる形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ膜タンパク質；「Ｍｍｓ１３−ＺＺ＋ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、ｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃに含まれる形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ膜タンパク質；「Ｍｍｓ１３−ｓｃＦｖ」は、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖに含まれる形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ膜タンパク質を示す。
【図５】ＢａｃＭＰｓ上でのβ−ガラクトシダーゼ結合アッセイを示す。「ＺＺ」は、ｐＵＭ１３ＺＺに含まれる形質転換体から抽出されたＢａｃＭＰｓ；「ｓｃＦｖ」は、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖに含まれる形質転換体から抽出されたＢａｃＭＰｓ；「ＺＺ＋ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、ｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃに含まれる形質転換体から抽出されたＢａｃＭＰｓを示す。
【図６】Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１  ＤｓｂＡタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ  ２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のＤｓｂＡと大腸菌由来のものとを比較した。陰影は、確認された配列モチーフを示す。
【図７】Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１  ＤｓｂＢタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ  ２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のＤｓｂＢと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。
【図８】Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１  ＤｓｂＣタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ  ２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のＤｓｂＣと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。
【図９】Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１  ＤｓｂＤタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ  ２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のＤｓｂＤと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。
【図１０】Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１  ＤｓｂＧタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷ  ２．１を用いて、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のＤｓｂＧと大腸菌由来のものとを比較した。濃い陰影は、確認された配列モチーフを、薄い陰影は予測された配列モチーフを示す。
【図１１】本発明の一態様に係るｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法を示す。（Ａ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇに用いた発現ベクターの概略図を示し、（Ｂ）は、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲを示す。
【図１２】Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｉｄｉｎの発現及び局在化分析を示す。（Ａ）はＢａｃＭＰｓの膜画分のウェスタンブロッティングを、（Ｂ）は抗体結合アッセイを示す。レーン１、レーン２及びレーン３はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体及び野生型を示す。
【図１３】ウェスタンブロッティングによる全細胞抽出物の発現分析を示す。（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によって、（Ｂ）は抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって検出した。レーン１、レーン２及びレーン３はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体及び野生型を示す。
【図１４】ＢａｃＭＰｓ表面への抗体結合アッセイを示す。（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によって、（Ｂ）は抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって検出した。レーン１、レーン２及びレーン３はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体由来のＢａｃＭＰｓ及び野生型由来のＢａｃＭＰｓを示す。
【図１５】ＢａｃＭＰｓの膜画分のウェスタンブロッティングを示す。（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体によって、（Ｂ）は抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって検出した。レーン１及び２はそれぞれ、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体由来のＢａｃＭＰｓの膜画分、及び、野生型由来のＢａｃＭＰｓの膜画分を示す。
【図１６】上から順に、（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ、野生型、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体、及び、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体の蛍光画像を示す。
【図１７】本発明の一態様に係るＩｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法を示す。（Ａ）はｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇに用いた発現ベクターの概略図を示し、（Ｂ）は、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ、ｅＭＨＣ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
＜１＞Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇによるタンパク質−磁性粒子複合体の創製
本発明の第１の側面は、グラム陰性磁性細菌において、ジスルフィド結合タンパク質と磁性粒子との複合体を製造する方法に関する。即ち、該製造方法では、グラム陰性磁性細菌を使用し、磁性粒子と、該磁性粒子上に固定化されたジスルフィド結合タンパク質とを含んだ、組み換えタンパク質−磁性粒子複合体を製造する。
【００２１】
一般に、グラム陰性細菌の細胞質内は還元的環境である。そのため、ジスルフィド結合（以下、「Ｓ−Ｓ結合」ともいう）が構造形成に影響する外来タンパク質、例えば、抗体分子などを、細胞質内に存在する磁性細菌粒子上に発現させるとＳ−Ｓ結合を形成しない。一方、グラム陰性細菌のペリプラズムは酸化的環境であるため、Ｓ−Ｓ結合を含むタンパク質の発現に適している。そこで、該製造方法では、ジスルフィド結合タンパク質の発現をペリプラズムに誘導し、ＢａｃＭＰｓの産生を細胞質にて行う。
グラム陰性磁性細菌としてはＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）  ＡＭＢ−１を使用することができる。Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１は、鎖状に配列したナノサイズのＢａｃＭＰｓを細胞質で合成する。ＢａｃＭＰｓは、脂質二重膜と、該脂質二重膜に囲まれた純粋なマグネタイト（直径５０〜１００ｎｍ）とを含み、強力なフェリ磁性を示す。同様なマグネタイトを生成する他のグラム陰性菌株も、本発明において使用可能である。
【００２２】
該製造方法は、以下で説明する工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む。
（ｉ）共発現工程
本工程では、グラム陰性細菌中で、（ａ）結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質と、（ｂ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合した結合パートナータンパク質を含んだ第２の融合タンパク質とを共発現させる。
【００２３】
ジスルフィド結合タンパク質としては、例えば、図１（Ａ）に示すｓｃＦｖ（単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ））が挙げられる。ｓｃＦｖは、一般的に入手が容易であり、Ｆｃ融合ｓｃＦｖは、ヒンジ領域間でのジスルフィド結合とＣＨ３領域間での相互作用によって抗体様の二量化構造を形成し、二価の結合の親和性効果を提供する。また、大腸菌の細胞質における溶解性とｉｎ  ｖｉｖｏフォールディングとを改善する。
単一ドメインの抗体フラグメント（ｓｄＡｂ、ＶＨＨ又はナノボディという）を細胞質においてＢａｃＭＰｓ上で機能的に発現させる代替的なアプローチが報告されている。ｓｄＡｂは、その厳密な折り畳み及び安定性のため、体内への適用に適しているが、それらはラクダ科の動物又はサメの免疫によって調製されるため、有用性が限定される。それに対し、ｓｃＦｖは一般に入手可能であり、抗体様の二量化構造を形成するため、抗体及び磁性粒子錯体の開発の可能性を拡張することが予想される。
ジスルフィド結合タンパク質は、図１に示すｓｃＦｖに限定されず、ＩｇＧ及びＩｇＭ等の免疫グロブリン（抗体）や、これらが特異的に認識する抗原のうち細菌やウイルス等の表面抗原、インターロイキン類及びケモカイン類等の各種サイトカイン、ＥＧＦ及びＴＧ等の各種増殖因子、それらの受容体、それらの断片、並びに、それらの変異体を使用することができる。
【００２４】
ジスルフィド結合タンパク質には、結合タンパク質が融合される。
図１に示す例では、結合タンパク質として免疫グロブリンＦｃドメイン（Ｆｃ）が用いられているが、結合タンパク質はこれに限定されず、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、ｐ５３、ｐ１６、Ｅ２Ｆ、それらの断片及びそれらの変異体を使用することができる。
結合タンパク質は、結合パートナータンパク質と結合親和性を有する。結合パートナータンパク質は図１ではＺＺ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のタンパク質ＡのＺＺドメイン）である。
結合パートナータンパク質としては、該ＺＺドメインに限られず、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭＤＭ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ、ＤＰ、それらの断片及びそれらの変異体を使用することができる。
【００２５】
結合タンパク質と結合パートナータンパク質との適切な組み合わせを選択することにより、これらの相互作用によって目的のジスルフィド結合タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に効率的に固定化することができる。
例えば、ＫＤ値が１０−１２〜１０−６の範囲にある組み合わせを使用することができる。具体的には、結合タンパク質と結合パートナータンパク質との組み合わせとしてＳｔｒｅｐ−ｔａｇとＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎとの組み合わせ、ｐ５３とＭＤＭ２との組み合わせ、ｐ１６及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄとの組み合わせ、Ｅ２ＦとＤＰとの組み合わせが挙げられる。なお、望むならば、結合タンパク質と結合パートナータンパク質とが相互に入れ替え可能であることを当業者は容易に理解するであろう。
【００２６】
磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質としては、図１（Ａ）に示すＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ由来のＭｍｓ１３が挙げられる。Ｍｍｓ１３タンパク質は、マグネタイトの表面上の脂質二重膜と一体化しており、ＢａｃＭＰｓのマグネタイトと強固に結合することができる。
磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質としては、Ｍｍｓ１３以外にも、Ｍｍｓ１３と同様にアンカータンパク質であるＭｍｓ１６及びＭｍｓ２４や、マグネタイト形成に関与するＭｍｓ５、Ｍｍｓ６及びＭｍｓ７や、鉄イオン輸送タンパク質ＭａｇＡが挙げられる。
【００２７】
該工程（ｉ）では、第１の融合タンパク質（図１では、ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の発現が前記細菌のペリプラズムへと誘導され、第２の融合タンパク質（図１では、ＺＺ−Ｍｍｓ１３）の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される。そのため、第１の融合タンパク質に含まれるジスルフィド結合タンパク質は、ペリプラズムの酸化的環境下でジスルフィド結合を形成し、折り畳まれる。その結果、以下で説明する工程（ｉｉｉ）で形成される複合体において、ジスルフィド結合タンパク質は、その機能を維持した状態で磁性粒子上に固定化される。
【００２８】
前記第１の融合タンパク質の発現のペリプラズムへの誘導は、該タンパク質のＮ末端に付加されるシグナルペプチドにより行われる。該シグナルペプチドとしては、例えば、図１に示す大腸菌ＤｓｂＣ由来のものを使用することができる。内在性のＤｓｂＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法が成立する上で効率的にペリプラズムに移行すべきタンパク質であり、また、将来的な全長ＤｓｂＣとの融合も想定し得るという利点がある。勿論、タンパク質の発現をペリプラズムに誘導できる他の公知のシグナルペプチドも本発明に利用可能である。そのようなシグナルペプチドとしては、大腸菌のＤｓｂＡ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＭｄｏＤ及びＴｏｒＡ由来のもの、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのＰｅｌＢ由来のもの、並びに、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ由来ものなどが挙げられる。
【００２９】
（ｉｉ）培養工程
本工程では、前記第１及び第２の融合タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する。ここで、融合タンパク質を生産するのに充分な条件とは、例えば、温度２５〜２９℃、ｐＨ６．０〜７．５、微好気条件において、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）培地を用いて３〜７日間培養を行う培養条件である。
【００３０】
（ｉｉｉ）細胞膜破壊工程
本工程では、前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する。そしてこの工程により、ジスルフィド結合タンパク質と磁性細菌粒子との複合体が形成される。
即ち、細胞膜が破壊されることによって結合タンパク質と結合パートナータンパク質との相互作用が可能となり、ジスルフィド結合タンパク質が磁性細菌粒子上に捕捉され、ジスルフィド結合タンパク質とＢａｃＭＰｓとの複合体が形成される。
前記細菌の細胞膜の破壊は、当該分野で周知の方法を単独でまたは組み合わせて行ってもよい。例えば、リゾチーム等により細胞壁を破壊した時に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｂｒｉｊｉ  ３５等の非イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２等の両イオン性界面活性剤、又は、ＳＤＳやＮ−ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎｅ等の陰イオン性界面活性剤などを添加することが好ましい。なお、本工程中、ジスルフィド結合タンパク質等の分解を防止するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を存在させることも望ましい。
【００３１】
（ｉｖ）単離工程
本発明の製造方法は、更に、前記工程（ｉｉｉ）で形成された、ジスルフィド結合タンパク質とＢａｃＭＰｓとの複合体を、前記破壊された細胞から単離する単離工程（ｉｖ）を含んでいても良い。
【００３２】
前記複合体を単離する方法は、特に限定されず、当該分野で周知の方法であってよい。ジスルフィド結合タンパク質の単離は例えば、磁気を利用してＢａｃＭＰｓを回収することにより行われる。磁気を利用した回収には、ｃｏｌｕｍｎａｒ  ｎｅｏｄｙｍｉｕｍ−ｂｏｒｏｎ（Ｎｄ−Ｂ）磁石等の磁石が使用される。
【００３３】
前記複合体の単離は、細胞が完全に可溶化してから直ちに行ってもよいが、好ましくは１０分以上経過した後に行われ得る。このタイミングであれば、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との相互作用により、目的のジスルフィド結合タンパク質が完全にＢａｃＭＰｓ上に補足されているため、良好な収率で前記複合体を単離することができる。
【００３４】
本発明の別の態様は、ジスルフィド結合タンパク質の製造方法に関する。
該製造方法は、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）に加え、更に、前記複合体から前記ジスルフィド結合タンパク質を回収する回収工程を含む。
例えば、ｐＨ２〜４の酸性緩衝液、ｐＨ１０〜１２のアルカリ性緩衝液、３Ｍ以上の高イオン強度緩衝液、結合タンパク質もしくは結合パートナータンパク質に対する特異的競合ペプチド等を用いて、前記複合体から前記ジスルフィド結合タンパク質を回収することができる。
【００３５】
次いで、前記製造方法で使用されるベクター及び該ベクターを含んだ形質転換体について説明する。
前記製造方法では、前記工程（ｉｉ）において、通常はベクターを導入した形質転換体が培養される。従って、本発明の範囲には、タンパク質−磁性粒子複合体の製造に使用されるベクター及び該ベクターを含んだ形質転換体も含まれる。
【００３６】
本発明の一態様に係るベクターは、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子と；第２の融合タンパク質をコードする遺伝子と；該第１の融合タンパク質をコードする遺伝子に連結されたシグナル配列とを含む。
ここで、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子は、結合タンパク質をコードする遺伝子とジスルフィド結合タンパク質をコードする遺伝子とを融合したものであり、第２の融合タンパク質をコードする遺伝子は、ＢａｃＭＰｓに結合又は一体化され得るタンパク質をコードする遺伝子と結合パートナータンパク質をコードする遺伝子とを融合したものである。
【００３７】
シグナル配列は、ジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質を、酸化的環境であるペリプラズムへと誘導するため、分子内でジスルフィド結合が形成される。これによって、ジスルフィド結合タンパク質が機能を保持した状態で、タンパク質−磁性粒子複合体を得ることができる。
【００３８】
本発明のベクターの一例が、図１（Ｂ）の（ｃ）に示される。図１（Ｂ）の（ｃ）に示す例において、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子は「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」、第２の融合タンパク質をコードする遺伝子は「ｍｍｓ１３−ＺＺ」、シグナル配列は、「ｄｓｂＣ」である。ただし、シグナル配列に連結した第１の融合タンパク質をコードする遺伝子と、第２の融合タンパク質をコードする遺伝子とは、それぞれ別のベクターに組み込まれて宿主細胞を形質転換してもよい。
【００３９】
また、ベクターは、目的タンパク質の分離及び精製等に有利なタグペプチドをコードする遺伝子を含んでいてもよい。図１（Ｂ）に示す例では、ベクターは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合遺伝子の末端に連結されたＦＬＡＧ  ｔａｇをコードする遺伝子（ＦＬＡＧ）を含んでいる。
ベクターは更に、タンパク質合成効率を向上させるための遺伝子を含んでいてもよい。
【００４０】
また、ベクターは、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターを含んでいるべきである。
図１（Ｂ）に示す例では、当該プロモーターとして、恒常的に発現するｍｍｓ１６プロモーターが使用され、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合遺伝子及びｍｍｓ１３−ＺＺ融合遺伝子は、ｍｍｓ１６プロモーターによって制御される。
本発明のベクターは、グラム陰性磁性細菌を形質転換できるものであれば、いずれでも使用可能であるが、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターが挙げられる。中でも、好適には、プラスミドベクターを使用することができる。
【００４１】
本発明の第１の側面にかかるタンパク質−磁性粒子の製造方法、並びに、該製造方法で使用されるベクター及び形質転換体によれば、煩雑な作業を伴うことなく、ワンステップで、正確にフォールディングされたジスルフィド結合タンパク質をＢａｃＭＰｓ上に固定した、タンパク質−磁性粒子複合体を得ることができる。従って、得られた複合体においてジスルフィド結合タンパク質はその機能を維持している。
より詳細に説明すると、ＢａｃＭＰｓが生産される磁性細菌の細胞質は、還元的環境である。従って、細胞質でジスルフィド結合タンパク質を発現させる従来の方法では、ＢａｃＭＰｓ上でのタンパク質のジスルフィド結合は形成されない。このような従来の方法では、ジスルフィド結合の形成は、ＢａｃＭＰｓの抽出及び精製プロセス中の空気酸化に依存し、空気酸化によるジスルフィド結合形成の速度と収率は、ｉｎ  ｖｉｖｏと比較して非常に遅く、且つ、ミスフィールディング又はアンフォールディングのために、タンパク質の凝集又は分解が生ずる懸念があった。本発明の第１側面にかかる製造方法等では、磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質を含んだ第２の融合タンパク質の発現が前記細菌の細胞質へと誘導される一方で、結合タンパク質に融合したジスルフィド結合タンパク質を含んだ第１の融合タンパク質の発現は、酸化的環境にあるペリプラズムへと誘導されるため、機能を維持した状態でジスルフィド結合タンパク質を磁性粒子上に固定化させた複合体を得ることができた。
また、複合体の調製のために、ターゲットタンパク質の精製やＳ−Ｓ結合形成を行うための前工程等を必要としなかった。調製された複合体は、細胞から抽出後、直接利用できた。
以上の事実から、本発明の第１の側面によれば、全く新しいＳ−Ｓ結合タンパク質の調製法（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法）が提供される。該方法は、抗体とＢａｃＭＰｓとの複合体の開発の可能性を拡張することが期待される。
また、抗体のみならず、様々なジスルフィド結合タンパク質の磁性細菌粒子上への機能発現が可能となり、創薬研究における標的リガンド又はリード化合物スクリーニングのハイスループット化を実現する画期的な方法を提供することができる。例えば、該製造方法により得られたジスルフィド結合タンパク質−ＢａｃＭＰｓ複合体は、リガンド−受容体相互作用又はアフィニティー生成の磁性キャリアとして有用であり、可能性のあるリガンド又は薬剤の効率的なスクリーニングを提供する。
【００４２】
以下、本発明の第２の側面について説明する。
＜２＞Ｉｎ  ｖｉｖｏドッキングによる複数タンパク質−磁性粒子複合体の創製
本発明の別の側面は、複数のタンパク質と磁性粒子との複合体に関する。
該複合体について、図１１を参照しながら説明する。
【００４３】
本側面に係るタンパク質−磁性粒子複合体は、目的タンパク質である複数のタンパク質（即ち、第１及び第２の目的タンパク質）と、磁性粒子と、足場タンパク質と、を含む。該複合体において、足場タンパク質は磁性粒子に結合又は一体化され、複数のタンパク質は足場タンパク質を介して該磁性粒子上に固定されている。
図１１に示す例では、第１及び第２の目的タンパク質はそれぞれ、蛍光緑色タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ））及びｍＣｈｅｒｒｙとして示される。また、磁性粒子は磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）、足場タンパク質はＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎとして示される。この例では、磁性粒子はグラム陰性磁性細菌によって産生された磁性細菌粒子（ＢａｃＭＰｓ）として示されるが、本側面に係るタンパク質−磁性粒子複合体において、磁性粒子は磁性細菌によらずに他の公知の方法で作製した磁性粒子であってもよい。
【００４４】
上記のように、足場タンパク質は、該磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質、並びに、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質を含んでいる。
図１１の例では、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質はＭｍｓ１３として、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質はそれぞれ、ＣｏｈＣ及びＣｏｈＲとして示される。ここで、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質は、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質が足場タンパク質に結合するための足場の役割を果たす。典型的には、第１の結合タンパク質と第２の結合タンパク質とは異なるタンパク質である。
【００４５】
第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とは、通常、ペプチドリンカーで連結されている。ペプチドリンカーとしては、当該分野で一般的に使用されるペプチドリンカーを使用することができ、５〜１００個、好ましくは５〜２０個のアミノ酸からなるペプチドである。
ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｎ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは整数］で示されるペプチドを使用することができる。図１１に示す例で使用したペプチドリンカーは、１０個のアミノ酸からなる（Ｎ４Ｓ）２ペプチドである。
また、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質のいずれか一方と、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質との間も、通常、ペプチドリンカーで連結されている。ペプチドリンカーとしては、当該分野で一般的に使用されるペプチドリンカーを使用することができ、５〜２００個、好ましくは５０〜１００個のアミノ酸からなるペプチドである。図１１に示す例では、第１の結合パートナータンパク質と、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質とがペプチドリンカーで連結されており、該ペプチドリンカーは、１００個のアミノ酸からなる（Ｎ４Ｓ）２０ペプチドである。
【００４６】
第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質は、前記第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質とそれぞれ結合し、これらの結合を介して第１及び第２の目的タンパク質が磁性粒子上に固定化される。即ち、第１及び第２の結合タンパク質はそれぞれ、第１及び第２の目的タンパク質が前記足場に結合するためのタグのような役割を果たす。
【００４７】
結合タンパク質と結合パートナータンパク質の組み合わせとしては、ＫＤ値が１０−１０〜１０−９の範囲のものを使用することができる。
結合タンパク質と結合パートナータンパク質との組み合わせの具体例として、例えば、ｃｏｈｅｓｉｎとｄｏｃｋｅｒｉｎドメインとの組み合わせ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇと抗体Ｆｃ領域ドメインとの組み合わせ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａと抗体Ｆｃ領域ドメインとの組み合わせ、塩基性ロイシンジッパーモチーフと酸性ロイシンジッパーモチーフとの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
図１１に示す例では、結合タンパク質及び結合パートナータンパク質としてそれぞれ、セルロース分解菌が生産するタンパク質複合体セルロソームのｃｏｈｅｓｉｎ及びｄｏｃｋｅｒｉｎドメインを用いた。Ｃｏｈｅｓｉｎ及びｄｏｃｋｅｒｉｎの組み合わせは、ＫＤ値が１０−１０〜１０−９と結合が強く、更に、Ｃｏｈｅｓｉｎ／ｄｏｃｋｅｒｉｎ結合には種特異性がある。ＢａｃＭＰｓ上に足場として複数のｃｏｈｅｓｉｎドメインを局在させ、タンパク質にｄｏｃｋｅｒｉｎドメインを融合した融合タンパク質を複数、共発現させることで、ＢａｃＭＰｓ上に複数のタンパク質を機能的に固定化できることが見出された。
図１１に示す例では、第１の結合タンパク質及び第２の結合タンパク質であるＤｏｃＣ及びＤｏｃＲがそれぞれ、第１の結合パートナータンパク質及び第２の結合パートナータンパク質であるＣｏｈＣ及びＣｏｈＲに結合することにより、第１及び第２の目的タンパク質（ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）をＢａｃＭＰｓ上に固定化している。
【００４９】
ここで、前記第１の目的タンパク質と前記第２の目的タンパク質のうち一方のタンパク質の機能が、もう一方のタンパク質の存在によって発現される系は、本発明において特に興味のある対象である。ここで、「タンパク質の機能が発現される」とは、該タンパク質の活性が増強されることの他に、該タンパク質が正確にフォールディングされること、該タンパク質に、その対象分子との結合能力を付与すること、該タンパク質の構造が安定化されることも意図する。
【００５０】
第１の目的タンパク質と第２の目的タンパク質との組み合わせの具体例としては、例えば、
−ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とｍＣｈｅｒｒｙとの組み合わせ、
−ＭＨＣ  ＩＩ（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ  ＩＩ））とＨＬＡ−ＤＭ（Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＤＭ）との組み合わせ、
−Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  Ａとｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの組み合わせ、
−Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅとｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとの組み合わせ、
−ＥｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅとＣｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅとの組み合わせ、
−ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとＣｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅとの組み合わせ、
−Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅとＧｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅとの組み合わせ
−Ａｃｙｌ−ＡＣＰ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅとＡｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｆｏｒｍｙｌａｔｉｎｇ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅとの組み合わせ
が挙げられる。
【００５１】
第１の目的タンパク質と第２の目的タンパク質との好ましい組み合わせとしては、ＭＨＣ  ＩＩとＨＬＡ−ＤＭとの組み合わせが興味深い。
ｅＭＨＣ  ＩＩ（ｅｍｐｔｙ  ＭＨＣ  ＩＩ）は、ヒトの免疫機構を担う重要なタンパク質であり、関節リウマチといった自己免疫疾患や臓器移植の際の拒絶反応に関連している。そして、ＭＨＣ  ＩＩは、α鎖とβ鎖から構成されるヘテロ二量体の一回膜貫通タンパク質であり、細胞膜上に発現して種々の疾患及び病原体由来の抗原タンパク質の分解産物（抗原ペプチド）と結合し、抗原ペプチド−ＭＨＣ  ＩＩ複合体（ｐＭＨＣ  ＩＩ）を形成する。ＭＨＣ  ＩＩに結合した抗原ペプチドが特異的にＴ細胞受容体を介してヘルパーＴ細胞に認識されることで、細胞が活性化する。よって、抗原ペプチドをワクチンに用いたペプチドワクチン療法の開発では、ＭＨＣ  ＩＩの抗原ペプチドとの結合能の解析や該抗原ペプチドの同定が重要である。
一方、ＨＬＡ−ＤＭはＭＨＣ  ＩＩと構造が類似したタンパク質であり、ｅＭＨＣ  ＩＩと相互作用することで構造を安定化するシャペロン様の機能を有する他、ＭＨＣ  ＩＩに結合する抗原ペプチドの選択に関与していると考えられている。
【００５２】
よって、ＭＨＣ  ＩＩとそのシャペロン様機能を有するＨＬＡ−ＤＭとをＢａｃＭＰｓ上に共局在させたタンパク質−磁性粒子複合体において、ＭＨＣ  ＩＩが、ＨＬＡ−ＤＭの存在によって抗原結合能を保持し得ることの利点は、当業者にとって明らかであろう。このようなタンパク質−磁性粒子は、例えば、抗体ペプチドのスクリーニングを目的としたペプチド結合試験等に有用である。また、磁性粒子を含んでいるため、混合物からの分離が容易である。しかしながら、本発明以前に、磁性粒子上で２種のタンパク質が足場を介して機能的に局在化され得るという証拠はなかった。
【００５３】
本発明の好適な態様では、本発明の第１の側面でも用いたグラム陰性磁性細菌Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１を使用することができる。従って、本発明の第２の側面の一態様は、グラム陰性磁性細菌において、磁性粒子と該磁性粒子に固定化された複数のタンパク質とを含んだ磁性粒子−複数タンパク質複合体の製造方法である。
より詳細には、以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
【００５４】
（ｉ）共発現工程
本工程では、グラム陰性磁性細菌中で、前記第１及び第２の融合タンパク質と、前記足場タンパク質とを共発現させる。
具体的には、（ａ）第１の結合タンパク質と該第１の結合タンパク質に融合した第１の目的タンパク質とを含んだ第１の融合タンパク質、（ｂ）第２の結合タンパク質と該第２の結合タンパク質に融合した第２の目的タンパク質とを含んだ第２の融合タンパク質、及び（ｃ）磁性細菌粒子に結合又は一体化され得るタンパク質に融合し、且つ、第１の結合パートナータンパク質と第２の結合パートナータンパク質とを含んだ足場タンパク質を共発現させる。
【００５５】
該工程で使用することのできる、第１及び第２の目的タンパク質、第１及び第２の結合タンパク質、並びに、第１及び第２の結合パートナータンパク質としては、上述したタンパク質を使用することができる。
【００５６】
（ｉｉ）培養工程
本工程では、前記第１及び第２の目的タンパク質、並びに、前記足場タンパク質を生産するのに充分な条件下で前記工程（ｉ）の細菌を培養する。ここで、「融合タンパク質を生産するのに充分な条件」とは、本発明の第１の側面で説明したのと同様の条件である。
本工程では、前記第１及び第２の目的タンパク質とＢａｃＭＰｓとの複合体が形成される。即ち、第１及び第２融合タンパク質並びに足場タンパク質はいずれも、磁性細菌の細胞質で発現される。該細菌を上記条件で培養することにより、細胞質内にこれらのタンパク質が生成し、結合タンパク質と結合パートナータンパク質との結合親和力によって、第１及び第２目的タンパク質がＢａｃＭＰｓ上に足場タンパク質を介して固定され、複数タンパク質−磁性粒子複合体が形成される。勿論、目的のタンパク質の一つ又は両方がジスルフィド結合タンパク質である、それらに対して、本発明の第１の側面を使用してもよい。つまり、その一つ又は両方の発現をペリプラズムに誘導してもよい。
【００５７】
（ｉｉｉ）細胞膜破壊工程
本工程では、前記工程（ｉｉ）の細菌の細胞膜を破壊する。
前記細菌の細胞膜の破壊は、本発明の第１の側面の細胞膜破壊工程（ｉｉｉ）で説明したのと同様の方法によって行われてよい。
（ｉｖ）単離工程
該製造方法は、更に、前記工程（ｉｉ）で形成された前記複合体を、前記工程（ｉｉｉ）で破壊された細胞から単離する単離工程（ｉｖ）を更に含んでいてもよい。複合体の単離は、本発明の第１の側面の単離工程（ｉｖ）で説明したのと同様の方法によって行われてよい。
また、該製造方法は、更に、前記複合体から、第１及び第２の目的タンパク質を回収する回収工程を更に含んでいてもよい。該工程は第１の側面において説明した回収工程と同様の工程である。
【００５８】
前記製造方法では、前記工程（ｉｉ）において、以下の構成を有するベクターを導入した形質転換体が培養される。従って、本発明の範囲には、タンパク質−磁性粒子複合体の製造に使用されるベクター及び該ベクターを含んだ形質転換体も含まれる。
【００５９】
図１１（Ａ）は、前記製造方法で使用されるベクターの一例を示す。該ベクターは、足場タンパク質をコードする遺伝子（図１では、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｉｄｉｎ）と、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子（図１では、Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｏｃｋｅｒｉｎ）とを含む。
【００６０】
足場タンパク質をコードする遺伝子は、磁性粒子に結合又は一体化され得るタンパク質をコードする遺伝子（図１１ではＭｍｓ１３）と；ペプチドリンカーをコードする遺伝子（図１１では親水性ポリペプチドリンカーのＮＳ  ｌｉｋｅｒ（Ｎ４Ｓ）２０））と；第１及び第２の結合パートナータンパク質をコードする遺伝子（図１１ではｃｏｈｅｈｉｎドメインのＣｏｈＣ及びＣｏｈＲ）と；第１の結合パートナータンパク質をコードする遺伝子と第２の結合パートナータンパク質をコードする遺伝子とを連結するペプチドリンカーをコードする遺伝子と；発現確認用の遺伝子（図１１では、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ）と；で構成されている。
【００６１】
第１及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｏｋｅｒｉｎ）はそれぞれ、第１及び第２の目的タンパク質をコードする遺伝子（図１１ではＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）と；第１及び第２結合タンパク質をコードする遺伝子（図１１ではＤｏｃＣ及びＤｏｃＲ）とで構成されている。第１及び第２結合タンパク質をコードする遺伝子はそれぞれ、第１及び第２の目的タンパク質をコードする遺伝子に連結されている。即ち、図１１では、ＧＦＰの末端にはＤｏｃＣが融合しており（ＧＦＰ−ＤｏｃＣ）、Ｃｈｅｒｒｙの末端にはＤｏｃＲが融合している（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲ）。
そして、図１１（Ｂ）にも示す通り、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子と第１の融合タンパク質をコードする遺伝子との間には、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）が含まれることが好ましい。或いは、それらの遺伝子を別々のベクター上に含ませてもよい。本発明の第２の側面で使用できるベクターも、本発明の第１の側面について記載したものである。
【００６２】
足場タンパク質をコードする遺伝子の発現、並びに、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子及び第２の融合タンパク質をコードする遺伝子の発現は、それぞれ、プロモーターによって制御される。
図１１に示す例では、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｆｄｉｎの発現は、恒常的に発現するｍｍｓ１６プロモーターによって制御され、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの発現は、人工オペロンを構築しテトラサイクリン発現誘導システムであるＰｍｓｐ１（ｔｅｔＯ）によって制御される。
【００６３】
上述の製造方法の工程（ｉｉ）では、上記構成を有するベクターを磁性細菌に導入し、作製した形質変換体を培養する。
図１１（Ｂ）に示す例では、発現した足場タンパク質Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎは、ＢａｃＭＰｓ上に局在し、その後、テトラサイクリンの添加により発現が誘導されたＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲが、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ中のＣｏｈＣ及びＣｏｈＲに結合する。その結果、目的タンパク質であるＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙが、前記Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎを介してＢａｃＭＰｓ上に固定化される。
【００６４】
本発明の第２の側面にかかる複数タンパク質−磁性粒子の製造方法、並びに、該製造方法で使用されるベクター及び形質転換体によれば、機能性タンパク質の生産及び磁性粒子上への固定化をワンステップで行うことができ、機能性タンパク質の煩雑な精製ステップが必要ない。また、結合タンパク質（足場分子）と結合パートナータンパク質（タグ分子）との組み合わせにより、複数のタンパク質を任意の数で、任意の位置に固定化することができる。更に、タグの役割を果たす結合タンパク質と目的の機能性タンパク質とを遺伝子融合しているため、配向性を維持した状態で固定化することができる。
これまでに、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオルガネラへの機能性タンパク質の固定化において、ペプチドリンカーを介して複数のタンパク質を融合し、単一の融合タンパク質として発現させることで、複数のタンパク質を固定化する方法があったが、構造の複雑なタンパク質の融合や複数のタンパク質の融合によって、凝集塊の形成、ミスフォールディング及びプロテアーゼによる分解が誘発されるという問題があった。本発明の製造方法、並びに、ベクター及び形質転換体によれば、足場タンパク質を介して複数のタンパク質を発現させているため、このような問題を伴うことなく複数のタンパク質を磁性粒子上に固定化することが可能である。
また、本発明の第２の側面にかかる複数タンパク質−磁性粒子によれば、例えば、一連の代謝反応を行う酵素群を固定化することによる反応効率の向上や、目的タンパク質の安定化を可能にすることが期待される。また、活性化にシャペロンや補因子となる特定のタンパク質が必要な目的タンパク質と、該シャペロンや捕因子とを共局在化させた複合体は、医療分野等での応用が期待される。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法による磁性細菌粒子上でのｓｃＦｖの機能的発現
（１−１）試料
発現ベクター構築のためのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅にはＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を、遺伝子クローニング用の試薬としてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用した。ＩｇＧ結合試験にはＡＰ（アルカリホスファターゼ）標識ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ）を、Ａｎｔｉ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｓｃＦｖの結合活性評価にはｂｉｏｔｉｎ  β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭＳ）及びＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
遺伝子クローニングの宿主としては、大腸菌株ＴＯＰ１０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、大腸菌形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で、３７℃で培養した。
プラスミドベクターは、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｍｓ１３  ａｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｓｏｃｉｅｔｙ．（２００６）に記載されたｐＵＭ１３ＺＺを基にして構築した。
【００６６】
（１−２）Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来Ｄｓｂタンパク質ファミリーのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析
Ｍ.．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１の各Ｄｓｂタンパク質の配列はＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）より検索した。Ｄｓｂタンパク質のシグナルペプチドについては、まずＳｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｅｂｓｉｔｅ（http://www.signalpeptide.de/）におけるデータベースを用い、実験的に確定されているか又は配列から予測されているか、或いはデータベース上にないかどうかを調べた。データベース上にないものについては、ＰｒｅｄｉＳｉ（http://www.predisi.de/）を用いてシグナル配列の予測を行った。膜貫通領域については、文献上で予測領域が報告されている大腸菌ＤｓｂＢ以外はＳＯＳＵＩ（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui）を用いて予測を行った。
また、Ｄｓｂタンパク質の相同性解析にはＣｌｕｓｔａｌＷ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）を使用した。
【００６７】
ＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅよりＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来のＤｓｂタンパク質ファミリーを検索した結果、大腸菌と同様、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及びＤｓｂＧが見つかった。一方、ｏｘｉｄａｓｅ機能を持つＤｓｂＡに相当するタンパク質は見つからなかった。各Ｄｓｂタンパク質について、大腸菌で解析されているモチーフやＳ−Ｓ結合部位を中心に、図６〜図１０にまとめた。
ＤｓｂＡを除いたＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１由来の各Ｄｓｂタンパク質は大腸菌とは相同性がほとんどないものの、触媒部位のＣＸＸＣモチーフを有していた。また、ＤｓｂＢは大腸菌と同様に、ＤｓｂＡの酸化に関わるＣＸＸＣモチーフに加え、もう１組のシステインのペアを有すると予想された。膜タンパク質であるＤｓｂＢ及びＤｓｂＤについては、大腸菌と同様、それぞれ４つ及び８つの膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ：ＴＭ）領域を有することがＳＯＳＵＩによって予測された。
【００６８】
解析したＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１からはＤｓｂＡが見つからなかったが、機能的にＤｓｂＢのパートナー分子であることから、ＮＣＢＩのデータベースの元となったＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１株ではｄｓｂＡ遺伝子を含むゲノムの一部が欠落した可能性が考えられる。あるいは別の可能性として、大腸菌ではＳ−Ｓ結合ｉｓｏｍｅｒａｓｅであるｄｓｂＣ遺伝子の過剰発現がｄｓｂＡ欠損株の機能を補完することから、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１においてもＤｓｂＣがＤｓｂＡの機能の一部を担っていることも考えられる。
以上の解析結果から、Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１も大腸菌と同様、ペリプラズムにおけるＳ−Ｓ結合タンパク質の酸化とそれに伴うフォールディング機構を備えていることが示唆された。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法が機能する前提として重要な知見である。
【００６９】
（１−３）プラスミドの構築と磁性細菌の培養
プラスミドを、標準的なクローニング技術（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）又はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって構築した。
抗β−ガラクトシダーゼ単鎖抗体（ｓｃＦｖ）とヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）の融合遺伝子とを発現するベクター（ｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃ）（図１（Ｂ）の（ｃ））は、両端にＮｓｉＩ部位を持ち、かつ５’末端に大腸菌ペリプラズムタンパク質であるＤｓｂＣのシグナル配列（ＤｓｂＣｓｓ）およびＦＬＡＧタグをコードする配列を持つように人工合成したｓｃＦｖ−Ｆｃ融合遺伝子を、アンカータンパク質Ｍｍｓ１３をコードするｍｍｓ１３とＰｒｏｔｅｉｎ  ＡのＩｇＧ結合ドメイン（ＺＺ）の融合遺伝子を発現するｐＵＭ１３ＺＺ（図１（Ｂ）の（ａ））のＮｓｉＩ部位（Ｍｍｓ１３−ＺＺ遺伝子の開始コドンに相当）に挿入することで構築した。なお、ｍｍｓ１６プロモーターからｓｃＦｖ１３Ｒ４−Ｆｃ融合遺伝子およびＭｍｓ１３−ＺＺ融合遺伝子までを単一オペロンとして発現させるために、ｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子の挿入により失われたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列をＭｍｓ１３−ＺＺ遺伝子の上流に付加するよう人工合成遺伝子を設計した。
一方、コントロールベクターとして従来型のＭｍｓ１３融合タンパク質として発現するＭｍｓ１３−ｓｃＦｖ発現ベクターを構築するため、ＳｓｐＩ消化したｐＵＭ１３ＺＺに対し、両端にＳｓｐＩ部位を持つようにＰＣＲ増幅したｓｃＦｖ遺伝子を挿入した（ｐＵＭ１３ｓｃＦｖ）（図１（Ｂ）の（ｂ））。
【００７０】
各発現プラスミド（ｐＵＭ１３ＺＺ、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖ及びｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃ）を、Ｙ．Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｔａｋｅｙａｍａ，Ｔ．Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ａ．Ｔ．Ｗａｈｙｕｄｉ，Ｒ．Ｓａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｒｙｐｔｉｃ−Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃｒｙｐｔｉｃ−Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ，Ｓｏｃｉｅｔｙ．（２００３）に記載された方法に従って、エレクトロポレーションによってＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１に形質転換した。
【００７１】
Ｍ.．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ  ７００２６４）を、Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｆ．Ｔａｄａｋｏｒｏ，Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５（１９９１）６５１−６５５に記載される方法従い、２８℃でｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）で磁性微好気的に培養し、作製したＭ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１形質転換体は同じ条件下、５μｇ／ｍｌのアンピシリンを用いて培養した。
【００７２】
（１−４）磁性細菌粒子の調製
集菌したＡＭＢ−１野生株もしくは各形質転換体（２５０ｍｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ相当）を２．５ｍｌのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁したのち、リゾチーム及びＰＭＳＦをそれぞれ終濃度０．４ｍｇ／ｍｌおよび２ｍＭとなるよう添加し、室温で５分間静置した。続いて、０．５ｍｌのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  ＣａＣｌ２，０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２，０．０２ｍｇ/ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ）を加え、室温で５分間静置した。次にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度０．２％加え、室温にて０〜１２０分間穏やかに撹拌した後、Ｎｄ−Ｂ磁石を用いて磁性細菌粒子画分を磁気回収した。その後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、精製磁性細菌粒子を得た。
【００７３】
（１−５）ＩｇＧ捕捉試験
本発明のコンセプト証明を行うため、Ｍｍｓ１３−ＺＺ融合タンパク質をコードするｐＵＭ１３ＺＺのＡＭＢ−１形質転換体を用いたＩｇＧ結合試験を行った。
ＡＭＢ−１野生株もしくはｐＵＭ１３ＺＺ形質転換体の細胞ペレット（４５ｍｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ相当）に対し、０から２μｇ/ｍｌのＡＰ標識ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを加え、磁性細菌粒子を抽出した。磁性細菌粒子各５０μgを５０μｌのＰＢＳに懸濁したのち、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を５０μｌ加え、室温で２０分間基質反応を行った後、ルミノメーターを用いて発光強度を測定した。
その結果、ＩｇＧ−ＡＰの容量依存的な結合が認められ、少なくとも１６ｎｇ／ｍｌの低濃度であっても検出することが可能であることが示された（図２）。Ｄｏｎｋｅｙ  ＩｇＧとＰｒｏｔｅｉｎ  Ａとの結合はヒトＩｇＧ１と比べると弱いものの、この濃度は僅か０．１８μｇ／ｌ  ｃｕｌｔｕｒｅに相当し、機能性分子の発現量が非常に低い場合であっても本システムが機能することが示された。
【００７４】
（１−６）ウェスタンブロッティング
ＡＭＢ−１野生株もしくは各ＡＭＢ−１形質転換体より得られた磁性細菌粒子０．１〜０．２ｍｇに対し、還元の場合は１０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１％ＬＤＳ溶液を、非還元の場合は５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１％ＳＤＳ溶液を１０〜２０μｌ加え、９５℃で１５分間熱処理を行い、磁気分離により上清を回収したものを粒子膜画分とした。得られた上清をサンプルバッファーと混合しＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０〜２０％  ｇｒａｄｉｅｎｔ）にて泳動したのち、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（４８ｍＭ  Ｔｒｉｓ，３９ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用いたセミドライ法でＰＶＤＦ膜にブロッティングした。抗原抗体反応は２％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ（２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ）に溶解した１μｇ／ｍｌの１次抗体もしくはＡＰ標識２次抗体を用いて行った。２次反応後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄したのち、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ−Ｂｌｕｅを用いてＡＰ活性の検出を行った。
【００７５】
（１−６−１）ｓｃＦｖ−ＦｃとＭｍｓ１３−ＺＺとの結合タイムコースの解析
次に、モデルタンパク質である変異型ヒト抗β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質とＭｍｓ１３−ＺＺの共発現ベクター（ｐＵＭ１３／ｓｃＦｖＦｃ）のＡＭＢ−１形質転換体を用いてＦｃとＺＺとの結合に必要な時間を調べた。ここで用いた変異型ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１３Ｒ４）は、大腸菌の細胞質内において高レベルで可能性発現するように改変されたものである。
リゾチームおよびＤＮａｓｅ  Ｉで１０分間部分的に破砕処理した細胞に対し、細胞を完全に破砕し可溶化するためにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、０、１０、３０及び６０分後に磁性細菌粒子を分離した。その結果、予想に反しＦｃとＺＺとの結合の大部分がｔｉｍｅ０で起こり、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加後１０分以降に最大レベルに達した（図３）。これらの結果から、ＡＭＢ−１形質転換体からＦｃ融合タンパク質が結合した磁性細菌粒子を得るためには、細胞を完全に破砕してから１０分後の回収で十分であることが示された。
【００７６】
（１−６−２）ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現解析
Ｍｍｓ１３−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ各融合遺伝子発現ベクターのＡＭＢ−１形質転換体における発現レベルを確かめるため、リニアエピトープもしくは構造エピトープの抗体をそれぞれ用いたウェスタンブロッティングを行った。
その結果、Ｍｍｓ１３−ｓｃＦｖは、還元条件および非還元条件で、リニアエピトープ認識の抗ＦＬＡＧ抗体により予想された４１ｋＤａの単一のバンドとして検出されたが、構造エピトープ認識の抗ヒトλ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（ＶＬ−λ）抗体では検出されなかった（図４）。一方、ｓｃＦｖ−Ｆｃの単量体（５２ｋＤａ）は還元条件では抗ＦＬＡＧ抗体で検出されたが、非還元条件では抗ＦＬＡＧ抗体および抗ヒトＶＬ−λの両方で２量体（１０５ｋＤａ）および３量体（１５７ｋＤａ）に相当する２本のバンドとして検出された（図４）。
これらの結果から、Ｍｍｓ１３−ｓｃＦｖは、細胞質において磁性細菌粒子上で正しくフォールディングされなかったが、一方で、ペリプラズム内に発現したｓｃＦｖ−ＦｃはＦｃのヒンジ領域を介すると思われる２量体、又は、２量体に非共有結合が加わった３量体としてＳ−Ｓ結合を伴い正しくフォールディングされたものと考えられる。なお、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質の多量体形成は他のグループでも報告されている。
【００７７】
（１−７）β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ結合試験
磁性粒子上に捕捉されたｓｃＦｖ−Ｆｃが抗原結合能を持っているかどうかを確かめるため、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの結合試験を行った。
ｐＵＭ１３ＺＺ、ｐＵＭ１３ｓｃＦｖもしくはｐＵＭ１３ＺＺ／ｓｃＦｖＦｃを導入したＡＭＢ−１から抽出した磁性細菌粒子各５０μｇに対し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔに懸濁したｂｉｏｔｉｎ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（１μｇ／ｍｌ）を加え、室温で１５分静置した。２００μｌのＰＢＳ−Ｔで１回洗浄したのち、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（１μｇ/ｍｌ）を加え、室温で１５分静置した。２００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄したのち、５０μｌのＰＢＳに懸濁した。これにＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を５０μｌ加えて３０分間反応させ、ルミノメーターにより発光強度を測定した。
【００７８】
ｓｃＦｖ−ＦｃとＭｍｓ１３−ＺＺの共発現形質転換体から抽出した磁性細菌粒子ではビオチンラベルしたβ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの結合が検出されたのに対し（図５、ＺＺ＋ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、Ｍｍｓ１３−ＺＺ単独もしくはＭｍｓ１３−ｓｃＦｖの形質転換体から抽出した磁性細菌粒子では認められなかった（図５、ＺＺ及びｓｃＦｖ）。このことから、細胞質で発現したＭｍｓ１３−ｓｃＦｖは磁性細菌粒子上で機能発現しなかったのに対し、ペリプラズムに発現したｓｃＦｖ−Ｆｃは磁性細菌粒子上で機能発現していることが示された。
ここで用いたｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１３Ｒ４）は、大腸菌の細胞質において高い可溶性とフォールディング能を持つよう機能改変された抗β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１３）の変異体である。しかしながら、高い可溶性を持つｓｃＦｖ１３Ｒ４であっても従来の直接発現法では磁性細菌粒子上で機能発現しなかった。
【００７９】
以下で説明する実施例２及び３は、本発明の第２の側面に対応する。
＜実施例２＞Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法による磁性細菌粒子上でのＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの共局在
本実施例では、ＢａｃＭＰｓに固定化する複数の目的タンパク質として、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを使用した。
（２−１）試料
試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水をＭｉｌｌｉＱ  Ｌａｂ（日本ミリポア）で処理した純水を用いた。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ｍｏｕｓｅ由来ａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体は、ＡＣＲＩＳより購入した。Ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体及び、ｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体はＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した。Ｇｏａｔ由来ＡＬＰ標識抗ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。組み換えＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙはＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳより購入した。プレートリーダーにはＳＨ−９０００（コロナ電気）を用いた。ＡＬＰの発光基質には和光純薬株式会社のルミホス５３０を用いた。
また、本実施例では融合タンパク質の発現ホストとして磁性細菌Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１株のｍｍｓ１３遺伝子欠損株（Δｍｍｓ１３株）を使用した。プラスミド構築には、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【００８０】
プラスミドベクターは、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ａ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ．，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１０）に記載されたｐＵＭｔＯＲ１３ＧＦＰを基にして構築した。
【００８１】
（２−２）プラスミドの構築と磁性細菌の培養
図１１（Ａ）に、本実施例で構築したプラスミドコンストラクトｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを示す。該プラスミドは、Ｐｍｓｐ１（ｔｅｔＯ）プロモーターの下流にＧＦＰとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＣｅｌＳ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＣ）の融合タンパク質（ＧＦＰ−ＤｏｃＣ）、ｍＣｈｅｒｒｙとＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓのＳｃａＡ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＲ）の融合タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲ）、及びＰｍｍｓ１６プロモーターの下流にＭｍｓ１３、ＮＳ  ｌｉｎｋｅｒ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＣ）、Ｒ．ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＲ）、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇの融合タンパク質（Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ）の遺伝子を含む。
更に、Ｐｍｍｓ１６プロモーターの下流にＧＦＰ−ＤｏｃＣ、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの遺伝子を含むｐＵＭｔｅｔＤｏｃ（図示せず）を構築した。
【００８２】
作製した各プラスミドを用いて、エレクトロポレーション法によりΔｍｍｓ１３株の形質転換を行った。磁性細菌の培養には、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）を培地として用い、５Ｌの培地に、プレカルチャーを１／１０００植菌し、室温２６〜２９℃で静置することで培養を行った。植菌時には、アルゴンガスでバブリング（１５分間）することにより微好気状態を作った。また、形質転換体の培養の際は終濃度５．０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、対数増殖期中期に終濃度５００ｎｇ／ｍｌ  ＡＴｃを添加し、一晩培養した。ＢａｃＭＰｓの回収は、以下に示す方法で行った。
【００８３】
（２−３）磁性細菌粒子の調製
菌体培養後、遠心分離（９０００ｇ、４℃、１０分間）を行い、培養液から磁性細菌を回収した。回収した磁性細菌は、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に懸濁し、フレンチプレス（有限会社大岳製作所，５５０１Ｍ）を使用して１８００ｋｇ／ｃｍ２で菌体破砕を行った（３回）。破砕液をガラスの容器に移し、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ（ネオジウム−鉄−ボロン）磁石を添付することにより、ＢａｃＭＰｓを回収した。上清を取り除き、更に１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、磁気分離することでＢａｃＭＰｓの洗浄を行った（１０回）。ＢａｃＭＰｓを適量のＰＢＳに分散させ吸光度（６６０ｎｍ）を測定し、検量線より乾燥重量に換算した。
【００８４】
（２−４）ウェスタンブロッティング及びＢａｃＭＰｓ上での抗体結合試験
野生型（ＷＴ）及び各形質転換体の菌体培養液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間）し、菌体を回収した。菌体２×１０９  ｃｅｌｌｓに対して１％ＳＤＳ溶液２０μｌを添加し９９℃で３０分間煮沸した。更に、３×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、９９℃で５分間加熱し、菌体サンプルとした。また、ＷＴ及び各形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ２５〜５００μｇに対し、１％ＳＤＳ溶液３０μｌを添加後、超音波により拡散させながら煮沸した（１００℃、３０分間)。遠心分離（１８０００ｇ、５分間）により上清を回収し、３×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒをサンプルに１５μｌ加え、９９℃で５分間加熱し、粒子膜画分サンプルとした。コントロールとして、組み換えＧＦＰ及び組み換えｍＣｈｅｒｒｙを用いた。
【００８５】
各サンプルをアクリルアミド濃度１５％のゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜へセミドライ法でブロッティングを行った。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜に対し、ＡＬＰ標識抗ｃ−ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）または、一次抗体に、ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体（０．０５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）、ｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）、二次抗体にＧｏａｔ由来ＡＬＰ標識ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体（０．５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）を反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳ−Ｔを用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰ−Ｂｌｕｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加え発色させた。また、解析には画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊを用いてピクセル強度を算出した。
【００８６】
次に、ＢａｃＭＰｓ上での抗体結合試験を行った。
ＷＴ及び形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ  ５０μｇにＡＬＰ標識抗ｃ−ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）、ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）またはｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）１００μｌを室温で３０分間反応させた。洗浄後、ｍｏｕｓｅ由来抗ＧＦＰモノクローナル抗体またはｍｏｕｓｅ由来抗ｍＣｈｅｒｒｙモノクローナル抗体を反応させたＢａｃＭＰｓは、更に二次抗体としてｇｏａｔ由来ＡＬＰ標識抗ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（１μｇ／ｍｌ）を反応させた。洗浄後、ＴＢＳ  ５０μｌにＢａｃＭＰｓを懸濁した。９６穴プレートに移した後にルミホス５３０を５０μｌ添加し、５分後の発光強度を測定した。
【００８７】
（２−４−１）形質転換体におけるＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎの局在確認
Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎのＣ末端に融合したｃ−ｍｙｃ  ｔａｇに対する抗体を用いて、形質転換体におけるＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ（５７ｋＤａ）の発現確認を行った。ウェスタンブロッティングの結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体において、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎの発現を確認することができた（図１２（Ａ）、レーン１）。
また、上記ＢａｃＭＰｓへの抗体結合試験により、精製したＢａｃＭＰｓ上でのＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎの局在を確認した。その結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体から精製したＢａｃＭＰｓにおいて、抗ｃ−ｍｙｃ抗体の結合が確認された（図１２（Ｂ）、レーン１）。
以上の結果より、形質転換体内で発現したＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎはＢａｃＭＰｓ膜上に局在し、固定化されていることが示された。
【００８８】
（２−４−２）形質転換体におけるＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの発現並びにＢａｃＭＰｓ上への結合確認
形質転換体におけるＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの発現を確認するために、ウェスタンブロッティングによるＧＦＰ−ＤｏｃＣ（３６ｋＤａ）、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲ（３８ｋＤａ）の検出を行った。その結果、形質転換体において、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの発現を確認することができた（図１３（Ａ）及び（Ｂ）、レーン１）。
また、各形質転換体のＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲのバンドを画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊを用いて解析し、ピクセル強度の比較を行った。ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体のＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲのピクセル強度を１００％としたとき、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体において、ＧＦＰ−ＤｏｃＣが１８％、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲが６９％であった。よって、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体では、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体に比べ、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの発現量が低下していることが示された。Ｄｏｃｋｅｒｉｎは、Ｃｏｈｅｓｉｎと結合していない状態では構造が不安定となり、細胞内でプロテアーゼにより分解されることが報告されている。従って、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎを発現しないｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体では、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲが分解され、発現量が低下したと考えられる。
【００８９】
また、ＧＦＰ抗体及び抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体を用いたＢａｃＭＰｓ上への抗体結合試験の結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体から精製したＢａｃＭＰｓにおいて、抗ＧＦＰ抗体及び抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体の結合を確認できた（図１４（Ａ）及び（Ｂ）、レーン１）。よって、形質転換体内で発現したＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲは、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎが局在したＢａｃＭＰｓ上に結合していることが示された。
これらの結果から、足場となるＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ及びＧＦＰ−ＤｏｃＣ、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲを共発現させることで、ＢａｃＭＰｓ上にワンステップで２種類のタンパク質を固定化できることが示された。
【００９０】
（２−４−３）ＢａｃＭＰｓ上でのＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの共局在の確認
足場であるＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎは、それぞれＤｏｃＣ及びＤｏｃＲと結合するＣｏｈＣ及びＣｏｈＲを１ドメインずつ含んでいる。従って、Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ上にＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲが共局在した場合、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの結合量比が１：１になる。
ＢａｃＭＰｓ上に結合したＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの固定化量を算出するために、精製したＢａｃＭＰｓの膜画分に含まれるＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲ量をウェスタンブロッティングにより定量した。濃度既知のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを用いて検量線を作成し、Ｉｍａｇｅ  Ｊによる解析を行った（図１５）。
その結果、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの結合量はそれぞれ１ｍｇ  ＢａｃＭＰｓあたり３８０ｎｇ及び５７０ｎｇであった。よってＢａｃＭＰｓ上に同程度のＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲが固定化されていることが示された。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲの結合量と比較してＧＦＰ−ＤｏｃＣの結合量がわずかに低い理由は、ＧＦＰ−ＤｏｃＣがプロテアーゼによる分解を受けやすいことが影響していることにあると考えられる。
【００９１】
（２−５）形質転換体の蛍光顕微鏡観察
形質転換体のＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光顕微鏡観察を行い、細胞内での局在解析を行った。ＷＴ及び形質転換体の培養液を、２％アガロースゲルを塗布したスライドガラス上に滴下し、観察を行った。ＧＦＰ蛍光の検出にはＧＦＰ検出用フィルター（励起／検出：４６６ｎｍ：５２５ｎｍ）を用いた。ｍＣｈｅｒｒｙの検出にはＣＹ３フィルター（励起／検出：５１３−５５６ｎｍ／５７０−６１３ｎｍ）を用いた。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙのＦＲＥＴの観察には励起フィルター（４６０−４９５ｎｍ）及び検出フィルター（５８０ｎｍ）を組み合わせたＦＲＥＴ検出フィルター用いた。
蛍光観察の結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃを保持する形質転換体においてｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は検出されたが、ＧＦＰの蛍光は検出されなかった（図１６（Ｂ））。これはＧＦＰ−ＤｏｃＣの発現量が低いことが原因であると考えられる。ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体においてはＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が検出された（図１６（Ｃ））。また、それらの蛍光から、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙが細胞内で同一の位置に局在していることが示された。
【００９２】
更に、ＧＥＰの励起波長を照射し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光波長を検出することでＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙと間のＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を観察した。ここで、ＦＲＥＴとは、２個の蛍光分子が近接して（１０ｎｍ以下）位置する場合に、一方の分子が吸収したエネルギーが、他方の分子に移動し、蛍光を発する現象である。
観察の結果、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体において、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの局在位置と同様の位置に、ＦＲＥＴによるｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が検出された（図１６（Ｃ）の“ＦＲＥＴ”のレーン）。従って、ＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲが近接に位置していることが示された。
これらの結果から、ｐＵＭｔｅｔＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体において、菌体内で発現したＧＦＰ−ＤｏｃＣ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ＤｏｃＲは、ＢａｃＭＰｓ上に局在したＭｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎに結合し共局在していることが示された。
【００９３】
本実施例では、ｃｏｈｅｓｉｎドメインを有するｍｉｎｉｓｃａｆｏｌｌｄｉｎ及びｄｏｃｋｅｒｉｎを融合した蛍光タンパク質を磁性細菌ＡＭＢ−１において共発現することで、ＢａｃＭＰｓ上に共局在できることが示された。本手法は、タンパク質の精製や固定化のために煩雑な操作を行う必要が無く、非常に簡便にタンパク質−磁性粒子複合体を作製することができる。
【００９４】
＜実施例３＞Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｏｃｋｉｎｇ法によるＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ及びシャペロン様タンパク質ＨＬＡ−ＤＲの磁性粒子上への共局在によるＭＨＣの機能発現
本実施例では、ＢａｃＭＰｓに固定化する複数の目的タンパク質として、ｅＭＨＣ  ＩＩ及びＨＬＡ−ＤＭとを使用した。
【００９５】
（３−１）試料
試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水をＭｉｌｌｉＱ  Ｌａｂ（日本ミリポア）で処理した純水を用いた。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体はシグマアルドリッチジャパンより購入した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＨＡ  ｔａｇモノクローナル抗体はａｂｃａｍより購入した。Ｎ末端ビオチン標識ＨＡ３０６−３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）は株式会社ベックスより購入した。ＡＬＰ標識ストレプトアビジンはＲｏｃｈｅより購入した。プレートリーダーにはＳＨ−９０００（コロナ電気）を用いた。ＡＬＰの発光基質には和光純薬株式会社のルミホス５３０を用いた。
また、本実施例では融合タンパク質の発現ホストとして磁性細菌Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１株のｍｍｓ１３遺伝子欠損株（Δｍｍｓ１３株）を使用した。プラスミド構築には、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。
プラスミドベクターは、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ａ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ．，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ  ＡＭＢ−１，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１０）に記載されたｐＵＭｔＯＲ１３ＧＦＰを基にして構築した。
【００９６】
（３−２）プラスミドの構築と磁性細菌の培養
図１７（Ａ）に、本実施例で構築したベクターコンストラクトｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを示す。
該ベクターは、Ｐｍｓｐ１（ｔｅｔＯ）プロモーターの下流にＭＨＣ  ＩＩの細胞外ドメイン、ＦＬＡＧ  ｔａｇ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＣｅｌＳ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＣ）の融合タンパク質（ＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ）、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＡ−ｔａｇ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓのＳｃａＡ由来Ｄｏｃｋｅｒｉｎ（ＤｏｃＲ）の融合タンパク質（ＤＭ−ＤｏｃＲ）、及びＰｍｍｓ１６プロモーターの下流にＭｍｓ１３、ＮＳ  ｌｉｎｋｅｒ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＣ）、Ｒ．ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＲ）、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇの融合タンパク質（Ｍｍｓ１３−ｍｉｎｉｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ）の遺伝子を含む。
更に、Ｍｍｓ１３、ＮＳ  ｌｉｎｋｅｒ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来Ｃｏｈｅｓｉｎ（ＣｏｈＣ）、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇの融合タンパク質（Ｍｍｓ１３−ｃｏｈＣ）の遺伝子を含むベクターコンストラクトｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｃｏｈＣ（図示せず）を構築した。
【００９７】
作製した各プラスミドを用いて、エレクトロポレーション法によりΔｍｍｓ１３株の形質転換を行った。
また、磁性細菌の培養には、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＧＭ）を培地として用い、５Ｌの培地に、プレカルチャーを１／１０００植菌し、室温（２６〜２９℃）で静置することで培養を行った。植菌時には、アルゴンガスでバブリング（１５分間）することにより微好気状態を作った。また、形質転換体の培養の際は終濃度５．０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加し、対数増殖期中期に終濃度５００ｎｇ/ｍｌ  ＡＴｃを添加し、一晩培養した。
【００９８】
（３−３）磁性細菌粒子の調製
磁性細菌粒子の調製は、上記実施例２の（２−３）で説明したのと同様の方法で行った。
【００９９】
（３−４）ウェスタンブロッティング及びＢａｃＭＰｓ上での抗体結合試験
ＷＴ及び各形質転換体の菌体培養液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間）し、菌体を回収した。菌体２×１０９ｃｅｌｌｓに対して１％ＳＤＳ溶液２０μｌを添加し９９℃で３０分間煮沸した。更に、３×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し９９℃で５分間加熱し、菌体サンプルとした。ＷＴ及び各形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ２００μｇに対し、１％ＳＤＳ溶液３０μｌを添加後、超音波により拡散させながら煮沸した（１００℃、３０分間）。遠心分離（１８０００ｇ、５分間）により上清を回収し、３×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒをサンプルに１５  μｌ加えて９９℃で５分間加熱し、粒子膜画分サンプルとした。
各サンプルを、アクリルアミド濃度１２．５％のゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜へセミドライ法でブロッティングを行った。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜に対し、ＡＬＰ標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）またはＡＬＰ標識抗ＨＡ  ｔａｇモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）を反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳ−Ｔを用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰ−Ｂｌｕｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔａｔｅを加え、発色させた。
【０１００】
次に、形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ上に、目的タンパク質であるｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲが結合していることを確認するため、抗体結合試験を行った。
ＷＴ及び形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ５０μｇにＡＬＰ標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ、ＰＢＳＴ）、ＡＬＰ標識抗ＨＡ  ｔａｇモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ）１００μＬを、室温で３０分間反応させた。洗浄後、ＴＢＳ５０μｌにＢａｃＭＰｓを懸濁した。９６穴プレートに移した後、ルミホス５３０を５０μｌ添加し、５分後の発光強度を測定した。
【０１０１】
（３−４−１）ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲの発現確認
図１７（Ａ）に示すように、プラスミドｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆは、ｅＭＨＣ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲはリボソーム結合サイト（ＲＢＳ）を介してオペロンを構成している。また、ｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｃｏｈＣ（図示せず）も同様の構成を有する。
ウェスタンブロッティングの結果から、ｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体、及び、ｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｃｏｈＣを保持する形質転換体おいて、ｅＭＨＣ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲの発現を確認した。ここでは、ｅＭＨＣ−ＤｏｃＣに導入したＦＬＡＧ  ｔａｇ及びＤＭ−ＤｏｃＲに導入したＨＡ  ｔａｇに対する抗体を用いて検出を行った。
【０１０２】
（３−４−２）ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲのＢａｃＭＰｓ上への結合確認
形質転換体由来ＢａｃＭＰｓ上にｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲが結合していることを確認するために、抗体結合試験を行った。ｐＵＭＭＨＣ  ＩＩ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｍｉｎｉｓｃａｆを保持する形質転換体由来ＢａｃＭＰｓにおいては、ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲの結合を確認することができた。一方、ｐＵＭＭＨＣ  Ｉ−ＤＭＤｏｃ−Ｍ１３ｃｏｈＣを保持する形質転換体由来ＢａｃＭＰｓにおいては、ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣの結合が確認できた。
【０１０３】
（３−５）ペプチド結合アッセイ及びｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣのペプチド結合能の評価
ペプチド結合アッセイを行い、ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣのペプチド結合能の評価を行った。具体的には、ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ及びＤＭ−ＤｏｃＲ結合ＢａｃＭＰｓ（ｅＭＨＣ  ＩＩ/ＤＭ−ＢａｃＭＰｓ）及びｅＭＨＣ  ＩＩ−ＤｏｃＣ結合ＢａｃＭＰｓ（ｅＭＨＣ  ＩＩ−ＢａｃＭＰｓ）に対して、インフルエンザヘマグルチニン由来抗原ペプチド（ＨＡ３０６−３１８）の結合能を評価した。
ペプチドは、ＤＭＳＯを用いて５ｍｇ／ｍｌに調整し、使用するまで−２０℃で保存した。ＷＴ及び各形質転換体から得られたＢａｃＭＰｓ５０μｇに０．１〜１０μＭ（ＰＢＳＴ）に調整したビオチン標識ＨＡ３０６−３１８１００μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。その後１００μｌ  ＰＢＳを用いて３回洗浄を行い、ＡＬＰ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ−ＳＡ：０．５Ｕ/ｍｌ、ＰＢＳＴ）１００μＬを加え、３０分間室温で反応させた。その後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）１００μｌを用いて２回洗浄を行い、ＴＢＳ  ５０μｌに懸濁したものをサンプルとして使用した。９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅに移し、ルミホス５３０（５０μｌ）を加え、５分間室温で反応させた後、発光プレートリーダーを用いて発光強度を測定した。
【０１０４】
その結果、ｅＭＨＣ  ＩＩ／ＤＭ−ＢａｃＭＰｓでは抗原ペプチドの結合が確認されたが、一方、ＤＭ−ＤｏｃＲが共局在していないｅＭＨＣ  ＩＩ−ＢａｃＭＰｓには、抗原ペプチドは結合しなかった。
更に、ＨＡ３０６−３１８濃度、反応時間のカイネティクスを解析した。
【０１０５】
本実施例では、磁性細菌内でｅＭＨＣ  ＩＩ及びシャペロンであるＨＬＡ−ＤＭを共局在させることにより、従来生産が困難であったｅＭＨＣ  ＩＩの調製に成功した。
既に述べた通り、ＭＨＣ  ＩＩ分子は、ヒトの免疫機構を担う重要なタンパク質であり、種々の疾患及び病原体由来の抗原タンパク質の分解産物（抗原ペプチド）と結合し、抗原ペプチド−ＭＨＣ  ＩＩ複合体（ｐＭＨＣ  ＩＩ）を形成する。それ故、ＭＨＣ  ＩＩのペプチド結合能の解析、抗原ペプチドの同定は重要である。
抗原ペプチドと結合していない状態のＭＨＣ  ＩＩ（ｅＭＨＣ  ＩＩ）は構造が不安定であり、凝集塊を形成する。そのため、組み換えＭＨＣ  ＩＩは、例えば、α鎖及びβ鎖を封入体として別々に生産した後、抗原ペプチドと混合しリホールディングすることにより作製されており、この方法では、煩雑な操作が必要である。また、ＵＶ分解性抗原ペプチドを導入したｐＭＨＣ  ＩＩにＨＬＡ−ＤＭを添加し、ＵＶを照射することでペプチド結合能を有したｅＭＨＣ  ＩＩを作製されることが報告されているが、この系においてペプチド結合能を有したｅＭＨＣ  ＩＩを作製するためには、高濃度のＨＬＡ−ＤＭが必要になる。即ち、従来、ＭＨＣ  ＩＩの、目的の抗原ペプチド候補とのペプチド結合能を評価するためには、煩雑な実験ステップを必要とするか、又は、非常に高濃度の試料を必要としていた。加えて、親和性の高い抗原ペプチドを用いてｐＭＨＣ  ＩＩを作製しなければ充分な安定性が得られなかった。このような、組み換えＭＨＣ  ＩＩの作製の煩雑さ及び困難さがＭＨＣ  ＩＩ研究のボトルネックとなっていた。
しかし、本実施例では、磁性細菌内でｅＭＨＣ  ＩＩ及びシャペロンであるＨＬＡ−ＤＭを共局在させることで、従来生産が困難であったｅＭＨＣ  ＩＩを簡便且つ効率的に、またその機能を維持した状態で調製することができた。本実施例においては、磁性細菌の菌体内という限られた空間内でｅＭＨＣ  ＩＩとＨＬＡ−ＤＭとを共発現させ、且つ、足場タンパク質を介してこれらを共局在させ、ｅＭＨＣ  ＩＩとＨＬＡ−ＤＭを近接した位置に配置できることから、ペプチド結合能を保持したｅＭＨＣ  ＩＩを効率的に生産することが可能である。更に、ｅＭＨＣ  ＩＩ及びＨＬＡ−ＤＭはＢａｃＭｐｓ上に固定化されていることから、外部磁場を用いて簡便に回収することが出来るため、抗原ペプチドスクリーニング技術の簡便化や応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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