(57)【要約】【課題】幹細胞から単層上皮・内皮細胞層等の単層細胞層を製造する方法及び本発明の方法により得られた単層細胞層を用いた医薬の提供。【解決手段】幹細胞を、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地で培養する工程（第１工程）、続いてＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤を含む培地で培養する工程（第２工程）を含む、幹細胞を分化誘導して分化細胞の単層細胞層を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、幹細胞を分化誘導して分化細胞の単層細胞層を製造する方法。
【請求項２】
幹細胞を、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地で培養する工程（第１工程）、続いてＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤を含む培地で培養する工程（第２工程）を含む、幹細胞を分化誘導して分化細胞の単層細胞層を製造する方法。
【請求項３】
ＢＭＰ／アクチビン阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤が、イマチニブである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該培地が無血清培地である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分化細胞が、角膜内皮細胞、網膜色素上皮細胞、血管内皮細胞、肺胞上皮細胞、尿細管上皮細胞及び小腸上皮細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分化細胞が、角膜内皮細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法で得られた分化細胞の単層細胞層。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法で得られた分化細胞の単層細胞層を含む、医薬。
【請求項１２】
細胞シートの形態であることを特徴とする、請求項１１記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から分化細胞の単層細胞層を製造する方法に関する。さらに本発明は、該方法により得られた単層の細胞層、並びにそれを用いた医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮系の細胞は大きくわけて重層扁平上皮と、単層細胞層である単層上皮および内皮とがある。例えば眼科系であれば角膜上皮細胞は重層扁平上皮であり、角膜内皮細胞は単層細胞層である。近年、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）をはじめとする種々の幹細胞から、さまざまな組織への誘導が試みられている。ｉＰＳ細胞を含めた種々の幹細胞は、その多能性ゆえに、多様な転写因子を発現している。なかでもｐ６３の２つのアイソフォームであるＴＡｐ６３とｄｅｌｔａＮｐ６３は、細胞を重層化させる制御因子であり（非特許文献１、２）、ｉＰＳ細胞を含めた種々の幹細胞は、これらのｐ６３の発現のもとで重層扁平上皮に分化させることが可能である。
一方単層上皮・内皮においては、ｐ６３の発現が抑制されていることが報告されている（非特許文献３）。
【０００３】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を含めた種々の幹細胞は、もともとｐ６３を発現しているため、ｐ６３の抑制を加えない条件下では細胞が重層化する傾向にある。この重層化を抑制する誘導方法が未開発であったため、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から上皮系の細胞へ誘導したとしても、それらは重層上皮を形成してしまい、角膜内皮細胞をはじめとする単層上皮・内皮に誘導することは困難であった。
これらｐ６３の発現を亢進させる代表的な経路として、ＢＭＰシグナル経路とＷｎｔ／β−カテニン経路が報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
生体内には、角膜内皮、網膜色素上皮、血管内皮、肺胞上皮、尿細管上皮、小腸上皮、胆管上皮等の様々な単層上皮・内皮があり、これらの単層上皮・内皮は、例えば角膜内皮であればポンプ機能による透明性維持、肺胞上皮であればガス交換、小腸上皮であれば吸収といった機能が必要であるが、これらの機能は単層の状態であればこそ発揮できるものであり、重層化してしまうと機能障害を生じてしまう。また、胆管上皮のように細い管腔を覆う上皮では、重層上皮化すると管腔を物理的に狭窄させてしまう。そのため、幹細胞からこれらの組織を分化誘導するためには単層の状態での安定化が必須である。
【０００５】
本発明者らは、幹細胞からの角膜内皮細胞の製造・分化誘導方法について報告している（特許文献１、非特許文献６）。
一方、ＬＤＮ１９３１８９は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンのレセプターであるＡＬＫ２とＡＬＫ３の選択的阻害剤であり、イマチニブは細胞内のβ−カテニンを細胞膜のカドヘリン群と結合させることで細胞内Ｗｎｔ／β−カテニン経路を抑制することが知られており（非特許文献４）、イマチニブが抗がん剤の作用としてｐ６３を抑制することも知られている（非特許文献５）。
イマチニブはＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）／ｃ−ｋｉｔ阻害剤としても知られている。
しかしながら、これらの化合物を用いて、幹細胞から単層細胞層を製造・分化誘導する方法については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０５１７２２
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Der-Yuan Wang, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:3102-3108.
【非特許文献２】Johann Bergholz & Zhi-Xiong Xiao. Cancer Microenvironment 2012;5:311-322.
【非特許文献３】Paull AC & Whikehart DR. Mol Vis 2005 May 6;11:328-334.
【非特許文献４】Rao AS, et al. J Clin Endocrinol Metab. 2006 Jan;91(1):159-168.
【非特許文献５】Ongkeko WM, et al. Laryngoscope. 2006 Aug;;116(8):1390-1396.
【非特許文献６】Hatou S, et al. Stem Cells Dev. 2013 Mar 1;22(5):828-839.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、それらから誘導される種々の幹細胞、及び他の体性幹細胞）から単層上皮・内皮細胞層等の単層細胞層を製造する方法を提供することであり、幹細胞を分化誘導して所望する分化細胞を単層細胞層の状態で得ることにより、当該細胞が有する生理学的機能を維持した状態で安定して製造・提供することである。さらに本発明は、本発明の方法により得られた単層細胞層を用いた医薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、幹細胞を分化誘導する際に特定の因子を添加することにより、細胞の重層化を抑制し、効率的に単層細胞層へと分化誘導させることが可能なことを見出し、さらに得られた単層細胞層の機能を確認して本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］幹細胞を、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、幹細胞を分化誘導して分化細胞の単層細胞層を製造する方法。
［２］幹細胞を、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地で培養する工程（第１工程）、続いてＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤を含む培地で培養する工程（第２工程）を含む、幹細胞を分化誘導して分化細胞の単層細胞層を製造する方法。
［３］ＢＭＰ／アクチビン阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤が、イマチニブである、上記［２］記載の方法。
［５］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［７］該培地が無血清培地である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］分化細胞が、角膜内皮細胞、網膜色素上皮細胞、血管内皮細胞、肺胞上皮細胞、尿細管上皮細胞及び小腸上皮細胞からなる群から選択される細胞である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］分化細胞が、角膜内皮細胞である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法で得られた分化細胞の単層細胞層。
［１１］上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法で得られた分化細胞の単層細胞層を含む、医薬。
［１２］細胞シートの形態であることを特徴とする、上記［１１］記載の医薬。
【発明の効果】
【００１１】
生体内には、角膜内皮、網膜色素上皮、血管内皮、肺胞上皮、尿細管上皮、小腸上皮、胆管上皮等の様々な単層上皮・内皮があり、これらの単層上皮・内皮は、単層の状態でその生理学的機能を発揮することができ重層化してしまうと機能障害を生じる。本発明は、幹細胞を分化誘導し、所望する分化細胞を単層細胞層の状態で得ることができるため、該細胞が有する機能を損なうことがなく、従って眼科領域、心血管領域、呼吸器領域、腎泌尿器領域、消化器領域等の様々な再生医療に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞におけるｐ６３アイソフォーム（ＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３）の発現を調べた結果を示す図である。ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞（ｉＰＳ−ＮＣＣ；ＮＣ）及びヒト角膜内皮細胞（ｈＣＥ）について調べた。角膜内皮細胞ではＴＡｐ６３及びｄｅｌｔａＮｐ６３の発現が抑制されていることが確認された。
【図２】幹細胞を、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤およびＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤が、細胞内におけるＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３の発現を抑制することを示した図である。ｉＰＳ−ＮＣＣを用いた。ＢＭＰ／アクチビン阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を、Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤としてイマチニブをそれぞれ用いた。ＬＤＮ１９３１８９添加によるＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３の発現量への影響を図２Ａ、Ｂに、イマチニブ添加によるＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３の発現量への影響を図２Ｃ、Ｄに示す。
【図３】ＢＭＰ／アクチビン阻害剤およびＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤を含有する培地で培養することにより、細胞の重層化が抑制され、単層細胞層の形成が可能になることを示した図である。ＬＤＮ１９３１８９とイマチニブのいずれも含まない培地でｉＰＳ−ＮＣＣを培養した場合（左図）と、イマチニブとＬＤＮ１９３１８９をともに添加した培地で３日間培養した場合（右図）の細胞の形態を示す。ｉＰＳ−ＮＣＣは重層化する一方、ｉＰＳ−ＮＣＣをイマチニブとＬＤＮ１９３１８９を添加した培地で分化誘導した場合、モザイク状の配列を呈した単層細胞層を形成することがわかる。
【図４】ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含有する培地、あるいはＢＭＰ／アクチビン阻害剤とＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤とを含有する培地で培養することによりタイトジャンクションを有する単層細胞層の形成が可能になることを示した図である。ＬＤＮ１９３１８９とイマチニブの両方とも含まずにｉＰＳ−ＮＣＣを培養した場合と、ＬＤＮ１９３１８９を添加した培地で１週間培養した時点、および、その後イマチニブとＬＤＮ１９３１８９を添加した培地で４日間培養した時点での、タイトジャンクションのマーカーであるＺＯ−１の発現を免疫染色法で示す（図４Ａ−Ｆ）。ＬＤＮ１９３１８９とイマチニブ両方とも含まない場合、ＺＯ−１の発現は乏しく、タイトジャンクションの形成は不十分である（図４Ａ、Ｄ）。ＬＤＮ１９３１８９を添加した培地で１週間培養した時点では、ＺＯ−１の発現は核や細胞質にとどまっているものの、一部細胞境界にみられるようになり、タイトジャンクションが形成されつつあることがわかる（図４Ｂ、Ｅ）。さらに、その後イマチニブとＬＤＮ１９３１８９を添加した培地で４日間培養した時点で、ＺＯ−１は細胞境界にみられるようになり、タイトジャンクションが形成されていることがわかる。細胞の重なりも見られず、単層細胞層が形成されている（図４Ｃ、Ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
本発明において「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化し得る細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞）、体細胞由来人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells；ｉＰＳ細胞）、ｉＰＳ細胞から誘導した各種幹細胞（例、ｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞）、間葉系幹細胞、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）（例、皮膚幹細胞、角膜実質幹細胞、脂肪幹細胞）が挙げられ、所望される細胞（例、角膜内皮細胞）への分化誘導が可能なものが挙げられる。より好ましくはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞である。所望される細胞が角膜内皮細胞である場合には角膜実質由来の神経堤幹細胞から分化誘導させることもまた好ましい。神経堤幹細胞とは、自己複製能と多分化能を持つ多能性の幹細胞であり、脊椎動物の発生過程では、神経管の背側から体中に移動し、様々な組織の形成に寄与することが知られている。角膜内皮は角膜実質と同じく神経堤由来とされている。
【００１４】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。
具体的には、ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
【００１５】
ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。
具体的には、ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）等が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Nature. 2008 Jul 31;454(7204):646-50）、低分子化合物を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 Jan 9;4(1):16-9、Cell Stem Cell. 2009 Nov 6;5(5):491-503）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4）など、ｉＰＳ細胞の作製法については技術的な改良が鋭意行なわれているが、作製されたｉＰＳ細胞の基本的な性質、すなわち多分化能を有するという点は作出方法によらず同等であり、いずれも本発明の方法に用い得る。
本発明では、より好ましくはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を用いる。神経堤幹細胞を用いることで角膜内皮細胞への分化誘導が容易になる。ｉＰＳ細胞からの神経堤幹細胞の誘導は当分野で知られている手法に従って、あるいはそれに準じた方法で実施することができる。例えばNature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載された方法に準じて実施することができる。
【００１６】
体性幹細胞としては、ヒトに由来するものが使用できる。ここで体性幹細胞とは、例えば角膜内皮細胞へと分化し得る細胞であり、例えば角膜実質に由来する神経堤幹細胞（ＣＯＰｓ）、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells）、皮膚由来多能性前駆細胞（skin-derived precursors：ＳＫＰｓ）等が挙げられる。好ましくはＣＯＰｓ及びＳＫＰsである。ＣＯＰｓは、例えばStem Cells. 2006; 24(12): 2714-2722に記載の方法によって調製することができる。具体的には、マウス角膜から上皮、内皮を取り除いた後の角膜実質をコラゲナーゼ処置し、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、Ｂ２７サプリメント、ＬＩＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で分離した細胞を培養することによってスフェア状の細胞塊を形成する細胞集団を得て調製する。ＳＫＰｓは、例えばNat Cell Biol., 2001 vol. 3, 778-784に記載された方法に準じて調製することができる。
【００１７】
本発明において「分化細胞」とは、機能及び形態が特殊化した細胞をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないかまたはほとんどない。本発明では、単層細胞層とすることがその機能を発揮する上で好ましい細胞であり、具体的には角膜内皮細胞、網膜色素上皮細胞、血管内皮細胞、肺胞上皮細胞、尿細管上皮細胞、小腸上皮細胞等が挙げられる。
【００１８】
１．単層細胞層の製造方法
本発明の製造方法は、幹細胞から分化細胞を単層細胞層として製造する方法であり、分化誘導の過程で培地中にＢＭＰ／アクチビン阻害剤を添加することを特徴とする。本発明の製造方法の別の実施態様は、分化誘導の過程で、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤の添加に加えＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤をも添加することを特徴とする。好ましくは一定期間ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地中で培養し、その後ＢＭＰ／アクチビン阻害剤とＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤との両方を含む培地中で培養する。
【００１９】
本発明において、幹細胞から分化細胞へと分化誘導する方法は、取得を所望する分化細胞の種類に応じ、当分野で通常実施されている方法や既報に従って適宜選択することができ特に限定されないが、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤が、好ましくはＢＭＰ／アクチビン阻害剤とＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤とが、分化誘導の過程で必須的に添加される。
ＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤以外に、分化誘導に必要な各種因子（分化誘導因子）は、取得を目的とする分化細胞の種類や実施する分化誘導方法によって異なり、それらに応じて適宜決定される。
例えば、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する場合は、特許文献１に記載の方法及び分化誘導因子を用いることができる。
【００２０】
本工程で用いる幹細胞は上述の通りであるが、好ましくは取得を所望する細胞への分化がある程度運命付けられた細胞である。例えば角膜内皮細胞の単層細胞層の取得を目的とする場合、角膜内皮細胞への分化が運命付けられた細胞、具体的には、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞及び角膜実質由来神経堤幹細胞（ＣＯＰｓ）が用いられる。皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）を用いることもまた好ましい。例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等のより未分化な幹細胞を直接用いる場合には上記工程の前に、神経堤幹細胞へと誘導する工程を実施することができ、また、実施することが好ましい。かかる工程は、例えば、Nature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載の方法、及びそれに準じた方法によって実施することができる。
【００２１】
本発明において「ＢＭＰ／アクチビン阻害剤」とは、ＢＭＰ／アクチビンが関与するシグナル経路を負に制御し得る物質であって、最終的にＢＭＰ／アクチビンの機能が阻害されればその作用点は特に限定されない。
本発明で用いるＢＭＰ／アクチビン阻害剤として、具体的には下記構造を有するＬＤＮ１９３１８９（CAS登録番号：1062368-24-4）が例示される。
【００２２】
【化１】
2015019628.tif 000002
【００２３】
ＬＤＮ１９３１８９は、ＢＭＰ  Ｔｙｐｅ  ＩレセプターであるＡＬＫ２及びＡＬＫ３を阻害し、その結果Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８のリン酸化を阻害する。ＢＭＰシグナルは発生を調節し、成熟組織において重要な生理学的役割を果たす。
その他にもＡＬＫ阻害剤であるドーソモルフィン（Dorsomorphin；CAS登録番号：866405-64-3）、ＳＢ４３１５４２（CAS登録番号：301836-41-9）、ＤＭＨ−１（CAS登録番号：1206711-16-1）等、ＴＧＦ  Ｔｙｐｅ  ＩＩレセプター阻害剤であるＬＹ２１０９７６１（CAS登録番号：700874-71-1）、ＬＹ２１５７２９９（CAS登録番号：700874-72-2）、Ｎｏｇｇｉｎ等、あるいは、アクチビンおよびＢＭＰファミリーのアンタゴニストであるフォリスタチン（follistatin；CAS登録番号：117628-82-7）等、あるいは、Ｓｍａｄ阻害剤であるピルフェニドン（Pirfenidone；CAS登録番号：53179-13-8）等がＬＤＮ１９３１８９の代替化合物の候補として挙げられる。
これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。本発明では、好ましくは、ＬＤＮ１９３１８９が用いられ、ＬＤＮ１９３１８９は特表２０１１−５１４９０８に開示されている。ＢＭＰ／アクチビン阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類や添加する時期によって適宜設定されるが、ＬＤＮ１９３１８９の場合、通常１０ｎＭ〜１μＭ、好ましくは１００ｎＭ程度である。１種又は２種以上の阻害剤を組み合わせて用いても良い。
【００２４】
本発明において「Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤」とは、Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔが関与する経路を負に制御し得る物質であって、最終的にＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔの機能が阻害されればその作用点は特に限定されない。
本発明で用いるＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤として、具体的には下記構造を有するイマチニブ（Imatinib；CAS登録番号：152459-95-5）が例示される。
【００２５】
【化２】
2015019628.tif 000003
【００２６】
イマチニブはGLEEVEC（登録商標）、グリベック（登録商標）として市販されている。
チロシンキナーゼ阻害剤であるニロチニブ（Nilotinib;CAS登録番号：641571-10-0）、ダサチニブ（Dasatinib；CAS登録番号：302962-49-8）、エルロチニブ（Erlotinib；CAS登録番号：183321-74-6）、ゲフィチニブ（Gefitinib；CAS登録番号：184475-35-2）、アファチニブ（Afatinib；CAS登録番号：850140-72-6）、ラパチニブ（Lapatinib；CAS登録番号：231277-92-2）、ＣＵＤＣ−１０１（CAS登録番号：1012054-59-9）、スニチニブ（Sunitinib；CAS登録番号：557795-19-4）、ＰＰ−１２１（CAS登録番号：1092788-83-4）、ＣＰ−６７３４５１（CAS登録番号：343787-29-1）、クレノラニブ（Crenolanib；CAS登録番号：670220-88-9）、ソラフェニブ（Sorafenib；CAS登録番号：284461-73-0）、ポナチニブ（Ponatinib；CAS登録番号： 943319-70-8）、アキシチニブ（Axitinib；CAS登録番号： 319460-85-0）、トセラニブ（Toceranib；CAS登録番号：356068-94-5）、テラチニブ（Telatinib；CAS登録番号：332012-40-5）、タンヅチニブ（Tandutinib；CAS登録番号：387867-13-2）等がイマチニブの代替化合物の候補になりうる。
これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。本発明では、好ましくは、イマチニブが用いられる。Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類や添加する時期によって適宜設定されるが、イマチニブの場合、通常０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１０μＭ程度である。１種又は２種以上の阻害剤を組み合わせて用いても良い。
【００２７】
本発明において、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤は、幹細胞から所望の分化細胞へと分化誘導させる過程で添加される。好ましくはＢＭＰ／アクチビン阻害剤を添加し、一定期間培養した後、Ａｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤を添加する。各阻害剤を添加するタイミングは分化誘導が所望される細胞の種類や用いる阻害剤の種類によって異なるが、例えば神経堤幹細胞から角膜内皮細胞の単層細胞へと分化誘導する場合には、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を含む培地中で５〜１０日、好ましくは７日程度培養し、続いてＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤の両方を含む培地中で３〜４日程度培養する。必要に応じて培地交換や細胞の再播種を行なう。
【００２８】
本発明で用いる培地は、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下、便宜上、基礎培地とも称する）に各分化誘導因子（所望される分化細胞によって異なる）を添加してなるものである。基礎培地としては、例えば、MEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、商業的に入手可能である。さらに本発明で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得る。本工程で用いられる培地が血清含有培地である場合には、ウシ血清（Bovine Serum）、ウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum）などの哺乳動物の血清が使用でき、該血清の培地中の濃度は０．１〜２０％、好ましくは１〜１０％である。
本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、無血清で、組成が化学的に明らかな培地である。無血清培地としては、例えば、MEM、DMEM/F12、HuMEC Basal SFM、Defined Keratinocyte−SFM、Human Endothelial-SFM等が挙げられ、いずれも商業的に入手可能かあるいは既知文献に従って適宜調製することができる。その一例として実施例ではHuman Endothelial-SFMを使用する。
かかる培地に、ＢＭＰ／アクチビン阻害剤を添加して、あるいはＢＭＰ／アクチビン阻害剤及びＡｂｌ／ＰＤＧＦＲ／ｃ−ｋｉｔ阻害剤を添加して使用する。
【００２９】
本発明で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレンなど）、増殖因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などが挙げられる。これらの血清代替物もまた商業的に入手可能である。また、必要に応じてビタミン、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）等を含有できる。
【００３０】
本発明は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で、分化細胞へと分化誘導するに十分な期間、１〜１０％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて培養することによって実施される。所望される分化細胞が角膜内皮細胞の場合、幹細胞としてｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞またはＣＯＰｓ、あるいはＳＫＰｓが好ましく用いられる。必要に応じて、添加する分化誘導因子の種類（組合せ）を変えることができ、また好ましい。幹細胞としてより未分化な状態、すなわちｉＰＳ細胞を用いる場合には、本発明の方法の前にｉＰＳ細胞から神経堤幹細胞へと分化誘導する工程をさらに行う（例えば、Nature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載の方法、およびそれを改良した方法によって実施することができる）が、該工程には通常１カ月程度要する。角膜実質からＣＯＰｓへの分化誘導も同様に通常１カ月程度要する（該工程の詳細はStem Cells. 2006; 24(12): 2714-2722等を参照）。神経堤幹細胞への分化誘導はＴｗｉｓｔ１（TWIST, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 1）、Ｓｏｘ９（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ９）等の神経堤幹細胞マーカーの発現を調べることによって確認することができる。
【００３１】
本発明において、幹細胞から特定の分化細胞に分化誘導されたかどうかの確認は、該分化細胞の機能を発揮するためのタンパク質やそれをコードする遺伝子（いわゆる細胞マーカー）の発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲを利用した方法等によって評価することができる。例えば分化細胞が、角膜内皮細胞の場合には、該マーカーとしては、N-cadherin、Na+,K+-ATPase、Na+,HCO3-co-transporter、collagen typeIV、collagen typeVIII、carbonic anhydrase、Keratin 8、Keratin 18、Paired-like homeodomain transcription factor 2、Integrin alpha 3、Claudin 10b等が挙げられる。
網膜色素上皮細胞のマーカーとしては、BEST1、RPE65、MERTK、CRALBP、collagen typeIV等が挙げられる。
血管内皮細胞のマーカーとしては、CD31、CD133、FLK-1（VEGFR-2)、Tie-2、VE-cadherin等が挙げられる。
肺胞上皮細胞のマーカーとしては、T1α等が挙げられる。
尿細管上皮細胞のマーカーとしては、EpCAM、TROP2等が挙げられる。
小腸上皮細胞のマーカーとしては、CDX2、E-cadherin等が挙げられる。
【００３２】
また、幹細胞から特定の分化細胞に分化誘導されたかどうかの確認は、該分化細胞が特徴的に発揮する機能の有無を評価することによっても行なうことができる。例えば分化細胞が、角膜内皮細胞の場合には、細胞のＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能は、例えばUssing chamberを用いてInvestigative Ophthlmology & Visual Science, 2010 vol. 51, No. 8, 3935-3942やCurrent Eye Research, 2009 vol. 34, 347-354に記載の方法に従って測定することができる。例えば分化細胞が、肺胞上皮細胞の場合にはガス交換機能を、小腸上皮細胞の場合には吸収能を測定することによって確認できる。尿管上皮細胞においても例えばUssing chamberを用いてイオン輸送機能を測定することによって確認できる（五十里彰、腎尿細管上皮細胞における電解質輸送体の分子生理学的研究、薬学雑誌、2009:129(9):1025-1031.）。網膜色素上皮細胞においても、蛍光ラベルを行った視細胞外節や蛍光ビーズなどを培養液に添加して細胞へのとりこみ状態をフローサイトメトリー等を用いて評価する貪食能測定法によって確認できる。
【００３３】
簡便には、細胞形態を評価することによっても分化誘導を確認することができる。内皮細胞へと分化した細胞はモザイク状の増殖形態を示す。さらに角膜内皮細胞や上皮細胞は、隣り合う細胞間にタイトジャンクションを形成し、細胞のバリア機能を有し得る。タイトジャンクションタンパク質としてＺＯ−１が挙げられる。
【００３４】
本発明の製造方法では、幹細胞を所望する分化細胞へ効率的に分化誘導することにより、分化細胞を大量に、且つ単層細胞層の状態で供給できる。得られた分化細胞の単層細胞層は医薬として利用することができる。例えば角膜内皮細胞の単層細胞層は、角膜移植用の角膜内皮細胞シートに利用することができる。
【００３５】
２．細胞を含む医薬
本発明は、上記した本発明の製造方法により製造された分化細胞の単層細胞層を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある）を提供する。
例えば、角膜内皮細胞を単層の角膜内皮細胞シートとして製造する場合には、幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞、皮膚由来多能性前駆細胞）を培養基材上に播種し、本発明の方法により、該培養基材上で角膜内皮細胞への分化を誘導する。本発明において用いられる培養基材としては、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ラミニン等の天然物由来の高分子材料、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生分解性高分子材料、ハイドロキシアパタイト、羊膜等が挙げられる。好ましくは、移植の際に拒絶反応を引き起こさないようなものが、移植対象によって適宜設定される。
【００３６】
移植には、コンフルエントな状態になった角膜内皮細胞が用いられる。その為には、通常、幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞、皮膚由来多能性前駆細胞）の細胞数を、細胞シートを形成させることができる細胞密度となるよう設定して播種する。通常、播種される細胞密度は、１．０×１０４〜５．０×１０６細胞数／ｃｍ２、より好ましくは、１．０×１０５〜１．０×１０６細胞数／ｃｍ２である。
【００３７】
本発明によって得られる角膜内皮細胞シートは、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑等の治療における移植片として用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。
【００３９】
参考例１：角膜内皮細胞ではＴＡｐ６３及びｄｅｌｔａＮｐ６３の発現が抑制されている。
Ｓｔｕｄｅｒらの方法(Nat Protoc. 2010 5(4):688-701)により誘導しコンフルエントにしたｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞と、角膜移植に使用した海外ドナー角膜の残存部から採取したヒト角膜内皮細胞から、RNeasy kit (Qiagen社)を用いてＲＮＡを抽出後、ReverTra Ace α kit (Toyobo社)を用いてｃＤＮＡを作成した。
GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems Japan)を用いて各細胞のＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３、ＧＡＰＤＨの発現を比較した(図１)。
各プライマー配列は以下のとおり。
【００４０】
【表１】
2015019628.tif 000004
【００４１】
実施例１：イマチニブ及びＬＤＮ１９３１８９は、ＴＡｐ６３及びｄｅｌｔａＮｐ６３の発現を抑制する。
Ｓｔｕｄｅｒらの方法(Nat Protoc. 2010 5(4):688-701)により誘導したｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞の培地を、以下に示す内皮誘導培地に交換し、かつＬＤＮ１９３１８９(100nM, STEMGENT, San Diego, CA)を加えた群と加えない群（各ｎ＝４）にわけて分化誘導した。
（内皮誘導培地）
・Human Endothelium Serum Free Medium (HE-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
・all-trans retinoic acid (1μM, Sigma-Aldrich, St. Louis,  MO)
・6-bromoindirubin-3′-oxime (BIO; glycogen synthase kinase (GSK) 3β inhibitor) (1μM, Calbiochem, Darmstadt, Germany)
・Y27632 (10μM, nacalai tesque, Kyoto, Japan)
・fibroblastic growth factor 2 (FGF2) (10ng/ml, Sigma-Aldrich)
誘導開始から７日目の時点で細胞を回収し、RNeasy kit (Qiagen社)を用いてＲＮＡを抽出後、ReverTra Ace α kit (Toyobo社)を用いてｃＤＮＡを作成した。SYBR Green enzyme mixture (Thunderbird SYBR qPCR mix; TOYOBO)を用い、Step One Plus (Applied Biosystems)にてＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３発現量の定量的ＰＣＲ法を行った。プライマーの配列は表１に記載のとおり。ＬＤＮ１９３１８９添加群の細胞で有意にＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３の発現が抑制されていることを確認した（図２Ａ、Ｂ）。
同様に、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞を、内皮誘導培地にイマチニブ（10μM, Cell Signaling Technology Danvers, MA）を添加した群と、イマチニブを添加ない群（各ｎ＝４）にわけて分化誘導し、誘導開始から４日目の時点で細胞を回収し、同様の方法でＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３発現量の定量的ＰＣＲ法を行った。イマチニブ添加群の細胞で有意にＴＡｐ６３、ｄｅｌｔａＮｐ６３の発現が抑制されていることを確認した（図２Ｃ、Ｄ）。
【００４２】
実施例２：角膜内皮細胞の単層細胞層の製造
（材料と方法）
［分化誘導］
１）Ｓｔｕｄｅｒらの方法（Nat Protoc. 2010 5(4):688-701）により誘導しコンフルエントにしたｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞の培地を取り除き、以下の組成の培地（培地Ａ）に交換した。
（培地Ａ）
・Human Endothelium Serum Free Medium (HE-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
・all-trans retinoic acid  (1μM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
・6-bromoindirubin-3′-oxime (BIO; glycogen synthase kinase (GSK) 3β inhibitor) (1μM, Calbiochem, Darmstadt, Germany)
・Y27632 (10μM, nacalai tesque, Kyoto, Japan)
・fibroblastic growth factor 2 (FGF2) (10ng/ml, Sigma-Aldrich)
・LDN193189 (100nM, STEMGENT, San Diego, CA)
２〜３日毎に培地Ａを用いて培地交換し、７日間培養した。
２）７日目にAccutase (Invitrogen)処理し遠心分離後、上清を除去し細胞を回収した。
３）以下の組成の培地（培地Ｂ）に交換し、細胞を０．１％ゼラチン、あるいは、MAPTrix-C #166214 (Kollodis BioSciences, North Augusta, SC)でコートした培養皿に播種した。
（培地Ｂ）
・Human Endothelium Serum Free Medium (HE-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
・all-trans retinoic acid  (1μM)
・BIO (1μM)
・Y27632 (10μM)
・fibroblastic growth factor 2 (FGF2) (10ng/ml)
・LDN193189 (100nM)
・5% KnockOut Serum Replacement (KSR) (Invitrogen)
４）播種後、接着細胞密度が3000 cells/mm2以上になった時点で以下の組成の培地（培地Ｃ）に変更し培養すると、変更後３〜４日目で単層の角膜内皮細胞層を得ることができた。
（培地Ｃ）
・Human Endothelium Serum Free Medium (HE-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
・Y27632 (10μM)
・fibroblastic growth factor 2 (FGF2) (10ng/ml)
・LDN193189 (100nM)
・imatinib (10μM, Cell Signaling Technology Danvers, MA)
・1% KnockOut Serum Replacement (KSR) (Invitrogen)
なお、培地Ｃに交換後、細胞がコンフルエントにいたらない場合はBIO (1μM)を上記培地に加えた。
また、同様に、LDN193189を含まない点以外は培地Ａと同じ組成の培地を用いてｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞を培養した。
【００４３】
［免疫蛍光染色］
ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞に、上記の工程において培地Ａ、Ｂ及びＣからＬＤＮ１９３１８９とイマチニブを除いてコンフルエントにいたらせた細胞、上記の工程において培地Ｃからイマチニブを除いてコンフルエントにいたらせた細胞および上記工程のとおり、ＬＤＮ１９３１８９とイマチニブの両者を用いてコンフルエントにいたらせた細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄後Morphosave (Ventana Medical Systems)で１５分間処理し、さらにＰＢＳで洗浄後10% normal donkey serumでブロッキングを行った。ウサギ抗ＺＯ−１抗体（invitrogen、×１００希釈）にて１昼夜処理し、ＰＢＳで洗浄後ロバ抗ウサギ二次抗体を１時間反応させ蛍光顕微鏡で観察した。
（結果）
Ｓｔｕｄｅｒらの方法（Nat Protoc. 2010 5(4):688-701）により誘導しコンフルエントにしたｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞の像を図３の左図に示す。この段階ですでに一部の細胞で重層化が始まっており、細胞の形態も細長い形が多い。この細胞を上記［分化誘導］の方法に従って分化誘導するとモザイク状の単層細胞層を形成するようになった（図３の右図）。
また、ＬＤＮ１９３１８９とイマチニブの両方ともを含まない場合、ＺＯ−１の発現は乏しく、タイトジャンクションの形成は不十分であった（図４Ａ、Ｄ）。ＬＤＮ１９３１８９のみを用いると、ＺＯ−１の発現は核や細胞質にとどまっているものの、一部細胞境界にみられるようになり、タイトジャンクションが形成されつつあることがわかる（図４Ｂ、Ｅ）。さらに、ＬＤＮ１９３１８９とイマチニブの両方を用いるとＺＯ−１は細胞境界にみられるようになり、タイトジャンクションが形成されていることがわかる。細胞の重なりも見られず、単層細胞層が形成されている（図４Ｃ、Ｆ）。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、幹細胞を分化誘導し、所望する細胞を単層細胞層の状態を得ることができる。従って該細胞が有する機能を損なうことがないので、眼科領域、心血管領域、呼吸器領域、腎泌尿器領域、消化器領域等の様々な再生医療に応用可能である。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：ＴＡｐ６３プライマー（フォワード）
配列番号２：ＴＡｐ６３プライマー（リバース）
配列番号３：ｄｅｌｔａＮｐ６３プライマー（フォワード）
配列番号４：ｄｅｌｔａＮｐ６３プライマー（リバース）
配列番号５：ＧＡＰＤＨプライマー（フォワード）
配列番号６：ＧＡＰＤＨプライマー（リバース）
【図１】
2015019628.tif 000005
【図２】
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【図３】
2015019628.tif 000007
【図４】
2015019628.tif 000008
【配列表】
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