(57)【要約】【課題】サバイビンタンパク質の細胞内動態とサバイビンプロモーター活性について、細胞解析を行う方法を提供する。【解決手段】細胞解析方法は、（１）サバイビンプロモーターと、発光タンパク質をコードする遺伝子とを含む第１のベクター、およびプロモーターと、サバイビン遺伝子と、蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターである第２のベクターとを準備すること、（２）細胞に前記第１のベクターと第２のベクターとを導入すること、（３）（２）の前記細胞を薬剤に曝すこと、（４）前記細胞が、前記薬剤に曝される前後に亘る期間内の少なくとも２つの時点で、明視野の観察、蛍光強度の測定および発光強度の測定をそれぞれ行うこと、（５）（４）の結果から、前記細胞に関する情報を得ることを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）サバイビンプロモーターと、その下流に機能的に連結された発光タンパク質をコードする遺伝子とを含む第１のベクター、およびプロモーターと、その下流に機能的に連結されたサバイビン遺伝子と、その下流に機能的に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターである第２のベクターとを準備すること、
（２）採取および／または培養された細胞に前記第１のベクターと第２のベクターとを導入すること、
（３）（２）の前記細胞を試薬に曝すこと、
（４）前記細胞が、前記試薬に曝される前および後のそれぞれ少なくとも１つの時点で、明視野の観察、蛍光強度の測定および発光強度の測定をそれぞれ行うこと、および
（５）（４）の結果から、前記細胞に関する情報を得ること、
を含むサバイビンについての細胞解析方法。
【請求項２】
前記明視野の観察、前記蛍光強度の測定および前記発光強度の測定が、それぞれ経時的に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記明視野の観察と、前記蛍光強度の測定と、前記発光強度の測定とを、予め定められた順番で繰り返して行う請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記明視野の観察と、前記蛍光強度の測定と、前記発光強度の測定とが、共通する特定の興味領域について行われる請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記特定の興味領域が、１つの細胞を含む領域である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記評価が、前記明視野の観察により得られた情報から、前記細胞の形態変化を判定すること、前記蛍光強度の測定により得られた結果から、サバイビンタンパク質の局在部位を特定すること、および前記発光強度の測定により得られた結果からサバイビンプロモーター活性の程度を判断することに基づいて行われる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記明視野の観察が、位相差観察である請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記明視野の観察、前記蛍光強度の測定および前記発光強度の測定が、それぞれ撮影手段により撮像され、形成された画像を用いて行われる請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記試薬として抗癌剤を使用して、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法を行い、それにより得られた結果に基づいて、前記細胞が由来する対象における癌の転移率および／または予後を評価することを含む癌の解析方法。
【請求項１０】
（１）サバイビンプロモーターと、その下流に機能的に連結された発光タンパク質をコードする遺伝子とを含む第１のベクター、およびプロモーターと、その下流に機能的に連結されたサバイビン遺伝子と、その下流に機能的に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターである第２のベクターとを準備すること、
（２）採取および／または培養された細胞に前記第１のベクターと第２のベクターとを導入すること、
（３）（２）の前記細胞を被検物質に曝すこと、
（４）前記細胞が、前記被検物質に曝される前および後のそれぞれ少なくとも１つの時点で、明視野の観察、蛍光強度の測定および発光強度の測定をそれぞれ行うこと、および
（５）（４）の結果から、被検物質の効果を評価すること、
を含む被検物質の薬効をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
前記明視野の観察、前記蛍光強度の測定および前記発光強度の測定が、それぞれ経時的に行われる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記明視野の観察と、前記蛍光強度の測定と、前記発光強度の測定とを、予め定められた順番で繰り返して行う請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記明視野の観察と、前記蛍光強度の測定と、前記発光強度の測定とが、共通する特定の興味領域について行われる請求項１０〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記特定の興味領域が、１つの細胞を含む領域である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記評価が、前記明視野の観察により得られた情報から、前記細胞の形態変化を判定すること、前記蛍光強度の測定により得られた結果から、サバイビンタンパク質の局在部位を特定すること、および前記発光強度の測定により得られた結果からサバイビンプロモーター活性の程度を判断することに基づいて行われる請求項１０〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記明視野の観察が、位相差観察である請求項１０〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記明視野の観察、前記蛍光強度の測定および前記発光強度の測定が、それぞれ撮影手段により撮像され、形成された画像を用いて行われる請求項１０〜１６の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サバイビンタンパク質の発現に関して細胞を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）タンパク質は、アポトーシスの抑制と細胞分裂の調整機能を有するタンパク質である。サバイビンタンパク質は、正常組織ではほとんど観察されないが、胎児の組織や多くの癌において高発現することが知られている。また、サバイビンの局在部位を特定することにより、癌の転移率や予後を評価することも提案されている。
【０００３】
このような事情から、サバイビンは癌治療のターゲットとして注目されており、サバイビンの発現抑制剤の創製が開始されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｉｏｕ，  Ｓ．  Ｋ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｍ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔａｒｎａｗａｓｋｉ，  Ａ．  Ｓ（２００３）．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｍｏｎｉｔ．  ９，１２５−１２９
【非特許文献２】Ｌｉ  Ｆ．，  Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  Ｇ．，  Ｃｈｕ  ＥＹ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９６：５８０−５８４
【非特許文献３】Ｔａｎａｋａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６：１２７−１３４
【非特許文献４】Ｌｅｈｎｅｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  ２００２；１０：１３４−１３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の状況に鑑みて、癌の基礎研究やサバイビンをターゲットとする薬効スクリーニングにおいては、サバイビンの細胞内動態とプロモーター活性を検出することが有用であると考える。
【０００６】
本願発明の課題は、サバイビンタンパク質の細胞内動態とサバイビンプロモーター活性について、細胞解析を行う方法を提供することである。より詳しくは、サバイビンタンパク質の細胞内動態とサバイビンプロモーター活性とを同時に、例えば、１つの組織および／または１つの細胞において同時に、観察する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明は、細胞解析方法を提供する。細胞解析方法は、細胞解析方法は、（１）サバイビンプロモーターと、発光タンパク質をコードする遺伝子とを含む第１のベクター、およびプロモーターと、サバイビン遺伝子と、蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターである第２のベクターとを準備すること、（２）細胞に前記第１のベクターと第２のベクターとを導入すること、（３）（２）の前記細胞を薬剤に曝すこと、（４）前記細胞が、前記薬剤に曝される前後に亘る期間内の少なくとも２つの時点で、明視野の観察、蛍光強度の測定および発光強度の測定をそれぞれ行うこと、（５）（４）の結果から、前記細胞に関する情報を得ることを含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、サバイビンタンパク質の細胞内動態とサバイビンプロモーター活性について、細胞解析を行う方法が提供される。それにより、サバイビンタンパク質の細胞内動態とサバイビンプロモーター活性とを同時に、例えば、１つの組織および／または１つの細胞において同時に観察することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施の形態１に係るベクターを示す図。
【図２】実施の形態２に係る観察システムの構成を示す模式図。
【図３】実施の形態２に係る観察システムを示すブロック図。
【図４】実施の形態２に係る処理手順を示すフローチャート。
【図５】実施の形態３に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図。
【図６】実施の形態３に係る処理手順を示すフローチャート。
【図７】実施の形態４に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図。
【図８】Ｄ−ルシフェリンの励起スペクトル（Ｅｘ）と蛍光スペクトル（Ｅｍ）を示すグラフ。
【図９】例１における薬剤刺激前のＨｅＬａ細胞の位相差観察像を示す図。
【図１０】例１における薬剤刺激前のＨｅＬａ細胞の蛍光観察像を示す図。
【図１１】例１における薬剤刺激前のＨｅＬａ細胞の発光観察像を示す図。
【図１２】例１のタイムラプス観察における各撮像のタイミングを示す模式図。
【図１３】例１における薬剤刺激後３０分経過時点のＨｅＬａ細胞の位相差観察像を示す図。
【図１４】例１における薬剤刺激後３０分経過時点のＨｅＬａ細胞の蛍光観察像を示す図。
【図１５】例１における薬剤刺激後３０分経過時点のＨｅＬａ細胞の発光観察像を示す図。
【図１６】図１０および図１４に示された指定されたＲＯＩにおける発光強度の計時変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態１について、詳細に説明する。実施の形態１は、細胞におけるサバイビン遺伝子の発現量とその分布、サバイビンプロモーター活性の程度および形態に関する情報を得る方法に係る。
【００１１】
対象におけるサバイビン遺伝子の発現は、対象が特定の状態、例えば、癌であるときに高い。また、サバイビンタンパク質の分布は、それが存在する組織や細胞の状態に応じて変化する。
【００１２】
従って、サバイビン遺伝子の発現の程度とサバイビンタンパク質の分布との情報から、特定の細胞または組織がどのような状態にあるのか、特定の細胞にあるのか否かを判定することが可能である。１つの実施形態は、この原理を利用するサバイビンについての細胞解析方法である。
【００１３】
例えば、特定の試料、例えば、組織または細胞において、例えば、サバイビン遺伝子が高発現している場合に、その試料が癌化した試料、即ち、癌組織または癌細胞であると判定することが可能である。更なる１つの実施形態は、この原理を利用する癌の解析方法である。
【００１４】
或いは、癌細胞を被検物質に曝す前後で、サバイビン遺伝子の発現とサバイビンタンパク質の分布がどのように変化するのかを指標として、被検物質が特定の作用、例えば、抗癌作用を有するか否かを評価することが可能である。もう１つの実施形態は、この原理を利用する薬効スクリーニング方法である。
【００１５】
ベクターを利用して、サバイビン遺伝子の発現とサバイビンタンパク質の分布の情報を得ることが可能である。
【００１６】
細胞解析方法は、次の工程を含んでよい；
（１）サバイビンプロモーターと、その下流に機能的に連結された発光タンパク質をコードする遺伝子とを含む第１のベクター、およびプロモーターと、その下流に機能的に連結されたサバイビン遺伝子と、その下流に機能的に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む発現ベクターである第２のベクターとを準備すること、
（２）採取および／または培養された細胞に前記第１のベクターと第２のベクターとを導入すること、
（３）（２）の前記細胞を薬剤に曝すこと、
（４）前記細胞が、前記薬剤に曝される前後に亘る期間内の少なくとも２つの時点で、明視野の観察、蛍光強度の測定および発光強度の測定をそれぞれ行うこと、および
（５）（４）の結果から、前記細胞に関する情報を得ること。
【００１７】
実施形態において使用されるベクターは、第１のベクターと第２のベクターが使用される。第１のベクターと第２のベクターについて、図１（１）および（２）を参照しながら説明する。
【００１８】
図１（１）に示される第１のベクター１は、サバイビン遺伝子のプロモーター活性の程度を測定するためのベクターである。第１のベクター１は、サバイビンプロモーター２と、その下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子３とを含む。ここで、「機能的に連結された」とは、サバイビンプロモーター２の制御下において、レポーター遺伝子３が正常に発現されるように、サバイビンプロモーター２の下流に第１のレポーター遺伝子３が結合されていることをいう。
【００１９】
サバイビンプロモーター２は、それ自身公知の何れのサバイビンプロモーターであってよく、好ましくは、使用される試料に依存して選択された種類のサバイビンプロモーターであってよい。例えば、ヒトの細胞および組織について解析を行う場合では、ヒト由来のサバイビンプロモーターを使用することが好ましい。ヒトサバイビンプロモーターの配列を表１に配列番号１として示す。
【表１】
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【００２０】
サバイビンプロモーターとして使用される配列番号１で示されるヒトサバイビンプロモーターは、サバイビンプロモーターとしての機能を維持している限り、１個〜数個の塩基が欠失、置換および／または付与されていてもよい。他の公知のサバイビンプロモーターについても、同様に何れか公知のプロモーター配列について、それ独自のサバイビンプロモーター活性が維持されている限り、１個〜数個の塩基の欠失、置換および／または付与がなされていてもよい。
【００２１】
第１のレポーター遺伝子３は、何れか公知の発光タンパク質をコードする遺伝子であってよい。第１のレポーター遺伝子３の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、オベリン遺伝子、コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子、ヒオドシエビルシフェラーゼ遺伝子）および蛍光タンパク質遺伝子（例えば、ＢＦＰ遺伝子、ＣＦＰ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＹＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子）などであってよく、好ましくはルシフェラーゼである。
【００２２】
第１のベクターは、更に、ｎｅｏ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子などの更なる遺伝子を含んでもよい。また更に、第１のレポーター遺伝子３の下流にポリＡなどの転写終結遺伝子を含んでもよい。第１のベクターとして、発光タンパク質をコードする遺伝子を含む市販のベクターを利用してもよい。例えば、そのような市販のベクターの発光タンパク質をコードする遺伝子の上流にサバイビンプロモーターを組み込めばよい。そのような組み込みは、例えば、制限酵素による切断と、リガーゼによる連結などの遺伝子工学的手法を利用してよい。或いは、遺伝子工学的手法により、サバイビンプロモーター２と、その下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子３とを含む配列からなるポリヌクレオチドから第１のベクターを製造してもよい。第１のベクターの製造は、それ自身公知の技術を利用して行ってよい。
【００２３】
第１のベクターは、プラスミドベクターであっても、ウイルスベクターであってもよいが、プラスミドベクターが好ましい。
【００２４】
図１（２）に示される第２のベクター４は、発現ベクターであり、サバイビンタンパク質の分布を示すためのベクターである。第２のベクター４は、強力なプロモーターと、その下流に機能的に連結されたサバイビン遺伝子と、その下流に機能的に連結された第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子とを含む。ここで、「機能的に連結された」とは、目的とする遺伝子が目的とする機能、即ち、サバイビン遺伝子を発現すること、または第２のレポータータンパク質を発現することができるように結合していることをいう。
【００２５】
強力なプロモーターは、その下流に連結された遺伝子が強制的に読まれるように制御するプロモーターである。強力なプロモーターは、一般的に発現ベクターにおいて使用されるそれ自身公知のプロモーターであればよい。強力なプロモーターの例は、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｓｉｍｉａｎ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーターであればよい。
【００２６】
サバイビン遺伝子は、それ自身公知の何れかのサバイビン遺伝子であればよく、例えば、ヒト、チンパンジー、マーモセット、ゼノパス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫およびマウスのサバイビン遺伝子であればよい。好ましくは、使用される試料に依存して選択された種類のサバイビン遺伝子であってよい。例えば、ヒトの細胞および組織について解析を行う場合では、ヒト由来のサバイビン遺伝子を使用することが好ましい。ヒトサバイビン遺伝子の配列を表２に配列番号２として示す。
【表２】
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【００２７】
サバイビン遺伝子として使用される配列番号２で示されるヒトサバイビン遺伝子は、サバイビン遺伝子としての機能、および発現されるサバイビンタンパク質としての活性が維持している限り、１個〜数個の塩基が欠失、置換および／または付与されていてもよい。他の公知のサバイビン遺伝子についても、同様に何れか公知の配列について、それ独自のサバイビン遺伝子としての機能、および発現されるサバイビンタンパク質としての活性が維持している限り、１個〜数個の塩基の欠失、置換および／または付与がなされていてもよい。
【００２８】
第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子であればよく、好ましくは、第１のレポータータンパク質として使用する発光タンパク質、並びに発光タンパク質の基質などの発光関連物質から蛍光を生じる可能性のある励起および蛍光スペクトルよりも、長波長側に励起波長を有する蛍光タンパク質が好ましい。具体的には、例えば、第１のレポータータンパク質としてルシフェラーゼを用いる場合、その基質としてルシフェリンが使用される。ルシフェリンは、それ自体が、短波長によって蛍光を発する。従って、ルシフェリンから蛍光が生じることのない波長の蛍光タンパク質を第２のレポータータンパク質を選択することが望ましい。好ましい蛍光タンパク質の例は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、ＰｈｉＹＦＰ、ＹｓＹｅｌｌｏ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ｍＰｌｕｍおよびｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙなどであってよい。好ましい蛍光タンパク質をコードする遺伝子の配列の１例として、ＥＹＦＰの配列を表３に示す。
【表３】
2015019637.tif 000005
【００２９】
第２のベクターは、更に、ｎｅｏ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子などの更なる遺伝子を含んでもよい。また更に、第２のベクターは、第２のレポーター遺伝子の下流にポリＡなどの転写終結遺伝子を含んでもよい。第２のベクターとして、強力なプロモーターおよび／または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む市販のベクターを利用してもよい。例えば、そのような市販のベクターにおいて、強力なプロモーターの下流であり、且つ蛍光タンパク質をコードする遺伝子の上流に対して、サバイビン遺伝子を組み込めばよい。そのような組み込みは、例えば、制限酵素による切断と、リガーゼによる連結などの遺伝子工学的手法を利用してよい。或いは、遺伝子工学的手法により、強力なプロモーターと、その下流に機能的に連結されたサバイビン遺伝子と、その下流に機能的に連結された第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子とを含む配列からなるポリヌクレオチドから第２のベクターを製造してもよい。第２のベクターの製造は、それ自身公知の技術を利用して行ってもよい。
【００３０】
第２のベクターは、プラスミドベクターであっても、ウイルスベクターであってもよいが、プラスミドベクターが好ましい。
【００３１】
第１のベクターと第２のベクターとの試料への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法などにより行えばよい。
【００３２】
試料に導入された第１のベクターと第２のベクターは、互いに独立して機能する。第１のベクターは、試料中の環境に依存したサバイビンプロモーターの活性に従って、第１のレポータータンパク質を発現する。第２のベクターは、強いプロモーターにより強制的にサバイビンと蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現する。発現された融合タンパク質は、試料中の環境に依存して試料において分布する。
【００３３】
「試料」は、細胞および／または組織であってよい。組織は、生体から採取された組織であってよく、生体から採取され、培養された組織であってもよく、生体から採取または採取および培養された組織から切り出された切片であってもよい。細胞は、生体から採取された細胞であっても、生体から採取され、単離された細胞であっても、培養された細胞であっても、生体から採取された後に培養された細胞であっても、継代培養された細胞であってもよい。細胞は、生体から採取された組織を酵素より消化することにより準備してもよい。また試料は生物個体、胚、卵であってもよい。
【００３４】
試料に対して第１のベクターと第２のベクターを導入した後に、試料に含まれる特定の細胞について、その形態を明視野で観察し、且つ第１のベクターに基づく発光シグナルと、第２のベクターに基づく蛍光シグナルとを順次測定する。この際に、これらの形態観察と発光および蛍光シグナルの測定は、試料に含まれる特定の細胞について行う。このような形態観察と、発光および蛍光シグナルの測定は、共通する興味領域（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）を指定することにより、同じ対象、例えば、同じ細胞について明視野観察、発光シグナルの測定および蛍光シグナルの測定を行える観察装置または観察システムを利用して行うことが可能である。そのような観察装置および観察システムにより撮像された画像について、明視野観察、発光強度の測定および蛍光強度の測定を行ってもよい。
【００３５】
そのような観察システムの１例として、実施の形態２について図２〜図４を参照して説明する。なお、この実施形態により本発明が限定されるものではない。
【００３６】
図２に示すように、発現量測定装置１０００は、細胞１０２０と、細胞１０２０を収納した容器１０３０（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３０を配置するステージ１０４０と、発光画像撮像ユニット１０６０と、蛍光画像撮像ユニット１０８０と、情報通信端末１１００と、で構成されている。また、発現量測定装置１０００において、発光画像撮像ユニット１０６０に含まれる対物レンズ１０６０ａと蛍光画像撮像ユニット１０８０に含まれる対物レンズ１０８０ａとは、図示の如く、細胞１０２０、容器１０３０およびステージ１０４０を挟んで上下の対向する位置に配置される。なお、発光画像撮像ユニット１０６０および蛍光画像撮像ユニット１０８０の配置を入れ替えてもよい。
【００３７】
細胞１０２０は、サバイビンプロモーターと組み合わせて発光タンパク質（具体的には例えばルシフェラーゼ）を発現する発光関連遺伝子、サバイビン遺伝子と組み合わせて蛍光タンパク質（具体的には例えばYＦＰ）を発現する蛍光関連遺伝子を導入した生きたものである。ここで、本明細書において発光とは、生物発光および化学発光を含む概念である。
【００３８】
なお、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子とを融合した融合遺伝子を導入した生きたものでもよい。具体的には、細胞１０２０は、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子とを融合したベクターを導入した生きたものでもよい。換言すると、細胞１０２０に対し解析対象であるサバイビンプロモーターまたはサバイビン遺伝子とそれぞれ組み合わせた発光関連遺伝子または蛍光関連遺伝子との組を複数導入してもよい。これにより、細胞１０２０に導入したサバイビンプロモーター活性とサバイビン遺伝子発現量を一緒に測定し、さらにそれらに加えて、細胞の形態を明視野で観察する。即ち、蛍光でサバイビン遺伝子の発現量を測定し、発光でサバイビンプロモーターの活性の程度を測定し、明視野で細胞の形態を観察する。具体的には、細胞１０２０は、第１のベクターを導入すると共に、第２のベクターを導入した生きたものでもよい。
【００３９】
発光画像撮像ユニット１０６０は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２０の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６０は、図示の如く、対物レンズ１０６０ａと、ダイクロイックミラー１０６０ｂと、ＣＣＤカメラ１０６０ｃと、で構成されている。対物レンズ１０６０ａは、具体的には、（開口数／倍率）2の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６０ｂは、細胞１０２０から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、対物レンズ１０６０ａを介して当該ＣＣＤカメラ１０６０ｃのチップ面に投影された細胞１０２０の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、情報通信端末１１００と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２０が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２０の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。なお、図２では、ダイクロイックミラー１０６０ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６０ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６０は、対物レンズ１０６０ａおよび１台のＣＣＤカメラ１０６０ｃで構成されてもよい。
【００４０】
蛍光画像撮像ユニット１０８０は、具体的には倒立型の蛍光顕微鏡であり、細胞１０２０の蛍光画像を撮像する。蛍光画像撮像ユニット１０８０は、図示の如く、対物レンズ１０８０ａと、ダイクロイックミラー１０８０ｂと、キセノンランプ１０８０ｃと、ＣＣＤカメラ１０８０ｄと、で構成されている。ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、対物レンズ１０８０ａを介して当該ＣＣＤカメラ１０８０ｄのチップ面に投影された細胞１０２０の蛍光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、情報通信端末１１００と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２０が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２０の蛍光画像および明視野画像を撮像してもよい。ダイクロイックミラー１０８０ｂは、細胞１０２からの蛍光を透過するとともに、キセノンランプ１０８０ｃから照射された励起光が細胞１０２０へ照射されるように励起光の方向を変える。キセノンランプ１０８０ｃは励起光を照射する。
【００４１】
ここで、発光画像撮像ユニット１０６０および蛍光画像撮像ユニット１０８０は、具体的には、それぞれ倒立型の発光顕微鏡および倒立型の蛍光顕微鏡でもよく、ステージ１０４０は回転するものでもよい。
【００４２】
情報通信端末１１００は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、情報通信端末１１００は、図３に示すように、大別して、制御部１１２０と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４０と、記憶部１１６０と、通信インターフェース部１１８０と、入出力インターフェース部１２００と、入力部１２２０と、出力部１２４０と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００４３】
記憶部１１６０は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭなどのメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスクなどを用いることができる。そして、記憶部１１６０は制御部１１２０の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。
【００４４】
通信インターフェース部１１８０は、情報通信端末１１００と、ＣＣＤカメラ１０６０ｃおよびＣＣＤカメラ１０８０ｄと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８０は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
【００４５】
入出力インターフェース部１２００は、入力部１２２０や出力部１２４０に接続する。ここで、出力部１２４０には、モニター（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力部１２４０をモニターとして記載する場合がある）。また、入力部１２２０には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
【００４６】
制御部１１２０は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）などの制御プログラムや各種の処理手順などを規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１０２０は、大別して、蛍光画像撮像指示部１１２０ａと、発光画像撮像指示部１１２０ｂと、蛍光画像取得部１１２０ｃと、発光画像取得部１１２０ｄと、判定部１１２０ｅと、蛍光測定部１１２０ｆと、発光測定部１１２０ｇと、選択部１１２０ｈ、発現量測定部１１２０ｉと、明視野画像撮像指示部１１２０ｊと、明視野画像取得部１１２０ｋと、形態同定部１１２０ｌで構成されている。
【００４７】
蛍光画像撮像指示部１１２０ａは、通信インターフェース部１１６０を介して、ＣＣＤカメラ１０８０ｄへ蛍光画像の撮像を指示する。発光画像撮像指示部１１２０ｂは、通信インターフェース部１１６０を介して、ＣＣＤカメラ１０６０ｃへ発光画像の撮像を指示する。蛍光画像取得部１１２０ｃは、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像を、通信インターフェース部１１６０を介して取得する。発光画像取得部１１２０ｄは、ＣＣＤカメラ１０６０ｃで撮像した発光画像を、通信インターフェース部１１６０を介して取得する。明視野画像指示部１１２０ｊは、通信インターフェース部１１６０を介して、ＣＣＤカメラ１０６０ｃおよび／またはＣＣＤカメラ１０８０ｄへの明視野画像の撮像を指示する。明視野画像取得部１１２０ｋは、ＣＣＤカメラ１０６０ｃおよび／またはＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した明視野画像を通信インターフェース部１１６０を介して取得する。同一視野内の１つの細胞、または複数の細胞、または互いに異なる細胞を、予め設定された時間および間隔に応じたタイミングで撮像したタイムラプス映像または１画像上に同時に画像再生することにより、時間軸に沿った動画（またはコマ送り）ないし１画像表示をしてもよい。
【００４８】
判定部１１２０ｅは、蛍光画像および／または発光画像に基づいて、各遺伝子が導入されているか否かを細胞１０２０ごとに判定する。蛍光測定部１１２０ｆは、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定する。発光測定部１１２０ｇは、ＣＣＤカメラ１０６０ｃで撮像した発光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた発光強度をそれぞれ測定する。
【００４９】
形態同定部１１２０ｈは、明視野画像取得部１１２０ｋで得られた明視野画像に含まれる１つの細胞または複数の細胞のそれぞれについて、予め設定した特徴点、即ち、細胞の輪郭の形状、核の輪郭の形状を判定し、それに基づいて、予め設定された特定の特徴点を有すると同定する。形態同定部１１２０ｈの同定の結果に基づいて、選択部１１２０ｈは、経時的に測定すべき細胞を選択する。ここで、特徴点の判定は、１つの細胞または複数の細胞について、複数の時間点で測定された特徴点の変化の有無により行われてもよい。即ち、特徴点の同定は、少なくとも２つの時間点において、細胞の輪郭および／または核の輪郭に変化があるか否かを判定することにより行われてもよい。
【００５０】
発現量測定部１１２０ｊは、選択部１１２０ｉで選択した細胞１０２０を対象として、蛍光測定部１１２０ｆで測定した蛍光強度に基づいて解析対象のサバイビン遺伝子の発現量を測定し、発光測定部１１２０ｇで測定した発光強度に基づいて解析対象のサバイビンプロモーター活性の程度を測定する。なお、発現量測定部１１２０ｊは、複数の細胞１０２０または選択部１１２０ｉで選択した細胞１０２０を対象として、蛍光測定部１１２０ｆで測定した蛍光強度に基づいて解析対象のサバイビン遺伝子の発現量を測定すると共に、ＣＣＤカメラ１０８０ｄで撮像した蛍光画像に基づいて解析対象の遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を同定してもよい。
【００５１】
以上の構成において、発現量測定装置１０００で行われる処理の一例を、図４を参照して説明する。なお、以下では、第１のベクターおよび第２のベクターを複数の細胞１０２０に導入し、導入した複数の細胞１０２０のうち特定の細胞１０２０を対象として、発光画像における発光強度でサバイビンプロモーター活性の程度を経時的に測定し、蛍光画像における蛍光強度および分布でサバイビンタンパク質の分布を経時的に測定し、且つ明視野画像における観察により形態を同定する場合の処理の１例について説明する。
【００５２】
まず、情報通信端末１１００は、蛍光画像撮像指示部１１２０ａの処理で通信インターフェース部１１６０を介してＣＣＤカメラ１０８０ｄへ蛍光画像の撮像を指示し、発光画像撮像指示部１１２０ｂの処理で通信インターフェース部１１６０を介してＣＣＤカメラ１０６０ｃへ発光画像の撮像を指示し、明視野画像撮像指示部１１２０ｊの処理で通信インターフェース部１１６０を介してＣＣＤカメラ１０８０ｄへ明視野画像の撮像を指示する（ステップＳＢ−１）。つぎに、ＣＣＤカメラ１０８０ｄは、撮像範囲中に存在する複数の細胞１０２０の蛍光画像を撮像し（ステップＳＢ−２）、当該蛍光画像を情報通信端末１１００へ送信する（ステップＳＢ−３）。一方、ＣＣＤカメラ１０６０ｃは、撮像範囲中に存在する複数の細胞１０２０の発光画像を撮像し（ステップＳＢ−４）、当該発光画像を情報通信端末１１００へ送信する（ステップＳＢ−５）。更に、ＣＣＤカメラ１０８０ｄまたはＣＣＤカメラ１０６０ｃは、撮像範囲中に存在する複数の細胞１０２０の明視野画像を撮像し（ステップＳＢ−６）、当該明視野画像を情報通信端末１１００へ送信する（ステップＳＢ−７）。なお、蛍光画像の撮像指示および発光画像の撮像指示および明視野画像の撮像指示は、異なる時刻または時間間隔で行ってもよい。例えば、サバイビンプロモーターの活性の程度を測定するために用いる発光画像の撮像、サバイビン遺伝子の発現量を測定するために用いる蛍光画像の撮像、および細胞の形態を同定するための明視野画像の撮像は、それぞれ数秒おき、数分おきまたは数時間おきに行ってもよい。また、励起光は蛍光画像を撮像する時のみ細胞１０２０へ照射する。
【００５３】
つぎに、情報通信端末１１００は、（ａ）蛍光画像取得部１１２０ｃの処理で通信インターフェース部１１６０を介して蛍光画像を取得し、（ｂ）発光画像取得部１１２０ｄの処理で通信インターフェース部１１６０を介して発光画像を取得し、（ｃ）明視野画像取得部１１２０ｋの処理で通信インターフェース部１１６０を介して明視野画像を取得し、（ｄ）制御部１１２０の処理でクロック発生部１１４０から時刻を取得し、（ｅ）取得した蛍光画像と発光画像と明視野画像と時刻とを対応付けて記憶部１１６０の所定の記憶領域に記憶する（ステップＳＢ−８）。
【００５４】
つぎに、情報通信端末１１００は、判定部１１２０ｅの処理で、蛍光画像および／または発光画像に基づいて、ベクターが導入されているか否かを細胞１０２０ごとに判定する（ステップＳＢ−９）。つぎに、ベクターが導入されている細胞１０２０が少なくとも１つ存在した場合（ステップＳＢ−１０：Ｙｅｓ）、情報通信端末１１００は、蛍光測定部１１２０ｆの処理で蛍光画像に基づいて各細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定すると共に、発光測定部１１２０ｇの処理で発光画像に基づいて各細胞１０２０から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定する（ステップＳＢ−１１）。
【００５５】
つぎに、情報通信端末１１００は、形態同定部１１２０ｌの処理で、明視野画像に基づいて、形態に関する特徴点を細胞１０２０ごとに判定することで、細胞の形態を細胞１０２０ごとに同定する（ステップＳＢ−１２）。なお、蛍光関連遺伝子を含む第２のベクターを細胞１０２０に導入し、それにより得られた蛍光強度に基づいて細胞形態の特徴点を細胞１０２０ごとに判定することで、細胞の形態を細胞１０２０ごとに同定してもよい。また、形態の特徴点の判定は、所定の部位、具体的には核、細胞膜、細胞質などの明視野画像および／または蛍光画像における時間点での位置データについて、明視野画像および／または蛍光画像と時刻とを対応付けて記憶部１１６０の所定の記憶領域に記憶し、更なる時間点での対応する位置データと比較することにより行ってもよい。
【００５６】
つぎに、情報通信端末１１００は、選択部１１２０ｈの処理で、ステップＳＢ−１２で形態が同定された細胞１０２０の中から測定対象の細胞１０２０を選択する（ステップＳＢ−１３）。つぎに、情報通信端末１１００は、発現量測定部１１２０ｊの処理で、ステップＳＢ−１３で選択した細胞１０２０を対象として、蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定すると共に、蛍光画像に基づいて解析対象のサバイビン遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を同定する（ステップＳＢ−１４）。なお、ステップＳＢ−１２において蛍光強度または蛍光画像を用いる場合、ステップＳＢ−１４では、蛍光強度に基づいて解析対象のサバイビン遺伝子の発現量を測定し、発光強度に基づいてサバイビンプロモーターの活性の程度を測定してもよい。
【００５７】
そして、情報通信端末１１００は、制御部１１２０の処理で、上述したステップＳＢ−１〜ステップＳＢ−１４までの処理を例えば予め設定した時間間隔で所定の回数繰り返し実行し、所定の回数終了した場合（ステップＳＢ−１５：Ｙｅｓ）には処理を終了する。
【００５８】
ここで、発光画像、蛍光画像および明視野画像の撮像および取得だけを繰り返し実行し、解析の時点で、発光強度の測定、蛍光強度の測定、蛍光の分布、形態の同定、細胞１０２０の選択、発現量の測定、活性の程度の測定を行ってもよい。つまり、解析に必要な元データである発光画像、蛍光画像および明視野画像だけをまとめて取得し、その後、解析の時点で、発光強度の測定、蛍光強度の測定、蛍光の分布、形態の同定、細胞１０２０の選択、発現量の測定、活性の程度の測定を行ってもよい。具体的には、発光画像、蛍光画像および明視野の取得後に、解析の時点で、細胞１０２０の選択、発現量の測定、発現されたサバイビン遺伝子の分布の測定、形態の同定を行ってもよい。また、発光画像、蛍光画像および明視野画像の取得を行った後、解析の時点で、形態の同定、細胞１０２０の選択を行ってもよい。また、発光画像、蛍光画像および明視野画像の取得後に、解析の時点で、細胞１０２０の選択を行ってもよい。
【００５９】
また、蛍光画像を取得した後、測定対象の細胞１０２０を選択し、そして発光画像を取得してもよい。
【００６０】
以上、詳細に説明したように、発現量測定装置１０００によれば、発光関連遺伝子と蛍光関連遺伝子と解析対象のサバイビン遺伝子とサバイビンプロモーターを導入した生きた細胞１０２０を対象として、細胞１０２０から発せられた発光の発光強度を測定し、細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度を測定し、測定した発光強度または測定した蛍光強度に基づいて解析対象の遺伝子の発現量を測定する、測定した細胞の形態の同定にあたって、細胞は、発光関連遺伝子、蛍光関連遺伝子および解析対象のサバイビン遺伝子およびサバイビンプロモーターを同定された細胞を用いて行う。このような方法により、１つの細胞について、サバイビン遺伝子の発現量および発現の分布の状態、サバイビンプロモーターの活性の程度、並びに形態情報を簡便且つ正確に得ることが可能であり、また、得られた複数の情報に基づいて、総合的に細胞解析を行うことが可能となる。
【００６１】
また、発現量測定装置１０００によれば、細胞１０２０が撮像範囲中に複数存在する場合、複数の細胞１０２０の蛍光画像を撮像し、複数の細胞１０２０の発光画像を撮像し、撮像した発光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた発光の発光強度をそれぞれ測定し、撮像した蛍光画像に基づいて、各細胞１０２０から発せられた蛍光の蛍光強度をそれぞれ測定し、更に各細胞１０２０の形態を明視野画像に基づいて特徴点として測定し、測定した発光強度および／または測定した蛍光強度および／または形態に関する特徴点の情報に基づいて、解析対象のサバイビン遺伝子の発現量、サバイビンプロモーターの活性の程度、形態同定若しくは形態の変化を細胞１０２０ごとに測定し、細胞１０２０ごとに細胞解析を行う。これにより、複数の細胞１０２０を対象として、解析対象のサバイビン遺伝子の発現量、サバイビンプロモーター活性の程度および形態同定若しくは形態変化の同定を細胞１０２０ごとに測定若しくは評価することができる。
【００６２】
また、発現量測定装置１０００によれば、発現量の測定において、選択された細胞１０２０を対象として、測定した蛍光強度に基づいて解析対象のサバイビン遺伝子の発現量を測定すると共に、撮像した蛍光画像に基づいて解析対象のサバイビン遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を同定し、且つ発光画像に基づいてサバイビンプロモーターの活性の程度を測定しながら、更に、明視野画像に基づいて細胞形態の判定および／または細胞形態の変化を、それぞれ時間軸に沿って細胞ごとに測定することが可能である。これにより、解析対象のサバイビン遺伝子とサバイビンプロモーター活性の程度および細胞形態の状態および／または変化を評価することができるだけでなく、サバイビン遺伝子の細胞１０２０内における発現部位を得ることができる。
【００６３】
また、発現量測定装置１０００を利用すれば、具体的には、抗がん剤およびそのリード化合物の評価を行うことができる。特に、抗がん剤がサバイビン遺伝子の発現および／または発現部位、並びにサバイビンプロモーター活性の程度、並びに細胞の形態に影響を与えるか否か、或いは、どの程度の影響を与えることが可能であるかを判定および／またはモニターすることが可能であり、更に、そのリード化合物がサバイビン遺伝子の転写活性に影響を与えるかどうかを同時にモニターすることができる。また、発現量測定装置１０００を利用すれば、具体的には、サバイビン遺伝子について、発光測定によるサバイビンププロモーター活性の程度および明視野による細胞１０２０の形態の状態および／または変化をモニターしながら、蛍光検出にて発現時期・局在性を同定することで、被検物質の有用性を総合的に評価することができる。
【００６４】
以下、添付図面を参照して、本発明にかかる測定装置としての顕微鏡ユニットおよび顕微鏡装置の好適な実施の形態３を詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付している。
【００６５】
まず、本発明の実施の形態３にかかる顕微鏡装置について説明する。図５は、この実施の形態３にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図５に示すように、この実施の形態にかかる顕微鏡装置１００ａは、蛍光観察を行う蛍光顕微鏡ユニット１０１と、生物発光観察を行う生物発光観察ユニット１０２ａと、発光標識および蛍光標識が付与された標本Ｓを保持する保持手段としての保持部７と、各顕微鏡ユニット１０１，１０２ａによって撮像した標本Ｓの標本像などを表示するモニター２０９と、顕微鏡装置１００ａの全体の処理および動作を制御する制御装置ＰＣ２０１と、を備える。蛍光顕微鏡ユニット１０１と生物発光顕微鏡ユニット１０２ａとは、互いに隣接して配置される。
【００６６】
蛍光顕微鏡ユニット１０１は、蛍光対物レンズとしての対物レンズ２０１および蛍光結像レンズとしての結像レンズ２０２を有する高倍率の蛍光結像光学系と、この蛍光結像光学系によって結像される標本Ｓの標本像である蛍光標本像を撮像する蛍光撮像手段としての撮像装置２０３と、標本Ｓを励起する励起光を発する励起光源２０４と、励起光源２０４からの励起光を集光するレンズ２０５と、蛍光ユニットとしての蛍光キューブ２０６と、を備える。
【００６７】
対物レンズ２０１は、標本側に大きなＮＡを有し、標本Ｓに付与された蛍光標識の各点から発せられる蛍光をほぼ平行光束に変換する。結像レンズ２０２は、対物レンズ２０１によってほぼ平行光束に変換された蛍光を集光して標本Ｓの標本像である蛍光標本像を結像する。蛍光結像光学系は、蛍光標本像を４０倍以上の高倍率で結像する。撮像装置２０３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなどの固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像される蛍光標本像を撮像し、画像データを生成して制御装置ＰＣ２０１に出力する。
【００６８】
蛍光キューブ２０６は、標本Ｓを励起するための励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルターとしての励起フィルター２０６ａと、この励起光によって励起された標本Ｓから発せられる蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターとしての吸収フィルター２０６ｂと、励起光を反射して蛍光を透過させるダイクロイックミラー２０６ｃとを一体に備える。励起フィルター２０６ａは、励起光源２０４から発せられる各種波長の光の中から所定の波長域の励起光を抽出するバンドパスフィルターであり、吸収フィルター２０６ｂは、所定のカットオフ波長を有するロングウェーブパスフィルターである。なお、吸収フィルター２０６ｂは、所定の波長範囲の蛍光を抽出するバンドパスフィルターでもよい。バンドパスフィルターは、標本Ｓから発せられる生物発光と蛍光の波長が近い場合に有効である。
【００６９】
励起光源２０４は、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザーなどによって実現され、励起光照射手段としての励起光源４およびレンズ２０５は、励起光源２０４からの励起光を、励起光フィルター２０６ａを介し、ダイクロイックミラー２０６ｃによって反射させ標本Ｓに照射する。なお、励起光源２０４は、制御装置ＰＣ２０１からの指示をもとに点灯および消灯を行う。
【００７０】
生物発光顕微鏡ユニット１０２ａは、生物発光対物レンズとしての対物レンズ２１１および生物発光結像レンズとしての結像レンズ２１２を有する低倍率の生物発光結像光学系と、この生物発光結像光学系によって結像される標本Ｓの標本像である生物発光標本像を撮像する生物発光撮像手段としての撮像装置２１３と、を備える。
【００７１】
対物レンズ２１１は、標本側に大きなＮＡを有し、標本Ｓに付与された発光標識の各点から自己発光によって発せられる生物発光をほぼ平行光束に変換する。結像レンズ２１２は、対物レンズ２１１によってほぼ平行光束に変換された生物発光を集光して標本Ｓの標本像である生物発光標本像を結像する。生物発光結像光学系は、蛍光結像光学系の結像倍率よりも低い結像倍率で生物発光標本像を結像する。このとき、生物発光結像光学系は、標本側のＮＡをＮＡｏ、結像倍率をβとして、（ＮＡｏ／β）2≧０．０１を満足することが望ましい。
【００７２】
撮像装置２１３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなどの固体撮像素子を有し、この固体撮像素子の撮像面上に結像される生物発光標本像を撮像し、画像データを生成して制御装置ＰＣ２０１に出力する。なお、撮像装置２１３が有する固体撮像素子は、高感度のモノクロームＣＣＤであって０℃程度の冷却ＣＣＤを用いるとよい。
【００７３】
保持部２０７は、標本Ｓを直接載置するプレパラート、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体、インキュベーターなどの保持部材２０７ａと、この保持部材２０７ａとともに標本Ｓを２次元的に移動させる可動ステージ２０７ｂとを有する。可動ステージ２０７ｂは、制御装置ＰＣ２０１からの指示をもとに、ステージ駆動部２０８によって駆動される。
【００７４】
制御装置ＰＣ２０１は、ＣＰＵを備えたコンピュータなどの処理装置によって実現され、撮像装置２０３，２１３、励起光源２０４、ステージ駆動部２０８およびモニター２０９を電気的に接続し、これらの各構成部位の動作を制御する。制御装置ＰＣ２０１は、特に、撮像切換制御手段として、撮像装置２１３によって撮像される生物発光標本像の像特性をもとに、生物発光顕微鏡ユニット１０２ａによる生物発光標本像の撮像と、蛍光顕微鏡ユニット１０１による蛍光標本像の撮像とを切り換える撮像切換処理の制御を行う。
【００７５】
ここで、制御装置ＰＣ２０１が制御する撮像切換処理について説明する。図６は、撮像切換処理の処理手順を示すフローチャートである。図６に示すように、制御装置ＰＣ２０１は、可動ステージ２０７ｂによって生物発光結像光学系の視野内に移動された標本Ｓの生物発光標本像を撮像装置２１３によって撮像する（ステップＳ１０１）。この撮像結果をもとに、制御装置ＰＣ２０１は、生物発光標本像の像特性としての像強度があらかじめ設定したしきい値より大きい領域が生物発光標本像内にあるか否かを判断する（ステップＳ１０３）。像強度がしきい値より大きい領域がないと判断された場合（ステップＳ１０３：Ｎｏ）、制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０１からの処理を繰り返す。
【００７６】
一方、像強度がしきい値より大きい領域があると判断された場合（ステップＳ１０３：Ｙｅｓ）、制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０１で撮像した生物発光標本像を記録し（ステップＳ１０５）、可動ステージ２０７ｂによって蛍光結像光学系の視野内に標本Ｓを移動する（ステップＳ１０７）。そして、制御装置ＰＣ２０１は、生物発光標本像の像強度がしきい値より大きい領域に対応する蛍光標本像を撮像装置２０３によって撮像して記録し（ステップＳ１０９）、撮像切換処理を終了する。なお、標本Ｓの経過観察を行う場合、制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０９の後、可動ステージ２０７ｂによって標本Ｓを再び生物発光結像光学系の視野内に移動し、ステップＳ１０１からの処理を繰り返すように制御するとよい。また、ステップＳ１０９での撮像は、タイムラプス撮像または１画像の撮像のどちらでもよい。また、同一視野内の異なる細胞を、予め設定されたタイミングで撮像したタイムラプス映像または１画像上に同時に画像再生することにより、時間軸に沿った動画（またはコマ送り）ないし１画像表示をしてもよい。
【００７７】
制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０５およびＳ１０９では、撮像した生物発光標本像および蛍光標本像を自装置内に備えるＲＡＭなどの記憶部に記憶する。また、制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０１およびＳ１０９では、撮像した生物発光標本像および蛍光標本像をモニター２０９に逐次表示するようにしてもよい。さらに、制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０１〜Ｓ１０５の間、すなわち、生物発光顕微鏡ユニット１０２によって標本Ｓの生物発光観察を行っている間、励起光源２０４を消灯し、ステップＳ１０９で標本Ｓの蛍光観察を行う場合、励起光源２０４を点灯するように制御を行うとよい。あるいは、励起光源２０４から蛍光ユニッ２０ト６までの光路上にシャッターなどの遮光装置を設け、制御装置ＰＣ２０１は、未照射手段として、励起光源２０４を点灯および消灯する替わりに、遮光装置を開閉することによって励起光の照射を制御するようにしてもよい。
【００７８】
なお、制御装置ＰＣ２０１は、ステップＳ１０３では、生物発光標本像内の部分的な領域の像強度をもとに蛍光観察への切り換えを判断するようにしたが、生物発光標本像の全体の像強度をもとに切り換えを判断するようにしてもよい。また、制御装置ＰＣ２０１は、これらの像強度を、たとえば、所定時点から現時点までの累積の像強度として取得してもよく、あるいは現時点の瞬間的な像強度として取得してもよい。なお、生物発光標本像の全体の像強度を取得する場合には、撮像装置２１３に替えてフォトマルチプライヤーなどの高感度の受光素子を用いてもよい。
【００７９】
以上説明したように、この実施の形態３にかかる顕微鏡装置によれば、蛍光観察用の蛍光顕微鏡ユニット１０１と生物発光観察用の生物発光顕微鏡ユニット１０２ａとを隣接して備えるとともに、蛍光結像光学系および生物発光結像光学系の各視野内に標本Ｓを移動させる可動ステージ２０７ｂとを備えるため、適宜に蛍光観察と生物発光観察とを切り換えることができ、また、生物発光標本像の像特性としての像強度に応じて、生物発光観察から蛍光観察へ即時に切り換えることができる。
【００８０】
なお、生物発光結像光学系は、対物レンズ２１１および結像レンズ２１２によって標本像を結像する無限遠補正光学系として説明したが、対物レンズのみによって標本像を結像する有限補正光学系としてもよい。
【００８１】
また、上述した撮像切換処理では、生物発光標本像の像強度などの像特性をもとに生物発光観察から蛍光観察に切り換えるようにしたが、蛍光観察で標本Ｓに照射する励起光強度や標本Ｓから発光される蛍光強度が弱く、励起光および蛍光によって標本Ｓに与えるダメージが小さい場合などには、蛍光標本像の像強度などの像特性をもとに蛍光観察から生物発光観察に切り換えるようにしてもよい。
【００８２】
図７は、実施の形態４にかかる顕微鏡装置の構成を示す模式図である。図７に示すように、この実施の形態４にかかる顕微鏡装置６００は、実施の形態３にかかる顕微鏡装置１００ａに加えて、透過照明を行う照明手段としての透過照明ユニット１０３ａと、この透過照明ユニット１０３ａが有するシャッター２４３等を駆動させる照明駆動部２４６と、制御装置ＰＣ２０１に替わる制御装置ＰＣ２０６と、を備える。その他の構成は、実施の形態３と同じであり、同一の構成部分には同一符号を付している。
【００８３】
透過照明ユニット１０３ａは、透過照明用の白色光を発するハロゲンランプ等の白色光源２４４と、白色光の照射および未照射を切り換えるシャッター２４３と、白色光源２４４からの白色光を標本Ｓ上に集光させる照明レンズ系２４５とを備え、標本Ｓに対して、蛍光顕微鏡ユニット１０１と反対側に配置されている。照明レンズ系２４５は、コレクタレンズ２４５ａおよびコンデンサーレンズ２４５ｂを有し、標本Ｓに対してクリティカル照明を行う。なお、照明レンズ系２４５は、標本Ｓに対してケーラー照明を行うようにしてもよい。
【００８４】
照明駆動部２４６は、制御装置ＰＣ２０６からの指示をもとに、シャッター２４３および蛍光照明ユニット１０４ａを駆動する。ここで、蛍光照明ユニット１０４ａは、筐体２２６によって一体に保持された励起光源２０４、レンズ２０５および蛍光キューブ２０６を有する。照明駆動部２４６は、シャッター２４３を開閉して標本Ｓに対する白色光の照射および未照射を切り換えるとともに、蛍光キューブ２０６を対物レンズ２０１と結像レンズ２０２との間の光路上に挿脱するように蛍光照明ユニット１０４ａを移動させる。
【００８５】
制御装置ＰＣ２０６は、制御装置ＰＣ２０１と同様に撮像装置２０３，２１３、励起光源２０４およびステージ駆動部８の動作を制御するのに加えて、照明駆動部２４６の動作を制御する。制御装置ＰＣ２０６は、蛍光観察から透過照明による観察に切り換える場合、蛍光キューブ２０６を対物レンズ２０１と結像レンズ２０２との間から取り除くように蛍光照明ユニット１０４ａを移動させ、励起光源２０４を消灯し、シャッター２４３を開いて透過照明させる。透過照明による観察から蛍光観察に切り換える場合、制御装置ＰＣ２０６は、シャッター２４３を閉じ、蛍光キューブ２０６が対物レンズ２０１と結像レンズ２０２との間に配置されるように蛍光照明ユニット１０４ａを移動させ、励起光源２０４を点灯する。
【００８６】
また、生物発光観察から透過照明による観察に切り換える場合、制御装置ＰＣ２０６は、蛍光観察から透過照明による観察に切り換える場合の制御に加えて、ステージ駆動部２０８によって可動ステージ２０７ｂを駆動し、標本Ｓを蛍光結像光学系の視野内に移動させる制御を行う。なお、制御装置ＰＣ２０６は、シャッター２４３を開閉する替わりに、白色光源２４４を点灯および消灯するようにしてもよい。
【００８７】
なお、透過照明ユニット１０３ａは、明視野観察用の照明を行うように示したが、明視野観察用に限らず、暗視野観察用、微分干渉観察用または位相差観察用の照明を行うようにしてもよい。また、これらの各種観察用の照明を切り換え可能に備えてもよい。なお、微分干渉観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット１０３ａは、コンデンサーレンズ２４５ｂの光源側に偏光子および偏光分離プリズムを備え、蛍光結像光学系には、対物レンズ１の瞳側に偏光合成プリズムおよび検光子を配設するとよい。また、位相差観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット１０３ａは、コンデンサーレンズ２４５ｂの光源側にリングスリットを備え、蛍光結像光学系には、対物レンズ２０１の略瞳位置に位相板を配設するか、対物レンズ２０１を位相板を有する対物レンズに切り換えるようにするとよい。さらに、暗視野観察用の照明を行う場合、透過照明ユニット１０３ａは、コンデンサーレンズ２４５ｂの光源側にリングスリット等を備えるようにするとよい。
【００８８】
また、透過照明ユニット１０３ａは、高倍率で透過照明による観察を行うために蛍光結像光学系に対応させて配置するように示したが、低倍率で観察を行えるように生物発光結像光学系に対応させて配置してもよい。あるいは、これらの結像光学系の両方に対応させて配置してもよく、各結像光学系に対して適宜配置を切り換えられるようにしてもよい。
【００８９】
ところで、顕微鏡装置６００では、顕微鏡装置１００ａの構成に透過照明ユニット１０３ａ、照明駆動部２４６をさらに備えるように示したが、これに限定されず、たとえば、顕微鏡装置の各構成に、透過照明ユニット１０３ａと、照明駆動部２４６もしくは照明駆動部２４７とをさらに備えるようにしてもよい。
【００９０】
例えば、顕微鏡装置２００の構成には、透過照明ユニット１０３ａ、照明駆動部２４６がさらに備えられていてもよい。その場合、例えば、制御装置ＰＣ７は、制御装置ＰＣ２と同様に撮像装置２０３，２１３、励起光源２０４、回転駆動装置２１４およびステージ駆動部２１８を制御するとともに、制御装置ＰＣ２０６と同様に照明駆動部２４６によって透過照明ユニット１０３ａおよび蛍光照明ユニット１０４ａを制御する。
【００９１】
すなわち、制御装置ＰＣ２０９は、蛍光観察または生物発光観察から透過照明による観察に切り換える場合、ミラー２３４および蛍光キューブ２０６を対物レンズ２０１と結像レンズ２０２との間から取り除くように蛍光照明ユニット１０５を移動させ、シャッター２３３を閉じて励起光を未照射とし、シャッター２４３を開いて透過照明させる。透過照明による観察から蛍光観察または生物発光に切り換える場合、制御装置ＰＣ２０９は、シャッター２４３を閉じ、蛍光キューブ２０６またはミラー２３４が対物レンズ２０１と結像レンズ２０２との間に配置されるように蛍光照明ユニット１０５またはミラー２３４を移動させる。蛍光観察を行う場合には、さらにシャッター２３３を開いて標本Ｓに蛍光を照射させる。
【００９２】
このように、この実施の形態４にかかる顕微鏡装置６００によれば、蛍光結像光学系および生物発光結像光学系の少なくとも一方に対応し、標本Ｓに対して透過照明を行う透過照明ユニットを備えるようにしているため、蛍光観察および生物発光観察ばかりでなく各種の透過照明による観察を行うことができ、標本Ｓを多角的に観察することができる。
【００９３】
なお、上述した顕微鏡装置１００ａ，６００は、それぞれ正立型の顕微鏡装置として示したが、倒立型の顕微鏡装置としてもよい。また、上述した顕微鏡装置は、例えば、各種反応（例えば薬物刺激や光照射など）の検査や治療などに好適に用いることができる。
【００９４】
以上、実施の形態について詳細に説明したが、本発明において、発光とは、化学反応により光を発生し得ることをいい、特に生物発光および化学発光を好適な例として含む用語である。これに対し、蛍光とは励起光により光を発生し得ることをいう。ここで、生物発光による光エネルギーにより励起されるＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）は、基質溶液との化学反応が支配的要因であるので、本発明では発光に含めるものである。サンプルから発生する光は、特に生きた細胞に危害が少ない約４００ｎｍ〜約９００ｎｍの間の波長を持つ電磁放射線をいう。発光するサンプルの撮像は、極めて低レベルの光（通常は単一光子事象）を検出し、画像の構築が可能になるまで光子放射を積分できる光検出器の使用を必要とする。そのような高感度光検出器の例には、単一光子事象を増幅した後、検出系に固有の背景ノイズに対して単一光子を検出できるカメラまたはカメラ群で、例えばＣＣＤのような撮像素子群を具備するＣＣＤカメラを例示できる。一般に、高感度を得るために、ＣＣＤカメラを液体窒素などで冷却する場合がある。高い開口数（ＮＡ）とくに、開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０１以上である対物レンズを用いる場合には、冷却温度をマイナス５℃〜マイナス２０℃、好ましくはマイナス５℃〜常温でも画像化できると本発明者らによって確認された。さらに、検討を進めた結果、上記光学的条件（ＮＡ／β）の２乗が０．０７１以上である場合に、５分以内、場合によっては１分程度で視認可能で且つ解析可能な細胞画像を提供できることを突き止めた。一般に生きたサンプルは形状ないし発光部位の変化の為に、３０分を越える撮像時間では鮮明な発光画像を得ることは困難な場合が多い。従って、本発明では、短時間、特に３０分以内、好ましくは１分〜１０分の間で１つの発光画像を取得し、撮像時間が速い蛍光測定との連携に有利な方法と装置を提供する。
【００９５】
例えば関連する態様として、選択した生物適合成分の分布および／または局在に対するある処置の効果を記録するために、蛍光シグナルの局在および／または発光シグナルの強度を経時的に追跡したい場合は、光子放射の測定または撮像を選択した時間間隔で反復することにより、一連の画像を構築することができる。間隔は数分程度の短いものであってもよいし、数日または数週間程度に長いものであってもよい。発光画像または蛍光（または透過光）発光の重ね合せ画像は、画面表示、印刷された紙、グラフィック加工されたイメージ等の様々な形式で表現できる。
【００９６】
他の関連する態様として、本発明は、発光性タンパク質をコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に含む構築物でトランスジェニックまたはキメラにした動物におけるプロモーター誘導事象の存在を検出した後にプロモーター誘導事象の活性度をモニタリングする方法を包含する。プロモーター誘導事象には、そのプロモーターを直接活性化する物質の投与、内因性プロモーター活性化因子の産生を刺激する物質の投与（例えばＲＮＡウイルス感染によるインターフェロン産生の剌激）、内因性プロモーター活性化因子の産生をもたらす状態に置くこと（例えば熱ショックまたはストレス）などがある。
【００９７】
またもう１つの態様として、本発明は、病原体による感染の重篤化を抑制するのに有効な治療用化合物を同定する方法をも包含する。この方法では、病原体と蛍光成分と発光成分の複合体を対照動物と実験動物、若しくはそれらの培養された組織（ないし細胞）に投与し、その実験動物を治療用化合物候補で処置する。そして、上述の方法によって測定対象であるサンプル内の蛍光シグナルの局在を確認した後に、局内が確認されたサンプルのみから発光シグナル（生物発光または化学発光）、並びに明視野画像を連続的に測定する。こうすることによって、その化合物の治療上の有効性をモニタリングできる。
【００９８】
さらなる別な態様として、本発明は、様々な不透明度を持つ媒質を通して局在化したサンプルを蛍光シグナルによって選んだ後で、局在が確認されたサンプルのみから連続的に発光測定する方法を包含する。この方法では、発光シグナルを、その媒質を透過した光子を積分して画像を作成することもできるが、局在が確認されたサンプルのみを媒質（例えば、臓器組織）から外科的に取り出して、取り出したサンプルを適宜の培養環境下で発光測定するように方法の改良を行なうことができる。限定された外科手術（例えばバイオプシー）は、元となる生物（例えば、哺乳類、とくにヒト）への身体的負担を最小限にし、必要なサンプルのみを安定した検査環境下に移して、種々の見込み有る薬剤に対する応答、治療後の経過管理、予防医学的試験を長期に実行できるという利点を有する。
【００９９】
或いは、そのような観察装置または観察システムは、例えば、特開２００９−１４８２５５および国際公開ＷＯ２００６−１０６８８２に開示されている手段を使用してもよく、例えば、ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ  ＬＶ２００（オリンパス社製）などの明視野、蛍光観察および発光観察を行うことが可能な観察システムを使用してもよく、或いは、公知の何れかの観察装置または観察システムを使用してもよい。そのような観察装置は、位相差観察が可能であることが好ましい。
【０１００】
明視野での観察、発光シグナルの測定および蛍光シグナルの測定は、何れの順番で行われてもよく、例えば、明視野での観察、発光シグナルの測定および蛍光シグナルの測定の順番であっても、発光シグナルの測定、蛍光シグナルの測定および明視野での観察の順番であって、発光シグナルの測定、明視野での観察および蛍光シグナルの測定の順番であっても、他の任意の順番であってもよい。また、同じ観察または測定を連続して複数回行ってもよい。
【０１０１】
明視野での観察は、例えば、１ｍｓｅｃ〜１０００ｍｓｅｃ、好ましくは、１０ｍｓｅｃ〜２００ｍｓｅｃの露出であってよい。蛍光シグナルの測定は、例えば、１００ｍｓｅｃ〜１０ｓｅｃ、好ましくは１００ｍｓｅｃ〜１ｓｅｃの露出であってよい。発光シグナルの測定は、例えば、１ｓｅｃ〜６０ｍｉｎ、好ましくは１ｓｅｃ〜１０ｍｉｎの露出であってもよい。
【０１０２】
明視野での観察、蛍光および発光シグナルの測定の後に、試料を薬剤に曝す。この薬剤による試料中の細胞の形態変化、サバイビンプロモーター活性の程度の変化およびサバイビンタンパク質の分布の変化を観察する。この観察は、経時的に行うことが好ましい。
【０１０３】
蛍光シグナルの測定は、例えば、蛍光強度および／または蛍光量を測定することにより行われてよい。発光シグナルの測定は、例えば、発光強度および／または発光量を測定することにより行われてよい。
【０１０４】
試料の薬剤への暴露前の時点で得られた観察の結果と、暴露後の特定の時点で得られた観察の結果とを比較することにより、薬剤により生じる試料における変化を観察することが可能である。
【０１０５】
細胞解析を行う際の薬剤の例は、スタウロスポリン、マイトマイシン、シスプラチン、アクチノマイシンD、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、エトポシド、イマチニブおよびＹＭ−１５５であるが、これに限定されるものではなく、実施者が所望に応じて薬剤を選択してよい。
【０１０６】
また、既に既知の薬剤を用いて、対象から採取された細胞について解析を行うことにより、その細胞の特性を判定することが可能である。例えば、特定の抗癌剤を薬剤として使用することにより、当該抗癌剤が対象の癌に有効であるか、否かを判定されてもよい。
【０１０７】
或いは、例えば、特定の薬剤が、試料である癌細胞に対して有効であるか否かを判定することにより、試料の由来する対象における癌の転移率および／または予後を判定してもよい。このような癌の転移率および/または予後を判定することにより、癌を解析してもよい。
【０１０８】
また、試料として特定の状態であることが既知の細胞株を使用してもよい。例えば、癌細胞株を用いて、上記の細胞解析方法を行うことにより、被検物質の抗癌作用についてスクリーニングすることが可能である。そのようなスクリーニング方法は、前述の細胞解析方法において使用される試薬に代えて、被検物質を用いればよい。
【０１０９】
例えば、被検物質の抗癌作用をスクリーニングするために使用される細胞の例は、ＨｅＬａ細胞、Ｃａ  Ｓｋｉ細胞、ＴＣ−１細胞およびＨＴ１０８０細胞などであってよいが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
実施形態によれば、形態変化、サバイビンタンパク質の局在化の状態およびサバイビンプロモーター活性の程度に関する情報を１つの細胞について得ることが可能である。それらの情報に基づいて細胞解析を行うことにより、総合的に細胞を解析することが可能となる。また、それらの情報に基づいて薬効を評価することにより、総合的に被検物質の薬効をスクリーニングすることが可能となる。
【０１１１】
［例］
例１
［ＨｅＬａ細胞におけるサバイビンタンパク質の動態の蛍光イメージングおよび発光イメージングを用いたサバイビンプロモーター活性の検出］
例１では、２つのベクターを用いて蛍光イメージングと発光イメージングを行った。第１のベクターは、サバイビンプロモーター制御下でルシフェラーゼを発現するベクターを使用した。第２のベクターは、サバイビンとＥｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＥＹＦＰ）の融合タンパク質を発現するベクターを使用した。これらのベクターを１つの細胞にトランスフェクトした。その後、同一の生細胞におけるサバイビンタンパク質の細胞内動態とサバイビンプロモーター活性を長時間に渡って追跡した。
【０１１２】
例１における実験の手順について、以下に説明する。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＭＣＳにＢａｍＨＩ，  ＮｈｅＩでサバイビンタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２）を、ＮｈｅＩ  ，  ＥｃｏＲＩでＥＹＦＰ遺伝子（配列番号３）を挿入し、サバイビン−ＥＹＦＰの融合タンパク質発現ベクター（Ｓｕｖ−ＥＹＦＰ）を作製した。
【０１１３】
例１ではサバイビンタンパク質の動態を検出するためのタグとして、ＹＦＰを用いた。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の発光基質であるＤ−ルシフェリンの励起および蛍光スペクトルを示す図８から分かるように、ＹＦＰ励起より短波長の励起波長を有する蛍光蛋白質をタグとして使用した場合、蛍光観察に際してＤ−ルシフェリンが励起され、Ｄ−ルシフェリン由来の蛍光がバックグラウンドノイズとして検出される可能性がある。従って、Ｄ−ルシフェリンより長波長側に励起波長を有する蛍光蛋白質（ＹＦＰ，  ＲＦＰなど）が蛍光と発光の同時イメージングに好適であると考えた。
【０１１４】
サバイビンプロモーターの活性をモニターするレポーターとして、サバイビンプロモーター領域（配列番号１）をｐＧＬ４．１４（ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＭＣＳにＢｇｌＩＩ，  ＨｉｎｄＩＩＩで挿入し、サバイビンプロモーター：：ｌｕｃ２発現ベクター（ｐＳｕｖ：：ｌｕｃ２）を作製した。
【０１１５】
φ３５ｍｍ−ガラスボトムディッシュに播いたＨｅＬａ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用してＳｕｖ−ＥＹＦＰおよびｐＳｕｖ：：ｌｕｃ２ベクターを導入した。２４時間培養した後、１０％のＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に培地を交換し、最終濃度５００μＭでＤ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて１時間静置した。ディッシュをＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ  ＬＶ２００（オリンパス社製）にセットした後、明視野画像、蛍光画像および発光画像の撮影を行った。撮像中のＨｅＬａ細胞は５％  ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内に静置され、観察時の対物レンズの倍率は１００倍、ＣＣＤカメラはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス社製）、Ｂｉｎｎｉｎｇは１ｘ１、露出時間は２００ｍｓｅｃ（明視野観察）、１ｓｅｃ（蛍光観察）、９分（発光観察）であった。明視野像は位相差観察法で取得した。蛍光観察時の励起フィルターはＢＰ４９０−５００ＨＱ、分光フィルターはＢＰ５１５−５６０ＨＱを使用した。発光観察時に分光フィルターは使用しなかった。観察の結果得られた薬剤刺激前の位相差画像、蛍光画像および発光画像をそれぞれ図９、図１０および図１１に示す。図９では、刺激前では、ＨｅＬａ細胞が楕円形の細胞膜とその中に含まれる核を有していることが明確に観察された。また、焦点の合っていない細胞については、その表面に反射している光により円形として示されていた。図１０に示すように、刺激前の蛍光画像では、細胞質内に均一に広がって分布する蛍光シグナルが観察され、細胞の輪郭がはっきりとしており、核は黒く示されていた。図１１に示すように、細胞の内部は全体的に、細胞内以外の部分に比べて明るく示されていた。図１２に示される細胞内部は、焦点のあった細胞のある部分以外に比べて、全体的に均一にぼんやりと明るく示された。
【０１１６】
薬剤刺激後の画像取得を行った後、明視野画像、蛍光画像および発光画像のタイムラプス撮影を行った。タイプラプス撮影は、アポトーシスを誘発する薬剤であるスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ、ＳＴＳ）を最終濃度１ｕＭで添加した後に開始した。１ｕＭ  ＳＴＳ添加後のＨｅＬａ細胞を５％  ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内に静置して観察を行った。タイムラプス観察時の対物レンズの倍率は１００倍、ＣＣＤカメラはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス社製）、Ｂｉｎｎｉｎｇは１ｘ１、露出時間は２００ｍｓｅｃ（明視野観察）、１ｓｅｃ（蛍光観察）、９分（発光観察）、インターバル時間は１０分、総撮像時間は１０時間であった。明視野像は位相差観察法で取得した。タイムラプス観察時の蛍光観察時の励起フィルターはＢＰ４９０−５００ＨＱ、分光フィルターはＢＰ５１５−５６０ＨＱを使用した。発光観察時に分光フィルターは使用しなかった。このような明視野撮像、蛍光撮像および発光撮像についてのタイムラプス観察時の撮像のタイミングを模式的に図１２に示す。タイムラプス観察の結果得られた薬剤刺激後の位相差画像、蛍光画像および発光画像をそれぞれ図１３、図１４および図１５に示す。図１３に示すように、ＳＴＳ刺激後の細胞では、核が収縮し、細胞膜からのブレブと思われる突起が多く観察された。図１４に示すように、細胞の輪郭はぼんやりとし、核および骨格にまでからも蛍光シグナルが観察された。また、図１４に示すように、刺激後の細胞内の明るさは、刺激前に比較してより明るくなった。
【０１１７】
得られた発光画像に対して興味領域（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）を指定した（図１１および図１５）。指定したＲＯＩの発光強度をタイムラプス観察の結果得られた各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度の計時変化をグラフで表示した（図１６）。
【０１１８】
図９および図１３に示すように、薬剤刺激後にＨｅＬａ細胞の急速な収縮が観察された。図１０に示すように、薬剤刺激前にはＨｅＬａ細胞においてサバイビンタンパク質は細胞質に局在しており、核内にはほとんど存在していないことが示されている。しかしながら、図１４に示すように、薬剤刺激後にはサバイビンタンパク質の局在が変化し、細胞質以外の部分にもサバイビンタンパク質が移行した。図１１および図１５に示すように、薬剤刺激後３０分でサバイビンプロモーター活性が急激に上昇する様子が観察された。図１６のグラフから、サバイビンプロモーター活性の上昇は、薬剤刺激後３０分経過時点と１時間２０分経過時点でピークを迎え、その後急速に減衰していることが分かった。これらの結果から、薬剤ＳＴＳは、ＨｅＬａ細胞の収縮、細胞内サバイビンタンパク質の非局在化およびサバイビンプロモーター活性の一時的な上昇作用を有することが示唆された。
【０１１９】
以上の実験結果より、ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷを用いた明視野、蛍光および発光イメージングを行うことで、同一細胞における形態変化とサバイビンタンパク質の局在とサバイビンプロモーター活性を経時的かつ定量的に捉えることができた。その結果、薬剤が細胞に及ぼす作用の詳細な解析が可能であることが示された。サバイビンはアポトーシスの抑制と細胞分裂の調整機能を有するタンパク質であり、正常組織ではほとんど観察されず、胎児の組織と多くのヒト癌において高発現することが報告されている。また、サバイビンが核と細胞質のいずれに局在するかで、癌の予後評価が異なることが知られている。これらの報告からサバイビンタンパク質の発現量とその局在部位は癌マーカー並びに癌の予後マーカーとして有望であると考えられている。サバイビンプロモーター活性と局在部位をシングルセルレベルで検出可能である本手法は、サバイビンをターゲットとした被検物質の薬効スクリーニングや癌の予後評価において特に有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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