(57)【要約】【課題】本発明は、標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法、標的核酸を検出するためのキット及び核酸クロマトグラフィー担体を提供することを課題とする。【課題を解決するための手段】斯かる課題を解決する手段として、増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体、当該担体を用いた方法及び当該担体を含むキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法であって、
前記核酸クロマトグラフィーは、前記標的核酸を含む溶液を、核酸クロマトグラフィー担体上で展開開始部分から展開して、前記核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する核酸クロマトグラフィーである方法において、
（ａ）前記展開開始部分、
（ｂ）前記増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いる方法。
【請求項２】
前記プライマー捕捉部分が、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、前記増幅した標的核酸において二本鎖を形成する領域の塩基配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸が、二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる核酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出部分が、前記標的核酸の一本鎖を形成する領域と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化された検出部分である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸を検出するためのキットであって、
（１）標的核酸の鋳型配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（２）（ａ）展開開始部分、
（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分とを備えた核酸クロマトグラフィー担体
を含む、キット。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出するための核酸クロマトグラフィー担体であって、
（ａ）展開開始部分、
（ｂ）前記標的核酸を検出可能な検出部分
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分と
を備えた、核酸クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法が実施できるように構成された、請求項７に記載の核酸クロマトグラフィー担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法、標的核酸を検出するためのキット及び核酸クロマトグラフィー担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
PCR法を応用し、生体試料中に含まれるウイルスや細菌等の存在や、一塩基多型（ＳＮＰ）などの生体固体の遺伝子情報を解析する技術（遺伝子検査）が提案されている。特に、PCR法を実施するためのサーマルサイクラーの小型化や普及が進み、医療等の現場での活用が期待されている。当該技術において、ＰＣＲ法により増幅した核酸断片は、電気泳動法により検出されることが一般的であったが、必要な設備、機材、試薬の制限が大きかった。
【０００３】
これに対して、標的核酸と、標的核酸と関連付けられた検出用プローブとの間のハイブリダイゼーションを利用し、標的核酸を検出する方法である核酸クロマトグラフィー法が提案されている。核酸クロマトグラフィー法を有利に実施するための改良方法も提案されている（特許文献１）。このような核酸クロマトグラフィー法の技術により、遺伝子検査を実施できる環境の拡大が実現されている。
【０００４】
しかしながら、このような核酸クロマトグラフィーにおいて、PCR産物である試料中に含まれる未反応のPCRプライマーが、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用若しくは非特異的に吸着し、標的核酸の検出感度を低下若しくは誤検出を発生させる場合があった。
【０００５】
未反応のPCRプライマーを除去する手段としては、スピンカラムなどの手法が従前知られている。しかしながら、スピンカラムや遠心分離機等の追加の設備、機器等が必要となり、幅広い環境で実施ができるとの核酸クロマトグラフィー法の特性を十分に生かせない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公報WO2013/039228号公報
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の態様の一例を模式的に示す。（Ａ）展開開始時には、試料中に標的核酸及び未反応のPCRプライマーが含まれている。（Ｂ）未反応のPCRプライマーが、プライマー捕捉部分に補足される。（Ｃ）標的核酸が、検出部分で検出される。
【図２】実施例で作成したクロマトグラフィー担体を模式的に示す。
【図３】電気泳動図を示す。各レーンは、下記のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物をそれぞれ電気泳動に供した。１：ウシゲノム、２：ブタゲノム、３：ニワトリゲノム。図中、Mはサイズマーカーを示す。sは各レーンにおける特異的（specific）バンド、cは共通して増幅するバンド（common）を示す。
【図４】核酸クロマトグラフィーの結果を示す。１〜３は、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを固定化していない、プライマー捕捉領域を備えない担体を用いた結果を示す。４〜６は、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを固定化した、プライマー捕捉領域を備えた担体を用いた結果を示す。下記のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物をそれぞれ核酸クロマトグラフィーに供した。１及び４：ウシゲノム、２及び５：ブタゲノム、３及び６：ニワトリゲノム。（Ａ）核酸クロマトグラフィーの全体像を示す。（Ｂ）検出部分の拡大図を示す。囲みは、検出部分の模式図を示す。図中、「*」は特異的な増幅の検出、「#」は非特異的な検出をそれぞれ示す。「c」は、共通して増幅した核酸の検出を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、主にオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法、標的核酸を検出するためのキット及び核酸クロマトグラフィー担体を提供することを目的とする。特に、増幅反応試料中に含まれる未反応のオリゴヌクレオチドプライマーにより、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイゼーションに競合的に作用若しくは非特異的に吸着することを低減し、標的核酸の検出感度の向上若しくは誤検出の発生を抑制した発明を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、核酸クロマトグラフィーにおいて、増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いることで、上記課題を解決できることを見出した。本発明は、斯かる発見に基づき、さらに検討を重ねて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
【００１１】
項１、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法であって、
前記核酸クロマトグラフィーは、前記標的核酸を含む溶液を、核酸クロマトグラフィー担体上で展開開始部分から展開して、前記核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する核酸クロマトグラフィーである方法において、
（ａ）前記展開開始部分、
（ｂ）前記増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いる方法。
【００１２】
項２、前記プライマー捕捉部分が、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分である、項１に記載の方法。
【００１３】
項３、前記オリゴヌクレオチドが、前記増幅した標的核酸において二本鎖を形成する領域の塩基配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、項２に記載の方法。
【００１４】
項４、前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸が、二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる核酸である、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００１５】
項５、前記検出部分が、前記標的核酸の一本鎖を形成する領域と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化された検出部分である、項４に記載の方法。
【００１６】
項６、標的核酸を検出するためのキットであって、
（１）標的核酸の鋳型配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（２）（ａ）展開開始部分、
（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分とを備えた核酸クロマトグラフィー担体
を含む、キット。
【００１７】
項７、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出するための核酸クロマトグラフィー担体であって、
（ａ）展開開始部分、
（ｂ）前記標的核酸を検出可能な検出部分
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分と
を備えた、核酸クロマトグラフィー担体。
【００１８】
項８、項１〜５のいずれか１項に記載の方法が実施できるように構成された、項７に記載の核酸クロマトグラフィー担体。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、増幅した標的核酸を高感度で検出する手段が提供される。高感度の検出能を奏する本発明は、遺伝子検査に基づく各種検査、例えば、医療における感染症診断や体質検査、並びに、食品検査における混入菌の検出、農産物や食肉の品種鑑定などにおける応用が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．標的核酸を検出する方法
本発明の方法において、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出する。標的核酸は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅したものであればよい。例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法などの公知の方法により増幅された標的核酸が例示され、ＰＣＲ法により増幅された標的核酸が好適である。ＰＣＲ法による増幅は、複数の標的核酸を増幅するマルチプレックスＰＣＲであってもよい。
【００２１】
標的核酸
標的核酸は、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラなどのいずれであってもよく、好適には二本鎖ＤＮＡである。標的核酸が二本鎖ＤＮＡである場合は、その全長に渡って二本鎖である二本鎖ＤＮＡであっても、一部分で二本鎖を形成し他の部分は一本鎖である二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００２２】
標的核酸は、対応する鋳型核酸に基づき増幅される。鋳型核酸は、本発明の方法の具体的な目的に応じて、適宜設定することができる。鋳型核酸は、例えば、被験対象である生体に由来する試料（血液、血清、血漿、尿、痰、唾液、組織、細胞等）の中に存在するものを用いることができる。鋳型核酸の調製方法は、公知の手法より適宜選択することができる。鋳型核酸としては、ゲノム上の塩基配列、ｃＤＮＡの塩基配列などが例示される。
【００２３】
オリゴヌクレオチドプライマー
オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列に応じて当業者が適宜設計することができる。オリゴヌクレオチドプライマーの塩基長は、例えば１５〜１００塩基程度とすることができる。
【００２４】
例えば、ＰＣＲ法で二本鎖ＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅される二本鎖ＤＮＡの両鎖それぞれの３’末端領域と相補的にハイブリダイズ可能な配列を含む２本のオリゴヌクレオチドプライマーである相補的にハイブリダイズ可能な配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’側領域に位置することが、増幅反応（特に、PCR法。）が有利に進行するとの観点から、好ましい。また、上記相補的にハイブリダイズ可能な配列は、完全に相補的な配列からなることが好ましい。上記配列の塩基長は、例えば、１５〜３５塩基程度、好ましくは１８〜２８塩基程度、特に２０〜２５塩基程度とすることができる。
【００２５】
本明細書において、「相補的にハイブリダイズ可能」とは、２本の核酸鎖（ヌクレオチド鎖）の間で、配列の相補性に基づき安定かつ特異的な結合（すなわち、対形成。）が生じ得ることを主に示す。相補的なハイブリダイゼーションが生じるために、対を形成する２本の核酸鎖の間で、配列は100％相補的である必要はないと理解されている。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプライマーは、必要に応じて、鋳型核酸の塩基配列以外の塩基配列を含むこともできる。例えば、このような塩基配列は、標的核酸を検出するための、検出用プローブと相補的にハイブリダイズ可能なタグ配列であってもよい。タグ配列は、増幅反応が有利に進行するとの観点から、上記の鋳型核酸の塩基配列に対応する配列に比して５’側に存在することが好ましい。タグ配列は例えば、２０〜５０塩基程度とすることができる。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくもと１つは、前記タグ配列が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーであることが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、特許文献１に記載されており、公知である。
【００２８】
連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸（ないし塩基）がないとそれ以上ＤＮＡ鎖を伸長しないと考えられている。このため、本発明の連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、本連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まない。こうした天然塩基等を含まないことで、前記鋳型となることを回避して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を抑制又は回避できる。
【００２９】
連結部位のある態様として、天然塩基等を有しないない単なる骨格鎖が挙げられる。具体的には、糖−リン酸骨格や、他の公知の人工オリゴヌクレオチドに適用される骨格が例示される。
【００３０】
連結部位の別の態様として、リン酸ジエステル結合を介してヌクレオチドに隣接される、元素数が２〜４０である一重鎖構造を含む鎖状の連結基が挙げられる。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止が不完全になりやすく、元素数が４０を超えると、ヌクレオチドの溶解性が低下するおそれがある。ＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止の効果の観点から、鎖状の連結基の元素は、２〜３６であることが好ましく、より好ましくは３〜１６である。
【００３１】
この場合の連結部位は、連結部位における回転を容易にするため、炭素−炭素一重結合、炭素−酸素一重結合、炭素−窒素一重結合、Ｓ−Ｓ一重結合などの一重結合を含むことが好ましい。連結部位は、一重結合を主体とするものであることが好ましい。連結部位は、一重結合を含む限り、一部に芳香環またはシクロアルカンを含んでいてもよい。
【００３２】
連結部位は、元素数が２〜４０であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、構造的に簡易であるほか、連結部位としての導入も容易である。
【００３３】
連結部位の具体例としては、以下の式（１）で表される連結部位が挙げられる。
【００３４】
５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’    式（１）
［式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２〜４０の整数を表す。］
【００３５】
式（１）において、ｍは、好ましくは２〜３６であり、より好ましくは３〜１６である。
【００３６】
式（１）中のＨは、置換されていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１〜８であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
【００３７】
また、他の連結部位としては、以下の式（２）で表される連結部位が挙げられる。
【００３８】
５’−（ＯＣnＨ2n）l−３’    式（２）
［式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。］
【００３９】
式（２）において、（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２〜３６であり、より好ましくは３〜１６である。
【００４０】
式（２）中のＨは、式（１）中のＨと同様に置換されていてもよい。
【００４１】
連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
【００４２】
【化１】
2015019591.tif 000002
【００４３】
さらに、連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
【００４４】
【化２】
2015019591.tif 000003
【００４５】
タグ配列が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーは、公知の手段により合成することができる。例えば、アルキレン鎖を有するホフォスホアミダイト試薬（例えば、GlenResearch社等から入手することができる）を用いて合成することができる。
【００４６】
タグ配列が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる標的核酸を増幅することができる。このような標的核酸は、一本鎖部分により検出が可能であるため、好ましい標的核酸の態様の1つである。なお、標的核酸が一本鎖を形成する領域を含む標的核酸である場合、本明細書において二本鎖を形成する部分と一本鎖を形成する部分とを含む全体を標的核酸という。
【００４７】
オリゴヌクレオチドプライマーは、標識物質が結合していることが好ましい。本発明の核酸クロマトグラフィーにおいて、当該標識物質を用いて標的核酸を検出することができる。標的物質は、公知のものを用いることができる。オリゴヌクレオチドプライマーに結合する標識物質は、それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資であっても、他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質であってもよい。それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資としては、蛍光標識物質（例えば、FITC、ローダミン等。）が挙げられる。他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどのハプテン；アルカリホスファターゼ、ペルオキシターゼなどの酵素等が挙げられる。オリゴヌクレオチドプライマーが標識物質を備えたものとする手法は、当業者が適宜公知の手段から選択することができる。
【００４８】
標識物質は、オリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１方、または両方に結合していてもよい。本発明の態様の1つにおいて、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーとは異なるもう一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、標識物質が結合しているオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００４９】
標的核酸の増幅
標的核酸の増幅をするための具体的手段は、当業者が適宜設定することができる。例えば、増幅がＰＣＲ法による増幅である場合、用いるポリメラーゼ（耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。）の種類、熱サイクル条件（例えば、変性、アニーリング及び伸長の各工程の温度及び時間。）、反応溶液の組成は、当業者が適宜選択することができる。
【００５０】
核酸クロマトグラフィー
本発明の方法において、標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する。核酸クロマトグラフィーは、後述する所定の核酸クロマトグラフィー担体を用いる以外は、公知の手法に従い行うことができる。例えば、特許文献１に記載の方法に準じて行うことができる。具体的には、核酸クロマトグラフィーにおいて、標的核酸を含む溶液を、核酸クロマトグラフィー担体上で展開開始部分から展開して、前記核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する。
【００５１】
標的核酸を含む溶液（展開媒体）は、標的核酸を含み、核酸クロマトグラフィー担体においてキャピラリー現象により拡散移動可能な溶液であれば特に限定されない。水、水と有機溶媒との混合溶液などを溶媒とする水性媒体であることが好ましい。また、必要に応じて、pHを一定単位にするための成分を含むことができる。このような成分として、公知の酢酸と酢酸ナトリウムからなる酢酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムからなるリン酸緩衝液、クエン酸とクエン酸ナトリウムからなるクエン酸緩衝液、PBSなどの緩衝成分が挙げられる。また、標的核酸を含む溶液として、増幅反応の反応液そのものを用いることもできる。
【００５２】
本発明の核酸クロマトグラフィーにおいて、展開媒体を展開開始部分から展開する。展開を開始する手段は特に限定されるものではない。ピペット等で展開開始部分に標的核酸を含む溶液を滴下する、核酸クロマトグラフィーを標的核酸を含む溶液に浸漬するなどの手段が挙げられる。簡便性及びコンタミネーションの可能性を低減させるとの観点から、溶液に浸漬する手段が好ましい。
【００５３】
なお、本発明の核酸クロマトグラフィーにおいて、展開を開始する前の変性処理（例えば、８５℃程度以上での熱変性、化学変性）は行わないことが好ましい。
【００５４】
溶液を核酸クロマトグラフィー担体上で展開するに際して、キャピラリー現象により液体の展開が実現できる範囲内において、核酸クロマトグラフィー担体を略鉛直に保持しても、略水平状体に保持してもよい。
【００５５】
次いで、核酸クロマトグラフィー担体上で展開させた溶液に含まれる標的核酸を、核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する。標的核酸を検出する手段は、特に限定されるものではない。
【００５６】
本発明の好適な態様においては、標的核酸の検出は、標的核酸と、検出部分に備えられた検出用プローブとの相補的なハイブリダイゼーションに基づく。すなわち、標的核酸と検出用プローブとの相補的なハイブリダイゼーションにより、検出部分に捕捉された標的核酸を検出する。
【００５７】
標的核酸の検出は、オリゴヌクレオチドプライマーに結合した標識物質を用いた検出であってもよい。標識物質が、検出可能なシグナルを発する標識物資標識物質である場合、直接目視や適切な検出機器により検出をすることができる。標識物質が他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質である場合、必要な反応を適宜行った後に検出を行う。例えば標識物質がビオチンである場合、ストレプトアビジン等を結合させた着色ラテックス粒子を用いて検出することができる。標識物質と組み合わせてシグナルを発する他の成分との反応の実施は、検出を行う際に実施しても、展開開始前、展開中などの時点で実施してもよい。
【００５８】
核酸クロマトグラフィーを実施する条件は、展開媒体の展開、相補的なハイブリダイゼーション等が阻害されない限り、特に限定されない。温度は、例えば、５〜４０℃程度、好ましくは１５〜３５℃程度、特に室温程度とすることができる。核酸クロマトグラフィーに要する時間は、核酸クロマトグラフィー担体の形状と基材の種類、展開媒体の組成に応じて、適宜設定することができる。典型的には、２〜５０分程度とすることができる。
【００５９】
核酸クロマトグラフィー担体
本発明の標的核酸の検出方法に用いる核酸クロマトグラフィー担体は、
（ａ）展開開始部分、
（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分
を備える。
【００６０】
核酸クロマトグラフィー担体の基材は、キャピラリー現象により液体を移動させることが可能な、公知の固相の基材を使用することができる。例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料からなる基材、ろ紙などのセルロース系材料からなる基材等が挙げられる。
【００６１】
核酸クロマトグラフィー担体の形状は、核酸クロマトグラフィーが実施できる形状であれば、特に限定されるものではない。キャピラリー現象により展開媒体を移動させることが可能な形状が好ましい。好ましい態様の1つにおいては、核酸クロマトグラフィー担体長尺状体とすることができる。核酸クロマトグラフィー担体が長尺状体である場合、その長手方向に沿う一端を展開開始部分とすることが好ましい。核酸クロマトグラフィー担体は、単一の材料からなるものであっても、複数の材料が全体として展開媒体キャピラリー現象によりが移動可能なように連結されたものであってもよい。
【００６２】
展開開始部分は、展開媒体の展開の開始をする核酸クロマトグラフィーの部位である。展開媒体への浸漬により展開を開始する場合、チューブ中の展開媒体との接触を容易にするために、展開開始部分を先細り状の形態とすることもできる。展開開始部分であることを示す位置マーカーが核酸クロマトグラフィー担体に付されていてもよい。
【００６３】
増幅した標的核酸を検出可能な検出部分は、標的核酸を検出可能である限り特に限定されない。好ましい態様においては、核酸配列とハイブリダイズする検出用プローブが担体上に固定化されている。検出用プローブは、好適には核酸配列と相補的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００６４】
本発明の好ましい態様である、標的核酸が二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる標的核酸である場合、検出用プローブとして標的核酸の一本鎖を形成する領域と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００６５】
検出用プローブを、担体上に固定化する手段は、特に限定されるものではない。例えば、検出用プローブと担体の基材とを、必要に応じてリンカーを介在させて、共有結合により固定化する手段；検出用プローブと担体との間の静電的相互作用により固定化する手段などが例示される。検出用プローブと担体との間の静電的相互作用により固定化させ、さらに紫外線などで共有結合を生じさせる手段であってもよい。
【００６６】
検出部分は、１種の標的核酸を検出可能であっても、２種以上の標的核酸を検出可能であってもよい。複数種の標的核酸を検出可能である場合、展開方向に沿って、検出用プローブが種類毎に、適当な間隔で固定化されている態様が好ましい。
【００６７】
本発明の核酸クロマトグラフィー担体は、前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えることを特徴とする。「展開開始部分と検出部分との間」とは、展開開始部分から展開を開始した展開媒体が、検出部分に比して早く到達する位置であれば特に限定されない。展開方向に対して、プライマー捕捉部分が検出部分に比して近位に位置すると換言することもできる。
【００６８】
プライマー捕捉部分は、展開媒体中のオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能であれば、その態様は特に限定されない。プライマー捕捉部分は、展開媒体中の標的核酸は捕捉せずに、そのまま検出部分へ向けた移動（展開）を継続できることが好ましい。
【００６９】
プライマー捕捉部分の好ましい態様においては、標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（プライマー捕捉用オリゴヌクレオチド）が担体上に固定化されている。このような態様において、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーとは、相補的にハイブリダイズ可能である。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマー対のうち、一方のみに対応するプライマー捕捉用オリゴヌクレオチドであっても、両方に対応するプライマー捕捉用オリゴヌクレオチドであってもよい。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドの塩基長は、例えば、２０〜５０塩基程度とすることができる。
【００７０】
特に好ましくは、プライマー捕捉部用オリゴヌクレオチドは、標的核酸において二本鎖を形成する領域の塩基配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、標的核酸が一本鎖部分を有する標的核酸である場合、プライマー捕捉部用オリゴヌクレオチドは、一本鎖部分とはハイブリダイズしないことが好ましい。これは、当該一本鎖部分は、標的核酸の検出に用いることが好ましいためである。
【００７１】
プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを担体上に固定する手段は、前述の検出用プローブを担体上に固定化する手段に準じる。ただし、検出用プローブとプライマー捕捉用オリゴヌクレオチドとを固定する手段は、同一であっても異なってもよい。
【００７２】
本発明の検出方法は、標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いることで、オリゴヌクレオチドプライマーによる標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイゼーションへの干渉や、オリゴヌクレオチドプライマーと検出用プローブとのハイブリダイゼーションを大幅に抑制することができる。これにより、標的核酸の検出感度の向上が実現される。
【００７３】
本発明の態様の一例を模式的に示す。
【００７４】
２．キット
本発明は、標的核酸を検出するためのキットをも提供する。本発明のキットは、
（１）標的核酸の鋳型配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（２）（ａ）展開開始部分、
（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分とを備えた核酸クロマトグラフィー担体
を含む。
【００７５】
オリゴヌクレオチドプライマー及び核酸クロマトグラフィー担体は、上記「１．」欄に記載のものを使用する。本発明のキットにより、上記の標的核酸を検出する方法を簡便に実施することができる。
【００７６】
本発明のキットは、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分は、例えば標的核酸を増幅するための試薬、鋳型核酸のポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられる。本発明の標的核酸を検出する方法を実施するための手順を書き記した書面等を含むこともできる。
【００７７】
３．核酸クロマトグラフィー担体
本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出するための核酸クロマトグラフィー担体をも提供する。
【００７８】
本発明の核酸クロマトグラフィー担体は、
（ａ）展開開始部分、
（ｂ）前記標的核酸を検出可能な検出部分
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分と
を備える。
【００７９】
本発明の核酸クロマトグラフィー担体は、上記「１．」欄に記載の標的核酸を検出する方法が実施できるように構成されていることが好ましい。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【００８１】
［実施例１］
（１）クロマトグラフィー担体の作製
クロマトグラフィー担体は、特許文献１に記載の方法に準じて作成した。図２に、作成したクロマトグラフィー担体を模式的に示す。
【００８２】
具体的には、メルクミリポア製Hi-Flow Plusメンブレンシート（60mm×600ｍｍ）に表１に示す塩基配列からなる検出用DNAプローブをそれぞれ含む溶液を、特開2003-75305号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT（登録商標）スポッターを用いてライン状にプリント点着し検出用DNAプローブを固定化した。その後、幅2.5mmの紙片に切り出し、核酸クロマトグラフィー担体として試験に供試した。なお、今回検出用DNAプローブとして使用した合成オリゴヌクレオチドDNAの塩基配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table 1に記載の100種の塩基配列のうちから選んだ4種の配列である。各検出用DNAプローブのプリント位置は、図２に示されている。
【００８３】
【表１】
2015019591.tif 000004
【００８４】
また、赤色顔料を用いて図２に示すように3つの位置マーカーラインを形成した。
【００８５】
更に、図２に示すように、001プローブラインの下部（展開開始部分の側）に、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドをプリント点着し固定化したエリアを設けた。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドとしては、ターゲットのPCR増幅産物溶液の中からPCR未反応のPCRプライマーがハイブリダイゼーションして捕捉除去されるように後述のPCRプライマーに相補な塩基配列のオリゴヌクレオチドDNAを混合して用いた。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドの塩基配列を表２に示す。
【００８６】
【表２】
2015019591.tif 000005
【００８７】
また、対照としては、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを固定化していないクロマトグラフィー担体を用いた。
【００８８】
（２）標的核酸の増幅
ウシゲノム（50ng）、ブタゲノム（50ng）、ニワトリゲノム（50ng）のそれぞれを鋳型として、下記のプライマーを用いて、マルチプレックスPCRを行った。
【００８９】
＜使用したPCRプライマー＞
PCRプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドDNAの塩基配列を表３に示す。ターゲットのウシ、ニワトリ、ブタ用の各々のＦプライマーには、ポリメラーゼが認識しないスペーサーＸを介して、クロマトグラフィー担体に固定化した検出用DNAプローブ（プローブNo.：002、003、004）に相補なオリゴヌクレオチドDNAがそれぞれ連結されている。また、各々のRプライマーはその5’末端をビオチン修飾した。
【００９０】
【表３】
2015019591.tif 000006
【００９１】
Xは、連結部位を表す。連結部位は、以下の式に示すGlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeC3を用いて導入した。
【００９２】
【化３】
2015019591.tif 000007
【００９３】
［式中、iPRはイソプロピル基を示す。DMTは、ジメトキシトリチル基を示す。］
【００９４】
マルチプレックスPCRの熱サイクル条件は、下記の通りとした：
＜熱サイクル条件＞
９５℃で９分、（９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で30秒）を１サイクルとして３５サイクル、その後７２℃で５分保持後、４℃に冷却。
【００９５】
図３に、３％アガロース電気泳動による泳動図を示す。
【００９６】
（３）核酸クロマトグラフィー
上記（１）で製造した核酸クロマトグラフィー担体及び対照の担体を用いて、（２）で得たＰＣＲ産物を、核酸クロマトグラフィーに供した。核酸クロマトグラフィーは、特許文献１に準じて行った。
【００９７】
具体的には、下記の組成の溶液を展開した。
＜展開＞
ＰＢＳ        ：３０μＬ
ラテックス液  ：  ２μＬ
増幅反応液    ：１０μＬ
ミリポア水    ：  ５μＬ
【００９８】
展開液は、ＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩液)、ラテックス液及び増幅反応液を混合して調整した。ラテックス液には、青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズにストレプトアビジンを被覆させたものを所定の濃度となるようにＰＢＳを用いて調製した。
【００９９】
結果を図４に示す。
【０１００】
図４に示すとおり、プライマー捕捉領域を備えた担体を用いることで、明らかに非特異的な検出が低減された。すなわち、本発明の核酸クロマトグラフィー担体を用いることで、核酸クロマトグラフィーでの誤検査のリスクが大幅に低減されることが実証された。また、非特異的な検出シグナルが低減することにより、ターゲットＤＮＡの検出感度の向上が図れることも実証された。
【図１】
2015019591.tif 000008
【図２】
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【図３】
2015019591.tif 000010
【図４】
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【配列表】
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