(57)【要約】      （修正有）【課題】病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療する方法の提供。【解決手段】（ａ）心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を有する対象を特定する工程と、（ｂ）前記対象の心臓細胞でｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程と、を含む、その必要がある対象の、病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療する方法。阻害する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を前記対象に投与する工程を含む治療方法。ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子であり、アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を有する対象を特定する工程と、
（ｂ）前記対象の心臓細胞でｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程と
を含む、その必要がある対象の、病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療する方法。
【請求項２】
阻害する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を前記対象に投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２６又は配列番号２７に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
阻害性ＲＮＡ分子が二本鎖領域を含み、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に同一な配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
二本鎖領域が、配列番号２６又は配列番号２７と実質的に同一な配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、非経口投与又は直接注射によって心臓組織に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
非経口投与が静脈内又は皮下投与である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテル、又は舌下投与によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の発現又は活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第２の心臓肥大治療薬を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の治療薬が、β遮断薬、イオノトロープ、利尿薬、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩ拮抗薬、ＢＮＰ、Ｃａ＋＋遮断薬、エンドセリン受容体拮抗薬、及びＨＤＡＣ阻害薬からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の治療薬が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬と同時に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の治療薬が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の前又は後に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞の１つ又は複数の症状が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の投与の後に対象内で改善される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ又は複数の症状が、高い運動能力、高い心臓駆出容積、低い左心室拡張末期圧、低い肺毛細血管楔入圧、高い心拍出量、高い心係数、低い肺動脈圧、低い左心室収縮末期及び拡張末期径、低い左心室及び右心室壁応力、低い壁張力、高い生活の質、低い疾患関連罹患率又は死亡率、又はこれらの組合せである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の投与が、対象での心臓肥大から心不全への移行を遅延させる、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）病的な心臓肥大又は心不全を発症する危険性がある対象を特定する工程と、
（ｂ）前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程と
を含む、その必要がある対象で病的な肥大又は心不全を予防する方法。
【請求項２０】
阻害する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を心臓細胞に送達する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２６又は配列番号２７に相補的な配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
阻害性ＲＮＡ分子が二本鎖領域を含み、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に同一な配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
二本鎖領域が、配列番号２６又は配列番号２７と実質的に同一な配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
危険性のある対象が、長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、及び病的な肥大からなる群から選択された１つ又は複数の危険因子を示す可能性がある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
危険性のある対象が、心臓肥大に対する遺伝的素因を有すると診断された、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
危険性のある対象が、心臓肥大の家族歴を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その細胞が、機能性ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂを発現することができない哺乳類。
【請求項３０】
マウスである、請求項２９に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３１】
トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その細胞が、前記非ヒト哺乳類の細胞で活性な異種プロモーターの制御下にあるＭｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂコード領域を含む哺乳類。
【請求項３２】
マウスである、請求項３１に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項３１に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３４】
組織特異的プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項３３に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３５】
組織特異的プロモーターが心筋特異的プロモーターである、請求項３３に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３６】
天然のｍｉＲ−４９９対立遺伝子の一方又は両方、及び／又は天然のｍｉＲ−２０８ｂ対立遺伝子の一方又は両方を欠くトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞。
【請求項３７】
前記天然のｍｉＲ−４９９対立遺伝子の両方、及び／又は前記天然のｍｉＲ−２０８ｂ対立遺伝子の両方を欠く、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大及び拡張型心筋症を予防する方法。
【請求項３９】
対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程を含む、その必要がある対象での心臓肥大の進行を阻害する方法。
【請求項４０】
（ａ）筋骨格系障害の危険性を有し、あるいは危険性がある対象を特定する工程と、
（ｂ）前記対象の骨格筋細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程と
を含む、その必要がある対象の筋骨格系障害を治療又は予防する方法。
【請求項４１】
前記筋骨格障害が、筋萎縮症、抗重力に応答した筋肉疲労、及び除神経からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程が、成熟ｍｉＲ−４９９又は成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドを前記対象に投与する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドが配列番号２６又は配列番号２７の配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂをコードする発現ベクターを前記対象に投与する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ウイルス発現ベクターがアデノウイルス発現ベクターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
発現ベクターが非ウイルス発現ベクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
非ウイルス発現ベクターが脂質ビヒクル内に含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ポリヌクレオチドが脂質ビヒクル内に含まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の発現及び／又は活性を、前記対象の骨格筋細胞で増大させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記骨格筋細胞の１つ又は複数の速骨格筋遺伝子の発現を、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を増大させた後に低下させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
１つ又は複数の速骨格筋遺伝子が、トロポニンＩ２、トロポニンＴ３、速骨格ミオシン軽鎖、及びα骨格アクチンからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
非ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ治療薬を対象に投与する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターを特定するための方法であって、
（ａ）細胞を候補物質に接触させる工程と、
（ｂ）ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の活性又は発現を、候補物質の不在下での活性又は発現と比較する工程と
を含み、測定した活性又は発現の間の差から、前記候補物質がｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターであることが示される方法。
【請求項５５】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補物質に接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏで候補物質に接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターが、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターが、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの拮抗薬である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
候補物質が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現を評価する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現を評価する工程が、ノーザンブロット又はＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を評価する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を評価する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂによって調節された遺伝子の発現又は活性を評価する工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ｍｉＲ−４９９によって調節された遺伝子が、β−ミオシン重鎖又は速骨格筋タンパク質遺伝子である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ｍｉＲ−２０８ｂによって調節された遺伝子が、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、ＴＨＲＡＰ１、又は速骨格筋タンパク質遺伝子である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
速骨格筋タンパク質遺伝子が、トロポニンＩ２、トロポニンＴ３、速骨格筋ミオシン軽鎖、又はα骨格アクチンである、請求項６４又は請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を評価する工程が、α−ミオシン重鎖発現レベルとβ−ミオシン重鎖発現レベルとの比を評価する工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含む医薬品組成物。
【請求項６９】
前記阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子である、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７０】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含む、請求項６９に記載の医薬品組成物。
【請求項７１】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２６又は配列番号２７に相補的な配列を含む、請求項７０に記載の医薬品組成物。
【請求項７２】
阻害性ＲＮＡ分子が二本鎖領域を含み、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に同一な配列を含む、請求項６９に記載の医薬品組成物。
【請求項７３】
二本鎖領域が、配列番号２６又は配列番号２７と実質的に同一な配列を含む、請求項７２に記載の医薬品組成物。
【請求項７４】
ｍｉＲ−４９９の阻害薬及びｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含む、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７５】
注射用に配合される、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７６】
非経口投与用のキットと組み合わせた、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７７】
非経口投与が静脈内又は皮下投与である、請求項７６に記載の医薬品組成物。
【請求項７８】
カテーテル投与用のキットと組み合わせた、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７９】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列を含有するポリヌクレオチドを含む、医薬品組成物。
【請求項８０】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクター内に含有される、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【請求項８１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２６又は配列番号２７の配列を含む、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【請求項８２】
前記ポリヌクレオチドが脂質送達ビヒクルに含まれる、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【請求項８３】
ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の成熟配列を含有するポリヌクレオチドを含む、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年７月３１日出願の米国仮出願第６０／９５２，９１１号、２００７年１０月１５日出願の米国仮出願第６０／９８０，１１３号、及び２００７年１０月１６日出願の米国仮出願第６０／９８０，３１４号の利益を主張するものであり、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所（the National Institutes of Health）からの認可番号ＨＬ５３３５１−０６の下で助成支援によってなされたものである。政府は、本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
電子提出されたテキストファイルの記述
本明細書と共に電子提出されたテキストファイルの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名: UTFD: 1992WO.txt、記録日: 2008年7月30日、ファイルサイズ９キロバイト）。
【０００４】
本発明は、一般に、発生生物学及び分子生物学の分野に関する。より特定すれば、本発明は、心筋細胞及び骨格筋細胞における遺伝子調節及び細胞生理に関する。具体的には、本発明は、β−ミオシン重鎖（β-MHC）の発現低下をもたらすＭＥＦ２−依存性ｍｉＲＮＡならびにβ−ＭＨＣと共発現する第２のｍｉＲＮＡの阻害に関する。これらのｍｉＲＮＡの阻害は、心臓肥大及び心不全の治療を提供する。速遅筋線維スイッチが望まれる筋骨格疾患を治療するための、これら２種のｍｉＲＮＡの上方制御も企図される。
【背景技術】
【０００５】
冠動脈疾患や心筋梗塞、うっ血性心不全、心臓肥大などの心疾患及びその徴候は、今日の米国において主要な健康上のリスクであることを明らかに示している。これらの疾患に罹っている患者の診断、治療、及び支援にかかるコストは、何十億ドルにもなる。心疾患の、２つの特に重篤な徴候は、心筋梗塞及び心臓肥大である。心筋梗塞は、典型的には、アテローム性動脈硬化の結果として急性血小板冠動脈閉塞が冠動脈に生じ、心筋細胞死が引き起こされる。心筋細胞、即ち心臓の筋肉細胞は最終分化し、一般に細胞分裂が不可能になるので、これらの細胞は一般に、急性心筋梗塞の過程で死んだ場合に瘢痕組織に置き換えられる。瘢痕組織は収縮を起こさず、心臓機能に寄与することができず、心収縮中に拡張することによって、あるいは心室のサイズ及び有効半径を増大させることによって、例えば肥大性になることによって、心臓機能にしばしば有害な役割を演じる。
【０００６】
心臓肥大に関して、ある理論は、これを異常な発達に似ている疾患と見なし、したがって、心臓の発生上のシグナルは肥大性疾患に寄与する可能性があるか否かという問題を提起する。心臓肥大は、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、及び心収縮タンパク質遺伝子の遺伝変異を生じるものを含めた事実上全ての形の心疾患に対する心臓の適応反応である。肥大応答は、最初は心拍出量を増大させる補償的機構であるが、持続的肥大によって拡張型心筋症（DCM）、心不全、及び突然死をもたらす可能性がある。米国では、約５０万人が毎年心不全と診断されており、その死亡率は５０％に達する。心臓肥大の原因及び結果は、十分に文書化されてきたが、根本的な分子機構は明らかにされていない。これらの機構を理解することは、心疾患の予防及び治療における主要な課題であり、心臓肥大及び心不全を特に目標とする新しい薬物の設計の際に、治療様式として極めて重要になる。
【０００７】
薬剤治療は、心不全の徴候を低減あるいは無くすための主なメカニズムを代表する。利尿薬は、軽度から中程度の心不全の第一線の治療をなす。利尿薬が有効でない場合、アンギオテンシン転換酵素（ACE）阻害薬（例えば、エナロプリル及びリシノプリル）などの血管拡張薬、又は変力薬療法（即ち、心筋収縮の力を増大させることによって心拍出量を改善する薬物）を使用してもよい。残念ながら、これら標準的な療法の多くには、非常に数多くの副作用があり、一部の患者には禁忌である。このように、現在使用されている薬剤には、特定の患者集団で深刻な欠点がある。新しく安全で効果的な薬剤を利用可能であることは、現在利用可能な薬理学的様式を使用することができない、あるいはこれらの手段からの十分な軽減を受けられない患者に、間違いなく利益をもたらす。
【０００８】
成人の心臓におけるα−及びβ−ＭＨＣアイソフォームの比は、心収縮性の主要な決定因子である。β−ＭＨＣ、即ち成人の心臓の主なミオシンアイソフォームは、比較的低いＡＴＰアーゼ活性を示すのに対し、α−ＭＨＣは、高いＡＴＰアーゼ活性を有する。心筋梗塞や高血圧、その他の障害など、様々な病理学的刺激に応答して、β−ＭＨＣ発現は増大し、一方、α−ＭＨＣ発現は、結果として起こる筋原線維ＡＴＰアーゼ活性の低下及び心筋線維の短縮速度の低下と共に減少し、最終的には収縮不全に至る。注目すべきことに、心臓のα−ＭＨＣ含量のわずかな変化が、心仕事量に対して深い影響力を及ぼす可能性がある。
【０００９】
非常に数多くのシグナル経路、特に、異常なカルシウムシグナル伝達が行われる経路が、心臓肥大及び病理学的再構築を促進させる（Heineke & Molkentin、2006）。ストレスに応答する肥大成長では、運動に応答して引き起こされる生理的肥大とは異なるシグナル伝達経路及び遺伝子発現パターンが行われる。ストレス媒介性心筋肥大は、非常に数多くの有害な結果に関連した複雑な現象であり、異なる分子及び組織学的特性によって心臓が線維化し、拡張し、代償不全になり、筋細胞の変性及び死を通してしばしば心不全になる。したがって、基本的な分子機構の解明と、有害な心臓成長を抑制する新規な治療標的の発見に、強い関心が持たれている。
【００１０】
成人の骨格筋線維は、特殊化した収縮及び代謝特性を基にして、速遅収縮サブタイプに分類することができる。これらの性質は、ミオシン重及び軽鎖トロポミオシン及びトロポニンならびにミオグロビンの、速遅収縮タンパク質アイソフォームの特定の組の発現を反映している（Nayaら、2000）。低速収縮筋は、姿勢維持や持続的自発運動などの長期活動で主に使用される。高速収縮線維は、大きな力で突発する活動で主に使用される。成人の骨格筋表現化型は、静的ではなく、代わりに荷重負担及び収縮使用パターンの変動を調節する能力を保持し、その結果、形態、表現型、及び収縮特性に適合される。例えば、宇宙飛行の微小重力環境における身体負荷の除去は、かなりの程度の筋萎縮と、げっ歯類及びヒトの両方に関する収縮及び代謝特性の遅速変化に相関した変性タンパク質表現型をもたらす（Tsikaら、2002; Baldwin及びHaddad, 2001; Edgerton及びRoy、（2000）; Fittsら、2000）。
【００１１】
筋肉使用の不足から生じる筋萎縮症である非活動性萎縮は、典型的には、寝たきりの人々、手足にギプスを付けた人々、又はその他の理由で非活動的な人々に見られる。除神経を含めた筋線維の電気的活動の崩壊も、筋萎縮症をもたらす。短期間の非活動状態の後、筋萎縮は元に戻る可能性がある。しかし、筋肉の極端な非活動状態は、骨格筋線維が永久に失われ、これらの繊維が結合組織に置き換えられる可能性がある。骨格筋の速筋線維遺伝子を抑制し、それによって遅筋線維遺伝子の相互発現を活性化させることによって、筋萎縮症の症状を低減、あるいは予防することができると考えられる。インスリン耐性（ＩＩ型糖尿病の患者に見られるインスリン刺激によるグルコース摂取の欠如）と遅筋対速筋収縮筋繊維のパーセンテージとの、正の相関もある。
【００１２】
マイクロＲＮＡは、最近、とりわけ発生タイミング、アポトーシス、脂肪代謝、及び造血性細胞分化の調節を含めたいくつかの生物学的プロセスに関係している。マイクロＲＮＡ（miRs）は、個々のｍｉＲＮＡ遺伝子から、又はタンパク質コーディング遺伝子のイントロンから、又は多数の緊密に関連したｍｉＲＮＡをしばしばコードするポリシストロン転写物から得られる長さ約１８〜約２５ヌクレオチドの小さな非タンパク質コーディングＲＮＡである。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００３）の概説を参照されたい。ｍｉＲは、その配列が完全に相補的である場合はその分解を促進させることによって、あるいはその配列がミスマッチを含有する場合は翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして働く。
【００１３】
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（pol II）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（pol III; Qiら、（2006）Cellular & Molecular Immunology Vol.3: 411-419参照）によって転写され、初期転写物から発生し、一般に数千塩基の長さである１次ｍｉＲＮＡ転写物（pri-miRNA）で終わる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＤｒｏｃｈａによって、核内で、約７０〜約１００ヌクレオチドヘアピン形前駆体（pre-meRNA）に処理される。細胞質に輸送した後、ヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをさらにＤｉｃｅｒで処理して、二本鎖ｍｉＲＮＡを生成する。次いで成熟ｍｉＲＮＡ鎖をＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（RISC）に組み込み、その標的ｍＲＮＡに、塩基対相補性によって結合させる。ｍｉＲＮＡ塩基がｍＲＮＡ標的と完全に対になる比較的まれなケースでは、ｍＲＮＡ分解が促進される。より一般的には、ｍｉＲＮＡは、不完全なヘテロ二本鎖を標的ｍＲＮＡと形成し、ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼすか、あるいはｍＲＮＡの翻訳を阻害する。
【００１４】
「シード」領域で終わる、塩基２〜８個に跨るｍｉＲＮＡの５’部分は、標的認識のため特に重要である（Krenz及びRobbins、2004; Kiriazis及びKranias, 2000）。シードの配列は、標的配列の系統発生的保存と共に、多くの現行の標的予測モデルの基礎を形成する。ｍｉＲＮＡ及びその標的を予測するための、増えつつある最先端のコンピュータ的アプローチが利用可能になっているが、標的の予測は、依然として主な課題であり実験検証を必要とする。ｍｉＲＮＡの機能が特定のｍＲＮＡ標的の調節にあるとみなすことは、ｍｉＲＮＡが何百もの潜在的な高及び低親和性ｍＲＮＡ標的と塩基対を形成することができること、及び複数のｍｉＲＮＡが個々のｍＲＮＡを標的とすることによって、さらに複雑にされる。ｍｉＲＮＡの機能に関する理解を高めることによって、正常な発生、分化、細胞間及び細胞内通信、細胞周期、血管新生、アポトーシス、及び多くのその他の細胞過程に寄与する調節ネットワークが、間違いなく明らかにされよう。最近、本発明者らは、α−ミオシン重鎖（MHC）遺伝子のイントロンによってコードされ、かつ心臓ストレスに応答するβ−ＭＨＣ発現の上方制御及び心臓の速骨格筋遺伝子の抑制に必要とされる、心臓特異的マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８について報告した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている同時係属出願ＷＯ２００８／０１６９２４参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、心臓及び骨格筋におけるマイクロＲＮＡの関与について詳述する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、心臓の成長、機能、及びストレス応答性のレギュレーターとしての、マイクロＲＮＡの重要な役割を発見し、心疾患に関する未発見の調節機構及び潜在的な治療標的を明らかにした。したがって本発明は、その必要がある対象において、病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を有する対象を特定する工程と、前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程とを含む。別の実施形態では、この方法はさらに、第２の治療薬を対象に投与する工程を含む。第２の治療薬は、例えば、β遮断薬、イオノトロープ、利尿薬、ＡＣＥ阻害薬、ＡＩＩ拮抗薬、ＢＮＰ、Ｃａ＋＋−遮断薬、及びＥＲＡ、又はＨＤＡＣ阻害薬であってもよい。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのアンタゴｍｉｒを投与する工程を含む。一実施形態では、本発明はｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂのアンタゴｍｉｒを提供する。別の実施形態では、ｍｉｒ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性は、成熟ｍｉＲ４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって阻害される。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性は、阻害ＲＮＡ分子を投与することによって阻害され、この阻害ＲＮＡ分子は、成熟ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ配列との同一性を有する配列を含んでいるものである。阻害ＲＮＡ分子は、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子であってもよい。
【００１８】
本発明は、病的な心臓肥大又は心不全を発症する危険性のある対象を特定する工程と、前記対象の心臓細胞でｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程とを含む、その必要がある対象の病的な肥大又は心不全を予防する方法も提供する。一実施形態では、阻害する工程は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を心臓細胞に送達する工程を含む。別の実施形態では、危険性のある対象が、長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、及び病的な肥大からなる群から選択された１つ又は複数の危険因子を示す可能性がある。
【００１９】
アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、阻害ＲＮＡ分子、又はｍｉＲ−４９９もしくはｍｉＲ−２０８ｂ発現もしくは活性のその他のモジュレーターを、標的器官、組織、又は細胞型に送達するのに適した当業者に知られている任意の方法によって投与してもよい。例えば、本発明のある実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターを、静脈内注射や動脈内注射、心膜内注射、皮下注射などの非経口的投与によって、又は組織（例えば、心臓組織、骨格筋組織）への直接注射によって、投与してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターは、経口、経皮、腹腔内、皮下、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、又は舌下投与経路によって投与してもよい。その他の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターは、カテーテルシステムによって投与してもよい。
【００２０】
本発明は、その必要がある対象の筋骨格系障害を治療又は予防する方法も意図する。一実施形態では、この方法は、筋骨格系障害の危険性を有する、あるいは危険性がある対象を特定する工程と、前記対象の骨格筋細胞でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程とを含む。筋骨格系障害には、例えば、非活動性萎縮、抗重力に応答した筋肉疲労、及び除神経を含めてもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程は、前記対象に、成熟ｍｉＲ−４９９及び／又は成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドを投与する工程を含む。その他の実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程は、前記対象に、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂをコードする発現ベクターを投与する工程を含む。別の実施形態では、この方法はさらに、非−ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ治療薬を対象に投与する工程を含む。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを心臓又は骨格筋細胞に投与する工程を含む、心臓又は骨格筋の収縮性を調節する方法を提供する。別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを心臓細胞に投与する工程を含む、心臓収縮タンパク質遺伝子発現を調節する方法が提供される。別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを骨格筋細胞に投与する工程を含む、骨格筋収縮タンパク質遺伝子発現を調節する方法が提供される。さらに別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを骨格筋細胞に投与する工程を含む、骨格筋細胞の線維型スイッチを誘発する方法を提供する。モジュレーターは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性の作動薬又は拮抗薬であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲβ、ミオスタチン（ＧＤＦ８としても知られている）、Ｓｏｘ  ６、及び速筋収縮タンパク質の発現は、細胞とｍｉＲ−４９９阻害薬とを接触させることによって、細胞内で増加する。その他の実施形態では、ＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲβ、ミオスタチン、Ｓｏｘ  ６、及び速筋収縮タンパク質の発現は、細胞とｍｉＲ−４９９作動薬とを接触させることによって、細胞内で減少する。別の実施形態では、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、ＴＨＲＡＰ１、及び速筋収縮タンパク質の発現は、細胞とｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬とを接触させることによって、細胞内で増加する。さらに別の実施形態では、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、ＴＨＲＡＰ１、及び速筋収縮タンパク質の発現は、細胞とｍｉＲ−２０８ｂ作動薬とを接触させることによって、細胞内で減少する。本発明の方法により増加させても減少させてもよい速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の例には、トロポニンＩ２、トロポニンＴ３、ミオシン軽鎖、又はα骨格アクチンが含まれる。
【００２２】
本発明は、その細胞が機能性ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを発現することのできない、トランスジェニック非ヒト哺乳類も包含する。別の実施形態では、本発明は、その細胞が、前記非ヒト哺乳類の細胞内で活性な異種プロモーターの制御下にあるｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂコード領域を含んでいる、トランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳類がマウスである。
【００２３】
本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターを特定するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、細胞と候補物質とを接触させる工程と、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程と、工程（ｂ）での活性又は発現を、候補物質の不在下での活性又は発現と比較する工程とを含み、測定された活性又は発現同士の差から、候補物質がｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターであることが示される。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで候補物質と接触させてもよい。候補物質は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子であってもよい。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬又は拮抗薬であってもよい。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターは、ｍｉＲ−２０８など、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの上流レギュレーターの作動薬又は拮抗薬であってもよい。
【００２４】
本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含む医薬品組成物も提供する。阻害薬は、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害ＲＮＡ分子であってもよい。別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列を含有するポリヌクレオチドを含む医薬品組成物を提供する。ポリヌクレオチドは、発現ベクター内に含有されていてもよい。
【００２５】
本発明は、これらの図面の１つ又は複数を、本明細書に提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ｍｉＲ−２０８が、α−ＭＨＣ遺伝子によりコードされ、心臓において特異的に発現されることを示した図である。ＭｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内にコードされる。星印は、配列保存を示す（図１Ａ）。ｍｉＲ−２０８が、α−ＭＨＣ遺伝子によりコードされ、心臓において特異的に発現されることを示した図である。成体マウス組織のノーザン分析よるｍｉＲ−２０８の転写産物の検出。Ｕ６ｍＲＮＡは、ローディングコントロールとしての役目を果たす（図１Ｂ）。
【図２Ａ】α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣの制御を示す図である。甲状腺ホルモン及びＴＲＥによる、クラススイッチの制御。
【図２Ｂ】α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣの制御を示す図である。速から遅への筋線維収縮性スイッチにおけるストレス／甲状腺機能低下のモデル。
【図３】ヒトの心臓におけるｍｉＲ−２０８の検出を示す図である。α−ＭＨＣ及びｍｉＲ−２０８の転写産物を、６匹の正常個体及び６匹の特発性心筋症の個体に由来する心臓組織のノーザンブロットにより検出した。α−ＭＨＣ及びｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８の発現レベルの間には、密接な相関があり、一方、成熟ｍｉＲ−２０８の発現は、後者が下方制御された後も維持されている。
【図４】ｍｉＲ−２０８突然変異マウスの作製を示す図である。（図４Ａ）相同的組換えによるｍｉＲ−２０８突然変異マウスを作製するための戦略。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を、ｌｏｘＰ部位に隣接するネオマイシン耐性カセットで置き換えた。ネオマイシンカセットを、ヘテロ接合マウスとＣＡＧ−Ｃｒｅトランス遺伝子を包含する遺伝子導入マウスとを交配させることにより、マウスの生殖細胞系列において除去した。（図４Ｂ）野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異マウスに由来する心臓のノーザン分析によるｍｉＲ−２０８の転写産物の検出。
【図５】表示の遺伝子型の新生仔マウスの心臓におけるα−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣのタンパク質レベルのウェスタン分析を示す図である。各遺伝子型の２匹のマウスを分析した。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして検出した。
【図６】ＭｉＲ−２０８−／−マウスは、圧負荷に応答して心臓肥大の減少を示す。野生型及びＭｉＲ−２０８−／−マウスの心臓の組織切片を、マッソントリクロームで染色した。ｍｉＲ−２０８の不在により、ＴＡＢに２１日間供された野生型マウスに見られた肥大及び線維症が減少する。スケールバーは、上のパネルにおいて２ｍｍに等しく、下のパネルにおいて２０μｍに等しい。
【図７】ＭｉＲ−２０８−／−マウスは、カルシニューリンの活性化に応答して心臓肥大の減少を示す。カルシニューリントランス遺伝子（CnA-Tg）を発現する６週齢のマウスの心臓及びＭｉＲ−２０８−／−；ＣｎＡ−Ｔｇマウスの心臓の組織切片を、マッソントリクロームで染色した。ｍｉＲ−２０８の不在により、ＣｎＡ−Ｔｇマウスに見られた肥大及び線維症が減少する。スケールバーは、上のパネルにおいて２ｍｍに等しく、下のパネルにおいて２０μｍに等しい。
【図８】ＭｉＲ−２０８−／−マウスが、胸部大動脈瘤絞扼術（TAB）及びカルシニューリンの活性化に応答して、β−ＭＨＣの上方制御に失敗したことを示す図である。
【図９】成体野生型及びｍｉＲ−２０８遺伝子導入マウスにおける、α−及びβ−ＭＨＣタンパク質レベルのウェスタン分析を示す図である。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして検出した。
【図１０】ＭｉＲ−２０８−／−マウスが、プロピルチオウラシル（PTU）投与による甲状腺機能低下に応答して、β−ＭＨＣの上方制御に失敗したことを示す図である。
【図１１】β−ＭＨＣ発現の調節におけるｍｉＲ−２０８の役割の概略図である。
【図１２】Ｔｈｒａｐ１を介したβ−ＭＨＣ及び速骨格筋遺伝子の発現の制御におけるｍｉＲ−２０８の役割の概略図である。
【図１３】心臓肥大におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの作用機構を示す図である。
【図１４】野生型、ｍｉＲ−２０８＋／−マウス及びｍｉＲ−２０８−／−マウスの心臓におけるｍｉＲ−４９９の発現を示すノーザンブロットの図である。野生型及び突然変異マウスにおける、ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９ならびにＭｙｈ７ｂの発現の間には直接相関がある。
【図１５】Ｍｙｈ７ｂ遺伝子座の構造及びその中のｍｉＲ−４９９コード領域の位置を示す図である。
【図１６】ｍｉＲ−２０８が心臓のｍｙｈ７ｂの発現を制御する図である。（図１６Ａ）Ｍｙｈ７ｂは、ｍｉＲ−４９９のように、心臓及び遅骨格筋（ヒラメ筋）において特異的に発現する。（図１６Ｂ）心臓及び４種の骨格筋型（腓腹筋／足底（GP）、前脛骨筋（TA）長趾伸筋（EDL）又はヒラメ筋）についてのｍｉＲ−４９９に関するリアルタイムＰＣＲ分析により、ｍｉＲ−４９９が心臓及びヒラメ筋において優勢に発現することが確認される。ＴＡ及びＥＤＬにおいては、ｍｉＲ−４９９のわずかなレベルの発現のみが検出できた。（図１６Ｃ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、胚形成期間中、ｍｙｈ７ｂが心臓及び体節において特異的に発現することを示す。（図１６Ｄ）野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異の動物の両方に関するノーザンブロット分析により、ｍｉＲ−２０８の不在下で、ｍｉＲ−４９９の発現は心臓において特異的に不在であるが、ヒラメ筋においてはいまだ発現することが示された（下方のブロット）。
【図１７】野生型のマウス、心疾患のマウスにおけるｍｉＲ−４９９の発現を示すノーザンブロットを示す図である。ＭＩ、心筋梗塞。ＣｎＡ  Ｔｇ、カルシニューリン遺伝子導入マウス。
【図１８】心筋におけるｍｉＲ−２０８によるｍｉＲ−４９９の制御の概略図である。
【図１９】心筋及び骨格筋の両方におけるｍｉＲ−２０８によるｍｉＲ−４９９の制御の概略図である。
【図２０】ｍｉＲ−４９９が、ＴＨＲＡＰＩ、ＰＵＲβ及びＧＤＦ８（別名ミオスタチン）を標的とすることにより、ミオシンのスイッチング及び線維型の同一性を制御する図である。
【図２１Ａ】α−ＭＨＣの発現の阻害が、ｍｉＲ−２０８のレベルの低下をもたらすことを示す図である。ＰＴＵ暴露の０、３、６、９、１２、１５、１８及び２１日におけるα−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣの転写産物に関する相対発現レベル。
【図２１Ｂ】α−ＭＨＣの発現の阻害が、ｍｉＲ−２０８のレベルの低下をもたらすことを示す図である。ＰＴＵ暴露の０、３、６、９、１２、１５、１８及び２１日におけるα−及びβ−ＭＨＣの転写産物に関する相対発現レベル。
【図２１Ｃ】α−ＭＨＣの発現の阻害が、ｍｉＲ−２０８のレベルの低下をもたらすことを示す図である。ＰＴＵ投与期間の表示の時点における、ラット心臓組織中のｍｉＲ−２０８のノーザンブロット分析。
【図２２】ｍｉＲ−２０８ノックアウトにおける速骨格遺伝子の上方制御を示す図である。
【図２３】ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスにおける心臓ストレス応答遺伝子の調節不全を示す図である。
【図２４】心臓遺伝子制御におけるｍｉＲ−２０８の役割モデルを示す図である。α−ＭＨＣ遺伝子はｍｉＲ−２０８をコードし、これはさらなる標的の中でＴＨＲＡＰ１及び骨格筋遺伝子の発現を負に制御する。α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣ遺伝子は連結し、ｍｉＲ−２０８はストレスシグナル伝達に応答したβ−ＭＨＣの上方制御及びＰＴＵによるＴ３シグナル伝達に対する遮断に必要である。α−及びβ−ＭＨＣは、それぞれ速収縮及び遅収縮を促進する。
【図２５】ｍｉＲ−２０８の予測標的としてのＴＨＲＡＰ１を示す図である。ＴＨＲＡＰ１の３’ＵＴＲ中の推定ｍｉＲ−２０８結合部位の配列アライメントにより、高レベルの相補性及び配列保存が示される（配列番号６〜１３）。
【図２６】３’ＵＴＲ  ＴＨＲＡＰ１のルシフェラーゼアッセイを示す図である。ＴＨＲＡＰ１の３’ＵＴＲを含むルシフェラーゼ遺伝子の発現が、ｍｉＲ−２０８を共形質移入した細胞において減少したが、ｍｉＲ−１２６を共形質移入した細胞（対照）では減少しなかった。
【図２７】ｍｉＲ２０８突然変異マウスの心臓における速骨格筋遺伝子の上方制御を示す図である。
【図２８】Ｍｙｈ７遺伝子座（β-MHC）の構造及びその中のｍｉＲ−２０８ｂコード領域の位置を示す図である（配列番号２７及び配列番号３０〜３６）。
【図２９】ミオシン重鎖遺伝子（myh6及び myh7、別名α-MHC及びβ-MHC）のゲノム重複によるｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−２０８ｂが発現した図である。ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−２０８ｂは、α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣにより共発現される（図２９Ａ）。ミオシン重鎖遺伝子（myh6及び myh7、別名α-MHC及びβ-MHC）のゲノム重複によるｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−２０８ｂが発現した図である。全成熟ｍｉＲは配列中の３塩基が異なるが、相同なシード領域を共有する（図２９Ｂ）（配列番号２７及び配列番号５）。
【図３０】ｍｙｏｍｉＲは、それらのミオシン宿主遺伝子と共発現及び共制御されることを示す図である。（図３０Ａ）ノーザン分析は、ｍｉｒ−２０８ｂが、ベースライン状態で心臓において非常に低レベルで発現し、腓腹筋／足底（GP）、前脛骨筋（TA）又は長趾伸筋（EDL）などの速骨格筋線維においては発現しないことを示している。ＭｉＲ−２０８ｂは遅骨格筋のヒラメ筋において高度には発現する。（図３０Ｂ）表示のミオシン遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲ分析は、ＰＴＵ含有の餌を動物に与えることによる甲状腺受容体シグナル伝達の遮断が、ラットの心臓組織においてα−ＭＨＣの発現を抑制し、β−ＭＨＣの発現を誘導することを示している。この効果は、甲状腺ホルモン（T3）の後続補給により反転できる。ｍｙｈ７ｂの発現は、幾分β−ＭＨＣの発現パターンに似ている。（図３０Ｃ）生後間もなくβ−ＭＨＣからより多くのα−ＭＨＣへのシフトが起こる。成体の心臓において、ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−４９９の活性化に関与しているが、ｐ１、ｐ６及び成体の野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異動物の心臓試料についてのノーザンブロット分析は、β−ＭＨＣ遺伝子から作製したｍｉＲ−２０８ｂの存在が、ｍｉＲ−２０８が不在であってもｍｉＲ−４９９の発現を起動させるために十分であることを示している。（図３０Ｄ）ｍｙｏｍｉＲに関するノーザンブロット分析は、ｍｉＲ−２０８ｂが、ｍｉＲ−２０８の不在下でのストレスシグナル伝達に応答したβ−ＭＨＣの誘導の減少を反映していることを示している。ＭｉＲ−２０８ノックアウト動物は、ストレス及び甲状腺機能低下に応答したβ−ＭＨＣの増加を抑える。ノーザン分析は、ＰＴＵに応答した野生型（WT）動物におけるｍｉＲ−２０８ｂの激しい誘導を示すが、ｍｉＲ−２０８の不在下（ノックアウト、KO）でのｍｉＲ−２０８ｂの誘導はわずかである。２０８ａ又は２０８ｂのいずれかの存在は、ｍｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９を活性化するために十分であることに留意されたい。
【図３１】ＰＴＵ投与による甲状腺機能低下が、ｍｉＲ−２０８ｂの発現を強く誘導することを示す図である。β−ＭＨＣのように、ｍｉＲ−２０８ｂはベースライン状態下で心臓において激しく発現するが、その発現は、甲状腺機能低下に応答して強く誘導される。この誘導は、甲状腺ホルモン（T3）の後続補給により反転できる。
【図３２】ＰＴＵ投与による甲状腺機能低下期間のｍｉＲ−２０８ｂの時間依存性誘導を示す図である。ＰＴＵ投与によるｍｉＲ−２０８ｂの誘導は、３日後に明らかである。このｍｉＲ−２０８ｂのＰＴＵ誘導性発現は、ＰＴＵ投与の継続により増加する。
【図３３】ｍｉＲ−２０８が、ｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９の発現を制御することを示す図である。（Ａ）ノーザンブロットが、ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの発現は、ｍｉＲ−２０８ヘテロ接合体（+/-）及びホモ接合体（KO）突然変異動物において用量依存的に下方制御されることを示す。（Ｂ）ＭｉＲ−２０８ｂは、ｍｉＲ−２０８遺伝子導入動物において上方制御され、β−ＭＨＣの発現と相関する。（Ｃ）心筋においてｍｉＲ−２０８によりｍｉＲ−４９９が制御される概略図である。
【図３４】心臓のリモデリングのｍｉＲ−２０８による制御の概略モデルを示す図である。ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの発現の制御を介して、直接的又は間接的のいずれかで心臓のリモデリングを制御する。
【図３５】ｍｉＲ−２０８ｂノックアウトマウスモデルを設計するための標的戦略の概略モデルを示す図である。
【図３６】ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂ両方のための結合部位領域を過剰発現する遺伝子導入マウスモデルの概略図である。骨格筋及び心筋の特異的プロモーター（筋クレアチンキナーゼ（MCK））を使用した、ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂ両方のための結合領域部位の骨格筋特異的過剰発現は、心筋及び骨格筋の両方においてｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９を取り除き、その結果両方のｍｉＲＮＡ（配列番号５、２６及び２７）のノックダウンを起こすはずである。
【図３７】Ｍｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の発現はＭＥＦ２に依存することを示す図である。（図３７Ａ）ゲル移動度シフトアッセイを、空のｐｃＤＮＡ−Ｆｌａｇ又はＦｌａｇ−ＭＥＦ２Ｃのいずれかを形質移入したＣＯＳ−１細胞由来の核抽出物及びプローブとして放射標識ＭＥＦ２部位を使用して実施した。ｐｃＤＮＡ−Ｆｌａｇは放射標識ＭＥＦ２部位に結合できないが（レーン１）、ＭＥＦ２Ｃの過剰発現が結合を誘導し（レーン２）、これはポリクロナールＦｌａｇ抗体１μｇを用いてスーパーシフトできる（レーン３）。特異的及び非特異的な競合相手を、５０倍モル過剰で使用した（レーン４〜６）。（図３７Ｂ）ＣＯＳ細胞（２４ウェルプレート、５×１０４細胞／ウェル）に、ｍｙｈ７ｂ−ルシフェラーゼレポーター（野生型及びMef2突然変異体）１００ｎｇ、Ｍｅｆ２ｃをコードする発現ベクター５０ｎｇ、Ｍｅｆ２コアクチベーター、ミオカルジンタンパク質及びｐＣＭＶ−ｌａｃＺ３０ｎｇを形質移入した。Ｍｅｆ２ｃ及びミオカルジンによるｍｙｈ７ｂレポーターの活性化は、Ｍｅｆ２結合部位を必要とした。（図３７Ｃ）ＭＥＦ２部位は、ｍｙｈ７ｂ／ｒｎｉＲ−４９９の心臓の発現に必須である。ＬａｃＺ遺伝子導入マウスの胚を作製し、Ｅ１２．５及びｐ１におけるβ−ラクトシダーゼの発現に関して染色した。ｍｙｈ７ｂ遺伝子の０．８Ｋｂ上流の領域は、心臓のｌａｃＺの発現を起動するために十分であったが、ＭＥＦ２部位の突然変異は、心臓における発現を破壊した。（図３７Ｄ）ノーザンブロット分析は、ｍｉＲ−４９９の発現が心臓特異的ＭＥＦ２Ｄ遺伝子導入動物の心臓において増加するが、ｍｉＲ−４９９のレベルは、ＭＥＦ２Ｃ及びＤが欠失した心臓において減少することを示す。
【図３８】ｍｉＲ−４９９が、β−ＭＨＣ及び速骨格筋遺伝子の発現を制御することを示す図である。（図３８Ａ）ｍｉＲ−４９９に関するノーザンブロット分析は、筋特異的プロモーターを使用したｍｉＲ−４９９の遺伝子導入過剰発現が、すべての筋肉型においてｍｉＲ−４９９レベルを効果的に誘導することを示している。（図３８Ｂ）リアルタイムＰＣＲ分析は、遺伝子導入過剰発現がベースラインの心臓発現レベルと比較して、速骨格筋型（GP、TA及びEDL）の中で最も高レベルな、効果的なｍｉＲ−４９９の過剰発現をもたらすことを示す。（図３８Ｃ）野生型又は遺伝子導入動物のいずれかの筋組織についてのリアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−４９９の過剰発現が、ヒラメ筋、ＴＡ及びＥＤＬにおけるβ−ＭＨＣの発現を起動するために十分であるが、それは、心臓、ヒラメ筋及びＥＤＬにおける速骨格トロポニンＩ２（TnnI2）及びＴ３（TnnT3）を抑制することを示す。（図３８Ｄ）野生型及びｍｉＲ−４９９遺伝子導入動物の両方の筋線維の急速凍結組織切片の異染性ＡＴＰアーゼ染色は、遺伝子導入マウスの速線維（EDL）中の遅筋線維において劇的な増加を示す。（図３８Ｅ）ＰＴＵに応答したβ−ＭＨＣの発現についてのｍｉＲ−２０８除去の抑制効果は、ｍｉＲ−４９９を再導入した場合ない。ｍｉＲ−２０８突然変異動物の心臓におけるｍｉＲ−４９９遺伝子導入的再導入は、β−ＭＨＣ及びその対応ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２０８ｂの激しい誘導をもたらす。（図３８Ｆ）ｍｉＲ−２０８の除去は、速骨格筋遺伝子の不適切な誘導を誘導するが、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において遺伝子導入的に発現する場合、ｍｉＲ−４９９は、非常に強力にこれらの遺伝子を抑制する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
心筋及び骨格筋は、収縮の効率を規制する、ミオシンアイソフォームの発現を調節することによって、仕事負荷、甲状腺ホルモンシグナル伝達、及び損傷などの様々な病態生理学的刺激に応答する。最近、本発明者らは、α−ミオシン重鎖（MHC）遺伝子のイントロンによってコードされ、かつ心臓ストレスに応答したβ−ＭＨＣ発現の上方制御及び心臓の速骨格筋遺伝子の抑制に必要とされる、心臓特異的マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８について報告した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている同時係属出願ＷＯ２００８／０１６９２４参照）。
【００２８】
ここで本発明者らは、自らの初期の研究を拡張し、ｍｉＲ−２０８が、密接に関係するマイクロＲＮＡ、それぞれＭｙｈ７ｂ遺伝子及びβＭＨＣ遺伝子のイントロンによってコードされているｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの、心臓発現にも必要とされていることを示す。心臓、ならびに遅骨格筋でのＭｙｈ７ｂ及びｍｉＲ−４９９の発現は、ＭＥＦ２転写因子、横紋筋遺伝子発現のシグナル依存性レギュレーターによって制御される。ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ２０８の強制発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの速遅筋線維変換を媒介するのに十分である。ｍｉｒ−２０８及びｍｉＲ−４９９は、Ｔｈｒａｐ１、甲状腺ホルモン受容体コレギュレーター、及び転写因子のＰＵＲファミリーのメンバーの発現を、負に調節することができ、即ち、心筋及び骨格筋でのβ−ＭＨＣ発現を負に調節する。Ｓｏｘ６は、遅筋線維型特異的遺伝子のリプレッサーとして機能する。野生型筋管でのＳｏｘ６発現のノックダウンは、β−ＭＨＣ発現に著しい増加をもたらす。β−ＭＨＣプロモーターの分析は、胎児骨格筋の線維型分化及び心臓のβ−ＭＨＣ調節においてＳｏｘ６が極めて重要な役割を演ずることを示唆する、Ｓｏｘコンセンサス配列を明らかにした。これらの知見は、収縮性及びシグナル応答性を管理する調節マイクロＲＮＡをコードすることによって横紋筋のＭｙｈ遺伝子が遺伝子発現パターンを調節する、一般的な調節機構を明らかにする。横紋筋疾患の状況でｍｉＲ−４９９発現を調節することによって、骨格筋及び心筋遺伝子発現を操作する戦略を、これらの発見に照らして記述する。
【００２９】
本発明者らは、ゲノムが、ｍｉＲ−２０８ｂと呼ばれる第２のタイプのｍｉＲ２０８を含有することも発見し、これは、イントロン３１でβ−ＭＨＣ遺伝子内に位置し、またβ−ＭＨＣのように、ｍｉＲＮＡ  ２０８ｂは、心筋及び遅骨格筋（ヒラメ筋）で単独で発現する。このマイクロＲＮＡの配列は、いわゆるシード領域、即ちあるｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を定義するマイクロＲＮＡの領域において、１００％の相同性でｍｉＲ−２０８と大きく重複する。このように、ｍｉＲ−２０８ｂは、ヒトの心臓収縮性に計り知れない影響を及ぼす可能性があり、心臓収縮性を調節するｍｉＲ−２０８ｂの調節も、本発明によって企図される。
【００３０】
このように本発明は、ｍｉＲＮＡそのものを使用することによって、あるいはアデノウイルスベクターもしくはβ−ＭＨＣ発現を高める異所性発現のその他の手段を使用することによって、内因性ｍｉＲ−２０８ｂ遺伝子又はｍｉＲ−２０８遺伝子（ｍｉＲ−４９９を上方制御する）を治療により活性化させ、あるいは外因性ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂを心臓に導入することによる、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のアゴニズムを包含する。ｍｉＲ−２０８変異マウスの心臓での、いくつかの速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の上方制御は、ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−２０８ｂが、速骨格筋遺伝子プログラムを典型的には抑制することを示唆しており、これは骨格筋及び心筋でのｍｉＲ−４９９に関して同様の役割をすることを意味する。このように、心臓でのこれら遺伝子の活性化は、心臓収縮性を調節する潜在的な手法を示している。
【００３１】
さらに本発明者らは、骨格筋で速筋線維遺伝子を抑制するために、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを使用し、それによって遅筋線維遺伝子の相互発現を活性させることを提示する。遅筋線維遺伝子の発現は、高いインスリン感受性及び骨格筋持久力に連関している。骨格筋での遅筋線維遺伝子の抑制及び速筋線維遺伝子の活性化は、非活動性萎縮、抗重量に応答した筋肉疲労、及び除神経を含めた非常に数多くの筋骨格系障害に関連している。
【００３２】
このように本発明らは、ｍｉＲ−２０８のように、ｍｉＲ−４９９が心臓でのβ−ＭＨＣ遺伝子発現の筋特異的な必須レギュレーターであることを発見した。さらに、ｍｉＲ−２０８ｂは、さらに心臓線維症を調節する、心臓でのミオシン遺伝子発現の筋特異的な必須レギュレーターであることを発見した。これらの知見は共に、心臓収縮性及び骨格筋機能を制御するためのこれらマイクロＲＮＡの使用のように、完全に新規である。
【００３３】
ｍｉＲ−４９９遺伝子のゲノム位置の分析は、α−ＭＨＣ遺伝子のホモログであるＭｙｈ７ｂ遺伝子の２０番目のイントロン内に含有されることを示した（図１５;配列番号２６は、成熟miRNA配列を挙げ;配列番号２５は、前駆体配列のステムループ構造を示す。）。マウス、ラット、ヒト、イヌ、フクロネズミ、ニワトリ、及びＸ．トロピカリス（X.tropicalis）に関するｍｉＲ−４９９のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡコード配配列は、それぞれ配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に示される（図１５）。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子は、脊椎動物で保存され、心筋及び遅骨格筋（例えば、ヒラメ筋）で単独で発現する。
【００３４】
ｍｉＲ−４９９発現を調節することが示されたｍｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内に位置するイントロンｍｉＲＮＡである。正確なイントロンの位置は、特定の種及び特異的な転写物に依存する。例えばヒトでは、ｍｉＲ−２０８が、α−ＭＨＣ遺伝子の２８番目のイントロン内にコードされ、一方マウスでは、２９番目のイントロン内にコードされる。ヒト、マウス、ラット、及びイヌに関するｍｉＲ−２０８のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡコード配列は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に示される。成熟ｍｉＲ−２０８配列は、配列番号１５に示される。α−ＭＨＣのように、ｍｉＲ−２０８は、心臓で単独に発現する（図１）。
【００３５】
ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１４）
ａｃｇｇｇｃｇａｇｃ  ｔｔｔｔｇｇｃｃｃｇ  ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ  ｇａｔｇｃｔｃａｃｇ  ｔａｔａａｇａｃｇａ  ｇｃａａａａａｇｃｔ  ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ  ａ
【００３６】
マウスｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１５）
ａｃｇｇｇｔｇａｇｃ  ｔｔｔｔｇｇｃｃｃｇ  ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ  ｇａｃｔｃｔｃａｃｇ  ｔａｔａａｇａｃｇａ  ｇｃａａａａａｇｃｔ  ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ  ａ
【００３７】
ラットｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１６）
ａｃｇｇｇｔｇａｇｃ  ｔｔｔｔｇｇｃｃｃｇ  ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ  ｇａｃｔｃｔｃａｃｇ  ｔａｔａａｇａｃｇａ  ｇｃａａａａａｇｃｔ  ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ  ａ
【００３８】
イヌｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１７）
ａｃｇｃａｔｇａｇｃ  ｔｔｔｔｇｇｃｔｃｇ  ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ  ｇａｔｇｃｔｃａｃｇ  ｔａｔａａｇａｃｇａ  ｇｃａａａａａｇｃｔ  ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ  ａ
【００３９】
ｍｉＲＮＡ標的の確認のためにＰｉｃＴａｒアルゴリズムを使用して（Krekら、2005）、本発明者らは、甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質１（THRAP1）がｍｉＲ−２０８に関して予測された標的であることを確認した。ヒト、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、フグ、及びゼブラフィッシュからのＴＨＲＡＰ１  ３’ＵＴＲ配列を、それぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３に示す（図２５）。
【００４０】
筋収縮性の調節に関わる可能性があるマイクロＲＮＡに関する更なる調査において、本発明者らは、βＭＨＣ遺伝子が、イントロン３１内にｍｉＲ−２０８と密接に関連しているｍｉＲ２０８ｂを含有することを見出した。ｍｉＲ−２０８ｂの発現はβＭＨＣの発現に続き、即ち、心筋及び遅骨格筋（ヒラメ筋）で単独で発現する。このマイクロＲＮＡの配列は、あるｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を定義するのを助けるマイクロＲＮＡの部分である、いわゆるシード領域で、１００％の相同性でｍｉＲ−２０８と大きく重複する（下線により示される。）。
ｍｉＲ−２０８  ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＵＧＵ（配列番号５）
ｍｉＲ−２０８ｂ  ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ（配列番号２７）
【００４１】
ヒト、マウス、ラット、イヌ、フクロネズミ、及びＸ．トロピカリスのｍｉＲ−２０８ｂに関するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡコード配列を、それぞれ配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に示す（図２８）。図２８は、ｍｉＲ−２０８ｂ前駆体配列（配列番号３６）のステムループ構造も示す。
【００４２】
心臓肥大、心不全、及び心筋梗塞を治療する方法
本発明は、その必要がある対象の病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を有する対象を特定する工程と、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程とを含む。別の実施形態では、この方法は、病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を発症する危険性がある対象を特定する工程と、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程とを含む。病的な心臓肥大又は心不全を発症する危険性がある対象は、例えば長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、又は病的な肥大を含めた、１つ又は複数の危険因子を示す可能性がある。ある実施形態では、危険性のある対象は、心臓肥大に対して遺伝的素因を有すると診断され得る。本発明のいくつかの実施形態では、危険性がある対象は、心臓肥大の家族歴を有する可能性がある。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大及び拡張型心筋症を予防する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、対象の心臓細胞でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び活性を阻害する工程を含む、その必要がある対象で心臓肥大の進行を阻害する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程を含む、心不全又は心臓肥大を有する対象の運動負荷を増大させ、入院を減少させ、生活の質を改善し、罹患率を低下させ、かつ／又は死亡率を低下させる方法を提供する。
【００４４】
このように本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を利用して、心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療するための方法を提供する。好ましくは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬の投与の結果、対象の心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞の１つ又は複数の症状が改善され、あるいは心臓肥大から心不全への移行が遅くなる。１つ又は複数の改善される症状は、例えば、高い運動能力、高い心臓駆出容積、低い左心室拡張末期圧、低い肺毛細血管楔入圧、高い心拍出量、高い心係数、低い肺動脈圧、低い左心室収縮末期及び拡張末期径、低下した心臓線維症、心筋での少ないコラーゲン沈着、低い左心室及び右心室壁応力、低い壁張力、高い生活の質、及び低い疾患関連罹患率又は死亡率であってもよい。さらに、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の使用は、心臓肥大及びそれに関連した症状が引き起こされるのを予防することができる。
【００４５】
ｍｉＲＮＡの機能は、アンタゴｍｉｒの投与によって、阻害し得る。最初にＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ及びその同業者によって、「アンタゴｍｉｒ」は、ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の化学修飾されたリボヌクレオチドであることが記述された（Krutzfeldtら、2005）。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル−糖修飾など、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、修飾ヌクレオチドのみ含む。アンタゴｍｉｒは、部分又は完全ホスホロチオエート主鎖をもたらす１つ又は複数のホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達及び安定性を促進させるため、アンタゴｍｉｒを、コレステロール部分にその３’末端で結合してもよい。ｍｉＲＮＡを阻害するのに適したアンタゴｍｉｒは、長さが約１５〜約５０ヌクレオチドであってもよく、より好ましくは長さ約１８〜約３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さ約２０〜約２５ヌクレオチドである。「部分的に相補的」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を指す。アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に倒して実質的に相補的であってもよく、即ち、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。その他の実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的である。
【００４６】
マイクロＲＮＡ機能の阻害は、成熟ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、又はｍｉＲ−２０８ｂ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって、実現してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種又は複数の「ロックト核酸」からなるものであってもよい。「ロックト核酸」（LNA）は、リボース糖部分の２’及び４’炭素の間に余分な橋を含有することによって、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドに高い熱安定性を与える「ロックされた」構造をもたらす、修飾されたリボヌクレオチドである。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸主鎖ではなくペプチドをベースにした主鎖を含有するペプチド核酸（PNA）を含んでいてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドが含有していてもよいその他の化学修飾には、限定するものではないが、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、及び４’チオ修飾などの糖修飾と、１種又は複数のホスホロチオエート、モルホリノ、又はホスホノカルボキシレート結合などの主鎖修飾が含まれる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，６９３，１８７号及び第７，０６７，６４１号参照）。いくつかの実施形態では、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル−修飾リボヌクレオチドを含有し少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドが中央にある、２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。これらの「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮアーゼＨ依存性分解機構を引き起こすことが可能である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，８３８，２８３号に記載されるように、安定性を高め効力を改善するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の修飾は当技術分野で知られており、本発明の方法で使用するのに適している。マイクロＲＮＡの活性を阻害するのに有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約１９〜約２５ヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的であってもよく、即ち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であってもよい。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的な配列を含む。
【００４７】
ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、及びｍｉＲ−２０８ｂの機能を阻害するための別の手法は、成熟ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、及びｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して少なくとも部分的な配列同一性を有する阻害ＲＮＡ分子を投与することである。阻害ＲＮＡ分子は、ステムループ構造を含む二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子（shRNA）であってもよい。阻害ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に同一な配列、例えば約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、阻害ＲＮＡの二本鎖領域は、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも実質的に同一な配列を含む。「実質的に同一な」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を指す。その他の実施形態では、阻害ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、標的ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％の同一性を含有していてもよい。
【００４８】
本明細書に記述される阻害ヌクレオチド分子は、好ましくは、ｍｉＲ−４９９（配列番号２６）、ｍｉＲ−２０８（配列番号５）、又はｍｉＲ−２０８ｂ（配列番号２７）の成熟配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、及びｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬は、成熟ｍｉＲ−４９９、成熟ｍｉＲ−２０８、又は成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して完全に相補的な配列を含むアンタゴｍｉｒである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９の阻害薬は、５’−ＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＵ−３’（配列番号２６）に対して部分的に、あるは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８の阻害薬は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＵＧＵ−３’（配列番号５）に対して部分的に、あるいは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ（配列番号２７）に対して部分的に、あるいは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、及びｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬は、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ｍｉＲ−４９９の阻害薬は、５’−ＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＵ−３’（配列番号２６）に対して実質的に相補的な配列を含む、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８の阻害薬は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＵＧＵ−３’（配列番号５）に対して実質的に相補的な配列を含む、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ（配列番号２７）に対して実質的に相補的な配列を含む、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される、「実質的に相補的な」は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、成熟又は前駆体ｍｉＲＮＡ配列）に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的な配列を指す。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、又はｍｉＲ−２０８ｂに関する前駆体ｍｉＲＮＡ配列（pre-miRNA）に対して実質的に相補的な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４９９、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８、又はｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列のステムループ領域外に位置する配列に対して、実質的に相補的な配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−４９９の機能の阻害薬は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択されたｐｒｅ−ｍｉＲ−４９９配列に対して実質的に相補的な配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８の機能の阻害薬は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７からなる群から選択されたｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８配列に対して実質的に相補的な配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ｂの機能の阻害薬は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５からなる群から選択されたｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列に対して実質的に相補的な配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
本発明のその他の実施形態では、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、及びｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬は、リボザイムやｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの阻害ＲＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−４９９の阻害薬は、成熟ｍｉＲ−４９９配列（配列番号２６）に対して１００％の同一性を有する配列を含んでいる、二本鎖領域を含む阻害ＲＮＡ分子である。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８の阻害薬は、成熟ｍｉＲ−２０８配列（配列番号５）に対して１００％の同一性を有する配列を含んでいる、二本鎖領域を含む阻害ＲＮＡ分子である。別の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬は、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列（配列番号２７）に対して１００％の同一性を有する配列を含んでいる、二本鎖領域を含む阻害ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２０８ｂ、及びｍｉＲ−４９９の機能の阻害薬は、成熟ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２０８ｂ、又はｍｉＲ−４９９配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含んでいる二本鎖領域を含む、阻害ＲＮＡ分子である。
【００５２】
本発明は、治療後にｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ拮抗薬を除去又は一掃するための方法も企図される。この方法は、心臓組織でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ拮抗薬の結合部位を過発現する工程を含んでいてもよい。別の実施形態では、本発明は、治療後にｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを除去又は一掃するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、骨格筋及び心筋特異的プロモーター（筋クレアチンキナーゼ（MCK））を使用した、骨格筋でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ結合部位領域の過発現を含む。結合部位領域は、好ましくは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのシード領域の配列を含有する。いくつかの実施形態では、結合部位は、ＴＨＲＡＰ１やＰＵＲβなど、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの１つ又は複数の標的の３’ＵＴＲからの配列を含有していてもよい。別の実施形態では、マイクロＲＮＡの機能を弱め又は停止させるため、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ拮抗薬を、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの後に投与してもよい。
【００５３】
併用療法
本発明の別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬をその他の治療様式と組み合わせて使用することが考えられる。心血管障害の状況における心臓肥大の現行の医学的管理は、少なくとも２つのタイプの薬物、即ちレニン−アンギオテンシン系阻害薬及びβ−アドレナリン作動性遮断薬の使用を含む（Bristow、1999）。心不全の状況における病的な肥大を治療する治療薬には、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ACE）阻害薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬が含まれる（Eichhorn及びBristow、1996）。心臓肥大の治療用に開示されたその他の薬剤には、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（米国特許第５，６０４，２５１号）及びニューロペプチドＹ拮抗薬（ＷＯ９８／３３７９１）が含まれる。
【００５４】
非薬理学的治療は、主に、薬理学的治療の補助として使用される。非薬理学的治療の１つの手段では、食事に含まれるナトリウムを減少させる。さらに、非薬理学的治療では、陰性変力薬（例えば、あるカルシウムチャネル遮断薬及び抗不整脈薬、例えばジソピラミド）、心臓毒（例えば、アムフェタミン）、及び血漿増量薬（例えば、非ステロイド系抗炎症薬及びグルココルチコイド）を含めたある沈殿薬物の排除も必要とする。
【００５５】
このように、上述の療法に加え、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを用いたより「標準的な」薬学的心臓療法を、対象に提供することもできる。その他の治療薬の例には、限定するものではないがいわゆる「β遮断薬」、抗高血圧薬、強心薬、抗血栓薬、血管拡張薬、ホルモン拮抗薬、変力薬、利尿薬、エンドセリン受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシン２型拮抗薬、及びサイトカイン遮断薬／阻害薬、及びＨＤＡＣ阻害薬が含まれる。併用療法では、ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の発現又は活性を阻害させることもでき、あるいは、ｍｉＲ−２０８及び／又はｍｉＲ−２１やｍｉＲ−１９５などの心臓再構築に関わる追加のｍｉＲＮＡの発現又は活性を阻害することもできる。併用療法は、ｍｉＲ−２９などの特定のマイクロＲＮＡの過発現を含んでもいてもよい。
【００５６】
組合せは、心臓細胞と、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬及び標準的な薬剤を含む単一の組成物又は医薬品製剤とを接触させることによって、あるいは、心臓細胞と、２種の異なる組成物又は製剤、即ち一方の組成物がｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含み他方が標準的な薬剤を含んでいるものとを同時に接触させることによって、実現することができる。あるいは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を使用する療法は、数分から数週間までに及ぶ間隔で（１種又は複数の）その他の薬剤を投与する前又は後に行ってもよい。標準的な薬剤及びｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬を別々に細胞に施用する実施形態では、一般にそれぞれの送達時と送達時との間で有効時間が確実に途切れないようになされ、したがって、薬剤及びｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬は、有利に複合された効果を依然として細胞に及ぼすことができるようになる。そのような場合、典型的には、細胞と両様式とを互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に接触させることが企図され、その遅延時間は、わずかに約１２時間であることが最も好ましい。しかしそのような状況では、治療時間を著しく延ばすことが望ましい可能性があり、その場合、それぞれの投与と投与の間で数日（2、3、4、5、6又は7）から数週間（1、2、3、4、5、6、7、又は8）が続く。
【００５７】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬、又はその他の薬剤の、複数回投与が望まれることも考えられる。これに関し、様々な組合せを用いることができる。例示として、ｍｉＲ−４９９又はｍｉｒ−２０８ｂの阻害薬が「Ａ」であり、その他の薬剤が「Ｂ」である場合、合計で３及び４回の投与に基づけば、以下の順番が例として挙げられる。
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ
その他の組合せも同様に企図される。
【００５８】
治療計画は、臨床状態に応じて様々となる。しかし、長期にわたる維持は、ほとんどの状況で適切であると見なされる。疾患進行中の短い期間内など断続的に、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬で肥大を治療することが望ましい可能性もある。
【００５９】
薬理学的治療薬及び投与方法、投薬量などは、当業者に周知であり（例えば、参照により関連ある部分が本明細書に組み込まれている「Physicians Desk Reference」、Klaassenの「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、及び「The Merck Index, Eleventh Edition」参照）、本明細書の開示に照らして本発明と組み合わせることができる。投薬量のいくつかの変更は、治療がなされる対象の状態に応じて必ず行われることになる。投与に関与する者は、いずれにしても、個々の対象に適した用量を決定することになり、そのような個々の決定は、当業者の範囲内である。
【００６０】
本発明で使用してもよい薬理学的治療薬の非限定的な例には、抗高リポタンパク血症薬、抗動脈硬化薬、抗血栓／線維素溶解薬、血液凝固薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、昇圧薬、うっ血性心不全の治療薬、抗狭心症薬、抗菌薬、又はこれらの組合せが含まれる。
【００６１】
さらに、β遮断薬を本発明の実施例では使用したが、新しい組の心臓療法標的遺伝子を開発するのに下記のいずれかを使用してもよいことに、留意すべきである（下記参照）。これら遺伝子の多くは重複し得ることが予測されるが、新しい遺伝子標的をおそらく開発することができる。
【００６２】
ある実施形態では、「抗高リポタンパク血症薬」として本明細書で知られているより多くの血液脂質及び／又はリポタンパク質の１種の濃度を低下させる薬剤の投与を、特にアテローム性動脈硬化症及び血管組織の肥厚又は遮断の治療において、本発明による心臓血管療法と組み合わせることができる。ある実施形態では、抗高リポタンパク血症薬は、アリールオキシアルカン／フィブリン酸誘導体、樹脂／胆汁酸捕捉剤、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモン類似体、種々雑多な薬剤、又はこれらの組合せを含んでいてもよい。
【００６３】
アリールオキシアルカン／フィブリン酸誘導体の非限定的な例には、ベクロブレート、エンザフィブレート、ビニフィブレート、シプロフィブレート、シノフィブレート、クロフィブレート（アトロミド−Ｓ）、クロフィブリン酸、エトフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル（ロビド）、ニコフィブレート、ピリフィブレート、ロニフィブレート、シムフィブレート、及びテオフィブレートが含まれる。
【００６４】
樹脂／胆汁酸捕捉剤の非限定的な例には、コレスチラミン（コリバー、ケストラン）、コレスチポル（コレスチド）、及びポリデキシドが含まれる。
【００６５】
ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の非限定的な例には、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラバコール）、又はシムバスタチン（ゾコール）が含まれる。
【００６６】
ニコチン酸誘導体の非限定的な例には、ニコチネート、アセピモックス、ニセリトロール、ニコクロネート、ニコモール、及びオキシニアシン酸が含まれる。
【００６７】
甲状腺ホルモン及びその類似体の非限定的な例には、エトロキセート、チロプロピン酸、及びチロキシンが含まれる。
【００６８】
種々雑多な抗高リポタンパク血症薬の非限定的な例には、アシフラン、アザコステロール、ベンフルオレックス、β−ベンザブチラミド、カルニチン、コンドロイチン硫酸、クロメストロン、デタキストラン、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、エリタデミン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、４酢酸ペンタエリスリトール、α−フェニルブチラミド、ピロザジル、プロブコール（ロレルコ）、β−シトステロール、スルトシル酸−ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノール、及びキセンブシンが含まれる。
【００６９】
抗動脈硬化症薬の非限定的な例には、カルバミン酸ピリジノールが含まれる。
【００７０】
ある実施形態では、血栓の除去又は予防を補助する薬剤の投与を、特にアテローム動脈硬化症及び血管構造（例えば、動脈）の遮断の治療において、モジュレーターの投与と組み合わせてもよい。抗血栓薬及び／又は線維素溶解薬の非限定的な例には、抗凝血薬、抗凝血拮抗薬、抗血小板薬、血栓溶解薬、血栓溶解拮抗薬、又はこれらの組合せが含まれる。
【００７１】
ある実施形態では、例えばアスピリンやワーファリン（クマジン）など、経口投与することができる抗血栓薬が好ましい。
【００７２】
抗凝血薬の非限定的な例には、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロミンジオン、クロリンジオン、クメタロール、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、ビスクマ酢酸エチル、エチリデンジクマロール、フルインジオン、ヘパリン、ヒルジン、リアポレートナトリウム、オキサジジオン、多硫酸ペントサン、フェニンジオン、フェンプロクモン、ホスビチン、ピコタミド、チオクロマロール、及びワーファリンが含まれる。
【００７３】
抗血小板薬の非限定的な例には、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（パーサンチン）、ヘパリン、スルフィンピラノン（アンツラン）、及びチクロピジン（チクリド）が含まれる。
【００７４】
血栓溶解薬の非限定的な例には、組織プラミノゲンアクチベーター（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ）、アニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（エミナーゼ）が含まれる。
【００７５】
対象が出血しており、あるいは出血する可能性が高いある実施形態では、血液凝固を高めることができる薬剤を使用してもよい。血液凝固促進薬の非限定的な例には、血栓溶解拮抗薬及び抗凝固拮抗薬が含まれる。
【００７６】
抗凝固拮抗薬の非限定的な例には、プロタミン及びビタミンＫ１が含まれる。
【００７７】
血栓溶解拮抗薬の非限定的な例には、アミオカプロン酸（アミカール）及びトラネキサム酸（アムスタット）が含まれる。抗血栓薬の非限定的な例には、アナグレリド、アルガトロバン、シルスタゾール、ダルトロバン、デフィブロチド、エノキサパリン、フラキシパリン、インドブフェン、ラモパラン、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド、テデルパリン、チクロピジン、及びトリフルサルが含まれる。
【００７８】
抗不整脈薬の非限定的な例には、クラスＩ抗不整脈薬（ナトリウムチャネル遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈薬（β−アドレナリン遮断薬）、クラスＩＩＩ抗不整脈薬（再分極遅延薬）、クラスＩＶ抗不整脈薬（カルシウムチャネル遮断薬）、及び種々雑多な抗不整脈薬が含まれる。
【００７９】
ナトリウムチャネル遮断薬の非限定的な例には、クラスＩＡ、クラスＩＢ、及びクラスＩＣ抗不整脈薬が含まれる。クラスＩＡ抗不整脈薬の非限定的な例には、ジスピラミド（ノルペース）、プロカイナミド（プロネスチル）、及びキニジン（キニデックス）が含まれる。クラスＩＢ抗不整脈薬の非限定的な例には、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカード）、及びメキシレチン（メキシチル）が含まれる。クラスＩＣ抗不整脈薬の非限定的な例には、エンカイニド（エンカイド）及びフレカイニド（タムボコル）が含まれる。
【００８０】
通常ならβ−アドレナリン遮断薬、β−アドレナリン拮抗薬、又はクラスＩＩ抗不整脈薬として知られているβ遮断薬の非限定的な例には、アセブトロール（セクトラル）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロノール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、塩酸ブチドリン、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール、ニプラジロール、オキスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベタペース）、スルフィナロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロール、及びキシビノロールが含まれる。ある実施形態では、β遮断薬は、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含む。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の非限定的な例には、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オキスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、及びトリプロロールが含まれる。
【００８１】
クラスＩＩＩ抗不整脈薬としても知られている再分極を引き延ばす薬剤の非限定的な例には、アミオダロン（コルダロン）及びソタロール（ベタペース）が含まれる。
【００８２】
通常ならクラスＩＶ抗不整脈薬として知られているカルシウムチャネル遮断薬の非限定的な例には、アリールアルキルアミン（例えば、ベプリジル、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニルアミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）、ピペラジン誘導体（例えば、シンナジリン、フルナリジン、リドフラジン）、又はベンシクランやエタフェノン、マグネシウム、ミベフラジル、又はペルヘキシリンなどの種々雑多なカルシウムチャネル遮断薬が含まれる。ある実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬は、長期間作用するジヒドロピリジン（ニフェジピン型）カルシウム拮抗薬を含む。
【００８３】
種々雑多な抗不整脈薬の非限定的な例には、アデノシン（アデノカルド）、ジゴキシン（ラノキシン）、アセカイニド、アジュマリン、アモプロキサン、アプリンジン、トシル酸ブレチリウム、ブナフチン、ブトベンジン、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラニド、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イパトロピウム、リドカイン、ロラジュミン、ロルカイニド、メオベンチン、モリシジン、ピルメノール、プラジュマリン、プロパフェノン、ピリノリン、ポリガラクツロン酸キニジン、硫酸キニジン、及びビキジルが含まれる。
【００８４】
抗不整脈薬の非限定的な例には、交感神経作動薬、α／β遮断薬、α遮断薬、抗アンギオテンシンＩＩ薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、及び種々雑多な抗高血圧薬が含まれる。
【００８５】
α−アドレナリン遮断薬又はα−アドレナリン拮抗薬としても知られているα遮断薬の非限定的な例には、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、メシル酸エルゴロイド、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシン、及びヨヒムビンが含まれる。ある実施形態では、α遮断薬は、キナゾリン誘導体を含んでもよい。キナゾリン誘導体の非限定的な例には、アルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、及びトリマゾシンが含まれる。
【００８６】
ある実施形態では、抗高血圧薬は、α及びβ両方のアドレナリン拮抗薬である。α／β遮断薬の非限定的な例には、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）が含まれる。
【００８７】
抗アンギオテンシンＩＩ薬の非限定的な例には、アンギオテンシン変換酵素阻害薬及びアンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が含まれる。アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ACE阻害薬）の非限定的な例には、アラセプリル、エナラプリル（バソテック）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、キナプリル、及びラミプリルが含まれる。アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、ＡＮＧ受容体遮断薬、又はＡＮＧ−ＩＩタイプ−１受容体遮断薬（ARBS）としても知られるアンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬の非限定的な例には、アンギオカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、及びバルサルタンが含まれる。
【００８８】
交感神経遮断薬の非限定的な例には、中枢に作用する交感神経遮断薬又は末梢に作用する交感神経遮断薬が含まれる。中枢神経系（CNS）交感神経遮断薬としても知られている、中枢に作用する交感神経遮断薬の非限定的な例には、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ワイテンシン）、グアンファシン（テネックス）、及びメチルドーパ（アルドメット）が含まれる。抹消に作用する交感神経遮断薬の非限定的な例には、ガングリオン遮断薬、アドレナリンニューロン遮断薬、β−アドレナリン遮断薬、又はα１−アドレナリン遮断薬が含まれる。ガングリオン遮断薬の非限定的な例には、メカミルアミン（インベルシン）及びトリメタファン（アルフォナド）が含まれる。アドレナリンニューロン遮断薬の非限定的な例には、グアネチジン（イスメリン）及びレセルピン（セルパシル）が含まれる。β−アドレナリン遮断薬の非限定的な例には、アセニトロール（セクトラル）、アテノロール（テノルミン）、ベタキソロール（ケルロン）、カルテオロール（カルトール）、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）、メトプロロール（ロプレッサー）、ナダノール（コルガード）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（ビスケン）、プロプラノロール（インデラル）、及びチモロール（ブロカドレン）が含まれる。α１−アドレナリン遮断薬の非限定的な例には、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（カルデュラ）、及びテラゾシン（ヒトリン）が含まれる。
【００８９】
ある実施形態では、心臓血管治療薬には、血管拡張薬（例えば、脳血管拡張薬、冠状動脈拡張薬、又は抹消血管拡張薬）を含めてもよい。ある好ましい実施形態では、血管拡張薬は、冠状動脈拡張薬を含む。冠状動脈拡張薬の非限定的な例には、アモトリフェン、ベンダゾール、ヘミコハク酸ベンフロジル、ベンジオダロン、クロラシジン、クロモナール、クロベンフロール、クロニトレート、ジラゼップ、ジピリダモール、ドロプレニルアミン、エフロキセート、エリスリチルテトラニトラン、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル、ガングレフェン、ヘレストロールビス（β−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、トシル酸イトラミン、ケリン、リドフラニン、マンニトールヘキサニトラン、メジバジン、ニコルグリセリン、４硝酸ペンタエリスリトール、ペントリニトロール、ペルヘキシリン、ピメフィリン、トラピジル、トリクロミル、トリメタジジン、トロルニトレートホスフェート、及びビスナジンが含まれる。
【００９０】
ある実施形態では、血管拡張薬には、長期治療血管拡張薬又は高血圧緊急血管拡張薬を含めてもよい。長期治療血管拡張薬の非限定的な例には、ヒドララジン（アプレソリン）及びミノキシジル（ロニテン）が含まれる。高血圧緊急血管拡張薬の非限定的な例には、ニトロプルシド（ニプリド）、ジアゾキシド（ハイパースタットIV）、ヒドララジン（アプレソリン）、ミノキシジル（ロニテン）、及びベラパミルが含まれる。
【００９１】
種々雑多な抗高血圧薬の非限定的な例には、アジュマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェニオード、シクレタイニン、シクロシドミン、タンニン酸クリプテナミン、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミルアミン、メチルドーパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペムピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン、プロトベラトリン、ラウバシン、レシメトール、リルメニデン、サララシン、ナトリウムニトロルシシド、チクリナフェン、カンシル酸トリメタファン、チロシナーゼ、及びウラピジルが含まれる。
【００９２】
ある実施形態では、抗高血圧薬は、アリールエタノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、第４級アンモニウム化合物、レセルピン誘導体、又はスルホンアミド誘導体を含んでもよい。
【００９３】
アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例には、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ソタロール、及びスルフィナロールが含まれる。
【００９４】
ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例には、アルチジド、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロルメチアジド、及びトリクロルメチアジドが含まれる。
【００９５】
Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例には、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、及びラミプリルが含まれる。
【００９６】
ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例には、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、及びニトレンジピンが含まれる。
【００９７】
グアニジン誘導体の非限定的な例には、ベタニジン、ベブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン、グアンチジン、グアンファシン、グアノクロール、グアノキサベンズ、及びグアノキサンが含まれる。
【００９８】
ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例には、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジン、及びトドララジンが含まれる。
【００９９】
イミダゾール誘導体の非限定的な例には、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チアメニジン、及びトロニジンが含まれる。
【０１００】
第４級アンモニウム化合物の非限定的な例には、臭化アザメトニウム、塩化クロリソンダミン、ヘキサメトニウム、ペンタシニウムビス（メチルスルフェート）、臭化ペンタメトニウム、酒石酸ペントリニウム、塩化フェナクトロピニウム、及びメト硫酸トリメチジニウムが含まれる。
【０１０１】
レセルピン誘導体の非限定的な例には、ビエタセルピン、デセルピジン、レシンナミン、レセルピン、及びシロシンゴピンが含まれる。
【０１０２】
スルホンアミド誘導体の非限定的な例には、アムブシド、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネタゾン、トリパミド、及びキシパミドが含まれる。
【０１０３】
昇圧剤は、一般に、外科処置中に生じる可能性があるショック中に、血圧を上昇させるのに使用される。抗降圧薬としても知られる昇圧剤の非限定的な例には、アメジニウムメチルスルフェート、アンギオテンシンアミド、ジメトフリン、ドーパミン、エチフェルミン、エチレフリン、ゲペフリン、メタラミノール、ミドドリン、ノレピネフリン、フォレドリン、及びシネフリンが含まれる。
【０１０４】
うっ血性心不全を治療するための薬剤の非限定的な例には、抗アンギオテンシンＩＩ薬、後負荷−前負荷低減治療薬、利尿薬、及び変力薬が含まれる。
【０１０５】
ある実施形態では、アンギオテンシン拮抗薬に耐えることができない動物対象を、併用療法で治療してもよい。そのような療法は、ヒドララジン（アプレソリン）及び２硝酸イソソルビド（イソルジル、ソルビトレート）の投与を組み合わせることができる。
【０１０６】
利尿薬の非限定的な例には、チアジド又はベンゾチアジアジン誘導体（例えば、アルチアジド、ベンドロフルメタジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロロメチアジド、トリクロルメチアジド）、有機水銀化合物（例えば、クロルメロドリン、メラルリド、メルカムファミド、メルカプトメリンナトリウム、メルクマリル酸、メルクマチリンドジウム、塩化第１水銀、マーサリル）、プテリジン（例えば、フルテレン、トリアムテレン）、プリン（例えば、アセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パモブロム、プロテオブロミン、テオブロミン）、アルドステロン拮抗薬を含むステロイド（例えば、カンレノン、オレアンドリン、スピロノラクトン）、スルホンアミド誘導体（例えば、アセタゾラミド、アムブシド、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾラミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキスゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、キネタゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（例えば、アミノメトラジン、アミソメトラジン）、カリウム保持性拮抗薬（例えば、アミロリド、トリアムテレン）、あるいはアミノジンやアルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクルナフェン、及び尿素などの種々雑多な利尿薬が含まれる。
【０１０７】
強心薬としても知られる陽性変力薬の非限定的な例には、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ヘミコハク酸ベンフロジル、ブクラデシン、セルベロシン、カムホタミド、コンバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドーパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリスロフェレイン、フェナルコミン、ギタリン、ギトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム、ミルリノン、ネリホリン、オレアンドリン、オウアバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロシラリジン、レシブフォゲニン、シラレン、シラレニン、ストルファンチン、スルマゾール、テオブロミン、及びキサモテロールが含まれる。
【０１０８】
特定の実施形態では、変力薬は、強心グリコシド、β−アドレナリン作動薬、又はホスホジエステラーゼ阻害薬である。強心グリコシドの非限定的な例には、ジゴキシン（ラノキシン）及びジギトキシン（クリストジギン）が含まれる。β−アドレナリン作動薬の非限定的な例には、アルブテロール、バムブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン、ドブタミン（ドブトレックス）、ドーパミン（イントロピン）、ドペキサミン、エフェドリン、エタフェドリン、エチルノレピネフリン、フェノテロール、ホルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキシロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール、及びキサモテロールが含まれる。ホスホジエステラーゼ阻害薬の非限定的な例には、アムリノン（イノコール）が含まれる。
【０１０９】
抗狭心症薬には、有機硝酸化合物、カルシウムチャネル遮断薬、β遮断薬、及びこれらの組合せを含めてもよい。
【０１１０】
ニトロ血管拡張薬としても知られている有機硝酸化合物の非限定的な例には、ニトログリセリン（ニトロ−ビッド、ニトロスタット）、２硝酸イソソルビド（イソルジル、ソルビトレート）、及び硝酸アミル（アスピロール、バポロール）が含まれる。
【０１１１】
エンドテリン（ET）は、心不全の発症に関わると考えられる強力な生理学的及び病態生理学的効果を発揮する２１アミノ酸のペプチドである。ＥＴの効果は、２種類の細胞表面受容体との相互作用を通して媒介される。Ａ型受容体（ET-A）は、血管収縮及び細胞増殖に関連しており、一方Ｂ型受容体（ET-B）は、内皮細胞媒介性血管収縮及びアルドステロンなどのその他の神経ホルモンの放出に関連している。ＥＴの生成あるいは関連ある細胞を刺激するその能力を阻害することができる薬剤は、当技術分野で知られている。ＥＴの生成の阻害では、その前駆体からの活性ペプチドの処理に関わる酵素末端エンドセリン変換酵素を遮断する薬剤を使用する。細胞を刺激するＥＴの能力の阻害では、ＥＴとその受容体との相互作用を遮断する薬剤を使用する。エンドセリン受容体拮抗薬（ERA）の非限定的な例には、ボセンタン、エンラセンタン、アムブリセンタン、ダルセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アボセンタン、クラゾセンタン、エドネンタン、シタクスセンタン、ＴＢＣ  ３７１１、ＢＱ  １２３、及びＢＱ  ７８８が含まれる。
【０１１２】
ある実施形態では、２次的な治療薬に、例えば予防的、診断的、又は進展度診断的な、治癒及び軽減のための手術を含む、いくつかのタイプの外科処置を含めてもよい。手術、特に治癒のための手術は、本発明や１種又は複数のその他の薬剤など、その他の治療薬と併せて使用してもよい。
【０１１３】
血管及び心臓血管の疾患及び障害のためのそのような外科的治療薬は、当業者に周知であり、限定するものではないが器官に対して手術を行うこと、心臓血管の機械式プロテーゼを提供すること、血管形成、冠状動脈再潅流、カテーテルアブレーション、対象に対して移植可能な心臓徐細動器を提供すること、機械式循環支援、又はこれらの組合せを含めてもよい。本発明で使用してもよい機械式循環支援の非限定的な例には、大動脈内バルーン反対拍動法、左心室補助デバイス、又はこれらの組合せが含まれる。
【０１１４】
筋骨格系疾患を治療する方法
本発明は、骨格筋細胞での速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現又は活性を減少させる方法も提供する。一実施形態では、この方法は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを骨格筋細胞に投与する工程を含む。
【０１１５】
いくつかの速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の上方制御を、ｍｉＲ−２０８対立遺伝子を両方とも欠くマウスの心臓で観察した。ｍｉＲ−２０８ｂノックアウトマウスの心臓での速骨格筋収縮タンパク質遺伝子のこの上方制御は、ｍｉＲ−２０８が正常に機能して速骨格筋遺伝子プログラムを抑制することを示している。同時に生ずるｍｉＲ−４９９発現の減少を、ｍｉＲ−２０８変異マウスで観察し、ｍｉＲ−４９９も速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を負に調節し得ることが示唆された。β−ＭＨＣ遺伝子のイントロンによってコードされたｍｉＲ−２０８ｂは、ｍｉＲ−２０８とは３個の塩基のみ異なり、心筋及び遅骨格筋でのみ発現する。このように、ｍｉＲ−２０８ｂは、速骨格筋遺伝子プログラムも調節することができ、線維の同一性を決定することができる。
【０１１６】
骨格筋では、遅筋線維遺伝子の抑制及び速筋線維遺伝子の活性化は、限定するものではないが非活動性萎縮、抗重量に応答した筋肉疲労、及び除神経を含めた数多くの筋骨格系障害に関連している。このように、骨格筋細胞でのｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２０８ｂ、又はｍｉＲ−４９９の発現は、速筋線維遺伝子の抑制に役立てることができ、それによって遅筋線維遺伝子の相互発現が活性化される。したがって本発明は、その必要がある対象の筋骨格系障害を治療又は予防するための方法も包含する。一実施形態では、この方法は、筋骨格系障害の危険性を有する、あるいは危険性がある対象を特定する工程と、前記対象の骨格筋細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程とを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬を、筋骨格系障害を発症する危険性を有する、あるいはその危険性がある対象の骨格筋に投与する工程を含んでもよい。別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬を骨格筋に投与することによって、低重力環境に応答した筋肉疲労を治療又は予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂを骨格筋に投与することによって、筋萎縮を治療又は予防する方法を提供する。
【０１１７】
さらに、本明細書に示される結果は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ発現を高めることによって遅筋線維遺伝子発現を増大させる戦略を使用して、インスリン感受性を増大させることができることを示唆している。骨格筋は、ヒトにおけるインスリン刺激グルコース摂取の大部分に関与している。インスリン耐性は、ＩＩ型糖尿病の患者に見られるインスリン刺激グルコース摂取の欠乏である。インスリン耐性と遅対速痙攣筋線維のパーセンテージとの間に相関がある。このように別の実施形態では、本発明は、骨格筋細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程を含む、骨格筋でのインスリン感受性を増大させる方法を企図している。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を増大させる工程は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬を投与する工程を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬は、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６又は配列番号２７の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、ロックト核酸やペプチド核酸などの１つ又は複数の化学修飾、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）や２’−フルオロ及び４’チオ修飾などの糖修飾と、１つ又は複数のホスホロチオエート、モルホリノ、又はホスホノカルボキシレート結合などの主鎖修飾を含有してもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドがコレステロールに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの機能を増大させ、補い、又は置換するよう作用するｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂとは異なる薬剤であってもよい。
【０１１９】
別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬は、ベクターからｉｎ  ｖｉｖｏで発現してもよい。「ベクター」は、問題の核酸を細胞の内部に送達するのに使用することができる組成物である。限定するものではないが直鎖型ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に結合したポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスを含めた数多くのベクターが、当技術分野では知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自己複製プラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例には、限定するものではないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターなどが含まれる。発現構造は、生細胞内で複製することができ、又は合成によって作製することができる。本出願の目的で、「発現構造」、「発現ベクター」、及び「ベクター」という用語は、一般的な例示の意味で本発明の適用を実証するために同義に使用され、本発明を限定するものではない。
【０１２０】
一実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂを発現するための発現ベクターは、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂをコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結された」プロモーターを含む。本明細書で使用される「作動可能に連結された」又は「転写制御下」という文言は、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置及び向きにあり、その結果、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現が制御されることを意味する。ｍｉＲ−４９９をコードするポリヌクレオチドは、１次マイクロＲＮＡ−４９９配列（pri-miR-499）、前駆体マイクロＲＮＡ−４９９配列（pre-miR-499）、又は成熟ｍｉＲ−４９９配列をコードしてもよい。ｍｉＲ−２０８ｂをコードするポリヌクレオチドは、１次マイクロＲＮＡ−２０８ｂ配列（pri-miR-208b）、前駆体マイクロＲＮＡ−２０８ｂ配列（pre-miR-208b）、又は成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号２６又は配列番号２７の配列を含む。配列番号２６又は配列番号２７の配列を含むポリヌクレオチドは、長さ約１８〜約２０００ヌクレオチド、長さ約７０〜約２００ヌクレオチド、長さ約２０〜約５０ヌクレオチド、又は長さ約１８〜約２５ヌクレオチドであってもよい。その他の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂをコードするポリヌクレオチドは、イントロンをコードする核酸内に、あるいはｍＲＮＡの非翻訳領域をコードする核酸内に、あるいは非コードＲＮＡ内に位置する。一実施形態では、発現構造は、Ｍｙｈ７ｂ遺伝子の２０番目のイントロンの配列を含有してもよい。別の実施形態では、発現構造は、Ｍｙｈ７（β-MHC）遺伝子の３１番目の配列を含有してもよい。
【０１２１】
別の実施形態では、発現ベクターは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を細胞又は対象に送達するのに使用してもよい。ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を発現させるための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、この発現したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に部分的に又は完全に相補的なものである。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を発現させるための発現ベクターは、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ又は複数のプロモーターを含み、この発現したｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と同一の、あるいは部分的に同一の配列を含むものである。「部分的に同一」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が同一の配列を指す。
【０１２２】
本出願の全体を通して、「発現構造」という用語は、核酸コード配列の一部又は全てを転写することができる遺伝子産物をコードする核酸を含有する、任意のタイプの遺伝子構造を含むことを意味する。転写物は、タンパク質に翻訳してもよいが、必ずしもその必要はない。いくつかの実施形態では、発現は、問題の遺伝子をコードする核酸の転写のみ含む。
【０１２３】
ある実施形態では、問題のポリヌクレオチドをコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構、又は導入された合成機構によって認識された、ＤＮＡ配列を指す。プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼの開始部位の周りにクラスター形成された転写制御モジュールの群を指すため、本明細書で使用されることになる。プロモーターをどのように組織化するかに関する考えの多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（tk）及びＳＶ４０早期転写単位に関するものを含めたいくつかのウイルスプロモーターの分析から得られる。より最近の研究によって増強されたこれらの研究は、プロモーターが、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなりかつ転写アクチベーター又はリプレッサータンパク質用の１つ又は複数の認識部位を含有している、個別の機能的モジュールからなることを示した。
【０１２４】
各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部位を位置付けるよう機能する。この最も良く知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳類末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスが不十分ないくつかのプロモーターでは、開始部位そのものの上にある個別のエレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。
【０１２５】
追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位から３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが最近示された。プロモーターエレメント同士の間隔はしばしば柔軟性があり、したがってプロモーター機能は、これらエレメントが互いに反転又は移動したときに保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント同士の間隔を、活性が低下する前に５０ｂｐ引き離すことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協調的に、あるいは独立して、転写を活性化するよう機能することができるように見える。
【０１２６】
その他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復、ラットインスリンプロモーター、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、及びクリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターを使用して、問題のポリヌクレオチドの高レベルの発現を得ることができる。問題のポリヌクレオチドを発現させるための、当技術分野で周知のその他のウイルス又は哺乳類細胞もしくは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図されるが、発現レベルが所与の目的に十分であることを条件とする。
【０１２７】
周知の性質を有するプロモーターを用いることによって、形質移入又は形質転換後に問題のポリヌクレオチドの発現のレベル及びパターンを、最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択によって、遺伝子産物の誘導発現を行うことができる。表１及び２は、問題の遺伝子の発現を調節するために、本発明の文脈で用いてもよいいくつかの調節エレメントを列挙する。このリストは、遺伝子発現の促進に関与する可能性があるエレメントの全てを網羅したものではなく、単にそのエレメントを例示したものである。
【０１２８】
エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同様に組織化される。即ちエンハンサーは、それぞれが１種又は複数の転写タンパク質に結合する多くの個々のエレメントからなる。
【０１２９】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、実用可能である。エンハンサー領域は全体として、ある距離を隔てて転写を刺激することができなければならず、これは、プロモーター領域又はその成分エレメントに関して必ずしも真実である必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位及び特定の向きでＲＮＡ合成の開始を誘導する１つ又は複数のエレメントを持たなければならず、それに対してエンハンサーは、これらの特異性に欠けている。プロモーター及びエンハンサーは、しばしば重複及び近接し、しばしば非常に類似したモジュラー組織を有するように見える。
【０１３０】
以下は、発現構造内で問題の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用することができる、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、及び誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである（表１及び表２）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核プロモーターデータベースEPDBのように）を、遺伝子発現の促進に使用することができる。真核細胞は、送達複合体の一部として、あるいは追加の遺伝子発現構造として、適切な細菌ポリメラーゼが提供された場合、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【０１３１】
【表１】
2015013864.tif 000003
【０１３２】
【表２】
2015013864.tif 000004
【０１３３】
【表３】
2015013864.tif 000005
【０１３４】
特に関心が持たれているのは、筋特異的プロモーター（例えば、筋クレアチンキナーゼ）であり、より特定すれば心特異的プロモーターである。これらのプロモーターには、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Franzら、1994; Kellyら、1995）、αアクチンプロモーター（Mossら、1996）、トロポニン１プロモーター（Bhavsarら、1996）；Ｎａ＋／Ｃａ２＋エクスチェンジャープロモーター（Barnesら、1997）、ジストロフィンプロモーター（Kimuraら、1997）、α７インテグリンプロモーター（Ziober及びKramer、1996）、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（LaPointeら、1996）、及びαＢ−クリスタリン／低分子量熱ショックタンパク質プロモーター（Gopal-Srivastava、1995）、αミオシン重鎖プロモーター（Yamauchi-Takiharaら、1989）、及びＡＮＦプロモーター（LaPointeら、1988）が含まれる。
【０１３５】
ｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化が行われるように、ポリアデニル化シグナルを含むことが望まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を首尾良く実施するのに極めて重要とは考えられず、ヒト成長ホルモンやＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの任意のそのような配列を用いてもよい。発現カセットのエレメントとしては、ターミネーターも企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるように、かつカセットからその他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるように働くことができる。
【０１３６】
本発明のある実施形態では、本発明の核酸構造を含有する細胞を、発現構造にマーカーを含めることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏで特定することができる。そのようなマーカーは、特定可能な変化を細胞にもたらし、発現構造を含有する細胞の容易な特定を可能にする。通常、薬物選択マーカーを含めることによって、形質転換体のクローニング及び選択が支援され、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに耐性を与える遺伝子が、有用な選択可能なマーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などの酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーを用いることもできる。用いられる選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することが可能である限り、重要とは考えられない。選択可能なマーカーのその他の例は、当業者に周知である。
【０１３７】
発現ベクターを細胞に導入することができるいくつかの方法がある。本発明のある実施形態では、発現構造が、ウイルスゲノムからのウイルス又は設計製作された構造を含む。あるウイルスが、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に進入し、宿主細胞と一体化し、ウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力によって、このウイルスは、外来遺伝子が哺乳類細胞に移動するのに魅力的な候補になった（Ridgeway、1988; Nicolas及びRubenstein、1988; Baichwal及びSugden、1986; Temin、1986）。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ送達に好ましい方法の１つでは、アデノウイルス発現ベクターを使用する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構造のパッケージングを支援し、（ｂ）内部でクローニングされたポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するような構造を含むことを意味する。発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子組換え形態を含む。アデノウイルス、３６ｋＢ直鎖型二本鎖ＤＮＡウイルスの遺伝子構成の知識により、アデノウイルスＤＮＡの大部分を７ｋＢまでの外来配列で置換することが可能である（Grunhaus及びHorwitz、1992）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体の組込みをもたらさないが、それはアデノウイルスＤＮＡが、潜在的な遺伝毒性無しでエピソーム的手法により複製できるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、広範な増幅後にゲノム再配列が検出されなかった。アデノウイルスは、その細胞周期段階とは無関係に、事実上全ての上皮細胞に感染することができる。
【０１３９】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作のしやすさ、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染性により、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なｃｉｓエレメントである１００〜２００塩基対逆方向反復（ITR）を含有する。
【０１４０】
アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、又は少なくとも条件付き欠損であるという要件以外、アデノウイルスベクターの性質は、本発明を首尾良く実施するのに極めて重要とは考えられない。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型又はサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明で使用される条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための、好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス５型が、多量の生化学及び遺伝情報について知られているヒトアデノウイルスであるからであり、ベクターとしてアデノウイルスを用いるほとんどの構造で歴史的に使用されてきた。
【０１４１】
上述のように、本発明による典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を持たないことになる。したがって、Ｅ１コード配列が除去される位置で、問題の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入するのに最も都合が良くなる。しかし、アデノウイルス配列内の構造の挿入位置は、本発明では重要でない。問題の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって記述されるように、Ｅ３置換ベクターの欠失Ｅ３領域の代わりに、ヘルパー細胞系もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域で挿入されてもよい。
【０１４２】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子の発現（Levreroら、1991; Gomez-Foixら、1992）及びワクチン開発（Grunhaus及びHorwitz、1992; Graham及びPrevec、1991）で使用した。最近の動物研究では、組換えアデノウイルスを遺伝子療法に使用できることが示唆された（Stratford-Perricaudet及びPerricaudet、1991; Stratford-Perricaudetら、1990; Richら、1993）。組換えアデノウイルスを種々の組織に投与する研究は、気管注入（Rosenfeldら、1991; Rosenfeldら、1992）、筋肉注射（Ragotら、1993）、抹消静脈注射（Herz及びGerard、1993）、及び脳への定位接種（Le Gal La Salleら、1993）を含む。
【０１４３】
レトロウイルスベクターは、細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させるのにも適している。レトロウイルスは、そのＲＮＡを、逆転写のプロセスによって感染細胞内で二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする、一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Coffin、1990）。次いで得られたＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を誘導する。組込みは、受容細胞及びその後継でのウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子の上流で見出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含有する。２つの長い末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの５’及び３’末端に存在する。これらの配列は、強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組込みも必要とする（Coffin、1990）。
【０１４４】
レトロウイルスベクターを構成するために、問題の遺伝子をコードする核酸を、あるウイルス配列の位置でウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系が構成される（Mannら、1983）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、この細胞系に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージすることが可能になり、次いで培地に分泌される（Nicolas及びRubenstein、1988; Temin、1986; Mannら、1983）。次いで組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、任意選択により濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、広く様々な細胞型に感染することができる。しかし、組込み及び安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。
【０１４５】
その他のウイルスベクターは、本発明で発現構造として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988; Baichwal及びSugden、1986; Couparら、1988）アデノ随伴ウイルス（AAV）（Ridgeway、1988; Baichwal及びSugden、1986; Hermonat及びMuzycska、1984）、及びヘルペスウイルスなどウイルスから得られたベクターを使用してもよい。これらのベクターは、様々な哺乳類細胞に関していくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989; Ridgeway、1988; Baichwal及びSugden、1986; Couparら、1988; Horwichら、1990）。
【０１４６】
センス又はアンチセンス遺伝子構造の発現を行うために、発現構造を細胞に送達しなければならない。この送達は、細胞系を形質転換する実験室手順のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいはある疾患状態の治療のようにｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで実現してもよい。送達のための１つの機構は、ウイルス完成を介するものであり、発現構造が感染性ウイルス粒子内にカプシド形成される。
【０１４７】
発現構造を培養哺乳類細胞内に移動させるためのいくつかの非ウイルス的方法も、本発明によって企図される。これらの方法は、リン酸カルシウム沈殿（Graham及びVan Der Eb、1973; Chen及びOkayama、1987; Rippeら、1990）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal、1985）、電気穿孔法（Tur-Kaspaら、1986; Potterら、1984）、直接微量注入（Harland and Weintraub, 1985）、ＤＮＡ−負荷リポソーム（Nicolau及びSene、1982; Fraleyら、1979）、及びリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Fechheimerら、1987）、高速微粒子銃を使用した遺伝子照射（Yangら、1990）、及び受容体媒介性形質移入（Wu及びWu、1987; Wu及びWu, 1988）を含む。これら技法のいくつかは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの使用で首尾良く適応させることができる。
【０１４８】
発現構造が細胞内に送達されると、問題の遺伝子をコードする核酸を様々な部位に位置付け、発現させることができる。ある実施形態では、遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。この組込みは、同族組換え（遺伝子置換）を介した同種の位置及び向きであってもよく、あるいはランダムな非特異的位置に組み込んでもよい（遺伝子増加）。さらに別の実施形態では、核酸を、ＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞内で安定に維持することができる。そのような核酸セグメント又は「エピソーム」は、宿主細胞周期とは無関係に、あるいは同調して、維持及び複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構造を細胞にどのように送達するか、及び細胞内で核酸がどこに残っているかは、用いられる発現構造のタイプに依存する。
【０１４９】
本発明のさらに別の実施形態では、発現構造は、裸の組換えＤＮＡ又はプラスミドからのみなる。この構造の移動は、細胞膜を物理的に、あるいは化学的に透過可能にする上述の方法のいずれかによって行うことができる。これは、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの移動に適用可能であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用にも適用することができる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、リン酸カルシウム沈殿物の形をとるポリオーマウイルスＤＮＡを、成体及び新生マウスの肝臓及び脾臓に首尾良く注入し、活発なウイルス複製及び急性感染を実証した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ及びＮｅｓｈｉｆ（１９８６）も、リン酸カルシウム沈殿プラスミドの直接腹腔内注射の結果、トランスフェクトされた遺伝子が発現したことを実証した。問題の遺伝子をコードするＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで同様の手法で移動させることができ、かつ遺伝子産物を発現できることも考えられる。
【０１５０】
裸のＤＮＡ発現構造を細胞に移動させるための、本発明のさらに別の実施形態では、粒子衝突を行ってもよい。この方法は、ＤＮＡコーティングされた微小発射物を高速に加速させて、細胞膜を穿孔させ、死滅させることなく細胞に進入することができる能力に依存する（Kleinら、1987）。小粒子を加速させるためのいくつかの機器が、開発されてきた。そのような１つの機器は、電流を発生させるのに高電圧放電を利用し、それによって動力を供給する（Yangら、1990）。使用される微小発射物は、タングステンや金のビーズなど、生物学的に不活性な物質からなる。
【０１５１】
ラット及びマウスの肝臓、皮膚、及び筋組織を含めた選択された器官に、ｉｎ  ｖｉｖｏで衝撃を与えた（Yangら、1990; Zeleninら、1991）。これは、銃と標的器官との間で任意の介在組織を無くすため、即ちｅｘ  ｖｉｖｏ処置のため、組織又は細胞の外科的曝露を必要とし得る。この場合も、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達されてもよく、依然として本発明により組み込むことができる。
【０１５２】
本発明のその他の実施形態では、発現構造をリポソームに閉じ込めてもよい。リポソームは、リン脂質２重層膜及び内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。これらのリポソームは、リン脂質が過剰な水溶液に懸濁したときに自発的に形成される。脂質成分は、閉構造の形成の前に自己再配列し、水を閉じ込め、脂質２重層の間に溶質を溶解する（Ghosh及びBachhawat、1991）。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も企図される。
【０１５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、リポソーム媒介性核酸送達及び外来ＤＮＡの発現は、非常に首尾良く行われた。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａ及びヘパトーマ細胞での、リポソーム媒介性送達及び外来ＤＮＡの発現の実現可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注射後にラットで首尾良く行われるリポソーム媒介性遺伝子移動を実現した。
【０１５４】
本発明のある実施形態では、リポソームを赤血球凝集ウイルス（HVJ）と複合させてもよい。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソーム被包ＤＮＡの細胞進入を促進させることが示された（Kanedaら、1989）。その他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合し、あるいは併せて用いることができる（Katoら、1991）。さらに別の実施形態では、リポソームを、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１と複合させ、あるいは併せて用いることができる。そのような発現構造が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで核酸の移動及び発現に首尾良く用いられた場合、これらの構造は本発明に適用可能である。細菌プロモーターをＤＮＡ構造に用いる場合、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含むことも望ましくなる。
【０１５５】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するのに用いることができる、その他の発現構造は、受容体媒介性送達ビヒクルである。これらのビヒクルは、ほぼ全ての真核細胞における受容体媒介性エンドサイトーシスによる、高分子の選択的摂取を利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布により、送達は、非常に特異的に行うことができる（Wu及びWu、1993）。
【０１５６】
受容体媒介性遺伝子標的ビヒクルは、一般に、２つの成分、即ち細胞受容体特異的リガンド及びＤＮＡ結合剤からなる。いくつかのリガンドを、受容体媒介性遺伝子移動のために使用した。最も詳細にわたって特徴付けられたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）（Wu及びWu、1987）及びトランスフェリン（Wagnerら、1990）である。最近、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオグリコタンパク質を遺伝子送達ビヒクルとして使用し（Ferkolら、1993; Peralesら、1994）、表皮成長因子（EGF）も、遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するのに使用した（Myers、ＥＰＯ  ０２７３０８５）。
【０１５７】
その他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含んでもよい。例えばＮｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、リポソームに組み込まれたラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドを用い、肝細胞によるインスリン遺伝子の摂取の増加が観察された。このように、特定の遺伝子をコードする核酸を、リポソームを含む、あるいは含んでいない任意の数の受容体−リガンド系によって細胞型に特異的に送達できることは、可能性のあることである。例えば、表皮成長因子（EGF）は、ＥＧＦ受容体の上方制御を示す細胞内への核酸の媒介性送達の受容体として使用することができる。マンノースは、肝細胞にマンノース受容体を向けるのに使用することができる。また、ＣＤ５（CLL）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（T細胞白血病）、及びＭＡＡ（メラノーマ）に対する抗体を、標的部分として同様に使用することができる。
【０１５８】
特定の例では、ポリヌクレオチドを陽イオン脂質と組み合わせて投与してもよい。陽イオン脂質の例には、限定するものではないがリポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＯＴＡＰが含まれる。参照により特に組み込まれるＷＯ／００７１０９６の公報は、ＤＯＴＡＰ、即ち遺伝子療法に効果的に使用することができるコレステロール又はコレステロール誘導体製剤など、種々の製剤について記述している。その他の開示は、ナノ粒子を含む種々の脂質又はリポソーム製剤と、投与方法についても論じており、これらには、限定するものではないが米国特許公開第２００３０２０３８６５号、第２００２０１５０６２６号、第２００３００３２６１５号、及び第２００４００４８７８７号が含まれ、いずれも、製剤とその他の関連する核酸の投与及び送達形態を及びその他の関連する投与態様を開示する程度まで、参照により特に組み込まれているものである。粒子を形成するのに使用される方法も、それらの態様に関して参照により組み込まれている米国特許第５，８４４，１０７号、第５，８７７，３０２号、第６，００８，３３６号、第６，０７７，８３５号、第５，９７２，９０１号、第６，２００，８０１号、及び第５，９７２，９００号に開示されている。
【０１５９】
ある実施形態では、遺伝子移動は、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件下でより容易に行うことができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法は、動物から細胞を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に核酸を送達し、次いで修飾した細胞を元の動物に戻すことを指す。この療法では、動物からの組織／器官の外科的除去、又は細胞及び組織の１次培養を行う。
【０１６０】
薬物製剤及び対象への投与経路
本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬又は作動薬を含む医薬品組成物も包含する。臨床的用途が企図される場合、医薬品組成物は、意図される用途に適した形で調製されることになる。一般に、この調製では、本質的に発熱物質が無く、それと共にヒト又は動物に有害となり得るその他の不純物が無い、組成物が調製される。
【０１６１】
高分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、及び水中油エマルジョンやミセル、混合ミセル、リポソームなどの脂質をベースにした系などのコロイド分散系は、マイクロＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害薬の送達ビヒクルとして、又は特定のマイクロＲＮＡを発現する構造として、使用してもよい。本発明の核酸を心筋及び骨格筋組織に送達するの適した市販の脂肪エマルジョンには、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、及びその他同様の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（即ち、人工膜ベシクル）である。そのような系の調製及び使用は、当技術分野で周知である。例示的な製剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，９８１，５０５号、第６，２１７，９００号、第６，３８３，５１２号、第５，７８３，５６５号、第７，２０２，２２７号、第６，３７９，９６５号、第６，１２７，１７０号、第５，８３７，５３３号、第６，７４７，０１４号、及びＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。
【０１６２】
一般に、送達ビヒクルを安定にし、標的細胞による摂取を可能にする、適切な塩及び緩衝液を用いることが望まれる。緩衝液は、組換え細胞が対象に導入されるときにも用いられることになる。本発明の水性組成物は、医薬品として許容される担体又は水性媒体に溶解あるいは分散させた、阻害薬であるポリヌクレオチド又はｍｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（例えば、リポソーム又はその他の複合体又は発現ベクター）又は細胞を含む、有効量の送達ビヒクルを含む。「医薬品として許容される」又は「薬理学的に許容される」という文言は、動物又はヒトに投与したときに、有害な、アレルギー性の、又はその他の不適当な反応をもたらさない分子の部分及び組成物を指す。本明細書で使用される「医薬品として許容される担体」には、ヒトへの投与に適した医薬品などの、医薬品の配合に使用するのに適切な、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌薬、等張及び吸収遅延薬などが含まれる。医薬品として活性な物質にそのような媒体及び薬剤を使用することは、当技術分野で周知である。任意の従来の培地又は薬剤が本発明の活性成分に適合しない範囲を除き、治療組成物に使用することが企図される。組成物のベクター又は細胞を不活性にしないことを条件に、追加の活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０１６３】
本発明の活性組成物は、古典的な医薬品調製物を含んでもよい。本発明によるこれら組成物の投与は、その投与経路を介して標的組織が利用可能である限り、任意の一般的な経路を介するものであってもよい。この経路には、経口、経鼻、又は経頬が含まれる。あるいは投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射によるもの、又は心組織への直接注射によるものであってもよい。ｍｉＲＮＡ阻害薬を含む医薬品組成物又はｍｉＲＮＡ配列を含む発現構造は、カテーテルシステムによって、又は治療薬を心臓に送達するために冠状動脈循環を分離するシステムによって、投与してもよい。治療薬を心臓及び冠状血管構造に送達するための様々なカテーテルシステムは、当技術分野で知られている。本発明での使用に適したカテーテルをベースにした送達方法又は冠状動脈分離法の、いくつかの非限定的な例は、参照によりその全体が本明細書に全て組み込まれている米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６．９５３，４６６号、ＷＯ  ２００５／０８２４４０、ＷＯ  ２００６／０８９３４０、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、及び米国特許公開第２００７／００６０９０７号に開示されている。そのような組成物は、通常、上述のように医薬品として許容される組成物として投与されることになる。
【０１６４】
活性化合物は、非経口的に、あるいは腹腔内から投与してもよい。例示として、遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合して調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、また油中で調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止する防腐剤を含有する。
【０１６５】
注射での使用又はカテーテル送達に適した医薬品形態には、例えば、滅菌水性溶液又は分散液と、滅菌注射液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。一般にこれら調製物は、容易に注射することができる可能性が存在する程度まで、滅菌されかつ流体である。調製物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有してもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、また分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物の動作の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、等張薬、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましくなる。注射組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤の組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンで使用することによって、行うことができる。
【０１６６】
滅菌注射液は、活性化合物を適切な量で、所望の任意のその他の成分（例えば、上記にて列挙されたもの）と共に溶媒に組み込み、その後、滅菌濾過することによって調製してもよい。一般に分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び所望のその他の成分、例えば上記にて列挙されたものを含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法には、（１種又は複数の）活性成分と、任意の追加の所望の成分であって先に滅菌濾過されたその溶液からの成分との粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥技法が含まれる。
【０１６７】
本発明の組成物は、一般に、天然、あるいは塩の形で配合してもよい。医薬品として許容される塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸など）由来の酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第２鉄）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、及びプロカインなど）から得ることもできる。
【０１６８】
配合したら、溶液は、投薬製剤に適合する手法で、かつ治療上有効になるような量で、投与することが好ましい。この製剤は、注射液や薬物放出カプセルなどの様々な剤形で、容易に投与することができる。例えば、水溶液での非経口投与では、この溶液は一般に、適切に緩衝され、液体希釈液はまず、例えば十分な生理食塩液又はグルコースで等張的にされる。そのような水溶液を、例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に使用してもよい。好ましくは、滅菌水性媒体は、特に本発明の開示に照らして、当業者に知られているように用いられる。例示として、単回用量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入流体１０００ｍｌに添加し、あるいは提案される輸液部位で注射してもよい（例えば、「Remingon's Pharmaceutical Sciences」第15版、第1035〜1038頁及び1570〜1580頁参照）。投薬量のいくらかの変更は、治療がなされる対象の状態に応じて必ず行われることになる。投薬に責任がある者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ生物学的製剤基準室（FDA Office of Biologics standards）によって求められる滅菌性、発熱原性、全体的な安全性、及び純度の標準を満たすべきである。
【０１６９】
本明細書に記述される組成物のいずれかを、キットに含めてもよい。非限定的な例では、個々のｍｉＲＮＡはキットに含まれる。キットはさらに、水と、二本鎖のｍｉＲＮＡのハイブリッド形成を促進させるハイブリッド形成緩衝液とを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、標的ｍｉＲＮＡの機能を阻害するための１種又は複数のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。キットは、細胞へのｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ阻害薬の送達を促進させる１種又は複数の形質移入試薬を含んでもよい。
【０１７０】
キットの構成要素は、水性媒体で、あるいは凍結乾燥形態で包装してもよい。キットの容器手段は、一般に、成分を入れることができ、好ましくは適切に一定分量を採取することができる、少なくとも１種のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその他の容器手段を含むことになる。複数の構成要素がキット内にある場合（標識試薬及び標識を一緒に包装してもよい。）、キットは一般に、追加の成分を別々に入れることができる第２、第３、又はその他の追加の容器を含有することになる。しかし、成分の様々な組合せをバイアルに入れてもよい。本発明のキットは、典型的には、核酸を入れる手段と、市販のため密に閉じ込めた任意のその他の試薬容器も含むことになる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出又はブロー成型されたプラスチック容器を含んでもよい。
【０１７１】
キットの成分が１種及び／又は複数の液体溶液で提供される場合、その液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。
【０１７２】
しかし、キットの成分は、（１種又は複数の）乾燥粉末として提供してもよい。試薬及び／又は成分を乾燥粉末として提供する場合、この粉末は、適切な溶媒を添加することによって元に戻すことができる。溶媒は、別の容器手段で提供してもよいと考えられる。
【０１７３】
容器手段は、一般に、核酸製剤が入れられる、好ましくは適切に分配される、少なくとも１種のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、及び／又はその他の容器手段を含むことになる。キットは、滅菌した、医薬品として許容される緩衝液及び／又はその他の希釈液を入れるための、第２の容器手段を含んでもよい。
【０１７４】
本発明のキットは、典型的には、例えば所望のバイアルが保持される射出及び／又はブロー成型されたプラスチック容器など、市販のために密に閉じ込めたバイアルを入れるための手段も含むことになる。
【０１７５】
そのようなキットは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ阻害薬であるオリゴヌクレオチドを保存又は維持し、あるいはそれらの分解を防止する、成分を含んでもよい。そのような成分は、ＲＮアーゼを含まなくてもよく、又はＲＮアーゼから保護するものであってもよい。そのようなキットは、一般に、適切な手段で、個々の試薬又は溶液のそれぞれに合わせた全く異なる容器を含むことになる。
【０１７６】
キットは、キットの成分を用いるための、ならびにこのキットに含まれない任意のその他の試薬を使用するための、取扱指示書も含むことになる。取扱指示書は、実施することができる変形例を含んでもよい。キットは、非経口又はカテーテル投与などの様々な投与経路によってｍｉＲＮＡ作動薬又は拮抗薬を投与するための、用具又は機器を含んでもよい。
【０１７７】
そのような試薬は、本発明のキットの実施形態であることが企図される。しかし、そのようなキットは、上記にて特定された特定の品目に限定されず、ｍｉＲＮＡの取扱い又は特徴付けで使用される任意の試薬を含んでもよい。
【０１７８】
モジュレーターを特定するための方法
本発明はさらに、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターを特定するための方法を含む。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの特定された阻害薬は、心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞の予防又は治療又は回復で有用である。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの特定された作動薬は、筋骨格系障害の治療又は予防に有用である。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターは、本発明の方法により心臓障害及び／又は筋骨格系障害を治療するための医薬品組成物に含めてもよい。
【０１７９】
これらのアッセイは、候補物質の大きなライブラリーのランダムスクリーニングを含んでもよく、あるいはこのアッセイは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は機能をより容易に阻害し、あるいは高めやすくすると考えられる構造的属性に配慮して選択された、特定の種類の化合物に焦点を当てるために使用してもよい。
【０１８０】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターを特定するには、一般に、候補物質の存在下及び不在下でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの機能を決定することになる。例えば、その方法は一般に、
（ａ）候補物質を提供する工程と、
（ｂ）候補物質とｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂとを混合する工程と、
（ｃ）ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を測定する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の活性を、候補物質の不在下での活性と比較する工程と
を含み、測定した活性同士の差から、候補物質が確かにｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターであることが示される。
アッセイは、単離された細胞、器官、又は生きている生物で実施してもよい。
【０１８１】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現の評価は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現レベルの評価を含んでもよい。当業者なら、例えばノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲを含めたＲＮＡ発現レベルの様々な評価方法に精通しているであろう。ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現の評価は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性の評価を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性の評価は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂによって調節される遺伝子の発現又は活性の評価を含む。ｍｉｒ−４９９によって調節された遺伝子には、例えば、β−ミオシン重鎖及び速骨格筋タンパク質遺伝子、例えばトロポニンＩ２、トロポニンＴ３、ミオシン軽鎖、及びα骨格アクチンが含まれる。ｍｉＲ−２０８ｂによって調節される遺伝子には、例えば、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、ＴＨＲＡＰ１、及び速骨格筋タンパク質遺伝子が含まれる。本発明のある実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性の評価は、心臓でのα−ミオシン重鎖発現レベルとβ−ミオシン重鎖発現レベルとの比の評価を含む。その他の実施形態では、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性の評価は、骨格筋での種々のβ−ミオシン重鎖アイソフォームの発現レベルの評価を含む。当業者なら、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂによって調節された遺伝子の活性又は発現を評価する、様々な方法に精通しているであろう。そのような方法には、例えば、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、又はウェスタンブロット法が含まれる。
【０１８２】
当然ながら、本発明の全てのスクリーニング法は、有効な候補を見出すことができないという事実にも関わらずそれ自体が有用であることが理解されよう。本発明は、それらを見出す方法だけでなく、そのような候補をスクリーニングするための方法を提供する。
【０１８３】
本明細書で使用される「候補物質」という用語は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのβ−ＭＨＣ−調節態様を潜在的にモジュレートできる任意の分子を指す。典型的には、様々な商業的供給源から、有用な化合物の同定を「強力に推し進める」目的で、有用な薬物の基本的基準を満たすと考えられる、分子ライブラリーを獲得することになる。コンビナトリアル発生ライブラリー（例えば、アンタゴmirライブラリー）を含めたそのようなライブラリーのスクリーニングは、多数の関連（及び非関連）化合物を活性に関してスクリーニングする、迅速で効率的な方法である。コンビナトリアル手法は、活性だが通常なら望ましくない化合物をモデルにした第２、第３、及び第４世代化合物の生成による、潜在的な薬物の迅速な発展にも向いている。本発明の方法によりスクリーニングすることができる候補物質の非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子である。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターは、ｍｉＲ−２０８など、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの上流レギュレーターの作動薬又は拮抗薬であってもよい。
【０１８４】
実行するのに素早く安価で容易なアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。そのようなアッセイは、一般に単離された分子を使用し、素早くかつ大量に実行することができ、それによって短時間で得ることが可能で情報量が増大する。試験管、プレート、皿、及びディップスティックやビーズなどのその他の面を含めた様々な容器を、アッセイの実行に使用することができる。
【０１８５】
化合物のハイスループットスクリーニングの技法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ８４／０３５６４に記載されている。多数の小アンタゴｍｉｒ化合物は、プラスチックのピンやいくつかのその他の面などの固体基板上で合成してもよい。そのような分子は、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂにハイブリダイズする能力について、素早くスクリーニングすることができる。
【０１８６】
本発明は、化合物が細胞内でｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性及び発現を変化させる能力に関するスクリーニングも企図する。骨格筋細胞由来のものを含めた様々な細胞系は、この目的に向けて特に設計製作された細胞も含めてそのようなスクリーニングアッセイで利用することができる。１次心臓細胞も、Ｈ９Ｃ２細胞系で可能であるように、使用することができる。
【０１８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでは、特定の欠陥を有するように、あるいは生体内の種々の細胞に到達し作用するという候補物質の能力の測定に使用することができるマーカーを保持するように設計製作された、トランスジェニック動物を含めた心疾患又は筋骨格系疾患の様々な動物モデルを使用する。それらのサイズ、取扱いの容易さ、それらの生理機能及び遺伝子構造に関する情報により、マウスは、特にトランスジェニックに関して好ましい実施形態である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、及びサル（チンパンジー、テナガザル、及びヒヒ）を含めたその他の動物も同様に適している。阻害薬のアッセイは、これらの種のいずれかから得られた動物モデルを使用して実施してもよい。
【０１８８】
試験化合物による動物の治療では、適切な形をとる化合物を動物に投与する。投与は、臨床目的で利用可能な任意の経路によって行われることになる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の有効性の決定では、限定するものではないが肥大シグナル伝達経路及び肥大の身体的症状の変化を含めた様々な異なる基準を用いてもよい。また、毒性及び用量応答の測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｃｙｔｏアッセイの場合よりも有意義な手法で、動物で行うことができる。
【０１８９】
一実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを、心筋及び／又は骨格筋細胞に投与する工程を含む、心筋及び／又は骨格筋収縮性を調節する方法を提供する。別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを、心臓細胞に投与する工程を含む、心収縮タンパク質遺伝子発現を調節する方法が提供される。別の実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性のモジュレーターを、骨格筋細胞に投与する工程を含む、骨格筋収縮タンパク質遺伝子発現を調節する方法が提供される。さらに別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８の発現又は活性のモジュレーターを、骨格筋細胞に投与する工程を含む、骨格筋細胞の線維型スイッチを誘導する方法を提供する。モジュレーターは、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性の作動薬又は拮抗薬であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲβ、ミオスタチン、及びＳｏｘ  ６の発現は、細胞をｍｉＲ−４９９阻害薬に接触させることによって、細胞内で増加する。その他の実施形態では、ＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲβ、ミオスタチン、及びＳｏｘ  ６の発現は、細胞をｍｉＲ−４９９作動薬に接触させることによって、細胞内で減少する。別の実施形態では、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、及びＴＨＲＡＰ１の発現は、細胞をｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬に接触させることによって、細胞内で増加する。さらに別の実施形態では、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、及びＴＨＲＡＰ１の発現は、細胞をｍｉＲ−２０８ｂ作動薬に接触させることによって、細胞内で減少する。
【０１９０】
本発明のある実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性の阻害薬を、心臓細胞に投与する工程を含む、心臓細胞でのβ−ＭＨＣ発現を減少させる方法が提供される。本発明のその他の実施形態では、内因性ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を増加させる工程、又は外因性ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを心臓細胞に投与する工程を含む、心臓細胞でのβ−ＭＨＣ発現を上昇させる方法が提供される。本発明の一実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性の阻害薬を心臓細胞に投与する工程を含む、心臓細胞での速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を増加させる方法が提供される。本発明の別の実施形態では、内因性ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を増加させる工程、又は外因性ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを心臓細胞に投与する工程を含む、心臓細胞での速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を減少させる方法が提供される。本発明の方法により増加又は減少させることができる速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の例には、限定するものではないがトロポニンＩ２、トロポニンＴ３、ミオシン軽鎖、又はα骨格アクチンが含まれる。
【０１９１】
一実施形態では、本発明は、心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を有する対象を特定する工程と、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬を対象に投与する工程とを含む、その必要がある対象の病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療する方法を提供する。本発明のある実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ阻害薬は、（ａ）細胞を候補物質に接触させる工程と、（ｂ）ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の活性又は発現を、候補物質の不在下での活性又は発現と比較する工程とを含む方法によって特定することができ、候補物質の不在下での細胞内の活性又は発現と比較して、候補物質に接触させた細胞内でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現が減少した状態は、候補物質がｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬であることを示している。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明は、筋骨格系障害を有する、あるいは筋骨格系障害を発症する危険性がある対象を特定する工程と、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ作動薬を対象に投与する工程とを含む、その必要がある対象の筋骨格系障害を治療する方法を提供する。本発明のある実施形態では、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ作動薬は、（ａ）細胞を候補物質に接触させる工程と、（ｂ）ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の活性又は発現を、候補物質の不在下での活性又は発現と比較する工程とを含む方法によって特定することができ、候補物質の不在下での細胞内の活性又は発現と比較して、候補物質に接触させた細胞内でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現が増加した状態は、候補物質がｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬であることを示している。
【０１９３】
トランスジェニック動物
本発明の特定の実施形態は、機能的ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂ対立遺伝子の一方又は両方を欠くトランスジェニック動物を提供する。また、誘導性の組織選択的又は構成的プロモーターの制御下でｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂを発現するトランスジェニック動物、そのような動物から得られる組換え細胞系、及びトランスジェニック胚は、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂが心筋細胞の発生及び分裂と病的な心臓肥大及び心不全の発症で演ずる、正確な役割を決定するのに役立てることができる。さらに、これらのトランスジェニック動物は心臓の発生に洞察を提供するかもしれない。核酸をコードする誘導性の、あるいは抑制可能なｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの使用は、過剰に調節された、あるいは調節されていない発現のモデルを提供する。また、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂに関して「ノックアウト」されたトランスジェニック動物も、一方又は両方の対立遺伝子において、企図される。
【０１９４】
一般的な実施形態では、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子の発現を可能にする手法でゲノムに所与のトランス遺伝子を組み込むことにより生成される。トランスジェニック動物を生成する方法は、一般に、Ｗａｇｎｅｒ及びＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号; 参照により本明細書に組み込まれている）及びＢｒｉｎｓｔｅｒら（１９８５; 参照により本明細書に組み込まれている。）によって記述されている。
【０１９５】
典型的には、ゲノム配列によって挟まれた遺伝子を、微量注入によって受精卵に移入する。微量注入された卵を宿主のメスに移植し、後代を、トランス遺伝子の発現についてスクリーニングする。トランスジェニック動物は、限定するものではないが爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、及び魚類を含めたいくつかの動物から得た受精卵から生成してもよい。
【０１９６】
微量注入用のＤＮＡクローンは、当技術分野で知られている任意の手段によって調製することができる。例えば、標準的な技法を使用して、微量注入用のＤＮＡクローンを、細菌プラスミド配列を除去するのに適した酵素で切断し、そのＤＮＡ断片をＴＢＥ緩衝液中１％のアガロースゲル上で電気泳動することができる。ＤＮＡバンドは、臭化エチジウムで染色することによって視覚化され、発現配列を含有するバンドが切除される。次いで切除されたバンドを、ｐＨ７．０の、０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含有する透析バッグに入れる。ＤＮＡを透析バッグに電気溶離し、１：１のフェノール：クロロホルム溶液で抽出し、２体積のエタノールによって沈殿させる。ＤＮＡを、低塩緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Tris、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ  EDTA）１ｍｌ中に再溶解し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラムで精製する。カラムを最初に高塩緩衝液３ｍｌ（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Tris、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ  EDTA）でプライム処理し、その後、低塩緩衝液５ｍｌで洗浄する。ＤＮＡ溶液をカラムに３回通して、ＤＮＡをカラムマトリックスに結合する。低塩緩衝液３ｍｌで１回洗浄した後、ＤＮＡを０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶離し、２体積のエタノールにより沈殿させる。ＤＮＡ濃度を、ＵＶ分光光度計で、２６０ｎｍでの吸収により測定する。微量注入では、ＤＮＡ濃度を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４、及び０．１ｍＭ  EDTA）中３μｇ／ｍｌに調節する。微量注入用にＤＮＡを精製するその他の方法は、Ｐａｌｍｉｔｉｅｒら（１９８２）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）に記載されている。
【０１９７】
例示的な微量注入手順では、６週齢のメスのマウスに、妊馬血清性ゴナドトロピン（PMSG; Sigma）５  ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）で、それから４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG; Sigma）５  ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）で、過剰排卵を誘発させる。メスを、ｈＣＧ注射直後にオスと一緒に置く。ｈＣＧ注射から２１時間後、交尾したメスをＣ０２窒息又は頚椎脱臼によって犠牲にし、切除した卵管から胚を回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma）を含んだダルベッコリン酸緩衝生理食塩液に入れる。周囲を取り囲む卵丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。次いで前核胚を洗浄し、注射時まで、５％ＣＯ２、９５％空気の加湿雰囲気を有する３７．５℃のインキュベータ内で、０．５％ＢＳＡ（EBSS）を含有するアール平衡塩溶液に入れる。胚は、２つの細胞段階で移植することができる。
【０１９８】
ランダムな周期の成体メスマウスを、精管切除したオスと対にする。Ｃ５７ＢＬ／６又はスイスマウス又はその他同等の株を、この目的で使用することができる。レシピエントのメスを、ドナーのメスと同時に交尾させる。胚移植時に、レシピエントのメスを、体重１ｇ当たり２．５％のアバーチン０．０１５ｍｌを腹腔内注射することによって、麻酔をかける。卵管を、単一正中背面切開によって露出させる。次いで切開を、卵管の直上で体壁に沿って行う。次いで卵嚢を、時計工用ピンセットで破る。移される胚を、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝整理食塩液）中に入れ、注入ピペットの先端に入れる（約１０〜１２胚）。ピペットの先端を卵管漏斗に挿入し、胚を移す。移した後、切開を２針縫うことによって閉じる。
【０１９９】
定義
本明細書で使用される「心不全」という用語は、心臓が血液を送出する能力が低下する、任意の状態を意味するのに広く使用される。その結果、うっ血及び浮腫が組織に発症する。最も頻繁に、心不全は、冠血流量の減少から生じる心筋の収縮性が低下することによって引き起こされ、しかし、心臓弁の損傷、ビタミンの欠乏、及び原発性心筋疾患を含めた多くのその他の要因が、心不全をもたらす可能性がある。心不全の正確な生理学的機構は、全体が理解されていないが、心不全は一般に、交感神経、副交感神経、及び圧受容器応答を含めた心臓の自律的な性質のいくつかの障害に関わると考えられる。「心不全の徴候」という文言は、心不全に関連した実験所見を含む、息切れ、圧痕水腫、肥大した圧痛肝、うっ血頚静脈、及び肺ラ音などの心不全に関連する続発症の全てを包含するのに広く使用される。
【０２００】
「治療」という用語又は文法上の均等物は、心不全の症状の改善及び／又は回復を包含する（即ち、心臓が血液を送出する能力）。心臓の「生理学的機能の改善」は、本明細書に記述される測定（例えば、駆出分画、短縮率、左心室内寸法、心拍数の測定）ならびに動物の生存に対する任意の影響のいずれかを使用して評価することができる。動物モデルの使用では、治療したトランスジェニック動物と未治療のトランスジェニック動物の応答を、本明細書に記述されるアッセイのいずれかを使用して比較する（さらに、治療され及び未治療の非トランスジェニック動物を、対照として含めてもよい。）。それによって、本発明のスクリーニング法で使用される心不全に関連した任意のパラメータに改善を引き起こす化合物を、治療化合物として特定することができる。
【０２０１】
「拡張型心筋症」という用語は、収縮期の収縮機能が不十分な、対称的に拡張した左心室の存在を特徴とする心不全のタイプを指し、さらに、右心室も頻繁に関与するものである。
【０２０２】
「化合物」という用語は、疾患、病気、疾病、又は身体機能の障害を治療又は予防するのに使用することができる、化学的部分、医薬品、及び薬物などを指す。化合物は、知られており及び潜在的な治療化合物の両方を含む。化合物は、本発明のスクリーニング法を使用したスクリーニングによって、治療的であると決定することができる。「知られている治療化合物」は、そのような治療に効果的であることが示されている（例えば、動物試験又はヒトへの投与による過去の経験を通して）治療化合物を指す。言い換えれば、知られている治療化合物は、心不全の治療に有効な化合物に限定されない。
【０２０３】
本明細書で使用される「心臓肥大」という用語は、成人の心筋細胞が肥大成長を通してストレスに応答するプロセスを指す。そのような成長は、細胞分裂無しでの細胞サイズの増大と、力の発生を最大限にするための、細胞内での追加のサルコメアのアセンブルと、胎児心臓遺伝子プログラムの活性化を特徴とする。心臓肥大は、罹患及び死亡の高い危険性をしばしば伴い、したがって、心臓肥大の分子機構の理解を目標にした研究は、人間の健康に著しい影響を及ぼす可能性がある。
【０２０４】
本明細書で使用される「モジュレート」という用語は、生物学的活性の変化又は変更を指す。モジュレーションは、タンパク質活性の増加又は減少、キナーゼ活性の変化、結合特性の変化、又はタンパク質もしくは問題のその他の構造に関連した生物学的、機能的、もしくは免疫学的な性質の任意のその他の変化であってもよい。「モジュレーター」という用語は、上述の生物学的活性を変化させる、あるいは変更することが可能な任意の分子又は化合物を指す。
【０２０５】
「β−アドレナリン受容体拮抗薬」という用語は、ベータ（β）型のアドレナリン受容体（即ち、カテコールアミン、特にノレピネフリンに応答するアドレナリン作動系の受容体）を、部分的に、あるいは完全に遮断することが可能な化合物又は化学的実体を指す。いくつかのβ−アドレナリン受容体拮抗薬は、ある受容体サブタイプ（一般に、β１）に対し、ある程度の特異性を示し；そのような拮抗薬を、「β１−特異的アドレナリン受容体拮抗薬」及び「β２−特異的アドレナリン受容体拮抗薬」と呼ぶ。「β−アドレナリン受容体拮抗薬」という用語は、選択的及び非選択的な拮抗薬である化合物を指す。β−アドレナリン受容体拮抗薬の例には、限定するものではないがアセブトロール、アテノロール、ブトキサミン、カルテオロール、エスモロール、ラベトロール、メトプロロール、ナドロール、ペンブトロール、プロパノロール、及びチモロールが含まれる。知られているβ−アドレナリン受容体拮抗薬の誘導体の使用は、本発明の方法に包含される。実際、β−アドレナリン受容体拮抗薬として機能的に振る舞う任意の化合物は、本発明の方法に包含される。
【０２０６】
「アンギオテンシン変換酵素阻害薬」又は「ＡＣＥ阻害薬」という用語は、レニン−アンギオテンシン系で比較的不活性なアンギオテンシンＩから活性なアンギオテンシンＩＩへの変換に関与する酵素を、部分的に、あるいは完全に阻害することが可能な化合物又は化学的実体を指す。さらにＡＣＥ阻害薬は、ブラジキニンの分解を同時に阻害し、ＡＣＥ阻害薬の抗高血圧作用を著しく高める可能性がある。ＡＣＥ阻害薬の例には、限定するものではないがベナゼプリル、カプトプリル、エナロプリル、フォシノプリル、リシノプリル、キアプリル、及びラミプリルが含まれる。知られているＡＣＥ阻害薬の誘導体の使用は、本発明の方法により包含される。実際、ＡＣＥ阻害薬として機能的に振る舞う任意の化合物は、本発明の方法に包含される。
【０２０７】
本明細書で使用される「遺伝子型」という用語は、生物の実際の遺伝子構成を指し、一方、「表現型」は、個体によって示される物理的な特徴を指す。さらに、「表現型」は、ゲノムの選択的発現の結果である（即ち、細胞歴の発現であり、細胞外環境に対するその応答である。）。実際、ヒトゲノムは、推定３００００〜３５０００遺伝子を含有する。各細胞型では、これら遺伝子のごくわずかな割合（即ち、１０〜１５％）が発現する。
【０２０８】
特許請求の範囲及び／又は明細書で「含む（comprising）」という用語と併せて使用するときの、「ａ」又は「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は複数」の意味とも一致している。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆の場合もできると考えられる。さらに、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を実現するのに使用することができる。本出願の全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するのに用いられる機器又は方法に関して誤差の標準偏差を含むことを示すのに使用される。特許請求の範囲での「又は」という用語の使用は、代替物のみ指すことを明示しない限り、あるいは代替物が相互に排他的であることを明示しない限り、「及び／又は」を意味するのに使用されるが、この開示は、代替物のみと「及び／又は」を指すという定義を支持する。
【０２０９】
本明細書及び（１つ又は複数の）請求項で使用される「含む（comprising）」（及び「含む（comprise）」や「含む（comprises）」などのcomprisingの任意の形）、「有する（having）」（及び「有する（have）」や「有する（has）」などのhavingの任意の形）、「含む（including）」（及び「含む（includes）」や「含む（include）」などのincludingの任意の形）、又は「含有する（containing）」（及び「含有する（contains）」や「含有する（contain）」などのcontainingの任意の形）は、包括的又は制約の無い形であり、追加の飲用されていない要素又は方法工程を排除するものではない。
【０２１０】
セクションの見出しを、再検討を容易にするために本出願に挿入したが、そのような見出しは、実施形態の部分と解釈すべきではない。
【０２１１】
以下の実施例を、本発明の様々な態様をさらに例示するために含める。当業者なら、以下に示す実施例に開示される技法は、本発明の実施に際して十分に機能する本発明者により発見された技法及び／又は組成物を表すものであり、したがってその実施のための好ましい態様を構成すると見なすことができると、解釈すべきである。しかし当業者なら、本発明の開示に照らして、多くの変更を開示された特定の実施形態に行うことができ、それでも本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様の、あるいは類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【０２１２】
ｍｉＲ−２０８を、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内にコードする（図１Ａ）。α−ＭＨＣと同様に、ｍｉＲ−２０８を、心臓において特異的に発現し、肺においてわずかに発現する（図１Ｂ）。ｍｉＲ−２０８を、別個の転写産物として転写するのではなく、α−ＭＨＣのｐｒｅ−ｍＲＮＡの外側に処理する。しかし、興味深いことに、ｍｉＲ−２０８は、少なくとも１４日の著しく長い半減期を示し、その結果α−ＭＨＣのｍＲＮＡの発現が下方制御された場合でも、機能を発揮できる。マウスにおけるｍｉＲ−２０８の遺伝的欠失は、明白な表現型の誘導に失敗したが、２月齢の野生型及びｍｉＲ−２０８−／−動物由来の心臓についてのマイクロアレイ分析により、多数の速骨格筋収縮性タンパク質遺伝子の顕著な発現をもたらすｍｉＲ−２０８の除去を明らかにし、速骨格筋収縮性タンパク質遺伝子は通常は心臓において発現しない。したがって、これらの結果は、通常の状態下でｍｉＲ−２０８は、単独の心臓特異的ＭＨＣ遺伝子と共発現し、心臓における骨格筋遺伝子の発現を抑制することにより、心筋細胞の同一性を維持することを示唆する。
【０２１３】
ｍｉＲ−２０８の最も注目に値する機能が、心臓のストレスに対するｍｉＲ−２０８ヌルマウスの異常応答によって明らかになった（van Rooij、Science 2007）。胸部大動脈狭窄による圧負荷又は心臓の病理的リモデリングを起動するカルシウム／カルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンによるシグナル伝達に応答して、ｍｉＲ−２０８ヌルマウスは、実質的には心筋細胞の肥大又は線維症がなく、β−ＭＨＣの発現を上方制御できないことを示した（図６〜８）。対照的に、ＡＮＦ及びＢＮＰをコードするストレス応答遺伝子などの他のストレス応答遺伝子は、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において強く誘導され、ｍｉＲ−２０８が、心臓ストレス応答の他のファセットから離れることができる、β−ＭＨＣの発現の調節に特異的に関与することを実証した。
【０２１４】
β−ＭＨＣの発現は、甲状腺ホルモンシグナル伝達によって抑制され、甲状腺機能低下状態において上方制御される（Leungら、2006）。ｍｉＲ−２０８−／−動物は、甲状腺機能低下を誘導する、Ｔ３阻害剤のプロピルチオウラシル（PTU）投与の後に、β−ＭＨＣの発現の上方制御に対してもさらに耐性であった。しかし、興味深いことに、出生前のβ−ＭＨＣの発現は、ｍｉＲ−２０８突然変異マウスにおいて普通であり、ｍｉＲ−２０８がβ−ＭＨＣの発現の生後の制御に特異的に関与することを示し、このことはβ−ＭＨＣ遺伝子の甲状腺ホルモン応答性の獲得と一致する（図５）。
【０２１５】
ｍｉＲ−２０８の作用機構の手がかりは、ｍｉＲ−２０８−／−の心臓と甲状腺機能亢進症心臓との類似性によってもたらされ、これらは両方ともβ−ＭＨＣの発現の遮断、ストレス応答遺伝子の上方制御ならびに病的な肥大及び線維症に対する防御を表す（図６〜１０）。ｍｉＲ−２０８−／−心臓における速骨格筋遺伝子の上方制御（図２２及び２７）は、甲状腺機能亢進症状態における速骨格筋線維の誘導もまた模倣する（Weiら、2005）。
【０２１６】
これらの知見は、ｍｉＲ−２０８が、少なくとも部分的に、心臓におけるストレス応答及び甲状腺ホルモンのシグナル伝達経路の共通の構成要素の発現を抑制することによって作用することを示唆している。ｍｉＲ−２０８の最も強い予測標的の１つは、甲状腺ホルモン受容体（TR）共調節因子のＴＨＲＡＰ１であり、これは転写について正及び負の効果を発揮できる。（Pantosら、2006;Yao及びEghbali,1992；図１２）。ＴＲは、負の甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）を介して作用し、成体の心臓においてβ−ＭＨＣの発現を抑制する（Zhaoら、2005）。したがって、ｍｉＲ−２０８の不在下のＴＨＲＡＰ１の発現の増加により、β−ＭＨＣの発現に対するＴＲの抑制活性の強化が予測され、ｍｉＲ−２０８−／−の心臓におけるβ−ＭＨＣの発現の遮断と一致する。しかし、ＴＨＲＡＰ１はｍｉＲ−２０８の本物の標的であると思われ（図２５及び２６）、これらのデータは、β−ＭＨＣの発現の制御においてさらなる標的の関与の可能性を排除するものではない。
【０２１７】
β−ＭＨＣに対する微妙なシフトでも、成体の心臓の機械的性能及び効率を低下させるので、心疾患の期間のβ−ＭＨＣの発現における増加を防ぐために、ｍｉＲ−２０８の制御を利用することは治療価値があると思われる。心臓特異性及び正常な心臓の発達に対してではない、心臓ストレス応答に対するｍｉＲ−２０８の関与が、ｍｉＲ−２０８（及びその下流エフェクター）を、β−ＭＨＣのレベルを操作するための魅力的な治療標的にさせる（図１３）。
【０２１８】
材料及び方法
ノーザンブロット分析。心不全でない、あるいは心不全と診断された、無記名のヒトの左心室の心臓組織試料を、Ｇｉｌｅａｄ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ（Westminster、CO）から入手した。全ＲＮＡを、マウス、ラット及びヒトの心臓組織試料から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Gibco/BRL）を使用して単離した。ｍｉｃｒｏＲＮＡを検出するためのノーザンブロットを、前記のように実施した（１）。ローディングコントロールの役目を果たすＵ６プローブ（Ｕ６フォワード：５−ＧＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣ−３（配列番号２８）；Ｕ６リバース：５−ＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧ−３（配列番号２９））。α−ＭＨＣの発現を検出するために、成体の野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異動物の両方の心臓組織由来のＲＮＡ１０μｇを含むノーザンブロットを、５’ＵＴＲ領域及び第１エキソンの一部を包含する、α−ＭＨＣのｃＤＮＡ断片を用いて解析した。
【０２１９】
ＰＴＵの投与。甲状腺ホルモンの欠乏は、表示の期間、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｏ．（TD 97061）（Madison、WI）から購入したＰＴＵ０．１５％を補足した、ヨードを含まない餌を動物に与えることによって誘導した。
【０２２０】
マイクロアレイ及びリアルタイムＰＣＲ分析。心臓組織由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Invitrogen）を使用して単離した。マイクロアレイ分析を、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０アレイ（Affymetrix）を使用して実施した。ランダムヘキサマープライマー（Invitrogen）を用いたＲＴ−ＰＣＲを、ＲＮＡ試料について実施し、その後遺伝子のサブセットの発現を、ＡＢＩから購入したＴａｑｍａｎプローブを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。
【０２２１】
ｍｉＲ−２０８突然変異マウスの作製。ｍｉＲ−２０８標的ベクターを作製するために、ｍｉＲ−２０８コード領域の上流に伸長した０．４ｋｂの断片（５’アーム）を、ＳｃａＩＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、ｌｏｘＰ部位及びＦｒｔ−隣接ネオマイシンカセットの上流のｐＧＫｎｅｏＦ２Ｌ２ｄｔａ標的プラスミドに連結した。３．３ｋｂの断片（３’アーム）を、ＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ネオマイシン耐性及びＤｔａ陰性選択カセットの間のベクターに連結した。破壊された対立遺伝子を担持する標的ＥＳ細胞を、５’及び３’のプローブを用いてサザンブロット分析により特定した。３種のｍｉＲ−２０８標的ＥＳクローンを特定し、胚盤胞注入に使用した。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６に交配させ、突然変異対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を得た。
【０２２２】
ウェスタンブロット。ミオシンを、記載のように心臓組織から抽出した（Morkin、2000）。ＭＨＣのイソ型をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、マウスモノクロナールα−ＭＨＣ（BA-G5）（ATCC、Rockville、MD）及びβ−ＭＨＣに高度に特異的なマウスモノクロナール抗ミオシン（遅、骨格Ｍ８４２１）（Sigma、MO）を用いてウェスタンブロットを実施した。すべての横紋筋ミオシンを検出するために、汎特異的抗体（マウスモノクロナール3-48;Accurate Chemical & Scientific Corporation、NY）を使用した。ＴＨＲＡＰ１を、心臓タンパク質溶解物４００μｇから免疫沈降することによって検出した。試料を４℃において１時間予備クリアリング後、上清を、ウサギポリクロナール抗ＴＨＲＡＰ１（R.Roeder、Rockefeller Universityのご厚意により送られた）１μｌ及びプロテインＡビーズ１５μｌと共に４℃において一晩インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸した。免疫沈降したＴＨＲＡＰ１タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ウサギポリクロナール抗ＴＨＲＡＰ１を１：３０００の希釈、及び抗ウサギＩｇＧ標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを１：５０００の希釈で使用し、Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Santa Cruz）により検出して分析した。
【０２２３】
組織学的分析及びＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。組織学に使用する組織を、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｈｅｉｔ溶液中でインキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、切片にし、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）処理し、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色又は標準的技術（Krenz及びRobbins、2004）によりｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションした。３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブを、Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔキット（Amersham）を使用して作製した。シグナルを、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤く疑似カラー化した。
【０２２４】
経胸壁心エコー検査。心臓機能及び心臓体積を、断層心エコーにより覚醒マウスにおいて、Ｖｉｎｇｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（GE Vingmed Ultrasound、Horten、Norway）及び１１．５−ＭＨｚのリニアアレイ変換器を使用して評価した。Ｍモード心エコー図を使用して、拡張末期及び収縮末期の前壁厚及び後壁厚を測定した。左室（LV）内径（LVID）を、拡張期（LVIDd）又は収縮期（LVIDs）のいずれかにおける最も大きな前後径として測定した。データを、単一観察者による盲検により、マウスの遺伝子型に対して分析した。ＬＶの短縮率（FS）を、以下の式に従って計算した。：ＦＳ（％）＝［（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）／ＬＶＩＤｄ］×１００。
【０２２５】
遺伝子導入マウスの作製。対象のｍｉＲＮＡに隣接するマウスのゲノム断片を、α−ＭＨＣ及びヒトＧＨポリ（ａ）＋シグナルを含む、心臓特異的発現プラスミドにサブクローン化した（Kiriazis及びKranias、2000）。ゲノムＤＮＡをマウスの尾の生検から単離し、ヒトＧＨポリ（ａ）＋シグナルに特異的なプライマーを使用してＰＣＲにより分析した。
【０２２６】
ＬａｃＺ及びＭＣＫ遺伝子導入マウスの作製。ｍｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の心筋及び骨格筋の発現に関与するシス調節エレメントを探索するために、マウスｍｙｈ７ｂ遺伝子の０．８Ｋｂのゲノム断片をｌａｃＺレポーター遺伝子の上流のｈｓｐ６８の基本プロモーターと融合し、Ｆ０遺伝子導入マウスの胚における発現に関して試験した。遺伝子導入マウスの作製のために、構築体をＳａｌＩで消化し、ベクター配列を除去した。ＤＮＡ断片を、ＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラム（Qiagen、MD）を使用して精製し、Ｂ６Ｃ３Ｆ１雌のマウス由来の受精卵に注入し、前記のように偽妊娠したＩＣＲマウスに移植した（Lienら、1999）。胚を回収し、β−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。筋クレアチンキナーゼ（MCK）遺伝子由来の筋特異的エンハンサーの調節下で、ｍｉＲ−４９９の構造的活性型を発現する遺伝子導入マウスは、他の所に記載する。（Nayaら、（2000）J. Biol. Chem.、Vol.275:4545-4548）。ゲノムＤＮＡをマウスの尾の生検から単離しヒトＧＨポリ（ａ）＋シグナルに特異的なプライマーを使用してＰＣＲにより分析した。
【０２２７】
プラスミド及び形質移入アッセイ。ｍｉＲ−２０８コード領域を包含する３０５ｂｐのゲノム断片をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＭＶ６に連結した。全ネズミＴＨＲＡＰ１−ＵＴＲを包含する１ｋｂの断片を、ＰＣＲ増幅し、ＨＡ−タグ化ｐＣＭＶ６発現構築体及びホタルルシフェラーゼ（f-luc）レポーター構築体（pMIR-REPORTTm、Ambion）に連結した。ＵＣＧＵＣＵＵＡ  ｍｉＲ−２０８のシード結合配列の突然変異体を、ＰＣＲに基づく突然変異生成を介して構築した。
【０２２８】
（実施例１）
ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−４９９の発現に必要である。
心臓におけるｍｉＲ−２０８の作用機構をさらに探求するために、本発明者らは、野生型及びｍｉＲ−２０８ヌルマウス由来の心臓におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現パターンを、マイクロアレイ分析により明確にした。突然変異体の心臓において上方制御及び下方制御されるいくつかのｍｉｃｒｏＲＮＡの中で、本発明者らは、ｍｉＲ−４９９が、正常な心臓において非常に豊富であるが、ｍｉＲ−２０８突然変異体においてバックグラウンドレベルを超えて発現しなかったことを発見した。これらの知見は、ノーザンブロットにより確認した（図１４）。ｍｉＲ−４９９遺伝子のゲノムの位置の分析は、ｍｉＲ−４９９遺伝子のゲノムが、α−ＭＨＣ遺伝子の相同体であるＭｙｈ７ｂ遺伝子の２０番目のイントロン内に含まれることを示した（図１５）。ｍｙｈ７ｂに関するＲＴ−ＰＣＲが、宿主遺伝子のｍＲＮＡが、ｍｉＲ−２０８の不在下で用量依存的に無効になることを示すので、ｍｉＲ−２０８は、Ｍｙｈ７ｂを制御し、その結果ｍｉＲ−４９９の転写レベルの発現を制御すると思われる（図１４）。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子は、脊椎動物において保存され、心筋及び遅骨格筋（例えば、ヒラメ筋）だけにおいて発現する（図１６Ａ）。ｍｉＲ−４９９に関するこの発現パターンは、ｍｉＲ−４９９に関するリアルタイムＰＣＲ分析により確認した（図１６Ｂ）。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子の３’末端を対象とするプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、このミオシンが心臓及び体節においてＥＩ０．５と同様に早く発現したことを示した（図１６Ｃ）。ｍｉＲ−２０８の遺伝子欠失は、ｍｉＲ−４９９の心臓発現を特異的に阻害し、骨格筋の発現は無傷のままである（図１６Ｄ）。これらのデータは、ｍｉＲ−２０８がさらなるミオシンのＭｙｈ７ｂの起動に必要であり、Ｍｙｈ７ｂは関連ｍｉＲ−４９９を生み出す。さらに、ｍｉＲ−４９９は心臓肥大期間に下方制御される（図１７）。
【０２２９】
（実施例２）
ＭＥＦ２は、心筋及び骨格筋においてｍｉＲ−４９９の発現を制御する。
Ｍｙｈ７遺伝子の５’隣接領域内に、本発明者らは、生物種間に保存された潜在的ＭＥＦ２の共通配列を特定した。この配列は、ゲル移動度シフトアッセイにおいてＭＥＦ２につよく結合し（図３７Ａ）、この配列の突然変異は、結合（図３７Ａ）及びＭＥＦ２によるルシフェラーゼレポーターの転写活性化（図３７Ｂ）の両方を無効にする。Ｍｙｈ７遺伝子のプロモーター領域を、ｌａｃＺレポーターに融合し、遺伝子導入マウスを作製した。図３７Ｃに示すように、このゲノム領域は、Ｅ１２．５において心臓で特異的な直接ｌａｃＺ発現に十分であった。生後の心臓において、ｌａｃＺの染色が心室においてのみ観察され、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと一致する（データ非掲載）。ＭＥＦ２部位の突然変異は、ｌａｃＺトランス遺伝子の発現を完全に除去した（図３７Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルについてのノーザンブロット分析はＭＥＦ２に対して感受性であるｍｉＲ−４９９の発現もまた示した。ＭＥＦ２Ｄの心臓特異的過剰発現はｍｉＲ−４９９の発現の増加をもたらすが、ＭＥＦ２Ｃ及びＤ両方の心臓での欠失は、ｍｉＲ−４９９の発現の減少を起こした（図３７Ｄ）。ＭＥＦ２のＭｙｈ７ｂのプロモーターとの直接結合は、Ｍｙｈ７ｂ及びｍｉＲ−４９９のｉｎ  ｖｉｖｏの発現に必要である。
【０２３０】
ＭＥＦ２部位を、保存Ｅボックス配列（CANNTG）に並列し、これらはＭＥＦ２により骨格筋遺伝子の発現を起動するｂＨＬＨタンパク質のＭｙｏＤファミリーのメンバーに対する結合部位としての役目を果たす。実際に、ＭｙｏＤを、普遍的ｂＨＬＨタンパク質Ｅ１２と一緒にプロモーター由来のＥボックスに結合した。この配列の突然変異は、骨格筋におけるｌａｃＺトランス遺伝子の発現を妨げるが、心臓における発現には影響しなかった。
【０２３１】
（実施例３）
ｍｉＲ−４９９のための標的の特定
ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９の間の配列相同性、及びｍｉＲ−２０８の遺伝子破壊が、速骨格筋遺伝子に特異的な強い誘導及び心臓におけるβ−ＭＨＣの抑制をもたらすことを実証する本発明者らの先のデータを得、ｍｉＲ−４９９は、骨格筋において同等の機能を有し、線維型の優勢な調節因子として作用できると思われる。ｍｉＲ−４９９の発現及びその宿主転写産物は、筋原性転写因子のＭＥＦ２により制御され、ＭＥＦ２は遅線維遺伝子の発現及び筋持久性の陽性調節因子である。本発明者らはｍｉＲ−４９９の線維型の制御は、線維型の制御に関与するｍｉＲ−４９９の標的遺伝子に依存すると思われることを示唆する。
【０２３２】
ＭｉＲ−２０８はｍｉＲ−４９９に対して高度に相同性であり、両方のｍｉｃｒｏＲＮＡがＭｈｃ遺伝子のイントロンによってコードされるという注目に値する事実は、それらが共通の制御機構を共有していることを示唆する。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現に配列特異的な方法で負に影響するので、相同性の高さが、ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９が標的遺伝子中の重複によって同等の機能を発揮する可能性を増す。本発明者らは、ｍｉＲ−４９９の標的の役割を果たすと思われる、ＭＨＣ発現の転写調節因子を特定した。これらの調節因子は、ｍｉＲ−４９９の発現が、心臓においてｍｉＲ−２０８によって調節され、ｍｉＲ−２０８のノックダウンがｍｉＲ−４９９の発現を除去することをもまた示している。
【０２３３】
本発明者らの先のデータが、ｍｉＲ−２０８の遺伝子破壊が、心臓において速骨格筋遺伝子に特異的な強い誘導をもたらすことを実証したので、ｍｉＲ−４９９は骨格筋において同等の機能を有し、線維型の主要な調節因子として作用できると思われる。この仮説に一致して、この転写産物のプロモーター分析は、ｍｉＲ−４９９の発現及びその宿主転写産物が、筋原性転写因子のＭＥＦ２により制御され、ＭＥＦ２は骨格筋線維型及び遅線維遺伝子の発現の中心的調節因子であることを示す。本発明者らは、
ＭＥＦ２活性が、筋持久性を促進し、長時間の運動後の筋肉疲労を防ぐことを示し、ＭＥＦ２のこれらの作用が、少なくとも部分的にｍｉＲ−４９９の発現の直接活性化に依存することを示唆する（図１８）。
【０２３４】
これらのデータは、Ｍｙｈ７ｂ遺伝子のＭＥＦ２調節性発現が、遅筋及び心臓に特異的なｍｉＲＮＡのｍｉＲ−４９９をさらに誘導することを示し、ｍｉＲ−４９９は速骨格筋遺伝子プログラムの発現を下方制御する。さらに、これらのデータは、骨格筋線維型の中心的調節因子としてのｍｉＲ−４９９に関する証拠を提供する（図１９）。ＭｉＲＮＡ−４９９は、ＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲβ及びＧＤＦ８（別名ミオスタチン）を標的とすることが予測され、ＧＤＦ８（別名ミオスタチン）はミオシン発現及び筋線維型の極めて重要な調節因子として知られ、筋線維の同一性におけるｍｉＲ−４９９の機能性のエフェクターであると思われる遺伝子である（図２０）。ＴＨＲＡＰ１は、ｍｉＲ−２０８により標的とされ、甲状腺受容体シグナル伝達を制御することが以前に特定された（van Rooijら、2007）。成体骨格筋は、転写の再プログラミング能力を維持している。この特性は、免荷（NWB）ヒラメ筋において容易に観察可能であり、免荷（NWB）ヒラメ筋は遅から速への線維型移行と同時にβ−ミオシン重鎖（βMyHC）遺伝子の発現の減少を受ける。ＮＷＢ状態下のＭｙＨＣ遺伝子発現におけるこの減少は、Ｓｐ３、Ｐｕｒα及びＰｕｒβタンパク質間の相互作用によって仲介される。これらのデータは、Ｐｕｒタンパク質がＳｐ３と連携し、筋肉細胞がそれらの表現型をリモデルできる転写プログラムを制御することを実証する（Jiら、2007）。ｍｉＲ−４９９は、ＰＵＲβを直接標的とするので、線維型の制御は、ＰＵＲβを標的とすることによって仲介できる。筋肉制御に関与するさらなる標的は、ミオスタチンである。ミオスタチンは、骨格筋成長の負の調節因子として作用する、形質転換成長因子−βファミリーのメンバーである。マウスにおいて、ミオスタチン遺伝子の遺伝子破壊は、体重及び筋肉量の著しい増加をもたらす。同様に、ｍｄｘノックアウトマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのミオスタチンへの薬理学的干渉は、ジストロフィー表現型の機能的改善をもたらす（Tangら、2007）。結果として、ミオスタチンは、筋肉消耗を伴う疾患の治療のための重要な治療標的である。筋肉特異的線維型を制御するためにｍｉＲ−４９９の機能性を操作することは、筋ジストロフィーのように、臨床病理学のための広範囲にわたる影響を有しうる。さらに、これらの結果は、ｍｉＲ−４９９の発現を上昇させることによる遅線維遺伝子の発現を強化するための戦略が、インスリン感受性、耐久性及び遅線維遺伝子プログラムの他の有益な態様を拡大することを示唆する。
【０２３５】
（実施例４）
ＭｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−２０８ｂにより相殺される。
ｍｉＲ−２０８ｂはβ−ＭＨＣ（別名myh7）遺伝子内に位置し、ｍｉＲ−２０８ｂは宿主遺伝子と共発現する（図２８）。成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列は、ｍｉＲ−２０８と比較して３塩基が異なるが、同一のシード領域を有する。２種のｍｉＲＮＡとそれらの宿主遺伝子の間の相同性は、α−ＭＨＣ（myh6）及びβ−ＭＨＣを生み出すゲノム重複の結果であり得る（図２９）。ノーザンブロット分析を実施し、ｍｉＲ−２０８ｂの発現パターンを調べた。ベースライン時に、ｍｉＲ−２０８ｂはその宿主遺伝子（β-MHC）と同等の発現パターン、即ち発現はヒラメ筋、遅骨格筋において優勢に観察されるが、心臓及び速骨格筋型においてはほとんど発現が観察されない（図３０Ａ）。
【０２３６】
生後、Ｔ３シグナル伝達は、陽性Ｔ３応答エレメント（TRE）を介してα−ＭＨＣの転写を誘導するが、一方、β−ＭＨＣ遺伝子のプロモーター中の陰性ＴＲＥは、転写の抑制を仲介する（Ojamaaら、（2000）Endocrinology、Vol.141: 2139-2144）。ミオシン制御に応答したｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９（即ちmyomiR）の発現を試験するために、ラットにＰＴＵ含有の餌を２週間与え、Ｔ３シグナル伝達を遮断し、その後ＰＴＵ投与ラットにＴ３を補給し、ＰＴＵ効果を反転させた。予想通り、ＰＴＵは、α−ＭＨＣの減少及びＰＴＵに応答したβ−ＭＨＣの増加を誘導し、このことはＴ３によって反転できた（図３０Ｂ）。それほどではないが、ｍｙｈ７ｂの発現は、β−ＭＨＣの発現パターンをたどっており、ＰＴＵに応答して発現を誘導し、ＰＴＵと一緒にＴ３に応答して発現が減少した（図３０Ｂ）。ノーザンブロット分析は、ｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９は、それぞれβ−ＭＨＣ及びｍｙｈ７ｂの発現パターンを正確にたどっていたことを示す（図３１）。ＰＴＵに長く暴露するほど時間と共にｍｉＲ−２０８ｂの発現が増加するので、この増加は用量依存性であると思われる（図３２）。
【０２３７】
α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣは心臓において相殺されるので、ｍｉＲ−２０８／ｍｉＲ２０８ｂの発現は、相対的に一定レベルを維持すると思われる。マウスにおいてβ−ＭＨＣは、胚形成及び生後わずかの期間に発現される主要なＭＨＣ遺伝子であるが、α−ＭＨＣは成人期にわたって発現する。本発明者らの先のデータは、成体の心臓においてｍｉＲ−２０８がｍｉＲ−４９９の発現に必要であることを示したので、本発明者らは、ｍｉＲ−２０８ｂがｍｉＲ−２０８と置換できるかどうかを試験した。ｐ１、ｐ６及び成体の心臓おけるｍｙｏｍｉＲ関するノーザン分析は、ｍｉＲ−２０８の不在下で、ｍｉＲ−４９９が発現を維持し、同時にｍｉＲ−２０８ｂが存在することを示した（図３０Ｃ）。ｍｉＲ−２０８ｂもまたβ−ＭＨＣと同等の方法で、ミオシンのスイッチに応答するかどうかを試験するために、野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異動物の両方にＰＴＵを投与した。ＰＴＵに応答して、α−ＭＨＣの発現は、激しく抑制され、野生型の動物においてｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２０８の喪失をもたらした（星印で示した）。予想通り、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において、ｍｉＲ−４９９は完全になくなり、野生型動物においてＰＴＵに応答してわずかに誘導されただけであった。しかし、ｍｉＲ−２０８ｂはβ−ＭＨＣのようにＰＴＵにより強く誘導され、一方ｍｉＲ−２０８の不在下で、この誘導は非常にわずかであった（図３０Ｄ）。同時にこれらの結果は、ミオシン遺伝子内に位置するｍｙｏｍｉＲがミオシン遺伝子の発現レベルを制御し、したがってそれらがｍｉＲＮＡを包含することを示唆する。
【０２３８】
以前本発明者らは、心臓特異的なｍｉＲ−２０８の欠失が、ストレス刺激によるβ−ＭＨＣの発現の誘導を阻害することを示した（図８）。β−ＭＨＣの発現は、ベースラインにおいて非常に低いが、ｍｉＲ−２０８ｂに関するノーザンブロットは、ｍｉＲ−２０８の対立遺伝子の１つ又は両方の除去に対応するｍｉＲ−２０８ｂの発現の用量依存的減少を示した（図３３Ａ）。しかし、β−ＭＨＣの発現を誘導することが示されている（図９）、ｍｉＲ−２０８の遺伝子導入過剰発現はｍｉＲ−２０８ｂの発現を誘導した（図３３Ｂ）。これらのデータは、ｍｉＲ−２０８が心臓のβ−ＭＨＣの発現についての効果の上流調節因子であると思われるが、病的心臓のリモデリングは、ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの制御に起因するものであり得ることもまた暗示する（図３３Ｃ及び３４）。
【０２３９】
（実施例５）
ＭｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９は速骨格筋表現型を抑制する。
ｍｉＲ−２０８ヌルマウスの心臓における速骨格筋遺伝子の上方制御は、ｍｉＲ−４９９の遅線維特異的発現と相まって、これらのｍｉＲＮＡが速骨格筋遺伝子の発現を抑制するために機能できることを示唆した。この問題に取り組むために、ＭＣＫプロモーター及びエンハンサーの調節下で速骨格筋においてｍｉＲ−４９９を発現する遺伝子導入マウスを作製した。速線維においてｍｉＲ−４９９を発現する多数の安定な遺伝子導入系を得た（図３８Ａ）。心臓の発現と比較して、これらの遺伝子導入動物は、ヒラメ筋及び速骨格筋型において効率的にｍｉＲ−４９９を過剰発現した（図３８Ｂ）。線維型特異的遺伝子の発現の分析は、ｍｉＲ−４９９の強制発現によって、速線維が遅筋線維表現型に形質転換したことを示した。野生型及びｍｉＲ−４９９遺伝子導入動物の両方における５種すべての筋肉型に対する遺伝子発現分析は、ｍｉＲ−４９９が、ヒラメ筋、ＴＡ及びＥＤＬにおいて、β−ＭＨＣの発現を起動させるために十分である一方、ｍｉＲ−４９９は心臓、ヒラメ筋及びＥＤＬにおいて速骨格トロポニンＩ及びＴを抑制することを示した（図３８Ｃ）。これらの遺伝子導入動物の速筋線維は、それらの深い赤色により容易に特定可能であり、ミオグロビンの発現及び血管新生が高レベルであることを表していた。同様に、組織切片の異染性ＡＴＰアーゼ染色は、遺伝子導入マウスの速線維（EDL）において遅筋線維遺伝子の発現が劇的に増加したことを示した（図３８Ｄ）。
【０２４０】
ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物におけるｍｉＲ−４９９の喪失が、β−ＭＨＣ及び速骨格筋遺伝子の調節と連続して、又は並行しているかどうかを確定するために、ｍｉＲ−４９９をｍｉＲ−２０８ヌルバックグラウンドにおいて形質導入的に過剰発現させた。β−ＭＨＣに関するノーザンブロット分析及びリアルタイムＰＣＲは、ＰＴＵが、野生型（WT）動物において強力にβ−ＭＨＣ及びｍｉＲ−２０８ｂを誘導するが、ｍｉＲ−２０８突然変異動物（KO）においては誘導しなかったことを示す。しかし、遺伝子導入過剰発現によるｍｉＲ−４９９の再導入は、ｍｉＲ−２０８の不在下でβ−ＭＨＣについてのこの抑制効果を無効にする（図３８Ｅ）。さらに、ｍｉＲ−２０８の不在下で速骨格トロポニンの発現の誘導は、ｍｉＲ−４９９トランス遺伝子の存在下で抑制される（図３８Ｆ）。これらのデータは、ｍｉＲ−４９９が、遅骨格線維表現型を駆動させるために十分であり、ｍｉＲ−２０８突然変異動物においてβ−ＭＨＣ及び速骨格遺伝子についての効果に関与することを示す。
【０２４１】
ｍｉＲ−２０８ｂは遅骨格筋において発現するので、ｍｉＲ−２０８ｂが直接又はｍｉＲ−４９９の調節を介してのいずれかで、骨格筋において線維型の同一性を制御していると強く思われる。先のデータは、ｍｉＲ−２０８（miR-208bの心臓ファミリーメンバー）の心臓における除去がｍｉＲ−４９９の心臓における阻害及び速骨格筋遺伝子の上方制御をもたらすことを示した（図２２及び２７）。骨格筋からｍｉＲ−２０８ｂを除去することにより、ｍｉＲ−４９９の発現を阻害し、速骨格筋遺伝子の発現を起こし、その結果遅から速への線維型のシフトを誘導すると思われる。ｍｉＲ−２０８ｂの機能的意味を、さらに詳細に調査するために、標的戦略を設計し、マウスゲノムからｍｉＲ−２０８ｂを非常に正確に取り除いた（図３５）。ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方を取り除くためのさらなる研究もまた着手できる。骨格筋及び心筋特異的プロモーター（筋クレアチンキナーゼ（MCK））を使用したｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂ両方のための結合部位領域の骨格筋特異的過剰発現は、心筋及び骨格筋両方においてｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９を取り除くはずであり、その結果両方のｍｉＲＮＡに関してノックダウンが作製される（図３６）。
【０２４２】
（実施例６）
ｍｉＲ−２０８によるＭｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の調節
心臓において、ｍｉＲ−２０８は速骨格遺伝子の発現を抑制することによって心筋細胞の同一性の維持に関与する系の上流調節因子であり、さらに、ストレスに応答した病的リモデリングにも寄与する。ｍｉＲ−２０８は、少なくとも部分的に、さらなるｍｉＲＮＡの、ミオシン遺伝子ｍｙｈ７ｂ内に位置するｍｉＲ−４９９の発現を制御することによって関与する。ｍｉＲ−２０８は骨格筋において不在であるが、密接に関連するｍｉＲのｍｉＲ−２０８ｂが、β−ＭＨＣ転写産物から遅骨格筋において発現される。遅骨格筋線維に対するｍｉＲ−４９９の限定発現に基づき、ｍｉＲ−２０８ｂは遅骨格筋中の速線維遺伝子プログラムを抑制するためにｍｉＲ−４９９を誘導できる。しかし、本発明者らのデータは、ｍｉＲ−４９９がβ−ＭＨＣの発現に必要であり、ｍｉＲ−４９９は、β−ＭＨＣが、ｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９の活性化を介してそれ自身の発現を刺激するフィードフォワードループを生じることを示す。
【０２４３】
ｍｉＲ−２０８＋／−マウスの心臓におけるｍｉＲ−２０８の発現が５０％減少することにより、Ｍｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の発現において対応する減少をもたらし、ｍｉＲ−２０８の不在がＭｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の発現を完全に除去することは注目に値する。ｍｉＲ−２０８の発現レベルに対するＭｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９の感受性は、ｍｉＲ−２０８の標的（１つ又は複数）が正確に制御されることを示唆し、ｍｉＲＮＡは通常オン−オフスイッチではなく、遺伝子発現の優れたチューナーとして考えられているので、このことは例外的である。
【０２４４】
本発明者らは、先に、甲状腺ホルモン受容体共調節因子のＴＨＲＡＰ１を、ｍｉＲ−２０８の標的であると確定した。ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９間のシード配列中の重要な重複のため、これらのｍｉＲＮＡは重複標的を有しうる。したがって、ｍｉＲ−４９９はＴＨＲＡＰ１を制御でき、その結果β−ＭＨＣ及び速骨格遺伝子の発現を調節する。ＴＨＲＡＰ１に加えて、転写因子のＳｏｘファミリーのメンバーであるＳｏｘ６は、表現型にもまた寄与できる。骨格筋において高度に発現し、心筋及び骨格筋においてβ−ＭＨＣの発現を負に制御することで知られるＳｏｘ６は、その３’ＵＴＲ中に多数の保存ｍｉＲ−４９９結合部位を含み、筋肉遺伝子発現に対するｍｉＲ−４９９の効果の有望なメディエーターを表す。
【０２４５】
（実施例７）
ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９による心臓リモデリングの制御
ｍｉＲ−２０８の最も注目に値する機能が、心臓ストレスに対するｍｉＲ−２０８ヌルマウスの異常応答によって明らかになった（von Rooijら、（2007）Science、Vol.316:575-579）。胸部大動脈狭窄による圧負荷又はカルシニューリンによるシグナル伝達に応答して、ｍｉＲ−２０８ヌルマウスは、肥大又は線維症を実際には示さず、β−ＭＨＣの発現を上方制御できなかった。対照的に、ＡＮＦ及びＢＮＰをコードする遺伝子などの他のストレス応答遺伝子は、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において強く誘導され、ｍｉＲ−２０８がβ−ＭＨＣの発現の調節に特異的に関与することを実証しており、これらは心臓ストレス応答の他のファセットから離れることができない。本発明者らのデータは、ｍｉＲ−４９９が、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において見られる遺伝子制御効果のいくつかに関与することを示すので、ｍｉＲ−４９９突然変異動物もまた、ｍｉＲ−２０８突然変異動物のように、心臓の病的リモデリングに耐性であり得る。ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−４９９の両方の不在は、保護効果を誘導することができる。
【０２４６】
α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣは心臓において相殺されるので、ｍｉＲ−２０８／ｍｉＲ２０８ｂの発現は、相対的に一定レベルを維持すると思われる。しかし、α−ＭＨＣはマウスにおける優勢なＭＨＣのイソ型であり、β−ＭＨＣはヒトにおいて優勢であるのでｍｉＲ−２０８対ｍｉＲ−２０８ｂの相対的発現は、したがってマウス対ヒトにおいて異なる。ｍｉＲ−２０８は、マウスにおいてストレス及び甲状腺機能低下に応答した心臓のβ−ＭＨＣの発現に必要であるので、ｍｉＲ−２０８ｂは、心疾患中のβ−ＭＨＣに対するヒトのシフトにおいて重要な役割を果たすことができる。それにもかかわらず、これらのデータは、これらのｍｉＲＮＡとミオシン遺伝子との間のクロストークの密接な形態が存在するに違いないことを示している。筋肉特異的線維型を制御するための、ｍｉＲ−２０８ｂの機能性の操作は、筋ジストロフィーのように、臨床病理学のための広範囲にわたる暗示を有しうる。さらに、これらの結果は、ｍｉＲ−２０８ｂの発現を上昇させることによる遅線維遺伝子の発現を強化するための戦略が、インスリン感受性、耐久性及び遅線維遺伝子プログラムの他の有益な態様を拡大することを示唆する。
【０２４７】
本明細書に論じられ引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示され特許請求の範囲に記載される組成物及び方法の全ては、本発明の開示に照らして過度な実験を行うことなくなされかつ実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して述べてきたが、当業者なら、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される組成物及び方法と、方法の工程又は工程の順序とに、変更を加えることができることが明らかにされよう。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連しているある薬剤を、本明細書に記載される薬剤の代わりに用いることができ、それと共に同じあるいは同様の結果が実現できることが明らかにされよう。当業者に明らかなそのような類似する置換例及び変更例の全ては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内であると見なされる。
【０２４８】
参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書に記述されるものを補う例示的な手順又はその他の詳細を提供する範囲まで、参照により本明細書に特に組み込む。
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【図１】
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【図２Ａ】
2015013864.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2015013864.tif 000026
【図２１Ａ】
2015013864.tif 000027
【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含む医薬品組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015013864000001.app
【外国語明細書】
2015013864000001.pdf