(57)【要約】【課題】実際に酵素反応を行うことなく、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法、及び該方法を用いた酵素反応に用いる非天然基質を選択する方法を提供する。【解決手段】ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する活性中心原子の位置と、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する活性中心原子の位置とに基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法に関する。【選択図】図２
2015022487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する活性中心原子の位置と、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する活性中心原子の位置とに基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項２】
前記活性中心原子が、二リン酸基に含まれるリン原子である請求項１記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項３】
前記活性中心原子が、二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子であり、
前記天然基質中に存在する活性中心原子の位置から、前記非天然基質中に存在する活性中心原子の位置までの距離が０．４Å以下である場合に、非天然基質を用いた際の酵素反応が充分に進行すると判断する請求項１又は２記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項４】
前記活性中心原子が、二リン酸基に含まれるα末端側のリン原子であり、
前記天然基質中に存在する活性中心原子の位置から、前記非天然基質中に存在する活性中心原子の位置までの距離が０．７Å以下である場合に、非天然基質を用いた際の酵素反応が充分に進行すると判断する請求項１〜３のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項５】
前記天然基質が下記式（Ｘ）で表されるアリル性二リン酸であり、前記非天然基質が下記式（Ｘ）で表され、下記式（Ｘ）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが他の原子又は原子団により置換されているアリル性二リン酸誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【化１】
2015022487.tif 000018
（式（Ｘ）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【請求項６】
前記アリル性二リン酸誘導体が、下記式（Ｘ−１）で表されるアリル性二リン酸であり、下記式（Ｘ−１）中のＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが他の原子又は原子団により置換され、下記式（Ｘ−１）中のＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は他の原子又は原子団により置換されていない請求項１〜５のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【化２】
2015022487.tif 000019
（式（Ｘ−１）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【請求項７】
前記酵素反応が、前記非天然基質にイソペンテニル二リン酸が結合する反応である請求項１〜６のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項８】
前記酵素がプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である請求項１〜７のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項９】
ドッキングシミュレーションを計算するソフトがドッキングシミュレーションソフトＧＯＬＤである請求項１〜８のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法を用いて、酵素反応に用いる非天然基質を選択する方法。
【請求項１１】
前記非天然基質がアリル性二リン酸誘導体である請求項１０に記載の酵素反応に用いる非天然基質を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法、及び該方法を用いた酵素反応に用いる非天然基質を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛋白質の構造解析に、コンピューターを用いた構造シミュレーションが取り入れられてきている。蛋白質の３次元構造の決定などが、コンピューターを用いて行なわれており、Ｘ線結晶解析により決定された３次元構造データからなるデータベースや、ホモロジーモデリング等で決定した３次元構造データからなるデータベースが構築されている。蛋白質の３次元構造は、これらのデータベースから容易に取得することが出来る。
【０００３】
蛋白質の３次元構造データを利用および解析して、蛋白質立体構造構築の原理や、蛋白質の作用メカニズムなどの研究が進んでいるところである。蛋白質の３次元構造データを利用した解析として、蛋白質と低分子化合物であるリガンドとのドッキングシミュレーションが挙げられる。これらのシミュレーションに関連するソフトウェア群は複数開発されており、一般的に利用可能なレベルになっている（非特許文献１〜３）。その結果、容易に蛋白質構造シミュレーションを研究に用いることが可能になってきた。
【０００４】
ドッキングシミュレーションは、蛋白質とリガンドとの結合能の予測や、化合物ライブラリーから薬剤候補化合物を探索するスクリーニングなどに利用されている。
【０００５】
蛋白質には生体内で種々の化学反応を触媒する酵素が含まれる。そして、蛋白質自体の構造や、触媒対象である基質に応じて、酵素の活性レベルが変化することが知られている。そのため、特定の蛋白質の特定の基質に対する酵素活性について情報を得たい場合は、実際に酵素反応を行なって、酵素活性を測定する必要があり、労力と時間がかかってしまうという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｕｅｎ  Ｎ，  Ｐｅｉｔｓｃｈ  ＭＣ：  ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ：  Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９７，  １８：２７１４−２７２３
【非特許文献２】ＤｅＬａｎｏ，  Ｗ．  Ｌ．  Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．  （２００８）  ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ．，
【非特許文献３】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  （ｍｏｅ），  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．  Ｍｏｔｒｅａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記課題を解決し、実際に酵素反応を行うことなく、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法、及び該方法を用いた酵素反応に用いる非天然基質を選択する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように、ドッキングシミュレーションは、蛋白質とリガンドとの結合能の予測や、化合物ライブラリーから薬剤候補化合物を探索するスクリーニングなどに利用されている。これらリガンドや薬剤候補化合物は、一般的に蛋白質（酵素）の阻害剤であることが多い。一方、本発明者らは、蛋白質の阻害剤として設計した化合物であっても、酵素反応の基質として僅かに反応する場合もあることから、阻害剤として設計した化合物を非天然基質としてとらえるとの考えに想到し、ドッキングシミュレーションを、従来適用されていた蛋白質の阻害剤に対してではなく、天然基質と異なる構造を有する非天然基質に対して適用することで、非天然基質を用いた際の酵素反応（酵素活性）の予測に応用できるのではないかと考えた。この考えのもと、鋭意検討を重ねた結果、ドッキングシミュレーションにより酵素基質複合体をシミュレートし、複合体における非天然基質の活性中心原子の位置が、複合体における天然基質の活性中心原子の位置に近い場合、非天然基質を用いた際に酵素反応が進行することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する活性中心原子の位置と、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する活性中心原子の位置とに基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法に関する。
【０００９】
上記活性中心原子が、二リン酸基に含まれるリン原子であることが好ましい。
【００１０】
上記活性中心原子が、二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子であり、上記天然基質中に存在する活性中心原子の位置から、上記非天然基質中に存在する活性中心原子の位置までの距離が０．４Å以下である場合に、非天然基質を用いた際の酵素反応が充分に進行すると判断することが好ましい。
【００１１】
上記活性中心原子が、二リン酸基に含まれるα末端側のリン原子であり、上記天然基質中に存在する活性中心原子の位置から、上記非天然基質中に存在する活性中心原子の位置までの距離が０．７Å以下である場合に、非天然基質を用いた際の酵素反応が充分に進行すると判断することが好ましい。
【００１２】
上記天然基質が下記式（Ｘ）で表されるアリル性二リン酸であり、上記非天然基質が下記式（Ｘ）で表され、下記式（Ｘ）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが他の原子又は原子団により置換されているアリル性二リン酸誘導体であることが好ましい。
【化１】
2015022487.tif 000003
（式（Ｘ）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【００１３】
上記アリル性二リン酸誘導体が、下記式（Ｘ−１）で表されるアリル性二リン酸であり、下記式（Ｘ−１）中のＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが他の原子又は原子団により置換され、下記式（Ｘ−１）中のＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は他の原子又は原子団により置換されていないことが好ましい。
【化２】
2015022487.tif 000004
（式（Ｘ−１）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【００１４】
上記酵素反応が、上記非天然基質にイソペンテニル二リン酸が結合する反応であることが好ましい。
【００１５】
上記酵素がプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素であることが好ましい。
【００１６】
ドッキングシミュレーションを計算するソフトがドッキングシミュレーションソフトＧＯＬＤであることが好ましい。
【００１７】
本発明はまた、上記非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法を用いて、酵素反応に用いる非天然基質を選択する方法に関する。
【００１８】
上記非天然基質がアリル性二リン酸誘導体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する活性中心原子の位置と、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する活性中心原子の位置とに基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法であるので、実際に酵素反応を行うことなく、非天然基質を用いた際の酵素反応（酵素活性）を予測できる。そして、当該方法を用いて、酵素反応に用いる非天然基質を選択することにより、酵素反応に用いることが可能な非天然基質を効率的に選択でき、非天然基質から非天然化合物を効率的に生合成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれるＧＰＰのみを示した図である。
【図２】ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれるＧＰＰと、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と非天然基質である非天然基質Ｏ−１の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質Ｏ−１とを重ねあわせた図である。
【図３】ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれるＧＰＰと、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と非天然基質である非天然基質Ｏ−６の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質Ｏ−６とを重ねあわせた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
従来から、非天然基質を用いた際の酵素反応（酵素活性）を知るためには、非天然基質を有機合成する工程、酵素を発現させて精製する工程、合成した非天然基質と精製した酵素を用いて実際に酵素反応を行い酵素活性を測定する工程が必要であった。
【００２２】
一方、本発明の非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法は、ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する活性中心原子の位置と、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する活性中心原子の位置とに基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測する方法である。
【００２３】
すなわち、ドッキングシミュレーションの結果である酵素基質複合体中における天然基質及び非天然基質の配置情報（位置情報）に基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応を予測できるため、実際に酵素反応等を行うことなく、非天然基質を用いた際の酵素反応（酵素活性）を予測できる。そして、当該方法を用いて、酵素反応に用いる非天然基質を選択することにより、酵素反応に用いることが可能な（酵素の基質として使用可能な）非天然基質を短期間で効率的に選択でき、非天然基質（例えば、後述するアリル性二リン酸誘導体）から非天然化合物（例えば、後述する変性イソプレンオリゴマー、変性ポリイソプレン）を効率的に生合成することが可能となる。
【００２４】
本明細書において、ドッキングシミュレーションとは、ドッキングシミュレーション用ソフトウェアプログラム（ドッキングシミュレーションを計算するソフト）によりコンピューター上で２種の分子（酵素と基質）の結合状態（酵素基質複合体）を予測することを意味する。
【００２５】
本明細書において、天然基質とは、酵素の本来の基質、すなわち天然に存在する基質を意味し、例えば、酵素が後述するプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の場合、天然基質（天然開始基質）は、後述する式（Ｘ）で表されるアリル性二リン酸である。
【００２６】
本明細書において、非天然基質とは、酵素の本来の基質以外の基質を意味し、例えば、酵素が後述するプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の場合、非天然基質（非天然開始基質）は、後述するアリル性二リン酸誘導体である。
【００２７】
本明細書において、複合体とは、酵素基質複合体を意味する。
【００２８】
本明細書において、活性中心原子とは、基質における反応部位周辺に位置する原子を意味し、当業者であれば、酵素反応の種類に応じて適宜選択できる。例えば、酵素が後述するプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の場合、アリル性二リン酸の二リン酸基に含まれるリン原子である。
【００２９】
本発明を適用できる酵素としては特に限定されず、全ての酵素に対して適用できるが、以下においては、本発明の一例として、酵素がプレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である場合を例にして、詳細に説明する。
【００３０】
本明細書において、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素とは、アリル性基質（アリル性二リン酸）とイソペンテニル二リン酸との間の縮合反応を触媒し、イソプレン単位が１単位増えた新たなアリル性二リン酸を合成することにより、アリル性基質（アリル性二リン酸）に順次イソペンテニル二リン酸を連結していく反応を触媒する活性を有する酵素を意味する。
【００３１】
上記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、既に多くの存在が確認されている。
Ｚ型（新たに増えたイソプレン単位がシス構造）にプレニル鎖を伸長させる酵素としては、例えば、Ｚ−ノナプレニル二リン酸合成酵素（Ｉｓｈｉｉ,Ｋ.ｅｔ  ａｌ.,（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ,Ｊ.,２３３，７７３.）、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素(Ｔａｋａｈａｓｈｉ,Ｉ.ａｎｄ  Ｏｇｕｒａ,Ｋ.（１９８２）Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,９２,１５２７.;Ｋｅｅｎｍａｎ,Ｍ.Ｖ.ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ,Ｃ.Ｍ.（１９７４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.,１６１，３７５．)、Ｚ−ファルネシル二リン酸合成酵素（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｈｏｒｔ  （Ｃ−１５）  ｃｈａｉｎ  Ｚ−ｉｓｏｐｒｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｏｎｇ  （Ｃ−５０）  ｃｈａｉｎ  ｉｓｏｐｒｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，  Ｓｃｈｕｌｂａｃｈ，  ＭＣ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，  ２７５（３０），２２８７６−２２８８１（２０００））、デヒドロドキリキル二リン酸合成酵素（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｄｏｌｉｃｈｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  Ｅｎｄｏ，Ｓｈｏｔａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ），１６２５（３），（２００３）ｐ．２９１−２９５．）等が挙げられる。
また、Ｅ型（新たに増えたイソプレン単位がトランス構造）にプレニル鎖を伸長させる酵素としては、例えば、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素、オクタプレニル二リン酸合成酵素、デカプレニル二リン酸合成酵素等が挙げられる。
各々の酵素により生成できる最大のイソプレン単位の数、プレニル鎖の伸長方向（トランス構造、シス構造）が決まっているため、目的のイソプレン単位数やプレニル鎖の伸長方向に応じて使用する酵素を変更すればよい。なお、本発明では、イソプレンオリゴマーのプレニル鎖の伸長方向（トランス構造、シス構造）は、特に限定されない。
【００３２】
地球上に存在する全ての生物が上記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を有するが、上記プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を有する生物としては、例えば、ミクロコッカス・ルテウスＢ−Ｐ２６（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  Ｂ−Ｐ２６）、エシェヒリア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロマイセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アラビドプシス・サリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ヘベア・ブラジリエンシス（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペリプロカ・セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ  ｓｅｐｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、ＡＴＣＣ４９４２６）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｒｓ  Ｌ．）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）等が挙げられる。
【００３３】
プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素による酵素反応では、まずアリル性基質の二リン酸基が脱離し、アリルカチオン中間体が生成する。次にイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）のアリル位のプロトンが脱離するとともに縮合反応が起こり、生成物が生合成される。すなわち、この反応では、アリル性基質にイソペンテニル二リン酸が結合する。そして、この反応において、重要なのはアリル性基質の脱リン酸化であり、３位のメチル基による電子的な効果とともに、酵素のアミノ酸による効果が、脱リン酸化反応に影響を与えるものと考えられる。従って、当該酵素反応では、酵素基質複合体を形成した際に、天然基質と非天然基質とで二リン酸基の位置が大きく異なれば、当該非天然基質を基質として用いた場合、脱リン酸化は起こらず酵素反応は進行しない。一方、二リン酸基の位置が近ければ、当該非天然基質を基質として用いた場合、脱リン酸化が起こり、酵素反応は進行する。
【化３】
2015022487.tif 000005
【００３４】
このように、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素による酵素反応においては、アリル性基質の二リン酸基が重要である。そのため、ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する活性中心原子（二リン酸基に含まれる原子）の位置と、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する活性中心原子（二リン酸基に含まれる原子）の位置とが、近ければ、当該非天然基質を用いた際の酵素反応が進行する可能性が高い。従って、両者の活性中心原子（二リン酸基に含まれる原子）の位置を比較することにより、非天然基質を用いた際の酵素反応が進行するか否か、すなわち、非天然基質にイソペンテニル二リン酸が結合する酵素反応が進行するか否かを予測することができる。
【００３５】
プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の本来の基質である天然基質（天然開始基質）は、下記式（Ｘ）で表されるアリル性二リン酸である。
【化４】
2015022487.tif 000006
（式（Ｘ）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【００３６】
なお、本明細書において、ＯＰＰ（ＯＰＰ基）は、二リン酸基（下記式（Ａ−１）で表される基）を意味し、リン原子に結合する３個の水酸基を有しているが、水溶液中では、これらの水酸基の一部又は全部が解離する（例えば、下記式（Ａ−２）で表される基となる）。本明細書において、ＯＰＰは、このような水酸基の一部又は全部が解離している基も含む概念である。
【化５】
2015022487.tif 000007
【化６】
2015022487.tif 000008
【００３７】
式（Ｘ）のｎは１〜１０（好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３）の整数を表す。
【００３８】
上記式（Ｘ）で表されるアリル性二リン酸としては、例えば、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ゲラニルファルネシル二リン酸（ＧＦＰＰ）等が挙げられる。なかでも、多くのプレニルトランスフェラーゼの天然基質であるという理由から、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰが好ましい。
【００３９】
一方、非天然基質としては、特に限定されないが、上記式（Ｘ）で表されるアリル性二リン酸に対応する非天然基質としては、例えば、上記式（Ｘ）で表され、上記式（Ｘ）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが他の原子又は原子団により置換されているアリル性二リン酸誘導体であることが好ましい。
【００４０】
本発明者らは、アリル性二リン酸誘導体を開始基質として使用して、イソプレンオリゴマーやポリイソプレンを製造する方法について、既に特許出願を行なっている（特開２０１２−０３６３６０号公報）。当該特許出願について、以下において、簡単に説明する。
【００４１】
イソプレンオリゴマーやゴム分子（ポリイソプレン）を合成（生合成）する際の開始基質としては、当該使用する酵素が反応を触媒するものを使用する必要がある結果、イソプレンオリゴマーやゴム分子（ポリイソプレン）の原料として使用される開始基質の構造が限定されていた。具体的には、開始基質としては、オリゴマーを生成させるための酵素に起因する制限により、天然に存在するジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸等に限定されていた。
【００４２】
これに対し、本発明者らは、鋭意検討した結果、イソプレンオリゴマーやポリイソプレンを製造する際の開始基質として、構造の一部が変性されたファルネシル二リン酸等のアリル性二リン酸誘導体を使用することで、末端部が変性されたイソプレンオリゴマーやポリイソプレン、すなわち、末端部の構造が天然に存在するイソプレンオリゴマー、ポリイソプレンと異なるイソプレンオリゴマー、ポリイソプレン（変性イソプレンオリゴマー、変性ポリイソプレン）の製造が可能であることを見出した。
【００４３】
そして、このような変性イソプレンオリゴマーや変性ポリイソプレンは、特開２０１２−０３６３６０号公報に記載のように、実質的に分子（ゴム分子）の末端部分のみに変性が加えられており、分子（ゴム分子）が本来有する特性を阻害されることなくシリカ等の充填剤との親和性に優れ、ゴム組成物に配合することにより、従来よりも高い次元でゴム分子と充填剤が複合したゴム組成物が得られ、例えば、低発熱性、ウェットグリップ性能に優れたゴム組成物を提供できるため、空気入りタイヤの製造に用いられるタイヤ用ゴム組成物に好適に使用できる。
【００４４】
従って、本発明の方法により、酵素反応に使用可能な、すなわち、開始基質として使用した場合に酵素反応が充分に進行するアリル性二リン酸誘導体を効率的に選択できることは、非常に重要である。なお、変性イソプレンオリゴマーや変性ポリイソプレンは、特開２０１２−０３６３６０号公報に記載の方法により調製できる。
【００４５】
上記式（Ｘ）中のイソプレン単位に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）としては、例えば、水素原子、メチル基、メチレン基、炭素原子、メチン基等が挙げられる。
【００４６】
上記他の原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子、炭素原子等が挙げられる。なかでも、窒素原子は強い分子間力を有し、酵素や細胞膜との強い相互作用を生じ、更に、シリカ等の充填剤との相互作用も強いという理由から、窒素原子が好ましい。
【００４７】
上記他の原子団としては、窒素原子含有基、酸素原子含有基、硫黄原子含有基、ケイ素原子含有基、炭素原子含有基等が挙げられ、例えば、アセトキシ基、アルコキシ基（好ましくは炭素数１〜３のアルコキシ基、より好ましくはメトキシ基）、水酸基、アリール基（好ましくはフェニル基）、アルキル基（好ましくは炭素数１〜５のアルキル基、より好ましくはエチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基）、アセチル基、Ｎ−アルキル−アセトアミノ基（アルキルの炭素数は好ましくは１〜５）、アジド基等が挙げられる。
なかでも、窒素原子は強い分子間力を有し、酵素や細胞膜との強い相互作用を生じるという理由から、抗菌性に関しては、Ｎ−アルキル−アセトアミノ基（より好ましくはＮ−メチル−アセトアミノ基、Ｎ−ブチル−アセトアミノ基）、アジド基が好ましい。また、シリカ等の充填剤との相互作用が強いという理由から、アルコキシ基、水酸基が好ましい。
【００４８】
アリル性二リン酸誘導体としては、酵素基質複合体を形成した際に、天然基質と非天然基質とで二リン酸基の位置が近くなりやすいという理由から、下記式（Ｘ−１）で表されるアリル性二リン酸であり、下記式（Ｘ−１）中のＩＩ部分に含まれる原子又は原子団の少なくとも１つが他の原子又は原子団により置換され、下記式（Ｘ−１）中のＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団は他の原子又は原子団により置換されていないことがより好ましい。
【化７】
2015022487.tif 000009
（式（Ｘ−１）中、ｎは１〜１０の整数を表す。（式（Ｘ−１）中のｎは、式（Ｘ）中のｎと同一である。））
【００４９】
上記式（Ｘ−１）中のＩＩ部分、ＩＩＩ部分に含まれる原子又は原子団（置換される前の原子又は原子団）としては、上記式（Ｘ）について説明したものと同様のものが挙げられる。
【００５０】
上記他の原子又は原子団としては、上記式（Ｘ）について説明したものと同様のものが挙げられる。
【００５１】
イソプレン単位の一部が改変されたアリル性二リン酸（アリル性二リン酸誘導体）としては、例えば、下記式（Ａ）〜（Ｓ）、（Ｏ−１）〜（Ｏ−６）、（Ｐ−１）〜（Ｐ−６）で表される化合物等が挙げられる。なかでも、シリカ等の充填剤との相互作用がより強く、低発熱性、ウェットグリップ性能、耐摩耗性の向上効果が高いという理由から、下記式（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｋ）、（Ｌ）、（Ｒ）が好ましく、下記式（Ｂ）、（Ｃ）がより好ましい。また、抗菌性に優れるという理由から、下記式（Ｇ）〜（Ｑ）で表される構造が好ましく、下記式(Ｋ)、(Ｌ)、又は(Ｑ)で表される構造がより好ましい。
【化８】
2015022487.tif 000010
【化９】
2015022487.tif 000011
【化１０】
2015022487.tif 000012
【００５２】
上記式（Ａ）〜（Ｓ）、（Ｏ−１）〜（Ｏ−６）、（Ｐ−１）〜（Ｐ−６）などで表されるアリル性二リン酸誘導体は、例えば、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール等から、特開２０１２−０３６３６０号公報に記載の方法を参考に当業者であれば製造できる。
【００５３】
また、活性中心原子としては、上述のように、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素による酵素反応においては、アリル性基質（アリル性二リン酸）の二リン酸基が重要であるため、二リン酸基に含まれる原子であることが好ましく、二リン酸基に含まれるリン原子であることがより好ましい。具体的には、二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子、二リン酸基に含まれるα末端側のリン原子が好ましく、反応部位（脱離する部位）により近く、より反応に関与しているという理由から、二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子がより好ましい。
【００５４】
なお、二リン酸基において、ω末端側のリン原子、α末端側のリン原子は、それぞれ、下記式（Ａ−１）中に示すリン原子を意味する。
【化１１】
2015022487.tif 000013
【００５５】
非天然基質を用いた際の酵素反応（非天然基質にイソペンテニル二リン酸が結合する反応）が充分に進行するという理由から、ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子（Ｐ１）の位置から、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子（Ｐ１’）の位置までの距離が、好ましくは０．４Å以下、より好ましくは０．３Å以下である。
【００５６】
非天然基質を用いた際の酵素反応（非天然基質にイソペンテニル二リン酸が結合する反応）が充分に進行するという理由から、ドッキングシミュレーションにより酵素と天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる天然基質中に存在する二リン酸基に含まれるα末端側のリン原子（Ｐ２）の位置から、ドッキングシミュレーションにより酵素と非天然基質の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質中に存在する二リン酸基に含まれるα末端側のリン原子（Ｐ２’）の位置までの距離が、好ましくは０．７Å以下である。
【００５７】
なお、Ｐ１、Ｐ２の参考として、図１において、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれるＧＰＰのみを示した図を示す。
【００５８】
本発明において、ドッキングシミュレーションは、公知の方法により行うことができ、使用するドッキングシミュレーション用ソフトウェアプログラム（ドッキングシミュレーションを計算するソフト）や、パラメータの設定条件等も特に限定されない。
【００５９】
ドッキングシミュレーションを計算するソフトとしては、例えば、ドッキングシミュレーションソフトＧＯＬＤ（化学情報協会（ＪＡＩＣＩ））、ＤＯＣＫ、ＡｕｔｏＤｏｃｋ、ｍｙＰｒｅｓｔｏのｓｉｅｖｇｅｎｅ、ＴＲＩＰＯＳ社製のＦｌｅｘＳＩＳ等が挙げられる。なかでも、ＧＯＬＤのドッキングシミュレーション評価は早くから行なわれ、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２６７（３），７２７−７４８（１９９７）（Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｐ．，Ｇｌｅｎ，ＲＣ．，Ｌｅａｃｈ，ＡＲ．，Ｔａｙｌａｒ，Ｒ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ．）において、結晶解析の結果が充分に再現されることが報告され、また、ＰＤＢの３０５の蛋白質−リガンド複合体に対する検証では、７１％の厳格な合格基準であることから判断して正確であると情報公開されているという理由から、ドッキングシミュレーションソフトＧＯＬＤであることが好ましい。
【００６０】
ドッキングシミュレーションは、例えば、実施例に記載の方法により行うことができ、当業者であれば、実施例に記載の方法を参考に、対象とする酵素、天然基質、非天然基質等に応じて適宜実施可能である。
【００６１】
本発明では、ドッキングシミュレーションの結果である酵素基質複合体中における天然基質及び非天然基質の配置情報（位置情報）に基づいて、非天然基質を用いた際の酵素反応が進行するか否かを予測できるため、実際に酵素反応等を行うことなく、非天然基質を用いた際の酵素反応（酵素活性）を予測できる。そして、当該方法を用いて、酵素反応に用いる非天然基質を選択することにより、具体的には、活性中心原子の位置が天然基質と近い非天然基質を選択することにより、酵素反応に用いることが可能な（酵素の基質として使用可能な）非天然基質を短期間で効率的に選択でき、非天然基質（例えば、アリル性二リン酸誘導体）から非天然化合物（例えば、変性イソプレンオリゴマー、変性ポリイソプレン）を効率的に生合成することが可能となる。
【実施例】
【００６２】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００６３】
＜非天然基質の合成＞
特開２０１２−０３６３６０号公報に記載の方法を参考に、下記非天然基質Ｏ−１〜Ｏ−６、Ｐ−１〜Ｐ−６を合成した。
【化１２】
2015022487.tif 000014
【化１３】
2015022487.tif 000015
【００６４】
＜ドッキングシミュレーション（基質の活性中心原子間距離の測定）＞
次に、基質として、天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）と、非天然基質である非天然基質Ｏ−１〜Ｏ−６、Ｐ−１〜Ｐ−６、酵素として、以下の２種の酵素、ドッキングシミュレーションを計算するソフトとして、ドッキングシミュレーションソフトＧＯＬＤを用いて、活性中心原子間距離の測定を行った。なお、活性中心原子としては、二リン酸基に含まれるω末端側のリン原子、二リン酸基に含まれるα末端側のリン原子を選択し、上述のＰ１の位置からＰ１’の位置までの距離、Ｐ２の位置からＰ２’の位置までの距離を算出した。
【００６５】
酵素１：ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰ合成酵素）
由来：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
ＰＤＢ  ＩＤ：  ２ｑ８０    
Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．  Ｖ．  ２８１  ２２００４  ２００６          
タイトル：  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＧＧＰＰ
著者：Ｋａｖａｎａｇｈ，  Ｋ．Ｌ．，  Ｄｕｎｆｏｒｄ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｂｕｎｋｏｃｚｉ，  Ｇ．，  Ｓｍｅｅ，  Ｃ．，  Ｖｏｎｄｅｌｆｔ，  Ｆ．，  Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ，  Ｃ．，  Ｗｅｉｇｅｌｔ，  Ｊ．，  Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ａ．，  Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｍ．，  Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ，  Ｕ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  （ＳＧＣ）
【００６６】
酵素２：ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰ合成酵素）
由来：古細菌（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）
出芽酵母のＧＧＰＰ合成酵素ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｅ８Ｘを鋳型にして、Ｓｗｉｓｓ  ｍｏｄｅｌにより作成
【００６７】
（シミュレーション条件）
「ｐｒｏｔｅｉｎｓ」
初めにドッキングシミュレーションしたい酵素（例えば、対象：ＧＧＰＰ合成酵素、由来：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＰＤＢ  ＩＤ：２ｑ８０）を指定し、ＧＯＬＤ上に読み込ませた。
「ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ＆ｔａｕｔｏｍｅｒｓ」
酵素上で水素原子が付加すべきところに自動的に付加させた。酵素−基質の安定化をｓｃｏｒｅ化することにおいて、水素結合は重要な要素の１つであるため、ここで水素を付加することは必須である。
「Ｅｘｔｒａｃｔ／Ｄｅｌｅｔｅ  Ｗａｔｅｒｓ」
Ｘ線上にある水の影響について設定することが可能である。ＧＯＬＤにおいては水分子が常に動いている設定でドッキングシミュレーションをすることができないため、Ｘ線上で表示されている位置での影響しか計算を行わない。そのため、水分子は今回のドッキングシミュレーションでは必要ないと判断し、Ｄｅｌｅｔｅ  Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  Ｗａｔｅｒｓで水分子をすべて座標上から削除した。
「Ｄｅｌｅｔｅ  Ｌｉｇａｎｄｓ」
配位子もドッキングシミュレーションを行うためには不必要な存在であるため、Ｄｅｌｅｔｅ  Ｌｉｇａｎｄｓで元々のＸ線上に存在している配位子を削除した。
「Ｍｅｔａｌ」
金属の設定はｄｅｆａｕｌｔの設定で行った。
・基質側の設定
「Ｓｅｌｅｃｔ  Ｌｉｇａｎｄｓ」
実際に酵素に対してドッキングシミュレーションさせる基質を選択した。「Ａｄｄ」にて実際に基質のｍｏｌ２ファイルを選択し、ドッキングシミュレーションさせる基質を選択した。選択できる基質の数は複数可能であるがあまり多すぎるとエラーが生じてしまうため、１０個以内に収める方がよい。配位子の状態をどのようにするかを設定する部分である。
Ｆｌｉｐ  ｐｙｒａｍｉｄａｌ  Ｎ・・・ピラミッド型のＮ原子を回転させた。
Ｆｌｉｐ  ａｍｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ・・・アミド結合を回転させた。
Ｄｅｔｅｃｔ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｈ  ｂｏｎｄｓ・・・分子内の水素結合を削除した。
Ｆｌｉｐ  ｒｉｎｇ  ｃｏｒｎｅｒｓ・・・リング状の角を回転させた。
Ｍａｔｃｈ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ・・・コンフォメーションを合わせた。
以上の項目を選択した。
【００６８】
以上の設定により、基質ごとにドッキングシミュレーションを行った。そして、天然基質（ＧＰＰ）と、非天然基質の二リン酸基のリン原子間の距離（上述のＰ１の位置からＰ１’の位置までの距離、Ｐ２の位置からＰ２’の位置までの距離）を計算した。
【００６９】
図２に、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれるＧＰＰと、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と非天然基質である非天然基質Ｏ−１の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質Ｏ−１とを重ねあわせた図を示す。同様に、図３に、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれるＧＰＰと、ドッキングシミュレーションによりＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ＧＧＰＰ合成酵素と非天然基質である非天然基質Ｏ−６の複合体をシミュレートした際の該複合体に含まれる非天然基質Ｏ−６とを重ねあわせた図を示す。
【００７０】
図２、３より明らかなように、ＧＰＰと、非天然基質Ｏ−１とでは、二リン酸基が近く、ＧＰＰと、非天然基質Ｏ−６とでは、二リン酸基が遠いことが分かる。このことから、基質として、非天然基質Ｏ−１を用いた場合、酵素反応が進行することが予想されるが、基質として、非天然基質Ｏ−６を用いた場合、酵素反応が進行しないことが予想される。
【００７１】
＜酵素反応＞
次に、天然基質と、非天然基質の二リン酸基のリン原子間の距離と、実際の酵素活性との間に相関性があるか否かを確認するために、実際に酵素反応を行い酵素活性を測定した。
【００７２】
（酵素の調製）
酵素の調製には、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素が組み込まれたｐＥＴ１５ｂ（ｐＥＴ１５ｂ／ｈｕｍａｎ−ＧＧＰＳ）を用いた。なお、ｐＥＴ１５ｂ／ｈｕｍａｎ−ＧＧＰＳは、東北大学多元物質科学研究所の佐上博准教授より譲渡して頂いた。ｐＥＴ１５ｂ／ｈｕｍａｎ−ＧＧＰＳを用いてヒートショック法によってＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩培養し、形質転換株を選択した。
同様に、古細菌（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換株を作製した。なお、古細菌由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、東北大学工学部西野徳三教授より譲渡して頂いた。
【００７３】
（ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（プレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質）の生産）
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地が入った試験管に接種し、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液のうち１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ三角フラスコに接種し、３７℃で３時間振盪培養後、０．１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃で１８時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。上記で得られた湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られた上清から、ＨｉｓＴｒａｐ（アマシャム社製）を用いてゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を精製した。精製した酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製を確認した。
【００７４】
（酵素活性の測定）
精製した酵素を１０ｍｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ
塩化マグネシウム、２５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ 開始基質（天然基質であるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又は非天然基質である非天然基質Ｏ−１〜Ｏ−６、Ｐ−１〜Ｐ−６）、１ｍＭ
イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）反応液を調整し、３７℃のｗａｔｅｒ  ｂａｔｈで１時間反応させた。反応終了後、飽和食塩水１００ｍｌとペンタン５００ｍｌを加え、攪拌後、静置した。その後、上清（ペンタン層）をエバポレーションにより濃縮乾固した。その一部をＮＭＲにより構造を確認し、イソプレンオリゴマーを得た。なお、酵素活性は、ＩＰＰの減少量に基づいて算出し、ＧＰＰを用いた時の活性を１００％とした場合の相対活性として示した。相対活性が７０％以上の場合、酵素活性が充分にあると判断した。
【００７５】
ドッキングシミュレーションにより算出した、天然基質（ＧＰＰ）と、非天然基質の二リン酸基のリン原子間の距離（上述のＰ１の位置からＰ１’の位置までの距離、Ｐ２の位置からＰ２’の位置までの距離）、及び各基質を用いた場合の相対活性を表１、２に示した。なお、表１には、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を使用した場合の結果を、表２には、古細菌由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を使用した場合の結果を示した。また、相対活性が７０％以上の例を実施例、７０％未満の例を比較例として示した。
【００７６】
【表１】
2015022487.tif 000016
【００７７】
【表２】
2015022487.tif 000017
【００７８】
表１、２より、天然基質と、非天然基質の二リン酸基のリン原子間の距離と、実際の酵素活性との間に明らかな相関性が見られた。具体的には、天然基質と、非天然基質の二リン酸基のリン原子間の距離が近い場合、例えば、天然基質中に存在するＰ１から、非天然基質中に存在するＰ１’までの距離が０．４Å以下の場合、及び／又は、天然基質中に存在するＰ２から、非天然基質中に存在するＰ２’までの距離が０．７Å以下の場合、相対活性が７０％以上となり、非天然基質を用いた際の酵素反応が充分に進行する（酵素活性が充分にある）ことが明らかとなった。
【図１】
2015022487.tif 000020
【図２】
2015022487.tif 000021
【図３】
2015022487.tif 000022