(57)【要約】【課題】付加的に特別に開発されたハードウエアコンポーネント無しで、システムの充填状態または最終浸漬の時点のような環境パラメータに依存せずに、浸漬液の供給を、常に必要量が浸漬フィルム領域に存在するように制御することができるように、浸漬媒体の検出および供給制御方法をさらに発展させること。【解決手段】本発明によれば、光源のオートフォーカス信号および照射照明部６の中間画像面に配置された変調対象物６ｂの反射のうちの少なくとも一方を介して、浸漬フィルム領域１の状態が顕微鏡の検出ユニット１６またはオートフォーカス装置の検出ユニット１１において検出され、評価され、浸漬過程の変更ならびにエラー処理の目的で制御ユニットにさらに伝送される。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
とりわけ自動化された顕微鏡にて、ビームスプリッタ（１０）を介して顕微鏡光線路に入力反射される光源（９）を使用して、顕微鏡対物レンズ（２）のフロントレンズとプレパラート（４）との間で浸漬媒体を検出し、浸漬フィルム領域（１）への該浸漬媒体の供給を制御するための方法において、
該光源（９）のオートフォーカス信号および照射照明部（６）の中間画像面に配置された変調対象物（６ｂ）の反射のうちの少なくとも一方を介して、該浸漬フィルム領域（１）の状態が、該顕微鏡の検出ユニット（１６）またはオートフォーカス装置の検出ユニット（１１）において検出され、評価され、浸漬過程の変更ならびにエラー処理の目的で制御ユニットにさらに伝送される、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
・前記フロントレンズとプレパラート（４）との間に浸漬媒体が無い状態で、プレパラート支持体の底部にフォーカスする工程、
・前記オートフォーカス信号をオートフォーカス装置の後方反射として検出すること、および前記照射照明部（６）の中間画像面に配置された前記変調対象物（６ｂ）の反射を、前記検出ユニットの１つ（１１または１６）により検出することのうちの少なくとも一方を行なう工程、
・前記オートフォーカス信号および前記変調対象物（６ｂ）の反射のうちの少なくとも一方を、使用される装置のソフトウエアによって、使用される検出ユニット（１１または１６）の最大ダイナミックレンジに適合する工程、
・浸漬媒体を、前記フロントレンズと前記プレパラート（４）との間で浸漬フィルム領域（１）に供給する工程（自動浸漬）、
・前記オートフォーカス信号の強度変化を、後方反射、および前記フロントレンズと前記浸漬フィルム領域（１）の反射性境界面との間の光学的経路長の変化のうちの少なくとも一方として検出および検知すること、および前記変調対象物（６ｂ）からの反射の強度変化および尖鋭度のうちの少なくとも一方を検出および検知することのうちの少なくとも一方を行なう工程、
・前記オートフォーカス信号の強度のスケーリング、前記オートフォーカス信号の経路長変化、および前記変調対象物（６ｂ）からの反射強度のうちの少なくとも一つに依存して、前記浸漬媒体の供給を変更または停止する工程、
を特徴とする請求項１に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項３】
前記浸漬フィルム領域（１）への浸漬媒体の供給を変更する時点を、前記オートフォーカス信号の変化、経路長の変化、および前記変調対象物（６ｂ）からの反射の変化のうちの少なくとも一つに依存して調整する、ことを特徴とする請求項１または２に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項４】
前記浸漬フィルム領域（１）への浸漬媒体の供給の終了後に、空気と浸漬媒体との間の屈折率の差により引き起こされる、対物レンズに依存するシステムの焦点のずれを補正する、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項５】
前記焦点の補正後に、前記オートフォーカス装置のソフトウエアは、前記浸漬フィルム領域からの変化したオートフォーカス信号を、浸漬状態で作業する目的で、前記検出ユニットの最大ダイナミックレンジに新たに適合する、ことを特徴とする請求項４に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項６】
変化したオートフォーカス信号の標準形からの偏差および前記変調対象物（６ｂ）からの反射の偏差のうちの少なくとも一つを、浸漬状態での顕微鏡観察中に検出し、これにより浸漬過程ないし浸漬状態に補正的に介入できるようにする、ことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項７】
前記オートフォーカス信号および前記変調対象物（６ｂ）からの反射のうちの少なくとも一方に対する限界値を、前記浸漬フィルム領域（１）に浸漬媒体が無い状態での露光時間と浸漬媒体がある状態での露光時間との間で設定する、請求項１から６のいずれか一項に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項８】
前記変調対象物（６ｂ）として線形格子を使用する、ことを特徴とする請求項１、２、３、６および７のいずれか一項に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項９】
前記変調対象物（６ｂ）からの反射の強度を検出するためにフィルタキューブ（５）にあるビームスプリッタ（５ｂ）が使用され、該ビームスプリッタは、前記変調対象物（６ｂ）の照明に使用される波長において、反射率が２５％から７５％の間であり、透過と反射の和が＞９０％であるスペクトル経過を必要とする、ことを特徴とする請求項１、２、３、６、７および８のいずれか一項に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【請求項１０】
前記オートフォーカス信号の検出および前記変調対象物（６ｂ）からの反射の検出のうちの少なくとも一方は、偽光を抑圧するために空間的フィルタリングおよびフーリエフィルタリングのうちの少なくとも一方を介して行われる、ことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の浸漬媒体を検出し浸漬媒体の供給を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ自動化された顕微鏡にて、光源を備えるオートフォーカス装置を使用して、顕微鏡対物レンズのフロントレンズとプレパラートとの間で浸漬媒体を検出し浸漬フィルム領域への浸漬媒体の供給を制御するための方法に関する。ここで光源は、ビームスプリッタを介して顕微鏡光線路に入力反射される。
【背景技術】
【０００２】
現代の顕微鏡では、とりわけハイエンド分野では、光学的に高級な多数の対物レンズが、対物レンズのフロントレンズと被観察プレパラートとの間のスリットに、いわゆる浸漬媒体が充填されている場合にだけ最適に動作するように考慮されており、設計されている。この浸漬媒体の役目は、空気の光学的特性よりもガラスに類似するその光学的特性に基づき、結像の際に改善された光学的特性を提供することである。培養装置または対象物の周囲に配置された他の構成部材を備える顕微鏡の場合、この浸漬媒体を手作業で適用することは非常に面倒なことになり得る。同様に操作者は、浸漬媒体の状態を判定するのがほとんど不可能である。なぜなら浸漬媒体は、通常、見ることが非常に困難であるか、あるいは全く見えないからである。それどころか自動化された顕微鏡では、アクセスないしコントロールが完全に排除されている。なぜなら顕微鏡全体が、閉鎖されたケーシング内に存在するからである。
【０００３】
特許文献１には、顕微鏡対物レンズのレンズと、試料支持体との間に、対物レンズに固定のエレメントによって浸漬フィルムを形成する装置および方法が記載されている。ここで対物レンズに固定のエレメントは、浸漬フィルム領域を規定する。センサユニットを介して浸漬フィルム領域内の浸漬フィルムの状態が検出される。浸漬フィルムの状態に依存して、フィルム領域への浸漬の供給が制御されて行われる。この解決策の欠点は、対物レンズ固定のセンサユニットが存在することであり、このセンサユニットは顕微鏡の構造に不利に作用する。
【０００４】
さらに特許文献２には、浸漬液の検出が焦点座標の評価を介して行われる顕微鏡システムが記載されている。ここでは、浸漬液が途切れると、焦点座標が移動するという事実が利用される。なぜなら浸漬液が無いと、顕微鏡対物レンズの焦点がずれるからである。この解決策では、焦点ずれの検出が非常に面倒である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】独国特許発明第１０２００６０４２０８８号明細書
【特許文献２】特開２０１２−０９３３８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この従来技術の解決策から出発して、本発明の基礎とする課題は、この目的のために付加的に特別に開発されたハードウエアコンポーネント無しで、システムの充填状態または最終浸漬の時点のような環境パラメータに依存せずに、浸漬液の供給を、常に必要量が浸漬フィルム領域に存在するように制御することができるように、浸漬媒体の検出および供給制御方法をさらに発展させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によればこの課題は、請求項１の方法工程を備える、国際公開第２００７／１４４１９７号による顕微鏡用のオートフォーカス装置を使用した、冒頭に述べた形式の方法によって解決される。
【０００８】
有利な変形実施形態は、従属請求項２から１０に記載されている。
本発明によれば、光源のオートフォーカス信号および照射照明部の中間画像面に配置された変調対象物の反射のうちの少なくとも一方を介して、浸漬フィルム領域の状態が、顕微鏡の検出ユニットまたはオートフォーカス装置の検出ユニットにおいて検出され、評価され、浸漬過程の変更ならびにエラー処理の目的で制御ユニットにさらに伝送される。
【０００９】
詳細には以下の方法工程が行われる：
・フロントレンズとプレパラーとの間に浸漬媒体が無い状態で、プレパラート支持体の底部に好ましくはオートフォーカスする工程、
・オートフォーカス信号をオートフォーカス装置からの後方反射として検出すること、および照射照明部の中間画像面に配置された変調対象物の反射を、検出ユニットの１つにより検出することのうちの少なくとも一方を行なう工程、
・オートフォーカス信号および変調対象物からの反射のうちの少なくとも一方を、使用される装置のソフトウエアによって、使用される検出ユニットの最大ダイナミックレンジに適合する工程（スケーリング）、
・浸漬媒体を、フロントレンズとプレパラートの間の浸漬フィルム領域に供給する工程（自動浸漬）、
・オートフォーカス信号の強度変化を、後方反射、およびフロントレンズと浸漬フィルム領域の反射性境界面との間の光学的経路長の変化のうちの少なくとも一方として検出および検知すること、および変調対象物からの反射の強度変化および尖鋭度のうちの少なくとも一方を検出および検知することのうちの少なくとも一方を行なう工程、
・オートフォーカス信号の強度のスケーリング、オートフォーカス信号の経路長変化、および変調対象物からの反射強度のうちの少なくとも一つに依存して、浸漬媒体の供給を変更または停止する工程。
【００１０】
オートフォーカス信号は、光線路中に存在する、種々の物質間の境界面に依存して変化する種々の後方反射から成る。この強度変化は、「浸漬媒体が存在しない」または「浸漬が行われた」などの浸漬の種々の状態間の移行を区別するのに利用される。とりわけ、空気／ガラス移行部のオートフォーカス信号と浸漬媒体／ガラス移行部のオートフォーカス信号との差は、空気と浸漬媒体との屈折率の差が大きいため非常に大きい。
【００１１】
顕微鏡対物レンズのフロントレンズとプレパラートとの間のスリット（浸漬フィルム領域）に浸漬媒体がもたらされた後、後方反射は格段に減少する。あるいはそれどころが選択されたスケーリングにおいて完全に消失する。したがってオートフォーカス信号の強度のこの跳躍的変化は、浸漬が形成されたことの明確なサインであり、これにより供給は直接または設定された時間的オフセットの後に停止される。設定された時間内に強度の跳躍的変化が生じなければ、これはエラー観察に対する指標である。例えば浸漬システムないし搬送システムの電子的または機械的欠陥が存在し得る。技術的欠陥が存在しないことを前提にすれば、浸漬媒体の欠如を識別することもできる。
【００１２】
空気と浸漬媒体との間の屈折率の差に基づいて、システムの焦点は、光学的計算から既知の大きさだけ対物レンズに依存してずれる。
そしてシステムの焦点は、この既知の大きさだけプレパラート支持体底部に向かって後調整される。オートフォーカス装置のソフトウエアは、浸漬状態で作業することができるようにするため、今や弱いこのオートフォーカス信号を検出ユニットの最大ダイナミックレンジに再び適合する。
【００１３】
浸漬されない状態と浸漬された状態との間のオートフォーカス信号の強度差を、浸漬過程の評価のために利用することができる。
異物または気泡が浸漬フィルム領域に存在していると、これはオートフォーカス信号の標準形からの偏差を引き起こし、したがって同様に検知されることができる。浸漬媒体をさらに供給することにより、ないしは全浸漬過程を再スタートすることにより、気泡または他の異物は再び除去される。
【００１４】
反対の場合、オートフォーカスモードで、存在する浸漬の途切れを検出することもできる。なぜならこの場合もオートフォーカス信号が同様に消失するか、または格段に変化するからである。これは、システムの焦点が既知の大きさだけ再び元に戻り、その際に信号が変化するからである。プレパラート支持体底部のオートフォーカス信号を予想される箇所で監視してみると、このオートフォーカス信号は、空気／ガラス移行部の反射によって、浸漬／ガラス移行部のオートフォーカス信号よりも格段に強度が大きい。この強度の跳躍的変化も、自動露光制御部によって評価することができる。さらにソフトウエアに、露光時間の間（浸漬ありと浸漬無し）の任意の限界値を基準として設定することができる。
【００１５】
本発明の方法は、相応に装備された顕微鏡の既存のハードウエアによる自動浸漬の検出を可能にする。ハードウエア的にはさらなるセンサを後装備する必要がない。なぜなら本方法は、ソフトウエアにおいて既存のハードウエアコンポーネントを完全にシミュレートすることができるからである。
【００１６】
浸漬フィルム領域が変化する際には、オートフォーカス信号の強度の他に、顕微鏡対物レンズのフロントレンズとプレパラートとの間の光学的経路長も変化するから、浸漬媒体の浸漬フィルム領域への供給を変更する時点を、オートフォーカス信号の変化および経路長の変化のうちの少なくとも一つに依存して調整すると有利である。
【００１７】
択一的ないし補充的な、変調対象物画像の入力反射方法を考察すると、経路長の変化は、変調対象物画像の反射のデフォーカスに作用し、変調対象物が浸漬媒体の無い状態でフォーカスされた場合には反射の強度変化にも作用する。この情報は、例えば使用される格子のエッジ急峻度を介して検出し、浸漬状態を識別するために付加的にまたは単独で使用することができる。反射が再びフォーカスされると、これまで説明した方法と同じように、ここでも反射画像の強度に差が現れる。
【００１８】
照射光線路の中間画像面で格子画像の構成体が使用される場合、顕微鏡光線路のフィルタキューブにあるビームスプリッタに対しては、格子を照明するために使用される波長において反射率が可及的に２５％から７５％の間であり、透過と反射の和が＞９０％であるスペクトル経過が必要になる。そして反射の強度は、顕微鏡的検出により判定される。ここでは、偽光を抑圧するために空間的フィルタリングまたはフーリエフィルタリングを後処理として実行することもできる。
【００１９】
実施例に基づき、本発明の方法を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】国際公開第２００７／１４４９７号から公知の、顕微鏡用のオートフォーカス装置を示す図。
【図２】図１の照射照明部を示す図。
【図３】空気／ガラス移行部の高いオートフォーカス信号を示す図。
【図４】浸漬媒体／ガラス移行部の低いオートフォーカス信号を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１は、国際公開第２００７／１４４９７号から公知の、顕微鏡用のオートフォーカス装置を示す。このオートフォーカス装置によって、浸漬媒体の検出、ならびにｚ−駆動部３を備える顕微鏡対物レンズ２とプレパラート４との間で浸漬フィルム領域１への浸漬媒体の供給の制御が実行される。
【００２２】
照射・格子画像入力反射による本発明の方法をより良く理解するため、これを簡単に説明する。
ダイクロイット（Ｄｉｃｈｒｏｉｔ）としても構成することのできるフィルタキューブ５のビームスプリッタ５ｂを介して顕微鏡照明光線路が、光源６ａ、変調対象物（線形格子）６ｂおよび照射鏡筒レンズ６ｃ（図２）から成る照射照明部６から入力結合される。その際にプレパラート４は、ビームスプリッタ５ｂとダイクロイックビームスプリッタ７を介し、顕微鏡対物レンズ２を通して照明される。ビームスプリッタ５ｂの設けられたフィルタキューブ５は、この適用例では付加的に位置５ａと５ｃに選択フィルタを有する。
【００２３】
オートフォーカス装置は光変調器（透過格子）８を有し、この光変調器は、中心波長が８００ｎｍ超である赤外線ＬＥＤ光源９（ＩＲ−ＬＥＤ光源）により、反射モードのために照明される。光変調器８により形成された変調対象物は、ビームスプリッタ１０とビームスプリッタ７を介して浸漬フィルム領域１ないしプレパラート４に投影される。ｚ−移動装置および結像光学系１２を備える検出ユニット１１（カメラ）が前置されているので、光変調器８の中間画像１３が検出ユニット１１（カメラ）に結像される。ここで結像光学系１２は、同様にｚ−移動装置の設けられたオートフォーカス対物レンズから成る。透過格子として構成された光変調器８には、スリット状絞りとしてストライプ格子１４が設けられている。さらに中間画像１３には阻止フィルタ１５が前置されており、この阻止フィルタは、対応のオートフォーカススペクトル領域の光線だけが検出ユニット１１に達するようにする。
【００２４】
浸漬フィルム領域１の状態は、本発明によれば、ＩＲ−ＬＥＤ光源９のオートフォーカス信号を介してオートフォーカス装置の検出ユニットにおいて検出され、評価され、浸漬過程の変更およびエラー処理のために制御ユニットにさらに伝送される。
【００２５】
これは以下の方法工程により行われる：
・フロントレンズとプレパラート（４）との間に浸漬媒体が無い状態で、プレパラート支持体の底部に好ましくはオートフォーカスする工程、
・オートフォーカス信号をオートフォーカス装置の後方反射として検出すること、および照射照明部（６）の中間画像面に配置された変調対象物（６ｂ）の反射を、検出ユニットの１つ（１１または１６）により検出することのうちの少なくとも一方を行なう工程、
・オートフォーカス信号および変調対象物（６ｂ）からの反射のうちの少なくとも一方を、使用される装置のソフトウエアによって、使用される検出ユニット（１１または１６）の最大ダイナミックレンジに適合する工程、
・浸漬媒体を、顕微鏡対物レンズ（２）のフロントレンズとプレパラート（４）との間で浸漬フィルム領域（１）に供給する工程（自動浸漬）、
・オートフォーカス信号の強度変化を、後方反射、および顕微鏡対物レンズ（２）のフロントレンズとプレパラート底部における浸漬フィルム領域（１）の反射性境界面との間の光学的経路の変化のうちの少なくとも一方として検出および検知すること、および変調対象物（６ｂ）からの反射の強度変化および尖鋭度のうちの少なくとも一方を検出および検知することのうちの少なくとも一方を行なう工程、
・オートフォーカス信号の強度のスケーリング、オートフォーカス信号の経路長変化、および変調対象物（６ｂ）からの反射強度のうちの少なくとも一つに依存して、浸漬媒体の供給を変更または停止する工程。
【００２６】
ＩＲ−ＬＥＤ光源９から発する光が顕微鏡画像に侵入することは、検出ユニット１６の前方に配置されたブロックフィルタ５ｃ（選択フィルタ）によって阻止される。
図３と４は、浸漬フィルム領域１に存在する、種々異なる物質間の境界面に依存して変化する種々の後方反射（オートフォーカス信号）を示す。したがってこれによって、存在する浸漬状態が正確に識別される。図３は、空気／ガラス移行部の相対的に高いオートフォーカス信号を示し、図４には、浸漬媒体／ガラス移行部の格段に小さなオートフォーカス信号が示されている。
【符号の説明】
【００２７】
１…浸漬フィルム領域、２…顕微鏡対物レンズ、３…ｚ−駆動部、４…プレパラート、５…フィルタキューブ、６…照射照明部、６ｂ…変調対象物、７…ビームスプリッタ、８…光変調器、９…赤外線ＬＥＤ光源、１０…ビームスプリッタ、１１…検出ユニット、１２…結像光学系、１３…中間画像、１４…ストライプ格子、１５…阻止フィルタ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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