(57)【要約】【課題】近年、赤潮による被害が増加しており、赤潮を早期に検出できる方法が求められている。そこで、迅速且つ正確であり、赤潮プランクトンの同定が可能な、核酸増幅法による検出方法が注目されている。そこで、特異性、感度及び増幅効率に優れ、現場で容易に利用することができる核酸増幅法用のプライマーセットが求められていた。【解決手段】本発明は、赤潮プランクトンのゲノムのITS1 - 5.8 S ribosomal RNA - ITS2領域、又はMitochondrialCytochromoe C Oxidase Subunit I領域を特異的に増幅して検出可能なプライマーセット、及び、これらのプライマーセットを用いた赤潮検出方法を提供する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の１又は複数からなる赤潮検出用プライマーセット
（ａ）配列番号１に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号３に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号５に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号７に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
【請求項２】
定量的核酸増幅法に用いられるプローブを含むプライマーセットであって、以下の（ｅ）〜（ｈ）に記載の１又は複数からなる赤潮検出用プライマーセット
（ｅ）配列番号１に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号９に示されるオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、プライマーセット
（ｆ）配列番号３に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、プライマーセット
（ｇ）配列番号５に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号１１に示されるオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、プライマーセット
（ｈ）配列番号７に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号１２に示されるオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、プライマーセット
【請求項３】
LAMP法により核酸を特異的に増幅するように設計されたプライマーセットであって、以下の（ｉ）〜（ｌ）に記載の１又は複数からなる赤潮検出用プライマーセット
（ｉ）配列番号１３に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１４に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１５に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１６に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｊ）配列番号１７に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１８に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１９に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２０に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｋ）配列番号２１に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２２に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２４に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｌ）配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２６に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２７に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２８に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
【請求項４】
前記プライマーセット（ａ）〜前記プライマーセット（ｌ）のいずれかのプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が欠失、付加、又は置換されたオリゴヌクレオチドを含み、赤潮検出用プライマーセットとして機能し得る、赤潮検出用プライマーセット
【請求項５】
請求項１〜請求項４いずれか一項に記載のプライマーセットを用いて赤潮プランクトンの核酸を特異的に増幅する工程を含む、赤潮検出方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤潮を検出するためのプライマーセット、及び赤潮検出方法である。
【背景技術】
【０００２】
赤潮とは、ある特定種のプランクトンが大増殖することにより海や湖沼、河川の水が着色する現象をいう。水産養殖が盛んな地域では、赤潮の発生により、養殖魚のエラにプランクトンが詰まることや損傷することによる窒息、プランクトンの産出する毒素、プランクトンの死骸の分解による溶存酸素濃度の低下等を原因として、養殖魚が大量斃死する被害が問題となっている。
【０００３】
赤潮の原因となるプランクトンの中でも水産養殖に被害を与えるものとして、Heterosigma akashiwoや、Chattonella属等のラフィド藻類、Alexandriumu属、Karenia属、Cochlodinium属等の渦鞭毛藻類が挙げられる。これらの赤潮プランクトンは、採取された海水を顕微鏡で観察することによって調べられている。また、赤潮プランクトンの発生を高感度に検出する技術も開発されている。
【０００４】
これまでの赤潮検出技術としては、植物プランクトンセンサーを用いて出力波形のピークの高さを測定して赤潮の発生を検知する方法（特許文献１参照）、試料と接触した二枚貝類に属する貝の筋肉の活動電位の変化を測定する、赤潮等の有害浮遊生物の検出方法（特許文献２参照）、ルミノール系試薬により生じる化学発光の発光量によりスーパーオキシド及び／又は過酸化水素を放出する植物プランクトン濃度を定量する方法（特許文献３参照）、水中の赤潮の蛍光体の発光波長を測定することにより高感度で検出が可能な蛍光検出器（特許文献４参照）等が挙げられる。
【０００５】
また、赤潮の原因となるプランクトンを核酸増幅法により特異的に高感度で検出する試みが行われている（非特許文献１、及び非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−０４５０７４号公報
【特許文献２】特開２０００−０９３０３８号公報
【特許文献３】特開平１１−０７５８９３号公報
【特許文献４】特開平０８−２６１９３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ryoma Kamikawa, Yoshihiko Sako et al, “Application of a Real-timePCR Assay to a Comprehensive Method of Monitoring Harmful Algae”, MicrobesEnviron. Vol.21, 2006
【非特許文献２】Masao Adachi, “Analysis of Alexandrium (Dinophyceae) Species UsingSequences of the 5.8s Ribosomal DNA and Internal Transcribed Spacer Regions”,J. Phycol. Vol.32, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、赤潮による被害が増加しており、赤潮の発生を早期に検出できる方法が求められている。そこで、迅速且つ正確であり、赤潮プランクトンの種の同定が可能な、核酸増幅法による検出方法が注目されている。核酸増幅法では、一般的な核酸増幅用の装置や試薬を所有していればよく、プライマーセットを設計する以外には、特殊な設備を必要としないため、安価に導入することができる。
【０００９】
しかしながら、上述の非特許文献に記載のプライマーセットでは、赤潮プランクトン以外の種のプランクトンの核酸も増幅するなど、特異性に問題があった。また、増幅産物のサイズが大きいため、増幅効率が低く、迅速に検出することができなかった。そこで、特異性、感度及び増幅効率に優れ、容易に現場で導入することができる核酸増幅用のプライマーセットが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の課題を解決するため、発明者らは、赤潮プランクトンのゲノムのITS1 - 5.8 S ribosomal RNA - ITS2領域、又はMitochondrial
Cytochromoe C Oxidase Subunit I領域の一部を特異的に増幅して検出するプライマーセットを設計し、さらに、これらのプライマーセットを用いた赤潮検出方法の発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の１又は複数からなる赤潮検出用プライマーセットを提供する。
【００１２】
（ａ）配列番号１に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｂ）配列番号３に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｃ）配列番号５に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｄ）配列番号７に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
【００１３】
さらに、本発明は、定量的核酸増幅法に用いられるプローブを含むプライマーセットであって、以下の（ｅ）〜（ｈ）に記載の１又は複数からなる赤潮検出用プライマーセットを提供する。
【００１４】
（ｅ）配列番号１に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号９に示されるオリゴヌクレオチドから構成されたプローブを含む、プライマーセット
（ｆ）配列番号３に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドをから構成されたプローブを含む、プライマーセット
（ｇ）配列番号５に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号１１に示されるオリゴヌクレオチドから構成されたプローブを含む、プライマーセット
（ｈ）配列番号７に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号８に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットに加えて、配列番号１２に示されるオリゴヌクレオチドから構成されたプローブを含む、プライマーセット
【００１５】
さらに、本発明は、LAMP法により核酸を特異的に増幅するように設計されたプライマーセットであって、以下の（ｉ）〜（ｌ）に記載の１又は複数からなる赤潮検出用プライマーセットを提供する。
【００１６】
（ｉ）配列番号１３に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１４に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１５に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１６に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｊ）配列番号１７に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１８に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号１９に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２０に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｋ）配列番号２１に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２２に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２４に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｌ）配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２６に示されるオリゴヌクレオチド、配列番号２７に示されるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２８に示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
【００１７】
また、本発明は、上述のプライマーセット（ａ）〜プライマーセット（ｌ）のいずれかのプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が欠失、付加、又は置換されたオリゴヌクレオチドを含み、赤潮検出用プライマーセットとして機能し得る、赤潮検出用プライマーセットを提供する。
【００１８】
また、本発明は、上述のプライマーセットを用いて赤潮プランクトンの核酸を特異的に増幅する工程を含む赤潮検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅法では、種特異性が高いため、他のプランクトンの核酸の混入により生じる擬陽性の発生が抑えられる。また、本発明のプライマーセットは、増幅産物のサイズが１００塩基前後となるように設計されており、核酸の増幅効率が高く、迅速且つ正確な検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】定量的核酸増幅法による赤潮検出の感度を示す図である。
【図２】定量的核酸増幅法による赤潮検出の種特異性を示す図である。
【図３】LAMP法による赤潮検出の感度を示す図である。
【図４】LAMP法による赤潮検出の種特異性を示す図である。
【図５】愛南町海域におけるHeterosigma akashiwoの検出を示す図である。
【図６】愛南町海域におけるCochlodinium polykrikoidesの検出を示す図である。
【図７】愛南町海域におけるKarenia mikimotoiの検出を示す図である。
【図８】愛南町海域におけるChattonella sp.の検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、赤潮プランクトンを迅速且つ正確に検出可能なプライマーセット、及び該プライマーセットを用いた赤潮検出方法を提供する。
【００２２】
本発明のプライマーセットを用いることにより、赤潮プランクトンとして知られているHeterosigma akashiwo、Cochlodinium
polykrikoides、、Karenia  mikimotoi、Chattonella marina、Chattonella antiqua、及び、Chattonella ovataを検出することができる。より具体的には、（ａ）、（ｅ）及び（ｉ）のプライマーセットではHeterosigma akashiwoを、（ｂ）、（ｆ）及び（ｊ）のプライマーセットではCochlodinium polykrikoidesを、（ｃ）、（ｇ）及び（ｋ）のプライマーセットではKarenia  mikimotoiを、（ｄ）、（ｈ）及び（ｌ）のプライマーセットではChattonella marina、Chattonella antiqua、及びChattonella ovataを、それぞれ特異的に検出することができる。
【００２３】
本発明の、Heterosigma akashiwo、Cochlodinium
polykrikoides、及びKarenia  mikimotoiを検出するプライマーセットは、それぞれの赤潮プランクトンのゲノムのITS1 - 5.8 S ribosomal RNA - ITS2領域を標的とする。すなわち、赤潮プランクトンのITS1 - 5.8 S ribosomal RNA - ITS2領域の塩基配列を有する核酸の一部及び／又は該塩基配列に相補的な核酸の一部と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。5.8 S ribosomal RNA領域は、種特異性が高いため、特異性に優れた赤潮検出が可能である。
【００２４】
一方、（ｄ）、（ｈ）及び（ｌ）のプライマーセットは、Chattonella marina、Chattonella antiqua、及びChattonella ovataのゲノムのMitochondrial
Cytochromoe C Oxidase Subunit I領域を標的とする。Chattonella属には、上述の3種が赤潮プランクトンとして知られているが、危険性は大きく変わらないため、種を区別せずに検出することが好ましい。本発明のプライマーセットでは、上述の3種をまとめて検出することが可能である。
【００２５】
すなわち、本発明のChattonella属を検出するプライマーセットは、Chattonella属のゲノムのMitochondrial Cytochromoe C Oxidase Subunit I領域の塩基配列を有する核酸の一部及び／又は該塩基配列に相補的な核酸の一部と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。
【００２６】
ストリンジェントな条件とは、例えば、一般的な核酸増幅法に用いられる反応液の塩濃度において、温度が約５０℃〜約７０℃、好ましくは約５５℃〜約６５℃の条件等が挙げられる。
【００２７】
本発明のプライマーセットのうち、（ａ）〜（ｄ）は、一般的な核酸増幅法用に設計されたプライマーセット、（ｅ）〜（ｈ）は、定量的核酸増幅法、特にリアルタイム核酸増幅法（Real-time PCR）に用いられるプローブを含んだプライマーセット、さらに、（ｉ）〜（ｌ）は、LAMP法用に設計されたプライマーセットである。
【００２８】
本発明は、核酸増幅法により、サンプル中に含まれる赤潮プランクトンの存在／非存在の判定や、サンプル中に含まれる赤潮プランクトン数の定量、定量された赤潮プランクトンのからの危険度判定を行うことができる。サンプル中に含まれる赤潮プランクトン数の定量を行う場合には、定量的核酸増幅法が好ましく用いられる。
【００２９】
定量的核酸増幅法としては、例えば、リアルタイム核酸増幅法が挙げられる。リアルタイム核酸増幅法では、より具体的にはTaqMan（登録商標）Probe法（ロシュ社）、QProbe（登録商標）法（日鉄住金環境株式会社）、ユニバーサルQProbe（登録商標）法、インターカレーター法等が挙げられる。なかでも、TaqMan（登録商標）Probe法を好適に用いることができる。
【００３０】
TaqMan（登録商標）Probe法を用いる場合には、5’末端を蛍光色素、3’末端をクエンチャー物質で修飾した標的特異的なプローブを設計する。これをプライマーセットと同時に核酸増幅反応系に加えることにより、プローブは鋳型DNAに特異的にハイブリダイズする。DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解されるため、蛍光物質が遊離して蛍光を発する。したがって、反応液中の蛍光強度を測定することにより、増幅産物の量をリアルタイムに知ることができる。
【００３１】
本発明のプローブは、具体的には、配列番号９に示されるオリゴヌクレオチドから構成され、蛍光色素及びクエンチャー物質で修飾したプローブはHeterosigma akashiwoの検出に、配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドから構成され、蛍光色素及びクエンチャー物質で修飾したプローブはCochlodinium polykrikoidesの検出に、配列番号１１に示されるオリゴヌクレオチドから構成され、蛍光色素及びクエンチャー物質で修飾したプローブはKarenia  mikimotoiの検出に、配列番号１２に示されるオリゴヌクレオチドから構成され、蛍光色素及びクエンチャー物質で修飾したプローブはChattonella marina、Chattonella antiqua、及び、Chattonella ovataの検出に、それぞれ用いることができる。しかし、プローブを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、定量的な検出が可能であれば、これらに限定されない。
【００３２】
また、各プライマーセットを用いて核酸増幅した場合の増幅産物のサイズは、（ａ）のプライマーセットでは、127bp、（ｂ）のプライマーセットでは、100bp、（ｃ）のプライマーセットでは、99bp、（ｄ）のプライマーセットでは、143bpとなる。いずれもサイズが100bp前後であるため、効率的に増幅産物が得られ、迅速且つ正確な検出が可能となると考えられる。
【００３３】
また、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（特許第3313358号公報）とは、鎖置換反応を利用した核酸増幅法であり、4種類のプライマーが用いられる。両端にループ構造を備えた増幅産物を起点として、最終的には繰り返し配列を有する複数のサイズの増幅産物が得られる。電気泳動又は反応液の濁度により、定量的な検出が可能である。
【００３４】
LAMP法による核酸増幅では、F3、B3、FIP（Forward Inner Primer）、及びBIP（Backward Inner Primer）の4種類のプライマーが用いられる。本発明では、具体的には、Heterosigma akashiwoの検出では、F3には配列番号１３に示されるオリゴヌクレオチド、B3には配列番号１４に示されるオリゴヌクレオチド、FIPには配列番号１５に示されるオリゴヌクレオチド、BIPには、配列番号１６に示されるオリゴヌクレオチドが用いられる。また、Cochlodinium
polykrikoidesの検出では、F3には配列番号１７に示されるオリゴヌクレオチド、B3には配列番号１８に示されるオリゴヌクレオチド、FIPには配列番号１９に示されるオリゴヌクレオチド、BIPには配列番号２０に示されるオリゴヌクレオチドが用いられる。
【００３５】
Karenia  mikimotoiの検出では、F3には配列番号２１に示されるオリゴヌクレオチド、B3には配列番号２２に示されるオリゴヌクレオチド、FIPには配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチド、BIPには、配列番号２４に示されるオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、Chattonella
marina、Chattonella antiqua、及びChattonella
ovataの検出では、F3には配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチド、B3には配列番号２６に示されるオリゴヌクレオチド、FIPには配列番号２７に示されるオリゴヌクレオチド、BIPには配列番号２８に示されるオリゴヌクレオチドが用いられる。しかし、各赤潮プランクトンの検出が可能であれば、プライマーのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、これらに限定されない。
【００３６】
また、配列番号１〜配列番号２８に示したオリゴヌクレオチド以外でも、配列番号１〜配列番号２８に示したオリゴヌクレオチドの１又は複数の塩基が欠失、置換、又は付加されたオリゴヌクレオチドを含み、同等の増幅産物を生じることにより赤潮検出用プライマーセットとして機能し得るプライマーセット、及び該プライマーセットを用いた赤潮検出方法は、本発明に含まれる。
【実施例】
【００３７】
さらに、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【００３８】
実施例１．赤潮プランクトン培養株を用いた定量的核酸増幅法の検証
赤潮プランクトン培養株を用いて、定量的核酸増幅法により赤潮プランクトンの検出を行った。各赤潮プランクトンに対するプライマーセット及びTaqMan（登録商標）プローブの配列を表１に示す。反応条件は、最初の熱変性を98℃で1分間行い、96℃1秒・58℃30秒の温度変化を40サイクル行った。反応時間は全体で50分であった。
【００３９】
【表１】
2015146774.tif 000003
【００４０】
得られた結果の検出感度を図１、特異性を図２に示す。Heterosigma akashiwo、Cochlodinium
polykrikoides、及びChattonella属は0.001細胞／反応液まで、Karenia  mikimotoiは0.0001細胞／反応液まで検出が可能であった。また、Heterosigma akashiwo、Cochlodinium
polykrikoides、Karenia  mikimotoiは種特異的に検出され、さらにChattonella属の3種は、同一のプライマーセットで検出されることが確認された。
【００４１】
実施例２．赤潮プランクトン培養株を用いたLAMP法の検証
赤潮プランクトン培養株を用いて、LAMP法により赤潮プランクトンの検出を行った。各赤潮プランクトンに対するプライマーセット配列を表１に示す。反応条件は、65℃・1時間とした。
【００４２】
【表２】
2015146774.tif 000004
【００４３】
得られた結果の検出感度を図３、特異性を図４に示す。Heterosigma akashiwo、及びCochlodinium
polykrikoidesは0.01細胞／反応液まで、Karenia  mikimotoi、及びChattonella属は0.001細胞／反応液まで検出が可能であった。また、Heterosigma
akashiwo、Cochlodinium polykrikoides、Karenia  mikimotoiは種特異的に検出され、さらにChattonella属の3種は、同一のプライマーセットで検出されることが確認された。
【００４４】
実施例３．愛媛県愛南町海域における赤潮検出の実証
2012年1月から2012年9月にかけて、愛媛県愛南町の海域で定量的核酸増幅法による赤潮検出を実施した。深浦、久良、船越、福浦、御荘の5箇所で採取された海水50mLを遠心して得られた沈殿物からDNAを抽出し、TaqMan（登録商標）プローブを含んだプライマーセットにより定量的核酸増幅を行った。プライマー、及びプローブは表１に示した配列のオリゴヌクレオチドを用いた。反応条件は、最初の熱変性を98℃で1分間行い、96℃1秒・58℃30秒の温度変化を40サイクル行った。反応時間は全体で50分であった。
【００４５】
各赤潮プランクトンの5箇所での検出結果と、水深2mの水温を、図５〜図８に示す。海水サンプルから各赤潮プランクトンを高感度に検出することに成功した。
【図１】
2015146774.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
2015146774.tif 000008
【図５】
2015146774.tif 000009
【図６】
2015146774.tif 000010
【図７】
2015146774.tif 000011
【図８】
2015146774.tif 000012
【配列表】
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