(57)【要約】      （修正有）【課題】マスト細胞の活性の抑制、ヒスタミンの産生抑制、血管透過性増大の抑制さらに、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの改善により抗アレルギー作用を有する新規菌株並びにその菌体を含有する飲料、食品及び抗アレルギー剤を提供する。【解決手段】モンゴルの乳製品由来のラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する新規乳酸菌株、及びこの菌株を含有する飲料、食品、有効成分として含有する抗アレルギー剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）０６ＣＣ２（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−１６５６）に属する乳酸菌株。
【請求項２】
請求項１記載の菌株を含有する飲料。
【請求項３】
請求項１記載の菌株を含有する食品。
【請求項４】
請求項１記載の菌株を有効成分として含有する抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アレルギー作用を有する菌株並びにその菌体を含有する飲料、食品及び抗アレルギー剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎やアレルギー喘息のようなＩ型アレルギー疾患の患者数は世界中で増加する傾向にある。アレルギー性疾患の治療は、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤及びステロイド等を用いた薬物療法が一般的である。しかし、最近では、予防医学の観点から、代替医療としてアレルギーに効果のある機能性食品やサプリメントの研究開発がさかんに行われている。
【０００３】
とくに、腸管免疫に作用する乳酸菌が、アレルギー疾患の予防及び治療に効果があるとして注目されている。（例えば、特許文献１〜３参照。）。腸管免疫とは、経口的に取り込まれた病原微生物等を排除する免疫機構であり、過剰反応する腸管免疫を抑制できれば、アレルギー性疾患の予防及び治療に貢献できると考えられている。
【０００４】
例えば、高抗アレルギー活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｌ．）ｐａｒａｃａｓｅｉＫＷ３１１０株、及びその変異株を有効成分とする抗アレルギー機能を有する飲食物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮することが開示されている（特許文献４参照。）。また、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）に属する乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する乳酸菌、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される乳酸菌を有効成分として含む抗アレルギー剤は、Ｉ型アレルギーの発症に関わるＩｇＥ抗体量を減少させてアレルギー体質を改善することが開示されている（特許文献５参照）。また、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株と、この菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する抗アレルギー剤が開示されている（特許文献６参照。）。また米由来の抗アレルギー作用を有する乳酸菌と、この乳酸菌を含む米を材料とする食品組成物及び医薬品組成物なども提案されている（特許文献７参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献２】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献３】特開２００５−１３９１６０号公報
【特許文献４】特許第３５８５４８７号公報
【特許文献５】特許第４２１２８３８号公報
【特許文献６】特許第５０６６０９１号公報
【特許文献７】特許第５１５０７２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したＩ型アレルギー症状は、粘膜マスト細胞もしくは好塩基球の活性化によって引き起こされるとされている。マスト細胞表面に多価抗体として結合したＩｇＥはヒスタミン、ロイコトリエンやプロスタグランジンのような多くの化学伝達物質を放出させる引き金であり、これら化学伝達物質がＩ型アレルギー症状を引き起こすことが知られている。ＩｇＥ抗体はＩ型アレルギー反応において重要な役割を果たしており、ＩｇＥ抗体はＢ細胞が分化したＩｇＥ産生プラズマ細胞から分泌される。ＩｇＥの産生はＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの歪みが引き起こすものと考えられている。それ故、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの調節がＩ型アレルギー軽減治療の一つと考えられている。
【０００７】
乳酸菌は世界中で極めて多様な食品に利用されており、特に乳製品に多く使用されている。いくつかの乳酸菌はプロバイオティクスと呼ばれており、それらは宿主に健康効果をもたらす生きた微生物のことである。いくつかの乳酸菌株は免疫調整やＩ型アレルギー症状を軽減させる能力を持っている。これらのメカニズムは、血清中のＩｇＥレベルの減少がＴｈ２優位からＴｈ１優位へとＴｈ１／Ｔｈ２バランスのシフトに起因しているとされている。とりわけプロバイオティクスがＴｈ１を優性にし、ＩｇＥ産生を阻害することが重要である。
【０００８】
本発明者らは、モンゴル伝統的乳製品よりプロバイオティクス乳酸菌を分離した。特にラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）０６ＣＣ２株にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｈ１免疫反応を高める作用を見出した。Ｉ型アレルギーにおける０６ＣＣ２株を含むプロバイオティクス乳酸菌の効果を検証するため、コンパウンド４８/８０を用いたアレルギー試験、受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応によるアレルギー試験とオボアルブミン（ＯＶＡ）感作による３種類のＩ型アレルギーモデルマウスを用いた評価を行ったところ、０６ＣＣ２株の経口投与がすべての試験においてアレルギー症状に効果的であることが分かった。さらに０６ＣＣ２株はＴｈ１／Ｔｈ２バランスの調節だけでなくマスト細胞の活性化、ヒスタミンの遊離と血管透過性増大の阻害を通してマウスにおけるＩ型アレルギー症状を軽減することが示唆された。本発明の課題は、マスト細胞の活性の抑制、ヒスタミンの産生抑制、血管透過性増大の抑制さらに、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの改善により抗アレルギー作用を有する新規菌株並びにその菌体を含有する飲料、食品及び抗アレルギー剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）０６ＣＣ２（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−１６５６）に属する乳酸菌株を提供する。さらに、この菌株を含有する飲料、食品、この菌株を有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
Ｉ型アレルギー症状へ効果をもつ供試乳酸菌のうち、０６ＣＣ２株投与群において、それぞれのアレルギー試験のアレルギースコアが対照群よりも抑制された。コンパウンド
４８／８０によるマウスの引っかき回数の抑制とＰＣＡ反応後のマウスの耳のエバンスブルー量の低下の結果から、０６ＣＣ２の経口投与はマウスにおいて、マスト細胞活性の抑制とそれによるヒスタミン産生の抑制および血管透過性増大の抑制が推察された。また、０６ＣＣ２株の経口投与により、ＯＶＡ感作マウスの引っかき回数の抑制、血清中の総ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量とヒスタミン量の抑制が確認された。さらに、ＯＶＡ感作マウスの脾臓細胞から産生されるＩＦＮ−γ量とパイエル板中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２レセプター  β２のｍＲＮＡ発現の増大及び脾臓細胞から産生されるＩＬ−４量とパイエル板中のＩＬ−４ｍＲＮＡ発現の減少が見られた。よって、０６ＣＣ２株は腸管免疫を介し、Ｔｈ１サイトカインの増大とＴｈ２サイトカインの抑制を促すことで、Ｉ型アレルギー抑制効果を持つことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】乳酸菌投与後のＯＶＡ感作マウスにおける引っかき回数を示すグラフである。
【図２】乳酸菌投与後のＯＶＡ感作マウスの血清中の（ａ）は総ＩｇＥ量、（ｂ）は、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量への影響を示すグラフである。
【図３】乳酸菌投与後のＯＶＡ感作マウスの血清中のヒスタミン量への影響を示すグラフである。
【図４】乳酸菌投与後のＯＶＡ感作マウスの脾臓細胞からのサイトカイン産生への影響を示すグラフである。
【図５】乳酸菌投与後のＯＶＡ感作マウスのサイトカインのｍＲＮＡ発現への影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する新菌株は、モンゴルの乳製品であるアーロール（牛乳で作ったチーズ）から新規に見い出したもので、「０６ＣＣ２」と命名して、平成２５年７月１１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。寄託番号は［ＦＥＲＭ−Ｐ−１６５６］である。
【００１３】
以下、これら新菌株の菌学的性質を実施例に基づいて説明する。本実施例では、Ｉ型アレルギー症状へ効果をもつ乳酸菌の選抜のため、モンゴル乳製品由来でプロバイオティクス性を有する１０株の乳酸菌を３つのアレルギー試験(コンパウンド４８／８０を用いたアレルギー実験、ＰＣＡ反応を用いたアレルギー実験、ＯＶＡ感作によるアレルギー実験)に供試した。
【００１４】
表１に示す乳酸菌１０菌株をマウスにおけるコンパウンド４８／８０を用いたアレルギー試験とＰＣＡ反応によるアレルギー試験に供試した。それらのうち、４株（０６ＴＣａ３９，０６ＴＣａ４０，０６ＣＣ２，０６ＣＣ９）がコンパウンド
４８／８０によるアレルギー試験においてマウスの引っかき回数を抑制した（表２参照）。
【００１５】
コンパウンド４８／８０は、マウスにおいてマスト細胞を活性化し、ヒスタミンの産生を増大し、痒みを生じさせると報告されている。（Ｋｕｂｅｓ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９９６年、第３２巻、ｐ６９９−７０８参照）。
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＰＭ００８は、コンパウンド ４８／８０処理したマウスにおいて、大腸と皮膚におけるＩＬ−４の発現を抑制することにより痒みを抑え、その結果、引っかき回数を抑えることが報告されている（Ｊａｎｇ  ＳＥ.  ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ”、２０１１年、第３３巻、ｐ５３９−５４４参照）。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、いくつかの乳酸菌株がマウスの骨芽細胞をＩｇＥで処理した際、その細胞の脱顆粒反応を抑制することが報告されている（Ｋａｗａｈａｒａ  Ｔ．、“Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ”、２０１０年、第８１巻、ｐ７１４−７２１参照）。
【００１６】
コンパウンド４８／８０によるアレルギー試験において効果が見られた４株（０６ＴＣａ３９，０６ＴＣａ４０，０６ＣＣ２，０６ＣＣ９）は、マウスにおいてマスト細胞の活性を抑制し、ヒスタミン産生を抑制する可能性があることが推察された。
【００１７】
これらの４株をマウスへ経口投与し、ＰＣＡ処理を行った。ＰＣＡ反応は、ｉｎ  ｖｉｖｏの試験において、もっともシンプルなアレルギー反応の一つであり、ＩｇＥによるマスト細胞の活性化が起こり、ヒスタミンのような化学伝達物質が産生され、血管の透過性が増大する。これら４株のうち、２株（０６ＣＣ２と０６ＴＣａ３９）の投与群のマウス耳中のエバンスブルー量が有意に減少していた（Ｐ＜０．０５）。
【００１８】
０６ＣＣ２と０６ＴＣａ３９株をマウスにおけるＯＶＡ感作によるアレルギー試験に供試し、マウスの引っかき回数、血清、脾臓細胞及びパイエル板について調査した。ＯＶＡ感作によるマウスのアレルギー試験はプロバイオティクスのアレルギーへの効能を調査するのによく使われている実験である。
いくつかの乳酸菌株において、ＯＶＡで感作したマウスの血清中のＩｇＥ量を減少させることにより、アレルギー症状を軽減させることが示されている（Ｓｅｇａｗａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”、  ２００８年、  第１２１巻、  ｐ．１−１０参照）。
【００１９】
０６ＣＣ２株投与群は対照群にくらべ、有意にＯＶＡ感作後の引っかき回数だけでなく、血清中の総ＩｇＥとＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を減少させた（Ｐ＜０．０５）（図１及び図２参照）。さらに、０６ＣＣ２株を経口投与したマウスの血清中のヒスタミン量も有意に減少していた（Ｐ＜０．０５）（図３参照）。この結果は上述した、０６ＣＣ２株はマスト細胞活性化とヒスタミン産生の抑制作用を有しているという推測を支持していると考えられる。一方、０６ＴＣａ３９株投与によるＯＶＡ感作マウスの血清中のＩｇＥとヒスタミン量への効果は認められなかった。
【００２０】
マウスに、モンゴル乳製品由来乳酸菌の経口投与により抗Ｉ型アレルギー作用について検討した。供試菌株をマウスに経口投与し、コンパウンド４８／８０処理によるＩ型アレルギー試験及びＰＣＡ反応により、Ｉ型アレルギー試験を実施した。コンパウンド４８／８０を用いる実験系は、マスト細胞を刺激して、ヒスタミン産生を促進し、かゆみを誘発させるＩ型アレルギー反応モデルであることが知られている。ＰＣＡ反応はＩｇＥによるマスト細胞の活性化に伴うヒスタミンなどの化学伝達物質を産生させ、血管透過性を上昇させるＩ型アレルギー反応モデルであることが知られている（Ｉｎａｇａｋｉ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，１９８６年，第８０巻，  ｐ．  ２８５−２９０参照）。本実施例では、それぞれのアレルギー試験の中で、０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９株を投与したマウスにおいて、アレルギースコアが抑制された。
【実施例】
【００２１】
乳酸菌株：モンゴル乳製品由来でプロバイオティクスとして有望な１０株を使用した（表１）。それぞれの乳酸菌株を、ＭＲＳ（メルク社製)を用いて、３７℃で２４時間培養した。培養後、菌を１００００×ｇで５分間遠心し、菌体を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄した。その後１時間煮沸した。煮沸後、さらにＰＢＳを用いて遠心洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥した菌体粉末は生理食塩水に懸濁し、マウスの経口投与に用いた。尚、表１中、ａの馬乳酒は、馬の乳を発酵させた製品、ｂのアーロールは、牛乳で作ったハードタイプのチーズである。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
マウス： 特定病原体除去 ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（５もしくは６週齢）を九動株式会社(熊本県、日本）より購入した。マウスは特定病原体除去の状態で、１２時間の明暗周期の下、１ケージあたり５頭で飼育した。マウスに標準エサＣＥ−２（日本クレア製）を与え、自由給水とした。マウスは購入後、５〜７日間順化し、実験に用いた。また、動物実験の方法は九州保健福祉大学の動物実験委員会と動物実験ガイドラインに従って実施した。
【００２４】
［マウスのコンパウンド ４８／８０によるアレルギー試験］
コンパウンド ４８／８０注射による全身性のアレルギー誘導試験を行った。コンパウンド４８／８０を生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに懸濁し、１００μＬをマスト細胞の脱顆粒剤としてマウスに皮下注射した。乳酸菌体粉末は１０％（Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅ）の濃度で生理食塩水に懸濁し、マウス１頭あたり０．２ｍＬを１日２回、強制経口投与した。乳酸菌のマウスへの投与はコンパウンド４８／８０注射の２日前から始めた（ｎ＝５／群）。対照群として等量の生理食塩水を与えた。コンパウンド４８／８０注射後４０分間の、マウスの引っかきの回数を調べた。
【００２５】
［マウスのＰＣＡ反応によるアレルギー試験 ］
ＰＣＡ反応によるアレルギー試験を行った。１ｍｇペントバルビタールを含む生理食塩水０．５ｍＬを腹腔内に投薬し、マウスに麻酔をかけ、マウスの耳に生理食塩水を用いて調製した抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−ＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ  Ｊａｐａｎ製，東京，日本）２ｍｇ／ｍＬ溶液を１０μＬ皮内に注射した。２４時間後、ペントバルビタールによる麻酔の下、０．４％エバンスブルー（Ｓｉｇｍａ  Ｊａｐａｎ製）と０．１％アルブミン−ＤＮＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｊａｐａｎ製）を含む生理食塩水を尾静脈より注射した。その３０分後、両耳を取りエバンスブルー量の測定を行った。エバンスブルーは１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ  ０．５ｍＬで懸濁、２４時間３７℃でインキュベートすることで抽出した。抽出液にアセトン：リン酸＝５：１３で調製した溶液を２ｍＬ加え、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上澄み液を回収し、６２０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＵＶ−１２０１，島津製作所製）で測定した。乳酸菌の投与については、ＤＮＰ−ＩｇＥ注射の２日前から、上述した濃度で実施し、エバンスブルーおよびアルブミン−ＤＮＰ溶液の尾静脈注射の前まで行なった。
【００２６】
［マウスのＯＶＡ感作によるアレルギー実験］
次に、マウスに、これら２株をそれぞれ投与し、ＯＶＡを用いてＩ型アレルギーとして知られている花粉症病態を発症させた。すなわち、マウスのＩ型アレルギー性鼻炎モデルを作成するためにＯＶＡで感作した。５週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用意し、乳酸菌を上述した濃度で経口投与開始した。乳酸菌投与開始後２日に１回目の感作として２０μｇＯＶＡと２ｍｇＡｌ（ＯＨ）３−ｇｅｌを含む生理食塩水を２００μＬ腹空内に投与し、同じ操作を乳酸菌投与開始後９日に２回目の感作として実施した。乳酸菌投与開始後１６日からは１００μｇＯＶＡを含む生理食塩水を１０μＬ経鼻より感作した。この操作を１週間に定期的に３回実施した。乳酸菌投与開始後２３，３０，３７日には、ＯＶＡ経鼻感作後２０分間のマウスの引っかきの回数を調べた。また、乳酸菌投与開始後３７日目には、マウスより血液、脾臓及びパイエル板を採取し、以後の実験に用いた。
【００２７】
０６ＣＣ２株投与マウスは対照群に比べて、ＯＶＡ惹起後の引っかき回数が有意に抑制された。一方、０６ＴＣａ３９株投与群では見られなかった。また、０６ＣＣ２株投与群は対照群に比べ、ＯＶＡ惹起マウスの血清中ＩｇＥ及びヒスタミン量が有意に減少していた。さらに、脾臓細胞からのＩＦＮ−γ量の増大とＩＬ−４遺伝子発現の減少及びパイエル板におけるＩＦＮ−γとＩＬ−１２レセプター  β２  ｍＲＮＡ遺伝子発現の増大とＩＬ−４遺伝子発現の減少が認められた。以上のことから、Ｉ型アレルギーマウスにおいて０６ＣＣ２株の経口投与は腸管免疫を介して、マスト細胞の活性の抑制、ヒスタミンの産生抑制、血管透過性増大の抑制さらに、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの改善作用があると考えられる。
【００２８】
［ＯＶＡ感作マウス血清中のＩｇＥとヒスタミン量の測定］
血液を１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離し、血清を得て、−３０℃で保存した。０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて調製した１００ｍｇ／ｍＬのＯＶＡ溶液をマイクロプレートに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩放置した。その後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。次に０．４％ＢＳＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を３００μＬ加え、２５℃で２時間放置し、５回ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＯＶＡ特異的ＩｇＥを測定するために血清を０．４％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで１００倍希釈し、それぞれのウェルに１００μＬずつ加え、２５℃で２時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、０．４％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで、ＨＲＰ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ（ＢＥＴＨＹＬ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を１００００倍希釈した溶液を作成し、１００μＬずつ各ウェルに加え、２５℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、１００μＬずつＴＭＢ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を加え、２５℃で３０分間反応させた。その後、１００μＬずつ４Ｎ硫酸溶液を加え、反応を止めた。そして、マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００；Ｃｏｒｏｎａ  ｅｌｅｃｔｏｒｉｃ，Ｈｉｔａｃｈｉｎａｋａ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。また、血清中の総ＩｇＥ及びヒスタミン量は、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｓｐｉ−ｂｉｏ，Ｍｏｎｔｉｇｎｙ−ｌｅ−Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【００２９】
［ＯＶＡ感作マウスの脾臓細胞からのサイトカイン産生］
ＯＶＡ感作マウスより脾臓を採取し、細胞を回収した。０．１４Ｍ  ＮＨ４Ｃｌを含む０．０１７ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．６５）により溶血処理の後、細胞を５％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０に２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で懸濁した。その細胞溶液を１ｍＬずつ２４ｗｅｌｌプレートに加え、１００μｇ／ｍＬ  ＯＶＡを添加し、７２時間、３７℃、５％ＣＯ２の下インキュベートした。インキュベート後、培養液を回収し、１０００ｒｐｍで５分遠心分離した。その上清を−８０℃で保存し、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＩＦＮ−γとＩＬ−４量を測定した。
【００３０】
［ＯＶＡ感作マウスの脾臓細胞のＦＡＣＳ解析］
脾臓細胞をＦＢＳを２％含むＲＰＭＩ培地で洗浄し、１×１０６ｍｌの濃度で懸濁した。そして、細胞を５０ｎｇ／ｍｌホルボールミリステートアセテート （ＰＷＡ）（Ｓｈｉｇａ  Ｊａｐａｎ）, ５０ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｗａｋｏ）と１μｌ／ｍｌ  ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加え、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔ
（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて、細胞を洗浄及び固定し、細胞内のＩＦＮ−γとＩＬ−４を染色した。染色に用いた抗体はＩＦＮ−γ：ＦＩＴＣ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ
及びＩＬ−４：ＰＥ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓ  ＩＬ−４，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎを使用した。染色後、細胞を洗い、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ３Ｓ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００３１】
［ＯＶＡ感作マウスのパイエル板の遺伝子発現解析］
パイエル板中のＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１２レセプター  β２，ＩＬ−４，ＩＬ−１０  ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７３００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ，東京，日本）を使用して分析した。各群のそれぞれのマウスの小腸から５−６個のパイエル板をとり、ＴＲＩｚｏｌ溶液に懸濁し、ｍＲＮＡの抽出を行った。抽出後、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  α（東洋紡，大阪, 日本)のｏｌｉｇｏ−ｄＴ（２０）プライマーを使用してｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１２レセプター  β２，ＩＬ−４，ＩＬ−１０の特異的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）を使用した。それぞれの特異的プライマー・プローブは、ＩＦＮ−γ（ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｍｍ０１１６８１３４＿ｍｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ），ＩＬ−１２ｐ４０（ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｍｍ００４３４１７４＿ｍｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）, ＩＬ−１２レセプター  β２ （ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｍｍ００４３４２００＿ｍｌ，Ｍｍ００４３４２００ｍｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）, ＩＬ−４ （ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｍｍ００４４５２５９＿ｍｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）,ＩＬ−１０（ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｍｍ００４３９６１４＿ｍｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）を使用した。ＰＣＲの反応組成は説明書に従った。すべてのデータは比較Ｃｔ法を用いて、マウスβ―ａｃｔｉｎの値で補正した。マウスβ―ａｃｔｉｎのＰＣＲはＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）を使用し、β―ａｃｔｉｎのプライマーはｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣ−３’，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ−３’を使用した。ＰＣＲの反応は５０℃で２分間、９５℃で１０分間反応させ、その後９５℃で１５秒, ６０℃で１５秒、７２℃で３１秒の反応を５０回繰り返した。反応終了後には、９５℃で１５秒,６０℃で１分,９５℃で１５秒,６０℃で１５秒の反応を行い、融解曲線を作成し、β―ａｃｔｉｎ特異的なＰＣＲ反応を確認した。
【００３２】
［統計解析］
マウスのコンパウンド４８／８０によるアレルギー試験の引っかき回数とＰＣＡ反応によるアレルギー試験のエバンスブルー量の結果はｏｎｅ−ｗａｙ    ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）、Ｔｕｋｅｙ法により統計解析した。ＯＶＡ感作によるアレルギー試験におけるマウスの引っかき回数はｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ  を使用した。血清中のＩｇＥ及びヒスタミン、脾臓細胞からのサイトカイン産生量、パイエル板中のサイトカイン遺伝子発現は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｕｋｅｙ  ｔｅｓｔ、もしくはｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを使用して解析した。Ｐ値が０．０５未満の時、統計学的に有意差があると判断した。
【００３３】
［乳酸菌投与のマウスにおけるコンパウンド４８／８０によるアレルギーモデルへの影響］
供試乳酸菌１０株を、マウスを用いたコンパウンド ４８／８０によるアレルギー試験に供試した。適当量のコンパウンド
４８／８０の注射は著しくマウスのマスト細胞を活性化し、ヒスタミンを産生させ、かゆみを誘発させることが知られている（Ｋｕｂｅｓ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、“Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９９６年、  第３２巻、  ｐ．６９９−７０８参照）。本実施例において表２に示すとおり、マウスへコンパウンド４８／８０を注射した後、０６ＴＣａ３９，
０６ＴＣａ４０，０６ＣＣ２，０６ＣＣ９株投与群の引っかき回数は、対照群よりも有意に抑制していた（Ｐ＜０．０５）。表２中、マウスの引っかきは対照群に対する割合で示した。実験１、２、３は独立して実施した。数値は値±標準偏差で示した（ｎ＝５）。＊（アスタリスク）を付した数値は対照群とくらべてｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｔｕｋｅｙ  ｔｅｓｔ  による有意差を示している（ｐ＜０．０５）。
【００３４】
【表２】
2015023802.tif 000004
【００３５】
［乳酸菌投与のマウスにおけるＰＣＡ反応によるアレルギーモデルへの影響］
本発明者らは前述のコンパウンド４８／８０によるアレルギー試験で効果が認められた菌株（０６ＴＣａ３９，０６ＴＣａ４０，０６ＣＣ２，０６ＣＣ９）をＰＣＡ反応によるアレルギー試験に供試した。ＰＣＡは生体におけるシンプルなＩ型アレルギー反応である。本実施例において、表３に示すとおり、ＰＣＡ反応後、０６ＴＣａ３９，０６ＣＣ２株を投与したマウスは、対照群よりもマウスの耳より抽出されたエバンスブルー量が有意に少なかった（Ｐ＜０．０５）。表３中、マウスのＰＣＡ反応は、耳にＩｇＥを注射し、尾静脈からＡｌｂｕｍｉｎ−ＤＮＰとエバンスブルーを含む溶液を注射することにより行なった。マウスの耳から抽出したエバンスブルーの濃度は、対照群に対するパーセントで表した。実験１と２は独立して実施した。数値は値±標準偏差で示した（ｎ＝７）。＊（アスタリスク）を付した数値はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｔｕｋｅｙ  ｔｅｓｔ  により対照群に対して有意差を示している（ｐ＜０．０５）。
【００３６】
【表３】
2015023802.tif 000005
【００３７】
［乳酸菌投与のＯＶＡ感作マウスにおける引っかき回数への影響］
発明者らは前述のＰＣＡ反応で効果が認められた２菌株（０６ＴＣａ３９，０６ＣＣ２株）をマウスのＯＶＡ感作によるアレルギー鼻炎モデルに供試した。図１に示すとおり、ＯＶＡ経鼻感作後の対照群の引っかき回数は著しく増加した。０６ＣＣ２株を投与群は、対照群に比べＯＶＡ感作マウスの引っかき回数は著しく抑制された。一方、０６ＴＣａ３９株投与群においては、引っかき回数の抑制は見られなかった。０６ＣＣ２株の経口投与は３種類のアレルギー試験においてその症状の有効性が見られた。
【００３８】
［乳酸菌投与のＯＶＡ感作マウスの血清中のＩｇＥ量への影響］
０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９株投与開始後３７日目の血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を測定した（図２参照）。対照群に比べ、血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は有意に減少していた（Ｐ＜０．０５）。０６ＴＣａ３９株投与群においては、血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は対照群と殆んど変わらず、有意差は認められなかった。
【００３９】
［乳酸菌投与のＯＶＡ感作マウス血清中のヒスタミン量への影響］
０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９株投与開始後３７日目の血清中のヒスタミン量を測定した。図３に示すとおり、対照群に比べ、０６ＣＣ２株投与群の血清中ヒスタミン量が有意に減少していた。一方、０６ＴＣａ３９株投与群においては、血清中のヒスタミン量は対照群と殆んど変わらず、有意差は認められなかった。
【００４０】
［乳酸菌投与によるＯＶＡ感作マウスの脾臓細胞からのサイトカイン産生への影響］
０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９株投与後３７日目のＯＶＡ感作マウスから調製した脾臓細胞を初代培養し、培養液中のＩＦＮ−γとＩＬ−４量を調べた（図４参照）。調製された脾臓細胞は上述したとおりＯＶＡと共培養した。０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９投与群の脾臓細胞から産生されたＩＦＮ−γの量は対照群に比べ、有意に増加していた（Ｐ＜０．０５）。０６ＣＣ２株投与群の脾臓細胞から産生されたＩＬ−４量は対照群ばかりでなく０６ＴＣａ３９投与群よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。また、０６ＴＣａ３９株投与群の脾臓細胞から産生されたＩＬ−４量は対照群よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。そして、図４（ｃ）にＩＦＮ−γ／ＩＬ−４産生の割合を示す。０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９投与群のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４産生の割合は対照群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。さらに、０６ＣＣ２投与群の割合は０６ＴＣａ３９投与群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。それぞれの群からの脾臓細胞を集め、ＰＭＡ、イオノマイシンにより細胞を刺激し、細胞内で産生されるＩＦＮ−γとＩＬ−４量をＦＡＣＳで測定した。その結果を表４に示す。各グループのマウスに対して生理食塩水、０６ＣＣ２、０６ＴＣａ３９株を経口投与した。脾臓細胞をＰＭＡ、イオノマイシンおよびＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐと６時間、３７℃で共培養し、細胞内に蓄積されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４量を染色した。染色した細胞は、ＦＡＣＳで解析した。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
０６ＣＣ２株を投与したマウスの脾臓細胞において、ＩＦＮ−γ陽性細胞が多かったのに対し、０６ＴＣａ３９投与群においては０６ＣＣ２株投与群よりもＩＦＮ−γ陽性細胞は少なかった。また、０６ＣＣ２株投与群の脾臓細胞においては、ＩＬ−４陽性細胞は対照群と比べ、ほとんど同じであったが、０６ＴＣａ３９株投与群においては対照群よりも少なかった。
【００４３】
［乳酸菌投与によるＯＶＡ感作マウスのパイエル板におけるサイトカインのｍＲＮＡ発現への影響］
０６ＣＣ２及び０６ＴＣａ３９株投与後３７日目のＯＶＡ感作マウスのパイエル板におけるＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１２レセプター  β２，ＩＬ−４，ＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現を測定した。図５に示すとおり、０６ＣＣ２の株を投与した群は対照群に比べ、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２レセプター  β２のｍＲＮＡ発現の有意な上昇とＩＬ−４ｍＲＮＡの有意な減少が見られた（Ｐ＜０．０５）。尚、ＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−１０のｍＲＮＡは変化が見られなかった。一方、０６ＴＣａ３９投与群においては、ＩＬ−１２レセプター  βのｍＲＮＡ発現の有意な上昇が見られたが、その他サイトカインの発現においては変化が見られなかった。
【００４４】
ＯＶＡ感作したマウスにおいて、Ｔｈ１免疫の増大とＴｈ２免疫の抑制によるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの改善に関連して、Ｉ型アレルギー病態の予防と軽減作用をもつ乳酸菌が報告されている（Ｓｅｇａｗａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”、  ２００８年、  第１２１巻、  ｐ．１−１０参照）。本実施例において、０６ＣＣ２株投与群の脾臓細胞から産生されたサイトカインは対照群に比べ、有意なＩＦＮ−γの増大とＩＬ−４の減少が見られた（Ｐ＜０．０５）（図２参照）。
【００４５】
結果として、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の割合が０６ＣＣ２株の投与により対照群よりも有意に増大した（Ｐ＜０．０５）（図２参照）。したがって、０６ＣＣ２株の経口投与は過去の報告のように、ＯＶＡ感作マウスにおいて、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１優位にすることによりアレルギー症状の軽減に反映されたことが分かった。また、ＦＡＣＳ解析において、０６ＣＣ２株投与マウスから調製した脾臓細胞はＰＭＡとイオノマイシン刺激によってＩＦＮ−γ陽性細胞の増加が見られた（表４参照）。
【００４６】
０６ＣＣ２株は過去の報告で、健常マウスにおけるＴｈ１サイトカイン産生増大を示した（Ｔａｋｅｄａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、  “Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２０１３年、  第７７巻、印刷中参照）。また、インフルエンザ感染マウスにおいてもＴｈ１サイトカイン産生増大を示し、結果としてインフルエンザ感染の抑制に反映されたことを示している（Ｔａｋｅｄａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、  “Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ”、  ２０１１年、第１１巻、ｐ．  １９７６−１９８３参照）。本実施例により、０６ＣＣ２株は健常マウスやインフルエンザ感染マウスばかりでなく、ＯＶＡ感作マウスにおいても、Ｔｈ１サイトカイン産生が増大することが分かった。
【００４７】
ＩＦＮ−γとＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞により産生され、細胞性免疫において重要な働きを持ち、ＩｇＥの産生を抑制することが報告されている（ｖａｎ  Ｈａｌｔｅｒｅｎ  Ａ．  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、  “Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、  １９９７年、第
１５９巻、ｐ．  ３００９−３０１５参照）。それゆえ、マウスへの０６ＣＣ２株投与によるＴｈ１免疫の活性化がＩ型アレルギー症状の軽減に寄与していると考えられる。一方、０６ＴＣａ３９株を投与したＯＶＡ感作マウスの脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生量も対照群に比べ増加していたが、０６ＴＣａ３９株投与群は引っかき回数、血清中のＩｇＥ及びヒスタミン量の抑制は認められなかった。
【００４８】
ＯＶＡ感作した０６ＣＣ２、０６ＴＣａ３９投与群のパイエル板中のｍＲＮＡの発現について調べたところ、Ｔｈ１サイトカインとして、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１２ｐ４０，ＩＬ−１２レセプターβ２、Ｔｈ２サイトカインとしてＩＬ−４、下方制御サイトカインとして、ＩＬ−１０の発現を調べた。パイエル板は腸管免疫の器官で、生体中において、投与した乳酸菌と免疫細胞が直接作用する主な場所であると考えられる。
【００４９】
図５に示すように、０６ＣＣ２投与群ではＩＦＮ−γとＩＬ−１２レセプターβ２の発現は、対照群よりも有意に高く、ＩＬ−４は有意に低かった。一方、０６ＴＣａ３９投与群はＩＬ−１２レセプター  β２発現が高かったものの、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の発現には影響しなかった。これらの結果は、ＯＶＡ感作マウス由来脾臓細胞の初代培養中のサイトカイン産生の結果に一致していた。よって、０６ＣＣ２の経口投与はＯＶＡ感作マウスにおいて腸管免疫を介し、Ｔｈ１免疫反応を活性化、Ｔｈ２免疫反応を抑制し、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を減少させ、さらにマスト細胞活性とそのヒスタミン産生を抑制し、そして引っかき回数を減らしていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
したがって、０６ＣＣ２株の経口投与はマウスを用いた３つのＩ型アレルギー試験（コンパウンド ４８／８０による試験,ＰＣＡ反応による試験, ＯＶＡ感作による試験）において有効性を示した。これらの試験より、０６ＣＣ２株は腸管免疫を介して、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを、Ｔｈ１優位に改善し、血中のＩｇＥ産生、マスト細胞の活性とヒスタミン産生の抑制、そして、血管透過性増大を抑制し、かゆみを抑えると考えられる。よって、０６ＣＣ２株はＩ型アレルギー予防の代替薬として可能性があり、サプリメントや食品に応用できると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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