(57)【要約】【課題】飲み易く、後味のすっきりとした清酒の製造に使用されるコハク酸低生産性清酒酵母の育種法を提供する。【解決手段】シクロヘキシミド感受性である清酒酵母を親株として、変異処理することなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含有する選択培地で生育した菌株から、親株と比較して酸度及びコハク酸の生成量が低下し、且つリンゴ酸の生成量が同等以上である菌株を選抜する育種法であり、清酒酵母は、きょうかい酵母９号、きょうかい酵母９０１号、及びきょうかい酵母７０１号から選択される少なくとも一つである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヘキシミド感受性である清酒酵母を親株として、変異処理することなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含有する選択培地で生育した菌株から、酸度及びコハク酸の生成量が前記親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が前記親株におけるリンゴ酸の生成量以上である菌株を選抜するコハク酸低生産性清酒酵母の育種法。
【請求項２】
前記親株は、きょうかい酵母９号、きょうかい酵母９０１号、及びきょうかい酵母７０１号からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１に記載のコハク酸低生産性清酒酵母の育種法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のコハク酸低生産性清酒酵母の育種法で育種されたコハク酸低生産性清酒酵母。
【請求項４】
サッカロミセス・セレビシエ（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７８１）である請求項３に記載のコハク酸低生産性清酒酵母。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のコハク酸低生産性清酒酵母を用いて醸造する清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コハク酸低生産性清酒酵母の育種法、該育種法を用いて育種したコハク酸低生産性清酒酵母、及び該コハク酸低生産性清酒酵母を用いて醸造する清酒の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒における消費者の嗜好は、時に大きく変わり、その嗜好に合った清酒を製造するには、様々な特徴を備える清酒酵母を育種する必要がある。消費者の嗜好に大きくかかわる清酒の要素として、芳香、うま味、酸味等が代表的である。清酒における最近の消費者の嗜好としては、飲み易く、後味のすっきりとした味が好まれ、うま味や酸味が強い、濃厚な味は敬遠される傾向にある。
【０００３】
清酒のうま味や酸味は、有機酸の組成や量によって左右される。例えば、リンゴ酸は、爽やかな酸味を与え、コハク酸は、コクのある酸味を与えることが知られている。コハク酸は、濃厚な味わいの清酒では好ましい味となり得るが、コハク酸の含有量が過多になると、コクのある酸味が強調されるため、清酒独特の雑味（くどさ）が際立ち、清酒の飲みやすさと、後味のすっきり感とを低下させる場合がある。また、清酒のうま味と香りとのバランスが損なわれる虞もある。したがって、飲み易く、すっきりとした味の清酒を製造するには、リンゴ酸を増加させながら、清酒中に含まれる総有機酸（酸度）、そのなかでも特にコハク酸を減少させることが望ましい。
【０００４】
例えば、特許文献１では、ミトコンドリア外膜タンパク質Ｆｉｓ１をコードするＦＩＳ１遺伝子を破壊して、酵母のコハク酸生産性を高めることなく、リンゴ酸の生産性を向上させる育種法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１４２１６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の育種法では、ミトコンドリアの分裂に関与するＦＩＳ１遺伝子を破壊するため、親株である清酒酵母のアルコール耐性や、発酵能等の形質に影響が及ぶ虞がある。また、当該文献の育種法で得られた変異株は、親株と比較して清酒中のリンゴ酸は増加しているが、コハク酸は十分に減少しておらず、飲み易く、後味のすっきりとした清酒を製造できない虞がある。
【０００７】
本発明は、飲み易く、後味のすっきりとした清酒の製造に使用されるコハク酸低生産性清酒酵母、及びその育種法を提供することを目的とする。さらに、当該清酒酵母を用いて醸造する清酒の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明を含む。
［発明１］
シクロヘキシミド感受性である清酒酵母を親株として、変異処理することなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含有する選択培地で生育した菌株から、酸度及びコハク酸の生成量が前記親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が前記親株におけるリンゴ酸の生成量以上である菌株を選抜するコハク酸低生産性清酒酵母の育種法。
［発明２］
前記親株は、きょうかい酵母９号、きょうかい酵母９０１号、及びきょうかい酵母７０１号からなる群から選択される少なくとも一つである発明１に記載のコハク酸低生産性清酒酵母の育種法。
［発明３］
発明１又は２に記載のコハク酸低生産性清酒酵母の育種法で育種されたコハク酸低生産性清酒酵母。
［発明４］
サッカロミセス・セレビシエ（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７８１）である発明３に記載のコハク酸低生産性清酒酵母。
［発明５］
発明３又は４に記載のコハク酸低生産性清酒酵母を用いて醸造する清酒の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本構成のコハク酸低生産性清酒酵母の育種法は、上記構成を有することから、目的のコハク酸低生産性清酒酵母を簡便かつ効率的に取得することができる。その結果、コハク酸低生産清酒酵母を用いて酸度及びコハク酸を減少させ、リンゴ酸を増加させた飲み易く、後味のすっきりした清酒を製造することができる。また、選抜したコハク酸低生産性清酒酵母は、変異処理をしていないので、親株のアルコール耐性や発酵能等の優れた形質を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明に係るコハク酸低生産性清酒酵母の醪日数に伴う炭酸ガス減少量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸（以下、ＡＺＣと称す）は、プロリンアナログであり、プロリンと競合してタンパク質合成時に新生タンパク質に取り込まれ、異常タンパク質を生成させる。ＡＺＣに耐性を示す変異株は、プロリンを蓄積し、有機酸の生成にも大きく影響を与えることが知られている。そこで、本発明者らは、ＡＺＣに耐性を示す清酒酵母の変異株を育種、取得することを試みた。その結果、得られたＡＺＣ耐性変異株の形質を調べたところ、予期しないことに、シクロヘキシミド感受性であるＡＺＣ耐性変異株は、酸度及びコハク酸の生成量が親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上である特徴を備えるという新しい知見を得た。
【００１２】
本発明に係るコハク酸低生産性清酒酵母の育種法、該育種法を用いて育種したコハク酸低生産性清酒酵母、該清酒酵母を用いて醸造する清酒の製造方法に関する実施形態について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態や図面に記載される構成に限定されることを意図しない。
【００１３】
ここで、本明細書中に記載される「コハク酸低生産性清酒酵母」とは、酸度及びコハク酸の生成量が親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上である清酒酵母を意味する。
【００１４】
［コハク酸低生産性清酒酵母の育種法］
本発明に係るコハク酸低生産性清酒酵母の育種法は、シクロヘキシミド感受性である清酒酵母を親株として、変異処理を行うことなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含有する選択培地を用いてコハク酸低生産性清酒酵母を選抜する方法である。
【００１５】
（育種に用いる親株）
本発明のコハク酸低生産性清酒酵母の育種法は、シクロヘキシミド感受性であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母であればすべての酵母に利用することができる。親株として使用する清酒酵母は、実験室で利用する実験室酵母でもよいが、清酒の醸造で一般に利用される既存の清酒酵母が好ましい。既存の清酒酵母としては、例えば、公益財団法人日本醸造協会から頒布されている泡あり酵母のきょうかい酵母１号、２号、３号、４号、５号、６号、７号、８号、９号、１０号、１１号、１２号、１３号、１４号、１５号；泡なし酵母のきょうかい酵母６０１号、７０１号、９０１号、１００１号、１４０１号、１５０１号、１６０１号、１７０１号、１８０１号；尿素非生産のＫＡｒｇ７号、ＫＡｒｇ９号、ＫＡｒｇ１０号等が挙げられる。また、他の酵母としては、例えば、株式会社秋田今野商店の清酒酵母群；各県工業総合研究センターが開発した清酒酵母群；学校法人東京農業大学が開発した花酵母等が挙げられる。また、市販のシクロヘキシミド耐性の清酒酵母であっても、育種改良によりシクロヘキシミド感受性となった清酒酵母は、利用することができる。本発明の清酒酵母の育種法は、これら清酒酵母を親株として用いることにより、親株の特徴を維持しながら、酸度及びコハク酸の生成量が親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上である清酒酵母を取得することができる。
【００１６】
（ＡＺＣ耐性株の取得）
ＡＺＣ耐性株の取得方法としては、例えば、先ず、親株である清酒酵母を、ＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）を用いて、２５〜３７℃で、３日間振とう培養し、得られた培養液を遠心分離にて集菌し、洗浄する。１０倍に濃縮した１０９細胞／ｍｌの酵母懸濁液１００μｌを、５００ｍｇ／ＬのＡＺＣ含有ＳＤ寒天培地（２％グルコース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（アミノ酸を含まないもの）、２％寒天）に塗布する。３０℃で約２週間インキュベーションした後、生育したコロニーをＡＺＣ耐性株として釣菌する。
【００１７】
（ＡＺＣ耐性株の一次スクリーニング）
上記ＡＺＣ耐性株に関して、一次スクリーニングを行っても良い。一次スクリーニングは、例えば、一段仕込みによる小仕込み試験を行い、ＡＺＣ耐性株の発酵能、有機酸の生成量（酸度）等を親株と比較して、菌株を選択する。小仕込み試験は、例えば、１０〜２０℃で、１０〜２０日間培養を行う。小仕込み試験では、原料米を液化した融米を使用してもよい。液化した融米は、例えば、原料米又は原料米を粉砕した粉砕米に、汲水及び耐熱性酵素であるα−アミラーゼを添加し、６０〜９０℃で液化することにより得られる。液化した融米を使用する場合、総米における融米の比率は、例えば、融米の調製に使用した原料米として換算することができる。菌株の選択方法としては、例えば、発酵能が親株以上であり、且つ酸度が親株と比較して５％以上低下した菌株を選択する。これにより、酸度及びコハク酸の生成量が親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上である菌株を効率よく選択することが可能となる。
【００１８】
（コハク酸低生産性清酒酵母の選択方法）
コハク酸低生産性清酒酵母の選抜方法としては、例えば、三段仕込みの小仕込み試験を行い、上槽後、酸度、リンゴ酸、及びコハク酸の生成量を分析して、酸度及びコハク酸の生成量が親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上である菌株を選択する。小仕込み試験は、例えば、１０〜２０℃で、１５〜３０日間培養を行う。小仕込み試験では、原料米を液化した融米を使用してもよい。リンゴ酸及びコハク酸の分析方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量が好適に用いられる。
【００１９】
その他のコハク酸低生産性清酒酵母の選抜方法としては、例えば、得られたＡＺＣ耐性株を、麹汁培地、合成培地等の清酒酵母用の一般的な培地で１５〜２０℃で、１０〜３０日培養を行い、酸度、リンゴ酸、及びコハク酸を分析して、酸度及びコハク酸の生成量が親株における酸度及びコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上である菌株を選択することも可能である。清酒酵母用の一般的な培地は、好ましくは麹汁培地である。麹汁培地は、例えば、米麹３００ｇに蒸留水１Ｌを加えて、５５〜６０℃で６時間糖化後、濾過した液を蒸留水でブリックス（Ｂｒｉｘ）を１０〜１５％程度に調整し、オートクレーブ滅菌（例えば、１２１℃、２０分）することで得ることができる。
【実施例】
【００２０】
［ＡＺＣ耐性株の取得］
本発明に係るコハク酸低生産性清酒酵母の育種法に関して、シクロヘキシミド感受性であるきょうかい酵母を親株として、変異処理を行うことなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含有する選択培地を用いてＡＺＣ耐性株を取得し、評価した。
【００２１】
（育種試験に用いた親株）
親株は、シクロヘキシミド感受性株であるきょうかい酵母９号（以下、Ｋ−９株と称す）、きょうかい酵母７０１号（以下、Ｋ−７０１株と称す）、及び尿素非生産性であるＫ−９０１ＨＲ株を使用してコハク酸低生産性清酒酵母の育種試験を行った。また、比較対象として、シクロヘキシミド耐性株であるきょうかい酵母Ｎｏ．７７株（以下、Ｎｏ．７７株と称す）を用いてＡＺＣ耐性株の育種試験を行った。Ｋ−９０１ＨＲ株は、きょうかい酵母９０１号（以下、Ｋ−９０１株と称す）を親株とする尿素非生産性の酵母であり、以下の育種方法を用いて取得した。
【００２２】
Ｋ−９０１株をＹＭ培地で１日培養した後、菌体を集菌し、洗浄した。この洗浄菌体に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）５ｍｌ、４０％グルコース液０．２５ｍｌ、ＥＭＳ０．２５ｍｌを加え、３０℃で１時間ゆっくり撹拌した後、菌体を滅菌水で洗浄し、ＹＭ寒天培地に塗布して３０℃、３日間培養してコロニーを形成させた。このコロニーをＹＭ寒天培地及び１．５％ジメチルサクシネートを含むＹＭ寒天培地に移して、３０℃で培養し、ジメチルサクシネートを含むＹＭ寒天培地で生育できなかった菌株を選択し、Ｋ−９０１Ｈ株とした。Ｋ−９０１Ｈ株をＹＰＤ培地にて３０℃で振とう培養し、対数増殖期の細胞を集菌洗浄したものをＣＡＯ培地（０．１７％イーストナイトロジェンベース（Ｎ源を含まないもの）、１０ｍｇ／Ｌカナバニン、５ｍＭオルニチン、１ｍＭアルギニン、２％グルコース、２％寒天）に４×１０６〜１０×１０６個／プレートになるように塗布した。当該プレートを３０℃で１０日間培養し、生育してきたシングルコロニーの１０菌株をＡｒｇ培地及びＯｒｎ培地にレプリカし、Ａｒｇ培地で生育できずにＯｒｎ培地で生育した菌株を尿素非生産性株として分離した。
【００２３】
（ＡＺＣ耐性株の取得方法）
ＡＺＣ耐性株の取得は、以下の方法による。先ず、Ｋ−９株、Ｋ−７０１株、Ｋ−９０１ＨＲ株、及びＮｏ．７７株を５ｍｌのＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）で３日間培養後、各菌体を遠心分離にて集菌し、洗浄した。１０倍に濃縮した１０９細胞／ｍｌの酵母懸濁液１００μｌを、５００ｍｇ／ＬのＡＺＣ含有ＳＤ寒天培地に塗布した。３０℃で約２週間インキュベーションした後、生育したコロニーをＡＺＣ耐性株として釣菌した。Ｋ−９株から３１菌株、Ｋ−７０１株から１３菌株、Ｋ−９０１ＨＲ株から１０菌株、Ｎｏ．７７株から２菌株のＡＺＣ耐性株を取得した。これら菌株を以下のＡＺＣ耐性株の評価試験に供した。
【００２４】
［Ｋ−９株を親株とするＡＺＣ耐性株の評価］
Ｋ−９株を親株とするＡＺＣ耐性の３１菌株について、一次スクリーニングを行い、選択された菌株をコハク酸低生産性清酒酵母の選抜試験に供した。
【００２５】
（一次スクリーニング）
一次スクリーニングは、先ず小仕込み試験を行い、得られた上槽酒の酸度と、発酵能（アルコール度数）を評価した。小仕込み試験は、総米３０ｇ（掛米：一般米、精米歩合７８％）、麹歩合２３％（精米歩合７２％）、汲水歩合１５０％、及び酵母添加量２×１０９細胞となるように調製して、一段仕込みで実施した。発酵温度は、１５℃の一定とし、１５日後に上槽した。ＡＺＣ耐性株の３１菌株のうち、酸度が親株より５％以上低下した菌株は１７菌株（５５％）であった。これら１７菌株のうち、酸度が低く（親株より１０％以上低下）、良好な発酵能を有する５菌株（Ｋ９−１〜Ｋ９−５株）をコハク酸低生産性清酒酵母の選抜試験に供した。
【００２６】
（コハク酸低生産性清酒酵母の選抜試験）
上記５菌株（Ｋ９−１〜Ｋ９−５株）と、親株であるＫ−９株を用いて小仕込み試験を行い、上槽酒中の酸度、リンゴ酸、及びコハク酸を分析して、親株に対するＡＺＣ耐性株の酸度、並びにリンゴ酸及びコハク酸の生成量を評価した。小仕込み試験は、掛米（一般米、精米歩合７８％）２５５ｇ、麹米（五百万石、精米歩合７０％）４５ｇ、汲水６００ｇ、乳酸５０μｌ相当、及び酵母の最終濃度が２×１０６細胞／ｍｌとなるように、以下の表１に示す掛米、麹米、及び汲水の配合量で、三段仕込みで実施した。発酵温度は、１５℃の一定とし、２９日後に上槽した。
【００２７】
【表１】
2015146792.tif 000002
【００２８】
（酒質及び有機酸の分析試験方法）
Ｋ９−１〜Ｋ９−５株及び親株であるＫ−９株について、上記三段仕込みで得られた上槽酒の酒質及び有機酸に関する分析を行った。酒質の分析については、独立行政法人酒類総合研究所が定める「酒類総合研究所標準分析法」（平成２２年１１月４日、ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｎｒｉｂ.ｇｏ.ｊｐ/ｄａｔａ/ｎｒｉｂａｎａｌｙｓｉｓ.ｈｔｍ）に基づいて、アルコール度数、日本酒度、酸度及び香気成分を分析した。具体的には、以下の（１）〜（４）の方法である。
（１）アルコール度数：蒸留−密度（比重）法である浮ひょう法、振動式密度計法あるいはそれに準ずる方法を用いて測定した。
（２）日本酒度：日本酒度は、水に対する酒の比重を示す指標である。４℃の水と同じ重さの清酒の日本酒度を０とし、それより軽いものを（＋）、重いものを（−）で表している。具体的には、日本酒度計を用いて１５℃における清酒の密度を測定し、日本酒度を算出した。
（３）酸度：酸度は、清酒に含まれる、有機酸（乳酸、リンゴ酸、コハク酸等）の総量を示した値であり、１０ｍＬの清酒を中和するのに要した水酸化ナトリウム水溶液の滴定量（ｍＬ）で表している。具体的には、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和滴定法により酸度を測定した。
（４）香気成分：清酒の香気成分である酢酸イソアミル及びカプロン酸エチルについて、ヘッドスペース法によりガスクロマトグラフィー（型番ＧＣ−２０１０、株式会社島津製作所製）を用いて分析した。
【００２９】
有機酸の分析については、高速液体クロマトグラフを用いて行った。具体的には、以下の分析条件で行った。
装置：高速液体クロマトグラフ「ＬＣ−２０型」（株式会社島津製作所製）
検出器：電気伝導度検出器「ＣＤＤ−１０Ａｖｐ」（株式会社島津製作所製）
カラム：「Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈ」（株式会社島津製作所製）
カラム温度：４０℃
移動相：ｐ−トルエンスルホン酸（５ｍｍｏｌ／Ｌ）
緩衝溶液：ｐ−トルエンスルホン酸（５ｍｍｏｌ／Ｌ），Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＥＤＴＡ−４Ｈ（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）
流量：移動相０．８ｍＬ／ｍｉｎ，緩衝溶液０．５ｍＬ／ｍｉｎ
また、各検体に関して生産性を確認するために、酒化率（Ｌ／ｔ）を算出した。酒化率は、１トンの白米から生成されるアルコール量（Ｌ）の割合を百分率で表したものである。各菌株の上槽酒の酒質及び有機酸組成について、以下の表２に分析結果を示す。
【００３０】
【表２】
2015146792.tif 000003
【００３１】
ＡＺＣ耐性株は、親株であるＫ−９株と比較して、表２に示すように、アルコール度数や、日本酒度は、略同じ値を示したが、酸度が何れの菌株も１２％以上低い値になった。一般的に、酸度が低い菌株は、有機酸の種類にかかわらず、何れの有機酸も低い値を示すことが多いが、Ｋ９−１〜Ｋ９−５株の何れの菌株でも、親株以上のリンゴ酸の生成量を確保しながら、コハク酸の生成量が顕著に減少（１９〜４０％減少）していた。また、香気成分に関しては、カプロン酸エチルは、何れの菌株も親株と略同等であり、酢酸イソアミルは、何れの菌株も増加していた。カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルは、清酒の吟醸香として特に重要な香気成分である。つまり、これらＡＺＣ耐性株は、生産性を示す酒化率も親株と比較して同等以上であることから、飲み易く、後味がすっきりとした吟醸香を有する清酒を効率よく製造できると考えられる。
【００３２】
図１は、本発明に係るコハク酸低生産性清酒酵母の醪日数に伴う炭酸ガス減少量を示したグラフであり、ＡＺＣ耐性の５菌株及び当該菌株の親株であるＫ−９株の炭酸ガス減量が示されている。醪の仕込みにおける初添の醪日数は−２日目、仲添の醪日数は０日目、留添の醪日数は１日目である。図１からも明らかなように、Ｋ−９株を親株とするＫ９−１〜Ｋ９−５株の醪日数に伴う炭酸ガス減量は、親株と比較して略同等の傾向を示した。従って、Ｋ９−１〜Ｋ９−５株の何れの菌株も、清酒の製造に十分利用できる酵母であることが確認された。
【００３３】
（試験醸造）
試験醸造には、小仕込み試験でリンゴ酸が増加し、コハク酸が大きく減少していた２菌株（Ｋ９−１株、Ｋ９−３株）と、親株であるＫ−９株を使用した。試験醸造は、掛米（一般米、精米歩合７８％）７６５ｇ、麹米（五百万石、精米歩合７２％）１３５ｇ、汲水１８００ｇ、乳酸５０μｌ相当、及び酵母の最終濃度が５×１０６細胞／ｍｌとなるように、以下の表３に示す掛米、麹米、及び汲水の配合量で、三段仕込みで実施した。発酵温度は、１５℃の一定とし、２９日後に上槽した。ＡＺＣ耐性株のうちＫ９−１株（識別の表示：ＧＬ−１２）を、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７８１として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託している。
【００３４】
【表３】
2015146792.tif 000004
【００３５】
（上槽酒の成分分析）
上槽酒は、一般分析及び有機酸分析に使用した。其々の菌株を用いた上槽酒の一般分析及び有機酸分析結果を以下の表４に示す。一般分析及び有機酸の分析は、「酒質及び有機酸の分析試験方法」の項に記載した同じ方法を用いて行った。
【００３６】
【表４】
2015146792.tif 000005
【００３７】
Ｋ９−１株及びＫ９−３株は、小仕込み試験の結果と同じく、親株であるＫ−９株と比較して、アルコール度数や、日本酒度は、略同じ値を示したが、酸度はＫ９−１株では２２．０％、Ｋ９−３株では２８．５％低下した。リンゴ酸の生成量は、親株と比較して、Ｋ９−１株では１６．７％、Ｋ９−３株では１８．３％増加し、コハク酸の生成量は、Ｋ９−１株では３１．４％、Ｋ９−３株では４１．９％減少した。つまり、これらＫ９−１株及びＫ９−３株は、酸度及びコハク酸を顕著に低下させ、且つリンゴ酸を増加させることから、飲み易く、後味がすっきりとした清酒を製造できると考えられる。
【００３８】
（官能試験）
Ｋ９−１株、Ｋ９−３株、及びＫ−９株の各上槽酒について、９人のパネリストによる官能試験を行った。官能試験は、香り、味、後味、コク、苦味等を総合して５段階の採点法により吟醸酒としての評価を行った。点数が小さい方が良好な清酒となる。以下の表５に官能試験結果を示す。
【００３９】
【表５】
2015146792.tif 000006
【００４０】
Ｋ９−１株の上槽酒は、Ｋ−９株の上槽酒と比較して、良好な結果が得られ、Ｋ９−３株の上槽酒もＫ−９株の上槽酒と比べて同等の結果が得られた。香り、味、後味、コク、苦味等を総合した官能試験では、上記結果であったが、Ｋ９−１株及びＫ９−３株の上槽酒は、Ｋ−９株の上槽酒と比較して、飲み易く、すっきりとした味わいであることで共通していた。
【００４１】
［Ｎｏ．７７株を親株とするＡＺＣ耐性株の評価］
シクロヘキシミド耐性を備えるＮｏ．７７株を親株とするＡＺＣ耐性株の２菌株（Ｎｏ．７７−１株及びＮｏ．７７−２株）、及び親株であるＮｏ．７７株を用いて小仕込み試験を行い、酸度、リンゴ酸、及びコハク酸を分析して、親株に対するＮｏ．７７−１株及びＮｏ．７７−２株の酸度、並びにリンゴ酸及びコハク酸の生成量を評価した。
【００４２】
（小仕込み試験）
Ｎｏ．７７−１株及びＮｏ．７７−２株と、親株であるＮｏ．７７株とを用いて総米約２００ｇの小仕込み試験を行い、上槽酒の成分、及び有機酸組成について検討した。小仕込み試験は、掛米（α化米、精米歩合７０％）１６０ｇ、麹米４０ｇ、汲水３７０ｇ、乳酸５０μｌ相当、及び酵母添加量５×１０９細胞となるように調製して、一段仕込みで実施した。発酵温度は、１５℃の一定とし、２２日後に上槽した。上槽酒の一般分析及び有機酸分析結果を以下の表６に示す。一般分析及び有機酸の分析は、「酒質及び有機酸の分析試験方法」の項に記載した同じ方法を用いて行った。
【００４３】
【表６】
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【００４４】
シクロヘキシミド耐性のＮｏ．７７株を親株とするＮｏ．７７−１株及びＮｏ．７７−２株は、表６に示すように、親株であるＮｏ．７７株と比較して、何れの菌株も酸度が高かった。有機酸組成の結果においても、Ｎｏ．７７−１株及びＮｏ．７７−２株では、リンゴ酸は親株と比較して高い値となったが、コハク酸も顕著に増加していた。つまり、コハク酸低生産性清酒酵母を取得するためには、シクロヘキシミド感受性である清酒酵母を使用することが必要であることが示された。
【００４５】
［Ｋ−７０１株を親株とするＡＺＣ耐性株の評価］
Ｋ−７０１株を親株とするＡＺＣ耐性株の１３菌株と、親株であるＫ−７０１株を用いて小仕込み試験を行い、親株に対するＡＺＣ耐性株の酸度を評価した。
【００４６】
（小仕込み試験）
ＡＺＣ耐性の１３菌株と、親株であるＫ−７０１株とを用いて総米約１００ｇの小仕込み試験を行い、上槽酒の成分、及び酸度について検討した。小仕込み試験は、掛米（α化米、精米歩合７０％）７２ｇ、麹米１８ｇ、汲水１８２ｇ、乳酸１５μｌ相当、及び酵母添加量２×１０９細胞となるように調製して、一段仕込みで実施した。発酵温度は、１５℃の一定とし、２２日後に上槽した。各上槽酒の酸度を、親株であるＫ−７０１と比較すると、１３菌株のうち９菌株（Ｋ７０１−１〜Ｋ７０１−９株）は、酸度が５％以上低下していた。Ｋ７０１−１〜Ｋ７０１−９株の日本酒度、アルコール度数、及び酸度の分析結果を以下の表７に示す。
【００４７】
【表７】
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【００４８】
シクロヘキシミド感受性であるＫ−７０１株を親株とするＡＺＣ耐性株を１３菌株取得したが、これら１３菌株のうち表７に示すＫ７０１−１〜Ｋ７０１−９の９菌株が、親株であるＫ−７０１株と比較して、酸度が５％以上低下していた。Ｋ７０１−１〜Ｋ７０１−９の９菌株の有機酸組成については、何れの菌株もコハク酸の生成量が親株におけるコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上であった（データ示さず）。
【００４９】
［Ｋ−９０１ＨＲ株を親株とするＡＺＣ耐性株の酸度の評価］
Ｋ−９０１ＨＲ株を親株とするＡＺＣ耐性株の１０菌株と、親株であるＫ−９０１ＨＲ株を用いて小仕込み試験を行い、親株に対するＡＺＣ耐性株の酸度を評価した。
【００５０】
（小仕込み試験）
Ｋ９０１−１〜Ｋ９０１−１０株と、親株であるＫ−９０１ＨＲ株とを用いて総米約１００ｇの小仕込み試験を行い、上槽酒の成分、及び酸度について検討した。小仕込み試験は、掛米（α化米、精米歩合７０％）７２ｇ、麹米１８ｇ、汲水１８２ｇ、乳酸１５μｌ相当、及び酵母添加量２×１０９細胞となるように調製して、一段仕込みで実施した。発酵温度は、１５℃の一定とし、２２日後に上槽した。上槽酒の酸度を分析して、Ｋ−９０１ＨＲ株と比較すると、何れの菌株も酸度が５％以上低下していた。Ｋ９０１−１〜Ｋ９０１−１０株の日本酒度、アルコール度数、及び酸度の分析結果を以下の表８に示す。
【００５１】
【表８】
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【００５２】
シクロヘキシミド感受性であるＫ−９０１ＨＲ株を親株とするＡＺＣ耐性株の１０菌株（Ｋ９０１−１〜Ｋ９０１−１０株）の何れもが、親株であるＫ−９０１ＨＲ株と比較して、酸度が５％以上低下していた。Ｋ９０１−１〜Ｋ９０１−１０の１０菌株の有機酸組成については、何れの菌株もコハク酸の生成量が親株におけるコハク酸の生成量未満であり、且つリンゴ酸の生成量が親株におけるリンゴ酸の生成量以上であった（データ示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係るコハク酸低生産性清酒酵母の育種法、該育種法を用いて育種したコハク酸低生産性清酒酵母、及び該清酒酵母を用いて醸造する清酒の製造方法は、清酒の製造において利用可能であり、本醸造、純米酒、吟醸酒、純米吟醸酒の製造に利用することができる。
【図１】
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