(57)【要約】【課題】グルコアミラーゼ活性が高く、褐変が少なく、得られる清酒の呈味がすっきりした清酒用麹菌を提供すること、及びこの麹菌を用いた清酒の製造方法及び清酒を提供すること。【解決手段】麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＣＫ３３−３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３７）または麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＫ１２−２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３８）及びこの麹菌を使用して清酒を製造する。この麹菌は、親株であるＡＯＫ３００６からトランスポゾンを利用して変異株バンクを得、その中から褐変性の指標としてチロシナーゼ活性、呈味の指標としてアミノ酸度により選抜した。この麹菌を使用して製造された清酒は吟醸香が優れ、褐変もほとんどなかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＣＫ３３−３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３７）。
【請求項２】
麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＫ１２−２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３８）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は麹菌に関する。さらに詳しくは、得られる清酒の吟醸香が優れ、かつ酒粕の色調の黒色化のほとんどない、特に清酒用に適した新規な麹菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、消費者の好みに合わせた種々の清酒が開発されているが、特に吟醸香の優れたものが望まれている。吟醸香は麹菌と酵母によるところが大きい。麹菌では、グルコアミラーゼ活性が高いものが吟醸香の高い清酒を製造できることが知られている。したがって、グルコアミラーゼ活性の高い麹菌が求められている（非特許文献１）。
グルコアミラーゼを高濃度に含有させるために、麹菌の培養方法が検討されている（例えば特許文献１）。しかしながら、麹菌自体でグルコアミラーゼ活性の十分高いものは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】岩間直子，２００７年岩手大学博士論文（http://ｈｄｌ．ｈａｎｄｌｅ．ｎｅｔ／１０１４０／４１４０）
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２６５１６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、吟醸香の優れた清酒用麹菌を開発すべく、グルコアミラーゼ活性を指標として、種々の麹菌の探索を行った。その結果、本願出願人が保有する未公開麹菌株ＡＯＫ３００６株が最もグルコアミラーゼ活性が高かった。この菌株はまた、でんぷんの分解・溶解に係るα−アミラーゼ活性も高かった。
しかしながら、この菌株を用いて製造した米麹は褐色を呈し、得られる酒粕の色が黒色を帯び（褐変）、酒粕の貯蔵中に黒い斑点が発生することが分かった（黒粕）。また、清酒の雑味の原因となるアミノ酸等の呈味成分が多く、すっきりとした味の清酒が得られないという欠点があった。褐変はチロシナーゼ活性に、アミノ酸生成はペプチダーゼ活性によるところが大きい。したがって、この麹菌のみで清酒を醸造することは市場性の点から問題があり、他の麹菌と混合して使用せざるを得ないが、その場合は折角の吟醸香が十分に発揮されなかった。さらに、複数の麹菌を混合して使用する場合は、麹の生育状況を一定に制御しにくく、酵素活性の測定によって麹の状況を把握する等の注意が必要となり、工程が煩雑となる。
【０００６】
そこで、本発明者は、ＡＯＫ３００６株の変異によって、グルコアミラーゼ活性を維持しつつ、チロシナーゼ活性がより低く、すっきりした香味に影響するアミノ酸度を低く制御可能なアミノペプチダーゼ活性の低い、前記の欠点が軽減された変異株の取得を試みた。人工的な突然変異株を得る手段としては、放射線や紫外線を照射する方法、化学薬品に要る方法等種々の方法が試みられているが、本発明者は、内在性トランスポゾンによる変異株の取得の検討を行った。
トランスポゾン遺伝子は１〜２ｋｂｐのユニットからなり、両端に２０〜３０ｂｐの逆向きの反復配列ＴＩＲとその外側に２〜１０ｂｐ程度の同方向の反復配列ＴＳＤを有し、ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅコードする配列がＴＩＲ内部領域に位置する構造をとっている。転移の際はｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅがＴＩＲを認識して、ゲノムからトランスポゾンを切り出して他の位置に挿入すると推測されている。
【０００７】
麹菌のトランスポゾン遺伝子は既に本発明者により報告されており、Ｃｒａｗｌｅｒと命名されている（小笠原博信：醸協，３３４（２０１０））。しかしながら、Ｃｒａｗｌｅｒの実用的な応用に関しては、これまであまり研究報告がない。
【０００８】
従って、本発明の目的は、グルコアミラーゼ活性が高く、褐変が少なく、得られる清酒の呈味がすっきりした清酒用麹菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＡＯＫ３００６株を親株として、トランスポゾンによる変異を行い、得られる変異株のなかから、上記の目的を達成できる２株を選抜し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＣＫ３３−３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３７）。
２．麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＫ１２−２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３８）。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の麹菌の親株であるＡＯＫ３００６株は、従来知られている麹菌に比してグルコアミラーゼ活性が高いが、本発明の２株とも親株とほぼ同程度の活性を維持しており、褐変は親株よりはるかに少ない。そして醸造した清酒中に生成するアミノ酸が少なく、すっきりした呈味を生じる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】低チロシナーゼ株のスクリーニング例と、チロシナーゼ活性と糖化液保存中の褐変性の相関を表した図である。
【図２】選抜株麹の活性とそれを使用したモデル酒粕の褐変性を表した図である。
【図３】変異株のアミノ酸度を表した図である。
【図４】変異株の相対チロシナーゼ活性を表した図である。
【図５】選抜株による麹のグルコアミラーゼ及びαアミラーゼ活性を表した図である。
【図６】選抜株による麹のアミノ酸度を表した図である。
【図７】選抜株による麹のチロシナーゼ活性及びモデル酒粕の褐変性を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の麹菌の親株であるＡＯＫ３００６株は、出願人が保有している未公開株である。この株は、通常の麹菌に比して、清酒の吟醸香生成に大きく寄与するとされるグルコアミラーゼ活性、でんぷんを溶解するα-アミラーゼ活性が高い。しかしながら、この株は褐変という欠点がある。ＡＯＫ３００６株は活性型ＤＮＡトランスポゾンＣｒａｗｌｅｒを多コピーで有し、分生胞子への強いストレス処理によりＣｒａｗｌｅｒが転移する。そこで、本発明者はＡＯＫ３００６株を、麹菌トランスポゾンＣｒａｗｌｅｒによる変異を行い、変異株バンクを得、本発明の目的を達成できる株の選抜を行った。
【００１３】
ＡＯＫ３００６のトランスポゾン変異は、例えば熱や化学薬品によるストレス処理やこれらの組み合わせで処理をすることにより行う。化学薬品としては、通常銅イオン、過酸化水素水や、ｐＨ３．０程度の酸処理が挙げられ、銅イオンが好ましい。化学薬品による処理は、例えば、親株の分生胞子の濃度が約１０６〜１０７個／ｍｌになるように調整した分生胞子懸濁液に、化学薬品を加え、２７〜３５℃で、４〜８時間振とうする。化学薬品の濃度は通常、銅イオンの場合は約１５〜２５ｍＭ、過酸化水素水の場合は０．０５〜０．２％、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）の場合は０．２Ｍにて処理を行う。熱処理は通常５０〜５２℃で６〜８時間振とうすることにより行う。
このようにして得られる変異株バンクの中から吟醸酒・純米酒に適した優良麹菌の選抜を行った。なお、この麹菌変異株バンクはＣｒａｗｌｅｒ転移の有無や転移先は不明な菌株群である。
【００１４】
ＡＯＫ３００６変異株バンクから、まず、チロシナーゼ活性とペプチダーゼ活性を指標として一次スクリーニングを行う。チロシナーゼ活性は麹菌における褐変と相関があることが知られており、活性が低いほど褐変が少ない。ペプチダーゼ活性は呈味に関連するアミノ酸度と関連し、活性が低いほど清酒中のアミノ酸含量が少なく、すっきりした味わいを呈する。
【００１５】
麹菌の実用に伴う酵素活性の多くは米麹培養特異的なものが多く、特に今回目的としたチロシナーゼやペプチダーゼはその例であり、米麹を作成しての評価が必須である。しかしながら、従来のシャーレや麹蓋を用いる麹製造はスペースや機材の関係からスクリーニングには向いていない。そこで、本発明者は５０ｍｌのコニカル・チューブを用いた少量麹製造法について検討した。即ち、ポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレート上のミラクロスに生育させた麹菌をミラクロスとともに剥離し乾燥させた後、セルロースフィルターにて分生胞子を分離した。滅菌したジャガイモでんぷんで５０倍としたものをモデル種麹とした。蒸米８ｇをコニカル・チューブに入れ、各菌株のモデル種麹を接種した後、セルロースフィルターで蓋をして培養した。培養温度の遷移、攪拌時間などを検討することによって少量でも現場での麹製造と同等のグルコアミラーゼやα−アミラーゼ活性を有する麹のサンプル調整が可能となった。これにより、目標であったトランスポゾン変異株バンクをスクリーングするための律速となる方法を確立することできた。
【００１６】
このようにして選抜したいくつかの変異株を用いて、さらに小仕込みによる吟醸酒の醸造を行い、官能試験により、最も優れた株を選抜する。
本発明者は、このようにして、ＡＯＫ３００６変異株バンクから、新規な麹菌ＣＫ３３−３株及びＴＫ１２−２株を選抜した。ＣＫ３３−３株はＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３７、ＴＫ１２−２株はＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３８として、特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００１７】
本発明のＣＫ３３−３株とＴＫ１２−２株のグルコアミラーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、いずれも親株であるＡＯＫ３００６株とほぼ同等である。そして、褐変性の原因となるチロシナーゼ活性は親株に比して低く、酒粕の黒色化が抑制される。また、清酒の雑味の原因となる麹中のアミノ酸生成が少なく、すっきりした味わいの清酒が得られ、酒質が向上する。特に、ＣＫ３３−３株は麹中のチロシナーゼ活性が低く、ＴＫ１２−２株はアミノ酸生成が少ない。
【００１８】
本発明の麹菌ＣＫ３３−３株及びＴＫ１２−２株を用いて清酒を醸造するには、従来の麹菌と全く同様の方法で差支えない。麹菌ＣＫ３３−３株及びＴＫ１２−２株は、単独で清酒用の種麹として使用可能である。もちろん、この２つを併用してもよく、目的に応じて他の麹菌と併用しても差し支えない。
このようにして得られる清酒においては、その酒粕の褐変が少なく、清酒自体の色合いも良好で、吟醸香が優れている、したがって、本発明の麹菌は特に吟醸酒用の種麹として適している。ただし、清酒以外の用途、例えば味噌、醤油、甘酒又は麹漬けや甘酒配合飲料等の加工食品の製造にも使用できる。さらに、麹を利用する飯寿司や魚醤油などの水産加工食品の製造にも使用できる。本発明の麹菌を用いてこれらの加工食品を製造するには、従来公知の製造方法そのままで差支えない。
【実施例】
【００１９】
以下に、本発明を参考例、実施例で説明する。
実施例１
[麹菌ＡＯＫ３００６変異株バンクの調整]
（１）親株（ＡＯＫ３００６株）分生胞子の調整
ＡＯＫ３００６株の分生胞子をポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ）に塗布し、３０℃で７−１０日間培養する。分生胞子が生育したＰＤＡ上の麹菌体を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０水に懸濁した後、ミラクロスで麹菌糸や寒天培地などを濾過する。０．１％Ｔｗｅｅｎ８０水で分生胞子を数回洗浄し、滅菌水に再度懸濁して分生胞子の濃度が約１０６個／ｍｌになるように調整して、分生胞子懸濁液とする。
【００２０】
（２）ストレス処理（トランスポゾン転移）
銅イオン処理は、分生胞子懸濁液に硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を２０ｍＭとなるように添加し、３０℃で６時間しんとう培養する。終了後、滅菌水で分生胞子を数回洗浄し、滅菌水に再度懸濁して銅イオン・ストレス処理済み分生胞子懸濁液とする。
高温処理は、分生胞子懸濁液を５０℃で６時間しんとう培養する。終了後、高温ストレス処理済み分生胞子懸濁液とする。
上記の処理で生存率が０．０１−０．００２％程度となる。栄養培地で増殖してくる分生胞子中ではトランスポゾンが転移した可能性が高い。
【００２１】
(３)選抜培養
ストレス処理済み分生胞子懸濁液をツァペック・ドックス寒天培地（ＣＤＡ）に塗布し、３０℃にて３−７日間培養する。生育してきた単独コロニーをランダムに採取し新たなＣＤＡに植菌し、増殖後、トランスポゾン変異候補株として保存する。（麹菌変異株バンク）
【００２２】
参考例１
[麹菌変異株バンクからの優良株の選抜]
○少量麹製造法の開発
５０ｍｌのコニカル・チューブを用いた少量麹製造法を開発し、候補株から優良株の選抜を検討した。
ＰＤＡプレート上のミラクロスに生育させた麹菌をミラクロスとともに剥離し乾燥させた後、セルロースフィルターにて分生胞子を分離した。滅菌したジャガイモでんぷんで５０倍としたものをモデル種麹とした。
蒸米８ｇをコニカル・チューブに入れ、各菌株のモデル種麹を接種した後、セルロースフィルターで蓋をして培養した。培養温度の遷移、攪拌時間などを適宜選択することによって少量でも現場での麹製造と同等のグルコアミラーゼやα−アミラーゼ活性を有する麹のサンプル調整が可能である。
【００２３】
○酵素活性の測定
麹の酵素活性測定用抽出液の調整は以下のようにして行った。
国税庁所定分析法に準じ、麹１０ｇを５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５．０、０．５％ＮａＣｌ）にて室温で３時間抽出し、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、アミノ酸度などの測定用酵素抽出液とした。少量麹製造法からのサンプルでは麹２ｇを１０ｍｌの緩衝溶液にて抽出した。
チロシナーゼ活性測定用には、氷上で摩砕し、１時間の抽出後、遠心した上清を粗酵素溶液とした。
グルコアミラーゼ（ブドウ糖を作る力）およびα−アミラーゼ活性（米でんぷんを分解解・溶解する力）の測定は、キッコーマン社製麹酵素活性測定用キットを用いた。
アミノ酸度（清酒の雑味の原因）は、麹酵素抽出液をフォルモール滴定によって測定した。
チロシナーゼ活性（褐変性の指標）は、摩砕抽出した粗酵素液に０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を添加し、氷中で３０分間酸処理を行い、チロシナーゼの活性化を行った。０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と１０ｍＭのＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシ・フェニルアラニン）を加え４０℃で３０分間反応させた。
・チロシナーゼによってＤＯＰＡが酸化されて生じるオレンジ色のＤＯＰＡｃｈｒｏｍｅを４７５ｎｍの波長により測定した。
【００２４】
○低チロシナーゼ株のスクリーニング例
ＡＯＫ３００６変異株について、チロシナーゼ活性を指標として、一次スクリーニングした。酵素活性測定には７０％精米を使用した少量麹製造法により作成した麹を用い、摩砕抽出液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）のジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）酸化活性を親株に対する相対活性として示した（図１）。対照としてグルコアミラーゼは低いがチロシナーゼも低くスクリーニングの目標株にもなる市販種麹菌Ｎｏ．５（秋田今野商店製）を用いた。図１より対照のＮｏ．５ほど低くはないが、チロシナーゼ相対活性が親株より５０％以下の株が多く認められた。また、麹糖化液保存中（３７℃２週間）の褐変性もチロシナーゼ活性と相関していた（図１下段）。また、グルコアミラーゼやα−アミラーゼ活性は親株と同等であった。
このようにして、グルコアミラーゼやα−アミラーゼ活性は親株と同等でアミノ酸度やチロシナーゼ活性が低い株を選抜することが可能であった。
【００２５】
参考例２
[選抜株による実用麹製造試験とモデル酒粕での褐変性]
参考例１において、チロシナーゼ相対活性と麹糖化液の褐変性が低かったＣＫ１１株、ＣＫ１３株、ＣＫ１９株（ＣＫ株はＣｕイオン・ストレスにより分離された株）およびＴＫ４株（ＴＫ株は高温ストレスにより分離された株）について現場と同様の麹試験製造を行った。選抜株の麹製造工程における実用性評価を行うと共に発酵試験後の酒粕における褐変性の相関性について検討した。親株および選抜株の種麹は９７％精米と木灰を基質としフラスコ内ではあるが、種麹製造現場に準じた方法で調製した。４０％精米１．５ｋｇからの蒸米に各選抜株の種麹を接種して麹製造を行った。出麹は６３時間と吟醸用麹づくりとしてはやや長めであったが、作業経過上の問題点は無く、親株ＡＯＫ３００６とも同調して作業を進めることができた。出麹の相対チロシナーゼ活性はＣＫ１３株で親株に近い高い活性が認められたが、他の３株では一次スクリーニングと同様の結果となった（図２）。ＣＫ１３株は選抜株から除外された。優良株選抜では麹蓋による確認は必須であることが再認識された。これら麹と酵母（秋田流花酵母ＡＫ−１）による１５℃での発酵残渣を遠心分離しモデル酒粕として６ヶ月間の褐変化試験を行ったところ、麹のチロシナーゼ活性に相関して褐変化が認められた（図２下段）。
【００２６】
実施例２
[低チロシナーゼ及び低ペプチダーゼ活性麹菌株のスクリーニング]
スッキリした味わいの純米酒製造を目指す低ペプチダーゼ活性株につてクリーニングを行った。
７０％精米を用いた少量麹中のペプチダーゼ活性を反映するアミノ酸度を指標に選抜を行い、相対チロシナーゼ活性及びペプチダーゼ活性がいずれも低いＣＫ３３−３株（Ｎｏ．３４）およびＴＫ１０株（Ｎｏ．４１）とチロシナーゼ活性はやや高いものの麹中のアミノ酸含量が低いＴＫ１２−２株（Ｎｏ．４３）を選抜した（図３、図４）。これらのグルコアミラーゼやα−アミラーゼは親株ＡＯＫ３００６とほぼ同等であった。
【００２７】
実施例３
[選抜麹菌株による吟醸麹製造試験と純米吟醸酒の小仕込試験]
トランスポゾン変異株バンクからの約６０株の少量麹スクリーニングにより、麹中のアミノ酸含量やチロシナーゼ活性の低い優良麹菌株候補であるＣＫ１１、ＣＫ１９、ＣＫ３３−３、ＴＫ４、ＴＫ１０、ＴＫ１２−２を選抜した。前述同様に各選抜株の種麹を作成し、秋田酒こまち４０％精米１．５ｋｇにて麹蓋を用いて麹製造試験を行った。対照として市販種麹「吟香」に使用されている麹菌株（今野商店より分譲）を使用した。６３時間の出麹となり吟醸用麹としてはやや遅めとなったが、生育がかなり遅れたＣＫ１１株以外は現場における作業工程上の問題点は認められなかった。
グルコアミラーゼやα−アミラーゼ活性はＣＫ１１株以外の選抜株で親株ＡＯＫ３００６とほぼ同等であった（図５）。「吟香」のグルコアミラーゼ活性は低くα−アミラーゼ活性がやや高いこの種麹の特徴を示していた。麹アミノ酸度は選抜株で低い傾向にあり、特にＴＫ１２−２株が低かった（図６）。選抜株の麹チロシナーゼ活性は今回の実用性評価試験でも低く、特にＣＫ３３−３株が最も低い結果を示した（図７）。また、酒粕褐変化モデル試験（３０℃−６ヶ月）でも親株では褐変化が顕著であったのに対し、ＣＫ１９、ＣＫ３３−３やＴＫ４株では褐変化が抑制されていた（図７下段）。
【００２８】
実施例４
次にこれら麹を用いて小仕込みによる純米吟醸酒製造試験を行った。即ち、麹２００ｇ、蒸米８００ｇ、汲み水（添加水）１．５Ｌとし秋田流花酵母ＡＫ−１により発酵を行い、もろみ日数２４日で製成酒とした。その官能試験結果を表１に示した。
【００２９】
【表１】
2015019605.tif 000002
【００３０】
ＣＫ１１株以外は良好な発酵経過をとり、その他は選抜株の特徴を示す「すっきり」型の純米吟醸酒が醸造された。中でもＣＫ３３−３株、ＴＫ１２−２株による生成酒は低ペプチダーゼ活性麹に起因する特徴を有し親株や吟香より評価が高かった。これら新規麹菌株は酒粕の褐変性も軽減されると推定される。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の麹菌ＣＫ３３−３株及びＴＫ１２−２株を使用して醸造した清酒は、吟香が優れている。また、酒粕の色調の黒色化がほとんどない。したがって、清酒用醸造用の麹菌として極めて有用である。さらには、清酒以外の味噌・醤油の醸造等にも利用可能と思われる。
【受託番号】
【００３２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＣＫ３３−３  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３７
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＫ１２−２  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３８
【図１】
2015019605.tif 000003
【図２】
2015019605.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015019605.tif 000007
【図６】
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【図７】
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