(57)【要約】【課題】適度な強度を有しつつ高い透明度を併せ持つガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体、細胞シート、およびガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置の提供。【解決手段】１）ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程Ｄを含むことを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。２）前記工程Ｄの前に、ガラス化工程を経ていないハイドロゲルから自由水を除去してガラス化させて、ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ａを含むガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。３）前記工程Ａは半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程であるガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程Ｄを含むことを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ｄの前に、ガラス化工程を経ていないハイドロゲルから自由水を除去してガラス化させて、ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ａを含む請求項１に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項３】
前記工程Ａは半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程である請求項２に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項４】
前記工程Ａと前記工程Ｄの間に、前記ハイドロゲル乾燥体を再水和させてガラス化後のハイドロゲルを得る工程Ｂと、
前記工程Ｂの後に、前記ガラス化後のハイドロゲルを再びガラス化させてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得る工程Ｃと、を含む請求項２又は３に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項５】
前記紫外線の総照射量が１００〜６０００ｍＪ／ｃｍ２である請求項１〜４のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項６】
前記半球状凸面及び前記半球状凹面が、哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有する請求項３〜５のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項７】
前記ハイドロゲルが細胞外マトリックス成分を含有する請求項１〜６のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項８】
前記細胞外マトリックス成分がブタ由来アテロコラーゲンである請求項７に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法を用いて得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜。
【請求項１０】
４００ｎｍにおける吸光度が０．０５〜０．３である請求項９に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
【請求項１１】
細胞外マトリックス成分を１ｃｍ２あたり０．１〜１０．０ｍｇ含有する請求項９又は１０に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
【請求項１２】
膜の厚さが１〜１０００μｍである請求項９〜１１のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
【請求項１３】
ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程Ｄ１を含むことを特徴とするガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料の製造方法。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜を乾燥して得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体。
【請求項１５】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のガラス化後のハイドロゲル膜に細胞が付着してなることを特徴とする細胞シート。
【請求項１６】
半球状凹面を有する鋳型と、該半球状凹面に対向して配置される半球状凸面を有する鋳型と、該凹面又は凸面を囲んで配置される壁面鋳型とを備えたことを特徴とする、ガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体、細胞シート、およびガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス成分を含有したハイドロゲルを、低温でゆっくりと乾燥させ、ガラス化工程を経た後に、このハイドロゲル乾燥体を再水和して得られるガラス化後のハイドロゲルが開示されている。ハイドロゲルをガラス化させることにより、適度な強度を保持したハイドロゲル乾燥体を得ることができる。また、ワイヤ、針金、ナイロン繊維等の支持体と一体化させて取り扱い性を高めたガラス化後のハイドロゲルが開示されている（特許文献１）。
【０００３】
またハイドロゲルに重力を利用した自由水の除去工程を導入することで得られる、糸状、管状、および棒状のハイドロゲル乾燥体、ならびに再水和して得られるガラス化後のハイドロゲルが報告されている（特許文献２）。
【０００４】
さらに、壁面鋳型を用いて、ハイドロゲル内の自由水の一部を基盤と壁面鋳型の隙間から流出させてハイドロゲルからの自由水の除去を促進させ、ゲル内の自由水を除去する時間を短縮させる技術が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−２２８７６８号公報
【特許文献２】特開２００７−２０４８８１号公報
【特許文献３】国際公開第２０１２／０２６５３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のガラス化した後に再水和して得られるガラス化後のハイドロゲルも、ある程度の強度と透明性を有していた。しかし、ハイドロゲルの強度を高める目的で細胞外マトリックス成分濃度を高めた場合などでは、ガラス化後のハイドロゲルが白濁する場合があった。したがって、適度な強度を有しつつも、従来よりもさらに高い透明度を併せ持つガラス化後のハイドロゲルの製造については、未だ検討の余地があった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、適度な強度を有しつつ高い透明度を併せ持つガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体、該ガラス化後のハイドロゲル膜を用いた細胞シート及びガラス化後のハイドロゲル膜の製造に用いる製造装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程を有することで、高い強度及び透明性を有するガラス化後のハイドロゲル膜が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する、紫外線を照射した後に再水和する工程を含むガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体、細胞シート、およびガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置を提供するものである。
【００１０】
（１）ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程Ｄを含むことを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（２）前記工程Ｄの前に、ガラス化工程を経ていないハイドロゲルから自由水を除去してガラス化させて、ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ａを含む前記（１）に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（３）前記工程Ａは半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程である前記（２）に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（４）前記工程Ａと前記工程Ｄの間に、前記ハイドロゲル乾燥体を再水和させてガラス化後のハイドロゲルを得る工程Ｂと、
前記工程Ｂの後に、前記ガラス化後のハイドロゲルを再びガラス化させてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得る工程Ｃと、を含む前記（２）又は（３）に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（５）前記紫外線の総照射量が１００〜６０００ｍＪ／ｃｍ２である前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（６）前記半球状凸面及び前記半球状凹面が、哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有する前記（３）〜（５）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（７）前記ハイドロゲルが細胞外マトリックス成分を含有する前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（８）前記細胞外マトリックス成分がブタ由来アテロコラーゲンである前記（７）に記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法。
（９）前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法を用いて得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜。
（１０）４００ｎｍにおける吸光度が０．０５〜０．３である前記（９）に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
（１１）細胞外マトリックス成分を１ｃｍ２あたり０．１〜１０．０ｍｇ含有する前記（９）又は（１０）に記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
（１２）膜の厚さが１〜１０００μｍである前記（９）〜（１１）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜。
（１３）ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程Ｄ１を含むことを特徴とするガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料の製造方法。
（１４）前記（９）〜（１２）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜を乾燥して得られることを特徴とするガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体。
（１５）前記（９）〜（１２）のいずれか一つに記載のガラス化後のハイドロゲル膜に細胞が付着してなることを特徴とする細胞シート。
（１６）半球状凹面を有する鋳型と、該半球状凹面に対向して配置される半球状凸面を有する鋳型と、該凹面又は凸面を囲んで配置される壁面鋳型とを備えたことを特徴とする、ガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法によれば、適度な強度と透明度を併せ持つガラス化後のハイドロゲル膜が得られる。
また、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は適度な強度と透明度を有しているので、生体移植材料をはじめとする優れた新規材料として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本明細書中における各工程、並びに各工程を経た後のゲル及びゲル乾燥体の呼称を説明した図である。
【図２】ガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置の一例を示す断面図である。
【図３】ガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置の一例を示す斜視図である。
【図４】本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の製造工程の第一実施形態を、模式的に示した図である。
【図５】実施例１〜５において得られたガラス化後のハイドロゲル膜（図中で「水和体」と表示した）及びそれを乾燥して得られた乾燥体（図中で「乾燥体」と表示した）、並びに比較例１において得られたガラス化後のハイドロゲル（図中で「水和体」と表示した）およびガラス化後のハイドロゲル再乾燥体（図中で「乾燥体」と表示した）の吸光度の測定結果を示した図である。
【図６】実施例１〜５において得られた各「ガラス化後のハイドロゲル膜」および比較例１において得られたガラス化後のハイドロゲルの透明度を比較した画像である。
【図７】実施例６における、半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造工程（工程Ａ）の一部を模式的に説明した図である。
【図８】実施例６における、半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造工程（工程Ａ）の一部を模式的に説明した図である。
【図９】実施例６における、半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造工程（工程Ｂ）を模式的に説明した図である。
【図１０】実施例６における、半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造工程（工程Ｃ〜Ｄ）を模式的に説明した図である。
【図１１】実施例６における、半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造工程（工程Ｃ〜Ｄ）を模式的に説明した図である。
【図１２】実施例７および実施例８における、ガラス化後のハイドロゲル膜の角膜上皮面への移植結果を示す画像である。
【図１３】実施例９および実施例１０における、ガラス化後のハイドロゲル膜の角膜実質層間への移植結果を示す画像である。
【図１４】実施例１１および実施例１２における、ガラス化後のハイドロゲル膜の角膜内皮面への移植結果を示す画像である。
【図１５】実施例１３における、平面状のガラス化後のハイドロゲル膜上、比較例２におけるガラス化後のハイドロゲル上、での角膜上皮細胞の培養結果を示す画像である。
【図１６】実施例１４における、半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜上での角膜内皮細胞の培養結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「ハイドロゲル」とは、高分子が化学結合によって網目状構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を指し、より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
【００１４】
本明細書中において、「ガラス化後のハイドロゲル」とは、ガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の工程を経て作製されたハイドロゲルのことを指す。
尚、本明細書中においては、ハイドロゲル膜の作製工程を詳細に説明するにあたり、当該ガラス化工程の直後であり再水和の工程を経ていないハイドロゲルの乾燥体に対しては、単に「ハイドロゲル乾燥体」とした。そして、当該ガラス化工程の後に再水和の工程を経て得られたゲルを「ガラス化後のハイドロゲル」として区別して表し、そのゲルをガラス化させて得られた乾燥体を「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」とした。また、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射する工程（後述の工程Ｄ１）を施して得られるものを「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射処理を施したハイドロゲル材料」とし、該ハイドロゲル材料に再水和する工程（後述の工程Ｄ２）を施して得られるゲルを「ガラス化後のハイドロゲル膜」とし、ガラス化後のハイドロゲル膜を乾燥させて得られた乾燥体を「ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体」とした。従って、「ガラス化後のハイドロゲル」及び「ガラス化後のハイドロゲル膜」は水和体である。本明細書中における各工程、並びに各工程を経た後のゲル及びゲル乾燥体の呼称を図１に示す。
【００１５】
《ガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法》
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
［第１実施形態］
本実施形態のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法は、
半球状凸面を有する鋳型と半球状凹面を有する鋳型との間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させて、前記ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ａ、を含む。
【００１６】
（工程Ａ）
ここで、半球状凸面を有する鋳型および半球状凹面を有する鋳型として、該鋳型を備えた製造装置の一例を図２に示す。図２左に示す製造装置１０は、下方に半球状凹面を有する半球状凹面鋳型１ａと、半球状凹面鋳型１ａの上方に半球状凹面鋳型１ａに対向して配置され、該凹面と対応する形状の半球状凸面を有する半球状凸面鋳型２ａと、該凹面を囲んで配置される壁面鋳型３とを備える。又は、下方と上方に配置される鋳型の凹面と凸面の組み合わせは逆でもよく、図２右に示すように、下方に半球状凸面鋳型２ｂと、半球状凸面鋳型２ｂの上方に配置され該凸面と対応する形状の凹面を有する半球状凹面鋳型１ｂとの組み合わせであってもよい。
【００１７】
壁面鋳型３は、上面、底面を有していない筒状の枠体とすることができ、壁面鋳型の形状は、所望のガラス化後のハイドロゲル膜の形状と同形状に設計することができる。具体的には、例えば円形のガラス化後のハイドロゲル膜を作製する場合には、壁面（枠）が環状のもの（円筒状）を使用することができる。また、矩形のガラス化後のハイドロゲル膜を作製する場合には、壁面（枠）が矩形上のもの（角筒状）とすることができる。図３に本発明の製造装置の一例である製造装置１０の斜視図を示す。
【００１８】
以下、工程Ａについて説明する。図４は、本実施形態のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法の一実施形態を例示した模式図である。
【００１９】
例えば、下方に半球状凹面鋳型１ａを配置し、該凹面を囲むように半球状凹面鋳型１ａの上に壁面鋳型３を配置し、壁面鋳型内部にゾルを注入して、完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを保持させ、上方に半球状凸面鋳型２ａを配置することで、半球状凸面鋳型２ａと半球状凹面鋳型１ａとの間に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルを配置させることができる。
【００２０】
このとき半球状凸面鋳型２ａと半球状凹面鋳型１ａとの間に、さらに支持体を配置してもよい。支持体としては、ナイロン膜、ワイヤ、針金等によって成形した環状体や、ガーゼ、その他の織成体等からなる網状体等の適宜なものであってよく、生体吸収体としてもよい。その使用態様に応じてその形状、大きさ、素材等を選択すればよい。
【００２１】
ガラス化後のハイドロゲル膜の作製に用いられる細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨなどを選択しハイドロゲルを作製することが可能である。複数種の原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣したガラス化後のハイドロゲル膜を得ることができる。
【００２２】
また、ハイドロゲルの作製に用いられる合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。ハイドロゲルの量は、作製するガラス化後のハイドロゲル膜の厚さを考慮して調節することができる。
【００２３】
なかでも、ハイドロゲルの原料はコラーゲンが好ましく、コラーゲンゲルを用いる場合には、コラーゲンゾルを、半球状凹面鋳型１ａ上に配置された壁面鋳型３内部に注入し、保温してゲル化を誘導させたものを使用することができる。
【００２４】
更に、コラーゲンのなかでもより好ましいハイドロゲルの原料として、ブタ由来アテロコラーゲンを例示できる。ブタ由来のコラーゲンのゾルは、同濃度のウシ由来のネイティブコラーゲンのゾルよりも粘性が低いため、ゾルの濃度を高めた場合でも均一な状態のゲルを製造することができ、さらにウシ由来のコラーゲンのように反芻動物由来基準に抵触する恐れも無い。また、アテロコラーゲンは、ネイティブコラーゲンよりも、炎症反応やアレルギー反応を起こしにくいコラーゲンである。そのため、ブタ由来アテロコラーゲンを用いることで、生体移植材料として非常に優れたガラス化後のハイドロゲル膜を製造することができる。
【００２５】
ブタアテロコラーゲンゾルを使用する場合を例に説明すると、コラーゲンゾルは、至適な塩濃度を有するものとして、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ)、基礎培養液、無血清培養液、あるいは血清含有培養液などで調製することができる。また、コラーゲンゲル化の際の溶液のｐＨは、６から８程度が好ましい。
【００２６】
特に無血清培養液を用いる場合、他動物血清成分中に含まれる移植に適さない物質（抗原、病原因子等）がゲル膜に含まれることを回避できるため、生体移植材料としてより好ましいガラス化後のハイドロゲル膜とすることができる。
【００２７】
ここで、コラーゲンゾルの調製は４℃で行うのが望ましい。その後、ゲル化する際の保温は、用いるコラーゲンの動物種に依存したコラーゲンの変性温度より低い温度でなければならないが、一般的には２０℃〜３７℃の温度で数分から数十分でゲル化できる温度に保温して行うことができる。
【００２８】
また、コラーゲンの濃度が０．２％以上のアテロコラーゲンゾルはゲル化が弱すぎることがなく、コラーゲンの濃度が０．８％以下のアテロコラーゲンゾルは均一化も容易となる。したがって、アテロコラーゲンゾルのコラーゲンの濃度は０．４〜０．６％が好ましく、より好ましくは０．５％程度である。
【００２９】
このように調整されたアテロコラーゲンゾルを壁面鋳型３内部に注入する。前記濃度のアテロコラーゲンゾルは粘性を有しているため、アテロコラーゲンゾルを壁面鋳型３内部に注入して迅速に保温すれば、アテロコラーゲンゾルは半球状凹面鋳型１ａと壁面鋳型３との間隙から流出することなく数分以内にゲル化することができる。
【００３０】
そして、上記のように、下方に半球状凹面鋳型１ａを配置し、該凹面を囲むように半球状凹面鋳型１ａの上に壁面鋳型３が配置されると、両者は当接状態となるが、物理的には半球状凹面鋳型１ａと壁面鋳型３の表面が当接する面の細かな凸凹により、自由水を流出させることができる程度のわずかな隙間が形成されることになる。そうすると、前記の完全にはゲル化していない状態のハイドロゲルがゲル化された後、当該ハイドロゲル内の自由水を除去することができる。
【００３１】
このとき、上方に配置される半球状凸面鋳型２ａおよび半球状凹面鋳型１ｂは、図２及び図３中で示されるように、壁面鋳型３の筒内に挿入可能な棒状の形態であってもよい。このような形態とすることで、棒状の半球状凸面鋳型２ａ又は半球状凹面鋳型１ｂが筒内を自重により落下し、ハイドロゲルに一定の圧力をかけることができ、より効率的に自由水を流出させることが可能となる。上方に配置される棒状の鋳型の重さは、ハイドロゲルの種類や濃度により適宜定められる。
【００３２】
次いで、ハイドロゲル乾燥体を得るため、ハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲル内の自由水を完全に除去し、さらに結合水の部分除去を進行させる。この際、ゲルの乾燥を促進させるため、半球状凹面鋳型１ａ上にハイドロゲルを残して、上方に配置された半球状凸面鋳型２ａおよび壁面鋳型３を取り除くことが好ましい。ハイドロゲルは自由水が流出しているために、半球状凹面鋳型１ａ上で変形等することなく、半球状凸面鋳型２ａおよび壁面鋳型３に保持された形状を維持することができる。
【００３３】
このガラス化工程（ハイドロゲル内の自由水を完全に除去した後に、結合水の部分除去を進行させる工程）の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れたガラス化後のハイドロゲル膜を得ることができる。なお、必要に応じて短期間のガラス化後に再水和して得たガラス化後のハイドロゲル膜をＰＢＳ等で洗浄し、再度ガラス化することもできる。
【００３４】
乾燥方法としては、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、１０℃４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、もしくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等の方法を例示することができる。
【００３５】
前記半球状凸面及び前記半球状凹面は、哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有していることが好ましい。これにより、製造されたガラス化後のハイドロゲル膜を哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有するゲル膜とすることができる。哺乳動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有するゲル膜は、該動物の眼球の角膜移植材料として好適に用いることができる。前記曲率半径は、移植先の眼球の形状に合わせて適宜定めることができるため、移植時のゲル膜と眼球との適合性を格段に高めることが可能である。ここでいう「角膜に対応する」とは、角膜の層の全ての部分に対応することを指し、角膜前面に対してでも、角膜後面に対してでもよい。またここでいう「対応する」とは、移植先の眼球において、本来の角膜の曲率半径とほぼ一致していることを意味し、「ほぼ一致」するとは、角膜移植材料として用いた場合、移植先の任意の眼球部分の面に沿って良好に付着できる一致の状態を指す。
【００３６】
本実施形態のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法は、工程Ａの後に、
前記ハイドロゲル乾燥体を再水和させてガラス化後のハイドロゲルを得る工程Ｂと、
前記工程Ｂの後に、前記ガラス化後のハイドロゲルを再びガラス化させてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得る工程Ｃと、
ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程Ｄ１と該工程Ｄ１を経て作製されたガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線照射を施したハイドロゲル材料を再水和する工程Ｄ２と、を含む。なお、以下の本実施形態の説明では、工程Ｄ１および工程Ｄ２からなる工程を工程Ｄとして説明する。
本実施形態において、工程Ｄにおいて紫外線を照射する対象の「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」は、工程Ａ、工程Ｂ及び工程Ｃの順で作製された「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」、或いはその後、更に、工程Ｄ及び工程Ｃの順を経て作製された「ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体」である。
以下、各工程について説明する。
【００３７】
（工程Ｂ）
ハイドロゲル乾燥体をＰＢＳや使用する培養液などで再水和することでガラス化後のハイドロゲルを得ることができる。ここで、再水和する液体には、生理活性物質などの各種の成分が含まれていてもよく、例えば、生理活性物質としては、抗生物質をはじめとする各種医薬品、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等が挙げられる。また、これらを複数含有させることも可能である。
【００３８】
（工程Ｃ）
乾燥方法は、工程Ａと同様に、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。ガラス化後のハイドロゲルを再乾燥させることで、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得ることができる。
【００３９】
（工程Ｄ）
紫外線の照射には、公知の紫外線照射装置を使用することができる。
ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、単位面積あたりの総照射量が、１００〜６０００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０００〜４０００ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましく、２２００〜３２００ｍＪ／ｃｍ２であることがさらに好ましい。この範囲の照射量であると、ガラス化後のハイドロゲル膜の透明度および強度を特に好ましいものとすることができる。
【００４０】
また、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射は、複数回繰り返し行ってもよい。ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、１度目の紫外線の照射を行った後に、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の再水和および再ガラス化の工程を行い、その後２度目以降のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射を行うことが好ましい。
単位面積あたりの紫外線総照射量が同一であるとき、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射を、複数回に分割して繰り返して行うことで、ガラス化後のハイドロゲル膜の透明度および強度をより高めることができる。また分割の回数は多いほど好ましい。例えば、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射の単位面積あたりの総照射量が、１０００〜４０００ｍＪ／ｃｍ２の範囲であるとき、該範囲内での照射回数が２〜１０回であることが好ましく、２〜６回であることがより好ましい。
また、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、紫外線の照射部位を、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の一方の面と他方の面（上面と下面）とに分けて照射して、その総照射量を、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体への単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
【００４１】
紫外線の照射を、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に行うことで、ガラス化後のハイドロゲル膜の強度と透明度が高まることは、ガラス化後のハイドロゲル膜内の高分子化合物同士が、紫外線によって架橋されるからと考えられる。つまり、当該操作により、高い透明度と強度をガラス化後のハイドロゲル膜に維持させることができると考えられる。
【００４２】
本実施形態によれば、適度な強度と透明度を併せ持つ半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜が得られる。
【００４３】
《ガラス化後のハイドロゲル膜》
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法によって得られる本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、以下に説明するような物性を有することが好ましい。
【００４４】
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、４００ｎｍにおける吸光度が０．０５〜０．３であることが好ましく、０．０５〜０．２であることがより好ましく、０．０５〜０．１２であることがさらに好ましい。前記吸光度が上記範囲にあるガラス化後のハイドロゲル膜は、透明度が非常に高いため、高い透明度が要求される材料、例えば、角膜代替物や角膜細胞移植用キャリアとして特に好適である。
【００４５】
さらに、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜が優れる点として、物質透過性を挙げることができる。角膜には血管が存在せず、角膜への酸素、栄養等の物質交換は角膜の周囲の涙や前眼房水より行われる。したがって、角膜への移植に相応しい材料の条件としては、物質透過性に優れることが挙げられる。その点、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、分子量２００ｋＤａ以上の高分子を透過することができるため、角膜の細胞への物質交換を妨げることのない、角膜への移植に大変適した材料である。
【００４６】
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、使用時に破れる恐れが低く、実用上大変優れるものである。特に上記のような角膜代替物や角膜細胞移植用キャリアとして用いる場合、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の強度は、移植操作に耐え得る強度であり角膜本来の強度とも近しいとの観点から好ましい。
【００４７】
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、細胞外マトリックス成分を該膜の単位面積１ｃｍ2あたり０．１〜１０．０ｍｇ含有することが好ましく、０．５〜５．０ｍｇ含有することがより好ましく、１．０〜４．０ｍｇ含有することがさらに好ましい。特に、アテロコラーゲンを１ｃｍ2あたり０．２５〜５．０ｍｇ含有することで、強度および透明性において、好ましいガラス化後のハイドロゲル膜とすることができ、１．５〜２．５ｍｇ含有させることで、強度および透明性において、より好ましいガラス化後のハイドロゲル膜とすることができる。なお、「該膜の単位面積１ｃｍ2あたり」とは、膜の厚さを任意として、該膜片１ｃｍ2あたりに含有される成分を指す。
【００４８】
本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の厚さは特に制限されないが、１〜１０００μｍであることが好ましく、１〜５００μｍであることがより好ましく、２．５〜１００μｍであることがさらに好ましく、５．０〜５０．０μｍであることが特に好ましい。このようなゲル膜の厚さは、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜を角膜代替物や角膜細胞移植用キャリアとして用いる場合にも、好適な厚さであるため好ましい。
【００４９】
《細胞シート》
本発明の細胞シートは、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜に細胞が付着してなるものである。本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、紫外線照射により強度および透明性が増すことに加え、細胞付着性も上昇する。そのため、細胞が付着してなる細胞シートとしても、従来品より優れるものである。当該細胞は、細胞シート上で培養されてもよい。本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は生体適合性に優れるので、例えば、ゲル膜に自己由来の細胞が付着した細胞シートは、移植材料として用いることができる。
【００５０】
細胞シートに付着する細胞の種類や状態は特に限定されず、例えば、被蓋上皮細胞、腺上皮細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、神経細胞、グリア細胞等が挙げられる。また、本発明の細胞シートに含まれるゲル膜が角膜代替物や角膜細胞移植用キャリアとして好適であるとの観点からは、当該細胞は角膜上皮細胞、角膜内皮細胞等の角膜由来の細胞であることが好ましい。ここで、用いる細胞は正常な成熟分化細胞に限定されるものではなく、胚性幹（ＥＳ；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞や体性幹（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞や人工多能性幹（ｉＰＳ；Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ）細胞などの未分化細胞、癌細胞などの病巣由来細胞、あるいは外来性遺伝子を導入したような形質転換細胞であってもよい。また、２種類以上の異なった種類や状態の細胞を組み合わせて用いてもよい。
【実施例】
【００５１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造》
［実施例１］
＜支持体の準備＞
ナイロンメンブレン （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｔ＃ＲＰＮ１７８２Ｂ）を支持体くり抜き機（森下製版、刃：直径２４ｍｍ〜３３ｍｍ）でくり抜き、外径３３ｍｍ、内径２４ｍｍの支持体を製作した。直径３５ｍｍペトリディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ＃３５１００８）に、７０％エタノールを入れ、ペトリディッシュ中に作製した支持体を１０分程度浸し、支持体を滅菌した。７０％エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに３ｍＬのＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ８５３７、Ｌｏｔ＃ＲＮＢＢ９２３６）を入れ、支持体を洗浄した。このＰＢＳによる洗浄は計３回繰り返した。ペトリディッシュからＰＢＳを取り除き、代わりに３ｍＬの無血清培養液（Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ、以下ＳＦＭと云う）（ＤＭＥＭ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ, Ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ.＃１１８８５， Ｌｏｔ＃１０３６０００）, ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ＃１５６３０−０８０）, １００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ ａｎｄ １００ｕｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ （ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ＃１５１０４））を入れ使用するまでの数１０分間ＳＦＭに浸しておいた。
【００５２】
＜平面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体の準備＞
＜工程Ａ＞
氷上で冷却した５０ｍＬコニカルチューブに３ｍＬの前記ＳＦＭと、３ｍＬの１．０％ブタ由来アテロコラーゲン溶液（ＮＭＰ コラーゲンＰＳ 溶液、１．０２%，Ｌｏｔ＃ＰＳＢＪＣ０５Ｓ, ｃｉｃａ ｌｏｔ. Ｉ３Ｘ０５）を加え、均一に混合した混合液を作製した。直径６０ｍｍの疎水性ポリスチレン製培養シャーレ（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ、＃３５３００２）の底表面を基板とし、その上面に直径５０ｍｍの円形に切断したシート状のポリエチレンビニルを乗せた。その上に内径が３４ｍｍの筒状壁面鋳型を設置した。さらに筒状壁面鋳型内のポリエチレンビニル上に、ＳＦＭで平衡化した前記支持体を乗せた。すなわち、底面が基板上に乗せたポリエチレンビニル、壁面が前記筒状壁面鋳型である容器とした。その容器の中に前記ＳＦＭと１．０％ブタ由来アテロコラーゲンとの等量混合液４ｍＬを流し入れ、クリーンベンチ内に３０分間静置させた。
５％ＣＯ２／９５％空気存在下、３７℃の条件で２時間静置した。
壁面鋳型を上下にわずかに動かすことでアテロコラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除し、ゲル内の自由水を鋳型の外側に流出させた。ゲルから流出した自由水を回収したのち、再び壁面鋳型を元に戻して、基板上に乗せたポリエチレンビニル上のゲルを鋳型ごとカルチャーパルＣＯ２（コアフロント、ＣＯ２ ２．５Ｌ）で満たした２．５Ｌ標準型気密角形ジャーに入れ、４℃で２日間静置し、当該ゲルから自由水と気泡を除去した。なお、当該自由水は基板上に乗せたポリエチレンビニルと壁面鋳型の隙間から流出し、ゲルは鋳型の筒内部に保持されていた。
再度コラーゲンゲルと壁面鋳型間の接着を解除し、ゲルから流出した自由水を回収した。次いで、壁面鋳型を完全に取り外し、ゲルを１０℃、湿度４０％（４０％ＲＨ）の条件下で２日間静置し、乾燥させ、平面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体を得た。
【００５３】
実施例１においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程（工程Ｄ）を４回に分けて繰り返し行った。それに伴い、工程Ｃも４回繰り返した。なお、各工程Ｃにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のＵＶが照射されるようにした。
【００５４】
（工程Ｂ〜Ｄ：１回目）
＜工程Ｂ＞
前記基板上に乗せたポリエチレンビニルと、その上面に形成された前記平面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体とを前記直径６０ｍｍペトリディッシュに入れ、さらに３７℃に加温した前記ＰＢＳを５ｍＬ注いで当該アテロコラーゲンゲル乾燥体を浸し、１０分間静置し、当該乾燥体を再水和させ、さらに、前記ＰＢＳの５ｍＬを新しいＰＢＳに交換して同様に１０分間静置する操作を２回繰り返し、ＰＢＳで平衡化された、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲルを得た。
＜工程Ｃ＞
得られたブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲルを１０℃、４０％ＲＨの条件下で１日間静置して乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た。
＜工程Ｄ＞
ＵＶリンカー（フナコシ、ＦＳ−１５００）を用いて、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に1回目のＵＶ照射（６００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。このＵＶ照射後の当該乾燥体を、前記ＰＢＳを５ｍＬ入れた前記直径６０ｍｍペトリディッシュに移し、１０分間静置し、再水和を行った。
【００５５】
（工程Ｃ〜Ｄ：２回目）
１回目のＵＶ照射後に得られたブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を１０℃、４０％ＲＨの条件下で１日間静置して乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た（工程Ｃ）。その後、１回目と同様にして、工程Ｄを行った。
（工程Ｃ〜Ｄ：３回目）
２回目と同様にして工程Ｃを、１回目と同様にして工程Ｄを行った。
（工程Ｃ〜Ｄ：４回目）
２回目と同様にして工程Ｃを、１回目と同様にして工程Ｄを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例１の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Ｃを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例１の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。
【００５６】
［実施例２］紫外線の総照射量２４００ｍＪ／ｃｍ２（１２００ｍＪ／ｃｍ２×２回）
実施例２においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程（工程Ｄ）を１２００ｍＪ／ｃｍ２ずつ２回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Ｃも２回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例２の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Ｃを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例２の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例１と同様、各工程Ｃにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、該ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のＵＶが照射されるようにした。
【００５７】
［実施例３］紫外線の総照射量１６００ｍＪ／ｃｍ２（８００ｍＪ／ｃｍ２×２回）
実施例３においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程（工程Ｄ）を８００ｍＪ／ｃｍ２ずつ２回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Ｃも２回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例３の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Ｃを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例３の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例１と同様、各工程Ｃにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のＵＶが照射されるようにした。
【００５８】
［実施例４］紫外線の総照射量３２００ｍＪ／ｃｍ２（８００ｍＪ／ｃｍ２×４回）
実施例４においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程（工程Ｄ）を８００ｍＪ／ｃｍ２ずつ４回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Ｃも４回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例４の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Ｃを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例４平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例１と同様、各工程Ｃにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のＵＶが照射されるようにした。
【００５９】
［実施例５］紫外線の総照射量３２００ｍＪ／ｃｍ２（１６００ｍＪ／ｃｍ２×２回）
実施例５においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程（工程Ｄ）を１６００ｍＪ／ｃｍ２ずつ２回に分けて繰り返し行い、それに伴い、工程Ｃも２回繰り返し、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例５の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。さらに、工程Ｃを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例５の平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。なお、実施例１と同様、各工程Ｃにおいてガラス化後のハイドロゲル再乾燥体の上面と下面を逆さにし、当該ハイドロゲル再乾燥体の両表面に等量のＵＶが照射されるようにした。
【００６０】
［比較例１］
実施例１と同様に工程Ａ及び工程Ｂを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する比較例１のガラス化後のハイドロゲルを得た。さらに、工程Ｃを行い、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する比較例１の平面状のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た。
【００６１】
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜の透明度の測定》
実施例１〜５で作製したガラス化後のハイドロゲル膜及びそれらの乾燥体、並びに比較例１で作製したガラス化後のハイドロゲル及びガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に対して、分光光度計（日本分光、Ｖ−５５０）を用い、フィルムフォルダ（日本分光、ＦＬＨ−２６７）に挿入して、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６２】
実施例１〜５のガラス化後のハイドロゲル膜及びそれらの乾燥体、並びに比較例１のガラス化後のハイドロゲル及びガラス化後のハイドロゲル再乾燥体における透明度の測定結果を図５に示す。また、測定に用いた各実施例のガラス化後のハイドロゲル膜及び比較例のガラス化後のハイドロゲル（上段：背景が黒紙、下段：背景の右上が黒紙、左上が白紙、下半分が文字）の画像を図６に示す。
図５に示された吸光度の値から明らかなように、工程Ｄの紫外線照射を経て製造された実施例１〜５のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体は、工程Ｄの紫外線照射を経ずに製造された比較例１のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体と比較し、著しく透明度が上昇していた。また、図５に示された吸光度の値および図６に示された画像から明らかなように、工程Ｄの紫外線照射を経て製造された実施例１〜５のガラス化後のハイドロゲル膜は、工程Ｄの紫外線照射を経ずに製造された比較例１のガラス化後のハイドロゲルと比較して、著しく透明度が上昇していた。
【００６３】
また、特に、実施例１及び実施例２の結果から、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に対する紫外線の総照射量が２４００ｍＪ／ｃｍ２付近の値の時に最もガラス化後のハイドロゲル膜の透明度が高いことがわかる。
【００６４】
さらに、意外なことに、実施例１と実施例２との比較、及び実施例４と実施例５との比較によれば、同量の紫外線の照射エネルギーを与えた場合には、紫外線の照射を複数回に分けて行った場合の方が、よりブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜の透明度を高められることが判明した。
【００６５】
以上の結果から明らかなように、透明性に優れたガラス化後のハイドロゲル膜及びその乾燥体を製造する方法が確立できた。
【００６６】
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の製造》
［実施例６］紫外線の総照射量２４００ｍＪ／ｃｍ２（６００ｍＪ／ｃｍ２×４回）
＜鋳型の準備＞
図３で示したものと同様の半球状凸面鋳型、半球状凹面鋳型、および壁面鋳型を、７０％エタノールを吹き付けて滅菌し、その後クリーンベンチ内で風乾させた。
【００６７】
＜支持体の準備＞
ナイロンメンブレンを支持体くり抜き機（森下製版、刃：直径１１ｍｍ〜１４ｍｍ）でくり抜き、外径１４ｍｍ、内径１１ｍｍの支持体を製作した。直径３５ｍｍペトリディッシュに、７０％エタノールを入れ、ペトリディッシュ中に作製した支持体を１０分程度浸し、支持体を滅菌した。７０％エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに３ｍＬのＰＢＳを入れ、支持体を洗浄した。このＰＢＳによる洗浄は計３回繰り返した。ペトリディッシュからＰＢＳを取り除き、代わりに３ｍＬのＳＦＭを入れ使用するまでの数１０分間ＳＦＭに浸しておいた。
次いで、氷上で冷却した５０ｍＬコニカルチューブに、１ｍＬの前記ＳＦＭと、１ｍＬの１．０％ブタ由来アテロコラーゲン溶液を加え、均一に混合した混合液に前記支持体を浸し、支持体をＳＦＭとブタ由来アテロコラーゲンの均一混合液でコーティングした。
【００６８】
＜工程Ａ＞
前記のとおり作製し、ＳＦＭとブタ由来アテロコラーゲンの均一混合液でコーティングされた支持体を半球状凹面鋳型の上面に、半球状凹面鋳型の凹面部分を支持体で囲むようにして乗せた。
前記半球状凹面鋳型に乗せられた支持体の外径（１４ｍｍ）よりも大きな内径（１５ｍｍ）を有する筒状の壁面鋳型を前記半球状凹面鋳型の凹面を囲むように設置させた。すなわち、底面が半球状凹面鋳型、壁面が筒状の壁面鋳型であって、底面と壁面が分離可能な容器とした。その容器中に０．７ｍＬの前記ＳＦＭとブタ由来アテロコラーゲンの均一混合液を流し入れ、クリーンベンチ内に１５分間静置させた。この様子を図７に示す。１５分の静置後、完全にはゲル化せずにゲル化進行状態のブタ由来アテロコラーゲンゲルが得られたことを確認した。
次いで、この完全にはゲル化せずにゲル化進行状態のブタ由来アテロコラーゲンゲルが入った筒内部に凸面を有する棒状の自重落下型の半球状凸面鋳型を入れ、底面に配置した前記半球状凹面鋳型と該凹面にかみ合う自重落下型の半球状凸面鋳型とで完全にはゲル化せずにゲル化進行状態のブタ由来アテロコラーゲンゲルを挟み込むようにして当該ゲルを加圧し、５％ＣＯ２／９５％空気存在下、３７℃の条件で２時間静置することで完全にゲル化した。次いで、自重落下型の半球状凸面鋳型を取り外し、ゲルを半球状凹面鋳型および壁面鋳型ごとカルチャーパルＣＯ２（コアフロント、ＣＯ２ ２．５Ｌ）で満たした２．５Ｌ標準型気密角形ジャー（コアフロント）に入れ、４℃で一晩（約１６時間）静置し、当該ゲルから自由水と気泡を除去した。なお、当該自由水は半球状凹面鋳型と壁面鋳型の隙間から流出し、ゲルは鋳型の筒内部に保持されていた。
壁面鋳型を上下にわずかに動かすことで当該ゲルと壁面鋳型間の接着を解除し、当該ゲルから自由水を鋳型の外側に流出させた。当該ゲルから流出した自由水を回収したのち、壁面鋳型を元に戻して、当該ゲルを鋳型ごと前記カルチャーパルＣＯ２で満たした２．５Ｌ標準型気密角形ジャーに入れ、４℃で３日間静置し、当該ゲルから自由水と気泡をさらに除去した。この様子を図７に示す。
再度当該ゲルと壁面鋳型間の接着を解除して壁面鋳型を除去した後、当該ゲルから流出した自由水を回収した。次いで、半球状凹面鋳型上の当該ゲルを１０℃、４０％ＲＨの条件下で１日間風乾機（エスペック,ＰＤＲ−３ＫＰ）を用いて乾燥させ、ガラス化後の半球面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体を得た。この様子を図８に示す。
【００６９】
実施例６においては、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射した後に再水和する工程（工程Ｄ）を４回に分けて繰り返し行った。それに伴い、工程Ｃも４回繰り返した。
【００７０】
（工程Ｂ〜Ｄ：１回目）
＜工程Ｂ＞
前記半球状凹面鋳型と、半球状凹面鋳型上面に形成された前記ガラス化後の半球面状のブタ由来アテロコラーゲンゲル乾燥体（工程Ａで作製）とを前記直径３５ｍｍペトリディッシュに入れ、さらに３７℃に加温した前記ＰＢＳを４ｍＬ注いで当該ゲル乾燥体を浸し、１０分間静置し、当該ゲル乾燥体を再水和させた。半球状凹面鋳型から剥がれた再水和された半球面状のガラス化後のハイドロゲルを、前記ＰＢＳの４ｍＬを新しいＰＢＳに交換して同様に１０分間静置する操作を２回繰り返すことで、ＰＢＳで平衡化された、半球面状のガラス化後のハイドロゲルを得た。この様子を図９に示す。
＜工程Ｃ＞
得られた半球面状のガラス化後のハイドロゲルを半球状凸面鋳型上に乗せ１０℃、４０％ＲＨの条件下で１日間静置し当該ゲルを乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体を得た。
＜工程Ｄ＞
ＵＶリンカー（フナコシ、ＦＳ−１５００）を用いて、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に1回目のＵＶ照射（６００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。なお、当該再乾燥体へのＵＶ照射は、当該再乾燥体を半球状凸面鋳型上に乗せた状態で行った。この様子を図１０に示す。このＵＶ照射後の当該再乾燥体を、前記ＰＢＳを５ｍＬ入れた前記直径６０ｍｍペトリディッシュに移し、１０分間静置し、再水和を行った。
【００７１】
（工程Ｃ〜Ｄ：２回目）
１回目のＵＶ照射後に得られたブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜を半球状凹面鋳型上に静置し、１０℃、４０％ＲＨの条件下で１日間静置して乾燥させ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜再乾燥体を得た（工程Ｃ）。
その後、今度は半球状凹面鋳型上に当該ゲル膜を載せて行った以外は、１回目と同様にして、工程Ｄを行った。この様子を図１０に示す。
（工程Ｃ〜Ｄ：３回目）
２回目と同様にして工程Ｃを、今度は半球状凸面鋳型上にて１回目と同様にして工程Ｄを行った。この様子を図１１に示す。
（工程Ｃ〜Ｄ：４回目）
２回目と同様にして工程Ｃを、今度は半球状凹面鋳型上にて１回目と同様にして工程Ｄを行い、実施例６のブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜を得た。この様子を図１１に示す。さらに、工程Ｃを行い、実施例６のブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体を得た。
【００７２】
以上の結果から明らかなように、半球面状であって透明性に優れた、ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜及びその乾燥体を製造する方法を確立できた。
【００７３】
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜のウサギ眼球角膜への移植》
実施例１〜６のガラス化後のハイドロゲル膜は、比較例１の従来のガラス化後のハイドロゲルよりも遥かに高い透明度を有していた。したがって、生体移植材料のなかでも、特に高い光透過性と強度が要求される眼球への移植材料として特に好適であると考えられた。
【００７４】
＜ウサギ角膜上皮面へのブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜の移植＞
［実施例７］
ウサギ角膜上皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例１で作製）の移植手術を行った。角膜実質から前方（直径５ｍｍの円状、厚み約２００μｍ）を切除、ＰＢＳ（−）を用いて３７℃で５〜１０分放置し再水和し支持体から切り離した直径８ｍｍの当該ゲル膜を移植した。
［実施例８］
ウサギ角膜上皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例６で作製）の移植手術を行った。角膜実質から前方（直径５ｍｍの円状、厚み約２００μｍ）を切除、ＰＢＳ（−）を用いて３７℃で５〜１０分放置し再水和し支持体から切り離した直径８ｍｍの当該ゲル膜を移植した。
【００７５】
移植から１ヶ月後の、実施例７および実施例８でのウサギ角膜の様子を図１２に示す。
実施例１で作製した平面状のゲル膜は、移植先の眼球面と形状が異なるためにゲル膜に皺が発生してしまっていた。
一方、実施例６で作製した半球面状のゲル膜は、被験者動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有し角膜形状に適合しているため、ゲル膜に皺が発生することが無く、眼球により良好に付着していた。
＜ウサギ角膜実質層間へのブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜の移植＞
［実施例９］
ウサギ角膜実質層間へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例１で作製）の移植手術を行った。角膜実質を深さ約２００μｍで層間剥離し、ＰＢＳ（−）を用いて３７℃で５〜１０分放置し再水和し支持体から切り離した直径８ｍｍの当該ゲル膜を層間に移植した。
［実施例１０］
ウサギ角膜実質層間へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例６で作製）の移植手術を行った。角膜実質を深さ約２００μｍで層間剥離し、ＰＢＳ（−）を用いて３７℃で５〜１０分放置し再水和し支持体から切り離した直径８ｍｍの当該ゲル膜を層間に移植した。
移植から４ヶ月後の、実施例９と実施例１０のウサギ角膜の様子を図１３に示す。
実施例９と実施例１０で移植された両ゲル膜ともに、透明性が維持されており、炎症惹起も見られなかった。したがって、実施例１及び実施例６のガラス化後のハイドロゲル膜は、生体移植材料として大変優れていることがわかる。
【００７６】
＜ウサギ角膜内皮面へのブタ由来アテロコラーゲンを含有するガラス化後のハイドロゲル膜の移植＞
［実施例１１］
ウサギ角膜内皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例１で作製）の移植手術を行った。角膜切開層より、支持体から切り離した直径６ｍｍ、厚み２０μｍの当該ゲル膜を挿入し、エアタンポナーデにより角膜後面に付着させた（ｎ＝４）。
［実施例１２］
ウサギ角膜内皮面へ、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例６で作製）の移植手術を行った。角膜切開層より、支持体から切り離した直径６ｍｍ、厚み２０μｍの当該ゲル膜を挿入し、エアタンポナーデにより角膜後面に付着させた（ｎ＝４）。
【００７７】
角膜内皮面への移植に際しては、ゲル膜をストロー状の器具内で折りたたむようにして保持し、内皮面へ付着させる際には再び展開するようにして移植させた。実施例１および実施例６のガラス化後のハイドロゲル膜はこのような手術操作における一定の物理的ストレスに耐えうる十分な強度を有しており、眼科手術の実用性の観点からも大変優れた材料である。
【００７８】
移植直後の、実施例１１および実施例１２でのウサギ角膜の様子を図１４に示す。
実施例１１および実施例１２で移植された両ゲル膜ともに、透明性が維持されており、炎症惹起も見られなかった。したがって、ブタ由来アテロコラーゲンを含有する実施例１及び実施例６のガラス化後のハイドロゲル膜は、生体移植材料として大変優れていることがわかる。
【００７９】
角膜内皮の細胞は一旦障害を受けると、自然には治癒されない。水疱性角膜症に代表される角膜内皮障害の患者数は多く、内皮細胞の移植技術への期待は大変高い。実施例１および実施例６のゲル膜は角膜内皮再生医療に使用可能な、大変有用な材料であることが確認された。
【００８０】
ただし、実施例１で作製した平面状のゲル膜は、移植先の角膜内皮面との形状が異なるために後面付着時にゲル膜に皺が発生してしまっていた。また、実施例１で作製した平面状のゲル膜は術後角膜後面より剥離した。
一方、実施例６で作製した半球面状のゲル膜は、被験動物の眼球の角膜に対応する曲率半径を有し角膜形状に適合しているため、ゲル膜に皺が発生することが無く角膜後面に付着していた。また、実施例６で作製した半球面状のゲル膜は術一ヵ月後においても剥離せず角膜後面に沿って付着していることが確認された。
【００８１】
ウシ由来のコラーゲンは、反芻動物由来でありＢＳＥ（牛海綿状脳症）のほか未知の異種感染症リスクの存在が指摘されており、厳重な管理が必要である。また、コラーゲンがネイティブコラーゲンである場合は、抗原となり得るテロペプチドが分子端に存在するために移植後に炎症がより強く引き起こされる可能性がある。一方で、実施例１〜６のハイドロゲル膜は、抗原性がより弱いと考えられるブタ由来アテロコラーゲンを用いて作製可能であり、ウシ由来と比較して反芻動物に存在するＢＳＥのリスクが存在しないため人への生体移植材料として産業化するにあたり、大変好適である。
【００８２】
アテロコラーゲンを用いてゲル膜を作製した場合、ネイティブコラーゲンを用いた場合と比べ、ゲルの強度が弱くなるという問題があった。しかし、本発明のガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法では、ガラス化後のハイドロゲル再乾燥体に紫外線を照射する工程を含むことにより、角膜への移植材料としても十分利用可能な程度まで、強度を高めることができた。
【００８３】
従来、実施例７〜１２で行ったような角膜手術では、移植材料として羊膜を用いていた。羊膜は完全には透明ではない。また１人のドナーから得られる羊膜の面積では、最大２０人程度の移植しかできず、医療機器として実用化するためには小ロットであり、安全性や有効性を保証するための検査を施すと移植に使える枚数が極めて少なくなり費用が過大になる問題があった。また移植用の小片とするとほぼ平面状の膜となるため、角膜形状に適合していなかった。
実施例６で作製したブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜は、被移植者の眼球面に合わせてゲル膜を大量に作製可能であり、さらにブタ由来アテロコラーゲン以外の他個体由来の生体物質を用いなくともよい。したがって、本発明に係るガラス化後のハイドロゲル膜は、従来用いられてきた羊膜にある欠点を持たない優れた移植材料である。
【００８４】
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜上での上皮細胞培養》
ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体（実施例１で作製）を再水和させ、チャンバー（トランズウェル１２ウェルプレート３４６０、コーニング）上のメンブレンに付着させ、いったん乾燥させることでメンブレンにガラス化後のハイドロゲル膜を固定させた。チャンバーをセットし、１．５ｍＬの細胞培養液をチャンバー外側に、チャンバー上に０．５ｍＬの細胞懸濁液（２×１０4 ／ｍＬ）を播種して、５％ＣＯ2 ／９５％空気存在下の３７℃の保湿インキュベーター内で培養した。細胞は、ヒト角膜上皮細胞を用いた。約１カ月間培養の後、ホルマリンで固定し、直接ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した。
【００８５】
［実施例１３］
ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例１で作製）を用い、上記の方法で、ゲル膜上で角膜上皮細胞の培養を行い、実施例１１の細胞シートを得た。
［比較例２］
ブタ由来アテロコラーゲンを含有する平面状のガラス化後のハイドロゲル（比較例１で作製）を用い、ゲル上で角膜上皮細胞の培養を行った。培養方法および培養条件は、実施例１３と同様に行い、比較例２の細胞シートを得た。
【００８６】
図１５は実施例１３と比較例２の細胞シート切片のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色結果の画像である。
比較例２のゲル上には、角膜上皮細胞の培養状態は不良であり、良好なシート化ができなかった。一方、図１５の画像から明らかなように、工程Ｄを経て製造された実施例１のゲル膜には、角膜上皮細胞が良好な状態で培養されていた。
【００８７】
《ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜上での角膜内皮細胞培養》
［実施例１４］
ブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜（実施例６で作製）を用い、ゲル膜上で角膜内皮細胞の培養を行った。しかし、半球面状のゲル膜上で単に細胞を培養しても、膜の凹面の中心に細胞が溜まってしまう。そこで、１２ウェルプレート（住友ベークライト社製  ＭＳ−８０１２０）底面に再水和させた実施例６のゲル膜を張り付けたのち、一旦乾燥させ、当該ゲル膜に１３０万個／ウェル（４０００個／ｍｍ２）でヒト正常角膜内皮細胞を播種し、一晩（約１６時間）培養した。ヒト正常角膜内皮細胞が播種された当該ゲル膜を、ウェルの底から丁寧にはがし、別のウェルに用意したテフロン（登録商標）製Ｏ-リングの上に当該ゲル膜の支持部を浮かせるようにのせ一週間培養を継続し、実施例１４の細胞シートを得た。なお、その他の培養条件および操作は実施例１３と同様に行った。図１６に得られた実施例１４の細胞シートを示す。図１６の画像からも明らかなように、角膜内皮細胞がブタ由来アテロコラーゲンを含有する半球面状のガラス化後のハイドロゲル膜上に均一に生着していることがＨＥ染色にて確認された。また、内皮細胞密度は約２８００/ｍｍ２であった。
【００８８】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
高い強度及び透明性を有する本発明のガラス化後のハイドロゲル膜は、角膜由来の上皮細胞、内皮細胞等を培養でき、その後生体への移植が可能であるため、角膜上皮の外傷のみならず、水疱性角膜症に代表される角膜内皮障害など角膜再生が必要とされる治療に幅広く利用できる。
【符号の説明】
【００９０】
１…半球状凹面鋳型、２…半球状凸面鋳型、３…壁面鋳型、１０…製造装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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