(57)【要約】【課題】木質バイオマスを原料として使用し、Ｄ−乳酸生産菌を用いて、高い光学純度のＤ−乳酸を高い生産量で製造する方法を提供すること。【解決手段】木質バイオマスに酵素及びＤ−乳酸生産菌を同時に作用させて糖化及び発酵を併行して行うことによりＤ−乳酸を生産するＤ−乳酸の製造方法であって、前記の糖化及び発酵を塩基の存在下においてｐＨ４．０〜７．０で行うＤ−乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質バイオマスに酵素及びＤ−乳酸生産菌を同時に作用させて糖化及び発酵を併行して行うことにより、Ｄ−乳酸を生産するＤ−乳酸の製造方法であって、前記の糖化及び発酵を塩基の存在下においてｐＨ４．０〜７．０で行うＤ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
培養容器の底部から、塩基を含む第１層、木質バイオマスを含む第２層、並びに酵素及びＤ−乳酸生産菌を含む第３層を、この順番で配置して、糖化及び発酵を併行して行う、請求項１に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項３】
木質バイオマスがパルプである、請求項１又は２に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項４】
木質バイオマスが漂白クラフトパルプ、蒸解未漂白パルプ、酸素脱リグニンパルプである、請求項１から３の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項５】
糖化及び発酵を嫌気条件下で行う、請求項１から４の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項６】
塩基が炭酸カルシウムである、請求項１から５の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項７】
Ｄ−乳酸生産菌が、ラクトバシラス属乳酸菌である、請求項１から６の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項８】
Ｄ−乳酸生産菌が、ラクトバシラス・デルブルキに属する乳酸菌である、請求項１から７の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、木質バイオマスを原料として使用し、Ｄ−乳酸生産菌を用いてＤ−乳酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースを含む木質系バイオマスを原料とし、酵素や微生物を添加して、糖化や糖化発酵を行って糖液や発酵液を得る方法は多く実施されている。また、乳酸は、生物の解糖系によりグルコースなどの糖分が分解されて生産される有機酸であり、さらにTCA回路に誘導されて生体エネルギー産生の起点になる重要な化合物である。
【０００３】
非特許文献１には、セルロースを併行糖化発酵することによって乳酸を生産することが記載されている。非特許文献２及び３には、木片を粉砕及び化学処理してから、セルラーゼと乳酸菌とを使用して併行糖化発酵を行うことによって乳酸を生産することが記載されている。非特許文献４には、Entetococcus faecalisｍによる木材加水分解物の発酵によってＬ−乳酸を生産することが記載されている。非特許文献５には、セルラーゼとLactobacillus coryniformis とを使用して併行糖化発酵によってＤ−乳酸を生産することが記載されている。非特許文献６には、ペーパースラッジを原料として併行糖化発酵によって乳酸を生産することが記載されている。
【０００４】
また、特許文献１には、キャッサバパルプから高収率かつ安価に乳酸を生産する方法が記載されている。しかし、この方法は、乳酸を生産する方法であるが、Ｄ−乳酸のみを生産する方法ではない。
【０００５】
さらに、特許文献２には、ラクトバシラス・デルブルキに属する乳酸菌を用いてＤ−乳酸を発酵することが記載されている。この文献は、グルコースを基質としてＤ−乳酸を発酵するものであり、グルコース以外の原料を基質とすることについての記載はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shin-ichiro Abe and Motoyoshi Takagi, Simultaneous Saccharification and Fermentation of Cellulose to Lactic Acid, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 37, Pp. 93-96 (1991)
【非特許文献２】Moldes, A. B., Alonso, J. L. and Parajo, J. C, Strategies to improve the bioconversion of processed wood into lactic acid by simultaneous saccharification and fermentation., J. Chem. Technol. Biotechnol., 76: 279-284 (2001)
【非特許文献３】Moldes, A. B., Alonso, J. L. and Parajo, J. C., Multi-step feeding systems for lactic acid production by simultaneous saccharification and fermentation of processed wood, Bioprocess Engineering, Volume 22, Issue 2, pp 175-180 (2000)
【非特許文献４】Young-Jung Wee, Jong-Sun Yun, Don-Hee Park, Hwa-Won Ryu, Biotechnological production of l(+)-lactic acid from wood hydrolyzate by batch fermentation of Enterococcus faecalis, Biotechnology Letters, Volume 26, Issue 1, pp 71-74 (2004)
【非特許文献５】R Yanez, A Belen Moldes, JL Alonso, JC Parajo, Production of D (-)-lactic acid from cellulose by simultaneous saccharification and fermentation using Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Biotechnology letters, Volume 25, Issue 14, pp 1161-1164 (2003)
【非特許文献６】S Marques, JAL Santos, FM Girio, JC Roseiro, Lactic acid production from recycled paper sludge by simultaneous saccharification and fermentation, Biochemical Engineering Journal, Volume 41, Issue 3, pp 210-216 (2008)
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−０９７１３６号公報
【特許文献２】特開２０１０−２７９３３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、木質バイオマスを原料として使用し、Ｄ−乳酸生産菌を用いて、高い光学純度のＤ−乳酸を高い生産量で製造する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、木質バイオマスを使用して酵素による糖化工程とＤ−乳酸生産菌による発酵工程とを併行して行う際に、糖化及び発酵を塩基の存在下においてｐＨ４．０〜７．０で行うことによって高い光学純度のＤ−乳酸を高い生産量で製造できることを見出した。これにより本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  木質バイオマスに酵素及びＤ−乳酸生産菌を同時に作用させて糖化及び発酵を併行して行うことによりＤ−乳酸を生産するＤ−乳酸の製造方法であって、前記の糖化及び発酵を塩基の存在下においてｐＨ４．０〜７．０で行うＤ−乳酸の製造方法。
（２）  培養容器の底部から、塩基を含む第１層、木質バイオマスを含む第２層、並びに酵素及びＤ−乳酸生産菌を含む第３層を、この順番で配置して、糖化及び発酵を併行して行う、（１）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【００１１】
（３）  木質バイオマスがパルプである、（１）又は（２）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（４）  木質バイオマスが漂白クラフトパルプ、蒸解未漂白パルプ、酸素脱リグニンパルプである、（１）から（３）の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（５）  糖化及び発酵を嫌気条件下で行う、（１）から（４）の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【００１２】
（６）  塩基が炭酸カルシウムである、（１）から（５）の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（７）Ｄ−乳酸生産菌が、ラクトバシラス属乳酸菌である、（１）から（６）の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（８）Ｄ−乳酸生産菌が、ラクトバシラス・デルブルキに属する乳酸菌である、（１）から（７）の何れか１項に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、木質バイオマスを原料として使用し、Ｄ−乳酸生産菌を用いて、高い光学純度のＤ−乳酸を高い生産量で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＬＢＫＰパルプからの併行糖化発酵によりＤ−乳酸を製造した場合における、培養液のｐＨ及びＤ−乳酸量の推移を示す。培養器内の最下層にｐＨ調整を目的に炭酸カルシウムを配置し、その上にＬＢＫＰパルプを配置し、ｐＨ5.5に調整済みの発酵培地を入れ、パルプ糖化用酵素をＬＢＫＰパルプに混ぜ、最後に前培養液を接種し、回転振とう・３７℃で３日間培養した。上記条件で行ったデータをプロットした。
【図２】図２は、ＬＢＫＰパルプからの併行糖化発酵によりＤ−乳酸を製造した場合における、培養液のｐＨ及びＤ−乳酸量の推移を示す。培養器内の最下層にｐＨ調整を目的に炭酸カルシウムを配置し、その上にＬＢＫＰパルプを配置し、ｐＨ5.5に調整済みの発酵培地を入れ、パルプ糖化用酵素をＬＢＫＰパルプに混ぜ、最後に前培養液を接種し、静置・３７℃で３日間培養した。上記条件で行ったデータをプロットした。
【図３】図３は、ＬＢＫＰパルプからの併行糖化発酵によりＤ−乳酸を製造した場合における、培養液のｐＨ及びＤ−乳酸量の推移を示す。培養器内にＬＢＫＰパルプを配置し、次いでｐＨ5.5に調整済みの発酵培地を入れ、パルプ糖化用酵素をＬＢＫＰパルプに混ぜ、最後に前培養液を接種し、回転振とう・３７℃で３日間培養した。上記条件で行ったデータをプロットした。
【図４】図４は、ＬＢＫＰパルプからの併行糖化発酵によりＤ−乳酸を製造した場合における、培養液のｐＨ及びＤ−乳酸量の推移を示す。培養器内にＬＢＫＰパルプを配置し、ｐＨ5.5に調整済みの発酵培地を入れ、パルプ糖化用酵素をＬＢＫＰパルプに混ぜ、最後に前培養液を接種し、静置・３７℃で３日間培養した。上記条件で行ったデータをプロットした。
【図５】図５は、ＬＢＫＰパルプからの併行糖化発酵によりＤ−乳酸を製造した場合における、培養液のｐＨ及びＤ−乳酸量の推移を示す。培養器内の最下層にｐＨ調整を目的に炭酸カルシウムを配置し、その上にＬＢＫＰ、またはＬＵＫＰ、またはＬＯＫＰを配置し、ｐＨ5.5に調整済みの発酵培地を入れ、パルプ糖化用酵素をＬＢＫＰパルプに混ぜた。最後に前培養液を接種し、４５℃で開始１日間静置培養し、後半２日間回転振とう培養した。上記条件で行ったデータをプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
＜木質バイオマス＞
本発明の方法で原料として使用する木質バイオマスとしては、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、木本性植物の切株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられる。さらに、木材由来の紙、古紙、パルプ等を原料として利用することができる。これらの木質バイオマスは、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、木質バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであっても用いることができる。
【００１６】
木質バイオマスの原料としては、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属植物、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属植物、ポプラ属植物、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属植物、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属植物等が利用できる。特に、ユーカリ属植物、アカシア属、ヤナギ属植物が原料として大量に採取し易いため好ましい。例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属又はアカシア（Ａｃａｃｉａ）属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。
【００１７】
（糖化及び発酵処理に適した前処理）
本発明においては、木質バイオマスに、糖化処理及び発酵処理に適した前処理を施すことができる。前処理としては、以下に何れかの処理を挙げることができる。このような前処理を行うことにより、木質バイオマス中のリグノセルロースは、糖化発酵可能な状態となる。
機械的処理、化学的処理、水熱処理、加圧熱水処理、二酸化炭素添加水熱処理、蒸煮処理、湿式粉砕処理、希硫酸処理、水蒸気爆砕処理、アンモニア爆砕処理、二酸化炭素爆砕処理、超音波照射処理、マイクロ波照射処理、電子線照射処理、γ線照射処理、超臨界処理、亜臨界処理、有機溶媒処理、相分離処理、木材腐朽菌処理、グリーン溶媒活性化処理、各種触媒処理、ラジカル反応処理、オゾン酸化処理。
これらの処理は、各単独処理もしくは複数を組み合わせた処理のいずれであってもよい。中でも、木質バイオマスに対し、アルカリ処理、加圧熱水処理、機械的処理から選択される1つ以上の前処理を行うことが好ましい。
【００１８】
機械的処理としては、破砕、裁断、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、木質バイオマス中のリグノセルロースを糖化発酵処理工程で糖化発酵され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー等を用いることができる。
【００１９】
化学的処理は、酸やアルカリ等の薬品の水溶液に木質バイオマスを浸漬して、酵素糖化処理に適した状態にする処理である。化学的処理に使用する薬品等については特に限定されないが、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、硫酸、希硫酸などの硫化物、炭酸塩又は亜硫酸塩から１種以上選択されたものである。水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、硫化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、亜硫酸ナトリウム等から選択された１種以上の薬品の水溶液に浸漬してなるアルカリ処理等が化学処理として好適である。また、オゾン、二酸化塩素などの酸化剤による化学的処理も可能である。化学的処理は、前記機械的処理と組み合わせてそれらの前処理の後処理として行うことが好適である。化学的処理に使用する薬品の添加量は、状況に応じて任意に調整可能であるが、薬品コスト低下の面から、またセルロースの溶出・過分解による収率低下防止の面から、木質バイオマスの絶乾１００質量部に対して５０質量部以下であることが望ましい。化学的処理における薬品の水溶液への浸漬時間及び処理温度は、使用する原料や薬品によって任意に設定可能であるが、処理時間３０分〜１時間、処理温度８０〜１３０℃が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理時間は１時間以下、処理温度は１３０℃以下であることが好ましい。
【００２０】
糖化及び発酵処理に適した前処理が施されている木質バイオマスに対しては、リグノセルロース原料を含む懸濁液の調製に使用する前に、殺菌処理を行うことが好ましい。木質バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なｐＨに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化・発酵工程に適したｐＨに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化・発酵工程に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やｐＨを調整してから原料を送り出すことで、好適ｐＨ、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。
【００２１】
（広葉樹クラフトパルプ）
本発明の特に好ましい態様においては、広葉樹クラフトパルプを、木質バイオマスとして使用することができる。該パルプを製造するための原料として使用する木材チップとしては、ユーカリ、オーク、アカシア、ビーチ、タンオーク、オルダー等の広葉樹材であれば特に限定されない。また、使用する広葉樹材に多少の針葉樹材を含まれていても構わない。
【００２２】
上記した木材チップをクラフト蒸解処理に供することによって、広葉樹未漂白クラフトパルプ（ＬＵＫＰ）を得ることができる。次いで、酸素脱リグニン工程により酸素脱リグニンパルプを得ることができる。さらに、酸素脱リグニンパルプを漂白処理に供することによって、広葉樹漂白クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を得ることができる。
クラフト蒸解は公知の方法により行うことができる。例えば、木材をクラフト蒸解する場合、クラフト蒸解液の硫化度は５〜７５％、好ましくは２０〜３５％であり、有効アルカリ添加率は絶乾木材質量当たり５〜３０質量％、好ましくは１０〜２５質量％であり、蒸解温度は１４０〜１７０℃である。しかし、クラフト蒸解の条件はこれらに限定されるものではない。また、クラフト蒸解方式は、連続蒸解法あるいはバッチ蒸解法のどちらでもよく、連続蒸解釜を用いる場合は、蒸解白液を分割で添加する蒸解法でもよく、その方式は特に限定されない。
【００２３】
蒸解に際して使用する蒸解液には、蒸解助剤として公知の環状ケト化合物、例えばベンゾキノン、ナフトキノン、アントラキノン、アントロン、フェナントロキノン及び前記キノン系化合物のアルキル、アミノ等の核置換体、或いは前記キノン系化合物の還元型であるアントラヒドロキノンのようなヒドロキノン系化合物、さらにはディールスアルダー法によるアントラキノン合成法の中間体として得られる安定な化合物である９，１０−ジケトヒドロアントラセン化合物等から選ばれた１種又は２種以上が添加されてもよい。添加率は特に限定されないが、一般的には、木材チップの絶乾質量当たり０．００１〜１．０質量％である。
【００２４】
クラフト蒸解法により得られた未漂白化学パルプは、所望により、洗浄工程を経て、公知の酸素脱リグニン法により脱リグニンすることができる。酸素脱リグニン法に用いるアルカリとしては苛性ソーダあるいは酸化されたクラフト白液を使用することができる。酸素ガスとしては、深冷分離法からの酸素、ＰＳＡ（ＰＲＥＳＳＵＲＥ Ｓｗｉｎｇ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）からの酸素、ＶＳＡ（Ｖａｃｕｕｍ Ｓｗｉｎｇ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）からの酸素等が使用できる。
【００２５】
酸素脱リグニン工程では、前記酸素ガスとアルカリが中濃度ミキサーにおいて中濃度のパルプスラリーに添加され、混合が十分に行われた後、加圧下でパルプ、酸素及びアルカリの混合物を一定時間保持できる反応塔へ送られ、脱リグニンされる。酸素ガスの添加率は特に限定されないが、絶乾パルプ質量当たり０．５〜３質量％であり、アルカリ添加率は０．５〜４質量％である。また、反応温度は８０〜１２０℃で、反応時間は１５〜１００分であり、パルプ濃度は８〜１５質量％であるが、これらの条件は特に限定されない。
【００２６】
酸素脱リグニンを施されたパルプは洗浄工程へ送ることができる。酸素脱リグニン後の洗浄工程で使用する洗浄機、及び多段漂白工程中の洗浄に使用する洗浄機は、特に限定されるものではない。例えば、プレッシャーディフューザー、ディフュージョンウオッシャー、加圧型ドラムウオッシャー、水平長網型ウオッシャー、プレス洗浄機等を挙げることができる。
【００２７】
上記の通り脱リグニン処理されたパルプは多段漂白工程へ供することができる。多段漂白工程は、二酸化塩素（Ｄ）、アルカリ（Ｅ）、酸素（Ｏ）、過酸化水素（Ｐ）、オゾン（Ｚ）といった公知のＥＣＦ漂白法を組合せて行うことができる。また、多段漂白工程中に、高温酸処理段（Ａ）や酸洗浄段、酵素処理段、高温二酸化塩素漂白段、過硫酸や過酢酸等による過酸漂白段を導入することもできる。多段漂白工程中には、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）やジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）等によるキレート剤処理段等を導入することもできる。
【００２８】
上記により、本発明の特に好ましい態様において原料として使用できる広葉樹漂白クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を得ることができる。
【００２９】
＜糖化及び発酵処理＞
本発明においては、木質バイオマスに酵素及びＤ−乳酸生産菌を同時に作用させて糖化及び発酵を併行して行うが、その際に、糖化及び発酵を塩基の存在下においてｐＨ４．０〜７．０で行うことを特徴とする。ｐＨは、好ましくはｐＨ４．５〜５．５であり、更に好ましくｐＨ４．６〜５．８であり、特に好ましくはｐＨ４．９〜５．６である。
【００３０】
使用する塩基の種類は、培養液のｐＨをｐＨ４．０〜７．０に調節できるものであれば特に限定されず、無機塩基でも有機塩基でもよい。無機塩基としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどが挙げられる。有機塩基としては、例えば、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン、リジンなどが挙げられる。塩基は好ましくは、上記の中でも無機塩基であり、特に好ましくは炭酸カルシウムである。
【００３１】
糖化及び発酵を併行して行う際、木質バイオマスに酵素及びＤ−乳酸生産菌を同時に作用させる方法は、培養液のｐＨをｐＨ４．０〜７．０に調節できる限り特に限定されない。但し、本発明の好ましい態様によれば、培養容器の底部から、塩基を含む第１層、木質バイオマスを含む第２層、並びに酵素及びＤ−乳酸生産菌を含む第３層を、この順番で配置して、糖化及び発酵を併行して行うことができる。上記の通り、第１層〜第３層をこの順番で配置することにより、培養液のｐＨをｐＨ４．０〜７．０に調節するという塩基の作用を上手く達成することができる。
【００３２】
糖化及び発酵は、嫌気条件下又は好気条件下の何れで行ってもよいが、好ましくは嫌気条件下で行うことができる。糖化及び発酵を、嫌気条件下で行うことにより、好気条件下で行う場合と比較してより高い光学純度のＤ−乳酸を製造することが可能になる。嫌気条件としては、例えば、糖化及び発酵処理中に培養液の回転振とうは行わないという条件を挙げることができ、この場合でも１日に１回〜数回程度培養液を攪拌することは構わない。一方、好気条件としては、培養液の回転振とうしながら糖化及び発酵処理を行うことが挙げられる。培養液を回転振とうする際の回転速度は特に限定されないが、例えば、１０〜２００ｒｐｍなどを挙げることができる。
【００３３】
糖化で使用する酵素は、セルロース分解酵素であれは、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素である。各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いれば良い。
【００３４】
市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤がある。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、ジェネンコア社製のセルラーゼ製剤等が挙げられる。
【００３５】
原料固形分１００質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は、０．５〜１００質量部が好ましく、１〜５０質量部が特に好ましい。
【００３６】
発酵処理に用いられる微生物としては、糖類（六炭糖、五炭糖）を発酵して、Ｄ−乳酸を製造できるＤ−乳酸生産菌であれば特に限定はされない。Ｄ−乳酸生産菌としては、例えば、ラクトバシラス属 (Lactobacillus)、ビフィドバクテリウム属 (Bifidobacterium)、エンテロコッカス属 (Enterococcus)、ラクトコッカス属 (Lactococcus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、リューコノストック属 (Leuconostoc)、又はスポロラクトバシラス属（Spololactobacillus属）に属する細菌を挙げることができるが、特に限定されない。具体的には、ラクトバシラス・デルブルキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）などを挙げることができるが、特にこれらに限定されない。また、遺伝子組換え技術を用いて作製した遺伝子組換え微生物（細菌等）を用いることもできる。遺伝子組換え微生物としては、六炭糖又は五炭糖を発酵してＤ−乳酸を生産できる微生物を特に制限なく用いることができる。
【００３７】
微生物は固定化しておいても良い。微生物を固定化しておくと、次工程で微生物を分離して再回収するという工程を省くことができるため、少なくとも回収工程に要する負担を軽減することができ、微生物のロスが軽減できるというメリットがある。また、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。
【００３８】
糖化及び発酵処理の温度は、酵素及び発酵の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、通例２５℃〜５０℃が好ましく、３７℃〜５０℃がさらに好ましい。培養は、連続式が好ましいが、バッチ方式でも良い。培養時間は、酵素濃度などによっても異なるが、バッチ式の場合は１０〜２４０時間、さらに好ましくは１５〜１６０時間である。連続式の場合も、平均滞留時間が、１０〜１５０時間、さらに好ましくは１５〜１００時間である。
【００３９】
＜Ｄ−乳酸の回収＞
上記した発酵により生産されたＤ−乳酸は、発酵液から公知の方法により分離・精製することにより回収することができる。例えば、発酵液を、遠心分離や濾過等によって不溶な物質（菌体など）を除去した後、イオン交換樹脂などで脱塩し、その溶液から、結晶化やカラムクロマトグラフィー等の常法に従って所望の乳酸を分離・精製することができる。
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
本発明の効果を以下の実施例と比較例を挙げて具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみであるという制約は受けない。
【００４１】
実施例１
＜前培養＞
−８０℃で凍結保存したＤ−乳酸生産菌であるLactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii NBRC3202株［独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から入手可能］を解凍した。オートクレーブにより滅菌した前培養培地（培地組成は下記表１参照）１０ｍｌに一白金耳接種し、３７℃、４８-７２時間静置培養を行ない、前々培養液を調製した。さらに、滅菌処理した前培養培地３０ｍｌに、前々培養液を０．９ｍｌ接種する。これを３７℃、４８時間静置培養を行ない、前培養液を調製した。
【００４２】
前培養培地はオートクレーブ前に７０％硫酸でｐＨを5.5に調整した。
【表１】
2015080430.tif 000002
【００４３】
＜本培養＞
次に、培養容器として２５０ｍｌの滅菌フィルター付きキャップのプラスチック製三角フラスコを用意した。この容器の一番下にｐＨ調整剤として炭酸カルシウム４ｇ（４質量％）を、その上にＬＢＫＰ（５質量％）を入れ、全量が５０ｍｌになるように蒸留水で調整した後、オートクレーブ滅菌した。
【００４４】
オートクレーブ後、常温になったところで、クリーンベンチ内で下表２に示すオートクレーブした発酵培地を５０ｍｌ入れ、ポリペプトン及び酵母エキスを含んだ窒素源が５質量％、ＬＢＫＰ（製造方法は後述）が５質量％になるように調整した。さらに、２．５％のジェネンコア社製セルラーゼ製剤をＬＢＫＰに万遍なく混ざるように２質量％添加し、さらに前培養液を２質量％接種した。
【００４５】
発酵培地はオートクレーブ前に７０％硫酸でｐＨを5.5に調整した。
【表２】
2015080430.tif 000003
【００４６】
（広葉樹クラフトパルプ製造方法）
広葉樹混合木材チップ（ユーカリ７０％、アカシア３０％）を用い、液比４、硫化度２８％、有効アルカリ添加率１７％（Ｎａ2Ｏとして）となるように調製した蒸解白液に木材チップに加えた後、蒸解温度１６０℃にて２時間クラフト蒸解を行なった。クラフト蒸解終了後、黒液を分離し、得られたチップを解繊後、遠心脱水と水洗浄を３回繰り返し、次いでスクリーンにより未蒸解物を除き、蒸解未漂白パルプ（ＬＵＫＰ）を得た。この未漂白パルプ絶乾質量に対して、ＮａＯＨを２．０％添加し、酸素ガスを注入し、１００℃で６０分間酸素脱リグニン処理を行ない、酸素脱リグニンパルプ（ＬＯＫＰ）を得た。続いて、酸素脱リグニンパルプを、Ｄ−Ｅ−Ｐ−Ｄの４段漂白処理に供した。漂白時のパルプ濃度は全て１０質量％に調製し、最初の二酸化塩素処理（Ｄ）は、対絶乾パルプの二酸化塩素添加率１．０質量％、７０℃、４０分間処理を行ない、イオン交換水にて洗浄、脱水した。次いで、パルプ絶乾質量に対してＮａＯＨ添加率を１質量％として、７０℃、９０分間のアルカリ抽出処理（Ｅ）を行ない、イオン交換水にて洗浄、脱水した。次いで、パルプ絶乾質量に対して過酸化水素添加率を０．２％、ＮａＯＨ添加率を０．５％とし、７０℃、１２０分間の過酸化水素処理（Ｐ）を行ない、イオン交換水にて洗浄、脱水した。次いで、パルプ絶乾質量に対して二酸化塩素添加率を０．２％とし、７０℃、１２０分間の二酸化塩素処理（Ｄ）を行ない、イオン交換水にて洗浄、脱水後、白色度８５％の漂白パルプ（ＬＢＫＰ）を得た。
【００４７】
培養用のフラスコキャップの滅菌フィルター上に切り込みを入れたテープを張り、発酵により生産される乳酸と炭酸カルシウムが反応して発生する炭酸ガスをフラスコ外へ放出した。また、外部からの空気流入を極力抑制するように施し、フラスコに該キャップで締め、外部との通気を遮断した。
【００４８】
前記培養セットを１２０ｒｐｍの回転振とうで３日間培養させ、ｐＨ、グルコース、Ｄ−乳酸を経時的に測定した。尚、ｐＨ、Ｄ−乳酸量を図１に示す。
【００４９】
図１から、ｐＨは4.9から5.2に制御制御でき、発酵による乳酸生産でのｐＨ低下を炭酸カルシウムにより抑えられることが確認できた。又、Ｄ−乳酸量は培養２日目で５４−５６ｇ/Ｌ、光学純度は９３％ｅｅであった。
【００５０】
尚、本実施例にて、グルコース及び乳酸を分析するために以下の通り、試料調整を行った。
培養開始〜直後、1日目、2日目、3日目の培養液を2ml採取し、遠心分離した。その上清を0.22μmのディスクフィルター（DISMIC  13HP020AN、ADVANTEC社製）にてろ過し、脱塩水で20倍希釈したものをグルコース及び乳酸定量用試料とする。
【００５１】
（グルコース定量）
上記定量用試料を専用セルに300μL採取し、バイオセンサー（BF-5／王子計測機器社製）のオートサンプラーにセットして自動計測した。尚、電極は、プレナ電極交換用グルコース電極EDO05-0003／王子計測機器社製）を使用。
【００５２】
（乳酸定量）
上記定量用試料をマイクロバイアルに1ml採取してオートサンプラーにセットし、高速液体クロマトグラフHPLC（alliance・2695／Waters社製）を用い、以下の条件で自動計測した。
カラム：住友分析センター社製SUMICHIRAL  OA-5000（内径4.6ｍｍ、カラム長25.0ｃｍ）
温度：３０℃
移動相：２ｍＭ  ＣｕＳＯ4・７Ｈ2Ｏの水−２-プロパノール混液（９８：２）溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２５４ｎｍ
【００５３】
（光学純度）
Ｄ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
光学純度（％ｅｅ）  ＝  （Ｄ−Ｌ）／（Ｄ＋Ｌ）×１００
ここで、ＤはＤ−乳酸濃度、ＬはＬ−乳酸濃度を表す。
【００５４】
実施例２
回転振とうせず静置培養するという条件以外は実施例１と同じで、３日間培養を行い、ｐＨ、グルコース、Ｄ−乳酸を経時的に測定した。尚、ｐＨ、Ｄ−乳酸量を図２に示す。
【００５５】
図２から、ｐＨは4.9に制御制御でき、実施例１と同様に、発酵による乳酸生産でのｐＨ低下を炭酸カルシウムにより抑えられることが確認できた。
又、Ｄ−乳酸量は培養２日目で５７−５９ｇ/Ｌ、光学純度は９７％ｅｅと、実施例１より何れも高くなった。静置で嫌気状態である実施例２の方が乳酸生産及び光学純度にとって良い状態だったと考えられた。
【００５６】
比較例１
発酵培地に炭酸カルシウムを入れないという条件以外は実施例１と同じで、３日間培養を行い、ｐＨ、グルコース、Ｄ−乳酸を経時的に測定した。尚、ｐＨ、Ｄ−乳酸量を図３に示す。
【００５７】
図３から、ｐＨは3.5まで低下した。又、Ｄ−乳酸量は実施例１及び実施例２で得られた５４g/Ｌ超に比べ、培養３日目で約７ｇ/Ｌと低く、乳酸生産にはｐＨ調整が必要であることが確認された。
【００５８】
比較例２
発酵培地に炭酸カルシウムを入れないという条件と静置培養するという条件以外は実施例１と同じで、３日間培養を行い、ｐＨ、グルコース、Ｄ−乳酸を経時的に測定した。尚、ｐＨ、Ｄ−乳酸量を図４に示す。
【００５９】
図４から、ｐＨは3.3まで低下した。又、Ｄ−乳酸量は実施例１及び実施例２で得られた５４g/Ｌ超に比べ、培養３日目で約１７ｇ/Ｌと低く、比較例と同様に、乳酸生産にはｐＨ調整が必要であることが確認された。比較例１の７ｇ/Ｌに比べ、比較例２では１７ｇ/Ｌと２倍以上のＤ−乳酸量が得られたのは、静置による嫌気状態が乳酸生産に好条件であったこと考えられた。
【００６０】
比較例３
実施例１、２でｐＨ調整剤として使用していた炭酸カルシウム代替で、糖化時のｐＨ緩衝剤として酢酸を使用した。実施例１の条件に対して炭酸カルシウムを除き、０．１Ｍ酢酸でｐＨを５．０とした。さらに、ジェネンコア社製のセルラーゼ製剤を２．５％添加後、Ｄ−乳酸生産菌を２％接種し、静置で３日間培養させ、ｐＨ、グルコース、Ｄ−乳酸を経時的に測定した。
【００６１】
本条件ではＤ−乳酸生産量は17.7ｇ/Ｌ(対グルコース消費収率１４０％)であり、培養１日目以降から生菌数が激減し、Ｄ−乳酸生産が停止した。酢酸緩衝液では乳酸発酵による乳酸生産に適したｐＨ４．５以上を維持することができず、乳酸菌が生存し難くなり、Ｄ−乳酸生産が停止したと考えられる。
【００６２】
実施例３
ＬＢＫＰ以外にＬＵＫＰ、ＬＯＫＰも評価パルプとし、培養温度を４５℃で、培養開始２４時間は静置し、その後２日間は１２０ｒｐｍの回転振とうする以外は実施例１と同じ培養を行い、ｐＨ、グルコース、Ｄ−乳酸を経時的に測定した。尚、ｐＨ、Ｄ−乳酸量の変動を図５に示す。
【００６３】
培養３日後のＤ−乳酸量は、ＬＢＫＰの５５．５ｇ/Ｌに対し、ＬＯＫＰが５５．９ｇ/Ｌ、ＬＯＫＰが５３．４ｇ/Ｌとほぼ同等量得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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