(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、パルミトオレイン酸(POA)をサッカロミセス・セレビシェ(出芽酵母)を用いて効率的に生産する方法であって、酵母株が産生する脂質量を低下させることなく、全脂質中に占めるPOA含量を増大させる方法、さらにPOA含量の高い脂質を短い培養日数で生産する方法を提供することにある。【解決手段】  本発明は、サッカロミセス・セレビシェを、高濃度(0.2-4g/l)のメチオニン存在下で培養すること、さらに低温(18〜27℃)培養することにより、脂質産生量を低下させることなく、脂質中のパルミトオレイン酸(POA)含量を増大させる方法を提供する。  さらに、OLE1遺伝子を導入してΔ9不飽和化酵素(Ole1p)が過剰発現しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株を用いることで、増殖を促進して、POA含量の高い脂質を短い培養日数で生産する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質産生能を有するサッカロミセス・セレビシェを、0.2-4g/lの濃度のメチオニン存在下で培養し、培養した細胞から脂質を採取することを特徴とする、パルミトオレイン酸(POA)を高含量に含む脂質の製造方法。
【請求項２】
前記培養を、18〜27℃の温度条件下で行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記サッカロミセス・セレビシェが、DGAT(ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ)を過剰発現しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記サッカロミセス・セレビシェが、染色体上のDGA1遺伝子が破壊又は機能低下しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記サッカロミセス・セレビシェが、OLE1遺伝子が導入され、Δ9不飽和化酵素(Ole1p)が過剰発現しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法に用いることができるサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であって、DGAT及びOle1pを過剰発現し、かつ染色体上のDGA1遺伝子が破壊又は機能低下していることを特徴とする、POA含量の高い脂質生産能を有するサッカロミセス・セレビシェ形質転換株。
【請求項７】
さらに、HIS3及びLEU2遺伝子を過剰発現している、請求項６に記載のサッカロミセス・セレビシェ形質転換株。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法で得られた脂質から、POAを単離することを特徴とする、POAの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性脂肪酸であるパルミトオレイン酸を、酵母を用いて効率的に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
パルミトオレイン酸(POA)は、炭素数16で二重結合を9位に１つもつ脂肪酸であり、近年様々な機能を持つ脂肪酸として注目されている(非特許文献１)。例えば、POAはリポカインと呼ばれる脂質由来のホルモン様の物質として、インシュリン抵抗性などの制御に関わり、生活習慣病の改善に重要な因子として報告されている(特許文献１、非特許文献２)。また、POAの投与によって、糖尿病モデルマウスの症状の改善が見られたり(非特許文献３)、POAを含むマカデミアナッツの摂取によって肥満した患者の体重が減少すること(非特許文献４)などが報告されている。さらに、POAは抗菌活性をもつことも報告されており(特許文献２)、スキンケアなどにも有用と考えられている。これらの生理活性以外にも、工業原料としても注目されている。例えば、POAは、融点が低くかつ酸化安定性が高いことから、バイオディーゼルに適した脂肪酸とされており(非特許文献５)、また有機触媒反応によって容易に１−オクテンを生成し、これがポリエチレンの原料であることから、ポリエチレンの供給源としても注目されている(非特許文献１)。
【０００３】
しかしながら、POAは植物油脂に多量に含まれている脂肪酸ではなく、主な供給源は、マカデミアナッツ油で、30％程度含まれているが(非特許文献１)、大規模に栽培されているような生産量はない。また、キャッツクローというツタ植物やシーバックソーンという落葉低木の実や(非特許文献１)、藍藻などの原核生物や真核の藻類にも多量に含まれているものがあることが報告されているが(特許文献３、非特許文献６)、いずれも生産手段としては確立されていない。真菌類では、サッカロミセス属やクルベロマイセス属が脂質中の脂肪酸として多く含んでいるが(特許文献４、非特許文献７)、これらはいずれも脂質自体の含量が低く、十分な生産量を得ることは困難であった。
【０００４】
そこで、これらのPOAの需要に対応するために、代謝工学的手法によりPOAを多量に生産するシステムの構築が試みられている(非特許文献１)。酵母サッカロミセス・セレビシェ(出芽酵母)は、遺伝子工学技術が確立され、全ゲノム配列も決定されているなどの利点から、これらの代謝工学的手法による物質生産の宿主として盛んに用いられている。また、古来より醸造に用いられるなど産業上重要な微生物であり、菌体そのものも栄養価のあるものとして食用できるものである。さらに、上述したようにサッカロミセス・セレビシェは元来その脂肪酸として30〜50％程度のPOAを有していることが報告されており(特許文献４)、POA生産の宿主に適している。一方、上述のようにサッカロミセス・セレビシェは、その菌体成分のうち、脂質の占める割合は5％程度で、POA含量が高くても生産量は実用レベルには達していなかった。
【０００５】
本発明者らは、従来から出芽酵母の脂質生産性を高めて、代謝工学的手法により脂質生産をデザインする研究を進めており、主要な貯蔵脂質であるトリアシルグリセロール(TAG)の合成酵素であるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)の遺伝子(DGA1：出芽酵母のDGAT)を出芽酵母SNF2(転写因子)遺伝子破壊株に過剰発現させて、脂質含量を増加させることに成功している(特許文献５、非特許文献８)。また、Dga1p(DGA1によりコードされる蛋白質)について解析を行い、N末端の2番目から37番目までのいずれかのアミノ酸が欠失したDga1pが活性型であることを見出している(特許文献６、非特許文献９)。さらに、このN末端欠失型のDga1pを出芽酵母のdga1破壊株に過剰発現させることによって、脂質含量が45％に増加させることに成功し、その脂質含量増加が、細胞内のヒストンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(ESA1)の発現量減少に基づくESA1機能の低下によることを解明した(特願２０１２−１７９６０４、特願２０１２−２３２９５６、非特許文献９)。しかしながら、これらの報告では、脂質含量の増加を目的とした遺伝子改変、培養条件を用いており、POAの含量の増加を意図したものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０２８３３６
【特許文献２】ＷＯ２０１１／０１１４８６
【特許文献３】特開平８−９９９２７
【特許文献４】特開平６−２５３８７２
【特許文献５】特許第４８０３５８４号
【特許文献６】特許第５３３９３７１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wu, Y. et al., Prog. Lipid Res. 51, 340 (2012)
【非特許文献２】Cao, H. et al., Cell 134, 933 (2008)
【非特許文献３】Yang, Z.-H. et al., Lipids Health Disease 10, 120 (2011)
【非特許文献４】Somerset, S.M. et al., e-SPEN Journal 8, e113 (2013)
【非特許文献５】Knothe, G. Energy Fuels 24, 2098 (2010)
【非特許文献６】Matsunaga, T. et al., FEMS Microbiol. Lett. 133, 137 (1995)
【非特許文献７】Rattray,J.B.M.  Microbial lipids (Ratledge,C. and Wilkinson, S.G., eds),vol.1, pp.555-697, Academic Press, London(1989)
【非特許文献８】Kamisaka, Y. et al., Biochem. J. 408, 61 (2007)
【非特許文献９】Kamisaka, Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88, 105 (2010)
【非特許文献１０】Kamisaka, Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 7345 (2013)
【非特許文献１１】Nikawa, J. & Kawabata, M., Nucleic Acids Res., 26, 860 (1998)
【非特許文献１２】Kainou, K. et al., Yeast 23, 605 (2006)
【非特許文献１３】Sherman, F. et al., Methods in Yeast Genetics. pp. 163-167, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1986)
【非特許文献１４】Kimura, K. et al., J. Biosci. Bioeng. 117, 53 (2014)
【非特許文献１５】Hunter, K. & Rose, A.H. Biochim. Biophys. Acta 260, 639 (1972)
【非特許文献１６】Suutari, M. et al., J. Gen. Microbiol. 136, 1469 (1990)
【非特許文献１７】Kajiwara, S. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 568 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、様々な機能を持つ脂肪酸として注目されているPOAを出芽酵母により効率的に生産する方法を提供するものである。
具体的には、酵母株が産生する脂質含量を低下させることなく、全脂質中に占めるPOA含量を増大させることができる培養条件、及び遺伝子改変の検討を行うことであり、さらにPOA含量を高める培養条件下であっても、増殖能が落ちない酵母株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決すべく、本発明者らが以前に脂質蓄積性形質転換株として開発したDGA1変異体(DGA1ΔN)を発現するDGA1の破壊株を用いて、種々の培養条件を検討した。その結果、当該形質転換株を、高濃度のメチオニンを添加して培養することによって、脂質含量は高いままで、POA含量を10％程度増加させることに成功した。
そして、この形質転換株を通常よりも低温(20−25℃)で培養することによって、さらにPOA含量を増加させるとともに、脂質含量を低下させずに増殖を増加させることを見出し、結果的にPOA生産量の総量を増加させることに成功した。
出芽酵母のdga1破壊株は、高濃度メチオニン存在下での低温培養では、野生株に比べて培養初期に乾燥重量が増加するまでのラグタイムが増加しており、この点を改善するため更に検討を行った。そして、Δ9不飽和化酵素をコードするOLE1遺伝子を共発現させることによって、同条件下での培養で増殖能が高まり、さらに、POA含量も増加することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の〔１〕〜〔８〕に示す通りである。
〔１〕脂質産生能を有するサッカロミセス・セレビシェを、0.2-4g/lの濃度のメチオニン存在下で培養し、培養した細胞から脂質を採取することを特徴とする、パルミトオレイン酸(POA)を高含量に含む脂質の製造方法。
〔２〕前記培養を、18〜27℃の温度条件下で行う、前記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕前記サッカロミセス・セレビシェが、DGAT(ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ)を過剰発現しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記サッカロミセス・セレビシェが、染色体上のDGA1遺伝子が破壊又は機能低下しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕前記サッカロミセス・セレビシェが、OLE1遺伝子が導入され、Δ9不飽和化酵素(Ole1p)が過剰発現しているサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕前記〔５〕に記載の製造方法に用いることができるサッカロミセス・セレビシェ形質転換株であって、DGAT及びOle1pを過剰発現し、かつ染色体上のDGA1遺伝子が破壊又は機能低下していることを特徴とする、POA含量の高い脂質生産能を有するサッカロミセス・セレビシェ形質転換株。
〔７〕さらに、HIS3及びLEU2遺伝子を過剰発現している、前記〔６〕に記載のサッカロミセス・セレビシェ形質転換株。
〔８〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法で得られた脂質から、POAを単離することを特徴とする、POAの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、出芽酵母により様々な機能を持つ脂肪酸として注目されているパルミトオレイン酸(POA)を製造する際に、脂質産生能を低下させることなく全脂質中のPOA含有量を高めることができる。さらに、POA含量が高くても増殖能が低下せず、効率よくPOAを生産する形質転換出芽酵母を提供できる。また、これら技術を用いて高含量のPOAを含む脂質を効率的に生産する手段が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】BY4741野生株あるいはΔdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2の2つのベクターあるいはpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26の3つのベクターで形質転換した形質転換株について、培地へのメチオニン添加がPOA生産量に与える影響を、表１、表２で示したデータをもとに計算して表した。
【図２】BY4741Δdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26で形質転換した形質転換株について、培地へのメチオニン添加量がPOA生産量に与える影響を、表３、表４で示したデータをもとに計算して表した。
【図３】BY4741野生株あるいはΔdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26で形質転換した形質転換株について、培養時間に対する増殖の変化をOD600で調べた。培養は、窒素源欠乏のSD培地(100g/l グルコース、1.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids & ammonium sulfate、5g/l ammonium sulfate、2g/l methionine)で、30℃、20℃で行った。データは、3回の実験結果の平均と標準偏差で表した。
【図４】BY4741野生株あるいはΔdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26で形質転換した形質転換株を、2g/lメチオニン存在下で培養した時の培養温度がPOA生産量に与える影響を、表７、表８で示したデータをもとに計算して表した。
【図５】BY4741野生株あるいはΔdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26あるいはpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2/OLE1、pL2137-26で形質転換した形質転換株について、培養時間に対する増殖の変化をOD600で調べた。培養は、窒素源欠乏のSD培地(100g/l グルコース、1.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids & ammonium sulfate、5g/l ammonium sulfate、2g/l methionine)で、20℃で行った。データは、3回の実験結果の平均と標準偏差で表した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．本発明で用いるPOA生産性酵母
本発明のPOA生産性酵母としては、サッカロミセス・セレビジェ(出芽酵母)に属する酵母であれば、天然のパン酵母、ワイン酵母などを含めどのような酵母を用いてもよいが、形質転換効率の高さや扱いやすさを考慮すると、樹立された培養株であって形質転換用親株として広く用いられている栄養要求性等の選択マーカーを有する実験室酵母野生株、または当該株を用いた形質転換株を用いることが好ましい。本発明で単に「野生株」というとき、主として、これらの樹立された栄養要求性等の選択マーカーを有する野生株をいう。典型的な栄養要求性の野生株としてはBY4741株、S288C株、W303株などがあり、これらの野生株を宿主として脂質生産能を増強させる遺伝子操作を行った形質転換株を用いることが特に好ましい。本発明の実施例では、ウラシル、ロイシン、メチオニン及びヒスチジン要求性でジェネティシン耐性のBY4741株及びその形質転換株を用いている。
なお、本発明において「脂質」というときは、水に不溶で有機溶媒に可溶で、かつ脂肪酸が共有結合した化合物を指し、主要な脂質は微生物で蓄積されるTAG(トリアシルグリセロール)である。特に、含まれる脂肪酸の炭素数が14から22で、不飽和結合の数が0から6のものの有用性が高い。
脂質生産能の高い形質転換株を製造するための好ましい方法としては、主要な貯蔵脂質TAGを合成する酵素をコードするDGAT遺伝子を、サッカロミセス・セレビシェ宿主に導入し、DGATを過剰発現させる。典型的なDGAT遺伝子は、サッカロミセス・セレビシェ由来のDGA1遺伝子、またはその5’末端側の一部を欠失させた改変遺伝子である。当該改変遺伝子は、DGA1遺伝子がコードするDga1pのN末端側の2〜37番目までのいずれかのアミノ酸が欠失したタンパク質(以下、N末端側配列欠失 DGAT蛋白質ともいう。)をコードしており、当該改変遺伝子を用いる方が、全長のDGA1遺伝子を用いるよりも得られる組換え酵素蛋白質の酵素活性が高いことは既知である(例えば、特許文献６、非特許文献９)。なお、DGATは、主要なTAG合成酵素なので、「TAG合成酵素」と表現することもある。DGATは種間での保存性が高いので、導入するDGAT遺伝子はどの生物由来のDGAT遺伝子を用いてもよい。
本発明において「DGAT」及びそれをコードする「DGAT遺伝子」というとき、上記「N末端側配列欠失 DGAT蛋白質」及びそれをコードする改変遺伝子も含まれる。
本発明におけるDGAT遺伝子などの発現手法は、通常のサッカロミセス・セレビシェの形質転換方法に従う。染色体外で複製するベクター中に組み込んで行っても、染色体内に組み込まれるベクター中に組み込んで行ってもよく、DGAT遺伝子を含有する組み換えベクターを用いてサッカロミセス・セレビジェを形質転換する。
【００１４】
DGATを過剰発現するサッカロミセス・セレビジェ株としては、SNF2遺伝子破壊株(特許文献５、非特許文献８)と共に、DGA1遺伝子の破壊によって、染色体上の隣に位置するヒストンアセチルトランスフェラーゼをコードするESA1遺伝子が機能低下した株を用いることで、よりPOA生産への大きな効果を得ることができる。なお、ESA1遺伝子がコードするヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写制御に重要な役割を持つ必須遺伝子であるため、発現したESA1蛋白質の機能低下は、生育が阻害されない程度に行う必要がある。そのために、ゲノム上でESA1遺伝子に隣接するDGA1遺伝子を破壊することが最も好ましい。
本発明において、「DGA1遺伝子の破壊」又は「SNF2遺伝子の破壊」というとき、DGA1遺伝子又はSNF2遺伝子の発現が一時的ではなく恒常的に阻害されている状態を指す。特に、DGA1遺伝子のORFの3’末端側の領域を選択マーカーを含むコンストラクトで置き換えた破壊株が望ましい。その際の破壊株を取得する方法は、既に記載された方法(非特許文献１１、特許文献８)等によって行うことができる。
例えば、マーカー遺伝子の両端に、破壊しようとする対象遺伝子の上流域、下流域の配列を付加したDNAを作成し、該DNAを用いて宿主を形質転換することにより、導入したDNAが、破壊しようとする遺伝子の上流と下流域部分で、相同的組み替えを起こし、対象遺伝子を破壊することができる。対象遺伝子が破壊された変異株は、マーカー遺伝子の発現による形質変化により識別できる。
本発明においては、その他の手法でも、遺伝子の機能を欠失あるいは低下させることができるものであれば使用可能である。これらには、上記破壊対象遺伝子を単離した後、適当な制限酵素で切断し、該切断部位にマーカー遺伝子を挿入して得た断片を用いて形質転換する方法、マーカー遺伝子を、破壊対象遺伝子の一部含むプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、形質転換する方法、あるいは突然変異剤などにより、ランダム変異を生じさせて、対象遺伝子が変異したものをスクリーニングする方法等がある。
【００１５】
本発明で用いる形質転換出芽酵母株には、マーカー遺伝子を含んでいることが好ましい。その際のマーカー遺伝子としては、アミノ酸などの栄養要求性変異を相補する遺伝子や抗生物質薬剤耐性遺伝子などがあげられるが、サッカロミセス・セレビシェのLEU2遺伝子あるいはそれと相同性を有する他の生物の遺伝子をマーカーとするベクター及びHIS3遺伝子あるいはそれと相同性を有する他の生物の遺伝子をマーカーとするベクターを含むことが望ましい。何種類かのプラスミドを共存させる場合は、LEU2、HIS3以外のマーカー遺伝子は、発現させる出芽酵母の形質転換株が選別できるのであれば、どのようなものを用いてもよい。なお、LEU2は、ロイシン要求性変異を相補する遺伝子で、ロイシン合成に必要な３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を、HIS3は、ヒスチジン要求性変異を相補する遺伝子で、ヒスチジン合成に必要なイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子である。
【００１６】
本発明において好ましく用いられる脂質生産能の高い形質転換株としては、DGAT(Dga1p)を出芽酵母SNF2遺伝子破壊株に過剰発現させた形質転換株(特許文献５、非特許文献８)、及びN末端29残基欠失Dga1p(特許文献６)を出芽酵母のDGA1遺伝子破壊株で過剰発現させた形質転換株が挙げられる。特に、N末端29残基欠失Dga1pをdga1破壊株など細胞内のESA1機能を低下させた出芽酵母で過剰発現させた形質転換株(特願２０１２−１７９６０４、特願２０１２−２３２９５６、非特許文献９)が最も好ましく用いられる。
以下、主に、典型的なN末端欠失型のDga1pを出芽酵母のdga1破壊株に導入した形質転換株を用いる場合について説明するが、本発明は当該場合のみに限定されない。
【００１７】
２．本発明におけるPOA含量を高めるための培養条件
（１）高濃度メチオニン含有培地
本発明では、POA産生用の培地としては、出芽酵母用の通常の培地中に高濃度のメチオニンを含有させることを特徴としている。
培地に添加するメチオニン量は、0.2-4g/l、好ましくは0.3-3g/l、特に好ましくは0.5-2g/l程度の濃度で添加することによって、形質転換株のPOA生産性を向上させることができる。
その際、メチオニン含有量以外の各培養条件、例えば培地の炭素源、窒素源の種類、アミノ酸、培養温度、培養時間などについては、POA生産性が高くなるのに最適な条件を適宜選択する事ができる。
好ましいPOA産生用の培地としては、後述の実施例に挙げたようなSD培地(グルコースを炭素源とし、イーストナイトロジェンベースを窒素源とし、要求栄養素を加えた培地)に対して、高濃度のメチオニンを添加した培地を例示することができる。また、DGAT遺伝子などを染色体外で複製するベクターで発現させる場合であっても、YPD培地(グルコースを炭素源とし、酵母エキス、ペプトンを含む培地)のようなベクターを維持するために必要な選択栄養素を含む完全培地でも遺伝子が脱落する恐れはなく、ある程度のPOA生産性を示すことができる。
また、POA産生の際には、出芽酵母細胞内に蓄積する脂質全体の総量も増大させることが好ましく、そのためには、ロイシンなど栄養要求性酵母株については、培地中に通常よりも高濃度のロイシンなどを加えることによって、脂質生産性を向上させることができる。また、培地にPOAの原料脂肪酸となる、パルミチン酸を高濃度で加えると、形質転換株の高い脂肪酸取り込み能によって、パルミチン酸が細胞内に取り込まれ、細胞内でのPOA含量がさらに高まる。
【００１８】
（２）培養温度条件、培養時間
本発明の高濃度メチオニン添加培地での培養においては、培養温度もPOA生産に大きな影響を与える。通常の出芽酵母の培養で用いる培養温度は28-30℃であるが、本発明では、それよりも低温の18-27℃での培養が好ましい。より好ましくは20-25℃であり、22-24℃の範囲で最も高いPOA生産性を得ることができる。
培養時間については、通常7日間培養が最もPOA生産性が高くなるが、形質転換株の種類によっては増殖が速くて4日間培養でもある程度のPOA生産性が得られる場合と、増殖は遅いが10日間培養でPOA含量が非常に高くなる場合などがあり、培養温度などとの組み合わせで、求められるPOA生産に必要な条件を選択することができる。
【００１９】
３．OLE1遺伝子を過剰発現する形質転換株の作製
本発明のPOA生産性出芽酵母である野生型の出芽酵母または前述の各種脂質蓄積性の形質転換株に対して、パルミチン酸をPOA に変換するΔ9不飽和化酵素(Ole1p)をコードするOLE1遺伝子を導入し、Ole1p過剰産生株とする。
その際のOLE1遺伝子の出芽酵母への導入法は、通常のサッカロミセス・セレビシェの形質転換方法に従う。染色体外で複製するベクター中に組み込んで行っても、染色体内に組み込まれるベクター中に組み込んで行ってもよく、OLE1遺伝子を含有する組み換えベクターを用いて上記野生型出芽酵母または脂質蓄積性の形質転換株へのOLE1遺伝子導入を行う。
当該Ole1p過剰産生株を、本発明のPOA生産性培地である高濃度のメチオニン添加培地において培養するか、または当該培養を低温下で行うことで、高いPOAの生産が可能となる。Ole1p過剰産生株を用いたことで、増殖能が高まり培養日数を短縮することができるため、高いPOA含量の油脂を生産することに効果的である。
【００２０】
４．POAの単離法、測定法
本発明で得られたサッカロミセス・セレビシェの菌体内には、DGAT 遺伝子を過剰発現させるかどうかなどによって量は異なるが、POAを高含量に含む脂質が蓄積される。特に、DGAT遺伝子を過剰発現させた場合は、脂質の約90％がTAGであるため、POAを高含量に含むTAGとして菌体内に蓄積される。当該POA含有脂質は、培養菌体を破砕し、クロロホルム、メタノールなどの有機溶媒によって抽出することにより簡単に分離・精製することができる。
さらに、脂質を脂肪酸メチルエステルなどに誘導体化した後、液体クロマトグラフィーによってPOAメチルエステルを簡単に分離・精製することができる。
また、全脂質中の組成分析及びPOA含有量の測定は、脂肪酸をエステル化することで、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーを用いて簡単に測定できる。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００２２】
〔実施例１〕  ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを過剰発現させた出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株を高濃度メチオニン含む培地で培養することによるPOA含有脂質生産
本発明者らは、酵母サッカロミセス・セレビシェにN末端29残基を欠失した活性の高いDga1p(Dga1pΔNp)を過剰発現させた遺伝子改変によって、乾燥重量あたり45％程度の脂質含量の高い形質転換株の構築に成功しており、この脂質中のPOA含量は36％程度であった(特願２０１２−１７９６０４、特願２０１２−２３２９５６、非特許文献１０)。そこで、脂質含量を高く保ちつつ、POA含量を更に増加させるために、既に報告したこの脂質蓄積性の高い形質転換株をもとにして検討を行った。この形質転換株とは、BY4741Δdga1株(Mat a leu2Δ0 his3Δ1 ura3Δ1 met15Δ0 SNF2::kanMX4)(インビトロジェン社製)を、pL1091-5ベクター(2μmを複製開始部位とするマルチコピーベクターで、インサート遺伝子の発現にグルコース培地で高発現のADH1プロモーターをもち、酵母での選択マーカーとしてURA3遺伝子を持ち、大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子をもつベクター)にDga1pΔNpをコードするコンストラクトDGA1ΔNを組み込んだpL1091-5/DGA1ΔNとpL11177-2ベクター(pL1091-5と類似であるが、選択マーカーとしてLEU2遺伝子を持つベクター)で、形質転換して得た株であり、その作製については既報どおりである(特願２０１２−１７９６０４、特願２０１２−２３２９５６、非特許文献１０)。
この形質転換株とBY4741Δdga1株を上記２ベクターとpL2137-26ベクター(pL1091-5と類似であるが、選択マーカーとしてHIS3遺伝子を持つベクター)(非特許文献１２)で形質転換した株、さらに比較として野生株を同様のベクターで形質転換した株を用いて検討を行った。形質転換は、前報と同様に酵母形質転換キット(S.c. EasyComp Transformation Kit, インビトロジェン社製)を用いて行った。
【００２３】
得られた形質転換株は、液体培地中で30℃(あるいは15℃、20℃、25℃)、120rpmのロータリーシェーカーで培養した。培地は、10％GSD(100g/l グルコース、1.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate、5g/l ammonium sulfate、20mg/lヒスチジン(pL2137-26ベクターで形質転換していない場合のみ)、20 mg/lメチオニン)の窒素源が欠乏した培地を基本として、実験によってさらにメチオニンなどを添加した。培養は、主に７日間(場合によって4日間、10日間)行った。
培養後、菌体を遠心分離(3000rpm, 5分)によって沈降させ、105℃で3時間加熱して、その乾燥重量を測定した。さらに、乾燥させた菌体に、1ml 10％塩酸メタノール、0.5mlジクロロメタンを加えて60℃で3時間反応させて脂肪酸メチルエステルを生成させた後、内部標準として250nmol heptadecanoic acid methylesterを加え、さらに1mlヘキサン、1ml飽和食塩水を加えて、二層分配した。この時のヘキサン層にきた脂肪酸メチルエステルを、ガスクロマトグラフ(島津製  GC-17A, TC-70カラム)で測定し、内部標準との比により、全脂肪酸量を算出した。また、内部標準を除いた脂肪酸組成も算出した。
【００２４】
形質転換株のPOA含量が高くなる培養条件を検討したところ、通常よりも高濃度である2g/lのメチオニンを添加すると、高い脂質含量を保ったままでPOA含量を増加することができ、最大で50％まで増加させることができた(表１，２)。BY4741株は、メチオニン要求性の株であるが、通常0.02g/lのメチオニンを添加させれば生育には充分であり(非特許文献１３)、この効果はメチオニン要求性を単に相補するためではなく、これまで見出されていなかったものと考えられた。また、POA含量の増加は、Δdga1株だけでなく、野生株でも認められ、その効果はdga1破壊に依存せず、一般的なものであることが示された。さらに、pL2137-26ベクターも含めて形質転換した株のほうが、野生株由来の形質転換株も含めてPOA含量への効果が高いことが見出された。我々は既に、BY4741Δsnf2株をpL2137-26ベクターで形質転換した株では増殖が増加し、αリノレン酸からステアリドン酸への変換が促進されることを見出しているが(非特許文献１４)、この結果とも関連する結果と考えられた。実際、今回の形質転換株でも2g/lメチオニン存在下での培養では、pL2137-26ベクターで形質転換した株では乾燥重量が増加しており、脂質含量が同等であることから全脂肪酸量及びPOA生産量も増加することが見出された。
また、表１、２のデータからPOA生産量を算出して、各形質転換株で比較すると、３つのベクターで形質転換した野生株あるいはΔdga1株では、2g/lのメチオニン添加によってそれぞれ1.4倍、1.6倍に増加し、Δdga1株由来の形質転換株ではPOA含量だけでなく、POA生産量も増加することが確認された(図１)。
以上の結果より、以降の実験は、pL2137-26ベクターを含む３つのベクターで形質転換した株を用いて検討を行った。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
【表２】
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【００２７】
Δdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL11177-2、pL2137-26で形質転換した株(URA3、LEU2及びHIS3遺伝子含有)について、さらに添加メチオニン濃度の効果を検討した。その結果、3g/lメチオニン添加まで増殖は増加し、脂質含量は0.5-1g/lメチオニン添加で最大となるものの、2g/lまで高い値を維持していた(表３)。POA含量は、0.25g/l以上のメチオニン添加で一貫して増加し、2g/lで最大となった(表４)。
また、この培養におけるPOA生産量を算出し、比較したところ、特に0.5-2g/lメチオニン添加で高い生産量を示すことが確認された(図２)。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【表４】
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【００３０】
さらに、POA含量を増加させる高濃度メチオニンの添加効果が、他のアミノ酸、特にイオウ原子をもつアミノ酸、ペプチドでも認められるかどうか検討した(表５，６)。驚いたことに、イオウ原子をもつアミノ酸であるシステインは同じ濃度を添加すると増殖をほぼ完全に低下させた。イオウ原子をもつトリペプチドであるグルタチオンは、増殖は阻害しなかったが、POA含量に対する効果は認められなかった。また、他のアミノ酸であるグリシン、グルタミンの添加では、おそらく窒素源として働くためか脂質含量が顕著に低下した。以上の結果より、メチオニンの効果はアミノ酸一般の効果あるいはイオウ原子をもつことによる効果ではなく、メチオニンに特異的なものであることが示唆された。
また、BY4741株のメチオニン要求性を相補する遺伝子であるMET17(MET15とも名づけられている)を、
5’-TAGGATCCATGCCATCTCATTTCG-3’(配列番号１)と
5’-ATGCGGCCGCATTACGCACACTCATG-3’(配列番号２)
のプライマーを用いてPCRにて増幅し、既に報告したようにしてpL1177-2ベクターにサブクローニングし、得られたpL1177-2/MET17ベクターをpL1091-5/DGA1ΔNとpL2137-26(HIS3遺伝子含)とともに、Δdga1株を形質転換した株を取得した。この形質転換株での高濃度メチオニンの効果を検討したところ、POA含量は高濃度メチオニンによって増加したが、その値はMET17を発現させない場合に比べて低かった(表６)。また、MET17の過剰発現によっては、高濃度メチオニンの添加と同様な効果を与えないことが見出された。
この結果は、POA含量の増加には、メチオニン合成系が活発化することが重要ではなく、メチオニンが大量に存在することが重要であることを示唆するものである。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
【表６】
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【００３３】
〔実施例２〕  ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを過剰発現させた出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株を低温(20−25℃)で培養することによるPOA含有脂質生産
実施例１で用いたBY4741Δdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26で形質転換した脂質蓄積性株(URA3,LEU2,HIS3選択マーカー遺伝子含)を用いて、2g/lメチオニン添加培地でのPOA含有脂質の生産をさらに効率的に行うために、培養温度の影響を検討した。一般に、脂質を産生する微生物では培養温度を下げると脂質中の不飽和化が亢進して不飽和脂肪酸が増加することが知られているが、出芽酵母においては温度低下によって脂肪酸組成がそれほど変化しないという報告がなされている(非特許文献１５)。また、出芽酵母においては、低温培養により不飽和脂肪酸が増加するというよりも鎖長が短くなり炭素数16の脂肪酸が増加し、POAが増加するという報告もなされている(非特許文献１６)。
また、これらの報告では脂質蓄積が低い通常の出芽酵母を用いているため、多くの脂肪酸は細胞膜の構成成分であるリン脂質に含まれていると推測され、本願で用いている脂質蓄積性酵母株のようにトリアシルグリセロールに含まれる脂肪酸が多い場合とは異なると考えられる。細胞膜のリン脂質中の脂肪酸は培養温度などの環境変化に応答して変化することが知られているが、貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールに含まれる脂肪酸の培養温度による影響については、あまり報告されていない。
そこで、本実施例では、野生株とΔdga1株由来の形質転換株を2g/lメチオニン添加培地(100g/l グルコース、1.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate、5g/l ammonium sulfate、2g/lメチオニン)で20℃で培養したところ、驚いたことに野生株、Δdga1株由来形質転換株ともに乾燥重量が顕著に増加し、全脂肪酸量もそれに伴って増加した(表７)。また、POA含量も増加し、最大54％にまで増加させることができた(表８)。
野生株由来の形質転換株でも含量は低いが同様に20℃培養でPOA含量を増加させることができた。20℃培養でのPOA含量の増加は、高濃度メチオニンによるPOA含量の増加に相乗的な効果があり、両者の作用点は異なることが示唆された。
【００３４】
一方、20℃培養によって乾燥重量が顕著に増加するという結果は、調べた限りでは報告がなく、本発明が初めてであり、興味深い実験結果である。出芽酵母の20℃培養では、30℃培養に比べて増殖速度が低下することはよく知られており、今回用いた形質転換株の増殖を濁度(600nmでの吸光度)で調べたところ、確かに20℃培養では、増殖速度が低下していることが確認された(図３)。しかしながら30℃培養では7日間培養する間に増殖は頭打ちになるのに対し、20℃培養での増殖は頭打ちになるレベルが高く、7日間培養中に30℃培養の増殖を超えていくことが見出された。調べた限りでは、このような20℃培養での増殖プロファイル、すなわち増殖速度は遅いが7日程度培養すると増殖量(乾燥重量)が高くなることについての機構は知られていない。なお、この現象は高濃度のメチオニン添加には依存せず、Δdga1破壊にも依存していなかった。また、図３は野生株由来の形質転換株に比べてΔdga1株由来の形質転換株は増殖速度が遅いこと、メチオニンの添加によって増殖の立ち上がりが遅れることを示している。
【００３５】
【表７】
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【００３６】
【表８】
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【００３７】
BY4741Δdga1株をpL1091-5/DGA1ΔN、pL1177-2、pL2137-26で形質転換した脂質蓄積性株(URA3,LEU2,HIS3選択マーカー遺伝子含)を2g/lメチオニン存在下で、さらに25℃と15℃で培養したところ、25℃では20℃とほぼ同様な脂質含量及びPOA含量を示すことが見出された(表７，８)。一方、15℃では増殖が顕著に低下し、10日間培養でも十分な乾燥重量(1.48mg/ml)、脂肪酸量(0.5mg/ml)を得ることはできなかった。また、POA含量も20℃よりも更に高くなることもなかった。
最後に、表７，８で示した培養におけるPOA生産量を算出したところ、野生株由来形質転換株ではほとんど変化しなかったが、Δdga1株由来形質転換株では20℃、25℃培養で30℃培養に比べて1.4倍ほど生産量が増加しており、低温培養の効果が確認できた(図４)。
以上の結果より、POA生産に適した培養温度は、18℃〜27℃程度であり、特に20℃〜25℃が好ましいことが見出された。
【００３８】
〔実施例３〕Δ9不飽和化酵素をコードするOLE1遺伝子を過剰発現する形質転換株を用いたPOAの生産
POAは、パルミチン酸からΔ9不飽和化酵素(Ole1p)によって変換されるため、POA含量を増加させるためには、この酵素をコードするOLE1遺伝子を発現することが効果的であることが推測された。ただし、Ole1pは、パルミチン酸の不飽和化だけでなくステアリン酸の不飽和化によるオレイン酸の合成も触媒することから、必ずしもPOAだけを増加させないことも考えられる。実際、これまでOLE1遺伝子を出芽酵母で過剰発現させた場合には、POA含量はそれほど大きな変化が起こらないことが報告されている(非特許文献１７)。
そこで、本実施例では、BY4741株を、OLE1遺伝子を含有するベクターであるpL1177-2/OLE1とpL1091-5/DGA1ΔN、pL2137-26(URA3,LEU2，HIS3選択マーカー遺伝子含)で形質転換した株を取得し、OLE1遺伝子の過剰発現の影響を検討した。
OLE1遺伝子を含むpL1177-2/OLE1は、まず5’末端側にBamHI認識部位を含み、3’末端側にNotI認識部位を含んだOLE1遺伝子をPCRによって増幅し、その後pL1177-2に組み込んで作製した。PCRは、
5’-ATGGATCCATGCCAACTTCTGGAACT-3’(配列番号３)と
5’-ATGCGGCCGCCTTAAAAGAACTTACCAG-3’(配列番号４)をプライマーとし、
出芽酵母ゲノムDNAをテンプレートとして、0.4 units DNA polymerase (KOD plus, Toyobo社製)、0.2mM dNTP mixture、0.25μM プライマー、1.2mM MgCl2を含む添付の緩衝液中で反応させた(全反応液  20μl)。増幅条件は、94℃で2分間反応させた後、94℃(15秒間)／55℃(30秒間)／68℃(90秒間)を１サイクルとして30回くり返すことで行った。その後のコンストラクトの精製、pL1177-2へのサブクローニング、pL1177-2/OLE1を含む3種類のベクターによる酵母の形質転換は、既報(特許文献５，６)の通り行った。
BY4741Δdga1株由来のOle1p過剰発現株は、脂質含量が大きく低下し、POA含量もやや増加している程度であった(表９，１０)。しかしながら、低温、高濃度メチオニン存在下(20℃、2g/lメチオニン添加培地)では増殖の立ち上がりが遅いのに対し、Ole1pの過剰発現でそのラグが顕著に短縮され(表９、図５)、4日間培養でのPOA含量は既に54％と高い値であった。また、野生株由来のOle1p過剰発現株では低温、高濃度メチオニン存在下での増殖は変化しないが(表９、図５)、POA含量は顕著に増加させることが見出された。さらに、野生株由来の形質転換株では、Ole1pの過剰発現による脂質含量の低下はそれほど顕著ではなく、POA含量増加の効果が高かった。
Δdga1株由来のOle1pを過剰発現した形質転換株における20℃で4日培養後のPOA生産量は、表９及び１０のデータからみて、過剰発現しない形質転換株に比べてPOA含量が増加すると共に、高いPOA生産量を示した。しかし、7日、10日培養した場合では、POA含量が増加しているが、全体としてのPOA生産量は低下した。
以上の結果より、Ole1pの過剰発現では、増殖を促進し、培養日数を短縮して高いPOA含量の油脂を生産することに効果的であり、特に野生株由来の形質転換株ではPOA含量の増加に効果的であることが見出された。なお、Δdga1株由来の形質転換株ではOle1pの過剰発現によるPOA含量の増加が、7日間培養以降有意に認められなかったのは、ゲノム由来のOle1pが充分活性化しているためと考えられる。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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