(57)【要約】【課題】収差の大きいサンプル内の観察対象についても鮮明な画像を取得する。【解決手段】光源２から発せられた照明光をサンプルＡに照射する対物レンズ５と、該対物レンズ５に入射させる照明光の波面を調節する波面調節装置３と、対物レンズ５に入射させる照明光の光束径を変化させるＮＡ調節装置６と、対物レンズ５から照明光を照射した結果、サンプルＡにおいて発生する光を撮影して画像を取得する撮影装置７とを備える顕微鏡１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から発せられた照明光をサンプルに照射する対物レンズと、
該対物レンズに入射させる照明光の波面を調節する波面調節装置と、
前記対物レンズに入射させる照明光の光束径を変化させるＮＡ調節装置と、
前記対物レンズから照明光を照射した結果、前記サンプルにおいて発生する光を撮影して画像を取得する撮影装置とを備える顕微鏡。
【請求項２】
光源から発せられた照明光の光束径を減少させて対物レンズに入射させるＮＡ縮小ステップと、
該ＮＡ縮小ステップにおいて光束径が減少させられた照明光をサンプルに照射して、照明光の光軸に交差する方向に広がるサンプルの画像を取得する撮像ステップと、
該撮像ステップにおいて取得された画像内において補正対象領域を設定する領域設定ステップと、
該領域設定ステップにおいて設定された補正対象領域について収差を低減するように、前記対物レンズに入射させる照明光の波面を調節する波面調節ステップとを含む収差補正方法。
【請求項３】
前記波面調節ステップにおいて適正な波面に調節された後に、前記対物レンズに入射させる照明光の光束径を増大させるＮＡ増大ステップをさらに含み、
該ＮＡ増大ステップ、該ＮＡ増大ステップにより光束径が増大された照明光を用いた前記撮像ステップおよび前記波面調節ステップを１回以上繰り返す請求項２に記載の収差補正方法。
【請求項４】
前記領域設定ステップと前記波面調節ステップとの間に、前記補正対象領域のピント調節を行うピント調節ステップを含む請求項３に記載の収差補正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡と収差補正方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡によってサンプル内の観察対象物を撮影する場合において、入射光線がサンプル内を通過するときに発生する収差を、波面補正装置を用いて補正する技術が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
この非特許文献１の技術では、サンプル内において発生する収差を見込んで、サンプルに入射させる入射光線の波面を予め変調しようとするものである。具体的には、画像を取得し、画像を評価し、波面を補正することを繰り返すことにより、サンプル内で発生する収差を少なくする波面（真の波面）に近づけていくことが行われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ａｕｇｕｓｔ  １５，２００９  ／  Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１６  ／  ＯＰＴＩＣＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  ２４９５−２４９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、サンプル内で発生する収差が大きい場合（即ち、サンプル内の屈折率が著しく不均一である場合）には、点像分布関数（ＰＳＦ）が大きく乱れて観察対象が存在しない場所にも像（偽像）が現れる。観察対象の真像は波面が真の波面に近づくに従って強度が増加していくのに対し、観察対象の偽像は、波面が真の波面に近づくに従って消滅していく性質を有する。このため、画像の取得、評価および波面の補正を繰り返すだけの非特許文献１の技術では、波面を真の波面に近づけることは困難であるという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、収差を大きく発生させるサンプル内の観察対象についても鮮明な画像を取得することができる顕微鏡と収差補正方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源から発せられた照明光をサンプルに照射する対物レンズと、該対物レンズに入射させる照明光の波面を調節する波面調節装置と、前記対物レンズに入射させる照明光の光束径を変化させるＮＡ調節装置と、前記対物レンズから照明光を照射した結果、前記サンプルにおいて発生する光を撮影して画像を取得する撮影装置とを備える顕微鏡を提供する。
【０００７】
本態様によれば、ＮＡ調節装置を作動させて光束径を小さくした照明光を対物レンズに入射させることにより、対物レンズからサンプルに照射される照明光のＮＡを小さくすると、軸外収差が小さくなり、サンプル内において照明光が集光されるスポット形状が光軸と垂直方向に狭くなる。収差が大きいサンプル内では、スポット形状が変形して広がるため、観察対象が存在しない場所に偽像が発生し、真像と偽像との区別が付かないが、軸外収差を抑えた撮影により、画像内における偽像を弱く形成することができる。したがって、真像を特定しやすくなり、特定された真像を用いて、波面調節装置により照明光の波面を、収差を少なくする適正な波面に調節することができる。
【０００８】
また、本発明は、光源から発せられた照明光の光束径を減少させて対物レンズに入射させるＮＡ縮小ステップと、該ＮＡ縮小ステップにおいて光束径が減少させられた照明光をサンプルに照射して、照明光の光軸に交差する方向に広がるサンプルの画像を取得する撮像ステップと、該撮像ステップにおいて取得された画像内において補正対象領域を設定する領域設定ステップと、該領域設定ステップにおいて設定された補正対象領域について収差を低減するように、前記対物レンズに入射させる照明光の波面を調節する波面調節ステップとを含む収差補正方法を提供する。
【０００９】
本態様によれば、ＮＡ縮小ステップにおいて光束径を減少させた照明光を対物レンズに入射させることにより、サンプル内に照明光が集光されることにより形成されるスポット形状を光軸に直交する方向に狭くすることができる。これにより、撮像ステップにおいて取得される画像内には、偽像が弱められた観察対象の像が形成される。したがって、形成された画像に現れる真像に基づいて領域設定ステップにおいて補正対象領域を特定しやすく、特定された補正対象領域について、波面調節ステップにおいて、収差を低減するように照明光の波面を調節することにより、対物レンズの焦点位置に精度よく照明光を集光させることができる。
【００１０】
上記態様においては、前記波面調節ステップにおいて適正な波面に調節された後に、前記対物レンズに入射させる照明光の光束径を増大させるＮＡ増大ステップをさらに含み、該ＮＡ増大ステップ、該ＮＡ増大ステップにより光束径が増大された照明光を用いた前記撮像ステップおよび前記波面調節ステップを１回以上繰り返してもよい。
【００１１】
このようにすることで、被写界深度を深くして特定された観察対象について、被写界深度を浅くして解像度の高い画像を取得しながら、波面を調節して収差を低減することができる。
【００１２】
また、上記態様においては、前記領域設定ステップと前記波面調節ステップとの間に、前記補正対象領域のピント調節を行うピント調節ステップを含んでいてもよい。
このようにすることで、被写界深度を深くして特定された観察対象を含む補正対象領域について、ピント調節を行って焦点を真像の位置に一致させることにより、その後にＮＡ拡大ステップにより、照明光の光束径を増大させて、被写界深度を絞っても観察対象を見失わずに観察し続けることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、収差の大きいサンプル内の観察対象についても鮮明な画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡の制御部におけるゼルニケ係数の決定方法を説明する図である。
【図３】図１の顕微鏡における無収差のサンプルに集光されるレーザ光のスポット形状を示す（ａ）ｘｙ投影図、（ｂ）ｘｚ投影図である。
【図４】図１の顕微鏡における収差の大きなサンプルに集光されるレーザ光のスポット形状の一例を示す（ａ）ｘｙ投影図、（ｂ）ｘｚ投影図である。
【図５】図１の顕微鏡の作用を説明するために用いられるサンプルの一例を示す（ａ）ｘｙ投影図、（ｂ）ｘｚ投影図である。
【図６】図１の顕微鏡において収差の大きなサンプル内でＮＡを最大としたレーザ光を走査した場合の（ａ）蛍光画像、（ｂ）ｘｚ投影図をそれぞれ示す図である。
【図７】図１の顕微鏡において収差の大きなサンプル内でＮＡを縮小したレーザ光を走査した場合の（ａ）蛍光画像、（ｂ）ｘｚ投影図をそれぞれ示す図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る収差補正方法を説明するフローチャートである。
【図９】図１の顕微鏡において収差の大きなサンプル内で収差を理想的に補正してＮＡを最大としたレーザ光を走査した場合の（ａ）蛍光画像、（ｂ）ｘｚ投影図をそれぞれ示す図である。
【図１０】図１の顕微鏡において収差の大きなサンプル内で収差を理想的に補正してＮＡを縮小したレーザ光を走査した場合の（ａ）蛍光画像、（ｂ）ｘｚ投影図をそれぞれ示す図である。
【図１１】図８のフローチャートの変形例を示す図である。
【図１２】図１の顕微鏡のＮＡ調節装置を波面調節装置で実現する場合について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、レーザ光を発生するレーザ光源２と、該レーザ光源２から発せられたレーザ光の波面を調節する波面調節装置３と、レーザ光を２次元的に走査するスキャナ４と、該スキャナ４により走査されたレーザ光を集光して標本Ａに照射する対物レンズ５と、対物レンズ５に入射させるレーザ光の光束径を変化させるビームエキスパンダ（ＮＡ調節装置）６と、対物レンズ５により集光された蛍光を検出する受光部７と、波面調節装置３およびビームエキスパンダ６を制御するとともに受光部７により受光された蛍光強度とスキャナ４による走査位置とから蛍光画像を構成する制御部８と、該制御部８により構成された蛍光画像を表示する表示部９と、制御部８に対して入力を行う入力部１０とを備えている。図中、符号１１はリレー光学系、符号１２〜１４はレンズ、符号１５はダイクロイックミラーである。
【００１６】
波面調節装置３は、レーザ光源２から発せられた光を偏向するミラー３ａと、反射型の液晶素子３ｂとを備えている。液晶素子３ｂは、レーザ光の光束を反射させる際にその波面に所望の変調を施すことができるようになっている。レーザ光の波面に付与する変調は、制御部８からの指令により設定され、所望の変調を実現する位相パターンを液晶素子３ｂにおいて発生させることにより行われる。液晶素子３ｂにおいて反射され波面が変調されたレーザ光はミラー３ａにおいて再度偏向されて、後段のリレー光学系１１に入射されるようになっている。
【００１７】
入力部１０は、例えば、マウスまたはキーボード等の入力装置である。入力部１０の操作により、表示部９に表示された蛍光画像において、表示されたポインタを移動させて、操作者が任意の領域を指定することができるようになっている。
【００１８】
ビームエキスパンダ６は、光軸方向に配列された複数のレンズ６ａ，６ｂと、少なくとも１つのレンズ６ａを光軸方向に移動させる駆動部６ｃとを備えている。ビームエキスパンダ６は、駆動部６ｃの作動により少なくとも１つのレンズ６ａを光軸方向に移動させることにより、対物レンズ５に入射させるレーザ光の光束径を縮小または拡大することができるようになっている。
【００１９】
制御部８は、ビームエキスパンダ６を作動させてレーザ光の光束径を十分に小さく絞った状態で、受光部７により受光された蛍光強度とスキャナ４による走査位置とから蛍光画像を構築するようになっている。そして、制御部８は構築された蛍光画像を表示部９に出力し、表示させるようになっている。
【００２０】
表示部９に表示された蛍光画像において、操作者が入力部１０を用いて観察したい領域を指定した場合には、制御部８は、波面調節装置３を作動させて、指定された領域について収差を補正する処理を行うようになっている。
具体的には，制御部８は、波面調節装置３を作動させて、レーザ光の波面を変化させ、その状態で指定された領域内における蛍光強度の平均値を算出することを繰り返し、指定された領域内における蛍光強度の平均値が最大となる波面を検出するようになっている。
なお、制御部８は、蛍光強度の平均値を算出することに代えて、蛍光強度の和等を算出してもよい。
【００２１】
さらに具体的には、制御部８は、波面形状を直交関数、例えば、以下のようなＺｅｒｎｉｋｅ関数（Ｚ５〜Ｚ３７）を含むＺｅｒｎｉｋｅ近似多項式によって表現する。Ｚｅｒｎｉｋｅ関数に限定されるものではなく、他の任意の直交関数を用いることができる。
【００２２】
【数１】
2015022073.tif 000003
ここで、Ａｎｍはゼルニケ係数である。
【００２３】
制御部８は、各Ｚｅｒｎｉｋｅ関数Ｚ５〜Ｚ３７において、波面変形形状を固定してゼルニケ係数Ａｎｍを変更しながら指定領域内の蛍光強度の平均値が最も大きくなるゼルニケ係数を選択する処理を行うようになっている。制御部による係数の選択は、例えば、図２に示されるように、断続的な係数毎に蛍光強度の平均値Ｉ１〜Ｉ３をプロットしていき、その近似曲線が最大値となる係数Ａｍａｘを求めること（いわゆる山登り法）により行われる。
【００２４】
制御部８は、各Ｚｅｒｎｉｋｅ関数Ｚ５〜Ｚ３７について蛍光強度が最大値となる係数Ａｍａｘが求められた後に、全ての各Ｚｅｒｎｉｋｅ関数Ｚ５〜Ｚ３７の総和を演算することにより、収差を少なくする波面を決定するようになっている。
【００２５】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて蛍光画像を取得するには、制御部８がビームエキスパンダ６を作動させてレーザ光源２からのレーザ光の光束径を絞り、対物レンズ５によってサンプルＡにレーザ光を集光させる。そして、スキャナ４を作動させてサンプルＡに集光されたレーザ光を２次元的に走査させる。
【００２６】
無収差のサンプルＡ内においては、図３（ａ），（ｂ）に示されるように、一点の真像Ｐ１に集光するレーザ光のスポットは、収差が大きいサンプルＡの場合には、図４（ａ），（ｂ）に示されるように真像Ｐ１および偽像Ｐ２〜Ｐ５を含む複数のスポットに分離し、それぞれのスポットが光軸方向（Ｚ軸方向）およびそれに交差する方向に延びるようになる。このようなサンプルＡの蛍光画像を取得する場合について、例えば、図５に示されるように収差が大きいサンプルＡに３つの小球状の蛍光ビーズ（観察対象）Ｑ１〜Ｑ３が３次元的に分布して配置されている場合を例に挙げて説明すると以下の通りとなる。
【００２７】
図６に示されるように、真像Ｐ１および偽像Ｐ２〜Ｐ５を含む複数のスポットをサンプルＡ内において２次元的に走査すると、図６（ｂ）に示されるように、一の蛍光ビーズＱ１に対しては真像Ｐ１が通過するが、他の一の蛍光ビーズＱ２に対しては偽像Ｐ２，Ｐ３のみが通過し、もう１つの蛍光ビーズＱ３にはスポットは通過しない。このとき得られる蛍光画像は図６（ａ）の通りである。
【００２８】
この蛍光画像においては一の蛍光ビーズＱ１について真像Ｐ１が通過したときに発生した蛍光像Ｒ１と、他の一の蛍光ビーズＱ２に偽像Ｐ２，Ｐ３が通過したときに発生した蛍光像Ｒ２２，Ｒ２３とが表れている。図６（ａ）に示されるスポットをＸ方向に走査するラインスキャンでは、Ｘ座標の大きい位置に現れる偽像Ｐ３の方が、Ｘ座標の小さい位置に現れる偽像Ｐ２よりも先に蛍光ビーズＱ２を通過するので、偽像Ｐ３による蛍光ビーズＱ２の蛍光像Ｒ２３が、Ｘ座標の小さい方（図６（ａ）では向かって左側）に、偽像Ｐ２による蛍光ビーズＱ２の蛍光像Ｒ２２が、Ｘ座標の大きい位置（図６（ａ）では向かって右側）に現れる。また、真像Ｐ１よりもＹ座標の小さい位置に現れる偽像Ｐ２，Ｐ３による蛍光ビーズＱ２の蛍光像は、蛍光ビーズＱ２の真像Ｐ１による蛍光像Ｒ２が現れるべき位置よりもＹ座標の大きい位置（図６（ａ）では向かって下側）に現れる。蛍光ビーズＱ２の真像Ｐ１による蛍光像Ｒ２、蛍光ビーズＱ３の真像による蛍光像Ｒ３は現れていない。
【００２９】
しかしながら、この蛍光画像のみを表示部９に表示した場合に、観察者は、どの蛍光像が真像Ｐ１によるものに相当し、どの蛍光像が偽像Ｐ２〜Ｐ５によるものに対応しているのかを区別することができない。このため、どの蛍光像に対して収差補正を行うべきかを判断することが困難である。
【００３０】
これに対して本実施形態に係る顕微鏡１においては、観察の初期に、制御部８がビームエキスパンダ６を作動させて、レーザ光の光束径を縮小させ、対物レンズ５からはＮＡの小さいレーザ光をサンプルＡに照射させる。このようにすることで、真像Ｐ１および偽像Ｐ２〜Ｐ５に分離していたスポットは、図７（ｂ）に示されるように、真像Ｐ１のスポットが深さ方向に伸び、軸外収差が小さくなることから偽像Ｐ２〜Ｐ５のスポットが真像Ｐ１に近寄って薄くなる。
【００３１】
これにより、取得される蛍光画像においては、図７（ａ）に示されるように、偽像Ｐ２，Ｐ３は薄くなり、これらの偽像Ｐ２，Ｐ３が蛍光ビーズＱ２を通過することにより現れる蛍光像Ｒ２２’，Ｒ２３’は薄くなる。その結果、観察者が、偽像Ｐ２，Ｐ３による蛍光像Ｒ２２’，Ｒ２３’を真像Ｐ１による蛍光像Ｒ２と見誤る不都合の発生を防止することができる。
【００３２】
そして、取得された蛍光画像が表示され、観察者が入力部１０から、図７（ａ）に示されるように、蛍光画像上における補正対象領域Ｂを指定した場合には、制御部８は、波面調節装置３を作動させて、指定された補正対象領域Ｂについて収差を補正する処理を行うようになっている。
【００３３】
次に、本発明の一実施形態に係る収差補正方法について以下に説明する。
本実施形態に係る収差補正方法は、図８に示されるように、レーザ光のＮＡを最大にした状態で（ステップＳ０）、スキャナ４を作動させてレーザ光を照射し、蛍光画像を取得する（ステップＳ１）。
【００３４】
取得された蛍光画像をモニタ９に表示し、表示された蛍光画像を観察者が確認することにより、蛍光像がレーザ光のスポットの真像Ｐ１によるものであるか偽像Ｐ２〜Ｐ５によるものであるかを判断し（ステップＳ２）、真像Ｐ１によるものであると確認できた場合には、入力部１０によって補正対象領域Ｂを選択し（ステップＳ３）、収差補正を行う（ステップＳ４）。収差補正を行うことにより、理想的にはスポットの偽像Ｐ２〜Ｐ５が消滅し、無収差のサンプルに集光させた場合と同様の真像Ｐ１のみからなるスポットが形成されるので、図９（ａ）に示されるように、鮮明な蛍光像Ｒ１を得ることができる。
【００３５】
モニタ９に表示された蛍光画像によっては蛍光像がレーザ光のスポットの真像Ｐ１によるものであることが確認できない場合には、制御部９はビームエキスパンダ６を作動させて、レーザ光の光束径を絞り（ステップＳ５）、スキャナ４を作動させてレーザ光を照射し、蛍光画像を取得する（ステップＳ６）。これにより、レーザ光のスポットは図７（ｂ）に示されるように深さ方向に長くなるので、各位置の蛍光像としては、図７（ａ）に示されるように、レーザ光のスポットの真像Ｐ１により発生した蛍光像Ｒ１，Ｒ２が蛍光画像上に現れる。
【００３６】
これにより、観察者が、入力部１０によって補正対象領域Ｂを選択し（ステップＳ７）、収差補正を行う（ステップＳ８）。収差補正を行うことにより、図１０（ｂ）に示されるように、理想的にはスポットの偽像Ｐ２〜Ｐ５が消滅し、無収差のサンプルに集光させた場合と同様の真像Ｐ１のみからなるスポットが形成されるので、図１０（ａ）に示されるように、鮮明な蛍光像Ｒ１，Ｒ２を得ることができる。
【００３７】
そして、制御部８は、レーザ光のＮＡが最大であるか否かを判定し（ステップＳ９）、最大である場合には処理を終了し、最大ではない場合には、ＮＡを大きくする（ステップＳ１０）。この状態で、スキャナ４を作動させてレーザ光を照射し、蛍光画像を取得する（ステップＳ１１）。
【００３８】
そして、観察者が取得された蛍光画像をモニタ９上で確認して、蛍光画像が鮮明であるか否かを判断し（ステップＳ１２）、蛍光画像が鮮明である場合には、ＮＡが最大となるまでステップＳ９からの工程を繰り返し、蛍光画像が不鮮明である場合には、ステップＳ８からの工程を繰り返す。
ＮＡを増大させることにより、レーザ光のスポットの偽像Ｐ２〜Ｐ５が水平方向に伸びるので、再度収差補正を行うことで、より鮮明なスポットを形成することができる。
【００３９】
このように、補正対象領域Ｂを指定する前にレーザ光のＮＡを絞ることによって、被写界深度を深くしているので、蛍光画像上に偽像Ｐ２〜Ｐ５のみによる蛍光像Ｒ２２，Ｒ２３が発生する領域を減少させ、補正対象領域Ｂを指定し易くすることができるという利点がある。その結果、補正対象領域Ｂ内の真像Ｐ１に基づく蛍光像を用いて収差補正を容易に行うことができる。すなわち、収差の大きいサンプルＡであっても、無収差のサンプルのように極めて小さいスポットをサンプルＡ内に集光させることができて、図９に示されるように、鮮明な蛍光画像を取得することができる。また、ＮＡが最大となるまで画像取得と収差補正とを繰り返すことにより、分解能の高い蛍光画像を取得することができる。
【００４０】
なお、本実施形態においては、図７（ａ），（ｂ）に示されるように、ＮＡを絞った時点でレーザ光のスポットの真像Ｐ１の深さ方向の中心位置が一の蛍光ビーズＱ１に一致している（ピントが合っている）場合を例示した。このため、ＮＡを増大させて、レーザ光のスポットの真像Ｐ１が深さ方向に短くなっても、一の蛍光ビーズＱ１の蛍光像Ｒ１を蛍光画像上に常に表示させておくことができる。
【００４１】
しかしながら、一般にはレーザ光のスポットの真像Ｐ１の深さ方向の中心位置は観察対象である蛍光ビーズＱ１に一致していない。すなわち、ピントがずれているので、図１１に示されるように、図８のステップＳ７とステップＳ８との間に、ピント合わせを行うステップＳ１３を設けることが好ましい。これにより、ＮＡを増大させて蛍光画像の分解能を高めていっても、真像Ｐ１による蛍光像Ｒ１を見失わずに済むという利点がある。
【００４２】
また、ステップＳ１２の蛍光画像が鮮明であるか否かの判断は、観察者が行ってもよいが、ＮＡを増加させた後に取得された画像からＮＡを増加させる前に取得された画像を減算して、ＮＡを増加させる前の画像の輝度の方が大きかった画素（減算の結果、輝度がマイナスとなった画素）のみの蛍光強度の総和の絶対値を評価値として評価することにより、制御部８により、画像の善し悪しを自動的に判定することにしてもよい。
【００４３】
また、本実施形態においては、ＮＡ調節装置として、ビームエキスパンダ６を例示したが、これに代えて、瞳位置に配置した絞りの開口の大きさを調節するものを採用してもよい。また、ＮＡ調節装置としては、波面調節装置３の一部を共用してもよい。例えば、図１２に示されるように、実際に使用するレーザ光が入射される領域Ｔ１については波面の調節を行い、その周辺に位置する領域Ｔ２に入射されるレーザ光については、チルト等の大きな補正を行って対物レンズ５に入射しないようにしてもよい。
【００４４】
また、本実施形態においては、制御部８が波面調節装置３およびビームエキスパンダ６を制御することとしたが、これに限定されるものではなく、観察者が表示部９を見ながら波面調節装置３およびビームエキスパンダ６を操作することにしてもよい。
【００４５】
また、反射型の液晶素子３ｂを有する波面調節装置３を例示したが、これに限定されるものではなく、透過型の液晶素子を用いてもよいし、他の任意の波面調節装置を採用してもよい。
【符号の説明】
【００４６】
Ａ  サンプル
Ｓ５  ＮＡ縮小ステップ
Ｓ６  撮像ステップ
Ｓ７  領域設定ステップ
Ｓ８  波面調節ステップ
Ｓ１０  ＮＡ増大ステップ
Ｓ１３  ピント調節ステップ
１  顕微鏡
２  レーザ光源（光源）
３  波面調節装置
５  対物レンズ
６  ビームエキスパンダ（ＮＡ調節装置）
７  受光部（撮影装置）
【図１】
2015022073.tif 000004
【図２】
2015022073.tif 000005
【図３】
2015022073.tif 000006
【図４】
2015022073.tif 000007
【図５】
2015022073.tif 000008
【図６】
2015022073.tif 000009
【図７】
2015022073.tif 000010
【図８】
2015022073.tif 000011
【図９】
2015022073.tif 000012
【図１０】
2015022073.tif 000013
【図１１】
2015022073.tif 000014
【図１２】
2015022073.tif 000015