(57)【要約】      （修正有）【課題】低分子量でもコアセルベーション（自己集合）能を発現しうる新規なペプチドを提供する。【解決手段】下記（ａ）または（ｂ）の温度依存性自己集合性を示すペプチド。（ａ）化学式１で表されるペプチド2015013850.tif 000021（ｎは３〜３００の整数）（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されてなるペプチド。【選択図】図４
2015013850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のペプチド（ただし、Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧｌｙまたはＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであるものを除く）：
（ａ）下記化学式１：
【化１】
2015013850.tif 000019
式中、
ｎは、３〜３００の整数であり、
Ｘ１は、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンであり、
Ｘ２は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘ３は、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアミノ酸欠失であり、
Ｘ４は、グリシン、アラニンまたはアミノ酸欠失であり、
ただし、Ｘ３およびＸ４がともにアミノ酸欠失となることはない、
で表されるペプチド；
（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドであって、温度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項２】
ｎが３〜１０の整数である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ１がトリプトファン、シクロヘキシルアラニン、またはフェニルアラニンであり、Ｘ２がグリシンであり、Ｘ３がバリンであり、Ｘ４がグリシンまたはアミノ酸欠失である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号２〜配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列で表される繰り返し配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２、配列番号８、および配列番号９のいずれかのアミノ酸配列で表される繰り返し配列を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号１３〜配列番号３３のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２９、および配列番号３２のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
下記（ｄ）のペプチドおよび下記（ｅ）のペプチドからなる群から選択される２つのペプチドが−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基を介して連結されてなるペプチド：
（ｄ）下記化学式２：
【化２】
2015013850.tif 000020
式中、
ｎは、３〜３００の整数であり、
Ｘ５は、トリプトファン、チロシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンであり、
Ｘ６は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘ７は、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアミノ酸欠失であり、
Ｘ８は、グリシン、アラニンまたはアミノ酸欠失であり、
ただし、Ｘ７およびＸ８がともにアミノ酸欠失となることはない、
で表されるペプチド；
（ｅ）前記（ｄ）のペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドであって、温度依存性自己集合性を示すペプチド。
【請求項９】
分子量が３０００未満である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを溶解した水溶液を加熱する工程を含む、ペプチドを自己集合させる方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドが自己集合してなる、ペプチド集合体。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１１に記載のペプチド集合体を含む、細胞培養基材。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞培養基材を用いて細胞を培養する培養工程と、
培養された細胞を含む細胞シートを回収する回収工程と、
を含む、細胞シートの製造方法。
【請求項１４】
前記回収工程が、培養物を冷却して前記細胞培養基材を液化させた後に、前記細胞シートを回収する工程を含む、請求項１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドおよびその自己集合方法、その集合体、これらを用いた細胞培養基材、並びに、細胞シートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体をはじめとする動物組織を構成するタンパク質として、エラスチンが知られている。このエラスチンは、コラーゲンと同様に細胞外において機能する繊維状のタンパク質であり、ゴムのように伸縮する性質（弾性）を有していることから、組織への柔軟性の付与に関与している。このため、伸縮性が必要とされる組織・器官（ヒトでは例えば、皮膚の真皮、靱帯、腱、肺、血管壁など）に広く分布している。
【０００３】
このエラスチンは、生体内においてはまず、前駆体タンパク質であるトロポエラスチン（分子量約７０，０００）として血管平滑筋細胞や線維芽細胞で生合成される。トロポエラスチンは次いで、ミクロフィブリルと称される糖タンパク質の周囲や間隙に自己集合した後、分子間で適切に架橋されて不溶性のエラスチンとなる。生体内における正常なエラスチンの形成には、この第一段階であるトロポエラスチンの規則的な自己集合が重要であり、この自己集合の現象は「コアセルベーション」と称されている。つまり、正常なエラスチンの形成にはコアセルベーションが深く関与しているのである。
【０００４】
エラスチンのコアセルベーション特性は、試験管内において観察することができる（図１）。すなわち、トロポエラスチンやエラスチン由来の配列を有する一連のペプチド（エラスチン由来ペプチド）の水溶液は、低温（２５℃以下）では透明で均一な溶液である。しかし、温度を体温（３７℃）以上に上げていくと、分子が自己集合し、その結果溶液は白濁する。白濁した溶液を再度冷却すると透明な溶液へと戻るが、冷却せずにそのまま放置すると、溶液系は二層に分離する。具体的には、エラスチン分子をわずかしか含まない平衡溶液（上層）と、分子が濃縮されてなる粘性のコアセルベート層（下層）との二層に分離するのである。この層分離過程も可逆的であり、温度を２５℃以下に下げると再び元の透明な均一溶液となる。この可逆的な自己集合・解離の特性が「コアセルベーション」であり、正常なエラスチンの線維形成や、さらには弾性機能の発現に重要な特性である。
【０００５】
エラスチンの前駆体であるトロポエラスチンの一次構造上の特徴は、疎水性アミノ酸を多く含む疎水性領域と、分子間の架橋に関わる架橋領域とが交互に繰り返されていることである。疎水性領域には様々な疎水性アミノ酸の繰り返し配列が存在し、その繰り返し配列の一つであるVal-Pro-Gly-Val-Gly（以下、「ＶＰＧＶＧ」と略すこともある；また、本明細書において、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側へと向かって、左から右へと記載する（以下同様））からなるペンタペプチド配列は、これまでに報告されているほとんど全ての動物種に存在する。また、この繰り返し配列を有する合成ポリペプチド（ＶＰＧＶＧ）ｎ（ｎ≧４０）はコアセルベーション特性を示すことから、ＶＰＧＶＧ繰り返し配列がエラスチンの弾性機能を担う配列であることが示唆されている。
【０００６】
このように、ＶＰＧＶＧの繰り返しアミノ酸配列を有するポリペプチドは、自己集合能を有することにより生体材料や薬物送達システム（ＤＤＳ）用材料等の基盤素材としての利用価値が高い。しかしながら、当該ポリペプチドを工業的に利用するには、繰り返し配列の繰り返し数（ｎ）が非常に大きく、調製が困難な高分子量のペプチドを合成する必要があり、時間およびコストがかかる。このため、これまでのところ工業的な利用はほとんどなされていない。なお、海外からの報告として、遺伝子工学的に合成されたIle-Pro-Gly-Val-Gly（以下、「ＩＰＧＶＧ」と略すこともある）繰り返し配列を有するポリマーを生体材料に利用することが、Dan W. Urry教授によって従来提案されていた（非特許文献１を参照）。
【０００７】
ここで、本発明者らは、従来報告されている合成ポリペプチド（ポリペンタペプチド；（ＶＰＧＶＧ）ｎや（ＩＰＧＶＧ）ｎ）において、Ｎ末端アミノ酸（バリン、イソロイシン）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）で置き換えると、繰り返し配列の繰り返し数（ｎ）が小さく調製が容易な低分子量でもコアセルベーション（自己集合）能を発現させることができることを見出し、特許出願している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−１２６７１３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Phys. Chem. B, 101, 11007-11028 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、（ＶＰＧＶＧ）ｎのＮ末端アミノ酸をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）で置き換えたポリペンタペプチド（（ＦＰＧＶＧ）ｎ）については低分子量（少ない繰り返し数）でもコアセルベーション（自己集合）能が発揮されることが従来知られているが、その他のポリペンタペプチド配列や、ポリテトラペプチド等の基本繰り返し配列自体がより短いペプチドについては、低分子量でのコアセルベーション能が発揮されるかどうかは知られていないのが現状である。より低分子量でも自己集合が可能なペプチドが開発されれば、種々の産業における工業化にとって非常に有利であることから、かような新規ペプチドの開発が望まれている。
【００１１】
そこで本発明は、低分子量でもコアセルベーション（自己集合）能を発現しうる新規なペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上述したような課題に鑑み、鋭意検討を行なった。その過程で、下記化学式１で表される構造を有するペプチドにより上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の一形態（第１の形態）によれば、下記（ａ）または（ｂ）のペプチド（ただし、Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧｌｙまたはＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであるものを除く）が提供される。なお、本明細書では、下記化学式１における繰り返し配列である「Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４」を配列番号１とする。
【００１４】
（ａ）下記化学式１：
【００１５】
【化１】
2015013850.tif 000003
【００１６】
式中、
ｎは、３〜３００の整数であり、
Ｘ１は、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンであり、
Ｘ２は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘ３は、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアミノ酸欠失であり、
Ｘ４は、グリシン、アラニンまたはアミノ酸欠失であり、
ただし、Ｘ３およびＸ４がともにアミノ酸欠失となることはない、
で表されるペプチド；
（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドであって、温度依存性自己集合性を示すペプチド。
【００１７】
また、上記形態の好ましい形態において、ｎは３〜１０の整数であり、さらに好ましい形態において、Ｘ１はトリプトファン、シクロヘキシルアラニン、またはフェニルアラニンであり、Ｘ２はグリシンであり、Ｘ３はバリンであり、Ｘ４はグリシンまたはアミノ酸欠失である。
【００１８】
さらに好ましい形態において、ペプチドは、配列番号２〜配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列で表される繰り返し配列を有することが好ましく、配列番号２、配列番号８、および配列番号９のいずれかのアミノ酸配列で表される繰り返し配列を有することがより好ましく、配列番号１２〜配列番号３２のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが特に好ましく、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、および配列番号３１のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが特に好ましい。
【００１９】
また、本発明の他の形態（第２の形態）によれば、下記（ｄ）のペプチドおよび下記（ｅ）のペプチドからなる群から選択される２つのペプチドが−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基を介して連結されてなるペプチドも提供される：
（ｄ）下記化学式２：
【００２０】
【化２】
2015013850.tif 000004
【００２１】
式中、
ｎは、３〜３００の整数であり、
Ｘ５は、トリプトファン、チロシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンであり、
Ｘ６は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘ７は、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアミノ酸欠失であり、
Ｘ８は、グリシン、アラニンまたはアミノ酸欠失であり、
ただし、Ｘ７およびＸ８がともにアミノ酸欠失となることはない、
で表されるペプチド；
（ｅ）前記（ｄ）のペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドであって、温度依存性自己集合性を示すペプチド。
【００２２】
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記ペプチドを溶解した水溶液を加熱する工程を含む、ペプチドを自己集合させる方法が提供される。
【００２３】
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記ペプチドが自己集合してなる、ペプチド集合体が提供される。
【００２４】
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記ペプチドまたは上記ペプチド集合体を含む細胞培養基材、これを利用した細胞シートの製造方法もまた、提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、低分子量でもコアセルベーション（自己集合）能を発現しうる新規なペプチドが提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】エラスチンのコアセルベーション特性を説明するための説明図である。
【図２】実施例における、固相法によるペプチドの化学合成の様子を説明するための説明図である。
【図３】実施例における、固相法によるペプチドの化学合成の様子を説明するための説明図である。
【図４】実施例において合成したペプチドである（ＷＰＧＶＧ）３のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図５】実施例において合成したペプチドである（ＹＰＧＶＧ）５のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図６】実施例において合成したペプチドである（ＶＰＧＦＧ）４のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図７】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＧＶＡ）４のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図８】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＡＶＧ）４のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図９】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＧＦＧ）４のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１０】実施例において合成したペプチドである（ＣｈａＰＧＶＧ）３のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１１】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＧＶ）３のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１２】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＧＧ）６のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１３】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＧＬＧ）５のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１４】実施例において合成したペプチドである（ＦＰＧＩＧ）５のコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１５】実施例において合成したペプチドダイマーであるＮ−ダイマーのコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１６】実施例において合成したペプチドダイマーであるＣ−ダイマーのコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１７】実施例において合成したペプチドダイマー（Ｎ−ダイマー）の合成中間体であるＮ−モノマーのコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１８】実施例において合成したペプチドダイマー（Ｃ−ダイマー）の合成中間体であるＣ−モノマーのコアセルベーション特性を評価した結果を示すグラフである。
【図１９】実施例において合成したペプチドダイマー（Ｎ−ダイマーおよびＣ−ダイマー）のコアセルベーション特性を評価した結果を、対応する合成中間体のモノマー（Ｎ−モノマーおよびＣ−モノマー）並びにこれらの合成原料である（ＦＰＧＶＧ）５と比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を実施するための具体的な形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の具体的な形態のみに限定されるわけではない。
【００２８】
本発明の一形態（第１の形態）によれば、下記（ａ）または（ｂ）のペプチドが提供される。
【００２９】
（ａ）下記化学式１：
【００３０】
【化３】
2015013850.tif 000005
【００３１】
式中、
ｎは、３〜３００の整数であり、
Ｘ１は、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンであり、
Ｘ２は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘ３は、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアミノ酸欠失であり、
Ｘ４は、グリシン、アラニンまたはアミノ酸欠失であり、
ただし、Ｘ３およびＸ４がともにアミノ酸欠失となることはない、
で表されるペプチド；
（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドであって、温度依存性自己集合性を示すペプチド。
【００３２】
ここで、本発明に係るペプチドの範囲からは、Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであるもの、および、Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４がＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであるものは除外されている。
【００３３】
Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４において、Ｘ３およびＸ４はアミノ酸欠失（つまり、アミノ酸が存在しない）でありうるが、Ｘ３およびＸ４がともにアミノ酸欠失となることはない。したがって、本発明に係るペプチドの繰り返し単位（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）は４アミノ酸または５アミノ酸となる。そして、（ａ）のペプチド（化学式１で表されるペプチド）におけるｎは、この繰り返し単位である４アミノ酸または５アミノ酸の繰り返し回数（重合度）を表す。そして、このｎは、本発明では３以上の整数であることが必須である。これは、ｎ≧３のときに初めて、ペプチドがコアセルベーション（自己集合）能を発現するためである。一方、上限について、タンパク質化学的に取り扱いが可能な分子サイズとして、ｎは３００以下の整数である。ここで、下限について、ｎは、好ましくは４以上の整数であり、より好ましくは５以上の整数であり、さらに好ましくは６以上の整数である。一方、上限について、ｎは、好ましくは１００以下の整数であり、より好ましくは１０以下の整数である。
【００３４】
（ａ）のペプチド（化学式１で表されるペプチド）の好ましい実施形態の一例として、以下の配列番号２〜１０のいずれかの繰り返し配列を有するものが挙げられる。
【００３５】
・ＷＰＧＶＧ（配列番号２）
・ＹＰＧＶＧ（配列番号３）
・ＶＰＧＦＧ（配列番号４）
・ＦＰＧＶＡ（配列番号５）
・ＦＰＡＶＧ（配列番号６）
・ＦＰＧＦＧ（配列番号７）
・ChaＰＧＶＧ（配列番号８）
・ＦＰＧＶ（配列番号９）
・ＦＰＧＧ（配列番号１０）
・ＦＰＧＬＧ（配列番号１１）
・ＦＰＧＩＧ（配列番号１２）
ここで、シクロヘキシルアラニン（Cha）とは、アラニン（ＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＨ）の不斉炭素原子に結合したメチル基がシクロヘキシル基で置換されたアミノ酸である。
【００３６】
ＷＰＧＶＧ（配列番号２）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝２（配列番号１４）、ｎ＝３（配列番号１５）のものがある。ＹＰＧＶＧ（配列番号３）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝３（配列番号１６）、ｎ＝４（配列番号１７）、ｎ＝５（配列番号１８）のものがある。ＶＰＧＦＧ（配列番号４）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝４（配列番号１９）、ｎ＝５（配列番号２０）、ｎ＝６（配列番号２１）のものがある。ＦＰＧＶＡ（配列番号５）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝３（配列番号２２）、ｎ＝４（配列番号２３）、ｎ＝５（配列番号２４）、ｎ＝６（配列番号２５）のものがある。ＦＰＡＶＧ（配列番号６）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝４（配列番号２６）のものがある。ＦＰＧＦＧ（配列番号７）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝３（配列番号２７）、ｎ＝４（配列番号２８）のものがある。ChaＰＧＶＧ（配列番号８）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝３（配列番号２９）、ｎ＝４（配列番号３０）のものがある。ＦＰＧＶ（配列番号９）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝３（配列番号３１）、ｎ＝４（配列番号３２）、ｎ＝５（配列番号３３）のものがある。ＦＰＧＧ（配列番号１０）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝６（配列番号３４）のものがある。ＦＰＧＬＧ（配列番号１１）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝４（配列番号３５）のものがある。ＦＰＧＩＧ（配列番号１２）を繰り返し配列とする本発明に係るペプチドの例としては、ｎ＝４（配列番号３６）のものがある。
【００３７】
これらのなかでも、より低分子量でコアセルベーション（自己集合）能を示すものとして、ＷＰＧＶＧ（配列番号２）、ChaＰＧＶＧ（配列番号８）、またはＦＰＧＶ（配列番号９）を繰り返し配列とするペプチドが好ましい。これらの繰り返し配列を有するペプチドは、ｎ＝３というきわめて小さい分子量であっても、コアセルベーション（自己集合）を示すのである。特に、テトラペプチドであるＦＰＧＶ（配列番号９）を繰り返し配列とする場合には、ｎ＝３のときにたった１２アミノ酸でコアセルベーション（自己集合）を示すことから、工業化などを見据えた場合にはきわめて有用性の高いペプチドであるといえる。なお、これらの繰り返し配列が好ましいという事実を一般化すると、化学式１において、Ｘ１はトリプトファン（Ｗ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）またはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であることが好ましく、Ｘ２はグリシン（Ｇｌｙ）であることが好ましく、Ｘ３はバリン（Ｖａｌ）であることが好ましく、Ｘ４はグリシン（Ｇｌｙ）またはアミノ酸欠失であることが好ましく、グリシン（Ｇｌｙ）であることがより好ましいといえる。一方、Ｘ１はチロシン（Ｔｙｒ）ではないことが好ましく、Ｘ４はアラニン（Ａｌａ）ではないことが好ましい。特に、本発明により提供されるペプチドは、エラスチンのアミノ酸配列に基づき設計されたものである。このため、繰り返し配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）の中心に位置する「Ｐｒｏ−Ｘ２」のアミノ酸配列が、エラスチンと同様の「Ｐｒｏ−Ｇｌｙ」として保存されている（つまり、Ｘ２がＧｌｙである）ことが好ましい。かような形態によれば、温度依存的な自己集合能を発揮させることが可能となる。
【００３８】
また、本発明に係るペプチドを、実施形態のペプチドとして比較した場合には、自己集合能に優れる（すなわち、10 mg/mlという低濃度でもコアセルベーション現象を生じる）という観点から、（ＶＰＧＦＧ）４（配列番号１７）、（ＶＰＧＦＧ）５（配列番号１８）、（ＶＰＧＦＧ）６（配列番号１９）、（ＦＰＧＶＡ）５（配列番号２２）、（ＦＰＧＶＡ）６（配列番号２３）、（ＣｈａＰＧＶＧ）４（配列番号２８）、および（ＦＰＧＶ）５（配列番号３１）が好ましい。また、（ＶＰＧＦＧ）５（配列番号１８）、（ＶＰＧＦＧ）６（配列番号１９）、（ＣｈａＰＧＶＧ）４（配列番号２８）、および（ＦＰＧＶ）５（配列番号３１）がより好ましく、（ＣｈａＰＧＶＧ）４（配列番号２８）が特に好ましい。
【００３９】
なお、本発明により提供されるペプチドのＣ末端は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここで、Ｃ末端がエステル（−ＣＯＯＲ）である場合におけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基、−ＯＢｕｔ、−ＯＰａｃ（フェナシル基）、−ＯＴｃｅ（トリクロロエチル基）、−ＯＮｂ（ｐ−ニトロベンジル基）、−ＯＤｐｍ（ジフェニルメチル基）、−ＯＢｚｌ（ＯＭｅ）（ｐ−メトキシベンジル基）、−ＯＰｉｃ（４−ピコリル基）などが挙げられる。
【００４０】
また、本発明により提供されるペプチドのＮ末端のアミノ基は、保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基、Ｆｍｏｃ基、Ｂｏｃ基など）で保護されていてもよい。
【００４１】
さらに、本発明により提供されるペプチドは、遊離体であってもよいし、塩であってもよい。かような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロ酢酸）との塩などが用いられる。
【００４２】
本発明によれば、上記（ａ）に示す化学式１で表されるペプチドに加えて、当該ペプチドのアミノ酸配列がわずかに改変されてなるアミノ酸配列からなるペプチドもまた、温度依存的な自己集合能を有するものである限り、本発明の技術的範囲に包含されうる。具体的には、上記（ｂ）に記載のように、（ａ）のペプチドにおいて１または数個（好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドもまた、温度依存的な自己集合能を有するものであれば、本発明の技術的範囲に包含されうるのである。なお、特定のペプチドが温度依存的な自己集合能を示すものであるか否かについては、後述する実施例に記載の手法によって、判定されうる。
【００４３】
さらに、アミノ酸にはＤ型およびＬ型の光学異性体が存在する。後述する実施例にはＬ型のアミノ酸を用いた例が記載されているが、少なくとも一部がＤ型のアミノ酸で置き換えられたペプチドもまた、同様の自己集合の性質を示すと考えられ、本願発明の技術的範囲に包含されうる。つまり、化学式１で表される本願発明のペプチドを構成するアミノ酸は、すべての部位においてＬ型であってもＤ型であってもよいが、好ましくはすべてのアミノ酸がＬ型である。
【００４４】
本発明の他の形態（第２の形態）によれば、上述したようなテトラペプチドまたはペンタペプチドの繰り返し配列からなるペプチドオリゴマーの二量体（本明細書では、「ペプチドダイマー」とも称する）もまた、提供される。具体的には、本発明の他の形態によれば、下記（ｄ）のペプチドおよび下記（ｅ）のペプチドからなる群から選択される２つのペプチドが−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基を介して連結されてなるペプチドもまた、提供される：
（ｄ）下記化学式２：
【００４５】
【化４】
2015013850.tif 000006
【００４６】
式中、
ｎは、３〜３００の整数であり、
Ｘ５は、トリプトファン、チロシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンであり、
Ｘ６は、グリシンまたはアラニンであり、
Ｘ７は、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはアミノ酸欠失であり、
Ｘ８は、グリシン、アラニンまたはアミノ酸欠失であり、
ただし、Ｘ７およびＸ８がともにアミノ酸欠失となることはない、
で表されるペプチド；
（ｅ）前記（ｄ）のペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されてなるペプチドであって、温度依存性自己集合性を示すペプチド。
【００４７】
ここで、上記（ｄ）のペプチドは、Ｘ５がイソロイシンであってもよいことを除き、上述した本発明の第１の形態における（ａ）のペプチドと同じである。また、本形態（第２の形態）に係るペプチドを構成する（ｄ）のペプチドおよび（ｅ）のペプチドの範囲からは、上述した本発明の第１の形態においては除外されていた「Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧｌｙまたはＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであるもの」は除外されていない。
【００４８】
本形態（第２の形態）に係るペプチドダイマーは、上記（ｄ）のペプチドおよび上記（ｅ）のペプチドからなる群から選択される２つのペプチドが−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基を介して連結されてなるものである。ここで、「２つのペプチドが−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基（２つのＣｙｓ残基の側鎖に存在するＳ原子どうしがジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）した構造）を介して連結」される具体的な形態について特に制限はない。例えば、後述する実施例２に記載されている「Ｎ−モノマー（ペプチドのＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）残基が結合したもの）」のＣｙｓ残基のチオール結合（−ＳＨ）がジスルフィド結合することにより−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基が形成されたもの（Ｎ−ダイマー）が挙げられる。同様に、後述する実施例２に記載されている「Ｃ−モノマー（ペプチドのＣ末端にシステイン（Ｃｙｓ）残基が結合したもの）」のＣｙｓ残基のチオール結合（−ＳＨ）がジスルフィド結合することにより−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基が形成されたもの（Ｃ−ダイマー）であってもよい。さらに、Ｎ−モノマーおよびＣ−モノマーのそれぞれのＣｙｓ残基のチオール結合（−ＳＨ）がジスルフィド結合することにより−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−基が形成されたもの（ヘテロダイマー）であってもよい。
【００４９】
本発明により提供されるペプチドを製造する手法について特に制限はなく、ペプチドの取得に関する従来公知の知見が適宜参照されうる。例えば、本発明のペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造されうる。
【００５０】
本発明に係るペプチド（第１の形態に係るペプチドおよび第２の形態に係るペプチドダイマー）の分子量については特に制限はないが、より低分子量であるほど工業的な生産等の点で好ましいという理由から、好ましくは３０００未満であり、より好ましくは２５００以下であり、さらに好ましくは２０００以下である。
【００５１】
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。すなわち、本発明のペプチドを構成するアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたペプチドは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などが挙げられる。
【００５２】
上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にペプチドが塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００５３】
本発明のペプチドの合成には、通常市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、それ自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去して、目的のペプチドを取得する。
【００５４】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。また、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰなどの縮合剤を使用することも可能である。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ、ＨＯＡｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
【００５５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用されうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適当な混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用されうることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜約５０℃の範囲である。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．１〜１０倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００５６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択されうる。
【００５７】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００５８】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチル、トリクロロエチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状の、置換または非置換のアルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、ジフェニルメチルエステル、４−ピコリルエステル）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
【００５９】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜約４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００６０】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００６１】
ペプチドを得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチドとを製造し、これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
【００６２】
ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして、所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
【００６３】
さらに、本発明により提供されるペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から当該ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、当該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
【００６４】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ法）、（Loop-Mediated Isothermal Amplification）LAMP法、および逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法によって直接増幅することもできる。
【００６５】
また、上述したように、本発明の第２の形態に係るペプチドダイマーは、その合成中間体として、本発明の第１の形態に係るペプチド等のＮ末端またはＣ末端にシステイン（Ｃｙｓ）残基が結合したモノマー（実施例２に記載の「Ｎ−モノマー」および「Ｃ−モノマー」）を用いる。これらのモノマーについても、上述した本発明の第１の形態に係るペプチドの合成方法が同様に適用可能である。
【００６６】
そして、上述したＮ−モノマーおよびＣ−モノマーといったモノマーのシステイン（Ｃｙｓ）残基どうしでジスルフィド結合を形成させることにより、本発明の第２の形態に係るペプチドダイマーを得ることが可能である。このジスルフィド結合の形成反応を行う具体的な手法や条件については特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。例えば、後述する実施例２に記載のように、Ｎ−モノマーやＣ−モノマーを炭酸アンモニウム水溶液中、１〜１０℃程度の温度で空気酸化することにより、上述したジスルフィド結合の形成（およびペプチドダイマーの合成）が可能である。
【００６７】
本発明により提供されるペプチドおよびペプチドダイマーは、温度依存的に自己集合する性質（温度依存性自己集合性）を有する。つまり、自身が溶解している溶液の温度が上昇すると、ある時点において可逆的に自己集合して凝縮体を形成し、冷却とともに自己集合が解消されて元の溶解状態へと戻るのである。この性質を利用して、本発明の他の形態によれば、上述した本発明の第１の形態または第２の形態に係るペプチドを溶解した水溶液を加熱する工程を含む、ペプチドを自己集合させる方法が提供される。また、本発明のさらに他の形態によれば、上述した本発明のペプチドが自己集合してなる、ペプチド集合体が提供される。
【００６８】
本発明のペプチドの自己集合化は、本発明のペプチドが溶解している溶液を加熱することにより行うことができる。
【００６９】
ペプチド溶液におけるペプチドの濃度に特に制限はないが、好ましくは1〜100 mg/ml程度である。また、加熱手段についても特に制限はなく、当該技術分野において一般的に用いられている、水浴、ブロックヒーター、インキュベーターといった加熱手段が同様に用いられうる。なお、加熱温度についても特に制限はなく、ペプチドのコアセルベーション（自己集合）が生じる温度であればよい。なお、ペプチドのコアセルベーション（自己集合）が生じる温度は低いほど好ましい。一例として、後述する実施例に記載の手法により濁度を測定した場合における、濁度１．０となる溶液の温度は、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下であり、さらに好ましくは４０℃以下であり、特に好ましくは３０℃以下であり、最も好ましくは２５℃以下である。
【００７０】
本発明により提供されるペプチドは、組織工学用バイオマテリアルや薬物送達システム（ＤＤＳ）、化粧品の基材、微生物や酵素等の固定化材等の原料として広い用途で利用されることが期待される。
【００７１】
また、本発明により提供されるペプチドやその集合体は、細胞培養基材としても有用である（特開２０１２−１２６７１３号公報を参照）。すなわち、本発明のさらに他の形態によれば、本発明に係るペプチドまたはペプチド集合体を含む細胞培養基材もまた、提供される。
【００７２】
この場合、本発明により提供されるペプチドやその集合体をそのまま単独で細胞培養基材として用いてもよいし、従来公知の他の細胞培養基材と併用してもよい。なお、本発明により提供されるペプチドやその集合体と併用されうる従来公知の他の細胞培養基材としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、キチン−キトサン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、テネイシン、アガロース、アルギン酸、セルロース、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール（ＰＬＧＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）(ＰＨＥＭＡ)、ポリカプロラクトン、フッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレンなど）などが挙げられる。
【００７３】
さらに、本発明の他の形態によれば、細胞シートの製造方法もまた、提供される。具体的には、本発明により提供される細胞シートの製造方法は、上述した本発明に係るペプチドまたはペプチド集合体を含む細胞培養基材を用いて細胞を培養する工程（培養工程）と、培養された細胞を含む細胞シートを回収する工程（回収工程）とを含む点に特徴を有する。これにより、培養された細胞を含む細胞シートが製造されるのである。
【００７４】
上述した製造方法を実施する具体的な方法については特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。培養方法の一例としては、例えば、本発明に係る細胞培養基材を敷き詰めた培養皿上で、細胞を培養するという方法が例示される。この方法によれば、２次元組織体（細胞シート）が形成され、これを簡便に分離・回収することができる。この際、２次元組織体（細胞シート）を形成させてこれを回収するには、培養皿上に本発明に係る細胞培養基材を敷き詰め、その上で通常の細胞培養を行えばよい。そして、充分に細胞が増殖したのを確認した後、大量の培養液を添加して培養皿をシェイクすることで、培養皿から細胞シートを剥離させることができる。
【００７５】
なお、本発明により提供される細胞培養基材は本発明に係るペプチドまたはその集合体からなるものであることから、コアセルベーション能（温度依存性自己集合性）を示すものである。したがって、本発明に係る細胞培養基材上で細胞を培養した後、培養物を冷却すると、当該細胞培養基材は液化する。このように細胞培養基材を液化させた後に培養された細胞を回収しても、回収された細胞はシート状の形状を保持したままでいることが、実験により示されたのである。
【００７６】
すなわち、上述した細胞シートの製造方法の好ましい実施形態においては、回収工程が、培養物を冷却して細胞培養基材を液化させた後に、細胞シートを回収する工程を含む。なお、培養物を冷却する際の温度については、細胞培養基材が液化しうる温度であれば特に制限はないが、一例として、好ましくは２５℃以下、より好ましくは１５℃以下に冷却すれば、細胞培養基材のコアセルベーション能を利用してこれを十分に液化させることが可能となる。一方、培養物を冷却する際の温度の下限値についても特に制限はないが、細胞を正常な状態で生存させるという観点からは５℃以上の温度であることが好ましい。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例を用いて本発明の好適な実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施例のみに限定して解釈されるべきではない。
【００７８】
≪実施例１：ペプチドの化学合成≫
化学合成法（固相法）により、下記の表１に示すペプチドを合成した。ここで、化学合成法（固相法）としては、Fmoc法を用いた。なお、ペプチド合成用の樹脂、およびFmocアミノ酸としては、全て渡辺化学工業株式会社製の製品を用いた。また、合成用試薬としては、渡辺化学工業株式会社および和光純薬工業株式会社製の製品を用いた。
【００７９】
具体的には、合成用の樹脂（Fmoc-NH-SAL-Resin）に、順次Fmocアミノ酸を結合させていくことにより、目的のペプチドを合成した（図２および図３を参照）。なお、図２においてＣ末端（アミノ酸Ａ５の側の末端）に結合しているアミノ基（−ＮＨ２）は固相法に用いた合成用樹脂由来のものであり、これにより合成されたＣ末端にはアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２）が存在している（以下同様）。この際、アミノ酸の縮合には0.45M HBTU-HOBtおよび2M DIEAを用い、ペプチドの導入が終了した樹脂にTFA（必要に応じてスカベンジャーを添加）を加え25℃で1時間〜2時間撹拌した後、TFAを除去した。得られた残渣を水とアセトニトリルとの混合液に溶解した後凍結乾燥した。得られたペプチドを、高速液体クロマトグラフィー（HPLC、東ソー株式会社製）を用いて精製し、MALDI TOF-MS測定による質量分析（装置：Voyager-DE、アプライドバイオシステムズ社製）を行い、目的のペプチドが高純度に得られたことを確認した。
【００８０】
【表１】
2015013850.tif 000007
【００８１】
≪実施例２：ペプチドダイマーの化学合成≫
以下の手法により、ペプチドダイマーを合成した。
【００８２】
まず、上記と同様の化学合成法（固相法）により、（ＦＰＧＶＧ）５のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）残基を導入したペプチド（Ｃ（ＦＰＧＶＧ）５；「Ｎ−モノマー」とも称する）および（ＦＰＧＶＧ）５のＣ末端にシステイン（Ｃｙｓ）残基を導入したペプチド（（ＦＰＧＶＧ）５Ｃ；「Ｃ−モノマー」）をそれぞれ合成した。続いて、これらのＮ−モノマーおよびＣ−モノマーのそれぞれを、以下のスキームに従って空気酸化することによりジスルフィド結合を形成させて、Ｎ末端で架橋されたホモダイマー（「Ｎ−ダイマー」とも称する）およびＣ末端で架橋されたホモダイマー（「Ｃ−ダイマー」とも称する）をそれぞれ合成した。
【００８３】
【化５】
2015013850.tif 000008
【００８４】
≪ペプチドのコアセルベーション（自己集合）特性の測定≫
上記で得られたそれぞれのペプチドについて、種々の濃度のペプチド水溶液（10〜100 mg/ml）を作製し、ペルチェ式温度コントローラー付き分光光度計（JASCO Ubest V-560、日本分光株式会社製）を用いて窒素気流下で濁度測定を行った。測定条件は、測定波長400 nm、温度範囲５〜５０℃、温度変化速度0.5℃/minであった。なお、本測定において、ＷＰＧＶＧの濃度20 mg/mlおよび30 mg/mlのものについては、HPLC精製後のサンプルを用いた。一方、その他のペプチドについては、Sep-Pak（登録商標）（Waters社）による粗精製後のサンプルを用いた。
【００８５】
結果を下記の表２〜１１および図４〜１４に示す。なお、下記の表において、「○」はコアセルベーション（自己集合）を示したものであり、「×」はコアセルベーションを示さなかったものであり、「−」は未測定のものである。
【００８６】
【表２】
2015013850.tif 000009
【００８７】
【表３】
2015013850.tif 000010
【００８８】
【表４】
2015013850.tif 000011
【００８９】
【表５】
2015013850.tif 000012
【００９０】
【表６】
2015013850.tif 000013
【００９１】
【表７】
2015013850.tif 000014
【００９２】
【表８】
2015013850.tif 000015
【００９３】
【表９】
2015013850.tif 000016
【００９４】
【表１０】
2015013850.tif 000017
【００９５】
【表１１】
2015013850.tif 000018
【００９６】
上記の表および図面に示すように、本発明に係るペプチドはいずれも、従来公知の高分子量ポリペプチドと同等の十分なコアセルベーション（自己集合）能を示した。
【００９７】
≪ペプチドダイマーのコアセルベーション（自己集合）特性の測定≫
上記で得られたペプチドダイマー（Ｎ−ダイマーおよびＣ−ダイマー）について、10 mg/mlの水溶液を作製し、上記と同様の手法および条件により濁度測定を行った。なお、本測定においては、HPLC精製後のサンプルを用いた。また、参照例として、上記で得られたＮ−モノマーおよびＣ−モノマーについても同様にして濁度測定を行った。結果を図１５〜１８に示す。さらに、上記モノマーの合成原料である（ＦＰＧＶＧ）５についての濁度測定の結果も含めて比較したグラフを図１９に示す。図１９に示すように、Ｎ−ダイマーおよびＣ−ダイマーはいずれも、対応するモノマーと比較して低温でコアセルベーションを示し、優れた自己集合能を有するものであることがわかる。なお、図１９に示すように、（ＦＰＧＶＧ）５は10 mg/mlという低濃度ではコアセルベーションを示さなかった。
【００９８】
以上のことから、本発明によれば、低分子量であってもコアセルベーション（自己集合）能を有するペプチドおよびペプチドダイマーが提供されうることがわかる。さらに、本発明の第１の形態により提供されるペプチドは、分子量サイズが小さいにも関わらず、高分子量のポリペプチドと同様、体温（３７℃）付近での自己集合開始温度を示し、かつ可逆的な集合、脱集合の性質を示すことも確認された。また、本発明により提供されるペプチドダイマーは、10 mg/mlという低濃度であっても、１５℃以下という低温で自己集合し、かつ可逆的な集合、脱集合の性質を示すことも確認された。
【００９９】
本発明により提供されるペプチドは、上述したような化学合成法によって容易に合成が可能である（もちろん、遺伝子的に合成されてもよい）。また、従来公知のポリペンタペプチドと比較してアミノ酸配列の長さが短いことから、合成後の精製に要する手間が著しく低減されうるという利点もある。
【０１００】
また、従来のペプチドの固相合成では、固相としての樹脂へ各アミノ酸を結合していく際に、その導入率が９５〜９９％と完全ではないことから、樹脂からペプチドを切り出した後の目的物の含量は９５〜９７％程度であり、アミノ酸が１残基、４残基など抜けたものが不純物として混在するのが一般的である。これに対し、本発明により提供されるペプチドは、簡易な配列構造を有するため、その合成では、側鎖保護基を必要としないアミノ酸を用いることが可能である。したがって、各アミノ酸を合成用の樹脂へほぼ１００％の収率で導入していくことにより、完全に単一のペプチドを合成することができれば、HPLCによる精製を行うことなく、樹脂より切り出したペプチドをそのまま使用することも可能となる。このように、合成の観点からも利点を有する本発明のペプチドは、工業上きわめて有用な材料として期待されるものである。
【０１０１】
具体的には、本発明により提供されるペプチドは、水溶性であり、内部に薬物を包含することが可能な効率のよいＤＤＳ担体を簡易に合成することができる等、様々な医用材料として利用できることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
〔配列番号１〕
本発明における（ａ）のペプチドが有する繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）である。
〔配列番号２〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｗ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号３〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号４〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号５〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ａである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号６〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号７〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号８〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｃｈａ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号９〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｖ、Ｘ４＝アミノ酸欠失である場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号１０〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝アミノ酸欠失、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号１１〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｌ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号１２〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｉ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（本発明の一実施形態）。
〔配列番号１３〕
実施例においてペプチドの合成に用いられた、配列番号１の繰り返しアミノ酸配列においてＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｇ、Ｘ３＝Ｗ、Ｘ４＝Ｇである場合の繰り返しアミノ酸配列である（比較例）。
〔配列番号１４〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＷＰＧＶＧであってｎ＝２である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号１５〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＷＰＧＶＧであってｎ＝３である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号１６〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＹＰＧＶＧであってｎ＝３である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号１７〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＹＰＧＶＧであってｎ＝４である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号１８〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＹＰＧＶＧであってｎ＝５である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号１９〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＶＰＧＦＧであってｎ＝４である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２０〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＶＰＧＦＧであってｎ＝５である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２１〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＶＰＧＦＧであってｎ＝６である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２２〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶＡであってｎ＝３である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２３〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶＡであってｎ＝４である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２４〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶＡであってｎ＝５である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２５〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶＡであってｎ＝６である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２６〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＡＶＧであってｎ＝４である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２７〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＦＧであってｎ＝３である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２８〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＦＧであってｎ＝４である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号２９〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＣｈａＰＧＶＧであってｎ＝３である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３０〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＣｈａＰＧＶＧであってｎ＝４である本発明に係るポリペンタペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３１〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶであってｎ＝３である本発明に係るポリテトラペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３２〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶであってｎ＝４である本発明に係るポリテトラペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３３〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＶであってｎ＝５である本発明に係るポリテトラペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３４〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＧであってｎ＝６である本発明に係るポリテトラペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３５〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＬＧであってｎ＝４である本発明に係るポリテトラペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３６〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＦＰＧＩＧであってｎ＝４である本発明に係るポリテトラペプチドのアミノ酸配列である。
〔配列番号３７〕
実施例において合成された、繰り返しアミノ酸配列（Ｘ１−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）がＶＰＧＷＧであってｎ＝３であるポリペンタペプチドのアミノ酸配列である（比較例）。
【図１】
2015013850.tif 000022
【図２】
2015013850.tif 000023
【図３】
2015013850.tif 000024
【図４】
2015013850.tif 000025
【図５】
2015013850.tif 000026
【図６】
2015013850.tif 000027
【図７】
2015013850.tif 000028
【図８】
2015013850.tif 000029
【図９】
2015013850.tif 000030
【図１０】
2015013850.tif 000031
【図１１】
2015013850.tif 000032
【図１２】
2015013850.tif 000033
【図１３】
2015013850.tif 000034
【図１４】
2015013850.tif 000035
【図１５】
2015013850.tif 000036
【図１６】
2015013850.tif 000037
【図１７】
2015013850.tif 000038
【図１８】
2015013850.tif 000039
【図１９】
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