(57)【要約】【課題】温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにおいて、抗体のＤＢＣ（Dynamic Binding Capacity）を保ちつつ、吸着材の収縮を抑えた吸着材を提供する。【解決手段】担体にプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドを結合した吸着材であって、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に接触させた体積（Ａ）と、５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に接触させた時の体積（Ｂ）が、下記式（１）を満たす、吸着材。      （（Ａ−Ｂ）／Ａ）＜０．０２５  ・・・  （１）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体にプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドが結合された吸着材であって、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に接触させた体積（Ａ）と、５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に接触させた時の体積（Ｂ）が、下記式（１）を満たす、吸着材。
（（Ａ−Ｂ）／Ａ）＜０．０２５  ・・・  （１）
【請求項２】
前記プロテインＡのＢドメイン変異体が、６０℃以下の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化する、請求項１記載の吸着材。
【請求項３】
前記プロテインＡのＢドメイン変異体を結合する前の前記担体１ｍＬ当たりカルボキシル基１０〜４００μｍｏｌが導入されている、請求項１又は２記載の吸着材。
【請求項４】
５℃以下におけるイムノグロブリンの最大結合容量が、吸着材１ｍＬ当たり２０ｍｇ以上である、請求項１から３の何れか１項に記載の吸着材。
【請求項５】
前記担体の平均粒子径が２０〜２００μｍである、請求項１から４の何れか１項に記載の吸着材。
【請求項６】
前記担体が、ポリビニルアルコールの架橋重合体から構成される、請求項１から５の何れか１項に記載の吸着材。
【請求項７】
当該吸着材が粒子状のクロマト充填剤である、請求項１から６に記載の吸着材。
【請求項８】
前記担体が膜である、請求項１から４の何れか１項に記載の吸着材。
【請求項９】
前記担体が中空糸状である、請求項８に記載の吸着材。
【請求項１０】
担体にプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドを結合された吸着材の製造方法であって、
前記担体１ｍＬ当たりカルボキシル基１０〜４００μｍｏｌを導入することと、
前記担体に導入された前記カルボキシル基と前記プロテインＡのＢドメイン変異体とをカップリングすることと、
を含む、吸着材の製造方法。
【請求項１１】
前記プロテインＡのＢドメイン変異体が、６０℃以下の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化する、請求項１０記載の吸着材の製造方法。
【請求項１２】
前記吸着材を２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に接触させた体積（Ａ）と、５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に接触させた時の体積（Ｂ）が、下記式（２）を満たす、請求項１０又は１１に記載の吸着材の製造方法。
（（Ａ−Ｂ）／Ａ）＜０．０２５  ・・・  （２）
【請求項１３】
５℃におけるイムノグロブリンの最大結合容量が、吸着材１ｍＬ当たり２０ｍｇ以上である、請求項１０から１２の何れか１項に記載の吸着材の製造方法。
【請求項１４】
前記担体の平均粒子径が２０〜２００μｍである、請求項１０から１３の何れか１項に記載の吸着材の製造方法。
【請求項１５】
前記担体が、ポリビニルアルコールの架橋重合体から構成される、請求項１０から１４の何れか１項に記載の吸着材の製造方法。
【請求項１６】
前記吸着材が粒子状のクロマト充填剤である、請求項１０から１５の何れか１項に記載の吸着材の製造方法。
【請求項１７】
前記担体が膜である、請求項１０から１３の何れか１項に記載の吸着材の製造方法。
【請求項１８】
前記担体が中空糸状である、請求項１７に記載の吸着材の製造方法。
【請求項１９】
温度応答性プロテインＡを用いた抗体の精製方法であって、
請求項１から９の何れか１項に記載の吸着材の前記温度応答性プロテインＡに抗体を結合させる結合工程と、
抗体と前記温度応答性プロテインＡが結合する温度の緩衝液であって、第１の水素イオン指数の緩衝液を用いて、前記吸着材を洗浄する洗浄工程と、
抗体が前記温度応答性プロテインＡから遊離する温度の緩衝液であって、前記第１の塩水素イオン指数より低い第２の水素イオン指数の緩衝液を用いて、前記吸着材に捕捉された抗体を溶出する溶出工程と、
を含む、抗体の精製方法。
【請求項２０】
前記第２の水素イオン指数がｐＨ３．０〜８．０の範囲である、請求項１９に記載の抗体の精製方法。
【請求項２１】
前記洗浄工程における吸着材の体積（Ｃ）と、前記溶出工程における吸着材の体積（Ｄ）が下記式（３）を満たす、請求項１９又は２０に記載の抗体の精製方法。
（（Ｃ−Ｄ）／Ｃ）＜０．０２５  ・・・  （３）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の精製技術に関し、特に、温度変化に伴い抗体との結合性に変化を示すプロテインＡを含む吸着材、吸着材の製造方法、及び抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬、及び対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、抗体の利用価値が高まっている。抗体は、免疫した動物の血液、抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液、及び動物の腹水培養液等から得られる。ただし、血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、及び複雑な夾雑物等の不純物を含んでいる。したがって、不純物から抗体を分離し、抗体単量体を精製するためには、通常、煩雑で長い時間を要する精製工程が必要とされている。
【０００３】
液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要な方法である。液体クロマトグラフィーとしては、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
【０００４】
アフィニティークロマトグラフィーにおいては、下記（Ａ）〜（Ｃ）の工程を経て、純度及び濃度の高い抗体が精製される。
（Ａ）抗体と不純物とが混じった試料をカラムに負荷する工程（負荷工程）
（Ｂ）負荷したカラムから精製対象とする抗体以外の不純物を取り除く工程（洗浄工程）
（Ｃ）精製対象とする抗体をカラムから溶出し、回収する工程（溶出工程）
【０００５】
近年、抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして、プロテインＡが注目を集めている。プロテインＡは、スタフィロコッカス属黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する。天然のプロテインＡは、中性条件下で、抗体のＦｃ領域に対して特異的に高い親和性を有する。そのため、天然のプロテインＡを用いて抗体を精製する際には、まず、天然のプロテインＡをリガンドとして有する固定相に抗体を含む溶液を中性条件下で接触させて、担体上の天然のプロテインＡに抗体を特異的に吸着させる。そして、中性の緩衝液で担体に吸着しなかった成分を洗浄し、除去した後、ｐＨ３．０付近の酸性の溶液を用いて、担体上の天然のプロテインＡから抗体を遊離させる（例えば、特許文献１、２参照。）。特許文献１では、実施例において、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）からなる酸性の溶液を用いて、プロテインＡ担体から抗体を溶出させている。また、特許文献２でも、実施例において、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩（ｐＨ２．８）、又は０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ２．９）からなる酸性の溶液を用いて、プロテインＡ担体から抗体を溶出させている。しかし、このような強い酸性条件では、精製対象である抗体の、変性や失活を引き起こすリスクを有する。
【０００６】
天然のプロテインＡは、上述したように緩衝液の水素イオン指数の変化に応じて抗体との親和性を変化させるため、精製対象となる抗体を酸性条件にさらす必要がある。そのため、精製対象となる抗体の活性を損なう場合がある。これに対し、緩衝液の水素イオン指数を変化させることなく、温度変化に伴う立体構造の変化等によって抗体との親和性が変化する変異プロテインＡ（温度応答性プロテインＡ）を用いた、抗体の精製方法が提案された（例えば、特許文献３、４参照。）。温度応答性プロテインＡをアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして用いることにより、緩衝液を酸性にする必要がなくなるため、抗体の活性を保つことが可能となる。しかしながら、温度応答性プロテインＡ担体を用いた抗体の精製において、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の不純物の除去性を高めつつ、担体からのプロテインＡの脱離を抑制する手段については研究が進んでいない。
【０００７】
また、温度応答性プロテインＡを用いる抗体の精製方法では、抗体の溶出の際に４０℃程度まで温度を上昇させる必要があるが、高温に設定することよって、抗体の活性がある程度低下することは避けられない。抗体の活性の低下を避けるためには、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲を低温側にシフトさせることが有効であるが、それを実現する手段についてはこれまで検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１９６９９８号公報
【特許文献２】特表２００７−５２６８９７公報
【特許文献３】国際公開第２００８／１４３１９９号
【特許文献４】国際公開第２０１１／０１７５１４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、温度応答性プロテインＡを有する固定相に捕捉された抗体を溶出する溶出工程において、固定相に抗体を結合する結合工程の後の固定相を洗浄する洗浄工程で使用する緩衝液に対して低い水素イオン指数の緩衝液を用いることによって、不純物が効果的に除去され、かつ担体からの温度応答性プロテインＡの脱離も抑制されること、並びに抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲が低温側にシフトことを初めて見出した。さらに本発明者らは、溶出工程において低い水素イオン指数の緩衝液に接触させることによって、上記利点があるものの、吸着材が収縮することを初めて見出した。この吸着材の収縮は、緩衝液の水素イオン指数（ｐＨ６〜９）を変化させることなく、温度を４０℃程度まで上げることのみによって抗体を遊離させている従来の温度応答性プロテインＡによる精製方法では見られない現象である。
【００１０】
そこで、本発明は、温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー吸着材を用いた低い水素イオン指数による溶出において、抗体のＤＢＣ（Dynamic Binding Capacity）を保ちつつ、低い水素イオン指数による収縮を抑えた吸着材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すために鋭意検討した結果、温度応答性プロテインＡを結合する担体のカルボキシル基の導入量を最適化することにより、低い水素イオン指数における上記アフィニティークロマトグラフィー吸着材の収縮を抑えることが可能となり、溶出工程を安定に行うことが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明によれば以下の態様の吸着材、吸着材の製造方法、及び抗体の精製方法が提供される。
（１）担体にプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドを結合した吸着材であって、吸着材を２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に５℃で接触させた体積（Ａ）と、５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に２５℃で接触させた時の体積（Ｂ）が、下記式（１）を満たす、吸着材。
（（Ａ−Ｂ）／Ａ）＜０．０２５  ・・・  （１）
（２）プロテインＡのＢドメイン変異体が、６０℃以下の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化する、（１）記載の吸着材。
（３）プロテインＡのＢドメイン変異体を結合する前の担体１ｍＬ当たりカルボキシル基１０〜４００μｍｏｌが導入されている、（１）又は（２）に記載の吸着材。
（４）５℃におけるイムノグロブリンの最大結合容量が、吸着材１ｍＬ当たり２０ｍｇ以上である、（１）から（３）の何れか１つに記載の吸着材。
【００１３】
（５）担体の平均粒子径が２０〜２００μｍである、（１）から（４）の何れか１つに記載の吸着材。
（６）担体が、ポリビニルアルコールの架橋重合体から構成される、（１）から（５）の何れか１つに記載の吸着材。
（７）当該吸着材が粒子状のクロマト充填剤である、（１）から（６）の何れか１つに記載の吸着材。
（８）担体が膜である、（１）から（４）の何れか１つに記載の吸着材。
（９）膜が中空糸状である、（８）に記載の吸着材。
【００１４】
（１０）担体にプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドを結合された吸着材の製造方法であって、
担体１ｍＬ当たりカルボキシル基１０〜４００μｍｏｌを導入することと、
担体に導入されたカルボキシル基とプロテインＡのＢドメイン変異体とをカップリングすることと、
を含む、吸着材の製造方法。
（１１）プロテインＡのＢドメイン変異体が、６０℃以下の条件下においてイムノグロブリンとの結合性が温度によって変化する、（１０）の吸着材の製造方法。
（１２）吸着材を２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に接触させた体積（Ａ）と、５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に接触させた時の体積（Ｂ）が、下記式（２）を満たす、（１０）又は（１１）の吸着材の製造方法。
（（Ａ−Ｂ）／Ａ）＜０．０２５  ・・・  （２）
（１３）５℃におけるイムノグロブリンの最大結合容量が、吸着材１ｍＬ当たり２０ｍｇ以上である、（１０）から（１２）の何れか１つの吸着材の製造方法。
（１４）担体の平均粒子径が２０〜２００μｍである、（１０）から（１３）の何れか１つの吸着材の製造方法。
（１５）担体が、ポリビニルアルコールの架橋重合体から構成される、（１０）から（１４）の何れか１つの吸着材の製造方法。
（１６）吸着材が粒子状のクロマト充填剤である、（１０）から（１５）の何れか１つの吸着材の製造方法。
（１７）担体が膜である、（１０）から（１３）の何れか１つの吸着材の製造方法。
（１８）担体が中空糸状である、（１７）の吸着材の製造方法。
【００１５】
（１９）温度応答性プロテインＡを用いた抗体の精製方法であって、
（１）から（９）の何れか１つの吸着剤の温度応答性プロテインＡに抗体を結合させる結合工程と、
抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度の緩衝液であって、第１の水素イオン指数の緩衝液を用いて、吸着材を洗浄する洗浄工程と、
抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度の緩衝液であって、第１の塩水素イオン指数より低い第２の水素イオン指数の緩衝液を用いて、吸着材に捕捉された抗体を溶出する溶出工程と、
を含む、抗体の精製方法。
（２０）第２の水素イオン指数がｐＨ３．７〜７．５の範囲である、（１９）の抗体の精製方法。
（２１）洗浄工程における吸着材の体積（Ｃ）と、溶出工程における吸着材の体積（Ｄ）が下記式（３）を満たす、（１９）又は（２０）の抗体の精製方法。
（（Ｃ−Ｄ）／Ｃ）＜０．０２５  ・・・  （３）
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、不純物を効果的に除去し、かつ担体からの温度応答性プロテインＡの脱離が少ない低い水素イオン指数で抗体の精製を行うときに、担体の収縮を抑えて安定に抗体を溶出可能な温度応答性プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー吸着材を提供可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態（以下において、「本実施形態」という。）を詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想が下記のものに特定されることはない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲内において種々の変更を加えることができる。
【００１８】
本実施形態に係る吸着材は、担体１ｍＬ当たりカルボキシル基１０〜４００μｍｏｌを導入し、担体に導入されたカルボキシル基とプロテインＡのＢドメイン変異体とをカップリングすることによって製造することができる。そのため、本実施形態に係る吸着材は、担体にプロテインＡのＢドメイン変異体を含むポリペプチドをアミド結合した吸着材であって、プロテインＡのＢドメイン変異体を結合する前に、担体１ｍＬ当たりカルボキシル基１０〜４００μｍｏｌが導入されている。なお、カルボキシル基とは、ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基を含む。プロテインＡのＢドメイン変異体である温度応答性プロテインＡは、低温領域で抗体と結合し、高温領域で抗体を遊離させる性質を有する。
【００１９】
担体が備える支持体の形状は、特に限定されないが、例えば平膜状、及び中空糸状等の膜状、又は粒子（ビーズ）状である。中空糸状の支持体は、モジュール成型が容易であり、モジュールあたりの膜面積が大きいため、好適に用いられる。また、好ましくは平均粒子径が２０〜２００μｍのクロマト充填剤等のビーズ状の支持体は、一般的に、体積あたりの表面積が、膜状の支持体の体積あたりの表面積と比較して大きく、大量の抗体を吸着できるため、好適に用いられる。
【００２０】
支持体の材料は、特に限定されないが、支持体が膜状である場合、多孔性膜を形成し得る高分子材料が好適に用いられる。例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレナフタレート等のポリエステル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリクロロトリフルオロエチレン等の含フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、及びポリカーボネート等の非結晶性樹脂などが支持体の材料に使用できる。
【００２１】
支持体がビーズ状である場合、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリビニルアルコールの架橋重合体（架橋ポリビニルアルコール）、及び架橋セルロースなどが支持体の材料に使用できる。架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースは親水性が高く、不純物の吸着を抑制できるため、支持体の材料として好適に用いられ得る。
【００２２】
支持体は、例えば複数の細孔を有し得る。細孔径は、特に限定されないが、例えば５〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０〜７００ｎｍであり、さらに好ましくは２０〜５００ｎｍである。細孔径が５ｎｍ未満であると、分離できる抗体の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍより大きいと、基材の表面積が小さくなり、抗体の結合量が少なくなる傾向にある。
【００２３】
支持体には、カップリング基として、カルボキシル基又はＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化されたカルボキシル基が導入される。カップリング基として、他に、臭化シアン活性化基、水酸基、エポキシ基、アルデヒド基、及びチオール基等が支持体に導入されてもよい。担体表面に導入されるリガンドである温度応答性プロテインＡは一級アミノ基を有している。ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性基、エポキシ基、及びホルミル基等は、温度応答性プロテインＡの一級アミノ基とカップリングする。例えば、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基は、カップリング反応時に他の薬品が不要であり、反応が迅速であり、一級アミノ基と強固な結合を形成するという利点を有する。
【００２４】
支持体と、カップリング基と、の間に、スペーサーが導入されてもよい。支持体へのカップリング基の導入方法は、さまざまな文献に開示されている。
【００２５】
カップリング基を末端、及び／又は側鎖に有するグラフト高分子鎖を支持体に導入してもよい。カップリング基を有するグラフト高分子鎖を支持体に導入することで、カップリング基の密度を任意に高める等、制御することが可能となる。カップリング基を有する高分子鎖を支持体にグラフトするか、あるいはカップリング基に変換し得る前駆体官能基を有する高分子鎖を支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。
【００２６】
グラフト高分子鎖の導入方法はいかなる方法でもよい。例えば、あらかじめ高分子鎖を調製し、支持体にカップリングしてもよい。あるいは、「リビングラジカル重合法」や「放射線グラフト重合法」の手法により、支持体上で直接グラフト鎖を重合してもよい。「放射線グラフト法」は、支持体にあらかじめ反応開始剤を導入する必要がなく、適応可能な支持体が多種であるため、好適に用いることができる。
【００２７】
「放射線グラフト重合法」でグラフト鎖を導入する場合、支持体にラジカルを生成させる手段は任意である。しかし、支持体全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線を照射することが好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、あるいはＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等から得られる。
【００２８】
電離性放射線の照射線量は、例えば１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、支持体の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
【００２９】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に、支持体にラジカルを生成させた後、次にそれらを反応性化合物と接触させる前照射法と、支持体を反応性化合物と接触させた状態で支持体にラジカルを生成させる同時照射法と、がある。実施の形態においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
【００３０】
グラフト重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一に溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトンや２−ブタノン等のケトン類；水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
【００３１】
グラフト重合に使用されるカップリング基を有するモノマーとしては、カルボキシル基をカップリング基とするため、アクリル酸、及びメタクリル酸等のモノマーが挙げられる。他に、一級アミノ基をカップリング基とする場合、アリルアミン等が挙げられる。そして、エポキシ基をカップリング基とする場合、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）等が挙げられる。グリシジルメタクリレートは、さまざまなエポキシ基の開環反応を利用してさまざまな官能基を形成することが可能であるため、工業的にも好適に用いることが可能である。
【００３２】
カップリング基としてカルボキシル基を支持体に導入するときには、まずグリシジルメタクリレートをグラフト重合後、グリシジルメタクリレートのエポキシ基を加水分解してジオールとする。そして、ジオール由来の水酸基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることにより、環状酸無水物に由来するカルボキシル基を形成（開環ハーフエステル化反応）する。製造コストの点で、環状酸無水物は、無水コハク酸又は無水グルタル酸であることが望ましいが、これらに限定されない。
【００３３】
低い水素イオン指数の緩衝液に接触させても収縮が起こりにくい吸着材を製造するには、支持体に導入するカルボキシル基の量を、担体１ｍＬ当たり、好ましくは１０〜４００μｍｏｌとし、より好ましくは１０〜１６５μｍｏｌとし、さらに好ましくは１０〜５０μｍｏｌとする。ここで、担体単位体積あたりのカルボキシル基の導入量を低く設定することにより吸着材の収縮が抑えられる要因は必ずしも明らかではないが、最終的な吸着剤上の残存カルボキシル基量が少なくなるため、収縮が抑えられるものと考えられる。ただし、本開示は、収縮が抑えられる原理がこれに限られることを意図しない。収縮が抑えられる原理が別であっても、下記式（４）を満たす吸着剤は、本実施形態に含まれる。
【００３４】
本実施形態に係る吸着材を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に接触させた体積（Ａ）と、５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に接触させた時の体積（Ｂ）は、下記式（４）を満たす。
（（Ａ−Ｂ）／Ａ）＜０．０２５  ・・・  （４）
【００３５】
開環ハーフエステル化反応に用いられる触媒としては、本反応を促進するものであれば特に限定されないが、具体的にはトリエチルアミン、イソブチルエチルアミン、ピリジン、及び４−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。これらの中で、トリエチルアミン又は４−ジメチルアミノピリジンが好ましく、反応速度や収率の点で４−ジメチルアミノピリジンが最も好ましい。
【００３６】
開環ハーフエステル化反応は、上記触媒を添加したトルエン等の不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。
【００３７】
開環ハーフエステル化反応により形成されたカルボキシル基は、ＮＨＳ活性反応によって、活性エステルに変換される。カルボキシル基と比較して活性エステルは反応性が高い。そのため、温度応答性プロテインＡ等のリガンドを担体上に迅速に固定することが望まれる場合、活性エステル化工程を行うことが好ましい。
【００３８】
活性エステルは、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘの化学構造を有する。Ｘは、ハロゲンやＮ−ヒドロキシスクシンイミド基又はその誘導体、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基又はその誘導体、ペンタフルオロフェニル基、並びにパラニトロフェニル基などの脱離性基であるが、これらに限定されない。活性エステルとしては、反応性、安全性及び製造コストの観点から、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが望ましい。カルボキシル基に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと、カルボジイミドと、を同時に反応させることによって、カルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへ変換される。
【００３９】
カルボジイミドは、−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−の化学構造を有する有機化合物である。カルボジイミドとしては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミドの濃度は、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度は０℃以上１００℃以下、反応時間は２分〜１６時間の範囲で設定されるのが望ましい。反応溶媒としては、Ｎ，Ｎ'−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やトルエンなどが使用できる。
【００４０】
以上説明した温度応答性アフィニティークロマトグラフィー担体の基材には、温度応答性リガンドとして、プロテインＡのＢドメイン変異体である温度応答性プロテインＡが導入される。温度応答性プロテインＡは、温度に依存して、抗体との親和性が変化するよう変異されたプロテインＡである。具体的には、温度応答性プロテインＡは、低温で抗体と結合し、抗体と結合した時の温度よりも高い温度で抗体から解離する。温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号）を参考に調製することができる。
【００４１】
ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基と、温度応答性プロテインＡと、のカップリング反応は、例えば以下のように行われる。まず、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．２）、酢酸緩衝液（ｐＨ３．６〜５．６）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ５．８〜８．５）、又は炭酸緩衝液（ｐＨ９．２〜１０．６）などのアミノ基成分を含まない緩衝液を用いて、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で温度応答性プロテインＡを含む溶液を準備する。この水溶液を担体表面の活性エステルと接触させると、温度応答性プロテインＡに含まれるアミノ基等の官能基が活性エステルと反応し、アミド結合が形成される。その結果、温度応答性プロテインＡが、共有結合によって、担体表面の活性エステルに固定化される。ここで、接触時間は２分〜１６時間の範囲で設定するとよい。温度応答性プロテインＡを担体の表面に固定した後は、適当な洗浄液で担体を洗浄することが望ましい。このとき、洗浄液は０．５ｍｏｌ／Ｌ程度の塩（ＮａＣｌ）及び０．１％程度の非イオン性界面活性剤を含む緩衝液であることが望ましい。これによって、共有結合せずに物理吸着しているだけの温度応答性プロテインＡを担体表面から取り除くことができる。
【００４２】
温度応答性プロテインＡを担体表面に固定した後（好ましくは更に温度応答性プロテインＡを固定した担体を洗浄した後）、未反応のカルボキシル基又は活性エステルを、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、未反応のカルボキシル基又は活性エステルを保護することが好ましい。これによって、不純物等の精製対象外の分子が不本意に担体表面に固定されるのを防ぐことができる。特に担体の基材表面に導入された官能基が活性エステルである場合、この操作がされることが好ましい。
【００４３】
本明細書では、活性エステル基にアミノ基を有する低分子化合物を反応させる操作を、「ブロッキング」と記述することがある。なお、カルボキシル基又は活性エステルを低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は、一般に、生体関連物質の基材表面への非特異的な吸着を抑制するからである。このためには、アミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を用いることが好ましい。このような低分子化合物としては、例えば、エタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、及びジグリコールアミン（ＩＵＰＡＣ名：２−（２−アミノエトキシ）エタノール）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの低分子化合物は、ＰＢＳなどの緩衝液に１０〜１，０００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解される。低分子化合物の溶解液を、温度応答性プロテインＡを固定した基材を備える担体と接触させることにより、基材表面の未反応の活性エステル基がブロッキングされる。反応温度は例えば４〜３７℃の範囲で設定され、反応時間は例えば２分〜１６時間の範囲で設定されるとよい。
【００４４】
温度応答性プロテインＡがビーズ状の担体に固定された場合は、市販の空カラム又はガラス管から作製した空カラムに、固定相である温度応答性プロテインＡ固定化担体を詰めて用いてもよい。市販のジャケット付き空カラム（商品名  ＸＫカラム、ＧＥヘルスケア・ジャパン）は、カラム自体の温度をジャケット循環水の温度を制御することで任意に制御することができるので、好適に使用することができる。担体が膜状の場合は、それぞれの形状に従い、市販の膜ホルダーに固定するか、任意のモジュール形状に加工して使用してもよい。
【００４５】
温度応答性プロテインＡが固定された基材を備える担体は、ｐＨ４〜８の範囲の中性溶液を保存液中に、２〜１０℃程度の低温で保存される。保存液としては、抗菌性を考慮して、２０％エタノールが好ましい。
【００４６】
上述したように、温度応答性プロテインＡは、低温で抗体と結合し、抗体と結合した時の温度よりも高い温度で抗体から解離する。したがって、温度応答性プロテインＡを備える担体が充填されたカラムを用いて抗体を精製する際には、まず、低温条件下で、精製対象の抗体単量体と、除去対象の抗体凝集体及び不純物と、を含む溶液を、温度応答性プロテインＡを備える担体が充填されたカラムに注入する。低温条件とは、例えば０℃以上２０℃以下、好ましくは１℃以上１５℃以下、最も好ましくは２℃以上１３℃以下である。これにより、精製対象の抗体が、担体が備える温度応答性プロテインＡによって捕捉される。一方、不純物は、温度応答性プロテインＡによって捕捉されないので、カラムから溶媒と共に流れ去る。
【００４７】
なお、精製対象の抗体単量体と、除去対象の抗体凝集体及び不純物と、を含む溶液を、温度応答性プロテインＡを備える担体が充填されたカラムに注入する前に、溶液を、例えば細孔径０．２μｍのマイクロフィルタを用いて粗精製してもよい。
【００４８】
本実施形態で精製する抗体には、限定はされないが、例えばヒト抗体、マウス、ウシ、ヤギ、及びヒツジ等の有蹄動物等の非ヒト動物抗体、ヒトと非ヒト動物のキメラ抗体、並びに非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等が含まれ、好ましくはヒト抗体である。さらに好ましくはヒトモノクローナル抗体である。また、抗体のクラス、サブクラスは限定されず、いずれのクラス、サブクラスの抗体も本実施形態において精製し得るが、好ましくはＩｇＧ、その中でもＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４である。また、重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失した抗体、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換した抗体、あるいは天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体であってもよい。さらに、抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合していてもよい。
【００４９】
上述したように、温度応答性プロテインＡは、低温で抗体を結合し、抗体と結合する時の温度よりも高い温度で抗体を遊離させる特性がある。そのため、あらかじめ温度応答性プロテインＡの抗体との結合特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させることにより抗体を固定相に吸脱着させることが好ましい。抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度範囲は、抗体を有する一定量の固定相に結合可能な抗体の最大結合量に対して、抗体の結合量が５０％以上となる温度範囲である。また、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲は、抗体を有する一定量の固定相に結合可能な抗体の最大結合量に対して、抗体の結合量が５０％以下となる温度範囲である。
【００５０】
抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度範囲、及び抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲は、例えば以下の手順に従って決定される。
（１）５℃以下、１０℃、以後、抗体が変性する温度の直下までの１０℃間隔で設定されたそれぞれの温度条件下において、温度応答性プロテインＡを有する固定相に抗体を結合させる。
（２）抗体が変性する温度の直下まで昇温して固定相から抗体を溶出し、抗体を定量する。
（３）抗体を固定相に吸着させた時の温度に対して抗体の溶出量をプロットする。次に、抗体の結合量（溶出量）の最大値の５０％と、プロットと、の間を結んだ線の交点における温度（以下、「５０％結合温度」と呼ぶ。）を境とし、５０％以上の抗体の結合量を与える温度範囲を、抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度範囲とする。また、５０％以下の抗体の結合量を与える温度範囲を、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲とする。
【００５１】
抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度範囲は、上述したように、例えば０℃以上２０℃以下、好ましくは１℃以上１５℃以下、より好ましくは２℃以上１３℃以下の温度範囲である。抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲は、不純物除去性を高め、プロテインＡの脱離を抑制するという観点から、例えば１５℃以上５０℃以下、好ましくは１５℃以上３０℃以下、より好ましくは２０℃以上２５℃以下の温度領域である。
【００５２】
ここで、抗体を温度応答性プロテインＡから遊離させる溶出工程に用いる緩衝液の水素イオン指数を、温度応答性プロテインＡを有する固定相を洗浄する洗浄工程に用いる緩衝液の水素イオン指数より低く設定する。当該条件の下、洗浄工程において、抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度範囲として、例えば０℃以上２０℃以下、好ましくは０℃以上１５℃以下、より好ましくは１℃以上１５℃以下、さらに好ましくは２℃以上１３℃以下の温度の緩衝液を用いる。また、溶出工程において、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲として、例えば１５℃以上５０℃、好ましくは１５℃以上３０℃以下、より好ましくは２０℃以上２５℃以下の温度の緩衝液を用いる。これにより、特に溶出工程において、緩衝液の温度が１５℃以上３０℃以下であっても、不純物除去性を高め、プロテインＡの脱離を抑えつつ、抗体の回収率を維持することが可能であることを、本発明者らは見出した。なお、抗体と温度応答性プロテインＡが結合する温度範囲と、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲と、が、一部重複しているが、これは、洗浄工程と溶出工程における水素イオン指数の違いがあれば許容されるものである。また、溶出工程における緩衝液の温度は、洗浄工程における緩衝液の温度より高くてもよい。
【００５３】
さらに、モノクローナル抗体の製造に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養温度は通常３７℃である。そのため、抗体を温度応答性プロテインＡから溶出させる温度を３７℃以下に設定すれば、抗体の活性の低下を避けることができる。この時、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離するのに適した温度範囲は、１０℃以上３７℃以下、好ましくは１５℃以上３０℃以下の温度領域である。
【００５４】
以下、本実施形態に係る抗体の精製方法を、工程毎に説明する。
【００５５】
１）固定相の温度応答性プロテインＡに抗体を結合させる結合工程
本実施形態の精製方法において、上記抗体を含有する混合物溶液は、温度応答性プロテインＡに吸着される温度まで冷却された後に、温度応答性プロテインＡを有する固定相を備えるアフィニティークロマトグラフィーカラムに供給される。その場合、予め、温度応答性プロテインＡと抗体が結合する温度を確認しておき、抗体を含有する混合物溶液の温度をその温度に調整する。
【００５６】
抗体を含有する混合物溶液は、プロテアーゼ等の不純物を含有している場合があり、低温で保存されている場合がある。抗体を含有する混合物の保存温度が、温度応答性プロテインＡと抗体が結合する温度の範囲内の場合は、そのまま抗体を温度応答性プロテインＡに吸着させてもよい。また、温度応答性プロテインＡカラムの直上流に熱交換器を配置して、抗体を含有する混合物溶液を温度応答性プロテインＡカラムにロードしながら、連続的に抗体を含有する混合物溶液の温度を調節することも可能である。
【００５７】
あるいは、クロマトグラフィーカラムを所定の温度に調節した恒温水槽に浸漬することによって、抗体を含有する混合物溶液の温度を調節することも可能である。クロマトグラフィーカラムの直上流に熱交換器を配置することに加えて、クロマトグラフィーカラムを、所定の温度に調節した恒温水槽に浸漬し、抗体を含有する混合物溶液の温度を調節してもよい。
【００５８】
２）温度応答性プロテインＡを有する固定相を洗浄する洗浄工程
抗体と温度応答性プロテインＡが結合する低い温度の緩衝液であって、第１の塩濃度及び第１のｐＨの緩衝液を用いて、固定相を洗浄する。緩衝液としては、リン酸緩衝液及びトリス塩酸緩衝液等が使用可能である。抗体と温度応答性プロテインＡが結合する低い温度とは、例えば０℃以上２０℃以下、好ましくは０℃以上１５℃以下、より好ましくは１℃以上１５℃以下、さらに好ましくは２℃以上１３℃以下である。第１の塩濃度とは、例えば１５０ないし１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２５０ないし８００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは３５０ないし６００ｍｍｏｌ／Ｌである。また、第１のｐＨとは、例えば７．５ないし９．０であり、好ましくは７．６ないし９．０、さらに好ましくは７．６ないし８．８であり、より好ましくは７．７ないし８．６、さらに好ましくは８．０ないし８．６である。当該洗浄工程における緩衝液の塩濃度及びｐＨをこれらの範囲に設定することによって、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等のカラム内に残留していた夾雑物が好適に除去され、後に回収する抗体の純度を高めることが可能となる。なお、緩衝液の塩濃度及びｐＨの両方をこれらの範囲に設定することが好ましいが、塩濃度のみ、あるいはｐＨのみをこれらの範囲に設定してもよい。
【００５９】
３）温度応答性プロテインＡを有する固定相に捕捉された抗体を溶出する溶出工程
抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度の緩衝液であって、第２の塩濃度及び（又は）第２のｐＨの緩衝液をカラムに通して、固定相に捕捉された抗体を溶出する。抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度とは、例えば２５℃以上５０℃以下、好ましくは３０℃以上４５℃以下である。ただし、緩衝液の温度を可能な限り低く設定することによって、不純物除去性を高め、担体から温度応答性プロテインＡが脱離することを抑制することが可能となる。このような効果を最大限高めるためには、抗体が温度応答性プロテインＡから遊離する温度範囲を、例えば１５℃以上５０℃以下、好ましくは１５℃以上３０℃以下、より好ましくは２０℃以上２５℃以下に設定する。また、第２の塩濃度とは、第１の塩濃度より低く、例えば０ないし１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０ないし３００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０ないし１００ｍｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌである。第２のｐＨとは、第１のｐＨより低く、例えば５．０ないし８．０であり、好ましくは５．０ないし７．０であり、より好ましくは５．０ないし６．５である。当該溶出工程における緩衝液の塩濃度及びｐＨをこれらの範囲に設定することによって、担体から温度応答性プロテインＡが脱離することを抑制することが可能となる。そのため、抗体の溶出液に、温度応答性プロテインＡが混入することを抑制することが可能となる。なお、緩衝液の塩濃度及びｐＨの両方をこれらの範囲に設定することが好ましいが、塩濃度のみ、あるいはｐＨのみをこれらの範囲に設定してもよい。
【００６０】
また、前記のように、抗体を温度応答性プロテインＡから溶出させる温度を３７℃以下にすれば抗体の活性の低下を避けることができる。本発明者らは、抗体を温度応答性プロテインＡから遊離させる温度範囲を１０℃以上３７℃以下、好ましくは１０℃以上３０℃以下、より好ましくは１５℃以上３０℃以下、さらに好ましくは２０℃以上２５℃以下に設定するとき、第２のｐＨ条件を低めに設定することで回収率を高められることを見出した。この第２のｐＨ条件は、例えば、ｐＨ３．０ないし８．０であり、好ましくはｐＨ３．５ないし７．０であり、より好ましくはｐＨ３．９ないし６．５、さらに好ましくはｐＨ４．０ないし６．０である。
【００６１】
さらに、１）固定相の温度応答性プロテインＡに抗体を結合させる結合工程の前に、低塩濃度及び高水素イオン指数の緩衝液を温度応答性プロテインＡを有する固定相に接触させる平衡化工程があってもよい。平衡化工程における緩衝液の塩濃度は、例えば０ないし１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０ないし２５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０ないし１００ｍｍｏｌ／Ｌである。平衡化工程における緩衝液のｐＨは、例えば５．０ないし９．０であり、好ましくは６．０ないし９．０であり、より好ましくは７．０ないし９．０である。当該平衡化工程における緩衝液の塩濃度及びｐＨをこれらの範囲に設定することによって、その後の結合工程における温度応答性プロテインＡを有する固定相の抗体の結合容量を大きくすることが可能となる。
【００６２】
ただし、温度応答性プロテインＡを有する固定相を備えるアフィニティーカラムが繰り返し使用される場合は、５）カチオン交換樹脂を含む固定相に捕捉された抗体を溶出する溶出工程における緩衝液と同じ塩濃度及びｐＨの緩衝液を、平衡化工程において、温度応答性プロテインＡを有する固定相に接触させてもよい。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例によって実施の形態をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
（温度応答性プロテインＡ担体の調製）
架橋ポリビニルアルコールビーズにカルボキシル基を導入した後、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。さらに、ＮＨＳ活性化された架橋ポリビニルアルコールビーズと、温度応答性プロテインＡと、を接触させることで、温度応答性プロテインＡを架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化した。詳細は以下のとおりである。
【００６５】
１）カルボキシル基の導入
無水コハク酸２３．０ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン８．９８ｍｇ及びトリエチルアミン０．０１ｍＬをトルエン３０ｍＬに溶解させた反応液を用意した。次に、架橋ポリビニルアルコールビーズ（平均粒子径７０μｍ）１ｇを反応液と７０℃で接触させ、４時間攪拌した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズにカルボキシル基を導入した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。
【００６６】
２）カルボキシル基の導入量の測定
カルボキシル基を導入した架橋ポリビニルアルコールビーズに１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に浸漬させた後精製水で洗浄した。１ｍＬのビーズを採取し、測定溶液（精製水１００ｍＬ及びフェノールフタレイン溶液）を加えて試料とした。ビーズを含まない測定溶液のみをブランクとした。ブランク及び試料を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで滴定し、ｐＨ１０の点を終点として、下記（５）式にてカルボキシル基の導入量を算出した。
Ａ＝（Ｂ２−Ｂ１）×１００×Ｆ・・・（５）
Ａ：試料１ｍＬ中のカルボキシル基の中和に必要な水酸化ナトリウム水溶液のμｍｏｌ数
Ｂ１：ブランクの滴定に用いた０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液の量（ｍＬ）
Ｂ２：試料の滴定に用いた０．１ｍｏｌ／ｍＬ水酸化のトリウム水溶液の量（ｍＬ）
Ｆ：水酸化ナトリウム溶液のファクター
【００６７】
３）カラムパッキング
カルボキシル基を導入した架橋ポリビニルアルコールビーズを、空のカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２００ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に充填した。
【００６８】
４）ＮＨＳ活性化
ビーズを充填したカラムを４０℃に加温しながら、ＮＨＳ活性化反応液（ＮＨＳ０．１１ｇ、脱水イソプロピルアルコール８０ｍＬ、ジイソプロピルカルボジイミド０．１５ｍＬ）を０．４ｍＬ／分の流速でカラムに６０分間透過し、ビーズ表面のカルボキシル基をＮＨＳ活性化した。反応後、氷冷しながらカラムに脱水イソプロピルアルコールを０．４ｍＬ／分の流速で３０分間透過させることで洗浄した。洗浄後のカラムを、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、４℃で保存した。
【００６９】
５）温度応答性プロテインＡのカップリング
温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号）の実施例１１を参考にして調製した。次に、カルボキシル基をＮＨＳ活性化したカラムに氷冷した１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を２ｍＬ透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを塩酸に置換した。次いで、温度応答性プロテインＡ５６ｍｇを１ｍＬのカップリング緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）に溶解した温度応答性プロテインＡ溶液を用意した。さらに、温度応答性プロテインＡ溶液を０．４ｍＬ／分の流速でカラムに供給した後、カラム中に温度応答性プロテインＡ溶液を２．５時間保持させた。その後、カラムに温度応答性プロテインＡを含まないカップリング緩衝液を透過させ、担体上のＮＨＳ活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインＡを洗浄し、回収した。
【００７０】
６）ブロッキング
温度応答性プロテインＡをカップリングしたカラムにブロッキング反応液（０．５ｍｏｌ／Ｌ  エタノールアミン、０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を１０ｍＬ透過し、室温で３０分間放置することで、残留ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このカラムを洗浄液（０．１ｍｏｌ／Ｌ  クエン酸緩衝液、０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ４．５）で洗浄し、その後２０％エタノールでカラムに封入した状態で、４℃で保存した。
【００７１】
（温度応答性プロテインＡ担体による溶出時収縮の測定）
温度応答性プロテインＡ担体を充填したカラムをクロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に装着した。収縮測定は、抗体を使用せず、吸着及び、溶出緩衝液を用いて下記条件で行った。各ステップの温度は、カラム、及びカラム上流の配管（１ｍ）を、所定温度に設定した恒温水槽に浸漬することで、調整した。
１−１）吸着ステップ
・吸着緩衝液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ    
（ｐＨ８．０）
・平衡化：５ビーズ体積（吸着緩衝液使用）
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・ビーズ体積：３．９２ｍＬ
・吸着温度：２℃
１−２）洗浄ステップ
・洗浄緩衝液：吸着緩衝液と同一
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・洗浄温度：２℃
１−３）温度溶出ステップ
・温度溶出緩衝液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸緩衝液＋３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・溶出温度：２５℃
【００７２】
（温度応答性プロテインＡ担体の収縮率測定）
本実施の形態の収縮率の評価は、溶出ステップ前後でカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ  Ｃｏｌｏｍｎ  ５／２００、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）内の樹脂のベット高を測定し、カラム内の体積を計算した後、下記（６）式より算出した。
【００７３】
収縮率（％）＝（（Ａ−Ｂ）／Ａ）×１００・・・（６）
Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に５℃で接触させたときの吸着材体積
Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に２５℃で接触させたときの吸着材体積
【００７４】
（免疫グロブリンの最大結合容量および動的吸着容量測定）
クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、温度変化による免疫グロブリン（献血ヴェノグロブリン−ＩＨ、ベネシス社製）の吸着・溶出試験を行った。
吸着・洗浄・溶出の各ステップで緩衝液は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。
免疫グロブリンは、５ｍｇ/ｍＬになるよう、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に希釈したものを使用した。
吸着温度を２℃、溶出温度を４０℃とした。
カラムの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一度停止し、カラムを所定温度の恒温水槽に浸漬し、その後１０分以上放置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。
温度溶出後、溶出しきれなかった抗体を、低ｐＨの溶出緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出させた。
各溶出画分のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定し、下記（７）式より免疫グロブリン濃度を算出し、さらに下記（８）式より免疫グロブリンの最大結合容量を算出した。
免疫グロブリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍの吸光度／１．３８・・・（７）
最大結合容量（ｍｇ／ｍＬ）＝
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／ビーズ体積・・・（８）
動的吸着容量は、得られた破過曲線の１０％破過点の溶出容量から算出した。
【００７５】
上記実験の結果を表１にまとめた。その結果、ＤＢＣは２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、問題は無く、カルボキシル基導入量は２７μｍｏｌ／ｍＬで収縮率もほぼ０であった。
【表１】
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【実施例２】
【００７６】
カルボキシル基の導入の反応液を無水コハク酸２３０．２ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン９０．０ｍｇ及びトリエチルアミン０．１０３ｍＬをトルエン３０ｍＬに溶解させた以外、実施例１と同様の方法で、温度応答性プロテインＡ担体を調整した。実施例１と同様の方法で、カルボキシル基導入量及び収縮率を測定した結果、ＤＢＣは２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、カルボキシル基導入量は１６５μｍｏｌ／ｍＬで０．５％であった。
【実施例３】
【００７７】
カルボキシル基の導入の反応液を無水コハク酸５７．６０ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン２２．４５ｍｇ及びトリエチルアミン０．０２６ｍＬをトルエン３０ｍＬに溶解させた以外、実施例１と同様の方法で、温度応答性プロテインＡ担体を調整した。実施例１と同様の方法で、カルボキシル基導入量及び収縮率を測定した結果、ＤＢＣは２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、カルボキシル基導入量は４９μｍｏｌ／ｍＬで収縮率は、ほぼ０％であった。
【実施例４】
【００７８】
カルボキシル基の導入の反応液を無水コハク酸１５．３５ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン６．０ｍｇ及びトリエチルアミン０．００７ｍＬをトルエン３０ｍＬに溶解させた以外、実施例１と同様の方法で、温度応答性プロテインＡ担体を調整した。実施例１と同様の方法で、カルボキシル基導入量及び収縮率を測定した結果、ＤＢＣは２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、カルボキシル基導入量は２０μｍｏｌ／ｍＬで収縮率は、ほぼ０％であった。
【実施例５】
【００７９】
カルボキシル基の導入の反応液を無水コハク酸１１．５１ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン４．５０ｍｇ及びトリエチルアミン０．００５ｍＬをトルエン３０ｍＬに溶解させた以外、実施例１と同様の方法で、温度応答性プロテインＡ担体を調整した。実施例１と同様の方法で、カルボキシル基導入量及び収縮率を測定した結果、ＤＢＣは２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、カルボキシル基導入量は１４μｍｏｌ／ｍＬで収縮率は、ほぼ０％であった。
［比較例］
カルボキシル基の導入の反応液を無水コハク酸１．１５ｇ、４−ジメチルアミノピリジン０．４５ｇ及びトリエチルアミン０．５１ｍＬをトルエン３０ｍＬに溶解させた以外、実施例１と同様の方法で、温度応答性プロテインＡ担体を調整した。実施例１と同様の方法で、カルボキシル基導入量及び収縮率を測定した結果、ＤＢＣは２０ｍｇ／ｍＬ以上で問題なかったが、カルボキシル基導入量は４６０μｍｏｌ／ｍＬで、収縮率が２．９％であった。
【００８０】
［参考例１］
（温度応答性プロテインＡ担体による抗体の精製）
温度応答性プロテインＡ担体を、空カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）、Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／２０  ｃｏｌｕｍｎ）に充填した。充填方法は、提供者の取扱説明書を参考に、実施した。そして、カラムをクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ）に装着した。
【００８１】
また、不純物を含む培養上澄みとして、３７℃で培養した、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液を清澄化し、ポリクロナール抗体（（株）ベネシス社、献血ヴェノグロブリンＩＨ）を１ｍｇ／ｍＬ相当量を加えたものを用いた。ＣＨＯ細胞培養液は、無血清培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  ＩＳ  ＣＨＯ−ＣＤ培地）にて培養したＣＨＯ細胞の培養液（細胞密度約８．９×１０６／ｍＬ、生細胞率６６％）を用い、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、培養上澄みを取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
【００８２】
次に、下記の条件で、カラムに抗体を含む培養上澄みを注入し、担体に抗体を吸着させた。さらに、下記の条件で、カラムを洗浄し、その後、カラムから抗体を溶出させた。ここで、洗浄緩衝液のｐＨより、溶出緩衝液のｐＨを低くした。
１−１）吸着ステップ
・      抗体濃度：１ｍｇ／ｍＬ
・      平衡化緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
・      平衡化：１０ビーズ体積（吸着緩衝液使用）
・      抗体負荷量：１１ｍＬ
・      流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・      ビーズ体積：０．５５ｍＬ
・      吸着温度：２℃
１−２）洗浄ステップ
・      洗浄緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
・      流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・      洗浄温度：２℃
１−３）溶出ステップ
・      溶出緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
・      流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・      透過液量：２０ｍL
・      溶出温度：４０℃
【００８３】
（抗体の濃度測定）
溶出液中に含まれる抗体濃度を、２８０ｎｍの紫外線吸収（ＵＶ吸収）を測定することで、下記（９）式を用いて算出した。
抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝吸光度／１．３８・・・（９）
【００８４】
（宿主タンパク（ＨＣＰ）の濃度測定）
溶出液中に含まれるＨＣＰ濃度を、市販のＨＣＰ測定キット（ＣＹＧＮＵＳ社、ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号：Ｆ５５０）を用いて測定した。測定は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。精製前の、抗体量１ｍｇ当たりに含まれるＨＣＰ量をＣ1、精製後の、抗体１ｍｇ当たりに含まれるＨＣＰ量をＣ2とすると、精製によるＨＣＰ除去性は、対数除去係数（ＬＲＶ）で表すことができる。ここで、対数除去係数は下記（１０）式を用いて算出した。
対数除去係数（ＬＲＶ）＝Ｌｏｇ10（Ｃ1／Ｃ2）］・・・（１０）
【００８５】
（ＤＮＡの濃度測定）
溶出液中に含まれるＤＮＡ濃度を、市販のＤＮＡアッセイキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）及び、測定装置（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。測定は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。精製前の、抗体量１ｍｇ当たりに含まれるＤＮＡ量をＣ3、精製後の、抗体１ｍｇ当たりに含まれるＤＮＡ量をＣ4とすると、精製によるＤＮＡ除去性は、対数除去係数（ＬＲＶ）で表すことができる。ここで、対数除去係数は下記（１１）式を用いて算出した。
対数除去係数（ＬＲＶ）＝Ｌｏｇ10（Ｃ3／Ｃ4）］・・・（１１）
【００８６】
（プロテインＡ含量の測定方法）
溶出液中に含まれるプロテインＡ含量を、市販のプロテインＡアッセイキット（ＣＹＧＮＵＳ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、カタログ番号：Ｆ４００）を用いて測定した。測定は、アッセイキットに付属の取扱い説明書（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｆ４００）を参考に実施したが、説明書４ページ記載のプロトコールにおける１〜４の工程を、冷室（１０℃）内で実施し、それ以外の工程を、室温で行った。
【００８７】
上記精製実験の結果を、表２にまとめた。その結果、ＨＣＰ除去性、ＤＮＡ除去性は十分に高く、且つ、溶出画分中に含まれるプロテインＡ含有量も十分に少なかった。
【表２】
2015124177.tif 000003
【００８８】
［参考例２］
洗浄緩衝液として、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた以外、参考例１と同様の方法で抗体の精製を実施した。その結果、表２に示すように、洗浄緩衝液のｐＨより溶出緩衝液のｐＨが高いため、ＨＣＰ除去性、ＤＮＡ除去性が低かった。
【００８９】
［参考例３］
洗浄緩衝液として、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外、参考例１と同様の方法で抗体の精製を実施した。その結果、表２に示すように、洗浄緩衝液と溶出緩衝液とで塩濃度とｐＨが同じであるため、ＨＣＰ除去性、ＤＮＡ除去性が低かった。
【００９０】
［参考例４］
洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液として、２０ｍＭリン酸緩衝液＋１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた以外、参考例１と同様の方法で抗体の精製を実施した。その結果、表２に示すように、ＨＣＰ除去性、ＤＮＡ除去性は十分に高かったが、洗浄緩衝液と溶出緩衝液とで塩濃度とｐＨが同じであるため、溶出画分中に含まれるプロテインＡ含有量が多かった。
【００９１】
［参考例５］
洗浄緩衝液として、２０ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）、及び溶出緩衝液として、２０ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた以外、参考例１と同様の方法で抗体の精製を実施した。その結果、表２に示すように、ＨＣＰ除去性、ＤＮＡ除去性は十分に高かったが、洗浄緩衝液と溶出緩衝液とで塩濃度が同じであり、洗浄緩衝液のｐＨより溶出緩衝液のｐＨが高いため、溶出画分中に含まれるプロテインＡ含有量が多かった。
【００９２】
［参考例６］
洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液として、２０ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた以外、参考例１と同様の方法で抗体の精製を実施した。その結果、表２に示すように、ＨＣＰ除去性、ＤＮＡ除去性は十分に高かったが、洗浄緩衝液と溶出緩衝液とで塩濃度とｐＨが同じであるため、溶出画分中に含まれるプロテインＡ含有量が多かった。