(57)【要約】      （修正有）【課題】肺癌の診断、治療、及び転移予防等に有用な新規ＤＮＡアプタマーの提供。【解決手段】特定の配列で示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有し、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマーを含む肺癌細胞の検出用キット、肺癌細胞の検出用キット、ＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする肺癌の検出方法、肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物の製造のためのＤＮＡアプタマーの使用、ＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステム。前記非小細胞肺癌細胞がＰＣ−９細胞であり、糖鎖部分、リン酸エステル部分及び核酸塩基部分での化学的置換からなる選択される、少なくとも１つの化学修飾し、更に蛍光標識したＤＮＡアプタマー。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２０で示される配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有し、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
配列番号１〜２０で示される配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列において、１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有し、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Ｘは、１）配列番号１〜２０で示される配列から選択されるヌクレオチド配列、又は２）配列番号１〜２０で示される配列から選択されるヌクレオチド配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である
該ＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
Ｐ１は、配列番号２１で示される第１プライマー認識配列であり、及び
Ｐ２は、配列番号２２で示される第２プライマー認識配列である、請求項３に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項５】
前記非小細胞肺癌細胞が、ＰＣ−９細胞である、請求項１〜４のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項６】
糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項７】
５’末端又は３’末端に蛍光標識を有する、請求項１〜６のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項８】
前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９から選ばれる一種以上を含む発光波長４２１nmから７１２nmの有機系蛍光団である、請求項７に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項９】
５’末端又は３’末端を１級から３級アミノ基もしくはチオール基で化学修飾された請求項１〜８のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光特性を有する量子ドット表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１０】
５’末端又は３’末端のいずれか片側を蛍光標識、残る片側を１級から３級アミノ基もしくはチオール基で化学修飾された請求項１〜８のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光特性を有する量子ドット表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１１】
５’末端又は３’末端を１級から３級アミノ基もしくはチオール基を有する蛍光化合物で化学修飾された請求項１〜８のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光特性を有する量子ドット表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１２】
５’末端又は３’末端を蛍光標識された請求項１〜８のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１３】
前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄、珪素及び量子ドットから選ばれる一種以上である請求項１２記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、肺癌細胞の検出用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、肺癌細胞の検出用キット。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、肺癌の検出方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡアプタマーを肺細胞、肺組織、血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答を観測することによって肺癌細胞の存在を検出する工程を含む、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記応答が、蛍光応答である、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記応答が、ラマン散乱応答である、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２１】
肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物の製造のための請求項１〜１３のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合し得る核酸（ＤＮＡアプタマー）、及び該核酸（ＤＮＡアプタマー）を含む組成物を提供することを課題とする。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は疾患による死因として依然として高い比率を占めており、肺癌を早期に診断するための診断薬およびその検出法を開発することは医学、生物学を含む学際領域の最も重要な課題である。肺癌を含む全ての細胞は、その細胞が産生するたんぱく質によりその表面が覆われている。これら発現したたんぱく質に対して特定の配列を有する核酸が吸着することは既に多くの文献に紹介されている（例えば、非特許文献１及び２、特許文献１及び２）。
【０００３】
これら特定のターゲットに対して特異的に吸着しうる核酸配列はアプタマーと呼ばれている。これらアプタマーは化学合成法による製造が可能であることから従来病因たんぱく質と特異的に吸着するものの代表的存在であった抗体のように生体内で合成する必要がないことが特徴である。これらアプタマーを診断に用いる場合は蛍光標識を行い蛍光顕微鏡での検出が多く用いられている（例えば非特許文献２）。
【０００４】
これら目的とするターゲットに対して特異的に吸着する新規のアプタマーの探索には試験管内進化法（in vitro selection法）が最も有効な手段として用いられている。特にＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の２ステップがある（例えば特許文献３）。この選別と増幅を選択圧を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。
【０００５】
さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法や、低分子やタンパク質だけでなく細胞や組織（正確には、表面に存在する分子）に結合するアプタマーを得る手法（Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法。例えば、非特許文献３）などが報告されている。この手法は従来のＳＥＬＥＸ法に比べ、膜たんぱく質の解析が不要であること、細胞表面に存在する様々な膜たんぱく質のアプタマーを同時に選別できること、さらに、目的細胞とより特異的に結合するアプタマーを選抜できると言った特徴がある。
【０００６】
これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾に関しても安価に行うことができ、作用機序が単純で、免疫原性もほとんどないという抗体にはない利点がある。
【０００７】
一方、日本における肺癌の死亡率は、１９５０年以降一貫して増加しており、１９９３年以降は肺癌死亡数は癌死亡数の第１位となっている。肺癌は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌の２つに大別され、前者が全肺癌のうち８０〜８５％を占める。非小細胞肺癌は、その組織型により扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌などに分類され、その２／３は発見時既に切除不能例であり薬物療法が治療の中心になる。進行肺癌の治療成績をあげること、即ち化学療法の成績をあげることが、非小細胞肺癌の治療成績の向上に不可欠である。そのためには、正常細胞と癌細胞を識別し、癌細胞と特異的に結合する生体分子が必要となる。従って、より早期の診断及び効果的な治療剤の開発に有用な新規な肺癌バイオマーカーの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１４９３０２
【特許文献２】特開２０１１−９２１３８
【特許文献３】国際公開ＷＯ／９１１９８１３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙａｘｉｎ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，７６（１７）：５２３０−５２３５，  ２００４．
【非特許文献２】Ｙｅｎ−Ａｎ  Ｓｈｉｅｈ，  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  ＮＡＮＯ., Ｖｏｌ．４，  Ｎｏ．３，  １４３３−１４４２，２０１０.
【非特許文献３】Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ.，Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ.，９(４)：６６８，２００８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のような背景の下に、本発明は、肺癌の診断、治療、及び転移予防等に有用な非小細胞肺癌に関わる新規ＤＮＡアプタマーを提供することを課題とするものである
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を用いることによって非小細胞肺癌細胞に対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有するＤＮＡが非小細胞肺癌細胞に対する特異的アプタマーとして機能し得ることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、一つの態様において、
（１）配列番号１〜２０で示される配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有し、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー；
（２）配列番号１〜２０で示される配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列において、１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有し、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー；
（３）非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有し、
ここで、Ｘは、１）配列番号１〜２０で示される配列から選択されるヌクレオチド配列、又は２）配列番号１〜２０で示される配列から選択されるヌクレオチド配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である、
該ＤＮＡアプタマー；
（４）  Ｐ１は、配列番号２１で示される第１プライマー認識配列であり、及びＰ２は、配列番号２２で示される第２プライマー認識配列である、上記（３）に記載のＤＮＡアプタマー。
（５）前記非小細胞肺癌細胞が、ＰＣ−９細胞である、上記（１）〜（４）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー；
（６）糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、上記（１）〜（５）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー；
（７）５’末端又は３’末端に蛍光標識を有する、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー；
（８）前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９から選ばれる一種以上を含む発光波長４２１nmから７１２nmの有機系蛍光団である上記（７）に記載のＤＮＡアプタマー；
（９）５’末端又は３’末端を１級から３級アミノ基もしくはチオール基で化学修飾された（１）〜（８）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光特性を有する量子ドット表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
（１０）５’末端又は３’末端のいずれか片側を蛍光標識、残る片側を１級から３級アミノ基もしくはチオール基で化学修飾された（１）〜（８）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光特性を有する量子ドット表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
（１１）５’末端又は３’末端を１級から３級アミノ基もしくはチオール基を有する蛍光化合物で化学修飾された（１）〜（８）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光特性を有する量子ドット表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
（１２）５’末端又は３’末端を蛍光標識された（１）〜（８）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
（１３）前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄、珪素及び量子ドットから選ばれる一種以上である（１２）記載のＤＮＡアプタマー。
【００１３】
別の態様において、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーによる肺癌細胞の検出に関し、詳細には、
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、肺癌細胞の検出用組成物；
（１５）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、肺癌細胞の検出用キット；
（１６）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、肺癌の検出方法；及び
（１７）前記ＤＮＡアプタマーを肺細胞、肺組織、血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答を観測することによって肺癌細胞の存在を検出する工程を含む、上記（１６）に記載の検出方法；
（１８）前記応答が、蛍光応答である、上記（１７）に記載の検出方法
（１９）前記応答が、ラマン散乱応答である上記（１７）記載の検出方法
に関する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーを医薬組成物及びドラッグデリバリーシステムに用いることに関し、詳細には、
（２０）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物；
（２１）肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物の製造のための上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーの使用；
（２２）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステムに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合する新規ＤＮＡアプタマーを用いることによって、かかる肺癌細胞の効率的な検出が可能となる。特に、蛍光標識等の検出部位を付与したＤＮＡアプタマーを含むキット等に応用することで、生体から採取した肺細胞や組織を測定対象とする簡便かつハイスループットな検出又はイメージングを行うことができる。また、さらに前記の蛍光標識を施したＤＮＡアプタマーを金属ナノ粒子に固着させた分散液を含むキット等に応用することで、生体から採取した肺細胞や組織を測定対象とする簡便かつハイスループットな検出又はイメージングを行うことができる。そのような肺癌細胞の検出によって、癌の発症や転移の有無、癌の予後や悪性度の診断が可能となる。
【００１６】
また、本発明のＤＮＡアプタマーは非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合し得るという性質を有することから、上記ＤＮＡアプタマーに抗癌剤等の薬物をコンジュゲートさせて用いることによって、当該薬剤をターゲット部位に確実に作用させることが可能となるため、肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物又はかかる医薬組成物のためのドラッグデリバリーシステムとしても有用性が期待できる。
【００１７】
さらに、本発明のＤＮＡアプタマーにおけるコンセンサス配列は、わずか３０塩基程度の比較的短い領域であることから、製造のための手間やコストを抑制すること、及び種々の用途に応じて所望の化学修飾や更なる機能の付加を行うことが容易であるという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、磁性粒子を用いた２本鎖ＤＮＡの１本鎖化を示す模式図である。
【図２】図２は、配列番号１を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図３】図３は、配列番号１を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図４】図４は、配列番号２を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図５】図５は、配列番号２を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図６】図６は、配列番号３を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図７】図７は、配列番号３を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図８】図８は、配列番号４を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図９】図９は、配列番号４を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図１０】図１０は、配列番号４を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図１１】図１１は、配列番号４を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図１２】図１２は、配列番号５を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図１３】図１３は、配列番号５を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図１４】図１４は、配列番号６を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図１５】図１５は、配列番号６を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図１６】図１６は、配列番号７を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図１７】図１７は、配列番号７を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図１８】図１８は、配列番号７を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図１９】図１８は、配列番号７を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図２０】図２０は、配列番号８を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図２１】図２１は、配列番号８を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図２２】図２２は、配列番号９を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図２３】図２３は、配列番号９を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図２４】図２４は、配列番号１０を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図２５】図２５は、配列番号１０を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図２６】図２６は、配列番号１０を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図２７】図２７は、配列番号１０を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図２８】図２８は、配列番号１１を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図２９】図２９は、配列番号１１を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図３０】図３０は、配列番号１１を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図３１】図３１は、配列番号１１を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図３２】図３２は、配列番号１２を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図３３】図３３は、配列番号１２を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図３４】図３４は、配列番号１３を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図３５】図３５は、配列番号１３を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図３６】図３６は、配列番号１４を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図３７】図３７は、配列番号１４を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図３８】図３８は、配列番号１５を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図３９】図３９は、配列番号１５を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図４０】図４０は、配列番号１６を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図４１】図４１は、配列番号１６を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図４２】図４２は、配列番号１７を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図４３】図４３は、配列番号１７を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図４４】図４４は、配列番号１８を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図４５】図４５は、配列番号１８を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図４６】図４６は、配列番号１９を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図４７】図４７は、配列番号１９を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【図４８】図４８は、配列番号２０を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の実像図である。
【図４９】図４９は、配列番号２０を有するＤＮＡアプタマーによるＰＣ−９細胞の蛍光イメージング図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２０】
１．ＤＮＡアプタマー
本願において「ＤＮＡアプタマー」とは、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖オリゴＤＮＡを意味し、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合する機能を有する一本鎖オリゴＤＮＡである。
【００２１】
一般に、肺癌は、顕微鏡で観察される細胞の形態によって、小細胞肺癌と非小細胞肺癌に分けられる。非小細胞肺癌は腺癌（ＡＤＣ）、大細胞癌（ＬＣＣ）、扁平上皮癌（ＡＳＣ）の３つに分けられ、それぞれ異なる種類の癌細胞を持っており、異なる方法で成長する。腺癌は非小細胞肺癌のなかでは発生頻度が高く、肺癌の半分以上を占める。大細胞癌は発育が比較的はやいという以外にはっきりとした特徴はなく、肺癌の７％を占める。扁平上皮癌は肺癌の２５％を占め、特に男性に多くみられるなどの特徴を有する。
【００２２】
本明細書における「非小細胞肺癌」の非限定的な例は、主として上記の形態学的分類により扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌に分類され、さらに、その非限定的な例は腺癌であるVMRC-LCD、Ａ−５４９、ABC-1、PC-3、 RERF-LC-Aｄ１、RERL-LCAｄ２、RERF-LC-KJ、RERF-LC-MS、RERF-LC-OK、ＬＣ３１９、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、扁平上皮癌であるＮＣＩ−Ｈ２２６、 ＮＣＩ−Ｈ６４７、  ＨＡＲＡ、  ＨＡＲＡ−Ｂ、ＬＣ−１ｓｑ、ＫＬ−２、ＫＮＳ−６２、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ｓｑ１、ＶＭＲＣ−Ｌｃｐ、大細胞癌としてＬＸ１、ＬＵ６５、ＬＵ６５Ａ、ＬＵ６５Ｂ、ＬＵ−６５Ｃ５、ＬＵ９９、ＬＵ９９Ａ、ＬＵ９９Ｂ、ＬＵ９９Ｃ、Ｏｋａ−Ｃ−１が挙げられる。
【００２３】
本発明に係るＤＮＡアプタマーの結合ターゲットとしては、好ましくは肺腺癌細胞であり、より好ましくはＰＣ−９細胞およびＰＣ-１４細胞である。
【００２４】
ＰＣ−９細胞は、Ａｎｋｅ  Ｂｉｌｌ，  Ａｎｔｏｎ  Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｂａｒｂａｒａ  Ａｌｂｅｒｔｏｎｉ，Ｊｉｎ−Ｎａ  Ｓｏｎｇ，Ｌｕｋａｓ  Ｃ．  Ｈｅｕｋａｍｐ，Ｄａｖｉｄ  Ｗａｌｒａｆｅｎ，Ｆｒａｎｚｉｓｋａ  Ｔｈｏｒｗｉｒｔｈ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．  Ｖｅｒｖｅｅｒ，  Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ｚｉｍｍｅｒ，  Ｌｉｓａ  Ｍｅｆｆｅｒｔ  Ａｒｎｅ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓａｍｐｕｍａ  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｒｏｍａｎ  Ｋ．  Ｔｈｏｍａｓ，Ｒｏｌａｎｄ  Ｔ，  Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ｔｈｏｒｓｔｅｎ  Ｌａｎｇ，ａｎｄ  ＭｉｃｈａｅｌＦａｍｕｌｏｋ．Ｃｙｔｏｈｅｓｉｎｓ  Ａｒｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＥｒｂＢ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．，  Ｃｅｌｌ．  １４３，  ２０１−２０１１，  ２０１０．等に記載されている。
【００２５】
また近年独立行政法人  理化学研究所バイオリソースセンターの解析により理化学研究所が保有するＰＣ−１４肺腺癌と株式会社免疫生物研究所の販売するＰＣ−９が細胞株起源確認検査(STR多型解析)の結果、同一パターンを示し、同一の細胞株である可能性が高いことが判明しており、本特許でもこれら２つの株を同一のものとして扱うものとするが、アプタマー自身の細胞への親和性は別途検討を行い、その特性を評価し、本報実験例に記載した。
【００２６】
典型的な態様において、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、以下に示す配列番号１〜２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列を有する。なお、本明細書において、ヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端方向に左から右に記載する。
＜配列番号１＞
ＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴ
＜配列番号２＞
ＴＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣ
＜配列番号３＞
ＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＴ
＜配列番号４＞
ＡＣＴＧＧＴＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴ
＜配列番号５＞
ＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＣＧ
＜配列番号６＞
ＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＴＡＧＧＴＧ
＜配列番号７＞
ＧＧＧＴＴＴＧＧＴＴＣＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＣＴ
＜配列番号８＞
ＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＧ
＜配列番号９＞
ＣＧＧＧＧＧＴＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴ
＜配列番号１０＞
ＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣ
＜配列番号１１＞
ＧＴＴＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴ
＜配列番号１２＞
ＴＡＴＧＴＣＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＧＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＧＴＴＴ
＜配列番号１３＞
ＴＧＡＴＣＡＡＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＧＧＴＴ
＜配列番号１４＞
ＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴ
＜配列番号１５＞
ＧＴＧＣＴＴＡＣＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＧＧＧＴ
＜配列番号１６＞
ＡＧＣＣＴＴＧＴＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＣＧＣＧＣＴ
＜配列番号１７＞
ＧＧＴＧＴＡＧＧＣＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧ
＜配列番号１８＞
ＧＴＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣ
＜配列番号１９＞
ＧＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣ
＜配列番号２０＞
ＴＣＣＣＧＣＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＧＴＡ
【００２７】
本発明に係るＤＮＡアプタマーは、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号１〜２０配列における１もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、１〜３個であり、より好ましくは１又は２個であり、さらに好ましくは１個である。
【００２８】
また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係るＤＮＡアプタマーの配列は、上記配列番号１〜２０のそれぞれと９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９６％以上の相同性である配列（以下、「相同体」という場合がある。）であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，ＰＮＡＳ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：５８７３−５８７７）または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。
【００２９】
１もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準ＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう（例えば、Ｌｏａｋｅｓら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７０：４２６−４３５）。
【００３０】
ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド（ｃａｒｂｏｚａｍｉｄｅ）、ならびにニトロアゾール誘導体（３’−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールなど）が挙げられる（Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２４３７）。
【００３１】
また、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態におけるＤＮＡアプタマーの長さは、上限としては、例えば２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下である。
【００３２】
全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号１〜２０における塩基数以上、すなわち３３塩基又は３４塩基以上である。
【００３３】
ＤＮＡアプタマーは１本鎖（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に２本鎖構造を形成する場合であっても、そのＤＮＡアプタマーの長さは１本鎖の長さとして計算するものとする。
【００３４】
好ましい実施態様において、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、上記配列番号１〜２０のいずれかの配列、及びその５’及び３’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該ＤＮＡアプタマーは、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Ｘは、配列番号１〜２０で示される配列から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である。好ましくは、Ｐ１は、ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ(配列番号２１)であり、及びＰ２は、ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ（配列番号２２）である。
【００３５】
本発明に係るＤＮＡアプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換（例えば、２’−０メチル化）、リン酸エステル部分での化学的置換（例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アセチル基等）、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。
【００３６】
同様に、５’又は３’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
また、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、後述の肺癌細胞の検出方法又は当該検出用キットにおいて用いるために、例えば５’末端又は３’末端に連結した検出標識を有することができる。かかる検出標識としては、蛍光標識が好ましいが、ラマン散乱標識、酵素標識、さらに赤外線標識を用いてもよい。
【００３８】
蛍光標識は、当該技術分野において慣用されている蛍光標識剤を用いることができるが、例えば、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９など、市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。
【００３９】
さらに、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００４０】
酵素標識の例としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、発光基質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを標識剤として用いてもよい。
【００４１】
ラマン散乱標識に関しては、前記の蛍光標識されたアプタマーの例えば５’末端又は３’末端に金属表面と結合能を有する置換基として特に限定するものではないが、チオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることにより当該アプタマー吸着金属粒子から発せられる増強ラマン散乱光を検出することで細胞認識を行うものである。この場合、特に限定するものではないが、金属ナノ粒子として、金、銀、銅、鉄、珪素、量子ドットなどを用いることができる。
【００４２】
２．ＤＮＡアプタマーの選別
本発明のＤＮＡアプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳＥＬＥＸ法）が用いられる。当該ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド（アプタマー）の選別と、ＰＣＲによる指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより，ターゲット物質に親和性を有する核酸分子（一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ）を得るというものである。
【００４３】
また、その改良手法として、例えばＧｕｏ，ｅｔ ａｌ.，Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ.，９(４)：６６８，２００８に記載されているようなＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を用いることが好ましい。この手法は、ターゲットとして細胞自体を用いることができるため、従来のＳＥＬＥＸ法と比較して、細胞表面に膜タンパク質の解析が不要であること、細胞表面に結合し得る複数のアプタマーを同時に選抜できること、及びターゲット細胞に対してより特異的に結合するアプタマーを選抜できるといった利点を有するものである。なお、これら以外にも当該技術分野において周知の方法を用いて本発明のＤＮＡアプタマーを選別及び取得することもできる。
【００４４】
上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール（いわゆる、ＤＮＡプール）からターゲットとする分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。当該選択されたアプタマー分子のみをＰＣＲ法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができるというものである。
【００４５】
具体的には、まず、２０〜３００塩基、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００塩基程度のランダムなヌクレオチド配列（塩基配列）領域を含む１本鎖核酸分子、例えば、オリゴＤＮＡを調製する。オリゴＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。プライマー認識配列部分は、ＰＣＲ増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約２０〜５０、好ましくは２０〜３０塩基程度である。また、ＰＣＲ増幅後の１本鎖ＤＮＡを電気泳動などで分離可能とするために、５’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。
【００４６】
次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸分子（ライブラリープール）と、ターゲット細胞とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、混合物を遠心機にかけて、核酸分子−ターゲット細胞複合体と遊離核酸分子とを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた核酸分子−ターゲット細胞複合体を用いてＰＣＲ反応を行うことで細胞結合性核酸配列の増幅を行う。
【００４７】
この後、ターゲット細胞と複合体を形成している核酸分子を当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうち細胞結合能を有するｓｓＤＮＡを分離することができ、さらにＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたｓｓＤＮＡをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。
【００４８】
上述の核酸分子とターゲット細胞との混合、ターゲット細胞と結合した核酸分子の分離、ＰＣＲ増幅、増幅された核酸分子を再びターゲット細胞との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。
【００４９】
得られた核酸分子は、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。
【００５０】
３．癌細胞の検出用組成物、検出方法、及びキット
上述のように、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、非小細胞肺癌細胞に対して特異的に結合する機能を有することから、当該肺癌細胞の検出において好適に用いることができ、本発明のＤＮＡアプタマーを含む検出用組成物は、非小細胞肺癌に対する腫瘍マーカとしても用いることができる。
【００５１】
具体的には、本発明のＤＮＡアプタマーを含む検出用組成物を肺細胞、肺組織、血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させ、その後、当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答（シグナルの有無）を観測することによって肺癌細胞の存在を検出する。
【００５２】
当該生体から採取された試料は、動物、好ましくはヒトから採取したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養液成分試料等であれば、その形態は特に限定されない。
【００５３】
また、肺癌細胞の存在を検出するための「応答」は、蛍光応答もしくはラマン散乱応答であることが好ましく、そのため上記で述べたとおり、蛍光応答においてはＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端にＴＡＭＲＡ（商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させることが好ましい。またラマン散乱応答においてはＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端にＣｙ３．５（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させ、さらに前記のチオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることが好ましい。
【００５４】
また、本発明の肺癌細胞の検出用組成物は、その簡便性や携帯性を高めるためＤＮＡアプタマーを含むキットとして提供することもできる。当該キットにおいてＤＮＡアプタマーは、通常、適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該ＤＮＡアプタマーが固相担体上に固定されたＤＮＡアレイの態様で提供されることができる。
【００５５】
例えば、ＤＮＡアプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によってＤＮＡアプタマーを固相担体表面に固定化することができる。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【００５６】
４．医薬組成物及びＤＤＳ
別の態様において、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用医薬組成物を提供するものである。好ましくは、当該医薬組成物は、ＤＮＡアプタマーに加えて、有効量の肺癌の転移予防又は治療のための医薬化合物（有効成分）、及び医薬上許容される担体を含むことができる。例えば、本アプタマーを金ナノ粒子に結合したものを用いて、癌の温熱療法用の試薬として利用できる可能性がある。
【００５７】
上記「肺癌」は、扁平上皮癌（ＡＳＣ）、腺癌（ＡＤＣ）、及び大細胞癌（ＬＣＣ）を含む非小細胞肺癌であり、好ましくはＰＣ-9細胞（ＰＣ-14細胞）と関連する腺癌である。「転移予防又は治療」には、癌細胞の遊離、移動、転移、浸潤または増殖の抑制、アポトーシスの誘導が含まれ得る。
【００５８】
転移の抑制とは、癌細胞が原発巣から異なる部位に到達し、該部位において癌を二次的に生じることを抑制することを意味する。
【００５９】
本発明の医薬組成物中に含まれる有効成分は、肺癌の転移予防又は治療に有効なものであれば、特に限定されるものではないが、好ましくは抗癌剤である。かかる抗癌剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、化学療法剤、分子標的治療薬これら以外の他の抗癌剤等が挙げられる。
【００６０】
アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、クロラムブチル、ジブロモダルシトール、チオテパ、カルムスチン、ブスルファンなどが挙げられる。
【００６１】
代謝拮抗剤としては、６−メルカプトプリン、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、シタラビン、エノシタビン、メトトレキセートなどが挙げられる。
【００６２】
抗生物質としては、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ドキソルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、アクチノマイシンＤなどが挙げられる。
【００６３】
その他の抗癌剤としては、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシドラステット、ゲフィニチブ、シクロホスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、フルオロウラシル、メシル酸イマニチブ、メソトレキサート、リツキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、タモキシフェン、カンプトテシン、メルファラン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィランなどが挙げられる。
【００６４】
分子標的治療薬の標的は細胞表面抗原、増殖因子・受容体・シグナル伝達系、細胞周期、アポトーシス、テロメア・テロメラーゼ、転移・血管新生などに分類される。
【００６５】
細胞表面抗原を標的とする分子標的治療薬は抗体であることが多い。代表はＲｉｔｕｘｉｍｉｂ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、Ｔｒａｓｔｕｚｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ 、Ｏｎｃｏｐｈａｓｇｅ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅなどが挙げられる。
【００６６】
増殖因子・受容体・シグナル伝達系にかかわる分子標的治療薬は数え切れないほどあるが、特に限定するものではないが、Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂやｃ−ｋｉｔおよびＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害薬、特にＥＧＦＲチロシンキナーゼなどが挙げられる。
【００６７】
分子標的治療薬としては、ＶＥＧＦそのものに対する抗体であるＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂや、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ、Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅなどが挙げられる。
【００６８】
本発明の医薬組成物中に含まれる医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６９】
本発明の医薬組成物の癌細胞内への導入を促進するために、当該組成物には、さらに核酸導入用試薬を含むこともできる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、多様な製剤形態、例えば、カプセル剤、錠剤、液剤等の剤形をとることができ、限定はしないが、より一般的には、液剤化され、注射剤とされるか、または、経口剤とされるか、又は徐放剤とされる。
【００７２】
当該注射剤は、当該技術分野における周知の方法より調製することができる。例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等の適切な溶媒に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。
【００７３】
経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の剤形に製剤化される。
【００７４】
徐放剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、マイクロカプセル等の剤形に製剤化される。
【００７５】
製剤化する場合には、好ましくは、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等の安定化剤が添加され得る。
【００７６】
さらに、本発明の医薬組成物の製剤化においては、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等の必要な補助添加物を含んでもよい。
【００７７】
液状製剤とした場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。また、徐放剤とした場合、徐放用担体として例えば、可溶性コラーゲン又は可溶性コラーゲン誘導体、ゼラチン等の蛋白質、セラミックス多孔体、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、キチン又はキチン誘導体、水膨潤性高分子ゲル等を使用することができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、その形態に応じた適切な投与経路により投与され得る。経口的に又は非経口的に投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。また、徐放剤の形態にして生体内、例えば患部、皮下、筋肉内等に埋め込むことにより投与することができる。投与量及び投与回数等は、投与の目的、投与方法、癌の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、基本的には上記有効成分における望ましい投与形態に従う。
【００７９】
また、本発明のＤＮＡアプタマーをリポソームやナノ粒子等の輸送材料の表面に付着もしくは内包させることによって、当該輸送材料中に含まれる医薬成分を肺癌細胞に選択的に輸送することができる。従って、更なる態様において、本発明は上記ＤＮＡアプタマーを含有する、肺癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステムを提供するものである。
【００８０】
当該ドラッグデリバリーシステムによって輸送され得る医薬成分は、典型的には上述の抗癌剤であるが、肺癌の転移予防又は治療に有用な物質である限り、それら以外にもトキシン、癌成長阻害遺伝子、自殺遺伝子、又は、肺癌の成長及び転移に重要な役割を果たす遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等であることもできる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００８２】
実施例１：アプタマーの選別
Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を用いて、ランダムな配列を有するＤＮＡプールから非小細胞肺癌細胞であるＰＣ−９細胞に特異的に結合するアプタマーの選別を行った。当該Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法における各工程は以下のとおりである。
１）  ＤＮＡプールの調製（ＤＮＡアプタマー候補群の溶液調製）
２）  ターゲット物質とＰＣ−９細胞との混合
３）  ターゲット結合性ＤＮＡと非結合性ＤＮＡの分離
４）  ターゲット結合性ＤＮＡの複製（ターゲット物質と結合したＤＮＡアプタマーを増幅する工程）
５）  ターゲット結合性ＤＮＡの精製（増幅したＤＮＡアプタマーを１本鎖ＤＮＡに精製する工程）
６）  ターゲット結合性核酸のクローンニング（得られたＤＮＡアプタマーの配列解析の前処理）
７）  これら１）〜６）の工程を６ラウンド実行
８）  ターゲット結合性核酸の配列解析（シーケンサーによるＤＮＡアプタマーのヌクレオチド配列の解析）
【００８３】
より詳細な実験手順は、以下のとおりである。
ＤＮＡプールは、以下の配列を有する全長が７０塩基でランダム配列部分（Ｎ）が３４塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
ＤＮＡ  ｐｏｏｌ:Ｒａｎｄｏｍ３４（日本遺伝子研究所社製）
・配列:  ５’-ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ(Ｎ３４)ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ−３’
・長さ:  ７０塩基(ランダム配列は中央の３４塩基)
・分子量:  ２１３９１．３  ｇ／ｍｏｌ
・モル吸光係数:  ６３０４７５  Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ
【００８４】
ランダム配列の両側は、後のＰＣＲにおいてプライマーによって認識され、増幅を可能にするための配列である。上記ランダムＤＮＡを細胞培養用培地（和光純薬工業株式会社製：ＲＰＭ１−１６４０）バッファーを溶媒として１μＭのＤＮＡプールを調製した。
【００８５】
その後、ＰＣ−９細胞を培養シャーレで培養し、細胞数が１０６〜１０７個になるまで培養した。培養後培地を除去し、さらに同シャーレにリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する。）を２ｍＬ添加して細胞を洗浄した。このシャーレにＥＤＴＡ含有０．０５％トリプシン溶液１ｍＬを添加し、３７℃インキュベーターに２分間静置した。細胞がシャーレから剥がれていることを確認した後、ＰＢＳを４ｍＬ添加し、これを１５ｍＬ遠沈管にて回収し、２００ｇで３分間遠心処理を行った。その後上澄み液をアスピレータにより除去した。それにＰＢＳを３ｍL添加し、ピペッティングにより細胞を懸濁させたのち２００ｇで３分間遠心処理を行い、上澄みを除去する洗浄工程を２回行った。培地を３３０ｕＬ中１０６セルになるように調製した。調製した懸濁液に予め準備しておいた１μＭのランダムＤＮＡ（ＤＮＡプール）溶液３７０μＬを混和し、ボルテックスにより十分に混和させた。
【００８６】
得られた混合溶液を３７℃インキュベーター内に１時間静置した。その後同遠沈管を用いて４００ｇで４分間遠心処理を行い、上澄みを除去した後ＰＢＳを５００μL添加し４００ｇで４分間遠心処理を行った。この洗浄操作を３回行った。上澄みを除去した後ＰＢＳ２００μＬを添加し、９５℃で１０分間加熱した。１３０００ｇで５分間遠心処理を行い、上澄みを回収した。
【００８７】
分離したＰＣ-9細胞結合性のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。装置は、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ−ＴＰ６００）を用いた。プライマーは、上記ランダムＤＮＡの共通配列に対応する１８塩基のプライマーを用いた（日本遺伝子研究所社製）。当該プライマーの５’末端側には、後述のように１本鎖ＤＮＡの分離を可能にするためビオチン修飾を施してある。
【００８８】
精製したＤＮＡにストレプトアビジンを加えて磁性粒子に吸着させ、磁石により磁性粒子を回収したのち上澄みを除去、その後アルカリバッファー変性により上澄み中に磁性粒子と結合していない１本鎖ＤＮＡを回収した（図１）。その後アルカリバッファーをＰＢＳバッファーに置換することで、磁性粒子と結合した目的物である１本鎖ＤＮＡを回収した。これを１ラウンドとし、この操作を６回行った。
６ラウンド後、ビオチン非修飾の１８塩基プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物をライフテクノロジーズ社製ＩｏｎＰＧＭシステムを用いてシークエンサー解析した。
【００８９】
実施例２：蛍光標識ＤＮＡアプタマーによる非小細胞肺癌細胞の染色
ＰＣ-9細胞を培養シャーレで培養し、細胞数が１０６〜１０７になるまで培養する。これにシークエンサー解析により見出されたＰＣ-9細胞に対して親和性のあるヌクレオチド配列からなるＤＮＡアプタマーの５‘末端をＴＡＭＲＡ（商標）で修飾し、このＤＮＡを超純水により１００μＭに調製したアプタマー溶液を２０μＬとり、１ｍＬ培養液を有する培養シャーレに分散させながら添加した。これを３７℃１時間インキュベーターに静置した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、さらにＰＢＳを２ｍＬ添加した状態でオリンパス製の倒立型蛍光顕微鏡ＩＸ７１により観察した。配列番号１〜２０を有するＤＮＡアプタマーによる結果を、それぞれ図２から図４９に示す。これらの蛍光標識ＤＮＡアプタマーがＰＣ−９細胞に特異的に結合し、それによってＰＣ−９細胞に対する良好な蛍光イメージング画像が得られることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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