(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の免疫グロブリンG、例えばラットIgGやヒトIgGのFab断片とのタンパク質（抗体等）の捕捉剤等、該捕捉剤を充填して成るタンパク質分離精製用クロマトグラフィー用カラム、特に、抗体精製用のアフィニティクロマトグラフィー用カラムの提供。【解決手段】免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していないタンパク質。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していないタンパク質。
【請求項２】
ラットIgG又はヒトIgGのFab断片に対する中性領域での結合活性は低下していない請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
野生型プロテインG・Bドメインが、ストレプトコッカス属連鎖球菌のプロテインGのB1、B2、又はB3のいずれかである、請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
野生型プロテインG・B１ドメインの変異体であって、野生型のプロテインG・B1ドメインから成るタンパク質に比べて、免疫グロブリンGのFab領域との結合性及び／または同Fc領域との結合性の弱酸性域における結合性が低下している改良型タンパク質のアミノ酸配列における一個又は数個のアミノ酸を更に変異することによって得られる変異体を含み、特定の免疫グロブリンGに対する中性域での抗体結合活性が該改良型タンパク質に比べた場合に向上している、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
改良型タンパク質が配列番号１７〜２４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
野生型プロテインG・B１ドメインの変異体のアミノ酸配列において、36位グルタミン酸からアスパラギン酸への変異及び37位ヒスチジンからアスパラギンへの変異を有するアミノ酸配列からなる、請求項４又は請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質のタンデム型多量体であるタンパク質。
【請求項９】
三量体、四量体、又は五量体である、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１０】
多量体を構成する細胞膜外ドメイン変異体が互いに同一である、請求項８又は９記載のタンパク質。
【請求項１１】
各細胞膜外ドメイン変異体がリンカー配列によって連結されている、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質であるタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質が水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質の捕捉剤。
【請求項１８】
ヒトIgGのFab断片又はラットIgG精製用である、請求項１７記載の捕捉剤。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の捕捉剤を含む、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質の精製用アフィニティクロマトグラフィー。
【請求項２０】
請求項１７に記載の精製用アフィニティクロマトグラフィーを用いて、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質を精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していないタンパク質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗体をはじめとするタンパク質の精製は生化学研究における重要な課題であり、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなど様々な技術が知られている。アフィニティクロマトグラフィは、目的タンパク質との特異的な親和性を利用して目的タンパク質を精製する方法である。この方法はでは容易に選択的にタンパク質の回収が可能であるが、その親和性が非常に強いため、クロマト充填剤に吸着させたタンパク質を解離させるために、一般的にはｐＨ２．５程度の酸性緩衝液での溶出が必要となることが多い。そのような強酸性条件では、タンパク質の変性などの活性低下が起こりやすく、より温和な条件での精製が求められている。
【０００３】
連鎖球菌由来のタンパク質であるプロテインGはストレプトコッカス属連鎖球菌の細胞膜に存在する膜タンパク質であり、抗体の一種である免疫グロブリンGのFc領域に対する特異的結合活性を有することが知られている（非特許文献１、特許文献１）。プロテインGは、複数のドメインからなるマルチドメイン型膜タンパク質で、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性（以下、「抗体結合活性」と呼ぶ）を示すのは、このうちの一部の細胞膜外ドメインである（非特許文献２）。例えば、特許文献８の図１に示すG148株由来のプロテインGの場合、抗体結合活性を示すのは、B1、B2、B3の３つのドメインである（文献によってC1、C2、C3ドメインとも表記される）。また、GX7805株のプロテインGでは３つの、GX7809のプロテインGでは２つの抗体結合ドメインが存在する。これらは、いずれも60アミノ酸弱の小型タンパク質で、そのアミノ酸配列の間には高い同一性が見られることが知られている）。また、プロテインＧを切断して各々のドメイン単独を単離しても、抗体結合活性は保たれることが知られている（非特許文献３）。
【０００４】
プロテインGの細胞膜外ドメインは、現在、その選択的な抗体結合活性を利用した多くのプロテインG細胞膜外ドメイン含有製品が上市されている（例えば、抗体精製のためのアフィニティクロマトグラフィー用担体（特許文献３、４）や抗体を検出するための検査試薬、研究試薬など）。プロテインＧの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は、中性〜弱酸性域で高く、強酸性域で低いことが知られている（非特許文献４）。ゆえに、抗体の単離、回収、精製を目的とした場合、まず、血清等の抗体を含む試料溶液を中性状態にして、プロテインＧの細胞膜外ドメインを固定化したビーズ等の水不溶性の固相支持体に接触させ、抗体を選択的に吸着させる。この後、中性〜弱酸溶液(pH5〜8)で洗浄し抗体以外の成分を除去する。最後にpH2.4〜3.5の強酸性溶液を加え抗体を固定化したプロテインGから脱着させ、強酸性溶液と共に溶出させることが一般的である（特許文献３）。これにより、高い純度で抗体を単離、回収、精製することができる。
【０００５】
しかし、抗体はpH2.4〜3.5の強酸性溶液におくと変性凝集等で劣化することがあり、抗体の種類によっては、本来の機能を失う場合もある（非特許文献４）。これを防ぐために、pH2.4〜3.5より高いpHの弱酸性域で処理することが試みられるが、プロテインGの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は強いので、弱酸性域では抗体はプロテインGから溶出せず、十分な回収量が得られない。一方、プロテインG細胞膜外ドメインはFabとも結合することが知られており（非特許文献２）、一つの抗体分子はFc領域とFab領域の２つの領域で、プロテインG細胞膜外ドメインと結合可能である。このような結合状態になると、抗体とプロテインGの細胞膜外ドメインは容易に解離できず、抗体の回収は困難になる。
【０００６】
これまでに本発明者等は、熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、及びタンパク質分解酵素に対する耐性等（これらの特性を総称して、単に「タンパク質安定性」ともいう）を有するプロテインGの細胞膜外ドメイン変異体からなる改良型タンパク質を開発し（特許文献５及び特許文献６）、更に、弱酸性域における免疫グロブリンのFc領域との結合性及び／または同Fab領域との結合性が低下した改良型タンパク質も開発した（特許文献７）。しかしながら、これらの改良型タンパク質はいずれも抗体結合活性を示す１つのドメインのみを含むものである。
【０００７】
更に、本発明者等は、上記改良型タンパク質のタンデム型多量体から成るタンパク質を開発した（特許文献８）。かかるタンパク質は、野生型のプロテインG・B1ドメインのタンデム型多量体に比べて、IgG1及びIgG3という異なるサブクラスのヒト免疫グロブリンGのFc領域との弱酸性域における結合性がより大きく低下しており、該タンパク質を含む本発明の捕捉剤を充填したタンパク質分離精製用クロマトグラフィー用カラムにおいては、捕捉したヒト免疫グロブリンGを弱酸性領域（pH4〜5程度）において、変性のない状態でより容易に溶出することが可能となった。
【０００８】
しかしながら、このような従来の改良型タンパク質は、野生型のプロテインGの細胞膜外ドメインを含むタンパク質に比べて、特定の免疫グロブリンG、例えばラットIgGやヒトIgGのFab断片との中性域での抗体結合活性が低下していることから、これらの抗体の捕捉及び回収が困難な場合がある、という課題を抱えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表平03−501801公報
【特許文献２】特許第2764021号公報
【特許文献３】特開平03−128400号公報
【特許文献４】特開2003−088381号公報
【特許文献５】特開2009-95322号公報
【特許文献６】特開2009-118749号公報
【特許文献７】特開2009-297018号公報
【特許文献８】国際公開第2013/018880号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bjorck L, Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 969-974.
【非特許文献２】Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press, Inc., San Diego,  CA, USA.
【非特許文献３】Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL. (1994) Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry 19, 4721-4729.
【非特許文献４】Gagnon P. (1996) Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems Inc., Tucson, AZ, USA.
【非特許文献５】Watanabe H, Matsumaru H, Ooishi A, Feng Y, Odahara T, Suto K, Honda S. Optimizing pH response of affinity between protein G and IgG Fc: how electrostatic modulations affect protein-protein interactions. J Biol Chem. 2009 284(18), 12373-12383.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明が解決しようとする課題は、従来の改良型タンパク質が有する弱酸性域における免疫グロブリンのFc領域との結合性の低下という優れたｐH応答性を維持しつつ、更に、特定の免疫グロブリンGに対する中性域での抗体結合活性が、野生型のプロテインGの細胞膜外ドメインを含むタンパク質に比べた場合には低下していない、即ち、従来の改良型タンパク質に比べた場合には向上している、という特長を有する新規タンパク質、更に、該タンパク質が固定化されていることを特徴とする、抗体精製用アフィニティクロマトグラフィー充填剤等として有用な、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFab領域を有するタンパク質（抗体等）の捕捉剤等を提供することである。
更に、本発明が解決しようとする課題は、該捕捉剤を充填して成るタンパク質分離精製用クロマトグラフィー用カラム、特に、抗体精製用のアフィニティクロマトグラフィー用カラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、プロテインGの細胞膜外ドメイン変異体からなる改良型タンパク質に代表されるような、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、野生型のプロテインG・B1ドメインから成るタンパク質に比べて、免疫グロブリンGのFab領域との結合性及び／または同Fc領域との結合性の弱酸性域における結合性が低下している改良型タンパク質のアミノ酸配列における一部のアミノ酸を変異することによって、上記の所望の効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１３】
即ち、本発明の各態様は、以下のとおりである。
［態様１］
免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していないタンパク質。
［態様２］
ラットIgG又はヒトIgGのFab断片に対する中性領域での結合活性は低下していない態様１記載のタンパク質。
［態様３］
野生型プロテインG・Bドメインが、ストレプトコッカス属連鎖球菌のプロテインGのB1、B2、又はB3のいずれかである、態様１又は２記載のタンパク質。
［態様４］
野生型プロテインG・B１ドメインの変異体であって、野生型のプロテインG・B1ドメインから成るタンパク質に比べて、免疫グロブリンGのFab領域との結合性及び／または同Fc領域との結合性の弱酸性域における結合性が低下している改良型タンパク質のアミノ酸配列における一個又は数個のアミノ酸を更に変異することによって得られる変異体を含み、特定の免疫グロブリンGに対する中性域での抗体結合活性が該改良型タンパク質に比べた場合に向上している、態様１ないし３のいずれか一項に記載のタンパク質。
［態様５］
改良型タンパク質が配列番号１７〜２４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、態様４に記載のタンパク質。
［態様６］
野生型プロテインG・B１ドメインの変異体のアミノ酸配列において、36位グルタミン酸からアスパラギン酸への変異及び37位ヒスチジンからアスパラギンへの変異を有するアミノ酸配列からなる、態様４又は態様５に記載のタンパク質。
［態様７］
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる、態様６に記載のタンパク質。
［態様８］
態様１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質のタンデム型多量体であるタンパク質。
［態様９］
三量体、四量体、又は五量体である、態様８記載のタンパク質。
［態様１０］
多量体を構成する細胞膜外ドメイン変異体が互いに同一である、態様８又は９記載のタンパク質。
［態様１１］
各細胞膜外ドメイン変異体がリンカー配列によって連結されている、態様８ないし１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
［態様１２］
態様１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質であるタンパク質。
［態様１３］
配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する、態様１２記載のタンパク質。
［態様１４］
態様１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
［態様１５］
態様１４に記載の核酸を含有する組換えベクター。
［態様１６］
態様１５に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
［態様１７］
態様１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質が水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質の捕捉剤。
［態様１８］ヒトIgGのFab断片又はラットIgG精製用である、態様１７記載の捕捉剤。
［態様１９］
態様１７又は１８に記載の捕捉剤を含む、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質の精製用アフィニティクロマトグラフィー。
［態様２０］
態様１７に記載の精製用アフィニティクロマトグラフィーを用いて、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質を精製する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しているという従来の改良型タンパク質が有する優れたｐH応答性を維持しつつ、特定の免疫グロブリンGに対する中性域での抗体結合活性が、野生型のプロテインGの細胞膜外ドメインを含むタンパク質に比べた場合には低下していない、即ち、従来の改良型タンパク質に比べた場合には向上している、という特長を有する新規タンパク質を提供することが出来る。
【００１５】
その結果、該タンパク質を含む本発明の捕捉剤を充填したタンパク質分離精製用クロマトグラフィー用カラムにおいては、捕捉した抗体を弱酸性領域において、変性のない状態でより容易に溶出することが可能となる。
【００１６】
更に、従来の改良型タンパク質を利用した場合には実質的に精製することが困難であった、特定の免疫グロブリンG、例えば、ラットIgG及びヒトIgGのFab断片でも、本発明のタンパク質は中性域での抗体結合活性が従来の改良型タンパク質に比べた場合には向上しているために、該タンパク質を含む本発明の捕捉剤にそれら免疫グロブリンGを十分に吸着させることが出来るので、その結果、該捕捉剤を用いることによって、それら免疫グロブリンGを精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】部位特異的変異導入PCR反応とテンプレートプラスミド切断反応の模式図である。
【図２】改良型プロテインＧ（PG19）のSPR測定結果である。
【図３】本発明の変異体（E37D/H38N）のSPR測定結果である。
【図４】本発明の変異体（H43V）のSPR測定結果である。
【図５】本発明の変異体（H33Q）のSPR測定結果である。
【図６】本発明の変異体の各抗体種への結合力変化率を示す。多角形の頂点は各抗体種を示し、抗体種軸上の中心からの距離は改良型プロテインＧ(PG19)の各抗体種に対するＳＰＲ結合レスポンスを１とした時の変異体の結合変化率を示す。
【図７】本発明の組換えPG固定化カラムによるpH勾配アフィニティクロマトグラフィーの結果を示す。
【図８】本発明の組換えPG固定化カラムを用いてラット血清からの抗体精製の結果を示す。
【図９】本発明の組換えPG固定化カラムを用いてラット血清からの抗体精製の結果を示す。
【図１０】本発明の組換えPG固定化カラムを用いてヒトIgGのFab断片の精製の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
連鎖球菌由来のタンパク質であるプロテインGは、抗体の一種である免疫グロブリンGのFc領域に対する特異的結合活性を有することが知られており（参照文献１）、この抗体結合性を利用した抗体の精製や除去、および抗体を利用した診断、治療、検査等に有用なタンパク質である。プロテインGは、複数のドメインからなるマルチドメイン型膜タンパク質で、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性（以下、「抗体結合活性」と呼ぶ）を示すのは、このうちの一部の細胞膜外ドメインである（参照文献２）。たとえば、G148株由来のプロテインGの場合、抗体結合活性を示すのは、B1、B2、B3の３つのドメインである（文献によってC1、C2、C3ドメインとも表記される）。また、GX7805株のプロテインGでは３つの抗体結合ドメインが、GX7809のプロテインGでは２つの抗体結合ドメインが存在する。これらは、いずれも60アミノ酸弱の小型タンパク質で、そのアミノ酸配列の間には高い同一性が見られる。また、プロテインＧを切断して各々のドメイン単独を単離しても、抗体結合活性は保たれることが知られている（参照文献３）。
【００１９】
本発明は、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していないタンパク質に係るものである。
【００２０】
ここで、免疫グロブリンGの例としては、ヒト及びヒト以外の動物、特に、ラット、マウス、ハムスター、ヤギ及びウサギ等の哺乳類の各種抗体、並びに、ヒトIgGのFab断片等の各抗体の各種断片を含む。Fc部分またはFab部分を有するものであれば、その構造又は構成要素に特に制限はなく、当業者に公知の任意の様々な型の抗体分子及びそれらのフラグメント分子を包合する。即ち、通常の（完全な）IgG型抗体分子に加えて、例えば、一本鎖抗体(scFv)、一本鎖抗体の二量体、二重特異性抗体、ダイアボディ型二重特異性抗体、及び多量体化低分子抗体、並びに、Fabフラグメント、F(ab’)2及びFab’等の各種の抗体フラグメントを挙げることが出来る。
【００２１】
又、「結合活性は低下していない」とは、例えば、本明細書の実施例に記載されているカラムクロマトグラフィによる免疫グロブリンGの精製において、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質を補足剤として使用した場合と比べて、本発明のタンパク質を補足剤として使用した場合に、IgG溶出画分に含まれるIgG量が実質的に低下していないことによって示される。
【００２２】
野生型プロテインG・Bドメインの例としては、ストレプトコッカス属連鎖球菌のプロテインGのB1、B2、又はB3のいずれかを挙げることができる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、野生型プロテインG・B１ドメインの変異体であって野生型のプロテインG・B1ドメインから成るタンパク質に比べて、免疫グロブリンGのFab領域との結合性及び／または同Fc領域との結合性の弱酸性域における結合性が低下している従来の改良型タンパク質のアミノ酸配列における一個又は数個のアミノ酸を更に変異することによって得られる変異体を含むものが好ましい。このような、弱酸性域における結合性が低下している従来の改良型タンパク質の例として、特許文献８に記載されている野生型プロテインG・B1ドメインの改良型タンパク質（配列番号１３〜２０に記載のアミノ酸配列）を挙げることができる。尚、これらのアミノ酸配列を本願明細書の配列表において、配列番号１７〜２４として示す。
【００２４】
本明細書の実施例２における結合親和性の測定評価の結果（図６）に示されるように、変異によって得られる変異体を含むタンパク質は、特定の免疫グロブリンGに対する中性域での抗体結合活性が該改良型タンパク質に比べた場合に数倍〜数百倍向上していることを特徴とする。
【００２５】
このような変異の対象となるアミノ酸に特に限定はないが、例えば、以下の代表例に示されるように、ヒスチジン及びグルタミン酸等を挙げることができる。改良型タンパク質のアミノ酸配列における変異の好適例として、例えば、野生型プロテインG・B１ドメインの変異体のアミノ酸配列において、32位ヒスチジンからグルタミンへの変異、36位グルタミン酸からアスパラギン酸への変異、37位ヒスチジンからアスパラギンへの変異、及び／又は42位ヒスチジンからバリンへの変異等を例示することができる。
【００２６】
このような改良型タンパク質のアミノ酸配列における変異は、例えば、本明細書の実施例に記載されているような、当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。
【００２７】
このような改良型タンパク質のアミノ酸配列を更に変異した結果得られる変異体のアミノ酸配列の具体例として、配列番号１４〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において、変異が行われたアミノ酸以外の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異体であって、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していない、即ち、特定の免疫グロブリンGに対する中性域での抗体結合活性が該改良型タンパク質に比べた場合に向上しているタンパク質を挙げることができる。
【００２８】
本発明のタンパク質は、これらタンパク質のタンデム型多量体とすることが出来る。多量体は上記野生型に準じて、適宜、例えば、二量体、三量体、四量体、又は五量体とすることが出来る。更に、本発明のタンパク質に含まれる多量体を構成する夫々の細胞膜外ドメイン変異体は互いに異なるか、又は、互いに同一である。
【００２９】
更に、各ドメイン変異体がリンカー配列によって連結されていても良い。このようなリンカー配列は、各変異体のアミノ酸配列等を考慮して、当業者が適宜設計し調整することが出来る。
【００３０】
又、本発明のタンパク質は、任意の他タンパク質のアミノ酸配列をN末端側もしくはＣ末端側に連結した融合型アミノ酸配列からなる融合タンパク質としても良い。このような融合タンパク質に使用する他のアミノ酸配列としては、例えば、oxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain(OXADac)のアミノ酸配列が挙げられる。この場合のOXADac−プロテインG変異体融合タンパク質は、OXADac領域に由来するアビジン結合活性とプロテインG変異体領域に由来する抗体結合活性の複数の機能を単一分子で担うことが可能である。
【００３１】
例えば、本発明のタンパク質をHisタグ付きあるいは他のタンパク質との融合タンパク質の形態で合成する場合、合成した後にタグと変異体タンパク質の間を、あるいは他のタンパク質と本発明のタンパク質の間を配列特異的タンパク分解酵素で分解しても、本発明のタンパク質のN末端側もしくはＣ末端側に１乃至数個のアミノ酸残基が残る場合もあり、また、大腸菌等を用いて本発明のタンパク質を生産する際には、N末端側に開始コドン由来のメチオニン等が付加されることがあるが、これらのアミノ酸残基の付加により、以下に示すような本発明のタンパク質の活性は変わらない。また、これらのアミノ酸残基の付加により、設計された変異が及ぼす効果を失うこともない。したがって、本発明のタンパク質は当然これらの変異も含む。なお、このようなアミノ酸残基の付加のない本発明のタンパク質を作製するためには、たとえば、大腸菌等を用いて生産したタンパク質を、さらにメチオニルアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて、N末のアミノ酸残基を選択的に切断し（参照文献７）、反応混合物よりクロマトグラフィー等で分離精製することで、得ることができる。
【００３２】
本明細書において、以上のタンパク質、タンデム型多量体及びの融合タンパク質を含めて、単に、「タンパク質」ともいう。本発明は更に、係るタンパク質をコードする核酸、該核酸を含有する組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体に係る。
【００３３】
又、上記のタンパク質が水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、免疫グロブリンG又は免疫グロブリンGのFc領域あるいはFab領域を有するタンパク質（「免疫グロブリンG等」ともいう）の捕捉剤、該捕捉剤を含む抗体、免疫グロブリンG等の精製用アフィニティクロマトグラフィー、該精製用アフィニティクロマトグラフィーを用いて、免疫グロブリンG等を精製する方法等にも係る。ここで、「アフィニティを有する」、とは例えば、クロマトグラフィにおいて免疫グロブリンG等が吸着できることを指す。以下の実施例に示されるように、本願発明のタンパク質を用いることによって、ある種の免疫グロブリンG、例えば、ヒトIgGのFab断片及びラットIgGを十分に吸着させることが出来るので、上記の捕捉剤は、特に、これらの精製用捕捉剤として非常に有用である。
【００３４】
本発明の精製方法においては、上記のタンパク質を抗体補足剤として利用するために、タンパク質がアガロースビーズに代表させる水不溶性担体（水不溶性の固相支持体）に固定化されて成る充填剤をガラス管等のカラムに充填したアフィニティカラムを使用することが好ましい。
【００３５】
吸着緩衝液としては、ｐＨが中性付近のものを用い、用いる塩種はｐＨが調整可能であれば、いずれでもよいが、代表的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液に塩化ナトリウムなどの電解質を溶解させたものを使用する。吸着緩衝液のｐＨとしては、９．０〜６．５で、好ましくはｐＨ８．０〜７．０のものを用いる。また、溶出緩衝液としては、目的とする免疫グロブリンG等が溶出するｐＨ領域であればよく、ｐＨ６．５〜２．０のものを用いる。溶出緩衝液の種類としては、当業者に公知のいずれのものでもよく、代表例として、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液等を上げることができる。
【００３６】
本発明の精製方法における操作自体は当業者に公知の通常の操作で実施することが可能である。即ち、通常のアフィニティ精製と同様に、まず、吸着緩衝液で安定化したカラムに精製したい免疫グロブリンG等を含むサンプル溶液をインジェクションし、上記充填剤に免疫グロブリンG等を吸着させる。その後、吸着緩衝液でカラム中に残る非吸着成分を洗い流したあと、溶出緩衝液で吸着している免疫グロブリンG等を溶出させ、溶出液中に免疫グロブリンG等を回収する。尚、吸着緩衝液及び溶出緩衝液の流量（流速）及びカラム温度等のその他のアフィニティ精製の条件は当業者が適宜決めることが出来る。
【００３７】
サンプル溶液は血清・腹水培養液など免疫グロブリンG等を含むものであれば、その由来・その他の成分に制限はない。更に、本発明の精製方法においては、精製手段として、ドメイン変異体（人工的に変異させたドメイン）を含むタンパク質と免疫グロブリンG等との間のアフィニティを利用するものであればよく、カラムを使用する方法以外にも、免疫沈降法や磁気ビーズに該タンパク質を固定化したもの等の当業者に公知の任意の手段を用いることが出来る。
【００３８】
本発明における好適なタンパク質を得る際にその基礎として使用する改良型タンパク質に含まれる野生型プロテインG・B１ドメインの変異体の好適例としては、上記の特許文献８に記載の変異体タンパク質を挙げることができる。かかる変異体タンパク質は、特許文献７又は特許文献８に記載の方法に従って、当業者であれば、例えば、以下のような方法で容易に調製することが出来る。
【００３９】
１．タンパク質の製造
（１）遺伝子工学的手法によるタンパク質の製造
ａ．タンパク質（変異体）をコードする遺伝子
本発明においては、上記設計されたタンパク質を製造するため、遺伝子工学的方法を使用することできる。
このような方法に使用する遺伝子は、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・Bドメインから成るタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下しており、一方で、免疫グロブリンGに対する中性領域での結合活性は低下していないタンパク質、例えば、配列番号１４〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において、変異が行われたアミノ酸以外の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異体であって、上記のような本発明の特性を有するタンパク質をコードする核酸からなる。
【００４０】
また、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ対応する各野生型プロテインG・細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質するタンパク質をコードする核酸もあげられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。たとえば、例えば、高い同一性（同一性が60％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは90％以上）を有する核酸がハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1％SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００４１】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、本発明のタンパク質の所望の構造に応じて、以上の核酸と上記任意のリンカー配列をコードする核酸を含む。タンデム型多量体を構成する各変異体タンパク質をコードする核酸とリンカー配列をコードする核酸がそれぞれ交互に複数連結したものでもよく、または該核酸と任意のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸とを連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。
【００４２】
ｂ．遺伝子、組み替えベクターおよび形質転換体
前記した本発明の遺伝子は、化学合成、ＰＣＲ、カセット変異法、部位特異的変異導入法などにより合成することができる。たとえば、末端に20塩基対程度の相補領域を有する100塩基程度までのオリゴヌクレオチドを複数化学合成し、これらを組み合わせてオーバーラップ伸長法（参照文献８）を行うことにより目的の遺伝子を全合成することができる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記の塩基配列を含む遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の遺伝子を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００４３】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばpK4，pRK401，pRF31等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110，pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13，YEp24，YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、本発明の変異体タンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子の塩基配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。 また、製造するタンパク質の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグ配列としては、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、BioEaseタグなどの公知のタグをコードする塩基配列を利用することができる。
【００４４】
遺伝子がベクターに挿入されたか否かの確認は、公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができる。たとえば、プラスミドベクターなどの場合、コンピテントセルを用いてベクターをサブクローニングし、ＤＮＡを抽出後、ＤＮＡシーケンサーを用いてその塩基配列を特定することで確認できる。他のベクターについても細菌あるいは他の宿主を用いてサブクローニング可能なものは、同様の手法が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを利用したベクター選別も有効である。
形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の変異体タンパク質が発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００４５】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、開始コドン、本発明の変異体タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００４６】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４７】
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ついで、ＰＣＲの増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SyberGreen液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００４８】
ｃ．形質転換体培養によるタンパク質の取得
組替えタンパク質として製造する場合、本発明のタンパク質は、上述の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。培養物とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜３７℃で１２時間〜３日間行う。
【００５０】
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を採取する。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００５１】
また、タンパク質の生合成反応にかかわる因子（酵素、核酸、ＡＴＰ、アミノ酸など）のみを混合させた、いわゆる無細胞合成系を利用すると、生細胞を用いることなく、ベクターから本発明の変異体タンパク質を試験管内で合成することができる（参照文献９）。その後、前記と同様の精製法を用いて、反応後の混合溶液から本発明の変異体タンパク質を単離精製することができる。
単離精製した本発明のタンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するため、該タンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる（参照文献１０）。
【００５２】
（２）他の手法によるタンパク質の製造
本発明のタンパク質は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによっても製造することができる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている（参照文献１１）。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的のタンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィーなどを利用することができる（参照文献１１）。
【００５３】
２．タンパク質の固定化
本発明のタンパク質は、その抗体結合性を利用して、抗体等の捕捉剤として利用することができる。該抗体捕捉剤は、抗体の精製や除去、抗体を利用した診断、治療、検査等に用いることができる。
本発明の抗体捕捉剤は、本発明のタンパク質を含む限りにおいて、どのような形態であってもよいが、好ましくは、本発明の変異体タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化した形態が適切である。用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機-有機、有機-無機などの複合担体などが挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、抗体あるいは免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質の選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例として挙げられる。
【００５４】
市販品としては多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L等を例示することができる。ただし、本発明においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。又、本発明に用いる水不溶性担体としては、本抗体捕捉剤の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。
【００５５】
担体の形態としては、ビーズ状、線維状、膜状(中空糸も含む)など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10〜2500μmのものが使いやすく、とりわけ、リガンド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。
さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基、ヨードアセチル基などが挙げられる。
上記担体への変異体タンパク質の固定化においては、変異体タンパク質の立体障害を小さくすることにより捕捉効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
【００５６】
上記の担体へ導入される変異体タンパク質およびスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法及び条件は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化し（担体が元々持っている官能基よりリガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変え）、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、捕捉剤の滅菌時または利用時に蛋白類が担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。
【００５７】
３．タンパク質および抗体捕捉剤の性能確認試験
上記のようにして製造されたタンパク質（以下、単に「タンパク質」ともいう）、及び抗体捕捉剤は、以下の性能確認試験を行い良好なものを選択することができるが、本発明のタンパク質および抗体捕捉材はいずれも良好な性能を有していた。
【００５８】
（１）抗体結合性試験
本発明のタンパク質の抗体結合性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、表面プラズモン共鳴（SPR）法などを利用して確認・評価することができる。中でもSPR法は、生体間の相互作用をラベルなしでリアルタイムに経時的に観察することが可能であることから、変異体タンパク質の結合反応を速度論的観点から定量的に評価することができる。
また、水不溶性の固相支持体に固定化した変異体タンパク質の抗体結合性は、上記のSPR法や液体クロマトグラフィー法で確認・評価することができる。中でも液体クロマトグラフィー法は、抗体結合性に及ぼすｐＨ依存性を的確に評価することができる。
（２）タンパク質の熱安定性試験
本発明の変異体タンパク質の熱安定性は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法、加熱後の残留活性などを利用して評価することができる。中でもＣＤスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、変異体タンパク質の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。
【００５９】
〔参照文献〕
参照文献１；Bjorck L, Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 69-74.
参照文献２；Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press, Inc., San Diego,  CA.
参照文献３；Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL. (1994) Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry 19, 4721-4729.
参照文献４；Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. (1995) Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. Structure 3, 265-278.
参照文献５；Derrick JP, Wigley DB. (1994) The third IgG-binding domain from streptococcal protein G. An analysis by X-ray crystallography of the structure alone and in a complex with Fab. J Mol Biol. 243, 906-918.
参照文献６；Alexander P, Fahnestock S, Lee T, Orban J, Bryan P. (1992) Thermodynamic analysis of the folding of the streptococcal protein G IgG-binding domains B1 and B2: why small proteins tend to have high denaturation temperatures. Biochemistry 14, 3597-3603.
参照文献７；D'souza VM, Holz RC. (1999) The methionyl aminopeptidase from Escherichia coli can function as an iron(II) enzyme. Biochemistry 38, 11079-11085.
参照文献８；Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pullen J. M. and Pease L. R. (1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.
参照文献９；岡田雅人、宮崎香(2004)タンパク質実験ノート(上)、羊土社
参照文献１０；大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール１−機能解析編、秀潤社
参照文献１１；大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール２−構造解析編、秀潤社
【００６０】
尚、特許文献８には以下の内容が具体的に開示されている。
【００６１】
実施例１においては、[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列、[配列番号2]で示されるプロテインG・B2ドメインの野生型アミノ酸配列及び[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列に基づき、プロテインGのB1、B2、あるいはB3ドメインに変異を導入した本発明に用いるタンパク質に含まれる変異体タンパク質（以降、「改良型プロテインG」と呼ぶ）のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位を選定し、置換するアミノ酸残基を特定することが記載されている。
【００６２】
実施例２では、選定した変異対象部位と上記特定した置換するアミノ酸残基の情報を利用して、[配列番号4] 〜[配列番号19]で示される複数の改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計し、更に、具体的アミノ酸配列として[配列番号13]〜[配列番号20]を最終的に選別し、この配列を示す改良型プロテインGを実際に合成し、その分子特性を評価したことが記載されている。
【００６３】
実施例３では、改良型プロテインGのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列（[配列番号13]〜[配列番号20]）及びOxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain (OXADac)の塩基配列[配列番号31] を用いた、変異体タンパク質の塩基配列について記載されている。
【００６４】
実施例４では、[配列番号21]〜[配列番号29]の塩基配列からなるPG遺伝子を用いて、改良型プロテインGをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いたOxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain (OXADac) [配列番号31]と変異体タンパク質の融合タンパク質の製造について記載されている。
【００６５】
実施例５では、各種プライマー（[配列番号32]〜[配列番号35]）を用いて、改良型プロテインGをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いたMet付加改良型プロテインGの製造について記載されている。
【００６６】
実施例６では、改良型プロテインGの純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で確認したこと、実施例７では、改良型プロテインGの分子量をMALDI-TOF型質量分析計で計測することで、製造したタンパク質を同定したこと、実施例８では、OXADac-PG融合タンパク質を固定化したカラムを用いてpH勾配アフィニティクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出するpHを調べることで、改良型プロテインGの弱酸性域での抗体解離性を評価したこと、実施例９では、OXADac-PG融合タンパク質を固定化したカラムを用いてステップワイズpHアフィニティクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出を、いくつかのpHで調べることで、改良型プロテインGの弱酸性域での抗体解離性を評価したこと、実施例１０では、変異体タンパク質（プロテインG変異体）の結合解離性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価したこと、実施例１１では、中性領域、およびヒスチジン残基の95%以上がプロトン化する弱酸性領域において、変異体タンパク質の抗体結合性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価したこと、実施例１２では、変異体タンパク質の熱安定性を評価したこと、実施例１３では、変異体タンパク質の単結晶を作製し、立体構造をＸ線回折解析により決定したことが記載されている。
【００６７】
更に、実施例１４では、カルボキシル末端側にシステイン残基、Hisタグを付加した三量体野生型PG(CGB01H-3D,配列番号３６) または本発明のタンパク質である変異型PGのタンデム型三量体(CGB19H-3D,配列番号３７)をコードする 遺伝子を組み込んだ2種の人工合成プラスミドを用いた、プロテインGの細胞膜外ドメイン変異体のタンデム型多量体の製造及び該タンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーカラムの作製及び当該カラムによるヒトIgG1抗体、IgG3抗体の精製等に関して記載されている。
【００６８】
実施例１５では、IgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体との抗体結合解離性に関してプロテインGの細胞膜外ドメイン変異体のタンデム型多量体と同単量体との比較が記載されている。
【００６９】
実施例１６では、カルボキシル末端にシステイン残基、Hisタグを付加した変異型PGの単量体変異型PG（CGB19H-1D、図４、配列番号３８）、変異型PGのタンデム型四量体PG（CGB19H-4D、図４、配列番号３９）、および変異型PGのタンデム型五量体PG（CGB19H-5D、図４、配列番号４０）をコードする遺伝子を組み込んだ３種の人工合成発現用プラスミドを用いた、プロテインGの細胞膜外ドメイン変異体の単量体及びタンデム型四量体、五量体の製造に関して記載されている。
【００７０】
実施例１７では、プロテインGの細胞膜外ドメイン変異体の単量体およびタンデム型多量体をカルボキシル末端のシステイン残基を介して固相に固定化して、IgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体に対する各変異タンパク質の抗体結合性をSPR法により比較評価したことが記載されている。
【００７１】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。Ala;L-アラニン残基、Arg;L-アルギニン残基、Asp;L-アスパラギン酸残基、Asn;L-アスパラギン残基、Cys;L-システイン残基、Gln;L-グルタミン残基、Glu;L-グルタミン酸残基、Gly;L-グリシン残基、His;L-ヒスチジン残基、Ile;L-イソロイシン残基、Leu;L-ロイシン残基、Lys;L-リジン残基、Met;L-メチオニン残基、Phe;L-フェニルアラニン残基、Pro;L-プロリン残基、Ser;L-セリン残基、Thr;L-スレオニン残基、Trp;L-トリプトファン残基、Tyr;L-チロシン残基、Val;L-バリン残基。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端(以下N末端という)が左側に位置し、カルボキシル末端(以下C末端という)が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【実施例１】
【００７２】
本実施例では、本発明のタンパク質（変異体）を製造した。これらは、Watanabeらが報告した（非特許文献５）、プロテインGの細胞膜外ドメイン変異体（以下、「改良型プロテインG」と呼ぶ）を含む融合タンパク質（配列番号１）のヒスチジン残基等の一部を野生型のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなる。
【００７３】
即ち、Watanabeら（非特許文献５）の方法により作製した改良型プロテインG（PG19）を含む融合タンパク質の遺伝子（配列番号２）を含む発現プラスミドに対し、野生型残基のコドンを含んだセンスおよびアンチセンスオリゴDNAプライマー（配列番号３〜８）を用いて、部位特異的変異導入PCR反応とテンプレートプラスミド切断反応（図１）によって、改良型プロテインGのアミノ酸配列の一部を野生型アミノ酸残基に戻した３種の変異体をコードする変異体遺伝子をそれぞれ作製した。これら３種の変異体のアミノ酸配列は、それぞれ、改良型プロテインGのアミノ酸配列（表１中の（PG19））において、32位のヒスチジンが野生型のプロテインG・B1ドメインにおけるグルタミンであること（配列番号１４）、改良型プロテインGの36位のグルタミン酸と37位のヒスチジンが野生型のプロテインG・B1ドメインにおけるアスパラギン酸とアスパラギンであること（配列番号１５）、及び改良型プロテインGの42位のヒスチジンが野生型のプロテインG・B3ドメインにおけるバリンであること（配列番号１６）を特徴とする。尚、これらの各変異体を含む本発明のタンパク質は、以降、本明細書及び図面中では、変異体のN末端に付加されたメチオニンを１番目のアミノ酸として数え、夫々、「PG19 H33Q」（配列番号９）、「PG19 E37D/H38N」（配列番号１０）及び「PG19 H43V」（配列番号１１）と称す。
【００７４】
次に、これらの各変異体の遺伝子を含む発現プラスミドを単離精製した後、これによって発現用大腸菌BL21(DE3)株（Novagen）を形質転換した。前培養した形質転換体を、2ml / 200mlで2YT培地に継代し、O.D.600 = 0.8~1.0になるまで振とう培養した。目的タンパク質を発現させるため0.5mM IPTGを加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mLのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った後濾過滅菌し、これを全タンパク質溶液とした。Ni Sepharose（GE ealthcare） 2mlカラムに変異体を吸着させ、20mMイミダゾールにて洗浄後、500mMイミダゾールにて溶出し、精製タンパク質とした。改良型プロテインG（PG19）に関しても、対応する発現プラスミドを用いて同様の方法で作製した。
【実施例２】
【００７５】
本実施例では、実施例１で得られた変異体を、カルボキシル末端にあるシステイン残基を介して固相に固定化して、各変異体の抗体結合性をSPR法により評価した。また、比較のため改良型プロテインGも同様の方法で評価した。
【００７６】
まず、センサーチップCM-5（GE Healthcare）の測定セルに、改良型プロテインG（PG19）と変異体（PG19 H33Q, PG19 E37D/H38N, PG19 H43V）をEMCH (N-[ε-Maleimidocaproic acid] hydrazide, trifluoroacetic acid)（Thermo scientific）を用いたマレイミドカップリング法により固定化した。次いで、ラットおよびマウス血清由来IgG、ラットIgG1，IgG2a，IgG2bおよびマウスIgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3を、ランニング緩衝液（10 mM HEPES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.005% v/vTween20）に溶解し、1 μMおよび100 nMの試料抗体溶液を調整した。SPR測定はBiacore T100（GE Healthcare）を用い、反応温度25℃で行った（図２〜５）。
【００７７】
本発明の変異体および改良型プロテインＧを固定化したチップに試料抗体を流し結合親和性を測定した結果、本発明の変異体（PG19 E37D/H38N）は改良型プロテインG（PG19）と比較してラット抗体への結合親和性が１００倍以上向上していることが分かった（図６）。以上により、本発明の改良型プロテインG変異体の各抗体に対する結合親和性の測定評価をすることができた。
【００７８】
【表１】
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【実施例３】
【００７９】
本実施例では、プロテインGの細胞膜外ドメイン変異体の製造及び該タンパク質を用いるカラムを作製した。
（１）組換えPG発現プラスミドの作製
特許文献８（WO2013/018880）の実施例６に記載された、カルボキシル末端にシステイン残基、Hisタグを付加したタンデム型四量体PGであるrPG-A4（CGB19H-4D、配列番号３９）をコードする遺伝子を組み込んだ人工合成発現用プラスミドを鋳型として、合計８ヶ所の塩基置換を導入し、ヒスチジン残基を野生型残基に戻した変異体を含むタンデム型四量体から成るタンパク質であるrPG-A12（PG19 E37D/H38N-4D：配列番号１３）をコードする変異体遺伝子（配列番号１２）を作製した(タカラバイオ)。
【００８０】
（２）組換えPGの発現と精製
組換えPG発現プラスミドによって発現用大腸菌BL21(DE3)株 (Novagen) を形質転換した。前培養した形質転換体をLB培地に継代し、O.D.600 = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。目的タンパク質を発現させるため0.5mM IPTGを加え、さらに37℃で3時間振とう培養した。回収した菌体をPBSに懸濁し、超音波破砕を行った後遠心分離し、得られた上清を全タンパク質溶液とした。HisTrap FF (GE Healthcare Bioscience) 1mlカラムに組換えPGを吸着させ、20mMイミダゾールにて洗浄後、500mMイミダゾールにて溶出し、精製タンパク質とした。
【００８１】
（３）組換えPGの固定化とカラム作製
Sepharose4FastFlow(GE Healthcare)をガラスフィルターでろ別し、超純水で洗浄して担体10mlを得た。フラスコに担体を移液し、2M水酸化ナトリウム水溶液3mlとブタンジオールジグリシジルエーテル  4gを加え25℃で4時間振とうして反応させた。ガラスフィルターでろ別し、超純水で洗浄して活性化担体を得た。活性化担体1mLをガラスフィルターに採取してカップリング緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム、1.0M硫酸ナトリウム、1mM EDTA、pH 8.0）で洗浄した。活性化担体をフラスコに移し、組換えPGが6mg/mlの組換えPG含有溶液を1.3ml、カップリング緩衝液2mLを加え、37℃、150rpmで16時間振とうして固定化した。ガラスフィルターでろ別し、カップリング緩衝液で洗浄した。次いでフラスコに担体を移し、1Mチオグリセロール、0.1Mリン酸ナトリウム、1mM  EDTA、pH8.0の溶液3mlを加え37℃,150rpmで4時間振とうして未反応活性基をマスクした。ガラスフィルターでろ別し、洗浄液1(0.1Mトリス塩酸、0.5M塩化ナトリウム、pH8.0) 、洗浄液2(0.1M酢酸、0.5M塩化ナトリウム、pH4.0)を15mlで交互に3サイクル洗浄した。固定化担体1mlを超純水で洗浄し、Tricon 5/50 Columnにパッキングした。
【実施例４】
【００８２】
本実施例では、実施例３で作製した組換えPG固定化カラムの抗体吸着容量を測定した。
組換えPG固定化カラム、もしくはProtein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) を液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore (GE Healthcare Bioscience) にセットし、吸着緩衝液（20mM りん酸緩衝液、150mM 塩化ナトリウム、pH7.2）を1 ml/min の条件で流し平衡化させた後、1mg/mLに調製したヒトIgG (オリエンタル酵母)を注入した。溶出液の280nmにおける吸光度が注入サンプルの吸光度の15%に到達するまで注入を続けた後、吸着緩衝液で洗浄後、吸着緩衝液を20 mM くえん酸(pH2.4) へ置換した。
【００８３】
動的結合容量(DBC)は、溶出液の280 nmにおける非吸着成分を除いた吸光度が注入サンプルの吸光度の10 %に到達するまでに注入されたサンプル量から計算された。各固定化カラムのDBCを表２に示した。各組換えPG固定化カラムは市販カラムと比較して同等の動的結合容量を有していた。
【００８４】
【表２】
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【実施例５】
【００８５】
実施例３で作製した組換えPG固定化カラムによるpH勾配アフィニティクロマトグラフィーを実施した。
組換えPG固定化カラム、もしくはProtein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) を液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore (GE Healthcare Bioscience) にセットし、吸着緩衝液（20mM りん酸緩衝液、150mM 塩化ナトリウム、pH7.2）を1 ml/min の条件で流し平衡化させた後、1mg/mLに調製したヒトIgG(オリエンタル酵母)を注入した。吸着緩衝液で洗浄後、20 mM くえん酸緩衝液(pH5.0)に置換し、1.0mL/minの流速で60minかけて連続的に20mM くえん酸 (pH2.4)へ置換した。
【００８６】
ヒトIgG溶出ピークは、rPG-A4固定化カラムにおいてpH4.1付近、rPG-A12固定化カラムにおいてpH4.0付近、Protein G Sepharose 4 Fast FlowにおいてpH3.8付近であった(図７)。このことから、rPG-A12固定化カラムはProtein G Sepharose 4 Fast Flowカラムに比べてマイルドな酸性条件で溶出可能なことが明らかになった。
【実施例６】
【００８７】
実施例３で作製した組換えPG固定化カラムを用いてラット血清からの抗体精製を実施した。
組換えPG固定化カラム、もしくはProtein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) を液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore (GE Healthcare Bioscience) にセットし、吸着緩衝液（20mM りん酸緩衝液、150mM 塩化ナトリウム、pH7.2）を1 ml/min の条件で流し平衡化させた後、50倍希釈したラット血清(シグマアルドリッチ)を注入した。吸着緩衝液で洗浄後、20 mM くえん酸緩衝液(pH5.0)に置換し、さらに20mM くえん酸 (pH2.4)へ置換した。rPG-A12固定化カラム、Protein G Sepharose 4 Fast FlowカラムにおいてはラットIgGの溶出ピークが見られたが、rPG-A4固定化カラムにおいてはラット血清注入時のフロースルー液の280nmにおける吸光度がrPG-A12固定化カラム、Protein G Sepharose 4 Fast Flowカラムより高く、ラットIgG溶出ピークはほとんど見られなかった(図８)。
【００８８】
さらに、吸着緩衝液で洗浄後、20 mM くえん酸緩衝液(pH5.0)に置換せず、20mM くえん酸 (pH2.4)へ置換した以外は同様にして、ラット血清よりラット抗体を精製した(図９)。
rPG-A12固定化カラム、Protein G Sepharose 4 Fast FlowカラムそれぞれのラットIgG溶出画分を分取し、タンパク質量をBCA法 (Pierce) で測定したところ、rPG-A12固定化カラムでは937μg、Protein G Sepharose 4 Fast Flowカラムでは923μgであった。
以上のことから、rPG-A4固定化カラムでは精製不可能であったラットIgGを、rPG-A12固定化カラムでは精製可能なことが明らかになった。また、rPG-A12固定化カラムではラットIgG溶出ピークがシャープであることから、抗体精製においてプロセス効率を向上させるために有利であることが確認された。
【実施例７】
【００８９】
実施例３で作製した組換えPG固定化カラムを用いてヒトIgGのFab断片を精製した。
組換えPG固定化カラム、もしくはProtein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) を液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore (GE Healthcare Bioscience) にセットし、吸着緩衝液（20mM りん酸緩衝液、150mM 塩化ナトリウム、pH7.2）を1 ml/min の条件で流し平衡化させた後、ヒトγグロブリン (和光純薬) をパパイン消化後にHiTrap Q (GE Healthcare Bioscience)およびMabSelect Xtra (GE Healthcare Bioscience)にて精製したFab断片を注入した。吸着緩衝液で洗浄後、20 mM くえん酸緩衝液(pH5.0)に置換し、さらに20mM くえん酸 (pH2.4)へ置換した。rPG-A12固定化カラム、Protein G Sepharose 4 Fast FlowカラムにおいてはFab断片の溶出ピークが見られたが、rPG-A4固定化カラムにおいてはFab断片注入時のフロースルー液の280nmにおける吸光度がrPG-A12固定化カラム、Protein G Sepharose 4 Fast Flowカラムより高く、Fab断片溶出ピークはほとんど見られなかった(図１０)。以上のことから、rPG-A4固定化カラムでは精製不可能であったFab断片を、rPG-A12固定化カラムでは精製可能なことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
現在、野生型のプロテインG細胞膜外ドメインは、抗体の精製用のアフィニティクロマトグラフィー担体や抗体検出のための検査試薬として市販され、ライフサイエンスの各分野で広範に利用されている。また、近年の抗体医薬をはじめとする抗体関連産業の発展をうけて、これらの製品の需要が飛躍的に拡大している。したがって、多くのプロテインG細胞膜外ドメイン含有製品において、本発明のタンパク質を野生型と代替することにより、酸溶出に伴う抗体の劣化を低減することを可能にし、且つ、中性領域での結合活性が野生型のプロテインGの細胞膜外ドメインを含むタンパク質に比べた場合には低下していない、即ち、従来の改良型タンパク質に比べた場合には向上している、という特長を利用することによって、様々な動物種由来の抗体を扱う広範な技術分野において、その技術発展に大いに資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015019615.tif 000012
【図９】
2015019615.tif 000013
【図１０】
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【配列表】
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