(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテアーゼを阻害し、ディスペプシア、胃炎、胃潰瘍、胃食道逆流症、咽喉頭酸逆流症、過敏性大腸症候群、直腸関連炎症疾患、炎症性腸疾患等、胃腸菅内の有害なプロテアーゼ活性と関連する疾患に対して有用な物質、及び該物質を含有する医薬組成物の提供。【解決手段】プロテアーゼを阻害するシリカ、及び該シリカを含有する医薬組成物。該シリカとしては、ヒュームドシリカ、沈降シリカ、非晶質シリカ、コアセルベートシリカ、非晶質シリカゲル、シリカゾル、ヒドロゲルシリカ、およびキセロゲルシリカからなる群より選択されることが好ましい。該シリカは、特に、１０〜８０ｎｍまでの平均粒径（ｄ５０）及び５〜３５０ｍ２／ｇまでの表面積を有するものであることが好ましい。該シリカは、懸濁剤の状態であることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼを阻害するために使用するシリカ。
【請求項２】
胃腸菅内の有害なプロテアーゼ活性と関連する疾患または症状の、治療または予防のためのシリカ。
【請求項３】
胃腸菅内の有害なタンパク質分解と関連する疾患または症状の、治療または予防のためのシリカ。
【請求項４】
ディスペプシア、胃炎、胃潰瘍、胃食道逆流症、咽喉頭酸逆流症（extra-oesophageal reflux disease）、過敏性大腸症候群、直腸関連炎症疾患、および炎症性腸疾患からなる群より選択される疾患または症状の、治療または予防のためのシリカ。
【請求項５】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一つのシリカ。
【請求項６】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼおよびアスパラギン酸プロテアーゼからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一つのシリカ。
【請求項７】
プロテアーゼが、アスパラギン酸プロテアーゼである、請求項５のシリカ。
【請求項８】
アスパラギン酸プロテアーゼが、ペプシンである、請求項７のシリカ。
【請求項９】
ペプシンが、ヒトペプシン、ブタペプシン、ウマペプシン、マウスペプシン、ヒツジペプシン、およびウシペプシンからなる群より選択される、請求項８のシリカ。
【請求項１０】
ペプシンが、ヒトペプシンである、請求項９のシリカ。
【請求項１１】
ペプシンが、ヒト胃ペプシンである、請求項１０のシリカ。
【請求項１２】
ヒト胃ペプシンが、ペプシン１、ペプシン３ａ、ペプシン３ｂ、ペプシン３ｃ、およびガストリクシン（gastricsin）のいずれかから選択される、請求項１１のシリカ。
【請求項１３】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、請求項５のシリカ。
【請求項１４】
セリンプロテアーゼが、トリプシンである、請求項１３のシリカ。
【請求項１５】
シリカが、ヒュームドシリカ、沈降シリカ、非晶質シリカ、コアセルベートシリカ（coacervated silica）、非晶質シリカゲル、（アクア）シリカゾル、ヒドロゲルシリカ、およびキセロゲルシリカ（xerogel silica）からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一つのシリカ。
【請求項１６】
シリカが、非晶質シリカである、請求項１５のシリカ。
【請求項１７】
シリカが、ナノ粒子として存在する、請求項１〜１６のいずれか一つのシリカ。
【請求項１８】
シリカが、２０，０００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する、請求項１７のシリカ。
【請求項１９】
シリカが、１０，０００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する、請求項１８のシリカ。
【請求項２０】
シリカが、１ｎｍおよび５，０００ｎｍの間の平均粒径（ｄ５０）を有する、請求項１９のシリカ。
【請求項２１】
シリカが、５ｎｍおよび１００ｎｍの間の平均粒径（ｄ５０）を有する、請求項２０のシリカ。
【請求項２２】
シリカが、５ｎｍおよび５０ｎｍの間の平均粒径（ｄ５０）を有する、請求項２１のシリカ。
【請求項２３】
シリカが、１０から８０ｎｍまでの平均粒径（ｄ５０）および５０から３５０ｍ２／ｇまでの表面積を有する、請求項１〜２２のいずれか一つのシリカ。
【請求項２４】
プロテアーゼが、胃腸菅にある構成タンパク質、胃腸菅にある糖タンパク質、胃腸菅にある機能タンパク質、およびそれらの組み合わせから選択される基質に対する活性について阻害される、請求項１〜２３のいずれか一つのシリカ。
【請求項２５】
基質が、胃腸菅にある糖タンパク質または胃腸菅にある構成タンパク質である、請求項２４のシリカ。
【請求項２６】
基質が、胃腸菅にある構成タンパク質である、請求項２４のシリカ。
【請求項２７】
基質が、コラーゲンおよびムチンから選択される、請求項２６のシリカ。
【請求項２８】
基質が、胃腸菅にある機能タンパク質である、請求項２４のシリカ。
【請求項２９】
機能タンパク質が、アルブミンである、請求項２８のシリカ。
【請求項３０】
シリカが、シリカ懸濁剤の形態である、請求項１〜２９のいずれか一つのシリカ。
【請求項３１】
懸濁剤が、アルカリ性懸濁剤である、請求項３０のシリカ。
【請求項３２】
懸濁剤が、水を含み、またアンモニアまたは水酸化ナトリウムから選択されるアルカリ性培地を含む、請求項３１のシリカ。
【請求項３３】
シリカが、懸濁剤の重量に基づいて１０％から５０％の量で懸濁剤中に存在する、請求項３０〜３２のいずれか一つのシリカ懸濁剤。
【請求項３４】
シリカが、懸濁剤の重量に基づいて１５％から４５％の量で懸濁剤中に存在する、請求項３０〜３３のいずれか一つのシリカ懸濁剤。
【請求項３５】
シリカが、懸濁剤の重量に基づいて２５％未満の量で懸濁剤中に存在する、請求項３４のシリカ懸濁剤。
【請求項３６】
保存剤をさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか一つのシリカ懸濁剤。
【請求項３７】
イントラ（intra）ムチン相互作用を増加させるのに使用するための、請求項１〜３６のいずれか一つのシリカ。
【請求項３８】
粘液粘度を増加させるのに使用するための、請求項１〜３７のいずれか一つのシリカ。
【請求項３９】
粘液ゲル特性を改善するのに使用するための、請求項１〜３８のいずれか一つのシリカ。
【請求項４０】
ムチンが結腸ムチンもしくは胃ムチンであるか、または粘液が結腸粘液もしくは胃粘液である、請求項３７、３８、または３９のシリカ。
【請求項４１】
実施例に関して、本明細書中で実質的に定義されるシリカ。
【請求項４２】
実施例に関して、本明細書中で実質的に定義されるシリカ懸濁剤。
【請求項４３】
実施例に関して、本明細書中で実質的に定義される使用。
【請求項４４】
実施例に関して、本明細書中で実質的に定義される医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ阻害剤として使用するためのシリカ、前記シリカを含むシリカ懸濁剤、前記シリカおよびシリカ懸濁剤を含む医薬組成物、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐＨ１.５〜５.５の間で活性なタンパク質分解酵素群である。一般的な酸塩基触媒として機能し、またペプチド結合の切断のために不可欠である酵素活性部位における２つのアスパラギン酸基の存在によって、アスパラギン酸プロテアーゼは特徴付けられる。初期に特定されたアスパラギン酸プロテアーゼの１つはヒト胃ペプシンであり、それには複数のサブタイプ、すなわちペプシン１、３ａ、３ｂ、３ｃ、およびガストリクシン（gastricsin）がある。
【０００３】
ペプシンは不活性前駆体（酵素前駆体と名付けられた）として胃粘膜で合成され、その後、胃主細胞の刺激が、胃液で塩酸により活性化される胃細胞内腔へ放出される。ペプシンの主な役割は、食事性タンパク質およびペプチドを、吸収するのに適したアミノ酸断片に分解することである。各ペプシンサブタイプのタンパク質分解活性は、胃ｐＨ、タンパク質基質の種類、温度、溶質濃度、および基質濃度によって変わる。ペプシンは幅広い範囲のｐＨで活性があるものの、最適なタンパク質分解活性は通常、約ｐＨ２〜３である。
【０００４】
ペプシンは食事性タンパク質を特異的に分解するのではなくて、任意の適当なタンパク質、ペプチド、または糖タンパク質を無差別に切断する。したがってペプシンは、通常の生理機能に不可欠な、構成タンパク質（例えば、コラーゲンおよびエラスチン）および機能タンパク質（例えば、ヘモグロビンおよびアルブミン）を幅広く分解する。これらのタンパク質の無差別な分解（自己消化とも呼ばれる）は、ディスペプシア、胃炎、潰瘍、および胃食道逆流症を含む症状の多くの基礎病理である。これらの病状では、胃腸菅の粘膜が、ペプシンのタンパク質分解活性によって損傷する。
【０００５】
粘膜面には、多くの構成タンパク質および機能タンパク質（例えば、コラーゲン、高分子量タンパク質）が含まれ、それらは細胞外マトリックス（組織の基本骨格）の統合を維持するのに役立つ。胃における粘膜は、複数の防御機構（粘液ゲル層の分泌など）によってペプシン分解から保護される。粘液ゲル層は拡散障壁として働いて、ペプシンと基底粘膜面タンパク質との間の相互作用を妨げる。
【０００６】
しかしながら、粘液層はペプシンによって分解されるので、粘液分泌および分解の間における動的なバランスが存在する。このバランスが乱れ、粘液バリアが損なわれたならば、ペプシンは基底上皮およびコラーゲンを温浸することができ、結果的に組織破壊および胃傷害を起こす。同様に、ペプシンが食道括約筋を超えて食道に逆流する場合、食道粘膜は胃に存在するような保護機構を備えていないので、広範囲な組織損傷が起こり得る。
【０００７】
胃腸粘膜の損傷を防ぐために、ペプシンのタンパク質分解活性の阻害剤が提案されている。
【０００８】
米国特許第３，７４０，３１９号および米国特許第３，８４０，５１６号が記載するペプスタチンは、ストレプトマイセス株の培養濾液から抽出した化合物である。ペプスタチンは、ペプシンのタンパク質分解活性を阻害することを示し、胃潰瘍を扱う上で予防的な役割を有することを示唆した。
【０００９】
国際公開第０１／８７２８２号はアルギン酸塩の使用について記載し、それは、ペプシンタンパク質分解活性を阻害するための、褐藻目に属する藻類から抽出した多糖類である。４００ｋＤａ未満の分子量を有するアルギン酸塩は、ペプシンおよび胃液のタンパク質分解活性をそれぞれ、７０％および５５％まで阻害することを示した。
【００１０】
米国特許第３，１５５，５７５号は、アルミン酸ナトリウムと反応したキトサンの酸性塩の水性懸濁剤を用いる、胃腸障害治療の製剤に関する。反応した水性懸濁剤は「ラットモデル」において、ペプシンのタンパク質分解活性阻害を示した。
【００１１】
英国特許第１２１７２５６号は、リグノスルホン酸の遊離酸および任意の塩を含む、胃潰瘍の治療のための組成物を記載する。リグノスルホン酸は、インビトロ試験方法でカゼイン基質に対して、ペプシンのタンパク質分解活性が減少したことを示した。
【００１２】
また、英国特許第１２５３３１７号、米国特許第３，５２４，８５９号、米国特許第３，４５９，７５８号、および米国特許第３，４２７，３０５号に記載されているように、幅広い、小分子の有機化合物は、ペプシンを阻害することが知られている。
【００１３】
Qian et al [Eur Polym J, (2006), 42, 1653-1661] は、メタクリル酸メチルのコポリマーナノ粒子がペプシン活性を減少させたことを記載する。
【００１４】
Mouecoucou et al ［J Dairy Sci, (2003), 86, 3857-3865］の報告によると、様々な植物親水コロイドが、ペプシンのペプチド分解能力を低下させた。彼らが示したのは、キシラン、アラビアゴム、および低メトキシル化ペクチンが、ペプシンの存在下で、１〜８ｋＤａの分子量のペプチドの分解を阻害するということである。タンパク質基質に対するペプシン活性を減少することが示されている他の多糖類には、アルギン酸塩［Strugala et al, Int J Pharm, (2005) 304, 40-50］、寒天［Gouda and Johdka, Can J Pharm Sci, (1977), 12, 4-7］、硫酸化多糖類［Levey and Sheinfeld, Gastroenterology (1954), 27, 625-628］、および酸化デンプン硫酸塩 [Namekata, Chem Pharm Bull (1962) 10, 171] が含まれる。
【００１５】
Pearson and Roberts [Clin Sci, (2001), 100, 411-417]は、胃液中で、エカベトナトリウムがペプシン活性を阻害することを示した。阻害の程度は、ペプシンサブタイプに依存した。
【００１６】
Kratzel and Bernkop-Schnurch ［Peptides (2000), 21, 289-293］は、ペプスタチンＡのトリペプチド誘導体を合成し、それがペプシンインビトロに対して阻害作用を有することを示した。彼らが示すところによると、その誘導体は酵素の分解からペプチド薬剤を保護するのに適用されるかもしれないし、したがって経口バイオアベイラビリティーを増大するために用いられるかもしれない。
【００１７】
Foster et al ［Clin Sci, (1994), 87, 719-726］は、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４Ｐ がペプシン加水分解を阻害することができることから、インビボ粘膜保護剤としての可能性を有することを示した。
【００１８】
Beil et al ［Pharmacology, (1993), 47, 141-144］は、次クエン酸ビスマスがインビトロでブタペプシン活性を、ｐＨ依存的に阻害することを示した。また、Stables et al ［Aliment Pharmacol Ther, (1993), 7, 237-246］は、クエン酸ビスマスおよびラニチジンクエン酸ビスマスのいずれもがペプシン１、２、３、および５を阻害することを見出した。
【００１９】
多数の研究によって、カキ[Faisal et al, Comp Biochem and Physiol B, (1998), 121, 161-168]、Ａｎｃｈｕｓａ ｓｔｒｉｇｏｓａの根 [Abuereish, Phytochemistry, (1998), 48, 217-221]、カボチャ師部の滲出物（squash phloem exudates）[Christeller et al, Eur J Biochem (1998), 254, 160]、軟質小麦のふすま[Galleschi et al, Sciences de Aliments, (1997), 17, 173-182]、およびオタネニンジン[Sun et al, Planta Medica, (1992), 58, 432-435]を含む天然源からペプシン阻害剤が同定されている。
【００２０】
国際公開第００／１０５２７号、国際公開第００／１０５２８号、国際公開第００／１０５２９号、および国際公開第００／１０５３０号は、シリカ、チタニア、粘土、およびその混合物から選択されるコロイド性粒子を含む粘膜付着性組成物を開示する。これらの文献の粘膜付着性組成物は蠕動運動に対して抵抗性があり、活性成分を胃腸菅に送達するのに用いられる。しかしながら、活性な胃腸薬物として作用するシリカの能力については、一切、記載がない。
【００２１】
多様な物質について、ペプシンのタンパク質分解活性に対して阻害効果を有することが示さているにもかかわらず、シリカがプロテアーゼ阻害に適していることは、先行技術で触れられていない。
【発明の概要】
【００２２】
第１の態様において提供されるのは、プロテアーゼを阻害するために使用するシリカである。
【００２３】
第２の態様において提供されるのは、胃腸菅内の有害なプロテアーゼ活性と関連する疾患または症状の、治療または予防のためのシリカである。
【００２４】
第３の態様において提供されるのは、胃腸菅内の有害なタンパク質分解と関連する疾患または症状の、治療または予防のためのシリカである。
【００２５】
第４の態様において提供されるのは、ディスペプシア、胃炎、胃潰瘍、胃食道逆流症、咽喉頭酸逆流症（extra-oesophageal reflux disease）、過敏性大腸症候群、直腸関連炎症疾患、および炎症性腸疾患からなる群より選択される疾患または症状の、治療または予防のためのシリカである。
【００２６】
第５の態様において提供されるのは、イントラ（intra）ムチン相互作用を増加させるために使用するシリカである。
【００２７】
第６の態様において提供されるのは、粘液粘度を増加させるために使用するシリカである。
【００２８】
第７の態様において提供されるのは、粘液ゲル特性を改善するために使用するシリカである。
【００２９】
以下では参照をし易くするために、本発明における、これらの態様およびさらなる態様について、適当な見出しを付けて論じる。しかしながら、各見出しの下に示される内容は、その特定の見出しに限定されるわけではない。
【００３０】
（効果）
本発明は、多くの利益をもたらす。
【００３１】
ペプシン（および類似のタンパク質分解酵素、おそらく腸内の細菌起源のもの）は、決定的な攻撃因子であり、逆流性疾患病状と強く結び付く。シリカによるペプシンのタンパク質分解活性阻害は、逆流または管腔内容物の損傷可能性を減少させることによって、効果的な疾患治療となり得る。本発明のシリカは、タンパク質分解活性（例えば、ペプシン）を阻害するのに有効なので、治療において効果的である。
【００３２】
また、本発明のシリカは、白血球および細菌が存在することに起因して、炎症において増加するフリーラジカルをクエンチする能力を示す。フリーラジカルをクエンチする能力は物質のフリーラジカル除去能力の指標であるから、それは炎症性腸疾患における破壊力を減少させる能力である。
【００３３】
本発明のシリカ［特に小さい粒径（１０〜５０ｎｍ）のもの］は、粘膜層にわたるペプシンの拡散を遅延させることによって、上皮細胞を保護することもできる（つまり、ペプシンが食道粘膜に到着するのを減少させることを示しており、それは病変を妨げるのにとても効果的であり、また逆流症およびディスペプシアの症状に対して有利に作用する）。ペプシンが食道に与える損傷の程度は用量依存的であるから、食道に到達する攻撃因子の量のわずかな減少であっても、患者症状および逆流性疾患病状に対して顕著な効果を有する。
【００３４】
本発明のシリカはまた、機能が低下した粘液ゲルを修復し、ゲル特性を改善することを示す。これらの知見は、粘液層が損なわれ、基底粘膜を保護することができない、潰瘍性大腸炎および胃潰瘍の治療について、治療できる可能性を有する。
【００３５】
本発明のシリカはまた、ペプシンが粘液ゲルを分解するのを防ぎ、またペプシンがゲル形成特性に影響するのを防ぐこともできる。したがって、本発明のシリカは、過剰な攻撃因子（すなわち、ペプシン）が存在するような状況においても保護的であり得る。
【００３６】
（シリカ）
本発明の第１の態様において、プロテアーゼを阻害するために使用するシリカが提供される。
【００３７】
本発明において、プロテアーゼ阻害剤とは、基質に対するプロテアーゼ活性を妨げるのに有能な物質を指す。この観点から、阻害物質によってプロテアーゼ結合部位が占有されることは、阻害効果を示すために要求されないことが理解される。また、阻害剤はプロテアーゼとその基質との接触を妨げる単純なバリア材（barrier material）でないことも理解される。したがって、本発明は、基質に対するプロテアーゼ活性を阻害するために使用するシリカを提供する。
【００３８】
ある態様において、基質に対するプロテアーゼ阻害剤として使用するのに適したシリカであって、シリカがプロテアーゼの結合部位を占有するものが提供される。
【００３９】
（シリカ）
二酸化ケイ素の分野において、シリカは一般的な名前である。それは、例えば、ヒュームドシリカ、沈降シリカ、非晶質シリカ、コロイドシリカ、コアセルベートシリカ（coacervated silica）、非晶質シリカゲル、（アクア）シリカゾル、ヒドロゲルシリカ、およびキセロゲルシリカ（xerogel silica）などのいくつかの形態で存在するかもしれない。またシリカは、液剤（可溶性ケイ酸塩）、懸濁剤、粉末剤、顆粒剤、または錠剤の形で存在するかもしれない。
【００４０】
本発明のシリカは、ヒュームドシリカ、沈降シリカ、非晶質シリカ、コアセルベートシリカ、非晶質シリカゲル、（アクア）シリカゾル、および粉末剤からなる群より選択されるかもしれない。
【００４１】
好ましい態様において、本発明のシリカは非晶質シリカである。非晶質シリカが、コロイドシリカとして呼ばれ得ることは、当技術分野に公知である。したがって、非晶質シリカへの言及はコロイドシリカも含むことが理解される。
【００４２】
本発明のシリカは、典型的に、ナノ粒子として存在すべきである。
【００４３】
したがって、ある態様において、本発明のシリカはナノ粒子として存在する。さらなる態様において、シリカは、２０，０００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらなる態様において、シリカは、１８，０００ｎｍよりも大きくない平均粒径（ｄ５０）を有する。
【００４４】
好ましい態様において、シリカは、１０，０００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、約１ｎｍおよび５，０００ｎｍの間の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、４，３００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、８００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、１８０ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。より好ましい態様において、シリカは、５ｎｍおよび１００ｎｍの間の平均粒径（ｄ５０）を有する。好ましい態様において、シリカは、１から１，８００ｎｍまでの平均粒径（ｄ５０）を有する。好ましい態様において、シリカは、１０から８０ｎｍまでの平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、８０ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、２０ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。平均粒径（ｄ５０）が、５ｎｍから約１００ｎｍの範囲にあるシリカ（例えば、シリカゾル）は、長時間、顕著に沈殿することなく留まるかもしれないし、または、かなりの程度までは凝集しないかもしれない。
【００４５】
さらに好ましい態様において、シリカは、１００ｎｍ未満の平均粒径（ｄ５０）を有する。さらに好ましい態様において、シリカは、５ｎｍおよび５０ｎｍの間の平均粒径（ｄ５０）を有する。
【００４６】
特に好ましい態様において、シリカは、約２０ｎｍの平均粒径（ｄ５０）を有する。
【００４７】
表１３および以下のデータは、粒径４３００ｎｍ未満のシリカが好ましく、また好ましいのは８００ｎｍ未満であり、より好ましいのは１８０ｎｍ未満であり、さらに好ましいのは８０ｎｍ未満であり、最も好ましいのは２０ｎｍ未満であることを示す。
【００４８】
本明細書で用いるように、用語「平均粒径」は、所定のサイズがｄ５０を有する粒子集団を意味する。シリカゾルの平均粒径ｄ５０は、表面積滴定により測定し、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＥＭ）で確認した。他のシリカの種類の平均粒径は、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒによって測定した。光散乱検出を用いる、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｓを使用して、粒子のサイズを測定した。装置には名目上、１０００ｍｌのサンプル分配ユニットと任意の超音波能力が備えられた。我々は３００ＲＦレンズで０.０５μｍ〜８８０μｍのサイズの幅を与える単レンズ配置、および２つの後方散乱検出（backscattering）検出器を有する、４２成分（element）固体状態検出器アレイを用いた。我々はサンプルを１５〜２５％の不明瞭化に負荷し、測定パラメーターは８０％ポンプスピード、８０％攪拌スピード、５０％超音波処理、および３分の滞留時間であった。
【００４９】
シリカは２０から１２００ｍ２／ｇまでの範囲にある表面積を有するかもしれないし、好ましくは、シリカは２０から７５０ｍ２／ｇまでの表面積を有し、より好ましくは、シリカは５０から３５０ｍ２／ｇまでの表面積を有する。
【００５０】
特に好ましい態様において、シリカは、１０から８０ｎｍまでの平均粒径（ｄ５０）および５０から３５０ｍ２／ｇまでの表面積を有する。この態様において、シリカは好ましくは、ゾルの形態である。
【００５１】
（プロテアーゼ）
プロテアーゼは、タンパク質分解を行なう酵素である。したがって、それは、タンパク質のポリペプチド鎖においてアミノ酸を結合させるペプチド結合を加水分解する。
【００５２】
プロテアーゼを、いくつかのグループに分類してもよい。典型的には、それは以下の６のグループに分けられる：セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼである。
【００５３】
アスパラギン酸プロテアーゼには、ヒト胃ペプシンが含まれる。上述したように、ヒト胃ペプシンには複数のサブタイプがあり、すなわち、ペプシン１、３ａ、３ｂ、３c、およびガストリクシンがある。
【００５４】
したがって、ある態様において、本発明のプロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼである。好ましい態様において、本発明のプロテアーゼはペプシンである。
【００５５】
好ましい態様において、本発明のプロテアーゼは哺乳類ペプシンである。
【００５６】
好ましい態様において、本発明のプロテアーゼは、ヒトペプシン、ブタペプシン、ウマペプシン、マウスペプシン、ヒツジペプシン、イヌペプシン、ヤギペプシン、およびウシペプシンからなる群より選択される。
【００５７】
好ましい態様において、本発明のプロテアーゼはヒトペプシンである。
【００５８】
好ましい態様において、本発明のプロテアーゼはヒト胃ペプシンである。好ましくは、本発明のプロテアーゼは、ヒト胃ペプシンのサブタイプである。より好ましくは、本発明のプロテアーゼは、ペプシン１、３ａ、３ｂ、３ｃ、およびガストリクシンからなる群より選択される。
【００５９】
別の態様において、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはトリプシンである。別の態様において、プロテアーゼはトリプシンである。
【００６０】
好ましい態様において、本発明のプロテアーゼは、ペプシンおよびトリプシンから選択される。
【００６１】
（基質）
上述したプロテアーゼは、基質に作用する。典型的には、単一のプロテアーゼは、いくつかの異なる基質に作用することができる。
【００６２】
本発明によって阻害されるプロテアーゼは、典型的に、胃腸菅に存在または由来するものである。したがって、本発明の基質は、典型的に、胃腸菅にあるかまたは由来する基質である。したがって、本発明の基質には、胃腸菅にあるタンパク質が含まれる。
【００６３】
胃腸菅にあるタンパク質には、典型的に、構成タンパク質、糖タンパク質、および機能タンパク質が含まれる。
【００６４】
構成タンパク質は、胃腸菅の一部を形成するとみなされてもよくて、したがって、本質的に胃腸菅に存在すると考えられる。機能タンパク質は胃腸菅に存在すると考えてもよいものの、必ずしも胃腸菅それ自体の一部ではない。
【００６５】
本発明の構成タンパク質の例は、コラーゲン、ムチン、およびエラスチンである。コラーゲンは、腸に並ぶ上皮細胞の基底膜を形成する。コラーゲンは、広範囲のプロテアーゼ（例えば、ペプシン、さらには特定のマトリックスメタロプロテアーゼ）に分解することができる。
【００６６】
粘液は、タンパク質骨格に糖側鎖を含むムチン糖タンパク質（ムチン）からできている。プロテアーゼによるムチンの分解は、ゲル特性の減少および糖タンパク質の切断を起こす可能性があり、結果的に可溶化する。
【００６７】
ある態様において、本発明の基質は構成タンパク質である。好ましい態様において、構成タンパク質は、コラーゲンおよび／またはムチンである。
【００６８】
ある態様において、粘液は、胃または結腸起源である。
【００６９】
機能タンパク質の例には、胃腸菅に存在するタンパク質が含まれるが、胃腸菅の一部を形成するものは含まれない。したがって、本発明の作用によって保護される機能タンパク質の例は、アルブミンである。
【００７０】
ある態様において、基質は機能タンパク質である。ある態様において、機能タンパク質はアルブミンである。
【００７１】
（シリカ液体投与形態）
好ましい態様において、本発明に使用するために提供されるシリカは、シリカ液体投与形態（liquid dose form）である例えば懸濁剤またはゾルの形態であり、より好ましくはシリカゾルとして提供される。したがって、ある態様において、本発明のシリカは、懸濁剤またはシリカゾルとして存在する。懸濁剤またはゾルの組成物は、特に限定されることはない。しかしながら、ある態様において、懸濁剤またはゾルはアルカリ性培地を含む。別の態様において、懸濁剤またはゾルは酸性培地を含む。
【００７２】
懸濁剤またはゾルがアルカリ性培地を含む場合、アルカリ性培地は好ましくは、水並びにアンモニアおよび／または水酸化ナトリウムを含む。
【００７３】
ある態様において、本発明のシリカ懸濁剤またはゾルはシリカ、水、および安定アルカリ剤（stabilizing alkali）を含む。さらなる態様において、安定アルカリ剤は、アンモニアおよび水酸化ナトリウムから選択される。
【００７４】
ある態様において、シリカは、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約１０％から約６０％の量で、本発明の懸濁剤またはゾル中に存在するかもしれない。好ましくは、シリカは、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約１５％から約６０％の量で存在する。好ましくは、シリカは、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約２０％から約５０％の量で存在する。特に好ましい態様において、シリカは、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約２５％またはそれ未満の量で存在する。特に好ましい態様において、シリカは、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約２０％またはそれ未満の量で存在する。さらに好ましい態様において、シリカは、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約１％から２０％の量で存在する。
【００７５】
特に好ましい態様において、シリカは１から１８０ｎｍまでの平均粒径（ｄ５０）を有し、懸濁剤またはゾルの重量に基づいて約１から２０％の量で懸濁剤またはゾル中に存在する。
【００７６】
本発明のシリカ懸濁剤またはゾルは、さらなる構成要素として、例えば保存剤のように、貯蔵している間、微生物増殖を予防および／または阻害するものも含むかもしれない。
【００７７】
特に好ましい態様において、シリカ懸濁剤またはゾルは、懸濁剤の総重量に基づいて約３０％の量ので、約２０ｎｍの平均粒径（ｄ５０）を有するシリカを含む。
【００７８】
本発明に使用するためのシリカは、シリカあるいは本明細書で記載するシリカ懸濁剤またはシリカゾル、並びに１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、補助剤、または希釈剤を含む、医薬組成物の形態で提供されてもよいことがさらに理解される。したがって、本発明のさらなる態様において、シリカ、および１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、補助剤、または希釈剤を含む、プロテアーゼ阻害剤として使用するための医薬組成物が提供される。
【００７９】
（適用）
本明細書で記載されるように、本発明は、胃腸菅における不適切なタンパク質分解に関連した症状および疾患（例えば、ディスペプシア、胃炎、胃潰瘍、胃食道逆流症、咽喉頭酸逆流症、過敏性大腸症候群、および炎症性腸疾患）の治療に適している。したがって、ある態様において提供されるのは、ディスペプシア、胃炎、胃潰瘍、胃食道逆流症、咽喉頭酸逆流症、過敏性大腸症候群、および炎症性腸疾患からなる群より選択された疾患または症状の、治療または予防のためのシリカである。さらなる態様において提供されるのは、ディスペプシア、胃炎、胃潰瘍、胃食道逆流症、咽喉頭酸逆流症、および炎症性腸疾患からなる群より選択される疾患または症状の、治療または予防のためのシリカである。
【００８０】
さらに、胃腸菅のフリーラジカル濃度増加に関連する、疾患または症状の治療も考慮される。したがって、ある態様において提供されるのは、胃腸菅のフリーラジカル濃度増加に関連する、疾患または症状の、治療または予防のためのシリカである。
【００８１】
上記は、例えば以下：
i）様々な基質に対するプロテアーゼ阻害、
ii）フリーラジカル除去、並びに
iii）粘液の再生および修復
によって達成できるかもしれない。
【００８２】
理論に縛られなければ、シリカは、おそらく生体分子（例えば、ムコ多糖およびコラーゲン）の架橋結合および構造機構を促進し、ムチン分子の相互作用を強めることによって作用し得る。したがって、ムチンおよびシリカにおける相互作用は、粘液ゲルの生理化学的な特徴を改善するかもしれない。これは、基底粘膜に対して、より大きな保護を与えるかもしれない。
【００８３】
高純度ムチン糖タンパク質については、粘液溶液の流体力学的特徴が大いに増大したように、シリカとの相互作用があった。１００ｎｍ未満、より好ましくは２０ｎｍ未満のコロイドシリカの添加は、貯蔵（Ｇ´）および損失（Ｇ´´）係数を大きく増加させる結果となった。これらのシリカとの相互作用は、粘液と、エカベトナトリウムまたはアルギン酸塩との間で以前に見られたより強いものの、ｃａｒｂｏｐｏｌで見られる領域内ではある。
【００８４】
（治療）
シリカは、治療薬として使用されること、すなわち治療に適用されることが理解される。用語「治療」には、治療効果、軽減効果、および予防効果が含まれる。
【００８５】
治療は、ヒトまたは動物に対してであってもよくて、好ましくはヒトである。
【００８６】
（医薬組成物）
ある態様において本発明は、本発明に使用するための医薬組成物を提供し、それは、シリカおよび適宜含まれる医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤（それらの組み合わせも含む）を含む。
【００８７】
医薬組成物は、ヒトおよび獣医学における、ヒトまたは動物使用のためであるかもしれないし、また典型的に、医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤のいずれか１もしくはそれ以上を含む。医薬的に許容される担体または希釈剤は、医薬分野において周知であるし、また、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、 Mack Publishing Co.（A. R. Gennaro edit. 1985）にも記載される。医薬的な担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、目的の投与ルートおよび標準的な医薬習慣に従って選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として（あるいは担体、賦形剤、または希釈剤に加えて）、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含んでもよい。
【００８８】
保存剤、安定化剤、染料、および香味剤でさえも、医薬組成物中に提供されるかもしれない。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁化剤も、用いられるかもしれない。
【００８９】
異なる送達システムに依存する、異なる、組成物／製剤の必要条件が存在するかもしれない。一例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプ（mini−pump）または粘膜経路（例えば、経鼻スプレーとして、吸入用エアロゾル、または経口摂取可能な溶剤／懸濁剤）を用いて送達されるように製剤されるかもしれない。
【００９０】
（組み合わせ医薬）
本発明の化合物は、１またはそれ以上の他の活性薬剤（例えば、１またはそれ以上の他の医薬的な活性薬剤）と組み合わせて用いてもよい。
【００９１】
一例として、本発明の化合物は、他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて使用してもよい。他のプロテアーゼ阻害剤の例は、上述した参考文献に見つかるかもしれない。
【００９２】
（投与）
典型的には、医師は個々の患者に対して最も適切な投与量を決定するであろうし、それはその患者の年齢、体重、および反応によって変わる。以下の投与量は、平均的なケースの例示である。当然のことながら、用量域よりも高いかまたは低い場合が、その患者にとって良いこともある。
【００９３】
その必要に応じて、薬剤は０.０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与してもよくて、例えば、０.１〜１５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与しても良い。
【００９４】
さらなる例として、本発明の薬剤は、１日に１〜４回（好ましくは１日に１回もしくは２回）の投与計画で投与してもよい。いずれの個々の患者も、具体的な投与量および投与量の頻度を変えてもよく、それはいくつかの要素（用いられる具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および活性期間、年齢、体重、一般健康、性別、食性、投与の時間および様式、排泄率、薬剤の組み合わせ、特定の症状の重症度、並びに治療を受けている宿主）に従う。
【００９５】
用語「投与」は、これらに限定されないが、例えば、経口摂取できる液剤による送達を含む。
【００９６】
したがって、医薬的投与（および通常は非経口投与）にあたり、本発明のシリカは、通常の医薬的製剤技術および医薬的担体、補助剤、賦形剤、希釈剤などを利用して、いずれの適した方法で製剤することができる。おおよその効果的な投与割合は、平均的体重（７０Ｋｇ）の患者について、問題となっているシリカの個々の活性に従って、１〜１５０００ｍｇ／日（例えば、１０〜１００００ｍｇ／日、または１００〜５０００ｍｇ／日）の範囲であってもよい。より好ましく、より活性のあるシリカについてのより一般的な投与割合は、２００〜２０００ｍｇ／日、より好ましくは２００〜１０００ｍｇ／日、最も好ましくは２００〜５００ｍｇ／日である。これらは、単回投与計画、分割投与計画、および／または数日間にわたる複数回投与計画で与えられるかもしれない。経口投与は、単位用量あたり、化合物を１０〜２０００ｍｇ含む錠剤、カプセル剤、液剤、または懸濁剤に製剤化されるかもしれない。しかしながら、そのような効果的な日当たり投与量は、活性成分の固有活性および患者の体重に従って変わるだろうし、そのような修飾は医師の技術および判断の範囲内で行なわれる。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
（実施例）
以下で本発明をさらに詳しく記載するが、添付する図は単に例示としてのみ用いる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１はグラフを示す。
【００９９】
（物質）
本研究で用いたシリカ物質は、Precision Colloids LLC, Cartersville USA および ＩNEOS Silicas,Warrington UK から入手した。用いられた他の試薬は、標準的な研究室からの提供により得た。
【０１００】
液体またはゾルの形で提供されるシリカ物質は、脱イオン水中で１回希釈して必要濃度にして、徹底的に振盪した。この貯蔵液から、ある容量（以下の各試験方法で特定されるような量）を取って、試験溶液（すなわち、ペプシンおよび／または基質を含む試験溶液）における必要な最終濃度を提供した。
【０１０１】
粉末剤の形であるシリカ物質は、脱イオン水中で分散させ、必要な濃度まで希釈して、徹底的に振盪した。この貯蔵液から、ある容量（以下の各試験方法で特定されるような量）を取って、試験溶液（すなわち、ペプシンおよび／または基質を含む試験溶液）における必要な最終濃度を提供した。
【表１】
2015131805.tif 000003
【表２】
2015131805.tif 000004
【０１０２】
（ｐＨ測定）
ゾルの形態で供給されるシリカ物質のｐＨは、供給された状態で測定した。粉末の形態で供給されるシリカ物質のｐＨは、５％ｗ／ｖの懸濁剤から測定した。
【０１０３】
（実施例１８および１９の製剤：コロイド状に製粉したシリカ）
ガシル（Gasil）ＨＰ２７０を所定の粒径のコロイド状に製粉するのに用いた装置は以下：
Ｅｉｇｅｒ Ｔｏｒｒａｎｃｅ ｍｉｎｉｍｉｌｌ ２５０
１８２ｍｌ Ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｂｅａｄｓ
【０１０４】
Ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｂｅａｄｓ（１８２ｍｌ）を用いて、製粉機メーカーの使用説明書に従って、製粉機を組み立てた。
【０１０５】
１２％ｗ／ｖ固形成分含有量とのガシルＨＰ２７０スラリーを製造し（１２０ｇを、１００ｍｌの脱塩した水中）、オーバーヘッドパドル攪拌機（overhead paddle stirrer）を用いて１０分間、攪拌した。スラリーを製粉機に移し、４０００ｒｐｍで６０分間、製粉した。一定分量を１０分毎に取って、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒによる粒径分布（ＰＳＤ）分析をして、製粉の進行状況を評価した。
【０１０６】
Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ方法のパラメータは、以下：
ポンプ、スターラー、および超音波診断セット（５０％で）
２.５分の分散時間
【０１０７】
（実施例２２：か焼エアロジル）
エアロジル（１０ｇ）を１２ｃｍの皿に置き、次いで３００℃の炉中で２時間、か焼し、デシケーターに移して冷却した。
【０１０８】
（ペプシン溶液）
ペプシン（ＥＣ．３．４．２３．１）は以下の形態であった：
Ａ）ブタペプシンＡ（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７０１２）であり、２５００〜３５００単位／ｍｇタンパク質の特定化を伴う。ペプシンを０.０１ＭのＨＣｌ（ｐＨ２.２）中に溶解して、０〜１００μｇ／ｍｌの濃度とした。
Ｂ）ＨＣｌ（０.０１Ｍ）中で希釈されたヒト胃液（０〜１００μｇ／ｍｌのブタペプシンと同等の濃度）。
Ｃ）ＨＣｌ（０.０１Ｍ）中で希釈された精製ヒトペプシン３（０〜１００μｇ／ｍｌのブタペプシンと同等の濃度）。
Ｄ）ブタペプシンＡ（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７０１２）であり、２５００〜３５００単位／ｍｇタンパク質の特定化を伴う。ペプシンを、ｐＨ２のグリシン／ＨＣｌ緩衝液に溶解し、１ｍｇ／ｍｌの濃度にした。
Ｅ）ブタペプシンＡ（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７０１２）であり、２５００〜３５００単位／ｍｇタンパク質の特定化を伴う。ペプシンをＨＣｌ（０.０１Ｍ）中に溶解し、３ｍｇ／ｍｌの濃度にした。
【０１０９】
（方法）
（試験方法１：シリカとコラーゲン基質によるペプシン阻害）
ペプシン活性は、Moore (1969) Anal Biochem. 32:122-127; Chavira et al. (1984) Anal Biochem.136:446-460 and Will et al. (1984) Clin Chem. 30:707-711 の方法に基づくＡｚｏｃｏｌｌアッセイを用いて検出した。この方法は、コラーゲン分解活性に関する、試験物質の阻害効果を評価する。ペプシンのコラーゲン分解活性は、Ａｚｏｃｏｌｌ消化アッセイを用いて測定した。Ａｚｏｃｏｌｌは、市販品として入手可能なアゾ染料標識されたコラーゲンタイプＩ基質であり、ウシ皮由来である。ペプシンの存在下、赤いアゾ染料はコラーゲンから遊離し、生じる色の変化を検出することができ、それはコラーゲン分解活性と関連付けられる。
【０１１０】
コラーゲン基質はアゾ染料標識されたタイプＩコラーゲンであり、Ａｚｏｃｏｌｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ １９４９３３）は、＞１００メッシュの特定化を伴う。ＡｚｏｃｏｌｌをｐＨ２.０のグリシン／ＨＣｌ緩衝液中に溶解し、濃度を０.２５％として、磁気追従（magnetic follower）を用いて継続的に撹拌し、沈降を妨げた。
【０１１１】
シリカによるペプシン阻害は、次いで以下のように測定された。
【０１１２】
各試験物質（シリカ）について、菅の中で３つの混合液を作り、各々は、０、５０、もしくは１００μｇ／ｍｌ濃度のペプシン溶液（２００μｌ）のいずれかと２００μｌの試験物質（シリカ）を混合してなる（これにより、ペプシン０、２５、５０μg／ｍｌの最終濃度を得た）。ペプシン溶液Ａ、Ｂ、およびＣを用いた。
【０１１３】
Ａｚｏｃｏｌｌ溶液（１０００μｌ）を各菅に加え、徹底的に混合した。菅を３７℃で２時間、振盪しながら（１２００ｒｐｍ）インキュベートし、頻繁に逆転させて、いかなる沈殿作用も妨害した。次いで、菅を４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。遠心分離後、２００μｌの上澄みをマイクロプレートに移し、４９０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定した（マイクロプレートリーダーを用いる）。４９０ｎｍで測定されたＯＤは、可溶なアゾ染料の放出に起因する、タイプＩコラーゲン分解の指標である。
【０１１４】
ペプスタチンＡ溶液（５μｇ／ｍｌ）をＨＣｌ（０.０１Ｍ）中で調製し、次いで、５０μｇ／ｍｌペプシン標準溶液で希釈し（１：２）、ポジティブコントロールとして用いた。ネガティブコントロールは蒸留水であり、５０μｇ／ｍｌペプシン標準溶液で希釈した（１：２）。
【０１１５】
５０μｇ／ｍｌペプシンにおける、ペプシン活性のパーセント阻害は、式１を用いて、転正（ｃａｌ．）曲線によって測定した。
【０１１６】
式１：％ペプシン阻害＝（ＯＤｃａｌ−ＯＤｔｅｓｔ）／（ＯＤｃａｌ×１００）
ここで、
ＯＤｃａｌ＝５０μg／ｍｌの濃度で転正曲線から決定されたＯＤ値
ＯＤｔｅｓｔ＝５０μg／ｍｌの濃度の試験試料から決定されたＯＤ値
【０１１７】
シリカによるコラーゲン基質に対するペプシン活性のパーセント阻害（実施例１〜２２）を測定し、表２、３、４、および１３でデータに示した。
【０１１８】
（試験方法２：タンパク質基質としてのサクシニルアルブミンとシリカとによるペプシン阻害）
ペプシン活性は、Hutton et al (1986) Biochem Soc Trans. 14:735-736 のＮ末端アッセイであり、Strugala et al (2005) Int J Pharm. 304:40-50 に詳述されているものを用いて検出した。タンパク質分解酵素としてペプシン（ディスペプシアに関する）を用い、またタンパク質基質としてサクシニルアルブミンを用いるＮ末端アッセイは、タンパク質基質が消化されたときに新たに形成されたＮ末端を検出する比色法である。
【０１１９】
タンパク質基質はサクシニルアルブミン（市販品として入手不可）であり、それは以下のように製造した。ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.５で、濃度が０.２ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、磁性撹拌機を用いて絶えず混合した。コハク酸無水物（０.０１４ｍｇ／ｍｌ）をゆっくり加え、その間、ＮａＯＨ（２Ｍ）を滴下して加え、ｐＨを７.５に維持した。混合物を余すところなく、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。次いで、サクシニルアルブミンをＨＣｌ（０.０１Ｍ）中に溶解して、濃度を１０ｍｇ／ｍｌとし、ＨＣｌ（１Ｍ）の滴下添加によりｐＨを２.２に調整して、基質を溶解した。
【０１２０】
各試験物質（シリカ）について、３つの混合液を作り、各々は、０、５０、もしくは１００μｇ／ｍｌ濃度のペプシン溶液（１０μｌ）のいずれかと１０μｌの試験物質（シリカ）を混合して、ペプシン０、２５、５０μg／ｍｌの最終濃度を得た。ペプシン溶液Ａ、Ｂ、およびＣを用いた。
【０１２１】
対照試験においては、ＮａＨＣＯ３の添加後に１０μｌの１００μｇ／ｍｌペプシンのみを含む１０μｌ試験物質も準備した。これは、試験物質によるアッセイにおける矛盾干渉（conflict interference）を考慮するためである。
【０１２２】
サクシニルアルブミン溶液（５０μｌ）を加え、３７℃で３０分間、振盪しながら（６００ｒｐｍ）インキュベートした。
【０１２３】
ペプシン活性を、４％ＮａＨＣＯ３（５０μｌ）を添加することによりクエンチした。５０℃で１０分間、インキュベーションしながら、１％トリニトロベンゼンスルホン酸（５０μｌ）を加えて、色が生成した。１０％ドデシル硫酸ナトリウム（５０μｌ）および１ＭのＨＣｌ（２５μｌ）を加えて、反応を終了した。
【０１２４】
４０５ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定し、関連する対照試験のＯＤ（４０５ｎｍ）を試験標準曲線（test standard curve）のＯＤ（４０５ｎｍ）から引き算した。０μｇ／ｍｌペプシンを含む試験物質のＯＤ（４０５ｎｍ）は、４０５ｎｍで０.０００のＯＤに規格化した。
【０１２５】
５０μｇ／ｍｌペプシンにおけるペプシン活性のパーセント阻害は、式１で測定され、データを表１３に示した。
【０１２６】
（試験方法３：流体力学的パラメーターおよびサイズ排除クロマトグラフィーで測定された、シリカによる分解された粘液の回復および保護）
溶液の粘液溶解薬活性を決定するための一連の方法が存在する。これらには、粘度測定法、流体力学、ゲル濾過、およびムチンの代謝回転を特定するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動法が含まれる。
【０１２７】
基質は、ブタの胃（屠殺場から入手）から取られた天然の粘液ゲルである。粘液は、タンパク質骨格が糖側鎖からなるムチン糖タンパク質（ＧＰ）でできている。粘液の分解はゲル特性の損失をもたらし、またＧＰ分子の切断は、その可溶化および分子量の減少をもたらす。
【０１２８】
粘液ゲルの消化のインビトロモデルは、約１ｇ天然のブタの胃粘液を５ｍｌの試験溶液と混合して含む菅を準備して、これを３７℃で維持した。この混合物から、各時点で１ｍｌをサンプルし、未使用の試験溶液でサンプルしたものを置き換えた。
【０１２９】
試験溶液は、以下：
ペプシン溶液Ｄ
ペプシン溶液Ｄ＋シリカ
【０１３０】
１ｍｌの試験溶液を０、４、８、および２４時間でサンプリングし、未使用の試験溶液に取り替えた。粘液ゲルの状態は視覚的および流体力学的に評価され、また可溶化されたＧＰの分解特性は、セファロースＣＬ−２Ｂ（４０×１ｃｍカラム）を用いるサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって測定した。１５０μｌ試験サンプルを積み、塩アジド（０.２Ｍ ＮａＣｌ／０.０２％Ｎａアジド）で溶離し、４８×１ｍｌフラクションを回収した。各フラクションの粘液ＧＰレベルを、Mantle & Allen (1978) Biochem Soc Trans. 6:601-609 に記載されるような過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）アッセイで測定した。ゲル特性は、粘度および流体力学的データを用いて研究した。
【０１３１】
粘度および流体力学データ分析：
ゲル特性を、円錐と平板の幾何配置（Cone and Plate geometry）（ＣＰ ４℃／４０ｍｍ）を用いる、Ｂｏｈｌｉｎ ＣＶＯで制御されたストレス・レオメータで振動流体力学により測定した。
【０１３２】
振幅スイープを行なって試験物質の線形粘弾性領域（linear viscoelastic region）（ＬＶＥＲ）を見つけて、次いで中間点での振幅を周波数掃引に適用した。測定は、３７℃で、０.１〜１００Ｈｚの範囲にわたる周波数振動で行なった。
【０１３３】
得られたパラメーターは、
Ｇ´（Ｇプライム）：弾性または貯蔵係数であり、固体様振る舞いの尺度（単位＝Ｐａ）；
Ｇ´´（Ｇダブルプライム）：粘性または損失係数であり、液体様振る舞いの尺度（単位＝Ｐａ）；
δ（デルタ）：位相角であり、ゲル強度の尺度。
Ｔａｎδ＝Ｇ´´／Ｇ´。
δ＜４５℃であるならば、物質はゲルであり（Ｇ´が優性）、位相角が小さいほどゲルは強い。
【０１３４】
（試験方法４：フリーラジカルの存在下における、シリカの作用）
フリーラジカル生成系は、過酸化水素、アスコルビン酸塩、ＦｅＳＯ４、およびＥＤＴＡである。この反応はフェントン反応として知られており、ヒドロキシル、スーパーオキサイド、およびアスコルビン酸塩ラジカルを生成する。希釈剤としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.４）を用いて、０.５ｍＭ アスコルビン酸塩、０.５ｍＭ ＦｅＳＯ４、０.５ｍＭ ＥＤＴＡを含む貯蔵液を製造した。使用の直前に、１０２μｌの３０％Ｈ２Ｏ２（９.８Ｍ）を、２０ｍｌの貯蔵液に加え、フリーラジカル産生を開始させた（容器は光から保護される）。標準的な曲線を作成し、それには、０、２.５、５、７.５、および１０ｍＭのＨ２Ｏ２が含まれる。
【０１３５】
２−デオキシ−Ｄ−リボース（３０.８ｍＭ）のＰＢＳ溶液（１００μｌ）を、１０００μｌのフリーラジカル反応混合液に加えた（最終濃度２.８ｍＭ）。
【０１３６】
このアッセイのポジティブコントロールは、１００μＭの没食子酸プロピル（ＰＧ）である。ネガティブコントロールは、ミリポア水（または試験物質の希釈液）である。
【０１３７】
１０００μｌの標準／サンプル／コントロールを標識した試験管に加え、続いて３０.８ｍＭのデオキシリボース混合溶液（１００μｌ）を加えた。振盪しながら、３７℃で１時間、水浴中でインキュベーションした後、１％チオバルビツール酸溶液（１０００μｌ）および２.８％トリクロロ酢酸溶液（１０００μｌ）を加えた。乾燥した蓄熱ヒーター（dry block heater）により１００℃で１５分間、加熱し、次いで菅を冷却した。ブタン−１−オール（２０００μｌ）を加え、次いで４０００ｇで２分間、遠心分離し、有機上層を使い捨てのキュベットにデカントし、分光計を用いてＯＤ５３２ｎｍを読んだ。
【０１３８】
算出：
％阻害＝（ＯＤｃａｌ-ＯＤｔｅｓｔ）／ＯＤｃａｌ×１００
ここで、
ＯＤｃａｌ＝５ｍＭのＨ２Ｏ２で転正曲線から決定されたフリーラジカル活性
ＯＤｔｅｓｔ＝５ｍＭのＨ２Ｏ２で試験サンプルから決定されたフリーラジカル活性
【０１３９】
（試験方法５：ペプシン拡散に対する、シリカのバリア特性）
ペプシンのインビトロ拡散を、フランツ（Franz）細胞モデルを用いて測定した。フランツタイプ拡散細胞は、拡散および薬物送達を評価するための確立された技術であって、Ｔ.Ｆｒａｎｚ博士によって開発された。フランツ細胞は、皮膚における局所的な薬剤の拡散を測定する目的で皮膚および経皮分野において有名であるものの、バッカルおよび経口吸収を含む幅広い投与にも用いられる。
【０１４０】
研究で用いたフランツ細胞の寸法は以下：
ドナーチャンバー（Donor chamber）：１.５ｍｌ
膜：オクタノール中に浸したミリポアＰＴＦＥ膜、細孔径が０.４５μｍ
受容体チャンバー：５ｍｌ
開口部：９ｍｍ直径
拡散面積：６３.６ｍｍ２
【０１４１】
フランツ細胞は、磁性撹拌機プレートが組み込まれたサーモスタット制御の加熱ブロックを用いて、３７℃で維持した。
【０１４２】
受容体チャンバーにおける興味ある化合物は、チャート式記録計およびｍｍでの反応尺度への出力を有する検出器およびＨＰＬＣポンプ（１ｍｌ／分）を用いる、継続的なクローズドシステムＵＶ分光測定により検出した。
【０１４３】
受容体チャンバーにＨＣｌ（０.０１Ｍ）を満たし、膜を適当な位置に固定した。ペプシン溶液Ｅ（５００μｌ）をドナーチャンバーで処理した。受容体チャンバーにペプシンが存在するか否かは、３０分にわたる２８０ｎｍ（Ａ２８０）の波長で吸光度により検出した。ペプシン拡散がシリカに与える影響は、ペプシン用量の処理前に、膜への０.１ｍｌ用量の処理によって評価した。
【０１４４】
フランツ細胞の試験において、以下は、胃・食道逆流モデルのインビボ構成要素に関連する。
ドナーチャンバー：食道細胞内腔であり、リフラックサート（refluxate）を表す 
膜：食道扁平上皮膜
受容体チャンバー：食道細胞の細胞質
【０１４５】
拡散のパーセント遅延は、３０分での平均応答から算出し、以下の式を用いた：
（コントロールの応答−試験したものの応答）／コントロールの応答×１００
【０１４６】
（試験方法６：トリプシン活性アッセイ）
ｐＨ７.６で、基質ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）を用いる、持続的な速度の（rate）分光光度法アッセイによりトリプシン活性を測定した。アルギニン残基の開裂は新たな生成物を生み出し、それは２５３ｎｍで検出することができる。２５３ｎｍで吸光度を時間とともに３０℃でモニターし、加水分解の最大速度を算出した。
【０１４７】
トリプシン（ＥＣ３.４.２１.４）は、タイプＩウシ膵臓トリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｔ８００３）を用いた。ＨＣｌ（１ｍＭ）中で希釈したトリプシン（５００μ／ｍｌ）の溶液を用いた。
【０１４８】
基質は、Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル塩酸塩（ＢＡＥＥ）（Ｓｉｇｍａ Ｂ４５００）を用いた。６７ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７.６）中において、０.２５ｍＭ溶液を製造した。
【０１４９】
ポジティブコントロールは、大豆トリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ ９３６１８）であり、５００μ／ｍｌで、６７ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７.６）中、希釈した。
【０１５０】
ＢＡＥＥ溶液（３０００μｌ）をキュベットにピペットで入れて、３０℃に平衡化した。安定になるまで、ＵＶ分光測定により、２５３ｎｍで吸光度をモニターした。試験溶液（２００μｌ）を、逆転させて直ちに混合しながら、加えた。２５３ｎｍで吸光度を５分間、記録した。１秒あたり、２５３ｎｍで吸光度の変化（ΔＡ２５３ｎｍ／ｓ）を算出した。
【０１５１】
試験で用いた条件は、１００μｌのトリプシン（５００μ／ｍｌ）＋１００μｌの下記いずれか：
１）１ｍＭＨＣｌ（酵素単独）
２）大豆トリプシン阻害剤（５００μ／ｍｌ）
３）シリカ溶液
シリカからのバックグランド（background）は、１００μｌのシリカ＋１００μｌの１ｍＭ ＨＣｌ（酵素なし）を用いて評価した。
【０１５２】
算出：
％トリプシン阻害＝{（ΔＡ２５３ｎｍ／ｓ トリプシン−ΔＡ２５３ｎｍ／ｓ 試験）÷ΔＡ２５３ｎｍ／ｓ トリプシン}×１００ 
【０１５３】
（結果）
【表３】
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【表４】
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【０１５４】
ペプシン溶液Ａを用いる最終反応液において、ｐＨ２.２および０.４％シリカで、試験方法１によりペプシン阻害を測定した。
【０１５５】
表２で表されるデータは、コラーゲン基質に対してペプシン阻害する際の、シリカ粒径の影響を示す。すなわち、シリカ粒径が４３００ｎｍ未満であることが好ましく、より好ましくは８０ｎｍ未満である。シリカは、ゾルの形態で投与されることが好ましい。これらのことは、図１でグラフを用いて示す。
【０１５６】
【表５】
2015131805.tif 000007
【表６】
2015131805.tif 000008
【０１５７】
表３は、高濃度のシリカで、コラーゲン基質とのペプシン活性が完全に阻害され得ることを示す。％シリカ濃度は、好ましくは０.１％以上であり、より好ましくは０.４％以上であるものの、２％未満であることが好ましい。これらの値はアッセイ反応混合物におけるシリカの最終濃度であり、加える値ではないので、より高いかもしれない治療用量としては関連しないかもしれない。
【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
表４はシリカが、ヒト由来（ヒト胃液および単離されたヒトペプシン３）のペプシンを阻害することができることを示す。阻害の程度は、ブタペプシンに対して得られる値（各々、９３％、４２％、および９８％である）と似ている。
【０１６０】
【表８】
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表５は以下のことを示す。シリカと天然粘液の混合物が、天然の胃ブタ粘液の流体力学的特性における顕著な増加（Ｇ´およびＧ´´の増加）をもたらし、これは、相乗的相互作用のように、シリカの添加によって天然粘液のゲルが変わることを示唆する。混合物はＧ´優位に留まるから、ふさわしいゲルである。位相角（δ）が７°から約１７℃へとわずかに高くなったことは、ゲルが、天然の粘液−粘液相互作用ほど強くはなかったものの、それでも良好な粘液ゲルとして予想される範囲内にあることを示す。
【０１６１】
典型的には、健康的な胃粘液では位相角（δ）が７〜１０°であるのに対して、健康的な結腸粘液ではその範囲が１０〜１５°である。位相角（δ）が２０°を超える場合はあまりにも液体様である粘液層を示すのに対して、７°未満の粘液はあまりにも弾性があるか、または固体様の性質が強いと考えられるので流動能力を欠く。それぞれ２９.９３および５５.７という大きすぎる位相角（δ）において、３７℃で４日間、貯蔵するか（表６）、またはペプシンで分解して（表７）得られた分解粘液は、シリカの存在下で位相角（δ）の低下が示された。
【０１６２】
【表９】
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【０１６３】
表６で記載された分解粘液は、まずは４日間、３７°で貯蔵することにより分解した。その分解粘液に対して、表６で示されるように、異なる用量でシリカを加えた。弱められた粘液ゲルは、ゲル形成能力が減少し、基底粘膜を保護することができないような、潰瘍性大腸炎および胃潰瘍病状のモデルである。表６は以下のことを示す。シリカ用量の増加は、粘液ゲルの回復をもたらし、それは、約１５°の位相角で示されるような健康な粘液に欲求されるゲル強度の範囲内でもたらされ、また他の２つの評価した流体力学的パラメーター（Ｇ´およびＧ´´）も変化させる。（Ｇ´）は用量依存的に増加するのに対して、流速の尺度としての液体様特性（Ｇ´´）は、シリカ投与量の高い場合でも比較的、一定に留まる。ゲル強度の尺度としての位相角（δ）は、用量依存的に減少し、天然の粘液ゲルのそれに接近する。これの治療的利点は、粘液層が損なわれた場合の、潰瘍性大腸炎および胃潰瘍の治療である。
【０１６４】
【表１０】
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【０１６５】
シリカ（ペプシンおよび粘液で共インキュベート）は、ペプシンによって分解された粘液を用量依存的に保護することができた（表７の実施例１０）。シリカが存在しない場合、粘液はペプシンによって完全に分解され、もはやゲルでなかった（δ＞４５）。１〜２０％で投与された場合、好ましい粒径１〜１８０ｎｍのシリカと粘液のインキュベーションは、ペプシンによるゲル特性の損失を防ぐことができた（表７）。これを、インキュベーション溶液で測定されたムチン糖タンパク質の可溶化における減少によって、繰り返した（表８）。特に、高分子量糖タンパク質分子（重合体構造を示す）の見かけの相当な妨害があり、したがって粘液ゲルのゲル特性はシリカの存在下で維持された。しかしながら、ペプシンによる分解から粘液を保護する能力は、シリカの物性に応じて変わった。シリカは、好ましくは粒径１０〜１８０ｎｍにあり、好ましくはシリカゾルの形態で投与され、また１〜２０％で投与される。実施例２１はペプシンの存在下で粘液分解の著しい阻害を示したものの（表７）、高分子量の見かけの減少を示さなかった（表８）。これは他の、小さい粒径（＜１８０ｎｍ）のシリカの振る舞いと逆であった。したがって、シリカゾルとアエロジルの形態にあるシリカとの間で作用様式が異なることを示した。
【０１６６】
【表１１】
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【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
シリカは、ペプシンの拡散を阻害することができた（表９を参照）。ペプシンが下層に達するのを防ぐこのような能力は、病変発生を妨げるのに有効であるし、またゆえに、逆流症およびディスペプシアの病状に有効である。
【０１６９】
【表１３】
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【０１７０】
シリカは、表１０で示すように、フリーラジカルを除去することができる。このことは、炎症から生じ得る損傷を制御することと関連しているかもしれない。
【０１７１】
【表１４】
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【０１７２】
【表１５】
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【０１７３】
シリカは、トリプシン（それはセリンプロテアーゼである）の酵素活性を阻害することができる（最終濃度２５０μ／ｍｌ）。活性は、試験方法６を用いてｐＨ７.６で観察され、表１１および１２で示した。
【０１７４】
【表１６】
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【０１７５】
試験方法１および２はペプシン溶液Ａを用い、試験方法３はペプシン溶液Ｄを用いた。
【０１７６】
表１３に表されるデータは、総合的な能力で最も高かったものを示す。すなわち、シリカが、臨床的に関連性のある以下の３つの基質：
コラーゲン（基底膜および皮膚の構成成分）、
タンパク質（細胞の構成要素）、および
粘液（胃腸菅に並ぶ保護的なゲル）
に対して、胃酵素ペプシン活性を阻害することができるかを示す。
【０１７７】
表１３は、１０から８０ｎｍまでの粒径のシリカ、および／または５０から３５０ｍ２／ｇまでの表面積のシリカ、および／またはゾルの形態であるシリカが、総合的に最も良い結果を出したことを示す。表面積があまりにも大きければ、ペプシン活性部位への貫通（penetration）および／または粘液層への貫通が制限されるかもしれないし、表面積があまりにも小さければ、シリカとペプシンとが接触する表面積が、ペプシン阻害を行なうのに十分でないかもしれない。
【０１７８】
表１３および上記のデータは、粒径４３００ｎｍ未満のシリカが好ましく、より好ましいのは８００ｎｍ未満であり、より好ましいのは１８０ｎｍ未満であり、さらに好ましいのは８０ｎｍ未満であり、最も好ましいのは２０ｎｍ未満であることを示す。シリカは、好ましくはヒドロゲルの懸濁剤（すなわち、ルシライト）の形態で投与され、より好ましくはスポンジ・タイプのシリカの懸濁剤（すなわち、ガシルタイプ）、より一層好ましいのは懸濁剤（すなわち、製粉したガシル）としてであり、さらに好ましいのはコロイドシリカの懸濁剤（カオリン、アエロジル）としてであり、最も好ましいのはゾルの形態（すなわち、ナノゾル）である。上述したシリカタイプは、粉末の形態で投与されるてもよい。
【０１７９】
本発明に記載した態様の様々な修飾および変更をすることは、本発明の範囲と精神から逸脱しない範囲で当業者にとって明らかなことである。本発明は特定の好ましい態様との関連で記載しているものの、特許請求される本発明が、そのような特定の態様によって不当に制限されるべきでないことは理解されよう。実際、本発明を実行するために記載された形態の様々な修飾は関連分野の当業者にとって明らかなことであり、特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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