(57)【要約】【課題】成長ホルモンポリペプチド並びにその作成及び使用方法の提供。【解決手段】本発明は、伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合した成長ホルモンを含む組成物、その組成物をコードしている単離した核酸、それを含むベクター及び宿主細胞、並びにそのような組成物の作出方法、そして成長ホルモン関連疾患、障害及び症状の治療におけるそれら組成物の使用に関する。本開示は、成長ホルモンを投与することにより改善される、回復する、又は阻害される、任意の疾患、障害、又は状態の治療に有効である可能性のある組成物及び方法を指向する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府後援研究に関する説明）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からのＳＢＩＲ助成２Ｒ４４ＧＭ０７９８７３−０２のもと、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、全てが係属中である、２００９年６月８日に出願の米国仮特許出願第６１／１８５，１１２号、２００９年８月２５日に出願の同６１／２３６，８３６号、及び２００９年１１月１０日に出願の同６１／２８０，９５５号、並びにその両方が２０１０年２月３日に出願された米国特許出願第１２／６９９，７６１号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２３１０６号の優先権を主張するものであり、これらの全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、ヒトの成長及び発生の制御に関わるホルモンである。ソマトトロピンとしても知られる成長ホルモン（本明細書においては以下「ＧＨ」とする）は、下垂体前葉で生産され、そこから分泌される、あるクラスのタンパク様ホルモンである。ＧＨの分泌は視床下部からの成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）によって刺激され、そしてソマトスタチンにより抑制される。この下垂体ホルモンは、体形成、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様及び糖尿病誘発効果などを含む、数多くの生物効果を示す（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ヒト成長ホルモンは、胎盤ホルモン、プロラクチン、及びその他の、ＧＨの遺伝的及び種による変異体を含む、類似したホルモンファミリーのメンバーである。ＧＨは、まとめてソマトメジンとして知られているいくつかのペプチドホルモンのうちの、その生理活性の大部分を占めるインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１、以前はソマトメジンＣとして知られていた）の分泌を制御する。
【０００４】
数多くの疾患及び障害は、ＧＨの欠損と関連している。欠損は、先天性のもの、小児期において後天的に発症するもの、又は成人してから後天的に発症するものである場合があり、及び部分的なもの又は完全なものである場合もある。いくつかの症例においては欠損は一過性であるが、より一般的には永久的なものであり、また、その他の下垂体ホルモンの欠損に関連して生じる場合がある。小児における成長ホルモンの欠損は、小人症、成長障害又は低身長を引き起こす。成人での欠損は稀であるが、症状は体重の減少及び骨密度の低下、並びに数多くの心理学的な症状を含む場合がある。その他のホルモン性又は腺性障害はしばしば、成長ホルモンの欠損と一致する。
【０００５】
小児期における身長増加への刺激が、ＧＨの最も広く知られている効果であり、ＧＨが軟骨の軟骨細胞の分裂及び増殖を直接刺激すること、及びＧＨがＩＧＦ−１の生産をもまた刺激することの、少なくとも２つの機序により機能していると考えられている。ＩＧＦ−１は様々な組織における成長刺激効果を有する。ＩＧＦ−１は標的組織内でさらに生成され、このことによりＩＧＦ−１は外見上、エンドクリン的及びオートクリン／パラクリン的両方のホルモンとなる。ＩＧＦ−１はまた、骨の成長を促進するための骨芽細胞及び軟骨細胞の活性にも刺激効果を有する。
【０００６】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、タンパク質、炭水化物及び脂質の代謝におけるその効果を通して、体の成長において重要な役割を果たす。体の成長へのその効果に加えて、ｈＧＨがインビトロにおいて血液細胞を刺激すること（Ｄｅｒｆａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，
１９９８；  Ｍｅｒｃｈａｖ  ｅｔ  ａｌ；  １９８８）、赤血球及びヘモグロビン数を増加させること（Ｖａｌｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｖｉｈｅｒｖｕｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）、血漿細胞株においてＩｇの増殖及び生産の両方を高めること（Ｋｉｍａｔａ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｄａ，  １９９４）及びＣＤ８＋細胞数を刺激すること、並びにＣＤ４＋細胞数の割合を減少させること（Ｇｅｆｆｎｅｒ，  １９９７）が示されてきた。
【０００７】
注入が可能な形態のＧＨが、小児及び成人におけるＧＨの欠損であるターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群用に、及び在胎期間の発育遅延用に市販されてきた。加えて、加齢に対抗するための手段及び体重管理、並びに、末梢血での血液の再生が可能な細胞の導入においても使用されている。
【０００８】
ｈＧＨの分子量が２２ｋＤＡであり、腎臓におけるろ過の閾値（約７０ｋＤａ）よりもかなり小さいことから（非特許文献４）、ヒトにおける天然のｈＧＨの半減期は２０分未満である。従って、臨床的有益性を達成するためには、市販のｈＧＨ調整物は毎日投与しなくてはならない。より少ない回数の注入を可能にする（毎日ではなく、２又は４週毎）持続放出形態のＧＨ、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ａｌｋｅｒｍｅｓ）が１９９９年、ＦＤＡにより認可されたが、この製品は２００４年に製造中止になった。
治療用タンパク質を化学的に修飾することによってそのインビボでのクリアランス率を変化させ、そしてそれに伴う血中半減期を変化させることが可能である。一般的な修飾の一例にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分の付加がある。これは典型的には、ＰＥＧのアルデヒド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基をアミン基（例えばリシン側鎖又はＮ末端）と反応させることを介してタンパク質に結合させるものである。しかしながら、この結合過程では、分離を必要とする異種産物混合物の形成を生じる場合があり、これにより、生産量が有意に低下し、製造が複雑になるために完全に化学的に単一な産物が生成されない。また、ＰＥＧ化過程においてＧＨの結合部位に隣接したアミノ酸側鎖が修飾された場合には、その薬理学的機能が妨げられる可能性がある。その他の方法には、治療用ＧＨタンパク質にＦｃドメインを遺伝的に融合させることが挙げられる。Ｆｃドメインの結合により治療用タンパク質のサイズが増大し、それにより、腎臓を介したクリアランス率が低下する。加えて、Ｆｃドメインによって、ＦｃＲｎ受容体への結合能力、及びＦｃＲｎ受容体よりリソソームから再生される能力が付与され、それにより薬物動態学的半減期が長くなる。残念ながら、Ｆｃドメインは組換え発現においては正しく折りたたまれず、封入体として知られる不溶性沈殿物を形成する傾向にある。これらの封入体は可溶化しなければならず、機能性タンパク質を、時間のかかる、非効率的な、費用のかかる工程を通して異常に折りたたまれた凝集体から復元しなければならない。従って、半減期が長く、そのためより低頻度で投与することができるがより安全で、そして生産がより簡単で、生産にかかる費用もより安い、成長ホルモン組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈａｗｌａ，  Ｒ，  Ｋ．  （１９８３）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ３４，  ５１９
【非特許文献２】Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｃ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，  ７６９
【非特許文献３】Ｔｈｏｒｎｅｒ，  Ｍ．  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８１，  ７４５
【非特許文献４】Ｃａｌｉｃｅｔｉ  （２００３）  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：１２６１−１２７７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、成長ホルモンを投与することにより改善される、回復する、又は阻害される、任意の疾患、障害、又は状態の治療に有効である可能性のある組成物及び方法を指向する。具体的には、本発明は、成長ホルモン（ＧＨ）に結合した、非反復配列及び／又は非構造性コンホメーションを有する伸張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を１つ以上含む、融合タンパク質の組成物を提供する。部分的には本開示は、融合タンパク質を含む医薬組成物、及び成長ホルモン関連疾患、障害又は状態を治療するためのその使用を指向する。
【００１１】
一実施形態において本発明は、表１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％同一の成長ホルモンを含む、単離した融合タンパク質を提供し、ここで前記成長ホルモンは少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約４００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約２０００、から約３０００アミノ酸残基までの伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合されており、ここでＸＴＥＮは（ａ）ＸＴＥＮが表３に示された配列から選択された、比較できる同等の長さのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％の同一性を示す少なくとも約２００の連続したアミノ酸を含むこと；（ｂ）ＸＴＥＮ配列中のエピトープを予測するために−５、又は−６、又は−７、又は−８、又は−９以上のスコアに基づいてＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムを用いて解析した場合、ＸＴＥＮ配列が予測されるＴ−細胞エピトープを含まないこと；（ｃ）ＸＴＥＮが１０未満、又は９未満、又は８未満、又は７未満、又は６未満、又は５未満、又はそれより低い部分列スコアを有すること；及び（ｄ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和がＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％以上を構成すること、を特徴とする。一実施形態において、単離した融合タンパク質の成長ホルモンはヒト成長ホルモンである。別の実施形態において、単離した融合タンパク質は少なくとも第二のＸＴＥＮを含み、ここでこの融合タンパク質は表５に示した多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ＸＴＥＮ配置又はその変異構造をとる。
【００１２】
別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定した場合に９０％を超えるランダムコイル構造又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％のランダムコイル構造を有すること；及びＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定した場合、ＸＴＥＮ配列は２％未満のアルファヘリックス及び２％のベータシートを有すること、を特徴とする。
【００１３】
別の実施形態において、本発明はＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、ここでＸＴＥＮは、アスパラギン及びグルタミン残基の総和がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり、メチオニン及びトリプトファン残基の総和がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であり、ＸＴＥＮ配列が有する正電荷アミノ酸残基が５％未満であり、ＧＯＲアルゴリズムを用いて決定した場合にＸＴＥＮ配列は９０％を超えるランダムコイル構造、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％のランダムコイル構造を有し；及びＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合にＸＴＥＮ配列は２％未満のアルファヘリックス及び２％のベータシートを有する、ことを特徴とする。
【００１４】
別の実施形態において本発明はＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、ここでＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％がオーバーラップしていない配列モチーフから構成されることを特徴とし、ここで各配列モチーフは約９〜約１４アミノ酸残基であり、配列中の任意の２つの連続したアミノ酸残基は各配列モチーフ中に２回より多くは存在せず、配列モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つのアミノ酸を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態においては、ＧＨＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列の３０％より多くを１種類のアミノ酸が構成することはない。その他の実施形態においてＸＴＥＮは、セリン以外には同一のアミノ酸が３つ連続したアミノ酸配列を含まず、この場合には３つの連続したアミノ酸はセリン残基でしかない。その上さらにその他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は１００％がオーバーラップしていない配列モチーフから構成され、ここで各配列モチーフは１２アミノ酸残基である。一実施形態において、ＸＴＥＮ配列はオーバーラップしていない配列モチーフから成り、ここで配列モチーフは表２の１つ以上の配列由来である。
【００１６】
いくつかの実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮと結合していないＧＨと比較して向上した薬物動態学的特性を示す。向上した特性には、より長い終末相半減期、濃度曲線下面積の増大、治療ウィンドウ中での血中濃度が維持される時間の延長、連続投与の時間間隔の増大、及び全期間中でのモル用量の減少、が含まれるがこれらには限定されない。いくつかの実施形態において、対象に投与されるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の終末相半減期は、ＸＴＥＮと結合していなく、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍、又はそれ以上にも長くなる。その他の実施形態において向上した薬物動態学的特性は、指定された期間、治療ウィンドウ中で維持されるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度が、ＸＴＥＮと結合していなく、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨのと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍長く、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍であることを反映する。半減期及び治療ウインドウ中で推移する時間がより長いことは、ＸＴＥＮに結合していない対応するＧＨと比較して、より低頻度で投与すること及び対象に投与する融合タンパク質の量（モル等量）を低減させることを可能にする。一実施形態において治療上効果的な投与計画は、融合タンパク質結合していなく、かつ、同等の用量において対象に投与される対応するＧＨと比較して、融合タンパク質の少なくとも２つの連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷の間の時間を少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は少なくとも８倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍、長くする。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは生物学的に活性なタンパク質と結合させることで、その生物学的に活性なタンパク質の熱安定性を高める。熱安定性は、生物学的に活性なタンパク質を約３７℃に少なくとも約７日間曝露した後に生理活性の保持を測定し、ＸＴＥＮに結合した生物学的に活性なタンパク質と比較することによって確かめられる。前述したうちの一実施形態において生理活性は、ＸＴＥＮを含むがＸＴＥＮと結合していないＧＨと比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、又は約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、又は約５００％より長く保持される。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、少なくとも第一のＸＴＥＮを含む単離した融合タンパク質はＧＨを含み、ここでこのＧＨはヒト成長ホルモンである。いくつかの実施形態においては、単離した融合タンパク質は第二のＸＴＥＮをさらに含み、ここで第二のＸＴＥＮは第一のＸＴＥＮと同一であっても又は異なるものであってもよく、そしてこの融合タンパク質は表５に示される多重ＸＴＥＮ配置をとる。前述したうちの一実施形態において、第一及び第二のＸＴＥＮはそれぞれ表３から選択される配列であってもよく、又は表３から選択される配列と少なくとも少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％又は１００％の配列同一性を示すものであってもよい。別の実施形態において第二のＸＴＥＮ配列を含む単離した融合タンパク質は、表５に示した多重ＸＴＥＮ配置をとる。
【００１９】
一実施形態において単離した融合タンパク質は、ＸＴＥＮと結合していないＧＨと比較して免疫原性が低い。免疫原性は、例えば、同等の用量において対象に投与した後に、生物学的に活性なタンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の生産を測定することにより確かめられる。
【００２０】
いくつかの実施形態においては、成長ホルモンペプチドと、融合タンパク質のＸＴＥＮはスペーサーを介して結合し、ここでスペーサー配列は約１個〜約５０個の範囲のアミノ酸残基から成り、任意に開裂配列を含む。一実施形態において開裂配列はプロテアーゼによる開裂に感受性である。そのようなプロテアーゼの非限定的な例としては、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビン、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７又はＭＭＰ−２０、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、及びソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａが挙げられる。
【００２１】
いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨと比較して、対応するＧＨの標的受容体に対する結合親和性が低くなるように構成される。一実施形態においては、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質がＧＨの標的受容体に対して示す結合親和性は、ＸＴＥＮをもたない対応するＧＨの約０．０１％〜３０％、又は約０．１％〜約２０％、又は約１％〜約１５％、又は約２％〜約１０％の範囲である。別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＧＨの標的受容体に対して、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して少なくとも約３倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１７倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍低い結合親和性を示す。関連する実施形態において、低い親和性を有する融合タンパク質は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨと比較して、低い受容体介在性クリアランス及びそれに相当する、少なくとも約３倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１７倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍長い半減期を有する場合がある。
【００２２】
一実施形態において本発明は、表３５、表３６、及び表３７から選択される配列と、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離したＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、本発明はＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、ここでＧＨＸＴＥＮは、融合タンパク質に結合していないＧＨと比較して、生理学的条件において少なくとも３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも６０倍高い溶解度を示す。
【００２４】
いくつかの実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーで決定した場合に、実際の分子量よりも大きい見かけの分子量（Ａｐｐａｒｅｎｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ）を示す。ここでこの見かけの分子量は、少なくとも約１００ｋＤ、又は少なくとも約１５０ｋＤ、又は少なくとも約２００ｋＤ、又は少なくとも約３００ｋＤ、又は少なくとも約４００ｋＤ、又は少なくとも約５００ｋＤ、又は少なくとも約６００ｋＤ、又は少なくとも約７００ｋＤであるが、融合タンパク質の各ＧＨ構成要素の実際の分子量は約２５ｋＤ未満である。従って、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質の実際の分子量よりも約４倍大きい、又は約５倍大きい、又は約６倍大きい、又は約７倍大きい、又は約８倍大きい見かけの分子量を有する場合がある。場合により、前述した実施形態の単離したＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は生理学的条件下において、約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８より大きい見かけの分子量因子を示す。
【００２５】
本発明は、表１から選択されるＧＨ（又は断片若しくはその配列変異体）、表３から選択されるＸＴＥＮ（又はその配列変異体）を含み、表５から選択される構造をとるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を検討するが、組成物の配列及び構造はこれらには限定されない。通常、生じるＧＨＸＴＥＮは、ＸＴＥＮと結合していない対応するＧＨの生理活性を少なくとも部分的には保持するだろう。その他の例においてＧＨ構成要素は、ＧＨＸＴＥＮ中にスペーサー配列と共に組み入れられた任意の開裂配列による開裂よってＸＴＥＮから放出される際に、生物学的に活性なもの又は活性が増したもののいずれかとなる。
【００２６】
ＧＨＸＴＥＮ組成物の一実施形態において本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供し、（ＸＴＥＮ）ｘ−ＧＨ−（ＸＴＥＮ）ｙ：Ｉ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；ｘは０又は１のいずれかであり、及びｙは０又は１であり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
いくつかの実施形態においては、ＸＴＥＮを成長ホルモンのＮ−又はＣ−末端を介して成長ホルモンに融合させる。いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、ヒト成長ホルモン並びにＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＥ１４４、及びＡＥ２８８から選択される第一及び第二のＸＴＥＮを含む。
【００２７】
ＧＨＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ：ＩＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり及びｙは０又は１のいずれかであり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００２８】
別の実施形態では本発明は、融合タンパク質が式ＩＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＧＨ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）ｚ：ＩＩＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００２９】
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＩＶの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）−（ＧＨ）：ＩＶ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００３０】
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式Ｖの融合タンパク質である、単離した融合成長ホルモンを提供し、
（ＧＨ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）：Ｖ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００３１】
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）：ＶＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００３２】
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）−（ＸＴＥＮ）：ＶＩＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００３３】
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩＩの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（（Ｓ）ｍ−（ＧＨ）ｘ−（Ｓ）ｎ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｏ）ｔ：ＶＩＩＩ
式中、（１）ｘ＋ｙ＞１、（２）ｔ＝１、ｘ＞０及びｙ＞０である場合、（３）１つより多いＧＨ、Ｓ、又はＸＴＥＮが含まれ、ＧＨ、ＸＴＥＮ、又はＳがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合；及び（４）ｔ＞１であり、各サブユニット中に含まれるｍ、ｎ、ｏ、ｘ、又はｙがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合以外は、ｔは０より大きい整数であり（１、２、３、など）；ｍ、ｎ、ｏ、ｘ、及びｙはそれぞれ独立して整数であり（０、１、２、３、など）、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは任意に開裂部位を含むスペーサーであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【００３４】
いくつかの実施形態においては、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質をそれを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮと結合していない対応するＧＨであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨと比較して、融合タンパク質が治療ウインドウ中で推移する時間が少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍以上に延長される。その他の例においては、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質をそれを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮに結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量において投与されるＧＨの連続投与の間隔と比較して、治療上効果的な用量計画を維持するために必要な連続投与の間隔を少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間、又は少なくとも約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約１４日間、又は少なくとも約２１日間延長することができる。
【００３５】
ＧＨ、ＸＴＥＮ、及び任意のスペーサー配列のＮ末端からＣ末端にかけての配置が異なるように、融合タンパク質を設計することができる。これら配置の例にはＸＴＥＮ−ＧＨ、ＧＨ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−Ｓ−ＧＨ、ＧＨ−Ｓ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＧＨ−ＸＴＥＮ、ＧＨ−ＧＨ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＧＨ−ＧＨ、ＧＨ−Ｓ−ＧＨ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＧＨ−Ｓ−ＧＨ、及びその多量体が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書に開示したように、配置の選択により、特定の薬物動態学的、物理／化学的、又は薬理学的特性を付与することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、（ｉ）ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと比較してより長い半減期を有する；（ｉｉ）他の点では同等の用量計画において、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；（ｉｉｉ）他の点では同等の用量計画において、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する；（ｉｖ）他の点では同等のモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも低頻度で融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；（ｖ）他の点では同等のモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも低頻度で融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する；（ｖｉ）他の点では同等の投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも累積して少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；又は（ｖｉｉ）他の点では同等の投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも累積して少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する；ことを特徴とする。
【００３７】
一実施形態において、上述した式Ｉ〜ＶＩＩＩのＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に結合していないＧＨの生理活性と比較して、少なくとも約０．１％、又は少なくとも約０．１％、又は少なくとも約１％、又は少なくとも約２％、又は少なくとも約３％、又は少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の生理活性を示す。別の実施形態において式Ｉ〜ＶＩＩＩのＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に共有結合していない対応する生物学的に活性な親タンパク質と同じ受容体又はリガンドに結合する。
【００３８】
本発明は、（ａ）融合タンパク質をコードしている組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を準備する工程、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能にする条件下において宿主細胞を培養する工程；及び（ｃ）融合タンパク質を回収する工程、を含む、成長ホルモンを１つ以上の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合させた融合タンパク質の生産方法を提供する。本方法の一実施形態において、融合タンパク質の成長ホルモンは、ヒト成長ホルモン又は表１から選択された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本方法の別の実施形態において、発現させた融合タンパク質中の１つ以上のＸＴＥＮは、表３から選択された配列と、少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％から約１００％の配列同一性を有する。本方法の別の実施形態において、ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞中での前記融合タンパク質の発現を高めるためにコドン最適化したものである。本方法の別の実施形態においては、宿主細胞は原核細胞である。本方法の別の実施形態において宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。本方法の別の実施形態において単離した融合タンパク質は、宿主細胞の細胞質から、実質的に可溶な形態で回収される。
【００３９】
本発明は、（ａ）前述した実施形態のいずれかの融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド、又は（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補鎖、から選択されたポリヌクレオチド配列を含む、単離した核酸を提供する。一実施形態において本発明は、（ａ）表３５、表３６、及び表３７から選択された、同等の長さのポリヌクレオチド配列；又は（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補鎖と、少なくとも８０％の配列同一性、又は約８５％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％から約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離した核酸を提供する。本発明は、この段落で上述した実施形態のうちのいずれかの核酸を含む、発現ベクターを提供する。一実施形態において前述の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した組換え制御配列をさらに含む。別の実施形態において前述した発現ベクターのポリヌクレオチド配列は、分泌シグナル配列をコードしているポリヌクレオチドにインフレームで融合させたものであり、このシグナル配列は原核性のシグナル配列であってもよい。一実施形態において、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＰｈｏＡシグナル配列から選択される。
【００４０】
本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は前述した段落で開示した発現ベクターを含んでいてもよい。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
【００４１】
一実施形態において本発明は、前述したいずれかの実施形態の融合タンパク質及び薬学上許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。別の実施形態において本発明は、包装材及び前述した実施形態の医薬組成物を含む少なくとも第一の容器、並びに医薬組成物及び保管及び操作条件を指示するラベル、並びに再構成及び／又は対象への医薬組成物の投与についての説明を記載したシートを含むキットを提供する。
【００４２】
本発明は、治療上有効量の、前述したいずれかの実施形態の融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、対象における成長ホルモン関連疾患の治療方法を提供する。本方法の一実施形態においては、成長ホルモン関連疾患は、成長ホルモン欠損、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、特発性低身長、ＡＩＤＳ消耗症候群、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び筋ジストロフィーから選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態においては組成物を、皮下に、筋内に、又は静脈内に投与することができる。一実施形態においては、組成物を治療上有効量で投与する。一実施形態において治療上有効量とは、融合タンパク質のＧＨに対応するが融合タンパク質に結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨと比較して、融合タンパク質が治療ウインドウ中で推移する期間の延長をもたらす。治療ウインドウ中で推移する時間の延長は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨよりも少なくとも３倍長くなる場合があり、あるいは、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨよりも少なくとも４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍、長くなる可能性がある。本治療方法のいくつかの実施形態においては、（ｉ）他の点では同等の用量計画において、ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと比較して、より少ないモル量（例えば約１／２未満、又は約１／３倍未満、又は約１／４未満、又は約１／５未満、又は約１／６未何、又は約１／８未満、又は約１／１００未満又はそれより少ない量）の融合タンパク質を投与した場合に、融合タンパク質は、ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積及び／又は同等の治療効果を達成する；（ｉｉ）融合タンパク質を、ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンより低頻度で（例えば、隔日、約７日おきに、約１４日おきに、約２１日おきに、又は約１ヶ月おきに）、かつ、他の点では同じ用量で投与した場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積及び／又は同等の治療効果を達成する；又は（ｉｉｉ）ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと比較して、累積してより少ないモル量（例えば約５％、又は約１０％、又は約２０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％未満）の融合タンパク質を、他の点では同じ投与計画で投与した場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積及び／又は同等の治療効果を達成する。累積してより少ないモル量は、少なくとも約１週間、又は約１４日、又は約２１日、又は約１ヶ月おきに測定する。本方法のいくつかの実施形態においては、ＩＧＦ−１濃度、ＩＧＦＢＰ３濃度、身長発育速度、除脂肪体重、体脂肪総量、主要脂肪、インスリン耐性試験への反応、軟骨細胞の分裂速度、軟骨細胞数、骨密度、骨成長、及び骨端板幅の増加、から選択される指標により、治療効果を測定する。
【００４４】
別の実施形態において本発明は、治療上効果的な用量計画に則って、前述した医薬組成物を対象に複数回連続して投与する工程を含む、疾患、障害又は状態の治療方法を提供する。前述した一実施形態において、治療上効果的な用量計画は、対応する融合タンパク質のＧＨではあるが融合タンパク質と結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨと比較して、融合タンパク質の少なくとも２つの連続した血中レベルのＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷の間の時間を少なくとも３倍、あるいは少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は７倍、又は少なくとも８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍、長くするものである。前述した別の実施形態においては、融合タンパク質に結合していない対応する生物学的に活性なタンパク質構成要素であって、かつ、治療上効果的な投与計画に則って対象に投与されるタンパク質構成要素と比較して、融合タンパク質をより低頻度で又は医薬組成物中の融合タンパク質をモル量においてより少ない総量で投与することは、成長ホルモン関連疾患の少なくとも１つの測定指標の改善をもたらす。
【００４５】
本発明は、疾患、障害又は状態の治療用薬物として調製された、前述したいずれかの実施形態の融合タンパク質を含む組成物の、それを必要とする対象における使用をさらに提供する。前述した一実施形態において、疾患、障害又は状態は、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、特発性低身長、ＡＩＤＳ消耗症候群、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び筋ジストロフィーから成る群より選択される。目的の適応に応じて、開示した任意の実施形態を、単独で又は併用で実施することができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
表１から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である成長ホルモン（ＧＨ）を含む単離した融合タンパク質であって、前記成長ホルモンは少なくとも約２００アミノ酸残基の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合しており、そして該ＸＴＥＮが、
（ａ）該ＸＴＥＮ配列が、表３から選択された同等の長さのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す、少なくとも約２００の連続したアミノ酸を含み；
（ｂ）−９又はそれを超えるスコアに基づくＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによってＸＴＥＮ配列中にあるエピトープの予測を行った場合に、該ＸＴＥＮ配列は予測されるＴ細胞エピトープを含まず；
（ｃ）１０未満の部分列スコアを有し；及び
（ｄ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和が、ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９０％より多くを構成することを特徴とする、
単離した融合タンパク質。
（項目２）
該成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、項目１に記載の単離した融合タンパク質。
（項目３）
第二のＸＴＥＮ配列をさらに含む単離した融合タンパク質であって、かつ、該融合タンパク質が表５に示した多重ＸＴＥＮ配置をとる、項目１又は２に記載の単離した融合タンパク質。
（項目４）
該成長ホルモンペプチド及び該ＸＴＥＮがスペーサーを介して結合しており、ここで該スペーサー配列が１〜約５０までのアミノ酸残基を含み、そして該スペーサーが開裂配列を任意に含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離した融合タンパク質。
（項目５）
該融合タンパク質が、ＸＴＥＮをもたない対応する天然の成長ホルモンと同じ標的受容体に結合し、かつ、前記融合タンパク質が、ＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンの結合親和性の少なくとも約０．１％〜３０％を保持する、項目１〜４のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目６）
表３５、表３６、及び表３７から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１〜５のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目７）
項目１〜６のいずれかに記載の単離した融合タンパク質及び薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物。
（項目８）
式Ｉに従って配置される、項目１〜６のいずれかに記載の単離したタンパク質であって、
（ＸＴＥＮ）ｘ−ＧＨ−（ＸＴＥＮ）ｙ      （Ｉ）
式中、各産物について独立して：
（ａ）ｘは０又は１のいずれかであり；及び
（ｂ）ｙは０又は１のいずれかであり、
ここでｘ＋ｙ≧１である、
単離したタンパク質。
（項目９）
該ＸＴＥＮを、該成長ホルモンのＮ末端又はＣ末端を介して成長ホルモンに融合させた、項目１〜６のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目１０）
ヒト成長ホルモン、並びにＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＥ１４４、及びＡＥ２８８から選択された第一の及び第二のＸＴＥＮを含む、項目１〜６及び８〜９のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目１１）
項目１〜６及び８〜１０のいずれかに記載の単離した融合タンパク質であって、
（ｉ）対象に投与した場合のＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと比較して、同等のモル用量で対象に投与した場合に、該融合タンパク質がより長い終末相半減期を有する；
（ｉｉ）他の点では同等な投与計画で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも、少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；
（ｉｉｉ）他の点では同等な投与計画で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも、少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する；
（ｉｖ）他の点では同等なモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも、該融合タンパク質を低頻度で投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；
（ｖ）他の点では同等なモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも、該融合タンパク質を低頻度で投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する；
（ｖｉ）他の点では同等な投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも、累積してより少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；又は
（ｖｉｉ）他の点では同等な投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも、累積してより少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する、ことを特徴とする、
単離した融合タンパク質。
（項目１２）
１つ以上の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合させた成長ホルモン（ＧＨ）を含む融合タンパク質の生産方法であって、
（ａ）項目１又は６に記載の融合タンパク質をコードしている組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を準備する工程；
（ｂ）該融合タンパク質が発現できる条件下において該宿主細胞を培養する工程；及び
（ｃ）該融合タンパク質を回収する工程を含む、生産方法。
（項目１３）
該融合タンパク質の該成長ホルモンが、
（ａ）ヒト成長ホルモン；又は
（ｂ）表１から選択された配列
と、少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
発現した融合タンパク質中の１つ以上のＸＴＥＮが、表３から選択された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１２又は１３に記載の方法。
（項目１５）
該融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子が、表３５、表３６、及び表３７から選択された核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列を含む、項目１２〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記融合タンパク質の該宿主細胞中での発現を高めるために、該ポリヌクレオチドのコドンを最適化する、項目１２〜１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
該宿主細胞が原核細胞である、項目１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
該宿主細胞の細胞質から、該単離した融合タンパク質を実質的に可溶性の形態で回収する、項目１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
項目１〜６及び８〜１１の融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む、単離した核酸。
（項目２０）
項目１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２１）
項目１９に記載の核酸を含み、かつ、原核宿主細胞である、単離した宿主細胞。
（項目２２）
治療上有効量の、項目１〜６及び８〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、対象における成長ホルモンに関連した状態の治療方法。
（項目２３）
該成長ホルモンに関連した状態が、成長ホルモンの欠如、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、特発性低身長、ＡＩＤＳ消耗症候群、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び筋ジストロフィーから選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
該治療上有効量が、該融合タンパク質の治療ウインドウ中での該融合タンパク質の血中濃度を、同等の量で対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する天然の成長ホルモンと比較して、少なくとも３倍長く維持する、項目２２又は２３に記載の方法。
（項目２５）
治療上効果的な用量計画に則って該融合タンパク質を対象に１回以上連続して投与すると、該融合タンパク質の血中レベルの連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷の間の時間が、ＧＨの確立された治療上の投与計画に則って投与される該融合タンパク質に結合していない対応する成長ホルモンと比較して長くなる、項目２２〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
項目２２〜２５のいずれかに記載の方法であって、
（ｉ）他の点では同等の投与計画で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも少ないモル量の該融合タンパク質を対象に投与すると、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等な治療効果を達成する；
（ｉｉ）他の点では同等のモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンよりも該融合タンパク質を低頻度で投与すると、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等な治療効果を達成する；又は
（ｉｉｉ）他の点では同等の投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと比較して、累積してより少ないモル量の該融合タンパク質を投与すると、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応する成長ホルモンと同等な治療効果を達成する、方法。
（項目２７）
該治療効果が、ＩＧＦ−１濃度、ＩＧＦＢＰ３濃度、身長発育速度、除脂肪体重、総体脂肪、体幹脂質、インスリン耐性試験への反応、軟骨細胞の分裂速度、軟骨細胞数、骨密度、骨成長、及び骨端板幅の増加、から選択される測定指標である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
項目７に記載の医薬組成物、該医薬組成物を識別するラベル、並びに、保管、再構成及び／又は該医薬組成物の対象への投与についての取扱説明書を含むキット。
【００４６】
それぞれの個々の出版物、特許、又は特許出願を、参照により組み入れられることを特に個別に示した場合と同じように、本明細書において言及した全ての出版物、特許、及び特許出願は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
本発明の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び具体的な実施形態に示した、付随する図表を参照することによりさらに説明され得る。
【図１】図１は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（図１Ａ〜Ｈ）の例を示す模式図であり、全てはＮ末端からＣ末端方向に図示されている。図１Ａは、それぞれが単一の成長ホルモン（ＧＨ）及びＸＴＥＮを含む、異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）を示し、第一の融合タンパク質はＸＴＥＮ分子を有し（１０２）、そのＸＴＥＮ分子はＧＨのＣ末端に結合し（１０３）、そして第二の融合タンパク質はＧＨのＮ末端に結合するＸＴＥＮ分子を有する（１０３）。図１Ｂはそれぞれが単一のＧＨ、スペーサー配列及びＸＴＥＮを含む、２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）を示し、第一の融合タンパク質はＸＴＥＮ分子を有し（１０２）、そのＸＴＥＮ分子はスペーサー配列のＣ末端に結合し（１０４）そしてスペーサー配列はＧＨのＣ末端に結合しており（１０３）、第二の融合タンパク質はスペーサー配列のＮ末端に結合するＸＴＥＮ分子を有し（１０４）そしてスペーサー配列はＧＨのＮ末端に結合している（１０３）。図１Ｃは、それぞれが２つの単一のＧＨ分子及び１つのＸＴＥＮ分子を含む２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、第一の融合タンパク質は第一のＧＨのＣ末端に結合したＸＴＥＮを有し、かつそのＧＨは第二のＧＨのＣ末端に結合し、そして第二の融合タンパク質は第一のＧＨのＮ末端にＸＴＥＮが結合し、第一のＧＨが第二のＧＨのＮ末端に結合する、反対向きの配置をとる。図１Ｄは、それぞれが２つの単一のＧＨ分子、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ分子を含む、２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、第一の融合タンパク質は第一はスペーサー配列のＣ末端に結合しているＸＴＥＮを有し、そしてスペーサー配列は第一のＧＨのＣ末端に結合し、第一のＧＨは第二のＧＨのＣ末端に結合しており、第二の融合タンパク質は、ＸＴＥＮがスペーサー配列のＮ末端に結合し、そしてスペーサー配列が第一のＧＨのＮ末端に結合し、第一のＧＨが第二のＧＨのＮ末端に結合している、反対向きの配置をとる。図１Ｅは、それぞれが２つの単一のＧＨ分子、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ分子を含む、２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、第一の融合タンパク質は第一のＧＨのＣ末端に結合したＸＴＥＮを有し、そして第一のＧＨはスペーサー配列のＣ末端に結合し、このスペーサー配列は第二のＧＨ分子のＣ末端に結合しており、第二の融合タンパク質は、ＸＴＥＮが第一のＧＨのＮ末端に結合し、第一のＧＨがスペーサー配列のＮ末端に結合し、同様にスペーサー配列が第二のＧＨ分子のＮ末端に結合している、反対向きの配置をとる。図１Ｆは、それぞれが１つのＧＨ分子及びＧＨのＮ末端及びＣ末端に結合した２つのＸＴＥＮ分子を含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）の配置を示す。図１Ｇは、２つのＸＴＥＮが単一のＧＨに結合した融合タンパク質の配置（１０６）を示し、ここで第二のＸＴＥＮとＧＨはスペーサー配列により離されている。図１Ｈは、２つのＧＨが２つのＸＴＥＮに結合した融合タンパク質の配置（１０６）を示し、ここで第二のＸＴＥＮは第一のＧＨのＣ末端に結合しており、第二のＧＨのＮ末端はＧＨＸＴＥＮのＣ末端に相当する。
【図２】図２は、図１の対応するＧＨＸＴＥＮポリペプチドをコードするＧＨＸＴＥＮ遺伝子のポリヌクレオチド構築物（図２Ａ−Ｈ）の例を示す模式図であり、全ては５’から３’方向に図示されている。これらＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子の具体例は、１つのＧＨ及びＸＴＥＮ（２００）；又は１つのＧＨ、１つのスペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ（２００）；２つのＧＨ及び１つのＸＴＥＮ（２０１）；又は２つのＧＨ、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ（２０１）；１つのＧＨ及び２つのＸＴＥＮ（２０５）；又は２つのＧＨ及び２つのＸＴＥＮ（２０６）を含む。これらの図においては、ポリヌクレオチドは以下の要素をコードし、全ての配列はインフレームで結合される：ＸＴＥＮ（２０２）、ＧＨ（２０３）、及び開裂配列を含む場合のあるスペーサーアミノ酸（２０４）。
【図３−１】図３は、２つの単量体ＧＨＸＴＥＮの例、及びその単量体融合タンパク質が、細胞表面にある標的受容体に結合する能力（その後細胞シグナル伝達を誘導する）を模式的に示す図である。図３Ａは、ＧＨ（１０３）及びＸＴＥＮ（１０２）からなるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）及び２つのＸＴＥＮ（１０５）に結合しているＧＨからなる  第二のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）を示す。図３Ｂは、Ｃ末端にＧＨを有するＧＨＸＴＥＮ（１００）及びＣ末端にＸＴＥＮを有するＧＨＸＴＥＮ（１０５）と、細胞表面（１０７）上の標的受容体（１０８）との間の相互作用を示す。この例においては、ＧＨが何も結合していない（フリーの）Ｃ末端を有する場合には受容体と高い親和性での結合を示すが、Ｃ末端にＸＴＥＮを有するＧＨＸＴＥＮは受容体としっかりと結合せず、図３Ｃに見られるとように解離する。図３Ｄは、高い親和性で結合したＧＨＸＴＥＮ（１００）は受容体（１０６）との結合を維持し、細胞中のエンドソーム（１１０）内に取り込まれることを示し、これは結合したＧＨの受容体介在性クリアランス及び細胞シグナル伝達の誘発（１０９）（細胞質を点描で色つけすることによって示した）を説明するものである。
【図３−２】図３は、２つの単量体ＧＨＸＴＥＮの例、及びその単量体融合タンパク質が、細胞表面にある標的受容体に結合する能力（その後細胞シグナル伝達を誘導する）を模式的に示す図である。図３Ａは、ＧＨ（１０３）及びＸＴＥＮ（１０２）からなるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）及び２つのＸＴＥＮ（１０５）に結合しているＧＨからなる  第二のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）を示す。図３Ｂは、Ｃ末端にＧＨを有するＧＨＸＴＥＮ（１００）及びＣ末端にＸＴＥＮを有するＧＨＸＴＥＮ（１０５）と、細胞表面（１０７）上の標的受容体（１０８）との間の相互作用を示す。この例においては、ＧＨが何も結合していない（フリーの）Ｃ末端を有する場合には受容体と高い親和性での結合を示すが、Ｃ末端にＸＴＥＮを有するＧＨＸＴＥＮは受容体としっかりと結合せず、図３Ｃに見られるとように解離する。図３Ｄは、高い親和性で結合したＧＨＸＴＥＮ（１００）は受容体（１０６）との結合を維持し、細胞中のエンドソーム（１１０）内に取り込まれることを示し、これは結合したＧＨの受容体介在性クリアランス及び細胞シグナル伝達の誘発（１０９）（細胞質を点描で色つけすることによって示した）を説明するものである。
【図４】図４は、ＸＴＥＮの組み立て、生産及び評価の、代表的な工程を示すフローチャートの模式図である。
【図５】図５は、融合タンパク質をコードしているＧＨＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み立てについての、代表的な工程を示すフローチャートの模式図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２アミノ酸（「１２−ｍｅｒ」）のモチーフである配列モチーフ５０２になるようにアニーリングさせ、これを次にＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ制限酵素部位を有するオリゴ５０３とライゲーションする。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が得られるまで、ライブラリー由来の配列モチーフを１２−ｍｅｒにさらにアニーリングさせる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングする。ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位を含むストッパー配列５０７、及びエキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４遺伝子５０８をコードし、その結果ＸＴＥＮ−ＧＨ融合タンパク質をコードしている遺伝子５００が得られる。
【図６】図６は、成長ホルモン（ＧＨ）及びＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードしている遺伝子の組み立て、その発現及び融合タンパク質としての回収、並びに候補ＧＨＸＴＥＮ産物としての評価における、代表的な工程を示すフローチャートの模式図である。
【図７】図７は、異なる処理方法を用いた、ＧＨＸＴＥＮ発現ベクターの設計を示す模式図である。図７Ａは、ＧＨをコードしている配列とその３’末端に融合させたＸＴＥＮをコードしている発現ベクターの例を示す。ここで留意すべき点は、このベクターにはさらなるリーダー配列を必要としないことである。図７Ｂは、ＣＢＤリーダー配列及びＴＥＶプロテアーゼ部位を有し、ＧＨをコードしている配列の５’末端に融合させたＸＴＥＮをコードしている発現ベクターを図示している。図７ＣはＣＢＤ及びＴＥＶプロセッシング部位を最適化したＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）に置き換えた以外は図７Ｂと同様の発現ベクターを図示する。図７Ｄは、ＮＴＳ配列、ＸＴＥＮ、ＧＨをコードしている配列、及びさらに第二のＸＴＥＮをコードしている配列をコードしている発現ベクターを図示している。
【図８】図８は、実施例２２に記載した、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードしている配列、それに結合したｈＧＨに、及びその下流、ＸＴＥＮのＣ末端に１４４又は２８８ＸＴＥＮのいずれかをコードしている配列を結合させたＧＨＸＴＥＮ遺伝子の、工程毎の構築物を示す模式図である。
【図９】図９は、図の横軸に示した、ＧＦＰ及びＸＴＥＮ配列を含む構築物の発現アッセイの結果を示す。レポーターであるＧＦＰの発現量を決定するために、発現培養を蛍光プレートリーダーを用いて（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）アッセイした。箱髭図でグラフ化したように、結果は、中間値の発現レベルは、「基準」であるＣＢＤＮ末端ヘルパードメインの発現と比較しておよそ半分の発現レベルであるが、ライブラリー由来の最も良いクローンの発現レベルは基準に非常に近いことを示し、このことはそれらの配列周辺のさらなる最適化の根拠となる。結果はまた、ＭＡアミノ酸から始まるライブラリーはＭＥから始まるものよりもよい発現レベルを有したことを示す（実施例１４を参照のこと）。
【図１０】図１０は、Ｎ末端から３番目及び４番目のコドン最適化のために、クローンＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７及びＬＣＷ５５２由来のクローンについてランダム化を行った、３種類のライブラリーを示す。図に示したようにこのライブラリーは、３番目及び４番目の残基がＸＴＥＮコドンの可能な限り全て組み合わせをとるように、これら残基を変更することにより設計された。各ライブラリーが可能な限り全てＸＴＥＮコドンを含むように、３番目及び４番目の残基がそれぞれ異なるコドンを有する１２アミノ酸をコードしている９対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、そしてＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素部位で切断したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）にライゲーションし、及び大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換して、３種類のライブラリーＬＣＷ０５６９、ＬＣＷ０５７０、及びＬＣＷ０５７１からのコロニーを得た。
【図１１】図１１は、実施例１５に記載したように、最適化工程を行った後に再試験した上位７５クローンの、基準であるＣＢＤ＿ＡＭ８７５構築物に対するＧＦＰ蛍光シグナルについての結果を示すヒストグラムである。結果は、ここでは、いくつかのクローンが基準よりも非常に良いことを示す。
【図１２】図１２は、Ｎ末端４８アミノ酸の２つの領域の好ましいコドン最適化の組み合わせを見いだすために用いた、コンビナトリアル手法の模式図である。この手法により、ＸＴＥＮタンパクの発現の最適化を向上させるためのＮ末端用の新規４８ｍｅｒを作出し、これはＸＴＥＮがＧＨのＮ末端にある場合に、ＸＴＥＮタンパク質を発現させ得るリーダー配列となった。
【図１３】図１３は、実施例１７に記載した、ＸＴＥＮのＮ末端のコドンを最適化した実験により得られた好ましいクローンの発現を、構築物配列のＮ末端にＣＢＤリーダー配列を含む基準となるＸＴＥＮクローンと比較して確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを示す。
【図１４】図１４は、ＧＦＰのＮ末端にＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を融合させた融合タンパク質の安定性試験からの、試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（実施例３９を参照のこと）。ＧＦＰ−ＸＴＥＮを、カニクイザルの血漿及びラット腎臓溶解物中で、３７℃で最長７日までインキュベートした。さらに、ＧＦＰ−ＸＴＥＮをカニクイザルに投与した場合についてもまた評価した。試料を０、１及び７日目に採血し、そしてＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解析し、その後ウェスタン解析及びＧＦＰに対する抗体を用いた検出により検出した。
【図１５】図１５は、実施例２５に記載したように、Ｋ２８８ポリペプチドに融合させたｈＧＨと結合させていないｈＧＨの結合活性を比較する、ｈＧＨの受容体結合アッセイの結果を示す。
【図１６】図１６は、実施例２５に記載した、ｈＧＨＲ−Ｆｃに対するｈＧＨ−ＡＭ８６４（丸）及びＡＭ８６４−ｈＧＨ（逆向きの三角）のインビトロ結合アッセイの結果を示す。修飾していない組換えｈＧＨ（四角）を対照として示す。
【図１７】図１７は、実施例２６に記載したように、ｈＧＨ及びＡＭ８６４−ｈＧＨの安定性への熱処理の効果を示す。図１７Ａは、２５℃及び８０℃で１５分間処理した２種類の調整物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、図１７Ｂは、２５℃での処理に対する８０℃で処理した試料の受容体結合活性に対応するパーセンテージとの間を示す。この結果は、ＸＴＥＮにより、ｈＧＨ及びＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に、熱安定性及び活性の保持が付与されることを示している。
【図１８】図１８は、実施例２５に記載したように、Ｃ末端ＸＴＥＮの付加が、ＧＨＸＴＥＮがＧＨ受容体に結合する、結合親和性を低下させる能力を決定するために行った、ＥＬＩＳＡベースのアッセイの結果を示す。
【図１９】図１９は、実施例１９に記載したように、Ｋ２８８に融合させたｈＧＨの、精製過程ごとの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図２０】図２０は、ｈＧＨ−Ｙ５７６及びＹ５７６−ｈＧＨの配置でＹ５７６に融合させたｈＧＨの最終的な精製タンパク質５μｇを用い、実施例２４に記載したように、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者の説明に従って行った、非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図２１】図２１は、実施例２４に記載したように行い、重ねて示した、２種類のＧＨＸＴＥＮ構築物、Ｙ５７６−ＧＨ及びｈＧＨ−Ｙ５７６（ＮからＣ末端）のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す。
【図２２】図２２は、実施例３０に記載したように、カニクイザルに静脈内投与した後の、２種類のＧＨＸＴＥＮ構築物Ｙ５７６−ＧＨ及びｈＧＨ−Ｙ５７６（ＮからＣ末端）の薬物動態学的プロファイルを示す。結果は、ｈＧＨのＸＴＥＮに対する向き（Ｎ末端対Ｃ末端）は、融合タンパク質のクリアランスには影響を及ぼさないことを示す。
【図２３】図２３は、実施例３０に記載したように、カニクイザルの皮下に５ｍｇ／ｋｇのＡＭ８６４−ｈＧＨを単回投与した後の薬物動態学的プロファイルを、同等のｈＧＨ濃度から得られたプロファイル（破線）と共に示す。３３時間後の終末相半減期をＷｉｎＮｏｎＬｉｎによりシングルコンパートメントフィッティングを用いて計算した。
【図２４】図２４は、実施例２７に記載したように、記載した用量のｈＧＨ又はＧＨＸＴＥＮ  ＡＭ８６４−ｈＧＨの投与に反応した、カニクイザルでのＩＧＦ−１分泌の結果を示す。
【図２５】図２５は、実施例２８に記載したように、体重１ｋｇ当たりに、記載した用量のｈＧＨ又はＡＭ８６４−ｈＧＨを投与した場合の、低酸素ラットモデルにおける効果を示す。結果は、より低頻度で投与した場合においても、ＧＨＸＴＥＮ構築物による生理活性の保持はｈＧＨの効力と同等であることを示す。
【図２６】図２６は、実施例２９に記載したように、低酸素ラットの頸骨骨端板の軟骨成長における偽薬、ｈＧＨ、及びＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の比較効果を示す。図は９日間処理した頸骨の組織学的横断面を示す。
【図２７】図２７は、実施例３１に記載したように皮下経路でラットに投与した、ｈＧＨ  ＧＨＴＸＥＮ融合タンパク質の薬物動態学的な結果を、修飾していない組換えｈＧＨと比較して示す。
【図２８】図２８は、実施例３２に記載したように、カニクイザルに皮下投与した後の、３種類のｈＧＨ  ＸＴＥＮ構築物の濃度プロファイルを示す。
【図２９】図２９は、実施例３３に記載したように、オス及びメスのカニクイザル（ｃｙｎｏｓ  ＳＣ）に、０．３（白丸）、１．５（四角）、及び７．５ｍｇ／ｋｇ（三角）の３種類の用量レベルで投与したＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の、薬物動態学的試験の結果を示す。
【図３０】図３０は、実施例３３に記載したように、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の投与に反応したＩＧＦ−１レベルの結果を示す（符号は図２９と同様である）。
【図３１】図３１は、実施例３４に記載したように、３種類の異なる経路を介して投与されたＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４のバイオアベイラビリティを比較した実験の結果を示す。ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４をオス及びメスのカニクイザル（ｃｙｎｏｓ  ＳＣ）に、１．５ｍｇ／ｋｇの濃度で、静脈（三角）、皮下（白丸）、及び筋内（四角）経路を介して投与した。ＧＨ  ＸＴＥＮの血漿濃度は図中に示した。
【図３２】図３２は、実施例３５に記載したように、様々な用量及び投与頻度（黒三角＝０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日；白三角＝１．５ｎｍｏｌ／日；四角＝３ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）で投与した媒体（白丸）、組換えｈＧＨ、５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日（黒丸）、ＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の、低酸素ラットの体重に及ぼす効果を示す。
【図３３】図３３は、図３２に図示したデータから導き出した結果に基づく、ｈＧＨ又はＧＨＸＴＥＮが治療ウインドウ中での血中レベルを維持する能力の、低酸素ラットモデルでのモデルとなった投与の結果を示す。符号は図３２と同様である。
【図３４】図３４は、実施例３７に記載したように、既知の分子量を有するタンパク質を用いて測定した、グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ排除クロマトグラフィー解析の結果を示す。グラフは吸収対保持容量として表した。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ−１４４；３）グルカゴン−Ｙ７２；及び４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果は、ＸＴＥＮ部分の長さが長くなるほど、見かけの分子量も増えることを示す。
【図３５】図３５は、実施例３８に記載したように、様々な長さの非構造性（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）ポリペプチドに結合した数種類のＧＦＰ組成物を、カニクイザルに皮下又は静脈内のいずれかを介して単回投与した後の薬物動態学的プロファイル（血漿濃度）を示す。組成物は、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６及びＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰであった。血液試料を注入後の様々な時点で解析し、血漿中のＧＦＰ濃度を、補足抗体として抗ＧＦＰポリクローナル抗体を、及び検出抗体として同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。結果を投与後の血漿濃度対時間（ｈ）として表し、この結果は具体的には、最も長い配列のＸＴＥＮを有する組成物であるＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの半減期がかなり長くなったことを示す。最も短い長さの配列を有する構築物であるＧＦＰ−Ｌ２８８の半減期が最も短かった。
【図３６】図３６は、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４へのヒトの反応を、４種類の動物、すなわちマウス、ラット、カニクイザル、及びイヌにおける測定結果に基づいて予測した、異種間物差し法（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ）の結果を示す。図３６Ａは、測定した終末相半減期対体重を示し、ヒトでのＴ１／２は１３９時間と予測された。図３６Ｂは、測定した薬剤クリアランス対体重を示し、ヒトでのクリアランス率は３０ｍｌ／時間と予測された。図３６Ｃは、測定した体積分布対体重を示し、ヒトでの値は５９７０ｍｌと予測された。
【図３７】図３７は、実施例４２に記載したように行った、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近ＵＶ円二色性スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の実施形態を記載する前に、それらの実施形態は例示のためだけに提供されたものであり、本発明の実施においては、本明細書に記載した本発明の実施形態に様々な変更を加えたものを用いることができることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、当業者はここで数多くの変異、変更及び置換を生じるだろう。
【００４９】
別段の指定のない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載したものと同様又は等価な方法及び材料を使用することができるが、以下に好適な方法及び材料を記載する。矛盾が生じる場合には、定義を含め、本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示のためだけのものであり、本発明を限定することを意図しない。本発明から逸脱することなく、当業者はここで数多くの変異、変更及び置換を生じるだろう
【００５０】
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、特段の指定のない限り、それらに割り当てられた意味を有する。
【００５１】
本明細書及び請求項で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明か出ない限り、複数の形態を含む。例えば、用語「ａ  ｃｅｌｌ」は、その混合物を含む、複数のｃｅｌｌを含む。
【００５２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書においては同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは直鎖であっても分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、そして非アミノ酸により中断されていてもよい。この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化により、又は任意のその他の操作（標識要素の結合のような）により、修飾を受けたアミノ酸ポリマーをもまた包含する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、グリシン及び、Ｄ又はＬ両方の光学異性体、及びアミノ酸アナログ及びペプチド模倣薬を含むがこれらには限定されない、天然の及び／又は非天然の又は合成のアミノ酸を指す。アミノ酸を表すためには、標準的な１文字又は３文字コードが使用される。
【００５４】
用語「天然のＬ−アミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）のＬ型の光学異性体を意味する。
【００５５】
配列に関し、かつ、本明細書で使用する場合、用語「天然に生じない」は、哺乳類で見られる野生型又は天然に生じる配列に対応するものをもたない、相補的でない、又は高い相同性をもたない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然に生じないポリペプチド又は断片は、適切にアライメントした場合に、天然の配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％又はそれ未満のアミノ酸配列同一性しか有さない可能性がある。
【００５６】
用語「親水性」及び「疎水性」は、ある物質が水に対して有する、親和性の度合いを指す。親水性の物質は水に高い親和性を有し、水に溶解しやすく、混合されやすく、又は湿水しやすいが、疎水性の物質は水への親和性を実質的に欠き、水をはじきやすく、及び水を吸収しにくく、及び水に溶解、混合又は湿水しない傾向にある。アミノ酸を、その疎水性にもとづいて特徴付けることができる。数多くの尺度が開発されてきた。尺度の一例には、Ｌｅｖｉｔｔ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （１９７６）  １０４：５９により開発されたものがあり、これは、Ｈｏｐｐ，  ＴＰ，  ｅｔ  ａｌ．，
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （１９８１）  ７８：３８２４に挙げられている。「親水性アミノ酸」の例には、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。特に目的となる親水性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリン、及びグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例としては、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンが挙げられる。
【００５７】
「断片」は、治療用及び／又は生理活性を少なくとも部分的に保持する天然の生物学的に活性なタンパク質の切断型形態である。「変異型」は、生物学的に活性なタンパク質の、治療用及び／又は生理活性を少なくとも部分的に保持する、天然の生物学的に活性なタンパク質との配列相同性を有するタンパク質である。例えば、変異型タンパク質は、基準となる生物学的に活性なタンパク質と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する可能性がある。本明細書で使用する場合、用語「生物学的に活性なタンパク質部分」は、例えば部位特異的突然変異生成、若しくは挿入により故意に、又は突然変異生成を介して偶然に修飾されたタンパク質を含む。
【００５８】
「宿主細胞」は、目的のベクターの提供源となり得る、又は提供源である個々の細胞又は細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。後代は、天然の、偶然の、又は故意の突然変異生成により、元の親細胞とは（形態学的に又は相補的なトータルＤＮＡのゲノムに関して）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のベクターを用いてインビボでトランスフェクションした細胞が含まれる。
【００５９】
本明細書において開示した様々なポリペプチドを記載するために使用される「単離した」は、その天然の環境の構成要素から、同定され、及び分離され、及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境から混入する物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は通常、そのポリペプチドの診断的又は治療用の使用を干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク様及び非タンパク様溶質を含む場合がある。当業者には明らかなように、天然に生じないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片は、その天然に生じる対応物から区別するための「単離」を必要としない。加えて、「濃縮した」、「分離した」又は「希釈した」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片は、その体積当たりの濃度又は分子数が通常、天然に生じる対応物のものよりも高いことから、その天然に生じる対応物からの区別が可能である。一般的には、組換え技術によって作出され、宿主細胞中で発現させたポリペプチドを「単離した」と見なす。
【００６０】
「単離した」ポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードしている核酸又はその他のポリペプチドをコードしている核酸は、同定し、そしてそのポリペプチドをコードしている核酸の天然の環境で通常不随している少なくとも１つの混入核酸分子から分離した、核酸分子である。単離したポリペプチドをコードしている核酸分子は、天然において見られる形態又は状態ではないものである。単離したポリペプチドをコードしている核酸分子はそのため、天然の細胞中に存在している特定のポリペプチドをコードしている核酸分子から区別することができる。しかしながら、単離したポリペプチドをコードしている核酸分子は、例えば天然の細胞のものとは異なり、核酸分子が染色体又は染色体外に局在する場合、通常はポリペプチドを発現している細胞中に含まれるポリペプチドをコードしている核酸分子、を含む。
【００６１】
「キメラ」タンパク質は、その配列中に、天然に生じる場合とは異なる位置に領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。この領域は、通常は別のタンパク質中に存在し得るものであり、融合ポリペプチド中で１つにまとめられたものであるか、又はそれらは通常同じタンパク質中に存在し得るものであるが、融合ポリペプチド中で新しい位置に配置されたものである。キメラタンパク質は、例えば、化学的な合成、又は、所望される関係においてペプチド領域をコードしたポリヌクレオチドの作出及び翻訳、により作出される可能性がある。
【００６２】
本明細書においては、「連結した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」、「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」、「融合した」、及び「融合」は、同じ意味で用いられる。これらの用語は、２つ以上の化学的要素又は構成要素を、化学的結合又は組換え技術を含む何らかの手段によって、接続することを指す。例えば、その配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコード配列に操作可能に結合される。通常「操作可能に結合した」は、結合したＤＮＡ配列が連続していること、及び転写段階にあること、又はインフレームで結合していることを意味する。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しい読み枠を維持する方法で、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連続したより長いＯＲＦになるように接続することを指す。従って、得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに相当する、２つ以上のセグメント（このセグメントは通常天然では接続されない）を含む、１つのタンパク質である。
【００６３】
ポリペプチドに関連した「直線（ｌｉｎｅａｒ）配列」又は「配列」は、配列中の互いに隣接した残基が連続しているポリペプチドの一次構造における、ポリペプチド中のアミノ酸の、アミノ末端からカルボキシ末端方向への順番である。「部分配列」は、１又は両方向にさらに残基を含んでいることが分かっているポリペプチドの、部分的な直線配列である。
【００６４】
「異種」は、比較される他の実体に由来し、その実体とは遺伝子型で区別できるものを意味する。例えば、グリシンリッチ配列をその天然のコード配列から除去し、そして天然の配列以外のコード配列に操作可能に結合したものが、異種グリシンリッチ配列である。ポリヌクレオチド又はポリペプチドに用いられる用語「異種」は、比較される他の実体に由来し、遺伝子型で区別できる、実体からのポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は同じ意味で用いられる。それらは、任意の長さの多量体型ヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造をとっていてもよく、既知又は未知のいずれの機能を有していても良い。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのような、修飾を受けたヌクレオチドを含んでいてもよい。修飾がある場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構成の前又は後に付与され得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチドの構成要素により、分断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識用構成要素の結合のように、重合の後にさらに修飾を受ける場合もある。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチドの相補鎖」は、対照となる配列に相補的な塩基配列を逆向きに有するポリヌクレオチド分子を示し、これらは対照配列と完全に適合してハイブリダイズすることができる。
【００６７】
ポリヌクレオチドに用いられる「組換え」は、そのポリヌクレオチドが、宿主細胞中で発現することが可能な構築物を生じる、インビトロクローニング、制限酵素消化及び／又はライゲーション工程、及びその他の過程の、様々な組み合わせによる産物であることを意味する。
【００６８】
本明細書においては、用語「遺伝子」又は「遺伝子断片」は同じ意味で用いられる。それらは、転写され翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子又は遺伝子断片はそのポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む限り、ゲノムであっても又はｃＤＮＡであってもよく、コード領域全体を含むものであっても又はそのセグメントを含むものであってもよい。「融合遺伝子」は、１つにまとめられた少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子である。
【００６９】
「相同性」又は「相同」は、配列の類似性又は２つ以上のポリヌクレオチド配列又は２つ以上のポリペプチド配列間での互換可能性を指す。２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性又は相同性を決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔのようなプログラムを用いた場合には、予め決められた設定を用いることができ、又は同一性、類似性又は相同性スコアを最適化するために、ｂｌｏｓｕｍ４５又はｂｌｏｓｕｍ８０のような適切な採点マトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を選択することができる。好ましくは、本明細書において相同なポリヌクレオチドとは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと定義され、それらの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９７％、さらに好ましくは９８％、及びより一層好ましくは９９％の配列同一性を有する。
【００７０】
「ライゲーション」は、２つの核酸断片又は遺伝子間で、それらを結合するホスホジエステル結合を形成させる工程を指す。ＤＮＡ断片又は遺伝子を１つにライゲーションさせるためには、ＤＮＡの末端は互いに一致（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）していなくてはならない。場合によっては、エンドヌクレアーゼによる消化の後、末端はそのままでも一致するだろう。しかしながら、通常エンドヌクレアーゼによる消化の後には突出末端が形成されるため、まず最初に、ライゲーションに適合する平滑末端にするための変換が必要となる場合がある。
【００７１】
用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、検出可能な程度にその他の配列よりも強く（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍より強く）その標的配列にハイブリダイズするであろう条件への言及を含む。通常、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的には、洗浄工程が行われる温度及び塩濃度で表される。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、一般的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン（又はその他の塩）濃度であり、かつ、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については温度が少なくとも約３０℃、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については温度が少なくとも約６０℃の条件であり、例えば、「ストリンジェント条件」は５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／１％  ＳＤＳ、６０℃〜６５℃での３回の洗浄、各回につき１５分、を含む場合がある。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、又は４２℃の温度を用いることもできる。ＳＤＳの濃度が約０．１％である場合、ＳＳＣの濃度は約０．１〜２×ＳＳＣまでと多様である。そのような洗浄温度は通常、決められたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）よりも約５℃〜２０℃低い温度に設定される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度（決められたイオン強度及びｐＨ条件下で）である。Ｔｍ及び核酸ハイブリダイゼーション条件を計算するための式は周知であり、またＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  Ｎ．Ｙ．；に見ることができる（特にｖｏｌｕｍｅ  ２  の  ｃｈａｐｔｅｒ  ９を参照のこと）。通常、ブロッキング試薬は非特異的なハイブリダイゼーションを阻害するために用いられる。そのようなブロッキング試薬は例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、断片化し、変性させたサケ精子ＤＮＡを含む。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのような特定の状況では、約３５〜５０％  ｖ／ｖ濃度のホルムアミドのような有機溶媒もまた使用される場合がある。当業者は、これら洗浄条件の有用な変異型を容易に理解できるであろう。
【００７２】
ポリヌクレオチド配列に用いられる、用語「パーセント同一性」及び「％同一性」は標準的なアルゴリズムを用いて少なくとも２つのポリヌクレオチド配列をアライメントした場合に一致する、残基のパーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムは、２つの配列間のアライメントを最適化するために、標準的な及び再現できる方法により、比較する配列中にギャップを挿入する場合があり、その結果２つの配列間でのより有意義な比較が達成される。パーセント同一性は、定義したポリヌクレオチド配列の全長について測定することができ、又は、より短い長さ（例えばより長い、定義されたポリヌクレオチド配列から得られた断片について、例えば少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０又は少なくとも４５０個の連続した残基の断片）について測定することができる。これらの長さは例示のためだけのものであり、本明細書、表、図、又は配列表により支持されるいずれの長さの断片も、そのパーセント同一性を測定する場合の長さを記載するために用いられ得ると見なされる。
【００７３】
本明細書において同定したポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアライメントした後に（最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要な場合にはギャップを挿入し、かつ、いずれの保守的置換は配列同一性の一部としては考慮しない）、第二の、基準となるポリペプチド配列又はその一部のアミノ酸残基と同一な、クエリー配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアライメントは、当該分野における様々な技術、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような、公的に使用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較する完全長配列について最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメント測定のための適切な指標を決定することができる。パーセント同一性を定義したポリペプチド配列全長について測定してもよく、又は、より短い長さ（例えばより長い、定義されたポリヌクレオチド配列から得られた断片の長さについて、例えば少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０又は少なくとも１５０個の連続した残基の断片）について測定することができる。これらの長さは例示のためだけのものであり、本明細書、表、図、又は配列表により支持されるいずれの長さの断片も、そのパーセント同一性を測定する場合の長さを記載するために用いられ得ると見なされる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関する用語「非反復性」は、ペプチド又はポリペプチド配列内の相同性が無いこと又は限られていることを指す。用語「実質的に非反復性」は、例えば、その配列中に、同一のアミノ酸型が４つ連続したアミノ酸の例がほとんど若しくは全くない、又はポリペプチドが１０以下の部分列スコア（以下で定義する）を有すること、又はＮからＣ末端の向きで、ポリペプチド配列を構成する配列モチーフのパターンがないこと、を意味する場合がある。本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関する用語「反復性」は、ペプチド又はポリペプチド配列内部の相同性の度合いを指す。対照的に、「反復性」配列は、複数の同一コピーの短いアミノ酸配列を含み得る。例えば、目的のポリペプチド配列はｎ−ｍｅｒの配列に分断してもよく、それにより同一配列の数を測定することができる。高度に反復性の配列は、配列が同一な部分が大きいが、非反復配列はほとんど同一の配列を含まない。ポリペプチドに関して配列は、決められた若しくは様々な長さのより短い配列のコピー、又は、モチーフそれ自体が非反復性配列を有し、完全長ポリペプチドを実質的に非反復性にする、モチーフを含む場合がある。非反復性が測定されるポリペプチドの長さは、３アミノ酸〜約２００アミノ酸、約６〜約５０アミノ酸、又は約９〜約１４アミノ酸と多様になり得る。ポリヌクレオチド配列に関して用いられる「反復性」は、配列内部の相同性の度合い、例えば指定された長さの同一のヌクレオチド配列の頻度、を指す。反復性は、例えば、同一配列の頻度を解析することにより測定することができる。
【００７５】
「ベクター」は核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞中に及び／又は宿主細胞間で移送する適切な宿主中において、好ましくは自己複製するものである。この用語は、主にＤＮＡ又はＲＮＡを細胞中に挿入することにおいて機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に機能する発現ベクターを含む。１つ以上の上述した機能を提供するベクターもまた含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入した場合に、ポリペプチド内で転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は一般に、目的の発現産物を得るために機能させることができる、発現ベクターを含む好適な宿主細胞を意味する。
【００７６】
ポリペプチドに関する「血清分解抵抗性」は、通常血清又は血漿中にプロテアーゼを含む、血液及びその成分による分解に、ポリペプチドが耐える能力を指す。血清分解抵抗性は、そのタンパク質をヒト（又は必要に応じてマウス、ラット、サル）の血清又は血漿と、通常ある範囲の期間（例えば０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）、通常約３７℃で混合することにより、測定することができる。これらの時点での試料をウェスタンブロット解析により解析することができ、抗体を用いてタンパク質を検出する。抗体はタンパク質中にタグを含むものであってもよい。ウェスタンブロット解析において、タンパク質が注入したタンパク質と同じサイズの単一のバンドを示す場合、タンパク質の分解は起きなかったこととなる。このような方法で、ウェスタンブロット解析又は等価の技術によって判断される、タンパク質の５０％が分解した時点が血清分解半減期又はそのタンパク質の「血清半減期」である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「ｔ１／２」は、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算される、終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、ログ濃度対時間曲線の終末相の線形部分の線形回帰により計算される、終末相の消失速度定数である。半減期は通常、生物中に蓄積された、投与された物質の半分量が代謝される、又は正常な生物学的プロセスによって排出されるために必要な時間を指す。本明細書において、用語「ｔ１／２」、「終末相半減期」、「排出半減期」及び「血中半減期」は、同じ意味で用いられる。
【００７８】
「見かけの分子量因子」又は「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列が示す見かけの分子量の相対的な増加又は減少の測定に関する、関連した用語である。見かけの分子量は、基準となる球状タンパク質との比較を行うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び類似の方法により決定され、「見かけのｋＤ」単位で表される。見かけの分子量因子は、見かけの分子量と実際の分子量との間の率の因子であり、実際の分子量はアミノ酸組成物に基づいて、組成物中の各アミノ酸型について算出した分子量を総和することにより予測される。
【００７９】
「流体力学半径」又は「ストークス半径」は、物質が液体中を移動していると仮定される、測定を行っている溶液中で有効な、溶液の粘性に影響されない分子の半径（Ｒｈ、ｎｍ単位）である。本発明の実施形態において、ＸＴＥＮ融合タンパク質の流体力学半径の測定は、より直観的測定である「見かけの分子量因子」と相関がある。タンパク質の「流体力学半径」は、その水溶液中での拡散率、並びに高分子でできたゲル中を移動するその能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量並びに形状及び稠密度を含む、その構造により決定される。米国特許第６，４０６，６３２号及び同第７，２９４，５１３号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用のような、流体力学半径の決定方法は当該分野において周知である。大部分のタンパク質は、最もコンパクトなタンパク質の三次元構造であり、最も小さい流体力学半径をとることができる、球状構造を有する。いくつかのタンパク質は、一般的な同様の分子量をもつ球状タンパク質に比べて大きな流体力学半径を有する結果、ランダムでかつ開かれた、非構造性の、又は線形構造をとる。
【００８０】
「生理学的な条件」は、温度、塩濃度、ｐＨを含む、生物対象の条件に類似した生物宿主中の一連の条件、並びに、インビトロでの条件を指す。生理学的に関連する条件をもつ、インビトロアッセイで使用するための宿主が確立されてきた。通常、生理学的な緩衝液は、生理学的な濃度の塩を含み、約６．５〜約７．８の範囲の中性のｐＨ、好ましくは約７．０〜約７．５、に調製される。様々な生理学的な緩衝液がＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）中に挙げられている。生理的な温度の範囲は約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃である。
【００８１】
「反応基」は、第二の反応基に結合することができる化学構造である。反応基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基が挙げられる。いくつかの反応基は、第二の反応基との結合が促進するように活性化させることができる。活性化の非限定的な例としては、カルボキシル基とカルボジイミドとの反応、カルボキシル基の活性化エステルへの変換、又はカルボキシル基のアジド官能基への変換が挙げられる。
【００８２】
「制御放出型製剤」、「遅延放出型製剤」、「デポ製剤」又は「徐放放出型製剤」は同じ意味で用いられ、その薬剤なしにポリペプチドを投与した場合の放出期間と比較して、本発明のポリペプチドの放出期間を延長することができる薬剤を指す。本発明の様々な実施形態は、様々な放出率を有してもよく、その結果、様々な治療量がもたらされる。
【００８３】
本明細書において、用語「抗原」、「標的抗原」又は「免疫原」は同じ意味で用いられ、抗体断片又は抗体断片ベースの治療が結合する又はそれに対して特異性を有する、構造又は結合決定因子を指す。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「ペイロード」は、低分子薬理作用団の対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）である、生物学的な又は治療用活性を有するタンパク質又はペプチド配列を指す。ペイロードの例には、サイトカイン、酵素、ホルモン及び血液及び成長因子が含まれるがこれらには限定されない。ペイロードは、化学治療薬、抗ウイルス性化合物、毒素、又は造影剤のような、遺伝子的に融合させた又は化学的に結合させた部分をさらに含んでもよい。これらの結合部分は、開裂可能又は開裂不可能な可能性のあるリンカーを介してポリペプチドの他の部分に結合する場合もある。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「アンタゴニスト」は、本明細書において開示した天然のポリペプチドの生理活性を、部分的に又は完全に、遮断する、阻害する、又は中和する任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、天然のポリペプチドと候補アンタゴニスト分子とを接触させる工程、及び、通常天然のポリペプチドに関連する、１つ以上の生理活性の検出可能な変化を測定する工程を含む場合がある。本発明に関する説明において、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体又は生物学的に活性なタンパク質の効果を低減させる任意のその他分子を含む可能性がある。
【００８６】
用語「アゴニスト」は、その最も広い意味で用いられ、そして本明細書において開示した天然のポリペプチドの生理活性を模倣する、任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は特に、アゴニスト抗体又は抗体断片、天然のポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などを含む。天然のポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、天然のポリペプチドと候補アゴニスト分子とを接触させる工程、及び、通常天然のポリペプチドに関連する、１つ以上の生理活性の検出可能な変化を検出する工程を含む場合がある。
【００８７】
本明細書において目的とする「活性」は、生物学的に活性な対応する天然のタンパク質の作用又は効果と一致する、融合タンパク質の構成要素の作用又は効果を指し、ここで「生理活性」とは、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、又は細胞での若しくは生理学的な反応を含むがこれらには限定されない、インビトロ又はインビボでの生物学的な機能又は効果を指す。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「治療」又は「治療する」又は「軽減する」又は「改善する」は、本明細書においては同じ意味で用いられる。これらの用語は、治療上の利益及び／又は予防上の利益を含むがこれらには限定されない、有益な又は所望される結果を得るための方法を指す。治療上の利益は、治療される障害の基礎症状の根絶又は改善を意味する。治療上の利益はまた、対象が基礎障害にいまだ罹患しているにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、基礎障害に関連する１つ以上の生理学的な症状の根絶又は改善により達成される。予防上の利益のために、特定の疾患を発症するリスクを有する対象に、又はこの疾患に対する診断がまだなされてはいないが、この疾患の１つ以上の生理学的な症状を訴えている対象に、組成物を投与してもよい。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「治療効果」は、本発明融合ポリペプチドの能力（生物学的に活性なタンパク質が保有する抗原性エピトープに対する抗体生産を誘導する能力以外の）によって引き起こされる、ヒト若しくはその他の動物における疾患の治癒、軽減、改善、又は予防、そうでなければヒト又は動物の身体的又は精神的な満足度を向上させる生理的な効果を含むがこれらには限定されない効果を指す。治療上有効量の決定、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮しての決定について、当業者は十分な能力を有する。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「治療上有効量」及び「治療上効果的な用量」は、単回又は複数回投与で対象に投与した場合に、単独で又は融合タンパク質組成物の一部分としてのいずれかにおいて、疾患の段階又は状態の任意の症状、態様、測定指標又は特徴に、任意の検出可能な、有益な効果をもたらすことができる、生物学的に活性なタンパク質の量を指す。そのような効果は、絶対的に有益である必要はない。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「治療上効果的な用量計画」は、単独で又は融合タンパク質組成物の一部分としてのいずれかにおいて投与される、生物学的に活性なタンパク質の連続的な投与用量のスケジュールを指し、ここで用量とは、疾患の段階又は状態の任意の症状、態様、測定指標又は特徴に持続的に有益な効果をもたらす治療上有効量である。
【００９２】
Ｉ）一般的な技術
本発明の実施においては、別段の指定のない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学及び組換えＤＮＡの、当該分野において標準的な技術が用いられる。その内容の全体が参照することにより本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，」３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，１９８７；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．；「ＰＣＲ  ２：    ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」，  Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５；  「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  及び  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；「Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，」１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００５；  及び  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  ＮＪ，  ２０００、を参照のこと。
【００９３】
ＩＩ）成長ホルモン
本発明は部分的には、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む、成長ホルモン（ＧＨ）の融合タンパク質組成物に関する。
【００９４】
（ａ）成長ホルモンタンパク質
「成長ホルモン」又は「ＧＨ」は、成長ホルモンタンパク質、並びにその種及び配列変異体を意味し、ヒトＧＨの１９１一本鎖アミノ酸配列を含むが、これには限定されない。ＧＨは、天然の、完全長タンパク質であってもよく、又は、天然のタンパク質の生理活性を少なくとも部分的に保持する切断型断片又は配列変異体であってもよい。下垂体由来のヒトＧＨ（以下「ｈＧＨ」）については２つの型が知られている。１つは約２２，０００ダルトンの分子量を有し（２２ｋＤ  ｈＧＨ）、もう一方は約２０，０００ダルトンの分子量を有する（２０ｋＤ  ｈＧＨ）。２０ｋＤ  ＨＧＨは、１９１のアミノ酸からなる２２ｋＤ  ｈＧＨから、３２番目から４６番目の１５アミノ酸残基を欠いたものと一致するアミノ酸配列を有する。いくつかの報告は、２０ｋＤ  ｈＧＨが２２ｋＤ  ｈＧＨよりも低いリスク及び高い活性を示すことが確認されたことを示した。本発明は、ＧＨＸＴＥＮ組成物用の、本明細書において開示したＸＴＥＮの融合パートナーとしての使用に適切な、２２  ｋＤ、２０ｋＤ  ｈＧＨ、並びにその種及び配列変異体、及びその切断型断片の使用について検討する。クローニングしたｈＧＨ遺伝子の分泌型での大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ  ｃｏｌｉ）内における発現（米国特許第４，８９８，８３０号；Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５５：１８９  ［１９８７］）、及びそのＤＮＡ及びアミノ酸配列が報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ，２８１：５４４  ［１９７９）；Ｇｒａｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３９：  ２４７［１９８５］）。
【００９５】
本発明は、ヒト、非ヒト霊長類、哺乳類（家畜を含む）由来のような、天然のＧＨ配列、配列断片との相同性を有するＧＨＸＴＥＮ組成物配列と、ＧＨの生理活性又は生物学的機能を少なくとも部分的に保持する非天然の配列変異体及び／又はＧＨ関連疾患、欠如、障害又は状態の予防、治療、緩和、又は回復に有用な非天然の配列変異体とを含めることについても検討する。非哺乳類のＧＨ配列については文献に詳述されている。例えば、サカナＧＨ配列のアライメントはＧｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３  ２６  ｐ．２９５−３００に見ることができる。鳥類ＧＨ配列の進化解析はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６
１９  ｐ．８４４−８５４に示されている。加えて、ヒトＧＨに相同の天然の配列は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴのような標準的な相同性検索技術によって見いだすことができる。
【００９６】
体組織におけるＧＨの効果は、通常、タンパク質同化として記述することができる。大部分のその他タンパク質ホルモンと同様に、天然のＧＨは、成長ホルモン受容体と呼ばれる、特定の原形質膜受容体との相互作用を介して作用する。ＧＨは、ＧＨの成長促進効果に関与し、生産された量を反映するＩＧＦ−１の生産を刺激するように肝臓及びその他組織に作用する。ＩＧＦ−１は次に、骨成長を促進するように、骨芽細胞及び軟骨細胞への刺激効果を有する。一実施形態において、本発明は、本明細書に上述した天然のＧＨの特性を、少なくとも１つ示すＧＨＸＴＥＮを提供する。
【００９７】
一実施形態において、対象組成物に組み入れられたＧＨは、天然に見られるタンパク質に対応する配列を有する、組換えポリペプチドである。別の実施形態においてＧＨは、配列変異体、断片、ホモログ、又は、対応する天然のＧＨの生理活性を少なくとも部分的に保持する天然の配列を模倣した配列である。表１は、本発明のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に包含される、様々な哺乳類の種由来のＧＨ配列の非限定的な例を提供する。これらＧＨ配列又は相同誘導体はいずれも、本発明の融合タンパク質に有用な可能性のある、天然のＧＨの生理活性を少なくとも部分的に保持する、個々の突然変異体を種又は属間でシャッフリングすることによって構築される。ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れることができるＧＨは、表１から選択される配列と、少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示すタンパク質を含む可能性がある。
【００９８】
表１：動物種からの成長ホルモンのアミノ酸配列
【表１−１】
2015124222.tif 000002
【表１−２】
2015124222.tif 000003
【表１−３】
2015124222.tif 000004
【００９９】
ＩＩＩ）成長ホルモン融合タンパク質組成物
本発明は部分的には、成長ホルモン（ＧＨ）の融合タンパク質組成物に関する。一態様において本発明は、伸張組換え組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）に共有結合した、ＧＨの完全長配列又は配列変異体を含む、ＧＨの単離した単量体融合タンパク質を提供する。以下により詳細に記載するように、融合タンパク質は、プロテアーゼを作用させた場合にＸＴＥＮ配列からＧＨを分離し、融合タンパク質からＧＨを放出するための開裂配列をさらに含むスペーサー配列を任意に含む。
【０１００】
一態様において本発明は、１つ以上の伸張組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）に共有結合した少なくとも第一の生物学的に活性な成長ホルモンタンパク質を含み、成長ホルモン−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物（以下「ＧＨＸＴＥＮ」）を生じる、単離した融合タンパク質を提供する。一実施形態においてこの成長ホルモンは、ヒト成長ホルモン又はｈＧＨの配列変異体である。以下により詳細に記載するように、融合タンパク質は、プロテアーゼを作用させた場合に融合タンパク質からＧＨを放出するための開裂配列をさらに含むスペーサー配列を任意に含む。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「ＧＨＸＴＥＮ」は、各ペイロード領域が成長ホルモンが関連する１つ以上の生物学的又は治療用活性を仲介する生物学的に活性なＧＨを含む、１つ以上のペイロード領域、及び、その他の領域の少なくとも１つが、担体となる少なくとも第一のＸＴＥＮポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを包含することを意味する。
【０１０２】
対象組成物のＧＨ、特に表１で開示したＧＨ、とそれらに対応する核酸及びアミノ酸配列は、当該分野において周知であり、また、その説明及び配列は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）のような公共のデータベース、及びＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）のような遺伝子特許データベースから入手可能である。ポリヌクレオチド配列は特定のＧＨ（例えば、完全長又は成熟したもののいずれか）をコードしている野生型ポリヌクレオチド配列であってもよく、又は例えば配列は、ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、例えば特定の種での発現のために最適化された；又は部位特異的突然変異体又は対立遺伝子変異体のような野生型タンパク質の変異体をコードしているポリヌクレオチドなどの、野生型ポリヌクレオチド（例えば、生物学的に活性な野生型タンパク質をコードしているポリヌクレオチド）配列の変異体であってもよい。当該分野において既知の方法、及び／又は本明細書で提供される指針及び方法に関連した方法を用い、本発明で検討されるＧＨＸＴＥＮ構築物を作出するための、ＧＨの野生型又は保存されたｃＤＮＡ配列又はコドン最適化された変異体の使用について当業者は十分な能力を有し、また、実施例においてより詳細に記述する。
【０１０３】
本発明のＧＨＸＴＥＮに組み入れられるＧＨは、生物学的、治療上、予防上、若しくは診断上興味深い又はここにおいて機能する任意の成長ホルモン若しくは配列変異体、又は対象に投与した場合に、成長ホルモンの欠如、成長ホルモンの欠損又は欠乏に関連する疾患、障害若しくは状態の緩和又は予防又は改善に有用な、任意の成長ホルモン若しくは配列変異体を含む。特に興味がもたれるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、相当する天然のＧＨと比較して、高い薬物動態学的指標、高い溶解度、高い安定性、又は複数のその他の強められた医薬特性を有するＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物であり、又は終末相半減期が長くなったＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、効力、安全性を改善し、又は低頻度での投薬をもたらし、及び／又は患者のコンプライアンスを改善する可能性がある。従ってＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、例えば、インビボにおける曝露を増加させること、又は、対象に投与した場合に、ＸＴＥＮに結合していないＧＨよりも治療ウインドウ中に保持される期間を長くすることによって、生物学的に活性なＧＨの治療効力を改善させることを含む、様々な目的において調製される。
【０１０４】
一実施形態において、対象組成物に組み込まれるＧＨは、天然に見られる対応するタンパク質の配列を有する組換えポリペプチドであってもよい。別の実施形態においてＧＨは、天然のＧＨの生理活性を少なくとも部分的に保持する、配列変異体、断片、ホモログ、又は天然の配列を模倣した配列である。非限定的な例においてＧＨは、表１から選択されるタンパク質配列と、少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列である。一実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに結合した単一のＧＨ分子を含む（以下により詳細に記載するように）。別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、同じＧＨの第一のＧＨ及び第二の分子を含み、１つ以上のＸＴＥＮ（例えば、又はｈＧＨの２つの分子）に結合した２つのＧＨを含む融合タンパク質を生じる。前述した実施形態のいくつかの例においてＧＨ及びＸＴＥＮ構成要素は、表５から選択されるＮ末端側からＣ末端への配置をとる。別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、Ｎ末端側からＣ末端への配置がＸＴＥＮ−ＧＨ−ＸＴＥＮである、第一の及び第二のＸＴＥＮに結合した単一のＧＨ分子を含み、ここでＧＨは、表１から選択されるタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列であり、そして第一の及び／又は第二のＸＴＥＮは、表３から選択される配列と少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列である。
【０１０５】
通常、ＧＨＸＴＥＮのＧＨ融合パートナー構成要素は、インビボにおいて使用した場合、又はインビトロアッセイに用いた場合に、特定の標的に対する結合特異性又は別の所望される生物学的特徴を示す。例えば、ＧＨＸＴＥＮは、成長ホルモンの膜貫通型受容体に結合する能力を有するアゴニストである。一実施形態においてＧＨＸＴＥＮの成長受容体への結合は受容体の二量体化を誘導し、そして、天然の成長ホルモンと比較して、細胞内シグナル伝達経路の少なくとも部分的な活性化を引き起こす。一実施形態において、成長ホルモンの膜貫通型受容体に結合したＧＨＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに結合していない天然の成長ホルモンと比較して、細胞内シグナル伝達経路を少なくとも約１％、又は約５％、又は約１０％、又は約１５％、又は約２０％、又は約２５％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は少なくとも約９５％活性化するだろう。
【０１０６】
本発明の対象ＧＨＸＴＥＮは、１つ以上の薬物動態学的指標の向上を示し、これらは任意にスペーサー配列の開裂によって融合タンパク質がＧＨから放出されることにより、向上される。向上した薬物動態学的指標を有するＧＨＸＴＥＮは、より低頻度での投薬を可能にし、又は最小有効量若しくは血中濃度（Ｃｍｉｎ）と最大耐量若しくは血中濃度（Ｃｍａｘ）との間となる、治療ウインドウ中での生物学的に活性なＧＨＸＴＥＮの維持のような（しかしこれには限定されない）、高められた薬理学的効果を可能にする。このような例においては、選択されたＸＴＥＮ配列を含む融合タンパク質へのＧＨの結合は、これらの特性の改善をもたらす可能性があり、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、それらをより有用な治療用又は予防用薬剤にする。
【０１０７】
ＩＶ）伸張（ＸＴＥＮＤＥＤ）組換えポリペプチド
一態様において本発明は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる、ＧＨが結合するのに有用な融合タンパク質パートナーとしてのＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供する。ＸＴＥＮは通常、主に小さい親水性アミノ酸からなる、天然に生じない、実質的に非反復的な配列の、伸張した長さのポリペプチドであり、生理的な条件下において二次構造又は三次構造の程度が低い、又はそれら構造をとらないものである。
【０１０８】
ＸＴＥＮは、融合タンパク質を作出するためにＧＨタンパク質に結合させた場合に、特定の所望される薬物動態学的、物理化学的及び医薬特性を付与する「担体」となるパートナーである、融合タンパク質パートナーとしての有用性を有する。そのような所望される特性には、向上した薬物動態学的指標及び組成物の溶解特性、などの本明細書において記載したその他の特性が含まれるがこれらには限定されない。そのような融合タンパク質組成物は、本明細書において記載した、特定の成長ホルモン関連疾患、障害又は状態の治療への有用性を有する。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ」は特に、一本鎖抗体又は軽鎖若しくは重鎖のＦｃ断片のような、抗体若しくは抗体断片を除外する。
【０１０９】
いくつかの実施形態においては、単一の融合タンパク質中に、担体として又は累積的に、１つ以上のＸＴＥＮ単位を用いる場合のＸＴＥＮは、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、好ましくは４００より長く約３０００残基までの長さの、長いポリペプチドである。その他の実施形態において、融合タンパク質の構成要素間のリンカーとして用いる場合又は融合タンパク質の半減期の延長は必要とされないが、ＧＨ融合パートナー構成要素の溶解度の向上若しくはその他の物理／化学的特性が望まれる場合のＸＴＥＮ配列は１００アミノ酸残基より短く、例えば約９６、又は約８４、又は約７２、又は約６０、又は約４８、又は約３６アミノ酸残基であり、これらをその特性に効果を及ぼすように、ＧＨを含む融合タンパク質組成物中に組み込む。
【０１１０】
本発明の融合タンパク質組成物を作出するために用いられる、生物学的に活性なタンパク質に結合させるＸＴＥＮの選択基準は通常、その後、融合タンパク質組成物に向上した医薬及び薬物動態学的特性を付与するために用いられる、ＸＴＥＮの物理的／化学的特性及び立体構造の特徴に関する。本発明のＸＴＥＮは、それら融合タンパク質のパートナーとして特に有用なものである、以下の有利な特性の内の１つ以上を示す：配座柔軟性、向上した水溶性、プロテアーゼへの高い抵抗性、低い免疫原性、弱い哺乳類の受容体への結合、及び長い流体力学的（又はストローク）半径。ＸＴＥＮにより向上する、ＧＨを含む融合タンパク質の特性の非限定的な例としては、全体的な溶解度及び／又は代謝安定性の向上、タンパク質分解に対する感受性の低下、免疫原性の低下、皮下又は筋内に投与した場合の吸収速度の低下、及び、より長い終末相半減期のような向上した薬物動態学的特性、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の増加、Ｃｍａｘがより低くなるような皮下又は筋内注入後の吸収の遅延（類似した経路により投与されるＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して）、が挙げられ、これにより、ＧＨの有害事象（治療用活性を保持するＧＨＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質を、長期間にわたって対象に投与したことによって累積的に生じる）の低減をもたらす。
【０１１１】
本発明のＸＴＥＮを含む組成物のような、タンパク質の物理的／化学的特性を決定するための様々な方法及びアッセイが当該分野において既知であり、特性としては、二次又は三次構造、溶解度、タンパク質凝集、融解特性、異物の混入及び水分含量が挙げられる。そのような方法には、分析用遠心法、ＥＰＲ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱解析、キャピラリー電気泳動、円二色性分析、示差走査熱量測定、蛍光、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、及びＵＶ／可視分光法が含まれる。さらに別の方法が、Ａｒｎａｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  （２００６）  ４８，  １−１３において開示されている。本発明へのこれら方法の適用は、当業者の理解の範囲内であろう。
【０１１２】
ＸＴＥＮが伸張した長さのポリマーであるにもかかわらず、通常ＸＴＥＮは、生理学的条件下において変性したペプチド配列のような挙動を示すように設計される。変性した、とはペプチド主鎖の大部分が構造的な制限をもたないことによって特徴付けられる、ペプチドの溶液中での状態を指す。多くのペプチド及びタンパク質は、高濃度の変性剤存在下において、又は高温下において変性構造をとる。変性構造のペプチドは、例えば、特徴的な円二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、そしてＮＭＲで決定される長距離相互作用を欠くことによって特徴付けられる。本明細書においては、「変性構造」及び「非構造性構造（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は同じ意味で用いられる。いくつかの実施形態において本発明は、生理的な条件下において、大部分が二次構造をもたない、変性した配列に類似したＸＴＥＮ配列を提供する。その他の例においてＸＴＥＮ配列は、生理的な条件下で、実質的に二次構造をもたない。本明細書中において使用される場合、「大部分がもたない（ｌａｒｇｅｌｙ  ｄｅｖｏｉｄｅｄ）」とは、本明細書において記載した手段によって測定又は決定した場合に、ＸＴＥＮ配列中の５０％未満のＸＴＥＮアミノ酸残基が二次構造に寄与することを意味する。本明細書中において使用される場合、「実質的にもたない」とは、本明細書において記載した手段によって測定又は決定した場合に、ＸＴＥＮ配列中の少なくとも約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は少なくとも約９９％のＸＴＥＮアミノ酸残基が二次構造に寄与しないことを意味する。
【０１１３】
特定のポリペプチド中での二次及び三次構造の有無を識別するための様々な方法が当該分野において確立されてきた。具体的には、二次構造は、例えば、「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での円二色性分光法を用いた分光光度法により測定することができる。アルファ−ヘリックス及びベータシートのような二次構造要素はそれぞれ、特徴的な形状及び強さのＣＤスペクトルを生じる。二次構造はまた、米国特許出願第２００３０２２８３０９Ａ１号に記載され、よく知られているＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，  Ｐ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：  ２２２−４５）及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６），  ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．    Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０−５５３）のような、特定のコンピュータープログラム又はアルゴリズムを介してポリペプチド配列から予測することができる。指定された配列について、アルゴリズムは、例えばアルファ−ヘリックス若しくはベータシートを形成する配列の、全残基及び／又は残基のパーセンテージとして、又はランダムコイル形成（二次構造を欠如している）を生じると予測される配列の残基のパーセンテージとして表される二次構造が、いくらかでも存在するか又は完全に二次構造がないかどうかを予測することができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質組成物中に用いられるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合に０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのアルファーヘリックスを有する場合がある。その他の例において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合に０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのベータシートを有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合に、０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのアルファーヘリックス及び０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのベータシートを有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のパーセンテージのアルファーヘリックス及び約２％未満のパーセンテージのベータシートを有する。その他の例において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムで決定した場合に、高いパーセンテージとなるランダムコイルを有する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムで決定した場合に、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、及び最も好ましくは少なくとも約９９％となる、ランダムコイルを有する。
【０１１５】
１．非反復性配列
いくつかの実施形態において、組成物のＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性である。通常、反復性アミノ酸配列は、コラーゲン及びロイシンジッパーのような天然の反復性配列に代表されるように、凝集する又は高次構造を形成する傾向に、又は結晶若しくは疑似結晶構造を生じるように接触する傾向にある。一方、非反復性配列が凝集しにくい傾向にあることは、もしも配列が反復性ならば凝集しやすくなるであろう、相対的に少ない数の荷電したアミノ酸頻度を有する、長い配列のＸＴＥＮを設計することを可能にする。通常ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、実質的に非反復配列であり、約１００よりも長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、好ましくは累積して４００より長く約３０００残基までの長さの、ＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態においてＸＴＥＮ配列は、セリン以外の同一のアミノ酸型が配列中で３つ連続することがなく、同一のアミノ酸型が３つ連続する場合にはそのアミノ酸はセリンでしかない、約１００より長く約３０００までの長さのアミノ酸残基、好ましくは４００より長く約３０００までの長さのアミノ酸残基を有する。前述した実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性となるであろう。
【０１１６】
ポリペプチド又は遺伝子の反復性の度合いは、当該分野において知られている、コンピュータープログラム又はアルゴリズム又はその他の方法によって測定される。ポリペプチド配列中の反復性は、指定された長さのより短い配列が、そのポリペプチド中にある回数を決定することにより評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９２個のオーバーラップした９−アミノ酸配列（又は９−ｍｅｒ「フレーム」）及び１９８個の３−ｍｅｒフレームを含むが、９−ｍｅｒ又は３−ｍｅｒ配列に特有な個数は、その配列中の反復性の量に依存するだろう。生成されるスコア（以下「部分列スコア」）は、ポリペプチド配列全体における部分列の反復性の度合いを反映するものである。本発明に関して、「部分列スコア」は、ポリペプチドの２００連続したアミノ酸配列中に存在する、各ユニーク３−ｍｅｒフレームの頻度の総和を、２００アミノ酸配列中におけるユニーク３−ｍｅｒ配列の絶対数で除算したものを意味する。反復性の第一の２００アミノ酸及び及び非反復ポリペプチドから算出される各部分配列の例を表４４に示す。いくつかの実施形態において本発明は、各ＧＨＸＴＥＮが、１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、及び最も好ましくは５未満の部分列スコアを有する１つ以上のＸＴＥＮを含む、ＧＨＸＴＥＮを提供する。この段落で上述した実施形態において、約１０未満（すなわち９、８、７など）の部分列スコアを有するＸＴＥＮは、「実質的に非反復性」である。
【０１１７】
ＸＴＥＮの非反復性特徴は、反復性配列を有するポリペプチドと比較して、ＧＨを含む融合タンパク質に、より高度の溶解性及び凝集する傾向の低下を付与する。これらの特性は、非常に高い濃度の薬剤を含む、いくつかの例においては１００ｍｇ／ｍｌを超える薬剤を含む、ＸＴＥＮ医薬調製物を含む製剤の処方を容易にする。
【０１１８】
さらに、実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳類に投与した場合の免疫原性を低減させるために又は免疫原性を実質的に除去するために、配列内部の反復性の度合いが低くなるように設計される。大部分が、グリシン、セリン及びグルタミン酸のような３種類のアミノ酸に限定される、短い、繰り返しモチーフに含まれるポリペプチド配列は、これらの配列中に予測されるＴ細胞エピトープがないにいも関わらず、哺乳類に投与した場合に、相対的に高い抗体力価を生じ得る。これは、タンパク質凝集、交差免疫原性及び反復性炭水化物を含む反復性エピトープが高度免疫原性であり、そして例えば、Ｂ細胞活性化を誘導するＢ細胞受容体の架橋を生じることから示されてきたように、ポリペプチドの反復性の性質によって引き起こされる可能性がある。（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２５：１６７６−８２；  Ｙａｎｋａｉ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３４５：１３６５−７１；  Ｈｓｕ，  Ｃ．  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６０：３７０１−５）；  Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９５）  ２５（１２）：３４４５−３４５１）。
【０１１９】
２．配列モチーフの例
本発明は、アミノ酸配列が非反復性であるより短い配列又はモチーフの単位を複数含む、ＸＴＥＮを包含する。ＸＴＥＮ配列の設計においては、ＸＴＥＮ配列を作出するために多量体化した配列モチーフのライブラリーを用いた「ビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）」法の使用にもかかわらず、非反復性の基準を満たしうることを発見した。従って、ＸＴＥＮ配列がわずか４つの異なる型の配列モチーフを、複数単位含む場合でも、モチーフ自体が通常非反復性アミノ酸配列からなることから、ＸＴＥＮ配列全体は実質的に非反復性となる。
【０１２０】
一実施形態においてＸＴＥＮは、各モチーフが約９〜３６アミノ酸残基であり、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は約１００％がオーバーラップしていない配列モチーフからなる、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、好ましくは４００より長く約３０００残基までの長さの、非反復配列を有する。その他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は約１００％は、各モチーフが９〜１４アミノ酸残基の、オーバーラップしていない配列モチーフからなる。その上さらにその他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列構成要素の少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は約１００％は、各モチーフが１２アミノ酸残基の、オーバーラップしていない配列モチーフからなる。これらの実施形態においては、配列全体が非構造性、及び柔軟性特徴を有するように、配列が主に小さい親水性アミノ酸からなることが好ましい。ＸＴＥＮに含まれるアミノ酸の例には、例えば、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、及びグリシンがある。コドン最適化、配列モチーフをコードしているポリヌクレオチドの組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）、タンパク質の発現、発現タンパク質の荷電分布及び溶解度、並びに二次及び三次構造、のような変数を試験した結果、その配列が実質的に非反復性になるように設計した場合、向上した特徴をもつＸＴＥＮ組成物は主に、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基を含むことを見いだした。一実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）又はプロリン（Ｐ）から選択される４つ〜６つの型のアミノ酸を主に含み、この配列は実質的に非反復配列として配置され、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さ、好ましくは４００より長く約３０００残基までの長さのものである。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、配列の少なくとも約８０％がオーバーラップしていない配列モチーフからなる、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、好ましくは４００より長く約３０００残基までの長さ配列を有し、ここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸からなる９〜３６アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ配列中のいずれか１種類のアミノ酸型の含量が３０％を超えない配列を有する。その他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％はオーバーラップしていない配列モチーフからなり、ここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸からなる９〜３６アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ中のいずれか１種類のアミノ酸型の含量は３０％を超えない。その他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％はオーバーラップしていない配列モチーフからなり、ここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む１２アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ中のいずれか１種類のアミノ酸型の含量は３０％を超えない。一層さらにその他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、から約１００％は、オーバーラップしていない配列モチーフを含みここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む１２アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ中のいずれか１種類のアミノ酸型の含量は３０％を超えないものである。
【０１２１】
その上さらにその他の実施形態においてＸＴＥＮは、配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％がオーバーラップしていない配列モチーフを含む、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、好ましくは４００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さのを非反復性配列含み、ここでモチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む９〜１４アミノ酸残基のモチーフであり、そしていずれのモチーフ中の任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、その配列モチーフ中に３回以上反復されないものである。その他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％は、オーバーラップしていない配列モチーフを含み、ここでモチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む１２アミノ酸残基のモチーフであり、そしていずれのモチーフ中の任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、その配列モチーフ中に３回以上反復されないものである。その他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％はオーバーラップしていない配列モチーフを含み、ここでモチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）を含む１２アミノ酸残基のモチーフであり、そしていずれのモチーフ中の任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、その配列モチーフ中に３回以上反復されないものである。一層さらにその他の実施形態において、ＸＴＥＮは１２アミノ酸の配列モチーフを含み、ここでアミノ酸はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択され、そして、いずれのモチーフ中の任意の２つの連続したアミノ酸残基の配列は、その配列モチーフ中に３回以上反復されず、及び完全長ＸＴＥＮ配列中のいずれか１種類のアミノ酸型の含量は３０％を超えないものである。この段落の前述した実施形態においてＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性となるであろう。
【０１２２】
いくつかの実施形態において本発明は、配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％が、表２のアミノ酸配列から選択される２つ以上のオーバーラップしていない配列モチーフを、複数単位含む、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの、累積して４００より長く約３０００残基までの長さの非反復性ＸＴＥＮ配列を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態においてＸＴＥＮは、配列の約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％が、表２の単一のモチーフファミリーから選択される２つ以上のオーバーラップしていない配列モチーフを含む、オーバーラップしていない配列モチーフを含み、その結果、配列全体が実質的な非反復性を保持する「ファミリー」配列となる。従って、これらの実施形態においてＸＴＥＮ配列は、表２のＡＤモチーフファミリー、又はＡＥモチーフファミリー、又はＡＦモチーフファミリー、又はＡＧモチーフファミリー、又はＡＭモチーフファミリー、又はＡＱモチーフファミリー、又はＢＣファミリー、又はＢＤファミリーの配列の、オーバーラップしていない配列モチーフを複数単位含む。その他の実施形態においてＸＴＥＮは、表２の２つ以上のモチーフファミリーからのモチーフ配列を含む。
【０１２３】
表２：１２アミノ酸のＸＴＥＮ配列モチーフ及びモチーフファミリー
【表２−１】
2015124222.tif 000005
【表２−２】
2015124222.tif 000006
＊は、様々な置換を入れて用いた場合にも、個々のモチーフ配列が「ファミリー配列」を生じることを示す。
【０１２４】
その他の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ組成物は、配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％が、表８〜１１の１つ以上のポリペプチド配列から選択されたオーバーラップしていない３６アミノ酸配列のモチーフを含む、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの、好ましくは４００より長く約３０００残基までの長さの非反復性ＸＴＥＮ配列を含む。
【０１２５】
ＧＨＸＴＥＮ融合タンパクのＸＴＥＮ構成要素の１００％未満のアミノ酸がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択された４〜６種のアミノ酸を含む、又は配列の１００％未満が表２の配列モチーフを含む、又は表３のＸＴＥＮと１００％未満の配列同一性を有するそれら実施形態において、その他のアミノ酸残基は、任意のその他１４種の天然のアミノ酸から選択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％親水性アミノ酸を含むように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体にわたって散在し、配列モチーフ中若しくは配列モチーフ間に局在し、又はＸＴＥＮ配列中の１つ以上の短い配列中に集中して存在する。ＧＨＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）ではないアミノ酸を含む例においては、アミノ酸が疎水性残基ではないことが好ましく、かつ、ＸＴＥＮ構成要素の二次構造を実質的に与えないものであるべきである。ＸＴＥＮの構築において好ましくない疎水性残基には、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンが含まれる。加えて、ＸＴＥＮ配列が、システイン（ジスルフィド形成及び酸化を避けるため）、メチオニン（酸化を避けるため）、アスパラギン及びグルタミン（脱アミド化を避けるため）をほとんど含まない（例えば５％未満）又は全く含まないようにＸＴＥＮ配列を設計することができる。従っていくつかの実施形態において、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）に加えてその他のアミノ酸を含む、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素においては、アルファ−ヘリックス及びベータシートを構成する配列が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムで測定した場合に、５％未満となり得、ランダムコイルの形成が、ＧＯＲアルゴリズムで測定した場合に、少なくとも９０％、又は少なくとも約９５％又はそれ以上となるだろう。
【０１２６】
３．配列の長さ
本発明の別の態様においては、本発明は、伸張した長さの配列を有するＸＴＥＮポリペプチドの担体を含むＧＨＸＴＥＮ組成物を包含する。本発明は、非反復性の、非構造性ポリペプチドの長さの増大がＸＴＥＮの非構造性の特性を向上させ、その結果、ＸＴＥＮ担体を含む融合タンパク質の生物学的及び薬物動態学的特性を向上させるという発見を活用する。実施例においてより詳細に記載するように、ＸＴＥＮの長さを比例的に増大させると、それが単一ファミリーの配列モチーフ（例えば、表２の４種類のＡＥモチーフ）を固定した順番で繰り返すことによって作出したものであっても、ＧＯＲアルゴリズムにより決定されるランダムコイル形成のパーセンテージが、より短い長さのＸＴＥＮと比較した場合よりも高くなる。実施例において記載するように、通常、非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを増大させると、より短い長さの配列の非構造性ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質に比べて、融合タンパク質の終末相半減期は不釣り合いなまでに増大する。
【０１２７】
本発明のＧＨＸＴＥＮ中に含めることが検討されるＸＴＥＮの非限定的な例を表３に示す。一実施形態において本発明は、融合タンパク質のＸＴＥＮ配列の長さが、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までであり、いくつかの例においては４００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、ここでＸＴＥＮが、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して向上した薬物動態学的特性をＧＨＸＴＥＮに付与する、ＧＨＸＴＥＮ組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＧＨＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮ配列は、約１００、又は約１４４、又は約２８８、又は約４０１、又は約５００、又は約６００、又は約７００、又は約８００、又は約９００、又は約１０００、又は約１５００、又は約２０００、又は約２５００又は約３０００までの長さのアミノ酸残基である可能性がある。その他の例においてＸＴＥＮ配列は、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、４０１〜約５００、約５００〜９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００、又は約２０００〜約３０００の長さのアミノ酸残基である可能性がある。一実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、表３から選択されたＸＴＥＮと、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示すＸＴＥＮ配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においてＸＴＥＮ配列は、最適化したＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）をコードしているヌクレオチドを、融合タンパク質をコードしている遺伝子のＸＴＥＮ部分に挿入することにより、ＸＴＥＮ配列の発現がＧＨＸＴＥＮのＮ末端構成要素として最適になるように設計される。一実施形態において発現したＧＨＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４８又はＡＭ４８、ＡＥ６２４、又はＡＥ９１２又はＡＭ９２３の配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の実施形態においてＸＴＥＮは、実施例１４〜１７に記載したＮ末端残基を有する。
【０１２８】
その他の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮ配列中の残基の累計が約４００から約３０００アミノ酸残基である、第一の及び第二のＸＴＥＮ配列を含む。前述した実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、各配列が、表３から選択された少なくとも第一のＸＴＥＮと又は加えて第二のＸＴＥＮと、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す、第一の及び第二のＸＴＥＮ配列を含む。ＧＨＸＴＥＮ組成物中に用いられる１つ以上のＸＴＥＮの例としては、少なくとも１つのＧＨのＮ−及びＣ末端にＸＴＥＮが結合した構築物が挙げられるがこれには限定されない。
【０１２９】
以下により詳細に記載するように、本発明は対象に投与する融合タンパク質に標的半減期を付与する長さのＸＴＥＮを選択することによってＧＨＸＴＥＮを設計する方法を提供する。通常、累積した長さが約４００残基の、より長いＸＴＥＮをＧＨＸＴＥＮ組成物中に組み込むと、累積した長さがより短い（例えば約２８０残基より短い）ＸＴＥＮと比較して、半減期がより長くなる。しかしながら別の実施形態においてはさらに、対象に皮下又は筋内投与した後の体内吸収率をよりゆるやかにするために、より長い配列長のＸＴＥＮを含むように、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を設計する。そのような実施形態においては、同等な用量のＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、Ｃｍａｘが低下し、このことは、治療ウインドウにおいて組成物がＧＨＸＴＥＮを維持する能力に寄与する。従ってＸＴＥＮは、本明細書において記載したその他の物理的／化学的特性を付加することで、投与されるＧＨＸＴＥＮに持続性の特性を付与する。
【０１３０】
表３：ＸＴＥＮポリペプチド
【表３−１】
2015124222.tif 000007
【表３−２】
2015124222.tif 000008
【表３−３】
2015124222.tif 000009
【表３−４】
2015124222.tif 000010
【表３−５】
2015124222.tif 000011
【０１３１】
４．ＸＴＥＮセグメント
一実施形態において本発明は、ＸＴＥＮ構成要素の累積した長さが約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、ＸＴＥＮ構成要素が表３、８、９、１０、１１、及び１２から選択された少なくとも１種類のポリペプチド配列セグメントを含み、ＸＴＥＮ配列のその他の部分が全体にわたって少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％又はそれ以上の親水性アミノ酸を含み、そしてＸＴＥＮ配列のその他の部分が約２％未満の疎水性又は芳香族アミノ酸、又はシステインからなる、単離したＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態においてＸＴＥＮは、同一の又は異なる複数のセグメントを含む。別の実施形態において本発明は、ＸＴＥＮ構成要素の累積した長さが約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、ＸＴＥＮ構成要素が少なくとも約１００〜約９２３、又は少なくとも約１００〜約８７５、又は少なくとも約１００〜約５７６、又は少なくとも約１００〜約２８８、又は少なくとも約１００〜約１４４までのアミノ酸残基の少なくとも１種類の配列セグメントを含み、ここで配列セグメントは少なくとも３種類の異なる型のアミノ酸を含み、かつ、配列セグメント中のグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和が配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を構成し、そしてＸＴＥＮ配列のその他の部分の及び少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％が親水性アミノ酸を含み、ＸＴＥＮ配列のその他の部分の未満約２％が疎水性芳香族アミノ酸、又はシステインを含む、単離したＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。別の実施形態において本発明は、ＸＴＥＮ構成要素の累積した長さが約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、かつ、ＸＴＥＮ構成要素が少なくとも約２００〜約９２３、又は少なくとも約２００〜約８７５、又は少なくとも約２００〜約５７６、又は少なくとも約２００〜約２８８アミノ酸残基の少なくとも１種類の配列セグメントを含み、ここで配列セグメント中のグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和は配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を構成し、そしてセグメントの部分列スコアが１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、及び最も好ましくは５未満であり、ＸＴＥＮ配列のその他の部分の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％が親水性アミノ酸を含み、かつ、ＸＴＥＮ配列のその他の部分の未満約２％が疎水性、芳香族又はシステインアミノ酸を含む、単離したＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
【０１３２】
５．Ｎ末端ＸＴＥＮの発現を高める配列
いくつかの実施形態において本発明は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端に組み込まれる短い長さのＸＴＥＮ配列を提供する。結合融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドに組み込まれた、最適化されたＮ末端リーダーポリヌクレオチド配列（Ｎ末端ＸＴＥＮをコードする）を含む好適な発現ベクターで形質転換した宿主細胞における、融合タンパク質の発現が高められる。実施例１４〜１７に記載したように、結合融合タンパク質中に最適化されたＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）を含む、そのような発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞における融合タンパク質の発現が、ＮＴＳを含まないポリヌクレオチドの対応する融合タンパク質の発現と比較して、非常に高くなること、及び発現を高めるために用いられる、非ＸＴＥＮリーダー配列を組み込む必要がなくなることが見いだされてきた。一実施形態において本発明は、ＮＴＳを含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質であって、結合融合タンパク質をコードしている遺伝子の宿主細胞中での発現が、Ｎ末端ＸＴＥＮ配列を含まないＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（ＮＴＳを欠損した遺伝子をコードしている）の発現と比較して、約５０％、又は約７５％、又は約１００％、又は約１５０％、又は約２００％、又は約４００％高められたＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
【０１３３】
一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４８又はＡＭ４８のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列を含む。ＡＥ４８又はＡＭ４８のアミノ酸配列は以下に示す通りである。
ＡＥ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ
ＡＭ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳ
【０１３４】
別の実施形態においては、短い長さのＮ末端ＸＴＥＮを、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端領域を形成するより長い長さのＸＴＥＮに結合させる。この場合、短い長さのＮ末端ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチド配列は、宿主細胞中での発現を高める特性に寄与し、上述したように、長い長さの発現したＸＴＥＮは、融合タンパク質中でのＸＴＥＮ担体としての特性の向上に寄与する。前述した融合タンパク質において短い長さのＸＴＥＮは、本明細書において開示した任意のＸＴＥＮ（例えば、表３のＸＴＥＮ）と結合し、ＸＴＥＮを生じ、これはその後本明細書において開示した任意のＧＨ（例えば、表１のＧＨ）のＮ末端に融合タンパク質の構成要素として結合する。あるいは、短い長さのＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチド（又はその相補鎖）は、本明細書において開示した任意のＸＴＥＮ（又はその相補鎖）をコードしているポリヌクレオチドに結合して、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードしている遺伝子を生じ、これはその後本明細書において開示した任意のＧＨをコードしているポリヌクレオチドの５’末端に（又はその相補鎖の３’末端に）結合する。いくつかの実施形態において、長い長さを有するＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、配列ＡＥ６２４、ＡＥ９１２、及びＡＭ９２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す。
【０１３５】
上述した、前述のＮ末端ＸＴＥＮ実施形態のいずれかにおいて、Ｎ末端ＸＴＥＮは、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードしているヌクレオチドを融合タンパク質の標的部分をコードしている遺伝子に連結するために、制限エンドヌクレアーゼの制限酵素部位を用いることができるように、好ましくはＧＥＳＴＰＡから選択された、約１つ〜約６つのアミノ酸残基をさらに有していてもよい。Ｎ末端配列の生成方法及び本発明の融合タンパク質への組み込みについては、実施例においてより詳細に記載されている。
【０１３６】
６．実効電荷
その他の実施形態において、ＸＴＥＮポリペプチドは、実効電荷を有するアミノ酸を組み込んだこと、及び／又はＸＴＥＮ配列中の疎水性アミノ酸の割合を低下させたことにより付与された、非構造性の特徴を有する。全実効電荷及び実効電荷密度は、ＸＴＥＮ配列における荷電したアミノ酸の含量を変えることにより制御される。いくつかの実施形態において、組成物のＸＴＥＮの実効電荷密度は、１残基当たり、＋０．１より高い又は−０．１未満の電荷である場合がある。その他の実施形態において、ＸＴＥＮの実効電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、又は約２０％又はそれ以上になる可能性がある。
【０１３７】
ヒト又は動物の大部分の組織及び表面が実効負電荷を有することから、いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮを含む組成物と、血管、健康な組織のような様々な表面、若しくは様々な受容体との間の非特異的相互作用を最小にするために、実効負電荷を有するように設計される。特定の理論に拘束されないが、ＸＴＥＮは、それぞれが実効負電荷を有し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列全体に分布しているＸＴＥＮポリペプチド中の個々のアミノ酸の間の静電反発力により、オープン構造をとることができる。ＸＴＥＮの伸張した長さの配列における実効負電荷のそのような分布は非構造性構造を引き起こすことができ、このことはその後、流体力学半径の有意な増大を生じる可能性がある。好ましい実施形態において負電荷は、グルタミン酸残基を組み込むことによって付加される。従って、一実施形態において本発明は、約８、１０、１５、２０、２５、又は約３０％ものグルタミン酸を含むＸＴＥＮ配列を有する、ＸＴＥＮを提供する。通常、グルタミン酸残基は、ＸＴＥＮ配列中で一定の間隔で配置されるだろう。いくつかの例において、ＸＴＥＮには、ＸＴＥＮ  ２０ｋＤ当たり、約１０〜８０、又は約１５〜６０、又は約２０〜５０個のグルタミン酸残基を含めることができ、これにより、非常に似たｐＫａを有する荷電した残基を含むＸＴＥＮを生じさせることができる。これらグルタミン酸残基の添加により、産物の電荷均一性を向上させ、等電点をはっきりさせ、得られるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的特性、例えば精製工程の単純化、を向上させることができる。
【０１３８】
本発明の組成物のＸＴＥＮは通常、正電荷をもつアミノ酸を全く又はほとんど含まない。いくつかの実施形態においてＸＴＥＮは、正電荷のアミノ酸残基を約１０％未満有する場合が、又は正電荷のアミノ酸残基を約７％未満、又は約５％未満、又は約２％未満、又は約１％未満有する場合がある。しかしながら本発明は、リジンのイプシロンアミンと、ペプチド上の反応基、リンカーブリッジ（ｌｉｎｋｅｒ  ｂｒｉｄｇｅ）若しくは薬剤上の反応基、又はＸＴＥＮ主鎖に結合する小分子、との結合を可能にするために、限られた数の、リジンのような正電荷アミノ酸をＸＴＥＮに組み込んだ構築物についても検討する。前述の一実施形態においてＸＴＥＮは、約１〜約１００のリジン残基、又は約１〜約７０のリジン残基、又は約１〜約５０のリジン残基、又は約１〜約３０のリジン残基、又は約１〜約２０のリジン残基、又は約１〜約１０のリジン残基、又は約１〜約５の範囲のリジン残基、又は１つのみのリジン残基を有する。前述のリジンを含むＸＴＥＮを用いることにより、ＸＴＥＮ、成長ホルモン、及び成長に関連する疾患又は障害の治療に有用な化学療法薬、を含む融合タンパク質を構築する。この場合、ＸＴＥＮ構成要素に組み込まれる薬剤の最大分子数は、ＸＴＥＮに組み込まれるリジン又は反応性側鎖を有するその他のアミノ酸（例えば、システイン）の数よって決定される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、よりよい発現又は精製挙動を生じるように、セリン又はグリシンのようなその他の残基によって離された、荷電した残基を含む。実効電荷に基づき、いくつかのＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、又は６．５もの等電点（ｐＩ）を有する。好ましい実施形態においてＸＴＥＮは、１．５から４．５までの等電点を有するだろう。これらの実施形態において、本発明のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物中に組み込まれたＸＴＥＮは、非構造性構造並びに哺乳類のタンパク質及び組織へのＸＴＥＮ構成要素の結合を低下させることに寄与する実効負電荷を、生理的な条件下で有する。
【０１４０】
疎水性アミノ酸がポリペプチドの構造に関わることから、本発明は、ＸＴＥＮ中の疎水性アミノ酸含量が通常、５％未満、又は２％未満、又は１％未満であるＸＴＥＮを提供する。一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素中におけるメチオニン及びトリプトファンのアミノ酸含量は通常、５％未満、又は２％未満、及び最も好ましくは１％未満である。別の実施形態においてＸＴＥＮは、１０％未満の正電荷アミノ酸残基を含み、又は約７％未満、又は約５％未満、又は約２％未満の正電荷アミノ酸残基を含み、メチオニン及びトリプトファン残基の総和が２％未満となる場合があり、及びアスパラギン及びグルタミン残基の総和が全ＸＴＥＮ配列の１０％未満となる場合がある、配列を有するだろう。
【０１４１】
７．低い免疫原性
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低度の免疫原性しかもたない、又は実質的に非免疫原性である組成物を提供する。ＸＴＥＮの免疫原性には、例えば、非反復配列、非構造性構造、高度の溶解性、低度な自己凝集性又は自己凝集性の欠如、配列中のタンパク質分解部位が低頻度であるか又は無い、及びＸＴＥＮ配列中のエピトープが低頻度であるか又は無い、などの複数の因子が関与している可能性がある。
【０１４２】
立体構造エピトープは、タンパク質抗原における複数の不連続なアミノ酸配列を含む、タンパク質表面の領域から形成される。このタンパク質の正確な折り畳みが、宿主の体液性免疫系によって「異物」として認識されることができるようになる、明確な、安定した空間配置、又はエピトープをこれらの配列にもたらし、その結果このタンパク質に対する抗体の生産又は細胞介在性免疫反応の活性化が生じる。後者の例において、タンパク質に対する個々の免疫反応は、個々のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性に関与する、Ｔ細胞エピトープの認識により大きく影響される。Ｔ細胞表面上の同種Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の認識は、ＣＤ４分子のような特定のその他のコレセプターの交差結合と共に、Ｔ細胞の活性化状態を誘導することができる。活性化により、サイトカインの放出が引き起こされ、さらに抗体を生産するＢ細胞のようなその他リンパ球が活性化され、又は完全な細胞免疫反応としてＴキラー細胞が活性化される。
【０１４３】
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面上で抗原を提示するための、ペプチドが特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力は、数多くの因子、とりわけその一次配列に依存する。一実施形態において、低度の免疫原性は、抗原提示細胞中での抗原プロセシングに抵抗性をもつＸＴＥＮ配列を設計すること及び／又はＭＨＣ受容体に強く結合しない配列を選択することにより達成される。本発明は、ＭＨＣ  ＩＩ受容体への結合が低下するように、並びにＴ細胞受容体又は抗体結合に対するエピトープの形成を回避するように設計され、その結果低度の免疫現性を生じる、実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、部分的に、ＸＴＥＮ配列の配座柔軟性の、すなわちアミノ酸残基の選択及び順番が原因である二次構造の欠損の、直接的な結果である。例えば、特に興味深い配列は、水溶液中で密に折りたたまれた構造をとる傾向が低い、又は生理的条件下で立体構造エピトープを生じる可能性のある配列である。標準的な治療行為及び用量でのＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、通常、ＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成を引き起こさず、そしてＧＨＸＴＥＮ組成物中のＧＨ融合パートナーの免疫原性を低下させる。
【０１４４】
一実施形態において対象融合タンパク質に用いられるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まない場合がある。タンパク質の免疫原性を低下させることを目的とした、そのようなエピトープの除去についてはこれまでに開示されてきた。例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる、国際公開第９８／５２９７６号、同第０２／０７９２３２号、及び同第００／３３１７号を参照のこと。ヒト細胞エピトープのアッセイについても記載されてきた（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２８１：  ９５−１０８）。特に興味がもたれるのは、Ｔ細胞エピトープを生成することなくオリゴマー化することができる、又は非ヒト配列のペプチド配列である。このペプチド配列は、Ｔ細胞エピトープの存在について、及び６〜１５−ｍｅｒ配列の頻度について、具体的には、非ヒト９−ｍｅｒ配列の頻度について、これら配列のダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）を試験し、その後エピトープ配列を除去又は壊すようにＸＴＥＮ配列の設計を変更することにより達成される。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合すると予測されるＸＴＥＮのエピトープの数を制限することにより、実質的に非免疫原性となる。ＭＨＣ受容体に結合可能なエピトープの数を減少させることにより、同時に、Ｔ細胞活性化能並びにＴ細胞ヘルパー機能の低下、Ｂ細胞活性化又はアップレギュレーションの低下、及び抗体生産の減少が生じる。予測されるＴ細胞エピトープの低度は、実施例４５に示したエピトープ予測アルゴリズム、例えばＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７：  ５５５−６１）など、により決定することができる。タンパク質中の特定のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５５５、に開示されたように、そのペプチドフレームが複数の最も共通したヒトＭＨＣアレルに結合する場合のＫｄ（解離定数、親和性、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））の対数である。スコアの範囲は、少なくとも２０ｌｏｇ、約１０から約−１０（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄの結合定数に相当する）にわたり、そしてＭＨＣ上でのペプチド提示に際してアンカー残基として役立つ疎水性アミノ酸、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなど、を回避することにより、スコアを低下させることができる。いくつかの実施形態において、ＧＨＸＴＥＮに組み込まれるＸＴＥＮ構成要素は、約−５以上、又は−６以上、又は−７以上、又は−８以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコア、又は−９以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにおいて、予測されるＴ細胞エピトープを含まない。本明細書で使用する場合、「−９以上」のスコアは、１０から−９のスコアをまとめて包含し得るが、−１０のスコアは、−１０は−９未満であるとして包含しない。
【０１４５】
別の実施形態において、対象融合タンパク質に組み込まれたものを含む本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ配列における既知のタンパク質分解部位を制限し、ＸＴＥＮのＭＨＣＩＩ受容体に結合することができる低分子へのプロセシングを低減させることにより、実質的に非免疫原性とされる。別の実施形態においてＸＴＥＮ配列は、実質的に二次構造をとらず、多くのプロテアーゼへの抵抗性に寄与する高いエントロピーの構造を有する配列を使用することにより、実質的に非免疫原性とされる。従って、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの低下及びＸＴＥＮからの既知のタンパク質分解部位の除去は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ組成物を、免疫系の受容体を含む哺乳類の受容体に実質的に結合できないようにする。一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳類の受容体に対して＞１００ｎＭの結合定数（Ｋｄ）、又は哺乳類の細胞表面若しくは血中ポリペプチド受容体に対して５００ｎＭより大きいＫｄを有する場合がある。
【０１４６】
加えて、ＸＴＥＮが非反復性配列であり、そのためにエピトープをもたないことは、Ｂ細胞がＸＴＥＮに結合する能力、又はＸＴＥＮがＢ細胞を活性化する能力を制限する。認識された反復性配列は、たとえＢ細胞わずかしか存在しなかったとしても多価接触を形成することができ、そして複数のＴ細胞非依存性受容体の交差結合の結果、Ｂ細胞の増殖及び抗体生産を刺激することができる。一方、ＸＴＥＮはその伸張配列全体にわたって多くの異なるＢ細胞との接触を形成するが、ＸＴＥＮ配列に反復性がないことにより、各個々のＢ細胞は、個々のＸＴＥＮとは１つ若しくは少数の接触を形成することしかできない。いずれの理論にも拘束されず、ＸＴＥＮが、Ｂ細胞増殖とそれによる免疫反応を刺激する能力は、通常非常に低い。一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮは、融合していない対応するＧＨと比較して、低い免疫原性を有する。一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮを３種類までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＧＨＸＴＥＮ  ＩｇＧを生じるが、１：１０００希釈においては検出できない。別の実施形態において、ＧＨＸＴＥＮを３種類までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＧＨ  ＩｇＧを生じるが、１：１０００希釈においては検出できない。別の実施形態において、ＧＨＸＴＥＮを３種類までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＸＴＥＮ  ＩｇＧを生じるが、１：１０００希釈においては検出できない。前述の実施形態において哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、又はカニクイザルである場合がある。
【０１４７】
高度な反復性を有する配列と比較した場合の、非反復性ＸＴＥＮ配列のさらなる特徴は、非反復性ＸＴＥＮが形成する抗体との接触はより弱いということである。抗体は多価分子である。例えば、ＩｇＧは、２つの同一の結合部位を有し、ＩｇＭは１０の同一の結合部位を含む。従って、反復性配列に対する抗体は、高い結合力を有するそれら反復性配列との多価接触を形成することができ、これらの接触がそれら反復性配列の能力及び／又は除去に影響を与える可能性がある。一方、非反復性ＸＴＥＮに対する抗体は多価相互作用を生じる可能性があり、これはＧＨＸＴＥＮ組成物が血中で維持される期間を長くすることができるような、免疫クリアランスの低下を生じる可能性がある。
【０１４８】
８．流体力学半径の増大
別の態様において本発明は、ＸＴＥＮポリペプチドが長い流体力学半径を有し、ＸＴＥＮを組み込んだＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に見かけの分子量の相当する増加を付与する、ＸＴＥＮを提供する。実施例３７に詳述したように、ＸＴＥＮとＧＨ配列の結合は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、流体力学半径が長い、見かけの分子量が大きい、及び見かけの分子量因子が大きい可能性がある、ＧＨＸＴＥＮ組成物を生じる。例えば、延長された半減期が望まれる治療上の適用においては、長い流体力学半径のＸＴＥＮを１つ以上のＧＨを含む融合タンパク質に組み込むことにより、組成物の流体力学半径を効果的に、およそ３〜５ｎｍである糸球体細孔径を超えるものに増大させることができ（約７０ｋＤＡの見かけの分子量に相当する）（Ｃａｌｉｃｅｔｉ．  ２００３．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：１２６１−１２７７）、その結果、血中タンパク質の腎クリアランスが低下する。タンパク質の流体力学半径は、その分子量と形状、又は緊密さを含むその構造によって決定される。特定の理論に拘束されず、ＸＴＥＮはペプチドの個々の電荷間の静電反発、又は二次構造を与える能力を欠いた、配列中の特定のアミノ酸による固有の柔軟性によって、オープン構造をとることができる。オープンな、伸張した、かつ、非構造性の構造をもつＸＴＥＮポリペプチドは、一般的な球状タンパク質のような二次及び／又は三次構造をもつ同等の配列長及び／又は分子量を有するポリペプチドと比較して、比例的により長い流体力学半径をもつことができる。米国特許第６，４０６，６３２号及び同第７，２９４，５１３号に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用などの流体力学半径の決定方法は当該分野において周知である。実施例３７に示す結果のように、長い長さのＸＴＥＮの付加は、流体力学半径、見かけの分子量、及び見かけの分子量因子などの指標の増大をもたらし、所望される特徴的な見かけの分子量又は流体力学半径のカットオフを有するようにＧＨＸＴＥＮを設計することを可能にする。従って、特定の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも約５ｎｍ、又は少なくとも約８ｎｍ、又は少なくとも約１０ｎｍ、又は１２ｎｍ、又は少なくとも約１５ｎｍの流体力学半径を有することができるように、ＸＴＥＮを含めて構成することができる。前述の実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質中のＸＴＥＮによって与えられる長い流体力学半径は、生じる融合タンパク質の腎クリアランスの低下を引き起こすことができ、その結果、相当する終末相半減期の増大、平均滞留時間の増加、及び／又は腎クリアランス率の低下を引き起こす。
【０１４９】
別の実施形態においては、生理的な条件下において少なくとも約１５０ｋＤａ、又は少なくとも約３００ｋＤａ、又は少なくとも約４００ｋＤａ、又は少なくとも約５００ｋＤＡ、又は少なくとも約６００ｋＤａ、又は少なくとも約７００ｋＤＡ、又は少なくとも約８００ｋＤａ、又は少なくとも約９００ｋＤａ、又は少なくとも約１０００ｋＤａ、又は少なくとも約１２００ｋＤａ、又は少なくとも約１５００ｋＤａ、又は少なくとも約１８００ｋＤａ、又は少なくとも約２０００ｋＤａ、又は少なくとも約２３００ｋＤａ又はそれ以上の見かけの分子量をもつ融合タンパク質を作出するために、選択した長さ及び配列のＸＴＥＮを選択的にＧＨＸＴＥＮ中に組み込むことができる。別の実施形態においては、生理的な条件下において少なくとも３の、あるいは少なくとも４の、あるいは少なくとも５の、あるいは少なくとも６の、あるいは少なくとも８の、あるいは少なくとも１０の、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量因子を、又は少なくとも２０若しくはそれ以上の見かけの分子量因子を有するＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を生じるように、選択した長さ及び配列のＸＴＥＮを選択的にＧＨに結合させることができる。別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は生理的な条件下で、融合タンパク質の実際の分子量に対して、約４〜約２０の、又は約６〜約１５の、又は約８〜約１２の、又は約９〜約１０の見かけの分子量因子を有する。
【０１５０】
Ｖ）．ＧＨＸＴＥＮの構造配置及び特性
対象組成物のＧＨは、天然の、完全長ポリペプチドには限定されず、組み換えたもの、並びに生物学的及び／又は薬理学的に活性な変異体又はその断片をも含む。当然のことながら、ＧＨの生理活性又は薬理学的特性に関するＧＨ変異体を、本発明の精神から逸脱することなく作出するために、例えば、様々なアミノ酸の欠失、挿入及び置換を行うことができる。ポリペプチド配列中の保守的アミノ酸置換の例を表４に示した。しかしながら、ＧＨの配列同一性が、本明細書において開示した特定の配列と比較して１００％未満であるＧＨＸＴＥＮを用いた実施形態においては、本発明は、指定されたＧＨの指定されたアミノ酸残基を、任意のその他１９種類の天然のＬ−アミノ酸で置換することを検討する。ここで置換されるアミノ酸の位置は、隣接した残基を含む、ＧＨ配列中の任意の位置であってよい。任意の１置換が生理活性の望ましくない変化を生じる場合には、次に別のアミノ酸のうちの１つを使用して置換することができ、そして本明細書において記載した方法又は、例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３６４，９３４号に示された保守的及び非保守的突然変異についての指針を用いて、又は当該分野において一般的に知られている方法を用いて、構築物を評価することができる。加えて、変異体は例えば、ＧＨの完全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基を付加したポリペプチド、又はＧＨの完全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端から１つ以上のアミノ酸残基を欠失したポリペプチドを含む得場合があり、このポリペプチドは天然のペプチドの生理活性を全てではなくても、いくらか保持する。
【０１５１】
表４：保守的アミノ酸置換の例
【表４】
2015124222.tif 000012
【０１５２】
（ａ）ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の配置
本発明は、ＧＨ及びＸＴＥＮ構成要素をＮ末端側からＣ末端側への特定の配置で含む、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、ブロック共重合体を形成するように、１つ以上のＧＨが１つ以上のＸＴＥＮのＮ末端又はＣ末端のいずれかに、スペーサーと共に又はスペーサーを伴わずに結合し、その結果、生じるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質中でのＧＨ及びＸＴＥＮの配置はブロック共重合体化学において既知の配置と同様になる。１つ以上のＧＨ、ＸＴＥＮ、又はスペーサーを含む場合、各ＧＨ、ＸＴＥＮ、又はスペーサーは同じ又は異なる配列を有し、ＧＨ及び／又はＸＴＥＮは連続して又は交互に（規則的に又は変則的に）結合する。従って、本明細書で提供する全ての式において、１つ以上のＧＨ、ＸＴＥＮ、又はスペーサーが含まれる場合、各ＧＨ、ＸＴＥＮ、及びスペーサーは同じか又は異なるものである。いくつかの実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、１つのＸＴＥＮポリペプチドに結合したＧＨを含む、単量体融合タンパク質である。その他の実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合したＧＨを含む単量体融合タンパク質である。その上さらにその他の実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、１つのＸＴＥＮポリペプチドに結合した２つ以上のＧＨを含む単量体融合タンパク質である。その上さらにその他の実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合した２つ以上のＧＨを含む単量体融合タンパク質である。表５に本発明のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に包含される配置の非限定的な例を示すが、本明細書において開示した又は当該分野において既知のスペーサー及び開裂配列の組み込みを含むその他の数多くの変異型が当業者には明かであろう。
【０１５３】
表５：ＧＨＸＴＥＮの配置
【表５】
2015124222.tif 000013
＊単一とは１つの構成要素であり、複数が２つ以上の構成要素であることを特徴とする
＊＊成長因子及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
【０１５４】
本発明は、表１から選択された単一の又は複数のＧＨ（又は断片若しくはその配列変異体）、及び表３から選択された単一又は複数のＸＴＥＮ（又はその配列変異体）を含み、表５に示した配置をとる、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を検討するが、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物はこれらには限定されない。通常、生じるＧＨＸＴＥＮは、対応するＸＴＥＮと結合していないＧＨの生理活性を少なくとも部分的には保持する。その他の実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ中のスペーサー配列に組み込まれた任意の開裂配列の開裂により、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物がＸＴＥＮから分離される際に生物学的に活性になる又は生理活性が増加するＧＨ構成要素のいずれについても以下でより詳細に記載する。
【０１５５】
ＧＨＸＴＥＮ組成物の一実施形態において、本発明は式Ｉの融合タンパク質を提供し、（ＸＴＥＮ）ｘ−ＧＨ−（ＸＴＥＮ）ｙ：Ｉ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；ｘは０又は１のいずれかであり及びｙは０又は１のいずれかであり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１５６】
ＧＨＸＴＥＮ組成物の別の実施形態において、本発明は式ＩＩの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ：ＩＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり及びｙは０又は１のいずれかであり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式ＩＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＧＨ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）ｚ：ＩＩＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式ＩＶの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）−（ＧＨ）：ＩＶ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式Ｖの融合タンパク質である、単離した融合成長ホルモンを提供し、
（ＧＨ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）：Ｖ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式ＶＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）：ＶＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＧＨ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＨ）−（ＸＴＥＮ）：ＶＩＩ
式中、独立した各産物について、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１６２】
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（（Ｓ）ｍ−（ＧＨ）ｘ−（Ｓ）ｎ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｏ）ｔ：ＶＩＩＩ
式中、（１）ｘ＋ｙ＞１、（２）ｔ＝１、ｘ＞０及びｙ＞０である場合、（３）１つより多いＧＨ、Ｓ、又はＸＴＥＮが含まれ、ＧＨ、ＸＴＥＮ、又はＳがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合；及び（４）ｔ＞１であり、各サブユニット中に含まれるｍ、ｎ、ｏ、ｘ、又はｙがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合以外は、ｔは０より大きい整数であり（１、２、３など）；ｍ、ｎ、ｏ、ｘ、及びｙはそれぞれ独立して整数であり（０、１、２、３など）、ＧＨは成長ホルモンであり；Ｓは任意に開裂部位を含むスペーサーであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質をそれを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮと結合していない対応するＧＨであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨと比較して、融合タンパク質が治療ウインドウ中で推移する時間は少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも１００倍以上に延長される。その他の実施形態においては、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質をそれを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮに結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量において投与されるＧＨの連続投与の間隔と比較して、治療上効果的な用量計画を維持するために必要な連続投与の間隔を少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間、又は少なくとも約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約１４日間、又は少なくとも約２１日間延長することができる。
【０１６４】
本発明に包含される融合タンパク質のスペーサー配列群はいずれも任意である。スペーサーは、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を高めるために、又はＧＨ構成要素が望ましい三次構造をとることができるように及び／又は標的受容体と適切に相互作用できるように、立体障害を低減させるために提供される。スペーサーについて及び望ましいスペーサーの同定方法については、例えば、参照することにより特に本明細書に組み入れられる、Ｇｅｏｒｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １５：８７１−８７９、を参照のこと。一実施形態においてスペーサーは、１〜５０までのアミノ酸残基の長さの又は約１〜２５残基、又は約１〜１０残基までの長さのペプチド配列を１つ以上含む。開裂部位を除いたスペーサー配列は、任意の２０種類の天然のＬアミノ酸を含むことができ、好ましくは立体障害のない親水性アミノ酸を含むことができ、これらアミノ酸にはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）が含まれるがこれらには限定されない。いくつかの例においてスペーサーは、ポリグリシン又はポリアラニンであってよく、又は主にグリシン及びアラニン残基の混合物である。開裂配列を除外したスペーサーポリペプチドはほとんど又は実質的に二次構造をとらない（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及び／又はＧＯＲアルゴリズムで決定した場合、約１０％未満、又は約５％未満）。一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物に含まれる１つ又は両方のスペーサー配列は、同一又は異なる開裂配列をさらに含み、この開裂配列は、融合タンパク質からＧＨを開裂させるためのプロテアーゼによる作用を受ける。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、ＸＴＥＮから分離されることによって活性化する又はより活性化するＧＨを分離することができるように、ＧＨＸＴＥＮへの開裂配列の組み込みを設計する。開裂後にＧＨに結合している残りの残基のいずれもがＧＨの活性（例えば、受容体への結合のような）を認識できるほど干渉せず、さらに開裂配列の開裂にプロテアーゼが効果的に作用できるようにするために、開裂配列はＧＨ配列に有意に隣接した位置に、通常ＧＨ配列末端から１８以内、又は１２以内、又は６以内、又は２アミノ酸以内に配置される。いくつかの実施形態において、開裂部位は、対象への投与後にＧＨＸＴＥＮが開裂され得るように、哺乳類対象の内生プロテアーゼにより開裂され得る配列である。そのような例においては、プロドラッグ又はＧＨに対する血中貯留物としてＧＨＸＴＥＮは役立つだろう。本発明で検討される開裂部位の例には、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７又はＭＭＰ−２０から選択される、哺乳類の内生プロテアーゼによって開裂され得るポリペプチド配列、又はＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、及びソルターゼＡのような哺乳類のものではないプロテアーゼによって開裂され得るポリペプチド配列が挙げられるが、これらの配列には限定されない。前述したプロテアーゼ及びその他により開裂される配列は当該分野において既知である。配列並びにその配列変異体中の開裂配列及び切断部位を表６に示す。例えば、ＬＴＰＲＳＬＬＶの配列に作用するトロンビン（活性化凝固第ＩＩ因子）（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：
Ｄ３２０）は、配列中の４番目の位置のアルギニンの後ろを切断するだろう。活性なＦＩＩａは、凝固経路における第ＩＸ因子の下流にあり、リン脂質及びカルシウム存在下でのＦＸａによるＦＩＩの開裂によって生産される。その凝固における天然の役割はフィブリノゲンの開裂であり、これが一旦活性化されると、次に凝固の形成が始まる。ＦＩＩａ活性はしっかりと制御されており、特定の止血に凝固が必要な場合にのみ生じる。しかしながら、凝固は哺乳類においては途切れない過程であるため、ＧＨＸＴＥＮのＧＨとＸＴＥＮの間にＬＴＰＲＳＬＬＶ配列を組み込むと、凝固が生理的に必要な場合には外因性又は内因性いずれかの凝固経路の活性化に伴ってＸＴＥＮドメインが隣接したＧＨとの接点から分離され、それによりＧＨがその間放出されるだろう。同様に、内生プロテアーゼが作用するその他の配列をＧＨＸＴＥＮ中に組み込むことにより、特定の実施形態においては、「プロドラッグ」形態のＧＨＸＴＥＮから高度に活性化されたＧＨを提供する、ＧＨの持続放出を提供することができるだろう。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、切断部位の両側に隣接した２つ又は３つのアミノ酸のみ（全部で４〜６アミノ酸）が開裂配列に組み込まれる。その他の実施形態において、既知の開裂配列は、１つ以上の欠失若しくは挿入を有し、又はその既知配列の１つ若しくは２つ若しくは３ついずれかのアミノ酸の１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が置換されたものである。ここで欠失、挿入又は置換は、プロテアーゼへの感受性の低減又は増強を生じるがプロテアーゼへの感受性の喪失を生じず、ＸＴＥＮからのＧＨの放出速度を設計できる能力をもたらすものである。置換の例を表６に示す。
【０１６７】
表６：プロテアーゼ開裂配列
【表６】
2015124222.tif 000014
↓は開裂部位を示す
ＮＡ：適用なし
＊スラッシュの前、間、又は後に記載されている複数のアミノ酸は、その位置で置換できる別のアミノ酸を示す
「−」は、いずれのアミノ酸も、中列に記載した、対応するアミノ酸で置換できることを示す
【０１６８】
一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質中に組み込まれたＧＨは、表１の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは表１の配列と比較して少なくとも約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は約１００％の配列同一性を示す配列を有する。前述した実施形態のＧＨの活性を、アッセイを用いて、又は本明細書において記載した指標の測定若しくは決定によって評価することができ、そしてそれらの配列は、対象ＧＨＸＴＥＮに含めることが好適であろうと考えられる対応する天然のＧＨ配列の活性と比較して、少なくとも約４０％、又は約５０％、又は約５５％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％又はそれ以上の活性を保持する。好適なレベルの活性を保持することが認められたＧＨを、上に記載した１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合させることができる。一実施形態において、好適なレベルの活性を保持することが認められたＧＨを、表３の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する、あるいは表３の配列と比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合させることができ、その結果キメラ融合タンパク質が生じる。
【０１６９】
単一のＸＴＥＮに結合させた単一のＧＨを含む融合タンパク質の非限定的な例を表３５に示す。一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ組成物は、表３５のＧＨＸＴＥＮと少なくとも約８０％の配列同一性を有する、あるいは表３５のＧＨＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むだろう。１つ以上のＧＨに結合した２つのＸＴＥＮ分子を含む融合タンパク質の配列の非限定的な例を表３６に示すが、本発明はまた、１つ以上のＸＴＥＮ（表３から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を示し、同じ若しくは異なる）に結合した、その他のＧＨ（表１から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を示す配列を有する）を用いた置換についても検討する。この段落の上記に記載した、前述の融合タンパク質において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に、ＧＨとＸＴＥＮの間の位置又はＧＨに隣接した位置に、表６の開裂配列をさらに含めることができる（２つ以上のＧＨがそのＧＨＸＴＥＮに含まれている場合）。いくつかの例においては、開裂配列を含むＧＨＸＴＥＮは、プロテアーゼの接触を促進するために、ＧＨと開裂配列の間又はＸＴＥＮ又は開裂配列の間に１つ以上のスペーサー配列アミノ酸をもまた有するだろう。スペーサーアミノ酸は任意の天然のアミノ酸を含むが、好ましいアミノ酸はグリシン及びアラニンである。ＧＨ、ＸＴＥＮ、開裂配列及びスペーサーアミノ酸を含むＧＨＸＴＥＮの非限定的な例を表３７に示す。しかしながら、本発明はまた、表３７のＧＨ配列を任意の表１のＧＨ配列で置換すること、表３７のＸＴＥＮ配列を任意の表３のＸＴＥＮ配列で置換すること、及び表３７の開裂配列を任意の表６の開裂配列で置換することについても検討する。
【０１７０】
（ｂ）ＧＨＸＴＥＮの薬物動態学的特性
本発明は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して向上した薬物動態を有するＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質であって、本明細書に記載した方法を用いてこの組成物について決定した用量で使用した場合に、薬理学的効果をもたらす血中濃度ではあるが、同等の用量のＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、組成物の生物学的な有効成分の安全域に長期間滞留することを達成することができる、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。このような例において、ＧＨＸＴＥＮは、融合タンパク質組成物の治療ウインドウ中に長期間維持される。本明細書で使用する場合、「同等な用量」とは、等価なモル／ｋｇの、比較可能な方法で対象に投与される活性なＧＨ薬理作用団を含む用量を意味する。当該分野においては容易に理解されるように、「同等な用量の」ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を含む薬剤の重量はより重くなるだろうが、融合タンパク質用量中のＧＨのモル等価物は本質的には同じであり、及び／又はＧＨと比較してほぼ同じモル濃度を有するだろう。
【０１７１】
ＧＨに特性のＸＴＥＮを結合させることにより向上させることができるＧＨの薬物動態学的特性には、終末相半減期、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ容量の分布、及び成長ホルモン関連障害、疾患及び関連した症状の治療において向上した有用性をもたらすバイオアベイラビリティが含まれる。ＧＨＸＴＥＮ組成物のＧＨは、表１から選択されるタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列であって、表３から選択されるタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す１つ以上のＸＴＥＮに結合した配列である可能性がある。
【０１７２】
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態学的特徴に関する実施例でより詳細に記載したように、驚くことに、ＸＴＥＮ配列の長さを伸張することにより、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の終末相半減期が不釣り合いなまでに増大することが発見された。従って、本発明は、対象に投与するＧＨＸＴＥＮ組成物に標的半減期をもたらすように選択したＸＴＥＮを含む、ＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象に投与されるＧＨＸＴＥＮの終末相半減期が、ＸＴＥＮと結合していなく、かつ、比較できる用量において対象に投与される、対応する融合タンパク質に結合していないＧＨと比較して少なくとも約２倍長く、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約８０倍、又は少なくとも約１００倍、又はそれ以上にも長くなるように選択したＸＴＥＮを含む、ＸＴＥＮを含む単量体融合タンパク質を提供する。実施例に記載したように、様々な動物種に実験的に投与した本明細書で開示した様々なＧＨＸＴＥＮ組成物の終末相半減期の値が数時間にもなったのに反して、外生の投与されたヒト成長ホルモンの終末相半減期がヒトにおいては１５分未満であることが報告されてきた（Ｈｉｎｄｍａｒｃｈ，  Ｐ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  （２００８）  ３０（４）：  ４４３−４５０）。同様に、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＡＵＣは、対応する融合タンパク質に結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量で対象に投与されるＧＨのＡＵＣと比較して、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約１５０％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約５００％、又は少なくとも約１０００％、又は少なくとも約２０００％増加する可能性がある。ＧＨＸＴＥＮの薬物動態学的指標は、投与する工程、時間間隔をおいて血液試料を採取する工程、及びＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、放射標識測定法、又はその他の当該分野において既知の方法若しくは本明細書に記載した方法を用いてタンパク質をアッセイする工程、並びに、その後、データを標準的な方法によって計算し、半減期及びその他のＰＫ指標を導く工程を含む標準的な方法によって決定することができる。
【０１７３】
本発明はさらに、開裂配列をさらに含んでもよいスペーサー配列によって任意に離されている、又は第二のＸＴＥＮ配列によって離されている、第一の及び第二のＧＨ分子を含むＧＨＸＴＥＮを提供する。一実施形態において、ＧＨは、対応する融合タンパク質に結合していないＧＨと比較して、融合タンパク質に結合させた場合により低い活性を有する。そのような例において、図３８に示したように、ＧＨＸＴＥＮは、対象へ投与する際に、ＧＨ構成要素が開裂配列の開裂によって徐々に分離され、その結果ＧＨが活性又はその標的受容体若しくはリガンドに結合する能力を取り戻すように設計される。従って、前述したＧＨＸＴＥＮはプロドラッグ又は血中貯留物として役立ち、その結果融合タンパク質に結合していないＧＨと比較して長い終末相半減期をもたらす。
【０１７４】
（ｃ）ＧＨＸＴＥＮの薬理及び医薬特性
本発明は、ＸＴＥＮに共有結合したＧＨを含み、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して向上した特性を有し得るＧＨＸＴＥＮ組成物、並びに組成物中の２つのＧＨ構成要素それぞれの治療用及び／又は生理活性を向上させるための方法を提供する。加えて本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短いポリペプチド及び／又は反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含む、当該分野において既知の融合タンパク質と比較して、向上した特性を有するＧＨＸＴＥＮ組成物を提供する。加えてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、ペグ構築物のような化学結合体よりも、特に、研究及び開発の両方、並びに製品の製造の時点で時間及び費用を削減することができ、そして、ＧＨＸＴＥＮの製品及び代謝物の両面においてペグ結合体よりも低い毒性を有する、より均一で明確な製品を生じる細菌細胞発現系において組換えＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を作出できることから、大きな利益をもたらす。
【０１７５】
治療用薬剤としてのＧＨＸＴＥＮは、ＸＴＥＮを含まない治療薬よりも、１つ以上の向上した特性を含む数多くの利点を有し、これらの向上した特性の非限定的な例には、溶解度の向上、熱安定性の向上、免疫原性の低下、見かけの分子量の増加、腎クリアランスの低下、タンパク質分解の低下、代謝の低下、治療用効果の増大、より低い有効な治療用用量、バイオアベイラビリティの向上、治療ウインドウ中でのＧＨの血中レベルを維持することができる投薬間隔の延長、「設計された」吸収速度、凍結乾燥に対する安定性の向上、血清／血漿安定性の向上、終末相半減期の延長、血流における溶解度の向上、中和抗体による結合の減少、受容体介在性クリアランスの低下、副作用の減少、受容体／リガンド親和性又は受容体／リガンド活性化の保持、分解に対する安定性、凍結融解に対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、ユビキチン化に対する安定性、投与の簡便性、その他の薬剤的賦形剤又は担体との適合性、対象中での持続性、保存における安定性の向上（例えば、保持期限の増大）、生体中又は環境中での毒性の低下などが含まれる。向上した特性の実際の効果は、成長ホルモン関連疾患又は障害を有する対象に投与した場合に、ＧＨＸＴＥＮが治療用及び／又は生物学的効果の向上、又は患者のコンプライアンスの改善を生じるということである。
【０１７６】
発現タンパク質に物理的及び構造的な特性を測定するための特定のアッセイ及び方法は当該分野において既知であり、これらには、タンパク質凝集、溶解度、二次及び三次構造、融解特性、異物の混入及び水分含量などのような特性を決定する方法が含まれる。そのような方法には、分析用遠心法、ＥＰＲ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱解析、キャピラリー電気泳動、円二色性分析、示差走査熱量測定、蛍光、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、及びＵＶ／可視分光法が含まれる。さらに別の方法が、Ａｒｎａｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  （２００６）  ４８，  １−１３において開示されている。本発明へのこれら方法の適用は、当業者の理解の範囲内であろう。
【０１７７】
本発明の特定の機能において、融合パートナーとしてのＸＴＥＮは、ＧＨペイロードの溶解度、特に通常は大腸菌のような形質転換した宿主細胞では不溶性の封入体として発現するＧＨの発現におけるＧＨペイロードの溶解度、を向上させる（例えば、Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ９９：  ３０３；  Ｐａｔｒａ，  Ａ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，  １８：  １８２を参照のこと）。従って、水溶性又は安定性の度合いような、ＧＨの医薬的又は物理化学的特性の向上が望まれる場合、ＧＨＸＴＥＮ組成物の全体的な医薬特性を向上するように、第一の及び第二の融合タンパク質における、第一の及び第二のＸＴＥＮ配列の長さ及び／又はモチーフファミリー組成物はそれぞれ、それぞれの融合タンパク質に異なる度合いの溶解性及び／又は安定性を付与するように選択され得る。ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を、本明細書において記載した方法を用いて構築し、物理化学的特性を確認するためにアッセイし、必要な場合には、望ましい特性を生じるようにＸＴＥＮを調製することができる。一実施形態においてＧＨＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質が、融合タンパク質に結合していないＧＨと比較して少なくとも約２５％高い水溶性、又は対応する融合タンパク質に結合していないＧＨよりも少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約４００％、又は少なくとも約５００％、又は少なくとも約１０００％高い水溶性を有するように選択される。
【０１７８】
本発明は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、向上した溶解度及び回収の簡便性を有するＧＨＸＴＥＮを生産し、そして発現させたＧＨＸＴＥＮを宿主細胞から回収する方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、１つ以上のＸＴＥＮ構成要素を含み、累積した配列長が約８００より長い、又は約９００より長い、又は約１０００より長い、又は約１１００より長いアミノ酸残基の、ＧＨＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドで原核性宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換する工程、宿主細胞中でＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を発現させる工程、細胞質含有物を回収するために宿主細胞を溶解する工程、及び細胞質含有物を酸性化する（酸性化条件ではＧＨの溶解度を維持することができるが、大部分の宿主細胞タンパク質は不溶性になって沈殿する）工程を含む。前述の一実施形態においては、発現後の宿主細胞の粗溶解物を、ｐＨ約５．０未満に、又はｐＨ約４．７未満に、又はｐＨ約４．５未満に、又はｐＨ約４．２未満に酸性化することができ、そして、約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％又はそれ以上の発現ＧＨを可溶性の形態で回収することができる。前述した実施形態の特徴としては、酸性化した溶解物を遠心分離することにより、濃縮したＧＨＸＴＥＮを、宿主細胞のタンパク質汚染物質から分離することができることがあり、これはＸＴＥＮ担体に融合させることによりＧＨに付与された溶解度の向上を反映するものである。この段落で上述した実施形態において、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは表３から選択される１つ以上のＸＴＥＮと少なくとも約８０％の配列同一性、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％の配列同一性を有する可能性があり、そしてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＧＨは表１から選択されるＧＨと少なくとも約８０％の配列同一性、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は１００％の配列同一性を有する可能性があり、そしてＧＨＸＴＥＮ構成要素は表５から選択されるＮ末端側からＣ末端側にかけての配置を有する可能性がある。
【０１７９】
一実施形態において本発明は、ＧＨＸＴＥＮ組成物、並びに、同等の用量における対応するＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、治療ウインドウ中でＧＨ構成要素を維持できる期間が非常に長い組成物の作出方法を提供する。当該分野においては容易に理解されるように、「同等な用量の」ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を含む薬剤の重量はより重くなるだろうが、融合タンパク質用量中のＧＨのモル等価物は同じであり、及び／又はＧＨと比較してほぼ同じモル濃度を有するだろう。治療ウインドウ中でＧＨ構成要素を維持できる組成物の作出方法は、与えられる用量及び用量計画を考慮して、望まれる薬物動態学的特性をＧＨに付与するための結合に適切なＸＴＥＮを選択する工程、そしてその後、薬物動態学的特性、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の活性、及び投与される組成物の安全性を確認するためのアッセイを行う工程を含む。この方法により、より長い期間、治療ウインドウ中のＧＨの血中濃度を維持することにより、投与される組成物の効力を向上させることが可能なＧＨＸＴＥＮを作出することができる。本明細書で使用する場合、「治療ウインドウ」とは、血中又は血漿濃度範囲として表される、許容できない毒性をもたず、疾患又は症状に効力又は所望の薬理学的効果を時間経過と共にもたらす薬剤又は生物学的製剤の量、すなわち、任意の正の治療効果を達成する最小量と（それ以上の用量又は濃度では）対象に対して毒性となる直前の反応を生じる最大量との間の、循環血液濃度である。加えて、治療ウインドウは通常、時間の観点も包含する；所望の薬理学的を時間経過と共にもたらし、許容できない毒性又は有害事象を生じない最大及び最小濃度。対象の治療ウインドウ中にある、投与された組成物は、「安全域」にあると言うこともできる。
【０１８０】
機能的な特徴又は生物学的及び及び薬理学的活性ならびにそれがもたらす指標を含む、本発明のＧＨＸＴＥＮ組成物の特徴は、望まれる特徴を測定するための、当該分野において既知の任意の好適なスクリーニングアッセイによって決定される。本発明は、所望される度合いの生物学的及び／又は治療用活性、並びに安全性プロファイルを有するＧＨＸＴＥＮを提供するために、異なる組成物又は配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をアッセイする方法を提供する。それぞれの配置のＧＨＸＴＥＮ及び／又はＧＨＸＴＥＮに組み込まれるＧＨ構成要素の活性を評価するために、特定のインビボ及びエクスビボな生物学的アッセイを用いる。これらのアッセイには、実施例のアッセイ、表３４のアッセイ、並びにＧＨの特性及び効果をアッセイするための以下の又はその他当該分野において既知のアッセイが含まれるがこれらには限定されない。結合定数（Ｋｄ）、ＥＣ５０値、並びにそれらリガンド−受容体複合体の解離半減期（Ｔ１／２）を含む、ＧＨＸＴＥＮのＧＨ受容体又はリガンドへの結合特性の決定を可能にするように、アッセイを実施することができる。結合親和性は、例えば、受容体又はリガンドに特異的に結合する能力の変化を検出する、競合型の結合アッセイ（例えば、実施例を参照のこと）により測定することができる。加えて、フローサイトメトリー又は表面プラズモン共鳴のような技術もまた、結合イベントを検出するために用いることができる。アッセイは可溶性の受容体分子を含む場合があり、又は細胞で発現した受容体への結合を決定する場合もある。そのようなアッセイには、増殖、細胞死、アポトーシス及び細胞移動についてのアッセイを含む、細胞を用いたアッセイが含まれる場合もある。使用可能なその他の、可溶性の受容体分子を含む場合のあるアッセイを用いては、発現したポリペプチドの受容体への結合を決定することができ、又は細胞に発現した受容体への結合を決定することができるだろう。対応するＧＨの標的受容体又はリガンドへの、ＧＨＸＴＥＮの結合親和性は、チップに結合した受容体若しくは結合タンパク質を用いたＢｉａｃｏｒｅアッセイ又は米国特許第５，５３４，６１７号に記載されたようなＥＬＩＳＡアッセイ、本明細書の実施例に記載したアッセイ、放射性−受容体アッセイ、又はその他の当該分野において既知のアッセイのような、結合型又は競合型の結合アッセイによってアッセイすることができる。加えて、ＧＨ配列変異体（単一の構成要素として又はＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）を、それらＧＨが天然のＧＨ、又はそのいくつかの画分と同様の結合特異性及び親和性及び親和性を有するかどうか、それらがＧＨＸＴＥＮへ組み込むのに好適かどうか、を決定するための競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて天然のＧＨと比較することができる。機能性アッセイには、ＧＨＸＴＥＮへの曝露の結果である、標的細胞中でのＩＧＦ−１の分泌及び／又は生成の増加、及び／又は、結果として生じる、骨成長を促進するための骨芽細胞及び軟骨細胞活性へのＩＧＦ−１の効果を刺激する効果が含まれ、これら全てはＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込むためのＧＨの活性又は得られたＧＨＸＴＥＮを評価するための好適な指標である。加えて、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が、そのタンパク質、炭水化物、及び脂質の代謝への作用、並びにインビトロでの血液細胞生産の刺激効果を介して体成長において機能していること（Ｄｅｒｆａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍｅｒｃｈａｖ  ｅｔ  ａｌ；  １９８８）、血液中での赤血球数及びヘモグロビン含量（Ｖａｌｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｖｉｈｅｒｖｕｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）、並びに増殖の向上、及び血漿細胞株におけるＩｇ生産（Ｋｉｍａｔａ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｄａ，  １９９４）、ＣＤ８＋細胞数の刺激を増加させること、及びＣＤ４＋細胞数の割合を低下させる（Ｇｅｆｆｎｅｒ，  １９９７）ことが知られている。長期的に測定することができる指標には、成長速度、身体の成熟度、及び成長における比較骨率が含まれる。前述の全ては、ＧＨＸＴＥＮに組み込まれるＧＨ構成要素の活性及び生じたＧＨＸＴＥＮを評価するために用いることができる。
【０１８１】
用量の最適化は全ての薬剤、特に治療ウインドウが狭い薬剤にとって重要である。例えば、異なる症状又は異常な臨床指標を呈している全患者のために標準化された、単一用量のＧＨが常に有効というわけではない場合もある。許容できない毒性を生じる可能性がある、及び用量が安全域外になる場合がある、又は臨床的な改善を達成しない不十分な能力を生じる場合のある量に対して、治療上又は薬理学的有効量のＧＨＸＴＥＮの決定を目的とするこれら因子についての考慮は当業医師の権限の範囲内である。
【０１８２】
多くの例において、異なる年齢又は疾患の度合いが異なる対象における、ＧＨの治療ウインドウが確立されてきており、これは文献から入手可能であり、又はＧＨを含む認可された製品の薬剤ラベルに記載されている。その他の例において、本開示のこれらＧＨＸＴＥＮを含む、新しい組成物の治療ウインドウを確立することができる。特定の組成物の治療ウインドウの確立方法は当業者に既知である（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  （２００５）を参照のこと）。例えば、標的疾患又は障害を有する対象において効力又は所望される薬理学的効果、有害事象の出現、及び循環血液レベルを決定するための用量漸増試験を行うことにより、特定の対象又は対対象集団に対する特定の薬剤若しくは生物製剤又は生物製剤と薬剤との併用についての治療ウインドウを決定することができる。用量漸増試験は、当該分野において知られているように若しくは本明細書において記載したように、代謝性疾患又は障害に関連する１つ以上の指標である生理的若しくは生化学的な指標、又は特定の適応についての有益なアウトカムに関連した臨床指標を対象又は対照群においてモニターする代謝試験と、無影響量、有害事象、最大耐量などを決定するための観察及び／又は測定指標と、決定若しくは導き出した循環血液レベルを確立する薬物動態学的指標の測定を介して、ＧＨＸＴＥＮの活性を評価することができる。この結果を次に、先に決定した指標又は効果レベルと一致する治療薬の、投与した用量と血中濃度に関連づけることができる。これらの方法により、用量範囲及び血中濃度を、所望の効果がもたらされる最小有効用量及び最大用量を血中濃度と関連づけることができ、これより高い用量で毒性が生じるた場合、投与した治療薬の治療ウインドウを確立することができる。最大用量より高い血中濃度の融合タンパク質（又はＧＨ構成要素で測定される）は、治療ウインドウ又は安全域の外にあると考えられるだろう。従って、前述した方法により、それより低量ではＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質が所望される薬理学的効果を示さないであろう血中レベルであるＣｍｉｎ、及び許容できない毒性又は有害事象を引き出すであろう濃度に達する前の最大の血中濃度を示すであろう血中レベルであるＣｍａｘを確立し、それらの量をＧＨＸＴＥＮの安全域の外にあるとするだろう。そのような確立された濃度を用い、融合タンパク質を治療ウインドウ中に維持するための適切な用量及び投与頻度を提供するＣｍａｘ及びＣｍｉｎを測定することにより、投与頻度及び用量をさらに改良することができる。本明細書において開示した手段又はその他当該分野において既知の方法により、当業者はＧＨＸＴＥＮが治療ウインドウに望ましい期間維持されているか、又は用量若しくはＸＴＥＮの配列長の調整が必要とされるかについて確認することができる。さらに、ＧＨＸＴＥＮを治療ウインドウに維持するための適切な用量及び投与頻度の決定は、治療ウインドウ範囲内にある連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷を生じ、そして標的疾患、障害又は症状に関連��る少なくとも１つの測定指標の改善をもたらすような、治療上効果的な用量の融合タンパク質をそれを必要とする対象に複数回の連続して投与するための投与スケジュールである、治療上効果的な用量計画を確立する。いくつかの例において、適切な用量で対象に投与されたＧＨＸＴＥＮは、対応するＸＴＥＮに結合していないＧＨであって、かつ、同等の濃度で投与されたＧＨと比較して、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質が治療ウインドウ中に少なくとも約２倍長い期間維持される、あるいは少なくとも約３倍長い；あるいは少なくとも約４倍長い；あるいは少なくとも約５倍長い；あるいは少なくとも約６倍長い；あるいは少なくとも約７倍長い；あるいは少なくとも約８倍長い；あるいは少なくとも約９倍長い又は少なくとも約１０倍長い又はそれより長く治療ウインドウ中に維持される、血中濃度を生じる。本明細書で使用する場合、「適切な用量」とは、対象に投与した場合に、所望される治療用又は薬理学的効果及び治療ウインドウ範囲内の血中濃度を生じるであろう、薬剤又は生物製剤の用量を意味する。
【０１８３】
一実施形態において、治療上効果的な用量計画で投与されたＧＨＸＴＥＮは、融合タンパク質に結合していない融合タンパク質に対応する生物学的に活性なタンパク質であって、かつ、同等な投与計画において対象に投与された融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の血中レベルにおける少なくとも２つの連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷との間隔の時間を、少なくとも約３倍長く；あるいは少なくとも約４倍長く；あるいは少なくとも約５倍長く；あるいは少なくとも約６倍長く；あるいは少なくとも約７倍長く；あるいは少なくとも約８倍長く；あるいは少なくとも約９倍長く又は少なくとも約１０倍長くする。別の実施形態においては、より低頻度で、又はモル換算してより少ない総用量の医薬組成物の融合タンパク質を治療上効果的な用量計画で投与した場合、ＧＨＸＴＥＮは、融合タンパク質に結合していない対応する生物学的に活性なタンパク質構成要素であって、かつ、ＧＨの治療上効果的な用量計画により対象に投与されたタンパク質構成要素と比較して、１つ、又は２つ、又は３つ又はそれ以上の測定指標の同等な改善を生じる。測定指標には、本明細書において開示した任意の臨床的、生化学的又は生理学的な指標、又は成長ホルモン関連障害を有する対象を評価するための当該分野において既知のその他指標が含まれる。
【０１８４】
本発明は、ＧＨＸＴＥＮがＧＨ標的受容体若しくはリガンドに対して示す親和性が、ＸＴＥＮに結合していない天然のＧＨが標的受容体若しくはリガンドに対して示す親和性の、少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％又はそれ以上である可能性のある、単離したＧＨＸＴＥＮを提供する。いくつかの例において、対象ＧＨＸＴＥＮとＧＨＸＴＥＮ天然の受容体若しくはリガンドとの間の結合親和性であるＫｄは、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、又は少なくとも約１０−７Ｍ、又は少なくとも約１０−８Ｍ、又はＧＨＸＴＥＮと天然の受容体若しくはリガンドとの間の親和性は少なくとも約１０−９Ｍである。
【０１８５】
その他の実施形態において本発明は、ＧＨ受容体に対する結合親和性が低くなるように特に設計された、単離したＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施形態において、ＧＨ１のＣ末端に融合させたＸＴＥＮを含む融合タンパク質のような融合タンパク質は、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＦ１４４、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ２８８、ＡＭ９２３−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、ＡＭ９２３−ｈＧＨ−ＡＦ１４４、ＡＭ９２３−ｈＧＨ−ＡＥ２８８、及び表３６−３７の配列から選択されたＧＨ融合タンパク質と、約９７％の配列同一性、又は少なくとも約９９％の配列同一性を示す。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、成長ホルモン関連疾患、障害及び状態の治療及び予防における天然のＧＨの使用が知られている又はその使用と関連がある、インビトロでの生理活性又は薬理学的効果に関する生理活性を、少なくとも約０．０５％、又は約０．１％、又は約１％、又は約１０％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９８％、又は又は約９９％保持する。保持されたＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の活性を評価するためにアッセイすることができる活性又は薬理学的効果の非限定的な例としては、ＧＨ受容体を有する細胞におけるシグナル伝達マーカー、誘導されたＩＧＦ−１濃度、誘導されたＩＧＦＢＰ３濃度、身長発育速度の変化、除脂肪体重、体脂肪総量、体幹脂肪、インスリン抵抗性症候群に関連した指標、軟骨細胞の分裂及び増殖速度の測定、骨密度の変化、及び骨成長（例えば骨端板幅の増大）が挙げられる。いくつかの実施形態においてＧＨ構成要素の活性は、完全なＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質により明かであるが、その他の例においてＧＨ構成要素の活性は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれた開裂配列にプロテアーゼが作用することによる、ＧＨの融合タンパク質からの開裂及び放出に際して、始めて明かになるであろう。前述した例においては、ＧＨ構成要素の受容体又はリガンドへの結合親和性がＸＴＥＮに結合した状態では低くなるように、上により詳細に記載したように、ＧＨＸＴＥＮ配列に組み込まれた開裂配列の開裂を介してＸＴＥＮから放出された場合にはＧＨ構成要素の受容体又はリガンドへの結合親和性が回復又は増大するように、ＧＨＸＴＥＮを設計する。
【０１８７】
その他の例においては、受容体介在性クリアランスを低下させることによって対象に投与したＧＨＸＴＥＮの終末相半減期を増大させるため、ＧＨ構成要素のＧＨ受容体への結合親和性が低くなるように、ＧＨＸＴＥＮを設計することができる。例えば、ＸＴＥＮを融合タンパク質のＧＨ構成要素のＣ末端に結合させる。その他の例においては、投与した組成物が原因である毒性又は副作用を低減させるため、ＧＨ構成要素のＧＨ受容体に対する結合親和性が低くなるようにＧＨＸＴＥＮを設計する。
【０１８８】
従って本発明は、少なくとも第一のＧＨ、並びに第一の及び第二のＸＴＥＮを含み、Ｎ末端側からＣ末端側への構成要素の特定の配置を有する一本鎖融合タンパク質構築物を作出することによる、ＧＨＸＴＥＮの終末相半減期を延長する方法を提供し、ここで融合タンパク質中の第一のＮ末端からＣ末端への配置をとるＧＨ及びＸＴＥＮ構成要素は、第二のＮ末端からＣ末端への配置をとるＧＨＸＴＥＮと比較して、低い受容体介在性クリアランス（ＲＭＣ）とそれに対応する増大した終末相半減期を有する。前述の一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮのＮ末端側からＣ末端側への配置はＸＴＥＮ−ＧＨ−ＸＴＥＮであり、これはＮ末端側からＣ末端側への配置がＸＴＥＮ−ＧＨであるＧＨＸＴＥＮと比較して、低い受容体結合性を有する。前述の別の実施形態において、ＧＨＸＴＥＮの配置はＧＨ−ＸＴＥＮである。前述した実施形態において、２つのＸＴＥＮ分子は、その配列組成物又は長さが、同一であっても異なっていてもよい。単一のＧＨに結合した２つのＸＴＥＮを含む、前述した実施形態の非限定的な例としては、構築物ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ２８８、ＡＥ８６４−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、ＡＭ９２３−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、及びＡＭ９２３−ｈＧＨ−ＡＥ２８８が挙げられる。本発明は、前述した例の相当する構成要素を表１のＧＨ及び表３のＸＴＥＮで置換し、構築物が、相当する構成要素を別の位置に配置した場合と比較して低い受容体介在性クリアランスを有するように、例えば表５の配置で作出したようなその他の構築物についても検討する。いくつかの実施形態において、終末相半減期を増大させる前述の方法は、受容体への結合が低下していない第二の配置をとるＧＨＸＴＥＮの半減期と比較して、終末相半減期を少なくとも約３０％、又は約５０％、又は約７５％、又は約１００％、又は約１５０％、又は約２００％、又は約３００％、又は約４００％又はそれ以上増大させる配置のＧＨＸＴＥＮを提供する。本発明は、オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）の低下又はオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の増大のいずれかの結果、受容体への結合親和性が低下した特定のリガンドはＮ−又はＣ末端いずれかの障害による影響を受ける場合があること（図３に示すように）、及び末端を組成物の別のポリペプチド（ＧＨの別の分子、ＸＴＥＮ、若しくはスペーサー配列のいずれか）への結合に用いることにより結合親和性の低下が生じるという事実を利用する。ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質について特定の配置を選択することにより、受容体介在性クリアランス率の低下が達成されるような、受容体への結合親和性の度合いの低下がもたらされる。ポリペプチドのその受容体への結合が活性化を起こさない場合、その結合はＲＭＣを誘導しないが、受容体の活性化はＲＭＣを誘導するように、通常、受容体の活性化はＲＭＣと関連する。しかしながら、いくつかの例、特にリガンドが高いオフレートを有する例において、リガンドはそれでもなお受容体介在性クリアランスを引き起こすことなく細胞シグナル伝達を開始するのに十分なほど結合することができ、この最終的な結果は、ＧＨＸＴＥＮのバイオアベイラビリティが維持されるということである。そのような例において、配置されたＧＨＸＴＥＮは、より高度にＲＭＣを誘導する配置をとるＧＨＸＴＥＮと比較して、長い半減期を有する。
【０１８９】
受容体介在性クリアランスを低下させるための成長ホルモン受容体への結合親和性の低下が求められるが、少なくとも部分的な生理活性の保持もまた望まれる場合、望ましい受容体活性化を得るために十分な結合親和性を、例えばシグナル伝達の開始によって、やはり維持しなければならない。従って、一実施形態において本発明は、ＧＨＸＴＥＮの標的受容体への結合親和性が、結合親和性が低下しない配置をとる対応するＧＨＸＴＥＮの親和性の、約０．０１％〜４０％、又は約０．０１％〜３０％、又は約０．０１％〜２０％の範囲になるように配置したＧＨＸＴＥＮを提供する。従って、配置されたＢＸＴＥＮの結合親和性は、ＧＨ構成要素の標的受容体への結合親和性が低下しない配置をとる対応するＧＨＸＴＥＮ又は融合タンパク質に結合していないＧＨの結合親和性と比較して、同等の条件で決定した場合に、好ましくは少なくとも約６０％低下、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９９％低下する。異なる表現を用いて表すと、配置されたＧＨＸＴＥＮのＧＨ構成要素は、ＧＨ構成要素の結合親和性が低下しない配置をとるＧＨＸＴＥＮの対応するＧＨ構成要素の結合親和性の、約０．０１％、又は少なくとも約０．１％、又は少なくとも約１％、又は少なくとも約２％、又は少なくとも約３％、又は少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも４０％と同程度の結合親和性を有する。前述した実施形態において、配置されたＧＨＸＴＥＮの標的受容体への結合親和性は、対応する天然のＧＨ又は対応するＧＨ構成要素の結合親和性が低下しない配置をとるＧＨＸＴＥＮと比較して「実質的に低下」するものである。従って、本発明は、上記において例を挙げたように、ＧＨＸＴＥＮが十分な数の受容体に結合してそれらを活性化させ、所望されるインビボでの生物学的反応を得ることができるが、そのような反応を得るのに必要とされる以上の数の受容体を活性化させないように配置することによってＲＭＣを低下させた組成物及びこの組成物の作出方法を提供する。増大した半減期は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して又はＧＨ構成要素が、低頻度での投与にもかかわらず臨床的効力を有する組成物を生じる、十分な生物学的又は薬理学的活性を維持するように配置されたＧＨＸＴＥＮと比較して、より多い用量及び少ない投与頻度での投与を可能にする。
【０１９０】
ＶＩ）．本発明の組成物の使用
別の態様において本発明は、ＧＨが介在する疾患、障害又は状態に有益な効果をもたらす方法を提供する。本発明においては、相対的に短い終末相半減期及び／又は狭い治療ウインドウを有するＧＨの欠点及び／又は限界を取り扱う。
【０１９１】
体の成長に関わる多くの過程は複数のペプチド及びホルモンによって制御され、そしてそのようなペプチド及びホルモン、並びにそのアナログが成長ホルモン関連疾患、障害及び状態の治療において有効であることが見いだされた。しかしながら、市販されている成長ホルモンの使用は、そのような疾患、障害及び状態に罹患した対象の管理において最適な効果をもたらさない。具体的には、成長ホルモン関連疾患及び障害の治療に用いられるペプチド及びホルモン生物製剤にとって重要なことは、用量の最適化及び投薬頻度である。成長ホルモンの半減期は短いため、臨床的有益性を達成するためには必然的に頻回投与となり、このことはそのような患者の管理を困難にする。
【０１９２】
一実施形態において本発明は、治療上又は予防上有効量のＧＨＸＴＥＮを対象に投与する工程を含む、成長ホルモン関連疾患、障害又は状態を有する対象において有益な効果を達成するための方法を提供すし、ここで前記投与は、成長ホルモン関連疾患、障害又は状態に関連する１つ以上の生化学的又は生理学的な指標又は臨床エンドポイントの改善を生じる。有効量とは、成長ホルモン関連疾患、障害又は症状の治療の補助（例えば、治癒又は重篤度の低減）又は予防（例えば、発症の「見込み」又は重篤度の低下）において有益な効果を生じるものである。いくつかの例においては、有益な効果を達成するための方法には、小児及び成人における先天性又は後天性のＧＨ欠如である、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、慢性腎不全、在胎期間の発育遅延、特発性低身長、ＡＩＤＳ消耗症候群、肥満、多発性硬化症、加齢、線維筋痛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、筋ジストロフィー、低筋肉量（例えばボディビルディング）、低骨密度、又はＧＨを用いることができることの任意のその他徴候（対象における内生成長ホルモンレベルが欠損している必要はない）を含むがこれらには限定されない、成長ホルモン関連疾患、障害又は症状を有する対象を治療するために、治療上有効量のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与する工程を含む。
【０１９３】
別の実施形態において本発明は、ＧＨの欠損を呈する対象における、ＩＧＦ−１生産の刺激方法を提供する。この方法は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量で投与されたＧＨを受けている対象と比較して、ＩＧＦ−１の血中レベルの上昇及び／又はＩＧＦ−１の血中レベルが上昇している期間の増大をもたらす、治療上有効量のＧＨＸＴＥＮを対象に投与する工程を含む。いくつかの例において、ＩＧＦ−１の増加は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％である。別の実施形態において本発明は、軟骨細胞の分裂及び数を刺激する方法を提供する。この方法は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量で投与されたＧＨを受けている対象と比較して、軟骨細胞の生産を少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％増加させる、治療上有効量のＧＨＸＴＥＮを投与する工程を含む。別の実施形態において本発明は、ＸＴＥＮに結合していないＧＨであって、かつ、同等の用量で投与されるＧＨを受けている対象と比較して、骨端板幅の増加することにより算出される骨成長が、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％増加する、治療上有効量のＧＨＸＴＥＮを投与する工程を含む方法を提供する。
【０１９４】
本明細書に記載したようにＧＨＸＴＥＮのＰＫ指標が向上した結果、成長ホルモン関連疾患、障害若しくは状態の症状、又は臨床的な異常を予防、治療、軽減、反転若しくは回復させるために、又は治療を受ける対象の生存を長くするために、ＧＨは、対応するＸＴＥＮに結合していないよりも長い投与間隔で投与される。
【０１９５】
本発明の方法は、望まれる指標又は臨床効果を達成するために十分な期間、治療上有効量のＧＨＸＴＥＮを連続して投与すること、及び／又は望まれる指標又は臨床効果を維持するために治療上有効量のＧＨＸＴＥＮを連続して投与することを含み、そしてそのような治療上有効量の連続投与をＧＨＸＴＥＮの治療上効果的な用量計画として、すなわち、本明細書に記載したがこれらには限定されない代謝性疾患の病期又は状態におけるいずれかの臨床徴候又は症状、態様、測定指標若しくは特徴に持続した有益な効果をもたらす、治療上有効量として示される用量の融合タンパク質組成物を連続して投与するための計画として、確立する。一実施形態においてこの方法は、ＸＴＥＮ配列に結合したＧＨと及び少なくとも１種の薬学上許容可能な担体とを含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を含む、治療上有効量の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含み、この投与により、ＸＴＥＮに結合していないＧＨを含む医薬組成物であって、かつ、同等の用量で投与される医薬組成物の投与による介入の効果と比較して、少なくとも１つの指標、生理的な状態、又はＧＨ構成要素が介在する臨床転帰（この非限定的な例は上に記載した）の大きな改善がもたらされる。一実施形態において、医薬組成物は、治療上有効量の用量で投与される。別の実施形態において医薬組成物は、本明細書において定義したような治療上効果的な用量計画により、投与期間にわたり複数回連続して投与される。
【０１９６】
治療上有効量のＧＨＸＴＥＮは、疾患病期、年齢、性別、及び対象の体重、並びに個々の対象における所望される反応を誘導する抗体又は抗体部分の能力、のような因子により多様になる。治療上有効量はまた、ＧＨＸＴＥＮの治療における有益な効果が、ＧＨＸＴＥＮのいずれかの毒性又は有害効果を上回る量である。予防上有効量とは、所望される予防的な結果を達成するために必要な期間にわたって要求されるＧＨＸＴＥＮの量を指す。
【０１９７】
本発明の方法には、患者における回復を簡便にするように、投与間隔を長くするために、及び持続的な効果を達成するために必要な薬剤の量を減少させるために、長時間作用型のＧＨＸＴＥＮ組成物が好ましい。一実施形態において治療方法は、治療上有効量のＧＨＸＴＥＮをそれを必要とする対象に投与する工程を含み、この投与により、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨ構成要素であって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨ構成要素と比較して、組成物中の融合タンパク質が確立された治療ウインドウ中で推移できる期間が長くなる。いくつかの例において、治療ウインドウ中に維持される期間は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨ構成要素であって、かつ、比較できる用量において対象に投与されるＧＨ構成要素の少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約８０倍、又は少なくとも約１００倍長くなる。この方法はさらに、治療上効果的な用量計画を用いてそれを必要とする対象にＧＨＸＴＥＮを複数回連続投与した場合、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨであって、かつ、ＧＨについて確立された投与計画で投与されるＧＨと比較して、融合タンパク質の血中レベルにおける連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷との間の時間間隔の増大を生じる。前述した実施形態において、連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷との間の時間間隔は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨ構成要素であって、かつ、ＧＨについて確立された投与計画で投与されるＧＨ構成要素の時間間隔の、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍又は少なくとも約８０倍、又は少なくとも約１００倍に長くなる。この段落の上記で記載した実施形態において、融合タンパク質の投与は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨ構成要素であって、かつ、同等の単位用量又は投与計画において対象に投与されるＧＨ構成要素と比較して、モル換算してより低容量の単位用量の融合タンパク質を用いた場合にも、対象疾患、状態、または状態の評価に有用だとして本明細書に開示した指標のうちの少なくとも１つの改善をもたらす。
【０１９８】
この治療方法は、成長ホルモン疾患、障害又は状態に関連する１つ以上の指標の改善に効果を及ぼす、治療上効果的な用量計画を用いてＧＨＸＴＥＮを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象へのＧＨＸＴＥＮの投与は、１つ以上の生化学的な、生理的な、又は臨床指標の改善を生じ、この改善の度合いは、同じアッセイ又は測定される臨床指標に基づいて決定したＸＴＥＮに結合していない対応するＧＨ構成要素を投与した場合の度合いよりも大きいものである。その他の実施形態において、対象へのＧＨＸＴＥＮの治療上効果的な用量計画を用いた投与は、１つ以上の生化学的な、生理的な、又は臨床指標の活性化を生じ、この活性化の度合いは、同じアッセイ又は測定される臨床指標に基づいて決定したＸＴＥＮに結合していない対応するＧＨ構成要素を投与した場合の活性化よりも長期間にわたる。前述の一実施形態において、対象へのＧＨＸＴＥＮの治療上効果的な用量計画を用いた投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して少なくとも約１０％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約１００％又はそれ以上の、対象における血中ＩＧＦ−１レベルのピーク濃度及び曲線下面積の改善を生じる。前述の別の実施形態において、対象へのＧＨＸＴＥＮの治療上効果的な用量計画を用いた投与は、同等の投与計画で対象に投与されるＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して、対象の体重を少なくとも約１０％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％又はそれ以上増加させる。
【０１９９】
本発明はさらに、本明細書に示した方法に従って使用するＧＨＸＴＥＮを、成長ホルモン関連疾患、障害、及び症状の治療に有用なその他の治療方法及び医薬組成物と併せて投与する、又は成長ホルモンが補助療法となる条件（例えば、インスリン抵抗性及び血糖コントロール不良）に投与することについて検討する。そのような組成物には、例えば、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬、インスリン、インスリンアナログ、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、デュアルＰＰＡＲアゴニスト、ＧＬＰ−１アゴニスト又はアナログ、ＰＴＰ１Ｂ阻害薬、ＳＧＬＴ阻害薬、インスリン分泌促進薬、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害薬、インスリン感作物質、免疫調節薬、ベータ−３アドレナリン受容体アゴニスト、Ｐａｎ−ＰＰＡＲアゴニスト、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害薬、ビグアニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬、メグリチニド、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素及びその他当該分野において既知の糖尿病治療薬、又は降圧剤、カルシウムチャネル遮断剤、及び関連製品が含まれる。いくつかの実施形態においては、ＧＨＸＴＥＮを投与することにより、対象における同等な臨床効果又は疾患、障害若しくは状態の測定指標を達成するために合わせて投与される医薬組成物の量を、より低用量にすることができる。
【０２００】
別の態様において本発明は、所望される薬理学的又は医薬特性を有するＧＨＸＴＥＮ組成物の設計方法を提供する。成長ホルモン関連疾患、障害、及び状態の治療における治療用効力の改善、ＧＨと比較した場合の融合タンパク質の薬物動態学的特徴の向上、薬理学的効果を達成するために必要な用量又は投与頻度の低減、医薬特性の向上、及びＧＨ構成要素が長期間治療ウインドウ中に維持される能力の向上、を含む様々な目的（融合タンパク質に結合していないＧＨと比較した）を考慮して、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を設計及び準備する。
【０２０１】
通常、融合タンパク質及び図４〜６に示したような本発明の組成物の設計及び生産工程には、（１）特定の疾患、障害又は症状の治療に対するＧＨ（例えば、天然のタンパク質、アナログ又は活性をもつ誘導体）の選択；（２）生じるＧＨＸＴＥＮに所望のＰＫ及び物理化学的特徴（例えば、その組成物を対象に投与すると、ＸＴＥＮに結合していないＧＨに比較して、非常に長い期間融合タンパク質が治療ウインドウ中に維持されるようになる）を付与し得るＸＴＥＮを選択する工程；（３）所望される効力又はＰＫ指標を達成するための、ＧＨＸＴＥＮのＮ末端側からＣ末端側への配置を確立する工程；（４）配置されるＧＨＸＴＥＮをコードしている発現ベクターの設計を確立する工程；（５）その発現ベクターで好適な宿主を形質転換する工程；及び（６）得られた融合タンパク質の発現及び回収、が含まれる。半減期が増大した（２４時間を上回る）又は治療ウインドウ中で維持される期間の延長が望まれるそれらのＧＨＸＴＥＮにおいて、組み込むために選択されるＸＴＥＮは通常、少なくとも約５００、又は約５７６、又は約８６４、又は約８７５、又は約９１２、又は約９２３のアミノ酸残基を有し、この場合には単一のＸＴＥＮがＧＨＸＴＥＮに組み込まれる。別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、前述した長さの第一のＸＴＥＮ、及び約１４４、又は約２８８、又は約５７６、又は約８６４、又は約８７５、又は約９１２、又は約９２３アミノ酸残基の第二のＸＴＥＮを含む。
【０２０２】
半減期の増大は必要とされないが、医薬特性（例えば、溶解度）の向上が求められるその他の実施形態においては、より短い長さのＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮを設計する。前述のいくつかの実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、少なくとも約２４、又は約３６、又は約４８、又は約６０、又は約７２、又は約８４、又は約９６アミノ酸残基を有するＸＴＥＮに結合したＧＨを含み、この場合、生理的な条件下における融合タンパク質の溶解度は、対応するＸＴＥＮに結合していないＧＨよりも、少なくとも３倍高く、あるいは、ＸＴＥＮに結合していないＧＨよりも少なくとも４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍またはそれより高い。前述の一実施形態においてＧＨは、ヒト成長ホルモンである。
【０２０３】
別の態様において、本発明は、製造の簡便性を改善するためのＧＨＸＴＥＮ組成物の作出方法を提供し、その結果、天然のＧＨと比較して、安定性の向上、水溶性の向上、及び／又は処方の簡便性がもたらされる。一実施形態において本発明は、ＧＨの水溶性を向上させる方法を含み、この方法は融合していない状態のＧＨと比較して、生理的な条件下で、生じるＧＨＸＴＥＮが高濃度でも可溶性形態になることを達成できるように、１つ以上のＸＴＥＮにＧＨを結合させる工程を含む。融合タンパク質に組み込んだ場合にＧＨに水溶性の向上を付与するＸＴＥＮの特性に関わる因子には、ＸＴＥＮ融合パートナーの高い溶解度及び溶液中におけるＸＴＥＮ分子間の自己凝集の度合いが低いこと、が含まれる。いくつかの実施形態においてこの方法は、融合していないＧＨと比較して、その溶解度が、生理的な条件下において、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％高い、又は少なくとも約５０％高い、又は少なくとも約７５％高い、又は少なくとも約９０％高い、又は少なくとも約１００％高い、又は少なくとも約１５０％高い、又は少なくとも約２００％高い、又は少なくとも約４００％高い、又は少なくとも約６００％高い、又は少なくとも約８００％高い、又は少なくとも約１０００％高い、又は少なくとも約２０００％高い、又は少なくとも約４０００％高い、又は少なくとも約６０００％高い、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。
【０２０４】
別の実施形態において、本発明は、ＧＨの品質保持期限を延長させる方法を含み、この方法は、得られるＧＨＸＴＥＮの品質保持期限が融合していない状態のＧＨよりも長くなるように選択した１つ以上のＸＴＥＮに、ＧＨを結合させる工程を含む。本明細書で使用する場合、品質保持期限とは、溶液中又はいくつかのその他の保存製剤中のＧＨ又はＧＨＸＴＥＮの機能活性が、過度な活性低下なしに、好適に維持される期間を指す。本明細書で使用する場合、「機能活性」とは、受容体又はリガンドへの結合能力、又は酵素活性、又は当該分野において知られているように、ＧＨと関連する既知の機能活性を１つ以上提示すること、のような薬理学的効果又は生理活性を指す。分解した又は凝集したＧＨは、溶液中に維持されるＧＨと比較して、通常、低い機能活性又は低いバイオアベイラビリティを有する。融合タンパク質に組み込んだ場合に、ＧＨの品質保持期限を延長させるためのこの方法の能力に関わる因子には、ＸＴＥＮ融合パートナーの、水溶性の向上、溶液中での自己凝集の低減、及び熱安定性の向上、が含まれる。具体的には、ＸＴＥＮが凝集する度合いが低いことは、ＧＨを高濃度で含む医薬調整物の調整方法を容易にし、そしてＸＴＥＮの熱安定性は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質がより長い期間、可溶性及び機能的な活性を維持する特性に関係する。一実施形態においてこの方法は、同じ保管条件及び取扱い条件においた基準よりも高い活性を示し、「延長した」又は「長くなった」品質保持期限を有するＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。この基準は融合してないな完全長ＧＨであってもよい。一実施形態において方法は、単離したＧＨＸＴＥＮを、ＸＴＥＮがその非構造性構造を維持する能力を向上させ、ＧＨＸＴＥＮの製剤中での溶解度を、対応する融合していないＧＨよりも長期間維持する１種類以上の薬学上許容可能な賦形剤と共に処方する工程を含む。一実施形態において方法は、指定された時点で基準と比較した場合、並びに基準と同じ保管条件及び取扱い条件においた場合に、溶液中での機能活性を約１００％より高く、又は機能活性を約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％又は２００％より高く維持し、その結果、品質保持期限の増大を生じるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を作出するために、ＧＨを１つ以上のＸＴＥＮに結合させる工程を含む。
【０２０５】
品質保持期限は、保管を開始した時点での機能活性を用いて正規化した、保管後に維持される機能活性に関してもまた、評価することができる。機能活性の延長又は伸張によって表される、延長した又は伸張した品質保持期限を有する本発明のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じ条件に同じ期間おかれたＸＴＥＮに結合していないＧＨの機能活性の、約５０％より高い、又は約６０％、７０％、８０％、又は９０％より高い活性と同等の活性を保持する。例えば、１つ以上のＸＴＥＮ配列に融合させたヒト成長ホルモンを含む本発明のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、様々な温度条件下で、最大２週間、又は４週間、又は６週間又はそれ以上の期間、そのもともとの活性の約８０％又はそれ以上を保持する。いくつかの実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、８０℃で１０分間加熱した場合に、溶液中におけるそのもともとの活性の少なくとも約５０％、又は約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、及びもっとも好ましくは少なくとも約９０％又はそれ以上を保持する。その他の実施形態においてＧＨＸＴＥＮは、３７℃で７日間加熱又は維持した場合に、液中におけるそのもともとの活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又はあるいは少なくとも約９０％又はそれ以上を保持する。別の実施形態においてＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質は、約３０℃から約７０℃までの温度に、約１時間〜約１８時間の時間にわたって曝露した後に、その機能活性を少なくとも約８０％又はそれ以上を保持する。この段落で前述した実施形態において、特定の時点におけるＧＨＸＴＥＮの保持された活性は、対応する融合タンパク質に結合していないＧＨの少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍高いものである。
【０２０６】
ＶＩＩ）．本発明の核酸配列
本発明は、ＧＨＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードしている単離したポリ核酸及びＧＨＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードしているポリ核酸分子に相補的な配列（その相同変異体を含む）を提供する。別の態様において本発明は、ＧＨＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードしている単離したポリ核酸及び、ＧＨＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードしているポリ核酸分子に相補的な配列（その相同変異体を含む）、の生産方法を包含する。通常、そして図４〜６に示したように、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の生産方法及び得られた遺伝子産物の発現方法には、ＧＨ及びＸＴＥＮをコードしているヌクレオチドを組み合わせる工程、構成要素をインフレームで結合させる（ライゲーションする）工程、コード遺伝子を宿主細胞にとって適切な発現ベクター中に組み込む工程、発現ベクターを適切な宿主細胞に形質転換する工程、及び形質転換した宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導する又はその発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培養する工程、及びその結果、当該分野において既知の標準的なタンパク質の精製方法により、単離した融合タンパク質として回収される、生物学的に活性なＧＨＸＴＥＮポリペプチドを生産する工程、が含まれる。本発明のポリヌクレオチド及び発現を作出するために、分子生物学における標準的な組換え技術が用いられる。
【０２０７】
本発明では、適切な宿主細胞中でＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を直接発現させるための組換えＤＮＡ分子を生成するために、ＧＨＸＴＥＮをコードする核酸配列（又はその相補鎖）を用いる。本発明の実施に好ましい複数のクローニング方法があり、それら方法の多くが、本発明のＧＨＸＴＥＮ組成物融合タンパク質をコードしている遺伝子又はその相補鎖を含む構築物を生成するために用いられる。いくつかの実施形態においては、少なくとも第一のＧＨ及び少なくとも第一のＸＴＥＮポリペプチドを含む単量体ＧＨＸＴＥＮをコードする遺伝子又はその相補鎖を作出するために、クローニング方法が用いられる。前述の一実施形態において遺伝子は、ｈＧＨ又は配列変異体をコードしている配列を含む。その他の実施形態においては、ＧＨＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質を宿主細胞中で発現させるための形質転換に用いられる、少なくとも第一のＧＨ分子又はそのその補鎖並びに第一の及び少なくとも第二のＸＴＥＮ又はそれらの相補鎖をコードしているヌクレオチドを含む、単量体ＧＨＸＴＥＮをコードする遺伝子を作出するために、クローニング方法が用いられる。この段落の前述した実施形態において遺伝子は、スペーサー配列をコードしているヌクレオチドをさらに含む場合があり、このヌクレオチドは開裂配列をコードしている場合もまたある。
【０２０８】
所望されるＸＴＥＮ配列の設計において、ＸＴＥＮをコードしている配列の作出に分子生物学的な「ビルディングブロック」法を使用するにもかかわらず、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性の性質が達成されることが発見された。このことは、上述したように、ペプチド配列モチーフをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーの使用によって達成された。このモチーフライブラリーは次にＸＴＥＮ配列をコードしている遺伝子を作出するためにライゲーション及び／又は多量体化される（図４及び５並びに実施例を参照のこと）。従って、発現した融合タンパク質のＸＴＥＮが、複数単位の４つの異なる配列モチーフしか含まなかったとしても、モチーフそれ自体が非反復性アミノ酸配列であるため、ＸＴＥＮ配列は全体として非反復性となる。従って、一実施形態において、ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドは、インフレームで操作可能に連結した非反復配列、又はモチーフをコードする複数のポリヌクレオチドを含み、この場合、得られる発現ＸＴＥＮアミノ酸配列は非反復性である。
【０２０９】
一方法においては、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含む構築物をまず最初に準備する。標準的な方法により、ＧＨ  ｍＲＮＡを保有し、そして検出可能なレベルでそれを発現していると考えられる組織又は単離した細胞を用いて調製したｃＡライブラリーから、組成物のＧＨをコードしているＤＮＡを得る。例えば約２０〜１００塩基の、目的のＧＨ遺伝子を同定するために設計されたプローブを用いて、標準的な分子生物学的技術を用い、ハイブリダイゼーションによって、ライブラリーをスクリーニングする。プローブに対する最も良い候補は、ヒト成長ホルモンへの高い相同性を有する配列を示し、十分な長さがあり、擬陽性を最小限にするために十分に明確なものであるが、１以上の位置においては配列が異なる可能性がある。必要に応じて、ｃＤＮＡに逆転写されない可能性がある前駆体及びプロセシング中間体のｍＲＮＡを検出するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，前記，に記載されているような、標準的なプライマーエクステンション法を用いてコード配列を得ることができる。ＧＨ遺伝子を含むＧＨＸＴＥＮ構築物を準備するために十分な材料を得るために、その後、標的ＤＮＡ又はＲＮＡコード配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることができる。ハイブリダイズする完全長遺伝子が所望のＧＨ遺伝子であることを確認するためのアッセイをその後行うことができる。これらの標準的な方法により，そのような提供源を用いて調製したｃＡライブラリーから、ＤＮＡを容易に得ることができる。ＧＨをコードしている遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから得ることもでき、又は公的に使用可能なデータベース、特許若しくは参考文献から得られたＤＮＡ配列を用いて、当該分野において既知の合成方法（例えば自動核酸合成、例えばＥｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４，１９８９））に記載されている方法の内の１つ）により、作出することができる。そのような方法は当該分野において周知であり、また、科学的及び特許文献に詳しく記載されている。例えば，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＡＳ）登録番号（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙにより発行されている）及び／又は  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（例えば，Ｌｏｃｕｓ  ＩＤ，ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ，及びＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）から、配列を得ることができる。ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ又はＧｅｎＢａｎｋデータベース中の登録番号に対応し、目的のタンパク質のアミノ酸配列又はタンパク質の断片若しくは変異体を含む、モデルタンパク質識別名はワールドワードウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブページ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能である。本明細書に示したそのような配列識別名、これらＣＡＳ及びＧｅｎＢａｎｋ及びＧｅｎＳｅｑアクセッション番号に関する要約のページ、並びに引用した雑誌出版物（例えばＰｕｂＭｅｄＩＤ番号（ＰＭＩＤ））はそれぞれ、その全体、特にそれらに記載されたアミノ酸配列に関して、参照することにより本明細書に組み入れられる。一実施形態において，ＧＨをコードしている遺伝子は、表１の任意のタンパク質のいずれか１つ、又はその断片若しくは変異体をコードする
【０２１０】
発現融合タンパク質が単一のＧＨを含む場合、次に、対象ＧＨＸＴＥＮタンパク質のＧＨ部分をコードしている遺伝子又はポリヌクレオチドを、生物系において高レベルのタンパク質を発現するために適切な転写及び翻訳配列の制御下にあるプラスミド又はその他のベクター構築物中にクローニングする。その後の工程では、ＸＴＥＮをコードしている二番目の遺伝子又はポリヌクレオチドを、構築物中のＧＨをコードしている遺伝子に隣接して及びインフレームでクローニングすることにより、ＧＨ遺伝子のＮ及び／又はＣ末端をコードしているヌクレオチドに遺伝的に融合させる。この第二の工程は、ライゲーション又は多量体化工程を通して行う。この段落の前述した実施形態においては、当然のことながら、作出された遺伝子構築物は、あるいは、それぞれの融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の相補鎖であってもよい。
【０２１１】
ＸＴＥＮをコードしている遺伝子を１つ以上の工程において、実施例において詳細に記述した方法を含む完全に合成的な方法又は制限酵素を介したクローニングのような酵素処理、ＰＣＲ、オーバーラップエクステンションを組み合わせた合成方法のいずれかにより作出することができる。本明細書において開示した方法を、例えばＸＴＥＮをコードしている短い配列のポリヌクレオチドを、所望される長さ及び配列のより長いＸＴＥＮ遺伝子にするためのライゲーションに、用いることができる。一実施形態においてこの方法は、ＸＴＥＮモチーフをコードしているコドン最適化オリゴヌクレオチド又は約９〜１４アミノ酸、若しくは約１２〜２０アミノ酸、若しくは約１８〜３６アミノ酸、若しくは約４８〜約１４４アミノ酸、若しくは約１４４〜約２８８若しくはそれより長い長さの配列セグメント、又は前述した範囲の長さのモチーフ若しくはセグメントの組み合わせの２つ以上を結合させる。
【０２１２】
あるいは、開示した方法を、ＸＴＥＮをコードしている配列を、所望の長さのより長い配列にするための多量体化に用いる。例えば、ＸＴＥＮの３６アミノ酸をコードしている遺伝子を７２アミノ酸をコードしている遺伝子になるように二量体化、そして１４４アミノ酸、さらに２８８アミノ酸などになるように二量体化することができる。多量体化しても、使用した最も短い単位のモチーフにおいて選択されたコドンの設計を介して、ＸＴＥＮをコードしている遺伝子の有する反復性が低い又は実質的に反復性を有さないようにＸＴＥＮポリペプチドを構築することができ、このことは形質転換した宿主中でのコード遺伝子の組換えを低減させ及び安定性を向上させることができる。非反復性配列の、ＸＴＥＮをコードしている遺伝子は、遺伝子合成の標準的な技術を用いてオリゴヌクレオチドから組み合わせられる。遺伝子の設計は、コドン使用頻度及びアミノ酸組成物を最適化するアルゴリズムを用いて行うことができる。本発明の一方法においては、図４及び５に示したように、相対的に短いＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチド構築物のライブラリーを作出し、次にこれを組み合わせる。このライブラリーは、ライブラリー中の各メンバーが同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコード配列が可能になるような、一様なコドンのライブラリーとなる可能性がある。そのようなライブラリーを、部分的に無作為化したオリゴヌクレオチドから組み合わせることができ、そして配列モチーフを含むＸＴＥＮセグメントのライブラリーの構築のために用いることができる。各位置におけるアミノ酸の選択並びにコドン使用頻度を制御するために、無作為化法を最適にすることができる。前述の目的を達成するための方法の例を、実施例において開示する。
【０２１３】
ポリヌクレオチドライブラリー
別の態様において本発明は、所望される長さ及び配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子を組み合わせるために用いられる、ＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
【０２１４】
特定の実施形態においてＸＴＥＮをコードしているライブラリー構築物は、固定された長さのポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。最初の工程として、９〜１４アミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーを組み合わせることができる。好ましい実施形態においては、１２アミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドらリブラリーを組み合わせる。
【０２１５】
ＸＴＥＮをコードしている配列セグメントをより長い配列をコードするように、二量体化又は多量体化することができる。二量体化又は多量体化は、ライゲーション、オーバーラップエクステンション、ＰＣＲアセンブリー又は類似した、当該分野において既知のクローニング技術によって行うことができる。この工程は、生じるＸＴＥＮをコードしている配列が、ＸＴＥＮをコードしている遺伝子を提供する配列の構成及び所望される長さに達するまで、複数回繰り返すことができる。理解できるように、例えば、１２アミノ酸のモチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーになるように二量体化及び／又はライゲーションすることができる。本発明においては、異なる長さ、例えば、９〜１４アミノ酸の長さのモチーフをコードしているモチーフのライブラリーからは、２７〜４２アミノ酸をコードしているライブラリーが生じると考えられる。次に、２７〜４２アミノ酸、好ましくは３６アミノ酸（実施例に示すように）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを、本明細書で開示したようなＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしている遺伝子中に組み込むための、所望の長さのＸＴＥＮ配列をコードする、連続したより長い長さのポリヌクレオチドを含むライブラリーになるように、順に二量体化することができる。いくつかの実施形態においてライブラリーは、特定の配列のＸＴＥＮファミリーに限定される、例えば表２のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、又はＡＱ配列に限定されるアミノ酸をコードする、ポリヌクレオチドの組み合わせである。その他の実施形態においてライブラリーは、２つ以上の表２のモチーフファミリー配列をコードする配列を含む。３６ｍｅｒをコードするライブラリー中のポリヌクレオチド配列の、代表的で非限定的な名前及び配列を表８〜１１に示し、それらの作出に用いられた方法を実施例においてより詳細に記載する。その他の実施形態においてＸＴＥＮをコードするライブラリーは、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のコドンがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）アミノ酸からなる群より選択される、アミノ酸をコードする無作為化した配列と結合しているポリヌクレオチドコドンのセグメントから構築される。その後このライブラリーを、例えば、４８、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５、９１２、９２３、１３１８のアミノ酸、又は全長が最大約３０００アミノ酸、並びにその中間の長さで、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の構成要素として発現させた場合に、コードされたＸＴＥＮが本明細書において開示した１つ以上の特性を有することができるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブラリーになるように、連続した二量体化又はライゲーションに用いることができる。いくつかの例においては、ポリヌクレオチドライブラリー配列は以下により詳細に記述した、「シークエンスアイランド」をもまた含む場合もある。
【０２１６】
図５は、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物及び本発明の実施形態におけるＧＨＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み合わせに含まれる、代表的で非限定的な工程のフローチャートの模式図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２アミノ酸（「１２−ｍｅｒ」）のモチーフである配列モチーフ５０２になるようにアニーリングさせ、これを次にＢｂｓＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を有するオリゴ５０３とライゲーションする。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が得られるまで、ライブラリー由来の配列モチーフを１２−ｍｅｒにさらにアニーリングさせる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングする。ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位に隣接したｓｔｕｆｆｅｒ配列を任意にコードし、この例では単一のＧＨ遺伝子（本実施例のｈＧＨをコードしている）５０８、単一のＧＨを含むＧＨＸＴＥＮをコードしている遺伝子５００が得られる。ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチド及び前駆配列の、非網羅的なリストを表７に示した。
【０２１７】
表７：ＸＴＥＮ及び前駆配列のＤＮＡ配列
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【０２１８】
ＸＴＥＮをコードしている遺伝子のライブラリーを、当該分野において既知の１つ以上の発現ベクターにクローニングすることができる。ライブラリー中での発現量が高いメンバーの同定を促進するために、レポータータンパク質に融合したものとしてライブラリーを構築することができる。公的なレポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータ−ガラクトシダーゼがある。スクリーニングすることにより、選択した宿主生物において高濃度で発現し得る、短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。続いて、ランダムなＸＴＥＮ二量体のライブラリーを生成し、高レベルの発現を指標としてスクリーニングを繰り返すことができる。その後、発現レベル、プロテアーゼ安定性、又は抗血清への結合のような数多くの特性について、得られた構築物をスクリーニングすることができる。
【０２１９】
本発明の一態様は、配列の作出においてコドンの最適化を行った、融合タンパク質の構成要素をコードしているポリヌクレオチド配列を提供するものである。特に興味がもたれるものは、ポリペプチド組成物の発現の増加及び生産宿主におけるコード遺伝子の安定性が向上、という結果を有するコドン最適化である。例えば、コドン最適化は、グリシンに富んだ、又は非常に反復性のアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列にとって、特に重要である。コドン最適化は、コンピュータープログラム（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２：３４６−５３）を用いて行われ、それらのうちのいくつかは、リボソーム休止を最小限にする（Ｃｏｄａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。一実施形態においては、ライブラリー中の全メンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、そのコドン使用頻度は多様であるコドンライブラリーを構築することにより、コドン最適化を行うことができる。そのようなライブラリーを、発現量が高く、かつ、ＸＴＥＮを含む製品の大規模生産に特に好適な遺伝的に安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。ＸＴＥＮ配列を設計する場合には数多くの特性を考慮することができる。コードＤＮＡ配列中の反復性を最小限にすることができる。加えて、生産宿主中での使用頻度がきわめて低いコドンの使用を避ける又は最低限にすることができる（例えば大腸菌におけるＡＧＧ及びＡＧＡアルギニンコドン、並びに１つのロイシンコドン）。大腸菌の例では、発現量の多いタンパク質においては、２つのグリシンコドン、ＧＧＡ及びＧＧＧ、はまれにしか使用されない。従って、ＸＴＥＮ配列をコードしている遺伝子のコドン最適化が強く求められる場合がある。高レベルのグリシンを含むＤＮＡ配列は、不安定性又は低い発現レベルを引き起こす場合のある、高いＧＣ含量になる傾向にある。従って、可能な場合には、ＸＴＥＮをコードしている配列のＧＣ含量が、ＸＴＥＮの生産に用いられるだろう生産生物に好適になるように、コドンを選択することが好ましい。
【０２２０】
任意に、完全長ＸＴＥＮをコードしている遺伝子は、１つ以上のシークエンスアイランドを含む。本明細書中においては、シークエンスアイランドとは、ＸＴＥＮライブラリー構築物配列からは区別され、完全長のＸＴＥＮをコードしている遺伝子中には存在しない又は存在するとは考えられない制限酵素部位を含む、短い長さの配列である。一実施形態において、シークエンスアイランドの配列は、５’−ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ−３’である。別の実施形態において、シークエンスアイランドの配列は、５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’である。
【０２２１】
別の方法として、ライブラリー中の全メンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、配列におけるそれぞれのアミノ酸のコドン使用頻度が多様であるコドンライブラリーを構築することができる。そのようなライブラリーを、発現量が高く、かつ、ＸＴＥＮを含む製品の大規模生産に特に好適な遺伝的に安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。
【０２２２】
任意に、望ましくない配列を含む単離物を除去するために、ライブラリー中のクローンについて配列決定を行うことができる。短いＸＴＥＮ配列から構築した、最初のライブラリーのアミノ酸配列にはいくつかの変異型が含まれる可能性がある。例えば、特定に位置に数多くの親水性アミノ酸が生じることが可能になるように、いくつかのコドンを無作為化することができる。多量体化を繰り替える工程の間に、得られたライブラリーメンバーを、溶解度又はプロテアーゼ抵抗性のようなその他の特徴についてスクリーニングすることができ、加えて発現量の高さについてスクリーニングすることができる。
【０２２３】
所望の長さ及び特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子を選択したら、構築物中のＧＨをコードしている遺伝子に隣接して及びインフレームで、又は任意にスペーサー配列に隣接してクローニングすることにより、ＧＨ遺伝子のＮ及び／又はＣ末端をコードしているヌクレオチドに遺伝的に融合させる。本発明は、コードされるＧＨＸＴＥＮに依存して、様々な前述した置換を提供する。例えば、上に図示した、式ＶＩの態様のような、１つのＧＨと２つのＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を遺伝子がコードしている場合、この遺伝子はＧＨをコードしているポリヌクレオチドと、その組成及び配列長が同じであっても異なっていてもよい、２つのＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドを含むであろう。前述の非限定的な一実施形態においては、ＧＨポリヌクレオチドはヒト成長ホルモンをコードし、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドはＡＥ９１２をコード氏、そしてＣ末端ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドはＡＥ１４４をコードするだろう。ＧＨ遺伝子をＸＴＥＮ構築物中にクローニングする工程は、ライゲーション又は多量体化工程を介して行うことができる。図２に示したように、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしている構築物を、構成要素ＸＴＥＮ  ２０２、ＧＨ  ２０３、及びスペーサー配列  ２０４を異なる配置で設計することができる。図２Ａに示したように、一実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、構成要素ＧＨ  ２０３及びＸＴＥＮ  ２０２を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｂに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、ＧＨ  ２０３、スペーサー配列  ２０４、及びＸＴＥＮ  ２０２を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｃに示したように、別の実施形態において構築物  ２０１は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、２分子のＧＨ  ２０３及びＸＴＥＮ  ２０２の構成要素をコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む単量体ポリペプチドをコードする。図２Ｄに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、２分子のＧＨ  ２０３、スペーサー配列  ２０４、及びＸＴＥＮ  ２０２の構成要素を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｅに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、ＧＨ  ２０３、スペーサー配列  ２０４、第二のＧＨ分子  ２０３、及びＸＴＥＮ  ２０２の構成要素を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｆに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、ＧＨ  ２０３、ＸＴＥＮ  ２０２、ＧＨ  ２０３、及び第二のＸＴＥＮ  ２０２の構成要素を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。スペーサーポリヌクレオチドは、任意に開裂配列をコードする配列を含む場合がある。当業者には明らかであるように、���述したその他の置換も可能である。
【０２２４】
本発明はまた、（ａ）表７のポリヌクレオチド配列、又は、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的な配列、と高いパーセンテージの配列同一性を有するＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチド変異体を含むポリヌクレオチドをも包含する。高いパーセンテージの配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述の（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、あるいは少なくとも約８２％、あるいは少なくとも約８３％、あるいは少なくとも約８４％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約８６％、あるいは少なくとも約８７％、あるいは少なくとも約８８％、あるいは少なくとも約８９％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９１％、あるいは少なくとも約９２％、あるいは少なくとも約９３％、あるいは少なくとも約９４％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９６％、あるいは少なくとも約９７％、あるいは少なくとも約９８％、及びあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドか、又はストリンジェント条件下で標的ポリヌクレオチド又はその相補鎖にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。
【０２２５】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の相同性、配列類似性又は配列同一性は、ＢｅｓｔＦｉｔ又はＧａｐペアワイズ比較プログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．  ５３７１１）のような既知のソフトウェア又はコンピュータープログラムにより、簡便に決定することもできる。ＢｅｓｔＦｉｔは、２つの配列間で最も一致する又は類似するセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの部分的な相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ．  １９８１．２：４８２−４８９）を利用する。Ｇａｐは全体的なアライメント、つまり１つの配列全体と別の類似した配列の全体のアライメントを、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの方法を（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  １９７０．４８：４４３−４５３）用いて行う。配列相同性、類似性又は同一性の度合いを決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔのような配列アライメントプログラムを用いる場合、デフォルトの設定を用いることができ、又は同一性、類似性若しくは相同性スコアを最適化するために適切な採点マトリックスを選択することができる。
【０２２６】
「相補的な」核酸配列とは、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの相補性の規定に従って、塩基対を形成することができる核酸配列である。本明細書で使用する場合、用語「相補的な配列」とは、上に示したものと同じヌクレオチド比較によって評価し得る場合に、又は本明細書において記載したようなストリンジェント条件下でＧＨＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができることを指標として決定した場合に、実質的に相補的な核酸配列を意味する。
【０２２７】
得られるＧＨＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを次に、個別に発現ベクター中にクローニングすることができる。核酸配列は様々な方法によってベクター中に挿入される。通常、当該分野において既知の技術を用い、ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター構成要素は通常、これらには限定されないが、１つ以上のシグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終止配列を含む。１つ以上のこれらの構成要素を含む好適なベクターの構築には、当業者に知られている、標準的なライゲーション技術が用いられる。そのような技術は当該分野において周知であり、そして科学的及び特許文献に詳細に記述されている。
【０２２８】
様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってもよい。本発明は、宿主細胞に適合し、及び宿主細胞から認識され、並びにＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を制御するようにＧＨＸＴＥＮ遺伝子に操作可能に連結した、複製及び制御配列を含むプラスミドベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製開始点、並びに形質転換細胞中において、表現型での選択を提供することができるタンパク質をコードする配列を含む。様々な細菌、酵母、及びウイルスについてのそのようなベクター配列が周知である。用いることができる、有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主中において、融合タンパク質をコードしているＤＮＡの発現に影響を及ぼすことができる好適な制御配列に操作可能に連結したＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列には、転写に効果を及ぼすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、及び転写及び翻訳の終止を制御する配列が含まれる。その他の好適なベクターには、これらには限定されないが、ＳＶ４０及びｐｃＤＮＡの誘導体、並びにＳｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ５７：３１−４０（１９８８）に記載されたような、ｃｏｌ  ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸなどの既知の細菌性プラスミド、ｐＭＢ９及びその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８  ９などの数多くのｐｈａｇｅＩ誘導体のようなファージＤＮＡと、Ｍ１３などのその他のファージＤＮＡ、及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミド又は２ｍプラスミドの誘導体などの酵母プラスミドと、セントロメアベクター及び種間を繋ぐ酵母シャトルベクター；昆虫又は哺乳類細胞において有用なベクターなどの、真核生物において有用なベクター；ファージＤＮＡ又は発現制御配列を用いるために改変されたプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導したベクター；などが含まれる。そのベクターが複製可能であり、かつ、選択した宿主細胞中で生存可能なことが必要とされる。必要に応じて、低又は高コピー数のベクターを用いることができる。
【０２２９】
原核生物宿主を用いた発現ベクターへの使用に好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５：６１５  （１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：５４４  （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７  （１９８０）；  欧州特許明細書第３６，７７６号］、並びにｔａｃプロモーターのような雑種プロモーター［ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：２１−２５  （１９８３）］が含まれ、これらの全てがＧＨＸＴＥＮポリペプチドをコードしているＤＮＡに操作可能に連結されるだろう。細菌系に使用するプロモーターにはまた、ＧＨＸＴＥＮポリペプチドをコードしているＤＮＡに操作可能に連結した、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も加えることができる。
【０２３０】
本発明は、例えば、非融合移入ベクター及び融合移入ベクターの両方を用いるバキュロウイルス発現系を含む、その他の発現系の使用についても検討する。非融合移入ベクターとしては、これらには限定されないが、ｐＶＬ９４１（Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２  （１９７８））、ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２  （１９７８）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、及び融合移入ベクターとしては、これらには限定されないが、ｐＡｃ７  ００（Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２  （１９７８））、ｐＡｃ７０１及びｐＡｃ７０−２（ｐＡｃ７００と同じだが、リーディングフレームが異なる）、ｐＡｃ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いることができる。
【０２３１】
哺乳類の発現ベクターは、複製開始点、好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに任意の必要とされるリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終止配列、及び５’隣接非翻訳配列、を含み得る。非翻訳遺伝子エレメントを提供するために、ＳＶ４０のスプライシングから生じたＤＮＡ配列、及びポリアデニル化部位を用いてもよい。本発明においてその使用が検討される哺乳類の発現ベクターには、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターのような誘導プロモーターを含むベクター、ＤＨＦＲ発現カセットを含む任意の発現ベクター又はｐＥＤ（Ｒａｎｄａｌ  Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  １９９１，  Ｒａｎｄａｌ  Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １６，１２  （１９９１））のようなＤＨＦＲ／メトトレキサート共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ベクターが含まれる。あるいは、ｐＥＥ１４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のような、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクターがある。ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）又は核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下においてエピソームでの発現を誘導するベクターを使用することができる。
【０２３２】
本発明で使用するために選択できる哺乳類の発現ベクターには、これらには限定されないが、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが含まれる。本発明において使用することができるワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（例えば、Ｒａｎｄａｌｌ  Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．１２  （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｗｉｌｅｙ  １９９１を参照のこと）には、これらには限定されないが、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１ｐＴＫｇｐｔＦｌＳなどが含まれる。
【０２３３】
本発明はにおいて使用することができる酵母発現系にはまた、これらには限定されないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどが含まれる。
【０２３４】
加えて、キメラＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターは、薬剤選択マーカーを含んでいてもよい。そのようなマーカーは、キメラＤＮＡ分子を含むベクターのクローニング及び選抜及び同定において補助的な役割を果たす。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）阻害剤、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を使用してもよい。免疫学的なマーカーもまた使用することができる。遺伝子産物をコードしている核酸と同時に発現させることが可能な限り、任意の既知の選択マーカーを使用してもよい。選択マーカーのさらなる例は当業者において周知であり、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターも含まれる。
【０２３５】
一実施形態においては、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をコードしているポリヌクレオチドを、発現宿主系に適切なＮ末端シグナル配列のＣ末端に融合させる。一般的にシグナル配列は、転座及び分泌過程に際してタンパク質からタンパク分解によって除去され、定義したＮ末端を生じる。細菌、酵母、昆虫、及び哺乳類の系を含む大部分の発現系について、多様なシグナル配列が記載されてきた。各発現系における、非限定的な、好ましい例のリストを本明細書の以下に記載する。大腸菌での発現において好ましいシグナル配列は、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、及びＤｓｂＡである。酵母での発現において好ましいシグナルペプチドは、ｐｐＬ−ａｌｐｈａ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸性ホスファターゼシグナルペプチド、ＣＰＹ、又はＩＮＵ１である。昆虫細胞での発現において好ましいシグナル配列は、スズメガ脂肪動態（ｓｅｘｔａ  ａｄｉｐｏｋｉｎｅｔｉｃ）ホルモン前駆体、ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＴＰＡ、ＰＡＰ、又はｇｐ６７である。哺乳類での発現において好ましいシグナル配列は、ＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパ及びＩｇＧラムダである。
【０２３６】
別の実施形態においては、発現量が高い独立したタンパク質ドメインを潜在的に含むリーダー配列を、ＧＨＸＴＥＮ配列のＮ末端に、プロテアーゼ開裂部位によって離して融合させることができる。設計したタンパク質分解部位での開裂を阻害しない、任意のリーダーペプチド配列を使用することができるが、好ましい実施形態における配列は、組成物全体の発現及び折り畳みが有意に悪影響を受けないように、及び好ましくは発現、溶解度、及び／又は折り畳み効率が有意に改善されるように、安定で、発現量の高い配列を含むだろう。多様な、好適なリーダー配列が文献において記載されてきた。好適な配列の非限定的なリストには、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、６ｘＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。リーダー配列を、文献及び上記に詳細に記載した方法によるコドン最適化、特にＡＴＧ開始コドンの次の２番目のコドンを最適化することにより、さらに改善することができる。
【０２３７】
インビトロにおいてタンパク質を特定の部位で開裂させる、様々な酵素を用いた方法が知られている。そのような方法には、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ）、Ｘａ因子（ＩＤＧＲ）、トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）、ＴＥＶプロテアーゼ（ＥＱＬＹＦＱＧ）、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱＧＰ）、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴＧ）、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／Ｎ又はＳ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍ（商標））、エロモナスアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、及びカルボシキペプチダーゼＡ及びＢの使用が含まれる。さらに別の方法が、Ａｒｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４８：  １−１３  （２００６）に開示されている。
【０２３８】
その他の例において本発明は、構築物及び、ヘルパードメインなしにタンパク質のＮ末端にあるＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するために、発現について最適化されたポリヌクレオチド配列であって、ＸＴＥＮの特徴を有する少なくとも約２０〜約６０アミノ酸をコードし、ＸＴＥＮ担体コードしている配列のＮ末端に組み込まれたポリヌクレオチド配列を含む構築物（言い換えると、最適化された２０〜６０のアミノ酸をコードしているポリヌクレオチドを、ＧＨのＮ末端側にあるＸＴＥＮ構成要素をコードしているポリヌクレオチドに、インフレームで結合させた構築物）の作出方法を提供する。前述した構築物の利点は、配列がその後の開裂を必要とせず、それによりＸＴＥＮを含む組成物の製造工程の数が少なくなることである。実施例により詳細に記載したように、最適化されたＮ末端配列は非構造性タンパク質としての特徴をもつが、その翻訳の開始を促進する能力及び発現の向上のために選択したアミノ酸をコードしているヌクレオチド塩基を含み得る。前述の一実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ４８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ４８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。一実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドＮＴＳは、
【化１−１】
2015124222.tif 000026
【化１−２】
2015124222.tif 000027
から選択された配列又はその相補鎖と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含む。
【０２３９】
別の実施形態においては、インビボのプロテアーゼによって認識されるように、リーダー配列構築物中のプロテアーゼ部位を選択する。この実施形態においては、適切なプロテアーゼの接触を回避しながら、リーダーを保持した状態で、タンパク質を発現系から精製する。次に、完全長構築物を患者に注入する。注入に際しては、構築物は開裂部位に特異的なプロテアーゼと接触するようになり、そしてプロテアーゼにより開裂される。開裂されていないタンパク質の活性が開裂した形態のタンパク質の活性よりも実質的に低い例においては、この方法は、活性形態のタンパク質がインビボで徐々に生成されるため、毒性を回避しながらもより高い初期投与量にすることができるので、有益な効果を有する。この適用に有用なインビボのプロテアーゼの、いくつかの非限定的な例には、組織カリクレイン、血漿カリクレイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、トロンビン及びマトリックスメタプロテアーゼ、又は表６のプロテアーゼが挙げられる。
【０２４０】
この方法では、単量体ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしているキメラＤＮＡ分子が構築物中で生成される。任意に、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである、別の構築物中に転移又はクローニングしてもよい。このとき、キメラＤＮＡ分子を発現することができる宿主細胞を、キメラＤＮＡ分子を用いて形質転換することができる。目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを、細胞宿主の型による、周知の方法によって宿主細胞中に転移させることもできる。例えば、原核細胞の場合には塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に用いられるが、その他の細胞宿主に対しては、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを用いてもよい。哺乳類細胞の形質転換に用いられるその他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションが挙げられる。通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．、前記を参照のこと。
【０２４１】
形質転換は、発現ベクターのような担体を使用して又は使用せずに行うこともできる。その後、形質転換した宿主細胞を、ＧＨＸＴＥＮをコードしているキメラＤＮＡ分子の発現に好適な条件下で培養する。
【０２４２】
本発明はまた、本明細書において開示した単量体融合タンパク質組成物を発現させるための宿主細胞をも提供する。好適な真核宿主細胞の例には、これらには限定されないが、ＶＥＲＯ細胞などの哺乳類細胞、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２などのＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞及びＣｖＩ細胞が挙げられる。好適な非哺乳類真核細胞の例としては、コードしているベクターのクローニング又は発現宿主に好適な、糸状菌又は酵母のような真核微生物が挙げられる。サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に用いられる、より原始的な真核宿主微生物である。その他には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０：  １４０  ［１９８１］；欧州特許第１３９，３８３号、１９８５年５月２日公開）；例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ７３７  ［１９８３］）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：１３５  （１９９０））、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルシキアヌスヤロウィア（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）などのクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９：９６８−９７５  （１９９１））；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２８：２６５−２７８  ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；ニューロスポーラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７６：５２５９−５２６３  ［１９７９］）；シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（欧州特許第３９４，５３８号、１９９０年１０月３１日公開）などのシュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；及び例えばニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポカルジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（国際公開第９１／００３５７号、��９９１年１月１０日公開）などの糸状菌、及びＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １１２：２８４−２８９  ［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２６：２０５−２２１  ［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  １４７０−１４７４  ［１９８４］）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ４：４７５−４７９  ［１９８５］）などのアルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主が挙げられる。メチロトローフ酵母は本明細書において好適であり、そして、これらには限定されないが、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）を含む属から選択される、メタノール上で成長することが可能な酵母を含む。このクラスの酵母の例を挙げた、特定の種の酵母のリストを、Ｃ．  Ａｎｔｈｏｎｙ，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，  ２６９  （１９８２）において見ることができる。
【０２４３】
本発明において使用することができる、その他の好適な細胞には、これらには限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えば、ＤＨ５−α菌株）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの原核宿主細胞系統、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の系統が挙げられる。好適な原核生物の非限定的な例としては、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）；アルカオエグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）；デロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）；クロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）；オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）；及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属のものが挙げられる。特定の系統の非限定的な例としては、アルカオエグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）；デロビブリオ・バクテリオボラス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；クロロフレクサス  ・アウランチアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）；エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）；ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）；ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）；ラクトバチルス  ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）；リステリア  ・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；オセアノバチルス・イヘイエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）；パラコッカス  ・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）；シュードモナス・メバロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）；スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）；スタフィロコッカス・ヘモリチクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）；ストレプトミ��ス・グリセオロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓ）；ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）；ストレプトコッカス  ・プニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；テルモプラズマ  ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）；テルモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）；ビブリオ  ・コラレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）；ビブリオ・パラヘモリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；及びビブリオ  ・ブルニフィクス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）が挙げられる。
【０２４４】
目的のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、プロモーターの活性、形質転換体の選抜又は遺伝子の増幅について適切に改変した、標準的な組成の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ栄養素混合物）中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現させるために選択した宿主細胞の使用について既に知られている条件であり、当業者には明かであろう。一般的には、細胞を遠心分離により回収し、物理的又は化学的な手段を用いて破砕し、そして得られた粗抽出物をさらなる精製にかける。宿主細胞から分泌される組成物の場合は、遠心分離で得られた上清を分離し、さらなる精製にかける。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的な破砕、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の簡便な方法によって破砕することができ、これら方法の全ては当業者には周知である。細胞溶解を含む実施形態は必然的に、キメラＤＮＡ分子の発現後の分解を制限する、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液の使用を伴うだろう。好適なプロテアーゼ阻害剤には、これらには限定されないが、ロイペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンが挙げられる。次に、飽和硫酸アンモニウムの濃度を段階的に上げることにより、上清を沈殿させることができる。
【０２４５】
試料中の遺伝子発現は、例えば，標準的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロット［Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：５２０１−５２０５  （１９８０）］、ドットブロット（ＤＮＡ解析）、又は本明細書において示した配列に基づく、適切に標識したプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、直接測定してもよい。あるいは、ＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、及びＤＮＡ−ＲＮＡ雑種デュプレックス又はＤＮＡ−タンパク質デュプレックスを含む特異的なデュプレックスを認識することができる抗体を用いてもよい。その後、抗体を標識することができ、そしてデュプレックスが表面上に結合している場合、表面上でのデュプレックスの形成に際して、デュプレックスに結合する抗体の存在を検出することができるようなアッセイを行ってもよい。
【０２４６】
あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するために、細胞又は組織切片の免疫組織学的染色及び培養細胞若しくは体液のアッセイ又は選択マーカーの検出のような、蛍光を用いた免疫学的な手法によって遺伝子発現を測定してもよい。免疫組織学的染色及び／又は体液試料に有用な抗体は、モノクローナルであっても又はポリクローナルであってもよく、そして任意の動物を用いて調製することができる。簡便に、天然のＧＨポリペプチド配列に対する若しくは本明細書において示したＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対する抗体を調製することができ、又はＧＨに融合させた外生の配列であって、かつ、特異的な抗体エピトープをコードしている配列に対する抗体を調製してもよい。当業者に周知の選択マーカーの例には、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが含まれる。
【０２４７】
発現したＧＨＸＴＥＮポリペプチド産物を当該分野において既知の方法、又は本明細書に開示した方法を介して精製することができる。ゲルろ過、アフィニティ精製、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの方法を用いることができ、各方法は、それぞれの宿主細胞によって生産された融合タンパク質を回収及び精製するために調整される。いくつかの発現ＧＨＸＴＥＮは、単離及び精製の間にリフォールディングを必要とする場合がある。精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．  Ｃａｓｔｏｒ  （ｅｄ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４，及びＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，前記、に記載されている。複数工程の分離についてはまた、Ｂａｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１７９−９０  （１９９０）及び  Ｂｅｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．  ６７９：６７−８３  （１９９４）に記載されている。
【０２４８】
ＶＩＩＩ）．医薬組成物
本発明は、ＧＨＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質及び少なくとも１種類の薬学上許容可能な担体を含む。本発明のＧＨＸＴＥＮポリペプチドを、ポリペプチドを水溶液又は緩衝液、薬学上許容可能な懸濁液及び乳濁液のような薬学上許容可能な担体媒体と共に混合する、薬学上有用な組成物を調製するための既知の方法に従って処方することができる。非水性溶媒の例としてはプロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール及び植物油が挙げられる。保管のためには、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）に記載されているように、所望される純度の有効成分を、任意に生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として調製する。
【０２４９】
医薬組成物を経口的に、経鼻的に、非経口的に又は吸入治療によって投与することができ、また、医薬組成物は錠剤、トローチ、顆粒、カプセル、丸薬、アンプル、座薬又はエアロゾルの形態にしてもよい。医薬組成物を、水性又は非水性希釈剤、シロップ、顆粒又は粉末に加えられた、活性成分の懸濁液、溶液及び乳濁液の形態としてもよい。加えて、医薬組成物に、その他の薬学的に活性な化合物、又は複数の本発明の化合物を含めることもできる。
【０２５０】
より具体的には、本医薬組成物を治療のために、経口、直腸、経鼻、局所（経皮、エアロゾル、バッカル及び舌下を含む）、経膣、非経口（皮下、注入ポンプによる皮下、筋内、静脈内及び皮内を含む）、硝子体内、及び経肺を含む、任意の好適な経路により投与してもよい。当然のことながら、好ましい経路は受容者の状態及び年齢、並びに治療する疾患によって多様になるだろう。
【０２５１】
一実施形態においては医薬組成物を皮下に投与する。この実施形態において組成物は、投与の前に再構成する、凍結乾燥した粉末剤として提供されるだろう。組成物を、患者に直接投与することができる、液体の形状で提供してもよい。一実施形態においては、患者がその組成物を容易に自己投与することができるように、予めシリンジに充填された溶液剤として組成物を提供する。
【０２５２】
本発明において有用な持続放出型製剤は、マトリックス及びコーティングした組成物を含む、経口製剤となるだろう。好適なマトリックス材料には、ワックス（例えば、カルナバろう、密ろう、パラフィンワックス、セレシン、セラックろう、脂肪酸、及び脂肪アルコール）、油、硬化油又は脂質（例えば、硬化菜種油、ヒマシ油、牛脂、ヤシ油、及び大豆油）、及びポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリエチレングリコール）が含まれ得る。その他の好適なマトリックス打錠材料としては、その他の担体及び増量剤を含む、微結晶セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、がある。錠剤は、顆粒、被覆した粉末、又はペレットをもまた含み得る。錠剤は多層であってもよい。多層錠は、活性成分が顕著に異なる薬物動態学的プロファイルを有する場合に特に好ましい。任意に、成形した錠剤を被覆しても又は被覆しなくてもよい。
【０２５３】
被覆用の組成物は、不溶性マトリックスポリマー及び／又は水溶性材料を含み得る。水溶性材料は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのようなポリマー、又は、糖（例えば、ラクトース、ショ糖、フルクトース、マンニトールなど）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、有機酸（例えば、フマル酸、コハク酸、乳酸、及び酒石酸）、のような単量体材料、及びその混合物になるだろう。任意に、腸溶性ポリマーを被覆組成物中に組み込んでもよい。好適な腸溶性ポリマーには、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタラート、ポリビニルアセテートフタラート、セルロースアセテートフタラート、セルロースアセテートトリメリテート、セラック、ゼイン、及びカルボキシ基を含むポリメタクリレートが挙げられる。好適な可塑化剤、例えば、ジエチルフタル酸、クエン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセチル化クエン酸エステル、セバチン酸ジブチル、及びヒマシ油を加えることにより、被覆組成物を可塑化してもよい。被覆組成物に、二酸化ケイ素、二酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、澱粉、粉末セルロース、ＭＣＣ、又はポラクリリンカリウムのような不溶性材料である場合のある、充填剤をもまた加えてもよい。被覆組成物を、有機溶媒又は水性溶媒に溶解した溶液又は乳液、又はその混合物としてもよい。水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、又はその混合物のような溶媒もまた使用することができる。
【０２５４】
本発明の組成物は、様々な賦形剤を用いて処方することができる。好適な賦形剤には、微結晶セルロース（例えばＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１）、ポリメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート、メチルメタクリレート、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）（ＥｕｄｒａｇｉｔＲＳ−３０Ｄなど）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ  ＣＲ  Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、水性エチルセルロース分散剤（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、及び硫酸プロタミンが含まれる。徐放性製剤もまた、例えば、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含む可能性がある担体を含み得る。薬学上許容可能な塩もまたこれら徐放性製剤中で使用することができ、塩の例としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩のような無機塩、並びにアセテート、プロピオン酸塩、マロン酸塩、又は安息香酸塩のような、有機酸の塩がある。組成物または、水、塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体、並びに湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソームを担体として用いてもよい。
【０２５５】
別の実施形態においては、本発明の組成物はリポソーム中に封入される。リポソームは、制御された方法で長期間にわたり、有益な活性薬剤を送達する上で有用であることが示されてきたものである。リポソームは、封入された水性の物質を含む、閉じた二重の膜である。リポソームはまた、単一の膜二重層を有するユニラメラ媒体、又は隣あうそれぞれの膜が水層によって離されている、複数の膜二重層を有するマルチラメラであってもよい。生じる膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）テールが二重膜の中心の方向にむき、親水性（極性）ヘッドが水相の方向に向いているというものである。一実施形態においては、主に肝臓及び脾臓において、単核食細胞系の組織による取り込みを回避するために、弾力性のある水溶性ポリマーを用いてリポソームを被覆してもよい。リポソームを覆うための好適な親水性ポリマーとしては、これらには限定されないが、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロースヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸アミド及び、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，３１６，０２４号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号に記載されている親水性ペプチド配列が含まれる。
【０２５６】
リポソームは、当該分野において既知の、任意の脂質又は脂質の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、ベシクル形成脂質は天然に生じるものであっても、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、並びに米国特許第６，０５６，９７３号及び同第５，８７４，１０４号に開示されたスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含む合成した脂質であってもよい。ベシクル形成脂質はまた、糖脂質、セレブロシド、又は１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−テトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１［（２，３，-−ジオ
レイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）のような陽イオン性脂質；又は米国特許第６，０５６，９７３号にまた開示されたジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）であってもよい。米国特許第５，９１６，５８８号及び同第５，８７４，１０４号に開示されたように、ベシクルに安定性を付与するために、一定の範囲のコレステロールもまた含まれ得る。
【０２５７】
さらに別のリポソーム技術が、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，７５９，０５７号；同第６，４０６，７１３号；同第６，３５２，７１６号；同第６，３１６，０２４号；同第６，２９４，１９１号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号；同第５，９６５，１５６号；同第５，９１６，５８８号；同第５，８７４，１０４号；同第５，２１５，６８０号；及び同第４，６８４，４７９号に記載されている。これらは、リポソーム及び脂質に覆われたマイクロバブル、並びにそれらの製造方法について記載しているものである。従って、当業者は、本発明の開示及びこれらその他特許の開示の両方を考慮することにより、本発明のポリペプチドを持続放出型にするためのリポソームを作出することができるだろう。
【０２５８】
液体製剤に求められる特性は、その製剤が静脈内、筋内、関節内、又は皮下投与に用いられる、２５、２８、３０、３１、３２ゲージの針の中を通過できるような形態で提供されることである。
【０２５９】
経皮的製剤を用いた投与は、一般的に、例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，１８６，９３８号及び同第６，１８３，７７０号、同第４，８６１，８００号、同第６，７４３，２１１号、同第６，９４５，９５２号、同第４，２８４，４４４号、及び国際公開第８９／０９０５１号に記載されている方法を含む、当該分野において既知の方法を用いてもまた、行うことができる。経皮パッチは、吸収に問題のあるポリペプチドを用いる場合に、特に有用な実施形態である。パッチは、皮膚を通過する活性成分の放出を、１２時間、２４時間、３日、及び７日間、制御することができる。一例として、１日用量の２倍を超える本発明のポリペプチドを、非揮発性の液体中に溶解する。本発明の組成物は、粘性のある、非揮発性の液体の形態で提供される。特定の製剤の皮膚への浸透は、当該分野における標準的な方法（例えば、Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍ．  ６４：１９４−１９５  （１９７５））により、測定され得る。好適なパッチの例としては、受身伝達皮膚パッチ，イオン導入皮膚パッチ，又はＮｉｃｏｄｅｒｍのような極微針を有するパッチがある。
【０２６０】
その他の実施形態においては、活性薬剤の嗅覚系を介したＣＮＳへの移動を可能にするように、及び全身投与を低減するために、組成物を経鼻的、口腔内、又は舌下経路を介して脳へと送達してもよい。この投与経路で一般的に用いられる装置は、米国特許第６，７１５，４８５号に含まれている。この経路を介して送達された組成物は、ＣＮＳへの投薬を増加させることが、又は特定の薬剤に関連する全身性毒性リスクを低減させることで、全身負荷を低減させることができるだろう。皮下に移植可能な装置を用いた送達のための医薬組成物の調製は、例えば、米国特許第３，９９２，５１８号；同第５，６６０，８４８号；及び同第５，７５６，１１５号に記載された方法などの、当該分野において既知の方法を用いて行うことができる。
【０２６１】
浸透圧ポンプを、錠剤、丸薬、カプセル又は移植可能な装置の形態での遅延放出型薬剤として用いても良い。浸透圧ポンプは当該分野において周知であり、そして当業者は、持続放出性薬剤のための浸透圧ポンプの提供に実績のある業者から、容易に入手することができる。例としては、ＡＬＺＡ社のＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡ社のＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社のＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム；Ｓｈｉｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム；及びＡｌｚｅｔ（商標）がある。浸透圧ポンプの技術について記載している特許としては、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，８９０，９１８号；同第６，８３８，０９３号；同第６，８１４，９７９号；同第６，７１３，０８６号；同第６，５３４，０９０号；同第６，５１４，５３２号；同第６，３６１，７９６号；同第６，３５２，７２１号；同第６，２９４，２０１号；同第６，２８４，２７６号；同第６，１１０，４９８号；同第５，５７３，７７６号；同第４，２００，０９８４号；及び同第４，０８８，８６４号がある。当業者は、本発明の開示及びこれらその他特許の開示の両方を考慮することにより、本発明のポリペプチドを持続放出型にするための浸透圧ポンプを生産することができるだろう。
【０２６２】
シリンジポンプもまた、遅延放出型製剤として用いることができる。それらの装置は、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第４，９７６，６９６号；同第４，９３３，１８５号；同第５，０１７，３７８号；同第６，３０９，３７０号；同第６，２５４，５７３号；同第４，４３５，１７３号；同第４，３９８，９０８号；同第６，５７２，５８５号；同第５，２９８，０２２号；同第５，１７６，５０２号；同第５，４９２，５３４号；同第５，３１８，５４０号；及び同第４，９８８，３３７号に記載されている。当業者は、当業者は、本発明の開示及びこれらその他特許の開示の両方を考慮することにより、本発明の組成物を持続放出型にするためのシリンジポンプを生産することができるだろう。
【０２６３】
ＩＸ）．医薬キット
別の態様において、本発明は、ＧＨＸＴＥＮポリペプチドの使用を促進するためのキットを提供する。このキットは、本明細書において示した医薬組成物、医薬組成物について記載したラベル、並びに、医薬組成物の保管、再構成及び／又は対象への投与についての説明を含む。いくつかの実施形態において、キットは好ましくは、（ａ）それを必要とする対象に投与することで、疾患、状態又は障害を治療するために十分な、一定の量のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質組成物、及び（ｂ）一定量の薬学上許容可能な担体を含み；注入又は再構成に直ちに用いられる製剤には水、緩衝液、若しくはデキストロースが共に；ＧＨＸＴＥＮ薬剤及び保管及び取扱い条件を記載したラベル、及び薬剤の認可された適用を示すシート、予防的使用における再構成及び／又はＧＨＸＴＥＮ薬剤の投与についての説明、及び／又は認可された適用の治療、適切な用量及び安全情報、及び薬剤のロット及び有効期限を示す情報が共に含まれる。前述の別の実施形態においてキットは、対象に送達するための適切な濃度のＧＨＸＴＥＮを使用者に提供する、好適に希釈されたＧＨＸＴＥＮ組成物を含む場合がある、第二の容器を含む場合がある。
【実施例】
【０２６４】
実施例１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例においては、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードしている、コドン最適化した遺伝子コレクションの構築について記載する。第一の工程として、ｐＥＴベクターベースで、かつ、Ｔ７プロモーターを含むｓｔｕｆｆｅｒベクターである、ｐＣＷ０３５９を構築した。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）及びＴＥＶプロテアーゼ認識部位、それに続くｓｔｕｆｆｅｒ配列と隣接したＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位をコードする。ＢｓａＩ及びＢｂｓＩは、消化後に一致する突出末端が生成されるように挿入された。ｓｔｕｆｆｅｒ配列の後には切断型のＧＦＰ遺伝子及びＨｉｓタグが続く。ｓｔｕｆｆｅｒ配列は終止コドンを含むため、ｓｔｕｆｆｅｒプラスミドｐＣＷ０３５９を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は蛍光を発しないコロニーを形成する。ｓｔｕｆｆｅｒセグメントを除去するためにｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られたベクター断片をアガロースゲル精製により単離した。モチーフのＡＤファミリーを反映させ、配列をＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と命名した。そのセグメントは、［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ、又はＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化２】
2015124222.tif 000028
【０２６５】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０１と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＤ３６配列がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＤ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【０２６６】
ＬＣＷ０４０１ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光をはっするものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、３９のクローンがＸＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表８に列挙した。
【０２６７】
表８：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表８−１】
2015124222.tif 000029
【表８−２】
2015124222.tif 000030
【表８−３】
2015124222.tif 000031
【０２６８】
実施例２：ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ、ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰ、又はＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化３】
2015124222.tif 000032
【０２６９】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０２と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＥ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＥ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【０２７０】
ＬＣＷ０４０２ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光を発するものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、３７のクローンがＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表９に列挙した。
【０２７１】
表９：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表９−１】
2015124222.tif 000033
【表９−２】
2015124222.tif 000034
【表９−３】
2015124222.tif 000035
【０２７２】
実施例３：ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列をＸＴＥＮ＿ＡＦ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ、又はＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化４】
2015124222.tif 000036
【０２７３】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０３と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＦ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＦ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【０２７４】
ＬＣＷ０４０３ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光を発するものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、４４のクローンが正しいＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１０に列挙した。
【０２７５】
表１０：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表１０−１】
2015124222.tif 000037
【表１０−２】
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【表１０−３】
2015124222.tif 000039
【０２７６】
実施例４：ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＧ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ、又はＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化５】
2015124222.tif 000040
【０２７７】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０４と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＧ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＧ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【０２７８】
ＬＣＷ０４０４ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光を発するものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、４４のクローンが正しいＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１１に列挙した。
【０２７９】
表１１：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【０２８０】
実施例５：ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６を順次二量体化し、ＡＥ７２、１４４、２８８、５７６及び８６４にすることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を構築した。３７種類の異なるＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントから、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのコレクションを構築した。３７種類の異なる３６−アミノ酸セグメントの全てを含む大腸菌培養を混合し、そしてプラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、挿入断片となる短い断片を生成した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、ベクターとしての長い断片を生成した。挿入断片及びベクター断片を倍の長さになるようにライゲーションし、ライゲーション混合物を用いてＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を形質転換し、そしてＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
【０２８１】
このＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４０６と命名した。ＬＣＷ０４０６由来の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリーであるＬＣＷ０４１０を得た。ＬＣＷ０４１０由来の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリーであるＬＣＷ０４１４を得た。ライブラリーから無作為に２つの単離体であるＬＣＷ０４１４．００１及びＬＣＷ０４１４．００２を選択し、その同一性を確認するために配列を決定した。ＬＣＷ０４１４由来の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリーであるＬＣＷ０４１８を得た。ＬＣＷ０４１８ライブラリー由来の９６の単離体をＧＦＰの蛍光強度についてスクリーニングした。ＰＣＲによって確認した挿入断片のサイズが正しく、かつ強い蛍光を呈する８つの単離体の配列を決定し、決定された配列及び発現のデータに基づき、２つの単離体（ＬＣＷ０４１８．０１８及びＬＣＷ０４１８．０５２）をその後の使用のために選択した。
【０２８２】
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特定のクローンであるｐＣＷ０４３２を、上述したもの同じ二量体化工程を介してＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８及びＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることにより構築した。
【０２８３】
実施例６：ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築
３７種類の異なるＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメント、４４種類のＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメント、及び４４種類のＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションを構築した。
【０２８４】
１２５種類の異なる３６−アミノ酸セグメントの全てを含む大腸菌培養を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、挿入断片となる短い断片を生成した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、ベクターとしての長い断片を生成した。挿入断片及びベクター断片を倍の長さになるようにライゲーションし、ライゲーション混合物を用いてＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を形質転換し、そしてＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコロニーを得た。
【０２８５】
このＸＴＥＮ＿ＡＭ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６１と命名した。ＬＣＷ０４６１の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＬＣＷ０４６２を得た。ＬＣＷ０４６２由来の１５１２単離体をタンパク質発現を指標にスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェルプレートに移し、初期培養として一晩培養した。これらの初期培養を新しい自動誘導培地で希釈し、２０〜３０時間培養した。蛍光プレートリーダーを用い、励起３９５ｎｍ及び放射５１０ｎｍで発現を測定した。１９２の単離体が高レベルの発現を示したため、これらをＤＮＡ配列決定にかけた。ＬＣＷ０４６２中の大部分のクローンが、高い発現及び類似した物理化学的特性を示したことから、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグメントの組み合わせの大部分から有用なＸＴＥＮ配列が得られたことが示唆される。ＬＣＷ０４６２由来の３０の単離体を、複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能タンパク質の構築に有用な、好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションとして選抜した。これらセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１２に列挙する。
【０２８６】
表１２：ＡＭ１４４セグメントのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表１２−１】
2015124222.tif 000044
【表１２−２】
2015124222.tif 000045
【表１２−３】
2015124222.tif 000046
【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
2015124222.tif 000050
【表１２−８】
2015124222.tif 000051
【０２８７】
実施例７：ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築
ＬＣＷ０４６２ライブラリー全体を実施例６に記載したように二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８クローンのライブラリーを得て、これをＬＣＷ０４６３と命名した。ＬＣＷ０４６３ライブラリー由来の１５１２の単離体を実施例６に記載したプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の多く発現しているクローンについて配列決定を行い、４０の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントを、２８８アミノ酸残基を有する、複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能タンパク質の構築のために選択した。
【０２８８】
実施例８：ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのＬＣＷ０４６２ライブラリー由来のセグメントとＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのＬＣＷ０４６３ライブラリー由来のセグメントとを再び組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーを生成した。この新しい、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６４と命名した。ＬＣＷ０４６２及びＬＣＷ０４６３をそれぞれ含む培養した大腸菌から、プラスミドを単離した。ＬＣＷ０４６４由来の１５１２の単離体を、実施例６に記載したプロトコールを用いてスクリーニングした。発現の高い１７６のクローンについて配列決定を行い、３９の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、より長いＸＴＥＮの構築、及び４３２アミノ酸残基を有する複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能タンパク質の構築のために選択した。
【０２８９】
並行して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４及びＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の好ましいセグメントを用い、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのＬＭＳ０１００ライブラリーを構築した。
【０２９０】
実施例９：ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築
ｓｔｕｆｆｅｒセグメントを除去するためにｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、生じたベクター断片をアガロースゲル精製によって単離した。
【０２９１】
ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧのアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素ＡｓｃＩの認識部位であるヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを含むシークエンスアイランドＡ（ＳＩ−Ａ）を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：
【化６】
2015124222.tif 000052
と、リン酸化していいないオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：
【化７】
2015124222.tif 000053
とをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、ＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、上述したように準備したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションさせ、ＳＩ−Ａを含むｐＣＷ０４６６を得た。次に、実施例８からの４３種類の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６６からのＳＩ−ＡセグメントのＣ末端を、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせ、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。
【０２９２】
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのＬＣＷ０４７９ライブラリー由来のセグメントと、４３種類の実施例８からの好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８１と命名した。
【０２９３】
実施例１０：ＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築
ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧのアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素ＦｓｅＩの認識部位であるヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを含むシークエンスアイランドＢ（ＳＩ−Ｂ）を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：
【化８】
2015124222.tif 000054
と、リン酸化していないオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：
【化９】
2015124222.tif 000055
とをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、実施例９で用いたようなＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションさせ、ＳＩ−Ｂを含むｐＣＷ０４６７を得た。次に、実施例８からの４３種類の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６７からのＳＩ−ＢセグメントのＣ末端を、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８０と命名した。
【０２９４】
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのＬＣＷ０４８０ライブラリー由来のセグメントと、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのＬＣＷ０４８１ライブラリー由来のセグメントを、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８７と命名した。
【０２９５】
実施例１１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように組み合わせた。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。１種類のＸＴＥＮ＿ＡＤ５７６の中間構築物について配列決定を行った。このクローンをカニクイザルを用いたＰＫ実験において評価し、半減期が約２０時間であることを測定した。
【０２９６】
実施例１２：ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例３に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のセグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように組み合わせた。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。１種類のＸＴＥＮ＿ＡＦ５４０の中間構築物について配列決定を行った。このクローンをカニクイザルを用いたＰＫ実験において評価し、半減期が約２０時間であることを測定した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の完全長クローンの１つが非常に高い溶解度を有し、カニクイザルにおいて６０時間を超える半減期を示した。シークエンスアイランドを含むＸＴＥＮ＿ＡＦ配列の二番目のセットを実施例９に記載したように組み合わせた。
【０２９７】
実施例１３：実施例ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように組み合わせた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の完全長クローンの１つが非常に高い溶解度を有し、カニクイザルにおいて６０時間を超える半減期を示した。
【０２９８】
実施例１４：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築及び１２ｍｅｒ付加ライブラリー（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ）のスクリーニング
この実施例では、ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。これまで、ＸＴＥＮをＮ末端に有するタンパク質の発現は低く、得られる値は本質的に、ＧＦＰ蛍光アッセイにおいては検出できなかった（Ｎ末端ＣＢＤヘルパードメインを有するタンパク質の発現の＜２５％）。コドンレベルでの多様性を作出するために、７種類のアミノ酸配列を選択し、コドン多様性を有するものを準備した。異なるコドンを有し、１２アミノ酸をコードしている７対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩで制限消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）とライゲーションし、そして、７種類のライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。得られたクローンは、発現のスクリーニングにＧＦＰの蛍光を用いることができるように、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰにＮ末端ＸＴＥＮ１２ｍｅｒをインフレームで融合させた配列を有するものである。作出した７種類のライブラリーから個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地中で飽和に達するまで一晩生育させた。理論的なライブラリーの多様性のおよそ１／２から１／３の数の範囲のコロニーを選択した（表１３を参照のこと）。
【０２９９】
表１３：１２ｍｅｒを付加したライブラリーの理論的多様性及びサンプリング数。無作為化したコドンを含むアミノ酸残基を下線で示す。
【表１３】
2015124222.tif 000056
【０３００】
飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）（発現アッセイの結果を示す、図９を参照のこと）。箱ひげ図としてグラフ化した結果は、ライブラリー由来の最も発現量の高いクローンの値は基準により近かったが、発現レベルの中間値は、「基準」であるＣＢＤＮ末端ヘルパードメインの発現レベルのおよそ半分であったことを示し、このことはこれらの配列の近傍にさらなる最適化が求められることを示すものであった。この結果は、発現レベルが基準となるＣＢＤＮ末端の＜２５％であった、これまでの型のＸＴＥＮとは著しく異なる。この結果はまた、アミノ酸ＭＥから始まるライブラリーの発現レベルよりも、アミノ酸ＭＡから始まるものの方が発現レベルが高いことを示す。このことは、最も発現レベルが高いクローンについて見た場合に最も顕著であり、基準により近いクローンの多くがＭＡを含む配列から始まるものである。ライブラリー中の配列の７５％のみがＭＡから始まる配列であるのに対し、基準であるＣＢＤ−ＡＭ８７５の３３％以内に入った１７６クローンのうち、８７％がＭＡから始まるものであり、最高レベルの発現についてはＭＡから始まるクローンの有意に高い割合が示された。最も発現の高い９６クローンについて同一性を確認するために配列決定を行い、ＬＣＷ５４６から４配列、ＬＣＷ５４７から４配列及びＬＣＷ５５２から４配列の、総和１２配列をさらなる最適化のために選抜した（表１４を参照のこと）。
【０３０１】
表１４：改良した１２ｍｅｒのＤＮＡヌクレオチド配列
【表１４−１】
2015124222.tif 000057
【表１４−２】
2015124222.tif 000058
【０３０２】
実施例１５：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築、及びコドン３と４を最適化したライブラリーのスクリーニング
この実施例では、ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の２つのコドン（前記実施例を参照のこと）を含む配列の３番目及び４番目のコドンを、好ましいコドンを決定するために無作為化したＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７及びＬＣＷ５５２由来のクローンに基づく３種類のライブラリーの３番目及び４番目の残基を、これらの位置が可能な限り全てのＸＴＥＮコドンの組み合わせを含むように変更した（図１０を参照のこと）。各ライブラリーに可能な限り全てのＸＴＥＮコドンが含まれるようにするため、３番目と４番目のコドンが異なり、１２アミノ酸をコードしている９対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩで制限消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）とライゲーションし、そして、ＬＣＷ０５６９〜５７１の３種類のライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。２４のＸＴＥＮコドンを用いた場合、各ライブラリーの理論的な多様性は５７６のユニークなクローンとなる。作出した３種類のライブラリー由来の総和５０４の個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地中で飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーできる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）。スクリーニングから得られた最も良い７５クローンについて配列決定を行い、レポーターであるＧＦＰの発現対基準試料についての再試験を行った（図１１を参照のこと）。５２のコロニーから使用可能なシークエンスデータが得られ、これをその後の解析に用いた。ライブラリー毎に分類した結果は、ＬＣＷ５４６が最も良いライブラリーであったことを示す。結果を表１５に示す。驚くべきことに、基準であるＣＢＤＮ末端のベースラインの測定値がたったの〜６００ＡＵであったのに対し、最も良いクローンのベースラインでの蛍光の測定値が〜９００ＡＵであったことを発見した。このことは、基準であるＣＢＤＮ末端の発現とおよそ同じ発現レベルを有した前段階のライブラリーの最もよいクローン（実施例１４）よりも、このライブラリーがおよそ３３％改良されたことを示すものである。
【０３０３】
表１５：３番目及び４番目のコドンを最適化したライブラリーの比較
【表１５】
2015124222.tif 000059
【０３０４】
このデータから、３番目及び４番目の位置の位置には好ましい特定のコドンがあることを示す、さらなる傾向が見いだされた。表１６に見られるようにＬＣＷ５６９ライブラリーでは、３番目の位置のグルタミン酸コドンＧＡＡとトレオニンコドンＡＣＴがより高い発現と相関した。
【０３０５】
表１６：ＬＣＷ５６９における、好ましい３番目と４番目のコドン
【表１６】
2015124222.tif 000060
【０３０６】
加えて、最も良かった７５クローンについての再試験から、複数のクローンの発現量が、今回は、基準となるクローンよりも非常に良かったことが示された。
【０３０７】
実施例１６：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築、並びに１２ｍｅｒ及び３６ｍｅｒコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング
この実施例では、ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の２つのコドン（前記実施例を参照のこと）に加えて、選択した１２の１２ｍｅｒ配列（前記実施例を参照のこと）を一番Ｎ末端側に、その後に１２５の先に構築した３６ｍｅｒセグメント（前記実施例を参照のこと）をコンビナトリアル手法を用いて組み合わせることにより、幅広い視点から、Ｎ末端について試験した。このことにより、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規の４８ｍｅｒを作出し、そして、Ｎ末端でのより長い配列の相互作用が、より長い配列の発現に及ぼす影響について評価することを可能にした（図１２）。３６ｍｅｒを組み合わせるために用いた二量体化工程と同様に（以下の実施例を参照のこと）、１２５種類の選択した３６ｍｅｒセグメントを含むプラスミドを制限酵素ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）からのプラスミドもまたＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。これらの断片を一緒にライゲーションし、ＬＣＷ０５７９ライブラリーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。このライブラリーは、一番Ｎ末端側の、選択した１２種類の１２ｍｅｒの今後のクローニングにおけるベクターとしても用いた。ＬＣＷ０５７９のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。選択した１２種類の１２ｍｅｒ配列をコードしている１２対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化したＬＣＷ０５７９ベクターとライゲーションし、そしてＬＣＷ０５８０ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンビテント細胞を形質転換した。理論的には多様性は１５００のユニークなクローンとなるため、作出したライブラリーから、総和して１５１２個の個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地中で、飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーされる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）。最も良かった９０のクローンについて配列決定を行い、レポーターであるＧＦＰの発現について再試験した。８３のクローンについて使用可能なシークエンスデータが得られたため、これらをその後の解析に用いた。それぞれのクローンに含まれるリーダーである１２ｍｅｒを決定するためにシークエンスデータを用い、そして各１２ｍｅｒが発現に及ぼす影響について評価した。クローンＬＣＷ５４６＿０６及びＬＣＷ５４６＿０９が非常に優れたＮ末端であるとして突出していた（表１７を参照のこと）。
【０３０８】
表１７：ＬＣＷ５４６＿０６及びＬＣＷ４５９＿０９から始まるクローンの相対的な効率
【表１７】
2015124222.tif 000061
【０３０９】
配列決定及び再試験のデータにおいて、同じ配列を有する独立した複数の例で同様の結果が示されたことは、このアッセイの信頼性を向上させるものである。加えて、６種類のユニーク配列を有する１０のクローンは基準となるクローンよりも非常に良いものであった。これらを表１８に示す。これらの配列について生じたものはこれらの配列のみであり、これらの配列についてはその他の配列は得られず、また、基準となるクローンよりも優れたものもなかったことが示された。これら６種類の配列がさらなる最適化のために優れていた。
【０３１０】
表１８：基準となるクローンよりも非常に良かった１２ｍｅｒ及び３６ｍｅｒのコンビナトリアルクローン
【表１８−１】
2015124222.tif 000062
【表１８−２】
2015124222.tif 000063
【０３１１】
実施例１７：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築、並びにＸＴＥＮ−ＡＭ８７５及びＸＴＥＮ−ＡＥ８６４のための１２ｍｅｒと３６ｍｅｒのコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング
【０３１２】
ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の４つのコドン（前記実施例を参照のこと）及びＮ末端１２ｍｅｒと３６ｍｅｒとの最も良い組み合わせ（前記実施例を参照のこと）に加えて、これらの好ましい配列のまとまりについて試験するために、コンビナトリアル手法を用いた。このことにより、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規の４８ｍｅｒを作出し、そして、これまでの結果のコンフルエンスについて試験することを可能にした。加えて、これらリーダー配列の能力が、全てのＸＴＥＮタンパク質の低い発現量に対する普遍的な解決となるかについて、新しい４８ｍｅｒをＸＴＥＮ−ＡＥ８６４及びＸＴＥＮ−ＡＭ８７５の両方の前に配置することによって評価した。３６ｍｅｒセグメントの全１２５のクローンを用いる代わりに、コンビナトリアルライブラリー中で最も良いＧＦＰの発現を示した、選択した６つの３６ｍｅｒセグメントのクローンからのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。ＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）及びＡＣ１０４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）からのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。これらの断片を一緒にライゲーションし、ＬＣＷ０５８５（−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）及びＬＣＷ０５８６（−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。これらのライブラリーは、一番Ｎ末端側の、選択した８種類の１２ｍｅｒの今後のクローニングにおけるベクターとしてもまた役立つ場合がある。ＬＣＷ０５８５及びＬＣＷ０５８６のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。先のスクリーニング（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２）において最も良いＧＦＰの発現を示した、選択した８種類の１２ｍｅｒ配列をコードしている８対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化したＬＣＷ０５８５及びＬＣＷ０５８６ベクターとライゲーションし、そして最終的なライブラリーである、ＬＣＷ０５８７（ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３−ＧＦＰ）及びＬＣＷ０５８８（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２−ＧＦＰ）ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンビテント細胞を形質転換した。理論的には多様性は４８のユニークなクローンとなるため、作出したライブラリーから総和２５２個の個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地中で、飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーされる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）。最も良かった３６のクローンについて配列決定を行い、レポーターであるＧＦＰの発現について再試験した。３６のクローンについて使用可能なシークエンスデータが得られたため、これら３６クローンをその後の解析に用いた。シークエンスデータを用いて、クローン中に含まれる１２ｍｅｒ、３番目のコドン、４番目のコドン及び３６ｍｅｒを決定し、多くのクローンが、同じ配列を含む独立した産物であることを明らかにした。加えて、これらのクローンについての再試験の結果の値は類似しており、このことはスクリーニング工程がロバストであることを示している。Ｎ末端における好ましい特定の組み合わせが見られ、そして基準である対照よりも一貫しておよそ５０％高い、蛍光の値が得られた（表１９及び２０を参照のこと）。これらのデータは、最適化したＮ末端ＸＴＥＮをコードしている配列を融合タンパク質遺伝子に加えることにより、融合タンパク質の発現が顕著に増加する、と言う結果を支持するものである．
【０３１３】
表１９：ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５への好ましいＮ末端の組み合わせ
【表１９】
2015124222.tif 000064
【０３１４】
表２０：ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４への好ましいＮ末端の組み合わせ
【表２０】
2015124222.tif 000065
【０３１５】
特に、ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５への好ましいＮ末端の組み合わせとＸＴＥＮ−ＡＥ８６４への好ましい組み合わせは同じではなく（表１９及び２０）、このことは、開始部位から１５０塩基離れた配列とのより複雑な相互作用が発現レベルに影響することを示している。好ましいヌクレオチド配列の配列を表２１に示し、そして独立して発現を確認するために、好ましいクローンをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図１３を参照のこと）。ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３及びＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２の完全長配列をさらなる解析用に選択した。
【０３１６】
表２１：ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５及びＸＴＥＮ−ＡＥ８６４の、Ｎ末端の最初の４８アミノ酸残基に対する好ましいＤＮＡヌクレオチド配列
【表２１】
2015124222.tif 000066
【０３１７】
実施例１８：ＧＨＸＴＥＮの作出及び評価方法；ＸＴＥＮ−ｈＧＨを例として
ＧＨＸＴＥＮ組成物の作出及び評価の一般的な模式図が図６に示されており、そしてこれは本実施例の基本的な説明の基礎となる。開示した方法及び当業者に既知の方法を、例示となる実施例に示した指針と共に用いることにより、熟練者は、ＸＴＥＮ、ＧＨ及び当該分野において既知のＧＨ変異体を含む、広範囲のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質を作出及び評価することができる。そのため、本実施例は単に例示するためだけのものであると解釈され、かつ、方法を制限するものでは一切なく；数々の変異型が当業者には明かであろう。本実施例においては、ＡＥファミリーモチーフのＸＴＥＮに結合した、ヒト成長ホルモンのＧＨＸＴＥＮが作出されるだろう。
【０３１８】
ＸＴＥＮをコードしているポリヌクレオチドの作出の一般的な模式図を、図４及び５に示す。図５は、本発明の実施形態のうちの１つの、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み合わせにおける、代表的な工程を示す模式的なフローチャートである。個別のオリゴヌクレオチド  ５０１をアニーリングさせ、１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）のような配列モチーフ  ５０２にし、これを次にＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ制限部位を含むオリゴ  ５０３とライゲーションする。モチーフライブラリーは、例えば、表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、又はＡＱ配列のような、特定の配列のＸＴＥＮファミリーに限定することができる。この例においては、ＡＥファミリーモチーフをモチーフライブラリーとして用いることができ、これを「ビルディングブロック」の長さにするために、例えば３６アミノ酸をコードするセグメントにするために、１２−ｍｅｒとアニーリングさせる。ＸＴＥＮ配列をコードしている遺伝子を、所望される長さのＸＴＥＮ遺伝子  ５０４になるまで、ライゲーションと「ビルディングブロック」の多量体化により組み合わせることができる。図５に示すように、この例におけるＸＴＥＮの長さは４８アミノ酸残基であるが、この方法により、より長い長さにすることもできる。例えば、多量体化は、ライゲーション、オーバーラップエクステンション、ＰＣＲアセンブリ−、又は当該分野において既知の同様のクローニング技術を用いて行うことができる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングすることができる。図５に示したこの例においては、ベクターは、Ｆｌａｇ配列  ５０６とそれに続く、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位に隣接したｓｔｕｆｆｅｒ配列  ５０７及びＧＨ遺伝子（例えば、ｈＧＨ）  ５０８をコードすることができ、結果としてＧＨＸＴＥＮ  ５００をコードしている遺伝子となり、これはこの例においては、Ｎ末端側からＣ末端側方向への配置がＸＴＥＮ−ｈＧＨである融合タンパク質をコードする。
【０３１９】
ＧＨをコードしているＤＮＡ配列は、適切な細胞源から調製したｃＤＮＡライブラリーから、若しくはゲノムライブラリーから当該分野において既知の標準的な方法を用いて簡便に得ることができ、又は公的に使用可能なデータベース、特許若しくは参考文献から得られたＤＮＡ配列を用いて合成的に（例えば自動核酸合成で）作出することもできる。その後、タンパク質のＧＨ部分をコードしている遺伝子又はポリヌクレオチドを構築物中にクローニングすることができ、本明細書において記載した構築物のように、これらは、生物系において高レベルのタンパク質を発現するために適切な転写及び翻訳配列の制御下にある、プラスミド又はその他のベクターであってもよい。ＸＴＥＮ部分をコードしている二番目の遺伝子又はポリヌクレオチド（図５の例においてはＡＥを含む４８アミノ酸残基として示される）を、ライゲーション又は多量体化工程を介して構築物中のｈＧＨをコードしている遺伝子に隣接して及びインフレームでクローニングすることにより、ｈＧＨ遺伝子のＮ末端をコードしているヌクレオチドに遺伝的に融合させることができる。この方法では、ＸＴＥＮ−ｈＧＨＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしているキメラＤＮＡ分子（又はその相補鎖）が構築物中に生成されるだろう。任意に、第二のＸＴＥＮコードしている遺伝子を挿入し、そしてＸＴＥＮ−ｈＧＨ遺伝子のＣ末端をコードしているヌクレオチドにインフレームでライゲーションすることができ、その結果ＸＴＥＮ−ｈＧＨ−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードしている構築物が得られるだろう。単量体ポリペプチドとして、融合パートナーの様々な置換をコードするように、構築物を異なる配置になるように設計することができる。例えば、Ｎ末端側からＣ末端側への配置が、ｈＧＨ−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−ｈＧＨ；ｈＧＨ−ＸＴＥＮ−ｈＧＨ；ＸＴＥＮ−ｈＧＨ−ＸＴＥＮ；並びに前述したものの多量体である融合タンパク質をコードする遺伝子を作出することができる。任意に、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである、別の構築物中に導入又はクローニングしてもよい。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現することができる宿主細胞を、キメラＤＮＡ分子を用いて形質転換するだろう。目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを、細胞宿主の型に依存する周知の方法により、前述したように、適切な宿主細胞に導入することができる。
【０３２０】
ＸＴＥＮ−ＧＨ発現ベクターを含む宿主細胞を、プロモーターを適切に活性化するために改変した、標準的な栄養培地中で培養するだろう。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現させるために選択した宿主細胞の使用について既に知られている条件であり、当業者には明かであろう。融合タンパク質を発現させた後に、細胞を遠心分離により回収し、物理的又は化学的な手段を用いて破砕し、そして、以下に記載したように融合タンパク質を精製するため、得られた粗抽出物をさらに用いるだろう。宿主細胞から分泌されるＧＨＸＴＥＮ組成物の場合は、遠心分離で得られた上清を分離し、さらなる精製にかけるだろう。
【０３２１】
試料中の遺伝子発現を、例えば、標準的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロット［Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロット（ＤＮＡ解析）、又は本明細書において示した配列に基づく、適切に標識したプローブを使用したｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、直接測定するだろう。あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するために、細胞の免疫組織学的染色のような、蛍光を用いた免疫学的な手法によって遺伝子発現を測定するだろう。免疫組織学的染色及び／又は体液試料に有用な抗体は、モノクローナルであっても又はポリクローナルであってもよく、そして任意の動物を用いて調製することができる。簡便に、本明細書において提供した配列に基づく合成ペプチドを用いてｈＧＨポリペプチド配列に対する抗体を調製してもよく、又はｈＧＨに融合させた外生の配列であって、かつ、特異的な抗体エピトープをコードしている配列に対する抗体を調製してもよい。選択マーカーの例は当業者には周知であり、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが含まれる。
【０３２２】
ＸＴＥＮ−ｈＧＨポリペプチド産物を当該分野において既知の方法を介して精製するだろう。ゲルろ過、アフィニティ精製、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの方法は全て、精製工程において使用することができる。精製の特定の方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．  Ｃａｓｔｏｒ  （ｅｄ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４，及びＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，前記、に記載されている。複数工程の分離についてはまた、Ｂａｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１７９−９０  （１９９０）及び  Ｂｅｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．  ６７９：６７−８３  （１９９４）に記載されている。
【０３２３】
図６に示したように、次に、単離したＸＴＥＮ−ｈＧＨ融合タンパク質をそれらの化学的及び活性の特性についての特徴付けを行うだろう。単離した融合タンパク質を、例えば、配列、純度、見かけの分子量、溶解度及び安定性について、当該分野において既知の標準的な方法を用いて解析するだろう。期待される基準を満たしている融合タンパク質を次に、活性について評価するだろう。活性は、インビトロ又はインビボで、本明細書に記載した成長ホルモンに関連した指標を測定することにより、本明細書で開示した１つ以上のアッセイを用いて、又は実施例若しくは表３４のアッセイを用いて、測定することができる。
【０３２４】
加えて、実施例３０〜３２に記載したように、標準的な薬物動態学的指標を決定するために、ＸＴＥＮ−ｈＧＨ融合タンパク質を１種以上の動物種に投与するだろう。
【０３２５】
ＸＴＥＮ−ｈＧＨ構築物の作出、発現及び回収、並びにその後、本明細書に開示した方法又は当該分野において既知のその他方法によりそれらの特徴を解析することを繰り返すことにより、当業者はｈＧＨ及びＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮ組成物を生産することができ、そして高い溶解度、高い安定性、薬物動態の改善及び免疫原性の低下のような、融合していない対応するｈと比較して全体的に向上した治療用活性を生じる期待される特性を確認するために、評価を行うことができる。求められる特性をもたないそれらの融合タンパク質については、異なる配列を構築し、発現させ、単離し、そしてそれらの特性を有する組成物を得るためにこれらの方法により評価することができる。
【０３２６】
実施例１９：Ｋ及びＹＸＴＥＮ配列に結合したｈＧＨの遺伝子及びベクターの構築
ＫシリーズのＧＨＸＴＥＮ構築物
【０３２７】
Ｎ末端にセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、その後ろにＴｏｍａｔｏＥｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位、その後にｈＧＨコード配列、及びその後にＫ２８８コード配列：ＣＢＤ−Ｋ２８８−ｈＧＨを含むタンパク質を発現する、ｐＥＴ−シリーズのベクターをＴ７プロモーターを用いて構築した。Ｋ２８８は反復配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２を有する。使用したＣＢＤ配列は、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔファイルＱ０６８５１で示され、ＣＢＤ融合タンパク質の精製についてはＯｆｉｒ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：１８０６に記載されている。ＴＥＶ開裂部位の配列はＥＮＬＹＦＱ／Ｘであり；Ｘの位置にはＧを用いた。この構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ大腸菌株中に形質転換し、そして発現を促進する条件化で生育させた。Ｃ細胞を回収し、破砕した。細胞上清をセルロースビーズ樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ  １００）にアプライし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして２０ｍＭ  ＮａＯＨでカラムから溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ＝８．０を用いて試料を滴定することにより、ｐＨを調製した。タンパク質の純度は９０％を超えると予測した。溶出したタンパク質を精製したＴＥＶプロテアーゼを用いて４℃で一晩消化し、消化した試料をセルロースビーズ樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ  １００）にアプライした。ＣＢＤはカラムに保持され、Ｋ２８８−ｈＧＨはフロースルー中に認められた。集めたフロースルーを陰イオン交換（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０）で溶出し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含む同じ緩衝液のシャローな（ｓｈａｌｌｏｗ）直線勾配を用いてカラムから溶出した。溶出した融合タンパク質を集め、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終的な精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。タンパク質の純度は９８％を超えると予測した。最終的なタンパク質はＫ２８８−ｈＧＨである。精製過程における試料のＳＤＳＰＡＧＥ解析を図２０に示した。
【０３２８】
ＹシリーズのＧＨＸＴＥＮ構築物
ＸＴＥＮデスティネーションベクター中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと末端が一致している）を導入した、ｈＧＨをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮプラスミドはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）−ＸＴＥＮ−Ｓｔｕｆｆｅｒの形態をもつ、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ３０の派生物であり、ここでＳｔｕｆｆｅｒは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、ＸＴＥＮは３６〜５７６又はそれを超える任意の長さであってよい。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮ中のｓｔｕｆｆｅｒ配列をｈＧＨをコードしている断片（図７Ｂ）と置換することにより、構築物を生成した。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮの特徴としては、ＣＢＤの上流のＴ７プロモーター、及びその後の、ｓｔｕｆｆｅｒ配列の上流にインフレームで融合したＸＴＥＮ配列がある。用いたＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿Ｙファミリーに属し、かつ、３６、７２、１４４、２８８、及び５７６アミノ酸を含む長さの配列をコードする。ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、ｓｔｕｆｆｅｒ断片を除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限消化したｈＧＨ  ＤＮＡ断片と開裂させたｐＣＢＤ−ＸＴＥＮベクターとをライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションで導入した。ＤＮＡミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下にあるＣＢＤ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ遺伝子である。得られたＤＮＡ配列は、３６、７２、１４４、及び２８８アミノ酸それぞれの長さのＸＴＥＮに結合したＧＨをコードするものであった。
【０３２９】
実施例２０：ＡＥ及びＡＭＸＴＥＮ配列を用いた、ｈＧＨ−ＸＴＥＮ遺伝子及びベクターの構築
ＸＴＥＮデスティネーションベクター中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＮｄｅＩ及びＢｂｓＩ制限部位（ＮｄｅＩ及びＢｓａＩと末端が一致している）を導入した、ｈＧＨをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＴｈｅｐＸＴＥＮプラスミドはＳｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮの形態をもつ、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ３０の派生物であり、ここでＳｔｕｆｆｅｒは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はＣＢＤのいずれかであってもよく、かつ、ＸＴＥＮは３６〜１３１８アミノ酸又はそれを超える任意の長さであってよい（図７）。ｐＸＴＥＮ中のｓｔｕｆｆｅｒ配列をｈＧＨをコードしている断片と置換することにより、構築物を生成した。ｐＸＴＥＮの特徴としては、ｓｔｕｆｆｅｒ配列の上流のＴ７プロモーター、及びｓｔｕｆｆｅｒ配列の下流にインフレームで融合したＸＴＥＮ配列がある。用いたＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮのＡＥ又はＡＭファミリーに属し、かつ、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５及び１３１８アミノ酸を含む長さの配列をコードするコードする。ＮｄｅＩ及びＢｓａＩエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、ｓｔｕｆｆｅｒ断片を除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限消化したｈＧＨ  ＤＮＡ断片と開裂させたｐＸＴＥＮベクターとをライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションで導入した。ＤＮＡミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下にあるｈＧＨ−ＸＴＥＮ遺伝子であり、ｈＧＨをＮ末端に有する融合タンパク質を発現させるために使用されるだろう。
【０３３０】
実施例２１：ＡＥ及びＡＭＸＴＥＮ配列を用いた、ＸＴＥＮ−ｈＧＨ及びＸＴＥＮ−ｈＧＨ遺伝子及びベクターの構築
ＸＴＥＮデスティネーションベクター中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと末端が一致している）を導入した、ｈＧＨをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮプラスミドはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）−ＸＴＥＮ−Ｓｔｕｆｆｅｒの形態をもつ、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ３０の派生物であり、ここでＳｔｕｆｆｅｒは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、ＸＴＥＮは３６〜１３１８又はそれを超える任意の長さであってよい（図７）。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮ中のｓｔｕｆｆｅｒ配列をｈＧＨをコードしている断片と置換することにより、構築物を生成した。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮの特徴としては、ＣＢＤの上流のＴ７プロモーター、及びその後の、ｓｔｕｆｆｅｒ配列の上流にインフレームで融合したＸＴＥＮ配列がある。用いたＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＥ及びＸＴＥＮ＿ＡＭファミリーに属し、かつ、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５及び１３１８アミノ酸を含む長さの配列をコードする。ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、ｓｔｕｆｆｅｒ断片を除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限消化したｈＧＨ  ＤＮＡ断片と開裂させたｐＣＢＤ−ＸＴＥＮベクターとをライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションで導入した。ＤＮＡミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下にあるＣＢＤ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ遺伝子であり、ｈＧＨをＣ末端に有する融合タンパク質を発現させるために使用されるだろう。
【０３３１】
実施例２２：ＸＴＥＮ−ＡＥ＿ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ−ＡＥ遺伝子及びベクターの構築
ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮデスティネーションベクター中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと末端が一致している）を導入した、ｈＧＨをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮ＿ＡＥプラスミドは４８アミノ酸のＮ末端ＸＴＥＮ発現配列−ＸＴＥＮ−Ｓｔｕｆｆｅｒの形態をもつ、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ３０の派生物であり、ここでＳｔｕｆｆｅｒは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、ＸＴＥＮは３６〜５７６又はそれを超える任意の長さであってよい。ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮ中のｓｔｕｆｆｅｒ配列をｈＧＨをコードしている断片と置換することにより、構築物を生成した。ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮの特徴としては、ＮＴＳの上流にあるＴ７プロモーターと、その後ろの、ｓｔｕｆｆｅｒ配列の上流にインフレームで融合したＸＴＥＮ配列がある。用いたＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＥファミリーに属し、かつ、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、及び１２９６アミノ酸を含む長さの配列をコードする。ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、ｓｔｕｆｆｅｒ断片を除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限消化したｈＧＨ  ＤＮＡ断片と開裂させたｐＮＴＳ−ＸＴＥＮベクターとをライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションで導入した。いくつかの例においては、１４４又は２８８アミノ酸の第二のＸＴＥＮ＿ＡＥ配列をｈＧＨコードしている遺伝子のＣ末端にライゲーションさせた。この工程は図８に示す。ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮデスティネーションベクター中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと末端が一致し、ＨｉｎｄＩＩＩの上流にさらにＢｂｓＩ部位を含む）を導入した、ｈＧＨをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。制限酵素消化、ライゲーション及び形質転換の後に得られた中間体プラスミドは、ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮ−ｈＧＨの形態を有し、ｈＧＨのＣ末端にＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する。中間体プラスミドをさらにＢｂｓＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸＴＥＮ−ｈＧＨ遺伝子のＣ末端にＡＥ１４４又はＡＥ２８８をコードしている配列を配置するように、ＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩに隣接した１４４又は２８８アミノ酸の第二のＸＴＥＮ＿ＡＥ配列とライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ中に形質転換した。ＤＮＡミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。上述した最終的なベクターの配置はＮＴＳ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ又はＮＴＳ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ＿ＸＴＥＮのいずれかであり、図７Ｃ及び７Ｄに示したようにＴ７プロモーターの制御下にある。
【０３３２】
実施例２３：ＧＨＸＴＥＮ＿ＡＥ構築物の精製
【０３３３】
タンパク質発現
上述したプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｇｏｌｄ大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換し、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天培地上にプレーティングし、そして３７℃で一晩生育させた。単一のコロニーを５ｍｌのＴＢ１２５培地中に播種し、３７℃で一晩生育させた。翌日、播種した材料を５００ｍｌのＴＢ１２５を入れ２Ｌのベッセル中に移し、そしてＯＤ＝０．６になるまで生育させ、その後０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて２６℃で１６時間生育させた。
【０３３４】
遠心分離によって細胞を回収し、細胞沈殿物を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。ＡＰＶ−２０００ホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。宿主細胞からのタンパク質混入物を沈殿させるために、次に溶解物のｐＨを酢酸を用いてｐＨ４．５に調製し、その後遠心分離によって除去した。酸処理をし、混入物を除いた溶解物を次にＤＥ５２陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにアプライし、ＮａＣｌで溶出した。溶出された画分をその後さらにｐＨ４．２まで酸性化し、ＭａｃｒｏＣａｐＳＰ陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにアプライした。ＮａＣｌで連続的に溶出することにより、産物を溶出した。産物に関わる凝集体及び残存する宿主細胞からの不純物（例えばエンドトキシン、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質）を除くために、クロマトグラフィー工程をＭａｃｒｏｃａｐ  Ｑを用いてさらに行った。
【０３３５】
タンパク質の純度は９８％を超えるものと予測した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行うことにより、及び全タンパク質濃度を測定することにより、溶出した融合タンパク質の量を決定した。多量のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質が溶出されたことは、ＸＴＥＮに結合していない対応するｈＧＨと比較して、融合タンパク質の溶解性の度合いが高いこと（例えば、Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ９９：  ３０３；Ｐａｔｒａ，  Ａ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，  １８：  １８２を参照のこと）、並びに宿主細胞からのタンパク質を沈殿させる酸性化条件においても可溶性を保持する能力を有することを反映するものである。．
【０３３６】
最終的な製剤及び保管
次に、タンパク質を交換した緩衝液を、１０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｃｅｌｌ  １００遠心限外ろ過を用いて１５ｍｇ／ｍｌ未満にならないように濃縮した。濃縮したものを０．２２μｍのシリンジフィルターをもちいて滅菌した。最終的な溶液を小分けにし、−８０℃で保存した。
【０３３７】
実施例２４：ＧＨＸＴＥＮ構築物の特徴解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
Ｙ５７６に結合したＧＨ（Ｙ５７６のＮ末端又はＣ末端のいずれかに）の、最終的に精製したＧＨＸＴＥＮタンパク質５μｇを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いた、製造業者による仕様書に従って行った、非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果のゲルを図２０に示す。
【０３３８】
分析サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００  ＳＷＸＬ（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー解析を行った。濃度１ｍｇ／ｍｌの精製したタンパク質２０μｇを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、流速０．６ｍｌ／分で分離した。クロマトグラムプロファイルは、ＯＤ２１４ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍでモニターした。カラムの校正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）は、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、トリオボアルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロブリン（１７ｋＤａ）及びビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含むマーカーである、ＢｉｏＲａｄのサイズ排除較正基準を用いて行った。生成したＹ５７６−ＧＨのクロマトグラフィープロファイルは、同じアッセイで泳動した基準となるタンパク質との比較することにより、それぞれの構築物の見かけの分子量が球状タンパク質の予測される分子量よりも有意に大きいことを示す（データは示さない）。
【０３３９】
分析ＲＰ−ＨＰＬＣ
Ｃ４（７．８ｍｍｘ２０ｃｍ）カラムを用いて、分析ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー解析を行った。流速１ｍｌ／分の移動相中で、０．１％ＴＦＡを加えた１００％アセトニトリルを用いてカラムを平衡化した。変性させた及び変性させていない、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度の精製したタンパク質２０μｇを別々にインジェクションした。０．１％ＴＦＡを含むＨＰＬＣグレードのＨ２０を含む緩衝液を１５分以内に５％〜６０％にする直線勾配により、タンパク質を分離及び溶出した。クロマトグラムプロファイルはＯＤ２１４ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍでモニターした。天然の及び変性させたＹ５７６−ＧＨのクロマトグラフィープロファイルを重ねて図２１に示す。
【０３４０】
実施例２５：ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイ
ＧＨと結合したＸＴＥＮ融合体の、ＧＨ受容体への結合能力を評価するために、それらを標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて試験した。アッセイは、組換えｈＧＨ受容体（ｈＧＨＲ−Ｆｃ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした、サンドイッチＥＬＩＳＡの形式によって実施した。その後ウェルをブロッキングし、洗浄し、そしてＧＨＸＴＥＮを捕捉するために、様々な倍率に希釈したＧＨＸＴＥＮ試料をウェル中でインキュベートする。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル又はモノクローナル抗ＧＨ又は抗ＸＴＥＮ抗体及びストレプトアビジンＨＲＰを用いて、結合したタンパク質を検出した。各血清希釈の比色反応を、結合させていないＧＨの検量線と比較することにより、結合したタンパク質の割合を算出することができる。図１５に示す、Ｋ２８８に結合したｈＧＨと組換えｈＧＨとを比較した最初のアッセイの結果は、ＧＨＸＴＥＮがｈＧＨ受容体に結合する能力を示す。第二のアッセイにおいては、ＡＭ８６４−ｈＧＨ及びｈＧＨ−ＡＭ８６４の配置をとる２種類のＧＨＸＴＥＮを組換えｈＧＨと比較した。図１６に示した結果は、天然のｈＧＨのＥＣ５０値が０．０７０１ｎＭであり、ＡＭ８６４−ｈＧＨでは０．３９０５、及びｈＧＨ−ＡＭ８６４では２．７３３であることをはっきりと示す。第三のアッセイにおいては、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のｈＧＨ構成要素にＣ末端ＸＴＥＮを付加することが、結合親和性を低下させる能力を有することを示すために、組換えｈＧＨをＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４と比較した。結果（図１８）は、結合親和性がｈＧＨと比較しておよそ１７倍低下することを示す。
【０３４１】
実施例２６：ｈＧＨ及びＧＨＸＴＥＮの安定性に及ぼす熱処理の効果
結合した治療用分子に構造的な安定性を付与する、ＸＴＥＮの能力について調査した。ｈＧＨ及びＡＭ８６４−ｈＧＨの試料を２５℃及び８０℃でインキュベートし、その後ゲル電気泳動及びクマシー染色で解析した。図１７は、２５℃及び８０℃で１５分間処理した２種類の調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、図１７Ｂは２５℃で処理した試料に対する８０℃で処理した試料の受容体結合活性の、対応するパーセンテージを示すものである。結果は、ｈＧＨはこの処理条件下で変性するが、ＧＨＸＴＥＮ構築物はこの実験条件下では、およそ８０％の受容体結合活性を保持する、高い安定性を維持することを示す。
【０３４２】
まとめ：ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素は、ＸＴＥＮに結合していないｈＧＨと比較して、向上した溶解度及び安定性特性を融合タンパク質に付与する。
【０３４３】
実施例２７：ＩＧ−１分泌におけるｈＧＨ及びＡＭ８６４−ｈＧＨの比較効果
投与した化合物に対する血中ＩＧＦ−１の反応を測定指標として用い、ＧＨＸＴＥＮの薬理学的効力を保持する能力を評価した。図２４は、カニクイザル（ｎ＝４／群）の血中ＩＧＦ−１レベルに及ぼす、ｈＧＨ（０．０７１ｍｇ／ｋｇ／日）の毎日の投与又はＡＭ８６４−ｈＧＨ（５ｍｇ／ｋｇ；１．１ｍｇ／ｋｇと等価）の単回投与の効果を示し、基準に対する変化（パーセンテージ）として図示する。結果は、実験開始時の１回のみの投与にもかかわらず、ＧＨＸＴＥＮ構築物により活性が向上したことを示す。
【０３４４】
実施例２８：体重増加に及ぼすｈＧＨ及びＡＭ８６４−ｈＧＨの比較効果
投与した化合物に対する低酸素ラットの体重増加を測定指標として用い、ＧＨＸＴＥＮの、薬理学的効力を保持する能力を評価した。図２５は、示した用量及び投与頻度で投与したｈＧＨ又はＡＭ８６４−ｈＧＨの低酸素ラットの体重に及ぼす効果を示す。結果は、ＧＨＸＴＥＮ構築物はより低頻度での投与でも、ｈＧＨと同等の用量と等価の効力である生物学的な活性を維持することを示す。ＡＭ８６４−ｈＧＨの投与量を増加させると体重の増加を生じることは、ｈＧＨと比較して、これらの条件におけるＧＨＸＴＥＮの薬物動態特性の向上を示している。
【０３４５】
実施例２９：軟骨に及ぼすｈＧＨ及びＡＭ８６４−ｈＧＨの比較効果
低酸素ラットの脛骨骨端板の増加を測定指標として用い、ＧＨＸＴＥＮの薬理学的効力を保持する能力を評価した。図２６は、処理９日後のラット脛骨の組織学的な横断切片において見られた、偽薬、ｈＧＨ、及びＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の比較効果を示すものであり、脛骨の端を点線で示した。群は図２６において示したものと同じである。図２６Ａは、処理９日後の偽薬群の横断切片の幅の平均が３４４±３８．６μｍであったことを示す。図２６Ｂは、９日後のｈＧＨ（１日当たり１０μｇ）群の横断切片の幅の平均が５９８±８．５μｍであったことを示す。図２６Ｃは、９日後のＡＭ８６４−ｈＧＨ（１５ｍｇ／ｋｇ、ｑ３ｄ）群の横断切片の幅の平均が９４４±８．５μｍであったことを示す。結果は、より低頻度での投与間隔にもかかわらず、ｈＧＨと比較して、ＧＨＸＴＥＮ構築物により活性が向上したことを示す。
【０３４６】
実施例３０：ＧＨＸＴＥＮタンパク質融合体のＰＫ解析
インビボでの薬物動態学的指標を決定するために、ＧＨ−Ｙ５７６及びＹ５７６ｈ−ＧＨ（この例では、Ｎ末端側からＣ末端側へのＧＨ及びＸＴＥＮの順序を表している）をカニクイザルに注入した。水性の緩衝液中に組成物を調製し、個別の動物に静脈経路を介して、０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。投与後、様々な時点で血清試料を採取し、アクセサリータンパク質の血清濃度を解析した。解析は、サンドイッチＥＬＩＳＡの形式において実施した。ウサギポリクローナル抗ＸＴＥＮ（Ｙ型ＸＴＥＮに対する）抗体でＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングした。次に、コーティングした抗体が化合物を捕捉することができるように、様々な倍率に希釈した血清試料をウェル中でインキュベートした。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル抗ＸＴＥＮ抗体及びストレプトアビジンＨＲＰを用いて結合したタンパク質を検出した。それぞれの希釈倍率の試料の比色反応を検量線と比較することにより、各時点での血清タンパク質濃度を算出した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを用いて薬物動態学的指標を算出した。
【０３４７】
図２２は、カニクイザルに静脈内投与した後の２種類のＧＨ構築物の濃度プロファイルを示す。ＩＶ投与後のｈＧＨ−Ｙ５７６の半減期は７時間、Ｙ５７６−ｈＧＨの半減期は１０．５時間と算出された。参考までに、文献中によく記載されている、成人のヒトにおける改変していないＧＨの出版されている半減期は、１０〜１５分である（例えば、Ｈｉｎｄｍａｒｃｈ、Ｐ．Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００８）３０（４）：４４３−４５０を参照のこと）。結果は、ＸＴＥＮに対するｈＧＨの位置（Ｎ末端体Ｃ末端）は融合タンパク質のクリアランスには影響を及ぼさなかったこと、及び、Ｙ５７６の付加が融合タンパク質の終末相半減期を大きく延長させたことを示す。
【０３４８】
カニクイザルにおける別の薬物動態学的研究を、ＡＭ８６４−ｈＧＨ構築物を用いて行った。図２３は、カニクイザルの皮下に５ｍｇ／ｋｇで単回投与した後のＡＭ８６４−ｈＧＨの薬物動態学的プロファイルを示す。算出した同等のｈＧＨ濃度を破線で示す。
【０３４９】
まとめ：ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素はこれらの条件においては、ＸＴＥＮに結合していないｈＧＨと比較して、向上した薬物動態学的特性を融合タンパク質に付与する。
【０３５０】
実施例３１：ラットを用いたｈＧＨＸＴＥＮ融合ポリペプチドのＰＫ解析
ｈＧＨＸＴＥＮポリペプチドのインビボでの薬物動態学的指標を決定するために、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質ＡＥ９１２−ｈＧＨ、ＡＭ８６４−ｈＧＨ（本実施例及び以下の実施例においてはＡＭ８７５−ｈＧＨと同義である）、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４及びＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ２８８をラットを用いて評価した。全ての組成物を水性の緩衝液中に調製し、皮下経路（ＳＣ）を介して１．５ｍｇ／ｋｇの組成物を、個別の動物に単回投与した。投与後、様々な時点で血漿試料を採取し、被験物質の濃度について解析を行った。解析はサンドイッチＥＬＩＳＡの形式において実施した。組換えｈＧＨＲ−Ｆｃを用いてＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、その後コーティングした抗体が化合物を捕捉することができるように、様々な倍率で希釈した血漿試料をウェル中でインキュベートした。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル抗ｈＧＨ抗体及びストレプトアビジンＨＲＰを用いて、結合したタンパク質を検出した。それぞれの希釈倍率の試料の比色反応を検量線と比較することにより、各時点での被験物質の濃度を算出した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを用いて薬物動態学的指標を算出した。
【０３５１】
図２７は、皮下の投与後の４種類のｈＧＨＸＴＥＮ構築物の濃度プロファイルを示す。算出された終末相半減期は、ＡＥ９１２−ｈＧＨが７．５時間、ＡＭ８６４−ｈＧＨ（ＡＭ８７５−ｈＧＨと同義）が６．８時間、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４が１２．４時間及びＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ２８８が１３．１時間であった。比較のために、同じ実験において改変していないｈＧＨについても並行して解析したが、これは非常により短い血漿半減期を示した。
【０３５２】
まとめ：齧歯類モデルを用いてこれら条件下で示したように、ｈＧＨを含む融合タンパク質中に異なるＸＴＥＮ配列を組み込むと、改変していないｈＧＨと比較して、４つ全ての組成物の薬物動態学的指標が有意に向上する。第二のＸＴＥＮタンパク質をＡＥ−ｈＧＨ構築物のＣ末端に付加すると、単一のＸＴＥＮを有する構築物と比較して終末相半減期がさらに延長され、これは受容体介在性クリアランスによるものだと考えられる。
【０３５３】
実施例３２：カニクイザルを用いたｈＧＨＸＴＥＮ融合ポリペプチドのＰＫ解析
ｈＧＨＸＴＥＮポリペプチドのインビボでの薬物動態学的指標に及ぼす第二のＸＴＥＮを組み込むことの影響を決定するために、１つ又は２つのＸＴＥＮ分子を含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（ＡＥ９１２−ｈＧＨ、ＡＭ８６４−ｈＧＨ、及びＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４）についての評価をカニクイザルを用いて行った。全ての組成物を水性の緩衝液中に調製し、皮下経路（ＳＣ）を介して１．５ｍｇ／ｋｇの組成物を、個別の動物に単回投与した。投与後、様々な時点で血漿試料を採取し、被験物質の濃度について解析を行った。解析はサンドイッチＥＬＩＳＡの形式において実施した。組換えｈＧＨＲ−Ｆｃを用いてＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、その後コーティングした抗体が化合物を捕捉することができるように、様々な倍率で希釈した血漿試料をウェル中でインキュベートした。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル抗ｈＧＨ抗体及びストレプトアビジンＨＲＰを用いて、結合したタンパク質を検出した。それぞれの希釈倍率の試料の比色反応を検量線と比較することにより、各時点での被験物質の濃度を算出した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを用いて薬物動態学的指標を算出した。図２８は、皮下投与後、３３６時間にわたる３種類のｈＧＨＸＴＥＮ構築物の濃度プロファイルを示す。融合タンパク質の平均終末相半減期は、ＡＭ８６４−ｈＧＨが３３時間、ＡＥ９１２−ｈＧＨが４４時間、及びＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４（ｈＧＨのＮ及びＣ末端に結合した２つのＸＴＥＮを含む）が１１０時間であった．
【０３５４】
まとめ：サルモデルを用いてこれら条件下で示したように、ｈＧＨを含む融合タンパク質中に異なるＸＴＥＮ配列を組み込むと、３つ全ての組成物の薬物動態学的指標が有意に向上した。ｈＧＨのＣ末端に結合した第二のＸＴＥＮを含む構築物の終末相半減期は、Ｎ末端に単一のＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮの終末相半減期と比較して、約２倍に延長された。
【０３５５】
実施例３３：カニクイザルにおけるＩＧＦ−１反応を測定することによる、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４ＧＨＸＴＥＮの薬力学的効果の評価
０．８０〜１．１３ｍｌの範囲の容量で、０．３、１．５、及び７．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４を、オス及びメスのカニクイザルに投与した。投与前、及び２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２１６、２６４、３３６、３８８、４３２、５０４時間後（１６）の血液試料（１．０ｍＬ）を、予め凍結させた、ヘパリン処理したチューブに採取し、血漿へと処理した。抗ＸＴＥＮ捕捉抗体及びビオチン化抗ｈＧＨ検出抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイにより、ＰＫを測定した。ＩＧＦ−１試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅに送付し、解析した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを用いて算出したＰＫ指標を、以下の表に示す。３種類の用量を投与した場合のＧＨＸＴＥＮ及びＩＧＦ−１レベルの血漿濃度プロファイルをそれぞれ、図２９及び図３０に示す（白丸＝０．３ｍｇ／ｋｇ；四角＝１．５ｍｇ／ｋｇ；三角＝７．５ｍｇ／ｋｇ）。結果は、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４を投与するとＩＧＦ−１のレベルが持続して増加することを示し、これは成長ホルモンの生物学的な作用機序及びＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の長い血漿半減期の両方と一致するものである。
【０３５６】
表２２：カニクイザルにおけるＰＫ指標
【表２２】
2015124222.tif 000067
【０３５７】
実施例３４：カニクイザルへの皮下及び筋内投与を介した、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の比較バイオアベイラビリティ
１．５ｍｇ／ｋｇのＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４を、静脈内、皮下、及び筋内経路を介してオス及びメスのカニクイザルに投与した。投与前、及び２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２１６、２６４、３３６、３８８、４３２、５０４時間後（１６）の血液試料（１．０ｍＬ）を、予め凍結させたヘパリン処理したチューブに採取し、その後血漿へと処理した。抗ＸＴＥＮ捕捉抗体及びビオチン化抗ｈＧＨ検出抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイにより、各時点における血漿レベルを測定した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを用いて算出したＰＫ及びバイオアベイラビリティ指標を以下の表に示す。血漿濃度プロファイルを図３１に示す（白丸＝皮下；三角＝ＩＶ；四角＝筋内）。バイオアベイラビリティの算出は、静脈内投与のＡＵＣを１００％と定義して行った。結果は、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４が高いバイオアベイラビリティを示し、かつ、注入後に注入部位から速やかに血管要素へと分散することを示す。
【０３５８】
表２３：カニクイザルにおけるＰＫ指標
【表２３】
2015124222.tif 000068
【０３５９】
実施例３５：ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の治療ウインドウの決定
低酸素ラットの、化合物の投与に反応した体重増加の測定指標を用いて、ＧＨＸＴＥＮ
ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の特異的活性を評価した。図３２は、低酸素ラットの体重に及ぼす、媒体（白丸）、５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日用量で投与した組換えｈＧＨ（白丸）、様々な用量及び様々な投与頻度で投与したＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４（黒三角＝０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日；白三角＝１．５ｎｍｏｌ／日；四角＝３ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）の効果を示す。結果は、１．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ほどの低用量でのＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の投与で、ｈＧＨの単独投与と同等の成長が生じることを示す。しかしながら、より低用量、０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の投与はこれら動物の成長を促進しない。ラットにおいて決定した薬物動態学的プロファイルに基づき、反復投与後の血漿レベルのモデルを、図３３に示すように構築した（符号は図３２と同じ）。このモデルは、より低い用量の非有効量と有効量を明確に区別するものである。結果は、低酸素ラットモデルにおける最適な成長を維持するためにには、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の血漿濃度は通常、約１ｎｍｏｌ／Ｌの濃度よりも高くなければならないことを示す。
【０３６０】
実施例３６：ＧＨＸＴＥＮを評価するためのヒトにおける臨床試験のデザイン
対応する成長ホルモン生物製剤と比較して、ＧＨＸＴＥＮ組成物の効力及び利点をヒトにおいて検証できるように、臨床試験をデザインすることができる。例えば、上記実施例において記載したような成長を含むＧＨＸＴＥＮ融合構築物を、組成物の効力を特徴付けるための臨床試験において使用することができる。試験は、成長ホルモンの投与により、改善される、回復する、又は抑制される、１つ以上の成長ホルモン関連疾患、障害、又は状態において実施することができる。成人患者におけるそのような研究には、３相が含まれる。第一に、最大耐量及びヒト（正常対象、又は成長疾患若しくは状態を呈する患者のいずれか）における薬物動態学及び薬力学を決定し、そして今後の研究における指針となる、潜在的な毒性及び有害事象を定義するための、成人患者における第Ｉ相安全性及び薬物動態学的研究を実施する。この研究は、ＧＨＸＴＥＮの融合タンパク質の組成物を漸増単回投与により投与し、生化学、ＰＫ、及び臨床指標を測定することによって実施する。この研究により、最大耐量の決定、並びに、それぞれの化合物の治療ウインドウを構成する用量及び血中薬剤の、閾値及び最大濃度を決定することができる。その後、疾患、障害又は状態を呈する患者における、臨床試験を実施する。
【０３６１】
第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験
小児患者におけるＧＨ欠損による低身長の反転、ターナー症候群の治療、慢性腎不全、プラダー・ウィリー症候群、胎児の成長遅延、又は成人患者（ＨＩＶ＋又は後天性下垂体腫瘍患者など）におけるボディマス組成物の回復（除脂肪体重の増加、脂肪の減少）などの、血中の成長ホルモン薬力学及びその他の生理的、ＰＫ、安全性及び臨床指標（以下に列挙したような）が試験にとって適切な患者において、第ＩＩ相投与試験を実施する。投与した融合タンパク質組成物の機能としては、指標及び臨床エンドポイントを測定する。このことにより、有害事象に関連した安全性データの収集に加えて、次の第ＩＩＩ相試験における適切な用量範囲情報が得られる。ＰＫ指標は、ＧＨＸＴＥＮ組成物の治療ウインドウ及び治療用投与計画を確立するための、生理的、臨床的及び安全指標データと関連し、臨床医がＧＨＸＴＥＮ組成物の適切な用量範囲を確立することを可能にする。最後に、患者には投与計画に則ったＧＨＸＴＥＮ組成物、及びポジティブコントロール（市販されている、認可された成長ホルモンなど）を投与し、又は偽薬を毎日、若しくは対象組成物が薬物動態学的及び薬力学的特性を示すのに適当だとみなされるその他の投与計画に則って偽薬を投与する第ＩＩＩ相効力試験を実施する。ここでは全ての薬剤は研究のエンドポイントに達するまでの適切な長さの期間にわたって投与される。モニターする指標には、ＧＨ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ３濃度、身長成長速度の変化、除脂肪体重、総体脂肪、体幹脂肪、インスリン抵抗性症候群に関連する指標、軟骨細胞の分裂及び複製の測定、及び／又は骨密度及び／又は骨成長の変化；偽薬若しくはポジティブコントロール群がとるであろう指標が含まれる。効力アウトカムは標準的な統計分析を用いて決定されるだろう。記載した方法において使用する場合、この研究においては、この化合物が安全であることを確認するための毒性及び有害事象マーカーもまた追跡する。
【０３６２】
実施例３７：異なるペイロードを有するＸＴＥＮ融合タンパク質の分析サイズ排除クロマトグラフィー
様々な治療用タンパク質及び伸張した長さの非構造性組換えタンパク質を含む融合タンパク質について、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。ＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００  ＳＷＸＬ（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）カラムを用いた例示的なアッセイにおいて、１ｍｇ／ｍｌ濃度の精製したグルカゴン融合タンパク質４０μｇを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ  ＮａＣｌを用い、流速０．６ｍｌ／分で分離した。クロマトグラムプロファイルをＯＤ２１４ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍでモニターした。全てのアッセイにおいて、カラムの校正は、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、トリオボアルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロブリン（１７ｋＤａ）及びビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含むマーカーである、ＢｉｏＲａｄのサイズ排除校正基準を用いて行った。図３４に、グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴン−Ｙ１４４、グルカゴン−Ｙ７２、グルカゴン−Ｙ３６の代表的なクロマトグラフィープロファイルを重ねて示す。データは、各化合物の見かけの分子量は結合させたＸＴＥＮ配列の長さに比例することを示す。しかしながら、データはまた、各構築物の見かけの分子量が球状タンパク質の予測される分子量よりも有意に大きいことを示す（同じアッセイで解析した基準と成るタンパク質との比較により示すように）。ＧＨＸＴＥＮ組成物を含む、評価した全ての構築物のＳＥＣ分析に基づく、見かけの分子量、見かけの分子量因子（算出した分子量に対する見かけの分子量の比率として示す）及び流体力学半径（ＲＨ、単位ｎｍ）を表２４に示す。結果は、５７６アミノ酸又はそれより大きい異なるＸＴＥＮを組み込むと、融合タンパク質の見かけの分子量がおよそ３３９ｋＤａ〜７６０大きくなり、８６４アミノ酸又はそれより大きいＸＴＥＮはおよそ８００ｋＤＡの見かけの分子量を付与することを示す。見かけの分子量が実際の分子量に対して比例的に増加するという結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー、すなわちＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、及びＡＭ由来のＸＴＥＮを含むように作出した融合タンパク質と一致するものであり、その増加は少なくとも４倍であり、かつ比率は約１７倍ほど高かった。加えて、５７６又はそれ以上のアミノ酸のＸＴＥＮ融合パートナーを、様々なペイロード（グルカゴンをＹ２８８に融合させた場合にはさらに２８８残基）を含む融合タンパク質中に組み込むと、流体力学半径は７ｎｍ又はそれより大きくなり、これはおよそ３−５ｎｍである糸球体細孔径よりもかなり大きいものである。従って、成長及びＸＴＥＮを含む融合タンパク質の腎クリアランスが低減すると予測され、このことは、対応する融合していない生物学的ペイロードタンパク質と比較して、終末相半減期の増大及び治療用又は生物学的効果の向上に寄与する。
【０３６３】
表２４：様々なポリペプチドのＳＥＣ解析
【表２４】
2015124222.tif 000069
【０３６４】
実施例３８：ＧＦＰに融合させた伸張ポリペプチドの、カニクイザルにおける薬物動態
ＰＫ指標に及ぼす組成物及び非構造性ポリペプチドの長さの効果を決定するために、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６及びＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態学的をカニクイザルにおいて試験した。注入後、様々な時点で血液試料を解析し、捕捉抗体として抗ＧＦＰポリクローナル抗体及び検出抗体として同じポリクローナル抗体をビオチン化したものを用いたＥＬＩＳＡによって、血漿中のＧＦＰ濃度を測定した。結果を図３５にまとめた。それらは、ＸＴＥＮ配列の長さが長くなると、半減期が驚くほど長くなっていることを示す。例えば、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮが２８８アミノ酸残基である）の半減期は１０時間であると決定された。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを５７６アミノ酸へと倍にすることにより、複数の融合タンパク質構築物、すなわちＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６の半減期が２０〜２２時間へと増加した。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さをさらに８３６残基へと増加させると、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの半減期は７２〜７５時間になった。従って、ポリマーの長さを２８８から５７６残基へと２８８残基増加させることで、インビボでの半減期が約１０時間長くなった。しかしながら、ポリペプチドの長さを５７６残基から８３６残基へと２６０残基させることによっては、半減期は５０時間よりも長くなった。これらの結果は、非構造性ポリペプチドの長さが、比例的よりも高くインビボ半減期を長くする、驚くべき閾値を有することを示す。従って、伸張した、非構造性ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して向上した薬物動態学的特性を有すると予測される。
【０３６５】
実施例３９：ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合させたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含む融合タンパク質を、３７℃で最長７日間、サル血漿及びラット腎臓溶解物中でインキュベートした。試料を０時点、１日目及び７日目で採取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで解析し、その後ウエスタン解析で解析した。抗ＧＦＰ抗体を用いた検出を図１４に示す。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の配列は血漿中で７日間にわたりインキュベートしても、無視できるほどしか分解の徴候を示さなかった。しかしながら、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４はラット腎臓溶解物では３日間で速やかに分解された。ＧＦＰ＿ＡＥ８６４を免疫沈降し、上述したようにＳＤＳ  ＰＡＧＥで解析して、融合タンパク質のインビボでの安定性を試験した。注入後７日までに採取した試料は、ほとんど分解の徴候を示さなかった。結果は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態学的特性の向上における因子である、血清プロテアーゼによる分解に対してＧＨＸＴＥＮが抵抗性であることを示す。
【０３６６】
実施例４０：複数の種におけるＥｘ４−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＰＫ解析及び予測されるヒト半減期
ＸＴＥＮに融合させた治療用タンパク質の、ヒトにおける予測される薬物動態学的プロファイルを決定するために、ＡＥ８６４ＸＴＥＮに融合させたエキセンジン−４を、単一の融合ポリペプチドとして用いて研究を行った。０．５−１．０ｍｇ／ｋｇのＥｘ４−ＸＴＥＮ構築物を、４種の異なる動物種の皮下及び静脈内に投与した。投与後、一定の間隔で血清試料を採取し、標準的な方法を用いて血清濃度を決定した。各種での半減期を決定し、表２５に示した。この結果を、平均体重に対する終末相半減期、分布容積、及びクリアランス率の異種間物差し法（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ）を用いて、ヒトにおける半減期を予測するために用いた。図３６Ａは、動物種における測定した終末相半減期対体重のプロットを示す。エクセナチドの報告された半減期が２．４時間であるのに対し（Ｂｏｎｄ，  Ａ．  Ｐｒｏｃ  （Ｂａｙｌ  Ｕｎｉｖ  Ｍｅｄ  Ｃｅｎｔ）  １９（３）：  ２８１−２８４．  （２００６））、７５ｋｇのヒトにおけるＥｘ４−ＸＴＥＮ構築物の予測されるＴ１／２は１４０時間である。図３６Ｂは測定した薬剤クリアランス対体重を示し、これによって予測されるクリアランス率の値は、７５ｋｇのヒトで３０ｍｌ／時間である。図３６Ｃは、測定した分布容積対体重を示し、ここで予測される値は、７５ｋｇのヒトにおいて５９７０ｍｌである。
【０３６７】
まとめ：結果から、エキセンジン−４のような、グルコースを制御するペプチドにＸＴＥＮを付加することにより、ＸＴＥＮに結合していないペプチドと比較して、終末相半減期を大きく増大させることができると結論することができる。
【０３６８】
表２５：Ｅｘ４−ＸＴＥＮの半減期
【表２５】
2015124222.tif 000070
＊異種間物差し法に基づく予測値
【０３６９】
実施例４１：ＸＴＥＮに結合させることによる、ペプチドペイロードの溶解度及び安定性の向上
ＸＴＥＮの、溶解度及び安定性の物理的／化学的特性を向上させる能力を評価するために、グルカゴンとより短い長さのＸＴＥＮを含む融合タンパク質を調製し、評価した。ｐＨが中性のトリス緩衝食塩水中に被験物質を調製し、タンパク質が溶液中において均一で、かつ、凝集していないことを確認するために、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液の特徴を逆相ＨＰＬＣ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。データを表２６に示す。比較する目的で、同じ緩衝液中に調製した、改変していないグルカゴン６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の溶解限度を測定した。結果は、付加した全ての長さのＸＴＥＮについて、溶解度が十分に向上したことを示す。重要なことは、大部分の例において、グルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は目的の濃度になるように調製され、そして示した構築物の最大溶解限度を決定するために評価されたのではないということである。しかしながら、グルカゴンをＡＦ−１４４ＸＴＥＮに結合させた例においては溶解限度を決定し、その結果は、ＸＴＥＮに結合させていないグルカゴンと比較して、溶解度が６０倍に向上したというものであった。加えて、グルカゴン−ＡＦ１４４ＧＨＸＴＥＮの安定性を評価し、溶液製剤中でのグルカゴン−ＡＦ１４４ＧＨＸＴＥＮが、冷蔵条件では少なくとも６ヶ月間、３７℃ではおよそ１ヶ月間安定であることを見いだした（データは示さない）。
【０３７０】
まとめ：このデータは、グルカゴンのような生物学的に活性なタンパク質に短い長さのＸＴＥＮポリペプチドを結合させると、融合タンパク質を生じることにより、そのタンパク質の溶解特性が向上し、並びに、より高いタンパク質濃度での安定性を付与するというまとめを支持するものである。
【０３７１】
表２６：グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物の溶解度
【表２６】
2015124222.tif 000071
【０３７２】
実施例４２：ＸＴＥＮ融合タンパク質の二次構造の特性解析
円二色性分光法により、融合タンパク質Ｅｘ４−ＡＥ８６４の二次構造の度合いを評価した。ＣＤ分光法は、Ｊａｓｃｏ  Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラー（ＴＰＣ−３４８ＷＩ）を備えたＪａｓｃｏＪ−７１５（Ｊａｓｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）円二色性分散計を用いて行った。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、タンパク質の濃度を０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。ＨＥＬＬＭＡのクオーツセルを用い、光路長０．１ｃｍで実験を行った。５°、２５°、４５°、及び６５°ＣでのＣＤスペクトルを取得し、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＪ−７００  ｖｅｒｓｉｏｎ１．０８．０１（Ｂｕｉｌｄ  １）Ｊａｓｃｏソフトウェアを用いて処理した。ＣＤ測定を行う前に５分間、試料を各温度で平衡化した。３００ｎｍから１８５ｎｍの範囲のスペクトルを、スキャン速度１００ｎｍ／分、バンド幅１ｎｍで２秒毎に測定し、全てのスペクトルは２回ずつ記録した。図３７に示したＣＤスペクトルは、二次構造の安定性の証拠を示さず、かつ、非構造性ポリペプチドのスペクトルと一致する。
【０３７３】
実施例４３：予測アルゴリズムを用いた、配列の二次構造の解析
アミノ酸配列の二次構造は、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ、又は「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６）．  ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０−５５３）のような特定のコンピュータープログラム又はアルゴリズムを介して評価することができる。アルゴリズムは、指定した配列中に、例えばアルファ−ヘリックス若しくはベータシーを形成する配列残基の総数及び／又は割合として、又はランダムコイルを形成すると予測される配列残基の割合として表される、いくらかの二次構造が存在するか、又は二次構造がまったくないかどうかを予測することができる。
【０３７４】
ＸＴＥＮ「ファミリー」に由来する複数の代表的な配列を、これら配列中の二次構造の度合いを評価するために、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧＯＲ方法の２種類のアルゴリズムツールを用いて評価した。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ及びバージニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）により、インターネットサイト「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」において提供されたものであり、２００９年６月１９日時点でのワールドワイドウェブにおけるＵＲＬは  ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１  であった。ＧＯＲツールは、Ｐｏｌｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ  Ｌｙｏｎｎａｉｓにより、インターネットサイト「Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」で提供されたものであり、２００８年６月１９日時点でのワールドワイドウェブでのＵＲＬは  ．ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌ  であった。
【０３７５】
解析の第一工程として、単一のＸＴＥＮ配列を２種類のアルゴリズムにより解析した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡを含む、４種類の、１２アミノ酸配列モチーフの複数のコピーから作出した８６４アミノ酸残基のＸＴＥＮである。この配列モチーフは、モチーフ中の反復性が限られていること、及び１２アミノ酸モチーフのいずれにおいても、その配列全体にわたって、任意の２つの連続したアミノ酸が２回を超えて繰り返されないこと、並びに、完全長ＸＴＥＮ中の連続した３つのアミノ酸が同一ではないこと、によって特徴付けられる。ＡＦ８６４配列のＮ末端から順に、より長い長さの部分についてＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧＯＲアルゴリズムによって解析した（後者は、最低１７の長さのアミノ酸を必要とする）。ＦＡＳＴＡ形式の配列を予測ツールに登録し、解析することによって、配列の解析を行った。解析の結果を表２７に示す。
【０３７６】
結果は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎによる計算では、ＡＥファミリーの４種類のモチーフ（表１）は、アルファ−ヘリックス及びベータシートを含まないことを示す。２８８残基までの配列が同様に、アルファ−ヘリックス及びベータシートを含まないことが見いだされた。４３２残基の配列は、わずかに二次構造を有すると予測され、ここでは２アミノ酸のみがアルファーヘリックスを構成し、その全体における割合は０．５％である。完全長ＡＦ８６４ポリペプチドは、アルファーヘリックスを構成する同じ２つのアミノ酸を有し、その全体における割合は０．２％である。ランダムコイル形成についての計算により、長さが増加すると、ランダムコイル形成の割合も増加することが明らかになった。配列の最初の２４アミノ酸におけるランダムコイル形成の割合は９１％であり、これは長さの増加と共に、完全長配列の最大９９．７７％まで増加した。
【０３７７】
その他のモチーフファミリーに由来する、５００アミノ酸又はそれより長い数多くのＸＴＥＮ配列についてもまた解析し、大部分が９５％を超えるランダムコイル形成を有することが明らかとなった。例外は、３つの連続したセリン残基を１回以上含む配列であり、これはベータシート形成を生じると予測された。しかしながら、これら配列でさえも、それでもなお、およそ９９％のランダムコイル形成を有した。
【０３７８】
一方、アミノ酸がＡ、Ｓ、及びＰに限定された、８４残基のポリペプチド配列をＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより評価したところ、これは予測されるアルファーヘリックスを高い割合で含むことが予測された。「ＡＡ」及び「ＡＡＡ」配列の繰り返しを複数含む配列の、全体にわたるアルファ−ヘリックス構造の割合は６９％であると予測された。ＧＯＲアルゴリズムにより、ランダムコイル形成は７８．５７％であると予測された。これは、本実施例において解析した、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐアミノ酸を含む１２アミノ酸配列モチーフを含む、任意の配列における割合よりもずっと少ないものであった。
【０３７９】
まとめ：この解析は、：１）連続したアミノ酸に関しては限られた反復性を有する、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡを含む複数の配列モチーフから作出したＸＴＥＮは、ごく僅かな量のアルファーヘリックス及びベータシートを含むと予測される；２）ＸＴＥＮの長さを長くすることによっても、アルファーヘリックス又はベータシート形成の確立の増加ははっきりとは認められない；及び３）Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡアミノ酸を含む非反復性の１２−ｍｅｒを付加することによりＸＴＥＮ配列の長さを徐々に長くすると、ランダムコイル形成の割合の増加が生じる、という結論を支持する。一方、高い度合いの内部反復性を有する、Ａ、Ｓ及びＰに限定したアミノ酸から作出したポリペプチドは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムで決定したように、高い割合のアルファーヘリックス、並びにランダムコイル形成を有すると予測される。これら方法によって評価した多数の配列により、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡの配列モチーフから作出され、限られた反復性（いずれか１つのモチーフにおける、２つ以下の同一の連続したアミノ酸として定義される）を有し、長さが約４００アミノ酸残基より長いＸＴＥＮは、ごく限られた二次構造しかもたないと予測される。３つの連続したセリンを含むモチーフを除外すると、表１の配列モチーフの任意の順序又は組み合わせは、実質的に二次構造を含まないＸＴＥＮ配列を生じるであろう、約４００残基を超える長さのＸＴＥＮポリペプチドを作出するために用いることができると考えられる。そのような配列は、本明細書において開示した、本発明のＧＨＸＴＥＮ実施形態で記載した特徴を有すると予測される。
【０３８０】
表２７：ポリペプチド配列のＣＨＯＵ−ＦＡＳＭＡＮ及びＧＯＲ予測計算
【表２７−１】
2015124222.tif 000072
【表２７−２】
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【表２７−３】
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【表２７−４】
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【表２７−５】
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【表２７−６】
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【表２７−７】
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【表２７−８】
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【表２７−９】
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＊Ｈ：アルファーヘリックスＥ：ベータシート
【０３８１】
実施例４４：ポリペプチド配列の反復性の解析
ポリペプチド全体に見られるより短い部分列の回数を定量することにより、ポリペプチドアミノ酸配列の反復性を評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、オーバーラップしている１９２個の、９アミノ酸の部分列（又は９−ｍｅｒ「フレーム」）を含むが、ユニークな９−ｍｅｒ部分列の回数は、その配列中の反復性の量に依存するであろう。本解析においては、ポリマー部分の最初の２００アミノ酸配列中にあるユニークな３−ｍｅｒ部分列の絶対数で割った、その２００アミノ酸にわたって存在する、各３アミノ酸フレームについてのユニークな３−ｍｅｒ部分列の数を総和することにより、異なる配列の反復性を評価した。得られた部分列スコアは、そのポリペプチドの反復性の度合いを反映するものである。
【０３８２】
表２８に示した結果は、２又は３アミノ酸型の非構造性ポリペプチドは高い部分列スコアを有するが、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡの１２アミノ酸モチーフからなる、内部の反復性が低い非構造性ポリペプチドは、１０未満、いくつかの例においては５未満の部分列スコアを有することを示す。例えば、２つのアミノ酸型を有し、短く、かつ反復性の高い配列を有するＬ２８８配列の部分列スコアは５０．０である。３つのアミノ酸型を有するが、短く、かつ反復性の配列を有するポリペプチドＪ２８８の部分列スコアは３３．３である。Ｙ５７６もまた３つのアミノ酸型を有するが、内部の反復性は形成されておらず、このことは、最初の２００アミノ酸にわたる部分列スコアが１５．７であることに反映される。Ｗ５７６は４つのアミノ酸型を含むが、内部反復性の度合いが高く、例えば「ＧＧＳＧ」、２３．４の部分列スコアを生じる。ＡＤ５７６は４つの型の１２アミノ酸モチーフを含み、それぞれが４つの型のアミノ酸からなる。個々のモチーフの内部反復性の度合いが低いことから、最初の２００アミノ酸全体の部分列スコアは１３．６である。一方、それぞれにおける内部反復性の度合いが低い、６型のアミノ酸を含む４種類のモチーフからなるＸＴＥＮの部分列スコアはより低く、すなわち、ＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、及びＡＭ８７５（４．５）である。
【０３８３】
まとめ：結果は、それぞれが４〜６型のアミノ酸を含む、１２アミノ酸部分列モチーフの組み合わせは本質的に非反復性であり、より長いＸＴＥＮポリペプチドにしても、配列全体が非反復性となることを示す。このことは、配列全体にわたって、各部分列モチーフが複数回用いられることには関わらない。一方、実際の配列は、部分列スコアをより低くするため、反復性の度合いが低くなるように設計することができるが、より少数のアミノ酸型から作出されたポリマーの部分列スコアはより高くなる。
【０３８４】
表２８：ポリペプチド配列の部分列スコアの計算
【表２８−１】
2015124222.tif 000081
【表２８−２】
2015124222.tif 000082
【表２８−３】
2015124222.tif 000083
【表２８−４】
2015124222.tif 000084
【０３８５】
実施例４５：ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの算出
９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏによって記載されたように［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７：  ５５５］、ポケットポテンシャルを加算することにより算出することができる。本実施例においては、個々のＨＬＡアレルについて、別個のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出した。表２９は例として、コーカサス（白人）集団では高い頻度で生じる、ＨＬＡ＊０１０１Ｂのポケットポテンシャルを示す。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を含むペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出するために、対応する個々のポケットポテンシャルを表２９に加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧを有する９ｍｅｒペプチドであるＨＬＡ＊０１０１Ｂのスコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の総和となるだろう。
【０３８６】
配列中にある、全ての９ｍｅｒ部分列についての処理を繰り返すことで、長いペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価することができる。その他のＨＬＡアレルによってコードされたタンパク質について、この処理を繰り返すことができる。表３０〜３３は、コーカサス（白人）集団では高い頻度で生じるＨＬＡアレルのタンパク質産物のポケットポテンシャルを示す。
【０３８７】
この方法によって算出されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、およそ−１０から＋１０までの範囲になる。しかしながら、Ｐ１位置に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ）をもたない９ｍｅｒペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは−１００９から−９８９の範囲になると算出された。この値は生物学的に意味をもたず、疎水性アミノ酸がＨＬＡへの結合におけるアンカー残基となることを反映するものであり、そして、Ｐ１に疎水性残基をもたないペプチドはＨＬＡに対して結合しないと考えられる。大部分のＸＴＥＮ配列は疎水性残基を有さないことから、９ｍｅｒ部分列の、全組み合わせのＴＥＰＩＴＯＰＥの範囲は、−１００９から−９８９になるであろう。この方法は、ＸＴＥＮポリペプチドがＴ細胞エピトープをほとんどもたない、又は全くもたないということを確認するものである。
【０３８８】
表２９：ＨＬＡ＊０１０１Ｂアレルのポケットポテンシャル
【表２９】
2015124222.tif 000085
【０３８９】
表３０：ＨＬＡ＊０３０１Ｂアレルのポケットポテンシャル
【表３０】
2015124222.tif 000086
【０３９０】
表３１：ＨＬＡ＊０４０１Ｂアレルのポケットポテンシャル
【表３１】
2015124222.tif 000087
【０３９１】
表３２：ＨＬＡ＊０７０１Ｂアレルのポケットポテンシャル
【表３２】
2015124222.tif 000088
【０３９２】
表３３：ＨＬＡ＊１５０１Ｂアレルのポケットポテンシャル
【表３３】
2015124222.tif 000089
【０３９３】
表３４：生理活性の具体例、アッセイの具体例及び好ましい指標
【表３４−１】
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【表３４−２】
2015124222.tif 000091
表３５：成長ホルモン及び単一のＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮの具体例
【表３５−１】
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【表３５−２】
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【表３５−３】
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【表３５−４】
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【表３５−５】
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【表３５−６】
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【表３５−７】
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【表３５−８】
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【表３５−９】
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【表３５−１０】
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【表３５−１１】
2015124222.tif 000102
【表３５−１２】
2015124222.tif 000103
【表３５−１３】
2015124222.tif 000104
【表３５−１４】
2015124222.tif 000105
【表３５−１５】
2015124222.tif 000106
【表３５−１６】
2015124222.tif 000107
【表３５−１７】
2015124222.tif 000108
【表３５−１８】
2015124222.tif 000109
【表３５−１９】
2015124222.tif 000110
【表３５−２０】
2015124222.tif 000111
【表３５−２１】
2015124222.tif 000112
【表３５−２２】
2015124222.tif 000113
【表３５−２３】
2015124222.tif 000114
【表３５−２４】
2015124222.tif 000115
【表３５−２５】
2015124222.tif 000116
【表３５−２６】
2015124222.tif 000117
【表３５−２７】
2015124222.tif 000118
【表３５−２８】
2015124222.tif 000119
【表３５−２９】
2015124222.tif 000120
【表３５−３０】
2015124222.tif 000121
＊配列名は、成長因子及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
表３６：成長ホルモン及び２つのＸＴＥＮ配列を含むＧＨＸＴＥＮの具体例
【表３６−１】
2015124222.tif 000122
【表３６−２】
2015124222.tif 000123
【表３６−３】
2015124222.tif 000124
【表３６−４】
2015124222.tif 000125
【表３６−５】
2015124222.tif 000126
【表３６−６】
2015124222.tif 000127
【表３６−７】
2015124222.tif 000128
【表３６−８】
2015124222.tif 000129
【表３６−９】
2015124222.tif 000130
【表３６−１０】
2015124222.tif 000131
【表３６−１１】
2015124222.tif 000132
【表３６−１２】
2015124222.tif 000133
【表３６−１３】
2015124222.tif 000134
【表３６−１４】
2015124222.tif 000135
【表３６−１５】
2015124222.tif 000136
【表３６−１６】
2015124222.tif 000137
【表３６−１７】
2015124222.tif 000138
【表３６−１８】
2015124222.tif 000139
【表３６−１９】
2015124222.tif 000140
【表３６−２０】
2015124222.tif 000141
【表３６−２１】
2015124222.tif 000142
【表３６−２２】
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【表３６−２３】
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【表３６−２４】
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【表３６−２５】
2015124222.tif 000146
【表３６−２６】
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【表３６−２７】
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【表３６−２８】
2015124222.tif 000149
【表３６−２９】
2015124222.tif 000150
【表３６−３０】
2015124222.tif 000151
【表３６−３１】
2015124222.tif 000152
【表３６−３２】
2015124222.tif 000153
【表３６−３３】
2015124222.tif 000154
【表３６−３４】
2015124222.tif 000155
【表３６−３５】
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【表３６−３６】
2015124222.tif 000157
【表３６−３７】
2015124222.tif 000158
【表３６−３８】
2015124222.tif 000159
【表３６−３９】
2015124222.tif 000160
【表３６−４０】
2015124222.tif 000161
【表３６−４１】
2015124222.tif 000162
【表３６−４２】
2015124222.tif 000163
＊配列名は、成長因子及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
表３７：成長ホルモン、ＸＴＥＮ及び開裂配列を含むＧＨＸＴＥＮの具体例
【表３７−１】
2015124222.tif 000164
【表３７−２】
2015124222.tif 000165
【表３７−３】
2015124222.tif 000166
【表３７−４】
2015124222.tif 000167
【表３７−６】
2015124222.tif 000168
【表３７−７】
2015124222.tif 000169
【表３７−８】
2015124222.tif 000170
【表３７−９】
2015124222.tif 000171
【表３７−１１】
2015124222.tif 000172
【表３７−１２】
2015124222.tif 000173
【表３７−１３】
2015124222.tif 000174
【表３７−１４】
2015124222.tif 000175
【表３７−１５】
2015124222.tif 000176
【表３７−１６】
2015124222.tif 000177
【表３７−１７】
2015124222.tif 000178
【表３７−１８】
2015124222.tif 000179
【表３７−１９】
2015124222.tif 000180
【表３７−２０】
2015124222.tif 000181
【表３７−２１】
2015124222.tif 000182
【表３７−２２】
2015124222.tif 000183
【表３７−２３】
2015124222.tif 000184
【表３７−２４】
2015124222.tif 000185
【表３７−２５】
2015124222.tif 000186
【表３７−２６】
2015124222.tif 000187
【表３７−２７】
2015124222.tif 000188
【表３７−２８】
2015124222.tif 000189
【表３７−２９】
2015124222.tif 000190
【表３７−３０】
2015124222.tif 000191
【表３７−３１】
2015124222.tif 000192
【表３７−３２】
2015124222.tif 000193
【表３７−３３】
2015124222.tif 000194
【表３７−３４】
2015124222.tif 000195
【表３７−３５】
2015124222.tif 000196
【表３７−３６】
2015124222.tif 000197
【表３７−３７】
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【表３７−３８】
2015124222.tif 000199
＊配列名は、成長因子、開裂配列及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
【図３−２】
2015124222.tif 000200
【図２６】
2015124222.tif 000201
【図１】
2015124222.tif 000202
【図２】
2015124222.tif 000203
【図３−１】
2015124222.tif 000204
【図４】
2015124222.tif 000205
【図５】
2015124222.tif 000206
【図６】
2015124222.tif 000207
【図７】
2015124222.tif 000208
【図８】
2015124222.tif 000209
【図９】
2015124222.tif 000210
【図１０】
2015124222.tif 000211
【図１１】
2015124222.tif 000212
【図１２】
2015124222.tif 000213
【図１３】
2015124222.tif 000214
【図１４】
2015124222.tif 000215
【図１５】
2015124222.tif 000216
【図１６】
2015124222.tif 000217
【図１７】
2015124222.tif 000218
【図１８】
2015124222.tif 000219
【図１９】
2015124222.tif 000220
【図２０】
2015124222.tif 000221
【図２１】
2015124222.tif 000222
【図２２】
2015124222.tif 000223
【図２３】
2015124222.tif 000224
【図２４】
2015124222.tif 000225
【図２５】
2015124222.tif 000226
【図２７】
2015124222.tif 000227
【図２８】
2015124222.tif 000228
【図２９】
2015124222.tif 000229
【図３０】
2015124222.tif 000230
【図３１】
2015124222.tif 000231
【図３２】
2015124222.tif 000232
【図３３】
2015124222.tif 000233
【図３４】
2015124222.tif 000234
【図３５】
2015124222.tif 000235
【図３６】
2015124222.tif 000236
【図３７】
2015124222.tif 000237
【配列表】
2015124222000001.app
【外国語明細書】
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