(57)【要約】【課題】ＬＭ−１抗体、機能性フラグメント、ＬＭ−１標的抗原、ならびにそれらを作製および使用するための方法の提供。【解決手段】本発明は、ＬＭ−１抗体、機能性フラグメント、修飾および変異形、核酸ならびに他の組成物を提供する。本発明は、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体、機能性フラグメント、修飾および変異形も提供する。抗体、機能性フラグメント、修飾および変異形、核酸ならびに他の組成物は、治療および診断方法において有用である。１つの方法としては、治療の必要がある被験体における新生物、腫瘍または癌の転移の治療が挙げられ、この方法は、ＬＭ−１抗体、ＬＭ−１抗原に結合する抗体、またはそのフラグメントの該被験体における新生物、腫瘍または癌の転移の治療に有効な量を該被験体に投与することを含む。【選択図】図６
2015131850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年１月８日に出願された出願第６１／１４３，３５１号および２００８年６月１６日に出願された出願第６１／０６１，８８１号（これらの出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に明確に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＬＭ−１として公知の抗体、およびＬＭ−１ターゲットまたは抗原として公知のターゲットに関する。前記ＬＭ−１として示された抗体は、ＩｇＭであり、異なる新生物、癌、腫瘍および転移タイプに結合する。ＬＭ−１は、様々な癌細胞タイプの成長を抑制し、様々な癌細胞タイプのアポトーシスを刺激し、誘導する。ＬＭ−１は、原発性新生物、腫瘍もしくは癌から生ずる１つ以上の部位での転移の形成もしくは樹立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）、または１つ以上の他の部位で形成したもしくは樹立された転移の成長もしくは増殖も低減する。
【背景技術】
【０００３】
原発性癌の末梢の部位での転移性疾患は、癌進行および再発の一因となる可能性を秘めている。従って、転移の樹立もしくは形成の抑制、または樹立された転移性腫瘍の転移成長、増殖もしくは進行の低減もしくは減少は、癌進行および再発の低減または抑制となる可能性が高い。本発明は、この要求に取り組み、関連した恩恵を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞へのまたは抗原への結合について競合する、単離および精製された抗体および機能性フラグメントを提供する。１つの実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、新生物、腫瘍もしくは癌または転移細胞への結合について競合する。もう１つの実施形態において、抗体またはその機能性フラグメントは、ＬＭ−１のＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質への結合について競合する。
【０００５】
特定の態様において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、胃腺癌（例えば、散在型または腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管または小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、ならびに白血病のうちの１つ以上に関する抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）への結合について競合する。そのようなポリペプチドは、胃腺癌（例えば、散在型または腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管または小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織または脳腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、ならびに白血病の検出および治療に特に有用である。
【０００６】
もう１つの実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合について競合する。追加の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＴＢ−３８；ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ２９９）、Ａ５４９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １０７）またはＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６８７）細胞への結合について競合する。さらなる実施形態において、抗体またはその機能性フラグメントは、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病のうちの１つ以上の、あるいは肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細���株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞のうちの１つの、増殖を抑制もしくは低減するか、またはアポトーシスを刺激もしくは誘導する。
【０００７】
本発明は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞にまたは抗原（例えばＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）に結合する、単離および精製された抗体またはその機能性フラグメントも提供する。１つの実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する腺癌細胞または扁平上皮癌に結合する。特定の態様において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病のうちの１つ以上に結合する。もう１つの実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病に結合する。追加の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉ���ｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞のうちの１つに結合する。
【０００８】
本発明は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖配列可変領域との約６０％以上の同一性を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含む、単離および精製された抗体および機能性フラグメントを提供する。１つの実施形態において、抗体またはその部分配列は、配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変領域配列または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の重鎖と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列、あるいは配列番号９として示す軽鎖可変領域配列または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の軽鎖と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列を含む。もう１つの実施形態において、抗体または部分配列は、配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変領域配列、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の重鎖と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列、および配列番号９として示す軽鎖可変領域配列または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の軽鎖と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列を含む。さらなる実施形態において、抗体または部分配列は、配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、アミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８）または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の重鎖可変領域内の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％または９５〜１００％同一の配列、あるいは配列番号９として示す軽鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１１もしくは１３のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１）または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の軽鎖可変領域内の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％または９５〜１００％同一の配列を含む。
【０００９】
本発明は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上のアミノ酸付加、欠失または置換を有する、単離および精製された抗体およびそれらの機能性フラグメントをさらに提供する。特定の態様において、抗体または機能性フラグメントは、配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖可変領域配列と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％もしくは９５〜１００％同一の配列、または配列番号９として示す軽鎖可変領域配列と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％もしくは９５〜１００％同一の配列を有する。さらなる態様において、抗体または機能性フラグメントは、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３として示す重鎖または軽鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、９０〜１０１）との１００％同一性を有する重鎖または軽鎖配列を有し、ならびに配列番号１、３、５、７または９および１１または１３として示す重鎖または軽鎖可変領域配列内のＣＤＲの外部の領域との１００％未満の同一性を有する。そのような変異体は、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）に、または参照抗体（例えば、ＬＭ−１）が結合する抗原のエピトープに結合することができる。
【００１０】
本発明は、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）または細胞（例えば、新生物、癌、腫瘍もしくは転移細胞）への結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性の約１〜５０００倍以内の結合親和性を有する、抗体およびそれらの機能性フラグメントも提供する。様々な実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）または胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性の約１〜５０００倍以内の結合親和性を有する。追加の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）または肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、もしくは肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞のうちの１つへの結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性の約１〜５０００倍以内の結合親和性を有する。さらなる実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）、または本明細書に示す１つ以上の細胞もしくは細胞株（例えば、胃腺癌、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば���立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病など、あるいは肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞のうちの１つ）への結合について、約ＫＤ１０−５Ｍから約ＫＤ１０−１３Ｍの範囲内の結合親和性を有する。
【００１１】
本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含む。様々な態様において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
【００１２】
本発明の抗体機能性フラグメントおよび部分配列は、本明細書に示す様々な抗体の機能性フラグメントおよび部分配列を含む。特定の実施形態において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるもしくは配列番号１、３、５、または７および９として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）への結合について競合するか、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞もしくは抗原への結合を少なくとも部分的に保持する、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の機能性フラグメントを提供する。特定の態様において、機能性フラグメントまたは部分配列は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ、ＶＨ、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディー（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディー（三価）、テトラボディー（四価）、ミニボディー（（ｓｃＦＶ−ＣＨ３）２）、二重特異性一本鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧデルタＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃである。追加の態様において、完全長抗体重もしくは軽鎖、または重もしくは軽鎖可変領域、の機能性フラグメントまたは部分配列は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖配列の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１）を含む。さらなる態様において、完全長抗体重もしくは軽鎖、または重もしくは軽鎖可変領域、の機能性フラグメントまたは部分配列は、約２０から３０、３０から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から４００、４００から５００アミノ酸残基長を有する。
【００１３】
本発明は、異種ドメインを含む、抗体および部分配列も提供する。１つの実施形態において、異種ドメインとしては、検出可能な標識、タグまたは細胞傷害剤が挙げられる。特定の態様において、検出可能な標識またはタグは、酵素、酵素基質、リガンド、受容体、放射性核種、Ｔ７−、Ｈｉｓ、ｍｙｃ−、ＨＡ−もしくはＦＬＡＧ−タグ、高電子密度試薬、エネルギー移動分子、常磁性標識、蛍光体、発色団、化学発光剤、または生物発光剤である。
【００１４】
本発明は、抗体およびそれらの機能性フラグメントをコードする核酸配列をさらに提供する。１つの実施形態において、核酸配列は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるもしくは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖可変領域配列またはその部分配列（例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７もしくは１００〜１１８、または配列番号９のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１）をコードする核酸配列と少なくとも７５〜１００％相補的または同一である。もう１つの実施形態において、核酸は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるもしくは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の部分配列（例えば、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７もしくは１００〜１１８、または配列番号１１もしくは１３のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１）をコードする。特定の態様において、核酸配列は、約１０から２０、２０から３０、３０から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から４００、４００から５００、または５００から１０００ヌクレオチド長を有する。追加の態様において、核酸配列は、配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３、またはそれらの部分配列をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする、あるいは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３または部分配列配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３をコードする核酸に相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズする。さらなる態様において、核酸は、配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３またはそれらの部分配列をコードするまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３またはそれらの部分配列に相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、またはリボザイム核酸である。アンチセンスポリヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、およびリボザイムポリヌクレオチドは、約１０から２０、２０から３０、３０から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から４００、４００から５００、５００から１０００、１０００から２０００ヌクレオチド長を有する場合があり、ならびに配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３またはそれらの部分配列（例えば、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７もしくは１００〜１１８、または配列番号１１もしくは１３のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１）をコードする核酸配列と少なくとも９０％相補的または同一である。尚、さらなる態様において、核酸配列は、発現制御配列またはベクター（例えば、ウイルス、細菌、真菌また���哺乳動物ベクター）を含む場合がある。
【００１５】
本発明は、配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重もしくは軽鎖可変領域配列と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖可変領域配列と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列を含む、抗体またはその部分配列を発現する、単離および精製された細胞ならびに形質転換宿主細胞をさらに提供する。前述の細胞は、抗体もしくはその部分配列を安定的にもしくは一過的に発現することができる、または抗体もしくはその部分配列をコードする核酸もしくはベクターで安定的にもしくは一過的に形質転換され得る、真核細胞および非真核細胞を含む。
【００１６】
本発明は、キットをさらに提供する。様々な実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）へのまたは細胞（例えば、新生物、癌、腫瘍もしくは転移細胞）への結合について競合する、抗体またはその機能性フラグメントを含む。特定の態様において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合について競合する、抗体またはその機能性フラグメントを含む。追加の実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）への、または肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ
３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、もしくは肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞のうちの１つへの結合について競合する、抗体またはその機能性フラグメントを含む。
【００１７】
本発明のキットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）に結合する、抗体および機能性フラグメントも含む。１つの実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する腺癌細胞または扁平上皮癌、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）細胞、肺腺癌細胞、膵腺癌細胞、結腸腺癌細胞、乳腺癌細胞、食道扁平上皮癌、に結合する抗体または機能性フラグメントを含む。もう１つの実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病に結合する抗体または機能性フラグメントを含む。追加の実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ
１９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞に結合する抗体または機能性フラグメントを含む。
【００１８】
本発明のキットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖配列可変領域との約６０％以上同一性を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含む抗体および機能性フラグメントをさらに含む。１つの実施形態において、キットは、配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変領域配列と、または配列番号１１もしくは１３として示す軽鎖可変領域配列と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列と、少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列を有する抗体またはその部分配列を含む。もう１つの実施形態において、キットは、配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変領域配列と、および配列番号１１もしくは１３として示す軽鎖可変領域配列と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列と、少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）同一の配列を有する抗体または部分配列を含む。さらなる実施形態において、キットは、配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７もしくは１００〜１１８）、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の重鎖可変領域内の１つ以上のＣＤＲ、と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％同一の配列、あるいは配列番号１１もしくは１３として示す軽鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１）、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２によって生産される抗体の軽鎖可変領域内の１つ以上のＣＤＲ、と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％同一の配列、を有する抗体または部分配列を含む。
【００１９】
追加の実施形態において、キットは、抗細胞増殖もしくは免疫強化治療もしくは療法薬、または抗新生物、抗癌もしくは抗腫瘍もしくは抗転移薬、または製造物（例えば、前記抗体、抗細胞増殖もしくは免疫強化治療もしくは療法を被験体に局所的に、局部的にまたは全身的にもたらすためのもの）も含む。特定の態様において、それらの説示は、望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患（例えば、新生物、腫瘍、癌もしくは転移）を治療するためのものである。
【００２０】
さらに加えて、本発明は、医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物は、抗体または機能性フラグメントおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む。もう１つの実施形態において、組成物は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）への結合について競合する抗体、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）に結合する抗体、あるいは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重もしくは軽鎖可変領域配列との約６０％以上の同一性を有する重もしくは軽鎖可変領域配列、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖もしくは軽鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％同一の配列を含む抗体と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む。さらなる実施形態において、組成物は、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）と医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む。
【００２１】
抗体、機能性フラグメントおよび抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）、修飾形は、治療の必要な被験体の治療に有用である。従って、本発明は、望ましくない細胞増殖、例えば細胞増殖性または増殖亢進性疾患、を有するまたは有するリスクがある被験体の治療（例えば、治療的なものまたは予防的なもの）において抗体、機能性フラグメントおよび抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）を使用する方法を提供する。１つの実施形態における方法は、望ましくない細胞増殖（例えば、細胞増殖性疾患）を有するまたは有するリスクがある被験体に、望ましくない細胞増殖を治療するために有効な量で、抗体または機能性フラグメント（例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体）または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）を投与することを含む。特定の態様において、細胞増殖性疾患は、転移性または非転移性、充実性または液性新生物、悪性疾患、腫瘍または癌である。様々な態様において、望ましくない細胞増殖（例えば、細胞増殖性疾患）は、脳、頭部もしくは頚部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、胃、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、膀胱、結腸、直腸、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頚、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、皮膚もしくは筋肉、または造血系を冒すか、またはこれらに少なくとも一部は存在する。追加の態様において、望ましくない細胞増殖（例えば、細胞増殖性疾患）としては、乳房、肺、甲状腺、頭部および頚部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、リンパ、胃腸管、口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、小腸、結腸、直腸、尿生殖路、子宮、子宮内膜、卵巣、子宮頚、膀胱、精巣、陰茎、前立腺、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚を冒す、もしくはこれらに少なくとも一部は存在するか、または造血性である、新生物、腫瘍、癌または転移が挙げられる。さらに特定の態様において、新生物、腫瘍、癌または転移は、肉腫、癌腫、腺癌、黒色腫、骨髄腫、芽腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病である。追加の特定の態様において、新生物、腫瘍または癌は、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌もしくは腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞もしくは腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、またはこれらの転移である。
【００２２】
もう１つの実施形態における方法は、転移を有するまたは転移を有するリスクがある被験体に、該被験体体内の他の部位、位置または領域への腫瘍、癌または新生物の拡大または播種を低減または抑制するために有効な量で、抗体もしくは機能性フラグメント（例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体）または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）を投与することを含む。様々な態様における方法は、１つ以上の他の部位への原発性腫瘍または癌の転移、１つ以上の他の部位での転移の形成または樹立を低減または抑制し、それによって、腫瘍もしくは癌再発または腫瘍もしくは癌進行を抑制または低減する。さらなる態様における方法は、転移を発生、形成もしくは樹立する可能性を秘めているまたは転移を発生、形成もしくは樹立する、腫瘍もしくは癌細胞の成長、増殖、運動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）または侵襲性を低減または抑制する；原発性腫瘍または癌から生ずる、該原発性腫瘍または癌とは異なる１つ以上の他の部位、位置または領域への転移の形成または樹立を低減または抑制する；転移が形成したまたは樹立された後、原発性腫瘍または癌とは異なる１つ以上の他の部位、位置または領域での該転移の成長または増殖を低減または抑制する；あるいは転移が形成したまたは樹立された後、追加の転移の形成または樹立を低減または抑制する。
【００２３】
さらなる特定の態様において、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移は、進行的に悪化している、または寛解状態である。さらなる追加の態様において、治療は、細胞増殖性疾患、または新生物、腫瘍もしくは癌に関連した１つ以上の有害な身体的症状を緩和または改善する；あるいは新生物、腫瘍または癌容積を低減または減少させる；新生物、腫瘍または癌容積の増加を抑制または予防する；新生物、腫瘍または癌進行または悪化を抑制する；新生物、腫瘍または癌細胞溶解またはアポトーシスを刺激する；あるいは新生物、腫瘍または癌増殖または転移を抑制する、低減または減少させる；あるいは被験体の寿命を延長する（ｐｒｏｌｏｎｇ）かもしくは延ばす（ｅｘｔｅｎｄ）；あるいは被験体の生活の質を向上させる。
【００２４】
方法は、被験体への局所的、局部的、または全身的投与を含む。例示的被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）としては、抗細胞増殖性もしくは抗増殖亢進性疾患（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移）または免疫強化治療または療法についての候補者、および前記治療または療法を受けているまたは受けたことがある者が挙げられる。
【００２５】
本発明は、治療が必要な被験体における疾患の併用治療法も提供する。一部の実施形態における方法は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）または細胞への結合について競合する抗体、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞に結合する抗体、および被験体への抗細胞増殖性または免疫強化治療または療法を、被験体に（例えば、互いの前に、実質的に互に同時に、または互いの後に）施すことを含む。もう１つの実施形態では、被験体への、ＬＭ−１抗体が結合する抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）、および抗細胞増殖または免疫強化治療または療法（例えば、互いの前、実質的に互に同時、または互いの後）。様々な態様において、抗細胞増殖または免疫強化治療または療法としては、外科的切除、放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、放射線照射療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、化学療法、免疫療法、温熱療法、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物エキス、植物アルカロイド、ニトロソウレア、ホルモン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド類似体、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞もしくはＢ細胞、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、インターフェロンまたはケモカインが挙げられる。
【００２６】
抗体およびそれらの機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する抗原の存在の検出、スクリーニングおよび同定に有用である。従って、本発明は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞および抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）の検出またはスクリーニング方法、本発明の前記方法による治療に適用できる被験体の同定方法を提供する。１つの実施形態における方法は、生体材料またはサンプルと抗体または機能性フラグメントとを、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞または抗原と前記抗体または機能性フラグメントとの結合を可能にする条件下で、接触させること、および細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞または抗原への前記抗体または機能性フラグメントの結合についてアッセイすることを含む。細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞または抗原への前記抗体または機能性フラグメントの結合は、前記生体材料が、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞または抗原を含有することを示す。もう１つの実施形態における方法は、ＬＭ−１抗体が結合する抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）の存在について生物学的サンプルを分析することを含む。ＬＭ−１に結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）の存在によって、本発明の方法による治療に適用できる被験体が同定される。もう１つの態様において、前記生体材料またはサンプルは、哺乳動物（例えば、ヒトなどの霊長類）被験体から得られる。
【００２７】
本発明は、望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有するまたは有するリスクが増している被験体を診断する方法、望ましくないまたは異常細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の存在または程度を判定または確認する方法、ならびにＬＭ−１抗体、すなわちＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体、での治療に適する被験体を同定する方法を提供する。様々な実施形態における方法は、被験体からの生体材料またはサンプルと、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と結合について競合する抗体または機能性フラグメント、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質）に結合する抗体または機能性フラグメント、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖配列可変領域との約６０％以上の同一性を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含む抗体または機能性フラグメントとを、前記抗体または機能性フラグメントの結合を可能にする条件下で接触させること、ならびに細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への前記抗体の結合をアッセイすることを含む。細胞またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）の存在または量を新生物、腫瘍または癌の存在または程度と相関させ、それによって、望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有するまたは有するリスクが増している被験体を診断することができ、あるいは新生物、腫瘍もしくは癌の存在もしくは程度を確証することができる。細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）の存在または量によって、治療への応答の確率増加のため、ＬＭ−１抗体、すなわちＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体、での治療に適する患者を同定することもできる。特定の態様において、被験体を診断するための方法は、望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有する（例えば、存在もしくは程度）、または有するリスクが増している者を同定する。１つの態様において、前記生体材料またはサンプルは、哺乳動物（例えば、ヒトなどの霊長類）被験体から得られる。追加の態様��おいて、前記生体材料またはサンプルは、生検材料、例えば、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣または子宮生検材料を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体の重鎖または軽鎖配列可変領域との６０％以上の同一性を有する重鎖および軽鎖配列可変領域配列を含む抗体またはその機能性フラグメント。
（項目２）
重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体またはその機能性フラグメントであって、前記重鎖または軽鎖可変領域配列のそれぞれにおけるＣＤＲの１つ以上が、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３で示す重鎖または軽鎖配列の対応するＣＤＲと少なくとも６０％同一である、抗体またはその機能性フラグメント。
（項目３）
配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１１０〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８もしくは９０〜１０１を含むＣＤＲを有する重鎖および軽鎖配列可変領域配列を含む抗体またはその機能性フラグメント。
（項目４）
前記ＣＤＲが、配列番号１、３、５もしくは７のＣＤＲ１、ＶＳＧＧＳＩＳＳＧＧＹＹ、ＣＤＲ２、ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ、およびＣＤＲ３、ＶＤＡＲＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＤＡＦＤＩ、または配列番号１１のＣＤＲ１、ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ、ＣＤＲ２、ＤＮＮＫＲＰＳＧ、もしくはＣＤＲ３、ＧＴＷＤＳＳＬＳＡＧＷＶを含むか、これらから成るか、またはこれらの中にある配列を含む、項目２または３の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目５）
ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質に結合する、項目１から３のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目６）
ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５への結合について細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産されるＬＭ−１抗体と競合する、抗体またはその機能性フラグメント。
（項目７）
前記ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５が、Ｎ末端ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５アミノ酸配列を含む、項目６に記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目８）
前記ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５が、
【化２５】
2015131850.tif 000003
に示される配列を含む、項目６に記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目９）
以下：
【化２６】
2015131850.tif 000004
に示されるＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５配列のアミノ酸１〜３００に結合する、抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１０）
ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５タンパク質へのＬＭ−１抗体の結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントであって、前記ＬＭ−１抗体が、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３を含む、抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１１）
前記ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５が、
【化２７】
2015131850.tif 000005
に示される配列を含む、項目６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１２）
前記ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質が、細胞の表面で発現される、項目６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１３）
前記ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質が、配列番号１６を含む、項目６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１４）
Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞に結合する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１５）
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１６）
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５への結合について競合する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１７）
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５への結合について競合する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１８）
Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞の増殖または成長を低減または抑制する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目１９）
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるようなＬＭ−１抗体と、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、黒色腫、小葉性もしくは腺管性の乳房の癌腫、乳癌、胃癌、膵臓癌、肉腫、胃腸癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、食道癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合について競合する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目２０）
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるようなＬＭ−１抗体の、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、黒色腫、小葉性もしくは腺管性の乳房の癌腫、乳癌、胃癌、膵臓癌、肉腫、胃腸癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、食道癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合を低減、減少または抑制する、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメント。
（項目２１）
項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体または機能性フラグメントをコードする核酸。
（項目２２）
治療の必要がある被験体において新生物、腫瘍または癌の転移を治療するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体における新生物、腫瘍または癌の転移の治療に有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２３）
１つ以上の部位での転移性新生物、腫瘍または癌の形成または樹立を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、被験体における１つ以上の部位での転移性新生物、腫瘍または癌の形成または樹立を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２４）
治療の必要がある被験体において原発性新生物、腫瘍または癌とは異なる１つ以上の部位、位置または領域への原発性新生物、腫瘍または癌の転移を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体における前記原発性新生物、腫瘍または癌とは異なる１つ以上の部位、位置または領域への前記原発性新生物、腫瘍または癌の転移を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２５）
治療の必要がある被験体において新生物、腫瘍または癌から生ずる転移の形成または樹立を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体における新生物、腫瘍または転移から生ずる転移の形成または樹立の低減または抑制に有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２６）
治療が必要な被験体において転移に発展することがあるまたは転移を引き起こすことがある新生物、腫瘍または癌細胞の成長、増殖、運動性または侵襲性を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記転移に発展することがあるまたは前記転移を引き起こすことがある新生物、腫瘍または癌細胞の成長、増殖、運動性または侵襲性を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２７）
治療が必要な被験体において新生物、腫瘍もしくは癌の再発、または新生物、腫瘍もしくは癌の進行を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体において新生物、腫瘍もしくは癌の再発、または新生物、腫瘍もしくは癌の進行を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２８）
転移が被験体において形成したまたは樹立された後に前記転移の成長または増殖を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体において前記転移が形成したまたは樹立された後に前記転移の成長または増殖を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２９）
転移が被験体において形成したまたは樹立された後に前記被験体における追加の転移の形成または樹立を低減または抑制するための方法であって、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ  ２６２３によって生産される、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるＬＭ−１抗体と、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する抗体またはその機能性フラグメントの、転移が前記被験体において形成したまたは樹立された後に前記被験体における追加の転移の形成または樹立を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。（項目３０）
前記抗体またはその機能性フラグメントが、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体または機能性フラグメントを含む、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、脳、脊柱、頭部もしくは頚部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、甲状腺、頭部もしくは頚部、胃腸管、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、膀胱、結腸、直腸、尿生殖路、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頚、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、陰茎、皮膚もしくは筋肉、または造血系を冒すか、またはこれらに少なくとも一部は存在する、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、造血性である、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、肉腫、癌腫、腺癌、骨肉腫、線維肉腫、黒色腫、骨髄腫、芽腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病を含む、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、胃腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌腫、肺癌、乳癌もしくは乳房の癌、胃癌、膵臓癌、胃腸癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮癌、またはホジキン病を含む、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ期新生物、腫瘍、癌、または転移を含む、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、進行的に悪化している、または寛解状態である、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、充実性または液性である、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記抗体または機能性フラグメントが、前記被験体に局所的に、局部的に、または全身的に投与される、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記新生物、腫瘍、癌もしくは転移に関連した１つ以上の有害な身体的症状を緩和もしくは改善する結果となる、または前記被験体の寿命を延長するかもしくは延ばす、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
前記治療が、転移の数、容積もしくはサイズを低減もしくは減少させるか、転移の数、容積もしくはサイズの増加を抑制もしくは予防するか、前記新生物、腫瘍、癌もしくは転移の進行もしくは悪化を抑制するか、転移細胞溶解もしくはアポトーシスを刺激するか、または転移の成長、増殖もしくは生存を抑制、低減もしくは減少させる、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
前記被験体が、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、抗転移もしくは免疫強化治療もしくは療法についての候補者であるか、前記治療もしくは療法を受けているか、または前記治療もしくは療法を受けたことがある、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
抗細胞増殖または免疫強化治療または療法を前記被験体に施すことをさらに含む、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
前記被験体が、哺乳動物である、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目４４）
前記被験体が、ヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記被験体が、新生物、腫瘍、癌または転移のための治療または療法を受けているまたは受けたことがある、項目２２から２９のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
治療の必要がある被験体において新生物、腫瘍または癌の転移を治療するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントの、前記被験体において前記新生物、腫瘍または癌の転移を治療するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目４７）
１つ以上の部位での転移性新生物、腫瘍または癌の形成または樹立を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントの、前記被験体における１つ以上の他の部位での転移性新生物、腫瘍または癌の形成または樹立を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目４８）
治療が必要な被験体において原発性新生物、腫瘍または癌とは異なる１つ以上の部位、位置または領域への原発性新生物、腫瘍または癌の転移を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントの、前記被験体において前記原発性新生物、腫瘍または癌とは異なる１つ以上の部位、位置または領域への前記原発性新生物、腫瘍または癌の転移を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目４９）
治療の必要がある被験体において新生物、腫瘍または癌から生ずる転移の形成または樹立を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体において新生物、腫瘍または癌から生ずる転移の形成または樹立を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目５０）
治療の必要がある被験体において転移に発展することがあるまたは転移を引き起こすことがある新生物、腫瘍または癌細胞の成長、増殖、運動性または侵襲性を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントの、前記転移に発展することがあるまたは前記転移を引き起こすことがある新生物、腫瘍または癌細胞の成長、増殖、運動性または侵襲性を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目５１）
治療が必要な被験体において新生物、腫瘍もしくは癌の再発、または新生物、腫瘍もしくは癌の進行を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントの、前記被験体において新生物、腫瘍もしくは癌の再発、または新生物、腫瘍もしくは癌の進行を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目５２）
転移が被験体において形成したまたは樹立された後に前記転移の成長または増殖を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体またはその機能性フラグメントの、前記転移が前記被験体において形成したまたは樹立された後に前記転移の成長または増殖を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目５３）
転移が被験体において形成したまたは樹立された後に前記被験体における追加の転移の成長または増殖を低減または抑制するための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３として示す重鎖または軽鎖配列と少なくとも７０％同一の重鎖および軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントの、転移が前記被験体において形成したまたは樹立された後に被験体における追加の転移の成長または増殖を低減または抑制するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目５４）
前記抗体またはその機能性フラグメントが、項目１から３、６、９または１０のいずれかに記載の抗体または機能性フラグメントを含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目５５）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、脳、脊柱、頭部もしくは頚部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、甲状腺、頭部もしくは頚部、胃腸管、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、膀胱、結腸、直腸、尿生殖路、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頚、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、陰茎、皮膚もしくは筋肉、または造血系を冒すか、またはこれらに少なくとも一部は存在する、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、造血性である、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目５７）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、肉腫、癌腫、腺癌、骨肉腫、線維肉腫、黒色腫、骨髄腫、芽腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、胃腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌腫、肺癌、乳癌もしくは乳房の癌、胃癌、膵臓癌、胃腸癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮癌、またはホジキン病を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ期新生物、腫瘍、癌、または転移を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、進行的に悪化している、または寛解状態である、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６１）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、充実性または液性である、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
前記抗体または機能性フラグメントが、前記被験体に局所的に、局部的に、または全身的に投与される、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６３）
前記新生物、腫瘍、癌もしくは転移に関連した１つ以上の有害な身体的症状を緩和もしくは改善する結果となる、または前記被験体の寿命を延長するかもしくは延ばす、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記治療が、転移の数、容積もしくはサイズを低減もしくは減少させるか、転移の数、容積もしくはサイズの増加を抑制もしくは予防するか、前記新生物、腫瘍、癌もしくは転移の進行もしくは悪化を抑制するか、転移細胞溶解もしくはアポトーシスを刺激するか、または転移の成長、増殖もしくは生存を抑制、低減もしくは減少させる、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６５）
前記被験体が、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、抗転移もしくは免疫強化治療もしくは療法についての候補者であるか、前記治療もしくは療法を受けているか、または前記治療もしくは療法を受けたことがある、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６６）
抗細胞増殖または免疫強化治療または療法を前記被験体に施すことをさらに含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６７）
前記被験体が、哺乳動物である、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目６８）
前記被験体が、ヒトである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記被験体が、新生物、腫瘍、癌または転移のための治療または療法を受けているまたは受けたことがある、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
前記抗体またはその機能性フラグメントが、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３として示す重鎖および軽鎖配列と少なくとも７０％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
前記抗体またはその機能性フラグメントが、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３として示す重鎖および軽鎖配列の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％同一の１つ以上のＣＤＲを有する重鎖および軽鎖配列を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記抗体またはその機能性フラグメントが、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３として示す重鎖および軽鎖配列の１つ以上のＣＤＲと少なくとも９０％同一の１つ以上のＣＤＲを有する重鎖および軽鎖配列を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
前記抗体またはその機能性フラグメントが、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３として示す重鎖および軽鎖配列の１つ以上のＣＤＲと少なくとも１００％同一の１つ以上のＣＤＲを有する重鎖および軽鎖配列を含む、項目４７から５３のいずれかに記載の方法。
（項目７４）
治療の必要がある被験体において新生物、腫瘍もしくは癌、またはそれらの転移を治療するための方法であって、ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５に結合する抗体またはその機能性フラグメントの、前記被験体において前記新生物、腫瘍もしくは癌、またはそれらの転移を治療するために有効な量を、前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目７５）
前記抗体または機能性フラグメントが、項目１から３、６、９または１０に記載の任意の抗体または機能性フラグメントである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５が、前記新生物、腫瘍または癌の細胞の表面で発現される、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、脳、脊柱、頭部もしくは頚部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、甲状腺、頭部もしくは頚部、胃腸管、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、膀胱、結腸、直腸、尿生殖路、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頚、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、陰茎、皮膚もしくは筋肉、または造血系を冒すか、またはこれらに少なくとも一部は存在する、項目７４に記載の方法。
項目７８）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、造血性である、項目７４に記載の方法。
（項目７９）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、肉腫、癌腫、腺癌、骨肉腫、線維肉腫、黒色腫、骨髄腫、芽腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病を含む、項目７４に記載の方法。
（項目８０）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、胃腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌腫、肺癌、乳癌もしくは乳房の癌、胃癌、膵臓癌、胃腸癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮癌、またはホジキン病を含む、項目７４に記載の方法。
（項目８１）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ期新生物、腫瘍、癌、または転移を含む、項目７４に記載の方法。
（項目８２）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、進行的に悪化している、項目７４に記載の方法。
（項目８３）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、寛解状態である、項目７４に記載の方法。
（項目８４）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、充実性または液性である、項目７４に記載の方法。
（項目８５）
前記ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５抗体または機能性フラグメントが、前記被験体に局所的に、局部的に、または全身的に投与される、項目７４に記載の方法。
（項目８６）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移に関連した１つ以上の有害な身体的症状を緩和または改善する結果となる、項目７４に記載の方法。
（項目８７）
前記治療が、転移の数、容積もしくはサイズを低減もしくは減少させるか、転移の数、容積もしくはサイズの増加を抑制もしくは予防するか、前記新生物、腫瘍、癌もしくは転移の進行もしくは悪化を抑制するか、転移細胞溶解もしくはアポトーシスを刺激するか、または転移の成長、増殖もしくは生存を抑制、低減もしくは減少させる、項目７４に記載の方法。
（項目８８）
前記被験体の寿命を延長するかもしくは延ばす、項目７４に記載の方法。
（項目８９）
前記被験体が、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、抗転移または免疫強化治療もしくは療法についての候補者であるか、前記治療もしくは療法を受けているか、または前記治療もしくは療法を受けたことがある、項目７４に記載の方法。
（項目９０）
抗細胞増殖または免疫強化治療または療法を前記被験体に施すことをさらに含む、項目７４に記載の方法。
（項目９１）
前記被験体が、哺乳動物である、項目７４に記載の方法。
（項目９２）
前記被験体が、ヒトである、項目７４に記載の方法。
（項目９３）
新生物、腫瘍または癌を検出または診断するための方法であって、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５の存在について生物学的サンプルを分析すること、およびＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５の存在または量を新生物、腫瘍または癌の存在と相関させることを含む、方法。
（項目９４）
前記生物学的サンプルが、被験体からのものである、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記被験体が、哺乳動物である、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
前記被験体が、ヒトである、項目９３に記載の方法。
（項目９７）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、脳、脊柱、頭部もしくは頚部、乳房、食道、口、鼻咽頭、鼻もしくは洞、甲状腺、頭部もしくは頚部、胃腸管、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、膀胱、結腸、直腸、尿生殖路、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頚、卵巣、骨髄、リンパ、血液、骨、精巣、陰茎、皮膚もしくは筋肉、または造血系を冒すか、またはこれらに少なくとも一部は存在する、項目９３に記載の方法。
（項目９８）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、造血性である、項目９３に記載の方法。
（項目９９）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、肉腫、癌腫、腺癌、骨肉腫、線維肉腫、黒色腫、骨髄腫、芽腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１００）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、胃腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌腫、肺癌、乳癌もしくは乳房の癌、胃癌、膵臓癌、胃腸癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、子宮癌、またはホジキン病を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１０１）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ期新生物、腫瘍、癌、または転移を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１０２）
新生物、腫瘍、癌、または転移が、進行的に悪化している、項目９３に記載の方法。
（項目１０３）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、寛解状態である、項目９３に記載の方法。
（項目１０４）
前記新生物、腫瘍、癌、または転移が、充実性または液性である、項目９３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、抗体ＬＭ−１のインビトロでの機能分析を図示するグラフを示す図である。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（「ＭＴＴ」）増殖アッセイを用いて、異なる癌腫細胞株の増殖に対する抗体治療の結果を測定したものであり、肺膵癌腫細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１に対するＬＭ−１の細胞増殖の濃度依存性抑制を示す。これらの研究のための対照は、無関係ＩｇＭ抗体を同様の濃度で添加した細胞培養上清枯渇物であった。
【図２】図２ＡおよびＢは、ＬＭ−１モノクローナル抗体が、細胞増殖を抑制して生存度を減少させること、またはＡ）２４時間のインキュベーション；およびＢ）４８時間のインキュベーション後に肺細胞のＥＰＬＣ−２７２Ｈ類表皮細胞癌腫のアポトーシスを誘導することを示す、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性のＭＴＴ還元アッセイの結果についての一連のグラフを示す図である。
【図３】図３は、ＬＭ−１抗体がアポトーシスを誘導することを示すグラフを示す図である。これらの研究では、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳアポトーシスアッセイを用いて、肺癌腫細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１のアポトーシスを検出した。これらの研究における対照は、同様の濃度の細胞培養上清枯渇物であった。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＬＭ−１モノクローナル抗体が、Ａ）２４時間のインキュベーション；およびＢ）４８時間のインキュベーション後にＬＯＵ−ＮＨ９１細胞のアポトーシスを誘導することを示す、細胞死ＥＬＩＳＡの結果を示す一連のグラフを示す図である。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｆは、Ａ）ＬＭ−１についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル；ならびにＢ）単糖類、Ｃ）二糖類、Ｄ）三糖類、Ｅ）四糖類およびＦ）オリゴ糖類への抗体ＬＭ−１結合についてのスクリーニングの結果を示す図である。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｆは、Ａ）ＬＭ−１についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル；ならびにＢ）単糖類、Ｃ）二糖類、Ｄ）三糖類、Ｅ）四糖類およびＦ）オリゴ糖類への抗体ＬＭ−１結合についてのスクリーニングの結果を示す図である。
【図５−３】図５Ａ〜５Ｆは、Ａ）ＬＭ−１についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル；ならびにＢ）単糖類、Ｃ）二糖類、Ｄ）三糖類、Ｅ）四糖類およびＦ）オリゴ糖類への抗体ＬＭ−１結合についてのスクリーニングの結果を示す図である。
【図５−４】図５Ａ〜５Ｆは、Ａ）ＬＭ−１についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル；ならびにＢ）単糖類、Ｃ）二糖類、Ｄ）三糖類、Ｅ）四糖類およびＦ）オリゴ糖類への抗体ＬＭ−１結合についてのスクリーニングの結果を示す図である。
【図６】図６は、注射後８週間維持された、ＬＭ−１注射マウスの体重を示す図である。無注射対照および非特異的ＩｇＭ注射対照における体重は、肝臓転移からの健康不良のため、ほぼ２０％低減された。
【図７】図７は、ＬＭ−１抗体が、腫瘍転移樹立、形成、または増殖（成長）を低減できることを示すデータを示す図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるＢｘＰＣ３細胞膜調製物分析を示す図である。Ａ）ＰＶＤＦ膜に移動してＬＭ−１抗体で染色された分画タンパク質；およびＢ）ＬＭ−１に結合したＰＶＤＦ膜上のスポット（これらを銀染色ＰＡＧＥに重ね合わせ、対応するスポットをゲルから切り取ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に付した）。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ＬＭ−１ターゲットの同定を示す図である。Ａ）ＢＸＰＣ−３抽出物のゲルクロマトグラフィー；Ｂ）〜Ｄ）選択し、アニオン交換クロマトグラフィーに付し、その後、ＬＭ−１抗体でブロットした画分９および１０。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ｓｉＲＮＡが、ＢｘＰｃ−３細胞をトランスフェクトしてＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５の発現をダウンレギュレートさせたことおよびＬＭ−１の結合を低減したことを示す図である。Ａ）ｓｉＲＮＡは、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５発現をダウンレギュレートさせた；Ｂ）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞へのＬＭ−１の結合が低減された（矢印）；およびＣ）負荷対照。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、抗ｎｍｔ５５抗体でのＭＫＮ細胞の免疫沈降、ならびにその後のＡ）抗ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５マウスｍＡｂ／抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ；Ｂ）抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ；Ｃ）ＬＭ−１／抗ヒトＩｇＭ  ＨＲ；およびＤ）抗ヒトＩｇＭ  ＨＲＰでの染色を示す図である。上部（より高い分子量）矢印は、ＮＯＮＯであり、底部（より低い分子量）矢印は、マウス重鎖である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ｎｍｔ５５でのＢｘＰＣ−３細胞の免疫沈降、ならびにその後のＡ）ＬＭ−１；およびＢ）抗ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５での染色を示す図である。矢印は、ｎｍｔ５５およびマウスＩｇＧ重鎖を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、抗ｎｍｔ５５でのＡ５４９細胞の免疫沈降、ならびにその後のＡ）抗ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５；およびＢ）ＬＭ−１での染色を示す図である。矢印は、ｎｍｔ５５およびマウスＩｇＧ重鎖の位置を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、組換え発現されたＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５−６ｘＨｉｓタンパク質に結合するＬＭ−１を示すデータを示す図である。
【図１５】図１５は、細菌発現ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５−６ｘＨｉｓタンパク質に結合するＬＭ−１を示すデータを示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、Ａ）ｎｍｔ５５発現  レーン１）Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量マーカー、レーン２）タンパク質発現のベースラインレベルを示すＴ０サンプル、レーン３）熱誘導後のｎｍｔ５５発現レベルを示すＴＦＩＮＡＬ；Ｂ）Ｐｒｏｆｉｎａ（商標）精製後のｎｍｔ５５  レーン１）Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量マーカー、レーン２）ペリプラズム発現からの精製および濃縮したｎｍｔ５５；およびＣ）Ｐｒｏｆｉｎａ（商標）精製後のｎｍｔ５５のウエスタンブロット  レーン１）Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量マーカー、レーン２）ＬＭ−１ｏｐｔ  ｓｃＦｖを使用して検出した、精製および濃縮したｎｍｔ５５、についてのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、様々な新生物、癌、腫瘍および転移細胞に結合する抗体に、少なくとも一部、基づく。非限定的な例示的抗体は、ブタペスト条約の条項のもと２００３年１１月６日にｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（「ＤＳＭＺ」−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  ｌｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるような、指定ＬＭ−１抗体である。細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体は、様々な新生物、癌、腫瘍および転移細胞に特異的に結合するヒトＩｇＭ抗体である。従って、ＬＭ−１は、様々な新生物、癌、腫瘍および転移細胞上で発現される抗原に結合する。ＬＭ−１は、様々な新生物、癌、腫瘍および転移細胞の増殖を抑制または低減することができる。ＬＭ−１は、様々な新生物、癌、腫瘍および転移細胞のアポトーシスを刺激または誘導することもできる。
【００３０】
本発明は、ＬＭ−１のターゲット、すなわちＬＭ−１に結合する抗原、の同定にも、少なくとも一部、基づく。本明細書に開示するように、ＬＭ−１抗体は、５４ｋＤａ核ＲＮＡ−およびＤＮＡ−結合タンパク質（ｐ５４ｎｒｂ）ならびに５５ｋＤａ核タンパク質（ｎｍｔ５５）としても公知である、非ｐｏｕドメイン含有オクタマー結合タンパク質（ＮＯＮＯ）に結合する。ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５は、新生物、癌、腫瘍または転移の治療のターゲットになり得る。ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５は、新生物、癌、腫瘍または転移の診断指標になり得る。例えば、細胞表面でのＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５の検出は、新生物、癌、腫瘍または転移の存在を示すことができる。ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５は、ワクチンにもなり得る。例えば、細胞表面ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５を発現する新生物、癌、腫瘍または転移を有する患者にＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５を投与して、該新生物、癌、腫瘍または転移に対する免疫応答を惹起することができる。
【００３１】
本発明の抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。抗体は、アミド結合または等価のものにより共有結合で連結されたアミノ酸、すなわち「残基」、を含むタンパク質である。抗体に関して用いるときの用語「モノクローナル」は、任意の真核性、原核性またはファージクローンを含む、単一のクローンに基づく、単一のクローンから得られるまたは単一のクローンに由来する抗体を指す。従って、「モノクローナル」抗体は、本明細書では構造的に定義しており、それを生産する方法ではない。
【００３２】
本発明の抗体は、任意の抗体クラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはサブクラスに属する場合がある。ＩｇＧの例示的サブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。
【００３３】
本発明の抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖配列、自然に存在する抗体の場合のような完全長、それらの混合物（例えば、カッパ鎖配列とラムダ鎖配列の融合体）、およびそれらの部分配列／フラグメントのいずれか、を有する場合がある。自然に存在する抗体分子は、２つのカッパ軽鎖または２つのラムダ軽鎖を含有する。
【００３４】
様々な重鎖および軽鎖可変領域配列、配列番号１〜１０、によって表される、ＬＭ−１抗体のアミノ酸配列および核酸配列は、以下の通りである：
太字で示す違いがある、アミノ酸配列（配列番号１、３、５、７および９）ならびに核酸配列（配列番号２、４、６、８および１０）によってそれぞれ表されるような、ヒトモノクローナル抗体ＬＭ−１の重鎖可変領域は、以下のとおりである：
下記配列番号１によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のアミノ酸配列：
【００３５】
【化１】
2015131850.tif 000006
下記配列番号３（１ＢＴＡ１．１６ＶＨ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のアミノ酸配列
：
【００３６】
【化２】
2015131850.tif 000007
下記配列番号５（１ＢＴＡ１．７ＶＨ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のアミノ酸配列：
【００３７】
【化３】
2015131850.tif 000008
下記配列番号７（１ＢＴＡ２．５ＶＨ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のアミノ酸配列：
【００３８】
【化４】
2015131850.tif 000009
下記配列番号９（ＶＨＬ１ｏｐｔ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のアミノ酸配列：
【００３９】
【化５】
2015131850.tif 000010
下記配列番号２によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のヌクレオチド配列：
【００４０】
【化６】
2015131850.tif 000011
下記配列番号４（１ＢＴＡ１．１６ＶＨ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のヌクレオチド酸配列：
【００４１】
【化７】
2015131850.tif 000012
下記配列番号６（１ＢＴＡ１．１７ＶＨ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のヌクレオチド酸配列：
【００４２】
【化８】
2015131850.tif 000013
下記配列番号８（１ＢＴＡ２．５ＶＨ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のヌクレオチド酸配列：
【００４３】
【化９】
2015131850.tif 000014
下記配列番号１０（ＶＨＬ１ｏｐｔ）によって表されるような、ＬＭ−１重鎖可変（ＶＨ）領域配列のヌクレオチド酸配列：
【００４４】
【化１０】
2015131850.tif 000015
アミノ酸配列（配列番号１１および１３）ならびに核酸配列（配列番号１２および１４）によってそれぞれ表されるような、ＬＭ−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、以下の通りである：
下記配列番号１１によって表されるような、ＬＭ−１軽鎖可変（ＶＬ）領域配列のアミノ酸配列：
【００４５】
【化１１】
2015131850.tif 000016
下記配列番号１３（ＶＫＬ１ｏｐｔ）によって表されるような、ＬＭ−１軽鎖可変（ＶＬ）領域配列のアミノ酸配列：
【００４６】
【化１２】
2015131850.tif 000017
下記配列番号１５によって表されるような、ＬＭ−１軽鎖（Ｌ）配列のアミノ酸配列：
【００４７】
【化１３】
2015131850.tif 000018
下記配列番号１２（１ＢＴＡ１．１６ＶＬ）によって表されるような、ＬＭ−１軽鎖可変（ＶＬ）領域配列のヌクレオチド酸配列：
【００４８】
【化１４】
2015131850.tif 000019
下記配列番号１４（ＶＫＬ１ｏｐｔ）によって表されるような、ＬＭ−１軽鎖可変（ＶＬ）領域配列のヌクレオチド酸配列：
【００４９】
【化１５】
2015131850.tif 000020
重鎖および軽鎖のそれぞれに３つある予測ＣＤＲを本明細書では適便にＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３；ならびにＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３と示す。ＣＤＲのナンバリングが、アミノ末端からはじまる本明細書に示す配列のアミノ酸残基番号に準拠し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従わないことを除き、ＣＤＲ位置は、Ｋａｂａｔの定義（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  （１９８７）、およびＫａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９１））に準拠したものである。重鎖可変領域ＣＤＲ配置は、それらのフレームワーク残基との９５％配列同一性のためハーセプチン抗体可変領域（ＰＤＢファイル１Ｎ８Ｚ）を手本にし、および軽鎖可変領域ＣＤＲ配置は、それらのフレームワーク残基との８２％配列同一性のためＰＤＢファイル２ＲＨＥａを手本にした。
【００５０】
例示的重可変領域鎖の予測ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１；ＶＳＧＧＳＩＳＳＧＧＹＹ、ＣＤＲ２；ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ、およびＣＤＲ３；ＶＤＡＲＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＤＡＦＤＩである。重鎖のＣＤＲＩは、アミノ酸２４〜３５をコードするヌクレオチド７２〜１０５にわたり、ＣＤＲ２は、アミノ酸５２〜６７をコードするヌクレオチド１５６〜２０１にわたり、およびＣＤＲ３は、アミノ酸１００〜１１８をコードするヌクレオチド３００〜３５４にわたる。
【００５１】
例示的軽可変領域鎖の予測ＣＤＲ配列は、９０〜１０１、ＣＤＲ１；ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ、ＣＤＲ２；ＤＮＮＫＲＰＳＧ、およびＣＤＲ３；ＧＴＷＤＳＳＬＳＡＧＷＶである。ラムダ軽鎖のＣＤＲ１は、位置２３〜３５にあるアミノ酸をコードするヌクレオチド６９〜１０５にわたる。ＣＤＲ２は、アミノ酸５１〜５８をコードするヌクレオチド１５３〜１７４にわたり、およびＣＤＲ３は、ヌクレオチド２７０〜３０３にわたり、アミノ酸９０〜１０１をコードする。
【００５２】
本発明に従って、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によってそれぞれ表されるようなＬＭ−１抗体に構造的におよび／または機能的に関連した、単離および精製された抗体および機能性（例えば、細胞または抗原結合）フラグメントを提供する。様々な実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合する。追加の実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）または腺癌細胞もしくは扁平上皮癌への結合について競合する。
【００５３】
本発明に従って、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５タンパク質に結合する、単離および精製された抗体および機能性（例えば、細胞または抗原結合）フラグメントも提供する。様々な実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、Ｎ末端ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５アミノ酸配列領域（例えば、ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５のアミノ酸１〜３００）に結合する。１つの態様において、ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５は、
【００５４】
【化１６】
2015131850.tif 000021
に示される配列を含む。
【００５５】
もう１つの態様において、ＮＯＮＯ−ｎｍｔ５５は、
【００５６】
【化１７】
2015131850.tif 000022
に示される配列を含む。
【００５７】
さらなる実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病のうちの１つ以上への結合について競合する。さらなる追加の実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、抗原（ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への、または胃腺癌（例えば、散在型または腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管または小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織または脳腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、ならびに白血病のうちの１つ以上への結合について競合する。尚、さらなる実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について競合する。特定の態様において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合を、競合的に、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上抑制する。
【００５８】
本発明に従って、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体および機能性フラグメントを提供する。１つの実施形態において、単離または精製された抗体またはその機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する。特定の態様において、前記抗体またはその機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する腺癌細胞もしくは扁平上皮癌上に存在する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する。追加の特定の態様において、前記抗体またはその機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する胃腺癌（例えば、散在型または腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管または小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織または脳腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、ならびに白血病のうちの１つ以上に結合する。さらなる特定の態様において、前記抗体またはその機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞上に存在する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する。
【００５９】
抗体または機能性フラグメントに関して用いるときの用語「結合する」または「結合」は、その抗体または機能性フラグメントが、細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）上に存在する対応するエピトープ（抗原決定基）と分子レベルで相互作用することを意味する。アミノ酸を含む抗原のエピトープは、概して、比較的短い配列、例えば約５から１５アミノ酸の長さ、を含む。エピトープは、連続している場合もあり、または連続していない場合もある。非連続アミノ酸配列エピトープは、タンパク質フォールディングのため形成する。エピトープを同定するための技術は、当業者に公知であり、それらとしては、抗体への結合についてオーバーラップするオリゴペプチドのスクリーニング（例えば、米国特許第４，７０８，８７１号）、エピトープマッピングのための市販されているファージ・ディスプレー・ペプチド・ライブラリー・キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）が挙げられる。エピトープ長ペプチド配列を用いて動物を免疫するとき、そのペプチド配列に結合するどの抗体が得られるのかを推論することによりエピトープを同定することもでき、およびＢＥＰＩＴＯＰＥ（Ｏｄｏｒｉｃｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１６：２０（２００３））などのコンピュータプログラムを用いてそれらを予測することができる。
【００６０】
本発明は、細胞成長もしくは増殖を抑制、減少もしくは低減するか、または細胞死、溶解もしくはアポトーシスを刺激もしくは誘導する抗体および機能性フラグメントをさらに提供する。特定の実施形態において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の新生物、腫瘍もしくは癌、または転移細胞への結合は、細胞成長もしくは増殖を抑制、減少もしくは低減する場合もあり、または細胞死、溶解もしくはアポトーシスを刺激もしくは誘導する場合もある。もう１つの実施形態において、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合は、細胞成長もしくは増殖を抑制、減少もしくは低減するか、または細胞死、溶解もしくはアポトーシスを刺激もしくは誘導する。さらなる実施形態では、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合。
【００６１】
本発明は、配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３とのある程度の同一性を示す、または配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３内の配列（例えば、１つ以上のＣＤＲ、例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）とのある程度の同一性を示す重鎖または軽鎖可変領域配列を含む、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に構造的におよび／または機能的に関連している、抗体および機能性フラグメントをさらに提供する。特定の実施形態において、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖または軽鎖配列可変領域との、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体内の配列（例えば、１つ以上のＣＤＲ、例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）との約６０％以上の同一性を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含む。他の特定の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖可変領域配列との、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体内の配列（例えば、１つ以上のＣＤＲ、例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）との少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性を有する重鎖または軽鎖を含む。追加の特定の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）との少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％または９５〜１００％の同一性を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含む。特定の態様において、抗体またはその機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体におけるそれぞれの重鎖または軽鎖可変領域配列内の１、２または３つのＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）との９５〜１００％同一性を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含む。
【００６２】
従って、本発明の抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体との少なくとも部分的な配列同一性を有するものを含む。そのような抗体および機能性フラグメントの同一パーセントは、６０％ほどの小ささである場合もあり、またはより大きい（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）場合もある。
【００６３】
前記同一パーセントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の全配列長にわたる場合もあり、または細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体内の連続領域もしくはエリアにわたる場合もある。特定の態様において、前記同一パーセントを共有する配列の長さは、５以上連続したアミノ酸、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５など連続したアミノ酸である。追加の特定の態様において、前記同一パーセントを共有する配列の長さは、２５以上連続したアミノ酸、例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５など連続したアミノ酸である。さらに特定の態様において、前記同一パーセントを共有する配列の長さは、３５以上連続したアミノ酸、例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０など連続したアミノ酸である。さらなる追加の特定の態様において、前記同一パーセントを共有する配列の長さは、５０以上連続したアミノ酸、例えば、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１１０など連続したアミノ酸である。尚、さらなる特定の態様において、前記同一パーセントを共有する配列の長さは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、もしくは７、および９として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体などの重もしくは軽鎖配列の可変領域配列の任意のＣＤＲ（例えば配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）の長さ、または可変領域内だがＣＤＲの外部の領域の長さに等しい。
【００６４】
用語「同一性」およびその文法上の語尾変化は、２つ以上の参照するエンティティーが同じであることを意味する。従って、２つの抗体配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照する領域または部分内に、同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照する領域または部分内に、同じポリヌクレオチド配列を有する。この同一性は、その配列の被定義エリア（領域またはドメイン）にわたり得る。「同一性エリア」は、同じである２つ以上の参照するエンティティーの部分を指す。従って、２つのタンパク質または核酸配列が、１つ以上の配列領域にわたって同一である場合、それらは、その領域内で同一性を共有する。例示的同一性は、参照抗体または機能性フラグメント、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体またはその部分配列との５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸を有する抗体および機能性フラグメントである。
【００６５】
用語「相同性の」または「相同性」は、２つ以上の参照するエンティティーが、所与の領域または部分にわたって少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。相同性または同一性「エリア、領域またはドメイン」は、２つ以上の参照するエンティティーの一部分が相同性を共有するまたは同じであることを意味する。従って、２つの抗体配列が、１つ以上の配列領域にわたって同一である場合、それらは、これらの領域において同一性を共有する。「実質的相同性」は、分子が、その参照分子、または相同性を共有するその参照分子の関連／対応領域もしくは部分、の構造もしくは機能（例えば、生物学的機能）の１つ以上についての少なくとも一部の構造もしくは機能を有するまたは有すると予測されるように、構造的にまたは機能的に保存されていることを意味する。実質的相同性を有する抗体または機能性フラグメントは、参照抗体と同様の活性または機能を少なくとも一部有するまたは有すると予測される。例えば、特定の実施形態において、１つ以上の修飾（例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の置換、欠失または付加）を有する、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について少なくとも部分的に競合する能力を保持し、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原への部分的な結合を少なくとも保持し、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体との実質的な相同性を有すると考えられる。
【００６６】
２配列間の同一性（相同性）の程度は、当該技術分野において公知のコンピュータプログラムおよび数学的アルゴリズムを用いて確かめることができる。配列同一（相同性）パーセントを計算するそのようなアルゴリズムは、一般に、比較領域またはエリアにわたって配列ギャップおよびミスマッチを計算に入れる。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）検索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）参照；ＮＣＢＩを通して公的に入手可能）は、次のような例示的検索パラメータを有する：ミスマッチ  −２；ギャップ開始  ５；ギャップ伸長  ２。ポリペプチド配列比較には、概して、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがスコア行列、例えばＰＡＭ  １００、ＰＡＭ  ２５０、ＢＬＯＳＵＭ  ６２またはＢＬＯＳＵＭ  ５０、と併用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）ならびにＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも、同一性の程度を定量するために用いられる（Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１３２：１８５（２０００）；およびＳｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１））。ドローネー（Ｄｅｌａｕｎａｙ）系トポロジーマッピングを用いるタンパク質構造類似性を定量するためのプログラムも開発された（Ｂｏｓｔｉｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：３２０（２００３））。
【００６７】
本発明の抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の少なくとも１つ以上の部分的活性または機能を保持するものを含む。本明細書に開示するような、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）は、悪性および非悪性、新生物、腫瘍および癌細胞上で発現される。細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に結合する、従って、ＬＭ−１のターゲット抗原を発現する細胞の非限定的な例としては、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管および小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、ならびに白血病、または肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、もしくは肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞のうちの１つ以上が挙げられる。従って、様々な実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に、あるいは１つ以上の細胞、例えば、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫もしくは小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性もしくは腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌もしくは腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病、あるいは肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９���（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ
３９３）細胞に結合する。
【００６８】
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体および機能性フラグメントは、細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に対して、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体より大きい相対結合親和性を有する場合もあり、または小さい相対結合親和性を有する場合もある。従って、本発明の追加の抗体および機能性フラグメントは、細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性より大きい、該結合親和性とほぼ同じ、または該結合親和性より小さい親和性を有するものを含む。例えば、本発明の抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に比べて、２〜５、５〜１０、１０〜１００、１００〜１０００もしくは１０００〜１０，０００倍親和性、または前述の値内もしくは前述の値を包含する任意の数値もしくは範囲、より大きい親和性を有することもあり、または小さい親和性を有することもある。１つの実施形態において、抗体またはその機能性は、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への、または新生物、癌、腫瘍もしくは転移細胞への結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性の約１〜５０００倍以内の結合親和性を有する。もう１つの実施形態において、抗体またはその機能性フラグメントは、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への、あるいは胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫もしくは小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性もしくは腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌もしくは腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番���ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性の約１〜５０００倍以内の結合親和性を有する。さらなる実施形態において、抗体またはその機能性は、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性の約１〜５０００倍以内の結合親和性を有する。前述の実施形態において、結合親和性は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の結合親和性より１〜５０００倍大きい場合もあり、または小さい場合もある。
【００６９】
結合親和性は、会合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）速度によって決まるものであり得る。平衡親和定数、Ｋ、は、Ｋａ／Ｋｄの比である。会合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：５４（２０００）；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ，Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９（１９９８））を用いて測定することができる。結合速度の実時間検出およびモニタリングのための機器および方法は、公知であり、市販されている（ＢｉａＣｏｒｅ  ２０００，Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；およびＭａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５（１９９９））。
【００７０】
追加の具体的な非限定的抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に対して、約Ｋｄ  １０−２Ｍから約Ｋｄ  １０−５Ｍ、または約Ｋｄ  １０−６Ｍから約Ｋｄ  １０−１２Ｍの範囲内の結合親和性を有する。特定の実施形態において、結合親和性は、５ｘ１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５ｘ１０−３Ｍ、１０−３Ｍ  ５ｘ１０−４Ｍ、１０−４Ｍ  ５ｘ１０−５Ｍ、１０−５Ｍ  ５ｘ１０−６Ｍ、１０−６Ｍ  ５ｘ１０−７Ｍ、１０−７Ｍ  ５ｘ１０−８Ｍ、１０−８Ｍ  ５ｘ１０−９Ｍ、１０−９Ｍ  ５ｘ１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ  ５ｘ１０−１１Ｍ、５ｘ１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ  ５ｘ１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ  ５ｘ１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ  ５ｘ１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍ未満である。特定の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）へのまたは新生物、腫瘍、癌もしくは転移細胞への結合について、約Ｋｄ  １０−５Ｍから約Ｋｄ  １０−１３Ｍの範囲内の結合親和性を有する。追加の特定の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫もしくは小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性もしくは腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌もしくは腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞もしくは腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、または白血病への結合について、約Ｋｄ  １０−５Ｍから約Ｋｄ  １０−１３Ｍの範囲内の結合親和性を有する。さらなる特定の実施形態において、抗体または機能性フラグメントは、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞への結合について、約Ｋｄ  １０−５Ｍから約Ｋｄ  １０−１３Ｍの範囲内の結合親和性を有する。
【００７１】
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と細胞へのまたは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合する、抗体および機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ
２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体より大きいもしくは小さい相対細胞増殖抑制もしくは低減活性、または大きいもしくは小さい細胞アポトーシス誘導もしくは刺激活性を有する場合がある。従って、本発明の抗体および機能性フラグメントは、ＬＭ−１抗体が結合する細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合するもの、ＬＭ−１抗体と細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合するもの、および細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体より大きいもしくは小さい相対細胞増殖抑制もしくは低減活性、または大きいもしくは小さい相対細胞アポトーシス誘導もしくは刺激活性を有するものを含む。
【００７２】
従って、本発明の抗体は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体とは異なる配列を有するが、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上の活性または機能を少なくとも一部は保持するものを含む。例示的活性および機能としては、例えば、ＬＭ−１抗体が結合する細胞への結合；ＬＭ−１抗体が結合する抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合；細胞へのまたは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合についてのＬＭ−１抗体との競合；細胞成長もしくは増殖の抑制もしくは低減、または細胞死、溶解もしくはアポトーシスの刺激もしくは誘導（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移細胞）；胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸癌、例えば腺癌、卵巣癌腫、肺癌、例えば肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫および小細胞肺癌腫、黒色腫、小葉性および腺管性の乳房の癌腫、乳癌、例えば侵襲性腺管もしくは小葉癌、胃癌、膵臓癌、例えば膵腺癌（例えば、腺管性のもの）、肉腫、胃腸癌、例えば胃癌、神経組織もしくは脳の腫瘍、例えば神経膠腫、食道癌、例えば食道扁平上皮癌および腺癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺癌、例えば前立腺腺癌、腎臓癌、例えば腎癌腫、卵巣癌、例えば腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、例えば扁平上皮細胞および腺癌、子宮癌、例えば腺癌、ホジキン病、リンパ腫、ならびに白血病のうちの１つ以上への結合；肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、もしくは肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞成長もしくは増殖の抑制、または肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、もしくは肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞死、溶解もしくはアポトーシスの刺激もしくは誘導などが挙げられる。
【００７３】
従って、本発明に従って修飾抗体および機能性フラグメントも提供するが、但し、前記修飾形が、未修飾もしくは参照抗体、または機能性フラグメント、の活性または機能の少なくとも一部を保持することを条件とする。１つの実施形態において、抗体またはその機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上のアミノ酸付加、欠失または置換を有する重鎖または軽鎖可変領域配列を含むが、但し、前記抗体または機能性フラグメントが、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなインタクト完全長ＬＭ−１抗体の少なくとも部分的な活性または機能を保持することを条件とする。１つの態様において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上のアミノ酸付加、欠失または置換を有する抗体または機能性フラグメントは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合する。もう１つの態様において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上のアミノ酸欠失、置換または付加を有する抗体または機能性フラグメントは、ＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する。追加の態様において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上のアミノ酸欠失、置換または付加を有する抗体または機能性フラグメントは、ＬＭ−１抗体が増殖を抑制または低減する細胞の増殖を抑制または低減する。さらなる態様において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の１つ以上のアミノ酸欠失、置換または付加を有する抗体または機能性フラグメントは、ＬＭ−１抗体が死、溶解またはアポトーシスを刺激または誘導する細胞の死、溶解またはアポトーシスを刺激または誘導する。尚、さらなる特定の態様において、細胞成長または増殖は、対照（未処理）��胞と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％以上、または前述のパーセント値内もしくは前述のパーセント値を包含する任意の数値もしくは範囲、抑制、減少または低減される。尚、さらに特定の態様において、細胞死、溶解またはアポトーシスは、対照（未処理）細胞と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％以上、または前述のパーセント値内もしくは前述のパーセント値を包含する任意の数値もしくは範囲である。
【００７４】
本明細書において用いる場合、用語「修飾する」およびその文法上の語尾変化は、その組成が参照組成から外れることを意味する。そのような修飾タンパク質、核酸および他の組成物は、参照未修飾タンパク質、核酸もしくは組成物より大きいもしくは小さい活性、または参照未修飾タンパク質、核酸もしくは組成物とは異なる機能を有することがある。
【００７５】
置換、付加および欠失を含む修飾体を「変異体」と呼ぶこともできる。アミノ酸変異体の具体的な非限定的例としては、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体フラグメントおよび部分配列が挙げられる。例示的ＬＭ−１抗体部分配列およびフラグメントとしては、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の一部分であって、細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合についてＬＭ−１抗体と少なくとも部分的に競合する部分、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合活性を少なくとも一部保持する部分、あるいはＬＭ−１抗体が増殖を抑制または低減する細胞の増殖を抑制または低減する能力を保持する部分、あるいはＬＭ−１抗体が死、溶解またはアポトーシスを刺激または誘導する細胞の死、溶解またはアポトーシスを刺激または誘導する能力を保持する部分が挙げられる。
【００７６】
本明細書において用いる場合、用語「フラグメント」または「部分配列」は、完全長分子の一部分を意味する。従って、抗体のフラグメントまたは部分配列は、完全長インタクト参照抗体より１つ以上少ないアミノ酸（例えば、重もしくは軽鎖可変もしくは定常領域の１つ以上の内部アミノ酸欠失または重もしくは軽鎖可変もしくは定常領域のアミノまたはカルボキシ末端いずれかからの１つ以上の末端アミノ酸欠失）を有する。核酸フラグメントは、完全長比較核酸配列より少なくとも１つ少ないヌクレオチドを有する。従って、フラグメントは、完全長天然分子以下の任意の長さを有し得る。
【００７７】
抗体に言及するときの用語「機能性フラグメント」および「機能性部分配列」は、機能または活性を有する抗体の一部分を指す。例えば、機能性フラグメントは、インタクト参照抗体の場合の１つ以上の部分的機能または活性、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の機能または活性を保持することができる。例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるような完全長インタクトＬＭ−１抗体の細胞へのまたは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合するＬＭ−１抗体部分配列、あるいは完全長インタクトＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合するＬＭ−１抗体部分配列は、機能性部分配列であると考えられる。
【００７８】
一本鎖抗体を含めて、抗体フラグメントは、重鎖または軽鎖可変領域（単数または複数）（例えば、１つ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３、それぞれ、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）のすべてまたは一部を、単独で、または次のものの１つ以上についてのすべてもしくは一部分との組み合わせで含む場合がある：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。重鎖または軽鎖可変領域（単数または複数）（例えば、１つ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３、それぞれ、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせの抗原結合部分配列も含む。
【００７９】
本発明の例示的抗体部分配列およびフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ、ＶＨ、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディー（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディー（三価）、テトラボディー（四価）、ミニボディー（（ｓｃＦＶ−ＣＨ３）２）、二重特異性一本鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧデルタＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃが挙げられる。そのような部分配列およびフラグメントは、完全長抗体のような結合親和性、完全長抗体のような結合特異性、または完全長抗体の場合のものの１つ以上の活性もしくは機能、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の機能または活性を有する場合がある。
【００８０】
抗体部分配列およびフラグメントを組み合わせることができる。例えば、ＶＬまたはＶＨ部分配列をリンカー配列によって連結し、それによってＶＬ−ＶＨキメラを形成することができる。詳細には、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖可変配列を、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の軽鎖可変配列と組み合わせることができる。従って、本発明は、１）細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９として示す重鎖可変配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖可変配列、２）細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号９として示す軽鎖可変配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の軽鎖可変配列を、単独で、および互いとの組み合わせで提供する。一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）部分配列の組み合わせをリンカー配列によって連結し、それによって、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖキメラを形成することができる。抗体部分配列およびフラグメントは、一本鎖抗体または可変領域（単数または複数）を単独で、または他の部分配列のすべてもしくは一部分との組み合わせで含む。
【００８１】
修飾タンパク質は、アミノ酸置換をさらに含む。置換は、保存的である場合もあり、または非保存的である場合もあり、および細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の定常領域に存在することもあり、または可変（例えば、超可変、例えばＣＤＲもしくはＦＲ）領域に存在することもある。特定の実施形態において、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるような、修飾ＬＭ−１抗体は、１つのまたは２、３の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する。
【００８２】
抗原結合に寄与する抗体構造決定因子、例えば、超可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ、これは、重鎖および軽鎖配列それぞれの中に３つあり、適便にＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３；ならびにＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３に示される；それぞれ、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、および配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）は、当業者に公知である。追加の領域、例えばＤおよびＪ領域、の位置も当業者に公知である。１つ以上のＣＤＲ配列が、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の少なくとも部分的な機能または活性、例えば、細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）結合、結合親和性（例えば、Ｋｄ）、細胞増殖抑制、または細胞アポトーシスの刺激もしくは誘導などを保持するために十分な、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体との配列同一性を有する、抗体およびそれらの部分配列。
【００８３】
従って、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の定常または可変領域におけるアミノ酸置換は、許容される可能性が高い。部分的な細胞もしくは抗原結合活性が少なくとも保持されるあるいは部分的な細胞増殖抑制またはアポトーシス刺激もしくは誘導活性が少なくとも保持されるのであれば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体のＣＤＲの外部の可変領域における１つの、２、３のまたは幾つかの置換も許容される可能性が高い。少なくとも部分的な細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）結合活性が少なくとも保持される（すなわち、細胞または抗原結合が破壊されない）、あるいは部分的細胞増殖抑制またはアポトーシス刺激もしくは誘導活性が少なくとも保持されるのであれば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、および配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）における１つのまたは２、３の保存的置換も許容される可能性が高い。細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ）における多くのアミノ酸の非保存的置換は、細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）結合活性、結合親和性（例えばＫｄ）、または抗体機能もしくは活性、例えば細胞増殖抑制、細胞アポトーシス刺激もしくは誘導、などのうちの１つ以上に影響を及ぼす可能性が高い。
【００８４】
「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、生物学的に、化学的にまたは構造的に類似した残基による置き換えである。生物学的に類似したとは、その置換が、生物活性、例えば細胞結合または細胞増殖抑制またはアポトーシス誘導もしくは刺激活性、を破壊しないことを意味する。構造的に類似したとは、それらのアミノ酸が、類似した長さの側鎖を有する、例えばアラニン、グリシンおよびセリン、または類似したサイズを有することを意味する。化学的類似性は、残基が、同じ電荷を有するか、または親水性でもあり疎水性でもあることを意味する。特定の例としては、ある疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンでの別のものの置換、またはある極性残基での別のものの置換、例えば、アルギニンでのリシンの、グルタミン酸でのアスパラギン酸の、もしくはグルタミンでのアスパラギンの、セリンでのトレオニンの置換、およびこれらに類するものが挙げられる。
【００８５】
特定の実施形態において、重鎖または軽鎖超可変領域配列またはその中の領域、例えばＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３；配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）またはＦＲは、１〜１０、１〜５、１〜３またはそれより少ない（例えば、１もしくは２）のアミノ酸置換を有するであろう。追加の実施形態において、重鎖または軽鎖超可変領域配列内のアミノ酸置換は、１つより多くのＣＤＲ内でのものではない。追加の実施形態において、重鎖または軽鎖超可変領域配列内のアミノ酸置換は、ＣＤＲ内でのものではない。もう１つの実施形態において、超可変領域配列内の置換は、ＦＲ内でのものではない。
【００８６】
所与の修飾の効果をアッセイして、未修飾抗体、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、の細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）結合活性、親和性または抗体機能もしくは活性の少なくとも一部を保持する抗体および機能性フラグメントを同定することが容易にできる。例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の可変領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内または外部）におけるアミノ酸置換を、細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）結合、細胞増殖抑制または低減活性、細胞死、溶解またはアポトーシスの誘導または刺激などについてアッセイすることができる。
【００８７】
局所的突然変異性分析を用いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）における特定の置換の影響を予測することができる（Ｓｈａｐｉｒｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２５９（１９９９））。簡単に言うと、配列比較によって、ＩｇイントロンＤＮＡ内に位置するジおよびトリヌクレオチド配列の中での突然変異性の階層が示され、それによって、突然変異性がより大きいまたはより小さい領域が予測される。定量構造活性相関（ＱＳＡＲ）を用いて、抗体認識ドメインの性質、および従って、リガンド結合に関与するアミノ酸を同定することができる。そして次に、ＯＳＡＲに基づく予測モデルを用いて、置換（突然変異）の影響を予測することができる。例えば、その抗原と相互作用する抗体の会合および解離速度に対する突然変異の影響を利用して、両方の反応速度（ＫａおよびＫｄ）定数についての定量的予測モデルが構築されており、そしてまた、それを用いてその抗体に対する他の突然変異の影響を予測する（Ｄｅ  Ｇｅｎｓｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：２９８９７（２００２））。従って、当業者は、そのような分析を用いて、非置換抗体または機能性フラグメントの活性または機能を少なくとも一部分保持する抗体または機能性フラグメントを生じさせる結果となる可能性が高い抗体および機能性フラグメントのアミノ酸置換を同定することができる。
【００８８】
突然変異誘発のための残基または領域のもう１つの同定法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓによって記載されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１（１９８９））。ターゲット残基のうちの１つの残基または群を同定し（例えば、荷電残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）、中性のまたは負電荷を有するアミノ酸（最も望ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置換して、細胞内または外部の周囲水性環境とそれらのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。その後、それらの置換への機能的感受性を明示するドメインを、その置換部位でのまたはその置換部位に対するさらなるまたは他の変異体の導入により、精選する。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決めておくが、突然変異は予め決めておく必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の遂行能力を最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発をターゲットコドンまたは領域で行うことができ、発現された変異体を、抗原もしくは細胞結合について、または新生物、腫瘍、癌もしくは転移細胞のアポトーシスを誘導するもしくは増殖を抑制する能力についてスクリーニングする。
【００８９】
自然に存在するＬ−アミノ酸がＤ形アミノ酸で置換されることを除き、アミノ酸置換は、同じアミノ酸でのものであり得る。従って、修飾体は、Ｌ−アミノ酸を置換した１つ以上のＤ−アミノ酸、またはＬ−アミノ酸を置換したＤ−アミノ酸の混合物を含む。修飾体は、構造的および機能的類似体、例えば、合成もしくは非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体および誘導体化形態を有するペプチドミメティックも含む。
【００９０】
修飾形は、誘導体化配列、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基を形成するアミノ酸；塩、メチルおよびエチルエステルからの遊離カルボキシ基；Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成する遊離ヒドロキシル基、ならびに自然に存在するアミノ酸誘導体、例えば、プロリンについての４−ヒドロキシプロリン、リシンについての５−ヒドロキシリシン、セリンについてのホモセリン、リシンについてのオルチニンなどをさらに含む。当該技術分野において公知の方法（例えば、ＰＣＲに基づく部位特異的、欠失および挿入突然変異誘発、化学的修飾および突然変異誘発、架橋など）を用いて、修飾体を生産することができる。
【００９１】
修飾形は、付加および挿入を含む。例えば、付加は、タンパク質（例えば、抗体）、核酸または他の組成物への任意のタイプの分子の共有結合性または非共有結合性付着であり得る。概して、付加および挿入は、異なる活性または機能をもたらす。
【００９２】
付加物および挿入物としては、融合（キメラ）ポリペプチドまたは核酸配列が挙げられ、これは、その配列に共有結合で付着させた参照天然（野生型）配列中には通常存在しない１つ以上の分子を有する配列である。特定の例は、多機能タンパク質（例えば、多重特異性抗体）を生成するための別のタンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸配列である。
【００９３】
本発明に従って、異種ドメインを含む抗体、核酸および他の組成物を提供する。例えば、異種ドメインは、様々な異なるタイプの小さなまたは大きな機能性部分から成る場合がある。そのような部分としては、核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小さな有機化合物、例えば薬物（例えば、細胞抗増殖剤）、金属（金、銀）などが挙げられる。異種ドメインは、アミノ酸付加物または挿入物である場合もある。
【００９４】
異種ドメインの特定の非限定的例としては、例えば、タグ、検出可能な標識および細胞傷害剤が挙げられる。タグおよび検出可能な標識の具体的な例としては、酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）；酵素基質；リガンド（例えば、ビオチン）；受容体（アビジン）；放射性核種（例えば、Ｃ１４、Ｓ３５、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｈ３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、ガリウム−６７および６８、スカンジウム−４７（ｓｃａｎｔｉｕｍ−４７）、インジウム−１１１、ラジウム−２２３）；Ｔ７−、Ｈｉｓ−、ｍｙｃ−、ＨＡ−およびＦＬＡＧ−タグ；高電子密度試薬；エネルギー移動分子；常磁性標識；蛍光体（フルオレセイン、フルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｓｃａｍｉｎｅ）、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン）；発色団；化学発光剤（イミダゾール、ルシフェラーゼ、アクリジニウム、シュウ酸塩）；ならびに生物発光剤が挙げられる。細胞傷害剤（細胞毒）の具体的な例としては、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、毒素、コレラ毒素およびリシンが挙げられる。
【００９５】
異種ドメインの追加の例としては、例えば、抗細胞増殖剤（例えば、抗新生物、抗腫瘍もしくは抗癌、または抗転移剤）が挙げられる。抗細胞増殖剤（例えば、抗新生物、抗腫瘍もしくは抗癌、または抗転移剤、細胞毒など）の具体的な非限定的例は、本明細書に開示しており、当該技術分野において公知である。
【００９６】
２つのエンティティーが、少なくとも一部、異なる機能または活性を維持するように、タンパク質（例えば、抗体）、核酸または他の組成物と付加または挿入物（例えば、異種ドメイン）の間にリンカー配列を挿入してもよい。リンカー配列は、可撓性構造；規則二次構造を形成できないこと；またはいずれかのドメインを促進することができるもしくはいずれかのドメインと相互作用することができる疎水性もしくは荷電特性を含む、１つ以上の特性を有することができる。可撓性タンパク質領域において概して見つけられるアミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。他の近天然アミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａ、もリンカー配列において用いることができる。リンカー配列の長さは、様々であり得る（例えば、米国特許第６，０８７，３２９号参照）。リンカーとしては、化学的架橋および結合体化剤、例えば、スルホ−スクシンイミジル誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ）、ジスクシンイミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルグルタル酸塩（ＤＳＧ）およびジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）がさらに挙げられる。
【００９７】
付加のさらなる例としては、グルコシル化、脂肪酸、脂質、アセチル化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔａｔｉｏｎ）、ならびに保護／ブロック基および非常に多数の化学的修飾のいずれかによる誘導体化が挙げられる。他の変更および可能性は、当業者には容易にわかることなので、本発明の範囲内であると考えられる。
【００９８】
組成物の修飾語として用いる用語「単離された」は、その組成物が、人の手によって作られたものである、またはインビボ環境におけるそれらの自然に存在する１つ以上の他の成分から分離されていることを意味する。一般に、そのように分離された組成物には、それらが天然の場合、通常、会合している１つ以上の材料、例えば１つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜、が実質的にない。従って、単離された組成物は、その組成物が自然に存在する生物の細胞内の他の生体成分から、またはそれが（例えば、合成的にもしくは細胞培養により）生産される人工培地から、実質的に分離されている。例えば、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチドおよび核酸から実質的に分離されており、例えばポリペプチド、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリなどの、何百万ものポリペプチドまたは核酸配列の中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのライブラリを含まない。単離された核酸は、他のポリペプチドおよび核酸から実質的に分離されており、例えばポリペプチド、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリなどの、何百万ものポリペプチドまたは核酸配列の中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのライブラリを含まない。用語「単離された」は、その組成物の代替物理的形態を除外せず、例えば、単離されたタンパク質は、タンパク質多量体、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）または誘導体化形態を含むだろう。
【００９９】
組成物の修飾語として用いる用語「精製された」は、それが天然の場合、通常、会合している材料の大部分またはすべてが無い組成物を指す。従って、細胞から分離されたタンパク質は、標準的な方法により細胞成分から分離されたとき、実質的に精製されたとみなされる一方で、化学的に合成された核酸配列は、その化学的前駆体から分離されたとき、実質的に精製されたとみなされる。従って、精製されたとは、絶対純度を必要としない。さらに、「精製された」組成物を１つ以上の他の分子と組み合わせることができる。従って、用語「精製された」は、組成物の組み合わせを除外しない。
【０１００】
「精製された」タンパク質および核酸は、標準的な精製方法によって生産されたタンパク質および核酸を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現ならびに化学合成によって生産されたタンパク質および核酸も含む。「精製された」は、不純物レベルが、ヒトまたは非ヒト動物への投与について監督機関、例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、に許容されるレベルより下である組成物を指す。
【０１０１】
実質的純度は、質量で、分子の少なくとも約６０％以上であり得る。純度は、約７０％または８０％以上である場合もあり、より高い、例えば９０％以上である場合もある。純度は、より低い場合があり、例えば、製薬用担体中、重量％での分子の量は、６０％未満である場合もあるが、通常それが会合している他の成分と比較してその分子の相対比率のほうが高いであろう。純度は、例えばＵＶ分光法、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、気相）、ゲル電気泳動（例えば、銀またはクマシー染色）および配列分析（ペプチドおよび核酸）をはじめとする、任意の適切な方法によって決定することができる。
【０１０２】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産方法は、当該技術分野において公知である。例えば、キーホル・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）もしくはオボアルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの担体に場合によっては結合体化された、またはフロイント完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントと場合によっては混合された、および動物を免疫するために使用される、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）またはその免疫原性フラグメント。従来のハイブリドーマ技術を用いて、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に応答する免疫動物から脾細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合させることができる。そのハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡにより、例えば、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）との反応性についてスクリーニングすることができる。抗体および機能性フラグメントの追加の非限定的な特定のスクリーニングおよび選択法としては、ファージディスプレー、リボソームによるタンパク質−ｍＲＮＡ連結およびｍＲＮＡディスプレー、酵母、細菌、哺乳動物細胞またはレトロウイルス上でのディスプレー、インビトロコンパートメント化によるマイクロビーズ、タンパク質−ＤＮＡディスプレー、酵母２−ハイブリッドによる成長選択、タンパク質フラグメント相補性（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５（２００５））が挙げられる。
【０１０３】
細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と細胞へのまたは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合する抗体を、従来の競合結合アッセイを用いてスクリーニングおよび同定することができる。スクリーニングされた抗体を、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と細胞へのまたは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合する能力に基づいて、選択することができる。細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合についてＬＭ−１抗体と競合する能力、または細胞もしくは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）へのＬＭ−１抗体の結合を抑制、予防もしくは遮断する能力は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をはじめとする、当該技術分野において公知の様々なアッセイによって判定することができる。
【０１０４】
タンパク質および抗体、それらの部分配列およびフラグメント、ならびに他の修飾配列は、遺伝学的方法論によって生産することができる。そのような技術は、Ｃｏｓ細胞またはＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞へのタンパク質または抗体をコードする遺伝子のすべてまたは一部の発現を含む。そのような宿主細胞は、完全長を発現する場合もあり、またはフラグメント、例えばｓｃＦｖ、を発現する場合もある（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７（１９９１）、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；および米国特許第４，９４６，７７８号参照）。抗体および機能性フラグメント、ならびに核酸配列は、当業者に公知の方法、例えば自動ペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ参照）、を用いて化学合成することにより、生産することもできる。
【０１０５】
抗体の産生に適する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）は、当該技術分野において公知の様々な標準的タンパク質精製または組換え発現技術のいずれによって生産してもよい。例えば、細菌または真核細胞（例えば、酵母）をはじめとする細胞に、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）をトランスフェクトすることができる。Ｌｍ−１は、Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ
３８３）、または肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞などの細胞上にも存在する。従って、組換えＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）、全細胞、または細胞調製物、そのような細胞の細胞抽出物もしくは画分を使用して動物を免疫して、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ
２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体と細胞へのまたは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）への結合について競合する抗体、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体を生産することができる。
【０１０６】
免疫することができる動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシもしくは去勢ウシ、モルモットまたは霊長類が挙げられる。初回免疫処置およびいずれの任意の後続免疫処置も、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下経路によって行うことができる。後続免疫処置は、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）調製物の同じでの場合もあり、または異なる濃度での場合もあり、および規則的な間隔での場合もあり、または不規則な間隔での場合もある。
【０１０７】
動物としては、ヒトＩｇＧ遺伝子座を含むように遺伝子修飾されたものであって、従って、ヒト抗体を生産するために使用することができるものが挙げられる。内因性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物は、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号に記載されている。ヒトポリクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのさらなる方法が記載されている（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：８８９（２００２）；ＷＯ  ９８／２４８９３；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９６／３４０９６；ＷＯ  ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号参照）。ヒト抗体を生産するための技術の概要は、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５（１９９５））に記載されている。
【０１０８】
ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレー技術、またはそれらの組み合わせをはじめとする他の技術を用いて、抗体を産生させることもできる（例えば、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号参照；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．），１９８０、およびＨａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８も参照）。
【０１０９】
抗体部分配列およびフラグメントを、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、例えば、全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって、作製することができる。ペプシンでの酵素的切断によって生産された抗体部分配列およびフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２に示される５Ｓフラグメントを生じさせる。チオール還元剤を使用してこのフラグメントをさらに切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを生産することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接生産される（例えば、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号；ならびにＥｄｅｌｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｙｍｏｌ．１：４２２（１９６７）参照）。米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６（１９９１）；Ｓｈｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７９９５（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８（１９８８）に記載されているように、一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を生産することができる。抗体を切断する他の方法、例えば、一価軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的もしくは化学的方法も用いることができる。
【０１１０】
当業者に公知の方法を用いて、増加された結合親和性などの改変された特性を有する修飾抗体および機能性フラグメントを生産することができる。例えば、親和性成熟技術を用いて、抗体結合親和性を向上させることができる（ＵＳ  ２００４／０１６２４１３  Ａ１；米国特許第６，６５６，４６７号、同第６，５３１，５８０号、同第６，５９０，０７９号および同第５，９５５，３５８号；Ｆｉｅｄｌｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１５：９３１（２００２）；Ｐａｎｃｏｏｋら，Ｈｙｂｒｉｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ  ２０：３８３（２００１）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：８２５（１９９８）；Ｗｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６０３７（１９９８）；およびＯｓｂｏｕｒｎら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：１８１（１９９６））。
【０１１１】
例えば、ＣＤＲグラフト法（ＥＰ  ２３９，４００；Ｗ０９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、メニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ５９２，１０６；ＥＰ  ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９（１９９４））、および連鎖シフト法（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとする、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて、抗体をヒト化することができる。ヒトコンセンサス配列（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９（１９９４）；およびＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１））は、ヒト化抗体を生産するために以前に用いられている（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６００（１９９３））。
【０１１２】
キメラ抗体を生産するための方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号）。ある種の抗体からの可変ドメインで別の種の可変ドメインが置換されているキメラ抗体は、例えば、Ｍｕｎｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５９７（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４（１９８４）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３６４（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５（１９８９）；およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８（１９８９）に記載されている。
【０１１３】
抗体法においてさらに利用することができる適切な技術としては、親和精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムでの精製、またはこれらの技術の任意の組み合わせが挙げられる。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗体アイソタイプを判定することができ、例えば、マウスＩｇ吸着抗ヒトＩｇを用いてヒトＩｇを同定することができる。
【０１１４】
本発明に従って、抗体および機能性フラグメントを生産する方法をさらに提供する。１つの実施形態における方法は、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞、を動物に投与すること；ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）にまたはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞に結合する抗体の発現について前記動物をスクリーニングすること；ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞に結合する抗体を生産する動物を選択すること；および選択された動物から前記抗体を単離することを含む。もう１つの実施形態における方法は、ヒト免疫グロブリンを発現することができる動物に、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞を投与すること；ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）にまたはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞に結合する抗体を生産する動物から脾臓細胞を単離すること；前記脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを生産すること；およびＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）にまたはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞に結合する抗体の発現について前記ハイブリドーマをスクリーニングすることを含む。
【０１１５】
本発明に従って、本明細書に示すような抗体およびそれらの抗体の機能性フラグメントを発現する宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞を精製または単離するが、場合によっては、該宿主細胞は、発現された抗体または機能性フラグメントをコードする核酸で形質転換されたものではない。追加の実施形態において、宿主細胞は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体との５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％以上の配列同一性を有する重鎖または軽鎖配列を含む抗体または機能性フラグメントを発現する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の重鎖可変領域配列または軽鎖可変領域配列内の１つ以上のＣＤＲ（例えば、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、および配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）との少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％の同一性を有する重鎖または軽鎖配列を発現する。
【０１１６】
本発明に従って、単離および精製された核酸を提供する。本発明の核酸としては、数ある中でも、１）細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体に構造的にまたは機能的に関連している抗体および機能性フラグメントをコードする核酸配列：２）細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体をコードする核酸配列、あるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体との配列同一性を有する抗体および機能性フラグメントをコードする核酸配列とある程度の相補性または同一性を示す、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３のすべてまたは一部分（例えば、１つ以上のＣＤＲ、１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）を含む抗体および機能性フラグメントをコードする核酸配列；ならびに４）細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体との配列同一性を有する抗体および機能性フラグメントをコードする配列にハイブリダイズする核酸配列が挙げられる。
【０１１７】
特定の実施形態において、核酸配列は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体またはその機能性フラグメントの重鎖または軽鎖配列をコードする。もう１つの実施形態において、核酸配列は、配列番号１、３、５、７または９および１１または１３をコードする核酸配列と７５〜１００％相補的または同一である。さらなる実施形態において、核酸配列は、配列番号９をコードする核酸と７５〜１００％相補的または同一である。
【０１１８】
アミノ酸置換、付加または欠失を含む抗体などのタンパク質は、核酸によってコードされ得る。それ故に、アミノ酸置換、付加または欠失を含むタンパク質をコードする核酸配列も提供する。
【０１１９】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」およびこれらに類するものは、ホスホエステル結合または等価のものにより連結されている少なくとも２つ以上のリボまたはデオキシリボ核酸塩基対（ヌクレオチド）を指す。核酸は、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオシドを含む。核酸は、一本鎖、二本鎖または三本鎖、環状または線状分子を含む。例示的核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸、自然に存在するおよび自然に存在しない核酸、例えば合成核酸が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２０】
核酸は、様々な長さのものであり得る。核酸長は、概して、約２０ヌクレオチドから２０Ｋｂ、または前述の長さ内のもしくは前述の長さを包含する任意の数値もしくは範囲、１０ヌクレオチドから１０Ｋｂ、１から５Ｋｂ以下、１０００から約５００ヌクレオチド以下の長さにわたる。核酸は、より短い場合もあり、例えば、１００から約５００ヌクレオチド、または約１２から２５、２５から５０、５０から１００、１００から２５０、もしくは約２５０から５００ヌクレオチドの長さ、あるいは前述の長さ内のもしくは前述の長さを包含する任意の数値もしくは範囲もしくは値である場合もある。特定の実施形態において、核酸配列は、約１０から２０、２０から３０、３０から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から４００、４００から５００、５００から１０００、１０００から２０００ヌクレオチド、または前述の長さ内のもしくは前述の長さを包含する任意の数値もしくは範囲の長さを有する。追加の実施形態において、核酸配列は、長さが、配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３、またはそれらの部分配列、例えば、配列番号２のヌクレオチド７２〜１０５、１５３〜２０１もしくは３００〜３５４および配列番号１２のヌクレオチド６９〜１０５、１５３〜１７４もしくは２７０〜３０３、のいずれかをコードするような範囲にわたる。より短いポリヌクレオチドは、一般に、「オリゴヌクレオチド」または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡの「プローブ」と呼ばれる。しかし、そのようなオレゴヌクレオチドの長さに上限はない。
【０１２１】
ポリヌクレオチドは、Ｌ形またはＤ形およびそれらの混合物を含み、これらは、被験体に投与されたときに耐分解性になるようにこれらをさらに修飾されることがある。特定の例としては、被験体の様々な組織または体液中に存在するエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに対して耐性の５’および３’結合が挙げられる。
【０１２２】
本発明に従って、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体のすべてまたはフラグメントをコードする核酸にハイブリダイズする核酸配列を提供する。１つの実施形態において、核酸配列は、配列番号１、３、５、７もしくは９またはそれらの一部分（例えば、配列番号２のヌクレオチド７２〜１０５、１５３〜２０１もしくは３００〜３５４）をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする。もう１つの実施形態において、核酸配列は、配列番号１１もしくは１３またはそれらの一部分（例えば、配列番号１２の軽鎖可変領域ＣＤＲに対応するヌクレオチド位置、６９〜１０５、１５３〜１７４もしくは２７０〜３０３）をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする。さらなる実施形態において、核酸配列は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体のすべてまたは部分配列もしくはフラグメントをコードする核酸配列と少なくとも７５〜１００％相補的または相同的である。
【０１２３】
用語「ハイブリダイズする」およびその文法上の語尾変化は、核酸配列間の結合を指す。ハイブリダイズする配列は、一般に、参照核酸とのまたは参照配列に相補的な配列との約５０％より大きい相同性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の同一性）を有するであろう。参照配列と、例えば参照配列のアミノ酸配列をコードする核酸と、１００％または完全に相補的であるハイブリダイズする配列は、ミスマッチのない１００％塩基対合を示す。ハイブリダイズする配列間のハイブリダイゼーション領域は、概して、少なくとも約１２〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチド、１００〜２００ヌクレオチド以上、または前述の長さ内のもしくは前述の長さを包含する任意の数値もしくは範囲である。
【０１２４】
本発明に従って、アンチセンスポリヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、およびリボザイム核酸をさらに提供する。１つの実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、またはリボザイム核酸は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体をコードする核酸配列あるいは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３またはそれらの一部分をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズし、ならびに細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の発現を場合によっては低減する。もう１つの実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、またはリボザイム核酸は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７、９、１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体またはその部分配列（例えば、配列番号２のヌクレオチド７２〜１０５、１５３〜２０１もしくは３００〜３５４または配列番号１２のヌクレオチド６９〜１０５、１５３〜１７４もしくは２７０〜３０３）をコードする核酸配列と少なくとも６０％以上（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）相補的または相同的である。アンチセンスポリヌクレオチドは、約１０から２０、２０から３０、３０から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から４００、４００から５００、５００から１０００、１０００から２０００ヌクレオチド、または前述の長さ内のもしくは前述の長さを包含する任意の数値もしくは範囲の長さを有する場合がある。
【０１２５】
本明細書において用いる場合、用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に結合することができるポリヌクレオチドまたはペプチド核酸を指す。アンチセンスは、ＲＮＡ転写産物またはＤＮＡを結合する、一本鎖、二本鎖、三本鎖またはより多くの鎖のＲＮＡおよびＤＮＡポリヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。特定の例としては、センスＲＮＡに結合するＲＮＡおよびＤＮＡアンチセンスが挙げられる。例えば、一本鎖核酸は、細胞からのグリコーゲンの代謝、異化、除去または分解に関与するタンパク質転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）をターゲットにすることができる。アンチセンス分子は、概して、センス鎖に９５〜１００％相補的であるが、それらのヌクレオチドの一部しかセンス分子に結合しない「部分的に」相補的（１００％未満相補的、例えば９５％、９０％、８０％、７０％および時としてそれより少ない）、または前述のパーセント値内のもしくは前述のパーセント値を包含する任意の数値もしくは範囲である場合もある。
【０１２６】
三本鎖形成性アンチセンスは、二本鎖ＤＮＡに結合し、それによって遺伝子の転写を抑制することができる。遺伝子の転写開始部位に由来する、例えば、そのスタート部位から位置−１０と＋１０の間のオリゴヌクレオチドが、１つの特定の例である。
【０１２７】
遺伝子発現を抑制する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉと呼ばれる）は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら，Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７  （１９９８）；Ｆｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６  （１９９８）；ＷＯ  ０２／４４３２１；ＷＯ  ０１／６８８３６；ＷＯ  ００／４４８９５、ＷＯ  ９９／３２６１９、ＷＯ  ０１／７５１６４、ＷＯ  ０１／９２５１３、ＷＯ  ０１／２９０５８、ＷＯ  ０１／８９３０４、ＷＯ  ０２／１６６２０；およびＷＯ  ０２／２９８５８参照）。「ヘアピン」構造を形成するＲＮＡをコードする核酸によって、またはハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子を構成するコード核酸のそれぞれの末端からのＲＮＡの発現によって、ＲＮＡｉサイレンシングを誘導することができる。
【０１２８】
ＲＮＡの特異的切断を触媒する酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムを使用して、コードされたタンパク質の発現を抑制することができる。リボザイムは、相補的ターゲットＲＮＡを用いて配列特異的ハイブリッドを形成し、その後、その相補的ターゲットＲＮＡは切断される。具体的な例としては、例えば、グリコーゲンの代謝、異化、除去または分解に関与するタンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性切断を特異的におよび効率的に触媒することができる、遺伝子工学によって作られたハンマーヘッド・モチーフ・リボザイム分子が挙げられる。
【０１２９】
アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉおよび三本鎖形成性核酸を本明細書では総称して「抑制性核酸」または「抑制性ポリヌクレオチド」と呼ぶ。そのような抑制性核酸またはポリヌクレオチドは、それが結合するまたはターゲットにする配列の発現を抑制または低減することができ、および従って、コードされたタンパク質を適宜抑制または低減することができる。
【０１３０】
抑制性ポリヌクレオチドは、インビボで機能するために発現制御要素を必要としない。抑制性ポリヌクレオチドは、細胞によって吸収される場合もあり、または受動的拡散によって細胞に進入する場合もある。場合によっては、ベクターを用いて抑制性ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。抑制性ポリヌクレオチドは、核酸によってコードされて転写されることがある。さらに、細胞におけるまたはインビボでのコードされたアンチセンスの発現持続または増加のために、抑制性ポリヌクレオチドをコードする核酸を発現制御要素に作動可能に連結させることができる。抑制性核酸は、本明細書に開示するまたはデータベースにおいて入手できるタンパク質および核酸配列に基づいて設計することができる。
【０１３１】
核酸配列は、ヌクレオチドおよびヌクレオシド置換、付加および欠失、ならびに誘導体化形および融合／キメラ配列（例えば、組換えポリペプチドをコードするもの）をさらに含む。例えば、遺伝子コードの縮重のため、核酸は、  をコードする核酸、それらの修飾形および変異体に関して縮重した配列および部分配列を含む。他の例は、  をコードする配列に相補的な核酸である。
【０１３２】
核酸欠失体（部分配列およびフラグメント）は、約１０から２５、２５から５０または５０から１００ヌクレオチドを有する場合がある。そのような核酸は、細胞、培養基、生物学的サンプル（例えば、組織、器官、血液もしくは血清）における、または被験体における、ポリペプチド部分配列の発現に、遺伝子操作に（ＰＣＲ増幅のためのプライマーおよびテンプレートとして）、およびタンパク質をコードする配列の存在または量を（例えば、ハイブリダイゼーションによって）検出するためのプローブとして有用である。
【０１３３】
様々な標準的クローニングおよび化学合成技術を用いて、核酸を生産することができる。技術としては、抗体をコードする配列にアニールすることができるプライマー（例えば、縮重プライマー混合物）を使用するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡターゲットを用いる核酸増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない。化学合成（例えば、固相ホルホルアミダイト合成）または遺伝子からの転写によって核酸を生産することもできる。その後、それらの生産された配列をインビトロで翻訳し、またはプラスミドにクローニングし、増殖し、その後、細胞（例えば、宿主細胞、例えば酵母もしくは細菌、真核細胞、例えば動物もしくは哺乳動物細胞においてまたは植物において）発現させることができる。
【０１３４】
本発明に従って、本発明の核酸配列を含むベクターをさらに提供する。１つの実施形態において、ベクターは、本明細書に示すような抗体または機能性フラグメントをコードする核酸配列を含む。もう１つの実施形態において、ベクターは、    をコードする核酸配列を含む。
【０１３５】
ベクターとしては、ウイルスベクター、原核（細菌）ベクターおよび真核（植物、真菌、哺乳動物）ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、インビトロまたはインビボでの核酸の発現に使用することができる。「発現ベクター」と呼ばれる、そのようなベクターは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、その部分配列およびフラグメントをコードする核酸、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体の修飾形または変異体をコードする核酸、抑制性核酸をコードする核酸をはじめとする、核酸の導入に、ならびに細胞におけるまたは被験体におけるインビボでの、コードされたタンパク質または抑制性核酸の（例えば、溶液中でのまたは固相での）発現に有用である。
【０１３６】
ベクターは、核酸の操作にも用いることができる。遺伝子操作のために「クローニングベクター」を利用することができ、それを利用して、挿入された核酸を転写または翻訳することができる。
【０１３７】
ベクターは、一般に、インビトロまたはインビボでの細胞における増殖のための複製起点を含有する。ベクター内に存在する、発現制御要素をはじめとする、制御要素を、転写および翻訳を助長するために、適宜、含めることができる。
【０１３８】
ベクターは、選択マーカーを含む場合がある。「選択マーカー」は、その遺伝子を含有する細胞の選択に備える遺伝子である。「陽性選択」は、選択マーカーを含有する細胞が、陽性選択への暴露時に生き残るプロセスを指す。薬物耐性は、陽性選択マーカーの一例である−このマーカーを含有する細胞は、選択薬物を含有する培養基中で生き残るであろうが、このマーカーを欠く細胞は、死ぬであろう。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子、例えば、Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒ、およびピューロマイシンに対する耐性を付与するｐｕｒｏが挙げられる。他の陽性選択マーカー遺伝子としては、このマーカーを含有する細胞の同定またはスクリーニングを可能にする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子としては、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＧＦＰ様発色団、ルシフェラーゼ）についての遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、および表面マーカー、例えば、数ある中でもＣＤ８、が挙げられる。「陰性選択」は、陰性選択マーカーを含有する細胞が、適切な陰性選択剤への暴露時に死滅するプロセスを指す。例えば、単純疱疹ウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））を含有する細胞は、薬物ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性である。類似して、ｇｐｔ遺伝子は、細胞を６−チオキサンチンに対して感受性にする。
【０１３９】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（分裂中および非分裂中の細胞を感染させるにはレンチウイルス）、フォーミーウイルス（米国特許第５，６２４，８２０号、同第５，６９３，５０８号、同第５，６６５，５７７号、同第６，０１３，５１６号および同第５，６７４，７０３号；ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９）、アデノウイルス（米国特許第５，７００，４７０号、同第５，７３１，１７２号および同第５，９２８，９４４号）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純疱疹ウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に基づくベクター（米国特許第５，５６１，０６３）、レオウイルス、ロタウイルスゲノム、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）または乳頭腫ウイルス（Ｃｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９（１９８４）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，１９８２；Ｓａｒｖｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６（１９８１）；米国特許第５，７１９，０５４）に基づくものが挙げられる。アデノウイルスは、ゆっくりと複製するおよび／または最終分化した細胞を効率的に感染させ、ならびにゆっくりと複製するおよび／または最終分化した細胞にターゲッティングするために使用することができる。発現に有用な追加のウイルスベクターとしては、パラボウイルス、ノーウォークウイルス、コロナウイルス、パラミクソ−およびラブドウイルス、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス）ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられる。
【０１４０】
核酸を発現制御要素に作動可能に連結させると、核酸を発現させることができる。本明細書において用いる場合、用語「作動可能に連結された」は、述べている要素間の、それらをそれらの所期の様式で作動させるような、物理的または機能的関係を指す。従って、核酸に「作動可能に連結された」発現制御要素は、それらの制御要素が核酸の転写および適宜その転写産物の翻訳を調節することを意味する。
【０１４１】
用語「発現制御要素」は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼす核酸を指す。プロモーターおよびエンハンサーは、発現要素の特定の非限定的例である。「プロモーター配列」は、下流（３’方向）配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。このプロモーター配列は、転写開始を助長するヌクレオチドを含む。エンハンサーも遺伝子発現を調節するが、それが作動可能に連結されている遺伝子の転写スタート部位から離れたところで機能することができる。エンハンサーは、その遺伝子の５’または３’末端いずれかで、ならびにその遺伝子の内部で（例えば、イントロンまたはコーディング配列において）機能する。追加の発現制御要素としては、リーダー配列および融合パートナー配列、多重遺伝子の生成のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）要素、またはポリシストロン性、メッセージ、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするような遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、関心のある転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナル、および停止コドンが挙げられる。
【０１４２】
発現制御配列は、作動可能に連結された核酸の転写がシグナルまたは刺激の存在なしで発生する「構成的」要素を含む。作動可能に連結された核酸の発現を増加させるまたは減少させる、シグナルまたは刺激に応じて発現をもたらす発現制御要素は、「調節性」である。作動可能に連結された核酸の発現をシグナルまたは刺激に応じて増加させる調節性要素は、「誘導性要素」と呼ばれる。作動可能に連結された核酸の発現をシグナルまたは刺激に応じて減少させる調節性要素は、「抑制性要素」と呼ばれる（すなわち、そのシグナルが発現を減少させ；そのシグナルが除去されるまたは存在しないと、発現は増加される）。
【０１４３】
発現制御要素は、「組織特異的発現制御要素」と呼ばれる、特定の組織または細胞タイプにおいて活性な要素を含む。組織特異的発現制御要素は、特定の細胞または組織タイプにおいて、概して、より活性である。それらは、転写アクチベータ―タンパク質、または他の細胞または組織タイプと比較して、その特定の細胞もしくは組織タイプにおいて活性な他の転写調節因子によって認識されるからである。
【０１４４】
組織特異的発現制御要素としては、増殖亢進性細胞、例えば新生物、腫瘍および癌ならびに転移をはじめとする細胞増殖性疾患、において活性なプロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。そのようなプロモーターの特定の非限定的例は、ヘキソキナーゼＩＩ、ＣＯＸ−２、アルファ−フェトプロテイン、胎児性癌抗原、ＤＥ３／ＭＵＣ１、前立腺特異的抗原、Ｃ−ｅｒＢ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ逆転写酵素および低酸素応答性プロモーターである。
【０１４５】
細菌発現のための、構成的プロモーターとしては、Ｔ７、ならびに誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）が挙げられる。昆虫細胞系の場合、構成的または誘導性プロモーター（例えば、エクジソン）を使用することができる。酵母の場合、構成的プロモーターとしては、例えば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２、および誘導性プロモーター、例えばＧＡＬ、が挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｃｈ．１３，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；Ｇｒａｎｔら，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４  （１９８７），ｅｄｓ．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，１９８７，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｃｈ．３，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，１９８６；Ｂｉｔｔｅｒ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：６７３−６８４  （１９８７），ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＳｔｒａｔｈｅｒｎら，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８２）参照）。
【０１４６】
哺乳動物発現については、ウイルスまたは他の起源の構成的プロモーターを使用することができる。例えば、ＳＶ４０、またはウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）およびこれらに類するもの、または哺乳動物細胞のゲノムに由来する誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモーター；熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答要素）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；マウス乳癌ウイルスＬＴＲ）が使用される。
【０１４７】
本発明に従って、本発明の核酸およびベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、抗体、機能性フラグメント、重もしくは軽鎖配列、または重もしくは軽鎖配列の一部分（例えば、可変領域、または１つ以上のＣＤＲ、配列番号１、３、５、７もしくは９のアミノ酸２４〜３５、５２〜６７、もしくは１００〜１１８、または配列番号１１のアミノ酸２３〜３５、５１〜５８、もしくは９０〜１０１）をコードする核酸で細胞を安定的にまたは一過的に形質転換させる。もう１つの実施形態では、アンチセンスまたは抑制性核酸で細胞を安定的にまたは一過的に形質転換させる。
【０１４８】
宿主細胞としては、原核および真核細胞、例えば、細菌、真菌（酵母）、植物、昆虫および動物（例えば、霊長類およびヒトを含む、哺乳動物）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。前記細胞は、初代細胞分離株、細胞培養物（継代、樹立もしくは不死化細胞株）、多数の細胞の一部、またはエクスビボでのもしくは被験体における（インビボでの）組織もしくは器官である場合がある。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸もしくはコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイク・ウイルス、ＴＭＶ）に感染させたもしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させた動物細胞系、または安定した発現のために作り変えられた形質転換動物細胞系。
【０１４９】
細胞（例えば、宿主細胞）または生物に関して用いるときの用語「形質転換された」または「トランスフェクトされた」は、外来分子、例えばタンパク質または核酸（例えば、トランスジーン）、の細胞への組み込みの結果としてのその細胞における遺伝子変化を意味する。従って、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞は、外来分子が人の手により、例えば組換えＤＮＡ技術により、導入された細胞またはその後代である。
【０１５０】
細胞およびその後代において核酸を安定的にまたは一過的にトランスフェクトまたは形質転換する（発現する）ことができる。従って、宿主細胞は、安定的にまたは一過的に抗体、機能性フラグメントまたは核酸を発現するものを含む。その（それらの）細胞を増殖させて、導入された抗体を発現させる、または核酸を転写することができる。トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞の後代は、複製中に突然変異が発生することがあるので、親細胞と同一でないことがある。
【０１５１】
概して、細胞トランスフェクションまたは形質転換は、「ベクター」（これは、プラスミド、ウイルス、例えばウイルスベクター、または核酸の挿入もしくは組み込みにより操作することができる当該技術分野において公知の他のビヒクルを指す）を利用する。
【０１５２】
ターゲット細胞リガンドまたは受容体に結合する表面上にタンパク質を含めることにより、特定の細胞タイプ（例えば、増殖亢進性細胞）をターゲットにするようにウイルス粒子または小胞を設計することができる。あるいは、細胞タイプ特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーをベクターに含めて、ターゲット細胞において核酸を発現させることができる。従って、インビトロ、エクスビボまたはインビボでのトランスフェクションまたは形質転換のために、ウイルス粒子もしくは小胞それ自体、ウイルスベクター、またはウイルス表面上のタンパク質が、細胞をターゲットにするようにすることができる。
【０１５３】
ターゲット細胞（例えば、宿主細胞）への組成物（例えば、タンパク質および核酸）の導入は、当該技術分野において公知の方法、例えば、浸透圧ショック（例えば、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合などによって行うこともできる。他の技術を用いて、核酸およびポリペプチドのインビトロ、エクスビボおよびインビボでの導入を遂行することもできる。例えば、高分子物質、例えばポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン−ビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレンビニルアセテートコポリマー。コアセルベーション技術によりまたは界面重合により作製されたマイクロカプセルの中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルもしくはポリ（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｏｌａｔｅ））マイクロカプセルの使用により、核酸を捕捉することができ、またはコロイドシステムの中に核酸を捕捉することができる。コロイド分散システムとしては、高分子複合体、ナノ−カプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質系システム（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げられる。
【０１５４】
様々な組成物を細胞に導入するためのリポソームは、当該技術分野において公知であり、それらとしては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リポフェクチンおよびＤＯＴＡＰ（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、同第５，０００，９５９号、同第４，８６３，７４０号、および同第４，９７５，２８２号；ならびにＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）が挙げられる。遺伝子療法に有用なピペラジン系両性カチオン性脂質も公知である（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号参照）。カチオン性脂質システムも公知である（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号参照）。高分子物質、マイクロカプセルおよびコロイド分散システム、例えばリポソーム、を本明細書では、総称して「小胞」と呼ぶ。従って、細胞、組織または器官へのインビトロ、インビボおよびエクスビボでの送達のウイルスおよび非ウイルスベクター手段を含む。
【０１５５】
本発明は、インビボ法を含む。例えば、ＬＭ−１抗体または機能性フラグメントが結合する細胞、例えば望ましくない増殖性細胞または細胞増殖性疾患が、哺乳動物などの被験体（例えば、ヒト被験体）体内に存在する場合がある。従って、そのような細胞、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を発現する細胞表面を有する被験体を、例えばそのような細胞に結合する抗体またはその部分配列もしくはフラグメントを投与することにより、あるいは抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）を投与することにより、治療することができる。
【０１５６】
本発明に従って、被験体における望ましくない細胞増殖または細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患を治療する方法を提供する。本明細書に示す抗体、機能性フラグメント、修飾および変異形のいずれかで、そのような方法を実施することができる。１つの実施形態における方法は、被験体に、該被験体における望ましくない細胞増殖または細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患を治療するために有効な量の、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体を投与することを含む。もう１つの実施形態における方法は、被験体に、該被験体における望ましくない細胞増殖または細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患を治療するために有効な量の、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体を投与することを含む。
【０１５７】
本明細書において用いる場合、細胞、組織または器官に関連して用いるときの用語「細胞増殖性疾患」および「細胞増殖亢進性疾患」ならびにそれらの文法上の語尾変化は、望ましくない、過剰なまたは異常な細胞、組織または器官成長、増殖、分化または生存を指す。増殖亢進性細胞は、参照正常細胞、例えば、同じ組織もしくは器官のものであるが増殖亢進性細胞ではない細胞、または通常は分化することができない細胞、などの望ましいものより成長、増殖または生存が多い細胞を意味する。望ましくない細胞増殖および増殖亢進性疾患は、被験体における望ましくない、過剰なまたは異常な細胞数、細胞成長、細胞増殖、細胞生存または分化を特徴とする疾病および生理状態、両方とも良性過形成性状態、を含む。そのような疾患の具体的な例としては、転移性および非転移性新生物、腫瘍および癌（悪性疾患）が挙げられる。
【０１５８】
様々な実施形態における方法は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体を、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）結合する抗体を、被験体に、該被験体における細胞増殖性または細胞増殖亢進性疾患を治療するために有効な量で投与することを含む。特定の態様において、前記疾患は、新生物、腫瘍または転移性もしくは非転移性癌（悪性疾患）である。追加の態様において、前記疾患は、乳房、肺、甲状腺、頭部および頚部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸管（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮内膜、子宮頚、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚、または造血系を冒す、あるいはこれらに少なくとも一部は存在する。
【０１５９】
用語「腫瘍」、「癌」および「新生物」は、交換可能に用いており、およびその成長、増殖または生存が、正常な対照細胞の成長、増殖または生存より多い細胞または細胞集団、例えば、細胞増殖性または分化性疾患を指す。概して、この増殖は、無制御である。用語「悪性疾患」は、近接組織の浸潤を指す。用語「転移」は、被験体体内の腫瘍、癌または新生物の他の部位、位置または領域への拡大または播種を指し、前記部位、位置または領域は、原発性腫瘍または癌とは異なる。
【０１６０】
本発明の方法を用いて、原発性腫瘍もしくは癌の他の部位への転移、または原発性腫瘍もしくは癌から遠位の他の部位での転移性腫瘍もしくは癌の形成もしくは樹立を低減または抑制することができ、それによって、腫瘍もしくは癌再発または腫瘍もしくは癌進行を抑制または低減することができる。従って、本発明の方法は、数ある中でも、１）転移を発現する可能性のあるまたは発現する腫瘍または癌細胞（例えば、播種性腫瘍細胞、ＤＴＣ）の成長、増殖、運動性または侵襲性を低減または抑制すること；２）原発性腫瘍または癌から生ずる該原発性腫瘍または癌とは異なる１つ以上の他の部位、位置または領域への転移の形成または樹立を低減または抑制すること；３）転移が形成したまたは樹立された後、原発性腫瘍または癌とは異なる１つ以上の他の部位、位置もしくは領域での該転移の成長または増殖を低減もしくは抑制すること；および４）転移が形成したもしくは樹立された後、追加の転移の形成もしくは樹立を低減もしくは抑制することを含む。
【０１６１】
新生物、腫瘍および癌は、肉腫、癌腫、腺癌、黒色腫、骨髄腫、芽腫、神経膠腫、リンパ腫または白血病を含む。例示的癌としては、例えば、癌腫、肉腫、腺癌、黒色腫、神経の（芽腫、神経膠腫）、中皮腫および細網内皮性、リンパ性または造血性新生物疾患（例えば、骨髄腫、リンパ腫または白血病）が挙げられる。特定の態様において、新生物、腫瘍または癌としては、肺腺癌、肺癌腫、散在性または間質性胃癌腫、結腸腺癌、前立腺癌、食道癌腫、乳癌腫、膵腺癌、卵巣腺癌、副腎の腺癌、子宮内膜の腺癌または子宮腺癌が挙げられる。
【０１６２】
新生物、腫瘍および癌は、良性、悪性、転移および非転移型を含み、ならびに任意の期（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶもしくはＶ）もしくはグレード（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３など）の新生物、腫瘍もしくは癌、または進行している、悪化している、安定している、もしくは寛解状態である新生物、腫瘍もしくは癌を含む。
【０１６３】
新生物、腫瘍および癌は、乳房、肺、甲状腺、頭部および頚部、鼻咽頭、鼻または洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸管（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮内膜、子宮頚、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚、ならびに造血系をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、多数の原発性腫瘍タイプから生ずる場合があり、および続発部位に転移することがある。
【０１６４】
「充実性新生物、腫瘍または癌」は、概して互いに集まって塊を形成している新生物、腫瘍または癌（例えば、転移）を指す。具体的な例としては、内臓腫瘍、例えば黒色腫、乳、膵臓、子宮および卵巣癌、精巣癌（精上皮腫を含む）、胃または結腸癌、ヘパトーム、副腎、腎および膀胱癌腫、肺、頭部および頚部癌、ならびに脳腫瘍／癌が挙げられる。
【０１６５】
癌腫は、上皮または内分泌組織の悪性疾患を指し、ならびに呼吸器系癌腫（肺、小細胞肺）、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む。この用語は、例えば癌腫性および肉腫性組織から成る悪性腫瘍を含む、癌肉腫を含む。腺癌は、腺組織の癌腫、または腫瘍が腺様構造を形成する癌腫を含む。黒色腫は、メラノサイト、および皮膚、目（網膜を含む）または身体の他の領域において発生し得る色素細胞に由来する他の細胞の悪性腫瘍を指す。さらなる癌腫は、子宮／子宮頚、子宮内膜、肺、頭部／頚部、結腸、膵臓、精巣、副腎、腎臓、食道、胃、肝臓および卵巣から生じ得る。
【０１６６】
肉腫は、間葉細胞起源の悪性腫瘍を指す。例示的肉腫としては、例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫および線維肉腫が挙げられる。
【０１６７】
神経新生物としては、神経膠腫、膠芽腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫が挙げられる。
【０１６８】
治療可能な新生物、腫瘍および癌の具体的な非限定的例としては、悪性および非悪性新生物、腫瘍および癌、ならびに転移が挙げられる。詳細には、任意の期（例えば、第ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢもしくはＩＶ期）またはグレード（例えば、グレードＧ１、Ｇ２もしくはＧ３）の新生物、腫瘍、癌または転移。追加の非限定的な例としては、胃腺癌（例えば、散在型もしくは腸管型のもの）、結腸直腸腺癌、扁平上皮細胞肺癌腫、肺腺癌、食道の扁平上皮癌、膵臓の腺癌、膀胱の尿路上皮（ｕｒｏｔｈｅｌ）癌腫、腎臓の腎癌腫、前立腺の腺癌、乳房の腺管癌腫、乳房の小葉癌腫、卵巣の腺癌、副腎の腺癌、子宮内膜の腺癌または子宮腺癌が挙げられる。
【０１６９】
「液性新生物、腫瘍または癌」は、細網内皮系または造血系の新生物、腫瘍または癌、例えば、リンパ腫、骨髄腫もしくは白血病、または事実上、散在性である新生物を指す。白血病の特定の例としては、急性および慢性リンパ芽球性のもの、骨髄芽球性（ｍｙｅｏｌｂｌａｓｔｉｃ）のものおよび多発性骨髄腫が挙げられる。概して、そのような疾病は、低分化型急性白血病、例えば赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病、から生ずる。具体的な骨髄性疾患としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられるが、これらに限定されず；リンパ性悪性疾患としては、Ｂ系列ＡＬＬおよびＴ系列ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫および異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・ステルンベルグ病が挙げられる。
【０１７０】
本明細書において用いる場合、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」およびそれらの文法上の語尾変化は、個々の患者に、その患者において生理的応答または転帰を得るために望ましいプロトコル、レジメン、プロセスまたは治療薬を受けさせることを意味する。治療を受けたいずれの患者も、特定の治療プロトコル、レジメン、プロセスまたは治療薬に応答しないことがあるので、治療することによって、それぞれのおよびあらゆる患者または患者集団において所望の生理的応答または転帰が達成される必要はない。従って、所与の患者または患者集団は、治療に応答できないこともあり、または不適当に応答することもある。
【０１７１】
本発明の方法は、任意の投与方式によって、または任意の経路、全身性、局部および局所投与によって実施することができる。例示的投与経路としては、静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、皮内、筋肉内、皮下、胸膜内、経皮（局所）、経粘膜、頭蓋内、髄腔内、眼内、直腸、経口（食事）および粘膜経路が挙げられる。
【０１７２】
本発明の方法は、数ある中でも、所与の被験体の状態の検出可能なまたは測定可能な向上、例えば、細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移の存在に関連した１つ以上の有害な（身体的）症状または結果の緩和または改善、すなわち、治療恩恵または有益効果をもたらす方法を含む。
【０１７３】
治療的恩恵または有益効果は、状態または病状の任意の客観的もしくは主観的、一過的、一時的もしくは長期向上、あるいは細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍もしくは癌、または転移、に関連したまたは起因する有害症状の発症、重症度、継続期間もしくは頻度の低減である。本発明による治療方法の満足な臨床エンドポイントは、例えば、１つ以上の関連病状、有害症状または合併症の重症度、継続期間もしくは頻度の漸増的または部分的低減、あるいは細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍もしくは癌、または転移、の生理的、生化学的または細胞的発現または特徴の１つ以上の抑制または逆転があるとき、達成される。従って、治療的恩恵または向上は、治癒、例えば、ターゲット増殖性細胞（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の破壊、あるいは細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍もしくは癌、または転移、に関連したまたは起因する１つ以上の、大部分のまたはすべての病状、有害症状または合併症の除去である。しかし、治療的恩恵または向上は、すべてのターゲット増殖性細胞（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）あるいは細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍もしくは癌、または転移、に関連したまたは起因するすべての病状、有害症状または合併症の治癒または完全な破壊である必要はない。例えば、腫瘍または癌の進行または悪化を抑制することによる、腫瘍もしくは癌細胞塊の部分的破壊、または腫瘍もしくは癌量、サイズもしくは細胞数の安定化は、腫瘍または癌の一部分または大部分の質量、サイズまたは細胞がそのままであったとしても、死亡率を低減し、ほんの数日間、数週間または数か月間であっても寿命を延ばすことができる。
【０１７４】
治療的恩恵の具体的な非限定的例としては、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移容積（サイズもしくは細胞量）あるいは細胞数の低減；新生物、腫瘍または癌容積増加の抑制または予防（例えば、安定化）；新生物、腫瘍または癌進行、悪化または転移の遅速または抑制；新生物、腫瘍または癌細胞溶解またはアポトーシスの刺激、誘導または増加；あるいは新生物、腫瘍または癌増殖、成長または転移の抑制が挙げられる。本発明の方法は、直ぐに効果を現さない場合がある。例えば、治療後に新生物、腫瘍または癌細胞数または量が増加することがあるが、その後、時間が経つにつれて、その新生物、腫瘍もしくは癌、または転移の細胞溶解またはアポトーシス後、所与の被験体における腫瘍細胞量、サイズまたは細胞数の最終的な安定化または低減が生ずることがある。
【０１７５】
抑制、低減、減少、遅延または予防することができる新生物、腫瘍、癌および転移に関連したさらなる有害症状および合併症としては、例えば、悪心、食欲不振、嗜眠、疼痛および不快感が挙げられる。従って、細胞増殖亢進性疾患に関連したまたは起因する有害症状または合併症の重症度、継続期間または頻度の部分的または完全な減少または低減、被験体における快適さの向上、例えば、エネルギー、食欲、心理的快適さの増加は、すべて、治療恩恵の特定の非限定的な例である。従って、治療恩恵または向上は、治療を受ける被験体の生活の質の主観的向上も含む場合がある。
【０１７６】
様々な実施形態における方法は、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移サイズまたは容積を低減または減少させ、新生物、腫瘍または癌、転移サイズまたは容積の増加を抑制または予防し、新生物、腫瘍または癌進行または悪化を抑制または遅延し、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移細胞溶解またはアポトーシスを刺激し、あるいは新生物、腫瘍または癌増殖または転移を抑制、低減、減少または遅延する。追加の実施形態における方法は、被験体の寿命を延長するかもしくは延ばす。さらなる実施形態における方法は、被験体の生活の質を向上させる。
【０１７７】
新生物、腫瘍もしくは癌、または転移を含有する生検サンプル（例えば、血液または組織サンプル）の検査により、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移細胞容積または細胞数を確証することができ、従って、新生物、腫瘍もしくは癌または転移細胞の量または数または容積の低減または安定化、あるいは新生物、腫瘍、癌、または転移細胞樹立、形成、増殖、成長または生存の抑制（アポトーシス）が発生したかどうかを確証することができる。充実性新生物、腫瘍または癌についての、観血的および非観血的イメージング法により、新生物、腫瘍または癌サイズまたは容積を確認することができる。血液もしくは血清、または骨髄の、例えば、細胞の集団、数およびタイプ（例えば、造血性細胞増殖亢進性疾患、播種性腫瘍細胞）についての検査により、新生物、腫瘍、癌、もしくは転移細胞の量もしくは数の低減もしくは安定化、または新生物、腫瘍、癌、もしくは転移樹立、形成、増殖、成長もしくは生存の抑制（アポトーシス）が発生したかどうかを確証することができる。
【０１７８】
本発明の組成物および方法を、所望の効果をもたらす任意の他の治療または療法と併用することができる。詳細には、抗細胞増殖活性または機能を有するものとして特徴づけられている治療および療法を適用することができる。例示的治療および療法としては、抗細胞増殖または免疫強化剤または薬が挙げられる。
【０１７９】
前記治療および療法は、本発明の任意の他の方法、例えば、抗細胞増殖性または抗細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の前に行われる場合があり、実質的に同時に行われる場合がある。
【０１８０】
従って、本発明は、併用方法を提供し、この方法は、前記抗体、機能性フラグメント、ならびに修飾および変異形のいずれかを、任意の治療レジメン、治療プロトコルまたは組成物、例えば、本明細書に示すまたは当該技術分野において公知の抗細胞増殖プロトコル（ｒｏｔｏｋｏｌ）、剤、薬、と併用する。１つの実施形態における方法は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、および抗細胞増殖または免疫強化治療、剤または薬を投与することを含む。もう１つの実施形態における方法は、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体、および抗細胞増殖または免疫強化治療、剤または薬を投与することを含む。前記抗細胞増殖または免疫強化治療、剤または薬は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、あるいはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体の投与の前に行われる場合があり、前記投与と実質的に同時発生的に行われる場合があり、または前記投与の後に行われる場合がある。
【０１８１】
本明細書において用いる場合、「抗細胞増殖」、「抗新生物」、「抗腫瘍」または「抗癌」治療、療法、活性または作用は、異常なまたは望ましくない細胞増殖（細胞増殖亢進）、細胞増殖亢進性疾患、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移に関連したまたは起因する病状、有害症状または合併症の治療に有用である任意の療法、治療レジメン、薬剤、薬物、プロトコルまたはプロセスを意味する。個々の療法、治療レジメン、薬剤、薬物、プロトコルまたはプロセスが、細胞増殖、細胞成長、細胞増殖亢進、新生物、腫瘍または癌（悪性）成長、増殖、生存または転移を抑制、減少、遅速、低減、遅延または予防することができる。そのような治療、療法、レジメン、プロトコル、薬剤および薬物は、細胞周期進行または細胞増殖もしくは成長を破壊、低減、抑制または遅延すること；細胞アポトーシス、溶解または死を増加、刺激または増進すること；核酸またはタンパク質合成または代謝を抑制すること；細胞分裂を低減、減少、抑制または遅延すること；あるいは細胞生存、または細胞生存因子、成長因子もしくはシグナリング経路（細胞外もしくは細胞内）の生産もしくは利用を減少、低減または抑制することによって、効果を現すことができる。
【０１８２】
抗細胞増殖治療および療法の例としては、化学療法、免疫療法、放射線療法（電離または化学放射線療法）、局所または局部温熱（加温）療法および外科的切除が挙げられる。
【０１８３】
抗細胞増殖剤および薬の具体的な非限定的クラスとしては、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物エキス、植物アルカロイド、ニトロソウレア、ホルモン（ステロイド）、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体が挙げられる。微生物毒素の具体的な非限定的例としては、細菌コレラ毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、ジフテリア毒素、および植物毒素リシンが挙げられる。薬物の具体的な例としては、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、ＡＺＴ、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）および５−アザシチジン関連化合物、ペントスタチン、ゲムシタビン、シタラビン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、カリケアマイシン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、テニポシド、エトポシド、ヒドロキシウレア、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、レバミソール、イホスファミド、ミトタン、ミトキサントロン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシンおよびジブロモマンニトールが挙げられる。ホルモンの具体的な非限定的例としては、プレドニゾン、プレドニゾロン、ジエチルスチルベステロール、フルオキシメステロン、フルタミド、ロイプロリド、トレミフェン、トリアムシノロン、ゾラデックス、および性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｔｒｏｐｈｉｎ）放出ホルモンアンタゴニストが挙げられる。
【０１８４】
放射線療法は、被験体への内部または外部送達を含む。例えば、被験体が放射性同位元素を内在化するまたは別様に物理的に放射性同位元素と接触することなく、アルファ、ベータ、ガンマおよびＸ線を被験体に外部から施すことができる。Ｘ線量の具体的な例は、長期間（３から５／週）の５０から２００レントゲンの日用量から、２０００から６０００レントゲンの単回用量まで様々である。線量は、大きな幅があり、照射期間、同位元素の半減期、放射される放射線のタイプ、治療する細胞のタイプおよび位置ならびに疾病の進行期に依存する。放射性核種の具体的な非限定的例としては、例えば、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、７２Ｓｅ、８８Ｙ、９０Ｓｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１０５Ｒｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｏｓ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、２２７Ａｃ、および２２８Ｔｈが挙げられる。
【０１８５】
腫瘍細胞に結合する抗体は、抗細胞増殖治療または療法の特定の例である。抗腫瘍抗体としては、例えば、白血病細胞ＣＤ３３抗原に結合するＭ１９５抗体（米国特許第６，５９９，５０５号）；卵巣癌腫ＣＡ６腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体ＤＳ６（米国特許第６，５９６，５０３号）；上皮細胞表面Ｈ抗原に結合するヒトＩＢＤ１２モノクローナル抗体（米国特許第４，８１４，２７５号）；および結腸、乳、卵巣および肺癌腫によって発現されるＬｅＸ炭水化物エピトープに結合するＢＲ９６抗体が挙げられる。利用することができる追加の抗腫瘍抗体としては、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗Ｈｅｒ−２ｎｅｕ抗体）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、Ｂｅｘｘａｒ、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｏｎｃｏｌｙｍ、１７−１Ａ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、３Ｆ８（抗神経芽腫抗体）、ＭＤＸ−ＣＴＬＡ４、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）およびＭｙｌｏｔａｒｇが挙げられる。
【０１８６】
本明細書において用いる場合、治療、療法、薬剤または薬物に関して用いるときの用語「免疫強化」は、その治療、療法、薬剤または薬物が、体液または細胞によって媒介される、免疫応答の増加、刺激、誘導または促進をもたらすことを意味する。そのような療法は、一般に免疫応答を強化することができ、または特定のターゲット、例えば、細胞増殖性または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍もしくは癌、または転移、に対する免疫応答を強化することができる。
【０１８７】
免疫強化剤の具体的な非限定的例としては、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、インターフェロンおよびケモカインが挙げられる。免疫強化剤および治療の追加の例としては、細胞増殖性疾患に対する抗体を発現するか、でなければ細胞増殖性疾患に対する免疫応答を開始させる可能性が高い免疫細胞、例えばリンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞が挙げられる。免疫原性を強化または刺激するサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦβが挙げられ、これらも免疫強化剤の非限定的な例である。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、およびリンフォタクチンをはじめとするケモカインは、免疫強化剤のさらなる非限定的例である。
【０１８８】
本発明の方法は、数ある中でも、別の治療プロトコルまたは療法レジメン、プロセスまたは治療薬の必要または使用を低減する結果となる方法も含む。例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移についての本発明の方法は、所与の被験体においてそれが抗細胞増殖（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移）あるいは免疫強化治療または療法、例えば、新生物、腫瘍もしくは癌または転移治療または療法のための化学療法薬、放射線療法、免疫療法または外科手術、のより少ない頻度または低減用量または排除をもたらす結果となる場合、治療恩恵を有する。
【０１８９】
本発明に従って、抗細胞増殖（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌または抗転移）治療または療法の必要または使用を低減する方法を提供する。１つの実施形態における方法は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、もしくは７および９として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体を、細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を治療するためにおよび抗細胞増殖（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移）または免疫強化療法の必要を低減または排除するために有効な量で、被験体に投与することを含む。もう１つの実施形態における方法は、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体を、細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を治療するためにおよび抗細胞増殖（例えば、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移）または免疫強化療法の必要を低減または排除するために有効な量で、被験体に投与することを含む。前記方法は、抗新生物、抗腫瘍、抗癌もしくは抗転移または免疫強化療法の前に行われる場合があり、前記療法と実質的に同時に行われる場合があり、または前記療法の後に行われる場合がある。
【０１９０】
治療恩恵または向上を達成するために望ましい治療方法もしくは療法における用量、または前記治療方法もしくは療法において「有効な量」、または前記治療方法もしくは療法において「十分な量」は、例えば、ターゲット（例えば細胞増殖亢進性疾患）に関連したまたは起因する１つ、幾つかまたはすべての病状、有害症状または合併症の、測定可能なまたは検出可能な程度の、任意の客観的または主観的緩和または改善を含むが、ターゲット（例えば細胞増殖亢進性疾患）病状、有害症状または合併症の進行または悪化の予防、抑制または遅延は、満足な転帰である。従って、細胞増殖亢進性疾患の場合、その量は、所与の被験体に治療恩恵をもたらすために、または所与の被験体における前記疾患の病状、有害症状もしくは合併症を緩和もしくは改善するために十分なものであろう。単回もしくは多回用量を投与することができ、あるいは治療もしくは療法のターゲット（例えば、細胞増殖亢進性疾患）の状態またはその治療もしくは療法の任意の副作用（単数もしくは複数）による指示に応じてその用量を比例的に増加または低減することができる。
【０１９１】
例示的で非限定的な量（用量）は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲、および前述の範囲内の任意の数値もしくは範囲または値である。より多いまたはより少ない量（または用量）、例えば、０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇおよび前述の範囲内の任意の数値もしくは範囲または値、を投与することができる。追加の例示的で非限定的な量（または用量）は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、１．０〜２５ｍｇ／ｋｇ、１．０〜１０ｍｇ／ｋｇ、および前述の範囲内の任意の数値もしくは範囲または値にわたる。
【０１９２】
本発明の方法は、日に、週に、月に、または年に１回以上（例えば、１〜１０、１〜５または１〜３回）実施することができる。当業者は、投与を遅らせるまたは中止することがいつ適切であるか、わかるであろう。例示的で非限定的な投薬スケジュールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０週以上にわたって、週に１〜７回、および前述の範囲内の任意の数値もしくは範囲または値である。
【０１９３】
勿論、いずれの治療または療法についても典型的であるように、異なる被験体は、治療に対して異なる応答を示すであろうし、特定の治療プロトコル、レジメンまたはプロセスに対して応答しない者もあり、または不適当に応答する者もある。従って、有効なまたは十分な量は、治療する疾患（例えば、細胞増殖、良性過形成または新生物、腫瘍もしくは癌およびタイプまたは期、例えば腫瘍または癌グレード、および進行性である場合には後または早期）、望まれる治療効果、ならびに個々の被験体（例えば、被験体の中でのバイオアベイラビリティー、性別、年齢など）ならびに遺伝的および後成的変異性（例えば、ファーマコゲノミクス）に基づく治療に対する被験体の応答に、少なくとも一部は依存するであろう。
【０１９４】
細胞毒性および生存度（細胞アポトーシス、溶解、成長、増殖など）は、当該技術分野において公知の比色、発光、放射分析または蛍光アッセイをベースにした様々な方法で測定することができる。細胞生存度を判定するための比色技術としては、例えば、トリパン・ブルー排除が挙げられる。簡単に言うと、細胞をトリパン・ブルーで染色し、血球計数器を使用して計数する。生細胞は色素を排除するが、死んでいるおよび死にゆく細胞は青色色素を吸収するので、光学顕微鏡下で容易に区別される。ニュートラル・レッドは、生細胞によって吸収され、細胞リソソーム内に集中する。ニュートラル・レッド染色細胞数の定量により、光学顕微鏡で生細胞を判定することができる。
【０１９５】
細胞生存度を判定するための蛍光技術としては、例えば、ヨウ化プロピジウム、蛍光ＤＮＡインターカレート剤が挙げられる。ヨウ化プロピジウムは、生細胞から排除されるが、死細胞の核を染色する。そこで、ヨウ化プロピジウム標識細胞のフローサイトメトリーを用いて、生細胞および死細胞を定量することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、細胞の構造的損傷および死を示すので、分光光度計酵素アッセイによってそれを測定することができる。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるので、蛍光色素標識抗体でそれを検出することができる。蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８は、ＤＮＡを標識するので、それを用いて細胞の増殖を定量することができる（例えば、フローサイトメトリー）。蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥまたはＣＦＤＡ−ＳＥ）の定量的組み込みにより、細胞分裂分析することができる（例えば、フローサイトメトリー）。この技術は、インビトロでもインビボでも用いることができる。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）は、ＤＮＡと会合するとスペクトルシフトを被る蛍光インターカレーターであるので、それにより細胞分裂分析することができる（例えば、フローサイトメトリー）。
【０１９６】
細胞増殖を判定するための放射分析技術としては、例えば、［３Ｈ］チミジンが挙げられ、これは生細胞の新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるので、しばしばこれを用いて細胞の増殖を判定する。死細胞からのクロム（５１Ｃｒ）放出をシンチレーションカウンティングによって定量して、細胞生存度を定量することができる。
【０１９７】
細胞生存度を判定するための発光技術としては、例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。この技術は、存在するＡＴＰの量を定量して、生細胞の数を決定する。
【０１９８】
細胞生存度および細胞増殖を判定するための市販のキットとしては、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｒａｋ  ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；蛍光試薬の差次的取り込みに基づいて迅速な細胞カウントおよび生存度判定をもたらすＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ（商標）Ａｓｓａｙ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）；ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；およびＣｙｔｏＬｕｘ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）が挙げられる。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）は、時間分解蛍光分析法を用いて細胞増殖および生存度を判定することができる。Ｑｕａｎｔｏｓ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙは、溶解細胞からのＤＮＡ−色素複合体の蛍光を測定する、蛍光に基づくアッセイである（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存度アッセイは、細胞生存度を測定するための発光アッセイである（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【０１９９】
用語「被験体」および「患者」は、本明細書では交換可能に用いており、動物、概して哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類（ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク、テナガザル）、家畜（イヌおよび猫）、農場および牧場動物（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、研究および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。被験体は、インビボ効力を研究するための（例えば、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類などの）疾病モデル動物（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移動物モデル）を含む。ヒト被験体は、１歳と５歳の間、５歳と１０歳の間、および１０歳と１８歳の間の年齢の子供、例えば新生児、乳児、幼児および十代の者、１８歳と６０歳の間の成人、ならびに例えば６０歳と６５歳の間、６５歳と７０歳の間および７０歳と１００歳の間の年齢の老人を含む。
【０２００】
被験体は、治療が必要な哺乳動物（例えば、ヒト）を含む。すなわち、彼らは、望ましくないもしくは異常な細胞増殖（細胞増殖亢進）または細胞増殖亢進性疾患を有する。被験体は、望ましくない細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患を有するリスクがあるものを含む。被験体は、抗細胞増殖または免疫強化治療または療法の必要が、そのような治療を警告するラボまたは臨床診断のため、必要な被験体、抗細胞増殖または免疫強化療法を受けている被験体、および抗細胞増殖または免疫強化療法を受けたことがあり、再発または再出現のリスクがある被験体をさらに含む。
【０２０１】
リスクがある被験体は、細胞増殖性または細胞増殖亢進性疾患（例えば、良性過形成、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）に関する家族歴を有するもの、前記疾患に関する遺伝的素因を有するもの、または前記疾患に以前に罹った経験があり、再発もしくは再出現のリスクがあるものを含む。リスクがある被験体は、発癌性物質もしくは突然変異誘発因子への環境的暴露、例えば喫煙者、または職業（工業、化学、農業）環境におけるものをさらに含む。細胞増殖性または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍または癌、を発現するリスクがあるそのような被験体を腫瘍関連遺伝子、遺伝子欠失または遺伝子突然変異についての遺伝子スクリーニングで同定することができる。例えば、Ｂｒｃａｌを欠く被験体は、乳癌を発現するリスクがある。例えば、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）などの結腸癌を発現するリスクがある被験体は、腫瘍サプレッサー遺伝子欠失または突然変異を有する。細胞増殖性疾患に対する特定の遺伝的素因を有する、リスクがある被験体は、公知である（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ２ｎｄ  ｅｄ．ｂｙ  Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ（Ｅｄｉｔｏｒ）（２００２）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  ＷＢ  Ｃｏｌｅｍａｎ  ａｎｄ  ＧＪ  Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ（２００１）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；およびＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９９５））。
【０２０２】
従って、リスクがある被験体を治療して、細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患を発現する尤度、または細胞増殖性疾患を治癒した後に同じもしくは異なる細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患の再発もしくは再出現を被る尤度を抑制または低減することができる。そのような治療の結果は、細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患を発現するリスクを低減することである場合もあり、あるいは治療を受けた、リスクがある被験体における細胞増殖性もしくは細胞増殖亢進性疾患またはそれらの病状、有害症状もしくは合併症を予防することである場合もある。
【０２０３】
本発明は、適切な包装材に包装された、抗体、機能性フラグメント、修飾および変異形、核酸、薬剤、薬物および医薬製剤を含むキットであって、場合によっては、そのキット成分を使用するための説示、例えば本発明の方法を実施するための説示、を併せて含むキットをさらに提供する。１つの実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、あるいはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体を含む。１つの態様において、前記説示は、望ましくない細胞増殖もしくは増殖亢進、または細胞増殖亢進性疾患を治療するためのものである。別の１つの態様において、前記説示は、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移を治療するためのものである。さらなる実施形態において、キットは、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、あるいはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体と、望ましくない細胞増殖もしくは増殖亢進、または細胞増殖亢進性疾患を治療するための説示と、抗細胞増殖または免疫強化治療、剤または薬とを含む。様々な態様において、キットは、抗新生物、抗癌または抗腫瘍剤を含む。尚、さらなる態様において、キットは、製造物、例えば、抗体または核酸、抗細胞増殖または免疫強化治療、剤または薬を被験体に局所的に、局部的にまたは全身的に送達するための製造物を含む。
【０２０４】
用語「包装材」は、キットの成分を収容する物理的構造を指す。包装材は、成分を無菌に維持することができ、およびそれを目的として一般に使用される材料（例えば、紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）で製造されたものであり得る。ラベルまたはパッケージ添付書類は、例えば、本発明の方法、例えば細胞増殖性または細胞増殖亢進性疾患の治療、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）についてのあるいは細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞についてのスクリーニング、検出または同定のためのアッセイ、を実施するために適する成文化された説示を含む場合がある。従って、追加の実施形態において、キットは、溶液中で、インビトロで、インビボで、またはエクスビボで本発明の方法を実施するための説示をはじめとするラベルまたはパッケージ添付書類を含む。
【０２０５】
従って、説示は、本明細書に記載する本発明の方法のいずれかを実施するための説示を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物を、細胞増殖性または細胞増殖亢進性疾患、例えば新生物、腫瘍もしくは癌、または転移を治療するための被験体への投与についての説示と共に、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。加えて、説示は、満足のいく臨床エンドポイント、または発生し得る任意の有害症状もしくは合併症、保管情報、有効期限、またはヒト被験体での使用について米国食品医薬品局などの監督機関により要求されている情報の標示を含むことがある。
【０２０６】
前記説示は、「印刷物」上、例えば、キット内の紙もしくは厚紙上、キットもしくは包装材に付けられた、またはキットの成分を収容しているバイアルもしくはチューブに付けられたラベル上にある場合がある。説示は、音声またはビデオテープを含む場合があり、加えて、コンピューター可読媒体、例えばディスク（フロッピー（登録商標）ディスケットもしくはハードディスク）、光学ＣＤ、例えばＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ、電子記憶媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭ、ならびにこれらのハイブリッド、例えば磁気／光学記憶媒体に説示を含めることができる。
【０２０７】
加えて、本発明のキットは、緩衝剤、保存薬、またはタンパク質／核酸安定剤を含む場合がある。前記キットは、活性についてアッセイするための対照成分、例えば、対照サンプルまたは標準物質を含む場合もある。前記キットのそれぞれの成分が個々の容器の中にまたは混合物の状態で封入することができ、およびそれらの様々な容器のすべてが単一のまたは多数のパッケージ内にある場合もある。
【０２０８】
抗体（例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、あるいはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体）、核酸、ならびに本発明の他の組成物（例えば、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）および方法は、医薬製剤に含まれるまたは医薬製剤を利用する場合がある。そのような医薬製剤は、インビボまたはエクスビボでの被験体の治療または被験体への投与もしくは送達に有用である。
【０２０９】
医薬製剤は、「医薬的に許容される」および「生理的に許容される」担体、希釈剤または賦形剤を含む。本明細書において用いる場合、「医薬的に許容される」および「生理的に許容される」は、医薬投与と適合性の、溶媒（水性のものまたは非水性のもの）、溶液、エマルジョン、分散媒、コーティング、等張および吸収促進または遅延剤を含む。そのような製剤を液体；エマルジョン、懸濁液、シロップもしくはエリキシル、または固体形態；錠剤（コーティングされているもしくはコーティングされていないもの）、カプセル（ハードもしくはソフト）、粉末、顆粒、結晶またはマイクロビーズに含めることができる。補助化合物（例えば、保存薬、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）も前記製剤に組み込むことができる。
【０２１０】
医薬製剤を、特定の局所、局部または全身投与または送達経路に適合するようにすることができる。従って、医薬製剤は、特定の経路による投与に適する担体、希釈剤または賦形剤を含む。本発明の組成物の投与経路の具体的な非限定的例は、非経口、例えば、静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、皮内、筋肉内、皮下、胸膜内、経皮（局所）、経粘膜、頭蓋内、髄腔内、眼内、直腸、経口（食事）、粘膜投与、ならびに前記治療法または投与プロトコルに適する任意の他の処方である。
【０２１１】
非経口適用に使用される溶液または懸濁液は、滅菌希釈剤、例えば注射用蒸留水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えばアスコルビン酸または二亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および毒性を調整するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含む場合がある。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基でｐＨを調整することができる。
【０２１２】
注射のための医薬製剤は、滅菌水溶液（水溶性である場合）または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために適する担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、ならびにこれらに類するもの）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。抗菌および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを前記組成物に含めることができる。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含めることで、注射用組成物の吸収を延期することができる。
【０２１３】
滅菌注射用製剤は、適切な溶剤に必要量の活性組成物を上記成分の１つまたは組み合わせと共に添合することによって、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および任意の他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性組成物を添合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合の調製方法は、例えば、任意の追加の所望成分と前記活性成分の粉末を、予め調製したそれらの溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【０２１４】
経粘膜または経皮投与については、浸透させるべきバリヤに適する浸透剤をその製剤に用いる。そのような浸透剤は当該技術分野において公知であり、それらとしては、例えば、経粘膜投与については、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレー、吸入器具（例えば、アスピレーター）または坐剤の使用によって遂行することができる。経皮投与のための活性化合物は、軟膏、膏薬、ゲル、クリームまたはパッチに調合される。
【０２１５】
前記医薬製剤は、身体からの急速な排泄に対して保護する担体、例えば、制御放出製剤または時間遅延材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルを用いて調製される場合がある。局所、局部もしくは全身送達または制御放出もしくは徐放を達成するためにインプラントおよびマイクロカプセル化送達システムなどの製品を使用して、前記製剤を送達することもできる。
【０２１６】
生体分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸、を使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には公知である。前記材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入することもできる。リポソーム懸濁液（抗体またはウイルスコートタンパク質を使用して細胞または組織にターゲッティングされたリポソームを含む）を医薬的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような公知の方法に従って調製することができる。
【０２１７】
投与に適する追加の医薬製剤は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）；Ｋｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．（２０００）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９３）参照）。
【０２１８】
タンパク質（抗体）、核酸（抑制性）、治療、療法、薬剤、薬物および医薬製剤をはじめとする本発明に従って使用する組成物を、投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形に包装することができる。本明細書において用いる場合の「投薬単位形」は、単一投薬量治療として適する物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位が、所望の治療または療法（例えば、有益）効果を生じさせるように計算された、担体、賦形剤、希釈剤またはビヒクルと会合した組成物の量を含有する。前記単位投薬形は、利用される特定の組成物、達成される効果、ならびに治療を受ける被験体の薬動力学およびファーマコゲノミクスをはじめとする（しかし、必ずしもこれらに限定されない）様々な要因に依存するであろう。
【０２１９】
本発明は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）をスクリーニング、検出および同定する、無細胞（例えば、溶液での、固相での）および細胞ベースの（例えば、インビトロまたはインビボ）方法を提供する。前記方法は、生体材料またはサンプルを使用して、溶液中、インビトロで、およびインビボで、例えば動物からの新生物、腫瘍もしくは癌または転移細胞、組織または器官（例えば、生検材料）を使用して、行うことができる。
【０２２０】
本発明に従って、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体が結合する細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）についての同定、検出またはスクリーニング方法を提供する。１つの実施形態における方法は、生体材料またはサンプルと、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体とを、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体とを、前記抗体の細胞または抗原への結合を可能にする条件下で接触させること；および前記細胞または抗原への前記抗体の結合についてアッセイすることを含む。前記抗体の細胞または抗原への結合により、それらの存在が検出される。１つの態様において、前記生体材料またはサンプルは、哺乳動物被験体から得られる。さらなる態様において、前記細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する前記抗体は、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体とは異なる。
【０２２１】
本発明は、望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有するまたは有するリスクが増している被験体の進行、望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の存在または程度を診断およびモニターする、ならびに治療への応答確率増加のために、ＬＭ−１抗体、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体での治療に適した被験体を同定する、無細胞（例えば、溶液での、固相での）および細胞ベースの（例えば、インビトロまたはインビボ）方法も提供する。前記方法は、生体材料またはサンプル、例えば、新生物、腫瘍もしくは癌または転移細胞、組織または器官を含むまたは示す疑いがある細胞生検材料を使用して、溶液中、インビトロで行うことができる。前記方法は、インビボで、例えば動物において、行うこともできる。
【０２２２】
本発明に従って、望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有するまたは有するリスクが増している被験体の進行を診断およびモニターする方法、望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の存在または程度を判定する方法、およびＬＭ−１抗体、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体での治療に適する被験体を同定する方法を提供する。１つの実施形態における方法は、生体材料またはサンプル（例えば、被験体からのもの）と、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体とを、またはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体とを、前記抗体の細胞または抗原への結合を可能にする条件下で接触させること；および前記抗体の前記細胞または抗原への結合についてアッセイすることを含む。前記抗体の前記細胞または抗原への結合は、細胞または抗原の存在または量を確認するために用いることができ、その存在または量と、望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）を有するリスク増加とを、あるいは望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の存在または程度とを相関させ、それによってその被験体を診断することができる。細胞または抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）の存在または量によって、治療に適する被験体、例えば、増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の治療、例えば、細胞株ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３によって生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、７もしくは９および１１もしくは１３として示す重鎖および軽鎖配列によって表されるようなＬＭ−１抗体、あるいはＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）に結合する抗体での治療、に好適に応答する、より大きな確率を有する被験体を同定することもできる。１つの態様において、生体材料またはサンプルは、ヒトから得られる。もう１つの態様において、生体材料またはサンプルは、生検材料（例えば、肺、膵臓、胃、乳房、食道、卵巣または子宮の生検材料）を含む。望ましくないもしくは異常な細胞増殖または細胞増殖亢進性疾患（例えば、新生物、腫瘍もしくは癌、または転移）の進行をモニターする方法は、規則的なまたは不規則な間隔、例えば、１日１回、週２回、週１回、月２回、月１回、年４回、半年ごとにまたは年２回、年１回など、適宜、行うことができる。
【０２２３】
本発明の同定、検出、スクリーニングおよび診断アッセイは、可能性のあるまたは疑いのある増殖亢進性細胞、例えば細胞増殖亢進性疾患または適切なサンプルの細胞、の分析によって行うことができる。細胞としては、乳房、肺、甲状腺、頭部および頚部、鼻咽頭、鼻もしくは洞、脳、脊柱、副腎、甲状腺、リンパ、胃腸管（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮内膜、子宮頚、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、副腎、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、皮膚、および造血系、ならびに転移または続発部位に由来する増殖亢進性、不死化、新生物、腫瘍および癌細胞株ならびに初代分離株が挙げられる。
【０２２４】
組成物、例えば、タンパク質（例えば、抗体）、材料、サンプル、または治療に関して用いるときの用語「接触」は、その組成物（例えば、抗体などのタンパク質）と他の参照エンティティーとの直接的または間接的相互作用を意味する。直接的相互作用の特定の例は、結合である。間接的相互作用の特定の例は、その組成物が媒介分子に基づいて作用し、そしてまたその媒介分子がその参照エンティティーに基づいて作用する場合である。従って、例えば、細胞（例えば、細胞増殖亢進性疾患を含む細胞）と抗体の接触は、その抗体をその細胞に結合させること、またはその抗体を媒介物（例えば、抗原）に基づいて作用させ、そしてまたその媒介物がその細胞に基づいて作用することを含む。
【０２２５】
用語「アッセイ」および「測定」ならびにこれらの文法上の語尾変化は、本明細書では交換可能に用いており、定性的判定もしくは定量的判定のいずれか、または定性的判定と定量的判定の両方を指す。これらの用語を結合に関して用いるとき、本明細書に示すおよび当該技術分野において公知の様々な方法をはじめとする、結合の相対量、親和性または特異性をアッセイする任意の手段が考えられる。例えば、抗体結合は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロットまたは免疫沈降アッセイによってアッセイまたは測定することができる。
【０２２６】
用語「相関」およびその文法上の語尾変化は、２つ以上のエンティティー間の関係または関連を指す。例えば、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）、または（例えば、その細胞表面で）ＬＭ−１抗原を発現する細胞は、様々な腫瘍、新生物、癌および転移と関係づけられる。従って、細胞表面発現ＬＭ−１抗原（ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）と癌とのこの関係のため、それらは互いに相関している。従って、ＬＭ−１抗原（例えば、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５）または（例えば、その細胞表面で）ＬＭ−１抗原を発現する細胞の量を相関させることで、被験体における腫瘍、新生物、癌または転移の存在および／または程度を示すことができる。
【０２２７】
別様に定義していない限り、本明細書において用いるすべての専門および科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価の方法および材料を本発明の実施または試験の際に用いることができるが、適する方法および材料を本明細書に記載する。
【０２２８】
本明細書において引用するすべての出版物、特許、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号および他の参照は、それら全体が参照により援用されている。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が支配することとなる。
【０２２９】
本明細書において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に別様に示していない限り、多数の指示対象を含む。従って、例えば、１つの「抗体」への言及は、多数の抗体を含み、および「１つの治療または療法」への言及は、多数の同時的、連続的または逐次的投与、治療または療法を含む、などの場合がある。
【０２３０】
本明細書において用いる場合、すべての数値または数値範囲は、その文脈が明確に別様に示していない限り、そのような範囲内またはそのような範囲を包含する全整数、および範囲内のまたは範囲を包含する値または整数の分数を含む。従って、例えば、９０〜１００％の範囲への言及は、前述の値内のまたは前述の値を包含する任意の数値または範囲、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、および９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％など、ならびに前述の範囲内の任意の数値範囲、例えば９０〜９２％、９０〜９５％、９５〜９８％、９６〜９８％、９９〜１００％などを含む。追加の例において、１〜５，０００倍の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍など、および１．１、１．２、１．３、１．４、１．５倍など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５倍など、ならびに前述の範囲内の任意の数値範囲、例えば１〜２、５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜５００、１００〜１０００、５００〜１０００、１０００〜２０００、１０００〜５０００などを含む。さらなる例において、ＫＤ
１０−５Ｍから約ＫＤ  １０−１３Ｍの範囲への言及は、前述の値内または前述の値を包含する任意の数値または範囲を含む。
【０２３１】
非常に多数の実施形態を説明するために断言的な言葉を用いて本発明を本明細書に開示する。具体的には、本発明は、物質または材料、方法段階および条件、プロトコル、手順、アッセイまたは分析などの、特定の主題が、完全にまたは部分的に除外される実施形態も含む。従って、本発明は、本明細書に、本発明が何を含まないかに関して一般には表示していないが、それにもかかわらず、本発明に明白に含まれない態様を開示する。
【０２３２】
本発明の多数の実施形態を説明した。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。従って、以下の実施例は、例証のためのものであり、本特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２３３】
実施例１
本実施例は、材料および方法の説明を含む。
【０２３４】
細胞培養：２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（両方とも１％）を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ，Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）においてヒト肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１を培養し、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で、３７℃でインキュベートした。記載するアッセイのために、細胞を亜集密まで成長させ、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、使用した。
【０２３５】
ハイブリドーマの生産：リンパ球を、それらをＨＡＢ−１ヘテロミエローマに融合させることによって固定化した。簡単に言うと、添加剤を伴わないＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＡ，Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）でＨＡＢ−１ヘテロミエローマ細胞を２回洗浄し、それらの細胞を５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、脾臓またはリンパ節のいずれかから取った凍結リンパ球を解凍し、添加剤を伴わないＲＰＭＩ  １６４０でこれらの細胞を２回洗浄し、これらの細胞を５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。ＨＡＢ−１細胞ペレットとリンパ球細胞ペレットの両方を、添加剤を伴わない１０ｍＬ  ＲＰＭＩ  １６４０に再び懸濁させ、Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞カウンティングチャンバでカウントした。それらの細胞を再び洗浄し、ＨＡＢ−１細胞およびリンパ球を一緒に１：２から１：３の比率で添加し、それらを混合し、その混合物を８分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ）を３７℃に予温し、５０ｍＬチューブを弱く回転させながらそのＰＥＧがそれらのペレット上に注意深く１滴ずつ流れていくようにした。次に、そのペレットを穏やかに再懸濁させ、そのチューブを３７℃の水浴の中で正確に９０秒間回転させた。添加剤を伴わないＲＰＭＩの満液１０ｍＬピペットでそれらの細胞を２回洗浄し、５分間、１５００ｒｐｍでそれらの細胞を遠心分離した。ＨＡＴサプリメント（ＰＡＡ，Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）および１０％ＦＣＳ、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを伴う１ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０（「ＲＰＭＩ  １６４０  ＨＡＴ」）を２４ウエルプレートのそれぞれのウエルに添加した。細胞ペレットをＲＰＭＩ  １６４０  ＨＡＴに溶解し、０．５ｍＬの細胞をその２４ウエルプレートのそれぞれのウエルに添加した。その後、その２４ウエルプレートを３７℃インキュベーターに入れ、週１回、ＲＰＭＩ  １６４０  ＨＡＴ培地を交換した。４から６週間後、それらの細胞培養上清を酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で抗体生産についてスクリーニングした。
【０２３６】
このプロトコルを用いると、産生されたトリオーマのおおよそ８０％から９０％が生存可能であり、おおよそ５０％が免疫グロブリンを分泌する。自己腫瘍組織切片を用いて陽性クローンを免疫組織化学的に検査し、陽性反応を示したクローンを、その後、再びクローニングした。
【０２３７】
ｃＤＮＡ合成およびＲＴ−ＰＣＲ：抗体の配列を得るために、ＱｉａｇｅｎからのＲＮＡＳＥ  Ｋｉｔを使用してそのトリオーマから全ＲＮＡを単離した。当該技術分野において標準的な方法、例えば、Ｋｒｅｎｎら（Ｃｌｉｐ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：１６８−１７５，１９９９）に記載されているもの、を用いて全ＲＮＡを調製することもできる。ハイブリドーマ細胞株ＬＭ−１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２３）から得た全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅをその製造業者の説示に従って使用して５μｇの全ＲＮＡで行った。１．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｐＭプライマー、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、およびＩＵ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５μＬ量でＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅を行った。それらのＰＣＲ産物を、次のサイクルプロフィールを用いて増幅した：２分間、９５℃、その後、３０秒間、９４℃を３５サイクル；それぞれ、（ＶＨ３およびＶＨ４プライマーについては）３０秒間、６５℃、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ６については６０℃およびＶＬプライマーについては５２℃；４分間、７２℃で最終伸長。
【０２３８】
抗体の配列決定：それらのＰＣＲ産物を、２％アガロース（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるゲル電気泳動、続いてＪｅｔｓｏｒｂゲル抽出キット（Ｇｅｎｏｍｅｄ，Ｂａｄ  Ｏｅｙｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＰＣＲ産物のゲル抽出を用いて精製した。その後、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ＋クローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してそれらのＰＣＲ産物をクローニングした。ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーション・サイクル・配列決定・キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１０の陽性クローンを配列決定し、ＡＢＩＰｒｉｓｍ３７３自動ＤＮＡシークエンサーで分析した（Ｔ３およびＴ７プライマーを使用して、両方の鎖を配列決定した）。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）配列比較ソフトウェア用のＤＮＡＳＩＳならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベースを使用して、それらの配列を分析した。前記国際免疫遺伝学（「ＩＭＧＴ」）データベースは、フランス、モンペリエのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒでＭａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃによってコーディネートされたものである。
【０２３９】
パラフィン切片の免疫組織化学染色：パラフィン包埋ヒト組織を切断した（２μｍ）。それぞれ５分間の２回のキシレン洗浄、それぞれ５分間の２回の１００％エタノール洗浄、１回、５分間のメタノール（７０ｍＬ）およびＨ２Ｏ２（５００μＬ）洗浄、それぞれ３分間の２回の９０％エタノール洗浄、それぞれ３分間の２回の８０％エタノール洗浄、それぞれ３分間の２回の７０％エタノール洗浄、およびＴｒｉｓ／ＮａＣｌ（５リットルの蒸留Ｈ２Ｏ中の、およびｐＨをＨＣｌで７．４に調整した、３グラムのＴｒｉｓ、４０．５グラムのＮａＣｌ）での洗浄によって、パラフィンを除去した。
【０２４０】
組織切片が入っているスライドガラスを、圧力釜の中の３００ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏおよびクエン酸（ｐＨ５．５）中で、５分間、１００℃でインキュベートした。スライドガラス１枚につき、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）中の０．５％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＦｒａｃｔｉｏｎＶ（「ＢＳＡ」；Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１５０μＬで、それらのスライドガラスを１５分間ブロックし、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで１回洗浄した。
【０２４１】
ＢＳＡ／ＰＢＳ（Ｄａｋｏ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１：５０希釈した（ＣＡＭ５．２は１：１０希釈した）一次抗体（例えば、ＬＭ−１、無関係、ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  ＩｇＭ，Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、１０μｇ／ｍＬ）、ＣＫ８抗体、またはマウスＣＡＭ  ５．２抗体）と共にそれらの切片を２．５時間、３７℃の加湿インキュベーターの中でインキュベートした。その後、それらの切片をＴｒｉｓ／ＮａＣｌ（５リットルの蒸留水中の、およびｐＨをＨＣｌで７．４に調整した、３グラムのＴｒｉｓ、４０．５グラムのＮａＣｌ）で３回洗浄し、続いて、３０％ウサギ血清を含有するＰＢＳ中で１：５０希釈した二次抗体（例えば、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトまたはウサギ抗マウス結合体（Ｄａｋｏ））と共に室温（「ＲＴ」）で１時間インキュベートした。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄した後、それらの組織切片をＰＢＳ中で１０分間インキュベートし、その後、１５０μＬジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）で１０分間、室温で染色した。流れる水道水を（１０〜１５分）用いて反応を停止させ、それらの切片をヘマトキシリンで対比染色した。グリセロール−ゼラチンでマウントした後、光学顕微鏡を使用してそれらの切片を分析した。
【０２４２】
自己腫瘍からの凍結切片の免疫組織化学染色
腫瘍：凍結ヒト組織を切断（４μｍ）し、２時間、空気乾燥させ、アセトン中で固定し、３０分間、空気乾燥させ、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ（５リットルの蒸留水中の、およびｐＨをＨＣｌで７．４に調整した、３グラムのＴｒｉｓ、４０．５グラムのＮａＣｌ）で洗浄した。その後、３％粉乳を含有するＰＢＳで１５〜３０分間、室温でそれらの凍結切片をブロックした。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄した後、それらの切片を、ＬＭ−１ヒトＩｇＭ抗体、無関係ヒトモノクローナルＩｇＭ（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ、１０μｇ／ｍＬ）、ＣＫ８（ＢＳＡ／ＰＢＳで１；５０希釈したもの；Ｄａｋｏ）またはマウスＣＡＭ  ５．２抗体（ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１０希釈したもの）と共に３０分間、室温でインキュベートした。それらの切片をＴｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄し、続いて二次抗体（７０％ＰＢＳおよび３０％ヒト血清中の、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトまたはウサギ抗マウス結合体  １：５０）と共に３０分間、室温でインキュベートした。Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄し、ＰＢＳ中で１０分間インキュベートした後、それらの切片を、ジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）で１０分間、室温で染色した。水道水を流しながら反応を停止させ、それらの切片をヘマトキシリンで対比染色した。グリセロール−ゼラチンでマウントした後、光学顕微鏡を用いてそれらの切片を分析した。
【０２４３】
腫瘍細胞膜抽出物の調製：例えばＨｅｎｓｅｌら（Ｉｎｔ．７．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５，１９９９）に記載されているような、当該技術分野における標準的な方法を用いて、記載されているように腫瘍細胞からの膜タンパク質の単離を行った。詳細には、集密腫瘍細胞（例えば、ＬＯＵ−ＮＨ９１細胞）をＰＢＳで２回洗浄し、細胞スクレーパーで回収し、遠心分離し、低張緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再び懸濁させ、氷上で１５分間インキュベートした。その後、それらの細胞を５分間、超音波処理し、１０，０００ｘｇでの１０分間の遠心分離によって核をペレットにした。その上清をスイングアウトローターで４０分間、１００，０００ｘｇで遠心分離して、膜をペレットにした。ペレットを低張緩衝液で洗浄した後、それらのペレットを膜溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、および１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に再び懸濁させた。競合プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もすべての溶液に添加した。
【０２４４】
ウエスタンブロッティング：例えばＨｅｎｓｅｌら（Ｉｎｔ．７．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５，１９９９）に記載されているような標準的な技法を用いて、ウエスタンブロットを行った。簡単に言うと、ブロットしたニトロセルロース膜を、３％低脂肪粉乳を含有するＰＢＳでブロックし、続いて、２０〜４０μｇのＬＭ−１ヒトＩｇＭ抗体または無関係ヒト対照ＩｇＭ（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ）と共に１時間インキュベートした。二次抗体（ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体  １：１，０００、Ｄｉａｎｏｖａ）を、Ｐｉｅｒｃｅ（ＫＭＦ，Ｓｔ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ化学発光キットで検出した。
【０２４５】
サイトスピン調製：Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を添加することにより前記付着成長細胞を剥離させ、続いて、加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で５分間インキュベートし、５分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、それらの細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０細胞培養基（ＰＡＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で２回洗浄した。細胞数を１ｘ１０５細胞／ｍＬの密度に調整した。この溶液からの１００μＬをサイトスピン遠心分離機（ＣＹＴＯＳＰＩＮ  ２、Ｓｈａｎｄｏｎ，ＵＫ）で２分間、５０ｒｐｍで遠心分離して顕微鏡用スライドガラスに移した。残りのサイトスピンを少なくとも２時間乾燥させ、下で明細に述べるように染色した。
【０２４６】
サイトスピンおよび凍結切片の免疫ペルオキシダーゼ染色：サイトスピンを少なくとも２時間、室温で乾燥させるか、凍結切片を、それらを切断した後、少なくとも２時間、乾燥させた。その後、それらの切片またはサイトスピンを１０分間、アセトン中で固定した。固定した凍結切片／サイトスピンを３０分間、室温で乾燥させ、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ（５リットルの蒸留水中の、およびｐＨをＨＣｌで７．４に調整した、３グラムのＴｒｉｓ、４０．５グラムのＮａＣｌ）で３回洗浄し、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ中に５分間、入れておいた。それらの凍結切片／サイトスピンを、ＰＢＳ中の３％粉乳（凍結切片／サイトスピンあたり１００μＬ）で１５〜３０分間ブロックし、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌで３回洗浄した。それらの凍結切片／サイトスピンを、室温の加湿チャンバーの中で３０分間、凍結切片／サイトスピンあたり１００μＬの一次抗体（例えば、０．５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中、２０μｇ／ｍＬ；ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：５０でのＣＫ８；ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：１０でのＣＡＭ  ５．２；または陰性対照としてＲＰＭＩ  １６４０培地（ＰＡＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ））中でインキュベートした。インキュベーション後、それらの凍結切片／サイトスピンをＴｒｉｓ−ＮａＣｌで３回洗浄した。
【０２４７】
その後、それらの凍結切片／サイトスピンを、室温の加湿チャンバーの中で３０分間、凍結切片／サイトスピンあたり１００μＬの二次抗体（７０％ＢＰＳ＋３０％ウサギまたはヒト血清＋例えば、１：５０ウサギ抗マウス抗体（ペルオキシダーゼ結合）または１：５０ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（ペルオキシダーゼ結合）；Ｄａｋｏ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）含有溶液中でインキュベートし、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌで３回洗浄し、１０分間、ＰＢＳに入れておいた。その後、０．０５％ジアミノベンジジンおよび０．０２％過酸化水素を含有する１００μＬの溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ（Ｍｕｎｃｈｅｎ），Ｇｅｒｍａｎｙ）中で１０分間、それらの凍結切片／サイトスピンをインキュベートした。インキュベーション後、それらの凍結切片／サイトスピンを蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、５分間、ヘマトキシリン染色溶液（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れておいた。その後、１５分間、水道水を流しながらそれらの凍結切片／サイトスピンをすすぎ、蒸留Ｈ２Ｏで洗浄し、予温したグリセロール−ゼラチンをかぶせた。
【０２４８】
グリコシダーゼアッセイ：分画遠心分離によって調製した、ＢＸＰＣ−３細胞の膜抽出物をグリコシル化研究に用いた。すべてのタイプのＮ−およびＯ−結合炭水化物鎖を切断するために、１％ドデシル硫酸ナトリウムおよび１％β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で３分間、９５℃でその膜抽出物を変性させた。その変性抽出物を、反応緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、１％ノニデットＮＰ−４０、１％β−メルカプトエタノール）で、０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈した。Ｏ−およびＮ−結合炭水化物の脱グリコシル化のために、１００μＬのアリコートを、１０Ｕ  Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）または５ｍＵ  Ｏ−グリコシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかと共に、３７℃で、一晩インキュベートした。反応緩衝液中の未処理抽出物は、対照として役立った。脱グリコシル化の程度をＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびウエスタンブロッティング手順によって分析した。
【０２４９】
実施例２
この実施例は、実施例１５および１６において説明する研究において用いる材料および方法の説明を含む。
【０２５０】
材料：ＲＰＭＩ  １６４０およびＦＣＳ（ＰＡＡ）、ｓｉｌｅｎｔ  Ｆｅｃｔ（ＢｉｏＲＡＤ）、細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃ５７８９）、Ｓｉ  ＧＥＮＯＭＥ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、μＭＡＣＳ、μＣｏｌｕｍｎｓ、ならびにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄｓおよび抗ヒトＩｇＭ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。
【０２５１】
ＰＢＳ：８００ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏ中の８ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．４４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および０．２４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４。
【０２５２】
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ：４００μＬ  Ｔｗｅｅｎ２０を添加した、８００ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏ中の８ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．４４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および０．２４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４。
【０２５３】
溶解緩衝液１：１％  Ｔｒｉｔｏｎ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８。
【０２５４】
低張（Ｈｙｐｏｔｏｎ）緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２。
【０２５５】
ランニング緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ  グリシン、０．１％ＳＤＳ。
【０２５６】
トランスファー緩衝液：１０ｍＬにつき１個のプロテアーゼ阻害剤ミニタブレットを添加した、４８ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３９ｍＭ  グリシン、２０％ＭｅＯＨ  ｐＨ９．２（Ｒｏｃｈｅ）。
【０２５７】
ローディング色素：２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、２１０ｍＭ  ＤＴＴ。
【０２５８】
膜調製用の溶解緩衝液（２）：１０ｍＬにつき１個のプロテアーゼ阻害剤ミニタブレットを添加した、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ、０．５％Ｎａ−ＤＯＣ、１０％グリシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（Ｒｏｃｈｅ）。
【０２５９】
トランスフェクション：前日にＢｘＰｃ−３細胞を６ウエルプレートに２ｘ１０５細胞／ウエルでプレーティングした。トランスフェクション当日、２つの溶液を調製した（ウエルあたり）：５μＬ  ｓｉｌｅｎｔ  Ｆｅｃｔを伴う１２５μＬの無血清培地（ＳＦＭ）、および１２５μＬのＳＦＭと２２．５μＬの５μＭ  ＲＮＡの溶液（最終濃度５０ｎＭ）。両方の溶液を混合し、３０分間、室温でインキュベートし、その混合物を細胞に一滴ずつ添加した。５〜６時間後に培地を交換した。４８時間後、細胞を１ｘＰＢＳで１回洗浄した。細胞を２００μＬ溶解緩衝液１に回収した。
【０２６０】
全細胞溶解産物の調製：予冷したＰＢＳで９ｘ１０６細胞（ＭＫＮ、ＢｘＰＣ、Ａ５４９）を３回洗浄した。細胞ペレットを１ｍＬ溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に再び懸濁させた。時々混合しながら氷上で３０分インキュベートした後、細胞を４℃で、１０，０００ｘｇで遠心分離して、細胞破壊片を沈降させた。上清を新たな１．５ｍＬ管に移した。
【０２６１】
細胞膜抽出物の調製：培養皿から培地を除去した後、予冷したＰＢＳで細胞を３回洗浄した。５ｍＬの予冷したＰＢＳを１５ｃｍ培養皿に添加し、細胞スクレーパーを使用して細胞をこすり落とした。細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに写し、１，３００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。異なる培養皿から細胞ペレットを集め、ＰＢＳで再び洗浄した。１，３００ｒｐｍで５分間の遠心分離後、細胞を低張緩衝液（１０ｍＬ／１ｇ  細胞ペレット）に懸濁させた。その細胞懸濁液を５分ごとに攪拌混合しながら３０分間インキュベートし、その後、液体窒素を用いて５回、凍解した。細胞破壊片を沈降させるために、その懸濁液を１０分間、１３，０００ｒｐｍで、４℃で遠心分離した。その後、その得られた上清を超遠心分離機で４５分間、１２５，０００ｘｇで、４℃で遠心分離した。懸濁液の４ｇの結果として得られたペレットを１ｍＬ溶解緩衝液に再び懸濁させ、ショートパルス（２秒）超音波処理で溶解した。その懸濁液を１０分間、１３，０００ｒｐｍで、４℃で遠心分離し、膜画分を含有する上清を新たな１．５ｍＬチューブに移した。
【０２６２】
免疫沈降：免疫沈降をμＣｏｌｕｍｎｓおよびμＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で行った。１５０〜３００μＬ膜調製物または３００〜４００μＬ完全溶解産物に、１．５μＬのモノクローナルマウス抗体（抗ｎｍｔ５５）および５０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍｉｒｃｏ  Ｂｅａｄｓ（磁気標識したもの）を添加し、溶解緩衝液を満たして８００μＬの合計量にした。
【０２６３】
その懸濁液を、４℃で１６ｒｐｍで回転させながら３０分間インキュベートした。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  μＣｏｌｕｍｎｓを、μＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場に配置した。２００μＬの溶解緩衝液ですすぐことによりカラムの準備をした。細胞溶解産物をそのカラムに適用した。溶解産物をカラムに通した後、５ｘ２００μＬの溶解緩衝液で洗浄した。溶離のために、２０μＬの予熱（９５℃）１ｘＳＤＳゲル負荷緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８；５０ｍＭ  ＤＴＴ；１％ＳＤＳ；０．００５％ブロモフェノールブルー；１０％グリセロール）をカラムに適用し、５分間、室温でインキュベートした。新たな回収チューブをカラムの下に置き、別の５０μＬの予熱（９５℃）１ｘＳＤＳゲル負荷緩衝液でカラムを溶離した。
【０２６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：１５μＬ負荷緩衝液を３５μＬの溶解細胞に添加した後、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。１レーンにつき１４μＬを負荷し、ゲルを４５分間、４０ｍＡで泳動させた。
【０２６５】
ウエスタンブロット：ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてウエット・ブロッティング・チャンバ（ＢｉｏＲａｄ）で１時間、３５０ｍＡでゲルをブロットした。ブロットをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ドライミルクで１時間ブロックした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ドライミルク中、一次抗体抗ｇｒｐ７８（１：２０００）、抗ｎｍｔ５５（１：２５００）および抗ビメンチン（１：１２５０）を、１時間適用した。ＬＭ１  Ｃ７（４０μｇ／ｍＬ）を２時間適用した。ブロットを５分間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を１時間適用した。ブロットを１５分間、３回洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ溶液で現像した。
【０２６６】
ＦＡＣＳ：細胞を常に氷上で保持し、氷冷して滅菌濾過したＰＢＳを使用した。トランスフェクションからの細胞を細胞解離溶液で１０分間溶解し、その後、完全成長培地に再び懸濁させ、５分間、８００ｇで遠心分離し、細胞を新たな完全培地に再び懸濁させて計数し、細胞を完全培地中、２ｘ１０５／ｍＬに調整し、氷上で３０分間インキュベートした。エッペンドルフチューブ１本につき細胞１ｍＬを分取し、ＰＢＳで洗浄し、４℃で８００ｇで遠心して沈降させ、５００μＬ  ＰＢＳに再び懸濁させ、回転させて沈降させ、その後、一次抗体：２５  ｒｅｓｐ．１００μｇ／ｍＬでのＬＭ１、または１：５０  ｒｅｓｐ  １：２５〜１：１００での抗ｎｍｔ５５を添加した。陰性対照は、アイソタイプ対照抗体であり、一次抗体を伴わないものであった。抗体インキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、二次抗体（抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ、Ｆ０３１７）または抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ｄｉａｎｏｖａ、１１５−０９５−００８）−２００μＬ中の１：５０希釈物、を添加し、３０分間（暗所で）インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５０μＬ  ＰＢＳ中のものをＦＡＣＳチューブに移した。ＦＡＣＳ  Ｓｃａｎ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）でＦＡＣＳを行い、フリーソフトウェアＷｉｎＭＤＩ２．８でデータを解析した。
【０２６７】
細胞培養：Ａ５４９（癌腫性ヒト肺胞基底上皮細胞）およびＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎細胞）をＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｉａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）から入手した。Ａ５４９およびＨＥＫ２９３細胞のための成長培地は、グルタミン不含のＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＡ）に１０％ウシ胎仔血清、１％  １−グルタミンおよび抗生物質を補足したものであった。細胞を３７℃、９５％空気および５％ＣＯ２で培養し、２から３日ごとに継代させた。
【０２６８】
Ｎｏｎｏ−センスおよび−アンチセンス構築物の生成：次のプライマーセット：５’プライマー−ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＡＡＣ−３’、および３’−プライマー５’−ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＣ−３’を使用し、ヒト膵癌細胞株ＢｘＰＣ．ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒトＮｏｎｏ  ｃＤＮＡを増幅させた。このフラグメントをＴＡクローニングによりｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートして、５０：５０比のＮｏｎｏ−センスプラスミドとＮｏｎｏ−アンチセンスプラスミドを生じさせた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、幾つかのＮｏｎｏ−センスおよびアンチセンス構築物を同定し、「ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ−Ａｎｔｉ」および「ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ」と呼んだ。ＰＣＲ産物の発現構築物への配列方向をＤＮＡ配列決定によって確認した（Ｑｉａｇｅｎ）。
【０２６９】
安定した細胞株の構築：安定した細胞株を産生させるために、ＴｒａｎｓＰａｓｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（ＢｉｏＬａｂｓ）をその製造業者の説示に従って使用して、Ａ５４９細胞に、５μｇのｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ−ＡｎｔｉまたはｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓプラスミドをトランスフェクトした（これは、ネオマイシン耐性を付与する）。トランスフェクションの２日後、細胞を１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＰＡＡ）中で２週間選択した。次に、Ｇ４１８耐性クローンを選択し、ｍｎｔ５５抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）またはペンタ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してウエスタンブロットによりＮｏｎｏタンパク質発現低減または増加について分析した。幾つかの陽性クローンを同定し、増幅させた。
【０２７０】
細菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるタンパク質生産：「ｐＥＸＰ５−ＣＴ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ」と呼ばれるヒトＮｏｎｏ遺伝子の完全長転写産物をコードするプラスミドでＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ２）Ｅ．Ｃｏｌｉを形質転換させた。アンピシリンを含有するＬＢプレートで形質転換体を選択し、その後、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを補足したＬＢ培地において２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩、コロニーを成長させた。アンピシリンを補足した新たなＬＢ培地でその一晩培養物を２５倍希釈し、０．９のＯＤ６００に達するまで３７℃で培養した。その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加および３７℃で３時間のインキュベーションによってタンパク質発現を誘導した。遠心分離によって細菌を回収し、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１／１０００  ＮＰ−４０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１／１０  グリセロール、５０μＭ  ＰＭＳＦならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  リソザイムおよびアンチプロテアーゼ剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）を含有する緩衝液中での超音波処理によって溶解した。遠心分離（１０分、５０００ｇ）による細胞破壊片の除去後、タンパク質をウエスタンブロット分析によって確認した。
【０２７１】
実施例３
本実施例は、ＬＭ−１モノクローナル抗体を発現する細胞株の産生の説明を含む。実施例１における材料および方法を用いて、下記の研究を行った。ＬＭ−１モノクローナル抗体重鎖および軽鎖可変領域配列の説明も含む。
【０２７２】
上で説明したように、癌患者のリンパ節から得たリンパ球とヘテロミエローマ細胞株ＨＡＢ−１（ｔａｌｌｅｒら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６２：５９５−５９８，１９９０）を融合させることによって、ＬＭ−１モノクローナル抗体発現ハイブリドーマを得た。前記リンパ源は、患者の年齢または性別に関して事前に選択しなかった。得られた細胞は、３つの細胞の融合体であるのでトリオーマとして知られているタイプのハイブリドーマである。正常なＢリンパ球と同様に、このトリオーマは、抗体を生産する能力を有する。抗体の特異性は、そのトリオーマを産生させるために用いた患者からの原リンパ球の特異性によって決まる。
【０２７３】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、それらのハイブリドーマ上清を抗体生産についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ後、抗体を、主として、それらの自己腫瘍に対して腫瘍特異的反応について免疫組織化学的に検査した。前記ＬＭ−１抗体は、肺腺癌を有する患者のリンパ球から産生させた。
【０２７４】
重鎖および軽鎖のそれぞれに３つある予測ＣＤＲを本明細書では適便にＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３；ならびにＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３と示す。
【０２７５】
ＬＭ−１重可変領域鎖の予測ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１、ＶＳＧＧＳＩＳＳＧＧＹＹ、ＣＤＲ２、ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ、およびＣＤＲ３、ＶＤＡＲＹＤＹＶＷＧＳＹＲＹＤＡＦＤＩである。ＬＭ−１重鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸２４〜３５をコードするヌクレオチド７２〜１０５にわたり、ＣＤＲ２は、アミノ酸５２〜６７をコードするヌクレオチド１５３〜２０１にわたり、およびＣＤＲ３は、アミノ酸１００〜１１８をコードするヌクレオチド３００〜３５４にわたる。
【０２７６】
軽可変鎖の予測ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１；ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ、ＣＤＲ２；ＤＮＮＫＲＰＳＧ、およびＣＤＲ３；ＧＴＷＤＳＳＬＳＡＧＷＶである。ラムダ軽鎖のＣＤＲ１は、位置２３〜３５にあるアミノ酸をコードするヌクレオチド６９〜１０５にわたる。ＣＤＲ２は、アミノ酸５１〜５８をコードするヌクレオチド１５３〜１７４にわたり、およびＣＤＲ３は、ヌクレオチド２７０〜３０３にわたり、アミノ酸９０〜１０１をコードする。
【０２７７】
実施例４
本実施例は、ＬＭ−１抗体の免疫組織化学的特性づけの説明を含む。実施例１における材料および方法を用いて下記の研究を行った。
【０２７８】
ハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体を特性づけするために、前記材料および方法において説明した免疫ペルオキシダーゼアッセイを用いて正常および腫瘍組織のパネルに対して抗体を検査した。このアッセイによって、組織が抗体により染色されることのおよび抗原の分布の外観を得た。
【０２７９】
腫瘍細胞に特異的であり、正常細胞には特異的でない抗体をさらに特性づけした。先ず、これらの抗体を異なる患者からの同じタイプの腫瘍に対して検査した。次に、これらの抗体を他の器官の腫瘍に対して検査し、最後に正常組織に対して検査した。これらのアッセイを用いて、ヒトＬＭ−１モノクローナル抗体を同定した。この腫瘍反応性抗体は、ＩｇＭ／λアイソタイプのものである（表１）。
【０２８０】
【表１】
2015131850.tif 000023
このヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の遺伝的起源を調査するために、ＶＨ遺伝子を増幅し、クローニングし、配列決定した。その配列をＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベース内の生殖細胞系配列と比較して、最も相同性の生殖細胞系遺伝子を同定し、体細胞突然変異を検出した。結果を表２に提示する。ＶＨセグメントのヌクレオチド配列と最も近い報告生殖細胞系ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列との同一度は、表２にまとめたようにおおよそ９９．６％であった。
【０２８１】
【表２】
2015131850.tif 000024
ＶＨ４遺伝子ファミリーの遺伝子は、ＬＭ−１抗体を発現した。抗体の親和性成熟の指標である、ＶＨ領域と生殖細胞系遺伝子との高い相同性および低いＲ／Ｓ比は、これらの抗体が、いずれも、抗原接触に起因する体細胞突然変異による親和性成熟を被らないことを示している。前記データは、ＬＭ−１抗体が、自然に存在する非親和性成熟抗体のファミリーに属することを示している。
【０２８２】
自己腫瘍に対する最初の検査の後、様々なパラフィン包埋および凍結包埋癌腫および正常組織に対する免疫組織化学染色を用いて、より詳細に、これらの抗体の反応パターンを調査した。ＬＭ−１抗体は、正常組織との検出可能な結合活性を示さなかった（表３）。
【０２８３】
【表３】
2015131850.tif 000025
対照的に、ＬＭ−１抗体は、様々な異なる腫瘍組織を染色した（表４）。
【０２８４】
【表４】
2015131850.tif 000026
ＬＭ−１抗体は、検査した様々な腫瘍組織に関して広い染色パターンを生じさせた。これらの研究において使用した陽性対照抗体は、肺および食道の扁平上皮癌についてはヒトサイトケラチン５／６（「ＣＫ  ５／６」；Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に対するマウスモノクローナル抗体、ならびにヒトサイトケラチンに対するマウスモノクローナル抗体（「ＣＡＭ  ５．２」；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙ）であった。追加の陽性対照抗体（結腸の腺癌についてはＡＥＩ／ＡＥ３、および乳房の侵襲性腺管癌腫については抗体ＣＫ８）をこれらの研究において使用した。
【０２８５】
ＬＭ−１抗体によって認識される抗原を調査するために、樹立肺癌腫細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１の膜抽出物を用いてウエスタンブロットを行った。抗体ＬＭ−１は、７０ｋＤａの近似的分子量を有する抗原と反応した。膜抽出物へのＩｇＭ抗体の非特異的結合を除外するために、無関係ヒト対照ＩｇＭを対照として使用した。
【０２８６】
さらに、ＬＭ−１モノクローナル抗体は、多数の癌腫細胞株も特異的に染色した。詳細には、ＬＭ−１抗体は、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、および肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）細胞を特異的に結合した。材料および方法セクションにおいて説明したサイトスピンプロトコルに従って、これらの細胞のスライドガラスを染色した。
【０２８７】
実施例５
本実施例は、ＬＭ−１抗体の細胞増殖抑制研究の説明を含む。実施例１における材料および方法を用いて、下記の研究を行った。
【０２８８】
当該技術分野において標準的である多数の方法によって、例えばテトラゾリウム塩の還元によって、細胞増殖をアッセイすることができる。黄色テトラゾリウム塩３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（「ＭＴＴ」）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、代謝活性細胞によって、一部はミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の作用によって、還元して還元等価物、例えばＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ、を生じさせた。得られた細胞内紫色ホルマザンを可溶化し、分光測光手段によって定量することができる。ＭＴＴ細胞増殖アッセイは、細胞増殖速度および、代謝事象がアポトーシスをもたらす場合には、細胞生存度低減を測定するものである。
【０２８９】
ＭＴＴアッセイのために、細胞をトリプシン処理し、１０％ウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）（ＬＯＵ−ＮＨ９１については２０％ＦＣＳ）、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する１０ｍＬのＲＰＭＩ−１４６０培地（完全培地）にそれらの細胞を再懸濁させた。その後、それらの細胞を計数し、１ｘ１０６細胞／ｍＬに希釈した。この懸濁液の５０μＬをピペットで９６ウエルプレートのウエルに移し、その結果、おおよそ５ｘ１０４細胞／ウエルにした。ウエルの第一列は、空にしておいた。その後、完全培地で希釈した抗体５０μＬをそれぞれのウエルに添加した。その後、その９６ウエルプレートを２４または４８時間、３７℃のインキュベーターでインキュベートした。インキュベーション時間の後、５０μＬ  ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中、５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれのウエルに添加した。その９６ウエルプレートを３０分間、３７℃でインキュベートし、５分間、８００ｘｇで遠心分離した。上清を吸引し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をそれぞれのウエルに添加し、細胞ペレットを再び懸濁させた。ＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍの波長および６９０ｎｍの参照波長での吸収を判定した。
【０２９０】
図１に示すように、２４時間後、モノクローナル抗体ＬＭ−１は、肺癌腫細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１の細胞増殖を抑制した。これらの研究では、上清を枯渇させたＬＭ−１モノクローナル抗体と共に、または抗体を伴わずに、ＬＯＵ−ＮＨ９１細胞を２４時間インキュベートした。ｙ軸は、５４０ｎｍでの吸収と６９０μｍでの吸収の差（Ａ５４０−Ａ６９０）を示す。これらのグラフから明らかであるようにＬＭ−１モノクローナル抗体とのインキュベーションは、２４時間のインキュベーション期間後も、４８時間のインキュベーション期間後も、細胞増殖および細胞生存度を減少させる結果となった。
【０２９１】
前述の研究のさらなる例示的結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。２４または４８時間後、モノクローナル抗体ＬＭ−１は、ヒト類表皮細胞癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈの細胞増殖を濃度依存的に抑制したが、細胞培養上清を枯渇させた対照は、不変のままであった（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０２９２】
実施例６
本実施例は、ＬＭ−１抗体の細胞アポトーシス研究の説明を含む。実施例１における材料および方法を用いて、下記の研究を行った。
【０２９３】
当該技術分野において標準的な多数のアッセイを用いて、抗体が細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを判定することができる。例えば、ＣＥＬＬ  ＤＥＡＴＨ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＬＭ−１抗体がアポトーシスを誘導する程度を分析した。この細胞死検出ＥＬＩＳＡは、ＤＮＡおよびヒストンそれぞれに対するマウスモノクローナル抗体を使用する定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ原理に基づく。このアッセイにより、アポトーシスから死滅する細胞の細胞質に放出されるモノ−およびオリゴ−ヌクレオソームの特異的判定が可能となる。
【０２９４】
詳細には、１ｘ１０４腫瘍細胞（ＬＯＵ−ＮＨ９１）を９６ウエルプレートにプレーティングし、ＣＯ２インキュベーターの中で、３７℃および７％ＣＯ２で、２４時間、異なる濃度のヒトＩｇＭ抗体ＬＭ−１の存在下でインキュベートした。無関係ＩｇＭ抗体を伴う細胞培養上清枯渇物が陰性対照として役立った。
【０２９５】
そのインキュベーション期間後、細胞を１０分間、２００ｘｇで遠心分離し、上清を除去した。その後、得られた細胞ペレットを２００μＬの溶解緩衝液と共に３０分間、室温でインキュベートした。遠心分離後、２０μＬの上清をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に写し、８０μＬの免疫試薬（１０％抗ヒストン−ビオチンと、１０％抗ＤＮＡ−ペルオキシダーゼ（抗ＤＮＡ  ＰＯＤ）と、８０％インキュベーション緩衝液との混合物）を添加し、その後、２５０ｒｐｍでＭＴＰシェーカーを用いて室温で２時間インキュベートした。そのインキュベーション期間後、インキュベーション緩衝液での洗浄段階により、未結合成分を除去した。基質としてＡＢＴＳ（商標）（５ｍＬ基質緩衝液中のＡＢＴＳ（商標）（２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズ−チアゾリン−スルホネート］）錠剤１個）を用いて光度計測によりＰＯＤを判定した。ブランクとしてのＡＢＴＳ（商標）溶液（おおよそ４９０μＬの参照波長）と比較して４１５ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダーを用いてこの反応の結果として形成される緑色沈殿の色強度を判定することにより、抗体誘導アポトーシスを測定した。この色強度に基づき、抗体誘導アポトーシスのレベルを計算した。
【０２９６】
これらの研究は、２４時間のインキュベーション後（図３および４Ａ）および４８時間のインキュベーション後（図４Ｂ）にＬＯＵ−ＮＨ９１癌腫細胞において抗体ＬＭ−１がアポトーシスを誘導することを明確に示した。これらの図中のＹ軸は、４１５ｎｍでの吸収と４９０ｎｍ参照波長での吸収の間の差（Ａ４１５−Ａ４９０）であり、培地対照は、ＲＰＭＩ  １４６０培地である。ＬＭ−１抗体の濃度は、上清中、２５μｇまたは５０μｇ／ｍＬであった。
【０２９７】
実施例７
本実施例は、ＬＭ−１抗体を使用することによるインビボ新生物イメージングの説明を含む。
【０２９８】
肺癌腫などの新生物を有する疑いがある患者に、本明細書中で説明する方法を用いて、放射性ヨウ素標識ＬＭ−１抗体または別の腫瘍特異的ポリペプチドおよび放射性標識非特異的抗体の用量を与えた。イメージングについての腫瘍の局在定位は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（Ｎ．Ｅｎｇｌ．７．Ｍｅｄ．，２９８：１３８４，１９７８）の手順に従って果たした。Ｉ．Ｖ．により、１３１Ｉ−ＬＭ−１抗体およびＴｃ−９９ｍ標識非特異的抗体の溶液の等容量の輸液を患者に投与することができる。試薬のＩ．Ｖ．投与の前に、概して、患者を抗体調製物（未標識）に対するまたは該抗体調製物と同種の抗体に対する過敏性について予備検査する。１３１Ｉの甲状腺取り込みを阻止するために、ルゴール液を１日２または３回、５滴の用量で経口投与する（これは、放射性ヨウ素標識抗体の注射の１日以上前に開始する）。標識調製物の注射後４、８および２４時間の時点で、様々な身体領域および視野の画像を撮る。存在する場合には、新生物、例えば結腸直腸癌腫、が、ＤｅＬａｎｄら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：３０４６，１９８０）によって１３１Ｉ標識抗ＣＥＡ抗体およびＴｃ−９９ｍ標識ヒト血清アルブミンについて説明されているように、Ｔｃ−９９ｍカウントの１３１Ｉのものからのサブトラクションでのガンマ・カメラ・イメージングにより、検出される。注射後８時間の時点で、イメージングは通常明瞭であり、２４時間スキャンが終わるまで向上する。
【０２９９】
実施例８
この実施例は、ＬＭ−１抗体、例えば標識抗体混合物、を使用することによる新生物治療の説明を含む。
【０３００】
新生物、例えば肺癌腫、を有すると診断された患者を、以下のように本発明のポリペプチドで治療することができる。ルゴール液を患者に、例えば１日３回７滴、投与することができる。その後、１３１Ｉ−ＬＭ−１抗体の治療用量をその患者に投与することができる。例えば、５０ｍＣｉの１３１Ｉ用量を週１回、３週間にわたって与え、その後、血液毒性がその療法をさえぎるまで、個別に調整した間隔、例えば３ヶ月に１回、で繰り返すことができる。正確な治療レジメンは、一般に、担当医またはその治療の監督者によって決められる。放射性ヨウ素標識抗体を５０ｍＬの滅菌生理食塩水での緩徐Ｉ．Ｖ．輸液として投与することができる。３回目の注射投与後、特に、第二治療サイクル後、または療法開始の１０週間後、原発性腫瘍および転移のサイズの低減を書き留めることができる。
【０３０１】
実施例９
本実施例は、結合体抗体による新生物治療の説明を含む。
【０３０２】
新生物を有すると診断された患者、例えば、胸部に転移した肺癌腫を有する患者を、１３１Ｉ−ＬＭ−１、１０Ｂ−ＬＭ−１、およびＴｃ−９９ｍ標識非特異的抗体の溶液で治療することができる。７０ｋｇの患者体重に基づき１００ＭＣｉの１３１Ｉ活性をもたらすために十分な量の１３１Ｉ−標識ＬＭ−１抗体（５０ｍＬの滅菌生理食塩水中のもの）を患者に投与することができる。この投薬量は、抗体分子あたり４０〜８０個のホウ素原子および８〜１６個のホウ素−１０原子を有する抗体３．３ｍｇに等しい。実施例６の手順を用いて、前記新生物を最初に正確に局在定位する。加えて、前の実施例の場合のように、ルゴール液を継続的に患者に投与しなければならない。その後、それらの規定された腫瘍位置に、十分に平行な熱中性子ビームを集束させることができる。８から２０分間で送達される４００〜８００ラドの外部中性子ビームの照射をそれぞれの腫瘍位置に対して行い、および場合によっては個別に調整した間隔で、放射性標識したまたはしていない腫瘍定位抗体を投与してそれを繰り返すが、同時に行われる外部照射療法が指示されない限り、通常は３２００ラドの総線量を超えない。所望される場合には、この療法に加えて、化学療法薬などの抗腫瘍剤を患者に投与することもできる。
【０３０３】
実施例１０
本実施例は、ＬＭ−１抗体の追加の免疫組織化学的特性づけの説明を含む。
【０３０４】
免疫組織化学分析により、ＬＭ−１抗体が様々な形態の癌に結合することが明らかになった。例えば、ＬＭ−１は、検査したすべてのグレードおよび期の肺腺癌に結合し、男性または女性間での差は検出されなかった。詳細には、ＬＭ−１抗体は、
【０３０５】
【化１８−１】
2015131850.tif 000027
での肺腺癌に結合し、それぞれの期の細胞のＬＭ−１についての陽性染色百分率が高い（４０％、５０％または６０％より高く、一般には９０％以上）。
【０３０６】
ＬＭ−１は、検査したすべてのグレードおよび期の肺扁平上皮癌にも結合し、男性または女性間での差は検出されなかった。詳細には、ＬＭ−１抗体は、
【０３０７】
【化１８−２】
2015131850.tif 000028
での肺扁平上皮癌に結合し、それぞれの期の細胞のＬＭ−１についての陽性染色百分率が高い（３０％より高く、一般には９０％以上）。
【０３０８】
さらに、ＬＭ−１は、検査したすべてのグレードおよび期の結腸腺癌に結合し、男性または女性間での差は検出されなかった。詳細には、ＬＭ−１抗体は、
【０３０９】
【化１８−３】
2015131850.tif 000029
での結腸腺癌に結合し、それぞれの期の細胞のＬＭ−１についての陽性染色百分率が高い（３０％より高く、一般には９０％以上）。
【０３１０】
加えて、ＬＭ−１は、検査したすべてのグレードおよび期の膵腺癌に結合し、男性または女性間での差は検出されなかった。詳細には、ＬＭ−１抗体は、
【０３１１】
【化１９】
2015131850.tif 000030
でのならびに内分泌腫瘍に基づく膵腺癌に結合し、それぞれの期の細胞のＬＭ−１についての陽性染色百分率が高い（３０％より高く、一般には９０％以上）。
【０３１２】
このように、従って、ＬＭ−１抗原は、男性と女性両方のすべてのグレードおよび期の肺腺癌、肺扁平上皮癌、結腸腺癌および膵腺癌で偏在的に発現される。従って、ＬＭ−１抗原は、ターゲットとなり、ＬＭ−１抗体およびそれらの機能性フラグメントは、男性と女性の両方におけるすべての期の肺腺癌、肺扁平上皮癌、結腸腺癌および膵腺癌を治療するための療法となる。
【０３１３】
免疫組織化学分析により、ＬＭ−１抗体が様々な転移形態の癌に結合することも明らかになった。詳細には、ＬＭ−１は、肺腺癌および肺扁平上皮癌から生ずるリンパ節および脳転移に結合する。ＬＭ−１は、乳房侵襲性腺管および侵襲性小葉癌から生ずるリンパ節転移にも結合する。さらに、ＬＭ−１は、結腸腺癌から生ずる肝臓転移、肺転移およびリンパ節転移に結合する。加えて、ＬＭ−１は、胃腺癌（腸管型および散在型のもの）から生ずる、膵腺癌から生ずる、ならびに頭部および頚部扁平上皮癌から生ずるリンパ節転移に結合する。従って、ＬＭ−１抗原は、ターゲットとなり、ＬＭ−１抗体およびそれらのフラグメントは、これらおよび他の癌から生ずる転移性腫瘍の樹立もしくは形成、または樹立した転移性腫瘍の成長を低減または抑制するための、ならびに癌再発または転移性腫瘍形成もしくは樹立への癌の進行または樹立されたもしくは形成した転移の成長もしくは増殖のリスクを低減するための療法になる。
【０３１４】
免疫組織化学分析により、ＬＭ−１抗体が様々な健常非癌性組織に検出可能に結合しないことも明らかになった。詳細には、ＬＭ−１は、胃（腺性）、結腸（上皮性）、肺（腺性もしくは肺胞性）、食道（上皮性）、膵臓（腺性）、肝臓（腺性）、腎臓（上皮性）、前立腺（腺性）、精巣（胚性）、乳房（腺性）、子宮（上皮性）、卵巣（腺性）、小腸（上皮性）、膀胱（上皮性）または副腎（内分泌腺性）には検出可能に結合しない。ＬＭ−１は、小脳、大脳皮質、内皮、網膜、輸卵管、心臓、腎臓、リンパ節、膵臓、甲状腺、副甲状腺、下垂体、胎盤、皮膚、脾臓、筋肉または胸腺にも検出可能に結合しない。
【０３１５】
実施例１１
本実施例は、２００３年１１月６日に寄託された、ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６２３として寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、もしくは７および１１として示す重鎖および軽鎖可変領域配列を有する抗体によって代表されるようなＬＭ−１抗体上に存在する炭水化物（Ｎ−グリカン）のプロファイルする研究の説明を含む。
【０３１６】
簡単に言うと、ヒト／マウスハイブリドーマから得たＬＭ−１を典型的な非ヒトグリカン構造の存在について評価した。ヒトおよび非ヒト哺乳動物グリカン構造は、シアリル化グリカンに基づいて区別することができる：ヒト起源のシアリル化グリカンは、シアル酸としてＮｅｕ５Ａｃしか含有しないが、齧歯動物および大部分の他の哺乳動物は、シアリル化構造にＮｅｕ５Ｇｃも組み込まれている。
【０３１７】
遊離過メチル化Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を用いて、前記抗体上に存在する構造を判定した。過メチル化グリカンにおけるＮｅｕ５ＧｃによるＮｅｕ５Ａｃ残基の置換によって３０Ｄａの質量シフトが導入される。過メチル化グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために、１．４ｍｇのＬＭ−１をＰＮＧａｓｅ  Ｆで消化し、遊離グリカンを精製した。過メチル化後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによりグリカンを分析した。
【０３１８】
ＬＭ−１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを図５Ａに示す。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ８ＧｌｃＮａｃ２は、高マンノースタイプのグリカンを表す。他の構造は、
【０３１９】
【化２０】
2015131850.tif 000031
に対応する。
【０３２０】
最も優勢なグリカン構造のみを図５Ａに示す。同定したすべてのグリカン構造を表５に列挙する：
【０３２１】
【表５−１】
2015131850.tif 000032
【０３２２】
【表５−２】
2015131850.tif 000033
ＬＭ−１に関するＮ−グリカンの詳細な分析をＡｒｎｏｌｄら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２９０８０（２００５）に発表されているデータと比較した。ＬＭ−１抗体のグリコプロファイリングは、複雑なグリカンパターンを示す。高マンノース構造（Ｍａｎ５からＭａｎ９）の有意な含量があり、シアリル化グリカンの有意な量もある。ガラクトシル化およびフコシル化グリカン（例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ）は、グリカンの小率しか構成しない。ＬＭ−１のグリカン組成は、ヒト血清ＩｇＭのグリコシル化に関してはＡｒｎｏｌｄらによって発表されたデータに匹敵する。しかし、グリコフォームに差がある。
【０３２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析（図５Ａ）は、異なるシアリル化Ｎ−グリカン上のＮｅｕＡｃとＮｅｕＧｃの両方の存在を明示している。シアリル化グリカンのそれぞれに、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃまたは両方のシアル酸を有するアイソフォームが存在する。
【０３２４】
実施例１２
本実施例は、炭水化物ターゲット抗原へのＬＭ−１の結合を示すと思われるデータを含む。本実施例は、炭水化物ライブラリーおよび血液型抗原に対するＬＭ−１抗体での結合研究の説明も含む。
【０３２５】
ＬＭ−１抗体は、多数の様々な腫瘍細胞、例えば肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  １９６）、肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＤＶ−９０（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３０７）、類表皮肺癌腫細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３８３）、および肺扁平上皮癌細胞株ＬＯＵ−ＮＨ９１（ＤＳＭＺアクセッション番号ＡＣＣ  ３９３）のうちの１つ以上、に結合する。実施例１において説明したように、腫瘍細胞をＮ−グリコシダーゼで処理し、その後、それらの細胞へのＬＭ−１の結合について分析した。
【０３２６】
本データは、Ｎ−グリコシダーゼ処理細胞へのＬＭ−１結合が有意に低減されたことを示しており、これは、ＬＭ−１が結合するエピトープにおける炭水化物部分の可能な改善を示唆しているが、実施例１６に記載するその後のデータは、ＬＭ−１が細菌発現抗原に結合することを示し、これは、炭水化物が抗原へのＬＭ−１の結合にとって必須ではないことを意味する。
【０３２７】
炭水化物のパネルをＬＭ−１抗体の結合についてスクリーニングした。詳細には、このパネルは、ポリアクリルアミド（ｐａｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）スペーサーに結合体化された単、二、三、四およびオリゴ糖類を含む。前記炭水化物、前記炭水化物中の糖数およびスペーサーのタイプを表６に列挙する。
【０３２８】
【表６−１】
2015131850.tif 000034
【０３２９】
【表６−２】
2015131850.tif 000035
【０３３０】
【表６−３】
2015131850.tif 000036
【０３３１】
【表６−４】
2015131850.tif 000037
【０３３２】
【表６−５】
2015131850.tif 000038
【０３３３】
【表６−６】
2015131850.tif 000039
【０３３４】
【表６−７】
2015131850.tif 000040
ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。簡単に言うと、炭水化物結合体を９６ウエル・マイクロタイタープレート上に固定させ、２％ウシ血清アルブミンでブロックし、第一段階では一次抗体と共にインキュベートした。ＰＯＤ標識二次ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、コード３０９−０３５−０９５）と共にインキュベートし、１５分間、ＴＭＢ−マイクロウエルペルオキシダーゼ基質（ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、コードＴＭＢ−５００）で現像し、参照波長としての６３０ｎｍに対して４５０ｎｍでＯＤを測定して、検出を行った。それぞれのプローブを二重反復で調査した。
【０３３５】
陽性シグナルは０．５から１．０のＯＤ範囲でなければならないので、第一の研究を６つの結合体のパネルに対して行って、検査のための個々の抗体希釈を見つけた。さらに、得られたシグナルの炭水化物特異性を立証するために、および非特異的アーチファクトを排除するために、２つのタイプの対照研究を行った：（ｉ）化学的には匹敵するが炭水化物でない抗原としてアミノグルシトール−結合体（番号０）の使用、および（ｉｉ）炭水化物構造を改変する、Ｗｏｏｄｗａｒｄ（Ｗｏｏｄｗａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ  ７８：１４３（１９８５））による過ヨウ素酸塩との炭水化物結合体のプレインキュベーション。従って、シグナル強度低下により、抗体結合の炭水化物特性が検出される。
【０３３６】
加えて、炭水化物を結合しない市販のヒトＩｇＭ抗体を、陰性対照として６つの結合体のパネルに対して調査した。この研究は、個々のマイクロタイタープレートそれぞれに関するそれぞれの結合体についてのブランク対照を含んだ。ブランクは、一次抗体とのインキュベーションを伴わないウエルを意味する。
【０３３７】
単一濃度、０．５μｇ／ｍＬ  ＬＭ−１、２μｇ／ｍＬ  ｈＩｇＭ陰性対照、およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２対照抗体については１：２０希釈（これは、０．１μｇ／ｍＬ未満の濃度を意味する）でスクリーニングを行った。ＮＭ−ＴＦ２抗体を、この抗体によって強く認識されるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−結合体（表６、番号３７）に対して検査した。シグナル強度は、常に、４より大きいＯＤまで測定された。
【０３３８】
ブランクプローブのシグナル強度は、常に、ＯＤ＜０．００２０で測定された。図５Ｂ〜５Ｆは、抗体ＬＭ−１についてのスクリーニングの結果を示すものであり、表６に列挙したような単糖類−（図５Ｂ）、二糖類−（図５Ｃ）、三糖類−（図５Ｄ）、四糖類−（図５Ｅ）およびオリゴ糖類−（図５Ｆ）結合体への結合に関する例証となる。対照バーは、順番に、ブランク、非炭水化物結合体（表６、番号「０」）、そして陽性対照Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２である。
【０３３９】
スクリーニングは、陽性対照抗体Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２と比較して高い抗体濃度にもかかわらず低いシグナル強度を示した。さらに、相対的に高い結合が非炭水化物対照（０）について測定されたが、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２についてはそうではなかった。それにもかかわらず、荷電炭水化物結合体への結合は、非荷電炭水化物結合体と比較して強化されるようであった。しかし、重ねて、実施例１６のデータは、炭水化物が抗原へのＬＭ−１結合にとって必須でないことを示す。
【０３４０】
シグナルの特異性を確認するために、ならびに高いバックグラウンドと区別するために、３つの追加の研究を行った。これらの研究には結合体６ＯｓｕＬａｃＮＡｃ（表６、番号７７）を選択した。この結合体に対するシグナル強度が強化されたからである。加えて、陽性対照抗体Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２を、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−結合体（表６、番号３７）に対して調査した：
（ｉ）すべての被覆抗原が結合している濃度（飽和濃度）で開始する、一連の異なる濃度の抗体の結合体６ＯｓｕＬａｃＮＡｃ（表６、番号７７）に対する結合。用いるＥＬＩＳＡ条件下で最大結合を生じさせる結果となる抗体濃度で、濃度依存的結合の測定を開始した。結合体６ＯｓｕＬａｃＮＡｃへの結合については、ＬＭ−１（２０μｇ／ｍＬ）を使用した。Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２の開始濃度は、＜０．１μｇ／ｍＬであった（結合体番号３７、表６、への結合）。ＯＤと濃度の直線関係は、非特異的吸収を示し、これは、この炭水化物への特異的な結合が無いことを意味する。
【０３４１】
（ｉｉ）４つの濃度（希釈段階１：２）での６ＯｓｕＬａｃＮＡｃ（表６、番号７７）および非炭水化物結合体（表６、番号０）に対する抗体結合の比較。結合体６ＯｓｕＬａｃＮＡｃ（表６、番号７７）に対するならびに非炭水化物結合体（表６、番号０）に対する濃度依存的結合をより小さい濃度範囲で調査した。対照抗体Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２での測定は行わなかった。この抗体は、非炭水化物結合体に結合しないからである。炭水化物結合体への結合と非炭水化物結合体への結合の比較は、ある程度、特異的炭水化物認識を示すことができる。
（ｉｉｉ）過ヨウ素酸塩インキュベーションを伴うまたは伴わない６ＯｓｕＬａｃＮＡｃ（表６、番号７７）および非炭水化物結合体（表６、番号０）への結合。酸性ｐＨでの穏やかな過ヨウ素酸塩酸化は、ヒドロキシル基に隣接する炭水化物を切断する（Ｗｏｏｄｗａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ  ７８：１４３（１９８５））ので、従って、炭水化物媒介抗体結合の特異性を確認するためのツールとなる。炭水化物抗原と過ヨウ素酸塩のプレインキュベーションは、抗体結合のシグナル強度を低下させるであろう。ＬＭ−１抗体の結合は、シグナル低下が測定されたＮｅｍｏｄ−ＴＦ２対照抗体と比較して、過ヨウ素酸塩に対して感受性でなかった。さらに、炭水化物被覆ウエルへの結合増加ばかりでなく、非炭水化物被覆ウエルへの結合増加も測定された。これは、ことによるとサンプル中の不純物（単数または複数）によって媒介される、高いバックグラウンド結合についての解釈を裏付ける。
【０３４２】
データは、いずれの糖への特異的結合も不在であることを示している。従って、検査した炭水化物がターゲットを表す、およびタンパク質部分がエピトープの一部であり得るという可能性は低いようである。
【０３４３】
血液型抗原の分析のために、標準的な赤血球凝集反応アッセイを用いて、ＬＭ−１抗体をＡ１、Ａ２、ＢおよびＯ血液型への結合についてスクリーニングした。赤血球凝集反応は、赤血球（ＲＢＣ）が関係するものであり、（公知抗体を有する）ＲＢＣ表面抗原を同定するために、または（公知表面抗原を有するＲＢＣを用いて）抗体をスクリーニングするために用いることができる。結果は、ＬＭ−１が、Ａ１、Ａ２、ＢおよびＯ血液型抗原のいずれにも検出可能に結合しなかったことを示している。
【０３４４】
リンパ球および顆粒球へのＬＭ−１抗体結合の分析について。簡単に言うと、静脈血をボランティアから採血し、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配を調製して血液成分を分離した。フィコールは、血液をその成分（例えば、赤血球、白血球など）に分離するために使用されるフィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）の一部である。フィコール−パックをカラムの底に配置し、その後、血液をゆっくりとフィコール−パックの上に積層する。遠心分離後、カラム内で以下の層が見えるようになる、上から下へ：血漿および他の成分、単核細胞（ＰＢＭＣ／ＭＮＣ、例えばリンパ球）、フィコール−パック、そしてペレット形で存在するであろう赤血球および顆粒球。フィコール密度勾配での分離後、異なる細胞集団（リンパ球、顆粒球）を洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために使用した。その後、細胞（２ｘ１０５）を、氷上で、１００μｇ／ｍＬの最終濃度でのＬＭ−１抗体または同じ濃度でのアイソタイプを合せたヒト対照抗体（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、１５分間、氷上でインキュベートし、０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、その後、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（１：５０、Ｄｉａｎｏｖａ）と共に１５分間、氷上でインキュベートした。０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで抗体を最適に希釈し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）によって細胞を分析した。結果は、ＬＭ−１がリンパ球および顆粒球に検出可能に結合しなかったことを示している。
【０３４５】
実施例１３
本実施例は、ＬＭ−１抗体フラグメントが細胞増殖抑制活性を保持することを示す研究の説明を含む。
【０３４６】
２００３年１１月６日に寄託された、ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６２３として寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体によって代表されるまたは配列番号１、３、５、もしくは７および１１として示す重鎖および軽鎖可変領域配列を有する抗体によって代表されるようなＬＭ−１抗体を、ＮＡＰ（商標）−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）との緩衝液交換に付し、その後、ペプシン消化に付した。抗体の各ミリグラムにつき、５μｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、その後、１０〜１５分間、３７℃水浴内でインキュベートした。１／１０容量の３．０Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）の添加により反応を停止させ、その後、１０，０００ｇで３０分間、遠心分離した。無関係対照ヒトＩｇＭ抗体（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ＩｇＭ、Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのペプシン消化も行った。アポトーシス研究前に、ＦＶフラグメントおよびヒト対照ＩｇＭフラグメントをＰＢＳに対して透析した。ＳＤＳゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングにより、両方の抗体のペプシン切断を確認した。実施例４において説明したＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いて、ＢＸＰＣ−３およびＭＫＮ−４５細胞の増殖に対する効果を研究した。
【０３４７】
データは、ＬＭ−１  ＦＶフラグメントがＢＸＰＣ−３およびＭＫＮ−４５細胞の細胞増殖を抑制することを示している。前述の結果は、ＬＭ−１抗体フラグメントが、細胞増殖を抑制または低減する能力を保持することを示している。
【０３４８】
実施例１４
本実施例は、ＬＭ−１抗体のインビボ研究の説明を含む。データは、ＬＭ−１抗体が、有効であり、結腸癌腫、肺癌、膵臓癌、化学療法に耐性の腫瘍をはじめとする様々な腫瘍のサイズ、ならびに腫瘍転移を低減できることを示している。
【０３４９】
ＨＴ−２９ヒト結腸癌腫細胞は、ヒトにおける転移についてのモデルであると考えられる。この結腸癌腫は、マウスにおいて肝臓に転移する。
【０３５０】
簡単に言うと、ＨＴ−２９細胞（１ｘ１０６）を３群の無胸腺マウス（週齢１０週Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に門脈内注射した。接種後第７、９、１１、１３および１５日の時点で、マウスに２６０μｇのＰＡＴ−ＬＭ１（〜１０．４ｍｇ／ｋｇ、群１）および２６０μｇの非特異的ＩｇＭ（群２）を１日おきに投与した。追加の対照動物（群３）は、いずれの治療も受けなかった（無注射）。第６０日の時点で肝臓に関する巨視的および微視的腫瘍病変を有する動物の数をそれぞれの群について判定した。
【０３５１】
ＬＭ−１注射マウスの体重は、ＨＴ−２９細胞の注射後８週間にわたって維持された。対照的に、無注射対照マウスおよび非特異的ＩｇＭ注射対照マウスに関する体重は、肝臓転移からの健康不良のため、６０日の観察期間中にほぼ２０％低下した（図６）。
【０３５２】
肝臓に関する多数の巨視的および微視的病変が、無注射対照マウスの約８０％において、および非特異的ＩｇＭ対照マウスの約７０％において発生した。対照的に、ＬＭ−１注射マウスの約２０％しか肝臓に関する巨視的病変または微視的病変のいずれかを有さなかった（図７）。従って、前述の結果は、ＬＭ−１抗体が、腫瘍転移樹立、形成、または転移性細胞の増殖（成長）を低減できることを示している。
【０３５３】
上述の結果は、ＬＭ−１抗体が、肝臓における転移の数を低減することを示している。ＬＭ−１抗体治療は、腫瘍細胞注射後、動物の初期体重を維持する。これはＬＭ−１の全身性抗腫瘍活性を示すだろう。
【０３５４】
Ａ−５４９は、動物において肺癌腫を形成するヒト細胞株であり、従って、ヒト肺癌腫（例えば、非小細胞肺癌腫、ＮＳＣＬＣ）の動物モデルとして使用することができる。Ａ−５４９肺癌腫細胞（２．０ｘ１０６）を第０日の時点でマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨａｎＨｓｄ−ｓｃｉｄ、週齢６〜８週、群あたりｎ＝１０）に皮下注射した。ＬＭ−１抗体（２００μｇ）または対照ｍＡｂ（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＭ）、またはビヒクル対照（ＮａＣｌ）を第１、３、５、７および９日の時点でマウスに腹腔内投与した。第１７日の時点でマウスを犠牲にし、腫瘍重量および容積を判定した。
【０３５５】
ＬＭ−１抗体を注射したマウスにおける平均腫瘍サイズは、対照ｍＡｂを注射したマウスより有意に少なかった。ＬＭ−１抗体を注射したマウスの腫瘍サイズの低減は、対照ｍＡｂを注射したマウスと比較して、７１％であった。
【０３５６】
組織学的分析により、ＬＭ−１治療マウスにおいて腫瘍病変が腫瘍細胞アポトーシスならびに腫瘍成長抑制および退縮の証拠を示すことが明らかになった。ＬＭ−１治療マウスにおいて、腫瘍病変は、壊死の証拠も示した。
【０３５７】
ＢＸＰＣ−３は、動物において膵臓癌（癌腫）を形成するヒト細胞株であり、従って、ヒト膵臓癌の動物モデルとして使用することができる。ＢＸＰＣ−３細胞（２．０ｘ１０６）を第０日の時点でマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨａｎＨｓｄ−ｓｃｉｄ、週齢６〜８週、群あたりｎ＝１０）に皮下投与した。第８日（５用量）時点でおよび第４週（４用量）に腫瘍が樹立した状態（触診できる）になった後、１日おきにＬＭ−１抗体（２００μｇ）または対照ｍＡｂ（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＭ）を腹腔内投与した。第２４日の時点でマウスを犠牲にし、腫瘍容積を判定した。
【０３５８】
ＬＭ−１抗体を注射したマウスにおける樹立膵臓腫瘍のサイズは、対照ｍＡｂを注射したマウスより有意に少なかった。ＬＭ−１抗体を注射したマウスの腫瘍サイズの低減は、対照ｍＡｂを注射したマウスと比較して、４４％であった。
【０３５９】
樹立腫瘍モデルにおいてＬＭ−１活性を判定するために、マウスにおける樹立Ａ−５４９細胞肺癌腫をＬＭ−１抗体での治療に付した。Ａ−５４９肺癌腫細胞（２．０ｘ１０６）を第０日の時点でマウス（ＮＭＲＩヌードマウス、週齢６〜８週、群あたりｎ＝１０）に皮下投与した。腫瘍が樹立した状態（触診可能、約７ｍｍ２）になった後、樹立した腫瘍を有するマウス（肺癌腫細胞投与の１４日後）に、ＬＭ−１抗体（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、もしくは２７ｍｇ／ｋｇ）または対照食塩水もしくはＩｇＭ  ｍＡｂ（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＭ、６７５μｇ）を、１日おきに、ｑｏｄ、６回、腹腔内投与した。第１４日の時点で、平均腫瘍容積は、約２００ｍｍ３であった。第２７日の時点でマウスを犠牲にし、腫瘍容積を判定した。
【０３６０】
樹立腫瘍容積の低減は、用量依存性であり、腫瘍容積の最大低減は、２７ｍｇ／ｋｇの用量で観察された。腫瘍容積は、１および３ｍｇ／ｋｇの用量で安定するようであった。９ｍｇ／ｋｇの用量では、腫瘍容積の明白な低減はなかった。
【０３６１】
上述の結果は、ＬＭ−１抗体が、結腸癌腫、肺癌、膵臓癌、化学療法に耐性の腫瘍をはじめとする様々な腫瘍タイプのサイズ、ならびに腫瘍細胞転移樹立、形成および増殖（成長）を低減できることを示している。上述の結果は、ＬＭ−１抗体が、腫瘍もしくは転移の数、サイズを低減できる、または様々な樹立腫瘍の数もしくはサイズを安定させることができることも示している。
【０３６２】
実施例１５
本実施例は、ＬＭ−１ターゲット同定および検証の説明を含む。データは、ＬＭ−１抗体が、５４ｋＤａ核ＲＮＡ−およびＤＮＡ−結合タンパク質（ｐ５４ｎｒｂ）ならびに５５ｋＤａ核タンパク質（ｎｍｔ５５）としても公知の、非ｐｏｕドメイン含有オクタマー結合タンパク質（ＮＯＮＯ）に明らかに結合できることを示している。
【０３６３】
簡単に言うと、ＢｘＰＣ３細胞の膜調製物を２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＤＥ）によって分析した。分画タンパク質（図８Ａ）をＰＶＤＦ膜に移し、その後、ＬＭ−１抗体で染色した。ＰＶＤＦ膜上に示されているスポット（ＬＭ−１に結合したもの；図８Ｂ）を銀染色ＰＡＧＥに重ね合わせ、８つの対応するスポットをそのゲルから切り取り、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＤＥ）に付した。
【０３６４】
同定されたフラグメントの配列データベースとの比較後、確率の順にそれぞれのスポットからのタンパク質を列挙する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果は、スポット１ａ、ビメンチン、デスミン、チューブリン、アルファ、ケラチン、および神経フィラメント；スポット１ｂ、ビメンチン、デスミン、ペリフェリン、ケラチン、および神経フィラメント；スポット１ｃ、ビメンチン、デスミン、ペリフェリン、ケラチン、神経フィラメント、およびアルファ−インターネキシン；スポット２、サイトケラチン８；スポット３、非同定物、胃抑制性ポリペプチド、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド、ホスホリパーゼＣ−アルファ、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ；スポット４、サイトケラチン１８、およびＡＴＰ−結合カセットタンパク質；スポット５、ベータアクチン；スポット６、５４ｋＤａタンパク質、非−ＰＯＵドメイン含有（ＮＯＮＯ）、およびヒトスプライシング因子；スポット７、非同定物、フコシルトランスフェラーゼ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、ＨＥＣＴドメイン含有１、およびＡｌｕサブファミリーＳＢ１；スポット７、非同定物、フコシルトランスフェラーゼ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、ＨＥＣＴドメイン含有１、およびＡｌｕサブファミリーＳＢ１；スポット８、非同定物、セリン／アルギニン反復マトリックス２、ｒａｓグアニル放出タンパク質、無名タンパク質産物、およびｍＫＩＡＡ０２３２タンパク質であった。
【０３６５】
ＢＸＰＣ−３抽出物のゲルクロマトグラフィーによってもＬＭ−１ターゲットを同定し（図９Ａ）、画分９および１０を選択してアニオン交換クロマトグラフィーおよびその後のＬＭ−１抗体でのブロッティングに付した（図９Ｂ〜９Ｄ）。対応するゲル（５８および６５ｋＤａ）から適切なサイズの染色されたＬＭ−１ターゲットタンパク質を切り取り、配列決定した。
【０３６６】
簡単に言うと、タンパク質バンドを還元し、アルキル化し、その後、プロテアーゼトリプシンで消化した。得られたペプチドを、ペプチド質量フィンガープリントを得るために８００Ｄａ〜４５００Ｄａの範囲に関してＭＡＬＤＩ  ＭＳで測定した。プログラムＰｒｏＦｏｕｎｄでのデータベース検索をＮＣＩＢデータベースに対して行った。
【０３６７】
バンド１：このタンパク質をカルネキシン［６７．９ｋＤａ／ｐＩ  ４．６／ｇｉ｜１７９８３２／ホモサピエンス］として同定した。
【０３６８】
バンド２：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ１［５６．３ｋＤａ／ｐＩ  ６．７／ｇｉ｜４８８５２８１／ホモサピエンス］をバンド２において同定した。
【０３６９】
バンド３：このタンパク質をカルネキシン［６７．９ｋＤａ／ｐＩ  ４．６／ｇｉ｜１７９８３２／ホモサピエンス］として同定した。
【０３７０】
バンド４：バンド４のタンパク質を非ＰＯＵドメイン含有、オクタマー結合、［５４．３ｋＤａ／ｐＩ  ９．１／ｇｉ｜３４９３２４１４／ホモサピエンス］として同定した。
【０３７１】
バンド５：このバンドの同定は、おそらくこのゲルバンドにおける低いタンパク質濃度のため、実際には明瞭でない。しかし、このタンパク質バンドが、非ＰＯＵドメイン含有、オクタマー結合、［５４．３ｋＤａ／ｐＩ  ９．１／ｇｉ｜３４９３２４１４／ホモサピエンス］から成るという証拠がある。
【０３７２】
バンド６：ケラチン９［６２．３ｋＤａ／ｐＩ  ５．１／ｇｉ｜５５９５６８９９／ホモサピエンス］とシャペロニン［６１．２ｋＤａ／ｐＩ  ５．７／ｇｉ｜３１５４２９４７／ホモサピエンス］の混合物をこのタンパク質バンドにおいて見つけることができた。ケラチン９は、不純物であろう。
【０３７３】
野生型ＮＯＮＯのアミノ酸配列（配列番号１６）と、野生型と同一であるＬＭ−１ターゲットにおいて同定された配列を、太字で目立たせる（第一同定）。
【０３７４】
【化２１】
2015131850.tif 000041
野生型ＮＯＮＯのアミノ酸配列と、野生型と同一であるＬＭ−１ターゲットにおいて同定された配列を、太字で目立たせる（第二同定）。
【０３７５】
【化２２】
2015131850.tif 000042
上記データは、ＬＭ−１が新たな癌ターゲット、すなわち、５４ｋＤａ核ＲＮＡ−およびＤＮＡ−結合タンパク質（ｐ５４ｎｒｂ）ならびに５５ｋＤａ核タンパク質（ｎｍｔ５５）としても公知の、非ＰＯＵドメイン含有オクタマー結合タンパク質（ＮＯＮＯ）の膜結合アイソフォーム、に結合することを示している。このタンパク質は、癌、腫瘍および悪性細胞上で発現され、ＬＭ−１結合は、それが結合する細胞のアポトーシスを誘導する。
【０３７６】
ｎｍｔ５５遺伝子は、染色体Ｘｑ１３．１（７０，４２０，１５８−７０，４３７，７４３）にマッピングされることが報告されている。ヒト活性Ｘ染色体を含有する（３つのハイブリッド）またはヒト不活性Ｘ染色体を含有する（５つのハイブリッド）、８つのマウス／ヒト体細胞ハイブリッドにおける３３Ｘ結合遺伝子の発現分析により、ｎｍｔ５５遺伝子が、活性ヒトＸとのハイブリッドにおいてしか発現されないことを示すことが報告された。この遺伝子は、約１８ｋｂにわたり、およびサイズが４０から１，２２７ｂｐにわたる１２のエキソンから成る。この出発コドンがエキソン３の中にあり、停止コドンがエキソン１２の中にあることは報告されている。
【０３７７】
ＬＭ−１ターゲットのアイデンティティーを検証するために、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを行って、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５の発現をダウンレギュレートさせた。ＬＭ１の結合は、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５がそのターゲットであるならば消失するはずである。
【０３７８】
簡単に言うと、ＢｘＰｃ−３細胞を特異的ｓｉＲＮＡ（ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ｓｉＧＥＮＯＭＥ  Ｓｍａｒｔ  Ｐｏｏｌ）で一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に回収した。細胞を溶解し、サンプルを１０％ＰＡＧＥで泳動させ、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。その膜ブロットをα−ｎｍｔ５５またはＬＭ−１  ＩｇＭのいずれかで染色した。
【０３７９】
ｓｉＲＮＡは、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５発現をダウンレギュレートさせた（図１０Ａ）。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＬＭ−１の結合は低減された（図１０Ｂ、矢印）。これらの研究は、ＬＭ−１がＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５に結合することの確証となる。
【０３８０】
ＬＭ−１ターゲットのアイデンティティーをさらに確証するために、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５に結合する市販の抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、ＭＡ３−２０２４）を用いて、ＭＫＮ、ＢｘＰＣ−３およびＡ５４９細胞膜調製物の免疫沈降研究を行った。結果を図１１〜１３に示す。
【０３８１】
図１１Ａ〜１１Ｄは、ＭＫＮ細胞での結果を示すものである。簡単に言うと、細胞膜抽出物を抗ｎｍｔ５５で免疫沈降させ、その後、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５マウスｍＡｂ／抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（図１１Ａ）、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（図１１Ｂ）、ＬＭ−１／抗ヒトＩｇＭ  ＨＲＰ（図１１Ｃ）、抗ヒトＩｇＭ  ＨＲＰ（図１１Ｄ）で染色した。上部（より高い分子量）矢印は、ＮＯＮＯであり、底部（より低い分子量）矢印は、マウス重鎖である。
【０３８２】
図１２Ａ〜１２Ｂは、ＢｘＰＣ−３細胞での結果を示すものである。簡単に言うと、細胞膜抽出物を抗ｎｍｔ５５で免疫沈降させ、その後、ＬＭ−１で染色した（図１２Ａ）、または抗ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５で染色した（図１２Ｂ）。矢印は、ｎｍｔ５５およびマウスＩｇＧ重鎖を示す。これらの結果は、抗ｎｍｔ５５抗体はＢｘＰＣ−３細胞膜抽出物からのタンパク質を沈降させることができることを示している。
【０３８３】
図１３Ａ〜１３Ｂは、Ａ５４９細胞での結果を示すものである。簡単に言うと、細胞膜抽出物を抗ｎｍｔ５５で免疫沈降させ、その後、抗ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５で染色した（図１３Ａ）、またはＬＭ−１で染色した（図１３Ｂ）。矢印は、ｎｍｔ５５およびマウスＩｇＧ重鎖を示す。これらの結果は、抗ｎｍｔ５５抗体が、Ａ５４９細胞膜抽出物からのタンパク質を沈降させることができることを示している。
【０３８４】
ＬＭ−１ターゲットのアイデンティティーをさらに検証するために、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５に結合する抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、ＭＡ３−２０２４）またはＬＭ−１を用いてＡ５４９、ＢｘＰＣ−３およびＭＫＮ細胞のＦＡＣＳ分析を行った。これらの研究により、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５が、Ａ５４９、ＢｘＰＣ−３およびＭＫＮ細胞の細胞表面上で発現されることが明らかになった。
【０３８５】
Ａ５４９細胞をＮＯＮＯアンチセンスで安定的にトランスフェクトし、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５に結合する抗体およびＬＭ−１を用いてＦＡＣＳ分析により分析した。ベクターを生成するために、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒトＮｏｎｏ  ｃＤＮＡ（１４２２ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲ増幅後、Ｎｏｎｏ完全長転写産物をＴＡクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓに挿入した。この方法は、非定方向クローニング戦略であり、従って、Ｎｏｎｏ−センス（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ）プラスミドとＮｏｎｏ−アンチセンス（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ−Ａｎｔｉ）プラスミドの間の比率は、おおよそ５０：５０である。ＰＣＲによるスクリーニング後、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）の制御下でＮＯＮＯをセンス方向で有する（ＮＯＮＯ−センス）およびアンチセンス方向で有する（ＮＯＮＯ−アンチ）幾つかのクローンを同定した。
【０３８６】
ＴｒａｎｓＰａｓｓトランスフェクション試薬を使用してＡ５４９細胞をＮＯＮＯ−アンチでトランスフェクトし、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８中で２〜３週間、選択した。このアンチセンスを有する７つの安定した細胞株が樹立された。これらの細胞における内因性Ｎｏｎｏタンパク質発現のウエスタンブロット分析により、対照細胞におけるレベルと比較してタンパク質レベルの有意な低減が明らかになった。
ＮＯＮＯ−アンチでトランスフェクトしたＡ５４９細胞のＦＡＣＳ研究により、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５とＬＭ−１の両方の該細胞へのより弱い結合が明らかになった。これらの研究は、Ａ５４９細胞の細胞表面でのＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５発現のダウンレギュレーションが、アンチＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５およびＬＭ−１の該細胞への結合を低減することを示している。
【０３８７】
ＴｒａｎｓＰａｓｓトランスフェクション試薬を使用して、ＮＯＮＯ−センスをＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８中で２〜３週間、選択した。ＮＯＮＯを過発現する１０の安定した細胞クローンが樹立された。これらの細胞のウエスタンブロット分析は、組換えＮｏｎｏ−６ｘＨｉｓ融合タンパク質の安定した過発現を示した。これらの安定した細胞株は、ＦＡＣＳ研究のために使用することができ、またはＮｏｎｏ−６ｘＨｉｓタンパク質精製後、特定のターゲットＥＬＩＳＡの生成のために使用することができる。
【０３８８】
ＮＯＮＯでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞にＬＭ−１が結合することを確認するために、４０μｇのＨＥＫ２９３−Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ−Ａ９およびＨＥＫ２９３ｗｔ細胞溶解産物をウエスタンブロットのために使用した。ブロッティング後、ＬＭ−１（ＩｇＭ）およびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・結合体二次抗体（抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ）を使用して免疫反応性タンパク質を検出した（図１４Ａ）。ＬＭ−１−Ｎｏｎｏ相互作用がターゲット特異的であることを証明するために、同じタンパク質プローブを対照ＩｇＭで分析した（図１４Ｂ）。この分析により、ＬＭ−１とＮｏｎｏ−６ｘＨｉｓ融合タンパク質の特異的相互作用が明らかになった。融合タンパク質と内在性タンパク質の異なるサイズは、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓにおける組換えタンパク質発現のアーチファクトである。
【０３８９】
実施例１６
この実施例は、ＮＯＮＯタンパク質のグリコシル化がＬＭ−１結合に必要であるかどうかを判定するための研究の説明を含む。
【０３９０】
ＮＯＮＯグリコシル化がＬＭ−１結合に必要であるかどうかを判定するために、ヒトＮＯＮＯ遺伝子（ｐＥＸＰ５−ＣＴ）をＢＬ２１（ＤＥ３）細菌に形質転換させた。形質転換後、幾つかの陽性細菌クローンを、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導してＬＢ培地において発現させた。ウエスタンブロット分析は、ＬＭ−１（ＩｇＭ）が、細菌発現Ｎｏｎｏ−６ｘＨｉｓ融合タンパク質に結合することを明示した（図１５）。細菌がタンパク質をグリコシル化しないという事実により、ＬＭ−１抗体−抗原（ターゲット）相互作用が抗原（ターゲット）グリコシル化を必要とするという命題は排除される。
【０３９１】
実施例１７
本実施例は、様々なＬＭ−１抗体変異体、および結合研究の説明を含む。これらの結合研究は、ＬＭ−１抗体配列変異体が、抗原ｎｍｔ５５をターゲットにする結合能力を保持することを示している。
【０３９２】
様々なＬＭ−１抗体を組換えｓｃＦｖ（一本鎖）抗体として発現させ、ターゲット細胞（Ａ５４９、ＢｘＰＣ−３、ＨＴ−２９、Ｈｅｌａ、ＣＲＬ１４２４およびＨＤＦａ細胞）への結合について分析した。重および／または軽鎖Ｖ（可変）ドメインのタンパク質配列における単一アミノ酸変化は、細胞発現レベルに、およびことによると抗体のターゲット抗原への親和性に影響を及ぼし得る。それにもかかわらず、ＥＬＩＳＡアッセイによって判定したところ、すべての変異体が、ターゲットを発現する細胞に、ならびに細菌発現ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５に、検出可能に結合する。
【０３９３】
結合について研究する前記種々のＬＭ−１  ｓｃＦｖ抗体は、配列番号３および１１によって表されるＬＭ−１  ｓｃＦｖ（新規）、１ＢＴＡ１．１６ＶＨおよび１ＢＴＡ１．１６ＶＬ）、ＬＭ−１  ｓｃＦｖ（例えば、配列番号１および１１によって表されるもの）、ＬＭ−１  ｓｃＦｖ  ｏｐｔ（例えば、配列番号９および１３によって表されるもの）、ハイブリドーマ由来ＬＭ−１  ＩｇＭ、ならびにｐｅｒＣ．６（商標）細胞株（Ｐｅｒｃｉｖｉａ）において生産されたＬＭ−１  ＩｇＭ（配列番号３および１１）である。
【０３９４】
ばらつきのない細胞密度に成長させたヒト癌細胞株（Ａ５４９、ＢｘＰＣ−３、ＨＴ−２９、Ｈｅｌａ、ＣＲＬ１４２４およびＨＤＦａ細胞）の生細胞集団を用いて、結合分析を行った。ヒト抗体をそれらの細胞に添加した。それらが、抗体によって認識されるターゲット抗原を提示した場合には、結合が発生するだろう。蛍光タグ（ＦＩＴＣ）を有する二次抗体を添加し、その後、そのタグをＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって検出する。本発明者らは、ＬＭ−１  ｓｃＦｖタンパク質のためにマウス抗ＦＬＡＧ  ＦＩＴＣを、およびＩｇＭタンパク質のためにマウス抗ヒトＩｇＭ  ＦＩＴＣを使用する。
【０３９５】
結合は、右への集団シフトによって表され、このシフトが陰性対照より大きい場合には、これを陽性であるとみなす。幾つかの事象が「偽陽性」シフトの原因となり得る。細胞が独力で自己蛍光を発し、そのためそれらを測定する必要がある。一部の細胞株は他のものよりこれを行うからである。一次抗体だけの添加は細胞をシフトさせ、二次抗体だけの添加も同様である。これらの事象のすべてを陰性対照とみなす。ターゲット抗原に対して陰性の細胞株（ＨＤＦａ−皮膚細胞株）への前記抗体の結合も行う。
【０３９６】
Ａ５４９、ＢｘＰＣ−３、ＨＴ−２９、Ｈｅｌａ、ＣＲＬ１４２４およびＨＤＦａ細胞株をＬＭ−１結合について比較した。１０，０００細胞の濃度をそれぞれの細胞株について用いた。抗体を１００ｕｇ／ｍＬで添加したが、反応１回につき使用したタンパク質の総量は、２０ｕｇである。このデータは、研究したＬＭ−１抗体のすべての形態が、ターゲット抗原を発現する前記５つの細胞株に結合することを示している。
【０３９７】
次に、ＬＭ−１ターゲット抗原、ｎｍｔ５５、を細菌において発現させ、抗ＨＩＳ樹脂を使用して精製した。クマシー染色ＳＤＳ−ゲルは、予想したサイズである５０〜６０Ｋｄａ領域において幾つかのバンドを示した。５５Ｋｄａバンドが最も強かったが、唯一のバンドではなかった。これらの他のバンドは、総合タンパク質濃度に寄与するであろう。ＥＬＩＳＡアッセイを行った。簡単に言うと、ｎｍｔ５５をプレートにコーティングし、ブロックし、その後、抗体でプローブし、その後、適切な二次抗体−ＨＲＰを添加し、検出する。このデータは、研究したＬＭ−１抗体のすべての形態が細菌発現ｎｍｔ５５ターゲット抗原に結合することを示している。
【０３９８】
実施例１８
本実施例は、アイソタイプ交換ＬＭ１  ＩｇＧ抗体の産生および結合研究の説明を含む。
【０３９９】
簡単に言うと、次のプライマーセット：５’プライマー−ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ−３’および３’−プライマー、５’−ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＣＣＣを使用し、テンプレートとしてヒトＬＭ１  ＩｇＭハイブリドーマ．ｃＤＮＡを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＬＭ１のＶＨ領域を増幅させた。ＬＭ１のＣＨ領域は、発現ベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１をテンプレートとして使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。次のプライマーセットを使用した：５’プライマー−ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＴＴＣ−３’、および３’−プライマー、５’−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ
ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ。
【０４００】
ＬＭ１重鎖を生産するために、ＶＨ領域とＣＨ領域をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によってライゲートし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。次のプライマーセットを使用した：５’プライマー−ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ−３’、および３’−プライマー、５’−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ。このフラグメントをＴＡクローニングによってｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートした。ＴＡクローニング後、ＬＭ１重鎖をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩによってｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ  ＴＡベクターから切断し、ｐＶｉｔｒｏ２−ｎｅｏ−ｍｃｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の第一発現カセットに転移させた。
【０４０１】
ＬＭ１の軽鎖は、次のプライマーセット：５’プライマー−ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ−３’、および３’−プライマー、５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＣを使用し、ヒトＬＭ１  ＩｇＭハイブリドーマ．ｃＤＮＡをテンプレートとして使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。このＰＣＲフラグメントをＴＡクローニングによってｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートした。ＴＡクローニング後、ＬＭ１軽鎖をＥｃｏＲＶ／Ｓａｌ  ＩによってｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ  ＴＡベクターから切断し、ｐＶｉｔｒｏ２−ｎｅｏ−ｍｃｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の第二発現カセットに転移させた。すべてのＰＣＲ産物の配列をＤＮＡ配列決定（Ｑｉａｇｅｎ）によって確認した。
【０４０２】
ＩｇＧ形が結合活性を保持することを確認するために、抗体をＨＥＫ２９３細胞において発現により生産し、Ａ５４９およびＢｘＰｃ−３細胞への抗体結合を評価した。これらの研究のために使用した材料としては、ＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＡ、Ｅ１５−０３９）、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ、Ａ１５−１５１）、１％グルタミン（ＰＡＡ、Ｍ１１−００４）、細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃ５７８９）、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ、ｄｉａｎｏｖａ、１０９−０９５−００３、および１ｘＰＢＳが挙げられる。
【０４０３】
２．５μｇ／μＬの保存濃度および１．７５と１．７８の間のＡ２６０／Ａ２８０比を有する発現プラスミド「ｐＶｉｔｒｏ２−ＬＭ１−ＨＣ−ＬＣ」を利用した。おおよそ２５００ｃｍ２（１６ｘ１５４ｃｍ２  ポリ−Ｄリシン被覆ウエルプレート）の表面の血清含有培地（ＤＭＥＭ  １％ＦＢＳ）においてトランスフェクション手順を行った。簡単に言うと、血清含有条件下で培養し、指数増殖期の中間で回収したＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクション手順を行う２４時間前に計数した。それらを約２．５ｘ１０７細胞／プレートの濃度に希釈し、翌日までインキュベートした。細胞を再びカウントし、それらがそれらの濃度のほぼ２倍（５．０ｘ１０７細胞／プレート（細胞密度おおよそ８０％））になったら、下で説明するようにそれらをトランスフェクトした。
【０４０４】
トランスフェクション複合体の調製のために、１．５ｍｇ  ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ＤＮＡを（１６の１５０ｃｍ２プレートのために十分な）４０ｍＬの新たな無血清培地で希釈した。ピペットで吸い上げ吸出してその溶液を混合した後、１０ｍＬ  ＰＥＩを添加し、直ちに攪拌混合して均質化し、８分間、室温でインキュベートした。３２４ｍＬの血清含有培地（１０％）の添加後、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体をそれらの細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞からＰＥＩを除去するために、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。その後、プレートに７０ｍＬの血清含有培地（１％ＦＢＳ）を満たし、一晩インキュベートした。死細胞を除去するために、培地を交換し、すべてのプレートを通常は６日間、３７℃でインキュベートした。後のタンパク質精製のために、それらの上清を４℃で保管した。
【０４０５】
結合研究のために、Ａ５４９およびＢｘＰｃ−３細胞を細胞解離溶液でトリプシン処理し、完全培地に再び懸濁させ、２ｘ１０５／ｍＬにした。氷上で３０分後、細胞をＦＡＣＳチューブ１本につき１ｍＬで分散させ、５００ｇおよび４℃での遠心分離により氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。２００μＬ  ＰＢＳ中、指示濃度のＩｇＧ抗体を用いて、または抗体なしで、染色を行った。抗体を氷上で３０分間インキュベートし、その後、氷冷ＰＢＳで洗浄し、二次抗体をチューブ１本につき２００μＬ中、１：５０希釈で適用した。暗所でのさらに３０分のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳに適用した。
【０４０６】
ＦＡＣＳ分析により、ＬＭ１  ＩｇＧ抗体がＡ５４９細胞にもＢｘＰＣ−３細胞にも結合することが明らかになった。これは、この抗体が抗原／エピトープ特異性を保持することを示している。
【０４０７】
実施例１９
本実施例は、ＬＭ−１が、ターゲット抗原、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５、の、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５のＮ末端３００アミノ酸配列を含む部分に結合することを示す追加の結合研究の説明を含む。
【０４０８】
簡単に言うと、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムへの分泌のためにｎｍｔ−５５をｐＰＯＷベクターにクローニングした。（実施例１６で説明した）ｐＥＸＰ５−ＣＴにおいてクローニングしたヒトＮＯＮＯ遺伝子からＮＯＮＯ遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、ｐｅｌＢ分泌シグナルによってＥ．ｃｏｌｉペリプラズムへの分泌を可能にする細菌発現ベクターｐＰＯＷに導入した。
【０４０９】
ｎｍｔ−５５  ｐＰＯＷを発現させるために、完全長ｎｍｔ５５をコードする、ｐＰＯＷプラスミドを含有する新たに形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０ｍＬ  スターター培地に接種し、おおよそ２５０ｒｐｍで振盪させながら３３℃の酵母トリプトン（ＹＴ）アンピシリン培地において成長させた。一晩インキュベートした後、２５ｍＬのこの培地を、２リットルのエルレンマイヤーフラスコの中のアンピシリンを含有する１７５ｍＬのテリフィックブロス（ＴＢ）に添加した。おおよそ２５０ｒｐｍで振盪させながら３３℃で培養物を、〜４．０００の光学密度（ＯＤ６００）に達するまで（〜３時間）成長させ、１ｍＬアリコート、後の比較のために４℃で保管した（Ｔ０）。その後、培養物を４２℃インキュベーターに移し、さらに３時間、成長させ続けた。定期的に進行を確認し、３時間後、ＯＤ６００が安定したら誘導を停止させた。１ｍＬアリコートを誘導後に取り（ＴＦＩＮＡＬ）、後の比較のために４℃で保管した。
【０４１０】
培養物を２５０ｍＬポリカーボネートボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に移し、４０００ｘｇ、４℃で２０分間、遠心分離して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をペレットにした。その後、培地をデカントし、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（商標）抗Ｈｉｓ精製を用いるタンパク質抽出および精製のために、それらのペレットを−２０℃で保管した。
【０４１１】
ｎｍｔ−５５  ｐＰＯＷを抽出するために、解凍ペレットをピペッティングおよび混合攪拌により、１５ｍＬのＰｒｏｆｉｎｉａ変性ＩＭＡＣ溶解緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に完全に再懸濁させて細胞を溶解した。その後、プローブソニケーター（振幅１０μｍ）を３０秒間隔で４分間使用して氷上でその溶解産物を超音波処理した。２ｍＬ微量遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）における遠心分離（２０，２３０ｘｇ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミニヒュージ５４２）によってその溶解産物を清澄にし、真空下で０．４５μｍフィルターによって濾過した。その後、溶解産物を精製のために５０ｍＬサンプルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ；ＢＤ）に移した。
【０４１２】
Ｐｒｏｆｉｎｉａ（商標）変性固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いてＨｉｓタグにより精製を行った。簡単に言うと、抽出したｎｍｔ−５５をＰｒｏｆｉｎｉａ（商標）自動ＩＭＡＣタンパク質精製によって精製した。精製のために使用した緩衝液は、Ｂｉｏ−Ｒａｄによって１．４ｘ濃縮物として供給されたものであった。これらの濃縮物に尿素を添加して６Ｍ尿素の最終濃度を得た。そのシステムにＩＭＡＣ（Ｎｉ−ＮＴＡ）を取り付け、製造業者の推奨に従ってその計器を準備した。Ｐｒｏｆｉｎｉａ  ＩＭＡＣプロトコル：
【０４１３】
【表７】
2015131850.tif 000043
緩衝液交換は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５装置によって行った。簡単に言うと、１５ｍＬの１ｘＰＢＳ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器に添加し、４０００ｒｐｍ（４℃）で１５分間回転させて、膜上の一切の保存薬を除去した。全溶離サンプル容積（４ｍＬ）をその膜レザバーに添加し、１ｘＰＢＳ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で１５ｍＬにし、４０００ｒｐｍ（４℃）で３０分間回転させた。サンプルが〜１．０ｍＬになったら、その流出物を廃棄し、追加の１４ｍＬの１ｘＰＢＳ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）をそのレザバーに添加し、このプロセスを繰り返した。さらに２回繰り返して、確実に尿素濃度が十分低くなるようにする。タンパク質を回収し、ＯＤ２８０により濃度を測定する。
【０４１４】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥシステムを製造業者の推奨に従って使用して、ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動をＴ０、ＴＦＩＮＡＬで行った。
【０４１５】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢｌｏｔ（商標）Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の推奨に従って使用して、ウエスタンブロットを行った。移動後の膜を、５％脱脂粉乳ＴＢＳ−Ｔを使用して１時間、室温でブロックした。ブロッキング剤を廃棄し、一次抗体（ＬＭ−１ｏｐｔ  ｓｃＦｖ；Ｃ末端にＦＬＡＧおよびＨｉｓタグを有するＬＭ−１の一本鎖Ｆｖ変異体）を５％脱脂粉乳ＴＢＳ−Ｔ中、１：５００の比で添加し（合計量５ｍＬ）、１時間、室温で（搖動しながら）インキュベートした。その後、一次抗体を廃棄し、５ｍＬ  ＴＢＳ−Ｔを５分間隔で３回交換して膜を洗浄した。二次抗体（抗ＦＬＡＧ  ＨＲＰ結合体）を５％脱脂粉乳ＴＢＳ−Ｔ中、１：１０００の比で添加し、さらに１時間（搖動しながら）インキュベートした。５ｍＬ  ＴＢＳ−Ｔを５分間隔で３回交換して膜を再び洗浄し、さらに５分間ＴＢＳで洗浄した。検出は、Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ比色検出（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるものであった。
【０４１６】
その後、銀染色タンパク質のゲル中での消化（Ｉｎ−ｇｅｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）についての質量スペクトル分析を行った。簡単に言うと、精製ｎｍｔ５５から興味のあるゲルバンド（図１６Ｂ）を切り取り、１．５ｍＬ微量遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れ、約１５分間、３００μＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ品質の水で２回洗浄した。その後、ゲルプラグを５０μＬの５０％アセトニトリル／５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で２回洗浄して、ゲルプラグからすべての汚れを除去した。それぞれの洗浄は、おおよそ３０分の長さであった。
【０４１７】
その後、ゲルプラグを、それが不透明になるまで、１００μＬのアセトニトリルで脱水し、その後、その液をデカントし、真空遠心でそのプラグを乾燥させた。その後、そのプラグを再び水和し、５６℃で１時間、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の中でインキュベートし、その後、放置して室温に冷却した。その後、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の等量の５５ｍＭヨードアセトアミドをそのサンプルに添加し、暗所で４５分間インキュベートした。この後、ＤＴＴ／ヨードアセトアミド溶液をデカントし、そのサンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で１０分間洗浄し、その後、１００％アセトニトリルで１０分間脱水した。再び、そのサンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で１５分間、再水和した。その後、この液をデカントし、１０分間、１００％アセトニトリルで置換した。その後、その液をデカントし、真空遠心によってそのプラグを乾燥させた。
【０４１８】
配列決定グレード、変性ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を、２００μＬ  １ｍＭ  ＨＣｌまたは１％酢酸に２０から２５μｇを溶解して最終濃度を１００ｎｇ／μＬから１２５ｎｇ／μＬの間にすることにより、新たに調製した。２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで保存溶液を１：１０希釈して、最終濃度＝１０から１２．５ｎｇ／μＬにすることにより、作業用トリプシンを作った。
【０４１９】
真空遠心後、乾燥したプラグを２０μＬの作業用トリプシン溶液に２０分間、再び水和した。過剰なトリプシン溶液をピペットで除去し、３７℃で４時間、そのサンプルを消化した。２５μＬの１０％ギ酸の添加によってその消化を停止させ、１５分間放置した。上清を回収し、そのゲルプラグを１５分間、１５μＬの５０％アセトニトリル／５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで抽出して追加のペプチドを回収し、最初の上清と共にプールし、この時点で、そのプラグを廃棄した。その後、そのサンプルを真空遠心で５μＬに濃縮し、分析のためにＬＣ−ＭＳＤ−ＴｏＦ質量分析計に直接負荷した。
【０４２０】
図１６Ａは、ｎｍｔ５５発現のＰＡＧＥ分析を示すものである。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用してゲルを染色した。レーン１）Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量予備染色タンパク質マーカー。レーン２）タンパク質発現のベースラインレベルを示す、Ｔ０サンプル。レーン３）４２℃での熱誘導後のｎｍｔ５５発現レベルを示すＴＦＩＮＡＬ。
【０４２１】
図１６Ｂは、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（商標）精製後のｎｍｔ５５のＰＡＧＥ分析を示すものである。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用してゲルを染色した。レーン１）Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量予備染色タンパク質マーカー。レーン２）Ｅ  ｃｏｌｉにおけるペリプラズム発現から精製および濃縮したｎｍｔ５５。ＮＭＴ５５の予想ＭＷは、５５ＫＤａであるが、約３０ＫＤａのタンパク質バンドが観察された。これは切断産物を示唆している。
【０４２２】
図１６Ｃは、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（商標）精製後のｎｍｔ５５のウエスタンブロットを示すものである。レーン１）Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量予備染色タンパク質マーカー。レーン２）ＬＭ−１ｏｐｔ  ｓｃＦｖを一次抗体として使用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化させた抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を二次抗体として使用して検出した、精製および濃縮したｎｍｔ５５。約３０ＫＤａのタンパク質バンドがＬＭ−１ｏｐｔ  ｓｃＦｖによって検出された。
【０４２３】
クマシー染色ゲルからの微弱な３０ＫＤａタンパク質バンド（図１６Ｂ）を切り出し、説明したように質量スペクトル分析のために処理した。それらの質量スペクトルおよびコンピュータデータベース検索から、幾つかのヒットを同定した。
【０４２４】
【化２３】
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Ｍｏｗｓｅスコアに基づく確率をそれらのタンパク質ヒットに関して行った。イオンスコアは、−１０＊Ｌｏｇ（Ｐ）であり、この式中のＰは、観察されるマッチがランダム事象である確率である。
【０４２５】
個々のイオンスコア＞５１は、同一性または広範な相同性を示す（ｐ＜０．０５）。タンパク質スコアは、タンパク質ヒットを格付けするために、非確率的ベースとしてのイオンスコアから誘導する。
【０４２６】
ｎｍｔ５５についての配列カバー率は１１％であった。質量分析計およびデータベース検索から同定したＮＯＮＯの対応ペプチド（太字、アンダーライン付き）は、組換えＮＭＴ５５のＮ末端領域内のペプチド配列に対応する。従って、ＬＭ−１が結合するエピトープは、ＮＯＮＯ／ｎｍｔ５５のＮ末端３０ＫＤａドメイン、すなわちアミノ酸１〜３００、内に少なくとも存在する。
【０４２７】
【化２４】
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【図１】
2015131850.tif 000046
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2015131850000001.app
【外国語明細書】
2015131850000001.pdf