(57)【要約】【課題】高感度の検出器への切り替えに伴う感度の調整作業を容易かつ迅速に行う。【解決手段】試料Ｓに励起光を照射し、試料Ｓから発せられる蛍光を集光する顕微鏡本体１０と、顕微鏡本体１０により集光された蛍光を受光して光電変換可能なマルチアルカリＰＭＴ２１と、マルチアルカリＰＭＴ２１よりも感度が高く、顕微鏡本体１０により集光された蛍光を受光して光電変換可能なＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１と、このマルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１とを切り替える光路切り替えミラー４０と、光路切り替えミラー４０によりマルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替える場合に、切り替える直前のマルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶと、マルチアルカリＰＭＴ２１の感度に対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の感度の比率とに基づいて、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶを設定する制御本体部とを備える顕微鏡システム１００を提供する。【選択図】図１
2015022021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に光を照射し、該試料から発せられる観察光を集光する顕微鏡本体と、
該顕微鏡本体により集光された観察光を受光して光電変換可能な第１検出器と、
該第１検出器よりも感度が高く、前記顕微鏡本体により集光された観察光を受光して光電変換可能な第２検出器と、
これらの第１検出器と第２検出器とを切り替える切り替え部と、
該切り替え部により前記第１検出器から前記第２検出器に切り替える場合に、切り替える直前の前記第１検出器の印加電圧と、該第１検出器の感度に対する前記第２検出器の感度の比率とに基づいて、該第２検出器に印加する印加電圧を設定する感度設定部とを備える顕微鏡システム。
【請求項２】
前記感度設定部が、さらに前記第１検出器の光電面の陰極感度特性に対する前記第２検出器の光電面の陰極感度特性の比率に基づいて、前記第２検出器に印加する印加電圧を設定する請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記感度設定部が、さらに前記第１検出器の増倍段のゲイン特性に対する前記第２検出器の増倍段のゲイン特性の比率に基づいて、前記第２検出器に印加する印加電圧を設定する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記第１検出器により光電変換して得られた光電信号を増幅する第１増幅部と、
前記第２検出器により光電変換して得られた光電信号を増幅する第２増幅部と備え、
前記切り替え部により前記第１検出器から前記第２検出器に切り替える場合に、前記感度設定部が、前記第１増幅部のゲイン特性に対する前記第２増幅部のゲイン特性の比率に基づいて、前記第２増幅部の増幅ゲインを設定する請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記第２検出器が、光電面にＧａＡｓＰ化合物を用いた光電子増倍管またはハイブリッドフォトディテクタである請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記第２検出器が、観察光の強度をフォトンカウンティング法により検出する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、走査型レーザ顕微鏡に用いられる検出器として、マルチアルカリ光電面を使用したマルチアルカリＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、光電子増倍管）の他に、光電面にＧａＡｓＰ（Ｇａｌｌｉｕｍ  Ａｒｓｅｎｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｄｅ）化合物を使用し、マルチアルカリＰＭＴよりも高感度なＧａＡｓＰ−ＰＭＴやＨＰＤ（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｈｏｔｏ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）が知られている。
【０００３】
ＧａＡｓＰ−ＰＭＴやＨＰＤはマルチアルカリＰＭＴと比較して光電面の寿命劣化が顕著であり非常に高価でもあるため、観察・計測の重要度に応じてマルチアルカリＰＭＴとＧａＡｓＰ−ＰＭＴやＨＰＤとを切り替えながら使用し、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴやＨＰＤの光電面の劣化を抑制することが望ましい。
【０００４】
しかし、マルチアルカリＰＭＴとＧａＡｓＰ−ＰＭＴやＨＰＤとは増倍段構造の相違によりＨＶ（Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ、印加電圧）ゲインが異なるため、切り替え後に感度を調整する必要があり、しかも、切り替え後のＧａＡｓＰ光電面の劣化や生きた標本の状態変化あるいは活性の損失を回避するために、感度調整には容易性かつ迅速性が求められる。
【０００５】
ここで、複数の蛍光検出器間の感度のばらつきを補正する技術が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。特許文献１に記載の技術は、蛍光分光計において蛍光の各波長域に対応する検出器の感度を校正し、また、特許文献２に記載の技術は、マルチセルタイプのＰＭＴにおいて各セル間の感度を補正する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１０−５０７８２８号公報
【特許文献２】特開２００６−５８２３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１，２に記載の技術は、同種あるいは同機種の蛍光検出器間の感度のばらつきを補正することはできるが、特許文献１，２には異種のＰＭＴ間の感度補正に関して言及されていない。そのため、これらの特許文献１，２の技術を採用しても、マルチアルカリＰＭＴからＧａＡｓＰ−ＰＭＴまたはＨＰＤに切り替えた場合に、感度を容易かつ迅速に調整することができないという問題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、高感度の検出器への切り替えに伴う感度の調整作業を容易かつ迅速に行うことができる顕微鏡システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料に光を照射し、該試料から発せられる観察光を集光する顕微鏡本体と、該顕微鏡本体により集光された観察光を受光して光電変換可能な第１検出器と、該第１検出器よりも感度が高く、前記顕微鏡本体により集光された観察光を受光して光電変換可能な第２検出器と、これらの第１検出器と第２検出器とを切り替える切り替え部と、該切り替え部により前記第１検出器から前記第２検出器に切り替える場合に、切り替える直前の前記第１検出器の印加電圧と、該第１検出器の感度に対する前記第２検出器の感度の比率とに基づいて、該第２検出器に印加する印加電圧を設定する感度設定部とを備える顕微鏡システムを提供する。
【００１０】
本発明によれば、顕微鏡本体により試料からの観察光を集光し、その観察光を第１検出器または第２検出器により受光して光電変換することで、試料の画像情報を得ることができる。また、感度が高い第２検出器により、第１検出器よりも鮮明な画像情報を得ることができる。
【００１１】
この場合において、第１検出器と第２検出器は感度が異なるため、第１検出器から第２検出器に切り替える場合に、同じ値の電圧を印加したのでは同じ輝度の画像情報を得ることができない。これに対し、感度設定部により、切り替える直前の第１検出器の印加電圧および第１検出器の感度に対する第２検出器の感度の比率に基づいて、第２検出器に印加する印加電圧を設定することで、切り替えの前後で輝度の大きさをほぼ一定に保つとともに、切り替え後に印加電圧を再調整する場合と比較して切り替えに伴う感度の調整作業の容易化および迅速化を図ることができる。
【００１２】
これにより、第２検出器の光電面が劣化し易い場合でも、切り替え後の第２検出器の光電面の劣化を最小限に留めるとともに、生きた標本の状態変化や活性の損失も抑制することができる。
【００１３】
上記発明においては、前記感度設定部が、さらに前記第１検出器の光電面の陰極感度特性に対する前記第２検出器の光電面の陰極感度特性の比率に基づいて、前記第２検出器に印加する印加電圧を設定することとしてもよい。
【００１４】
光電面の種類によって陰極感度の波長依存性が異なるため、このように構成することで、実際に計測する観察光の波長に対応した陰極感度特性により、より適切な印加電圧を設定することができる。
【００１５】
上記発明においては、前記感度設定部が、さらに前記第１検出器の増倍段のゲイン特性に対する前記第２検出器の増倍段のゲイン特性の比率に基づいて、前記第２検出器に印加する印加電圧を設定することとしてもよい。
このように構成することで、第１検出器と第２検出器とで増倍段の構成が異なる場合であっても、より適切な印加電圧を設定することができる。
【００１６】
上記発明においては、前記第１検出器により光電変換して得られた光電信号を増幅する第１増幅部と、前記第２検出器により光電変換して得られた光電信号を増幅する第２増幅部と備え、前記切り替え部により前記第１検出器から前記第２検出器に切り替える場合に、前記感度設定部が、前記第１増幅部のゲイン特性に対する前記第２増幅部のゲイン特性の比率に基づいて、前記第２増幅部の増幅ゲインを設定することとしてもよい。
【００１７】
このように構成することで、検出器の切り替えによる画像の明るさの変化が第２検出器に印加する印加電圧の調整範囲を超えてしまう場合であっても、切り替えの前後の輝度の大きさをほぼ一定に保つことができる。
【００１８】
上記発明においては、前記第２検出器が、光電面にＧａＡｓＰ化合物を用いた光電子増倍管またはハイブリッドフォトディテクタであることとしてもよい。
光電面にＧａＡｓＰ化合物を用いた光電子増倍管やハイブリッドフォトディテクタは、光電面が劣化し易く高価でもあるが、マルチアルカリ光電面を使用した光電子増倍管よりも光電面の変換効率に優れる。
【００１９】
上記発明においては、前記第２検出器が、観察光の強度をフォトンカウンティング法により検出することとしてもよい。
このように構成することで、観察光が微弱であっても第２検出器により高精度に検出することできる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、高感度の検出器への切り替えに伴う感度の調整作業を容易かつ迅速に行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。
【図２】図１のシステム制御ＰＣの概略構成図である。
【図３】図１の走査型蛍光コンフォーカル顕微鏡装置を正面から見た図である。
【図４】図３の走査型蛍光コンフォーカル顕微鏡装置を側面から見た図である。
【図５】図３の走査型蛍光コンフォーカル顕微鏡装置を上方から見た図である。
【図６】本発明の一実施形態の第４変形例に係る顕微鏡システムにおけるマルチアルカリＰＭＴおよびＧａＡｓＰ−ＰＭＴの特性数値の一例を示す図表である。
【図７】本発明の一実施形態の第４変形例に係る顕微鏡システムにおけるＨＶ換算表の一例を示す図表である。
【図８】本発明の一実施形態の第５変形例に係る顕微鏡システムにおけるマルチアルカリＰＭＴおよびＧａＡｓＰ−ＰＭＴの特性数値の一例を示す図表である。
【図９】本発明の一実施形態の第５変形例に係る顕微鏡システムにおけるＨＶ換算表の一例を示す図表である。
【図１０】本発明の一実施形態の第５変形例に係る顕微鏡システムにおけるマルチアルカリＰＭＴとＧａＡｓＰ−ＰＭＴのＨＶの相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムについて図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、図１〜図５に示すように、走査型蛍光コンフォーカル顕微鏡装置１と、走査型蛍光コンフォーカル顕微鏡装置１の制御等を行うシステム制御ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）３とを備えている。
【００２３】
走査型蛍光コンフォーカル顕微鏡装置１は、試料Ｓに励起レーザ光（以下、励起光という。）を照射し、試料Ｓから発せられる蛍光（観察光）を集光する顕微鏡本体１０と、顕微鏡本体１０により集光された蛍光を検出し光強度信号を取得する第１検出ユニット２０および第２検出ユニット３０と、これらの第１検出ユニット２０および第２検出ユニット３０を切り替える光路切り替えミラー（切り替え部）４０とを備えている。
【００２４】
顕微鏡本体１０は、試料Ｓを載置するステージ５（図３〜５参照）と、励起光を発生する光源（図示略）と、光源から発せられた励起光を反射するダイクロイックミラー（ＤＭ）１１と、ダイクロイックミラー１１により反射された励起光を走査するスキャナ１３と、スキャナ１３により走査された励起光を集光する瞳投影レンズ１５と、瞳投影レンズ１５により集光された励起光を平行光に変換する結像レンズ１７と、結像レンズ１７により平行光に変換された励起光を試料Ｓに照射する一方、試料Ｓにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ１９とを備えている。
【００２５】
ダイクロイックミラー１１は、光源からの励起光を反射する一方で、試料Ｓにおいて発生し対物レンズ１９により集光されて励起光の光路を戻る蛍光を透過させて、励起光の光路から蛍光を分岐させるようになっている。
【００２６】
スキャナ１３は、図３〜５に示す走査ユニット（ＳＵ）７に収容されている。また、スキャナ１３は、例えば、２軸ガルバノミラーであり、相互に直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を対向させて構成されている。このスキャナ１３は、２枚のガルバノミラーを揺動させて励起光を偏向し、試料上で励起光を２次元的（Ｘ軸方向およびＹ軸方向）に走査することができるようになっている。
【００２７】
第１検出ユニット２０は、走査ユニット７に内蔵されている。この第１検出ユニット２０は、蛍光を検出し光量に応じた大きさの光強度信号を出力するマルチアルカリＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、光電子増倍管、第１検出器）２１と、マルチアルカリＰＭＴ２１にＨＶ（Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ、印加電圧）を印加する第１ＨＶ電源２３と、マルチアルカリＰＭＴ２１から出力された光強度信号を増幅する第１増幅器（第１増幅部）２５とを備えている。
【００２８】
マルチアルカリＰＭＴ２１は、サイドオン型のＰＭＴであり、蛍光を受光して光強度信号に光電変換するマルチアルカリ光電面（図示略）を備えている。
【００２９】
第２検出ユニット３０は、図３〜５に示す高感度検出ユニット（ＨＳＤ：Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）９に収容されている。この第２検出ユニット３０は、蛍光を検出して光電変換し、その光量に応じた大きさの光強度信号を出力するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ（Ｇａｌｌｉｕｍ  Ａｒｓｅｎｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｄｅ−ＰＭＴ、第２検出器）３１と、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１にＨＶを印加する第２ＨＶ電源３３と、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１から出力された光強度信号を増幅する第２増幅器（第２増幅部）３５とを備えている。
【００３０】
ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１は、ヘッドオン型のＰＭＴであり、ＧａＡｓＰ化合物を使用した光電面（図示略）を備えている。このＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１は、マルチアルカリＰＭＴ２１よりも高い感度を有している。
【００３１】
光路切り替えミラー４０は、ダイクロイックミラー１１を透過した蛍光の光路に挿脱可能に設けられている。この光路切り替えミラー４０は、蛍光の光路に挿入されると、蛍光を第１検出ユニット２０に向けて反射するようになっている。蛍光の光路から光路切り替えミラー４０が外されると、蛍光はそのまま第２検出ユニット３０に入射するようになっている。
【００３２】
システム制御ＰＣ３は、図２に示すように、装置の設定、画像取得および画像解析等を行う制御本体部（感度設定部）４１と、制御本体部４１にユーザが指示を入力する入力部４３と、試料Ｓの画像等を表示するモニタ４５とを備えている。
【００３３】
制御本体部４１は、入力部４３に入力されたユーザの指示に従い、スキャナ１３の走査条件の設定、光路切り替えミラー４０の切り替え、第１増幅器２５および第２増幅器３５の増幅ゲインの設定、第１ＨＶ電源２３および第２ＨＶ電源３３のＨＶの設定等を行うようになっている。
【００３４】
また、制御本体部４１は、スキャナ１３の作動を制御し、第１増幅器２５または第２増幅器３５から送られてくる光強度信号をスキャナ１３の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換し、試料Ｓの画像情報を生成するようになっている。制御本体部４１は、生成した画像情報をモニタ４５に表示するようになっている。
【００３５】
また、制御本体部４１は、生成した画像情報を読み込み、演算処理して画像解析することができるようになっている。１つの制御本体部４１により、装置の設定、画像取得および画像解析等を行うことで、ＨＶや増幅ゲインの設定値と画像の明るさとを内部データとして包括的に参照、比較および演算することができる。
【００３６】
さらに、制御本体部４１は、光路切り替えミラー４０によりマルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替える場合に、切り替える直前に第１ＨＶ電源２３に設定されていたマルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶと、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶゲイン（感度）に対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶゲイン（感度）の比率とに基づいて、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶの初期値を第２ＨＶ電源３３に設定するようになっている。
【００３７】
例えば、制御本体部４１は、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替え後に得られる画像が、切り替え前にマルチアルカリＰＭＴ２１により得られた画像と略同一の明るさになるようなＨＶの初期値を算出し、算出したＨＶの初期値を第２ＨＶ電源３３に設定してから、マルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替えるようになっている。
【００３８】
マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶゲイン特性とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶゲイン特性は、これらのＰＭＴの製造メーカに問い合わせることで典型的なデータとして取得できる。また、ＰＭＴの製造工程中やユーザがＰＭＴを設置した後に実測値として取得することもできる。
【００３９】
ここで、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶゲインに対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶゲインの比率の計算方法について説明する。
マルチアルカリＰＭＴ２１の仕様例として、例えば、増倍段（ダイノード）の段数：９、陽極−陰極間の印加電圧：１０００Ｖ、陰極放射感度：７０ｍＡ／Ｗ、ゲイン：９．５×１０６、陽極放射感度：６６５×１０３Ａ／Ｗとする。また、増倍段の電極構造／材質で決まる指数ｋ：０．７５とする。
【００４０】
この場合、陽極放射感度と（ＨＶ）ｋ・ｎが比例関係にあることから、陽極放射感度＝３．７４×１０−１５×（ＨＶ）６．７５という計算式で、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶと陽極放射感度とを関連付けることができる。
【００４１】
一方、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の仕様例として、例えば、増倍段の段数：９、陽極−陰極間の印加電圧：８００Ｖ、陰極放射感度：２００ｍＡ／Ｗ、ゲイン：３×１０６、陽極放射感度：６００×１０３Ａ／Ｗとする。また、指数ｋ：０．７５とする。
【００４２】
この場合、マルチアルカリＰＭＴ２１と同様にして、陽極放射感度と（ＨＶ）ｋ・ｎが比例関係にあることから、陽極放射感度＝１．５２×１０−１４×（ＨＶ）６．７５という計算式で、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶと陽極放射感度とを関連付けることができる。
【００４３】
そして、マルチアルカリＰＭＴ２１に印加する電圧をＨＶｍａとし、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加する電圧の初期値をＨＶｇａｐとし、マルチアルカリＰＭＴ２１をＨＶｍａで使用したときの陽極照射感度とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１をＨＶｇａｐで使用したときの陽極照射感度とが一致すると仮定すると、下記の計算式（１）が成り立つ。
陽極放射感度＝３．７４×１０−１５×（ＨＶｍａ）６．７５＝１．５２×１０−１４×（ＨＶｇａｐ）６．７５・・・（１）
【００４４】
計算式（１）より、ＨＶｇａｐ＝０．８１２×ＨＶｍａの関係式が求まる。
よって、本仕様例においては、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶゲインに対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶゲインの比率が０．８１２となる。
【００４５】
このように構成された顕微鏡システム１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１００によりマルチアルカリＰＭＴ２１を用いて試料Ｓを観察する場合は、制御本体部４１により蛍光の光路に光路切り替えミラー４０を挿入するとともに第１ＨＶ電源２３にＨＶｍａを設定する。そして、ステージ５に試料Ｓを載置して光源から励起光を発生させる。
【００４６】
光源から発せられた励起光は、ダイクロイックミラー１１により反射された後、スキャナ１３により偏向されて瞳投影レンズ１５により集光され、結像レンズ１７により平行光に変換されて対物レンズ１９により試料Ｓに照射される。これにより、スキャナ１３の揺動動作に応じて試料Ｓ上で励起光が２次元的に走査される。
【００４７】
励起光が照射されることにより試料Ｓにおいて蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ１９により集光され、結像レンズ１７、瞳投影レンズ１５、スキャナ１３を介して励起光の光路を戻り、ダイクロイックミラー１１を透過して励起光の光路から分岐される。ダイクロイックミラー１１を透過した蛍光は、光路切り替えミラー４０により反射されて第１検出ユニット２０に入射する。
【００４８】
第１検出ユニット２０においては、マルチアルカリＰＭＴ２１により蛍光が検出されてその光量に応じた大きさの光強度信号が出力され、第１増幅器２５によりその光強度信号が増幅されて、システム制御ＰＣ３の制御本体部４１に送られる。
【００４９】
制御本体部４１においては、入射した光強度信号がスキャナ１３の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換され、試料Ｓの画像情報が生成される。生成された画像情報はモニタ４５に表示される。これにより、マルチアルカリＰＭＴ２１により得られた画像によって試料Ｓを観察することができる。
【００５０】
次に、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１を用いて試料Ｓを観察する場合は、制御本体部４１により蛍光の光路から光路切り替えミラー４０を外すとともに第２ＨＶ電源３３にＨＶｇａｐを設定する。そして、マルチアルカリＰＭＴ２１を用いる場合と同様に、顕微鏡本体１０により試料Ｓに励起光を照射する。
【００５１】
この場合、試料Ｓにおいて発生し対物レンズ１９により集光されて励起光の光路を戻る蛍光は、ダイクロイックミラー１１を透過して、光路切り替えミラー４０を介さずに第２検出ユニット３０に入射する。
【００５２】
第２検出ユニット３０においては、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１により蛍光が検出されて光強度信号が出力され、第２増幅器３５により光強度信号が増幅されて制御本体部４１に送られる。そして、制御本体部４１により、その光強度信号に基づいて試料Ｓの画像情報が生成され、モニタ４５に表示される。これにより、マルチアルカリＰＭＴ２１よりも感度が高いＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１によって得られたより鮮明な画像によって試料Ｓを観察することができる。
【００５３】
ここで、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１はマルチアルカリＰＭＴ２１と比較して、光電面が劣化し易く、また高価でもある。そのため、例えば、種々の実験条件を最適化する段階の予備実験ではマルチアルカリＰＭＴ２１を使用し、本実験のみＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替えてこれを使用することで、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の光電面の劣化を抑制することが望ましい。
【００５４】
以下、マルチアルカリＰＭＴ２１を用いて予備実験を行い、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替えて本実験を行う場合について説明する。
この場合において、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１は増倍段構造の相違によりＨＶゲイン（感度）が異なるため、マルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替える際に、同じ値のＨＶを印加したのでは同じ輝度の画像情報を得ることができない。
【００５５】
例えば、ＨＶｍａとＨＶｇａｐの違いはｘ０．８１２（２３％差）と僅かであるが、増倍ゲインとしては約４倍寄与することになる。そのため、ＨＶ設定を変更しないままマルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切替えると、画像が４倍も明るくなってしまう。
【００５６】
これに対し、本実施形態に係る顕微鏡システム１００は、制御本体部４１が、光路切り替えミラー４０によりマルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替える場合に、切り替える直前のマルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶおよびマルチアルカリＰＭＴ２１の感度に対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の感度の比率に基づいて、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶを設定する。
【００５７】
すなわち、予備実験では、マルチアルカリＰＭＴ２１により鮮明な画像が得られるようにユーザがＨＶｍａを調整して試料Ｓの画像を取得される。次いで、本実験する場合に、制御本体部４１により、直近のＨＶｍａに基づいて、マルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替える前後の画像の明るさが略同一になるようなＨＶｇａｐが算出されて第２ＨＶ電源３３に設定され、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替えられる。
【００５８】
したがって、本実施形態に係る顕微鏡システム１００によれば、マルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１への切り替えの前後で輝度の大きさをほぼ一定に保つとともに、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替え後にＨＶを再調整する場合と比較して切り替えに伴う感度の調整作業の容易化および迅速化を図ることができる。これにより、切り替え後のＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の光電面の劣化を最小限に留めるとともに、生きた試料Ｓの状態変化や活性の損失も抑制することができる。
【００５９】
本実施形態においては、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替えた場合に、必要に応じてユーザがＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶを追加調整し、画質を最適化することとしてもよい。
【００６０】
また、本実施形態においては、制御本体部４１が、第１増幅器２５のゲイン特性に対する第２増幅器３５のゲイン特性の比率に基づいて、第２増幅器３５の増幅ゲインを設定することとしてもよい。
このようにすることで、マルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１への切り換えによる画像の明るさの変化がＨＶｇａｐの調整範囲を超えてしまう場合であっても、これらの切り替えの前後の輝度の大きさをほぼ一定に保つことができる。
【００６１】
本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の仕様例として増倍段数をいずれも同一（９段）とし、単純な一次比例で関係付けたが、例えば、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の増幅段数が異なる場合であっても、同様に換算計算を実行することが可能である。
【００６２】
この場合、増倍段数に応じて次数を換算することになり、計算式がやや複雑になる。そこで、第１変形例としては、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶｍａとＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶｇａｐを換算したＨＶ換算表（ＬＵＴ：Ｌｏｏｋ−Ｕｐ−Ｔａｂｌｅ、図示略）を予め用意し、制御本体部４１がＨＶ換算表を参照してＨＶｇａｐを設定することとしてもよい。
【００６３】
また、本実施形態においては、第２検出器としてＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１を例示して説明したが、第２変形例は、第２検出器として、光電面にＧａＡｓＰ化合物を使用し、増倍段にアバランシェダイオードを使用したＨＰＤ（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｈｏｔｏ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、図示略）を採用することとしてもよい。
【００６４】
第２検出器としてＨＰＤを採用した場合も、増倍特性を予め把握して換算を行うことで、マルチアルカリＰＭＴ２１で得られた感度特性を同様に算出して、ＨＶｇａｐの初期値を設定することができる。
【００６５】
次に、第３変形例としては、制御本体部４１が、さらにマルチアルカリＰＭＴ２１の光電面の陰極感度特性に対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の光電面の陰極感度特性の比率にも基づいて、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶｇａｐを設定することとしてもよい。
【００６６】
ＰＭＴは、通常、光電面の種類によって陰極感度の波長依存性が異なるため、実際に計測する蛍光波長に対応した陰極感度特性から、上記の関係式を導くことが望ましい。この場合、測定対象の生体試料に蛍光標識する蛍光色素や蛍光タンパクの種類によって装置に設定・使用する蛍光フィルタの種類に応じて、参照する波長特性を選択してもよい。
このようにすることで、実際に計測する観察光の波長に対応した陰極感度特性により、より適切なＨＶｇａｐを設定することができる。
【００６７】
なお、感度ゲインおよび増倍ゲインは、個々のＰＭＴ毎の個体差が大きい場合がある。装置組込みの製造工程〜ユーザ納入過程において、ＰＭＴメーカから納品時に添付される出荷試験データを参照して、個体ごとに上記の仕様数値を変えて計算／換算表を作成することとしてもよい。このようにすることで、ＰＭＴの個体差の影響を受けずにより正確な換算を行うことができ、ユーザの手間を省き、実験準備に要する時間を短縮することができる。
【００６８】
次に、第４変形例としては、制御本体部４１が、さらにマルチアルカリＰＭＴ２１の増倍段のゲイン特性に対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の増倍段のゲイン特性の比率に基づいて、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶｇａｐを設定することとしてもよい。
【００６９】
上記の計算例では、ＰＭＴ増倍段の電極構造/材質で決まる指数ｋとして、通常の０．７〜０．８の中間値である０．７５を例示して説明したが、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の増倍段の構造が異なる場合は、それぞれの構造に応じた指数ｋを用いることでより正確な換算を行うことができる。
【００７０】
例えば、９００Ｖと６００ＶなどＨＶを変えて増倍ゲインを実測することで、指数ｋを算出することとしてもよい。また、予め測定した標準値を用いてもよいし、バラツキを考慮して個々のＰＭＴごとに実際に測定して得られた数値を用いてもよい。
このようにすることで、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の増倍段の構成が異なる場合に、より適切なＨＶｇａｐを設定することができる。
【００７１】
ここで、ＨＶ換算表の作成例について説明する。
まず、ＰＭＴゲインは次の計算式（２）により求められる。
Ｇａｉｎ＝Ａ×（ＨＶ）ｋ・ｎ・・・（２）
【００７２】
ただし、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１とに適用する増幅器（第１増幅器２５、第２増幅器３５）が相違し、増幅器回路ゲインが異なる。そのため、下記の計算式（３）を使用するのが好ましい。
【００７３】
総合Ｇａｉｎ＝Ｇａｍｐ×Ａ×（ＨＶ）ｋ・ｎ・・・（３）
ここで、
Ｇａｍｐ：増幅器ゲイン
である。
【００７４】
また、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の特性数値の一例を図６に示す。
上記計算式（３）と図６に示す特性数値により、図７に示すＨＶ換算表を作成することができる。図６において、Ｇａｍｐ（増幅器ゲイン）については、回路ゲインそのものを入力する必要はなく、マルチアルカリＰＭＴ２１を使用する場合の設定値とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１を使用する場合の設定値との相対関係を正しく入力すればよい。
【００７５】
マルチアルカリＰＭＴ２１およびＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１の各光電面の種類や各増倍段の構造が異なっても、予め特性数値を入手しておくことで、マルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替えたときに画像の明るさが変化しないようにＨＶ換算してＨＶ換算表を作成し、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶｇａｐの初期値を設定しておくことができる。
【００７６】
本変形例では、増幅器ゲインの影響を加味することとしたが、実際にはアナログ積算回路の積算ゲインや、アナログ信号をデジタル変換した後のデータ演算など、多種多様な実施手段により信号ゲインを変更することができる。信号ゲインを変更する手段が変わっても本発明の趣旨を普遍的に適用できることは言うまでもない。
【００７７】
次に、第４変形例においては、マルチアルカリＰＭＴ２１およびＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１と第１増幅器２５および第２増幅器３５のゲインについてのみ着目したが、第５変形例としては、マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１とを切り替えて蛍光検出を行う場合の検出光学系における伝達効率の違いを含めてＨＶｇａｐを設定することとしてもよい。
【００７８】
この場合の計算式（４）は下記の通りである。
総合Ｇａｉｎ＝Ｔｏｐｔ×Ｇａｍｐ×Ａ×（ＨＶ）ｋ・ｎ・・・（４）
ここで、
Ｔｏｐｔ：検出光学系の伝達効率
である。
【００７９】
検出光学系の伝達光路とは、検出光路内に存在する光路切り替えミラー４０、ダイクロイックミラー１１、バリアフィルタ（図示略）など、各光学素子の反射率および／または透過率を積算したもので与えられる。マルチアルカリＰＭＴ２１およびＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１間のＨＶの調整が目的のため、必ずしも透過率／反射率の絶対値を把握していなくてもよく、相対的な比率が分かれば、ＨＶの計算を行うことができる。
例えば、ファイバ接続によって外部検出器に蛍光を導いて検出し、ファイバによる伝達効率を加味してＨＶを計算することとしてもよい。
【００８０】
図１において、仮に、光路切り替えミラー４０の反射率を９０％とすると、マルチアルカリＰＭＴ２１のＴｏｐｔは０．９０となる。一方、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１には蛍光が素通しで入射するためＴｏｐｔは１．００となる。Ｔｏｐｔは、計算上、相対的な比率しか意味がないので、計算式（４）においてそれぞれ９０、１００を入力することとすればよい。
【００８１】
また、蛍光検出においては、検出光路にダイクロイックミラー（図示略）を挿入することとしてもよい。その場合は、Ｔｏｐｔとして、検出する蛍光波長に対応した分光波長反射率もしくは分光波長透過率を用いて計算することとしてもよい。このようにすることで、より有効なＨＶ換算を行うことができる。
【００８２】
本変形例では、上記計算式（４）と図８に示す特性数値により、図９に示すＨＶ換算表を作成することができる。マルチアルカリＰＭＴ２１とＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶの相関は図１０に示す通りである。図１０において、縦軸はマルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶｍａを示し、横軸はＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶｇａｐを示している。
【００８３】
図９に示すＨＶ換算表では、マルチアルカリＰＭＴ２１で設定するＨＶの範囲を拡げ、５００Ｖ〜１１００Ｖとしている。このとき、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に設定するＨＶの換算結果は、計算上４４９Ｖ〜９６６Ｖとなる。
そこで、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１において適用できるＨＶに制限（上限／下限）を設けることが望ましい。
【００８４】
上限については以下の通りである。
すなわち、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１においては最大定格ＨＶがマルチアルカリＰＭＴ２１よりも低いことが多く、仮にＨＶｇａｐの上限を９００Ｖとすると、マルチアルカリＰＭＴ２１で１０４０Ｖよりも大きな値のＨＶｍａを設定した場合は換算値を適用することができない。
【００８５】
このような場合は、ユーザに対して警告を表示することとしてもよい。また、第２増幅器３５の増幅器ゲインを高く設定できる場合は、増幅器ゲインを大きな設定値に設定し直し、増幅器ゲインを含めて補正するようにしてもよい。
【００８６】
下限については以下の通りである。
すなわち、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に印加するＨＶｇａｐを低くしてＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１を使用する場合は、増倍率が下がるため光電面からより多くの電子を放出させることになり、劣化が促進され寿命がさらに短くなる。このため、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１は、ＨＶ設定値の下限を設定しておくことが望ましい。
【００８７】
仮に、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１におけるＨＶ設定値の下限を５００Ｖとすると、マルチアルカリＰＭＴ２１で５４０Ｖよりも低い数値のＨＶｍａを設定した場合は、換算値を適用することができない。このような場合は、ユーザに対して警告を表示することとしてもよい。また、第２増幅器３５の増幅器ゲインを低く設定できる場合は、増幅器ゲインを低い設定値に設定し直し、増幅ゲインを含めて補正するようにしてもよい。
【００８８】
次に、第６変形例としては、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１が蛍光の強度をフォトンカウンティング法により検出することとしてもよい。この場合、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶ設定値に対応するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のフォトンカウント値を予め算出して保存しておくこととしてもよい。
【００８９】
そして、制御本体部４１が、光路切り替えミラー４０によりマルチアルカリＰＭＴ２１からＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１に切り替える場合に、切り替える直前のマルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶｍａと、マルチアルカリＰＭＴ２１のＨＶゲインに対するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のＨＶゲインの比率とに基づいて、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１のフォトンカウント値を設定することとすればよい。
このようにすることで、観察光が微弱であってもＧａＡｓＰ−ＰＭＴ３１により高精度に検出することできる。
【００９０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【符号の説明】
【００９１】
１０    顕微鏡本体
２１    マルチアルカリＰＭＴ（第１検出器）
２５    第１増幅器（第１増幅部）
３１    ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ（第２検出器）
３５    第２増幅器（第２増幅部）
４０    光路切り替えミラー（切り替え部）
４１    制御本体部（感度設定部）
１００    顕微鏡システム
Ｓ    試料
【図１】
2015022021.tif 000003
【図２】
2015022021.tif 000004
【図３】
2015022021.tif 000005
【図４】
2015022021.tif 000006
【図５】
2015022021.tif 000007
【図６】
2015022021.tif 000008
【図７】
2015022021.tif 000009
【図８】
2015022021.tif 000010
【図９】
2015022021.tif 000011
【図１０】
2015022021.tif 000012