(57)【要約】    【課題】本発明は、所望の方向から単一細胞を鮮明に解析できる顕微鏡システム等を提供することを課題とする。    【解決手段】本発明は、単一細胞を解析するための顕微鏡システムであって、顕微鏡と、顕微鏡のステージに載置される培養容器中に配置される、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、磁性体を含む、少なくとも１つのマイクロプレートと、磁場発生手段と、を備え、前記磁場発生手段が、マイクロプレートを所望の位置及び／又は角度に動かせるよう構成されている、顕微鏡システムを提供する。【選択図】図４
2015022042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞を解析するための顕微鏡システムであって、
顕微鏡と、
顕微鏡のステージに載置される培養容器中に配置される、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、磁性体を含む、少なくとも１つのマイクロプレートと、
磁場発生手段と、を備え、
前記磁場発生手段は、マイクロプレートを所望の位置及び／又は角度に動かせるよう構成されている、顕微鏡システム。
【請求項２】
前記顕微鏡が、共焦点レーザ顕微鏡又は位相差顕微鏡である、請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記磁場発生手段が、環状の磁石又はコイルであり、
前記マイクロプレートが、環状の磁石又はコイルの中央に配置される、請求項１又は２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記培養容器が、マイクロ流体デバイスである、請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡システムを用いて単一細胞を解析する方法であって、
前記マイクロプレートに細胞を接着させる工程と、
前記磁場発生手段を制御して前記マイクロプレートを顕微鏡で観察しやすい位置及び／又は角度に動かす工程と、
前記マイクロプレートに接着した細胞を顕微鏡で観察する工程と、
を含む方法。
【請求項６】
前記顕微鏡が共焦点レーザ顕微鏡又は位相差顕微鏡であって、前記磁場発生手段によって、細胞の観察したい断面がｘ−ｙ平面となるようにマイクロプレートを傾ける、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物の細胞への侵入又は細胞からの放出の解析に用いられる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
単一細胞の解析用キットであって、
基板上にアルギン酸カルシウムゲルを介して、１以上のマイクロプレートが固定されたマイクロプレート固定基板を備え、
前記マイクロプレートは、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、磁性体を含む、
キット。
【請求項９】
さらに、磁場発生手段を備える、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一細胞を鮮明に観察することが可能な顕微鏡システム、及びこの顕微鏡システムを用いた単一細胞の解析方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な分野において、細胞の挙動や、細胞や微生物との相互作用を、単一細胞レベルで解析する方法が求められている。一例として、寄生虫、細胞、又はウイルスなどの感染性微生物が、宿主細胞に侵入するメカニズムの研究において、宿主細胞と、微生物の細胞膜の境界まで鮮明に観察できる方法が求められている。
【０００３】
これまでにも、電気力、流体力学、磁力を利用したマイクロ流体デバイスなど、マイクロ加工デバイスを利用して、単一細胞レベルで細胞を解析する方法が提案されている（例えば、非特許文献１及び２）。
しかしながら、これらの方法では、接着細胞を解析する場合、基板から細胞を剥離することが必要となり、解析に先立ってトリプシン処理が行われる。このような化学物質による処理は、細胞の生存率を低下させ、細胞の形態や機能に悪影響を及ぼす可能性がある（非特許文献３）。接着細胞の挙動や機能、微生物との相互作用を解析するためには、その接着性を維持して自然に近い状態で解析することが望ましい。生体を構成する細胞の大部分は接着細胞であることから、このような解析方法が強く求められている。
【０００４】
単一細胞を基板に接着させたまま解析できる方法として、共焦点レーザ顕微鏡を用いる方法がある。共焦点レーザ顕微鏡では、一点の光源から発せられたレーザ光が、対物レンズによってサンプルに照射され、サンプルからの反射や散乱光を光検出装置が検出し、光信号が電気信号に変換されてコンピュータに記録される。厚みのあるサンプルであっても、様々な深さでｘ−ｙ方向にスキャンして２次元断層像を得ることができる。ｚ方向に深度を様々に変えて撮影した２次元断層像をコンピュータで重ね合わせることにより、３次元立体画像を再構築することができる。
【０００５】
しかしながら、この方法では、ｘ−ｙ平面での解像度は最高で１００ｎｍ程度となる一方、原理上、ｚ軸方向の解像度は３−４倍低くなる。また高解像度な三次元画像の取得のためには、一細胞に対して３０分から一時間という長時間に及ぶ平面スキャンを繰り返すため、蛍光色素の褪色に常に直面し、かつ瞬時に起こる細胞の現象を捉えることが不可能であった。したがって、これまでは、単一細胞を観察する場合、細胞が接着するシャーレの台座を傾斜させたり、対物レンズを傾けて光軸を傾斜させたりして、様々な角度から観察することが試みられてきた。しかしながら、これらの方法では傾斜角度に限界があり、光軸を変えると位相差観察や蛍光観察が困難になるという問題もあり、細胞を所望の方向から鮮明に観察することはできなかった。
【０００６】
ところで、本発明者らは、接着細胞を単一細胞レベルでハンドリングできるマイクロプレートを開発した。このマイクロプレートを用いれば、マイクロプレート上で接着細胞を一つずつ培養することができるので、毒性のある化学物質を用いることなく、接着細胞を浮遊細胞と同じように扱うことができるようになった（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. E. Ali, et al., Nature, vol. 442, pp. 403-411, 2006.
【非特許文献２】J. Nilsson, et al., Analytica Chimica Acta, vol. 649, pp. 141-157, 2009.
【非特許文献３】J. Bereiter-Hahn, et al., Journal of Cell Science, vol. 96, pp. 171-88, 1990.
【非特許文献４】H. Onoe and S. Takeuchi, J. Micromech. Microeng., vol. 18, 095003, 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、所望の方向から単一細胞を鮮明に解析できる顕微鏡システム等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、上記マイクロプレートに磁性体を加えれば、磁場を利用してマイクロプレートを自在に移動させ傾けることができることを見出した。さらに、コイルを用いて電流を変化させるなどの方法で磁場を制御することにより、１度単位で、精密にマイクロプレートを所望の位置に移動させ、所望の角度に傾斜させることができることを見出した。
そして、かかるシステムを用いて、実際に細胞が接着したマイクロプレートを自在に傾けて共焦点レーザ顕微鏡で観察することにより、あらゆる方向で１００ｎｍ程度の解像度を持つ２次元画像が得られる結果、細胞内のアクチンファイバーや微小管の一本一本の繊維の断面まで鮮明に観察することができることを確認した。また、接着細胞に寄生虫が侵入する際の両者の細胞膜における相互作用も鮮明に観察することができ、寄生虫侵入のプロセスに関する新たな知見を得た。
加えて、かかるマイクロプレートを細胞に毒性を与えることなく極めて効率よく製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕単一細胞を解析するための顕微鏡システムであって、
顕微鏡と、
顕微鏡のステージに載置される培養容器中に配置される、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、磁性体を含む、少なくとも１つのマイクロプレートと、
磁場発生手段と、を備え、
前記磁場発生手段は、マイクロプレートを所望の位置及び／又は角度に動かせるよう構成されている、顕微鏡システム；
〔２〕前記顕微鏡が、共焦点レーザ顕微鏡又は位相差顕微鏡である、上記〔１〕に記載の顕微鏡システム；
〔３〕前記磁場発生手段が、環状の磁石又はコイルであり、
前記マイクロプレートが、環状の磁石又はコイルの中央に配置される、上記〔１〕又は〔２〕に記載の顕微鏡システム；
〔４〕前記培養容器が、マイクロ流体デバイスである、上記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の顕微鏡システム；
〔５〕上記〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の顕微鏡システムを用いて単一細胞を解析する方法であって
前記マイクロプレートに細胞を接着させる工程と、
前記磁場発生手段を制御して前記マイクロプレートを顕微鏡で観察しやすい位置及び／又は角度に動かす工程と、
前記マイクロプレートに接着した細胞を顕微鏡で観察する工程と、
を含む方法；
〔６〕前記顕微鏡が共焦点レーザ顕微鏡又は位相差顕微鏡であって、前記磁場発生手段によって、細胞の観察したい断面がｘ−ｙ平面となるようにマイクロプレートを傾ける、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕微生物の細胞への侵入又は細胞からの放出の解析に用いられる、上記〔５〕又は〔６〕に記載の方法；
〔８〕単一細胞の解析用キットであって、
基板上にアルギン酸カルシウムゲルを介して、１以上のマイクロプレートが固定されたマイクロプレート固定基板を備え、
前記マイクロプレートは、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、磁性体を含む、キット；
〔９〕さらに、磁場発生手段を備える、上記〔８〕に記載のキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の顕微鏡システム及び解析方法によれば、単一細胞を自在に傾けて、あらゆる断面の２次元画像を直接得ることができるので、あらゆる断面について極めて高解像度の画像を短時間で得ることができる。
これにより、これまでわからなかった細胞内部の構造や、細胞内タンパク質やオルガネラの局在を詳細に知ることができる。また、細胞間相互作用や細胞と微生物の相互作用における両者の細胞膜の境界も鮮明に観察することができるので、そのメカニズムの研究に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１ａは、マイクロプレートの製造方法の概略を示す。図１ｂ及びｃは、基板上に形成されたマイクロプレートの写真とSEM像をそれぞれ示す。図１ｄは、環状の磁石の中央に置いたシャーレにマイクロプレートを配置し、マイクロプレートを操作する際に用いるナノツイーザをシャーレ中に配置している様子を示す。
【図２Ａ】図２Ａ左は、マイクロプレートに細胞が接着した様子を、右は１つのマイクロプレート表面に接着した細胞が拡がった様子を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マイクロプレートの直径を変えて、細胞の接着の状態を調べた結果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、マイクロプレート上に添加する細胞の濃度を変えて、細胞の接着の状態を調べた結果を示す。
【図３】図３は、磁場を利用して細胞の位置や角度を制御した際の代表的な顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、磁場によってマイクロプレートを立たせ、ナノツイーザを用いて2つの細胞を接触させようとする像を示す。
【図５】図５は、共焦点レーザ顕微鏡による観察の様子を示す概念図である。
【図６】図６は、従来法（左）と、本発明の方法（右）によって得た、細胞の断面の共焦点レーザ顕微鏡像である。図右は、細胞表面に存在するアクチンファイバーと、細胞内に局在する微小管繊維の断面図を、細胞の傾斜化後観察した図が示されている。
【図７】図７は、寄生虫が宿主細胞に接着した様子を示す共焦点レーザ顕微鏡像である。細胞表面に局在する微小管が、侵入中の寄生虫側に集合している様子が示されている。この現象は従来の共焦点顕微鏡による三次元合成画像からは得られず、細胞の傾斜化による高解像度な図で初めて観察が可能となった。
【図８】図８は、宿主細胞に侵入していく寄生虫を示す共焦点レーザ顕微鏡像である。細胞表面に局在するアクチンファイバーが、侵入中の寄生虫を取り囲むように集合している様子が示されている。この現象は従来の共焦点顕微鏡による三次元合成画像からは得られず、細胞の傾斜化による高解像度な図で初めて観察が可能となった。
【図９】図９は、宿主細胞内に侵入した寄生虫を示す共焦点レーザ顕微鏡像である。侵入後の寄生虫に宿主由来の微小管が集合している様子が高解像度に観察された。
【図１０】図１０は、宿主細胞に侵入していく寄生虫を示す位相差顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［顕微鏡システム］
本発明に係る顕微鏡システムは、単一細胞を解析するための顕微鏡システムであって、顕微鏡と、少なくとも１つのマイクロプレートと、磁場発生手段と、を備える。
本明細書において「顕微鏡」は、単一細胞を観察できるものである限り特に限定されないが、例えば、実体顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザ走査顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡、位相差顕微鏡などの光学顕微鏡；透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡などの電子顕微鏡；原子間力顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡、走査型近接場光顕微鏡などの走査型プローブ顕微鏡；Ｘ線顕微鏡；超音波顕微鏡などが挙げられる。
中でも、本発明に係る顕微鏡システムは、細胞を所望の位置及び／又は角度に動かすことができることから、共焦点レーザ顕微鏡や位相差顕微鏡が適している。
【００１３】
本明細書において、「マイクロプレート」は、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、且つ磁性体を含むことを特徴とする微小な構造体を意味する。マイクロプレートの主面とは、マイクロプレートの最も大きな面を意味する。主面に「細胞が１個のみ接着できる」とは、細胞とマイクロプレートが、接着したときの１個の細胞が、主面の面積の大半を覆う程度のサイズであることを意味する。
したがって、細胞とマイクロプレートの接着面における細胞の最大径が、マイクロプレートの最大径の４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上となるような関係が好ましい。細胞とマイクロプレートの接着面における細胞の最大径とは、細胞の接着面の形状の周囲における任意の２点を結んだ直線の長さが最大となる場合の長さを意味する。また単一細胞を二日間以上培養すると細胞は分裂、増殖するが、細胞とマイクロプレートの接着面のサイズをこのような関係とすると、分裂後、マイクロプレート上に初めにあった細胞はそのまま接着状態を維持し、増殖した細胞はもとの細胞の上部に重なって存在し、次第にマイクロプレートから剥離される。そのためマイクロプレートの細胞数を安定的かつ長期間にわたって単一に限定することが可能となる。
【００１４】
マイクロプレートの主面は、円形や正多角形等、どのような形状であってもよい。主面の最大径は当業者が適宜測定することができるが、例えば、周囲における任意の２点を結んだ直線の長さが最大となる場合の長さとすればよい。
マイクロプレートは、全体として、平板、ディスク状、又は円錐台等の形状とすることができるが、これらに限定されない。
なお、マイクロプレートに２個以上の細胞が重なって接着できる場合であっても、そのうち１個の細胞のサイズが上記条件を満たしている限り、「細胞が１個のみ接着できる」に該当する。
【００１５】
マイクロプレートの径を制御することにより、接着する細胞の主面上での拡がりや高さを制御することができる。例えば、線維芽細胞の場合、主面の径を１０μｍ〜３０μｍとすれば、接着した細胞はほぼスフェア状となる。主面の径を４０μｍ〜７０μｍとすると、接着した細胞は山状になる。細胞のサイズや目的に応じて、マイクロプレートの径は自由に決定すればよい。
【００１６】
本明細書において「磁性体」とは、磁性を帯びることが可能な物質をいい、当該磁性体を含むマイクロプレートを、磁場によって動かすことができる限り、どのような物質であってもよい。例えば、酸化鉄、酸化クロム、鉄、パーマロイ（permalloy）等のＦｅ−Ｎｉ合金などが挙げられるがこれらに限定されない。
磁性体を含むマイクロプレートに外部から磁場をかけると、磁性体に磁気双極子モーメントが誘導され、マイクロプレートが磁場に沿って動く。
また、磁性体はどのような形状であってもよい。例えば、マイクロプレート平面状に磁性体を長方形にパターニングすれば、その長軸方向が与えられた磁場方向に配向する。
【００１７】
マイクロプレートに接着した細胞は、顕微鏡のステージに置かれる培養容器中に配置される。培養容器は、細胞の観察に影響を及ぼさない限りどのようなものであってもよいが、例えばガラス製のシャーレでよい。培養容器に細胞の種類等に応じて選択される培養液や緩衝液を入れ、その中に細胞が接着したマイクロプレートを配置することにより、接着性を含む細胞の活性を維持するのに適した環境で細胞を観察することが可能となる。
また、培養容器として、マイクロ流体デバイスを用いてもよい。マイクロ流体デバイスとは、MEMS（Microelectromechanical Systems）などのマイクロ加工技術を利用して、微小流路や反応容器を作製したデバイスである。培養容器としてマイクロ流体デバイスを用いてもよいし、培養容器としてシャーレを用い、その中にマイクロ流体デバイスを配置してもよい。
【００１８】
マイクロプレートは、細胞が１個のみ接着できる主面を有し、且つ磁性体を含む限り、どのような材料で形成されていてもよいが、顕微鏡による細胞の観察を阻害しないよう、透明度が高く、生体適合性に優れた材料が望ましい。また、フォトリソグラフィ、エッチングなどのマイクロ加工に適した材料としてもよい。
マイクロプレートを構成する材料としては、例えば、ガラス、金属、半導体、セラミックス、樹脂（例えばパラキシリレン系ポリマー）、又はこれらの複合材料などが挙げられるがこれらに限定されない。複数の材料からなる層構造としてもよい。
【００１９】
マイクロプレートは、これらの材料と磁性体とを単に積層して形成してもよいし、これらの材料で磁性体を封じ込めるように形成してもよい。磁性体が細胞に悪影響を及ぼす材料である場合は、生体適合性に優れた材料でこれを封じ込めるようにマイクロプレートを形成することが好ましい。
【００２０】
マイクロプレートの表面は、細胞の接着を促進する物質でコーティングしてもよい。細胞の接着を促進する物質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリクスや、ポリＬリジンなどの陽性電荷物質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
本明細書において「磁場発生手段」は、マイクロプレート中の磁性体に作用してマイクロプレートを所望の位置及び／又は角度に動かすことができる限りどのようなものであってもよいが、例えば磁石やコイルが挙げられる。磁場発生手段の形状も特に限定されないが、例えば、環状の磁石やコイルとすることができる。この場合、磁石やコイルを顕微鏡のステージに置き、その中央にマイクロプレートが来るように配置することにより、ステージと垂直な方向の磁場によってマイクロプレートの動きを制御することができる。
環状の磁場発生手段を用いれば、共焦点レーザ顕微鏡を用いる場合にもレーザ光の光路を阻害しないという利点もある。
磁場発生手段としてコイルを用いる場合、コイルに流す電流の量を調節することによって、マイクロプレートの傾斜角度を精緻に制御することが可能となる。
【００２２】
本発明に係る顕微鏡システムは、単一細胞の解析に適したその他の部材を適宜備えることができる。
【００２３】
［顕微鏡システムの製造方法］
本発明に係る顕微鏡システムは、既存の顕微鏡に、マイクロプレートと磁場発生手段を適宜配置することにより構成することができる。マイクロプレートは、培養容器内に配置する。磁場発生手段はその形状に応じて、細胞の観察を阻害しないよう配置すればよい。例えば、環状の磁石やコイルを用いる場合には、その中央にマイクロプレートが来るように顕微鏡のステージに置けばよい。
【００２４】
マイクロプレートは、非特許文献４や国際公開ＷＯ２００９／０８８０８８等に記載された方法に準じて製造することができる。
また、図１（ａ）に示されるように、フォトリソグラフィ法によって形成してもよい。
図１（ａ）に示す方法では、ＳｉＯ2基板をでアルギン酸ハイドロゲルでコーティングして犠牲層を形成した後、パリレン（登録商標）でさらにコーティングする。その上にクロム層とパーマロイ層を順に蒸着により形成し、必要に応じてパターニングする。クロム層はパーマロイをパリレンに接着するための層として機能する。
パーマロイは、溶出して細胞に悪影響を及ぼす可能性があるため、ここにパリレンをさらに積層する。その後、アルミニウムマスクをパリレン上にパターニングし、エッチングによってマイクロプレートを所望の形状に成形する。
続いて、フォトレジストを除去し、適宜洗浄した後、マイクロプレート表面は細胞の接着を促進する物質でコーティングし、マイクロプレートの周囲に露出した基板表面は、細胞接着やタンパク質吸着が生じにくい物質（例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマー）でコーティングする。
図１（ａ）の方法は一例であり、材料や、積層方法、パターニング方法は、当業者が適宜選択することができる。
【００２５】
こうして、基板上にマイクロプレートがアレイ状に配置された構造体（マイクロプレート固定基板）をアルギン酸ハイドロゲルから成る犠牲層を溶かすことにより、個々のマイクロプレートを得ることができるが、犠牲層を溶かす前のマイクロプレート固定基板の状態で流通させることも可能である。アルギン酸ハイドロゲルは、褐藻などに含まれる多糖類の一種であり、従来より細胞のカプセル化や培養基盤のための構造体などに用いられているほど細胞毒性がないことが広く知られている。
犠牲層として、アルギン酸カルシウムハイドロゲルを用いれば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することでハイドロゲル中のカルシウムイオンがナトリウムに置換されることでゲルが溶出するので、使用者において簡便にマイクロプレートを基板から外すことができる。ゲルの溶出は、ＰＢＳ添加後一分以内で起こる。アルギン酸カルシウムゲルを用いる場合、そのままパリレンを積層するとゲルの水分によってパリレンの構造が壊れることがあるため、脱気などの方法でゲルの水分をある程度除去してからパリレンを積層するとよい。
ＰＢＳは細胞に悪影響を与えることもないので、マイクロプレート固定基板を購入した使用者が、アレイ状に並んだマイクロプレート上にまず細胞を接着させ、その後ＰＢＳで洗浄することによって、それぞれに単一細胞が接着したマイクロプレートを得ることが可能である。
なお、犠牲層は、細胞に悪影響を及ぼすことなく溶出させることができるものであればよく、アルギン酸ハイドロゲル以外の材料を用いてもよい。例えば犠牲層をゼラチンで形成すれば、穏やかに加熱することにより犠牲層を除去することができ、また光刺激に応答して分解する光分解性ゲルを用いることで、特定の波長の光を照射することで除去することができる。
【００２６】
［単一細胞の解析方法］
本発明に係る単一細胞の解析方法は、本発明の顕微鏡システムを用いるものであり、前記マイクロプレートに細胞を接着させる工程と、前記磁場発生手段を制御して前記マイクロプレートを顕微鏡で観察しやすい位置及び／又は角度に動かす工程と、前記マイクロプレートに接着した細胞を顕微鏡で観察する工程と、を含む。
【００２７】
マイクロプレートに細胞を接着させる工程は、マイクロプレート固定基板を培地の中に置き、ここに適当な濃度の細胞をマイクロプレート上に分散させてインキュベートするだけでよい。細胞濃度は、細胞の種類やマイクロプレートの密度に応じて適宜選択することができるが、例えば、2×105cell/mL程度とすることができる。
細胞がアレイ状のマイクロプレートのそれぞれに接着したら、犠牲層の種類に応じた方法でマイクロプレートを基板から外す。この際、磁場をかけながら外すとマイクロプレートの動きを制御することができる。
【００２８】
磁場発生手段を制御してマイクロプレートを観察しやすい位置及び／又は角度に動かす工程は、磁場発生手段の種類に応じて適宜行うことができる。所望の形状の磁石を手動で、またはスタンドに固定するなどして、必要な方向に必要な強さの磁場をかけることができる。また、コイルを用いる場合には、流す電流を調節することにより、磁場の方向や強度を調節することができる。
マイクロプレートは、例えば磁場をかけながら、ナノツイーザ（nano-tweezers）等の器具を用いて動かしてもよい。ナノツイーザによれば、マイクロプレートを一つずつ精緻に配置することが可能である。
また、本工程では、マイクロプレートを、マイクロ流体デバイスの流路に配置し、流体の動きでマイクロプレートの位置や動きを制御することもできる。流路に堰を適宜設計することによって、マイクロプレートを所望の場所に移動及び固定できるので、例えばアレイ状に並べてもよい。マイクロ流体デバイスによれば、多くのマイクロプレートを高速に一括して再配置することができ、その状態で磁場をかけて、多くのマイクロプレートを同様に傾けることも可能である。また、マイクロ流体デバイスに配置すれば、層流を加えて新鮮な培養液や反応刺激物を細胞に送達することも可能である。
【００２９】
マイクロプレートに接着した細胞を顕微鏡で観察する工程は、顕微鏡の種類に応じて適宜行うことができる。マイクロプレートを傾ける工程で傾けたマイクロプレートには、その傾斜角度が維持されるように、磁場をかけ続けて行う。
【００３０】
例えば、共焦点レーザ顕微鏡を用いる場合、従来は接着細胞を傾けることができなかったため、接着面に垂直な方向（ｚ軸方向）の断面は、接着面と平行な面（ｘ−ｙ平面）の２次元画像を複数取得して、これに基づいて３次元画像を再構築して得るほかなかった。したがって、ｚ軸方向の１つの断面を得るためにも、複数の２次元画像を取得しなければないため時間を要し、また、ｘ−ｙ平面に比較して解像度が低い画像しか得られなかった。
これに対し、本発明によれば、マイクロプレートを傾けることによって、画像を得たい断面をｘ−ｙ平面とすることができるので、１枚の画像として直接撮影でき、極めて解像度の高い画像を短時間で得ることが可能である。
なお、本明細書において、顕微鏡の「ｘ−ｙ平面」とは、顕微鏡の光軸に垂直な平面を意味する。
【００３１】
このような方法により、後述する実施例に示すとおり、細胞内のアクチンファイバーや微小管一本一本の繊維の断面が点状に観察された。
また、本発明に係る解析方法によれば、マイクロプレートに山状に接着した細胞の頂点付近から寄生虫が侵入する様子を鮮明に捉えることができた。寄生虫の侵入や放出は２０秒程度の短時間で起こるものであるため、複数のｘ−ｙ画像を得て３次元画像を再構築する方法で観察することはほとんど不可能であった。
本発明に係る方法によれば、微生物が細胞に侵入したか否かのみならず、細胞と微生物との境界の様子や、微生物が侵入する角度等も観察することができる。また細胞の膜表面下で起こる現象は、基礎生物学にとどまらず創薬や細胞スクリーニングなどの広い領域の研究対象となっており、外界から細胞内に移入するエンドサイトーシス・ファゴサイトーシス、細胞外からの小胞などの輸送とされるエキソサイトーシス、またマイクロサイズの小胞の膜直下でのやり取りであるメンブレントラフィックが挙げられる。これらの現象も従来より全て細胞をシャーレごと傾斜化するなどの方法で解析しようとされており、本デバイスの応用され得る技術として考えられる。
【００３２】
また、後述する実施例に示すとおり、位相差顕微鏡を用いて本発明の解析方法を実施することにより、寄生虫などの微生物が細胞に侵入するときの細胞接着のタイミング、細胞に対してどのような角度で侵入するか、どのようなタイムスケールで侵入するのかを観察できる。従来の方法では細胞を傾けることができず、膜で起こる現象の方向と観察の光軸が同軸上にあるため、微生物と細胞との境界線を観察することができなかった。
【００３３】
また、本発明に係る解析方法は短時間で画像を取得できるので、蛍光標識するイメージング技術と組み合わせることが可能である。従来のタンパク質を蛍光標識するイメージング技術と組み合わせることにより、どのタンパク質が、いつ、どの場所で、どのタイミングで発現するかを確認することが可能である。
【００３４】
本発明に係る方法は、そのほか、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、免疫細胞の遊走の検出などにも有用である。また、それぞれ単一細胞が接着したマイクロプレートを向かい合わせて、細胞同士の相互作用を解析することも可能である。
【００３５】
［単一細胞の解析用キット］
本発明に係る単一細胞の解析用キットは、マイクロプレート固定基板、即ち、基板上にマイクロプレートがアレイ状に配置された構造体を備える。マイクロプレート固定基板においては、マイクロプレートがアルギン酸カルシウムゲルを介して基板に固定されていることが好ましい。このような構成であれば、使用者においてマイクロプレート固定基板上の各マイクロプレートに単一細胞を接着させた後、ＰＢＳで洗浄することによって、穏やかにマイクロプレートを基板から分離することができる。
【００３６】
解析用キットは、さらに、磁場発生手段を備えていてもよい。また、単一細胞の解析に必要な試薬、緩衝液、容器、使用説明書等を備えていてもよい。
【００３７】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
［材料と方法］
（１）マイクロプレートの作製
図１ａに、マイクロプレートの製造方法の概略を示す。
ガラス基板上にアルギン酸ハイドロゲル層を設けた。アルギン酸ハイドロゲル層は、まず塗布されたアルギン酸ナトリウム溶液を塩化カルシウム溶液に漬けてゲル化させることにより、目的の厚みを持った薄膜のハイドロゲルを得る。このアルギン酸の上にマイクロプレートを配置することで、ハイドロゲル層を溶かすことで、プレート上の細胞に毒性を与えることなく、基板からマイクロプレートを分離できる犠牲層としての機能を有する。
マイクロプレートの材料には、生体適合性と透明度に優れたParylene-C（DPX−C、Speedline Technology）を用いた。アルギン酸ハイドロゲルの犠牲層上に、paryleneを積層し（Labcoater PDS2010 Specialty Coating Systems, Indianapolis）、クロム層とパーマロイ（78 Permalloy, 100-nm-thickness, Nilaco corp.）層をさらにスパッタリングして、paryleneマイクロプレートに磁性を与えた。パーマロイ層は、その上部にフォトレジストを塗布し、任意の形状を持つマスクを通じて光を照射することで、目的の形状をしたフォトレジストマスクをパターニングした後に、王水によりエッチングする。その後、露出したクロム層をHY液（和光純薬工業）によりエッチングし、フォトレジスト以外の領域のパリレン層を露出させる。この際、フォトレジストマスクのパターンを長方形に設計することで、長方形の形状をもつクロム・パーマロイ層を形成することができる。
クロム層は、パーマロイとparyleneの接着層として機能する。
続いて、パーマロイの微量の溶出が細胞に毒性を与えるのを防ぐため、パーマロイをparylene層で再度コーティングし、接着細胞がパーマロイに直接接触しないようにした。paryleneの第１層と第２層を合わせた厚みは約１μｍであった。Alマスク層をparylene上にフォトレジストを用いてパターニングし、O2プラズマでエッチングした（RIE-10NR、SAMCO、International Inc.）。O2プラズマではAl層はエッチングされず、paryleneとアルギン酸ハイドロゲルのみがエッチングされる。そのためAl層でカバーされていない部分が、ガラス基板表面が露出するまでエッチングされ、Al層のparyleneとアルギン酸の層が残る。この際、任意のAlマスク層の形状を作製することで、その形状に応じたparyleneマイクロプレートを作製することが可能となる。最後に、細胞接着の促進を阻害するフォトレジストをアセトンにより除去し、イソプロピルアルコール（IPA）でリンスした。
続いて、基板表面にタンパク質吸着と細胞接着を防ぐ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ポリマーを塗布し、基盤に残っているAl層を除去した。これによりAl層の直下に存在するparyleneの表面が露出する。その後細胞の接着を誘導するタンパク質であるフィブロネクチンを添加することで、MPCポリマーのあるガラス表面にはフィブロネクチンは接着せず、マイクロプレートのみに吸着し、細胞が接着するようにパターニングした。マイクロプレートの材質であるparyleneは疎水性の表面を有するため、フィブロネクチンの疎水性の構造と特異的に吸着するため、タンパク質の塗布が可能となると考えられる。
図１ｂ及びｃに、基板上に形成されたマイクロプレートの光学顕微鏡写真とSEM像をそれぞれ示す。長方形のバーの形をしたパーマロイのパターンがparyleneでコーティングされたマイクロプレートが観察された。
【００４０】
（２）細胞
ヒト包皮線維芽細胞（human foreskin fibroblast cells; HFF）及びマウス線維芽細胞様細胞（NIH/3T3）を用いた。細胞の培養条件は、37℃、5% CO2とし、10％のウシ胎児血清（FBS, F7524-500ML, SIGMA）及び10μg/mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地（DMEM, 11885, Gibco）を培地として用いた。細胞をマイクロプレート上に分散させた後、プレートへの予備的な細胞接着が完了するまで2時間培養した。マイクロプレートに接着していない細胞を除去するために、マイクロプレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でリンスした。
【００４１】
（３）微生物
Toxoplasma gondiiを用いた。T. gondii RH株は、HFF細胞内で維持した。T. gondiiはDMEM中、タキゾイト（tachyzoite）として増殖させた。寄生虫は、21Gの針で吸引して宿主細胞から分離し、ポリカーボネート膜フィルター（pore size 3μｍ、Millipore）で濾過して宿主細胞と細胞残屑を除いた。Caを含むPBSバッファ（pH 7.2）で洗浄し、500×gの遠心処理を10分行って回収した。
【００４２】
（４）細胞染色
細胞染色は、細胞を4％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、0.1％ Triton X-100で透過性にし、1% BSAで1時間ブロッキングした。α−チューブリン染色は、細胞をマウスモノクローナル抗α−チューブリン抗体（1:100、Sigma）とインキュベートし、続いて、Alexa-Fluor-488結合抗マウスIgG（1:100、Molecular Probes）とインキュベートした。アクチン・フィラメントは、TRITC結合ファロイジン（1:100、Molecular Probes）で染色した。DAPI（ProLong gold antifade reagent with DAPI, Invitrogen）で核を対比染色した後、Olympus顕微鏡で蛍光像を得た。
【００４３】
［結果］
１．マイクロプレートへの細胞の接着
細胞は、各マイクロプレートに接着した後、図２Ａに示されるとおり、その表面全体に拡がった。いくつかの細胞は、二つのマイクロプレートにまたがって配置された。細胞が接着して拡がるまで約2時間かかった。
各マイクロプレート上の細胞数は、マイクロプレートの直径と懸濁した細胞の濃度に依存した。
マイクロプレートの直径を変えて、細胞の接着の状態を調べた結果を図２Ｂに示す。直径が小さいとアポトーシスが起きる可能性が高く、マイクロプレートに接着する細胞数とのバランスから、50μｍのマイクロプレートが最適であると判断した。
また、マイクロプレート上に添加する細胞の濃度を変えて、細胞の接着の状態を調べた結果を図２Ｃに示す。HFF細胞では、4×104細胞/mL、NIH3T3細胞では、2×105細胞/mLのときに、1個ずつ細胞が接着したマイクロプレートが最も多く得られた。
その後、PBSを添加することで磁場をかけながら基板からプレートをはずした。その際細胞はマイクロプレートから剥離されず、接着状態を維持したまま、マイクロプレートごと浮遊した。浮遊化させることにより、ナノツイーザ（AOI electronics, co., Ltd）やマイクロピペットを用いて、個別に一つ一つの細胞を操作することができた。PBSによる剥離前、剥離後、細胞の操作前、操作後のすべての段階において細胞は生存しており、活性が維持されていることが確認された。またParyleneはヤング率が4GPaにも及ぶ高い機械的強度を有するため、細胞の培養後もひずみやたわみを生じることなく、平板な表面構造を維持していた。また磁場をかけた後も平坦な表面構造を維持していた。
【００４４】
２．細胞の位置や角度の制御
図３に、磁場を利用して細胞の位置や角度を制御した際の代表的な顕微鏡写真を示す。
磁場を強くすると、ほとんどの細胞はマイクロプレートごと傾いた（Tilt）。また、磁場の方向を帰ると、その場で回転した（Rotation）。さらに、磁場の方向を制御することにより、300μm/minの速度で、細胞を水平方向に移動させることができた（Translational motion）。これらの動作を組み合わせることにより、目的のマイクロプレート上の細胞のみを顕微鏡の視野内に配置させ、目的の角度に配向させた状態で長時間の観察が可能となる。これらの動作は、パーマロイ層が20 μm×5 μm×100 nmの形状を持つ場合、0.2 mTの磁場の強さで作用する。ただこの磁場の強さに限定されることはなく、パーマロイ層の厚みや形状を変えることで、任意の磁場の強度に応答することが可能となる。
図４は、磁場によってマイクロプレートを立たせ、ナノツイーザを用いて2つの細胞を接触させたところを示す。このように精密に細胞の角度と位置を制御することにより、細胞の相互作用を最適な方向から観察できるようになった。従来から複数の細胞を接着化状態で配置し、細胞間相互作用の解析を行う研究が広く行われてきたが、細胞の隣接配置のために上記のトリプシンなどの細胞を剥離する工程を入れなければならず、細胞周期の変動や細胞死の誘導、また接着状態を阻害されているため膜タンパク質の変質により本来の細胞の機能を見ることができないという問題があった。そこで本手法を用いることで細胞を接着状態が維持されたまま隣接配置が可能であるため、より組織に存在する細胞に近い活性を保持して、細胞の機能を観察、解析することに成功した。
【００４５】
３．共焦点レーザ顕微鏡による観察。
図５に、共焦点レーザ顕微鏡による観察の概念を示す。上段に示すとおり、従来は容器等に接着した細胞を観察する場合、容器に垂直な方向の断面については、複数の水平断面像から三次元構造を再構築して得なければならず、解像度が低くなる上に、時間もかかるという問題があった。
本発明によれば、マイクロプレートを自由に回転させることができるため、マイクロプレートに垂直な方向を顕微鏡のｘ−ｙ平面にすることができ、あらゆる方向の断面図を、従来の方法で水平断面像と得るのと同じように得ることができる。したがって、解像度の高い像を短時間で得ることが可能である。そのため細胞内の蛍光物質の褪色が最低限に抑えられるという利点だけでなく、微生物の感染などの数秒単位で起こる細胞の現象をリアルタイムでとらえることが可能となる。
【００４６】
図６に、従来法と本発明の方法による細胞の像の比較を示す。従来法では細胞の輪郭がはっきりせず、アクチンファイバーや微小管も不鮮明にしか見られなかった（図左）。
本発明に係る方法で、マイクロプレートを回転させて観察したところ、細胞の輪郭が明瞭に観察され、アクチンファイバーや微小管の断面を、鮮明な点として捉えることができた（図右）。細胞内には多くの種類のタンパク質が存在し、細胞の生命活動維持に貢献している。そのほとんどが研究対象となっており、詳細な細胞内での局在や発現量を解析するための簡便で高解像度な画像を取得できる手法として応用が可能となる。
【００４７】
４．微生物の細胞への侵入の観察（共焦点レーザ顕微鏡）
マイクロプレートを立てた状態で、T. gondiiが細胞に侵入する様子を共焦点レーザ顕微鏡で横から観察した。
代表的な像を図７〜９に示す。感染性微生物は、通常、宿主細胞の膜への接着、侵入、細胞内への封入の３つの段階を経て宿主細胞に感染する。微生物と宿主細胞の相互作用を調べるためには、各段階において、宿主細胞の形態を制御しながら、細胞膜周辺の細胞境界の高解像度の画像を得る必要がある（T. Teshima, et al., Digest Tech. Papers MicroTAS'12 Conference, Okinawa, October 29 - November 1, 2012, pp. 2.A1-2.、V. Carruthers, et al., Current Opinion in Microbiology, vol. 10, pp. 83-89, 2007.）。
この点、図７に示されるとおり、本発明の方法によれば、T. gondiiが細胞に近づくと、細胞膜表面がT. gondiiに引き寄せられるように盛り上がることが観察された。そして、図８に示されるとおり、細胞膜がT. gondiiを包むような状態で、T. gondiiが細胞に侵入していく様子が鮮明に見られた。また、細胞内に封入された微生物とその周囲の様子も明らかとなった（図９）。
従来、微生物は宿主細胞の細胞膜を破壊して侵入すると考えられており、微生物と宿主細胞の膜の間にこのような相互作用があることは、本発明によって確認されたまったく新しい知見である。
【００４８】
５．微生物の細胞への侵入の観察（位相差顕微鏡）
マイクロプレートを傾けた状態で、T. gondiiが細胞に侵入する様子を位相差顕微鏡で横から観察した。その結果、寄生虫が細胞に侵入していく様子を動画で捉えることができた。いくつかの時点の像を図９に示す。これにより、寄生虫が宿主細胞に侵入していく角度、侵入の際の寄生虫の形態やタイムスケールが明らかになった。
従来の方法では、容器等に接着した細胞に寄生虫が侵入する方向と、観察の光軸とが同軸上にあったため、位相差顕微鏡で細胞に寄生虫が侵入する様子を観察することは不可能であり、寄生虫が宿主細胞に侵入していく角度やタイムスケールは、本発明によって確認されたまったく新しい知見である。本技術を、現在盛んに研究されているタンパク質の局在を可視化する細胞イメージング技術と組み合わせることにより、侵入に必要なタンパク質を細胞の侵入時に、いつ、どの場所で、どのタイミングで発現するかを確認することが可能となり、それらのワクチン候補となる薬剤の効能スクリーニングの一助として期待される。
【図１】
2015022042.tif 000003
【図２Ａ】
2015022042.tif 000004
【図２Ｂ】
2015022042.tif 000005
【図２Ｃ】
2015022042.tif 000006
【図３】
2015022042.tif 000007
【図４】
2015022042.tif 000008
【図５】
2015022042.tif 000009
【図６】
2015022042.tif 000010
【図７】
2015022042.tif 000011
【図８】
2015022042.tif 000012
【図９】
2015022042.tif 000013
【図１０】
2015022042.tif 000014