(57)【要約】【課題】ＩｇＥ媒介性疾患を治療するための新規組成物および方法に関する。【解決手段】本発明は、高親和性でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する免疫グロブリンに関し、該組成物は、膜アンカーＩｇＥを発現する細胞を阻害することができる、該免疫グロブリンを含む。このような組成物は、アレルギーおよび喘息を含む、ＩｇＥ媒介性疾患を治療するために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＥ＋  ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を阻害する方法であって、前記細胞を共結合分子と接触させることを含み、前記共結合分子は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合し、前記共結合分子は、前記細胞表面上でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに共結合する、方法。
【請求項２】
前記共結合分子は、ＩｇＥに特異性を有する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記共結合分子は、第１のＦｖ領域および第２のＦｖ領域を含む二重特異性抗体であり、前記第１のＦｖ領域はＩｇＥに結合し、第２のＦｖ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記共結合分子は、Ｆｃ領域を含むＦｃ融合物であり、前記Ｆｃ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩｇＥに特異性を有する共結合分子であって、前記共結合分子は、親ＦｃポリペプチドのＦｃ変異体を含み、前記Ｆｃ変異体は、前記親Ｆｃポリペプチドに対して強化されたＦｃγＲＩＩｂに対する結合親和性を有する、共結合分子。
【請求項７】
前記Ｆｃ変異体は、前記親Ｆｃポリペプチドと比較して、前記Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記修飾は、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６５、２６６、２６７、２６８、２９８、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、および３３２からなる群から選択され、番号付けは、ＥＵ指標に従う、請求項６に記載の共結合分子。
【請求項８】
前記修飾は、Ｌ２３５Ｙ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｗ、ならびにＬ３２８Ｙ  ２６７Ｄおよび２６７Ｅからなる群から選択される置換である、請求項６に記載の共結合分子。
【請求項９】
前記修飾は、２６７Ｄおよび２６７Ｅからなる群から選択される置換である、請求項８に記載の共結合分子。
【請求項１０】
３２８Ｆ、３２５Ｄ、３２５Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３９Ｅ、および２６６Ｍからなる群から選択される置換をさらに含み、番号付けは、ＥＵ指標に従う、請求項９に記載の共結合分子。  
【請求項１１】
可変領域およびＦｃ領域を含む抗体であって、前記可変領域は、膜アンカーＩｇＥに結合し、前記Ｆｃ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する、抗体。
【請求項１２】
前記可変領域ＶＨドメインは、配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２、および配列番号４のＣＤＲ３、または配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２、および配列番号２０のＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記可変領域ＶＬドメインは、配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２、および配列番号８のＣＤＲ３、または配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２、および配列番号２４のＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づき、２００８年９月１７日に出願された米国仮出願第６１／０９７，８１９号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用され、また「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＣＤ３２ｂ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」の表題で、２００８年５月３０日に出願されたＵＳＳＮ第１２／１５６，１８３号に関連し、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、高親和性でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する免疫グロブリンに関し、該組成物は、膜アンカーＩｇＥを発現する細胞を阻害することができる。このような組成物は、アレルギーおよび喘息を含む、ＩｇＥ媒介性疾患を治療するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギー等のアレルギー性疾患および状態は、過去数十年の間に非常に蔓延し、現在、先進工業諸国の人口の１０〜４０％が罹患している。アレルギー性疾患は、生活の質に著しく影響を及ぼし、喘息およびアナフィラキシーの重篤な症例で生じる場合がある、死亡を含む重篤な合併症をもたらし得る。アレルギーは蔓延しており、仕事や学校の時間損失の最大の原因であり、個人の生活に対するそれらの影響、ならびに医療システムおよび経済へのそれらの直接的および間接的費用は、莫大である。例えば、アレルギー性鼻炎（季節性鼻アレルギー）は、米国の人口の２２％以上が罹患し、一方アレルギー性喘息は、米国の少なくとも２０００万の居住者が罹患していると考えられている。米国におけるアレルギー性疾患の経済的影響は、医療費および生産性の損失を含み、９０年代初期だけで、６４億ドルに達すると推定されている。
【０００４】
大半のアレルギー性疾患は、免疫グロブリンＥ  （ＩｇＥ）媒介性の過敏症反応により生じる。ＩｇＥは、微量濃度で血清中に通常存在する、抗体のクラスである。これは、その成熟化の特定の段階で、その表面上に抗体を発現するＩｇＥ分泌形質細胞により生成される。アレルギー患者は、彼らが敏感である、通常は無害である抗原に対する結合特異性的を有する、上昇レベルのＩｇＥを生成する。これらのＩｇＥ分子は、血液中で循環し、循環中の好塩基球、ならびに粘膜裏層に沿った、および皮膚の下のマスト細胞の表面上のＩｇＥ特異的受容体に結合する。抗原またはアレルゲンのマスト細胞、好塩基球、および他の細胞型上のＩｇＥへの結合は、ＩｇＥ分子を架橋し、下にある受容体を凝集し、よって、細胞にヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ブラジキニン、および血小板活性化因子等の、血管作動性およびニューロン刺激性介在物質を放出させる。抗体免疫複合体に起因する免疫系の抗原への即時反応から、Ｔ細胞により媒介される遅延型または細胞媒介過敏症反応と対照的に、即時型または抗体媒介過敏反応という用語につながった。ＩｇＥ媒介性免疫反応は、特にＩ型過敏症反応と称される。
【０００５】
ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）に対する高親和性受容体は、即時アレルギー症状の重要な介在物質である。マスト細胞および好塩基球に加え、アレルギー性反応の主要介在物質であるＦｃεＲＩは、好酸球、血小板、ならびに単球および樹状細胞等の抗原提示細胞上を含む、いくつかの他の細胞型上に見出される。ＩｇＥのさらなる受容体は、ＦｃεＲＩＩであり、ＣＤ２３または低親和性ＩｇＥ  Ｆｃ受容体としても知られる。ＦｃεＲＩＩは、Ｂリンパ球、マクロファージ、血小板、および気道平滑筋等の、多くの他の細胞型上で広く発現する。ＦｃεＲＩＩは、ＩｇＥ発現および後続のＦｃεＲＩＩ表面発現のフィードバック制御に関与する可能性がある。
【０００６】
ＩｇＥは、大半のアレルギー性反応の媒介に中心的な役割を果たすため、体内のＩｇＥレベルを制御するための治療を考案し、ＩｇＥ合成を調節することには、多くの関心が持たれている。ＩｇＥレベルの下方制御によるＩｇＥ媒介性のアレルギー性疾患を治療するための、いくつかの対処法が提案されている。対処法の１つは、Ｆｃ受容体結合部位またはその近くでＩｇＥのε鎖を結合することによって、ＩｇＥ分子を中和することを含む。例えば、オマリズマブ（ゾレア）は、ＦｃεＲｌと同じＦｃ部位上でＩｇＥｎに結合する、組み換えヒト化モノクローナル抗ＩｇＥ抗体である。組織マスト細胞および好塩基球に結合し、感作する抗原特異的ＩｇＥの量を減弱するオマリズマブは、アトピー患者において、血清総ＩｇＥまたは循環ＩｇＥの減少をもたらす。これは、次いで、アレルギー性疾患の症状の軽減につながる。興味深いことに、血清ＩｇＥレベルは、オマリズマブ−ＩｇＥ複合体形成のため、治療開始後に増加し、治療停止後、最大１年の間、高いレベルを維持する場合がある。結果的に、この問題は、診断検査において偽陰性につながる場合があり、したがって、ＩｇＥレベルは日常的に確認されなければならない。したがって、ＩｇＥ媒介性疾病および疾病症状を低減させるための、改善された方法および組成物の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、高親和性でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する新規共結合分子、このような共結合分子を含む組成物、ならびにＩｇＥ媒介性疾患を治療するための該新規共結合分子の使用方法を提供する。本発明の共結合分子は、膜ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂ、すなわち、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を発現する細胞を阻害することができる。本発明の共結合分子は、好ましくは、循環ＩｇＥも結合することができる。本明細書に開示される阻害方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を、細胞表面上で、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂを共結合する共結合分子と接触させることを含む。
【０００８】
本明細書に開示される組成物は、細胞表面上で、高親和性でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂの共結合を可能にする共結合分子を含む。一実施形態において、共結合分子は、高親和性で、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する免疫グロブリンを含む。本発明の共結合分子は、好ましくは、細胞表面上で、膜アンカーＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに共結合し、好ましくは、約１００ｎＭ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩｂに結合する。好適な実施形態において、共結合分子は、免疫グロブリンであり、さらなる好適な実施形態において、免疫グロブリンは抗体であり、該抗体のＦｖ領域は、特異的にＩｇＥに結合する。好適な実施形態において、該抗体は、循環および膜アンカーＩｇＥの両方に結合する。代替的な実施形態において、該抗体は、循環ＩｇＥに対して膜アンカーＩｇＥに選択的に結合する。別の実施形態において、共結合分子は、第１の標的特異的領域および第２の標的特異的領域を有する二重特異的抗体であり、第１の標的特異的領域は、ＩｇＥに結合し、第２の標的特異的領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。好適な実施形態において、第１および第２の標的特異的領域は、Ｆｖ領域であり、第１のＦｖ領域は、ＩｇＥに結合し、第２のＦｖ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。別の実施形態において、共結合分子は、Ｆｃ領域を含むＦｃ融合物であり、該Ｆｃ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。この実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ融合パートナーは、ＩｇＥに結合する。
【０００９】
一実施形態において、共結合分子は、ＦｃγＲＩＩｂと結合し、該結合の親和性は、約１００ｎＭ未満、例えば、約９５ｎＭ以下、約９０ｎＭ以下、約８５ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約７４ｎＭ以下のＫｄを有する。
【００１０】
一実施形態において、高親和性でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂを共結合する共結合分子は、親免疫グロブリンに対して変異体免疫グロブリンを含む。一実施形態において、変異体免疫グロブリンは、変異体Ｆｃ領域を含み、該変異体Ｆｃ領域は、親Ｆｃ領域と比較して、１つ以上（例えば、２つ以上）の修飾を含み、該修飾は、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６５、２６６、２６７、２６８、２９８、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、および３３２からなる群から選択される位置であり、付番は、ＥＵ指標に従う。別の実施形態において、修飾は、ＥＵ指標に従う、２３４、２３５、２３６、２３７、２６６、２６７、２６８、３２７、３２８からなる群から選択される位置においてである。別の実施形態において、修飾は、ＥＵ指標に従う、２３５、２３６、２６６、２６７、２６８、３２８からなる群から選択される位置においてである。別の実施形態において、修飾は、ＥＵ指標に従う、２３５、２３６、２３９、２６６、２６７、２６８、および３２８からなる群から選択される位置においてである。別の実施形態において、修飾は、ＥＵ指標に従う、２３４、２３５、２３６、２３７、２６６、２６７、２６８、３２７、３２８からなる群から選択される位置においてである。
【００１１】
一実施形態において、該修飾は、２３４Ｆ、２３４Ｇ、２３４Ｉ、２３４Ｋ、２３４Ｎ、２３４Ｐ、２３４Ｑ、２３４Ｓ、２３４Ｖ、２３４Ｗ、２３４Ｙ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３５Ｈ、２３５Ｉ、２３５Ｎ、２３５Ｐ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｓ、２３５Ｗ、２３５Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｔ、２３６Ｄ、２３６Ｆ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｋ、２３６Ｌ、２３６Ｍ、２３６Ｐ、２３６Ｑ、２３６Ｒ、２３６Ｓ、２３６Ｔ、２３６Ｖ、２３６Ｗ、２３６Ｙ、２３６Ａ、２３６Ｅ、２３６Ｎ、２３７Ａ、２３７Ｅ、２３７Ｈ、２３７Ｋ、２３７Ｌ、２３７Ｐ、２３７Ｑ、２３７Ｓ、２３７Ｖ、２３７Ｙ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２６５Ｅ、２６６Ｄ、２６６Ｉ、２６６Ｍ、２６７Ａ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｇ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｎ、２６８Ｑ、２９８Ｄ、２９８Ｅ、２９８Ｌ、２９８Ｍ、２９８Ｑ、３２５Ｌ、３２６Ａ、３２６Ｅ、３２６Ｗ、３２６Ｄ、３２７Ｄ、３２７Ｇ、３２７Ｌ、３２７Ｎ、３２７Ｑ、３２７Ｅ、３２８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｙ、３２８Ｈ、３２８Ｉ、３２８Ｑ、３２８Ｗ、３２９Ｅ、３３０Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｋ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該修飾は、２３４Ｎ、２３４Ｆ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｔ、２３６Ｄ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｌ、２３６Ｓ、２３６Ｙ、２３６Ｅ、２３６Ｎ、２３７Ｈ、２３７Ｌ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｎ、２３９Ｅ、２６６Ｉ、２６６Ｍ、２６７Ａ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｇ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｎ、２６８Ｑ、２９８Ｅ、２９８Ｌ、２９８Ｍ、２９８Ｑ、３２５Ｌ、３２６Ａ、３２６Ｅ、３２６Ｗ、３２６Ｄ、３２７Ｄ、３２７Ｌ、３２７Ｅ、３２８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｙ、３２８Ｈ、３２８Ｉ、３２８Ｑ、３２８Ｗ、３３０Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｋ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該修飾は、２３４Ｄ、２３
４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該修飾は、２３４Ｅ、２３５Ｙ、２３５Ｒ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｎ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｄ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｙ、３２８Ｗからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該修飾は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該修飾は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｄ、３２８Ｆ、３２８Ｙ、および３２８Ｗからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。
【００１２】
一実施形態において、該修飾は、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆの組み合わせの置換の、少なくとも１つをもたらし、付番は、ＥＵ指標に従う。
【００１３】
一実施形態において、本明細書に開示される修飾は、親免疫グロブリンに対して、少なくとも１つの受容体に対する親和性を低減させ、該受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａからなる群から選択される。この実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリン変異体は、親免疫グロブリンに対してＡＤＣＣまたはＡＤＣＰの低減を媒介し得る。代替的な実施形態において、本明細書に開示される修飾は、親免疫グロブリンに対して、少なくとも１つの受容体に対する親和性を増加させ、該受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａからなる群から選択される。この実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリン変異体は、親免疫グロブリンに対してＡＤＣＣまたはＡＤＣＰの亢進を媒介することができる。
【００１４】
免疫グロブリン組成物を含む、新規共結合分子を操作するための方法も、本明細書に開示する。
【００１５】
本明細書に記載される免疫グロブリンを含む、共結合分子をコードする単離された核酸も、本明細書に開示する。随意に制御配列に操作可能に連結される核酸を含むベクターも、本明細書に開示する。ベクターを含有する宿主細胞、および共結合分子を産生し、随意に回収するための方法も、本明細書に開示する。
【００１６】
本明細書に開示される免疫グロブリンを含む共結合分子も、本明細書に開示する。  共結合分子は、治療製品に用途を見出し得る。一実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、抗体であってもよい。
【００１７】
本明細書に記載される共結合分子、および生理学的または薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物も開示する。
【００１８】
ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を阻害する方法も、本明細書に開示する。本明細書に記載される細胞を阻害する方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を共結合分子と接触させることを含み、該共結合分子は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。最も好適な実施形態において、該共結合分子は、細胞表面上で、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに共結合する。好適な実施形態において、阻害方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を抗体と接触させることを含み、該抗体は、そのＦｖ領域を介してＩｇＥに結合し、該抗体は、Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域は、１００ｎＭまたはそれ以下のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。他の実施形態において、該Ｆｃ領域は、自然ＩｇＧ１に対して高い親和性で、ＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩａに結合する。他の実施形態において、方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を共結合分子と接触させることを含み、該共結合分子は、第１のＦｖ領域および第２のＦｖ領域を含む二重特異性抗体であり、該第１のＦｖ領域はＩｇＥに結合し、該第２のＦｖ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。代替的な実施形態において、方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を共結合分子と接触させることを含み、該共結合分子は、Ｆｃ領域を含むＦｃ融合物であり、該Ｆｃ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。
【００１９】
他の好適な方法は、ＩｇＥ分泌を低下させる方法を含む。方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を共結合分子と接触させることを含み、該共結合分子は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する。
【００２０】
Ｂ細胞の成熟化を阻害する方法も含む。この方法は、ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を共結合分子と接触させることを含み、該共結合分子は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する。
【００２１】
本明細書に開示される共結合分子の治療および診断用途も、記載する。最も好適な実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、免疫グロブリンＩｇＥにより媒介される、１つ以上のＩｇＥ媒介性疾患、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患等を治療するために使用される。特定の実施形態において、本明細書に開示される組成物により治療され得る、アレルギー性およびアトピー性疾患は、アレルギー性およびアトピー性喘息、アトピー性皮膚炎および湿疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎および鼻結膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性脈管炎、アナフィラキシーショック、ならびに任意の種類の環境的もしくは食物アレルギーに対するアレルギーを含むが、これらに限定されない。本明細書に開示される治療方法は、このような投与を必要とする患者に、細胞の表面上で、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに共結合する、治療有効量の共結合分子を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋  Ｂ細胞を阻害するための新しい機構的アプローチの図説である。適切な刺激の下で、未変性Ｂ細胞は、ＩｇＥ＋Ｂ細胞に分化することができる。抗原のＩｇＥ  Ｂ細胞受容体との結合は、これらの細胞を活性化し、これは、後に、循環ＩｇＥを放出する形質細胞に分化することができる。例えば、マスト細胞、好塩基球、および好酸球上で、ＦｃεＲに結合する循環ＩｇＥの結合は、これらの細胞を活性化する。ヒスタミン、プロスタグランジン、および他の化学介在物質の放出は、最終的に、アレルギーおよび喘息の臨床症状をもたらす。自然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有するオマリズマブは、ＩｇＥのＦｃεＲへの結合を阻止することができる。図中で、抗ＩｇＥ−ＩＩｂＥとして参照される、ＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性を有する抗ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥのＦｃεＲへの結合を阻止するだけでなく、ｍＩｇＥ  ＦｃγＲＩＩｂ共結合によるＩｇＥ＋Ｂ細胞の活性化も阻害することができる。
【００２３】
【図２】Ｆｃ変異体抗ＣＤ１９抗体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴センサグラム。
【００２４】
【図３】Ｂｉａｃｏｒｅにより決定された、ヒトＦｃγＲに対するＦｃ変異体抗体の親和性。グラフは、変異体および野生型ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃγＲＩ（Ｉ）、Ｈ１３１  ＦｃγＲＩＩａ（Ｈ  ＩＩａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＩＩｂ）、およびＶ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ  ＩＩＩａ）への結合のログ（ＫＡ）を示す。Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７ＥおよびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆの、Ｖ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、検出できなかった。Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ（Ｆｃ−ＫＯ）の検査された全ての受容体への結合は、検出できなかった。
【００２５】
【図４】Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴により決定された、ヒトＦｃγＲに対するＦｃ変異体抗体の親和性。表は、変異体および野生型ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃγＲＩ、Ｈ１３１  ＦｃγＲＩＩａ  ＦｃγＲＩＩｂ、およびＶ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の平衡ＫＤ、ならびに自然（野生型）ＩｇＧ１に対するそれぞれの倍数結合を提供する。ｎ．ｄ．＝検出不可能。
【００２６】
【図５−１】抗ＩｇＥ抗体の、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列。ＣＤＲの境界は、抗体可変領域の構造的配列に基づき、以前に説明されたように定義された（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：１９８６−１９９８）。
【図５−２】抗ＩｇＥ抗体の、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列。ＣＤＲの境界は、抗体可変領域の構造的配列に基づき、以前に説明されたように定義された（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：１９８６−１９９８）。
【図５−３】抗ＩｇＥ抗体の、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列。ＣＤＲの境界は、抗体可変領域の構造的配列に基づき、以前に説明されたように定義された（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：１９８６−１９９８）。
【００２７】
【図６】重鎖および軽鎖の野生型ならびに変異体定常領域のアミノ酸配列。
【００２８】
【図７】ＩｇＥ＋Ｂ細胞を標的とするように使用され得る、抗ＩｇＥ完全長抗体のアミノ酸配列。
【００２９】
【図８】野生型および変異体ＩｇＥ抗体の、ＩｇＥ  Ｆｃ領域およびＦｃγＲＩＩｂへの結合の親和性データの表。
【００３０】
【図９】野生型および変異体抗ＩｇＥ抗体の、ＩｇＥ  Ｆｃ領域およびＦｃγＲＩＩｂへの結合の親和性データのプロット。
【００３１】
【図１０】捕獲試薬として市販の（ＭａｂＴｅｃｈ）および自社の（オマリズマブおよびＭａＥ１１）抗ＩｇＥ抗体を使用したＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ。
【００３２】
【図１１】抗ＩｇＥ抗体オマリズマブの可変領域は、ＥＬＩＳＡプロトコルのＩｇＥ検出において、ＭａｂＴｅｃｈ捕獲抗体と競合しない。
【００３３】
【図１２】ＦｃγＲＩＩｂ親和性に対して強化された変異体抗ＩｇＥ抗体を有する、クラス変換されたＩｇＥ＋Ｂ細胞は阻害するが、ＦｃγＲ結合（Ｆｃ変異体Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ）を欠損する、またはＩｇＥ（モタビズマブ）への結合を欠損する抗体は阻害しない。プロットは、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０（α−ＣＤ４０）アゴニスト抗体、および異なる濃度の示される抗体と共に１２日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＥの濃度を示す。
【００３４】
【図１３】変異体抗ＩｇＥ抗体は、クラス変換されたＩｇＧ２＋Ｂ細胞を阻害しない。プロットは、ＩＬ−４、α−ＣＤ４０、および異なる濃度の示される抗体と共に１２日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＧ２の濃度を示す。
【００３５】
【図１４】ＦｃγＲＩＩｂ親和性に対して強化された変異体抗ＩｇＥ抗体による、クラス変換されたＩｇＥ＋Ｂ細胞の阻害。プロットは、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０（α−ＣＤ４０）アゴニスト抗体、および異なる濃度の示される抗体と共に１４日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＥの濃度を示す。データは、抗体の最低濃度に対して正規化された。
【００３６】
【図１５】ＦｃγＲＩＩｂ親和性に対して強化された変異体抗ＩｇＥ抗体による、クラス変換されたＩｇＥ＋Ｂ細胞の阻害。プロットは、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０（α−ＣＤ４０）アゴニスト抗体、抗ＣＤ７９ｂ  ＢＣＲ架橋抗体、および異なる濃度の示される抗体と共に１４日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＥの濃度を示す。データは、抗体の最低濃度に対して正規化された。
【００３７】
【図１６】ＦｃγＲＩＩｂ親和性に対して強化された変異体抗ＩｇＥ抗体による、クラス変換されたＩｇＥ＋Ｂ細胞の阻害。プロットは、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０（α−ＣＤ４０）アゴニスト抗体、抗μＢＣＲ架橋抗体を、および異なる濃度の示される抗体と共に１４日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＥの濃度を示す。データは、抗体の最低濃度に対して正規化された。
【００３８】
【図１７】強化されたＡＤＣＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能の変異体抗ＩｇＥ抗体による、クラス変換されたＩｇＥ＋Ｂ細胞の阻害。プロットは、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０（α−ＣＤ４０）アゴニスト抗体、抗ＣＤ７９ｂ  ＢＣＲ架橋抗体、および異なる濃度の示される抗体と共に１４日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＥの濃度を示す。
【００３９】
【図１８】強化されたＡＤＣＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能の変異体抗ＩｇＥ抗体による、クラス変換されたＩｇＥ＋Ｂ細胞の阻害。プロットは、ＩＬ−４、抗ＣＤ４０（α−ＣＤ４０）アゴニスト抗体、抗μＢＣＲ架橋抗体、および異なる濃度の示される抗体と共に１４日間インキュベートした後の、ＰＢＭＣから放出されたＩｇＥの濃度を示す。
【００４０】
【図１９】抗ＩｇＥ抗体の活性を検査するためのｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ生体内試験のプロトコル。示される日は、Ｄｅｒ  ｐ１に特異的なＩｇＥ抗体に対して陽性の検査結果のドナーからのＰＢＭＣ移植後の日数を示す。Ｄｅｒｐ１  ｖａｃｃ．は、Ｄｅｒ  ｐ１抗原を用いたワクチン接種を示す。
【００４１】
【図２０】各治療群のｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ生体内モデルからの全血清ＩｇＧレベル。示される日（７、２３、および３７）は、図１９のプロトコルに概説される採血時点を示す。ＰＢＳは、未処置ビヒクル群を示し、オマリズマブは、オマリズマブ＿ＩｇＧ１で処置された群を示し、３  Ｈ１Ｌ１  ＭａＥ１１群は、野生型ＩｇＧ１（ＩｇＧ１）、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異体（ＩＩｂＥ）、またはＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ（Ｆｃ−ＫＯ）Ｆｃ領域のいずれかを含む、ヒト化ＭａＥ１１で処置された群を示す。
【００４２】
【図２１】各処置群のｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ生体内モデルからの全血清ＩｇＥレベル。示される日（７、２３、および３７）は、図１９のプロトコルに概説される採血時を示す。ＰＢＳは未処置ビヒクル群を示し、オマリズマブは、オマリズマブ＿ＩｇＧ１で処置された群を示し、３  Ｈ１Ｌ１  ＭａＥ１１群は、野生型ＩｇＧ１（ＩｇＧ１）、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異体（ＩＩｂＥ）、またはＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ（Ｆｃ−ＫＯ）Ｆｃ領域のいずれかを含む、ヒト化ＭａＥ１１で処置された群を示す。ＥＬＩＳＡ法の定量限界は、３１．６ｎｇ／ｍＬであり、この限界以下の試料は、プロットにおいて３１．６ｎｇ／ｍＬとして報告された。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
Ｂ細胞上での膜アンカーＩｇＥのＦｃγＲＩＩｂとの共結合の阻害作用を模倣する共結合分子を、本明細書で説明する。例えば、Ｆｃドメインが、最大約４３０倍を上回る親和性で、ＦｃγＲＩＩｂに結合するように操作された変異体抗ＩｇＥ抗体を、本明細書で説明する。自然ＩｇＧ１に対して、ＦｃγＲＩＩｂ結合強化された（ＩＩｂＥ）変異体は、一次ヒトＩｇＥ＋Ｂ細胞において、ＢＣＲ誘発カルシウム動員および生存率を強く阻害する。同族ＩｇＥ  ＢＣＲおよびＦｃγＲＩＩｂの共結合によるＢ細胞機能を抑制する抗体等の単一分子の使用は、ＩｇＥ媒介性疾病の治療において、新しいアプローチを表し得る。ＩｇＥ媒介性疾病の例としては、これらに限定されないが、アレルギー反応および喘息を含み、以下により詳細に説明される。
【００４４】
本開示に従う共結合分子は、以下により詳細に概説する種々の構成を呈し得る。一実施形態において、共結合分子は、高親和性でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する免疫グロブリンを含む。この実施形態において、免疫グロブリンは、好ましくは、細胞の表面上で、膜アンカーＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに共結合し、約１００ｎＭ未満のＫｄで結合する。別の実施形態において、共結合分子は、第１の標的特異的領域および第２の標的特異的領域を有する二重特異的分子であり、第１の標的特異的領域は、ＩｇＥに結合し、第２の標的特異的領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合するが、いくつかの実施形態においては、約１０ｎＭ未満のＫｄ、または約１ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合し得、いくつかの実施形態において、１００ｐＭ未満のＫｄで結合し得る。好適な実施形態において、共結合分子は、二重特異的抗体であり、第１および第２の標的特異的領域は、Ｆｖ領域であり、第１のＦｖ領域は、ＩｇＥに結合し、第２のＦｖ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。別の実施形態において、共結合分子は、Ｆｃ領域を含むＦｃ融合物であり、該Ｆｃ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。この実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ融合パートナーは、ＩｇＥに結合する。
【００４５】
いくつかの定義を本明細書で説明する。このような定義は、文法的上の同等語を包含するものとする。
【００４６】
本明細書に使用される、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性の細胞媒介性細胞障害性」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞の溶解を生じる、細胞媒介性反応を意味する。
【００４７】
本明細書に使用される、「ＡＤＣＰ」または「抗体依存性の細胞媒介性ファゴサイトーシス」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞のファゴサイトーシスを生じる、細胞媒介性反応を意味する。
【００４８】
本明細書における、「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書における、「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を意味する。例えば、置換Ｓ２６７Ｅは、変異体ポリペプチド、この場合、位置２６７のセリンが、グルタミン酸と置換される、定常重鎖変異体を指す。本明細書で使用される、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の追加を意味する。本明細書で使用される、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。
【００４９】
本明細書における、「抗体」とは、認識される免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部により実質的にコードされる、１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。例えば、ヒトにおいて、認識される免疫グロブリン遺伝子は、無数の可変領域遺伝子を一緒に構成する、カッパ（ｋ）、ラムダ（λ）、および重鎖遺伝子座、ならびにＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＥ、およびそれぞれＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）イソタイプをコードする、定常領域遺伝子ミュー（υ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）、およびアルファ（α）を含む。本明細書における抗体は、完全長抗体および抗体断片を含むものとし、任意の生物からの自然抗体、改変抗体、または実験、治療、もしくは他の目的のために組み換えにより生成された抗体を指し得る。
【００５０】
本明細書で使用される、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」とは、特定の定義された位置で存在し得る、２０の自然に生じるアミノ酸または任意の非自然類似体の１つを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される、「ＣＤ３２ｂ＋細胞」または「ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞」とは、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）を発現する任意の細胞または細胞型を意味する。ＣＤ３２ｂ＋細胞は、Ｂ細胞、形質細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、マスト細胞、好塩基球、または好酸球を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される、「ＩｇＥ＋細胞」とは、ＩｇＥを発現する任意の細胞または細胞型を意味する。本発明の好適な実施形態において、ＩｇＥ＋細胞は、膜アンカーＩｇＥ（ｍＩｇＥ）を発現する。ＩｇＥ＋細胞は、Ｂ細胞および形質細胞を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される、「ＣＤＣ」または「補体依存性細胞障害性」とは、１つ以上の補体タンパク質構成要素が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞の溶解を生じる、反応を意味する。
【００５４】
「共結合分子」または文法上の同等語は、分子のＦｃγＲＩＩｂへの結合のＫｄが、細胞表面上で約１００ｎＭ未満であり、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂの両方の同時結合をもたらす、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂの両方に結合することができる二機能性分子を意味する。
【００５５】
本明細書で定義される、「定常領域」とは、軽鎖または重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによりコードされる、抗体の領域を意味する。本明細書に使用される、「定常軽鎖」または「軽鎖定常領域」とは、カッパ（Ｃｋ）またはラムダ（Ｃλ）軽鎖によりコードされる抗体の領域を意味する。定常軽鎖は、典型的に、単一ドメインを含み、本明細書に定義されるように、ＣｋまたはＣλの位置１０８〜２１４を指し、付番は、ＥＵ指標に従う。本明細書に使用される、「定常重鎖」または「重鎖定常領域」とは、抗体のイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥとして定義する、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン遺伝子によりコードされる抗体の領域を意味する。完全長ＩｇＧ抗体において、本明細書に定義される、定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端〜ＣＨ３ドメインのＣ末端を指し、したがって、位置１１８〜４４７を含み、付番は、ＥＵ指標に従う。
【００５６】
本明細書で使用される、「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる、生化学事象を意味する。エフェクター機能は、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ等のＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、ならびにＣＤＣ等の補体媒介性エフェクター機能を含む。
【００５７】
本明細書で使用される、「エフェクター細胞」とは、１つ以上のＦｃおよび／または補体受容体を発現し、１つ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。  エフェクター細胞は、これらに限定されないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、天然キラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞を含み、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、任意の生物からであり得る。
【００５８】
本明細書で使用される、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＨ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単独でこの領域を指すか、または完全長抗体もしくは抗体断片と関連してこの領域を指してもよい。
【００５９】
本明細書で使用される、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン、およびいくつかの場合において、ヒンジの一部を除外する、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対する柔軟なヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭにおいて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでもよい。ＩｇＧにおいて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０〜そのカルボキシル末端までを含むように定義され、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う。Ｆｃは、単独でこの領域を指すか、または以下に記載される、Ｆｃポリペプチドと関連してこの領域を指してもよい。
【００６０】
本明細書で使用される、「Ｆｃポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合物、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。免疫グロブリンは、Ｆｃポリペプチドであってもよい。
【００６１】
本明細書で使用される「Ｆｃ融合物」とは、１つ以上のポリペプチドが、Ｆｃに操作可能に連結されるタンパク質を意味する。本明細書において、Ｆｃ融合物は、先行技術において使用される、「免疫アドヘシン」、「Ｉｇ融合」、「Ｉｇキメラ」、および「受容体グロブリン」（時折ダッシュを伴う）の用語の同義語であるものとする（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：５２−６０、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１９５−２００、共に、参照によりその全体が本明細書に援用される）。Ｆｃ融合物は、免疫グロブリンのＦｃ領域を、一般的に任意のタンパク質、ポリペプチド、または小分子であり得る融合パートナーと結合する。Ｆｃ融合物の非Ｆｃ部分、すなわち、融合パートナーの役割は、標的結合を媒介することであり、したがって、抗体の可変領域に機能的に類似している。実質的に、いかなるタンパク質または小分子も、Ｆｃに連結され、Ｆｃ融合物を生成し得る。タンパク質融合パートナーは、これらに限定されないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、もしくはいくつかの他のタンパク質、またはタンパク質ドメインを含み得る。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合物を治療標的に誘導する、任意の治療薬を含み得る。このような標的は、任意の分子、例えば、疾病に関与する細胞外受容体であってもよい。
【００６２】
本明細書で使用される、「Ｆｃガンマ受容体」または「ＦｃγＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域を結合し、ＦｃγＲ遺伝子により実質的にコードされるタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーは、これらに限定されないが、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、イソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５、参照によりその全体が援用される）、ならびに任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型もしくはアロタイプを含む。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物からであり得る。マウスＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲイソ型もしくはアロタイプを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用される、「Ｆｃリガンド」または「Ｆｃ受容体」とは、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃリガンド複合体を形成する、任意の生物からの分子、例えば、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌タンパク質Ａ、連鎖球菌タンパク質Ｇ、およびウイルス性ＦｃγＲを含むが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲと相同であるＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も含む（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃを結合する未発見の分子を含んでもよい。
【００６４】
本明細書で使用される、「完全長抗体」とは、可変領域および定常領域を含む、抗体の自然な生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒトおよびマウスを含む大半の哺乳類において、ＩｇＧイソタイプの完全長抗体は、四量体であり、同一の２対の２つの免疫グロブリン鎖からなり、各対は、軽鎖１本と重鎖１本を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ３を含む。例えば、ラクダおよびラマ等の、いくつかの哺乳類において、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなり得、各重鎖は、Ｆｃ領域に結合する可変ドメインを含む。
【００６５】
本明細書において、「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる、１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。免疫グロブリンは、これらに限定されないが、抗体（二重特異的抗体）およびＦｃ融合物を含む。免疫グロブリンは、これらに限定されないが、完全長抗体、抗体断片、および個別の免疫グロブリンドメインを含む、いくつかの構造形態を有し得る。
【００６６】
本明細書で使用される、「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、タンパク質構造の分野の当業者によって確認される、別々の構造実体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは、典型的に、特有のβサンドウィッチ折り畳みトポロジーを有する。抗体のＩｇＧイソタイプにおける既知のＩｇドメインは、ＶＨ  Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、およびＣＬである。
【００６７】
本明細書で使用される、「ＩｇＧ」、もしくは「ＩｇＧ免疫グロブリン」、もしくは「免疫グロブリンＧ」とは、認識される免疫グロブリンγ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属する、ポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、このクラスは、サブクラスまたはイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。
【００６８】
本明細書で使用される、「ＩｇＥ」、もしくは「ＩｇＥ免疫グロブリン」、もしくは「免疫グロブリンＥ」とは、認識される免疫グロブリンε遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属する、ポリペプチドを意味する。ＩｇＥは、膜アンカー（ｍＩｇＥ）、または非膜アンカーであってもよく、本明細書において、循環ＩｇＥとも称される。
【００６９】
細胞の「阻害」またはその文法上の同等語は、標的細胞の活性化、増殖、成熟化、または分化の防止、または低減を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される、「イソタイプ」とは、それらの定常領域の化学的および抗原特性により定義される、免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。
【００７１】
本明細書において、「修飾」とは、タンパク質、ポリペプチド、抗体、または免疫グロブリンの物理的、化学的、または配列特性の変更を意味する。本明細書に記載される修飾は、アミノ酸修飾およびグリコフォーム修飾を含む。
【００７２】
本明細書で使用される、「グリコフォーム修飾」、もしくは「修飾されたグリコフォーム」、もしくは「操作されたグリコフォーム」とは、タンパク質、例えば、抗体に共有結合的に結合される糖組成物を意味し、該糖組成物は、親タンパク質と化学的に異なる。修飾されたグリコフォームは、典型的に、異なる糖またはオリゴ糖を指し、したがって、例えば、Ｆｃ変異体は、修飾されたグリコフォームを含み得る。代替的に、修飾されたグリコフォームは、異なる糖またはオリゴ糖を含むＦｃ変異体を指す場合がある。
【００７３】
本明細書で使用される、「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「親免疫グロブリン」「前駆体ポリペプチド」、「前駆体タンパク質」、または「前駆体免疫グロブリン」とは、本明細書に記載される、少なくとも１つのアミノ酸修飾のテンプレートおよび／または基礎として機能する変異体、例えば、任意のポリペプチド、タンパク質、または免疫グロブリンを生成するように後に修飾される、無修飾のポリペプチド、タンパク質、または免疫グロブリンを意味する。親ポリペプチドは、自然に生じるポリペプチドか、または自然に生じるポリペプチドの変異体もしくは操作された変型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。したがって、本明細書で使用される、「親Ｆｃポリペプチド」とは、変異体Ｆｃポリペプチドを生成するように修飾されるＦｃポリペプチドを意味し、本明細書で使用される、「親抗体」とは、変異体抗体を生成するように修飾される抗体を意味する（例えば、親抗体は、限定されないが、自然に生じるＩｇの定常領域を含むタンパク質を含み得る）。
【００７４】
本明細書で使用される、「位置」とは、タンパク質の配列における位置を意味する。位置は、順に番号付けされるか、確立された形式、例えば、Ｋａｂａｔに記載される、ＥＵ指標に従ってもよい。例えば、位置２９７は、ヒト抗体ＩｇＧ１での位置である。  
【００７５】
本明細書で使用される、「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つが共有結合的に結合されたアミノ酸を意味する。
【００７６】
本明細書で使用される、「残基」とは、タンパク質およびその関連するアミノ酸の同一性での位置を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７とも称され、Ｎ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１での残基である。
【００７７】
本明細書で使用される、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域により結合される分子、またはＦｃ融合物の融合パートナーを意味する。標的抗原は、タンパク質、糖、脂質、または他の化学化合物であってもよい。抗体またはＦｃ融合物は、標的抗原に対して親和性を有することに基づいて、所与の標的抗原に「特異的」であると言われる。
【００７８】
本明細書で使用される、「標的細胞」とは、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００７９】
本明細書で使用される、「可変領域」とは、それぞれ、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成する、Ｖｋ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかにより実質的にコードされる、１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
【００８０】
本明細書で使用される、「変異体ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」、または「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親ポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を意味する。親ポリペプチドは、自然に生じる、もしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであるか、または野生型ポリペプチドの修飾された変型であってもよい。  変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される変異体ポリペプチド（例えば、変異体免疫グロブリン）は、親ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して、約１〜１０のアミノ酸修飾、約１〜５のアミノ酸修飾等を有してもよい。本明細書において、変異体ポリペプチド配列は、親ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の相同性、例えば、少なくとも約９０％の相同性、９５％の相同性等を有し得る。したがって、本明細書で使用される、「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親Ｆｃ配列と異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃ領域のみを包含するか、または抗体、Ｆｃ融合物、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、またはＦｃにより実質的にコードされる他のポリペプチドと関連して存在してもよい。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。本明細書で使用される、「Ｆｃポリペプチド変異体」または「変異体Ｆｃポリペプチド」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親Ｆｃポリペプチドと異なるＦｃポリペプチドを意味する。本明細書で使用される、「タンパク質変異体」または「変異体タンパク質」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。本明細書で使用される、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親抗体と異なる抗体を意味する。本明細書で使用される、「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親ＩｇＧと異なる抗体を意味する。本明細書で使用される、「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修
飾によって、親免疫グロブリン配列と異なる免疫グロブリン配列を意味する。
【００８１】
本明細書において、「野生型」または「ＷＴ」とは、対立遺伝子変型を含む、自然界に認められるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。野生型タンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧ等は、意図的に修飾されていない、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００８２】
共結合分子
【００８３】
本明細書に記載される、共結合分子は、細胞の表面上で、ＦｃγＲＩＩｂおよびＩｇＥに結合することができる二機能性分子である。これらの分子は、本明細書により詳細に概説する、種々の構成を呈し得る。好ましくは、共結合分子は、必ずしも要求されないが、タンパク質性である。いくつかの実施形態において、共結合分子は、ＦｃγＲＩＩｂおよび／またはＩｇＥに対する特異性が、例えば、小分子、核酸、および／またはポリペプチドによって与えられる二機能性分子であり得る。好ましくは、共結合分子は、約１００ｎＭ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩｂ結合する。好適な実施形態において、共結合分子は、高親和性で、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに結合する免疫グロブリンを含む。この実施形態において、免疫グロブリンは、好ましくは、細胞の表面上で、膜アンカーＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに共結合する。別の実施形態において、共結合分子は、第１の標的特異的領域および第２の標的特異的領域を有する二重特異的分子であり、第１の標的特異的領域は、ＩｇＥに結合し、第２の標的特異的領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩｂに結合する。好適な実施形態において、共結合分子は、二重特異的抗体であり、第１および第２の標的特異的領域は、Ｆｖ領域であり、第１のＦｖ領域は、ＩｇＥに結合し、第２のＦｖ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄでＦｃγＲＩＩｂに結合する。別の実施形態において、共結合分子は、Ｆｃ領域を含むＦｃ融合物であり、該Ｆｃ領域は、約１００ｎＭ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩｂに結合する。この実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ融合パートナーは、ＩｇＥに結合する。
【００８４】
一実施形態において、共結合分子は、第１の領域が、ＩｇＥに結合し、第２の領域が、約１００ｎＭ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩｂに結合する、二機能性分子である。実質的に、任意のタンパク質、小分子または核酸、例えば、アプタマーは、二機能性結合分子を生成するように連結され、本明細書に概説されるリンカーを含んでもよい。好適な実施形態において、タンパク質融合パートナーは、これらに限定されないが、抗体の可変領域、受容体、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、もしくはいくつかの他のタンパク質の標的結合領域、またはタンパク質ドメインを含んでもよい。小分子融合パートナーは、共結合分子をＩｇＥ等の標的抗原に誘導する、任意の薬剤を含み得る。例えば、好適な実施形態において、共結合分子は、融合パートナーとして、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３を含んでもよい。好適な実施形態において、免疫グロブリンは、共結合分子としての用途を見出す。
【００８５】
免疫グロブリン
【００８６】
本明細書に記載される、免疫グロブリンは、共結合分子の好適な構成要素であり、抗体、Ｆｃ融合物、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、またはＦｃポリペプチドであってもよい。一実施形態において、免疫グロブリンは、抗体である。以下により詳細に概説するように、免疫グロブリンは、Ｆｖ領域が、ＩｇＥに結合し、Ｆｃ領域が、約１００ｎＭ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩｂに結合する、二機能性分子としての用途を見出す。加えて、抗体は、以下に概説するように、Ｆｃ融合物または二機能性抗体における用途を見出す。
【００８７】
抗体は、特定の抗原に結合する免疫タンパク質である。ヒトおよびマウスを含む大半の哺乳類において、抗体は、対のポリペプチド重鎖および軽鎖から構成される。軽鎖および重鎖可変領域は、抗体間で大幅な配列の多様性を示し、標的抗原の結合に関与する。各鎖は、個別の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインで構成され、したがって、一般的な用語の免疫グロブリンは
が、このようなタンパク質に使用される。
【００８８】
従来の抗体の構造単位は、典型的に、四量体を含む。各四量体は、典型的に、同一の２対のポリペプチド鎖から成り、各対は、「軽鎖」（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する）１本と、「重鎖」（典型的に、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）１本とを有する。ヒトの軽鎖は、κおよびλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソタイプを定義する。ＩｇＧは、これらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、これらに限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、これらに限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む、いくつかのサブクラスを有する。したがって、本明細書で使用される、「イソタイプ」とは、それらの定常領域の化学的および抗原特性により定義される、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。
【００８９】
軽鎖および重鎖のそれぞれは、可変領域および定常領域と称される、２つの個別の領域から構成される。ＩｇＧ重鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順に、ＮからＣ末端まで連結される４つの免疫グロブリンドメインから成り、それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、および重鎖定常ドメイン３を指す（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３とも称され、それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常γ１ドメイン、定常γ２ドメイン、および定常γ３ドメインを指す）。ＩｇＧ軽鎖は、ＶＬ−ＣＬの順に、ＮからＣ末端まで連結される２つの免疫グロブリンドメインから成り、それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを指す。定常領域は、配列の多様性が低く、重要な生化学事象を顕在化するいくつかの自然タンパク質の結合に関与する。微妙な相違が、可変領域に存在する場合があるが、これらの抗体クラス間の際立った特徴は、それらの定常領域である。
【００９０】
抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定因子を含有し、したがって、その標的抗原に対する抗原の特異性を決定する。可変領域は、同一クラス内の他の抗体と配列が最も異なるため、そう呼ばれる。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸を含む。可変領域において、３つのループが、重鎖および軽鎖のＶドメインのそれぞれに集められ、抗原結合部を形成する。それぞれのループは、アミノ酸配列の差異が最も大きい、相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」とする）と称される。重鎖および軽鎖にそれぞれ３つずつの、全部で６つのＣＤＲが存在し、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３と称される。ＣＤＲの外側の可変領域は、フレームワーク（ＦＲ）領域と称される。ＣＤＲほど多様ではないが、配列の可変性が、異なる抗体間のＦＲ領域も生じる。全体的に、抗体のこの特徴的な構造は、多大な抗原結合多様性（ＣＤＲ）が、抗原の広範囲なアレイに対して特異性を得るように、免疫系により探索され得る、安定した足場（ＦＲ領域）を提供する。多くの高解析の構造は、抗原と非結合のものもあれば、抗原と複合するものもある、異なる生物からの種々の可変領域の断片に対して利用可能である。抗体の可変領域の配列および構造上の特徴は、例えば、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ６８：９−１６；  Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：２６７−２７９に開示されており、参照によりその全体が本明細書に援用され、抗体の保存された特徴は、例えば、Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ２：３３９−３７６に開示されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００９１】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義する。免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書において、「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本明細書に記載される実施形態の関心対象は、定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジ領域を含む、重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体と関連して、ＩｇＧイソタイプは、それぞれ、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧと関連して、「ＣＨ」ドメインとは、以下の通りである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従い、位置１１８〜２２０を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従い、位置２３７〜３４０を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従い、位置３４１〜４４７を指す。
【００９２】
重鎖の別の重要な領域は、ヒンジ領域である。本明細書において、「ヒンジ」、もしくは「ヒンジ領域」、もしくは「抗体ヒンジ領域」、もしくは「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１と第２の定常ドメインの間にアミノ酸を含む、柔軟なポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵの位置２２０で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵの位置２３７で始まる。したがって、ＩｇＧにおいて、抗体ヒンジは、本明細書において、位置２２１（ＩｇＧ１でＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１でＧ２３６）を含むように定義され、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う。いくつかの実施形態において、例えば、Ｆｃ領域と関連して、一般的に、「下方ヒンジ」が、位置２２６または２３０から２３６を指す、下方ヒンジが含まれる。
【００９３】
本明細書に記載される実施形態の関心対象は、Ｆｃ領域である。本明細書で使用される、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン、およびいくつかの場合において、ヒンジの一部を除外する抗体の定常領域を含む、ポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対する柔軟なヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭにいて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧにおいて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間の下方ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０〜そのカルボキシル末端までを含むように定義され、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う。Ｆｃは、単独でこの領域を指すか、または以下に記載される、Ｆｃポリペプチドと関連してこの領域を指してもよい。本明細書で使用される、「Ｆｃポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合物、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００９４】
抗体のＦｃ領域は、いくつかのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される、数々の重要な機能的能力を付与する。Ｆｃ領域のＩｇＧにおいて、ＦｃはＩｇドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ２に通じるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞アームとの間の連通を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０、Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、イソ型ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、イソ型ＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにイソ型ＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナル伝達事象を媒介してもよい細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、天然キラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞を含む、種々の免疫細胞で発現しもよい。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の編成は、これらのエフェクター細胞を結合抗原の部位に動員し、典型的に、細胞内のシグナル伝達事象、ならびに炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞の活性、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスおよび細胞障害性攻撃等の、その後の重要な免疫反応をもたらす。細胞障害性および食細胞性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊す
る潜在的機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞の溶解を生じる細胞媒介性反応は、抗体依存性の細胞媒介性細胞障害性（ＡＤＣＣ）と称される（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６；  Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞のファゴトーシスを生じる、細胞媒介性反応は、抗体依存性の細胞媒介性ファゴトーシス（ＡＤＣＰ）と称される。
【００９５】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりこの受容体に実質的に良く結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＦｃγＲは、異なる親和性で、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％が同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けされる、免疫複合体により引き起こされる活性の正の調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容抑制チロシンモチーフを有し、したがって、阻害性である。したがって、前者は、活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは、抑制受容体と呼ばれる。親和性および活性化におけるこれらの相違にも関わらず、全てのＦｃγＲは、Ｃγ２ドメインのＮ末端および前述のヒンジで、Ｆｃ上の同じ領域に結合する。この相互作用は、構造的に良く特徴付けされ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：７３７−７４９、参照によりその全体が本明細書に援用される）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合されるヒトＦｃのいくつかの構造が、解明されている（ｐｄｂ登録コード１Ｅ４Ｋ）  （Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７−２７３、参照によりその全体が本明細書に援用される）（ｐｄｂ登録コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１６４６９−１６４７７、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００９６】
重複しているが、別個であるＦｃ上の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑの接触面として機能する。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合が、ＡＤＣＣを媒介する同じ方式で、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃγ２とＣγ３ドメインとの間のＦｃ上の部位は、エンドソームから形質膜陥入された抗体を血流に再循環させる結合である、新生受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。この過程は、大型の完全長分子による腎臓濾過の防止と共に、１〜３週間にわたる好適な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、抗体輸送において主要な役割も果たす。Ｆｃ上でのＦｃＲｎの結合部位は、細菌タンパク質ＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質の密着結合は、典型的に、タンパク質の精製中に、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇの親和性クロマトグラフィーを利用することにより、抗体を精製する手段として活用される。これらの領域の再現性、補体、およびＦｃＲｎ／タンパク質Ａ結合領域は、抗体の臨床特性およびそれらの発達の両方に重要である。
【００９７】
Ｆｃ領域の主な特徴は、Ｎ２９７で生じる、保存されたＮ結合グリコシル化である。場合によってオリゴ糖と称されるこの糖は、抗体にとって重要な構造的かつ機能的役割を担い、抗体が哺乳類発現系を使用して生成されなければならない、主な理由の１つである。ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合は、この修飾を必要とし、Ｎ２９７糖の組成物における変更、またはその消失は、これらのタンパク質への結合に影響を及ぼす（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：４５５３９−４５５４７．、Ｒａｄａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１６４７８−１６４８３、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１−６６０４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３：１３３−１４７、全て、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００９８】
本明細書に記載される実施形態の免疫グロブリンは、Ｆｃ融合物とも称される抗体様タンパク質であってもよい（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：５２−６０、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１９５−２００、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。本明細書において、「Ｆｃ融合物」とは、先行技術において使用される、「免疫アドヘシン」、「Ｉｇ融合」、「Ｉｇキメラ」、および「受容体グロブリン」（時折ダッシュを伴う）の用語の同義語であるものとする（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：５２−６０；  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１９５−２００）。Ｆｃ融合物は、本明細書で「融合パートナー」として称される、１つ以上のポリペプチドが、Ｆｃに操作可能に連結されるタンパク質である。Ｆｃ融合物は、抗体のＦｃ領域、したがって、その好適なエフェクター機能および薬物動態を受容体、リガンド、もしくはいくつかの他のタンパク質の標的結合領域、またはタンパク質ドメインと結合させる。後者の役割は、標的認識を媒介することであり、したがって、抗体の可変領域にと機能的に類似している。Ｆｃ融合物の抗体との構造的および機能的重複のため、本開示の抗体の論議は、Ｆｃ融合物にも拡大される。
【００９９】
実質的に、いかなるタンパク質または小分子も、Ｆｃに連結され、Ｆｃ融合物を生成し得る。タンパク質融合パートナーは、これらに限定されないが、任意の抗体の可変領域、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、もしくはいくつかの他のタンパク質、またはタンパク質ドメインを含み得る。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合物を標的抗原に誘導する、任意の薬剤を含み得る。このような標的抗原は、疾病に関与する、例えば、細胞外受容体等の任意の分子であってもよい。本明細書に記載される実施形態のＦｃ融合物は、好ましくは、ＩｇＥに対して特異性を有する。例えば、好適な実施形態において、本発明のＦｃ融合物は、融合パートナーとして、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３を含んでもよい。本発明のＦｃ融合物は、好ましくは、ＦｃγＲＩＩｂに対して親和性を強化するＦｃ領域に、１つ以上の変異体を含む。
【０１００】
融合パートナーは、ＮもしくはＣ末端、または末端間のある残基を含む、Ｆｃ領域の任意の領域に連結されてもよい。一実施形態において、融合パートナーは、Ｆｃ領域のＮまたはＣ末端で連結される。種々のリンカーは、融合パートナーにＦｃ領域を共有結合的に連結するように、本明細書に記載されるいくつかの実施形態に用途を見出し得る。本明細書において、「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「係留配列」、またはそれらの文法上の同等語は、２つの分子を結合し、多くの場合、２つの分子を構造に配置する働きをする分子、または分子群（単量体または重合体等）を意味する。リンカーは、当該分野に公知であり、例えば、ホモまたはヘテロ二機能性リンカーが、周知である（参照によりその全体が援用される、１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，ｐａｇｅｓ  １５５−２００を参照のこと）。いくつかの対処法は、分子を共有結合的に一緒に連結するように使用され得る。これらは、これらに限定されないが、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮとＣ末端の間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介した連結、および化学的架橋試薬を介した連結を含む。この実施形態の一態様において、リンカーは、組み換え技術またはペプチド合成により生成される、ペプチド結合である。リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主として得る：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒ。リンカーペプチドは、所望の活性を維持するように、相互に対して適切な高次構造を成すような方式で、２つの分子を連結するのに適当な長さを有するべきである。この目的に適切な長さは、少なくとも１つの、かつ５０を超えないアミノ酸残基を含む。一実施形態において、リンカーは、長さが約１〜３０のアミノ酸である。一実施形態において、長さが１〜２０のアミノ酸のｈリンカーが使用されてもよい。有用なリンカーは、当業者に理解されるように、グリシン−セリン重合体（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１として記述）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２として記述）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３として記述）を含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、および他の
柔軟なリンカーを含む。代替的に、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体を含む、種々の非タンパク質性重合体は、リンカーとしての用途を見出し得る、つまり、Ｆｃ領域を融合パートナーに連結するように用途を見出し得る。
【０１０１】
融合パートナーとして、Ｆｃポリペプチドも企図される。したがって、本明細書に記載される免疫グロブリンは、２つ以上のＦｃ領域を含む、多量体Ｆｃポリペプチドであってもよい。このような分子の利点は、単一タンパク質分子で、Ｆｃ受容体に複数の結合部位を提供することである。一実施形態において、Ｆｃ領域は、化学工学的アプローチを使用して連結されてもよい。例えば、Ｆａｂ’およびＦｃ’は、ヒンジのシステイン残基に由来するチオエーテル結合により連結され、ＦａｂＦｃ２等の分子を生成してもよい。Ｆｃ領域は、ジスルフィド操作および／または化学的架橋を使用して連結されてもよい。一実施形態において、Ｆｃ領域は、遺伝学的に連結されてもよい。一実施形態において、免疫グロブリンにおけるＦｃ領域は、参照によりその全体が援用される、「Ｆｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  Ｆｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ」の表題で、２００４年１２月２１日に出願されたＵＳＳＮ第１１／０２２，２８９号に記載される、生成され、直列に連結されたＦｃ領域に遺伝学的に連結される。直列に連結されたＦｃポリペプチドは、２つ以上のＦｃ領域、例えば、１〜３つのＦｃ領域、２つのＦｃ領域を含んでもよい。最も好適な構造的および機能的特性で、ホモまたはヘテロ直列に連結されたＦｃ領域を得るために、多くの操作構造体を研究することは、有利である場合がある。直列に連結されたＦｃ領域は、ホモ直列に連結されたＦｃ領域であってもよい、つまり、１つのイソタイプのＦｃ領域は、同じイソタイプの別のＦｃ領域に遺伝学的に融合されてもよい。直列に連結されたＦｃポリペプチド上に複数のＦｃγＲ、Ｃ１ｑ、および／またはＦｃＲｎ結合部位が存在するため、エフェクター機能および／または薬物動態が強化され得ることが予期される。代替の実施形態において、異なるイソタイプからのＦｃ領域が、直列に連結されてもよく、ヘテロ直列に連結されたＦｃ領域と称される。例えば、ＦｃγＲおよびＦｃαＲＩ受容体を標的とする能力のため、ＦｃγＲおよびＦｃαＲＩの両方に結合する免疫グロブリンは、臨床の改善を提供し得る。
【０１０２】
本明細書に開示される実施形態の免疫グロブリンは、抗体クラスのいずれかに属する、免疫グロブリン遺伝子によっても実質的にコードされてもよい。特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＧクラスに属する配列を含む、抗体またはＦｃ融合物に用途を見出す。  図１は、これらのヒトＩｇＧ配列の整列を提供する。代替の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、抗体のＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する配列を含む、抗体またはＦｃ融合物に用途を見出す。本明細書に開示される免疫グロブリンは、１本以上のタンパク質鎖を含んでもよく、例えば、ホモまたはヘテロオリゴマーを含む単量体もしくはオリゴマーである、抗体またはＦｃ融合物であってもよい。
【０１０３】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意の生物、例えば、哺乳類（これらに限定されないが、ヒト、ゲッ齒類（これらに限定されないが、マウスおよびラットを含む）、ウサギ目（これらに限定されないが、ウサギおよびノウサギを含む）、ラクダ科（これらに限定されないが、ラクダ、ラマ、およびヒトコブラクダを含む）、ならびにこれらに限定されないが、原猿、広鼻猿類（新世界ザル）、オナガザル上科（旧世界ザル）、およびテナガザル、小型および大型類人猿を含むヒト上科を含むヒト以外の霊長類からの遺伝子により実質的にコードされてもよい。特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、実質的にヒトであってもよい。
【０１０４】
当該分野に周知のように、免疫グロブリン多型が、ヒト集団に存在する。Ｇｍ多型は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３分子のマーカーのＧ１ｍ、Ｇ２ｍ、およびＧ３ｍアロタイプと称される、アロタイプ抗原決定基をコードする対立遺伝子を有する、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ３遺伝子により決定される（γ４鎖上で、Ｇｍアロタイプは発見されていない）。マーカーは、「アロタイプ」と「イソアロタイプ」とに分類され得る。これらは、イソタイプ間の強い配列の相同性に応じて、異なる血清学的根拠により区別される。アロタイプは、Ｉｇ遺伝子の対立遺伝子型により特定される抗原決定基である。アロタイプは、異なる個別の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のわずかな相違を表す。たった１つのアミノ酸の相違でさえ、アロタイプ決定基を引き起こすことができるが、多くの場合、いくつかのアミノ酸置換が生じている。アロタイプは、抗血清が対立遺伝子の相違のみを認識する、サブクラスの対立遺伝子間の配列相違である。イソアロタイプは、１つ以上の他のイソタイプの非多型相同領域と共有されるエピトープを生成する一イソタイプにおける対立遺伝子であり、このため、抗血清は、関連するアロタイプと関連する相同イソタイプの両方と反応する（Ｃｌａｒｋ，１９９７，ＩｇＧ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｃｈｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：８８−１１０、Ｇｏｒｍａｎ  ＆  Ｃｌａｒｋ，１９９０，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２（６）：４５７−６６、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１０５】
ヒト免疫グロブリンの対立遺伝子型は、明確に特徴付けされている（ＷＨＯ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  １９７６，３：３５７−３６２、ＷＨＯ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５９９−６０１、Ｌｏｇｈｅｍ  Ｅ  ｖａｎ，１９８６，Ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ，Ｍｏｎｏｇｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  １９：４０−５１、全てが、参照によりその全体が本明細書に援用される）。加えて、他の多型も特徴付けされている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５４：１−９、参照によりその全体が本明細書に援用される）。  現在、１８のＧｍアロタイプが知られている：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）もしくはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）もしくはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）もしくはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．４３−７８（１９９０）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．：５０，１９９−２１１、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。固定された組み合わせで受け継がれるアロタイプは、Ｇｍハプロタイプと呼ばれる。本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意の免疫グロブリン遺伝子の任意のアロタイプ、イソアロタイプ、またはハプロタイプにより実質的にコードされ得る。
【０１０６】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、これらに限定されないが、抗体、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、およびＦｃ融合物を含む、Ｆｃポリペプチドを構成してもよい。一実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、可変領域および定常領域を含む、抗体の自然な生物学的形態を構成する完全長抗体である。ＩｇＧイソタイプにおいて、完全長抗体は、四量体であり、同一の２対の２本の免疫グロブリン鎖からなり、各対は、軽鎖１本と、重鎖１本を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ３を含む。別の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、単離されたＦｃ領域またはＦｃ断片である。
【０１０７】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、これらに限定されないが、それぞれ、抗体断片、二重特異的抗体、ミニ抗体、ドメイン抗体、合成抗体（時折、本明細書において、「抗体模倣物」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合（時折、「抗体結合体」と称される）、およびそれぞれの断片を含む、種々の構造であってもよい。
【０１０８】
一実施形態において、抗体は、抗体断片である。  特定の抗体断片は、これらに限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一変数からなるｄＡｂ断片、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）２つのドメインを結合して、抗原結合部位の形成を可能にするペプチドリンカーにより、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結される、単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単一鎖Ｆｖ二量体、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築される多価または多特異性断片である、「二重特異性抗体」もしくは「三重特異性抗体」を含む。抗体断片は、修飾されてもよい。例えば、分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結する、ジスルフィド橋の組み込みにより安定化され得る。抗体の形式および構造の例は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１２６−１１３６およびＣａｒｔｅｒ  ２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：３４３−３５７ならびにそこに引用される参考文献に記載されており、参照により全てが明示的に援用される。
【０１０９】
一実施形態において、本明細書に開示される抗体は、多特異性抗体、および特に二重特異性抗体であってもよく、時折、「二重特異性抗体」と称される。これらは、２つ（以上）の異なる抗原に結合する抗体である。二重特異性抗体は、例えば、化学的に、またはハイブリッドハイブリドーマから調製される等の、当該分野に公知の種々の方式で製造され得る。一実施形態において、抗体はミニ抗体である。ミニ抗体は、ＣＨ３ドメインに連結されるｓｃＦｖを含む、最小化された抗体様タンパク質である。いくつかの場合において、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に結合され得、一部または全てのヒンジ領域を含み得る。多特異性抗体の説明においては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１２６−１１３６、ならびにそこに引用される参考文献を参照し、参照により全てが明示的に援用される。
【０１１０】
非ヒト、キメラ、ヒト化、および完全なヒト抗体
【０１１１】
当該分野に周知のように、抗体の可変領域は、種々の種属から配列を構成することができる。いくつかの実施形態において、抗体可変領域は、これらに限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、およびサルを含む、ヒト以外の供給源からであり得る。いくつかの実施形態において、足場の構成要素は、異なる種属の混合物であり得る。したがって、本明細書に開示される抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であってもよい。一般的に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は、１種属以上からの領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウスまたは他のヒト以外の種属からの可変領域およびヒトからの定常領域を含む。
【０１１２】
「ヒト化抗体」とは、概して、ヒト抗体で発見される配列と交換された可変ドメインフレームワーク領域を有した非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてこのような抗体と同一である。ヒト以外の生物由来の核酸によりコードされる一部または全てのＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植され、移植されたＣＤＲにより決定される特異性の抗体を作製する。このような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載される。選択された受容体フレームワーク残基の対応するドナー残基への「逆突然変異」は、多くの場合、初期の移植されたコンストラクトで失われた親和性を回復するために要求される（米国特許第５，６９３，７６２号、参照によりその全体が援用される）。ヒト化抗体は、至適に、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含み、したがって、典型的には、ヒトＦｃ領域を含む。ヒト化抗体は、遺伝学的に操作された免疫系を有するマウスを使用しても生成され得る。  Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４。ヒト以外の抗体のヒト化および再構成のための種々の技法および方法は、当該分野に周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、ならびにそれに引用される参考文献を参照のこと）。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減するためのヒト化または他の方法は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３に記載される、表面再構成法を含み得る。一実施形態において、親抗体は、当該分野に公知のように、親和成熟化されている。構造に基づく方法が、例えば、米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載されるよう
に、ヒト化および親和性成熟化において利用されてもよい。選択に基づく方法は、抗体可変領域をヒト化および／または親和成熟するように、つまり、その標的抗原の可変領域の親和性を増加するように利用されてもよい。他のヒト化方法は、限定されないが、ＵＳＳＮ第０９／８１０，５０２号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法を含む、ＣＤＲの一部のみの移植を含んでもよい。構造に基づく方法は、例えば、参照によりその全体が援用される、ＵＳＳＮ第１０／１５３，１５９号、ならびに関連する出願に記載されるように、ヒト化および親和性成熟化において利用されてもよい。特定の変形において、抗体の免疫原性は、参照によりその全体が援用される、２００４年１２月３日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｈｏｓｔ  Ｓｔｒｉｎｇ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の表題で、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：１９８６−１９９８およびＵＳＳＮ第１１／００４，５９０号に記載される方法を使用して低減される。
【０１１３】
一実施形態において、抗体は、本明細書に概説する、少なくとも１つの修飾を伴う完全なヒト抗体である。「完全な（Ｆｕｌｌｙ）ヒト抗体」または「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ヒト抗体」とは、本明細書に概説する修飾を伴う、ヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体を指す。完全なヒト抗体は、例えば、遺伝子導入マウス（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：４５５−４５８）、または選択法と合わせたヒト抗体ライブラリ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１０２−１０８）を使用して、取得されてもよい。一実施形態において、ヒトと同等の抗体は、参照によりその全体が援用されるＰＣＴ／ＵＳ０９／４１１４４に概説されるように、計算的に生成されてもよい。
【０１１４】
抗ＩｇＥ抗体
【０１１５】
本明細書に記載する免疫グロブリンは、ＩｇＥに結合する。本発明の抗ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥに特異性を有する、既知または不明の任意の可変領域を含んでもよい。既知の抗ＩｇＥ抗体は、これらに限定されないが、マウス抗体ＭａＥ１１、ＭａＥ１３、およびＭａＥ１５、ＵＳ第６７６１８８９号、ＵＳ第６３２９５０９号、ＵＳ第２００８０００３２１８Ａ１号、およびＰｒｅｓｔａ，ＬＧ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３‐２６３２に記載されるもの等の、Ｅ２５、Ｅ２６、およびＥ２７、特に、ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５としても知られ、オマリズマブとしても知られるＥ２５を含む、これらの抗体のヒト化および／または操作された変型を含み、参照により全てが本明細書に明示的に援用される。ＭａＥ１１の好適な操作された変型は、本明細書の実施例に記載されるＨ１Ｌ１  ＭａＥ１１である。本発明に有用であり得る他の抗ＩｇＥは、マウス抗体ＴＥＳ−Ｃ２１、ＣＧＰ５１９０１としても知られるキメラＴＥＳ−Ｃ２１（Ｃｏｒｎｅ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９：８７９‐８８７；Ｒａｃｉｎｅ−Ｐｏｏｎ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６２：６７５‐６９０）、ならびに、限定されないが、Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ６：９７１‐９８０に記載される抗体等、ＴＮＸ−９０１としても知られるＣＧＰ５６９０１を含む、この抗体のヒト化および／または操作された変型を含む。本明細書に用途を見出し得る他の抗ＩｇＥ抗体は、ＵＳ第６０６６７１８号、ＵＳ第６０７２０３５号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８９４、ＵＳ第５３４２９２４号、ＵＳ第５０９１３１３号、ＵＳ第５４４９７６０号、ＵＳ第５５４３１４４号、ＵＳ第５３４２９２４号、およびＵＳ第５６１４６１１号に記載され、参照により全てが本明細書に援用される。他の有用な抗ＩｇＥ抗体は、マウス抗体ＢＳＷ１７を含む。これらの抗体のいくつかの可変領域ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲのアミノ酸配列を、図５に提供する。
【０１１６】
Ｆｃ変異体およびＦｃ受容体結合特性
【０１１７】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、Ｆｃ変異体を含んでもよい。Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸修飾を含み、該アミノ酸修飾は、１つ以上の最適化された特性を提供する。本明細書に開示されるＦｃ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、その親とアミノ酸配列が異なる。したがって、本明細書に開示されるＦｃ変異体は、親と比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。代替的に、本明細書に開示されるＦｃ変異体は、親と比較して、１つ以上のアミン酸修飾、例えば、約１〜５０のアミノ酸修飾、例えば、親と比較して、約１〜１０のアミノ酸修飾、約１〜５のアミノ酸修飾等を有してもよい。したがって、Ｆｃ変異体の配列、および親Ｆｃポリペプチドの配列は、実質的に相同である。例えば、本明細書において、変異Ｆｃ変異体配列は、親Ｆｃ変異体配列と約８０％の相同性、例えば、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、少なくとも９８％の相同性、少なくとも約９９％の相同性等を有する。本明細書に開示される修飾は、挿入、欠失、および置換を含む、アミノ酸修飾を含む。本明細書に開示される修飾は、グリコフォーム修飾も含む。修飾は、一般的に、分子生物学を使用して行われるか、または酵素的に、もしくは化学的に行われてもよい。
【０１１８】
本明細書に開示されるＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾によって定義される。したがって、例えば、Ｓ２６７Ｅは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｓ２６７Ｅを伴うＦｃ変異体である。同様に、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを伴うＦｃ変異体を定義する。野生型アミノ酸の同一性は、不特定であってもよく、この場合、前述の変異体は、２６７Ｅ／３２８Ｆと称される。置換が提供される順番は、恣意的であり、つまり、例えば、２６７Ｅ／３２８Ｆは、３２８Ｆ／２６７Ｅと同じＦｃ変異体などであることに留意する。特に記載のない限り、本明細書で論議される位置は、ＥＵ指標、またはＥＵ付番規定に従い番号付けされる（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＫａｂａｔもしくはＥＵ付番のＥＵ指標またはＥＵ指標は、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１１９】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＦｃ変異体は、ヒトＩｇＧ配列に基づき、したがって、ヒトＩｇＧ配列は、これらに限定されないが、例えば、ゲッ齒類および霊長類配列等の他の生物からの配列を含む、他の配列が比較される「基本」配列として使用される。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧＤ、ＩｇＧ等の、他の免疫グロブリンクラスからの配列も含む。本明細書に開示されるＦｃ変異体は、１つの親ＩｇＧと関連して操作されるが、変異体は、別の第２の親ＩｇＧと関連して、またはそれに「移行」されてもよいものとする。これは、典型的には、第１と第２のＩｇＧとの配列間の配列または構造相同性に基づき、第１と第２のＩｇＧとの間の「等価の」または「対応する」残基および置換を決定することにより行われる。相同性を確立するために、本明細書に概説する第１のＩｇＧのアミノ酸配列は、第２のＩｇＧの配列と直接比較される。配列を整列させた後、当該分野で知られている相同性整列プロブラムの１つ以上を使用し（例えば、種属間の保存残基を使用し）、整列を維持するために必要な挿入および欠失をすることにより（すなわち、恣意の欠失および挿入を通して、保存残基の排除を避ける）、第１の免疫グロブリンの一次配列における特定のアミノ酸に等価な残基が定義される。保存残基の整列は、そのような残基の１００％を保存し得る。しかしながら、７５％を超える、またはわずかに５０％の保存残基の整列も、等価残基を定義するのに十分である。等価残基は、構造が決定されたＩｇＧの三次構造のレベルである、第１と第２のＩｇＧとの間の構造的相同性を決定することにより定義されてもよい。この場合、等価残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の主鎖原子の２つ以上の原子座標（Ｎ上にＮ、ＣＡ  上にＣＡ、Ｃ上にＣ、およびＯ上にＯ）が、整列後、約０．１３ｎｍ以内であるものと定義される。別の実施形態において、等価残基は、整列後、約０．１ｎｍ以内である。整列は、最良のモデルが、タンパク質の非水素タンパク原子の原子座標の最大重複を与えるように配向され、位置付けられた後に、達成される。等価または対応する残基がどのように決定されるかに関わらず、また、ＩｇＧが作製される親ＩｇＧの同一性に関わらず、本明細書に開示される、発見されたＦｃ変異体は、Ｆｃ変異体と有意な配列または構造的相
同性を有する、あらゆる第２の親ＩｇＧに操作されてもよいということである。したがって、例えば、等価残基を決定するための上述の方法、または他の方法を使用することにより、親抗体がヒトＩｇＧ１である、変異体抗体が生成される場合、変異体抗体は、異なる抗原、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体等に結合する、別のＩｇＧ１親抗体に操作されてもよい。また、上述のように、親Ｆｃ変異体の構成は、本明細書に開示されるＦｃ変異体を、他の親ＩｇＧに移行する能力に影響を及ぼさない。
【０１２０】
本明細書に開示されるＦｃ変異体は、種々のＦｃ受容体結合特性のために最適化され得る。１つ以上の最適化された特性を示すように操作される、または予測されるＦｃ変異体は、本明細書において、「最適化されたＦｃ変異体」と称される。最適化され得る特性は、限定されないが、ＦｃγＲに対して強化または低減される親和性を含む。一実施形態において、本明細書に開示されるＦｃ変異体は、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂに対して強化された親和性を有するように最適化される。他の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、ＦｃγＲＩＩｂに対して強化された親和性を提供するが、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、および／またはＦｃγＲＩＩＩｂを含む、１つ以上の活性化ＦｃγＲに対して低減された親和性を提供する。ＦｃγＲ受容体は、これらに限定されないが、ヒト、カニクイザル、およびマウスを含む、任意の生物からの細胞上で発現されてもよい。本明細書に開示されるＦｃ変異体は、ヒトＦｃγＲＩＩｂに対して強化された親和性を有するように最適化されてもよい。
【０１２１】
本明細書で使用される、親Ｆｃポリペプチドより「大きな親和性」、もしくは「改善された親和性」、もしくは「強化された親和性」、もしくは「良好な親和性」とは、結合アッセイの変異体および親ポリペプチドの量が、基本的に同じである時、Ｆｃ変異体が、親Ｆｃポリペプチドより有意に高い会合平衡定数（ＫＡ もしくはＫａ）、または低い解離平衡定数（ＫＤもしくはＫｄ）で、Ｆｃ受容体に結合することを意味する。例えば、改善されたＦｃ受容体結合親和性を有するＦｃ変異体は、受容体結合親和性が、例えば、限定されないが、Ｂｉａｃｏｒｅを含む、本明細書に開示される結合方法によって、当業者により決定される、親Ｆｃポリペプチドと比較したＦｃ受容体結合親和性において、約５倍〜約１０００倍、例えば、約１０倍〜約５００倍の改善を示し得る。したがって、本明細書で使用される、親ポリペプチドと比較して「低減された親和性」とは、Ｆｃ変異体が、親Ｆｃポリペプチドより有意に低いＫＡまたは高いＫＤで、Ｆｃ受容体に結合することを意味する。より大きいまたは低減された親和性は、親和性の絶対レベルに対しても定義され得る。例えば、本明細書のデータによると、野生型（自然）ＩｇＧ１は、約２ｍＭ、または約２０００ｎＭの親和性で、ＦｃγＲＩＩｂに結合する。さらに、本明細書に記載されるいくつかのＦｃ変異体は、野生型ＩｇＧ１の約１０倍を上回る親和性で、ＦｃγＲＩＩｂに結合する。本明細書に開示される、大きな、または強化された親和性とは、約１００ｎＭより低い、例えば、約１０ｎＭ  〜約１００ｎＭの間、約１〜約１００ｎＭの間、または約１ｎＭ未満のＫＤを有することを意味する。
【０１２２】
本発明の抗ＩｇＥ抗体は、好ましくは、ＦｃγＲＩＩｂに対して高い親和性を有する。本明細書において、高い親和性とは、抗体とＦｃγＲＩＩｂとの間の相互作用の親和性が、１００ｎＭより強いことを意味する。つまり、抗体のＦｃγへの結合に対する平衡解離定数Ｋｄは、１００ｎＭより低い。
【０１２３】
一実施形態において、Ｆｃ変異体は、１つ以上の活性化受容体に対して、ＦｃγＲＩＩｂに対して選択的に強化された親和性を提供する。選択的に強化された親和性とは、Ｆｃ変異体が、親Ｆｃポリペプチドと比較して、活性化受容体に対してＦｃγＲＩＩｂに改善された親和性を有するが、親Ｆｃポリペプチドと比較して、活性化受容体に対して低減された親和性を有するか、またはＦｃ変異体が、親Ｆｃポリペプチドと比較して、ＦｃγＲＩＩｂおよび活性化受容体の両方に改善された親和性を有するが、親和性の改善は、活性化受容体に対してよりＦｃγＲＩＩｂに対しての方が大きいことかのいずれかを意味する。代替の実施形態において、Ｆｃ変異体は、１つ以上の活性化ＦｃγＲへの結合を低減もしくは切断する、１つ以上の補体タンパク質への結合を低減もしくは切断する、１つ以上のＦｃγＲ媒介エフェクター機能を低減もしくは切断する、および／または１つ以上の補体媒介エフェクター機能を低減もしくは切断する。
【０１２４】
ＦｃγＲの異なる多型形態の存在は、本明細書に開示されるＦｃ変異体の治療有用性に影響を与える、また別のパラメータを提供する。ＦｃγＲの異なるクラスに対する所与のＦｃ変異体の特異性および選択性は、Ｆｃ変異体が、所与の疾患の治療のための所与の抗原を標的とする能力に有意に影響を及ぼすが、これらの受容体の異なる多型形態に対するＦｃ変異体の特異性または選択性は、研究または前臨床実験が、検査に適切であってもよいか、そして最終的に、どの患者集団が治療に反応する可能性があるかないかを、部分的に決定し得る。したがって、これらに限定されないが、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ等を含む、Ｆｃ受容体多型に対する、本明細書に開示されるＦｃ変異体の特異性または選択性は、有効な研究および前臨床実験の選択、臨床試験のデザイン、患者の選択、用量依存性、および／または臨床試験に関わる他の態様を導くために使用され得る。
【０１２５】
本明細書に開示されるＦｃ変異体は、これらに限定されないが、補体タンパク質、ＦｃＲｎ、およびＦｃ受容体ホモログ（ｃＲＨ）を含む、ＦｃγＲ以外のＦｃ受容体との相互作用を調節する修飾を含んでもよい。ＦｃＲＨは、これらに限定されないが、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３、ＦｃＲＨ４、ＦｃＲＨ５、およびＦｃＲＨ６を含む（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６）。
【０１２６】
所与の疾患を治療するための、所与のＦｃ変異体の最も有益な選択を決定する重要なパラメータは、Ｆｃ変異体の構成である。したがって、所与のＦｃ変異体のＦｃ受容体選択性または特異性は、抗体、Ｆｃ融合物、または融合パートナーと結合したＦｃ変異体を構成するかによって、異なる特性を提供する。一実施形態において、本明細書に開示されるＦｃ変異体のＦｃ受容体特異性は、その治療有用性を決定する。治療目的の所与のＦｃ変異体の有用性は、標的抗原のエピトープもしくは形態、および治療される疾患または徴候に依存する。いくつかの標的および徴候において、より大きなＦｃγＲＩＩｂ親和性、および低減された活性化ＦｃγＲ媒介エフェクター機能が、有益であり得る。他の標的抗原および治療用途において、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を増加する、または  ＦｃγＲＩＩｂおよび活性化受容体の両方に対する親和性を増加することが有益であり得る。
【０１２７】
抗ＩｇＥ抗体の活性を最適化するための手段
【０１２８】
１つ以上のＦｃγＲへの親和性を変更するための手段を本明細書に記載する。好適な実施形態において、親和性は、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂに対して変更され、これによって、免疫グロブリンが、１つ以上のＦｃγＲＩＩｂ媒介性阻害エフェクター機能を媒介する能力を変更する。本発明の手段は、アミノ酸修飾（例えば、機能最適化のための位置的手段、機能最適化のための置換手段等）、およびグリコフォーム修飾（例えば、グリコフォーム修飾のための手段）を含む。
【０１２９】
アミノ酸修飾
【０１３０】
アミノ酸修飾を含む免疫グロブリンを本明細書に開示し、該修飾は、１つ以上のＦｃγＲへの親和性を変更する。好ましくは、該アミノ酸修飾は、ＦｃγＲＩＩｂへの親和性を改善する。しかしながら、いくつかの実施形態において、修飾は、１つ以上の活性化受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａへの親和性を改善してもよい。ＦｃγＲへの結合を変更するための修飾は、「Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｆｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ」の表題で、２００５年５月５日に出願されたＵＳＳＮ第１１／１２４，６２０号、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＣＤ３２ｂ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ」の表題で、２００８年５月３０日に出願されたＵＳＳＮ第１２／１５６，１８３号に記載されており、ともに、参照により本明細書に明示的に援用される。
【０１３１】
本明細書に記載される、抗ＩｇＥ抗体の活性を最適化するための位置的手段は、免疫グロブリンＦｃγＲＩＩｂ結合特性、エフェクター機能、および抗体の潜在的な臨床特性の修飾を可能にする、１つ以上の重鎖定常領域位置（例えば、位置：２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６５、２６６、２６７、２６８、２９８、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、および３３２）でのアミノ酸の修飾を含むが、これに限定されない。
【０１３２】
特に、例えば、ＦｃγＲＩＩｂへの親和性を変更することにより、抗ＩｇＥ抗体の活性を最適化するための置換手段は、限定されないが、１つ以上の重鎖定常領域位置でのアミノ酸の置換、例えば、次の重鎖定常領域位置：２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６５、２６６、２６７、２６８、２９８、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、および３３２での、１つ以上のアミノ酸置換を含み、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、置換手段は、親Ｆｃ領域と比較して、少なくとも１つ（例えば、２つ以上）の置換を含み、該修飾は、ＥＵ指標に従う、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２からなる群から選択される位置である。一実施形態において、置換手段は、ＥＵ指標に従う、２３５、２３６、２３９、２６６、２６７、２６８、および３２８からなる群から選択される位置での１つ以上（例えば、２つ以上）の置換を含む。
【０１３３】
一実施形態において、該置換手段は、２３４Ｆ、２３４Ｇ、２３４Ｉ、２３４Ｋ、２３４Ｎ、２３４Ｐ、２３４Ｑ、２３４Ｓ、２３４Ｖ、２３４Ｗ、２３４Ｙ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３５Ｈ、２３５Ｉ、２３５Ｎ、２３５Ｐ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｓ、２３５Ｗ、２３５Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｔ、２３６Ｄ、２３６Ｆ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｋ、２３６Ｌ、２３６Ｍ、２３６Ｐ、２３６Ｑ、２３６Ｒ、２３６Ｓ、２３６Ｔ、２３６Ｖ、２３６Ｗ、２３６Ｙ、２３６Ａ、２３６Ｅ、２３６Ｎ、２３７Ａ、２３７Ｅ、２３７Ｈ、２３７Ｋ、２３７Ｌ、２３７Ｐ、２３７Ｑ、２３７Ｓ、２３７Ｖ、２３７Ｙ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２６５Ｅ、２６６Ｄ、２６６Ｉ、２６６Ｍ、２６７Ａ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｇ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｎ、２６８Ｑ、２９８Ｄ、２９８Ｅ、２９８Ｌ、２９８Ｍ、２９８Ｑ、３２５Ｌ、３２６Ａ、３２６Ｅ、３２６Ｗ、３２６Ｄ、３２７Ｄ、３２７Ｇ、３２７Ｌ、３２７Ｎ、３２７Ｑ、３２７Ｅ、３２８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｙ、３２８Ｈ、３２８Ｉ、３２８Ｑ、３２８Ｗ、３２９Ｅ、３３０Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｋ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、２３４Ｎ、２３４Ｆ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｔ、２３６Ｄ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｌ、２３６Ｓ、２３６Ｙ、２３６Ｅ、２３６Ｎ、２３７Ｈ、２３７Ｌ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｎ、２３９Ｅ、２６６Ｉ、２６６Ｍ、２６７Ａ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｇ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｎ、２６８Ｑ、２９８Ｅ、２９８Ｌ、２９８Ｍ、２９８Ｑ、３２５Ｌ、３２６Ａ、３２６Ｅ、３２６Ｗ、３２６Ｄ、３２７Ｄ、３２７Ｌ、３２７Ｅ、３２８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｙ、３２８Ｈ、３２８Ｉ、３２８Ｑ、３２８Ｗ、３３０Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｋ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、２
３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つの置換（例えば、１つ以上の置換、２つ以上の置換等）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。
【０１３４】
一実施形態において、該置換手段は、２３４／２３９、２３４／２６７、２３４／３２８、２３５／２３６、２３５／２３９、２３５／２６７、２３５／２６８、２３５／３２８、２３６／２３９、２３６／２６７、２３６／２６８、２３６／３２８、２３７／２６７、２３９／２６７、２３９／２６８、２３９／３２７、２３９／３２８、２３９／３３２、２６６／２６７、２６７／２６８、２６７／３２５、２６７／３２７、２６７／３２８、２６７／３３２、２６８／３２７、２６８／３２８、２６８／３３２、３２６／３２８、３２７／３２８、および３２８／３３２からなる群から選択される位置での、少なくとも２つの置換（例えば、修飾の組み合わせ）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、２３５／２６７、２３６／２６７、２３９／２６８、２３９／２６７、２６７／２６８、および２６７／３２８からなる群から選択される位置での、少なくとも２つの置換（例えば、修飾の組み合わせ）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、２３４Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６７Ｅ、２３４Ｆ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／３２８Ｆ、２３４Ｗ／２３９Ｄ、２３４Ｗ／２３９Ｅ、２３４Ｗ／２６７Ｅ、２３４Ｗ／３２８Ｙ、２３５Ｄ／２６７Ｅ、２３５Ｄ／３２８Ｆ、２３５Ｆ／２３９Ｄ、２３５Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｆ／３２８Ｙ、２３５Ｙ／２３６Ｄ、２３５Ｙ／２３９Ｄ、２３５Ｙ／２６７Ｄ、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２６８Ｅ、２３５Ｙ／３２８Ｆ、２３６Ｄ／２３９Ｄ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６８Ｅ、２３６Ｄ／３２８Ｆ、２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３７Ｄ／２６７Ｅ、２３７Ｎ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６７Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６８Ｅ、２３９Ｄ／３２７Ｄ、２３９Ｄ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／３２８Ｗ、２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３９Ｅ／２６７Ｅ、２６６Ｍ／２６７Ｅ、２６７Ｄ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／３２５Ｌ、２６７Ｅ／３２７Ｄ、２６７Ｅ／３２７Ｅ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｉ、２６７Ｅ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２７Ｄ、２６８Ｄ／３２８Ｆ、２６８Ｄ／３２８Ｗ、２６８Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３２８Ｆ、２６８Ｅ／３
２８Ｙ、３２７Ｄ／３２８Ｙ、３２８Ｆ／３３２Ｅ、３２８Ｗ／３３２Ｅ、および３２８Ｙ／３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも２つの置換（例えば、置換の組み合わせ）であり、付番は、ＥＵ指標に従う。
【０１３５】
一実施形態において、該置換手段は、次の置換の少なくとも１つ、または置換の組み合わせ：２３４Ｆ／２３６Ｎ、２３４Ｆ／２３６Ｄ、２３６Ａ／２３７Ａ、２３６Ｓ／２３７Ａ、２３５Ｄ／２３９Ｄ、２３４Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６７Ｅ、２３４Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｄ／２６７Ｅ、２３５Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｓ／２６７Ｅ、２３５Ｔ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｄ、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｅ／２６７Ｅ、２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３７Ｄ／２６７Ｅ、２３７Ｎ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６７Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６６Ｍ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６８Ｄ、２３６Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２６７Ｄ／２６８Ｄ、２６７Ｄ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／３２５Ｌ、２６７Ｄ／３２７Ｄ、２６７Ｄ／３２７Ｅ、２６７Ｅ／３２７Ｄ、２６７Ｅ／３２７Ｅ、２６８Ｄ／３２７Ｄ、２３９Ｄ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｈ、２６７Ｅ／３２８Ｉ、２６７Ｅ／３２８Ｑ、２６７Ｅ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｄ／２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｗ／２３９Ｅ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３４Ｗ／２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３５Ｆ／２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３４Ｅ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３５Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３５Ｙ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／２６７Ａ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３４Ｗ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３５Ｆ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｗ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６８Ｅ／３２８Ｙ、２６７Ａ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／２６８Ｅ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／３２６Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２６Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／３２７Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２７Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／３３２Ｅ、２３４Ｗ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３５Ｆ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６７Ａ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２
６８Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｗ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２６Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２７Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｗ／２３６Ｄ／２３９Ｅ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｗ／３３２Ｅ、および２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅをもたらし、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、次の置換の少なくとも１つ、または置換の組み合わせ：２６６Ｄ、２３４Ｆ／２３６Ｎ、２３４Ｆ／２３６Ｄ、２３６Ａ／２３７Ａ、２３６Ｓ／２３７Ａ、２３５Ｄ／２３９Ｄ、２３４Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６７Ｅ、２３４Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｄ／２６７Ｅ、２３５Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｓ／２６７Ｅ、２３５Ｔ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｄ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｅ／２６７Ｅ、２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３７Ｄ／２６７Ｅ、２３７Ｎ／２６７Ｅ、２６６Ｍ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６８Ｄ、２３６Ｄ／２６８Ｄ、２６７Ｄ／２６８Ｄ、２６７Ｄ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／３２５Ｌ、２６７Ｄ／３２７Ｄ、２６７Ｄ／３２７Ｅ、２６７Ｅ／３２７Ｅ、２６８Ｄ／３２７Ｄ、２３９Ｄ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｈ、２６７Ｅ／３２８Ｉ、２６７Ｅ／３２８Ｑ、２６７Ｅ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３４Ｄ／２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｗ／２３９Ｅ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３４Ｗ／２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３５Ｆ／２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３４Ｅ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３５Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３５Ｙ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／２６７Ａ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３４Ｗ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３５Ｆ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｗ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６８Ｅ／３２８Ｙ、２６７Ａ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／２６８Ｅ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／３２６Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２６Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／３２７Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ
／３２７Ｄ／３２８Ｙ、２３４Ｗ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３５Ｆ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６７Ａ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｗ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２６Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２７Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｗ／２３６Ｄ／２３９Ｅ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｗ／３３２Ｅ、および２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅをもたらし、付番は、ＥＵ指標に従う。一実施形態において、該置換手段は、次の置換の少なくとも１つ、または置換の組み合わせ：２３４Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｌ、２３６Ｓ、２３６Ｙ、２３７Ｈ、２３７Ｌ、２３９Ｄ、２３９Ｎ、２６６Ｉ、２６６Ｍ、２６７Ａ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６７Ｇ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２６８Ｎ、２６８Ｑ、２９８Ｅ、２９８Ｌ、２９８Ｍ、２９８Ｑ、３２６Ａ、３２６Ｅ、３２６Ｗ、３２７Ｄ、３２７Ｌ、３２８Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｄ、３３０Ｈ、３３０Ｋ、２３４Ｆ／２３６Ｎ、２３４Ｆ／２３６Ｄ、２３５Ｄ／２３９Ｄ、２３４Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６７Ｅ、２３４Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｄ／２６７Ｅ、２３５Ｆ／２６７Ｅ、２３５Ｔ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２６７Ｄ、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｅ／２６７Ｅ、２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３７Ｄ／２６７Ｅ、２３７Ｎ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６７Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６６Ｍ／２６７Ｅ、２３４Ｅ／２６８Ｄ、２３６Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２６７Ｄ／２６８Ｄ、２６７Ｄ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、２６７Ｅ／３２５Ｌ、２６７Ｄ／３２７Ｄ、２６７Ｄ／３２７Ｅ、２６７Ｅ／３２７Ｄ、２６７Ｅ／３２７Ｅ、２６８Ｄ／３２７Ｄ、２３９Ｄ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｈ、２６７Ｅ／３２８Ｉ、２６７Ｅ／３２８Ｑ、２６７Ｅ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｄ／２３６Ｎ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３４Ｗ／２３９Ｅ／２６７Ｅ、２３５Ｙ／２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２３９Ｄ／２６７Ｅ、２３
５Ｙ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／２６８Ｅ、２３４Ｗ／２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３５Ｆ／２３９Ｄ／３２８Ｙ、２３４Ｅ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３５Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３５Ｙ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／２６７Ａ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３４Ｗ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３５Ｆ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｗ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６８Ｅ／３２８Ｙ、２６７Ａ／２６８Ｄ／３２８Ｙ、２６７Ｅ／２６８Ｅ／３２８Ｆ、２３９Ｄ／３２６Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２６Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／３２７Ｄ／３２８Ｙ、２６８Ｄ／３２７Ｄ／３２８Ｙ、２３９Ｄ／２６７Ｅ／３３２Ｅ、２３４Ｗ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３５Ｆ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６７Ａ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｗ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２６Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２７Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｗ／２３６Ｄ／２３９Ｅ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｆ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｗ／３３２Ｅ、および２３９Ｄ／２６８Ｄ／３２８Ｙ／３３２Ｅをもたらす。
【０１３６】
一実施形態において、該置換手段は、次の置換の少なくとも１つ、または置換の組み合わせ：２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆをもたらし、付番は、ＥＵ指標に従う。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、イソタイプの修飾、つまり、親ＩｇＧの別のＩｇＧのアミノ酸タイプへの修飾のための手段を含んでもよい。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、２つのイソタイプが異なる位置で、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ１位置をＩｇＧ３からのアミノ酸と置換するための置換手段によって構築されてもよい。したがって、１つ以上の置換手段、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒ、および４３６Ｆを含む、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が、構築されてもよい。本発明の他の実施形態において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体は、２つのイソタイプが異なる位置で、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ２を、ＩｇＧ１からのアミノ酸と置換するための置換手段によって構築されてもよい。したがって、１つ以上の置換手段、例えば、次のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６での、グリシンの挿入を指す）、および３２７Ａの１つ以上を含む、ハイブリッド変異体ｇＧ抗体が、構築されてもよい。
【０１３８】
グリコフォーム修飾
【０１３９】
抗体を含む多くのポリペプチドは、オリゴ糖とのグリコシル化等の糖鎖を含む、種々の翻訳後修飾を受ける。グリコシル化に影響を与えることができるいくつかの要因が存在する。種属、組織および細胞型は全て、グリコシル化がどのように生じるかにおいて重要であることが示されている。加えて、血清濃度等の培養条件の変更を通して、細胞外環境は、グリコシル化に直接的な影響を与える（Ｌｉｆｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（８）：８１３−８２２）。
【０１４０】
全ての抗体は、重鎖の定常領域の保存位置で糖を含有する。各抗体のイソタイプは、明確な種々のＮ結合型糖構造を有する。重鎖に結合される糖とは別に、ヒトＩｇＧの最大３０％は、グリコシル化Ｆａｂ領域を有する。ＩｇＧは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で、単一結合型二触角性糖を有する。血清からか、またはハイブリドーマまたは操作された細胞で細胞外生成される、いずれのＩｇＧにおいても、ＩｇＧは、Ａｓｎ２９７結合型糖に関して異種である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：２６−３２）。ヒトＩｇＧにおいて、コアオリゴ糖は、通常、異なる数の外側残基を有する、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる。
【０１４１】
本明細書に開示される免疫グロブリンの糖鎖は、オリゴ糖の説明に通常使用される命名法を参照して説明される。この命名法を使用する糖化学の総説は、Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５−５８３に見られる。この命名法は、例えば、マンノースを表すＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグリコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースを表すＧａｌ、フコースを表すＦｕｃ、およびグルコースを表すＧｌｃを含む。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＡｃ、および５−グルコリルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＧｃの省略標記によって記載される。
【０１４２】
「グリコシル化」とは、オリゴ糖（２つ以上の単糖の連結、例えば、２〜約１２の単糖の連結を含有する糖）の糖タンパク質への結合を意味する。オリゴ糖測鎖は、典型的に、ＮまたはＯ結合のいずれかを通して、糖タンパク質の骨格に連結される。本明細書に開示される免疫グロブリンのオリゴ糖は、一般的に、Ｎ結合型オリゴ糖としてＦｃ領域のＣＨ２ドメイに結合される。「Ｎ結合型グリコシル化」とは、糖タンパク質鎖における、糖鎖のアスパラギン残基への結合を指す。当業者は、例えば、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、および  ＩｇＧ３のそれぞれ、ならびにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＤ  ＣＨ２ドメインが、アミノ酸残基２９７で、Ｎ結合型グリコシル化のための単一部位を有することを認識するであろう（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１）。
【０１４３】
本明細書の目的において、「成熟型コア糖構造」とは、一般的に、二触角性オリゴ糖に典型的な、次の糖構造：ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃｏｓｅ）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２からなる、Ｆｃ領域に結合される処理されたコア糖構造を指す。成熟型コア糖構造は、一般的に、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合を介して、糖タンパク質のＦｃ領域に結合される。「二分ＧｌｃＮＡｃ」とは、成熟型コア糖構造のｂ１，４マンノースに結合されるＧｌｃＮＡｃ残基である。二分ＧｌｃＮＡｃは、ｂ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ酵素（ＧｎＴＩＩＩ）により、酵素的に成熟型コア糖構造に結合され得る。ＣＨＯ細胞は、通常、ＧｎＴＩＩＩを発現しないが  （Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３３７０−１３３７８）、そのように操作することができる（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
【０１４４】
修飾されたグリコフォームまたは操作されたグリコフォームを含むＦｃ変異体を、本明細書で説明する。本明細書で使用される、「修飾されたグリコフォーム」、または「操作されたグリコフォーム」とは、タンパク質、例えば、抗体に共有結合的に結合される糖組成物を意味し、該糖組成物は、親タンパク質のそれと化学的に異なる。操作されたグリコフォームは、これらに限定されないが、ＦｃγＲ媒介性エフェクター機能の強化または低減を含む、種々の目的に有用であり得る。一実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、Ｆｃ領域に共有結合的に結合される、フコシル化および／または二分オリゴ糖のレベルを制御するように修飾される。
【０１４５】
修飾されたグリコフォームを生成するための種々の方法は、当該分野において周知である（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）、（ＵＳ６，６０２，６８４、ＵＳＳＮ第１０／２７７，３７０号、ＵＳＳＮ第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ国際公開第００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０１／２９２４６Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０２／３１１４０Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０２／３０９５４Ａ１号）、（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｂｉｏｗａ，  Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］、参照により全てが明示的に援用される）。これらの技法は、例えば、操作された、種々の生物または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞、またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現させることにより、さもさければ、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシル基転移酵素］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することにより、またはＩｇＧが発現した後に、糖（類）を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合的に結合される、フコシル化および／または二分オリゴ糖のレベルを制御する。本明細書に開示される免疫グロブリンのグリコフォームを修飾するための他の方法は、糖操作された酵母株（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４（２）：２１０−２１５）、蘚類（Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｊｏｌ  ４４（７）：１８２６−８）、および植物（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４（１２）：１５９１−７）の使用を含む。修
飾されたグリコフォームを生成するための特定の方法の使用は、その方法に実施形態を制限するものではない。むしろ、本明細書に開示される実施形態は、それらがどのように生成されるかに関係なく、修飾されたグリコフォームを伴うＦｃ変異体を包含する。
【０１４６】
一実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、シアル化のレベルを変更するために、糖操作される。免疫グロブリンＧ分子における、高レベルのシアル化Ｆｃグルカンは、機能性に悪影響を与える可能性があり（Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（７）：１５２４−３４）、Ｆｃシアル化のレベルの相違は、変更された抗炎症性活性をもたらす可能性がある（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０−６７３）。抗体は、Ｆｃコア多糖のシアル化の際に抗炎症性特性を取得し得るため、Ｆｃシアル酸含有量の増加または低減のために、本明細書に開示される免疫グロブリンを糖操作することは、有益であり得る。
【０１４７】
操作されたグリコフォームは、典型的に、異なる糖またはオリゴ糖を指し、したがって、例えば、免疫グロブリンは、操作されたグリコフォームを含み得る。代替的に、操作されたグリコフォームは、異なる糖またはオリゴ糖を含む免疫グロブリンを指す場合がある。一実施形態において、本明細書に開示される組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化Ｆｃ変異体を含み、グリコシル化抗体の約５１〜１００％、例えば、組成物中の抗体の約８０〜１００％、９０〜１００％、９５〜１００％等は、フコースを欠失する、成熟型コア糖構造を含む。別の実施形態において、組成物中の抗体は、フコースを欠失する成熟型コア糖構造を含み、さらに、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、両方である。代替の実施形態において、組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化Ｆｃ変異体を含み、約５１〜１００％のグリコシル化抗体、例えば、組成物中の抗体の約８０〜１００％または９０〜１００％は、シアル酸を欠失する、成熟型コア糖構造を含む。別の実施形態において、組成物中の抗体は、シアル酸を欠失する成熟型コア糖構造を含み、さらに、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、両方である。また別の実施形態において、組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化Ｆｃ変異体を含み、グリコシル化抗体の約５１〜１００％、例えば、組成物中の抗体の約８０〜１００％または９０〜１００％は、シアル酸を含有する、成熟型コア糖構造を含む。別の実施形態において、組成物中の抗体は、シアル酸を含有する成熟型コア糖構造を含み、さらに、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、両方である。別の実施形態において、操作されたグリコフォームとアミノ酸修飾の組み合わせは、抗体に最適なＦｃ受容体結合特性を提供する。
【０１４８】
他の修飾
【０１４９】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、ＦｃγＲまたは補体媒介性機能自体に特に関連しない、最適化された特性を提供する１つ以上の修飾を含んでもよい。該修飾は、アミノ酸修飾であるか、または酵素的に、もしくは化学的に行われる修飾であってもよい。このような修飾は、例えば、その安定性、溶解性、または臨床使用の強化等の、免疫グロブリンのある程度の改善を提供する可能性がある。本明細書に開示される免疫グロブリンをさらなる修飾と結合することにより行わせてもよい、種々の改善を本明細書に開示する。
【０１５０】
一実施形態において、本明細書に開示される抗体の可変領域は、親和性成熟することができる、つまり、アミノ酸修飾が、抗体のその標的抗原への結合を強化するように、抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメインで行われ得る。このような種類の修飾は、標的抗原への結合の会合および／または解離動態を改善し得る。他の修飾は、代替標的に対する、標的抗原への選択性を改善するものを含む。これらは、非標的細胞に対して、標的上で発現する抗原への選択性を改善する修飾を含む。標的認識特性に対する他の改善は、さらなる修飾によって提供され得る。このような特性は、これらに限定されないが、特定の動態特性（すなわち、会合および解離動態）、代替標的に対する、特定の標的への選択性、および代替形態に対する、特定の標的形態への選択性を含んでもよい。例としては、完全長に対してスプライス変異体、細胞表面に対して可溶性形態、種々の多型変異体の選択性、または標的抗原の特定の立体構造形態が挙げられる。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリンの内在化の低減または強化を提供する、１つ以上の修飾を含んでもよい。
【０１５１】
一実施形態において、修飾は、これらに限定されないが、安定性、溶解性、およびオリゴマー状態を含む、本明細書に開示される免疫グロブリンの生物物理学的特性を改善するように行われる。修飾は、例えば、より高い安定性を提供するように、免疫グロブリンのより好適な分子内相互作用を提供する置換、または高溶解性のために、露出非極性アミノ酸の極性アミノ酸との置換を含むことができる。本明細書に開示される免疫グロブリンに対する他の修飾は、特定の構造、またはホモ二量体もしくはホモ多量体分子を可能にするものを含む。このような修飾は、これらに限定されないが、操作されたジスルフィド、ならびに共有結合性ホモ二量体もしくはホモ多量体を生成するための機構を提供し得る、化学的修飾または集合法を含む。本明細書に開示される変異体に対するさらなる修飾は、特定の構造、またはヘテロ二量体、ヘテロ多量体、二機能性、および／もしくは多機能性分子を可能にするものを含む。このような修飾は、限定されないが、置換がホモ二量体の形成を低減し、ヘテロ二量体形成を増加する、ＣＨ３ドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換を含む。さらなる修飾は、修飾が二量体を形成する傾向を低減する、ヒンジおよびＣＨ３ドメインにおける修飾を含む。
【０１５２】
さらなる実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、タンパク質分解部位を除去する修飾を含む。これらは、例えば、生産収量を低減するプロテアーゼ部位、ならびに生体内投与タンパク質を分解するプロテアーゼを含み得る。一実施形態において、さらなる修飾は、脱アミド（すなわち、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド）、酸化、およびタンパク質分解部位等の、共有結合分解部位を除去するように行われる。除去に特に有用である脱アミド部位は、これらに限定されないが、グリシンが続く、アスパラギニルおよびグルタミル（ｇｌｔｕａｍｙｌ）残基、（それぞれ、ＮＧおよびＱＧモチーフ）を含む、脱アミドの傾向を強化するものである。このような場合、いずれの残基の置換も、脱アミドの傾向を有意に低減することができる。一般的な酸化部位は、メチオニンおよびシステイン残基を含む。導入または除去され得る他の共有結合性修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン測鎖の’’−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）、参照によりその全体が援用される）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化  を含む。さらなる修飾は、限定されないが、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化およびリン酸化等の、翻訳後修飾も含み得る。
【０１５３】
修飾は、生物学の産生に通常使用される、宿主または宿主細胞から得られる発現および／または精製収量を改善するものを含んでもよい。これらは、これらに限定されないが、種々の哺乳類細胞株（例えば、ＣＨＯ）、酵母細胞株、バクテリア細胞、および植物を含む。さらなる修飾は、重鎖が、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を除去する、または低減する修飾を含む。さらなる修飾は、重鎖が、鎖内ジスルフィド結合を形成する能力を除去する、または低減する修飾を含む。
【０１５４】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、例えば、限定されないが、全てが参照によりその全体が援用される、Ｃｒｏｐｐ  ＆  Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（２）：７５６６−７１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、およびＣｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３５）：９６４−７に記載される方法を含む、Ｓｃｈｕｌｔｚおよび共同研究者により開発された技術を使用して組み込まれた、非天然アミノ酸の使用を含む修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態において、これらの修飾は、上述の種々の機能的、生物物理学的、免疫学的、または製造特性の操作を可能にする。さらなる実施形態において、これらの修飾は、他の目的のために、さらなる化学修飾を可能にする。他の修飾が、本明細書において企図される。例えば、免疫グロブリンは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体等の、種々の非タンパク質性重合体の１つに連結されてもよい。さらなるアミノ酸修飾は、免疫グロブリンの特異的または非特異的な化学修飾もしくは翻訳後修飾を可能にするように行われてもよい。このような修飾は、これらに限定されないが、ペグ化およびグリコシル化を含む。ペグ化を可能にするように利用され得る特異的置換は、これらに限定されないが、効率的かつ特異的なカップリング化学法が、ＰＥＧか、さもなければ重合体部分を結合するために使用され得るような、新規システイン残基または非天然アミノ酸の導入を含む。特定のグリコシル化部位の導入は、新規Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ配列を本明細書に開示される免疫グロブリンに導入することにより、達成され得る。
【０１５５】
免疫原性を低減するための修飾は、親配列由来の処理されたペプチドのＭＨＣタンパク質への結合を低減する修飾を含んでもよい。例えば、アミノ酸修飾は、任意の一般的なＭＨＣ対立遺伝子を高親和性で結合することが予測される免疫エピトープが存在しないか、または最小数であるように操作されるだろう。タンパク質配列におけるＭＨＣ結合型エピトープの同定のいくつかの方法は、当該分野で知られており、本明細書に開示される抗体のエピトープをスコアするために使用されてもよい。例えば、参照により全てが明示的に援用される、ＵＳＳＮ第０９／９０３，３７８号、ＵＳＳＮ第１０／７５４，２９６号、ＵＳＳＮ第１１／２４９，６９２号、およびそこに引用される参考文献を参照のこと。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、ＦｃＲｎ結合を変更する免疫グロブリンと組み合わされてもよい。このような変異体は、免疫グロブリンに改善された薬物動態特性を提供し得る。ＦｃＲｎへの結合を増加する、および／または薬物動態特性を改善する好適な変異体は、これらに限定されないが、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、および４３４Ｍを含む、位置２５９、３０８、４２８、および４３４での置換を含むが、これらに限定されない（「Ｆｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｎｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＦｃＲｎ」の表題で、２００８年１２月２２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ第２００８／０８８０５３号、参照によりその全体が援用される）。ＦｃのＦｃＲｎへの結合を増加する他の変異体は、これらに限定されないが、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：  ６２１３−６２１６，  Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：３４６−３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００１，２７６（９）：６５９１−６６０４、参照によりその全体が援用される）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１  Ｓ（Ｄａｌｌ  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，１６９：５１７１−５１８０，  Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１：２３５１４−２３５２４、参照によりその全体が援用される）を含む。
【０１５７】
抗体の共有結合的修飾は、本明細書に開示される免疫グロブリンの範囲内に含まれ、概して、翻訳後に行われるが、必ずしもそうではない。例えば、抗体の共有結合的修飾のいくつかの種類は、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖、またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることにより、分子に導入される。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体の共有結合的修飾は、１つ以上の標識の追加を含む。「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を意味する。いくつかの実施形態において、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために、種々の長さのスペーサーのアームを介して抗体に結合される。タンパク質を標識するための種々の方法が、当該分野において知られており、本明細書に開示される免疫グロブリンの生成に使用され得る。
【０１５９】
複合体
【０１６０】
一実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、抗体「融合タンパク質」であり、時折、「抗体複合体」とも称される。融合パートナーまたは複合パートナーは、タンパク質性または非タンパク質性であり得、後者は、一般的に、抗体上および複合パートナー上の官能基を使用して生成される。複合パートナーおよび融合パートナーは、小分子化学化合物およびポリペプチドを含む、任意の分子であってもよい。例えば、種々の抗体複合体および方法は、Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５８４−５８８に記載されており、参照によりその全体が援用される。可能な複合パートナーは、これらに限定されないが、サイトカイン、細胞障害性薬剤、毒素、ラジオアイソトープ、化学療法剤、反脈管形成物質、チロシンキナーゼ阻害剤、および他の治療活性剤を含む。いくつかの実施形態において、複合パートナーは、むしろ負荷量と考えられてもよい、つまり、複合体の目的は、免疫グロブリンによる、複合パートナーの標的細胞、例えば、癌細胞または免疫細胞への標的送達である。したがって、例えば、毒素の免疫グロブリンの複合は、該毒素の標的抗原を発現する細胞への送達を標的とする。当業者により理解されるように、実際には、融合および複合の概念および定義は、重複する。融合または複合の意味は、本明細書に開示される任意の特定の実施形態にそれを制限するものではない。むしろ、これらの用語は、本明細書に開示される任意の免疫グロブリンが、ある所望の特性を提供するように、遺伝的に、化学的に、または他の方法で、１つ以上のポリペプチドもしくは分子に連結されてもよいという、広範な概念を伝達するように漠然と使用される。
【０１６１】
適切な複合体は、これらに限定されないが、以下に記載される標識、細胞障害性薬物（例えば、化学療法剤）、または毒素もしくはそのような毒素の活性断片を含む、薬物、および細胞障害性薬剤を含むが、これらに限定されない。適切な毒素およびそれらの対応する断片は、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン等を含む。細胞障害性薬剤は、ラジオアイソトープを抗体に複合することにより、または放射性核種を抗体に共有結合的に結合されたキレート剤に結合することにより作製される、放射化学物も含む。さらなる実施形態は、カリケアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ならびにデュオカルマイシンおよび類似体を利用する。
【０１６２】
一実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、サイトカインに融合または複合される。本明細書で使用される、「サイトカイン」とは、細胞間の介在物質として別の細胞に作用する、１つの細胞集団により放出されるタンパク質の一般的な用語である。例えば、参照によりその全体が援用される、Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：９１−１０１に記載されるように、サイトカインを、抗体に融合させて、一連の所望の特性を提供することができる。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、および通常のポリペプチドホルモンが挙げられる。ヒト成長ホルモン、Ｎメチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン等の成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、レラキシン、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン、肝成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子αおよびβ、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−β等の神経成長因子、血小板成長因子、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β等の形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘発因子、インターフェロンα、β、およびγ等のインターフェロン、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５等のインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ等の腫瘍壊死因子、Ｃ５ａ、ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が、サイトカインのうちに含まれる。本明細書で使用される、サイトカインは、自然供給源または組み換え細胞培養物からのタンパク質、および自然配列サイトカインの生物学的活性等価物を含む。
【０１６３】
また別の実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、腫瘍の事前標的化における使用のために、「受容体」（そのようなストレプトアビジン）に複合され得、そこでは、免疫グロブリン受容体複合体が、患者に投与された後、クリアリング剤を使用して、非結合複合体を循環から取り除き、その後、細胞障害性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に複合される「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。代替の実施形態において、免疫グロブリンは、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を採用するために、酵素に複合されるか、操作可能に結合される。ＡＤＥＰＴは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬剤）を変換するプロドラッグ活性化酵素に免疫グロブリンを複合する、または操作可能に連結することにより使用され得る。
【０１６４】
免疫グロブリンパートナーが、複合体として使用される時、複合体パートナーは、ＮまたはＣ末端、または末端間のある残基を含む、本明細書に開示される免疫グロブリンの任意の領域に連結されてもよい。種々のリンカーは、免疫グロブリンに複合体パートナーを共有結合的に連結するために、本明細書に開示される免疫グロブリンに用途を見出し得る。本明細書において、「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「係留配列」、またはそれらの文法上の同等語は、２つの分子を結合し、多くの場合、２つの分子を１つの構造に配置する働きをする分子、または分子群（単量体または重合体等）を意味する。リンカーは、当該分野において知られており、例えば、ホモまたはヘテロ二機能性リンカーが、周知である（参照によりその全体が援用される、１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，ｐａｇｅｓ  １５５−２００を参照のこと）。いくつかの方法を、分子を共有結合的に一緒に連結するように使用することができる。これらは、これらに限定されないが、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮとＣ末端の間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介した連結、および化学的架橋試薬を介した連結を含む。この実施形態の一態様において、リンカーは、組み換え技術またはペプチド合成により生成される、ペプチド結合である。リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る：Ｇｌｙ、  Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒ。リンカーペプチドは、所望の活性を維持するように、相互に対して適切な高次構造を成すような方式で、２つの分子を連結するのに適当な長さを有するべきである。この目的に適切な長さは、少なくとも１つの、かつ５０を超えないアミノ酸残基を含む。一実施形態において、リンカーは、長さが約１〜３０のアミノ酸であり、例えば、リンカーは、長さが１〜２０のアミノ酸であってもよい。有用なリンカーは、当業者に理解されるように、グリシン−セリン重合体（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１として記述）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２として記述）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３として記述）を含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合
体、および他の柔軟なリンカーを含む。代替的に、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体を含む、種々の非タンパク質性重合体は、リンカーとしての用途を見出し得る。
【０１６５】
共結合分子の産生
【０１６６】
共結合分子を産生し、実験的に試験するための方法も、本明細書に開示する。開示される方法は、実施形態を任意の特定の操作の用途または理論に限定するものではない。むしろ、提供される方法は、１つ以上の免疫グロブリンが、免疫グロブリンを取得するように産生され、実験的に試験され得ることを、一般的に例示して説明するものである。抗体分子生物学、発現、生成、およびスクリーニングのための一般的な方法は、Ｄｕｅｂｅｌ  ＆  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１により編集されたＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、およびＨａｙｈｕｒｓｔ  ＆  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２００１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５：６８３−６８９、Ｍａｙｎａｒｄ  ＆  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，  ２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２：３３９−７６、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載され、全て、参照によりその全体が援用される。
【０１６７】
本明細書に開示される一実施形態において、共結合分子をコードし、その後、所望する場合、宿主細胞内にクローン化、発現、および測定され得る核酸が作製される。したがって、各タンパク質配列をコードする、核酸、および特にＤＮＡが作製され得る。これらの実践は、周知の手順を使用して実施される。例えば、本明細書に開示される免疫グロブリンの生成に用途を見出し得る種々の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）、および  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に記載されており、ともに、参照によりその全体が援用される。当業者に理解されるように、多くの配列を含むライブラリの正確な配列の生成は、高価で時間がかかる可能性がある。本明細書において、「ライブラリ」とは、これらに限定されないが、核酸またはアミノ酸配列の一覧、種々の位置での核酸またはアミノ酸の一覧、ライブラリ配列をコードする核酸を含む物理的ライブラリ、または精製または未精製形態のいずれかの変異体タンパク質を含む物理的ライブラリを含む、任意の形態の変異体の一式を意味する。したがって、本明細書に開示されるライブラリを効果的に生成するように使用され得る、種々の技法がある。このような方法は、これらに限定されないが、遺伝子アセンブリ法、ＰＣＲに基づく方法、およびＰＣＲの変形を使用する方法、リガーゼ連鎖反応に基づく方法、合成組み換え、エラーを起こしやすい増幅法、およびランダム変異を伴うオリゴを使用する方法等の混合オリゴ法、古典的な部位指定変異導入法、カセット変異導入法、ならびに他の増幅および遺伝子合成法を含む。当該分野において知られているように、遺伝子アセンブリ、変異導入、ベクターサブクローン化等のための種々の市販のキットおよび方法があり、このような市販製品は、免疫グロブリンをコードする核酸の生成に用途を見出す。
【０１６８】
本明細書に開示される共結合分子は、タンパク質の発現を誘発する、または生じるような適切な条件下で、共結合分子をコードする核酸を含有する、核酸、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することにより生成することができる。発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により異なり、日常の実験を通して、当業者によって容易に確認されるであろう。これらに限定されないが、哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞、および酵母を含む、多種多様の適切な宿主細胞が使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される免疫グロブリンの生成に用途を見出し得る、種々の細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、ＡＴＣＣ（登録商標）細胞株カタログに記載されている。
【０１６９】
一実施形態において、共結合分子は、発現コンストラクトが、レトロウイルスまたはアデノウイルス等のウイルスを用いて哺乳類細胞に導入される系を含む、哺乳類発現系で発現される。任意の哺乳類細胞、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、および霊長類の細胞を使用することができる。適切な細胞は、限定されないが、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ  Ｃ．６、ＨｅＬａ、Ｓｐ２／０、ＮＳ０細胞、およびそれらの変異体を含む、既知の研究細胞も含む。代替の実施形態において、ライブラリタンパク質は、バクテリア細胞で発現される。バクテリア発現系は、当該分野に周知であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌、ストレプトコッカスクレモリス、およびストレプトコッカスリビダンスを含む。代替の実施形態において、免疫グロブリンは、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウラバＢｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）または酵母細胞（例えば、出芽酵母、ピキア等）で産生される。代替の実施形態において、共結合分子は、無細胞翻訳系を使用して、生体外で発現される。原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および真核（麦芽、ウサギ網状赤血球）細胞の両方に由来する生体外翻訳系が、利用可能であり、関心のタンパク質の発現レベル、および機能特性に基づき選択されてもよい。例えば、当業者に理解されるように、生体外翻訳が、例えば、リボソーム提示等の、いくつかの提示技術に必要である。加えて、免疫グロブリンは、化学合成法により産生されてもよい。動物（例えば、ウシ、ヒツジ、またはヤギの乳、発育鶏卵、全昆虫幼虫等）および植物（例えば、トウモロコシ、タバコ、ウキクサ等）の両方の形質転換発現系も同様。
【０１７０】
本明細書に開示される共結合分子をコードする核酸は、タンパク質を発現するために、発現ベクターに導入されてもよい。種々の発現ベクターが、タンパク質発現のために利用されてもよい。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み入れられるベクターを含んでもよい。発現ベクターは、宿主細胞型と適合可能であるように構築される。したがって、本明細書に開示される免疫グロブリンの生成に用途を見出す発現ベクターは、これらに限定されないが、哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞、酵母、および生体外系で、タンパク質発現を可能にするものを含む。当該分野において知られているように、本明細書に開示される共結合分子を発現するための用途を見出し得る、種々の発現ベクターが、商業的または別様に入手可能である。
【０１７１】
発現ベクターは、典型的に、制御もしくは調節配列と操作可能に連結するタンパク質、選択可能マーカー、任意の融合パートナー、および／または追加要素を含む。本明細書において、「操作可能に連結される」とは、核酸が、別の核酸配列と機能的関係に配置されることを意味する。概して、これらの発現ベクターは、共結合分子をコードする核酸に操作可能に連結される転写および翻訳調節核酸を含み、典型的に、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞に適している。一般的に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびに転写促進因子または活性化因子配列を含み得る。また当該分野において知られているように、発現ベクターは、典型的に、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にする、選択遺伝子またはマーカーを含有する。選択遺伝子は、当該分野に周知であり、使用される宿主細胞により異なる。
【０１７２】
共結合分子は、発現タンパク質の標的、精製、スクリーニング、提示等を可能にするように、融合パートナーに操作可能に連結されてもよい。融合パートナーは、リンカー配列を介して、免疫グロブリン配列に連結されてもよい。リンカー配列は、一般的に、少数のアミノ酸、典型的には、１０より少ないアミノ酸を含むが、それより長いリンカーも使用されてもよい。典型的には、リンカー配列は、柔軟かつ分解に対して耐性であるように選択される。当業者に理解されるように、広範な種々の配列のいずれをも、リンカーとして使用することができる。例えば、一般的なリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合パートナーは、免疫グロブリンおよび任意の関連する融合パートナーを所望の細胞部位または細胞外媒体に誘導する、標的またはシグナル配列であってもよい。当該分野において知られているように、特定のシグナル伝達配列は、成長媒体か、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔のいずれかの中に分泌されるタンパク質を標的とし得る。融合パートナーは、精製および／またはスクリーニングを可能にする、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列でもあってよい。このような融合パートナーは、これらに限定されないが、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（例えば、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システムで使用するためのＨ６およびＨ１０、または他のタグ（例えば、Ｎｉ＋２親和性カラム））、ＧＳＴ融合物、ＭＢＰ融合物、Ｓｔｒｅｐタグ、バクテリア酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、および抗体の標的とされるエピトープタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグ等）を含む。当業者に理解されるように、このようなタグは、精製、スクリーニング、または両方に有用であり得る。例えば、免疫グロブリンは、Ｎｉ＋２親和性カラムに固定することにより、Ｈｉｓタグを使用して生成されてもよく、次いで、精製後、同じＨｉｓタグは、（以下に記載するように）ＥＬＩＳＡまたは他の結合測定法を実施するために、抗体をＮｉ＋２被覆プレートに固定するために使用されてもよい。融合パートナーは、免疫グロブリンをスクリーニングするための選択法の使用を可能にし得る（以下を参照）。種々の選択法を可能にする融合パートナーは、当該分野において周知である。例えば、免疫グロブリンライブラリの
構成要素を遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合することにより、ファージ提示法が採用され得る（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６；  Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８、Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７、参照によりその全体が援用される）。融合パートナーは、免疫グロブリンの標識を可能にし得る。代替的に、融合パートナーは、発現ベクター上で、特定の配列に結合されてもよく、融合パートナーおよび関連免疫グロブリンが、共有結合的に、または非共有結合的に、それらをコードする核酸と連結されることを可能にする。外因性核酸の宿主細胞への導入方法は、当該分野において周知であり、使用される宿主細胞により異なる。技法は、これらに限定されないが、デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈降法、塩化カルシウム処理、ポリブレン媒介形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ウイルス性またはファージ感染、リポソームへのリヌクレオチドのカプセル封入、およびＤＮＡの核への直接微量注法を含む。哺乳類細胞の場合、形質移入は、一過性または安定性のいずれかであってもよい。
【０１７３】
一実施形態において、共結合分子は、発現後に精製または単離される。タンパク質は、当業者に知られている種々の方式で、単離または精製することができる。標準的な精製方法は、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣ等のシステムを使用して大気圧力または高圧で実施される、イオン交換、粗水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、および逆相を含むクロマトグラフィー技術を含む。精製法は、電気泳動法、免疫学、沈降法、透析法、および等電点電気泳動法も含む。タンパク質濃度と併用して、限外濾過法および透析濾過法も、有用である。当該分野に周知のように、種々の自然のタンパク質は、Ｆｃおよび抗体に結合し、これらのタンパク質は、本明細書に開示される免疫グロブリンの精製するための用途を見出すことができる。例えば、細菌タンパク質ＡおよびＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌タンパク質Ｌは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合し、当然、抗体の標的抗原にも同様に結合する。精製は、多くの場合、特定の融合パートナーにより可能となり得る。例えば、免疫グロブリンは、ＧＳＴ融合が採用される場合、グルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが採用される場合、Ｎｉ＋２親和性クロマトグラフィー、またはｆｌａｇタグが使用される場合、固定抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製されてもよい。適切な精製技法の一般的な指針については、例えば、参照によりその全体が援用される、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照のこと。必要な精製の程度は、免疫グロブリンのスクリーニングまたは使用に応じて異なる。いくつかの場合においては、精製は必要ない。例えば、一実施形態において、免疫グロブリンが分泌される場合、スクリーニングが、媒体から直接行われてもよい。当該分野に周知のように、いくつかの選択の方法は、タンパク質の精製を含まない。したがって、例えば、免疫グロブリンのライブラリは、ファージ提示ライブラリの中に作製される場合、タンパク質精製は実施されなくてもよい。
【０１７４】
生体外実験
【０１７５】
共結合分子は、これらに限定されないが、生体外検定法、生体内および細胞を用いた検定法、ならびに選択技術を使用するものを含む、種々の方法を使用してスクリーニングされてもよい。自動高処理スクリーニング技術が、スクリーニング手順に利用されてもよい。スクリーニングは、融合パートナーまたは標識の使用を採用してもよい。融合パートナーの使用は、上で論じられた。本明細書において、「標識された」とは、本明細書に開示される免疫グロブリンが、スクリーニングでの検出を可能にするように結合される、１つ以上の要素、同位体、または化学化合物を有することを意味する。一般的に、標識は、次の３つに分類される：ａ）抗体により認識される融合パートナーとして組み込まれるエピトープであってもよい、免疫標識、ｂ）放射性活性もしくは重同位体であってもよい、同位体標識、およびｃ）蛍光色素および比色色素、もしくは他の標識法を可能にするビオチン等の分子を含んでもよい、小分子標識。標識は、任意の位置で化合物に組み込まれてもよく、タンパク質発現中に、生体外または生体内に組み込まれてもよい。
【０１７６】
一実施形態において、共結合分子の機能的および／または生物物理学的特性は、生体外検定でスクリーニングされる。生体外検定は、関心のスクリーニング特性の広範なダイナミックレンジを可能にし得る。スクリーニングされ得る特性は、これらに限定されないが、安定性、溶解性、およびＦｃリガンド、例えば、ＦｃγＲに対する親和性を含む。複数の特性が、同時または個別にスクリーニングされてもよい。タンパク質は、検定の必要条件に応じて、精製されていても、精製されていなくてもよい。一実施形態において、スクリーンニングは、共結合分子を結合することが既知の、またはそう思われる、共結合分子のタンパク質または非タンパク質分子への結合に対する定性もしくは定量性結合検定である。一実施形態において、スクリーニングは、標的抗原への結合を測定するための結合検定である。代替の実施形態において、スクリーニングは、これらに限定されないが、ＦｃγＲのファミリー、新生児型受容体ＦｃＲｎ、補体タンパク質Ｃ１ｑ、および細菌タンパク質ＡおよびＧを含む、Ｆｃリガンドへの共結合分子の結合についての検定である。該Ｆｃリガンドは、任意の生物からであってもよい。一実施形態において、Ｆｃリガンドは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、および／またはサルからのものである。結合検定は、限定されないが、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）および  ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）を用いた検定、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（増幅発光性近接均質アッセイ）、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）としても知られる）、等温滴定熱量測定法、示差走査熱量測定法、ゲル電気泳動法、およびゲル濾過を含むクロマトグラフィーを含む、当該分野において知られている種々の方法を使用して実施され得る。これら、および他の方法は、免疫グロブリンのある融合パートナーまたは標識をうまく利用し得る。検定は、限定されないが、発色性、蛍光性、発光性、または同位体標識を含む、種々の検出方法を採用してもよい。
【０１７７】
共結合分子の生物物理学的特性、例えば、安定性および溶解性は、当該分野において知られている種々の方法を使用して試験されてもよい。タンパク質の安定性は、フォールドとアンフォールド状態の間の熱力学的平衡を測定することにより決定され得る。例えば、本明細書に開示される共結合分子は、化学変性剤、熱、またはｐＨを使用してほどかれてもよく、この移行は、これらに限定されないが、円二色性分光法、蛍光分光法、吸光分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法、およびタンパク質分解を含む方法を使用して監視されてもよい。当業者により理解されるように、フォールドおよびアンフォールドの移行の動態パラメータも、これら、および他の技法を使用して監視され得る。共結合分子の溶解性および全体的な構造の統合性は、当該分野において知られている広範な方法を使用して、定量的、または定性的に決定され得る。本明細書に開示される共結合分子の生物物理学的特性を特徴付けるための用途を見出し得る方法は、ゲル電気泳動法、等電点電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、ペプチドマッピング、オリゴ糖マッピング、質量分析法、紫外吸光分光法、蛍光分光法、円二色性分光法、等温滴定熱量測定法、示差走査熱量測定法、超遠心分析法、動的光散乱法、タンパク質分解および架橋結合、濁度測定、フィルタ遅延アッセイ、免疫学的検定、蛍光色素結合検定、タンパク質染色法、顕微鏡法、およびＥＬＩＳＡまたは他の結合検定を介した凝集物の検出を含む。Ｘ線結晶学的技法およびＮＭＲ分光法を採用した構造分析にも、用途を見出し得る。一実施形態において、安定性および／または溶解性は、所定の時間期間の後に、タンパク質溶液の量を決定することにより測定され得る。この検定において、タンパク質は、例えば、高温、低ｐＨ、または変性剤の存在等の、ある極端な条件に曝されても、曝されなくてもよい。機能は、典型的に、安定性、溶解性、および／またはよく折り畳まれた構造のタンパク質を必要とするため、前述の機能検定および結合検定も、このような測定を実施するための方式を提供する。例えば、免疫グロブリンを含む溶液は、標的抗原を結合するその能力について測定され、その後、１つ以上の所定の時間期間の間
、高温に曝され、その後、再び、抗原結合について測定され得る。アンフォールドおよび凝集タンパク質は、抗原を結合する能力があると予期されないため、活性残存量は、共結合分子の安定性および溶解性の尺度を提供する。
【０１７８】
一実施形態において、共結合分子は、１つ以上の細胞を用いた検定、または生体外検定を使用して試験されてもよい。このような検定において、細胞が、ライブラリに属する個別の変異体、または変異体群に曝されるように、精製もしくは未精製の免疫グロブリンが、典型的に、外因的に添加される。これらの検定は、必ずしもそうではないが、典型的に、免疫グロブリンの標的抗原に結合し、例えば、細胞溶解、ファゴサイトーシス、リガンド／受容体結合阻害、成長および／または増殖の阻害、アポトーシス等の、ある生化学事象を媒介する能力の生物学に基づく。このような検定は、多くの場合、細胞の免疫グロブリンへの応答、例えば、細胞生存、細胞ファゴサイトーシス、細胞溶解、細胞形態の変化、または自然遺伝子もしくはリポーター遺伝子の細胞発現等の転写活性化を監視することを含む。例えば、このような検定は、共結合分子のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣを誘発する能力を測定し得る。いくつかの検定において、例えば、血清補体、または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージ等のエェクター細胞等の、追加の細胞または構成要素が、つまり、標的細胞に加え、添加される必要がある場合がある。このような追加細胞は、任意の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルからであってもよい。架橋または単量体抗体は、抗体の標的抗原を発現する特定の細胞株のアポトーシスをもたらすか、または検定に添加された免疫細胞による、標的細胞への攻撃を媒介する場合がある。細胞の死または生存を監視するための方法は、当該分野において知られており、色素、フルオロフォア、免疫化学、細胞化学、および放射性試薬の使用を含む。例えば、カスパーゼ検定またはアネキシン−フルオロ結合物は、アポトーシスの測定を可能にし得、放射性基質（例えば、クロム−５１放出検定）の取り込み、もしくは放出、またはアラマーブルー等の蛍光色素の代謝減少は、細胞成長、増殖、または活性の監視を可能にし得る。一実施形態において、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡを用いた、細胞障害性検定（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ）が使用される。代替的に、死んだ、または損傷した標的細胞は、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ等の、１つ以上の自然な細胞内タンパク質の放出を測定することにより監視され得る。転写の活性化も、細胞
を用いた検定の機能を測定するための方法として機能する。この場合、上方制御または下方制御されてもよい自然遺伝子またはタンパク質について測定することにより、応答が監視されてもよく、例えば、特定のインターロイキンの放出が測定されてもよく、代替的に、ルシフェラーゼまたはＧＦＰリポーターコンストラクトを介して、読出しが行われてもよい。細胞を用いた検定は、免疫グロブリンの存在に対する応答としての、細胞の形態変化の測定も含み得る。このような検定用の細胞型は、原核または真核であってもよく、当該分野において知られている種々の細胞株が採用されてもよい。代替的に、細胞を用いたスクリーニングは、共結合分子をコードする核酸で、形質転換またはそれを形質移入された細胞を使用して実施される。
【０１７９】
生体外検定は、限定されないが、結合検定、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、細胞毒性、増殖、過酸化物／オゾン放出、エフェクター細胞の走化性、低減されたエフェクター機能抗体によるこのような検体の阻害、１００倍超の改善または１００倍超の減少等の活性の範囲、レセプター活性の混合、およびこのようなレセプタープロファイルから予期される検定結果を含む。
【０１８０】
生体内実験
【０１８１】
本明細書に開示される共結合分子の生物学的特性は、細胞、組織、および全生物実験において特徴付けされてもよい。当該分野において知られているように、薬物は、多くの場合、疾病または疾病モデルに対する治療における薬物の効果を測定するために、または薬物の薬物動態、毒性、および他の特性を測定するために、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含む動物において試験される。該動物は、疾病モデルと称される場合がある。本明細書に開示される共結合分子に関して、候補ポリペプチドのヒトでの効果の可能性を評価するために動物モデルを使用する時、特別な課題が生じる。これらは、少なくとも部分的に、ヒトＦｃ受容体に対する親和性に特定の作用を有する共結合分子は、オルソロガスな動物の受容体と同じ親和性作用を有さないかもしれないという事実による。これらの問題は、真のオルソロガスの正確な割り当てに関連する、回避不可能な不明確さ（Ｍｅｃｈｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２  ５４：４６３‐４６８、参照によりその全体が援用される）、およびいくつかのオルソロガスが、単純に、動物に存在しないという事実（例えば、ヒトは、ＦｃγＲＩＩａを有するが、マウスは有しない）により、さらに深刻化し得る。治療用物質は、多くの場合、これらに限定されないが、マウス株ＮＺＢ、ＮＯＤ、ＢＸＳＢ、ＭＲＬ／ｌｐｒ、Ｋ／ＢｘＮ、および遺伝子導入（ノックインおよびノックアウトを含む）を含む、マウスにおいて試験される。このようなマウスは、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）等の、ヒト臓器に特異的な、全身性自己免疫または炎症性疾患病変に似た、種々の自己免疫状態を発症させることができる。例えば、自己免疫疾患に対して意図される本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリンの疾患病変の発達を低減する、または阻害する能力を決定するようにマウスを処置することにより、このようなマウスモデルにおいて試験することができる。マウスとヒトＦｃγ受容体系間の不和合性のため、代替的なアプローチとして、ヒトＰＢＬまたはＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ，  ｈｕＰＢＭＣ−ＳＣＩＤ）を免疫欠損マウスに植え付けることにより、ヒトエフェクター細胞およびＦｃ受容体を伴う半機能的なヒト免疫系を提供する、
マウスＳＣＩＤモデルを使用する。このようなモデルにおいて、抗原攻撃（破傷風トキソイド等）は、Ｂ細胞を活性化して、形質細胞に分化し、免疫グロブリンを分泌し、したがって、抗原特性的液性免疫を再構成する。したがって、Ｂ細胞上でＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合する、本明細書に開示される二重標的免疫グロブリンは、Ｂ細胞分化を特異的に阻害する能力を検査するために試験されてもよい。このような実験法は、治療物質として使用される該免疫グロブリンの可能性の判定についての有意義なデータを提供し得る。他の生物、例えば、哺乳類も、試験に使用されてもよい。例えば、サルは、ヒトに対するその遺伝子的類似性のため、治療モデルに適しており、したがって、本明細書に開示される免疫グロブリンの本明細書に開示される免疫グロブリンの効果、毒性、薬物動態、または他の特性を試験するために使用することができる。ヒトにおける本明細書に開示される免疫グロブリンの試験が、最終的に、薬物としての承認のために必要となり、したがって、当然のことながら、これらの実験が意図される。したがって、本明細書に開示される免疫グロブリンは、その治療効果、毒性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定するように、ヒトにおいて試験され得る。
【０１８２】
本明細書に開示される共結合分子は、動物モデルまたはヒトにおけるＦｃ含有治療に優れた動作を与え得る。この明細書に記載する、このような免疫グロブリンの受容体結合プロファイルは、例えば、細胞障害性薬物の潜在能を増加するように、または薬物作用の選択性を改善するように、特定のエフェクター機能もしくはエフェクター細胞を標的にするように選択されてもよい。さらに、いくつかの、または全てのエフェクター機能を低減し、したがって、このようなＦｃ含有薬物の副作用、または毒性を低減し得る受容体結合プロファイルが、選択され得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ  およびＦｃγＲＩＩａに対して低減された結合を有する免疫グロブリンは、ほとんどの細胞媒介性エフェクター機能を排除するように選択され得るか、またはＣ１ｑに対して低減された結合を有する免疫グロブリンが、補体媒介性エフェクター機能を制限するように選択されてもよい。いくつかの状況において、このようなエフェクター機能は、毒性作用の可能性を有することが知られている。したがって、これらの排除は、Ｆｃ保有薬物の安全性を増加し、このような改善された安全性は、動物モデルにおいて特徴付けされ得る。いくつかの状況において、このようなエフェクター機能は、望ましい治療活性を媒介することが知られている。したがって、これらの強化は、Ｆｃ保有薬物の活性または潜在能力を増加し、このような改善された活性または潜在能力は、動物モデルにおいて特徴付けされ得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、種々のヒト疾患の臨床的適切な動物モデルにおける効果について評価することができる。多くの場合、適切なモデルは、特定の抗原および受容体に対する種々の遺伝子導入動物を含む。
【０１８４】
ヒトＦｃ受容体（例えば、ＣＤ３２ｂ）を発現するもの等、適切な遺伝子導入モデルは、免疫グロブリンおよびＦｃ融合物を、それらの効果において評価し、試験するために使用され得る。マウスまたは他のゲッ齒類において、エフェクター機能を直接的、または間接的に媒介するヒト遺伝子の導入による共結合分子の評価は、自己免疫疾患およびＲＡにおける効果の生理学的研究を可能にし得る。ＦｃγＲＩＩｂ等のヒトＦｃ受容体は、ヒト多型の特異性および組み合わせのゲッ齒類への導入をさらに可能にするであろう、遺伝子プロモーター（ＧからＣの−３４３）、または受容体１８７  ＩもしくはＴの膜貫通ドメイン等に多型を有する。多型特異的ＦｃＲに関与する種々の研究は、この項に限定されず、本明細書を通して指定される、ＦｃＲ一般の全ての論議および用途を包含する。本明細書に開示される免疫グロブリンは、このような遺伝子導入モデルにおいて、Ｆｃ含有薬物に優れた活性を与え得、特にヒトＦｃγＲＩＩｂ媒介活性用に最適化された結合プロファイルを有する変異体は、遺伝子導入ＣＤ３２ｂマウスにおいて、優れた活性を示し得る。他のヒトＦｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ等の遺伝子導入マウスの効果において、同様の改善が、それぞれの受容体に最適化された結合プロファイルを有する共結合分子について観察され得る。複数のヒト受容体の遺伝子導入マウスは、対応する複数の受容体に最適化された結合プロファイルを有する免疫グロブリンについて、改善された活性を示すであろう。
【０１８５】
ヒト患者における候補治療抗体の潜在的な効果を特徴付けるための、動物モデルの使用に関連する問題点および不明確さのため、本明細書に開示されるいくつかの変異体ポリペプチドは、ヒトにおける評価を評価するための代用としての有用性を見出し得る。このような代用分子は、動物系において、対応する候補ヒト免疫グロブリンのＦｃＲおよび／または補体生物学を模倣し得る。この模倣は、特定の免疫グロブリンおよび動物に対するヒト受容体との間の相対的関連親和性により顕在化される可能性が最も高い。例えば、阻害ヒトＦｃγＲＩＩｂに対して、低減された親和性を有するＦｃ変異体の潜在的なヒトにおける効果を評価するためにマウスモデルを使用する場合、適切な代用変異体は、マウスＦｃγＲＩＩに対して、低減された親和性を有するだろう。代用Ｆｃ変異体は、ヒトＦｃ変異体、動物Ｆｃ変異体、または両方と関連して作製され得ることに留意されたい。
【０１８６】
一実施形態において、共結合分子の試験は、標的抗原を持つ特定の標的細胞の欠乏の評価を容易にするために、霊長類（例えば、カニクイザルモデル）における効果の試験を含んでもよい。さらなる霊長類のモデルは、限定されないが、自己免疫、移植、および癌の治療試験における、Ｆｃポリペプチドを評価するための、アカゲザルの使用を含む。
【０１８７】
毒性試験は、標準的な薬理学的プロファイルで評価できない、または薬剤の反復投与後にのみに発生する、抗体、もしくはＦｃ融合物に関連する効果を決定するために実施される。大半の毒性試験は、新規治療学的実体がヒトに導入される前に、任意の予測できない有害作用が見過ごされないことを確実にするために、ゲッ齒類およびゲッ齒類以外の２つの種属において実施される。一般的に、これらのモデルは、遺伝子毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖／発生毒性、および発癌を含む、種々の毒性を測定することができる。前述のパラメータには、食消費量、体重、抗体産生、臨床化学の標準的な測定、および標準的な臓器／組織の肉眼および顕微鏡検査（例えば、心毒性）を含む。測定のさらなるパラメータは、もしあれば、注入部位損傷および中和抗体の測定である。従来、裸または複合のモノクローナル抗体治療学は、放射標識種属の正常組織、免疫原性／抗体産生、複合体またはリンカー毒性、および「傍観者」毒性を用いた、交差反応について評価される。それにもかかわらず、このような試験は、特定の問題に対処するように個別化され、ＩＣＨ  Ｓ６（上記される、生物工学製品についての安全性試験）で規定されるガイダンスに従わなければならない場合がある。従って、原則として、製品は、十分に良く特徴付けされ、不純物／汚染物が除去され、試験材料が、開発全体を通して同等であり、ＧＬＰコンプライアンスが維持されることが、原則である。
【０１８８】
本明細書に開示される共結合分子の薬物動態（ＰＫ）は、種々の動物系で試験され得、最も適切なのは、カニクイザルおよびアカゲザル等のヒト以外の霊長類である。血漿濃度およびクリアランスを使用して、６０００倍（０．０５〜３００ｍｇ／ｋｇ）の用量範囲にわたる単一または反復ｉ．ｖ．／ｓ．ｃ．投与が、半減期（日〜週）について評価され得る。定常状態での分布量および全身吸収レベルも測定され得る。このような測定のパラメータの例としては、一般的に、最大観測血漿濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘ到達時間（Ｔｍａｘ）、時間０〜無限大［ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）］  の血漿濃度時間曲線下面積、および見かけ消失半減期（Ｔ１／２）が挙げられる。さらなる測定パラメータは、ｉ．ｖ．投与および生体利用性の後に得た、濃度−時間データの区画解析を含み得る。
【０１８９】
本明細書に開示される共結合分子は、動物系またはヒトにおいて、Ｆｃ含有治療に優れた薬物動態を与え得る。例えば、ＦｃＲｎへの結合増加は、Ｆｃ含有薬物の半減期および曝露を増加し得る。代替的に、ＦｃＲｎへの結合減少は、このような薬物が副作用を有する時等、露出の減少が好まれる場合、Ｆｃ含有薬物の半減期および曝露を低減し得る。
【０１９０】
多数のＦｃ受容体が、種々の免疫細胞型上、ならびに異なる組織で異なって発現することは、当該分野において知られている。Ｆｃ受容体の異なった組織分布は、最終的に、本明細書に開示される共結合分子の薬力学（ＰＤ）および薬物動態（ＰＫ）特性に影響を与え得る。本発明の共結合分子は、多数のＦｃ受容体に対して様々な親和性を有するため、ＰＤおよび／またはＰＫ特性についてのポリペプチドのさらなるスクリーニングは、各候補ポリペプチドにより付与されるＰＤ、ＰＫ、および治療効果の最適なバランスを決定するのに非常に有用であり得る。
【０１９１】
薬力学試験は、限定されないが、特異的細胞の標的化、またはシグナル伝達機構の遮断、抗原特異的抗体の阻害の測定等を含み得る。本明細書に開示される共結合分子は、特定のエフェクター細胞集団を標的とし、それによって、可能性を改善するか、または特定の好ましい生理的区画の中への貫通を増加するように、特定の活性を誘発するようにＦｃ含有薬物を方向付けすることができる。例えば好中球活性および局在化は、ＦｃγＲＩＩＩｂを標的とする共結合分子のによって、標的とすることができる。このような薬力学作用は、動物モデル、またはヒトにおいて実証され得る。
【０１９２】
使用
【０１９３】
作製されると、本明細書に開示される共結合分子は、種々の方法において用途を見出す。好適な実施形態において、方法は、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂの両方が共結合分子によって結合され、細胞が阻害されるように、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂを発現する細胞を共結合分子と接触させることを含む。本内容において、「阻害される」とは、共結合分子が、ＩｇＥ＋Ｂ細胞の活性および／もしくは増殖を防止するか、または低減していることを意味する。
【０１９４】
本明細書に開示される共結合分子は、広範な製品において用途を見出し得る。一実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、治療、診断、または研究試薬である。共結合分子は、モノクローナルまたはポリクローナルである組成物において用途を見出し得る。本明細書に開示される共結合分子は、治療目的に使用されてもよい。当業者により理解されるように、本明細書に開示される共結合分子は、抗体等が使用され得る、任意の治療目的のために使用されてもよい。共結合分子は、限定されないが、自己免疫および炎症性疾患、感染症、および癌を含む疾患を治療するように、患者に投与されてもよい。
【０１９５】
本明細書に開示される目的における「患者」とは、ヒトおよび他の動物、例えば、他の哺乳類の両方を含む。したがって、本明細書に開示される共結合分子は、ヒト治療および獣医学的用途の両方を有する。本明細書に開示される、「治療」または「治療する」とは、疾病または疾患に対する治療的処置、ならびに予防的もしくは抑制手段を含むことを意味する。したがって、例えば、疾病の発現前の共結合分子の良好な投与は、疾病の治療をもたらす。別の実施例として、疾病の症状と戦うための、疾病の臨床病態後の最適化された共結合分子の良好な投与は、疾病の治療に含まれる。「治療」および「治療する」とは、疾病を根絶するための、疾病出現後の、最適化された免疫グロブリンの投与も包含する。予想される臨床症状の軽減、および疾病の回復の可能性を伴った、発現後、および臨床症状が発達した後の薬剤の良好な投与は、疾病の治療に含まれる。これらの「治療の必要な」とは、既に疾病または疾患を有する哺乳類、ならびに疾病または疾患が予防されるべきものを含む、疾病または疾患を有する傾向があるものを含む。
【０１９６】
一実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、不適切なタンパク質、または他の分子の発現を含む疾病を有する患者に投与される。本明細書に開示される範囲内において、これは、例えば、存在するタンパク質量の変化、タンパク質の局在化、翻訳後修飾、立体構造、突然変異体または病原体の存在等による、異常タンパク質により特徴付けされる疾病および疾患を含むものとする。同様に、疾病または疾患は、限定されないが、多糖およびガングリオシドを含む、分子変化により特徴付けされ得る。過剰存在は、限定されないが、分子レベルでの過剰発現、活性部位での出現の遷延もしくは蓄積、または正常に対してタンパク質の活性の増加を含む、任意の原因による場合がある。この定義内には、タンパク質の減少により特徴付けされる疾病および疾患が含まれる。この減少は、限定されないが、分子レベルでの発現の減少、活性部位での出現の短縮もしくは減少、タンパク質の突然変異型、正常に対してタンパク質の活性の減少を含む、任意の原因による場合がある。このような過剰存在またはタンパク質の減少は、正常な発現、出現、またはタンパク質の活性に対して測定され得、該測定は、本明細書に開示される免疫グロブリンの発達および／または臨床試験において、重要な役割を果たし得る。
【０１９７】
ＩｇＥ媒介性疾患、例えば、食物および環境アレルギー、ならびにアレルギー性喘息を治療するための新規方法を、本明細書において開示する。好適な実施形態において、本発明の製品および方法により治療され得るアレルギー性の疾病は、アレルギー性およびアトピー性喘息、アトピー性皮膚炎および湿疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎および鼻結膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性脈管炎、およびアナフィラキシーショックを含む。  治療され得る環境的および食物アレルギーは、チリダニ、ゴキブリ、ネコおよび他の動物、花粉（ブタクサ、ギョウギシバ、ロシアアザミ、カシ、ライ麦等）、カビおよび真菌（例えば、葉上生息菌、コウジカビ等）、天然ゴム、昆虫咬傷（ミツバチ、スズメバチ等）、ペニシリンおよび他の薬物、イチゴおよび他の果物ならびに野菜、落花生、大豆および他のマメ科植物、クルミおよび他の木の実、甲殻類および他の海産物、牛乳および他の乳製品、コムギおよび他の穀物、ならびに卵に対するアレルギーを含む。実際、いかなる食物アレルゲン、エアロアレルゲン、職業性アレルゲン、または他のＩｇＥ媒介性環境アレルゲンも、本発明に開示される製品の治療量により治療され得る。一般的なアレルゲンの例については、Ａｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｋｉｎ  ｔｅｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  １０  ｃｏｍｍｏｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１６（２），  ３７７−３８３（２００５）を参照のこと。
【０１９８】
本明細書に開示される共結合分子に対して良い臨床応答を示す可能性のある、または本明細書に開示される共結合分子で治療した時に、１つ以上の現在使用している治療薬よりも、有意に良好な応答を示す可能性がある患者を特定するための診断試験も、開示する。当該分野において知られている、ヒトにおけるＦｃγＲ多型を決定するための、いくつかの方法のいずれをも使用することができる。さらに、血液および組織試料等の臨床試料上で実施される、予後検査も開示する。このような検査は、機構に関わらず、活性について検定し得る。このような情報は、臨床試験の組み入れまたは除外のために、患者を特定するため、または適切な投与量および治療レジメンに関する決定を通知するために使用され得る。このような情報は、このような検定において優れた活性を示す、特定の共結合分子を含有する薬物を選択するためにも使用され得る。
【０１９９】
製剤
【０２００】
本明細書に開示される共結合分子および１つ以上の治療的活性剤が製剤化される、医薬組成物が企図される。本明細書に開示される共結合分子の製剤は、所望の程度の純度を有する該免疫グロブリンを任意の医薬的に許容される担体、賦形剤、安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０、参照によりその全体が援用される）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投与量および濃度において、受給者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、  防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルオルベンジル（ｏｒｂｅｎｚｙｌ）アルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖類、ＥＤＴＡ糖のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖類、甘味料および他の風味剤、微結晶セルロース、ラクトース、コーンスターチおよび他のスターチ類等の増量剤、結合剤、添加剤、着色剤、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンを含む医薬組成物は、酸および塩基付加塩の両方を含むものとする、医薬的に許容される塩として存在する等の、水溶性形態であってもよい。「医薬的に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的効果を維持し、生物学的に
、または別の点で望ましくないことがなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸で形成される塩類を指す。「医薬的に許容される塩基付加塩類」とは、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩等に由来するものを含む。いくつかの実施形態は、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩の少なくとも１つを含む。医薬的に許容される有機非毒性塩基由来の塩類は、一級、二級、および三級アミン類、自然に生じる置換アミン類を含む置換アミン類、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、およびエタノールアミン等の環式アミンならびにイオン交換樹脂の塩類を含む。生体内投与に使用される製剤は、無菌であってもよい。これは、無菌濾過膜を通した濾過、または他の方法により容易に達成される。
【０２０１】
本明細書に開示される共結合分子は、免疫リポソームとしても製剤化されてもよい。リポソームは、治療薬を哺乳類に送達するのに有用である、様々な種類の脂質、リン脂質、および／または界面活性物質を含む小胞である。免疫グロブリンを含有するリポソームは、当該分野において知られている方法により調製される。リポソームの構成要素は、通常、生体膜の脂質配置に類似する、二分子層構造に配列される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む、脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成され得る。リポソームは、所定の孔径のフィルタを通して押出され、所望の径のリポソームが得られる。
【０２０２】
共結合分子および他の治療活性剤は、限定されないが、コロイド脱混合現象技法、界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、またはポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微細球、微小乳濁液、ナノ粒子およびナノカプセル）、およびマクロエマルションを含む方法により調製される、マイクロカプセルに封入されてもよい。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に開示されており、参照によりその全体が援用される。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例としては、マトリックスが、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である、固体疎水性重合体の、半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド、グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸との共重合体、非分解性エチレン−ビニル酢酸、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸リュープロリドから成る注射可能な微小球）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、およびポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）のマトリックスに組み込まれる、所望の生理活性分子からなる微小球に基づく送達系である、ＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）（Ａｌｋｅｒｍｅｓから市販）が挙げられる。
【０２０３】
投与
【０２０４】
本明細書に開示される共結合分子を含む、例えば、無菌水溶液の形態での医薬組成物の投与は、限定されないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、局所（例えばゲル、塗剤、ローション、クリーム等）、腹膜内、筋肉内、肺内、膣内、非経口、直腸、または眼内を含む、様々な方式で行われてもよい。いくつかの場合において、例えば、創傷、炎症等の治療において、免疫グロブリンは、溶液またはスプレーとして直接適用されてもよい。当該分野において知られているように、医薬組成物は、導入様式に応じて製剤化されてもよい。
【０２０５】
皮下投与は、患者が、医薬組成物を自分で投与し得る状況において使用されてもよい。多くのタンパク質治療は、皮下投与の最大許容量で、治療有効量の製剤を可能にするのに十分に強力ではない。この問題は、アルギニン−ＨＣｌ、ヒスチジン、およびポリソルベートを含む、タンパク質製剤の使用により、ある程度対処され得る。本明細書に開示される抗体は、例えば、効力の増加、血清半減期の改善、または溶解性の強化により、皮下投与により適し得る。
【０２０６】
当該分野において知られているように、タンパク質治療物質は、多くの場合、ＩＶ注入、またはボーラスにより送達され得る。本明細書に開示される抗体は、また、このような方法を使用して送達されてもよい。例えば、注入ビヒクルとして０．９％の塩化ナトリウムを含む、静脈内注入による投与であってもよい。
【０２０７】
肺送達は、吸入器具または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む製剤を使用して達成されてもよい。  例えば、Ａｒａｄｉｇｍから市販されるＡＥＲｘ（登録商標）吸入可能技術、またはＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから市販されるＩｎｈａｎｃｅ（登録商標）肺送達システムが使用されてもよい。本明細書に開示される抗体は、肺内送達により適し得る。ＦｃＲｎは、肺に存在し、肺から血流への輸送を促進し得る（例えば、  Ｓｙｎｔｏｎｉｘ  ＷＯ  ０４００４７９８、Ｂｉｔｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：９７６３−８、ともに、参照によりその全体が援用される）。したがって、肺でより効果的にＦｃＲｎを結合する、または血流により効果的に放出される抗体は、肺内投与後、改善された生体適合性を有し得る。本明細書に開示される抗体は、例えば、改善された溶解性または等電点の変化により、肺内投与により適し得る。
【０２０８】
さらに、本明細書に開示される共結合分子は、例えば、胃内ｐＨでの改善された安定性、およびタンパク質分解に対する耐性の増加により、経口送達により適し得る。さらに、ＦｃＲｎは、成人の腸上皮で発現するようであり、したがって、改善されたＦｃＲｎ相互作用プロファイルを有する本明細書に開示される抗体は、径口投与後、強化された生体適合性を示し得る。抗体のＦｃＲｎ媒介性輸送は、胃腸管、呼吸器、および生殖器のもの等、他の粘膜でも生じ得る。
【０２０９】
加えて、いくつかの送達系のいずれも、当該分野において知られており、本明細書に開示される抗体を投与するために使用されてもよい。例としては、これらに限定されないが、リポソーム、微小粒子、微小球（例えば、ＰＬＡ／ＰＧＡ  微小球）等への封入が挙げられる。代替的に、膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、ゼラチン様物質の移植が使用されてもよい。徐放系は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクチド、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸（ｇｕｔａｍａｔｅ）との共重合体、エチレン−ビニル酢酸、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）等の乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸等の、重合物質またはマトリックスを含んでもよい。例えば、レトロウイルス感染、直接注射、または脂質、細胞表面受容体、または他の形質導入剤でのコーティングにより、本明細書に開示される免疫グロブリンをコードする核酸を投与することも可能である。全ての場合において、制御放出系が、所望の動作位置で、またはその近くで、免疫ブロブリンを放出するように使用されてもよい。
【０２１０】
用量
【０２１１】
投与の用量および頻度は、一実施形態において、治療的または予防的に有効であるように選択される。当該分野において知られているように、タンパク質分解、全身に対して局所的送達、および新しいプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、一般健康状態、性別、食生活、投与の時間、薬物相互作用、および症状の重篤度に対する調整、必要不である場合があり、当業者により、日常の実験で確認可能である。
【０２１２】
製剤における治療活性共結合分子の濃度は、約０．１〜１００重量％まで変動し得る。一実施形態において、共結合分子の濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲である。患者を治療するために、本明細書に開示される、治療有効量の免疫グロブリンが投与され得る。本明細書において、「治療有効量」とは、効果を生じる、投与される用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に依存し、既知の技法を使用して、当業者により確認可能である。  投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲、もしくはそれ以上、例えば、０．１、１、１０、または５０ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。一実施形態において、投与量は、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、単一用量の共結合分子のみが使用される。他の実施形態において、多用量の共結合分子が投与される。投与間の経過時間は、１時間未満、約１時間、約１〜２時間、約２〜３時間、約３〜４時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約２〜４日間、約４〜６日間、約１週間、約２週間、または２週間以上であり得る。
【０２１４】
他の実施形態において、本明細書に開示される共結合分子は、連続注入または長期休息期間なしの頻繁な投与のいずれかにより、メトロノミック投与計画で投与される。このようなメトロノミック投与は、休息期間なしの一定の間隔での投与を含み得る。典型的に、このような計画は、長期間、例えば、１〜２日間、１〜２週間、１〜２ヶ月間、または最大６ヶ月もしくはそれ以上の、慢性的な小用量、または連続注入を含む。小用量の使用は、副作用および休息期間の必要性を最小限にし得る。
【０２１５】
特定の実施形態において、本明細書に開示される共結合分子、および１つ以上の他の予防薬もしくは治療薬が、患者に周期的に投与される。周期治療は、一回目で第１の薬剤、２回目で第２の薬剤、任意に、追加回で追加の薬剤を投与し、任意の休息期間、そして１回またはそれ以上、この投与順序を繰り返すことを含む。反復の数は、典型的に、２〜１０回である。治療の反復は、１つ以上の薬剤への耐性の発生を低減するか、副作用を最小限にするか、または治療効果を改善し得る。
【０２１６】
併用療法
【０２１７】
本明細書に開示される共結合分子は、１つ以上の他の治療計画または薬剤と同時に投与されてもよい。追加の治療計画または薬剤は、同じ疾病を治療するため、随伴する合併症を治療するために使用されるか、または効力、または免疫グロブリンの安全性を向上するために使用されてもよい。
【０２１８】
特に好適な併用療法は、アレルギーおよび喘息等のＩｇＥ媒介性疾患の治療について承認されているもの、または臨床的に評価中のものを含む。特に、本発明の治療組成物は、２つの主要な薬物治療群の、副腎皮質ステロイド等の抗炎症薬、および／またはβ２作動薬の吸入と組み合わせて使用されてもよい。吸入される副腎皮質ステロイドは、フルチカゾン、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾン、トリアムシノロン、およびベクロメタゾンを含むが、一方、経口副腎皮質ステロイドは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンを含む。他のステロイドは、糖質コルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン等のアザルフィジンエイコサノイド、ならびにアントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾール、およびタラゾテン等の外用ステロイドを含む。気管支拡張剤は、気道の径を拡大し、肺への流入および肺からの流出を容易にする。本発明の療法と組み合わされてもよい気管支拡張剤は、メタプロテレノール、エフェドリン、テエルブタリン、およびアルブテロール等の短期間作用型気管支拡張剤、およびサルメテロール、メタプロテレノール、およびテオフィリン等の長期作用型気管支拡張剤を含む。
【０２１９】
本発明の療法は、アスプリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、オキサプロジン、ナブメントン、スリンダク、トルメンチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェン、およびナブメトン等の、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）と組み合わされてもよい。併用療法は、ロラタジン、フェキソフェナジン、セチリジン、ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマスチン、およびアゼラスチン等の、抗ヒスタミン薬を含んでもよい。併用療法は、噴霧形態あるいは経口形態の、クロモグリク酸、クロモグリク酸ナトリウム、およびネドロクロミル（ｎｅｄｒｏｃｒｏｍｉｌ）、ならびにオキシメタゾリン、フェニレフリン、およびプソイドエフェドリン等の、うっ血除去薬を含んでもよい。本発明の療法は、プランルカスト、ザフィルルカスト、およびモンテルカスト等のロイコトリエン受容体拮抗薬と呼ばれる抗炎症剤のクラス、ならびにジロートン等のロイコトリエン受容体合成阻害剤と組み合わされてもよい。
【０２２０】
本発明の療法は、アレルギー注射、ならびにＩｇＥまたはＦｃεＲの他の拮抗薬を含む、他の免疫療法と組み合わされてもよい。本発明の療法は、限定されないが、ケモカインＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、およびＣＲＴＨ２、およびＣＣＲ５の阻害剤、ならびにサイトカインＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、サイトカイン受容体のクラスＩＩファミリー、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、およびＩＬ−３３の阻害剤を含む、限定されない抗体およびＦｃ融合物を含むケモカインまたはサイトカインの拮抗薬と組み合わされてもよい。本発明の療法は、接着、転写因子、および／または細胞内シグナル伝達の修飾因子と組み合わされてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリンは、ＮＦ−ｋｂ、ＡＰ−１、ＧＡＴＡ−３、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ−６、ｃ−ｍａｆ、ＮＦＡＴ、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣＳ）、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）、ＭＡＰキナーゼ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびスフィンゴシン１−リン酸受容体の修飾因子と組み合わされてもよい。本発明の療法は、トシル酸（ｔｏｌｉｌａｔｅ）スプラタスト、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）の阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、およびヘパリン様分子とともに投与されてもよい。本発明の可能な併用療法は、Ｃａｒａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ３−Ｓ１−Ｓ６にさらに詳細に記載されている。
【０２２１】
本発明の療法は、また、１つ以上の抗生物質、抗真菌剤、または抗ウイルス剤と併せて使用されてもよい。本明細書に開示される抗体は、また、外科手術等の、他の治療計画と組み合わされてもよい。
【実施例】
【０２２２】
以下に提供する実施例は、単に例示を目的とする。これらの実施例は、本明細書に開示される任意の実施形態を、いかなる特定の用途または実施の理論にも限定するものではない。
【０２２３】
実施例１．ＩｇＥ＋ＦｃγＲＩＩｂ＋細胞を阻害するための新規方法
【０２２４】
免疫グロブリンＩｇＥは、影響を受けた組織における、アレルギー反応の中心的な発動因子であり、伝搬子である。ＩｇＥは、マスト細胞、好塩基球、好酸球、ならびに他の細胞型を含む、種々のエフェクター細胞上で発現する即時アレルギー性症状に関与する主要な受容体である、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）に対する高親和性受容体に結合する。免疫複合型ＩｇＥアレルゲンによるＦｃεＲＩの架橋は、これらの細胞を活性し、Ｉ型過敏症反応の発達を導き得る、ヒスタミン、プロスタグランジン、およびロイコトリエン等の化学伝達物質を放出する。承認されているモノクローナル抗体オマリズマブ（ゾレア）は、ＩｇＥに結合し、ＦｃεＲとの結合を遮断することにより、ＩｇＥを中和する。オマリズマブは、隔離を通して、生理活性ＩｇＥを低減し、組織マスト細胞および好塩基球に結合し、感作することができる抗原特異的ＩｇＥの量を減弱する。この自然循環ＩｇＥの中和は、次いで、アレルギー性疾病の症状の減少につながる。興味深いことに、血清ＩｇＥレベルは、オマリズマブ−ＩｇＥ複合体形成により治療開始後に増加し、治療停止後、最大１年の間、高いレベルを維持する。結果として、この問題は、診断検査において偽陰性につながる場合があり、したがって、ＩｇＥレベルは、日常的に確認されなければならない。
【０２２５】
ＩｇＥ経路を標的とする新規アプローチは、自然循環ＩｇＥの、エフェクター細胞上のＦｃεＲとの結合を遮断するだけでなく、ＩｇＥ産生の供給源を標的とする。ＩｇＥは、抗原侵入部位を排出するリンパ節に位置する、または局所的にアレルギー性反応の部位の、ＩｇＥ産生形質細胞により分泌される。ＩｇＥ産生形質細胞は、ＩｇＥ＋Ｂ細胞から分化する。Ｂ細胞のＩｇＥ産生へのクラス変換は、２つの個別の信号により誘発されるが、ともに、ＴＨ２細胞により提供され得る。
【０２２６】
分泌型および膜アンカー形態の２つの形態の免疫グロブリンがある。膜アンカー形態は、重鎖のＣ末端から伸長する膜アンカーペプチドを有するという点で、分泌型とは異なる。Ｂ細胞上の膜アンカー免疫グロブリンは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体とも称され、Ｂ細胞の機能において重要である。膜アンカー免疫グロブリンは、活性化リンパ芽球とＩｇ分泌形質細胞とに分化するように、休止Ｂ細胞の信号を形質導入することができる。
【０２２７】
膜アンカーＩｇＥを発現する分化されたＢ細胞は、本明細書では、ｍＩｇＥ＋ Ｂ細胞と称されるが、自然の負に調節するフィードバック機構である、阻害Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂを有する。ＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、およびマクロファージを含む、種々の免疫細胞上で発現し、そこでは、免疫調節において重要な機能を担う。Ｂ細胞上でのその正常な機能において、ＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を通して、Ｂ細胞活性を調節するためのフィードバック機構として機能する。成熟型Ｂ細胞上の免疫複合型抗原によるＢＣＲの共結合は、細胞増殖および分化をもたらす、カルシウム動員を含む細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。しかしながら、抗原に特異性を有するＩｇＧ抗体が産生されると、関連する免疫複合体（ＩＣ）は、ＢＣＲをＦｃγＲＩＩｂと架橋することができるが、この際、ＢＣＲの活性が、ＦｃγＲＩＩｂの結合、およびＢＣＲ活性の下方制御経路に干渉する、関連する細胞内シグナル伝達経路により阻害される。ｍＩｇＥをそれらのＢＣＲとして使用するｍＩｇＥ＋Ｂ細胞の表面上のＦｃγＲＩＩｂの発現は、これらの細胞型の負の調節因子として機能する。
【０２２８】
図１に図示する、ＩｇＥ媒介性疾病を阻害するための新規対処法は、膜アンカーＩｇＥと阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂとの共結合により、ＩｇＥ＋Ｂ細胞（すなわち、膜アンカーＩｇＥを発現するＢ細胞）を阻害することである。ＩｇＥを発現するようにクラス交換されたＢ細胞において、ｍＩｇＥは、ＢＣＲ（本明細書において、ｍＩｇＥ  ＢＣＲと称される）として機能する。このアプローチは、Ｂ細胞活性の免疫複合型媒介性抑制の自然な生物学的機構を模倣し得、これにより、ＩｇＥ産生形質細胞への分化を防止する。ＩｇＥ産生形質細胞は、骨髄に存在し、おそらく、数週間から数ヶ月の寿命を有する。新しいＩｇＥ分泌形質細胞は、分化中、ｍＩｇＥ発現Ｂ細胞段階を通るため、その生成が、この抗ＩｇＥ治療により、それらのｍＩｇＥ＋Ｂ細胞前駆体を阻害することにより抑止されると、既存の形質細胞は、数週間から数ヶ月以内に激減し、したがって、ｇＥの産生も徐々に軽減されるだろう。重要なことは、ｍＩｇＥを有するＩｇＥ＋記憶Ｂ細胞の阻害も、高親和性で、ＦｃγＲＩＩｂに共結合する抗ＩｇＥ免疫グロブリンにより阻害されるだろう。これが生じると、療法は、根底にある疾病に長期的に影響を与え得る。
【０２２９】
実施例２．ＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性を有する抗ＩｇＥ抗体
【０２３０】
生理学的状態下において、ＢＣＲのＦｃγＲＩＩｂとの架橋、および後続のＢ細胞の抑制は、ＩｇＧおよび同族抗原の免疫複合体を介して生じる。設計戦略は、単一の架橋抗体を使用して、この効果を再現することであった。ヒトＩｇＧは、弱い親和性（ＩｇＧ１に対して１００ｎＭ超）でヒトＦｃγＲＩＩｂに結合し、ＦｃγＲＩＩｂ媒介性阻害は、単量体ＩｇＧではなく、免疫複合型ＩｇＧに応答して生じる。この受容体に対する高親和性（１００ｎＭ未満）が、Ｂ細胞活性の最大阻害に要求されるであろうと推論された。本発明の抗ＩｇＥ抗体の阻害活性を強化するために、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を改善する変異体を用いて操作された。自然ＩｇＧ１に対して改善された親和性で、ＦｃγＲＩＩｂに結合する操作されたＦｃ変異体が、記載されている（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＣＤ３２ｂ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」の表題で、２００８年５月３０日に出願されたＵＳＳＮ第１２／１５６，１８３号、参照により本明細書に明示的に援用される）。
【０２３１】
変異体は、ＢＣＲ共受容体複合体の調節構成要素である、抗原ＣＤ１９を標的とする抗体の状況で、最初に生成された。この抗体のＦｖ領域はヒト化され、親和性成熟された、抗体４Ｇ７の型であり、本明細書において、ＨｕＡＭ４Ｇ７と称される。この抗体のＦｖ遺伝子は、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５にサブクローン化された（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）。Ｆｃドメインにおける突然変異は、部位特異的突然変異誘発を使用して導入された（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，ＴＸ）。加えて、置換Ｇ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ（Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ）を含む、Ｆｃ受容体に対して切断された親和性を有する、制御されたノックアウト変異体を生成した。この変異体は、Ｆｃ−ＫＯまたはＦｃノックアウトと称される。重鎖および軽鎖コンストラクトは、発現のために、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に同時導入され、抗体は、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して精製された。
【０２３２】
結合試験のための組み換えヒトＦｃγＲＩＩｂタンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａ受容体タンパク質をコードする遺伝子は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から購入し、６Ｘ  Ｈｉｓタグを含有するｐＴＴ５ベクター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）  にサブクローン化した。受容体（ＦｃγＲＩＩａおよびＶ１５８に対してＨ１３１およびＲ１３１、ならびにＦｃγＲＩＩＩａに対してＦ１５８）の対立遺伝子型は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異源性を使用して生成された。受容体をコードするベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入され、タンパク質は、ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製された。
【０２３３】
本明細書においてＢｉａｃｏｒｅとも称される、リアルタイムで生体分子相互作用について試験するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術である、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を使用して、受容体親和性について変異体を検査した。ＳＰＲ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して実施された。標準的な一級アミンカップリングプロトコルを使用して、タンパク質Ａ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ＣＭ５バイオセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を生成した。全ての測定は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ｖｏｌ／ｖｏｌ界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して実施された。２０ｎＭまたは５０ｎＭ含有ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液での抗体は、タンパク質Ａ／Ｇ表面上に固定化され、ＦｃγＲが注入された。各周期後、表面は、グリシン緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ１．５）を注入することにより再生された。データは、適切な非特異的信号（流動緩衝液の対照チャネルおよび注入の応答）を減算することにより、ＦｃγＲの注入前の時間および応答をゼロにすることにより処理された。動態分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合モデルを用いた、結合データの包括的適合により実施された。
【０２３４】
選択変異体抗ＣＤ１９抗体のＦｃγＲＩＩｂへの結合の代表的な一連のセンサグラムを図２に示す。Ｂｉａｃｏｒｅ結合データの適合から得た、ＦｃγＲの全てに対する全ての変異体および野生型（自然）ＩｇＧ１の親和性を図３にプロットし、図４に数値的に提供する。野生型ＩｇＧ１  Ｆｃが、μＭ台の親和性（図４において、ＫＤ＝１．８μＭ）で、ＦｃγＲＩＩｂと結合する一方で、阻害受容体により堅固に結合するいくつかの変異体、例えば、Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆが、操作された。ＵＳＳＮ  １１／１２４，６２０に記載する、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体も、活性受容体ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａに対して、改善された親和性を有し、したがって、媒介された、強化された抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）およびファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）が可能である。ＦｃノックアウトまたはＦｃ−ＫＯとも称されるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ変異体は、Ｆｃ受容体への結合を欠損し、本明細書に記載される実験において、対照として使用される。
【０２３５】
選択変異体は、ＩｇＥを標的とする抗体において構築される。抗ＩｇＥ抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を図５に提供する。アレルギー性喘息の治療に近年承認された、オマリズマブはヒト化抗体であり、ゾレアの商品名で市販されている。ＭａＥ１１は、オマリズマブのマウス前駆体である。Ｈ１Ｌ１＿ＭａＥ１１は、ＭａＥ１１の新規ヒト化変型である。これらの抗ＩｇＥ抗体の重および軽ＶＨおよびＶＬドメインをコードする遺伝子は、商業的に合成された（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。また、本明細書に記載する実験で負の対照として使用された、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体モタビズマブの可変領域ＶＨおよびＶＬ遺伝子が合成された。ＶＬ遺伝子は、Ｃκ定常鎖をコードする、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）にサブクローン化された。ＶＨ遺伝子は、自然ＩｇＧ１および変異体定常鎖をコードする、ｐＴＴ５ベクターにサブプローン化された。選択定常鎖のアミノ酸配列を図６に提供する。全てのＤＮＡは、配列の忠実度を確認するために配列決定された。選択抗体の完全長重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を図７に提供する。
【０２３６】
プラスミド含有重鎖および軽鎖遺伝子は、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３Ｅ細胞に同時導入され、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。成長５日後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質Ａ親和性により、抗体を培養上澄みから精製した。
【０２３７】
Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、ＩｇＥおよびＦｃγＲＩＩｂへの結合について、変異体および自然ＩｇＧ１抗ＩｇＥ抗体を検査した。使用された抗ＩｇＥ抗体の結合部位を含有する、ＩｇＥのＦｃ領域をコードするＤＮＡを合成し（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＴ５ベクターにサブクローン化した。ＩｇＥ  Ｆｃは、２９３Ｅ細胞で発現され、上述のタンパク質Ａを使用して精製された。ＳＰＲ測定は、分析物がＩｇＥのＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃ領域のいずれかであったことを除き、上述のタンパク質Ａ／抗体捕獲法を使用して実施された。データ取得およびあてはめは上述の通りである。  図８は、これらの結合実験から得られた平衡結合定数（ＫＤｓ）、ならびにＦｃγＲＩＩｂへの結合についての自然ＩｇＧ１に対する折り畳み親和性を提供する。図９は、これらのデータのプロットを示す。結果は、抗体のＩｇＥに対する親和性の高さ、およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異体が、２桁以上異なって、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を改善することを確定すし、前の結果と一致する。
【０２３８】
特定の変異体、例えば、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅの使用は、ここで、本明細書に記載される機構に関する概念の例示説明を意図し、本発明をそれらの特定の使用に限定するものではない。ＵＳＳＮ第１２／１５６，１８３号およびＵＳＳＮ第１１／１２４，６２０号に提供されるデータは、いくつかの操作された変異体が、特定のＦｃ位置で、標的の特性を提供することを示唆する。ＦｃγＲ親和性、得にＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するための置換は、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２を含む。いくつかの実施形態において、置換は、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するために、限定されない、次の位置の少なくとも１つ以上に対して行われる：２３５、２３６、２３９、２６６、２６７、２６８、および３２８。
【０２３９】
ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するように置換を行うための、限定されない位置の組み合わせは、２３４／２３９、２３４／２６７、２３４／３２８、２３５／２３６、２３５／２３９、２３５／２６７、２３５／２６８、２３５／３２８、２３６／２３９、２３６／２６７、２３６／２６８、２３６／３２８、２３７／２６７、２３９／２６７、２３９／２６８、２３９／３２７、２３９／３２８、２３９／３３２、２６６／２６７、２６７／２６８、２６７／３２５、２６７／３２７、２６７／３２８、２６７／３３２、２６８／３２７、２６８／３２８、２６８／３３２、３２６／３２８、３２７／３２８、および３２８／３３２を含む。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するように置換を行うための位置の組み合わせは、限定されないが、２３５／２６７、２３６／２６７、２３９／２６８、２３９／２６７、２６７／２６８、および２６７／３２８を含む。
【０２４０】
ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するための置換は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅを含む。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するように置換を行うための位置の組み合わせは、限定されないが、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙを含む。
【０２４１】
ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するための置換の組み合わせは、Ｌ２３４Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３４Ｅ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３４Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｗ／Ｓ２３９Ｄ、Ｌ２３４Ｗ／Ｓ２３９Ｅ、Ｌ２３４Ｗ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３４Ｗ／Ｌ３２８Ｙ、Ｌ２３５Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３５Ｄ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３５Ｆ／Ｓ２３９Ｄ、Ｌ２３５Ｆ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３５Ｆ／Ｌ３２８Ｙ、Ｌ２３５Ｙ／Ｇ２３６Ｄ、Ｌ２３５Ｙ／Ｓ２３９Ｄ、Ｌ２３５Ｙ／Ｓ２６７Ｄ、Ｌ２３５Ｙ／Ｓ２６７Ｅ、Ｌ２３５Ｙ／Ｈ２６８Ｅ、Ｌ２３５Ｙ／Ｌ３２８Ｆ、Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２３９Ｄ、Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ／Ｈ２６８Ｅ、Ｇ２３６Ｄ／Ｌ３２８Ｆ、Ｇ２３６Ｎ／Ｓ２６７Ｅ、Ｇ２３７Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｇ２３７Ｎ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３２７Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｌ３２８Ｆ、Ｓ２３９Ｄ／Ｌ３２８Ｗ、Ｓ２３９Ｄ／Ｌ３２８Ｙ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ、Ｖ２６６Ｍ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｄ／Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｓ２６７Ｅ／Ａ３２７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ａ３２７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｉ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｙ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｈ２６８Ｄ／Ａ３２７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ／Ｌ３２８Ｆ、Ｈ２６８Ｄ／Ｌ３２８Ｗ、Ｈ２６８Ｄ／Ｌ３２８Ｙ、Ｈ２６８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｈ２６８Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｈ２６８Ｅ／Ｌ３２８Ｙ、Ａ３２７Ｄ／Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｗ／Ｉ３３２Ｅ、およびＬ３２８Ｙ／Ｉ３３２Ｅを含む。いくつかの実施形態においてＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を強化するための置換の組み合わせは、限定されないが、Ｌ２３５Ｙ／Ｓ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｅ、およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆを含む。
【０２４２】
実施例３．ＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性を有する抗ＩｇＥ抗体によるＩｇＥ＋Ｂ細胞の生体外阻害
【０２４３】
ＩｇＥを検出するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を確立した。ｐＨ９．４の炭酸水素ナトリウム緩衝液でコーティングした後、ｐＨ９．４（０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液）で、一晩、１０ｕｇ／ｍＬで、抗ＩｇＥ捕獲抗体との付着により、平底プレートを調製した。翌日、プレートを３％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断し、ＩｇＥ（ヒトＩｇＥ  ＥＬＩＳＡキットから、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の段階希釈が、１μｇ／ｍＬに３ｘ添加された。３時間後、プレートをＴＴＢＳで３ｘ（２００ｕｌ）洗浄し、結合ＩｇＥを測定した。ＨＲＰ複合型ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で、１時間、（１：５０００）で添加した。試料を３ｘ洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ５０−７６−００）を用いて検出した。反応を５０μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで読み取った。
【０２４４】
図１０は、３つのモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（ＭａｂＴｅｃｈ；１０７／１８２／１０１）、ＭａＥ１１＿ＩｇＧ１＿Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、およびオマリズマブ＿ＩｇＧ１＿Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒのプールを含む、種々の抗ヒトＩｇＥ抗体を用いた、  ＩｇＥの捕獲を示す。データは、市販の抗ＩｇＥ抗体試薬（ＭａｂＴｅｃｈ）、オマリズマブ、およびその親キメラ抗体ＭａＥ１１が、ＩｇＥを捕獲することができることを示す。ＩｇＥを検出するようにこの検定を使用するために、ＭａＥ１１およびオマリズマブ抗体が、ＭａｂＴｅｃｈ抗  ＩｇＥ試薬により捕獲されたＩｇＥに干渉するかどうかを決定することが必要であった。検定は、上述のように繰り返され、吸光度からのＩｇＥの濃度を、標準曲線を使用して計算した。図１１は、抗ＩｇＥ抗体オマリズマブ＿Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒが、現在のＥＬＩＳＡプロトコルにおいて、ＭａｂＴｅｃｈ抗ＩｇＥ抗体と競合しないことを示す。
【０２４５】
Ｆｃ変異体抗ＩｇＥ抗体を、ＩｇＥ＋Ｂ細胞を阻害するそれらの能力について検査した。ヒトＰＢＭＣを、５ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−４（ＩＬ−４）および１００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体（クローンＧ２８．５  ＩｇＧ１）を添加することにより、ＩｇＥ産生Ｂ細胞にクラス変換するように誘発した。抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０のアゴニストであり、したがって、活性化補助因子ＣＤ４０Ｌの活性を模倣する。様々な濃度の抗ＩｇＥ抗体を添加し、試料を１２日間、インキュベートした。捕獲抗体として５ｕｇ／ｍＬ  Ｍａｂｔｅｃｈ抗ＩｇＥを使用して、上述のようにＥＬＩＳＡプレートを調製し、遮断した。  １００ｕｌのＰＢＭＣ試料を添加し、３時間超インキュベートした後、ＴＴＢＳ  ３ｘ（２００ｕｌ）で洗浄した。抗体ＨＲＰ複合型抗体を添加し、上述のように検出した。標準曲線を使用して、４５０ｎｍでの吸光度をＩｇＥ濃度に変換した。結果を図１２に示す。ＦｃγＲ結合（Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ変異体）を欠損する抗体、または  ＩｇＥに対して特異性を持たない抗体（モタビズマブ抗ＲＳＶ抗体）は、分化されたＢ細胞からのＩｇＥ産生に影響を与えなかった。逆に、ＦｃγＲＩＩｂに対して大きい親和性を有する変異体抗体は、ＩｇＥ産生を阻害した。これらのデータは、表面ＩｇＥと阻害ＦｃγＲ受容体ＦｃγＲＩＩｂとの共結合が、その免疫グロブリン型のクラス変換されたＢ細胞を阻害することを示唆する。ＩｇＥ＋Ｂ細胞の阻害は、ＩｇＥ発現形質細胞の数を低減し、これは次いで、検出されるＩｇＥの量を低減する。ＩｇＥ産生Ｂ細胞に対するこの活性の選択性を評価するために、ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、同じ試料からヒトＩｇＧ２を測定した。図１３は、ＩｇＧ２分泌が阻害されなかったことを示し、高ＦｃγＲＩＩｂ親和性を有する抗ｇＥ抗体の阻害活性は、ＩｇＥ＋クラス変換された細胞に対して選択的であることを示す。承認された抗ＩｇＥ抗体オマリズマブの変異体を使用したこの実験の繰り返しは、高ＦｃγＲＩＩｂ親和性を有する変異体による類似した阻害結果を示した（図１４）。
【０２４６】
高ＦｃγＲＩＩｂ親和性を有する抗ＩｇＥ抗体のＩｇＥ産生を阻害する能力は、ｍＩｇＥ  ＢＣＲ刺激の存在下で評価された。ＩＬ−４およびα−ＣＤ４０アゴニスト抗体により促進されたＩｇＥへクラス変換で、上記の検定が繰り返され、加えて、Ｂ細胞が、抗μ抗体、または抗ＣＤ７９ｂ抗体のいずれかを使用して活性化された。これらの抗体は、ＢＣＲに架橋し、これにより、免疫複合型抗原に類似した信号を提供する。抗μ抗体は、膜アンカーＩｇＭに架橋結合し、抗ＣＤ７９ｂはＣＤ７９ｂに架橋し、これは、ＢＣＲ複合体のシグナル伝達構成要素である。ＰＢＭＣは、ＩＬ−４、α−ＣＤ４０、および抗ＣＤ７９ｂ  または抗μのいずれかと共に１４日間インキュベートされ、ＩｇＥは、上述のように検出された。抗ＣＤ７９ｂ（図１５）および抗μ（図１６）の結果は、Ｂ細胞がＢＣＲ架橋結合を介して刺激される時、ＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性を有する抗ＩｇＥ抗体が、ＩｇＥ産生を阻害することができることを示す。
【０２４７】
ＩｇＥ＋Ｂ細胞を阻害するための追加戦略は、これらを枯渇することである。  これは、エフェクター機能について強化された、抗ＩｇＥ抗体を使用して行うことができる。変異体Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅは、活性化受容体であるＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａ（図３および図４）への結合を増加し、したがって、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰエフェクター機能を改善する。上記のＢ細胞検定を、抗ＩｇＥ抗体オマリズマブのＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体を使用して実施した。ＰＢＭＣは、ＩＬ−４、α−ＣＤ４０、および抗ＣＤ７９ｂ（図１７）または抗μ（図１８）のいずれかと共に、１４日間インキュベートされ、ＩｇＥは、上述のように検出された。結果（図１７および１８）は、最適化されたエフェクター機能を有する抗ＩｇＥ抗体が、クラス変更されたＩｇＥ＋Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を阻害できることを示す。
【０２４８】
実施例４．ＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性を有する抗ＩｇＥ抗体によるＩｇＥ＋Ｂ細胞の生体内阻害
【０２４９】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、ヒトにおける治療活性の代用として、ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルを使用して評価された。この試験は、一般的なヒトアレルゲンであるチリダニタンパク質Ｄｅｒ  ｐ  １に応答する、本明細書に記載される抗ＩｇＥ抗体のＢ細胞活性および形質細胞発達を阻害する能力を検査した。この方法において、Ｄｅｒ  ｐ  １にアレルギー性反応を有する血液ドナーからのヒト末梢血白血球が、免疫欠損ＳＣＩＤマウスに移植され、自然または変異体抗ＩｇＥ抗体で処置された。マウスは、免疫応答を刺激するために、抗原によって攻撃され、形質細胞へのＢ細胞の発達の経過を検査するために、免疫グロブリンの産生が測定された。
【０２５０】
血液ドナーは、Ｄｅｒ  ｐ  １に対する抗ＩｇＥ抗体の存在に基づいて、チリダニ抗原に対するアレルギーについてスクリーニングされた。陽性反応のドナーは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得る（ｏｂｔａｉｎｅｄ）ために、白血球除去された。本試験のプロトコルを図２０に提供する。ＰＢＭＣ注入の１日前に、マウスに１００μｌの抗シアロＧＭ抗体（Ｗａｋｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を与え、マウス自然キラー（ＮＫ）細胞を枯渇した。翌日、マウスに、０．５ｍＬ量の３ｘ１０７  ＰＢＬを腹腔内に注入した。ＰＢＭＣ注入後、各群に７匹のマウスの、５つの異なるマウス群にマウスを分けた。ＰＢＭＣ注入後７日目、ＥＬＩＳＡ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）により、ヒトＩｇＧおよびＩｇＥレベルを決定するために、後眼窩洞／神経叢（ＯＳＰ）穿刺を介して、血液を全てのマウスから採取した。２日後（９日目）、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇ抗体またはＰＢＳを腹腔内に注入した。１１日目、マウスに、１５μｇのチリダニ抗原Ｄｅｒ  ｐ  １（ＬｏＴｏｘ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｄｅｒ  ｐ  １，Ｉｎｄｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）を腹腔内に注入した。２３日目（抗原ワクチン接種後１２日目）、ヒトＩｇＧおよびＩｇＥ抗体を決定するために、血液を全てのマウスから採取した。同じ日、マウスは、２回目の１０ｍｇ／ｋｇ抗体またはＰＢＳの腹腔内に注入を受けた。２日後（２５日目）、マウスは、１０ｕｇのチリダニ抗原Ｄｅｒ  ｐ  １の腹腔内追加免疫ワクチン接種を受けた。３７日目（抗原追加免疫後１２日目）、ヒト免疫グロブリン決定のために、血液をＯＳＰにより採取した。ヒトＩｇＧおよびＩｇＥ濃度は、上述のものと同様のＥＬＩＳＡ法を使用して測定された。
【０２５１】
血清ＩｇＧおよびＩｇＥレベルについての結果を、それぞれ図２１および２１に示す。抗原曝露前、ヒトＩｇＧおよびＩｇＥ抗体のレベルは、全群において低かった。Ｄｅｒ  ｐ  １免疫化後、全群が、高レベルのヒトＩｇＧを示し、移植されたヒトＢ細胞によるワクチン接種されたＤｅｒ  ｐ  １抗原または内因性マウス抗原のいずれかへの強い免疫応答を示した。ＩｇＧ応答とは逆に、処置群は、ＩｇＥ抗体の産生において、有意に異なった。オマリズマブおよびＨ１Ｌ１  ＭａＥ１１  のＩｇＧ１型は、ヒトＩｇＥの産生を阻害する能力において、ビヒクルと等しかった。しかしながら、Ｈ１Ｌ１  ＭａＥ１１のＦｃγＲＩＩｂｌ強化（ＩＩｂＥ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）型は、検出可能なレベルのヒトＩｇＥを示さなかった。全てのＦｃγＲへの結合を欠失する、Ｈ１Ｌ１  ＭａＥ１１のＦｃ−ＫＯ（変異体Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ）型は、ヒトＩｇＥ産生において亢進を示した。これは、おそらく、ヒトｍＩｇＥに架橋するその能力、したがってＩｇＥ＋Ｂ細胞を活性化するが、抗体のＩｇＧ１およびＩＩｂＥ型が有するもの等の、ＦｃγＲＩＩｂ阻害またはＦｃγＲＩＩａ／ＩＩＩａ細胞障害活性のその完全な欠損によるのである。これらの生体内データは、ＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性を有する抗ＩｇＥ抗体が、ヒトＩｇＥ＋Ｂ細胞活性化および免疫グロブリン分泌形質細胞分化を阻害することができ、したがって、本明細書に開示される免疫グロブリンのＩｇＥ媒介性疾患を治療する可能性を支持することを示す。
【０２５２】
引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に援用される。
【０２５３】
特定の実施形態が、例示の目的のため、上で説明されたが、詳細の多くの変形が、特許請求の範囲で記載される、本発明から逸脱することなく行われてもよいことを、当業者は理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年8月24日(2015.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１７からなる重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチド；および
ｂ）配列番号２１からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチド；
を含む抗ＩｇＥ抗体。
【請求項２】
前記重鎖ポリペプチドが配列番号４１からなり、前記軽鎖ポリペプチドが配列番号４０からなる、請求項１に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項３】
ａ）請求項１または２に記載の抗ＩｇＥ抗体に含まれる重鎖ポリペプチドをコードする第１の核酸；および
ｂ）請求項１または２に記載の抗ＩｇＥ抗体に含まれる軽鎖ポリペプチドをコードする第２の核酸；
を含む核酸組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１または２に記載の抗ＩｇＥ抗体の製造方法であって、
ａ）請求項４に記載の宿主細胞を、前記抗体が産生される条件下で培養する工程；および
ｂ）前記抗体を回収する工程；
を含む、製造方法。
【請求項６】
抗ＩｇＥ抗体を含む、アレルギー性喘息を治療するための医薬組成物であって、前記抗ＩｇＥ抗体が、以下のａ）とｂ）：
ａ）下記ｉ）およびｉｉ）を含む重鎖ポリペプチド：
ｉ）配列番号１８からなるｖｈＣＤＲ１、配列番号１９からなるｖｈＣＤＲ２、および配列番号２０からなるｖｈＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および
ｉｉ）Ｓ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ／２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、親ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの変異体Ｆｃ領域であって、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う、親ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドの変異体Ｆｃ領域；と、
ｂ）配列番号２２からなるｖｌＣＤＲ１、配列番号２３からなるｖｌＣＤＲ２、および配列番号２４からなるｖｌＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチド；
を含む抗ＩｇＥ抗体である、医薬組成物。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が配列番号１７からなる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記軽鎖ポリペプチドの可変領域が配列番号２１からなる、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記重鎖ポリペプチドの可変領域が配列番号１７からなり、前記軽鎖ポリペプチドの可変領域が配列番号２１からなる、請求項１に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項１０】
前記変異体Ｆｃ領域がＳ２６７Ｅを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記変異体Ｆｃ領域がＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記重鎖ポリペプチドが配列番号４２からなり、前記軽鎖ポリペプチドが配列番号４０からなる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2015187185000001.pdf