(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内における酸化還元状態の変化を、励起スペクトルの解析等に依らず、より簡便に評価することが可能な分子ツールの提供。【解決手段】蛍光タンパク質であるＳｉｒｉｕｓ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＢＦＰ２及びＶｅｎｕｓからなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、上記群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間に、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間に、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸でさらに置換された、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、６５番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓ）で置換され、６６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４６番目のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸（Ｅ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
配列番号５９のアミノ酸配列、又は、配列番号５９に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸（Ｅ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
配列番号６０のアミノ酸配列、又は、配列番号６０に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
配列番号５９のアミノ酸配列、又は、配列番号５９に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグリシン（Ｇ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
配列番号６１のアミノ酸配列、又は、配列番号６１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアルギニン（Ｒ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質と、第２のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質又は請求項５に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質、又は請求項９に記載の融合タンパク質を細胞内に存在させ、前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、検出された蛍光の蛍光強度に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内における酸化還元状態をモニターするための蛍光タンパク質、ＤＮＡ、ベクター、形質転換体、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内では、酸化還元反応が関連する様々な事象が起こっている。例えば細胞呼吸の代謝系の最終段階に位置する電子伝達系では、ＮＡＤＨの酸化によって生じた電子が最終的に酸素に伝達され、水が生成する。当該電子伝達系と共役して起こる酸化的リン酸化によりＡＴＰが生成する。
【０００３】
植物の光合成においても酸化還元反応が起こっている。葉緑体のチラコイド膜において、クロロフィル（光合成色素）が光エネルギーを用いて水を分解し、プロトン、酸素分子及び電子を生じる。このときに生じた電子によってＮＡＤＰ＋が還元され、ＮＡＤＰＨが生成する。さらに、チラコイド膜内外のプロトン濃度勾配を利用して、ＡＴＰ合成酵素によってＡＴＰが生成する。
【０００４】
また、好気生物が酸素を消費する過程で発生する活性酸素種は、非常に強力な酸化作用を有し、過剰に存在すると細胞内タンパク質、酵素、細胞膜、ＤＮＡなど、細胞を構成する多くの分子を酸化変性し、細胞機能障害を引き起こし得る。
【０００５】
細胞内におけるこのような酸化還元事象の詳細を理解するために、細胞内の酸化還元状態をモニターできる分子ツールの開発が望まれている。
【０００６】
細胞内の酸化還元状態をモニターできる分子ツールとして、蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＳ１４７及びＱ２０４がシステイン残基で置換された、ｒｏＧＦＰ（Redox-sensitive green fluorescent protein）が知られている（非特許文献１、２）。ｒｏＧＦＰは、上記２つのシステイン残基中のチオール基がジスルフィド結合により結ばれた酸化型、又は上記システイン残基中のチオール基が遊離状態である還元型のいずれかの形態で存在する。酸化型と還元型の存在比は、ｒｏＧＦＰの周囲環境の酸化還元状態に依存して変化する。当該変化は、ｒｏＧＦＰの励起スペクトルの形状変化として検出される。ｒｏＧＦＰの励起スペクトルには２つの励起極大波長（４００ｎｍ、４９０ｎｍ）が存在し、当該励起波長における蛍光強度の比を測定することで、ｒｏＧＦＰの周囲環境の酸化還元状態をモニターすることが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hanson G.T.et al., J.Biol.Chem., 2004, 279: 13044-13053.
【非特許文献２】Lohman J.R.et.al., Biochemistry, 2008, 47, 8678-8688
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ｒｏＧＦＰを使用した場合、細胞内における酸化還元状態をモニターするには、励起スペクトルを測定し、そのスペクトル形状を解析する必要があり、手間がかかるという課題があった。このため、細胞内における酸化還元状態の変化を、蛍光顕微鏡観察等により直接評価できるような、より簡便な方法が求められていた。
したがって、本発明の目的は、細胞内における酸化還元状態の変化を、励起スペクトルの解析等に依らず、より簡便に評価することが可能な分子ツールを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ＧＦＰ変異体に特定のアミノ酸変異を施した蛍光タンパク質が酸化条件又は還元条件にさらされると、驚くべきことに、励起光波長を固定して測定される蛍光タンパク質の蛍光強度が著しく変化することを見出した。例えば、ＧＦＰ変異体として知られているＳｉｒｉｕｓ（配列番号１）（Nagai,T.et al., Nature Methods, 2009, 6, 351-353）に対して特定のアミノ酸変異を施した蛍光タンパク質が酸化条件にさらされると、励起光波長を固定して測定される蛍光タンパク質の蛍光強度が著しく低下することを見出した。更に、当該蛍光タンパク質を用いれば、細胞内における酸化還元状態の変化を、その蛍光強度に基づいて測定することが可能となり、より簡便な分子ツールとして利用できることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
従って、本発明は以下の態様を有する。
［１］配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間に、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質。
［２］前記アミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）およびグリシン（Ｇ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸でさらに置換された、上記［１］に記載の蛍光タンパク質。
［３］配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記［２］に記載の蛍光タンパク質。
［４］配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、６５番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓ）で置換され、６６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４６番目のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸（Ｅ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記［２］に記載の蛍光タンパク質。
［５］配列番号５９のアミノ酸配列、又は、配列番号５９に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸（Ｅ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記［２］に記載の蛍光タンパク質。
［６］配列番号６０のアミノ酸配列、又は、配列番号６０に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記［２］に記載の蛍光タンパク質。
［７］配列番号５９のアミノ酸配列、又は、配列番号５９に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグリシン（Ｇ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記［２］に記載の蛍光タンパク質。
［８］配列番号６１のアミノ酸配列、又は、配列番号６１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアルギニン（Ｒ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、上記［２］に記載の蛍光タンパク質。
［９］上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質と、第２のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質。
［１０］上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質又は上記［５］に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
［１１］上記［９］に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
［１２］上記［１１］に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
［１３］細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質、又は上記［９］に記載の融合タンパク質を細胞内に存在させ、前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、検出された蛍光の蛍光強度に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることを含む方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の蛍光タンパク質によれば、励起スペクトルを測定することなく、細胞内における酸化還元状態の変化を、蛍光タンパク質の蛍光強度に基づいて簡便にモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の蛍光タンパク質（実施例１〜１０）の酸化型及び還元型のそれぞれにおける蛍光強度を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の蛍光タンパク質（実施例１１〜１４）の酸化型及び還元型のそれぞれにおける蛍光強度を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の蛍光タンパク質（実施例１〜１０）の、酸化型及び還元型の蛍光強度の内、より高い方に対する他方の蛍光強度の比を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の蛍光タンパク質（実施例１１〜１４）の、酸化型及び還元型の蛍光強度の内、より高い方に対する他方の蛍光強度の比を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｏｂａ−Ｑｓ（oxidation balance sensed quenching protein derived from serius）（配列番号５）の、酸化型及び還元型のそれぞれにおける励起スペクトル及び蛍光スペクトルである。また、還元型から酸化型へと変換した後、再度還元型へと変換したものを、再還元型として示す。励起スペクトルは、蛍光波長４２５ｎｍとし、２５０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で測定した。蛍光スペクトルは、励起光波長を３７５ｎｍとして測定した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｒｅ−Ｑｙ（reduction sensed quenching protein derived from YFP）（配列番号６５）の、酸化型及び還元型のそれぞれにおける励起スペクトル及び蛍光スペクトルである。励起スペクトルは、蛍光波長５２５ｎｍとし、２５０ｎｍ〜５１８ｎｍの範囲で測定した。蛍光スペクトルは、励起光波長を５１０ｎｍとして測定した。
【図４】図４は、Ｏｂａ−Ｑｓの蛍光強度が、Ｈ２Ｏ２を添加することにより経時的に低下する様子を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｏｂａ−ＱｓとＡｔＧｐｘ１との融合タンパク質の蛍光強度が、Ｈ２Ｏ２を添加することにより経時的に低下する様子を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、アミノ酸は、特に断らない限り１文字表記で表す。アミノ酸配列の表記は、例えば配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１４７番目のアミノ酸残基であるセリンを、特に断らない限りＳ１４７と表す。他のアミノ酸残基の場合も同様に表記する。また、アミノ酸配列における置換の表記は、例えば配列番号１のＳ１４７がＣに置換される場合、特に断らない限りＳ１４７Ｃと表す。他のアミノ酸置換の場合も同様に表記する。また、アミノ酸配列における挿入の表記は、例えばＳ１４７Ｃの置換がなされた配列番号１の、Ｃ１４７とＳ１４８との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入される場合、特に断らない限りＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤと表す。他のアミノ酸挿入の場合も同様に表記する。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｓｉｒｉｕｓ）に複数のアミノ酸残基が同時に置換及び／又は挿入された変異体は、先頭に「Ｓｉｒｉｕｓ」と記載し、それぞれの置換及び／又は挿入をハイフン（−）で結ぶこととする。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｓｉｒｉｕｓ）にＳ１４７Ｃ及びＱ２０４Ｃのアミノ酸置換がなされ、さらにＣ１４７とＳ１４８との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列は、「Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤ」と表す。配列番号１に対する他の変異体も同様に表記する。また、配列番号５９、６０又は６１に示されるアミノ酸配列に複数のアミノ酸残基が同時に置換及び／又は挿入された変異体も、先頭にそれぞれのアミノ酸配列を示す蛍光タンパク質名（「ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ」、「ＥＢＦＰ２」又は「Ｖｅｎｕｓ」）を表記する以外は、配列番号１の場合と同様に表記する。
【００１４】
本明細書において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つのタンパク質間の配列の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994))を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYXや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。なお、本明細書において、配列番号１、５９、６０及び６１のアミノ酸配列の変異体におけるアミノ酸配列の番号付けは、それぞれ配列番号１、５９、６０及び６１のアミノ酸配列を基準として行い、配列番号４４、８０、８１及び８２の塩基配列の変異体における塩基配列の番号付けは、それぞれ配列番号４４、８０、８１及び８２の塩基配列を基準として行う。
【００１５】
本明細書において「励起スペクトル」とは、検出する蛍光波長を固定し、励起光の波長を連続的に変化させ、得られる蛍光強度を波長ごとにプロットしたもののことである。本明細書において「励起極大波長」とは、上記励起スペクトルにおいて、最も強い蛍光強度を与える波長のことである。励起スペクトルは分光蛍光光度計により測定される。
【００１６】
本明細書において「蛍光スペクトル」とは、励起光の波長を固定して、得られる蛍光強度を波長ごとにプロットしたもののことである。励起波長の違いによって、蛍光スペクトルの形状は変化することはない。通常、固定する励起波長は励起極大波長を使用する。本明細書において「蛍光極大波長」とは、上記蛍光スペクトルにおいて、最も強い蛍光強度を与える波長のことである。蛍光スペクトルのピークは励起スペクトルのピークよりも長波長側に現れる。蛍光スペクトルは分光蛍光光度計により測定される。
【００１７】
励起光によって励起された、酸化型及び還元型の蛍光タンパク質が放出する蛍光の蛍光強度は、分光蛍光光度計や蛍光顕微鏡などで測定することが可能である。
【００１８】
本明細書において「ＧＦＰ変異体」とは、ＧＦＰのアミノ酸配列と高い同一性（例えば９０％以上の同一性）を有し、かつ固有の蛍光特性を有する、ＧＦＰの変異体のことである。特に限定されないが、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ（配列番号１）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などである。またＣＦＰにさらに変異を加えて作製されたｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ（配列番号５９）；ＢＦＰにさらに変異を加えて作製されたＥＢＦＰ２（配列番号６０）；ＹＦＰにさらに変異を加えて作製されたＶｅｎｕｓ（配列番号６１）などの蛍光タンパク質も、ＧＦＰ変異体に含まれる。
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間に、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質である。
【００２０】
本発明の蛍光タンパク質は、導入された上記２つのシステイン残基中のチオール基がジスルフィド結合により結ばれた酸化型、又は上記システイン残基中のチオール基が遊離状態である還元型のいずれかの形態で存在する。その半反応式は以下の通りである。
【００２１】
【数１】
2015091226.tif 000003
【００２２】
細胞内には、過酸化水素を含む活性酸素などの電子受容体（酸化剤）、及びグルタチオンやチオレドキシンなどの電子供与体（還元剤）が存在する。これらの量は、当該細胞の存在する環境に応じて変動する。ここで本発明において、「細胞内における酸化還元状態をモニターする」とは、当該細胞内における酸化剤及び還元剤の量の変動をモニターすることである。細胞内に本願発明の蛍光タンパク質が存在する場合、当該細胞内の酸化剤存在量が増大すると、上記半反応式の平衡は酸化型へと偏る。逆に、当該細胞内の還元剤存在量が増大すると、上記半反応式の平衡は還元型へと偏る。そして、細胞内における酸化還元状態の変化は、本発明の蛍光タンパク質の蛍光強度の変化として観察される。
【００２３】
励起光波長を固定して特定の波長（例えば蛍光極大波長）における蛍光強度を測定すると、本発明の蛍光タンパク質の酸化型の蛍光強度は、還元型の蛍光強度と異なる。したがって、蛍光タンパク質の蛍光強度を測定することにより、当該蛍光タンパク質が酸化型で存在しているのか、それとも還元型で存在しているのかが識別可能となり、当該蛍光タンパク質が存在する周囲環境における酸化還元状態をモニターすることができる。
【００２４】
本発明の蛍光タンパク質の酸化型及び還元型の蛍光強度の内、より高い方に対する他方の蛍光強度の比率は、通常８０％以下であり、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、一層好ましくは５０％以下、とりわけ好ましくは４０％以下、特に好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下である。
【００２５】
本発明の蛍光タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間に挿入されるアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）及びアルギニン（Ｒ）からなる群から選択されるいずれか１つである。励起光波長を固定して特定の波長（例えば蛍光極大波長）における蛍光強度を測定すると、当該アミノ酸挿入により、本発明の蛍光タンパク質の還元型の蛍光強度と酸化型の蛍光強度との間に差が生じる。当該還元型と酸化型との間の蛍光強度の差を拡大させるために、挿入されるべき上記アミノ酸としては、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアルギニン（Ｒ）が好ましい。
【００２６】
本発明の蛍光タンパク質の還元型と酸化型との間の蛍光強度の差をさらに拡大させるために、本発明の蛍光タンパク質は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号１、５９、６０及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸でさらに置換されることが好ましく、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸でさらに置換されることがより好ましい。
【００２７】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質である。
【００２８】
異なる色彩の発光を有する（すなわち、極大蛍光波長が大きく異なる）、複数の酸化還元応答性蛍光タンパク質は、その色彩の違いにより、同一細胞内で同時に使用しても区別可能である。また、極大励起波長が大きく異なる酸化還元応答性蛍光タンパク質の組み合わせは、一方の蛍光タンパク質がほとんど反応できない波長の励起光を照射することで、他方の蛍光タンパク質のみの蛍光を観察することを可能とする。
【００２９】
本発明の蛍光タンパク質の１つは、ＧＦＰ（励起極大波長３９５ｎｍ：蛍光極大波長５１０ｎｍ）において蛍光発光に関与するＹ６６をフェニルアラニン（Ｆ）へと置換したＳｉｒｉｕｓ（励起極大波長３５５ｎｍ：蛍光極大波長４２４ｎｍ）をベースとして作製され得る。したがって、Ｆ６６を有する本発明の蛍光タンパク質は、ＧＦＰをベースとして作製された、細胞内の酸化還元状態をモニターするための蛍光タンパク質（例えばｒｏＧＦＰ）とは異なる蛍光特性を有するため、両者の組み合わせは、同一細胞内で同時に使用しても区別可能である。
【００３０】
また、本発明の蛍光タンパク質の１つは、蛍光発光に関与する６６番目のアミノ酸としてトリプトファン（Ｗ）を有し、ＣＦＰ（励起極大波長４５２ｎｍ：蛍光極大波長５０５ｎｍ）様の蛍光特性を有する。また、本発明の蛍光タンパク質の１つは、蛍光発光に関与する６６番目及び２０３番目のアミノ酸としてチロシン（Ｙ）を有し、ＹＦＰ（励起極大波長５１３ｎｍ：蛍光極大波長５２７ｎｍ）様の蛍光特性を有する。また、本発明の蛍光タンパク質の１つは、蛍光発光に関与する６６番目のアミノ酸としてヒスチジン（Ｈ）を有し、ＢＦＰ（励起極大波長３８０ｎｍ：蛍光極大波長４４０ｎｍ）様の蛍光特性を有する。蛍光特性の異なる複数の本発明の蛍光タンパク質は、同一細胞内で同時に使用しても区別可能である。
【００３１】
Ｓｉｒｉｕｓ様の蛍光特性を有する、Ｆ６６を有する本発明の蛍光タンパク質においては、例えば励起光波長を３６５〜３８５ｎｍ付近に、好ましくは３７５ｎｍ付近に固定して、４１５〜４３５ｎｍ付近の、好ましくは４２５ｎｍ付近の波長における蛍光強度が測定される。また、ＣＦＰ様の蛍光特性を有する、Ｗ６６を有する本発明の蛍光タンパク質においては、例えば励起光波長を４２０〜４４０ｎｍ付近に、好ましくは４３０ｎｍ付近に固定して、４７０〜４９０ｎｍ付近の、好ましくは４８０ｎｍ付近の波長における蛍光強度が測定される。また、ＹＦＰ様の蛍光特性を有する、Ｙ６６及びＹ２０３を有する本発明の蛍光タンパク質においては、例えば励起光波長を４９０〜５１５ｎｍ付近に、好ましくは５１５ｎｍ付近に固定して、５２０〜５４０ｎｍ付近の、好ましくは５２８ｎｍ付近の波長における蛍光強度が測定される。また、ＢＦＰ様の蛍光特性を有する、Ｈ６６を有する本発明の蛍光タンパク質においては、例えば励起光波長を３７０〜３９０ｎｍ付近に、好ましくは３８０ｎｍ付近に固定して、４３０〜４５０ｎｍ付近の、好ましくは４４０ｎｍ付近の波長における蛍光強度が測定される。
【００３２】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、６５番目のアミノ酸残基がセリン（Ｓ）で置換され、６６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４６番目のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸（Ｅ）が挿入されたアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質である。
【００３３】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号５９のアミノ酸配列、又は、配列番号５９に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がグリシン（Ｇ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグルタミン酸（Ｅ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質である。
【００３４】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号６０のアミノ酸配列、又は、配列番号６０に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアスパラギン酸（Ｄ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質である。
【００３５】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号５９のアミノ酸配列、又は、配列番号５９に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にグリシン（Ｇ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質である。
【００３６】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号６１のアミノ酸配列、又は、配列番号６１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４６番目のアミノ酸残基がトリプトファン（Ｗ）で置換され、１４７番目及び２０４番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、かつ１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基との間にアルギニン（Ｒ）が挿入されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質である。
【００３７】
本発明の蛍光タンパク質の１つは、Ｓｉｒｉｕｓをベースとして作製され得る。野生型のＧＦＰを含め、従来の蛍光タンパク質の蛍光強度は、周囲環境のｐＨ変化に依存して変動する。しかしＳｉｒｉｕｓは、その蛍光強度がｐＨ非依存的であることが知られている（Nagai, T. et al., Nature Methods, 2009, 6, 351-353）。したがって、Ｓｉｒｉｕｓを親タンパク質として作製された本発明の蛍光タンパク質は、好ましくは蛍光特性のｐＨ感受性が低い。より好ましくは、本発明の蛍光タンパク質は、ｐＨ６．５〜８．０の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い。ここで、「ｐＨ感受性が低い」とは、ｐＨを変化させて、励起光波長を固定して蛍光極大波長における蛍光強度が測定されるとき、蛍光タンパク質の還元型の蛍光強度に対する酸化型の蛍光強度の比の変動率が通常７０％以内のことである。
【００３８】
本発明の蛍光タンパク質は、親タンパク質（Ｓｉｒｉｕｓ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｖｅｎｕｓ又はＥＢＦＰ２）に対して、アミノ酸変異を導入することで作製され得る。変異の導入方法については以下で詳述する。また、本発明の蛍光タンパク質は、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできる。
【００３９】
本発明の蛍光タンパク質は、それ単独の形態のみに制限されるものではなく、任意の改変、修飾等を加えた態様で使用することができる。例えば、第二のタンパク質との融合、タンパク質精製を容易とするためのペプチドタグ（例えばＨｉｓタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ）の付加、タンパク質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。
【００４０】
本発明の一態様は、本発明の蛍光タンパク質と、第二のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質である。本発明の蛍光タンパク質と、第二のタンパク質とは、所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して連結される。リンカーを構成するアミノ酸配列及びそのアミノ酸残基数は、本発明の蛍光タンパク質の機能を阻害しない限り、任意に選択され得る。例えば、可動性リンカーである(ＧＧＳＧＧ)６が挙げられる。上記第二のタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、ペルオキシダーゼ又はグルタレドキシンがある。特に、発明の蛍光タンパク質とペルオキシダーゼ又はグルタレドキシンとを融合させたタンパク質は、融合前の本発明の蛍光タンパク質と比較して、酸化還元感受性を向上させることができる。
【００４１】
本発明の融合タンパク質は、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ、及び第二のタンパク質をコードするＤＮＡを、リンカーをコードするＤＮＡと連結した形で組み換えベクターに挿入し、当該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することで作製することができる。また、本発明の蛍光タンパク質と第二のタンパク質とを別々に作製し、それらを連結することで作製することもできる。本発明の蛍光タンパク質と第二のタンパク質とを連結する時期に特に限定はなく、それらを個別に作製後速やかに連結させてもよく、又はいずれか一方のタンパク質が作製されて特定の用途に使用された後に、他方のタンパク質と連結させてもよい。
【００４２】
本発明の一態様は、本発明の蛍光タンパク質、又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡである。本発発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号４４、８０、８１及び８２からなる群から選択される塩基配列、又は、配列番号４４、８０、８１及び８２からなる群から選択される塩基配列に対して９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列において、本発明の蛍光タンパク質を特徴付ける置換部位のアミノ酸に対応するコドンが、それぞれのアミノ酸置換に対応するコドンに置き換えられ、かつ、１４７番目と１４８番目のアミノ酸残基に対応するコドンの間に、挿入されるべきアミノ酸に対応するコドンが挿入された塩基配列からなる。
【００４３】
本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの作製方法は、特に限定されないが、親タンパク質（Ｓｉｒｉｕｓ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｖｅｎｕｓ及びＥＢＦＰ２）をコードする、配列番号４４、８０、８１及び８２からなる群から選択される塩基配列、又は、配列番号４４、８０、８１及び８２からなる群から選択される塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを基に、ＰＣＲ、部位特異的変異法その他の一般的な遺伝子工学的手法によって作製することができる。また部位特異的変異等の遺伝子工学的手法は、例えばManiatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982）及びその他の、当業者に広く利用されている実験操作マニュアル書に記載されている。
【００４４】
本発明の一態様は、本発明の蛍光タンパク質、又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターである。本発明の組み換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよく、また本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等が挙げられる。
【００４５】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたり、あるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００４６】
また、本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択すればよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち宿主細胞の染色体複製とは無関係に自律的に複製可能なベクターであってもよい。また、宿主細胞のゲノムに統合され、統合された染色体と共に複製されるものであってもよい。例えば、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることが可能である。
【００４７】
利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＧＢＴ−９（Clontech社製）、ｐｅｔ２３ａ（Novagen社製）等を例示することができる。本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質の発現は、該タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込む等の操作も、前記Maniatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982）及びその他の実験操作マニュアル書の記載に基づいて行うことができる。
【００４８】
本発明の一態様は、本発明の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞である。宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、バチラス（Bacillus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌、エルウニア（Erwinia）属細菌、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属細菌、ロドバクター（Rhodobacter）属細菌、ストレプトミセス（Streptomyces）属微生物、ザイモモナス（Zymomonas）属微生物、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母等の微生物、カイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞を挙げることができる。
【００４９】
宿主細胞に組み換えベクターを導入する方法としては、前記のManiatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982）を初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、及び、BIO/TECHNOLOGY vol. 6, 1988, page 47等に記載されている。
【００５０】
本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質は、本発明の組み換えベクターを前記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、タンパク質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００５１】
本発明の一態様は、細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、本発明の蛍光タンパク質、又は融合タンパク質を前記細胞内に存在させ、前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、検出された蛍光の蛍光強度に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることを含む方法である。当該方法において、細胞内に本発明の蛍光タンパク質、又は融合タンパク質を存在させるためには、本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターを細胞へと形質転換し、当該細胞内で本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質を発現させるか、或いは、本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質を細胞内へ直接導入する。本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質を細胞内へ直接導入する方法は特に限定されないが、例えば、カチオン性脂質をベースとしたタンパク質導入試薬などを使用して行われる。また、エレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法によっても行われる。
【００５２】
上記における、蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光の検出は、特に限定されないが、例えば蛍光顕微鏡を使用して、又は分光蛍光光度計を使用して行われる。例えば検出される蛍光の蛍光強度を測定し、全てが酸化型となっている場合の当該タンパク質の蛍光強度、及び／又は全てが還元型となっている場合の当該タンパク質の蛍光強度と、測定された蛍光強度とを比較することで、細胞内の酸化還元状態がモニターできる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は決して以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【００５４】
以下の比較例及び実施例において、親タンパク質（Ｓｉｒｉｕｓ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｖｅｎｕｓ及びＥＢＦＰ２）からの変異体の作製は、部位特異的突然変異誘発法により行われた。使用されるプライマーの配列を以下の表１に示す。
【００５５】
【表１】
2015091226.tif 000004
【００５６】
【表２】
2015091226.tif 000005
【００５７】
ここで、表１及び２におけるプライマー名は「Ｐｒｉｍｅｒ＿プライマー番号（Ｆ／Ｒ）−導入される変異（導入される順）」として表記される。「Ｆ」はフォワードプライマー、「Ｒ」はリバースプライマーを示す。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ＿４（Ｆ）−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤ（配列番号２０）は、フォワードプライマーであり、Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤを導入するためのプライマーであることを示す。また、Ｐｒｉｍｅｒ＿５（Ｆ）−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤ−Ｉ１４６Ｎ（配列番号２２）は、フォワードプライマーであり、Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤが導入された後に、Ｉ１４６Ｎを導入するためのプライマーであることを示す。また、Ｐｒｉｍｅｒ＿１３（Ｆ）−Ｑ６５Ｓ＋Ｆ６６Ｗは（配列番号３８）は、フォワードプライマーであり、Ｑ６５Ｓ及びＦ６６Ｗを同時に導入するためのプライマーであることを示す。また、Ｐｒｉｍｅｒ＿１５（Ｆ）−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＥ−Ｓ１４８Ｄ−Ｉ１４６Ｇ（配列番号４２）は、フォワードプライマーであり、Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＥが導入され、Ｓ１４８Ｄが導入された後に、Ｉ１４６Ｇを導入するためのプライマーであることを示す。その他のプライマーも同様に表記される。
【００５８】
比較例１：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ（配列番号２）の作製
国際公開第２００９／０２０１９７号に記載の方法で作製されたＳｉｒｉｕｓをコードするＤＮＡ（配列番号４４）を、ｐｅｔ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだベクター（ｐｅｔ２３ａ／Ｓｉｒｉｕｓ）を鋳型として、ＰｒｉｍＳｔａｒ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用した部位特異的突然変異誘発法により、Ｓｉｒｉｕｓ（配列番号１）のＳ１４７Ｃ及びＱ２０４Ｃのアミノ酸変異に対応する塩基配列の変異を配列番号４４に導入した。
【００５９】
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、及び配列番号１６及び１７の組み合わせを使用した。
【００６０】
ｐｅｔ２３ａ／Ｓｉｒｉｕｓ １０ｐｇを鋳型として、上記プライマー、並びにＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘを用いてＰＣＲ（５０μｌ反応系）を行った。ＰＣＲは、９８℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、１５秒のアニーリング反応及び７２℃、２０秒の伸長・連結反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００６１】
作製した変異体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してＬＢ  ＋５０μＭアンピシリンプレート培地で一晩培養後、２０ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で約３時間前培養した。これを、１Ｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で本培養し、吸光度０．４〜０．６のときに、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養温度を２５℃に下げて一晩培養した。培養後の菌体を遠心により回収して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて破砕後、２００００×Ｇで３０分遠心して、Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃを含む上清を得た。
【００６２】
上記の上清を７０℃で３０分間加熱し、大腸菌由来のタンパク質を変性させた。その後、２００００×Ｇで１５分間遠心し、変性タンパク質を除去した。遠心後の上清をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０カラム（東ソー社製）にアプライし、２０％〜０％の間で溶出液中の硫酸アンモニウム濃度を連続的に低下させてフラクションを分取した。分画したフラクション中で夾雑物の少ない部分を一晩２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液中で透析した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃを得た。得られたタンパク質を、終濃度２０％になるようにグリセロールを加えて液体窒素で凍結し、保存した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号４５とする。
【００６３】
比較例２：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＡ（配列番号３）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、並びに配列番号１８及び１９の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号４６とする。
【００６４】
実施例１：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤ（配列番号４）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、並びに配列番号２０及び２１の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号４７とする。
【００６５】
実施例２：Ｏｂａ−Ｑｓ（Ｓｉｒｉｕｓ−Ｉ１４６Ｎ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤ）（配列番号５）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、配列番号２０及び２１、並びに配列番号２２及び２３の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。ただし、配列番号２０及び２１を用いてＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤに対応する変異を導入した後に、配列番号２２及び２３の組み合わせを使用してＩ１４６Ｎに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号４８とする。
【００６６】
実施例３：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＥ（配列番号６）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、並びに配列番号２４及び２５の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号４９とする。
【００６７】
実施例４：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｉ１４６Ｎ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＥ（配列番号７）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、配列番号２４及び２５、並びに配列番号２６及び２７の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。ただし、配列番号２４及び２５を用いてＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＥに対応する変異を導入した後に、配列番号２６及び２７の組み合わせを使用してＩ１４６Ｎに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５０とする。
【００６８】
実施例５：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＬ（配列番号８）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、並びに配列番号２８及び２９の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５１とする。
【００６９】
実施例６：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲ（配列番号９）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、並びに配列番号３０及び３１の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５２とする。
【００７０】
実施例７：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｉ１４６Ｆ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲ（配列番号１０）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、配列番号３０及び３１、並びに配列番号３２及び３３の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。ただし、配列番号３０及び３１を用いてＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲに対応する変異を導入した後に、配列番号３２及び３３の組み合わせを使用してＩ１４６Ｆに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５３とする。
【００７１】
実施例８：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｉ１４６Ｎ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲ（配列番号１１）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、配列番号３０及び３１、並びに配列番号３４及び３５の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。ただし、配列番号３０及び３１を用いてＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲに対応する変異を導入した後に、配列番号３４及び３５の組み合わせを使用してＩ１４６Ｎに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５４とする。
【００７２】
実施例９：Ｓｉｒｉｕｓ−Ｉ１４６Ｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲ（配列番号１２）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、配列番号３０及び３１、並びに配列番号３６及び３７の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。ただし、配列番号３０及び３１を用いてＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＲに対応する変異を導入した後に、配列番号３６及び３７の組み合わせを使用してＩ１４６Ｓに対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５５とする。
【００７３】
実施例１０：ｒｏＣＦＰ（Ｓｉｒｉｕｓ−Ｑ６５Ｓ−Ｆ６６Ｗ−Ｉ１４６Ｇ−Ｓ１４７Ｃ−Ｓ１４８Ｄ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｄ１４８ｉｎｓＥ）（配列番号１３）の作製
変異を導入するためのプライマーとして、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７、配列番号２４及び２５、配列番号３８及び３９、配列番号４０及び４１、並びに配列番号４２及び４３の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。ただし、配列番号２４及び２５の組み合わせを用いてＣ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＥに対応する変異を導入し、そして、配列番号４０及び４１の組み合わせを用いてＳ１４８Ｄ対応する変異を導入した後に、配列番号４２及び４３の組み合わせを用いてＩ１４６Ｇ対応する変異を導入した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５６とする。
【００７４】
実施例１１：Ｏｂａ−Ｑｃ（ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ−Ｉ１４６Ｇ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｄ１４８ｉｎｓＥ）（配列番号６２）の作製
ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅをコードするＤＮＡ（配列番号８０）を、ｐｅｔ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだベクター（ｐｅｔ２３ａ／ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号７３及び７４の組み合わせ、並びに配列番号７８及び７９の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。
【００７５】
実施例１２：Ｏｂａ−Ｑｂ（ＥＢＦＰ２−Ｎ１４６Ｌ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｈ１４８ｉｎｓＤ）（配列番号６３）の作製
ＥＢＦＰ２をコードするＤＮＡ（配列番号８１）を、ｐｅｔ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだベクター（ｐｅｔ２３ａ／ＥＢＦＰ２）を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号６６及び６７の組み合わせ、並びに配列番号６８及び６９の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。得られたＯｂａ−Ｑｂを、Ｃ末端にｐｅｔ２３ａ由来のヒスチジンタグを含む配列（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）を含む状態で実施例１５に使用した。なお、ＧＦＰ及びその変異体のＣ末端側の１１アミノ酸は、一般的に蛍光特性に関与しない部分であり、その先に他のタンパク質を連結しても蛍光特性は変化しないことが知られている。
【００７６】
実施例１３：Ｒｅ−Ｑｃ（ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ−Ｉ１４６Ｗ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｄ１４８ｉｎｓＧ）（配列番号６４）の作製
ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅをコードするＤＮＡ（配列番号８０）を、ｐｅｔ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだベクター（ｐｅｔ２３ａ／ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号７０及び７１の組み合わせ、並びに配列番号７２及び７３の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。得られたＲｅ−Ｑｃを、Ｃ末端にｐｅｔ２３ａ由来のヒスチジンタグを含む配列（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）を含む状態で実施例１５に使用した。
【００７７】
実施例１４：Ｒｅ−Ｑｙ（Ｖｅｎｕｓ−Ｎ１４６Ｗ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ−Ｃ１４７＿Ｈ１４８ｉｎｓＲ）（配列番号６５）の作製
ＶｅｎｕｓをコードするＤＮＡ（配列番号８２）を、ｐｅｔ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだベクター（ｐｅｔ２３ａ／Ｖｅｎｕｓ）を鋳型として、変異を導入するためのプライマーとして、配列番号７４及び７５の組み合わせ、並びに配列番号７６及び７７の組み合わせを使用した他は、比較例１と同様にして作製した。得られたＲｅ−Ｑｙを、Ｃ末端にｐｅｔ２３ａ由来のヒスチジンタグを含む配列（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）を含む状態で実施例１５に使用した。
【００７８】
実施例１５：蛍光タンパク質の蛍光強度の測定
実施例１〜１４並びに比較例１及び２で作製した蛍光タンパク質の１μＭ溶液を調製し、分光蛍光光度計ＦＰ−８５００（日本分光株式会社）を使用して各蛍光タンパク質の蛍光強度を測定した。蛍光タンパク質の還元型の蛍光強度を測定する場合は、蛍光強度測定前に1 mM ジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下で15分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ還元型とした。蛍光タンパク質の酸化型の蛍光強度を測定する場合は、蛍光強度測定前に、50μM塩化銅存在下にて15分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ酸化型とした。
比較例１及び２、並びに実施例１〜９で作製した蛍光タンパク質においては、分光蛍光光度計の感度をｍｅｄｉｕｍに設定し、蛍光波長４２５ｎｍとし、励起・蛍光バンド幅を共に５ｎｍに設定して、２５０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で励起スペクトルを測定した。極大蛍光波長（３７５ｎｍ付近）における各蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
実施例１０、１１及び１３で作製した蛍光タンパク質の蛍光強度は、蛍光波長４８０ｎｍで２５０〜４６０ｎｍの範囲で励起スペクトルを測定し、極大励起波長（４３０ｎｍ付近）における蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
実施例１２で作製した蛍光タンパク質の蛍光強度は、蛍光波長４４０ｎｍで２５０〜５００ｎｍの範囲で励起スペクトルを測定し、極大励起波長（３８０ｎｍ付近）における蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
実施例１４で作製した蛍光タンパク質の蛍光強度は、蛍光波長５２５ｎｍで２５０〜５１８ｎｍの範囲で励起スペクトルを測定し、極大励起波長（５１５ｎｍ付近）における蛍光タンパク質の蛍光強度を記録した。
各蛍光タンパク質の酸化型及び還元型の蛍光強度を図１Ａ及びＢに示す。
また、各蛍光タンパク質の還元型及び酸化型の蛍光強度の内、いずれか高い方に対する他方の蛍光強度との比を図２Ａ及びＢに示す。
【００７９】
比較例１（Ｓｉｒｉｕｓ−Ｓ１４７Ｃ−Ｑ２０４Ｃ）の場合、酸化型と還元型とで蛍光強度に差はなかった。しかし、比較例１の蛍光タンパク質の１４７番目と１４８番目のアミノ酸の間に特定のアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）又はアルギニン（Ｒ））を挿入することで、還元型と比較して酸化型の蛍光強度が低下した（実施例１、３、５及び６）。特に、実施例１の蛍光タンパク質では、還元型に対する酸化型の蛍光強度比率が約４０％であった。しかし、１４７番目と１４８番目のアミノ酸の間にアラニン（Ａ）を挿入した場合には、還元型と酸化型との間で蛍光強度に差はなかった（比較例２）。
【００８０】
実施例１、３、５及び６の蛍光タンパク質の１４６番目のアミノ酸を、特定のアミノ酸（アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ））でさらに置換した。その結果、還元型と比較して酸化型の蛍光強度がさらに低下した（実施例２、４及び７〜９）。特に、実施例２の蛍光タンパク質は、還元型に対する酸化型の蛍光強度比率が２０％以下であった。実施例２の蛍光タンパク質が酸化されたときに示すこのような極めて顕著な消光効果に基づいて、本明細書では当該タンパク質をＯｂａ−Ｑs（oxidation balance sensed quenching protein derived from serius）とも呼ぶ。
【００８１】
実施例１０で作製した蛍光タンパク質（ｒｏＣＦＰ）は、実施例３の蛍光タンパク質にさらに変異を施したものである。具体的には、ＣＦＰの構造を参考として蛍光発光に関与するアミノ酸に変異を導入することで、ＣＦＰ様の蛍光特性を示すようになった（励起極大波長４３５ｎｍ、蛍光極大波長４８０ｎｍ）。これは、Ｓｉｒｉｕｓ変異体である実施例１〜９の蛍光タンパク質の蛍光特性（励起極大波長約３７５ｎｍ、蛍光極大波長約４２５ｎｍ）とは大きく異なる。なお、還元型と比較して酸化型の蛍光強度が低い点という本発明の蛍光タンパク質の特徴は失われていない（図１Ａ及び２Ａ）。したがって、実施例１０の蛍光タンパク質と実施例１〜９のいずれか１つの蛍光タンパク質とを同時に使用すれば、従来よりも示差性に優れた解析が可能となり得る。
【００８２】
実施例１１及び実施例１２で作製した蛍光タンパク質は、親タンパク質として、それぞれｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ及びＥＢＦＰ２を採用した変異体である。それぞれ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ及びＥＢＦＰ２の蛍光特性を保持しつつ、還元型と比較して酸化型の蛍光強度が低い点という本発明の蛍光タンパク質の特徴は失われていない（図１Ｂ及び２Ｂ）。実施例１１及び１２の蛍光タンパク質が酸化されたときに示す極めて顕著な消光効果に基づいて、本明細書では実施例１１及び１２の蛍光タンパク質を、それぞれＯｂａ−Ｑｃ（oxidation balance sensed quenching protein derived from CFP）及びＯｂａ−Ｑｂ（oxidation balance sensed quenching protein derived from BFP）とも呼ぶ。
【００８３】
実施例１３及び実施例１４で作製した蛍光タンパク質は、親タンパク質として、それぞれｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ及びＶｅｎｕｓを採用した変異体である。それぞれ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ及びＶｅｎｕｓの蛍光特性を保持していた。そして驚くべきことに、実施例１〜１２の蛍光タンパク質とは異なり、酸化型と比較して還元型の蛍光強度が著しく低下することが明らかとなった（図１Ｂ及び２Ｂ）。実施例１３及び１４の蛍光タンパク質が還元されたときに示すこのような極めて顕著な消光効果に基づいて、本明細書では実施例１３及び１４の蛍光タンパク質を、それぞれＲｅ−Ｑｃ（reduction sensed quenching protein derived from CFP）及びＲｅ−Ｑｙ（reduction sensed quenching protein derived from YFP）とも呼ぶ。
【００８４】
図３Ａは、Ｏｂａ−Ｑｓ（配列番号５）の、酸化型及び還元型のそれぞれにおける励起スペクトル及び蛍光スペクトルである。また、還元型から酸化型へと変換した後、再度還元型へと変換したものを、再還元型として示す。励起スペクトルは、蛍光波長４２５ｎｍとし、２５０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で測定した。蛍光スペクトルは、励起光波長を３７５ｎｍとして測定した。図３Ａで示される通り、本発明の蛍光タンパク質の励起スペクトルの極大励起波長における蛍光強度は、蛍光スペクトルの極大蛍光波長における蛍光強度とほぼ同一である。したがって、励起スペクトル測定により得られた極大蛍光波長（４３０ｎｍ付近）における蛍光強度の値は、蛍光スペクトルの極大励起波長における蛍光強度の値と同等とみなすことができる。
【００８５】
図３Ｂは、Ｒｅ−Ｑｙ（配列番号６５）の、酸化型及び還元型のそれぞれにおける励起スペクトル及び蛍光スペクトルである。励起スペクトルは、蛍光波長５２５ｎｍとし、２５０ｎｍ〜５１８ｎｍの範囲で測定した。蛍光スペクトルは、励起光波長を５１０ｎｍとして測定した。図３ＡのＯｂａ−Ｑｓの場合と異なり、Ｒｅ−Ｑｙの還元型の励起スペクトル及び蛍光スペクトルにおける蛍光強度は、酸化型の励起スペクトル及び蛍光スペクトルにおける蛍光強度と比較して著しく低下した。
【００８６】
実施例１６：Ｏｂａ−ＱｓとＡｔＧｐｘ１との融合タンパク質（Ｏｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１）（配列番号５７）の作製
実施例２で作製された、ｐｅｔ２３ａにＯｂａ−Ｑｓに対応する塩基配列が挿入されたベクター（ｏｂａ−Ｑｓ／ｐｅｔ２３ａと称する）に対して、シロイナズナのグルタチオンペルオキイダーゼ１（ＡｔＧｐｘ１）に対応する塩基配列を挿入した。さらに、Ｏｂａ−Ｑに対応する塩基配列とＡｔＧｐｘ１に対応する塩基配列との間に、可動性リンカーである(ＧＧＳＧＧ)６に対応する塩基配列を挿入した。得られたベクターを、Ｏｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１／ｐｅｔ２３ａと称する。
【００８７】
Ｏｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１／ｐｅｔ２３ａを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してＬＢ  ＋５０μＭアンピシリンプレート培地で一晩培養後、２０ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で約３時間前培養した。これを、１Ｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で本培養し、吸光度０．４〜０．６のときに、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養温度を２５℃に下げて一晩培養した。培養後の菌体を遠心により回収して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて破砕後２００００×Ｇで３０分遠心して、Ｏｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１を含む上清を得た。
【００８８】
得られた上清を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）にアプライし２０ｍＭイミダゾール−２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む洗浄バッファーで洗浄後、１００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて溶出した。分画したフラクション中で夾雑物の少ない部分を一晩２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液中で透析した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｏｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１を得た。得られた融合タンパク質を、終濃度２０％になるようにグリセロールを加えて液体窒素で凍結し、保存した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号５８とする。
【００８９】
実施例１７：Ｈ２Ｏ２の添加による、Ｏｂａ−Ｑｓ及びＯｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１の蛍光強度の経時変化の測定
あらかじめ５００μＭのＤＴＴで還元した１０μＭのＯｂａ−Ｑｓ溶液、及びＯｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１溶液（いずれも脱気済み）を、５０ｍＭのトリシンバッファーで１００倍に希釈したもの（タンパク質の終濃度１００ｎＭ）をそれぞれサンプルとして使用した。分光蛍光光度計ＦＰ−８５００（日本分光株式会社）を使用して各サンプルの蛍光強度を測定した。分光蛍光光度計の感度をｍｅｄｉｕｍに設定し、励起波長３７５ｎｍとし、励起・蛍光バンド幅を共に５ｎｍに設定して、蛍光波長４２５ｎｍにおける蛍光強度を１０秒ごとに測定した。測定開始１分後に所定の濃度のＨ２Ｏ２を加え、蛍光強度の経時変化を観察した（図４、５）。
【００９０】
Ｏｂａ−Ｑｓ単体（図４）では、測定開始１００秒後（１０ｍＭのＨ２Ｏ２添加４０秒後）に蛍光強度は３０％程度低下した。一方、Ｏｂａ−Ｑｓ−ＡｔＧｐｘ１（図５）では、測定開始１００秒後（１０ｍＭのＨ２Ｏ２添加４０秒後）に蛍光強度は６０％も低下した。本発明の蛍光タンパク質をペルオキシダーゼと融合することで、酸化還元感受性をさらに向上させることができた。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の蛍光タンパク質は、励起スペクトルを測定することなく、細胞内における酸化還元状態の変化を、蛍光強度に基づいて簡便にモニターすることができる。また、蛍光特性の異なる複数の本発明の蛍光タンパク質を同時に使用すると、従来よりも示差性に優れた解析が可能となる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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