(57)【要約】      （修正有）【課題】長期貯蔵及び配送において安定な、特に皮下投与のための、ＴＮＦ関連障害等を処置又は予防するための、単一ドメイン抗原結合分子（ＳＤＡＢ）、特にＴＮＦ結合ナノボディ分子製剤の提供。【解決手段】ａ）１つまたは複数の単一ドメイン分子を含み、少なくとも１つの単一ドメイン分子がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、例えば少なくとも１つの、好ましくは２つの腫瘍壊死因子αに結合する単一ドメイン分子を含む、ＳＤＡＢ、（ｂ）凍結乾燥保護剤、及び（ｃ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液を含む製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ結合ナノボディ分子、
（ｂ）約５％〜約１０％の濃度の、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースから選択される凍結乾燥保護剤、
（ｃ）約０．０１％〜０．６％の濃度の、ポリソルベート８０またはポロキサマー１８８から選択される界面活性剤、および
（ｄ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約１０〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液または約２０ｍＭの濃度のトリス緩衝液から選択される緩衝液、
を含み、製剤中のＴＮＦ結合ナノボディ分子が、４℃で少なくとも３カ月間貯蔵した後にその結合活性の少なくとも約７０％を保持している製剤。
【請求項２】
（ｉ）４℃で少なくとも１２カ月間貯蔵した後に５％未満の高分子量（ＨＭＷ）種、
（ｉｉ）４℃で少なくとも１２カ月間貯蔵した後に５％未満の低分子量（ＬＭＷ）種、  （ｉｉｉ）４℃で少なくとも１２カ月間貯蔵した後に１０％未満の酸性種、および／または
（ｉｖ）４℃で少なくとも１２カ月間貯蔵した後に５％未満の塩基性種
を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
液体形態、凍結乾燥形態、再構成した凍結乾燥形態、または凍結した大量貯蔵形態である、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
（ａ）約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１３０ｍｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ結合ナノボディ分子、
（ｂ）約５％〜約１０％の濃度のスクロース、
（ｃ）約０．０１％〜０．０２％の濃度のポリソルベート８０、および
（ｄ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約１０〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液からなる群から選択される緩衝液、
を含む液体製剤または凍結乾燥製剤である、請求項１から３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
（ａ）約８０ｍｇ／ｍＬ〜約２８０ｍｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ結合ナノボディ分子、
（ｂ）約５％〜約１０％の濃度のスクロース、
（ｃ）約０．０１％〜０．０２％の濃度のポリソルベート８０、および
（ｄ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約１０〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液からなる群から選択される緩衝液、
を含む大量貯蔵製剤であり、少なくとも１００リットルの製剤が凍結条件で貯蔵される、請求項１から３のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
製剤のｐＨが、５、５．５、５．８〜６．１、６．０、６．１、６．５および７からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
スクロース、ソルビトールまたはトレハロースの濃度が、約５％、約７．５％、または約１０％である、請求項１から６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子が、１つまたは複数の単一ドメイン分子で構成される単鎖ポリペプチドである、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
【請求項９】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子が一価または多価である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子が単一特異性または多特異性である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１１】
１つまたは複数の単一ドメイン分子が、ＣＤＲ移植した、ヒト化した、ラクダ化した、脱免疫化した、またはファージディスプレイによって選択したものである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１２】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子が、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と結合する１つまたは複数の単一ドメイン分子と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質と結合する１つの単一ドメイン分子とを含む単鎖融合ポリペプチドである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１３】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子が、図３０に示すアミノ酸配列（配列番号１）、またはそれに少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１４】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子の単一ドメイン分子のうちの少なくとも１つが、ＤＹＷＭＹ（配列番号２）（ＣＤＲ１）、ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号３）（ＣＤＲ２）およびＳＰＳＧＦＮ（配列番号４）（ＣＤＲ３）のアミノ配列を有する、または前記ＣＤＲのうちの１つと１個の保存的アミノ酸置換によって異なるＣＤＲを有する３個のＣＤＲを含む、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１５】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子の単一ドメイン分子のうちの少なくとも１つが、図３０（配列番号１）のアミノ酸約１〜１１５のアミノ酸配列を有する可変領域、または前記可変領域と１０個までのアミノ酸が異なる可変領域を含む、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１６】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子が、ＨＳＡと結合する少なくとも１つの単一ドメイン分子をさらに含み、ＳＦＧＭＳ（配列番号５）（ＣＤＲ１）、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６）（ＣＤＲ２）およびＧＧＳＬＳＲ（配列番号７）（ＣＤＲ３）のアミノ配列を有する、または前記ＣＤＲのうちの１つと１個の保存的アミノ酸置換によって異なるＣＤＲを有する３個のＣＤＲを含む、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１７】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子の単一ドメイン分子のうちの少なくとも１つが、ＨＳＡと結合し、図３０（配列番号１）のアミノ酸約１２５〜２３９のアミノ酸配列を有する可変領域、または前記可変領域と１０個までのアミノ酸が異なる可変領域を含む、請求項１から７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１８】
ＴＮＦ結合ナノボディを細胞培養物中で発現させることと、
ＴＮＦ結合ナノボディを、クロマトグラフィー精製ステップ、または限外濾過／ダイアフィルトレーションステップのうちの少なくとも１つに通すことによって、ＴＮＦ結合ナノボディを精製することと、
約５％〜約１０％の濃度のスクロース、約０．０１％、０．０２％の濃度のポリソルベート８０、および、製剤のｐＨが約５〜７．５となるような、約１０〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液または約２０ｍＭの濃度のトリス緩衝液を含有する製剤中で、ＴＮＦ結合ナノボディの濃度を約１０〜２５０ｍｇ／ｍＬに調整することと
を含む、ＴＮＦ結合ナノボディの製剤を調製する方法またはプロセス。
【請求項１９】
ＴＮＦ結合ナノボディ分子と凍結乾燥保護剤、界面活性剤、および緩衝液との混合物を凍結乾燥することによって、凍結乾燥した混合物を形成することと、
凍結乾燥した混合物を希釈剤中で再構成することによって、（ａ）約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１３０ｍｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ結合ナノボディ分子、（ｂ）約５％〜約１０％の濃度の、スクロースまたはトレハロースからなる群から選択される凍結乾燥保護剤、（ｃ）約０．０１％〜０．０２％の濃度の、界面活性剤としてのポリソルベート８０、および（ｄ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約１０〜約２０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液または約２０ｍＭの濃度のトリス緩衝液を含む、再構成した製剤を調製することとを含む、ＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有する再構成した製剤を調製する方法。
【請求項２０】
請求項１から１７のいずれかに記載の製剤と使用説明書とを含有する容器を含む、キットまたは製品。
【請求項２１】
製剤がバイアルまたは注射用シリンジ中に存在する、請求項２０に記載のキットまたは製品。
【請求項２２】
製剤が充填済み注射用シリンジ中に存在する、請求項２０に記載のキットまたは製品。
【請求項２３】
シリンジまたはバイアルが、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーから選択されるポリマー材料でできている、請求項２１に記載のキットまたは製品。
【請求項２４】
対象に、請求項１から１７のいずれかに記載の製剤を含む医薬組成物を投与することによって、ＴＮＦ関連障害に関連する１つまたは複数の症状を低下させることを含む、ＴＮＦ関連障害を治療または予防する方法。
【請求項２５】
ＴＮＦ関連障害が炎症性または自己免疫性障害である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＴＮＦ関連障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、関節炎状態（たとえば、乾癬性関節炎、多関節若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、または多発性硬化症から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から１７のいずれかに記載の製剤の試料を提供することと、
色、透明度、粘度、または１つもしくは複数のＨＭＷ、ＬＭＷ、酸性もしくは塩基性種の量から選択される製剤のパラメータを評価することと、
パラメータが事前に選択された基準を満たすかどうかを判定することによって、プロセスを分析することと
を含む、製造プロセスを分析する方法。
【請求項２８】
バッチ間の変動を監視もしくは制御する方法または試料を参照標準と比較する方法において２つ以上の試料製剤を比較することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記比較に基づいて、製剤を分類、選択、受入もしくは廃棄、出荷もしくは保留、薬物製品へと加工、輸送、異なる場所に移動、製剤化、ラベル貼付、包装することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
製剤の評価したパラメータに関するデータが含まれ、製剤のバッチの識別情報が任意選択により含まれる記録を提供することと、前記記録を決定者に提出することと、任意選択で、前記決定者から通信を受信することと、任意選択で、決定者からの通信に基づいて製剤のバッチを出荷または市場取引するかどうかを判定することとをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容の全体が本明細書中に参照により組み込まれている、２００８年１０月２９日に出願の米国特許出願第６１／１０９，４７４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出されており、その全体が本明細書中に参照により組み込まれている配列表を含有する。２００９年１０月２７日に作成された前記のＡＳＣＩＩコピーは、名称がＷ２２３７３ＷＯ．ｔｘｔであり、大きさが８，３４３バイトである。
【背景技術】
【０００３】
生命工学の進歩により、組換えＤＮＡ技法を用いて医薬に応用するための様々なタンパク質の生成が可能となった。タンパク質は伝統的な有機および無機薬物よりも大きくかつ複雑となる傾向があるため、そのようなタンパク質の製剤は特別な問題を引き起こす。タンパク質が生物活性を保つためには、製剤は、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列のコンフォメーション完全性を保存する一方で、同時にタンパク質の複数の官能基を分解から保護しなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち、結合の形成もしくは切断によるタンパク質の改変の結果、新しい化学実体を生じることを含む任意のプロセス）または物理的不安定性（すなわち、タンパク質の高次構造の変化）を含むことができる。化学的不安定性は、たとえば、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離またはジスルフィド交換から生じる可能性がある。物理的不安定性は、たとえば、変性、凝集、沈殿または吸着から生じる可能性がある。３つの一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質の凝集、脱アミド化および酸化である（Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０（４）：３０７〜３７７（１９９３））。
【０００４】
フリーズドライとは、タンパク質を保存するために一般的に用いられている技法であり、目的のタンパク質調製物から水を除去する役割を果たす。フリーズドライ、すなわち凍結乾燥は、乾燥させる材料を最初に凍結し、その後、氷または凍結した溶媒を昇華によって真空環境下で除去するプロセスである。フリーズドライプロセス中の安定性を増強させるため、および／または貯蔵する際の凍結乾燥生成物の安定性を改善させるために、賦形剤を凍結乾燥前の製剤中に含めることがある（Ｐｉｋａｌ，Ｍ．、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、３（９）２６〜３０（１９９０）およびＡｒａｋａｗａら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、８（３）：２８５〜２９１（１９９１））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、長期貯蔵および配送において安定な、特に皮下投与のためのタンパク質製剤を開発する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、（本明細書中で「ＳＤＡＢ分子」とも称される単一ドメイン抗原結合分子の製剤に関する（たとえばナノボディ分子、特にＴＮＦ結合ナノボディ分子の製剤）。ＳＤＡＢ分子には、１つまたは複数の標的タンパク質と相互作用する、たとえば結合する、１つまたは複数の単一抗原結合ドメインが含まれてもよい。製剤は、たとえば医薬製剤として、対象、たとえばヒトに投与するために有用である。たとえばＴＮＦ関連障害を処置または予防するための、本明細書中に記載の製剤を調製および使用する方法も開示する。
【０００７】
［注釈：ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（商標）およびナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（商標）はＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．の登録商標である］
【０００８】
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）、（ｂ）凍結乾燥保護剤、（ｃ）（任意選択で）界面活性剤、（ｄ）（任意選択で）増量剤、（ｅ）（任意選択で）等張性調整剤、（ｆ）（任意選択で）安定化剤、（ｇ）（任意選択で）保存料、および（ｈ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような緩衝液が含まれる製剤を特徴とする。一部の実施形態では、製剤は、液体製剤、凍結乾燥製剤、再構成した凍結乾燥製剤、エアロゾル製剤、または大量貯蔵製剤（たとえば凍結した大量貯蔵製剤）である。特定の実施形態では、製剤は、注射（たとえば、皮下、血管内、筋肉内もしくは腹腔内）によって、または吸入によって対象に投与する。
【０００９】
特定の実施形態では、製剤中のＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌもしくは約３００ｍｇ／ｍｌである。
【００１０】
他の実施形態では、製剤の凍結乾燥保護剤は、糖、たとえば、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースである。たとえば、凍結乾燥保護剤は、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１０％、約５％〜約８％、または約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、もしくは約９％（重量／体積）の濃度のスクロース、ソルビトール、またはトレハロースとすることができる。
【００１１】
さらに他の実施形態では、製剤中の緩衝液は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、もしくは約３０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液である。他の実施形態では、製剤中の緩衝液は、約５ｍＭ未満〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、もしくは約３０ｍＭの濃度で存在するトリス緩衝液である。製剤の緩衝液のｐＨは、概して約５〜７である。一部の特定の実施形態では、製剤の緩衝液のｐＨは、約５〜約７．５、約５．５〜約７．２である。たとえば、緩衝液のｐＨは、約５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５または７とすることができる。
【００１２】
一部の実施形態では、製剤には、約０．００１％〜０．６％、たとえば、約０．０１％〜０．６％、約０．１％〜０．６％、約０．１％〜０．５％、約０．１％〜０．４％、約０．１％〜０．３％、約０．１％〜０．２％、または約０．０１％〜０．０２％の濃度の界面活性剤が（任意選択で）含まれる。一部の場合では、製剤は、０％より高く約０．６％まで（たとえば約０．１％〜０．２％のポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、ポロキサマー１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸（ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）ソルビタン、またはその組合せを含有する。特定の実施形態では、製剤は、約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％〜０．０２％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１％〜０．２％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％または０．２％のポリソルベート８０を含有する。あるいは、製剤に、ポロキサマー１８８を約０．０１％〜０．６％、約０．１％〜０．６％、約０．１％〜０．５％、約０．１％〜０．４％、約０．１％〜０．３％、または約０．１％〜０．２％含めることができる。
【００１３】
特定の実施形態では、製剤には、約１０〜約２００ｍＭ、約２５〜約１７５ｍＭ、約５０〜約１５０ｍＭ、約７５〜約１２５ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度の増量剤、たとえばグリシンが（任意選択で）含まれる。
【００１４】
他の実施形態では、製剤には、等張性調整剤、たとえば、製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする分子が（任意選択で）さらに含まれる。例示的な等張性調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が含まれる。
【００１５】
さらに他の実施形態では、製剤には、安定化剤、たとえば、目的のタンパク質（たとえばＳＤＡＢ分子）と合わせた場合に、凍結乾燥、液体または貯蔵形態の目的のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または低下させる分子が（任意選択で）さらに含まれる。例示的な安定化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が含まれる。特定の実施形態では、製剤には、以下の範囲のうちの１つまたは複数の安定化剤が含まれる：スクロースは約１％〜約１２％（たとえば、約５％、約７．５％、約８％または約１０％）、ソルビトールは約１％〜約７％（たとえば、約３％、約４％、約５％）、イノシトールは約１％〜約５％、グリシンは約１０ｍＭ〜約１２５ｍＭ（たとえば、約２５ｍＭ〜１００ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭ）、塩化ナトリウムは約１０ｍＭ〜１５０ｍＭ（たとえば、約２５ｍＭ〜１００ｍＭ、約５５ｍＭ）、メチオニンは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ（たとえば、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約１００ｍＭ）、アルギニンは約１０ｍＭ〜約１２５ｍＭ（たとえば、約２５ｍＭ〜約１２０ｍＭ、または約１００ｍＭ）、アルギニン塩酸塩は約１０ｍＭ〜約７０ｍＭ（たとえば、約１０ｍＭ〜約６５ｍＭ、または約５５ｍＭ）。
【００１６】
他の実施形態では、製剤には、さらにメチオニンが約１０〜約２００ｍＭ、約２５〜約１７５ｍＭ、約５０〜約１５０ｍＭ、約７５〜約１２５ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度で含まれ得る。
【００１７】
一実施形態では、製剤の一構成成分が、凍結乾燥保護剤、等張性調整剤および／または安定化剤のうちの１つまたは複数として機能することができる。たとえば、構成成分、たとえばスクロースの濃度に応じて、凍結乾燥保護剤、等張性調整剤および／または安定化剤のうちの１つまたは複数として役割を果たすことができる。製剤中で構成成分のうちのいくつかが必要な他の実施形態では、様々な構成成分を使用する。たとえば、製剤が凍結乾燥保護剤、等張性調整剤および安定化剤を必要とする場合は、様々な構成成分を使用する（たとえば、スクロース、グリシンおよびイノシトールを組み合わせて使用することができ、その結果、それぞれ凍結乾燥保護剤、等張性調整剤および安定化剤の組合せが生じる）。
【００１８】
一実施形態では、製剤には、（ａ）約０．５〜約３００ｍｇ／ｍＬ、たとえば、約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１８ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、または約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）、（ｂ）約５％〜約１０％、たとえば、約５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約１０％の濃度のスクロース、（ｃ）約０〜約０．６％、たとえば、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、または０．６％の濃度のポリソルベート８０、（ｄ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のグリシン、（ｅ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のメチオニン、および（ｆ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５、たとえば、５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５、または７となるような、ヒスチジン緩衝液（約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度）またはトリス緩衝液（約２０ｍＭの濃度）が含まれる。
【００１９】
一実施形態では、製剤は液体製剤である。１つの代表的な実施形態では、液体製剤には、ａ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、たとえば、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１８ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）、（ｂ）約５％〜約１０％、たとえば約７％〜約８％、たとえば７．５％の濃度のスクロース、または約１％〜約７％（たとえば、約３％、約４％、約５％）のソルビトール（ｃ）たとえば約０．０１％〜０．０２％（たとえば０．０１％）の濃度のポリソルベート８０、（ｄ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のグリシン、（ｅ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のメチオニン、および（ｆ）製剤のｐＨが約５〜７．５、たとえば、５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５、または７となるような、ヒスチジン緩衝液（約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度）またはトリス緩衝液（約２０ｍＭの濃度）が含まれる。液体製剤は、使用説明書と共にデバイス、シリンジまたはバイアルなどの製品中に存在することができる。特定の実施形態では、シリンジまたはバイアルは、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーなどのポリマー材料でできている。他の実施形態では、製剤は、注射用デバイス（たとえば注射用シリンジ、たとえば充填済み注射用シリンジ）中に存在することができる。シリンジは、たとえば、自己注射器（たとえばペン型注射デバイス）および／または使用説明書が含まれる単一バイアル系として、個々の投与用に適応させ得る。製剤は、対象、たとえば患者に、注射、たとえば末梢投与（たとえば、皮下、血管内、筋肉内または腹腔内投与）によって投与することができる。
【００２０】
他の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤である。１つの代表的な実施形態では、凍結乾燥製剤には、ａ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、たとえば、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１８ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）、（ｂ）約５％〜約１０％、たとえば約４％〜約７％、たとえば５％の濃度のスクロース、（ｃ）たとえば約０．０１％〜０．０２％（たとえば０．０１％）の濃度のポリソルベート８０、（ｄ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のグリシン、（ｅ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のメチオニン、および（ｆ）製剤のｐＨが約５〜７．５、たとえば、５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５または７となるような、ヒスチジン緩衝液（約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、たとえば約２０ｍＭの濃度）またはトリス緩衝液（約２０ｍＭの濃度）が含まれる。凍結乾燥製剤は、凍結乾燥物を適切な水性組成物と混合することによって再構成することができる。
【００２１】
さらに他の実施形態では、製剤は大量貯蔵製剤である。１つの代表的な実施形態では、大量貯蔵製剤には、ａ）約８０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍｌ、たとえば、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２７５ｍｇ／ｍＬ、または約３００ｍｇ／ｍＬの濃度ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）、（ｂ）約５％〜約１０％、たとえば、約４％〜約８％、たとえば、５％、または７．５％の濃度のスクロース、（ｃ）たとえば約０．０１％〜０．０２％の濃度のポリソルベート８０、（ｄ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のグリシン、（ｅ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のメチオニン、および（ｆ）製剤のｐＨが約５〜７．５、たとえば、５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５または７となるような、ヒスチジン緩衝液（約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度）またはトリス緩衝液（約２０ｍＭの濃度）が含まれる。大量貯蔵製剤は凍結することができる。特定の実施形態では、大量貯蔵製剤は、たとえば、１０リットルを超える、５０リットル、１００、１５０、２００リットルまたはそれ以上の大規模で調製することができる。
【００２２】
特定の実施形態では、製剤のＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）には、１つまたは複数の単一結合ドメイン（たとえば１つまたは複数のナノボディ）が含まれる。たとえば、ナノボディ分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン（１、２または３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる）を含むポリペプチド、たとえば単鎖ポリペプチドを含む、またはそれからなることができる。ＳＤＡＢ分子の例には、軽鎖を天然に欠く分子（たとえば、ＶＨＨ、ナノボディ、またはラクダ科由来の抗体）が含まれる。そのようなＳＤＡＢ分子は、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコなどのラクダ科動物から誘導するまたは得ることができる。他の実施形態では、ＳＤＡＢ分子には、それだけには限定されないが、サメ単一ドメインポリペプチド（ＩｇＮＡＲ）、および単一ドメイン足場（たとえばフィブロネクチン足場）などの他の天然に存在する単一ドメイン分子を含めた単一ドメイン分子が含まれ得る。単一ドメイン分子はサメ由来であってもよい。
【００２３】
一実施形態では、製剤のＳＤＡＢ分子は、１つまたは複数の単一ドメイン分子で構成されている単鎖ポリペプチドである。実施形態では、ナノボディ分子は一価または多価（たとえば、二価、三価、もしくは四価）である。他の実施形態では、ナノボディ分子は単一特異性または多特異性（たとえば、二重特異性、三重特異性もしくは四重特異性）である。ＳＤＡＢ分子は、組換えの、ＣＤＲ移植した、ヒト化した、ラクダ化した、脱免疫化した、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製した（たとえばファージディスプレイによって選択した）、１つまたは複数の単一ドメイン分子を含み得る。たとえば、ＳＤＡＢ分子は、１つまたは複数の標的抗原と結合する１つまたは複数の単一ドメイン分子を含む単鎖融合ポリペプチドとすることができる。典型的には、標的抗原は、哺乳動物、たとえばヒトのタンパク質である。特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、フィブリン、フィブリノーゲン、またはトランスフェリンのうちの１つまたは複数から選択される血清タンパク質、たとえばヒト血清タンパク質と結合する。
【００２４】
１つの例示的な実施形態では、製剤のＳＤＡＢ分子は、標的抗原、たとえば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と結合する２つの単一ドメイン分子（たとえば２つのラクダ科可変領域）と、血清タンパク質、たとえばＨＳＡと結合する１つの単一ドメイン分子（たとえばラクダ科可変領域）との単鎖ポリペプチド融合体からなる、三価の二重特異性分子である。
ＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子は、Ｎ末端からＣ末端まで以下の順序で配列させることができる：ＴＮＦα結合単一ドメイン分子−ＨＳＡ結合単一ドメイン分子−ＴＮＦα結合単一ドメイン分子。１つまたは複数の標的に対する単一ドメイン分子の任意の順序または組合せを、本明細書中に記載の通り製剤化できることが理解されるであろう。
【００２５】
一実施形態では、製剤のＳＤＡＢ分子は、本明細書中で「ＡＴＮ−１０３」とも称され、図３０に示すアミノ酸配列（配列番号１）、またはそれに実質的に同一なアミノ酸配列（たとえば、図３０に示すアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上同一である、または２０、１５、１０、５、４、３、２、１個までのアミノ酸変化（たとえば、欠失、挿入もしくは置換（たとえば保存的置換）を有するアミノ酸配列）を含む、またはそれからなる。本明細書中に記載の通り製剤化することができるさらなる三価の二重特異性ナノボディ分子の例には、ＷＯ２００６／１２２７８６号の表２９に開示されているＴＮＦ２４、ＴＮＦ２５、ＴＮＦ２６、ＴＮＦ２７、ＴＮＦ２８、ＴＮＦ６０およびＴＮＦ６２が含まれる。
【００２６】
特定の実施形態では、ＴＮＦαと結合する、製剤のＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子のうちの少なくとも１つは、ＤＹＷＭＹ（配列番号２）（ＣＤＲ１）、ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号３）（ＣＤＲ２）および／またはＳＰＳＧＦＮ（配列番号４）（ＣＤＲ３）のアミノ配列を有する、または前記ＣＤＲのうちの１つと３、２または１個未満のアミノ酸置換（たとえば保存的置換）によって異なるＣＤＲを有する、１、２、または３個のＣＤＲが含まれる。他の実施形態では、単一ドメイン分子は、図３０のアミノ酸約１〜１１５のアミノ酸配列、またはそれに実質的に同一なアミノ酸配列（たとえば、図３０に示すアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である、または２０、１５、１０、５、４、３、２、１個までのアミノ酸変化（たとえば、欠失、挿入もしくは置換（たとえば保存的置換）を有するアミノ酸配列）を有する可変領域を含む。実施形態では、ＴＮＦα結合単一ドメイン分子は、図３０に示すＴＮＦα結合単一ドメイン抗体分子の１つまたは複数の生物活性を有する。たとえば、ＴＮＦα結合単一ドメイン分子は、図３０に示すＴＮＦα結合単一ドメイン分子によって認識されるエピトープと同じまたは類似のエピトープと結合する（たとえば、三量体形態のＴＮＦαと結合する、ＴＮＦ受容体と接触したＴＮＦα部位と結合する、第１のＴＮＦ単量体（単量体Ａ）の８８位にＧｌｎを含み、９０位にＬｙｓを含み、第２のＴＮＦ単量体（単量体Ｂ）の１４６位にＧｌｕを含むＴＮＦα三量体中のエピトープ、またはＷＯ０６／１２２７８６号に開示されているエピトープと結合する）。他の実施形態では、ＴＮＦα結合単一ドメイン分子は、ＷＯ０６／１２２７８６号に開示されているＴＮＦα結合単一ドメイン分子のいずれかに類似の活性（たとえば、結合親和性、解離定数、結合特異性、ＴＮＦ−阻害活性）を有する。
【００２７】
他の実施形態では、ＴＮＦα結合ナノボディ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されているナノボディのうちの１つまたは複数を含む。たとえば、ＴＮＦα結合ナノボディ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている一価、二価、三価ＴＮＦα結合ナノボディ分子とすることができる。例示的なＴＮＦα結合ナノボディには、それだけには限定されないが、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、ＴＮＦ３、そのヒト化形態（たとえば、ＴＮＦ２９、ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３１、ＴＮＦ３２、ＴＮＦ３３）が含まれる。一価ＴＮＦα結合ナノボディのさらなる例は、ＷＯ２００６／１２２７８６号の表８に開示されている。例示的な二価ＴＮＦα結合ナノボディ分子には、それだけには限定されないが、ＴＮＦ５５およびＴＮＦ５６が含まれ、これは、ペプチドリンカーを介して連結された単一の融合ポリペプチドを形成する２つのＴＮＦ３０ナノボディを含む（ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている）。二価ＴＮＦα結合ナノボディ分子のさらなる例は、ＴＮＦ４、ＴＮＦ５、ＴＮＦ６、ＴＮＦ７、ＴＮＦ８としてＷＯ２００６／１２２７８６号の表１９に開示されている）。
【００２８】
他の実施形態では、ＨＳＡと結合する、製剤のＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子のうちの少なくとも１つは、ＳＦＧＭＳ（配列番号５）（ＣＤＲ１）、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６）（ＣＤＲ２）および／またはＧＧＳＬＳＲ（配列番号７）（ＣＤＲ３）アミノ配列を有する、または前記ＣＤＲのうちの１つと３、２または１個未満のアミノ酸置換（たとえば保存的置換）によって異なるＣＤＲを有する、１、２、または３個のＣＤＲが含まれる。他の実施形態では、単一ドメイン分子は、図３０（配列番号１）のアミノ酸約１２５〜２３９のアミノ酸配列、またはそれに実質的に同一なアミノ酸配列（たとえば、図３０に示すアミノ酸配列（配列番号１）と比較して少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である、または２０、１５、１０、５、４、３、２、１個までのアミノ酸変化（たとえば、欠失、挿入もしくは置換（たとえば保存的置換）を有するアミノ酸配列）を有する可変領域を含む。実施形態では、ＨＳＡ結合単一ドメイン分子は、図３０（配列番号１）に示すＨＳＡ結合単一ドメイン分子の１つまたは複数の生物活性を有する。たとえば、ＨＳＡ結合単一ドメイン分子は、図３０（配列番号１）に示すＨＳＡ結合単一ドメイン分子によって認識されるエピトープと同じまたは類似のエピトープと結合する。他の実施形態では、ＨＳＡ結合単一ドメイン分子は、ＷＯ０６／１２２７８６号に開示されているＨＳＡ結合単一ドメイン分子のうちの任意のものに類似の活性（たとえば、結合親和性、解離定数、結合特異性）を有する。
【００２９】
他の実施形態では、ＨＳＡ結合ＳＤＡＢ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されているナノボディのうちの１つまたは複数を含む。たとえば、ＨＳＡ結合ＳＤＡＢ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている一価、二価、三価のＨＳＡ結合ナノボディ分子であってもよい。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ＳＤＡＢ分子は、ＨＳＡと結合する結合特異性のうちの少なくとも１つを有する、単一特異性または多特異性の分子であってもよい。例示的なＴＮＦα結合ナノボディには、それだけには限定されないが、ＷＯ０６／１２２７８６号に開示されているＡＬＢ１、そのヒト化形態（たとえば、ＡＬＢ６、ＡＬＢ７、ＡＬＢ８、ＡＬＢ９、ＡＬＢ１０）が含まれる。
【００３０】
他の実施形態では、ＳＤＡＢ分子の単一ドメイン分子のうちの２つ以上を、連結基を用いてまたは用いずに、遺伝子またはポリペプチド融合体として融合する。連結基は当業者に明らかな任意の連結基とすることができる。たとえば、連結基は１〜１００個の原子の長さの生体適合性ポリマーとすることができる。一実施形態では、連結基には、ポリグリシン、ポリセリン、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリイソロイシン、もしくはポリアルギニン残基、またはその組合せが含まれる、またはそれからなる。たとえば、ポリグリシンまたはポリセリンリンカーには、少なくとも５、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、３５および４０個のグリシンおよびセリン残基が含まれてもよい。使用することができる例示的なリンカーには、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復、たとえば、１、２、３、４、５、６、７回またはそれ以上の反復の（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号８）反復が含まれる。実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ（配列番号９）または（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）の配列を有し、ｎは４、５、または６である。
【００３１】
本発明の製剤には、第２の部分を、たとえば共有または非共有結合させることによって改変したＳＤＡＢ分子が含まれてもよい。たとえば、ナノボディ分子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧなど）等の適切な薬理学的に許容されるポリマーと共有結合させることができる。ｐｅｇ化したナノボディ分子の例は、ＷＯ０６／１２２７８６号にＴＮＦ５５−ＰＥＧ４０、ＴＮＦ５５−ＰＥＧ６０、ＴＮＦ５６−ＰＥＧ４０およびＴＮＦ５６−ＰＥＧ６０として開示されている。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の製剤は、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で少なくとも３、６、９、１２カ月（たとえば、少なくとも２４、３０、３６カ月）の間安定である。特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子の完全性は、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で少なくとも３、６、９、１２カ月（たとえば、少なくとも２４、３０、３６カ月）の間製剤中で貯蔵した後に維持される。たとえば、製剤中のＳＤＡＢ分子は、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で貯蔵した後にＳＤＡＢ分子の少なくとも５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％のまたは１００％までの生物活性、たとえば結合活性を保持する。一部の実施形態では、製剤には、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で少なくとも３、６、９、１２カ月（たとえば、少なくとも２４、３０、３６カ月）の間製剤中で貯蔵した後に、１０％、９％、５％、４％、３％、２％、１％未満またはそれ以下未満の高分子量（ＨＭＷ）種が含まれる。他の実施形態では、製剤には、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で少なくとも３、６、９、１２カ月（たとえば、少なくとも２４、３０、３６カ月）の間製剤中で貯蔵した後に、１０％、９％、５％、４％、３％、２％、１％未満またはそれ以下未満の低分子量（ＨＭＷ）種が含まれる。さらに他の実施形態では、製剤には、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で少なくとも３、６、９、１２カ月（たとえば、少なくとも２４、３０、３６カ月）の間製剤中で貯蔵した後に、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満またはそれ以下未満の酸性種が含まれる。さらに他の実施形態では、製剤には、約２℃〜約２５℃（たとえば約４℃または２５℃）の温度で少なくとも３、６、９、１２カ月（たとえば、少なくとも２４、３０、３６カ月）の間製剤中で貯蔵した後に、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満またはそれ以下未満の塩基性種が含まれる。ＨＭＷ、ＬＭＷ、酸性および塩基性種は、本明細書中に記載のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）などの標準の技法を用いて、製剤中で検出することができる。
【００３３】
一部の実施形態では、凍結乾燥ＳＤＡＢ製剤を再構成した際、製剤は、凍結乾燥前の製剤と比較してＳＤＡＢ構造の少なくとも８０％、９０％、９５％またはそれ以上を保持する。ＳＤＡＢ構造は、たとえば、結合アッセイ、バイオアッセイ、またはＨＭＷ種対ＬＭＷ種の比によって決定する。
【００３４】
また、本発明の製剤には、ＴＮＦ−α関連障害、たとえば、それだけには限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）（たとえば中等度から重度の関節リウマチ）、関節炎状態（たとえば、乾癬性関節炎、多関節若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、および／または多発性硬化症を含めた炎症性または自己免疫性障害の治療に有用な第２の薬剤、たとえば、第２の治療上または薬理学的に活性な薬剤も含めることができる。たとえば、第２の薬剤は、抗ＴＮＦ抗体またはそのＴＮＦ結合断片であってよく、第２のＴＮＦ抗体は製剤のＴＮＦ結合ＳＤＡＢ分子とは異なるエピトープと結合する。ＴＮＦ結合ＳＤＡＢ分子と共製剤化することができる薬剤の他の非限定的な例には、それだけには限定されないが、サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、および細胞分裂抑制剤が含まれる。一実施形態では、さらなる薬剤は、それだけには限定されないが、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、プレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾン、およびトリアムシノロンを含めたコルチコステロイド、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）およびスルファサラジンなどの疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、レフルノミド（Ａｒａｖａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））（メトトレキサートを含むまたは含まない）、およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））を含めた腫瘍壊死因子阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（たとえばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））などの可溶性インターロイキン１受容体、金、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｉｎ（登録商標））、ペニシラミン、ならびにアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロスポリンを含めた細胞毒性剤を含めた、関節炎の標準的な治療である。そのような併用療法では、より低い用量の投与される治療剤を有利に利用して、様々な単独療法に関連する潜在的な毒性または合併症が回避され得る。
【００３５】
賦形剤および／または第２の治療剤の代替の組合せは、本明細書中に提供する指針に従って特定および試験することができる。
【００３６】
さらに別の実施形態では、本明細書中に記載の製剤は、たとえばヒト対象（たとえばＴＮＦα関連障害に罹患している患者）に投与するために適している。製剤は、注射（たとえば、皮下、血管内、筋肉内もしくは腹腔内）または吸入によって対象に投与することができる。
【００３７】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の製剤を調製する方法またはプロセスを特徴とする。この方法またはプロセスには、ＳＤＡＢ分子を細胞培養物中で発現させることと、たとえば、ＳＤＡＢ分子をクロマトグラフィー精製ステップ、限外濾過／ダイアフィルトレーションステップのうちの少なくとも１つに通すことによって、ＳＤＡＢ分子を精製することと、本明細書中に記載の凍結乾燥保護剤、界面活性剤および緩衝液、たとえば、約５％〜約１０％、たとえば約５％、約１０％の濃度のスクロース、約０〜約０．０２％、たとえば、０．０１％、０．０２％の濃度のポリソルベート８０、（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のグリシン、（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のメチオニン、および（ｆ）製剤のｐＨが約５〜７．５、たとえば、５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５または７となるような、ヒスチジン（約１０〜約２０ｍＭの濃度）またはトリス緩衝液（約２０ｍＭの濃度）を含有する製剤中で、ＳＤＡＢ分子の濃度をたとえば約１０〜２５０ｍｇ／ｍＬに調整することとが含まれる。
【００３８】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦ結合ＳＤＡＢ分子を含有する再構成した製剤を調製する方法またはプロセスを特徴とする。この方法には、ＳＤＡＢ分子、凍結乾燥保護剤、界面活性剤および緩衝液の混合物を凍結乾燥することによって、凍結乾燥した混合物を形成することと、凍結乾燥した混合物を希釈剤中で再構成することによって、本明細書中に記載の製剤を調製することとが含まれる。一実施形態では、製剤には、（ａ）約０．５〜約２００ｍｇ／ｍＬ、たとえば、約１ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１８ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子、（ｂ）約５％〜約１０％、たとえば、約５％、約１０％の濃度のスクロース、（ｃ）約０〜約０．０２％、たとえば、０．０１％、０．０２％の濃度のポリソルベート８０、（ｄ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のグリシン、（ｅ）（任意選択で）約０〜約１００ｍＭ、たとえば１００ｍＭの濃度のメチオニン、および（ｆ）製剤のｐＨが約５〜７．５、たとえば、５、５．５、５．８〜６．１、６、６．１、６．５または７となるような、ヒスチジン（約１０〜約２０ｍＭの濃度）またはトリス緩衝液（約２０ｍＭの濃度）が含まれる。
【００３９】
別の態様では、本発明は、対象（たとえばヒト対象）において、ＴＮＦα関連障害、たとえば、それだけには限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）（たとえば中等度から重度の関節リウマチ）、関節炎状態（たとえば、乾癬性関節炎、多関節若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、および／または多発性硬化症を含めた炎症性または自己免疫性障害を治療または予防する方法に関する。この方法には、対象、たとえばヒト患者に、本明細書中に記載のＴＮＦ結合ＳＤＡＢ製剤、たとえばＴＮＦ結合ＳＤＡＢ分子を含有する製剤が含まれる医薬組成物を、単独でまたは本明細書中に記載の併用療法のうちの任意のものと組み合わせて、ＴＮＦα関連障害の症状の１つまたは複数が低下するような量で投与することが含まれる。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の製剤を含有するデバイス、シリンジまたはバイアルが含まれるキットまたは製品を特徴とする。キットまたは製品には、使用説明書が含まれていてもよい。特定の実施形態では、シリンジまたはバイアルは、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーなどのポリマー材料でできている。他の実施形態では、製剤は、注射用デバイス（たとえば注射用シリンジ、たとえば充填済み注射用シリンジ）中に存在することができる。シリンジは、たとえば、自己注射器（たとえばペン型注射デバイス）および／または使用説明書が含まれる単一バイアル系として、個々の投与用に適応させ得る。一実施形態では、注射用デバイスは、使用および投与の説明書が添付されていてもよい、充填済みペンまたは他の適切な自己注射用デバイスである。
【００４１】
特定の実施形態では、注射（たとえば皮下、血管内、筋肉内もしくは腹腔内）による投与（たとえば自己投与）に関する説明書と共にあらかじめ包装した、キットまたは製品（たとえば、単一または複数用量単位を含む充填済みペンまたはシリンジ）を、対象、たとえば患者または医療提供者に提供する。
【００４２】
他の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の製剤を経鼻、経皮、静脈内投与するためのデバイスを提供することを特徴とする。たとえば、本明細書中に記載の製剤を投与するための経皮パッチを提供する。さらに他の場合では、本明細書中に記載の製剤を投与するための静注バッグを提供する。実施形態では、静注バッグは、生理食塩水または５％デキストロースと共に提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦαナノボディ分子を必要としている患者（たとえばヒト患者）に、本明細書中に記載の製剤をどのように投与するかを指示する方法を特徴とする。この方法には、（ｉ）患者に、本明細書中に記載のＳＤＡＢ分子の製剤の少なくとも１つの単位用量を提供することと、（ｉｉ）患者に、少なくとも１つの単位用量を、たとえば注射（たとえば、皮下、血管内、筋肉内または腹腔内）によって自己投与することを指示することとが含まれる。一実施形態では、患者は、ＴＮＦα関連障害、たとえば、本明細書中に記載の炎症性または自己免疫性障害に罹患している。
【００４４】
別の態様では、本発明は、レシピエントに、本明細書中に記載のＴＮＦαナノボディ分子の製剤の投与について指示する方法を特徴とする。この方法には、レシピエント（たとえば、最終使用者、患者、医師、小売りもしくは卸売りの薬局、流通業者、または病院、養護施設クリニックもしくはＨＭＯの院内薬局）に、製剤をどのように患者に投与すべきかを指示することが含まれる。
【００４５】
別の態様では、本明細書中に記載のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦαナノボディ分子の製剤の流通方法を提供する。この方法には、レシピエント（たとえば、最終使用者、患者、医師、小売りもしくは卸売りの薬局、流通業者、または病院、養護施設クリニックもしくはＨＭＯの院内薬局）に、患者を少なくとも６、１２、２４、または３６カ月間、処置するために十分な単位投薬量のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦαナノボディ分子を含有する包装品を提供することが含まれる。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦαナノボディ分子を含有する本明細書中に記載の製剤の包装品または包装品のロットの品質を評価する方法またはプロセスを特徴とする（たとえば、有効期限が切れているかどうかを判定するため）。この方法には、包装品の有効期限が切れているかどうかを評価することが含まれる。有効期限は、製造、アッセイ、または包装などの事前に選択された事象から少なくとも６、１２、２４、３６、または４８カ月であり、たとえば、２４または３６カ月より長い。一部の実施形態では、決断またはステップを分析の結果として行い、たとえば、生成物の有効期限が切れているかどうかによって、包装品中のＳＤＡＢ分子を、使用もしくは廃棄、分類、選択、出荷もしくは保留、輸送、新しい場所に移動、商取引に出荷、販売もしくは売り出す、商取引から撤退または売り出しをやめる。
【００４７】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤を貯蔵、流通、または使用する方法を特徴とする。この方法には、製剤を一定期間、所定の温度、たとえば２５℃未満、たとえば、凝固点未満または１５℃、１０℃、または４℃未満で貯蔵することが含まれる。実施形態では、この方法には、製剤をレシピエント、たとえば最終使用者、たとえば患者または医療提供者に、類似または異なる条件下（たとえば、最初の貯蔵期間よりも高い温度）で貯蔵するために提供することがさらに含まれる。製剤は、液体製剤、凍結乾燥製剤または再構成した製剤とすることができる。
【００４８】
別の態様では、本発明は、生成物またはプロセス、たとえば製造プロセスを分析する方法を特徴とする。この方法には、本明細書中に記載のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤を提供することと、色（たとえば、無色からわずかに黄色、または無色から黄色）、透明度（たとえば、透明からわずかに乳白色または透明から乳白色）、または粘度（たとえば、２０℃〜３０℃、たとえば２５℃などの周囲温度で測定した場合に約１〜５ｃＰ）、本明細書中に記載の１つまたは複数のＨＭＷ、ＬＭＷ、酸性および／または塩基性種の量等の製剤のパラメータを評価することとが含まれる。１つまたは複数のパラメータの評価が含まれてもよい。任意選択で、パラメータが事前に選択された基準を満たすかどうかの判定を決定する、たとえば、事前に選択された基準が存在するか、または事前に選択された範囲で存在するかどうかを判定し、それによってプロセスを分析する。
【００４９】
一実施形態では、プロセスの評価には、ＳＤＡＢ分子製剤の安定性の測定が含まれる。
抗体製剤の安定性は、たとえば、凝集体の形成によって測定することができ、これは、たとえば、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、本明細書中に記載のように色、透明度、または粘度によってアッセイする。製剤は、事前に設定された期間にわたって、任意選択で所定の温度で、アッセイパラメータの変化が約１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．０５％、もしくは０．００５％未満またはそれ以下未満である場合に、安定であると判定することができ、したがってさらなる加工または流通が許容される。
【００５０】
一実施形態では、この方法には、決定された値を参照値と比較することによって、製造プロセスを分析することが含まれる。
【００５１】
一実施形態では、この方法には、分析に少なくとも部分的に基づいて製造プロセスを維持することがさらに含まれる。一実施形態では、この方法には、分析に基づいて製造プロセスを変更することがさらに含まれる。
【００５２】
別の実施形態では、この方法には、本明細書中に記載の方法または分析に基づいてプロセスに関する決定を行うことが含まれる、選択されたプロセスによって作製されたＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤のプロセス、たとえば製造プロセスを評価することが含まれる。一実施形態では、この方法には、方法または分析に少なくとも部分的に基づいて製造プロセスを維持または変更することがさらに含まれる。したがって、別の実施形態では、評価を行う団体は本明細書中に記載の方法または分析を実施せず、本明細書中に記載の方法または分析によって得られる結果を使用するのみである。
【００５３】
別の実施形態では、この方法には、バッチ間の変動を監視もしくは制御する方法または調製物を参照標準と比較する方法において、２つ以上の調製物を比較することが含まれる。
【００５４】
さらに別の実施形態では、この方法には、判定に少なくとも部分的に基づいて、調製物を、たとえば、分類、選択、受入または廃棄、出荷または保留、薬物製品へと加工、輸送、異なる場所に移動、製剤化、ラベル貼付、包装、商取引への出荷、販売または売出しを行うという決断を行うことがさらに含まれてもよい。
【００５５】
別の態様では、本発明は、たとえば品質管理または出荷の規格分析において、本明細書中に記載のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤の品質を評価する方法を特徴とする。この方法には、ＳＤＡＢ分子製剤を色（たとえば、無色からわずかに黄色、または無色から黄色）、透明度（たとえば、透明からわずかに乳白色または透明から乳白色）、または粘度（たとえば、２０℃〜３０℃、たとえば２５℃などの周囲温度で測定した場合に約１〜５ｃＰ）等のパラメータについての評価を提供することが含まれる。評価には、上記パラメータのうちの１つまたは複数の評価が含まれてもよい。また、この方法には、溶液パラメータが事前に選択された基準を満たすかどうか、たとえば、事前に選択された基準が存在するか、または事前に選択された範囲で存在するかどうかを判定することが含まれていてもよい。観察された溶液パラメータが事前に選択された値の範囲内にあるか、または事前に選択された標準の基準を満たす場合は、調製物を包装、使用、販売、商取引への出荷、廃棄などについて選択する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、規制要件、たとえば、規制機関、たとえばＦＤＡの承認後要件を順守する方法を特徴とする。この方法には、本明細書中に記載のパラメータについて抗体製剤の評価を提供することが含まれる。承認後要件には、上記パラメータのうちのさらに１つの測定が含まれてもよい。また、この方法には、任意選択で、観察された溶液パラメータが事前に選択された基準を満たすか、またはパラメータが事前に選択された範囲内にあるかどうかを判定することと、任意選択で、分析の値もしくは結果を提出すること、または、たとえば値もしくは結果を規制機関に送信することによって、機関と通信することとが含まれる。
【００５７】
別の態様では、本発明は、たとえば、出荷の規格、ラベルの要件、または公定要件、たとえば本明細書中に記載の特性を満たす、事前に選択された特性を有する、ＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤のバッチを作製する方法を特徴とする。この方法には、試験製剤を提供することと、試験製剤を本明細書中に記載の方法に従って分析することと、試験製剤が事前に選択された基準を満たすかどうか、たとえば、参照値、たとえば本明細書中に開示した１つまたは複数の参照値と事前に選択された関係性を有するかどうかを判定することと、試験抗体調製物を選択して生成物のバッチを作製することとが含まれる。
【００５８】
別の態様では、本発明は、ＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤の複数のバッチを特徴とし、それぞれのバッチの１つまたは複数のパラメータ（たとえば、本明細書中に記載の方法によって決定された値または溶液パラメータ）は、事前に選択された所望の参照値または基準、たとえば本明細書中に記載の範囲または基準から事前に選択された範囲より狭い範囲でしか変動がない。一部の実施形態では、製剤の１つまたは複数のバッチの１つまたは複数のパラメータを決定し、その決定の結果としてバッチまたは複数のバッチが選択される。一部の実施形態には、決定の結果を事前に選択された値または基準、たとえば参照標準と比較することが含まれる。他の実施形態には、たとえば値またはパラメータの決定の結果に基づいて、投与するバッチの用量を調整することが含まれる。
【００５９】
別の態様では、本発明は、報告を受信する実体に報告を提供すること、ＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦナノボディ分子の製剤の試料を、参照標準、たとえばＦＤＡの要件の順守について評価すること、ＳＤＡＢ分子の調製物が何らかの事前に定義された要件を満たすという別の団体からの表示を求めること、またはＳＤＡＢ分子の調製物に関する情報を別の団体に提出することのうちの、１つまたは複数の方法を特徴とする。例示的な受信実体または他の団体には、政府、たとえば米国連邦政府、たとえば政府機関、たとえばＦＤＡが含まれる。この方法には、第１の国、たとえば米国においてＳＤＡＢ分子の水性製剤を作製および／または試験するステップ、試料の少なくとも一定分量を第１の国の外に送ること、たとえば、米国外である第２の国に送ること、ＳＤＡＢ分子の調製物の構造に関するデータ、たとえば、本明細書中に記載の構造および／または鎖に関連するデータ、たとえば、本明細書中に記載の方法のうちの１つまたは複数によって作成されたデータが含まれる報告を、準備または受信するステップ、ならびに前記報告を、報告を受信する実体に提供するステップのうちの１つもしくは複数（またはすべて）が含まれる。
【００６０】
一実施形態では、報告を受信する実体は、データが所定の要件または参照値を満たしているかどうかを判定することができ、たとえばＳＤＡＢ分子の製剤の製造者、流通業者または販売者が、報告を受信する実体からの応答を受けてもよい。一実施形態では、記録を受信する実体から承認を受けた後、ＳＤＡＢ分子の製剤の調製物の選択、包装、または商取引を行う。
【００６１】
別の態様では、本発明は、ＳＤＡＢ分子の製剤を評価する方法を特徴とする。この方法には、たとえば本明細書中に記載の１つまたは複数の方法によって準備した、ＳＤＡＢ分子の存在またはレベルに関連するデータを受信することと、前記データが含まれ、任意選択でＳＤＡＢ分子のバッチの識別情報が含まれる記録を提供することと、前記記録を決定者、たとえば政府機関、たとえばＦＤＡに提出することと、任意選択で、前記決定者から通信を受信することと、任意選択で、決定者からの通信に基づいてＳＤＡＢ分子のバッチを出荷または市場取引するかどうかを判定することとが含まれる。一実施形態では、この方法には、試料を出荷することがさらに含まれる。
【００６２】
本明細書中で引用するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
【００６３】
別段に定義しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書中に記載のものに類似または等価の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００６４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】乾燥粉末（ＤＰ）調製物として６カ月まで貯蔵した、１０６Ｕ／ｍｇのＴＮＦ結合ナノボディ（ＡＴＮ−１０３）の凍結乾燥製剤の生物活性の結果を示す図である。製剤は示した温度で貯蔵した。
【図２】ＴＮＦ結合ナノボディ（ＡＴＮ−１０３）の凍結乾燥製剤のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合活性の結果を示す図である。結果はＴＮＦ結合ナノボディ参照標準のパーセンテージ（％）として示す。
【図３】凍結乾燥製剤の高分子量（ＨＭＷ）種の％に関して、サイズ排除−ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）の結果を示す図である。
【図４】凍結乾燥製剤の％ＴＮＦ結合ナノボディに関して、ＳＤＳ−キャピラリー電気泳動（ＳＤＳ−ＣＥ）の結果を示す図である。
【図５】対照および頑健性の凍結乾燥サイクルに供した製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図６】高濃度液体製剤で６カ月まで貯蔵した後の１０６Ｕ／ｍｇのＴＮＦ結合ナノボディの生物活性の結果を示す図である。
【図７】示した温度で６カ月まで貯蔵した高濃度液体製剤のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合活性（ＴＮＦ結合ナノボディ参照標準のパーセンテージ）の結果を示す図である。
【図８】示した温度で６カ月まで貯蔵した後の高濃度液体製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図９】示した温度で６カ月まで貯蔵した後の高濃度液体製剤の％ＬＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１０】示した温度で６カ月まで貯蔵した後の高濃度液体製剤の％ＡＴＮ−１０３のＳＤＳ−ＣＥの結果を示す図である。
【図１１】充填済みシリンジ中の高濃度液体製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１２】充填済みシリンジ中の高濃度液体製剤の％ＬＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１３】充填済みシリンジ中の高濃度液体製剤のＣＥＸ−ＨＰＬＣによる％酸性種の結果を示す図である。
【図１４】充填済みシリンジ中の高濃度液体製剤のＣＥＸ−ＨＰＬＣによる％塩基性種の結果を示す図である。
【図１５】高濃度液体製剤−他の製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である（他の安定化および不安定化賦形剤の特定）。
【図１６】ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１７】ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の％ＬＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１８】ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の％酸性種ＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１９】ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の％塩基性種ＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２０】１０×凍結解凍サイクル後のＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２１】１０×凍結解凍サイクル後のＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の％ＬＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２２】１０×凍結解凍サイクル後のＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の濁度（４５５ｎｍでの吸光度）の結果を示す図である。
【図２３】１０×凍結解凍サイクル後のＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の濃度（２８０ｎｍでのＵＶ吸光度による）の結果を示す図である。
【図２４】ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体製剤：製造プロセスにおいて潜在的に遭遇する短期間の熱ストレス後のＳＥ−ＨＰＬＣによる％ＨＭＷを示す図である。
【図２５】ｐＨおよび製剤の関数としての低濃度液体製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である（４０℃）。
【図２６】ｐＨおよび製剤の関数としての低濃度液体製剤の％ＬＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である（４０℃）。
【図２７】ｐＨおよび製剤の関数としての低濃度液体製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である（４℃）。
【図２８】振盪後のｐＨおよび製剤の関数としての低濃度液体製剤の％ＨＭＷ種のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２９】ＡＴＮ−１０３の予測された構造を示す模式図である。
【図３０】ＡＴＮ−１０３ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図３１】示されている条件下で貯蔵した、約１００ｍｇ／ｍｌのＡＴＮ−１０３を含有する示した製剤（ＨＳＴ、ＨＳＧＴ、ＨＳＧＭＴ、ＨＳｏｒｂおよび対照）の、ＳＥ−ＨＰＬＣによって検出されたＨＭＷ種の％を示す棒グラフである。
【図３２】示されている条件下で貯蔵した、約１００ｍｇ／ｍｌのＡＴＮ−１０３を含有する示した製剤（ＨＳＴ、ＨＳＧＴ、ＨＳＧＭＴ、ＨＳｏｒｂおよび対照）の、ＳＥ−ＨＰＬＣによって検出されたＬＭＷ種の％を示す棒グラフである。開始時点または４℃で２週間後では、ＬＭＷ種は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）が含まれる安定な製剤は、高濃度および低濃度のＳＤＡＢ分子（「製剤」）の貯蔵に適していることが特定された。製剤化されるＳＤＡＢ分子は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（すなわち、夾雑タンパク質などを含まない）。「本質的に純粋」なタンパク質とは、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９０重量％のタンパク質、好ましくは少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に均質」なタンパク質とは、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
【００６７】
製剤中のＳＤＡＢ分子の完全性は、様々な条件下で液体または凍結乾燥した生成物として長期貯蔵した後に一般に維持される。たとえば、ＳＤＡＢ分子の完全性は、広範囲の貯蔵温度（たとえば−８０℃〜４０℃）、剪断応力（たとえば振盪）および界面応力（凍結解凍サイクル）に曝した後に十分に維持される。
【００６８】
さらに、凍結乾燥材料では、ＳＤＡＢ分子の完全性は再構成のプロセス中に十分に維持される。さらに、様々な温度（たとえば−８０℃〜４０℃）での長期貯蔵（たとえば１２カ月まで）後のＬＭＷ種およびＨＭＷ種の比較的低い蓄積、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物活性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合活性によって実証されるように、ＳＤＡＢ分子の完全性は医薬品として使用するために十分に維持される。
【００６９】
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明の全体にわたって記載する。
【００７０】
本明細書中で使用する冠詞「ａ」および「ａｎ」とは、１つまたは複数（たとえば少なくとも１つ）の冠詞の文法上の目的語をいう。
【００７１】
本明細書中で使用する用語「または（ｏｒ）」とは、内容により明らかにそうでないと指定される場合以外は、用語「および／または」を意味し、それと交換して使用可能である。
【００７２】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書中で交換して使用可能である。
【００７３】
「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、一般に、測定した量の、測定の性質または精度を考慮して許容される度合の誤差を意味する。例示的な誤差の度合は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【００７４】
ＳＤＡＢ分子の「安定な」製剤は、長期間、たとえば、６、１２カ月、２４カ月、３６カ月またはより長くにわたって、凝集、断片化、脱アミド化、酸化、または生物活性の変化のうちの任意の１つまたは複数の徴候をわずかにしか示さない、または示さない。たとえば、一実施形態では、ＳＤＡＢ分子の１０％未満しか凝集、断片化、または酸化されない。凝集、沈殿、および／または変性は、色および／もしくは透明度の視覚的検査などの既知の方法、またはＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィーによって評価することができる。タンパク質がその生物活性を保持する能力は、抗体の化学的に変更された形態を検出および定量することによって評価することができる。たとえばサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価することができるサイズ改変（たとえば切取り）。他の種類の化学的変更には荷電の変更（たとえば脱アミド化の結果として起こるもの）が含まれ、これは、たとえばイオン交換クロマトグラフィーによって評価することができる。
【００７５】
たとえば抗原結合アッセイで決定された所定の時点での分子の生物活性が、医薬製剤を調製した時点で示された生物活性の約５０％以上の範囲内である場合に、ＳＤＡＢ分子は医薬製剤中で「その生物活性を保持」している。
【００７６】
「再構成した」製剤とは、凍結乾燥したタンパク質製剤を、タンパク質が再構成した製剤中に分散されるように希釈剤に溶かすことによって調製されたものである。再構成した製剤は、目的のタンパク質で処置する患者への投与（たとえば非経口または末梢投与）に適しており、本発明の特定の実施形態では、皮下投与に適したものであり得る。
【００７７】
「等張」または「等浸透圧」とは、目的の製剤がヒト血液と類似または本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張または等浸透圧の製剤は、一般に約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、たとえば蒸気圧または氷凍結型の浸透圧計を用いて測定することができる。
【００７８】
「等張性調整剤」とは、製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物をいう。例示的な等張性調整剤は、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、またはアルギニン塩酸塩である。典型的には、等張性調整剤は、全体的な製剤がヒト血液に類似の浸透力を発揮するような量で加える。たとえば、ヒト血液は約３００ｍＭの溶質を含有する。典型的には、医薬生成物は、３００ｍＭの全モル濃度を標的とする。これは約３００〜３１０ｍＯｓｍの浸透圧に相当し、典型的な範囲は２５０ｍＯｓｍ〜３５０ｍＯｓｍである。必要な等張性調整剤の量は、計算によって最初に推定することができる。全モル濃度への寄与は、賦形剤分子の分子量、および分子の既知の特性、たとえば、分子が２つのイオン性種に分離するのか、または分子が非イオン性であるのか（分離しない）から推定することができる。さらに、具体的なタンパク質分子の浸透圧性寄与をタンパク質濃度の関数として理解することが必要である。このパラメータは実験によって決定することができる。
【００７９】
たとえば、１００ｍｇ／ｍＬの抗ＴＮＦナノボディタンパク質濃度を有する、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０の製剤（等張性を補正していない）から開始して、最初のステップとして、開始製剤の推定モル濃度は以下のように計算することができる：
１０ｍＭのヒスチジン＝１０ｍＭ
５％のスクロースは約１４６ｍＭに相当する
５％＝５ｇ／１００ｍＬ＝５０ｇ／Ｌ→（５０ｇ／Ｌ）／（３４２．３ｇ／ｍｏｌ）＝０．１４６ｍｏｌ／Ｌ＝１４６ｍＭ
０．０１％のポリソルベート８０は本質的に０モル濃度を及ぼし、無視することができる。
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質：実験により、１００ｍｇ／ｍＬの抗ＴＮＦナノボディタンパク質は約４８ｍＭに相当する浸透圧を及ぼすことが決定された。
【００８０】
したがって、初期製剤中のモル濃度へのすべての寄与を合計すると、
１０ｍＭ＋１４６ｍＭ＋４８ｍＭ＝２０４ｍＭ
であり、標的モル濃度が３１０ｍＭである場合は、標的の残りを構成するための対応するモル濃度の量は、
３１０ｍＭ−２０４ｍＭ＝１０６ｍＭ
である。
【００８１】
したがって、等張性調整剤の推奨される量は、１０６ｍＭの非イオン性等張性調整剤、または５３ｍＭの、２つのイオン種に完全に分離するイオン性等張性調整剤である。
【００８２】
等張性調整剤の初期推定値を決定した後、製剤を実験によって試験することが推奨される。したがって、提供した例では、１００ｍＭのグリシンを初期製剤に加えた。（単純にするために推奨される１０６ｍＭの端数を切り捨てて１００ｍＭとした）。予想されるモル浸透圧濃度は、
１０ｍＭのヒスチジン＋１４６ｍＭのスクロース＋４８ｍＭのタンパク質＋１００ｍＭのグリシン＝３０４ｍＭであり、
製剤の実験による浸透圧値＝３０５ｍＯｓｍ
である。
【００８３】
「凍結乾燥保護剤」とは、目的のタンパク質と合わせた場合に、凍結乾燥および続く貯蔵の際にタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を顕著に防止または低下させる分子である。例示的な凍結乾燥保護剤には、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースなどの糖、グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸、ベタインなどのメチルアミン、硫酸マグネシウムなどのリオトロピック塩、三価以上の糖アルコール、たとえば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどのポリオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ならびにその組合せが含まれる。典型的には、凍結乾燥保護剤は、トレハロースまたはスクロースなどの非還元糖である。凍結乾燥保護剤は凍結乾燥前の製剤に「凍結乾燥保護する量」で加え、これは、凍結乾燥保護する量の凍結乾燥保護剤の存在下でタンパク質を凍結乾燥した後、タンパク質は凍結乾燥および貯蔵の際にその物理的および化学的安定性ならびに完全性を本質的に保持することを意味する。
【００８４】
「安定化剤」とは、目的のタンパク質（たとえばＳＤＡＢ分子）と合わした場合に、凍結乾燥、再構成、液体または貯蔵形態の目的のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または低下させる分子をいう。例示的な安定化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が含まれる。
【００８５】
本明細書における目的の「希釈剤」とは、薬学的に許容でき（ヒトへの投与に安全かつ無毒性）、再構成した製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤には、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（たとえばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【００８６】
「保存料」とは、再構成した製剤中の細菌作用を本質的に低下させ、したがって、たとえば複数回使用の再構成した製剤の生成を容易にする、希釈剤に加えることができる化合物である。潜在的な保存料の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の保存料には、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、ならびにｍ−クレゾールが含まれる。本明細書において最も好ましい保存料はベンジルアルコールである。
【００８７】
「増量剤」とは、凍結乾燥した混合物の質量を増し、凍結乾燥したケークの物理的構造に寄与する（たとえば、解放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥したケークの生成を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびキソルビトール（ｘｏｒｂｉｔｏｌ）が含まれる。
【００８８】
本発明の方法および組成物には、指定した配列を有するポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）および核酸、またはそれに実質的に同一もしくは類似の配列、たとえば、指定した配列と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高く同一である配列が包含される。アミノ酸配列のコンテキストでは、本明細書中で使用する用語「実質的に同一」とは、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造的ドメインおよび／または共通の機能的活性を有することができるように、第２のアミノ酸配列中のアラインメントしたアミノ酸残基にｉ）同一である、またはｉｉ）その保存的置換である、十分なまたは最小限の数のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸をいう。たとえば、参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造的ドメインを含有するアミノ酸配列。他の実施形態では、アミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（たとえば保存的置換）を含有して、参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性の同一性パーセンテージに達することができる。
【００８９】
ヌクレオチド配列のコンテキストでは、本明細書中で使用する用語「実質的に同一」とは、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドがコードしている、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードしているように、第２の核酸配列中のアラインメントしたヌクレオチドと同一である、十分なまたは最小限の数のヌクレオチドを含有する第１の核酸配列をいう。たとえば、参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００９０】
また、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびその任意の組合せも、本発明のポリペプチドとして含まれる。本発明のタンパク質に言及する際の用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」には、対応するネイティブ抗体またはポリペプチドの機能的特性の少なくとも一部を保持する、任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドの断片には、本明細書中の他の箇所に記述した特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片が含まれる。本発明のポリペプチドの変異体には、上述の断片、およびアミノ酸の置換、欠失、または挿入が原因でアミノ酸配列が変更されたポリペプチドが含まれる。変異体は、天然に存在するまたは天然に存在しないものであってよい。天然に存在しない変異体は、当技術分野で知られている突然変異誘発技法を用いて生成し得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。本発明の断片の誘導体は、ネイティブポリペプチド上には見つからない追加の特徴を示すように変更されたポリペプチドである。例には融合タンパク質が含まれる。また、変異体ポリペプチドは本明細書中で「ポリペプチド類似体」とも呼び得る。本明細書中で使用するポリペプチドの「誘導体」とは、機能的側鎖の反応によって化学的に誘導体化した１つまたは複数の残基を有する対象ポリペプチドをいう。
また、２０種の標準のアミノの１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するポリペプチドも、「誘導体」として含まれる。たとえば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してよく、５−ヒドロキシリシンでリシンを置換してよく、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してよく、ホモセリンでセリンを置換してよく、オルニチンでリシンを置換してよい。
【００９１】
用語「機能的変異体」とは、天然に存在する配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされており、天然に存在する配列の１つまたは複数の活性を有することができるポリペプチドをいう。
【００９２】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は本明細書中で交換して使用可能である）の計算は以下のように行う。
【００９３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のためにアラインメントする（たとえば、最適アラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列は無視することができる）。好ましい実施形態では、比較目的のためにアラインメントする参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である（本明細書中で使用するアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。
【００９４】
２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適アラインメントのために導入しなければならないギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【００９５】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は数学アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのどちらかを用い、ギャップの重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さの重み付け１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４４〜４５３）のアルゴリズムを用いて決定する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびにギャップの重み付け４０、５０、６０、７０、または８０および長さの重み付け１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）。特に好ましいパラメータ組（別段に指定しない限りは使用すべきものである）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２スコア付けマトリックスである。
【００９６】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０の重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７）のアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００９７】
本明細書中に記載の核酸およびタンパク質配列は、たとえば他のファミリーメンバーまたは関連する配列を特定するために、公開データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行って、本発明の核酸（配列番号１）分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、本発明のタンパク質（配列番号１）タンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２に記載のようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。
【００９８】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００９９】
本発明の様々な態様を以下に詳述する。
【０１００】
単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子
単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子には、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子が含まれる。例には、それだけには限定されないが、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン、操作したドメインおよび抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が含まれる。ＳＤＡＢ分子は、当技術分野の任意のもの、または任意の将来の単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、それだけには限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、サカナ、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含めた任意の種に由来するものであり得る。また、この用語には、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）およびサメ以外の種に由来する天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含まれる。
【０１０１】
本発明の一態様では、ＳＤＡＢ分子は、サカナ中に見つかる免疫グロブリンの可変領域に由来することができる、たとえば、サメの血清中に見つかる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプに由来するものとすることができる。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１４：２９０１〜２９０９に記載されている。
【０１０２】
本発明の別の態様によれば、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。そのような単一ドメイン分子は、たとえば、ＷＯ９４０４６７８号およびＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４４６〜４４８に開示されている。明確にする理由のために、軽鎖を天然に欠く重鎖分子に由来するこの可変ドメインは、慣用の４本鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、たとえば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコから誘導することができる。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）以外の他の種も軽鎖を天然に欠く重鎖分子を生じる場合があり、そのようなＶＨＨは本発明の範囲内にある。
【０１０３】
ＳＤＡＢ分子は、以下により詳細に記載するように、組換えの、ＣＤＲ移植した、ヒト化した、ラクダ化した、脱免疫化したおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製した（たとえばファージディスプレイによって選択した）ものとすることができる。
【０１０４】
用語「抗原結合」には、標的抗原またはそのエピトープと結合する界面を形成する決定要因を含むポリペプチドの一部、たとえば本明細書中に記載の単一ドメイン分子が含まれることを意図する。タンパク質（またはタンパク質模倣体）に関して、抗原結合部位には、典型的には、標的抗原と結合する界面を形成する１つまたは複数のループ（少なくとも４個のアミノ酸またはアミノ酸模倣体からなる）が含まれる。典型的には、ポリペプチド、たとえば単一ドメイン抗体分子の抗原結合部位には、少なくとも１もしくは２個のＣＤＲ、またはより典型的には少なくとも３、４、５もしくは６個のＣＤＲが含まれる。
【０１０５】
用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、しばしば、当技術分野ではヒトまたは動物起源のＶＬまたはＶＨドメインと同一または実質的に同一であると理解される。免疫グロブリン可変ドメインは、特定の種、たとえばサメおよびラマにおいて、アミノ酸配列がヒトまたは哺乳動物のＶＬまたはＶＨとは異なるように進化している場合があることを理解されたい。しかし、これらのドメインが抗原結合に主に関与している。用語「免疫グロブリン可変ドメイン」には、典型的には、少なくとも１もしくは２個のＣＤＲ、またはより典型的には少なくとも３個のＣＤＲが含まれる。
【０１０６】
「定常免疫グロブリンドメイン」または「定常領域」には、ヒトまたは動物起源のＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４ドメインと同一または実質的に類似である免疫グロブリンドメインが含まれることを意図する。たとえばＣｈａｒｌｅｓ  Ａ  ＨａｓｅｍａｎｎおよびＪ．Ｄｏｎａｌｄ  Ｃａｐｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、２０９、２１０〜２１８（１９８９）を参照されたい。用語「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３またはこれらに実質的に類似の免疫グロブリンドメインが含まれる定常免疫グロブリンドメインのＦｃ部分をいう。
【０１０７】
特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、一価、または多特異性の分子（たとえば、二価、三価、もしくは四価の分子）である。他の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、単一特異性、二重特異性、三重特異性または四重特異性分子である。分子が「単一特異性」であるか「多特異性」、たとえば「二重特異性」であるかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数をいう。多特異性分子は、本明細書中に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または標的ポリペプチドおよび異種ポリペプチドもしくは固体支持体材料などの異種エピトープに特異的であり得る。
【０１０８】
本明細書中で使用する用語「結合価」とは、ＳＤＡＢ分子中に存在する潜在的な結合ドメイン、たとえば抗原結合ドメインの数をいう。それぞれの結合ドメインは１つのエピトープと結合する。ＳＤＡＢ分子が複数の結合ドメインを含む場合、それぞれの結合ドメインは、「二価単一特異性」と呼ばれる２つの結合ドメインを有する抗体では同じエピトープと特異的に結合してよく、または「二価二重特異性」と呼ばれる２つの結合ドメインを有するＳＤＡＢ分子では異なるエピトープと特異的に結合してよい。また、ＳＤＡＢ分子は、それぞれの特異性について二重特異性かつ二価であってもよい（「二重特異性四価分子」と呼ばれる）。二重特異性二価分子およびそれらを作製する方法は、たとえば、そのすべての開示が本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、ならびに米国出願公開第２００３／０２０７３４号および第２００２／０１５５５３７号に記載されている。二重特異性四価分子およびそれらを作製する方法は、たとえば、そのどちらの開示も本明細書中に参照により組み込まれている、ＷＯ０２／０９６９４８号およびＷＯ００／４４７８８号に記載されている。一般に、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号、ＷＯ９２／０８８０２号、ＷＯ９１／００３６０号、ＷＯ９２／０５７９３号、Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０〜６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい。
【０１０９】
特定の実施形態では、ＳＤＡＢ分子は、１つまたは複数の標的抗原と結合する相補的可変ドメインまたは免疫グロブリンの定常、たとえばＦｃ領域を欠く、１つまたは複数の単一ドメイン分子（たとえばナノボディ）を含む単鎖融合ポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドによって認識される例示的な標的抗原には、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が含まれる。特定の実施形態では、抗原結合単一ドメイン分子は、血清タンパク質、たとえば、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））またはトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ）のうちの１つまたは複数から選択されるヒト血清タンパク質と結合する。
【０１１０】
ＴＮＦα
腫瘍壊死因子アルファは、当技術分野において関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎および多発性硬化症などの炎症性障害に関連していることで知られている。ＴＮＦａならびに受容体（ＣＤ１２０ａおよびＣＤ１２０ｂ）はどちらも非常に詳細に研究されている。生物活性型のＴＮＦａは三量体である。抗ＴＮＦａ抗体を用いてＴＮＦａの作用と拮抗するいくつかの戦略が開発されており、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）などが現在市販されている。ＴＮＦａに対する抗体分子が知られている。ＴＮＦａ結合単一ドメイン抗原結合分子（たとえばナノボディ）の数々の例は、そのすべての内容がその全体で本明細書中に参照により組み込まれている、ＷＯ２００４／０４１８６２号、ＷＯ２００４／０４１８６５号、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている。単一ドメイン抗原結合分子のさらなる例は、そのすべての内容がその全体で本明細書中に参照により組み込まれている、ＵＳ２００６／２８６０６６号、ＵＳ２００８／０２６０７５７号、ＷＯ０６／００３３８８号、ＵＳ０５／０２７１６６３号、ＵＳ０６／０１０６２０３号に開示されている。他の実施形態では、ＴＮＦａおよび血清タンパク質、たとえばＨＳＡに対する単一、二重、三重および他の多特異的な単一ドメイン抗体が、これらの参考文献中に開示されている。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＴＮＦα結合ナノボディ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されているナノボディのうちの１つまたは複数を含む。たとえば、ＴＮＦα結合ナノボディ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている一価、二価、三価ＴＮＦα結合ナノボディ分子とすることができる。例示的なＴＮＦα結合ナノボディには、それだけには限定されないが、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、ＴＮＦ３、そのヒト化形態（たとえば、ＴＮＦ２９、ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３１、ＴＮＦ３２、ＴＮＦ３３）が含まれる。一価ＴＮＦα結合ナノボディのさらなる例は、ＷＯ２００６／１２２７８６号の表８に開示されている。例示的な二価ＴＮＦα結合ナノボディ分子には、それだけには限定されないが、ＴＮＦ５５およびＴＮＦ５６が含まれ、これは、ペプチドリンカーを介して連結された単一の融合ポリペプチドを形成する２つのＴＮＦ３０ナノボディを含む（ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている）。二価ＴＮＦα結合ナノボディ分子のさらなる例は、ＴＮＦ４、ＴＮＦ５、ＴＮＦ６、ＴＮＦ７、ＴＮＦ８としてＷＯ２００６／１２２７８６号の表１９に開示されている）。
【０１１２】
他の実施形態では、ＨＳＡ結合ナノボディ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されているナノボディのうちの１つまたは複数を含む。たとえば、ＨＳＡ結合ナノボディ分子は、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されている一価、二価、三価のＨＳＡ結合ナノボディ分子とすることができる。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ナノボディ分子は、ＨＳＡと結合する結合特異性のうちの少なくとも１つを有する、単一特異性または多特異性の分子とすることができる。例示的なＴＮＦα結合ナノボディには、それだけには限定されないが、ＷＯ０６／１２２７８６号に開示されているＡＬＢ１、そのヒト化形態（たとえば、ＡＬＢ６、ＡＬＢ７、ＡＬＢ８、ＡＬＢ９、ＡＬＢ１０）が含まれる。
【０１１３】
他の実施形態では、ナノボディ分子の単一ドメイン分子のうちの２つ以上を、連結基を用いてまたは用いずに、遺伝子またはポリペプチド融合体として融合する。連結基は当業者に明らかな任意の連結基とすることができる。たとえば、連結基は１〜１００個の原子の長さの生体適合性ポリマーであってもよい。一実施形態では、連結基には、ポリグリシン、ポリセリン、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリイソロイシン、もしくはポリアルギニン残基、またはその組合せが含まれる、またはそれからなる。たとえば、ポリグリシンまたはポリセリンリンカーには、少なくとも５、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、３５および４０個のグリシンおよびセリン残基が含まれてもよい。使用することができる例示的なリンカーには、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復、たとえば、１、２、３、４、５、６、７回またはそれ以上の反復の（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号８）反復が含まれる。
実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ（配列番号９）または（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）の配列を有し、ｎは４、５、または６である。
【０１１４】
１つの例示的な実施形態では、本明細書中で「ＡＴＮ−１０３」と呼ぶ、標的抗原、たとえば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）と結合する２つの単一ドメイン抗体分子（たとえば２つのラクダ科可変領域）と、血清タンパク質、たとえばＨＳＡと結合する１つの単一ドメイン抗体分子（たとえばラクダ科可変領域）との単鎖ポリペプチド融合体からなる抗原結合ポリペプチドが、タンパク質Ａまたはその機能的変異体と結合することが示された。ＡＴＮ−１０３は、ヒト化した三価の二重特異的なＴＮＦａを阻害する融合タンパク質である。このタンパク質の抗原は腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ）である。図２９は、ＡＴＮ−１０３の予測される構造の模式図を提供する。この融合タンパク質はラクダ科に由来し、ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと高度の配列および構造的な相同性を有する。その単一のポリペプチド鎖は、ＴＮＦαに対する２つの結合ドメインおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する１つの結合ドメインからなり、２つの９個のアミノ酸のＧ−Ｓリンカーがドメインを接続している。ＡＴＮ−１０３の詳細な説明はＷＯ０６／１２２７８６号に提供されている。
【０１１５】
対応する発現ベクターのＤＮＡ配列から予測されたＡＴＮ−１０３ポリペプチド鎖の完全なアミノ酸配列を図３０に示す（残基は、ＮＨ２末端を配列番号１の残基番号１として開始して番号付けされている）。ＤＮＡ配列によってコードされている最後のアミノ酸残基はＳ３６３であり、タンパク質のＣＯＯＨ末端を構成する。ジスルフィド結合したＡＴＮ−１０３の予測された分子質量（翻訳後修飾なし）は３８４３４．７Ｄａである。ＡＴＮ−１０３はＮ−連結グリコシル化コンセンサス配列を含有しない。ナノエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間質量分析によって優勢なアイソフォームで観察された分子質量は３８４３３．９Ｄａに対応し、翻訳後修飾が存在しないことが確認された。
【０１１６】
図３０では、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引いた。予測される分子内ジスルフィド結合は、関与するシステイン残基の接続によって図示した。ＴＮＦとの結合ドメインを太字で示し、ＨＳＡとの結合ドメインを太字の斜体で示す。これらの結合ドメインを接続するアミノ酸リンカーは斜体である。ポリペプチド鎖についてシグナルペプチド（−１９ＭＧＷ・・・ＶＨＳ−１）も示す。
【０１１７】
ＳＤＡＢ分子の調製
ＳＤＡＢ分子は、組換えの、ＣＤＲ移植した、ヒト化した、ラクダ化した、脱免疫化した、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製した（たとえばファージディスプレイによって選択した）、１つまたは複数の単一ドメイン分子（たとえばナノボディ）からなり得る。抗体およびＳＤＡＢ分子を作製する技法、ならびに組換えによってそれらを改変する技法は当技術分野で知られており、以下に詳述する。
【０１１８】
当業者に知られている数々の方法が抗体を得るために利用可能である。たとえば、モノクローナル抗体は、既知の方法に従ってハイブリドーマを作製することによって産生し得る。その後、この様式で形成したハイブリドーマを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準の方法を用いてスクリーニングして、指定した抗原と特異的に結合するナノボディを産生する１つまたは複数のハイブリドーマを特定する。指定した抗原の任意の形態、たとえば、組換え抗原、天然に存在する形態、任意の変異体またはその断片、ならびにその抗原ペプチドを免疫原として使用し得る。
【０１１９】
抗体およびＳＤＡＢ分子を作製する１つの例示的な方法には、タンパク質発現ライブラリ、たとえば、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが含まれる。ファージディスプレイは、たとえば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：１３１５〜１３１７、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９１／１７２７１号、ＷＯ９２／２０７９１号、ＷＯ９２／１５６７９号、ＷＯ９３／０１２８８号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／０９６９０号、およびＷＯ９０／０２８０９号に記載されている。
【０１２０】
ディスプレイライブラリの使用に加えて、指定した抗原を用いて非ヒト動物、たとえばげっ歯類、たとえば、マウス、ハムスター、またはラットを免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物にはヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部が含まれる。
たとえば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を用いてマウス抗体産生を欠くマウス株を遺伝子工学的に作製することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生および選択し得る。たとえば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：１３〜２１、ＵＳ２００３−００７０１８５号、１９９６年１０月３１日公開のＷＯ９６／３４０９６号、および１９９６年４月２９日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号を参照されたい。
【０１２１】
別の実施形態では、ＳＤＡＢ分子を非ヒト動物から得て、その後、改変する、たとえば、ヒト化、脱免疫化、キメラを、当技術分野で知られている組換えＤＮＡ技法を用いて生成し得る。キメラ抗体およびＳＤＡＢ分子を作製するための様々な手法が記載されている。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１、１９８５、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２、１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公開０１７３４９４号、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。また、ヒト化抗体およびＳＤＡＢ分子は、たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子を発現するが、内在性マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを用いても産生させ得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書中に記載のヒト化抗体およびＳＤＡＢ分子の調製に使用し得る例示的なＣＤＲ移植方法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のすべてのＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置き換えてよく、または、ＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置き換えてもよい。ヒト化抗体およびＳＤＡＢ分子と所定の抗原との結合に必要なＣＤＲの数だけを置き換える必要がある。
【０１２２】
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインの等価の配列で置き換えることによって作製することができる。ヒト化抗体またはその断片を作製する例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２〜１２０７、Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：
２１４、ならびにＵＳ５，５８５，０８９号、ＵＳ５，６９３，７６１号、ＵＳ５，６９３，７６２号、ＵＳ５，８５９，２０５号、およびＵＳ６，４０７，２１３によって提供されている。これらの方法には、少なくとも１つの重鎖または軽鎖からの免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全体または一部をコードしている核酸配列を、単離する、操作する、および発現させることが含まれる。そのような核酸は、上述の所定の標的に対するナノボディを産生するハイブリドーマおよび他の供給源から得られ得る。その後、ヒト化したＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子をコードしている組換えＤＮＡを適切な発現ベクター内にクローニングすることができる。
【０１２３】
特定の実施形態では、ヒト化したＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子を、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換および／または復帰突然変異の導入によって最適化する。そのような変更された免疫グロブリン分子は当技術分野で知られているいくつかの技法の任意のものによって作製することができ（たとえば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：７３０８〜７３１２、１９８３、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２７９、１９８３、Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３〜１６、１９８２）、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００号の教示に従って作製し得る）。
【０１２４】
ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子をヒト化する技法はＷＯ０６／１２２７８６号に開示されている。
【０１２５】
また、ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子は、ＷＯ９８／５２９７６号およびＷＯ００／３４３１７号に開示されている方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失または「脱免疫化」によっても改変し得る。手短に述べると、たとえばナノボディの重鎖および軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩと結合するペプチドについて分析することができる。これらのペプチドは潜在的なＴ細胞エピトープを表す（ＷＯ９８／５２９７６号およびＷＯ００／３４３１７号に定義）。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、ＷＯ９８／５２９７６号およびＷＯ００／３４３１７号に記載のように、「ペプチドスレッディング」と呼ばれるコンピュータモデリング手法を適用することができ、さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフについて検索することができる。これらのモチーフは１８種の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのうちの任意のものと結合し、したがって潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは単一のアミノ酸置換によって排除することができる。典型的には、保存的置換を行う。排他的ではないが、多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列中の位置に共通のアミノ酸を使用し得る。たとえば、ヒト生殖系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８、Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１６巻（５）：２３７〜２４２、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９〜８１７、およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４：４６２８〜４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国によって蓄積）。これらの配列は、ヒト配列源として、たとえば、フレームワーク領域およびＣＤＲに使用することができる。また、たとえばＵ．Ｓ．６，３００，０６４号に記載のように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も使用することができる。
【０１２６】
ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子は、タンパク質を産生するように遺伝子操作した宿主生細胞によって産生させることができる。細胞を遺伝子操作してタンパク質を産生させる方法は当技術分野で周知である。たとえばＡｕｓａｂｅｌら編（１９９０）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。そのような方法には、タンパク質をコードしておりその発現を可能にする核酸を宿主生細胞内に導入することが含まれる。これらの宿主細胞は、培養物中で成長させた細菌細胞、真菌細胞、または、好ましくは動物細胞とすることができる。細菌宿主細胞には、それだけには限定されないが大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞が含まれる。適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例には、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および外来ＤＮＡを切断することができない任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が含まれる。使用することができる真菌宿主細胞には、それだけには限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞が含まれる。使用することができる動物細胞系のいくつかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８である。当業者に周知の方法（たとえば、形質転換、ウイルス感染症、および／または選択）によって新しい動物細胞系を確立することができる。任意選択で、タンパク質は宿主細胞によって培地内に分泌されてもよい。
【０１２７】
改変ＳＤＡＢ分子
本発明の製剤は、フレームワーク領域のうちの１つ中の少なくとも１つのアミノ酸位置が、天然に存在するドメイン、たとえばＶＨドメインのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子を含有し得る。
【０１２８】
ヒト化ＳＤＡＢ分子などの本発明のＳＤＡＢ分子の一部のアミノ酸配列は、フレームワーク領域のうちの少なくとも１つ中の少なくとも１つのアミノ酸位置が、天然に存在するドメイン、たとえば天然に存在するＶＨＩ−Ｉドメインのアミノ酸配列と異なってもよいことを理解されたい。
【０１２９】
また、本発明には、ＳＤＡＢ分子の誘導体の製剤も含まれる。そのような誘導体は、一般に、ＳＤＡＢ分子および／または本明細書中に開示したＳＤＡＢ分子を形成するアミノ酸残基のうちの１つもしくは複数の修飾によって、特に化学的および／または生物学的（たとえば酵素的）修飾によって得ることができる。
【０１３０】
そのような修飾の例、およびそのような様式（すなわち、タンパク質主鎖上であってもよいが、好ましくは側鎖上）で修飾することができるＳＤＡＢ分子配列内のアミノ酸残基の例、そのような修飾を導入するために使用することができる方法および技法、ならびにそのような修飾の潜在的な使用および利点は、当業者に明らかであろう。
【０１３１】
たとえば、そのような修飾は、ＳＤＡＢ分子内または上への１つまたは複数の官能基、残基または部分、特に、ＳＤＡＢ分子に１つまたは複数の所望の特性または機能性を与える１つまたは複数の官能基、残基または部分の導入（たとえば、共有結合または他の適切な様式による）を含み得る。そのような官能基の例は当業者に明らかであろう。
【０１３２】
たとえば、そのような修飾は、ＳＤＡＢ分子の半減期、溶解度および／もしくは吸収を増加させる、ＳＤＡＢ分子の免疫原性および／もしくは毒性を低下させる、ＳＤＡＢ分子の任意の望ましくない副作用を排除もしくは減弱させる、ならびに／またはＳＤＡＢ分子に他の有利な特性を与えるおよび／もしくはその望ましくない特性を低下させる、または前述のうちの２つ以上の任意の組合せの、１つまたは複数の官能基の導入（たとえば、共有結合または任意の他の適切な様式による）を含み得る。そのような官能基およびそれらを導入する技法の例は当業者に明らかであり、本明細書中上記で引用した一般的な背景技術中に言及したすべての官能基および技法、ならびにそれ自体が医薬タンパク質の修飾、特に抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび−１４８−単一ドメイン抗体が含まれる）の修飾のために知られている官能基および技法を広く含むことができ、これについてたとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８０）を参照する。そのような官能基は、やはり当業者に明らかなように、本発明のナノボディに直接（たとえば共有）連結していてよく、または適切なリンカーもしくはスペーサーを介していてもよい。
【０１３３】
半減期を増加させるおよび／または医薬タンパク質の免疫原性を低下させるための１つの幅広く使用されている技法は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧなど）等の適切な薬理学的に許容されるポリマーの付着を含む。一般に、当技術分野で抗体ならびに抗体断片（それだけには限定されないが、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖが含まれる）に使用されるｐｅｇ化などの、ｐｅｇ化の任意の適切な形態を使用することができ、たとえば、Ｃｈａｐｍａｎ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、５３１〜５４５（２００２）、ＶｅｒｏｎｅｓｅおよびＨａｒｒｉｓ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５４、４５３〜４５６（２００３）、ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．、２、（２００３）およびＷＯ０４／０６０９６５号に言及されている。タンパク質をｐｅｇ化するための様々な試薬も、たとえばＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、米国から市販されている。
【０１３４】
好ましくは、部位特異的ｐｅｇ化、特にシステイン残基を介したものを使用する（たとえばＹａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６、１０、７６１〜７７０（２００３）を参照。たとえば、この目的のために、ＰＥＧはＳＤＡＢ分子中に天然に存在するシステイン残基に付着していてよく、ＳＤＡＢ分子は、すべてそれ自体が当業者に知られているタンパク質工学の技法を用いて、ＰＥＧと付着するための１つもしくは複数のシステイン残基が適切に導入されるように修飾してもよく、または、ＰＥＧの付着のための１つもしくは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を本発明のナノボディのＮおよび／もしくはＣ末端と融合させてもよい。
【０１３５】
好ましくは、ＳＤＡＢ分子では、５０００より大きい、たとえば１０，０００より大きく２００，０００未満、たとえば１００，０００未満、たとえば２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧを使用する。
【０１３６】
ｐｅｇ化に関して、一般に、本発明には、１つまたは複数のアミノ酸位置でｐｅｇ化されており、好ましくは前記ｐｅｇ化が、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させる、（２）免疫原性を低下させる、（３）ｐｅｇ化のそれ自体知られている１つもしくは複数のさらなる有益な特性を提供する、（４）ＳＤＡＢ分子の親和性に本質的に影響を与えない（たとえば、以下の実施例に記載したものなどの適切なアッセイによって決定したところ、前記親和性を９０％以下、好ましくは５０％以下、および１０％以下しか低下させない）、ならびに／または（４）ＳＤＡＢ分子の他の所望の特性のいずれにも影響を与えないものである、任意のＳＤＡＢ分子も包含されることにも注意するべきである。適切なＰＥＧ基およびそれらを特異的または非特異的に付着させる方法は、当業者に明らかであろう。
【０１３７】
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、ＳＤＡＢ分子の発現に使用する宿主細胞に応じて、通常は翻訳時および／または翻訳後修飾の一部としての、Ｎ−連結またはＯ−連結グリコシル化を含む。
【０１３８】
製剤
ＳＤＡＢ分子、たとえばナノボディ分子の製剤には、ＳＤＡＢ分子、凍結保護剤として役割を果たすことができる化合物、および緩衝液が含まれる。製剤のｐＨは、一般にｐＨ５．５〜７．０である。一部の実施形態では、製剤は液体として貯蔵する。他の実施形態では、製剤は液体として調製し、その後、貯蔵の前に、たとえば、凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥させる。乾燥製剤は、乾燥化合物、たとえばエアロゾルもしくは粉末として使用するか、または、その元のもしくは別の濃度まで、たとえば、水、緩衝液、もしくは他の適切な液体を用いて再構成することができる。
【０１３９】
ＳＤＡＢ分子精製プロセスは、ＳＤＡＢ分子を凍結液としての長期貯蔵およびその後のフリーズドライに適した製剤中に移すことが許容されるように設計する（たとえばヒスチジン／スクロース製剤を用いる）。製剤は特定の濃度でタンパク質と共に凍結乾燥する。
その後、凍結乾燥製剤を、必要に応じて適切な希釈剤（たとえば水）で再構成して、元の製剤の構成成分を所望の濃度まで、一般に凍結乾燥前の濃度と比較して同じまたはより高い濃度まで、再溶解させることができる。
【０１４０】
凍結乾燥製剤を再構成して、元々フリーズドライした液体の体積に対する、凍結乾燥物に加えた水または希釈剤の量に応じて、元の濃度（すなわち凍結乾燥前）とは異なる濃度を有する製剤を生成してもよい。適切な製剤は、抗体の完全性の１つまたは複数のパラメータをアッセイすることによって特定することができる。アッセイしたパラメータは、一般に、ＨＭＷ種のパーセンテージまたはＬＭＷ種のパーセンテージである。
【０１４１】
ＨＭＷ種またはＬＭＷ種のパーセンテージは、製剤中の全タンパク質含有量パーセンテージとして、または経時的な（すなわち貯蔵中の）増加パーセンテージの変化のどちらかとして決定する。許容される製剤中のＨＭＷ種の全パーセンテージは、凍結乾燥物または液体として−２０℃〜４０℃（たとえば、−２０℃〜２５℃、−２０℃〜１５℃、２℃〜８℃、約２℃、または約２５℃）で少なくとも１年間貯蔵した後に１０％以下のＨＭＷ種、または凍結乾燥物または液体として−２０℃〜４０℃で少なくとも１年間貯蔵した後に約１０％以下のＬＭＷ種である。「約」とは、言及した数値の±２０％を意味する。したがって、「約２０℃」とは１６℃〜２４℃を意味する。
【０１４２】
典型的には、安定性プロファイルは、冷蔵生成物では２°〜８℃、および室温の生成物では２５℃において、１０％未満のＨＭＷ／ＬＭＷである。ＨＭＷ種またはＬＭＷ種は、凍結乾燥物として貯蔵した製剤において、凍結乾燥物を再構成した後にアッセイする。４０℃とは、安定性を試験するため、および、たとえば輸送中に生成物を移す間に起こり得る非貯蔵条件への短期間の曝露における安定性を決定するために、一般に使用する加速条件である。
【０１４３】
アッセイしたパラメータがＨＭＷ種またはＬＭＷ種のパーセンテージ変化である場合、貯蔵後の一方または両方の種中の全タンパク質のパーセントを、貯蔵前（たとえば製剤を調製した際）の一方または両方の種中のパーセント全タンパク質と比較する。パーセンテージの差異を決定する。一般に、液体製剤中のＨＭＷ種またはＬＭＷ種中のタンパク質のパーセンテージの変化は、２℃〜８℃または２５℃で約１８〜２４カ月間貯蔵した後に、１０％以下、たとえば、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、または約３％以下である。「約」とは、所定の値または値の範囲の言及した数値の±２０％、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内を意味する。したがって、約１０％とは８％〜１２％を意味する。凍結乾燥した生成物として貯蔵した製剤化粒は、再構成後、または液体製剤中で、−３０℃〜８℃（たとえば４℃または−２０℃）で約６、９、１０、１２、１５、１８〜２４カ月間貯蔵した後に、一般に、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、もしくは約１％未満のＨＭＷ種、または約５％未満、約４％未満、約３％未満、もしくは約２％未満、もしくは約１％未満のＬＭＷ種を有する。
【０１４４】
ＳＤＡＢ分子（たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子）の製剤は、凍結液体製剤または凍結乾燥物として、たとえば、少なくとも６、９、１０、１２カ月間、または少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、もしくは少なくとも５年間貯蔵することができる。一例では、ＴＮＦ結合ナノボディ分子製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、ＴＮＦ結合ナノボディ分子製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、１０％のスクロース、０．０２％のポリソルベート８０、１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、１０％のスクロース、１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディを含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、約８０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、１００ｍＭのアルギニン（塩基）、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ５．８を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５５ｍＭのＮａＣｌ、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．１を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５５ｍＭのアルギニンＨＣｌ、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．１を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、１００ｍＭのグリシン、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、１００ｍＭのメチオニン、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、８％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、８８〜１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、１１８ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、２０ｍＭのトリス、５％のスクロース、１１７ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子、ｐＨ７．２を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、約８０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、約５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。一例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ５．５を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌ、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ５．５を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、７５ｍＭの塩化ナトリウム、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ５．５を有する。一例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌ、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディを含有し、ｐＨ６．０を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、７５ｍＭの塩化ナトリウム、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。一例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．５を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌ、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．５を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、７５ｍＭの塩化ナトリウム、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．５を有する。一例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ７．０を有する。別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌ、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ７．０を有する。さらに別の例では、製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、７５ｍＭの塩化ナトリウム、約１ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ７．０を有する。さらに別の例では、ＴＮＦ結合ナノボディ分子製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、２５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ分子を含有し、ｐＨ６．０を有する。
【０１４５】
製剤の構成成分および製剤中のＳＤＡＢ分子、たとえばＴＮＦ結合ナノボディ分子の完全性をアッセイする方法に関するさらなる詳細を、以下に提供する。
【０１４６】
製剤中のＳＤＡＢ分子の濃度は、一般に、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬ、たとえば、０．５ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍＬまたは約１０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌもしくは約３００ｍｇ／ｍｌである。範囲についての文脈では、「約」とは、言及した範囲の下限の数値の−２０％および言及した範囲の上限の数値の＋２０％を意味する。たとえば約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲についての文脈では、これは８ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬを意味する。一部の場合では、製剤中のＳＤＡＢ分子の濃度は、たとえば、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、たとえば、０．５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ〜４５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬとすることができる。そのようなＳＤＡＢ分子製剤を治療剤として使用することができる。したがって、製剤中のＳＤＡＢ分子の濃度は、処置する対象によって寛容され、投与方法に適切である製剤の体積中の用量を提供するために十分なものである。１つの非限定的な例では、体積制限が小さい（たとえば１回の注射あたり約１ｍｌ〜１．２ｍｌ）皮下で高用量を供給するためには、ＳＤＡＢ分子の濃度は、一般に、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ以上、たとえば、１００ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬである。そのような高濃度を、たとえば、凍結乾燥製剤を適切な体積の希釈剤（たとえば、滅菌注射用水、緩衝生理食塩水）中で再構成することによって達成することができる。一部の場合では、再構成した製剤の濃度は約１００ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬ（たとえば、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、２７５ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ）である。高濃度、たとえば２５０ｍｇ／ｍＬまでを、長期貯蔵、たとえば、ＳＤＡＢ分子の大量調製物の凍結貯蔵に使用することができる。
【０１４７】
吸入を介した送達には、製剤は、一般に、吸気用のエアロゾルの制限された体積中で十分な用量を提供するために、多少濃縮されている（たとえば約１００ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ）。一部の場合では、低濃度（たとえば約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ）を使用する。送達する用量を送達方法に適用させる方法、たとえばジェット噴霧器または計量エアロゾルが、当技術分野で知られている。
【０１４８】
緩衝液および凍結保護剤
本明細書中に記載の製剤のｐＨは、一般に、ｐＨ約５．０〜約７．０、たとえばｐＨ約５．５〜約６．５、ｐＨ約５．５〜約６．０、ｐＨ約６．０〜約６．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、またはｐＨ６．５である。一般に、溶液をｐＨ５．５〜６．５に維持することができる緩衝液、たとえば約６．０のｐＫＡを有する緩衝液を用いて製剤を調製する。適切な緩衝液には、それだけには限定されないが、ヒスチジン緩衝液、トリス、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジレート、ホスフェート、アセテート、スクシネート、およびシトレートが含まれる。緩衝液の濃度は約４ｍＭ〜約６０ｍＭ、たとえば約５ｍＭ〜約２５ｍＭであり、たとえば、ヒスチジンは一般に６０ｍＭの濃度で使用する。一部の場合では、ヒスチジン緩衝液は約５ｍＭ、約１０ｍＭまたは約２０ｍＭの濃度で使用する。他の場合では、アセテートまたはスクシネート緩衝液は約５ｍＭまたは約１０ｍＭの濃度で使用する。
【０１４９】
凍結保護剤は当技術分野で知られており、たとえば、スクロース、トレハロース、およびグリセロールが含まれる。生物系において低い毒性を示す凍結保護剤を一般に使用する。凍結保護剤は、製剤中に約０．５％〜１５％、約０．５％〜２％、約２％〜５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、および約５％（重量／体積）の濃度で含まれる。
【０１５０】
ＴＮＦ結合ナノボディ製剤中で緩衝液として使用することができるヒスチジン緩衝液は、凍結保護特性を有し得る。本発明の一部の実施形態では、ヒスチジン緩衝液は、糖、たとえばスクロースなどの凍結保護剤と併せて使用する。本発明の製剤は、たとえば、製剤の緩衝液も凍結保護構成成分もヒスチジンでないなど、実質的な量のヒスチジンの使用を特に排除することができる。
【０１５１】
製剤の粘度は、一般に、製剤の投与経路に適合するものである。一部の実施形態では、製剤の粘度は、１ｃＰ〜４ｃＰ、たとえば約２ｃＰ〜３．５ｃＰである。他の実施形態では、製剤の粘度は約５ｃＰ〜約４０ｃＰである。特定の実施形態では、製剤の粘度は、約１ｃＰ、２ｃＰ、２．４ｃＰ〜２．８ｃＰ、３ｃＰ、３．１ｃＰ〜３．２ｃＰ、４ｃＰ、５ｃＰ、１０ｃＰ、１５ｃＰ、２０ｃＰ、２５ｃＰ、３０ｃＰ、３５ｃＰ、または４０ｃＰである。
【０１５２】
界面活性剤
特定の実施形態では、界面活性剤を製剤中に含める。界面活性剤の例には、それだけには限定されないが、ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、またはポリソルベート８５）などの非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウレル（ｌａｕｒｅｌ）硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノレアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタイン、イソステアラミドプロピル−ベタイン（たとえばラウロアミドプロピル）、ミリスタルニドプロピル（ｍｙｒｉｓｔａｒｎｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、メチルココイルタウリン酸ナトリウム、またはメチルオフェイル（ｏｆｅｙｌ）タウリン酸二ナトリウム、ならびにＭｏｎａｑｕａｔ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、およびエチレンとプロピレングリコールとのコポリマー、たとえばポロキサマー（たとえばポロキサマー１８８）が含まれる。
【０１５３】
加える界面活性剤の量は、たとえばＨＭＷ種またはＬＭＷ種のＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてアッセイして、許容されるレベルまで再構成したタンパク質の凝集を低下させ、ＴＮＦ結合ナノボディ製剤の凍結乾燥物の再構成後に粒子の形成を最小限にするような量である。また、界面活性剤の添加は、ＴＮＦ結合抗体の凍結乾燥製剤の再構成時間も減少させ、溶液の脱気を援助することも示されている。たとえば、界面活性剤は、製剤（液体または凍結乾燥前）中で、約０．００１％〜０．６％、たとえば、約０．００５％〜０．０５％、約０．００５％〜約０．２％、および約０．０１％〜０．２％の量で存在することができる。
【０１５４】
製剤への添加
製剤は、無菌溶液または無菌凍結乾燥物として貯蔵する。また、製剤中の微生物作用の防止は、少なくとも１つの抗菌剤および／または抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを製剤中に含めることによっても達成することができる。一部の場合では、凍結乾燥物を静菌水（たとえば０．９％のベンジルアルコールを含有する水）で再構成する。保存料を製剤中に包含させる際の考慮事項は当技術分野で知られており、特定の製剤および送達方法に適合する保存料を特定する方法も知られている（たとえばＧｕｐｔａら（２００３）、ＡＡＰＳ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、５：論文８、ページ１〜９を参照）。
【０１５５】
一部の場合では、製剤は等張である。一般に、当技術分野で知られている、溶液のモル浸透圧濃度／等張性に寄与する任意の構成成分を製剤に加えることができる（たとえば、塩、糖、ポリアルコール、またはその組合せ）。等張性は、一般に、塩基性製剤の構成成分（スクロースなど）を等張濃度で使用することによって、または糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）もしくはソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの塩等の追加の構成成分を加えることによって達成する。
【０１５６】
一部の場合では、たとえば、等張性を達成するまたは製剤のＴＮＦ結合ナノボディの完全性を増加するために、塩をＴＮＦ結合ナノボディ製剤中で使用する。使用に適した塩は上述されている。塩の濃度は０ｍＭ〜約３００ｍＭとすることができる。
【０１５７】
特定の場合では、界面変性を減少させるために、Ｔｗｅｅｎ（たとえば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）を用いて製剤を調製する。Ｔｗｅｅｎの濃度は約０．００１％〜約０．０５％とすることができる。一例では、Ｔｗｅｅｎ８０は製剤中に０．０１％の濃度で使用する。
【０１５８】
特定の他の場合では、アルギニンを用いて製剤を調製する。製剤中のアルギニンの濃度は約０．０１％〜約５％とすることができる。一例では、アルギニンは製剤中に２％の濃度で使用する。一部の場合では、Ｔｗｅｅｎおよびアルギニンをどちらも本明細書中に記載のＴＮＦ結合製剤に加える。
【０１５９】
さらに他の場合では、ソルビトール、グリシン、メチオニン、または塩化ナトリウムの少なくとも１つを用いて製剤を調製し得る。ソルビトールを製剤中に含める場合は、約１％〜約１０％の濃度まで加えることができる。一例では、ソルビトールは５％の濃度で製剤中に見つかる。グリシンを製剤中に含める場合は、約０．１％〜約２％の濃度まで加えることができる。一例では、グリシンは製剤中に１％の濃度で見られる。メチオニンを製剤中に含める場合は、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度まで加えることができる。一例では、メチオニンは１００ｍＭの濃度で製剤に加える。別の例では、メチオニンは、約１０ｍＭ、約２０ｍＭまたは約７０ｍＭの濃度で製剤に加える。塩化ナトリウムを製剤中に含める場合は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度まで加えることができる。一例では、塩化ナトリウムは５５ｍＭの濃度で製剤に加える。
【０１６０】
貯蔵および調製方法
凍結
一部の場合では、抗体を含有する製剤を貯蔵のために凍結する。したがって、製剤は、凍結解凍サイクル下を含めたそのような条件下で比較的安定であることが望ましい。製剤の適切性を判定する１つの方法は、試料製剤を、少なくとも２回、たとえば、３回、４回、５回、８回、１０回、またはそれ以上のサイクルの凍結（たとえば−２０℃または−８０℃で）および解凍（たとえば、３７℃の水浴中の急速解凍または２℃〜８℃の緩徐解凍による）に供し、凍結解凍サイクル後に蓄積されるＬＭＷ種および／またはＨＭＷ種の量を決定し、凍結解凍手順の前に試料中に存在するＬＭＷ種またはＨＭＷ種の量と比較することである。ＬＭＷまたはＨＭＷ種の増加が安定性の減少を示す。
【０１６１】
凍結乾燥
製剤は凍結乾燥後に貯蔵することができる。したがって、凍結乾燥後の製剤のタンパク質構成成分の安定性について製剤を試験することは、製剤の適切性の判定に有用である。
この方法は、凍結について上述したものと同様であるが、試料製剤を凍結する代わりに凍結乾燥し、その元の体積まで再構成し、ＬＭＷ種および／またはＨＭＷ種の存在について試験する。凍結乾燥した試料製剤を凍結乾燥しなかった対応する試料製剤と比較する。対応する試料と比較した凍結乾燥試料中のＬＭＷまたはＨＭＷ種の増加が、凍結乾燥した試料の安定性の減少を示す。
【０１６２】
一般に、凍結乾燥プロトコルには、凍結乾燥機内に試料を入れること、予冷期間、凍結、真空開始、一次乾燥温度への勾配、一次乾燥、二次乾燥温度への勾配、二次乾燥、および試料に栓をすることが含まれる。凍結乾燥プロトコルについて選択することができるさらなるパラメータには、真空度（たとえばミクロン）およびコンデンサー温度が含まれる。温度の適切な勾配率は、約０．１℃／分〜２℃／分、たとえば、０．１℃／分〜１．０℃／分、０．１℃／分〜０．５℃／分、０．２℃／分〜０．５℃／分、０．１℃／分、０．２℃／分、０．３℃／分、０．４℃／分、０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分、および１．０℃／分である。凍結乾燥サイクルの凍結中の適切な棚温度は、一般に、約−５５℃〜−５℃、−２５℃〜−５℃、−２０℃〜−５℃、−１５℃〜−５℃、−１０Ｃ〜−５℃、−１０℃、−１１℃、−１２℃、−１３℃、−１４℃、−１５℃、−１６℃、−１７℃、−１８℃、−１９℃、−２０℃、−２１℃、−２２℃、−２３℃、−２４℃、または−２５℃である。棚温度は一次乾燥および二次乾燥で異なってもよく、たとえば、一次乾燥は二次乾燥よりも低い温度で行うことができる。
非限定的な例では、一次乾燥を０℃で実施し、二次乾燥を２５℃で実施することができる。
【０１６３】
一部の場合では、凍結中および真空開始前に徐冷プロトコルを使用する。そのような場合では、徐冷時間を選択しなければならず、温度は一般に組成物のガラス転移温度よりも高い。一般に、徐冷時間は、約２〜１５時間、約３〜１２時間、約２〜１０時間、約３〜５時間、約３〜４時間、約２時間、約３時間、約５時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、または約１５時間である。徐冷の温度は、一般に、約−３５℃〜約−５℃、たとえば、約−２５℃〜約−８℃、約−２０℃〜約−１０℃、約−２５℃、約−２０℃、約−１５℃、約０℃、または約−５℃である。一部の場合では、徐冷温度は、一般に、−３５℃〜０℃、たとえば、−２５℃〜−８℃、−２０℃〜−１０℃、−２５℃、−２０℃、−１５℃、０℃である。
【０１６４】
本明細書中に記載の製剤の安定性は、−２５℃〜３０℃の一次乾燥棚温度、および２時間〜９時間、０℃〜３０℃の二次乾燥期間を含めた、様々な凍結乾燥パラメータを用いて試験することができる。
【０１６５】
１つの非限定的な例では、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０の、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディのタンパク質濃度の製剤を大量に製剤化し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、タンパク質を１００ｍｇ／ｍＬで送達するために生成物を充填体積の約半分で再構成する。ＴＮＦ抗体は、生成物温度において極端に凍結乾燥させた後に頑健であることが実証された。５０℃で４週間貯蔵した後の安定性プロファイルは、様々なフリーズドライサイクルを用いて調製した材料と同一であり（たとえば図１６〜２０を参照）、その一部は一次乾燥中に１０℃近くの生成物温度の差があった（たとえば図１３）。一般に、凍結乾燥サイクルは、１０時間〜１００時間、たとえば、２０時間〜８０時間、３０時間〜６０時間、４０時間〜６０時間、４５時間〜５０時間、５０時間〜６５時間、実行することができる。
【０１６６】
抗体製剤を貯蔵する温度範囲の非限定的な例は、約−２０℃〜約５０℃、たとえば、約−１５℃〜約３０℃、約−１５℃〜約２０℃、約５℃〜約２５℃、約５℃〜約２０℃、約５℃〜約１５℃、約２℃〜約１２℃、約２℃〜約１０℃、約２℃〜約８℃、約２℃〜約６℃、ならびに約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、１０℃、１５℃、２５℃、または３０℃である。貯蔵温度にかかわらず、特定の場合では、試料は、そのような組成物に関して予想することができる、貯蔵および輸送の条件中に一時的に起こり得る温度変化の下で安定である。
【０１６７】
噴霧乾燥
一部の場合では、製剤を噴霧乾燥し、その後に貯蔵する。噴霧乾燥は当技術分野で知られている方法を用いて実施し、液体または凍結の噴霧乾燥を使用するように改変することができる（たとえば、Ｎｉｒｏ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｕｐｐｅｒｔｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、英国）、もしくはＢｕｃｈｉ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）、または米国特許公開第２００３００７２７１８号および第２００３００８２２７６号などの方法を用いる）。
【０１６８】
ＳＤＡＢ分子の完全性決定
ＬＭＷ種およびＨＭＷ種の蓄積は、抗体安定性の有用な測定である。製剤中のＬＭＷまたはＨＭＷのいずれかの蓄積は、製剤の一部として貯蔵されるタンパク質の不安定性の指標である。ＨＰＬＣを伴ったサイズ排除クロマトグラフィーを用いてＬＭＷおよびＨＭＷ種の存在を決定することができる。そのような測定のための適切な系は当技術分野で知られており、たとえばＨＰＬＣ系（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）である。当技術分野で知られている他の系、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＨＭＷおよびＬＭＷ種を監視するため）、抗体活性のバイオアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、精製した標的タンパク質（たとえばＴＮＦα）と結合する能力、ならびに陽イオン交換−ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ、変異体を検出し、表面荷電を監視するため）を用いて、製剤中の抗体の完全性を評価することができる。一例では、バイオアッセイは、生物活性を実証するためにＴＮＦα依存性の活性の阻害を様々な濃度の製剤化したナノボディ分子の存在下で検査する、細胞に基づくアッセイである。
【０１６９】
製品
また、本出願は、本明細書中に記載の製剤が含まれる製品も提供し、製剤の使用説明書を提供する。
【０１７０】
たとえば医薬品として対象に投与するために使用する製剤は、無菌でなければならない。これは、当技術分野で知られている方法を用いて、たとえば滅菌濾過膜を通した濾過によって、液体の製剤化または凍結乾燥および再構成の前、またはその後に達成する。あるいは、構造に損傷を与えない場合は、製剤の構成成分をオートクレーブによって滅菌し、その後、濾過または照射によって滅菌した構成成分と組み合わせて、製剤を生成することができる。
【０１７１】
医薬製剤は、皮下注射または複数チャンバのシリンジを含めたシリンジなどの経皮送達デバイスを用いて投与することができる。一実施形態では、デバイスは、付属または一体型の針を備えた、充填済みシリンジである。他の実施形態では、デバイスは、針が付属されていない、充填済みシリンジである。針を充填済みシリンジと共に梱包することができる。一実施形態では、デバイスは、自己注射デバイス、たとえば自己注射シリンジである。別の実施形態では、注射デバイスはペン型注射器である。さらに別の実施形態では、シリンジは、固定針（ｓｔａｋｅｄ  ｎｅｅｄｌｅ）シリンジ、ルアーロックシリンジ、またはルアースリップシリンジである。他の適切な送達デバイスには、ステント、カテーテル、顕微針、および埋め込み型の徐放デバイスが含まれる。組成物は、たとえば、インラインフィルターを備えたまたは備えない静脈内チューブを含めた、標準の静脈内装備を用いて静脈内投与することができる。
【０１７２】
特定の実施形態では、シリンジは自己注射デバイスと共に使用するために適している。
たとえば、自己注射デバイスには、液剤を送達するためのペン型注射デバイスなどの単一バイアル系が含まれてもよい。そのようなデバイスは、たとえば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）、Ｙｐｓｏｍｅｄ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、スイス、ｗｗｗ．ｙｐｓｏｍｅｄ．ｃｏｍ、Ｂｉｏｊｅｃｔ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｏｒｅｇ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、英国）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ  Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）、およびＺｏｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡによって作製または開発されており、ＢＤ  Ｐｅｎｓ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、およびＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊチップ無針注射器（Ｊ−ｔｉｐ  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ）（登録商標）、ＤｏｓｅＰｒｏ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）などが製造者から市販されている。二重バイアル系を含む認識されているデバイスには、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）などの、再構成した溶液を送達するためのカートリッジ中で凍結乾燥した薬物を再構成するためのペン型注射器系が含まれる。
【０１７３】
製品には、製剤を含有するために適した容器が含まれてもよい。適切な容器は、それだけには限定されないが、デバイス、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、噴霧器（たとえば超音波もしくは振動メッシュ噴霧器）、静脈溶液バッグ、または吸入器（たとえば定量吸入器（ＭＤＩ）もしくはドライパウダー吸入器（ＤＰＩ））とすることができる。容器は、ガラス、金属、またはポリカーボネート、ポリスチレン、もしくはポリプロピレンなどのプラスチック等の任意の適切な材料で作ることができる。たとえば、容器（たとえばシリンジまたはバイアル）は、ガラス、プラスチック、環状オレフィンコポリマー、または環状オレフィンポリマーで作ることができる。容器（たとえばシリンジまたはバイアル）は、栓、たとえばゴム栓を有していてもよい。本発明の製剤を貯蔵するための容器の特定の実施形態には、（ｉ）ゴム栓を備えたガラス製バイアル中の液体、（ｉｉ）ゴム製プランジャーを備えたガラス製の事前充填可能なシリンジ中の液体、（ｉｉｉ）ゴム製プランジャーを備えた事前充填可能なポリマー製シリンジ、たとえば環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、または環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）中の液体が含まれる。
【０１７４】
一般に、容器は、合物からの顕著な量のタンパク質を吸着せず、製剤の構成成分と反応性のない材料の容器である。
【０１７５】
一部の実施形態では、容器は、栓、たとえばＷｅｓｔ  ４４３２／５０  １３１９のシリコン処理した灰色の栓またはＷｅｓｔ  ４０２３  Ｄｕｒａｆｌｕｏｒ栓を備えた透明なガラス製バイアルである。一部の実施形態では、容器はシリンジである。特定の実施形態では、製剤は、１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０を、充填済みシリンジ中に含む。別の実施形態では、製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６を、事前充填可能な環状オレフィン製シリンジおよびＷｅｓｔ  ４４３２／５０のシリコン処理した灰色のゴム製プランジャー中に含む。他の実施形態では、製剤には、約１０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６が、事前充填可能なガラス製シリンジおよびＷｅｓｔ  ４４３２／５０のシリコン処理した灰色のゴム製プランジャーまたはＷｅｓｔ  ４０２３／５０のＤａｉｋｙｏ  Ｆｌｏｕｒｏｔｅｃ／Ｂ２でコーティングしたゴム製プランジャー中に含まれる。
【０１７６】
本明細書中に記載の製品には、包装材料をさらに含めることができる。包装材料は、使用または投与の情報に加えて、たとえば、生成物を使用することができる条件に関して規制機関によって要求される情報を提供する。たとえば、包装材料は、患者に、どのようにして本明細書中に記載の製剤を含有する充填済みシリンジを注射するか、または、どのようにして指定した期間内、たとえば２〜２４時間またはそれより長い期間にわたって凍結乾燥製剤を水性希釈剤中で再構成して溶液を形成するかについての指示を提供することができる。本明細書中で特許請求した製剤は、ヒトの医薬生成物の使用に有用である。
【０１７７】
特定の実施形態では、製剤は噴霧器として投与することができる。噴霧器の例には、非限定的な例として、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、および振動メッシュ噴霧器が含まれる。これらのクラスでは、様々な方法を用いてエアロゾルを液体から生じる。一般に、これらの製剤中でタンパク質の完全性を維持することができる任意のエアロゾル発生デバイスが、本明細書中に記載の製剤の送達に適している。
【０１７８】
他の実施形態では、医薬組成物は医療用デバイスを用いて投与することができる。たとえば、医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。周知の埋込錠およびモジュールの例には、制御された速度で医薬品を分注するための埋め込み型の微量注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を介して医薬品を投与するための治療用デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号、医薬品を正確なインフュージョン速度で送達するための医薬品注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流の埋め込み型インフュージョン器具を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、複数チャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。また、治療的組成物は、皮下または筋肉内投与のための生分解性または非生分解性の持続放出製剤の形態とすることもできる。たとえば、米国特許第３，７７３，９１９号および第４，７６７，６２８号ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５５８７号を参照されたい。また、連続投与は、埋め込み型または外部のポンプを用いて達成することもできる。また、投与は、断続的に、たとえば単一の１日１回の注射で、または連続的に低用量で、たとえば持続放出製剤で実施することもできる。送達デバイスは、ＳＤＡＢ分子の投与に最適に適切であるように改変することができる。たとえば、シリンジは、ＳＤＡＢ分子の貯蔵および送達に最適な程度までシリコン処理することができる。
もちろん、多くの他のそのような埋込錠、送達系、およびモジュールも知られている。また、本発明は、第１および第２の薬剤を投与するためのデバイスも特徴とする。デバイスには、たとえば、医薬調製物を貯蔵するための１つまたは複数のハウジングが含まれてもよく、単位用量の第１および第２の薬剤を送達するように構成することができる。第１および第２の薬剤は、同じまたは別々の区画中に貯蔵することができる。たとえば、投与前にデバイスで薬剤を合わせることができる。また、第１および第２の薬剤を投与するために異なるデバイスを使用することも可能である。
【０１７９】
投与および処置方法
本発明の製剤は、対象（たとえばヒト対象）に、単独でまたは第２の薬剤、たとえば第２の治療上もしくは薬理学的に活性な薬剤と組合せて、ＴＮＦα関連障害、たとえば炎症性または自己免疫性障害を治療または予防する（たとえばそれに関連する１つまたは複数の症状を低下または寛解させる）ために投与される。用語「処置する」とは、治療剤を、統計的に有意な度合までまたは当業者が検出可能な度合まで、障害に関連する状態、症状、もしくはパラメータを改善させる、または障害の進行を妨げるために有効な量、様式、および／またはモードで、投与することをいう。有効な量、様式、またはモードは対象に応じて変動する場合があり、対象に合わせ得る。
【０１８０】
処置することができる免疫障害の非限定的な例には、それだけには限定されないが、自己免疫障害、たとえば、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ループス関連関節炎または強直性脊椎炎が含まれる）、強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、血管炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎が含まれる）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、真性糖尿病（Ｉ型）、たとえば皮膚の炎症状態（たとえば乾癬）、急性炎症状態（たとえば、内毒血症、敗血症、菌血症を伴う敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、毒素ショック症候群および感染症）、移植片拒絶ならびにアレルギーが含まれる。一実施形態では、ＴＮＦα関連障害は、関節炎障害、たとえば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ（ＲＡ）（たとえば中等度から重度の関節リウマチ）、骨関節炎、乾癬性関節炎、もしくは強直性脊椎炎、多関節若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、または乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、および／または多発性硬化症のうちの１つまたは複数から選択される障害である。
【０１８１】
特定の実施形態では、製剤には第２の治療剤が含まれる。たとえば、ＴＮＦ−ナノボディでは、第２の薬剤は、抗ＴＮＦ抗体またはそのＴＮＦ結合断片であってよく、第２のＴＮＦ抗体は製剤のＴＮＦ結合ＳＤＡＢ分子とは異なるエピトープ特異性を有する。ＴＮＦ結合ＳＤＡＢと共製剤化することができる薬剤の他の非限定的な例には、たとえば、サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、および細胞分裂抑制剤が含まれる。一実施形態では、追加の薬剤は、それだけには限定されないが、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、プレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾン、およびトリアムシノロンを含めたコルチコステロイド、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）およびスルファサラジンなどの疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、レフルノミド（Ａｒａｖａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））（メトトレキサートを含むまたは含まない）、およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））を含めた腫瘍壊死因子阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（たとえばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）などの可溶性インターロイキン−１受容体、金、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｉｎ（登録商標））、ペニシラミン、ならびにアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロスポリンを含めた細胞毒性剤を含めた、関節炎の標準の処置である。そのような併用療法では、低用量の投与した治療剤を有利に利用して、様々な単独療法に関連する潜在的な毒性または合併症が回避され得る。
【０１８２】
本発明の製剤は、液体溶液の形態とすることができる（たとえば、注射用およびインフュージョン用の液剤）。そのような組成物は、非経口モード（たとえば、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射）、または吸入によって投与することができる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」および「非経口投与した」とは、経腸および外用投与以外の、通常は注射による投与形式を意味し、皮下または筋肉内投与、ならびに静脈内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、表皮下、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射およびインフュージョンが含まれる。一実施形態では、本明細書中に記載の製剤を皮下投与する。
【０１８３】
医薬製剤は、製造および貯蔵条件下で無菌的かつ安定である。また、投与における規制および業界の標準を満たすことを保証するために、医薬組成物を試験することもできる。
【０１８４】
医薬製剤は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高いタンパク質濃度に適した他の規則的な構造として製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、本明細書中に記載の薬剤を、所要量で、必要に応じて上述した成分のうちの１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に取り込ませ、続いて滅菌濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、本明細書中に記載の薬剤を、塩基性分散媒を含有する無菌ビヒクルおよび上述したもののうちの所用の他の成分内に取り込ませることによって調製する。溶液の適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所用の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１８５】
一部の実施形態では、製剤を説明するパラメータ、たとえば製品のラベル上に見られ得るパラメータを特徴づける。そのようなパラメータには、たとえば、色（典型的には、無色からわずかに黄色、または無色から黄色）、透明度（典型的には、透明からわずかに乳白色、または透明から乳白色）、および粘度（典型的には、２０℃〜３０℃などの周囲温度で測定した場合に約１〜５ｃＰ）が含まれる。そのようなパラメータは当技術分野で知られている方法によって測定することができる。たとえば、透明度は、市販の乳白標準（たとえば、Ｈａｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ＣＯ、８０５３９から入手可能）を用いて測定することができる。
【実施例】
【０１８６】
本発明を以下の実施例によってさらに例示する。実施例は例示目的のみで提供する。これらは、いかなる様式でも本発明の範囲または内容を限定すると構成されるべきでない。
【０１８７】
（実施例１）
ＡＴＮ−１０３の高濃度の凍結乾燥製剤の安定性（６カ月期間）
たとえば治療的用途のために使用する抗体を貯蔵する一方法は、凍結乾燥によって調製した乾燥粉末としての方法である。したがって、凍結乾燥ＴＮＦ結合製剤の長期安定性を研究した。
【０１８８】
手短に述べると、ヒト化ＴＮＦ結合ナノボディ（５０ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース（重量／体積）、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０を含有する製剤を滅菌濾過によって調製し、５ｍｌの発熱物質除去したガラス製チューブバイアル内に分注し、その後、凍結乾燥した。製剤を４℃、２５℃、または４０℃で１カ月、３カ月、および６カ月間貯蔵し、その後、滅菌水（ＵＳＰ）中で再構成して、製剤が１００ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、１０％のスクロース、０．０２％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０であるような、再構成した製剤をもたらした。
【０１８９】
高濃度液体の安定性は、生物活性、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージ、ＳＤＳ−ＣＥによるＴＮＦ結合ナノボディのパーセンテージおよび生成物ではない不純物のパーセンテージ、ならびに相対的保持時間のＣＥＸ−ＨＰＬＣ評価および溶出プロファイルとＴＮＦ結合ナノボディ参照標準との比較性によって評価した。
【０１９０】
凍結乾燥ＴＮＦ結合ナノボディ製剤を、ＷＯ２００６／１２２７８６号に開示されているアッセイを用いて、生物活性についてアッセイした。図１は、そのようなバイオアッセイの組のデータを例示する。データは１ミリグラムあたりの単位として表した。試料は、貯蔵前に約５〜５．５×１０６Ｕ／ｍｇであり、インキュベーション後に約４．５〜５．５×１０６Ｕ／ｍｇであった。全体的に、どの試料でも６カ月間の貯蔵後に生物活性の量に実質的な変化はなかった。したがって、製剤は、生物活性によって決定したところ、少なくとも６カ月の間、凍結乾燥製剤の貯蔵に適している。
【０１９１】
また、凍結乾燥ＴＮＦ結合ナノボディ製剤を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合活性についてもアッセイした。図２は、そのような結合アッセイの組のデータを例示する。製剤の初期結合活性は参照試料の約１００％であり、どの試料でも６カ月間の試験期間にわたって実質的に変化しなかった。したがって、製剤は、ＨＳＡ結合活性によって決定したところ、少なくとも６カ月の間、凍結乾燥製剤の貯蔵に適している。
【０１９２】
ＳＥ−ＨＰＬＣを用いてＨＭＷ種のパーセンテージをアッセイした。凍結乾燥および再構成前の製剤中のＨＭＷ種のパーセンテージは、製剤中の全タンパク質の約０．１％であり、また、４℃および２５℃で貯蔵したすべての試料中でも約０．１％〜０．２％であった（図３）。４０℃で６カ月間の貯蔵の後、製剤は約０．３５％のＨＭＷ種であった（図３）。したがって、４℃および２５℃で６カ月間貯蔵した試料中のＨＭＷ種レベルに実質的な増加はなかった。
【０１９３】
ＳＥ−ＨＰＬＣを用いてＬＭＷ種のパーセンテージをアッセイした。製剤中のＬＭＷ種のパーセンテージは、４℃、２５℃および４０℃の温度で６カ月まで、検出限界未満（すなわち０．０％）であった。
【０１９４】
ＳＤＳ−ＣＥを用いてＴＮＦ結合ナノボディのパーセンテージをアッセイした。製剤中の初期ＴＮＦ結合ナノボディのパーセンテージは約１００％であり、どの試料でも６カ月間の試験期間にわたって実質的に変化しなかった（図４）。
【０１９５】
ＳＤＳ−ＣＥを用いて生成物ではない不純物のパーセンテージをアッセイした。４℃、２５℃および４０℃の温度で６カ月までの製剤で、ＳＤＳ−ＣＥによって無視できる量の生成物ではない不純物しか観察されなかった。
【０１９６】
また、凍結乾燥ＴＮＦ結合ナノボディ製剤を、ＣＥＸ−ＨＰＬＣを用いて同一性についても試験した。製剤の溶出プロファイルは、４℃、２５℃および４０℃の温度で６カ月まで、参照標準と比較可能であった。指定したピークの相対的保持時間は、４℃、２５℃および４０℃の温度で６カ月まで、１．００標準で変化していなかった。
【０１９７】
凍結乾燥ＴＮＦ結合ナノボディ製剤の再構成特性に対する、ポリソルベート８０を添加する効果も試験した。以下の表に見ることができるように、ポリソルベート８０を凍結乾燥した生成物に添加することで、凍結乾燥粉末の外見および溶解を改善させることによって生成物の品質が改善する。
【０１９８】
【表１】
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【０１９９】
本明細書中に記載のデータは、分解生成物の限定的な変化を様々な温度で貯蔵時間の関数として示す。
【０２００】
（実施例２）
凍結乾燥に対するＴＮＦ結合ナノボディ製剤の頑健性
標的凍結乾燥サイクルを適用することによって凍結乾燥製剤に加えて（実施例１）、２つの追加の「頑健性」凍結乾燥サイクルを同じ製剤に適用することによって、２つの追加の薬物製品のロットを調製した。２つの「頑健性」凍結乾燥サイクルは、製造の設定において起こり得る顕著なプロセスの逸脱を模倣する。標的（対照）凍結乾燥サイクル研究と同じ薬物製品の製剤を頑健性研究で使用した：１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、ｐＨ６．０。再構成した後（凍結乾燥前の充填された生成物の約半分の体積の再構成希釈剤を使用）、ＡＴＮ−１０３製剤は以下の通りであった：２０ｍＭのヒスチジン、１０％のスクロース、０．０２％のポリソルベート８０、１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、ｐＨ６．０。
【０２０１】
顕著なプロセスの逸脱を模倣した２つの頑健性凍結乾燥サイクルを、「高水分」および「攻撃的」と称する。図５は、頑健性凍結乾燥サイクルに供した製剤が、標的（対照）サイクルのそれと匹敵する安定性を示すことを実証している。凍結乾燥頑健性製剤のバイアルを対照凍結乾燥サイクルと並べて加速安定性上に置き、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０２０２】
これらのデータは、ＡＴＮ−１０３凍結乾燥製剤は、生成物に影響を与えずに顕著なプロセスの逸脱に対して頑健であることを実証している。
【０２０３】
ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて、対照および頑健性の凍結乾燥サイクルに供した製剤のＬＭＷ種のパーセンテージをアッセイした。凍結乾燥ＴＮＦ結合ナノボディの、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＬＭＷ種のパーセンテージは、ｔ０および５０℃で１カ月までにおいて、３つのサイクルすべてで検出限界未満（すなわち０．０％）であった。
【０２０４】
凍結乾燥の実施
すべての実行において、凍結乾燥機内の放射を最小限にするために、扉の前のアルミニウム箔遮蔽および６３ｍｍの棚の高さを使用した。すべての実行において、凍結乾燥機に対して一定の負荷を維持するために１つのトレイを完全に満たした。すべてのタンパク質バイアルについて栓をオートクレーブし、乾燥させた。タンパク質試料のすべてのバイアルを脱イオン水ですすぎ、発熱物質を除去した。トレイの残りの部分を埋めるために使用したバイアルおよび栓は未処理であった。
【０２０５】
ＴＮＦ結合ナノボディ製剤を播種したバイアルを、バイオセーフティキャビネット中、１６０ｍｇ／バイアルの標的で無菌的に調製した。それぞれの実行の前に、安定性研究用のバイアルを３．２ｍｌの新鮮な製剤で満たした（事前に凍結乾燥していない材料）。凍結乾燥中、凍結乾燥機に対して一定の負荷を維持するために、追加のバイアルを標的凍結乾燥サイクルと適合性のある適切な緩衝液で満たした。凍結乾燥はタンパク質アレイ内で熱電対を使用することによって監視した。
【０２０６】
変調示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）
ｍＤＳＣ用のすべての試料は、０．５℃の振幅および１００秒間の期間の変調モードで実行した。凍結乾燥後の粉末には、試料を２℃／分で１５０℃まで加熱した。すべての粉末試料は窒素をパージしたグローブボックスを用いて調製した。液体試料には、すべての温度勾配を０．５℃／分で行い、温度を凍結乾燥サイクルで利用したものと一致させた。
最終加熱勾配は２℃／分で行ってガラス転移を拡大した。液体試料は実験室ベンチ上で調製した。
【０２０７】
水分分析
カールフィッシャー滴定を用いて凍結乾燥した試料中の水分をアッセイした。凍結乾燥した試料は３ｍｌのメタノールで再構成した。
【０２０８】
２つ組または３つ組の、５００μＬの注入を行った。適合性確認のために、使用後に１％の水標準を注入した。
【０２０９】
フーリエ変換赤外線分光分析（ＦＴＩＲ）
ＦＴＩＲにより、乾燥粉末状態の抗体の二次構造を測定した。３００ｍｇのＫＢｒ中に分散させた約１ｍｇの製剤化した乾燥タンパク質を含有するペレットを圧延し、２００回走査した。データ収集後、分析はスクロースプラセボのスペクトル減算、ベースライン補正、補整、二次導関数、および面積の正規化を含む。
【０２１０】
安定性
製剤中の凍結乾燥した抗体の安定性を貯蔵時間および温度の関数として評価した。凍結乾燥したＴＮＦ結合ナノボディの試料を、凍結乾燥後、２℃〜８℃で４週間の貯蔵後、ならびに５０℃で２週間および４週間の貯蔵後にアッセイした。冷蔵試料はウォークイン型の冷蔵した冷室中で貯蔵した。高温試料は５０℃に設定したＬａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ中で貯蔵した。適切な時点で、試料を貯蔵から取り出し、アッセイ前に室温まで加温または冷却した。
【０２１１】
再構成および視覚的外見
凍結乾燥後分析および貯蔵安定性分析のどちらからの凍結乾燥製剤のバイアルも、１．３ｍｌの滅菌注射用水で再構成する前、その間、およびその後に視覚的に検査した。バイアルを、ライトボックス中で黒および白色の背景の両方に対して、再構成前のケーク色、完全性、水分、粒子、および欠陥について検査した。凍結乾燥したケークを視覚検査した後、クリンプ除去装置（ｄｅ−ｃｒｉｍｐｅｒ）を使用して蓋およびクリンプシールをバイアルから取り外した。栓を取り外し、適切なピペットを用いて滅菌注射用水をバイアル内にゆっくりと分注した。ケークを完全に湿らせることを確実にするために回旋動作を用いて希釈剤を分注した。希釈剤を完全に分注した後、標準の実験室タイマーを用いて再構成の測時を開始し、バイアルに再度栓をした。最後の固体片が溶けた際に再構成が完了した。バイアルを手の間で回転させることで再構成が促進された。凍結乾燥したケークが再構成の過程にある間、透明度、気泡発生、および発泡などの、溶解中の溶液の状態に関する観察を記録した。再構成が完了した後、再構成時間を記録し、生じた溶液が定着し、再構成中に形成された気泡の大部分が散逸されることを可能にするために、バイアルをベンチ上に数分間静置した。その後、再構成した溶液を、ライトボックス中で黒および白色の背景の両方に対して、色、透明度、および粒子について検査した。
【０２１２】
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
２マイクロリットルのＴＮＦ結合ナノボディ製剤のニートな試料を、保護カラムを備えたＧ３０００ｓｗｘｌカラム上に注入した（ＴｏｓｏＨａａｓ部品番号０８５４１および０８５４３）。移動相は、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを加えたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）であった。流速は０．７５ｍｌ／分であり、実行時間は３０分間であった。紫外線吸光度を２８０ｎｍの波長で監視した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ（商標）ソフトウェアを用いて、主なＴＮＦ結合ナノボディピークを高および低分子量種から分離するためにクロマトグラムを積分した。
【０２１３】
濃度決定のための紫外線−可視吸光度分光分析（Ａ２８０）
１００ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を有する製剤の試料を、１０μｌの試料をそれぞれ１９９０μｌおよび３９９０μｌの１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、ｐＨ６．０に加えることによって約０．５ｍｇ／ｍＬおよび０．２５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。２００マイクロリットルの生じた溶液を、９６ウェルマイクロプレート中の個々のウェル中に緩衝液ブランクと共に入れた。プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓプレートリーダーで２８０ｎｍおよび３２０ｎｍの波長の紫外線吸光度について読み取った。３２０ｎｍの吸光度を２８０ｎｍの吸光度から減算し、消光係数（１．４０５ｍＬ／ｍｇ−ｃｍ）×経路長（１ｃｍ）によって除算することで、それぞれのウェル中の溶液のタンパク質濃度が決定された。適切な希釈係数を適用し、平均タンパク質濃度を決定した。
【０２１４】
光散乱のための紫外線−可視吸光度分光分析（Ａ４２０）
２００マイクロリットルの分析するそれぞれのＴＮＦ結合ナノボディ試料を、９６ウェルマイクロプレート上の個々のウェル内に一定分量で入れた。緩衝液ブランクが対照として役割を果たした。プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーで４２０ｎｍの波長の可視吸光度について読み取った。
【０２１５】
サイクル開発戦略
一連の連続的なステップ（以下に記載）を使用して凍結乾燥サイクルを開発した。
【０２１６】
生成物臨界温度の特定
ＴＮＦ結合ナノボディの生成物臨界温度は変調示差走査熱量（ｍＤＳＣ）によって特定した。この方法は、凍結した生成物のガラス転移温度を特定するために使用する（ｍＤＳＣ）。一次乾燥中に生成物をこの温度未満に維持する凍結乾燥サイクルにより、インタクトなケーク構造が得られるはずである。最低温度の適切な温度は−２５℃であると推定され、したがって、この温度は、一般に、本明細書中に記載の抗体の製剤およびその凍結乾燥方法を開発する際に条件および製剤を試験するために設計された手順に含まれる。
【０２１７】
凍結乾燥サイクルの実行
上述した研究の結果に基づいて、３つの異なる凍結乾燥サイクルを行って、貯蔵に適した凍結乾燥製剤を調製するための適切な凍結乾燥手順または他の手順を開発における、３つの目的のパラメータを検査した。検査した第１のパラメータは対照サイクルであり、以前の安定性研究からのサイクルを繰り返す。すべての以前の開発上の安定性サイクルでこのサイクルを利用したため、これがこの分析の出発点として役割を果たした。
【０２１８】
試験した第２のパラメータは、高い残留水分含量を有する凍結乾燥したケークを作製するために二次乾燥ステップを行わないことの影響であった。この凍結乾燥サイクルは、高い残留水分含量に対するＴＮＦ結合ナノボディ製剤の感受性の評価として役割を果たし、正式な凍結乾燥頑健性研究を実行する前の、初期の臨床ロット中の製造の逸脱の評価に使用することができる。
【０２１９】
試験した第３のパラメータは攻撃的サイクルであった。一次乾燥温度を対照サイクルの設定点よりも大幅に高く増加させることで、一次乾燥中のＴＮＦ結合ナノボディ製剤の生成物温度を大幅に増加させることができる。この凍結乾燥サイクルは、凍結乾燥中の生成物温度に対するＴＮＦ結合ナノボディ製剤の感受性の評価として役割を果たし、正式な凍結乾燥頑健性研究を実行する前の、初期の臨床ロット中の製造の逸脱の評価に使用することができる。
【０２２０】
凍結乾燥サイクルの評価
ＴＮＦ結合ナノボディ製剤に対する選択した凍結乾燥サイクルの評価は、２つの側面、すなわち、凍結乾燥後に行った試験に基づく即時比較、および加速条件下でインキュベーションした後に引き起こされる潜在的な長期的影響に分割して行った。
【０２２１】
生成物臨界温度の特定
ＴＮＦ結合ナノボディ製剤生成物は、ほぼ５０％のタンパク質を含有していた。したがって、タンパク質が凍結および凍結乾燥した状態の物理特性を支配すると予測された。凍結乾燥前に、周囲以下の変調示差走査熱量（ｍＤＳＣ）により、製剤の凍結濃縮した非晶質相のガラス転移温度を検索した。攻撃的凍結乾燥開発サイクルのデータに基づいて、−１２℃の生成物温度が、凍結乾燥中にそれ未満に保つ臨界温度として選択された。
【０２２２】
（実施例３）
ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体製剤の安定性（６カ月期間）
一部の場合では、ＴＮＦ結合ナノボディ製剤を液体様式で貯蔵することが望ましい。したがって、比較的高濃度のＴＮＦ結合ナノボディを含有する液体ＴＮＦ結合製剤の長期安定性を研究した。手短に述べると、ヒト化ＴＮＦ結合ナノボディ（約８０ｍｇ／ｍＬ）、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０を含有する製剤を、製剤を発熱物質除去したステンレス鋼製容器中で滅菌濾過することによって貯蔵用に調製した。製剤を−２０℃または４℃で約３カ月および６カ月間貯蔵した。高濃度液体の安定性は、生物活性、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージ、ＳＤＳ−ＣＥによるＡＴＮ−１０３のパーセンテージおよび生成物ではない不純物のパーセンテージ、ならびに相対的保持時間のＣＥＸ−ＨＰＬＣ評価および溶出プロファイルとＴＮＦ結合ナノボディ参照標準との比較性によって評価した。
【０２２３】
生物活性アッセイを高濃度液体ＴＮＦ結合ナノボディ製剤の安定性パラメータとして使用した。アッセイを上記実施例１中に記載のように実施した。試料を−２０℃および４℃で約３カ月および６カ月間貯蔵した。データは１ミリグラムあたりの単位として表した（図６）。試料は、貯蔵前に約６×１０６Ｕ／ｍｇであり、インキュベーション後に約４．５〜５×１０６Ｕ／ｍｇであった。これは、貯蔵中に試料の生物活性が本質的に変化しないことを反映している。値の変動はアッセイ固有の変動を反映する。試料中の生物活性の量は減少していないため、これらのデータは、ＴＮＦ−結合の貯蔵について製剤が適切であることのさらなる支持を提供する。
【０２２４】
高濃度液体ＴＮＦ結合ナノボディ製剤を用いて、さらに別の安定性パラメータ、結合活性のそれを検査した。これらの実験では、−２０°および４℃で６カ月間貯蔵した後の製剤の結合活性のパーセンテージを対照と比較した。このアッセイは、ＴＮＦとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合の結合親和性を特に監視する。製剤の初期結合活性は参照試料の約１００％であり、どの試料でも６カ月間の試験期間にわたって実質的に変化しなかった（図７）。測定された結合活性は参照の約１１０％までであり、このアッセイで一般に観察される誤差を考慮すると、これは、経時的に試料の結合活性が本質的に変化しないことを反映しており、結合の結果において温度に関連する傾向はなかった。
【０２２５】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてＨＭＷ種のパーセンテージをアッセイした。貯蔵前の高濃度液体製剤中の高分子量種のパーセンテージは製剤中の全タンパク質の０．１％〜０．１５％であり、６カ月まで貯蔵した際、−２０℃で貯蔵した試料中で約０．１％であり、４℃で貯蔵した試料中で約０．２％であった（図８）。したがって、−２０℃および４℃で少なくとも６カ月間貯蔵した試料においてＨＭＷ種レベルの実質的な増加はなかった。
【０２２６】
高濃度液体ＴＮＦ結合ナノボディ製剤中のＬＭＷ種のパーセンテージも、ＴＮＦ結合ナノボディ液体製剤中でアッセイした。製剤中のＬＭＷ種のパーセンテージは、６カ月まで、−２０℃の温度で検出限界未満（すなわち０．０％）であり、４℃で貯蔵した試料中で約０．１％であった（図９）。したがって、−２０℃および４℃で少なくとも６カ月間貯蔵した試料においてＬＭＷ種のレベルの実質的な増加はなかった。
【０２２７】
ＳＥ−ＨＰＬＣを用いてＬＭＷ種のパーセンテージをアッセイした。高濃度液体製剤中のＬＭＷ種のパーセンテージは、４℃、２５℃および４０℃の温度で６カ月まで検出限界未満（すなわち０．０％）であった。
【０２２８】
ＳＤＳ−ＣＥを用いてＴＮＦ結合ナノボディのパーセンテージをアッセイした。高濃度液体製剤中の初期ＴＮＦ結合ナノボディのパーセンテージは約１００％であり、どの試料でも６カ月間の試験期間にわたって実質的に変化しなかった（図１０）。
【０２２９】
ＳＤＳ−ＣＥを用いて生成物ではない不純物のパーセンテージをアッセイした。液体高濃度ＴＮＦ結合ナノボディ製剤では、−２０℃および４℃の温度で６カ月まで、ＳＤＳ−ＣＥによって無視できる量の生成物ではない不純物しか観察されなかった。
【０２３０】
また、高濃度液体製剤を、ＣＥＸ−ＨＰＬＣを用いて同一性についても試験した。ＣＥＸ−ＨＰＬＣは同一性の試験として用いる。高濃度液体製剤のＴＮＦ−結合の溶出プロファイルは、−２０℃および４℃の温度で６カ月まで、参照標準と比較可能であった。指定したピークの相対的保持時間は、−２０℃および４℃の温度で６カ月まで、１．００標準で変化していなかった。
【０２３１】
本明細書中に記載のデータは、分解生成物の限定的な変化を様々な温度で貯蔵時間の関数として示す。
【０２３２】
（実施例４）
液体の充填済みシリンジ中のＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体製剤の安定性（１２カ月期間）
１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、約８０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、ｐＨ６．０の製剤で充填済みシリンジ内に満たしたＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによる酸性および塩基性種のパーセンテージ、ならびに相対的保持時間の評価および溶出プロファイルとＴＮＦ結合ナノボディ参照標準との比較性によって評価した。製剤を４℃で１２カ月、２５℃で３カ月、および４０℃で２カ月間貯蔵した。
【０２３３】
開始時点では、約０．７％のＨＭＷ種が存在していた。４℃で１２カ月後には、約０．８％のＨＭＷ種までの最小限の増加が存在していた。２５℃で３カ月後には、ＨＭＷ種は約１．８％まで増加した。４０℃で２カ月後、ＨＭＷ種は経時的に約２７％まで増加していた（図１１）。
【０２３４】
開始時点では、約０．１％のＬＭＷ種が存在していた。４℃で１２カ月後には、０．２５％のＬＭＷ種までの最小限の増加が存在していた。２５℃で３カ月後には、約０．５％のＬＭＷまでのわずかな増加が存在していた。４０℃で２カ月後、分解は経時的に約１．４％のＬＭＷ種まで増加していた（図１２）。
【０２３５】
開始時点では、約６％の酸性種が存在していた。４℃で１２カ月後には、約７．５％の酸性種が存在していた。２５℃で３カ月後には、約７．３％の酸性種が存在しており、酸性種は経時的に増加していた。４０℃で２カ月後、酸性種は経時的に約８．３％まで増加していた（図１３）。
【０２３６】
開始時点では、約１．７％の塩基性種が存在していた。４℃で１２カ月後には、約２．９％の塩基性種が存在していた。２５℃で３カ月後には、約２．９％の塩基性種が存在しており、塩基性種は経時的に増加していた。４０℃で２カ月後、塩基性種は経時的に約２７％まで増加していた（図１４）。
【０２３７】
すべての試料の相対的保持時間および溶出プロファイルはＴＮＦ結合ナノボディ参照標準と比較可能であった。
【０２３８】
データは、分解生成物の限定的な変化を４℃および２５℃での貯蔵時間の関数として示し、製剤が充填済みシリンジ中の液体として適していることが示されている。分解生成物の一部の注目すべき変化が、液体のストレス条件である４０℃で観察された。
【０２３９】
（実施例５）
ＡＴＮ−１０３の高濃度液体−他の製剤の安定性（他の安定化および不安定化賦形剤の特定）
ＴＮＦ結合ナノボディ液体製剤の可能な賦形剤をスクリーニングするために、他の高濃度のＴＮＦ結合ナノボディ液体製剤の安定性を検査した。さらなる安定性を提供し、製剤を等張（ヒト対象への注射に適切）にするために、様々な賦形剤を用いた補足研究を行った。ＴＮＦ結合ナノボディの濃度は８８ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であった。
【０２４０】
検査した製剤は以下の通りである：
１．１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、１００ｍＭのアルギニン（塩基）、ｐＨ５．８
２．１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．１
３．１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、５５ｍＭのアルギニンＨＣｌ、ｐＨ６．１
４．１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ６．０
５．１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、１００ｍＭのメチオニン、ｐＨ６．０
６．１０ｍＭのヒスチジン、８％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０
対照：１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０
【０２４１】
初期溶液特性を、ｐＨ、重量モル浸透圧濃度、濃度、濁度、および粘度について分析した。すべての製剤が等張溶液をもたらし、Ａ４５５の測定によって許容される透明度および低い粘度（２．４ｃＰ〜３．１ｃＰ）が示され、充填済みシリンジおよび自己注射の実現可能性が示された。
【０２４２】
【表２】
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【０２４３】
高濃度液体の安定性は、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージによって評価した。これらの材料を、５℃、２５℃および４０℃で３カ月の間、安定にした。４０℃で２週間のデータを図１５に示す。
【０２４４】
分解生成物の一部の注目すべき変化が、液体のストレス条件である４０℃で観察された。手短な加速した安定性（４０℃で２週間）により、製剤４、５および６が、対照（１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）と比較して、比較可能または改善された安定性をもたらすことが示された。製剤１、２および３は安定性に負の影響を与えると考えられる。
【０２４５】
データは、グリシン、メチオニン、および増加したスクロースが高濃度ＴＮＦ結合ナノボディ液体製剤に対して安定化させることを示す。データは、アルギニン塩基、アルギニン塩酸塩および塩化ナトリウムが、一部の条件下で高濃度ＴＮＦ結合ナノボディ液体製剤に対して不安定化させ得ることを示す。
【０２４６】
（実施例６）
高濃度液体製剤ＴＮＦ結合ナノボディ、短期間（２週間の期間）、ヒスチジンおよびトリス緩衝液の安定性
液体としてのＴＮＦ結合ナノボディの安定性を以下の図１６〜１９に例示する。２つの製剤、すなわち、２０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、ｐＨ６．０中の１１８ｍｇ／ｍＬのＡＴＮ−１０３、および２０ｍＭのトリス、５％のスクロース、ｐＨ７．２中の１１７ｍｇ／ｍＬのＡＴＮ−１０３を検査した。製剤の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージ、ならびにＣＥＸ−ＨＰＬＣによる酸性のパーセンテージおよび塩基性種のパーセンテージによって評価した。データは、分解生成物の限定的な変化を４℃での貯蔵時間の関数として示す。分解生成物の一部の注目すべき変化が、液体のストレス条件である４０℃で観察された。データは、ヒスチジンおよびトリス緩衝液中のＴＮＦ結合ナノボディの安定性がこれらの製剤化条件下で本質的に同様であることを示し、ヒスチジンがわずかにより有利な性能を有する（わずかに少ないＬＭＷ）。後に、製剤化前の活性により上昇したｐＨ（７以上）がより高度のＬＭＷ形成をもたらすことが決定され、このことが以下で観察される利点を説明している。
【０２４７】
（実施例７）
ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体製剤の安定性：界面ストレス（凍結／解凍）の評価
図２０〜２３は、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０中の約８０ｍｇ／ｍＬの液体ＴＮＦ結合ナノボディ製剤の安定性を実証している。評価は−８０℃および３７℃の複数の凍結解凍サイクル後のサイズ排除−ＨＰＬＣ、濁度、および濃度の評価に基づく。
【０２４８】
データは、−８０℃および３７℃の複数の凍結解凍サイクルの関数としての、安定性の限定的な変化を示す。
【０２４９】
（実施例８）
ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体製剤の安定性：製造プロセスにおいて潜在的に遭遇する短期間の熱ストレスの評価
図２４は、液体ＴＮＦ結合ナノボディが原薬および薬物製品の製造プロセス中に潜在的に遭遇し得る短期間の熱ストレスに対して頑健であることを実証する。高濃度液体を、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０中、約８０ｍｇ／ｍＬおよび５０ｍｇ／ｍＬで研究した。評価は、４０℃で８時間、２５℃で７日間、および５℃で２９日間曝露させた後の、サイズ排除ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージに基づく。データは、凝集体の限定的な変化を５℃および２５℃での貯蔵時間の関数として示す。凝集体の一部の変化が、液体のストレス条件である４０℃で観察された。
【０２５０】
ＴＮＦ結合ナノボディの高濃度液体の、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＬＭＷ種のパーセンテージは、示した温度および期間で検出限界未満（すなわち０．０％）であった。
【０２５１】
（実施例９）
ＡＴＮ−１０３の低濃度液体製剤の安定性：最適ｐＨおよび製剤化の評価
図２５〜２８は、ｐＨ５．５、６．０、６．５、および７．０で緩衝した、低濃度（約１ｍｇ／ｍＬ）の液体ＴＮＦ結合ナノボディ製剤の安定性を実証する。低濃度液体ＴＮＦ結合ナノボディの安定性を、４０℃の温度への曝露などのストレス（図２５および２６）、振盪（図２８）、ならびに凍結／解凍に応答した、製剤化およびｐＨの関数として検査した。３つの以下の製剤、すなわち、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌ、および１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、７５ｍＭの塩化ナトリウムのそれぞれについて、４つのｐＨを評価した。このデータ組では、Ｔｗｅｅｎ−８０をポリソルベート８０の別名として使用している。研究試料はＳＥ−ＨＰＬＣおよびＵＶを用いて評価した（濃度および濁度−Ａ４５５によって測定）。
【０２５２】
図の符号：
ＨＳＴ：１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０
ＨＳＴＡ：１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭのアルギニンＨＣｌ
ＨＳＴＳ：１０ｍＭのヒスチジン、５％のスクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０、７５ｍＭの塩化ナトリウム
【０２５３】
結果により、５．５〜７．０のｐＨ範囲が製剤に適切であることが示される。データは、一部の条件下では、ｐＨ７．０がある程度の有害な効果（増加した低分子量種）を示し得ることを示す。データは、アルギニンＨＣｌまたは塩化ナトリウムを原薬製剤に加えることで顕著な利益は存在せず、一部の場合では不安定化が存在し得ることを示す。
【０２５４】
図２７は、４℃で貯蔵した後のＴＮＦ結合ナノボディのＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷ種のパーセンテージを示し、４週間後に本質的な変化がないことが観察された。低濃度のＴＮＦ結合ナノボディの、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＬＭＷ種のパーセンテージは、４℃で試験したすべての溶液条件において検出限界未満（すなわち０．０％）であった。複数の凍結解凍サイクルの結果として、ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷもしくはＬＭＷ種、またはＵＶ  Ａ２８０もしくはＡ４５５では顕著な変化は観察されなかった。
【０２５５】
（実施例１０）
低濃度ＴＮＦ結合ナノボディ液体：ｐＨおよび製剤化の関数としての振盪の効果の評価
また、ＴＮＦ結合ナノボディがこのｐＨ範囲にわたって３００ｒｐｍで４時間（１５℃）の振盪に感受性があることを示すデータも提示する（図２８）。塩化ナトリウムおよびアルギニンを含有する製剤が振盪に対して特に感受性がある。ヒスチジン、スクロース、ｔｗｅｅｎ−８０の製剤が、それぞれのｐＨ群内で最も少ない高分子量分解を示した。ｐＨ６．０および７．０のヒスチジン、スクロース、ｔｗｅｅｎ−８０の製剤が最も少ないＨＭＷ分解を示した。
【０２５６】
振盪後の低濃度ＴＮＦ結合ナノボディのＵＶ吸光度を、２８０ｎｍ（濃度を監視するため）および４５５ｎｍ（濁度を監視するため）で監視した。振盪の結果として顕著な変化は観察されなかった。
【０２５７】
ＳＥ−ＨＰＬＣならびに２８０ｎｍ（濃度を監視するため）および４５５ｎｍ（濁度を監視するため）でのＵＶ分析によって、低濃度ＴＮＦ結合ナノボディ溶液を複数の凍結解凍サイクル後に検査した。複数の凍結解凍サイクルの結果としてＳＥ−ＨＰＬＣまたはＵＶ  Ａ２８０もしくはＡ４５５の顕著な変化は観察されなかった。
【０２５８】
（実施例１１）
高濃度液体製剤のＴＮＦ結合ナノボディの安定性、短期間（２週間の期間）、等張性調整剤の検査
液体としてのＴＮＦ結合ナノボディの安定性を以下に例示する。
【０２５９】
５個の製剤を図３１および３２に示すように検査し、本明細書中でＨＳＴ、ＨＳＧＴ、ＨＳＧＭＴ、ＨＳｏｒｂおよび対照と称する。検査した製剤のそれぞれを以下に記載する。
【０２６０】
【表３】
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【０２６１】
製剤は、液体として４℃および４０℃（ストレス条件）で２週間、ゴム製プランジャーを備えたポリプロピレン製チューブおよび環状オレフィンコポリマー製充填済みシリンジ中で貯蔵した。
【０２６２】
製剤の安定性は、図３１および３２に示すようにＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷのパーセンテージおよびＬＭＷのパーセンテージによって評価した。データは、分解生成物の限定的な変化を４℃での貯蔵時間の関数として示す。図３２に示す試料では、開始時点または４℃で２週間後では、ＬＭＷは検出されなかった。ＬＭＷは４０℃（ストレス）試料でのみ検出された。データは、５個すべての製剤が、分解生成物の比較可能な変化をストレス条件４０℃での貯蔵時間の関数として示していること示す。したがって、データは、すべての製剤が液体剤形に適切であることを示す。
【０２６３】
（実施例１２）
低濃度および高濃度の液体製剤でのＴＮＦ結合ナノボディの安定性、標的製剤の確認、ならびに一次包装容器の検査
液体としてのＴＮＦ結合ナノボディの安定性を以下に例示する。
【０２６４】
３個の製剤を検査した：
（ａ）１０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、
（ｂ）５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、
（ｃ）１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ結合ナノボディ、２０ｍＭのヒスチジン、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０。
【０２６５】
製剤は以下の一次包装容器中で調製した：
（ａ）１つの販売業者からの事前充填可能なＩ型医薬グレードのガラス製シリンジおよびＷｅｓｔ  ４４３２のシリコン処理した灰色のゴム製プランジャー
（ｂ）第２の販売業者からの事前充填可能なガラス製のＩ型医薬グレードのシリンジおよびＷｅｓｔ  ４４３２のシリコン処理した灰色のゴム製プランジャー
（ｃ）事前充填可能な環状オレフィンコポリマーおよびＷｅｓｔ  ４４３２のシリコン処理した灰色のゴム製プランジャー。
【０２６６】
製剤をｔ＝０で分析し、満足できるものであることが判明した。製剤は４℃、２５℃および４０℃で３カ月貯蔵したものであった。
【０２６７】
均等物
本明細書中で言及したすべての参考文献は、それぞれの個々の出版物または特許もしくは特許出願が、その全体がすべての目的ために参照により組み込まれていると明確にかつ個別に示されている場合と同じ程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
【０２６８】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書中に記載のものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明および添付の図から当業者に明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図する。
【図１】
2015091844.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015091844.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月25日(2014.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つまたは複数の単一ドメイン分子を含み、少なくとも１つの単一ドメイン分子がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬの濃度の単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子、
（ｂ）凍結乾燥保護剤、及び
（ｃ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液
を含む製剤。
【請求項２】
ヒスチジン緩衝液が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、または約３０ｍＭの濃度である、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
製剤のｐＨが、５、５．５、５．８−６．１、６．０、６．１、６．５、７、７．２及び７．５からなる群より選択される、請求項１または２記載の製剤。
【請求項４】
前記凍結乾燥保護剤が、糖、アミノ酸、ベタインなどのメチルアミン、硫酸マグネシウムなどのリオトロピック塩、ポリオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、プルロニックス及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項５】
前記糖が、スクロース、ソルビトール、及びトレハロースからなる群より選択される、請求項４記載の製剤。
【請求項６】
前記アミノ酸が、グルタミン酸一ナトリウム及びヒスチジンからなる群より選択される、請求項４記載の製剤。
【請求項７】
前記ポリオールが、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール及びマンニトールなどの三価以上の糖アルコールからなる群より選択される、請求項４記載の製剤。
【請求項８】
前記スクロース、ソルビトールまたはトレハロースが、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１０％、約５％〜約８％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、または約９％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項５記載の製剤。
【請求項９】
ＳＤＡＢ分子が、単鎖ポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１０】
ＳＤＡＢ分子が、一価、または二価、三価、四価などの多価である、請求項１〜９のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１１】
ＳＤＡＢ分子が、単一特異性、または二重特異性、三重特異性若しくは四重特異性などの多特異性である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１２】
１つまたは複数の単一ドメイン分子が、ＣＤＲ移植した、ヒト化した、ラクダ化した、脱免疫化した、またはファージディスプレイによって選択されたものである、請求項１〜１１のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１３】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、ＳＦＧＭＳ（配列番号５）（ＣＤＲ１）、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６）（ＣＤＲ２）及びＧＧＳＬＳＲ（配列番号７）（ＣＤＲ３）のアミノ配列を有する３つのＣＤＲ、または前記ＣＤＲのうちの１つと、３、２若しくは１個未満のアミノ酸置換（例えば保存的（同類）置換）によって異なるＣＤＲ（例えば、前記ＣＤＲのうちの１つから１つの同類アミノ酸置換によって異なるＣＤＲ）を有する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１４】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、図３０（配列番号１）のアミノ酸１２５〜２３９のアミノ酸配列、またはそれに実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、図３０に示すアミノ酸配列（配列番号１）と比較して少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である、または２０、１５、１０、５、４、３、２、１個までのアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入もしくは置換（例えば保存的（同類）置換）を有するアミノ酸配列）を有する可変領域を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１５】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、国際公開公報２００６／１２２７８６号に記載のＡＬＢ１、またはそのヒト化形態（例えばＡＬＢ６、ＡＬＢ７、ＡＬＢ８、ＡＬＢ９、ＡＬＢ１０）である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の製剤。
【請求項１６】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、図３０（配列番号１）に示すＨＳＡ結合単一ドメイン分子の１つまたは複数の生物活性を有する、請求項１記載の製剤。
【請求項１７】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、図３０（配列番号１）に示すＨＳＡ結合単一ドメイン分子によって認識されるエピトープと同じまたは類似のエピトープと結合する、請求項１６記載の製剤。
【請求項１８】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、国際公開公報２００６／１２２７８６号に開示されているＨＳＡ結合単一ドメイン分子のうちの任意のものに類似の活性（例えば、結合親和性、解離定数、結合特異性）を有する、請求項１６記載の製剤。
【請求項１９】
ＨＳＡに結合する単一ドメイン分子の少なくとも１つが、一価、二価、三価のＨＳＡ結合ナノボディ分子などの、国際公開公報２００６／１２２７８６号に開示されているナノボディのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２０】
ＳＤＡＢ分子が、少なくとも１つの、好ましくは２つの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合する単一ドメイン分子を含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２１】
ＳＤＡＢ分子が、自己免疫障害、例えば、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ループス関連関節炎、または強直性脊椎炎が含まれる）、強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、血管炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎が含まれる）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、真性糖尿病（Ｉ型）、例えば皮膚の炎症状態（例えば乾癬）、急性炎症状態（例えば、内毒血症、敗血症、菌血症を伴う敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、毒素ショック症候群および感染症）、移植片拒絶ならびにアレルギーの処置において有用である、１つまたは複数の単一ドメイン分子を含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の製剤。
【請求項２２】
ＳＤＡＢ分子を細胞培養中で発現させることと、
ＳＤＡＢ分子を、クロマトグラフィー精製ステップ、または限外濾過／ダイアフィルトレーションステップのうちの少なくとも１つに通すことによって、ＳＤＡＢ分子を精製することと、
約５％〜約１０％の濃度のスクロース、及び、製剤のｐＨが約５〜７．５となるような、約５〜約５０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液を含有する製剤中で、ＳＤＡＢ分子の濃度を約０．１〜約３５０ｍｇ／ｍＬに調整することと
を含む、ＳＤＡＢ分子の製剤を調製する方法またはプロセス。
【請求項２３】
ＳＤＡＢ分子と凍結乾燥保護剤、及び緩衝液との混合物を凍結乾燥することによって、凍結乾燥した混合物を形成することと、
凍結乾燥した混合物を希釈剤中で再構成することによって、（ａ）約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＤＡＢ分子、（ｂ）約５％〜約１０％の濃度の、スクロースまたはトレハロースからなる群から選択される凍結乾燥保護剤、および（ｃ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５となるような、約５〜約５０ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液を含む、再構成した製剤を調製することと
を含む、ＳＤＡＢ分子を含有する再構成した製剤を調製する方法。
【請求項２４】
請求項１から２１のいずれかに記載の製剤と使用説明書とを含有する容器を含む、キットまたは製品。
【請求項２５】
製剤がバイアルまたは注射用シリンジ中に存在する、請求項２４に記載のキットまたは製品。
【請求項２６】
製剤が充填済み注射用シリンジ中に存在する、請求項２４に記載のキットまたは製品。
【請求項２７】
シリンジまたはバイアルが、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーから選択されるポリマー材料でできている、請求項２５に記載のキットまたは製品。
【請求項２８】
対象に、請求項２０または２１の製剤を含む医薬組成物を投与することによって、ＴＮＦ関連障害に関連する１つまたは複数の症状を低下させることを含む、ＴＮＦ関連障害を治療または予防する方法。
【請求項２９】
ＴＮＦ関連障害が炎症性または自己免疫性障害である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＴＮＦ関連障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、関節炎状態（例えば、乾癬性関節炎、多関節若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、または多発性硬化症から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から２１のいずれかに記載の製剤の試料を提供することと、
色、透明度、粘度、または１つもしくは複数のＨＭＷ、ＬＭＷ、酸性もしくは塩基性種の量から選択される製剤のパラメータを評価することと、
パラメータが事前に選択された基準を満たすかどうかを判定することによって、プロセスを分析することと
を含む、製造プロセスを分析する方法。
【請求項３２】
バッチ間の変動を監視もしくは制御する方法または試料を参照標準と比較する方法において２つ以上の試料製剤を比較することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記比較に基づいて、製剤を分類、選択、受入もしくは廃棄、出荷もしくは保留、薬物製品へと加工、輸送、異なる場所に移動、製剤化、ラベル貼付、包装することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
製剤の評価したパラメータに関するデータが含まれ、製剤のバッチの識別情報が任意選択により含まれる記録を提供することと、前記記録を決定者に提出することと、任意選択で、前記決定者から通信を受信することと、任意選択で、決定者からの通信に基づいて製剤のバッチを出荷または市場取引するかどうかを判定することとをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【外国語明細書】
2015091844000001.pdf