(57)【要約】【課題】  ヒトＦｃγＲＩＩＩａを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用してヒトＦｃγＲＩＩＩａを効率的に製造する方法を提供すること。【解決手段】  ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、少なくとも細胞外領域の一部を含むタンパク質を、大腸菌型コドンを用いて変換したポリヌクレオチドを利用することで、大腸菌でヒトＦｃγＲＩＩＩａを効率的に製造することができる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換した、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換した、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収する、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＦｃレセプターをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃレセプターの製造方法に係る。特に本発明は、ヒトＦｃレセプターの一つであるヒトＦｃγＲＩＩＩａを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０７Ｍ−１以下であることが報告されている（非特許文献２）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。
【０００４】
遺伝子工学的手法を用いたＦｃγＲＩＩＩａの発現は、大腸菌または動物細胞を宿主とした例が報告されている（非特許文献３および４）。しかしながら、大腸菌を宿主とした発現系では、ＦｃγＲＩＩＩａの発現量が極めて低く、工業的生産が困難であった。また動物細胞を宿主とした発現系では、培養にかかる時間が長く、生産性が必ずしも高くないため、培養コストが高い問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献２】Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７
【非特許文献３】Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ．Ｔ．等，Ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌｓ，１１，１０７１−１０８０，２０１１
【非特許文献４】Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ．Ｐ．等，Ｎａｔｕｒｅ，４０６，２６７−２７３，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用してヒトＦｃγＲＩＩＩａを効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、少なくとも細胞外領域の一部を含む領域のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際に、大腸菌型のコドンを用いることで、大腸菌を宿主としたヒトＦｃγＲＩＩＩａの効率的製造を実現し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換した、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチド。
【００１０】
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換した、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
（Ｃ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、（Ａ）に記載のポリヌクレオチド。
【００１２】
（Ｄ）（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００１３】
（Ｅ）（Ｄ）に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【００１４】
（Ｆ）（Ｅ）に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液からヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収する、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、細胞外領域（図１のＥＣ）の一部である、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質をポリヌクレオチドに変換する際、大腸菌型コドンを用いて変換することを特徴としている。前記タンパク質は、細胞外領域（図１のＥＣ）のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含んでいればよく、細胞外領域（図１のＥＣ）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞外領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。さらにタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質であっても、本発明に含まれる。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、細胞外領域の一部である、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基（または、さらに前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したもの）を少なくとも含むタンパク質から、コードするアミノ酸は変えずに、大腸菌の翻訳機構において利用頻度が低いコドン（レアコドン）から利用頻度が高いコドンに変換することにより得られる。具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれレアコドンであるため、それらのコドンを避けるように変換すればよい。なお宿主におけるコドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することで可能である。本発明のポリヌクレオチドの一例として、配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドの作製方法としては、
（Ｉ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドに対して、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法を用いて、大腸菌型コドンとなるよう変異を導入し、作製する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列を大腸菌型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換したものを設計し、当該設計した配列からなるポリヌクレオチドを人工的に合成する方法、
が例示できる。なお前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を例示することができる。前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した（本発明のポリヌクレオチドを含む）ベクター（本発明のベクター）で宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターで宿主を形質転換して得られる本発明の形質転換体から、本発明のベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
【００２１】
本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収することで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２２】
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物からヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収するには、本発明の形質転換体におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａの発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製してヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒトＦｃγＲＩＩＩａを精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕してヒトＦｃγＲＩＩＩａを抽出した後、精製すればよい。ヒトＦｃγＲＩＩＩａを精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを高純度に調製することができる。
【００２３】
得られたヒトＦｃγＲＩＩＩａのＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、配列番号１に記載のヒトＦｃγＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、細胞外領域の一部である１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基（または、さらに前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したもの）を少なくとも含むタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換して得られるポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換することで、大腸菌でヒトＦｃγＲＩＩＩａを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図２】実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃγＲＩＩＩａの抗体結合活性を示した図である。図中のエラーバーは誤差の最大、最小を示している。
【図３】実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃγＲＩＩＩａのヒトＩｇＧサブクラスへの特異性を示した図である。図中の白棒はヒトＦｃγＲＩＩＩａ（市販品）の結果であり、黒棒は実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃγＲＩＩＩａの結果である。
【図４】ヒトＦｃγＲＩＩＩａをヒト型コドン（ｈｕｍａｎ  ｃｏｄｏｎ、上段）および大腸菌型コドン（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏｄｏｎ、下段）を用いてポリヌクレオチドに変換したときの、ヌクレオチド配列を比較した図である。
【図５】大腸菌を形質転換する発現ベクターとして、ｐＥＴ−ｈＦｃＲ３（比較例１、白棒）およびｐＥＴ−ｅＦｃＲ３（実施例１、黒棒）を用いたときの、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ生産性を比較した図である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  ヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ベクターの作製（大腸菌型コドン）
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００２８】
【表１】
2015035958.tif 000003
（２−２）二段階目のＰＣＲは、（２−１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００２９】
【表２】
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（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３を抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３のうち、ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号２４（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００３０】
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３で発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００３１】
実施例２  ヒトＦｃγＲＩＩＩａの抗体結合確認
（１）実施例１で得られた、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種後、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始９０分後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトＦｃγＲＩＩＩａの抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌから希釈系列を作製し固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）を含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、（４）で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】
さまざまな量のガンマグロブリン（抗体）を固定化したプレートに対し、（４）で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液を一定量添加したときの、プレートへのガンマグロブリン（抗体）固定化量と抗体結合活性に相当する吸光度（４５０ｎｍ）との関係をまとめた図を図２に示す。なお図２において（−）は、ガンマグロブリン（抗体）の固定化を行なわなかったプレート（ネガティブコントロール）である。プレートへの抗体固定化量が減少するほど吸光度も減少していることから、ヒトＦｃγＲＩＩＩａがヒト抗体と結合していることが確認できる。
【００３３】
実施例３  ヒトＦｃγＲＩＩＩａの特異性確認
実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃγＲＩＩＩａ、および市販のヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）のヒトＩｇＧサブクラスへの特異性を評価した。固定化抗体をガンマグロブリン製剤からヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４（シグマアルドリッチ社製）に変更し、プレートへの固定化量を１μｇ／ｗｅｌｌとした他は、実施例２（５）と同様の方法で評価した。
【００３４】
評価結果を図３に示す。実施例２で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａのＩｇＧサブクラスへの特異性は、市販のヒトＦｃγＲＩＩＩａと同様であった。したがって、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際に大腸菌型のコドンを用いても、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａの抗体への特異性に問題がないことが確認された。
【００３５】
比較例１  ＦｃγＲＩＩＩａの発現ベクターの作製（ヒト型コドン）
（１）Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１２４０６１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）を鋳型とし、配列番号２７（５’−ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ−３’）および配列番号２８（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なうことで、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを調製した（コドンはヒト型コドン）。ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。その後、得られたＰＣＲ産物を鋳型として再度同条件のＰＣＲを行なうことで前記ポリヌクレオチドを増幅した。
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（３）（２）で得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ３を抽出した。
（４）作製した発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ３のうち、ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例１（５）と同様の方法で配列解析を行なった。
【００３６】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ３で発現されるポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２５と同じであった。また当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２９に示し、大腸菌型コドンを用いて変換したポリヌクレオチドの配列（実施例１、配列番号２６）と配列を比較した結果を図４に示す。ヒト型コドンを用いた場合（ｈｕｍａｎ  ｃｏｄｏｎ、配列番号２９）と大腸菌型コドンを用いた場合（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏｄｏｎ、配列番号２６）とのヌクレオチド配列の相同性は約７６％であった。
【００３７】
実施例４  ＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の発現量比較
（１）実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３、または比較例１で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ３で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始９０分後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で好気的に振とう培養した。
（４）（２）の培養開始から１０時間後、２４時間後、３２時間後に培養液２ｍＬを採取した。採取した培養液は遠心分離により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトＦｃγＲＩＩＩａ濃度を、実施例２（５）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。なおヒトＦｃγＲＩＩＩａ濃度は、濃度既知のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて検量線を作成して算出した。
【００３８】
結果を図５に示す。培養液あたりのヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現量で比較したところ、発現ベクターとして、大腸菌型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換し作成した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３（実施例１）のほうが、ヒト型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換し作成した発現ベクターｐＥＴ−ｈＦｃＲ３（比較例１）よりも、特に培養初期段階（培養開始１０時間後および２４時間後）で発現量が増大していた。すなわちヒトＦｃγＲＩＩＩａをポリヌクレオチドに変換する際、大腸菌型コドンを用いて変換し、当該変換したポリヌクレオチドを含むベクターで大腸菌を形質転換して得られた形質転換体を培養することで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを高効率に製造できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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