(57)【要約】      （修正有）【課題】神経ＮＦ１癌抑制遺伝子における生殖系の変異は、叢状神経線維腫の発生を特徴とする神経系の一般的な遺伝疾患である、フォンレックリングハウゼンの神経線維腫症１型（ＮＦ１）を引き起こすので、該叢状神経線維腫を治療するための医薬の提供。【解決手段】式（１）で表される化合物又は該化合物の塩。前記化合物の治療有効量が２００ｍｇ〜５００ｍｇであり、前記化合物を患者に少なくとも１日１回投与する方法。2015187104.tif 000010【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
叢状神経線維腫を治療する方法であって、式１による化合物：
【化６】
2015187104.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、４−ピラジニル、１−メチル−１Ｈ−ピロリル、アミノ置換フェニルもしくは
アミノ−低級アルキル置換フェニル（前記アミノ基はそれぞれの場合において、遊離して
いるか、またはアルキル化もしくはアシル化されている）、五員環炭素原子で結合してい
る１Ｈ−インドリルもしくは１Ｈ−イミダゾリル、または環炭素原子において結合してお
り、窒素原子において非置換もしくは酸素で置換されている非置換ピリジルもしくは低級
アルキル置換ピリジルであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ他とは独立に、水素または低級アルキルであり、
基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１個または２個は、それぞれ、ニトロ、
フルオロ置換低級アルコキシまたは式ＩＩの基
−Ｎ（Ｒ９）−Ｃ（＝Ｘ）−（Ｙ）ｎ−Ｒ１０  （ＩＩ）
［式中、
Ｒ９は、水素または低級アルキルであり、
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノまたはＯ
−低級アルキル−ヒドロキシミノであり、
Ｙは、酸素または基ＮＨであり、
ｎは、０または１であり、
Ｒ１０は、少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族基、または芳香族、芳香族−脂
肪族、脂環式、脂環式−脂肪族、複素環もしくは複素環−脂肪族の基である］であり、
残りの基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他とは独立に、水素、非置換
低級アルキルまたは遊離もしくはアルキル化アミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロ
リジニルもしくはモルホリニルによって置換されている低級アルキル、または低級アルカ
ノイル、トリフルオロメチル、遊離もしくはエーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、
遊離もしくはアルキル化もしくはアシル化アミノ、または遊離もしくはエステル化カルボ
キシである］
または少なくとも１個の塩形成基を有するこうした化合物の塩の治療上有効な少なくとも
１用量を提供するステップを含む方法。
【請求項２】
前記化合物が式１の薬学的に許容できる塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式１の薬学的に許容できる塩がメシル酸塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
叢状神経線維腫または同様の状態を有する患者を診断するステップをさらに含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項５】
叢状神経線維腫または同様の状態を生じるリスクにある患者を同定するステップをさら
に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
式１による前記化合物の前記治療上有効な用量が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇであり、
前記化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
式１による前記化合物の前記治療上有効な用量が約３５０ｍｇ〜約４５０ｍｇであり、
前記化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
式１による前記化合物の前記治療上有効な用量が約４００ｍｇであり、前記化合物の前
記用量が患者に１日２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
叢状神経線維腫を治療する方法であって、式２による化合物
【化７】
2015187104.tif 000008
の治療上有効な少なくとも１用量を提供するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記化合物が式２の薬学的に許容できる塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
叢状神経線維腫または同様の状態を有する患者を診断するステップをさらに含む、請求
項９に記載の方法。
【請求項１２】
叢状神経線維腫または同様の状態を生じるリスクにある患者を同定するステップをさら
に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
式２による前記化合物の前記治療上有効な用量が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇであり、
前記化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
式２による前記化合物の前記治療上有効な用量が約３５０ｍｇ〜約４５０ｍｇであり、
前記化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
式２による前記化合物の前記治療上有効な用量が約４００ｍｇであり、前記化合物の前
記用量が患者に１日２回投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
叢状神経線維腫を治療する方法であって、式３による化合物
【化８】
2015187104.tif 000009
の治療上有効な少なくとも１用量を提供するステップを含む方法。
【請求項１７】
叢状神経線維腫または同様の状態を有する患者を診断するステップをさらに含む、請求
項１６に記載の方法。
【請求項１８】
叢状神経線維腫または同様の状態を生じるリスクにある患者を同定するステップをさら
に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
式３による前記化合物の前記治療上有効な用量が約２００ｍｇ〜約５００ｍｇであり、
前記化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項１６に記載の方法
。
【請求項２０】
式３による前記化合物の前記治療上有効な用量が約３５０ｍｇ〜約４５０ｍｇであり、
前記化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項１６に記載の方法
。
【請求項２１】
式３による前記化合物の前記治療上有効な用量が約４００ｍｇであり、前記化合物の前
記用量が患者に１日２回投与される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記述
本発明の開発の一部は、助成金番号ＮＳ０５２６０６のもとでＮＩＨから、助成金番号
Ｗ８１ＸＷＨ−０５−１−０１８５のもとで国防総省から、政府の支持を受けて行われた
。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
優先権主張
本出願は、２００８年６月２７日出願の米国仮特許出願第６１／０７６，１８５号およ
び２００８年１０月８日出願の米国仮特許出願第６１／１０３，６５０号についての利益
を主張し、これらの仮特許出願はいずれも、それぞれ個別にその全体が参照により本明細
書に組み込まれているかのごとく、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
本明細書に開示の多様な態様および実施形態は、一般には、例えば神経線維腫のような
、腫瘍の形成を特徴とする疾患のモデル化、治療、予防および診断に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＮＦ１癌抑制遺伝子の変異は、米国、ヨーロッパ、日本のみで約２５０，０００名の患
者に影響を及ぼしている、一般的で広範に広まったヒトの遺伝疾患である神経線維腫症１
型（ＮＦ１）を引き起こす。ＮＦ１遺伝子は、少なくとも部分的にｐ２１ｒａｓのＧＴＰ
アーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）として機能する３２０キロダルトンのタンパク質であ
るニューロフィブロミンをコードしている。ニューロフィブロミンは、脊椎動物種間で高
度に保存されており、酵母およびショウジョウバエのそれに相当するものと高い相同性を
有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＮＦ１個体は、ＮＦ１患者のうちのあわせて２５〜４０％に影響を及ぼしている叢状神
経線維腫を含む、広範囲にわたる悪性および非悪性の症状発現を示し、これらの神経線維
腫は、生涯罹患率および死亡率の主要な原因である。この状態がこの変異を有する人に負
の影響を与えること、ならびにこの状態および関連状態に対する有効な治療法がないこと
から、この状態に対するさらなる治療法の必要性が差し迫っている。本明細書に開示の多
様な態様および実施形態は、この必要性に対処している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態は、式１による化合物：
【化１】
2015187104.tif 000002
［式中、Ｒ１は、４−ピラジニル、１−メチル−１Ｈ−ピロリル、アミノ置換フェニル
もしくはアミノ−低級アルキル置換フェニル（前記アミノ基はそれぞれの場合において、
遊離しているか、またはアルキル化もしくはアシル化されている）、５員環炭素原子で結
合している１Ｈ−インドリルもしくは１Ｈ−イミダゾリル、または環炭素原子で結合して
おり、窒素原子において非置換もしくは酸素で置換されている非置換ピリジルもしくは低
級アルキル置換ピリジルであり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ他とは独立して水素または
低級アルキルであり、
基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１個または２個は、それぞれ、ニトロ、
フルオロ置換低級アルコキシまたは式ＩＩの基−Ｎ（Ｒ９）−Ｃ（＝Ｘ）−（Ｙ）ｎ−Ｒ
１０  （ＩＩ）
［式中、Ｒ９は、水素または低級アルキルであり、Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ
−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノ（hydroximino）またはＯ−低級アルキル−ヒ
ドロキシミノであり、Ｙは、酸素または基ＮＨであり、ｎは、０または１であり、Ｒ１０
は、少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族基、または芳香族、芳香族−脂肪族、脂環
式、脂環式−脂肪族、複素環もしくは複素環−脂肪族の基である］であり、残りの基Ｒ４
、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他とは独立に、水素、非置換低級アルキルま
たは遊離しているかもしくはアルキル化されたアミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピ
ロリジニルまたはモルホリニルによって置換されている低級アルキル、または低級アルカ
ノイル、トリフルオロメチル、遊離もしくはエーテル化もしくはエステル化（esterifed
）ヒドロキシ、遊離もしくはアルキル化もしくはアシル化アミノ、または遊離もしくはエ
ステル化カルボキシである］、または少なくとも１個の塩形成基を有するこうした化合物
の塩の治療上有効な少なくとも１用量を提供するステップを含む、ある種の神経線維腫症
、例えば叢状神経線維腫を有する患者を治療する方法を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、この化合物は式１の薬学的に許容できる塩であり、いく
つかの実施形態において、この式１の薬学的に許容できる塩はメシル酸塩である。
【０００８】
他のいくつかの実施形態は、叢状神経線維腫または同様の状態を有する患者を診断する
ステップをさらに含む。さらに他の実施形態は、叢状神経線維腫または同様の状態を生じ
るリスクにある患者を同定するステップを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、式１による化合物の治療上有効な用量は、約２００ｍｇ
〜約５００ｍｇであり、該化合物のこの用量は患者に少なくとも１日１回投与される。さ
らに他の実施形態では、式１による化合物の治療上有効な用量は、約３５０ｍｇ〜約４５
０ｍｇであり、該化合物のこの用量は患者に少なくとも１日１回投与される。いくつかの
実施形態では、約４００ｍｇの式１による化合物の治療上有効な用量を患者に１日当たり
２回治療する。
【００１０】
いくつかの実施形態は、式２による化合物：
【化２】
2015187104.tif 000003
の治療上有効な少なくとも１用量を提供するステップを含む、ある種の神経線維腫症、例
えば叢状神経線維腫を有する患者を治療することを含む。
【００１１】
さらに他の実施形態は、式３による化合物：
【化３】
2015187104.tif 000004
の治療上有効な少なくとも１用量を提供するステップを含む、ある種の神経線維腫症、例
えば叢状神経線維腫を有する患者を治療する方法を含む。
【００１２】
さらに他の実施形態は、ある種の神経線維腫症、例えば叢状神経線維腫を有する患者を
治療する医薬品の調製のための、式（１）、（２）または（３）による少なくとも１種の
化合物または薬学的に許容できるその塩の使用を含む。
【００１３】
本開示の実施形態についての以下の説明を、添付の図面、図、模式図、および式などと
あわせて参照することにより、本開示の上記の態様およびこれらを達成する方法はより明
らかになり、その態様がよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
対応する参照符号は、いくつかの図にわたって対応する部分を示すために使用している
。
【００１５】
【図１Ａ】造血微小環境の役割を調査するための戦略の模式図である。
【図１Ｂ】蛍光サイトメトリーを用いて作製した追跡図である。Ｎｆ１＋／−骨髄は、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスにおける叢状神経線維腫形成に必要である。
【図２Ａ】時間（ｘ軸）の関数としてのパーセント生存率（ｙ軸）のカプランマイヤープロットを示す図である。Ｎｆ１＋／−またはＷＴの骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスを１年齢まで追跡した。
【図２Ｂ】ＷＴのＢＭ（１）またはＮｆ１＋／−のＢＭ（２〜３）を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの写真である。
【図２Ｃ】ＷＴまたはＮｆ１＋／−の骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの脊髄後根神経節および末梢神経の解剖の写真である。矢印は、脊髄後根神経節における腫瘍および末梢神経における腫瘍を指している。
【図３Ａ】脊髄後根神経節および近位末梢神経のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）切片の図である。
【図３Ｂ】マッソンのトリクロームで染色した切片の倍率２００×の写真である。ドナー骨髄およびレシピエントマウスの遺伝子型を示している。
【図３Ｃ】アルシアンブルーで染色した切片の倍率２００×の図である。パネル２および３における小さな矢印は、肥満細胞を指している。パネル３における大きな矢印は、血管を指している。
【図３Ｄ】異なる遺伝子型間の肥満細胞の数における差異を示している棒グラフである。Ｎｆ１＋／−ＢＭを移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの腫瘍由来の系列を、ＦＡＣＳによって単離する。
【図３Ｅ】種々の骨髄由来系列の蛍光サイトメトリーを用いた表現型評価データを示した図である。骨髄（パネル１）および腫瘍細胞（パネル２）は、ＥＧＦＰ＋ＣＤ４５．２陽性集団について単離および選別した。肥満細胞（パネル３）、マクロファージ（パネル４）、Ｂリンパ球（パネル４）およびＴリンパ球の集団を同定するために、腫瘍関連ＣＤ４５．２細胞をさらに分離した。腫瘍中の各造血細胞集団の比率を示している。
【図３Ｆ】Ｎｆ１＋／−ＢＭを移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの腫瘍からＦＡＣＳによって単離した系列の遺伝子型同定を示しているゲルの図である。矢印は、それぞれの表現型系に由来して表示する対立遺伝子の増幅ＤＮＡ産物を指している。
【図４Ａ】時間（ｘ軸）の関数としてのパーセント生存率（ｙ軸）のカプランマイヤープロットを示す図である。
【図４Ｂ】ＷＴのＢＭ（パネル１）またはＮｆ１＋／−のＢＭ（パネル２）を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの脊髄および後根の写真である。矢印は、近位神経における腫瘍を指している。
【図４Ｃ】異なる遺伝子型のドナー細胞を用いて測定した脊髄後根神経節（ＤＲＧ）の大きさを例示しているグラフである。
【図４Ｄ】Ｎｆ１＋／−またはＮｆ１＋／−；Ｗ／Ｗの変異体の骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの脊髄後根神経節および近位脊髄神経の代表的な組織学的切片の写真である。
【図５Ａ】Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスをメシル酸イマチニブで処置する効果を例示しているＰＥＴ画像である。
【図５Ｂ】メシル酸イマチニブまたはＰＢＳを用いた１２週間の処置後の平均ＦＤＧ−ＰＥＴ強度の変化をまとめた図である。
【図５Ｃ】特定の末梢神経を解剖することによって採取したデータを示した図である。
【図５Ｄ】メシル酸イマチニブまたはプラセボで処置したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスの組織学的解析を示している写真である。
【図５Ｅ】メシル酸イマチニブの処置の有無について関数としてプロットした肥満細胞数／ＨＰＦを示している棒グラフである。
【図５Ｆ】メシル酸イマチニブの処置の有無について関数としてプロットしたTunnel陽性細胞数／ＨＰＦを示している棒グラフである。
【図６】叢状神経線維腫を有する患者のメシル酸イマチニブでの治療前および治療後のＭＲＩスキャンの図である。
【図７】透過型電子顕微鏡検査による脊髄後根神経節の超微細構造解析の図である。パネル１〜４、７５０×、パネル５〜８、１５００×。パネル１〜２  ＷＴのＢＭを移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の近位脊髄神経、パネル３〜８  Ｎｆ１＋／−のＢＭを移植したレシピエント由来の近位神経。（Ｕ）無髄軸索、（Ｓ）は神経内膜空間の拡大を示している。矢印はコラーゲン束を指し、（Ｍ）は腫瘍に浸潤している肥満細胞を示している。
【図８】マウスから採取した組織試料の顕微鏡写真である。これらの画像は、ＦＤＧ−ＰＥＴを用いた叢状神経線維腫の同定を例示している。９カ月齢で撮像した、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスのＦＤＧ−ＰＥＴ画像および脊髄神経の解剖。
【図９】トルジン（Toludine）ブルーで染色し、１００×および６００×の倍率で示している組織試料の顕微鏡写真である。矢印は、肥満細胞を指している。
【図１０】Ｎｆ１＋／−；Ｗｖ／Ｗｖの骨髄を移植した、放射線照射したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘレシピエントの骨髄から単離した個々の骨髄前駆体のＤＮＡの遺伝型同定を示しているゲルの図である。
【図１１Ａ】ＦＤＧ−ＰＥＴを用いた叢状神経線維腫の同定の図である。９カ月齢で撮像した、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスのＦＤＧ−ＰＥＴ画像および脊髄神経の解剖。
【図１１Ｂ】Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−およびＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの目的の坐骨神経部位からのＦＤＧ−ＰＥＴの平均強度を示しているグラフである。
【図１１Ｃ】Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（パネル１）およびＰＥＴ陽性腫瘍を有するＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウス（パネル２〜４）由来の脊髄後根神経節からの代表的な解剖の写真である。
【図１２】メシル酸イマチニブまたはプラセボでの処置後にＴＵＮＥＬを使用した、叢状神経線維腫におけるアポトーシスの評価。プラセボ対照（左パネル）またはメシル酸イマチニブ（右パネル）で処置した叢状神経線維腫からの代表的な切片の図である。矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を示している。
【図１３Ａ】頭部および頸部、ＭＲＩ画像である。
【図１３Ｂ】パネルＣ、Ｄ：メシル酸イマチニブでの処置のそれぞれ６カ月前および６カ月後の、軸面のＭＲＩ  Ｔ２重み付き連続画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に提示および／または記載の実施形態は、網羅的であることも、以下の詳細な説明
に開示の詳細な形態を限定することも意図するものではない。むしろ、これらの実施形態
は、他の当業者が、本明細書中に述べる種々の態様および実施形態の原理および実施方法
を認めて理解することができるように、選択して記載しているものである。
【００１７】
種々の疾患の動物モデルは、モデル化された疾患についての理解を深めるために、かつ
おそらくそれと同程度に重要なことには、モデル化された疾患を診断、治療および／また
は予防するための新規な物質および／または方法を開発および試験するために極めて有効
な手段であることがわかってきている。腫瘍発生に対する細胞自律的寄与および非細胞自
律的寄与についての解剖を可能にするとされるネズミ科のモデルは、かなり重要になりつ
つある。マウスの腫瘍モデルをヒトへの推定に用いる場合には、厳格な精査を行わなけれ
ばならず、こうした実験戦略の意義は、ヒトの疾患状態に対して明白で証明可能な生理学
的関連性がある状況の中でのみ認めることができる。
【００１８】
したがって、ヒトの癌をマウスでモデル化するときの基本原理としては、ヒトの腫瘍と
同じ組織において関連分子経路の変異を生じさせることが必要である。さらに、ヒトの疾
患をモデル化するために利用されるマウスの腫瘍は、信用性ある一連の細胞性の結末およ
び分子的な結末にてヒト表現型を再現するべきである。実験の設計および結果の解釈の際
に十分な注意が払われる場合、ヒトにおける腫瘍発生を研究するためマウスモデルが首尾
よく使用されている。例えば、遺伝子のモデル化は、フォンレックリングハウゼンズの（
Von Recklinghausens’s）神経線維腫症の場合のように、ヒトの腫瘍が、単一の遺伝子変
異にまで単純化できる、遺伝子上の遺伝性の特徴によるものである場合に特に効果が大き
い。したがって、本発明のいくつかの態様は、ヒトにおけるいくつかの型の神経線維腫の
形成を最小限に抑えるのに適したマウスモデルを教示している。特定の疾患の動物モデル
が、同じまたは同様のヒト疾患のための治療法を開発するのに効果的であることを最もう
まく証明するのは、多くのヒト疾患動物モデルとは異なり、特定の動物モデルについて考
案された治療法がヒト患者の治療において効果的であると示すことを実証することであろ
う。
【００１９】
神経線維腫症（Neurofibromatoris）のためのマウスモデルの開発
フォンレックリングハウゼンズの神経線維腫症は、単一遺伝子の疾患である。大半の場
合、この疾患は、生殖系の突然変異および完全な体細胞のヘテロ接合、その後、細胞型に
おいてヘテロ接合性が稀に消失してにこの疾患の定型的な症状発現を生じることによって
顕在化される。この疾患ではほぼ常に、腫瘍は、影響うけた患者の末梢神経系において発
生する。ヒトの組織の試験により、シュワン細胞の重要な役割が示唆されているが、これ
らの試験は、先行する事象を推定するために経験に基づく情報に依存していることを欠点
としている。Ｎｆ１コンディショナルノックアウトマウスモデルはＮｆ１の組織特異的な
欠失を可能にして、この方法に光明を投じた。生理学的に重要な全体的なヘテロ接合性の
状況において、これらの試験は、叢状神経線維腫を形成する遺伝的障害は胚性シュワン細
胞系におけるＮｆ１ヘテロ接合性の消失にある可能性が高いことを明らかにしている。こ
れらの腫瘍の組織病理学的解析では、ヒトで生じた腫瘍とは視覚上区別できない。
【００２０】
マウス遺伝学のおかげで、異なる遺伝形態において、腫瘍許容性または腫瘍抵抗性のい
ずれでもよいという微小環境の重要な役割が明らかにされている。これらのデータにより
、シュワン細胞系以外でのＮｆ１ヘテロ接合性が腫瘍形成に必要であることが示されてい
る。例えば、これらのマウスでは末梢神経への肥満細胞の浸潤が腫瘍出現の数カ月前に認
められるが、腫瘍非形成性のＮｆ１野生型（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）の遺伝子型では認めら
れない。肥満細胞は、ヒトの神経線維腫中で観察されるが、マウスモデルが存在しないた
め、腫瘍の発生または維持における機能的役割の試験を直接には研究できない。Ｎｆ１ハ
プロ不全性の要件は、神経冠シュワン細胞系を標的とするさらなるＣｒｅ導入遺伝子（ペ
リオスチン−Ｃｒｅ、Ｐ０−Ｃｒｅおよびタモキシフェン誘導性ＰＬＰ−Ｃｒｅを含む）
によって代用されていることに注目すると興味深い。これらの観察により、シュワン細胞
系以外でのＮｆ１ヘテロ接合性の必要性がさらに確認される。組織特異的Ｃｒｅ導入遺伝
子を使用して集められたデータでは、企図した実験条件下で、野生型環境において腫瘍が
発生できる可能性は下がっていない。実際に、本発明者らは、早期に広範かつ強力に発現
する神経冠特異的Ｃｒｅドライバーを利用すると、ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおいてさ
えも末梢神経の過形成を生じるが、ｆｌｏｘ／−マウスよりは少ないことを観察している
。
【００２１】
本明細書中に開示される結果によって、後者のモデルはＮＦ１を患うヒトの生理学的状
態からはかけ離れており、そのような条件ではＬＯＨ（ヘテロ接合性の喪失）が非常に稀
な確率事象になるので、単離の際に生じる完全欠損性(nullizygous)の胚性シュワン細胞
前駆体が微小環境において腫瘍に発達するには比較的不利であることが例示される。これ
らのマウスモデルによって、単離した完全欠損性細胞の嚢(pocket)は、形成されたヘテロ
接合性肥満細胞との見かけの相乗作用によって、有意な選択優位性を得ることが示される
。これらの結果についてのデータと矛盾しない１つの解釈は、強力なＣｒｅを介した組換
えモデルにおける過形成が、シュワン細胞において非生理的で広範なＮｆ１喪失を反映し
ているだけでなく、さらなる系列におけるさらなるＮｆ１喪失をも反映しており、その喪
失が切り分けたＬＯＨという障害を打開し得るということである。
【００２２】
神経線維腫は、末梢神経に関連して生じ、シュワン細胞、内皮細胞、線維芽細胞、脱顆
粒している炎症性の肥満細胞、および周皮細胞／血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）からなり、
大きなコラーゲン沈着物を含んでいる。Ｎｆ１コンディショナルノックアウトマウスモデ
ルは、シュワン細胞系におけるＮｆ１のヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）が神経線維腫の誘
発に必要であるが十分ではないように見えることを示して、ヒト腫瘍からの再帰的研究を
強めている。報告されているように、腫瘍進行には、腫瘍微小環境中のシュワン細胞とＮ
ｆ１ハプロ不全細胞系との間の複雑な相互作用が必要である。したがって、Ｎｆ１  ＷＴ
のバックグラウンドでは、シュワン細胞におけるＮｆ１完全欠損が必要であり得るが、腫
瘍形成を引き起こすためには必ずしも十分ではない。腫瘍を形成しているヘテロ接合マウ
スについて報告されている１つの特徴は、腫瘍発生のかなり前に、末梢神経に肥満細胞が
出現することである。さらに、シュワン細胞馴化培地と肥満細胞とを混合するｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏの実験より、Ｎｆ１ヘテロ接合肥満細胞が完全欠損性シュワン細胞からの馴化培地
に対して過敏性であることが示されている。それら細胞型の腫瘍形成モデルとして、本発
明者らは、いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、新生物が発生
する前において、Ｎｆ１ヘテロ接合性肥満細胞の末梢神経への浸潤および腫瘍発生に寄与
するＮｆ１完全欠損性シュワン細胞との関与を含むことを仮説とした。
【００２３】
他のＷＴ環境において、内在性の完全欠損性シュワン細胞系の特異的除去と組み併せて
腫瘍形成を誘導するにはヘテロ接合Ｎｆ１＋／−由来骨髄の養子移入で足りるという知見
から、骨髄由来細胞においてはハプロ不全性の必要性があるが、これらの腫瘍中に見られ
る他の細胞型には必要でないことが示唆される。さらに、このことが因果的相互作用を構
成するという仮説が、ドナー骨髄におけるｃ−Ｋｉｔシグナル伝達性に関する遺伝的要件
、およびドナーのヘテロ接合性肥満細胞が初期型の末梢神経腫瘍中に浸潤することによっ
て、強く支持される。
【００２４】
ｃ−Ｋｉｔ受容体は、肥満細胞の発生および機能において中心的な役割を有している。
神経線維腫の２つの主な構成要素である、シュワン細胞および線維芽細胞は、多くの異な
る刺激物質に応答してｋｉｔ−リガンドを分泌する。例えば、神経線維腫組織中にｋｉｔ
−リガンドｍＲＮＡ転写産物が多いことが報告されており、ＮＦ１患者は、その血清中に
高レベルのｋｉｔリガンドを有することが報告されている。ＦＤＡに承認されている薬理
学的作用剤であるメシル酸イマチニブは、前臨床試験で、ｃ−Ｋｉｔを含むいくつかのチ
ロシンキナーゼを阻害することによって働くと考えられていた。
【００２５】
疾患のマウスモデルで神経線維腫に対する効力を試験した際に、メシル酸イマチニブは
予想外の効力を示した。この化合物の治療上有効な用量を投与することは、神経線維腫の
病状を反転させるのに劇的な効果を有する。イマチニブでの治療により、この化合物で治
療した動物において、肥満細胞が末梢神経から消失する結果となった。ＮＦ１シュワン細
胞とヘテロ接合肥満細胞との間でｃ−Ｋｉｔを介した相互作用を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏの
試験が進むにつれて、そのｉｎ  ｖｉｖｏの試験は、メシル酸イマチニブ応答性腫瘍の維
持に関して依然として必要であることを明らかにしている。
【００２６】
炎症および肥満細胞の腫瘍の発生における役割は、活発に研究されている領域である。
肥満細胞は、高親和性のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）およびｃ−ｋｉｔ受容体の活性化後
にヒスタミン、セロトニン、プロテオグリカン、およびロイコトリエンなどの炎症のメデ
ィエーターを放出する。さらに、報告によると、肥満細胞は、シュワン細胞の強力な増殖
因子、生存因子、および走化性因子でもある血管新生因子であるＶＥＧＦを放出する。Ｖ
ＥＧＦは、腫瘍形成における血管新生のスイッチにも関連付けられてきている。最後に、
肥満細胞は、周皮細胞および線維芽細胞の増殖を促進する増殖因子であるＰＤＧＦ−β、
ならびに線維芽細胞の増殖およびコラーゲンの合成を促進する増殖因子であるＴＧＦ−β
も放出する。
【００２７】
メシル酸イマチニブおよび腫瘍微小環境。
神経線維腫の状況における重要な問題は、肥満細胞がどのようにシュワン細胞と共同し
て腫瘍形成を誘発するかである。本明細書中に示すデータは、腫瘍中の他の細胞型が必ず
しもヘテロ接合性である必要はないことを示している。しかし、浸潤しているＮｆ１ヘテ
ロ接合性肥満細胞が主に完全欠損性シュワン細胞と相互に作用して腫瘍形成を促進するの
か、または代替的に、局所的なストローマと間接的に相互作用すること、およびこれらの
腫瘍中に含まれるさらなる細胞型が腫瘍の誘発に必要な媒介因子であるのかどうかを断定
するにはやや早急である。神経線維腫中でのさらなるパラクリン相互作用、ならびにこれ
らがどのように腫瘍の形成および維持に影響を及ぼし得るかについてのよりよい理解のた
めに、さらなる試験が待望されている。
【００２８】
さらに、本明細書中および過去のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において報告されている遺伝的
結果より、メシル酸イマチニブは、複数のＮｆ１＋／−周皮細胞、および線維芽細胞の腫
瘍を促進する機能、を阻害することが示されている。ここでも、これらのさらなる腫瘍細
胞におけるヘテロ接合性の必要性がないことにより、腫瘍の退縮を引き起こすメシル酸イ
マチニブの能力が肥満細胞に対するその阻害活性によって排他的に引き起こされているわ
けではない可能性がある点がが除外されているわけではない。以下の仮説は、メシル酸イ
マチニブのような化合物を用いた治療が腫瘍を減少させるという事実を実例として示すも
のであって、限定するものではなく、これは、本発明の一態様であり、この結果を説明し
ようとして提供するあらゆる所与の理論または説明の正確さに決して依存しない。メシル
酸イマチニブおよび同様の化合物または類似の系統の化合物は、他の腫瘍細胞型において
さらなるおよび／または他の潜在的に重要な可能性のある腫瘍促進活性を偶然に阻害する
こともある。例えば、メシル酸イマチニブは、肥満細胞においてｃ−Ｋｉｔを阻害するこ
とに加えて、ＰＤＧＦＲを介して血管新生を低減し得、かつｃ−Ａｂｌを介して線維形成
／コラーゲン産生を低減し得る。これらの重要かつ魅力的なシナリオを解決するために、
さらなる調査が必要とされることもあり、暫定的に、１つ観察されるのは、この化合物の
有効量が神経線維腫のマウスモデルおよび叢状神経線維腫のような状態に属するヒトの患
者において腫瘍退縮を引き起こすことである。
【００２９】
ｃ−ｋｉｔの薬理学的阻害は、腫瘍サイズおよび代謝活性を低減する。
本発明を実施するために使用され得る化合物としては、式１の化合物：
【化４】
2015187104.tif 000005
［式中、Ｒ１は、４−ピラジニル、１−メチル−１Ｈ−ピロリル、アミノ置換フェニルも
しくはアミノ−低級アルキル置換フェニル（前記アミノ基はそれぞれの場合において、遊
離しているかまたはアルキル化もしくはアシル化されている）、五員環炭素原子で結合し
ている１Ｈ−インドリルもしくは１Ｈ−イミダゾリル、または環炭素原子で結合しており
、窒素原子において非置換もしくは酸素で置換されている非置換ピリジルもしくは低級ア
ルキル置換ピリジルであり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ他とは独立して水素または低級
アルキルであり、基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１個または２個は、それ
ぞれ、ニトロ、フルオロ置換低級アルコキシまたは式ＩＩの基−Ｎ（Ｒ９）−Ｃ（＝Ｘ）
−（Ｙ）ｎ−Ｒ１０  （ＩＩ）であり、式中、Ｒ９は、水素または低級アルキルであり、
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノ（hydroximin
o）またはＯ−低級アルキル−ヒドロキシミノであり、Ｙは、酸素または基ＮＨであり、
ｎは、０または１であり、Ｒ１０は、少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族基、また
は芳香族、芳香族−脂肪族、脂環式、脂環式−脂肪族、複素環もしくは複素環−脂肪族の
基であり、残りの基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他とは独立に、水素
、非置換低級アルキルまたは遊離しているかもしくはアルキル化されたアミノ、ピペラジ
ニル、ピペリジニル、ピロリジニルまたはモルホリニルによって置換されている低級アル
キル、または低級アルカノイル、トリフルオロメチル、遊離もしくはエーテル化もしくは
エステル化（esterifed）ヒドロキシ、遊離もしくはアルキル化もしくはアシル化アミノ
、または遊離もしくはエステル化カルボキシである］または少なくとも１個の塩形成基を
有するこうした化合物の塩などが挙げられる。
【００３０】
式１の化合物は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、特許出願ＵＳ５
，５２１，１８４に、詳細には、化合物の請求項および有効な実施例の最終産物に、一般
的かつ具体的に開示されている。式１の化合物の上記の定義において遊離基および記号は
、本明細書にその全体が組み込まれている、ＵＳ５，５２１，１８４に示されているよう
な意味を有する。
【００３１】
本発明の目的で、イマチニブは、そのモノメシル酸塩の形態で適用することができる。
モノメシル酸イマチニブは、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、ＵＳ６
，８９４，０５１に開示されている方法に従って調製することができる。同様に含有され
るのは、その中に開示される対応する多形体、例えば結晶の改変形態である。
【００３２】
成人患者では、約２００〜約８００ｍｇの間の日用量、例えば４００ｍｇのイマチニブ
のモノメシル酸塩を経口的に投与する。モノメシル酸イマチニブは、いずれも、その全体
が、それぞれ別々に組み込まれているかのように本明細書に組み込まれている、ＵＳ５，
５２１，１８４、ＵＳ６，８９４，０５１、ＵＳ２００５／０２６７１２５またはＷＯ２
００６／１２１９４１に記載のような剤形で投与することができる。これらの化合物のさ
らなる考察には、例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、米国特許
出願第１１／８１５，０４６号、現在の米国公開第２００８／００１１４００１  Ａ１号
、２００８年５月１５日公開を参照されたい。
【００３３】
チロシンキナーゼ活性に関与していると考えられる疾患の治療に特に有用な１種類の化
合物は、化合物メシル酸イマチニブ（４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−
Ｎ−［４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フ
ェニル］−ベンズアミド）である。イマチニブは、例えば、ＷＯ０３／０６６６１３に開
示されている方法に従って調製することができる。この化合物の１種の薬学的に許容でき
る塩は、以下のような式３に示すメシル酸イマチニブ：
【化５】
2015187104.tif 000006
である。
【００３４】
メシル酸イマチニブは、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびｃ−ａｂｌチロシンキナ
ーゼの強力な阻害剤である。この化合物は、保護された商標名Ｇｌｅｅｖｅｃの下で市販
されている。これは、Ｋｉｔを発現している（ＣＤ  １１７＋）患者の治療用に米国で承
認されている。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  Ｃｌｅａｒｉｎｇｈｏｕｓｅ（
ｗｗｗ．ｇｕｉｄｌｉｎｅ．ｇｏｖ）に従って、成人ヒト患者における初期推奨用量レベ
ル４００ｍｇを１日２回投与した。実際の治療上有効な用量は、患者特異的であり、患者
の体重、年齢、性別、年齢、全体的な健康状態および薬剤に対する応答性を含む多様な要
因を元に、処方する医師によって決定される。
【００３５】
マウスモデルの１つの限界は、この動物の生存期間が短いことであり、これを考慮に入
れると、どれだけ長く生きた腫瘍が反応すると予想され得るのかをマウスの試験に基づい
て予測することはできない。しかし、マウスモデルでのこれらの結果は、これらの化合物
を用いた治療は、いくつかの腫瘍で侵されているヒトに対して有益な効果を有し得、有す
るであろうことを強く示唆している。メシル酸イマチニブを用いたヒト患者の治療がその
ヒト患者において腫瘍のサイズを低減させるのに成功した際に得られた予想外に良好な結
果により、この仮説がさらに支持される。
【００３６】
例としてであって限定されるものではないが、以下の考察を提供する。特発性の癌の発
生の背景にある細胞機構および分子的機構に関する理論は、近年、著しく発展してきてい
る。細胞自律的事象が１個の細胞にその通常の調節を超えさせて悪性腫瘍の発生をもたら
すという初期の概念、およびさらに腫瘍の起源の細胞型の同一性は、現在、協力して再調
査されている。１個の細胞における一連の遺伝的事象および後成的事象が悪性の表現型に
向かう軌道に乗ると同時に、大部分の型の癌は、腫瘍形成性の状態を可能にしてさらに促
進する許容性の微小環境を取り入れることが次第に明らかになってきており、この仮説に
よれば、抵抗性の環境は、基本的に腫瘍形成の可能性をなくすであろう。腫瘍形成の取り
入れられた許容性のプロセスに対する、同定された非細胞の自律的な寄与因子の中には、
血管新生、局所的なストローマの関与、および他の細胞型間の炎症がある。パラクリン相
互作用の詳細な順序の理解、相対的重要性、および非腫瘍形成性環境相互作用の分子基盤
は、依然として初期段階にある。しかし、本明細書に開示の化合物の治療的使用は、本明
細書に記載の材料および／または方法を使用して意欲的に治療または制御され得る多様な
疾患または状態についていかなる仮定の機構によっても提案される分子病因によっても決
して限定されるものではない。
【００３７】
これらのデータは、叢状神経線維腫形成における骨髄由来細胞の役割と矛盾しない。ま
た、これらのデータより、ｃ−ｋｉｔ受容体の薬理学的阻害および遺伝的阻害はＮｆ１マ
ウスにおける叢状神経線維腫形成を予防または少なくとも遅延し得ることが示される。こ
れらの結果により、神経線維腫を進行させるためには、腫瘍微小環境中に骨髄由来細胞の
Ｎｆ１ハプロ不全性および特にｃ−ｋｉｔ受容体の活性化に依存するものが必要であるこ
とが示される。このデータは、肥満細胞が腫瘍形成に積極的に関与していることを示し、
ヒトの第１〜２相の臨床試験の新規治療標的を同定するものである。
【００３８】
本開示は、起源の腫瘍細胞と微小環境との間の複雑な相互作用に対する具体的な洞察を
提供する、重要なヒトの癌についての生理学的に関連性のあるマウスモデルの一例を提供
する。一方、ヒトの疾患のモデルとしてこのマウスを使用した研究により、腫瘍形成性細
胞よりもむしろ腫瘍形成のための微小環境を標的とすることによってこれまで治療不能の
腫瘍を治療するための潜在的な治療方法が示唆される。ヒトとマウスとの間の相当な細胞
の相違および生理学的な相違のため、ヒトの神経線維腫を治療するためにメシル酸イマチ
ニブのような化合物を使用することの効力は、その化合物を用いてヒトの治療に成功する
ことによってのみ「証明する」ことができる。少なくとも部分的に、ヒトは一般にマウス
よりも長命であるので、神経線維腫のような状態を有するヒトを治療するメシル酸イマチ
ニブの能力は、慢性骨髄性白血病を治療するためにこの化合物を用いた場合とは異なり、
薬剤耐性の発生をもたらし得る。ＣＭＬでは、メシル酸イマチニブは白血病細胞に対して
直接作用すると考えられており、変異した構成的に活性なチロシンキナーゼ腫瘍性タンパ
ク質（Ｂｃｒ−ａｂｌ）を標的とする。このＢｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子は、第２の部位変異
の獲得を介して薬剤耐性を獲得し得る。対照的に、例えば神経線維腫に対するメシル酸イ
マチニブのように抗ｃ−ｋｉｔ剤の排他的でなくとも主要な活性は、非腫瘍細胞作用性の
もの、例えば、薬剤耐性について選択するために使用可能な経路がなくてもよいＷＴタン
パク質に対するものである可能性が高い。
【００３９】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメシル酸イマチニブよりも１０倍も高いＮｆ１ヘテ
ロ接合肥満細胞に対する阻害活性を有する化合物を同定した（非公開の結果）。患者がフ
ォンレックリングハウゼンズの神経線維腫症と限局性白皮症との双方を有する、極めて少
数の症例が報告されている。これらの試験は、限局性白皮症がｃ−Ｋｉｔ受容体の希少形
態(hypomorphic)の変異から結果として生じたことを意味する。これらの患者は、神経線
維腫がないと報告された。この回避についての他の信頼できそうな説明としては、これら
の個体は、肥満細胞が欠損していたということである。したがって、これらの報告は、ヒ
トでの神経線維腫形成におけるｃ−Ｋｉｔおよび肥満細胞の重要性を確認させ得るもので
ある。
【００４０】
ここで述べる神経線維腫マウスモデルの遺伝的な適応性および細胞の適応性により、フ
ォンレックリングハウゼン神経線維腫症の場合以外のヒトの癌に一般的な関連性を有する
腫瘍形成における微小環境の関与についての重要な詳細が明らかにされる。
【実施例】
【００４１】
実験
材料および方法
動物および試薬。
これらの試験で利用するＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスは、以前に記
載されている（Ｚｈｕら、２００２）、「Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ  ｉｎ  ＮＦ１：Ｓ
ｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｅｎｖ
ｉｒｏｎｍｅｎｔ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６、９２０〜９２２。Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１
ｆｌｏｘ／−マウスを作製するために、本発明者らは、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／
ｆｌｏｘマウスをＮｆ１＋／−マウスと異種交配させた。動物の使用を含むすべての方法
は、インディアナ大学医学部（Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  
ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の組織内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  
Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
他に明記しない限り、化学薬品はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【００４２】
造血細胞の養子移入。
叢状神経線維腫進行についての微小環境調節の役割を評価するために、骨髄移植を実施
した。簡単に説明すると、ＷＴ  ＧＦＰマウスまたはＮｆ１＋／−  ＧＦＰマウスからの
同系のＷＴまたはＮｆ１＋／−の骨髄細胞をレシピエントあたり２００万個、若年成体の
Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／
−マウスに２回にわたり分割線量を与えて１１００ｒａｄの電離放射線でこれらを処置し
た後に養子移入した。
【００４３】
ＰＥＴ画像解析。
叢状神経線維腫を検査し、かつ解剖学的に位置決定をするために、［１８Ｆ］フルオロ
デオキシグルコース（［１８Ｆ］ＦＤＧ）ＰＥＴおよびＸ線ＣＴの画像診断を組み合わせ
た。ＣＴ画像を集めている際には、テンプレートは、標準化した関心体積（ＶＯＩ）で得
るために、領域にわたって横方向に配置し、それによって研究者がＦＤＧの取込みを定量
化できるようにした。登録して重ね合わせたＣＴ画像データを使用して、特定の椎骨を識
別した（例えば、標識Ｌ１〜Ｓ１）。操作者は、次いで、この脊髄に沿って場所を選択し
て、Ｌ１〜Ｓ１間を通る脊髄の経路を決定する。次に、３個の円形の関心領域（ＲＯＩ）
を脊髄に沿った挿入場所に配置して、脊髄および脊髄後根神経節の領域を取り込む。最後
に、これらの円形のＲＯＩを組み合わせて、脊髄、左側脊髄後根神経節、および右側脊髄
後根神経節のＶＯＩを作成する。ＦＤＧ画像は、尾静脈注射による約０．５〜１．０ｍＣ
ｉのＦＤＧの注射後４５分に取得した。すべての動物に、覚醒したままＦＤＧの注射を行
い、動物を画像診断用に動けなくさせるために注射後約４０分でイソフルラン麻酔を行っ
た。
【００４４】
予備的な画像診断試験は、非腫瘍形成性のＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマ
ウスにおいて、かつ完全な浸透度で神経線維腫を生じるＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／
−マウスにおいて実施する。実験的なＰＥＴ画像診断ならびに脊髄後根神経節および近位
末梢神経の解剖の双方の予備的な試験では、遺伝子型にかかわらず６カ月齢以前のいずれ
のマウスにおいても腫瘍は検出されなかった（データは示していない）。同様に、Ｋｒｏ
ｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスでは、９カ月齢で腰仙領域にＦＤＧの取込みは
ほとんどなかった（図８Ａ）。対照的に、坐骨神経において腫瘍が一般的である９カ月齢
のＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスのＦＤＧ  ＰＥＴスキャンでは、脊椎の腰部
においてＦＤＧ−ＰＥＴ強度の特異的な増大が示された（図８Ａ；矢印）。画像診断を行
った動物のその後の剖検により、ＦＤＧ  ＰＥＴ画像で同定された腫瘍について一致した
検証が得られた（図８Ｂ）。比較可能年齢のＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘの
コホートに対するＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスのコホートからのＦＤＧ−Ｐ
ＥＴ画像情報の概要を図８Ｃに示す。これらの試験は、非侵襲性のＦＤＧ−ＰＥＴ画像診
断がＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスにおける叢状神経線維腫の同定に有効であ
ることを実証している。
【００４５】
脊髄後根神経節の解剖。
これらを屠殺した直後に、死後のマウスを４％パラホルムアルデヒド中で灌流して固定
する。次いで、脊髄後根神経節および末梢神経を解剖顕微鏡下で摘出する。組織を電子顕
微鏡解析によって解析するマウスを、２％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアル
デヒド、および０．１Ｍカコジル酸塩（ｐＨ７．４）で灌流固定する。
【００４６】
腫瘍サイズの測定。
腫瘍のサイズを評価するために、カリパスを使用して近位脊髄後根神経節の最も大きく
なり得る幅および長さを測定した後に、脊髄後根神経節サイズの解剖測定を実施する。腫
瘍の体積は、スフェロイドのおよその体積を確定することによって決定する（例えば、０
．５２×（幅）２×長さ）。
【００４７】
脊髄後根神経節におけるドナー細胞の表現型の評価。
腫瘍中に再構成させるドナー由来の細胞型（１種または複数）を調べるために、フロー
サイトメトリー解析を実施した。簡単に説明すると、脊髄後根神経節を摘出し、細かく切
り刻み、コラゲナーゼＶによって消化した。次いで、この単一細胞懸濁液を、抗ＣＤ１１
７、ＣＤ３１またはＣｏｌ１Ａ、およびＦｃεＲＩの抗体と混合した。次いで、細胞集団
を、蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）を使用して分離した。
【００４８】
組織学的解析。
腫瘍の形態を詳細に調べるために、パラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオシン（
Ｈ＆Ｅ）で染色した。ヒトの叢状神経線維腫の乾燥重量のうちコラーゲンが約６０％を占
めることを考慮に入れて、組織切片をマッソントリクロームでさらに染色した。腫瘍中の
肥満細胞の存在を決定するために、アルシアンブルー染色を実施した。
【００４９】
透過型電子顕微鏡検査。
灌流固定後、組織を段階的な一連のエタノールおよびアセトンの中で脱水し、Ｅｐｏｎ
−Ａｒａｌｄｉｔｅ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈ
ａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）中に包埋した。超薄切片（銀〜金）を酢酸ウラニルおよびクエン
酸鉛で染色し、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｅｉｎｄｈｏ
ｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で検査した。
【００５０】
実験１
Ｎｆ１ヘテロ接合骨髄（ＢＭ）の養子移入は、腫瘍関連のレシピエントの生存を低減する
。
ここで図１を参照すると、この模式図は、レシピエントマウスの遺伝子型、レシピエン
トの電離放射線後に養子移入した細胞の遺伝子型、および移植後に得られた測定値を図示
している。腫瘍微小環境中の造血細胞におけるＮｆ１のヘテロ接合性が神経線維腫形成に
必要とされる遺伝的ハプロ不全性の原因となっているという仮説を検証するために、本発
明者らは、シュワン細胞の約１０％において、Ｋｒｏｘ２０−Ｃｒｅ導入遺伝子により切
断されたＮｆ１対立遺伝子を２つ有するマウスにＮｆ１ヘテロ接合の骨髄を移入した（Ｋ
ｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）。Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマ
ウスは、すべての細胞系において機能的に野生型であり、神経線維腫は観察されない。相
補的な実験として、ＷＴの骨髄細胞を、上記のようなシュワン細胞系においてＮｆ１生殖
系完全欠損対立遺伝子および組換え可能なｆｌｏｘ対立遺伝子を有するマウスに移植した
（Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−）。Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスは、
以前に記載されているように、均一に叢状神経線維腫を生じる（Ｚｈｕら、２００２）。
一部のＮｆ１＋／−またはＷＴの骨髄を電離放射線後のレシピエントに養子移入し、叢状
神経線維腫の発生およびこれらの腫瘍に関連した死亡率を１歳齢までモニタリングした。
【００５１】
ここで図２Ａを参照すると、それぞれのプロット線の隣に遺伝子型を示している。主要
な罹患の明白な徴候を示し次第、マウスを屠殺した。Ｙ軸は、生存しているマウスの百分
率を示している。Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ＋Ｎｆ１＋／−ＢＭ（点線）
対Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ＋ＷＴ ＢＭ（白四角）（Ｐ＜０．００２）
、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ＋Ｎｆ１＋／−ＢＭ（点線）対Ｋｒｏｘ２０
；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−（白丸）（有意差なし）の比較。Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／
−（白丸）対Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−＋ＷＴ骨髄（黒四角）（ｐ＜０．０．０
０２）。移植６カ月後、ヘテロ接合のＮｆ１＋／−骨髄を移植した機能的な生殖系ＷＴ（
Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）レシピエントは、運動麻痺、体重減少を示し
始め、１５％のマウスのみが全実験期間生存した。例えば、図２ＡおよびＢを参照された
い。この死亡率は、大部分は、生殖系ヘテロ接合性Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マ
ウスにおける以前の観察を反映している（図２Ａ）。対照的に、ＷＴの骨髄で再構成した
Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの約９０％は、生存しており、叢状神経
線維腫形成の臨床的な特徴を示さなかった（図２Ａ）。これらのデータは、生殖系ヘテロ
接合性（Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−）マウスへのＷＴ骨髄細胞の移植が、その生
存を、完全な骨髄を含む非腫瘍形成性Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの
生存と比較可能なレベルまで回復させるという逆の実験によって確認された（図２Ａ）。
【００５２】
ここで図２ＣのＷＴまたはＮｆ１＋／−いずれかの骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ
１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの脊髄後根神経節および末梢神経の解剖の写真を参照する。
矢印は、脊髄後根神経節および近位末梢神経における腫瘍を指している。この病的なマウ
スの脳および脊髄の剖検により、２２匹うちの２１匹のＮｆ１＋／−骨髄移植レシピエン
トは、ＷＴの骨髄を移植した非症候性のマウスの脊髄と比較して、全体の脊髄の厚さの増
加を有することが明らかになった。この異常な形態は、腫瘍形成性Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１
ｆｌｏｘ／−マウスのものと似ている。
【００５３】
ここで図２Ｃ、異なる遺伝子構成を有するマウスの脊髄後根神経節の顕微鏡写真を参照
する。矢印は、運動麻痺を示す肢に働いている神経節を指す。図２Ｃのパネル２および３
は、Ｎｆ１＋／−骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの脊髄
後根神経節から生じている別々の腫瘍の存在を示し、またこれらの腫瘍が特に坐骨神経に
よく認められたことを示している。腫瘍の体積測定解析により、腫瘍を生じなかったマウ
スにおける影響を受けていない脊髄後根神経節と比較して、体積で３〜６倍増加している
ことが明らかとなった。坐骨神経および腰仙骨神経叢に浸潤しているこの腫瘍のサイズが
大きいことおよび解剖学的な部位は、観察された行動異常後肢麻痺、水腎および拡大した
弛緩膀胱の原因である可能性が高い（図２Ｂ）。まとめると、これらのデータにより、シ
ュワン細胞ヘテロ接合性消失の環境におけるＮＦ１ヘテロ接合の骨髄の存在は、最初にＫ
ｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−腫瘍形成性マウスにおいて観察された罹患および末梢神
経過形成を再現するために十分であることが示される。
【００５４】
実験２
Ｎｆ１＋／−骨髄（ＢＭ）レシピエントは、叢状神経線維腫を発生する。
ここで図３Ａを参照すると、病理学的解析により、Ｎｆ１ヘテロ接合骨髄レシピエント
における叢状神経線維腫の存在が確認された。パネル１および６は、ＷＴのＢＭを移植し
たＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の切片である。パネル２、３、７
、８は、Ｎｆ１＋／−のＢＭを移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス
由来である。パネル４、５、９、１０は、ＷＴのＢＭを移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆ
ｌｏｘ／−マウス由来である。上のパネルの写真は、１００×のもとで光学顕微鏡法を用
いて撮影したものであり、下のパネルの写真は、２００×のもとで撮影したものである。
Ｎｆ１＋／−骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の脊髄
後根神経節は、以下の正常構造の崩壊、すなわち、波状のシュワン細胞および過染色性の
核を有する浸潤細胞（図３Ａ、パネル７〜８）、過剰なコラーゲン沈着（図３Ｂ、パネル
２、３）、血管新生（図３Ｃ、パネル３における大きな矢印は血管を特定している）、お
よび典型的な超微細構造の異常（図７）を含む、ヒトの叢状神経線維腫の典型的な組織学
的特徴を示す。図７では、パネル１〜４、７５０×、パネル５〜８、１５００×。パネル
１〜２  ＷＴのＢＭを移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の近
位脊髄神経、パネル３〜８  Ｎｆ１＋／−のＢＭを移植したレシピエント由来の近位神経
。これらの写真において、（Ｕ）は無髄軸索を示し、（Ｓ）は神経内膜空間の拡大を示し
、矢印はコラーゲン束を指し、（Ｍ）は腫瘍に浸潤している肥満細胞を示している。対照
的に、ＷＴの骨髄を移植した、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスまたはＫ
ｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスからの神経はいずれかが、脊髄後根神経節および
近位末梢神経の切片の全体にわたって正常に見える均一に広がった核を示し（例えば、図
３Ａ、パネル１、４〜６、および９〜１０を参照されたい）、コラーゲン沈着の形跡はな
かった。Ｎｆ１＋／−の骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス
から単離される腫瘍は、叢状神経線維腫の組織学的特徴を有する。
【００５５】
ここで図３Ｂ、パネル１、４〜５、血管新生、および維持された正常な超微細構造の形
態（図７）を参照する。神経線維腫は複数の細胞型を含む複雑な腫瘍であり、その中で、
ＬＯＨはシュワン細胞系に特有である（Ｚｈｕら、２００２）。肥満細胞の浸潤は、ヒト
およびネズミ科の叢状神経線維腫の特徴である（Ｚｈｕら、２００２）。本明細書中で用
いるこの状態のネズミ科モデルにおいて、本発明者らは、腫瘍出現前に肥満細胞による末
梢神経の浸潤を観察している。したがって、再構成されたＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ
／ｆｌｏｘマウスのヘテロ接合の骨髄も、広範囲な肥満細胞浸潤を示した（図３Ｃ、パネ
ル２〜３）。蛍光サイトメトリーを用いて、Ｎｆ１＋／−骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；
Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの神経線維腫中の内皮細胞（ＣＤ３１）、線維芽細胞（
Ｃｏｌ１Ａ）、および造血細胞（ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ１１７）を精製する。
【００５６】
ここで図３Ｄを参照する。矢印は、それぞれの表現型の系列からの示した対立遺伝子の
増幅ＤＮＡ産物を指している。驚くべきことに、その後の遺伝子型同定により、ＦｃεＲ
Ｉも発現する（図示せず）、ｃ−Ｋｉｔ集団のみが、Ｎｆ１完全欠損対立遺伝子を有して
いることが示された（図３Ｄ）。これらのデータは、Ｎｆ１完全欠損欠損シュワン細胞の
部位への移植したヘテロ接合肥満細胞のホーミングを含む再構成されたＫｒｏｘ２０；Ｎ
ｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘにおける本物の叢状神経線維腫の出現と矛盾しない。
【００５７】
ここで図３Ｅを参照する。骨髄（ＢＭ）（バンド１−および腫瘍細胞（パネル２）は、
ＥＧＦＰ＋；ＣＤ４５，２陽性集団によって単離および選別する。肥満細胞（パネル３）
、マクロファージ（パネル４）、Ｂリンパ球（パネル４）およびＴリンパ球（パネル５）
のために、腫瘍関連ＣＤ４５．２細胞をさらに分離する。グラフは、腫瘍中の各造血細胞
集団の比率を示している。
【００５８】
ここで図３Ｆ、Ｎｆ１＋／−の骨髄（ＢＭ）をトランスフェクトした（trasfected）Ｋ
ｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの腫瘍からＦＡＣＳによって単離される系
列の遺伝子型を参照する。図３Ｆ中の矢印は、表示している表現型系列から単離した同一
の対立遺伝子の増幅ＤＮＡ産物によって形成されるゲル上のバンドを指している。
【００５９】
Ｎｆ１＋／−骨髄を介した腫瘍形成にはｃ−Ｋｉｔが必要とされる。
再構成された叢状神経線維腫中に検出されたＮｆ１ヘテロ接合細胞のみが骨髄由来であ
った。この発見は、肥満細胞のハプロ不全性の必要性が腫瘍形成に関係していることを示
している本発明者らの以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの観察と一致して
いる。ｃ−ｋｉｔの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、肥満細胞の成長および機能の
多くの面を制御すると考えられている。本発明者らは、ｃ−Ｋｉｔ活性が、Ｎｆ１＋／−
の骨髄由来の肥満細胞の移動、増殖、および生存を制御しているようであることを報告し
ている。本発明者らは、これらの状況間の関連性を仮定し、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏ
ｘ／ｆｌｏｘマウスに移植したＮｆ１＋／−骨髄細胞におけるｃ−ｋｉｔ活性の遺伝的な
破壊による、腫瘍進行に対する作用を試験した。
【００６０】
養子移入したＮｆ１＋／−骨髄におけるｃ−ｋｉｔの遺伝的な破壊により、レシピエン
トＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおける叢状神経線維腫の発生が阻止
される。簡単に説明すると、Ｎｆ１＋／−マウスは、キナーゼ活性をそれぞれ８５％（Ｗ
４１／Ｗ４１）〜９５％（Ｗｖ／Ｗｖ）低減するｃ−ｋｉｔ受容体における点変異によっ
て肥満細胞の可動性を阻害された低下形態のマウス２系統と独立に異系交配した。
【００６１】
ここで図４Ａを参照する。Ｎｆ１＋／−；Ｗｖ／Ｗｖ二重変異体マウスまたはＮｆ１＋
／−；Ｗ４１／Ｗ４１二重変異体マウスのいずれかからの骨髄を、それぞれ５匹および１
０匹のＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスに移植した。Ｎｆ１＋／−；Ｗの
変異体骨髄を移植したマウスの罹患率は、Ｎｆ１＋／−の骨髄を移植したＮｆ１ｆｌｏｘ
／ｆｌｏｘマウスと比較して、有意に低下した。Ｎｆ１＋／−またはＮｆ１＋／−；Ｗ変
異体の骨髄を移植したＫｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを１年間追跡した
。この２群間の遺伝子型および統計的有意性を示している。したがって、Ｎｆ１＋／−骨
髄のレシピエントとは対照的に、Ｎｆ１＋／−；Ｗ変異体の骨髄を移植したＫｒｏｘ２０
；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の脊髄後根神経節および近位末梢神経は、正常な
形態を有し、肥大も腫瘍の証拠も示さない（図４Ｂ）。これらの結果は、Ｎｆ１ハプロ不
全性は、骨髄内で生じるという仮説を支持し、さらに、その活性成分がｃ−Ｋｉｔ依存的
な細胞型に固有であることを詳細に示す。ここで図４Ｃを参照すると、Ｋｒｏｘ２０；Ｎ
ｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの坐骨神経由来の個々の脊髄後根神経節（ＤＲＧ）の体積
の、遺伝子型の関数としてのグラフを示している。個々の点は個々のＤＲＧの体積を表し
、直線はそれぞれの実験群からの平均体積を表す。Ｎｆ１＋／−骨髄細胞で再構成された
レシピエントは、ｃ−ｋｉｔ経路を不活化するｃ−ｋｉｔ受容体の変異をさらに含むＮｆ
１＋／−骨髄によって再構成されたマウス（Ｎｆ１＋／−；Ｗ／Ｗ）よりも、有意により
高い平均坐骨神経ＤＲＧ体積を有する。
【００６２】
ここで図４Ｄを参照すると、パネル１〜３に示している切片は、Ｈ＆Ｅで染色されてい
る。パネル４〜６の切片は、アルシアンブルーを用いて染色されている。矢印は、肥満細
胞を強調している。養子移入した骨髄の遺伝子型をパネルのそれぞれの列の下に示してい
る。
【００６３】
実験４
メシル酸イマチニブおよび他の潜在的に可能な薬剤の、腫瘍の負担に対する活性を評価
するために、本発明者らは、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスにおける叢状神経
線維腫の同定および縦断的観察を可能にする非侵襲性のフッ化（fluoridinated）デオキ
シグルコース陽電子放出断層撮影ＦＤＧ−ＰＥＴ画像化プロトコルを実証した（方法の段
落および図８も参照されたい）。
【００６４】
ここで図５Ａを参照すると、メシル酸イマチニブを用いた１２週間の処置後、平均ＦＤ
Ｇ−ＰＥＴ陽性腫瘍において画像が変化する。関心領域、３匹の個々のマウスにおける時
系列のスキャン、および実験上の治療群を確認している。次いで、本発明者らは、２５０
ｍｇ／ｋｇ／日のメシル酸イマチニブまたはプラセボ対照（ＰＢＳ）のいずれかを用いた
経口処置で坐骨神経の領域においてＰＥＴ取込み陽性が確認される８〜９カ月齢のＫｒｏ
ｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスのコホートを同定した。腫瘍の進化を評価するために
、続けてＦＤＧ−ＰＥＴ画像化試験を行った。メシル酸イマチニブまたはＰＢＳを用いた
３週間の処置の前および後に画像化した３匹のマウスからの、影響を受けている神経の代
表的なＦＤＧ−ＰＥＴ軸面切片を示している。予測したように、ＦＤＧの取込みの増加は
、メシル酸イマチニブまたはＰＢＳでの処置前に、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−動
物においてその脊椎の側方に多く認められた（図５Ａ、パネル１、３、５）。ＦＤＧの取
込みは、ＰＢＳ対照（図５Ａ、パネル６）と比較して、メシル酸イマチニブで処置したＫ
ｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウス（図５Ａ、パネル２〜４）において質的に著しく
低下した。処置したすべての動物においてＦＤＧ−ＰＥＴ強度を注意深く定量化するため
に、標準化した関心領域（ＲＯＩ）を各動物において利用して、定量的なＦＤＧの取込み
の値（ｍＣｉ／ｍｌ組織）を求めた。シリンダーの形状の三次元ＲＯＩを利用して、この
ＲＯＩシリンダーで脊柱の側方の領域を封入し、すべての場合にＬ１〜Ｓ１の特定の椎骨
の標識を用いて、均一性を確実にした。治療の前および後の、１匹の実験動物からの代表
的な結果をパネル７〜８（図５Ａ）に示している。これらの画像より、メシル酸イマチニ
ブでの処置は、この動物中の腫瘍サイズを縮小させることが例示される。ここで図５Ｂを
参照すると、１２匹の実験用マウスの１コホートの坐骨神経領域ＲＯＩについてのグラフ
形式で示しているＰＥＴ画像化結果の概要を図面上に表している。全体として、メシル酸
イマチニブで処置したマウスは、処置後のＦＤＧ−ＰＥＴの取込みに平均５０％の減少（
ｐ＜０．０３５）を有した。対照的に、ＰＢＳで処置したコホートにおける腫瘍の代謝活
性は、ＦＤＧ取込み率において、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスで叢状神経線
維腫が出現する時間の関数として観察されるＦＤＧにおける進行性の取込みと比較可能な
、中程度であるが有意でない上昇を有した。
【００６５】
代謝活性（ＦＤＧ取込み）における変化は腫瘍における組織学的な変化と直接関連があ
るかどうかを決定するために、画像化したコホートを屠殺し、脊髄を検査し、組織学的に
評価するために切片を調製した。
【００６６】
ここで図５Ｃの、ビヒクルプラセボ対メシル酸イマチニブで処置したＫｒｏｘ２０；Ｎ
ｆ１ｆｌｏｘ／−マウスの全坐骨神経からの脊髄後根神経節の平均体積を参照する（ビヒ
クル対照群においてｎ＝２８、グリベック処置群においてｎ＝２８）。実線は、各それぞ
れの群の平均体積を示している。各記号は、個々の神経の体積を示している。剖検で、本
発明者らは、Ｋｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスの同年齢のコホートからの
全脊髄後根神経節の体積の比較も行った。ＦＤＧ−ＰＥＴ画像化試験と一致して、メシル
酸イマチニブ処置群では、脊髄後根神経節体積がＰＢＳ処置群と比較して明らかに減少し
ていた。
【００６７】
メシル酸イマチニブまたはＰＢＳで処置したマウスにおける脊髄後根神経節および近位
周囲の神経の組織学的評価も実施した。ここで図５Ｄを参照すると、Ｈ＆Ｅ染色、アルシ
アンブルー染色、およびマッソンのトリクローム染色の後の代表的な切片を示している。
この実験的な療法、標本を調製するために利用した染色を図の左側に示している。各組の
パネルにおける画像の倍率を図の下に示している。列の表題で示しているように、パネル
１〜６に示している試料は、メシル酸イマチニブで処置したマウスから得たものであり、
パネル７〜１２に示している試料は、プラセボのみで処置したマウスから得たものである
。パネル１０の矢印は、それぞれの切片上で認められる肥満細胞を指している。質的に、
プラセボ処置マウスから採取した神経では、メシル酸イマチニブ処置マウスと比較して、
正常な神経構造の異常な崩壊があり、細胞充実性が増大している。これは、遠位後根部お
よび近位神経部を示す組織切片において例示される（図５Ｄ、パネル７〜１２と比較した
パネル１〜６）。さらに、メシル酸イマチニブで処置したマウスから摘出した神経におけ
る肥満細胞の数が、ＰＢＳ処置の対照と比較して著しく減少する（図５Ｄ、パネル３、４
対パネル９、１０）。あわせると、ＰＥＴ、肉眼的解剖および組織学的データにより、Ｋ
ｒｏｘ２０；Ｎｆ１ｆｌｏｘ／−マウスにおいて腫瘍体積を減少させるメシル酸イマチニ
ブの潜在可能性が同定されている。
【００６８】
ここで図５Ｅの、イマチニブで処置したマウスとこの化合物で処置していないマウスと
の間の肥満細胞の数における劇的な差を例示している棒グラフを参照する。ここで図５Ｆ
、メシル酸イマチニブで処置したマウス対この化合物で処置していないマウスから採取し
た試料において、Ｔｕｎｎｅｌ陽性細胞／ＨＰＦがより少ないことを例示している棒グラ
フを参照する。
【００６９】
本発明者らのマウスモデルの１つの限界は、この動物の生存期間が短いことである。し
たがって、本発明者らは、長命の腫瘍がどのように反応すると予想され得るのかを本発明
者らのマウスの試験に基づいて予測することはできない。時間をかけて、腫瘍細胞が、例
えば肥満細胞シュワン細胞相互作用のような、特定の早期のパラクリン事象と独立させる
ようなさらなる特性を得ることも考え得ることである。
【００７０】
実験５
メシル酸イマチニブを用いて特別な配慮によって使用する、叢状神経線維腫を有する小児
の治療。
ＮＦ１を有する乳児および幼児に主に存在する叢状神経線維腫は、速い増殖および近接
器官への浸潤を特徴とすることが多く、正常な器官機能の損傷を生じることが多い。さら
に、これらの腫瘍は、治療法がない悪性腫瘍に進行する可能性が高い。良性の場合でも、
これらの腫瘍が生命を脅かすことがあり、外科手術の治療のような主要な臨床的挑戦は有
効性が限られており、広く許容できる他の療法もない。大きな三叉神経叢状神経線維腫を
含む、ＮＦ１の典型的な臨床徴候を示している３歳児が、生命を脅かす気道圧縮で小児科
腫瘍診療所に紹介された。この状態および関連状態のネズミ科のモデルにおける本発明者
らの現在の試験に基づいて、主治医は、限られた試みのために、この小児に３５０ｍｇ／
ｍ２／用量のメシル酸イマチニブを設定した。
【００７１】
ここで図６の、叢状神経線維腫を有する発端患者におけるメシル酸イマチニブの効力の
評価を参照する。腫瘍の周辺は、双方のパネルにおいて厚い暗線でなぞってある。メシル
酸イマチニブを用いた治療の前（パネル１）および３カ月後（パネル２）の、叢状神経線
維腫を有するＮＦ１患者の頭部および中咽頭の矢状方向のＭＲＩスキャン。治療の前およ
び３カ月後のＭＲＩスキャンにより、著しい約７０％の腫瘍体積の縮小が明らかになった
（図６）。副作用の観察されない６カ月間の治療後、患者は、症状が再発することなしに
治療を６カ月間停止した。
【００７２】
ここで図１３Ａを参照する。横列Ａ、Ｂのパネルは、冠状ＭＲＩ  Ｔ１重み付きＳＴＩ
Ｒ連続画像である。それぞれ、メシル酸イマチニブ前（横列Ａ）およびメシル酸イマチニ
ブを用いた治療の６カ月後（横列Ｂ）。これらの画像により、治療の前および後における
腫瘍サイズの著しい縮小の証拠が示される。
【００７３】
ここで図１３Ｂを参照すると、双方の一連の画像において、メシル酸イマチニブ前の画
像（横列Ｃ）における腫瘍による右への移動を伴う上気道の著しい狭小化（矢印）に対す
る、イマチニブ治療後（横列Ｄの画像）を示している。メシル酸イマチニブを用いた治療
後に得られた画像により、後部から正中線に向かって気道拡大を伴って著しく改善されて
いることが示される。それぞれの画像において、腫瘍の領域を示している。
【００７４】
これは、化合物メシル酸イマチニブを用いた、ヒトにおける医薬介入が結果として叢状
神経線維腫の大きさを有意に縮小させる明白な証拠である。１名のみの患者の経過を反映
しているにもかかわらず、この顕著な結果は、ネズミ科のモデルにおける前臨床試験と一
致している。
【００７５】
多様な態様および実施形態の原理が組み込まれている例示的実施形態を以上に開示して
きたが、本発明は、開示の実施形態によって限定されるものではない。それよりも、本出
願は、本明細書中に開示の一般原理を用いて開示される情報の任意の変形、使用、または
適応をカバーすることを意図するものである。さらに、本出願は、本発明が関連する当分
野で既知のものまたは慣習的に実施されているものに属し、かつ添付の特許請求の範囲の
限定に含まれるような本開示からの逸脱物、およびその等価物をカバーすることを意図す
るものである。
【図１Ａ】
2015187104.tif 000011
【図１Ｂ】
2015187104.tif 000012
【図２Ａ】
2015187104.tif 000013
【図２Ｂ】
2015187104.tif 000014
【図２Ｃ】
2015187104.tif 000015
【図３Ａ】
2015187104.tif 000016
【図３Ｂ】
2015187104.tif 000017
【図３Ｃ】
2015187104.tif 000018
【図３Ｄ】
2015187104.tif 000019
【図３Ｅ】
2015187104.tif 000020
【図３Ｆ】
2015187104.tif 000021
【図４Ａ】
2015187104.tif 000022
【図４Ｂ】
2015187104.tif 000023
【図４Ｃ】
2015187104.tif 000024
【図４Ｄ】
2015187104.tif 000025
【図５Ａ】
2015187104.tif 000026
【図５Ｂ】
2015187104.tif 000027
【図５Ｃ】
2015187104.tif 000028
【図５Ｄ】
2015187104.tif 000029
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
2015187104.tif 000033
【図８】
2015187104.tif 000034
【図９】
2015187104.tif 000035
【図１０】
2015187104.tif 000036
【図１１Ａ】
2015187104.tif 000037
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
2015187104.tif 000039
【図１２】
2015187104.tif 000040
【図１３Ａ】
2015187104.tif 000041
【図１３Ｂ】
2015187104.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月28日(2015.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
叢状神経線維腫を治療するための医薬であって、式１による化合物：
【化６】
2015187104.tif 000043
［式中、
Ｒ１は、４−ピラジニル、１−メチル−１Ｈ−ピロリル、アミノ置換フェニルもしくは
アミノ−低級アルキル置換フェニル（前記アミノ基はそれぞれの場合において、遊離して
いるか、またはアルキル化もしくはアシル化されている）、五員環炭素原子で結合してい
る１Ｈ−インドリルもしくは１Ｈ−イミダゾリル、または環炭素原子において結合してお
り、窒素原子において非置換もしくは酸素で置換されている非置換ピリジルもしくは低級
アルキル置換ピリジルであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ他とは独立に、水素または低級アルキルであり、
基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１個または２個は、それぞれ、ニトロ、
フルオロ置換低級アルコキシまたは式ＩＩの基
−Ｎ（Ｒ９）−Ｃ（＝Ｘ）−（Ｙ）ｎ−Ｒ１０  （ＩＩ）
［式中、
Ｒ９は、水素または低級アルキルであり、
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシミノまたはＯ
−低級アルキル−ヒドロキシミノであり、
Ｙは、酸素または基ＮＨであり、
ｎは、０または１であり、
Ｒ１０は、少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族基、または芳香族、芳香族−脂
肪族、脂環式、脂環式−脂肪族、複素環もしくは複素環−脂肪族の基である］であり、
残りの基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ他とは独立に、水素、非置換
低級アルキルまたは遊離もしくはアルキル化アミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロ
リジニルもしくはモルホリニルによって置換されている低級アルキル、または低級アルカ
ノイル、トリフルオロメチル、遊離もしくはエーテル化もしくはエステル化ヒドロキシ、
遊離もしくはアルキル化もしくはアシル化アミノ、または遊離もしくはエステル化カルボ
キシである］
または少なくとも１個の塩形成基を有する該化合物の塩を治療上有効な少なくとも１用量
含み、式１による該化合物の治療有効用量が２００ｍｇ〜５００ｍｇであり、該化合物の
該用量が患者に少なくとも１日１回投与される、医薬。
【請求項２】
前記化合物が式１の薬学的に許容できる塩である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記式１の薬学的に許容できる塩がメシル酸塩である、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
前記治療有効用量が叢状神経線維腫を有すると診断された患者に投与される、請求項１
に記載の医薬。
【請求項５】
前記治療有効用量が叢状神経線維腫を生じるリスクにあると同定された患者に投与され
る、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
式１による前記化合物の前記治療上有効な用量が３５０ｍｇ〜４５０ｍｇであり、前記
化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
式１による前記化合物の前記治療上有効な用量が４００ｍｇであり、前記化合物の前記
用量が患者に１日２回投与される、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
叢状神経線維腫を治療するための医薬であって、式２による化合物
【化７】
2015187104.tif 000044
を治療上有効な少なくとも１用量含み、式２による該化合物の治療上有効な用量が２００
ｍｇ〜５００ｍｇであり、該化合物の該用量が患者に少なくとも１日１回投与される、医
薬。
【請求項９】
前記化合物が式２の薬学的に許容できる塩である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
前記治療有効用量が叢状神経線維腫を有すると診断された患者に投与される、請求項８
に記載の医薬。
【請求項１１】
前記治療有効用量が叢状神経線維腫を生じるリスクにあると同定された患者に投与され
る、請求項８に記載の医薬。
【請求項１２】
式２による前記化合物の前記治療上有効な用量が３５０ｍｇ〜４５０ｍｇであり、前記
化合物の前記用量が患者に少なくとも１日１回投与される、請求項８に記載の医薬。
【請求項１３】
式２による前記化合物の前記治療上有効な用量が４００ｍｇであり、前記化合物の前記
用量が患者に１日２回投与される、請求項８に記載の医薬。
【外国語明細書】
2015187104000001.pdf