(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、前記タンパク質を高効率に製造する方法の提供。【解決手段】シグナル認識粒子と、Ｎ末端側にシグナル認識粒子依存性シグナルペプチドを付加したタンパク質とを、宿主で共発現させることでタンパク質の生産量を向上させる方法であって、ここで、タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質であり、シグナル認識粒子がＦｆｈであるタンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル認識粒子と、Ｎ末端側にシグナル認識粒子依存性シグナルペプチドを付加したタンパク質とを、宿主で共発現させる、前記タンパク質の製造方法。
【請求項２】
タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
シグナル認識粒子がＦｆｈである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
宿主が大腸菌である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
シグナル認識粒子依存性シグナルペプチドが配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
Ｆｆｈが配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４または５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、前記タンパク質を高効率に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体（遺伝子組み換え体）を用いた異種タンパク質の生産は、バイオ医薬などに用いられる有用タンパク質を生産する際に広く利用されている。しかしながら、分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質を前記宿主内に発現させようとした場合、前記宿主内が還元的雰囲気であったり、前記宿主内にジスルフィドイソメラーゼが存在しない等の理由で、前記タンパク質が正しい立体構造をとることができず、結果として、タンパク質としての機能を有しないインクルージョンボディとして生産されることがある。
【０００３】
この現象を防ぐため、例えば、遺伝子組み換え大腸菌を用いた異種タンパク質の生産では、当該タンパク質のＮ末端側にシグナルペプチドまたはリーダーペプチドと呼ばれる１５から３０アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを付加することで、酸化的雰囲気かつジスルフィドイソメラーゼが存在する、大腸菌の外膜と内膜との間のペリプラズム領域に分泌発現させる方法が知られている（特許文献１）。細胞におけるタンパク質分泌において、シグナルペプチドは内膜のＳｅｃＡ、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ等の膜タンパク質より構成される分泌チャンネルに目的タンパク質を結合させる機能を有し、当該目的タンパク質が分泌チャンネルを通過してペリプラズム領域に移送されるとシグナルペプチダーゼと呼ばれるプロテアーゼにより、付加したシグナルペプチドが目的タンパク質から分離除去される。シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の特徴として、以下の３つがあげられる（特許文献１）。
（ｉ）Ｎ末端領域には、アルギニンやリジンといった塩基性アミノ酸が少なくとも１つ含まれており、当該塩基性アミノ酸の側鎖の正電荷と細胞膜表面の負電荷とのイオン結合によりシグナルペプチドが細胞膜内へと移行する。
（ｉｉ）中心領域では、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンといった疎水性アミノ酸が多く含まれ、細胞膜内への貫通に関与する。
（ｉｉｉ）Ｃ末端領域では、細胞膜貫通後にシグナルペプチダーゼにより切断される特定のアミノ酸が認識部位として存在しており、当該認識部位で切断されることで成熟体タンパク質がペリプラズム領域や細胞外へと放出される。
【０００４】
組換えタンパク質を宿主のペリプラズム領域に分泌発現させるには、前記タンパク質のＮ末端側に、ペリプラズムへの分泌発現を促進させるシグナルペプチドが付加された状態で発現させる必要がある。しかしながら、前記方法を用いた場合、活性型タンパク質としての生産性が低いという問題があった。またシグナルペプチドの改変により生産性を向上させた例も報告（特許文献１から３）されているが、工業的な生産には十分とはいえなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１７５６８６号公報
【特許文献２】特開２００８−０７３０４４号公報
【特許文献３】ＷＯ２００８／０３２６５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、前記タンパク質を高効率に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、シグナル認識粒子と、Ｎ末端側にシグナル認識粒子依存性シグナルペプチドを付加したタンパク質とを、宿主で共発現させることで、前記タンパク質の生産量が向上できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（Ａ）シグナル認識粒子と、Ｎ末端側にシグナル認識粒子依存性シグナルペプチドを付加したタンパク質とを、宿主で共発現させる、前記タンパク質の製造方法。
【０００９】
（Ｂ）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（Ａ）に記載の製造方法。
【００１０】
（Ｃ）シグナル認識粒子がＦｆｈである、（Ａ）または（Ｂ）に記載の製造方法。
【００１１】
（Ｄ）宿主が大腸菌である、（Ｃ）に記載の製造方法。
【００１２】
（Ｅ）シグナル認識粒子依存性シグナルペプチドが配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、（Ｄ）に記載の製造方法。
【００１３】
（Ｆ）Ｆｆｈが配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（Ｄ）または（Ｅ）に記載の製造方法。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
本発明の製造方法は、宿主で発現させようとするタンパク質のＮ末端側にシグナル認識粒子（Ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下ＳＲＰと表記）依存性ペプチドを付加した上で、当該タンパク質とＳＲＰとを共発現させて製造することに特徴がある。ＳＲＰは分泌シャペロンの一つであり、タンパク質とＲＮＡの複合体である。真核生物では６個のタンパク質（ＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ１９、ＳＲＰ５４、ＳＲＰ６８、ＳＲＰ７２）と７Ｓ  ＲＮＡより構成され、原核生物ではＳＲＰ５４の相同体であるＦｆｈと呼ばれる分子量５万のタンパク質と４．５Ｓ  ＲＮＡより構成される（Ｓａｒａｏｇｉ等，Ｔｒａｆｆｉｃ，１２（５），５３５−５４２，２０１１）。ＳＲＰは、ｍＲＮＡ−リボゾーム複合体からタンパク質のシグナルペプチド部分が合成されると、直ちに当該タンパク質に結合して分泌チャンネルに移送し、ｍＲＮＡ−リボゾーム−合成途中タンパク質−ＳＲＰ−分泌チャンネルの複合体が形成される。タンパク質は合成されながら分泌チャンネルを通過し、ペリプラズム領域で正しい立体構造にフォールディングされる。ＳＲＰとＳＲＰ依存性シグナルペプチドは、異種タンパク質を発現させようとする宿主に応じて適切なものを選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合の好ましい一例として、ＳＲＰは配列番号２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＧＤ７）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｆｆｈ）があり、ＳＲＰ依存性シグナルペプチドはＤｓｂＡシグナルペプチド（配列番号３、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＧ４）、ＴｏｒＴシグナルペプチド、ＴｏｌＢシグナルペプチドがある。
【００１６】
Ｎ末端側にＳＲＰ依存性ペプチドを付加したタンパク質とＳＲＰとを共発現させるには、Ｎ末端側にＳＲＰ依存性ペプチドを付加したタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）およびＳＲＰをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）を同じ発現ベクターに挿入し、当該ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで共発現させてもよいし、ポリヌクレオチドＡとポリヌクレオチドＢをそれぞれ異なる発現ベクターに挿入し、当該二つの発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで共発現させてもよい。宿主が大腸菌の場合、ポリヌクレオチドＡおよびポリヌクレオチドＢを挿入する発現ベクターとしてはｐＴｒｃやｐＵＣが例示でき、ポリヌクレオチドＡとポリヌクレオチドＢをそれぞれ異なる発現ベクターに挿入する場合における、ポリヌクレオチドＡを挿入する発現ベクターとしてはｐＴｒｃが、ポリヌクレオチドＢを挿入する発現ベクターとしてはｐＡＣＹＣが、それぞれ例示できる。
【００１７】
本発明の製造方法で製造するタンパク質に特に限定はなく、一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモンなどのヒト由来タンパク質、およびそれらの受容体タンパク質があげられる。なお、本発明の製造方法で製造するタンパク質は、完全体であってもよいし、当該タンパク質の機能に重要な部分のみから構成されるタンパク質であってもよいし、さらに当該タンパク質を構成するアミノ酸の一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されていてもよい。以降、本発明の製造方法により製造可能なタンパク質のうち、ヒトＦｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。
【００１８】
本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）（図１参照）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、があげられる。
【００１９】
前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質や、配列番号３１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つの置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１２−２７０３７５号）があげられる。
（１）配列番号３１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号３１の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号３１の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号３１の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号３１の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号３１の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号３１の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号３１の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号３１の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号３１の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号３１の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号３１の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号３１の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号３１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号３１の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号３１の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号３１の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号３１の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号３１の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号３１の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号３１の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号３１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号３１の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号３１の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号３１の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号３１の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号３１の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号３１の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号３１の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号３１の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号３１の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号３１の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号３１の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号３１の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号３１の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号３１の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号３１の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号３１の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号３１の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号３１の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号３１の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号３１の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
本発明の製造方法で用いる宿主としては、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌等が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。なお宿主が大腸菌でタンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合は、特開２０１２−０３４５９１号に開示した方法等により、遺伝子組み換え大腸菌を培養することで、ヒトＦｃ結合性タンパク質とＳＲＰとを共発現させればよい。
【００２０】
本発明の製造方法において、宿主培養液から発現したタンパク質を回収するには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズム領域に発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで、発現したタンパク質を含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズム領域から培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したタンパク質を回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと６ｍＭ  ＭｇＳＯ４と２５０Ｕ／Ｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）と０．３ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅと０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．５％  ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）と５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（特願２０１２−１２９７３２号）や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。
【００２１】
回収したタンパク質を含む溶液は、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等により当該タンパク質を精製単離することができる。陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基といった陽イオン交換基を担体に結合したものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０（以上、東ソー社製）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）があげられる。疎水クロマトグラフィー用担体は、エーテル基、フェニル基、ブチル基といった疎水性官能基を担体に結合させたものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｅｔｈｅｒ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０（以上、東ソー社製）があげられる。各種クロマトグラフィー用担体を用いて精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／トリス塩酸塩緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等）により平衡化しておく。前述の方法で回収したタンパク質を含む溶液を、平衡化したクロマトグラフィー用担体に導入することで前記タンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、溶出用緩衝液を用いて吸着した前記タンパク質を溶出させることにより精製された前記タンパク質を含む溶液を得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）と、Ｎ末端側にＳＲＰ依存性シグナルペプチドを付加したタンパク質とを、宿主で共発現させて、前記タンパク質を製造することを特徴としている。本発明の製造方法により、組換えタンパク質の生産量を大幅に向上させることが可能となり、産業上有用な組換えタンパク質の製造効率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】天然型ヒトＦｃγＲＩの構造を示す図。
【実施例】
【００２４】
以下、タンパク質としてヒトＦｃ結合性タンパク質を用いたときの実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質発現ベクターの作成
（１）大腸菌Ｗ３１１０株をＬＢ平板培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。
（２）（１）の大腸菌コロニーを鋳型とし、配列番号４（５’−ｇａａｔｔｃｇｔｇｃａｃｇａｔａａａｔｇｔｔｔｇａｔａａｔｔｔａ−３’）および配列番号５（５’−ｇａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｔａｇｃｇａｃｃａｇｇｇａａ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは表１に示す反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間加熱し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃での５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰返した後、７２℃で７分加温することで実施した。得られたＰＣＲ産物を、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて精製することで、ＳＲＰのタンパク質成分であるＦｆｈ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（約１．５ｋｂｐ）を得た。
【００２６】
【表１】
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（３）得られたＦｆｈをコードするポリヌクレオチドを制限酵素Ａｌｗ４４ＩおよびＰｓｔＩで消化し、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
（４）市販ベクターｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社）を制限酵素Ａｌｗ４４ＩおよびＰｓｔＩで消化し、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。得られた制限酵素消化ベクターは、タカラバイオ社製アルカリフォスファターゼを用いて５０℃で３０分処理後、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて精製することで、約３．５ｋｂｐの一本鎖ポリヌクレオチドを得た。
（５）（２）と（３）で得たポリヌクレオチドを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、このライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（和光純薬社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＡＣＹＣＳＲＰを抽出した。
（７）（６）で作製した発現ベクターｐＡＣＹＣＳＲＰのうち、Ｆｆｈおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジー社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号７（５’−ｔｃｃｃｔｔｔｔｔｔｇｃｇｇｃａｔｔｔｔｇｃｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔｔｔｇｃｔｃａｃ−３’）または配列番号８（５’−ｃｇｃｃｔｃｃａｔｃｃａｇｔｃｔａｔｔａａｔｔｇｔｔｇｃｃｇｇｇａａｇｃｔａｇａ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。解析の結果設計通りであることを確認した。Ｆｆｈ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に示す。
【００２７】
比較例１  ＳｅｃＢ発現ベクターの作成
比較のため、ＳＲＰとは異なる分泌シャペロンである、ＳｅｃＢを発現可能なベクターを作成した。ＳｅｃＢは細胞質で生産されたタンパク質に結合し、分泌チャンネル通過までの間、タンパク質の凝集を防ぐとともにアンフォールドの状態に保つと考えられている(Ｃｏｌｌｉｅｒ等，Ｃｅｌｌ，５３（２），２７３−２８３，１９８８)。ＳｅｃＢの介在で、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ｐＩＩＩといったタンパク質が分泌される。
【００２８】
プライマーとして配列番号９（５’−ｇａａｔｔｃｇｔｇｃａｃｇａｔａａａｔｇｔｃａｇａａｃａａａａｃ−３’）および配列番号１０（５’−ｇａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｔｃａｇｇｃａｔｃｃｔｇａｔｇ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、実施例１（１）から（６）と同様の操作を行ない、ＳｅｃＢ（配列番号１１）をコードする約４７０ｂｐのポリヌクレオチドを市販ベクターｐＡＣＹＣ１７７に挿入した発現ベクターｐＡＣＹＣＳｅｃＢを得た。また実施例１（７）と同様の操作を行ない、ベクターに挿入したＳｅｃＢをコードするポリヌクレオチドの配列が設計通りであることを確認した。ＳｅｃＢをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。
【００２９】
実施例２  ｐＴｒｃｄｓｂベクターの作製
ＳＲＰ依存性シグナルペプチドの一つである、ＤｓｂＡシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＫＩＷＬＡＬＡＧＬＶＬＡＦＳＡＳＡ、配列番号３）をコードするオリゴヌクレオチドを、以下に示す方法で発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入することで、発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂを作製した。
（１）配列番号１３（５’−ｃａｔｇａａａａａａａｔｃｔｇｇｃｔｇｇｃｇｃｔｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｔｔｔａｇｃｇｃｇａｇｃｇｃｇａａａａｔｃｇａａｇａａｇｃ−３’）および配列番号１４（５’−ｃａｔｇｇｃｔｔｃｔｔｃｇａｔｔｔｔｃｇｃｇｃｔｃｇｃｇｃｔａａａｃｇｃｃａｇｃａｃｃａｇａｃｃｃｇｃｃａｇｃｇｃｃａｇｃｃａｇａｔｔｔｔｔｔｔ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合し、９５℃で５分間加熱後、１５℃になるまで１分間で１℃毎に温度を下げることで、二本鎖オリゴヌクレオチドＤｓｂＡｐ１を調製した。なお、ＤｓｂＡｐ１は使用時まで１５℃で保持した。
（２）（１）で調製したＤｓｂＡｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで消化した発現ベクターｐＴｒｃ９９ａに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、このライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂのうち、ＤｓｂＡシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジー社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１５（５’−ｔｇｔｇｇｔａｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｇｇ−３’）または配列番号１６（５’−ｔｃｇｇｃａｔｇｇｇｇｔｃａｇｇｔｇ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。解析の結果設計通りであることを確認した。
【００３０】
実施例３  ヒトＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８）発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧの作製
実施例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂに、Ｃ末端側にシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＧ）を付加したヒトＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８−ＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを挿入することで、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧを作製した。なおヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８（配列番号１８）は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列中、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域からなるヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報）のうち、
配列番号１７の３７番目のスレオニンがイソロイシンに、
配列番号１７の６３番目のバリンがグルタミン酸に、
配列番号１７の６９番目のアラニンがバリンに、
配列番号１７の７１番目のセリンがロイシンに、
配列番号１７の８４番目のセリンがスレオニンに、
配列番号１７の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、
配列番号１７の２９２番目のプロリンがリジンに、
配列番号１７の２９３番目のグルタミン酸がリジンに、
配列番号１７の２９７番目のグルタミンがリジンに、
配列番号１７の３０１番目のヒスチジンがリジンに、
配列番号１７の３０４番目のプロリンがリジンに、
それぞれアミノ酸置換したヒトＦｃ結合性タンパク質である。またヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（配列番号１７）のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列において１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、当該領域において６０箇所アミノ酸置換が生じている（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号１９に記載の配列からなるＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、配列番号２０（５’−ｃａｔｇｃｃａｔｇｇｇａｃａａｇｔａｇａｔａｔｃｃｃｃａａａｇｃｔｇｔｇａｔｔａａｇｃｔｇｃａａｃｃ−３’）および配列番号２１（５’−ｃｃｇｇａａｇｃｔｔａｇｃｃｇｃａｇｔｃｃｇｇｇｇｔｃｔｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔａｃｃｃａｇｔａｃ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、ヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）得られたＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例２で作製の発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂにライゲーションし、そのライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを添加したＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧのうち、ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例２（５）と同様の方法でヌクレオチド配列を解析した。
【００３１】
発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２３に、それぞれ示す。なお配列番号２２において、１番目のメチオニンから１９番目のアラニンまでがＤｓｂＡシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）、２７番目のグルタミンから３００番目のアスパラギン酸までがヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号１８）、３０１番目のシステインから３０２番目のグリシンまでがシステインタグのアミノ酸配列である。なお配列番号２２において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（２７番目のグルタミンから３００番目のアスパラギン酸までの領域）は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。
【００３２】
比較例２  ヒトＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８）発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧの作製
比較のため、ＳｅｃＢ依存性シグナルペプチドの一つである、ＰｅｌＢシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号２４）をヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８−ＣＧのＮ末端側に付加したポリペプチドを発現可能なベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧを作製した。
（１）オリゴヌクレオチドとして、配列番号２５（５’−ｃａｔｇａａａｔａｃｃｔｇｃｔｇｃｃｇａｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｔｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｃｇｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｇｇｃｇａｔｇｇｃ−３’）および配列番号２６（５’−ｃａｔｇｇｃｃａｔｃｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｃａｇｃｇａｇｇａｇｃａｇｃａｇａｃｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇｃａｇｃａｇｇｔａｔｔｔ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、実施例２と同様の操作を行なうことで、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをｐＴｒｃ９９ａに挿入した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを作製した。
（２）発現ベクターとして、（１）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを用いた他は、実施例３（１）から（３）と同様な操作を行なうことで、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧを調製した。
（３）実施例２（５）と同様な方法で、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧのヌクレオチド配列を解析した。
【００３３】
発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２８に、それぞれ示す。なお配列番号２７において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２４）、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがヒトＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号１８）、２９９番目のシステインから３００番目のグリシンまでがシステインタグのアミノ酸配列である。なお配列番号２７において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までの領域）は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。
【００３４】
実施例４  ｐＡＣＹＣＳＲＰおよびｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧでの形質転換とヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
（１）実施例１で作製したＦｆｈ発現ベクターｐＡＣＹＣＳＲＰおよび実施例３で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧ発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧで大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを添加したＬＢ平板培地上で形質転換体を分離した。
（２）分離したコロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを添加したＬＢ培地２０ｍＬに植菌後、１００ｍＬの振とうフラスコ中、３０℃で３時間振とう培養し、２０℃に冷却後、０．０５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２０℃で２日間振とう培養した。
（３）（２）の培養液１ｍＬを遠心分離して培養上清と菌体を分離した。回収した菌体は、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ溶液（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を１ｍＬ加えて２０分間浸透させることで溶菌処理を行ない、再度遠心分離して残渣を除くことで、菌体抽出液を得た。
（４）（３）で得た培養上清および菌体抽出液中のヒトＦｃ結合性タンパク質の量を以下に示すＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定し（４℃で１８時間）、固定化終了後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、１．０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）によりブロッキングした。
（４−２）前記洗浄緩衝液にて洗浄後、酸処理液を１．０ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ａｎｔｉ−ｈＦｃγＲ１／ＣＤ６４抗体試薬（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加した（３０℃で１時間）。
（４−４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＧｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ｈ＋ＩＨＲＰ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（４−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３５】
定量の結果、培養上清中に４．９ｍＬ／Ｌ、菌体抽出液中に２．６ｍｇ／Ｌ、合計７．５ｍｇ／ＬのヒトＦｃ結合性タンパク質を生産していることが確認された。
【００３６】
比較例３  ｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧのみでの形質転換とヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
（１）実施例３で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧ発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧのみで大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを添加したＬＢ平板培地上で形質転換体を分離した。
（２）分離したコロニーを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを添加したＬＢ培地２０ｍＬに植菌後、１００ｍＬの振とうフラスコ中、３０℃で３時間振とう培養し、２０℃に冷却後、０．０５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２０℃で２日間振とう培養した。
（３）実施例４（３）から（４）と同様な操作を行なうことで、ヒトＦｃ結合性タンパク質生産性を評価した。
【００３７】
定量した結果、培養上清中に２．２ｍＬ／Ｌ、菌体抽出液中に３．６ｍｇ／Ｌ、合計５．８ｍｇ／ＬのヒトＦｃ結合性タンパク質を生産していることが確認された。実施例４と比較し、菌体抽出液へのヒトＦｃ結合性タンパク質の発現量は高かったものの、培養上清へのヒトＦｃ結合性タンパク質の発現量は低く（半分以下）、合計の発現量も低かった。すなわち宿主で、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）とＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加した目的タンパク質とを共発現させることで、前記目的タンパク質の（特に培養上清への）生産性が向上することがわかる。
【００３８】
比較例４  ｐＡＣＹＣＳｅｃＢおよびｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧでの形質転換とヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換させるためのベクターとして、比較例１で作製したＳｅｃＢ発現ベクターｐＡＣＹＣＳｅｃＢおよび実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧ発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧを用いた他は、実施例４と同様な操作を行ない、ヒトＦｃ結合性タンパク質生産性を評価した。
【００３９】
定量した結果、ヒトＦｃ結合性タンパク質の生産量は、培養上清中に２．６ｍＬ／Ｌ、菌体抽出液中に２．２ｍｇ／Ｌ、合計４．８ｍｇ／Ｌと、いずれも実施例４と比較し低かった。すなわち宿主で、ＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加した目的タンパク質とＳＲＰ以外の分泌シャペロン（ＳｅｃＢ）とを共発現させても、当該目的タンパク質の生産性向上に寄与しないことがわかる。
【００４０】
比較例５  ｐＡＣＹＣＳＲＰおよびｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧでの形質転換とヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換させるためのベクターとして、実施例１で作製したＦｆｈ発現ベクターｐＡＣＹＣＳＲＰおよび比較例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧを用いた他は、実施例４と同様な操作を行ない、ヒトＦｃ結合性タンパク質生産性を評価した。
【００４１】
定量した結果、ヒトＦｃ結合性タンパク質の生産量は、培養上清中に０．３８ｍＬ／Ｌ、菌体抽出液中に２．６ｍｇ／Ｌ、合計２．９ｍｇ／Ｌと、いずれも実施例４と比較し低かった。すなわち宿主で、ＳＲＰとＳｅｃＢ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加した目的タンパク質とを共発現させても、当該目的タンパク質の生産性向上に寄与しないことがわかる。
【００４２】
比較例６  ｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧのみでの形質転換とヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換させるためのベクターとして、比較例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧのみを用いた他は、比較例３と同様な操作を行ない、ヒトＦｃ結合性タンパク質生産性を評価した。
【００４３】
定量した結果、ヒトＦｃ結合性タンパク質は、菌体抽出液中にのみ２．３ｍｇ／Ｌ生産し、培養上清へは発現しなかった。
【００４４】
比較例７  ｐＡＣＹＣＳｅｃＢおよびｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧでの形質転換とヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換させるためのベクターとして、比較例１で作製したＳｅｃＢ発現ベクターｐＡＣＹＣＳｅｃＢおよび比較例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌＦｃＲｍ６８−ＣＧのみを用いた他は、比較例３と同様な操作を行ない、ヒトＦｃ結合性タンパク質生産性を評価した。
【００４５】
定量した結果、Ｆｃ結合性タンパク質は、菌体抽出液中にのみ２．９ｍｇ／Ｌ生産し、培養上清へは発現しなかった。すなわち宿主で、ＳｅｃＢとＳｅｃＢ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加した目的タンパク質とを共発現させても、当該目的タンパク質の生産性向上に寄与しないことがわかる。
【００４６】
実施例５  ＳＲＰ／Ｆｃ結合性タンパク質タンデム発現ベクターの作製、当該ベクターでの形質転換およびヒトＦｃ結合性タンパク質生産性評価
実施例４では、ＳＲＰとＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加したタンパク質とを共発現させる際に、ＳＲＰをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、およびＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて宿主を形質転換させたが、本実施例では、ＳＲＰをコードするポリヌクレオチドおよびＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む一つのベクターを用いて宿主を形質転換し、当該タンパク質の生産性を評価した。
（１）実施例１で作製したｐＡＣＹＣＳＲＰを鋳型とし、配列番号２９（５’−ａｇｔｔｇｇａａｇｃｔｔａｔｇｔｔｔｇａｔａａｔｔｔａ−３’）および配列番号３０（５’−ｃｃａｔｔｇａａｇｃｔｔｔｔａｇｃｇａｃｃａｇｇｇａａ−３’）の記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとした他は、実施例１（２）と同様な操作でＰＣＲを行ない、Ｆｆｈをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）実施例３で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧ発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製後、タカラバイオ社製アルカリフォスファターゼで５０℃で３０分処理し、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて当該ベクターを精製した。
（３）（１）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、（２）で得られたベクターにライゲーションし、このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（タカラバイオ社）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを添加したＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドとＳＲＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧ−ＳＲＰを抽出した。
（５）（４）で得られた発現ベクターｐＴｒｃｄｓｂＦｃＲｍ６８−ＣＧ−ＳＲＰを、実施例２（５）と同様に配列分析を行ない、設計通りの配列であることを確認した。
（６）（３）で得られた形質転換体を実施例４と同様な操作を行ない、ヒトＦｃ結合性タンパク質の生産性を確認した。
【００４７】
定量した結果、培養上清中に４．７ｍｇ／Ｌ、菌体抽出液中に２．２ｍｇ／Ｌ、合計６．９ｍｇ／ＬのヒトＦｃ結合性タンパク質を生産していることが確認された。すなわち、ＳＲＰをコードするポリヌクレオチドおよびＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む一つのベクターで宿主を形質転換して得られた形質転換体を用いて、ＳＲＰとＳＲＰ依存性シグナルペプチドをＮ末端側に付加したタンパク質とを共発現させても、当該タンパク質の生産性を向上させることができることがわかる。
【００４８】
実施例４および５ならびに比較例３から７の結果をまとめたものを表２に示す。
【００４９】
【表２】
2015023821.tif 000003
【図１】
2015023821.tif 000004
【配列表】
2015023821000001.app