(57)【要約】      （修正有）【課題】アテローム性動脈硬化症の効果的な治療法の提供。【解決手段】２０〜９０重量％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有する食事用油組成物の効果量を対象へ投与することにより、循環酸化低密度リポタンパク質‐ベータ‐２‐糖タンパク質１及び循環ミエロペルオキシダーゼのレベルを低下させる方法を含む、アテローム性動脈硬化症の効果的な治療法。食事用油組成物が１５〜２５重量％の飽和脂肪酸（ＳＦＡ）、４０〜６０重量％の一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、及び５〜３５％のＰＵＦＡを含む治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清中の循環ｏｘＬＤＬ‐ベータ‐２‐糖タンパク質１複合体および循環ミエロペルオキシダーゼを減少させるための治療用組成物であって、当該治療用組成物が１ないし９９％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む魚油製剤を含み、前記多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を、ＤＨＡとＥＰＡとＤＰＡの比率が０．１ないし１、０．１ないし０．５、および０．５ないし１の比率で含有することを特徴とする治療用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の治療用組成物において、該ＰＵＦＡを混合した治療用組成物が、ドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）から選択される組合せが実質的に単一のＰＵＦＡが支配的にならないように含まれていることを特徴とする治療用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の治療用組成物において、該組成物が１５〜２５重量％の飽和脂肪酸（ＳＦＡ）、４０〜６０重量％の一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、および５〜３５％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含むことを特徴とする治療用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の治療用組成物において、該組成物の剤形がカプセルであり、当該カプセルはヒトにおいて１日あたり１０００ｍｇの投与量で有効であることを特徴とする治療用組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の治療用組成物において、前記剤形が前記治療用組成物を含有する食用油であって、ヒトにおいて１日あたり１６ｍｌの最小投与量で有効である食用油を含有していることを特徴とする治療用組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の治療用組成物を製造する方法であって：
ａ）食用油を容器に投入するステップと；
ｂ）多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）であるドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を、ＤＨＡとＥＰＡとＤＰＡの比率が０．１ないし１、０．１ないし０．５、および０．５ないし１で提供するサーモン油を前記容器に添加する、ステップと；
ｃ）前記食用油とサーモン油を攪拌して混合するステップと；
を具えることを特徴とする、治療用組成物を製造する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の治療用組成物を製造する方法が、前記食用油とサーモン油以外の天然由来の抗酸化剤を添加するステップを具えることを特徴とする、治療用組成物を製造する方法。
【請求項８】
請求項６に記載の治療用組成物を製造する方法において、前記食用油が植物油を含むことを特徴とする、治療用組成物を製造する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の治療用組成物を製造する方法において、前記植物油が落花生油、糠油、大豆油、トウモロコシ油、ゴマ油、カノーラ油、サフラワー油、オリーブ油、およびピーナッツ油から成る群より選択されることを特徴とする、治療用組成物を製造する方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の治療用組成物を製造する方法において、該食用油がビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、または抗酸化植物抽出物の少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、治療用組成物を製造する方法。
【請求項１１】
ヒト血清中の循環ｏｘＬＤＬ‐ベータ‐２‐糖タンパク質１複合体および循環ミエロペルオキシダーゼを減少させるための、請求項１に記載の治療用組成物の製造における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）であるドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００８年１１月１４日出願の米国仮特許出願第６１／１１４，８２３号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明の態様は、アテローム性動脈硬化症の予防および治療のための、循環酸化低密度リポタンパク質‐ベータ‐２‐糖タンパク質１複合体を減少させる、天然の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有料理油組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
循環コレステロールの増加は、アテローム性動脈硬化症の発症における確立されたリスク因子である。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁が弱くなり、これらの血管内における血流が細るプロセスとして説明することができる。この一連のイベントは、冠動脈で発生することが多く、これは心臓への血流の遮断を引き起こして心筋梗塞（心臓の損傷）につながり、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）と称される場合が多い。
【０００４】
血清コレステロールの濃度を制御するスタチンなどの治療薬は、冠動脈心疾患の治療にある程度の効果を持つことが示されている。このような治療薬は、コレステロール合成自体を阻害することによってコレステロールを有するリポタンパク質の循環レベルを調節するが、アテローム性動脈硬化症の開始に必要とされる段階であるコレステロール吸収または酸化などの下流イベントには効果を示さない。しかし、コレステロールレベルは、食事による動物性脂肪の摂取量が高いこと、ならびに食事による供給が不十分であると判断される場合に肝臓およびその他の組織中において身体がコレステロールを合成することにより、常に上昇への圧力を受けている。
【０００５】
大きく分けて４種類のリポタンパク質が公知であり、これらはすべて、脂質核をリン脂質およびアポリポタンパク質の両親媒性表面層が取り囲むという類似の基本構造を共有している。脂質核が大きいほど、リポタンパク質粒子の密度は低くなる。これらは、サイズが小さい順に：末梢組織からコレステロールを捕捉することで脂質コアを作り出し、従って「善玉コレステロール」と称される場合が多い、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）；超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）のレムナントから肝臓で形成される、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）；やはり肝臓で作られ、主としてトリグリセリド、ならびに小腸で形成されてトリグリセリドおよび食事性脂肪から構成されるカイロミクロンを含有する、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；である。
【０００６】
有用な抗アテローム性動脈硬化症薬である化合物が多くの特許で開示されている。例えば、「患者におけるコレステロールの生合成を阻害する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ）」を開示する米国特許第４，６８１，８９３号、および「ヒドロキシ置換アゼチジノン化合物およびＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の組み合わせ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｚｅｔｉｄｉｎｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ＨＭＧ  ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」を開示する米国特許第５，８４６，９６６号である。この特許（米国特許第４，６８１，８９３号）、ならびに本願で言及されるすべてのその他の特許および特許出願は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【０００７】
ＬＤＬはアテローム性動脈硬化症を発症させる前に一連の転換および複合体化を経る必要があるという考えが、より最近の証拠によって支持されている。推定される初期の段階は、アテローム性動脈硬化症の発症において中心的な役割を果たす酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）の形成である。ＬＤＬは、酸化修飾によってその生物学的性質が変化し、その結果として、成長因子、ならびに内皮細胞、平滑筋細胞、およびマクロファージからのサイトカイン産生の調節に加えて、単球およびＴリンパ球の化学遊走が発生する。培養内皮細胞からのｏｘＬＤＬの細胞毒性は、アテローム生成的であることが明らかに実証されている。これらの研究から動脈壁におけるＬＤＬ酸化のアテローム生成メカニズムが明らかに示されたが、その後の研究では、冠動脈心疾患の患者における循環ｏｘＬＤＬレベルの臨床的重要性に対してより重点が置かれ始めている。この循環ｏｘＬＤＬは、マロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ‐ＬＤＬ）および銅ｏｘＬＤＬに対して産生されたマウスモノクローナル抗体を用いた免疫測定法によって測定される。
【０００８】
より最近の試験もまた、冠動脈心疾患の患者において血漿中ｏｘＬＤＬレベルの上昇が見られることを示している。血漿中ｏｘＬＤＬレベルの上昇は、ＣＨＤに対する生化学的リスクマーカーとして確立されている。ｏｘＬＤＬレベルが、高血圧症、高脂血症、または喫煙などのその他のリスク因子との関連性を持たないことは、ｏｘＬＤＬレベルの上昇がＣＨＤに対する独立したリスク因子であることを示唆しており、全コレステロール、トリグリセリド、ａｐｏＢ、またはＨＤＬレベルなどのその他の生化学的マーカーと比較すると、ｏｘＬＤＬレベルとＣＨＤとの間の関連性は、ＣＨＤに対する非常に優れたリスク指標である。
【０００９】
内皮細胞によるｏｘＬＤＬの取り込みもまた、アテローム性動脈硬化症の開始および発症に不可欠な段階であることが示されている。接着分子は炎症マーカーであり、これはｏｘＬＤＬによって上方制御され、アテローム生成において中心的な役割を果たしている。ｏｘＬＤＬがＣＨＤに寄与することを示し得る別の形は、アテローム性動脈硬化巣におけるアポトーシス細胞の蓄積を補助することによる。
【００１０】
魚油、およびより具体的には魚油の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）成分であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）は、強心刺激薬（ｃａｒｄｉｏｔｏｎｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）として使用される可能性を持つことが示された。ヒト冠動脈内皮細胞で実施されたいくつかのインビトロ実験から、ＥＰＡおよびＤＨＡが、魚および魚油の抗アテローム性動脈硬化症効果の１つの経路であり得る接着分子発現の低減を行う可能性のあることが示唆された。
【００１１】
別の例では、食事性魚油の大動脈血栓症、血小板凝集、およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性に対する影響がラットモデルで研究され、恐らくは血小板凝集および酸化ストレスに関連する動脈損傷を低減することによって、動脈血栓症の形成が遅延されることが示された。
【００１２】
また、高不飽和ＥＰＡおよびＤＨＡが、含有する二重結合の数が少ない脂肪酸よりも容易に酸化されることも、単相化学系において十分に確立されている。過去の研究では、別々の極性相および非極性相を有するこのような脂肪酸のＬＤＬを濃縮しても、酸化が増加することはないことが示された。
【００１３】
また、Ｗａｎｄｅｒによる研究（Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．８，ｐｇ  ７８９，（２００２））からは、ＥＰＡ／ＤＨＡリッチｏｘＬＤＬによって誘発されるアポトーシスの度合いが、ＥＰＡ／ＤＨＡリッチではないｏｘＬＤＬよる誘発と比較してＵ９３７細胞中にて非常に低いことも示されており、従ってＰＵＦＡの補給後は、ＥＰＡ／ＤＨＡリッチｏｘＬＤＬによって誘発される細胞アポトーシスが減少し、その減少は脂質ヒドロペルオキシドの濃度と関連しないという結論が導かれた。この結果は、ＥＰＡ／ＤＨＡが、酸化障害を低減するのではなく、動脈壁内での細胞アポトーシスを減少させることによってアテローム性動脈硬化症に対する保護効果を提供することを示唆している。
【００１４】
アテローム性動脈硬化症はまた、脂質の過剰な蓄積によって動脈壁が徐々に肥厚化するという特徴も有する。Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７２（３４），ｐｇ．２０９６３，（１９９７）およびＳｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．８，ｐｇ．１２１１，（２００２）に記載のように、炎症誘発性因子および脂質異常症が、その発生に対する主たる寄与因子である。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が、アテローム性動脈硬化症の病変部またはプラークに蓄積するコレステロールの主たる形態であるが、そのプロセスを開始するには、ＬＤＬはまず酸化構造（ｏｘＬＤＬ）へ修飾される必要があり、ＭｃＭｕｒｒａｙ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．９２，ｐｇ．１００４，（１９９３）に示されるように、ＬＤＬをｏｘＬＤＬへ修飾するための最も重要なアテローム生成誘発性メカニズム（ｐｒｏ−ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）は、酸化ストレスである。
【００１５】
天然のＬＤＬとは異なり、ｏｘＬＤＬはβ２ＧＰＩ‐糖タンパク質と結合して最終的には安定な非解離性複合体を形成する（ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体、酸化低密度リポタンパク質‐ベータ‐２‐糖タンパク質１複合体）。これらの安定な複合体は、病原性であって、臨床的に高い意義を有すると考えられており、アテローム生成誘発性抗原であることが示唆され、アテローム性血栓症の発症に対する血清学的リスク因子である。
【００１６】
ＭＰＯの役割
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、好中球、単球、およびマクロファージで発現されるヘムペルオキシダーゼ‐シクロオキシゲナーゼ酵素である。ＭＰＯは、強力な抗菌性物質である次亜塩素酸などの殺菌性の反応性酸化体を形成することにより、自然免疫防御系に関与する。しかし、次亜塩素酸はまた、核酸塩基と反応することも報告されており、その結果、炎症過程におけるＤＮＡ損傷に対するマーカーであり、ヒトアテローム性動脈硬化症組織中に豊富に存在する５‐クロロウラシルが形成される。
【００１７】
ＭＰＯ由来の酸化体が、組織障害、ならびに急性および慢性血管炎症性疾患の発症と進行に寄与するという証拠が最近になって発表された。ＭＰＯの循環レベルは、主たる有害な心臓イベントに対するリスクを予測するものであることが示されており、ＭＰＯ由来の塩素化化合物の特定のレベルは、アテローム性動脈硬化症の疾患進行に対する公知のバイオマーカーである（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｊ，Ｂｙｕｎ  Ｊ，Ｎｈａｎ  ＴＱ，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ＤＫ，Ｐｅｎｎａｔｈｕｒ  Ｓ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ５−ｃｈｌｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３０９６−３１０４）。
【００１８】
脂質タンパク質のＭＰＯ触媒酸化に対する別の指標は、ヒトアテローム性動脈硬化症病変部およびこのような病変部から抽出されるリポタンパク質で識別される次亜塩素酸による攻撃ならびに３‐クロロチロシンの形成によって観察される（Ｈａｚｅｎ  ＳＬ，Ｈｅｉｎｅｃｋｅ  ＪＷ，３−Ｃｈｌｏｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ｉｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｉｎｔｉｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９：２０７５−２０８１（１９９７）；Ｔｈｕｋｋａｎｉ  ＡＫ，ＭｃＨｏｗａｔ  Ｊ，Ｈｓｕ  ＦＦ，Ｂｒｅｎｎａｎ  ＭＬ，Ｈａｚｅｎ  ＳＬ，Ｆｏｒｄ  ＤＡ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｃｈｌｏｒｏ  ｆａｔｔｙ  ａｌｄｅｈｙｄｅｓ  ａｎｄ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：３１２８−３１３３（２００３））。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、混合ＰＵＦＡが豊富な魚油および／または藻油を含有する料理油製剤を毎日の食事に長期間にわたって用いた患者が、循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の著しい減少を示すことを見出した。料理油製剤のこの良好な効果は、公知のおよび記載の文献から得ることはできない。
【００２０】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、ＰＵＦＡの混合物を含有する魚油カプセルの１日１回の投与量を用いた第二の試験によってこの予想外の結果の追跡を行い、料理油による試験で観察されたものと同じ循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルの驚くべき低下を示した。この結果をさらに拡張して、本発明者らは、主として単一のＰＵＦＡ（ＤＨＡ）を含有する油とＰＵＦＡの混合物（ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ）を含有する油との間の比較試験を行い、主として単一のＰＵＦＡを含有する油と比較して、ＰＵＦＡ混合物においてＯｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルの驚くべき統計的に有意なさらなる低下を示した。
【００２１】
第四の試験では、本発明者らは、未処理のコントロールグループと比較して、混合ＰＵＦＡの経口投与量を摂取した患者において循環ＭＰＯレベルが驚くべき統計的に有意な低下を示すことを見出した。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の態様は、料理油組成物に製剤されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の少なくとも１つの治療効果一日量を提供することによって、循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を減少させるための新規な方法を含み、ここで、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの少なくとも１つを、魚油および／または藻油の成分として添加し、落花生油、糠油、大豆油、トウモロコシ油、ゴマ油、カノーラ油、サフラワー油、オリーブ油、ピーナッツ油、および／またはその他の植物油などの１もしくは２つ以上の公知の料理油と混合して、安定な料理油組成物とする。
【００２３】
本発明の態様は、魚油および／または藻油の１日用カプセル（ｄａｉｌｙ  ｃａｐｓｕｌｅ）を患者に提供することによってエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の少なくとも１つの治療効果一日量を送達し、循環ＯｘＬＤＬおよびＭＰＯを減少させる方法を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
アテローム性動脈硬化症は、脂質の過剰な蓄積によって動脈壁が徐々に肥厚化するという特徴を有する。炎症誘発性因子および脂質異常症が、その発生に対する主たる寄与因子である。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が、アテローム性動脈硬化症の病変部またはプラークに蓄積するコレステロールの主たる形態であるが、そのプロセスを開始するには、ＬＤＬはまず酸化構造（ｏｘＬＤＬ）へ修飾される必要があり、ＬＤＬをｏｘＬＤＬへ修飾するための最も重要なアテローム生成誘発性メカニズムは、酸化ストレスである。
【００２５】
天然のＬＤＬとは異なり、ｏｘＬＤＬはβ２‐糖タンパク質１と結合して最終的には安定な非解離性複合体を形成する（ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体）。最初の反応は可逆的であるが、これに続いて、病原性であって臨床的に高い意義を有すると考えられている安定な非解離性複合体が形成される（Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ／−β２ＧＰＩ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎｅｗ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｌｕｐｕｓ  １４，７３６（２００５））。マクロファージによるｏｘＬＤＬの取り込みは、スカベンジャー受容体ＣＤ３６によって媒介され、これは、アテローム性動脈硬化症プラーク内において泡沫細胞の形成を引き起こす（Ｐｏｄｒｅｚ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ３６  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＬＤＬ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８），１０８５（２０００））。
【００２６】
ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩの取り込みが抗‐β２ＧＰＩ抗体の存在下にて大きく高まることから、このメカニズムは、アテローム性動脈硬化症プラーク内における泡沫細胞の発生に対する生理学的に妥当な説明となっている。従って、ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体は、アテローム生成誘発性抗原であることが示唆されており、アテローム性血栓症の発症に対する血清学的リスク因子および寄与因子である。
【００２７】
従って、循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体を減少させることは、アテローム性血栓症の治療における重要な薬理学的標的であり、本発明の目的である。
【００２８】
循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体は、ヒト血漿中循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体を検出する二重抗体「サンドイッチ」技術（ＥＬＩＳＡ）に基づく免疫測定法を用いて正確に測定することができる。９６‐ウェルプレートのウェルを、ウェル内に導入されたいずれのβ２ＧＰＩとも結合するヒトβ２ＧＰＩに対するモノクローナル抗体でコーティングする。結合したｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩは、ヒトａｐｏＢ１００に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体を用いて検出される。ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の濃度は、４５０ｎｍで測定される明確な黄色を形成する発色団試薬テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いてＨＲＰの酵素活性を測定することで決定される。形成された色の強度は、分光光度計を用いて測定され、結合したｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の量に正比例する。結果は、この複合体の既知溶液を用いて作成された標準曲線に対してプロットされ、試験した血漿中の循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の正確な測定値が得られる。
【００２９】
本発明の料理油は、標準的な料理油を、ＥＰＡ（２０％）およびＤＨＡ（８０％）を合わせて少なくとも３５％含有する藻油の７．５重量／重量％と混合することによって作製することができる。試験用に選択される標準的な料理油は、一般的に用いられる落花生油およびヒマワリ油である。混合プロセスは、窒素下（酸化防止のため）、摂氏２０〜４０度の温度にて、密閉系で実施される。
【００３０】
オープンラベル無作為化実験を行い、脂質異常症の患者における循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルに対するこの料理油の効果を、健康に良い料理用植物油、すなわち落花生油およびヒマワリ油との比較で評価した。
【００３１】
血清中ＬＤＬコレステロールレベルが１３０〜２５０ｍｇ／ＤＬであり、血清中トリグリセリドレベルが１５０〜５００ｍｇ／ＤＬである、１８〜６０歳の男女の患者を選択した。既知の冠動脈疾患を持つ患者、脂質異常症の食事療法を受けている患者、スタチン／フィブラートもしくはその他の高脂血症薬を受けている患者、重度の肝疾患もしくは腎機能障害を持つ患者、または妊娠中／授乳中の女性は、本実験対象の候補集団から除外した。
【００３２】
各患者には、試験期間中における効果および副作用の両方の評価を行うことができるように、血小板と合わせたＲＢＣの測定、心電図、１２時間空腹時脂質プロファイル、空腹時血中グルコース、甲状腺プロファイル、肝機能試験、および腎機能試験から成る総合的な身体検査を、開始時、中間時（月１回）、および終了時（３ヶ月）に施した。
【００３３】
男女の比率がおよそ同じである４８人の健康な患者を採用して、ＳＡＳバージョン８．２を用いてＡ、Ｂ、およびＣの３つのグループに無作為に分割し、以下のようにして処理を開始した：
グループＡ  −  ３ヶ月の期間にわたり、通常の料理用途に用いられる７．５重量／重量％の藻油を含有する料理油を３×５００ｍｌ。
グループＢ  −  ３ヶ月の期間にわたり、通常の料理用途に用いられる標準的な落花生油を３×５００ｍｌ。
グループＣ  −  ３ヶ月の期間にわたり、通常の料理用途に用いられる標準的なヒマワリ油を３×５００ｍｌ。
【００３４】
第二の試験では、新たに無作為に選択し、上記のようにしてスクリーニングした４８人の患者を２つのセットに分割し、グループＡは未処理のままとし、第二のセットであるグループＢには、１ヶ月間、朝食時に毎朝、１日１回用の市販の魚油カプセル（２×５００ｍｇ）を与えた。循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルを、上記の第一の試験で述べたものと同じ方法を用いて第１日および第３０日に測定した。
【００３５】
第三の試験では、本発明者らは、主として単一のＰＵＦＡ、および混合ＰＵＦＡの補給量を２４体のモルモットに４週間与えてこれらを比較し、各々の循環ｏｘＬＤＬ‐ベータ‐２糖タンパク質複合体の減少に対する効果を調べた。８０％ＤＨＡ、２０％ＥＰＡのＰＵＦＡ混合物（ＡＯ）対ＰＵＦＡ濃度が３５％ＤＨＡ、３５％ＥＰＡ、および３０％ＤＰＡの混合物（ＳＯ）を用い、循環ＯｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩを、上記第一の試験で述べたものと類似の方法を用いて測定した。
【００３６】
第四の試験では、新たに無作為に選択し、スクリーニングした２４人のヒト患者を２つのセットに分割し、グループＣは未処理のままとし、第二のセットであるグループＦＯには、１ヶ月間、朝食時に毎朝、１日１回用の市販の魚油カプセル（２×５００ｍｇ）を与えた。循環ＭＰＯレベルを、第１日、およびできるだけ第３０日に近い時点で測定した。循環ＭＰＯは、ヒト血漿中循環ＭＰＯを検出する二重抗体「サンドイッチ」技術（ＥＬＩＳＡ）に基づく免疫測定法を用いて正確に測定した。
【００３７】
実験結果
７．５重量／重量％の藻油を含有する料理油を用いた患者対ヒマワリおよび落花生料理油を用いた患者である第一の試験では、血漿を採取して循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体を測定し、本明細書で述べる結果を得た。
【００３８】
まず、ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の濃度曲線のプロットを、参照標準溶液を順次希釈し、各濃度について吸光度（４５０ｎｍ）を測定して検量線をプロットすることで行い、同時に、以下の表１に示すように、２つの反復サンプルとして採取した２４の未知血漿サンプルの測定を、これらのサンプル中のｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の未知濃度を測定することで行う。
【００３９】
標準溶液はＡ１〜Ｆ２のウェルに、患者の血漿サンプルは２つの反復サンプルにて、Ａ３〜Ｈ８の一連のウェルに示す。患者血漿サンプルのウェル中の数字は患者のコード番号を表し、文字については、Ｉは開始時の血漿サンプル、１Ｍ、２Ｍは１ヶ月または２ヶ月の中間時の血漿サンプル、およびＦは終了時の血漿サンプルを表す。
【００４０】
次に、表１からの検量線用標準吸光度の結果をプロットして検量線とし、そのグラフから二次多項式を推定する。
ｙ  ＝  ３．６３８２ｘ２  ＋  ８９．５４ｘ  −  ０．１２２７
Ｒ２  ＝  ０．９９９９
【００４１】
2015091855.tif 000002
【００４２】
次に、検量線から得られたこの式を、表１からの吸光度データに適用し、以下の表２に示すように、発明者らの実験の過程で患者から採取した血漿サンプル中の循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の補正濃度を得る。
【００４３】
2015091855.tif 000003
【００４４】
以下の表３は、発明者らの試験からの５４人の患者において観察された、３ヶ月の期間にわたる循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体濃度の変化をまとめて示すものである。明らかに分かるように、７．５重量／重量％の藻油を含有する料理油を摂取した試験グループＡの患者は、統計的に有意である循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルの低下を示し、前述のように、これはこれらの患者において、アテローム血栓性疾患の発症の著しい低減に繋がるはずである。
【００４５】
2015091855.tif 000004
【００４６】
試験グループＡにおける循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の減少の平均は−１１．７８％であり、これは、コントロールグループＢの減少の平均である−０．３３％およびコントロールグループＣで見られた循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の０．６４％という数の増加と比較して、著しく大きいものである。これらの３つのグループでは、それぞれ、０．０１６、０．０１１、および０．０１１の標準偏差、ならびにアルファ０．０１における０．０２１、０．０１０、０．０１０の信頼レベルにて、統計的有意性が見られる。
【００４７】
第二の試験では、魚油のカプセル２×５００ｍｇを１日１回患者に与え、循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルを３０日間の開始時と終了時とに上述の方法で測定し、結果を本明細書にて示す。
【００４８】
以下の表４に示すように魚油の脂質プロファイルの分析を行い、これは、混合ＰＵＦＡ（ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）の存在を示しており、循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の測定結果は、以下の表５に示す。
【００４９】
2015091855.tif 000005
【００５０】
試験グループＦ（魚油カプセル）における循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の減少の平均は−９．７７％であり、これは、以下の表５に示すように、０．５４％という「Ｃ」で標識したコントロールグループで見られた循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体の数値的増加とは大きく異なっている。ＦおよびＣグループでは、それぞれ、アルファ０．０５における０．００７および０．００２の信頼レベルでの０．０１４、０．００５の標準偏差にて統計的有意性が見られる。
【００５１】
2015091855.tif 000006
【００５２】
モルモットによるさらなる実験では、本発明者らは、補給量（２５０ｍｇ／体重１ｋｇ）の藻油（ＡＯ）を補給量（２５０ｍｇ／体重１ｋｇ）のサーモン油（ＳＯ）と比較して、２４体のモルモットにこれらを４週間与えて比較し、各油の循環ｏｘＬＤＬ‐ベータ‐２糖タンパク質複合体の減少に対する効果を調べた。８０％ＤＨＡ、２０％ＥＰＡのＰＵＦＡ混合物（ＡＯ）対ＰＵＦＡ濃度が３５％ＤＨＡ、３５％ＥＰＡ、および３０％ＤＰＡの混合物（ＳＯ）を用いた。本発明者らは、両方ともにｏｘＬＤＬ複合体を減少させたが、混合ＰＵＦＡがおよそ３倍高い効果を有していたことを見出した。この実験の結果を表６に示す。食餌のエネルギー分布は、４５：３０：２５  炭水化物：脂肪：タンパク質であった。
【００５３】
2015091855.tif 000007
【００５４】
グループＡには、２５０ｍｇ／ｋｇ体重のサーモン油を与えた。
グループＢには、２５０ｍｇ／ｋｇ体重の藻油を与えた。
グループＡにおける循環ｏｘＬＤＬ減少の平均＝９５％の信頼レベルにおいて−１２．０２％＋／−０．７１
グループＢにおける循環ｏｘＬＤＬ減少の平均＝９５％の信頼レベルにおいて−４．６４％＋／−０．４０
【００５５】
循環ＭＰＯへの効果の分析
１日あたり、混合ＰＵＦＡを含有する２×５００ｍｇの魚油カプセルを処方された対象における酸化ＬＤＬ‐ベータ‐２‐糖タンパク質の減少に関する本発明者らの研究の過程において、本発明者らはまた、そのようなｏｘＬＤＬの減少が起こり得るメカニズムの１つ、すなわち循環ミエロペルオキシダーゼに応じた減少についても調べた。
【００５６】
オープンラベル無作為化実験を行い、脂質異常症の患者における循環ｏｘＬＤＬ‐β２ＧＰＩ複合体レベルに対するこの料理油の効果を、健康に良い料理用植物油、すなわち落花生油およびヒマワリ油との比較で評価した。
【００５７】
実験への採用の前１５日間は健康であったと自己申告した２０〜５０歳の男女の健康な患者２４人を、ほぼ同じ男女比で採用し、ＳＡＳバージョン８．２を用いて無作為に２つのグループ、Ｃ（コントロール未処理）およびＦ（魚油カプセル処理）に分割した。既知の冠動脈疾患を持つ患者、脂質異常症の食事療法を受けている患者、スタチン／フィブラートもしくはその他の高脂血症薬を受けている患者、重度の肝疾患もしくは腎機能障害を持つ患者、または妊娠中／授乳中の女性は、本実験対象の候補集団から除外した。各患者には、最初に身体検査によるスクリーニングを施し、各対象が健康であることを確認した。
【００５８】
グループＦの各患者には、２×５００ｍｇの魚油カプセルを与え、１日１回、朝食中に飲み込んでもらった。処理の初日とおよそ３０日目とに血液を採取し、血漿中の循環ＭＰＯレベルを測定した。
【００５９】
循環ＭＰＯの減少の平均を、改変ＥＬＩＳＡ分析法によって４０５ｎｍで測定した。以下の表７に示すように、試験グループＦ（魚油カプセル）は、「Ｃ」で標識したコントロールグループで見られた−０．３％という循環ＭＰＯの数値的減少と比較して、−８．１％という統計的に有意であるより大きな減少を示した。ＦおよびＣグループでは、それぞれ、アルファ０．０５における０．００６および０．００３の信頼レベルでの０．０１１、０．００６の標準偏差にて統計的有意性が見られる。
【００６０】
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【００６１】
本発明の態様は、アテローム性動脈硬化症の予防および治療の手段としての、ヒト血清中の循環ｏｘＬＤＬ‐ベータ‐２‐糖タンパク質１複合体および循環ＭＰＯのレベルを低下させるための方法であって、１〜９９重量％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有する食事用油組成物の効果量をヒトに投与することを含む。
【００６２】
本発明の態様は、食事用油組成物が食用の料理油をさらに含む方法をさらに含み、ここで、この組成物は、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）１５〜５５重量％；一不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）４０〜８０重量％；および多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）５〜４５重量％の脂肪酸分布を有する。
【００６３】
本発明の態様は、食事用油組成物がカプセルを介して投与される方法をさらに含み、このカプセルは、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）５〜１０重量％；一不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）５〜１０重量％；および多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）２０〜９０重量％の脂肪酸分布を有する食事用油組成物を含有する。
【００６４】
本発明の態様は、好ましい多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）であり、好ましくは、０．１〜１、０．１〜０．５、および０．５〜１の比率である方法をさらに含む。
【００６５】
本発明の態様は、ＰＵＦＡ画分が、魚類油（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌ）および藻油から成る群より選択される少なくとも１つの油を含み、魚類油および藻油が、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ、および天然の抗酸化剤を含む方法をさらに含む。
【００６６】
本発明の態様は、食用の料理油が植物油を含む方法をさらに含む。
【００６７】
本発明の態様は、食用の料理油が、落花生油、糠油、大豆油、トウモロコシ油、ゴマ油、カノーラ油、サフラワー油、オリーブ油、およびピーナッツ油から成る群より選択される油を含む方法をさらに含む。
【００６８】
本発明の態様は、食用の料理油が、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、または抗酸化植物抽出物の少なくとも１つをさらに含む方法をさらに含む。
【００６９】
本発明の態様は、食事用油組成物を製造するためのプロセスであって：
ａ）容器に食用の料理油を投入すること；
ｂ）魚類油および藻油から成る群より選択される少なくとも１つの油をこの容器に添加すること；および、
ｃ）この油を混合されるまで攪拌すること、
を含むプロセス、をさらに含む。