(57)【要約】【課題】微細藻類由来のバイオ燃料の生産性を高めるために、含有する脂肪酸含有率を高める。【解決手段】微細藻類を培養する培地の栄養塩濃度を一定にし、かつ無機塩濃度を調整することで増殖特性を劣化させることなく脂肪酸含有率を高めることを可能とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類の培養において、
培地の栄養塩濃度を一定にし、かつ無機塩濃度を調整して培養を行う培養方法。
【請求項２】
前記無機塩濃度は、海水の１０％〜５０％に調整されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地に含まれる塩化ナトリウムの濃度が２ｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類は、緑藻網、プラシノ藻網、トレボウクシア藻網に属する藻類およびこれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記微細藻類は、トレボウクシア藻網に属する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記微細藻類は、クロロコッカムリトラーレである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，微細藻類の培養方法に関する。詳細には、培地の無機塩濃度を調整し、増殖速度に影響を与えずに脂肪酸含有率を高めた微細藻類の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、産業活動の発達などに伴って、大気中に放出された二酸化炭素による温室効果で地球温暖化が進展することが問題となっている。一方、化石燃料枯渇のおそれから、原油価格高騰等の問題が生じている。
【０００３】
大気中の二酸化炭素を削減する手段として、植物の光合成による二酸化炭素の固定化がある。植物の中でも、特に微細藻類は陸生植物と比較して高い増殖力を有するため、有望な二酸化炭素の削減手段として注目されている（特許文献１等参照）。さらに、微細藻類の中には、油成分を内部で生成し蓄積するものが知られており、そのような微細藻類を用いて、発電所や工場で二酸化炭素の排出量を抑えながら燃料を合成するプロセスが検討されている（特許文献２、非特許文献１〜２等参照）。
【０００４】
例えば、クロロコッカムリトラーレのように高濃度の二酸化炭素でも培養可能で、かつ脂質を生成する微細藻類が知られている（非特許文献３）。利用される微細藻類の二酸化炭素への耐性が高いと燃料電池などの高濃度二酸化炭素を排出する装置からの排気の直接導入が可能となるばかりか、その濃度では生存できない他の微生物のコンタミネーションを避けることができるという利点がある。
【０００５】
一方、微細藻類の脂質生産過程については、培地の硝酸塩などの窒素栄養分が枯渇すると脂肪酸を蓄積し始めることはよく知られているが、そのメカニズムについてはいまだに解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−３１３１４１号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０９５８８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】彼谷邦光、Microbiol. Cult. Coll. 26(1):1-10, 2010
【非特許文献２】松本光史、電気評論、72-77, 2010. 10
【非特許文献３】M.Ota et.al., Bioresource Technology 100 (2009) 5237-5242
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記事情に鑑み、本発明は、二酸化炭素を高効率で固定化し、さらに微細藻類の脂質の生産性を向上させて、バイオ燃料生産のコストを下げるためことを目的とする。詳細には、非特許文献３に示されるように、従来３４質量％程度であった微細藻類の脂肪酸含有率を向上させ、微細藻類による脂質の生産性を向上することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、クロロコッカムリトラーレなどの微細藻類の培地の無機塩濃度を調整することで蓄積する脂肪酸の含有率が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微細藻類の培養方法によれば、細胞濃度に影響を与えることなく蓄積する脂肪酸含有率を飛躍的に高めることが可能となる。そのため、現在使用している培養設備を用いて微細藻類の脂質の生産性を向上させることができ、バイオ燃料の生産性を高めることを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】脂肪酸含有率（η）および脂肪酸濃度（Ｐ）の培地無機塩濃度依存性を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、培地の無機塩濃度を調整し、脂肪酸含有率を高めた微細藻類の培養方法に関する。以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は、本発明の単なる一例であって、当業者であれば、適宜設計変更可能である。
【００１３】
（微細藻類）
本発明に用いることのできる微細藻類は、脂肪酸を藻体内に蓄積することができるものである。
【００１４】
本発明において、「藻類」とは、光合成を行う生物のうち、陸上植物（コケ植物、シダ植物、種子植物）を除いたものの総称であり、「微細藻類」とは、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な藻類をさす。微細藻類の分類としては、脂肪酸を藻体内に蓄積することができるものであれば特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれであってもよい。
【００１５】
本発明において、微細藻類は淡水性藻類および海洋性藻類のいずれも用いることができるが、海水で培養可能な海洋性藻類が好ましい。また、本発明の方法に用いられる微細藻類は、二酸化炭素耐性が強いものが好ましい。
【００１６】
本発明の一実施態様において、本発明の方法に用いられる微細藻類は緑色植物門に属する。好ましくは、緑藻網、プラシノ藻網、トレボウクシア藻網に属する藻類およびこれらの組み合わせの群から選択される。本発明の方法に用いられる微細藻類は、より好ましくはトレボウクシア藻網に属する藻類であり、さらに好ましくはクロロコッカムリトラーレ（Chlorococcum littorale）である。
【００１７】
本発明の一実施態様において、微細藻類は、このなる微細藻類の種の混合物であってもよい。他の実施態様では、微細藻類は、単一の微細藻類の種であってもよい。さらに、本発明の方法に用いることのできる微細藻類には、野生型、変異型（天然または誘導されたもの）または遺伝子改変された微細藻類が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
（培養方法）
本発明の微細藻類の培養は、以下のような条件下、微細藻類の培養方法として一般的に知られている方法を用いることができる。例えば、トレボウクシア藻網に属する微細藻類を培養できる公知の方法を用いることができる。具体的には、これに限定されないが、液体培地を入れた偏平フラスコ等の培養容器に該微細藻類を接種して、藻体が沈殿しない程度に緩やかに攪拌しながら光照射下で通気培養することにより行うことができる。
【００１９】
本発明に用いられる液体培地としては、当該微細藻類を培養できる液体培地として公知のものを希釈した溶液を使用できる。例えば、海洋性微細藻類を用いる場合には、天然海水および／または人工海水を希釈した溶液を培地として用いることができる。人工海水は、天然海水に含まれる塩類を模した塩類である。該人工海水の所定量を蒸留水に溶解することで、天然海水を模した海水成分をもつ水溶液を作製することができる。希釈倍率は、通常使用される培地の１．５〜１０倍である。例えば、通常の海水に含まれる無機塩濃度を１００部とした場合、本発明の培地は１０部〜５０部の無機塩濃度を有する。具体的には、これらに限定されないが、本願発明の培地は塩化ナトリウムを２ｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌの濃度で含有してもよい。また、本発明に用いられる液体培地は有機栄養源を含有してもよい。
【００２０】
一実施態様において、本発明の培養方法は、該液体培地に当該微細藻類が生育するのに適した公知の通気量で通気を行うことができる。例えば、１０ｍＬ／分〜５００ｍＬ／分で通気することができる。好ましくは５０ｍＬ／分〜３００ｍＬ／分で通気することができる。本発明の方法において、液体培地は、好ましくは５％〜２０％の二酸化炭素を含む気体で通気される。より好ましくは、５％の二酸化炭素を含む気体で通気される。
【００２１】
また、本発明において、培養温度は当該微細藻類が生育するのに適した公知の培養温度でよく、通常、１５〜３５℃で行うことが好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。
【００２２】
本発明において、光照射条件は、当該微細藻類の種類および液体培地中の藻体濃度によって適宜調整することができる。例えば、５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ〜５００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの範囲の光強度で行うことができる。光源には、これらに限定されないが、太陽光、蛍光灯、およびＬＥＤを用いることができる。また、光照射は、連続照射および明暗サイクルを有する照射のいずれであってもよい。
【００２３】
（脂肪酸の分離）
上記のとおり、本発明の方法により、所望の日数または所望の密度までになるまで培養した微細藻類は、遠心分離、綿状沈殿または濾過を含み得る当業者に公知の方法で、回収することができる。次いで、回収された微細藻類の細胞を、フレンチプレスまたはガラスビーズ細胞粉砕器等を用いて破壊または溶解し、有機溶媒または超臨界流体などを用いて、脂肪酸を抽出する。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
下記のとおり調整した培地を用いて、クロロコッカムリトラーレの培養を１８日間行った。培養条件は温度２２℃、光強度１７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、通気ガス流量１００ｍＬ／分とした。通気ガス組成は二酸化炭素５％、窒素９５％とした。
【００２６】
培地には日本製薬（株）のダイゴ人工海水ＳＰおよびダイゴＩＭＫ培地の混合溶液を用いた。ダイゴ人工海水ＳＰは、２０７２７ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含む海水成分の無機塩を含有する人工海水である。一方、ダイゴＩＭＫ培地は、表１に記載の濃度で窒素やリンなどの栄養塩を含む培地である。
【００２７】
ダイゴＩＭＫ培地由来の栄養塩の濃度は表１の濃度に保持したまま、ダイゴ人工海水ＳＰ由来の無機塩を希釈して、培地を調整した。ダイゴ人工海水ＳＰの希釈倍率は１倍（希釈なし）、２倍、５倍、１０倍、２０倍に調整した。増殖特性はシグモイド型の一般的な特性を示し、希釈倍率１倍〜１０倍までは大きな変化は認められなかった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
図１に脂肪酸含有率と脂肪酸濃度の希釈率依存性を示す。脂肪酸含有率、脂肪酸濃度ともに希釈倍率２倍で極大を示し、脂肪酸含有率は４７．９質量％を示した。これは従来の報告値から１．４倍の改善となる。希釈倍率５倍および１０倍では希釈なしに比べて変化は認められなかったが、培地成分を節約できるという意味では有用な結果である。希釈倍率２０倍では増殖特性が落ちるため、脂肪酸濃度は減少した。
【図１】
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