(57)【要約】      （修正有）【課題】画像に映し出された傷や異物を細胞の計数の対象から除外して、細胞の数を正確に計数する。【解決手段】培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する細胞計数装置であって、撮像された画像の中で細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出する細胞候補抽出手段２５２と、抽出した細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出する大きさ情報算出手段２５３と、算出された大きさ情報が細胞の大きさよりも大きいものと判断したときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外する計数対象除外手段２５４と、除外されなかった細胞候補を細胞として特定し、当該細胞の数を計数する細胞計数手段２５５とを備えた細胞計数装置。【選択図】図７
2015091220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する細胞計数装置であって、
前記細胞が表われている画像の画像データを取得する画像データ取得手段と、
前記画像データにもとづいて、前記画像の中で前記細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出する細胞候補抽出手段と、
抽出された前記細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出する大きさ情報算出手段と、
算出された前記大きさ情報が前記細胞の大きさよりも大きいことを示す数値であるときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外する計数対象除外手段と、
除外されなかった前記細胞候補を前記細胞として特定し、当該細胞の数を計数する細胞計数手段とを備えた
ことを特徴とする細胞計数装置。
【請求項２】
前記大きさ情報が、
前記細胞候補を矩形の領域枠で囲んだときの長辺と短辺との比、又は、前記矩形の領域の面積
のうちの一方又は両方である
ことを特徴とする請求項１記載の細胞計数装置。
【請求項３】
前記画像データにもとづいて前記培養容器の皺を検出する皺検出手段を備え、
前記皺検出手段は、前記皺が検出された画像を、前記細胞の計数に使用する画像から除外する
ことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞計数装置。
【請求項４】
前記皺検出手段は、
前記画像の平均輝度を算出し、前記平均輝度と基準値とを比較し、前記平均輝度が前記基準値よりも高いときに、前記培養容器に皺があるものとして当該皺を検出する
ことを特徴とする請求項３記載の細胞計数装置。
【請求項５】
培養液が封入された培養容器を撮像する画像取得装置と、前記培養液中の細胞を計数する細胞計数装置とを備えた細胞計数システムであって、
前記細胞計数装置が、前記請求項１〜請求項４のいずれかに記載の細胞計数装置である
ことを特徴とする細胞計数システム。
【請求項６】
培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する細胞計数方法であって、
前記細胞が表われている画像の画像データを取得するステップと、
前記画像データにもとづいて、前記画像の中で前記細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出するステップと、
抽出された前記細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出するステップと、
算出された前記大きさ情報が前記細胞の大きさよりも大きいことを示す数値であるときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外するステップと、
除外されなかった前記細胞候補を前記細胞として特定し、当該細胞の数を計数するステップとを有する
ことを特徴とする細胞計数方法。
【請求項７】
培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する処理を細胞計数装置に実行させるための細胞計数プログラムであって、
前記細胞が表われている画像の画像データを取得するステップと、
前記画像データにもとづいて、前記画像の中で前記細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出するステップと、
抽出された前記細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出するステップと、
算出された前記大きさ情報が前記細胞の大きさよりも大きいことを示す数値であるときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外するステップと、
除外されなかった前記細胞候補を前記細胞として特定し、当該細胞の数を計数するステップと
を前記細胞計数装置に実行させる
ことを特徴とする細胞計数プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムに関し、特に、培養容器に封入された培養液中の細胞の数を数えるための細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような細胞培養においては、細胞の増殖に併せて、培養液における細胞の密度を適正な範囲に維持することが必要である。
【０００３】
例えば、培養液における細胞密度が大きすぎると各細胞に十分な酸素や栄養を供給することができなくなり、細胞増殖効率が低下する。また、培養液における細胞密度が小さすぎても十分な増殖効率が得られない。
このため、細胞培養においては、培養中に細胞密度を把握するため、適宜、培養容器内における培養液中の細胞数を計測する必要があった。
【０００４】
そこで、培養容器に封入された培養液中の細胞の数を自動的に計測する方法が提案されている。
例えば、培養容器の一部を撮像し、この撮像した画像において細胞が表れている部分を細胞オブジェクトとして自動的に抽出し、この抽出した細胞オブジェクトの数を細胞の数としてカウントして表示する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
この技術を用いることにより、培養液中の細胞の数を自動的に計測することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２４３１８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述した特許文献１に記載の技術においては、次のような問題があった。
例えば、培養容器の一部を撮像して得られた画像には、その培養容器に封入された培養液や、この培養液中に浮遊する細胞が映し出される。
ただし、その画像に対して所定の画像処理を行った結果、何らかの要因で、その画像上に黒い点が表れることがある。
この黒い点は、細胞ではないので、この黒い点も一緒に細胞としてカウントされることがないようにしなければならない。
このため、同技術においては、その黒い点の大きさが細胞よりも小さいことに着目し、画像処理を行う際に、細胞よりも小さい面積あるいは長さで表れている部分をノイズとして除去していた。
【０００７】
ところが、同技術においては、培養容器として、ウェルプレート、ディッシュ、フラスコを用いることを想定していた（段落［０１１０］）。
これらは、ガラス、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂などを材料として形成された硬質の容器である。このため、表面に傷がつきにくい。
ただし、培養容器には、これら硬質の容器だけでなく、例えば、ポリオレフィンなどの軟包材を材料として形成された袋状（バッグ型）の培養バッグもある。
培養バッグは、可撓性及び柔軟性に富んだ軟包材を材料として形成されていることから、表面に傷がつきやすい。
特に、培養バッグは、表面にローラーを押し当てて転がすなどして中の培養液を攪拌する場合や、インキュベータから出し入れする場合、クリーンベンチで培養液の追加を行う場合などがあり、これらの状況下で表面に傷が付いたり異物が付着したりすることがある。
【０００８】
このように表面に傷や異物が付いている培養バッグに培養液が封入されている場合において同技術を用いてこの培養バッグを撮像したとき、取得された画像には、それら傷等が細胞よりも大きな面積をもって、あるいは、細胞よりも長い長さをもって映し出されることがある。
そうすると、それら傷等は、ノイズとして除去されないことから、細胞として計数されてしまう。このため、計数値が実際の細胞の数よりも多くなってしまうので、計数値の誤差が大きくなる。その結果、このような場合は、正確性が欠如した計数値が算出されることとなる。
【０００９】
本発明は、上記の事情にかんがみなされたものであり、画像に映し出された細胞を計数する際に、様々な傷や異物等を、細胞の計数の対象から除外可能とし、これにより、細胞の計数値の正確性や、細胞の計数を行う装置の信頼性を向上可能とする細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的を達成するため、本発明の細胞計数装置は、培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する細胞計数装置であって、細胞が表われている画像の画像データを取得する画像データ取得手段と、画像データにもとづいて、画像の中で細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出する細胞候補抽出手段と、抽出された細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出する大きさ情報算出手段と、算出された大きさ情報が細胞の大きさよりも大きいことを示す数値であるときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外する計数対象除外手段と、除外されなかった細胞候補を細胞として特定し、当該細胞の数を計数する細胞計数手段とを備えた構成としてある。
【００１１】
また、本発明の細胞計数システムは、培養液が封入された培養容器を撮像する画像取得装置と、培養液中の細胞を計数する細胞計数装置とを備えた細胞計数システムであって、細胞計数装置が、の細胞計数装置である構成としてある。
【００１２】
また、本発明の細胞計数方法は、培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する細胞計数方法であって、細胞が表われている画像の画像データを取得するステップと、画像データにもとづいて、画像の中で細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出するステップと、抽出された細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出するステップと、算出された大きさ情報が細胞の大きさよりも大きいことを示す数値であるときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外するステップと、除外されなかった細胞候補を細胞として特定し、当該細胞の数を計数するステップとを有する方法としてある。
【００１３】
また、本発明の細胞計数プログラムは、培養容器に封入された培養液中の細胞を計数する処理を細胞計数装置に実行させるための細胞計数プログラムであって、細胞が表われている画像の画像データを取得するステップと、画像データにもとづいて、画像の中で細胞が表われている可能性のある部分を細胞候補として抽出するステップと、抽出された細胞候補の大きさに関する情報を大きさ情報として算出するステップと、算出された大きさ情報が細胞の大きさよりも大きいことを示す数値であるときに、当該細胞候補を、細胞の計数対象から除外するステップと、除外されなかった細胞候補を細胞として特定し、当該細胞の数を計数するステップとを細胞計数装置に実行させる構成としてある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムによれば、画像に映し出された細胞を計数する際に、様々な傷や異物等を、細胞の計数の対象から除外することができる。これにより、細胞の計数値の正確性や、細胞の計数を行う装置の信頼性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態における細胞計数システムの構成を示すブロック図である。
【図２】画像取得装置の構成を示す外観斜視図である。
【図３】画像取得装置の構成を示す側面図である。
【図４】画像取得装置の押さえ板及び回動板の構成を示す図であって、（ｉ）は、押さえ板が容器を押さえる前の状態を示す側面断面図、（ii）は、回動板及び押さえ板を下方から見た状態を示す図（（ｉ）のＡ−Ａ矢視図）、（iii）は、押さえ板が容器を押さえている状態を示す側面断面図である。
【図５】上面に容器が載置された載置台の透光孔を下方から見た状態を示す図である。
【図６】細胞計数装置の構成を示すブロック図である。
【図７】細胞計数装置の制御手段の構成を示すブロック図である。
【図８】押さえ板が容器を押さえている状態を示す側面断面図である。
【図９】容器に封入された培養液と、この培養液内の細胞が映し出された画像を模式的に示す図である。
【図１０】各細胞を領域枠で囲んだ状態の画像を模式的に示す図である。
【図１１】細胞に領域枠を付した状態を示す図である。
【図１２】容器の傷が映し出された画像（ｉ）と、容器の表面に付着した異物が映し出された画像（ii）を示す図である。
【図１３】容器の傷が映し出された画像を示す図であって、（ｉ）は、傷に領域枠を付した状態の画像を示す図、（ii）は、その領域枠を消去した状態の画像を示す図である。
【図１４】容器の表面に付着した異物が映し出された画像を示す図であって、（ｉ）は、異物に領域枠を付した状態の画像を示す図、（ii）は、その領域枠を消去した状態の画像を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態の細胞計数システムを用いた細胞計数方法の手順を示すフローチャートである。
【図１６】細胞計数処理の手順を示すフローチャートである。
【図１７】実施例として、本発明の細胞計数システムを用いて容器内の細胞の数を計数した結果を示す図表である。
【図１８】図１７に示した細胞の計数結果を棒グラフとして示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムの具体的な実施形態について、図面を参照して説明する。
【００１７】
［細胞計数装置及び細胞計数システム］
図１に示すように、細胞計数システム１は、画像取得装置１０と、細胞計数装置２０とを備えている。
画像取得装置１０は、袋状の容器２（図２参照）に封入された培養液ｍ内の細胞ｃを撮像し、この細胞ｃの画像を取得するための装置である。
【００１８】
ここで、容器２は、透明性を有する樹脂製のフィルムを用いて形成された中空の培養容器であって、細胞ｃが浮遊、沈殿、接着等している培養液ｍが封入されている。
この容器２は、軟包材を材料として、袋状（バッグ型）に形成されている。このように、容器２の材料として軟包材を用いることで、容器２に可撓性及び柔軟性を付与することができる。軟包材としては、例えば、特開２００４−３２３０７７号公報（加圧抽出形の袋状容器）に記載されているものなどを用いることができる。
また、容器２は、細胞培養に必要なガス透過性を有しており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような条件を満たす培養容器の材料としては、例えばポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴム等を挙げることができる。
【００１９】
画像取得装置１０は、図２、図３に示すように、筐体１１、載置台１２、押さえ板１３、回動手段１４、撮像手段１５、昇降手段１６、照明手段１７、移動手段１８などを備えている。
筐体１１は、直方体状に形成された中空の箱体であって、上面部分には、ほぼ矩形状で平板の載置台１２が取り付けられている。この載置台１２の上面には、容器２が載置される。
【００２０】
押さえ板１３は、ほぼ矩形状の平板であって、図４（ｉ）〜（iii）に示すように、中央部分には、長円形状の透光孔１３１が、平板の厚み方向に貫通孔として穿設されている。
また、押さえ板１３の下側面（載置台１２の上面に対向する面）のうち透光孔１３１の周縁には溝が形成されており、この溝には、透明で平板状の透明部材１３２が嵌合されている。
透明部材１３２は、透光孔１３１の下部を閉塞する。また、透明部材１３２の下面は、押さえ板１３の下面と同一面となっており、容器２を押圧する。
この透明部材１３２には、例えば、ガラス板やアクリル板などを用いることができる。
【００２１】
また、押さえ板１３は、回動手段１４の回動板１４１の下面側に取り付けられている。
回動手段１４は、載置台１２の端部に固定された基部１４２と、ほぼ矩形板状の回動板１４１と、この回動板１４１を基部１４２に軸支する棒状の回動軸１４３と、回動板１４１の上面に取り付けられたハンドル１４４とを有している。
ハンドル１４４は、回動板１４１を回動させるときに計測者が把持する部材である。このハンドル１４４を持ちながら、回動軸１４３の中心軸を中心として回動板１４１を回動させると、この回動板１４１の下面側に取り付けられた押さえ板１３が、載置台１２の上面に載置された容器２に対向して配置される。そして、容器２の上面に押さえ板１３を接触させ、さらに容器２を押さえ込む方向に回動手段１４の回動板１４１を回動させつつ押さえ板１３を押さえ込むと、この押さえ板１３は、容器２を凹状に窪ませる。
この状態において、容器２は、載置台１２と押さえ板１３との間に挟み込まれた状態となる（図４（iii）参照）。
そして、回動手段１４には、ロック機構（図示せず）が設けられており、押さえ板１３が容器２を押さえ込んで凹状に窪ませた状態を維持する。
また、回動板１４１と押さえ板１３との間には圧縮ばね１３４が嵌合されており、押さえ板１３が容器２を押さえ込むときに、圧縮ばね１３４による付勢によっても、その押さえ板１３が容器２を押さえ込むようになっている。
【００２２】
また、押さえ板１３の下面には、透光孔１３１及び透明部材１３２の周辺に、矩形棒状の厚み設定部材１３３が接合されている（図４（ｉ）、（iii）参照）。
厚み設定部材１３３は、押さえ板１３の下面からさらに下方へ突出した状態で接合されており、この厚み設定部材１３３の下面は、透明部材１３２が嵌合されている押さえ板１３の下面よりもさらに下方に位置している。
この押さえ板１３を容器２の上面から下方に押さえ込んだとき、図４（iii）に示すように、厚み設定部材１３３の下方では、容器２の上側フィルム２１と下側フィルム２２が接触又は近接した状態となるが、厚み設定部材１３３が接合されていない押さえ板１３の下面の下方では、容器２の上側フィルム２１と下側フィルム２２が接触せず、これら上側フィルム２１と下側フィルム２２との間に培養液ｍが留まった状態となる。
ただし、この部分は、押さえ板１３により上方からある程度押さえ込まれているため、この部分の培養液ｍの厚みである液厚ｔ１（この部分における上側フィルム２１と下側フィルム２２との間の距離）は、押さえ板１３により押さえ込まれていない状態の培養液ｍの液厚ｔ０（図４（ｉ）参照）よりも薄くなっている。
【００２３】
撮像手段１５は、例えばＣＣＤカメラを用いることができ、容器２に封入された培養液ｍ内の細胞ｃを撮像する。
この撮像手段１５は、筐体１１の内部に配置されており、容器２内の細胞ｃを、この容器２の下方から撮像する。
この撮像手段１５は、後述するように移動手段１８によって筐体１１の内部を一定方向に往復移動可能となっているが、この撮像手段１５が容器２を押さえている押さえ板１３の下方に位置するときの当該撮像手段１５の直上には、載置台１２に穿設された透光孔１２１が位置するようになっている。
【００２４】
透光孔１２１は、載置台１２の厚み方向（図４（ｉ）においては上下方向）に穿設された貫通孔であって、容器２を押さえている押さえ板１３の透光孔１３１の直下に位置している。
載置台１２の上面のうち透光孔１２１の周縁には溝が形成されており、この溝には、ほぼ透明で平板状の透明部材１２２が嵌合されている。
透明部材１２２は、透光孔１２１の上部を閉塞している。また、この透明部材１２２の上面は、載置台１２の上面と同一面となっている。
この透明部材１２２には、例えば、ガラス板やアクリル板などを用いることができる。
【００２５】
また、撮像手段１５には、細胞ｃを拡大して撮像するための対物レンズ１５１が接続されている。
【００２６】
昇降手段１６は、撮像手段１５を昇降させるための機構、例えば送りネジなどを備えており、計測者がダイヤル１６１を回転させることにより、撮像手段１５を上昇又は下降させることができるようになっている。
この昇降手段１６は、撮像手段１５の焦点合わせに用いられる。計測者は、細胞計測装置２０の表示手段２４（後述）に表示された細胞ｃの画像を見ながら、ダイヤル１６１を回転させることにより、その細胞ｃに対する撮像手段１５の焦点を合わせることができる。
なお、ネジの送りは手動に限らず、電動送りであってもよい。電動送りの場合は、撮像手段１５の焦点合わせを自動的に行うことが可能な自動焦点調整（オートフォーカス）をさらに備えることができる。
【００２７】
照明手段１７は、ＬＥＤなどの光源（図示せず）と集光レンズ１７１とを備えており、光源から放射された光を集光レンズ１７１で集光し、載置台１２の上面に載置された容器２に対し、特に、押さえ板１３により押さえられている容器２の当該部分に対してその光を照射する。
この照明手段１７は、後述するように移動手段１８によって移動可能となっているが、この照明手段１７が容器２を押さえ込んでいる押さえ板１３の上方に位置しているとき、集光レンズ１７１で集光された光は、回動手段１４の回動板１４１に穿設された透光孔１４５と押さえ板１３の透光孔１３１とを通り、押さえ板１３の透明部材１３２を透過し、この押さえ板１３の透光孔１３１に対向している容器２の当該部分である測定可能範囲（図４（iii）参照）に対して照射される。これにより、撮像手段１５による細胞ｃの撮像に必要な明るさが提供される。
また、照明手段１７には、光源から放射される光の明るさを調整するための明るさ調整つまみ１７２と、この明るさ調整つまみ１７２により調整された範囲で光源に流れる電流又は光源に印加される電圧を調整するサイリスタなどの調整部品（図示せず）が配置されている。
【００２８】
移動手段１８は、照明手段１７と撮像手段１５とを一定の方向（図２に示す画像取得装置１０においては、左右方向）に往復移動させるための機構を備えている。この機構には、例えば、電動アクチュエータを用いることができる。
また、移動手段１８には、図３に示すように、板状のステージ１８１が備えられており、このステージ１８１には、昇降手段１６を介して撮像手段１５が載置されるとともに、Γの字状に形成されたアーム部材１７３の下端が取り付けられている。そして、このアーム部材１７３の上部先端部分には、照明手段１７が配置されている。
これにより、移動手段１８は、そのステージ１８１を移動させることにより、撮像手段１５と照明手段１７とを一度に同じ方向へ移動させることができるようになっている。
【００２９】
そして、この移動手段１８による移動により、撮像手段１５は、容器２における測定可能範囲（容器２のうち載置台１２の透光孔１２１に対向する範囲、図４（iii）、図５参照）において、複数の撮像範囲を順に撮像する。
撮像範囲は、図５に示すように、容器２の測定可能範囲内における一定の範囲であり、撮像手段１５が一回の撮像によって画像を取得する範囲である。
撮像範囲は、測定可能範囲内に複数あり、撮像手段１５は、移動手段１８による移動に伴って、それら複数の撮像範囲を順に撮像する。
なお、図５においては、撮像範囲が、測定可能範囲内に２０箇所設定してある。これら複数の撮像範囲は、隣同士が接触していてもよく、あるいは、離間していてもよい。また、それら複数の撮像範囲は、一部が重なっていてもよい。
撮像手段１５は、撮像した画像を画像データとして細胞計数装置２０へ送信する。
【００３０】
細胞計数装置２０は、コンピュータなどの情報処理手段であって、撮像手段１５によって撮像された画像を処理し、計数対象物である細胞ｃの数を計数する。また、細胞計数装置２０は、計数した細胞ｃの数にもとづいて、容器２内の細胞ｃの密度などを算出することができる。
【００３１】
細胞計数装置２０は、図６に示すように、通信手段２１と、記憶手段２２と、入力操作手段２３と、表示手段２４と、制御手段２５とを備えている。
通信手段２１は、画像取得装置１０から送信されてきた画像データを受信する画像データ取得手段として機能する。
記憶手段２２は、細胞計数装置２０の有する各種機能を実行するためのプログラムやデータなどを記憶する。また、記憶手段２２は、通信手段２１で受信された画像データを記憶する。
入力操作手段２３は、キーボードやマウスなどで構成されており、計測者による操作によって所定の命令や各種情報等を入力する。
表示手段２４は、液晶ディスプレイなどで構成されており、画像データにもとづく画像や所定のデータなどを表示する。
【００３２】
制御手段２５は、例えば、ＣＰＵにより構成することができ、記憶手段２２に記憶されているプログラムを読み込んで実行することにより、細胞計数装置２０の構成各部に指令を送り、又は自ら動作して、細胞計数装置２０の有する各種機能を実行・制御する。
【００３３】
また、制御手段２５は、記憶手段２２から画像データを取り出すと、この画像データの示す画像に表れた細胞ｃの数を計数する細胞計数処理を実行する。
この細胞計数処理を実行するに際して、制御手段２５は、次の処理を実行する。
（１）容器の皺の検出
（２）細胞候補の抽出
（３）傷、異物の除外
（４）細胞の計数
これらの処理について、以下、順に説明する。
【００３４】
（１）容器の皺の検出
制御手段２５は、画像取得装置１０の撮像手段１５により画像が取得された容器２上の撮像範囲にこの容器２の皺があることを検出する皺検出手段２５１（図７参照）として機能する。
この容器２の皺の検出は、画像の輝度値を用いて行われる。具体的には、次の手順で行われる。
制御手段２５は、画像の区画であるピクセルごとに、輝度値を算出する。
輝度値は、１ピクセルごとの色のデータを、０〜２５５の数値で表したものである。
【００３５】
制御手段２５は、一つの画像におけるすべてのピクセルについて輝度値を算出すると、これらすべてのピクセルの輝度値の平均値を算出し、この算出した平均値を、当該画像の平均輝度とする。制御手段２５は、このようにして算出した平均輝度を記憶手段２２へ送って記憶させる。
次いで、制御手段２５は、記憶手段２２から基準値を取り出し、この基準値と算出した平均輝度とを比較する。そして、平均輝度が基準値よりも低いか否かを判断する。
判断の結果、平均輝度が基準値よりも低いときは、当該画像が取得された撮像範囲内に皺が無いものと判断し、この画像を細胞ｃの計数に使用する。
一方、平均輝度が基準値よりも高いときは、当該画像が取得された撮像範囲内に皺があるものと判断し、この画像については、細胞ｃの計数に使用する画像から除外する。
【００３６】
このような処理を行う理由は、次の通りである。
画像取得装置１０の載置台１２の上面に容器２が載置されると、撮像手段１５が、その容器２内の細胞ｃを撮像する。撮像により取得された画像は、細胞計数装置２０の表示手段２４に表示される。これにより、計測者は、その画像を目視することができる。
計測者は、この画像に細胞ｃが鮮明に映し出されるように、画像取得装置１０のダイヤル１６１を回して撮像手段１５の焦点を合わせるとともに、照明手段１７の明るさ調整つまみ１７２を回して、この照明手段１７から容器２に照射される光の明るさを調整する。
ここで、撮像手段１５の焦点合わせは、撮像手段１５の焦点すなわちピントを細胞ｃに合わせるために行うものであり、照射光の明るさの調整は、表示手段２４に表示された画像の全体の輝度値を調整して、細胞ｃが鮮明に映し出されるようにするために行うものである。
【００３７】
これらの調整は、容器２を押さえ込んでいる押さえ板１３の下方に撮像手段１５が位置し、その押さえ板１３の上方に照明手段１７が位置し、これら撮像手段１５と照明手段１７が静止した状態となっているときに行われる。つまり、それらの調整は、容器２における複数の撮像範囲のうちの一つの撮像範囲を撮像手段１５が撮像しているときに行われる。
調整が完了すると、撮像手段１５は、当該一つの撮像範囲と他の複数の撮像範囲を順番に一つ一つ撮像していき、これらの静止画像を取得する。このとき、当該一つの撮像範囲について調整された撮像手段１５の焦点と照明手段１７からの光の明るさは、他の複数の撮像範囲を撮像する際にもそのまま維持され適用される。
【００３８】
複数の撮像範囲は、容器２における測定可能範囲内にあり、この測定可能範囲は、数ｃｍ２程度の面積である。このため、一つの撮像範囲について調整された撮像手段１５の焦点と照明手段１７からの光の明るさを他の複数の撮像範囲にそのまま適用した場合でも、基本的には、これら撮像範囲を撮像した画像において細胞ｃが鮮明に映し出される。
ただし、それら他の複数の撮像範囲のうちのいずれかの撮像範囲において、容器２の表面に皺があるような場合には、この撮像範囲を撮像した画像の輝度値が高くなり、この画像に映し出されている細胞ｃが不鮮明となる。
【００３９】
その理由は、次による。
容器２の上面に押さえ板１３が載置され、さらにこの押さえ板１３により容器２が押し込まれた状態にあるとき、この押さえ板１３の下面の下方における培養液ｍの液厚は、押さえ板１３により押さえ込まれていない状態の容器２内の培養液ｍの液厚ｔ０（図４（ｉ）参照）の半分以下の厚み、すなわち、図４（iii）に示す液厚ｔ１となる。
この液厚ｔ１は、容器２の測定可能範囲内に皺がない場合の液厚である。
これに対し、その測定可能範囲における複数の撮像範囲のうちのいずれかの撮像範囲に皺があった場合、この部分の培養液ｍの液厚は、液厚ｔ１よりもさらに薄くなる。具体的に、この部分の液厚は、図８に示すように、液厚ｔ２となる。
【００４０】
照明手段１７からの光が容器２内の培養液ｍに照射されるとき、この培養液ｍに入射する光に対する透過光の割合は、液厚が液厚ｔ１となっている箇所よりも、液厚ｔ２となっている箇所の方が大きくなる。
ただし、照明手段１７からの光の明るさは、複数の撮像範囲のうちの一の撮像範囲において調整されるものであり、この撮像範囲を撮像して得られた画像の輝度値は、最適な値に調整されたものとなっている。そして、この撮像範囲における培養液ｍの液厚は、液厚ｔ１であるものと想定される。
これに対し、液厚が液厚ｔ２である箇所では、透過光が、液厚ｔ１である箇所に比べて多くなる。そうすると、撮像手段１５に入射する光の量が多くなるので、この撮像手段１５により撮像された画像の輝度値が高くなる。
【００４１】
画像の全体にわたって輝度値が高いとき、この画像では、培養液ｍが表れているピクセルの輝度値と、細胞ｃが表れているピクセルの輝度値が、近い値となる。このため、この画像を細胞計数装置２０の表示手段２４に表示させると、培養液ｍと細胞ｃとの色の差が小さくなり、細胞ｃの輪郭がぼやけた状態あるいは薄れた状態となるので、この細胞ｃが不鮮明となる。
しかも、制御手段２５は、画像に映し出された細胞ｃを適切に抽出するために、この画像に対して二値化処理などの画像処理を行うが、二値化処理などは輝度値にもとづいて行うものであり、この輝度値が培養液ｍと細胞ｃとの間で近い値になっていると、細胞ｃの輪郭が黒として選択されない可能性が高くなり、この細胞ｃを適切に抽出することができなくなる。
【００４２】
このように、画像が取得された撮像範囲内に皺がある場合、この画像の平均輝度が基準値よりも高くなり、この画像において細胞ｃが不鮮明となるので、この画像から細胞ｃを適切に抽出することができなくなる。このため、当該画像については、細胞ｃの計数に使用する対象画像から除外することとした。
なお、平均輝度と比較される基準値は、例えば、画像において細胞ｃが不鮮明となる可能性のある輝度、あるいは、二値化処理を行うときの閾値又はこの閾値に近い値などを用いることができる。ただし、この基準値は、これらの値に限るものではなく、細胞計数処理を実行するためのプログラムを開発する者、又は、当該プログラムを起動させて細胞ｃの計数を行う計測者などが、任意の数値を選択して設定することができる。
【００４３】
（２）細胞候補の抽出
制御手段２５は、輝度が基準値以下である画像に対して、輝度の調整を行い、この画像において暗い部分（輝度値が小さいピクセル）を強調する処理を行う。この強調処理は、この後に行う細胞候補の抽出において、細胞ｃの輪郭を繋ぎやすくするために行うものである。
【００４４】
また、制御手段２５は、その画像に対して二値化処理を行う。二値化処理は、ピクセルごとに、各ピクセルの輝度値と所定の閾値とを比較し、その輝度値が所定の閾値よりも高いときは、このピクセルを白とし、その輝度値が所定の閾値よりも低いときは、このピクセルを黒として表す処理である。
ここで、画像には培養液ｍと細胞ｃが映し出されるが、培養液ｍは、透明性を有するために輝度値が高くなるのに対し、細胞ｃは、その表面で光が透過しにくくなるため、輪郭に沿って輝度値が低くなる。このため、この画像に対して二値化処理を行うと、培養液ｍが映し出されている部分では白くなり、細胞ｃが映し出されている部分では、その輪郭部分が黒くなる。
【００４５】
さらに、制御手段２５は、黒を示すピクセルの座標を算出し、この黒を示すピクセルが複数隣接し合って一まとまりとなっている部分を、細胞ｃの候補として抽出する細胞候補抽出手段２５２（図７参照）として機能する。
具体的に、制御手段２５は、二値化処理を行った画像の中から黒を示すピクセルの座標を算出し、これら黒を示すピクセルの中から隣接するピクセル同士を繋ぎ合わせる。そして、一つの繋がりとなった複数のピクセルを一つの細胞ｃの候補として抽出する。これにより、制御手段２５は、画像の中で細胞ｃが表われている可能性のある部分を、細胞ｃの候補として抽出することができる。
なお、図９は、二値化処理を行った画像において抽出された細胞ｃの候補を模式的に円「○」で示した図である。
【００４６】
次いで、制御手段２５は、抽出した細胞ｃの候補の一つ一つに対してシリアル番号を付していくラベリング処理を行う。
また、制御手段２５は、ラベリング処理によって付したシリアル番号と、画像上の細胞ｃの候補の座標とを関連付け、細胞候補リストとして、記憶手段２２に記憶させる。
【００４７】
続いて、制御手段２５は、抽出した細胞ｃの候補の一つ一つについて、この細胞ｃの候補を構成しているピクセルの数をカウントする。
そして、制御手段２５は、そのピクセル数のカウント値と所定の閾値とを比較し、そのカウント値が所定の閾値よりも大きいか否かを判断する。
判断の結果、そのカウント値が所定の閾値よりも大きいときは、そのカウント値がカウントされた細胞ｃの候補を、そのまま細胞ｃの候補として存続させる。
一方、そのカウント値が所定の閾値よりも小さいときは、そのカウント値がカウントされた細胞ｃの候補を、細胞候補リストから除外する。
【００４８】
この処理を行うことにより、細胞候補リストに挙げられている細胞ｃの候補の中から、細胞ｃ以外のものであって細胞ｃよりも小さいものを除外することができる。
このような処理を行う理由は、次による。二値化処理を行った後の画像においては、培養液ｍが白色で表示され、細胞ｃの輪郭が黒色で表示される。ただし、二値化処理を行った結果、白色で表示されている培養液ｍの中に、細胞ｃ以外のものとして黒色の点が表示されることがある。また、細胞ｃの形状によっては、この細胞ｃの一部が独立し、黒色の点として表示されることがある。
これらのうち、細胞ｃ以外のものとして表示された黒色の点は、細胞ｃではないので、細胞ｃとして計数すべきでない。また、細胞ｃの一部が独立して表示された黒色の点は、細胞ｃの一部であるが、この黒色の点についても計数するとダブルカウントとなってしまうので、細胞ｃとして計数すべきでない。
そこで、これら黒色の点については、細胞ｃの候補ではないものとして、細胞候補リストから除外することとした。その方法として、黒色の点を構成しているピクセルの数が実際の細胞ｃを表している細胞ｃの候補を構成するピクセルの数よりも少ないことに着目し、細胞候補リストに挙げられた細胞ｃの候補の中から、ピクセル数が所定の閾値よりも少ない細胞ｃの候補については、細胞候補リストから除外する方法を用いることとした。
【００４９】
（３）傷、異物の除外
制御手段２５は、図１０に示すように、抽出した細胞ｃの候補の一つ一つを矩形の領域ｓで囲む処理を実行する。
領域ｓは、画像上に描かれる矩形の区域であって、四つの辺のそれぞれに細胞ｃが内接するような位置及び大きさで形成される。
領域ｓを特定するための四つの辺である領域枠ｆは、当該画像の縦方向に平行な線である領域縦線ｆａと、当該画像の横方向に平行な線である領域横線ｆｂとによって構成されており、二本の領域縦線ｆａと二本の領域横線ｆｂとによって長方形又は正方形のいずれかの形状で形成される。
領域枠ｆは、四つの辺のそれぞれに細胞ｃが内接していることから、二本の領域縦線ｆａの間隔すなわち領域横線ｆｂの長さが、細胞ｃの横方向の長さを表し、二本の領域横線ｆｂの間隔すなわち領域縦線ｆａの長さが、細胞ｃの縦方向の長さを表している。
【００５０】
なお、図９、図１０においては、細胞ｃを模式的に真円で表しているが、実際には、図１２（ｉ）、（ii）に示すように、細胞ｃが真円として表れないことが多い。このような場合でも、領域ｓは、図１１に示すように、細胞ｃが内接する矩形の領域ｓとして画像上に描かれる。
【００５１】
また、制御手段２５は、領域ｓで囲んだ細胞ｃの候補の中から、傷や異物を除外する計数対象除外手段２５４（図７参照）として機能する。
画像には、本来、培養液ｍと細胞ｃのみが映し出されているはずであるが、例えば、容器２上の撮像範囲内に傷や異物が付いていた場合には、図１２（ｉ）、（ii）に示すように、それら傷や異物が画像に映し出される。
傷や異物は、細胞ｃではないため、細胞ｃの数をカウントする際には、対象外とする必要がある。
ところが、二値化処理を行った後の画像においては、それら傷や異物が、細胞ｃと同じように黒く残ってしまう。そうすると、これら傷や異物も、細胞ｃとともに、細胞ｃの候補として抽出され、細胞数の計数の対象とされてしまう。これでは、細胞数を正確に計数することができない。
そこで、画像に映し出された傷や異物については、細胞ｃの候補から除外することとした。その方法として、傷や異物が細胞ｃよりも大きいことに着目し、領域ｓの大きさが本来の細胞ｃの大きさよりも大きいことを示す数値であるときは、この領域ｓで囲まれた細胞ｃの候補を傷又は異物であるとして、その候補から除外することとした。
【００５２】
このように傷や異物を細胞ｃの候補から除外するために、制御手段２５は、領域ｓの大きさに関する情報である大きさ情報を算出する大きさ情報算出手段２５３（図７参照）として機能する。
ここで、大きさ情報には、長短比と、領域ｓの面積とを挙げることができる。
長短比は、領域枠ｆの領域縦線ｆａの長さと領域横線ｆｂの長さとの比である。具体的には、領域縦線ｆａの長さと領域横線ｆｂの長さの大きい方を小さい方で除算して得られた商として算出することができる。
制御手段２５は、細胞ｃの候補ごとにその長短比を算出すると、この長短比と閾値とを比較し、その長短比が閾値よりも小さい数値であるか否かを判断する。そして、長短比が閾値よりも小さい数値であるときは、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃであると判断する。一方、長短比が閾値よりも大きい値であるときは、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃではなく傷又は異物であると判断する。
【００５３】
この判断について、さらに説明する。
領域ｓで囲まれたものが細胞ｃの場合、細胞ｃは、比較的丸いので、長短比は、１に近い数値となる。
これに対し、領域ｓで囲まれたものが傷の場合、傷は、通常細長いので、長短比は、大きい数値となる。
また、領域ｓで囲まれたものが異物の場合、異物は、いびつな形をしていることが多いので、長短比は、１よりも大きい数値となる。
このように、長短比は、細胞ｃについては１に近い数値となるのに対し、傷や異物については１よりも大きい数値となる。
そこで、閾値として１よりも大きい数値（例えば、２．５など）を設定しておき、この閾値と長短比とを比較する。そして、長短比が閾値よりも大きい値であるときは、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃではなく傷又は異物であると判断することができる。
そして、細胞ｃではないと判断された細胞ｃの候補については、細胞候補リストに挙げられている細胞ｃの候補の中から除外する。
これにより、それら傷や異物を細胞ｃの計数の対象から除外することができ、細胞ｃの計数の結果を正確なものとすることができる。
【００５４】
なお、上記の説明においては、長短比の算出の仕方の例として、「領域縦線ｆａの長さと領域横線ｆｂの長さの大きい方を小さい方で除算して得られた商」を挙げた。
ただし、長短比の算出の仕方は、これに限るものではなく、例えば、領域縦線ｆａの長さを領域横線ｆｂの長さで除算して得られた商、又は、領域横線ｆｂの長さを領域縦線ｆａの長さで除算して得られた商を用いてもよい。
これら「例えば」として挙げた算出の仕方を用いた場合、画像における傷や異物の向きにより、算出した長短比が１よりも小さい数値となることがある。すなわち、領域横線ｆｂの長さを領域縦線ｆａの長さで除算して得られた商を長短比とする場合において、画像上の傷の向きが横長のときは、商が１よりも大きくなるが、その傷の向きが縦長のときは、商が１よりも小さくなる。ここで、このようにして長短比が算出された領域ｓ内の細胞候補は、細胞ｃではなく傷であるため、いずれの長短比が算出されたときでも、細胞ｃの候補から除外する必要がある。そこで、閾値として、１よりも大きい方の閾値（例えば、２．５など）と、１よりも小さい方の閾値（例えば、２．５に対応する０．４など）の二つを設定しておくようにする。そして、長短比が前者の閾値よりも大きい場合だけでなく、長短比が後者の閾値より小さい場合にも、この領域ｓで囲まれた細胞ｃの候補を細胞候補リストから除外するようにする。これにより、画像上の傷や異物の向きが横長と縦長のいずれの場合であっても、当該傷等を細胞候補から除外することができる。
【００５５】
領域ｓの面積は、領域枠ｆの領域縦線ｆａの長さと領域横線ｆｂの長さとを乗算して得られる積である。
制御手段２５は、細胞ｃの候補ごとに領域ｓの面積を算出すると、この面積と閾値とを比較し、領域ｓの面積が閾値よりも小さい値であるか否かを判断する。そして、領域ｓの面積が閾値よりも小さい値であるときは、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃであると判断する。一方、領域ｓの面積が閾値よりも大きい値であるときは、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃではなく傷又は異物であると判断する。
【００５６】
この判断について、さらに説明する。
容器２の表面に形成された傷は、細胞ｃに比べて面積が大きくなることが多い。
また、容器２の表面に付着する異物には、体積が細胞ｃよりも大きいものが多い。
これら傷や異物が画像に映し出されたとき、これら傷や異物の面積は、細胞ｃの面積よりも大きいものとなる。
そこで、細胞ｃの面積よりも大きい面積を閾値として設定しておき、この閾値と領域ｓの面積とを比較する。そして、領域ｓの面積が閾値よりも大きい値であるときは、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃではなく傷又は異物であると判断することができる。
そして、細胞ｃではないと判断された細胞ｃの候補については、細胞候補リストに挙げられている細胞ｃの候補の中から除外する。
これにより、それら傷や異物を細胞ｃの計数の対象から除外することができ、細胞ｃの計数の結果を正確なものとすることができる。
なお、このように傷や異物を細胞候補リストから除外した場合、制御手段２５は、表示手段２４に表示された画像において、除外した傷や異物に付されていた領域枠ｆを消去する処理を行うことができる（図１３、図１４参照）。
【００５７】
また、ここでは、細胞ｃの候補が傷や異物であるか否かを判断する際に用いられる大きさ情報として、長短比と領域ｓの面積とを挙げたが、実際の判断においては、長短比又は領域ｓの面積のうちの一方のみを用いることができ、あるいは、両方を用いることができる。
ただし、容器２の表面に付いた傷は、画像上、どのような向きで映し出されるかわからない。例えば、図１２（ｉ）及び図１３（ｉ）においては、傷が画像の横方向に向かって伸びる方向に表れている。このような場合、この傷を囲んだ領域枠ｆの長短比が非常に大きい数値となるので、大きさ情報として長短比を用いることにより、この傷を細胞ｃの候補から除外することができる。
ところが、その傷が画像の右上から左下に向かって斜め方向に伸びている場合、この傷を囲んだ領域枠ｆの長短比は、１に近い数値となる。そうすると、大きさ情報として長短比を用いた場合には、この傷を細胞ｃの候補から除外することができなくなる。
そこで、大きさ情報として長短比とともに領域ｓの面積を併用する。これにより、上記の傷については、この傷を囲んだ領域ｓの面積が、細胞ｃを囲んだ領域ｓの面積よりも非常に大きなものとなる。よって、この傷を細胞ｃの候補から確実に除外することができる。
【００５８】
また、容器２の表面に付いた異物についても、上記の傷の例と同様のことが言える。
異物は、通常いびつな形状をしているため、大きさ情報として長短比を用いることにより、この異物を細胞ｃの候補から除外することができる。
ところが、異物の中には丸いものも存在する。そうすると、大きさ情報として長短比を用いた場合には、この異物を細胞ｃの候補から除外することができなくなる。
そこで、大きさ情報として長短比とともに領域ｓの面積を併用する。異物は、通常、細胞ｃよりも面積が大きい。このため、大きさ情報として領域ｓの面積を用いることにより、この異物を細胞ｃの候補から確実に除外することができる。
【００５９】
（４）細胞の計数
制御手段２５は、領域ｓで囲んだ細胞ｃの候補の中から傷や異物を除外し、この除外した後の細胞ｃの候補にもとづいて、細胞ｃの数を計数する細胞計数手段２５５（図７参照）として機能する。
具体的に、制御手段２５は、記憶手段２２に記憶されている細胞候補リストを参照し、傷や異物が除外された後の細胞候補リストに挙げられている細胞ｃの候補の数を、その画像に映し出されている細胞ｃの数として算出する。
制御手段２５は、算出した細胞ｃの数を、表示手段２４に表示させることができる。また、その細胞ｃの数を、細胞計数装置２０に接続されたプリンターなどを用いて印字出力させることもできる。
さらに、制御手段２５は、複数の画像のそれぞれについて細胞ｃの数を算出すると、これら算出した細胞ｃの数にもとづいて、容器２内の細胞ｃの密度を算出することができる。
【００６０】
［細胞計数方法］
次に、本実施形態の細胞計数システム１を用いて容器２内の細胞ｃの数を計数する方法である細胞計数方法の手順について、図１５を参照して説明する。
【００６１】
準備段階として、画像取得装置１０においては、移動手段１８による移動により、照明手段１７が載置台１２の上面端部（図２においては、載置台１２の上面右端部）の上方に位置し、撮像手段１５がこの照明手段１７の下方に位置するように配置される。
また、押さえ板１３及び回動板１４１は、回動手段１４の基部１４２を中心として上方に起き上がった状態とされる。
【００６２】
容器２には、細胞ｃが入った培養液ｍが封入されている。
この容器２は、細胞ｃの培養を行うために、室内温度を一定に保つ機能を有するインキュベータ（図示せず）の中に載置されている。
【００６３】
計測者は、インキュベータから容器２を取り出す（Ｓ１０。Ｓは、ステップを表す）。
計測者は、取り出した容器２を、画像取得装置１０の載置台１２の上面上に載置する（Ｓ１１）。
この状態で、計測者は、自身の手により、あるいは、ローラーなどを用いて、容器２の上面を上下動させるなどして、培養液ｍを攪拌する（Ｓ１２）。この攪拌は、所定回数、例えば、５０回程度行うようにすることができる。
【００６４】
攪拌が終了すると、計測者は、載置台１２の端辺に軸支された回動板１４１を回動させながら、押さえ板１３を容器２の上に載せ、この押さえ板１３を容器２に対して押さえ込む（Ｓ１３）。このとき、容器２の表面において押さえ板１３により押えられる部分に皺が寄らないように、当該部分を左右水平方向に伸ばしながら、押さえ板１３を押さえ込むことが望ましい。
【００６５】
次いで、計測者は、移動手段１８を操作して、照明手段１７及び撮像手段１５を移動させ、照明手段１７の集光レンズ１７１が押さえ板１３の上方に位置させるとともに、撮像手段１５をその押さえ板１３の下方に位置させるようにする。
続いて、計測者は、画像取得装置１０と細胞計数装置２０の電源を投入する（電源をＯＮにする）。これにより、照明手段１７からは、光が放射され、この光が、集光レンズ１７１で集光され、回動板１４１の透光孔１４５、押さえ板１３の透光孔１３１及び透明部材１３２を通って、容器２内の培養液ｍに照射される。
【００６６】
また、画像取得装置１０の撮像手段１５は、載置台１２の透光孔１２１及び透明部材１２２を通して、容器２を撮像する。このとき、撮像手段１５は、容器２のうち載置台１２の透光孔１２１に露出している範囲を測定可能範囲とし、この測定可能範囲内の一つの撮像範囲に対して撮像を行う。
撮像により取得された画像は、画像データとして、撮像手段１５から細胞計数装置２０へ送信される。
【００６７】
細胞計数装置２０の通信手段２１は、画像データを受信する。
制御手段２５は、その画像データにもとづく容器２の画像を、表示手段２４に表示させる。
計測者は、細胞計数装置２０の表示手段２４に表示された画像を目視により確認する（Ｓ１４）。
【００６８】
計測者は、容器２を、所定時間、画像取得装置１０の載置台１２の上面上にて静置させる。この静置は、容器２の内面上などに細胞ｃを配置させるとともに、細胞計数装置２０の表示手段２４に表示された画像において細胞ｃと傷や異物等とが同時に鮮明に映し出されるようにするために行うものである。この静置する時間は、例えば、３分間などとすることができる（Ｓ１５）。
静置している間、計測者は、細胞計数装置２０の表示手段２４に表示された画像が、容器２の培養液ｍ中の細胞ｃを鮮明に映し出しているか否かを確認する。この確認において、画像が細胞ｃを鮮明に映し出していないとき、計測者は、画像取得装置１０のダイヤル１６１をまわすことにより、その画像に細胞ｃが鮮明に映し出されるように、撮像手段１５を上下に移動させて、この撮像手段１５の焦点を調整する。
また、計測者は、容器２を静置している間、細胞計数装置２０の表示手段２４に表示された画像を目視しながら、照明手段１７による照明の程度を確認する。そして、この照明手段１７による照明の程度が適切な明るさでないとき、計測者は、照明手段１７の明るさ調整つまみ１７２をまわすことにより、照明の程度を調整する。
【００６９】
容器２の静置が完了した後、細胞計数装置２０の制御手段２５は、画像に映し出された細胞ｃの数を計数する細胞計数処理を実行する（Ｓ１６）。そして、この計数の結果である細胞ｃの数を記憶手段２２に記憶させるとともに、表示手段２４に表示させる。
その後、計測者は、画像取得装置１０の載置台１２から容器２を取り出し、インキュベータの内部にこの容器２を収納する（Ｓ１７）。
これにより、細胞数の計数が終了する。
【００７０】
次に、細胞計数装置２０が実行する細胞計数処理について、図１６を参照して説明する。
画像取得装置１０の撮像手段１５は、容器２の静置（図１５のＳ１５）が終了した後、この容器２に封入された培養液ｍ内の細胞ｃを撮像する。
このとき、撮像手段１５は、容器２の測定可能範囲内における複数の撮像範囲に対して一つ一つ順番に撮像を行い、この撮像により取得した画像を、画像データとして細胞計数装置２０へ送信する。
【００７１】
細胞計数装置２０の通信手段２１は、画像取得装置１０の撮像手段１５から送信されてきた画像データを受信する。制御手段２５は、通信手段２１にて受信された画像データを記憶手段２２へ送って記憶させる。
制御手段２５は、複数の画像データの中から一の画像データを記憶手段２２から取り出す（Ｓ２０）。
制御手段２５は、この取り出した画像データにもとづいて、この画像データが示す画像の輝度値を算出する（Ｓ２１）。このとき、制御手段２５は、画像の区画であるピクセルごとに輝度値を算出し、画像におけるすべてのピクセルについて輝度値を算出すると、これらすべてのピクセルの輝度値の平均を当該画像の平均輝度として算出する。
【００７２】
そして、制御手段２５は、記憶手段２２から基準値を取り出し、この基準値と算出した平均輝度とを比較し、平均輝度が基準値以下であるか否かを判断する（Ｓ２２）。
判断の結果、平均輝度が基準値を超過しているときは、この画像については、Ｓ２４以降の処理を実行せず、細胞数の計数を行うための画像から除外する（Ｓ２３）。
この処理を行なうことにより、容器２の表面に皺があったために、画像の輝度が高くなり、細胞ｃが不明瞭となった画像を、細胞数の計数を行うための画像から除外することができる。
そして、Ｓ２３の処理を実行した場合、制御手段２５は、新たな画像データを記憶手段２２から取り出し、この画像データに対してＳ２１以降の処理を実行する。
【００７３】
一方、平均輝度が基準値以下であるときは、制御手段２５は、その画像について輝度を調整する（Ｓ２４）。
次いで、制御手段２５は、その画像について暗い部分を強調するように画像処理を施す（Ｓ２５）。
続いて、制御手段２５は、その画像に対して二値化処理を行う（Ｓ２６）。
そして、制御手段２５は、二値化処理を行った画像の中から黒を示すピクセルの座標を算出し、これら黒を示すピクセルの中から隣接するピクセル同士を繋ぎ合わせ、一つの繋がりとなった複数のピクセルを一つの細胞ｃの候補として抽出する。
このようにして、画像上、細胞ｃの候補をすべて抽出すると、制御手段２５は、抽出した細胞ｃの候補の一つ一つに対してシリアル番号を付していくラベリング処理を行う（Ｓ２７）。
【００７４】
また、制御手段２５は、細胞ｃの候補の一つ一つについて、これら細胞ｃの候補を構成するピクセルの数を算出し、このピクセル数が所定の閾値よりも少ないものについては、細胞候補リストから除外する（Ｓ２８）。
【００７５】
さらに、制御手段２５は、抽出した細胞ｃの候補の一つ一つに対して、矩形の領域ｓで囲んでいく（Ｓ２９）。
そして、制御手段２５は、細胞ｃの候補の一つ一つに対して、領域枠ｆの長短比を算出する（Ｓ３０）。
また、制御手段２５は、記憶手段２２から閾値を取り出し、この閾値と領域枠ｆの長短比とを比較し、長短比が閾値よりも小さい値であるか否かを判断する（Ｓ３１）。
判断の結果、長短比が閾値よりも大きい値であるときは、制御手段２５は、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃではないもの、例えば、容器２の表面の傷又は異物であると判断する。そして、この領域ｓにより囲まれた細胞ｃの候補を細胞候補リストから除外する（Ｓ３２）。これにより、それら傷や異物を、細胞ｃの計数の対象から除外することができる。
一方、長短比が閾値よりも小さい値であるときは、制御手段２５は、この領域ｓで囲まれたものを細胞ｃの候補として残しておく。
【００７６】
次いで、制御手段２５は、細胞ｃの候補の一つ一つに対して、領域ｓの面積を算出する（Ｓ３３）。
そして、制御手段２５は、記憶手段２２から閾値を取り出し、この閾値と領域ｓの面積とを比較し、領域ｓの面積が閾値以下であるか否かを判断する（Ｓ３４）。
判断の結果、領域ｓの面積が閾値よりも大きい値であるときは、制御手段２５は、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃではないもの、例えば、容器２の表面の傷又は異物であると判断する。そして、この領域ｓにより囲まれた細胞ｃの候補を細胞候補リストから除外する（Ｓ３５）。これにより、それら傷や異物を、細胞ｃの計数の対象から除外することができる。
一方、領域ｓの面積が閾値以下であるときは、制御手段２５は、この領域ｓで囲まれたものが細胞ｃであるものと判断する。
【００７７】
制御手段２５は、記憶手段２２に記憶されている細胞候補リストを参照し、細胞ｃの候補の数を計数する（Ｓ３６）。そして、計数した結果を細胞ｃの数として記憶手段２２に保存させるとともに、表示手段２４に表示させる。
【００７８】
また、制御手段２５は、記憶手段２２に記憶されているすべての画像データについて、Ｓ２０〜Ｓ３６までの処理を行ったか否かを判断する（Ｓ３７）。
判断の結果、Ｓ２０〜Ｓ３６までの処理を行っていない画像データがあるときは、制御手段２５は、記憶手段２２から当該画像データを取り出して、Ｓ２０〜Ｓ３６までの処理を実行する。
一方、Ｓ２０〜Ｓ３６までの処理を行っていない画像データがないときは、制御手段２５は、各画像ごとに計数した細胞ｃの数の平均を算出する。また、制御手段２５は、各画像ごとに計数した細胞ｃの数にもとづいて、容器２内の細胞ｃの密度を算出する（Ｓ３８）。算出した平均及び密度は、記憶手段２２に記憶される。
制御手段２５は、これらＳ２０〜Ｓ３８の各処理を実行し、この実行が完了すると、細胞計数処理を終了する。
【００７９】
このような内容の細胞計数処理を実行することにより、制御手段２５は、画像に映し出された細胞ｃの数をより正確に計数することができる。そして、この計数の結果にもとづいて、容器２内の細胞ｃの密度をより正確に算出することができる。
特に、制御手段２５は、皺検出手段２５１として機能することにより、容器２の表面に皺があるために細胞ｃが不鮮明となっている画像については、細胞ｃの計数に用いる画像から除外する。
また、制御手段２５は、大きさ情報算出手段２５３及び計数対象除外手段２５４として機能することにより、画像に映し出された傷や異物等を細胞ｃの候補から除外する。
これらの機能を実行することにより、制御手段２５は、細胞ｃが不鮮明な画像を計数対象の画像から除外でき、画像に表れた傷や異物等を細胞ｃの候補から除外することができるので、細胞ｃが鮮明に映し出された画像を用いて、この画像内の細胞ｃの数を正確に計数でき、この計数の結果にもとづいて、容器２内の細胞ｃの密度や、容器２内の全細胞数を高精度で算出することが可能となる。
【実施例】
【００８０】
以下、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
【００８１】
細胞計数システム１として、図２〜図４に示す構成を備えた画像取得装置１０と、図６、図７に示す構成を備えた細胞計数装置２０とを用意した。
これらのうち、画像取得装置１０には、２００万画素ＣＣＤカメラと位相差光学系の顕微鏡を撮像手段１５として搭載した。
対物レンズ１５１には、倍率が１０倍のものを使用した。
照明手段１７には、赤色ＬＥＤ照明を使用した。
【００８２】
容器２は、東洋製罐グループホールディングス株式会社製の１Ｌ培養バックＣＣＢ−ｓｔを使用した。
培養液ｍは、株式会社細胞科学研究所の免疫細胞療法研究用無血清培養液（ＩＬ−２  ７００  ＩＵ／ｍｌ）を使用した。
細胞ｃは、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．のヒト末梢血単核細胞ＨＭＮＣ−ＰＢを使用した。
容器２に封入する培養液ｍの量は、１Ｌとした。
そして、培養液ｍ中の細胞ｃの密度は、１．７５×１０６［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］とした。
【００８３】
この容器２を、３７℃（５％  ＣＯ２）の培養条件下で、８日間、安置することにより、細胞ｃを培養した。
そして、図１５に示したフローチャートの手順にしたがって、画像取得装置１０を用いて容器２内の細胞ｃを撮像し、図１６に示したフローチャートの手順にしたがって、その撮像した画像を細胞計数装置２０の表示手段２４に表示させるとともに、その画像に映し出されている細胞ｃの数を計数した。
１回の撮像範囲（図５参照）は、０．６５ｍｍ×０．５ｍｍとした。
【００８４】
その結果を、図１７、図１８に示す。
図１７は、各撮像範囲ごとに取得した画像を用いて細胞ｃの数を計数した結果等を示す図表である。
詳細に説明すると、図１７の「番号」は、撮像範囲ごとに撮像した画像のそれぞれに付したシリアル番号を示している。
「傷除去なし」は、図１６に示すＳ２２〜Ｓ２３の各処理（基準値よりも輝度値が高い画像を除外する処理。以下、高輝度画像除外処理という）と、図１６に示すＳ２９〜Ｓ３５の各処理（領域の大きい細胞候補を除外する処理。以下、大領域除外処理という）とを、実行しなかった場合における、画像ごとの細胞ｃの計数値を示している。
「傷除去あり」は、高輝度画像除外処理と大領域除外処理とを実行した場合における、画像ごとの細胞ｃの計数値を示している。
「目視計数」は、細胞計数装置２０の表示手段２４に表示された画像を、計測者が、目視により細胞ｃの数を計数した結果を示している。
【００８５】
「平均」は、「傷除去なし」と「傷除去あり」と「目視計数」のそれぞれにおける細胞ｃの計数結果の平均値を示している。
「標準偏差」は、「傷除去なし」と「傷除去あり」と「目視計数」のそれぞれにおける細胞ｃの計数結果の散らばり具合を数値化して示している。
「誤差（％）」は、「目視計数」の「平均」に対する「傷除去なし」の「平均」の誤差と、「目視計数」の「平均」に対する「傷除去あり」の「平均」の誤差を、それぞれ百分率で示している。具体的な計算方法を挙げると、前者の誤差は、「傷除去なし」の「平均」と「目視計数」の「平均」との差を「目視計数」の「平均」で除算して１００を乗算した数値であり、後者の誤差は、「傷除去あり」の「平均」と「目視計数」の「平均」との差を「目視計数」の「平均」で除算して１００を乗算した数値である。
図１８は、図１７に示す「傷除去なし」の「平均」と「傷除去あり」の「平均」を棒グラフで示すとともに、「目視計数」の「平均」を点線で示したものである。
【００８６】
図１７に示すように、「傷除去あり」の欄においては、「番号」が１番と２番と３番の画像が、細胞ｃの計数対象の画像から除外されている。これは、「傷除去なし」においては、高輝度画像除外処理を実行していなかったが、「傷除去あり」においては、高輝度画像除外処理を実行したために、それら1番〜３番の画像を除外したことを示すものである。このことから、１番〜３番の画像は、輝度値が基準値よりも高かったことがわかる。
【００８７】
そして、このように、高輝度画像除外処理を行って輝度値が基準値よりも高い画像を除外したことにより、細胞ｃの計数をより正確なものとすることができた。その理由は、次の通りである。
１番〜３番の画像に映し出されている細胞ｃの数は、「傷除去なし」の欄に示すように、「７０」、「５３」、「１０」といった数値となっている。これら「７０」等の数値は、「目視計数」の「平均」に示されている「１２４」という数値、すなわち、一つの画像に本来映し出されるべき細胞ｃの数よりも非常に少ない数値となっている。これは、１番〜３番の画像が撮像された容器２上に皺があったために、これらの画像の輝度値が基準値よりも高くなっており、細胞ｃが不鮮明となってしまっているからであると考えられる。
そして、それら１番〜３番の画像を含む２０枚の画像を用いて細胞ｃを計数した結果を示す「傷除去なし」の「平均」と、それら１番〜３番の画像を除外して細胞ｃを計数した結果を示す「傷除去あり」の「平均」とを比較したとき、前者は、「目視計数」の「平均」よりも少ない数値となっているのに対し、後者は、「目視計数」の「平均」に近い数値となっている。
したがって、高輝度画像除外処理を行ったことにより、細胞ｃの数をより正確に計数できることが、この実施例の計測結果から明らかにすることができた。
【００８８】
また、図１７、図１８に示すように、「番号」が４番から２０番までの画像について、「傷除去なし」の欄に示された細胞ｃの計数値と「傷除去あり」の欄に示された細胞ｃの計数値とを比較したとき、「傷除去なし」の計数値が、「傷除去あり」の計数値よりも、少ない数値となっている。これは、大領域除外処理を行ったことにより、細胞候補から傷や異物が除外されたためである。
そして、「傷除去なし」の「平均」と「傷除去あり」の「平均」とを比較すると、後者の方が、「目視計数」の「平均」に近い数値となっている。
よって、大領域除外処理を行ったことにより、細胞ｃの数をより正確に計数できることが、この実施例の計測結果から明らかにすることができた。
【００８９】
［細胞計数プログラム］
次に、細胞計数プログラムについて説明する。
上記の実施形態におけるコンピュータ（細胞計数システムにおける画像取得装置及び細胞計数装置）の細胞計数機能（細胞計数方法を実行するための機能）は、記憶手段（例えば、ＲＯＭやハードディスクなど）に記憶された細胞計数プログラムにより実現される。
【００９０】
細胞計数プログラムは、コンピュータの制御手段（ＣＰＵなど）に読み込まれることにより、コンピュータの構成各部に指令を送り、細胞計数方法として実行される各種処理、例えば、画像取得装置の画像取得処理、細胞計数装置の制御手段による画像の輝度算出処理、平均輝度が基準値よりも高い画像の不採用処理である高輝度画像除外処理、二値化処理、ラベリング処理、領域設定処理、領域の長短比算出処理、領域の面積算出処理、長短比又は面積にもとづく領域の除外処理である大領域除外処理、細胞数の計数処理などを行わせる。
これによって、細胞計数機能は、ソフトウエアである細胞計数プログラムとハードウエア資源であるコンピュータ（画像取得装置及び細胞計数装置）の各構成手段とが協働することにより実現される。
【００９１】
なお、細胞計数機能を実現するための細胞計数プログラムは、コンピュータのＲＯＭやハードディスクなどに記憶される他、コンピュータ読み取り可能な記録媒体、たとえば、外部記憶装置及び可搬記録媒体等に格納することができる。
外部記憶装置とは、ＣＤ−ＲＯＭ等の記憶媒体を内蔵し、細胞計数装置に外部接続されるメモリ増設装置をいう。一方、可搬記録媒体とは、記録媒体駆動装置（ドライブ装置）に装着でき、かつ、持ち運び可能な記録媒体であって、たとえば、フレキシブルディスク，メモリカード，光磁気ディスク等をいう。
【００９２】
そして、記録媒体に記録されたプログラムは、コンピュータのＲＡＭ等にロードされて、制御手段により実行される。この実行により、上述した実施形態における画像取得装置及び細胞計数装置の機能が実現される。
さらに、コンピュータで細胞計数プログラムをロードする場合、他のコンピュータで保有された細胞計数プログラムを、通信回線を利用して自己の有するＲＡＭや外部記憶装置にダウンロードすることもできる。このダウンロードされた細胞計数プログラムも、制御手段により実行され、上記実施形態における画像取得装置及び細胞計数装置の細胞計数機能を実現する。
【００９３】
以上説明したように、本実施形態の細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムによれば、画像に映し出された細胞を計数する際に、この細胞よりも大きく映し出された傷や異物を、細胞の計数の対象から除外することができる。これにより、細胞の計数値の正確性や、細胞の計数を行う装置の信頼性を向上させることができる。
【００９４】
以上、本発明の細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムの好ましい実施形態について説明したが、本発明に係る細胞計数装置、細胞計数システム、細胞計数方法及び細胞計数プログラムは上述した実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上述した実施形態では、画像取得装置の撮像の対象として可撓性を有する培養容器を挙げたが、画像取得装置の撮像の対象は、可撓性を有する培養容器に限るものではなく、硬質の材料を用いて形成された培養容器に収められている培養液及び細胞であってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、容器内の細胞の数を計数する装置に利用可能である。
【符号の説明】
【００９６】
１  細胞計数システム
１０  画像取得装置
２０  細胞計数装置
２１  通信手段（画像データ取得手段）
２２  記憶手段
２４  表示手段
２５  制御手段
２５１  皺検出手段
２５２  細胞候補抽出手段
２５３  大きさ情報算出手段
２５４  計数対象除外手段
２５５  細胞計数手段
２  容器（培養容器）
ｍ  培養液
ｃ  細胞
ｓ  領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１２】
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