(57)【要約】【課題】  ピシウム属菌の種の同定を、特殊な方法や装置を用いることなく、短期間で、正確かつ簡便に行う方法、及び、ピシウム属菌の防除方法を提供する。【解決手段】  ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法であって、同定の対象とするピシウム属菌Ｘについて、アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性を計測するステップＩと、ステップＩで得られた計測結果と、既知のピシウム属菌Ｙの、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性との異同を判定するステップＩＩとを有し、前記ステップＩＩで、前記ピシウム属菌Ｘの感受性が前記ピシウム属菌Ｙの感受性と同程度である場合に、前記ピシウム属菌Ｘは前記ピシウム属菌Ｙと同種であると判断する、ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法、及びピシウム属菌の感染を防除する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法であって、
同定の対象とするピシウム属菌Ｘについて、アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性を計測するステップＩと、
ステップＩで得られた計測結果と、既知のピシウム属菌Ｙの、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性との異同を判定するステップＩＩとを有し、
前記ステップＩＩで、前記ピシウム属菌Ｘの感受性が前記ピシウム属菌Ｙの感受性と同程度である場合に、前記ピシウム属菌Ｘは前記ピシウム属菌Ｙと同種であると判断する、ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法。
【請求項２】
前記アミノグリコシド系抗生物質Ａがストレプトマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ピシウム属菌Ｙが、ピシウム・バンテプーリ（Pythium vanterpoolii）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
同定の対象とするピシウム属菌Ｘが、芝草に病害をもたらすピシウム属菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
芝草のピシウム属菌Ｘによる植物病原性の感染を防除する方法であって、
芝生に感染しているピシウム属菌Ｘの種を、請求項４に記載の方法により同定し、得られた同定結果から、用いる防除剤を選択し、選択した防除剤を芝草に適用することを特徴とする、芝草のピシウム属菌Ｘによる植物病原性の感染を防除する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピシウム属菌の種の同定を、特殊な方法や装置を用いることなく、短期間で、正確かつ簡便に行う方法、及びピシウム属菌の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
芝草に発生する病害には、真菌、細菌、卵菌等を病原体とする様々なものがあるが、最も深刻な病害のひとつとして、卵菌類に属するピシウム属菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ）による病害がある。芝草がピシウム属菌を原因とするピシウム病に感染すると、葉枯れ等の病徴を示し、放置すると病害は急速に拡大し、芝生に大きな被害をもたらす。ピシウム属菌の防除は耕種的管理方法のみでは困難であり、殺菌剤を用いた、発生前の予防、及び発生後の早期治療を行うことを要する。
【０００３】
ピシウム属菌は土壌から植物に感染する病害菌であり、芝草以外にも、農業、園芸業、林業、水産業等の分野において、苗立枯病を代表とする深刻な病害をもたらす。このような病害の防除を的確に行うためには、病害の早期診断が必要である。病害を早期に発見、診断すれば、防除に伴う労力と費用を大幅に節減することが可能となる。
【０００４】
従来、芝草病害の診断は、通常、感染芝上に現れる病徴の外観観察、又は、サンプルを採取して研究室等で病害菌を同定することにより行われている。
しかしながら、病徴の外観観察による診断は、熟練者が行うことが必要であり、また観察だけで病原菌の種類を正確に診断することは極めて難しい。
病害菌の同定は、菌を増殖させて顕微鏡観察により形態的特徴を鑑別して菌の種類を判別するものである。この方法には、特殊な機器や、特に熟練した研究者による専門的な鑑別が必要となる。また、菌糸や遊走子嚢の形成を見るのに数日、さらに卵胞子の形成まで見て確認しようとすると、通常２週間以上の期間を要する。
以上の方法のほかに、抗原抗体反応を利用した菌の検出法が知られているが、病原菌の種の正確な同定はできず、擬陽性を示す等の問題がある。
【０００５】
その他、ピシウム属菌の迅速な診断方法として、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法。ＤＮＡ配列の断片を大量に増幅する分子生物学の手法の一種。）による、種の特異的なＤＮＡ配列を検出する方法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。この方法は、ピシウム属菌の中でも特に芝草における重要病害菌であるピシウム・バンテプーリの検出に用いられている（特許文献２）。しかし、ＰＣＲ法は、特殊な専用装置を必要とし、一般的に実施できる方法ではない。
よって、ピシウム属菌の種を短期間で正確に同定できる、簡便な方法が望まれていた。
【０００６】
本発明に関連して、一部のピシウム属菌は、ストレプトマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質に感受性を示すことが知られている（非特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−２３４３９９号公報
【特許文献２】特開平１１−３４６７６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｓａｎｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｆｉｖｅ  Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｕｒｆｇｒａｓｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，１５８：６０９−６１５（２０１０）
【非特許文献２】Ｌｅｅ  Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｒｕｅ  ｆｕｎｇｉ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ａｎｄ  Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９９：８３６−８４３（２００５）
【非特許文献３】Ｍａｈｌ  Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｔｏ  ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５６（７）：４０２１−４０２３（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した従来技術に鑑みてなされたものであり、ピシウム属菌の種の同定を、特殊な方法や装置を用いることなく、短期間で正確に、かつ簡便に行う方法、及び、ピシウム属菌の防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ピシウム・バンテプーリが、アミノグリコシド系抗生物質の一種であるストレプトマイシンに対して高い感受性を有すること、そして、この現象を利用することで、ピシウム・バンテプーリとそれ以外のピシウム属菌とを区別できることを見出し、この知見を一般化することで、ピシウム属菌の種を同定する方法、ピシウム属菌の防除方法につき本発明を完成するに至った。
【００１１】
かくして本発明によれば、下記〔１〕〜〔４〕のピシウム属菌の種を同定する方法、及び、〔５〕のピシウム属菌の防除方法が提供される。
〔１〕ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法であって、
同定の対象とするピシウム属菌Ｘについて、アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性を計測するステップＩと、
ステップＩで得られた計測結果と、既知のピシウム属菌Ｙの、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性との異同を判定するステップＩＩとを有し、
前記ステップＩＩで、前記ピシウム属菌Ｘの感受性が前記ピシウム属菌Ｙの感受性と同程度である場合に、前記ピシウム属菌Ｘは前記ピシウム属菌Ｙと同種であると判断する、ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法。
〔２〕前記アミノグリコシド系抗生物質Ａが、ストレプトマイシンである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記ピシウム属菌Ｙが、ピシウム・バンテプーリ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖａｎｔｅｒｐｏｏｌｉｉ）である、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕同定の対象とするピシウム属菌Ｘが、芝草に病害をもたらすピシウム属菌である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕芝草におけるピシウム属菌Ｘの感染を防除する方法であって、
〔４〕に記載の方法により、前記ピシウム属菌Ｘの種を同定し、同定した結果から、用いる防除剤を選択し、このものを芝草に適用することを特徴とする、芝草におけるピシウム属菌Ｘの感染を防除する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の同定方法によれば、ピシウム属菌の種の同定を、特殊な方法や装置を用いることなく、短期間で、正確かつ簡便に行うことができる。これにより、芝草がピシウム属菌に侵されていた場合、原因となるピシウム属菌の種が早期に正確に同定されるため、同定されたピシウム属菌に対する防除方法、防除剤等を、早期に芝草に適用することができる。
本発明の防除方法によれば、ピシウム属菌の種の同定を、短期間で、正確かつ簡便に行った上で、最適な防除剤を早期に適用することができ、病害を最小限に抑え、さらなる連鎖障害等の病害被害を回避し、防除に伴う労力や費用を大幅に節減することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を、（１）ピシウム属菌の種の同定方法、及び（２）ピシウム属菌の防除方法に項分けして詳細に説明する。
（１）ピシウム属菌の種の同定方法
本発明の同定方法は、ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法であって、
（Ｉ）同定の対象とするピシウム属菌Ｘについて、アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性を計測するステップＩと、
（ＩＩ）ステップＩで得られた計測結果と、既知のピシウム属菌Ｙの、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性との異同を判定するステップＩＩとを有し、
前記ステップＩＩで、前記ピシウム属菌Ｘの感受性が前記ピシウム属菌Ｙの感受性と同程度である場合に、前記ピシウム属菌Ｘは前記ピシウム属菌Ｙと同種であると判断する、ピシウム属菌Ｘの種を同定する方法である。
【００１４】
ピシウム属菌は、ストラメノパイル生物の卵菌綱の１属であり、土壌や水域環境に広く分布している。これまでに少なくとも世界で１５０種、日本国内では約５０種が報告されている。一般には農作物の根や地表面付近の茎葉の病原として知られている。ピシウム属菌による病害は、その種によって病原性やそれにかかわる発生生態が明らかに違っているため、種を知ることは、ピシウム属菌による病害の効率的防除につながる。
【００１５】
同定の対象とするピシウム属菌Ｘは、特に限定されないが、下記に示す、ピシウム属の植物病原菌種を例示することができる。
ピシウム・アカンソフォロン（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｃａｎｔｈｏｐｈｏｒｏｎ）
ピシウム・アフェルティレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｆｅｒｔｉｌｅ）
ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）
ピシウム・アリストスポラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｉｓｔｏｓｐｏｒｕｍ）
ピシウム・アレノマネス（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ）
ピシウム・カロリニアナム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｃａｒｏｌｉｎｉａｎｕｍ）、
ピシウム・コロラタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｃｏｌｏｒａｔｕｍ）
ピシウム・コニディオフォラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｕｍ）
ピシウム・デバリアナム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ  ）
ピシウム・デリエンセ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｌｉｅｎｓｅ）
ピシウム・ディシミレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｉｓｓｉｍｉｌｅ）
ピシウム・ディソトカム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｔｏｃｕｍ）
ピシウム・エチヌラタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）
ピシウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）
ピシウム・ヘリコイデス（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｈｅｌｉｃｏｉｄｅｓ）
ピシウム・ハイドノスポラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｈｙｄｎｏｓｐｏｒｕｍ）
ピシウム・インフラタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ）
ピシウム・インテルメディアム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）
ピシウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）
ピシウム・イワヤマイ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｗａｙａｍａｉ）
ピシウム・マミラタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍａｍｉｌｌａｔｕｍ）
ピシウム・ミリオティラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ）
ピシウム・パディカム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｐａｄｄｉｃｕｍ）
ピシウム・パレカンドラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｐａｒｏｅｃａｎｄｒｕｍ）
ピチウム・ポルフィラエ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｐｏｒｐｈｙｒａｅ）
ピシウム・ロストラタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｒｏｓｔｒａｔｕｍ）
ピシウム・スピノサム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ）
ピシウム・スプレンデンス（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）
ピシウム・サルカタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｕｌｃａｔｕｍ）
ピシウム・シルバティカム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ）
ピシウム・トルロサム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）
ピシウム・ウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）
ピシウム・バンテプーリ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖａｎｔｅｒｐｏｏｌｉｉ）
ピシウム・ベクサンス（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）
ピシウム・ビオラエ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｉｏｌａｅ）
ピシウム・ジンギベリス（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｚｉｎｇｉｂｅｒｉｓ）
これらの中でも、芝草に病害をもたらすピシウム属菌であるのが好ましく、ピシウム・バンテプーリ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖａｎｔｅｒｐｏｏｌｉｉ）、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、ピシウム・グラミニコラ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）であるのが好ましく、ピシウム・バンテプーリが特に好ましい。
【００１６】
〔Ｉ〕ステップＩ
本発明の方法のステップＩは、同定の対象とするピシウム属菌Ｘについて、アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性を計測するステップである。
【００１７】
アミノグリコシド系抗生物質は、アミノ糖を含む配糖体抗生物質の総称である。本発明に用いるアミノグリコシド系抗生物質としては、特に限定されないが、ストレプトマイシン、カスガマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、パロモマイシン、バリダマイシン、ベカナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ジベカシン、リボスタマイシン、ハイグロマイシンＢ等が挙げられる。これらは、一種単独で、或いは二種以上を組み合わせて用いることができる。
異なる種類の抗生物質を用いれば、異なる種のピシウム属菌の同定が可能となる。これらのうち、より簡便にかつ正確に、芝草におけるピシウム属菌の同定が可能となることから、ストレプトマイシンを用いるのが特に好ましい。
【００１８】
「アミノグリコシド系抗生物質に対する感受性」とは、アミノグリコシド系抗生物質によって菌の生育が抑制される程度を意味する。
例えば、同じ濃度の同一のアミノグリコシド系抗生物質を適用した場合に、生育抑制の程度はピシウム属菌の菌種によって異なる。
また、同一のアミノグリコシド系抗生物質を、濃度を変えて（例えば、０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍの間）適用した場合に、同じ程度の生育抑制が現れる濃度は菌種によって異なる。
さらに、適用時間や適用温度によっても、菌の生育が抑制される程度に差異が生じる場合がある。
【００１９】
菌の生育が抑制される程度を計測する方法としては、特に限定されないが、より短時間でより簡便に実施でき、再現性のあるデータが得られやすいことから、アミノグリコシド系抗生物質を含有する培地で菌を培養し、生育程度を計測する方法が好ましい。この場合、定量的データを得るために、培地として固形培地を用い、菌糸の伸長を測定するのがより好ましい。
なお、培地としては、特に制約はないが、ピシウム属菌の培養に一般的に用いられるポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）を好ましく用いることができる。
【００２０】
菌の生育が抑制される程度の計測は、より具体的には、次のようにして行うことができる。すなわち、一定濃度のアミノグリコシド系抗生物質Ａを含有する固形培地に菌を接種し、一定温度（例えば、２０℃、２５℃、３０℃等）で一定時間（例えば、２４時間、４８時間、９６時間等）培養し、菌糸の伸長（長さ、単位は〔ｍｍ〕）を測定する。同時に、アミノグリコシド系抗生物質Ａを含有しない固形培地を用いた場合の菌糸の伸長も同様に測定し、それを基準にして伸長が抑制された程度を明らかにする。
【００２１】
アミノグリコシド系抗生物質Ａの濃度(使用量)は特に限定されず、使用方法、温度などの条件、同定対象のピシウム属菌の種などに応じて、最適な濃度を選択すればよい。
例えば、前記培地で培養する方法で、ストレプトマイシンを用いてピシウム・バンテプーリの同定を行う場合においては、培地中のストレプトマイシンの濃度は、５０〜５００ｐｐｍが好ましく、１５０〜２５０ｐｐｍがより好ましく、１９０〜２１０ｐｐｍが特に好ましい。
【００２２】
〔ＩＩ〕ステップＩＩ
ステップＩＩは、ステップＩで得られた計測結果と、既知のピシウム属菌Ｙの、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性との異同を判定するステップである。
既知のピシウム属菌Ｙの、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性も、ステップＩに記載の、ピシウム属菌Ｘについて、アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性を計測する方法と同様にして計測することができる。
【００２３】
具体的には、ピシウム属菌Ｘと、既知のピシウム属菌Ｙに関し、アミノグリコシド系抗生物質の有無による伸長が抑制された値（ｍｍ）を比較する。例えば、伸長が抗生物質を含有しない場合の２分の１になるときの抗生物質濃度を認定して比較し、異同を判定する。
【００２４】
また、伸長抑制の程度を、グラフ化するなどして、数値の差、比、あるいは数値を統計的に、より定量的に解析したものを、求められる有意差の有無などに利用することもできる。
【００２５】
本発明においては、前記ステップＩＩで、前記ピシウム属菌Ｘの感受性が前記ピシウム属菌Ｙの感受性と同程度である場合に、前記ピシウム属菌Ｘは前記ピシウム属菌Ｙと同種である、すなわち、ピシウム属菌Ｘの種はピシウム属菌Ｙであると同定することができる。
ここで、同程度とは、個体差、測定誤差、計測方法等によって影響を受けること等を考慮して、経験的に同じであると判断される範囲をいう。通常、計測値の差が全体の±１０％以内のである場合を同程度という。
なお、複数の検体を用いて計測し、平均値を用いることで、判定精度をより高めることができる。
【００２６】
一方、前記ピシウム属菌Ｘの感受性が前記ピシウム属菌Ｙの感受性とは異なると判定される場合には、前記ピシウム属菌Ｘの種は、ピシウム属菌Ｙと同種ではないと判断する。その場合には、ピシウム属菌Ｘの感受性を、ピシウム属菌Ｙ以外の、他のピシウム属菌Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３・・・の感受性と比較してその異同の判定を行い、同程度のものがあれば、ピシウム属菌Ｘの種は、そのピシウム属菌（Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３・・・）であると同定することができる。
【００２７】
本発明においては、種の異同を判定する際、前記ステップＩＩの判定方法に、種の異同を判定するその他の方法を組み合わせて判定し、ピシウム属菌Ｘの同定を行うこともできる。
種の異同を判定するその他の方法としては、特に限定されず、例えば、生育最適温度を計測する方法；病徴観察による方法；培養した菌についての肉眼若しくは顕微鏡による形態観察を用いる方法；抗原抗体反応を利用する方法；ＰＣＲにより種特異的なＤＮＡ配列を検出する方法；等が挙げられる。
【００２８】
ピシウム属菌は種によって生育最適温度が異なる。例えば、ピシウム・バンテプーリに適した培養温度は、２０〜２５℃である。同定対象のピシウム属菌Ｘを培養し、その生育最適温度が２０〜２５℃であることが認定されれば、前記アミノグリコシド系抗生物質Ａに対する感受性との移動の判定と併せて、より明確に、ピシウム属菌Ｘがピシウム・バンテプーリであると判断することができる。
【００２９】
また、病徴観察あるいは培養した菌についての肉眼若しくは顕微鏡による形態観察によって、同定の対象とするピシウム属菌が属する可能性のある種を数種類に限定した後に、本発明の同定方法によって、ピシウム属菌の種を最終的に同定することもできる。
【００３０】
本発明の同定方法によれば、早期にピシウム属菌の種が正確に同定されるため、同定されたピシウム属菌に対する最適な防除剤、使用農薬等を早期に選定し、対象植物等に適用することができる。したがって、病害を最小限に抑え、さらなる連鎖障害等の病害被害を回避し、防除に伴う労力や費用を大幅に節減することが可能となる。
【００３１】
（２）ピシウム属菌の防除方法
本発明の防除方法は、芝草におけるピシウム属菌Ｘの感染を防除する方法であって、上述した本発明の同定方法により、前記ピシウム属菌Ｘの種を同定し、同定した結果から、用いる防除剤を選択し、このものを芝草に適用することを特徴とする。
同定されたピシウム属菌に対する最適な防除剤の選択方法、選択された防除剤の芝草への適用方法としては、従来公知の方法を用いることができる。
防除剤の芝草への適用方法としては、例えば、ピシウム属菌に感染している場所を含む広い範囲に、選択された防除剤の水溶液を散布する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例によってなんら制限されるものではなく、本発明の趣旨に適合し得る範囲で適宜変更を加えて実施することが可能である。
【００３３】
〔実施例１（菌種間の比較）〕
ストレプトマイシン（濃度２００ｐｐｍ及び比較として０ｐｐｍ）を含有するＰＤＡ培地に、下記表１に記載したピシウム属菌の保存菌株を植菌した。
【００３４】
【表１】
2015019646.tif 000002
【００３５】
未同定の、Ｐｓｐ−１，Ｐｓｐ−２の２菌株は、菌叢と菌糸の観察からは、ピシウム・グラミニコラとピシウム・バンテプーリのどちらにも近く、どちらかに同定できなかったものである。
これらの菌株を、ストレプトマイシン非存在下、及び、ストレプトマイシン存在下（濃度２００ｐｐｍ）、２０℃でそれぞれ培養し、２４時間、４８時間、６９時間及び９６時間後の菌糸の伸長（ｍｍ）を測定した。なお、３８ｍｍを超える場合には、表中、「＞３８」と記載した。測定結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2015019646.tif 000003
【００３７】
表２から、ピシウム・バンテプーリは、ストレプトマイシン(濃度２００ｐｐｍ)により菌糸伸長が顕著に抑制されるのに対し、ピシウム・アファニデルマタム、ピシウム・グラミニコラではそのような抑制がほとんど見られないことがわかる。
Ｐｓｐ−１は、ピシウム・バンテプーリと同様の結果が得られたことから、ピシウム・バンテプーリであると同定することができる。
また、Ｐｓｐ−２は、菌糸伸長の抑制結果が、ピシウム・バンテプーリの抑制パターンとは明確に異なり、ピシウム・グラミニコラの抑制パターンと同様であることから、ピシウム・グラミニコラであると同定することができる。
【００３８】
以上の同定結果の成否を確認するために、Ｐｓｐ−１、Ｐｓｐ−２につき、菌の種類の判別を専門家に依頼した。その結果、上記と同じ結果が得られた。
【００３９】
〔実施例２（最適温度の検討）〕
培養温度を２０℃、２５℃、又は３１℃とした以外は、実施例１と同様に試験を行った。その結果を下記表３に示す。
【００４０】
【表３】
2015019646.tif 000004
【００４１】
表３から、ピシウム・バンテプーリは、２０〜２５℃において、菌糸伸長の抑制が検出できることがわかる。また、ピシウム・グラミニコラは、２０〜２５℃では菌糸伸長の抑制はほとんどみられないが、３１℃では菌糸伸長の抑制が認められる。
Ｐｓｐ−１は、２０〜２５℃で菌糸伸長の抑制がみられ、ピシウム・バンテプーリと同様の抑制パターンを有していることから、ピシウム・バンテプーリであると同定することができる。
また、Ｐｓｐ−２は、２０〜２５℃では菌糸伸長の抑制が顕著に現れず、３１℃で菌糸伸長の抑制がみられたことから、ピシウム・バンテプーリではなく、ピシウム・グラミニコラであると同定することができる。
【００４２】
〔実施例３（濃度感受性の比較）〕
ストレプトマイシンの濃度を０、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、及び５００ｐｐｍのいずれかとした以外は、実施例１と同様に試験を行った。その結果を、下記表４に示す。
【００４３】
【表４】
2015019646.tif 000005
【００４４】
表４から、ストレプトマイシン濃度を、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、及び５００ｐｐｍと変化させた場合、ストレプトマイシン濃度５００ｐｐｍでは、ピシウム・バンテプーリ以外の菌株についてもある程度の菌糸伸長抑制が見られる。よって、種同定の目的には、ピシウム・バンテプーリにのみ顕著な菌糸伸長抑制がみられる、５００ｐｐｍ以外の濃度で試験を行うのが好ましいことがわかる。
Ｐｓｐ−１は、２４時間後、２８時間後、９６時間後のいずれにおいても、かつ、ストレプトマイシン濃度５０、１００、２００、５００ｐｐｍのいずれにおいても、菌糸伸長の抑制がみられ、ピシウム・バンテプーリと同様の抑制パターンを有していることから、ピシウム・バンテプーリであると同定することができる。
【００４５】
これらの結果から、本発明によれば、ピシウム属菌の種の同定を、特殊な方法や装置を用いることなく、短期間で、正確かつ簡便に行うことができることが分かる。