(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の提供。特に前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する並びにモノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンに結合する抗体またはその抗原結合断片を含むＡＤＣの提供。【解決手段】ＰＳＭＡは、少なくとも２５０のＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)細胞に対する、ＰＣ−３(TM)細胞選択性を有する抗体薬物複合体。１つには、ＡＤＣを用いる組成物及び方法、例えば、ＰＳＭＡ媒介疾患を処置するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンに複合した、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗体または抗原結合断片を含む抗体薬物複合体であって、ＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)細胞との間の細胞選択性が少なくとも２５０である前記抗体薬物複合体。
【請求項２】
抗体または抗原結合断片が、特異的にＰＳＭＡに結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３】
モノクローナル抗体または抗原結合断片がＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、請求項２に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４】
抗体または抗原結合断片が、ＰＳＡＭの立体構造エピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５】
抗体または抗原結合断片が、
（ｉ）第２の抗体の、ＰＳＭＡ上のその標的エピトープへの特異的結合を競合的に阻害する、または、
（ｉｉ）PSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1、Abgenix 4.22.3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1、Abgenix 4.152.1および
（ａ）配列番号：２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖
を含む抗体からなる群から選択される抗体で定義される、ＰＳＭＡ上のエピトープに結合する、
請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
第２の抗体がPSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1、Abgenix 4.22.3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1、Abgenix 4.152.1ならびに、
（ａ）配列番号：２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖
を含む抗体からなる群から選択される、請求項５に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７】
第２の抗体がAB-PGl-XGl-006、AB-PGl-XGl-026ならびに、
（ａ）配列番号：２および３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８および９で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖
を含む抗体からなる群から選択される、請求項５に記載の抗体薬物複合体。
【請求項８】
第２の抗体が、
（ａ）配列番号：２で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖
を含む、請求項７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項９】
第２の抗体が、
（ａ）配列番号：３で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：９で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖：
を含む、請求項７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１０】
抗体が、AB-PGl-XGl-006、AB-PGl-XGl-026ならびに、
（ａ）配列番号：２および３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子をコードする重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８および９で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子をコードする軽鎖
を含む抗体からなる群から選択される抗体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１１】
抗体が少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる、請求項１０に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１２】
抗体が少なくとも９７％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる、請求項１１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１３】
抗体が少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる、請求項１２に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１４】
抗体が少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる、請求項１３に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１５】
抗体またはその抗原結合断片が、AB-PG1-XG1-006、AB-PGl-XGl-026またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号：２および３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８および９で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖
を含む抗体、およびその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号：２で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：８で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖、および、
その抗原結合断片
を含む、請求項１６に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号：３で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および、
（ｂ）配列番号：９で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖、および、
その抗原結合断片：
を含む、請求項１６に記載の抗体薬物複合体。
【請求項１９】
抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥであるか、またはＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤまたはＩｇＥの免疫グロブリン定常領域および／または可変領域を有する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２１】
抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２２】
抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２３】
抗体が組み換え抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２４】
抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２５】
抗体が二重特異性抗体または多特異性抗体である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２６】
抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはＦｖ断片である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２７】
抗原結合断片がＣＲＤ３含有断片である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２８】
ＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)細胞との間の選択性が少なくとも５００、１０００、２５００、６０００または１３，０００である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項２９】
抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも３つのモノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニン分子に複合している、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３０】
抗体またはその抗原結合断片が少なくとも４つのモノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニン分子に複合している、請求項２９に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３１】
モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンが、抗体またはその抗原結合断片に、式：
−Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−
式中、Ａはカルボン酸アシル単位であり；
Ｙはアミノ酸であり；
Ｚはアミノ酸であり；
ＸおよびＷはそれぞれ自壊的スペーサーであり；
ｎは０または１の整数であり；および
ｍは０または１、２、３、４、５または６の整数である、
で表される化合物とともに複合している、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３２】
Ａが
【化１】
2015187117.tif 000022
式中、ｑは１〜１０である、
である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３３】
Ａが、４−（Ｎ−スクシンイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル、ｍ−スクシンイミドベンゾイル、４−（ｐ−スクシンイミドフェニル）−ブチリル、４−（２−アセトアミド）ベンゾイル、３−チオプロピオニル、４−（ｌ−チオエチル）−ベンゾイル、６−（３−チオプロピオニルアミド）−ヘキサノイルまたはマレイミドカプロイルである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３４】
Ａがマレイミドカプロイルである、請求項３３に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３５】
Ｙが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３６】
Ｙがバリンである、請求項３５に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３７】
Ｚが、リジン、アセチルまたはホルミルで保護されたリジン、アルギニン、トシル基またはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチン、またはシトルリンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３８】
Ｚがシトルリンである、請求項３７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３９】
Ｙｍ−Ｚｍがバリン−シトルリンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４０】
Ｙｍ−Ｚｍがプロテアーゼで選択的に切断可能なタンパク質配列である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４１】
Ｘが、式
【化２】
2015187117.tif 000023
式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳである、
を有する化合物である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４２】
Ｘが、式
−ＨＮ−Ｒ１−ＣＯＴ
式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ５アルキルであり、ＴはＯ、ＮまたはＳである、
を有する化合物である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４３】
Ｘが、式
【化３】
2015187117.tif 000024
式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳであり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである、
を有する化合物である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４４】
Ｘがｐ−アミノベンジルカルバモイルオキシである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４５】
Ｘがｐ−アミノベンジルアルコールである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４６】
Ｘがｐ−アミノベンジルカルバメートである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４７】
Ｘがｐ−アミノベンジルオキシカルボニルである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４８】
Ｘが、γ−アミノ酪酸；α，α−ジメチルγ−アミノ酪酸またはβ，β−ジメチルγ−アミノ酪酸である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４９】
Ｗが
【化４】
2015187117.tif 000025
式中ＴはＯ、ＳまたはＮである、
である、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５０】
ｍおよびｎが０である、請求項３１〜４９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項５１】
ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−００６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５２】
ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−００６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５３】
ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−００６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５４】
ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−０２６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５５】
ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−０２６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５６】
ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−０２６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである、請求項３１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５７】
抗体薬物複合体が生細胞を結合する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５８】
細胞が腫瘍細胞である、請求項５７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項５９】
腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である、請求項５８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６０】
抗体薬物複合体が腫瘍の新生脈管系の内皮細胞に結合する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６１】
抗体薬物複合体がＰＳＭＡに結合するために細胞溶解を必要としない、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６１】
抗体薬物複合体が細胞周期停止を誘導する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６２】
抗体薬物複合体がＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６３】
抗体薬物複合体が１×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６４】
ＩＣ５０が１×１０−１１Ｍ未満である、請求項６３に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６５】
ＩＣ５０が１×１０−１２Ｍ未満である、請求項６４に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６６】
抗体薬物複合体が１１〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６７】
抗体薬物複合体が４２〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項６６に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６８】
抗体薬物複合体が６０〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項６７に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６９】
抗体薬物複合体が６５〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項６８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７０】
抗体薬物複合体が１１×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７１】
抗体薬物複合体が４２×１０−１２のＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７２】
抗体薬物複合体が６０×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７３】
抗体薬物複合体が８３×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７４】
６ｍｇ／ｋｇの用量でのｑ４ｄ×６の投与計画でマウスへ投与した場合に、抗体薬物複合体が少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％の治癒率をもたらす、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７５】
標識に結合している、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７６】
標識が、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、核磁気共鳴活性標識、発光性標識または発色性標識である、請求項７５に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７７】
凍結乾燥形態で包装された、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７８】
水性媒体中に包装された、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７９】
滅菌形態である、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項８０】
請求項１に記載の抗体薬物複合体と、薬学的に許容し得るキャリア、賦形剤または安定化剤とを含む、組成物。
【請求項８１】
２つまたは３つ以上の異なる請求項１に記載の抗体薬物複合体の組み合わせと、薬学的に許容し得るキャリア、賦形剤または安定化剤とを含む、組成物。
【請求項８２】
抗癌剤、免疫刺激剤、免疫調整剤、コルチコステロイドまたはその組み合わせをさらに含む、請求項８０または８１に記載の組成物。
【請求項８３】
抗癌剤が細胞毒性剤、腫瘍脈管系に作用する薬剤またはその組み合わせである、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
抗癌剤がドセタキセルである、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
免疫調整剤が、サイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせである、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８６】
免疫刺激剤が、インターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせである、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８７】
コルチコステロイドがプレドニゾンまたはヒドロコルチゾンである、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８８】
請求項１に記載の１つまたは２つ以上の抗体薬物複合体と、１つまたは２つ以上の非結合抗ＰＳＭＡ抗体とを含む組成物。
【請求項８９】
ＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害するための方法であって、
ＰＳＭＡ発現細胞と、ＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１〜７４のいずれかに記載の抗体薬物複合体とを接触させること
を含む、前記方法。
【請求項９０】
ＰＳＭＡ発現細胞が前立腺腫瘍細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＰＳＭＡ発現細胞が非前立腺腫瘍の新生脈管系の細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
ＰＳＭＡ発現細胞が、アンドロゲン依存性細胞またはアンドロゲン非依存性細胞である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
ＰＳＭＡ発現細胞と、抗癌剤、免疫刺激剤、免疫調節剤、コルチコステロイドまたはその組み合わせとを接触させることをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
抗癌剤が、細胞毒性剤、腫瘍新生脈管系に作用する薬剤またはその組み合わせである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
抗癌剤がドセタキセルである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
免疫調整剤が、サイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
免疫刺激剤がインターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
コルチコステロイドがプレドニゾンまたはヒドロコルチゾンである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
ＰＳＭＡ発現細胞において細胞周期停止をもたらすための方法であって、
ＰＳＭＡ発現細胞と、ＰＳＭＡ発現細胞において細胞周期停止を誘導するのに有効な量の請求項１〜７４のいずれかに記載の抗体薬物複合体とを接触させること
を含む、前記方法。
【請求項１００】
ＰＳＭＡ媒介疾患を処置するための方法であって、
ＰＳＭＡ媒介疾患を有する対象に、ＰＳＭＡ媒介疾患を処置するのに有効な量の請求項１〜７４のいずれかに記載の抗体薬物複合体を投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１０１】
ＰＳＭＡ媒介疾患が癌である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
癌が前立腺癌である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
癌が非前立腺癌である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
非前立腺癌が、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肉腫、乳癌、脳腫瘍、神経内分泌癌、結腸癌、精巣癌または黒色腫である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
ＰＳＭＡ媒介疾患を処置する他の治療剤を併用投与することをさらに含み、該併用投与が抗体薬物複合体の投与前、投与中または投与後になされる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
他の治療剤が、抗癌剤、免疫刺激剤、免疫調整剤、コルチコステロイドまたはその組み合わせである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
抗癌剤が、細胞毒性剤、腫瘍新生脈管系に作用する薬剤またはその組み合わせである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
抗癌剤がドセタキセルである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
免疫調整剤が、サイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
免疫刺激剤が、インターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
コルチコステロイドがプレドニゾンまたはヒドロコルチゾンである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
治療剤がワクチンである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１３】
ワクチンが対象をＰＳＭＡに対して免疫する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
方法が、さらなる他の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１５】
さらなる他の治療剤がプレドニゾンである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
腫瘍の増殖を阻害するための方法であって、
腫瘍の新生脈管系のＰＳＭＡ発現細胞と、腫瘍増殖を阻害するのに有効な量の請求項１〜７４のいずれかに記載の抗体薬物複合体とを接触させること
を含む、前記方法。
【請求項１１７】
ＰＳＭＡ発現細胞と、抗癌剤、免疫刺激剤、免疫調製剤、コルチコステロイドまたはその組み合わせとを接触させることをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
抗癌剤が、細胞毒性剤、腫瘍新生脈管系に作用する薬剤またはその組み合わせである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
免疫調整剤が、サイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
免疫刺激剤が、インターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせである、請求項１１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の元での、２００５年６月２０日出願の米国仮出願60/692,399および２００６年４月１４日出願米国仮出願60/792,360の利益を主張し、そのそれぞれの内容の全体を明細書中に参照により組み入れる。
【０００２】
政府支援
本発明の複数の側面は、国立衛生研究所助成CAl 07653 (DM)およびCA96075 (GPD)からの基金を用いてなされた可能性がある。したがって、政府は本発明に対する権利を有する場合がある。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して抗体薬物複合体（antibody-drug conjugate、ＡＤＣ）に関する。特に、本発明は、モノメチルアウリスタチンノルエフェドリン（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニン（ＭＭＡＦ）と複合した、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むＡＤＣに関する。かかる抗体薬物複合体は、ＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)細胞との間の細胞選択性が少なくとも２５０である。本発明はまた、部分的に、ＡＤＣの組成物およびＡＤＣを用いる方法に関する。提供される方法は、例えば、ＰＳＭＡ媒介疾患を処置する方法を含む。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
前立腺癌は最もよく知られた悪性腫瘍であり、米国において男性における癌死の第２の主要原因である(Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2005;55:10-30)。限局性前立腺癌は、典型的には、外科手術または放射線療法で処置し、再発疾患は一時的にアンドロゲン除去で制御できる(Klein EA, et al., Urol Clin North Am 2003;30:315-30)。しかしながら、ほぼ全ての前立腺癌は、最終的には、耐ホルモン性となり、そして急速に進行する(Denmeade SR, et al., Nat Rev Cancer 2002;2:389-96)。耐ホルモン性またはアンドロゲン非依存性前立腺癌は、従来の化学療法に対して大いに耐性があることが示されている。緩和ケアを除外すると、唯一の承認された化学療法は、プレドニゾンと組み合わせたドセタキセルであり、中等度（２．４ヶ月）の延命効果を提供する(Gulley J, et al., Am J Ther. 2004;351:1513-20; Petrylalc DP, et al., New Engl J Med 2004;351:1513-20)。新規な分子標的療法が必要とされている。
【０００５】
発明の要約
明細書中で提供される本発明は、特に高い選択性を呈するＡＤＣに関する。本発明の１つの側面において、抗体薬物複合体が提供され、これは、モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンに結合した、ＰＳＭＡに結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、この抗体薬物複合体は、ＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)との間の細胞選択性が少なくとも２５０である。１つの態様において、選択性は少なくとも５００、１０００、２５００、６０００または１３，０００である。もう１つの態様において、選択性は１５６７、６２８６または１３，６３６である。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも３つ、４つまたは５つのモノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニン分子と複合している。
【０００６】
本発明の組成物および方法において用いることができる抗体の例は、いくつかの態様で、本明細書中で提供される。別の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。さらに別の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。さらなる態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡの立体構造エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【０００７】
いくつかの態様において、抗原または抗原結合断片は、（ｉ）第２の抗体のＰＳＭＡ上のその標的エピトープへの特異的結合を競合的に阻害するか、または（ｉｉ）PSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1、Abgenix 4.22.3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1 and Abgenix 4.152.1からなる群から選択される抗体で定義されるＰＳＭＡ上のエピトープに結合する。他の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号：２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体からなる群から選択される抗体で定義されるＰＳＭＡ上のエピトープに結合する。
【０００８】
いくつかの態様において、第２の抗体は、PSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1 、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1 、Abgenix 4.22.3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1、Abgenix 4.152.1および（ａ）配列番号２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体からなる群から選択される。
【０００９】
他の態様において、第２の抗体は、AB-PG1-XG1-006、AB-PG1-XG1-026および（ａ）配列番号：２および３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８および９で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体からなる群から選択される。１つの態様において、第２の抗体は、（ａ）配列番号２で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む。さらなる態様において、第２の抗体は、（ａ）配列番号：３で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：９で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、抗体薬物複合体の抗体は、AB-PG1-XG1-006、AB-PG1-XG1-026および（ａ）配列番号：２および３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８および９で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体からなる群から選択される抗体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる抗体である。１つの態様において、抗体は、少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる。別の態様において、抗体は少なくとも９７％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる。さらに別の態様において、抗体は少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる。さらなる態様において、抗体は少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列を含む核酸分子でコードされる。
【００１１】
他の態様において、明細書中で提供される抗体薬物複合体の抗体またはその抗原結合断片は、AB-PG1-XG1-006、AB-PG1-XG1-026またはその抗原結合断片である。さらに他の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号：２および３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８および９で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体およびその抗原結合断片からなる群から選択される。１つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号：２で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、（ｂ）配列番号：８で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖、およびその抗原結合断片を含む。別の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号：３で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、（ｂ）配列番号：９で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖、およびその抗原結合断片を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥであるか、あるいはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤまたはＩｇＥの免疫グロブリン定常領域および／または可変領域を有する。
【００１３】
さらなる態様において、抗体はモノクローナル抗体である。さらに他の態様において、抗体はヒト化抗体である。さらに他の態様において、抗体はヒト抗体である。さらに他の態様において、抗体は組換え抗体である。さらなる態様において、抗体はキメラ抗体である。さらに追加的な態様において、抗体は二重特異性抗体または多重特異性抗体である。さらに他の態様において、抗体は一本鎖抗体である。
【００１４】
他の態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはＦｖ断片である。さらに他の態様において、抗原結合断片はＣＤＲ３含有断片である。
【００１５】
いくつかの態様において、モノメチルアウリスタチンノルエフェドリン（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニン（ＭＭＡＦ）は、抗体またはその抗原結合断片に、式（式１）−Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−、式中Ａはカルボン酸アシル単位であり；Ｙはアミノ酸であり；Ｚはアミノ酸であり；ＸおよびＷはそれぞれ自壊的(self-immolative)スペーサーであり；ｎは０または１の整数であり；およびｍは０または１、２、３、４、５または６の整数である、で表される化合物とともに複合している。いくつかの態様において、本発明の複合体は、式（式２）：Ｌ−｛Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−Ｄ｝ｐ、式中ＬはＰＳＭＡに結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ＤはＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、およびｐは１、２、３、４、５、６、７または８の整数である、で表される。複合体の残りの構成成分は、直上で定義したとおりである。
【００１６】
１つの態様において、カルボン酸単位"Ａｎ"は、抗体またはその抗原結合断片に、抗体またはその抗原結合断片由来の硫黄原子を介して連結している：
【化１】
2015187117.tif 000002
【００１７】
１つの態様において、Ａは
【化２】
2015187117.tif 000003
式中、ｑは１〜１０である、
で表される。それゆえ、１つの態様において、式２で表される複合体は：
【化３】
2015187117.tif 000004
式中、Ｌ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｗ、Ｄ、ｎ、ｍ、ｑおよびｐは先に定義したとおりである、
である。
【００１８】
別の態様において、Ａは４−（Ｎ−スクシンイミドメチル）シクロヘキサン−1−カルボニル、ｍ−スクシンイミドベンゾイル、４−（ｐ−スクシンイミドフェニル）−ブチリル、４−（２−アセトアミド）ベンゾイル、３−チオプロピオニル、４−（1−チオエチル）−ベンゾイル、６−（３−チオプロピオニルアミド）−ヘキサノイルまたはマレイミドカプロイルである。さらなる態様において、Ａはマレイミドカプロイルである。
【００１９】
別の態様において、Ｙはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンである。さらに別の態様において、Ｙはバリンである。さらなる態様において、Ｚはリジン、アセチルまたはホルミルで保護されたリジン、アルギニン、トシル基またはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチン、あるいはシトルリンである。さらに追加の態様において、Ｚはシトルリンである。１つの態様において、Ｙｍ−Ｚｍはバリン−シトルリンである。別の態様において、Ｙｍ−Ｚｍは、プロテアーゼで選択的に切断可能なタンパク質配列である。
【００２０】
さらなる態様において、Ｘは式
【化４】
2015187117.tif 000005
式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳである、
を有する化合物である。別の態様において、Ｘは式
−ＨＮ−Ｒ１−ＣＯＴ
式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ５アルキルであり、ＴはＯ、Ｎ、またはＳである、
を有する化合物である。さらなる態様において、Ｘは式
【化５】
2015187117.tif 000006
式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳであり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである、
を有する化合物である。１つの態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルカルバモイルオキシである。別の態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルアルコールである。さらなる態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルカルバメートである。さらに追加の態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルオキシカルボニルである。別の態様において、Ｘはγ−アミノ酪酸；α，α−ジメチル  γ−アミノ酪酸またはβ，βジメチル  γ−アミノ酪酸である。
【００２１】
いくつかの態様において、Ｗは
【化６】
2015187117.tif 000007
式中、ＴはＯ、ＳまたはＮである、
である。
【００２２】
他の態様において、ｍおよびｎは０である。
【００２３】
１つの態様において、抗体薬物複合体は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンである。別の態様において、抗体薬物複合体はＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。さらなる態様において、抗体薬物複合体は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。別の態様において、抗体薬物複合体は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンである。さらに別の態様において、抗体薬物複合体は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。さらなる態様において、抗体薬物複合体は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。別の態様において、抗体薬物複合体は、図６Ａ、図６Ｂまたは図６Ｃで示される化合物に複合したＰＳＭＡ結合性抗体またはその抗原結合断片である。
【００２４】
いくつかの態様において、抗体薬物複合体は生細胞に結合する。１つの態様において、細胞は腫瘍細胞である。別の態様において、腫瘍細胞は前立腺腫瘍細胞である。さらなる態様において、腫瘍細胞は非前立腺腫瘍の新生脈管系の細胞である。他の態様において、抗体薬物複合体はＰＳＭＡに結合するために細胞溶解を必要としない。さらに他の態様において、抗体薬物複合体は細胞周期停止を誘導する。さらに追加の態様において、抗体薬物複合体はＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害する。１つの態様において、抗体薬物複合体は１×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。別の態様において、ＩＣ５０は１×１０−１１Ｍ未満である。さらに別の態様において、ＩＣ５０は１×１０−１２Ｍ未満である。さらなる態様において、抗体薬物複合体は、１１〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。さらに追加の態様において、抗体薬物複合体は、４２〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。
【００２５】
さらに追加の態様において、抗体薬物複合体は、６０〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。別の態様において、抗体薬物複合体は、６５〜２０８×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。１つの態様において、抗体薬物複合体は、１１×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。別の態様において、抗体薬物複合体は、４２×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。さらに別の態様において、抗体薬物複合体は、６０×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。さらなる態様において、抗体薬物複合体は、８３×１０−１２ＭのＩＣ５０でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。
【００２６】
別の態様において、６ｍｇ／ｋｇの用量でのｑ４ｄ×６の投与計画でマウスに投与した場合に、抗体薬物複合体は少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％の治癒率をもたらす。１つの態様において、治癒率は２０％、３０％、４０％５０％、６０％、７０％、８０％であるかまたは８０％を超える。１つの態様において、マウスはアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌モデルであるものである。別の態様において、マウスは左後肢にＣ４−２細胞を筋内移植したヌードマウスである。さらなる態様において、マウスは例において提供されるものである。
【００２７】
いくつかの態様において、抗体薬物複合体は標識に結合している。他の態様において、標識は蛍光標識、酵素標識、放射性標識、核磁気共鳴活性標識、発光性標識または発色性標識である。
【００２８】
いくつかの態様において、抗体薬物複合体は、凍結乾燥形態で包装される。他の態様において、抗体薬物複合体は、水性培地中に包装される。さらなる態様において、抗体薬物複合体は滅菌形態である。
【００２９】
また明細書中において、１つまたは２つ以上の抗体薬物複合体を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は２つまたは３つ以上の異なる抗体薬物複合体を含む。他の態様において、１つまたは２つ以上の抗体薬物複合体と、１つまたは２つ以上の非複合抗ＰＳＭＡ抗体とを含む組成物を提供する。
【００３０】
いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容し得るキャリア、賦形剤または安定化剤をさらに含む。他の態様において、組成物は抗癌剤、免疫刺激剤、免疫調整剤、コルチコステロイドまたはその組み合わせをさらに含む。１つの態様において、抗癌剤は細胞毒性剤、腫瘍新生脈管系に作用する薬剤またはその組み合わせである。別の態様において、抗癌剤はドセタキセルである。さらに別の態様において、免疫調整剤はサイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせである。さらに別の態様において、免疫刺激剤は、インターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせである。さらなる態様において、コルチコステロイドはプレドニゾンまたはヒドロコルチゾンである。さらに追加の態様において、組成物はプレドニゾンおよびドセタキセルを含む。
【００３１】
本発明の抗体薬物複合体および組成物を用いるためのさまざまな方法が提供される。１つの態様において、ＰＳＭＡ発現細胞をＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害するに有効な量の抗体薬物複合体に接触させることを含む、ＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。別の態様において、ＰＳＭＡ発現細胞をＰＳＭＡ発現細胞において細胞周期停止を誘導するのに有効な量の抗体薬物複合体に接触させることを含む、ＰＳＭＡ発現細胞における細胞周期停止をもたらすための方法が提供される。さらに別の態様において、ＰＳＭＡ媒介疾患を有する対象にＰＳＭＡ媒介疾患を処置するのに有効な量の抗体薬物複合体を投与することを含む、ＰＳＭＡ媒介疾患を処置する方法が提供される。さらなる態様において、腫瘍の新生脈管系のＰＳＭＡ発現細胞を腫瘍増殖を阻害するのに有効な量の抗体薬物複合体に接触させることを含む、腫瘍増殖を阻害するための方法が提供される。
【００３２】
１つの態様において、ＰＳＭＡ媒介疾患は癌である。別の態様において、癌は前立腺癌である。さらに別の態様において、癌は非前立腺癌である。いくつかの態様において、非前立腺癌は膀胱癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肉腫、乳癌、脳腫瘍、神経内分泌癌、結腸癌、精巣癌または黒色腫である。
【００３３】
いくつかの態様において、本方法は、別の治療剤をＰＳＭＡ媒介疾患を処置するために併用投与することを含む。他の態様において、本方法はＰＳＭＡ発現細胞を他の治療剤に接触させることをさらに含む。いくつかの態様において、他の治療剤は抗体薬物複合体の投与前、投与中または投与後に投与される。１つの態様において、他の治療剤は抗癌剤、免疫刺激剤、免疫調整剤、コルチコステロイドまたはその組み合わせである。別の態様において、抗癌剤は細胞毒性剤、腫瘍新生脈管系に作用する薬剤またはその組み合わせである。さらに別の態様において、抗癌剤はドセタキセルである。さらに別の態様において、免疫調整剤はサイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせである。
【００３４】
さらに別の態様において、免疫刺激剤はインターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせである。さらなる態様において、コルチコステロイドはプレドニゾンまたはヒドロコルチゾンである。１つの態様において、治療剤はワクチンである。別の態様において、ワクチンは対象をＰＳＭＡに対して免疫する。別の態様において、本方法はさらに別の治療剤を投与することをさらに含む。１つの態様において、さらに別の治療剤はプレドニゾンである。それゆえ、１つの態様において、ドセタキセルおよびプレドニゾンの両方が投与される。
【００３５】
いくつかの態様において、ＰＳＭＡ発現細胞は前立腺腫瘍細胞または非前立腺腫瘍の新生脈管系の細胞である。いくつかの態様において、ＰＳＭＡ発現細胞はアンドロゲン依存性細胞またはアンドロゲン非依存性細胞である。
【００３６】
本発明の限定のそれぞれは、本発明のさまざまな態様を包含することができる。それゆえ、任意の１つの要素または要素の組み合わせに関連する本発明の限定のそれぞれが、本発明のそれぞれの側面を含むことができることが予測される。
【００３７】
図の簡単な説明
図１は、Ｃ４−２細胞における１１１Ｉｎ−標識化ＰＳＭＡの取り込みパーセントおよび総結合を示す。Ｃ４−２細胞を、１１１Ｉｎ−標識ｍＡｂとともに３７℃、５％ＣＯ２で培養した。指定された時間に、細胞を洗浄して非結合ｍＡｂを除去し、そして表面に結合したｍＡｂを低ｐＨバッファを用いて剥がした。低ｐＨ溶出液および細胞ペレットの放射活性（カウント毎分（ＣＰＭ））を、ガンマカウンターを用いて別々にカウントした。取り込み％（図１Ａ）は、細胞ペレットのＣＰＭ／（細胞ペレットのＣＰＭ＋低ｐＨ溶出液のＣＰＭ）×１００で計算した。総結合（図１Ｂ）は、細胞ペレットのＣＰＭに低ｐＨ溶出液のＣＰＭを足したものを表す。
【００３８】
図２は、３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞に対するＰＳＭＡ  ｍＡＢおよびＡＤＣの結合を示すグラフである。３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞を、漸増濃度のＰＳＭＡ  ｍＡＢ（黒四角）、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（白四角）またはアイソタイプ対照ＡＤＣ（白三角）とともに培養した。細胞を氷上で１時間培養し、洗浄して非結合ｍＡｂまたはＡＤＣを除去した。それから、細胞をヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣとともに培養し、再び洗浄し、そしてフローサイトメトリーで観察した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｍＡｂまたはＡＤＣ濃度の関数でプロットした。
【００３９】
図３は、ＰＳＭＡ陽性およびＰＳＭＡ陰性前立腺癌細胞株における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣおよび対照ＡＤＣのin vitroでの細胞毒性を示すグラフである。９６穴マイクロプレート中のＰＳＭＡ陽性Ｃ４−２細胞（図３Ａ）およびＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３(TM)細胞（図３Ｂ）をさまざまな濃度のＡＤＣに暴露した。９６時間後、処置および非処置培養における細胞生存を、アラマーブルーを用いてアッセイした。
【００４０】
図４は、異種移植研究でのカプランマイヤー生存および血清ＰＳＡレベルを示すグラフである。ヌードマウスにＣ４−２細胞を筋肉内移植し、第１７日における血清ＰＳＡに従って処置群（群あたり６マウス）に無作為に割り当て、それからＰＳＭＡ  ＡＤＣまたはビヒクルでｑ４ｄ×３で処置した。図４Ａは、０（ビヒクル対照、点線）、２ｍｇ／ｋｇ（細い実線）および１０ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＡＤＣで処置した動物の生存を示す。図４Ｂは、０（黒棒グラフ）、２ｍｇ／ｋｇ（斜線棒グラフ）および１０ｍｇ／ｋｇ（白棒グラフ）のＰＳＭＡ  ＡＤＣで処置したマウスにおける、３０日にわたる平均ＰＳＡ値を提供する。対照群の第３０日のデータは、３０日間生存しなかった２匹のマウスの第２７日の評価を含む。
【００４１】
図５は、別の異種移植研究において処置した動物のカプランマイヤー生存曲線を示す。ヌードマウスにＣ４−２細胞を筋肉内移植し、第１４日における血清ＰＳＡの従って処置群（群あたり５マウス）に無作為に割り当て、その後ＰＳＭＡ  ＡＤＣおよび対照でｑ４ｄ×６で処置した。マウスを０（ビヒクル対照、黒丸）、６ｍｇ／ｋｇ非修飾ＰＳＭＡ  ｍＡｂ（黒三角）、６ｍｇ／ｋｇ対照ＡＤＣ（白三角）、３ｍｇ／ｋｇＰＳＭＡ  ＡＤＣ（白四角）および６ｍｇ／ｋｇＰＳＭＡ  ＡＤＣ（黒四角）で処置した。
【００４２】
図６は、３つの異なる薬物リンカー(drug-linker)の化学構造を示す。図６ＡはｖｃＭＭＡＥ（マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＥ）の構造を示す。図６Ｂは、ｖｃＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＦ）の構造を示す。図６Ｃは、ｍｃＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦ）の構造を示す。
【００４３】
図７Ｂは、ＰＳＭＡ陽性（Ｃ４−２）およびＰＳＭＡ陰性（ＰＣ−３(TM)）前立腺癌細胞株における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（ｖｃＭＭＡＥ（図７Ａ）、ｖｃＭＭＡＦ（図７Ｂ）、ｍｃＭＭＡＦ（図７Ｃ））のin vitro細胞毒性を示す。９６穴マイクロプレート中の細胞をさまざまな濃度のＡＤＣに暴露した。４日後、処置および非処置培養物における細胞生存をアラマーブルーを用いてアッセイした。
【００４４】
図８は、ＰＳＭＡ  ＡＤＣの細胞周期に対する影響を示す。それぞれのパネルにおいて、左のピークはＧ１期に対応し、右のピークはＧ２／Ｍ期に対応する。Ｇ２／Ｍ期における細胞のパーセントはＰＳＭＡ  ＡＤＣでの処置で有意に増加し、ＤＮＡ合成後に起こる細胞分裂の停止と整合する。ＰＳＭＡ  ＡＤＣは、親３Ｔ３(TM)細胞の周期に影響を及ぼさない。
【００４５】
図９は、ＰＳＭＡ  ＡＤＶのｖｃＭＭＡＥ対ｖｃＭＭＡＦの比較からの結果を示す。
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明は、ひとつには、ＭＭＡＥ（本明細書中においてモノメチルアウリスタチンＥおよびモノメチルアウリスタチンノルエフェドリンとも呼称する）またはＭＭＡＦ（本明細書中においてモノメチルアウリスタチンＦおよびモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンとも呼称する)に複合した、ＰＳＭＡ結合性抗体またはその抗原結合断片を含むＡＤＣが、ＰＳＭＡ発現細胞を殺滅するのに特に有用であるという、驚くべき発見に関する。ＡＤＣは、ＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)細胞との間の細胞選択性が少なくとも２５０であり得る。いくつかの態様において、ＡＤＣは、（ＰＳＭＡ発現細胞の）あるレベルの細胞殺滅、例えばピコモル濃度またはそれに近いＩＣ５０値を呈する。他の態様において、ＡＤＣは、６ｍｇ／ｋｇでのｑ４ｄ×６の投与計画でＡＤＣ処置したマウスにおいて、少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％の治癒率をもたらす。それゆえ、これらのＡＤＣを用いる組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、マウスは例において提供されるものである。１つの態様において、マウスはアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌のモデルであるものである。別の態様において、マウスは左後肢にＣ４−２細胞を筋肉内移植したヌードマウスである。
【００４７】
ＡＤＣの抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡに結合する任意の抗体またはその抗原結合断片である。１つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、特異的にＰＳＭＡに結合し（例えば、特異的にＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、特異的にＰＳＭＡの立体構造エピトープに結合する、など）、そしてＰＳＭＡ上の標的エピトープに対する第２の抗体の特異的結合を競合的に阻害することができる。ここで、第２の抗体はPSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1、Abgenix 4.22,3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1、Abgenix 4.152.1ならびに（ａ）配列番号：２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体からなる群から選択される。
【００４８】
それゆえ、第２の抗体は、下記表１に示すハイブリドーマで製造されたまたは下記表１に示すプラスミドでコードされた任意の抗体を含む。これらのハイブリドーマおよびプラスミドは、国際寄託当局としてのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の要件に準拠し、かつ同要件を充足して寄託され、上記および表１において示す特許寄託指定を与えられている。
【００４９】
【表１】
2015187117.tif 000008
【００５０】
【表２】
2015187117.tif 000009
【００５１】
競合阻害を決定するため、当業者に公知のさまざまなアッセイを採用することができる。例えば、交差競合(cross-competition)アッセイを用いて、抗体またはその抗原結合断片が、別の抗体またはその抗原結合断片によるＰＳＭＡへの結合を競合的に阻害するかどうかを決定することができる。これらにはフローサイトメトリーまたは固相結合解析を利用した細胞ベースの方法を含む。固相または溶液相において、細胞表面に発現しないＰＳＭＡ分子に対して交差競合する抗体またはその抗原結合断片の能力を評価する他のアッセイもまた用いることができる。
【００５２】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、第２の抗体のＰＳＭＡ上のその標的エピトープへの特異的結合を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％、競合的に阻害する。阻害は、さまざまなモル比または質量比で評価することができる。例えば、競合結合実験は、第２の抗体またはその抗原結合断片に対し、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍または１０倍を超えるモル過剰の第１の抗体またはその抗原結合断片で行うことができる。
【００５３】
別の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、PSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、4.248.2、4.360.3、4.7.1、4.4.1、4.177.3、4.16.1、4.22.3、4.28.3、4.40.2、4.48.3、4.49.1、4.209.3、4.219.3、4.288.1、4.333.1、4.54.1、4.153.1、4.232.3、4.292.3、4.304.1、4.78.1、および4.152.1、PSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1、Abgenix 4.22.3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1、Abgenix 4.152.1および（ａ）配列番号：２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号：８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含む抗体からなる群から選択される抗体で定義されるＰＳＭＡ上のエピトープへ特異的に結合することができる。それゆえ、ＡＤＣの抗体または抗原結合断片は、上記表１に示されるハイブリドーマにより産生されるか、または同表に示されるプラスミドによりコードされる抗体で定義されるＰＳＭＡ上のエピトープに特異的に結合するものを含む。
【００５４】
エピトープを決定するために、業界で公知の標準的なエピトープマッピング法を用いることができる。例えば、抗体に結合するＰＳＭＡ抗原（例えば、合成ペプチド）の断片（ペプチド）を用いて、候補の抗体またはその抗原結合断片が同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。直線状エピトープに対し、所定の長さ（例えば８以上のアミノ酸）のオーバーラップペプチドを合成する。ＰＳＭＡタンパク質配列の８アミノ酸の断片のそれぞれをカバーする一連のペプチドを産生するように、ペプチドのオフセットを１アミノ酸とすることができる。より大きなオフセット、例えば２または３アミノ酸を用いて、産生するペプチドをより少なくすることができる。さらに、より大きなペプチド（例えば、９−、１０−または１１−マー）を合成することができる。抗体または抗原結合断片へのペプチドの結合は、表面プラズモン共鳴(BIACORE)およびＥＬＩＳＡアッセイを含む、標準的な手順を用いて決定することができる。
【００５５】
立体構造エピトープの調査のために、より大きなＰＳＭＡ断片を用いることができる。質量分析を用いて立体構造エピトープを決定する他の方法が記載されており、用いることができる（例えば、Baerga-Ortiz et al., Protein Science 11:1300-1308,2002およびそこに引用される参考文献を参照）。エピトープ決定のためのさらに他の方法が、標準的な実験室参考資料、例えばCurrent Protocols in Immunology, Coligan et al., eds., John Wiley & SonsのUnit 6.8（「Ｂ細胞エピトープのファージディスプレイ選択および解析」）およびUnit 9.8（「合成ペプチドコンビナトリアルライブラリーを用いる抗原決定基の同定」）などにおいて提供される。点変異または点欠失を公知のエピトープに導入し、それから１つまたは２つ以上の抗体または抗原結合断片との結合を試験し、どの変異が抗体または抗原結合断片の結合を減少させるかを決定することにより、エピトープを確認することができる。
【００５６】
特定の態様において、ＡＤＣの抗体、またはＡＤＣの抗原結合断片が由来する抗体は、ハイブリドーマにより産生されるものであり、これらは本明細書中で、それぞれ、PSMA 3.7、PSMA 3.8、PSMA 3.9、PSMA 3.11、PSMA 5.4、PSMA 7.1、PSMA 7.3、PSMA 10.3、PSMA 1.8.3、PSMA A3.1.3、PSMA A3.3.1、Abgenix 4.248.2、Abgenix 4.360.3、Abgenix 4.7.1、Abgenix 4.4.1、Abgenix 4.177.3、Abgenix 4.16.1、Abgenix 4.22.3、Abgenix 4.28.3、Abgenix 4.40.2、Abgenix 4.48.3、Abgenix 4.49.1、Abgenix 4.209.3、Abgenix 4.219.3、Abgenix 4.288.1、Abgenix 4.333.1、Abgenix 4.54.1、Abgenix 4.153.1、Abgenix 4.232.3、Abgenix 4.292.3、Abgenix 4.304.1、Abgenix 4.78.1、およびAbgenix 4.152.1と称される。他の態様において、抗体は、表１で示されるプラスミドによりコードされるものである。さらに他の特別な態様において、抗体は、配列番号：２〜７で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の重鎖コード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖、および配列番号：８〜１３で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数の軽鎖コード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖とを含むものである。
【００５７】
本明細書中で用いる、寄託されたハイブリドーマまたはプラスミドの名称は、抗体の名称と相互的に用いてもよい。名称が抗体を称することを意図するか、または抗体をコードするまたは産生するプラスミドまたはハイブリドーマを称するかは、それぞれ、当業者には明らかである。さらに、抗体の名称は、表１で示す名称の短縮形であってもよい。例えば、抗体AB-PG1-XG1-006は、AB-PG1-XG1-006、PG1-XG1-006、XG1-006、006、などと称してもよい。もう１つの例として、抗体の名称PSMA 4.232.3は、PSMA 4.232.1、4.232.3、4.232.1、4.232、などと称してもよい。抗体の名称における変化形の全ては、同じ抗体を称するものであり、異なるものを称するものではないことを意図する。
【００５８】
ＡＤＣの抗体、またはＡＤＣの抗原結合断片が由来する抗体は、特別な組み合わせの重鎖および軽鎖配列でコードされたものを含む。１つの態様において、抗体(AB-PG1-XG1-006)は、配列番号：２および８で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる。別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-026)は、配列番号：３および９で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる。さらに別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-051)は、配列番号：４および１０で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる。さらに別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-069)は、配列番号：５および１１で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる。
【００５９】
別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-077)は、配列番号：６および１２で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる。さらに別の態様において、抗体(PSMA 10.3)は、配列番号７および１３で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む。他の態様において、ＡＤＣの抗体またはＡＤＣの抗原結合断片が由来とするものは、配列番号：１４、１８、２２、２６および３０で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる重鎖可変領域、および配列番号：１６、２０、２４、２８および３２で規定されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる軽鎖可変領域を含む。
【００６０】
１つの態様において、抗体(AB-PG1-XG1-006)は、配列番号：１４および１６で規定される核酸配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる免疫グロブリン可変配列を含む。同様に、抗体は、配列番号：１５および１７で規定されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含むものであることができる。別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-026)は、配列番号：１８および２０で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる免疫グロブリン可変領域を含むか、または配列番号：１９および２１で規定されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。さらに別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-051)は、配列番号：２２および２４で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号：２３および２５で規定されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。
【００６１】
さらに別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-069)は、配列番号：２６および２８で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号：２７および２９で規定されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。別の態様において、抗体(AB-PG1-XG1-077)は配列番号：３０および３２で規定されるヌクレオチド配列の１つまたは複数のコード領域を含む核酸分子でコードされる免疫グロブリン可変配列を含むか、または配列番号３１および３３で規定されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列を含む。他の態様において、抗体は、配列番号：１５、１９、２３、２７および３１で規定されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：１７、２１、２５、２９および３３で規定されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６２】
本明細書中で使用する「コード領域」は、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の領域を指す。本明細書におけるその使用は、当該技術分野で知られた、広く認められた意味と一致する。
【００６３】
ある態様において、ＡＤＣの抗体、またはＡＤＶの抗原結合断片が由来する抗体は、前述の核酸と高度に相同な核酸分子でコードされるものである。いくつかの態様において、相同な核酸分子は、本明細書中で提供されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％相同であるヌクレオチド配列を含むことができる。他の態様において、ヌクレオチド配列は、本明細書中で提供されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％相同、少なくとも９７％相同、少なくとも９８％相同、または少なくとも９９％相同である。相同性は、当業者に周知の、さまざまな、公表されているソフトウェアツールを用いて計算することができる。例示的なツールは、米国国立衛生研究所の米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトより入手可能なＢＬＡＳＴシステムを含む。
【００６４】
高度に相同なヌクレオチド配列を同定する１つの方法は、核酸ハイブリダイゼーションを介するものである。そのため、本発明は、また、本明細書中に記載するＰＳＭＡ結合特性および他の機能的な特性を有する抗体を含み、これは、高度なストリンジェンシーの条件下で前述の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子でコードされる。関連配列の同定は、また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連核酸配列のクローニングに適した他の増幅技術を用いて達成することができる。ＰＣＲのプライマーを選択し、対象となる核酸配列の部分、例えばＣＤＲなどを増幅することができる。
【００６５】
本明細書中で用いる「高ストリンジェンシー条件」は、当該技術分野でよく知られたパラメーターを指す。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M, Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkなど、かかる方法をまとめた文献において見出すことができる。高ストリンジェンシー条件の一例は、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％  Ficoll、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションである。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、核酸をトランスファーしたメンブレンを、例えば室温の２×ＳＳＣ中、次いで６８℃以下の温度の０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
【００６６】
本明細書中で用いる、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合で内部連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書中、ＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つの領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中、ＬＣＶＲまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つの領域、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域によって隔てられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に、さらに細分化することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への結合を媒介する。
【００６７】
本明細書中で用いる、抗体の「抗原結合断片」の用語は、抗原（つまり、ＰＳＭＡ）に特異的に結合する能力を保つ抗体の１つまたは２つ以上の部分を指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片により実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合断片」の用語の範疇に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合により連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward et ah, (1989) Nature 341 :544-546)；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００６８】
ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、そしてより特別には重鎖ＣＤＲ３は、抗体の特異性に寄与する。これらのＣＤＲ領域、特にＣＤＲ３領域は、抗体に抗原特異性を賦与するため、これらの領域を、他の抗体または抗原結合断片に組み込み、抗体またはペプチドに同一の抗原特異性を賦与することができる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶおよびＶＨ、は、別々の遺伝子によりコードされるが、それらを、組換え手法を用い、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）として作製することを可能とする合成リンカーにより結合することができる。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」の用語の範疇に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、従来の手順、例えば本明細書中に引用文献として組み入れる、J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N. Y. Academic Press 1983)において記載されるタンパク質分解断片化手順などの従来の手順を用いて、ならびに当業者に公知の他の技術により得られる。断片は、インタクト抗体と同様の方法で、有用性についてスクリーニングする。
【００６９】
いくつかの態様において、ＡＤＶの抗体、またはその抗原結合断片は単離されたものである。本明細書中で用いる「単離された」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（または抗原結合断片）を実質的に含まない抗体（またはその抗原結合断片）を指すものとする（例えば、ＰＳＭＡに特異的に結合する単離された抗体は、ＰＳＭＡ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ＰＳＭＡのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、しかしながら、他の関連する抗原、例えば他の種（例えば、ＰＳＭＡ種ホモログ）からのものに対する交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体（またはその抗原結合断片）は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。本明細書中で用いる、「特異的結合」は、事前に決定された抗原、この場合はＰＳＭＡに結合する抗体を指す。典型的には、抗体は、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡのアイソフォームまたは変異体、または密接に関連した抗原以外の抗原である、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についての親和性より少なくとも２倍大きな親和性で結合する。
【００７０】
抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの、さまざまな抗体アイソタイプを包含する。本明細書中で用いる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子でコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。抗体は完全長であることができ、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤまたはＩｇＥの抗体定常領域および／または可変領域などの抗原結合断片のみを含むことができ、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片からとなることができる。
【００７１】
ＡＤＣの抗体またはＡＤＣの抗原結合断片が由来する抗体は、いくつかの態様において、モノクローナルである。抗体は、当該技術分野で周知のさまざまな技術で産生できる。モノクローナル抗体産生は、当該技術分野で周知の技術によりもたらされてもよい。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」の用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性および特定のエピトープに対する親和性を呈する。モノクローナル抗体産生の過程は、抗体を産生する能力を有する免疫体細胞、特に、対象となる抗原で事前にin vivoまたはin vitroのいずれかで免疫され、そしてＢ細胞骨髄腫ラインとの融合に適するＢ細胞を獲得することを伴う。
【００７２】
哺乳類リンパ球は、典型的には、所望のタンパク質またはポリペプチドによる動物（例えばマウス）のin vivo免疫付与により、免疫される。免疫賦与は、必要に応じて数週間までの間隔をおいて繰り返し、抗体の十分な力価を獲得する。いったん免疫されると、動物は抗体産生リンパ球のソースとして用いることができる。最後の抗原ブーストのあと、動物を殺処分し、脾臓を除去する。マウスリンパ球は、本明細書中に記載するマウス骨髄腫ラインと高いパーセンテージで安定した融合を示す。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスのものである。しかしながら、他のマウス系統、ウサギ、ハムスター、ヒツジおよびカエルを、また、抗体産生細胞調製のための宿主として用いてもよい。Goding(in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., pp. 60-61, Orlando, FIa., Academic Press, 1986)を参照のこと。特に、ゲノム中に挿入されたヒト免疫グロブリンを有する（そしてマウス免疫グロブリンを産生できない）マウス株を用いることができる。例は、Medarex/GenPharm Internationalにより産生されたＨｕＭａｂマウス系統、およびAbgenixにより産生されたXenoMouse系統を含む。かかるマウスは、免疫賦与に応答して、完全なヒト免疫グロブリン分子を産生する。いくつかの態様において、それゆえ、ＡＤＣは、ＰＳＭＡに結合する、完全なヒトモノクローナル抗体またはその抗原断片を含む。
【００７３】
分割形質芽球段階の抗体産生細胞は、優先的に融合する。体細胞を、抗原感作した動物のリンパ節、脾臓および末梢血から得てもよく、最適なリンパ細胞は、特定の融合系における経験に基づいた有用性に大いに依存する。抗体分泌リンパ球は、その後、細胞培養において無限に複製可能な、マウス）Ｂ細胞骨髄腫細胞または形質転換細胞と融合され、それにより、不死の、免疫グロブリン分泌細胞系を産生される。得られた融合細胞、またはハイブリドーマを培養し、得られたコロニーを所望のモノクローナル抗体の産生に関してスクリーニングする。抗体を産生するコロニーをクローニングし、in vivoまたはin vitroのいずれかで増殖させ、大量の抗体を産生する。細胞を融合する理論的基礎および実践的な手順の説明はKohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)に記載されており、これを本明細書中に引用文献として組み入れる。
【００７４】
代替的に、抗体を産生することができるヒト体細胞、特にＢリンパ球は、骨髄腫細胞系との融合に適する。個体の生検した脾臓、扁桃腺またはリンパ節からのＢリンパ球を用いてもよいが、より簡便に得られる末梢血Ｂリンパ球も用いることができる。リンパ球は、診断された前立腺癌または他のＰＳＭＡ発現癌の患者から由来してもよい。さらに、ヒトＢ細胞をEpstein-Barrウイルスで直接不死化してもよい(Cole et al., 1995, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77- 96)。体細胞ハイブリダイゼーション手順を主に用いることができるが、モノクローナル抗体産生のための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス形質転換または発癌性形質転換、を用いることができる。
【００７５】
ハイブリドーマ産生融合手順での使用に適する骨髄腫細胞系は、非抗体産生性であることができ、高い融合効率、および所望のハイブリドーマの増殖を支持する、ある選択培地における増殖を不可能にする酵素欠損を有する。融合細胞系の産生のために用いることができる、かかる骨髄腫細胞系の例は、マウス由来のP3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/l.Ag 4.1、Sp2/0-Agl4、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7、S194/5XX0 BuI、ラット由来のR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210ならびにヒト由来のU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC729-6を含む(Goding, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., pp. 65-66, Orlando, FIa., Academic Press, 1986; Campbell, in Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, eds. pp. 75-83, Amsterdam, Elseview, 1984)。
【００７６】
哺乳類骨髄腫細胞または細胞培養において無限の複製を可能とする他の融合パートナーは、標準的な周知の技術、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または他の融合剤を用いることによりもたらされる（Milstein and Kohler, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)を参照のこと、これを本明細書中に引用文献として組み入れる）。
【００７７】
他の態様において、ＡＤＣの抗体、またはＡＤＣの抗原結合断片が由来する抗体は、組み換え抗体である。本明細書中で用いる「組み換え抗体」という用語は、組み換え手段により作製、発現、生成または単離された抗体、例えば他の種の免疫グロブリンのトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体、ホスト細胞に形質導入された組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離した抗体、または他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子のスプライシングを伴う任意の他の手段により作製、発現、生成または単離された抗体を含むことを意図する。
【００７８】
さらに他の態様において、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である。本明細書中で用いる「キメラ抗体」の用語は、ヒト定常領域または定常および可変フレームワーク領域と、マウス可変領域または超可変領域とを組み合わせた抗体を指す。本明細書中で用いる「ヒト化抗体」の用語は、ヒトフレームワーク領域と結合した、親抗体からの抗原結合ＣＤＲのみを保つ抗体を指す(Waldmann, 1991, Science 252:1657参照)。マウス抗体の結合特異性を保つかかるキメラ抗体またはヒト化抗体は、本発明による適用のためにin vivoで投与した場合、低下した免疫原性を有すると見込まれる。
【００７９】
代替的な態様によると、本発明によるモノクローナル抗体は、二重特異性抗体、または多特異性抗体の形態に改変することができる。「二重特異性抗体」の用語は、（ａ）細胞表面抗原、および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合する、またはそれらと相互作用する、２つの異なる結合特異性を有する任意の物質、例えばタンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質またはペプチド複合体を含むことを意図する。「多特異性抗体」の用語は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、または（ｃ）少なくとも１つの他の構成要素に結合する、またはそれらと相互作用する、２つより多い異なる結合特異性を有する任意の物質、例えばタンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質またはペプチド複合体を含むことを意図する。
【００８０】
したがって、抗体は、エフェクター細胞上のＰＳＭＡおよびＦｃ受容体に向けられた二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および他の多特異性抗体を限定することなく含む。ダイアボディーは、二価の、二重特異性抗体であり、そこではＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖に発現されるが、がゆえに同一鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能とするには余りに短いリンカーを用いることにより、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインとともにペアリングさせ、２つの抗原結合部位を作出している（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照のこと）。
【００８１】
二重特異性抗体を、ＰＳＭＡ特異的抗原結合領域および殺腫瘍活性または抗腫瘍活性を有するエフェクター細胞特異的抗原結合領域から形成することができる。二重特異性抗体の２つの抗原結合領域は、化学的に連結するかまたは二重特異性抗体を産生するよう遺伝子操作された細胞により発現させることができる（一般的には、Fanger et al., 1995 Drug News & Perspec. 8(3):133-137を参照のこと）。殺腫瘍活性を有する好適なエフェクター細胞は、細胞障害性Ｔ細胞（主にＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラー細胞などを限定することなく含む。有効量の本発明による二重特異性抗体を、癌を有する対象に投与することができ、そして二重特異性抗体は、ＰＳＭＡを有する原発腫瘍または転移性腫瘍の部位への局在化後に、癌細胞を殺傷し、かつ／または増殖を阻害する。
【００８２】
ある態様において、ＡＤＣの抗体、またはＡＤＣの抗原結合断片が由来する抗体は、ヒト抗体である。本明細書中で用いる「ヒト抗体」の用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列でコードされないアミノ酸残基（例えば、in vitroでランダム突然変異または部位特異性突然変異により導入された、またはin vivoで体細胞変異により導入された変異）を含むことができる。しかしながら、本明細書中で用いる「ヒト抗体」の用語は、他の哺乳類種、例えばマウスなどの生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列中へと移植された抗体（本明細書中「ヒト化抗体」と呼ぶ）を含むことを意図しない。ＰＳＭＡに対するヒト抗体は、マウスの免疫系よりむしろヒト免疫系の部分を保持するトランスジェニックマウスを用いて生成することができる。そのいくつかの例は上述した。
【００８３】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分が遺伝子導入されたマウスを免疫することにより作製することができる。例えば、その内容を本明細書中に参照として組み入れる、米国特許第5,591,669号、第5,598,369号、第5,545,806号、第5,545,807号、第6,150,584号、およびそこに引用される引用文献を参照。これらの動物は、内因性の（例えば、マウスの）抗体産生の機能的欠失が存在するよう、遺伝学的に改変されている。動物は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含むようさらに改変され、これらの動物の免疫の結果、対象とする抗原に対する完全ヒト抗体を産生するようになる。これらのマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm)）の免疫に次いで、モノクローナル抗体が標準的なハイブリドーマ技術に従って作製される。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それゆえ、ヒトに投与された場合にヒト抗マウス抗体(HAMA)反応を誘発しない。
【００８４】
概して、限定こそしないが、マウスは最初の免疫において６〜１６週齢である。例えば、ＰＳＭＡ抗原（例えば、組み換えＰＳＭＡまたはＰＳＭＡ発現細胞）の精製または濃縮調製物を用いて、腹腔内（ＩＰ）免疫するが、当業者に公知の他の免疫ルートも用いることができる。ＰＳＭＡ抗原はアジュバント、例えば完全フロイトアジュバントなどと組み合わせて注入され、いくつかの態様においては、最初の注入に続いて、アジュバント、例えば不完全フロイトアジュバントなどの中の抗原で追加免疫する。免疫反応は、免疫プロトコールの経過中にわたって、例えば眼窩後部出血(retroorbital bleeds)により得た血漿試料でモニターする。血漿をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、抗ＰＳＭＡヒト免疫グロブリンの十分な力価のマウスを融合に用いる。マウスを、殺処分および脾臓摘出の３日前に抗原で静脈内に追加免疫する。
【００８５】
ＡＤＣの抗体またはその抗原結合断片は、いくつかの態様において、生存ＰＳＭＡ発現細胞への結合能について選択することができる。生存ＰＳＭＡ発現細胞への結合を実証するため、フローサイトメトリーを用いることができる。例えば、ＰＳＭＡ発現細胞系（標準増殖条件下での増殖）またはＰＳＭＡを発現する前立腺細胞を、さまざまな濃度のモノクローナル抗体とともに０．１％Tween 80および20%マウス血清を含有するＰＢＳ中で混合し、３７℃で１時間培養する。洗浄後、細胞を蛍光標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ヒト抗ＰＳＭＡ抗体を用いる場合）と一次抗体染色と同じ条件下で反応させた。試料は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）装置で、単一細胞をゲートする光および側方散乱特性を用いて解析することができる。蛍光顕微鏡検査法を用いる代替的なアッセイを、フローサイトメトリーに加えて、またはこれに代えて用いることができる。細胞は、染色して蛍光顕微鏡検査法で検査することができる。この方法により、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の濃度に依存して感度は低下するかもしれない。したがって、いくつかの態様において、ＡＤＣは生細胞に結合する。それゆえ、ＡＤＣは、いくつかの態様において、ＰＳＭＡと結合するために細胞溶解を要しない。
【００８６】
抗体は、いくつかの態様において、ＰＳＭＡ発現細胞の細胞溶解を推進する。細胞溶解は補体媒介性であってもよく、またはエフェクター細胞により媒介されてもよい。１つの態様において、細胞溶解を、生体、例えば哺乳類において実行することができ、そして、生細胞は腫瘍細胞である。抗体またはその抗原結合断片で標的化できる腫瘍の例は、前立腺、膀胱、膵臓、肺、大腸、腎臓、黒色腫および肉腫などの、ＰＳＭＡを発現する任意の腫瘍を含む（これはＰＳＭＡを発現する新生脈管系を有する腫瘍を含む）。１つの態様において、腫瘍細胞は前立腺癌細胞である。
【００８７】
クロム放出アッセイによるin vitroでの細胞溶解活性の試験により、in vivoモデルにおける試験に先立つ、初期スクリーニングを提供することができる。この試験は、標準のクロム放出アッセイを用いて実行することができる。簡潔には、健康なドナーからの多形核白血球（ＰＭＮ）、または他のエフェクター細胞を、フィコール・ハイパック(Ficoll Hypaque)密度遠心法で精製することができ、次いで混入赤血球を溶解させる。洗浄したＰＭＮは、熱不活性化ウシ胎仔血清を１０％添加したＲＰＭＩ中に懸濁し、ＰＳＭＡ発現５１Ｃｒ標識細胞と、さまざまな腫瘍細胞対エフェクター細胞比（エフェクター細胞：腫瘍細胞）で混合することができる。その後、精製抗ＰＳＭＡ  ＩｇＧをさまざまな濃度で添加することができる。無関係のＩｇＧを陰性対照として用いることができる。アッセイは、０〜１２０分間、３７℃で実行することができる。試料は、培養上清への５１Ｃｒ放出を測定することにより、細胞溶解に関してアッセイすることができる。また、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体および／またはＡＤＣを互いに組み合わせて試験し、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体および／またはＡＤＣにより増強されるかどうかを決定できる。ＰＳＭＡおよび／またはＡＤＣに結合する抗体はまた、in vivoモデルにおいて（例えば、マウスにおいて）試験し、ＰＳＭＡ発現細胞、例えば腫瘍細胞の細胞溶解を媒介し、これを殺傷する効力を決定することができる。
【００８８】
ＡＤＣの抗体、またはＡＤＣが由来する抗原結合断片を、例えば、排他的であることを意図しない、以下の基準に基づいて選択することができる：
１）ＰＳＭＡを発現する生細胞への結合；
２）ＰＳＭＡに対する結合の高い親和性；
３）ＰＳＭＡ上のユニークなエピトープ（例えば、前に産生された抗体で認識されないエピトープ）への結合；
４）ＰＳＭＡ発現細胞のオプソニン化；
５）エフェクター細胞の存在下におけるＰＳＭＡ発現細胞の増殖阻害、食作用および／または殺傷の媒介；
６）ＮＡＡＬＡＤａｓｅ、葉酸ヒドラーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶおよび／またはγ−グルタミルヒドラーゼ活性の調節（阻害または増強）；
７）増殖阻害、細胞周期停止および／またはエフェクター細胞の非存在下における細胞毒性；
８）ＰＳＭＡの内在化；
９）ＰＳＭＡ上の立体構造エピトープへの結合；
１０）ＰＳＭＡを発現しない細胞または組織との最小限の交差反応性；および、
１１）ＰＳＭＡの単量体形態よりむしろＰＳＭＡの二量体形態に対する優先的な結合。
抗体は、これらの基準の１つまたは２つ以上、そしてできる限り全てを満たす。
【００８９】
１つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、立体構造エピトープ、例えばＰＳＭＡの細胞外ドメイン内の立体構造エピトープなどに結合する。抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片が立体構造エピトープに結合するか否かを決定するために、それぞれの抗体を天然タンパク質を用いたアッセイ（例えば、細胞表面結合の非変性免疫沈降、フローサイトメトリー解析など）および変性タンパク質（例えば、変性タンパク質のウエスタンブロット、免疫沈降、など）を用いたアッセイで試験することができる。結果の比較により、抗体またはその抗原結合断片が立体構造エピトープに結合するかどうかが示される。天然タンパク質には結合するが変性タンパク質には結合しない抗体またはその結合断片は、いくつかの態様において、立体構造エピトープに結合するものである。したがって、いくつかの態様において、ＡＤＣはＰＳＭＡの構造エピトープに結合する。
【００９０】
別の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ上の二量体特異的なエピトープに結合する。概して、二量体特異的エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ単量体よりもむしろＰＳＭＡ二量体に優先的に結合する。抗体またはその抗原結合断片が優先的に（つまり、選択的におよび／または特異的に）ＰＳＭＡ二量体に結合するか否かを決定するために、抗体またはその抗原結合断片を、天然の二量体ＰＳＭＡタンパク質および解離した単量体ＰＳＭＡタンパク質を用いたアッセイ（例えば、免疫沈降、次いでウエスタンブロット）で試験することができる。結果の比較により、抗体またはその抗原結合断片が優先的に二量体に結合するか否かが示される。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡ二量体には結合するが、単量体ＰＳＭＡタンパク質には結合しない。したがって、いくつかの態様において、ＡＤＶはＰＳＭＡ上の二量体特異的エピトープに結合する。
【００９１】
それゆえ、本発明はまた、ＰＳＭＡ多量体を選択的に結合するＡＤＣもまた含む。特にＡＤＣによるＰＳＭＡ多量体の結合に関して、本明細書中で用いる「選択的に結合する」は、抗体が、ＰＳＭＡタンパク質単量体よりむしろＰＳＭＡタンパク質多量体に優先的に結合する（例えば、より大きな結合力で、より高い結合親和性で）ことを意味する。いくつかの態様において、本発明のＡＤＣは、ＰＳＭＡタンパク質多量体に、ＰＳＭＡタンパク質単量体に対してＡＤＣが呈するよりも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍またはこれを超える結合力および／または結合親和性で結合する。ＡＤＣは、いくつかの態様において、ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合するが、ＰＳＭＡタンパク質単量体には結合せず、すなわち、ＰＳＭＡタンパク質多量体へと独占的に結合する。いくつかの態様において、ＡＤＣはＰＳＭＡタンパク質二量体を選択的に結合する。
【００９２】
本明細書中で用いるＰＳＭＡタンパク質多量体は、少なくとも２つのＰＳＭＡタンパク質またはその断片のタンパク質複合体である。ＰＳＭＡタンパク質多量体は、完全長ＰＳＭＡタンパク質（例えば、配列番号：１）、組み換え可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ、例えば配列番号：１の４４〜７５０のアミノ酸）および多量体を形成する前述の断片（例えば、二量体および／または高次のＰＳＭＡ多量体を形成するのに必要なタンパク質ドメインを保持するもの）のさまざまな組み合わせで構成することができる。いくつかの態様において、多量体を形成するＰＳＭＡタンパク質の少なくとも１つは、組み換え可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）ポリペプチドである。ＰＳＭＡタンパク質多量体は、二量体、例えば組み換え可溶性ＰＳＭＡタンパク質から形成されるものなどであることができる。１つの態様において、二量体はｒｓＰＳＭＡホモ二量体である。本明細書中で言及されるＰＳＭＡタンパク質多量体は、天然のコンフォメーションを取っていると想定されており、かかるコンフォメーションを有することができる。ＰＳＭＡタンパク質は、ある態様において、ともに非共有的に結合し、ＰＳＭＡタンパク質多量体を形成する。例えば、ＰＳＭＡタンパク質は非共有的に結合し、非変性条件下で二量体を形成することが見出された。ＰＳＭＡタンパク質多量体は、ＰＳＭＡ活性を保つことができる。ＰＳＭＡ活性は、葉酸ヒドラーゼ活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性またはγ−グルタミルヒドラーゼ活性などの、酵素活性であってよい。多量体のＰＳＭＡ活性を試験する方法は、当該技術分野において周知である（O'Keefe et al. in: Prostate Cancer: Biology, Genetics, and the New Therapeutics, L.W.K. Chung, W.B. Isaacs and J.W. Simons (eds.) Humana Press, Totowa, NJ, 2000, pp. 307-326で概説される）。
【００９３】
ＡＤＣの抗体またはその抗原結合断片は、細胞上に発現されるＰＳＭＡに結合できるかまたはそれとともに内在化される。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＳＭＡの内在化を誘発する。あるいは、抗体またはその抗原結合断片の内在化は、ＰＳＭＡの日常的な内在化の結果であり得る。したがって、ＡＤＣは細胞上に発現されるＰＳＭＡとともに内在化され得る。
【００９４】
抗体またはその抗原結合断片、およびそれゆえ本発明のＡＤＣは、細胞表面ＰＳＭＡおよび／またはｒｓＰＳＭＡを、サブナノモーラーの親和性で特異的に結合することができる。結合親和性は、約１×１０−９Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１０Ｍまたはそれ未満、または約１×１０−１１Ｍまたはそれ未満であり得る。特定の態様において、結合親和性は、約５×１０−１０Ｍ未満である。
【００９５】
抗体またはその抗原結合断片は、いくつかの態様において、少なくとも１つのＰＳＭＡの酵素活性を調節することができる。活性は、in vitroおよびin vivoでのＮ−アセチル化α−連結酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）、葉酸ヒドラーゼ、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ、γ−グルタミルヒドラーゼ活性、およびその組み合わせからなる群から選択することができる。調節は、少なくと１つのＰＳＭＡ酵素活性の増強または阻害であってよい。
【００９６】
ＮＡＡＬＡＤａｓｅの組織レベルは、ホモゲナイズした組織を界面活性剤で可溶化し、不溶性物質を遠心分離によりペレッティングし、そして残った上清におけるＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を測定することにより決定できる。同様に、体液におけるＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性はまた、はじめに遠心分離で細胞物質をペレッティングし、そして上清に対しＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性についての典型的な酵素アッセイを実行することにより測定することができる。ＮＡＡＬＡＤａｓｅ酵素アッセイは、Frieden, 1959, J. Biol, Chem., 234:2891に記載されている。このアッセイにおいて、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ酵素の反応産生物はグルタミン酸である。これは、Ｎ−アセチルアスパラギン酸およびグルタミン酸を生じる、酵素が触媒するＮ−アセチルアスパルチルグルタミン酸の切断に由来するものである。ＮＡＤ（Ｐ）＋要求段階において、グルタミン酸は、グルタミン酸脱水素酵素により触媒される反応において、２−オキソグルタル酸、さらにＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じる。反応の過程は、ＮＡＤ（Ｐ）＋のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの転換に起因する３４０ｎｍでの吸光度の変化により、簡便にかつ便利に測定することができる。
【００９７】
ＰＳＭＡの葉酸ヒドラーゼ活性は、Hestonなど（例えば、Clin. Cancer Res. 2(9):1445-51, 1996; Urology 49(3A Suppl): 104-12,1997)に記載されている酵素アッセイを実行することにより測定することができる。ＰＳＭＡなどの葉酸ヒドラーゼは、ポリグルタミン酸化葉酸からガンマ結合グルタミン酸塩を除去する。葉酸ヒドラーゼ活性は、トリ−ガンマグルタミン酸メトトレキサート（ＭＴＸＧｌｕ３）、ジ−ガンマグルタミン酸メトトレキサート（ＭＴＸＧｌｕ２）またはプテロイルグルタミン酸塩（ＰｔｅＧｌｕ５）などの基質を用いて、例えばキャピラリー電気泳動により測定できる（Clin. Cancer Res. 2(9):1445-51, 1996を参照のこと）。ＰＳＭＡをポリグルタミン酸塩基質とともに時限培養(timed incubation)し、次いで分離し、そして加水分解産物を同定する。
【００９８】
本発明のＡＤＣは、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに複合した抗体またはその抗原結合断片を含む。抗体またはその抗原結合断片は、いくつかの態様において、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに、以下の式（式１）で表される化合物と共に複合することができる。（式１）：−Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−、式中、Ａはカルボン酸アシル単位であり；Ｙはアミノ酸であり；Ｚはアミノ酸であり；ＸおよびＷはそれぞれ自壊的スペーサーであり；ｎは０または１の整数であり；およびｍは０あるいは１、２、３、４、５または６の整数である。本発明の複合体は、いくつかの態様において、式（式２）で表される。（式２）：Ｌ−｛Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−Ｄ｝ｐ、式中ＬはＰＳＭＡに結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ＤはＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、およびｐは１、２、３、４、５、６、７または８の整数である。他の構成要素は上記のとおりである。１つの態様において、カルボン酸単位「Ａｎ」は、抗体または抗原結合断片に由来する硫黄原子を介して抗体または抗原結合断片に結合する：
【化７】
2015187117.tif 000010
【００９９】
１つの態様において、Ａは、
【化８】
2015187117.tif 000011
式中、ｑは１〜１０である、
である。それゆえ、１つの態様において、複合体は：
【化９】
2015187117.tif 000012
式中、Ｌ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｗ、Ｄ、ｎ、ｍ、ｑおよびｐは上記で定義したものである、
である。
【０１００】
別の態様において、Ａは４−（Ｎ−スクシンイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル、ｍ−スクシンイミドベンゾイル、４−（ｐ−スクシンイミドフェニル）−ブチリル、４−（２−アセトアミド）ベンゾイル、３−チオプロピオニル、４−（１−チオエチル）−ベンゾイル、６−（３−チオプロピオニルアミド）−ヘキサノイルまたはマレイミドカプロイルである。さらなる態様において、Ａはマレイミドカプロイルである。さまざまなカルボン酸アシル単位およびその合成および付着の方法の代表的な例は、米国特許第6,214,345号に記載され、その全体の内容を本明細書中に参照として組み入れる。
【０１０１】
別の態様において、Yはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンである。さらに別の態様において、Ｙはバリンである。さらなる態様において、Ｚはリジン、アセチルまたはホルミルで保護されたリジン、アルギニン、トシル基またはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチン、あるいはシトルリンである。さらに追加の態様において、Ｚはシトルリンである。１つの態様において、Ｙｍ−Ｚｍはバリン−シトルリンである。別の態様において、Ｙｍ−Ｚｍはプロテアーゼで選択的に切断可能なタンパク質配列である。
【０１０２】
さらなる態様において、Ｘは式：
【化１０】
2015187117.tif 000013
式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳである、
を有する化合物である。別の態様において、Ｘは式−ＨＮ−Ｒ１−ＣＯＴ、式中Ｒ１はＣ１〜Ｃ５アルキルであり、ＴはＯ、ＮまたはＳである、で表される化合物である。さらなる態様において、Ｘは式
【化１１】
2015187117.tif 000014
式中、ＴはＯ、Ｎ、またはＳであり、Ｒ２はＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである、
を有する化合物である。１つの態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルカルバモイルオキシである。別の態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルアルコールである。さらなる態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルカルバミン酸塩である。さらに追加の態様において、Ｘはｐ−アミノベンジルオキシカルボニルである。別の態様において、Ｘはγ−アミノ酪酸、α，α−ジメチルγ−アミノ酪酸またはβ，β−ジメチルγ−アミノ酪酸である。
【０１０３】
いくつかの態様において、Ｗは
【化１２】
2015187117.tif 000015
式中、ＴはＯ、ＳまたはＮである、
である。
【０１０４】
１つの態様において、式１で表される化合物は、マレイミドカプロイルである。マレイミドカプロイルは、２つの特異的アウリスタチンを抗ＣＤ３０ｍＡｂ（ＡＣ１０）に結合するために用いられてきた(Doronina, Svetlana et al. "Novel Linkers for Monoclonal AntibodyMediated Delivery of Anticancer Agents", AACR, Anaheim, CA, Abstract No. 1421, April 16-20, 2005)。マレイミドカプロイルはチオール基と反応し、チオエーテルを形成する。
【０１０５】
ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦは、抗体またはその抗原結合断片に、当業者に公知の（例えば、Niemeyer, CM, Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, 2004）または本明細書中に記載の方法を用いて結合させることができる。いくつかの態様において、１つより多いＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子を、抗体またはその抗原結合断片に複合することできる。他の態様において、１、２、３、４、５、６、７または８個のＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が抗体またはその抗原結合断片に結合する。さらに他の態様において、少なくとも３、４または５個のＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が抗体またはその抗原結合断片に結合する。さらなる態様において、３、４または５個のＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ分子が抗体またはその抗原結合断片に結合する。
【０１０６】
本発明によるＡＤＣは、非ＰＳＭＡ発現細胞の殺傷をＰＳＭＡ発現細胞の殺傷と比較した場合に、特に高いレベルの選択性を有することが見出された。それゆえ、いくつかの態様において、ＡＤＣのＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２細胞またはＬＮＣａＰ(TM)細胞との間の選択性は、少なくとも２５０である。他の態様において、選択性は、少なくとも３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１７５００、２００００であるかまたはこれを超える。いくつかの態様において、選択性は、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜５０００、５０００〜１００００、１００００〜１５０００または１５０００〜２００００の間である。本明細書中で定義される「選択性」は、Ｃ４−２細胞またはＬＮＣａＰ(TM)細胞（ＰＳＭＡ発現細胞）に対するＰＣ−３(TM)細胞（非ＰＳＭＡ発現細胞）におけるＡＤＣのＩＣ５０値の比率を指す。
【０１０７】
本発明のＡＤＣが、いくつかの態様において、ＰＳＭＡ発現特異的細胞殺滅を、非常に低濃度、例えばピコモル濃度またはその付近で媒介することもまた見出された。ＡＤＣは、いくつかの態様において、１×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、または１×１０−１２Ｍ未満の濃度のＩＣ５０を呈する。特定の態様において、ＩＣ５０は約１．５×１０−１１Ｍ未満の濃度で達成される。別の態様において、提供されるＡＤＣは、１０〜２１０、４０〜２１０、６０〜２１０または６５〜２１０ｐＭの間のＩＣ５０を呈する。さらに別の態様において、提供されるＡＤＣは約１０．４０、６０、または８０ｐＭのＩＣ５０を呈する。さらに別の態様において、提供されるＡＤＣは約１１、４２、６０または８３ｐＭのＩＣ５０を呈する。
【０１０８】
ＡＤＣが、いくつかの態様において、マウスにおける少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の治癒率をもたらすこともまた明らかとなった。他の態様において、マウスにおける治癒率は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。さらに他の態様において、治癒率は２０〜４０％、４０〜６０％または６０〜８０％である。本明細書中で用いる「治癒率」は、研究期間の開始から約５００日後でなお生存する、腫瘍の形跡がなく、計測できるＰＳＡレベルを有しないマウスの数を、研究期間の開始時のマウスの数で割ったものを指す。治癒率を評価するため、マウスに６ｍｇ／ｋｇのＡＤＣをｑ４ｄ×６の投与計画で投与した。いくつかの態様において、研究開始時におけるマウスの数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０匹であるかまたはこれを超える。研究の例に関するさらなる詳細を、本明細書中の下記の例で提供する。１つの態様において、マウスはアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌のモデルのものである。別の態様において、マウスはＣ４−２細胞を左後肢に筋肉内移植したヌードマウスである。腫瘍の存在を決定するためのおよびＰＳＡレベルを測定するための技術は、当業者に周知である。
【０１０９】
本発明のＡＤＣの生存ＰＳＭＡ発現細胞に対する結合は、ＰＳＭＡ発現細胞の増殖を阻害でき、その結果として細胞周期停止（例えば、Ｇ２／Ｍ停止）が起こり、ＰＳＭＡ発現細胞などのアポトーシスを促進する。本明細書中で用いる「結果として細胞周期停止を起こす」は、ＡＤＣの投与に起因するＧ２／Ｍ期の細胞の数の増加を指す。いくつかの態様において、ＡＤＣはアポトーシスをもたらすことができる。いくつかの態様において、ＡＤＣは、結果として細胞周期停止および引き続くアポトーシスの両方を引き起こす。それゆえ、本発明のＡＤＣを、これらの可能性のあるエンドポイントをもたらすための、in vitroおよびin vivoの方法において用いることができる。特に、本発明のＡＤＣをＰＳＭＡ媒介疾患を処置するための方法において用いることができる。
【０１１０】
本明細書中で用いる「ＰＳＭＡ媒介疾患」は、ＰＳＭＡがこれらの疾患の原因となるか、または兆候である任意の疾患である。ＰＳＭＡ媒介疾患は、また、ＰＳＭＡの異常（例えば過剰発現）がある疾患または障害を含む。ＰＳＭＡは１００ｋＤの前立腺組織に発現するＩＩ型膜糖タンパク質である（Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7:927-935；米国特許番号第5,162,504号）。ＰＳＭＡは、トランスフェリン受容体と配列同一性を有し(Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54: 1807-1811)、かつＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を示す(Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 93:749-753)ＩＩ型膜貫通タンパク質として特徴付けられた。より重要には、ＰＳＭＡは前立腺癌において増加した量で発現され、そして上昇したレベルのＰＳＭＡがまたこれらの患者の血清において検出可能である(Horoszewicz et al., 1987；Rochon et al., 1994, Prostate 25:219-223；Murphy et al., 1995, Prostate 26:164-168；およびMurphy et al., 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479)。それゆえ、ＰＳＭＡ媒介障害は、例えば、前立腺癌である。ＰＳＭＡ発現は疾患の進行とともに増加し、現在は治療法のない転移、耐ホルモン性疾患において最高となる。さらに、興味深いデータによれば、ＰＳＭＡはまた、膀胱、膵臓、肉腫、黒色腫、肺、および腎臓の腫瘍細胞を含む、さまざまな他の重要な腫瘍の新生脈管系において豊富に発現するが、正常な脈管系においては発現しないことが示された。それゆえ、ＰＳＭＡ媒介疾患は、ＰＳＭＡが腫瘍または腫瘍の新生脈管系の細胞において発現する癌を含む。
【０１１１】
それゆえ、任意のＰＳＭＡ媒介障害を処置するために用いることができる組成物および方法を提供する。例えば、ＡＤＣを用いて腫瘍の脈管新生を阻害することができる。別の例において、ＰＳＭＡ  ＡＤＣを用いて腫瘍細胞を殺傷することができる。いくつかの態様において、２つまたは３つ以上の異なるＡＤＣを組み合わせて用いる。別の態様において、１つまたは２つ以上の非結合抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片を、１つまたは２つ以上のＡＤＣとともに単一の治療において組み合わせて、所望の治療効果を達成することができる。例として、エフェクター細胞の存在下において標的細胞の高度に有効な殺傷を媒介する、および／またはＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害する、非結合抗ＰＳＭＡ抗体を、１つまたは２つ以上のＡＤＣとともに用いることができる。さらに別の態様において、ＡＤＣを１つまたは２つ以上の追加の治療剤と組み合わせることができる。治療剤は、抗癌剤、例えばドセタキセルなど；コルチコステロイド、例えばプレドニゾンまたはヒドロコルチゾンなど；免疫刺激剤；免疫調整剤；またはそれらのある組み合わせを含む。
【０１１２】
抗癌剤は、細胞毒性剤、化学療法剤および腫瘍新生脈管系に作用する薬剤を含む。細胞毒性剤は、細胞障害性放射性核種、化学毒素およびタンパク質毒素を含む。細胞障害性放射性核種または放射線治療アイソトープは、アルファ線放射アイソトープ、例えば２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａまたは２２３Ｒａなどであってもよい。あるいは、細胞障害性放射性核種は、ベータ線放射性アイソトープ、例えば８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１５３Ｓｍまたは１６６Ｈｏなどであってもよい。さらに、細胞障害性放射性核種はオージェおよび低エネルギー電子を放射することができ、アイソトープ１２５Ｉ、１２３Ｉ、または７７Ｂｒを含む。
【０１１３】
好適な化学毒素または化学療法剤は、エンジインファミリー分子の成員、例えばカリケアマイシンおよびエスペラマイシンなどを含む。化学毒素はまた、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択することができる。他の抗新生物剤は、ドラスタチン類（米国特許番号第6,034,065号および第6,239,104号）およびその誘導体を含む。ドラスタチン類およびその誘導体は、ドラスタチン１０（ドラバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−ドラフェニン）ならびにその誘導体であるアウリスタチンＰＨＥ（ドラバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン−メチルエステル）(Pettit, G.R. et al., Anticancer Drug Des. 13(4):243-277, 1998；Woyke, T. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45(12):3580-3584, 2001)、およびアウラスタチンＥなどを含む。毒素はまた、毒性レクチン類、植物毒素、例えばリシン毒素、アブリン毒素、モデシン毒素、ボツリヌス毒素およびジフテリア毒素を含む。他の化学療法剤は、当業者に公知である。
【０１１４】
腫瘍脈管系に作用する薬剤は、チューブリン結合剤、例えばコンブレスタチンA4(Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, 2001)、アンギオスタチンおよびエンドスタチン（Rosen, Oncologist 5:20, 2000において総説され、本明細書中に参照により組み込む）ならびにインターフェロン誘導性タンパク質 10 (米国特許番号第. 5,994,292)を含む。多数の他の抗血管新生剤もまた意図されており、これらは以下を含む：２ＭＥ２、アンギオスタチン、アンギオザイム、抗ＶＥＧＦ  ＲｈｕＭＡｂ、Ａｐｒａ（ＣＴ−２５８４）、Ａｖｉｃｉｎｅ、ベネフィン、ＢＭＳ２７５２９１、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ４０４７、ＣＣ５０１３、ＣＣ７０８５、ＣＤＣ８０１、ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）、ＣＭ１０１、コンブレスタチンＡ−４プロドラッグ、ＥＭＤ１２１９７４、エンドスタチン、フラボピリドール、ゲニステイン（ＧＣＰ）、緑茶抽出物、ＩＭ−８６２、ＩｍｍＴｈｅｒ、インターフェロンアルファ、インターロイキン−１２、イレッサ（ＺＤ１８３９）、マリマスタット、メタスタット（Ｃｏｌ−３）、ネオバスタット、オクトレオチド、パクリタキセル、ペニシラミン、フォトフリン、フォトポイント、ＰＩ−８８、プリノマスタット（ＡＧ−３３４０）、ＰＴＫ７８７（ＺＫ２２５８４）、ＲＯ３１７４５３、ソリマスタット、スクアラミン、ＳＵ１０１、ＳＵ５４１６、ＳＵ−６６６８、スラジスタ（ＦＣＥ２６６４４）、スラミン（Ｍｅｔａｒｅｔ）、テトラチオモリブデン酸塩、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０およびバイタクシン。さらなる抗血管新生剤がKerbel, J. Clin. Oncol. 19(18s):45s-51s, 2001に記載され、それを本明細書中に参照により組み入れる。
【０１１５】
ＡＤＣを１つまたは２つ以上の免疫刺激剤、例えばＩＬ−２および免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むもの）などとともに投与し、免疫反応を誘発または増強することができる。免疫刺激剤は、いくつかの態様において、免疫系の特定のアーム、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などを刺激することができる。免疫刺激剤は、インターロイキン−２、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組み合わせを含む。免疫調整剤は、サイトカイン、ケモカイン、アジュバントまたはその組み合わせを含む。免疫応答を増加させるのに有用なケモカインは、限定することなく、ＳＬＣ、ＥＬＣ、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびその組み合わせを含む。
【０１１６】
他の治療剤はワクチンであることができる。いくつかの態様において、ワクチンは、対象をＰＳＭＡに対して免疫する。かかるワクチンは、いくつかの態様において、任意に免疫応答を誘発または増強する１種または２種以上のアジュバントとともに、抗原、例えばＰＳＭＡ二量体などを含む。アジュバントは、免疫応答を高める物質である。多くの種類のアジュバントが当該技術分野で周知である。アジュバントの特定の例は、モノホスホリル脂質Ａ(MPL, SmithKline Beecham)；ＱＳ２１(SmithKline Beecham)を含むサポニン類；免疫刺激性オリゴヌクレオチド類（例えば、Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995に記載されたＣｐＧオリゴヌクレオチド類）；フロイント不完全アジュバント；フロイント完全アジュバント；モンタニド；ビタミンＥおよびスクワレンおよび／またはトコフェロールなどの生分解性油から作製されるさまざまな油中水エマルジョン、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１、ならびにその組み合わせを含む。製剤、例えば米国出願番号第10/976352号に記載されるものなどもまた、本明細書中で提供される方法におけるワクチンとしての使用を意図している。製剤の開示を、本明細書中に参照により組み入れる。
【０１１７】
ワクチンは、いくつかの態様において、本明細書中に記載されたＰＳＭＡタンパク質二量体などの、１つまたは２つ以上の単離されたＰＳＭＡタンパク質多量体を含む。いくつかの態様において、ＰＳＭＡタンパク質多量体組成物は、（組成物におけるＰＳＭＡタンパク質の総量の）少なくとも約１０％のＰＳＭＡタンパク質多量体を含有する。他の態様において、ＰＳＭＡタンパク質多量体組成物は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９．５％のＰＳＭＡタンパク質多量体を含有する。１つの態様において、ＰＳＭＡタンパク質多量体組成物は、実質的にＰＳＭＡタンパク質単量体を伴わない実質的に純粋なＰＳＭＡタンパク質多量体を含有する。特定のパーセンテージのリストは、推論により、列挙したパーセンテージの間の挙げていないパーセンテージの全てを含むものと理解される。
【０１１８】
サイトカインはまた、そのリンパ球調節特性の結果として、ワクチン接種プロトコールにおいて用いることができる。かかる目的に有用な多くのサイトカインが当業者にし知られており、これらはインターロイキン−２（ＩＬ−２）；ＩＬ−４；ＩＬ−５；ワクチンの保護効果を増強することが示されているＩＬ−１２（例えば、Science 268: 1432-1434, 1995を参照のこと）；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−１５；ＩＬ−１８；その組み合わせなどを含む。そのため、サイトカインを抗原、ケモカインおよび／またはアジュバントと併せて投与し、免疫応答を増加させることができる。
【０１１９】
他の治療剤を、非複合形態または複合形態、例えば抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片に複合した形態で、本発明の組成物中に存在させることまたは本発明の方法において使用することができる。１つまたは２つ以上の毒素分子の抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片へのカップリングは、多くの化学メカニズム、例えば共有結合、親和結合、インターカレーション、配位結合および錯体形成を含むことができる。
【０１２０】
共有結合は、既存の側鎖の直接縮合、または外部架橋分子の組み込みのいずれかにより達成することができる。多くの二価のまたは多価の薬剤は、タンパク質分子を他のタンパク質、ペプチドまたはアミン基などにカップリングするのに有用である。例えば、文献には、カルボジイミド類、ジイソシアン酸塩類、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン類、およびヘキサメチレンジアミン類などのカップリング剤が多数記載されている。このリストは、当該技術分野で公知のさまざまなカップリング剤を網羅することを意図するものではないが、むしろ、より一般的なカップリング剤を例示するものである。
【０１２１】
いくつかの態様において、まず抗体を誘導体化し、それから治療剤を誘導体化産物に付着させることが望まれる場合のあることが意図される。この手法で用いるための好適な架橋剤は、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、およびＳＭＰＴ、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエンなどを含む。
【０１２２】
さらに、タンパク毒素は、抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片に遺伝子的手法で融合し、ハイブリッド免疫毒素融合タンパク質を形成することができる。融合タンパク質は、追加のペプチド配列、例えば抗ＰＳＭＡ抗体と毒素とを作動可能に付着するペプチドスペーサーなどの、付加的なペプチド配列を、かかる付加的な配列が融合タンパク質の標的化または毒素活性を明確に損なわない限り含むことができる。タンパク質は、当該技術分野で周知の、ペプチドリンカーまたはスペーサー、例えばグリシン−セリンスペーサーペプチド、またはペプチドヒンジなどで付着させることができる。したがって、例えば、抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片のＣ末端は、タンパク毒素分子のＮ末端に融合し、抗ＰＳＭＡ抗体の結合特性を保つ免疫毒素を形成することができる。他の融合配置は当業者に公知であろう。融合免疫毒素を発現するために、融合タンパク質をコードする核酸を、標準的な方法に従って、融合タンパク質の安定した発現、例えば哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞などにおける発現のために、発現ベクター中に挿入する。融合タンパク質は、細胞または培養上清から、標準的な手順、例えばＰＳＭＡアフィニティーカラムなどを用いて、単離および精製することができる。
【０１２３】
放射性核種は、典型的には、キレート化により抗体またはその抗原結合断片にカップリングする。例えば、金属性放射性核種の場合、二価のキレート剤を通常用いて、アイソトープを抗体または他の対象とするタンパク質に連結する。典型的には、キレート剤を、はじめに抗体に付着させ、そしてキレート剤−抗体複合体を金属性放射性同位体に接触させる。米国特許第5,124,471号、第5,286,850号および第5,434,287号（これらを本明細書中に参照により組み入れる）に記載される、ペンタ酢酸ジエチレントリアミン（ＤＴＰＡ）系のアミノ酸を含む、多数の二価のキレート剤がこの目的のために開発されている。別の例として、ヒドロキサム酸に基づく二価のキレート化剤が米国特許第5,756,825号に記載されており、その内容を本明細書中に組み入れる。別の例は、p-SCN-Bz-HEHA（Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''，Ｎ''''，Ｎ'''''−ヘキサ酢酸ｌ，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−オクタデカン）(Deal et al, J Med. Chem. 42:2988, 1999)であり、それは２２５Ａｃなどの放射性金属の有効なキレート化剤である。さらにもう１つの例はＤＯＴＡ（Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−テトラ酢酸1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン）であり、それは二価のキレート化剤（McDevitt et al., Science 294:1537-1540, 2001）であり、標識化し次いで複合させる、二段法で用いることができる。
【０１２４】
他の治療剤はまた、選択的複製ウイルスを含む。ｐ５３経路標的アデノウイルス突然変異体ｄｌ１５２０、ＯＮＹＸ−０１５などの複製能を有するウイルスは、腫瘍細胞を選択的に殺傷する(Biederer, C. et al., J. MoL Med. 80(3):163-175, 2002)。ウイルスは、いくつかの態様において、ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片に複合できる。
【０１２５】
本発明で提供される組成物を、他の治療的処置様式と併せて用いることができる。そのような他の処置は、外科手術、放射線療法、凍結外科手術、温熱療法、ホルモン処置、化学療法、ワクチンおよび他の免疫療法を含む。
【０１２６】
本発明のＡＤＣは、その抗体またはその抗原結合断片を介するなどして、標識に連結することができる。標識は、例えば、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、核磁気共鳴活性標識、発光性標識または発色性標識を含む。
【０１２７】
提供される組成物は、ＡＤＣと混合される、生理学的にまたは薬学的に受許容し得るキャリア、賦形剤または安定化剤を含むことができる。いくつかの態様において、組成物が２つまたは３つ以上の異なるＡＤＣを含む場合、ＡＤＣの抗体またはその抗原結合断片のそれぞれはＰＳＭＡの異なる立体構造エピトープに結合する。
【０１２８】
本明細書中で用いる、「標的細胞」は、本発明のＡＤＣが標的とすることができる、対象（例えば、ヒトまたは動物）における任意の望まない細胞を意味する。いくつかの態様において、標的細胞はＰＳＭＡを発現するまたは過剰発現する細胞である。ＰＳＭＡを発現する細胞またはＰＳＭＡ発現細胞は、腫瘍細胞、例えば、前立腺、膀胱、膵臓、肺、腎臓、大腸腫瘍細胞、ならびに黒色腫および肉腫細胞を典型的に含む。
【０１２９】
本発明の薬学的組成物は、併用療法において、つまり、他の剤を組み合わせて、投与することができる。例えば、併用療法は、本発明の組成物を、少なくとも１種の抗腫瘍剤、免疫調整剤、免疫刺激剤また他の慣用の療法とともに含むことができる。他の剤は、剤のＰＳＭＡ発現細胞に対する指向性ターゲティング（directed targeting）のために、ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片に複合させてもよく、またはＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む組み換え融合分子として形成してもよい。別の態様において、他の治療剤は複合していなくてもよい。追加の治療剤を、併用投与により、ＰＳＭＡ発現細胞に投与するか、またはこれに接触させることができる。本明細書中で用いる「併用投与する」は、２つまたは３つ以上の治療剤を、同時に単一の組成物における混合物として、または順次、混合物が付加的効果さらには相乗効果さえ発揮するような十分に近接した時間で投与することを指す。さらなる態様において、追加の治療剤を、１つまたは２つ以上のＡＤＣあるいはその組成物の投与前、投与中または投与後に、投与することができる。
【０１３０】
本明細書中で用いる、「薬学的に許容し得るキャリア」または「生理学的に許容し得るキャリア」は、生理学的に適合性の任意のおよび全ての塩、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。いくつかの態様において、キャリアは、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適したものである。投与経路に依存して、活性化合物を、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護する材料でコーティングできる。
【０１３１】
投与の際、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容し得る量および薬学的に許容し得る組成物にて適用する。「薬学的に許容し得る」の用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。かかる製剤は、塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性キャリア、および任意に他の治療剤、例えば、アジュバント、ケモカインおよびサイトカインを含む追加の免疫増強剤などを、通常的に含んでもよい。医薬に用いられる場合、塩は薬学的に許容し得るものであるべきだが、薬学的に許容し得ない塩を便利に用いて、その薬学的に許容し得る塩を製造してもよく、これは本発明の範疇から除外されない。
【０１３２】
塩は親化合物の所望の生物学的活性を保ち、いかなる好ましくない毒物学的効果も示さない（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J Pharm. Sci. 66: 1-19を参照のこと）。かかる塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪酸、モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに、非毒性有機アミン類、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、チオロプロカイン(chioroprocaine)、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【０１３３】
所望により、ＡＤＣを薬学的に許容し得るキャリアと組み合わせることができる。本明細書中で用いる「薬学的に許容し得るキャリア」は、ヒトへの投与に好適な、１つまたは２つ以上の適合性の固体または液体増量剤、希釈剤または被包物質を意味する。「キャリア」の用語は、それによって有効成分が混合され、適用が容易になる、天然または合成の、有機または無機成分を示す。薬学的な組成物の構成要素はまた、所望の薬学的な効能を実質的に障害する相互作用がないような方法で混合することができる。
【０１３４】
薬学的な組成物は、以下のものを含む、好適な緩衝剤を含有してもよい：塩中の酢酸：塩中のクエン酸；塩中のクエン酸；塩中のホウ酸；および塩中のリン酸。
【０１３５】
薬学的な組成物は、また、随意に、好適な保存料、例えば以下のものを含有してもよい：塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベン類およびチメロサール。
【０１３６】
薬学的な組成物は都合よく薬学的投薬形態で存在してもよく、製薬当該技術分野で周知の任意の方法で作製してもよい。全ての方法は、活性薬剤を１つまたは２つ以上の副成分を構成するキャリアとの組み合わせにする段階を含む。概して、活性化合物を液体キャリア、微粉化した固体キャリア、またはその療法とともに、均一にそして密接に組み合わせにすることにより、組成物を作成し、それから、必要ならば、産生物を成形する。
【０１３７】
非経口投与に好適な組成物は、化合物の滅菌水性または非水性生成物を含み、それは、いくつかの態様において、被投与者の血液と等張である。この生成物は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従って製造してもよい。滅菌注射可能な生成物は、また、非毒性の非経口の許容し得る希釈剤または溶媒中、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液など、の滅菌の注射可能な溶液または懸濁液であってよい。採用してもよい許容し得るビヒクルおよび溶媒にあるのは、水、リンガー溶液、および生理食塩水である。さらに、滅菌の、固定油を、溶媒または懸濁培地として都合よく採用する。この目的のために、モノ−またはジ−グリセリドを含む、任意の無刺激性の固定油を採用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射可能な生成物中で用いてもよい。経口、皮下、静脈内、筋内、などの投与に適合するキャリア製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAにおいて見つけることができる。
【０１３８】
活性化合物を、例えばインプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化搬送システムを含む、制御放出製剤など、急速な放出に対して化合物を保護するキャリアとともに作製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー類、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ酢酸などを用いることができる。製剤の施生物のための多くの方法が特許化され、当業者に一般的に公知となっている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０１３９】
本発明の治療剤を、注射または時間を掛けての漸進的注入によってなどの、任意の慣用の経路で投与することができる。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、腫瘍内、または経皮であってよい。抗体を含有する化合物を治療的に用いるとき、投与経路は静脈内および肺のアエロゾルによるものを含む。抗体を含むアエロゾル搬送系を製造するための技術は、当業者に周知である。概して、系は抗体の生物学的特性、例えばパラトープ結合能、を有意には損なわない構成要素を利用すべきである（例えば、Sciarra and Cutie, "Aerosols," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp. 1694-1712を参照のこと；参照により組み入れる）。当業者は、過度の実験を用いることなく、抗体を産生するためのさまざまなパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
【０１４０】
本発明の化合物を、有効量で投与する。「有効量」は、単独で、またはさらなる用量および／または他の治療剤とともに所望の反応を引き起こす、例えば対象においてＰＳＭＡ媒介疾患を処置する、本明細書中で提供される任意のＡＤＣの量である。これは疾患の一時的な進行をゆっくりとすることのみに関連することができるが、いくつかの態様において、それは恒久的に疾患の進行を停止することに関連する。これを、決められた方法でモニターできる。疾患または状態の処置に対する所望の反応は、また、発病を遅延させることができ、あるいは疾患または状態の発病を阻害さえできる。有効な量は、所望の治療的終点をもたらす、ＡＤＣ単独の量とすることができる。有効な量は、また、所望の結果をもたらすもう１つの剤とともに組み合わせたＡＤＣの量でもある。
【０１４１】
量は、もちろん、処置する独自のＰＳＭＡ媒介疾患、状態の重篤度、年齢を含めた個々の患者のパラメーター、健康状態、サイズおよび体重、処置の期間、併用方法の性質（もしあれば）、投与の特別な経路および医療関係者の知識および技能の範疇内の要素のようなものに、依存するであろう。これらの要素は当業者に周知であり、決められた実験のみで対処できる。個々の構成要素またはその組み合わせの最大量、つまり、正常な医学的判断に従った最大安全量を用いることが、一般的に好まれる。しかしながら、患者は医学的な理由、心理的理由のため、または、実質的ないかなる他の理由のために、最低用量または耐量を主張するかもしれないということを、当業者は理解しているであろう。
【０１４２】
前述の方法において用いられる薬学的組成物は、好ましくは滅菌され、単独またはもう１つの剤と組み合わせて、有効量のＡＤＣを含有し、患者への投与に適合する重量単位または用量における所望の反応をもたらす。反応は、例えば、ＡＤＣ組成物の生理学的効果、例えば腫瘍の退化または疾患兆候の減少など、を決定することにより測定できる。他のアッセイが当業者に公知であり、反応のレベルを決定するために採用することができる。
【０１４３】
対象に投与するＡＤＣの用量を、異なるパラメーターに従って、用いる投与様式および対象の状態に従って、選択することができる。他の要素は、処置の所望の期間を含む。対象における反応が最初の適用量で不十分である場合、より高用量（または異なる、より限局的な送達ルートによる有効な高用量）を患者の耐容性が許す範囲で採用してもよい。
【０１４４】
概して、用量は約１０μｇ／ｋｇ〜約１００，０００μｇ／ｋｇの範囲とすることができる。いくつかの態様において、用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。さらに他の態様において、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。さらに他の態様において、用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。さらなる態様において、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇである。組成物に基づき、用量を連続的に、例えば持続性輸注ポンプにより、または定期的な間隔で、送達することができる。いくつかの態様において、ＡＤＣを経静脈で投与するとき、用量は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの間、またはその間の任意の値である。特別な組成物の複数の用量の所望の時間間隔を、当業者により、過度の実験をすることなく、決定することができる。組成物の投与のための他のプロトコールは、当業者に公知であろうところ、投与量、投与のスケジュール、投与部位、投与の様式などは前述のものと異なる。いくつかの態様において、ｑ４ｄ×３またはｑ４ｄ×６の投与計画で、対象にＡＤＣを投与する。１つの態様において、用量を経静脈で投与する。別の態様において、投与計画は、単回静脈内投与である。
【０１４５】
例えば、試験目的または獣医学的治療目的のための、ヒト以外の哺乳類へのＡＤＣ組成物の投与を、上記のものと実質的に同様の条件下で実行する。
【０１４６】
本発明の組成物は、in vitroおよびin vivo診断的または治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を培養物における、例えばin vitroまたはex vivoにおける、または対象における、例えば、in vivoにおける、細胞へと投与し、さまざまなＰＳＭＡ媒介疾患を処置、予防または診断することができる。本明細書中で用いる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。対象は、ＰＳＭＡの典型的な異常発現（例えば、過剰発現）を特徴とする障害を有するヒト患者を含み、そのような障害は「ＰＳＭＡ媒介疾患」の定義に含まれる。
【０１４７】
本明細書中で提供される組成物を、癌のin vivo治療において利用することができる。ＡＤＣを用いて、複合物の投与および局在化に続き、悪性細胞または組織の増殖を阻害することができる。提供される組成物は、いくつかの態様において、抗ＰＳＭＡ抗体を含むことができ、補体結合または抗体依存性細胞毒性により腫瘍の崩壊を媒介するかもしれない。代わりに、組成物は追加の治療剤を含有することができ、その結果、相乗治療効果をもたらす(Baslya and Mendelsohn, 1994 Breast Cancer Res. and Treatment 29:127-138)。
【０１４８】
本発明の組成物を、また、いくつかの態様において、補体および／または非複合抗ＰＳＭＡ抗体とともに投与することができる。従って、ＡＤＣおよび血清または補体を含む組成物は本発明の範疇内にある。組成物は、補体がヒト抗体またはその抗原結合断片に対して近接近して位置している点で有利である。代わりに、ＡＤＣ、抗体またはその抗原結合断片ならびに／あるいは補体または血清を別々に投与することができる。
【０１４９】
本発明の治療の使用は、多くの利点を有する。ＡＤＣは、例えば前立腺癌細胞における、ＰＳＭＡを標的にするため、他の組織を傷つけずにしておくことができる。結果として、そのような生物学的薬剤での処置は、とくに高齢の患者において、より安全である。本発明による処置は、いくつかの態様において、特に有効であると期待される、なぜなら、癌の転移が、例えば前立腺癌の転移などが優位となりうる、骨髄およびリンパ節へと、高レベルのＡＤＣを誘導するからである。本発明による治療を、血清前立腺特異性抗原および／またはステージ、嚢胞外、精液または神経周囲の浸潤、断端陽性、発症しているリンパ節などの患者の癌の病理学的性質などの臨床的パラメーターで有効にモニターすることができる。代わりに、これらのパラメータを用いて、治療を採用すべき時を示すことができる。
【０１５０】
本発明の組成物、例えば１つまたは２つ以上のＡＤＣおよびおよび取り扱い説明書を含むキットも、また、本発明の範疇内にある。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、例えば補体、化学療法剤、コルチコステロイド、またはＰＳＭＡを結合する１つまたは２つ以上の抗体をさらに含有することができる。他のキットは、また、ＰＳＭＡ多量体を含むことができる。別の態様において、キットは、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどの１つまたは２つ以上の収容手段または一式の収容手段を厳重な管理下で受け入れる、区分化されたキャリアを含むことができる。第１の搬送手段または一連の搬送手段は、１つまたは２つ以上の抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含有してもよい。第２の搬送手段または一連の搬送手段は、いくつかの態様において、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦあるいはＭＭＡＥまたはＭＭＡＦへと複合した式１で表される化合物を含有する。いくつかの態様において、第３の搬送手段または一連の搬送手段は、式１で表される化合物を含有する。in vivo腫瘍局在化およびＡＤＣを含有する治療手段において用いるためのキットを、作製することができる。キットの構成要素を、水性培地においてまたは凍結乾燥形態において、パッケージ化することができる。ＡＤＣ複合の構成要素を、完全に複合した形態で、中間体の形態で、またはキットの使用者により複合される分離した部分として、供給することができる。
【０１５１】
本明細書中で用いる、ポリペプチド、タンパク質またはその断片に関し、「単離される」は、その天然環境から分離され、十分量で存在し、その同定または使用が可能となることを意味する。単離されるは、タンパク質またはポリペプチドを指すとき、例えば以下のことを意味する：（ｉ）発現クローニングにより選択的に生産される、または（ｉｉ）クロマトグラフまたは電気泳動によるものとして精製される。単離されるタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋なものであってもよいが、そうである必要もない。「実質的に純粋である」という用語は、タンパク質またはポリペプチドが、その意図する使用に対して実践的および適切な範囲において、天然またはin vivoの系で見受けられるかもしれない他の物質が実質的にないということを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該技術分野で周知の技術により産生してもよい。単離されるタンパク質を、薬学的に許容し得るキャリアとともに薬学生成物中で混合してもよく、タンパク質はごく僅かな重量パーセントの生成物のみを含んでもよい。それにも関わらず、タンパク質は、生物系と関連するかもしれない物質から分離される、つまり他のタンパク質から単離されるという点において、単離される。
【０１５２】
本明細書中で提供される組成物は、凍結乾燥形態であることができ、または水性培地中に提供されることができる。
【０１５３】
本発明を以下の例でさらに説明するが、決して、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願の全体において引用される、全ての引用文献（印刷物の引用文献、公開特許、および同時継続中の特許出願）の全体の内容は、本明細書中参照により組み入れると明示する。
【０１５４】
例
例１：アウリスタチンが結合した、前立腺特異的膜抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体の強力な抗癌活性
材料および方法
細胞系および抗体
ＬＮＣａＰ(TM)（ＣＲＬ−１７４０）、ＰＣ−３(TM)（ＣＲＬ−１４３５）、および３Ｔ３(TM)（ＣＲＬ−２７５２）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville, MD)より得た。ＬＮＣａＰ(TM)からのサブ細胞系(sub-cell line)であるＣ４−２細胞系は、The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH)より得た。３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞系は、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (New York, NY)より得た。ＬＮＣａＰ(TM)、Ｃ４−２およびＰＣ−３(TM)はＲＰＭＩ１６４０(Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で培養し、３Ｔ３(TM)および３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡはＤＭＥＭ(Life Technologies)中で培養した。培養培地に、１０％ウシ胎仔血清(Hyclone, Logan, UT)、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン(Life Technologies)を添加した。
【０１５５】
公開されている方法(Ma D, et al., Leukemia 2002; 16:60-6.)に従い、Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ(TM)および３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡが、それぞれ約２×１０５、６×１０５および＞１×１０６コピー数／細胞のレベルのＰＳＭＡを発現していることを決定した。Ｃ４−２は、アンドロゲン依存性のＬＮＣａＰ(TM)細胞のアンドロゲン非依存性サブクローンである。ＰＣ−３(TM)は、ＰＳＭＡを発現しない、脱分化(de-differentiated)前立腺癌細胞系である。ＰＳＭＡ  ｍＡｂ(AB-PG1-XG1-006(PTA-4403およびPTA-4404)ならびにAbgenix 4.40.2(PTA-4360))は、米国特許出願第10/395,894号およびSchulke N et al., PNAS USA, 2003; 100:12590-5（そのそれぞれの全体を参照により本明細書中に組み入れる）に先に記載されたとおりに産生した。Abgenix 4.40.2を対照群として用いた。完全ヒトＰＳＭＡ  ｍＡｂ（ＩｇＧ１、κ）は、先に記載されたとおりに(Schulke N et al., PNAS USA, 2003; 100:12590-5)、組み換え可溶性ＰＳＭＡおよびＬＮＣａＰ細胞で免疫した後のヒト免疫グロブリン遺伝子座トランスジェニックマウス(XenoMice(TM), Abgenix, Inc., Fremont, CA)において産生した。
【０１５６】
ＰＳＭＡの内在化
ｍＡｂを、National Cancer Institute (Bethesda, MD)より得た二価のキレートであるペンタ酢酸シクロヘキシル−ジエチレントリアミ（ＣＨＸ−ＤＴＰＡ）で修飾し、先に記載されたとおりに(Ma D, et al., Leukemia 2002;16:60-6; Nikula TK, et al., JNucl.Med 1999;40: 166-76)、１１１Ｉｎ(PerkinElmer, Boston, MA)で標識した。放射性複合体を過剰の３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞とインキュベートし、公開されている方法(Ma D, et al., Leukemia 2002; 16:60-6; Nikula TK, et al., JNucl.Med 1999;40: 166-76)に従って結合分画を測定することにより、１１１Ｉｎ標識ｍＡｂが＞９０％免疫反応性であることを決定した。内在化解析のために、１１１Ｉｎ標識ｍＡｂを、２×１０５個のＣ４−２細胞とともに３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。連続する時点において（at sequential time points）、非結合ｍＡｂをＰＢＳ中で洗浄することにより除去し、細胞表面ｍＡｂを低ｐＨバッファ（ｐＨ２．４、グリシン／ＮａＣｌ）を用いて溶出した。低ｐＨ溶出液を細胞ペレットから分離して計数し、取り込み％を先に記載されたとおりに計算した(McDevitt MR, et al., Cancer Res 2000;60:6095-100)。
【０１５７】
抗体薬物複合体の製造
リンカーの合成および設計、ならびに細胞毒性剤とリンカーとの結合は、米国特許第6,884,889号および米国特許第6,214,345号（そのそれぞれの全体を本明細書中に参照により組み入れる）に記載されたとおりに実行した。ｍＡｂと、マレイミドカプロイル（ｍｃ）−バリン（Ｖａｌ）−シトルリン（Ｃｉｔ）−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）との結合は、記載されたとおりに実行した(Doronina SO, et al., Nat. Biotechnology. 2003 ;21 :778- 84)。５０ｍＭホウ酸塩を含有するｐＨ８．０のＰＢＳ中のＰＳＭＡ  ｍＡｂおよびアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１(Calbiochem, San Diego, CA)を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（最終１０ｍＭ）で３７℃にて３０分間処理した。最終反応濃度は、７．５ｍＬ〜８．０ｍｌ、１ｍＬの０．５Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ８および０．５Ｍ  ＮａＣＬ、１ｍＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、およびそれぞれ０．５ｍＬまたは０ｍＬのＰＢＳであった。溶液を４０℃で１時間インキュベートし、抗体をゲルろ過カラム上で精製した。カラムをＰＢＳ中の１０ｍＭ  ＤＴＰＡで平衡化し、１０ｍＬの抗体還元混合物を搭載し、そしてＰＢＳ／ＤＴＰＡバッファ中、８ｍＬ／分で溶出した。産生された抗体−システインチオールの濃度を、５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）での滴定により決定した(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)。同等の化学物質を、Sigma (St. Louis, MO)より得ることができる。
【０１５８】
完全に還元したmAb Abgenix 4.40.2 （２２．６ｍＬの７．８μＭ  ｍＡｂ、７５．６μＭシステインチオール）を、３５．４３μＬの１０ｍＭ  ＤＴＮＢで部分的に再酸化し、そして完全に還元したmAb AB-PG1 -XG1 -006（２５．１ｍＬの１１．２μＭ  ｍＡｂ、９５．８μＭシステインチオール）を５６．２７μＬの１０ｍＭ  ＤＴＮＢで部分的に再酸化した。溶液の色は、即座に黄色となった。
【０１５９】
次いで、薬剤ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−パラアミノベンジルカルバメート−ＭＭＡＥ（ｖｃＭＭＡＥ）を、部分的に再酸化したｍＡｂに以下のように結合した。最初にｍＡｂを０℃に冷却した。ｖｃＭＭＡＥ（抗体あたり５モル当量：ｖｃＭＭＡＥの１０ｍＭストック溶液、それぞれ８９．７および１４０．６μＬ）を５ｍＬのアセトニトリルに溶解し、その後慎重にボルテックスしながら抗体溶液に添加した。反応溶液を氷上でインキュベートした。さらなる色の変化は観察されなかった。反応混合物を２０モル当量のシステイン／薬剤とともに急冷した。複合体は、ゲルろ過カラムを用いて４℃で精製し、８．０ｍＬ／分のＰＢＳで溶出した。公開されている方法(Doronina SO, et al.、Nat Biotechnol. 2003;21:778-84)を用いて、ＡＤＣが、ｍＡｂあたり３．０〜３．５の薬剤を含有する≧９８％の単量体ｍＡｂを有することを決定した。
【０１６０】
代替的に、ｍＡｂと、マレイミドカプロイル（ｍｃ）−バリン（Ｖａｌ）−シトルリン（Ｃｉｔ）−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）との結合を記載されたとおりに(Doronina SO, et al., Nat. Biotechnology. 2003 ;21 :778-84)実施した。５０ｍＭホウ酸塩含有ＰＢＳ、ｐＨ８．０中のＰＳＭＡ  ｍＡｂおよびアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１(Calbiochem, San Diego, CA)を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１０ｍＭ最終）で、３７℃にて３０分間処理した。ｍＡｂを、Sephadex G-25カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)に通すことにより、１ｍＭ  ＤＴＰＡ(Aldrich, Milwaukee, WI)含有ＰＢＳ中へと交換した。ｍＡｂ溶液を４℃に冷却し、冷ＣＨ３ＣＮ中でマレイミド薬物誘導体と混合した。１時間後、反応物を過剰のシステインとともに急冷し、そして複合体を濃縮し、ＰＢＳバッファへと交換した。公開されている方法(Doronina SO, et al., Nat Biotechnol. 2003;21:778-84)を用いて、ＡＤＣが、ｍＡｂあたり３．０〜３．５の薬剤を含有する、≧９８％の単量体ｍＡｂを有することを決定した。
【０１６１】
ＡＤＣの細胞表面ＰＳＭＡとの反応性
３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡおよび親３Ｔ３(TM)細胞に対するＰＳＭＡ  ｍＡｂおよびＡＤＣの結合を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(BD Bioscience, San Diego, CA)を用いて解析した。簡潔に述べると、２×１０５の３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ（または３Ｔ３(TM)）細胞を、異なる濃度のｍＡｂまたはＡＤＣとともに、氷上で１時間インキュベートした。洗浄後、結合抗体の存在を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)を用いて検出した。アイソタイプ対照抗体およびＡＤＣを同時に調べた。
【０１６２】
in vitro細胞毒性アッセイ
ＰＳＭＡ陽性細胞（Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ(TM)または３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ）およびＰＳＭＡ陰性細胞（ＰＣ−３(TM)または３Ｔ３(TM)）を、９６穴マイクロプレート(Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)に２．５×１０３細胞／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。それから、細胞を連続希釈したＡＤＣとともに４日間培養した。細胞培養培地を、１０％のアラマーブルー(Biosource International, Camarillo, CA)を含有する新鮮培地と交換し、細胞を４時間培養した。次いで、プレートを５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を用いて、蛍光プレートリーダーで読み込んだ。細胞生存を処置および非処置培養物において比較し、そして５０％細胞殺傷のために必要なＡＤＣの濃度（ＩＣ５０値）を決定した。
【０１６３】
アンドロゲン非依存性前立腺癌の異種移植モデル
全ての動物研究は、動物管理使用委員会(Animal Care and Use Committee)ガイドラインにしたがって実行した。６〜８週齢の無胸腺雄ヌードマウス(National Cancer Institute, Frederick, MD)に、記載されたとおりに(McDevitt MR, et al. Cancer Res 2000;60:6095-100)、左後肢へ５０％Matrigel(Beckon Dickinson Labware, Bedford, MA)と混合した５×１０６個のＣ４−２細胞の筋肉内注射で移植した。処置開始の約１日前に、ＥＬＩＳＡ(Medicorp, Montreal, Quebec, Canada)で測定した前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の血清レベルに従って、動物をランダム化した。ＡＤＣ、ｍＡｂおよびビヒクル対照を尾静脈注射を介して投与した。実験の第１シリーズにおいて、マウスを６匹の群にて、２または１０ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＡＤＣまたはビヒクル対照で処置した。処置は移植後１７日目に開始し、これは４日間隔での３回の注射（ｑ４ｄ×３）からなるものであった。実験の第２シリーズにおいては、０、３または６ｍｇ／ｋｇの用量レベルで試験した。処置は移植後１４日目に開始し、これは４日間隔での６回の注射（ｑ４ｄ×６）からなるものであった。動物を、その外見、ＰＳＡレベルおよび腫瘍サイズについてモニターした。生存率を実験を通して記録した。
【０１６４】
研究解析
処置の効果を、両側で対応のある分析を用いたｔ−検定（ＰＳＡレベルについて）またはログランク検定（動物生存について）により、有意性に関して検討した。ｐ＜０．０５であるとき、データは有意性があると考えた。
【０１６５】
結果
ＰＳＭＡ  ｍＡｂのヒト前立腺癌細胞への内在化
内在化を１１１Ｉｎ−標識ＰＳＭＡ  ｍＡｂおよびＣ４−２細胞を用いて試験した。長時間にわたる総結合および取り込み％を図１に示す。半分より多い結合ｍＡｂは、２時間以内に内在化された（図１Ａ）。総結合は長時間にわたって増加しているが、これは恐らくＰＳＭＡリサイクリングによるものである（図１Ｂ）。したがって、ＰＳＭＡ  ｍＡｂは、容易にＰＳＭＡ発現細胞へと内在化される。
【０１６６】
ＰＳＭＡ  ＡＤＣのＰＳＭＡ発現細胞との反応性
フローサイトメトリーを用いて、ＰＳＭＡ  ｍＡｂおよびＡＤＣの結合を比較した。非修飾ｍＡｂおよびＡＤＣは、広範囲の希釈の範囲にわたって、同程度のレベルの３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡへの結合を示した（図２）。結合の最大量も、最大結合の半分に対して必要な濃度のいずれも、複合により明確には影響されなかった。３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞上のアイソタイプ対照ＡＤＣまたは抗体、または親３Ｔ３(TM)細胞上のＰＳＭＡ  ｍＡｂまたはＡＤＣに対して、有意な結合は観察されなかった。
【０１６７】
ＰＳＭＡ  ＡＤＣのin vitroでの有効性および選択性
ＰＳＭＡおよび対照ＡＤＣを、ヒト前立腺癌細胞系および３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞に対して、in vitroでの細胞毒性について試験をした。図３は、代表的実験における、ＰＳＭＡ陽性Ｃ４−２細胞およびＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３(TM)細胞に対する用量反応曲線を示し、そしてさまざまな細胞系に対するＩＣ５０値を表２に列挙する。ＰＳＭＡ  ＡＤＣは、６５〜２１０ｐＭのＩＣ５０で、観察した全てのＰＳＭＡ陽性細胞系を強く排除したところ、一方、これらの濃度はＰＳＭＡ陰性細胞に対しては影響をおよぼさなかった。対照的に、およそ１０００倍の高濃度が対照ＡＤＣに対しては必要とされ、その活性はＰＳＭＡの発現に非依存的であった（図３および表２）。
【０１６８】
【表３】
2015187117.tif 000016
【０１６９】
アンドロゲン非依存性前立腺癌の異種移植モデルにおけるＰＳＭＡ  ＡＤＣの効能
ＰＳＭＡ  ＡＤＣのin vivoでの効能は、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌のマウスモデルにおいて評価した。ヌードマウスの左後肢にＣ４−２細胞を移植した。約１４〜１７日後、血清ＰＳＡレベルを測定し、動物を無作為に処置群へと割り当てるために用いた。動物をＰＳＭＡ  ＡＤＣで経静脈的に処置し、腫瘍量、ＰＳＡレベルおよび他のパラメーターを、５００日の間にわたってモニターした。
【０１７０】
第１の実験において、動物をｑ４ｄ×３で、０、２または１０ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＡＤＣにて処置した。処置せずにおくと、腫瘍は急速に増殖し、動物の生存期間の中央値は３２日であった。対照的に、２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＡＤＣで処置した群の生存期間の中央値は、それぞれ、５８日（Ｐ＝０．００３５）および９４．５日（Ｐ＝０．０００６）であった（図３、表４Ａ）。ＰＳＭＡ  ＡＤＣ処置により、用量依存的な様式で、生存期間の中央値は４．５倍にまで、有意に改善した。治療関連毒性の徴候はなかった。
【０１７１】
血清ＰＳＡレベルを、長期にわたってＥＬＩＳＡで測定した。図４Ｂは、調査第１７、２３および３０日におけるそれぞれの群の平均ＰＳＡ濃度を描く。１０ｍｇ／ｋｇでの処置により、ＰＳＡレベルは第１７日で８．８±１１．７ｍｇ／ｍＬから第３０日で０．７±０．９ｎｇ／ｍＬへと、＞１０倍で低下したところ、一方、対照群のＰＳＡレベルは同じ期間においては＞６０倍増加した。中間の反応が２ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＡＤＣにおいて観察された。第３０日におけるＰＳＡレベルにおける違いは、２ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＝０．００４８）および１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＝０．００４８）投与群の両方に対して有意であった。１０ｍｇ／ｋｇ群における６匹のうちの３匹の動物は、調査第５２日において検出不可能なＰＳＡを有した。
【０１７２】
これらの所見から延長して、非修飾ｍＡｂおよびアイソタイプ対照ＡＤＣをまた含む、
第２のＰＳＭＡ  ＡＤＣ調査を実施した。第１４日において、それぞれの群（ｎ＝５）において、平均ＰＳＡレベル２．０±１．１ｎｇ／ｍｌランダム化し、動物をｑ４ｄ×６の投与計画で処置した。それぞれの群に対するカプラン・マイヤー生存曲線を、図５で描く。ビヒクル対照、６ｍｇ／ｋｇ非修飾ＰＳＭＡ  ｍＡｂおよび６ｍｇ／ｋｇ対照ＡＤＣで処置した動物は、それぞれ、２９日、３１日および３１日の、類似した生存期間の中央値を有した；そして差異は有意ではなかった。しかしながら、生存期間の中央値は、３ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＡＤＣで処置した動物に対しては、それぞれ、４９日および１４８日へと延長した（表３）。
【０１７３】
６ｍｇ／ｋｇでのＰＳＭＡ  ＡＤＣ処置群は、ランダム化後の生存を、対照ＡＤＣ群に対して７．９倍に改善した（Ｐ＝０．００１８）。第５００日において、５動物のうち２動物は腫瘍の徴候を示さず、測定不可能なＰＳＡであり、処置により治癒したと見なされた。第１の調査におけるように、処置により第２９日におけるＰＳＡレベルに対して有意な効果を有した（６ｍｇ／ｋｇ  ＰＳＭＡおよびビヒクル群に対してＰ＝０．００６８）。さらに、６ｍｇ／ｋｇ  ＰＳＭＡ  ＡＤＣ群において、血清ＰＳＡは処置後、検出不可能なレベルへと減少し、５動物のうち４動物において第６３日まで検出不可能であった。ＡＤＣ両方に関連する明白な毒性はなかった。外見および活動性は治療によって影響されず、処置動物およびビヒクル対照動物の体重は、いかなる時点においても、顕著に異なることはなかった。
【０１７４】
【表４】
2015187117.tif 000017
【０１７５】
例２：３つの異なる薬物リンカーへと複合したＰＳＭＡ  ｍＡｂの評価
ｖｃＭＭＡＥおよび２つの他の薬物リンカーへと複合するときのＰＳＭＡである、ｖｃＭＭＡＦおよびｍｃＭＭＡＦは、上昇した。３つの異なる薬物リンカーの完全な化学構造を、図６で描く。
【０１７６】
ＰＳＭＡ  ｍＡｂの３つの薬物リンカー複合体の生成物
３つの薬物リンカーを、チオエーテル結合を介してＰＭＳＡ  ｍＡｂへと直接複合し、抗体複合あたり約４つの薬物を作製した。ｍＡｂ鎖間ジスルフィドの部分的還元を、僅かに過剰なトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とともに、ｐＨ７．２および３７℃で進行させ、生じた薬物リンカーとの遊離チオールの複合体を定量化した。簡潔には、ＰＳＭＡ  ｍＡｂ（１０ｍｇ、ＰＢＳ中６７．５ｎｍｏｌ）を３７℃で１ｍＭのＤＴＰＡおよび１６９ｎｍｏｌのＴＴＣＥＰとともに９０分間培養した。培養中３時点（３０、６０および９０分）で、ｍＡｂの５０μｇのアリコートを除去し、過剰のｖｃＭＭＡＥとともに反応させた。得られたＡＤＣの疎水性相互作用クロマトグラフィーによる解析により還元の進行が分かった。結果は、ｍＡｂが急速に上の条件下で、還元され、必然的に１時間後に完了したことを示した。さらに、還元の範囲は、平均５薬物／ｍＡｂの薬物負荷となった。
【０１７７】
上の部分部分的に還元されたｍＡｂからの薬物リンカーで４負荷したＡＤＣを作製するために、０．５当量のＤＴＮＢを添加し、ｍＡｂ群を再酸化し、所望のレベルへと戻した。次いで、３ｍｇのこの物質（２０．３ｎｍｏｌ）を、１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）反応溶液中のｖｃＭＭＡＥ、ｖｃＭＭＡＦまたはｍｃＭＭＡＦとともに反応させた。反応を１時間０℃で進行させ、次いで２０％の過剰Ｎ−アセチルシステインで急冷した。ＡＤＣを未反応薬物および他の小分子不純物からPD-10カラム(Amersham Biosciences/GE Healthcare, Piscataway, NJ)上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分離し、遠心分離機濃縮機器(30kD MWCO)(Amicon Bioseparations, Millipore Corporation, Bedford, MA)で濃縮した。
【０１７８】
３つの薬物リンカー複合の特徴づけの概要を、表４〜６において、vcMMAE、vcMMAFおよびmcMMAFに対して各々提供する。３つの薬物リンカーのそれぞれに対し、Ｈ／Ｌ鎖負荷分布および種類の分布で決定されるように、ＡＤＣはｍＡｂあたり約４つの薬物、および逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを用いて決定されるように＜２％の遊離薬物を含有する。全ての複合に対し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより凝集は検出されなかった。さらに、総体的なｍＡｂの収率は７０〜８０％であった。
【０１７９】
【表５】
2015187117.tif 000018
【０１８０】
【表６】
2015187117.tif 000019
【０１８１】
【表７】
2015187117.tif 000020
【０１８２】
ヒト前立腺癌細胞におけるＰＳＭＡ  ｍＡｂ複合体の有効性および選択性
in vitro細胞毒性研究を、ＰＳＭＡ陽性細胞系およびＰＳＭＡ陰性細胞系で実施した。簡潔には、ＰＳＭＡ陽性細胞（Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ(TM)または３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ）およびＰＳＭＡ陰性細胞（ＰＣ−３(TM)または３Ｔ３(TM)）を９６ウェルマイクロプレートへと２．５×１０３細胞数／ウェルで添加し、一晩３７℃および５％ＣＯ２で培養した。次いで細胞を段階希釈したＡＤＣで４日間培養し、１０％Alamar Blueを用いた非処置対照群に対して比較したパーセント細胞殺傷をアッセイした。５０％細胞殺傷に必要なＡＤＣの濃度（ＩＣ５０値）を決定した。
【０１８３】
図５は、代表的実験における、ｖｃＭＭＡＥ（図７Ａ）、ｖｃＭＭＡＦ（図７Ｂ）およびｍｃＭＭＡＦ（図７Ｃ）複合体の、ＰＳＭＡ陽性Ｃ４−２細胞およびＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３(TM)細胞に対する用量反応曲線を描く。Ｃ４−２およびＰＣ−３(TM)細胞系における有効性（ＩＣ５０）および選択性の概要を表７でリスト化する。ＰＳＭＡ発現Ｃ４−２細胞におけるＩＣ５０は、ｖｃＭＭＡＦ、ｍｃＭＭＡＦおよびｖｃＭＭＡＥ複合体それぞれに対して、１１、４２、および６０のピコモル濃度であった。対照的に、ＰＣ−３(TM)ＰＳＭＡ陰性細胞におけるＩＣ５０は、９０ｎＭより大きく、９４から２６４ｎＭの範囲にわたった。ＰＣ−３(TM)およびＣ４−２におけるそれぞれの複合体の有効性に基づき、選択性は、ｖｃＭＭＡＦ、ｍｃＭＭＡＦおよびｖｃＭＭＡＥ複合体それぞれに対して、１３，６３６；６，２８６および１，５６７であると計算された。ｖｃＭＭＡＦ複合体は、Ｃ４−２  ＰＳＭＡ陽性細胞系に対して最も有効的であり、ｍｃＭＭＡＦはＰＣ−３(TM)対照細胞系に対して最も非毒性的であった。ｖｃＭＭＡＥ複合体を比較し、ｍｃＭＭＡＦおよびｖｃＭＭＡＦ複合体、それぞれに対しての選択性において、４倍および９倍の改善があった。
【０１８４】
【表８】
2015187117.tif 000021
【０１８５】
ＰＳＭＡ  ｍＡｂ薬物複合体による細胞殺滅の機構
細胞周期解析を実施し、ＭＭＡＥ複合ｍＡｂにより媒介される細胞毒性のメカニズムを決定した。３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡまたはＣ４−２細胞を、０．２ｎＭ  ＰＳＭＡ  ＡＤＣまたは２０ｎＭ非修飾ＰＳＭＡ  ｍＡｂの存在下で培養した。非処置細胞は対照培養の役割を果たした。１２時間、２４時間および４８時間において、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、総ＤＮＡを検出し、フローサイトメトリーで解析した。図８で示すように、ＰＳＭＡ  ＡＤＣで処置した細胞をＧ２期で停止させた。処置後４８時間までに、染色体で複製したセットの細胞の百分率は、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ培養に対しては＞５０％、および非処置培養に対しては２％となった。非修飾ｍＡｂで処置された細胞の３％のみが４８時間においてＧ２／Ｍ期であったため、細胞周期停止には毒性、この場合はＭＭＡＥの存在が必要であった。データにより、ＭＭＡＥ  ＡＤＤＣでの前立腺癌細胞の処置によりＧ２／Ｍ停止、次いで標的細胞のアポトーシスを誘導することが示された。
【０１８６】
本出願に引用される、前述の特許、特許出願および引用文献のそれぞれを、本明細書中にその全体を参照により組み入れる。引用文献の列挙は、引用文献のいかなるものも先行技術の引用文献であることを承認することを意図するものではない。今、好ましい態様に記載したように、本明細書中で規定される教示の視点において当業者に提唱するであろう。それゆえ、すべての変形、修飾および変化は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範疇内にあると考えられると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】Ｃ４−２細胞における１１１Ｉｎ−標識化ＰＳＭＡの取り込みパーセントを示すグラフである。
【図１Ｂ】Ｃ４−２細胞における１１１Ｉｎ−標識化ＰＳＭＡの総結合を示すグラフである。
【図２】３Ｔ３(TM)−ＰＳＭＡ細胞に対するＰＳＭＡ  ｍＡＢおよびＡＤＣの結合を示すグラフである。
【図３Ａ】ＰＳＭＡ陽性前立腺癌細胞系における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣおよび対照ＡＤＣのin vitroでの細胞毒性を示すグラフである。
【図３Ｂ】ＰＳＭＡ陰性前立腺癌細胞系における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣおよび対照ＡＤＣのin vitroでの細胞毒性を示すグラフである。
【０１８８】
【図４Ａ】異種移植研究でのカプランマイヤー生存を示すグラフである。
【図４Ｂ】異種移植研究での血清ＰＳＡレベルを示すグラフである。
【図５】別の異種移植研究において処置した動物のカプランマイヤー生存曲線である。
【図６Ａ】ｖｃＭＭＡＥ（マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＥ）の化学構造である。
【図６Ｂ】ｖｃＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＦ）の化学構造である。
【図６Ｃ】ｍｃＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦ）の化学構造である。
【０１８９】
【図７Ａ】ＰＳＭＡ陽性（Ｃ４−２）およびＰＳＭＡ陰性（ＰＣ−３(TM)）前立腺癌細胞系における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（ｖｃＭＭＡＥ）のin vitro細胞毒性を示すグラフである。
【図７Ｂ】ＰＳＭＡ陽性（Ｃ４−２）およびＰＳＭＡ陰性（ＰＣ−３(TM)）前立腺癌細胞系における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（ｖｃＭＭＡＦ）のin vitro細胞毒性を示すグラフである。
【図７Ｃ】ＰＳＭＡ陽性（Ｃ４−２）およびＰＳＭＡ陰性（ＰＣ−３(TM)）前立腺癌細胞系における、ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（ｍｃＭＭＡＦ）のin vitro細胞毒性を示すグラフである。
【図８】ＰＳＭＡ  ＡＤＣの細胞周期に対する影響を示すグラフである。
【図９】ｖｃＭＭＡＥおよびｖｃＭＭＡＦの細胞生存への影響を比較した図である。
【図１Ａ】
2015187117.tif 000026
【図１Ｂ】
2015187117.tif 000027
【図２】
2015187117.tif 000028
【図３Ａ】
2015187117.tif 000029
【図３Ｂ】
2015187117.tif 000030
【図４Ａ】
2015187117.tif 000031
【図４Ｂ】
2015187117.tif 000032
【図５】
2015187117.tif 000033
【図６Ａ】
2015187117.tif 000034
【図６Ｂ】
2015187117.tif 000035
【図６Ｃ】
2015187117.tif 000036
【図７Ａ】
2015187117.tif 000037
【図７Ｂ】
2015187117.tif 000038
【図７Ｃ】
2015187117.tif 000039
【図８】
2015187117.tif 000040
【図９】
2015187117.tif 000041
【配列表】
2015187117000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月8日(2015.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノメチルアウリスタチンノルエフェドリンまたはモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンに複合した、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗体または抗原結合断片を含む抗体薬物複合体であって、ＰＣ−３(TM)細胞とＣ４−２またはＬＮＣａＰ(TM)細胞との間の細胞選択性が少なくとも２５０である前記抗体薬物複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
１つの態様において、カルボン酸アシル単位"Ａｎ"は、抗体またはその抗原結合断片に、抗体またはその抗原結合断片由来の硫黄原子を介して連結している：
【化１】
2015187117.tif 000042
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本明細書中で用いる、寄託されたハイブリドーマまたはプラスミドの名称は、抗体の名称と相互的に用いてもよい。名称が抗体を称することを意図するか、または抗体をコードするまたは産生するプラスミドまたはハイブリドーマを称するかは、それぞれ、当業者には明らかである。さらに、抗体の名称は、表１で示す名称の短縮形であってもよい。例えば、抗体AB-PG1-XG1-006は、AB-PG1-XG1-006、PG1-XG1-006、XG1-006、006、などと称してもよい。もう１つの例として、抗体の名称Abgenix 4.232.3は、Abgenix 4.232.3、4.232.3、4.232.1、4.232、などと称してもよい。抗体の名称における変化形の全ては、同じ抗体を称するものであり、異なるものを称するものではないことを意図する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、そしてより特別には重鎖ＣＤＲ３は、抗体の特異性に寄与する。これらのＣＤＲ領域、特にＣＤＲ３領域は、抗体に抗原特異性を賦与するため、これらの領域を、他の抗体または抗原結合断片に組み込み、抗体またはペプチドに同一の抗原特異性を賦与することができる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨ、は、別々の遺伝子によりコードされるが、それらを、組換え手法を用い、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）として作製することを可能とする合成リンカーにより結合することができる。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」の用語の範疇に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、従来の手順、例えば本明細書中に引用文献として組み入れる、J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N. Y. Academic Press 1983)において記載されるタンパク質分解断片化手順などの従来の手順を用いて、ならびに当業者に公知の他の技術により得られる。断片は、インタクト抗体と同様の方法で、有用性についてスクリーニングする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
抗体は、いくつかの態様において、ＰＳＭＡ発現細胞の細胞溶解を推進する。細胞溶解は補体媒介性であってもよく、またはエフェクター細胞により媒介されてもよい。１つの態様において、細胞溶解を、生体、例えば哺乳類において実行することができ、そして、生細胞は腫瘍細胞である。抗体またはその抗原結合断片で標的化できる腫瘍の例は、前立腺、膀胱、膵臓、肺、大腸および腎臓癌、黒色腫および肉腫などの、ＰＳＭＡを発現する任意の腫瘍を含む（これはＰＳＭＡを発現する新生脈管系を有する腫瘍を含む）。１つの態様において、腫瘍細胞は前立腺癌細胞である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
本発明のＡＤＣは、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに複合した抗体またはその抗原結合断片を含む。抗体またはその抗原結合断片は、いくつかの態様において、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに、以下の式（式１）で表される化合物と共に複合することができる。（式１）：−Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−、式中、Ａはカルボン酸アシル単位であり；Ｙはアミノ酸であり；Ｚはアミノ酸であり；ＸおよびＷはそれぞれ自壊的スペーサーであり；ｎは０または１の整数であり；およびｍは０あるいは１、２、３、４、５または６の整数である。本発明の複合体は、いくつかの態様において、式（式２）で表される。（式２）：Ｌ−｛Ａｎ−Ｙｍ−Ｚｍ−Ｘｎ−Ｗｎ−Ｄ｝ｐ、式中ＬはＰＳＭＡに結合する抗体またはその抗原結合断片であり、ＤはＭＭＡＥまたはＭＭＡＦであり、およびｐは１、２、３、４、５、６、７または８の整数である。他の構成要素は上記のとおりである。１つの態様において、カルボン酸アシル単位「Ａｎ」は、抗体または抗原結合断片に由来する硫黄原子を介して抗体または抗原結合断片に結合する：
【化７】
2015187117.tif 000043
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
塩は親化合物の所望の生物学的活性を保ち、いかなる好ましくない毒物学的効果も示さない（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J Pharm. Sci. 66: 1-19を参照のこと）。かかる塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪酸、モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに、非毒性有機アミン類、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、チオロプロカイン(chioroprocaine)、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｂ】
2015187117.tif 000044
【外国語明細書】
2015187117000001.pdf