(57)【要約】【課題】モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株を提供する。【解決手段】ホスホトランスアセチラーゼを欠損し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼを高発現する、乳酸生産性モーレラ属細菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼを欠損し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼを高発現する乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項２】
前記ホスホトランスアセチラーゼを完全欠損する、請求項１に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項３】
前記乳酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤＨ依存性である、請求項１または２に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項４】
前記乳酸デヒドロゲナーゼが乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項５】
前記乳酸デヒドロゲナーゼがサーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属細菌に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項６】
前記乳酸デヒドロゲナーゼがサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項７】
前記乳酸デヒドロゲナーゼがサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）39E株に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項８】
前記ホスホトランスアセチラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項９】
前記モーレラ属細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項１０】
ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号NITE AP-01657で寄託されている、乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項１１】
ゲノムＤＮＡの塩基配列中に、配列番号５の塩基配列と、配列番号７の塩基配列と、配列番号９の塩基配列とを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項１２】
ゲノムＤＮＡの塩基配列中に、配列番号１の塩基配列および配列番号３の塩基配列がない、請求項１１に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
【請求項１３】
オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼを欠損し、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第一のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-1）およびアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第二のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-2）をゲノムに有するモーレラ属細菌株（dpyrF株）を準備する工程と、
前記dpyrF株の第一の前記pta-1を標的遺伝子とする相同組換えにより、前記pta-1を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）およびオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyrF）を導入する工程と、
前記dpyrF株の前記pta-2を標的とする相同組換えにより、前記pta-2を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）および外来性の抗生物質耐性遺伝子を導入する工程と
を備える、乳酸生産性モーレラ属細菌株の作製方法。
【請求項１４】
オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼを欠損し、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第一のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-1）およびアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第二のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-2）をゲノムに有するモーレラ属細菌株（dpyrF株）を準備する工程と、
前記dpyrF株の前記pta-2を標的とする相同組換えにより、前記pta-2を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）および外来性の抗生物質耐性遺伝子を導入する工程と、
前記dpyrF株の第一の前記pta-1を標的遺伝子とする相同組換えにより、前記pta-1を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）およびオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（pyrF）を導入する工程と
を備える、乳酸生産性モーレラ属細菌株の作製方法。
【請求項１５】
前記pta-1がコードするタンパク質および前記pta-2がコードするタンパク質が、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から重複しないように選択される、請求項１３または１４に記載の作製方法。
【請求項１６】
前記pta-1の塩基配列および前記pta-2の塩基配列が、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列からなる群から重複しないように選択される、請求項１３または１４に記載の作製方法。
【請求項１７】
前記pyrFが配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１８】
前記pyrFが配列番号７の塩基配列からなる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１９】
前記モーレラ属細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２０】
前記dpyrF株がＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号NITE P-1057で寄託されている、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２１】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がＮＡＤＨ依存性の乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２２】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がサーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属細菌に由来する、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２３】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）に由来する、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２４】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）39E株に由来する、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２５】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２６】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号５の塩基酸配列からなる、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２７】
前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２８】
前記抗生物質耐性遺伝子が配列番号１０のタンパク質をコードする、請求項１３〜２７のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項２９】
前記抗生物質耐性遺伝子が配列番号９の塩基配列からなる、請求項１３〜２８のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項３０】
前記G3PDプロモーターの塩基配列が配列番号１３の塩基配列に含まれる、請求項１３〜２９のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項３１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株、または請求項１３〜３０のいずれか１項に記載の作製方法によって作製された乳酸生産性モーレラ属細菌株を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株に関する。
【背景技術】
【０００２】
モーレラ（Mooorella）属細菌は高熱性酢酸生産菌であり、有機炭素源および合成ガス（Ｈ２＋ＣＯ＋ＣＯ２）のいずれを基質としても生育が可能であるという特徴を有する。また、モーレラ属細菌は、ほぼ唯一の代謝産物として酢酸を生産するが、比酢酸生産速度が非常に高く、例えば、中温性酢酸生産菌A. woodii の比酢酸生産速度が約０．２９  ｇ／ｇ−乾菌体／ｈであるのに対して、M. thermoaceticaの比酢酸生産速度は約１ｇ／ｇ−乾菌体／ｈであることなどが報告されている。そのため、モーレラ属細菌を有用物質生産に利用することができれば、より効率的な生産が期待される。
【０００３】
そのため、モーレラ属細菌の代謝経路を改変し、乳酸等の有用物質を生産しようとする試みが行われてきた。例えば、特許文献１には、モーレラ属細菌に、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼを導入することにより、高い乳酸生産能力を付与したことが記載されている。なお、野生型のモーレラ属細菌も乳酸デヒドロゲナーゼを持つが、その活性が低いため、乳酸はほとんど生産されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−９０６００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特開２０１３−９０６００号公報（特許文献１）に記載の方法により作製した乳酸生産性モーレラ属細菌では、代謝産物として乳酸および酢酸を生産するため、乳酸生産効率をさらに向上させられる余地があると考えられた。
【０００６】
そこで、本発明は、モーレラ属細菌の代謝経路を改変し、酢酸の生産を抑制し、乳酸の生産を増大させた菌株を提供すること、すなわち、モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、オロチジン５’リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyrF）および抗生物質耐性遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いることにより２回の遺伝子組換えを行うことが可能となり、モーレラ属細菌のpyrF破壊株において、ゲノム上に存在する２個のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を破壊するとともに、pyrF、抗生物質耐性遺伝子および乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することで、モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株を作製することができることを知得し、本発明を完成させた。
【０００８】
より詳細には、本発明は以下のものである。
（１）アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼを欠損し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼを高発現する、乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（２）前記ホスホトランスアセチラーゼを完全欠損する、（１）に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（３）前記乳酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤＨ依存性である、（１）または（２）に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（４）前記乳酸デヒドロゲナーゼが乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（５）前記乳酸デヒドロゲナーゼがサーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属細菌に由来する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（６）前記乳酸デヒドロゲナーゼがサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）に由来する、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（７）前記乳酸デヒドロゲナーゼがサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）39E株に由来する、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（８）前記ホスホトランスアセチラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（９）前記モーレラ属細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（１０）ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号NITE AP-01657で寄託されている、乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（１１）ゲノムＤＮＡの塩基配列中に、配列番号５の塩基配列と、配列番号７の塩基配列と、配列番号９の塩基配列とを有する、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（１２）ゲノムＤＮＡの塩基配列中に、配列番号１の塩基配列および配列番号３の塩基配列がない、（１１）に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株。
（１３）オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼを欠損し、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第一のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-1）およびアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第二のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-2）をゲノムに有するモーレラ属細菌株（dpyrF株）を準備する工程と、前記dpyrF株の第一の前記pta-1を標的遺伝子とする相同組換えにより、前記pta-1を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）およびオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyrF）を導入する工程と、前記dpyrF株の前記pta-2を標的とする相同組換えにより、前記pta-2を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）および外来性の抗生物質耐性遺伝子を導入する工程とを備える、乳酸生産性モーレラ属細菌株の作製方法。
（１４）オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼを欠損し、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第一のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-1）およびアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第二のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-2）をゲノムに有するモーレラ属細菌株（dpyrF株）を準備する工程と、前記dpyrF株の前記pta-2を標的とする相同組換えにより、前記pta-2を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）および外来性の抗生物質耐性遺伝子を導入する工程と、前記dpyrF株の第一の前記pta-1を標的遺伝子とする相同組換えにより、前記pta-1を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）およびオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（pyrF）を導入する工程とを備える、乳酸生産性モーレラ属細菌株の作製方法。
（１５）前記pta-1がコードするタンパク質および前記pta-2がコードするタンパク質が、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から重複しないように選択される、（１３）または（１４）に記載の作製方法。
（１６）前記pta-1の塩基配列および前記pta-2の塩基配列が、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列からなる群から重複しないように選択される、（１３）または（１４）に記載の作製方法。
（１７）前記pyrFが配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１３）〜（１６）のいずれか１項に記載の作製方法。
（１８）前記pyrFが配列番号７の塩基配列からなる、（１３）〜（１７）のいずれか１項に記載の作製方法。
（１９）前記モーレラ属細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である、（１３）〜（１８）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２０）前記dpyrF株がＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号NITE P-1057で寄託されている、（１３）〜（１９）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２１）前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がＮＡＤＨ依存性の乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、（１３）〜（２０）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２２）前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がサーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属細菌に由来する、（１３）〜（２１）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２３）前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）に由来する、（１３）〜（２２）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２４）前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）39E株に由来する、（１３）〜（２３）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２５）前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１３）〜（２４）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２６）前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号５の塩基酸配列からなる、（１３）〜（２５）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２７）前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つである、（１３）〜（２６）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２８）前記抗生物質耐性遺伝子が配列番号１０のタンパク質をコードする、（１３）〜（２７）のいずれか１項に記載の作製方法。
（２９）前記抗生物質耐性遺伝子が配列番号９の塩基配列からなる、（１３）〜（２８）のいずれか１項に記載の作製方法。
（３０）前記G3PDプロモーターの塩基配列が配列番号１３の塩基配列に含まれる、（１３）〜（２９）のいずれか１項に記載の作製方法。
（３１）（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の乳酸生産性モーレラ属細菌株、または（１３）〜（３０）のいずれか１項に記載の作製方法によって作製された乳酸生産性モーレラ属細菌株を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株およびその作製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ウッド・リングダール経路（アセチルＣｏＡ経路）を説明する模式図である。
【図２】図２は、酢酸生産経路を表す模式図である。
【図３】図３は、吸光度と乾燥菌体質量との関係を表すグラフである。
【図４】図４は、pK18-ldhを説明する模式図である。
【図５】図５は、pK18-PG3D-kanを説明する模式図である。
【図６】図６は、（ａ，ｂ）相同組換えによるMoth_0864の破壊を表す模式図および（ｃ）ＰＣＲ産物の電気泳動結果を表す写真である。
【図７】図７は、（ａ）相同組換えによるMoth_1181の破壊を表す模式図および（ｂ）ＰＣＲ産物の電気泳動結果を表す写真である。
【図８】図８は、（ａ）相同組換えによるMoth_0940の破壊を表す模式図および（ｂ）ＰＣＲ産物の電気泳動結果を表す写真である。
【図９】図９は、各破壊遺伝子の転写レベルを表すグラフである。
【図１０】図１０は、Moth_0864由来タンパク質およびMoth_1184由来タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を表す写真である。
【図１１】図１１は、アセチルＣｏＡ経路関連遺伝子のゲノム上における位置を表す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明の一つの特徴は、酢酸非生産・乳酸生産株の作製方法にある。すなわち、モーレラ属細菌のオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyrF）欠損株において、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒するホスホトランスアセチラーゼをコードする２遺伝子を破壊するとともに、pyrF、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）および抗生物質耐性遺伝子を導入することにより、モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株を作製した点が本発明の一つの特徴である。
【００１２】
モーレラ属細菌において、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸を経由して酢酸を生産する経路に関与する酵素をコードする遺伝子は不明であった。モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）ATCC 39073株に関して、Pierce et al., 2008, Environ. Microbiol.; 10 (10):2550-73.は、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）の１，２−プロパンジオール分解に関わる酵素として同定されたPduLをコードする遺伝子（pduL）とのホモロジーから、Moth_0864（配列番号１）およびMoth_1181（配列番号３）もPduLであると推定している。PduLはプロピオニルＣｏＡからプロピオニルリン酸への反応を触媒するホスホトランスアセチラーゼであるため（Liu et al., 2007, J. Bacteriol. 189: 1589-1596.）、M. thermoacetica ATCC 39073株において、Moth_0864およびMoth_1181がコードするタンパク質はアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素ではなく、いずれも酢酸生産に関与していないものと考えられていた。
【００１３】
しかしながら、本発明者らは、実験（実施例を参照）により、M. thermoaceticaのMoth_0864およびMoth_1181を破壊すると酢酸を実質的に生産しない遺伝子組換え株が得られること、さらには、Moth_0864およびMoth_1181をコードするタンパク質を精製したものがともにアセチルＣｏＡとアセチルリン酸との相互変換を触媒することを確認し、Moth_0864およびMoth_1181がアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒するホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子であるとの確証を得た。なお、「酢酸を実質的に生産しない」とは、同一培養条件で基質（フルクトース）１モルあたりの酢酸生産量が、野生株に比べて１／３０未満、好ましくは１／５０以下であることをいうものとする。例えば（実施例を参照）、M. thermoaceticaの野生株であるATCC 39073株のYP/S-酢酸(mol/mol)が2.13±0.11であるのに対して、Moth_0864およびMoth_1181の両方を破壊したｄｐＬ１−２株では0.023±0.003となっており、約１／８０〜１／１１０である。一方、Moth_0864およびMoth_1181のいずれか一方を破壊したdpL1株およびdpL2株では、それぞれ、ほとんど変わらないか、約１／３に低下するだけであり、Moth_1181およびMoth_0940を破壊したdpL2-ak株では約１／２３〜１／３０に低下するに過ぎなかった。
【００１４】
また、pduLおよびPduLについて、プロテオバクテリア門に帰属するグラム陰性細菌であるSalmonella entericaとフィルミクテス門に帰属するグラム陽性細菌であるMoorella thermoaceticaとの間で相同性が高かったことに基づけば、同属であるモーレラ属細菌相互間でのアセチルＣｏＡとアセチルリン酸との相互変換を触媒する酵素およびそれをコードする遺伝子の相同性は相当に高いことが予想される。したがって、M. thermoacetica ATCC 39073株（ATCC 39073株に由来する菌株を含む）とその他のモーレラ属細菌株との間でも、Moorella属細菌の酢酸生産に関与するホスホトランスアセチラーゼおよびそれをコードする遺伝子の相同性は高く、ATCC 39073株およびそれに由来する菌株以外のモーレラ属細菌株について、Moth_0864およびMoth_1181に相当する遺伝子を特定し、その遺伝子および周辺のＤＮＡ塩基配列を解読すること、その遺伝子がコードするタンパク質がアセチルＣｏＡとアセチルリン酸との相互変換を触媒する酵素であることを確認することは困難ではないと考えられる。
【００１５】
［乳酸生産性モーレラ属細菌株の作製方法］
本発明の乳酸生産性モーレラ属細菌の作製方法は、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼを欠損し、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第一のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-1）およびアセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする第二のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-2）をゲノムに有するモーレラ属細菌株（dpyrF株）を準備する工程（準備工程）と、前記dpyrF株の第一の前記pta-1を標的遺伝子とする相同組換えにより、前記pta-1を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）およびオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyrF）を導入する工程（遺伝子組換工程１）と、前記dpyrF株の前記pta-2を標的とする相同組換えにより、前記pta-2を破壊するとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（G3PDプロモーター）および外来性の抗生物質耐性遺伝子を導入する工程（遺伝子組換工程２）とを備える。前記遺伝子組換工程１および前記遺伝子組換工程２は、互いの順序を入れ替えてもよい。
【００１６】
（dpyrF株）
dpyrF株の作製方法は、特開２０１２−２４９５７２号公報または特開２０１２−２４９５７３号公報の開示をもとに作製することができる。
オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pyrF）がコードするオロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼは、ウラシルの生合成に必要なピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）の生合成に関与する酵素の一つである。したがって、pyrF欠損株（dpyrF株）は、ＵＭＰを生合成できなくなるため、ウラシル要求性を発現する。dpyrF株にpyrFを導入するとウラシル要求性は消失するので、pyrFを選択マーカー遺伝子として利用することができる。また、dpyrF株は５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）に非感受性であるが、野生株は感受性であるので、５−ＦＯＡを選択物質として用いることで、dpyrF株を選別することができる。
本発明では、pyrFを破壊してdpyrF株を作製して用いてもよいし、既に作製されたdpyrF株を用いてもよい。
dpyrF株としては、特に限定されるものではないが、M. thermoacetica のpyrFを破壊して作製した株が好ましく、M. thermoacetica ATCC 39073株のpyrFを破壊して作製した株がより好ましく、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託番号NITE P-1057で寄託されている菌株がさらに好ましい。
【００１７】
（pta-1、pta-2）
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）ATCC 39073株では、前述のとおり、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素として、Moth_0864がコードするタンパク質およびMoth_1181がコードするタンパク質が同定された。前述のとおり、モーレラ属細菌は、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素として、アミノ酸配列およびコードする遺伝子が相違する２種類のホスホトランスアセチラーゼを有するものと推定される。すなわち、ゲノムに、第一のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-1）および第二のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（pta-2）を有すると思われる。
本発明では、この２つの遺伝子を破壊することにより、ホスホトランスアセチラーゼを欠損、好ましくは完全に欠損させる。
【００１８】
〈遺伝子組換工程１および遺伝子組換え工程２〉
遺伝子組換工程１では、骨格となる相同組換え用プラスミドに、pta-1の上流領域と、pyrFと、G3PDプロモーターと、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）と、pta-1の下流領域とをこの順に含み、かつ前記pyrFが本来のプロモーターにより発現され、前記ldhが前記G3PDプロモーターにより発現されるように組み込んで構築した遺伝子破壊用プラスミドを用いて相同組換えを行って、pta-1を破壊するとともに、pyrFおよびldhを導入する。
【００１９】
遺伝子組換え工程２では、骨格となる相同組換え用プラスミドに、pta-2の上流領域と、G3PDプロモーターと、抗生物質耐性遺伝子と、pta-2の下流領域とをこの順に含み、かつ前記抗生物質耐性遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現されるように組み込んで構築した遺伝子破壊用プラスミドを用いて相同組換えを行って、pta-2を破壊するとともに、抗生物質耐性遺伝子を導入する。
【００２０】
前記骨格となる相同組換え用プラスミドは、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ｐＫ１８、ｐＫ１９、ｐＫ１８ｍｏｂ、ｐＫ１９ｍｏｂ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ系プラスミド等が挙げられる。なお、遺伝子組換工程１で使用する遺伝子破壊用プラスミドと遺伝子組換工程２で使用する遺伝子破壊用プラスミドとは、骨格となる相同組換え用プラスミドは同じ種類のものであってもよいし、異なる種類のものであってもよい。
【００２１】
pta-1は、M. thermoacetica ATCC 39073株のMoth_0864（配列番号１）に相当する遺伝子であってもよいし、Moth_1181（配列番号３）に相当する遺伝子であってもよいが、pta-2とは相違する。
【００２２】
pta-2は、M. thermoacetica ATCC 39073株のMoth_0864（配列番号１）に相当する遺伝子であってもよいし、Moth_1181（配列番号３）に相当する遺伝子であってもよいが、pta-1とは相違する。
【００２３】
pta-1の塩基配列は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列からなる群から選択されることが好ましく、配列番号１の塩基配列および配列番号３の塩基配列からなる群から選択されることがより好ましい。ただし、pta-2の塩基配列とは相違する。
【００２４】
pta-2の塩基配列は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列からなる群から選択されることが好ましく、配列番号１の塩基配列および配列番号３の塩基配列からなる群から選択されることがより好ましい。ただし、pta-1の塩基配列とは相違する。
【００２５】
pta-1がコードするタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質が好ましく、さらにpta-2がコードするタンパク質とは相違することがより好ましい。
【００２６】
pta-2がコードするタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質が好ましく、さらにpta-1がコードするタンパク質とは相違することがより好ましい。
【００２７】
前記pyrFは、特に限定されず、同種モーレラ属細菌に由来するものが好ましく、配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることがより好ましく、配列番号７の塩基配列からなる遺伝子であることがさらに好ましい。
pyrFは選択マーカー遺伝子の一つであり、pyrF破壊株（dpyrF株）にpyrFを導入することにより、ウラシル要求性が消失するため、ウラシルを含有しない培地を用いて、pyrF導入株を選択することができる。
【００２８】
本発明において、遺伝子組換えの前後で菌種に変化はなく、例えば、Moorella thermoaceticaのある株を遺伝子組み換えして作製した乳酸生産性のモーレラ属細菌株は、菌種としては、M. thermoaceticaのままである。
【００２９】
（乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh））
上記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldh）は、乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来するものであれば特に限定されないが、ＮＡＤＨ依存性の乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものが好ましく、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属細菌に由来するものがより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）に由来するものがさらに好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）39E株に由来するものがいっそう好ましい。
このような乳酸デヒドロゲナーゼは耐熱性を有することから、モーレラ属細菌の培養温度でも高い乳酸生産性を有する。
また、上記ldhは、その上流に連結されたG3PDプロモーターにより発現される。
なお、M. thermoaceticaが有している本来の乳酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＰＨ依存性であると考えられる。
【００３０】
前記ldhは、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものが好ましく、配列番号５の塩基酸配列からなるものがより好ましい。
【００３１】
（抗生物質耐性遺伝子）
前記抗生物質耐性遺伝子は、特に限定されるものではないが、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つが好ましく、カナマイシン耐性遺伝子がより好ましい。
抗生物質耐性遺伝子は選択マーカー遺伝子の一つであり、抗生物質耐性遺伝子を導入することにより構成物質に対する耐性が付与されるため、抗生物質を含有する培地で培養することにより、抗生物質耐性遺伝子が導入された株を選択することができる。
上記抗生物質耐性遺伝子は、その上流に連結されたG3PDプロモーターによって発現される。
【００３２】
前記カナマイシン耐性遺伝子は、特に限定されないが、配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものが好ましく、配列番号９の塩基配列からなるものがより好ましい。
【００３３】
（G3PDプロモーター）
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（リン酸化）（ＧＡＰＤＨ）は、解糖系／糖新生に関与する酵素であり、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸と１，３−ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し、常時発現している。そのため、強力な発現プロモーターとして利用できる。
【００３４】
上記G3PDプロモーターは、特に限定されないが、同種モーレラ属細菌に由来するものが好ましく、由来が同一である細菌株に由来するものがより好ましい。例えば、本発明の菌株がM. thermoaceticaである場合には、上記G3PDプロモーターはM. thermoaceticaに由来するものが好ましい。
【００３５】
前記G3PDプロモーターの塩基配列は、配列番号１３の塩基配列に含まれるものが好ましい。
【００３６】
なお、本発明において、遺伝コードは標準コードと一部異なる場合があり、翻訳開始コドンとして、ＡＴＧ（ＡＵＧ）の他、ＴＴＧ（ＵＵＧ）、ＣＴＧ（ＣＵＧ）、ＧＴＧ（ＧＵＧ）、ＡＴＴ（ＡＵＵ）、ＡＴＣ（ＡＵＣ）、ＡＴＡ（ＡＵＡ）も使用され得る。これらは翻訳開始コドンとして使用されるときはメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）をコードするが、翻訳開始コドン以外として使用されるときは、標準コードと同じく、ＴＴＧ（ＵＵＧ）およびＣＴＧ（ＣＵＧ）はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）を、ＡＴＴ（ＡＵＵ）、ＡＴＣ（ＡＵＣ）およびＡＴＡ（ＡＵＡ）はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）を、ＧＴＧ（ＧＵＧ）はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）を、それぞれコードする。
【００３７】
［乳酸生産性モーレラ属細菌株］
上述した作製方法によって作製される本発明の乳酸生産性モーレラ属細菌は、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換を触媒する酵素であるホスホトランスアセチラーゼを欠損し、かつ乳酸デヒドロゲナーゼを高発現する。前記ホスホトランスアセチラーゼは完全欠損することが好ましい。
前記ホスホトランスアセチラーゼを欠損しているか否かは、酵素活性を調べることによって、またはホスホトランスアセチラーゼをコードする２遺伝子がともに破壊されているか否かを調べることによって、判定することができる。
前記乳酸デヒドロゲナーゼを高発現するか否かは、好ましくは乳酸を生産するか否かによって、より好ましくは酵素の比活性を測定することによって判定することができる。野生型のモーレラ属細菌では、酢酸がほぼ唯一の代謝産物であることから、乳酸生産性を有することは、乳酸デヒドロゲナーゼを高発現していると推定される。
【００３８】
前記乳酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＨ依存性であることが好ましい。モーレラ属細菌の本来の乳酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＰＨ依存性と考えられ、ＮＡＤＨ依存性であることは、外来性の乳酸デヒドロゲナーゼと考えられる。
【００３９】
前記乳酸デヒドロゲナーゼ（ldh）は乳酸生産性の好熱性嫌気性細菌に由来することが好ましく、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属細菌に由来することがより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）に由来することがさらに好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）39E株に由来することがいっそう好ましい。
【００４０】
前記ホスホトランスアセチラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。これら２つが欠損することで、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への変換が抑制されるからである。
【００４１】
乳酸生産性モーレラ属細菌株としては、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）の株であることが好ましく、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号NITE AP-01657で寄託されている、乳酸生産性モーレラ属細菌株（Moorella thermoacetica MTA-dpduL1-2株）が特に好ましい。
なお、MTA-dpduL1-2株は、dpL1-2株と同一の細菌株である。
【００４２】
本発明の乳酸生産性モーレラ属細菌株は、ゲノムＤＮＡの塩基配列中に、配列番号５の塩基配列と、配列番号７の塩基配列と、配列番号９の塩基配列とを有することが好ましく、さらに、ゲノムＤＮＡの塩基配列中に、配列番号１の塩基配列および配列番号３の塩基配列がないことがより好ましい。このような特徴は、上述した作製方法により作製されたことを強く示唆するためである。
【００４３】
［乳酸の製造方法］
本発明の乳酸生産性モーレラ属細菌株を有機栄養的に培養することにより、酢酸を実質的に生産することなく、乳酸を生産することができる。
【実施例】
【００４４】
〔１．概要〕
M. thermoaceticaは、糖質およびガスのどちらを基質とした場合でも、ほぼ唯一の代謝産物として酢酸を生産する。そのため、M. thermoaceticaを宿主とした物質生産を行う際に、酢酸の生産量をコントロールすることは非常に大事である。そこで本実施例では、酢酸非生産変異株の構築と同時に、M. thermoaceticaの酢酸の生産に関わる遺伝子の同定を行った。
M. thermoaceticaは、フルクトースおよびＨ２＋ＣＯ２混合ガスから、アセチルＣｏＡを経由して酢酸を生産する。酢酸の生産はアセチルＣｏＡからホスホトランスアセチラーゼと酢酸キナーゼの２酵素の関与により行われる（図２）。しかし、M. thermoaceticaにおいて抽出された酵素液からは、ホスホトランスアセチラーゼの存在が示唆されていた（Dlake, H. L. et al., 1981, J. Biol. Chem., 256: 11137-11144）が、ゲノム情報からは既知のホスホトランスアセチラーゼの存在が確認できなかった（Pierce, E. et al., 2008, Environ. Microbiol., 10: 2550-2573）。しかしながら、M. thermoaceticaのゲノム情報から、新規のホスホトランスアセチラーゼ候補となりうるPduLをコードしている遺伝子が２遺伝子（Moth_0864、Moth_1181）確認された。
PduLはSalmonella entericaで１，２−プロパンジオールの分解に関わる酵素として同定されており、ホスホトランスアセチラーゼ活性を持っていることが確認されている（Liu, Y. et al., 2007, J. Bacteriol., 189: 1589-1596）。そこで、本実施例ではPduLをコードしている遺伝子Moth_0864およびMoth_1181と、酢酸キナーゼをコードしている遺伝子Moth_0940とが酢酸生産に関与しているのかどうか調べた。具体的には、上記３遺伝子の破壊と同時にT-ldhを導入し、フルクトースを基質として酢酸生産から乳酸生産に代謝の流れが変化するかどうかにより調べた。
【００４５】
〔２．実験材料および機器〕
使用菌株およびプラスミド
本実施例で使用した菌株およびプラスミドを下記表１に示す。
【００４６】
【表１】
2015023854.tif 000002
【００４７】
基本培地および基本溶液の調整
Moorella用基本培地の調整
本実施例では、C. ljungdahliiの培養に用いられるATCC 1754 PETC培地を改変したものを基本培地として用いた。改変として、塩酸システイン・一水和物の最終濃度を０．３ｇ／Ｌに減らし、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除いた。培地作製は、還元剤（塩酸システイン・一水和物、６０ｇ／Ｌ）と基質（フルクトース等）を別に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）を改変したＭｉｌｌｅｒらの方法（Miller, T. L. et al., 1974, Appl. Microbiol., 27: 985-987）を用いた。各成分の組成と調製手順を以下に示す。
【００４８】
【表２】
2015023854.tif 000003
【００４９】
５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ６．９に調整後、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップ
培地が青から赤に変色するまでボイル（２０分間）
Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０）を注入しながら氷中で冷却（２０分間）
予めＣＯ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注
さらに、３分間ＣＯ２を注入した後、ブチルゴム栓およびアルミシールで密閉
オートクレーブ（１２１℃、１５分）
【００５０】
微量元素溶液の調製
【００５１】
【表３】
2015023854.tif 000004
【００５２】
ビタミン溶液作成方法
【００５３】
【表４】
2015023854.tif 000005
【００５４】
フルクトース溶液（２００ｇ／Ｌ）の調製
イオン交換水（１００ｍＬ）を２０分間ボイルして脱気
Ｎ２を注入しつつ、氷中で室温まで冷却後、フルクトース（２０ｇ）を加える
Ｎ２を注入しつつ、さらに氷中で２０分間冷却
０．４５μｍフィルターで濾過滅菌しつつ、Ｎ２を注入した滅菌済みバイアル瓶に注入
【００５５】
還元剤（６０ｇ／Ｌ）の調製
イオン交換水（１００ｍＬ）を２０分間ボイル
Ｎ２を注入しつつ氷中で室温まで冷却
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（６．０ｇ）を添加
Ｎ２を注入しつつさらに氷中で２０分間冷却
Ｎ２を注入した滅菌済みバイアル瓶に、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌しつつ注入
遮光して室温保存
※培地に対して１／５０量を添加
【００５６】
Ｔｉ（ＩＩＩ）クエン酸溶液の調製
イオン交換水にクエン酸ナトリウム二水和物（１１．７６ｇ）を加えて、２００ｍＬにメスアップ
２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却
Ｎ２ガス下で、２０％  塩化チタン（ＩＩＩ）水溶液（ナカライテスク）（１０．６ｍＬ）を混合
Ｎ２ガス下で、湯煎で沈殿を溶解させた飽和炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整
予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に８０ｍＬずつ分注
さらに、３分間Ｎ２を注入した後、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉
オートクレーブ（１２１℃、１５分）後、遮光し室温保存
※培地に対して１、２滴を添加
【００５７】
ウラシル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）の調製
ウラシル（３００ｍｇ）をジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）（３０ｍＬ）に溶解
６５ｍＬバイアル瓶に移し、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉
遮光し室温保存
※ウラシル要求性変異株（dpyrF株）培養時のみ培地に対して１／１０００量を添加
【００５８】
エレクトロポレーション・バッファー（２７２ｍＭ  スクロース溶液）の調製
スクロース（４６．６ｇ）をミリＱ水に溶解し、５００ｍＬにメスアップ
２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却
予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に５０ｍＬずつ分注
さらに、３分間Ｎ２を注入した後、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉
オートクレーブ（１２１℃、１５分）後、室温保存
【００５９】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１Ｍ、ｐＨ８．０）の調製
ミリＱ水（４００ｍＬ）にトリス塩基（６０．５５ｇ）を溶解
５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ８．０に合わせ、ミリＱ水で５００ｍＬにメスアップ
密栓してオートクレーブ（１２１℃、１５分）後、室温保存
【００６０】
ＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）の調製
ミリＱ水（４００ｍＬ）にエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物（ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ）（９３．０６ｇ）を懸濁
固形水酸化ナトリウム（１０ｇ）を少しずつ加え、ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを完全に溶解
５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを８．０に合わせ、ミリＱ水で５００ｍＬにメスアップ
オートクレーブ（１２１℃、１５分）後、室温保存
【００６１】
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーの調製
ミリＱ水（４９４ｍＬ）に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５ｍＬ）と、ＥＤＴＡ溶液（１ｍＬ）とを添加
密栓してオートクレーブ（１２１℃、１５分）後、室温保存
【００６２】
リン酸カリウムバッファー（５００ｍＭ、ｐＨ６．０）の調製
５００ｍＭ  リン酸水素二カリウム水溶液と、５００ｍＭ  リン酸二水素カリウム水溶液とを、ｐＨを確認しながら混ぜていき、ｐＨを６．０に調節
オートクレーブ（１２１℃、１５分）後、室温保存
【００６３】
ソニケーションバッファーの調製
ミリＱ水（１２ｍＬ）に、リン酸カリウムバッファー（５００ｍＭ、ｐＨ６．０）（１．５ｍＬ）および１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液（１．５ｍＬ）を添加
−２０℃で保存
【００６４】
５０×  ＴＡＥバッファーの調製
トリス塩基（２４２ｇ）と、酢酸（５７．１ｍＬ）と、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（１００ｍＬ）を混合し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップ
５０倍に希釈したものをアガロースゲル電気泳動用のバッファーとした。また５０倍希釈のものにアガロースを０．７〜１．０％になるように溶解し、アガロースゲルを作成した。
【００６５】
ＬＢ培地の作製
トリプトン（ナカライテスク）    １０ｇ
酵母エキス（ナカライテスク）      ５ｇ
ＮａＣｌ                        １０ｇ
イオン交換水１０００ｍＬに溶かしてオートクレーブ
プレート作成時には寒天末を１％添加
【００６６】
２×ＹＴ培地の作製
トリプトン（ナカライテスク）    １６ｇ
酵母エキス（ナカライテスク）    １０ｇ
ＮａＣｌ                          ５ｇ
イオン交換水１０００ｍＬに溶かしてオートクレーブ
プレート作成時には寒天末を１％添加
【００６７】
ＳＯＢ培地の作製
イオン交換水９５０ｍＬに対して、
トリプトン（ナカライテスク）    ２０ｇ、
酵母エキス（ナカライテスク）      ５ｇ、
ＮａＣｌ                      ０．５ｇ、および
２５０ｍＭ  ＫＣｌ                １０ｍＬ
を溶解後、ｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップ
オートクレーブ後、使用直前にオートクレーブ滅菌した２Ｍ  ＭｇＣｌ２（５ｍＬ）を添加
【００６８】
ＳＯＣ培地の作製
ＳＯＢ培地（１０００ｍＬ）に、フィルター滅菌した１Ｍ  グルコース（２０ｍＬ）を添加
【００６９】
Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー
まず以下の手順で、０．５Ｍ  ＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，２−ｂｉｓ［２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ］）を準備する。
ＰＩＰＥＳ（１５．１ｇ）をミリＱ水（８０ｍＬ）に溶解
５Ｎ  ＫＯＨを用いてｐＨを６．７に調整後、ミリＱ水で１００ｍＬにメスアップ
０．４５μｍフィルターで濾過滅菌後、−２０℃で保存
次に、以下の試薬をミリＱ水（８００ｍＬ）に溶解する。
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      １０．８８ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ        ２．２０ｇ
ＫＣｌ                  １８．６５ｇ
溶解後、０．５Ｍ  ＰＩＰＥＳ（２０ｍＬ）を添加し、ミリＱ水で１０００ｍＬにメスアップ
０．４５μｍフィルターで濾過滅菌後、−２０℃で保存
【００７０】
実験機器
・インキュベーター
ＢＲ−４３ＦＨ（タイテック）：振とう培養（５５℃、１８０ｒｐｍ）
ＴＶＡ６６０ＤＡ（アドバンテック）：静置培養（５５℃）
ＩＳ−６１（ヤマト科学）：静置培養（３７℃）
・遠心分離機
ＭＸ３００（トミー精工）
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１０（エッペンドルフ）
・吸光光度計
Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３３００  ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス）：菌体濃度測定、ＤＮＡ、ＲＮＡ濃度測定
ＵＶ−１６００（島津製作所）：酵素活性測定
・ｐＨメーター
Ｆ−２１（堀場製作所）：電極はＣＭ０５７−ＢＮＣ（ＣＥＭＣＯ）を使用
・ＰＣＲ装置
ＰＣ８０８（アステック）
ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（パーキンエルマー）
・ブロックインキュベーター
ＢＩ−５２５Ａ  （アステック）
・超音波破砕機
Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  （ブランソン）
・ｑＲＴ−ＰＣＲ
Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  １．５（ロシュ・ダイアグノスティックス）
・高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
微生物により代謝される生産物濃度の分析はＨＰＬＣを用いて行った。ＨＰＬＣのシステムは、ＰＵ−２０８０  Ｐｌｕｓ（ＨＰＬＣポンプ）、ＲＩ−２０３１  Ｐｌｕｓ（ＲＩディテクター）、ＣＯ−２０６５  Ｐｌｕｓ（カラムオーブン）、ＡＳ−２０５７  Ｐｌｕｓ（オートサンプラー）を用いた（いずれもＪＡＳＣＯ）。
移動相は０．１％（ｖ／ｖ）  Ｈ３ＰＯ４を用い、０．７ｍＬ／分の流速で流した。分離カラムには、ＲＳｐａｋ  ＫＣ−８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。また、ガードカラムとして、ＲＳｐａｋ  ＫＣ−Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ）を分離カラムの前に設置した。カラムオーブンの温度は、６０℃に設定した。測定時にはサンプルの上清に、内部標準として１００ｍＭのクロトン酸を含む０．２％（ｖ／ｖ）  Ｈ３ＰＯ４を１：１で混合し、酢酸セルロース親水性フィルター  ０．２０μｍ（Ｄｉｓｍｉｃ(R)−１３ＣＰ）で濾過してから測定を行った。オートサンプラーのインジェクションボリュームは１０μＬとした。
【００７１】
〔３．実験方法〕
大腸菌の培養
大腸菌は２×ＹＴ培地およびＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。カナマイシン耐性株のスクリーニングはカナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを、クロラムフェニコール耐性株のスクリーニングにはクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用した。
【００７２】
コンピテントセルの作製
コンピテントセルの作製は、井上法（Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28）を参考に、以下の手順で行った。まず、大腸菌を寒天末に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ（５ｍＬ）に植菌し、６〜８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。さらに、得られた培養液（２ｍＬ）をＳＯＢ培地（１００ｍＬ）に植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。得られた培養液を５０ｍｌずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷した Inoue transformation buffer（１６ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷したＩｎｏｕｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（４ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）（３００μＬ）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは−８０℃で保存した。
【００７３】
プラスミドの構築
遺伝子破壊用のプラスミドは以下の手順で構築した。まず、それぞれの目的の遺伝子であるMoth_0864、Moth_0940、Moth_1181を、上流１ｋｂｐおよび下流１ｋｂｐを含めて、ATCC 39073株のゲノムＤＮＡを鋳型に、それぞれ、プライマーセット0864-upF/0864-downR、0940-upF/0940-downR、1181-upF/1181-downRにより増幅した。回収したＤＮＡ断片は、pk18mobのSma Iサイトに２×ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘ（ニッポンジーン）を用いて挿入し、E. coli DH5α（タカラバイオ）に導入した。
形質転換体から得られたプラスミドを鋳型に、プライマーセット0864-downF-inv/0864-upR-inv、0940-downF-inv/0940-upR-inv、1181-inv-F/1181-inv-R、pk18-0864-inv-F/pk18-0864-inv-R、およびpk18-0940-inv-F/pk18-0940-inv-Rにより線状ベクターを構築した。
【００７４】
特開２０１３−９０６００号公報に記載の方法に従って、pK18mobのSma Iサイトに、pyrFの上流域、pyrF、G3PDプロモーター、T-ldh（Thermoanaerobacter pseudethanolicus 39E株に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）およびpyrFの下流域を組み込み（図４）、環状プラスミドpK18-ldhを作製した。
【００７５】
pk18-ldhを鋳型に、プライマーセットpyrF-IN-F/ldh-OUT-Rにより、pyrFおよびldhを含むＤＮＡ断片を増幅し、プライマーセット0864-downF-inv/0864-upR-inv、0940-downF-inv/0940-upR-inv、1181-inv-F/1181-inv-Rにより構築された線状ベクターと、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いてつなげ、pk18-d0864-ldh、pk18-d0940-ldh、pk18-d1181-ldhを構築した。
【００７６】
pK18mobのSma Iサイトに、pyrFの上流域、pyrF、G3PDプロモーター、pIKM1のカナマイシン耐性遺伝子（kanR）およびpyrFの下流域を組み込み（図５）、環状プラスミドpK18-PG3D-kanを構築した。
【００７７】
さらに、pk18-PG3PD-kanを鋳型に、プライマーセットkan-G3PD-F/pyrF-kan-Rにより、G3PDプロモーターおよびkanRを含むＤＮＡ断片を増幅し、プライマーセットpk18-0864-inv-F/pk18-0864-inv-R、pk18-0940-inv-F/pk18-0940-inv-Rにより構築された線状ベクターと、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてつなげ、pk18-d0864-kan、pk18-d0940-kanを構築した。
【００７８】
また、PduL大量発現用のプラスミド（pCold-M0864、pCold-M1181）は、moth_0864、moth1181をプライマーセットm0864-inf-f/m0864-inf-rおよびm1181-inf-f/m1181-inf-rを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、pCold IIのNde Iサイトに、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて挿入することで構築した。
使用プライマーを表５に、反応液組成を表６に、ＰＣＲ条件を表７および表８に、それぞれ示す。
【００７９】
【表５】
2015023854.tif 000006
【００８０】
【表６】
2015023854.tif 000007
【００８１】
【表７】
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【００８２】
【表８】
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【００８３】
大腸菌の形質転換
大腸菌への遺伝子導入は、コンピテントセルを用いて以下の手順でヒートショックにより行った。まず、コンピテントセルを−８０℃から取り出し、氷上で１０分間静置し、解
凍した。コンピテントセル（１００μＬ）にＤＮＡ溶液（５μＬ）を添加し、氷上で３０分間静置した。３０分後、４２℃で９０秒間インキュベートし、ヒートショックを行った。ヒートショック後、直ぐに氷上に移し、１〜２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地（８００ｍＬ）を添加し、３７℃で４５分間培養した。４５分後、抗生物質を含む２×ＹＴプレートに塗布し、３７℃、１２〜１６時間培養した。形成されたコロニーは２×ＹＴ（５ｍｌ）に植菌し、プラスミド抽出を行った。
【００８４】
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの抽出
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの抽出は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）を用いて、付属のプロトコールに従い行った。抽出したプラスミドは、制限酵素処理により目的のプラスミドが構築されていることを確認した。
【００８５】
ＰＡＭ法によるプラスミドのメチル化
ＰＡＭ法による遺伝子組換え用プラスミドのメチル化は、E. coli TOP10内で行った。まず、コンピテントセル化させたTOP10に、pBAD-M1281をヒートショックにより導入し、クロラムフェニコールを含む２×ＹＴプレートに塗布した。さらに、得られたpBAD-M1281を保有する形質転換体をコンピテントセル化させた。このコンピテントセルにM. thermoaceticaの遺伝子組換えのために構築したプラスミドをヒートショックにより導入し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む２×ＹＴプレートに塗布した。得られた形質転換体はカナマイシンおよびクロラムフェニコールと、アラビノース（５ｍｇ／Ｌ）を含む２×ＹＴ液体培地に植菌し、３７℃で９〜１６時間振とう培養した。培養後、得られた菌体からプラスミドを抽出し、エレクトロポレーションに用いた。
【００８６】
バイアルを用いた回分培養
バイアル瓶への還元剤の添加、植菌、またはサンプリングには、２２Ｇ×１・１／４または２７Ｇ×１・１／４の注射針（ニプロ）を付けたプラスチック注射器（テルモ）を用いて嫌気的に行った。操作はクリーンベンチ内で行い、注射針を刺すブチルゴム栓の部分は、ガスバーナーであぶって滅菌した。フルクトースで培養する場合は、植菌直前にフルクトース溶液（２００ｇ／Ｌ）を培地に対し１％（ｖ／ｖ）、還元剤（６０ｇ／Ｌ）を２％（ｖ／ｖ）、Ｔｉ（ＩＩＩ）クエン酸溶液を１、２滴添加し、前培養液を５％（ｖ／ｖ）植菌した。Ｈ２−ＣＯ２で培養する場合には、フルクトース溶液を添加せず、植菌後にＨ２−ＣＯ２［８０：２０（ｖ／ｖ）］を、バイアル瓶のヘッドスペースへ０．４５μｍの酢酸セルロース親水性フィルター（Ｄｉｓｍｉｃ−２５、アドバンテック、東洋濾紙）を通して置換し、０．２５ＭＰａ（約２．５ａｔｍ）になるように充填した。培養は５５℃で、フルクトースで培養時は静置培養、Ｈ２−ＣＯ２で培養時は１８０ｒｐｍで振盪培養を行った。
【００８７】
ロールチューブ法によるコロニー形成
ロールチューブの作成は、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）に従った。ロールチューブ作成にはモーレラ用基本培地（１８ｍＬ）が入ったバイアルに、低温ゲル化用寒天末（ナカライテスク、ゲル化温度３０〜３１℃）（０．３７ｇ）を添加し、オートクレーブ（１２５℃、１５分間）した培地を使用した。使用前に培地を湯煎により融解し、４０℃程度に保ちながら還元剤（０．４ｍＬ）、フルクトース溶液（０．２ｍＬ）、およびＴｉ（ＩＩＩ）クエン酸溶液１滴を添加した後、菌体を気泡ができないように植菌した。植菌後、氷水を入れたロールチューブ作成装置で回転させながら、寒天をバイアル瓶側面に固めた。その後、５５℃で５〜７日間静置培養した。形成されたコロニーは、クリーンベンチ内で滅菌済みのパスツールピペットを用いて培地ごと取り出し、５ｍＬの培地に植菌し、フルクトースを基質として静置培養した。
【００８８】
乾燥菌体質量測定
フルクトースを基質として用いてＯＤ６００＝０．０５〜０．８５になるように培養した培養液を使用した。採取した培養液は、吸光光度計にて吸光度を測定した。次に、得られたＯＤ６００の値から、乾燥菌体質量（ｇ／Ｌ）を求めるために、以下のように検量線を作成した。
まず、孔径０．４５μｍの酢酸セルロース親水性フィルター（Ｄｉｓｍｉｃ−２５、アドバンテック、東洋濾紙）を耐熱シャーレに入れて、８０℃で３時間乾燥後、デシケーターに入れて１時間放冷し、電子天秤（ＣＰＡ２２４Ｓ、ザルトリウス）で秤量した。続いてこのフィルター上で培養液（４０ｍＬ）を吸引ろ過し、イオン交換水で数回洗浄して水溶性成分を除去した後、耐熱シャーレに入れて、８０℃で約１晩乾燥し、デシケーターで１時間放冷した後に秤量した。ろ過前のフィルターの質量とろ過後の質量との差から、乾燥菌体質量を求めた。得られたデータを元に作成した検量線（図３）から、次の式（１）が得られた。
乾燥菌体質量（ｇ／Ｌ）＝ＯＤ６００×０．３８３      （１）
【００８９】
エレクトロポレーションを用いた M. thermoacetica への遺伝子導入
M. thermoacetica への遺伝子の導入はエレクトロポレーションを用いた。まず、dpyrF株をＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１程度になるまで培養し、１０分間遠心（５８００×ｇ、４℃）して上清を除去した。残った菌体にエレクトロポレーション・バッファー（１０ｍＬ）を加え、再懸濁後、１０分間遠心（５８００×ｇ、４℃）して上清を除去した。この操作をもう一度繰り返した後、ＯＤ６００＝１．０程度になるように菌体をエレクトロポレーション・バッファーにより再懸濁した。ＤＮＡ（２μｇ）を含む溶液を加えた菌体懸濁液（４００μＬ）をエレクトロポレーション用キュベット（２ｍｍギャップ）に移し、１５００Ｖ、５００Ω、５０μＦの条件でパルスをかけた。パルス後、すぐにキュベットを氷中に移し、３〜５分間静置した。冷却後、菌体懸濁液はウラシル（１μｇ／ｍＬ）を含む培地に植菌し、フルクトースにより５５℃で４８時間静置培養した。培養後、ロールチューブ法（ウラシルを含まない培地を使用）により、形質転換体の単離を行った。単離した菌株はゲノム抽出後、ＰＣＲにより目的の遺伝子がゲノム上に挿入されているか否かを確認した。
【００９０】
M. thermoacetica からのゲノムＤＮＡの抽出
M. thermoacetica からのゲノムＤＮＡの抽出には、定常期まで培養した菌体を使用した。
抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて行った。抽出プロトコールは一部添付のマニュアルを改変して行った。改変としては、Ｐｒｅ−ｌｙｓｅの段階で、バッファーＴ１（１８０μＬ）で再懸濁するところを、リゾチーム（東京化成工業）およびアクロモペプチダーゼ（和光純薬）をそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解させたＴＥバッファー（１８０μＬ）に菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。その後、のプロテイナーゼＫ（２５μＬ）を加え、３７℃で１５分間反応させた。この後の操作は、添付のマニュアルに従った。抽出したゲノムＤＮＡは−２０℃で保存し、必要なときに適宜解凍して使用した。
【００９１】
ＰＣＲによる形質転換体の確認
形質転換体の確認は、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表９に、反応液組成を表１０に、ＰＣＲ条件を表１１に、それぞれ示す。
【００９２】
【表９】
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【００９３】
【表１０】
2015023854.tif 000011
【００９４】
【表１１】
2015023854.tif 000012
【００９５】
M. thermoacetica からのトータルＲＮＡの抽出
M. thermoacetica からのトタルＲＮＡの抽出には、Ｈ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１〜０．１５、フルクトースでＯＤ６００=０．４〜０．８まで培養した菌体を使用した。抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ  ｋｉｔ  （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて行った。基本的なプロトコールは添付のマニュアルに従ったが、抽出の前処理として、リゾチームおよびアクロモペプチダーゼをそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解させたＴＥバッファー（１００μＬ）に菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。抽出したトータルＲＮＡは−２０℃または−７０℃で保存した。
【００９６】
定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）を用いた転写解析
ｑＲＴ−ＰＣＲを行うために、抽出したトータルＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。逆転写反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。逆転写に用いた反応液の組成を表１２に、反応条件を表１３に、それぞれ示す。作製したｃＤＮＡを鋳型にＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、定量ＰＣＲを行った。使用したプライマーおよび反応液組成と反応条件を以下の表に示す。ｍＲＮＡ量の内部標準にはｇｙｒＢのｍＲＮＡ量を使用して各遺伝子の相対転写量を測定した。
【００９７】
【表１２】
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【００９８】
【表１３】
2015023854.tif 000014
【００９９】
【表１４】
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【０１００】
【表１５】
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【０１０１】
【表１６】
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【０１０２】
大腸菌を用いたタンパク質の大量発現
タンパク質大量発現用の宿主として、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン）を使用した。構築したｐＣｏｌｄ−Ｍ０８６４、ｐＣｏｌｄ−Ｍ１１８１をＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入し、以下の通り培養することでPduLの大量発現を行った。まず、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）と、テトラサイクリン（１５ｇ／ｍＬ）と、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍＬ）とを含むＬＢ培地（５ｍＬ）に植菌し、３７℃で前培養した。次に、前培養と同様の抗生物質を含むＬＢ培地（１００ｍＬ）に前培養液を植菌し、３７℃で本培養した。ＯＤ６６０が約０．２になったところで培養液を１５℃のインキュベーターに移し、３０分間放置した。３０分後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう添加し、１５℃で１晩振とう培養した。培養後、５０ｍＬファルコンチューブに培養液を移し、遠心分離（８０００×ｇ、１０分間）した。遠心分離後、上清をきれいに取り除き、−８０℃で菌体ペレットを保存した。
【０１０３】
Ｈｉｓ  ｔａｇを利用したタンパク質の精製
タンパク質の精製には、ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｇｒａｖｉｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いた。まず、精製用サンプルの調整を行った。冷凍保存しておいた菌体ペレットの入ったファルコンチューブにＢ−ＰＥＲ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）（７ｍＬ）と、ＤＮａｓｅ（１０Ｕ／μＬ）（５０μＬ）と、ＭｇＣｌ２（１Ｍ）（３００μＬ）と、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）（７５０μＬ）とを添加した。これを２本（培養液１００ｍＬ分）作製し、１本にまとめた。超音波破砕機を用いて菌体を破砕し、破砕液を遠心分離（８０００×ｇ、２０分間）した。遠心分離後、上清を取り出し、精製用サンプルとした。次に、精製用サンプルを用いてタンパク質の精製を行った。まず、ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｇｒａｖｉｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓに、ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ添加し、重力により全て滴下されるまで静置した。滴下後、精製用サンプルをカラムに全量添加し、全て滴下されるまで静置した。滴下後、ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを８ｍＬ添加し、全て滴下されるまで静置した。ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（８．５ｍＬ）と、ＨｉｓＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１．５ｍＬ）と、５Ｍ  ＮａＣｌ（５００μＬ）とを混合したもの）（７ｍＬ）を添加し、全て滴下されるまで静置した。滴下後、ＨｉｓＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＬ）を添加し、滴下してきた抽出物を約５００μＬずつエッペンドルフチューブに回収した。回収したサンプルのＡ２８０を測定し、目的タンパク質が抽出されていると思われるサンプルを５本選択した。精製サンプルをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４により、脱塩濃縮した。脱塩濃縮後、精製タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０１０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製タンパク質の確認
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは以下の手順で行った。まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のランニング・ゲル（１２．５％ゲル）を作製するために、３０％  アクリルアミドストック溶液（２９０ｇ／Ｌ  アクリルアミド＋１０ｇ／Ｌ  Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）（７．１ｍＬ）と、イオン交換水（５．４５ｍＬ）と、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）（４．２５ｍＬ）と、１０％  ＳＤＳ（１７０μｌ）と、１０％  過硫酸アンモニウム（５７μＬ）と、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）（８．５μＬ）とを混合し、ゲル作製用のガラス板に直ぐに入れた。
ガラス板に入れた混合液に水飽和ブタノールを重層し、酸素の混入を防いだ。１時間放置後、ゲルが固まったのを確認したら、重層したブタノールを水流にさらしきれいに取り
除いた。次に、スタッキング・ゲルを作製するために、３０％  アクリルアミドストック溶液（０．７９ｍＬ）と、イオン交換水（２．８９ｍＬ）と、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）（１．２５ｍＬ）と、１０％  ＳＤＳ（５０μＬ）と、１０％  過硫酸アンモニウム（１７μＬ）と、ＴＥＭＥＤ（５μＬ）とを混合し、先ほど作製したランニング・ゲルの上に重層した。コームを差し、水飽和ブタノールを重層した後、１時間放置した。１時間後、ゲルが固まったのを確認したら、コームを抜き取り水でブタノールをきれいに取り除いた。
次にＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用するタンパク質溶液を、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｓｉｓ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２×と１：１の割合で混合し、９８℃で１０分間処理し、変性させた。作製したゲルを泳動バッファー（３ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ＋  １４．４ｇ／Ｌ  グリシン  ＋  １ｇ／Ｌ  ＳＤＳ）で満たした電気泳動槽（ＡＥ−６５３１、アトー）に設置し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（バイオラッド）サンプルをゲルにアプライした。アプライ後、２０ｍＡで９０分間電気泳動した。９０分後、ゲルをガラス板から取り外し、染色液（ＥｔＯＨ：４５％、酢酸：１０％、クーマジーブリリアントブルー  Ｒ−２５０：０．２５％）に１時間振とうしながら浸した。染色後、ゲルを脱色液（ＥｔＯＨ：２５％、酢酸：１０％）に振とうしながら浸し、何回か脱色液を交換しながら１晩放置した。
【０１０５】
タンパク質濃度の測定
粗酵素液のタンパク濃度の測定は、サンプルをソニケーションバッファーで適宜希釈したうえで、Ｐｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）を用いて行った。定量のための標準タンパク溶液にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を用い、検量線を求めた。
【０１０６】
ホスホトランスアセチラーゼ活性の測定
ホスホトランスアセチラーゼ活性は、Ｂｏｃｋらの方法（Bock, A. K. et al., 1999, J. Bacteriol., 181: 1861-1867）およびＦｅｒｒｙの方法（Ferry, J. G., 2011, Methods Enzymol., 494: 219-231）を参考に２つの方法で行った。１つ目の方法では、エルマン試薬を使用してＡ４１２の経時変化（ＨＳＣｏＡの生成量）を測定することにより活性を求めた。測定時の反応液組成は表１７  Ａ）に示す。１Ｕは１分あたりにＣｏＡＳＨが１μＭ生成される活性と定義した。２つ目の方法では、Ａ２３３の経時変化（アセチルＣｏＡの生成量）を測定することにより活性を求めた。測定時の反応液組成は表１７  Ｂ）に示す。１Ｕは１分あたりにアセチルＣｏＡが１μＭ生成される活性と定義した。
【０１０７】
【表１７】
2015023854.tif 000018
【０１０８】
[３．結果および考察］
酢酸生産関連遺伝子候補の破壊
酢酸生産関連遺伝子候補（Moth_0864、Moth_1181、Moth_0940）の破壊はdpyrF株を宿主として、それぞれの遺伝子とマーカー遺伝子であるpyrFおよび乳酸脱水素酵素遺伝子（T-ldh、T. pseudethanolicus ATCC 33223株由来）を相同組換えで置換することにより行った。エレクトロポレーションによる遺伝子の導入後、得られた候補株からゲノムを抽出し、それを鋳型としたＰＣＲ（図６、図７、図８の矢印の位置から増幅）により各遺伝子の破壊を確認した。その結果、ＰＣＲ産物の予想ＤＮＡ鎖長（表１８）から、Moth_0864単独破壊株（dpL1株）およびMoth_1181単独破壊株（dpL2株）が構築されていることが確認できた（図６、図７、図８）。Moth_0940単独破壊株については取得することができなかった。次に、得られたdpL1株またはdpL2株を宿主として、Moth_0864およびMoth_1181の二重破壊株、Moth_0864およびMoth_0940の二重破壊株、Moth_1181およびMoth_0940の二重破壊株の構築を試みた。二重破壊株におけるそれぞれの遺伝子の破壊はマーカー遺伝子であるkanRと置換することにより行った。得られた候補株のゲノムを鋳型としたＰＣＲ（図６、図７、図８の矢印の位置から増幅）により遺伝子破壊を確認した結果、ＰＣＲ産物の予想ＤＮＡ鎖長（表１８）から、Moth_0864およびMoth_1181の二重破壊株（dpL1-2株）ならびにMoth_1181およびMoth_0940の二重破壊株（dpL2-ak株）が構築されていることが確認できた（図６、図７、図８）。Moth_0864およびMoth_0940の二重破壊株については取得することができなかった。
【０１０９】
【表１８】
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【０１１０】
破壊遺伝子の転写の確認
各破壊株について、フルクトースでＯＤ６００＝０．１５〜０．４まで培養後、ＲＮＡを抽出し、破壊した遺伝子が転写されていないことをｑＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図９）。その結果、各破壊株において、破壊した遺伝子は転写されていないことが確認された。また、dpL1株においてはMoth_1181の転写量が、dpL2株においてはMoth_0864の転写量が、それぞれ、野生株と比較して増加していることが分かった。Moth_0864およびMoth_1181は、いずれもPduLをコードしていると思われ、同様の機能を持つ酵素をコードしている。そのため、破壊された遺伝子の機能を補うために、もう片方の遺伝子の転写量が増幅したと考えられる。
【０１１１】
酢酸生産関連遺伝子候補破壊株の増殖および代謝産物の観察
各破壊株において、遺伝子の破壊により菌体の増殖および酢酸と乳酸の生産量に影響が出たかどうかを調べるために、それぞれの株を基本培地にリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ６．５）および酵母エキス（５ｇ／Ｌ）を加えた培地でフルクトース（４５ｍＭ）を基質として回分培養を行い、ＯＤ６００、ｐＨ、および代謝産物濃度の経時変化を測定した。
まず単独破壊株において、Moth_0864破壊株（dpL１株）は、酢酸生産量および基質１ｍｏｌ消費あたりの酢酸生産量（ＹＰ／Ｓ−酢酸）について、野生株（ＡＴＣＣ  ３９０７３）との間に差はなかったが、Moth_1181破壊株（dpL2株）は、酢酸生産量およびＹＰ／Ｓ−酢酸について、野生株と比較して顕著に減少していた。さらに、dpL2株は、乳酸生産量および基質１ｍｏｌ消費あたりの乳酸生産量（ＹＰ／Ｓ−乳酸）が、野生株に比べ顕著に増加しており、酢酸生産から乳酸生産へ代謝の流れが変化していることが示唆された。また、dpL2株は、基質１ｍｏｌ消費あたりの乾燥菌体質量ＹＸ／Ｓが、野生株と比較して半分ほどになっており、これは酢酸生産に伴うＡＴＰ生産の減少が原因と思われる。これらのことから、Moth_1181は、酢酸生産に大きく関わっている遺伝子であることが示唆された。次に、二重破壊株に目を向けると、Moth_0864およびMoth_1181の二重破壊株（dpL1-2株）とMoth_1181およびMoth_0940の二重破壊株（dpL2-ak株）において、酢酸生産がほとんど行われていないことが分かった。dpL1-2株およびdpL2-ak株の両株とも、酢酸生産量およびＹＰ／Ｓ−酢酸が０に近い値になり、乳酸生産量およびＹＰ／Ｓ−乳酸が野生株およびdpL2株と比較して著しく増加しているため、代謝の流れが酢酸生産から完全に乳酸生産に変化していると考えられる。さらに、ＹＸ／Ｓが野生株の約半分になっており、酢酸生産に伴うＡＴＰ生産量の減少が考えられる。これらのことから、Moth_1181だけでなく、Moth_0864およびMoth_0940も酢酸生産に関わっている遺伝子であることが示唆された。特に、Moth_0864の単独破壊では影響が見られなかったこと、およびdpL2株において転写量が増加したことから、通常はMoth_1181が酢酸生産に大きく寄与しており、Moth_0864の酢酸生産への寄与は少ないと思われる。
【０１１２】
【表１９】
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【０１１３】
精製PduLを用いたホスホトランスアセチラーゼ活性の測定
破壊株の生産物から、Moth_0864およびMoth_1181が酢酸生産に関与していることが示唆された。そこで、これらの遺伝子がコードしているタンパク質（PduL）がホスホトランスアセチラーゼ活性を有しているのかどうかを調べるために、大腸菌を用いて大量発現させ、精製を行ったあと酵素活性測定を行った。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、予想された分子量（約２２．５ｋＤａ）にバンドが見られ、Moth_0864がコードしているタンパク質およびMoth_1181がコードしているタンパク質がともに精製されていることが確認された（図１０）。ホスホトランスアセチラーゼ活性は、アセチルＣｏＡからアセチルリン酸への反応およびアセチルリン酸からアセチルＣｏＡへの反応の両方向を測定した（表２０）。
【０１１４】
【表２０】
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【０１１５】
酢酸生産遺伝子として、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子および酢酸キナーゼをコードする遺伝子の同定を行った。遺伝子破壊による酢酸生産への影響を調べた結果、Moth_1181単独破壊株、Moth_0864、Moth_1181二重破壊株、およびMoth_1181、Moth_0940二重破壊株において酢酸生産量の減少が見られ、Moth_0864、Moth_1181およびMoth_0940の３遺伝子の酢酸生産への関与が示唆された。さらに、Moth_0940はゲノム情報から既知の酢酸キナーゼをコードすることが分かっていたが、Moth_0864およびMoth_1181はゲノム情報から新規のホスホトランスアシラーゼであるPduLをコードするとされていたため、実際にホスホトランスアセチラーゼ活性を有しているのか精製タンパク質を用いて活性測定を行った。その結果、Moth_0864およびMoth_1181がコードするタンパク質は、ともにホスホトランスアセチラーゼ活性を有していることが分かった。その中でも、Moth_1181がコードするタンパク質はMoth_0864のものと比較して非常に高いホスホトランスアセチラーゼ活性を有していた。単独破壊株（dpL1株、dpL2株）の酢酸生産性および活性測定の結果から、Moth_1181が特に酢酸生産に重要な遺伝子であることが示唆されたが、これは、Moth_1181がアセチルＣｏＡ経路（図１）を形成している酵素であるメチレン−ＴＨＦレダクターゼをコードしている遺伝子（Moth_1191）からわずか１０遺伝子下流にあることからも推測される（Pierce et al., 2008, Environ. Microbiol., 10: 2550-2573）。
【０１１６】
M. thermoacetica ATCC 39073の酢酸生産に関わる遺伝子の同定を行い、Moth_0864、Moth_1181、およびMoth_0940の酢酸生産への関与を明らかにし、ホスホトランスアセチラーゼをコードしている遺伝子としてMoth_0864およびMoth_1181を同定した。また、ホスホトランスアセチラーゼをコードしている遺伝子の中でもMoth_1181が酢酸生産に大きく関わっていることが分かった。また、Moth_0864およびMoth_1181がコードするタンパク質PduLが酢酸生産菌において酢酸生産を担っているという報告はこれまでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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