(57)【要約】【課題】発光量の少ない発光試料でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズを提供すること。【解決手段】鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズを提供することを課題とする。本発明の発光試料撮像方法では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズ２と、集光レンズ３と、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラ４と、モニタ５と、を用いて、発光試料であるサンプル１を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像する。【選択図】図１
2015018266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光試料を撮像する発光試料撮像方法において、
開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いること
を特徴とする発光試料撮像方法。
【請求項２】
前記発光試料は発光タンパク質であること
を特徴とする請求項１に記載の発光試料撮像方法。
【請求項３】
前記発光タンパク質は、導入された遺伝子から発現されたものであること
を特徴とする請求項２に記載の発光試料撮像方法。
【請求項４】
ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する発光細胞撮像方法において、
開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いること
を特徴とする発光細胞撮像方法。
【請求項５】
発光試料を撮像する発光試料撮像方法で用いる対物レンズにおいて、
開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であること
を特徴とする対物レンズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光試料を撮像する発光試料撮像方法および当該発光試料撮像方法で用いる対物レンズに関するものである。また、本発明は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する発光細胞撮像方法および当該発光細胞撮像方法で用いる対物レンズに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、発光試料の観察においては、発光試料からの発光量の測定が行われていた。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞の観察では、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べるために、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量の測定が行われていた。そして、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量の測定は、まず細胞を溶解した細胞溶解液とルシフェリンやＡＴＰやマグネシウムなどを含む基質溶液とを反応させ、ついで基質溶液と反応させた細胞溶解液からの発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量する、という手順で行われていた。つまり、発光量は細胞を溶解した後に測定されていた。これにより、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を細胞全体の平均値として測定することができた。ここで、ルシフェラーゼ遺伝子などの発光遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入する方法には例えばリン酸カルシウム法やリポフェクチン法やエレクトロポーション法などがあり、各方法は目的や細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。また、ルシフェラーゼ遺伝子がレポーター遺伝子として導入された細胞においてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さをルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量を指標として調べる際、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぐことで当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができ、また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターに繋いでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることで当該遺伝子の遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることができる。
【０００３】
また、時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を捉えるには生きた細胞からの発光量を経時的に測定する必要がある。そして、生きた細胞からの発光量の経時的測定は、まず細胞を培養するインキュベーターに分光測定計としてのルミノメーターの機能を付け、ついで培養している全細胞集団からの発光量をルミノメーターで一定時間ごとに測定する、という手順で行われていた。これにより、一定の周期性をもった発現リズムなどを測定することができ、よって、細胞全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができた。一方、発光遺伝子の発現が一過性である場合には、個々の細胞での発現量に大きなばらつきがある。例えば、ＨｅＬａ細胞などのクローン化した培養細胞であっても、細胞膜表面のレセプターを介した薬剤の応答が個々の細胞でばらつくことがある。さらに、分光測定法は、迅速であるが、容器内の細胞数が多いほど光強度が高まるので、発現量と細胞数を区別するのが難しい。従って分光測定法による発現量は定量性に欠ける。すなわち、細胞全体としての応答は検出されなくとも数個の細胞は応答している場合がある。このことから、発光遺伝子の発現が一過性である場合には、細胞全体からではなく個々の細胞から発光量を経時的に測定することが重要である。そして、顕微鏡を用いた生きた個々の細胞からの発光量の経時的測定は、各細胞の発光が極めて弱いので、液体窒素温度レベルの冷却ＣＣＤカメラで長時間露光したり、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラとフォトンカウンティング装置とを用いたりして行われていた。これにより、生きた個々の細胞における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができた。
【０００４】
ところで、最近、生物学分野や医学分野の研究において、生きた試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察の必要性が高まってきている。具体的には、発光や蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子の動的な機能発現を捉えるためにタイムラプスや動画撮像が求められている。現状では、蛍光試料を対象として撮像した画像による動的変化の観察（例えば、蛍光を利用したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。蛍光試料の撮像の場合、励起光を照射し続けることで蛍光試料から発せられる光量が時間の経過とともに減少するという性質があるため、定量的な評価に利用できる安定した画像を経時的に撮ることが困難であったが、しかし、鮮明な、つまり、空間分解能の高い画像を短い露出時間で撮ることができた。一方、発光試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察においては、発光試料からの発光が極めて小さいので、発光試料の観察には、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて行われていた。発光試料の撮像の場合、励起光を照射する必要がないため、定量的な評価に利用できる安定した画像を経時的に撮ることができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、微弱な発光の発光試料を撮像する場合、発光試料からの発光量が極めて少ないため、鮮明な画像を撮るのに必要な露出時間が長くなる、という問題点があった。また、撮像の時間間隔は単位時間あたりの光量に制約されるため、微弱な発光の発光試料を撮像する場合、鮮明な画像を非常に長い時間間隔で、例えば６０分以上の間隔で、経時的に撮ることができても、比較的短い時間間隔で、例えば２０ないし３０分間隔で鮮明な画像を連続的に撮像することは困難であった、という問題点があった。ましてや、非常に短い時間間隔で、例えば５ないし１０分間隔で発光試料を画像化することは極めて難しかった、という問題点があった。ゆえに、５分未満、例えば１分ないし３分程度で鮮明な画像を得ることは想定外の事であった。一般に、撮像に要する時間が長いほど、発現量の変動解析が不正確になり、定量性が低くなる。
【０００６】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、発光量の少ない発光試料でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる発光試料撮像方法は、発光試料を撮像する発光試料撮像方法において、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明は発光細胞撮像方法に関するものであり、本発明にかかる発光細胞撮像方法は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する発光細胞撮像方法において、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明は対物レンズに関するものであり、本発明にかかる対物レンズは、発光試料を撮像する発光試料撮像方法で用いる対物レンズにおいて、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明は対物レンズに関するものであり、本発明にかかる対物レンズは、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する発光細胞撮像方法で用いる対物レンズにおいて、当該対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明は対物レンズに関するものであり、本発明にかかる対物レンズは、発光試料を撮像する発光試料撮像方法で用いる対物レンズにおいて、当該対物レンズおよび／または当該対物レンズを包装する包装容器に、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値を表記したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明にかかる発光試料撮像方法では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いる。これにより、発光量の少ない発光試料（例えば、発光タンパク質（例えば、導入された遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞または発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体（例えば動物や臓器など）など）でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる、という効果を奏する。
【００１３】
また、本発明にかかる発光細胞撮像方法では、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である対物レンズを用いるので、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像対象として、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる、という効果を奏する。
【００１４】
また、本発明にかかる対物レンズは、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上であるので、発光量の少ない発光試料（例えば、発光タンパク質（例えば、導入された遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞または発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体（例えば動物や臓器など）など）でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる、という効果を奏する。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像対象として、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる、という効果を奏する。
【００１５】
また、本発明にかかる対物レンズは、従来の対物レンズと比較して、開口数が大きいことと、倍率が小さいことの両方を備えているので、本発明にかかる対物レンズを用いれば広範囲を分解能よく撮像することができる。これにより、例えば移動する発光試料や広い範囲に分布する発光試料を撮像対象とすることができる。
【００１６】
また、本発明にかかる対物レンズは、当該対物レンズおよび／または当該対物レンズを包装する包装容器（パッケージ）に、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値（例えば０．０１以上）を表記した。これにより、例えば発光画像観察を行う者は、表記された（ＮＡ÷β）2の値を確認すれば、発光試料を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するのに適した対物レンズを容易に選択することができる、という効果を奏する。
【００１７】
さらに、本発明者は、同一シャーレ内で培養された複数の細胞において、遺伝子発現の変動パターンが異なることも発見した。さらに、本発明者が追究した光学的条件によれば、撮像装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できることも突き止めた。これらの発光画像を蓄積型の撮像装置により顕微鏡観察する発光解析システムを発光顕微鏡と呼ぶこととする。発光顕微鏡は、好ましくは遮光のための開閉蓋（ないし開閉窓）を具備する遮光手段を有し、この遮光手段の開閉によって必要な生体試料をセットまたは交換するようになっている。目的に応じて、生体試料を収容する容器に対して化学的ないし物理学的刺激を行う操作を手動ないし自動で行うようにしてもよい。後述する本発明の最良の一形態では、発光顕微鏡は公知または独自の培養装置を搭載している。培養装置は、長期間のシステム内での解析を可能にするように、温度、湿度、ｐＨ、外気成分、培地成分、培養液成分を最適に維持する機能を備えている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置の構成の一例を示す図である。
【図２】図２は、（ＮＡ／β）2の値を表記した対物レンズ２の一例を示す図である。
【図３】図３は、対物レンズを簡略に示した図である。
【図４】図４は、現在市販されている一般的な顕微鏡の対物レンズによる像の明るさ（ＮＡ／β）2の一例を示す図である。
【図５】図５は、実施例１で用いる対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）の条件を示した図である。
【図６】図６は、実施例２で用いる対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）の条件を示した図である。
【図７】図７は、実施例２において撮像したＨｅＬａ細胞の画像を示す図である。
【図８】図８は、実施例３で用いる対物レンズの開口数（ＮＡ）の条件を示した図である。
【図９】図９は、実施例３において撮像したＨｅＬａ細胞の画像を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例３で用いた対物レンズの（ＮＡ／β）2の値と図９に示す画像の発光強度との関係を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明にかかる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
【００２０】
本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置の構成について図１を参照して説明する。図１は、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置の構成の一例を示す図である。図１に示すように、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置は、撮像対象であるサンプル１を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するためのものであり、対物レンズ２と集光レンズ３とＣＣＤカメラ４とモニタ５とで構成されている。なお、当該装置は図示の如くズームレンズ６をさらに備えてもよい。
【００２１】
サンプル１は、発光試料であり、例えば、発光タンパク質（例えば導入された遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、ホラジン遺伝子など）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞や、発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の臓器や、発光性の個体（動物など）などである。また、サンプル１は、具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞でもよい。ここで、発光試料の元となる生物学的材料は、例えば、真核動物、シアノバクテリア由来の細胞または組織が挙げられる。医学用途において、哺乳類、とくにヒトにおける検査すべき部位からバイオプシーにより切除した細胞を含む試料がとくに例示される。再生医療においては、少なくとも一部が人工的に改良ないし合成された生体試料であって、生物学的活性を良好に維持するかどうかを検査する目的に利用できる。他の一面において、本発明のアッセイ対象は、動物由来の細胞または生体組織に限らず、植物や昆虫由来の細胞または生体組織であってもよい。菌、ウイルスにおいては、従来のルミノメーターでは実行されなかった容器内の部分ごとの解析が対象となり得る。ルミノメーターではウェルまたはシャーレ等の容器内に無数の試料（例えば１ウェル当り１００万個以上）を重積することで強大な発光量を迅速に得るようにしている。本発明では、肉眼では全く見えない個々の発光試料の画像を生成するので、個々の細胞が識別できる程度の密度で容器内に収容しても、個別の細胞ないし生体組織を解析できる。このような個別の解析は、発光している細胞だけを統計的に合計したり平均化する解析方法を含んでいる。これにより、細胞１個当りの正確な相互作用に関する評価が行なえる。また、多数の混在する発光試料において、同様の発光量ないし発光パターンを有する細胞群ないし組織領域を識別することが可能となる。サンプル１を収容する試料容器としては、シャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、フローセルが挙げられる。ここで、容器底面は、光透過性の材料（ガラス、プラスチックなど）であるのは勿論のこと、２次元的データが得られやすいように、幅広（ないし扁平）な底面を有する容器であるのがさらに好ましい。複数の収容部分を一体化したウェルやキュベットにおいては、各収容部分の仕切り部分が遮光性の材料ないし染料で全面的に成形するのが好ましい。また、シャーレ等の上部開口を有する容器については、蒸発防止用のフタを覆い被せるのが好ましく、さらにフタの内面が反射防止用の被膜ないし染色を施すのがＳ／Ｎ比を向上させる上で好ましい。このような硬質のフタの代わりに、容器内の試料の上面にミネラルオイルのような液状のフタを配置するようにしてもよい。試料容器を載置するための試料ステージを、一般の顕微鏡装置のように、Ｘ軸方向およびＹ軸方向に移動させるようにして、必要に応じて別の撮像用の視野に変更するようにしてもよい。対物レンズ２は、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上のものである。ここで、対物レンズ２は、サンプル１の下方に倒立形式で配置してもよい。対物レンズ２は、生きた発光試料を培養条件のような恒温環境で安定に機能するように適宜の加熱手段（ペルチェ素��、温風ヒーターなど）により加熱してもよい。対物レンズ２は、さらに、光軸方向であるＺ軸方向に駆動（図では上下方向）するようにしてもよい。Ｚ軸駆動機構が備えられており、対物レンズ２をＺ軸（光軸方向）に沿って自動的に駆動する。対物レンズ２のＺ軸駆動機構としては、ラックピニオン機構やフリクションローラー機構が例として挙げられる。また、対物レンズ２は、所望の倍率に応じて適宜、油浸式にすることができる。また、どの倍率を選択するかは、評価（ないし解析）すべき試料のサイズに応じて任意に設定する。具体的には、細胞や組織を観察できる程度の低倍率（例えば５倍から２０倍）や細胞内または細胞外の微小物質を観察できる程度の高倍率（例えば４０倍から１００倍）であり得る。集光レンズ３は、対物レンズ２を介して到達したサンプル１からの発光を集める。ＣＣＤカメラ４は、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラであり、対物レンズ２や集光レンズ３を介してサンプル１を撮像する。モニタ５はＣＣＤカメラ４で撮像した画像を出力する。また、モニタ５は、発光試料の画像情報を動画で表示する構成を具備することにより、１以上の所望の細胞に関する活性の変化をリアルタイムな映像でもって観察するような解析方法を提供するのが好ましい。これにより、細胞単位または組織単位での発光の様子を臨場感と躍動感有る映像でもって、時系列で観察することが可能となる。
【００２２】
そして、対物レンズ２や対物レンズ２の包装容器（パッケージ）には、（ＮＡ／β）2の値を表記する。ここで、（ＮＡ／β）2の値を表記した対物レンズの一例について図２を参照して説明する。図２は、（ＮＡ／β）2の値を表記した対物レンズ２の一例を示す図である。従来の対物レンズには、レンズ種類（例えば“ＰｌａｎＡｐｏ”）、倍率／ＮＡ油侵（例えば“１００×／１．４０ｏｉｌ”）および無限遠／カバーガラス厚（例えば“∞／０．１７”）が表記されていた。しかし、本発明にかかる対物レンズ（対物レンズ２）には、レンズ種類（例えば“ＰｌａｎＡｐｏ”）、倍率／ＮＡ油侵（例えば“１００×／１．４０ｏｉｌ”）、無限遠／カバーガラス厚（例えば“∞／０．１７”）の他に、さらに射出開口角（例えば、“（ＮＡ／β）2：０．０５”）が表記されている。
【００２３】
以上、説明したように、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置において、対物レンズ２は、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値が０．０１以上である。これにより、発光量の少ない発光試料（例えば、発光タンパク質（例えば、導入された遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞または発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の個体（例えば動物や臓器など）など）でも、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる。具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像対象として、鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる。また、対物レンズ２は、従来の対物レンズと比較して、開口数が大きく且つ倍率が小さいので、対物レンズ２を用いれば広範囲を分解能よく撮像することができる。これにより、例えば動きのある発光試料や移動する発光試料や広い範囲に分布する発光試料を撮像対象とすることができる。また、対物レンズ２は、当該対物レンズ２および／または当該対物レンズ２を包装する包装容器（パッケージ）に、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）2の値（例えば０．０１以上）を表記した。これにより、例えば発光画像観察を行う者は、表記された（ＮＡ÷β）2の値を確認すれば、発光試料を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するのに適した対物レンズを容易に選択することができる。
【００２４】
従来、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイにおいては、細胞を溶解した後に発光量を測定するため、ある時点での発現量しか捉えることができず、しかも細胞全体の平均値としての計測になってしまう。また、培養しながらの計測においては、細胞コロニーの経時的な発現量の変化を捉えることはできるが、個々の細胞での発現量の変化を捉えることはできない。そして、個々の細胞の発光を顕微鏡で観察するためには、生きた細胞からの発光量が極めて弱いため、液体窒素温度レベルの冷却ＣＣＤカメラで長時間露光したり、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラでフォトンカウンティングをしたりしなければならない。そのため、発光検出のカメラは高価で大掛かりなものになってしまう。しかし、レポーター遺伝子産物としてのルシフェラーゼ活性を示す個々の細胞の発光を顕微鏡によって観察する際、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、イメージ・インテンシファイアを装着することなく、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラを用いて定量的な画像を取得することができる。すなわち、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、生きた状態で個々の細胞の発光を０℃程度の冷却ＣＣＤカメラによって観察することができるので、イメージ・インテンシファイアやフォトンカウンティングのための装置が不要である。つまり、低コストで発光試料の撮像を行うことができる。また、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、個々の生きた細胞の発光を、培養しながら経時的に観察することができ、さらにリアルタイムに観察することもできる。また、本発明にかかる発光試料撮像方法を実施するための装置を利用すれば、同じ細胞について、異なった条件での薬剤や刺激の応答をモニタすることができる。
【００２５】
ここで、本発明にかかる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズの理解を容易にするために、従来の対物レンズおよびそれを用いた発光画像観察について簡単に説明する。
一般に、顕微鏡観察における空間分解能εは、下記数式１で表される。
ε＝０．６１×λ÷ＮＡ                  ・・・（数式１）
（数式１において、λは光の波長であり、ＮＡは開口数である。）
また、観察範囲の直径ｄは、下記数式２で表される。
ｄ＝Ｄ÷Ｍ                  ・・・（数式２）
（数式２において、Ｄは視野数であり、Ｍは倍率である。なお、視野数は一般に２２から２６である。）
従来、顕微鏡用対物レンズの焦点距離は国際規格で４５ｍｍとされていた。そして、最近では、焦点距離を６０ｍｍとする対物レンズが使われはじめている。この焦点距離を前提にしてＮＡが大きい、つまり空間分解能が高いレンズを設計すると作動距離（ＷＤ）は一般には０．５ｍｍ程度であり、また長ＷＤ設計のものでも８ｍｍ程度であった。このような対物レンズを用いた場合、観察範囲は０．５ｍｍ径程度である。
【００２６】
しかし、ディッシュやガラズボトムディッシュに分散した細胞群や組織、個体の観察を行う場合、観察範囲が１から数ｃｍに及ぶことがある。このような範囲を分解能よく観察したいときには、低倍率でありながらＮＡを大きい値で維持しなければならない。換言すると、ＮＡはレンズ半径と焦点距離との比であるので、ＮＡが大きいまま広い範囲を観察できる対物レンズは、低倍である必要がある。そして、結果的に、このような対物レンズは大口径となる。なお、大口径の対物レンズの製作では、一般的に光学材料の物性の均一性やコーティングの均一性において、また、レンズ形状においても高い精度が求められる。
【００２７】
また、顕微鏡観察の場合、光学系の透過率や対物レンズの開口数やＣＣＤカメラのチップ面での投影倍率やＣＣＤカメラの性能などが像の明るさに大きく影響してくる。そして、像の明るさは、開口数（ＮＡ）を投影倍率（β）で割った値の２乗、すなわち（ＮＡ／β）2で評価される。ここで、図３に示すように、対物レンズには、一般に、入射開口角ＮＡと射出開口角ＮＡ'との間に下記数式３の関係があり、ＮＡ'2が観察者の目やＣＣＤカメラなどに届く明るさを示す値である。
ＮＡ'＝ＮＡ÷β                  ・・・（数式３）
（数式３において、ＮＡは入射開口角（開口数）であり、ＮＡ'は射出開口角であり、βは投影倍率である。）
一般の対物レンズにおいて、ＮＡ'は高々０．０４であり、ＮＡ'2は０．００１６である。また、現在市販されている一般的な顕微鏡の対物レンズにおける像の明るさ（ＮＡ／β）2の値を調査したところ、図４に示すように、０．０００５から０．００２の範囲であった。
【００２８】
ところが、図４に示す現在市販されている対物レンズを装着した顕微鏡を用いて、例えば細胞内でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ発光している細胞を観察しても、当該細胞からの発光を目視で観察することができないし、さらに０℃程度に冷却したＣＣＤカメラを用いて撮像した発光画像を観察しても細胞からの発光を確認することができない。なお、発光試料を観察する場合には、蛍光観察に必要な励起光の投影は不要である。例えば、落射蛍光観察では、対物レンズは、励起光投影レンズと蛍光を集光して画像を形成するレンズとの両方の機能を満たしている。
そこで、光量の少ない発光を画像で観察するためには、大きなＮＡと小さいβの特性を有する対物レンズが必要である。そして、結果的に、当該対物レンズは大口径となる傾向がある。なお、このような対物レンズでは、励起光投影の機能を考慮することなく機能を単純化して設計、製造しやすくすることが求められる。
【００２９】
また、発光や蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子の動的な機能発現を捉えるためにタイムラプスや動画撮像が求められている。最近では、蛍光を利用したタンパク質１分子の動画観察が行われている。これらの撮像では単位時間の撮像フレーム数が多いほど画像１フレームあたりの露出時間は短くなる。このような観察においては、明るい光学系、特に、明るい対物レンズが必要となる。しかし、蛍光に比べて発光タンパク質の光量は少ないので、１フレームの撮像に、例えば２０分の露出時間を要することが多い。このような露出時間でタイムラプス観察を行うには動的な変化が非常に遅い試料に限られる。例えば、約１時間に一度分裂する細胞では、その周期内の変化を観察することはできない。従って、シグナル・ノイズ比を高く維持しながら少ない光量を効率よく画像化するために、光学系の明るさを向上することは重要である。
【００３０】
以上の経緯を踏まえて製作された本発明の対物レンズは、一般に市販されている対物レンズ（例えば図４参照）に比べて、大きなＮＡと小さいβの特性を有している。よって、本発明の対物レンズのＮＡ'2は大きな値である。つまり、本発明の対物レンズは明るい対物レンズであると言うことができる。これにより、本発明の対物レンズのような明るい対物レンズを用いれば、光量の少ない発光試料からの発光を画像で観察することができる。また、より暗い像を観察するために、開口数の大きい本発明の対物レンズを実体顕微鏡に装着することで、イメージ・インテンシファイアを装着することなく、０℃程度に冷却したＣＣＤカメラでも、細胞の発光を画像で観察することができる。また、液体窒素冷却を用いるＣＣＤカメラで感度を上げる方法があるが、この場合ＣＣＤカメラが非常に高価に、大規模になる。また、単に感度のみを高めると外来ノイズも増えるので、高Ｓ／Ｎ比による測定は難しい。しかし、本発明の対物レンズを用いれば、ペルチェ冷却によるＣＣＤカメラでも、細胞の発光を画像で観察することができるので、外来ノイズ（例えば宇宙線）によるＳ／Ｎ比低下を招くことなく正確に発光測定できる。また、本発明の対物レンズは、例えば５〜１０ｃｍ程度の大口径である。これにより、従来では撮像対象となり得なかった移動する発光試料や広い範囲、例えば５〜５０ｍｍ径、好ましくは例えば１０〜３０ｍｍ径相当の領域に分布する発光試料などを撮像対象とすることができる。かかる広い観察範囲は、対物レンズの倍率やズーミング機構によって、自在に調節することが可能である。
【００３１】
以上の本発明の方法および装置は、必要とする装置構成を制御したり連携するためのソフトウェアまたは該ソフトウェアを特徴づけるコンピュータプログラムの形態で提供されてもよい。また、本発明の方法または装置を装置と同一ないし別個に配置されたデータベースと電気的に接続することにより、画像容量ないし解析情報量に制限されることなく、高速で且つ信頼性と質の高い解析結果を提供することが可能になる。
【実施例１】
【００３２】
本実施例１では、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光を画像で観察することができるような対物レンズの（ＮＡ／β）2の条件を検討した。
【００３３】
本実施例１における撮像対象（上述した実施の形態におけるサンプル１）は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子“ｐＧＬ３  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ”（プロメガ社（会社名））をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞である。なお、当該ＨｅＬａ細胞の発光画像観察にあたり、ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクション後１日培養してハンクス平衡塩類溶液で洗浄した後、１ｍＭのルシフェリンを含むハンクス平衡塩類溶液に置換した。本実施例１で用いた対物レンズ（上述した実施の形態における対物レンズ２）の開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）の条件は図５に示す通りである。図５は、実施例１で用いる対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）の条件を示した図である。図５に示すように、対物レンズのＮＡは０．０７４から０．４の値であり、対物レンズのβは０．２７から１．５の値である。本実施例１で用いたＣＣＤカメラ（上述した実施の形態におけるＣＣＤカメラ４）は０℃の冷却ＣＣＤカメラであり、当該ＣＣＤカメラの画素数は７６５×５１０、画素サイズは９μｍ×９μｍ、チップの面積は６．８９×４．５９（ｍｍ2）、量子効率は５５０ｎｍで５５％の仕様である。なお、本実施例１において、ＨｅＬａ細胞の撮像は、用いる装置（例えば図１参照）全体を暗幕で覆った状態で行われた。
【００３４】
本実施例１では、図５に示すように、検討した全ての（ＮＡ／β）2の条件で発光画像観察が可能であることが示された。これにより、（ＮＡ／β）2が０．０７１以上の対物レンズを用いれば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光画像観察が可能であることが示された。
【実施例２】
【００３５】
本実施例２では、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光を画像で観察することができるような対物レンズの（ＮＡ／β）2の条件を、異なる露出時間で検討した。
【００３６】
本実施例２における撮像対象は上述した実施例１と同じである。また、本実施例２で用いた対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）の条件は、図６に示す通りである。図６は、実施例２で用いる対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）の条件を示した図である。なお、本実施例２で用いた対物レンズは、上述した実施例１における図５に記載の“０．４Ｘ”、“０．８３Ｘ”および“１．５Ｘ”に対応するものである。また、本実施例２で用いたＣＣＤカメラは上述した実施例１と同じである。そして、露出時間は、図６に示すように、１分間または５分間である。なお、上述した実施例１と同様、本実施例２においても、ＨｅＬａ細胞の発光画像撮像は、用いる装置全体を暗幕で覆った状態で行われた。
【００３７】
本実施例２では、図７に示すように、“０．４Ｘ”の対物レンズを用いて５分間の露出時間で撮った画像Ａ、“０．８３Ｘ”の対物レンズを用いて５分間の露出時間で撮った画像Ｂ、“１．５Ｘ”の対物レンズを用いて５分間の露出時間で撮った画像Ｃおよび“１．５Ｘ”の対物レンズを用いて１分間の露出時間で撮った画像Ｄの全ての画像において、発光画像観察が可能である。これにより、（ＮＡ／β）2が０．０７１以上の対物レンズを用いる場合、露出時間が１分間でも、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光画像観察が可能であることが示された。
【実施例３】
【００３８】
本実施例３では、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光を画像で観察することができるような対物レンズの（ＮＡ／β）2の条件を、さらに高倍率にして検討した。
【００３９】
本実施例３における撮像対象は上述した実施例１または実施例２と同じである。また、本実施例３で用いた対物レンズは、オリンパス社製の“ＵＡｐｏ４０Ｘ  Ｏｉｌ  Ｉｒｉｓ”である。なお、対物レンズの開口数（ＮＡ）の条件は図８に示す通りであり、各開口数（ＮＡ）は対物レンズの絞り環を変えることによって設定した。図８は、実施例３で用いる対物レンズの開口数（ＮＡ）の条件を示した図である。図８に示すように、開口数（ＮＡ）の値は０．６５から１．３５である。そして、対物レンズ（Ａ〜Ｅ）の投影倍率（β）の値は、集光レンズですべて８倍に設定した。よって、図８に示すように、対物レンズの（ＮＡ／β）2の値は、０．００７から０．０２８まで変動する。また、本実施例３で用いたＣＣＤカメラはオリンパス社製の“ＤＰ３０ＢＷ”で、その動作温度は５℃、画素数は１３６０×１０２４、画素サイズは６μｍ×６μｍ、チップの面積（ｍｍ2）は１３．８×９．１８である。そして、露出時間は２分間である。なお、上述した実施例１および実施例２と同様、本実施例３においても、ＨｅＬａ細胞の撮像は、用いる装置全体を暗幕で覆った状態で行われた。
【００４０】
本実施例３では、図９に示すように、ＮＡが０．８３から１．３５の対物レンズで撮った画像Ｂから画像Ｅについては、容易にＨｅＬａ細胞の発光を確認することができた。つまり、図９の画像Ｂから画像Ｅまでは容易に発光が観察できた。一方、ＮＡが０．６５の対物レンズで撮った画像Ａについては、定量的に発光を確認することが困難であった。なお、図９で示した各画像は、４０倍の対物レンズ（オリンパス社製の“ＵＡｐｏ４０Ｘ  Ｏｉｌ  Ｉｒｉｓ”）の絞り位置を変えることによりそのＮＡを０．６５から１．３５まで段階的に変えて撮像したものである。これにより、露出時間が２分間である場合、（ＮＡ／β）2の値が０．０１以上であればルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞の発光画像観察が可能であることが示された。
【００４１】
ここで、実施例３で用いた（図８に示す）対物レンズの（ＮＡ／β）2の値と図９に示す画像（画像Ａ、画像Ｂおよび画像Ｃ）の発光強度との関係（図１０参照）から、細胞の発光画像観察に適する対物レンズの（ＮＡ／β）2の条件を検討した。図１０は、図９に示す画像（画像Ａ、画像Ｂおよび画像Ｃ）の発光強度を、対物レンズの（ＮＡ／β）2の値を横軸にとってプロットした図である。なお、発光強度とは、発光して明るい領域を含む規定された領域（例えば、図９の画像Ａにおいて四角で示した領域）全体からの光強度（ＣＣＤカメラの出力値）から、発光して明るい領域を含まず（発光せず暗い領域を含み）且つ前記規定された領域の面積と同じ面積を持つ領域全体からの光強度（ＣＣＤカメラの出力値）を差し引いたものである。
図１０に示すように、図９の画像Ａの発光強度と画像Ｂの発光強度との間に有意差があること、および図９の画像Ｂの発光強度と画像Ｃの発光強度との間に有意差があることを、各画像の発光強度のばらつき（画像の発光強度が取り得る範囲）に基づいて定量的に検出することができた。また、図１０において図９の画像Ａの発光強度は負の値も含むので、図９の画像Ａは発光画像観察に適さないことが図１０から分かる。したがって、以上の検討から、対物レンズの（ＮＡ／β）2の値が０．０１以上であれば、充分且つ確実に細胞の発光画像観察を行うことができることが示された。つまり、細胞の発光画像観察に適する対物レンズの（ＮＡ／β）2の値は０．０１以上であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上のように、本発明にかかる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズは、例えば、ルシフェラーゼなどの発光遺伝子をレポーター遺伝子とし、遺伝子発現を制御するプロモーターやエンハンサーの解析や、転写因子などのエフェクター遺伝子や様々な薬剤の効果などを調べるレポーターアッセイにおいて、好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００４３】
１  サンプル
２  対物レンズ
３  集光レンズ
４  ＣＣＤカメラ
５  モニタ
【図１】
2015018266.tif 000003
【図２】
2015018266.tif 000004
【図３】
2015018266.tif 000005
【図４】
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【図５】
2015018266.tif 000007
【図６】
2015018266.tif 000008
【図８】
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【図１０】
2015018266.tif 000010
【図７】
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【図９】
2015018266.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月26日(2014.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の細胞の遺伝子発現を解析する解析方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする解析方法：
発光タンパク質の遺伝子を細胞に導入する工程、
前記遺伝子を導入した細胞を、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）２の値が０．０１以上である光学条件下で前記細胞を撮像して発光画像を得る工程、
前記発光画像に基づき画像情報を処理する工程であって、前記細胞に対応する限定された領域の輝度情報を得る工程、
ここで輝度情報は前記ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を表す。
【請求項２】
前記細胞は、培養細胞であり、
さらに該培養細胞を培養する培養工程を含む請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
前記撮像は、前記培養工程期間中に時系列で実行される請求項２に記載の解析方法。
【請求項４】
前記細胞は、前記光学条件を満たす対物レンズを有する顕微鏡下に配置される請求項１〜３のいずれか１つに記載の解析方法。
【請求項５】
前記撮像は遮光された状態で実行される請求項１〜４のいずれか１つに記載の解析方法。