(57)【要約】      （修正有）【課題】インシュリンレセプターへの結合によって媒介されるインシュリンの有糸分裂促進特性に影響を及ぼさない過剰増殖性疾病、特に癌の処置方法の提供。【解決手段】ヒトインシュリンには結合せずに、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−１レセプターへのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の結合を妨げ、そしてＩＧＦ−１レセプターにより媒介されるシグナル伝達が阻害するように、ヒトＩＧＦ−１に結合し、ＩＧＦ−２と交差反応する抗体分子、特に完全なヒト抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）ＩＧＦ−１レセプターへのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合が妨げられ、そして
ｉｉ）ＩＧＦ−１レセプターにより媒介されるシグナル伝達が阻害されるように、
ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合し、
ｂ）マウスおよびラットのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合し、
ｃ）ヒトインシュリンには結合しない、
単離ヒト抗体分子であって、前記抗体分子は、
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗体分子；
ｉｉ）配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）および配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号１４（ＣＤＲ１）、配列番号１５（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗体分子；
ｉｉｉ）配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）および配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗体分子
を含む群から選択される、前記単離ヒト抗体分子。
【請求項２】
前記抗体分子が、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗ＩＧＦ抗体分子。
【請求項３】
前記抗体分子が、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）および配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号１４（ＣＤＲ１）、配列番号１５（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗ＩＧＦ抗体分子。
【請求項４】
前記抗体分子が、配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）および配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗ＩＧＦ抗体分子。
【請求項５】
配列番号８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を有する、請求項１ｉ）または２の抗体分子。
【請求項６】
配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する、請求項１ｉ）、２または５の抗体分子。
【請求項７】
配列番号１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を有する、請求項１ｉｉ）または３の抗体分子。
【請求項８】
配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する、請求項１ｉｉ）、３または７の抗体分子。
【請求項９】
配列番号２８のアミノ酸配列を含む可変重鎖を有する、請求項１ｉｉｉ）または４の抗体分子。
【請求項１０】
配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する、請求項１ｉｉｉ）、４または９の抗体分子。
【請求項１１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１２】
前記重鎖定常領域が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１である、請求項１１の抗体分子。
【請求項１３】
軽鎖定常領域がＩｇλである、請求項１〜１０のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１４】
軽鎖定常領域が配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１３の抗体分子。
【請求項１５】
ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、および
ｂ）配列番号３６のアミノ酸を含む軽鎖、
を有する、請求項５または６の抗体分子。
【請求項１６】
ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖、および
ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する、請求項７または８の抗体分子。
【請求項１７】
ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖、および
ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する、請求項９または１０の抗体分子。
【請求項１８】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または単鎖Ｆｖフラグメントである、請求項１〜１０のいずれか１項の抗体分子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子の可変重鎖もしくは可変軽鎖をコードするＤＮＡ分子、またはそのフラグメントもしくは変異体。
【請求項２０】
それぞれ請求項５、７または９において定義した抗体の可変重鎖をコードする、それぞれ配列番号７、１７または２７のヌクレオチド配列を有する、請求項１９のＤＮＡ分子。
【請求項２１】
それぞれ請求項６、８または１０において定義した抗体の可変軽鎖をコードする、それぞれ配列番号９、１９または２９のヌクレオチド配列を有する、請求項１９のＤＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子の可変重鎖および／または可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号７および／または配列番号９のヌクレオチド配列を含むか、あるいは配列番号１７および／または配列番号１９の配列を含むか、あるいは配列番号２７および／または配列番号２９の配列を含む、ＤＮＡ分子を含む、請求項２２の発現ベクター。
【請求項２４】
それぞれ可変重鎖および／または可変軽鎖をコードするＤＮＡ分子に連結した、それぞれ定常重鎖および／または定常軽鎖をコードするＤＮＡ分子をさらに含む、請求項２２または２３の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２、２３または２４の１つ以上の発現ベクターを有する宿主細胞。
【請求項２６】
哺乳動物細胞である、請求項２５の宿主細胞。
【請求項２７】
哺乳動物宿主細胞を請求項２２〜２４の１つ以上のベクターを用いてトランスフェクションすること、宿主細胞を培養すること、そして抗体を回収および精製することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項の抗体を作製するための方法。
【請求項２８】
請求項２２〜２４の１つ以上のベクターを含む哺乳動物宿主細胞を得ること、そして宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項の抗体を作製するための方法。
【請求項２９】
前記抗体を回収および精製することをさらに含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
医薬に使用するための請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子。
【請求項３１】
白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む造血系の癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌および胆嚢癌および胆管癌、特に肝細胞癌を含む胃腸管の癌；腎臓癌、前立腺癌および膀胱癌；乳癌、卵巣癌、子宮頚癌および子宮体癌を含む婦人科の癌；悪性黒色腫を含む、皮膚癌および頭頸部癌；ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫およびユーイング肉腫のような小児癌；神経膠芽腫のような脳癌；骨肉腫、軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫のような肉腫；肺癌、特に非小細胞肺癌；中皮腫および甲状腺癌から選択される癌性疾病の処置のための医薬品の調製のための請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子の使用。
【請求項３２】
前記医薬品は、白金ベースの化学療法、特にパクリタキセル／カルボプラチンまたはジェムシタビン／シスプラチンの白金２剤併用療法、ソラフェニブ、あるいはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、オーロラＢ、Ｐｌｋ１、ＰＩ３キナーゼ、またはｍＴｏｒの阻害剤の群から選択される化合物と組み合わせて使用される、請求項３１の使用。
【請求項３３】
請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項３４】
ａ）ＤＮＡ損傷剤、
ｂ）癌細胞におけるシグナル伝達経路または有糸分裂チェックポイントを阻害する治療的に活性な化合物、
ｃ）抗糖尿病薬
から選択される、１つ以上の追加の治療剤をさらに含む、請求項３３の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記の１つ以上の化合物ｂ）が、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、オーロラＢ、Ｐｌｋ１、ＰＩ３キナーゼ、またはｍＴｏｒの阻害剤の群から選択される、請求項３４の薬学的組成物。
【請求項３６】
白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む造血系の癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌および胆嚢癌および胆管癌、特に肝細胞癌を含む胃腸管の癌；腎臓癌、前立腺癌および膀胱癌；乳癌、卵巣癌、子宮頚癌および子宮体癌を含む婦人科の癌；悪性黒色腫を含む、皮膚癌および頭頸部癌；ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫およびユーイング肉腫のような小児癌；神経膠芽腫のような脳癌；骨肉腫、軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫のような肉腫；肺癌、特に非小細胞肺癌；中皮腫および甲状腺癌から選択される癌性疾病の処置のための請求項３３〜３５のいずれか１項の薬学的組成物。
【請求項３７】
白金ベースの化学療法、特にパクリタキセル／カルボプラチンまたはジェムシタビン／シスプラチンの白金２剤併用療法、ソラフェニブ、あるいはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、オーロラＢ、Ｐｌｋ１、ＰＩ３キナーゼ、またはｍＴｏｒの阻害剤の群から選択される化合物と組み合わせてさらに使用される、請求項３６の薬学的組成物。
【請求項３８】
白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む造血系の癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌および胆嚢癌および胆管癌、特に肝細胞癌を含む胃腸管の癌；腎臓癌、前立腺癌および膀胱癌；乳癌、卵巣癌、子宮頚癌および子宮体癌を含む婦人科の癌；悪性黒色腫を含む、皮膚癌および頭頸部癌；ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫およびユーイング肉腫のような小児癌；神経膠芽腫のような脳癌；骨肉腫、軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫のような肉腫；肺癌、特に非小細胞肺癌；中皮腫および甲状腺癌から選択される癌性疾病に罹患した患者に、請求項３３〜３５のいずれか１項の有効量の薬学的組成物を投与することを含む、前記患者を処置するための方法。
【請求項３９】
追加的に、有効量のパクリタキセル／カルボプラチンまたはジェムシタビン／シスプラチン、ソラフェニブ、あるいはＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、オーロラＢ、Ｐｌｋ１、ＰＩ３キナーゼまたはｍＴｏｒの阻害剤の群から選択される化合物が患者に投与される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
哺乳動物細胞に請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子を投与することを含み、これによりＩＧＦ−１レセプターによって媒介されるシグナル伝達並びにＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によって媒介される増殖および抗アポトーシスが阻害される、前記細胞におけるＩＧＦ−１レセプターへのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合を阻害するための方法。
【請求項４１】
哺乳動物細胞に請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子を投与することを含み、これによりインシュリンレセプターＩＲ−Ａによって媒介されるシグナル伝達が阻害され、そしてＩＧＦ−２によって媒介される増殖および抗アポトーシスが阻害される、前記細胞におけるインシュリンレセプターＩＲ−ＡへのＩＧＦ−２の結合を阻害するための方法。
【請求項４２】
前記投与がin vitroにおいて行なわれる、請求項４０または４１の方法。
【請求項４３】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合する抗体分子を用いての癌患者の処置の有効性をモニタリングするための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記患者の生体試料中の、全ＩＧＦ−１レベルを測定すること、
（ｂ）前記患者に前記抗ＩＧＦ抗体分子を投与すること、
（ｃ）前記患者の生体試料中の全ＩＧＦ−１レベルを測定すること（ここで、工程（ａ）において測定した全ＩＧＦ−１レベルと比較した、全ＩＧＦ−１レベルの増加量は、前記患者がどの程度、前記抗ＩＧＦ抗体分子を用いての処置に応答するかを示す）
を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記抗体分子が、請求項１〜１８のいずれか１項の抗体分子である、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記抗体分子が、ヒトＩＧＦ−１（配列番号４３）のアミノ酸配列LCGAELVDALQFVCGDR（配列番号４１）およびCCFRSCDLRRLEM（配列番号４２）を含むＩＧＦ−１内の非線形エピトープと結合する、抗ＩＧＦ抗体分子。
【請求項４６】
前記抗体分子が、ヒトＩＧＦ−１（配列番号４３）のアミノ酸配列LCGAELVDALQFVCGDR（配列番号４１）内の少なくとも８アミノ酸、およびアミノ酸配列CCFRSCDLRRLEM（配列番号４２）内の少なくとも１０アミノ酸と接触する、請求項４５の抗ＩＧＦ抗体分子。
【請求項４７】
前記抗体分子が、Ｘ線結晶学的手法によって決定したところ、ヒトＩＧＦ−１（配列番号４３）のLeu (5)、Cys (6)、Glu (9)、Leu (10)、Asp (12)、Ala (13)、Phe (16)、Val (17)、Arg (21)、Cys (47)、Cys (48)、Phe (49)、Ser (51)、Cys (52)、Asp (53)、Leu (54)、Arg (55)、Leu (57)、およびGlu (58)と接触する、請求項４５または請求項４６の抗ＩＧＦ抗体分子。
【請求項４８】
請求項４、９、１０または１７のいずれか１項の抗体分子である、請求項４５〜４７のいずれか１項の抗ＩＧＦ抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過剰増殖性疾病の療法、特に癌の療法に関する。
【０００２】
発明の背景
インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１；７０アミノ酸ポリペプチド）およびインシュリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２；６７アミノ酸ポリペプチド）は、多くの哺乳動物細胞の成長を強力に刺激することのできる、血清中に存在する７．５ｋＤの可溶性因子である(Pollack et al., 2004によって概説されている)。ＩＧＦは、血流中に分泌されるとＩＧＦＢＰと複合体を形成し、このＩＧＦＢＰは、ＩＧＦのターゲット組織へ向かう途中の血清中におけるタンパク質分解からＩＧＦを保護しそしてＩＧＦレセプターとのその会合を妨げる。ＩＧＦはまたターゲット組織自体においても自己分泌的にまたはパラ分泌的に分泌されることが知られている。これは正常な胎児の発育中にも起こることが知られており、ＩＧＦは、組織、骨および臓器の成長において重要な役割を果たす。それはまた多くの癌組織においても見られ、この場所においては、腫瘍細胞と間質細胞との間のパラ分泌シグナル伝達、または腫瘍細胞自体による自己分泌的なＩＧＦの産生が行なわれていると考えられている(LeRoith D, 2003によって概説されている)。
【０００３】
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、多くの正常組織上に発現されるＩＧＦ−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）（これは機能的に、二量体化したαサブユニットとβサブユニットからなる４６０ｋＤのヘテロ四量体である）に、類似した親和性で結合することができる(Rubin et al., 1995)。ＩＧＦ−２はまたＩＧＦ−２レセプターにも結合することができ、これはＩＧＦ−２が、ＩＧＦ−１Ｒに結合しＩＧＦ−１Ｒを通してシグナル伝達することを妨げると考えられている。この点から、ＩＧＦ−２Ｒは腫瘍抑制タンパク質であることが実証された。ＩＧＦ−１Ｒは、インシュリンレセプターと構造的に類似し、インシュリンレセプターは２つの形態ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂで存在し、これらはＩＲ−Ａの細胞外ドメインにおける選択的にスプライシングされた１２アミノ酸のエキソンの欠失が存在するか否かにより相違する。ＩＲ−Ｂは、大半の正常な成人組織において発現される優勢なＩＲアイソフォームであり、この場所で代謝におけるインシュリンの作用を媒介するように作用する。一方、ＩＲ−Ａは、発達中の胎児組織において高度に発現され、成人の正常な組織においては発現されないことが知られている。近年の研究はまた、ＩＲ−Ａはいくつかの癌において高度に発現されているが、ＩＲ−Ｂは発現されないことを示した。ＩＲ−Ａにおけるエキソンの欠失は、インシュリンの結合に対しては全く影響を及ぼさないが、ＩＧＦ−２がＩＲ−Ｂに対してよりもはるかに高い親和性で結合することを可能とする小さなコンフォメーション変化を引き起こす(Frasca et al., 1999; Pandini et al., 2002)。従って、癌組織におけるその発現およびＩＧＦ−２に結合する傾向の増加のために、ＩＲ−Ａは、癌におけるＩＧＦ−２の有糸分裂促進作用を媒介することでＩＧＦ１−Ｒと同じくらいに重要であり得る。
【０００４】
ＩＧＦ−１ＲへのＩＧＦの結合は、複雑な細胞内シグナル伝達カスケードを引き起こし、これにより増殖および生存を刺激するタンパク質が活性化される(Pollack et al., 2004によって概説されている)。
【０００５】
ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２ｎｅｕレセプターとは異なり、癌におけるＩＧＦ１−ＲまたはＩＲ−Ａレセプターの増幅は知られておらず、このことは、レセプターの活性化が活性リガンドの存在によって制御されていることを示す。多くの異なる癌タイプの発達、進行および転移におけるＩＧＦの役割を示す非常に多くの科学的、疫学的および臨床的な文献が存在する(Jerome et al., 2003;およびPollack et al., 2004によって概説されている)。
【０００６】
例えば、結腸直腸癌においては、ＩＧＦ−２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が、隣接する正常組織と比較して、結腸直腸の臨床腫瘍標本においては上昇している(Freier et al., 1999; Li et al., 2004)。また、結腸直腸新生物を有する患者では血清中ＩＧＦレベル上昇と増殖細胞指数には正の相関が見られる(Zhao et al., 2005)。さらに、血中の上昇したＩＧＦ−２レベルは、結腸直腸癌および腺腫を発症するリスクの増加と相関する(Renehan et al., 2000a)およびb); Hassan et al., 2000)。ＩＧＦ−２の発現上昇をもたらす後成的変化であるＩＧＦ−２遺伝子の親のインプリンティング消失（ＬＯＩ）は、結腸直腸腫瘍および他の腫瘍タイプを有する患者において近年同定された遺伝性の分子的特徴である。ＩＧＦ−２インプリンティング消失は、結腸直腸新生物(Cui et al., 2003; Cruz-Correa et al., 2004)および腺腫(Woodson et al., 2004)の５倍のリスクを伴うことが示された。ＩＧＦの結合を阻害しそしてレセプターに内部移行するＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットをターゲティングする抗体は、ＣＯＬＯ２０５などの異種移植された結腸癌由来細胞株の成長を遅延させることが示された(Burtrum et al., 2003)。
【０００７】
上昇したＩＧＦレベルは、ヒト肺腺癌の予後不良に関連しており(Takanami et al., 1996)、そしてＩＧＦは、多くのＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ由来細胞株によって発現および分泌される(Quinn et al., 1996)。ＩＧＦ−２のトランスジェニック過剰発現は、マウスモデルにおいて自然発生的に肺腫瘍を誘発する(Moorhead et al., 2003)。肝細胞癌（ＨＣＣ）に関しては、ＨＣＣのヒト臨床標本および動物モデルは、対応する正常組織よりも高いレベルのＩＧＦのｍＲＮＡおよびタンパク質を発現し、そしてこれは増加した腫瘍増殖と相関している(Wang et al., 2003; Ng et al., 1998)。ＩＧＦ−２はまたＨＣＣの血清学的マーカーであることが示され、対照と比較してＨＣＣ患者の血清中においてはレベルが上昇している(Tsai et al., 2005)。
【０００８】
ユーイング肉腫および横紋筋肉腫などの多くの小児固形腫瘍は、その増殖に関してＩＧＦシグナル伝達経路に特に依存しているようである(Scotlandi et al., 1996)。ＩＧＦ−２遺伝子のＬＯＩは、胎児性横紋筋肉腫の発生において主要な遺伝子的事象として関与している(Fukuzawa et al., 1999)。１型ＥＷＳ−ＦＬＩ１キメラ転写因子が、ＩＧＦリガンドおよびＩＧＦ−１Ｒを含むターゲット遺伝子の発現上昇並びにＩＧＦＢＰ−３の発現低下をもたらす染色体転座を通して発現される場合には、自己分泌ＩＧＦシグナル伝達もまた、ユーイング肉腫の増殖に強く影響すると考えられる。ＩＧＦ−１Ｒをターゲティングする抗体および小分子化合物が、異種移植された小児固形腫瘍に由来する細胞株の増殖を減少させることが示された(Kolb et al., 2008; Manara et al., 2007)。
【０００９】
ＩＧＦリガンド特異的抗体を使用して、ＳＣＩＤマウスに移植された成人ヒト骨内におけるヒト前立腺癌細胞の増殖を阻害することができることが実証された(Goya et al., 2004)。さらに、同じＩＧＦリガンド抗体は、ＩＧＦのパラ分泌供給を遮断し、そしてマウス異種移植系におけるヒト結腸直腸癌細胞の肝転移を抑制することができたことが実証された(Miyamoto et al., 2005)。
【００１０】
また、ＩＧＦシグナル伝達系が、化学療法剤および照射に対する癌の感受性を低下させることを示唆するかなりの数の証拠が存在する。この点に関する最も早期の所見の１つは、ＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウス胚が、ウイルスによる形質転換、発癌遺伝子および過剰発現された成長因子レセプターに抵抗性を有するという(Sell et al., 1993; Sell et al., 1994)、そして、ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現が、ＵＶ照射およびγ線照射により誘発されたアポトーシスから細胞を保護するという(Kulik et al., 1997)実証であった。さらに、大量のＩＧＦ−２を分泌する肝腫瘍細胞株を使用して、ＩＧＦ−２の中和が、in vitroにおいて特により低い細胞分裂停止用量のシスプラチンおよびエポトシドなどの化学療法剤に対する応答を有意に増加させることが判明し、このことは、ＩＧＦ−２が化学療法剤に対する感受性を低下させている可能性があることを示唆する(Lund et al., 2004)。これらの所見と一致して、ＩＧＦ−１Ｒをターゲティングする抗体は、化学療法薬および照射による増殖阻害に対する腫瘍異種移植片の感受性を増加させることが実証された(Goetsch et al., 2005)。
【００１１】
ヒトＩＧＦ−１およびヒトＩＧＦ−２への交差反応的結合を示す多くの抗体が報告されている。抗体ｓｍ１．２は、ヒトＩＧＦ−１に対して産生され、そしてヒトＩＧＦ−２に対して４０％の交差反応性を示し、そして２０ng/mlのヒトＩＧＦ−１を用いて刺激されたマウス線維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を阻害することが示された(Russell et al., 1984)。完全ＩＧＦ−１タンパク質および前記タンパク質の一部に対するモノクローナル抗体を産生することによってＩＧＦ−１を機能的にエピトープマッピングするように設計された研究において、ＩＧＦ−２と交差反応する多くの抗体が同定された(Manes et al., 1997)。ＩＧＦ−２との交差反応率は０〜８００％の範囲であり、そしてＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に同等に反応性であるいくつかの抗体が同定された。ＫＭ１４８６は、ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２と交差反応するラットモノクローナル抗体であり、そしてＫＭ１４８６は、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全マウスに移植されたヒト成人骨内におけるヒト前立腺癌細胞の増殖を阻害することができることが実証された(Goya et al., 2004)。さらに、ＫＭ１４８６は、ヒト結腸直腸癌の肝臓への転移を抑制することが実証された(Miyamoto et al., 2005)。ＫＭ１４８６はまた、WO 03/093317、JP 2003-310275、WO 2005/018671、WO 2005/028515、およびWO 2005/027970において記載されている。
【００１２】
ヒト疾病の処置のために、投与された抗体を体内から急速に排除し、これにより治療効果を低減させるヒト抗抗体反応および中和抗体を生成するリスクを最小限にするために、完全なヒト配列を有する抗体が非常に望ましい。従って、癌の発生および進行におけるＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２依存性のシグナル伝達の役割を考慮に入れると、完全なヒト抗体を得ることが望ましくなる。WO 2007/070432は、両方のリガンドの有糸分裂促進作用を同時に中和する完全なヒト抗体を記載している。
【００１３】
本発明の目的は、高い親和性を有する代替的なヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ＩＧＦ−１に対して高い親和性を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に対して高い親和性を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に対する適切な相対的な親和性を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、ＩＧＦ−２よりもＩＧＦ−１に対してより高い親和性を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、高いＩＧＦ−１中和効力を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、高いＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２中和効力を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、高い溶解性および安定性を有するヒト抗ＩＧＦ抗体を提供することであった。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、インシュリンのそのレセプターへの結合に影響を及ぼさない抗体を得ることであった。
【００２２】
治療剤の臨床開発は、薬物活性の薬力学的バイオマーカーによってサポートされる。ＩＧＦ−１Ｒをターゲティングする抗体を用いての臨床研究は、血清中全ＩＧＦ−１レベルの増加が、これらの薬剤のための有用な薬力学的マーカーであり得ることを実証した(Pollack et al., 2007)。血清中全ＩＧＦ−１レベルの増加の理由は、肝臓からＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰの両方を放出させる下垂体成長ホルモン（ＧＨ）分泌が関与するフィードバック機序に起因するようである。実際に、ヒトにおいて、全ＩＧＦ−１レベルの約１％にしか相当しない遊離または生物活性ＩＧＦ−１が、フィードバック応答を決定することが実証された(Chen et al., 2005)。
【００２３】
それ故、本発明のさらなる目的は、発生および／または進行においてＩＧＦが原因的に関与している疾病の処置のために、療法の有効性を薬理学的にモニタリングすることを可能とするバイオマーカーを伴う療法を提供することであった。
【００２４】
本発明の実験において、血清中全ＩＧＦ−１レベルは、本発明の抗ＩＧＦ抗体を適用すると上昇することを実証することができた。従って、全ＩＧＦ−１レベルは、抗ＩＧＦ抗体を用いての療法の有効性についての有用な薬力学的マーカーである。それ故、薬力学的効果をすでに前臨床的に試験することができるように、本発明の抗体は、例えばマウスまたはラットなどの適切な動物種に由来するＩＧＦと交差反応することが非常に有益である。
【００２５】
「全ＩＧＦ−１レベル」とは、血清結合タンパク質に結合したＩＧＦ−１と遊離（結合していない）ＩＧＦ−１の量を含む、血漿中または血清中のＩＧＦ−１の合わせた量をいう。
【００２６】
それ故、さらなる態様において、本発明は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合する抗体分子を用いての癌患者の処置の有効性を決定するための方法に関する。このような方法において、第一の工程では、例えば血清または血漿などの患者の生体試料中の全ＩＧＦ−１レベルを測定する。次に、抗体分子を投与し、その後、治療抗体がその効果を発揮することを可能とするに十分な期間の後、全ＩＧＦ−１レベルを再度決定する。第一工程において測定した全ＩＧＦ−１レベルと比較した全ＩＧＦ−１レベルの増加量は、患者がどの程度、前記抗ＩＧＦ抗体分子に応答するかを示す。この方法は好ましくは、本発明の抗体が投与される療法をモニタリングするために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｇは、ヒトＩＧＦ−１（図１Ａ）、マウスＩＧＦ−１（図１Ｂ）、ラットＩＧＦ−１（図１Ｃ）、ヒトＩＧＦ−２（図１Ｄ）、マウスＩＧＦ−２（図１Ｅ）、ラットＩＧＦ−２（図１Ｆ）およびヒトインシュリン（図１Ｇ）に対する、６０８１４、６０８１９および６０８８３と称されるＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡ結合滴定を示す。
【図２Ａ】図２は、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用した、ＩＧＦ−１（２０ng/mL）（図２Ａ）およびＩＧＦ−２（１００ng/mL）（図２Ｂ）により誘発されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を中和する抗体６０８３３の典型的な滴定を示す。
【図２Ｂ】図２は、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用した、ＩＧＦ−１（２０ng/mL）（図２Ａ）およびＩＧＦ−２（１００ng/mL）（図２Ｂ）により誘発されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を中和する抗体６０８３３の典型的な滴定を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＩＧＦ−２（１００ng/mL）により誘発されるＩＲ−Ａリン酸化を中和する抗体６０８３３の典型的な滴定を示す。図３Ｂは、ヒト血清（２０％）により誘発されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を中和する抗体６０８３３の典型的な滴定を示す。両方のアッセイを、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して実施する。
【図３Ｂ】図３Ａは、ＩＧＦ−２（１００ng/mL）により誘発されるＩＲ−Ａリン酸化を中和する抗体６０８３３の典型的な滴定を示す。図３Ｂは、ヒト血清（２０％）により誘発されるＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を中和する抗体６０８３３の典型的な滴定を示す。両方のアッセイを、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して実施する。
【図４Ａ】図４Ａ〜２Ｄは、ＩＧＦ−１（図４Ａおよび４Ｃ）およびＩＧＦ−２（図４Ｂおよび４Ｄ）により刺激されるＭＣＦ−７（図４Ａおよび４Ｂ）およびＣＯＬＯ２０５（図４Ｃおよび４Ｄ）の細胞増殖に対する、抗体６０８１４および６０８１９の効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜２Ｄは、ＩＧＦ−１（図４Ａおよび４Ｃ）およびＩＧＦ−２（図４Ｂおよび４Ｄ）により刺激されるＭＣＦ−７（図４Ａおよび４Ｂ）およびＣＯＬＯ２０５（図４Ｃおよび４Ｄ）の細胞増殖に対する、抗体６０８１４および６０８１９の効果を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜２Ｄは、ＩＧＦ−１（図４Ａおよび４Ｃ）およびＩＧＦ−２（図４Ｂおよび４Ｄ）により刺激されるＭＣＦ−７（図４Ａおよび４Ｂ）およびＣＯＬＯ２０５（図４Ｃおよび４Ｄ）の細胞増殖に対する、抗体６０８１４および６０８１９の効果を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜２Ｄは、ＩＧＦ−１（図４Ａおよび４Ｃ）およびＩＧＦ−２（図４Ｂおよび４Ｄ）により刺激されるＭＣＦ−７（図４Ａおよび４Ｂ）およびＣＯＬＯ２０５（図４Ｃおよび４Ｄ）の細胞増殖に対する、抗体６０８１４および６０８１９の効果を示す。
【図５】図５は、１０％増殖培地中におけるユーイング肉腫由来細胞株ＴＣ−７１の増殖に対する、抗体６０８１９および６０８３３の効果を示す。
【図６】図６は、２５、１２．５、６．２５、３．１３mg/kgの１回量の投与から２４時間後の、マウス血清中全ＩＧＦ−１レベルに対する抗体６０８１９の効果を示す。０mg/kgは、抗体による処置前の血清中全ＩＧＦ−１レベルを示す。
【図７】図７は、３０、１００、２００mg/kgの１回量の１０分間の静脈内注入による投与から２４時間後の、ラット血漿中全ＩＧＦ−１レベルに対する抗体６０８１９の効果を示す。０mg/kgは、抗体による処置前の血清中全ＩＧＦ−１レベルを示す。
【図８】図８は、１０％ＦＣＳを含有する増殖培地中におけるユーイング肉腫由来細胞株ＳＫ−ＥＳ−１の増殖に対する、抗体６０８１９およびラパマイシンの、単独または組み合わせての効果を実証する。
【図９】図９は、ＡＫＴのリン酸化およびＰＴＥＮレベルに対する、抗体６０８１９およびラパマイシンの、単独または組み合わせての効果を示す。
【図１０】図１０は、１０％ＦＣＳを含有する増殖培地中におけるＮＳＣＬＣ由来細胞株Ａ−５４９の増殖に対する、抗体６０８１９およびエルロチニブ／タルセバの、単独または組み合わせての効果を実証する。
【図１１】図１１は、ヒトＩＧＦ−１の３次元構造を示し、抗体６０８３３によって結合されるアミノ酸が強調されている（ダークグレイ）。ヒトＩＧＦ−１の線形アミノ酸配列が下に示され、抗体６０８３３と相互作用するアミノ酸に下線が付されている。
【図１２Ａ】図１２は、抗体６０８１４（Ａ）、６０８１９（Ｂ）および６０８３３（Ｃ）の可変鎖のアミノ酸およびＤＮＡの配列を示し；ＣＤＲは太文字である。
【図１２Ｂ】図１２は、抗体６０８１４（Ａ）、６０８１９（Ｂ）および６０８３３（Ｃ）の可変鎖のアミノ酸およびＤＮＡの配列を示し；ＣＤＲは太文字である。
【図１２Ｃ】図１２は、抗体６０８１４（Ａ）、６０８１９（Ｂ）および６０８３３（Ｃ）の可変鎖のアミノ酸およびＤＮＡの配列を示し；ＣＤＲは太文字である。
【００２８】
発明の簡単な説明
１つの態様において、本発明は、
ａ）ｉ）ＩＧＦ−１レセプターへのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合が妨げられ、そして
ｉｉ）ＩＧＦ−１レセプターにより媒介されるシグナル伝達が阻害されるように、
ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合し、
ｂ）マウスおよびラットのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合し、
ｃ）ヒトインシュリンには結合しない、
単離ヒト抗体分子に関し、前記抗体分子は、
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗体分子；
ｉｉ）配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）および配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号１４（ＣＤＲ１）、配列番号１５（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗体分子；
ｉｉｉ）配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）および配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する、抗体分子
を含む群から選択される。
【００２９】
別の態様において、本発明は、抗ＩＧＦ抗体分子に関し、前記抗体分子は、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、抗ＩＧＦ抗体分子に関し、前記抗体分子は、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）および配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号１４（ＣＤＲ１）、配列番号１５（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、抗ＩＧＦ抗体分子に関し、前記抗体分子は、配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）および配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、図１２Ａ〜Ｃにおいて示したようなアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖またはＣＤＲを有する抗ＩＧＦ抗体分子に関する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、抗ＩＧＦ抗体分子に関し、前記抗体分子は、ヒトＩＧＦ−１（配列番号４３）のアミノ酸配列LCGAELVDALQFVCGDR（配列番号４１）およびCCFRSCDLRRLEM（配列番号４２）を含むＩＧＦ−１内の非線形エピトープに結合する。好ましい実施態様において、前記抗体分子は、ヒトＩＧＦ−１（配列番号４３）のアミノ酸配列LCGAELVDALQFVCGDR（配列番号４１）内の少なくとも８アミノ酸、およびアミノ酸配列CCFRSCDLRRLEM（配列番号４２）内の少なくとも１０アミノ酸と接触する。さらに好ましい実施態様において、このような抗ＩＧＦ抗体分子は、Ｘ線結晶学的手法によって決定したところ、ヒトＩＧＦ−１（配列番号４３）のLeu (5)、Cys (6)、Glu (9)、Leu (10)、Asp (12)、Ala (13)、Phe (16)、Val (17)、Arg (21)、Cys (47)、Cys (48)、Phe (49)、Ser (51)、Cys (52)、Asp (53)、Leu (54)、Arg (55)、Leu (57)、およびGlu (58)と接触する。それぞれの方法が、本明細書の実施例９に開示されている。好ましくは、前記抗体分子は、配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、並びに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）および配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する。
【００３４】
抗体の結合は、抗体結合部位に、すなわち適切な抗原（または構造的に類似したタンパク質）の決定基と結合する免疫グロブリンの領域に、抗原（または構造的に類似したタンパク質またはそのフラグメント）を保持する非共有結合を介して起こる相互作用として定義される。
【００３５】
親和性（すなわち、抗体上の単一の抗原結合部位と単一のエピトープとの間の相互作用）は、会合定数ＫＡ＝Ｋ会合／Ｋ解離または解離定数ＫＤ＝Ｋ解離／Ｋ会合によって表現される。
【００３６】
ａ）による１つの態様において、前記抗体は、各ＩＧＦタンパク質に、表面プラズモン共鳴分析によって決定したような親和性で、０．０２nM〜２０nM、例えば０．２nM〜２nMの範囲のＫＤ値で、例えば、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４．０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０nMの親和性で結合する。この特性に基づいて、ＩＧＦの機能的シグナル伝達の中和が達成される。
【００３７】
ｃ）による１つの態様において、前記抗体は、ヒトＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２への結合に必要とされる最小濃度よりも少なくとも１００倍高い濃度でもヒトインシュリンに結合しない。
【００３８】
別の態様において、ｃ）において定義した抗ＩＧＦ抗体分子の特性は、それぞれＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に対する抗ＩＧＦ抗体分子の親和性が、インシュリンに対するその親和性と比較して、少なくとも１００倍およびさらには１０００倍超であるという事実によって特徴付けられる。例えば１００mg/kgを上回るいう非常に高い用量では弱い結合は完全に排除されない可能性があるが、抗ＩＧＦ抗体分子は治療用量ではインシュリンに結合しない。
【００３９】
１つの実施態様において、本発明の抗体分子は、インシュリンレセプターへの結合によって媒介されるヒトインシュリンの有糸分裂促進特性に影響を及ぼさない。（一般に、有糸分裂促進特性は、細胞分裂を開始させ有糸分裂を引き起こすように細胞に働きかける化合物の能力、例えばインシュリンの場合には、細胞増殖を促進する能力として定義される）。
【００４０】
別の実施態様において、本発明の抗体はまた、ＩＧＦ−１レセプターを介して媒介されるＩＧＦシグナル伝達を阻害する能力に加えて、インシュリンレセプターＩＲ−Ａを介して媒介されるＩＧＦ−２シグナル伝達を阻害する能力も有する。
【００４１】
本発明の抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に対して驚くべきほどに高い中和効力を有する。さらに、それらは、ＩＧＦ−２に対してよりもＩＧＦ−１に対して意外なより高い効力および結合親和性を有する。それらは高い溶解性および安定性を有し、それらは可変ドメインにおいて望ましくないグリコシル化または加水分解のモチーフがなく、そして血中で長い半減期を有する。
【００４２】
発明の詳細な説明
以下において、ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合する本発明の抗体分子を、「抗ＩＧＦ抗体分子」と称する。
【００４３】
「抗ＩＧＦ抗体分子」という用語は、ヒト抗ＩＧＦ抗体、抗ＩＧＦ抗体フラグメント、抗ＩＧＦ抗体様分子、および前記した抗体分子のいずれかとのコンジュゲートを包含する。抗体としては、本発明の意味においては、モノクローナル抗体、キメラ化モノクローナル抗体、および二重特異的または多重特異的抗体が挙げられるがそれらに限定されない。「抗体」という用語は、リンパ球によって産生されそして例えば血清中に存在するような完全な免疫グロブリン、ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体、免疫グロブリンもしくはモノクローナル抗体の結合特異性を有する、宿主細胞において組換え発現によって産生されたポリペプチド、およびその結合特異性を保持しながらさらなる処理によってこのような免疫グロブリン、モノクローナル抗体もしくはポリペプチドから誘導された分子を包含する。
【００４４】
特に、「抗体分子」という用語は、好ましくは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、完全なヒトの完全免疫グロブリンを含む。
【００４５】
さらなる態様において、前記抗体分子は、抗原結合領域を有する抗ＩＧＦ抗体フラグメントである。抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントを得るために、慣用的な技法を用いて、例えばパパインまたはペプシンを使用して消化を行なうことができる。パパイン消化の例が、WO 94/29348およびUS 4,342,566に記載されている。抗体のパパインによる消化は、典型的には、２つの同一な抗原結合フラグメント、いわゆるＦａｂフラグメント（各々が１つの抗原結合部位を有する）、および残りのＦｃフラグメントを産生する。ペプシンによる処理は、２つの抗原結合部位を有しそして依然として抗原と架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。抗体フラグメントを、それぞれのコーディングＤＮＡフラグメントを作製する分子生物学的方法によっても生成することができる。
【００４６】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む追加の残基を含む点においてＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（群）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは最初、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として産生された。
【００４７】
Zapata et al., 1995に記載のような一本鎖抗体および直鎖状抗体を含む、抗原に結合する抗体フラグメントまたは抗体様分子は、単一のポリペプチド上に、可変領域（群）を単独でまたは以下（軽鎖の定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン）の全部もしくは一部と組み合わせて含み得る。例えばいわゆる「ＳＭＩＰ」（「Small Modular Immunopharmaceutical」）、これは、結合ドメインＦｖとして単一ポリペプチド鎖を使用する抗体様分子であり、そのＦｖは、単一鎖ヒンジおよび定常ドメインＣＨ１の欠失したエフェクタードメインに連結されている(WO 02/056910)）。ＳＭＩＰを単量体または二量体として調製することができるが、それらは従来の抗体の二量体の二量体という構造を想定していない。また、本発明には、軽鎖の定常ドメイン領域、ＶＨ１、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと可変領域（群）との任意の組合せを含む、抗原結合フラグメントも含まれる。
【００４８】
抗体フラグメントまたは抗体様分子は、それらがＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２抗原の関連部分への特異的な結合を示す限り、定常領域の全部または一部のみを含むことができる。定常領域のタイプおよび長さの選択は、補体結合または抗体依存性細胞障害作用のようなエフェクター機能を全く望まない場合には、主に、抗体タンパク質の所望の薬理学的特性に依存する。抗体分子は、典型的には、２本の軽鎖／重鎖の対からなる四量体であるが、二量体、すなわち１本の軽鎖／重鎖の対、例えばＦａｂまたはＦｖフラグメントからなってもよいか、あるいは単量体の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）でもよい。
【００４９】
抗ＩＧＦ抗体様分子はまた、単一のＩｇ様ドメインにおいて抗原結合部位を有する、単一ドメインの抗体（例えばいわゆる「ナノボディ」）であってもよい(例えば、WO 03/050531において、そしてRevets et al., 2005によって記載されている)。抗体様分子の他の例は免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（ＩｇＳＦ；SrinivasanおよびRoeske, 2005）、またはＣＤＲを含むもしくはＣＤＲの移植された分子、または「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）である。ｄＡＢは、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応する、抗体の機能的結合単位である。ドメイン抗体は、約１３ｋＤａの分子量、または完全抗体の１０分の１未満のサイズを有する。完全なヒトＶＨおよびＶＬ ｄＡｂの一連の多くのそして高度に機能的なライブラリーが開発されている。ｄＡＢはまた「２重ターゲティング」にも利用可能であり、すなわち、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２に加えて１つの分子内のさらに他のターゲットにも結合するｄＡｂである。ｄＡｂライブラリー、選択法およびスクリーニング法、２重ターゲティングおよびより延長された血清中半減期を付与するためのｄＡｂフォーマットが、例えばUS 6,696,245、WO 04/058821、WO 04/003019およびWO 03/002609に記載されている。
【００５０】
一般に、抗体フラグメントおよび抗体様分子は、細菌、酵母、および哺乳動物細胞系において良好に発現される。
【００５１】
好ましい実施態様において、ｉ）において前記に定義した本発明の抗体分子は、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する（この配列は、そのＣ末端において、追加のＧｌｎを含み得る。このアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ番号付けによると可変領域のＣ末端であると考えられ得るか、またはあるいは配列表の配列に即して、それは定常軽鎖の第１のアミノ酸に相当し得る、配列番号３４参照）。
【００５２】
好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する抗体は、ＩｇＧ１定常重鎖領域を有する。好ましくは、このような抗体は、Ｉｇλ定常軽鎖領域を有する。好ましくは、このような抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を有する、６０８１４と称される抗体である。６０８１４と称される抗体の完全なアミノ酸配列を配列番号３５（重鎖）および配列番号３６（軽鎖）に示す。
【００５３】
別の好ましい実施態様において、ｉｉ）において前記に定義した本発明の抗体分子は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する（この配列は、そのＣ末端において、追加のＧｌｎを含み得る。このアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ番号付けによると可変領域のＣ末端であると考えられ得るか、またはあるいは配列表の配列に即して、それは定常軽鎖の第１のアミノ酸に相当し得る、配列番号３４参照）。
【００５４】
好ましくは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む可変重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する抗体は、ＩｇＧ１定常重鎖領域を有する。好ましくは、このような抗体は、Ｉｇλ定常軽鎖領域を有する。好ましくは、このような抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を有する、６０８１９と称される抗体である。６０８１９と称される抗体の完全なアミノ酸配列を配列番号３７（重鎖）および配列番号３８（軽鎖）に示す。
【００５５】
別の好ましい実施態様において、ｉｉｉ）において前記に定義した本発明の抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む可変重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する（この配列は、そのＣ末端において、追加のＧｌｎを含み得る。このアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ番号付けによると可変領域のＣ末端であると考えられ得るか、またはあるいは配列表の配列に即して、それは定常軽鎖の第１のアミノ酸に相当し得る、配列番号３４参照）。
【００５６】
好ましくは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む可変重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する抗体は、ＩｇＧ１定常重鎖領域を有する。好ましくは、このような抗体は、Ｉｇλ定常軽鎖領域を有する。好ましくは、このような抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を有する、６０８３３と称される抗体である。６０８３３と称される抗体の完全なアミノ酸配列を配列番号３９（重鎖）および配列番号４０（軽鎖）に示す。
【００５７】
マウスおよびラットのＩＧＦ−１と本発明の抗体との交差反応性は、これらの種におけるその内分泌効果、例えば成長ホルモン経路における効果を調べることを可能とする。ラットＩＧＦとの交差反応性は特に有利である。なぜなら、ラットは、毒性学的作用を研究するための薬物開発に好ましくは使用される優れた動物モデルであるからである。
【００５８】
おそらく、遊離ＩＧＦ−１が除去され、その結果として成長ホルモン経路を介したフィードバック調節が起こり、その結果、肝臓によってＩＧＦ−１の分泌が増加することに因る、全ＩＧＦ−１レベルに対する前記抗体の観察される薬力学的作用は、有用な薬力学的マーカーである。薬物開発の早期に用量／作用の関係の決定を可能とする、このようなマーカーを動物種において使用できることは、第Ｉ相臨床試験の準備を容易にし、この臨床試験ではＰＫ分析に加えて、患者における全ＩＧＦ−１レベルに対する薬力学的応答をモニタリングする。
【００５９】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子はまた、配列表に示されたアミノ酸配列によって定義される抗体の変異体であってもよい。従って、本発明はまた、前記に定義したａ）〜ｃ）の特徴を有する、これらのポリペプチドの変異体である抗体も具体化する。慣用的に利用可能な技術を使用して、当業者は、抗体６０８１４、６０８１９および６０８３３の機能的変異体を調製、試験および利用することができる。例は、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク中の少なくとも１つの位置が改変された変異抗体、フレームワーク領域において１つのアミノ酸置換を有する変異抗体（生殖系の配列から逸脱している）、保存的アミノ置換を有する抗体、６０８１４、６０８１９または６０８３３の抗体可変鎖をコードする配列表中に提示されるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ分子によってコードされる抗体、６０８１４、６０８１９および６０８３３の機能的に等価なコドン最適化変異体である。
【００６０】
また、最適化のために本発明の抗体を出発点として使用し、１つ以上のアミノ酸残基、好ましくは１つ以上のＣＤＲにおけるアミノ酸残基を多様化させることによって、そして得られた抗体変異体集合を、改良された特性を有する変異体についてスクリーニングすることによっても、変異体を得ることができる。特に好ましいのは、可変軽鎖のＣＤＲ３、可変重鎖のＣＤＲ３、可変軽鎖のＣＤＲ１および／または可変重鎖のＣＤＲ２における１つ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、当技術分野において公知の方法によって、例えばWO 2007/042309において言及されているいわゆるＴＲＩＭ技術によって行なうことができる。
【００６１】
個々のアミノ酸の特性を考慮に入れて合理的な置換を行なって、抗体６０８１４、６０８１９または６０８３３の全体的な分子構造を保存する抗体変異体を得ることができる。アミノ酸置換、すなわち「保存的な置換」を、例えば、それぞれのアミノ酸の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性に基づいて行ない得る。当業者は、例えばWO 2007/042309に記載の一般的に実践されているアミノ酸置換、およびこのように改変された抗体を得るための方法に熟知している。遺伝子コード並びに組換えおよび合成的なＤＮＡ技法を考慮に入れて、１つ以上の保存的なアミノ酸交換を有する変異抗体をコードするＤＮＡ分子を慣用的に設計し、そしてそれぞれの抗体を容易に得ることができる。
【００６２】
好ましい抗体変異体は、可変領域における、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましい抗体はまた、可変領域において少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列類似性を有する。
【００６３】
（２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸の比率を示す。「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的なアミノ酸置換を示すかのいずれかであるアミノ酸の比率を示す）。
【００６４】
さらなる実施態様において、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子は、「親和性成熟」抗体である。
【００６５】
「親和性成熟」抗ＩＧＦ抗体は、１つ以上のＣＤＲにおける１つ以上の改変を有するか、または１つ以上の完全なＣＤＲが置換されており、その結果、それぞれの親抗体と比較して、抗原に対する親和性が向上した、例えば６０８１４、６０８１９または６０８３３などの親抗ＩＧＦ抗体に由来する抗ＩＧＦ抗体である。このような抗体突然変異体を生成するための手順の１つは、ファージディスプレイを含む(Hawkins et al., 1992;およびLowman et al., 1991)。簡潔に言うと、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７個の部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ置換を生成する。このように生成した抗体突然変異体を、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイする。次いで、ファージディスプレイされた突然変異体を、本明細書において開示したようにその生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
【００６６】
親和性成熟抗体はまた、例えばMarks et al., 1992（可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）のドメインシャッフリングによる親和性成熟）、またはBarbas et al., 1994; Shier et al., 1995; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995;およびHawkins et al., 1992（ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発）によって記載されたような方法によっても作製され得る。好ましい親和性成熟抗体は、ターゲット抗原に対して、非常に高い親和性、例えば低いピコモルの親和性を有する。
【００６７】
本発明はまた、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子をコードするＤＮＡ分子にも関する。これらの配列は、配列表（抗体６０８１４のそれぞれ可変重鎖および軽鎖をコードするそれぞれ配列番号７および配列番号９；抗体６０８１９のそれぞれ可変重鎖および軽鎖をコードする配列番号１７および配列番号１９；抗体６０８３３のそれぞれ可変重鎖および軽鎖をコードする配列番号２７および配列番号２９）において示されるような抗体６０８１４、６０８１９および６０８３３をコードするそうしたＤＮＡ分子を含むがそれらに限定されない。
【００６８】
可変軽鎖をコードする、配列番号９、配列番号１９および２９において示される配列は、その３’末端において、Ｇｌｎのための追加のコドンを含み得る。
【００６９】
従って、本発明はまた、WO 2007/042309において定義されたような、高ストリンジェントな結合条件および洗浄条件下において配列表に示されたＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションする核酸分子にも関し、このような核酸分子は、抗体６０８１４、６０８１９または６０８３３と等価であるかまたはより優れた特性を有する抗体またはその機能的フラグメントをコードする。好ましい分子（ｍＲＮＡの観点から）は、本明細書において記載したＤＮＡ分子の１つと少なくとも７５％または８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性または配列同一性を有する分子である。
【００７０】
本発明の範囲内であるＤＮＡ変異体のさらに別のクラスは、それらがコードするポリペプチドを参照して定義され得る。これらのＤＮＡ分子は、配列表（それぞれ、配列番号７、１７および２７、または９、１９、２９）に示されたものとはその配列に関して逸脱しているが、遺伝子コードの縮重に因り、それぞれ抗体６０８１４、６０８１９または６０８３３の同一のアミノ酸配列を有する抗体をコードする。例として、真核細胞における抗体６０８１４、６０８１９または６０８３３の発現を考えると、可変軽鎖の最後の３つのアミノ酸をコードするそれぞれ最後の９つのヌクレオチドを、真核細胞におけるコドン出現頻度と一致させるように設計することができる。E.coliにおいて抗体を発現させることが望ましい場合、これらの配列をE.coliコドン出現頻度に一致させるように変更することができる。
【００７１】
本発明のＤＮＡ分子の変異体を、WO 2007/042309に記載のように、いくつかの異なる方法で構築することができる。
【００７２】
本発明の組換え抗ＩＧＦ抗体分子を作製するために、完全長の軽鎖（抗体６０８１４の場合、配列番号９および配列番号３３を含む配列）および重鎖（抗体６０８１４の場合、配列番号７および配列番号３１を含む配列）をコードするＤＮＡ分子（ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ）またはそのフラグメントを、前記配列が転写および／または翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入する。抗体６０８１９の場合、配列は、それぞれ、配列番号１９および配列番号３３、並びに配列番号１７および配列番号３１の配列であり、抗体６０８３３の場合、配列は、それぞれ、配列番号２９および配列番号３３、並びに配列番号２７および配列番号３１の配列である。
【００７３】
本発明の抗体を製造するために、当業者は、当技術分野において周知の多種多様な発現系から、例えばKipriyanowおよびLe Gall, 2004によって概説されたものから選択し得る。
【００７４】
別の態様において、本発明は、前記した抗体分子の可変重鎖および／または可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む発現ベクターに関する。好ましくは、このような発現ベクターは、配列番号７および／または配列番号９のヌクレオチド配列を含む、あるいは配列番号１７および／または配列番号１９の配列を含む、あるいは配列番号２７および／または配列番号２９の配列を含む、ＤＮＡ分子を含む。好ましくは、このような発現ベクターはさらに、それぞれ可変重鎖および／または可変軽鎖をコードするＤＮＡ分子に連結したそれぞれ定常重鎖および／または定常軽鎖をコードするＤＮＡ分子を含む。
【００７５】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現制御配列は、宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができる。特定の実施態様において、両方のＤＮＡ配列を同じ発現ベクターに挿入する。簡便なベクターは、前記したように、任意のＶＨ（可変重鎖）またはＶＬ（可変軽鎖）配列を容易に挿入および発現することができるように遺伝子工学操作された適切な制限酵素部位と共に、機能的に完全なヒトＣＨ（定常重鎖）またはＣＬ（定常軽鎖）免疫グロブリン配列をコードするものである。６０８１４、６０８１９および６０８３３の可変領域を有する抗体の場合、定常鎖は、抗体軽鎖については通常κまたはλであり、抗体重鎖についてはそれは、任意のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）または他の免疫グロブリン（対立遺伝子変異体を含む）であり得るがそれらに限定されない。
【００７６】
組換え発現ベクターは、また宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖をコードするＤＮＡを、シグナルペプチドが成熟抗体鎖ＤＮＡのアミノ末端にインフレーム内に連結されるようにベクターにクローニングし得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであっても、非免疫グロブリンタンパク質に由来する異種ペプチドであってもよい。あるいは、抗体鎖をコードするＤＮＡ配列はすでにシグナルペプチド配列を含んでいてもよい。
【００７７】
抗体鎖ＤＮＡ配列に加えて、組換え発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、およびポリアデニル化シグナル、および宿主細胞における抗体鎖の発現を制御する他の発現制御エレメントを含む、調節配列を有する。プロモーター配列の例（哺乳動物細胞における発現のために例示されている）は、ＣＭＶ（例えばＣＭＶシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ))、ポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、並びに強力な哺乳動物プロモーター、例えばネイティブな免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーターである。ポリアデニル化シグナルの例は、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０後期または初期ポリＡであり；あるいは、免疫グロブリン遺伝子などの３’ＵＴＲを使用することができる。
【００７８】
組換え発現ベクターはまた、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。抗ＩＧＦ抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分および／または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにこれらのＤＮＡ分子を含むベクターを、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、ポリカチオンにより媒介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈降法、電気穿孔法またはウイルスベクターによる導入を含む当技術分野において周知のトランスフェクション法に従って、宿主細胞、例えば細菌細胞またはより高等な真核細胞、例えば哺乳動物細胞に導入することができる。
【００７９】
好ましくは、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ分子は、宿主細胞中に、好ましくは哺乳動物細胞中に同時トランスフェクションされる２つのベクター上に存在する。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、前記したような１つ以上の発現ベクターを有する宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞に関する。
【００８１】
発現のための宿主として利用可能である哺乳動物細胞株は当技術分野において周知であり、そしてとりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２およびＡ−５４９細胞）、３Ｔ３細胞または任意のこのような細胞株の誘導体／子孫が挙げられる。ヒト、マウス、ラット、サルおよびげっ歯類の細胞株を含むがそれらに限定されない他の哺乳動物細胞、または酵母、昆虫および植物細胞を含むがそれらに限定されない他の真核細胞、または細菌などの原核細胞を使用し得る。本発明の抗ＩＧＦ抗体分子は、宿主細胞における抗体分子の発現を可能とするに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。
【００８２】
従って、さらなる態様において、本発明は、哺乳動物宿主細胞を、前記したような１つ以上のベクターを用いてトランスフェクションすること、宿主細胞を培養すること、そして前記抗体を回収および精製することを含む、前記したような抗体分子を産生するための方法に関する。別の実施態様において、本発明は、前記したような１つ以上のベクターを含む哺乳動物宿主細胞を得ること、そして前記宿主細胞を培養することを含む、前記したような抗体を産生するための方法に関する。別の実施態様において、前記方法はさらに、前記抗体を回収および精製することを含む。
【００８３】
抗体分子は好ましくは、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるか、または例えば分泌シグナルを伴わずに発現された場合、宿主細胞の溶解液から回収することができる。実質的に均一な抗体調製物が得られるように、組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質のために使用される標準的なタンパク質精製法を使用して抗体分子を精製することが必要である。例として、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子を得るのに有用である最先端の精製法は、第１工程として、培養培地または溶解液からの細胞および／または粒子状細胞破片の除去を含む。次いで、抗体を、混入物質の可溶性タンパク質、ポリペプチドおよび核酸から、例えば、イムノアフィニティーまたはイオン交換カラム、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィーまたは陽イオン交換樹脂による分画によって精製する。抗ＩＧＦ抗体分子調製物を得るためのプロセスにおける最終工程として、精製した抗体分子を、治療適用について下記したように、乾燥、例えば凍結乾燥し得る。
【００８４】
１つの実施態様において、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子は、アフィニティクロマトグラフィー（組換えプロテインＡ）、低ｐＨによるウイルス不活性化、深層ろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ナノろ過、および３０ｋＤ限外濾過／ダイアフィルトレーションを含む、一連の最先端の精製工程によって精製し得る(Shukla et al., 2007)。
【００８５】
さらなる態様において、本発明は、医薬に使用するための前記したような抗体分子に関する。
【００８６】
さらなる態様において、本発明は、活性成分として、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子、好ましくは完全抗体を含む、薬学的組成物に関する。
【００８７】
療法に使用するために、抗ＩＧＦ抗体分子は、動物またはヒトへの投与を容易にするのに適した薬学的組成物に含められる。抗ＩＧＦ抗体分子を生理的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥もしくは別様に乾燥された製剤、または水性液剤、または水性もしくは非水性懸濁剤の剤形で、抗ＩＧＦ抗体分子の典型的な製剤を調製することができる。担体、賦形剤、改変剤または安定化剤は、使用する用量および濃度において無毒性である。それらは、リン酸、クエン酸、酢酸および他の無機酸または有機酸並びにその塩などの緩衝系；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリンまたはデキストランを含む、単糖、二糖、オリゴ糖または多糖および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／またはイオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）または脂肪酸エステル、脂肪酸エーテルまたは糖エステルを含む。また、エタノールまたはイソプロパノールなどの有機溶媒も抗体製剤に含めることができる。賦形剤はまた、放出改変機能または吸収改変機能を有し得る。
【００８８】
抗ＩＧＦ抗体分子はまた、乾燥（凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、近臨界もしくは超臨界ガスによって乾燥、真空乾燥、風乾）、沈降または結晶化され得るか、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンおよびポリ−（メチルメタクリレート）を使用した、例えばコアセルベーション技法によってもしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システムに（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）、マクロエマルションに封入され得るか、あるいは、例えばｐｃｍｃ技術（タンパク質で被覆された微結晶、protein coated microcrystals）によって担体または表面上に沈降または固定化され得る。このような技法は、Remington, 2005に開示されている。
【００８９】
当然のこととして、in vivoにおける投与のために使用しようとする製剤は無菌でなければならず；例えば滅菌ろ過膜を通したろ過によるなどの従来の技法によって滅菌を行ない得る。
【００９０】
いわゆる高濃度液体製剤（ＨＣＬＦ、high cocentration liquid formulation）となるように抗ＩＧＦ抗体の濃度を増加させることが有用であり得；このようなＨＣＬＦを調製するための様々な方法が記載されている。
【００９１】
抗ＩＧＦ抗体分子はまた、持続放出調製物中にも含められ得る。このような調製物は、固体、半固体または液体の疎水性または親水性ポリマーマトリックスを含み、そして例えばフィルム、スティックまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態であり得、そして適用器具を介して適用され得る。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレートまたは酪酸酢酸スクロース）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド(US 3,773,919)、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間におよぶ分子の放出を可能とするが、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。封入された抗体が長時間体内に留まる場合、３７℃で湿気にさらされそれらは変性または凝集し得、その結果、生物学的活性が消失し、免疫原性の変化が生じる可能性がある。安定化のために合理的な方法を、関与するメカニズムに従って考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されるならば、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥（例えばWO 89/011297に記載）、適切な添加剤を使用した水分含量の制御、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化を達成し得る。
【００９２】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子のために使用され得る製剤は、US 7,060,268およびUS 6,991,790に記載されている。
【００９３】
ＩＧＦ抗体分子を、分散剤、懸濁剤またはリポソーム、錠剤、カプセル剤、散剤、噴霧剤、透過促進デバイスを含むもしくは含まない経皮もしくは皮内パッチまたはクリーム、ウエハース、鼻腔用、頬側用もしくは肺内用製剤などの他の適用剤形にも取りこむことができるか、あるいは、移植された細胞によって、または遺伝子療法後に個体自身の細胞によって産生させてもよい。
【００９４】
また、抗ＩＧＦ抗体分子を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基またはエチル基、または炭水化物基などの化学基を用いて誘導体化し得る。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改良するために、例えば血清中半減期を延長するためにまたは組織結合を増加させるために有用であり得る。
【００９５】
好ましい適用形態は、注入または注射による非経口であるが（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内）、吸入、経皮、鼻腔内、頬側内、経口によるなどの他の適用形態も適用可能であり得る。
【００９６】
好ましい実施態様において、本発明の薬学的組成物は、抗ＩＧＦ抗体、例えば抗体６０８１４、６０８１９または６０８３３を１０mg/mlの濃度で含み、そして、２５mMクエン酸Ｎａ（ｐＨ６）、１１５mM ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ポリソルベート２０）をさらに含む。
【００９７】
別の実施態様において、本発明の薬学的組成物は、抗ＩＧＦ抗体、例えば抗体６０８１４、６０８１９または６０８３３を１０mg/mlの濃度で含む水溶液であり、そして２５mMヒスチジンＨＣｌ（ｐＨ６）、３８．８ｇ/Ｌマンニトール、９．７０ｇ/Ｌスクロース、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ポリソルベート２０）をさらに含む。
【００９８】
静脈内注入のために、本発明の薬学的組成物を、生理溶液を用いて、例えば０．９％塩化ナトリウムまたはＧ５溶液を用いて希釈し得る。
【００９９】
薬学的組成物を凍結乾燥し得、そして使用前に注射用水（ＷＦＩ）を用いて復元し得る。
【０１００】
疾病の予防または処置のための抗体の適切な用量は、処置しようとする疾病のタイプ、疾病の重度および経過、抗体が予防目的のために投与されるのかまたは治療目的のために投与されるのか、治療履歴、患者の病歴および抗体に対する応答、並びに担当医の判断に依存する。前記抗体は、一度にまたは一連の処置を通して、患者に適切に投与される。
【０１０１】
疾病のタイプおよび重度に依存して、約１μg/kg〜２０mg/kg（例えば０．１〜１５mg/kg）の抗体が、例えば１回以上の別々の投与によるものであっても、または例えば１時間かけての注入などの連続的な注入によるものであろうと、患者への投与のための初回候補量である。典型的な処置計画は、通常、前記した要因に依存して、約０．１μg/kg〜約２０mg/kgまたはそれ以上の範囲の用量を用いる、毎週１回から３週間に１回の抗体の投与を含む。例えば、週１回の用量は５、１０または１５mg/kgとすることができる。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１０２】
投与しようとする抗体の「治療有効量」は、疾病または疾患を予防、回復または処置するために必要とされる最小量である。
【０１０３】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子およびそれを含む薬学的組成物は、過剰増殖性疾患の処置に有用である。
【０１０４】
特定の実施態様において、過剰増殖性疾患は癌である。
【０１０５】
癌は、癌が起始した組織のタイプ（組織学的タイプ）によって、および癌が最初に発達した体内の最初の部位または場所によっての２つの見方で分類される。癌が発達する最も一般的な部位としては、皮膚、肺、乳房、前立腺、大腸および直腸、子宮頸部および子宮が挙げられる。
【０１０６】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子は、以下：
・ＡＩＤＳに関連した癌、例えばカポジ肉腫；
・骨に関連した癌、例えばユーイング肉腫ファミリー腫瘍および骨肉腫；
・脳に関連した癌、例えば、成人脳腫瘍、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児上衣腫、小児髄芽腫、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児視覚路神経膠腫および視床下部神経膠腫および他の小児脳腫瘍；
・乳癌；
・消化器／胃腸管に関連した癌、例えば肛門、肝外胆管癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉性腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆管細胞癌、大腸癌、食道癌、胆嚢癌、成人原発性肝癌（肝細胞癌、肝芽腫）、小児肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌および胃癌（stomach、gastric）；
・内分泌に関連した癌、例えば副腎皮質癌、消化管カルチノイド腫瘍、膵島細胞癌（膵臓内分泌部）、副甲状腺癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍および甲状腺癌；
・眼に関連した癌、例えば眼球内黒色腫および網膜芽細胞腫；
・尿生殖器に関連した癌、例えば膀胱癌、腎臓（腎細胞）癌、陰茎癌、前立腺癌、腎盂移行上皮癌および尿管癌、精巣癌、尿道癌、ウィルムス腫瘍および他の小児腎臓腫瘍；
・生殖細胞に関連した癌、例えば小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍および精巣癌；
・婦人科の癌、例えば子宮頸部癌、子宮体癌、妊娠性絨毛腫瘍、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、子宮肉腫、膣癌および外陰癌；
・頭頸部に関連した癌、例えば下咽頭癌、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、潜在性原発性鼻咽頭癌、口腔咽頭癌、副鼻腔癌および鼻腔癌を伴う転移性扁平上皮性頸部癌、上皮小体癌および唾液腺癌；
・血液学的／血液に関連した癌、例えば白血病、例えば成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリー細胞白血病；並びにリンパ腫、例えばＡＩＤＳに関連したリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、妊娠中のホジキンリンパ腫、キノコ状真菌症、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および他の血液学的／血液に関連した癌、例えば慢性骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群および骨髄異形成／骨髄増殖性疾病；
・筋骨格に関連した癌、例えばユーイング肉腫ファミリー腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、小児横紋筋肉腫、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫および子宮肉腫；血管肉腫（hemangiosarcoma）および血管肉腫（angiosarcoma）；
・神経学的に関連した癌、例えば成人脳腫瘍、小児脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路神経膠腫および視床下部神経膠腫および他の脳腫瘍、例えば神経芽細胞腫、下垂体腫瘍および原発性中枢神経系リンパ腫；
・呼吸器／胸部に関連した癌、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫、胸腺腫および胸腺癌；
・皮膚に関連した癌、例えば皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌および皮膚癌；
・小さな青い円形細胞腫瘍
を含むが、それらに限定されない種々の癌の処置において有用である。
【０１０７】
特に、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子およびそれらを含む薬学的組成物は、白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む造血系の癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌および胆嚢癌および胆管癌を含む胃腸管の癌；腎臓癌、前立腺癌および膀胱癌；乳癌、卵巣癌、子宮頚癌および子宮体癌を含む婦人科の癌；悪性黒色腫を含む、皮膚癌および頭頸部癌；ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫およびユーイング肉腫のような小児癌；神経膠芽腫のような脳癌；骨肉腫、軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫のような肉腫；肺癌、中皮腫および甲状腺癌の処置において有益である。
【０１０８】
本発明の好ましい態様において、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子およびそれらを含む薬学的組成物は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、特に局所的に進行したまたは転移性のＮＳＣＬＣ（ステージＩＩＩＢ／ＩＶ期）の処置において有益である。これに関連して、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子を、白金ベースの化学療法、特にパクリタキセル／カルボプラチンまたはジェムシタビン／シスプラチンの白金２剤併用療法と組み合わせることができる。
【０１０９】
本発明のさらに好ましい態様において、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子およびそれらを含む薬学的組成物は、肝細胞癌、特に局所的に進行した肝細胞癌（ステージＩＩＩ／ＩＶ期）の処置において有益である。これに関連して、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子をソラフェニブと組み合わせることができる(Strumberg D., 2005)。
【０１１０】
別の実施態様において、抗ＩＧＦ抗体分子およびそれらを含む薬学的組成物は、乾癬および血管形成術後の再発狭窄症などであるがそれらに限定されない、非癌性の過剰増殖性疾患に有用である。さらに、ＩＧＦ−１の活性を減少させる遺伝子突然変異は、長寿に対してプラスの効果を有するという近年の観察に基づいて(Reinberg, 2008)、本発明の抗体は、成人に適用した場合に、老化を遅延させそして加齢に関連した疾病を予防するための療法において有用である可能性を有する。
【０１１１】
従って、さらなる態様において、本発明は、前記に概略を示した癌性疾病の処置のための医薬品の調製のための前記したような抗体分子の使用に関する。
【０１１２】
別の態様において、本発明は、前記に概略を示したような癌性疾病の処置のための前記したような薬学的組成物に関する。
【０１１３】
別の態様において、本発明は、前記に概略を示したような癌性疾病を患う患者に、有効量の本明細書において記載したような薬学的組成物を投与することを含む、前記患者を処置するための方法に関する。
【０１１４】
処置しようとする疾患に依存して、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子を、それ自体単独で、あるいは特に、ＤＮＡ損傷剤、または癌細胞において血管新生、シグナル伝達経路もしくは有糸分裂チェックポイントを阻害する治療的に活性な化合物から選択された１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用し得る。
【０１１５】
追加の治療剤は、場合により同じ薬学的調製物の一成分として抗ＩＧＦ抗体分子と同時に、あるいは抗ＩＧＦ抗体分子の投与前または投与後に投与され得る。
【０１１６】
特定の実施態様において、追加の治療剤は、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、オーロラＡ、オーロラＢ、ＰＬＫおよびＰＩ３キナーゼ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｒａｆ、ＫＳＰまたはＰＤＫ１の阻害剤の群から選択される１つ以上の阻害剤であり得るがそれらに限定されない。
【０１１７】
追加の治療剤のさらなる例は、ＣＤＫ、Ａｋｔ、ｓｒｃ／ｂｃｒ−ａｂｌ、ｃＫｉｔ、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｆｌｔ３、ＨＳＰ９０の阻害剤、ヘッジホッグアンタゴニスト、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｍｅｋ、ｍＴｏｒ、ＮＦκＢ、プロテアソーム、Ｒｈｏの阻害剤、ｗｎｔシグナル伝達阻害剤またはユビキチン化経路阻害剤である。
【０１１８】
オーロラ阻害剤の例は、ＰＨＡ−７３９３５８、ＡＺＤ−１１５２、ＡＴ−９２８３、ＣＹＣ−１１６、Ｒ−７６３、ＶＸ−６６７、ＭＬＮ−８０４５、ＰＦ−３８１４７３５、ＳＮＳ−３１４、ＶＸ−６８９、ＧＳＫ−１０７０９１６、ＴＴＰ−６０７、ＰＨＡ−６８０６２６、ＭＬＮ−８２３７およびＥＮＭＤ−２０７６であるがそれらに限定されない。
【０１１９】
ＰＬＫ阻害剤の例は、ＧＳＫ−４６１３６４である。
【０１２０】
ｒａｆ阻害剤の例は、ＢＡＹ−７３−４５０６（ＶＥＧＦＲ阻害剤でもある）、ＰＬＸ−４０３２、ＲＡＦ−２６５（ＶＥＧＦＲ阻害剤でもある）、ソラフェニブ（ＶＥＧＦＲ阻害剤でもある）、ＸＬ−２８１、およびＮｅｖａｖａｒ（ＶＥＧＦＲ阻害剤でもある）である。
【０１２１】
ＫＳＰ阻害剤の例は、イスピネシブ、ＡＲＲＹ−５２０、ＡＺＤ−４８７７、ＣＫ−１１２２６９７、ＧＳＫ−２４６０５３Ａ、ＧＳＫ−９２３２９５、ＭＫ−０７３１、ＳＢ−７４３９２１、ＬＹ−２５２３３５５およびＥＭＤ−５３４０８５である。
【０１２２】
ｓｒｃおよび／またはｂｃｒ−ａｂｌ阻害剤の例は、ダサチニブ、ＡＺＤ−０５３０、ボスチニブ、ＸＬ−２２８（ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤でもある）、ニロチニブ（ＰＤＧＦＲおよびｃＫｉｔ阻害剤でもある）、イマチニブ（ｃＫｉｔ阻害剤でもある）、ＮＳ−１８７、ＫＸ２−３９１、ＡＰ−２４５３４（ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、Ｔｉｅ２、Ｆｌｔ３の阻害剤でもある）、ＫＭ−８０およびＬＳ−１０４（Ｆｌｔ３、Ｊａｋ２の阻害剤でもある）である。
【０１２３】
ＰＤＫ１阻害剤の例はＡＲ−１２である。
【０１２４】
Ｒｈｏ阻害剤の例はＢＡ−２１０である。
【０１２５】
ＰＩ３キナーゼ阻害剤の例は、ＰＸ−８６６、ＰＸ−８６７、ＢＥＺ−２３５（ｍＴｏｒ阻害剤でもある）、ＸＬ−１４７、ＸＬ−７６５（ｍＴｏｒ阻害剤でもある）、ＢＧＴ−２２６、ＣＤＣ−０９４１、ＧＳＫ−１０５９６１５である。
【０１２６】
ｃＭｅｔまたはＨＧＦの阻害剤の例は、ＸＬ−１８４（ＶＥＧＦＲ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ３の阻害剤でもある）、ＰＦ−２３４１０６６、ＭＫ−２４６１、ＸＬ−８８０（ＶＥＧＦＲの阻害剤でもある）、ＭＧＣＤ−２６５（ＶＥＧＦＲ、Ｒｏｎ、Ｔｉｅ２の阻害剤でもある）、ＳＵ−１１２７４、ＰＨＡ−６６５７５２、ＡＭＧ−１０２、ＡＶ−２９９、ＡＲＱ−１９７、ＭｅｔＭＡｂ、ＣＧＥＮ−２４１、ＢＭＳ−７７７６０７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−４２１７９０３、ＳＧＸ−１２６、ＣＥＰ−１７９４０、ＡＭＧ−４５８、ＩＮＣＢ−０２８０６０およびＥ−７０５０である。
【０１２７】
ｃ−Ｍｙｃ阻害剤の例はＣＸ−３５４３である。
【０１２８】
Ｆｌｔ３阻害剤の例は、ＡＣ−２２０（ｃＫｉｔおよびＰＤＧＦＲの阻害剤でもある）、ＫＷ−２４４９、ＬＳ−１０４（ｂｃｒ−ａｂｌおよびＪａｋ２の阻害剤でもある）、ＭＣ−２００２、ＳＢ−１３１７、レスタウルチニブ（ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣの阻害剤でもある）、ＴＧ−１０１３４８（ＪＡＫ２の阻害剤でもある）、ＸＬ−９９９（ｃＫｉｔ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦＲの阻害剤でもある）、スニチニブ（ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲおよびｃＫｉｔの阻害剤でもある）およびタンデュチニブ（ＰＤＧＦＲおよびｃＫｉｔの阻害剤でもある）である。
【０１２９】
ＨＳＰ９０阻害剤の例は、タネスピマイシン、アルベスピマイシン、ＩＰＩ−５０４、ＳＴＡ−９０９０、ＭＥＤＩ−５６１、ＡＵＹ−９２２、ＣＮＦ−２０２４およびＳＮＸ−５４２２である。
【０１３０】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の例は、ＣＹＴ−９９７（チューブリンとも相互作用する）、ＴＧ−１０１３４８（Ｆｌｔ３の阻害剤でもある）およびＸＬ−０１９である。
【０１３１】
Ｍｅｋ阻害剤の例は、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＡＳ−７０３０２６、ＰＤ−３２５９０１、ＡＺＤ−８３３０、ＡＲＲＹ−７０４、ＲＤＥＡ−１１９およびＸＬ−５１８である。
【０１３２】
ｍＴｏｒ阻害剤の例は、ラパマイシン、テムシロリムス、デフォロリムス（ＶＥＧＦ阻害剤としても作用する）、エベロリムス（さらにＶＥＧＦ阻害剤である）、ＸＬ−７６５（ＰＩ３キナーゼ阻害剤でもある）およびＢＥＺ−２３５（ＰＩ３キナーゼ阻害剤でもある）である。
【０１３３】
Ａｋｔ阻害剤の例は、ペリフォシン、ＧＳＫ−６９０６９３、ＲＸ−０２０１およびトリシリビンである。
【０１３４】
ｃＫｉｔ阻害剤の例は、マシチニブ、ＯＳＩ−９３０（ＶＥＧＦＲ阻害剤としても作用する）、ＡＣ−２２０（Ｆｌｔ３およびＰＤＧＦＲの阻害剤でもある）、タンデュチニブ（Ｆｌｔ３およびＰＤＧＦＲの阻害剤でもある）、アキシチニブ（ＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲの阻害剤でもある）、スニチニブ（Ｆｌｔ３、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲの阻害剤でもある）およびＸＬ−８２０（ＶＥＧＦＲ阻害剤およびＰＤＧＦＲ阻害剤としても作用する）、イマチニブ（ｂｃｒ−ａｂｌ阻害剤でもある）、ニロチニブ（ｂｃｒ−ａｂｌおよびＰＤＧＦＲの阻害剤でもある）である。
【０１３５】
ヘッジホッグアンタゴニストの例は、ＩＰＩ−６０９、ＣＵＲ−６１４１４、ＧＤＣ−０４４９、ＩＰＩ−９２６およびＸＬ−１３９である。
【０１３６】
ＣＤＫ阻害剤の例は、セリシクリブ、ＡＴ−７５１９、Ｐ−２７６、ＺＫ−ＣＤＫ（ＶＥＧＦＲ２およびＰＤＧＦＲも阻害する）、ＰＤ−３３２９９１、Ｒ−５４７、ＳＮＳ−０３２、ＰＨＡ−６９０５０９、ＰＨＡ−８４８１２５およびＳＣＨ−７２７９６５である。
【０１３７】
プロテアソーム阻害剤／ＮＦκＢ経路阻害剤の例は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ＮＰＩ−００５２、ＣＥＰ−１８７７０、ＭＬＮ−２２３８、ＰＲ−０４７、ＰＲ−９５７、ＡＶＥ−８６８０およびＳＰＣ−８３９である。
【０１３８】
ユビキチン化経路阻害剤の例はＨＢＸ−４１１０８である。
【０１３９】
抗血管新生剤の例は、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦ（Ｒ）の阻害剤、並びにサリドマイドであり、このような薬剤は、ＢＩＢＦ１１２０（Vargatef（登録商標））、ベバシズマブ、モテサニブ、ＣＤＰ−７９１、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＫＲＮ−９５１、ＺＫ−ＣＤＫ（ＣＤＫの阻害剤でもある）、ＡＢＴ−８６９、ＢＭＳ−６９０５１４、ＲＡＦ−２６５、ＩＭＣ−ＫＤＲ、ＩＭＣ−１８Ｆ１、ＩＭｉＤ、サリドマイド、ＣＣ−４０４７、レナリドミド、ＥＮＭＤ−０９９５、ＩＭＣ−Ｄ１１、Ｋｉ−２３０５７、ブリバニブ、セディラニブ、１Ｂ３、ＣＰ−８６８５９６、ＩＭＣ−３Ｇ３、Ｒ−１５３０（Ｆｌｔ３の阻害剤でもある）、スニチニブ（ｃＫｉｔおよびＦｌｔ３の阻害剤でもある）、アキシチニブ（ｃＫｉｔの阻害剤でもある）、レスタウルチニブ（Ｆｌｔ３およびＰＫＣの阻害剤でもある）、バタラニブ、タンデュチニブ（Ｆｌｔ３およびｃＫｉｔの阻害剤でもある）、パゾパニブ、ＰＦ−３３７２１０、アフリベルセプト、Ｅ−７０８０、ＣＨＩＲ−２５８、トシル酸ソラフェニブ（Ｒａｆの阻害剤でもある）、バンデタニブ、ＣＰ−５４７６３２、ＯＳＩ−９３０、ＡＥＥ−７８８（ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２の阻害剤でもある）、ＢＡＹ−５７−９３５２（Ｒａｆの阻害剤でもある）、ＢＡＹ−７３−４５０６（Ｒａｆの阻害剤でもある）、ＸＬ−８８０（ｃＭｅｔの阻害剤でもある）、ＸＬ−６４７（ＥＧＦＲおよびＥｐｈＢ４の阻害剤でもある）、ＸＬ−８２０（ｃＫｉｔの阻害剤でもある）、ニロチニブ（ｃＫｉｔおよびｂｒｃ−ａｂｌの阻害剤でもある）、ＣＹＴ−１１６、ＰＴＣ−２９９、ＢＭＳ−５８４６２２、ＣＥＰ−１１９８１、ドビチニブ、ＣＹ−２４０１４０１およびＥＮＭＤ−２９７６から選択されるがそれらに限定されない。
【０１４０】
追加の治療剤はまた、ＥＧＦＲ阻害剤からも選択され得、それは小分子ＥＧＦＲ阻害剤または抗ＥＧＦＲ抗体であり得る。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブであるがそれらに限定されず；小分子ＥＧＦＲ阻害剤の例は、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびバンデタニブ（ＶＥＧＦＲの阻害剤でもある）である。ＥＧＦＲモデュレーターの別の例はＥＧＦ融合毒素である。
【０１４１】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子との組み合わせに有用であるさらなるＥＧＦＲおよび／またはＨｅｒ２阻害剤は、ＢＩＢＷ２９９２（Tovok（登録商標））、ラパチニブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＸＬ−６４７、ネラチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＡＶ−４１２、ｍＡＢ−８０６、ＢＭＳ−６９０５１４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＡＥＥ−７８８（ＶＥＧＦＲの阻害剤でもある）、ＡＺＤ−８９３１、ＡＲＲＹ−３８０、ＡＲＲＹ−３３３７８６、ＩＭＩＣ−１１Ｆ８、ゼマブ、ＴＡＫ−２８５、ＡＺＤ−４７６９である。
【０１４２】
療法において本発明の抗ＩＧＦ抗体分子と有利に組み合わせられ得る他の薬剤は、トシツムマブおよびイブリツモマブ・チウキセタン（２つの放射標識された抗ＣＤ２０抗体）；オファツムマブ、リツキシマブ、ＬＹ−２４６９２９８、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、ＰＲＯ−１３１９２１、ＦＢＴ−Ａ０５、ベルツズマブ、Ｒ−７１５９（ＣＤ２０阻害剤）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２抗体）、デノスマブ（破骨細胞分化因子リガンド阻害剤）、ガリキシマブ（ＣＤ８０アンタゴニスト）、ザノリムマブ（ＣＤ４アンタゴニスト）、ＳＧＮ４０（ＣＤ４０リガンドレセプターモデュレーター）、ＸｍＡｂ−５４８５、Ｃｈｉ Ｌｏｂ７/４、ルカツムマブ（lucatumumab）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０阻害剤）、ＣＡＴ−８０１５、エプラツズマブ、Ｙ９０−エプラツズマブ、イノツズマブ・オゾガミシン（ＣＤ２２阻害剤）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３阻害剤）、ＴＲＵ−０１６（ＣＤ３７阻害剤）、ＭＤＸ−１３４２、ＳＡＲ−３４１９、ＭＴ−１０３（ＣＤ１９阻害剤）またはマパツムマブ、チガツズマブ、レキサツムマブ、アポマブ、ＡＭＧ−９５１およびＡＭＧ−６５５（ＴＲＡＩＬレセプターモデュレーター）である。
【０１４３】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子と組み合わせて使用し得る他の化学療法薬は、ホルモン、ホルモン類似体および抗ホルモン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、フルベストラント、酢酸メゲストロール、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、フィナステリド、酢酸ブセレリン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、メドロキシプロゲステロン、オクトレオチド、アルゾキシフェン、パシレオチド、バプレオチド）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、リアロゾール、エキセメスタン、アタメスタン、フォルメスタン）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、アバレリックス、セトロレリックス、デスロレリン、ヒストレリン、トリプトレリン）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、ペメトレキセドのような葉酸代謝拮抗剤、５−フルオロウラシル、カペシタビン、デシタビン、ネララビン、およびジェムシタビンのようなピリミジン類似体、メルカプトプリンチオグアニン、クラドリビンおよびペントスタチン、シタラビン、フルダラビンのようなプリンおよびアデノシン類似体）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなアントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、ストレプトゾシン）；白金誘導体（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ロバプラチン、サトラプラチン）；アルキル化剤（例えばエストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、ニトロソ尿素、例えばカルムスチンおよびロムスチン、チオテパ）；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニンおよびビンクリスチンのようなビンカアルカロイド；およびパクリタキセル、ドセタキセルおよびその製剤、ラロタキセルのようなタキサン；シモタキセル、および、イクサベピロン、パツピロン、ＺＫ−ＥＰＯのようなエポチロン）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびエトポホス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン）、および混合型化学療法剤、例えばアミフォスチン、アナグレリド、インターフェロンα、プロカルバジン、ミトタン、およびポルフィマー、ベキサロテン、セレコキシブから選択されるがそれらに限定されない。
【０１４４】
１つの態様において、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子は、白金ベースの化学療法と組み合わせて、例えばパクリタキセル／カルボプラチンまたはジェムシタビン／シスプラチンの白金２剤併用療法と組み合わせて使用される。１つの実施態様において、このような組合せ療法は、数回、例えば６サイクル（３週間に１回）繰り返し得る。この処置に続いて、抗ＩＧＦ抗体分子単独を用いてのさらなる反復処置（例えば３週間に１回を６サイクル）を行ない得る。このレジメンを、例えばＮＳＣＬＣの処置に使用することができる。別の態様において、本発明の抗ＩＧＦ抗体分子をソラフェニブと組み合わせて使用する。１つの実施態様において、抗ＩＧＦ抗体分子を、ソラフェニブの連続投与と組み合わせて、１〜３週間の間隔で例えば１２サイクル繰り返し投与し得る。このレジメンを、例えば肝細胞癌の処置に使用することができる。
【０１４５】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子は、例えばより低い濃度で使用する場合には、ＩＧＦ−１Ｒをターゲティングする薬剤と組み合わせてもよい。このような薬剤としては、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体（例えばＣＰ−７５１８７１、ＡＭＧ−４７９、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、ＡＶＥ−１４６２、Ｒ−１５０７、ＢＩＩＢ−０２２、ＳＣＨ−７１７４５４、ｒｈｕ Ｍａｂ ＩＧＦＲ）、およびＩＧＦ１−Ｒのキナーゼドメインにターゲティングする新規な化学物質（例えばＯＳＩ−９０６またはＢＭＳ−５５４４１７、ＸＬ−２２８、ＢＭＳ−７５４８０７）が挙げられる。
【０１４６】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子はまた、手術、放射線療法、内分泌療法、生体応答調節物質、温熱療法および寒冷療法を含む他の療法、並びに任意の副作用を減弱する薬剤、例えば制吐剤および好ましい実施態様においては抗糖尿病薬、例えばメトホルミンと組み合わせて使用され得る。
【０１４７】
本発明の抗ＩＧＦ抗体分子はまた、上昇したＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２の血清中レベルが疾病の発生または進行に関連する癌の診断において、例えば、インシュリン様成長因子ＩＩ遺伝子（ＩＧＦ２）に影響を及ぼす後成的変化であるインプリンティング消失（ＬＯＩ）に起因する上昇したＩＧＦ−２レベルを決定するために有用である。特定の実施態様において、診断適用のための、例えば免疫組織染色によるヒト組織切片でのＩＧＦ−１の検出のための抗体は、ヒト抗体に由来するキメラ抗体である。このような抗体においては、定常領域またはその一部が、例えばマウスなどの別の種の抗体に由来するそれぞれの配列によって置換されている。一次抗体としてこのようなキメラ抗体を使用することによって、マウスＦｃ部分と特異的に反応する例えばヤギ抗体などの二次抗体は、キメラ一次抗体のマウス配列を特異的に認識し、そしてヒト組織試料中に存在する他のヒト免疫グロブリン分子のＦｃ部分には結合しない。従って、望ましくないバックグラウンド染色が回避される。
【０１４８】
本発明の抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２により媒介されるシグナル伝達を遮断することによって、体重および脂肪組織の形成の制御のために有用であり得る。この目的を達成するために、本発明の抗体は、単独でまたは他の抗肥満薬と組み合わせて投与される。
【０１４９】
材料および方法
ＩＧＦ−１に結合する高親和性完全ヒト抗体の選択
低ナノモルの親和性でヒトＩＧＦ−１に結合するヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ Ｇｏｌｄ）(Knappik et al., 2000)からの特定のＦａｂフラグメントクローンの選択を、３回のパンニングサイクルで、基本的にRauchenberger et al., 2003によって記載されているように行なう。ヒトＩＧＦ−１に対する親和性の向上したＦａｂフラグメントを同定するために、これらの「親」Ｆａｂクローンのいくつかを、基本的にNagy et al., 2002によって記載されているような「in vitro親和性成熟」を行う。ＨｕＣＡＬ由来の約１０８個のＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２カセットを用いて親配列を置換することによって、各クローンのＬ−ＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）およびＨ−ＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）配列を別々に多様化させる(Knappik et al., 2000)。ファージを、得られた「成熟ライブラリー」から調製し、そして各ライブラリーを、ヒトＩＧＦ−１に対し溶液パンニングを行う。最も高い親和性のヒトＩＧＦ−１への結合体を選択するために、抗原を減少させて、そしてヒトインシュリンによる阻害を伴いおよび伴わずに、当技術分野において公知の方法に従って、通常および高ストリンジェントな洗浄条件下で溶液のパンニングを行なう。３回のファージのパンニングの後のパンニング産出物を、Ｆａｂ発現ベクターにサブクローニングし、そしてヒトＩＧＦ−１に対する各Ｆａｂの親和性を、基本的にHaenel et al., 2005によって記載されたようなBioVeris (Witney, Oxfordshire, UK)によって開発された電気化学発光ベースの平衡滴定技術によって決定する。最善のＩＧＦ−１親和性を有するＦａｂクローンをシークエンスし、その後、親抗体と比較して特異性の変化が全くない、ヒトＩＧＦ−１に対してナノモル以下の親和性を有する、Krebs et al., 2001によって記載されたようなヒトＩｇＧ１抗体へと変換する。
【０１５０】
ＩｇＧ１抗体のクローニングおよび組換え発現
可変重鎖領域（ＶＨ）および可変軽鎖領域（ＶＬ）を、制限酵素による消化によってＦａｂ発現ベクターから切り出し、そして、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトＩｇλ軽鎖定常領域を含むｐｃＤＮＡ３．１ベースのプラスミドの適合する制限酵素部位にライゲーションする。エンドトキシンフリープラスミド調製物（Qiagen）を調製し、そして重鎖および軽鎖プラスミドを、業者のプロトコールに従って１mg/Ｌの各プラスミド濃度でＨＥＫfreestyle２９３細胞（Invitrogen）に同時トランスフェクションする。７２時間後、上清を収集し、そしてＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡによって決定する。抗体を改変プロテインＡカラム(GE Healthcare)で精製し、クエン酸緩衝液中に溶出し、その後、ＰＢＳ中２．５mg/mlの濃度まで透析する。あるいは、抗体発現プラスミドを安定に組み込んだＣＨＯ細胞株を生成し、そしてこれを使用して抗体を産生する。
【０１５１】
親和性定数を決定するための表面プラズモン共鳴分析
ａ）抗体捕捉法
センサーチップを、アミンカップリングキットのカップリング試薬を使用して、フローセル１においては約１０００ＲＵの参照抗体を用いて、およびフローセル２においては約１０００ＲＵのウサギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体を用いてコートする。１０００ＲＵのターゲットを、５μl/分の流速でBiacore3000ソフトウェアの表面調製ウィザードにセットする。使用するランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰである。以下のパラメーターを使用して親和性測定を行なう：２０μl/分の流速（ＨＣＢランニング緩衝液）；２５℃の検出温度；Ｆｃ１、Ｆｃ２流路；Ｆｃ１、Ｆｃ２検出；抗ＩＧＦ−ｈｕＭａｂ捕捉：１μg/ml溶液を３分間；５分間のＩＧＦ−Ａｇ会合；５分間のＩＧＦ−Ａｇ解離；再生：５０mM ＨＣｌを用いての３０秒間のパルス印加。ＩＧＦ抗原を、ランニング緩衝液（ＨＣＢ）で５００、２５０、１２５、６２．５および３１．３nMに希釈し、そして前記の種々の抗原希釈液をランダムな順番でＦｃ１およびＦｃ２の上に１つずつ流す。ランニング緩衝液のみを使用したブランクの送液を、間に送液する。ブランク送液曲線を、親和性分析の前に各結合曲線から差し引く。BIAevaluationソフトウェア(version4.1, Biacore, Freiburg, Germany)を使用してデータの評価を行なう。速度論の解離相および会合相を別々にあてはめる。ｋ解離値を別々にあてはめるために、解離相の初期２００〜３００秒間の時間枠を使用する（シグナルの定常的減少の範囲）。ｋ会合値を別々にあてはめるために、約１００秒間の初期時間枠を使用し（シグナルの定常的増加の範囲）、そして計算のために個々のｋ解離値を１：１のラングミュア結合モデルで使用する。速度論データの標準偏差を含む平均値を、対応する解離定数（ＫＤ）および会合定数（ＫＡ）と共に計算する。
【０１５２】
ｂ）ＩＧＦコート法
センサーチップをＩＧＦリガンドでコートした場合のＩＧＦリガンドへのＩＧＦ抗体の結合定数の決定を、センサーチップをそれぞれ３５．１pg/mm２および３８．５pg/mm２のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２でコートする以外は基本的に前記されたように行なう。その後、抗体を、以下の濃度：５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２nMでチップ上に流す。
【０１５３】
免疫吸着アッセイにおけるヒト、マウスおよびラットＩＧＦへのおよびヒトインシュリンへの結合の測定
高い親和性でＩＧＦ−１に結合した完全なヒトＩｇＧ１抗体をまた、直接的な免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）においてヒトＩＧＦ−１への結合について試験する。アッセイを、４℃で一晩９６ウェルMaxisorbプレートに０．５μg/mlの濃度でヒトＩＧＦ−１(R&D Systems, No. 291-G1)をコート（１００μl/ウェル）することによって行なう。コーティング緩衝液単独を、非特異的結合のための対照として使用する。その後、ウェルを１回洗浄緩衝液（１×ＴＢＳ−Ｔ）を用いて洗浄し、そして残存結合部位を２００μlのブロッキング緩衝液を用いて１時間かけて室温でオービタルシェーカーでブロッキングし、その後、さらなる洗浄サイクルにかける。ブロッキング緩衝液中の各試験抗体の連続３倍希釈液を、コートプレート上で直接調製する。使用する典型的な濃度は、５０、１６．６、５．６、１．８、０．６、０．２および０．０７ng/mlである。ブロッキング緩衝液単独を陽性対照として使用する。その後、プレートを撹拌しながら２時間室温でインキュベーションする。３回の洗浄サイクル後、ブロッキング緩衝液中で希釈した１００μl/ウェルのＨＲＰＯコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次試薬(Jackson ImmunoResearch Inc.)を全てのウェルに加える。室温で撹拌しながら２時間インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、そして１００μl/ウェルのＴＭＢ基質溶液（等量の溶液ＡおよびＢ）を全てのウェルにピペットで入れる。プレートを室温で撹拌しながら１０〜２０分間インキュベーションし、その後、１００μl/ウェルの１Ｍリン酸の添加によって反応を停止する。４５０nmの波長における吸光度を測定する（参照６５０nm）。
【０１５４】
マウスＩＧＦ−１(R&D Systems, No. 791-MG)、ラットＩＧＦ−１(IBT, No. RU100)、ヒトＩＧＦ−２(GroPep, No.FM001)、マウスＩＧＦ−２(R&D Systems, No. 792-MG)、ラットＩＧＦ−２(IBT, No.AAU100)およびヒトインシュリン（Roche）への完全ヒトＩＧＦ−１結合ＩｇＧ１抗体の結合もまた、ヒトＩＧＦ−１について前記したように（コートのために使用するヒトインシュリンの濃度が３μg/mlである以外）試験する。
【０１５５】
中和効力を決定するためのin vitroにおける細胞増殖アッセイ
ＭＣＦ−７乳癌由来細胞株（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２２）およびＣＯＬＯ２０５大腸癌由来細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２２）を、無血清ＲＰＭＩ培地中、１ウェルあたり１０００個の細胞という細胞密度で９６ウェルプレートに蒔く。１０ng/mlのＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２のいずれかを、１２、３７、１１１、３３３、１０００および３０００ng/mlの濃度の、ＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−２に結合しないヒト化アイソタイプ対照抗体、または抗体６０８１４、６０８１９および６０８３３の存在下または非存在下において加える。細胞を５日間培養し、その後、各ウェル中の相対的な細胞数をCellTiter-Glo発光細胞生存アッセイ（Promega）を使用して決定する。発光（ＬＵ＝発光単位）をXFluor GENios Pro 4を使用して記録する。
【０１５６】
ユーイング肉腫由来細胞株の増殖アッセイ
ユーイング肉腫由来細胞株ＴＣ−７１（ＡＴＣＣ番号ＡＣＣ５１６）およびＳＫ−ＥＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ８６）を、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×グルタマックスおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地中、１ウェルあたり１０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに蒔き、そして加湿雰囲気中で３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションする。次の日、試験抗体の連続希釈液、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に結合しないヒト化アイソタイプ対照抗体（ＣＤ４４−ｖ６にターゲティングするヒト化ＩｇＧ１抗体）、ラパマイシン、またはラパマイシンと試験抗体との組合せを、細胞に加える。使用する典型的な濃度は、３０、１０、３．３、１．１、０．３７および０．１２μg/mlであり（または組合せ研究においては１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１nMのラパマイシンおよび試験抗体）、そして各希釈は３連ウェルで行なう。その後、細胞と抗体を、１２０時間インキュベーションし、その後、各ウェル中の相対細胞数を、CellTiter-Glo発光細胞生存アッセイ（Promega）を使用して決定する。発光（ＬＵ＝発光単位）を、XFluor GENios Pro4を使用して記録し、そしてデータ分析のために３連ウェルからの平均値をとり、そして可変Ｈｉｌｌ勾配を含むシグモイド曲線分析プログラム(Graph Pad Prism)を使用して反復計算によってあてはめる。
【０１５７】
リン酸化ＡＫＴおよびＰＴＥＮレベルのウェスタンブロット分析
ＳＫ−ＥＳ−１細胞を、６ウェルプレート中の、１０％ウシ胎児血清を含有する培地中に蒔き、そして一晩インキュベーションした後、それらを、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に結合しない１００nMのアイソタイプ対照抗体（ＣＤ４４−ｖ６にターゲティングするヒト化ＩｇＧ１抗体）、１００nMの６０８１９、１００nMのラパマイシン、または１００nMの６０８１９と１００nMのラパマイシンとの組合せのいずれかで処理する。２４時間後、細胞を溶解し、そしてタンパク質濃縮後に凍結させた細胞溶解液をBradfordアッセイによって決定する。３０μgのタンパク質溶解液をＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（BioRad）にアプライすることによってウェスタンブロットを行ない、そしてこのゲルをCiterianゲルブロッティングサンドイッチ上にブロットする。ウェスタンブロットを、１：５０００（抗βアクチン）、１：１０００（抗ＰＴＥＮ）、または１：２０００（抗ホスホＡＫＴ）の希釈度の、ウサギ抗βアクチン（対照）抗体、ウサギ抗ＰＴＥＮ抗体（Cell Signaling９５５９番）、またはウサギ抗ホスホ−ｐＡＫＴ抗体（Cell Signaling４０６０番）と共に１％乳粉中で一晩インキュベーションする。ＴＢＳ中で洗浄した後、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰＯコンジュゲート二次抗体（Amersham）を１時間かけてアプライし、そしてＴＢＳ中でさらに洗浄した後、抗体反応性をＥＣＬによって検出し、そしてHyperfilm（Amersham）上で捕捉する。
【０１５８】
ＮＳＣＬＣ由来細胞株における抗ＩＧＦ抗体とＥＧＦＲ阻害剤とのin vitroにおける組合せ
ＮＳＣＬＣ由来細胞株Ａ−５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）を、２mMのＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に１ウェルあたり１０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに蒔き、そして３７℃および５％ＣＯ２で加湿雰囲気中で一晩インキュベーションする。次の日、試験ＩＧＦ抗体の連続希釈液、エルロチニブ／タルセバ、または試験ＩＧＦ抗体とエルロチニブとの組合せを、細胞に加える。使用する試験ＩＧＦ抗体の典型的な濃度は、３００００、１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２３、４１、１４ng/mLであり、そして使用するエルロチニブの典型的な濃度は、２００００、６６６７、２２２２、７４１、２４７、８２、２７、９nMであり、そして各希釈は３連ウェルで行なう。その後、細胞を１２０時間インキュベーションし、その後、各ウェル中の相対細胞数を、CellTiter-Glo発光細胞生存アッセイ（Promega）を使用して決定する。発光（ＬＵ＝発光単位）を、XFluor GENios Pro4を使用して記録し、そしてデータ分析のために３連ウェルからの平均値をとり、そして可変Ｈｉｌｌ勾配を含むシグモイド曲線分析プログラム(Graph Pad Prism)を使用して反復計算によってあてはめる。
【０１５９】
血清中のマウスおよびラットの全ＩＧＦ−１レベルに対する効果の決定
２５、１２．５、６．２５、および３．１３mg/kgの試験ＩＧＦ抗体の単回静脈内（ボーラス）投与を、６〜８周令の雌無胸腺ＮＭＲＩヌードマウス（ｎ＝５）に行なう。３０、１００、２００mg/kgの抗体６０８１９の単回の１０分間の静脈内投与を、６〜８周令の雄および雌のWistar Hanラット（雄ｎ＝４、雌ｎ＝４）に行なう。抗体処理前および投与から２４時間後に、血液試料を採取し、血清を回収し、そしてマウスまたはラットの全ＩＧＦ−１レベルをＯＣＴＥＩＡラット／マウス全ＩＧＦ−１イムノサイトメトリーアッセイを使用して決定する。アッセイを製造業者の指示に従って実施し、４５０nmにおける吸光度を測定し、そしてSoftMax Proソフトウェアを使用して評価する。標準曲線を使用して、全ＩＧＦ−１の血清中濃度（ng/ml）を決定する。統計学的分析を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して実施する。
【０１６０】
細胞ベースのＩＧＦ−１Ｒリン酸化ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＧＦ−１ＲまたはヒトＩＲ−Ａを組換え発現するマウス線維芽細胞株を、加湿インキュベーター中の、１０％熱失活ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム、０．０７５％重炭酸ナトリウム、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、および０．３μg/mlのピューロマイシンの補充されたＤＭＥＭ中に、３７℃および５％ＣＯ２で維持する。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて分離し、増殖培地中に再懸濁し、そして１００，０００細胞/mLまで希釈する。１００μL（１０，０００個の細胞）を、滅菌９６ウェルプレートのウェル中に播種し、そして加湿インキュベーター中３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションする。その後、細胞を、１００μL/ウェルのアッセイ培地（０．５％熱失活ＦＣＳ；１mMピルビン酸ナトリウム、０．０７５％重炭酸ナトリウム、およびＭＥＭ ＮＥＡＡの補充されたＤＭＥＭ）を用いて飢餓状態にし、そして以前のように一晩インキュベーションする。アッセイ培地中に調製した様々な濃度の試験抗体を細胞に加え、全ての試料を３連に調製して、各アッセイ条件について標準偏差を決定する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるαＩＲ−３(Calbiochem, No. GR11L)もまたこれらの実験において試験する。その後、ＩＧＦ−１（２０ng/mLの最終濃度）、ＩＧＦ−２（１００ng/mLの最終濃度）、またはヒト血清（２０％の最終濃度）を加え、そしてプレートを３０分間加湿インキュベーター中でインキュベーションする。増殖培地をＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドと交換することによって、２０分間かけて室温で細胞を固定する。３００μL/ウェルの洗浄緩衝液（０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ）を用いての５分間の２回の洗浄サイクルの後（撹拌しながら）、細胞を、室温で３０分間かけて１００μL/ウェルの洗浄緩衝液中１．２重量％過酸化水素を用いてクエンチする。細胞を、３００μL/ウェルの洗浄緩衝液を用いて再度洗浄し、そして１００μL/ウェルのブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中５％ＢＳＡ）を用いて６０分間かけて室温で撹拌しながらブロッキングする。ブロッキング緩衝液を除去し、そしてブロッキング緩衝液中で１：１０００に希釈した５０μl/ウェルの一次ホスホ−ＩＧＦ−１レセプターβ（ｔｙｒ１１３５／１１３６）／インシュリンレセプターβ（ｔｙｒ１１５０／１１５１）抗体(Cell Signaling, No. 3024)を加える。プレートを一晩４℃で撹拌しながらインキュベーションし、その後、前記のように３回洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中で１：５００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ(Dako, No. P0448)をコンジュゲートさせた５０μL/ウェルの抗ウサギＩｇＧヤギ免疫グロブリンを加える。室温で撹拌しながら６０分間インキュベーションした後、ウェルを前記のように洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして３００μLのＰＢＳで１回洗浄する。１００μL/ウェルのＴＭＢ基質溶液(Bender MedSystems, No. BMS406.1000)をウェルに加え、そして１０分間撹拌しながらインキュベーションし、この後、１００μL/ウェルの１Ｍリン酸を加えることによって反応を停止し、そして分光光度計（ＯＤ４５０nm、参照としてＯＤ６５０nm）を使用して吸光度を読み取る。ＩＧＦ−１ＲまたはＩＲ−Ａリン酸化阻害のＩＣ５０値を、グラフ分析によって決定する。
【０１６１】
Ｆａｂ−ＩＧＦ−１の共結晶化および構造決定
パパイン消化の前に１００mMのリン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）の緩衝液中でモノクローナル抗体を調製する。パパイン(Sigma Aldrich, P 3125番)を、製造業者の指示に従って消化緩衝液（１０mMシステイン塩酸塩、４mM ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）中で活性化する。ＩｇＧ抗体を活性化パパイン（酵素：ＩｇＧの比＝１：１００）と混合し、そして反応液を回転シェーカーで３７℃で一晩インキュベーションする。３０mMの最終濃度までヨードアセトアミドを加えることによって消化を停止する。Ｆｃフラグメント、Ｆｃ切断産物およびインタクトなＭａｂからＦａｂフラグメントを分離するために、消化混液を、リン酸緩衝液で平衡化させたプロテインＡMabSelectカラムにのせる。カラムを５カラム容量のＰＢＳで洗浄し、そしてＦａｂフラグメントを通過画分および洗浄画分において回収する。ＦｃフラグメントおよびインタクトなＭａｂを、１００mMクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いてカラムから溶出させ、そしてその後Ｆａｂフラグメントのサイズ排除クロマトグラフィーを、HiLoad Superdex 75カラムを使用して実施する。カラムに、２０mMトリエタノールアミン、１３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を０．５mL/分で流す。Ｆａｂフラグメントのタンパク質濃度を、２８０nmにおける吸光度を測定することによって決定する。Ｆａｂフラグメントの品質を、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって分析する。
【０１６２】
Ｆａｂ−ＩＧＦ−１複合体は、２倍モル過剰の組換えＩＧＦ−１(Gropep;レセプターグレード)を精製Ｆａｂに加え、これをその後、回転シェーカーで４℃で一晩インキュベーションすることによって生成される。複合体を（１５mg/mL）まで濃縮することおよび非結合ＩＧＦ−１の除去を、Amicon-Ultraデバイスを使用して実施する。Ｆａｂ：ＩＧＦ−１複合体の結晶化を、ハンギングドロップ（hanging drop）、シッティングドロップ（sitting drop）、および種晶添加（seeding）などの種々の技術を使用して行なう。１つの実施態様において、前記溶液を、沈降剤、すなわち沈降を誘導する試薬の存在に因りタンパク質の溶解度を減少させるリザーバと接触させることによって結晶を沈降させる。種々の条件のスクリーニングにより、沈降剤および添加剤の添加により操作される適切な緩衝系がもたらされる。沈降剤の濃度は、好ましくは５〜５０％ｗ/ｖである。緩衝剤のｐＨは好ましくは約３〜約６である。溶液中のタンパク質の濃度は、好ましくは、沈降を可能とする過飽和の濃度である。結晶化中の温度は好ましくは４〜２５℃である。
【０１６３】
原子座標によって規定されるＦａｂ：ＩＧＦ−１複合体の３次元構造は、結晶のＸ線回折パターンおよびそれから導かれた電子密度マップから得られる。結晶の回折は、２Åの解像度より良好である。結晶は、好ましくは、空間群Ｐ３２２１（１５４番）並びに約＝７０Å、ｂ＝７０Å、ｃ＝１９５Å；およびγ＝１２０°の単位格子寸法を有する。３次元構造を決定するための方法は、関連分子またはレセプターリガンド複合体の構造を使用する、分子置換である。モデル構築および最適化は、数回の反復工程においてそれぞれ２１％および２３％の最終Ｒ因子（ＲおよびＲfree）となるまで行なう。
【０１６４】
ラットにおける薬物動態パラメーターの決定
Wistarラットに、７２時間毎に１８、５２および２４８mg/kgの抗体の５回の静脈内ボーラス投与を行なう。種々の時点で血液試料を採取し、そして血漿中のヒト抗体濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定する。このことは、投与初日に抗体の平均薬物動態パラメーターを計算することを可能とし、そして半減期を投与の最終日の後に計算する（ｔ（ｎ）＝１００８時間）。
【０１６５】
実施例１
ＩＧＦ−１に結合する高親和性抗体の選択
ヒトＩＧＦ−１に対する親和性の向上したＦａｂフラグメントを同定するために、低ナノモルの親和性でＩＧＦ−１に結合すると同定されたいくつかの「親」Ｆａｂクローンについて「in vitro親和性成熟」を行い、ここで、親配列を、新たなＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２配列のライブラリーで置換することによって、各クローンのＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２配列を別々に多様化させる。得られた「成熟ライブラリー」についてヒトＩＧＦ−１上で溶液のパンニングを行ない、そして最善の親和性を有するクローンを、ＩｇＧ１抗体への変換のために選択し、そしてさらに試験する。最善のヒトＩＧＦ−１親和性を有する３つの抗体は６０８１４、６０８１９および６０８３３であり、これらは電気化学発光に基づいた平衡滴定法によって決定したところ、それぞれ１８０、１９０および１３０pMの親和性（ＫＤ）を有していた（表１に示す）。
【０１６６】
【表１】
2015131812.tif 000002
【０１６７】
また、抗体を、ヒト、マウス、およびラットのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、並びにヒトインシュリンへの結合について免疫吸着アッセイにおいて試験する。このことは、６０８１４、６０８１９および６０８３３が、マウスおよびラットのＩＧＦ−１、並びにヒト、マウスおよびラットのＩＧＦ−２と同等な交差反応結合を示すが、ヒトインシュリンには全く反応性を示さない（試験した最大濃度である５０ng/mlにおいて）ことを実証した（図１Ａ〜１Ｇ）。
【０１６８】
ヒト、マウスおよびラットのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２への抗体の結合に関する親和性定数もまた、表面プラズモン共鳴（Biacore）分析によって決定される。前記方法は、センサー上に抗体を捕捉すること、そして捕捉された抗体上にＩＧＦ抗原を流すことを含み、従って、ＩＧＦ抗原がセンサー上にコートされそして抗体が添加される場合に起こり得るあらゆる親和的作用が回避される。抗体６０８３３についてのこの方法を使用した親和性定数を表２に示し、これから、ヒトＩＧＦ−１およびヒトＩＧＦ−２に対して測定されたＫＤ値がそれぞれ０．０７nMおよび０．９nMであることが分かる。
【０１６９】
【表２】
2015131812.tif 000003
【０１７０】
実施例２
ＩＧＦシグナル伝達の阻害
ＩＧＦ−１ＲにＩＧＦが結合した後に起こる最初のシグナル伝達事象は、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化である。細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体６０８３３によるＩＧＦ誘発ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害を測定する。組換え体の生物活性なＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２により誘発されたＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の中和における、（１５μg/mL（１００nM）までの）６０８３３の効力および有効性を決定する。表３および図２の例において示したように、６０８３３は、ＩＧＦ−１（図２Ａ）およびＩＧＦ−２（図２Ｂ）により誘発されたシグナル伝達を強力かつ効果的に阻害する。同じアッセイにおいて、ＩＧＦ−１ＲをターゲティングするｍＡｂ αＩＲ３は、ＩＧＦ−１誘発シグナル伝達に関してはるかにより強度および効力が低く、そしてＩＧＦ−２により誘発されるシグナル伝達に対しても非常に弱い効果を示す。
【０１７１】
類似の細胞ベースのＩＲ−Ａリン酸化ＥＬＩＳＡを使用して、６０８３３がＩＲ−Ａを介したＩＧＦ−２シグナル伝達も阻害することができることを実証する。表４および図３Ａの例において示したように、６０８３３は、ＩＧＦ−２により誘発されたＩＲ−Ａリン酸化を強力かつ効果的に阻害する。これに対し、αＩＲ３はＩＲ−Ａに結合することができず、これは全く阻害作用を示さない。
【０１７２】
ヒトの血清または血漿の試料中のＩＧＦ生物活性のレベルはまた、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して測定することができる。これを使用して、ヒト血清中ＩＧＦ生物活性の中和における（１５μg/mL（１００nM）までの）６０８３３の効力および有効性を決定する。表３および図３Ｂの例において示したように、６０８３３は、ヒト血清中のＩＧＦ生物活性を強力かつ効果的に阻害する。
【０１７３】
【表３】
2015131812.tif 000004
【０１７４】
【表４】
2015131812.tif 000005
【０１７５】
実施例３
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２により誘発される細胞増殖に対する効果
ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２により誘発されるＭＣＦ−７（乳癌由来）およびＣＯＬＯ２０５（大腸癌由来）細胞株増殖に対する抗体６０８１４、６０８１９および６０８３３の効果を決定する。抗体６０８１４および６０８１９の効果の例を図４Ａ〜Ｄに示す。３つ全ての抗体が、ＩＧＦ−１（図４Ａおよび４Ｃ）およびＩＧＦ−２（図４Ｂおよび４Ｄ）により誘発されるＭＣＦ−７（図４Ａおよび４Ｂ）およびＣＯＬＯ２０５（図４Ｃおよび４Ｄ）の細胞増殖の用量依存性阻害を示す。ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２により誘発される各細胞株の増殖を５０％阻害するのに必要とされる各抗体の濃度を表５に示す。
【０１７６】
【表５】
2015131812.tif 000006
【０１７７】
実施例４
ユーイング肉腫由来細胞株の増殖に対する効果
１０％ＦＣＳを含有する培地中で増殖させたユーイング肉腫由来細胞株ＴＣ−７１の増殖に対する抗体６０８１９および６０８３３の効果を図５に示す。ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に結合しないヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較して、６０８１９および６０８３３は両方共、ＴＣ−７１細胞増殖の用量依存性阻害を示す。
【０１７８】
実施例５
マウスおよびラットの全ＩＧＦ−１レベルに対する効果
ＩＧＦターゲティング抗体を用いての活性ＩＧＦ−１の中和は、ＧＨ経路を介しての内分泌フィードバックをもたらし、これにより血清中全ＩＧＦ−１レベルの上昇が起こると予期され得る。抗体６０８１４、６０８１９および６０８３３は、マウスおよびラットのＩＧＦ−１と交差反応性であり、このことは、血清中全ＩＧＦ−１レベルに対する任意の薬物動態学的効果をこれらの種において測定することを可能とする。図６および７において示したように、マウス（図６）およびラット（図７）への抗体６０８１９の投与により、投与から２４時間後に血清中のマウスおよびラットの全ＩＧＦ−１レベルの用量依存的な上昇が起こる。これは、これらの抗体の活性の有用な薬物動態学的マーカーを示し、このマーカーをヒトにおける臨床開発において試験することができる。
【０１７９】
実施例６
ユーイング肉腫由来細胞株の増殖および細胞内シグナル伝達に対する、ＩＧＦリガンドターゲティング抗体とラパマイシンとの組合せの効果
ユーイング肉腫由来細胞株ＳＫ−ＥＳ−１の増殖に対する、抗体６０８１９およびｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの単独または組み合わせての効果を図８に示す。抗体６０８１９およびラパマイシンの両方および単独を用いて用量依存的な増殖阻害が見られ、どちらの単一薬剤も、１００nMにおいて約６０％の増殖阻害を達成する。抗体６０８１９およびラパマイシンの両方の等用量の組合せが、細胞増殖阻害に対する相加的な作用を実証し、１００nMの用量が組み合わせられた場合に約９５％阻害された。
【０１８０】
ＩＧＦにより誘発される細胞増殖は、細胞内タンパク質リン酸化事象の連鎖を介して媒介される。ＩＧＦ刺激によってリン酸化が増加する１つのタンパク質はＡＫＴである。図９は、１００nMの用量を使用した処置から２４時間後のＳＫ−ＥＳ−１細胞におけるＡＫＴのリン酸化に対する、抗体６０８１９およびラパマイシンの単独または組み合わせての効果を実証する。ＡＫＴのリン酸化を示す増殖中の非処理細胞と比較して、１００nMの抗体６０８１９はＡＫＴリン酸化を阻害した。逆に、１００nMのラパマイシンによる処理により、対照よりも高いレベルのリン酸化ＡＫＴがもたらされ、これはｍＴＯＲ阻害後の代償的なフィードバックメカニズムに起因すると考えられる。しかしながら、１００nMのラパマイシンおよび１００nMの抗体６０８１９を併用した場合、ＡＫＴのリン酸化は阻害される。このことは、ラパマイシンによる処置時にリン酸化ＡＫＴをもたらす代償的なフィードバックは、ＩＧＦリガンドの上昇に起因し、そしてこれらは抗体６０８１９によって阻害されることを示唆する。図９はまた、抗体６０８１９およびラパマイシンの両方が、単独または組み合わせて、ＰＴＥＮの全レベルに影響を及ぼさないことを実証する。
【０１８１】
実施例７
ＮＳＣＬＣ由来細胞株増殖に対する、ＩＧＦリガンドターゲティング抗体とＥＧＦＲ阻害剤との組合せの効果
ＮＳＣＬＣ由来細胞株Ａ−５４９の増殖に対する、抗体６０８１９およびＥＧＦＲ阻害剤のエルロチニブ／タルセバの単独または組み合わせての効果を図１０に示す。このモデルにおいては、細胞増殖に対する抗体６０８１９単独の効果は小さいものにすぎないが、タルセバは用量依存的な効果を示し、試験した最も高い用量（２０μM）において細胞増殖を約６０％阻害した。しかしながら、抗体６０８１９およびタルセバを併用する場合、より強力かつ効果的に細胞増殖が阻害され、相乗作用を示す。
【０１８２】
実施例８
Wistarラットにおける薬物動態特性
１８、５２および２４８mg/kgの投与初日のWistarラットにおける抗体６０８３３の平均薬物動態パラメーターを表６に示す。消失半減期を、投与最終日の後に計算し（ｔ（ｎ）＝１００８時間）、３つ全ての用量レベルに対する平均消失半減期は２２１時間（９．２日間）である。
【０１８３】
【表６】
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【０１８４】
実施例９
ＩＧＦ−１上の抗体結合部位を同定するためのＦａｂ−ＩＧＦ−１の共結晶化および構造決定
ＩＧＦ抗体と相互作用するヒトＩＧＦ−１上の残基を明確に決定するために、ＦａｂおよびＩＧＦ−１を共結晶化し、そして相互作用の構造を２Åよりも良好な解像度で決定した。抗体（Ｆａｂ）６０８３３によって接触されるＩＧＦ−１上の残基を表７に示す。ＩＧＦ−１上の全部で１９個の残基が、６０８３３上の１５個のＣＤＲ残基と接触する。これらの１９個のＩＧＦ−１残基の中で１７個が、ヒトＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のアミノ酸配列をアラインさせた場合（表７に列挙）、ヒトＩＧＦ−２と同一である。図１１は、ＩＧＦ−１の３次元構造を示し、６０８３３によって結合されるアミノ酸が強調され、ヒトＩＧＦ−１の線形アミノ酸配列も示され、相互作用するアミノ酸に下線が付されている。
【０１８５】
【表７】
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【０１８６】
【表８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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