(57)【要約】【課題】本発明は、消化器癌治療に使用される分子標的薬を提供すると共に、患者毎に当該分子標的薬による治療効果を予測するためのバイオマーカーを解明し、当該分子標的薬による治療効果が見込まれる消化器癌患者を選別するための方法を提供することを目的とする。【解決手段】プロスタグランジンD2合成酵素を使用することにより、内因性のプロスタグランジンD2産生を促進し、消化器癌細胞の増殖を抑制できる。更に、プロスタグランジンD2合成酵素は、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAの発現量が多い消化器癌細胞に対して、選択的に増殖抑制効果を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジンD2合成酵素を有効成分とする、消化器癌治療剤。
【請求項２】
ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAの発現量が多い消化器癌に対して適用される、請求項１に記載の消化器癌治療剤。
【請求項３】
消化器癌が、胃癌、膵癌、又は食道癌である、請求項１又は２に記載の消化器癌治療剤。
【請求項４】
消化器癌に対するプロスタグランジンD2合成酵素の治療効果を予測するためのバイオマーカーであって、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAからなることを特徴とする、バイオマーカー。
【請求項５】
消化器癌が、胃癌、膵癌、又は食道癌である、請求項４に記載のバイオマーカー。
【請求項６】
消化器癌患者から採取された消化器癌細胞におけるペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAの発現量を測定する工程を含む、プロスタグランジンD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定する方法。
【請求項７】
消化器癌が、胃癌又は膵癌である、請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
プロスタグランジンD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定するために使用される検査薬であって、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAを検出するための試薬を含むことを特徴とする、検査薬。
【請求項９】
消化器癌が、胃癌、膵癌、又は食道癌である、請求項８に記載の検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジンD2合成酵素を利用した消化器癌治療剤に関する。また、本発明は、消化器癌患者毎に当該消化器癌治療剤の薬効を予測するためのマーカー、及び当該マーカーを利用して当該消化器癌治療剤が有効な消化器癌患者を判定する方法に関する。更に、本発明は、当該消化器癌治療剤が有効な消化器癌患者を判定するために使用される検査薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジンは、腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼすことが知られているが、それ自体は、不安定で半減期が短いため、臨床応用は困難とされている。また、近年、プロスタグランジン産生酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２（COX-2）阻害剤によってプロスタグランジン産生を抑制することで、癌治療を試みる臨床試験が大腸腫瘍や乳腺腫瘍に対して行われたが（非特許文献１及び２参照）、一定した抗腫瘍効果が認められず、認可されるに至っていない。
【０００３】
プロスタグランジンは、プロスタグランジンH2（PGH2）、プロスタグランジンE2(PGE2)、プロスタグランジンD2（PGD2）、プロスタグランジンJ2（PGJ2）、プロスタグランジンI2（PGI2）、プロスタグランジンG2(PGG2）等の様々な種類がある生理活性物質であり、生体内でアラキドン酸カスケードよって生成することが知られている。アラキドン酸カスケードでは、アラキドン酸にシクロオキシゲナーゼ（COX）が作用してPGG2が生成し、PGG2がPGH2に変換された後、PGH2が各種酵素の作用を受けて、PGI2、PGE2、PGF2α、PGD2、トロンボキサンA2（TAX2）等が生成する（図１参照）。各プロスタグランジンは互いに類似した構造を有しているが、それぞれ異なる生理活性を示すことが知られており、更に、プロスタグランジンの中には、腫瘍に対して相反する作用を示すものが混在していることも知られている。例えば、PGE2は腫瘍増殖を亢進する作用を示すことが報告されており（非特許文献３及び４参照）、逆にPGD2は逆に抗腫瘍作用を示すことが報告されている（非特許文献５及び６参照）。そのため、COX-2阻害剤が癌治療において臨床応用できない原因の１つとして、COX-2阻害剤が様々な作用を示すプロスタグランジンの生成を一括して阻害し、結果として十分な抗腫瘍効果を発揮することができないことが考えられる。
【０００４】
一方、胃癌は、近年の診断技術と術前術後管理の発達により死亡率は減少しているものの、罹患者が多く、依然として癌による死因の中でも高い割合を占めている。また、胃癌を含めた消化器癌の症例は、近年増加傾向にあり、癌による死亡者数の内、消化器が約半数を占めている。
【０００５】
そのため、消化器癌の治療法の更なる向上が求められている。PGD2には胃癌細胞の増殖を抑制することが報告されており（非特許文献７参照）、胃癌治療効果が期待されるが、他のプロスタグランジンと同様、PGD2は、不安定で半減期が短いため臨床応用が困難である。また、近年、癌の治療に有効な分子標的薬が開発されており、胃癌分野でも分子標的薬として、HER2阻害剤であるトラスツズマブが臨床応用されているが、その適用は胃癌症例の２割程度に過ぎないのが現状である。また、分子標的薬を使用した癌治療では、患者によって所望の薬効が認められない場合があり、分子標的薬を開発する上で、患者への不要な投薬を回避するために、分子標的薬による治療効果を予測するためのバイオマーカーを解明しておくことも重要になっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Arber N. et. al., The England journal of medicine, 2006 Aug 31; 355(9): 885-95.
【非特許文献２】Harris RE. et. al., BMC Cancer, 2006; 6:27.
【非特許文献３】Sheng H. et. al., The Journal of biological chemistry, 2001 May 25; 276(21): 18075-81.
【非特許文献４】Doherty GA. Et al., BMC Cancer, 2009; 9:207.
【非特許文献５】Wang JJ. Et al., Cell Biology international, 2011 Nov; 35(11):1089-96.
【非特許文献６】Yoshida T et al., Surgery today, 1998; 28(7): 740-5.
【非特許文献７】Kim J. et al., Cancer Research, 2005; 65:6189-6198.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、消化器癌治療に有効な分子標的薬を提供することである。また、本発明の他の目的は、消化器癌治療に使用される分子標的薬を提供すると共に、患者毎に当該分子標的薬による治療効果を予測するためのバイオマーカーを解明し、当該分子標的薬による治療効果が見込まれる消化器癌患者を選別するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、胃癌や膵癌等の消化器癌の治療には、アラキドン酸カスケードの下流に位置するシグナルを標的分子とすることが有効になるとの考えの下で鋭意検討を行った。その結果、PGD2合成酵素を使用することにより、内因性のPGD2産生を促進し、消化器癌細胞の増殖を抑制できることを見出した。更に、PGD2合成酵素は、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１（PPARγ1）又はそのmRNAの発現量が多い消化器癌細胞に対して、選択的に増殖抑制効果を示すことをも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  プロスタグランジンD2合成酵素を有効成分とする、消化器癌治療剤。
項２．  ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAの発現量が多い消化器癌に対して適用される、項１に記載の消化器癌治療剤。
項３．  消化器癌が、胃癌又は膵癌である、項１又は２に記載の消化器癌治療剤。
項４．  消化器癌に対するプロスタグランジンD2合成酵素の治療効果を予測するためのバイオマーカーであって、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAからなることを特徴とする、バイオマーカー。
項５．  消化器癌が、胃癌、膵癌、又は食道癌である、項４に記載のバイオマーカー。
項６．  消化器癌患者から採取された消化器癌細胞におけるペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAの発現量を測定する工程を含む、プロスタグランジンD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定する方法。
項７．  消化器癌が、胃胃癌、膵癌、又は食道癌である、項６に記載の判定方法。
項８．  プロスタグランジンD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定するために使用される検査薬であって、ペルオキシソーム増殖因子活性受容体γ１又はそのmRNAを検出するための試薬を含むことを特徴とする、検査薬。
項９．  消化器癌が、胃癌、膵癌、又は食道癌である、項８に記載の検査薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、PGD2合成酵素を使用することにより、内因性のPGD2産生を促進し、消化器癌細胞の増殖や転移を抑制でき、効果的に消化器癌を治療することが可能になる。また、PGD2合成酵素は、PPARγ1の発現量が多い消化器癌に対して選択的に優れた治療効果を示すので、消化器癌患者における消化器癌細胞のPPARγ1又はそのmRNAの発現量を予め測定しておくことによって、PGD2合成酵素の投与が有効な消化器癌患者を選別でき、治療効果が見込まれない消化器癌患者への不要な投薬を回避して、より確実な消化器癌治療を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アラキドン酸カスケードによって各種プロスタグランジンが生成する経路の概略を示す図である。
【図２】PGD2を用いて胃癌細胞株に対するMTTアッセイを行った結果を示す図である。図中、「C」とはコントロールを示す。
【図３】PGD2シグナル経路の概略を示す図である。
【図４】胃癌細胞株におけるPPARγ1の発現量を測定した結果を示す図である。
【図５】胃癌細胞株において、PGD2による増殖抑制作用に対するPPARγ阻害剤の影響について分析した結果を示す図である。
【図６】胃癌細胞株において、PGD2及びPPARγ阻害剤がPGD2シグナル経路のPPARγ下流のβ-catenin、c-myc、及びcyclin D1に及ぼす影響について分析した結果を示す図である。
【図７】胃癌皮下モデルにおいて、PGD2が腫瘍サイズに与える影響について分析した結果を示す図である。
【図８】PGD2合成酵素を用いて胃癌細胞株に対するMTTアッセイを行った結果を示す図である。図中、「C」とはコントロールを示す。
【図９】PGD2合成酵素が胃癌細胞のPGD2産生量に与える影響について分析した結果を示す図である。
【図１０】胃癌細胞株において、PGD2合成酵素による増殖抑制作用に対するPPARγ阻害剤の影響について分析した結果を示す図である。
【図１１】胃癌皮下モデルにおいて、PGD2合成酵素が腫瘍サイズに与える影響について分析した結果を示す図である。
【図１２】胃癌皮下モデルにPGD2合成酵素を投与した後に、腫瘍組織をKi67の免疫組織染色を行った結果を示す図である。
【図１３】PGD2及びPGD2合成酵素を用いて膵癌癌細胞株及び食道癌細胞に対するMTTアッセイを行った結果を示す図である。図中、「C」とはコントロールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．消化器癌治療剤
本発明の消化器癌治療剤は、PGD2合成酵素を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の消化器癌治療剤について詳述する。
【００１３】
PGD2合成酵素は、PGH2を基質としてPGD2を生成する酵素である。本発明の消化器癌治療剤は、ヒトの消化器癌治療に適用されるので、本発明で使用されるPGD2合成酵素はヒト由来が使用される。ヒト由来のPGD2合成酵素のアミノ酸配列は公知であり、具体的には、ヒト由来のPGD2合成酵素のアミノ酸配列として、配列番号１が知られている。ヒト由来のPGD2合成酵素は、公知の遺伝子工学的手法を利用して組み換え体として得ることができる。また、本発明で使用されるPGD2合成酵素は、PGH2からPGD2を生成する活性があることを限度としてヒトPGD2合成酵素の１又は複数個（若しく数個）のアミノ酸を置換、欠失、付加、又は挿入した変異体であってもよい。具体的には、アミノ酸配列１において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入したアミノ酸配列からなり、且つPGH2からPGD2を生成する活性する変異体であっても、本発明においてPGD2合成酵素として使用することができる。
【００１４】
本発明の消化器癌治療剤は、その投与形態に応じて、PGD2合成酵素を薬学的に許容される担体、添加剤等と共に製剤化して使用される。
【００１５】
本発明の消化器癌治療剤の治療対象となる消化器癌については、特に制限されず、例えば、胃癌、膵癌、大腸癌、小腸癌、肝癌、胆嚢癌等が挙げられる。これらの消化器癌の中でも、本発明の消化器癌治療剤の治療対象として、好ましくは胃癌、膵癌及び食道癌、更に好ましくは胃癌が挙げられる。
【００１６】
本発明の消化器癌治療剤は、消化器癌の治療、消化器癌の進行抑制、消化器癌の再発防止等を目的として消化器癌患者に投与される。本発明の消化器癌治療剤は、化学療法、術前化学療法、及び術後補助化学療法のいずれにおいても使用することができるが、好ましくは化学療法が挙げられる。なお、本発明の消化器癌治療剤の投与対象として好適な消化器癌患者については、後述する「２．消化器癌に対するPGD2合成酵素の薬効の予測マーカー、及びPGD2合成酵素が有効な消化器癌患者の判定方法」の欄に記載する通りである。
【００１７】
本発明の消化器癌治療剤の投与方法については、特に制限されず、全身投与又は局所投与のいずれであってもよく、例えば、経口投与、皮内投与、筋肉注射、皮下投与、静脈注射、点滴投与、腹腔内投与等が挙げられる。これらの投与方法の中でも、治療効果を高めるという観点から、好ましくは点滴投与が挙げられる。
【００１８】
本発明の消化器癌治療剤の投与量については、患者の年齢、体重、消化器癌の種類や進行度等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、1〜5mg/kg-体重で、2〜3日に１回投与すればよい。
【００１９】
また、本発明の消化器癌治療剤は、消化器癌の治療に使用される他の抗癌剤と併用して使用してもよい。本発明の消化器癌治療剤と併用される抗癌剤の種類については、特に制限されないが、例えば、５−フルオロウラシル（5-FU）、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、イリノテカン（CPT-11）、シスプラチン、パクリタキセル（PTX）、ドセタキセル、マイトマイシン、アブラキサン等が挙げられる。
【００２０】
２．消化器癌に対するPGD2合成酵素の治療効果の予測マーカー、及びPGD2合成酵素が有効な消化器癌患者の判定方法
本発明の消化器癌治療剤は、PPARγ1又はそのmRNAの発現量が多い消化器癌に対して、選択的に優れた治療効果を示す。従って、本発明は、更に、PPARγ1又はそのmRNAからなる、消化器癌に対するPGD2合成酵素の治療効果を予測するためのバイオマーカーを提供する。
【００２１】
本発明のバイオマーカーは、消化器癌患者の消化器癌細胞において発現しているPPARγ1又はそのmRNAであり、消化器癌患者の消化器癌から採取された胃癌細胞から検出されるマーカーである。
【００２２】
消化器癌細胞内で発現しているPPARγ1の測定は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、消化器癌細胞からタンパク質を抽出し、抗PPARγ1抗体を用いた免疫学的方法やELISA法等によって、消化器癌細胞内で発現しているPPARγ1を測定することができる。また、手術摘出標本を用いて免疫組織化学染色方法やELISA法によりPPARγ1を測定することもできる。
【００２３】
また、消化器癌細胞内でのPPARγ1のmRNAの発現量についても、公知の方法に従って行うことができる。例えば、消化器癌細胞から全RNAを抽出し、逆転写酵素を利用してcDNAを作成し、更にPPARγ1遺伝子に対するプライマーを用いたRT-PCR法によりPPARγ1のmRNAを測定することができる。
【００２４】
本発明のバイオマーカーとして、PPARγ1又はそのmRNAのいずれを使用してもよいが、mRNAの方が高い精度で測定可能であり、好適である。
【００２５】
本発明のバイオマーカーは、消化器癌患者において、PGD2合成酵素の投与による治療効果を予測し、PGD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定するために使用される。具体的には、消化器癌患者から採取された消化器癌細胞において、本発明のバイオマーカーの発現量が多い程、PGD2合成酵素の投与による治療が有効であり、PGD2合成酵素による治療が有効な消化器癌患者と判定される。また、消化器癌患者から採取された消化器癌細胞において、本発明のバイオマーカーの発現量が少ない程、PGD2合成酵素の投与による治療効果が認められ難く、PGD2合成酵素による治療が相応しくない消化器癌患者と判定される。
【００２６】
また、後述する試験例２に示しているように、胃癌細胞株（OCUM-12、大阪市立大学大学院医学研究科腫瘍外科学講座（外科学第１）にて保管）は発明のバイオマーカーの発現量が少なく、PGD2合成酵素の投与による治療効果が認められ難いことが確認されている。従って、本発明のバイオマーカーの発現量に基づいてPGD2合成酵素の投与による治療効果を予測する指標の１つとして、胃癌細胞株（OCUM-12）を利用することができる。即ち、胃癌患者から採取された胃癌細胞における本発明のバイオマーカーの発現量が、胃癌細胞株（OCUM-12）に比べて、多い場合、好ましくは1.5倍以上である場合、更に好ましくは1.8倍以上である場合には、PGD2合成酵素の投与による治療が有効であり、PGD2合成酵素による治療が有効であると判定することができる。
【００２７】
更に、後述する試験例２に示しているように、胃癌細胞株（MKN-74、JCRB0255、独立行政法人医薬基盤研究所JCRB細胞バンクにて受託）は発明のバイオマーカーの発現量が多く、PGD2合成酵素の投与による治療が有効であることが確認されている。従って、本発明のバイオマーカーの発現量に基づいてPGD2合成酵素の投与による治療効果を予測する指標の１つとして、胃癌細胞株（MKN-74）を利用することもできる。即ち、消化器癌患者から採取された消化器癌細胞における本発明のバイオマーカーの発現量が、胃癌細胞株（MKN-74）に比べて、1/2倍以上である場合、更に好ましくは等倍以上である場合には、PGD2合成酵素の投与による治療が有効であり、PGD2合成酵素による治療が有効であると判定することができる。
【００２８】
３．消化器癌に対するPGD2合成酵素の薬効の予測するための検査薬
本発明の検査薬は、PGD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定するために使用される検査薬であって、PPARγ1又はそのmRNAを検出するための試薬を含むことを特徴とする。
【００２９】
PPARγ1は、前述するように、抗PPARγ1抗体を用いた免疫学的方法等によって測定できることが公知であり、PPARγ1を検出するための試薬としては、具体的には、抗PPARγ1抗体が挙げられる。本発明の検査薬が、PPARγ1を検出するための試薬として抗PPARγ1抗体を含む場合には、更に必要に応じて、消化器癌細胞からタンパク質を抽出するための試薬、免疫学的方法を行う上で必要になる試薬（２次抗体、発色物質等）、免疫組織化学染色方法を行うための試薬等が含まれていてもよい。
【００３０】
また、PPARγ1のmRNAは、前述するように、RT-PCR等によって測定できることが公知であり、PPARγ1のmRNAを検出するための試薬としては、具体的には、PPARγ1遺伝子に対するプライマーが挙げられる。本発明の検査薬が、PPARγ1のmRNAを検出するための試薬としてPPARγ1遺伝子に対するプライマーを含む場合には、更に必要に応じて、消化器癌細胞からmRNAを抽出するための試薬、逆転写酵素等が含まれていてもよい。
【００３１】
本発明の検査薬を用いて測定されたPPARγ1又はそのmRNAの発現量は、前述する「２．消化器癌に対するPGD2合成酵素の薬効のバイオマーカー、及びPGD2合成酵素が有効な消化器癌患者の判定方法」に従って、PGD2合成酵素が有効な消化器癌患者を判定するために使用される。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３３】
試験例１
本試験では、PGD2を用いて胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-2MD3、OCUM-2D、OCUM-12、MKN-74）に対するMTTアッセイを行った。具体的な試験方法は以下の通りである。なお、胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-2MD3、OCUM-2D、OCUM-12）は、大阪市立大学大学院医学研究科腫瘍外科学講座（外科学第１）にて保管されており、胃癌細胞株（MKN-74）は、細胞番号JCRB0255として、独立行政法人医薬基盤研究所JCRB細胞バンクにて受託されている。
【００３４】
96穴プレートに各胃癌細胞（1×105個/ml）を90μlずつ播き、更にPGD2の溶液を各濃度（最終濃度10-10〜10-6nM）となるように10μlずつ添加した。72時間、37℃にてインキュベートした後に、MTT(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, yellow tetrazole）溶液を添加し、3時間後にDMSO（ジメチルスルホキシド）を添加して570nmの吸光度を測定した。コントロールとしてPGD2を添加しなかったこと以外は上記と同条件で試験を行い、コントロールにおける570nmの吸光度を100％として細胞増殖率（％）を求めた。
【００３５】
得られた結果を図２に示す。この結果から、PGD2は、OCUM-2M、OCUM-2MD3、及びMKN-74の増殖を有意に抑制できるが、OCUM-2D及びOCUM-12の増殖には影響を及ぼさないことが明らかとなった。
【００３６】
試験例２
図３に示すように、PGD2シグナル経路には、PPARγが関与しており、更にPPARγ下流ではc-myc，cyclin D1，及びβ-cateninが関与している。そこで、本試験では、胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-2MD3、OCUM-2D、OCUM-12、MKN-74）におけるPPARγ1の発現量の測定を行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００３７】
各胃癌細胞について、RNeasy Mini Kit(QIAFEN社)を使用してmRNAを抽出した。次いで、得られたmRNAから、ReverTra Ace  qPCR RT Master Mix (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan)を用いてcDNAを作成した。更に、PPARγ1のプライマー（5'-CGAGAGTCAGCCTTTAACGAAATG-3'（配列番号２）、3'-GGTCTTCCATTACGGAGAGATCC-5'（配列番号３）；Sigmaより作成）を用いてABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), Quantitative RT-PCRを行うことによって、胃癌細胞におけるPPARγ1の発現量を求めた。OCUM-12におけるPPARγ1のmRNA量を１とする相対的発現量を算出し、各胃癌細胞におけるPPARγ1の発現量を評価した。
【００３８】
得られた結果を図４に示す。この結果から、５つの胃癌細胞の全てにおいてPPARγ1の発現が認められたが、PGD2による増殖抑制効果が認められた３つの胃癌細胞（OCUM-2M、OCUM-2MD3、及びMKN-74）では、PPARγ1の発現量が高かったのに対して、PGD2による増殖抑制効果が認められなかった２つの胃癌細胞（OCUM-2D及びOCUM-12）ではPPARγ1の発現量が相対的に低くなっていることが確認された。
【００３９】
試験例３
本試験では、胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-2MD3、OCUM-2D、OCUM-12、MKN-74）において、PGD2による増殖抑制作用に対するPPARγ阻害剤の影響について分析した。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００４０】
96穴プレートに各胃癌細胞（1×105個/ml）を80μlずつ播き、更にPPARγ阻害剤（BADGE、Tocris Bioscience）の溶液をPPARγ阻害剤の最終濃度が1μMとなるように添加し、更に1時間後にPGD2の溶液をPGD2の最終濃度が1μMとなるように10μlずつ添加した。71時間、37℃にてインキュベートした後に、MTT溶液を添加し、3時間後にDMSOを添加して570nmの吸光度を測定した。また、PPARγ阻害剤を添加せずにPGD2のみを添加した場合、及びPGD2を添加せずにPPARγ阻害剤のみを添加した場合についても、上記と同条件で試験を行った。コントロールとしてPPARγ阻害剤とPGD2の双方を添加せずに上記と同条件で試験を行い、コントロールにおける570nmの吸光度を100％として細胞増殖率（％）を求めた。
【００４１】
得られた結果を図５に示す。この結果から、PPARγ阻害剤は、胃癌細胞（OCUM-2M、OCUM-2MD3、及びMKN-74）においてPGD2による増殖抑制作用を低下させることが明らかとなった。なお、PGD2による増殖抑制効果が認められなかった胃癌細胞（OCUM-2D及びOCUM-12）については、PPARγ阻害剤による増殖への影響は認められなかった。
【００４２】
試験例４
本試験では、PGD2及びPPARγ阻害剤がPGD2シグナル経路のPPARγ下流のβ-catenin、c-myc、及びcyclin D1に及ぼす影響について、胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-12、MKN-74）において分析した。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００４３】
胃癌細胞株を10容量％ウシ胎児血清（FCS）含有ダルベッコ・フォークト変法イーグル最少必須培地10mlにて10cm培養ディッシュで2日間培養した後、培養液を2容量％FCS含有ダルベッコ・フォークト変法イーグル最少必須培地8mlに交換した。次いで、PPARγ阻害剤（BADGE、Tocris Bioscience）の溶液をPPARγ阻害剤の最終濃度が1μMとなるように1mlずつ添加し、更に1時間後にPGD2の溶液をPGD2の最終濃度が1μMとなるように10μlずつ添加した。添加後24時間、37℃で培養した後に、各胃癌細胞を回収してPRO-PREPTM Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Inc)を用いてタンパク質の抽出を行った。得られたタンパク質を、SDS-sample bufferを用いて電気泳動により分離した。PVDF膜（Bio.RAD社）とトランスブロットTurboブロッティングシステム（Bio.RAD社）を用いて、分離されたタンパク質をPVDF膜に転写した。転写されたタンパク質に対して、β-catenin、c-myc、及びcyclin D1に対する各抗体を反応させた後、当該抗体をペルオキシダーゼ標識二次抗体により標識し、電気化学発光（ECL）試薬、イムノスターLD（WAKO社）にて発光させ、化学発光検出システムによりタンパクの検出を行った。また、PPARγ阻害剤を添加せずにPGD2のみを添加した場合についても、上記と同条件で試験を行った。コントロールとしてPPARγ阻害剤とPGD2の双方を添加しなかったこと以外は上記と同条件で試験を行った。
【００４４】
得られた結果を図６に示す。この結果から、PGD2による増殖抑制効果が認められた胃癌細胞（OCUM-2M及びMKN-74）では、PGD2の添加はPPARγ下流のc-myc、cyclin D1、及びβ-cateninの発現を抑制することが明らかとなった。また、これらの胃癌細胞（OCUM-2M及びMKN-74）では、PPARγ阻害剤によって、PGD2によるc-myc及びcyclin D1の発現抑制が無効になることも確認された。一方、PGD2による増殖抑制効果が認められなかった胃癌細胞（OCUM-12）では、コントロールにおいて、PGD2の添加の有無によるc-myc、cyclin D1、及びβ-cateninの発現量の差はほとんど認められなかった。
【００４５】
試験例５
本試験では、胃癌皮下モデルにおいて、PGD2による腫瘍サイズに与える影響について確認した。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００４６】
胃癌細胞株（OCUM-2MD3）の5×106個の細胞を4週齢メスBALB/cマウスに皮下接種を行い、5日飼育した。胃癌細胞の接種後5日目から18日目までPGD2を6mg/kg，2mg/kgの用量で腹腔内に隔日投与した。PGD2の投与日に腫瘍径（3回/週）、体重（1回/週）を計測した。また、胃癌細胞の皮下接種後20日目に、マウスから皮下腫瘍を採取し、その腫瘍をパラフィン固定し、Ki67の免疫組織染色を行った。免疫染色後の評価方法は、陽性細胞の比率（Ki67 index）を用いて検討を行った。また、コントロールとして、PGD2を投与しないこと以外は、上記と同条件で試験を行った。
【００４７】
得られた結果を図７に示す。この結果から、胃癌皮下モデルにおいて、PGD2は腫瘍サイズが増大するのを有意に抑制できることが明らかとなった。
【００４８】
試験例６
試験例１〜５から、PGD2はPPARγの発現量が高い胃癌に対して抗腫瘍効果を示すこと、PGD2シグナルをターゲットにすることによって新たな胃癌の治療薬を創出し得ることが明らかとなった。但し、PGD2は不安定であり、薬剤としては適していないそこで、PGD2合成酵素が胃癌の治療薬になり得るかを確認するために、PGD2合成酵素を用いて胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-2MD3、OCUM-2D、OCUM-12、MKN-74）に対するMTTアッセイを行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００４９】
96穴プレートに各胃癌細胞（1×105個/ml）を90μlずつ播き、更にPGD2合成酵素（Recombinant Human Prostaglandin D2 synthase; ProSpec；配列番号１）の溶液を各濃度（PGD2合成酵素の最終濃度10-1〜10mg/ml）となるように10μlずつ添加した。95時間、37℃にてインキュベートした後に、MTT溶液を添加し、3時間後にDMSOを添加して570nmの吸光度を測定した。コントロールとしてPGD2を添加せずに上記と同条件で試験を行い、コントロールにおける570nmの吸光度を100％として細胞増殖率（％）を求めた。
【００５０】
得られた結果を図８に示す。この結果から、PGD2合成酵素は、PPARγ1の発現量が高い胃癌細胞（OCUM-2M、OCUM-2MD3、及びMKN-74）の増殖を有意に抑制できることが明らかとなった。
【００５１】
試験例７
本試験では、PGD2合成酵素が胃癌細胞（OCUM-2M、OCUM-12、MKN-74）のPGD2産生量に与える影響を分析した。
【００５２】
6穴プレートに胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-12、MKN-74）（1×105個）を含んだ10容量%FCS含有ダルベッコ・フォークト変法イーグル最少必須培地を2mlずつ播き、48時間37℃にて培養を行った後に、血清フリーのダルベッコ・フォークト変法イーグル最少必須培地900μlとPGD2合成酵素（Recombinant Human Prostaglandin D2 synthase; ProSpec；配列番号１）の溶液100μl（PGD2合成酵素の最終濃度10ng/ml）を添加して、更に48時間37℃にて培養を行った。その後、上清を採取し、ELISA法（Cayman chemical）にてPGD2産生量を測定した。また、比較のためにヒト癌関連線維芽細胞（CAF45；大阪市立大学大学院医学研究科腫瘍外科学講座（外科学第１）にて保管）についても、上記と同条件で試験を行った。更に、コントロールとして、PGD2合成酵素を添加しなかったこと以外は、上記と同条件で試験を行った。
【００５３】
得られた結果を図９に示す。この結果から、胃癌細胞に対してPGD2合成酵素を添加することによって、細胞によるPGD2が有意に促進されることが明らかとなった。一方、癌関連線維芽細胞（CAF45）では、PGD2合成酵素を添加しても、コントロールに対してPGD2産生量の有意差は認められなかった。
【００５４】
試験例８
本試験では、胃癌細胞株（OCUM-2M、OCUM-12、MKN-74）において、PGD2合成酵素による増殖抑制作用に対するPPARγ阻害剤の影響について分析した。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００５５】
96穴プレートに各胃癌細胞（1×105個/ml）を80μlずつ播き、更にPPARγ阻害剤（BADGE、Tocris Bioscience）の溶液をPPARγ阻害剤の最終濃度が1μMとなるように添加し、更に1時間後にPGD2合成酵素（Recombinant Human Prostaglandin D2 synthase; ProSpec）の溶液をPGD2合成酵素の最終濃度が10mg/mlとなるように10μlずつ添加した。95時間、37℃にてインキュベートした後に、MTT溶液を添加し、3時間後にDMSOを添加して570nmの吸光度を測定した。また、PPARγ阻害剤を添加せずにPGD2合成酵素のみを添加した場合、及びPGD2合成酵素を添加せずにPPARγ阻害剤のみを添加した場合についても、上記と同条件で試験を行った。コントロールとしてPPARγ阻害剤とPGD2合成酵素の双方を添加せずに上記と同条件で試験を行い、コントロールにおける570nmの吸光度を100％として細胞増殖率（％）を求めた。
【００５６】
得られた結果を図１０に示す。この結果から、PGD2合成酵素による胃癌細胞の増殖抑制効果は、PPARγ阻害剤によって抑制されることが確認され、PGD2合成酵素による胃癌細胞の増殖抑制効果はPGD2シグナル経路におけるPPARγが関与していることが明らかとなった。
【００５７】
試験例９
本試験では、胃癌皮下モデルにおいて、PGD2合成酵素による腫瘍サイズに与える影響について確認した。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００５８】
胃癌細胞株（OCUM-2MD3）の5×106個の細胞を4週齢メスBALB/cマウスに皮下接種を行い、5日飼育した。胃癌細胞の接種後5日目から16日目までPGD2合成酵素（Prostaglandin D2 synthase; GenWay Biotech, Inc.；配列番号１）を2mg/kgの用量で腹腔内に隔日投与した。PGD2合成の投与日に腫瘍径（3回/週）、体重（1回/週）を計測した。また、胃癌細胞の皮下接種後18日目に、マウスから皮下腫瘍を採取し、その腫瘍をパラフィン固定し、Ki67の免疫組織染色を行った。免疫染色後の評価方法は、陽性細胞の比率（Ki67 index）を用いて検討を行った。また、コントロールとして、PGD2を投与しないこと以外は、上記と同条件で試験を行った。
【００５９】
経時的に腫瘍径を測定した結果を図１１に示し、Ki67の免疫組織染色を行った結果を図１２に示す。なお、図１１及び１２には、胃癌皮下モデルに、PDG2自体を投与した場合の結果（試験例５の結果）についても併せて示す。この結果から、胃癌皮下モデルにおいて、PGD2合成酵素は腫瘍サイズが増大するのを有意に抑制でき、その抑制効果はPGD2自体を投与した場合に比べて格段に高いことが明らかとなった。
【００６０】
試験例１０
PGD2合成酵素が胃癌細胞以外の消化器癌細胞に与える影響を評価するために、PGD2合成酵素を用いて膵癌細胞（ＲＷＰ−１）及び食道癌細胞（Ｔ．Ｔ）に対するMTTアッセイを行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【００６１】
96穴プレートに膵癌細胞又は食道癌細胞（1×105個/ml）を90μlずつ播き、更にPGD2合成酵素（Recombinant Human Prostaglandin D2 synthase; ProSpec；配列番号１）の溶液又はPGD2の溶液を各濃度（PGD2合成酵素の最終濃度10-1〜10mg/ml、又はPGD2の最終濃度10-1〜103nM）となるように10μlずつ添加した。95時間、37℃にてインキュベートした後に、MTT溶液を添加し、3時間後にDMSOを添加して570nmの吸光度を測定した。コントロールとしてPGD2合成酵素及びPGD2を添加せずに上記と同条件で試験を行い、コントロールにおける570nmの吸光度を100％として細胞増殖率（％）を求めた。
【００６２】
得られた結果を図１３に示す。この結果から、PGD2合成酵素は、膵癌細胞及び食道癌細胞の増殖を有意に抑制できることが確認された。即ち、本結果から、PGD2合成酵素は、胃癌のみならず、膵癌や食道癌等の消化器癌の治療に有効であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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