(57)【要約】【課題】高い効率で試料溶液中の核酸を除去する方法が望まれていた。【解決手段】核酸を含有する溶液より前記核酸を除去する核酸除去方法であって、前記溶液とグラフェンオキサイドとを混合することにより、第１混合液を得る工程（ａ）と、前記第１混合液と２価以上のカチオンとを混合することにより、第２混合液を得る工程（ｂ）と、前記第２混合液を遠心分離することにより、前記第２混合液の上清を得る工程（ｃ）と、を有する核酸除去方法。【選択図】図９
2015023820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有する溶液より前記核酸を除去する核酸除去方法であって、
前記溶液とグラフェンオキサイドと２価以上のカチオンとを混合することにより、混合液中に凝集物を生成する工程（ａ）と、
前記混合液を遠心分離することにより、前記凝集物を沈殿させる工程（ｂ）と、
沈殿した前記凝集物を除去する工程（ｃ）と、
を有する核酸除去方法。
【請求項２】
前記２価以上のカチオンが金属イオンである、請求項１に記載の核酸除去方法。
【請求項３】
前記金属イオンがＭｇ２＋である、請求項２に記載の核酸除去方法。
【請求項４】
前記混合液中における前記Ｍｇ２＋の濃度が１０ｍＭ以上である、請求項３に記載の核酸除去方法。
【請求項５】
前記２価以上のカチオンがポリアミンである、請求項１に記載の核酸除去方法。
【請求項６】
前記ポリアミンがスペルミジン又はスペルミンである、請求項５に記載の核酸除去方法。
【請求項７】
前記混合液中における前記スペルミジンの濃度が０．１ｍＭ以上である、請求項６に記載の核酸除去方法。
【請求項８】
前記混合液中における前記スペルミンの濃度が０．１ｍＭ以上である、請求項６に記載の核酸除去方法。
【請求項９】
前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１から８のいずれかに記載の核酸除去方法。
【請求項１０】
核酸を含有する溶液より前記核酸を除去する核酸除去方法であって、
前記溶液とグラフェンオキサイドとを混合することにより、第１混合液を得る工程（ｄ）と、
前記第１混合液と２価以上のカチオンとを混合することにより、第２混合液中に凝集物を生成する工程（ｅ）と、
前記第２混合液を遠心分離することにより、前記凝集物を沈殿させる工程（ｆ）と、
沈殿した前記凝集物を除去する工程（ｇ）と、
を有する核酸除去方法。
【請求項１１】
前記２価以上のカチオンが金属イオンである、請求項１０に記載の核酸除去方法。
【請求項１２】
前記金属イオンがＭｇ２＋である、請求項１１に記載の核酸除去方法。
【請求項１３】
前記第２混合液中における前記Ｍｇ２＋の濃度が１０ｍＭ以上である、請求項１２に記載の核酸除去方法。
【請求項１４】
前記２価以上のカチオンがポリアミンである、請求項１０に記載の核酸除去方法。
【請求項１５】
前記ポリアミンがスペルミジン又はスペルミンである、請求項１４に記載の核酸除去方法。
【請求項１６】
前記第２混合液中における前記スペルミジンの濃度が０．１ｍＭ以上である、請求項１５に記載の核酸除去方法。
【請求項１７】
前記第２混合液中における前記スペルミンの濃度が０．１ｍＭ以上である、請求項１５に記載の核酸除去方法。
【請求項１８】
前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１０から１７のいずれかに記載の核酸除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸除去方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料溶液中よりＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸を除去する従来技術として、核酸を分解する酵素を用いる方法がある（特許文献１、非特許文献１及び２）。
【０００３】
また、他の従来技術として、スペルミジン又はスペルミンを用いる方法がある（非特許文献３及び４）。スペルミジン及びスペルミンは、それぞれ３価又は４価の正電荷を有するポリアミンである。核酸は負電荷を有する高分子であるため、スペルミン又はスペルミジンと結合し、凝集する。したがって、かかる凝集塊を遠心分離し、沈殿物を除くことにより、核酸を除去することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６/０９５７６９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｉｌｅｎｋｉｒｃｈｅｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  、“Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｄｓｏｒｂｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄｓ．”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２４巻、２０００年、ｐ．１９５−２０８
【非特許文献２】Ｕｔｅ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．  、“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９巻、２００１年、ｐ．５３３−５５２
【非特許文献３】Ｂａｒｂａｒａ  Ｃ．  Ｈｏｏｐｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  、“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９巻、１９８１年、ｐ．５４９３−５５０４
【非特許文献４】Ｊｕａｎ  Ｐｅｌｔａ，  ｅｔ  ａｌ．  、“ＤＮＡ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｂａｌｔｈｅｘａｍｉｎｅ”、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１巻、１９９６年、ｐ．５６５６−５６６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、核酸除去の更なる効率化が求められていた。
【０００７】
本開示は、試料溶液中の核酸を高効率に除去する核酸除去方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示に係る核酸除去方法は、核酸を含有する溶液より前記核酸を除去する核酸除去方法であって、前記溶液とグラフェンオキサイドとを混合することにより、第１混合液を得る工程（ａ）と、前記第１混合液と２価以上のカチオンとを混合することにより、第２混合液を得る工程（ｂ）と、前記第２混合液を遠心分離することにより、前記第２混合液の上清を得る工程（ｃ）と、を有する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示の核酸除去方法によれば、試料溶液中の核酸を高効率に除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本開示に係る核酸除去方法のフローチャートを示す図
【図２】実施例１の電気泳動結果を示す図
【図３】実施例２の吸光度測定結果を示す図
【図４】実施例３の吸光度測定結果を示す図
【図５】実施例４の吸光度測定結果を示す図
【図６】実施例５の吸光度測定結果を示す図
【図７】実施例６の電気泳動結果を示す図
【図８】実施例７の蛍光強度の時間変化結果を示す図
【図９】本開示に係る核酸除去方法のフローチャートを示す図
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示の第１態様に係る核酸除去方法は、核酸を含有する溶液より前記核酸を除去する核酸除去方法であって、前記溶液とグラフェンオキサイドと２価以上のカチオンとを混合することにより、混合液中に凝集物を生成する工程（ａ）と、前記混合液を遠心分離することにより、前記凝集物を沈殿させる工程（ｂ）と、沈殿した前記凝集物を除去する工程（ｃ）と、を有する。
【００１２】
上記第１態様によれば、試料溶液中の核酸を高効率に除去することができる。
【００１３】
本開示の第２態様に係る核酸除去方法は、上記第１態様において、前記２価以上のカチオンが金属イオンとしてもよい。
【００１４】
本開示の第３態様に係る核酸除去方法は、上記第２態様において、前記金属イオンがＭｇ２＋としてもよい。
【００１５】
本開示の第４態様に係る核酸除去方法は、上記第３態様において、前記混合液中における前記Ｍｇ２＋の濃度が１０ｍＭ以上としてもよい。
【００１６】
本開示の第５態様に係る核酸除去方法は、上記第１態様において、前記２価以上のカチオンがポリアミンとしてもよい。
【００１７】
本開示の第６態様に係る核酸除去方法は、上記第５態様において、前記ポリアミンがスペルミジン又はスペルミンとしてもよい。
【００１８】
本開示の第７態様に係る核酸除去方法は、上記第６態様において、前記混合液中における前記スペルミジンの濃度が０．１ｍＭ以上としてもよい。
【００１９】
本開示の第８態様に係る核酸除去方法は、上記第６態様において、前記混合液中における前記スペルミンの濃度が０．１ｍＭ以上としてもよい。
【００２０】
本開示の第９態様に係る核酸除去方法は、上記第１態様から第８態様のいずれかの態様において、前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡとしてもよい。
【００２１】
本開示の第１０態様に係る核酸除去方法は、核酸を含有する溶液より前記核酸を除去する核酸除去方法であって、前記溶液とグラフェンオキサイドとを混合することにより、第１混合液を得る工程（ｄ）と、前記第１混合液と２価以上のカチオンとを混合することにより、第２混合液中に凝集物を生成する工程（ｅ）と、前記第２混合液を遠心分離することにより、前記凝集物を沈殿させる工程（ｆ）と、沈殿した前記凝集物を除去する工程（ｇ）と、を有する。
【００２２】
本開示の第１１態様に係る核酸除去方法は、上記第１０態様において、前記２価以上のカチオンが金属イオンとしてもよい。
【００２３】
本開示の第１２態様に係る核酸除去方法は、上記第１１態様において、前記金属イオンがＭｇ２＋としてもよい。
【００２４】
本開示の第１３態様に係る核酸除去方法は、上記第１２態様において、前記第２混合液中における前記Ｍｇ２＋の濃度が１０ｍＭ以上としてもよい。
【００２５】
本開示の第１４態様に係る核酸除去方法は、上記第１０態様において、前記２価以上のカチオンがポリアミンとしてもよい。
【００２６】
本開示の第１５態様に係る核酸除去方法は、上記第１４態様において、前記ポリアミンがスペルミジン又はスペルミンとしてもよい。
【００２７】
本開示の第１６態様に係る核酸除去方法は、上記第１５態様において、前記第２混合液中における前記スペルミジンの濃度が０．１ｍＭ以上としてもよい。
【００２８】
本開示の第１７態様に係る核酸除去方法は、上記第１５態様において、前記第２混合液中における前記スペルミンの濃度が０．１ｍＭ以上としてもよい。
【００２９】
本開示の第１８態様に係る核酸除去方法は、上記第１０態様から第１７態様のいずれかの態様において、前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡとしてもよい。
【００３０】
（実施の形態）
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００３１】
図１は、本開示に係る核酸除去方法のフローチャートを示す図である。
【００３２】
始めに、核酸を含有する試料溶液を準備する（Ｓ１０）。ここで、本明細書において「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらに類するものである。また、試料溶液中の含有される核酸は、本開示に係る核酸除去方法によって除去される対象である。
【００３３】
次に、核酸を含有する試料溶液とグラフェンオキサイド（以下、「ＧＯ」と記載する）とを混合する（Ｓ２０）。混合方法としては、例えば、核酸を含有する試料溶液にＧＯを添加する。また、ＧＯの添加量は、ＧＯの濃度及び試料溶液の容量に依存する。例えば、核酸（濃度：１０μＭ）を１０μＬ及びカチオン（濃度：１ｍＭ）を１０μＬの場合は、ＧＯの濃度は、１００μｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下であることが望ましい。１００μｇ／ｍＬ以上の濃度であれば、十分な核酸除去効果を得ることができる。１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度であれば、後の工程においてＧＯを除去し易い。
【００３４】
次に、試料溶液とＧＯとを混合した混合溶液Ａを放置する（Ｓ３０）。放置している間に、試料溶液に含有される核酸がＧＯに吸着される。したがって、放置する時間は、試料溶液に含有される核酸がＧＯに十分に吸着される時間であればよいが、少なくとも１０秒間以上放置することが望ましい。
【００３５】
次に、混合溶液Ａと２価以上のカチオンとを混合する（Ｓ４０）。混合方法としては、例えば、混合溶液Ａに２価以上のカチオンを添加する。なお、カチオンは、陽イオン又は正イオンとも呼ばれる。２価以上のカチオンとして、Ｍｇ２＋などの金属イオン、又はスペルミジン若しくはスペルミンなどのポリカチオンなどが挙げられる。一方、Ｎａ＋などの１価のカチオンは、ＧＯとの凝集効率が低いため、核酸除去効率が十分に得られない。
【００３６】
次に、混合溶液Ａと２価以上のカチオンとを混合した混合溶液Ｂを放置する（Ｓ５０）。放置している間に、ＧＯとカチオンとの間で凝集が起こる。つまり、混合溶液Ｂ中に凝集物が生成される。放置する時間は、ＧＯとカチオンとが十分に凝集する時間であればよいが、少なくとも１０秒間以上放置することが望ましい。
【００３７】
次に、混合溶液Ｂを遠心分離し、凝集物を除去する（Ｓ６０）。遠心分離により沈殿した沈殿物は、主に核酸とＧＯとカチオンとからなる凝集物である。そのため、遠心分離後の混合溶液Ｂの上清を得ることにより、沈殿している凝集物を除去することができる。つまり、上清中には核酸は含まれていない。したがって、上清を得ることにより、核酸を含有しない試料溶液を得ることができる。なお、遠心分離の方法は、公知な方法が用いられる。また、遠心分離する条件は、混合溶液の容量などにより、適宜選択される。例えば、遠心分離は、１００００Ｇの遠心力にて数分間以上行なえばよい。
【００３８】
以上の一連の工程（Ｓ１０〜Ｓ６０）によって、試料溶液中の核酸を除去することができる。
【００３９】
なお、試料溶液とＧＯとを混合した後に、カチオンを混合する工程手順について説明したが、この手順に限定されない。図９に示すように、試料溶液とＧＯとカチオンとを一度に混合してもよい。また、試料溶液とカチオンとを混合した後に、ＧＯを混合してもよい。また、ＧＯとカチオンとを混合した後に、試料溶液を混合してもよい。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
除去対象である核酸には、合成オリゴＤＮＡを用いた。合成オリゴＤＮＡの配列は、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１）であった。以下、かかる合成オリゴＤＮＡを「Ｔ４３」と呼ぶ。なお、Ｔ４３はつくばオリゴサービス株式会社より入手した。
【００４１】
２価以上のカチオンには、スペルミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）を用いた。
【００４２】
以下に、実施例１の実験手順を記した。
【００４３】
始めに、表１に示された溶液Ａを調製した。
【００４４】
【表１】
2015023820.tif 000003
【００４５】
次に、溶液Ａを室温にて５分間インキュベートした。
【００４６】
次に、溶液Ａにスペルミン（濃度：１ｍＭ）を１０μＬ添加し、溶液Ｂを得た。溶液Ｂの総容量は、１００μＬとなった。
【００４７】
次に、溶液Ｂを室温にて１０分間インキュベートした。
【００４８】
次に、溶液Ｂを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は２分間であった。
【００４９】
次に、溶液Ｂの上清６μＬを採取した。採取した上清を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲルは、７ＭのＵｒｅａを含む２０％ポリアクリルアミドゲルであった。電気泳動に用いられたバッファーは、Ｔｒｉｓ−Ｂｒａｔｅ−ＥＤＴＡバッファー（以下、「ＴＢＥバッファー」と呼ぶ）であった。電気泳動において印加された電圧は３００Ｖであった。
【００５０】
（比較例１）
Ｔ４３及びスペルミンは、実施例１と同じものを用いた。
【００５１】
以下、比較例１の実験手順について記した。
【００５２】
始めに、表２に示された溶液Ｃを調製した。
【００５３】
【表２】
2015023820.tif 000004
【００５４】
次に、溶液Ｃを氷中に１５分間放置した。
【００５５】
次に、溶液Ｃを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は２分間であった。
【００５６】
次に、溶液Ｃの上清６μＬを採取した。採取した上清を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。電気泳動条件は、実施例１と同じであった。
【００５７】
図２に実施例１及び比較例１の電気泳動結果を示した。
【００５８】
図２において、レーン１は６μＬのＴ４３水溶液（濃度：１μＭ）を電気泳動した結果である。レーン１の結果は、Ｔ４３が全く除去されなかった場合の結果に相当する。図２において、レーン２の結果は実施例１の結果である。また、図２において、レーン３の結果は比較例１の結果である。
【００５９】
図２において、レーン１及びレーン３ではＴ４３に相当するバンドが確認された。一方、レーン２ではＴ４３に相当するバンドが確認されなかった。
【００６０】
以上の結果より、本開示に係る核酸除去方法により、Ｔ４３が試料溶液より除去されたことが確認された。
【００６１】
（実施例２）
Ｔ４３をλＤＮＡに変更した以外は、実施例１と同一のものを用いて実験を行なった。
【００６２】
除去対象である核酸には、λＤＮＡ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いた。
【００６３】
以下、実施例２の実験手順を記した。
【００６４】
始めに、表３に示された溶液Ｄを調整した。
【００６５】
【表３】
2015023820.tif 000005
【００６６】
次に、溶液Ｄを室温にて５分間インキュベートした。
【００６７】
次に、溶液Ｄにスペルミン（濃度：１ｍＭ）を１０μＬ添加し、溶液Ｅを得た。溶液Ｅの総容量は、１００μＬとなった。
【００６８】
次に、溶液Ｅを室温にて１０分間インキュベートした。
【００６９】
次に、溶液Ｅを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【００７０】
次に、溶液Ｅの上清５０μＬを採取した。採取した上清を吸光度解析した。具体的には、上清５０μＬと水７０μＬとを混合した溶液について、２６０ｎｍにおける吸光度が測定された。ＤＮＡ及びＲＮＡは２６０ｎｍに特徴的な吸光ピークを有するため、この吸光度を測定することで、溶液中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡの濃度を調べることができる。
【００７１】
（比較例２）
λＤＮＡ及びスペルミンは、実施例２と同一のものを用いた。
【００７２】
以下、比較例２の実験手順について記した。
【００７３】
始めに、表４に示された溶液Ｆを調製した。
【００７４】
【表４】
2015023820.tif 000006
【００７５】
次に、溶液Ｆを氷中に１５分間放置した。
【００７６】
次に、溶液Ｆを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【００７７】
次に、溶液Ｆの上清５０μＬを採取した。採取した上清を吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【００７８】
図３に実施例２及び比較例２の吸光度測定結果グラフを示した。グラフ横軸の「１」は、５０μＬのλＤＮＡ溶液（濃度：３２μｇ／ｍＬ）と７０μＬの水とを混合した溶液の吸光度値である。グラフ横軸の「１」の値は、λＤＮＡが全く除去されなかった場合の値に相当する。グラフ横軸の「２」の値は実施例２の値である。グラフ横軸の「３」の値は比較例２の値である。
【００７９】
グラフ横軸の「１」及び「３」の吸光度値は同程度であることが確認された。グラフ横軸の「２」の吸光度値は、「１」及び「３」と比較して、小さいことが確認された。
【００８０】
以上の結果より、本開示に係る核酸除去方法により、λＤＮＡが試料溶液より除去されたことが確認された。
【００８１】
（実施例３）
λＤＮＡをヒトゲノムＤＮＡに変更した以外は、実施例２と同一のものを用いて実験を行なった。
【００８２】
除去対象である核酸には、ヒトゲノムＤＮＡ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いた。
【００８３】
以下、実施例３の実験手順を記した。
【００８４】
始めに、表５に示された溶液Ｇを調整した。
【００８５】
【表５】
2015023820.tif 000007
【００８６】
次に、溶液Ｇを室温にて５分間インキュベートした。
【００８７】
次に、溶液Ｇにスペルミン（濃度：１ｍＭ）を１０μＬ添加し、溶液Ｈを得た。溶液Ｈの総容量は、１００μＬであった。
【００８８】
次に、溶液Ｈを室温にて１０分間インキュベートした。
【００８９】
次に、溶液Ｈを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【００９０】
次に、溶液Ｈの上清５０μＬを採取した。採取した上清を吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【００９１】
（比較例３）
ヒトゲノムＤＮＡ及びスペルミンは、実施例３と同一のものを用いた。
【００９２】
以下、比較例３の実験手順について記した。
【００９３】
始めに、表６に示された溶液Ｉを調製した。
【００９４】
【表６】
2015023820.tif 000008
【００９５】
次に、溶液Ｉを氷中に１５分間放置した。
【００９６】
次に、溶液Ｉを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【００９７】
次に、溶液Ｉの上清５０μＬを採取した。採取した上清を吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【００９８】
図４に実施例３及び比較例３の吸光度測定結果を示した。グラフ横軸の「１」は、５０μＬのヒトゲノムＤＮＡ溶液（濃度：３０μｇ／ｍＬ）と７０μＬの水とを混合した溶液の吸光度値である。グラフ横軸の「１」の値は、ヒトゲノムＤＮＡが全く除去されなかった場合の値に相当する。グラフ横軸の「２」の値は実施例３の値である。グラフ横軸の「３」の値は比較例３の値である。
【００９９】
グラフ横軸の「１」及び「３」の吸光度値は同程度であることが確認された。グラフ横軸の「２」の吸光度値は、「１」及び「３」と比較して、小さいことが確認された。
【０１００】
以上の結果より、本開示に係る核酸除去方法により、ヒトゲノムＤＮＡが試料溶液より除去されたことが確認された。
【０１０１】
（実施例４）
λＤＮＡをＲＮＡに変更した以外は、実施例２と同一のものを用いて実験を行なった。
【０１０２】
除去対象である核酸には、Ｂａｋｅｒ‘ｓ  Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）を用いた。なお、Ｂａｋｅｒ‘ｓ  Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡを、以下、単に「ＲＮＡ」と呼ぶ。
【０１０３】
以下、実施例４の実験手順を記した。
【０１０４】
始めに、表７に示された溶液Ｊを調整した。
【０１０５】
【表７】
2015023820.tif 000009
【０１０６】
次に、溶液Ｊを室温にて５分間インキュベートした。
【０１０７】
次に、溶液Ｊにスペルミン（濃度：１ｍＭ）を１０μＬ添加し、溶液Ｋを得た。溶液Ｋの総容量は、１００μＬであった。
【０１０８】
次に、溶液Ｋを室温にて１０分間インキュベートした。
【０１０９】
次に、溶液Ｋを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【０１１０】
次に、溶液Ｋの上清５０μＬを採取した。採取した上清を吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【０１１１】
（比較例４）
ＲＮＡ及びスペルミンは、実施例４と同一のものを用いた。
【０１１２】
以下、比較例４の実験手順について記した。
【０１１３】
始めに、表８に示された溶液Ｌを調製した。
【０１１４】
【表８】
2015023820.tif 000010
【０１１５】
次に、溶液Ｌを氷中に１５分間放置した。
【０１１６】
次に、溶液Ｌを４℃にて１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【０１１７】
次に、溶液Ｌの上清５０μＬを採取した。採取した上清を吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【０１１８】
図５に実施例４及び比較例４の吸光度測定結果を示した。グラフ横軸の「１」は、５０μＬのＲＮＡ溶液（濃度：１００μｇ／ｍＬ）と７０μＬの水とを混合した溶液の吸光度値である。グラフ横軸の「１」の値は、ＲＮＡが全く除去されなかった場合の値に相当する。グラフ横軸の「２」の値は実施例４の値である。グラフ横軸の「３」の値は比較例４の値である。
【０１１９】
グラフ横軸の「１」及び「３」の吸光度値は同程度であることが確認された。グラフ横軸の「２」の吸光度値は、「１」及び「３」と比較して、小さいことが確認された。
【０１２０】
以上の結果より、本開示に係る核酸除去方法により、ＲＮＡが試料溶液より除去されたことが確認された。
【０１２１】
（実施例５）
カチオンの種類及び濃度を変更した以外は、実施例２と同様の実験を行なった。
【０１２２】
以下に、実施例５の実験手順を記した。
【０１２３】
始めに、表３に示された溶液Ｄを調製した。
【０１２４】
次に、溶液Ｄを室温にて５分間インキュベートした。
【０１２５】
次に、溶液Ｄに、表９〜１１に示された物質をそれぞれ添加し、溶液Ｍ１〜Ｍ５を得た。溶液Ｍ１〜Ｍ５の総容量は、それぞれ１００μＬとなった。
【０１２６】
【表９】
2015023820.tif 000011
【０１２７】
【表１０】
2015023820.tif 000012
【０１２８】
【表１１】
2015023820.tif 000013
【０１２９】
次に、溶液Ｍ１〜Ｍ５を室温にて、それぞれ１０分間インキュベートした。
【０１３０】
次に、溶液Ｍ１〜Ｍ５を４℃にて、それぞれ１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【０１３１】
次に、溶液Ｍ１〜Ｍ５の上清５０μＬをそれぞれ採取した。採取した上清をそれぞれ吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【０１３２】
（比較例５）
カチオンの種類及び濃度を変更した以外は、実施例２と同様の実験を行なった。
【０１３３】
以下に、比較例５の実験手順を記した。
【０１３４】
始めに、表３に示された溶液Ｄを調製した。
【０１３５】
次に、溶液Ｄを室温にて５分間インキュベートした。
【０１３６】
次に、溶液Ｄに、表１２に示された物質をそれぞれ添加し、溶液Ｍ６〜Ｍ８を得た。溶液Ｍ６〜Ｍ８の総容量は、それぞれ１００μＬとなった。
【０１３７】
【表１２】
2015023820.tif 000014
【０１３８】
次に、溶液Ｍ６〜Ｍ８を室温にて、それぞれ１０分間インキュベートした。
【０１３９】
次に、溶液Ｍ６〜Ｍ８を４℃にて、それぞれ１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は５分間であった。
【０１４０】
次に、溶液Ｍ６〜Ｍ８の上清５０μＬをそれぞれ採取した。採取した上清をそれぞれ吸光度解析した。吸光度解析の条件は、実施例２と同じであった。
【０１４１】
図６に実施例５及び比較例５の吸光度測定結果のグラフを示した。グラフ横軸の「ＰＣ」は、５０μＬのλＤＮＡ溶液（濃度：３２μｇ／ｍＬ）と７０μＬの水とを混合した溶液の吸光度値である。グラフ横軸の「ＰＣ」の値は、λＤＮＡが全く除去されなかった場合の値に相当する。グラフ横軸のＮａ＋の値は、溶液Ｍ６〜Ｍ８の結果にそれぞれ対応する。グラフ横軸のＭｇ２＋の値は、溶液Ｍ１の結果に対応する。グラフ横軸のスペルミジンの値は、溶液Ｍ２及びＭ３の結果にそれぞれ対応する。グラフ横軸のスペルミンの値は、溶液Ｍ４及びＭ５の結果にそれぞれ対応する。
【０１４２】
ＮａＣｌを用いた場合の吸光度は、いずれの濃度においても、ＰＣと比較して大きかった。これは、Ｎａ＋とＧＯとによる凝集効率が低くかったため、ＧＯが試料溶液中に残り、ＧＯの吸光度が検出されたことが原因と考えられる。なお、ＧＯは２３０ｎｍ付近に吸光度のピークを有する。一方、ＭｇＣｌ２、スペルミジン又はスペルミンを用いた場合の吸光度は、ＰＣと比較して小さかった。
【０１４３】
以上の結果より、本開示に係る核酸除去方法において添加するカチオンとして、Ｎａ＋は不適であり、Ｍｇ２＋、スペルミジン及びスペルミンは適していることが確認された。Ｍｇ２＋、スペルミジン及びスペルミンが、それぞれ２価、３価及び４価であることを考えると、本開示に係る核酸除去方法において添加するカチオンは２価以上でなければいけないことが確認された。
【０１４４】
（実施例６）
塩濃度を変更した以外は、実施例１と同様の実験を行なった。
【０１４５】
以下に、実施例６の実験手順を記した。
【０１４６】
始めに、表１３に示された溶液Ｎ１〜Ｎ６をそれぞれ調製した。
【０１４７】
【表１３】
2015023820.tif 000015
【０１４８】
次に、溶液Ｎ１〜Ｎ６を室温にて、それぞれ５分間インキュベートした。
【０１４９】
次に、溶液Ｎ１〜Ｎ６にスペルミン（濃度：１ｍＭ）をそれぞれ１０μＬ添加し、溶液Ｐ１〜Ｐ６を得た。溶液Ｐ１〜Ｐ６の総容量は、それぞれ１００μＬとなった。
【０１５０】
次に、溶液Ｐ１〜Ｐ６を室温にて、それぞれ１０分間インキュベートした。
【０１５１】
次に、溶液Ｐ１〜Ｐ６を４℃にて、それぞれ１００００Ｇで遠心分離した。遠心分離時間は２分間であった。
【０１５２】
次に、溶液Ｐ１〜Ｐ６の上清６μＬをそれぞれ採取した。採取した上清を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりそれぞれ解析した。電気泳動条件は、実施例１と同じであった。
【０１５３】
図７に実施例６の電気泳動結果を示した。
【０１５４】
図７において、レーン１は６μＬのＴ４３水溶液（濃度：１μＭ）を電気泳動した結果である。レーン１の結果は、Ｔ４３が全く除去されなかった場合の結果に相当する。図７において、レーン２〜７の結果は、溶液Ｐ１〜Ｐ６の結果にそれぞれ対応する。
【０１５５】
図７において、レーン１ではＴ４３に相当するバンドが確認された。一方、レーン２〜７ではＴ４３に相当するバンドが確認されなかった。
【０１５６】
以上の結果より、本開示に係る核酸除去方法による核酸除去効果の効率は、塩濃度による影響を受けないことが確認された。
【０１５７】
（実施例７）
除去対象の核酸には、５’末端に蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が修飾されたオリゴＲＮＡを用いた。オリゴＲＮＡの配列は、５’−ＵＵＵＵＵＵＵＵＵ−３’（配列番号２）であった。以下、かかるＦＩＴＣ修飾オリゴＲＮＡを「ＦＩＴＣ−Ｕ９」と呼ぶ。なお、ＦＩＴＣ−Ｕ９は（つくばオリゴサービス株式会社より入手）より入手した。
【０１５８】
以下に、実施例７の実験手順を記した。
【０１５９】
始めに、表１４に示された溶液Ｑを調製した。
【０１６０】
【表１４】
2015023820.tif 000016
【０１６１】
次に、溶液Ｑの蛍光強度について測定を開始した。励起波長及び蛍光波長は、それぞれ４８２ｎｍ及び５２０ｎｍであった。この波長条件によって、ＦＩＴＣの蛍光強度を測定できる。なお、解析温度は３７℃であった。
【０１６２】
次に、測定開始５分後に、溶液Ｑ中にＦＩＴＣ−Ｕ９（濃度：１μＭ）を１０μＬ添加した。
【０１６３】
次に、測定開始１０分後に、溶液Ｑ中にＧＯ（濃度：２ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ添加した。
【０１６４】
ＦＩＴＣなどの蛍光分子がＧＯに吸着することにより、その蛍光強度が著しく抑制される。そのため、ＦＩＴＣの蛍光強度の時間変化を解析することにより、ＦＩＴＣ−Ｕ９のＧＯへの吸着挙動を知ることができる。
【０１６５】
図８に実施例７の測定結果を示した。測定開始５分後までは５２０ｎｍにおける蛍光強度はほとんど認められなかったが、ＦＩＴＣ−Ｕ９添加後に蛍光強度が急激に上昇した。ＦＩＴＣ−Ｕ９添加の５分後に、測定装置の蓋を開け、ＧＯを添加し、測定装置の蓋を閉めた。測定装置の蓋を閉めた後、蛍光強度は再びほぼ０になった。この蛍光強度の減少は、ＦＩＴＣ−Ｕ９がＧＯに吸着したことを示している。
【０１６６】
したがって、実施例７の結果より、核酸とＧＯとの吸着は、両者の混合直後に急速に起こることが確認された。つまり、本開示に係る核酸除去方法において、核酸を含有する試料溶液とＧＯとを混合した後の放置時間は、少なくとも１０秒以上であれば十分であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本開示に係る核酸除去方法は、高い核酸除去効率を有し、試料溶液中の不要な核酸の除去方法として有用である。
【図１】
2015023820.tif 000017
【図３】
2015023820.tif 000018
【図４】
2015023820.tif 000019
【図５】
2015023820.tif 000020
【図６】
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【図８】
2015023820.tif 000022
【図９】
2015023820.tif 000023
【図２】
2015023820.tif 000024
【図７】
2015023820.tif 000025
【配列表】
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