(57)【要約】【課題】微細藻類の細胞壁を破砕し、効率的に藻類から脂質を回収できるようにする。【解決手段】藻類から脂質を抽出する方法は、微細藻類を含む分散液に二酸化炭素を溶解させる工程と、二酸化炭素を溶解させる工程よりも後で、微細藻類に高圧分散装置により剪断力を加えることにより、微細藻類を破砕する工程とを備えている。二酸化炭素を溶解させる工程は、温度が０℃以上、４５℃以下、圧力が絶対圧で０．０８ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以下で行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類を含む分散液に二酸化炭素を溶解させる工程と、
前記二酸化炭素を溶解させる工程よりも後で、前記微細藻類に高圧分散装置により剪断力を加えることにより、前記微細藻類を破砕する工程とを備え、
前記二酸化炭素を溶解させる工程は、温度が０℃以上、４５℃以下で、圧力が絶対圧で０．０８ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以下で行う、藻類から脂質を抽出する方法。
【請求項２】
前記二酸化炭素を溶解させる工程において、温度を２℃以上、１５℃以下とする、請求項１に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
【請求項３】
前記微細藻類を破砕する工程を行った直後の前記分散液の温度と、前記微細藻類を破砕する工程を行う直前の前記分散液の温度との差は、２０℃以上、８０℃以下である、請求項１又は２に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
【請求項４】
前記微細藻類を破砕する工程において、ゲージ圧で１０ＭＰａ以上の圧力を加えた後、ゲージ圧で０．３ＭＰａ以下に減圧する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
【請求項５】
前記微細藻類を破砕する工程よりも後に、前記分散液から脂質を回収する工程を更に備えている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の藻類から脂質を抽出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、藻類から脂質を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化を始めとする環境問題に対する意識や関心が高まっている。このため、二酸化炭素の排出量を低減することや、二酸化炭素の固定化により大気中の二酸化炭素濃度を低減することについて様々な検討が行われている。例えば、化石燃料に代えてカーボンニュートラルな資源であるバイオマスをエネルギー源として利用する試みが活発になされている。
【０００３】
藻類は、脂質を産生することが知られている。藻類が産生した脂質を効率良く抽出することができれば、化石燃料に代わるエネルギー源となり得る。しかし、藻類から脂質を抽出するには、細胞壁が大きな障害となる。一般に藻類の細胞壁は、硬く且つ柔軟性を有するため、容易に破砕することができない。
【０００４】
藻類の細胞壁を破砕する方法として、例えば、特許文献１に、ヘマトコッカス藻を５％〜８５％エタノール水溶液に懸濁し、調整したスラリーをポンプにより加圧して間隙を通過させることによりヘマトコッカス藻を破砕する方法が記載されている。
【０００５】
また、特許文献２に、菌体の培養液を、超臨界状態又は擬臨界状態の溶解溶剤と混合した後、圧力を瞬時に下げることを特徴とする菌体の粉砕方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１３１２１９号公報
【特許文献２】特開昭６２-２８５７７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１では、十分な細胞破砕率が得られず、細胞内の成分を効率よく回収するのが困難という問題がある。また、特許文献２では、この方法の対象とできる菌体の一例として、糸状菌が挙げられているが、硬い細胞壁を有する微細藻類に適用できるかどうかは明らかでない。
【０００８】
本開示の課題は、微細藻類の細胞壁を破砕し、効率的に藻類から脂質を回収できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示に係る藻類から脂質を抽出する方法は、微細藻類を含む分散液に二酸化炭素を溶解させる工程と、二酸化炭素を溶解させる工程よりも後で、微細藻類に高圧分散装置により剪断力を加えることにより、微細藻類を破砕する工程とを備え、二酸化炭素を溶解させる工程は、温度が０℃以上、４５℃以下で、圧力が絶対圧で０．０８ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以下で行う。
【発明の効果】
【００１０】
本開示の藻類から脂質を抽出する方法によれば、微細藻類の細胞壁を破砕し、効率的に藻類から脂質を回収できる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜微細藻類＞
本開示において、微細藻類とは、酸素を発生する光合成を行う生物の中からコケ植物、シダ植物、及び種子植物を除いた残りのうちの、細胞サイズが直径１μｍ〜１００μｍのものをいう。なお、細胞サイズは、光学顕微鏡を用いて観察倍率４００倍で測定した細胞の長軸径である。微細藻類としては、例えば、緑藻植物門、紅色植物門、不等毛植物門、ハプト植物門、渦鞭毛植物門、及びユーグレナ植物門等が挙げられる（渡邉信著、「藻類ハンドブック」、株式会社エヌ・ティー・エス、ｐ．４９３）。
【００１２】
緑藻植物門の微細藻類の具体例としては、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ綱、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱、Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅ綱、及びＰｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ綱等が挙げられる。Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ綱の微細藻類の具体例としては、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属、及びＤｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ属等が挙げられる。Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱の微細藻類の具体例としては、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、及びＯｏｃｙｓｔｉｓ属等が挙げられる。Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅ綱の微細藻類の具体例としては、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ属が挙げられる。Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ綱の微細藻類の具体例としては、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属が挙げられる。不等毛植物門の微細藻類の具体例としてはＢａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱、及びＥｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ綱等が挙げられる。Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱の微細藻類の具体例としては、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、及びＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属等が挙げられる。Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ綱の微細藻類の具体例としては、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属が挙げられる。ハプト植物門の微細藻類の具体例としては、Ｐａｖｌｏｖｏｐｈｙｃｅａｅ綱、Ｐａｖｌｏｖａ属、及びＰｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属等が挙げられる。渦鞭毛植物門の微細藻類の具体例としては、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属、及びＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ属等が挙げられる。このうち、脂質の生産性及び脂質の回収性の観点から、好ましくはＣｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ属であり、更に好ましくはＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属である。微細藻類は、沼や池等に生息するものを採取したものでも、培養したものでもよく、更には商業的に入手したものでもよい。
【００１３】
＜分散液＞
本開示において微細藻類を分散させる液体は、特に限定されないが、分散性の観点と経済性の観点から水が好ましい。水は精製されていても、不純物を含んでいてもよい。また、海水であってもよい。分散液は、塩化ナトリウム等の塩、窒素若しくはリンを含む化合物、微量金属、無機系凝集剤、有機系凝集剤、キレート剤、及び緩衝剤等のいずれか１つ又は２つ以上からなる添加物を含んでいてもよい。
【００１４】
水を主成分とする培養液により微細藻類を培養した場合には、微細藻類の培養液をそのまま処理することができる。この場合には、分散液が通常の培養液に含まれる種々の成分を含んでいてかまわない。また、培養液に他の成分を添加してから処理してもよく、培養液を水又は所定の添加物を含む水溶液で希釈してから処理してもよく、培養液を水又は所定の添加物を含む水溶液に置換してから処理してもよい。
【００１５】
分散液中の微細藻類の濃度は、使用する微細藻類の種類にもよるが、処理速度の向上及び脂質の回収性の観点から、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がより好ましく、３０ｇ／Ｌ以上が更に好ましい。また、脂質の回収性及び分散液の流動性の観点から、２２０ｇ／Ｌ以下が好ましく、１８０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１２０ｇ／Ｌ以下が更に好ましく、８０ｇ／Ｌ以下がより更に好ましい。濃度の調整方法は特に限定されない。濃縮方法としては例えばろ過、遠心分離、重力沈降、凝集沈降、又は乾燥等の方法が挙げられる。希釈方法としては例えば水等の液体を添加する方法が挙げられる。なお、分散液中の微細藻類の濃度は、実施例に記載された方法により測定された値である。
【００１６】
＜脂質＞
本開示において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれる。単純脂質には、油脂又は脂肪酸エステルなどの脂肪酸と各種アルコールとのエステル等が含まれる。複合脂質には、脂肪酸、アルコール及びリン酸を含むリン脂質、並びに脂肪酸、アルコール及び糖を含む糖脂質等が含まれる。誘導脂質には、単純脂質又は複合脂質の加水分解生成物であり、水に不溶性の脂肪酸、高級アルコール、ステロール、テルペン、及び脂溶性ビタミン等が含まれる。脂質の回収性の観点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がより好ましく、油脂が更に好ましい。
【００１７】
−油脂−
油脂とは、脂肪酸とグリセリンとのエステルを意味し、具体的には、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドのような中性脂質をいう。油脂を構成する脂肪酸は、単一でなくてよい。
【００１８】
−脂肪酸−
脂肪酸は、炭素数が２〜４の短鎖脂肪酸、炭素数が５〜１２の中鎖脂肪酸、及び炭素数が１２以上の長鎖脂肪酸のいずれであってもよい。また、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよい。飽和脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、及びイコサン酸が挙げられる。一価の不飽和脂肪酸の具体例としては、９−ヘキサデセン酸、及び９−オクタデセン酸等が挙げられる。多価の不飽和脂肪酸の具体例としては、９，１２−オクタデカジエン酸、６，９，１２−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエン酸、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸が挙げられる。
【００１９】
−脂肪酸エステル−
脂肪酸エステルとは、油脂以外の、脂肪酸とアルコールとのエステルであり、長鎖脂肪酸と１価又は２価の高級アルコールとのエステルである蝋、中鎖脂肪酸と低級又は高級アルコールとのエステルである中鎖脂肪酸エステル等を含む。
【００２０】
＜微細藻類からの脂質の抽出＞
本開示の藻類から脂質を抽出する方法は、微細藻類を含む分散液に二酸化炭素を溶解させる工程と、二酸化炭素を溶解させる工程よりも後で、微細藻類に高圧分散装置により剪断力を加えることにより、微細藻類の細胞壁を破砕する工程とを備えている。二酸化炭素を溶解させる工程は、温度が０℃以上、４５℃以下で、圧力が絶対圧で０．０８ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以下で行う。
【００２１】
本開示の藻類から脂質を抽出する方法は、微細藻類を含む分散液に二酸化炭素を溶解させた後、微細藻類に高圧分散装置により剪断力を加えている。高圧分散装置により剪断力を加える際には、二酸化炭素の発泡等による力も微細藻類に加わっていると考えられる。このため、微細藻類の破砕効率を向上させることができると考えられる。
【００２２】
細胞壁が破砕されることにより微細藻類中の脂質は、分散液中に溶出する。分散液中に溶出した脂質は容易に回収することができる。
【００２３】
−二酸化炭素の溶解−
分散液へ二酸化炭素を溶解させるガス溶解処理は、例えば、二酸化炭素と分散液とを混合して行えばよい。二酸化炭素と分散液とを混合することにより、二酸化炭素を分散液に溶解させ、分散液中の二酸化炭素濃度を上昇させることができる。二酸化炭素と分散液との混合は、分散液を開放容器に入れて二酸化炭素を通気させても、分散液を密閉容器内に入れて二酸化炭素を通気させてもよい。二酸化炭素と分散液とを密閉容器内に入れて圧力をかけることにより混合してもよい。また、二酸化炭素の溶解処理において、分散液と二酸化炭素との接触面積が増えるように攪拌等を行ってもよい。また、分散液に二酸化炭素を直接溶解させるのではなく、二酸化炭素が高濃度に溶解した別の液体を分散液と混合することにより、ガス溶解処理を行ってもよい。
【００２４】
二酸化炭素と分散液とを混合する際の温度は、脂質の回収性の観点から、４５℃以下、好ましくは３０℃以下、より好ましくは１５℃以下、更に好ましくは１０℃以下、より更に好ましくは８℃以下であり、作業性及び経済性の観点から、０℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは３℃以上とすることができる。
【００２５】
二酸化炭素と分散液との混合は、脂質の回収性及び作業性の観点から、分散液の圧力を絶対圧で、０．０８ＭＰａ以上、好ましくは０．０９ＭＰａ以上、より好ましくは０．０９５ＭＰａ以上、更に好ましくは０．０９８ＭＰａ以上とすることができる。また、設備コスト及び加圧コストを抑える等の経済性の観点から、絶対圧で０．５ＭＰａ以下、好ましくは０．３ＭＰａ以下、より好ましくは０．２ＭＰａ以下、更に好ましくは０．１１ＭＰａ以下とすることができる。二酸化炭素を分散液と混合する際の圧力は絶対圧で、０．０８ＭＰａ〜０．５ＭＰ、好ましくは０．０９〜０．３ＭＰａ、より好ましくは０．０９５〜０．２ＭＰａ、更に好ましくは０．０９８〜０．１１ＭＰａ、特に好ましくは大気圧（０．１ＭＰａ）とすることができる。本実施形態の方法は、二酸化炭素を低圧で溶解させている。このため、高圧で二酸化炭素を溶解させる技術に用いる大型の加圧ポンプや耐圧容器等に伴う設備コスト及び加圧コストが不要であるため、本実施形態の方法は、容易かつ安価に工業的なスケールで実施できる点でも優れている。
【００２６】
二酸化炭素と分散液とを混合する混合時間は、脂質の回収性の観点から、１分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは２０分以上とすることができる。また、経済性の観点から、１２０分以下、好ましくは６０分以下、より好ましくは４０分以下とすることができる。
【００２７】
二酸化炭素と分散液との混合を、二酸化炭素を分散液に通気して行う場合には、単孔ノズル、マルチノズル、多孔パイプ、スパージャー、エアストーン、又はチューブ等の一般的な機器を使用したバブリングにより行うことができる。また、密閉容器内において二酸化炭素と分散液とを攪拌する場合には、攪拌翼等を用いて混合したり、密閉容器を回転又は振とうさせて混合したりすることができる。これらの中では、二酸化炭素の溶解性の観点から、二酸化炭素を分散液に通気して行うのが好ましく、更に攪拌しながら二酸化炭素を分散液に通気して行うのがより好ましい。
【００２８】
二酸化炭素を分散液に通気する場合には、脂質の回収性の観点から、分散液１Ｌ当たり、５０ｍＬ／ｍｉｎ以上、好ましくは１００ｍＬ／ｍｉｎ以上、より好ましくは１５０ｍL／ｍｉｎ以上とすることができる。また、経済性の観点から、１０００ｍＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは５００ｍＬ／ｍｉｎ以下、より好ましくは２５０ｍL／ｍｉｎ以下とすることができる。
【００２９】
二酸化炭素は、純粋な二酸化炭素であってもよく、不純物を含んでいてもよく、他の気体との混合気体であってもよい。
【００３０】
−微細藻類の破砕−
微細藻類を破砕する破砕処理は、高圧分散装置を用いることにより行うことができる。高圧分散装置は、基本的に、固体粒子や液滴粒子等の分散質を含む原料液を加圧した状態で狭い流路を通過させ、その後急激に減圧することで固体粒子や液滴粒子等の分散質を更に分散又は粉砕する装置である。原料液の加圧には高圧ポンプを用いることができる。原料液の通過させる流路の隙間は、加圧する圧力等によって可変するので一概には言えないが、直管の直径を１μｍ〜２０００μｍにしてもよく、１μｍ〜２０００μｍの穴を有するオリフィスを直管の流路の途中に配置して形成してもよく、１μｍ〜２０００μｍの隙間を有するスリットを直管の流路の途中に配置して形成してもよい。また、バルブの先端とバルブ受けの隙間に流路を形成させ、バルブの開度を調整することで、前記隙間の間隔を１μｍ〜２０００μｍとしてもよい。更に、１μｍ〜２０００μｍの隙間の流路を対向させて配置し、原料液同士を衝突させてもよい。流路の方向を例えば直角に曲げるなど急激に変化させて、流路の壁面に原料液を衝突させてもよい。
【００３１】
高圧分散装置としては、圧力式ホモジナイザー（株式会社エスエムテー）、高圧ホモゲナイザー（株式会社イズミフードマシナリ）、ミニラボ８．３Ｈ型（Ｒａｎｎｉｅ社）、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）、ナノヴェイタ（エス・ジーエンジニアリング株式会社、吉田機械工業株式会社）、スターバースト（スギノマシン株式会社）、アルティマイザー（スギノマシン株式会社）、ジーナスＰＹ（白水化学株式会社）、ＤｅＢＥＥ２０００（日本ビーイーイー株式会社）などが挙げられる。これらのうち、工業化においては大量処理が可能である観点から圧力式ホモジナイザーが好ましい。
【００３２】
具体的に、破砕処理は、分散液に高い圧力を加えた後、間隙となった狭い流路を通過させて急速に大気圧近くまで減圧して、分散液中の微細藻類に高い剪断力を加えることにより行うことができる。更に、間隙を通過した微細藻類を壁面等に衝突させてもよい。分散液に加える圧力（入口圧）は、藻類の破砕性及び脂質の回収性の観点から、ゲージ圧で１０ＭＰａ以上、好ましくは３０ＭＰａ以上、より好ましくは５０ＭＰａ以上、更に好ましくは８０ＭＰａ以上とすることができ、経済性の観点から、好ましくは２００ＭＰａ以下、より好ましくは１５０ＭＰａ以下、更に好ましくは１２０ＭＰａ以下とすることができる。藻類の破砕性、脂質の回収性の観点及び経済性の観点から、減圧後の圧力（出口圧）は大気圧（絶対圧で０．１ＭＰａ）とすることができる。流路の構造等により完全に大気圧まで減圧されなくてもよく、出口圧は絶対圧で０．３ＭＰａ以下であっても、０．２ＭＰａ以下であっても、０．１５ＭＰａ以下であっても、０．１１ＭＰａ以下であってもよい。
【００３３】
微細藻類の破砕操作前の温度と、破砕操作後の温度との温度差は、装置及びその操作条件等によって異なるが、藻類の破砕性及び脂質の回収性の観点から、例えば１０℃以上、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上とすることができる。また、コストの観点から好ましくは８０℃以下、より好ましくは６０℃以下、更に好ましくは４０℃以下とすることができる。破砕操作前の温度とは、破砕を行う装置に投入される直前の分散液の温度であり、破砕操作後の温度とは、破砕を行う装置から排出された直後の分散液の温度である。
【００３４】
微細藻類の破砕処理は、１回でもよく、複数回行ってもよい。破砕処理を複数回行う場合は、最初の破砕処理の前にだけ二酸化炭素の溶解処理を行ってもよく、すべての破砕処理の前に二酸化炭素の溶解処理を行ってもよく、いくつかの破砕処理の前に二酸化炭素の溶解処理を行ってもよい。
【００３５】
破砕処理は、連続処理としても、バッチ処理としてもよい。また、ガス溶解処理と破砕処理とを連続して行ってもよい。但し、ガス溶解処理と破砕処理との間に、分散液を一旦貯蔵する工程があってもよい。分散液の貯蔵温度は、分散液中の二酸化炭素濃度を維持する観点から、ガス溶解処理の際の温度以下であることが好ましい。また、分散液の凍結を避けるために０℃以上であることが好ましい。また、密閉した容器内で貯蔵することが好ましく、容器内に二酸化炭素が封入されていてもよい。
【００３６】
−脂質の回収−
脂質の回収方法は、微細藻類の破砕物を含む分散液から脂質を分取することができれば特に限定されない。例えば、溶媒抽出、遠心分離、静置処理、カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせて適用することができる。中でも、脂質の回収性の観点から、溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせが好ましく、中でも溶媒抽出と遠心分離との組み合わせ、又は溶媒抽出と静置処理との組み合わせが好ましい。
【００３７】
溶媒抽出は、微細藻類を破砕した後の分散液に抽出用の溶媒を添加して混合すればよい。溶媒を添加した後、攪拌を行ってもよい。微細藻類から溶出した脂質は、溶媒に溶解するため、溶媒相と水相とを相分離させて、溶媒相を回収することにより、脂質を回収することができる。
【００３８】
溶媒抽出に用いる溶媒としては、例えば、酢酸メチル、及び酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、及びジエチルエーテル等の鎖状並びに環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、及び四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、及び石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、及びトルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、及びイソプロピルアルコール（２−プロパノール）等のアルコール類；ブチレングリコール等の多価アルコール類；メチルエチルケトン等のケトン類；超臨界二酸化炭素等が挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
これらの溶媒の中でも、脂質の回収性の観点から、非極性溶媒が好ましい。非極性溶媒の具体例として、ハロゲン化炭化水素類、炭化水素類、又は芳香族炭化水素類が挙げられ、中でも、炭化水素類が好ましく、ヘキサンがより好ましい。また、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、及びアセトン等の水と相溶性のある溶媒を非極性溶媒に補助的に添加して用いることもできる。また、超臨界二酸化炭素等を用いた超臨界抽出を用いることもできる。更に、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、又は亜臨界抽出等を用いることもできる。例えば、「生物化学実験法２４  植物脂質代謝実験法」（山田晃弘  編著、株式会社学会出版センター、ｐ３−４）に記載の方法を参考にすることができる。
【００４０】
溶媒抽出の温度は特に限定されないが、脂質の回収性の観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上である。また、上記観点及び溶媒を加温する等の経済性の観点から、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下、更により好ましくは４０℃以下である。
【００４１】
また、溶媒抽出は１回でもよく、２回以上行ってもよい。溶媒抽出を２回以上行う場合は、同じ溶媒により行っても、異なる溶媒により行ってもよい。
【００４２】
遠心分離は、分離板型、円筒型、又はデカンター型等の一般的な機器を使用することができる。この場合の遠心力は、脂質の回収性の観点から、好ましくは５００Ｇ以上、より好ましくは１０００Ｇ以上とすることができる。また、経済性の観点から、好ましくは１００００Ｇ以下、より好ましくは５０００Ｇ以下、更に好ましくは２０００Ｇ以下とすることができる。
【００４３】
遠心分離の処理時間は、脂質の回収性の観点から、好ましくは１分以上、より好ましくは５分以上、更に好ましくは１０分以上とすることができる。また、経済性の観点から、好ましくは８０分以下、より好ましくは４０分以下、更に好ましくは２０分以下とすることができる。
【００４４】
遠心分離の際の温度は特に限定されないが、脂質の回収性及び経済性の観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下である。
【００４５】
溶媒抽出と遠心分離とを組み合わせる場合には、溶媒相と水相との分離を遠心分離により迅速に行うことができる。
【００４６】
静置処理は、脂質と水相とが相分離するまで反応液を静止状態に置けばよい。溶媒抽出と組み合わせる場合には、溶媒相と水相とが相分離するまで静止状態とすればよい。
【００４７】
本開示の藻類から脂質を抽出する方法によれば、このような簡便な操作により、体内に脂質を蓄積した微細藻類から高い回収率で脂質を抽出することができる。
【００４８】
微細藻類から抽出された脂質は、直接又は精製処理若しくは分解処理等を行ってバイオディーゼル燃料等のバイオ燃料として用いることができる。また、機能性食品又は医薬品等の原料、化成品の原料、化粧品の原料として用いることができる。
【実施例】
【００４９】
本開示について実施例を用いて更に詳細に説明する。以下の実施例において体内にトリグリセリド（ＴＡＧ）を蓄積したナンノクロロプシスを微細藻類の一例として説明するが、本開示はＴＡＧ及びナンノクロロプシスに限定されない。
【００５０】
＜分散液中の微細藻類の濃度（以下、藻体濃度ともいう。）の測定＞
分散液をフィルター（日本ポール製Supor-450、孔径０．４５μｍ）にて吸引ろ過し、等量の蒸留水で掛け洗いした。藻体を捕集したフィルターをアルミカップに移して１０５℃で２時間乾燥させた。乾燥後の重量を測定し、フィルターの風袋を差し引いた後、藻体濃度（ｇ／Ｌ）とした。また、分散液がフィルターで吸引ろ過しにくい場合は、適当な濃度に分散液を希釈して、乾燥後の重量を測定し、フィルターの風袋を差し引いた後、希釈率を乗じて藻体濃度（ｇ／Ｌ）とした。なお、希釈液には、ダイゴ人工海水ＳＰ（和光純薬工業製）を用いることができる。
【００５１】
＜藻体中の脂質量の測定＞
藻体の脂質の含量は、E.G.BlighとW.J.Dyerによって１９５９年に報告された生体材料からの脂質の抽出方法（Bligh ＆ Dyer法）に従って分析した（E.G.Bligh、W.J.Dyer、Canadian journal of biochemistry and physiology、37(1959)、p.911-917）。
【００５２】
処理前の試料０．５ｍＬに、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（メタノール溶液）を１００μＬ添加した。次に、２ＮのＨＣｌを１０μＬ添加し、更にクロロホルム５００μＬとメタノール０．９ｍＬを添加した。撹拌後、２５℃にて３０分間静置し、クロロホルム５００μＬと１．５％ＫＣｌを５００μＬ添加した。撹拌した後、遠心分離機、「himacCF7D2」（日立工機株式会社製）を用いて遠心分離（遠心力：１５００Ｇ、回転数：３０００ｒ／ｍｉｎ、温度：２５℃、時間：１５分間）した。次に、下層のクロロホルム相を採取し、窒素を用いて乾固した。次に、０．７ｍＬの０．５Ｎ ＫＯＨ−メタノール溶液（水酸化カリウム２．８ｇ、メタノール１００ｍＬ）を添加し、８０℃で３０分間保温してケン化を行った。更に１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液を添加し、８０℃にて１０分間保温してメチルエステル化を行い、溶媒と飽和食塩水をそれぞれ１ｍＬ添加して撹拌した後、２５℃で３０分間放置して溶媒相を取得した。溶媒にはヘキサンを用いた。得られた溶媒相を回収し、脂肪酸エステルの同定及び定量を下記の条件のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により行った。脂肪酸エステルの同定は、後述の標準物質とのリテンションタイムと同一かどうかにより判断した。またＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステルの量を、内部標準を基準にして算出し、その総量を乾燥藻体中の脂質量として求めた。
【００５３】
なお、このクロロホルム・メタノール溶媒抽出法は、単に藻体中の脂質量を測定するには有効であるが、使用する溶媒の安全性、回収性、リサイクル性の観点から、工業的な実用には適していない方法である。
【００５４】
−ＧＣ分析−
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７８９０Ａ
カラム：ＤＢ１−ＭＳ（Ｊ＆Ｗ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、２０ｍ×１００μｍ×０．１μｍ）
オーブン温度：１５０℃（０．５ｍｉｎ ｈｏｌｄ）−[４０℃／ｍｉｎ]−２２０℃（０ｍｉｎ ｈｏｌｄ）−[２０℃／ｍｉｎ]−３２０℃（２ｍｉｎ ｈｏｌｄ）−ｐｏｓｔ ｒｕｎ２ｍｉｎ
キャリアガス：水素
メイクアップガス：ヘリウム
サンプル注入量：５μＬ
注入法：スプリットモード（スプリット比＝７５：１）
注入口温度：３００℃
検出器：ＦＩＤ
カラム流量：０．２８ｍＬ／ｍｉｎコンスタント
圧力（ゲージ圧）：６２．４０３ｐｓｉ
標準物質：ＳＩＧＭＡ社製の下記脂肪酸エステルを用いた。
ラウリン酸メチル（Ｃ１２）、ミリスチン酸メチル（Ｃ１４）、パルミチン酸メチル（Ｃ１６）、ステアリン酸メチル（Ｃ１８）、パルミトレイン酸メチル（Ｃ１６：１）、オレイン酸メチル（Ｃ１８：１）、リノール酸メチル（Ｃ１８：２）、リノレン酸メチル（Ｃ１８：３）、エイコサペンタエン酸メチル（Ｃ２０：５）、ドコサヘキサエン酸メチル（Ｃ２２：６）
【００５５】
＜細胞数の測定＞
希釈した分散液２μＬをバクテリアカウンター（サンリード硝子製）の計算室に注入した後、光学顕微鏡（Nikon製、ECLIPSE80i）を用いて観察倍率４００倍で観察し、ブロック内の細胞数をカウントした。バクテリアカウンターの計算室のうち、０．０５ｍｍ角のブロックを使用した。計算室には、０．０５ｍｍ角のブロック１６マス（縦４マス×横４マス）からなる集合体が、２５個（縦５個×横５個）並んでいる。これらの集合体のうち、顕微鏡の観察画面の右上から左下までの対角線上に存在する５個の集合体中に含まれる細胞数をカウントした。すなわち、０．０５ｍｍ角のブロックの８０マス（１６マス×５個）中の細胞数をカウントした。バクテリアカウンターの計算室の深さは０．０２０ｍｍであり、０．０５ｍｍ角のブロック１つあたりの体積は１／２００００ｍｍ3である。カウントした細胞の総数を、該当するブロックの体積（１／２００００ｍｍ3×８０マス）で除し、更にカウントに用いた希釈液の希釈倍率をこれに乗ずることにより、希釈前のサンプル１ｍＬあたりの細胞数を求めた。なお、希釈液には、ダイゴ人工海水ＳＰ（和光純薬工業製）を用いた。
【００５６】
＜細胞破砕率の算出＞
前述の細胞数の測定方法により、分散液中の細胞数を測定した。破砕処理前の細胞数から破砕処理後の細胞数を引いて、破砕処理前の細胞数で除し、１００を乗じた値を細胞破砕率（％）とした。
【００５７】
＜脂質の回収率の測定＞
脂質は以下に示す溶媒抽出により回収した。回収した脂質は、メチルエステル化した後、前述のＧＣにて脂質量を定量した。
【００５８】
−ヘキサン抽出−
処理後の試料０．５ｍＬに、ヘキサン１ｍＬを添加し、２５℃にて３分間撹拌した後、遠心分離機、「himacCF7D2」（日立工機株式会社製）を用いて遠心分離（遠心力：１５００Ｇ、回転数：３０００ｒ／ｍｉｎ、温度：２５℃、時間：１５分間）した。次に、上層のヘキサン相を４００μＬ採取し、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（メタノール溶液）を４０μＬ添加した後、窒素を用いて乾固した。次に、０．７ｍＬの０．５Ｎ ＫＯＨ−メタノール溶液（水酸化カリウム２．８ｇ、メタノール１００ｍＬ）を添加し、８０℃で３０分間保温してケン化を行った。更に１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液を添加し、８０℃にて１０分間保温してメチルエステル化を行い、溶媒と飽和食塩水をそれぞれ１ｍＬ添加して撹拌した後、２５℃で３０分間放置して溶媒相を取得した。溶媒にはヘキサンを用いた。得られた溶媒相を回収し、脂肪酸エステルの同定及び定量を前述の条件のＧＣにより行った。またＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステルの量を、内部標準を基準にして算出し、その総量をヘキサン中の脂質量として求めた。
【００５９】
−脂質の回収率の算出−
以下の式（１）によりヘキサン溶媒による脂質回収率を算出した。
脂質回収率（％）＝ヘキサン中の脂質量／乾燥藻体中の脂質量×１００・・・（１）
【００６０】
＜実施例１＞
微細藻類の分散液として５００ｇの「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、微細藻類：Nannochloropsis oculata、分散液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）をガラス容器に仕込み、二酸化炭素を溶解させた。二酸化炭素の溶解は、分散液の液温を５℃として、攪拌（５０ｒ／ｍｉｎ）しながら、エアストーンである「セラミックストーン」（いぶき社製）を用いて２００ｍＬ／ｍｉｎの流速で二酸化炭素をバブリングして行った。バブリングは、絶対圧で０．１ＭＰａ（大気圧）にて、３０分間行った。次に、二酸化炭素を溶解させた分散液を圧力式ホモジナイザー（エスエムテー製ＬＡＢ２０００）に仕込み、一次（入口）圧がゲージ圧で１００ＭＰａ、二次（出口）圧が絶対圧で０．１ＭＰａ（大気圧）にて１パス処理し、細胞破砕率を求めた。なお、圧力式ホモジナイザー処理前の液温は３℃、処理後の液温は３２℃であった。細胞破砕率は、４６%であった。破砕後の脂質回収率は３２％であった。
【００６１】
＜実施例２＞
微細藻類の分散液として５００ｇの「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、微細藻類：Nannochloropsis oculata、分散液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）をガラス容器に仕込み、二酸化炭素を溶解させた。二酸化炭素の溶解は、分散液の液温を２５℃として、攪拌（５０ｒ／ｍｉｎ）しながら、エアストーンである「セラミックストーン」（いぶき社製）を用いて２００ｍＬ／ｍｉｎの流速で二酸化炭素をバブリングして行った。バブリングは、絶対圧で０．１ＭＰａ（大気圧）にて、３０分間行った。次に、二酸化炭素を溶解させた分散液を圧力式ホモジナイザー（エスエムテー製ＬＡＢ２０００）に仕込み、一次（入口）圧がゲージ圧で１００ＭＰａ、二次（出口）圧が絶対圧で０．１ＭＰａ（大気圧）にて１パス処理し、細胞破砕率を求めた。なお、圧力式ホモジナイザー処理前の液温は２５℃、処理後の液温は４１℃であった。細胞破砕率は、３３％であった。
【００６２】
＜比較例１＞
微細藻類の分散液として５００ｇの「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、微細藻類：Nannochloropsis oculata、分散液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）を圧力式ホモジナイザー（エスエムテー製ＬＡＢ２０００）に仕込み、一次（入口）圧がゲージ圧で１００ＭＰａ、二次（出口）圧が絶対圧で０．１ＭＰａ（大気圧）にて１パス処理し、細胞破砕率を求めた。なお、圧力式ホモジナイザー処理前の液温は２５℃、処理後の液温は４１℃であった。細胞破砕率は、２０％であった。破砕後の脂質回収率は１６％であった。
【００６３】
＜比較例２＞
微細藻類の分散液として５０ｇの「ヤンマリンＫ−１」（クロレラ工業製、微細藻類：Nannochloropsis oculata、分散液を構成する液体：海水、藻体濃度：５０ｇ／Ｌ）を１００ｍＬ容の圧力容器に仕込み、二酸化炭素ガスをゲージ圧で１０ＭＰａまで圧入し、４５℃で３０分間保持した後、容器を解放することで二酸化炭素ガスを抜出した。細胞破砕率は０％であった。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
表１から、比較例１の高圧分散処理のみでは、微細藻類の破砕効率が低く、脂質回収率も低いことがわかる。また、比較例２の超臨界状態の二酸化炭素を溶解した後、圧力を瞬時に下げる処理においても、微細藻類がうまく破砕できないことがわかる。一方、超臨界状態のような高圧で二酸化炭素を溶解しないにも関わらず、実施例の低圧で二酸化炭素を溶解した後、高圧分散処理する本開示の方法では、効果的に微細藻類の細胞壁を破砕し、効率的に藻類から脂質を回収できることがわかる。