(57)【要約】【課題】主として、コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚、特にホンモロコの精子の受精能について、時期を問わず簡便に評価することができる評価方法を提供することにある。【解決手段】コイ科ラスボラ亜科ダニオ属に属する魚、特にゼブラフィッシュの卵を用いることを特徴とする、タモロコ属に属する魚の精子の受精能を評価する方法を挙げることができる。  本発明によれば、タモロコ属に属する魚の精子の受精能を一年中評価することができる。また、絶滅が危惧されるタモロコ属に属する魚の卵の消耗を防ぐことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コイ科ラスボラ亜科ダニオ属に属する魚の卵を用いることを特徴とする、コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚の精子の受精能を評価する方法。
【請求項２】
コイ科ラスボラ亜科ダニオ属に属する魚が、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚が、ホンモロコ（Ｇｎａｔｈｏｐｏｇｏｎ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚の精子が、精巣細胞から体外的に作製された次の１〜４）いずれかに記載の精子である請求項１〜３いずれかに記載の方法。
１）繁殖期の雄性成魚の精巣細胞を培養し、分化させた精子
２）非繁殖期の雄性成魚の精巣細胞を培養し、分化させた精子
３）雄性稚魚の精巣細胞を培養し、分化させた精子
４）上記いずれかの精巣細胞を凍結保存したものから分化させた精子
【請求項５】
１８℃〜２８℃の水温下で、コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚の精子とコイ科ラスボラ亜科ダニオ属に属する魚の卵とを受精させ、培養することを特徴とする、コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚の精子の受精能を評価する方法。
【請求項６】
コイ科ラスボラ亜科ダニオ属に属する魚が、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚が、ホンモロコ（Ｇｎａｔｈｏｐｏｇｏｎ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）である請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
コイ科バルブス亜科タモロコ属に属する魚の精子が、精巣細胞から体外的に作製された次の１〜４）いずれかに記載の精子である請求項５〜７いずれかに記載の方法。
１）繁殖期の雄性成魚の精巣細胞を培養し、分化させた精子
２）非繁殖期の雄性成魚の精巣細胞を培養し、分化させた精子
３）雄性稚魚の精巣細胞を培養し、分化させた精子
４）上記いずれかの精巣細胞を凍結保存したものから分化させた精子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コイ科（Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ）バルブス亜科（Ｂａｒｂｉｎａｅ）タモロコ属（Ｇｎａｔｈｏｐｏｇｏｎ）（以下、単に「タモロコ属」という）に属する魚の精子の受精能を評価する方法に関するものである。特にホンモロコ（Ｇｎａｔｈｏｐｏｇｏｎ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）の精子の受精能を評価する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
純粋な日本産タモロコ属に属する魚は、年々少なくなってきている。例えば、琵琶湖固有種であるホンモロコの漁獲量は、１９９４年頃までは年間２００〜４００トンとほぼ安定していたが、１９９６年以降急激に落ち込み、２００７年には７トンにまで低下している。その原因として、ブラックバスやブルーギル等の外来魚による稚魚の捕食や葦原の減少が挙げられる。このようにホンモロコは、絶滅の危機にあると言われ、環境省レッドレストで絶滅危惧種ＩＡ類に指定されている。
また、ホンモロコは日本産コイ科の魚の中でも特に味がよく、その急激な減少は価格を急騰させ、現在では高級食材の一つとなっている。それ故、ホンモロコは重要な水産資源ともなっている。
【０００３】
絶滅危惧種であるホンモロコの種を保存すべく、様々な試みが行われている。滋賀県及びその周辺の自治体は、稚魚の大量放流や産卵繁殖場となる葦帯を含む浅水域の造成、さらには外来魚の駆除等の対策を講じて、水産資源の確保に取り組んでいる。
また、長期凍結保存可能な、ホンモロコの生殖巣由来の体細胞株を樹立して、ホンモロコの種の保存に役立てようという試みもある（特許文献１参照）。
さらには、ホンモロコの精子を集め凍結保存することも有効な方法と考えられている。
しかしながら、ホンモロコは、体が小さく１匹から確保できる精子にも限りがあり、概年生殖リズムで季節繁殖性（３〜７月）を有することから、繁殖期の、しかも成魚においてのみ精子を採取することが可能である。さらに、ホンモロコは、孵化後半年から１年で繁殖能力を獲得するが、稚魚の１／２〜２／３は最初の冬の間に死んでしまうため、そもそも繁殖能力を有する段階まで成長する個体数は著しく少ない。
【０００４】
一方、日本ウナギ、メダカ、ゼブラフィッシュ、テラピアといった魚類において、精巣を摘出して調製した精巣細胞から体外的に精子を作製することに成功している（非特許文献１〜４参照）。
このような精巣細胞から体外的に精子を作製する技術をホンモロコに応用し、種の保存に役立てることが考えられる。但しその場合、体外的に作製されたホンモロコの精子の受精能を評価するため、ホンモロコの卵が必要となる。
しかしながら、ホンモロコは、上記の通り、季節繁殖性のため、その卵の採取時期は１年の中の一定期間に限られ、またその数にも制限がある。
なお、精子の受精能の評価（卵割率、孵化率等）は、異系交配（交雑）のように新たな品種の作出を目的とするものではないことから、基本的に最も自然な同種の卵を用いて行われている。前記非特許文献に係るメダカやゼブラフィッシュでの受精能も同種の卵を用いて行われている。
【０００５】
ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）は、コイ科ラスボラ亜科（Ｒａｓｂｏｒｉｎａｅ）ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）（以下、単に「ダニオ属」という）に属するインド原産の熱帯魚である。コイ科に属する魚である点でホンモロコと共通するが、基本的にホンモロコとは異種である。
ゼブラフィッシュは、飼育が容易で、季節繁殖性がない。しかも多産で、１日で最大数百の卵を産する。それ故、いつでもある程度の数の卵を採取可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１３４０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｕｒａ  Ｃ，  Ｍｉｕｒａ  Ｔ，  Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｍ，  Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｋ，  ＆  Ｎａｇａｈａｍａ  Ｙ；  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｇｒｏｗｔｈ  ＆  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３８（３）：２５７−２６２（１９９６）
【非特許文献２】Ｓａｉｋｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．；  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｇｒｏｗｔｈ  ＆  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３９（３）：３３７−３４４（１９９７）
【非特許文献３】Ｓａｋａｉ  Ｎ；  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９（１４）：３３５９−３３６５（２００２）
【非特許文献４】Ｔｏｋａｌｏｖ  Ｓ  ＆  Ｇｕｔｚｅｉｔ  Ｈ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２３３（４）：１２３８−１２４７（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、主として、タモロコ属に属する魚、特にホンモロコの精子の受精能について、時期を問わず簡便に評価することができる評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、上記課題を解決することができる発明を見出し、本発明を完成した。
本発明として、例えば、下記を挙げることができる。
［１］ダニオ属に属する魚の卵を用いることを特徴とする、タモロコ属に属する魚の精子の受精能を評価する方法。
［２］１８℃〜２８℃の水温下で、タモロコ属に属する魚の精子とダニオ属に属する魚の卵とを受精させ、培養することを特徴とする、タモロコ属に属する魚の精子の受精能を評価する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、タモロコ属に属する魚の精子の受精能を一年中評価することができる。また、絶滅が危惧されるタモロコ属に属する魚の卵の消耗を防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】繁殖期のホンモロコ成魚から得られた精巣細胞の初代細胞培養結果を表す写真である（尺度は５０μｍ）。写真Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ培養７日目、１１日目、２４日目の細胞培養結果を表す。各写真の挿絵は、精子の鞭毛を示すと共に、選択エリアの高倍率イメージを示す。
【図２】非繁殖期のホンモロコ成魚から得られた精巣細胞の初代細胞培養結果を表す写真である（尺度は５０μｍ）。写真Ｄ、Ｅ、Ｆは、それぞれ培養７日目、１１日目、１８日目の細胞培養結果を表す。写真Ｆの挿絵は、精子の鞭毛を示すと共に、選択エリアの高倍率イメージを示す。
【図３】ホンモロコ稚魚から得られた精巣細胞の初代細胞培養結果を表す写真である（尺度は５０μｍ）。写真Ｇ、Ｈ、Ｉは、それぞれ培養４日目、１３日目、１９日目の細胞培養結果を表す。写真Ｉの挿絵は、精子の鞭毛を示すと共に、選択エリアの高倍率イメージを示す。
【図４】凍結保存した、ホンモロコ成魚又は稚魚の精巣細胞の初代細胞培養結果を表す写真である（尺度は１００μｍ）。写真Ａは、非繁殖期の成魚から調製した凍結保存した精巣細胞の２１日目の培養結果を表す。写真Ｂは、凍結保存した、ホンモロコ稚魚の精巣細胞の２７日目の培養結果を表す。各写真の挿絵は、選択エリアの高倍率イメージを示す。
【図５】ゼブラフィッシュの卵とホンモロコの体外分化精子との間の属間交配胚の形態を表す写真である。写真Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ受精後２時間、２４時間、５日における受精胚を表す。矢印は、属間交配胚で時折見られた形態学的に正常な胚を示す（尺度は５００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳述する。
タモロコ属に属する魚としては、特に制限されないが、例えば、ホンモロコ、タモロコ、カワバタモロコを挙げることができる。この中でもホンモロコが適当である。
ダニオ属に属する魚としては、特に制限されないが、例えば、ゼブラフィッシュ（ゼブラ・ダニオ）、ホワイトパール・ゼブラ・ダニオ、ロングフィン・ゼブラ・ダニオ、レオパード・ダニオ、パール・ダニオ、オレンジグリッター・ダニオ、ダニオ・エリスロミクロン、レッドゼブラダニオを挙げることができる。この中でもゼブラフィッシュが適当である。また、野生型でもその変異型（トランスジェニックを含む）でもよい。本発明において使用するダニオ属に属する魚の卵は、未受精の卵である。未受精のダニオ属に属する魚の卵は、ダニオ属に属する雌性成魚から、公知の文献（例えば、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ；  Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ），  Ｅｄ，ｐｐ２．１２−１２．２１（２００７））に記載の方法に従って得ることができる。
【００１３】
本発明においては、繁殖期の雄性成魚から採取した成熟精子やその凍結精子はもとより、例えば、精巣細胞から体外的に作製された下記のような精子も評価することができる。
１）繁殖期の雄性成魚の精巣細胞（鞭毛を持った精子を含む、全ての発生段階の精原細胞を含む）を培養し、分化させた精子
２）非繁殖期の雄性成魚の精巣細胞（Ａ型精原細胞と初期Ｂ型精原細胞のみ含む）を培養し、分化させた精子
３）雄性稚魚の精巣細胞（未分化生殖細胞：前駆精原細胞のみ含む）を培養し、分化させた精子
４）上記いずれかの精巣細胞を凍結保存したものから分化させた精子
本発明は、特にこれら精巣細胞から体外的に作製された精子の受精能を評価するのに有益である。
【００１４】
本発明における受精能の評価は、常法により行うことができる。具体的には、本発明は、例えば、未受精のダニオ属に属する魚の卵に、タモロコ属に属する魚の精子を加え、十分に混合することにより両者を受精させ、次いで培養し、培養後の卵について、常法により卵割、孵化率などの１又は２以上を評価することによって実施することができる。好ましくは、卵割を評価することにより受精能を評価する。
卵割の評価方法は特に限定されないが、常法により卵割が起こった受精卵（例えば、４卵期（２回卵割）、８卵期（３回卵割）等の受精卵）の数を計測する等の方法により、卵割が起こった受精卵の有無を確認すればよい。好ましくは、４卵期の受精卵の数を計測する。卵割が起こった受精卵の存在が確認される場合、具体的には、卵割が起こった受精卵が少なくとも１個確認される場合に、使用したタモロコ属に属する魚の精子が受精能を有すると判定することができる。
孵化を評価する方法も特に限定されず、常法により孵化した受精卵の数を計測すればよい。孵化した受精卵が少なくとも１個確認される場合に、使用したタモロコ属に属する魚の精子が受精能を有すると判定することができる。
受精は、１８℃〜２８℃の水温下で行うことができ、好ましくは、２２℃〜２４℃の水温下で行う。
受精後の培養温度についても、１８℃〜２８℃の水温が適当であり、２２℃〜２４℃の水温が好ましい。培養温度が１８℃より低い水温では、発生が遅延し、２８℃より高い水温では死滅する受精卵が増加するおそれがある。
培養時間は、例えば、卵割を評価する（好ましくは、４卵期の受精卵の有無を確認する）場合であれば、１０分〜１２時間が適当であり、好ましくは３０分〜５時間、より好ましくは１〜２時間である。
前記の体外的に作製された１）〜４）の精子を得るための初代細胞培養は、例えば、公知文献（Ｓａｋａｉ  Ｎ；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３９（３）：２３９−２４５（２００６））に記載された、ゼブラフィッシュの雄性生殖細胞培養方法をいくつか改良することにより行うことができる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例、参考例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに記載した態様に限定されるものではない。
【００１６】
［参考例１］精巣細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化精子の作製
（１）実験に供したホンモロコと精巣調製
雄のホンモロコ成魚（１〜２年齢、体長約９ｃｍ）は、滋賀県水産試験場における自然条件下の屋外池で飼育して、春（４月と５月）の繁殖期と夏（９月）の非繁殖期に得た。雄の稚魚（約５月齢）は、立命館大学薬学部細胞工学研究室において２５±１℃で自然な明暗サイクル下、胚から培養・飼育して、成長が乏しい稚魚（体長約４ｃｍ）のみ用いた。
各精巣は、次のようにして得た。
ホンモロコ成魚については、まず頭部をすばやい殴打で安楽死させ、稚魚は冷氷水に浸し安楽死させた。次いで表面を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで消毒し、精巣をホンモロコから無菌的に切り離し、０．５％（ｖ／ｖ）の市販の漂白剤を添加した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に移した。２分間の浸漬後、各々２分間滅菌ＰＢＳで精巣を３度洗った。この一部分を用いて精子を作製した。
【００１７】
（２）精巣細胞の初代培養
新鮮な細切精巣断片を５００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼを含むＬｅｉｂｏｖｉｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（インビトロゲン社製）中で、一定の振とう下（１４０ｒｐｍ）２０分毎に穏やかにピペッティングしつつ、２８℃２時間インキュベートして細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン画分Ｖ（ＢＳＡ：シグマ・アルドリッチ社製）を含むＨＥＰＥＳ緩衝Ｌｅｉｂｏｖｉｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（ｐＨ７．９）で１０倍に希釈し、１２０×ｇで７分間遠心分離した。上清液は捨て、細胞ペレットを１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ：インビトロゲン社製）、３％（ｖ／ｖ）のコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）血清、１００ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ：ペプロテック社製）、１００ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：ペプロテック社製）、１００ｎｇ／ｍＬのグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：ペプロテック社製）、１００ｎｇ／ｍＬのインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１：ペプロテック社製）、１０μＭのフォルスコリン（シグマ・アルドリッチ社製）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ・アルドリッチ社製）、１０ＩＵ／ｍＬのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ：あすか製薬社製）、１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ：あすか製薬社製）、５０ｎｇ／ｍＬの１１−ケトテストステロン（１１−Ｋ：コスモバイオ社製）、１００ｎｇ／ｍＬの１７β−エストラジオール（Ｅ２：和光純薬工業社製）、及び１０ｎｇ／ｍＬの１７α、２０β−ジヒロドキシ−４−プレグネン−３−オン（ＤＨＰ：トロント・リサーチ・ケミカルズ社製）を補充した精巣細胞培養培地（ＴＣＣＭ）中で再懸濁した。
繁殖期の成魚から調製した精巣細胞懸濁液は、精巣１片分を３ディッシュに、非繁殖期の成魚から調製した精巣細胞懸濁液は、精巣１片分を１ディッシュに、稚魚から調製した精巣細胞懸濁液は、５匹分（１０対）の精巣を１ディッシュにそれぞれ播種した。ディッシュには０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン（シグマ・アルドリッチ社製）で被覆された３５ｍｍのプラスチック製組織培養皿（旭硝子社製）を用いた。播種した細胞を加湿空気中、１８℃で培養した。培地は、３ないし４日毎に交換した。ＴＣＣＭに含まれた魚類胚抽出物を、公知文献（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ；  Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ），５ｔｈ  Ｅｄ，ｐ１０．１４（２００７））に従って、フナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ｃａｒａｓｓｉｕｓ）から調製した。
【００１８】
（３）精巣細胞からの精子の生成
上記のように培養した結果、繁殖期の成魚精巣では、鞭毛を持った精子を含む、全ての分化段階の生殖細胞が培養期間を通して観察された（図１のＡ〜Ｃ参照）。
一方、非繁殖期の成魚や稚魚から得られた精巣では、生殖細胞の多くが精原細胞であり、細胞培養の第１週の間、培養皿に接着した線維芽細胞様体細胞に付着していた（図２のＤ〜Ｆと図３のＧ〜Ｉ参照）。培養第２週目には生殖細胞は精母細胞と精子細胞に分化し、線維芽細胞様体細胞層上に塊を形成した。鞭毛を持った精子は、非繁殖期の成魚精巣では１６日目、稚魚では１９日目に細胞培養中で最初に観察された。鞭毛を持った精子は塊から分離し、生殖細胞塊の数と大きさは徐々に減少した。培養期間中線維芽細胞様体細胞は絶えず増殖し、培養底面にいっぱいになると剥離しはじめた。このフィーダー細胞の剥離が起こると精子産生の妨げとなるため、サブカルチャーする必要があった。
【００１９】
［参考例２］精巣細胞の凍結保存
（１）凍結保存方法
精巣細胞を、前記と同様に、非繁殖期の成魚と稚魚から調製した。細胞懸濁液を、１％ＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝Ｌｅｉｂｏｖｉｚ’ｓ  Ｌ−１５培地で１０倍に希釈し、成魚については約１片の精巣分の細胞を含む分量に、また稚魚については５対の精巣分の細胞を含む分量に分取してそれぞれ１２０×ｇで７分間遠心分離し、上清液を捨てた。細胞ペレットを、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞用凍結培地（リプロセル社製）２００μＬ中に懸濁し、クライオチューブバイアル（サーモサイエンティフィック社製）に移した。次いで、そのバイアルを液体窒素中に沈めることによって急速冷却し、少なくとも１日保存した。
加温については、凍結バイアルを液体窒素タンクから取り出し、事前に温めた（３７℃）、１０％ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｚ’ｓ  Ｌ−１５培地１０ｍＬの一部を加えることによって素早く行った。次いで、得られた細胞懸濁液を上記加温培地残液と合わせ、１２０×ｇで５分間遠心分離した。上清液を除去して、細胞ペレットを初代培養培地で再懸濁し、初代培養と同様に培養した。
【００２０】
（２）凍結保存した精巣細胞からの精子の生成
数日間凍結保存した精巣細胞を加温し、培養した。図４に示すように、鞭毛を持った精子が非繁殖期の成魚と稚魚から調製した両方の精巣細胞培養中において出現した。
【００２１】
［実施例１］精子の受精能評価
（１）実験方法
作製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化精子については、細胞培養物の上清培地を集め、８００×ｇで７分間遠心分離することによって精子を濃縮した。１００μＬ未満を残す程度に上清液を捨て、細胞ペレットを残液中に再懸濁した。
公知文献（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ；  Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ），  Ｅｄ，ｐｐ２．１２−１２．２１（２００７））に記載された方法に従って、未受精のゼブラフィッシュ（野生株、ペットショップにて購入、自家繁殖）又はホンモロコ（天然由来、滋賀県水産試験場等より分与）の卵をプラスチック製ペトリ皿に集めた。これに精子懸濁液を加え、１分間その皿を振とうして十分に混合した後、振とうしながら水５００μＬを徐々に加えて低張とした。さらに水を加えて、水温約２０℃〜２３℃（室温約２３℃）で卵を培養し、４細胞期と孵化期の胎生胚の全数を目視にて計数した。陽性コントロールとして、ホンモロコの卵と繁殖期におけるホンモロコの腹部を軽く圧迫して押し出した精子と受精させた。陰性コントロールとして、体外的に作製した精子を液体窒素による３回の凍結融解により死滅させた精子および精子を含まない培地のみを用いて、受精能評価を行った。その結果を表１に示す。
なお、ゼブラフィッシュ胚の通常の孵化温度（約３０℃）では、卵割段階で交雑胚が死滅した。
【００２２】
【表１】
2015146760.tif 000002
1) 腹部を軽く圧迫して押し出した精子
2) 精巣を摘出して調製した精巣細胞から体外的に作製
3) 急速凍結した精巣細胞から体外的に作製
Ａ：ゼブラフィッシュ、Ｂ：ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を注入したホンモロコ
【００２３】
（２）結果
多くの胚が正常に分割し（図５のＡ参照）、体節期段階に発育した（図５のＢ参照）。その後、多くの胚が尾や体軸の屈曲を含む異常な発育を示した（図５のＣ参照）。そして、受精後１０日以上長く生存する胚はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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