(57)【要約】【課題】  ＡＬＴ試薬におけるブランク反応値上昇の原因となっている試薬に処方されているＬＤのＨＧＤ活性を抑え、試薬ブランクの上昇を抑制して安定的な結果が得られる保存安定性及び測定範囲を確保した試薬および該試薬による測定方法を提供する。【解決手段】  アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定用試薬として、乳酸脱水素酵素をＬ体と反応するＬ−乳酸脱水素酵素と、これに敢えて同基質のＤ体と反応するＤ−乳酸脱水素酵素とを組み合わせ処方する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、乳酸脱水素酵素、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含むアラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬において、Ｄ−ＬＤと、敢えてこれと同基質のＬ−ＬＤとを組み合わせることを特徴とする、前記アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬。
【請求項２】
Ｌ−ＬＤを１０〜３，０００Ｕ／Ｌ、Ｄ−ＬＤを１，０００〜３０，０００Ｕ／Ｌ処方することを特徴とする請求項１のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定試薬。
【請求項３】
炭酸塩及び炭酸水素塩を１〜１５０ｍｏｌ／Ｌ処方することを特徴とする請求項１及び請求項２に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定試薬。
【請求項４】
アラニンアミノトランスフェラーゼを含有する可能性のある被検試料と、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、Ｄ−ＬＤおよび該Ｄ−ＬＤと同基質のＬ−ＬＤ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを処方することを特徴とする、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法。
【請求項５】
Ｌ−ＬＤを１０〜３，０００Ｕ／Ｌおよび該Ｄ−ＬＤと同基質のＤ−ＬＤを１，０００〜３０，０００Ｕ／Ｌ処方することを特徴とする請求項４に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
炭酸塩及び炭酸水素塩を１〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ処方することを特徴とする請求項４及び請求項５に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（以下「ＡＬＴ」という）活性測定において、試薬ブランクの変動を抑えることで安定的な結果が得られる試薬および該試薬を用いたアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＴは、心臓や肝に多く分布する酵素であり、各種疾患時に血中に遊出されるので、尿や血液等の生体液中におけるＡＬＴ活性の測定は、心疾患又は肝疾患の診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つである。
【０００３】
ＡＬＴ活性の測定法としては、Ｌ−アラニン及び２−オキソグルタル酸を基質として、ＡＬＴによって生成されるピルビン酸を乳酸脱水素酵素（以下、「ＬＤ」という）によって乳酸に変え、共存させておいた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤＨ」という）量の減少量を、波長３４０ｎｍ付近で測定することにより体液中のＡＬＴ活性を測定する方法が一般的に汎用されている。
【０００４】
日本では日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）が１９８９年に公表したＡＬＴ活性測定の勧告法［日本臨床化学会：ヒト血清中酵素活性測定の勧告法―アラニンアミノトランスフェラーゼ―（１９８９−０８−３０），臨床化学，１８（４），２５０−２６２（１９８９）］に沿った原理をもとにしたＡＬＴ活性測定法が普及している（非特許文献１）。
日本臨床化学会の公表した上記の勧告法は、測定値の互換性を得るために、臨床検査室等の環境レベルで共有することのできる共通の酵素活性測定を最適な条件で測定する方法であるため、一般には日常の検査法として使用することのできるものではないが、臨床検査薬メーカーは、日本臨床化学会の勧告法と測定値との互換性が取れるような試薬を提供している。
【０００５】
またＬＤの阻害作用を有する物質、特にオキサミン酸又はその塩を試薬に添加し、ＨＧＤ活性を抑える技術も報告されている（特許文献１）。さらにＬＤは通常使用されるＬ体乳酸のみに反応するＬ−乳酸脱水素酵素（以下、「Ｌ−ＬＤ」という）とＤ体の乳酸のみに反応するＤ−乳酸脱水素酵素（以下、「Ｄ−ＬＤ」という）とがあり、Ｄ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤ）を使用することによりＨＧＤ活性を抑える試薬が可能であることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３７５６８３２号公報
【特許文献２】特許第４８８４７３３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】臨床化学  勧告法総集編  ２０１２年版
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記したもののうち、臨床検査室等の大掛かりなレベルの施設を用いてＡＬＴ活性測定を行なっている施設では、一般的にその多くは日常の検査法として日本臨床化学会の勧告法と測定値との互換性が取れるような臨床検査薬メーカーの提供するＡＬＴ活性測定試薬を使用するが、生体試料は多種類の成分の混合物であり、また、ＡＬＴ活性測定試薬も多種類の成分の混合物であることから、試薬の安定化や夾雑物の影響を受けないようなＡＬＴ活性測定試薬の開発は極めて困難である。
【０００９】
特に、測定試薬をセットし、条件を設定するだけで自動的に測定する自動分析機と呼ばれている分析装置を用いる場合では、数週間に渡り蓋を開けたまま放置して測定することが多く、この場合、大気中の二酸化炭素を吸収し、ＡＬＴ活性測定試薬のｐＨが変化し、試薬ブランク反応値も変動し、得られるＡＬＴ活性測定値に誤差が生じるという問題は避けられなかった。
【００１０】
この試薬ブランクの反応変動はＬＤのα−ヒドロキシグルタレートデヒドロゲナーゼ（α−Ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性（以下、「ＨＧＤ活性」という）に由来し、ｐＨをアルカリ側にした方が抑えられることが報告さている。
一方既述した特許文献１において用いられるオキサミン酸又はその塩は安価であるため、ＨＧＤ活性を抑えた安価な試薬の供給が可能となるが、オキサミン酸又はその塩のみではブランク値上昇に対する抑制効果が不十分であり、試薬の測定値安定性において問題がある。
【００１１】
また特許文献２において、Ｄ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤ）を使用することによりＨＧＤ活性を抑えるようにする試薬については、これを使用した場合、ピルビン酸に対するＫｍ値がＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＤ）よりも高いことから、日常検査で使用される測定範囲が確保できないといった問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者らは、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、乳酸脱水素酵素、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含むアラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬において、試薬ブランク反応の上昇を抑制することを試みた結果、ＨＧＤ活性の試薬に対する影響を減少させることにより、その結果として試薬ブランク反応の変動を抑えることで安定的な測定結果が得られるＡＬＴ活性測定試薬および該試薬を用いたＡＬＴ活性測定方法を見出すことに成功した。具体的には上記の課題を解決するため、Ｄ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤ）のみではなく、これに敢えて上記したＤ−ＬＤと同じ基質のＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＤ）を組み合わせることを試みた。
【００１３】
このように、通常の場合において当業者らは、酵素活性測定は基質に対するＫｍとＶｍａｘから酵素活性を定義するため、Ｄ−ＬＤとＬ−ＬＤとの組み合わせのように複数の同じ基質に反応する酵素を組み合わせることは考えない。また本発明の課題でもあるＨＧＤ活性を抑えるために、わざわざＬ−ＬＤを組み合わせるというようなことは通常考えない。その理由は、Ｌ−ＬＤを少量でも組み合わせた場合、試薬ブランク反応の上昇が起こり得るためである。そこで本発明者らは鋭意検討した結果、Ｄ−ＬＤのみでＨＧＤ活性を抑えることが可能となるが、Ｄ−ＬＤ単独では他の課題も出てくることから問題となる測定範囲の確保のために敢えてＬ−ＬＤを組み合わせるという発想を試みたところ、それぞれの課題を解決することができることを見いだした。
【００１４】
具体的には、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、乳酸脱水素酵素、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤＨ」という）を含むアラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬において、一定量のＤ−ＬＤと一定量のＬ−ＬＤとを組み合わせた、前記アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬とすることにより前記した課題を解決することができた。また、本発明は、アラニンアミノトランスフェラーゼを含有する可能性のある被検試料と、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、一定量のＤ−ＬＤと一定量のＬ−ＬＤ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを一定量処方することを特徴とする、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ＡＬＴ活性測定試薬としてそれぞれ個別には知られているＤ−ＬＤと、これと同じ基質のＬ−ＬＤとを敢えて組み合わせることで、ＬＤ自体が示すＨＧＤ活性を測定結果に影響しない程度に抑制し、その結果、定量性が損なわれることなく、試薬ブランクを小さくし、また試薬容器開封保存後の試薬ｐＨ低下による試薬ブランク上昇の回避や、ピルビン酸に対するＬＤの見かけのＫｍ上昇によるＡＬＴ活性測定値への負の誤差を低減することに成功した。
【００１６】
また、Ｄ−ＬＤとＬ−ＬＤとを組み合わせることによりＤ−ＬＤのみでは十分な測定範囲が確保できない問題を解決し、ＨＧＤ活性の測定値変動のない安定した測定性能が得られるＨＧＤ活性測定のための試薬および、該試薬を用いたアラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定方法を完成させるに至った。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】オキサミン酸処方及び比較用のＡＬＴ活性測定試薬におけるブランク感度の経時的変化を示すグラフである。
【図２】本発明及び比較用のＡＬＴ活性測定試薬における測定上限を示すグラフである。
【図３】本発明及び比較用のＡＬＴ活性測定試薬におけるブランク感度の経時的変化を示すグラフである。
【図４】本発明及び比較用のＡＬＴ活性測定試薬を用いて測定した、プール血清中におけるＡＬＴ活性測定値の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のＡＬＴ活性測定試薬は、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、及び還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含む、これまで汎用されてきたＡＬＴ活性測定試薬の革命的改良である。汎用のＬ−アラニン、２−オキソグルタル酸、ＬＤ、及びＮＡＤＨを含む一般的なＡＬＴ活性測定試薬では、既述したようにＬ−アラニン及び２−オキソグルタル酸を基質として、ＡＬＴによって生成されるピルビン酸をＬＤによって乳酸に変え、共存させておいたＮＡＤＨ量の減少量を、波長３４０ｎｍ付近で測定することにより、ＡＬＴ活性を測定することができるが、試薬ブランク反応の変動による測定結果のバラツキが避けられない、という大きな課題を有している。
【００１９】
そこで本発明においては、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、ＬＤ、及びＮＡＤＨを含むアラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬において、試薬ブランク反応の上昇を抑制するための研究を重ねた結果、予想外のブランク反応の上昇を抑制することに成功したものである。つまりＤ−ＬＤのみでは測定範囲が確保できないという問題を解決し、ＬＤ自体が示すＨＧＤ活性の試薬に対する影響を測定結果に影響しない程度にまで抑制することにより、その結果として定量性が損なわれることなく試薬ブランク反応の変動幅を極端に小さくし、試薬容器開封保存後の試薬ｐＨ低下による試薬ブランク上昇の回避や、ピルビン酸に対するＬＤの見かけのＫｍ上昇によるＡＬＴ活性測定値への負の誤差を著しく低減させることに成功した。
【００２０】
具体的には、本発明のＡＬＴ活性測定試薬は、上記した公知の構成成分に加え、Ｄ−ＬＤと、敢えてこれに同じ基質のＬ−ＬＤとを処方する。通常、当業者は酵素活性測定に際して基質に対するKmとVmaxから酵素活性を定義するために、Ｄ−ＬＤと、これに同じ基質のＬ−ＬＤを組み合わせることは考えない。ここで用いるＤ−ＬＤとしては、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来の天然型Ｄ−ＬＤ、又はそれらの組み換え型Ｄ−ＬＤ、その変異型Ｄ−ＬＤを用いることができる。
【００２１】
また、Ｌ−ＬＤとしては、例えば、ニワトリ心臓由来、ブタ心臓由来、ブタ筋肉由来、若しくはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来の天然型Ｌ−ＬＤ、又はそれらの組換え型Ｌ−ＬＤを用いることができ、その由来は特には限定されない。なお本発明において「ＬＤ活性」とは、ピルビン酸を乳酸に還元する活性を意味する。また、その単位「Ｕ」は、１分間に１μｍｏｌの基質（ピルビン酸）を生成物（乳酸）に転換する酵素活性の量（標準温度は３０℃）で定義される。
【００２２】
Ｌ−ＬＤの処方量としては１０Ｕ／Ｌ未満では検体中のＡＬＴ活性を正確に測定することは難しく、また反対に３，０００Ｕ／Ｌを超えても、測定範囲を改善する上でそれ以上の効果が期待できないところからＬ−ＬＤの処方量としては１０〜３，０００Ｕ／Ｌまでの処方量とし、さらにこれにＤ−ＬＤを処方する。Ｄ−ＬＤの処方量としては、１，０００Ｕ／Ｌ未満では検体中のＡＬＴ活性を正確に測定することは難しく、反対に３０，０００Ｕ／Ｌを超えても、測定範囲を担保する上でそれ以上の効果が期待できないところから、Ｄ−ＬＤの処方量としては、１，０００〜３０，０００Ｕ／Ｌの範囲とするのが好ましい。
【００２３】
さらにこの場合、炭酸塩及び炭酸水素塩の処方も試薬ブランク反応の上昇を抑制するという点で効果的である。具体的には、例えば、炭酸塩及び炭酸水素塩としては、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム及び炭酸水素セシウム等を使用することができる。この場合の炭酸塩及び炭酸水素塩については１．０ｍｍｏｌ／Ｌ未満では効果がなく、反対に１５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えても試薬ブランク反応の上昇を抑制する上でそれ以上の効果が期待できないことから１〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であるのが好ましい。
【００２４】
本発明のＡＬＴ活性測定試薬に含有される構成成分の内、公知のＡＬＴ活性測定試薬に含まれる各種成分、すなわち、ＬＤ、ＮＡＤＨ、Ｌ−アラニン、及び２−オキソグルタル酸については、公知のＡＬＴ活性測定試薬と同様に用いることができる。
さらに本発明のＡＬＴ活性測定試薬は、公知のＡＬＴ活性測定試薬と同様に、適当な緩衝剤を更に含むことができ、この場合の緩衝剤としては、ＡＬＴ活性測定への悪影響がない限り、従来公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸、２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジル]エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、又はｎ−エチルモルフォリン等を使用することができる。
【００２５】
更に、本発明のＡＬＴ活性測定試薬は、前記必須配合成分及び緩衝剤の他に、必要により、一般的に添加される成分、例えば、キレート剤［例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等］、防腐剤（例えば、アジ化物等）、安定化剤（例えば、アルブミン又はグリセロール等）、及び／又は各種界面活性剤等を適宜添加することができる。
【００２６】
本発明のＡＬＴ活性測定試薬の試薬構成については、既知のＡＬＴ活性測定試薬と同様に、特に限定されるものではなく、例えば、１試薬にまとめることもできるし、あるいは、２試薬以上の試薬構成とすることもできるが、一般的には、各構成成分が安定な条件に分け、活性測定に至適な条件にて反応することができる試薬構成にすることが好ましい。このような試薬構成としては、例えば、アルカリ性で安定なＮＡＤＨ及びＬＤ等を含む第一試薬と、２−オキソグルタル酸等を含む第二試薬とに分け、反応時に活性測定に至適な試薬濃度及びｐＨになるようにこれらの各試薬を構成し、更に、第一試薬又は第二試薬のいずれか一方、あるいは、両方に、Ｌ−アラニンを添加することができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００２７】
また、被検試料として、ピルビン酸を含有する可能性のある被検試料（例えば、血液、血清、血漿、若しくは尿等の体液、又は細胞組織等）を測定する場合には、被検試料由来のピルビン酸の影響を排除するために、少なくともＬＤを第一試薬として含有し、２−オキソグルタル酸を第二試薬として含有する２試薬系とすることが好ましい。この場合ピルビン酸を含有する可能性のある被検試料と、ＬＤを含む第一試薬とを混合し、被検試料由来のピルビン酸を消去した後に第二試薬を添加することにより、被検試料由来のピルビン酸の影響を受けることなく、ＡＬＴ活性を測定することができる。
【００２８】
なお、少なくともＬＤ及び２−オキソグルタル酸を第二試薬として含有する２試薬系であっても、第二試薬添加後、例えば、数十秒から１分間程度で被検試料由来のピルビン酸を消去した後にＡＬＴ活性を測定することができるし、あるいは、１試薬系であっても同様の目的を果たすことができる。従って、本発明のＡＬＴ活性測定試薬は、特定の試薬構成に限定されるものではない。
【００２９】
本発明のＡＬＴ活性測定試薬は、本発明によるＡＬＴ活性測定方法に用いることができる。本発明のＡＬＴ活性測定方法では、被検試料と、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、ＬＤ、及びＮＡＤＨとを接触させ、ＮＡＤＨ量の減少量を、波長３４０ｎｍ付近で測定することにより、ＡＬＴ活性を安定的に測定することができる。
前記被検試料は、ＡＬＴ活性を含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、臨床診断に一般的に用いられる生体由来液、例えば、血液、血清、血漿、若しくは尿、又は細胞組織、あるいは実験サンプルなどを挙げることができる。
【００３０】
以下に本発明の内容を実施例の記載に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
本発明のＡＬＴ活性測定用の試薬として、表１に示す組成の第一試薬と、表２に示す組成の第二試薬とを調整した（以下これを「試薬Ａ」と称する）。また比較例として、オキサミン酸が含まれない第一試薬を調整し、表２に示す組成の第二試薬とを合わせて調整した（以下これを「試薬Ｂ」と称する）。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２】
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【００３４】
上記した試薬Ａと試薬Ｂとにより開封保存安定性試験をおこなった。
上記により調整した試薬Ａと試薬Ｂとを、それぞれ容器の蓋を開けた状態で自動分析装置（Ｈ７１８０；株式会社日立製作所製）にセットして２１日間放置し、３日目、７日目、１４日目、２１日目に、それぞれのブランク値を測定した。
【００３５】
具体的には、上記の自動分析装置の反応セルに、検体として生理食塩水４．５μＬと第一試薬１２０μＬとを加えて攪拌し、その後これを３７℃環境下において５分間加温した後、第二試薬４０μＬを加えて攪拌し、その後約１分後から５分後までの波長３４０ｎｍにおける吸光度変化量を自動分析装置により算出した。その結果は図１に示した通りであり、同図によりオキサミン酸が処方されている試薬Ａは、比較例としての試薬Ｂに比べてブランク値が低く、経時的なブランク変動についても０．６ｍＡｂｓ／ｍｉｎと、きわめて僅かであることから経時的なブランク変動が抑制されていることが明らかである。
【実施例２】
【００３６】
本発明のＡＬＴ活性測定用の試薬として、表３に示す組成を有する第一試薬と、前記実施例１の表２に示す組成を有する第二試薬とを調整した（以下この二試薬系試薬を「試薬Ｃ」と称する）。また比較例として、表３に示す組成よりＬ−ＬＤのみを除外した第一試薬を調整し、前記表２の第二試薬と合わせた二試薬系試薬を調整した（以下この二試薬系試薬を「試薬Ｄ」と称する）。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
測定範囲の上限について調べた結果、以下のことが明らかとなった。
つまり、前記した実施例２で調整した試薬Ｃおよび試薬Ｄを上記した実施例１および２で用いたのと同じ自動分析装置にセットし、実施例１と同じ方法により測定をした。この場合検体には生理食塩水を用いて５段階希釈されたハイレベルチェック・Ｅ（シスメックス株式会社製）を用いた。検体のＡＬＴ活性測定には検体の代わりに酵素キャリブレーター（株式会社カイノス製）を用い、得られた測定結果に基づいて算出した。
【００３９】
その結果は図２に表した通りであり、同図によりＤ−ＬＤ単独の試薬Ｄと比較し、Ｌ−ＬＤとＤ−ＬＤとの混合である試薬Ｃは、より広い測定範囲が担保されていることがわかる。具体的には、試薬Ｃおよび試薬Ｄともに１／５倍希釈の検体測定値が５００Ｕ／Ｌであるのに対し、希釈しない検体では、試薬Ｄの測定値が２３１６Ｕ／Ｌであり、これに対して，試薬Ｃの測定値は２４２４Ｕ／Ｌであり、試薬Ｃを用いる場合のほうが測定範囲の向上がみられた。
【実施例３】
【００４０】
本発明のＡＬＴ活性測定用の試薬として、表３に示す組成のうち炭酸水素カリウムのみを除外して調整した第一試薬と、前記実施例１の表２に示す組成を有する第二試薬とを調整した（以下この二試薬系試薬を「試薬Ｃ」と称する）。また比較例１として、表４に示す組成の第一試薬を調整し、これを前記表２の第二試薬と合わせた二試薬系試薬を調整した（以下この二試薬系試薬を「試薬Ｅ」と称する）。また比較例２として、表５に示す既知のＡＬＴ活性測定試薬と同じ組成の第一試薬を調整し、前記表２の組成を有する第二試薬とを合わせた二試薬系試薬を調整した（以下この二試薬系試薬を「試薬Ｆ」と称する）。
【００４１】
【表４】
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【表５】
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【００４２】
開封保存安定性について調べた結果、以下のことが明らかとなった。
すなわち、前記実施例１および実施例３で調整した試薬Ｃ、試薬Ｅおよび試薬Ｆを容器の蓋を開けた状態で自動分析装置（Ｈ７１８０；株式会社日立製作所製）にセットして３５日間放置するとともに、その間７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目に、それぞれ前記実施例１と同様の方法により測定を実施した。なお、この場合に検体には生理食塩水、プール血清を用いて測定した。
【００４３】
その場合における生理食塩水（ブランク）のＡＬＴ活性測定結果を図３に示す。この場合に、蓋を開けた状態のまま放置しておくと、比較用の試薬Ｅおよび試薬Ｆでは試薬ブランク値（吸光度ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）が経時的に変動（低下）するのに対し、本発明の試薬Ｃでは試薬ブランク値が殆ど変動しなかった。具体的には、試薬Ｅ：１．２ｍＡｂｓ／ｍｉｎ、試薬Ｆ：１．７ｍＡｂｓ／ｍｉｎの変動に対し、本発明品である試薬Ｃではブランク値の変動がみられなかった。しかもそれぞれ既知の同基質であるＬ−ＬＤとＤ−ＬＤとを敢えて組み合わせたことにより、試薬ブランクが−２．２ｍＡｂｓ／ｍｉｎから−０．３ｍＡｂｓ／ｍｉｎと、大幅に低減させることができることを確認した。
【００４４】
また検体としてプール血清を用いた場合におけるＡＬＴ活性の測定結果を図４に示す。この場合においても前記実施例２と同様の方法によりＡＬＴ活性測定をおこなった。該検体の測定値に関しても、蓋を開けた状態のままで放置しておくと、比較用の試薬Ｅおよび試薬ＦではＡＬＴ活性測定値（Ｕ／Ｌ）が経時的に上昇していくのに対し、本発明の試薬ＣではＡＬＴ活性の測定値に殆ど変動がみられなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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