(57)【要約】【課題】セルロース系バイオマスから得られる糖化液のようにグルコースとキシロースとが共存する糖原料を含有する発酵用液から、エタノールを効率良く生産するための方法の提供。【解決手段】カンジダ・インターメディアに属し、グルコース及びキシロースの共存下でエタノール生産能を有するエタノール生産酵母を用いてグルコースとキシロースを含有する発酵用液からエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方を０．５〜５質量％及びキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、グルコースとキシロースを含有する発酵用液からエタノールの生産に供することを特徴とするエタノールの生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・インターメディアに属し、グルコース及びキシロースの共存下でエタノール生産能を有するエタノール生産酵母を用いてグルコースとキシロースを含有する発酵用液からエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方を０．５〜５質量％及びキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、グルコースとキシロースを含有する発酵用液からエタノールの生産に供することを特徴とするエタノールの生産方法。
【請求項２】
前記エタノール生産酵母が、カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母である請求項１記載のエタノールの生産方法。
【請求項３】
エタノール生産に用いる発酵用液として、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、全ての糖類の合計含有量に占めるグルコースとキシロースの合計の含有割合が６０〜１００％質量％で、かつグルコースとキシロースの合計量に占めるグルコースの含有割合が３０〜９０質量％である発酵用液を用いる請求項１又は２記載のエタノールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセルロース系バイオマス等からの効率的なエタノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、環境面から微生物の発酵によるエタノール生産原料として注目されている。特に、最近では未利用バイオマスの有効活用という観点から、木材、紙類、あるいはバガス（サトウキビの搾りかす）、コーンストーバー（とうもろこしの芯、茎、葉）及びワラ類のような農業廃棄物といったようなセルロース系のバイオマス原料の利用が検討されている。
【０００３】
セルロース系バイオマスを用いて微生物の発酵によってエタノールを生産するためには、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースやこれらの一部分解物である多糖類を酵素法や希硫酸などを用いる加水分解法により分解し、六炭糖であるグルコース、マンノース及びガラクトースや五炭糖であるキシロースを主成分とする糖化液を得、この糖化液中の糖を微生物の発酵に供する必要がある。しかし、五炭糖のキシロースはエタノール発酵しづらいことが知られている。実際、グルコース等から効率よくエタノールを生産可能な酵母として知られているサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はキシロースからはエタノールを生産することができない。一方、キシロースからエタノールを生産できる酵母としては、クルイベロマイセス・セロビオボラス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｖｏｒｕｓ、現在ではカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に分類）が報告されているが（非特許文献１、特許文献１等）、そのエタノール生産効率は十分とはいえない。
【０００４】
ところで、微生物によるグルコース等の糖から発酵によりエタノールを生産するにあたっては、理論上はエタノールの原料である糖濃度を高くすればするほど、生産性が上がるように思われる。しかし、一般に、グルコース濃度が高すぎるとエタノールの生産速度が速くなりすぎ、発酵に用いている菌体内に急速にエタノールが蓄積し、菌体のエタノール耐性の問題から却って発酵が阻害されてしまう（非特許文献２，３）。この現象はグルコース阻害（グルコースリプレッション）として知られている。このグルコース阻害の影響から、発酵液中のエタノール濃度の上限値は、組み換え体のような特殊な微生物を用いない限り、通常４．５質量％程度が上限となる場合が多い（非特許文献４）。
このグルコース阻害は、前述したセルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いたエタノール発酵においても生じるが、これによってセルロース系バイオマス糖化液中に含まれるグルコース以外の糖であるキシロースは一層消費されづらくなってしまう。そして、通常、セルロース系バイオマス糖化液中に含まれる糖類の消費では、グルコースを完全に消費した後でなければキシロースを消費できないという序列があるため、グルコースの消費がグルコース阻害により停止してしまうと、キシロースの発酵が進行しなくなってしまう（例えば、非特許文献３等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−０２８２８９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６５５４１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Morikawa Y.et al「Ethanol productions from d-xylose and cellobiose by Kluyveromyces cellobiovorus」 Biotechnology and bioengineering、１９８５年、第２７巻、第４号、ｐ．５０９−５１３
【非特許文献２】K.-D. Entian 「Glucose repression:a complex regulatory system in yeast」 Microbiological Science、第３巻、ｐ．３６６−３７１
【非特許文献３】TW.Jeffries、YS.Jin 「Ethanol and thermotlerance in the bioconversion of xylose by yeasts」、Adv.Appl.Microbiol.２０００年、第４７巻、ｐ．２２１−２６８．
【非特許文献４】S-J.Haら「Engineered Saccharomyces cerevisiae capable of simultaneous cellobiose and xylose fermentation」 PNAS.２０１１年、１０８巻、ｐ．５０４−５０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、グルコース阻害は、セルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いるエタノール生産に及ぼす影響が大きい。
そのため、セルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いたエタノール発酵では、主な糖源としてグルコースを用いた場合と比較して、エタノール生産濃度の上限はさらに低くなり、また発酵速度も低くなってしまい、エタノールの生産効率が図りづらいという課題があった。
従って、本発明の課題は、セルロース系バイオマスから得られる糖化液のようにグルコースとキシロースとが共存する糖原料を含有する発酵用液から、エタノールを効率良く生産するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、カンジダ・インターメディアに属し、グルコース及びキシロースの共存下でエタノール生産能を有するエタノール生産酵母を用いてグルコースとキシロースを含有する発酵用液を用いてエタノール生産をする前に、ショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方とキシロースを特定量含有する培地で当該酵母を培養した後に、エタノール生産に供することによって、エタノールの生産効率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供することにある。
〔１〕カンジダ・インターメディアに属し、グルコース及びキシロースの共存下でエタノール生産能を有するエタノール生産酵母を用いてグルコースとキシロースを含有する発酵用液からエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方を０．５〜５質量％及びキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、グルコースとキシロースを含有する発酵用液からエタノールの生産に供することを特徴とするエタノールの生産方法。
〔２〕前記エタノール生産酵母が、カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母である〔１〕記載のエタノールの生産方法。
〔３〕エタノール生産に用いる発酵用液として、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、全ての糖類の合計含有量に占めるグルコースとキシロースの合計の含有割合が６０〜１００％質量％で、かつグルコースとキシロースの合計量に占めるグルコースの含有割合が３０〜９０質量％である発酵用液を用いる〔１〕又は〔２〕記載のエタノールの生産方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、グルコースと共にキシロースを含有するセルロース系バイオマスから効率的にエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例及び比較例の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示す図である。
【図２】実施例及び比較例の発酵液中のキシロース濃度の経時変化を示す図である。
【図３】実施例及び比較例のエタノール収率及びキシロース消費率の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）酵母
本発明のエタノールの生産方法では、カンジダ・インターメディアに属し、グルコース及びキシロースの共存下でエタノール生産能を有するエタノール生産酵母が用いられる。このようなエタノール生産酵母の例としては、カンジダ・インターメディア  ＮＢＲＣ１０６０１やカンジダ・インターメディア  ＡＴＣＣ６０３８１、特許文献２記載のカンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２が挙げられる。このうち、カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９）がエタノール生産効率の点で特に好ましい。該酵母は、本発明者が、独立行政法人  製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）から入手したカンジダ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として常法に従い自然変異させ、親株よりもエタノール生産能が高い株を選抜することにより取得した酵母であり、特許文献２に記載された酵母である。
【００１３】
（２）エタノール生産に供する前に実施する酵母の前培養
本発明においては、エタノール生産に供する前に、ショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方を０．５〜５質量％及びキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で前培養を行う。ショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方の含有量は１〜５質量％含有させることがより好ましい。また、キシロースは１〜４質量％とすることがより好ましい。なお、ショ糖と麦芽糖の両方を含有する場合には、これら２種の糖の含有量の合計量が上記範囲内である。ショ糖または麦芽糖のいずれか１種類またはその両方の含有量がこの範囲を外れた場合には、本発明のエタノール生産用の発酵用液中で効率のよいエタノール生産を行うことができない。
【００１４】
ショ糖又は麦芽糖としては、そのものを含有させてもよいし、ショ糖や麦芽糖を含有するセルロース系バイオマス加水分解液を用いることもでき、培地中のショ糖や麦芽糖の濃度が前記範囲になるように、セルロース系バイオマス加水分解液を前培養の培地中に添加すればよい。また、セルロース系バイオマス加水分解液にショ糖や麦芽糖を添加してその含有量を調整してもよい。
キシロースについても、そのものを含有させてもよいし、キシロースを含有するセルロース系バイオマス加水分解液を用いることもでき、培地中のキシロースの濃度が前記範囲になるように、セルロース系バイオマス加水分解液を前培養の培地中に添加すればよい。また、セルロース系バイオマス加水分解液にキシロースを添加してその含有量を調整してもよい。
【００１５】
本発明で用いることができるセルロース系バイオマス加水分解液とは、農業残渣（稲ワラ、麦ワラ、バガス（サトウキビの搾りかす）、コーンストーバー（とうもろこしの芯、茎、葉）等）、林業残渣（材木等）等から得られるセルロース系バイオマス、すなわちセルロースとヘミセルロースを含むバイオマスを希硫酸法等の加水分解法により糖類に分解して得られる液を指す。なお、セルロースはグルコースを構造単位とし、ヘミセルロースはグルコース、キシロース、マンノース及びガラクトース等を構造単位とする多糖類である。
本発明においては、セルロース系バイオマス加水分解液を用いる場合には、ショ糖とキシロースの含有量が多いバガスの加水分解液や麦芽糖とキシロースの含有量が多いコーンストーバーの加水分解液を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明で用いることのできるセルロース系バイオマス加水分解液としては、セルロース系バイオマスを希硫酸法や水熱分解法などによって加水分解して得られるものが挙げられる。希硫酸法としては、セルロース系バイオマスを乾燥させた後、粉砕し、これに重量が１０倍量になるように蒸留水および硫酸（０．２〜０．５質量％）を添加し、１９０℃〜２１０℃、５〜１０分で加水分解する方法が挙げられる（P-M.Bondessonら、「Ethanol and biogas production after steam pretreatment of corn stover with or without the addition of sulphuric acid」、Biotechnol.,for Biofuel.２０１３年、第６巻、ｐ．１−１１）。また、水熱分解法としては、セルロース系バイオマスを１９０℃〜２１０℃、５〜１０分加水分解する方法が挙げられる（同上文献）。
【００１７】
なお、セルロース系バイオマス加水分解液には、ショ糖や麦芽糖やキシロース以外にもグルコースやマンノースやガラクトース等のセルロースやヘミセルロース由来の糖が含まれ、これらの濃度が高いと生育阻害を起こす場合がある。そのため、ショ糖、麦芽糖、キシロースおよび他の糖を含んだ培地中の全糖濃度は１０質量％以下とすることが好ましい。
また、前培養の培地に含まれるショ糖、麦芽及びキシロース等以外の成分は特に限定されるものではないが、生育に適したアミノ酸、尿素、無機窒素塩、有機窒素塩、ポリペプトン、酵母アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源；酵母エキス等が挙げられる。
【００１８】
前培養の温度は、好ましくは１０℃〜３７℃であり、より好ましくは２５℃〜３２℃である。ｐＨは、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５である。また、前培養は好気条件で行うことが好ましい。
【００１９】
（３）エタノール生産用発酵用液
本発明のエタノールの生産方法は、前述のショ糖や麦芽糖とキシロースを所定量含有する培地で前培養することにより、セルロース系バイオマス由来の糖に特徴的なグルコースとキシロースとが共存する糖類から効率的にエタノールを生産できる点に特徴がある。したがって、本発明のエタノールの生産方法に用いる発酵用液は、グルコースとキシロースを含有することを前提とするものであるが、その組成は特に限定されない。
【００２０】
本発明で用いられる発酵用液は、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であることが好ましく、８〜１５質量％であることがより好ましく、１０〜１５質量％であることがさらに好ましい。本発明のエタノール生産法によれば、従来よりも高いエタノール濃度まで発酵させることが可能となり、後の蒸留、濃縮工程にかかるエネルギーを削減することが可能となるが、糖濃度があまり低すぎる場合、理論上、生産可能なエタノール濃度は低く抑えられてしまい、本発明の効果を十分に発揮できない。そのため、糖濃度は８質量％以上とすることが好ましい。一方、糖類の濃度が高すぎる場合には酵母自身のエタノール耐性が十分でないため、糖類の濃度は２０質量％以下とすることが好ましい。
【００２１】
また、本発明で用いられる発酵用液は、全ての糖類の合計含有量に占めるグルコースとキシロースの合計の含有割合が６０〜１００質量％であることが好ましく、８０〜１００質量％であることがより好ましい。
さらに、本発明で用いられる発酵用液は、グルコースとキシロースの合計量に占めるグルコースの含有割合が３０〜９０質量％であることが好ましく、より好ましくは５０〜８０質量％であり、さらに好ましくは６０〜７０質量％である。
【００２２】
含有する糖類としては、本発明の発酵用液の必須成分であるグルコースとキシロースの他、セルロース系バイオマス由来の糖類に含まれるマンノース及びガラクトース等の単糖類やショ糖や麦芽糖等の二糖類等が挙げられる。これらの糖類の原料としては、前述のセルロース系バイオマス加水分解液やセルロース系バイオマスを酵素法によって糖化した液を用いることができる。前培養でセルロース系バイオマス加水分解液を用いた場合には、同様にセルロース系バイオマス加水分解液を用いることが好ましい。なお、セルロース系バイオマス由来の糖類を原料に用いた場合であっても、本発明に用いられる発酵用液中の各成分の含有量の範囲内であれば、必要に応じてさらに別途糖類を添加してもよい。
【００２３】
本発明のエタノール生産に用いる発酵用液には、上記糖類の他にも適宜必要な成分を含有していてもよい。例えば、アミノ酸、尿素、ポリペプトン、アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源や、酵母エキス等を添加してもよい。なお、発酵方式として連続発酵法を用いた場合には、培養槽中のエタノールを含有する発酵液の抜き出し時に酵母も抜き出され、発酵槽内での酵母の増殖が必要となる場合が多いため、長期にわたる連続発酵を行う際には、このような成分を酵母の増殖に適するように適宜含有させることが好ましい。
【００２４】
（３）発酵条件
上記以外の発酵条件については、適宜、選択すればよいが、好ましい条件を挙げると以下の通りである。
【００２５】
本発明のエタノール生産方法は、エア供給速度を０．００１〜５００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の条件とすることが好ましい。この範囲とすることでエタノール生産効率をより向上させることができる。エア供給速度は０．００５〜１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．０１〜１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．１〜５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．５〜５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。ここでエアとは、大気であり、酸素供給量に換算すれば、その１／５である。
【００２６】
本発明のエタノール生産方法は、回分発酵法で行ってもよいし連続発酵法で行ってもよいが、本発明のエタノール生産方法ではセルロース系バイオマスに含まれる通常は発酵しづらいキシロースからも効率的にエタノール生産を行うことができるため、これらを含有する発酵用液を連続投入しても効率的に消費出来る点で、連続発酵にも適している。本発明を連続発酵法で行う場合、発酵用液を０．０００２〜２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給することが好ましく、０．００５〜０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．０１〜０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。
【００２７】
エタノール生産中の酵母濃度は、乾燥菌体重量で０．１〜５質量％に調整することが好ましく、０．５〜５質量％に調整することが好ましい。回分発酵法においては、エタノール発酵工程前の増殖工程においてこの濃度に調整すればよい。連続発酵法においては、培養開始前に前培養した酵母をこの濃度の範囲となるように植菌するか、植菌後、酵母濃度を２倍程度の増殖をともなってもよく、エタノール生産中は発酵用液の供給速度（すなわち発酵液抜き出し速度）や酸素濃度等の培養条件を調整しこの濃度の範囲となるように調整すればよい。
エタノール生産中の温度は、２０〜４０℃とすることが好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
（実施例）
カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９）をＹＮＢ培地（キシロース２質量％、および麦芽糖１質量％またはショ糖１質量％、酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１％酵母エキス）に添加し、４８時間、温度３０℃で前培養を行った。この前培養液を、発酵用液（グルコース８質量％、キシロース４質量％、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０））に１重量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加し、温度３０℃、酸素供給量は１Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量で、発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、エタノール生産を行い、発酵液中のエタノール濃度とキシロース濃度の経時変化を測定した。
なお、セルロース系バイオマス（バガス、コーンストーバー、広葉樹）の場合、グルコースとキシロースの質量比が７：３〜５：５の範囲であるため、本実施例で用いた発酵用液はセルロース系バイオマス糖化液を模擬したものといえる。
【００３０】
（比較例）
比較のために、前培養のＹＮＢ培地中の糖類として、キシロースとショ糖又は麦芽糖とを併用せず、キシロース、ショ糖またはグルコースのいずれかを３質量％含有した培地を用いる以外は、上記と同条件としてエタノール生産を行い、発酵液中のエタノール濃度とキシロース濃度の経時変化を測定した。
【００３１】
上記の実施例と比較例において測定した発酵液中のエタノール濃度の経時変化を図１に、キシロース濃度の経時変化を図２にそれぞれまとめた。
また、発酵開始から４８時間後のエタノール収率を下記式（１）で、キシロース消費率を下記式（２）で求め、図３にまとめた。
【００３２】
（数１）
エタノール収率：
（発酵開始４８時間後のエタノール濃度（質量％））÷（（８＋４）×０．５１（質量％））×１００（％）・・・式（１）
※分母の「（８＋４）×０．５１（質量％）」は発酵用液中のグルコース８質量％とキシロース４質量％が全てエタノールに変換されたと仮定した場合のエタノール濃度。
キシロース消費率：
（４（質量％）−４８時間後のキシロース濃度（質量％））÷４（質量％）×１００（％）・・・式（２）
【００３３】
図１からは、キシロース２質量％と、麦芽糖１質量％またはショ糖１質量％とを含有する培地で前培養した場合、全糖類を１２質量％含有する発酵用液を用いてエタノール生産を行ったものは、グルコースおよびキシロースが消費され、エタノールの生産をし続け、高濃度のエタノールを生産できることがわかる。一方、キシロースのみを３質量％含有する培地やショ糖のみを含有する培地やグルコースのみを３質量％含有する培地で前培養した場合には、糖の含有量は同量であっても、前記のキシロースに加え麦芽糖またはショ糖を添加した培地で前培養した場合よりもエタノールの生産濃度が低いことがわかる。
【００３４】
また、図２からは、前培養で糖類としてキシロースと共にショ糖または麦芽糖を含有する培地で培養した酵母をエタノール生産に供した場合には、エタノール生産時にキシロースを効率良く消費していることが分かる。一方、前培養で糖類としてキシロースまたはショ糖またはグルコースのみを含有する培地で培養した酵母をエタノール生産に供した場合には、エタノール生産時にキシロースを十分に消費できないていないことがわかる。
【００３５】
さらに、図３からは、本発明のエタノール生産方法は高いエタノール収率とキシロース消費率を有することがわかる。
したがって、本発明はセルロース系バイオマス糖化液からの効率的なエタノール生産方法として極めて有用であることがわかる。
【図１】
2015080416.tif 000002
【図２】
2015080416.tif 000003
【図３】
2015080416.tif 000004