(57)【要約】【課題】生活習慣病を予防、治療または改善するための組成物を提供することを課題とする。【解決手段】前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制する作用、脂肪細胞における脂肪蓄積量を減少させる作用および／または脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌を促進させる作用を有する、セサミノールを含有する組成物により、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セサミノールを有効成分として含む、脂肪細胞分化の抑制用、脂肪細胞の脂肪蓄積量低減用および／または脂肪細胞のアディポネクチン分泌促進用組成物。
【請求項２】
生活習慣病を予防、治療または改善するための組成物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
生活習慣病が、食習慣および／または運動習慣を原因として発症および進行する疾患もしくは症状である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
生活習慣病が、肥満、脂質異常症、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症またはメタボリック症候群である請求項２または３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セサミノールを有効成分として含む、脂肪細胞分化の抑制用、脂肪細胞の脂肪蓄積量低減用および／または脂肪細胞のアディポネクチン分泌促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化や運動不足など、人々のライフスタイルの変化に伴い、脂質異常症、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、メタボリック症候群などの患者が急増している。これらの疾患は、食習慣や運動習慣などの生活習慣がその発症および進行に関与することから、生活習慣病とも呼ばれている。生活習慣病は、日本人の主要な死因である心疾患や脳血管疾患に関与する重大な疾患である。
【０００３】
生活習慣病のうち、糖尿病、高血圧症、脂質異常症、動脈硬化症などは、肥満が危険因子として挙げられていることから、肥満も生活習慣病の一種に含まれる。また、肥満の予防、治療および改善が、生活習慣病の予防、治療および改善のための重要な対策の一つとして挙げられている。
【０００４】
肥満とは、体脂肪が正常以上に増加した状態を指すが、体内において脂肪は、脂肪組織に存在する脂肪細胞に蓄積されている。標準体重の成人では、脂肪細胞の直径は約70〜90μmであるが、肥満になると、脂肪細胞の直径は約130μmほどに肥大化する。すなわち、細胞レベルでは、肥満とは、脂肪の蓄積によって脂肪細胞が肥大化し、そのような脂肪細胞の数が増加した状態である。
【０００５】
脂肪細胞は、前駆脂肪細胞である線維芽細胞から分化するが、この前駆脂肪細胞は脂肪を蓄積することができないので、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することは、肥満の予防や改善に有効である。また、通常のサイズの脂肪細胞は、インスリン抵抗性を改善するアディポネクチンを分泌するが、肥大化した脂肪細胞では、アディポネクチンの分泌量が減少するだけでなく、インスリン抵抗性を惹起するTNFα、レジスチンおよび脂肪酸が過剰に分泌される。よって、脂肪細胞に蓄積された脂肪を低減させて、脂肪細胞を小型化させることも肥満の予防や改善に有効である。
【０００６】
さらに、上述のように、脂肪細胞から分泌されるアディポネクチンは、骨格筋および肝臓のAMPK（AMP-activated protein kinase）を活性化することにより、糖の取り込みを促進してインスリン抵抗性を改善する作用を有するので、アディポネクチンは糖尿病の予防や改善に有効であると考えられている。さらに、アディポネクチンには、マクロファージによる酸化LDLの取り込みを抑制する作用があるので、アディポネクチンは動脈硬化の予防や改善にも有効であると考えられている。よって、脂肪細胞のアディポネクチン分泌を促進させることは、肥満のみならず、糖尿病および動脈硬化症の予防や改善にも有効である。
【０００７】
生活習慣病の予防や治療には、食習慣や運動習慣の改善など様々なアプローチがあるが、近年では、種々の疾患の危険因子である肥満の予防や改善を目的として、脂肪の低減や脂肪細胞分化の抑制に有用な成分を配合した組成物などがこれまでに開発されている。例えば、特許文献１には、ゴマのリグナン類の一種であるセサミンを含む体脂肪低減剤が開示されており、セサミンを投与したラットにおいて、腎周辺脂肪組織が減少し、肝臓からのトリグリセリド分泌が減少したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−３０９５３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでに、生活習慣病の予防や改善のために有用な成分がいくつも見出されているが、より優れた効果を有するものがさらに求められている。このような事情に鑑みて、本発明は、生活習慣病の予防、治療または改善にとって、より効果的な有効成分を含む組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ゴマのリグナン類の一種であるセサミノールが、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制する作用、脂肪細胞の脂肪蓄積量を減少させる作用、および脂肪細胞のアディポネクチン分泌を促進させる作用を有することを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、セサミノールを有効成分として含む、脂肪細胞分化の抑制用、脂肪細胞の脂肪蓄積量低減用および／または脂肪細胞のアディポネクチン分泌促進用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化が抑制され、脂肪細胞における脂肪蓄積量が低減され、脂肪細胞におけるアディポネクチンの分泌が促進される。これらの作用により、生活習慣病を予防、治療および／または改善する効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウス由来前駆脂肪細胞株3T3-L1の分化誘導の過程においてセサミノールを添加して得た細胞をOil red O染色液で染色した写真である。
【図２】3T3-L1細胞の分化誘導の過程においてセサミノールを添加して得た細胞におけるグリセロール-３-リン酸脱水素酵素（GPDH）の活性に対するセサミノールの効果を示したグラフである。
【図３】3T3-L1細胞の分化誘導の完了後にセサミノールを添加して得た脂肪細胞をOil red O染色液で染色した写真である。
【図４】3T3-L1細胞から分化した脂肪細胞の脂肪蓄積量に対するセサミノールの効果を示したグラフである。
【図５】3T3-L1細胞から分化した脂肪細胞のアディポネクチン分泌に対するセサミノールの効果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の脂肪細胞分化の抑制用、脂肪細胞の脂肪蓄積量低減用および／または脂肪細胞のアディポネクチン分泌促進用組成物（以下、単に「組成物」ともいう）は、有効成分としてセサミノールを含む。セサミノールは、ゴマ種子中に含まれるリグナン類として知られており、以下の構造式で表される化合物である。
【００１５】
【化１】
2015013835.tif 000002
【００１６】
本発明に用いられるセサミノールの由来は特に限定されず、ゴマ種子などの植物由来のセサミノールであってもよいし、合成または半合成によって得られたセサミノールであってもよい。なお、ゴマ種子などからセサミノールを得る方法自体は公知であり、例えば、ゴマ種子や該種子の脱脂粕を原料として、所定の微生物が有する酵素の作用によってセサミノールを製造する方法が挙げられる（特開２００６−６１１１５号公報および特開２００８−１６７７１２号公報参照）。
【００１７】
本発明の実施形態においては、特開２００８−１６７７１２号公報に記載の方法に準じて、ゴマ種子の脱脂粕に含まれるセサミノール配糖体から得られたセサミノールを用いることが好ましい。なお、得られたセサミノールはそのままでも本発明の組成物に用いることができるが、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、脱臭、脱色、乾固などの処理に付してもよい。
【００１８】
本発明の実施形態において、組成物は、セサミノールのみからなるものであってもよいが、セサミノールが有する作用を損なわない範囲で、医薬部外品、医薬品、食品などの技術分野において通常用いられる他の成分を適宜配合してもよい。
【００１９】
そのような成分としては、例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドンなど）、充填剤（乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシンなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、崩壊剤（デンプン類、結晶セルロースなど）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂など）、乳化剤（レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴムなど）、非水性賦形剤（アーモンド油、分画ココヤシ油またはグリセリン、プロピレングリコール、エチルアルコールのような油性エステルなど）、保存剤（ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸など）、香料（合成香料、天然香料など）、甘味料（ショ糖、ステビアなど）、ｐＨ調整剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなど）、粉体（顔料、色素、樹脂など）、増粘剤（アラビアゴム、メチルセルロースなど）、酸化防止剤（ビタミンＣ、ビタミンＥなど）などが挙げられる。
【００２０】
本発明の組成物の投与形態は、特に限定されず、経口投与、注射投与（皮下、皮内、筋肉内、経静脈、経動脈）、皮膚上への投与または経皮投与などから適宜選択できるが、好ましくは、経口投与または注射投与である。
【００２１】
本発明の組成物の投与量は、特に限定されず、投与対象の体重や健康状態などに応じて適宜決定できる。一例を挙げれば、経口投与の場合、組成物の投与量は、成人１日あたりのセサミノール量として１〜100 mg、好ましくは２〜10 mgの範囲内である。また、注射投与の場合は、成人１日あたりのセサミノール量として１〜100 mg、好ましくは２〜10 mgの範囲内である。なお、本発明の組成物の投与回数も特に限定されず、１日に１回または複数回投与することができる。
【００２２】
本発明の組成物は、生活習慣病を予防、治療または改善するための組成物として提供することができる。ここで、生活習慣病とは、当該技術分野において、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒などの生活習慣が、その発症・進行に関与する疾患群として定義されている。本発明の組成物は、特に、食習慣および／または運動習慣を原因として発症および進行する疾患もしくは症状に好適である。そのような疾患および症状としては、例えば、肥満、脂質異常症（特に高トリグリセリド血症）、糖尿病（特にII型糖尿病）、高血圧症、動脈硬化症（特にアテローム性動脈硬化症）、メタボリック症候群などが挙げられる。なお、メタボリック症候群とは、内臓脂肪型肥満に加えて、高血糖、高血圧および脂質異常症のうち２つ以上を合併した状態を意味する。
【００２３】
本発明の組成物は、ヒトを含む哺乳動物を投与対象とすることができるが、特に、健常人および生活習慣病の患者が好適である。本発明の組成物は、健常人には生活習慣病の予防のために、生活習慣病の患者には該疾患の治療又は改善のために投与することができる。
【００２４】
本発明の組成物は、セサミノールの投与が可能であれば、医薬部外品、医薬品、食品、研究用試薬などのいずれの形態にあってもよいが、好ましくは、医薬部外品、医薬品または食品の形態である。
【００２５】
より具体的には、医薬部外品または医薬品の形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤、点滴などが挙げられる。また、食品の形態としては、例えば、飲料（ドリンク剤など）、食品（栄養機能食品、特定保健用食品を含む）、サプリメント（錠剤、カプセル剤、顆粒など）、病者用食品（病院食、介護食など）などが挙げられる。あるいは、本発明の組成物を、食品添加剤（液状、粉末状、ペースト状など）の形態にしてもよいし、食品添加物として、既存の調味料などに添加してもよい。なお、これらの形態の組成物の製造自体は、当該技術において公知の方法により行うことができる。
【００２６】
本発明の組成物におけるセサミノール含有量は、特に制限されず、組成物の形態に応じて適宜設定することができる。一例を挙げれば、セサミノール含有量は、組成物の全重量に対して0.0001〜50重量％、好ましくは0.0005〜40重量％、より好ましくは0.001〜35重量％である。
【００２７】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
調製例：  セサミノールの調製
本実施例では、特開２００８−１６７７１２号公報に記載の方法に準じて、Paenibacillus sp. KB0549株（寄託番号：FERM P-21057）を、ゴマ脱脂粕を含む培地中で培養することにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体から得られたセサミノールを用いた。具体的には、以下のようにして、セサミノールを調製した。
【００２９】
ゴマ脱脂粕（竹本油脂株式会社製）の温水抽出液に、1.0％トリプトン、0.5%酵母エキスおよび0.89％NaClを加えて得た培地にてKB0549を増殖させ、KB0549培養液を得た。得られた培養液を、ゴマ脱脂粕（10.0 kg；加熱殺菌し水分70%、pH6.0に調整済み）に加え、固体発酵機を用いて、37℃にて間歇撹拌とエアレーションを６日間継続して発酵処理を行った。
【００３０】
発酵させたゴマ脱脂粕を水分8.5％となるまで乾燥させた。得られた乾燥物に、該乾燥物重10.0 kgに対して100 Lの95%エタノールを加えて、50℃に加熱しながら撹拌して、セサミノールの抽出を行った。得られた抽出液をフィルタープレスにより珪藻土ろ過を行い、固形分を除去して濾液（82 L）を得た。得られた濾液を真空濃縮機で4.1 Lとなるまで濃縮した。得られた濃縮液に99.5％エタノールを４倍量以上加えて、濾紙濾過で不溶物を除去した。そして、得られた液をエバポレーターで濃縮して、セサミノールの高濃縮液（4.05 L）を得た。
【００３１】
得られた高濃縮液中のセサミノールおよびセサミノール関連化合物は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供して同定した結果、濃縮液（4.05 L）中にセサミノールが18.4 g含まれていた。なお、HPLC分析条件は次のとおりである：
HPLC：HITACHI LaChrom
カラム：Wakosil-II 5C18HG（φ4.6＊250 mm、和光純薬工業株式会社）
展開溶媒：A；10％アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、B；80％アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、Bを10%〜100％の直線勾配（40分間）で展開。
流速：0.8 ml／min
分析波長：280 nm
【００３２】
上記のセサミノールの高濃縮液をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して、本実施例で用いられるセサミノール溶液（3.0 mg/ml）を調製した。なお、得られたセサミノール溶液は、本実施例で用いられる各種の細胞株に対して毒性がなく、生存に影響を及ぼさないことが本発明者らにより確認されている。
【００３３】
実施例１：  セサミノールによる脂肪細胞分化への影響
（１）トリアシルグリセロール（TG）蓄積量の検討
前駆脂肪細胞は、脂肪細胞に分化すると、TGなどを含む脂肪滴を細胞内に蓄積するようになる。本実施例では、分化誘導の過程でセサミノールを前駆脂肪細胞に添加し、誘導完了後の細胞内のTGを、アゾ色素の１種であるOil red Oで染色することにより、セサミノールによる脂肪細胞分化への影響を評価した。
【００３４】
（1-1）細胞培養
マウス由来線維芽細胞株3T3-L1（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）を前駆脂肪細胞として用いた。3T3-L1細胞を1.0×105〜1.0×106 cells/mlの濃度で播種し、80〜90％コンフルエントになるまで37℃、５％CO2インキュベーター内で培養した。なお、培養培地として、10%牛胎児血清（FBS：株式会社ニチレイバイオサイエンス）、ペニシリン（50 units/ml、明治製菓株式会社）およびストレプトマイシン（50 mg/ml、明治製菓株式会社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM：日水製薬株式会社）を用いた。
【００３５】
（1-2）前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導
細胞を80〜90％コンフルエントになるまで培養した後、培地を、分化誘導剤としてウシ由来インスリン（0.2μM、和光純薬工業株式会社）、デキサメタゾン（0.25μM、和光純薬工業株式会社）および3-イソブチル-1-メチルキサンチン（0.5 mM、和光純薬工業株式会社）を添加したDMEMに交換した（この日を「誘導開始０日目」とする）。その２日後に、培地を、インスリン（0.2μM）のみを添加したDMEMに交換した。以後、２日ごとに培地を新しいDMEM培地に交換して、誘導開始８日目に分化誘導を完了した。なお、セサミノール溶液の添加（セサミノールの終濃度0.5または1.0μg/ml）は、誘導開始０、２、４および６日目の培地交換の際に行った。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで分化させた細胞を用いた。
【００３６】
（1-3）TG蓄積量に基づく脂肪細胞分化の評価
本実施例に用いたOil red O染色液は、Oil red O（和光純薬工業株式会社）をイソプロパノール（和光純薬工業株式会社）に溶解させて得た、Oil red O／イソプロパノール飽和溶液である。Oil red O染色液と超純水とを、体積比で６：４の割合で混合し、10分後、得られた混合液を0.45μmフィルターで濾過することによって得た。分化誘導させた細胞から培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２回洗浄した。細胞を70％エタノールにより30秒間固定した後、Oil red O染色液（２ml）を添加し、室温で２時間放置して染色した。そして、染色した細胞を50％エタノールで10秒間洗浄し、さらに、脱イオン水を用いて、水の赤みが消えるまで洗浄した。洗浄後、細胞を顕微鏡（OLYMPUS IX-70：オリンパス株式会社）で観察し、写真を撮影した。なお、各検体の写真を図１に示す。
【００３７】
図１より、対照では、ほぼ全ての細胞において脂肪滴の染色が認められた。これにより、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導が適切に行われたことが示された。他方、分化誘導の過程でセサミノールを終濃度0.5μg/mlで添加した検体では、染色された脂肪滴を有していない細胞が多数認められた。また、セサミノールを終濃度1.0μg/mlで添加した検体では、ほぼ全ての細胞において、染色された脂肪滴が認められなかった。これらの結果は、分化誘導の過程でセサミノールを添加された前駆脂肪細胞では、脂肪細胞への分化が抑制されたことを示唆する。したがって、セサミノールは、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制する作用を有することが示された。
【００３８】
（２）グリセロール-３-リン酸脱水素酵素（GPDH）の活性の検討
GPDHは、脂肪細胞におけるトリアシルグリセロール（TG；トリグリセリドとも呼ばれる）の合成の律速酵素である。また、GPDHの活性は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化するときに急激に増強することから、GPDHは脂肪細胞分化のマーカーとしても知られている。そこで、分化誘導によって得た細胞のGPDH活性を、WiseおよびGreenの方法（Wise, L.S. and Green, H., (1979) Participation of one isozyme of cytosolic glycerophosphate dehydrogenase in the adipose conversion of 3T3 cells. The Journal of Biological Chemistry, 254, 273-275.）により測定した。なお、用いた細胞は、上記（1-1）および（1-2）と同様にして得た。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで分化させた細胞を用いた。
【００３９】
（2-1）測定用試料の調製および活性測定
誘導開始８日目以降の3T3-L1由来の脂肪細胞をPBSで２回洗浄した。酵素抽出用バッファー(100 mM トリエタノールアミン、2.5 mM EDTA)（300μl）を細胞に添加し、セルスクレイパーで細胞を回収した。回収した細胞を超音波破砕（middle、２分30秒間、10秒間／20秒間）し、すみやかに遠心分離（13,000 rpm、５分、４℃)して上清を得た。得られた上清を測定用試料として用いた。
【００４０】
（2-2）GPDH活性の測定
ウォーターバスにて予め28℃に保温しておいた、酵素抽出バッファー（2800μl）の入った試験管内に、６mM 2-メルカプトエタノール（終濃度0.1 mM）、7.2 mM NADH（終濃度0.12 mM）、12 mM ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP：SIGMA社)（終濃度0.2 mM）および測定用試料（50μl）を添加して、340 nmでの吸光度を３分間測定した。GPDHの活性を、NADHの吸光係数（6.22 mＭ-1cm-1）を用いて、１分間当たりの吸光度の変化（NADHの変化量）に基づいて算出した。結果を図２に示す。なお、図２では、各測定用試料の酵素活性は、対照の酵素活性を100%として、これに対する比率として示されている。また、図中の「＊＊」は、対照に対してp値が0.01未満であることを示す。
【００４１】
図２より、セサミノールの添加量に依存して、分化誘導後の細胞のGPDH活性が低いことがわかった。この結果は、分化誘導の過程でセサミノールを添加された前駆脂肪細胞では、脂肪細胞への分化が抑制されたことを示唆する。よって、セサミノールは、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制する作用を有することが示された。
【００４２】
実施例２：  セサミノールによる脂肪細胞の脂肪蓄積量への影響
（1）分化誘導による脂肪細胞の調製
実施例１の（1-1）と同様にして、前駆脂肪細胞の3T3-L1細胞を80〜90％コンフルエントになるまで培養した。そして、培地を、分化誘導剤としてウシ由来インスリン（0.2μM、和光純薬工業株式会社）、デキサメタゾン（0.25μM、和光純薬工業株式会社）および3-イソブチル-1-メチルキサンチン（0.5 mM、和光純薬工業株式会社）を添加したDMEMに交換した（この日を「誘導開始０日目」とする）。その２日後に、培地を、インスリン（0.2μM）のみを添加したDMEMに交換した。以後、２日ごとに培地を新しいDMEM培地に交換して、誘導開始８日目に分化誘導を完了して、脂肪細胞を得た。
【００４３】
（2）TG蓄積量の検討
得られた脂肪細胞に、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が0.5または1.0μg/mlとなるように添加した。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで培養した細胞を用いた。３日後、実施例１の（1-3）と同様にして、細胞をOil red O染色液で染色し、洗浄した。細胞を顕微鏡（OLYMPUS IX-70：オリンパス株式会社）で観察し、写真を撮影した。なお、各検体の写真を図３に示す。観察後、細胞にイソプロパノール（３ml）を添加して、Oil red O染色液を抽出し、得られた抽出液の520 nmでの吸光度を測定した。そして、測定値に基づいて、各細胞のTG蓄積量を比較した。結果を図４に示す。なお、図４では、各検体のTG蓄積量は、対照の蓄積量を100%として、これに対する比率として示されている。また、図４中の「＊」は、対照に対するp値が0.05未満であることを示す。
【００４４】
図３より、セサミノールを添加した検体では、脂肪細胞の脂肪滴のサイズが、対照に比べて小さくなっている傾向にあることがわかった。また、図４より、セサミノールの添加によって、脂肪細胞のTG蓄積量が低減することがわかった。これらの結果より、セサミノールは、脂肪細胞の脂肪蓄積量を低減する作用を有することが示された。
【００４５】
実施例３：  セサミノールによる脂肪細胞のアディポネクチン分泌への影響
脂肪細胞からは種々の生理活性物質が分泌されるが、それらのうち、アディポネクチンはインスリン抵抗性の改善や動脈硬化を予防する作用を有することが知られている。本実施例では、脂肪細胞へのセサミノールの添加によるアディポネクチン分泌量の変化をSDS-PAGE法およびウェスタンブロット法により解析した。
【００４６】
（1）分化誘導による脂肪細胞の調製
実施例１の（1-1）と同様にして、前駆脂肪細胞の3T3-L1細胞を80〜90％コンフルエントになるまで培養した。そして、培地を、分化誘導剤としてウシ由来インスリン（0.2μM、和光純薬工業株式会社）、デキサメタゾン（0.25μM、和光純薬工業株式会社）および3-イソブチル-1-メチルキサンチン（0.5 mM、和光純薬工業株式会社）を添加したDMEMに交換した（この日を「誘導開始０日目」とする）。その２日後に、培地を、インスリン（0.2μM）のみを添加したDMEMに交換した。以後、２日ごとに培地を新しいDMEM培地に交換して、誘導開始８日目に分化誘導を完了して、脂肪細胞を得た。
【００４７】
（2）アディポネクチン発現量の検討
得られた脂肪細胞に、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が0.5または1.0μg/mlとなるように添加した。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで培養した細胞を用いた。３日後、細胞をPBSで1回洗浄した後、セルスクレイパーを用いてHEPESバッファーで1.5 mlチューブ中に回収した。そして、該チューブを遠心分離（10000 rpm、10秒間、４℃）に付して、上清を除き、沈殿（細胞）を回収した。回収した細胞に、可溶化バッファー（１％NP-40および１％Triton(登録商標)-X100、１mM PMSF、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlアプロチニン）を適量添加して、ボルテックスミキサーにより混合した。そして、チューブを30分間氷冷した後、超音波処理（5分間の処理および30秒間のインターバルを2回繰り返す）で細胞を破砕した。チューブを遠心分離（15000 rpm、４℃、10分間）に付して、可溶性の細胞溶解物を含む上清を回収した。回収した上清の一部について、Serva Blue G（Serva Electrophoresis GmbH社）を用いて595 nmの吸収に基づいてタンパク質の定量を行い、電気泳動に付すサンプル量を算出した。
【００４８】
細胞溶解物を含む上清と、サンプルバッファーとを等量ずつ混合し、電気泳動用サンプルを得た。得られたサンプルについて、常法に従って、SDS-PAGE法による電気泳動およびPVDF膜への転写を行った。転写後の膜を５％スキムミルクでブロッキングした後、後述の１次抗体と反応させ、PBSで５分間洗浄した。次いで、１次抗体と反応させた膜を、後述の２次抗体と反応させ、PBSで５分間洗浄した。そして、膜とDAB溶液（3,3'-ジアミノベンジジンテトラハイドロクロリド（10 mg）、蒸留水（１ ml）、0.2 M PBS（50 ml）および30% H2O2（100μl））とを反応させた後、膜を乾燥させ、Scion Image（フリーソフト：Scion社）を用いて、検出されたバンドの強度を定量した。そして、各検体における、β‐アクチンのバンド強度に対するアディポネクチンのバンド強度の比を算出した。
【００４９】
なお、本実施例に用いた１次抗体および２次抗体は次のとおりである。
（１次抗体）
・ラビット抗アディポネクチン抗体（Theromo SCIENTIFIC社）
・マウス抗アクチン抗体（ACTN05(c4)）（abcam社）
（２次抗体）
・ビオチンコンジュゲート抗ラビットIgG抗体（Dako A/S社）
・ビオチンコンジュゲート抗マウスIgG抗体（Dako A/S社）
【００５０】
結果を図５に示す。図５は、対照細胞における比を１として、セサミノールを添加した細胞における比を表す。この図より、セサミノールの添加量に依存して、アディポネクチンの発現量が顕著に増加していることが示された。したがって、セサミノールは、脂肪細胞のアディポネクチン分泌を促進する作用を示すことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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