(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＳＰ９０（熱ショック蛋白質９０）阻害剤の薬効の向上及び正常細胞に対する毒性の低減させるＨＳＰ阻害剤が結合したポリマーとＨＳＰ９０のクライアント蛋白質であるＨＥＲ２と特異的に結合する抗体又は抗体断片とを結合させる医薬組成物の提供。【解決手段】式（１）で表される高分子化合物又はその塩、及びそれを含む医薬組成物。2015124162.tif 000031前記ＨＳＰ９０阻害剤は、レゾルシノール誘導体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2015124162.tif 000019
［式中、Ｒ１はＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片を示し、Ｌは結合部位を示し、Ａ１及びＡ２は同一でも異なっていてもよく（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ２は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ３はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤残基を示し、Ｒ４はＮ（Ｒ５）ＣＯＮＨ（Ｒ６）を示し、Ｒ５、Ｒ６は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖若しくは直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔは１０〜４５０の整数を示し、ｎは１〜８の整数を示し、ｄ＋ｅ＋ｆは２〜５０の整数を示し、ｄ及びｅは１以上であり、ｄ＋ｅ＋ｆに対するｄの割合が２〜９８％、ｅの割合が２〜９８％、ｆの割合が０〜９６％］
で表される高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項２】
ＥＧＦＲファミリータンパク質がＨＥＲ２である請求項１に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項３】
抗体がトラスツズマブ若しくはペルツズマブ、抗体断片が該抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ若しくはＤｉａｂｏｄｙである請求項１または２に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項４】
抗体がトラスツズマブである請求項１〜３のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項５】
Ｌが下記式（２）
【化２】
2015124162.tif 000020
［式中、Ｘはフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基を示し、Ｙ１、Ｙ２はそれぞれ独立にフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｍは０〜３の整数を示し、ＺはＯまたはＮＨを示す］
である請求項１〜４のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項６】
Ａ１及びＡ２が共にエチレン基またはプロピレン基であり、Ｒ２がアセチル基またはプロピオニル基であり、Ｒ５、Ｒ６が共にシクロヘキシル基またはイソプロピル基である請求項１〜５のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項７】
フェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤がレゾルシノール誘導体である請求項１〜６のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【請求項８】
レゾルシノール誘導体が下記式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物である請求項７に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【化３】
2015124162.tif 000021
【化４】
2015124162.tif 000022
【化５】
2015124162.tif 000023
【化６】
2015124162.tif 000024
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩と、下記式（７）
【化７】
2015124162.tif 000025
［式中、Ｒ１’は抗体または抗体断片以外の低分子置換基を示し、Ｌ’は結合部位を示し、Ａ１’及びＡ２’は同一でも異なっていてもよく（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ２’は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ３’はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤残基を示し、Ｒ４’はＮ（Ｒ５’）ＣＯＮＨ（Ｒ６’）を示し、Ｒ５’、Ｒ６’は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖または直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔ’は１０〜４５０の整数を示し、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’は２〜６０の整数を示し、ｄ’及びｅ’は１以上であり、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’に対するｄ’の割合が２〜９８％、ｅ’の割合が２〜９８％、ｆ’の割合が０〜９６％］
で表される高分子化合物（Ｂ）あるいはその塩を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
式（７）の低分子置換基が、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、直鎖若しくは環状（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基で置換されていてもよいコハク酸イミド、または、システイン残基である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
式（７）のＬ’が下記式（８）
【化８】
2015124162.tif 000026
［式中、Ｙ１’、Ｙ２’はそれぞれ独立にフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｍ’は０〜３の整数を示し、Ｚ’はＯまたはＮＨを示す］
である請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
式（７）のＡ１’及びＡ２’が共にエチレン基またはプロピレン基であり、Ｒ２’がアセチル基またはプロピオニル基であり、Ｒ５’、Ｒ６’が共にシクロヘキシル基またはイソプロピル基である請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
式（７）のフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤がレゾルシノール誘導体である請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
レゾルシノール誘導体が下記式（９）、式（１０）、式（１１）または式（１２）で表される化合物である請求項１３に記載の医薬組成物。
【化９】
2015124162.tif 000027
【化１０】
2015124162.tif 000028
【化１１】
2015124162.tif 000029
【化１２】
2015124162.tif 000030
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩または請求項９〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を薬効成分とするＨＳＰ９０阻害剤。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩または請求項９〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を薬効成分とする抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤の高分子誘導体であって、ＨＳＰ９０のクライアントタンパク質に指向性を有するアクティブターゲティング型高分子化合物、該高分子化合物を含む医薬組成物、それらを用いたＨＳＰ９０阻害剤及び抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒートショックプロテイン９０（ＨＳＰ９０：熱ショックタンパク質９０）は分子シャペロン機能をもち、細胞内タンパク質の正確なフォールディングの維持と、その機能を保証する役割を持つ。そのクライアントタンパク質の中には、細胞周期・細胞死や細胞の生存・癌化に関わる機能タンパク質が多く含まれる（非特許文献１）。ＨＳＰ９０阻害剤はＨＳＰ９０に結合し、その機能を阻害することによってＨＳＰ９０クライアントタンパク質の不安定化・不活性化と分解を引き起こし、腫瘍細胞に対しては抗腫瘍活性を示す。
【０００３】
ＨＳＰ９０のクライアントタンパク質のひとつであるＨＥＲ２は、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；上皮成長因子受容体）ファミリータンパク質に属する細胞膜受容型チロシンキナーゼで、その発現の亢進が癌の進行と密接に関連があることが知られている（非特許文献２）。ＨＥＲ２にとって、ＨＳＰ９０と結合することが安定に存在し機能を維持するために必須である。
【０００４】
ＨＥＲ２をターゲットとする抗体−薬物複合体として、抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブとチューブリン重合阻害剤であるメイタンシン誘導体を結合させた化合物が知られている（特許文献１、非特許文献３）。該抗体−薬物複合体は抗体１分子あたりの薬物搭載数が約４分子である。同様に、トラスツズマブと抗癌剤であるタキソールやアドリアマイシンを結合させた抗体−薬物複合体が知られている（特許文献２）。また、ＨＳＰ９０阻害剤の高分子結合体が知られている（特許文献３）。
しかしながら、ＨＥＲ２に対して抑制効果を有するフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤を抗体に搭載させた抗体−薬物複合体は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５０１０２９号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／０８７４９７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００８／０４１６１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｅｃｋｅｒｓ  Ｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４（Ｓｕｐｐｌ．），Ｓ５５−６１（２００２）
【非特許文献２】Ｘｕ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．５，３７０２−３７０８（２００１）
【非特許文献３】Ｖｅｒｍａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３６７，１７８３−１７９１（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＨＳＰ９０阻害剤が結合したポリマーと、ＨＳＰ９０のクライアントタンパク質であるＨＥＲ２と特異的に結合する抗体または抗体断片とを結合させて、ＨＳＰ９０阻害剤をＨＥＲ２高発現の細胞に選択的に送達することにより、ＨＳＰ９０阻害剤の薬効の向上及び正常細胞に対する毒性の低減をもたらすことにある。また、該抗体−薬物複合体からほぼ中性で非酵素条件下においても薬物を放出することができるものであることも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決するためにフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤をポリエチレングリコール部分とポリグルタミン酸部分を有するブロック共重合体の側鎖カルボキシ基とエステル結合させ、該ポリマーとＨＳＰ９０のクライアントタンパク質であるＥＧＦＲファミリータンパク質、特にＨＥＲ２と特異的に結合する抗体または抗体断片等とを結合させた高分子化合物を創出し、該高分子化合物を用いて細胞増殖抑制試験を行った結果、化学療法剤として満足できる効果を見出し、本発明に至った。
即ち本発明は、以下の１）〜１６）を要旨とする。
【０００９】
１）下記式（１）
【化１】
2015124162.tif 000002
［式中、Ｒ１はＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片を示し、Ｌは結合部位を示し、Ａ１及びＡ２は同一でも異なっていてもよく（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ２は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ３はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤残基を示し、Ｒ４はＮ（Ｒ５）ＣＯＮＨ（Ｒ６）を示し、Ｒ５、Ｒ６は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖若しくは直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔは１０〜４５０の整数を示し、ｎは１〜８の整数を示し、ｄ＋ｅ＋ｆは２〜５０の整数を示し、ｄ及びｅは１以上であり、ｄ＋ｅ＋ｆに対するｄの割合が２〜９８％、ｅの割合が２〜９８％、ｆの割合が０〜９６％］
で表される高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【００１０】
２）ＥＧＦＲファミリータンパク質がＨＥＲ２である前記１）に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
３）抗体がトラスツズマブ若しくはペルツズマブ、抗体断片が該抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ若しくはＤｉａｂｏｄｙである前記１）または２）に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
４）抗体がトラスツズマブである前記１）〜３）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【００１１】
５）Ｌが下記式（２）
【化２】
2015124162.tif 000003
［式中、Ｘはフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基を示し、Ｙ１、Ｙ２はそれぞれ独立にフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｍは０〜３の整数を示し、ＺはＯまたはＮＨを示す］
である前記１）〜４）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【００１２】
６）Ａ１及びＡ２が共にエチレン基またはプロピレン基であり、Ｒ２がアセチル基またはプロピオニル基であり、Ｒ５、Ｒ６が共にシクロヘキシル基またはイソプロピル基である前記１）〜５）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
７）フェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤がレゾルシノール誘導体である前記１）〜６）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【００１３】
８）レゾルシノール誘導体が下記式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物である前記７）に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩。
【化３】
2015124162.tif 000004
【化４】
2015124162.tif 000005
【化５】
2015124162.tif 000006
【化６】
2015124162.tif 000007
【００１４】
９）前記１）〜８）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩と、下記式（７）
【化７】
2015124162.tif 000008
［式中、Ｒ１’は抗体または抗体断片以外の低分子置換基を示し、Ｌ’は結合部位を示し、Ａ１’及びＡ２’は同一でも異なっていてもよく（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ２’は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ３’はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤残基を示し、Ｒ４’はＮ（Ｒ５’）ＣＯＮＨ（Ｒ６’）を示し、Ｒ５’、Ｒ６’は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖若しくは直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔ’は１０〜４５０の整数を示し、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’は２〜６０の整数を示し、ｄ’及びｅ’は１以上であり、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’に対するｄ’の割合が２〜９８％、ｅ’の割合が２〜９８％、ｆ’の割合が０〜９６％］
で表される高分子化合物（Ｂ）あるいはその塩を含有する医薬組成物。
【００１５】
１０）式（７）の低分子置換基が、水素原子、置換基を有していてもよいフェニル基、直鎖若しくは環状（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基で置換されていてもよいコハク酸イミド、または、システイン残基である前記９）に記載の医薬組成物。
１１）式（７）のＬ’が下記式（８）
【化８】
2015124162.tif 000009
［式中、Ｙ１’、Ｙ２’はそれぞれ独立にフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｍ’は０〜３の整数を示し、Ｚ’はＯまたはＮＨを示す］
である前記９）または１０）に記載の医薬組成物。
【００１６】
１２）式（７）のＡ１’及びＡ２’が共にエチレン基またはプロピレン基であり、Ｒ２’がアセチル基またはプロピオニル基であり、Ｒ５’、Ｒ６’が共にシクロヘキシル基またはイソプロピル基である前記７）〜９）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１３）式（７）のフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤がレゾルシノール誘導体である前記９）〜１２）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００１７】
１４）レゾルシノール誘導体が下記式（９）、式（１０）、式（１１）または式（１２）で表される化合物である前記１３）に記載の医薬組成物。
【化９】
2015124162.tif 000010
【化１０】
2015124162.tif 000011
【化１１】
2015124162.tif 000012
【化１２】
2015124162.tif 000013
【００１８】
１５）前記１）〜８）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩または前記９）〜１４）のいずれか一項に記載の医薬組成物を薬効成分とするＨＳＰ９０阻害剤。
１６）前記１）〜８）のいずれか一項に記載の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩または前記９）〜１４）のいずれか一項に記載の医薬組成物を薬効成分とする抗癌剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤を搭載したポリマーに、ＨＳＰ９０のクライアントタンパク質であるＥＧＦＲファミリータンパク質、特にＨＥＲ２と特異的に結合する抗体または抗体断片を結合させたＨＳＰ９０阻害剤のアクティブターゲティング型高分子誘導体を提供し、ＨＳＰ９０阻害剤をＨＥＲ２高発現の細胞に選択的に送達可能となし、ＨＳＰ９０阻害剤の薬効の発現特性を変えて、その効果の向上を図るものである。そして、正常細胞に対する毒性の低減を達成し、副作用発現特性を変えるものである。また、ポリマーの側鎖カルボキシ基とＨＳＰ９０阻害剤のフェノール性水酸基をエステル結合させることにより、ＨＳＰ９０阻害剤をほぼ中性で非酵素条件下でも放出可能となし、腫瘍細胞の不均一性や加水分解酵素の個体差の影響を受けずに、期待する効果を発揮させることができる。本発明はＨＳＰ９０阻害剤を用いる新しい治療方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１で得られた高分子化合物（化合物１）に結合したＨＳＰ９０阻害剤のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）非酵素存在下の放出性を示す。
【図２】実施例２で得られた高分子化合物（化合物２）に結合したＨＳＰ９０阻害剤のインビトロ非酵素存在下の放出性を示す。
【図３】実施例１及び実施例２で得られた高分子化合物のフローサイトメトリー分析によるＨＥＲ２に対する抗原認識能を示す。
【図４】実施例１で得られた高分子化合物（化合物１）のインビトロ細胞増殖抑制結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のＨＳＰ９０阻害剤のアクティブターゲティング型高分子誘導体は、前記式（１）［式中、Ｒ１はＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片を示し、Ｌは結合部位を示し、Ａ１及びＡ２は同一でも異なっていてもよく（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ２は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ３はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤残基を示し、Ｒ４はＮ（Ｒ５）ＣＯＮＨ（Ｒ６）を示し、Ｒ５、Ｒ６は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖若しくは直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔは１０〜４５０の整数を示し、ｎは１〜８の整数を示し、ｄ＋ｅ＋ｆは２〜５０の整数を示し、ｄ及びｅは１以上であり、ｄ＋ｅ＋ｆに対するｄの割合が２〜９８％、ｅの割合が２〜９８％、ｆの割合が０〜９６％］で表される高分子化合物（Ａ）あるいはその塩である。
【００２２】
ＥＧＦＲファミリータンパク質とは、細胞の増殖や成長を制御するＥＧＦ（上皮成長因子）を認識してシグナル伝達を行うチロシンキナーゼ型受容体であり、細胞膜上の該受容体にＥＧＦが結合すると、受容体は活性化され、細胞の分化・増殖をおこす。ＥＧＦＲファミリータンパク質にはＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２（＝ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３及びＥＧＦＲ４等がある。本発明のＨＳＰ９０阻害剤のアクティブターゲティング型高分子誘導体におけるターゲットとしてはＥＧＦＲファミリータンパク質、中でもＥＧＦＲ２（＝ＨＥＲ２）が特に好ましい。
【００２３】
式（１）におけるＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片としてはＥＧＦＲファミリータンパク質と結合すれば特に限定されない。抗体断片とは該抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ若しくはＤｉａｂｏｄｙである。本発明に使用される抗体または抗体断片としては、例えば、Ｅ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１１６，１２６−１４０（２００８）やＭ．Ｄ．Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ，２２，３４１（２０１３）等に記載のペプチドが挙げられ、抗体としては市販されているトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）やペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）が好ましく、抗体断片としてはそれらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ若しくはＤｉａｂｏｄｙが好ましい。中でも特にトラスツズマブが好ましい。
【００２４】
式（１）の結合部位Ｌとしては、抗体または抗体断片部位とＨＳＰ９０阻害剤の結合したポリマー部位とを結合するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体または抗体断片部位のアミノ基とポリマー部位のアミノ基を結合する前記式（２）［式中、Ｘはフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｙ１、Ｙ２はそれぞれ独立にフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基を示し、ｍは０〜３の整数を示し、ＺはＯまたはＮＨを示す］で表される結合部位が好ましい。なお、式（２）の両端のアミノ基はそれぞれ抗体または抗体断片部位のアミノ基とポリマー部位のアミノ基を示している。この結合部位は、それを形成する反応の反応条件が温和で官能基選択的な反応で高反応収率であり、タンパク質の修飾に有用であるため使用した。
【００２５】
本発明においてフェニレン基の結合位置は特に限定されず、結合可能であればオルト、メタ、パラのいづれでもよい。
【００２６】
式（１）における置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、直鎖、分岐鎖または環状（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎーブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
式（１）における置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基としては、直鎖、分岐鎖または環状（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎーブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基等が挙げられる。
【００２７】
好ましくは、Ｘがシクロヘキシルメチル基、Ｙ１、Ｙ２が共にメチル基、ｍが０、ＺがＯ（酸素原子）が挙げられる。
【００２８】
式（１）におけるｔは１０〜４５０程度、好ましくは１０〜３４０程度である。
【００２９】
式（１）におけるＡ１、Ａ２としては、それぞれ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基が挙げられ、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。中でも好ましくはＡ１、Ａ２共にエチレン基またはプロピレン基であり、共にエチレン基が特に好ましい。
【００３０】
式（１）で表される本発明の高分子化合物（Ａ）のポリグルタミン酸構造部分は、グルタミン酸がα−アミノ酸型で結合した構造であり、各グルタミン酸ユニットはＬ型でもＤ型でもよい。式（１）におけるグルタミン酸ユニット数ｄ＋ｅ＋ｆは２〜５０、好ましくは５〜３０、特に好ましくは８〜１５である。したがって、ポリグルタミン酸構造部分の平均分子量は２００〜５０００程度、好ましくは５００〜３０００程度、特に好ましくは８００〜１５００程度である。
【００３１】
式（１）における該ポリグルタミン酸構造部分には、側鎖カルボキシ基に後記Ｒ３が結合しているグルタミン酸ユニット（ユニット数はｄ）、側鎖カルボキシ基に後記Ｒ４が結合しているグルタミン酸ユニット（ユニット数はｅ）、側鎖カルボキシ基が遊離カルボキシ基であるグルタミン酸ユニット（ユニット数はｆ）があり、それぞれが独立してランダムな配置にて存在してよい。
式（１）のグルタミン酸ユニット数ｄ＋ｅ＋ｆにおいて、ｄ及びｅは１以上であり、ｄの割合は２〜９８％、好ましくは５〜８０％、ｅの割合は２〜９０％、好ましくは２〜８０％、ｆの割合は０〜９０％、好ましくは０〜８０％である。
【００３２】
式（１）におけるＲ２としては水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基が挙げられる。Ｒ２としては（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基が好ましく、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基等が挙げられ、中でもアセチル基、プロピオニル基が好ましく、アセチル基が特に好ましい。
【００３３】
式（１）におけるＲ３は、フェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤の残基であれば特に限定されないが、例えば、Ｇ．Ｊｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，３３２，２７５−２８５（２０１３），Ｙ．Ｌ．Ｊａｎｉｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．１５，３４２−３５３（２０１０）等に記載のＨＳＰ９０阻害作用を示す化合物の残基が挙げられる。中でも、ＨＳＰ９０阻害作用を示すレゾルシノール誘導体の残基が好ましく、特に以下の式（１３）〜式（１６）で示す化合物の残基、中でも前記式（３）〜式（６）で示す化合物の残基が好ましい。
ＨＳＰ９０阻害剤が複数のフェノール性水酸基を有する場合、ポリエチレングリコール構造部分とポリグルタミン酸構造部分を有するブロック共重合体との結合部位は結合可能であれば特に限定されない。
【００３４】
【化１３】
2015124162.tif 000014
［式中、Ｒ５は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基またはｔ−ブチル基を示し、Ｒ６は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基またはイソプロピル基を示し、Ｒ７はＯまたはＳを示す］
【化１４】
2015124162.tif 000015
［式中、Ｒ８は水素原子、臭素原子、エチル基またはイソプロピル基を示し、Ｒ９は４−（Ｎ−メチルピペラジノ）フェニル基、４−（Ｎ−メチルピペラジノメチル）フェニル基、４−モルホリノフェニル基、４−モルホリノメチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基または４−ブロモフェニル基を示し、Ｒ１０はＯまたはＳを示す］
【化１５】
2015124162.tif 000016
［式中、Ｒ１１はエチル基、イソプロピル基、塩素原子または臭素原子を示し、Ｒ１２はモルホリノ基、ピペリジノ基、ピペラジノ基、ピロリジノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、Ｎ−アセチルピペラジノ基、Ｎ−メチルピペラジノ基、メチルスルホニルアミノ基、チオモルホリノ基、４−ヒドロキシエチルピペリジノ基または４−ヒドロキシピペリジノ基を示し、ｐは０または１であり、Ｒ１３はエチル基またはイソプロピル基を示す］
【化１６】
2015124162.tif 000017
［式中、Ｒ１４はピペリジノ基またはモルホリノ基を示し、ｑは２または３を示す］
【００３５】
式（１３）で表される化合物は公知化合物であり、例えば、国際公開２００６／０５５７６０号パンフレットに記載の方法により調製可能である。
式（１４）で表される化合物は公知化合物であり、例えば、国際公開２００６／０９５７８３号パンフレットに記載の方法により調製可能である。
式（１５）で表される化合物は公知化合物であり、例えば、国際公開２００４／０７２０５１号パンフレットに記載の方法により調製可能である。
式（１６）で表される化合物は公知化合物であり、例えば、国際公開２００５／０００７７８号パンフレット、国際公開２００６／０８８１９３号パンフレット、特開２０１３−６８０４号公報に記載の方法により調製可能である。
【００３６】
式（１）におけるＲ４はＮ（Ｒ５）ＣＯＮＨ（Ｒ６）であり、Ｒ５、Ｒ６は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖若しくは直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基である。該環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基としては、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基等が挙げられる。該三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖または直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としては、例えば、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ジメチルアミノプロピル基等が挙げられる。より好ましくは両者共にイソプロピル基またはシクロへキシル基が挙げられる。
【００３７】
式（１）におけるポリグルタミン酸ユニットとしてグルタミン酸が存在していてもよく、式（１）では遊離酸型として記載しているが、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩であってもよく、それらも本発明に含まれる。該アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。さらに、抗癌剤として非経口投与にて供せられる場合、溶解液にて溶液調製されるが、該溶液のｐＨ緩衝剤の陽イオンとの塩に基づくグルタミン酸塩であってもよい。
【００３８】
式（１）においてＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片１分子に結合するポリマー数であるｎは、該抗体または該抗体断片の抗原認識能を失わなければ特に限定されないが、１〜８程度が好ましい。
【００３９】
本発明には前記の高分子化合物（Ａ）あるいはその塩と、前記式（７）［式中、Ｒ１’は抗体または抗体断片以外の低分子置換基を示し、Ｌ’は結合部位を示し、Ａ１’及びＡ２’は同一でも異なっていてもよく（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基であり、Ｒ２’は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アシル基を示し、Ｒ３’はフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤残基を示し、Ｒ４’はＮ（Ｒ５’）ＣＯＮＨ（Ｒ６’）を示し、Ｒ５’、Ｒ６’は同一でも異なっていてもよく、環状（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基または三級アミノ基で置換されていてもよい分岐鎖若しくは直鎖（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔ’は１０〜４５０の整数を示し、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’は２〜６０の整数を示し、ｄ’及びｅ’は１以上であり、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’に対するｄ’の割合が２〜９８％、ｅ’の割合が２〜９８％、ｆ’の割合が０〜９６％］で表される高分子化合物（Ｂ）あるいはその塩を含有する医薬組成物も含まれる。
【００４０】
式（７）の抗体または抗体断片以外の低分子置換基であるＲ１’としては、例えば、水素原子、コハク酸イミド基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基、置換基を有していてもよいＮ−フェニルコハク酸イミド基、Ｎ−直鎖若しくは環状（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルコハク酸イミド基またはシステイン残基が挙げられる。ここでＮ−直鎖若しくは環状（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルコハク酸イミド基における直鎖若しくは環状（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
中でも特に好ましくはＮ−エチルコハク酸イミド基またはシステイン残基である。
【００４１】
式（７）の結合部位Ｌ’としては、例えば、前記の式（８）［式中、Ｙ１’、Ｙ２’はそれぞれ独立にフェニレン基または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｍ’は０〜３の整数を示し、Ｚ’はＯまたはＮＨを示す］で表される結合部位が好ましい。ここで、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
中でも、Ｙ１’、Ｙ２’が共にメチル基、ｍ’が０、Ｚ’がＯ（酸素原子）が特に好ましい。
【００４２】
式（７）におけるＡ１’、Ａ２’及びＲ２’は前記式（１）におけるＡ１、Ａ２及びＲ２と同様な基を意味し、好ましい基も同様である。また、ｔ’の範囲も前記式（１）におけるｔと同様な範囲であり、好ましい範囲も同様である。
【００４３】
式（７）におけるポリグルタミン酸構造部分のユニット数についても前記式（１）におけるポリグルタミン酸構造部分のユニット数と同様の範囲であり、好ましい範囲も同様である。
【００４４】
式（７）におけるＲ３’、Ｒ４’、Ｒ５’及びＲ６’は前記式（１）におけるＲ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６と同様な基を意味し、好ましい基も同様である。
【００４５】
本発明の医薬組成物に含有される式（１）で表される高分子化合物（Ａ）またはその塩と式（７）で表される高分子化合物（Ｂ）またはその塩において、Ａ１とＡ１’、Ａ２とＡ２’、ｔとｔ’、Ｒ２とＲ２’、Ｒ３とＲ３’、Ｒ４とＲ４’、ｄとｄ’、ｅとｅ’、ｆとｆ’、Ｙ１とＹ１’、Ｙ２とＹ２’、ｍとｍ’及びＺとＺ’は同じであっても異なっていてもよい。また、式（１）で表される高分子化合物（Ａ）またはその塩と式（７）で表される高分子化合物（Ｂ）またはその塩が会合してミセルを形成していてもよい。
【００４６】
次に、本発明の高分子化合物（Ａ）及び高分子化合物（Ｂ）の製造方法を簡単に説明する。なお、本発明の高分子化合物の製造方法はここに記載の製造方法や後記の実施例・参考例に記載の方法に限定されない。
【００４７】
式（１）や式（７）で表される高分子化合物においてポリマー部分はポリエチレングリコール構造部分とポリグルタミン酸構造部分を有するブロック共重合体から製造され、その構築方法は、ポリエチレングリコール構造部分とポリグルタミン酸構造部分を結合させる方法、ポリエチレングリコール構造部分にグルタミン酸を順次に遂次重合させる方法のいずれの方法でも可能である。
【００４８】
後者の方法としては、特開平５−９５５号公報等に記載の方法を応用して、例えば、市販の片末端Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノエチル基、他方片末端アミノエチル基で修飾されたポリエチレングリコールにＮ−カルボニルグルタミン酸無水物を順次反応させる方法が挙げられる。この場合、Ｎ−カルボニルグルタミン酸無水物はグルタミン酸側鎖のカルボキシ基が適当なカルボン酸保護基にて修飾された化合物が好ましい。当該カルボン酸保護基としては特に限定されないが、エステル型保護基が好ましく、特にベンジルエステルが好ましい。反応終了後、アルカリ加水分解反応や水素化分解反応により脱保護して目的とするブロック共重合体が得られる。
脱保護前に該ブロック共重合体のポリグルタミン酸構造部分の末端アミノ基をアシル化しておいてもよい。
【００４９】
次に、式（１）や式（７）で表される高分子化合物のポリマーのポリグルタミン酸構造部分の側鎖カルボキシ基にフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤を結合させる方法について説明する。
【００５０】
ポリエチレングリコール構造部分とポリグルタミン酸構造部分を有するブロック共重合体とフェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤とを、例えば、カルボジイミド脱水縮合剤の存在下で脱水縮合反応させればよい。この製造方法によれば、当該ブロック共重合体にＲ４またはＲ４’の置換基を同時に導入することができる。該カルボジイミド脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等が挙げられる。該脱水縮合反応の際に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の反応補助剤を用いてもよい。
【００５１】
次いで、結合部位であるＬまたはＬ’を導入するためにブロック共重合体のポリエチレングリコール構造部分の末端アミノ基の保護基、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を脱保護し、該アミノ基と保護した末端チオール基を有する（チオ）カルボン酸誘導体とをアミド結合させる。その後、末端チオール基の保護基を脱保護する。こうして得られたチオール化合物とＲ１’基を形成する低分子化合物を反応させることにより式（７）で表される高分子化合物（Ｂ）が得られ、さらに通常の造塩反応によりその塩を調製することができる。
一方、ＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片のアミノ基と末端マレイミド基を有するカルボン酸誘導体とをアミド結合させ、得られた化合物のマレイミド基に前記の末端チオール基の保護基を脱保護して得られたチオール化合物を付加反応させ式（１）で表される高分子化合物（Ａ）が得られ、さらに通常の造塩反応によりその塩を調製することができる。
前記各反応において、必要であれば精製工程を経由して製造してもよい。
【００５２】
本発明の医薬組成物はこうして得られた高分子化合物（Ａ）あるいはその塩と高分子化合物（Ｂ）あるいはその塩を混合して製造することができる。また、前記の高分子化合物（Ａ）（ｎ＝１である場合）の前駆体である末端チオール化合物と高分子化合物（Ｂ）の前駆体である末端チオール化合物の組成物と、ＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片のアミノ基と末端マレイミド基を有するカルボン酸誘導体とをアミド結合させて得られた化合物とを結合して製造することもできる。さらに、前記組成物がミセルを形成する場合には１ミセル当たりに結合している抗体または抗体断片は約１〜５分子程度である。さらに必要であれば、ＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片が結合していない残余のチオール基に抗体または抗体断片以外の低分子置換基を形成する化合物を結合させてもよい。
【００５３】
本発明の高分子化合物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で徐々にＨＳＰ９０阻害剤を解離し放出する。このことは、生体投与においても種差や個体差のある加水分解酵素に依存することなくＨＳＰ９０阻害剤を徐放的に遊離する物性を備えることを示す。
【００５４】
本発明の高分子化合物（Ａ）はＥＧＦＲファミリータンパク質と結合する抗体または抗体断片が結合しておりアクティブターゲティング能を有するから、抗体等が非結合の化合物と体内薬物動態挙動が大きく異なると考えられ、体内分布も大きく異なることが期待される。
【００５５】
本発明の高分子化合物及び医薬組成物はＨＳＰ９０阻害剤として使用することができ、また、抗癌剤として使用することができ、該用途も本発明に含まれるものである。当該ＨＳＰ９０阻害剤及び当該抗癌剤は注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、散剤等の通常使用されている製剤で使用することができる。製剤化に当たり、通常使用される薬学的に許容される担体や添加剤、例えば、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、保存剤、無痛化剤、色素、香料等を使用することができる。中でも、注射剤、点滴剤としての使用が好ましく、水、生理食塩水、５％ブドウ糖またはマンニトール液、水溶性有機溶媒（例えば、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモフォア等及びそれらの混合液等）並びに水と該水溶性有機溶媒の混合液等の使用が好ましい。
【００５６】
本発明の高分子化合物は、フェノール性水酸基を有するＨＳＰ９０阻害剤の治療効果を高めることを可能とするものであり、乳癌、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、子宮体癌、多発性骨髄腫、唾液腺癌等に適応可能である。
【実施例】
【００５７】
以下に、実施例、参考例及び試験例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００５８】
参考例１  Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノエチル，アミノエチルポリエチレングリコールと重合数約１１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
片末端Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノエチル基、他方片末端アミノエチル基のポリエチレングリコール（Ｒａｐｐ  ｐｏｌｙｍｅｒ社製、平均分子量３０００、ｔ＝６４）１．０７ｇをジメチルスルホキシド（１９ｍＬ）に溶解し、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメートＮ−カルボン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ：ポリエチレングリコール化合物に対して１２．５当量）１．６６ｇを加え、３０℃にて一晩撹拌した。酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え希釈後、ジイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）撹拌下に反応液を滴下し、１時間撹拌した。３０分静置後、上清を除き、ジイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）を加えさらに１時間撹拌した。この操作を４回繰り返して析出した固体をろ取した。固体をジイソプロピルエーテル（２０ｍＬ）にてさらに洗浄し、減圧下乾燥した。
得られた生成物２．２５ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（２．１３ｍＬ）を加え２０℃にて一晩撹拌しＮ−アセチル化した。酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え希釈し、ジイソプロピルエーテル（４００ｍＬ）撹拌下に滴下し２時間撹拌した。析出した固体をろ取し、ジイソプロピルエーテル（２０ｍＬ）にて洗浄後、減圧下乾燥した。
得られた生成物１．６６ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素１６６ｍｇを加えて、水素雰囲気下３０℃にて一晩撹拌しベンジルエステルを水素化分解した。パラジウム炭素をろ別後、酢酸エチル（３５ｍＬ）を加え希釈し、ジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）撹拌下に滴下した。２時間撹拌後、析出した固体をろ取し、ジイソプロピルエーテル（４０ｍＬ）にて洗浄した。
得られた生成物１．３５ｇをｐＨ１１の水酸化ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）に溶解し、塩化ナトリウム（１２ｇ）を加え、１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１１に調整した。この溶液を吸着樹脂ＨＰ−２０ｓｓ（三菱化学社製、１５０ｍＬ）のカラムに通塔し、５％塩化ナトリウム水溶液（６００ｍＬ）、次いで蒸留水（６００ｍＬ）にて洗浄後、５０％アセトニトリル水溶液（３００ｍＬ）にて溶出した。目的物を含む溶出画分を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（ダウケミカル社製、プロトン型、４０ｍＬ）のカラムに通塔し、さらに精製水（４０ｍＬ）にて溶出した。目的物を含む溶出画分を減圧濃縮後、凍結乾燥して標記化合物１．１２ｇを得た。
【００５９】
水酸化カリウム水溶液を用いた中和滴定値に基づく本化合物１分子中のグルタミン酸の平均重合数（カルボン酸数）は、１１．０９であった。
【００６０】
参考例２  末端に３−（２−ピリジルジチオ）プロパンアミド基を有するポリエチレングリコール化合物と重合数約１１のポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物の合成
参考例１で得られた化合物７３ｍｇをトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）に溶解し、氷冷下で１時間撹拌した。その後、ジイソプロピルエーテル（５ｍＬ）を加え減圧濃縮した。得られた固体をアセトニトリルに溶解し、標準ＲＣ透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒａ社製、ＭＷＣＯ（分画分子量）２０００Ｄａ）に移液し、外液として精製水を用い２７時間透析後、凍結乾燥した。得られた生成物５５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（１１．３ｍｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．３μＬ）を加え、室温にて１５分撹拌した。その後、精製水（１５μＬ）及び陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ（ダウケミカル社製、プロトン型、２００μＬ）を加え、３０分撹拌した。Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗをろ過にて除去後、ろ液を標準ＲＣ透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒａ社製、ＭＷＣＯ  ２０００Ｄａ）に移液し外液として精製水を用い２１時間透析後、凍結乾燥して、標記化合物５３．５ｍｇを得た。
【００６１】
参考例３  末端３−（２−ピリジニルジチオ）プロパンアミドポリエチレングリコールとポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と５−［２，４−ジヒドロキシ−５−（プロパン−２−イル）フェニル］−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オンの結合した高分子化合物の合成
参考例２で得られた化合物８０．０ｍｇと５−［２，４−ジヒドロキシ−５−（プロパン−２−イル）フェニル］−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（式（３）の化合物）３１．０ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、３５℃にて１５分撹拌し溶解させた。その後２５℃に降温し１時間撹拌後、４−（ジメチルアミノ）ピリジン２３．３ｍｇ及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド５９．７μＬを加え反応を開始させた。反応開始後２１時間にてＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド１４．９μＬを追加し、さらに２時間撹拌後、酢酸エチル（２ｍＬ）を加え希釈し、ジイソプロピルエーテル（１０ｍＬ）撹拌下に滴下した。２時間撹拌後、析出した固体をろ取し、ジイソプロピルエーテル（２ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶解後、標準ＲＣ透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒａ社製、ＭＷＣＯ  ２０００Ｄａ）に移液し、２１時間透析後に凍結乾燥して標記化合物９０．８ｍｇを得た。
【００６２】
参考例３で得られた高分子化合物に結合した式（３）の化合物の含量は、該高分子化合物に１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて３７℃で１時間攪拌後、遊離した式（３）の化合物を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析し、該化合物を用いて予め得られた検量線から求めた量から計算した。その結果、含量は２５．１％（ｗ／ｗ）であった。
【００６３】
実施例１  Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの結合した参考例３の高分子化合物の組成物（化合物１：Ｒ１＝Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｒ１’＝エチルコハク酸イミド基またはシステイン残基、Ｒ２＝Ｒ２’＝アセチル基、Ｒ３＝Ｒ３’＝５−［２，４−ジヒドロキシ−５−（プロパン−２−イル）フェニル］−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（式（３）の化合物）、Ｒ５＝Ｒ５’＝Ｒ６＝Ｒ６’＝イソプロピル基、Ａ１＝Ａ１’＝Ａ２＝Ａ２’＝エチレン基、Ｘ＝シクロヘキシルメチル基、Ｙ１＝Ｙ１’＝Ｙ２＝Ｙ２’＝メチル基、Ｚ＝Ｚ’＝Ｏ（酸素原子）、ｍ＝ｍ’＝０、ｎ＝１、ｔ＝ｔ’＝６４、ｄ＋ｅ＋ｆ＝ｄ’＋ｅ’＋ｆ’＝１１）の合成
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ製剤（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）１０．５ｍｇをｐＨ７．０に調整した１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（２ｍＬ）に溶解させ、ＰＤ−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通液（溶出溶媒：ｐＨ７．０に調整した１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液）し、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ画分（２．８５ｍＬ）を回収した。この画分に、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｎ−［（４−マレイミドメチル）シクロヘキシルカルボニルオキシ］スルホサクシンイミドナトリウム塩；東京化成工業社製）５０．７ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液（１０μＬ）を添加した。室温にて１５分撹拌後、ＰＤ−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通液（溶出溶媒：ｐＨ６．０に調整した１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液）し、マレイミド構造部位の結合したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ画分３．７９ｍＬを得た。参考例３で得られた高分子化合物３．４５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０μＬ）及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（１０μＬ：ｐＨ６．０）に溶解し、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）１２．２ｍｇ／ｍＬ水溶液（１０μＬ）を加え、２０分撹拌して還元反応に付しチオール化合物を得た。得られたチオール化合物１９．４ｍｇをマレイミド構造部位の結合したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ画分に加え室温にて５時間撹拌した。さらに５℃で１５時間放置後、Ｎ−エチルマレイミド４０．４ｍｇ／ｍＬ濃度の１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（１０μＬ：ｐＨ６．０）を加え１５分撹拌した。次いで、システイン塩酸塩２８４ｍｇ／ｍＬ濃度の１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（１０μＬ：ｐＨ６．０）を加え１５分撹拌した。この溶液をｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ｓ−３００ＨＲ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通液（溶出溶媒：１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０））し、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの結合した高分子化合物の複合体画分（１５．３ｍＬ）を分取した。この画分をＶＩＶＡＳＰＩＮ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＭＷＣＯ  ３０００Ｄａ）にて遠心濃縮し、標記化合物を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液溶液１ｍＬ（ｐＨ６．０）を得た。
【００６４】
実施例１で得られた溶液中の高分子化合物に結合したＴａｓｔｕｚｕｍａｂ濃度は、以下のアミノ酸分析にて確認した。得られた溶液２００μＬに３５％塩酸（２００μＬ）を加え、減圧密封下１１０℃で２４時間反応させ、各アミノ酸成分へと加水分解した。その後、減圧乾固し、０．１Ｍホウ酸緩衝液に再溶解後、常法により蛍光誘導体化し、ＨＰＬＣ（検出器：蛍光検出器）で分析し各アミノ酸濃度を定量した。同様の手法でＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（０．６７ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に含有される各アミノ酸濃度を定量した。得られた高分子化合物溶液中のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ濃度を標準品のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂのアミノ酸定量濃度をもとに算出したところ、２．５０ｍｇ／ｍＬであった。
【００６５】
実施例１で得られた高分子化合物溶液中の式（３）の化合物の濃度は、該溶液に１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて３７℃で１時間攪拌し加水分解後、遊離した式（３）の化合物をＨＰＬＣで分析し、該化合物を用いて予め得られた検量線から求めた量から計算した。その結果、濃度は０．２９４ｍｇ／ｍＬであった。
【００６６】
比較例１  参考例３で得られた高分子化合物の末端にシステイン残基の結合した高分子化合物（Ｂ）（比較化合物１：Ｒ１’＝システイン残基、Ｒ２’＝アセチル基、Ｒ３’＝５−［２，４−ジヒドロキシ−５−（プロパン−２−イル）フェニル］−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（式（３）の化合物）、Ｒ５’＝Ｒ６’＝イソプロピル基、Ａ１’＝Ａ２’＝エチレン基、Ｙ１’＝Ｙ２’＝メチル基、Ｚ’＝Ｏ、ｍ’＝０、ｔ’＝１、ｄ’＋ｅ’＋ｆ’＝１１）の合成
参考例３で得られた化合物を実施例１と同様のジスルフィド結合の還元反応に付して得られたチオール化合物３．８１ｍｇをＤＭＦ（１００μＬ）に溶解し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（５００μＬ：ｐＨ６．０）にて希釈した。次いで、システイン塩酸塩４，９３ｍｇを加え３０分撹拌した。この溶液を標準ＲＣ透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒａ社製、ＭＷＣＯ  ２０００Ｄａ）に移液し、外液として１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液を用い、３℃にて２４時間透析し、標記化合物を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液溶液１．５ｍＬ（ｐＨ６．０）を得た。
【００６７】
比較例１で得られた高分子化合物溶液中の式（３）の化合物の濃度は、該溶液に１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて３７℃で１時間攪拌し加水分解後、遊離した式（３）の化合物をＨＰＬＣで分析し、該化合物を用いて予め得られた検量線から求めた量から計算した。その結果、濃度は０．６２５ｍｇ／ｍＬであった。
【００６８】
参考例４  末端に３−（２−ピリジニルジチオ）プロパンアミド基を有するポリエチレングリコールとポリグルタミン酸とのブロック共重合体Ｎ−アセチル化物と３−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピルフェニル）−４−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５（４Ｈ）−オン（式（４）の化合物）の結合した高分子化合物の合成
参考例２で得られた化合物４６．８ｍｇと５−［２，４−ジヒドロキシ−５−（プロパン−２−イル）フェニル］−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（式（４）の化合物）２３．４ｍｇをＮ−メチル−２−ピロリドン（６１９μＬ）に溶解し、３５℃にて１５分撹拌し溶解させた。２５℃に降温し１時間撹拌後、４−（ジメチルアミノ）ピリジン１３．９ｍｇ及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド３６．０μＬを加え反応を開始させた。反応開始後１３．５時間にてＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド９．０μＬを追加し、さらに１時間撹拌後、酢酸エチル（１．２ｍＬ）を加え希釈し、ジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）撹拌下に滴下した。１．５時間撹拌後、析出した固体をろ取し、ジイソプロピルエーテル（２ｍＬ）にて洗浄した。得られた生成物４６．８ｍｇを１，４−ジオキサン（１ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸の１，４−ジオキサン溶液（３７０μＬ）を加え３０分撹拌した。次いで、酢酸エチル（１ｍＬ）を加え希釈し、ジイソプロピルエーテル（２０ｍＬ）撹拌下に滴下した。１．５時間撹拌後、析出した固体をろ取し、ジイソプロピルエーテル（２ｍＬ）にて洗浄した。得られた固体を氷冷した精製水に溶解し、標準ＲＣ透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒａ社製、ＭＷＣＯ  ２０００Ｄａ）に移液し、外液として精製水を用い３℃にて２４時間透析後、凍結乾燥して標記化合物４０．７ｍｇを得た。
【００６９】
参考例４で得られた高分子化合物に結合した式（４）の化合物の含量は、該高分子化合物に１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を加えて３７℃で１時間攪拌し加水分解後、遊離した式（４）の化合物を、ＨＰＬＣで分析し、予め該化合物を用いて得られた検量線から求めた量から計算した。その結果、含量は２５．５％（ｗ／ｗ）であった。
【００７０】
実施例２  参考例４で得られたブロック共重合体とＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂとの結合した高分子化合物（化合物２：Ｒ１＝Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｒ２＝アセチル基、Ｒ３＝３−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピルフェニル）−４−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５（４Ｈ）−オン（式（４）の化合物）、Ｒ５＝Ｒ６＝イソプロピル基、Ａ１＝Ａ２＝エチレン基、Ｘ＝シクロヘキシルメチル基、Ｙ１＝Ｙ２＝メチル基、Ｚ＝Ｏ（酸素原子）、ｍ＝０、ｔ＝６４、ｄ＋ｅ＋ｆ＝１１）の合成
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ製剤（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）９．７５ｍｇをｐＨ７．０に調整した１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（２ｍＬ）に溶解させ、ＰＤ−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通液（溶出溶媒：１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））し、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ画分（２．８５ｍＬ）を回収した。この画分に、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣナトリウム塩５０．２ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液（１０μＬ）を添加した。室温にて１５分撹拌後、ＰＤ−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通液（溶出溶媒：１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０））し、マレイミド構造部位の結合したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ画分３．２４ｍＬを得た。参考例４で得られた化合物２．３８ｍｇを１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（４０μＬ：ｐＨ６．０）に溶解し、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ８．５４ｍｇ／ｍＬ水溶液（１０μＬ）を加え、３０分撹拌してチオール化合物を含む溶液を得た。マレイミド構造部位の結合したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ画分（１．６ｍＬ）に該溶液（２０μＬ）を加え室温にて５時間撹拌した。次いで、Ｎ−エチルマレイミド１８ｍｇ／ｍＬを含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（１０μＬ：ｐＨ６．０）を加え１５分撹拌し、システイン塩酸塩１３０ｍｇ／ｍＬを含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（１０μＬ：ｐＨ６．０）を加え１５分撹拌した。この溶液にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を５００μＬ加え３０分撹拌後、ろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（１０ｍＬ：ｐＨ６．０）で洗浄し、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂが結合していない化合物及び低分子化合物を除去した。ろ取したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに、０．１Ｍグリシン緩衝液（１ｍＬ：ｐＨ３．０）を加え、１５分撹拌し標記の高分子化合物を溶出し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗをＭｉｌｌｅｘ−ＬＨ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使いろ別した。ろ液をＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ；ｐＨ９．０）にてｐＨ６．０にした。この溶液を標準ＲＣ透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒａ社製、ＭＷＣＯ  ２０００Ｄａ）に移液し、外液として１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．０）を用い３℃にて２４時間透析後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＭＷＣＯ  ３０００Ｄａ）にて遠心濃縮し、標記化合物を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液溶液１．０ｍＬを得た。
【００７１】
実施例２で得られた高分子化合物溶液中のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ濃度は、前記実施例１と同様にアミノ酸分析で行った。その結果、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ濃度は１．１７ｍｇ／ｍＬであった。化合物２の抗体１分子に結合しているポリマー数ｎは、平均で１．８である。
【００７２】
実施例２で得られた高分子化合物溶液中の式（４）の化合物の濃度は、実施例１と同様に該高分子化合物をアルカリ加水分解後にＨＰＬＣで分析し求めた。その結果、濃度は０．０２４６ｍｇ／ｍＬであった。
【００７３】
試験例１  実施例１で得られた高分子化合物（化合物１）の複合体に結合したＨＳＰ９０阻害剤のインビトロ非酵素存在下の放出性
実施例１で得られた高分子化合物（化合物１）の１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（１００μＬ：ｐＨ６．０）にＰＢＳ緩衝液（４００μＬ）を添加し、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、０時間、１時間、３時間、８時間、２４時間における該高分子化合物から加水分解され遊離した５−［２，４−ジヒドロキシ−５−（プロパン−２−イル）フェニル］−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（式（３）の化合物）をＨＰＬＣにて分析し得られたピーク面積と、該高分子化合物を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液、３７℃、１時間処理し薬物を全量加水分解したときの薬物のピーク面積との比を図１に示した。
図１から明らかなように、本発明の高分子化合物は加水分解酵素が存在しなくても薬物を徐放することができ、２４時間で５０％以上の薬物を放出するものであり、本発明の高分子化合物の優れた薬物放出性能を示している。
【００７４】
試験例２  実施例２で得られた高分子化合物（化合物２）に結合したＨＳＰ９０阻害剤のインビトロ非酵素存在下の放出性
実施例２で得られた高分子化合物（化合物２）の１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（１００μＬ：ｐＨ６．０）を使用して、試験例１と同様の条件で試験を行い、遊離した３−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピルフェニル）−４−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５（４Ｈ）−オン（式（４）の化合物）をＨＰＬＣにて分析し得られたピーク面積と、該高分子化合物を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液、３７℃、１時間処理し薬物を全量加水分解したときの薬物のピーク面積との比を図２に示した。
図２に明らかなように、本発明の高分子化合物は加水分解酵素が存在しなくても薬物を徐放することができ、２４時間で７０％以上の薬物を放出するものであり、本発明の高分子化合物の優れた薬物放出性能を示している。
【００７５】
試験例３  実施例１及び実施例２で得られた高分子化合物のフローサイトメトリー分析によるＨＥＲ２に対する抗原認識能アッセイ
ＨＥＲ２陽性乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３（ヒト乳癌細胞；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、培地１（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）及び１００μｇ／ｍＬカナマイシン（ライフテクノロジーズ社製）を添加したＭｃＣｏｙ’ｓ培地（ライフテクノロジーズ社製））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で継代培養維持している。
マイクロチューブ中の上記ＳＫ−ＢＲ−３細胞液に、実施例１及び実施例２で得られた高分子化合物または修飾を施していないＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを種々の濃度で（終濃度０．２、１．０、５．０μｇ／ｍＬ）添加し、暗所にて４℃で３０分間インキュベーションした。反応後の細胞を１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（−）（タカラバイオ社製）で洗浄し、ＰＥ（フィコエリスリン）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製）と暗所にて４℃で３０分間インキュベーションした。１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（−）で洗浄した後、フローサイトメーター（日本ＢＤ社製、ＬＳＲＩＩ）により細胞の蛍光強度を測定した。その結果を図３に示す。
図３から明らかなように、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を用いた抗原認識能アッセイの結果、実施例１及び実施例２で得られた高分子化合物（化合物１及び化合物２）は、修飾を施していないトラスツズマブと比べると抗原認識能は減弱しているが、濃度依存的な蛍光強度の変化を示し、ＨＥＲ２に対する抗原認識能を保持している。
【００７６】
試験例４  実施例１で得られた高分子化合物（化合物１）のインビトロ細胞増殖抑制アッセイ
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を９６穴プレートに１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、実施例１で得られた高分子化合物（化合物１）、比較例１で得られた抗体非結合の高分子化合物（比較化合物１）と修飾を施していないＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの併用との細胞増殖抑制効果を比較した。４時間培養後にウェル内を培地１で静かに洗浄し、さらに３日間培養後、細胞をメタノールにて固定しメチレンブルー色素を用いて染色した。染色後色素を０．３％塩酸にて抽出し、６６０ｎｍの吸光度を測定し、後述の方法により増殖抑制活性を評価した。結果を図４に示す。
増殖抑制活性は、高分子化合物を添加しない群の吸光度に対する高分子化合物添加群の吸光度の減少率で表すことができ、４パラメータ用量−作用曲線からＥＣ５０値（最大反応の半分の効果を示す濃度）をＨＳＰ９０阻害剤（Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ：式（３）の化合物）換算濃度として求めて図４及び表１に示した。
その結果、本発明の高分子化合物は、抗体非結合高分子化合物と修飾を施していないＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの併用を上まわる細胞増殖抑制効果を示した。
【００７７】
［表１］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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