(57)【要約】【課題】統合失調症を治療するうえで、脳の特定の領域に治療薬を送達する困難さを少なくとも部分的に克服できる新しい頭蓋内植込式デバイスを提供する。【解決手段】統合失調症を治療するための薬学的活性剤を送達するための頭蓋内植込式デバイスであって、統合失調症を治療するための抗精神病薬剤である薬学的活性剤；ポリカプロラクトンと、薬学的活性剤と、ω−３脂肪酸とから形成されるポリマーナノリポシェル；ポリマーナノリポシェルを組込んだ多孔質ポリマーマトリクスであって、エチルセルロースと変性ポリアミド６，１０とから形成される多孔質ポリマーマトリクスを含むデバイス、およびその製造方法が提供される。【選択図】図１２
2015013906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
統合失調症を治療するための薬学的活性剤を送達するための頭蓋内植込式デバイスであって、
統合失調症を治療するための抗精神病薬剤である前記薬学的活性剤と、
ポリカプロラクトンと、前記薬学的活性剤と、ω−３脂肪酸とから形成されるポリマーナノリポシェルと、
前記ポリマーナノリポシェルを組込んだ多孔質ポリマーマトリクスであって、エチルセルロースと変性ポリアミド６，１０とから形成される多孔質ポリマーマトリクスと、
を含む、デバイス。
【請求項２】
前記抗精神病薬剤は、非定型抗精神病薬剤または定型抗精神病薬剤である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記定型抗精神病薬剤は、クロルプロマジン、チオリダジン、メソリダジン、レボメプロマジン、ロキサピン、モリンドン、ペルフェナジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、ハロペリドール、フルフェナジン、ドロペリドール、ズクロペンチキソールもしくはプロクロルペラジン、またはその塩である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記定型抗精神病薬剤は、クロルプロマジンまたはその塩である、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記非定型抗精神病薬剤は、アミスルプリド、アリピプラゾール、アセナピン、ビフェプルノックス、ブロナンセリン、クロチアピン、クロザピン、イロペリドン、ルラシドン、モサプラミン、オランザピン、パリペリドン、ペロスピロン、ピマバンセリン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、バビカセリン、ジプラシドンもしくはゾテピン、またはその塩である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項６】
前記デバイスは、くも膜下腔に植込み可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記デバイスは、生物分解可能である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
患者の頭蓋内に植込むことにより、統合失調症を治療するために使用される請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の頭蓋内植込式デバイスを製造する方法であって、
薬学的活性剤を含有するポリマーナノリポシェルを形成するステップと、
前記ポリマーナノリポシェルを多孔質ポリマーマトリクスに組込むステップと、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、頭蓋内に植込むことができ、脳に薬学的活性剤を送達するための、特にアルツハイマー病、および統合失調症などの精神障害を治療するための、生物分解可能な薬物送達デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ほとんどの神経または精神障害の治療における課題の１つは、治療薬剤を脳内に送達することが困難であることにある。多くの潜在的に重要な診断および治療用の薬剤または遺伝子は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができないかまたは十分な量でＢＢＢを通過することができない。
【０００３】
薬剤を脳内に向かわせるためのメカニズムは、ＢＢＢを「通過」させるかまたはＢＢＢの「裏側」を通すかのいずれかに伴う。ＢＢＢを通過して薬物を送達する方法は、浸透手段により、生化学的にはブラジキニンなどの血管作動性物質を使用することにより、または高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）に局所的に曝露することにより、薬物を崩壊させることを必要とする。ＢＢＢを通過するのに用いられる他の方法は、グルコースやアミノ酸担体などの担体媒介輸送体、インスリンまたはトランスフェリンなどを輸送する受容体媒介トランスサイトーシス、およびｐ−糖タンパク質などの活性排出輸送体のブロックを含む内因性輸送システムの使用を必要とする。ＢＢＢの「裏側」に薬物を送達する方法は、脳内植込み（たとえば、針を用いて）および対流増進送達（convection-enhanced distribution）を含む。
【０００４】
また、ナノテクノロジーは、ＢＢＢを通過して薬物を輸送するのに役立つ可能性がある。この分野においてかなり多くの研究は、中枢神経系の腫瘍に対してナノ粒子を媒介して抗腫瘍薬物を送達する方法を模索している。たとえば、放射性標識のポリエチレングリコールにより被覆されたヘキサデシルシアノアクリレート・ナノ粒子は、ラット神経膠肉腫に標的され、そこで蓄積された。最近では、研究者は、ＢＢＢを通過するために、ナノ粒子を担持しているリポソームを構築しようとしている。しかしながら、どの戦略が最も効果的であるか、それらの戦略をどのようにすれば向上することができるかを決める研究をさらに行う必要がある。
【０００５】
アルツハイマー病や統合失調症は、治療が困難である多くの精神障害および神経障害（ＮＤ）のうち２つの例にすぎない。
【０００６】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）における最も一般的な疾患の１つであり、記憶力および認知能力の低下、ならびに視覚障害および運動協調障害を特徴とする。推定によると、世界中にアルツハイマー病の患者は約２６００万人いる。アルツハイマー病は、β−アミロイド斑が加齢に伴い脳内に進行性沈積することに関連し、細胞外老人斑および神経原線維濃縮体によって識別される。β−アミロイド斑の主成分は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の分解産物としてのβ−アミロイド（Αβ）ペプチドである。これらのΑβペプチドは、長さでは３７〜４３個のアミノ酸を有する。しかしながら、４０〜４３個のアミノ酸を有するΑβペプチドが、より短いアミロイドペプチドに比べて疎水性が高いため、Αβの凝集およびアミロイド斑形成の病原体となることは知られている。かなりの証拠によれば、Αβペプチドは神経毒性体のアミロイドを生成するために、重合過程を経る必要がある。研究では、酸化性ストレス、炎症および遊離基がアルツハイマー病の主な神経毒性誘因であるという可能性を示している。
【０００７】
ドネペジル、リバスチグミンおよびガランタミンは、アルツハイマー病の治療に用いられている現行薬剤である。リバスチグミンがブチリルコリンエステラーゼ酵素を阻害するのに対し、ドネペジルとガランタミンは、アセチルコリンエステラーゼを阻害することができる。補助剤、および、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびβ−カロテンなどの抗酸化剤は、酸化性損傷に対する保護をアルツハイマー病患者に提供するため、抗老化の治療として考えられる。
【０００８】
現在、アルツハイマー病を含む神経障害の有効治療にかかわる課題の１つは、神経障害患者に最小限の薬物毒性、改良された効能および高品質の生活を与えるために、利用可能な必須の薬物療法と薬物送達方法の改善との間のギャップを埋める必要があるということである。上述のように、血液脳関門（ＢＢＢ）に厳しく制限されているため、全身薬物投与によるアルツハイマー病の治療は依然として課題である。血液脳関門は、粒径および内皮浸透性に基づき、物質の脳内進入を制限することが示唆されている。血液脳関門は、緊密な細胞間結合およびＡＴＰ依存性排出ポンプを備え、脳内への薬物分子の送達を制限するため、全身経路を介するアルツハイマー病の治療法を非常に難しくさせる。親油性分子、ペプチド、栄養素およびポリマーは、貫通性の要件を満たすことができるが、これらの分子は、脳内における標的領域に到達および貫通することができず、または正常の感受性組織および細胞に本質的に非特異的に取込まれる。
【０００９】
統合失調症は、高罹患率、慢性と消耗性の特性、および再発と自殺のリスクがあるため、その疾患に対する効果的な治療法は必須である。上述したように、ＢＢＢを通過するように治療薬を輸送することに関連する問題は別として、統合失調症の維持療法が成功するか否かはまた、神経療法の定期解除、投与頻度の削減、抗精神病薬剤のより高い生体利用効率、および最終的に改善された患者の服薬コンプライアンスを含む多数の変数に依存している。これらの変数の多くは、従来の経口製剤の統合失調症療法（Pranzatelli，1999；Cheng，et al.，2000）によって実現することができない。現在、抗精神病薬剤に用いられる便利かつ好ましい薬物送達システムは、従来の錠剤またはカプセル製剤を含む。ほとんどの従来の経口薬物送達システムと同様に、それらは一次薬物放出速度式を示し、すなわち、薬物濃度は、摂取後には高いが、その後急激に減少するため、治療効果に最適な血漿中濃度を長期間に維持できず、投与量に依存する副作用をもたらす。
【００１０】
統合失調症の長期治療および陽性治療結果は、さまざまな要因により生じ得る治療計画のノンコンプライアンスに妨げられている。最も重要な要因の１つは、抗精神病薬剤に付随する耐えられない副作用である。非定型抗精神病薬剤は、錐体外路系の付随副作用がなく、かつ、プロラクチンに対する安全性プロファイルが優れているため、統合失調症の治療において一般的な選択肢として採用される。例として、非定型抗精神病薬剤は、オランザピンを含む。オランザピンは、体重の増加、脂質およびグルコース代謝の増加に関与している。別の非定型抗精神病薬剤であるクロザピンは、無顆粒球症を誘発し、致命的便秘に関与している。抗精神病薬剤の使用が一般にメタボリック症候群の危険性を増加させることは、既に実証されている。しかし、統合失調症の重症度と複雑さのため、医師は、患者の生命を脅かす悪影響にもかかわらず、抗精神病薬剤を処方し続ける。一部の抗精神病薬剤の投与頻度は、ノンコンプライアンスをもたらすことに関与している。たとえば、統合失調症の経口治療は１日に２〜４回投薬することがある。
【００１１】
いくつかの臨床研究は、非定型抗精神病薬剤のうち長時間作用型かつ注射可能なデポ製剤の安全性と有効性を証明しているが、デポ製剤には欠点があるため、服薬コンプライアンスまたは有効性に影響を与える可能性がある。デポ製剤の欠点は、患者が注射を受けたくないこと、重篤な副作用が発生した場合にすぐに薬をやめることができないこと、投与量の調整が難しいこと、複合かつ複雑な薬物動力学、および、注射部位における膿瘍形成、かゆみおよび長期の痛みを含む。また、デカノエート酸官能基を含有するデポ製剤は、その化学性質によって制限される（Kane，et al.，1998；McCauley and Connolly，2004；Rabin，et al.，2008）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、精神または神経障害を治療するために、脳の特定の領域に治療薬を送達する困難さを少なくとも部分的に克服できる新しい方法または組成物が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
第１実施形態によれば、本発明は、精神または神経障害を治療するために、ヒトまたは動物に薬学的活性剤を送達するための頭蓋内植込式デバイスを提供する。このデバイスは、障害を治療するための薬学的活性剤と、薬学的活性剤が表面上または内部に埋め込まれるポリマーナノ粒子と、該ナノ粒子を組込むポリマーマトリクスとを含む。
【００１４】
上記精神または神経障害は、アルツハイマー病、または統合失調症などの精神病性障害である。
【００１５】
上記薬学的活性剤は、塩酸ドネペジル、リバスチグミンまたはガランタミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤、メマンチンなどのＮＭＤＡ受容体拮抗剤、アミスルプリド、アリピプラゾール、アセナピン、ビフェプルノックス、ブロナンセリン、クロチアピン、クロザピン、イロペリドン、ルラシドン、モサプラミン、オランザピン、パリペリドン、ペロスピロン、ピマバンセリン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、バビカセリン、ジプラシドンまたはゾテピンなどの非定型抗精神病薬剤、クロルプロマジン、チオリダジン、メソリダジン、レボメプロマジン、ロキサピン、モリンドン、ペルフェナジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、ハロペリドール、フルフェナジン、ドロペリドール、ズクロペンチキソールもしくはプロクロルペラジンなどの定型抗精神病薬剤、またはその塩であってもよい。
【００１６】
ナノ粒子は、ナノリポ粒子であってもよく、好ましくはナノリポシェルまたはナノリポバブルである。
【００１７】
ナノリポ粒子は、ポリマーと薬学的活性剤とを含む組成物から形成されてもよい。組成物は、少なくとも１つのリン脂質および／または必須脂肪酸（ω−３脂肪酸など）をさらに含んでもよい。たとえば、ナノリポ粒子は、ポリカプロラクトンと薬学的活性剤とω−３脂肪酸とを含む組成物から形成されてもよく、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンメトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００）配合体および薬学的活性剤を含む組成物から形成されてもよい。
【００１８】
ナノリポ粒子は、ナノリポ粒子をターゲット分子に向けるためのペプチドリガンドをさらに含んでもよい。ペプチドリガンドは、ナノ粒子と結合してもよく、好ましくは、脳内のセルピン−酵素複合受容体（ＳＥＣ受容体）に結合することができる。ペプチドリガンドは、ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１）とＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２）とＫＶＬＦＬＶ（配列識別番号：３）とからなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１９】
ポリマーマトリクスは、エチルセルロースと変性ポリアミド６，１０とを含む組成物から形成されてもよく、キトサンと、オイドラギットと、アルギン酸ナトリウムとを含む組成物から形成されてもよい。
【００２０】
ポリマーマトリクスは、多孔質であってもよい。
デバイスは、ヒトまたは動物のくも膜下腔に植込み可能であってもよい。
【００２１】
デバイスは、生物分解可能であってもよい。
好ましい実施形態において、薬学的活性剤は、アルツハイマー病の治療剤であってもよく、ポリマーナノ粒子は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンメトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００）配合体および薬学的活性剤から形成されたナノリポバブルであってもよく、アミノ酸配列ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１）、ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２）またはＫＶＬＦＬＶ（配列識別番号：３）を有しかつ脳内のセルピン−酵素複合受容体（ＳＥＣ受容体）を標的とするペプチドリガンドに結合されてもよく、ポリマーマトリクスは、キトサンと、オイドラギットと、アルギン酸ナトリウムとから形成された多孔質骨格であってもよい。
【００２２】
代替的な好ましい実施形態において、薬学的活性剤は、統合失調症を治療するための抗精神病薬剤であってもよく、ポリマーナノ粒子は、ポリカプロラクトンと、薬学活性薬剤と、ω−３脂肪酸とから形成されたナノリポシェルであってよく、ポリマーマトリクスは、エチルセルロースと変性ポリアミド６，１０とから形成されてもよい。
【００２３】
第２実施形態によれば、本発明は、実質的に上述の頭蓋内植込式デバイスを製造する方法を提供する。この製造方法は、薬学的活性剤を含有するナノリポ粒子を形成するステップと、該ナノリポ粒子をポリマーマトリクスに組込むステップとを含む。
【００２４】
第３実施形態によれば、本発明は、精神または神経障害を治療する方法を提供する。この治療方法は、実質的に上述の頭蓋内植込式デバイスを患者の頭蓋内に植込むステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態に係る標的ナノリポバブル（ＮＬＢ）の特性を粒径分布およびゼータ電位により示す図であり、（Ａ）は、非標的ナノリポバブルの粒径分布プロファイルであり、（Ｂ）は、合成ペプチドリガンドのみの粒径分布プロファイルであり、（Ｃ）は、標的ナノリポバブルの粒径分布プロファイルであり、（Ｄ）は、標的ナノリポバブルの全体のゼータ電位分布プロファイルである。
【図２】合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１））を有する標的ナノリポソーム（ＮＬＰ）のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２））を有する標的ナノリポソーム（ＮＬＰ）のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図４】ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、非標的ナノリポバブル、および合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２））を有する標的ナノリポバブルのＤＳＣサーモグラムを示す図である。
【図５】合成ペプチドにより標的されたナノリポバブル、非標的ナノリポバブルとナノリポソームとの細胞毒性を示す図である。
【図６】ローダミンにより標識された、非標的ナノリポバブルと標的ナノリポバブルとの蛍光プロファイルを示す図である。
【図７】キトサン／オイドラギットＲＳ−ＰＯ／アルギン酸ナトリウムのポリマーマトリクス骨格の表面の走査電子顕微鏡観察像を異なる倍率（１３６０倍および２７６０倍）で示す図である。
【図８】ローダミンにより標識された、多孔質ポリマーマトリクス骨格における標的ナノリポバブルの共焦点蛍光顕微鏡写真を示す図であり、（Ａ）は、多孔質骨格のみの共焦点蛍光顕微鏡写真であり、（Ｂ）は、多孔質骨格における、ローダミンにより標識された標的ナノリポバブルの分布を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図９】本発明のポリマー植込式デバイスの相対的な大きさを示す図である。
【図１０】実施例２に係るポリマーデバイスの中心における力−距離のプロファイルを示す図である。
【図１１】改良浸漬析出反応により合成された、実施例２に係るポリアミド６，１０、エチルセルロースおよびポリアミド−エチルセルロースデバイスのＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図１２】実施例２に係るポリマーデバイスのＳＥＭ像をさまざまな倍率で示す図である。
【図１３】実施例２に係るクロルプロマジン担持のナノリポシェルの粒径分布プロファイルを示す典型的強度プロファイルの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
精神または神経障害を治療するために、ヒトまたは動物の特異的部位に薬学的活性剤を送達するための頭蓋内植込式デバイスについて説明する。この生物分解可能なデバイス（または剤形）は、該障害を治療するための薬学的活性剤と、薬学的活性剤を表面上または内部に埋込むポリマーナノ粒子と、該ナノ粒子を組込むポリマーマトリクスまたは骨格とを含む。このデバイスは、脳の前頭葉の領域におけるくも膜下腔内に植込むことができる。
【００２７】
精神または神経障害は、一般的に、アルツハイマー病、統合失調症または他の精神病などの退化性神経疾患である。これらの障害には、長期治療が必要とされる。デバイスは、長期間にわたって薬学的活性剤を制御して持続的に放出することができる。
【００２８】
アルツハイマー病を治療するための薬学的活性剤は、塩酸ドネペジル、リバスチグミンまたはガランタミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤、および、メマンチンなどのＮＭＤＡ受容体拮抗剤を含む。
【００２９】
統合失調症を治療するための薬学的活性剤は、アミスルプリド、アリピプラゾール、アセナピン、ビフェプルノックス、ブロナンセリン、クロチアピン、クロザピン、イロペリドン、ルラシドン、モサプラミン、オランザピン、パリペリドン、ペロスピロン、ピマバンセリン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、バビカセリン、ジプラシドンまたはゾテピンなどの非定型抗精神病薬剤、および、クロルプロマジン、チオリダジン、メソリダジン、レボメプロマジン、ロキサピン、モリンドン、ペルフェナジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、ハロペリドール、フルフェナジン、ドロペリドール、ズクロペンチキソールまたはプロクロルペラジンなどの定型抗精神病薬剤を含む。
【００３０】
ナノ粒子は、ナノリポ粒子であってもよく、典型的にはナノリポシェルまたはナノリポバブルである。
【００３１】
ナノリポ粒子は、生物分解可能なポリマーと薬学的活性剤とを含む組成物から形成されることができる。該組成物は、少なくとも１つのリン脂質および／または必須脂肪酸（ω−３脂肪酸など）をさらに含んでもよい。一実施形態において、ナノリポ粒子は、ポリカプロラクトンと薬学的活性剤とω−３脂肪酸とを含む組成物から形成される。別の実施形態において、ナノリポ粒子は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンメトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００）配合体および薬学的活性剤を含む組成物から形成される。ナノリポ粒子はまた、ローダミン標識したホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈ−ＤＳＰＥ）を含んでもよい。ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００の比率は、約５０：５０：１０（ｍｇ）〜約７５：２５：１０（ｍｇ）の範囲であることができる。
【００３２】
ナノリポシェルは、改良溶融分散法を用いて形成することができる。ナノリポバブルは、逆相蒸発法および窒素ガスを用いて調製することができる。ナノリポシェルまたはナノリポバブルは、不規則な形状を有してもよい。
【００３３】
薬学的活性剤は、ナノリポシェルまたはナノリポバブル内に埋込まれてもよく、ナノリポシェルまたはナノリポバブルによりカプセル化されてもよく、またはナノリポシェルまたはナノリポバブルに付着されてもよい。
【００３４】
ナノリポ粒子は、ナノリポ粒子をターゲット分子に向けるためのペプチドリガンドなどの親和性部分をさらに含むことができる。好ましくは、ペプチドリガンドは、アルツハイマー病患者の脳内で過剰発現されたセルピン−酵素複合受容体（ＳＥＣ受容体）に結合することが可能になるように選択される。ヒトのアポリポタンパク質Ａ−１から単離された６個のアミノ酸のペプチドに対応し、かつ、以下のアミノ酸配列：ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１）、ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２）またはＫＶＬＦＬＶ（配列識別番号：３）のいずれかを有する合成ペプチドが特に適切である。
【００３５】
このペンタペプチドドメインとホモロジーを有する配列モチーフは、アルツハイマー病に共通するΑβペプチドにおいて発見された。ＳＥＣ−受容体はまた、神経細胞株（ＰＣ１２）においてΑβ−ペプチドの内在化を媒介することが示されている。文献に記載された以前の研究は、ポリリジンが、ＳＥＣ−受容体を介して、合成ペプチド（可溶性）転送遺伝子と結合することによりヘパトーマ細胞株を形成することができることを証明した。しかしながら、研究は、２５〜３５個のアミノ酸を有するΑβペプチド（不溶性）がＳＥＣ−受容体により全く認識されず、有毒／凝集の性質をすべて保有していることも証明した。さらなる研究は、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ApoA-I）の配列モチーフがΑβペプチドとホモロジーを有することを証明した。以前の研究はまた、ApoA-IがΑβペプチドと結合し、Αβペプチドをアルツハイマー病によく見られる神経毒性を誘導しないようにすることを実証した。したがって、神経活性薬剤を特異的受容体（ＳＥＣ−受容体）に送達するための標的リガンドとして、ApoA-I（配列）を用いた新規な薬物送達戦略の開発が、本願において提案されている。
【００３６】
このペプチドリガンドは、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）配合体を用いて、ナノ粒子に結合または連結され、好ましくは共有結合によってナノ粒子に結合または連結されることができる。
【００３７】
ナノ粒子において、ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００：ペプチドリガンドの比率は、約５０：５０：１０：１〜約７５：２５：１０：１（ｍｇ）の範囲にあってもよく、ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００：Ｒｈ−ＤＳＰＥ：ペプチドリガンドの比率は、約５０：５０：１０：１：１〜７５：２５：１０：１：１（ｍｇ）の範囲にあってもよい。
【００３８】
本発明の一実施形態において、ポリマーマトリクスまたは骨格は、改良浸漬析出反応で、低抗原性を有する生物分解可能なポリマー、典型的な例としてはエチルセルロースおよび変性ポリアミド６，１０を含む組成物から形成される膜状のポリマーである。エチルセルロースおよびポリアミド６，１０は、それぞれアセトンおよび８５％のギ酸で可溶化されることができる。二重脱イオン水は、エチルセルロースとポリアミド６，１０とのポリマー混合物を沈殿させる非溶媒として使用される。
【００３９】
別の実施形態では、ポリマーマトリクスまたは骨格は、キトサン、オイドラギットおよびアルギン酸ナトリウムを含む組成物から形成され、典型的には、１：１：１〜約２：１：１の比率でキトサン：アルギン酸ナトリウム：オイドラギットＲＳ−ＰＯを含む組成物から形成される。
【００４０】
デバイスの平坦な表面を物質で、好ましくは疎水性ポリマーで被覆することにより、ナノリポシェルまたはナノリポバブルおよびその後の表面からの薬学的活性剤の生物活性的放出を制御してもよい。
【００４１】
脱イオン水分子は、ポリマーマトリクスまたは骨格を多孔性にさせるためのポロゲン剤（porogen agent）として使用することができる。気孔は、典型的には、大きさ上２０ミクロンより小さく、形状上比較的均一である。
【００４２】
本発明の一実施形態（実施例１でより詳細に説明する）において、デバイスは、アルツハイマー病を治療するための植込可能な剤形であり、薬学的活性剤は、特異的部位に標的する合成ペプチドリガンドを有するナノリポバブルに組込まれるアルツハイマー病の薬剤である（Forssen and Willis，1998，Torchilin，2008）。薬剤やペルフルオロカーボンガスは、ナノリポバブルのコアの中に組込まれている（Klibanov，1999；Cavalieri et al.，2006；Hernot and Klibanov，2008）。ナノリポバブルの表面は、ＰＥＧにより被覆され、１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲に分布するナノサイズの直径、および負電荷に向かって詠動するゼータ電位を有する。標的リガンドは、ＮＨＳとＤＣＣなどの架橋剤を用いたカップリング技術により、共有結合でナノリポバブルの表面に結合されるかまたは配置される（Nobs et al.，2004）。
【００４３】
デバイスのポリマーマトリクスまたは骨格は、約１：１：１〜約２：１：１（ｍｇ）の比率でキトサン：オイドラギット：アルギン酸ナトリウムの組合わせから形成される。また、脱イオン水分子などのポロゲン剤が添加され、骨格内において気孔を生成する。予め標識された標的ナノリポバブルは、２つの方法のうちいずれかを用いて、ポリマー骨格内に組込まれる。第１の方法では、標的ナノリポバブルは、撹拌でポリマー溶液を担持させてから、凍結乾燥される。第２の方法では、予めカプセル化された薬物を担持した標的ナノリポバブルは、注入でポリマー骨格内に埋込まれる。ポリマーマトリクスまたは骨格デバイスは、受動的または能動的に予めプログラムされた方法に従い、予め標識したまたは予めカプセル化した薬物を担持した標的ナノリポバブルを「賢く」放出することができるであろう。
【００４４】
予めカプセル化した薬物担持ナノリポバブルの放出プロファイルは、アルツハイマー病の遺伝子組換えたマウスモデルでモニタリングされる。骨格からの標的ナノリポバブルの放出は、活性医薬組成物が放出される受容体を介して、標的ナノリポバブルを目標細胞に導くおよび内在化する能力に基づいてモニタリングされる。
【００４５】
本発明の別の実施形態（実施例２でより詳細に説明する）において、デバイスは、統合失調症を治療するための剤形であって、脳の前頭葉の領域におけるくも膜下腔に埋込み可能である。薬学的活性剤は、クロルプロマジン（費用効果の高い抗精神病薬剤であるが、生体利用効率が非常に低いため、その使用が減少している）などの定型または非定型抗精神病薬剤である。ポリマーマトリクスは、エチルセルロースと変性ポリアミド６，１０との混合物から形成された膜状のポリマー組成物である。クロルプロマジン塩酸塩を収容する生物活性のナノリポシェルは、膜状組成物の中でマトリクス状に配列されている（matricized）。ナノリポシェルは、ポリカプロラクトン・ナノシェル内にカプセル化されたタラ肝油Ｂ．Ｐ．およびクロルプロマジン塩酸塩を含む。
【００４６】
送達デバイスによって提供された薬物の部位特異的送達およびナノリポシェル技術は、血液脳関門（ＢＢＢ）によってもたらされた困難の少なくとも一部を回避する。また、中枢神経系における治療用量を達成するために抗精神病薬剤を潜在的に毒性用量で投与する必要性を回避する。さらに、ナノリポシェルは、注入されることにより、ナノリポシェルを分解または崩壊させる可能性の高い体循環において長い距離で移動しなくで済む。活性薬剤は、ナノリポシェルの単純拡散または浸食、またはコアの消散によって、ナノリポシェルから放出されることができる。
【００４７】
提案されたデバイスは、膜状の骨格およびナノカプセル化技術によって、全身性副作用の減少、血清タンパク質結合の減少、肝代謝軽減および末梢部位における薬剤の不活性化の減少、および活性薬物のポリマー保護をもたらすことができるため、薬剤の分解を軽減することができる。さらに、薬物の大量投与を最も必要とされる脳内の領域に集中させることができる。デバイスが生物分解可能であるため、確実にデバイスを取除くのに必要とされる追加の手術を無くすことができる。さらに、クロルプロマジンは、制御されながら、最大１年に渡り近ゼロ次放出で放出されることができるため、ＣＮＳ領域内に最適なレベルを維持し、再発を防止する。また、本発明のデバイスは、部位特異的薬物送達によって、クロルプロマジンの生体利用効率を向上させることができるため、再び統合失調症を治療する薬剤の選択肢にすることができると考えられる。さらに、このデバイスは、指定薬剤の利点を補完医療に融合している。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのω−３脂肪酸は、ＣＮＳにおいて神経保護特性を有することが示されており、統合失調症患者に特に有用であると考えられる。タラ肝油Ｂ．Ｐ．は、ＥＰＡとＤＨＡの両方に富む。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の非限定的実施例により説明する。
実施例１：アルツハイマー病を治療するための薬物送達デバイス
材料および方法
材料
ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−メトキシポリエチレングリコール配合体（ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００）などのリン脂質、ローダミン標識したホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈ−ＤＳＰＥ）、キトサン（中間分子量）、オイドラギットＲＳ−ＰＯ、アルギン酸ナトリウム、および氷酢酸は、すべてシグマ−アルドリッチ 社（米国ミズーリ州セントルイス市）から購入された。Ｎ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、およびリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）は、Saarchem（Ｐｔｙ）社（南アフリカブラクパン市）から購入された。０．２２μｍの薄膜フィルタは、Millipore社（米国マサチューセッツ州ビレリカ）から購入された。窒素ガスは、Afrox社（南アフリカジャーミストン州インダストリアウェスト市）から購入された。全てのペプチドリガンドは、SBS  Genetech株式会社（中国上海市）により合成された。細胞生存率を測定するCytoTox-Glo（商標）細胞毒性アッセイ（キット）は、プロメガ社（米国ウィスコンシン州マディソン市）から購入された。すべての溶媒および試薬は、分析グレードであって、購入されたままで使用した。
【００４９】
ナノリポバブルの調製
適応逆相蒸発法（Suzuki et al.，2007）を用いて、ナノリポバブルを調製した。ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ配合体を、クロロホルム：メタノール（９：１）の有機溶媒相中に溶解した。この脂質溶液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）を加えた。その後、混合物をプローブ式超音波処理器（６０ｒｐｍ、３０秒間）で混ぜてから、回転蒸発器を用いて６５℃の温度に維持された水浴で２〜３時間の溶媒蒸発を行った。形成された脂質膜を、丸底ガラスチューブに入れて、４ｍＬのｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中に懸垂した。単層状のリポソーム（ＮＬＰ）は、凍結・解凍技術によって得られた。リポソーム溶液を−７０℃で凍結してから３７℃の水浴で再解凍した（６回繰返した）（Yagi et al.，2000）。粒径分布は、０．２２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタ（Verma et al.，2003，Zhua et al.，2007）を通り抜けるようにゆっくり押出すことにより得られた。得られた試料を、４℃で２４時間安定化した。５ｍＬの安定化したナノリポソームを含有する１５ｍＬのチューブは、窒素ガスに浴びられ、蓋をし、次いで、ナノリポバブル（ＮＬＢ）を形成するために、浴式超音波処理器に５分間放置した。
【００５０】
ナノリポバブルの表面への合成ペプチドリガンドの共有結合
ペプチド−ＰＥＧ−ナノリポバブルを調製した（Yagi et al.，2000；Janssen et al.，2003）。簡潔に言うと、まず、室温でＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ−ＣＯＯＨを有するナノリポバブル配合体をＮＨＳとＤＣＣの溶液により４時間活性化した。その後、適量の合成ペプチド（ＫＶＬＦＬＭ−ＮＨ２（配列識別番号：１）、ＫＶＬＦＬＳ−ＮＨ２（配列識別番号：２）またはＫＶＬＦＬＴ−ＮＨ２（配列識別番号：３））を処理したナノリポバブルに７５：１（ｍｇ）の比率で添加した。室温で一晩撹拌して結合反応を行った。次いで、溶媒を６５℃の温度に維持された水浴上で２〜３時間の回転蒸発によって蒸発した。次いで、結合されなかった合成ペプチドリガンドを除去するために、SnakeSkin（商標）プリーツ透析チューブ（10,000 MWCO，シグマ−アルドリッチ 社）を用いて、溶液をＰＢＳで２４時間透析した。その後、標的ナノリポバブルを凍結・解凍技術によって安定化した。粒径分布は、０．２２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタを通り抜けるようにゆっくり押出すことにより得られた。その後、標的ナノリポバブルは、使用されるまで４℃で保管された。
【００５１】
標的ナノリポバブルの物理化学特性の評価
粒径および粒径分布の測定
合成ペプチドリガンドと、非標的ナノリポバブルと、標的ナノリポバブルとの粒径および粒径分布を、ゼータサイザーナノＺＳ計器（マルバーンインスツルメンツ（Ｐｔｙ）社、英国ウースターシャー州）を用いて２５℃で分析した。分析前に、試料を脱イオン水に懸濁させ、次いで０．２２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタを通り抜けるように押出した。各分析を同じ方法で３回実施した。
【００５２】
ゼータ電位の測定
標的ナノリポバブルのゼータ電位を、ゼータサイザーナノＺＳ計器（マルバーンインスツルメンツ（Ｐｔｙ）社、英国ウースターシャー州）を用いて２５℃で分析した。分析前に、試料を脱イオン水に懸濁させ、次いで０．２２μｍ孔径のポリカーボネート膜フィルタを通り抜けるように押出した（同じ方法で３回実施した）。
【００５３】
フーリエ変換赤外分光分析
ナノリポバブルの面に結合した合成ペプチドリガンドの潜在的相互作用を特徴付けるために、標的ナノリポバブルに対しフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光光度法を実施した。試料を、ＯＭＮＩＣ  ＦＴＩＲリサーチグレードソフトウエアと連動するNicolet Impact 400D  ＦＴＩＲ分光光度計（ニコレット・インスツルメント社、米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いて４０００〜４００ｃｍ−１の間で変動する波数で高解像度で分析した。
【００５４】
示差走査熱量（ＤＳＣ）分析
ＤＳＣ実験を、メトラー・トレドＤＳＣシステム（ＤＳＣ−８２３、メトラー・トレド社、スイス）により行った。バージョン９．ｘのメトラーＳＴＡＲｅソフトウェアシステムを使用してデータを収集し、インジウムを使用して機器を較正した。試料（ｍｇ）をＤＳＣ標準アルミニウム試料容器に移し、密封した。試料を、８ｋＰａ窒素雰囲気下で、１０℃／分の速度で０〜２５０℃の温度範囲に加熱することにより分析した。各実験を３回繰返した。
【００５５】
神経細胞培養研究
ＰＣ１２細胞株は、原発性神経分化のモデル系として使用され、ドブネズミの褐色細胞腫（Greene and Tischler，1976）から得られ、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ、日本大阪府）から購入された。細胞を、５％のウシ胎児血清、１０％のウマ血清（両方とも熱不活性化）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ−アルドリッチ ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌグルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含有する）中で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気の培養器において３７℃に維持した。細胞を７５ｃｍ組織培養フラスコ中で培養または保存した。
【００５６】
細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイのため、異なる試料を添加する前に、ＰＣ１２細胞を１ウェル当り１０，０００個細胞の密度で平底の９６−ウェルプレートに播種し、一晩放置した。細胞生存率を評価するため、まず、ＰＣ１２細胞を異なる濃度（０．１、１および１０ｍｇ／ｍＬ）の合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：１）またはＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：２）で処理し、その後、１ｍｇ／ｍＬ濃度の非標的ナノリポバブルと合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＭまたはＫＶＬＦＬＳ）により標的されたナノリポバブルで処理した。次いで、プレートをＣＯ２培養器において３７℃で０時間および２４時間培養した。０時間および２４時間での細胞毒性を測定するために、５０μＬのCytoTox-Glu（商標）細胞毒性アッセイ試薬を各ウェルに添加した。プレートを直ちに室温で１５分間培養し、死滅細胞信号を、Victor  Ｘ３照度計（パーキンエルマー社、米国マサチューセッツ州ウェルズリー市）で測定した。０時間および２４時間での細胞生存率を測定するため、５０μＬの溶解試薬を各ウェルに添加し、細胞を完全溶解した。次いで、プレートを室温でさらに１５分間培養し、生細胞の信号を、Victor  Ｘ３照度計（Victor  Ｘ３、パーキンエルマー社、米国）で測定した。生存細胞の比率は、以下の式を用いて計算した。
【００５７】
【数１】
2015013906.tif 000003
【００５８】
式中、Ｘ％の平均ルミネセンスは、さまざまな製剤、またはペプチドリガンドまたは標的ナノリポバブルで処理された細胞のルミネセンス値である。ブランクの平均ルミネセンス（すなわち、細胞を含まない空のウェル内の１００μＬの培地に添加された５０μＬの底質のルミネセンス）および対照の平均ルミネセンスは、CytoTox-Glo（商標）ＣＴＣＡ試薬（すなわち、５０μＬの底質）で培養され、処理されなかった細胞のルミネセンス値である。
【００５９】
標的ナノリポバブルのエクスビボ（ex vivo）取込み
ex vivo追跡を可能にするために、標的ナノリポバブルをローダミンなどの蛍光タグで標識した。ＰＣ１２細胞を１０，０００細胞密度で滅菌ＮＡＮＣ９６−ウェルプレート（Sepsic社、南アフリカ）に播種した。２日目に、ＰＣ１２細胞を、ローダミンにより標識された、標的ナノリポバブルおよび非標的ナノリポバブルまたはＮＬＰとともに、３７℃で０時間、１２時間および２４時間培養した。得られた試料を、４℃で１０，０００ｇで２０分間遠心分離した。水性相を除去し、ローダミン蛍光均等物に関連付けられた量は、Victor  Ｘ３蛍光光度計（パーキンエルマー社、米国マサチューセッツ州ウェルズリー市）で測定した。
【００６０】
キトサン／オイドラギット／アルギン酸ナトリウム多孔質骨格の調製
オイドラギットＲＳ−ＰＯ溶液をアルギン酸ナトリウムの水溶液にゆっくり添加し、４時間攪拌した。その後適量の混合物をキトサン溶液に添加し、さらに２４時間撹拌した。また、脱イオン水分子をキトサン／オイドラギット／アルギン酸ナトリウム溶液に１：１０（Ｖ／Ｖ）の比率で添加した。混合された溶液をペトリ皿（直径１０ｍｍ、高さ５ｍｍ）に注いでから−７０℃の凍結装置で４８時間凍結し、その後２４時間凍結乾燥した（Virtis凍結乾燥機、Virtis（登録商標）、ニューヨーク市ガーディナー）。次いで、このポリマー骨格の試料を両面粘着カーボンテープで金属スタブに取付けてから、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＥＯＬ、日本東京都）で分析した。その後、顕微鏡写真を生成する前に、スパッタコーティングによりポリマー骨格に金の薄層を９０秒間コーティングした。
【００６１】
標識されたナノリポバブルの多孔質骨格内へのカプセル化およびその分布
ナノリポバブルを攪拌しながら多孔質骨格内に挿入した後、標識されたナノリポバブルの多孔質骨格内へのカプセル化およびその分布を評価した。試料混合物を−７０℃で２４時間以上冷凍した後、２５mTorr（Virtis（登録商標）、米国ニューヨーク市ガーディナー）でさらに２４時間凍結乾燥した。標識されたナノリポバブルの多孔質骨格内へのカプセル化と分布の研究は、共焦点顕微鏡を用いてモニタリングした。
【００６２】
多孔質骨格から標的ナノリポバブルのインビトロ（in vitro）放出
多孔質骨格内に予めカプセル化され、ローダミン標識したナノリポバブルの試料を２０ｍＬのＰＢＳ液（ｐＨ７．４、３７℃）に浸漬し、振とう培養器（Labex  Stuart  ＳＢＳ４０（登録商標）、南アフリカハウテン州）を用いて２０ｒｐｍで撹拌した。０、１０、２０および３０日目に、試料を分析のために取出した。
【００６３】
結果と考察
標的ナノリポバブルの物理化学特性
粒径分布およびゼータ電位で表した標的ナノリポバブルの物理化学特性を、動的光散乱測定（ゼータサイザーナノＺＳ、マルバーンインスツルメンツ社）の標準方法を用いて調べた。図１に示すように、非標的ナノリポバブルの直径は、１２９±１４ｎｍの範囲にあった。単独の合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２））の直径は、３６６±４１ｎｍの範囲にあった。１ｍｏｌ％の線形の合成ペプチドリガンドを円形の非標的ナノリポバブルに組込んでまたは結合して標的ナノリポバブルを生成すると、非標的ナノリポバブルに比べ、その粒径分布が１２９ｎｍから２７０ｎｍに増加した。このことは、合成ペプチドリガンドを非標的ナノリポバブルの表面に首尾よく組込んだことを裏付ける。標的ナノリポバブルの総ゼータ電位または表面電荷は、−２９ｍＶであった。
【００６４】
標的ナノリポバブルの構造変化の評価
ＦＴＩＲスペクトルは、リン脂質、リポソームおよび合成ペプチドリガンドの化学官能基のＩＲスペクトル、振動および性質を得るのに用いられる最も強力な化学分析技術の１つである（Weers and Sceuing，1991）。非標的ナノリポバブルおよび標的ナノリポバブルにおける潜在的相互作用を特徴付けるために、Nicolet Impact 400D ＦＴＩＲ分光光度計を用いてＦＴＩＲスペクトルを測定した。図２は、非標的ナノリポバブルおよびＫＶＬＦＬＭ合成ペプチド（配列識別番号：１）を有する標的ナノリポバブルの分子構造変化を証明した。図３は、非標的ナノリポバブルおよびＫＶＬＦＬＳ合成ペプチド（配列識別番号：２）を有する標的ナノリポバブルの分子構造変化を証明した。全体的には、これらの結果は、ナノリポバブルと合成ペプチドリガンドとの間に相互作用があったことおよび新規の標的ナノリポバブルが形成されたことを証明した。
【００６５】
示差走査熱量測定
メトラー・トレドＤＳＣ装置（ＤＳＣ−８２３、メトラー・トレド社、スイス）を用いて、ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、非標的ナノリポバブルおよび標的ナノリポバブルのＤＳＣの研究を行った。図４に示すように、ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、非標的ナノリポバブルおよび標的ナノリポバブルは、試料を１０℃／分の速度で０から２５０℃まで加熱する期間中、異なるＤＳＣサーモグラムを示した。純粋のＤＳＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧの前転移または吸熱転移ピークが非標的ナノリポバブルにおいて根絶されたことは、ナノリポバブルが著しく形成されたことを示唆する。１ｍｏｌ％の合成ペプチドリガンドの添加は、非標的ナノリポバブルの吸熱転移ピークを広げた。これらの結果は、合成ペプチドリガンドとペグ化された非標的ナノリポバブルの表面との間に相互作用が存在することを裏付ける。
【００６６】
標的ナノリポバブルのエクスビボ（ex vivo）細胞毒性研究
細胞毒性研究のために、標的ナノリポバブル、合成ペプチドリガンド、非標的ナノリポバブルおよびＮＬＰのＰＣ１２細胞株に対する細胞毒性を、Victor  Ｘ３機器を用いて評価した。図５に示すように、標的ナノリポバブル、単独の合成ペプチドリガンド、非標的ナノリポバブルおよびＮＬＰは、２４時間培養後、ＰＣ１２細胞株に対して異なる細胞毒性を示した。増加した細胞の死亡率が０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの異なる合成ペプチド濃度で検出されたが、単独のＰＣ１２細胞株と比較して、細胞増殖の低い抑制を示した。
【００６７】
標的ナノリポバブルのエクスビボ（ex vivo）取込み
ローダミン標識した非標的ナノリポバブルおよび合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１）およびＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２））を有する標的ナノリポバブルに対し、ＰＣ１２細胞株内への取込みまたは送達能力をVictor  Ｘ３機器により研究した。図６に示すように、０時間、１２時間、２４時間における標的ナノリポバブルの蛍光活性は、ＰＣ１２細胞株から最も効率的に検出された。非標的ナノリポバブルは、最小蛍光活性を示した。このことは、ＫＶＬＦＬＭおよびＫＶＬＦＬＳにより標的したナノリポバブルの強化された細胞取込みがＰＣ１２細胞株の表面上に過剰発現のＳＥＣ−Ｒ受容体により、高取込み効率で特異的に媒介されたことを示唆している。
【００６８】
骨格の形態
ポリマー骨格の表面形態をＳＥＭで調べた。図７は、異なる倍率（１３６０倍および２７６０倍）でキトサン／オイドラギット／アルギン酸ナトリウム多孔質骨格のＳＥＭ顕微鏡写真を示している。気孔は、大きさ上および形状上比較的均一であった。
【００６９】
骨格内におけるナノリポバブルのカプセル化およびその分布を確認するための共焦点顕微鏡検査
多孔質骨格内部へのナノリポバブルのカプセル化およびその分布を確認するために、共焦点顕微鏡検査を行った。図８は、キトサン／オイドラギットＲＳ−ＰＯ／アルギン酸ナトリウム多孔骨格内のローダミン標識したナノリポバブルの強い蛍光を示している。ＣＬＳＭ顕微鏡写真は、表面から深部までの多孔質骨格の内部全体に亘るローダミン標識したナノリポバブルの分布を示している。骨格のみからは、ローダミンの蛍光が観察されなかった。これらの結果は、ナノリポバブルが多孔質骨格に効率的に内在化されたことを証明する。蛍光パターンは、ナノリポバブルが多孔質骨格内に組込まれた後でも無傷な小胞であることを裏付けている。
【００７０】
実施例２：統合失調症を治療するための薬物送達デバイス
材料および方法
材料
本研究で利用されるポリマーは、改良界面反応によって合成されたポリアミド６，１０を含む。ヘキサメチレンジアミン（ＭＷ＝１１６．２ｇ／ｍｏｌ）、塩化セバコイル（ＭＷ＝２３９．１ｇ／ｍｏｌ）、無水ｎ−ヘキサン、無水臭化カリウム、塩酸アミトリプチリン、無水水酸化ナトリウムペレットは、ポリアミド６，１０の合成に使用された。上記単量体、エチルセルロース、ポリカプロラクトン、モデル薬物としてのクロルプロマジン塩酸塩、およびタラ肝油Ｂ．Ｐ．は、シグマケミカル社（米国ミズーリ州セントルイス市）から購入された。使用された他のすべての化学品は、分析グレードの市販ものであった。
【００７１】
植込可能なポリマー膜の調製
改良浸漬析出反応により、ポリマー膜を調製した。まず、改良界面重合反応（Kolawoleet al．，2007）を用いて合成した２００ｍｇの新規なポリアミド６，１０を２ｍｌのギ酸に溶かした。この溶液を３０００ｒｐｍで磁気攪拌し、全てのポリアミド６，１０が溶解するまで、６５℃に昇温した。１ｍｌのアセトンに溶解された２００ｍｇのエチルセルロースを含む別の溶液を調製した。３０００ｒｐｍで磁気攪拌しながら、ポリアミド−ギ酸溶液をエチルセルロース−アセトン溶液に添加した。攪拌は、均質溶液が形成されるまで続けられた。溶液を約１時間さらに撹拌した。攪拌が完了した時点から、約１０分間溶液を静置させた。その後、５ｍｌの二重脱イオン水を溶液に添加した。これにより、界面で白色ゲル状沈殿物を形成した。二重脱イオン水を連続添加しながら、沈殿物をブフナー器具で濾過して収集した。濾過により収集した沈殿物を適切に成形し、換気フードの下で２４時間乾燥した。得られた膜は、規則的で円形であり、表面に気孔があった。代わりに、膜を成形した後、−７０℃で４８時間凍結してから、４８時間凍結乾燥させることにより、高度な多孔率を有する骨格のような膜デバイスを作成することもできる。図９は、南アフリカ硬貨５ランド（左）と１０セント（右）に対して、この方法に従って形成されたデバイスの大きさを示している。
【００７２】
ＦＴＩＲ分光光度分析
製剤中の任意の相互作用により、ポリマー膜骨格において生じた任意の構造変化を評価するために、得られた骨格に対しフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法を行った。スペクトル１００ＦＴＩＲ分光計（パーキンエルマー社ライフサイエンス事業部、米国コネチカット州シェルトン市）を使用して、赤外光の相互作用に応答することにより、試料中の化学官能基の振動特性を検出した。
【００７３】
ポリマー膜の形態解析
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって表面形態を解析した。異なる倍率で顕微鏡写真を撮影した。試料は、金でスパッタコーティングしてから調製された。膜の形態解析は、デバイスの形状、表面形態および構造を明らかにした。
【００７４】
骨格の物理機械的性質の測定
テクスチャ解析を使用して、ブリネル硬さおよび変形エネルギーに基づいて、骨格の物理機械的特性を決定した。試験は、較正したTA.XT  plus  テクスチャ分析器（ステイブル・マイクロシステムズ、英国）を用いて行われた圧痕試験であった。圧痕試験では、圧迫を引起こす急激な衝撃を骨格に加え、形成された圧痕の体積によって硬さを測定する。分析器には、圧迫を引起こして骨格に圧痕を引起こすブリネル硬さプローブと呼ばれるスチール製プローブを取り付けた。分析に用いたパラメータ設定は、以下の表１にまとめられる。
【００７５】
【表１】
2015013906.tif 000004
【００７６】
タラ肝油で充填されたナノリポシェルの調製
改良溶融分散法を用いて、クロルプロマジン担持のナノリポシェルを調製した。６５℃で５００ｍｇのポリカプロラクトンを溶融した。溶融状態にある間、まず、０．１ｍｌのタラ肝油Ｂ．Ｐ．をポリカプロラクトンに添加した。次いで、５０ｍｇの塩酸クロルプロマジンを添加して分散を行った。適切に分散したら、ポリカプロラクトン−タラ肝油−クロルプロマジン分散液を換気フードの下に置くことによって固化させ融合させた。融合させた後、固体部分を造粒して、粒子をポリソルベート溶液に懸濁した。その後、２０００ｒｐｍの均質化処理および８０アンペアで５分間の超音波処理を行った。得られたナノリポシェルを、−７０℃で４８時間凍結してから、４８時間凍結乾燥した。
【００７７】
結果と考察
ＦＴＩＲ分光光度分析
ポリアミド６，１０とエチルセルロース、および改良浸漬析出反応により合成されたポリアミド−エチルセルロース膜の両方に対し、構造解析を実施した。結果は、改良浸漬析出反応によって生成された膜におけるポリアミドおよびエチルセルロース両方の官能基の組合わせの存在性および整合性を証明した（図１１）。したがって、本発明に係る新規なポリアミドエチルセルロース植込み式膜デバイスの形成が証明された。
【００７８】
ポリマー膜の形態的特徴
図１２は、さまざまな倍率で新規なポリマー膜のＳＥＭ像を示している。膜は不規則かつ高度に多孔質であるように見える。
【００７９】
薬物封入効率試験
ナノリポシェル製剤中において封入された薬物の度合いを評価するために、ナノリポシェルの薬剤担持率を測定した。ナノリポシェルをＰＢＳ液（ｐＨ７．４）に溶解させ、構築された標準曲線に対して紫外分光光度計（セシルＣＥ３０２１、セシル・インスツルメンツ（株）、英国ケンブリッジ市ミルトン）を用いて評価した。
【００８０】
【数２】
2015013906.tif 000005
【００８１】
クロルプロマジンを担持したナノリポシェルのポリマー：薬物比が５：１であるとき、４０％という最大の平均薬物封入効率（ＤＥＥ）値が計算された。ポリカプロラクトン濃度が低い場合、ＤＥＥが著しく低かった。４０％という平均ＤＥＥ値は十分である。
【００８２】
動的光散乱法によるナノリポシェルの粒径測定
調製されたナノリポシェルの平均粒径および粒径分布、ならびにそれらのゼータ電位および分子量は、動的光散乱技術を組込んだゼータサイザーナノＺＳ（マルバーンインスツルメンツ社、英国ウースターシャー州マルバーン市）を用いて、３７℃でさまざまな角度で測定された。クロルプロマジンを担持しない予備ナノリポシェルおよびクロルプロマジンを担持したナノリポシェル（図１３）に対し、ナノ粒子のＺ平均粒径が約１００ｎｍであることを記録した。この粒径は、神経ナノ薬剤学の治療粒径範囲にあるため、十分である。
【００８３】
結論
ポリアミド−エチルセルロース骨格は、成功裏にに合成され、容易に破損することを示す証拠はなかった。得られた骨格は、滑らかで規則的であり、一致した粒径を有した。クロルプロマジン担持のナノリポシェルも成功裏に調製されたが、ＤＥＥ値がやや低いように見える。今後は、ＤＥＥの最適化、および薬剤担持のナノリポシェルを骨格内に組込むことに基づき、研究を行う予定である。この研究が完成したら、体外薬物放出試験を実施し、薬物放出の度合いおよび持続時間を測定する。
【００８４】
参考文献
［参考文献］
2015013906.tif 000006
【００８５】
2015013906.tif 000007
【００８６】
2015013906.tif 000008
【００８７】
2015013906.tif 000009
【図１】
2015013906.tif 000010
【図２】
2015013906.tif 000011
【図４】
2015013906.tif 000012
【図５】
2015013906.tif 000013
【図６】
2015013906.tif 000014
【図１０】
2015013906.tif 000015
【図１１】
2015013906.tif 000016
【図１３】
2015013906.tif 000017
【図７】
2015013906.tif 000018
【図８】
2015013906.tif 000019
【図９】
2015013906.tif 000020
【図１２】
2015013906.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態に係る標的ナノリポバブル（ＮＬＢ）の特性を粒径分布およびゼータ電位により示す図であり、（Ａ）は、非標的ナノリポバブルの粒径分布プロファイルであり、（Ｂ）は、合成ペプチドリガンドのみの粒径分布プロファイルであり、（Ｃ）は、標的ナノリポバブルの粒径分布プロファイルであり、（Ｄ）は、標的ナノリポバブルの全体のゼータ電位分布プロファイルである。
【図２】合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１））を有する標的ナノリポソーム（ＮＬＰ）のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、非標的ナノリポバブル、および合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２））を有する標的ナノリポバブルのＤＳＣサーモグラムを示す図である。
【図４】合成ペプチドにより標的されたナノリポバブル、非標的ナノリポバブルとナノリポソームとの細胞毒性を示す図である。
【図５】ローダミンにより標識された、非標的ナノリポバブルと標的ナノリポバブルとの蛍光プロファイルを示す図である。
【図６】キトサン／オイドラギットＲＳ−ＰＯ／アルギン酸ナトリウムのポリマーマトリクス骨格の表面の走査電子顕微鏡観察像を異なる倍率（１３６０倍および２７６０倍）で示す図である。
【図７】ローダミンにより標識された、多孔質ポリマーマトリクス骨格における標的ナノリポバブルの共焦点蛍光顕微鏡写真を示す図であり、（Ａ）は、多孔質骨格のみの共焦点蛍光顕微鏡写真であり、（Ｂ）は、多孔質骨格における、ローダミンにより標識された標的ナノリポバブルの分布を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図８】本発明のポリマー植込式デバイスの相対的な大きさを示す図である。
【図９】実施例２に係るポリマーデバイスの中心における力−距離のプロファイルを示す図である。
【図１０】改良浸漬析出反応により合成された、実施例２に係るポリアミド６，１０、エチルセルロースおよびポリアミド−エチルセルロースデバイスのＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図１１】実施例２に係るポリマーデバイスのＳＥＭ像をさまざまな倍率で示す図である。
【図１２】実施例２に係るクロルプロマジン担持のナノリポシェルの粒径分布プロファイルを示す典型的強度プロファイルの図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2015013906.tif 000022
【図２】
2015013906.tif 000023
【図３】
2015013906.tif 000024
【図４】
2015013906.tif 000025
【図５】
2015013906.tif 000026
【図６】
2015013906.tif 000027
【図７】
2015013906.tif 000028
【図８】
2015013906.tif 000029
【図９】
2015013906.tif 000030
【図１０】
2015013906.tif 000031
【図１１】
2015013906.tif 000032
【図１２】
2015013906.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
標的ナノリポバブルの構造変化の評価
ＦＴＩＲスペクトルは、リン脂質、リポソームおよび合成ペプチドリガンドの化学官能基のＩＲスペクトル、振動および性質を得るのに用いられる最も強力な化学分析技術の１つである（Weers and Sceuing，1991）。非標的ナノリポバブルおよび標的ナノリポバブルにおける潜在的相互作用を特徴付けるために、Nicolet Impact 400D ＦＴＩＲ分光光度計を用いてＦＴＩＲスペクトルを測定した。図２は、非標的ナノリポバブルおよびＫＶＬＦＬＭ合成ペプチド（配列識別番号：１）を有する標的ナノリポバブルの分子構造変化を証明した。この結果は、ナノリポバブルと合成ペプチドリガンドとの間に相互作用があったことおよび新規の標的ナノリポバブルが形成されたことを証明した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
示差走査熱量測定
メトラー・トレドＤＳＣ装置（ＤＳＣ−８２３、メトラー・トレド社、スイス）を用いて、ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、非標的ナノリポバブルおよび標的ナノリポバブルのＤＳＣの研究を行った。図３に示すように、ＤＳＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、非標的ナノリポバブルおよび標的ナノリポバブルは、試料を１０℃／分の速度で０から２５０℃まで加熱する期間中、異なるＤＳＣサーモグラムを示した。純粋のＤＳＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＳＰＥ−ｍＰＥＧの前転移または吸熱転移ピークが非標的ナノリポバブルにおいて根絶されたことは、ナノリポバブルが著しく形成されたことを示唆する。１ｍｏｌ％の合成ペプチドリガンドの添加は、非標的ナノリポバブルの吸熱転移ピークを広げた。これらの結果は、合成ペプチドリガンドとペグ化された非標的ナノリポバブルの表面との間に相互作用が存在することを裏付ける。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
標的ナノリポバブルのエクスビボ（ex vivo）細胞毒性研究
細胞毒性研究のために、標的ナノリポバブル、合成ペプチドリガンド、非標的ナノリポバブルおよびＮＬＰのＰＣ１２細胞株に対する細胞毒性を、Victor  Ｘ３機器を用いて評価した。図４に示すように、標的ナノリポバブル、単独の合成ペプチドリガンド、非標的ナノリポバブルおよびＮＬＰは、２４時間培養後、ＰＣ１２細胞株に対して異なる細胞毒性を示した。増加した細胞の死亡率が０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの異なる合成ペプチド濃度で検出されたが、単独のＰＣ１２細胞株と比較して、細胞増殖の低い抑制を示した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
標的ナノリポバブルのエクスビボ（ex vivo）取込み
ローダミン標識した非標的ナノリポバブルおよび合成ペプチドリガンド（ＫＶＬＦＬＭ（配列識別番号：１）およびＫＶＬＦＬＳ（配列識別番号：２））を有する標的ナノリポバブルに対し、ＰＣ１２細胞株内への取込みまたは送達能力をVictor  Ｘ３機器により研究した。図５に示すように、０時間、１２時間、２４時間における標的ナノリポバブルの蛍光活性は、ＰＣ１２細胞株から最も効率的に検出された。非標的ナノリポバブルは、最小蛍光活性を示した。このことは、ＫＶＬＦＬＭおよびＫＶＬＦＬＳにより標的したナノリポバブルの強化された細胞取込みがＰＣ１２細胞株の表面上に過剰発現のＳＥＣ−Ｒ受容体により、高取込み効率で特異的に媒介されたことを示唆している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
骨格の形態
ポリマー骨格の表面形態をＳＥＭで調べた。図６は、異なる倍率（１３６０倍および２７６０倍）でキトサン／オイドラギット／アルギン酸ナトリウム多孔質骨格のＳＥＭ顕微鏡写真を示している。気孔は、大きさ上および形状上比較的均一であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
骨格内におけるナノリポバブルのカプセル化およびその分布を確認するための共焦点顕微鏡検査
多孔質骨格内部へのナノリポバブルのカプセル化およびその分布を確認するために、共焦点顕微鏡検査を行った。図７は、キトサン／オイドラギットＲＳ−ＰＯ／アルギン酸ナトリウム多孔骨格内のローダミン標識したナノリポバブルの強い蛍光を示している。ＣＬＳＭ顕微鏡写真は、表面から深部までの多孔質骨格の内部全体に亘るローダミン標識したナノリポバブルの分布を示している。骨格のみからは、ローダミンの蛍光が観察されなかった。これらの結果は、ナノリポバブルが多孔質骨格に効率的に内在化されたことを証明する。蛍光パターンは、ナノリポバブルが多孔質骨格内に組込まれた後でも無傷な小胞であることを裏付けている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
植込可能なポリマー膜の調製
改良浸漬析出反応により、ポリマー膜を調製した。まず、改良界面重合反応（Kolawoleet al．，2007）を用いて合成した２００ｍｇの新規なポリアミド６，１０を２ｍｌのギ酸に溶かした。この溶液を３０００ｒｐｍで磁気攪拌し、全てのポリアミド６，１０が溶解するまで、６５℃に昇温した。１ｍｌのアセトンに溶解された２００ｍｇのエチルセルロースを含む別の溶液を調製した。３０００ｒｐｍで磁気攪拌しながら、ポリアミド−ギ酸溶液をエチルセルロース−アセトン溶液に添加した。攪拌は、均質溶液が形成されるまで続けられた。溶液を約１時間さらに撹拌した。攪拌が完了した時点から、約１０分間溶液を静置させた。その後、５ｍｌの二重脱イオン水を溶液に添加した。これにより、界面で白色ゲル状沈殿物を形成した。二重脱イオン水を連続添加しながら、沈殿物をブフナー器具で濾過して収集した。濾過により収集した沈殿物を適切に成形し、換気フードの下で２４時間乾燥した。得られた膜は、規則的で円形であり、表面に気孔があった。代わりに、膜を成形した後、−７０℃で４８時間凍結してから、４８時間凍結乾燥させることにより、高度な多孔率を有する骨格のような膜デバイスを作成することもできる。図８は、南アフリカ硬貨５ランド（左）と１０セント（右）に対して、この方法に従って形成されたデバイスの大きさを示している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
結果と考察
ＦＴＩＲ分光光度分析
ポリアミド６，１０とエチルセルロース、および改良浸漬析出反応により合成されたポリアミド−エチルセルロース膜の両方に対し、構造解析を実施した。結果は、改良浸漬析出反応によって生成された膜におけるポリアミドおよびエチルセルロース両方の官能基の組合わせの存在性および整合性を証明した（図１０）。したがって、本発明に係る新規なポリアミドエチルセルロース植込み式膜デバイスの形成が証明された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ポリマー膜の形態的特徴
図１１は、さまざまな倍率で新規なポリマー膜のＳＥＭ像を示している。膜は不規則かつ高度に多孔質であるように見える。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
動的光散乱法によるナノリポシェルの粒径測定
調製されたナノリポシェルの平均粒径および粒径分布、ならびにそれらのゼータ電位および分子量は、動的光散乱技術を組込んだゼータサイザーナノＺＳ（マルバーンインスツルメンツ社、英国ウースターシャー州マルバーン市）を用いて、３７℃でさまざまな角度で測定された。クロルプロマジンを担持しない予備ナノリポシェルおよびクロルプロマジンを担持したナノリポシェル（図１２）に対し、ナノ粒子のＺ平均粒径が約１００ｎｍであることを記録した。この粒径は、神経ナノ薬剤学の治療粒径範囲にあるため、十分である。