(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、ヌクレアーゼ耐性を備えるＲＮＡ分子を簡便に製造するための手段を提供するものである。【解決手段】  本発明は下記の一般式１５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、当該ＲＮＡ分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
【請求項２】
下記、一般式２
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式２においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、当該ＲＮＡ分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
【請求項３】
下記、一般式３
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式３においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１５はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４、Ｘ１４はそれぞれ独立にウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、当該ＲＮＡ分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
【請求項４】
５’末端側に存在する下記、一般式４
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-５’
（一般式４においてＸ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、３’末端側に存在する下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、それらのＲＮＡ分子の間に存在する１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
【請求項５】
５’末端側に存在する下記、一般式５
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-３’
（一般式５においてＸ１５はアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ１６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、３’末端側に存在する下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、それらのＲＮＡ分子の間に存在する１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡ分子が２０個〜９５個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ分子が４０個〜９０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ分子が５０個〜８０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ分子が、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ，ガイドＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ、からなる群から選択されるＲＮＡ分子である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ分子が短ヘアピンＲＮＡである、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、当該ＲＮＡ分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含む、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
【請求項１２】
下記、一般式２
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式２においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、当該ＲＮＡ分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含む、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
【請求項１３】
下記、一般式３
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式３においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１５はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４、Ｘ１４はそれぞれ独立にウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含む、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
【請求項１４】
５’末端側に存在する下記一般式４
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-５’
（一般式４においてＸ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。）
と、３’末端側に存在する下記一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
の間に、１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
【請求項１５】
下記、一般式５
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-３’
（一般式５においてＸ１５はアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ１６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。）
と、３’末端側に存在する下記一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
の間に、１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含み、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ分子が２０個〜９５個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、請求項１１〜請求項１５のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記ＲＮＡ分子が４０個〜９０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、請求項１１〜請求項１６のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ＲＮＡ分子が５０個〜８０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、請求項１１〜請求項１７のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記ＲＮＡ分子が、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ，ガイドＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ、からなる群から選択されるＲＮＡ分子である、請求項１１〜請求項１８のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記機能性ＲＮＡ分子が短ヘアピンＲＮＡである、請求項１１〜請求項１９のいずれか１項に記載のキメラＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はRNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法に関する。更に本発明はヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．機能性RNAの核酸医薬としての利用に関する問題点
近年、アプタマーやリボザイム、small interfering RNA（siRNA）などの機能性RNAが遺伝子発現制御機能を有していることから、それらを医薬品としての応用することが期待されている。しかし、一般的にRNAは生体内に存在するRNA分解酵素(リボヌクレアーゼ、以降RNaseと表記)により速やかに分解されてしまうという欠点を有しており、RNase耐性化は機能性RNAを医薬品として使用する上で特に重要な課題となっている。
【０００３】
現在実用化されている核酸医薬は化学修飾を施した人工核酸によって構成されている。具体的な例としては、加齢黄斑変性症の治療薬として実用化されているアプタマー医薬（マクジェン）は、ピリミジン塩基の２’位にフッ素置換を、更にプリン塩基の２’位にOMe置換を施した化学修飾型の人工RNA（非特許文献１）である。また上記のアプタマー医薬には５’末端にポリエチレングリコールが付加されており、通常の核酸にはない高い組織滞留性及び生体内安定性を有している。しかしこのような化学修飾を施したRNAを医薬として用いる場合、製造コストや手間の増大に伴う高価格化や非天然物質の使用による生体への副作用が懸念されるなどの問題があり、大量生産や医薬品としての安全性については難があり、まだまだ実用化は難しいといえる。
【０００４】
２．ハンマーヘッド型リボザイムについて
RNAを医薬として応用するアプローチの一つとして、リボザイムを用いる試みが行われている。リボザイムとはタンパク質同様に触媒能力を有するRNA分子の総称である。ハンマーヘッド型リボザイムは、その二次構造が金槌型をしていることから命名されたリボザイムの１種である。ハンマーヘッドリボザイムはマグネシウムイオン存在下で５’-ＧＮＸ-３’配列の３’側を切断する自己切断型ＲＮＡであることが知られている（非特許文献２、非特許文献３）。更に特定の配列を有するハンマーヘッドリボザイムがRNase耐性を有することを本発明者らは見出し、特許出願を行っている（特許文献１）。
【０００５】
加えて本発明者らは化学修飾の様な非天然物質を用いる方法以外の手法により、ハンマーヘッドリボザイムの生体内での安定化について鋭意研究を行い、血清ヌクレアーゼ耐性を示す直鎖状ハンマーヘッドリボザイム44R1を発見した（非特許文献４）。この知見は、膵臓由来のRNaseAファミリーを多量に含む血液中でRNAは速やかに分解されるというこれまでの知見を大きく覆すものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１６５６５３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bell, C., et al., In Vitro cell Dev. Biol. Anim., 35, 533-542 (1999).
【非特許文献２】Buzayan, J.M., Gerlach, W.L. and Bruening, G., Nature, 323, 349-352 (1986).
【非特許文献３】Forster, A.C. and Symons, R.H., Cell, 49, 211 (1987).
【非特許文献４】越智明徳  平成22年度  豊橋技術科学大学大学院修士論文.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は上記で述べたRNA医薬の問題点を解決するべく、ハンマーヘッドリボザイム44R1がRNaseに耐性を示す機構を解明することにより、核酸医薬にRNaseに耐性を付与する新たな方法を提供することである。本発明の方法により新たな核酸医薬を提供することができると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らのこれまでの研究により、44R1は複数のRNA分子が凝集することでRNase耐性を示すような高次構造を形成していることが明らかとなっている。更にこの凝集体構造は44R1の基質認識配列に依存して形成されることが示唆されている。図１に直鎖状ハンマーヘッドリボザイム44R1の二次構造を示す。図１において矢印は、ハンマーヘッドリボザイムのリボザイム活性による標的配列の切断部位を示す。アルファベットの小文字は44R1の、大文字は標的基質であるヒトテロメラーゼRNAの鋳型配列(hTRtemp配列)をそれぞれ示しており、灰色の枠で囲まれた配列は基質認識配列である。
【００１０】
そこで本発明者らは44R1の基質認識配列のみからなるRNA分子（５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１）を調製し、このRNA分子に対して末端塩基の欠損、置換あるいは内側配列置換を施した様々な変異体を調製して、それら変異体のRNase耐性を検討することにより、RNaseに対して抵抗性を示す配列について解析した。
【００１１】
更に本発明者らは、そのような基質認識配列あるいはその変異体を含む任意のRNA分子に（機能性RNAなどの）RNA分子を結合させたキメラRNA分子を作成することにより、該RNA分子にRNaseに対する分解抵抗性を付与できることを見出した。よって本発明は、そのようなアプローチによって、（機能性RNAなどの）RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法を提供するものである。更に本発明は、そのような方法により作製されたヌクレアーゼ耐性能を有するキメラRNA分子を提供するものである。
【００１２】
本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’（配列番号２）
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
［態様２］
下記、一般式２
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’ （配列番号３）
（一般式２においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
［態様３］
下記、一般式３
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’ （配列番号４）
（一般式３においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１５はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４、Ｘ１４はそれぞれ独立にウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
［態様４］
５’末端側に存在する下記、一般式４
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-５’
（一般式４においてＸ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、３’末端側に存在する下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、それらのＲＮＡ分子の間に存在する１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
［態様５］    
５’末端側に存在する下記、一般式５
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-３’
（一般式５においてＸ１５はアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ１６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、３’末端側に存在する下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、それらのＲＮＡ分子の間に存在する１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子を作製することを含む、該ＲＮＡ分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法。
［態様６］
前記ＲＮＡ分子が２０個〜９５個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、態様１〜態様５のいずれか１に記載の方法。
［態様７］
前記ＲＮＡ分子が４０個〜９０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、態様１〜態様６のいずれか１に記載の方法。
［態様８］
前記ＲＮＡ分子が５０個〜８０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、態様１〜態様７のいずれか１に記載の方法。
［態様９］
前記ＲＮＡ分子が、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ，ガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡおよびリボソームＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子である、態様１〜態様８のいずれか１に記載の方法。
［態様１０］
前記ＲＮＡ分子が短ヘアピンＲＮＡである、態様１〜態様９のいずれか１に記載の方法。
［態様１１］
下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’（配列番号２）
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含む、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
［態様１２］
下記、一般式２
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’ （配列番号３）
（一般式２においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含む、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
［態様１３］
下記、一般式３
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’（配列番号４）
（一般式３においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１５はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４、Ｘ１４はそれぞれ独立にウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１６はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるRNA分子と、当該RNA分子の５’末端に１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含む、ヌクレアーゼ耐性能を有するキメラＲＮＡ分子。
［態様１４］
５’末端側に存在する下記、一般式４
５’-Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-５’
（一般式４においてＸ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表す。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、３’末端側に存在する下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、それらのＲＮＡ分子の間に存在する１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子。
［態様１５］
５’末端側に存在する下記、一般式５
５’-Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ-３’
（一般式５においてＸ１５はアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１４はウラシルを表すか又は欠損しており、Ｘ１６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ７、Ｘ８はそれぞれ独立にグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ独立にウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表し、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立にグアニンを表すか又は欠損しており、Ｘ１３はウラシルまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、３’末端側に存在する下記、一般式１
５’-ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６-３’
（一般式１においてＸ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立にアデニンを表すか又は欠損しており、Ｘ４はウラシルの塩基を表すか又は欠損しており、Ｘ５、Ｘ６はグアニンまたはアデニンのいずれかの塩基を表すか又は欠損している。但し、Ｘ５とＸ６が欠損しており且つＸ４がウラシルであることはない。）
を含む塩基配列からなるＲＮＡ分子と、それらのＲＮＡ分子の間に存在する１個〜１００個の塩基配列からなるＲＮＡ分子を含むキメラＲＮＡ分子。
［態様１６］
前記ＲＮＡ分子が２０個〜９５個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、態様１１〜態様１５のいずれか１に記載のキメラＲＮＡ分子。
［態様１７］
前記ＲＮＡ分子が４０個乃至９０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、態様１１〜態様１６のいずれか１に記載のキメラＲＮＡ分子。
［態様１８］
前記ＲＮＡ分子が５０個乃至８０個の塩基配列からなるＲＮＡ分子である、態様１１乃至態様１７のいずれか１に記載のキメラＲＮＡ分子。
［態様１９］
前記ＲＮＡ分子が、短ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ，ガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡおよびリボソームＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子である、態様１１〜態様１８のいずれか１に記載のキメラＲＮＡ分子。
［態様２０］
前記機能性ＲＮＡ分子が短ヘアピンＲＮＡである、態様１１〜態様１９のいずれか１に記載のキメラＲＮＡ分子。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、天然物質であるハンマーヘッドリボザイムに由来する配列を用いて、RNA分子（例えば機能性RNA分子）とのキメラRNA分子を作製することにより、該RNA分子に生体内安定性を付与することができる。よって非天然物質を用いた従来技術とは異なり、本発明の方法により作製されるキメラRNA分子は医薬などに応用するにあたり、生体への副作用や高価格という問題を有することがない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は直鎖状ハンマーヘッドボザイム44R1の二次構造を示す図である。
【図２】図２は本発明のアンチセンスRNAの配列を示す図である。
【図３】図３は短ヘアピンRNA1(shRNA)の末端へ44R1を付加したキメラRNAの構造のイメージを示す図である。
【図４】図４は44R1のステムループ部を短ヘアピンRNA1(shRNA)によって置き換えたキメラRNAの構造のイメージを示す図である。
【図５】図５はアンチセンスRNAおよび３’末端変異体調製用インサートDNAプライマーの塩基配列を示す図である。
【図６】図６は５’末端変異体、および内側変異体調製用インサートDNAプライマーの塩基配列を示す図である。
【図７】図７は３’末端変異体、５’末端変異体、および内側変異体塩基配列を示す図である。
【図８】図８はアンチセンスRNA及び変異体3d1の血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図９】図９は変異体3d2及び変異体3d3の血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】図１０は変異体AA及びAGの血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】図９は変異体AGの血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１２】図１２は変異体5d1及び変異体5d5の血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１３】図１３は変異体5d6及びヒト血清、タンパク質変性剤の電気泳動の結果を示す図である。
【図１４】図１４は変異体AAA及び変異体5GGAの血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１５】図１５は変異体mAAの血清処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１６】図１６はアンチセンスRNA及び変異体3d2、5d6のRNaseA処理後の電気泳動の結果を示す図である。
【図１７】図１７はshLuc.の構造を示す図である。
【図１８】図１８はshLuc.-AAAとshNeg.-AAAを作製する際に使用したプライマーセットの配列の構造を示す図である。
【図１９】図１９はshLuc.-AAAとshNeg.-AAAの血清処理による耐性の検討を行った結果を示す図である。
【図２０】図２０はキメラLuc.とキメラNeg.を作製する際に使用したプライマーセットの配列を示す図である。
【図２１】図２１はキメラLuc.とキメラNeg.について転写産物の解析を行った結果を示す図である。
【図２２】図２２はキメラLuc.の画分１と画分２のバンドにつき、分解状態の確認を行った図である。
【図２３】図２３はキメラNeg.の画分１と画分２のバンドにつき、分解状態の確認を行った図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記で述べたように本発明は、ハンマーヘッドリボザイム44R1の基質認識配列から得られた塩基配列を含む塩基配列の５’末端又は該塩基配列中に、RNA分子を有するキメラRNA分子を作製することにより、該RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法を提供するものである。キメラRNA分子の作製に使用される塩基配列はハンマーヘッドリボザイム44R1の基質認識配列から得られた塩基配列に限定されるものではなく、その配列が欠失又は置換し且つRNase分解耐性を有する、その変異体であってもよい。以下本発明の形態について詳細に説明する。
【００１６】
１．ハンマーヘッドリボザイム44R1に由来するアンチセンスRNAおよびその変異体について
本発明で使用する44R1の基質認識配列のみのRNAはヒトテロメラーゼRNAにおけるテロメア鋳型配列に対して相補的な塩基配列となるRNAである。以下本願明細書において、そのようなRNAを「本発明のアンチセンスRNA」と称する。
【００１７】
本発明のアンチセンスRNAの配列を図２に示す。図２においてアルファベットの小文字はアンチセンスRNAの塩基配列を、大文字はアンチセンスRNAの標的となるヒトテロメラーゼRNAの一部を、それぞれ示している。
【００１８】
下記の実施例１において本発明のアンチセンスRNA（５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１）の変異体のヌクレアーゼ耐性を検討した。３’末端の欠失変異体について検討をしたところ、３’末端のグアニンを１つ欠損した配列はヌクレアーゼ耐性を維持した。一方３’末端のグアニンを２つ欠損した配列は、ヌクレアーゼ耐性を示さなかった。３’末端のグアニンを２つ欠損した配列はまたヌクレアーゼ耐性を示した。３’末端の置換変異体について検討を行った結果、３’末端から１番目のグアニンをアデニンに置換した配列、２番目のグアニンをアデニンに置換した配列、及び３’末端から１番目と２番目のグアニンをアデニンに置換した配列はヌクレアーゼ耐性を維持した。更に本発明のアンチセンスRNAの配列において、３’末端から４番目から６番目の３つのアデニンもまた、ヌクレアーゼ耐性を維持したままで削除することが可能であると考えられる。
【００１９】
更に５’末端の欠失変異体について検討をしたところ、５’末端の配列の６個までの欠失はヌクレアーゼ耐性に影響せず、５’末端の配列を６個まで欠失した変異体はヌクレアーゼ耐性を維持した。このような結果から鑑みて、本願発明のアンチセンスRNAの基質認識配列において、ハンマーヘッドの５’側の配列よりも３’側の配列の方がヌクレアーゼ耐性において重要であると考えられる。
【００２０】
更にアンチセンスRNAの内側変異体のヌクレアーゼ耐性を検討したところ、５’末端から３番目のウラシルをアデニンに置換した変異体、５’末端から６番目から８番目のグアニンをアデニンに置換した変異体、および５’末端から９番目から１０番目のウラシルをアデニンに置換した変異体はヌクレアーゼ耐性を維持した。
【００２１】
以上の結果から本発明のアンチセンスRNAの配列において、３’末端から１番目と２番目の塩基はグアニンまたはアデニンのいずれかであるか又は欠損していてもよく、３’末端から３番目の塩基はウラシルであるか又は欠損していてもよく、３’末端から４番目から６番目の塩基はアデニンであるか又は欠損していてもよい。但し、３’末端から１番目と２番目の塩基が欠損しており、且つ３’末端から３番目の塩基がウラシルであることはない。
【００２２】
本発明のアンチセンスRNAの配列の変異体において、５’末端から１番目と２番目の塩基はグアニンであるか又は欠損していてもよく、５’末端から３番目の塩基はウラシルまたはアデニンであるか又は欠損していてもよく、５’末端から４番目の塩基はウラシルであるか又は欠損していてもよく、５’末端から５番目の塩基はアデニンであるか又は欠損しており、５’末端から６番目の塩基はグアニンまたはアデニンであるか又は欠損していてもよい。
【００２３】
更に本発明のアンチセンスRNAの配列の変異体において、５’末端から７番目と８番目の塩基はグアニンまたはアデニンであってもよく、５’末端から９番目と１０番目の塩基はウラシルまたはアデニンであってもよい。
【００２４】
本願明細書において本発明のアンチセンスRNAの変異体とは、上記で述べたような欠失・置換を有する変異体を意味するものである。本発明のアンチセンスRNAの変異体の具体的な例として、以下のような配列を挙げることができる。
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧ-３’：配列番号７
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡ-３’：配列番号８
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＡ-３’：配列番号９
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＡＡ-３’：配列番号１０
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＡＧ-３’：配列番号１１
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１２
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１３
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１４
５’-ＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１５
５’-ＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１６
５’-ＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１７
５’-ＧＧＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１８
５’-ＧＧＡＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’：配列番号１９
５’-ＧＧＵＵＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’ ：配列番号２０
２．本発明のアンチセンスRNAの構造及び結合の態様について
上記で述べたように本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体はそれ自身、RNaseによる分解に対して耐性を有している。本発明者らは鋭意検討した結果、本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体をRNA分子（機能性RNAなど）と結合させると、該RNA分子に対してヌクレアーゼ耐性を付与することを見出した。既に述べたように44R1は複数のRNA分子が凝集することで、RNase耐性を示すような高次構造を形成する。そしてそのような高次構造は44R1の基質認識配列に依存して形成されることが、これまでの研究により示唆されている。よって本発明の方法で、目的とするRNA分子（機能性RNAなど）と本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体が結合した場合にも、同様の凝集を起こすような高次構造を形成して分解耐性となると考えられる。
【００２５】
すなわち配列番号１から配列番号２１などに例示される本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体の塩基配列は、ギブス自由エネルギーが高いため、ほとんどワトソン−クリック型の塩基対を形成しないと考えられる。それゆえ、複数の同一配列が自己凝集することでエネルギー的に安定な状態、すなわち凝集体を形成すると考えられる。仮に、これらの５’側に他の機能性RNA配列等を付与したとしても、配列番号１から配列番号２１などに例示される本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体の塩基配列と塩基対を形成しなければ、この配列の局所的なギブス自由エネルギーが変化することはなく、その結果自己凝集が形成されることでRNA分解酵素耐性能が示されると考えられる。
【００２６】
本発明の第１の態様は、本発明のアンチセンスRNAの３’側から２番目から１１番目の塩基に相当するＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ（配列番号２１）またはその変異体を含む塩基配列とRNA分子とのキメラＲＮＡ分子を作製することにより、該RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法である。
【００２７】
本発明の第２の態様は、本発明のアンチセンスRNAの５’側の６つの塩基配列を欠失した配列であるＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ（配列番号１７）またはその変異体を含む塩基配列とRNA分子とのキメラRNA分子を作製することにより、該RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法である。
【００２８】
本発明の第３の態様は、本発明のアンチセンスRNAの配列であるＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ（配列番号１）またはその変異体を含む塩基配列とRNA分子とのキメラRNA分子を作製することにより、該RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法である。
【００２９】
本発明の第４の態様は、本発明のアンチセンスRNAの５’側から７番目から１２番目に相当するＧＧＵＵＡＧ（配列番号２２）またはその変異体を含む塩基配列が５’末端側に、本発明のアンチセンスRNAの３’側から２番目から１１番目の塩基に相当するＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ（配列番号２１）またはその変異体を含む塩基配列が３’末端側に存在し、その間にRNA分子を有するキメラＲＮＡ分子を作製することにより、該RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法である。
【００３０】
本発明の第５の態様は、本発明のアンチセンスRNAの５’側から１番目から１２番目に相当するＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧ（配列番号２３）またはその変異体を含む塩基配列が５’末端側に、本発明のアンチセンスRNAの３’側から２番目から１１番目の塩基に相当するＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ（配列番号２１）またはその変異体を含む塩基配列が３’末端側に存在し、その間にRNA分子を有するキメラRNA分子を作製することにより、該RNA分子にヌクレアーゼ耐性能を付与する方法である。
【００３１】
上記で述べた態様１〜３はRNA分子を、本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体の５’末端側に結合させている。一方上記で述べた態様４〜５は本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体のステムループ部を、RNA分子により置き換えている。機能性RNA分子が短ヘアピンRNA（shRNA）である場合を例として、態様１〜３の方法により作製させるキメラRNA分子の構造イメージを図３に、態様４〜５の方法により作製させるキメラRNA分子の構造イメージを図４に、それぞれ示す。
【００３２】
本願明細書において「ヌクレアーゼ耐性能」とはヌクレアーゼAにより６０分間以上処理を行った後においても、元のRNA分子の６０％以上が分解されずに残存する能力を意味する。なお本発明の方法により付与されるヌクレアーゼ耐性能の程度は場合によって異なっており、本発明の方法はヌクレアーゼ耐性を制御するという観点も包含する。
【００３３】
３．本発明のアンチセンスRNAと結合させるRNA分子について
本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体と結合させるRNA分子は、特に限定されるものではない。本発明で使用されるRNA分子の具体例としては、それらに限定されるものではないが、メッセンジャーRNA、アンチセンスRNA（本技術分野における通常の定義による任意のアンチセンスRNAを意味する）、ノンコーディングRNA、小ヘアピンRNA若しくは短ヘアピンRNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、リボザイム、アプタマー、およびguide RNA（crRNA、tracrRNA）などが挙げられる。
【００３４】
具体的には、真核生物遺伝子を対象としたshRNA、ウイルス遺伝子を対象としたshRNA、癌細胞特異的アプタマー配列、真核生物内在性のマイクロRNA、真核生物遺伝子を対象としたアンチセンスRNA、真核生物遺伝子を対象としたリボザイム、真核生物遺伝子を対象としたguide RNA、ウイルス遺伝子を対象としたアンチセンスRNA、ウイルス遺伝子を対象としたリボザイム、オルガネラゲノムやウイルスゲノムを対象としたguide RNAが挙げられる。
【００３５】
より具体的には、例えば、eGFP遺伝子発現用shRNA配列（５’-ＵＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＵＣＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＵＵＧＵＣＧＧＵＧＡＡＧＡＵＣＵＵＵＵ-３’：配列番号２４）(Sigma-Aldrich社のMISSION shRNAから転載)、あるいは、炎症マーカータンパク質に対するＲＮＡアプタマーＣＲＰ１−１（５’-ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＣＧＧＧＡＣＵＵＣＧＡＵＣＣＧＵＡＧＵＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＡＵＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＵＡＧＵＡＡＡＣＵＡＧＣＡＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＧＵＡＵＧＣＧＧＡＡＧＣＵ-３’ ：配列番号２５）（非特許論文 Orito et al., High-affinity RNA aptamers to C-reactive protein (CRP): newly developed pre-elution methods for aptamer selection, Journal of Physics: Conference Series 352 (2012) 012042）等が挙げられる。
【００３６】
本発明においてRNA分子が機能性RNAである態様は好適であり、短ヘアピンRNA(shRNA)である態様は特に好適である。なおshRNAとはRNA干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のRNA配列である。なお本発明で使用されるRNA分子は直鎖状のRNA分子でもよい。
【００３７】
そのようなRNA分子は通常はヌクレアーゼ耐性を有さないが、本発明によりそのようなRNA分子にヌクレアーゼ耐性が付与される。本発明で使用されるRNA分子は１個〜１００個の塩基配列からなるRNA分子であり、好ましくは２０個〜９５個の塩基配列からなるRNA分子であり、更に好ましくは４０個〜９０個の塩基配列からなるRNA分子であり、更に好ましくは５０個〜８０個の塩基配列からなるRNA分子である。更に本発明の好適な態様においてヌクレアーゼで処理をした後でも、本発明で使用されるRNA分子の機能は維持される。
【００３８】
４．本発明の方法で作製されるキメラRNA分子について
本発明は、本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体とRNA分子を結合させた、キメラRNA分子である。本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体は上記２で述べた通りであり、RNA分子は上記３で述べた通りである。
【００３９】
上記でも述べたように本発明のキメラRNA分子は血清中で安定であり、血清中での半減期が少なくとも１時間以上であり、場合によっては数日の半減期を有すると考えられる。一方本発明のアンチセンスRNAまたはその変異体が結合していないRNA分子の半減期はせいぜい十数分程度である。
【００４０】
本発明のアンチセンスRNAと医薬しての機能を期待することができるRNA分子を結合させたキメラRNAを用いて、例えば核酸医薬を作製することが期待できる。しかし本発明のキメラRNA分子の用途は核酸医薬に限定されるものではない。
【００４１】
本発明のアンチセンスRNAは化学修飾などを施していないので、生体への副作用などの先行技術に問題を有するものではなく、大量生産にも適している。よって本発明のキメラRNA分子を医薬組成物として用いることができる。
【００４２】
５．本発明の方法で作製されるキメラＲＮＡ分子の医薬としての応用について
本発明のキメラRNA分子を含む医薬組成物は血清中のヌクレアーゼに対して耐性であるので、静脈注射により投与することが可能であるという利点を有するが、それに限定されるものではなく、投与経路としては、静脈注射、経口投与、経皮投与、腹腔内投与、直腸内投与、経眼投与、膀胱内投与、気管内噴霧法、鼻腔内噴霧法など、いずれの投与経路を採用することもできる。本発明のキメラRNA分子の投与量は該ＲＮＡ分子の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、通常は血中濃度が０．００１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは０．０１μＭ〜１００μＭ、更に好ましくは０．１μＭ〜１０μＭである。
【００４３】
剤型としては、注射剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤等の種々の剤型が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、特に好ましい剤型は注射剤である。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のキメラRNA分子を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００４４】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００４５】
これらの製剤は、本発明のＲＮＡ分子を０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％、更に好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００４６】
その他、本発明は、趣旨を逸脱しない範囲で当業者の知識に基づき種々の改良、修正、変更を加えた形態で実施できるものである。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞
本実施例では４４Ｒ１の基質認識配列のみの塩基配列から成るRNA(本発明のアンチセンスRNA)及び該アンチセンスＲＮＡの様々な変異体を調製し、ヒト血清を用いた血清処理によって凝集体の形成及びRNase耐性を確認した。
【００４８】
実験方法
（１）RNA試料の調製
（ａ）インサートDNAの調製
アンチセンスRNA及び各種変異体RNAを調製するためのインサートDNAの調製を行った。変異体RNAに対応するインサートDNA配列を作製するために、受託合成によりDNAプライマーセットを調製した。これらのプライマーは互いに相補的な塩基対を形成する配列部分を有すようにデザインされており、プライマーセットのアニーリング後、一本鎖DNA部分をDNAポリメラーゼによってギャップフィリングすることでDNAインサートを形成させた。二重鎖DNAを調製するためのサーマルサイクラ―の条件は、94℃で30秒、アニーリング反応を55℃で30秒、伸長反応を74℃で30秒の順で７サイクル行った。反応系は5×Colorless Go Taq Flexi Buffer (Promega) 20 μl、25 mM MgCl2 (Promega) 12 μl、25 mM dNTPs (TaKaRa) 1.6 μl、各プライマー 1 pmol、Go Taq DNA polymerase (Promega) 1 μlを混合し滅菌水で100 μlに調製したものを使用した。図５と図６にアンチセンスRNA及び各種変異体RNA調製用インサートDNAのプライマーの配列を示す。切断に用いる制限酵素を括弧内に記し、制限酵素サイトを下線で示した。またRNAとして転写される配列を太字で示した。図５においてForwardプライマーはアンチセンスRNA調製用と同様のものを用いて調製したため3’変異体についてはReverseプライマーのみ記している。図６においてForwardプライマーは変異体5d1調製用と同様のものを用いて調製したため変異体5d1以外についてはReverseプライマーのみ記している。PCR後の溶液に12% PAGEを行いPCR産物としてインサートDNAが得られていることを確認した後、フェノール/クロロホルム抽出によって精製しエタノール沈殿法で濃縮した。
【００４９】
（ｂ）インサートDNAのライゲーション及びコンピテントセルへの導入
得られた各種0.15 μMインサートDNA 0.1μlにT-Vector pMD19 (TaKaRa) 1 μlおよびDNA ligation kit＜Mighty Mix＞(TaKaRa) 2 μlを加えて16℃で30分間インキュベーションすることでライゲーション反応を行い、氷上で30分間静置した。ライゲーション後の溶液をEscherichia coli JM109株コンピテントセル液100 μlと混合しHeat shock法によってコンピテントセルに導入した後、アンピシリン100 μg/ml及びX-gal 0.04 mg/mlを含むLB寒天培地に塗布して37℃で16時間培養を行った。得られた白色コロニーから各種インサート導入株につき4コロニーずつ選んでマスタープレートを作製し、コロニーPCRの後に10% native PAGEにてインサートDNAの有無を確認し配列決定を行うクローンを決定した。
【００５０】
（ｃ）インサート導入プラスミドの回収及び塩基配列解析
インサートの導入が確認されたクローンを上記（ｂ）で作製したマスタープレートよりアンピシリン100 μg/mlを含むLB培地5 mlに植菌し、37℃で16時間培養した。各培養液を2 ml回収し、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)を用いてプラスミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNAはそれぞれ吸光度測定により濃度を求め、BigDye Terminator v3.1/1.1 Cycle sequencing Kit (ABI)を用いて塩基配列解析用サンプルを調製し、Applied Biosystems 3130/3130xlジェネティックアナライザー(ABI)にて配列を確認した。
【００５１】
（ｄ）プラスミドの回収及び直鎖化
シークエンス解析にて配列の一致を確認した各種インサート導入E.coli JM109株をアンピシリン100 mg/mlを含むLB培地50 mlに植菌して37℃で16時間振盪培養し、PureYieldTM Plasmid Midipreps System (Promega)を用いてプラスミドを回収した。回収したプラスミド溶液70 μlに各制限酵素に対応する10×バッファー8 μl及び制限酵素2 μlを混合し37℃で16時間制限酵素処理を行った。制限酵素による切断の有無は制限酵素処理前及び後のプラスミドを1% アガロースゲル電気泳動を行って確認した。制限酵素処理による直鎖化が確認されたプラスミドはフェノール/クロロホルム抽出によって精製し、エタノール沈殿にて濃縮した。
【００５２】
（ｅ）各種RNA試料の調製
上記（ｄ）で得られた制限酵素処理後のプラスミドを鋳型DNAとし、直鎖化したプラスミド10 μgに10×Reaction Buffer for Thermo T7 RNA polymerase (TOYOBO) 50 μl、ribonuclease inhibitor (TAKARA) 1 μl、100 mM ATP 5 μl、100 mM GTP 5 μl、100 mM UTP 5 μl、50 mM CTP 10 μl、Thermo T7 RNA polymerase (TOYOBO) 5 μlを混合して滅菌水で500 μlに調製し、37℃で3時間転写反応させ、16%変性PAGE (7M尿素)にて転写産物の有無を確認した。また、この転写反応液から半量の250 μlを分取し、RQ1 RNase-Free DNase (Promega) 10 μlを加え37℃で30分間インキュベーションすることで鋳型DNAを分解した。DNase処理後の反応液はフェノール/クロロホルム抽出で精製してイソプロピルアルコール沈殿にて濃縮し、吸光度測定により濃度を求めた後に16%変性PAGE (7M尿素) で転写反応後の溶液と同様の転写産物が存在することを確認した。図７にRNA試料の塩基配列及び塩基鎖長、並びに予測されるギブス自由エネルギーの値を示す。図７において括弧内に各RNA試料のサイズ及び予測されるギブス自由エネルギー（△G）の値を示す。また、□はアンチセンスRNAと比べて塩基が欠損している部位を表し、下線部は塩基置換部位を示している。
【００５３】
（３）ヒト血清を用いたRNase耐性試験
得られた各RNA溶液27.5 μlに5×PBS (リン酸緩衝生理食塩水) 10 μlを加え、血清処理0分のサンプル用に7.5 μlを分取した後に2.1でRNase活性を測定したヒト血清10 μlを混合して37℃で反応させた。反応開始から10、30、60分後の反応液を10 μlずつ回収してタンパク質変性剤(変性溶液＊8 μl、2M NaOAc 2 μl、水飽和フェノール/クロロホルム 20 μl)と混合し、更に液体窒素に浸して反応を停止させた。また、予めタンパク質変性剤にヒト血清2.5 μlを加えた溶液に分取したRNA-PBS溶液7.5 μlを混合して液体窒素に浸し、血清処理0分サンプルとして調製した。これらの血清処理サンプルを氷上で融解させた後、25℃、15000 rpmで10分間遠心して上清を回収し16%変性PAGE (7M尿素)を行った。電気泳動後のゲルはSYBR（登録商標） Green I nucleic acid gel stain (Molecular Probes) にて染色し、フルオロ・イメージアナライザーFLA-9000 (FUJIFILM) を用いて解析して各種RNA試料の血清処理後の状態を確認した。
＊変性溶液組成：
4M グアニジンイソシアネート、25 mM クエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.1 M 2-メルカプトエタノール、0.5% Sodium N-lauroyl sarcosine (sarcosyl)
（ａ）アンチセンスRNAについて
アンチセンスRNAに対して血清処理を行った結果、本来のサイズを示す位置には依然としてバンドは見られず、高分子量側の領域で確認されたバンドが血清処理60分後でも存在していることが確認できた。また、これら高分子量側に見られるバンドはDNase処理後のサンプルでも同様に存在していたことから、DNAではなくRNAによるものであると考えられた。よって、アンチセンスRNAは複数のRNA分子が凝集体を形成することにより44R1と同様に血清RNase耐性を示すことが明らかとなった。
【００５４】
（ｂ）3’末端変異体について
3’末端変異体のうち末端の2塩基以上を欠損させた変異体ではアンチセンスRNAと比べて高分子量側のバンドの現れ方に大きな変化が見られた（図８、図９）。図８と図９において、MはRNAマーカーを表しており、“ ’ ”はDNase処理をしたことを示す。また、血清処理サンプルを電気泳動したレーン上の数字は血清処理の時間(分)である。具体的には、アンチセンスRNAと異なり本来のサイズを示す位置にもバンドが現れており、且つ、高分子量側の領域に現れるバンドの本数が少なくなっていた。特に変異体3d2においては高分子量側のバンドがほぼ見られず、本来のサイズを示す位置付近にあったバンドが血清処理60分後には極端に薄くなっていることが確認できた。一方、3’末端置換変異体においては位置や数に多少の違いはあるが、本来のサイズを示す位置より高分子量側の位置のバンドがDNase処理に関係なく複数見られ、且つ、血清処理60分後でも変わらず存在していたため（図１０、図１１）、アンチセンスRNAと同様にRNase耐性を有す凝集体構造を形成していることが示唆された。図１０と図１１において、MはRNAマーカーを表しており、“ ’ ”はDNase処理をしたことを示す。また、血清処理サンプルを電気泳動したレーン上の数字は血清処理の時間(分)である。これらの結果より、アンチセンスRNAの3’末端の2塩基がRNase耐性を示す凝集体の形成に関与しており、欠損させることによってこの凝集体構造の形成・維持が難しくなりRNase耐性が低下すると考えられる。
【００５５】
（ｃ）5’末端欠損変異体について
5’欠損変異体の血清処理後の電気泳動の結果では3’末端置換変異体の電気泳動の結果と同様に本来の位置を示す位置より高分子量を示す領域で複数のバンドが見られ、血清処理60分後でも血清処理0分と同様に存在していた（図１２、図１３）。図１２と図１３において、MはRNAマーカーを表しており、“ ’ ”はDNase処理をしたことを示す。また、血清処理サンプルを電気泳動したレーン上の数字は血清処理の時間(分)である。図１３において、Sはヒト血清を、Bはタンパク質変性剤をそれぞれ示している。5’末端の塩基はアンチセンスRNAの凝集体構造の形成にあまり関与しておらず、欠損させてもRNase耐性に対し影響が少ないことが示唆された。
【００５６】
（ｄ）タンパク質変性剤及びヒト血清の電気泳動について
変異体5d6の血清処理の際にタンパク質変性剤及びヒト血清について同時に16%変性PAGE (7M尿素)を行ったところ、核酸分子の存在を示すバンドは確認されなかった（図１３）。よって、血清処理後に見られるバンドはヒト血清或いはタンパク質変性剤由来のものではないことが確かめられた。即ち、血清処理後のバンドは転写したRNAが部分的に分解されて生じたバンドであることが示された。
【００５７】
（ｅ）内側配列置換変異体について
内側配列置換変異体の血清処理後の電気泳動の結果を見ると、3’末端置換変異体や5’末端欠損変異体と同様の結果が得られた（図１４〜図１５）。図１４〜図１５において、MはRNAマーカーを表しており、“ ’ ”はDNase処理をしたことを示す。また、血清処理サンプルを電気泳動したレーン上の数字は血清処理の時間(分)である。本来のサイズを示す位置より高分子量を示す範囲に複数のバンドが見られ、これらのバンドは血清処理60分後でも安定して存在していた。よって、アンチセンスRNAの内側配列を一部塩基置換あるいは塩基組成を変えずに配列を入れ替えた場合も凝集体構造を形成し、血清RNase耐性を示すことがこれらの結果より示された。
【００５８】
（ｆ）血清処理の小括
今回行った血清処理の結果より、アンチセンスRNAは複数のRNA分子が集まり凝集体を形成することで44R1と同様の血清RNase耐性を示すことが示唆された。また、変異体3d2の血清処理の結果からこの凝集体構造の形成には3’末端の2塩基が関与しており、欠損させることで凝集体の形成・維持が困難となり血清RNase耐性が低下することが明らかとなった。
【００５９】
更に各種変異体におけるバンドの現れ方についてまとめたものを表1に示す。表１において(1)は20−50 mer、(2)は50−100 mer、(3)は100−200 mer、(4)は200 mer以上のサイズの範囲を示し、血清処理60分後にバンドがあれば(＋)、無ければ(−)としている。
【００６０】
【表１】
2015112062.tif 000002
【００６１】
3’末端置換変異体、5’末端変異体、及び内側配列置換変異体では血清処理後の変異体3d2で見られたような大きな変化は確認されず、血清RNase耐性を示す凝集体構造の形成にはあまり関与していないことが示唆された。なお、これらの血清処理後の電気泳動の結果を見るとアンチセンスRNAに比べてバンドの見られる位置や数に多少の差が見られるが、これは変異させたことで凝集体構造に多少の変化が生じ血清RNaseによる分解を受けやすい構造が部分的に生じたためと考えられる。
【００６２】
（４）RNaseA耐性試験
調製したRNA試料のうちDNase処理したアンチセンスRNA、変異体3d2、変異体5d6溶液5.5 μlに5×PBS (リン酸緩衝生理食塩水) 12 μl、RNaseAlert（登録商標） Lab Test Kit (Ambion（登録商標）)付属の0.03 units/ml RNaseA 42.5 μlを混合して37℃で60分間反応させた。反応後の溶液はフェノール/クロロホルム 60 μlと混合し液体窒素に浸して反応を停止させた。この溶液を氷上で融解し、25℃、15000 rpmで遠心分離した後に上清を50 μl回収してエタノール沈殿にて濃縮した。濃縮したRNase A処理済みRNAサンプルに対し20%変性PAGE (7M尿素)を行い、血清処理と同様に染色、解析して各RNA試料のRNase A処理後における状態を確認した。
【００６３】
RNaseAによる耐性試験を行った結果、血清処理時の結果と比べアンチセンスRNA及び変異体3d2、5d6においてバンドの現れる位置や本数に大きな差は見られなかった（図１６）。図１６において、MはRNAマーカーを、AはアンチセンスRNAをそれぞれ示す。RNA試料は全てDNase処理をした上で使用したので“ ’ ”を付けて表記した。この結果より、血清処理後に確認されたバンドは血清中のRNaseAによるものであることが示された。また、アンチセンスRNA及び変異体5d6ではRNaseA処理60分後でも本来のサイズより高分子量側にバンドが確認できることから、これらのRNAはRNaseAに対して耐性を示す凝集体を形成していることが示唆された。
【００６４】
変異体3d2では最も濃く見られたバンドがRNaseA処理60分後に消失しており、RNaseAに耐性を示す凝集体はあまり形成されてないと考えられる。しかし、最も濃く現れていたバンドの上部に位置するバンドはRNaseA処理後にも存在していることから、凝集体構造は全く形成されないのではなく、形成・維持が難しくなっているものであると考えられる。なお、この変異体3d2においてRNaseA耐性を示すバンドはRNA試料調製時及び血清処理後の結果では明確に確認できていなかったが、今回のRNaseA処理では20%変性PAGE (7M尿素)にて確認したため明確に見られたと考えられる。
【００６５】
＜実施例２＞
（１）shRNAの３’末端に本発明のアンチセンスRNAの変異体を付加したキメラRNA分子を用いた検討
本実施例ではshRNAの３’末端に本発明のアンチセンスRNAの変異体を付加したキメラRNA分子を作製し、ヒト血清を用いた処理によってRNase耐性の検討を行った。具体的にはshRNA（shLuc.およびshNeg.）の３’末端に、５’末端から６番目から８番目のグアニンをアデニンに置換した本発明のアンチセンスRNAの変異体を結合させた二種類のキメラRNA（shLuc.-AAAおよびshNeg.-AAA）を作製した。それらのキメラRNA分子の作製は、実施例１に準じた手法で行った。shLuc.の構造を図１７に示す。shLuc.-AAAとshNeg.-AAAを作製する際に使用したプライマーセットの配列を、図１８に示す。
【００６６】
本実施例で作製したキメラRNA分子であるshLuc.-AAA（配列番号２４）とshNeg.-AAA（配列番号２５）の配列を下記に示す。配列番号２４と配列番号２５において３’末端の23 merの配列は本発明のアンチセンスRNAの変異体に由来し、その他の５’側の配列はshRNAに由来する。shLuc.は細胞内においてルシフェラーゼの発現による発光を抑制する。一方shNeg.はそのような遺伝子発現抑性機構がないので、ルシフェラーゼの発現による発光が抑性されることはない。
shLuc.-AAA：５’-ＧＧＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＵＧＵＣＣＵＣＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＵＵＵＧＧＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’（77 mer：配列番号２６）
shNeg.-AAA：５’-ＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡＧＵＵＧＧＵＧＣＵＣＵＵＣＡＵＣＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＧＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’（77 mer：配列番号２７）
同じく実施例１に準じた手法を用いて、shLuc.-AAAとshNeg.-AAAの血清処理による耐性の検討を行った。図１９は16%変性PAGE（7M尿素）を用いてそれらのキメラRNA分子の分解状態の確認を行った図である。各レーン状の数字は血清処理時間（分）を示している。shLuc.-AAAとshNeg.-AAAのキメラRNA分子は両者共に、約80 merのバンドは血清で60分間処理を行っても消失しなかった。よってshRNAの３’末端に本発明のアンチセンスRNAの変異体を付加したキメラRNA分子はRNase耐性を有することが示された。
【００６７】
（２）44R1のステムループ部にshRNAを組み込んだキメラRNA分子を用いた検討
本実施例では本発明の44R1のステムループ部に、shRNA（具体的にはshLuc.およびshNeg.）を組み込んだキメラRNA分子を二種類（キメラLuc.、キメラNeg.）作製し、ヒト血清を用いた処理によってRNase耐性の検討を行った。それらのキメラRNA分子の作製は、実施例１に準じた手法で行った。キメラLuc.とキメラNeg.を作製する際に使用したプライマーセットの配列を、図２０に示す。
【００６８】
本実施例で作製したキメラRNA分子であるキメラLuc.（配列番号２６）とキメラNeg.（配列番号２７）の配列を下記に示す。配列番号２６と配列番号２７において５’末端の20 merの配列と５’末端の17 merの配列は44R1由来の配列であって本発明のアンチセンスRNAを含んでいる。両者に挟まれた配列はshRNAに由来するものである。
キメラLuc.：５'-ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＣＧＧＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＵＧＵＣＣＵＣＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＵＵＵＵＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’(89 mer：配列番号２８)
キメラNeg.：５’- ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡＧＵＵＧＧＵＧＣＵＣＵＵＣＡＵＣＵＵＧＵＵＧ  ＵＵＵＵＵＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ-３’(89 mer：配列番号２９)
キメラLuc.とキメラNeg.について、転写産物の解析を行った結果を図２１に示す。両者のキメラRNA共に、80 mer程度の分子量を有する画分１と50 mer程度の分子量を有する画分２のバンドが認められた。なお画分１と画分２で検出されているのは同じRNAであるが、凝集の程度によって電気泳動の際に２つのバンドとして検出されたものと考えられる。画分１と画分２のバンドについて分離を行い、同じく実施例１に準じた手法を用いて血清処理による耐性の検討を行った。図２２は１６%変性ＰＡＧＥ（７Ｍ尿素）を用いてキメラLuc.の画分１と画分２のバンドにつき、分解状態の確認を行った図である。図２３は１６%変性PAGE（７Ｍ尿素）を用いてキメラＮｅｇ.の画分１と画分２のバンドにつき、分解状態の確認を行った図である。各レーン状の数字は血清処理時間（分）を示している。キメラLuc.とキメラNeg.の両者において、少なくとも高分子量の画分１は血清で６０分間処理を行っても消失しなかった。よってアンチセンスＲＮＡである４４Ｒ１のステムループ部にｓｈＲＮＡを組み込んだキメラＲＮＡ分子もＲＮａｓｅ耐性を有することが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２：ＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６
配列番号３：Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６
配列番号４：Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧＡＣＡＡＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６
配列番号５：Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ
配列番号６：Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＡＧ
配列番号７：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧ
配列番号８：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡ
配列番号９：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＡ
配列番号１０：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＡＡ
配列番号１１：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＡＧ
配列番号１２：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号１３：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号１４：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＵＧＧ
配列番号１５：ＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号１６：ＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号１７：ＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号１８：ＧＧＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号１９：ＧＧＡＵＡＧＧＧＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２０：ＧＧＵＵＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２１：ＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２２：ＧＧＵＵＡＧ
配列番号２３：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧ
配列番号２４：ＵＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＵＣＵＡＵＣＵＣＧＡＧＡＵＣＵＵＧＵＣＧＧＵＧＡＡＧＡＵＣＵＵＵＵ
配列番号２５：ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＣＧＧＧＡＣＵＵＣＧＡＵＣＣＧＵＡＧＵＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＡＵＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＵＡＧＵＡＡＡＣＵＡＧＣＡＣＵＣＡＧＵＧＣＵＣＧＵＡＵＧＣＧＧＡＡＧＣＵ
配列番号２６：ＧＧＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＵＧＵＣＣＵＣＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＵＵＵＧＧＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２７：ＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡＧＵＵＧＧＵＧＣＵＣＵＵＣＡＵＣＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＧＵＵＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２８：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＣＧＧＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＵＧＵＣＣＵＣＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＵＵＵＵＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
配列番号２９：ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＵＣＧＡＧＵＵＧＧＵＧＣＵＣＵＵＣＡＵＣＵＵＧＵＵＧ  ＵＵＵＵＵＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＵＧＧ
【図１】
2015112062.tif 000003
【図２】
2015112062.tif 000004
【図３】
2015112062.tif 000005
【図４】
2015112062.tif 000006
【図５】
2015112062.tif 000007
【図６】
2015112062.tif 000008
【図７】
2015112062.tif 000009
【図８】
2015112062.tif 000010
【図９】
2015112062.tif 000011
【図１０】
2015112062.tif 000012
【図１１】
2015112062.tif 000013
【図１２】
2015112062.tif 000014
【図１３】
2015112062.tif 000015
【図１４】
2015112062.tif 000016
【図１５】
2015112062.tif 000017
【図１６】
2015112062.tif 000018
【図１７】
2015112062.tif 000019
【図１８】
2015112062.tif 000020
【図１９】
2015112062.tif 000021
【図２０】
2015112062.tif 000022
【図２１】
2015112062.tif 000023
【図２２】
2015112062.tif 000024
【図２３】
2015112062.tif 000025
【配列表】
2015112062000001.app