(57)【要約】【課題】本発明は、２種以上の細胞を含む細胞群の培養において、簡便に特定の細胞種の純度を高める手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、細胞の培養方法であって、ａ）電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程、ｂ）細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させる工程、およびｃ）電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程を含む方法に関する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養方法であって、
ａ）電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程、
ｂ）細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させる工程、および
ｃ）電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
細胞群への電圧の印加により、電気刺激に鈍感な細胞の増殖能力は実質的に低下しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）が、第１電極を備える細胞培養基材上で細胞群を培養することを含み、工程ｂ）が第１電極に対向して第２電極を配置し、第１電極を正極とし第２電極を負極として細胞群に電圧を印加することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞を形態変化させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）が、電圧の印加により形態変化した細胞を除去することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
電気刺激に敏感な細胞が、線維芽細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
電気刺激に鈍感な細胞が、筋細胞および血管内皮細胞から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療において有用な細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を用いた再生医療が注目を集めている。細胞を用いた再生医療は、患者の組織から採取した細胞を生体外において大量に培養し、それを患者の体内に戻すことによって治療効果を得るものである。これまでは臓器移植でしか治療できなかったような疾患も細胞移植によって治療可能なことが近年示されるようになっている。詳細な治療のメカニズムは現在も研究されているところであるが、細胞移植によって心臓、肝臓、角膜などの疾患が治癒したという報告がなされている。
【０００３】
人間の身体には約２６０種類の細胞が存在すると言われており、それぞれの組織は複数種類の細胞から構成されている。例えば、心臓には心筋細胞、洞結節細胞、特殊心筋細胞、線維芽細胞の少なくとも４種類の細胞が存在し、肝臓には肝実質細胞、胆管上皮細胞、星細胞、クッパー細胞、類道内皮細胞の少なくとも５種類の細胞が存在する。そのため、組織から目的とする細胞を１００％の純度で回収することは難しい。このような細胞群の中から目的の細胞を選別するために、従来は蛍光色素で標識された抗体を用いる方法（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）や、磁気微粒子で標識された抗体を用いる方法（ＭＡＣＳ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）が用いられてきた（非特許文献１）。これらは抗体を用いて、目的とする細胞を高純度で分離する方法である。しかし、分離された細胞膜の表面には選別に用いた抗体が残存することが問題となっており、これらの方法で選別された細胞を治療目的で生体内に戻すことは難しい。そこで、抗体を用いずに細胞の純度を上げる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５１７０７７０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚｈｕ  Ｂ，Ｍｕｒｔｈｙ  ＳＫ．２０１３．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．２（１）：３−７．
【非特許文献２】Ｓ．Ｙｏｎｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２（２０１０），５３３−５４２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
患者の組織から細胞を採取する場合、目的とする細胞だけでなく他の種類の細胞が混入するという課題があった。細胞を用いた再生医療を実現するためには、目的とする細胞のみを回収する、または目的とする細胞の純度をなるべく高めるための技術が求められていた。
【０００７】
したがって、本発明は、２種以上の細胞を含む細胞群の培養において、簡便に特定の細胞種の純度を高める手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、細胞群の培養時に電圧を印加することにより、細胞種によって増殖能力が抑制され、特定の細胞の純度を高めることが可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）細胞の培養方法であって、
ａ）電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程、
ｂ）細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させる工程、および
ｃ）電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程、
を含む、前記方法。
（２）細胞群への電圧の印加により、電気刺激に鈍感な細胞の増殖能力は実質的に低下しない、（１）に記載の方法。
（３）工程ａ）が、第１電極を備える細胞培養基材上で細胞群を培養することを含み、工程ｂ）が第１電極に対向して第２電極を配置し、第１電極を正極とし第２電極を負極として細胞群に電圧を印加することを含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞を形態変化させる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程ｃ）が、電圧の印加により形態変化した細胞を除去することを含む、（４）に記載の方法。
（６）電気刺激に敏感な細胞が、線維芽細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）電気刺激に鈍感な細胞が、筋細胞および血管内皮細胞から選択される、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、２種以上の細胞を含む細胞群の培養において、簡便に特定の細胞の純度を高めることが可能となり、再生医療に有用な細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】マウス線維芽細胞（ＣＣＬ１６３）に電圧を印加する前（左）および電圧を印加した後（右）の写真を示す。
【図１ｂ】マウス線維芽細胞（ＣＣＬ１６３）に電圧を印加する前（左）および電圧を印加した後（右）の写真を示す。
【図１ｃ】マウス線維芽細胞（ＳＷＩＳＳ３Ｔ３）に電圧を印加する前（左）および電圧を印加した後（右）の写真を示す。
【図２】マウス筋芽細胞に電圧を印加する前（左）および電圧を印加した後（右）の写真を示す。
【図３】マウス血管内皮細胞に電圧を印加する前（左）および電圧を印加した後（右）の写真を示す。
【図４】マウス筋芽細胞を細胞培養基材に播種した直後（左）、電圧を印加せずに３日間培養した後（右上）、および電圧を印加して３日間培養した後（右下）の写真を示す。
【図５】マウス血管内皮細胞を細胞培養基材に播種した直後（左）、電圧を印加せずに３日間培養した後（右上）、および電圧を印加して３日間培養した後（右下）の写真を示す。
【図６】マウス線維芽細胞を細胞培養基材に播種した直後（左）、電圧を印加せずに３日間培養した後（右上）、および電圧を印加して３日間培養した後（右下）の写真を示す。
【図７】マウス線維芽細胞とマウス筋芽細胞を８：２の割合で含む細胞群に電圧を印加する前（上）および電圧を印加した直後（下）の写真を示す。線維芽細胞を赤色蛍光色素で標識し、筋芽細胞を緑色蛍光色素で標識した。
【図８】マウス線維芽細胞とマウス筋芽細胞を５：５の割合で含む細胞群に電圧を印加する前（上）および電圧を印加した直後（下）の写真を示す。線維芽細胞を赤色蛍光色素で標識し、筋芽細胞を緑色蛍光色素で標識した。
【図９】マウス線維芽細胞とマウス筋芽細胞を２：８の割合で含む細胞群に電圧を印加する前（上）および電圧を印加した直後（下）の写真を示す。線維芽細胞を赤色蛍光色素で標識し、筋芽細胞を緑色蛍光色素で標識した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の細胞培養方法は、電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程を含む。電気刺激に敏感な細胞は、電圧を印加することにより増殖能力が低下する細胞であり、例えば、電圧を印加することにより形態変化を生じる細胞である。電圧を印加することにより増殖能力が低下するとは、例えば、電圧を印加して３日間培養した後の細胞密度が、電圧を印加せずに３日間培養した後の細胞密度に対して、９０％以下である場合をいう。電気刺激に鈍感な細胞は、電圧を印加しても増殖能力が実質的に低下しない細胞であり、例えば、電圧を印加しても形態変化を生じない細胞である。増殖能力が実質的に低下しないとは、例えば、電圧を印加して３日間培養した後の細胞密度が、電圧を印加せずに３日間培養した後の細胞密度に対して、９７％以上である場合をいう。
【００１３】
細胞の形態変化には、顕微鏡で観察可能な細胞の外観の変化が包含され、細胞の輪郭の変化、細胞質の外観の変化、および核の外観の変化等が挙げられる。細胞の輪郭の変化としては、例えば図１ａおよび図１ｃの電圧印加後の写真に見られるような形態変化が挙げられる。すなわち、細胞の仮足が通常培養時よりも多く、例えば３本以上となるような輪郭の変化である。細胞質の変化としては、例えば、図１ｂの電圧印加後の写真に見られるような形態変化が挙げられる。すなわち、複数の顆粒が見られるようになることが挙げられる。電気刺激に敏感な細胞に対し、電圧を印加して細胞を形態変化させることにより、細胞の増殖能力を選択的に低下させることが可能になる。
【００１４】
電気刺激に鈍感な細胞としては、生体内で電気的活動を行う細胞が挙げられる。電気的活動を行う細胞とは、その活動に伴って活動電位という電気信号を発生する細胞をさす。活動電位は、主としてナトリウムイオン、カリウムイオンが、細胞内外の濃度差に従い、イオンチャネルを通じて受動的拡散を起こすことにより起きるものである。このような細胞は、常に電気刺激にさらされているため、電気刺激に鈍感であり、電圧を印加しても形態変化等を生じることがなく、またその増殖能力が実質的に変化することはないと考えられる。電気刺激に鈍感な細胞の具体例としては、筋細胞、神経細胞および血管内皮細胞等が挙げられる。
【００１５】
筋細胞には、筋収縮能に関し成熟した細胞のほか、未熟ではあっても、成熟した同種の細胞が備える収縮能と同質の収縮能を備える細胞が包含される。したがって、筋細胞には、成熟した筋細胞への分化途中の細胞や、成熟した筋細胞の幼弱細胞などの未成熟細胞が含まれる。筋収縮能に関し成熟した細胞としては、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞等が挙げられる。骨格筋細胞の未成熟細胞としては、筋管細胞、筋芽細胞、骨格筋サテライト細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。心筋細胞の未成熟細胞としては、心筋細胞の幼若細胞または分化途中にある細胞が挙げられ、例えば、心筋前駆細胞、心筋幹細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。平滑筋細胞の未成熟細胞としては、平滑筋細胞の幼若細胞または分化途中にある細胞が挙げられ、例えば、平滑筋前駆細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。
【００１６】
神経細胞としては、例えば、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などが挙げられる。神経細胞とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類でき、例えば、分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドーパミン分泌神経細胞、アセチルコリン分泌神経細胞、セロトニン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞、グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。別の観点では、神経細胞は、神経細胞が存在する部位の違いにより分類できる。これらの存在部位で分類される神経細胞としては、例えば、前脳神経細胞、中脳神経細胞、小脳神経細胞、後脳神経細胞、脊髄神経細胞などが挙げられる。
【００１７】
上記の電気刺激に鈍感な細胞以外の細胞は、電気刺激に敏感な細胞であると考えられる。具体的には、線維芽細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、乳腺細胞、ペリサイト、膵ランゲルハンス島細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。
【００１８】
本発明の培養方法は、線維芽細胞を含む細胞群の培養において、線維芽細胞の増殖能力を低下させる場合に特に好適に使用される。骨、軟骨、靭帯、腱、脂肪組織、筋膜、内臓の間を埋める結合組織には線維芽細胞が含まれている。結合組織とは上皮組織、神経組織、筋組織に含まれない組織全てをさし、生体組織から細胞を採取する場合に結合組織を完全に除くことは非常に難しく、目的とする細胞だけではなく線維芽細胞が混入してしまうため、線維芽細胞の増殖能力を低下させることは非常に重要である。
【００１９】
電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群は、電気刺激に敏感な細胞の１種以上と、電気刺激に鈍感な細胞の１種以上を含むものであればよく、それぞれ複数種を含んでいてもよい。生体組織から採取した細胞は、通常、複数種の細胞を含む細胞群であるが、本発明により、このような細胞混合物としての細胞群から、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させることができる。例えば、筋肉組織から採取した試料には、通常、筋細胞と繊維芽細胞が含まれるが、この筋細胞と繊維芽細胞を含む細胞群を、本発明の方法で培養することにより、電気刺激に鈍感な筋細胞を選択的に増殖させることができる。また、心臓から採取した試料には、通常、心筋細胞、洞結節細胞、特殊心筋細胞および線維芽細胞が含まれるが、この試料から得た細胞群を本発明の方法で培養することにより、電気刺激に鈍感な心筋細胞および特殊心筋細胞を選択的に増殖させることができる。
【００２０】
細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウスまたはヒトである。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。
【００２１】
電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、細胞破片等の不純物質を除去する分離処理等を行っておくことが好ましい。細胞群の播種に先だって、予め、各種の培養方法で予備培養して、細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養等の通常の培養方法が採用できる。
【００２２】
予備培養した細胞を、細胞培養基材上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術」に記載されている方法が使用できる。通常、１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。
【００２３】
細胞の培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等の基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。
【００２４】
本発明の培養方法は、細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させる工程を含む。印加する電圧は、培養液の種類や電極を構成する材料等によって、適切な値が変わるが、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させることができる電圧以上、および／または電気刺激に敏感な細胞に形態変化を生じさせることができる電圧以上で、電気刺激に鈍感な細胞の増殖能力を実質的に低下させない、および／または電気刺激に鈍感な細胞に形態変化を生じさせない程度の低い電圧を加えるのがよい。
【００２５】
印加電圧は、好ましくは０．５Ｖ以上、より好ましくは１Ｖ以上、さらに好ましくは１．５Ｖ以上であり、好ましくは１０Ｖ以下、より好ましくは５Ｖ以下、さらに好ましくは３Ｖ以下であるが、これに限定されるものではない。電圧を印加する時間は、好ましくは１０秒以上、より好ましくは２０秒以上、さらに好ましくは４０秒以上で、好ましくは６０分間以下、より好ましくは１０分間以下、さらに好ましくは２分以下であるが、これに限定されるものではない。例えば、１．５〜３Ｖの電圧を、４０秒〜２分間印加することが好ましい。電圧の印加は、複数回にわたって実施してもよい。
【００２６】
一実施形態においては、第１電極を備える細胞培養基材上で細胞群を培養し、第１電極に対向して第２電極を配置し、第１電極を正極とし第２電極を負極として細胞群に電圧を印加する。
【００２７】
第１電極を備える細胞培養基材としては、導電性材料からなる基材を用いてもよいし、絶縁性材料からなる基材上に導電性材料からなる電極を形成したものを用いてもよい。後者の場合、絶縁性材料からなる基材として、具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を使用できる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、並びに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。
【００２８】
絶縁性材料からなる基材上に導電性材料からなる電極を形成する場合、公知の成膜技術を利用できる。具体的には、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、電極材料、例えば金属膜または金属酸化物膜を成膜することにより、第１電極を備える細胞培養基材を製造することができる。
【００２９】
基材上への導電性材料の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法等が挙げられる。成膜は、上記の真空成膜法に限らず、塗布により実施してもよい。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。
【００３０】
導電性材料として、金属または金属酸化物、金属微粒子や導電性ナノファイバーが絶縁体に分散された膜、導電性の有機材料等が挙げられる。金属としては、銀、金、銅、白金等が挙げられ、金属酸化物としては、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）、ＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）、ＳｎＯ２(酸化スズ)等が挙げられ、金属微粒子としては、銀、金、銅、白金等の微粒子、導電性ナノファイバーとしてはカーボンナノチューブ、導電性の有機材料としては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）等が挙げられる。
【００３１】
第１電極は、特に制限されないが、透明電極材料で構成されることが好ましい。透明電極材料としては、例えば、ＩＴＯ、ＩＺＯ、ＳｎＯ２、導電性高分子であるポリエチレンジオキシチオフェン等が挙げられる。また、電圧印加後も透明であることが好ましい。本発明においては、ＩＴＯをスパッタリング法により基材上に成膜することが好ましい。透明な電極材料の膜は、細胞の観察において有利であり、細胞の形態変化を容易に認識することができる。
【００３２】
導電性材料の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。また、第１電極の抵抗は、好ましくは５〜５０Ω、より好ましくは５〜２０Ωである。抵抗が低いほど面内に均一に電圧を印加することができるため好ましい。
【００３３】
第１電極に対向して配置される第２電極は、細胞培養物を覆うことができる面電極であることが好ましい。面電極とすることにより、細胞培養物全体に電圧を印加することができる。第２電極は、特に制限されないが、白金や金で構成されることが好ましい。これらの金属は化学的に安定であるため電極表面や周辺で起こる化学変化に侵されにくいからである。また、電圧の印加においては、第１電極を正極とし第２電極を負極とすることが好ましい。それにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力をより効果的に低下させることができる。
【００３４】
なお、第１電極に対向して配置される第２電極は、第１電極とともに細胞培養基材に形成されていてもよい。この場合、典型的には、第１電極と第２電極とが櫛歯状に形成され、互いに噛み合うように配置されたものを挙げることができる。
【００３５】
本発明の細胞培養方法は、電圧印加後に、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程を含む。細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力が低下することから、そのまま細胞培養を続けることにより、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させることができる。電気刺激に鈍感な細胞の純度を高める観点から、電圧印加後、一定期間にわたり培養を続けることが好ましい。電圧印加後、好ましくは３日間以上、より好ましくは５日間以上、さらに好ましくは７日間以上にわたり培養を続けることが好ましい。時間の経過とともに電気刺激に敏感な細胞の増殖能力が回復した場合には、電圧の印加を繰り返し行ってもよい。電圧印加を繰り返す場合は、電気刺激に鈍感な細胞の増殖性に影響を与えないという観点から、１〜３日間程度のインターバルを置くことが好ましい。
【００３６】
細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞が形態変化することから、形態変化した細胞を細胞群から除去することにより、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させることもできる。形態変化した細胞を細胞群から除去する方法は、当技術分野公知の方法を使用でき特に制限されないが、例えばレーザーを用いて除去する方法が挙げられる（非特許文献２参照）。レーザーは、除去する細胞の種類により適宜選択されるが、赤外線レーザー（例えば、ＹＡＧレーザー）、紫外線レーザー（例えば、窒素レーザー、エキシマレーザー）、パルスレーザー等を使用できる。レーザーを使用することにより、目的とする細胞のみを精度高く死滅・除去することができるため好ましい。
【００３７】
電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させるとは、換言すれば、電気刺激に敏感な細胞に対する電気刺激に鈍感な細胞の割合を、電圧印加前よりも高めることをさす。それにより、電気刺激に鈍感な細胞の純度を高めることができる。細胞群に含まれる細胞の種類や、播種した細胞群における当初の割合にも依存するが、電気刺激に敏感な細胞に対する電気刺激に鈍感な細胞の割合は、電圧印加前よりも好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上高めること望ましい。結果として、細胞群における電気刺激に鈍感な細胞の割合を、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上高めること望ましい。
【００３８】
再生医療において細胞を増殖させて用いる場合、複数種の細胞が混在していると培養条件の調節が難しい場合があり、制御が困難である。また、目的としない細胞が目的細胞よりも増殖してしまう場合もある。本発明の細胞培養方法を用いることにより、電圧を印加するという簡便な手段により、特定の細胞を選択的に増殖させ、純度を高めることができる。したがって、再生医療のための細胞培養を効率的に実施することが可能になる。また、本発明の細胞培養方法は抗体を用いないことから、得られた細胞培養物や細胞シートなどの細胞組織体を生体移植する際にも有利である。
【００３９】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、ウシ血管内皮細胞ＨＨ、マウス線維芽細胞（ＣＣＬ１６３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３）をそれぞれ１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１晩培養後、ガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、ＩＴＯガラス基板は電源の正極と、Ｐｔ製面電極は電源の負極とつなげた。直流電源を用いて電圧を印加（２．０Ｖ、１００秒）した後に細胞の形態を確認したところ、線維芽細胞では細胞が異常な形態を示していたのに対し、筋芽細胞と血管内皮細胞では大きな形態変化は見られなかった（図１−３）。
【００４１】
＜実施例２＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、ウシ血管内皮細胞ＨＨ、マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３をそれぞれ１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１晩培養後、ガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、直流電源を用いて電圧を印加した（２．０Ｖ、１００秒）。電圧印加直後に、ヨウ化プロピジウムで死細胞を染色して各細胞の生存率を求めたところ、Ｃ２Ｃ１２：９５±２％、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３：９５±２％、ＨＨ：９６±１％であり、細胞による生存率の違いは見られなかった。
【００４２】
＜実施例３＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、ウシ血管内皮細胞ＨＨ、マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３をそれぞれ１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１晩培養後、ガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、直流電源を用いて電圧を印加した（２．０Ｖ、１００秒）。このとき、ＩＴＯガラス基板は正極と、Ｐｔ製面電極は負極とつなげた。電圧を印加して３日後に細胞増殖の様子を確認したところ、線維芽細胞では細胞増殖が大きく抑制されていたのに対し、筋芽細胞と血管内皮細胞の増殖性は、電圧を印加しないコントロールとほぼ同等であった（図４−６）。
【００４３】
＜実施例４＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、緑色蛍光色素ＰＫＨ６７で標識したマウス筋芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３と、赤色蛍光色素ＰＫＨ２６で標識したマウス線維芽細胞Ｃ２Ｃ１２が合計で１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるよう種々の割合で播種した。１晩培養後にガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、ＩＴＯガラス基板は電源の正極と、Ｐｔ製面電極は電源の負極とつなげた。直流電源を用いて電圧を印加（２．０Ｖ、６０秒）した後に細胞の形態を確認したところ、線維芽細胞では細胞が異常な形態を示していたのに対し、筋芽細胞ではそのような細胞は見られなかった（図７−９）。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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