(57)【要約】【課題】  過ヨウ素酸酸化処理を利用した糖タンパク質試料の調製方法であって、糖鎖分析に適した糖タンパク質試料を効率的に調製し得る方法を提供すること。【解決手段】  糖鎖と特異的に結合するポリマー粒子を用いて糖タンパク質試料を調製するに際し、糖タンパク質を担体に捕捉する前に、糖タンパク質の断片化と過ヨウ素酸酸化を行うことにより、効率的に糖タンパク質試料を調製し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質試料の調製方法であって、
（ａ）糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理して、糖タンパク質を断片化する工程、
（ｂ）試料中の断片化された糖タンパク質を過ヨウ素酸酸化処理して、糖タンパク質の糖鎖にアルデヒド基を導入する工程、
（ｃ）試料中の糖鎖にアルデヒド基が導入された糖タンパク質を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体に接触させ、当該糖タンパク質を当該担体に捕捉する工程、
（ｄ）糖タンパク質を捕捉した担体を洗浄する工程、
（ｅ）糖タンパク質を捕捉した担体から糖タンパク質を遊離させる工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、断片化された糖タンパク質を過ヨウ素酸酸化処理した後、還元処理を行い、再度、過ヨウ素酸酸化処理を行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
水素化ホウ素ナトリウムで還元処理が行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基がヒドラジド基又はアミノオキシ基である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記担体が下記の（式１）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、請求項５に記載の方法。
【化１】
2015040817.tif 000007
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項７】
前記担体が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、請求項６に記載の方法。
【化２】
2015040817.tif 000008
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項８】
工程（ｅ）において、酸処理により、前記担体から糖タンパク質を遊離させる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質試料を調製する方法に関し、特に、糖タンパク質のうち、糖が結合している領域のみを効率的に調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
【０００３】
糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
【０００４】
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動などに影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質などが挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
【０００５】
細胞や組織に発現しているタンパク質の動態を迅速に把握し，それらのタンパク質が関わる相互作用を解析することを目的とするプロテオミクス研究が９０年代から盛んに行われている。しかしながら、その一方で、糖タンパク質に担持されている糖鎖に注目した解析（グライコミクス解析）の例は比較的少ない。
【０００６】
非特許文献１では二次元電気泳動のゲルおよび転写後のメンブレンから糖鎖を抽出・分析する方法が報告されている。この方法は、精製にカラム操作を要するなど、スループットの観点からは実用的とはいえない。
【０００７】
非特許文献２には、糖鎖と特異的に結合するポリマー粒子を用いて糖鎖を精製し、同時に糖鎖を標識化する技術が報告されている。この方法を用いれば糖鎖のハイスループット精製が可能である。
【０００８】
また、特許文献１には、試料中の糖タンパク質を過ヨウ素酸酸化して糖鎖部分にアルデヒド基を導入した後、このアルデヒド基を通じて糖タンパク質を担体に捕捉し、その後、糖タンパク質の切断処理により、糖が結合しているペプチド断片のみを得る方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−９６７６９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐ.Ｃａｍｉｌｌｅｒｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４,  ｐｐ.４９−５９,  ２０００年
【非特許文献２】Ｈ.Ｓｈｉｍａｏｋａら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ  １３,  ｐｐ.１６６４−１６７３,  ２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、過ヨウ素酸酸化処理を利用した糖タンパク質試料の調製方法であって、糖鎖分析に適した糖タンパク質試料を効率的に調製し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、非特許文献２に記載された糖鎖と特異的に結合するポリマー粒子を用いて糖タンパク質試料を調製するに際し、糖タンパク質を担体に捕捉する前に、糖タンパク質の断片化と過ヨウ素酸酸化を行うことにより、効率的に糖タンパク質試料を調製し得ることを見出した。また、この方法において、過ヨウ素酸酸化と還元を複数回繰り返すことにより、糖タンパク質をより均一な形態で調製し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、より詳しくは以下を提供するものである。
【００１４】
（１）糖タンパク質試料の調製方法であって、
（ａ）糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理して、糖タンパク質を断片化する工程、
（ｂ）試料中の断片化された糖タンパク質を過ヨウ素酸酸化処理して、糖タンパク質の糖鎖にアルデヒド基を導入する工程、
（ｃ）試料中の糖鎖にアルデヒド基が導入された糖タンパク質を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体に接触させ、当該糖タンパク質を当該担体に捕捉する工程、
（ｄ）糖タンパク質を捕捉した担体を洗浄する工程、
（ｅ）糖タンパク質を捕捉した担体から糖タンパク質を遊離させる工程、
を含む方法。
【００１５】
（２）前記プロテアーゼがトリプシンである、（１）に記載の方法。
【００１６】
（３）工程（ｂ）において、断片化された糖タンパク質を過ヨウ素酸酸化処理した後、還元処理を行い、再度、過ヨウ素酸酸化処理を行う、（１）又は（２）に記載の方法。
【００１７】
（４）水素化ホウ素ナトリウムで還元処理が行われる、（３）に記載の方法。
【００１８】
（５）前記糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基がヒドラジド基又はアミノオキシ基である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（６）前記担体が下記の（式１）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、（５）に記載の方法。
【００２０】
【化１】
2015040817.tif 000002
【００２１】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（７）前記担体が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、（６）に記載の方法。
【００２２】
【化２】
2015040817.tif 000003
【００２３】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（８）工程（ｅ）において、酸処理により、前記担体から糖タンパク質を遊離させる、（１）から（７）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、効率的に糖タンパク質試料を調製することが可能となる。また、本発明において、過ヨウ素酸酸化処理を繰り返すことにより、より均一性の高い糖タンパク質試料として調製することも可能であるため、その後の糖鎖分析の効率化を図ることも可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、糖タンパク質試料の調製方法であって、（ａ）糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理して、糖タンパク質を断片化する工程、（ｂ）試料中の断片化された糖タンパク質を過ヨウ素酸酸化処理して、糖タンパク質の糖鎖にアルデヒド基を導入する工程、（ｃ）試料中の糖鎖にアルデヒド基が導入された糖タンパク質を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有する担体に接触させ、当該糖タンパク質を当該担体に捕捉する工程、（ｄ）糖タンパク質を捕捉した担体を洗浄する工程、（ｅ）糖タンパク質を捕捉した担体から糖タンパク質を遊離させる工程、を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明において「タンパク質」とは、完全なタンパク質のみならず、タンパク質の部分（例えば、ペプチド断片）も含む意である。
【００２７】
工程（ａ）において使用する「糖タンパク質を含む試料」は、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織などの生体試料を用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質を用いることができる。糖タンパク質における糖鎖は、Ｏ型糖鎖であっても、Ｎ型糖鎖であってもよい。試料は脱脂、脱塩、タンパク質分画などの方法により前処理されていてもよい。
【００２８】
糖タンパク質を断片化するための「プロテアーゼ」としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｖ８）プロテアーゼ、顎下線プロテアーゼ、ブロメライン、サーモリシンなどが挙げられるが、好ましくはトリプシンである。
【００２９】
プロテアーゼによる切断を容易にするために、プロテアーゼ処理の前に、試料中の糖タンパク質を変性又は還元してもよい。変性剤としては、例えば、界面活性剤やカオトロピック剤を用いることができ、還元剤としては、例えば、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ｔｒｉｓ−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いることができる。
【００３０】
工程（ｂ）においては、糖タンパク質の糖鎖にアルデヒド基を導入するために、過ヨウ素酸酸化処理を行う。これにより、糖鎖構造におけるｃｉｓ−ジオールをジアルデヒドに変換することができる。過ヨウ素酸酸化処理により形成された糖鎖上のアルデヒド基は、後述する担体上の官能基と反応するため、これにより担体上に糖タンパク質を捕捉することができる。
【００３１】
過ヨウ素酸酸化処理は、複数回繰り返すことができる。この場合、過ヨウ素酸酸化処理後、還元処理を行い、その後、再度、過ヨウ素酸酸化処理を行うというサイクルとなる。還元処理には、例えば、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）を好適に用いることができる。過ヨウ素酸酸化は、ジオールが結合する炭素鎖の開裂を伴なうため、これを繰り返すことにより、糖鎖をより短鎖にすることができる。これにより、糖タンパク質試料の均一性を高めることができる。この処理後、過ヨウ素酸を失活させるために、二亜硫酸ナトリウム添加、チオ硫酸ナトリム添加、脱塩処理、エチレングリコール添加などの処理を行ってもよい。簡便さなどの観点から、二亜硫酸ナトリウム添加またはチオ硫酸ナトリム添加が好ましい。
【００３２】
工程（ｃ）に用いる「担体」としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖タンパク質を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、精製のスループットが大幅に向上される。また、当該粒子として磁性体ビーズを用いれば、磁力を使って容器壁面などにビーズを集積できるため、ビーズの洗浄を容易に行うことができる。
【００３３】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖タンパク質の効率が低下する。
【００３４】
担体は、少なくとも表面の一部に糖タンパク質の糖鎖を捕捉するための官能基を有する。このような官能基としては、ヒドラジド基又はアミノオキシ基が好ましい。これら官能基は、糖タンパク質における糖鎖のアルデヒド基と反応して、ヒドラジド結合またはオキシム結合により糖タンパク質を捕捉することができる。
【００３５】
糖タンパク質を捕捉するための担体としては、下記（式１）又は（式２）で表される構造を有する架橋型ポリマーを担体として用いることが特に好ましい。
【００３６】
【化３】
2015040817.tif 000004
【００３７】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
架橋型ポリマーとして、例えば、下記の構造を有する架橋型ポリマーを挙げることができる。
【００３８】
【化４】
2015040817.tif 000005
【００３９】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ）」（住友ベークライト株式会社製、＃ＢＳ−４５６０３）を好適に用いることができる。
【００４０】
糖タンパク質を捕捉するポリマー粒子によって糖タンパク質を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖タンパク質捕捉時の温度は、好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００４１】
工程（ｄ）における、糖タンパク質を捕捉した担体の洗浄により、担体に捕捉された物質のうち糖タンパク質以外の物質（非特異的に吸着した物質）を除去することができる。
【００４２】
糖タンパク質以外の物質を除去する方法としては、疎水結合を解離する能力のあるカオトロピック試薬であるグアニジン水溶液で洗浄する方法や、純水や水溶性緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液など）で洗浄する方法を用いることができる。洗浄工程における洗浄条件としては、温度が４〜４０℃、洗浄時間が１０秒〜３０分である。洗浄方法としては、担体がポリマー粒子の場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
【００４３】
具体的には、遠沈管やチューブにポリマー粒子を入れ、洗浄液を加え、振とうの後、遠心操作によりポリマー粒子を沈殿させて、上清を除去する操作を繰り返すことにより洗浄する。例えば、遠心チューブ内にポリマー粒子を入れ、洗浄液を加え、ポリマー粒子を自然沈降、または、遠心分離により強制的に沈降させた後、上清を除去する操作を繰り返すことで洗浄することができる。前記洗浄操作は３〜６回行うことが好ましい。磁性ビーズを用いる場合には、遠心操作は不要であり、簡便である。
【００４４】
また、チューブ状の容器であって、底面部に、液体透過可能で該ビーズが不透過な孔径を有するフィルターを装着するフィルターチューブを用いることも可能である。該フィルターチューブにポリマー粒子を入れて使用することで、洗浄に要した洗浄液を、フィルターを介して除去することが可能となり、前記の遠心操作後の上清除去の工程が必要なくなり、作業性の向上を図ることができる。
【００４５】
また、６〜３８４穴のマルチウェルプレートの底部が前記フィルターを装着したものが各種市販されており、これらのプレートを用いることでハイスループット化することが可能である。特に９６穴マルチウェルプレートは、溶液分注機器、吸引除去システム、およびプレートの搬送システムなどが開発されており、ハイスループット化に最適である。
【００４６】
連続式にて糖タンパク質捕捉反応を行った場合には、洗浄処理は、カラムに洗浄溶液を通して糖タンパク質捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖タンパク質を捕捉した担体以外の物質を除去してもよい。
【００４７】
なお、担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用してキャッピングすることができる。
【００４８】
工程（ｅ）においては、糖タンパク質が捕捉された担体から糖タンパク質を遊離させる。担体から糖タンパク質を切り離すためには、酸処理を行うことが好ましい。酸処理においては、酸と有機溶媒の混合溶媒あるいは酸と水と有機溶媒の混合溶媒を用いることができる。酸と水と有機溶媒の混合溶媒の場合、水の含有率は好ましくは０．１％〜９０％、より好ましくは０．１％〜８０％、さらに好ましくは０．１％〜５０％である。水の代わりに水性緩衝液を含有してもよい。緩衝液の濃度は好ましくは０．１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭである。反応溶液のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。使用する酸は、例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、硫酸が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、さらに好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。反応は、糖タンパク質を遊離させる反応を効率よく行う観点から、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。
【００４９】
弱酸性から中性付近で、糖タンパク質の遊離反応を行うことができるため、従来の強酸性処理、たとえば１０％トリフルオロ酢酸処理による切出しのような強酸の存在下での切出し反応に比べて、シアル酸残基の脱離など糖鎖の加水分解などを引き起こすことを抑制することができるようになる。
【００５０】
続けて、上記工程で得られた遊離の糖タンパク質の糖鎖を標識化することも可能である。標識化の方法としては、還元的アミノ化法と交換反応法が挙げられる。
【００５１】
還元的アミノ化法においては、アミノ基を有する化合物により、糖タンパク質を標識化する。反応系においては、ｐＨが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃ で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。アミノ化合物の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましく、還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましい。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。
【００５２】
ここで、アミノ基を有する化合物は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有することが好ましく、具体的には下記の群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ，２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ，３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ，７−Ａｍｉｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｄｉｎｅ，２−Ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ，Ｅｔｈｙｌｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ，及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ。
【００５３】
特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨが酸性から中性の条件で、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃、好ましくは３０〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍで、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍ 、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、さらに好ましくは１時間〜３時間である。
【００５４】
また、還元剤は、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。
【００５５】
先の糖タンパク質の切り離し工程後、得られる溶液は標識された糖鎖と過剰量加えた未反応アミノ化合物、還元剤が存在するため、これら余剰試薬を除去する工程を行うのが好ましい。シリカカラムによる除去、ゲル濾過による除去、イオン交換樹脂による除去、いずれの方法を用いても良いが、シアル酸の離脱を防ぐために使用する溶媒は中性であることが好ましい。
【００５６】
一方、交換反応法においては、洗浄操作後、アミノオキシ基を有する化合物を作用させることにより、ヒドラゾン−オキシム交換反応（糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基がヒドラジド基の場合）またはオキシム−オキシム交換反応（糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基がアミノオキシ基の場合）によって糖タンパク質が担体から切り離され、同時にアミノオキシ化合物によって標識化される。よって、本標識方法の場合、酸処理によって糖タンパク質を担体から切り離す操作は不要となる。
【００５７】
アミノオキシ基を有する化合物としては、下記から選ばれた物質またはその塩であることが好ましい。
Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ;  Ｏ-ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ; Ｏ−（２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ;  Ｏ−（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ;  ２−ａｍｉｎｏｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ;  ２−ａｍｉｎｏｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ; ４−［（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ;  ４−［（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ; ４−［（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｎ−ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ.
アミノオキシ基を有する化合物は、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基およびこれら誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことが好ましい。特に下記（式３）で表される構造を有するものが好ましい。
【００５８】
【化５】
2015040817.tif 000006
【００５９】
交換反応時の反応液のｐＨは、ｐＨ２〜７が好ましく、ｐＨ３〜６がより好ましく、ｐＨ３．５〜５．５が最も好ましい。酢酸／アセトニトリル溶液を加えることにより、反応液を上記のｐＨに調整することができる。交換反応時の温度は、５０〜９５℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましく、７０〜９０℃が最も好ましい。交換反応時、反応容器を開放して加熱操作を行うことにより、溶媒を蒸発させながら反応を進め、最終的に乾固させることにより、効率よく交換反応を行うことができる。
【００６０】
なお、上記のように担体上の官能基と糖タンパク質の糖鎖との間の結合を切断する方法以外に、糖タンパク質における糖鎖とタンパク質との間の結合を切断する方法を利用することも考えられる。このような方法としては、グリコシダーゼなどの酵素を利用する方法やヒドラジン分解などの化学的方法が挙げられる。この場合も、酸処理による切断の場合と同様、その後に標識化することも可能である。
【００６１】
回収した標識化された糖鎖溶液はそのまま、あるいは、過剰に含まれる標識化合物を除去したのち、質量分析法やＨＰＬＣなどの分析手段によって分析することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６３】
（１）タンパク質の前処理
アシアロフェツイン１
ｍｇを１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７−０２８７５）５０μLに溶解させた後、１２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ  ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３−０２１５２）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）によってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。
【００６４】
（２）糖鎖の酸化
（１）で調整した溶液に、１００ｍＭの過ヨウ素酸水溶液５０μＬ添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、２５０ｍＭ二亜硫酸ナトリウム２５μＬ添加し、過ヨウ素酸を失活させた。
【００６５】
（３）ペプチド断片の回収
糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有する粒子５ｍｇ（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ））、住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０３）が入ったディスポカラムに上記糖鎖溶液２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミノ溶液にて粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にて粒子を洗浄した。
【００６６】
続いて、粒子の入ったディスポカラムに超純水２０μLおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１．５時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。
【００６７】
５０％アセトニトリル／超純水溶液５０μＬを粒子の入ったディスポカラムに添加後、溶液を遠心回収し、目的のペプチド断片を得た。
【００６８】
（４）ペプチド断片の確認
得られた溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ブルカー・ダルトニクス社、Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ）及びＬＣ−ＭＳ（島津製作所、ＬＣ−ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ)を用いて分析した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、糖タンパク質を効率的に調製することが可能になる。本発明は、学術的な研究目的か産業応用かを問わず、広く糖鎖分析において貢献するものである。