(57)【要約】【課題】コードされた多重粒子での比較ゲノムハイブリダイゼーションの提供。【解決手段】本明細書で開示されるのは、ａ）ゲノムＤＮＡ試料を提供するステップと、ｂ）粒子混合物を提供するステップであって、混合物は異なる粒子セットからの粒子を含み、ここで、各粒子セットは、多数のコードされた粒子および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有し、その結果、混合物は複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを集合的に含むステップと、ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で粒子混合物の一部分に試料を接触させるステップと、ｄ）検出可能な標識をモニタリングすることにより混合物のそれぞれの一部分中の粒子に対する試料のハイブリダイゼーションを評価するステップであって、モニタリングからのシグナルは検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を示すステップとを含む、ゲノムＤＮＡの評価方法に関する。【選択図】図５
2015128453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００５年１２月２３日に出願された米国出願第６０／７５３，５８４号、２００５年１２月２３日に出願された米国出願第６０／７５３，８２２号、２００６年２月３日に出願された米国出願第６０／７６５，３１１号、および２００６年２月３日に出願された米国出願第６０／７６５，３５５号に対する優先権を主張する。これらの各々の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、ゲノム量を評価する方法である。ＣＧＨは、例えば、先天性異常、遺伝性疾患および癌を分析するのに使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
本発明者らは、複数の試料を同時に評価するため、コードされた粒子を用いてゲノム量を評価する方法を発見した。いくつかの実施形態では、ゲノム量の差は、例えば、分析用ＤＮＡおよび参照ＤＮＡを単一の混合物に合わせることなく、未知の試料からのＤＮＡおよび参照ＤＮＡを同時に評価して検出することができる。分析用ＤＮＡおよび参照ＤＮＡは、互いに別個のままである。複数の試料を、例えば、単一の標識により評価することができる。いくつかの他の実施形態では、単一の検出標識を使用して、分析用ＤＮＡおよび参照ＤＮＡを同一の混合物中で比較してゲノム量の差を検出する。分析用ＤＮＡおよび参照ＤＮＡは、例えば、異なる直接または間接標識を有することができる。該方法はまた、遺伝子発現分析のように、他の核酸、例えば、ｍＲＮＡを評価するのに使用することもできる。
【０００４】
１つの態様では、本開示は、ゲノムＤＮＡの評価方法を特徴とする。該方法は、異なる粒子セットからの粒子を含む混合物を使用する。混合物が複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを集合的に含むように、各粒子セットは、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有する。該方法は、ゲノムＤＮＡ試料および粒子混合物を提供すること、ハイブリダイゼーション条件下で粒子混合物の一部に試料を接触させること、検出可能な標識をモニタリングして、混合物のそれぞれの一部分の粒子と試料のハイブリダイゼーションを評価することを含むことができる。モニタリングからのシグナルは、検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を示す。
【０００５】
１つを超える核酸試料（例えば、ゲノムＤＮＡを含む試料）が提供され得る。例えば、各核酸試料を、該方法により評価することができる。試料は、別々のコンパートメントで評価することができる。いくつかの実施形態では、１つを超えるＤＮＡ試料を、同一のコンパートメントで評価することができる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は分光法により検出することができる。例示的な検出可能な標識は、フィコエリトリンまたは他の蛍光分子を含有することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、核酸ハイブリダイゼーションプローブは、クローン化核酸を含む、またはクローン化核酸から得られる。例えば、核酸ハイブリダイゼーションプローブは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来の核酸を含有することができる。ＢＡＣ核酸は、ヒトゲノムＤＮＡまたはヒト以外（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヤギ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、鳥、爬虫類、ヒト以外の霊長類（例えば、サルまたはヒヒ）、またはハエ）のゲノムＤＮＡのセグメントを含有することができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、核酸ハイブリダイゼーションプローブは、特定の染色体遺伝子座に特異的な１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドのコレクション）を含有することができる。例えば、プローブは、互いに５０、２０、５、２、１、または０．５メガ塩基対内にある配列に対し特異的であってよい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、または２００個の異なる粒子セットを使用して、例えば、異なる遺伝子座の各個数を評価することができる。いくつかの実施形態では、１個の粒子セットのコードされた粒子すべてが、同一のコードを有することができる。他の実施形態では、各粒子は固有のコードを有し、どの粒子がどの粒子セットにあるか、またはどのプローブが各粒子に結合されるかを示す情報が保存される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、複数の試料のうち少なくとも１つの試料は、検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数がわかっている参照試料であってよい。該方法は、参照試料のモニタリングからのシグナルを他の試料からのシグナルと比較して、該試料の検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を判定することを含み得る。
【００１１】
１つを超えるＤＮＡ試料が提供されるいくつかの実施形態では、各試料を第１の間接標識で標識することができ、各試料を第２の間接標識で標識された参照ＤＮＡと合わせることができる。参照ＤＮＡは、検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数がわかっている参照源由来のゲノムＤＮＡとすることができる。例えば、第１の間接標識はフルオレセインとすることができ、第２の間接標識はビオチンとすることができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、評価は、（ｉ）試料の第１の一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）に、単一の標識、および第１の間接標識を結合する薬剤を含む第１部分（ｍｏｉｅｔｙ）を合わせること、ならびに（ｉｉ）試料の第２の一部分に、単一の標識、および第２の間接標識を結合する薬剤を含む第２部分を結合することを含み得る。例えば、第１部分は、ストレプトアビジンまたはアビジンおよび検出可能な標識（例えば、フィコエリトリン）を含み得、第２部分は、抗フルオレセイン抗体またはこの機能部分および検出可能な標識（例えば、フィコエリトリン）を含み得る。いくつかの実施形態では、各ゲノム試料の異なる粒子セットの各々からの少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、または１００個の粒子が評価される。
【００１３】
１つを超える試料が提供される場合、１つを超える試料はそれぞれ、マルチコンパートメントデバイスの異なるコンパートメント中にあってよい。いくつかの実施形態では、各試料は、マルチウェルプレートの異なるウェル中にあってよい。マルチウェルプレートは、９６ウェル、３８４ウェル、または１０２４ウェルのアッセイプレートであってよい。
【００１４】
該方法は、例えば、複数の異なる染色体遺伝子座においてヘテロ接合性を検出するのに使用することができ、染色体増幅が検出でき、ヘテロ接合性の欠損が検出でき、染色体遺伝子座のヘテロ接合性欠失が検出でき、染色体遺伝子座のホモ接合性欠失が検出できる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、粒子は、例えば、ハイブリダイゼーション後、ポリメラーゼに接触しない。いくつかの実施形態では、粒子は、例えば、ハイブリダイゼーション後、いずれの酵素にも接触しない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ試料は非標識であってもよい。該方法は、標識プローブをゲノム試料にハイブリダイズすることをさらに含むことができ、ゲノム遺伝子が試料に存在する場合、試料核酸鎖との標識プローブのハイブリダイゼーション、および粒子に結合した核酸ハイブリダイゼーションプローブとの試料核酸鎖のハイブリダイゼーションにより形成された複合体により標識プローブが粒子に固定化されるように、粒子に結合した核酸ハイブリダイゼーションプローブごとに、１つの標識プローブが同一のゲノム遺伝子座の遺伝的関連部位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標識プローブは、粒子に結合した核酸プローブとのゲノムＤＮＡ試料のハイブリダイズと同時にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、標識プローブは、粒子に結合した核酸プローブとのゲノムＤＮＡ試料のハイブリダイズの後でハイブリダイズすることができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、該方法は、１つのソースからのゲノムＤＮＡを間接標識で標識してゲノムＤＮＡ試料を提供することをさらに含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、例えば単一の検出可能な標識が使用される場合、該方法は、１つのソース由来のゲノムＤＮＡを単一の標識で標識してゲノムＤＮＡ試料を提供することをさらに含み得る。該方法のいくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ試料のすべてを、単一の標識で標識することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、未知のゲノム量を有するゲノムＤＮＡ試料のすべてを、同一の間接標識で標識することができる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ試料の大部分を、同一の間接標識で標識することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、該方法は、ハイブリダイゼーションを評価する前に粒子を攪拌することをさらに含み得る。
【００２１】
例えば、粒子は、ホログラフ的にコードすることができ、または単一の検出標識のスペクトルとは分離可能なスペクトルを有する蛍光色素によりコードすることができる。該方法のいくつかの実施形態では、粒子は磁性を有し得る。例えば、粒子は常磁性ビーズである。
【００２２】
別の態様では、本開示は、単一の検出可能な部分および１つの粒子混合物を用いるゲノムＤＮＡの評価方法を提供する。混合物は、（複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを混合物が集合的に含むように、各粒子セットが、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有する）異なる粒子セットからの粒子を含む。該方法は、少なくとも１つの参照ＤＮＡ試料および複数のゲノムＤＮＡ試料を提供することを含む。各試料は、同一の検出可能な部分で標識される。該方法はまた、ハイブリダイゼーション条件下で粒子混合物の一部に試料をそれぞれ接触させること、および検出可能な部分をモニタリングして、混合物のそれぞれの一部分の粒子と各試料のハイブリダイゼーションを評価することも含む。例えば、各試料は、別々の容器で粒子混合物と接触する。モニタリングからのシグナルは、検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を示すことができる。該方法は、本明細書に記載された他の特徴を含み得る。
【００２３】
別の態様では、本開示は、単一の検出可能な部分および１つの粒子混合物を用いる核酸の評価方法を特徴とする。混合物は、（複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを混合物が集合的に含むように、各粒子セットが、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有する）異なる粒子セットからの粒子を含む。該方法は、第１の間接標識で標識された少なくとも１つの参照核酸試料、および複数のテスト核酸試料を提供することを含み得る。各試料は、第２の間接標識で標識される。該方法は、ハイブリダイゼーション条件下で粒子混合物の一部に各テスト試料および参照試料を接触させる（各テスト試料は、別々の容器で粒子混合物および参照試料に接触する）こと、各テスト試料の第１の一部分に、単一の標識、および第１の間接標識を結合する薬剤を含む第１部分を結合すること、各テスト試料の第２の一部分に、単一の標識、および第２の間接標識を結合する薬剤を含む第２部分を結合すること、試料の第１の一部分における単一の標識、および試料の第２の一部分における単一の標識をモニタリングして、各テスト試料を評価することを含み得る。モニタリングからのシグナルは、各標的のコピー数を示すことができる。該方法は、テスト試料ごとに、第１の一部分における単一の標識からのシグナルを、第２の一部分における単一の標識からのシグナルと比較して、参照試料に対するテスト試料中のプローブコピー数の指標を得ることを含み得る。該方法は、本明細書に記載された他の特徴を含み得る。
【００２４】
別の態様では、本開示は、複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを混合物が集合的に含むように、各粒子セットが、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有することができる、異なる粒子セットからの粒子を含有する粒子混合物を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子座の少なくともいくつかに対するプローブは、細菌人工染色体ＤＮＡを含有することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子座の少なくともいくつかに対するプローブは、超音波処理した細菌人工染色体ＤＮＡを含有することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子座の少なくともいくつかに対するプローブは、合成オリゴヌクレオチドのコレクションを含有することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、粒子混合物は、少なくとも２つの試料からのハイブリダイズしたＤＮＡを含む粒子をさらに含み得る。各試料はゲノムＤＮＡを含み、各試料は異なる間接標識で標識することができる。いくつかの実施形態では、粒子混合物は、検出可能な標識で標識される単一の試料からのハイブリダイズしたＤＮＡ、または１つを超える試料（例えば、第１試料および第２試料）からのハイブリダイズしたＤＮＡをさらに含み得る。
【００２７】
別の態様では、本開示は、複数のコンパートメントを有するマルチコンパートメントプレートを特徴とする。少なくとも複数のウェルのそれぞれは、本明細書に記載されたもののいずれかのような１つの粒子混合物、および試料または参照ゲノム核酸を含有することができる。試料および参照核酸は別々の容器中にあってよい。いくつかの実施形態では、試料および参照核酸は、同一の標識で検出することができる。
【００２８】
別の態様では、本開示は、第１の間接標識で標識された参照ゲノムＤＮＡ（または他の参照核酸）試料と、第２の間接標識でゲノムＤＮＡ（または他の核酸）試料を標識するための試薬とを含むキットを特徴とする。キットはまた、単一の標識、および第１の間接標識を結合する１つの薬剤を含む第１部分、単一の標識、および第２の間接標識を結合する１つの薬剤を含む第２部分、および本明細書に記載されたもののいずれかのような粒子混合物の１つまたは複数を含むこともできる。キットはまた、場合により、単一の標識の検出法および／またはキットを用いるアッセイの実施に関する説明書を含むこともできる。
【００２９】
本明細書に記載された１つまたは複数の成分を含むキットも開示される。キットは、方法、例えば、本明細書に記載された方法のための成分を使用するための説明書を含む材料をさらに含むことができる。キットは、１つまたは複数のクローン化もしくは合成核酸配列（細菌人工染色体（ＢＡＣＳ）または合成オリゴヌクレオチドの１つもしくは複数のコレクション、または個々のオリゴヌクレオチドなど）、１つまたは複数のマイクロウェルプレート、および／または、例えば、本明細書に記載されたような１つまたは複数の粒子セット、または１つの粒子混合物を含むことができる。
【００３０】
ビーズなどの粒子は、ゲノム量を評価するための特に堅固なシステムを提供する。粒子ベースの方法は、液相速度に近いまたは液相速度でのハイブリダイゼーションを含むため、均一性が向上する。粒子は、特定の粒子に関する多くのデータ点を得ることを容易にする。例えば、小粒子（例えば、直径が最大数ミクロンの粒子）では、同一のプローブを有する少なくとも１０、５０、または１００粒子が、個別に分析され得る。大粒子は、各粒子の目立たない位置から複数のデータ点を得ることを可能にすることができる。大粒子では、多くのデータ点を得るのに必要な粒子は少ない場合が多い。統計は、同一のプローブ量を有する粒子集団に関する中央値または平均値シグナルを判定するのに適用することができる。
【００３１】
本明細書に記載された方法は、レシオメトリックアッセイに使用することができる。レシオメトリックアプローチは、複数のアッセイを競合的におよび同時に実施することでアッセイ精度の多くの潜在的誤差を訂正する。例えば、インキュベーション条件または捕捉分子もしくは標識試薬の濃度におけるいかなる変動も、正規化により訂正される。競合または非競合レシオメトリックアッセイは、例えば、比較ゲノム量または比較遺伝子発現に使用することができる。
【００３２】
本明細書に引用された特許、特許出願、および参考文献はすべて、参照により本書に組み込まれる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ゲノムＤＮＡの評価方法であって、
ゲノムＤＮＡ試料を提供することと、
粒子混合物を提供することであって、該混合物は、異なる粒子セットからの粒子を含み、ここで、各粒子セットは、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有し、その結果、該混合物は、複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを集合的に含むことと、
ハイブリダイゼーション条件下で該粒子混合物の一部分に該試料を接触させることと、
検出可能な標識をモニタリングすることにより該混合物のそれぞれの一部分中の粒子に対する該試料のハイブリダイゼーションを評価することであって、ここで、該モニタリングからのシグナルは、検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を示すことと
を含む方法。
（項目２）
単一の検出可能な標識が使用される、項目１に記載の方法。
（項目３）
１種類を超えるＤＮＡ試料が提供され、該ＤＮＡ試料のそれぞれが前記方法により評価される、項目１に記載の方法。
（項目４）
粒子セットのコードされた粒子がすべて同一のコードを有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記検出可能な標識が分光法により検出できる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記検出可能な標識がフィコエリトリンを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記核酸ハイブリダイゼーションプローブがクローン化核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記核酸ハイブリダイゼーションプローブがＢＡＣ核酸を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ＢＡＣ核酸がヒトゲノムＤＮＡセグメントを含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記ＢＡＣ核酸がヒト以外のゲノムＤＮＡセグメントを含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記核酸ハイブリダイゼーションプローブが、特定の染色体遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドのコレクションを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
少なくとも２０個の異なる粒子セットが、少なくとも２０個の異なるゲノム遺伝子座を評価するのに使用される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
複数の試料のうち少なくとも１つの試料が、検討する各ゲノム遺伝子座を既知のコピー数で有する参照試料であり、前記方法が、該参照試料のモニタリングからのシグナルを他の試料からのシグナルと比較して、該試料の検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を判定することを含む、項目３に記載の方法。
（項目１４）
各試料が第１の間接標識で標識され、および各試料が第２の間接標識で標識された参照ＤＮＡと合わせられる、項目３に記載の方法。
（項目１５）
前記参照ＤＮＡが、検討する各ゲノム遺伝子座を既知のコピー数で有する参照源からのゲノムＤＮＡである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の間接標識がフルオレセインであり、前記第２の間接標識がビオチンである、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記評価することが、（ｉ）前記試料の第１の一部分に、単一の標識、および第１の間接標識を結合する薬剤を含む第１部分を結合することと、（ｉｉ）該試料の第２の一部分に、単一の標識、および第２の間接標識を結合する薬剤を含む第２部分を結合することとを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記第１部分が、ストレプトアビジンおよびフィコエリトリンを含み、前記第２部分が、抗フルオレセインおよびフィコエリトリンを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
各試料が、マルチコンパートメントデバイスの異なるコンパートメントである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
各試料が、マルチウェルプレートの異なるウェルである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
少なくとも１００個の粒子が、各ゲノム試料の異なる粒子セットの各々から評価される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
複数の異なる染色体遺伝子座でのヘテロ接合性が検出できる、項目１に記載の方法。
（項目２３）
染色体増幅が検出できる、項目１に記載の方法。
（項目２４）
染色体のヘテロ接合性欠失が検出できる、項目１に記載の方法。
（項目２５）
染色体のホモ接合性欠失が検出できる、項目１に記載の方法。
（項目２６）
ハイブリダイゼーション条件下での接触後、前記粒子がポリメラーゼに接触しない、項目１に記載の方法。
（項目２７）
ハイブリダイゼーション条件下での接触後、前記粒子が酵素に接触しない、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ゲノムＤＮＡ試料が標識されておらず、前記方法が、標識プローブを該ゲノム試料にハイブリダイズすることをさらに含み、ここで、前記ゲノム遺伝子座が該試料に存在する場合、試料核酸鎖への該標識プローブのハイブリダイゼーションおよび該粒子に結合した該核酸ハイブリダイゼーションプローブに対する該試料核酸鎖のハイブリダイゼーションにより形成された複合体によって該標識プローブが該粒子に固定化されるように、粒子に結合した核酸ハイブリダイゼーションプローブの各々について、１つの標識プローブが同一のゲノム遺伝子座の遺伝的連鎖部位にハイブリダイズする、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記標識プローブが、前記粒子に結合した前記核酸プローブに対して前記ゲノムＤＮＡ試料がハイブリダイズするのと同時にハイブリダイズされる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記標識プローブが、前記粒子に結合した前記核酸プローブに対して前記ゲノムＤＮＡ試料がハイブリダイズした後にハイブリダイズされる、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
１つのソースからのゲノムＤＮＡを間接標識で標識してゲノムＤＮＡ試料を提供することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
１つのソースからのゲノムＤＮＡを前記単一の標識で標識してゲノムＤＮＡ試料を提供することをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目３３）
前記ゲノムＤＮＡ試料のすべてが前記単一の標識で標識される、項目２に記載の方法。
（項目３４）
未知のゲノム含量を有するゲノムＤＮＡ試料のすべてが同一の間接標識で標識される、項目１に記載の方法。
（項目３５）
ゲノムＤＮＡ試料の大部分が同一の間接標識で標識される、項目１に記載の方法。
（項目３６）
ハイブリダイゼーションを評価する前に前記粒子を攪拌することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記粒子が、ホログラフ的にコードされるか、または前記単一の検出標識のスペクトルと分離可能なスペクトルを有する蛍光色素によりコードされる、項目２に記載の方法。
（項目３８）
前記粒子が常磁性ビーズである、項目１に記載の方法。
（項目３９）
単一の検出可能な部分を用いるゲノムＤＮＡの評価方法であって、
少なくとも１つの参照ＤＮＡ試料、および各試料が同一の検出可能な部分で標識されている複数のゲノムＤＮＡ試料を提供することと、
粒子混合物を提供することであって、該混合物は、異なる粒子セットからの粒子を含み、ここで、各粒子セットは、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有し、その結果、該混合物は、複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを集合的に含むことと、
ハイブリダイゼーション条件下で該粒子混合物の一部分に該試料のそれぞれを接触させることであって、各試料は別々の容器において該粒子混合物に接触することと、
該検出可能な部分をモニタリングすることにより該混合物のそれぞれの一部分中の粒子に対する各試料のハイブリダイゼーションを評価することであって、ここで、該モニタリングからのシグナルは、検討する各ゲノム遺伝子座のコピー数を示すことと
と
を含む方法。
（項目４０）
単一の検出可能な標識を用いる核酸の評価方法であって、
第１の間接標識で標識された少なくとも１つの参照核酸試料、および各テスト試料が第２の間接標識で標識される複数のテスト核酸試料を提供することと、
粒子混合物を提供することであって、該混合物は、異なる粒子セットからの粒子を含み、ここで、各粒子セットは、多数のコードされた粒子、および特定の標的に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有し、その結果、該混合物は、複数の異なる標的に対するプローブを集合的に含むことと、
ハイブリダイゼーション条件下で該粒子混合物の一部分に該テスト試料の各々および参照試料を接触させることであって、ここで、各テスト試料は、別々の容器中で該粒子混合物および該参照試料に接触することと、
各テスト試料の第１の一部分に、該単一の標識、および該第１の間接標識を結合する薬剤を含む第１部分を結合することと、
各テスト試料の第２の一部分に、該単一の標識、および該第２の間接標識を結合する薬剤を含む第２部分を結合することと、
該試料の該第１の一部分における該単一の標識をモニタリングし、該試料の該第２の一部分における該単一の標識をモニタリングすることにより各テスト試料を評価することであって、ここで、該モニタリングからのシグナルは、各標的のコピー数を示すことと、
各テスト試料について、該第１の一部分における該単一の標識からのシグナルを、該第２の一部分における該単一の標識からのシグナルと比較して、該参照試料に対する該テスト試料中のプローブのコピー数の指標を得ることと
を含む方法。
（項目４１）
粒子混合物であって、該粒子混合物は、異なる粒子セットからの粒子を含み、ここで、各粒子セットは、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有し、その結果、該混合物は、複数の異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを集合的に含む、混合物。
（項目４２）
前記遺伝子座のうちの少なくともいくつかに対するプローブが、細菌人工染色体ＤＮＡを含む、項目４１に記載の粒子混合物。
（項目４３）
前記遺伝子座のうちの少なくともいくつかに対するプローブが、超音波処理した細菌人工染色体ＤＮＡを含む、項目４１に記載の粒子混合物。
（項目４４）
前記遺伝子座のうちの少なくともいくつかに対するプローブが、合成オリゴヌクレオチドのコレクションを含む、項目４１に記載の粒子混合物。
（項目４５）
少なくとも２つの試料からのハイブリダイズしたＤＮＡをさらに含み、ここで、各試料がゲノムＤＮＡを含み、各試料が異なる間接標識で標識される、項目４１に記載の粒子混合物。
（項目４６）
検出可能な標識で標識された、単一の試料からのハイブリダイズしたＤＮＡをさらに含む、項目４１に記載の粒子混合物。
（項目４７）
複数のウェルを有するマルチウェルプレートであって、該ウェルのうちの少なくとも複数のウェルの各々が、
項目４１に記載の粒子混合物と、
試料または参照ゲノムＤＮＡであって、ここで該試料および参照ＤＮＡが別々の容器中にあり、同一の標識で検出できる、試料または参照ゲノムＤＮＡと
を含む、マルチウェルプレート。
（項目４８）
キットであって、
第１の間接標識で標識された参照ゲノムＤＮＡ試料と、
第２の間接標識でゲノムＤＮＡ試料を標識するための試薬と、
単一の標識、および該第１の間接標識を結合する薬剤を含む第１部分と、
単一の標識、および該第２の間接標識を結合する薬剤を含む第２部分と、
項目４１に記載の粒子混合物と
を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１〜６は、１つの例に従ってアッセイビーズに固定化された捕捉分子との一連の特異的結合相互作用の概略図である。
【図２】図１〜６は、１つの例に従ってアッセイビーズに固定化された捕捉分子との一連の特異的結合相互作用の概略図である。
【図３】図１〜６は、１つの例に従ってアッセイビーズに固定化された捕捉分子との一連の特異的結合相互作用の概略図である。
【図４】図１〜６は、１つの例に従ってアッセイビーズに固定化された捕捉分子との一連の特異的結合相互作用の概略図である。
【図５】図１〜６は、１つの例に従ってアッセイビーズに固定化された捕捉分子との一連の特異的結合相互作用の概略図である。
【図６】図１〜６は、１つの例に従ってアッセイビーズに固定化された捕捉分子との一連の特異的結合相互作用の概略図である。
【図７】図７は、図１から６に記載された例示のアッセイの工程フローチャートである。
【図８】図８は、例示的実施形態に従って実施された参照アッセイの結果を示す。
【図９】図９は、例示的実施形態に従って実施された参照アッセイの結果を示す。
【図１０】図１０は、例示的実施形態に従って実施された参照アッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、発現ＲＮＡに関する二重の間接標識−単回ハイブリダイゼーションを用いる例示的アッセイからの結果を示す。
【図１２】図１２は、参照およびテスト試料が同一のウェル中にない、１つの実施形態に従って実施された単色（単一標識）アッセイからの結果を示す直線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（詳細な説明）
多重核酸アッセイは、効率的および経済的な設計特性により大幅に容易になる。本明細書に記載の通り、単一標識の検出は、大型多重アッセイを実施するのに使用することができる。該アッセイは、異なる粒子セットからの小粒子の混合物を利用する。各粒子セットは、多数のコードされた粒子、および特定のゲノム遺伝子座またはＲＮＡなど特定の標的に対する１つの核酸ハイブリダイゼーションプローブを含有する。異なるセットからの粒子は、複数の異なる標的に対するプローブを集合的に含む混合物を提供するのに併用することができる。
【００３５】
１つの例では、粒子混合物は、少なくとも２つの一部分、ＡおよびＢに分けられる。テスト試料ゲノムＤＮＡは、第１部分で標識され、標識された一部分Ａにハイブリダイズされる。参照ＤＮＡ（典型的には参照試料からのゲノムＤＮＡ）は、第１部分または異なる部分（すなわち、第２部分）と同じであり得る部分により標識される。参照ＤＮＡは、一部分Ｂにハイブリダイズされる。一部分Ａおよび一部分Ｂからのシグナルが測定され、次いで比較される。参照ＤＮＡおよび試料ＤＮＡが同一の部分により標識される場合、これらは異なる容器において処理される。両ハイブリダイゼーション反応物は、部分が直接標識である、または直接標識に結合している場合（例えば、ハイブリダイゼーションの前後に）部分を検出するように設定された装置を用いて、わずかな操作で評価することができる。
【００３６】
使用される部分は、間接標識（間接標識として使用される色素など）、直接標識（例えばフルオロフォアなどの色素など）、または特異的結合ペアのメンバーであってよい。検出は、例えば、特異的結合ペアの標識された第２メンバーを用いる２次検出により、直接的または間接的であり得る。
【００３７】
第２の例では、テストおよび参照試料ゲノムＤＮＡは、それぞれが異なる間接標識により標識される。間接標識は、典型的には特異的結合ペアの第１メンバーである。試料は互いに混合され、粒子混合物の同一の部分にハイブリダイズされる。インキュベーションおよび洗浄後、該部分は、２つの特異的結合ペアの対応する第２メンバーと共にインキュベーションするため、少なくとも２つの容器に分けられる。２つの特異的結合ペアのこれらの第２メンバーは、検出に使用される第３の標識、および必要に応じて第４の標識に結合することができる。一般に、検出標識および２つの間接標識は、すべて互いに区別できる。例えば、１つまたは複数の標識が蛍光標識である場合、これらは、分光により区別できるように異なる励起および／または発光スペクトルを有する。
【００３８】
例えば、ビオチンはテスト試料に対する間接標識として使用することができ、カルボキシフルオレセインは参照試料に対する間接標識として使用することができる。故に、第１容器では、蛍光標識されたストレプトアビジン（ビオチンに結合する）が添加およびインキュベートされ、ならびに第２容器では、蛍光標識された抗フルオレセイン（カルボキシフルオレセインに結合する）が添加およびインキュベートされる。ＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ（商標）システムでは検出に好ましい蛍光標識は、フィコエリトリンである。結合した蛍光標識産物（テストおよび参照試料由来の）と共にインキュベートされた粒子混合物はそれぞれ、次いで単色検出システムを用いて順次読み取られ、シグナルが比較された。
【００３９】
これらの例は、単一検出により比較またはレシオメトリック情報を得る方法を例証する。例示的適用では、多数の異なる粒子試料は、単一のマルチウェルプレートにおいて、異なる標的、例えば、異なるゲノム遺伝子座に対するプローブを有する粒子混合物を用いて処理することができる。粒子混合物は、プレートの各ウェルに入れる。各試料はウェルの１つに入れる。この様式では、複数の試料は、同時におよびロボットの助けにより処理することができる。次いで、混合物中の異なる粒子タイプに対するハイブリダイゼーションを検出するため、各試料は器具（フローサイトメーターなど）を用いて評価することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、テストおよび参照試料は、２つの異なる直接または間接標識により標識される。標識が、直接標識（例えば、シアニン３およびシアニン５などの蛍光色素）の場合、次いで試料は混合され、１つの粒子セットにハイブリダイズされ、２つの標識を区別できる器具により検出することができる。標識が間接標識（すなわち、ビオチンおよびフルオレセインなどの特異的結合ペアの第１メンバー）の場合、次いで特異的結合ペアの各第２メンバー（例えば、ストレプトアビジンおよび抗フルオレセイン）は、シアニン３およびシアニン５など固有の検出標識により標識することができ、２つの標識を区別できる器具により検出することができる。
【００４１】
粒子
核酸量、例えば、ゲノム量を評価するのに、様々な異なるタイプの粒子を使用することができる。粒子は、いかなる形（例えば、円筒形、球形など）、大きさ、組成、または生理化学的特性であってよい。粒子の大きさまたは組成は、例えば、粒子孔径を有するフィルター上でまたはいくつかの他の物理的特性、例えば、磁性により、粒子を液体から分離できるように選択することができる。
【００４２】
粒子は、一般に多重アッセイに適している。例えば、各粒子は、固有のコード、特に、ゲノムＤＮＡに特異的な核酸プローブ以外のコードを含む。コードは、埋め込まれるか（例えば、粒子内部に）さもなければハイブリダイゼーションおよび分析を通じて安定な形で粒子に結合される。粒子を同定し、故にこれに固定化された捕捉プローブを同定するため、コードは、蛍光特性、色、形、大きさ、光発光、量子ドット発光などによる、ホログラフィックコード化など、任意の検出可能な手段により提供することができる。いくつかの実施形態では、コードは、核酸により提供されるもの以外である。
【００４３】
例えば、粒子は、光学、化学、物理、または電子タグを用いてコードされ得る。このようなコード化技術の例は、光学バーコード蛍光色素、または他の手段である。
【００４４】
１つの例示的プラットフォームは、特異的捕捉プローブが固定化された粒子セットの各メンバーを同定する手段として、ポリマー粒子に含浸した蛍光色素の混合物を利用する。別の例示的プラットフォームは、円筒形ガラス粒子を同定するのにホログラフィックバーコードを用いる。例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら（５，９８１，１８０）は、異なる粒子タイプが、ポリマー粒子に含浸した２つを超える蛍光色素の様々な割合の混合物によりコードされる、粒子ベースのシステムを記載する。Ｓｏｉｎｉ（５，０２８，５４５）は、粒子の同定に時間分解蛍光を使用する、粒子ベースの多重アッセイシステムを記載する。Ｆｕｌｗｙｌｅｒ（４，４９９，０５２）は、色および／または大きさにより区別された粒子を用いる例示的方法を記載する。ＵＳ２００４−０１７９２６７、２００４−０１３２２０５、２００４−１０３０７８６、２００４−０１３０７６１、２００４−０１２６８７５、２００４−０１２５４２４、２００４−００７５９０７は、ホログラフィックバーコードによりコードされた例示的粒子を記載する。
【００４５】
ＵＳ６，９１６，６６１は、粒子に対するコードを提供する色素を有するナノ粒子に関連したポリマー微粒子を記載する。ポリマー微粒子は、直径１ミリメートル未満、例えば、直径約０．１から約１，０００マイクロメートル、例えば、３〜２５μｍまたは約６〜１２μｍの範囲の大きさを有してよい。ナノ粒子は、例えば、直径約１ナノメートル（ｎｍ）から約１００，０００ｎｍ、例えば、約１０〜１，０００ｎｍまたは２００〜５００ｎｍの直径を有してよい。
【００４６】
複数のゲノム遺伝子座を調べるための粒子混合物は、異なる粒子セットからの粒子を結合して調製することができる。各粒子セットは、特定の遺伝子座に特異的な同一のコードおよび核酸プローブ量を有する多数の粒子を含有することができる。例えば、異なる粒子要素の数は、１０〜３０００、１０〜５００、２０〜２００、５０〜２０００、５０〜５００、または５０〜２００、または７５〜３００の範囲であってよい。各粒子セットは、個別に調製することができ、次いで粒子セットの一部分は、粒子混合物を提供するため他の粒子セットの一部分に結合される。
【００４７】
粒子混合物の一部分がＤＮＡ試料の分析に使用される場合、特定の遺伝子座に特異的ないくつかの粒子（例えば、少なくとも１０、２０、３０、５０、８０、もしくは１００個の粒子、または１〜５個の粒子であっても）が、この個々の試料に関するハイブリダイゼーション反応において存在するように、粒子セットの各一部分は多数の粒子を含む。粒子は、プローブへの比較的迅速な結合を促進するため液体試料内で浮遊状態で攪拌することができる。
【００４８】
粒子は、粒子とのハイブリダイゼーションの程度を判定するために分析される。例えば、ゲノムＤＮＡに関連した標識が検出される。粒子は、粒子コードを読み取り、各特定の粒子に関連したシグナルを判定することができる装置を用いて個別に評価することができる。
【００４９】
核酸プローブ
粒子は、一般に、適用に応じて、１つの特定の染色体遺伝子座または遺伝子に特異的なプローブを有する。例えば、プローブは、クローン化ＤＮＡ（例えば、ＢＡＣまたは酵母人工染色体または他のソースのクローン化ＤＮＡ）、増幅ＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドから調製することができる。一般に、判定可能な配列の任意の核酸源を使用することができる。プローブは、粒子に固定化される（例えば、多孔性粒子では表面、または内部および／もしくは外部表面）。
【００５０】
ある染色体プローブは、合成オリゴヌクレオチドの混合物を含む。別の例示的タイプの染色体プローブは、断片化ＢＡＣ  ＤＮＡとして固定化することができるＢＡＣのクローン化ＤＮＡから得られる。
【００５１】
一般に、特定の粒子に結合され得るプローブは、断片の混合物であってよい。例えば、断片はランダムに重複する配列を含み、この大部分は６００から２，０００塩基対の間の長さを有する。それぞれが約６０から１５０塩基対の間の長さを有し、重複または隣接する配列を有する合成オリゴヌクレオチド配列の混合物は、プローブとして調製することができる。オリゴヌクレオチド混合物は、確定的組成を有し、費用効率の高い方法で調製することができる。
【００５２】
プローブは、特定の粒子と共有結合することができる。例えば、ＵＳ６，０４８，６９５は、プローブを結合する例示的方法を記載する。特定の粒子セットに対するプローブが、１つまたは複数の化学合成オリゴヌクレオチドである場合、オリゴヌクレオチドは、粒子上の基と反応できる化学基（例えば、アミン）により合成することができる。プローブはまた、例えば、プラスミド、コスミド、および人工染色体などの他のソースから得ることもできる。例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）は超音波処理され得、次いでこれを粒子と共有結合させる架橋剤と反応され得る。例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣまたはＥＤＡＣ化学）は、超音波処理したＢＡＣ  ＤＮＡなどの核酸プローブを粒子に結合するのに使用することができる。
【００５３】
一般に、プローブを粒子セットに結合する場合、セット中のすべての粒子は同一の「コード」を有する。故に検出器は、特定の結合したプローブとのハイブリダイゼーションに関するシグナルを、セット中のすべての粒子に関する「コード」と関連づけるであろう。しかし、同一の特定のプローブに関する２つを超える「コード」を使用することも可能である。ソフトウェア（または手動計算であっても）は、次いで２つの「コード」に関するシグナルを特定のプローブと関連づけるのに使用することができる。極端には、各粒子は固有のシリアル番号、すなわち自身のコードを有する。データベースが、どの粒子コードが特定のプローブにより修飾されるかを追跡する限り、検出器からのデータは、シグナルをプローブとのハイブリダイゼーションと関連づけるのに使用することができる。
【００５４】
標識
試料標識。例えば、分析用のゲノムＤＮＡなどの試料ＤＮＡを標識するには、様々な方法を用いることができる。標識は、少なくともいくつかの修飾ヌクレオチド、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、またはシアニン修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチドによる重合により導入することができる。いくつかの実施形態では、標識は、ランダムプライミングおよび重合により導入される。他の例には、ニックトランスレーション（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナポリス  ＩＮ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド  ＣＡ）および化学標識（Ｋｒｅａｔｅｃｈ  ＵＬＳ社、アムステルダム  ＮＬ）が挙げられる。一般に、ゲノムＤＮＡ試料の標識に適した任意の標識方法が使用され得る。
【００５５】
共有参照。多くの実施形態では、方法は、既知の参照試料と未知の実験試料との間のシグナル比を評価する。例えば、２つの間接標識（ビオチンおよびフルオレセイン）は、２つの試料の競合ハイブリダイゼーションを可能にするのに使用される。ハイブリダイゼーション後、試料は２つの（または２つを超える）一部分に分けられ、各一部分は個別に評価される。評価結果は、２つの間接標識レベルの比を得るのに使用することができる。このアプローチは、競合ハイブリダイゼーションを用いてアッセイ間の任意の変動を正規化するという利点を有する。参照および実験試料はいずれも、同一の粒子と混合した同一の容器において同時にアッセイされる。
【００５６】
並行参照。いくつかの実施形態では、既知および未知の試料を別々の状態に保つことも可能である。競合ハイブリダイゼーションは使用されない。この場合、参照試料は１つの容器においてアッセイされ、少なくとも１つの実験試料は、別の容器においてアッセイされる。例えば、容器はマルチウェルプレートの異なるウェルであってよい。複数の実験試料が使用される場合、それぞれは、異なる容器、例えばマルチウェルプレートの異なるウェルにおいて評価することができる。各プローブに関する実験試料シグナル対参照試料シグナルの比は、競合アッセイと同じ方法で得ることができる。
【００５７】
このアプローチが利用される場合、単一の参照試料を、いくつかのまたは多くの実験試料間で共有することができる。１日あたり複数の試料を必要とする実験では、複数の重複する標準試料の標識を回避することで試薬費用および労力の節約となり得る。また、別の分析用の異なる一部分を得るのに試料を操作する必要がない。各試料は１回のみ評価することができる。
【００５８】
非共有結合標識。さらに別の実施形態では、各試料の個別の共有結合標識化が回避される。例えば、非標識ゲノムＤＮＡ試料が、コードされた粒子に固定化された捕捉プローブにハイブリダイズされる。前記捕捉プローブは、上述のようなＢＡＣ  ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド混合物を含む。予め標識されたレポーター配列も、捕捉プローブの配列に隣接するが重複しない配列においてプローブ−試料複合体にハイブリダイズされる。これらの標識されたレポーター配列は、同じまたは異なるハイブリダイゼーション反応においてハイブリダイズすることができる。この方法では、標識されたレポーター配列は、アッセイ時に各試料を個別標識することに比べて、アッセイあたりの費用を低減しつつ、大規模環境で大量に作製することができる。
【００５９】
検出
ハイブリダイゼーションの程度を示すシグナルは、粒子ごとに、１つまたは複数の検出可能な標識からのシグナルを評価して検出することができる。粒子は、典型的には個別に評価される。例えば、粒子は、フローサイトメーターに通すことができる。例示的フローサイトメーターには、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ−ＥＳＰフローサイトメーター、またはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．社（フラートン  ＣＡ）から入手可能なＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーター、およびＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．社、フォートコリンズ、コロラド州から入手可能なＭＯＦＬＯ（商標）フローサイトメーターが挙げられる。フローサイトメトリーに加えて、微粒子を分離および分類する機器として遠心分離機を使用してもよい。適切なシステムは、米国特許第５，９２６，３８７号に記載されているシステムである。フローサイトメトリーおよび遠心分離に加えて、微粒子を分離および分類する機器としてフリーフロー電気泳動装置を使用してもよい。適切なシステムは、米国特許第４，３１０，４０８号に記載されているシステムである。粒子を、表面に置いて走査または画像化してもよい。
【００６０】
例示的適用
本明細書に記載されたゲノム評価方法は、診断学および法医学を含む、様々な適用を有する。例えば、該方法は、成人、生殖細胞、胎盤細胞、または胎児細胞のゲノム量を判定するのに使用することができる。細胞は、任意の種由来であってよいが、典型的には２倍体種または高い倍数性を有する種由来である。例えば、細胞は植物（例えば、作物）または動物（例えば、ヒトまたは家畜）由来であってよい。
【００６１】
ヒトの医学的用途に関し、該方法は、患者からの試料、例えば、生検、血液試料、羊水試料、または頬スワブからの試料を評価するのに使用することができる。特に、患者は、癌のリクスがあるまたは癌を有する患者であってよい。試料は、腫瘍近くのまたは腫瘍由来の組織からの試料であってよい。例えば、該方法は、癌腫もしくは肉腫由来、または肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸、尿生殖路の腫瘍、腺癌（例えば、結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍）、肺の非小細胞癌、小腸癌および食堂癌由来の細胞のゲノム量を評価するのに使用することができる。癌において変化した多くの染色体遺伝子座が知られている。例えばDutrillauxら、CancerGenet. Cytogenet.４９：２０３〜２１７頁（１９９０年）、ＵＳ５，６７０，３１４（肺癌）、ＵＳ５，６３５，３５１（神経膠腫）、およびＵＳ６，１１０，６７３を参照されたい。該方法は、血液細胞（例えば、ＢもしくはＴ細胞）、または白血病もしくはリンパ腫由来の細胞のゲノム量を評価するのに使用することができる。
【００６２】
本明細書に記載された方法は、他の核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ以外のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡに適応することもできる。
【００６３】
本発明のいくつかの態様は、以下の非限定例によりさらに例証される。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
この例示的レシオメトリックアッセイでは、粒子を、単一の標識により同時に複数の試料について評価するのに使用する。例えば、異なる試料は、２つの別々のマイクロプレートウェルなど、別々の容器に入れる。１つまたは複数の対照試薬は、２試料間の結果を正規化するのに各容器において使用する。
【００６５】
単一標識の読み出しシステムを用いる例示的マルチ結合アッセイを以下に記載する。多重マルチ結合アッセイを、例えば、２つの試料ＩおよびＩＩにより実施する。アッセイは、追加試料にまで広げることができる。各試料を、試料Ｉではビオチン、試料ＩＩではジニトロフェノール（ＤＮＰ）など、１つの間接標識で標識する。両試料からの特定の分析物は、それぞれの粒子タイプ上の核酸プローブとの結合をめぐって競合する。インキュベーションおよび洗浄後、粒子セットを、２つの特異的第２標識と共に別々にインキュベーションするため、２つの容器に分ける。第１容器では、蛍光標識されたストレプトアビジンを添加およびインキュベートし、ならびに第２容器では、蛍光標識された抗ＤＮＰを添加およびインキュベートする。ＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ（商標）システムに関しては、蛍光標識ラベルはフィコエリトリンが好ましい。結合した蛍光標識産物ＩおよびＩＩと共にインキュベートした各粒子セットの粒子を、粒子コードをフィコエリトリンシグナルと関連づける単色検出システムにより順次評価する。
【００６６】
図１に関して、アッセイビーズ１は、この表面に固定化された捕捉分子２を有する。この図では、捕捉分子は、この例の目的のため直鎖状核酸配列として概略的に示されるが、捕捉分子は、クローン化ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドなどの特異的結合ペアの任意の核酸メンバーであってよい。アッセイビーズは、第１の液体アッセイ緩衝液３において懸濁される。
【００６７】
図２では、２つの標識された試料が図１のビーズ懸濁液に添加される。この例では、試料は、遺伝子発現アッセイまたは比較ゲノムハイブリダイゼーションアッセイにおいて見出されるような核酸配列として概略的に示されるが、この方法は、特異的結合アッセイの任意のタイプにより功を奏するであろう。この図では、第１試料からの分子５は、第１の間接標識Ｂ（この例ではビオチン）で標識され、第２試料からの分子４は、第２の間接標識Ｄ（この例ではジニトロフェノール［ＤＮＰ］）で標識される。この例では、「Ｂ」標識された分子５の２倍の「Ｄ」標識された分子４が存在する。試料分子は、ビーズに固定化された結合ペア相補体との結合をめぐって競合するであろう。
【００６８】
図３は、インキュベーション、およびビーズ上の捕捉分子との試料分子の特異的結合後の、図１からのビーズおよび間接標識された試料分子を示す。標識された試料分子４および５は、捕捉分子２上での結合をめぐって競合し、結合が起きた場合、結合複合体６を形成した。各ビーズでの特異的結合イベントの数は、相補的な試料分子の濃度にほぼ比例する。この例では、「Ｂ」標識された試料分子５に比べて２倍の「Ｄ」標識された試料分子４が各ビーズで捕捉される。
【００６９】
図４では、捕捉された間接標識分析物７および８を有するビーズ複合体９は、洗浄され、第２の緩衝液１２で再懸濁される。洗浄は、ビーズに特異的結合されなかった任意の試料分子を除去する。ビーズはまた、アリコートＡおよびＢに分けて示される。これは、典型的には、攪拌により緩衝液でビーズを懸濁し、次いでビーズ−緩衝液の懸濁液容量の約半分を第２マイクロプレートウェルなどの第２容器にピペッティングして行われる。２つのアリコートは、ビーズ複合体９とほぼ同じ量および濃度を有する。
【００７０】
図５では、試料分子上の間接標識に相補的な異なる蛍光標識分子結合体１０および１１が、各アリコートに添加される。アリコートＡでは、蛍光標識１０（フィコエリトリンまたはシアニンまたは他のフルオロフォアなど）に結合したストレプトアビジンが添加される。蛍光標識は、下流の蛍光ビーズ読み取りシステムに適合するように選択される。アリコートＢでは、同じ蛍光標識１１に結合した抗ＤＮＰが添加される。ストレプトアビジンおよび抗ＤＮＰは、例示的なビオチンおよびＤＮＰ間接標識に相補的であることから、この例ではこれらが使用されるが、いずれの高親和性特異的結合ペアも使用することができる。
【００７１】
図６では、蛍光標識されたビーズ結合体１３および１４は、図５に示された混合物のインキュベーション後に生じ、続いて洗浄、および第３の緩衝液１５におけるビーズ複合体の再懸濁が行われた。各アリコートは、アッセイ試料の１つにおける分析物濃度にほぼ比例した各アリコートのビーズ上の蛍光標識集団を有する、蛍光標識されたビーズ複合体を含有する。各アリコートは、現在、各ビーズにおける蛍光標識密度に比例したシグナルを生成する、単一標識の蛍光ビーズ読み取りシステム（ＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ（商標）システムなど）により個別に読み取ることができる。
【００７２】
図７は、図１〜６に記載されたアッセイ例の工程フローチャートである。第１試料１６は、第１間接標識１７（この場合はビオチン）と共にインキュベートされ１８、第１間接標識された試料１９を生成する。別に、第２試料２０は、第２間接標識（ＤＮＰ）２１と共にインキュベートされ２２、第２間接標識された試料２３を生成する。間接標識を有するこれら２つの試料、１９および２３は、次いでコードされたビーズセット２４により競合的方法でインキュベートされる２５。ビーズセットは、例えば、各ビーズタイプに固定化された異なる捕捉分子を有する、コードされたＬＵＭＩＮＥＸビーズのセット（ＬＵＭＩＮＥＸ用語ではビーズ「領域」）であってよい。競合的インキュベーション２５の後、ビーズは洗浄され、洗浄緩衝液３４により再懸濁され２６、再懸濁されたビーズは２つのアリコート２７および２８に分けられる。
【００７３】
間接標識のそれぞれに対する蛍光標識された特異的相補体が、次いで各アリコートに別々に添加される。この例では、ストレプトアビジン−フィコエリトリン２９が、第１間接ビーズアリコート２７と共にインキュベートされる３１。ストレプトアビジンは、ビーズ複合体のビオチン間接標識と特異的に結合する。別に、抗ＤＮＰ−フィコエリトリン３０が、第２ビーズアリコート２８と共にインキュベートされる３２。抗ＤＮＰは、ビーズ複合体のＤＮＰ間接標識と特異的に結合する。次に、および２つのアリコートを別々の状態にしたまま、余分な蛍光結合体が洗浄緩衝液３５および３６で洗い流される３１および３２。最後に、それぞれ蛍光標識されたビーズアリコートが、この例ではＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ  １００（商標）またはｘＭＡＰ  ２００（商標）機器を用いて別々に読み取られる３３。
【００７４】
（実施例２）
図８から１０は、例示的参照アッセイの結果を示す。図８は、間接標識としてのビオチンおよびフルオレセインにより、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）プラットフォームで行われた１０の５乗のＢＡＣ−ＣＧＨアッセイの特異度および感度を示す。アミノ酸表面に対するカルボキシル化ビーズ表面を最初に修飾し、次いで１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣまたはＥＤＡＣ化学）を用いてＢＡＣ断片の５’末端をビーズに固定化することで、まず、５つのＢＡＣそれぞれからの断片化ＤＮＡを５セットのＬＵＭＩＮＥＸビーズに固定化した。次いで、それぞれが異なるＬＵＭＩＮＥＸビーズＩＤすなわち「領域」を有する、６つのビーズセットを、１つの多重ビーズセットにプールした。これらのステップを以下に詳述する。
【００７５】
ＢＡＣプローブ、基準、および試料。細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡは、捕捉プローブをコードされたビーズに固定化させるのに使用した。５つの異なるヒトＢＡＣ（すべてＨｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（バッファロー、ＮＹ）により提供された）を、次の実験：ＲＰ１１−２８９Ｄ１２（１５ｑ１１．２）；ＲＰ１１−５２４Ｆ１１（１７ｐ１１．２）；ＲＰ１１−１３９８Ｐ１２（４ｑ１６．３）；ＲＰ１１−４７６−Ｃ２０（２２ｑ１１．２１）；ＲＰ５−５９Ｄ１４（１７ｐ１３．３）において固定化捕捉分子として使用した。これらのＢＡＣは、染色体遺伝子座を括弧で示したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋクローン＃によりリストされる。
【００７６】
これらのＢＡＣは、実験における基準として使用した。５つのＢＡＣのプールを、ビオチン標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドによるＫｌｅｎｏｗランダムプライマー標識を用いて、陽性試料を酵素標識するのに使用した。さらに、陰性対照としてＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  １５２７９−０１１、カールスバッド  ＣＡ）を、コードされたビーズに固定化した。
【００７７】
ＢＡＣプローブの調製およびビーズへの固定化  ＢＡＣ  ＤＮＡは、ＬＵＭＩＮＥＸ社（オースチン  ＴＸ）製のＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ（商標）ビーズに固定化した。ｘＭＡＰ（商標）ビーズは、表面のカルボキシル基により官能化されたポリスチレンから成る。これらのビーズは、常磁性バージョンおよび非磁性バージョンの両方で提供される。常磁性ビーズは、洗浄ステップでは溶液からのビーズの分離を促進するが、洗浄がフィルターカラムまたはプレート（例えばＨＴＳ  ０．４５μｍ、カタログＭＳＨＶＮ４５１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ  ＭＡ）で実施される場合、非磁性ビーズについても同じプロトコルが機能する。
【００７８】
ＢＡＣおよび対照プローブの磁性ＬＵＭＩＮＥＸビーズへの固定化プロトコルは、以下の通りである。
【００７９】
４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミンおよびエチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）との反応によるカルボキシル化ビーズのアミノ転換
１．ＬＵＭＩＮＥＸスタンドード輸送／保管用バイアルから６つのビーズ領域（２４、４６、４７、５６、６８および７９）２５０μｌ（２．５×１０６ビーズ）を、シリコン処理した２００μｌピペットチップを用いて６つの別々の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注した。
【００８０】
２．７５０μｌの０．１Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０を各チューブに添加した。各チューブをボルテックスし超音波処理した。
【００８１】
３．サマリウム磁石ディスク磁石を１０分間バイアルの側に接触させて各チューブの電磁ビーズをペレット化した。電磁ビーズの攪乱を避けながら液体９００μｌを慎重に除去した。
【００８２】
４．各チューブでＭＥＳにより容量を合計８０μｌに調整した。１０μｌの４，９−ジオキサ−１，１２−ドデカンジアミン（５０μｌ／ｍｌ  ＭＥＳで）および１０μｌのＥＤＣ（ＭＥＳ中５０ｍｇ／ｍｌ）を各チューブに添加した。
【００８３】
５．ビーズを再懸濁するため各チューブをボルテックスし超音波処理した。
【００８４】
６．チューブ回転機で１２０分間室温にてインキュベートした。
【００８５】
７．ＰＢＳ  ９００μｌをビーズに添加し、ボルテックスし超音波処理した。
【００８６】
８．５分間、磁石を用いて電磁ビーズをペレット化した。メスピペットで液体１，０００μｌを除去し、１，０００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加した。各チューブをボルテックスし超音波処理してビーズを再懸濁した。
【００８７】
９．ビーズ３×の各チューブを、磁石でペレット化して洗浄し、液体を取り除き、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ  ０．０１％  ＢＳＡ  ０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を添加し、超音波処理しボルテックスした。最終的な緩衝液添加は、保存のための２５０μｌ  １×ＰＢＳ  ０．０１％  ＢＳＡであった。
【００８８】
ＢＡＣおよび対照ＤＮＡのビーズとのＥＤＣ結合
１．６つのビーズ領域それぞれの０．５×１０６アミノビーズ（５０μｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに等分し、ボルテックスし超音波処理した。
【００８９】
２．５．０μｌのＢＡＣ  ＤＮＡまたはＣｏｔ−１  ＤＮＡ（超音波処理により断片化した）（名目濃度５０ｎｇ／μｌ）を各チューブに添加し、簡単にボルテックスした。５μｌの溶解したてのＥＤＣ（ｄＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。直ちにボルテックスし、次いで暗所で３０分間室温にてインキュベートした。ＥＤＣ添加を繰り返し、ボルテックスし、３０分間インキュベートした。７００μｌの０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０をｄＨ２Ｏに添加しボルテックスした。
【００９０】
３．磁石を用いて電磁ビーズを５分間ペレット化した。上清を除去した。ビーズをｄＨ２Ｏ中９００μｌ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０において再懸濁し、ボルテックスし超音波処理した。１００℃で５分間加熱し、表面に結合した二本鎖ＤＮＡを変性させた。このステップをもう１回繰り返した。
【００９１】
多重ビーズミックスの調製
１．固定化したＢＡＣおよびＣｏｔ−１対照プローブを有するビーズの６チューブそれぞれをボルテックスし超音波処理した。各ビーズチューブからのアリコートを推定ビーズ収量２，５００ビーズ／μｌを有する新たなチューブに等分した。
【００９２】
２．多重ビーズミックスビーズを磁石で１０分間ペレット化した。２００μｌの加温したＡＭＢＩＯＮ（登録商標）Ｓｌｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃２（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン  ＴＸ）を添加した。１０μｌのアリコートで使用されたビーズミックスは、各アリコートの各領域の約２，５００ビーズと２０回ハイブリダイズするのに十分であった。
【００９３】
実証アッセイでは、試料ＤＮＡは、多重ビーズの調製に使用した同一のＢＡＣ  ＤＮＡ断片をプールして調製した。二本鎖であるＢＡＣ  ＤＮＡは、変性後、自体と特異的にハイブリダイズし、既知の濃度の試料により標準曲線を作成できるようにする。８つの濃度のそれぞれの希釈物（６．２５ｎｇ／ｍｌから２倍ずつ希釈）を基準として使用した。これらのＤＮＡ希釈物はそれぞれ、２つのアリコートに分け、２つのアリコートはそれぞれ、間接標識試料を作製するためフルオレセインまたはビオチンで標識した。
【００９４】
標識は、標準のシアニン色素標識ヌクレオチドの代わりにビオチン標識およびフルオレセイン標識ヌクレオチドを使用する、標準的ＢｉｏＰｒｉｍｅ（商標）ＢＡＣプラナーマイクロアレイランダムプライマー標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド  ＣＡ）を使用して実施した。詳細は以下の通りである。
【００９５】
１．５つのＢＡＣのそれぞれのアリコートを単一のチューブに等分し、ボルテックスした。２μｇの各プールをマイクロフュージチューブに添加した。容量を脱イオンＨ２Ｏで５０μｌに調整した。
【００９６】
２．キットからの２．５×ランダムプライマーミックス４０μｌを２つの標識反応物それぞれに添加した。２秒間ボルテックスし、１０秒間遠心分離した。
【００９７】
３．ＤＮＡをヒートブロックで５分間、１００℃で変性させた。氷スラリーで５分間スナップ冷却し、１０秒間遠心分離した。
【００９８】
４．ビオチンマスターミックス（６つの反応物に十分な）を作製した。
【００９９】
１６μｌのＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＥＤＴＡおよびトリス緩衝液中の非標識ｄＮＴＰヌクレオチドミックス、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、ヒューストン  ＴＸ）
１０μｌのビオチンｄＣＴＰ
６．５μｌのＫｌｅｎｏｗ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド  ＣＡ）
合計３２．５μｌ
５．マスターミックス１０μｌを各チューブに添加し、１０秒間遠心分離し、それぞれを３７℃で２時間インキュベートした。
【０１００】
６．各反応物から３μｌを除去し、アガロースゲルで電気泳動を行い標識した産物が約１００ｂｐ長であることを確認した。
【０１０１】
７．８μｌのＥＤＴＡをｄＨ２Ｏに添加し（ｐＨ８．０）、７０℃で１０分間インキュベートした。標識した試料を氷上に置いた。
【０１０２】
８．９０μｌのＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡおよび剪断したサケの精巣）を添加し、３８．８μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、ボルテックスした。２６０μｌのイソプロパノールを添加し、ボルテックスし遠心分離した。
【０１０３】
９．室温で２０分間インキュベートした。フルスピードで２０分間遠心分離した。必要とされるまで４℃で保存した。
【０１０４】
１０．使用前に、標識したＢＡＣを室温まで加温し、１０分間遠心分離した。
【０１０５】
１１．上清を除去し、７０％エタノール  ３０％  ｄ．１，０００μｌを添加した。さらに３分間遠心分離し、ペレットを残して全液体を除去した。
【０１０６】
１２．１０分間、または目視で乾燥するまで空気乾燥した。
【０１０７】
１３．脱イオンＨ２Ｏ  ２０μｌをペレットに添加し、室温で１０分間インキュベートした。標識したＤＮＡの推定濃度：２μｇ／２０μｌ（１００ｎｇ／μｌ）。
【０１０８】
上述のプロトコルを、ステップ４の第２のフルオレセインマスターミックスでは、ビオチンヌクレオチドに代えてフルオレセインヌクレオチドにより繰り返した。これら２つの操作の産物は、ビオチン標識したＢＡＣプールおよびフルオレセイン標識したＢＡＣプールであった。これらは、プローブに使用したのと同じＢＡＣの標識プールを含んでいた。これは、固定化されたプローブと完全に一致する陽性ハイブリダイゼーション相補体であろう。例えば、患者または他の被験者由来のゲノムＤＮＡなど、細胞から調製した核酸試料では、同じ手順を使用することができる。
【０１０９】
８対の直接標識した試料を、次いでＬＵＭＩＮＥＸ多重ビーズセットにそれぞれハイブリダイズした。８対を、図８の図の横軸に並んだ表記ごとに、上昇するフルオレセイン標識した試料濃度を、低下するビオチン標識した試料濃度と混合してまとめた。以下に詳述の通り、ハイブリダイゼーションは５０℃で２時間実施し、続いて３回のストリンジェント洗浄を５０℃で実施した。ストリンジェント洗浄緩衝液は、順に、２×ＳＳＣ＋５０％脱イオンホルムアミド、２×ＳＳＣ＋０．１％  Ｉｇｅｐａｌ、および０．２×ＳＳＣであった。
【０１１０】
ハイブリダイゼーションおよび検出
１．標識した試料の４つの希釈シリーズを１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブにおいて作製した。同じ標識希釈物の逆数ペアを混合して以下の８試料を形成した。
【０１１１】
試料＃    ５ＢＡＣプール、フルオレセイン    ５ＢＡＣプール、ビオチン
１        ０．０３９ｎｇ    ＋              ６．２５ｎｇ
２        ０．０７８ｎｇ    ＋              ３．１２ｎｇ
３        ０．１５６ｎｇ    ＋              １．５６ｎｇ
４        ０．３１ｎｇ      ＋              ０．７８ｎｇ
５        ０．７８ｎｇ      ＋              ０．３１ｎｇ
６        １．５６ｎｇ      ＋              ０．１５６ｎｇ
７        ３．１２ｎｇ      ＋              ０．０７８ｎｇ
８        ６．２５ｎｇ      ＋              ０．０３９ｎｇ
２．標識した試料の容量をＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ社、アッシュビル  ＮＣ）で凍結乾燥（ｄｒｙ  ｄｏｗｎ）した。上記のように調製した加温した多重ビーズミックス１０μｌを添加した。ピペットで混合し、ヒーターブロックで９８℃にて２分間変性させた。
【０１１２】
３．マイクロチューブをアルミホイルで覆った５０ｍｌ遠心分離チューブの内部でインキュベートしてハイブリダイズし、５０℃のオーブンの回転ラックに２時間置いた。
【０１１３】
４．ハイブリダイゼーション後、１ｍｌの０．２×ＳＳＣを各試料チューブに添加し、ボルテックスした。
【０１１４】
５．各チューブの内容物を９６ウェルＰＣＲプレートの２ウェルに移し、ハイブリダイズした各ビーズセットを１組の５００μｌアリコートに分けた。
【０１１５】
６．プレートウェルのビーズを磁石で１０分間ペレット化し、５００μｌの上清をビーズの減少を避けるため慎重に除去した。
【０１１６】
７．８μｇ／ｍｌのＰＪ３１Ｓストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｐｒｏｚｙｍｅ社、サンリアンドロ  ＣＡ）１００μｌを各ペアの１つのウェルに添加し、１００μｌの８μｇ／ｍｌ抗フルオレセイン−フィコエリトリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ−２１２５０）を各ペアの他のウェルに添加した。次いで、プレートを、ＮＣＳ（商標）Ｓｈａｋｅｒ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ボストン  ＭＡ）において室温で９５０ＲＰＭにて３０分間攪拌しながらインキュベートし、続いてビーズを１×ＰＢＳ＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で洗浄した。
【０１１７】
８．各プレートウェルのビーズを磁石で１０分間ペレット化し、１００μｌの上清をビーズの減少を避けるため慎重に除去した。１００μｌのトリス−ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ  ２０  緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁するため再ピペッティングにより混合した。
【０１１８】
９．試料をＬＵＭＩＮＥＸ  １００（商標）分析器で読み取り、各ウェルの各ビーズ領域の蛍光強度中央値を記録した。
【０１１９】
ステップ（７〜９）で上に詳述した通り、間接標識を用いた２つの試料の競合ハイブリダイゼーションアッセイの終了後、多重アッセイしたビーズセットを再び分けた。一方のアリコートは、４μｇ／ｍｌの抗フルオレセイン−フィコエリトリンで二次標識し、他方は、４μｇ／ｍｌの抗ストレプトアビジン−フィコエリトリンで二次標識した。これらの二次標識ビーズセットのそれぞれを、次いでＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ  ２００（商標）システムで別々に読み取った。
【０１２０】
この結果を図８に示す。各ＢＡＣからのシグナルは、別々のデータトレースとして示され、およびフルオレセイン標識した試料は、ビオチン標識したものとは別個に示される。それぞれは、約１６０：１の濃度範囲にわたるシグナルに対する線形濃度反応を示す。最大のフルオレセイン標識シグナルは、最も低いビオチン標識シグナルに干渉することはないようであり、この反対も同様である。また、ＣＯＴ−１が固定化したビーズからのシグナルは、特異的結合イベントからの最も低いシグナルよりも低い。こうしたシグナルは、全条件下のフルスケールの２％未満であった。これは、２つの間接標識は、これらの濃度範囲では実質的な干渉または交差反応性を示さないことを実証する。
【０１２１】
図９は、異なる様式でフォーマットされた図８からのデータを示す。これは、示差的遺伝子発現マイクロアレイ解析でしばしば使用されるタイプの、「同一対同一」散布図である。両軸のスケールは、ビオチンおよびフルオレセイン標識したＢＡＣ試料それぞれの正規化濃度である。理想的なまたは完全なアッセイでは、各データ点は対角線上にあるであろう。それぞれの競合アッセイした間接標識試料からのシグナルは、濃度が同じであるため、同じとなろう。実際のデータは対角線付近に密集し、理想との偏差はわずか１．５倍であり、典型的に少ない。標準ＣＧＨ（または同様に遺伝子発現）アッセイは、通常、生物学的有意性を示す閾値として２：１の示差的シグナルを用いる。
【０１２２】
（実施例３）
図１０は、間接標識ゲノムＤＮＡ試料に関する、上述した同一の多重ビーズセットを用いた、１０の５乗のＣＧＨアッセイの結果を示す。ゲノムＤＮＡ試料（ヒトゲノムＤＮＡ：男性；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、マジソン  ＷＩ）を２つのアリコートに分けた。一方のアリコートをフルオレセインで間接標識し、他方は、上述のＢｉｏＰｒｉｍｅ（商標）を用いてビオチンで間接標識して２つの間接標識試料を作製した。２つの間接標識試料を次いで混合し、多重ビーズセットに対して共に競合アッセイした。間接標識による競合アッセイ後、ビーズセットを分け、一方のアリコートを抗フルオレセイン−フィコエリトリンで二次標識し、他方はストレプトアビジン−フィコエリトリンで二次標識した。これらの二次標識ビーズセットのそれぞれを、次いでＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ  ２００（商標）システムで読み取った。結果のデータは、再び、図１０の「同一対同一」散布図としてフォーマットする。図９に示した意図的に構築された希釈シリーズと同様、ゲノムＤＮＡの分割した試料からのデータは、図の対角線にピタリと一致する。
【０１２３】
（実施例４）
本発明の別の態様を説明する例示的アッセイでは、合成の７０−ｍｅｒアミン修飾オリゴヌクレオチドプローブ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ハンツビル  ＡＬ）をＬｕｍｉｎｅｘ多重ビーズに固定化し、参照およびテスト試料が同じウェルにない場合は単色アッセイを実施した。この実験は１７個の異なるプローブを利用した。このうち４個は、下の表に詳述の通り、ＸおよびＹ染色体上の遺伝子座を表す５つのオリゴヌクレオチドをプールまたは組み合わせたセットであった。この多重プローブセットにより、男性および女性のＤＮＡを区別する実証アッセイを実施した。
【０１２４】
【表１−１】
2015128453.tif 000003
【表１−２】
2015128453.tif 000004
【表１−３】
2015128453.tif 000005
多重オリゴビーズミックスを作製するため、アミン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、コードされたＬｕｍｉｎｅｘ  ｚＭａｐ微小球またはビーズに結合するプロトコルは以下の通りであった。
【０１２５】
１．−２０℃の、乾燥ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）粉末（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌｏｇｙ社、ロックフォード
ＩＬ）の新鮮な１アリコートを室温に戻す。
【０１２６】
２．７０−ｍｅｒのＣ−６アミン修飾オリゴヌクレオチドを、ｄＨ２Ｏで１００μＭ（１００ピコモル／μＬ）まで再懸濁する。
【０１２７】
３．貯蔵ｘＭＡＰ微小球を光学ボルテックス（ｌｉｇｈｔ  ｖｏｒｔｅｘ）および超音波処理により約２０秒間再懸濁する。
【０１２８】
４．貯蔵微小球（１００μＬ）の１，２５０，０００ビーズを、１．５ｍｌ  Ｓｅａｌ−Ｒｉｔｅマイクロフュージチューブ（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、オカラ  ＦＬ）に移す。
【０１２９】
５．貯蔵微小球を、マイクロ遠心分離により≧８０００×ｇで３〜５分間（固体ペレットの形成に十分な時間）ペレット化する。
【０１３０】
６．上清を除去し、ペレット化した微小球を５０μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．５で約２０秒間（チューブにペレットまたはスメアリングが目で確認できなくなるのに十分な時間）、超音波処理により再懸濁する。
【０１３１】
７．１００μＭのアミンオリゴヌクレオチド１：４（３μＬのｄＨ２Ｏ中１μＬ）を、最終濃度２５μＭ（２５ピコモル／μＬ）に希釈する。
【０１３２】
８．捕捉オリゴ（２５ピコモル）１．０μＬを添加し、超音波処理により約２０秒間混合する。
【０１３３】
９．ｄＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣの新鮮溶液を調製する。（注：第２のＥＤＣ添加に再使用するためＥＤＣ粉末を乾燥剤に戻す）。
【０１３４】
１０．反応ごとに１つずつ、新鮮な１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ  ２５μＬを微小球（２５μｇまたは≒［０．４７μｇ／μＬ］ｆｉｎａｌ）に添加し、超音波処理により約２０秒間混合する。
【０１３５】
１１．（微小球の沈降を減少するため）１５分を目印に超音波処理しながら、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。
【０１３６】
１２．ｄＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣの新鮮溶液を調製する。（注：ＥＤＣ粉末のアリコートは今や捨てるべきである。本発明者は、結合エピソードごとにＥＤＣ粉末の新鮮なアリコートを用いることを推奨する）。
【０１３７】
１３．反応ごとに１つずつ、新鮮な１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ  ２５μＬを微小球に添加し、超音波処理により約２０秒間混合する。
【０１３８】
１４．１５分を目印に超音波処理しながら、暗所で室温にて３０分間インキュベートする。
【０１３９】
１５．０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０  １．０ｍＬを結合した微小球に添加し、ボルテックスおよび超音波処理により混合する。
【０１４０】
１６．結合した微小球を、マイクロ遠心分離により≧８０００×ｇで３〜５分間ペレット化する。
【０１４１】
１７．上清を除去し、結合した微小球を１．０ｍＬの０．１％  ＳＤＳ緩衝液でボルテックスおよび超音波処理により再懸濁する。
【０１４２】
１８．結合した微小球を、マイクロ遠心分離により≧８０００×ｇで６〜１０分間ペレット化する。
【０１４３】
１９．上清を除去し、結合した微小球を１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ  １００μＬ、ｐＨ８．０でボルテックスおよび超音波処理により約２０秒間再懸濁する。
【０１４４】
１００％の回収と想定すると、得られるオリゴ結合ビーズ濃度は、約１２，５００微小球／μＬである。
【０１４５】
同じ性別の名目上正常ないくつかの個体からプールした、標準的な正常ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン  ＷＩ）を、このアッセイではテスト試料として使用した。男性のＤＮＡはテスト試料として使用し、女性のＤＮＡは参照に使用した。各試料２μｇの標識は、ビオチン標識試料を提供するため、キットのシアニンヌクレオチドがビオチンヌクレオチドへ代わったこと以外、上記の実施例４の通りＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＢｉｏＰｒｉｍｅキットおよびＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製試薬により実施した。
【０１４６】
多重実証アッセイは、以下のプロトコルにより９６ウェルマイクロプレートの４ウェルを利用して、２組の両試料によりＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰビーズで実施した。
【０１４７】
１．試料ごとに、１．０μｇのビオチン標識ヒトゲノムＤＮＡをＭａｔｒｉｘ社（ハドソン  ＮＨ）製ポリプロピレン９６ウェルＶ底ポリプロピレンマイクロプレートの１ウェルに添加する。
【０１４８】
２．１０．０μｇのＣｏｔ  １  ＤＮＡおよび１０．０μｇのサケ精子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド  ＣＡ）を、ハイブリダイズするＶ底プレートの各ウェルに添加する。ビオチンＤＮＡはないが核酸ブロッカーを含有する陰性対照ウェルを含める（Ｃｏｔ  １  ＤＮＡおよびサケ精子）。これは、ビーズのブランクを判定するのに使用する。
【０１４９】
３．プレートを、３０〜１２０分間またはウェルの底が透明になるまでＳｐｅｅｄＶａｃで凍結乾燥する。
【０１５０】
４．Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｙｂ  ＩＩ  Ｂｕｆｆｅｒを手で温めて沈殿物を溶解し、１．５ｍＬチューブで緩衝液３／４を滅菌蒸留Ｈ２Ｏ  １／４に添加して希釈する。
【０１５１】
５．適量の多重オリゴビーズミックスを、結果が、（７．５μＬ／ウェルに十分な）〜３００の各ビーズコード／ウェルとなるよう、希釈したＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｙｂ  ＩＩ  Ｂｕｆｆｅｒに添加する。上下にピペッティングして混合する。
【０１５２】
６．ハイブリダイゼーション緩衝液の７．５μＬの多重オリゴビーズミックスを、ハイブリダイズするＶ底プレートの各ウェルに分注する。上下にピペッティングして混合する。
【０１５３】
７．Ｍａｔｒｉｘシングルストリッププレートキャップでウェルを蓋し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（ハーキュリーズ  ＣＡ）製プレートカバーでプレートを密封する。
【０１５４】
８．プレートの試料を、９６ウェルのサーマルサイクラーで１００℃にて２分間変性させ、次いで加熱蓋なしで２分間で５０℃に冷却する。
【０１５５】
９．プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＣＳマイクロプレートインキュベーターに入れ、５０℃および１１５０ｒｐｍ振盪にて一晩インキュベートする。
【０１５６】
１０．ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  Ｗａｓｈ、使用前に５０℃に加熱）１００μＬを各反応物に添加し、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＣＳプレートインキュベーターで２０分間、５０℃および１１５０ｒｐｍ振盪にてインキュベートする。
【０１５７】
１１．均一な真空濾過のため、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．４５ｍ  ＨＴフィルタープレートのすべてのウェルを、３０μＬの０．２×ＳＳＣで湿らせる。
【０１５８】
１２．洗浄のため、Ｍａｔｒｉｘ  Ｖ底プレートからの容量をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレートに移す。
【０１５９】
１３．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空マニホールドを用いて真空を静かに適用して液体を除去し、フィルタープレートの底をペパータオルで軽く押さえて乾かす。
【０１６０】
１４．２×ＳＳＣ、０．１％  Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  Ｗａｓｈ、使用前に５０℃に加熱）１００μＬを各反応物に添加し、トップをアルミホイルで（緩く）覆い、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＣＳマイクロプレートインキュベーターで２０分間、５０℃および１１５０ｒｐｍ振盪にてインキュベートする。
【０１６１】
１５．真空マニホールドを用いて真空を静かに適用して液体を除去し、フィルタープレートの底をペパータオルで軽く押さえて乾かす。
【０１６２】
１６．１００μＬの０．２×ＳＳＣ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  Ｗａｓｈ、使用前に５０℃に加熱）を各反応物に添加し、トップをアルミホイルで（緩く）覆い、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＣＳミキサーで１０分間、５０℃および１１５０ｒｐｍ振盪にてインキュベートする。
【０１６３】
１７．真空マニホールドを用いて真空を静かに適用して液体を除去し、フィルタープレートの底をペパータオルで軽く押さえて乾かす。
【０１６４】
１８．１００μＬの１×ＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎを、４．０μｇ／ｍＬのＰｈｙｃｏＬｉｎｋ（商標）ストレプトアビジン−Ｒ−ＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ  Ｌｏｔ  ＰＪ１３Ｓ）と共に各反応物に添加する。トップをアルミホイルで（緩く）覆い、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＣＳミキサーで３０分間、２５℃および１０５０ｒｐｍ振盪にてインキュベートする。
【０１６５】
１９．真空マニホールドを用いて真空を静かに適用して液体を除去し、フィルタープレートの底をペパータオルで軽く押さえて乾かす。
【０１６６】
２０．１００μＬの１×ＰＢＳ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を各反応物に添加し、フィルタープレートに真空を適用し、軽く押さえて乾かす。
【０１６７】
２１．１００μＬの１×ＰＢＳ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を各反応物に添加する。フィルタープレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＮＣＳマイクロプレートインキュベーターで少なくとも１分間、１０５０ｒｐｍで振盪する。
【０１６８】
２２．ビーズ領域ごとの蛍光シグナル中央値および５０という最少ビーズカウント設定を用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００機器により試料を読み取る。
【０１６９】
実証アッセイの結果を図１２に示す。女性試料のシグナル対男性試料のシグナルの比は縦軸上にあり、オリゴヌクレオチドプローブの識別は横軸上にある。各試料の２つの複製物に関するシグナルを平均化した。ＸおよびＹの性特異的染色体プローブは、単一線を上下に１．２超過するシグナル比を生じたのに対し、非性特異的プローブはすべて、上下１．２未満の比を生じた。
【０１７０】
（実施例５）
多重示差的遺伝子発現は、一般に、２つのフルオロフォアアッセイにより、プリントマイクロアレイで実施される。このタイプのアッセイでは、２つのＲＮＡ試料（参照およびテストする試料）が、標識されたヌクレオチドの存在下で逆転写酵素によりｃＤＮＡに酵素的に転換される。ｃＤＮＡ産物は、故に蛍光標識されたヌクレオチド画分を有し、これにより光学的に検出することができる。各試料は、２つの異なるフルオロフォア（典型的にはシアニン３およびシアニン５）により別々に標識され、標識された試料はプールされ、マイクロアレイに競合的にハイブリダイズされる。蛍光走査装置で検出された、マイクロアレイの各要素での２つの色素の比は、故にそれぞれの試料のアッセイされたＲＮＡ配列それぞれの相対濃度を示す。
【０１７１】
このタイプのアッセイは、本技術の１つの態様に従って、単一のフルオロフォア読み出しにより常磁性Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）ビーズで実施される。３８個の遺伝子を示すオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）プローブは、Ｏｐｅｒｏｎ社（ハンツビル  ＡＬ）から入手した。これらのオリゴプローブは、５’末端にアミノ基を有する７０−ｍｅｒ長のプローブであった。各オリゴ配列を、一般的なＥＤＡＣ結合化学を用いて、特定のｘＭＡＰビーズＩＤコードまたは領域を有するｘＭＡＰビーズ１セットに固定化した。陰性対照に加えて、示された３８個の遺伝子は、ＮＲＰ２、ＣＡＲＤ１４、ＩＧＦＡＬＳ、ＴＳＳＣ３、ＰＳＥＮ２、ＩＧＦＢＰ４、ＴＰ５３ＢＰ２、ＧＡＰＤ、ＰＲＯＤＨ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＲＡＢ６ＫＩＦＬ、ＩＬＦ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＰＩＧ１１、ＨＳＰＤ１、ＣＤＨ１、ＩＧＦＢＰ５、ＩＲＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＬＴＡ、ＤＦＦＢ、ＩＬ１６、ＰＴＰＮ１３、ＩＬ３、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＣＮＧ１、ＣＣＮＤ１、ＴＵＣＡＮ、ＲＩＰＫ３、ＣＡＳＰ６、ＩＬ２、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＬ２４、Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１、およびＴＲＩＰであった。３９のビーズタイプを、次いで多重ビーズセットにプールし、このセットからのアリコートを９６ウェルマイクロプレートのウェルに入れ、以下に記載の通り遺伝子発現を実施した。
【０１７２】
本技術を実証する目的のため、単一の参照ＲＮＡ試料を使用した（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホーヤ  ＣＡ）。単一試料を２つに分けた。故に、示差的アッセイの予想結果は、各遺伝子につき１：１比である。これは、遺伝子発現プラットフォームで行われる一般的な評価である。本技術の１つの態様に従い、ＲＮＡの一方のアリコートは、間接標識であるビオチンで標識し、他方はフルオレセインで標識した。これら２つの間接標識した試料を、次いでプールし、予め調製した多重ビーズセットと混合し、同時にハイブリダイズできるようにした。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション後、アッセイしたビーズセットを２つのアリコートに分けた。ストレプトアビジン−フィコエリトリンレポーター試薬（ビオチン標識試料に特異的）を添加し、一方のアリコートと共にインキュベートし、および抗フルオレセイン−フィコエリトリン（抗フルオレセイン標識試料に特異的）を添加し、他方のアリコートと共にインキュベートした。フィコエリトリンは、ｘＭＡＰ（商標）機器における好ましいレポーターフルオロフォアである。常磁性ビーズのアリコートを、次いでプレート磁石によりマイクロプレートウェルの壁に引き寄せ、ピペットで液体試薬を取り除き、および標識したビーズを洗浄緩衝液で再懸濁した。ビーズの２つのアリコートを、次いでＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  ２００（商標）機器で順次読み取った。
【０１７４】
得られたシグナルデータを、図１１に示したように散布図にプロットした。すべてのデータが同一線に位置した場合、これは、１：１の比および１．０の相関値Ｒ２に相当するであろう。この実証アッセイでは、相関計数は０．９６であった。この値は、２色素検出を用いる典型的なプリントマイクロアレイ（典型的には０．９２から０．９６の間のＲ２値を生じる）により生じる値と比べて進歩である。
【０１７５】
他の実施形態は、本特許請求の範囲内である。
【図１】
2015128453.tif 000006
【図２】
2015128453.tif 000007
【図３】
2015128453.tif 000008
【図４】
2015128453.tif 000009
【図５】
2015128453.tif 000010
【図６】
2015128453.tif 000011
【図７】
2015128453.tif 000012
【図８】
2015128453.tif 000013
【図９】
2015128453.tif 000014
【図１０】
2015128453.tif 000015
【図１１】
2015128453.tif 000016
【図１２】
2015128453.tif 000017
【配列表】
2015128453000001.app
【外国語明細書】
2015128453000001.pdf