(57)【要約】      （修正有）【課題】糸状菌に対し新たな作用機序を有する抗真菌薬の提供。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列において、先頭から４７番目と９６番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糸状菌に対する抗真菌活性を有するタンパク質、並びに当該タンパク質の還元状態下における、人への病原性を有する糸状菌（ただし、カンジダ属菌を除く）に対する抗真菌薬としての使用する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において、先頭から４７番目と９６番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糸状菌に対する抗真菌活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において、先頭から４７番目と９６番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糸状菌に対する抗真菌活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、または、Ｓ１００Ａ７タンパク質を用いた、人への病原性を有する糸状菌（ただし、カンジダ属菌を除く）に対する抗真菌薬。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、または、Ｓ１００Ａ７タンパク質、の還元状態下における、人への病原性を有する糸状菌（ただし、カンジダ属菌を除く）に対する抗真菌薬としての使用。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌に対する抗真菌物質ないし抗真菌薬に関し、特にＳ１００Ａ７タンパク質類を用いた抗真菌物質ないし抗真菌薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌症は真菌による感染症であり、例えば、白癬菌による白癬症、カンジダ属菌によるカンジダ症、クリプトコッカス属菌によるクリプトコッカス症、アスペルギルス属菌によるアスペルギルス症、放線菌による放線菌症、ケカビ目の真菌によるムコール症、マラセチア菌によるマラセチア症、ノカルジア属菌によるノカルジア症などが知られている。
【０００３】
従来、真菌症の治療は、主として、真菌の細胞膜や細胞壁の構成成分の合成を阻害する薬や核酸の合成を阻害する薬が使用されている。
【０００４】
しかしながら、その種類はまだ少なく、特に、糸状菌に対しては効果のないものもあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５２１３２２号公報
【特許文献２】特表平９−５０６０９８号公報
【特許文献３】特表２０１３−５２１３００号公報
【特許文献４】特表２００６−５１４１０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、新たな作用機序を有する抗真菌薬を提供可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、先頭から４７番目と９６番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糸状菌に対する抗真菌活性を有するタンパク質である。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、先頭から４７番目と９６番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糸状菌に対する抗真菌活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡである。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、または、Ｓ１００Ａ７タンパク質を用いた、人への病原性を有する糸状菌（ただし、カンジダ属菌を除く）に対する抗真菌薬である。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質、または、Ｓ１００Ａ７タンパク質、の還元状態下における、人への病原性を有する糸状菌（ただし、カンジダ属菌を除く）に対する抗真菌薬としての使用である。
【００１１】
なお、還元状態下とは、還元作用のある物質を添加するほか、使用環境自体が還元状態となる、または、還元状体である場合も含むものとする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、真菌、特に糸状菌を死滅させ、人体への安全性の高い抗真菌薬を提供可能とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトの皮膚上の物質に抗菌活性があり、それがＳ１００Ａ７であることを確認した一連の実験結果を示した図である。
【図２】使用環境の異なるＳ１００Ａ７の抗菌活性を示したグラフである。
【図３】各種糸状菌に対するＳ１００Ａ７の抗菌活性を評価したグラフである。
【図４】白癬菌にＳ１００Ａ７を採用させたときの細胞死の様子を蛍光法で示した写真である。
【図５】白癬菌内にＳ１００Ａ７が進入し細胞死する様子を示した電子顕微鏡写真である。
【図６】免疫抑制状体のマウスを用いたＳ１００Ａ７の投与の有無による生存実験結果を示したグラフである。
【図７】Ｓ１００Ａ７の投与の有無によるアスペルギルスの蔓延の様子を示したマウスの肺組織写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
タンパク質Ｓ１００Ａ７は、皮膚炎や感染症などにおいてその過剰発現が知られ、例えば乾癬の炎症マーカーとして把握されている。カルシウム結合タンパク質としても知られている。
また、過去の知見としては、Ｓ１００Ａ７は、黄色ブドウ球菌には効果がないものの、大腸菌その他の一部の細菌に対して死滅作用があることが知られていた。
一方、カンジダのみの検討結果であるが、真菌に対しては死滅作用がないことも知られていた。
【００１５】
本願発明者らは、皮膚疾患を研究する過程で、Ｓ１００Ａ７の特定場所のアミノ酸（システイン）の組が亜鉛をキレートし、これにより、カンジダを除く真菌、特に糸状菌に対して抗菌作用があることを発見して本発明に想到した。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１６】
まず、ヒトの皮膚上の物質を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。最終的にひとつのピークに（図１ａ上）、白癬菌（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）に対する高い抗菌活性が見られた（図１ａ下）。
【００１７】
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタンブロッティング（ＷＢ）によって、このピークを示す物質がＳ１００Ａ７であることを確認した（図１ｂ）。また、マトリックス支援レーザ離脱イオン化法（ＭＡＬＤＩ）により分子量の観点からもＳ１００Ａ７であることを確認した（図１ｃ）。なお、Ｓ１００Ａ７のアミノ酸配列を配列番号２に示す（アクセッション番号：ＣＲ５４２１６４）。
【００１８】
次に、Ｓ１００Ａ７の白癬菌に対する抗菌活性について詳細に検討した。図２ａは、濃度を変えたＳ１００Ａ７の、還元状態下のもの（図中ｒｅｄＰｓｏ）、酸化状態下のもの（図中ｏｘＰｓｏｒｉａｓｉｎ）、システインをアルキル化したもの（図中ｒｅｄ／ａｌｋＰｓｏ）、システインを硫酸化したもの（図中ｓｕｌｆＰｓｏ）の白癬菌に対する抗菌活性を示したグラフである。★印は有意な差を示す。図から１００Ａ７の還元状態下における抗菌活性が特に優れていることが確認できた。
【００１９】
また、Ｓ１００Ａ７のアミノ酸配列のうち、先頭から４６番目のシステインと９５番目のシステインに関し、片方またはいずれをもアラニンに置換した配列を作出し、これらについて、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、白癬菌（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）に対する抗菌活性を評価した。図２ｂに結果を示す。なお、★印は有意な差を示す。なお、配列番号中では先頭にメチオニンがあるためシステインは４７番目と９６番目に位置する。
【００２０】
図から、糸状菌である白癬菌やアスペルギルス属菌については、Ｓ１００Ａ７の特定箇所、すなわち、４６番目と９５番目との両方がシステインであることが重要であり、これらの場所がシステインでなければ抗菌活性を発揮しないことを確認した。一方、大腸菌に関しては当該アミノ酸は重要な役割を果たさず、ミュータントについても死滅作用が維持されることを確認した。なお、別途評価により、このシステインの組がＺｎをキレートすることも確認した。
【００２１】
以上の結果から、糸状菌についてＳ１００Ａ７、および、４６番目および９５番目のシステインを維持して変異させたタンパク質に抗菌活性があることが分かった。
【００２２】
次に、他の真菌（糸状菌）についても有効であることを確認する試験をおこなった。図３は、Ｓ１００Ａ７（還元状態）の濃度を変えて、各種糸状菌に対する、抗菌活性を測定した結果を示した図である。
【００２３】
抗菌活性を測定した菌は、アスペルギルス・フミガータス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍ．ｃａｎｉｓ）、マラセチア・ファーファー（Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ）、リゾプス・オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚｅ）、トリコフィトン‐メンタグロフィテス（Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ：毛瘡白癬菌）、白癬菌（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）である。
【００２４】
図から明らかなように、従来知見であるところのカンジダへの抗菌活性は示さないものの、それ以外の糸状菌については、一定濃度以上、すなわち、４μＭ程度以上の添加により抗菌活性（死滅作用）があることが確認できた。
【００２５】
白癬菌に還元状態下でＳ１００Ａ７を４μＭの濃度で添加し、ＴＵＮＥＬ法とＳＹＴＯＸ（米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ社登録商標）グリーン染色法にて蛍光観察をおこなった。図４に示したように、コントロールと対比して、Ｓ１００Ａ７が細胞内に進入し、ＤＮＡを分断して細胞死を誘導していることを確認した。なお、図中スケールは２００μｍである。なお、図示は省略するがアスペルギルスについても同様の観察結果が得られた。
【００２６】
また、Ｓ１００Ａ７を４μＭの濃度で添加した白癬菌の経時変化の透過型電子顕微鏡写真を図５に示す。図中、矢印は高電子密度物質を示し、細胞内小器官の変性像を示す。スケールは０．２μｍである。図示したように、添加２４時間後には、アポトーシスが生じていることが確認できた。
【００２７】
次に動物実験をおこなった。抗がん剤投与にて免疫抑制状態のマウスにアスペルギルスを投与し、アスペルギルス肺炎を発症させたものと、更に、Ｓ１００Ａ７を投与した個体とについて生存実験をおこなった。個体数はいずれも７とし、体重１ｋｇあたり５ｍｇのＳ１００Ａ７（還元状態）を経鼻的に投与した図６に生存曲線を示す。Ｓ１００Ａ７を投与しない群は、投与後５日以内に総て死滅してしまったが、投与した群は、４割程度しか死滅せず、Ｓ１００Ａ７の抗菌活性が実際に生体内でも維持・発揮されることが確認できた。
【００２８】
また、図７は、マウスの肺組織の写真である。グロコット−ゴモリ染色（ＧＭＳ）、ヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、走査型電子顕微鏡写真をそれぞれ示す。Ｓ１００Ａ７を投与しない場合は、アスペルギルス（矢頭印）が蔓延しているが、投与したものについてはほとんど観測されないことを確認した。なお、図中Ａは肺胞、Ａｄはアスペルギルス菌糸、Ｂは細気管支、Ｒは隔壁を表す。電子顕微鏡写真から、Ｓ１００Ａ７を投与した場合アスペルギルス菌糸が変形していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
Ｓ１００Ａ７は、ヒトがもともと皮膚や肺等で形成するタンパク質であるため安全性が高く、Ｓ１００Ａ７若しくは特定システインを維持しつつ残余を組み換えたタンパク質を用いて、抗真菌薬、特に糸状菌に対する抗真菌薬を提供し、また、当該タンパクを使用した真菌症治療に役立てることができる。
【００３０】
なお、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ自体も有用である。当該ＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現可能な形態で導入された細胞株を定法により増殖させ、抗真菌物質ないし抗真菌薬を得ることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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