(57)【要約】【課題】本発明は新規なＤＮＡ、および、そのＤＮＡを利用したカロテノイドの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】キサントフィロマイセス・デンドロアスのカロテノイド生産に関与するタンパク質をコードする新規なＤＮＡ、これを含むベクター、このベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、および、遺伝子組換えの手法で当該ＤＮＡの発現を増強した細胞を培養する工程含む、カロテノイドの製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｈ）：
（Ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡ；
（Ｄ）配列表の配列番号１に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｅ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｆ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｇ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡ；
（Ｈ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ；
のいずれかのＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（Ｉ）〜（Ｋ）：
（Ｉ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｊ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｋ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド；
のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
キサントフィロマイセス属に属する生物に由来する、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
前記生物が、キサントフィロマイセス・デンドロアスである請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
カロテノイド生産能を有する、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
前記宿主細胞がキサントフィロマイセス属に属する生物の細胞である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記キサントフィロマイセス属に属する生物が、キサントフィロマイセス・デンドロアスである、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
遺伝子組換えの手法を用いて、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現が付与および／または増強され、且つ、カロテノイド生産能を有する細胞を培養する工程を含む、カロテノイドの製造方法。
【請求項１１】
前記カロテノイド生産能を有する細胞が、キサントフィロマイセス属に属する生物の細胞である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記キサントフィロマイセス属に属する生物が、キサントフィロマイセス・デンドロアスである、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属に属する生物由来の新規なＤＮＡ、およびそのＤＮＡを利用したカロテノイドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは、植物、動物、微生物などが持つ黄色、赤色、紫色などの色素で、化学式Ｃ４０Ｈ５６の基本構造を持つ化合物の総称である。天然のカロテノイドとしては、βカロテン、αカロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンなど約６００種類が知られている。アスタキサンチンは、養殖魚の肉や皮膚、鶏卵の卵黄等の色調を改善するための飼料用添加物として広く用いられると共に、近年では、機能性食品素材としても注目されている。
【０００３】
キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（旧名：ファフィア・ロドジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ））は、アスタキサンチンを特異的に生成する酵母として知られ、工業的にアスタキサンチンを生産する手段の１つとして注目されている。このような背景から、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）からアスタキサンチン高生産株を得るための菌株改良研究が多数実施されてきており、当初は専らランダム変異導入法が菌株改良に利用された。しかし、ランダム変異導入法によるアスタキサンチン高生産株の取得は、多大な時間と労力を要するため、最近では、遺伝子工学的手法を利用した菌株改良研究が試みられている。
【０００４】
例えば、非特許文献１は、キサントフィロマイセス・デンドロアスの染色体に存在するリボゾームＤＮＡに、相同組換えを利用して外来遺伝子を導入する形質転換方法を開示している。
【０００５】
また、特許文献１は、キサントフィロマイセス・デンドロアスのカロテノイド生合成経路上の、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロテンへの反応を触媒する３種類の酵素をコードするＤＮＡ、および、それらのＤＮＡを含む発現ベクターをキサントフィロマイセス・デンドロアスに導入した形質転換体を開示している。
【０００６】
さらに、特許文献２は、キサントフィロマイセス・デンドロアスのメバロン酸経路上の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ合成酵素、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素、メバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素、およびファルネシルピロリン酸合成酵素を各々コードするＤＮＡ、および、それらのＤＮＡを含むベクターで形質転換した宿主細胞を培養することを含む、カロテノイドの製造法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第９７／２３６３３号
【特許文献２】特開２０００−５０８８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ，１８４，８９−９７，１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は新規なＤＮＡ、および、そのＤＮＡを利用したカロテノイドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、キサントフィロマイセス・デンドロアスのカロテノイド生産に関与するタンパク質をコードする新規なＤＮＡを見出した。さらに、生物の細胞において、当該ＤＮＡの発現を増強することで、当該生物細胞のカロテノイド生産能力が向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は、
以下の（Ａ）〜（Ｈ）：
（Ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡ；
（Ｄ）配列表の配列番号１に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｅ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｆ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｇ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡ；
（Ｈ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ；
のいずれかのＤＮＡに関する。
【００１２】
また、本発明は、以下の（Ｉ）〜（Ｋ）：
（Ｉ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｊ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｋ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド；
のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【００１３】
前記ＤＮＡは、キサントフィロマイセス属に属する生物に由来することが好ましい。
【００１４】
前記生物が、キサントフィロマイセス・デンドロアスであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
【００１６】
また、本発明は、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。
【００１７】
前記形質転換体がカロテノイド生産能を有することが好ましい。
【００１８】
前記宿主細胞がキサントフィロマイセス属に属する生物の細胞であることが好ましい。
【００１９】
前記キサントフィロマイセス属に属する生物が、キサントフィロマイセス・デンドロアスであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明は、遺伝子組換えの手法を用いて、前記ＤＮＡの発現が付与および／または増強され、且つ、カロテノイド生産能を有する細胞を培養する工程を含む、カロテノイドの製造方法に関する。
【００２１】
前記カロテノイド生産能を有する細胞が、キサントフィロマイセス属に属する生物の細胞であることが好ましい。
【００２２】
前記キサントフィロマイセス属に属する生物が、キサントフィロマイセス・デンドロアスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、キサントフィロマイセス・デンドロアスのカロテノイド生産に関与するタンパク質をコードする新規なＤＮＡ、および、そのＤＮＡを利用したカロテノイドの効率的な製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２５】
本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡである：
（Ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡ；
（Ｄ）配列表の配列番号１に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ。
【００２６】
ここで、「配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号１に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００２８】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２９】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、本発明のポリペプチドの理化学的性質を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００３０】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００３１】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  （１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、及び、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００３２】
上記で記載の「複数個の塩基」とは、例えば、６００個、好ましくは３００個、より好ましくは１００個、さらに好ましくは５０個、２０個、１０個、または５個以下の塩基を意味する。
【００３３】
上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡの起源となる生物は特に限定されないが、カロテノイドを生産する生物が好ましく、より好ましくはキサントフィロマイセス属に属する生物、さらに好ましくはキサントフィロマイセス・デンドロアス種に属する生物、さらにより好ましくはキサントフィロマイセス・デンドロアスＮＢＲＣ１０１２９株である。キサントフィロマイセス・デンドロアスＮＢＲＣ１０１２９株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手することができる。
【００３４】
該ＤＮＡの起源となる生物から該ＤＮＡを単離する方法は特に限定されないが、例えば、該ＤＮＡの起源となる生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施することにより、該ＤＮＡを増幅できる。該ＤＮＡが増幅できれば、当業者であれば公知の方法で、該ＤＮＡを単離できる。例えば、増幅された該ＤＮＡを適当なクローニングベクターに連結し、適当な宿主細胞に導入することにより、単離できる。
【００３５】
該プライマーの例としては、配列番号４および配列番号５で示されるＤＮＡ配列からなるプライマーの組合せが挙げられる。該ＤＮＡの起源となる生物が真核生物である場合、このようにして得られる該ＤＮＡは、イントロン等の非翻訳配列を含み得る。
【００３６】
本発明は、また、以下の（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡである：
（Ｅ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｆ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｇ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性有するＤＮＡ；
（Ｈ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ。
【００３７】
上記（Ｅ）〜（Ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡの起源となる生物は特に限定されないが、カロテノイドを生産する生物が好ましく、より好ましくはキサントフィロマイセス属に属する生物、さらに好ましくはキサントフィロマイセス・デンドロアス種に属する生物、さらにより好ましくはキサントフィロマイセス・デンドロアスＮＢＲＣ１０１２９株である。キサントフィロマイセス・デンドロアスＮＢＲＣ１０１２９株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より入手することができる。
【００３８】
該ＤＮＡの起源となる生物から該ＤＮＡを単離する方法は特に限定されないが、例えば、該ＤＮＡの起源となる生物のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施することにより、該ＤＮＡを増幅できる。該ＤＮＡが増幅できれば、当業者であれば公知の方法で、該ＤＮＡを単離できる。例えば、増幅された該ＤＮＡを適当なクローニングベクターに連結し、適当な宿主細胞に導入することにより、単離できる。該プライマーの例としては、配列番号４および配列番号５で示されるＤＮＡ配列からなるプライマーの組合せが挙げられる。このようにして得られる該ＤＮＡはイントロン配列を含まないため、該ＤＮＡの塩基配列を解析することで、該ＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列が明らかとなる。該ＤＮＡがコードするポリペプチドは特に限定されないが、例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。上記（Ｅ）〜（Ｈ）における、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、配列同一性、並びに、塩基の欠失、挿入、置換及び／または付加は、（Ａ）〜（Ｄ）と同様である。
【００３９】
本発明はまた、以下の（Ｉ）〜（Ｋ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡである：
（Ｉ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｊ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｋ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００４０】
上記（Ｋ）に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ，  １９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製できる。
【００４１】
配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号３に示したアミノ酸配列と、公知のタンパク質のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００４２】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００４３】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする：
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ；
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ；
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ；
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ。
【００４４】
上記で記載の「複数個のアミノ酸」とは、例えば、２０個、好ましくは１５個、より好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００４５】
上記（Ｊ）に記載のポリペプチドと配列表の配列番号３のアミノ酸配列との配列同一性は８５％以上だが、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００４６】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列と評価対象のアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００４７】
本発明のＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内でカロテノイド生産に関与し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。
【００４８】
本発明はまた、本発明のＤＮＡを含むベクターに関する。本発明において使用されるベクターは、本発明のＤＮＡを所望の宿主細胞に導入できるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、さらに、複数種の宿主へ導入可能なシャトルベクターなどが使用できる。本発明のＤＮＡは、所望の宿主細胞内において有効な発現プロモーター、ターミネーター等を付加して、ベクターに連結することが好ましい。各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。本発明のＤＮＡを含むベクターは特に限定されないが、例として、プラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＴ（実施例２参照）が挙げられる。
【００４９】
本発明はまた、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明のＤＮＡを含むベクターにより形質転換される宿主細胞は、特に限定されないが、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、及びキサントフィロマイセス属などの酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などのカビ、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、及びモノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属などの藻類、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属などのラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）類の各細胞が挙げられる他、タバコ、レタス、ナタネなどの植物細胞や動物細胞でもよいが、好ましい宿主細胞はキサントフィロマイセス属の細胞であり、より好ましくはキサントフィロマイセス・デンドロアスの細胞である。
【００５０】
本発明のＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する方法は特に限定されず、公知の方法を利用できる。例えば、宿主細胞としてキサントフィロマイセス・デンドロアスの細胞を用いる場合は、電気穿孔法を用い得る（実施例３参照）。ベクターの導入後、本発明のＤＮＡは宿主細胞の染色体とは独立に維持されてもよく、また、宿主細胞の染色体中に挿入されてもよい。さらに、ｒＤＮＡ配列等は染色体に複数存在することから、ｒＤＮＡ配列中に本発明のＤＮＡを配置することによって、宿主細胞の染色体中に複数挿入することができる。
【００５１】
本発明はまた、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強され、且つ、カロテノイド生産能を有する細胞を培養する工程を含む、カロテノイドの製造方法である。
【００５２】
遺伝子組換えの手法を用いて本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強された細胞は、本発明のＤＮＡを含むベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に限定されない。例えば、本発明のＤＮＡを元来有している細胞であって、該遺伝子の発現プロモーターとして機能するＤＮＡ、および／または、該遺伝子の発現を調節する機能を有するＤＮＡを、遺伝子組換えの手法を用いて、置換、付加、破壊、および／または、削除して得られる細胞は、本発明のＤＮＡを含むベクターにより宿主細胞を形質転換せずとも得られるが、本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強されている限りにおいて、遺伝子組換えの手法を用いて本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強された細胞に包含される。
【００５３】
カロテノイド生産能を有する細胞は、元来カロテノイド生産能を有する細胞に限定されず、遺伝子組換えの手法を用いてカロテノイド生産能が付与された細胞も、これに包含される。
【００５４】
遺伝子組換えの手法を用いて本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強され、且つ、カロテノイド生産能を有する細胞は特に限定されないが、好ましくは、キサントフィロマイセス属に属する生物の細胞であり、より好ましくはキサントフィロマイセス・デンドロアスの細胞である。
【００５５】
遺伝子組換えの手法を用いて本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強され、且つ、カロテノイド生産能を有する細胞の培養方法は特に限定されず、該細胞が生育し、カロテノイドの生産が可能であれば、いかなる培地組成、培養条件で培養してもよい。
【００５６】
遺伝子組換えの手法を用いて本発明のＤＮＡを発現する能力が付与および／または増強され、且つ、カロテノイド生産能を有する細胞の培養物から、カロテノイドを取得する方法は特に限定されず、公知の技術を単独で、または組み合わせて用いることで実施できる。例えば、培養物を、噴霧乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥等の手法を用いて乾燥することで、カロテノイド含有乾燥物を得られる。また、例えば、培養物を適当な溶媒で抽出した後、溶媒を留去することで、カロテノイド含有抽出物が得られる。さらに、カロテノイド含有抽出物を精製して、高純度のカロテノイドを取得することも可能である。
【００５７】
本発明において、カロテノイドは特に限定されないが、例えば、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、δ−カロテン、リコペン、β−クリプトキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、ルテイン、エキネノン、ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、および、アスタキサンチンが挙げられ、アスタキサンチンが特に好ましい。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
【００５９】
（実施例１）ＤＮＡの単離
以下の方法に従って、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株より、本発明のＤＮＡを単離した。
【００６０】
（ＰＣＲプライマーの作製）
キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の染色体ＤＮＡ配列情報から、配列表の配列番号４に示すプライマー１（５’−ＣＴＣＣＧＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＣＧＣＴＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＴＡＴＣ−３’）、および、配列表の配列番号５に示すプライマー２（５’−ＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡＴＴＣＣＣＴＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧ−３’）を設計し、合成した。
【００６１】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の菌体から、ＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ株式会社製）を用い、その取り扱い説明書に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子を含むと考えられる約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片について、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてダイレクトシーケンスを行い、その塩基配列を解析した。その結果判明した染色体ＤＮＡの配列を、配列表の配列番号１に示した。
【００６２】
（ｃＤＮＡ配列の決定）
キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の菌体から、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、その取扱い説明書に従って総ＲＮＡを調製した。この総ＲＮＡから、ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  ＫＩＴ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、その取扱い説明書に従いｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として上記で調製したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子を含むと考えられる約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片について、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてダイレクトシーケンスを行い、その塩基配列を解析した。その結果判明したｃＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２に示した。また、該ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を、配列表の配列番号３に示した。
【００６３】
（実施例２）ベクターの構築
まず、国際公開公報第９７／２３６３３号を参考にして設計した、配列表の配列番号６に示すプライマー３（５’−ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧ−３’）、および、配列表の配列番号７に示すプライマー４（５’−ＣＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＡＧＡＡＧＴＡＧ−３’）を用いて、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター配列を増幅した。これを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社製）に挿入して、プラスミドｐＵＣ１９Ｐを作製した。
【００６４】
次に、国際公開公報第９７／２３６３３号を参考にして設計した、配列表の配列番号８に示すプライマー５（５’−ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＣ−３’）、および、配列表の配列番号９に示すプライマー６（５’−ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧ−３’）を用いて、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのターミネーター配列を増幅した。これを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９Ｐに挿入して、プラスミドｐＵＣ１９ＰＴを作製した。
【００６５】
次に、配列表の配列番号１０に示すプライマー７（５’−ＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧ−３’）、および、配列表の配列番号１１に示すプライマー８（５’−ＣＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ−３’）を用いて、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ株式会社製）を鋳型としてＰＣＲを実施し、カナマイシン耐性遺伝子を増幅した。これを、制限酵素ＳｍａＩおよびＳａｌＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９ＰＴに挿入して、プラスミドｐＵＣ１９ＰＫＴを作製した。
【００６６】
次に、Ｇｅｎｅ．１９９７  Ｊａｎ  ３；１８４（１）：８９−９７を参考にして設計した、配列表の配列番号１２に示すプライマー９（５’−ＣＡＧＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧＧ−３’）、および、配列表の配列番号１３に示すプライマー１０（５’−ＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’）を用いて、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、リボゾーマルＤＮＡの一部を増幅した。これを、制限酵素ＮｄｅＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９に挿入して、プラスミドｐＵＣ１９Ｒを作製した。
【００６７】
次に、配列表の配列番号１４に示すプライマー１１（５’−ＣＡＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧ−３’）、および、配列表の配列番号１５に示すプライマー１２（５’−ＣＡＣＡＴＣＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧ−３’）を用いて、プラスミドｐＵＣ１９ＰＫＴを鋳型としてＰＣＲを実施し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターとターミネーターの間にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたＤＮＡを増幅した。これを、制限酵素ＣｌａＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＵＣ１９Ｒに挿入して、プラスミドｐＵＣ１９ＲＰＫＴを作製した。
【００６８】
次に、配列表の配列番号１６に示すプライマー１３（５’−ＧＧＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧ−３’）、および、配列表の配列番号１７に示すプライマー１４（５’−ＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＣＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＡＧＡＡＧ−３’）を用いて、プラスミドｐＵＣ１９ＲＰＫＴを鋳型としてＰＣＲを実施し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター配列を増幅した。これを、制限酵素ＢｓｔＢＩおよびＳａｃＩＩで処理して、プラスミドｐＵＣ１９ＲＰＫＴに挿入するためのＤＮＡ断片Ｐを作製した。
【００６９】
次に、配列表の配列番号１８に示すプライマー１５（５’−ＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＧＣＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＧＴＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’）、および、配列表の配列番号１９に示すプライマー１６（５’−ＣＣＣＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧ−３’）を用いて、プラスミドｐＵＣ１９ＲＰＫＴを鋳型としてＰＣＲを実施し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのターミネーター配列を増幅した。これを、制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩＩで処理して、プラスミドｐＵＣ１９ＲＰＫＴに挿入するためのＤＮＡ断片Ｔを作製した。
【００７０】
次に、ｐＵＣ１９ＲＰＫＴを制限酵素ＣｌａＩで処理し、さらにアルカリホスファターゼで脱リン酸化処理した後、上述のＤＮＡ断片ＰおよびＤＮＡ断片Ｔと連結することにより、プラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＴを作製した。
【００７１】
次に、配列表の配列番号４に示すプライマー１（５’−ＣＴＣＣＧＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＣＣＧＣＴＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＴＡＴＣ−３’）、および、配列表の配列番号５に示すプライマー２（５’−ＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡＴＴＣＣＣＴＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧ−３’）を用いて、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、両端に制限酵素ＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩの認識配列を付加したＤＮＡを増幅した。これを、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＴに挿入して、プラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＭＫを作製した。プラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＭＫは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターとターミネーターの間に本発明のＤＮＡが挿入された構造を有し、本発明のＤＮＡの発現ベクターとして機能する。このように作製したプラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＭＫを制限酵素ＮｄｅＩで消化し、線状ＤＮＡとしたものを、形質転換用ベクターとした。
【００７２】
（実施例３）形質転換体の取得
実施例２で作製した形質転換用ベクターを、電気穿孔法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｅｃｈｉｑｕｅｓ  １９９７  １０：９２９−９３２）により、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の細胞に導入し、抗生物質Ｇ４１８を４０ｍｇ／Ｌ添加したＹＭ寒天培地（ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、グルコース１．０％、寒天２．０％、ｐＨ６．２）のプレート上で、形質転換細胞を選択し、抗生物質Ｇ４１８を４０ｍｇ／Ｌ添加したＹＭ寒天培地のスラント上に移植して保存した。得られた形質転換細胞をキサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９（ｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＭＫ）株と命名した。
【００７３】
（実施例４）形質転換体によるアスタキサンチンの生産
抗生物質Ｇ４１８を４０ｍｇ／Ｌ添加したＹＭ培地（ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、グルコース１．０％、ｐＨ６．２）５ｍＬを入れた試験管をオートクレーブ殺菌し、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９（ｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＭＫ）株を接種した。これを２２℃で２日間振盪培養し、前培養液とした。次に、抗生物質Ｇ４１８を４０ｍｇ／Ｌ添加したＹＭ培地８０ｍＬを入れた振盪フラスコをオートクレーブ殺菌し、上述の前培養液０．８ｍＬを接種した。これを、２２℃で３日間振盪培養し、得られた培養液のアスタキサンチン含量および細胞乾燥物含量を測定した。アスタキサンチン含量を細胞乾燥物含量で除し、細胞乾燥物中のアスタキサンチン含量を算出した。その結果、細胞乾燥物中のアスタキサンチン含量は０．２８ｍｇ／ｇであった。
【００７４】
（比較例１）
プラスミドｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＭＫから、本発明のＤＮＡのみを除去したプラスミドであるｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＴを、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９株の細胞に導入して得られた形質転換細胞であるキサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ１０１２９（ｐＵＣＲＰＫＴ−ＰＴ）株を、実施例４と同様に培養し、細胞乾燥物中のアスタキサンチン含量を算出した。その結果、細胞乾燥物中のアスタキサンチン含量は０．２５ｍｇ／ｇであった。
【００７５】
実施例４と比較例１の結果から、本発明のＤＮＡを導入することにより、細胞によるアスタキサンチンの生産量が増加すると考えられる。
【００７６】
なお、培養液のアスタキサンチン含量は、以下のように測定した。培養液１ｍＬを密栓可能な１．５ｍｌ容のポリプロピレン製容器に分取し、約１５０００×Ｇで５分間遠心分離後に上清を除去する。これに約１ｇのガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）、１ｍｌのアセトンを加え、マルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いて４℃で３分間破砕処理する。破砕物をフィルターろ過（コスモナイスフィルターＳ、０．４５μｍ；ミリポア社製）して、固形物とガラスビーズを除去し、ＨＰＬＣを用いてアスタキサンチン含量を測定する。ＨＰＬＣを用いたアスタキサンチンの定量は、以下の条件で実施する。  カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５  φ４．６×２５０ｍｍ（野村化学株式会社製）、カラム温度：２５℃、移動相：アセトニトリル／メタノール／イソプロパノール＝８５／１０／５（体積比）、流速：０．８ｍＬ／分、検出波長：４７１ｎｍ。
【００７７】
培養液の細胞乾燥物含量は、以下のように測定した。予め風袋重量を測定した試験管に培養液５ｍＬを分取し、約５０００×Ｇで１０分間遠心分離後に上清を除去する。これに、水５ｍＬを添加して細胞を再懸濁し、同様に遠心分離した後、上清を除去する。これを１１０℃で１２時間乾燥した後重量を測定し、風袋重量との差から内容物重量を算出する。さらに、内容物重量を最初に分取した培養液量で除し、細胞乾燥物含量を算出する。
【配列表】
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