(57)【要約】【課題】糖類を原料として各種の有機化合物を製造する際に、化学品の発酵生産プロセス及び化学変換プロセスに供される糖液中の発酵阻害物質を十分に除去し、かつ糖液に対する溶媒の残留量が少なく、抽出に用いた溶媒のリサイクルを容易にすることができる糖類の精製方法、および該方法により得られる糖液を用いた有機化合物の製造方法を提供する。【解決手段】溶媒抽出法による糖液の精製方法であって、前記溶媒抽出を水／オクタノール分配係数が１．０以上の溶媒を用いて行なうことを特徴とする、糖液の精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒抽出法による糖類を含む液（糖液）の精製方法であって、前記溶媒抽出を水／オクタノール分配係数が１．０以上の溶媒を用いて行なうことを特徴とする、糖液の精製方法。
【請求項２】
前記溶媒が、炭素数６以上１２以下の芳香族炭化水素化合物、炭素数４以上１２以下の脂肪族エーテル、および炭素数５以上１２以下の脂肪族ケトンから選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の糖液の精製方法。
【請求項３】
前記溶媒の水／オクタノール分配係数が４．０以下である、請求項１または２に記載の糖液の精製方法。
【請求項４】
前記糖類が、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖を１つ以上含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖液の精製方法。
【請求項５】
前記糖液が、非可食原料由来の糖類を構成成分として含む糖液である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖液の精製方法。
【請求項６】
前記糖液中の糖濃度が、５質量％以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖液の精製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製方法により得られることを特徴とする精製糖液。
【請求項８】
水性媒体中で、請求項７に記載の精製糖液を含有する有機原料に有用物質生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る工程（以下「有機物生産工程」という。）を有することを特徴とする有機化合物の製造方法。
【請求項９】
前記有機化合物がアルコール類、アミン類、カルボン酸類、およびフェノール類から選ばれる少なくとも１つである、請求項８に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記アルコール類が、炭素数２〜１０の脂肪族アルコールである、請求項９に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項１１】
前記カルボン酸類が、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸である、請求項９または１０に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項１２】
有用物質生産能力を有する微生物の培養方法であって、請求項１１に記載の精製糖液を炭素源として用いることを特徴とする微生物の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶媒抽出法で処理した糖類を含む液（糖液）の精製方法、および該精製方法により得られる精製糖液に関する。また前記精製糖液を用いた有機化合物の製造方法および微生物の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖類を原料とした有機化合物の発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスは、広く利用されており、また前記各プロセスを経て得られた生産物は、種々の工業原料として利用されている。
これら発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの原料として使用される糖類として、現在はサトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデなどの可食原料に由来するものが挙げられる。
しかしこれらの可食原料由来の糖類は、今後の世界人口増加による可食原料価格の高騰、および天候不順や気候変動による可食原料の供給不足といった懸念がある。また食料不足の際に、可食原料を食用用途と競合して工業原料に利用することに対する倫理上の批判等の懸念もある。そこで、非可食原料や、不純物を含有する、より低純度の糖類などから、効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵生産原料や化学変換原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。
【０００３】
非可食原料から糖液を得る方法としては、非可食原料中のセルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法（特許文献１）や、非可食原料の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応により加水分解する方法（特許文献２）、または亜臨界や超臨界水による加水分解方法等が一般的に知られている。
しかし、これらの手法を用いた場合、非可食原料中のセルロース、ヘミセルロースが加水分解され、グルコースやキシロースといった糖が得られると共に、これらの糖の分解反応も進行するため、各種の副生成物も生成する。具体的には例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、シリンガアルデヒド等のアルデヒド化合物や、蟻酸、レブリン酸、バニリン酸、フェルラ酸、酢酸等のカルボン酸誘導体や、ベンゾキノン等の共役カルボニル化合物や、バニリン、グアヤコール等のフェノール性化合物等が生成する。このように生成した副生成物を除去、精製する方法として、有機溶媒を用いた溶媒抽出による除去方法（非特許文献１、２）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５９４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Letters in Applied Microbiology, 44, 2007, P666-672
【非特許文献２】Bioresource Technology 102, 2011, P1663-1668
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セルロースやヘミセルロースから糖を得る際に生じる副生成物のうち、フルフラールやヒドロキシメチルフルフラール、ベンゾキノン等のカルボニル化合物の中には、微生物を利用した発酵生産プロセスで反応を阻害する性質を有し、具体的には微生物の増殖阻害や発酵生産阻害を引き起こし、発酵生産の収率を低下させるものがあることが知られている。
なお、前記のような作用を及ぼす物質を総称し、以下「発酵阻害物質」という。そのためこれらの発酵阻害物質の存在は、非可食原料の糖液を発酵原料として利用する際の大きな課題であった。
【０００７】
また、化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する場合、上記のようなカルボニル化合物が糖液中に含有された場合、生成物が着色するといった問題があった。
【０００８】
また非特許文献１では糖液の精製の際、酢酸エチルを用いて溶媒抽出を行なっているが、酢酸エチルは水溶解度が高いため、発酵阻害物質を除去した後の糖液に残留しやすく、また糖液からの酢酸エチルの回収が困難であるといった問題がある。また非特許文献２では、有機系アミン化合物を用いて溶媒抽出をしているが、有機系アミン化合物を用いた場合、発酵阻害物質の除去効果が十分ではなく、また抽出後に回収しリサイクルすることが困難であるといった問題があった。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、糖類を原料として各種の有機化合物を製造する際に、化学品の発酵生産プロセス及び化学変換プロセスに供される糖液中の発酵阻害物質を十分に除去し、生成物の着色が少なく、かつ糖液に対する溶媒の残留量が少なく、抽出に用いた溶媒のリサイクルを容易にすることができる糖類の精製方法、および該方法により得られる糖液を用いた有機化合物の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の範囲の物性値を有する抽出溶媒を用いて溶媒抽出を行うことで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち本発明の要旨は、
［１］溶媒抽出法による糖類を含む液（糖液）の精製方法であって、前記溶媒抽出を水／オクタノール分配係数が１．０以上の溶媒を用いて行なうことを特徴とする、糖液の精製方法、
［２］前記溶媒が、炭素数６以上１２以下の芳香族炭化水素化合物、炭素数４以上１２以下の脂肪族エーテル、および炭素数５以上１２以下の脂肪族ケトンから選ばれる少なくとも１つである、上記［１］に記載の糖液の精製方法、
［３］前記溶媒の水／オクタノール分配係数が４．０以下である、［１］または上記［２］に記載の糖液の精製方法、
［４］前記糖類が、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖を１つ以上含む、上記［１］〜［３］のいずれか１に記載の糖液の精製方法、
［５］前記糖液が、非可食原料由来の糖を構成成分として含む糖液である、上記［１］〜［４］のいずれか１に記載の糖液の精製方法、
［６］前記糖液中の糖濃度が、５質量％以上である、上記［１］〜［５］のいずれか１に記載の糖液の精製方法、
【００１２】
［７］上記［１］〜［６］のいずれか１に記載の精製方法により得られることを特徴とする精製糖液、
［８］水性媒体中で、上記［７］に記載の精製糖液を含有する有機原料に有用物質生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る工程（以下「有機物生産工程」という。）を有することを特徴とする有機化合物の製造方法、  
［９］前記有機化合物がアルコール類、アミン類、カルボン酸類、およびフェノール類から選ばれる少なくとも１つである、上記［８］に記載の有機化合物の製造方法、
［１０］前記アルコール類が、炭素数２〜１０の脂肪族アルコールである、上記［９］に記載の有機化合物の製造方法、
［１１］前記カルボン酸類が、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸である、上記［９］または［１０］に記載の有機化合物の製造方法、
［１２］有用物質生産能力を有する微生物の培養方法であって、上記［１１］に記載の精製糖液を炭素源として用いることを特徴とする微生物の培養方法、に存する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の糖液の精製方法によれば、糖液中の発酵阻害物質の含有量を効率的に減少させることができる。そのため、得られた糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、効率よく目的とする有機化合物が得られ、その収率を向上させることができる。また抽出で用いた溶媒の糖液中における残留量を減らすことができ、かつ、溶媒のリサイクルも容易であることから、生産効率に優れたプロセス設計が可能になる。
また本発明の精製糖液は、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させ、また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。
また、本発明の有機化合物の製造方法であれば、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明の培養方法であれば、糖液中の発酵阻害物質を低減することができるため、発酵生産プロセスにおいて、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、もって発酵生産性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内であれば種々に変更して実施することができる。
【００１５】
＜第１の発明：糖液の精製方法＞
本発明の第１の発明は、糖液の精製において、水／オクタノール分配係数が１．０以上である溶媒（以下、「抽出溶媒」ということがある）を用いて糖液の溶媒抽出を行なうことを特徴とする。
第１の発明における糖液、並びに後述する第２の発明、第３の発明、および第４の発明（第１ないし第４の発明をまとめて「本発明」ということがある。）で用いられる「糖液」とは、上述の通り糖類を含有する液をいい、好ましくは糖類を含有する水溶液である。以下、糖液中に含まれる糖類から順に説明する。
【００１６】
（糖類）
本発明で用いる糖液に含まれる糖類は、特に限定はされず、いわゆる糖類一般を用いることができるが、微生物が炭素源として活用することができる糖が好ましい。具体的にはグリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；、セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハノース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類；等が挙げられる。
本発明で用いる糖液は、上記の糖類１種類を単独で含有していてもよいし、２種類以上を含有していてもよい。
【００１７】
本発明で用いる糖類のうち、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖を１つ以上含むことが好ましい。これらの糖は微生物の炭素源として活用しやすいためである。より好ましくは、糖類がこのような糖を主成分として含む。主成分とは、糖類の合計質量に対し、通常５０質量％以上を占める成分をいい、より好ましくは７０質量％以上１００質量％以下を占める成分をいう。
なお、「炭素数３以上、７以下の単糖を構成成分として含む糖」とは、炭素数３以上、７以下の単糖、炭素数３以上、７以下の単糖を構成成分として含む多糖類、またはこれらの混合物をいう。これらの糖類の中でも、ヘキソース、ペントース、およびこれらを構成成分とする二糖類がより好ましい。これらは自然界、植物の構成成分となっていることから豊富に存在し、原料の入手が容易であるためである。
【００１８】
上記ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。ペントースとしてはキシロース、アラビノースが好ましく、キシロースがより好ましい。二糖類としてはスクロースが好ましい。グルコース、キシロース、スクロースは、自然界、植物の主な構成成分となっているため、原料の入手が特に容易であるためである。
【００１９】
（糖液の由来、製法）
本発明で用いる糖液の製法は、特に限定はされないが、例えば上記の糖類の１種類以上を水に溶解して製造する方法や、上記の糖類を構成成分として含む原料（以下、「糖原料」ということがある。）を、その構成単位である糖類まで分解して製造する方法が挙げられる。また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液または糖蜜なども糖液として使用することができ、具体的にはサトウキビ、甜菜またはサトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。  
【００２０】
糖原料は、特に限定されないが、具体的には、セルロース、ヘミセルロース、デンプン等の多糖類や、多糖類を構成成分とする植物等が挙げられる。
前記糖原料は、食用にできるか否かの観点で、「可食原料」と「非可食原料」に分類することができる。
可食原料としては、サトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデ等が挙げられる。
非可食原料としては、具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、米ぬか、樹木、木材、植物油カス、ササ、タケ、パルプ類、古紙、食品廃棄物、水産物残渣、家畜廃棄物等が挙げられる。また、砂糖の製造工程で発生する糖蜜から砂糖を回収した後に残る廃糖蜜も糖原料として使用可能である。
このうち、非可食原料は、可食原料と異なり、食用用途と競合せず、また通常であれば廃棄、焼却処理をされるものが多いため、安定的な供給、資源の有効利用が図れる点で好ましい。
【００２１】
前記糖原料から糖類を得る方法は、特に限定されないが、例えばデンプン水溶液に希硫酸を加えて加水分解する方法、デンプン水溶液に種々の酵素を用いて、酵素分解して製造する方法、セルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法、糖原料の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応、亜臨界水、超臨界水等により加水分解する方法等が挙げられる。
【００２２】
本発明における糖液中に含まれる糖類の合計濃度（以下、「糖濃度」という）は、糖液の由来や、含有する糖の種類等によって大きく変動し、特に限定されないが、通常３質量％以上、好ましくは５質量％以上、通常６０質量％以下が好ましく、好ましくは５０質量％以下である。前記範囲内の糖液を用いることで、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性が向上する点で好ましい。
【００２３】
本発明で用いる糖液は、上記糖類を含有する水溶液であり、水と糖類以外に他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、例えば糖原料から糖類を得た際に生じる、糖類以外の副生成物や不純物を含んでいてもよい。具体的には、後述する糖類以外のカルボニル化合物、脂肪族共役アルコール等のアルコール化合物；リグニン由来のフェノール化合物；や、アルカリ金属化合物、アルカリ土類金属化合物、窒素化合物、硫黄化合物、ハロゲン化合物、硫酸イオン等の無機化合物；が挙げられる。
【００２４】
なお、本発明で用いる糖液は、上述した糖類が含有された水溶液であれば特に制限はないが、リグニン由来等の固形分に関しては、濾過や吸着等を用いて除去することが好ましい。また、本発明で用いられる糖液は、使用する目的に応じて水で希釈して糖濃度を下げて用いたり、糖類の追添加や濃縮により糖濃度を高めて用いることができる。
【００２５】
（糖類以外の有機化合物）
本発明で用いる糖液には、糖液を製造する工程および保管した際に生成する、糖類以外の有機化合物が通常含まれている。このような有機化合物として、例えばカルボニル化合物やフェノール化合物、不飽和炭化水素化合物が挙げられる。カルボニル化合物としては、構造内にカルボニル基を有するものであれば特に限定はされず、脂肪族カルボニル化合物でも、芳香族基を有するものであってもよい。好ましくは炭素数１以上、２０以下、より好ましくは炭素数１６以下、さらに好ましくは炭素数１２以下のカルボニル化合物である。上記範囲のカルボニル化合物は水溶性が比較的高く、糖液、特に糖を含む水溶液中に含まれることが多いためである。このようなカルボニル化合物の具体例としては、例えばフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、グリコールアルデヒド、蟻酸、ヒドロキシベンズアルデヒド、シリンガアルデヒド、バニリン、イソバニリン、オルトバニリン、コニフェニルアルデヒド等のアルデヒド化合物；１，４−ベンゾキノン等のケトン化合物、アクリル酸メチル、γ―ブチルラクトン等のエステル化合物；酢酸、レブリン酸等のカルボン酸；等が挙げられる。フェノール化合物の具体例としては、フェノール、カテコール、レゾルシノール、ハイドロキノン、クマル酸、フェルラ酸、イソオイゲノール、オイゲノール、グアイアコール、バニリン酸、ホモバニリン酸、アセトバニロン、没食子酸、シリング酸等が挙げられる。また、不飽和炭化水素化合物としてはリモネン等が挙げられる。
【００２６】
本発明者らは、前記カルボニル化合物やフェノール化合物が、糖液を原料とした有用化合物を発酵生産する工程において、特に有用化合物の生産量、蓄積量、および生産速度の低下減少を引き起こす発酵阻害物質となること、特にカルボニル化合物のうちフルフラールやヒドロキシメチルフルフラール、蟻酸といったアルデヒド類、及び１，４−ベンゾキノン等の共役ケトン類が強い発酵阻害を示す事を見出した。また前記発酵阻害物質を含有した糖液は、微生物の培養工程において、増殖量や増殖速度の低下が起こり、また化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する工程において、カルボニル化合物の反応性の高さから生成物の着色を起こすことを見出した。
【００２７】
（溶媒抽出処理）
第１の発明では、原料となる糖液から水／オクタノール分配係数が１．０以上である溶媒を用いて発酵阻害物質を抽出することで上記の糖液中に含まれる発酵阻害物質の含有量を低減させることができる。
本発明における溶媒抽出処理は、いわゆる分液処理であり、通常、水／オクタノール分配係数が１．０以上である溶媒と糖液とを混合し、糖液中に含まれる発酵阻害物質を前記抽出溶媒中に抽出する工程（以下、抽出工程ということがある）と、抽出工程後の糖液と抽出溶媒との混合溶液を静置し、二相分離した後、前記糖液と抽出溶媒とを分離する工程（以下、分離工程ということがある）を含む。これにより発酵阻害物質が糖液から分離され、糖液が精製される。なお、以下で前記溶媒抽出処理を単に「精製」ということがある。
【００２８】
本発明で使用する抽出溶媒は水／オクタノール分配係数が１．０以上の溶媒である。前記の抽出溶媒は発酵阻害物質の除去効率が高く、かつ水溶解度が低いため糖液中の溶媒の残留も低減される点で好ましい。また前記抽出溶媒の水／オクタノール分配係数の下限は好ましくは１．２以上であり、上限は特に限定はされないが、通常４．０以下であり、３．０以下であることが好ましい。前記範囲内とすることで、発酵阻害物質の除去効率を高く維持し、かつ糖液中の残留溶媒量を低減することができる。
なお、抽出溶媒は１種類の溶媒を単独で使用しても、２種類以上の溶媒を任意の割合で混合して使用してもよい。２種類以上の溶媒を混合して用いる場合の水／オクタノール分配係数は、その混合溶媒の水／オクタノール分配係数をさす。
【００２９】
本発明における抽出溶媒の具体例としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、トリメチルベンゼン、プロピルベンゼン等の芳香族炭化水素化合物；ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエチルエーテル、ジブチルエーテル、ジペンチルエーテル、ジイソアミルエーテル等の脂肪族エーテル化合物；メチルイソプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソプロピルケトン、ジイソブチルケトン等の脂肪族ケトン化合物；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の脂肪族アルコール；ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、メチルヘキサン、メチルシクロヘキサン、オクタン、メチルヘプタン、ジメチルヘキサン、ジメチルシクロヘキサン、デカヒドロナグタリン等の脂肪族炭化水素化合物；等が挙げられる。これらの中でも、発酵阻害物質の除去効率が高い点で、炭素数６以上１２以下の芳香族炭化水素化合物、炭素数４以上１２以下の脂肪族エーテル及び炭素数５以上１２以下の脂肪族ケトンから選ばれる少なくとも１つが好ましい。また、これらの中でも原料入手が容易な観点から、トルエン、キシレン、メチルイソブチルケトン、ジイソプロピルエーテルがより好ましい。
【００３０】
前記抽出工程における抽出時間は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常１分以上、好ましくは１０分以上であり、通常１０時間以下、好ましくは５時間以下である。
前記分離工程において、静置の時間は特に限定されず、通常抽出溶媒が形成する有機相と、通常糖液が形成する水相が二相に分離するまで静置することが好ましく、その後糖液から抽出溶媒を分離することが好ましい。分離操作は１回でもよく、また連続的に複数回行ってもよい。
【００３１】
前記抽出工程及び分離工程における温度は、本発明の効果を妨げない限り限定はされないが、通常１０℃以上であり、好ましくは２０℃以上であり、上限は、通常１００℃以下であり、好ましくは８０℃以下である。上記温度範囲であれば、糖の分解が抑制されるうえ、発酵阻害物質の除去効率が高くなる点で好ましい。
【００３２】
本発明の精製方法において使用する抽出溶媒の使用量は、本発明の効果を妨げない限り限定はされないが、糖液の量に対する抽出溶媒の量の比率が、通常１０質量％以上、好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上であり、通常５００質量％以下、好ましくは３００質量％以下、さらに好ましくは１５０質量％以下である。前記範囲内で精製を行うことで、製造コスト面で有利な量であること、かつ十分な発酵阻害物質の除去効果が得られる。
【００３３】
第１の発明における溶媒抽出処理の際、糖液中に固形物等が含まれる場合、抽出溶媒による発酵阻害物質の分離能を低下させる可能性がある。このような成分は溶媒抽出処理前に除去してもよい。前記の固形物等の除去方法は特に限定されるものではないが、濾過による除去、活性炭、イオン交換樹脂、合成樹脂による吸着除去処理等を行うことができる。
また、この溶媒抽出処理した糖液をさらに水素化処理や活性炭処理、イオン交換樹脂処理等を実施して、さらに不純物を除去してもよい。
【００３４】
＜第２の発明：精製糖液＞
前記第１の発明における溶媒抽出処理（精製）により、糖液中に含まれる発酵阻害物質の含有量を低減させることができるため、得られる糖液中の発酵阻害物質の濃度は、最初の糖液中の濃度より低い。なお、上記の精製に供した後の糖液を、以下「精製糖液」ということがある。
【００３５】
上記の発酵阻害物質を除去し、発酵阻害物濃度を低減することにより、後述する発酵プロセスにおいて、微生物の増殖や有用化合物の発酵生産の効率を向上させることができる。また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。
また前記第１の発明により得られた糖液は、通常、精製前の糖液に比べ、糖濃度に変化はない。
【００３６】
＜第３の発明：有機化合物の製造方法＞
前記第２の発明の精製糖液は、有機物質生産能力を有する微生物を作用させることにより、各種の有機化合物を製造することができる。
【００３７】
（有用物質生産能力を有する微生物）
第３の発明で用いる微生物は、有用物質生産能力を有する微生物であれば、特に限定はされない。
なお第３の発明における「有用物質生産能力を有する微生物」とは、該微生物を培地中で培養したときに、該培地中に有用物質を生成蓄積することができる微生物をいう。
【００３８】
（有用物質）
微生物が生産する有用物質としては、微生物が培地中に生成蓄積することができる有機化合物であれば限定されないが、具体的には、エタノール、プロパノール、ブタノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール等のアルコール類；１，５−ペンタメチレンジアミン、１，６−ヘキサメチレンジアミン等のアミン類；酢酸、酪酸、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、シス−アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソイソ吉草酸、グルタル酸、イタコン酸、アジピン酸、レブリン酸、キナ酸、シキミ酸、アクリル酸、メタクリル等のカルボン酸類；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン等のアミノ酸類；フェノール、カテコール、ハイドロキノン等のフェノール類；安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族カルボン酸類；イノシン、グアノシン等のヌクレオシド類、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド；イソブチレン、イソプレン、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物等が挙げられる。
【００３９】
これらの中でも、発酵生産として公知の方法を採用でき、かつ、樹脂原料として使用可能であることから、アルコール類、アミン類、カルボン酸類、フェノール類が好ましく、炭素数２〜１０の脂肪族アルコール類や、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸類がより好ましい。中でも、発酵生産性の観点から、エタノール、ブタンジオール、コハク酸がさらに好ましい。
【００４０】
（微生物）
第３の発明で用いる微生物は、有用物質生産能力を有する微生物であれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選択される微生物であることが好ましい。    
その中でも、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。
【００４１】
上記コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に分類される細菌である。
【００４２】
第３の発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl W, Ehrmann M, Ludwig W, Schleifer KH, Int J Syst Bacteriol., 1991, Vol.41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、およびその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株およびＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株とする。
【００４３】
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００４４】
第３の発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。また、第３の発明で使用可能なアナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Anaerobiospirillum succiniciproducens）等が挙げられる
【００４５】
また、第３の発明に使用可能なアクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）等が挙げられる。また第３の発明に使用可能なマンヘミア（Mannheimia）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Mannheimia succiniciproducens）等が挙げられる。
【００４６】
また第３の発明で使用可能なバスフィア（Basfia）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Basfia succiniciproducens）等が挙げられる。また、第３の発明で使用可能なザイモモナス（Zymomonas）属細菌としては、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等が挙げられる。また、第３の発明で使用可能なザイモバクター（Zymobacter）属細菌としては、ザイモバクター・パルメ（Zymobacter palmae）等が挙げられる。
【００４７】
また第３の発明で使用可能な糸状菌としては、Aspergillus属、Penicillium属、Rhizopus属等が挙げられる。このうち、Aspergillus属では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）等が挙げられ、Penicillium属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）等が挙げられる。また、Rhizopus属では、リゾパス・オリゼー（Rhizopus oryzae）等が挙げられる。
【００４８】
また、第３の発明で使用可能な酵母菌としては、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウィア属（Yarrowia）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）が挙げられる。
【００４９】
上記サッカロミセス属（Saccharomyces）としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、サッカロミセス・バイアヌス（Saccharomyces bayanus）等が挙げられる。また、上記シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が挙げられる。また、上記カンジダ属（Candida）としては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）等が挙げられる。また、上記ピキア属（Pichia）としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等が挙げられる。
【００５０】
また上記クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）等が挙げられる。また上記ヤロウィア属（Yarrowia）としては、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）等が挙げられる。また上記チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Zygosaccharomyces bailii）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）等が挙げられる。
【００５１】
上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００５２】
また上記微生物は、本来的に有用物質生産能力を有する微生物であるが、育種により有用物質生産能を付与したものであってもよい。
育種により有用物質生産能力を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、有用物質生合成経路における酵素遺伝子の発現強化や副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現低減など、公知の方法を採用することができる。例えば、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。エタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコール生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やアルコールデヒドロゲナーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。
【００５３】
上記ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨという）活性を低減させるような改変方法としては、特に限定はされないが、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＬＤＨ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＬＤＨをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、染色体上のｌｄｈ遺伝子を破壊したり、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。
ＬＤＨ活性が低減した株の具体的な作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A, Gene 1994 Vol.145(1), p69-73）等が挙げられる。
【００５４】
上記ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性が増強するような改変方法としては、特に限定されないが、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＰＣ活性が増強した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＰＣをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、ｐｃ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、プラスミドを用いたり、公知の相同組換え法によって染色体上で多コピー化させたりすることなどによって達成できる。なお、ＰＣ活性の増強は、染色体上またはプラスミド上でｐｃ遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても達成できる。
【００５５】
ＰＣ活性の増強に用いるｐｃ遺伝子としては、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。さらに、コリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｐｃ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＰＣ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００５６】
上記のようにして単離されたＰＣをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＰＣ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＰＣ活性増強株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＰＣをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＰＣ活性増強株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００５７】
染色体上またはプラスミド上にＰＣ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｐｃ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００５８】
本発明において用いられる微生物に、育種によりアルコール生産能を付与する場合としては、カルボン酸生産能を付与する場合と同様の方法で、ＬＤＨ活性を低減するよう改変された微生物を利用することができる。
【００５９】
上記アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物は、上述のＰＣ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。
ＡＤＨ活性の増強に用いるａｄｈ遺伝子としては、ＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のａｄｈＢ遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のａｄｈＥ２遺伝子を挙げることができる。さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００６０】
なお、本発明に用いる微生物は、有用物質生産能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００６１】
第３の発明で用いる微生物は、有用物質生産能を有し、且つペントース利用能を有する微生物であってもよく、ペントース利用能を有する微生物が好ましい。
本発明において、「ペントース利用能」とは、該微生物がペントースを炭素源として利用し、増殖または有用物質生産することができることをいう。
【００６２】
微生物が炭素源として利用するペントースとしては、炭素源として利用可能であれば特に限定されない。具体例としては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース等のアルドペントース類、リブロース、キシルロース等のケトペントース等が挙げられる。これらの中でも、アルドペントース類が好ましく、非可食原料として利用されるヘミセルロース系バイオマスに含まれるキシロース、アラビノースがより好ましい。中でも、ヘミセルロース系バイオマス中の含有量が多いキシロースが特に好ましい。
【００６３】
ここで、ペントース利用能を有する微生物は、本来的にペントース利用能を有する微生物であってもよいし、育種によりペントース利用能を付与したものでもよい。
育種によりペントース利用能を付与する手段としては、遺伝子組換え処理などが挙げられ、ペントース代謝経路の酵素遺伝子を導入など公知の方法を採用することができる。例えば、キシロース利用能を付与する場合は、後述するようなキシロースイソメラーゼ遺伝子を導入する方法、またはキシロースリダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。アラビノース利用能を付与する場合は、後述するようなアラビノースイソメラーゼ遺伝子およびリブロキナーゼ遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。
【００６４】
以下、育種によりペントース利用能を付与する具体例として、キシロース利用能の付与に関する改変例とアラビノース利用能の付与に関する改変例について説明する。
【００６５】
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースイソメラーゼ（以下、ＸｙｌＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。
ここで、「ＸｙｌＡ活性」とは、キシロースを異性化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．５）をいう。ＸｙｌＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＧａｏらの方法（Gao Q, Zhang M, McMillan JD, Kompala DS, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, Vol.98(100), p341-55）により、ＸｙｌＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００６６】
ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株の具体的な作製方法としては、ｘｙｌＡ遺伝子をプラスミドによって導入したり、公知の相同組換え法によって染色体上に導入したりすることなどによって達成できる。
【００６７】
ＸｙｌＡ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＡ遺伝子としては、ＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００６８】
さらに、大腸菌以外の細菌または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００６９】
上記のようにして単離されたＸｙｌＡをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＸｙｌＡ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＸｙｌＡをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００７０】
染色体上またはプラスミド上にｘｙｌＡ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｘｙｌＡ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００７１】
また、キシロース利用能の付与においては、ＸｙｌＡ活性の付与または増強に加えて、キシルロキナーゼ（以下、ＸｙｌＢとも呼ぶ）活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「ＸｙｌＢ活性」とは、キシルロースをリン酸化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１７）をいう。ＸｙｌＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＥｌｉａｓｓｏｎらの方法（Eliasson A, Boles E, Johansson B, Otensterberg M, Thevelein JM, Spencer-Martins I, Juhnke H, Hahn-Hatengerdal B, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, Vol.53, p376-82）により、ＸｙｌＢ活性を測定することによって確認することができる。
【００７２】
ＸｙｌＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸｙｌＢ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＢ遺伝子としては、ＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００７３】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００７４】
ＸｙｌＡ活性およびＸｙｌＢ活性を付与または増強する場合、導入するｘｙｌＡ遺伝子とｘｙｌＢ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
【００７５】
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースリダクターゼ（以下、ＸＲとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（以下、ＸＤＨとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることもできる。
【００７６】
ここで、「ＸＲ活性」とは、キシロースを還元してキシリトールを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２１）をいう。ＸＲ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＳａｓａｋｉらの方法（Sasaki M, Jojima T, Inui M, Yukawa H, Appl Microbiol Biotechnol., 2010, Vol.86(4), p1057-66）により、ＸＲ活性を測定することによって確認することができる。
【００７７】
ＸＲ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＸＲ活性の付与または増強に用いるｘｒ遺伝子としては、ＸＲ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来のＸＹＬ１遺伝子を挙げることができる。
【００７８】
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＲ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００７９】
次に、「ＸＤＨ活性」とは、キシリトールを脱水素化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．９）をいう。ＸＤＨ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＲｉｚｚｉらの方法（Rizzi M, Harwart K, Erlemann P, Bui-Thahn NA, Dellweg H, J Ferment Bioeng., 1989, Vol.67, p20-24）により、ＸＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００８０】
ＸＤＨ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＸＤＨ活性の付与または増強に用いるｘｄｈ遺伝子としては、ＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来のＸＹＬ２遺伝子を挙げることができる。
【００８１】
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００８２】
また、キシロース利用能の付与においては、ＸＤＨ活性およびＸＲ活性の付与または増強に加えて、ＸｙｌＢ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。ＸｙｌＢ活性の付与または増強に関しては上述の通りである。
【００８３】
アラビノース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にアラビノースイソメラーゼ（以下、ＡｒａＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロキナーゼ（以下、ＡｒａＢとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ（以下、ＡｒａＤとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。
【００８４】
ここで、「ＡｒａＡ活性」とは、アラビノースを異性化してリブロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．４）をいう。ＡｒａＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＰａｔｒｉｃｋらの方法（Patrick JW, Lee N, J. Biol. Chem., 1968, Vol.243, p4312-19）により、ＡｒａＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００８５】
ＡｒａＡ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＡ活性の付与または増強に用いるａｒａＡ遺伝子としては、ＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００８６】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００８７】
次に、「ＡｒａＢ活性」とは、リブロースをリン酸化してリブロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１６）をいう。ＡｒａＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＬｅｅらの方法（Lee N, Englesberg E, Proc. Natl. Acad. Sci., 1962, Vol.48, p335-48）により、ＡｒａＢ活性を測定することによって確認することができる。
【００８８】
ＡｒａＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＢ活性の付与または増強に用いるａｒａＢ遺伝子としては、ＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００８９】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００９０】
さらに、「ＡｒａＤ活性」とは、リブロース５リン酸を異性化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．４）をいう。ＡｒａＤ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＤｅａｎｄａらの方法（Deanda K, Zhang M, Eddy C, Picataggio S, Appl Environ Microbiol., 1996, Vol.62(12), p4465-70）により、ＡｒａＤ活性を測定することによって確認することができる。
【００９１】
ＡｒａＤ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＤ活性の付与または増強に用いるａｒａＤ遺伝子としては、ＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００９２】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のＡｒａＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００９３】
ＡｒａＡ活性およびＡｒａＢ活性およびＡｒａＤ活性を付与または増強する場合、導入するａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子、およびａｒａＤ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つまたは３つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
【００９４】
なお、第３の発明に用いる微生物は、ペントース利用能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００９５】
また、第３の発明に用いる微生物は、有用物質生産能を付与するための改変とペントース利用能を付与するための改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００９６】
第３の発明は、水性媒体中で、本発明の精製糖液を含有する有機原料に、有用物質生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る工程（以下、有機物生産工程、といことがある）を含むものである。中でも、精製糖液を含有する有機原料に前記微生物を作用させることにより有機化合物を生成させ、これを回収することが好ましい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。
【００９７】
第３の発明で前記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いても良いが、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。すなわち、前記微生物を予め増殖させておいた上で、前記微生物に有機化合物を生産させてもよい。上述のように種培養や本培養を行なうことで、前記微生物を予め増殖させることができるが、このときに使用する有機原料としては、精製糖液を用いてもよいし、その他の有機原料を用いてもよい。
【００９８】
なお、種培養または本培養した微生物を水性媒体中で増殖させながら、精製糖液を含有する有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよいし、予め種培養または本培養を行なうことで増殖させた菌体を、精製糖液を含有する有機原料を含む水性媒体中で有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよい。
【００９９】
また、第３の発明において用いられる微生物としては、上記微生物のほか、微生物の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
【０１００】
第３の発明では精製糖液を含有する有機原料を使用するが、必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。有機化合物製造方法において使用する精製糖液以外の有機原料としては、前記微生物が資化して有機化合物を生成させうる炭素源が挙げられ、その種類は特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプンまたはセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトールまたはリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロースまたはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【０１０１】
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機化合物の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、水性媒体に対して、通常５０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常３００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。また、培養液全量に対しては、通常１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは５〜５０ｇ／Ｌの範囲内で用いることができる。前記有機原料は、反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせ、水性媒体中に前記有機原料をさらに添加してもよい。
【０１０２】
（水性媒体）
第３の発明で使用する水性媒体とは、水、水を主成分とする水溶液、およびゲル（寒天）等と、糖液を含有する有機原料と、有用物質生産能を有する微生物、ならびに有機原料中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物のほか、微生物の培養に必要な成分を含む液体を意味し、溶解していない液体・固体が分散したものも含まれる。
【０１０３】
第３の発明で用いる水性媒体は特に限定されず、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、水性媒体は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、第３の発明で用いる微生物が資化して有機化合物を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０１０４】
また、前記水性媒体は、例えば上述した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンおよび二酸化炭素ガス（炭酸ガス）から選ばれる少なくとも１つを含有することが好ましい。炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。
【０１０５】
前記水性媒体中における炭酸イオンまたは重炭酸イオンを含有させる場合の濃度は、特に限定はされないが、通常１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上であり、また、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下である。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、水性媒体１Ｌ当たり通常５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましく、一方、水性媒体１Ｌ当たり通常２５ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下、さらに好ましくは１０ｇ以下の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましい。
【０１０６】
前記水性媒体のｐＨは、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、水性媒体のｐＨを、通常５．５以上、好ましくは６以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは７．１以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが好ましい。
【０１０７】
前記水性媒体のｐＨは、生産される有機化合物が酸性物質である場合には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。生産される有機化合物が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。
【０１０８】
第３の発明で用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体質量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
【０１０９】
第３の発明における有機物生産工程の反応時間は、特に限定はされないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。
【０１１０】
第３の発明における有機物生産工程の反応温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常生育至適温度より２℃以上、好ましくは７℃以上、より好ましくは１５℃以上、さらに好ましくは２０℃以上高い温度で行う。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３５℃以上、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。有機化合物生産反応の間、常に３５℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【０１１１】
第３の発明における有機物生産工程は、通気、攪拌して行ってもよく、製造する有機物や菌体の性質に合わせて適宜選択することができ、好気的雰囲気でおこなっても、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なってもよい。第３の発明における有機物生産工程は、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なうことが好ましい。ここでいう嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
【０１１２】
第３の発明における有機物生産工程は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。
【０１１３】
（有機化合物の回収工程、精製工程）
第３の発明は、上記の有機物生産工程により有機化合物が生成し、水性媒体中に蓄積させることができる。前記有機物生産工程で蓄積させた有機化合物は、常法に従って、水性媒体より回収する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、蓄積させた有機化合物がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸である場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、回収することができる。
【０１１４】
また第３の発明においては、前記の精製する工程で得られたものを精製する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には水性媒体から回収した溶液を結晶化（晶析）またはカラムクロマトグラフィーにより精製して、カルボン酸を得ることができる。蓄積させた有機化合物がエタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールである場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、蒸留等で濃縮し、その溶液を膜脱水するなどして、アルコールを精製することができる。
【０１１５】
＜第４の発明：微生物の培養方法＞
第４の発明の培養方法は、本発明の精製糖液を含有する有機原料を炭素源として用いて、有用物質生産能力を有する微生物を培養させる。本発明の培養方法によって得られた微生物は、その後、有機原料に作用させることによって有機化合物を生成させ、これを回収することができる。このときの有機原料としては、前記精製糖液を用いてもよいし、精製糖液中にその他の有機原料を含んでいてもよい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。
【０１１６】
第４の発明の培養方法では、精製糖液を含む寒天培地等の固体培地で培養してもよいし、精製糖液を含む液体培地で培養してもよい。後述する種培養や本培養を行なうことで、有機化合物生産反応に供する前記微生物を増殖させることができる。
【０１１７】
種培養は、本培養に供する前記微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。さらに、必要に応じて、前記培地に炭素源として精製糖液を添加してもよいし、グルコース等の有機原料を添加してもよい。
【０１１８】
種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【０１１９】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【０１２０】
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、好気性微生物の種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【０１２１】
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
【０１２２】
本培養は、後述する有機化合物生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。
【０１２３】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０１２４】
また、本培養においては、炭素源として精製糖液を含有する有機原料を使用する。必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。本培養において使用する精製糖液以外の有機原料としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、２種類以上を任意の組み合わせで添加してもよい。
【０１２５】
本培養における前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは５ｇ／Ｌ以上であり、通常１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【０１２６】
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、好気性微生物の本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【０１２７】
また、本培養においては、より有機化合物の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
本培養後の菌体は、後述する有機化合物生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
【実施例】
【０１２８】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
糖液中の各含有成分の存在量は、液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析により求めた。分析条件は以下の通りである。
【０１２９】
（液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析）
＜測定条件（１）：  糖、ギ酸の分析条件＞
ポンプ：島津製作所社製  ＬＣ−２０ＡＤ
カラムオーブン：島津製作所社製  ＣＴＯ−１０Ａ
ＵＶ検出器：島津製作所社製  ＳＰＤ−１０Ａ
ＲＩ検出器：島津製作所社製  ＲＩＤ−１０Ａ
カラム：信和化工社製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ＩＤ×３００ｍｍ装置：
溶離液：０．１１質量％過塩素酸溶液  １．０ｍＬ／分
検出方法：ＵＶ（２１０ｎｍ），ＲＩ
注入量：１０μＬ
【０１３０】
＜測定条件（２）  ：フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、ベンゾキノンの分析条件＞  
カラム        ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０    長さ１００ｍｍ×φ４．６ｍｍ、  
粒子径３μｍ（野村化学社製）
溶離液        ：Ａ液  ０．０５２質量％過塩素酸水溶液
Ｂ液  アセトニトリル
Ａ液／Ｂ液＝９５／５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）からＢ液１００ｖｏｌ％
２０分間でグラジエント分析
カラム温度    ：４０℃
流速          ：１．０ｍＬ／分
サンプル注入量：１０μＬ
検出波長      ：ＵＶ  （２１０ｎｍ）
【０１３１】
（除去率の算出方法）
溶媒抽出による除去率は、以下のように算出した。
糖液ならびに溶媒抽出処理した精製糖液を上記ＬＣ条件にて測定し、絶対検量線法を用いて各成分の濃度を算出し、溶媒抽出処理前後の濃度変化を下記式により算出した。
例えば１，４−ベンゾキノン（以下、単に「ベンゾキノン」といい、「ＢＱ」と略すことがある）の除去率は、以下のように算出した。
（ベンゾキノン（ＢＱ）除去率）（％）＝［１−（溶媒抽出処理後に含有するベンゾキノン濃度）／（溶媒抽出処理前の糖化液に含有するベンゾキノン濃度）］×１００
【０１３２】
（糖液の作製）
（合成例１）
超純水１０６．２ｍＬにグルコース１２．０ｇ、キシロース１．５ｇ、ヒドロキシメチルフルフラール０．１５ｇ、ベンゾキノン０．１５ｇを溶解させ、糖液を作製した。以下、糖液−１とする。
この糖液のＬＣ分析を行ったところ、グルコース１０．００質量％、キシロース１．２５質量％、ヒドロキシメチルフルフラール０．１３質量％、ベンゾキノン０．１３質量％
だった。また、糖液−１は黄色だった。
【０１３３】
（合成例２）
超純水９０．７ｍＬにグルコース８．００ｇ、キシロース１．００ｇ、フルフラール０．１０ｇ、ギ酸０．０４ｇを溶解させ糖液を作製した。以下、糖液−２とする。この糖液のＬＣ分析を行ったところ、グルコース７．９８質量％、キシロース１．００質量％、ギ酸０．０４質量％、フルフラール０．１１質量％であった。また、糖液−２は黄色だった。
【０１３４】
（実施例１）
（糖液の溶媒抽出処理（精製））
２００ｍＬ分液漏斗に、合成例１で調製した糖液−１を１０ｇ、トルエン１０ｇを加えた後、２５℃で３分混合した後静置した。水層を取り出し、精製糖液−１を得た。
精製糖液−１を上記同様、ＬＣ分析を行ない、各成分の存在量を確認したところ、糖濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が２．１％、ベンゾキノンの除去率が９７．０％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノンが大幅に除去された他、ヒドロキシメチルフルフラールも除去された。また、精製糖液−１は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１３５】
（実施例２）
使用したトルエンの量を２０ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−２を得た。この精製糖液−２をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が４．２％、ベンゾキノンの除去率が９８．５％だった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノンが大幅に除去された他、ヒドロキシメチルフルフラールも除去された。また、精製糖液−２は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１３６】
（実施例３）
抽出溶媒をジイソプロピルエーテル１０ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−３を得た。この精製糖液−３をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が５．８％、ベンゾキノンの除去率が７６．３％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノンが大幅に除去された他、ヒドロキシメチルフルフラールも除去された。また、精製糖液−３は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１３７】
（実施例４）
使用したジイソプロピルエーテルの量を２０ｇに変更した以外は、実施例３と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−４を得た。この精製糖液−４をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が９．９％、ベンゾキノンの除去率が８６．６％除去であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノンが大幅に除去された他、ヒドロキシメチルフルフラールも除去された。また、精製糖液−４は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１３８】
（実施例５）
抽出溶媒をメチルイソブチルケトン１０ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−５を得た。この精製糖液−５をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が６１．１％、ベンゾキノンの除去率が９０．５％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノンが大幅に除去された他、ヒドロキシメチルフルフラールも除去された。また、精製糖液−５は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１３９】
（実施例６）
使用したジイソプロピルエーテルの量を２０ｇに変更した以外は、実施例５と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−６を得た。この精製糖液−６をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が７５．５％、ベンゾキノンの除去率が９５．１％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノンが大幅に除去された他、ヒドロキシメチルフルフラールも除去された。また、精製糖液−６は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１４０】
（実施例７）
抽出溶媒をオクタノール１０ｇに変更した以外は、実施例１と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−７を得た。この精製糖液−７をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、ヒドロキシメチルフルフラールの除去率が３９．４％、ベンゾキノンの除去率が７７．０％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるベンゾキノン、ヒドロキシメチルフルフラールが除去された。また、精製糖液−７は、薄黄色であった。結果を表１に示した。
【０１４１】
【表１】
2015083002.tif 000002
【０１４２】
上記表中、ＨＭＦはヒドロキシメチルフルフラールを示し、ＢＱはベンゾキノンを示す。溶媒使用量のＶＲは、糖液に対する体積割合（ＶｏｌｕｍｅＲａｔｉｏ）を示す。
【０１４３】
（実施例８）
２００ｍＬ分液漏斗に、合成例２で調製した糖液−２を１０ｇ、トルエン１０ｇを加えた後、２５℃で５分混合した後静置した。水層を取り出し、精製糖液−８を得た。
精製糖液−８を上記同様、ＬＣ分析を行ったところ、糖濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が８３．６％であった。ギ酸は除去されなかった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された。また、精製糖液−８は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１４４】
（実施例９）
使用したトルエンの量を２０ｇに変更した以外は、実施例８と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−９を得た。この精製糖液−９をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が９０．９％であった。ギ酸は除去されなかった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された。また、精製糖液−９は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１４５】
（実施例１０）
抽出溶媒をジイソプロピルエーテル１０ｇに変更した以外は、実施例８と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−１０を得た。この精製糖液−１０をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が７４．５％、ギ酸の除去率が１５．９％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された他、ギ酸も除去された。また、精製糖液−１０は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１４６】
（実施例１１）
使用したジイソプロピルエーテルの量を２０ｇに変更した以外は、実施例１０と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−１１を得た。この精製糖液−１１をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が８５．３％、ギ酸の除去率が２６．７％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された他、ギ酸も除去された。また、精製糖液−１１は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１４７】
（実施例１２）
抽出溶媒をメチルイソブチルケトン１０ｇに変更した以外は、実施例８と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−１２を得た。この精製糖液−１２をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が９２．３％、ギ酸の除去率が３１．１％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された他、ギ酸も除去された。また、精製糖液−１２は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１４８】
（実施例１３）
使用したジイソプロピルエーテルの量を２０ｇに変更した以外は、実施例１２と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−１３を得た。この精製糖液−１３をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が９５．７％、ギ酸の除去率が４７．７％であった。
溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された他、ギ酸も除去された。また、精製糖液−１３は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１４９】
（実施例１４）
抽出溶媒をオクタノール１０ｇに変更した以外は、実施例８と同様の方法で溶媒抽出処理を行ない、精製糖液−１４を得た。この精製糖液−１４をＬＣ分析したところ、濃度の変化はなく、フルフラールの除去率が７４．０％、ギ酸の除去率が２４．１％であった。溶媒抽出処理によって、発酵阻害成分であるフルフラールが大幅に除去された他、ギ酸も除去された。また、精製糖液−１４は、薄黄色であった。結果を表２に示した。
【０１５０】
【表２】
2015083002.tif 000003
【０１５１】
上記表中、ＦＲＬはフルフラールを示し、ＦＡはギ酸を示す。溶媒使用量のＶＲは、糖液に対する体積割合（VolumeRatio）を示す。
【０１５２】
（合成例３）
特願２０１３−１６１４７７明細書、実施例に記載の方法により、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株より、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を作製した。なお、以下にその概要を説明するが、上記出願明細書の内容は、参照により本願に組み込まれるものとする。
＜ラクテートデヒドロゲナーゼ破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を、２質量％グルコースを含む以下の組成の培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍｌに溶解］（以下、培地（Ａ）という）１０ｍｌで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍｌに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５質量％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１５３】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｌｄｈ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１及び配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）  ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ  各々プライマー、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片をＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにより切断した結果、約１．０ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【０１５４】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるＬＤＨのコーディング領域の内部配列を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）にて平滑化し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて環状化させ、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにより切断した結果、約０．７５ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【０１５５】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むｌｄｈ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにて切断したｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにより切断した結果、約０．７５ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した。
【０１５６】
（Ｄ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Journal of Molecular Biology, 1970, 53, 159）  により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株は、常法（Wolf Hetal, J.Bacteriol., 1983, 156(3), p1165-70, Kurusu Yetal., Agric Biol Chem., 1990, 54(2), p443-7）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の形質転換は、電気パルス法（Res. Microbiol.,1993,144,p181-5）によって行い、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ  、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１５７】
次に、上記相同組み換え株を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０質量％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｌｄｈ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｌｄｈ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ｌｄｈ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号３及び配列番号４）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【０１５８】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の測定
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を、２質量％グルコースを含むＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した。
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記リン酸ナトリウム緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン）  にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【０１５９】
ＬＤＨ酵素活性の測定は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化によって検出することで行った。反応は、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株から調製された粗酵素液におけるＬＤＨ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるＬＤＨ活性は、１０分の１以下であった。
【０１６０】
＜ピルビン酸カルボキシラーゼ増強株の作製＞
（Ｆ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有するＤＮＡ断片であるＴＺ４プロモーター（特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片）の取得は、上記（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５及び配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、２．０質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２５０ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、ＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。この中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
【０１６１】
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号７及び配列番号８）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、ＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）にて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約３００ｂｐのプロモーター断片を、２．０質量％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。
【０１６２】
（Ｇ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ（特開平１２−９３１８３）を利用した。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域及び安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）にて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ｆ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株をＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した。
【０１６３】
（Ｈ）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｐｃ遺伝子の取得は、上記実施例４の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９及び配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。
ＰＣＲ反応終了後、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を０．１μｌ加え、７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。
【０１６４】
ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片をＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩ及びＡｐａＩにより切断した結果、約３．７ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ及び塩基配列解読装置３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果得られた塩基配列から推測されるアミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のＰＣと極めて高い相同性（９９．４％）を示したことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のｐｃ遺伝子であると断定した。
【０１６５】
（Ｉ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩ及びＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるｐｃ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このＤＮＡ断片を、同制限酵素にて切断したｐＴＺ４と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩ及びＡｐａＩにより切断した結果、約３．７ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＭＪＰＣ１と命名した。
【０１６６】
（Ｊ）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｐｃ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１１及び配列番号１２）を用いたＰＣＲによって行った。なお配列番号１２のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。
増幅産物の確認は、０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｐｃ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【０１６７】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片の取得はプラスミドｐＭＪＰＣ１を鋳型とし、配列番号１３及び配列番号１４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。なお配列番号１４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、１．０質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
【０１６８】
上記にて調整したｐｃ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）をＰｓｔＩで切断して調整したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩにより切断した結果、約１．０ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【０１６９】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｐｃ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１５及び配列番号１６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、１．０質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（タカラバイオ）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを配列番号１６及び配列番号１７のプライマーを用いたＰＣＲ反応に供した。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
【０１７０】
次に上記ｐＭＪＰＣ１７．１及びｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５質量％アガロースゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このｐｃ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩ及びＳｐｈＩで切断して調整したＤＮＡと混合、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｈＩにより切断した結果、約１．７ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＭＪＰＣ１７．３と命名した。
【０１７１】
（Ｋ）ピルビン酸カルボキシラーゼ増強株の作製
上記の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．３を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｐｃ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１７２】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｐｃ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．３に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ｐｃ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｐｃ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーター及びｐｃ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号１８および配列番号１９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１７３】
（Ｌ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の測定
上記（Ｋ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を、２質量％グルコースを含むＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記リン酸カリウム緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン）  にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を超遠心（１００，０００×ｇ，４℃，９０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【０１７４】
ＰＣ酵素活性の測定は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、  ０．１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、５ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム  、５ｍＭ  アデノシン３リン酸ナトリウム、０．３２  ｍＭ  ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（和光純薬、酵母由来）及び粗酵素液を含む反応液中で２５℃にて反応させて行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量とした。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株から調製した粗酵素液の比活性は０．１Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。一方、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製した粗酵素液の比活性は、本活性測定方法の検出限界以下であった。
【０１７５】
＜キシロースイソメラーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子導入株の作製＞
（Ｍ）大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株をＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。
この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１７６】
（Ｎ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロンのクローニング
大腸菌ＪＭ１０９株のｘｙｌＡＢオペロンの取得は、上記（Ｍ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該オペロン周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号２０および配列番号２１）を用いたＰＣＲによって行った。水性媒体組成は、鋳型ＤＮＡ  １μＬ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．０ｋｂの断片を検出した。得られたｘｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約２．９ｋｂのＤＮＡ断片は０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（カラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩにより切断した結果、約２．９ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＸｙｌＡＢ１と命名した。
【０１７７】
（Ｏ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入用プラスミドの構築
大腸菌由来ＸｙｌＡＢオペロンをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の染色体上ｌｄｈ遺伝子欠損部位に導入するため、ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｌｄｈ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号２２および配列番号２３）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１７８】
水性媒体組成は、鋳型ＤＮＡ  １μＬ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ  各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【０１７９】
増幅産物の確認は、０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．１ｋｂの断片を検出した。得られたｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）のＸｂａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１８０】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩにより切断した結果、約２．２ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＫＢ−ＬＤＨ２と命名した。
【０１８１】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの取得は、プラスミドｐＸｙｌＡＢ１を鋳型とし、配列番号２４および配列番号２５に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。
水性媒体組成は、鋳型ＤＮＡ  １μＬ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ  各々プライマーを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で２０秒、７２℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分とした。
【０１８２】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．２ｋｂの断片を検出した。得られたＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてｐＫＢ−ＬＤＨ２のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１８３】
この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡの挿入断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔおよび塩基配列解読装置３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果得られた塩基配列（ＸｙｌＡＢオペロン）は、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株のゲノム配列と完全に一致し、ＸｙｌＡＢオペロンに変異が入っていないことを確認し、これをｐＸｙｌＡＢ３と命名した。
【０１８４】
（Ｐ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＸｙｌＡＢ３を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
【０１８５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Res. Microbiol., 1993, 144, p181-5）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０１８６】
この培地上に生育した株は、ｐＸｙｌＡＢ３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１８７】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子欠損部位にｐＸｙｌＡＢ３に由来するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたものと親株と同じ配列に戻ったものが含まれる。ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたか否かの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＸｙｌＡＢオペロンをＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号２６および配列番号２７）を用いて分析すると、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたクローンでは４，１９６ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１８８】
（Ｑ）キシロース資化試験
上記（Ｐ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を２０ｇ／Ｌキシロースを含むＭＭ寒天培地［尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン  ２００μｇ、チアミン  ２００μｇ、寒天  １５ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］に植菌し、３０℃で３日間静置培養した。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株も同様に培養した。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株はキシロースを単一炭素源とした培地において生育できることが確認された。一方、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株は生育することはできなかった。
【０１８９】
（実施例１５）
＜精製糖液の発酵生産評価＞
（Ａ）種培養
Ａ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μｌ添加した。合成例３の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で５．１時間振とう培養した。
【０１９０】
（Ｂ）本培養
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．０５となるように接種し、３０℃で、１９．４時間振とう培養した。
【０１９１】
（Ｃ）コハク酸生産反応
上記（Ｂ）の本培養で得られた培養液を５，０００×ｇ、７分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁液［硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：１ｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］にＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２０になるように懸濁した。続いて、実施例１で作製した精製糖液−１を１．４ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．２ｇ、および蒸留水１．６ｍＬを混合して、基質溶液を調製した。５ｍＬ反応器に前記菌体懸濁液０．５ｍＬと、基質溶液０．５ｍＬを混合し、嫌気条件下において４０℃で反応させた。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．８ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．２ｇ／Ｌであった。
【０１９２】
（実施例１６）
コハク酸生産反応において、実施例３で作製した精製糖液−３を１．５ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．２ｇ、および蒸留水１．５ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例１５と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は７．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。
【０１９３】
（実施例１７）  
コハク酸生産反応において、実施例５で作製した精製糖液−５を１．５ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．２ｇ、および蒸留水１．５ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例１５と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１１．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。
【０１９４】
（比較例１）
コハク酸生産反応において、合成例１で作製した糖液−１を１．５ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．２ｇ、および蒸留水１．５ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例１５と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．３ｇ／Ｌ、グルコース濃度は７．９ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．１ｇ／Ｌであった。
【０１９５】
実施例１５〜１７、比較例１の結果を表３に示す。数値は、６時間後の各成分の濃度を表わす。
【０１９６】
【表３】
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【０１９７】
表１、２より本発明の精製により、発酵阻害物質であるヒドロキシメチルフルフラール、ベンゾキノン、フルフラール、ギ酸を除去できることが明らかとなった。本発明における抽出溶媒を使用することで、それぞれ特定の発酵阻害物質を効率よく除去できること、及び抽出溶媒量を増加させることで、糖濃度を変化させることなく、除去率が向上可能であることが明らかとなった。
【０１９８】
表３より、実施例１の精製糖液−１を使用した実施例１５では、比較例１に対してコハク酸濃度が６１％向上した。
また実施例３の精製糖液−３を使用した実施例１６では、比較例１に対してコハク酸濃度が１７％向上した。
実施例５の精製糖液−５を使用した実施例１７では、比較例１に対してコハク酸濃度が５５％向上した。
本発明の溶媒抽出処理を実施してベンゾキノン等が大幅に除去された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
【０１９９】
以上の結果より、本発明の糖液の精製方法により、得られる糖液中に含まれるカルボニル化合物等の発酵阻害物質が効率よく除去された精製糖液が得られることがわかる。特に
フルフラール等のアルデヒド化合物や、ベンゾキノン等の共役ケトンのような強い発酵阻害を呈する物質の除去には、非常に有効である。
そして本発明の精製糖液、特に共役ケトンが除去された精製糖液を有機化合物の生産に用いることで、効率のよい有機化合物の生産が可能であることが示された。好ましくはカルボン酸やアルコール、より好ましくはコハク酸の生産において有効である。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
本発明の糖類の処理方法によれば、糖液中の発酵阻害物質の含有量を減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、高い収率で目的とする有機化合物の収率を得ることができる。
また本発明の精製糖液は、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させ、また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。
また、本発明の有機化合物の製造方法は、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明の培養方法であれば、発酵生産プロセスにおける発酵阻害物質量を減少させることができるため、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、もって発酵生産性を向上させることができる。
【配列表】
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