(57)【要約】【課題】  単一の培養容器のみで、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことを可能とする。【解決手段】  リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体が固相化されて固相化面と非固相化面とが備えられ、固相化面において、抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で固相化されていることを特徴とする培養容器。この培養容器にリンパ球及び培養液を封入し、培養容器における固相化面が底面になるように培養容器を配置してリンパ球を活性化させ、次いで培養容器を反転し、培養容器における非固相化面が底面になるように培養容器を配置してリンパ球を増幅させる。【選択図】  図４
2015116152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体が固相化されて固相化面と非固相化面とが備えられ、前記固相化面において、抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で固相化されていることを特徴とする培養容器。
【請求項２】
前記固相化面と前記非固相化面とが接触しない形態で保持されていることを特徴とする請求項１の培養容器。
【請求項３】
容器内底面積１ｃｍ２当たり０．０１〜４ｍｌの気体が封入されていることを特徴とする請求項２の培養容器。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器を用いたリンパ球の培養方法であって、
前記培養容器にリンパ球及び培養液を封入し、前記培養容器における前記固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を活性化させる活性化工程と、
前記培養容器を反転し、前記培養容器における前記非固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を増幅させる増殖工程と、を有する
ことを特徴とするリンパ球の培養方法。
【請求項５】
前記活性化工程において、前記培養容器を仕切り部材により仕切ることで、前記培養容器内に培養部を形成し、この培養部にリンパ球及び培養液を封入し、
前記増殖工程として、
前記培養容器を反転し、前記培養容器における前記非固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を増幅させる第一の増殖工程と、
前記仕切り部材を移動又は除去して前記培養部の容積を拡張する容積拡張工程と、
前記培養部の容積を拡張した後に、リンパ球を増幅させる第二の増殖工程と、を有する
ことを特徴とする請求項４に記載のリンパ球の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養技術に関し、特にリンパ球を培養するための培養容器、及びリンパ球の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性フィルムから形成された培養バッグに細胞と培養液を封入して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
【０００３】
ところで、リンパ球を増殖させるためには、最初にリンパ球を活性化させる必要がある。このため、抗ＣＤ３抗体が固相化された基材上でリンパ球を活性化し、その後に活性化したリンパ球を培養バッグに封入して増殖が行われていた。
このとき、一般に、図８に示すように、リンパ球の活性化のために抗ＣＤ３抗体が底面に固相化されたフラスコが用いられ、リンパ球が活性化された後に、培養バッグに移し替えて、リンパ球の培養が行われていた。その理由は、リンパ球は、増殖のために抗ＣＤ３抗体による刺激を必要とする一方で、抗ＣＤ３抗体による刺激を受け続けると増殖しにくくなるという性質を持っているからである。このため、リンパ球が活性化した後は、抗ＣＤ３抗体が固相化されていない容器で、培養を行う必要があった。
【０００４】
リンパ球を活性化させるための培養容器としては、例えば特許文献１に記載の閉鎖系細胞培養容器などを挙げることができる。この閉鎖系細胞培養容器は、容器内の全面に抗ＣＤ３抗体が固相化されており（段落００４８，００５７）、リンパ球を効率的に活性化させることが可能になっている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１７５０２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このような閉鎖系細胞培養容器のみを用いてリンパ球の培養を行う場合、リンパ球が活性化した後も抗ＣＤ３抗体による刺激を受け続けるため、リンパ球が過剰刺激を受けて増殖が抑制されてしまう。このため、リンパ球を大量に効率的に培養するためには、この閉鎖系細胞培養容器を活性化専用容器として用い、細胞の増殖は別個の培養容器で行うことが望ましい。
したがって、この従来の技術では、リンパ球を大量に効率的に培養する場合には、活性化された細胞の移し替えの煩雑性や、コンタミネーションのリスクが生じるという問題があった。
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗ＣＤ３抗体を固相化し、固相化面と非固相化面とを備えたものを開発した。そして、固相化面が底面になるように培養容器を配置して、リンパ球の活性化を行い、その後、非固相化面が底面になるように培養容器を配置して、リンパ球の増殖を行うことにより、単一の容器内で、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことを可能とすることに成功した。
すなわち、本発明は、単一の培養容器により、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことが可能な培養容器、及びリンパ球の培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、リンパ球を培養するための培養容器であって、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体が固相化されて固相化面と非固相化面とが備えられ、前記固相化面において、抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の濃度で固相化されている構成としてある。
【０００９】
また、本発明のリンパ球の培養方法は、前記培養容器を用いたリンパ球の培養方法であって、前記培養容器にリンパ球及び培養液を封入し、前記培養容器における前記固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を活性化させる活性化工程と、前記培養容器を反転し、前記培養容器における前記非固相化面が底面になるように前記培養容器を配置して、リンパ球を増幅させる増殖工程とを有する方法としてある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、単一の培養容器のみで、専用の培養装置等を用いることなくリンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことができる。このため、抗体によるリンパ球への過剰刺激を防ぐための移し替えの煩雑性、及びコンタミネーションのリスクを排除することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係る培養容器を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る培養容器を、容器内面を貼り合わせた状態で保管した場合の抗体の移動結果のグラフを示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る培養容器の保管形態を示す図である。
【図４】本発明の第一実施形態に係るリンパ球の培養方法を示す図である。
【図５】本発明の第二実施形態に係るリンパ球の培養方法を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る培養容器、及びリンパ球の培養方法の実施例及び比較例を表す模式図である。
【図７】本発明の実施形態に係る培養容器、及びリンパ球の培養方法の実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。
【図８】従来のリンパ球の培養方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の培養容器、及びリンパ球の培養方法の実施形態について、詳細に説明する。まず、本発明の培養容器の一実施形態について、図１を参照して説明する。同図には、培養容器を積載台（図示していない）に載置して上方から見た概略図、及び側面から見た概略図が示されている。
【００１３】
［培養容器］
図１に示すように、本発明の実施形態に係る培養容器１０は、上下に対向する容器壁を有している。そして、容器内面の一方が、抗体２０を固相化した固相化面１１（図１（２）の容器内の底面）となっている。また、容器内面のもう一方が、抗体２０を固相化していない非固相化面１２（図１（ｂ）の容器内の上面）となっている。なお、培養容器１０には、チューブ１３が備えられ、これによって培養容器１０内へのリンパ球と培養液の封入、及び培養したリンパ球と培養液の回収が行われる。同図の例ではチューブ１３は培養容器１０に１本備えられているが、２本以上備えられていても良い。
【００１４】
培養容器１０は、細胞培養に必要なガス透過性を有するフィルムを用いて、袋状（バック型）に形成されている。このような培養容器１０の材料として、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。
固相化面１１に固相化する抗体２０としては、抗ＣＤ３抗体を用いることが好ましい。リンパ球は、抗ＣＤ３抗体によって活性化され、増殖させることができる。
【００１５】
固相化面１１における抗体２０の固相化の濃度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすることがより好ましい。
抗体２０の固相化の濃度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができ、その後にリンパ球を効率的に増殖させることが可能になるためである。また、抗体２０の固相化の濃度を４０ｎｇ／ｃｍ２より大きくしても、リンパ球の増殖効率に大きな差異がなく、抗体を過剰に使用することにより容器のコストが増すためである。
【００１６】
固相化面１１における抗ＣＤ３抗体の最密充填濃度は、３００ｎｇ／ｃｍ２であり、この濃度範囲までであれば、リンパ球を十分に活性化させて、その後にリンパ球を効率的に増殖させることができる。一方、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度が３００ｎｇ／ｃｍ２を超えると、培養容器１０内の培養液中に抗ＣＤ３抗体が浮遊して、リンパ球に過剰な刺激を与える場合があるため、好ましくない。
【００１７】
本実施形態の培養容器１０は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムからバッグ状の培養容器１０を製造する。培養容器１０は、図１に示すように、チューブ１３を取り付けて製造される。
【００１８】
次に、培養容器１０を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、抗体２０を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養容器１０を揺動することなどによって、培養容器１０内の底面上で緩衝液の液滴を移動させ、緩衝液に含まれる抗体２０を、培養容器１０内の底面上に付着させる。これにより、培養容器１０内の底面のみに抗体２０を付着させて、固相化面１１を形成する。このとき、培養容器１０内の上面は、抗体２０が付着されていない非固相化面１２として形成される。
【００１９】
次に、本実施形態の培養容器１０の保管形態について説明する。
本実施形態の培養容器１０は、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態で保持して保管されることが好ましい。
すなわち、培養容器１０を、固相化面１１と非固相化面１２とが接触した形態で、１．６ｋｇの荷重下で、２時間、３７℃で保持した場合、図２に示すように、約２割の抗体２０が、固相化面１１から非固相化面１２へ裏移りした。このように非固相化面１２へ移動した抗体２０は、リンパ球の活性化の後、増殖を行う際に、リンパ球に過剰刺激を与えて増殖率を低下させる要因となり得る。したがって、固相化面１１から非固相化面１２への抗体２０の移動は、できるだけ抑制することが好ましい。
【００２０】
そこで、本実施形態の培養容器１０を保管するにあたっては、培養容器１０に所定量の気体を封入して、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態を保持させることが好ましい。
具体的には、封入する気体の量は、培養容器１０内の底面積１ｃｍ２当たり０．０１〜４ｍｌとすることが好ましい。封入する気体の量をこのような範囲にすれば、固相化面１１と非固相化面１２とが接触することを防止することが可能となる。
封入する気体としては、特に限定されないが、不活性ガスとすることが好ましく、空気や窒素ガス等を用いることができる。このような気体を、例えば気体供給装置により、チューブ１３を介して培養容器１０に注入することができる。
【００２１】
本実施形態の培養容器１０の具体的な保管形態としては、図３の（１）に示すように、剛性のある外装容器６０により培養容器１０の形状を保持させることが好ましい。このような外装容器６０を用いて培養容器１０を保管する場合、少量の気体を培養容器１０に封入するだけで、培養容器１０を抗体２０の裏移りがないように保管することができる。
また、図３の（２）に示すように、培養容器１０を気体で膨満な状態にして梱包容器７０により保管することも好ましい。このようにすれば、複数個の培養容器１０を簡易に梱包して、抗体２０の裏移りがないように保管することができる。
【００２２】
以上説明したように、本実施形態の培養容器１０は、ガス透過性フィルムからなり、対向する容器内面の片方の面のみに抗体２０が固相化され、固相化面１１と非固相化面１２とを備えたものとなっている。また、培養容器１０に封入されたリンパ球は、容器内の底部に集まる。
このため、リンパ球の活性化にあたっては、培養容器１０を固相化面１１が底面になるように用い、リンパ球の増殖にあたっては、培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように用いることで、抗体２０によるリンパ球の過剰刺激を防止でき、単一の容器内で、リンパ球の活性化と増殖を効率的に行うことができる。その結果、煩雑な移し替えや、コンタミネーションのリスクを排除することが可能となっている。また、活性化から増殖の工程の移行は、容器を反転するという単純な操作であるため、専用の装置等を用いることなく簡便に行うことが可能となっている。
また、本実施形態の培養容器１０に所定量の気体を封入して、固相化面１１と非固相化面１２とが接触しない形態を保持させることで、リンパ球への過剰刺激防止効果を低減させることなく、培養容器１０を保管することが可能となる。
【００２３】
なお、従来のリンパ球の活性化に用いられるフラスコは、底面にのみ抗ＣＤ３抗体が固相化されており、これによって、リンパ球を活性化させることが可能になっている。しかしながら、フラスコは単一容器でリンパ球の活性化後の増殖工程に用いることはできない。その理由は、フラスコでは面積当たりの細胞数を適切な密度に維持できなくなるという問題があるためである。すなわち、リンパ球は活性化後に増殖するため、培養面積を拡大する必要がある。本実施形態であれば、例えば培養容器の一部をクリップ又はローラで仕切り、細胞の増殖に合わせてクリップ又はローラを移動又は除去すること等によって培養面積を拡大することは可能であるが、フラスコでは行えないため、フラスコは、リンパ球の活性化には用いられるものの、増殖には適さない。
【００２４】
［リンパ球の培養方法（第一実施形態）］
次に、本発明のリンパ球の培養方法の第一実施形態について、図４を参照して説明する。本実施形態のリンパ球の培養方法は、同図に示すように、（１）活性化工程、及び（２）増殖工程を有している。
【００２５】
（１）活性化工程
本実施形態のリンパ球の培養方法における活性化工程は、培養容器１０にリンパ球３０及び培養液４０を封入し、固相化面１１が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を活性化させる工程である。
上述した通り、固相化面１１には、抗体２０が固相化されており、この抗体２０としては、抗ＣＤ３抗体が好適に用いられる。
リンパ球３０の種類は、特に限定されず、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び単核球等を培養対象とすることができる。
培養液４０は、リンパ球３０の培養に一般的に用いられるものを使用することができ、例えばインターロイキン−２が添加された培養液などを好適に用いることができる。
この活性化工程において、培養容器１０内のリンパ球３０は、固相化面１１上に固相化された抗ＣＤ３抗体により、受容体分子のＣＤ３が刺激されて活性化される。
【００２６】
（２）増殖工程
本実施形態のリンパ球の培養方法における増殖工程は、培養容器１０を反転し、非固相化面１２が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を増幅させる工程である。
このように培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように配置することで、リンパ球３０を培養容器１０内における非固相化面１２側で培養することが可能になる。
これによって、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖させることができる。このため、リンパ球３０が抗ＣＤ３抗体から過剰刺激を受けた場合に生じる増殖効率の低下を防止することが可能になっている。
【００２７】
［リンパ球の培養方法（第二実施形態）］
次に、本発明のリンパ球の培養方法の第二実施形態について、図５を参照して説明する。本実施形態のリンパ球の培養方法は、同図に示すように、（１）活性化工程、（２）第一増殖工程、（３）容積拡大工程、及び（４）第二増殖工程を有している。
すなわち、本実施形態のリンパ球の培養方法は、増殖工程の途中に容積拡大工程を有しており、これによって、リンパ球の増殖効率を第一実施形態に比較してさらに向上させることが可能となっている。そこで、本実施形態では、増殖工程を上記（２）〜（４）の３つの工程に細分化して説明する。その他の点については、第一実施形態と同様のものとすることができる。
【００２８】
（１）活性化工程
本実施形態のリンパ球の培養方法における活性化工程では、まず培養容器１０を、仕切り部材５０を用いて仕切ることにより、培養部１０−１と、拡張可能部１０−２とに区分けする。
培養部１０−１は、リンパ球３０及び培養液４０を封入し、リンパ球３０の活性化を行う室である。
拡張可能部１０−２は、リンパ球３０及び培養液４０が封入されていない室であり、リンパ球３０の増殖に伴って培養部１０−１を拡張するための空間として用いられる。
培養部１０−１と拡張可能部１０−２の間を、リンパ球３０及び培養液４０は通過できない。
【００２９】
ここで、一般に、細胞には、培養初期において一定以上の細胞密度がないと増殖しにくいという性質がある。このため、培養部１０−１の容積を、培養初期には小さく、その後に大きくなるように調整することが好ましい。
また、図５では、仕切り部材５０としてクリップを用いて培養容器１０を仕切り、後にこのクリップを外して、培養容器１０内の全体を培養部１０−１とする工程が示されているが、培養容器１０の仕切り方はこれに限定されない。例えば、仕切り部材５０としてローラを用い、培養部１０−１を連続的に変更可能にしてもよく、培養部１０−１を任意の大きさに複数回変更することも可能である。
【００３０】
次に、培養容器１０における培養部１０−１にリンパ球３０と培養液４０を封入し、培養部１０−１における固相化面１１が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を活性化させる。
この活性化工程において、培養部１０−１内のリンパ球３０は、固相化面１１上に固相化された抗ＣＤ３抗体によって活性化される。
【００３１】
（２）第一増殖工程
次に、培養容器１０を反転し、非固相化面１２が底面になるように培養容器１０を配置して、リンパ球３０を増幅させる。
すなわち、培養容器１０を非固相化面１２が底面になるように配置することで、リンパ球３０を培養部１０−１における非固相化面１２側で培養することが可能になり、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖させることができる。このため、リンパ球を単一の容器内で効率的に増殖させることが可能になっている。
【００３２】
（３）容積拡大工程
容積拡大工程は、仕切り部材５０を移動又は除去することにより、培養部１０−１の容積を拡張する工程である。
これによって、培養部１０−１の容積を、増殖したリンパ球３０の細胞数に応じて調整することが可能になる。したがって、リンパ球３０の増殖効率をより一層向上させることが可能となる。
【００３３】
（４）第二増殖工程
第二増殖工程は、培養容器１０における培養部１０−１を拡張した状態で、リンパ球３０の培養を引き続き行う工程である。このとき、培養容器１０は、非固相化面１２が底面になるように配置されたままの状態である。
これによって、リンパ球３０を、固相化面１１に固相化された抗ＣＤ３抗体からの刺激を受けることなく増殖でき、かつ培養部１０−１内におけるリンパ球３０の密度が高すぎることにより、リンパ球３０の増殖効率が低下することを、防止することが可能となる。
なお、仕切り部材５０として複数のクリップやローラを用い、（３）と（４）を複数回繰り返して、培養部１０−１の容積の拡大を段階的に行うことも可能である。
【００３４】
以上説明したように、本発明の実施形態に係るリンパ球の培養方法によれば、本発明の実施形態に係る培養容器１０を用いて、固相化面１１が底面になるように配置してリンパ球３０の活性化を行い、その後、非固相化面１２が底面になるように配置してリンパ球３０の増殖を行うことができる。
このため、リンパ球３０が抗体２０によって過剰刺激を受けることを防止でき、単一の容器内で、リンパ球３０の活性化と増殖を効率的に行うことが可能となっている。
また、培養容器１０における培養部１０−１の容積を、増殖したリンパ球３０の細胞数に応じて調整し、リンパ球３０の増殖効率をより一層向上させることも可能である。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実施形態に係る培養容器、及びリンパ球の培養方法の実施例及び比較例について、図６及び図７を参照して説明する。図６は、実施例及び比較例を表す模式図であり、図７は、実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。なお、図６は、実施例と比較例の相違を示すためものであり、培養部の容積の拡張は省略している。
【００３６】
［実験１：培養容器の製造］
（実施例１）
プラスチック押出成形装置としてラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）を用いて、低密度ポリエチレンを押出成形し、厚み１００μｍのフィルムを成形した。次いで、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製し、このバッグをγ線滅菌して実験に供した。
【００３７】
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。このとき、リン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の片方（固相化面）のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、バッグ内に固相化面を形成し、培養容器を製造した。
なお、この培養容器を２個製造して、一方を固相化濃度の測定に用い、他方をリンパ球の培養試験に供した。これは、その他の実施例及び比較例についても同様である。
【００３８】
固相化濃度の測定は、以下のように行った。
まず、培養容器内の液を除去し、固相化面に１％ドデシル硫酸ナトリウム（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社製）を含むリン酸緩衝液（同上）５００μlを接触させ、３０分間静置させた後、プレゼントミキサー（タイテック株式会社製）にて強い振動を当て、吸着した抗体を剥離した。剥離液中の抗体量をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、固相化面積で割ることで吸着濃度を算出した。
【００３９】
実施例１の培養容器は、その内側の片面のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
実施例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、４０ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４０】
（実施例２）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。その他については、実施例１と同様の処理を行って、実施例２の培養容器を製造した。
【００４１】
実施例２の培養容器は、その内側の片面のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
実施例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、１１ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４２】
（比較例１）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、リン酸緩衝液の液滴をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、比較例１の培養容器を製造した。
【００４３】
比較例１の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
比較例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、容器内面の抗ＣＤ３抗体の濃度は、２５ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４４】
（比較例２）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを続けて封入した。このとき、リン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の片方（固相化面）のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、バッグ内に固相化面を形成した。さらに、リン酸緩衝液１０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、比較例２の培養容器を製造した。
【００４５】
比較例２の培養容器は、その内側の片面のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。
比較例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、固相化面における抗ＣＤ３抗体の濃度は、８ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４６】
［実験２：リンパ球の培養］
（活性化工程）
実験１の実施例１，２及び比較例１，２により得られた培養容器を、クリップを用いて、それぞれ培養部が、５ｃｍ×１１ｃｍとなるように区切った。
次いで、ヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）５．８×１０４個を、１０％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのALyS505N-7培地（株式会社細胞科学研究所製）に懸濁し、４ｍｌを培養容器に封入した。そして、そのまま３７℃で７５時間静置して、リンパ球の活性化工程を行った。
このとき、実施例１、２及び比較例２は、培養容器の固相化面を下にして行った。なお、比較例１の培養容器は、上記の通り、その内側の上下両面に同量の抗ＣＤ３抗体が固相化されており、上下の区別、すなわち、固相化面、非固相化面の区別はない。
【００４７】
（増殖工程）
活性化工程を完了した培養容器に、上記培地を４ｍｌ追加し、培養容器を上下反転して、そのまま３７℃で２６時間静置して、リンパ球の増殖を行った（第二実施形態における第一増殖工程）。
次に、クリップを外して、培養容器の培養部の容積を拡大し（第二実施形態における容積拡大工程）、上記培地を２０ｍｌ追加し、そのまま３７℃で６２時間静置して、リンパ球の増殖を引き続き行った（第二実施形態における第二増殖工程）。
培養開始からの上記各操作の時点（７５時間後、７５＋２６（＝１０１）時間後、７５＋２６＋６２（＝１６３）時間後）、及びクリップを外してから１８時間後（７５＋２６＋１８（＝１１９））に、各培養容器におけるリンパ球の数を計数した。その結果を図７に示す。
【００４８】
図７に示すように、培養容器内の片面のみにそれぞれ４０ｎｇ／ｃｍ２、１１ｎｇ／ｃｍ２の抗ＣＤ３抗体を固相化した実施例１，２では、増殖工程において、リンパ球を顕著に増殖することが可能になっている。このとき、固相化濃度が４０ｎｇ／ｃｍ２の場合（実施例１）と１１ｎｇ／ｃｍ２の場合（実施例２）との間で、増殖効率に大きな差異は見られなかった。
一方、培養容器内の両面に抗ＣＤ３抗体を固相化した比較例１では、実施例１，２と比較して、増殖工程におけるリンパ球の増殖効率が大幅に低くなっていることがわかる。
また、固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度を、実施例２よりもわずかに減らした比較例２では、増殖工程においてリンパ球をほとんど増殖することができていない。このことから、培養容器の固相化面に固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度は、約１０ｎｇ／ｃｍ２以上にすることが好ましいことがわかる。
【００４９】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養容器の大きさ、リンパ球の種類、及び培地を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、単一の培養容器を用いることによって、活性化された細胞の移し替えの煩雑性や、コンタミネーションのリスクを排除しつつ、リンパ球を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００５１】
１０  培養容器
１１  固相化面
１２  非固相化面
１３  チューブ
２０  抗体
３０  リンパ球
４０  培養液
５０  仕切り部材
６０  外装容器
７０  梱包容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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