(57)【要約】【課題】  共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いて単一粒子を個別に検出する走査分子計数法による単一粒子検出技術に於いて、複数種類の特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が混在する試料溶液中にて単一粒子を種類毎に検出できるようにすること。【解決手段】  本発明による試料溶液中の単一粒子を検出する技術は、互いに異なる波長帯域で発光しない複数種類の単一粒子を含む試料溶液内に於ける顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの特定の波長帯域の光を検出して時系列の光強度データを生成し、時系列光強度データに於いて特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下をその単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する。【選択図】図２
2015083922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず前記第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、前記第一の波長帯域に於いて発光し前記第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の低下であり、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、前記光検出部により検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう前記背景光の強度が調節されていることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項２の装置であって、前記背景光の強度が前記試料溶液中に発光粒子を分散することによって調節されていることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数することを特徴とする装置。
【請求項５】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程と
を含み、
前記単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず前記第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、前記第一の波長帯域に於いて発光し前記第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記時系列光強度データに於ける光強度の低下であり、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記時系列光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう前記背景光の強度が調節されていることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、前記背景光の強度が前記試料溶液中に発光粒子を分散することによって調節されていることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順と
をコンピュータに実行させ、
前記単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず前記第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、前記第一の波長帯域に於いて発光し前記第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光強度データに於ける光強度の低下であり、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記光検出領域からの光が前記第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が、前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９のコンピュータプログラムであって、前記検出される光の波長帯域が前記第一の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、前記検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、前記背景光の強度と前記第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう前記背景光の強度が調節されていることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１１】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記背景光の強度が前記試料溶液中に発光粒子を分散することによって調節されていることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な単一粒子検出技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の粒子の存在に依る光強度の変化を計測して単一粒子を検出し、種々の分析を可能にする単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラムに係る。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。
【０００３】
更に、本願出願人は、特許文献９〜１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合、端的に述べれば、試料溶液内に於ける光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）に浮遊する蛍光分子からの光を連続的に計測することにより得られた光強度データに対して統計的な演算処理が実行されて、蛍光分子の濃度及び／又はその他の特性が検出される。これに対し、特許文献９〜１１に於いて提案された新規な光分析技術では、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（発光粒子）を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。この光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）、更に、観測対象となる粒子の濃度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の良好に測定可能なレベル（１ｎＭ程度）よりも低い試料溶液に於いて、発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。かくして、「走査分子計数法」は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行でき、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等を良好に実行できない程度のより低い濃度の粒子の濃度及び／又は特性の検出が可能な強力なツールとして期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【特許文献９】国際公開第２０１１／１０８３６９
【特許文献１０】国際公開第２０１１／１０８３７０
【特許文献１１】国際公開第２０１１／１０８３７１
【特許文献１２】国際公開２０１０−１１９０９８
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【非特許文献４】カスク他３名、米国科学アカデミー紀要  １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.  Kask,  K.  Palo,  D.  Ullmann,  K.  Gall  PNAS  96,  13756-13761  (1999)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の如き発光する単一粒子の光を個別に検出する走査分子計数法に於いては、単一粒子からの光は、微弱であるので、迷光や水のラマン散乱による影響を受けやすい。即ち、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大を発光粒子の信号として識別する分析手法の場合、迷光や水のラマン散乱による光を誤って発光粒子の信号として識別してしまうことがある。また、単一粒子の光を検出する走査分子計数法の場合には、観測対象となる粒子（観測対象粒子）は、発光粒子に限られる。従って、発光しない粒子を観測したい場合には、観測対象となる粒子に発光標識（蛍光標識、りん光標識など）を付与する必要があるところ、観測対象粒子に常に適当な発光標識が付与可能であるとは限らない（発光標識の付与により、観測対象粒子が変性することもあり得る。）。
【０００７】
この点に関し、一般に、顕微鏡の光学系により光計測を行う場合、背景光が高いときには、迷光や水のラマン散乱による影響を受けにくい。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の場合、通常の光学顕微鏡よりも光軸方向の分解能が高いので、発光しない単一粒子がコンフォーカル・ボリュームの内部を通過すると、コンフォーカル・ボリュームからの光強度の低下が観測される（特許文献１２）。そこで、本願出願人は、特願２０１１−１８４６３５に於いて、観測対象粒子を発光しない単一粒子として用い、実質的に一定の背景光を放出する試料溶液内を光検出領域により走査する「走査分子計数法」と同様の要領にて光の検出を行い、発光しない単一粒子が光検出領域内へ包含された際の単一粒子の影を検出して、単一粒子の存在を検出する「反転型走査分子計数法」を提案した。かかる「反転型走査分子計数法」によれば、迷光やラマン散乱光を観測対象粒子の信号として誤検出することはなく、また、低濃度の発光しない単一粒子の検出が可能となる。
【０００８】
ところで、一般に、本発明の観測対象となる粒子は、特定の波長帯域に於いて光を放出するが、別の波長帯域に於いては殆ど光を放出しないという発光波長特性を有している。従って、同一の試料溶液内に於いて複数種類の粒子が混在する場合に、それらの粒子の光を放出しない波長帯域が異なっていれば、「反転型走査分子計数法」に於いて、光検出領域の光の検出波長を、複数の種類の粒子の光の放出のない波長帯域のそれぞれに設定することによって、検出波長に対応して試料溶液内に混在する複数種類の粒子のうちの特定の種類の粒子を別々に検出することが可能となり、種類の識別をしながら、粒子の検出を行えることとなる。
【０００９】
かくして、本発明の主な課題は、同一の試料溶液内に於いて複数種類の粒子が混在する場合に、反転型走査分子計数法の原理を利用して、複数種類のうちの特定の種類の粒子を検出し、或いは、種類の識別をしながら、単一粒子を検出することを可能にする新規な原理による単一粒子検出技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、単一粒子が第一の波長帯域に於いて発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて発光しない第二の単一粒子とを含み、光検出部により検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の低下であり、光検出部により検出される光の波長帯域が前記第二の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置によって達成される。
【００１１】
かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などにして、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。）。「前記光検出領域からの光が前記第一（第二）の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、」とは、検出光の波長帯域が第一（第二）の波長帯域に設定されている場合に、観測対象となる単一粒子が光検出領域内に存在していないときの検出光（即ち、背景光）の強度値が許容誤差の範囲内に収まることを意味している。換言すれば、背景光は、その変動が単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出光の強度の低下幅よりも十分に小さくなるよう調節される。一方、「第一（第二）の波長帯域に於いて実質的に発光」しない単一粒子とは、対応する波長帯域に於ける発光強度が背景光に比して十分に小さい単一粒子を意味する。即ち、かかる単一粒子の発光強度は、殆ど０であることが好ましいが、背景光の強度よりも有意に低いレベルであっても許容されてよい。なお、本明細書に於いて、「単一粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、単一粒子の存在を表す信号を指すものとする。
【００１２】
上記から理解される如く、本発明の装置に於いては、基本的には、「走査分子計数法」と同様に、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。かかる構成に於いて、光検出領域からの光に、検出光の波長帯域の有意な強度の背景光が含まれている場合には、検出光の波長帯域に於いて発光しない単一粒子が光検出領域に進入したときに或いは試料溶液内にて移動する光検出領域が検出光の波長帯域に於いて発光しない単一粒子を包含したときに、単一粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する背景光の光強度又は光量が低下することとなる。一方、検出光の波長帯域に於いて発光する単一粒子は、光検出領域内に存在しても、背景光に紛れて、光強度又は光量の低下が殆ど検出されないこととなる。かくして、本発明の装置では、単一粒子が第一の波長帯域に於いて発光せず第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて発光しない第二の単一粒子とを含む場合に、第一の波長帯域に於いて有意な背景光が放出されるときには、検出光の波長帯域を第一の波長帯域に設定し、かかる背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、第二の波長帯域に於いて有意な背景光が放出されるときには、検出光の波長帯域を第二の波長帯域に設定し、かかる背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する。そして、これにより、試料溶液中の互いに異なる粒子、即ち、第一及び第二の粒子がそれぞれ別々に、即ち、種類毎に検出され、種類毎に粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。即ち、本発明の装置に於いては、特定の波長帯域毎に、一定の背景光が存在する領域に於けるその特定の波長帯域に於いて発光しない単一粒子の影を検出することにより、単一粒子が個別に検出される。
【００１３】
上記の本発明の装置に於いて、光検出領域からの光に含まれているべき背景光としては、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってよい。この場合、試料溶液として使用する溶液中に光を放出又は散乱する物質が分散していない場合には、かかる溶液中に積極的に光を放出又は散乱する物質が溶解又は分散されてよい。また、試料溶液として使用する溶液が自家蛍光を発する場合には、その自家蛍光が上記の背景光として利用されてよい。特に、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光を必要とする場合には、顕微鏡装置に於いて照明光用の光源及び光学系が装備される。一方、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する物質の場合には、顕微鏡装置に於いて照明光は要しない。更に、背景光は、光検出領域内に単一粒子が存在する場合に低減するのであれば、透過照明等による照明光であってもよいことは理解されるべきである。なお、上記の本発明の構成に於いては、単一粒子の存在による背景光の低減を検出するところ、その背景光の低減の度合は、単一粒子の寸法と光検出領域の寸法との関係に依存する。この点に関し、後に詳細に述べる見積によれば、好ましくは、観測対象となる単一粒子の外径は、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好ましくは、単一粒子の外径が光検出領域の直径の３５％以上であることが見出されている。（特願２０１１−１８４６３５参照）
【００１４】
更に、上記の本発明の構成に於いて、或る特定の波長帯域の光の検出に際して、観測対象とならない検出光の波長帯域にて発光する単一粒子は、背景光の強度と略等しい強度を有していることが好ましい。これは、もし観測対象とならない単一粒子の光強度と背景光の強度との差が大きい場合には、光強度データに於いて、観測対象となる単一粒子の信号の検出に影響するためである（検出光の波長帯域にて発光する単一粒子の輝度が過大であると、背景光の値が過大に算定されることとなり、検出光の波長帯域にて発光する単一粒子の輝度が過小であると、観測対象の単一粒子に対応する光強度の低下と区別がしにくくなる）。そこで、上記の本発明に於いては、好適には、光検出部により検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、背景光の強度と第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、光検出部により検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、背景光の強度と第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう背景光の強度が調節される。かかる背景光の調節は、例えば、試料溶液中に発光物質を分散することによって為されてよい。
【００１５】
上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、単一粒子の存在による光強度又は光量の低下の度合が低減することとなるので、単一粒子による光強度又は光量の低下が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
【００１６】
また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が単一粒子の存在位置を通過したときにその単一粒子の存在による背景光の低減を検出して単一粒子を個別に検出する。しかしながら、単一粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの単一粒子から複数回、その存在を信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの単一粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの単一粒子を一つの（単一粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、単一粒子の特性によって変わるので、上記の如く、単一粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
【００１７】
試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける相対的な位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる単一粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
【００１８】
また、上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定されてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、単一粒子の存在を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度の強度を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の高い信号として現れる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、背景光の強度から計って所定閾値を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。
【００１９】
更に、本発明の装置により得られる光強度は、比較的微弱であり、細かい増減が生じ、かかる光強度の細かい増減は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、光強度の細かい増減を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。
【００２０】
上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された単一粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された単一粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された単一粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、単一粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。特に本発明の場合には、同一の試料溶液中に混在する発光しない波長帯域が互いに異なる単一粒子について、それぞれ、別々にカウンティング及び／又は濃度の算定が可能となる。
【００２１】
ところで、粒子のカウンティングの典型的な態様に於いては、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。しかしながら、その場合、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数の変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。そこで、上記の本発明の装置に於いては、粒子のカウンティングの別の態様として、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。即ち、上記の本発明の装置は、信号処理部が検出した単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域移動部による光学系の光検出領域の位置の移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。この場合、単一粒子の高濃度の試料溶液についての測定時間の短縮が期待され、単一粒子の低濃度の試料溶液についての測定は、十分な時間を費やして実行されることとなる。即ち、上記の構成によれば、単一粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。また、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果に於けるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。
【００２２】
上記の本発明の装置に於いて、発光しない波長帯域が互いに異なる単一粒子が混在する試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、第一又は第二の波長帯域に於ける光検出を背景光の存在下にて行い、背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、種類毎に（発光しない波長帯域毎に）単一粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する単一粒子検出技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順とをコンピュータに実行させ、単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度データに於ける光強度の低下であり、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
【００２３】
かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。かかる背景光の強度は、好適には、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、背景光の強度と第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、背景光の強度と第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう、例えば、試料溶液中に発光粒子を分散することなどによって、背景光の強度が調節される。また、単一粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上となる。
【００２４】
また、上記のコンピュータプログラムに於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。
【００２５】
更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
【００２６】
更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する手順及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。なお、上記のコンピュータプログラムの場合にも、粒子のカウンティングの於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記のコンピュータプログラムも、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう手順が構成されていてよい。
【００２７】
上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、発光しない波長帯域が互いに異なる単一粒子が混在する試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、第一又は第二の波長帯域に於ける光検出を背景光の存在下にて行い、背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、種類毎に（発光しない波長帯域毎に）単一粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程とを含み、単一粒子が第一の波長帯域に於いて実質的に発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて実質的に発光しない第二の単一粒子とを含み、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第一の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる時系列光強度データに於ける光強度の低下であり、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、光検出領域からの光が第二の波長帯域の実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる時系列光強度データに於ける光強度の低下であることを特徴とする方法が提供される。
【００２８】
かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。かかる背景光の強度は、好適には、検出される光の波長帯域が第一の波長帯域であるときには、背景光の強度と第二の単一粒子からの光強度とが実質的に等しく、検出される光の波長帯域が第二の波長帯域であるときには、背景光の強度と第一の単一粒子からの光強度とが実質的に等しくなるよう、例えば、試料溶液中に発光粒子を分散することなどによって、背景光の強度が調節される。また、単一粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上となる。
【００２９】
また、上記の方法に於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。
【００３０】
更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
【００３１】
更に、上記の方法に於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する過程及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。なお、上記の方法の場合にも、粒子のカウンティングの於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記の方法も、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。
【００３２】
上記の本発明の単一粒子検出技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００３３】
端的に述べれば、本発明の単一粒子検出技術は、溶液中に分散した発光しない単一粒子の検出を行う反転型走査分子計数法に於いて、単一粒子をその種類を識別しながら個別に検出することを可能にする。本発明の構成によれば、走査分子計数法と同様に、観測対象の単一粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能であるという利点、反転型走査分子計数法の迷光やラマン散乱光を観測対象粒子の信号として誤検出することが無くなるという利点を有するとともに、一つの溶液中に複数の種類の単一粒子が存在する場合でも、それらの複数の種類の単一粒子の発光しない波長帯域が異なっていれば、別々に検出可能となる点で有利である。波長帯域の選択は、予備実験等の結果を参考になされてよい。
【００３４】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による反転型走査分子計数法を実行する単一粒子検出装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明に於ける反転型走査分子計数法に於ける検出光波長帯域で発光しない単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）〜（Ｅ）は、発光しない波長帯域の異なる２種類の粒子が混在する溶液に於いて、検出光波長帯域の背景光を与えた場合の粒子の見え方を説明する図である。
【図３】図３は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の一つの態様をフローチャートの形式で表した図である。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、反転型走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図５】図５は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の別の態様をフローチャートの形式で表した図である。
【図６】図６は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の更に別の態様をフローチャートの形式で表した図である。
【図７】図７は、蛍光ビーズの蛍光画像である。（Ａ）は、ビーズが発光する波長帯域を検出光波長帯域に設定した場合であり、（Ｂ）は、ビーズが発光しない波長帯域を検出光波長帯域に設定した場合である。
【図８】図８は、ビーズを含まない溶液（ビーズなし）、無蛍光ビーズを含む溶液１（無蛍光ビーズ）、蛍光ビーズを含む溶液２（蛍光ビーズ）について、本発明による反転型走査分子計数法に従って検出されたパルス数の平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）とを示している。
【符号の説明】
【００３６】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３８】
単一粒子検出装置の構成
本発明による単一粒子検出技術を実現する単一粒子検出装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、単一粒子検出装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。単一粒子検出装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。なお、本発明の装置に於いては、複数の波長帯域の背景光の検出が行われるところ、背景光を発生させるための励起光の波長が選択できるように、図示の如く、光源２に於いて複数の発光源（レーザー）が設けられていてよい。測定の態様によって、波長が異なる励起光が同時に複数の発光源から出射され、対物レンズ８へ導入されるようになっていてもよい。
【００３９】
対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。なお、試料溶液中には、典型的には、観測対象物である検出波長帯域にて発光しない粒子と、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されており、検出波長帯域にて発光しない粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、検出波長帯域にて発光しない粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。
【００４０】
かくして、励起領域から放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて単一粒子検出のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。
【００４１】
ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａに於いて、一部の波長帯域の光が反射し、残りの波長帯域の光が透過する態様にて波長帯域により分割され、分割された光の各成分は、それぞれ、対応するバリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。また、本発明では、数分子程度の蛍光色素分子からの微弱光からなる背景光に於ける単一粒子の存在による光量の低下を検出するので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００４２】
更に、上記の単一粒子検出装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。また、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式と試料溶液の絶対的な位置を移動する方式とを組み合わせて、試料溶液の位置を動かしつつ、光検出領域の絶対的な位置の移動が実行されてよい。この場合、短時間のうちの光検出領域が同一の領域を通過することにより同一の単一粒子を繰り返し検出することが回避される。或いは、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式により、意図的に光検出領域に同一の領域を繰り返し通過させ、同一の単一粒子を複数回に亘って周期的に検出し、信号の精度の向上が図られてもよい。この場合、光検出領域の絶対的な位置の移動を所定時間に亘って実行した後に、試料溶液の位置が間歇的に移動して、試料溶液内の別の場所にて、同一の単一粒子の繰り返し検出を実行し、検出される単一粒子の数の増大が図られてよい。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されて、光検出領域の位置の軌跡が、試料溶液内にて三次元的に展開されるようになっていてもよい。
【００４３】
背景光を生成する発光物質が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、背景光を生成する発光物質が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。背景光を生成する発光物質がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、背景光は、照明光により与えられてもよい。その場合、対物レンズの上方から透過照明（ケーラー照明であってよい。）により試料溶液が照明される。
【００４４】
本発明の単一粒子検出技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の単一粒子検出技術に於いては、端的に述べれば、特定の波長帯域に於ける単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法（以下、「反転型走査分子計数法」と称する。）にて、即ち、特定の波長帯域に於ける背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、その特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出される。そして、複数の互いに異なる波長帯域に於ける光の検出を行うことにより、複数種類の単一粒子の存在を種類毎に検出し、それらの粒子の計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。以下、本発明による反転型走査分子計数法の原理について説明する。
【００４５】
１.反転型走査分子計数法の原理
特許文献９〜１１に記載されている「走査分子計数法」では、端的に述べれば、上記の如き単一粒子検出装置に於いて、発光粒子が分散された試料溶液内にて光検出領域の位置をしながら、光強度の測定が実行される。そして、光検出領域が発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出部に到達することにより、光強度の測定値の増大が生ずるので、かかる光強度値の増大を検出して、一つの発光粒子の存在が個別に検出されることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、従前のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００４６】
上記の通常の「走査分子計数法」の場合には、観測対象となる粒子は、発光粒子であり、検出光の波長帯域に於いて発光しない粒子を検出することができない。従って、発光しない粒子を観測対象とする場合には、かかる粒子に蛍光標識等の発光標識を付与する必要がある。しかしながら、粒子によっては、発光標識の付与が困難であったり、発光標識の付与に起因して粒子の変性が起き得る。また、粒子の放出する光をその粒子の存在を表す信号として識別する形式の場合、迷光や散乱光或いは光検出器の電気的ノイズにより、光強度データ上の値の増大が生じたときに、その値の増大を誤って発光粒子の信号として識別してしまう場合が在り得る。
【００４７】
そこで、本発明の「反転型走査分子計数法」は、上記の走査分子計数法による光計測に於いて、光検出領域から背景光を放出させ（或いは、光検出領域を照明光にて照明し）、観測対象となる粒子が光検出領域に進入した際に、検出される背景光が低下することを捉えて、単一粒子の検出が為される。具体的には、通常の走査分子計数法と同様に、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。既に触れたように、試料溶液中には発光物質が分散され、光検出領域ＣＶ内には、多数の発光物質が存在しているので、光検出領域ＣＶの移動中（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）、基本的には、それらの発光物質からの光が略一様に検出される。しかしながら、光検出領域ＣＶが移動する間に於いて１つの発光しない粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光物質の存在領域の体積が低減するので、発光物質の放出する光の総量が低減し、図２（Ｂ）に描かれている如く、時系列の光強度データ上に、釣鐘型のパルス状の有意な光強度（Ｅｍ）の低下が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の有意な光強度の低下、即ち、単一粒子の存在を表す信号を一つずつ検出することによって、単一粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する単一粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。
【００４８】
上記の光強度の低下の度合は、発光しない単一粒子の径と光検出領域の径との関係から概算することが可能である。典型的には、光検出領域内の光強度分布は、中心にて最大強度Ｉｍａｘを有し、半径ｒ方向に向かって低減する釣鐘型のプロファイルｆ（ｒ）を有している。従って、ｆ（ｒ）が略０になる光検出領域の半径ａを用いて、光検出領域内に発光しない粒子が存在していないときの光検出領域内から放出される光の総量αは、
α＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ  ［積分区間は、０〜ａ］      …（１）
にて与えられる。一方、光検出領域内に、半径ｂの発光しない単一粒子が進入し、光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなるので、排除された発光物質に相当する光量が低減することとなる。その排除された発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、
β＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ  ［積分区間は、０〜ｂ］      …（２）
にて与えられる。かくして、光強度の低下の割合は、β／αにより概算することが可能となる。ここで、ｆ（ｒ）がガウス関数であり、α＝１、ａ＝１となるとき、
ｆ（ｒ）＝０．６８４ｅｘｐ（−２ｒ２）      …（３）
となる。典型的には、背景光の変動率が１％程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が１％以下であると、信号の検出が不可能となるので、上記の式にて演算すると、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．１５以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を１０％以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．３５となる。なお、観測されるべき単一粒子が消光剤や蛍光エネルギー移動のアクセプタである場合、単一粒子が周囲（例えば、１０ｎｍ）の光を吸収するので、検出可能な単一粒子半径は、上記に例示の半径よりも低減し得る。
【００４９】
２．複数波長帯域での光測定を行う反転型走査分子計数法
「発明の概要」の欄に於いて触れた如く、本発明で観測対象となる粒子は、通常、光を放出する波長帯域（発光波長帯域）と実質的に光を放出しない波長帯域（非発光波長帯域）とを有しており、発光波長帯域と非発光波長帯域とは、粒子の種類によって互いに異なり、また、そのように粒子を調製することが可能である。そして、上記の如き反転型走査分子計数法に於いて、検出光の波長帯域、即ち、背景光の波長帯域を粒子の非発光波長帯域内に設定すれば、その粒子の影が形成され、粒子の存在が検出可能となる。一方、検出光の波長帯域に発光波長帯域を有する粒子の放出する光は、背景光と区別がつかず、かかる粒子は検出されない。即ち、図２（Ｃ）の如く、第一の波長帯域にて発光する粒子ａと第二の波長帯域にて発光する粒子ｂが存在している場合、図２（Ｄ）の如く、第一の波長帯域の背景光が検出される状態下では、粒子ａが発光するので、背景光の低下は生ぜず、粒子ａは検出されないが、粒子ｂは発光しないので、背景光の低下が生じ、これにより、その存在が検出されることとなる。一方、図２（Ｅ）の如く、第二の波長帯域の背景光が検出される状態下では、粒子ｂが発光するので、背景光の低下は生ぜず、粒子ｂは検出されないが、粒子ａは発光しないので、背景光の低下が生じ、これにより、その存在が検出されることとなる。
【００５０】
かくして、本発明に於いては、複数の波長帯域にて光検出を行い、波長帯域毎に背景光の低下を検出することによって、検出される波長帯域にて非発光波長帯域を有する単一粒子が検出される。既に述べた如く、非発光波長帯域は、粒子の種類によって異なるので、これにより、同一の試料溶液内に複数種類の粒子が混在する場合に、それらの非発光波長帯域が異なっていれば、種類を識別しながら、単一粒子の検出が可能となる。
【００５１】
反転型走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の単一粒子検出装置１を用いた本発明に従った反転型走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）単一粒子と背景光を生成する発光物質とを含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
【００５２】
（１）試料溶液の調製
本発明の単一粒子検出技術の観測対象物となる粒子は、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であって、粒径が光検出領域の径の好適には１５％以上、より好適には、３５％以上であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）などであってよい。また、背景光を与える発光物質としては、任意の発光分子、例えば、蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子であってよく、発光物質は、光検出領域内に常に数分子以上存在する濃度にて試料溶液中に溶解又は分散される。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。
【００５３】
また、特に、本発明の単一粒子検出技術に於いては、既に触れた如く、観測対象となる単一粒子の非発光波長帯域と特定の発光波長帯域とに於いて背景光が与えられるように試料の調製が行われる。例えば、試料溶液中に、第一の波長帯域に於いて発光せず第一の波長帯域とは異なる第二の波長帯域に於いて発光する第一の単一粒子と、第一の波長帯域に於いて発光し第二の波長帯域に於いて発光しない第二の単一粒子とが含まれる場合、第一の波長帯域に於いて背景光を与える発光物質と第二の波長帯域に於いて背景光を与える発光物質とが分散されてよい。この点に関し、粒子の発光波長帯域に於いて光の検出を行う場合、背景光の輝度と粒子の発光輝度とが完全に一致すること、粒子内の発光輝度が一様であり、また、複数の粒子間で輝度ムラがないことが理想であるが、必ずしもそのように粒子の輝度と背景光輝度とを調整する必要はなく、多少の輝度ムラや背景光の低下の度合のずれがあっても、解析上識別できれば十分である。例えば、例えば、無蛍光のコアに蛍光を示す外殻を持つような粒子、蛍光性物質が無蛍光の殻に覆われた粒子などであってもよい。背景光と粒子の輝度差については、背景光のＣＶ以下の輝度差であることが理想である。典型的な背景光のＣＶ値は１０％であるため、発光する粒子と背景光の輝度差が１０％以下となっていることが望ましく、好適には、試料溶液は、かかる状態が達成されるよう調製される。背景光は、蛍光、自家蛍光、散乱（ラマン散乱（溶媒（水）二硫化炭素、イソプレン、遷移金属錯体）、発光物質による光であってよく、或いは、均一光源による照明光であってもよい。
【００５４】
（２）試料溶液の光強度の測定（図３−ステップ１００）
本実施形態の反転型走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、本実施形態に於いては、複数の光検出器１６の各々が、互いに異なる波長帯域の光を検出し、検出された互いに異なる波長帯域毎に時系列光強度データが生成される。互いに異なる波長帯域の光の測定は、同時に行われてもよいし、同時に行われなくてもよい。また、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００５５】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された単一粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５６】
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの単一粒子の個別の検出、或いは、単一粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、単一粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の単一粒子検出技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の単一粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の単一粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（単一粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布を反転したプロファイルと略同様となる。）、個々の粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００５７】
具体的には、拡散係数Ｄを有する粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ      …（４）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ      …（５）
となるので、粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ      …（６）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００５８】
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
【００５９】
（ｉ）単一粒子信号の個別検出
時系列の光強度データに於いて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する（図４（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ｉｂｇから下に凸のガウス分布：
Ｉ＝Ｉｂｇ−Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（７）
であると仮定できるときには、有意な光強度の低下のプロファイル（背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（７）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００６０】
時系列光強度データからの単一粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光物質の発する光は確率的に放出されるものであり、また、その光強度は、比較的微弱であるので、細かい増減が生じるところ、かかる光強度の細かい増減（ゆらぎ）は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。スムージング処理は、かかるデータ上の細かい増減を無視できるようにすることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法（例えば、隣接平均法、サビンスキー-ゴレイ(Savinsky-golay)法のアルゴリズム）、パーセンタイルフィルタ法、ＦＦＴフィルタ法により為されてよい。スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。例えば、移動平均法等により為されてよい。
【００６１】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００６２】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が単一粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、下に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピークの強度（背景光からの最大低下量）Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの単一粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度（式（７）のＡ、背景光の低下分の最大値）、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、
下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞４．０［ｐｃ／１０μｓ］        …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
【００６３】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。特に、本実施形態に於いては、互いに異なる波長帯域の時系列光強度データの各々について、上記のステップ１１０〜１７０が実行され、それぞれの波長帯域についての粒子に対応するパルス信号の数が計数されてよい。なお、時系列光強度データから単一粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００６４】
（ii）粒子濃度の決定
更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい（粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
【００６５】
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の単一粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（８）
により与えられる。また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（９）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００６６】
かくして、光検出領域により試料溶液中にて走査して粒子を個別に検出する反転型走査分子計数法に於いて、上記の処理手順により、試料溶液中の粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。特に、本発明の場合に於いては、検出波長帯域毎に、粒子のカウンティングが為され、単一粒子濃度が決定され、これにより、粒子の種類毎の濃度の決定が可能となる。
【００６７】
（４）一定の信号数を検出する単一粒子検出処理
上記の単一粒子検出処理に於いては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。そこで、単一粒子検出処理の別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、粒子濃度）に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。なお、かかる構成に於いても、本発明の場合には、光計測から粒子濃度の算定までが、複数の検出波長毎に実行される。
【００６８】
（ｉ）基本原理
粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Ｃの試料溶液中に於いて、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される粒子信号の数Ｘは、
Ｘ＝ＣＳｕτＮＡ      …（１０）
となる。ここで、ＮＡは、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮＡ）      …（１１）
により、時間Ｔの関数として与えられる。なお、式（１１）に於いて、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと粒子検出数ＸＥとに基づいて
Ｖ＝ＸＥ／Ｔ      …（１２）
により与えられるので、粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮＡ）…（１３）
と表される。この式（１３）に於いては、粒子濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、粒子濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、粒子濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてもよい。
【００６９】
（ii）処理操作手順
一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図５のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（単一粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
【００７０】
（ａ）初期設定
図５を参照して、操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１に於ける処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
【００７１】
（ｂ）粒子数の検出
上記の如く終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数ｘの検出（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された粒子数ｘを累積して粒子の総数Ｘ（ｔｎ）を算定する処理（ステップ４０）とが粒子の総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップ５０）、反復して実行される。なお、ステップ３０〜５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップ２５）。
【００７２】
ステップ３０に於ける光検出・粒子数検出の処理は、図３に示した処理と同様であってよい。端的に述べれば、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為され、しかる後、得られた解析時間間隔ｔに於ける時系列光強度データに於いて、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の存在を表す信号の検出及び検出数のカウンティングが実行される。
【００７３】
かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データに於ける粒子数ｘが検出されると、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が
Ｘ（ｔｎ）＝Ｘ（ｔｎ−１）＋ｘ      …（１４）
により算出される（図５−ステップ４０）。なお、Ｘ（ｔｎ−１）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップ３０〜４０は、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、
Ｘ（ｔｎ）≧ＸＥ      …（１５）
が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。そして、ステップ３０〜５０を反復しているうちに、式（１５）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ３０〜５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップ６０）。
【００７４】
（ｃ）粒子数と測定終了時間の表示
ところで、解析時間間隔ｔ毎にステップ３０〜５０の反復実行期間に於いて（式（１５）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
【００７５】
上記の如き表示を実行する場合には、図５のステップ５０の判定に於いて、式（１５）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップ４０に於いて算定された最新の粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が表示器上に表示される（ステップ５２）。なお、既にステップ３０〜５０の反復実行が為されている場合には、それまでの粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップ３０〜５０の処理の開始後からの粒子の検出速度ｖが算出される（ステップ５４）。現在までの粒子の検出速度ｖは、
ｖ＝Ｘ（ｔｎ）／（Ｔｐ−Ｔｓ）      …（１６）
により与えられてよい。ここで、Ｔｐは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップ３０〜５０の処理終了までの時間）が、
Ｔｒ＝（ＸＥ−Ｘ（ｔｎ））／ｖ      …（１７）
により推定され、また、測定終了時間ＴＥ（ステップ３０〜５０の処理が終了する時間）が、
ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ      …（１８）
により推定される（ステップ５６）。そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップ５８）。なお、既にステップ３０〜５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、式（１７）又は（１８）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。
【００７６】
上記の図５のステップ３０〜５０の処理は、既に述べた如く、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図３のステップ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、光検出・粒子数検出の処理に於いては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの粒子の信号の検出・計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに粒子の検出・計数が達成されることとなる。
【００７７】
（ｄ）濃度算出等の分析
かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ−Ｔｓ）或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップ７０）。粒子濃度は、既に述べた如く、式（１２）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（１３）の関係を用いて決定される。
【００７８】
なお、式（１０）〜（１３）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出・計数を行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の単一粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定に於ける粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ・ｕｏ・τｏ）      …（１９）
により与えられる。また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。
【００７９】
（ｅ）試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の修正例
上記の試料溶液の光強度の測定と単一粒子の検出・計数の処理に於いて、別の態様として、解析時間間隔ｔは、固定値ではなく、単一粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図６（Ａ）は、解析時間間隔ｔを粒子の検出状況に応じて修正する処理（ステップ２０’）を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図６（Ｂ）は、ステップ２０’に於ける解析時間間隔ｔの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図６（Ａ）に於いて、図５と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
【００８０】
同図を参照して、図６の処理では、解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了する毎に解析時間間隔ｔが修正される（ステップ２０’）。また、図示の例の処理は、特に、開始から粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまでの一回の測定に於いて、予め定められた回数Ｎ（以下、「更新予定回数」と称する。）だけ、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルが実行されるよう構成される。具体的には、まず、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び開始時間Ｔｓの記憶（ステップ２５）の後、最初に光強度の測定と粒子の検出・計数の処理を実行する際、即ち、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルの実行回数ｋが０のとき、解析時間間隔ｔに、任意に設定されてよい初期値ｔｏが与えられる（図６（Ｂ）ステップ２００、２１０参照）。そして、処理サイクルの実行回数ｋが１増大され（ステップ２７０）、図５に記載の処理と同様に解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定及び粒子の検出・計数の処理が実行される（ステップ３０〜５０）。かくして、最初のサイクルの粒子数ｘ（＝Ｘ（ｔ１））が得られると、粒子検出速度ｖ（ステップ５４）、測定残り時間Ｔｒ（ステップ５６）が順に算定される。なお、図５の場合と同様に、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい（ステップ５２、５８）。また、最初の処理サイクルで粒子数が終了粒子数ＸＥに到達していたときには、そのまま、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理が終了する（ステップ５０）。
【００８１】
最初の処理サイクルの後、解析時間間隔ｔの修正と、図５の場合と同様の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクル（ステップ２０’、３０〜５８）が、粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまで反復される。その際、解析時間間隔ｔの修正を行うステップ２０’に於いては、まず、そのときまでに検出されている粒子数Ｘ（ｔｎ）が０であるか否かが判定される（ステップ２２０）。Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、直前のサイクルに於ける解析時間間隔ｔがｍ倍されてよい（ｍは、１以上の正数）。Ｘ（ｔｎ）＞０であるときには、測定残り時間Ｔｒと更新予定回数Ｎと処理サイクルの実行回数ｋとを用いて、解析時間間隔ｔが、
ｔ＝Ｔｒ／（Ｎ−ｋ）      …（２０）
により算定される（ステップ２４０）。なお、算定される解析時間間隔ｔには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔ｔが下限値ｔｍｉｎを下回るときには、解析時間間隔ｔは、下限値ｔｍｉｎに設定されてよい（ステップ２５０、２６０）。上記の如く、解析時間間隔ｔが修正される態様によれば、測定残り時間Ｔｒには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔ｔがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。
【００８２】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００８３】
反転型走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データに於いて、発光しない単一粒子の存在を表す信号が検出可能であることを共焦点蛍光顕微鏡像により検証した。
【００８４】
試料溶液として、２００μＭの蛍光色素ＡＴＴＯ４８８と５０μＭの蛍光色素ＡＴＴＯ６３３と１０ｆＭの蛍光ビーズ（FP-4052-2:spherotec(Ｄ:4000nm)）とを含む２０％ポリエチレングリコール溶液を調製した。かかる試料溶液を共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス社）を用いて観察し、共焦点蛍光顕微鏡像を得た。測定は、励起光４７３ｎｍ（１２０μＷ）と励起光６３５ｎｍ（４７μＷ）を用いて行った。用いられた蛍光ビーズは、励起光４７３ｎｍにて照明すると発光し、励起光６３５ｎｍにて照明したときには、殆ど発光しない粒子である。ＡＴＴＯ４８８とＡＴＴＯ６３３とは、それぞれ、励起光４７３ｎｍと励起光６３５ｎｍとにて蛍光観察する際の背景光を放出するための発光物質である。
【００８５】
図７は、（Ａ）励起光４７３ｎｍにて、及び、（Ｂ）励起光６３５ｎｍにて、それぞれ観察された共焦点蛍光顕微鏡像を示している。図から理解される如く、（Ａ）励起光４７３ｎｍの場合には、ビーズの影は殆ど検出されなかったのに対し、（Ｂ）励起光６３５ｎｍの場合には、各ビーズの影が観察された。このことは、本発明の如く、特定の波長帯域で発光し別の波長帯域で殆ど発光しない粒子の存在がその粒子の非発光波長帯域の背景光の存在下に於いては検出可能であり、発光波長帯域の背景光の存在下に於いて検出されないことを示している。
【実施例２】
【００８６】
反転型走査分子計数法に従って、ビーズを含む試料溶液中に於いて、ビーズの計数を行った。試料溶液として、０．５μＭの蛍光色素ＡＴＴＯ４８８を含む２０％ポリエチレングリコール溶液に１０ｆＭにて非蛍光ビーズ（CP-40-10: spherotec(Ｄ:4000nm)）を分散させた溶液１及び１０ｆＭにて蛍光ビーズ（FP-4052-2:spherotec(Ｄ:4000nm)）を分散させた溶液２とを調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の二つの試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、５０μＷの４８８ｎｍのレーザー光を用い、光学フィルター（６１５ＬＰと６７０ＢＰ）により、６５０−６９０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、９０００ｒｐｍ（６７．５ｍｍ／秒）とし、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを５０μ秒とし、１００秒間の測定を各溶液について３回ずつ行った。なお、上記の条件に於いては、溶液２中のビーズは蛍光を発するので、光強度の低下が生じ難い状態である。
【００８７】
光計測後のデータ処理に於いては、まず、取得された時系列フォトンカウントデータに於いて、「（ｉ）単一粒子の信号の個別検出」及び図３のステップ１１０〜１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウントデータにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度（背景光からの低下量の最大値）、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度≧背景光の平均値の２０％        …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを単一粒子の信号として抽出した。
【００８８】
図８は、ビーズを含まない溶液、無蛍光ビーズを含む溶液１、蛍光ビーズを含む溶液２について、上記の手順にて、時系列フォトンカウントデータに於いて検出されたパルスの数を示している。同図を参照して、無蛍光ビーズを含む溶液１に於いては、パルス数が２７００個程度検出されたのに対し、蛍光ビーズを含む溶液２に於いては、パルス数が大幅に減少した。これは、蛍光ビーズの発する光によって、背景光からの光強度の低下が生じ難くなったためであることを示唆している。かかる結果は、背景光と同様の光を発するか否かで、試料溶液中の特定の種類の粒子の検出が可能であることを示している。（蛍光ビーズを含む溶液２に於いて、パルス数が検出された理由は、蛍光ビーズの発光輝度にばらつきが存在するためであると考えられる。即ち、蛍光ビーズとされるビーズ中に於いて、発光輝度の弱いものが含まれていたためである。）
【００８９】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従った複数波長帯域に於ける反転型走査分子計数法によれば、試料溶液中に分散された発光波長帯域と非発光波長帯域とが互いに異なる単一粒子の検出及びその濃度に関する情報の取得が粒子の種類毎に可能となる。特に、本発明は、単一粒子の信号を個別に検出するので、試料溶液中の粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図７】
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