(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪酸結合タンパク質１（ＦＡＢＰ１）の発現又は作用を抑制し、脂肪肝の予防又は改善剤として有用な医薬、医薬外部品又は食品の提供。【解決手段】ＦＡＢＰ１の発現又は作用を抑制する化合物として、（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される化合物及びその化合物を含む脂肪肝の予防又は改善薬として有用な医薬、医薬外部品又は食品。（ａ）ＦＡＢＰ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、（ｂ）ＦＡＢＰ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを細胞内で生成する核酸コンストラクト、（ｃ）ＦＡＢＰ１遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸、（ｄ）ＦＡＢＰ１遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸結合タンパク質１（FABP1）の発現又は作用を抑制する化合物を有効成分とする脂肪肝の予防・改善剤。
【請求項２】
前記化合物が以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の予防・改善剤：
(a)FABP1遺伝子を標的とするsiRNA；
(b)FABP1遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト；
(c)FABP1遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸；
(d)FABP1遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム。
【請求項３】
siRNAが配列番号３又は４の配列を有する、請求項２に記載の予防・改善剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの予防・改善剤を含む、医薬、医薬部外品又は食品。
【請求項５】
FABP1の発現又は作用を抑制する作用を被験物質が示すか否かを調べることを特徴とする、脂肪肝の予防・改善剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
以下のステップ（１）〜（３）を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法：
（１）FABP1に対して、被験物質の存在下、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブを接触させるステップ；
（２）FABP1に対する前記プローブの結合を検出するステップ；及び
（３）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1と前記プローブの結合の低下が有効性の指標となるステップ。
【請求項７】
被験物質非存在下であること以外はステップ（１）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（３）における有効性の判定を行う、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法：
（ｉ）FABP1と、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブとの複合体に対して被験物質を接触させるステップ；
（ｉｉ）FABP1に対する前記プローブの結合を検出するステップ；及び
（ｉｉｉ）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1と前記プローブの結合の低下が有効性の指標となるステップ。
【請求項９】
被験物質非存在下であること以外はステップ（ｉ）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（ｉｉｉ）における有効性の判定を行う、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下のステップ（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法：
（Ｉ）FABP1遺伝子のプロモーター領域と該プロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む核酸コンストラクトが導入された細胞に被験物質を接触させるステップ；
（ＩＩ）レポーター遺伝子の発現を検出するステップ；及び
（ＩＩＩ)検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、レポーター遺伝子の発現の低下が有効性の指標となるステップ。
【請求項１１】
被験物質非存在下であること以外はステップ（Ｉ）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（ＩＩＩ）における有効性の判定を行う、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
以下のステップ（Ａ）〜（Ｃ）を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法：
（Ａ）FABP1が発現している細胞を被験物質の存在下で培養するステップ；
（Ｂ）前記細胞におけるFABP1の発現レベルを検出するステップ；及び
（Ｃ）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1の発現レベルの低下が有効性の指標となるステップ。
【請求項１３】
被験物質非存在下であること以外はステップ（Ａ）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（Ｃ）における有効性の判定を行う、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂肪肝の予防又は改善に関する。詳しくは、脂肪肝の予防又は改善に有効な薬剤、並びに脂肪肝の予防・改善剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メタボリックシンドロームの増加とともに、肝臓に中性脂肪が蓄積する脂肪肝も増加してきている。脂肪肝は進行すると肝硬変、肝臓がんへと進行することや、近年ではメタボリックシンドロームの増悪化に関与することが明らかとなり、治療のターゲットとすべき病態となっている。非アルコール性の脂肪肝は重篤な病変に進行しないと従来は考えられてきた。しかし、近年、非アルコール性の脂肪肝はNASHという病態を経て、肝硬変や肝癌へと進行することが明らかとなり、対策が望まれている。
【０００３】
全国の人間ドックの集計でも脂肪肝は受診者の約30%に認められ。２０年前の３倍近くにまで増加している。今後、診断法の確立により、罹患者はさらに増加すると考えられる。
【０００４】
現在、脂肪肝そのものを改善する薬は存在せず、改善方法としては、食事療法や運動療法が基本となっている。また、病状に応じて抗酸化剤、糖尿病治療薬、脂質異常症治療薬などが併用されている。
【０００５】
尚、脂肪肝を標的とした新たな薬剤が提案ないし報告されている（例えば特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１０５９４８号公報
【特許文献２】特開２０１２−２０１６２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
脂肪肝に対する現在の治療法には、治療の成否が患者の意思に依存すること、病院施設によって治療指針が異なり、徹底することが難しいこと、治療効果が表れるまでに時間がかかること、仕事や環境などの関係で長期にわたって実施しにくい場合があること等、解決すべき点が多く、新たな治療法へのニーズは高い。そこで本発明は、脂肪肝の予防又は改善に有効な手段を提供することを主たる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題に鑑み検討を進める中で骨格筋型の脂肪酸結合蛋白質（FABP）であるFABP3をマウス肝臓で発現させると脂肪肝になるということを発見し、FABPが肝臓の脂肪蓄積に重要な役割を演じているのではないかとの着想を得た。FABPは14〜15KDaの小型の細胞内タンパク質であり、脂質の輸送に重要な役割を果たしている。ヒトでは組織特異的に9種類のFABPがある。
【０００９】
上記着想に基づき、FABPの脂肪肝への関与を詳細に調べることにした。まず、肝臓特異的な発現を示すFABP1をマウス肝臓で強制発現させたところ、脂肪肝が誘導され、肝臓重量及び中性脂肪量の増加が認められた。この結果を受け、肝臓でのFABP1の発現又は機能を制限すれば脂肪肝を改善できると期待された。即ち、FABP1の発現又は機能の抑制が脂肪肝の予防ないし改善に有効であるとの着想を得た。FABP1の発現又は機能の抑制という戦略の有効性を検証するため、RNAiを利用した動物実験を行った。その結果、FABP1の機能抑制によって脂肪肝が著しく改善し、肝臓重量及び中性脂肪の低下をもたらすという、期待を超える効果が認められ、上記戦略が有効であることが確認された。FABP1の発現又は機能の抑制による脂肪肝の予防又は改善には、(i)従来技術のように治療法が患者の意思・生活に左右されないこと、(ii)従来技術と比較して、強力な脂肪肝治療効果が期待できること、(iii)従来技術では数カ月を要するのに対して、短期間での効果が期待されること、(iv)FABPは組織特異的な発現を示すため、FABP1に特異的な阻害剤は他臓器に与える影響が少ないと考えられること、(v)FABPは分子的に最下層にあるため、機能抑制による副作用が少ないと考えられること、等の利点がある。
以下に示す発明は、主として以上の成果ないし知見に基づく。
［１］脂肪酸結合タンパク質１（FABP1）の発現又は作用を抑制する化合物を有効成分とする脂肪肝の予防・改善剤。
［２］前記化合物が以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、［１］に記載の予防・改善剤：
(a)FABP1遺伝子を標的とするsiRNA；
(b)FABP1遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト；
(c)FABP1遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸；
(d)FABP1遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム。
［３］siRNAが配列番号３又は４の配列を有する、［２］に記載の予防・改善剤。
［４］［１］〜［３］のいずれかの予防・改善剤を含む、医薬、医薬部外品又は食品。
［５］FABP1の発現又は作用を抑制する作用を被験物質が示すか否かを調べることを特徴とする、脂肪肝の予防・改善剤のスクリーニング方法。
［６］以下のステップ（１）〜（３）を含む、［５］に記載のスクリーニング方法：
（１）FABP1に対して、被験物質の存在下、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブを接触させるステップ；
（２）FABP1に対する前記プローブの結合を検出するステップ；及び
（３）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1と前記プローブの結合の低下が有効性の指標となるステップ。
［７］被験物質非存在下であること以外はステップ（１）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（３）における有効性の判定を行う、［６］に記載のスクリーニング方法。
［８］以下のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、［５］に記載のスクリーニング方法：
（ｉ）FABP1と、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブとの複合体に対して被験物質を接触させるステップ；
（ｉｉ）FABP1に対する前記プローブの結合を検出するステップ；及び
（ｉｉｉ）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1と前記プローブの結合の低下が有効性の指標となるステップ。
［９］被験物質非存在下であること以外はステップ（ｉ）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（ｉｉｉ）における有効性の判定を行う、［８］に記載のスクリーニング方法。
［１０］以下のステップ（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を含む、［５］に記載のスクリーニング方法：
（Ｉ）FABP1遺伝子のプロモーター領域と該プロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む核酸コンストラクトが導入された細胞に被験物質を接触させるステップ；
（ＩＩ）レポーター遺伝子の発現を検出するステップ；及び
（ＩＩＩ)検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、レポーター遺伝子の発現の低下が有効性の指標となるステップ。
［１１］被験物質非存在下であること以外はステップ（Ｉ）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（ＩＩＩ）における有効性の判定を行う、［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］以下のステップ（Ａ）〜（Ｃ）を含む、［５］に記載のスクリーニング方法：
（Ａ）FABP1が発現している細胞を被験物質の存在下で培養するステップ；
（Ｂ）前記細胞におけるFABP1の発現レベルを検出するステップ；及び
（Ｃ）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1の発現レベルの低下が有効性の指標となるステップ。
［１３］被験物質非存在下であること以外はステップ（Ａ）と同一の条件下で操作したもの（コントロール群）を用意し、該コントロール群における検出結果と比較してステップ（Ｃ）における有効性の判定を行う、［１２］に記載のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】骨格筋型FABP（FABP3）を強制発現させた肝臓（右）。オイルレッドO染色の結果を示す。左はコントロール。赤い部分が脂質である。
【図２】肝臓型FABP（FABP1）を強制発現させたマウスの肝臓（右）。実験には２匹のマウス（マウス１、マウス２）を使用した。左はコントロール。
【図３】FABP1を強制発現させたマウスの肝臓の重量（左）と中性脂肪量（右）。
【図４】FABP1抑制剤の設計。二種類のアンチセンス核酸（siFABP1-A: CUUGAGUUACCUCUGUGUUAG（配列番号３）、siFABP1-B: CCUCUGUGUUAGUGGUUAUGG（配列番号４））を設計した。
【図５】アンチセンス核酸によるFABP1の抑制。siFABP1-Aを導入したHeLa細胞では蛍光の大幅な低下が認められる。siFABP1-A に比べると、siFABP1-Bを導入した場合の蛍光の低下は少ない。
【図６】siFABP1-Aの投与による脂肪肝の改善。アデノウイルスを用いてsiFABP1-Aを肥満マウスの肝臓へ投与した。１週間後に肝臓を摘出し、オイルレッドO染色に供した。コントロール（左）に比較して、siFABP1-Aを投与したマウスの肝臓（右）では脂肪の蓄積が大幅に少ない。
【図７】siFABP1-Aを投与したマウスの肝臓の重量（左）と中性脂肪量（右）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の局面は脂肪肝の予防・改善剤に関する。「脂肪肝」とは、肝臓に脂肪が過剰に蓄積した病態である。「脂肪肝」は、アルコールの摂取に起因又は伴うもの（アルコール性脂肪肝）であっても、そうでないもの（非アルコール性脂肪肝）でもよい。脂肪肝の予防・改善とは、脂肪肝を予防又は改善（部分的な治癒や症状の緩和なども含む）することを意味する。
【００１２】
本発明の予防・改善剤（以下、「本発明の薬剤」ともいう）は、脂肪酸結合タンパク質１（FABP1）の発現又は作用を抑制する化合物を有効成分とする。尚、二つの用語「抑制」と「阻害」は、その意味するところが重複し、しばしば置換可能に用いられる。そこで本明細書では、前後の文脈から区別が特に必要な場合を除き、統一して用語「抑制」を使用する。
【００１３】
FABP1はFABPファミリー分子の一つである。上記の通り、FABPは脂質の輸送に重要な役割を果たしており、ヒトでは組織特異的に9種類のFABPがある。FABP1は肝臓特異的な発現を示す。FABP1のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列をそれぞれ配列番号１（NCBI, ACCESSION: NP_001434, DEFINITION: fatty acid-binding protein, liver [Homo sapiens].）及び配列番号２（NCBI, ACCESSION: NM_001443, DEFINITION: Homo sapiens fatty acid binding protein 1, liver (FABP1), mRNA.）に示す。
【００１４】
本発明の有効成分となる、FABP1の発現又は作用を抑制する化合物とは、FABP1遺伝子の発現過程（転写、転写後調節、翻訳、翻訳後調節を含む）を抑制する化合物である。当該化合物の例は次の通りである。尚、本発明における「発現の抑制」は一過的抑制及び恒常的抑制のいずれでもよいが、FABP1の生理機能を考慮すれば一過的抑制が好ましい。
(a)FABP1遺伝子を標的とするsiRNA
(b)FABP1遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト
(c)FABP1遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸
(d)FABP1遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム
【００１５】
上記(a)及び(b)は、いわゆるRNAi（RNA interference；RNA干渉）による発現抑制に利用される化合物である。換言すれば、上記(a)又は(b)の化合物を有効成分とする本発明の薬剤によればRNAiによりFABP1の発現を抑制することができる。RNAiは真核細胞内で引き起こすことが可能な、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。哺乳動物細胞に対するRNAiでは、標的mRNAの配列に対応する配列の短い二本鎖RNA（siRNA）が使用される。通常、siRNAは21〜23塩基対である。哺乳動物細胞は二本鎖RNA（dsRNA）の影響を受ける２つの経路（配列特異的経路及び配列非特異的経路）を有することが知られている。配列特異的経路においては、比較的長いdsRNAが短い干渉性のRNA（即ちsiRNA）に分割される。他方、配列非特異的経路は、所定の長さ以上であれば配列に関係なく、任意のdsRNAによって惹起されると考えられている。この経路ではdsRNAが二つの酵素、即ち活性型となり翻訳開始因子eIF2をリン酸化することでタンパク質合成のすべてを停止させるPKRと、RNAase L活性化分子の合成に関与する2',5'オリゴアデニル酸シンターゼが活性化される。この非特異的経路の進行を最小限に留めるためには約30塩基対より短い二本鎖RNA（siRNA）を使用することが好ましい(Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250: 409-17; Manche et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 5239-48; Minks et al. (1979) J Biol Chem 254: 10180-3; 及び Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8を参照されたい）。
【００１６】
標的特異的なRNAiを生じさせるためには標的遺伝子のmRNA配列の一部と相同なセンスRNA及びこれに相補的なアンチセンスRNAからなるsiRNAを細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させればよい。上記(a)は前者の方法に対応する化合物であり、同様に上記(b)は後者の方法に対応する化合物である。
【００１７】
標的遺伝子（本発明の場合はFABP1遺伝子）を標的とするsiRNAは、通常、当該遺伝子のmRNAの配列における連続する領域と相同な配列からなるセンスRNAとその相補配列からなるアンチセンスRNAがハイブリダイズした二本鎖RNAである。ここでの「連続する領域」の長さは通常15〜30塩基、好ましくは18〜23塩基、より好ましくは19〜21塩基である。
【００１８】
末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAが高いRNAi効果を発揮することが知られている。そこで本発明においても、そのような構造のsiRNAを採用することが好ましい。オーバーハングを形成する塩基の長さは特に限定されないが、好ましくは2塩基（例えばTT、UU）である。
【００１９】
修飾したRNAからなるsiRNAを用いることにしてもよい。ここでの修飾の例としてホスホロチオエート化、修飾塩基（例えば蛍光標識塩基）の使用が挙げられる。
【００２０】
siRNAの設計及び調製は常法で行うことができる。siRNAの設計には通常、標的配列に固有の配列（連続配列）が利用される。尚、適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。
【００２１】
FABP1遺伝子を標的としたsiRNAの配列の例を以下に列挙する。
5'-CUUGAGUUACCUCUGUGUUAG-3'（配列番号３。後述の実施例で使用した配列）
5'-CCUCUGUGUUAGUGGUUAUGG-3'（配列番号４。後述の実施例で使用した配列）
【００２２】
上記(b)の「siRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト」とは、それを細胞に導入すると細胞内でのプロセスによって所望のsiRNA（標的遺伝子に対するRNAiを引き起こすsiRNA）が生ずる核酸性分子をいう。当該核酸コンストラクトの一つの例はshRNA（short hairpin RNA）である。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAがループ構造部を介して連結された構造（ヘアピン構造）を有し、細胞内でループ構造部が切断されて二本鎖siRNAとなり、RNAi効果をもたらす。ループ構造部の長さは特に限定されないが、通常は3〜23塩基である。
【００２３】
核酸コンストラクトの別の例は、所望のsiRNAを発現し得るベクターである。このようなベクターとしては、後のプロセスによってsiRNAに変換されるshRNAを発現する（shRNAをコードする配列がインサートされた）ベクター（ステムループタイプ又はショートヘアピンタイプと呼ばれる）、センスRNAとアンチセンスRNAを別々に発現するベクター（タンデムタイプと呼ばれる）が挙げられる。これらのベクターは当業者であれば常法に従い作製することができる（Brummelkamp TR et al.(2002) Science 296:550-553; Lee NS et al.(2001) Nature Biotechnology 19:500-505; Miyagishi M & Taira K (2002) Nature Biotechnology 19:497-500; Paddison PJ et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1443-1448; Paul CP et al.(2002) Nature Biotechnology 19 :505-508; Sui G et al.(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(8):5515-5520; Paddison PJ et al.(2002) Genes Dev. 16:948-958等が参考になる）。現在、種々のRNAi用ベクターが利用可能である。このような公知のベクターを利用して本発明のベクターを構築することにしてもよい。この場合、所望のRNA（例えばshRNA）をコードするインサートDNAを用意した後、ベクターのクローニングサイトに挿入し、RNAi発現ベクターとする。
【００２４】
尚、標的遺伝子に対するRNAi作用を発揮するsiRNAを細胞内で生じさせるという機能を有する限り、ベクターの由来や構造は限定されるものではない。従って、各種ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等）、非ウイルスベクター（リポソーム、正電荷型リポソーム等）等を用いることができる。ベクターに利用可能なプロモーターの例を示すと、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーターである。これらのプロモーターはRNAポリメラーゼIII系のプロモーターであり、高い発現効率を期待できる。
【００２５】
上記(c)はアンチセンス法による発現抑制に利用される化合物である。換言すれば、上記(c)の化合物を有効成分とする本発明の薬剤によれば、アンチセンス法によりFABP1の発現を抑制することができる。アンチセンス法による発現阻害を行う場合には例えば、標的細胞内で転写されたときに、FABP1をコードするmRNAの固有の部分に相補的なRNAを生成するアンチセンス・コンストラクトが使用される。このようなアンチセンス・コンストラクトは例えば、発現プラスミドの形態で標的細胞に導入される。一方、アンチセンス・コンストラクトとして、標的細胞内に導入されたときに、FABP1をコードするmRNA／又はゲノムDNA配列とハイブリダイズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチド・プローブを採用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド・プローブとしては、好ましくは、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるものが用いられる。
【００２６】
アンチセンス核酸としてDNA分子を使用する場合、FABP1をコードするmRNAの翻訳開始部位（例えば-10〜+10の領域）を含む領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００２７】
アンチセンス核酸と、標的核酸との間の相補性は厳密であることが好ましいが、多少のミスマッチが存在していてもよい。標的核酸に対するアンチセンス核酸のハイブリダイズ能は一般に両核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存する。通常、使用するアンチセンス核酸が長いほど、ミスマッチの数が多くても、標的核酸との間に安定な二重鎖（又は三重鎖）を形成することができる。当業者であれば、標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。
【００２８】
アンチセンス核酸はDNA、RNA、若しくはこれらのキメラ混合物、又はこれらの誘導体や改変型であってもよい。また、一本鎖でも二本鎖でもよい。塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分を修飾することで、アンチセンス核酸の安定性、ハイブリダイゼーション能等を向上させることなどができる。また、アンチセンス核酸に、細胞膜輸送を促す物質（例えば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810, published December 15, 1988を参照されたい)や、特定の細胞に対する親和性を高める物質などを付加してもよい。
【００２９】
アンチセンス核酸は例えば市販の自動DNA合成装置（例えばアプライド・バイオシステムズ社等）を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209やSarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451等を参照することができる。
【００３０】
標的細胞内におけるアンチセンス核酸の作用を高めるために、pol IIやpol IIIといった強力なプロモーターを利用することができる。即ち、このようなプロモーターの制御下に配置されたアンチセンス核酸を含むコンストラクトを標的細胞に導入すれば、当該プロモーターの作用によって十分な量のアンチセンス核酸の転写を確保できる。
【００３１】
アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）で機能することが知られている任意のプロモーター（誘導性プロモーター又は構成的プロモーター）によって行うことができる。例えば、SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウィルスの3'末端領域由来のプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)等のプロモーターを使用することができる。
【００３２】
本発明の一態様では、リボザイムによる発現抑制を利用する（上記(d)の化合物の場合）。部位特異的認識配列でmRNAを開裂させるリボザイムを用いて標的mRNAを破壊することもできるが、好ましくはハンマーヘッド・リボザイムを使用する。ハンマーヘッド・リボザイムの構築方法については例えばHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591を参考にすることができる。
【００３３】
アンチセンス法を利用する場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター（例えばpol IIやpol III）の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。
【００３４】
本発明の一態様では、FABP1の作用を抑制する化合物を有効成分とする。該当する化合物の例は、FABP1とそのリガンドである脂肪酸との結合を阻害するものである。具体的には、FABP1の脂肪酸結合ポケット又はその周囲に結合する抗体や、脂肪酸と競合的にFABP1に結合する化合物などを有効成分として採用し得る。ここでの抗体の種類や形態は特に問わない。ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。また、キメラ抗体（例えばヒトとマウスのキメラ）、ヒト化抗体、ヒト抗体等を用いることもできる。更には、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFvなどの抗体断片を用いることもできる。有効成分としての抗体は免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などによって調製することができる。尚、抗体自体を有効成分とするのではなく、細胞内で所望の抗体を発現可能なベクターを有効成分としてもよい。抗体以外の化合物についても同様である。
【００３５】
本発明の薬剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００３６】
製剤化する場合の剤型も特に限定されない。剤型の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。本発明の薬剤には、期待される効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の薬剤中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．１重量％〜約９５重量％の範囲内で設定する。
【００３７】
本発明の薬剤はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。核酸コンストラクトを有効成分とした場合（例えばRNAiを利用する態様）、in vivo投与に限らず、ex vivo投与を採用することもできる。
【００３８】
本発明の薬剤を投与する「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明の医薬はヒトに対して適用される。投与量は患者の症状、年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールの設定においては、患者の症状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
【００３９】
本発明の薬剤は、例えば、医薬、医薬部外品又は食品の形態で提供される。即ち、本発明は好ましい態様として、本発明の薬剤を含む医薬、医薬部外品及び食品を提供する。本発明での「食品」の例として一般食品（穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子類、牛乳、清涼飲料水、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント、栄養ドリンク等）、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品を挙げることができる。栄養補助食品又は食品添加物の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。食品の形態で提供することによって、本発明の有効成分を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。
【００４０】
尚、以上の記述から明らかな通り本出願は、脂肪肝の患者又は潜在的患者（将来罹患するおそれのある者）に対して本発明の薬剤を治療上有効量投与することを特徴とする、脂肪肝の治療法や予防法も提供する。
【００４１】
本発明の第２の局面は脂肪肝の予防・改善剤のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法では、FABP1の抑制が脂肪肝の予防・改善に有効であるとの知見に基づき、FABP1の発現又は作用を抑制する作用を被験物質が示すか否かを調べることを特徴とする。以下、本発明のスクリーニング方法の具体的な態様１〜４を説明する。本発明のスクリーニング方法は、その説明から明らかな通り、in vitroで実施される。
【００４２】
１．FABP1と脂肪酸との結合に対する阻害能に基づくスクリーニング１
この態様ではFABP1とそのリガンド（脂肪酸）との結合に注目し、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブ（以下、「結合プローブ」とも呼ぶ）を利用する。具体的には以下のステップ（１）〜（３）を行う。
（１）FABP1に対して、被験物質の存在下、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブを接触させるステップ
（２）FABP1に対する前記プローブの結合を検出するステップ
（３）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1と前記プローブの結合の低下が有効性の指標となるステップ
【００４３】
ステップ（１）では、FABP1を用意し、被験物質の存在下、結合プローブを接触させる。例えば、培養皿、マイクロウェルプレート（例えば、96ウェルプレート、384ウェルプレート）等、適当な容器内で、FABP1、被験物質、結合プローブが共存する状態を形成させる。当該３要素が共存する状態が形成される限り、添加順序は特に問わない。例えば、FABP1の溶液ないし懸濁液を用意し、被験物質を添加した後、結合プローブを添加する。溶媒には緩衝液、生理食塩水、培地等を使用することができる。温度条件としては、４℃〜３７℃を採用することができる。接触させる時間は例えば３分〜２時間、好ましくは５分〜３０分である。尚、最適な接触条件は予備実験によって決定することができる。
【００４４】
FABP1は天然由来であっても、組換え体であってもよい。FABP1遺伝子を発現可能なベクターで形質転換した大腸菌を利用した発現系によってFABP1を調製することができる。また、FABP1は市販もされており、市販品のFABP1を用いることにしてもよい。
【００４５】
被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬や栄養食品等の既存成分或いは候補成分も好ましい被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。
【００４６】
結合プローブとしては、1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS)、12-(9-anthroyloxy)oleic acid(12-AO)等の蛍光プローブ、脂肪酸誘導体、コレステロール誘導体等を利用することができる。
【００４７】
ステップ（２）ではFABP1に対する結合プローブの結合を検出する。使用する結合プローブに応じて適切な検出法を採用すればよい。例えば、蛍光プローブを利用した場合には蛍光の検出により、FABP1と結合プローブの結合を検出・評価できる。容易な検出を可能にするため、脂肪酸誘導体やコレステロール誘導体等をプローブとして利用する場合には、検出可能な標識物質で標識化されたものを用いることが好ましい。標識物質としては例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、3H、13C、32P、131I、 125I等の放射性同位体、及びビオチンを挙げることができる。
【００４８】
ステップ（３）では、検出結果に基づき被験物質の有効性を判定する。本発明では、FABP1と結合プローブの結合の低下を有効性の指標とする。即ち、FABP1と結合プローブの結合の低下を認めた場合に被験物質は有効であると判定し、FABP1と結合プローブの結合の低下を認めない場合に被験物質は有効でないと判定する。複数の被験物質を用いた場合には、結合の低下の程度に基づき、各被験物質の有効性を比較評価することができる。
【００４９】
ステップ（３）での判定結果に基づき有効な被験物質が選抜される。通常は、比較対象として、被験物質非存在下（その他の条件はステップ（１）と同一とする）で操作したもの（以下、「コントロール群」と呼ぶ）を用意し、それについても、FABP1に対する結合プローブの結合を検出する。そして、当該コントロール群の検出結果と試験群の検出結果を比較することによって、被験物質の有効性を判定する。このようにコントロール群との比較によって被験物質の有効性を判定すれば、より信頼性の高い判定結果が得られる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法によって選択された物質が十分な薬効を有する場合には、当該物質をそのまま脂肪肝の予防・改善剤の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、脂肪肝の予防・改善剤の有効成分として使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
【００５１】
２．FABP1と脂肪酸との結合に対する阻害能に基づくスクリーニング２
この態様では、FABP1と結合プローブの複合体に対する被験物質の作用を調べ、被験物質の有効性を判定する。具体的には以下のステップを行う。尚、特に言及しない事項については上記態様と同様であるため、重複する説明を省略し、対応する説明を援用する。
（ｉ）FABP1と、FABP1の脂肪酸結合ポケットに結合するプローブとの複合体に対して被験物質を接触させるステップ
（ｉｉ）FABP1に対する前記プローブの結合を検出するステップ
（ｉｉｉ）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1と前記プローブの結合の低下が有効性の指標となるステップ
【００５２】
この態様の接触ステップ（ｉ）では、FABP1と結合プローブの複合体（結合プローブが結合したFABP1）を用意しておき、当該複合体に対して被験物質を接触させる。この場合の条件（容器、溶媒、温度、時間など）は上記の態様に準ずる。また、ステップ（ｉｉ）の操作は上記態様のステップ（２）と同様である。
【００５３】
この態様においても「FABP1と結合プローブの結合の低下」を指標として被験物質の有効性を判定する（ステップ（ｉｉｉ））。FABP1と結合プローブの結合の低下をもたらす被験物質は、即ち、結合を阻害して、FABP1から結合プローブの解離を促すものであり、有効な化合物として選択される。この態様においても、コントロール群の検出結果との比較に基づき被験物質の有効性を判定することが好ましい。
【００５４】
３．レポーターアッセイを利用したスクリーニング
この態様では、いわゆるレポーターアッセイを利用する。具体的には以下のステップを行う。尚、特に言及しない事項については上記態様と同様であるため、重複する説明を省略し、対応する説明を援用する。
（Ｉ）FABP1遺伝子のプロモーター領域と該プロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む核酸コンストラクトが導入された細胞に被験物質を接触させるステップ；
（ＩＩ）レポーター遺伝子の発現を検出するステップ
（ＩＩＩ)検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、レポーター遺伝子の発現の低下が有効性の指標となるステップ
【００５５】
ステップ（Ｉ）では、FABP1遺伝子のプロモーター領域と該プロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む核酸コンストラクトが導入された細胞を用意する。「プロモーター」とは、その制御下にある遺伝子の転写の開始を調節する機能領域のことをいう。「制御下」とは「支配下」と同義であり、プロモーターとレポーター遺伝子が機能的に連結していることを意味する。プロモーターの制御下にレポーター遺伝子が配置されることによって、レポーター遺伝子の転写がプロモーターの制御（調節）を受ける。典型的にはプロモーターにレポーター遺伝子が直接連結されるが、レポーター遺伝子がプロモーターに転写制御される限りにおいて、プロモーターとレポーター遺伝子の間に他の配列が介在していてもよい。FABP1遺伝子のプロモーター領域の例を配列番号７に示す。プロモーター活性を示す限り、ここで示したプロモーター領域の一部を用いることにしてもよい。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）等を用いることができる。
【００５６】
核酸コンストラクトを適当な細胞にトランスフェクトすることにより、ステップ（Ｉ）に必要な細胞（スクリーニング用細胞）を得ることができる。核酸コンストラクトが導入される細胞としては各種動物細胞（ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞など）を利用することができる。
【００５７】
用意したスクリーニング用細胞に対して、被験物質を接触させる。例えば、スクリーニング用細胞の培養液中に被験物質を添加する。或いは、スクリーニング用細胞の培養液を、被験物質を含有するものに交換する。培養方法は常法に従えばよく、スクリーニング用細胞の種類に応じて決定できる。被験物質との接触時間は予備実験を通して設定すればよいが、例えば３０分〜４８時間である。
【００５８】
ステップ（Ｉ）に続くステップ（ＩＩ）では、レポーター遺伝子の発現を検出する。検出は常法に従えばよい。本発明で用いることが可能な汎用的なレポーター遺伝子に関しては、基本的な検出法が確立されており、成書や過去の論文等を参考にして、適切な方法や条件を容易に選択ないし設定することが可能である。
【００５９】
ステップ（ＩＩＩ)では、検出結果に基づき被験物質の有効性を判定する。本発明では、レポーター遺伝子の発現の低下を有効性の指標とする。即ち、レポーター遺伝子の発現の低下を認めた場合に被験物質は有効であると判定し、レポーター遺伝子の発現の低下を認めない場合に被験物質は有効でないと判定する。複数の被験物質を用いた場合には、結合の低下の程度に基づき、各被験物質の有効性を比較評価することができる。尚、この態様においても、コントロール群の検出結果との比較に基づき被験物質の有効性を判定することが好ましい。
【００６０】
４．FABP1発現細胞を利用したスクリーニング
この態様では、FABP1が発現している細胞を利用してスクリーニングを行う。具体的には以下のステップを行う。尚、特に言及しない事項については上記態様と同様であるため、重複する説明を省略し、対応する説明を援用する。
（Ａ）FABP1が発現している細胞を被験物質の存在下で培養するステップ
（Ｂ）前記細胞におけるFABP1の発現レベルを検出するステップ
（Ｃ）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、FABP1の発現レベルの低下が有効性の指標となるステップ
【００６１】
ステップ（Ａ）ではFABP1が発現している細胞（以下、「FABP1発現細胞」と呼ぶ）を用意し、これを被験物質の存在下で培養する。当該細胞としては、肝臓細胞、HepG2細胞株、HepaRG細胞株、ヒトiPSC由来肝細胞等を用いることができる。生体から新たに調製した細胞又はその継代細胞を用いても、或いは市販の細胞株などを用いてもよい。FABP1を強制発現するように操作した細胞（遺伝子組換え細胞）を使用することもできる。細胞の生物種は特に限定されない。生物種の例を挙げると、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サルである。
【００６２】
FABP1発現細胞を被験物質存在下で培養するためには、例えば、FABP1発現細胞を適当な容器（培養皿やマイクロウェルプレートなど）に播種して所定時間（例えば３０分〜１週間）経過した後、被験物質を培養液に添加するか或いは被験物質を添加した培養液に交換すればよい。播種後、直ちに被験物質の添加或いは被験物質を添加した培養液への交換を実施することにしてもよい。また、被験物質を予め添加した培養液を用いることにし、播種と同時に「被験物質が培養液中に存在した状態」が形成されるようにしてもよい。
【００６３】
被験物質存在下での培養時間は特に限定されないが、例えば３０分〜４８時間、好ましくは３０分〜１６時間とする。尚、最適な培養時間は予備実験によって決定することができる。
【００６４】
本明細書で言及しない事項（培地、培養温度など）については、使用する細胞の培養に一般的な培養条件に従えばよい。培養条件は、過去の報告や成書を参考にして、或いは予備実験を通じて決定すればよい。尚、培養温度は通常37℃とする。
【００６５】
ステップ（Ｂ）では、ステップ（Ａ）を経たFABP1発現細胞、即ち被験物質存在下で所定時間培養したFABP1発現細胞のFABP1発現レベルを検出する。FABP1発現レベルの検出法は特に限定されない。例えば、FABP1遺伝子のmRNA量をRT-PCRで定量することや、FABP1タンパク質の量を免疫学的に測定すること（例えばELISA法、ウエスタンブロット法による）によって検出可能である。
【００６６】
ステップ（Ｃ）ではステップ（Ｂ）の検出結果に基づき被験物質の有効性を判定する。本発明では、FABP1の発現レベルの低下を有効性の指標とする。即ち、FABP1の発現レベルの低下を認めた場合に被験物質は有効であると判定し、FABP1の発現レベルの低下を認めない場合に被験物質は有効でないと判定する。複数の被験物質を用いた場合には、発現レベルの低下の程度に基づき、各被験物質の有効性を比較評価することができる。尚、この態様においても、コントロール群の検出結果との比較に基づき被験物質の有効性を判定することが好ましい。
【実施例】
【００６７】
骨格筋型のFABPであるFABP3をマウス肝臓で発現させると脂肪肝になるということを発見し（図１）、FABPが肝臓の脂肪蓄積に重要な役割を演じているのではないかとの着想を得た。この着想の下、FABPの脂肪肝への関与を詳細に調べることにした。
【００６８】
１．FABP1の肝臓で強制発現
（１）方法
以下の方法によって、肝臓特異的な発現を示すFABP1をマウス肝臓で強制発現させた。ヒトFABP1遺伝子をコードするcDNAをアデノウイルスシャトルベクターであるpENTR-1Aベクター(life technologies社)にクローニングした。作製したpENTR-FABP1とアデノウイルスベクターであるpAd/CMV/V5-DESTベクター(life technologies社)をLR clonaseを用いて相同組換えしpAd-FABP1を作製した。pAd-FABP1を制限酵素PacIで消化しlinealizeした後、Lipofectamine 2000を用いて293A細胞にトランスフェクションし、FABP1発現アデノウイルスを産生させた。得られたウイルス粒子を293A細胞にさらに数回再感染させて増幅した後、塩化セシウム密度勾配超遠心法にてウイルス粒子を精製した。アデノウイルスベクターは尾静脈より注入した場合には殆ど全てが肝臓にてトラップされるため効率的に肝臓にて遺伝子を発現させることができる。マウスを麻酔後、作製したFABP1発現アデノウイルスを尾静脈に注入し肝臓にてFABP1を発現させた。ウイルス投与一週間後にマウスを解剖した。
【００６９】
（２）結果
図２に示す通り、コントロール（左）に比べFABP1を発現させた肝臓（右）では脂肪蓄積（原図では赤い部分が脂肪）が増加し脂肪肝が誘発された。即ち、FABP3だけでなく、FABP1でも脂肪肝が誘発されることが示された。試験後のマウスから肝臓を摘出し、肝臓重量と中性脂肪量を調べたところ、FABP1発現によって肝臓重量及び中性脂肪量が増加していた（図３）。つまり、FABP1の発現が肝肥大（脂肪蓄積と肝臓の負担増加）を促進した。即ち、肝臓でFABPの発現を上げると肝臓中の脂肪が減少し、脂肪肝になることが示された。以上の結果より、FABP1が肝臓の脂肪蓄積を制御する働きを持つことが示唆された。このことから、逆に肝臓でのFABP1発現を減少させると肝臓中の脂肪が減少し、脂肪肝が改善することが期待された。
【００７０】
２．FABP1の抑制による効果
FABP1の抑制が脂肪肝の改善に有効であるか否かを検討することにした。具体的にはアンチセンス薬剤によりFABP1を抑制した場合の効果・影響を調べた。
（１）方法
2種類のアンチセンス核酸（siFABP1-A: CUUGAGUUACCUCUGUGUUAG（配列番号３）、siFABP1-B: CCUCUGUGUUAGUGGUUAUGG（配列番号４））を設計した（図４）。これらのsiRNAを発現させるshDNA（配列番号５、６)を作製した。作製したshDNAをアデノウイルスシャトルベクターであるpENTR-U6ベクター(life technologies社)に連結しpENTR-siFABP-A,Bを作製した。FABP1効果を検討するために、本ベクターをFABP1と共にGFPを発現するpIRES2-FABP-GFPをHeLa細胞にコトランスフェクションした。高いFABP1発現抑制効果の見られたpENTR-siFABP-AとアデノウイルスベクターであるpAd/BLOCK-iT/DESTベクターをLR clonaseを用いて相同組換えし、pAd-siFABP1を作製した。これを制限酵素PacIで消化しlinealizeした後、Lipofectamine 2000を用いて293A細胞にトランスフェクションし、FABP1抑制アデノウイルスを産生させた。得られたウイルス粒子を293A細胞にさらに数回再感染させて増幅した後、塩化セシウム密度勾配超遠心法にてウイルス粒子を精製した。マウスを麻酔後、FABP1抑制アデノウイルスを尾静脈に注入しsiFABP1を肝臓にて発現させた。アデノウイルス投与一週間後にマウスを解剖した。
【００７１】
（２）結果
図５に示す通り、siFABP1-Aの使用によって蛍光の大幅な低下（高いFABP1抑制効果）が認められた。そこで、アデノウイルスを用いてsiFABP1-Aを高脂肪食摂食により肥満を呈した肥満マウス（C57 black/6J）の肝臓へ投与した。投与１週間後の結果を図６に示す。コントロール（左）が脂肪肝を呈しているのに対して、siFABP1-A投与マウス（右）では脂肪肝が劇的に改善した。試験後のマウスから肝臓を摘出し、肝臓重量と中性脂肪量を調べたところ、siFABP1-A投与マウスでは、肝臓重量の低位化（肝臓肥大の改善）と肝臓中中性脂肪量の減少が見られた（図７）。即ち、FABP1の発現を抑制する核酸（siFABP1-A）によって脂肪肝が改善することが実証された。
【００７２】
３．まとめ
以上の通り、FABP1を抑制するという戦略が脂肪肝の改善に有効であることが判明した。この戦略には、(i)従来技術のように治療法が患者の意思・生活に左右されないこと、(ii)従来技術と比較して強力な脂肪肝治療効果が期待できること、(iii)従来技術では数カ月を要するのに対して、短期間での効果が期待されること、(iv)FABPは組織特異的な発現を示すため、FABP1に特異的な阻害剤は他臓器に与える影響が少ないと考えられること、(v)FABPは分子的に最下層にあるため、機能抑制による副作用が少ないと考えられること、等の利点があり、臨床応用が大いに期待される。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、肝臓内において脂溶性物質の輸送を担う脂肪酸結合タンパク質の発現又は機能の制限により、脂肪肝を予防又は改善できる。即ち、脂肪肝を標的とした新たな治療法が提供される。
【００７４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号３：人工配列の説明：siFABP1-A
配列番号４：人工配列の説明：siFABP1-B
配列番号５：人工配列の説明：FABP1-shDNA-A
配列番号６：人工配列の説明：FABP1-shDNA-B
【図１】
2015020969.tif 000002
【図２】
2015020969.tif 000003
【図３】
2015020969.tif 000004
【図４】
2015020969.tif 000005
【図５】
2015020969.tif 000006
【図６】
2015020969.tif 000007
【図７】
2015020969.tif 000008
【配列表】
2015020969000001.app