(57)【要約】【課題】本発明は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。【解決手段】特定のフォワードプライマーと、特定のリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目〜１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目〜３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
【請求項２】
前記核酸プライマーセットを含む組成物が、液体で３ヶ月以上の冷蔵保存が可能である、請求項１に記載の核酸プライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸プライマーセットであって、該組成物に含まれる核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列を有し、リバースプライマーが配列番号６〜８のいずれで示される塩基配列を有する、核酸プライマーセット。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法。
（１）請求項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
【請求項５】
前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基がシトシンである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸プローブが、配列番号９または１０で示される塩基配列を有する、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項４から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、請求項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物。
【請求項９】
請求項４から７のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、請求項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセット、または、請求項８に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、確実かつ簡便なメチシリン耐性遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用するメチシリン耐性遺伝子の検出方法、ならびに該検出方法を実行するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、メチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ遺伝子）を獲得した黄色ブドウ球菌であり、幅広い抗生物質に対する耐性を示す。また、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌属でもメチシリン耐性遺伝子を獲得することがある。
メチシリン耐性を試験する方法としては、薬剤感受性試験、メチシリン耐性遺伝子がコードするＰＢＰ−２’を抗ＰＢＰ−２’抗体を用いたイムノアッセイで検出する方法、メチシリン耐性遺伝子又は該遺伝子と連鎖するＤＮＡをＰＣＲで増幅して検出する方法などが実施されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
薬剤感受性試験およびイムノアッセイ法は検査の前段階として被験者から得られた黄色ブドウ球菌を培養する必要がある。このため培養に要する時間も含めると検査には一日以上を要する。
【０００４】
これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌の遺伝子以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌の遺伝子を検出することが可能である（非特許文献３）。
【０００５】
核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も一般的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
【０００６】
この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて正確性に優れたメチシリン耐性遺伝子検出方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１に記載の検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−４８６２０
【特許文献２】特開２０１０−２３３５０５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1685-1691
【非特許文献２】Journal of Clinical Microbiology, July 2000, p.2170-2173
【非特許文献３】German Medical Science, July, 2009, 7:Doc06
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、より優れたメチシリン耐性遺伝子検出方法の確立を目指して、液状における保存安定性に着目した。すなわち本発明が解決しようとする課題は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。
【００１０】
核酸増幅検査を行うための検出試薬には一定期間保存可能であることが求められる。検査を行うごとに試薬を調製する必要がなければ迅速な検査が可能となる。また、試薬調製時に外来ＤＮＡ等によるコンタミネーションが生じる危険を大幅に低減もしくは排除することができ、結果として検査の正確性の向上にも寄与する。しかし特許文献１に記載の検出系は一定期間の安定性については確認されていなかった。
【００１１】
一方、特許文献２にはＤＮＡポリメラーゼとマグネシウムイオンおよび核酸プライマーとを別の液状組成物にすることで、液状における保存安定性を向上させる方法が記載されている。しかし前記文献では使用する核酸プライマーの違いによって保存期間が左右されるかどうかについて十分な検証がされていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、メチシリン耐性遺伝子の一部領域を特異的に増幅し、かつ冷蔵で保存可能な組成物を提供できる核酸プライマーを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のような構成からなる。
【００１３】
［項１］
下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目〜１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目〜３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
［項２］
前記核酸プライマーセットを含む組成物が、液体で３ヶ月以上の冷蔵保存が可能である、項１に記載の核酸プライマーセット。
［項３］
項１または２に記載の核酸プライマーセットであって、該組成物に含まれる核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列を有し、リバースプライマーが配列番号６〜８のいずれで示される塩基配列を有する、核酸プライマーセット。
［項４]
以下の（１）〜（３）の工程を含む、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法。
（１）項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
［項５］
前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される、項４に記載の方法。
［項６］
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基がシトシンである、項４または５に記載の方法。
［項７］
前記核酸プローブが、配列番号９または１０で示される塩基配列を有する、項４から６のいずれかに記載の方法。
［項８］
項４から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物。
［項９］
項４から７のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセット、または、項８に記載の組成物を含むキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、良好な保存安定性を有する液状のメチシリン耐性遺伝子検出用検出試薬、および該試薬を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法が提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図４】比較例１の結果を示す図である。
【図５】実施例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。
【００１７】
核酸プライマーセット
本発明の様態の一つは、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセットである。該核酸プライマーセットは、下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなり、このセットを含む組成物を含む反応液によってメチシリン耐性遺伝子の一部領域を増幅することができる。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目〜１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目〜３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
【００１８】
上記において、配列番号１はメチシリン耐性遺伝子配列の相補的配列であり、配列番号２はメチシリン耐性遺伝子配列である。配列情報はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から取得している（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＢＸ５７１８５６）。
【００１９】
核酸プライマーセットは、通常は１種類（１配列）以上のフォワードプライマーと１種類（１配列）以上のリバースプライマーとで構成される。好ましくは１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとで構成される。
【００２０】
このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列を有するものと、リバースプライマーとして配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列を有するものとの組合せが好ましい。
【００２１】
組成物
本発明の別の一つの様態は、メチシリン耐性遺伝子を検出する方法に用いるための前記核酸プライマーセットを含む組成物である。
前記組成物は、メチシリン耐性遺伝子を検出する方法に用いるためのキットの構成試薬の一部分であってもよい。
【００２２】
前記組成物には前記核酸プライマーセットが含まれる。前記組成物に含まれるその他の成分は特に限定されないが、後述する核酸プローブは前記組成物に含まれることが好ましく、マグネシウムイオンが前記組成物に含まれることが好ましい。前記組成物に添加されるマグネシウムイオンの形態は特に限定されないが、塩化マグネシウムや硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩として添加することが好ましい。
また、前記組成物として既存の核酸増幅用キットに含まれる試薬を利用してもよい。
【００２３】
前記組成物にはＤＮＡポリメラーゼは含まれないほうが好ましい。これは、ＤＮＡポリメラーゼと核酸プライマーセットとを混合したまま保存しておくと、非特異産物が生じる可能性が考えられるためである。
本明細書では、ＤＮＡポリメラーゼ等が含まれ、かつ前記核酸プライマーセットや核酸プローブが含まれない組成物を、前記組成物と区別して核酸増幅用試薬と記載する。
【００２４】
保存
本発明の核酸プライマーセットを含む組成物は、液体で長期間冷蔵保存することが可能である。
本明細書における「保存することが可能（保存可能）」とは、組成物の核酸増幅性能が保存によって損なわれないことを意味する。また、組成物中に、例えば核酸プローブなど、前記核酸プライマーセットによって生じる増幅産物を検出する機能を有する構成物が含まれる場合は、前記構成物による前記増幅産物の検出性能が損なわれないことも含める。
【００２５】
本明細書における保存前とは、組成物を調製した直後の状態を指す。また、保存後とは所定の期間、所定の条件で静置した後の状態を指す。
【００２６】
保存によって性能が損なわれないとは、必ずしも保存前後で性能変化が全く無いことを意味しない。組成物の性能としては、該組成物を適切な核酸増幅用試薬と混合した場合に標的としている核酸に対する核酸増幅性能および増幅産物検出性能が保たれていればよい。
【００２７】
上記の性能が保たれていることを判定する方法は、当業者が実施できる方法であれば特に限定されない。少なくとも１つ以上の方法で確認できれば、他の方法の結果にかかわらず性能は保たれているとしてよい。
性能が保たれていることの判定は、増幅産物検出の実施方法によっても異なるが、例えば、検出方法がアガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動であれば、増幅産物のバンドが通常実施される方法で検出可能であれば、核酸増幅性能は保たれているとしてよい。
また、蛍光標識プローブなど、蛍光物質を利用して検出する方法を用いるのであれば、例えば、検出反応で得られる蛍光強度や蛍光変化量などのシグナル値を測定し、当該シグナル値が保存前組成物を用いて核酸増幅および増幅産物検出を実施して得られるシグナル値の３０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であれば、核酸増幅性能および増幅産物検出性能は保たれているとしてよい。
【００２８】
本発明における「冷蔵」とは、一般的な冷蔵庫や低温室などの温度条件を指し、冷蔵保存とは前記条件で保存することを指す。冷蔵の温度上限は１０℃であるが、９℃であってもよいし、８℃であってもよいし、７℃であってもよいし、６℃であってもよいし、５℃であってもよいし、凍結しない範囲でさらに低い温度であってもよい。冷蔵の温度下限は凍結しない温度であればよいが、０℃であってもよいし、１℃であってもよいし、２℃であってもよいし、１０℃を超えない範囲でさらに高い温度であってもよい。温度の上限と下限の組み合わせは前記の範囲であれば任意だが、たとえば、７℃から１０℃、２℃から５℃の範囲に維持すればよい。
【００２９】
前記核酸プライマーセットを用いることで、冷蔵で保存可能な組成物を用意することが可能になる。保存期間としては少なくとも３ヶ月間は保存可能であり、好ましくは６ヶ月間、さらに好ましくは７ヶ月間、さらに好ましくは８ヶ月間、さらに好ましくは９ヶ月間、さらに好ましくは１０ヶ月間、さらに好ましくは１１ヶ月間、さらに好ましくは１２ヶ月間、さらに好ましくは１３ヶ月間、さらに好ましくは１４ヶ月間、さらに好ましくは１５ヶ月間、さらに好ましくは１８ヶ月間、さらに好ましくは２４ヶ月間保存可能である。
【００３０】
核酸プローブ
後述の本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法において用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
【００３１】
このような核酸プローブとして、配列番号９、１０の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。
【００３２】
上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。
【００３３】
標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
【００３４】
メチシリン耐性遺伝子の検出方法
本発明の異なる様態として、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法が挙げられる。該方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）前記の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
【００３５】
本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。メチシリン耐性遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
【００３６】
該方法で用いられるメチシリン耐性遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記のものを用いることができる。さらに、例えばメチシリン耐性遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
【００３７】
被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００３８】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる
【００３９】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００４０】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４１】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００４２】
本発明プローブが含まれる反応系でメチシリン耐性遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のメチシリン耐性遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にメチシリン耐性遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００４３】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるメチシリン耐性遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００４４】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４５】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【００４６】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
【００４７】
ＤＮＡ合成活性
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００４８】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ          塩化マグネシウム
１５ｍＭ          ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ      活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ        ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％            トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ      キャリアーＤＮＡ
【００４９】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００５０】
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００５１】
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００５２】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００５３】
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
【００５４】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００５５】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のメチシリン耐性遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【００５６】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【００５７】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００５８】
本発明のメチシリン耐性遺伝子の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００５９】
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００６０】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６１】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００６２】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００６３】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００６５】
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００６６】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６７】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００６８】
メチシリン耐性遺伝子検出キット
本発明のメチシリン耐性遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記メチシリン耐性遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。該キットは、核酸プライマーセットを含む組成物と、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む核酸増幅用試薬とは別々の容器に充填されていることが好ましい。
【実施例】
【００６９】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７０】
〔実施例１：ＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのメチシリン耐性遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
ＭＲＳＡゲノムを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７１】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号４）０．２５μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号７）０．０５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号９、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料  ＭＲＳＡゲノム１００コピー相当または精製水（３μｌ）
精製水０．４μｌ
【００７２】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００７３】
結果
図１は、前記核酸プライマーセットを用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光量の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。
メチシリン耐性遺伝子が存在する場合、核酸プライマーセットによってメチシリン耐性遺伝子の一部領域が核酸増幅され、続く工程で核酸増幅産物と核酸プローブとがハイブリダイズする。核酸プローブにはハイブリダイズすると消光する性質を持つ蛍光物質が標識されている。その後反応系の温度を上昇させると、ハイブリダイズしていた核酸プローブが核酸増幅産物から解離し発光するため、蛍光量が変化する。従って、蛍光量の変化が検出できればメチシリン耐性遺伝子の存在が確認できる。
図１より、ＭＲＳＡゲノムを試料として上記方法を実施したところ蛍光量の変化が観測され、メチシリン耐性遺伝子が検出された（図１  ＰＣ）。一方、水を試料として同様に実施した場合は遺伝子の検出は認められなかった（図１  ＮＣ）。以上から、本発明の検出方法がメチシリン耐性遺伝子の検出に有効であることが示された。
【００７４】
〔実施例２：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００７５】
試薬
以下の試薬（１）を調製した。
（１）ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号４）１２５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号７）２５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
【００７６】
測定
試薬（１）およびＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を７〜１０℃の条件で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。保存温度は常に一定ではなく上記範囲内で上下していた。
試薬（１）  ４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ  ３μｌ
試料  ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
【００７７】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００７８】
結果
図２は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図２  ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図２  ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、７〜１０℃で３ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。
【００７９】
〔実施例３：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認延長〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００８０】
試薬
実施例２と同じ。
【００８１】
測定
実施例２の試薬（１）を、実施例２と同条件でさらに３ヶ月間追加で保存し、合計６ヶ月間保存した。６ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。
試薬（１）  ４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ  ３μｌ
試料  ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
【００８２】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００８３】
結果
図３は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図３  ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図３  ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、７〜１０℃で６ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。
【００８４】
〔比較例１：異なる核酸プライマー、核酸プローブを用いた検出試薬の保存安定性確認〕（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００８５】
試薬
以下の試薬（２）を調製した。
（２）ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号１１）１５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号１２）７５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
【００８６】
測定
試薬（２）およびＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を７〜１０℃で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。
試薬（１）  ４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ  ３μｌ
試料  ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
【００８７】
結果
図４は本比較例の結果である。この例では、ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合に微弱な検出ピークしか確認できなかった（図４  ＰＣ）。また、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図４  ＮＣ）。以上から、比較例の核酸プライマーセットを用いた検出試薬は保存に問題があった。使用した試薬成分のうち前記実施例と本比較例とで異なるのは核酸プライマーセットのみである。従って、保存可能期間の差は核酸プライマーセットが異なることに由来すると考えられる。以上から、本発明の核酸プライマーセットはより保存に適している検出試薬を提供可能である。
【００８８】
〔実施例４：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認（温度変更）〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００８９】
試薬
以下の試薬（１）を調製した。
（１）ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号４）１２５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号７）２５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
【００９０】
測定
試薬（１）およびＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を２〜５℃の条件で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。なお、保存温度は一定ではなく上記範囲内で前後していた。
試薬（１）  ４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ  ３μｌ
試料  ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
【００９１】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００９２】
結果
図５は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図５  ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図５  ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、実施例１〜３よりも低温である２〜５℃で３ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。実施例１〜３および本実施例から、本発明の核酸プライマーセットを用いた組成物は、厳密な温度管理を必要とせず一般的な冷蔵条件で保存可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明をメチシリン耐性遺伝子遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れた検出方法を提供できる。さらに、本発明の核酸プライマーセットを用いることで冷蔵で保存可能な検出試薬を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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