(57)【要約】【課題】急性白血病に対する分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果を早期、正確かつ迅速に判定する方法の提供。【解決手段】被検者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、急性白血病における分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は急性白血病における分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、急性白血病における分化誘導薬の応答性若しくは治療効果又は急性白血病における分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の判定方法。
【請求項２】
生体試料が、血液又は骨髄である請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
分化誘導薬がレチノイン酸であり、分化誘導薬以外の白血病治療薬が、シタラビン又はステロイドである請求項１又は２記載の判定方法。
【請求項４】
ＰＣＡＦ又はその遺伝子の測定用試薬を含有する、急性白血病における分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は急性白血病における分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の診断薬。
【請求項５】
生体試料が、血液又は骨髄である請求項４記載の診断薬。
【請求項６】
分化誘導薬がレチノイン酸であり、分化誘導薬以外の白血病治療薬がシタラビン又はステロイドである請求項４又は５記載の診断薬。
【請求項７】
被験物質で処理した細胞中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、急性白血病の分化誘導薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
造血器腫瘍患者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、造血器腫瘍が慢性か急性かを判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性白血病(急性骨髄性白血病や急性リンパ性白血病)における、分化誘導薬の応答性又は治療効果の判定方法、分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の判定方法、分化誘導薬等の応答性又は治療効果の診断薬、分化誘導薬のスクリーニング方法、及び造血器腫瘍の慢性又は急性の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性白血病患者では、白血病細胞が無秩序に増殖し、正常な細胞分化が阻害されることから、これらの異常を引き起す細胞増殖や細胞分化制御機構を標的とした治療戦略が選択される。既存の治療の多くは、細胞増殖を阻害する手法や薬剤が用いられる。一方、分化を正常に戻す、もしくは誘導することで白血病細胞を無力化する薬剤としては、レチノイン酸誘導体ＡＴＲＡ（all-trans retinoic acid）が承認され、急性白血病の１種である急性前骨髄球性白血病（APL: Acute promyelocytic leukemia）に対する第一選択薬として使用されている。ＡＴＲＡは、未分化状態に保たれているＡＰＬ細胞を、好中球へと最終分化させることで、細胞の腫瘍性を失わせると考えられている（非特許文献１−４）。
【０００３】
ＡＰＬは、急性期において迅速かつ適切な治療が不可欠な致死性の疾患であるが、中には、ＡＴＲＡによる治療効果の乏しい患者や抵抗性を示す患者がいる（非特許文献５）。しかし、現在のところ、ＡＴＲＡによる治療効果は、ＡＰＬ患者でよく見られる出血傾向の改善など、臨床的な変化によって判断されている。また、ＡＰＬのみならず、急性骨髄性白血病（AML:Acute myelocytic leukemia）全般においても、治療による腫瘍細胞の減少は、芽球の減少などといった形態学的な変化により観察されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Blood. (1988) vol.72:567-72.
【非特許文献２】臨床血液 (2011) 52巻:469-483.
【非特許文献３】Nat Rev Cancer. (2010) vol.10:775-83.
【非特許文献４】Blood. (1991) vol.77:1080-6.
【非特許文献５】Leukemia. (2002) vol.16:1940-58.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の急性白血病に対する分化誘導薬への応答性や治療効果の判定、分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の判定は、出血傾向の改善や形態学的な変化の観察によるものであるため、正確でなく、また早期に判定できない等の問題があった。
従って、本発明の課題は、急性白血病に対する分化誘導薬等の白血病治療薬の応答性又は治療効果を早期、正確かつ迅速に判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者は、レチノイン酸による白血病細胞の分化誘導過程を詳細に検討していたところ、ヒストンアセチル化酵素ＰＣＡＦの発現とレチノイン酸に対する白血病細胞の反応性とが強く相関すること、またレチノイン酸に耐性の白血病細胞ではレチノイン酸投与後のＰＣＡＦ発現は上昇しないこと、さらに、レチノイン酸投与により寛解した白血病患者の骨髄においても発症時に比べてＰＣＡＦの発現が亢進していることを見出した。さらに、急性白血病ではＰＣＡＦの発現が低下している一方、分化に障害のない慢性骨髄性白血病や慢性リンパ腫ではＰＣＡＦの発現の低下がみられないことから、造血器腫瘍における急性と慢性の判別診断が可能になることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕被検者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、急性白血病における分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は急性白血病における分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の判定方法。
〔２〕生体試料が、血液又は骨髄である〔１〕記載の判定方法。
〔３〕分化誘導薬がレチノイン酸であり、分化誘導薬以外の白血病治療薬がシタラビン又はステロイドである〔１〕又は〔２〕記載の判定方法。
〔４〕ＰＣＡＦ又はその遺伝子の測定用試薬を含有する、急性白血病における分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は急性白血病における分化誘導薬以外の白血病治療薬の治療効果の診断薬。
〔５〕生体試料が、血液又は骨髄である〔４〕記載の診断薬。
〔６〕分化誘導薬がレチノイン酸であり、分化誘導薬以外の白血病治療薬がシタラビン又はステロイドである〔４〕又は〔５〕記載の診断薬。
〔７〕被験物質で処理した細胞中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、急性白血病の分化誘導薬のスクリーニング方法。
〔８〕造血器腫瘍患者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、造血器腫瘍が慢性か急性かを判定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法によれば、急性白血病における分化誘導薬の応答性又は治療効果、分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果等が早期、迅速かつ正確に診断できる。また、造血器腫瘍が慢性か急性かを早期、迅速かつ正確に診断できる。さらに、本発明のスクリーニング法によれば新たな分化誘導薬が細胞レベルの評価でスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＡＴＲＡによるＡＰＬ細胞におけるＰＣＡＦ発現誘導性を示す図である。左の図は、ＡＴＲＡ感受性ＡＰＬ細胞株であり、右の図はＡＴＲＡ耐性ＡＰＬ細胞株である。
【図２】ＡＴＲＡによるＡＰＬ患者細胞におけるＰＣＡＦ発現誘導性を示す図である。左の図は、末梢血細胞、右の図は骨髄細胞である。
【図３】ＡＴＲＡを含む治療によりＡＰＬ患者の骨髄中でＰＣＡＦの発現が増加することを示す図である。
【図４】各種の急性白血病におけるＰＣＡＦの発現低下を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の急性白血病における分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果の判定方法は、被検者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする。
【００１２】
本発明における急性白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病等が含まれるが、急性骨髄性白血病が好ましく、特に急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）が好ましい。
【００１３】
本発明における分化誘導薬としては、レチノイン酸（オールトランスレチノイン酸）、亜ヒ酸、Ａｍ８０などが挙げられるが、レチノイン酸が特に好ましい。分化誘導薬以外の白血病治療薬としては、シタラビン、ステロイド、エトポシド、アンスラサイクリン、メトトレキサートなどが挙げられるが、シタラビン又はステロイドが特に好ましい。
【００１４】
本発明において、分化誘導薬の応答性とは、対象となる急性白血病が分化誘導薬に対して耐性を有するか否かをいう。すなわち、応答性がある場合は、分化誘導薬耐性でなく、分化誘導薬が有効に作用する。
分化誘導薬や分化誘導薬以外の白血病治療薬の治療効果とは、対象となる急性白血病が分化誘導薬や分化誘導薬以外の白血病治療薬による治療効果が得られるか否かをいう。また治療効果の判定には、治療前の予測及び治療中の寛解状態になっているか否かの判定も含まれる。
【００１５】
生体試料としては、白血球、リンパ球又は白血病細胞を含む血液又は骨髄が挙げられる。
【００１６】
ＰＣＡＦ又はその遺伝子には、ＰＣＡＦタンパク質、ＰＣＡＦ遺伝子又はＰＣＡＦｍＲＮＡが含まれる。それらの発現量の測定法としては、イムノブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ｑＰＣＲ法、アセチル基転移酵素活性測定法等が挙げられる。なお、ＰＣＡＦ遺伝子のプロモーターの活性を測定することによって、ＰＣＡＦ遺伝子発現量を間接的に測定することもできる。
【００１７】
分化誘導薬もしくは分化誘導薬以外の白血病治療薬によりＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量が、細胞レベル又は組織レベルで増加する場合には、対象となる急性白血病は、分化誘導薬治療又は分化誘導薬以外の白血病治療に対して応答性があり、治療効果が得られると判定できる。このとき、コントロールとしては、分化誘導薬又は分化誘導薬以外の白血病治療薬耐性であることが知られている急性白血病を用いればよい。
【００１８】
本発明の分化誘導薬の応答性若しくは治療効果、又は分化誘導薬以外の白血病治療薬の治療効果の診断薬は、ＰＣＡＦ又は遺伝子の測定試薬を含有する。ＰＣＡＦ又はその遺伝子の測定試薬としては、ＰＣＡＦ又はその遺伝子を測定するためのイムノブロット用キット、ＥＬＩＳＡキット、ｑＰＣＲ用キット、アセチル基転移酵素活性測定キット等が挙げられる。この測定試薬には、イムノブロット用試薬、ＥＬＩＳＡ試薬、ｑＰＣＲ用試薬、酵素活性測定試薬等の他に、測定を行うためのプロトコール、コントロール試薬等が含まれていてもよい。
【００１９】
本発明の分化誘導薬のスクリーニング方法は、被験物質で処理した細胞中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする。
【００２０】
用いる細胞は、急性白血病細胞である。これらの細胞としては、既に株化され市販されているものを用いることができる。レチノイン酸等に対して応答性があることが知られている細胞を用い、当該細胞に被験物質を加えて処理した後、当該細胞中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定すればよい。コントロールとしては、被験物質で処理していない細胞中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を用いる。
【００２１】
細胞中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量がコントロールに比べて亢進している場合、その被験物質は急性白血病における分化誘導薬として有用であると判定できる。
【００２２】
本発明の造血器腫瘍が慢性か急性かの判定方法は、造血器腫瘍患者由来の生体試料中のＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする。生体試料としては、前記の判定方法と同様のもの、血液、骨髄等が用いられる。
【００２３】
造血器腫瘍としては、急性若しくは慢性の骨髄性白血病又はリンパ性白血病が挙げられる。ＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量の測定は、前記と同様にして行うことができる。
【００２４】
本発明によれば、ＰＣＡＦ又はその遺伝子の発現量が少ない場合には、急性白血病と判定でき、多い場合には慢性白血病と判定できる。コントロールとしては、健常者を用いることができる。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２６】
実施例１
ＡＴＲＡに対するＰＣＡＦの発現について、ＡＴＲＡ感受性のＡＰＬ細胞株ＮＢ４と、ＡＴＲＡ耐性のＡＰＬ細胞株ＮＢ４／ＲＡを用いて評価した。１×１０-5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ × １０ｍＬ  ＩＭＤＭ／１０％ＦＣＳの培養条件で、１μＭ  ＡＴＲＡ処理を行ない、経時的に細胞を回収後、蛋白質ならびにＲＮＡを抽出し、イムノブロット法ならびにｑＰＣＲ法を用いてＰＣＡＦの発現を検討した。それぞれ、ＡＴＲＡにより発現の変化しないコントロールとして、ＧＡＰＤＨならびにβａｃｔｉｎを使用した。
【００２７】
図１にその結果を示す。図１から、ＡＴＲＡ感受性ＡＰＬ細胞株ではＰＣＡＦの発現誘導が検出された（図１左）が、ＡＴＲＡ耐性のＡＰＬ細胞株ではＰＣＡＦの発現誘導は検出されなかった（図１右）。
【００２８】
実施例２
新規にＡＰＬを発症した患者から、治療開始前に末梢血（図２左）ならびに骨髄（図２右）よりＡＰＬ細胞の含まれる単核球をＦｉｃｏｌｌ密度遠心法により分離し、試験管内の３０％ＦＣＳ／ＩＭＤＭ中にて培養し、１μＭ  ＡＴＲＡ処理後、３、５、７日目に細胞を回収後、フェノール含有溶液にて溶解後、ＲＮＡをスピンカラムにより精製し、ＰＣＡＦｍＲＮＡの発現誘導をｑＰＣＲ法により確認した（図２上段）。ＡＴＲＡによるＡＰＬ細胞の好中球への分化は、細胞をサイトスピンによりスライドガラス上に付着させた後、ライトギムザ染色により確認した（図２下段）。
その結果、ＡＰＬ患者細胞ではＡＴＲＡにより好中球への分化が誘導され、ＰＣＡＦの発現が誘導されることがわかった。
【００２９】
実施例３
ＡＰＬを発症し、ＡＴＲＡを含む治療により寛解した患者の、治療開始前後の骨髄より、スピンカラムを用いてＲＮＡを調製し、ｑＰＣＲ法により、治療の奏功によるＰＣＡＦの発現上昇を確認した（図３）。本患者は、４１日目に形態学的寛解、７４日目以降分子生物学的寛解となっている。
この結果、ＰＣＡＦの発現量の測定によりＡＴＲＡ治療経過が評価できることがわかる。
【００３０】
実施例４
腫瘍組織における発現マイクロアレイを用いたｍＲＮＡ発現解析結果をまとめたデーターベース検索により、  急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ，Ｂ−ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ＡＬＬ，ｐｒｏ−Ｂ  ＡＬＬ，Ｔ−ＡＬＬ）において、ＰＡＣＦｍＲＮＡの発現が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）や健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、有為に低下していることが明らかになった（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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