(57)【要約】【課題】ラマン散乱光を分光測定するにあたり蛍光を除去しラマン散乱光を精度良く分光測定する。単一光源を用いて実施することを可能とする。【解決手段】狭線幅の励起レーザー光１０を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトル１１を得る第１測定と、第１測定時より広い線幅の励起レーザー光２０を同測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトル２１を得る第２測定と、を実施する。このとき、第１測定時の励起レーザー光の波長帯域が第２測定時の励起レーザー光の波長帯域に含まれるようにレーザーダイオードを制御する。第１測定によるスペクトル１１と第２測定によるスペクトル２１の差分を取ることにより、測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
狭線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第１測定と、
前記第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を前記測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第２測定と、を実施し、
前記第１測定によるスペクトルと前記第２測定によるスペクトルの差分を取ることにより、前記測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得るラマン分光測定方法。
【請求項２】
前記第１測定時の励起レーザー光の波長帯域が前記第２測定時の励起レーザー光の波長帯域に含まれることを特徴とする請求項１に記載のラマン分光測定方法。
【請求項３】
前記第１測定時の励起レーザー光の中心波長と前記第２測定時の励起レーザー光の中心波長とが実質的に等しいことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のラマン分光測定方法。
【請求項４】
前記第１測定時の励起レーザー光の光源に半導体レーザーを用い、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に半導体レーザーを用い、前記第２測定時には、前記測定対象物に照射される励起レーザー光を波長シフト制御することで、前記第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を前記測定対象物に照射することを特徴とする請求項１から請求項３のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法。
【請求項５】
前記第１測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーと、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーとが同一であることを特徴とする請求項４に記載のラマン分光測定方法。
【請求項６】
前記半導体レーザーが分布帰還型レーザーダイオード、分布反射型レーザーダイオード及び外部共振器型レーザーダイオードのうちのいずれかであることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法。
【請求項７】
前記波長シフト制御を、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーの温度を制御することで行うことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法。
【請求項８】
前記波長シフト制御を、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーの駆動電流を制御することで行うことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法。
【請求項９】
前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーを外部共振器型レーザーダイオードとし、前記波長シフト制御を、当該外部共振器型レーザーダイオードの外部共振器内の回折格子の角度を制御することで行うことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１０】
前記波長シフト制御を、異なる複数の設定波長に中心波長を制御することで行い、前記第１測定時の励起レーザー光の中心波長に対し、前記複数の設定波長のいずれか一つが短波長側にあり、他のいずれか一つが長波長側にあることを特徴とする請求項４から請求項９のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１１】
前記複数の設定波長を２種類とすることを特徴とする請求項１０に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１２】
前記波長シフト制御を、異なる複数の設定波長の間で中心波長を連続的に変化させることで行うことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１３】
前記波長シフト制御を、中心波長が２度以上繰り返して同一波長となるように反復変化させることで行うことを特徴とする請求項１０、請求項１１又は請求項１２に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１４】
前記第２測定を、前記設定波長毎に時分割でそれぞれスペクトルを得ることで実行することを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１５】
前記第１測定によるスペクトルにおけるラマンピークのうち、最も線幅の狭いピークの半値全幅をｗとしたとき、前記第２測定時の励起レーザー光の半値全幅を２ｗ以下とすることを特徴とする請求項１から請求項１４のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１６】
前記第１測定時の励起レーザー光の半値全幅が０．１〔ｎｍ〕以下であり、
前記第２測定時の励起レーザー光の半値全幅が０．２〔ｎｍ〕以上２．０〔ｎｍ〕以下であることを特徴とする請求項１から請求項１４のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法。
【請求項１７】
狭線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第１測定を実行する第１測定手段と、
前記第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を前記測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第２測定を実行する第２測定手段と、
前記第１測定によるスペクトルと前記第２測定によるスペクトルの差分を取ることにより、前記測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得る演算手段と、
を備えるラマン分光測定装置。
【請求項１８】
レーザーダイオードと、
分光器と、
前記レーザーダイオードから出射した光を測定対象物に導く励起光光学系と、
前記測定対象物から放たれた光を前記分光器に導く測定光光学系と、
前記レーザーダイオードを光源とし、前記測定対象物に照射される励起レーザー光の波長を制御する波長制御装置と、
前記分光器により分光された光の強度を検出し、スペクトルデータを出力する検出器と、
前記波長制御装置に波長制御指令を与え、前記検出器から前記スペクトルデータの入力を受けるとともに、前記演算手段として機能するコンピュータと、
を備え、
前記第１測定手段及び前記第２測定手段は、前記レーザーダイオード、前記分光器、前記励起光光学系、前記測定光光学系、前記波長制御装置及び前記検出器を共有して構成されてなる請求項１７に記載のラマン分光測定装置。
【請求項１９】
前記コンピュータは、前記第１測定時の励起レーザー光の波長帯域が前記第２測定時の励起レーザー光の波長帯域に含まれるように、前記波長制御装置に波長制御指令を与える請求項１８に記載のラマン分光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン散乱光を分光測定するためのラマン分光測定方法及びラマン分光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
電子内視鏡による体内管腔の観察・診断は、現在広く普及している診断方法である。この診断方法は、体内組織を直接観察するため、病変部を切除する必要がなく、被験者の負担が小さいことが特徴である。一方で、このように体内管腔を直接観察する方法は、生検後の病理検査に比べて確度や精度が低いと考えられており、撮像画質の向上の努力が継続的に行われている。
また、最近ではいわゆるビデオスコープ以外に、様々な光学原理を活用した診断装置や、超音波診断装置といったものが提案され、一部は実用化されている。これらの分野でも、その診断確度の改善のために、新しい測定原理を導入したり、複数の測定原理を組み合わせたりすることが行われている。
特に、組織からの蛍光や組織に塗布された蛍光物質からの蛍光を観察、測定することで、単に組織の画像を見るだけでは得られない情報を得られることが知られている。蛍光画像を取得し、通常の可視画像にオーバーラップさせて表示するといった蛍光画像内視鏡システムも提案されている。このようなシステムは、悪性腫瘍の早期発見につながるため、非常に期待されている。
また、蛍光画像を構成せずとも、蛍光の強度情報を取得することで組織の状態を判断する方法も知られている。このような方法では、電子内視鏡に搭載されている撮像素子を使用せずに蛍光を取得するものが多い。
また、蛍光のみならず、散乱光、ラマン散乱光等各種分光測定を同じ目的に用いる試みも進められている。
【０００３】
ラマン効果またはラマン散乱は、物質に光を入射したとき、散乱された光の中に入射された光の波長と異なる波長の光が含まれる現象である。
ラマン散乱光の振動数と入射光の振動数の差（ラマンシフト）は物質の構造に特有の値をとることから、ラマン効果は赤外分光法と同様に分子の構造や状態を知るための非破壊分析法として利用されている。
一方、蛍光は、Ｘ線や紫外線、可視光線が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出するものである。
ラマン分光測定は、一般に、試料に狭線幅（狭波長帯域）のレーザー光を励起光として照射し、試料より生じた測定光のうち励起光とは異なる波長を有するものの波長と強度を測定する。一般に励起光より長波長の測定光を測定することになる。そのため、ラマン散乱光の測定時には、励起光によって蛍光も発生し、ラマン散乱光と蛍光が同時に測定されることが多い。ラマン散乱光は蛍光に比べ弱いことが多く、蛍光によって微弱なラマン散乱光が埋没してしまう問題がある。また埋没しないまでも、蛍光によるバックグラウンドによって、ラマン散乱測定のＳＮ比が悪化したり、蛍光とラマン散乱光との分離が困難であったりといった問題もある。
この問題を解決するために、（１）励起光の波長を近赤外領域にし、蛍光の発生を大きく抑制する、（２）特許文献１に記載されるように、近い波長の２つの励起光を用い、各々の励起光でのラマン散乱測定を実施し（特許文献１のFig. ２参照）、得られた２つのデータを用いた演算から蛍光のバックグラウンドを除去する、（３）特許文献２に記載されるように、中心波長がほぼ同一波長の狭線幅のレーザーと広帯域のＬＥＤの二つの励起光源を用い、各々の励起光でのラマン散乱測定を実施し、得られた２つのデータを用いた演算から蛍光のバックグラウンドを除去する、といった方法がとられている。
上記（１）については、非常に有効な手法であるが、励起光の波長が長くなると、発生するラマン光の強度も大きく減少するため、生体組織等のラマン散乱光が弱い試料に対しては、必ずしも十分ではない。
そのため、上記（２）や（３）の手法が実施されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７８６４３１１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／００１９８１８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、以上の従来技術にあってはさらに次のような問題がある。
上記（２）の手法では、蛍光のバックグラウンドを除去したデータは、ラマンスペクトルの一次微分形状に似たスペクトル形状として観測される（特許文献１のFig. ３参照）。一次微分スペクトルはピーク形状が消失するため、元のピーク位置を一次微分スペクトルから直接読み取ることが困難で、そのままではラマンピークの同定等の解析において不便であり、積分することで微分前のラマンスペクトルに数値的に変換することが多い。
上記（３）の手法では、狭線幅のレーザーと、広帯域のＬＥＤの二つの励起光源を使用するため、光路の切り替えが必要になる。また、ＬＥＤ励起でのスペクトルを引くことで凹状のスペクトル形状が現れてしまう問題もある（特許文献２のFig. ２参照）。
【０００６】
本発明は以上の従来技術における問題に鑑みてなされたものであって、ラマン散乱光を分光測定するにあたり蛍光を除去しラマン散乱光を精度良く分光測定することを課題とする。
また、単一光源を用いて実施することを可能とし、装置を簡素化することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上の課題を解決するための請求項１記載の発明は、狭線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第１測定と、
前記第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を前記測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第２測定と、を実施し、
前記第１測定によるスペクトルと前記第２測定によるスペクトルの差分を取ることにより、前記測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得るラマン分光測定方法である。
【０００８】
請求項２記載の発明は、前記第１測定時の励起レーザー光の波長帯域が前記第２測定時の励起レーザー光の波長帯域に含まれることを特徴とする請求項１に記載のラマン分光測定方法である。
【０００９】
請求項３記載の発明は、前記第１測定時の励起レーザー光の中心波長と前記第２測定時の励起レーザー光の中心波長とが実質的に等しいことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のラマン分光測定方法である。
【００１０】
請求項４記載の発明は、前記第１測定時の励起レーザー光の光源に半導体レーザーを用い、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に半導体レーザーを用い、前記第２測定時には、前記測定対象物に照射される励起レーザー光を波長シフト制御することで、前記第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を前記測定対象物に照射することを特徴とする請求項１から請求項３のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法である。
【００１１】
請求項５記載の発明は、前記第１測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーと、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーとが同一であることを特徴とする請求項４に記載のラマン分光測定方法である。
【００１２】
請求項６記載の発明は、前記半導体レーザーが分布帰還型レーザーダイオード、分布反射型レーザーダイオード及び外部共振器型レーザーダイオードのうちのいずれかであることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法である。
【００１３】
請求項７記載の発明は、前記波長シフト制御を、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーの温度を制御することで行うことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法である。
【００１４】
請求項８記載の発明は、前記波長シフト制御を、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーの駆動電流を制御することで行うことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法である。
【００１５】
請求項９記載の発明は、前記第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーを外部共振器型レーザーダイオードとし、前記波長シフト制御を、当該外部共振器型レーザーダイオードの外部共振器内の回折格子の角度を制御することで行うことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のラマン分光測定方法である。
【００１６】
請求項１０記載の発明は、前記波長シフト制御を、異なる複数の設定波長に中心波長を制御することで行い、前記第１測定時の励起レーザー光の中心波長に対し、前記複数の設定波長のいずれか一つが短波長側にあり、他のいずれか一つが長波長側にあることを特徴とする請求項４から請求項９のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法である。
【００１７】
請求項１１記載の発明は、前記複数の設定波長を２種類とすることを特徴とする請求項１０に記載のラマン分光測定方法である。
【００１８】
請求項１２記載の発明は、前記波長シフト制御を、異なる複数の設定波長の間で中心波長を連続的に変化させることで行うことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載のラマン分光測定方法である。
【００１９】
請求項１３記載の発明は、前記波長シフト制御を、中心波長が２度以上繰り返して同一波長となるように反復変化させることで行うことを特徴とする請求項１０、請求項１１又は請求項１２に記載のラマン分光測定方法である。
【００２０】
請求項１４記載の発明は、前記第２測定を、前記設定波長毎に時分割でそれぞれスペクトルを得ることで実行することを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載のラマン分光測定方法である。
【００２１】
請求項１５記載の発明は、前記第１測定によるスペクトルにおけるラマンピークのうち、最も線幅の狭いピークの半値全幅をｗとしたとき、前記第２測定時の励起レーザー光の半値全幅を２ｗ以下とすることを特徴とする請求項１から請求項１４のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法である。
【００２２】
請求項１６記載の発明は、前記第１測定時の励起レーザー光の半値全幅が０．１〔ｎｍ〕以下であり、
前記第２測定時の励起レーザー光の半値全幅が０．２〔ｎｍ〕以上２．０〔ｎｍ〕以下であることを特徴とする請求項１から請求項１４のうちいずれか一に記載のラマン分光測定方法である。
【００２３】
請求項１７記載の発明は、狭線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第１測定を実行する第１測定手段と、
前記第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を前記測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出してスペクトルを得る第２測定を実行する第２測定手段と、
前記第１測定によるスペクトルと前記第２測定によるスペクトルの差分を取ることにより、前記測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得る演算手段と、
を備えるラマン分光測定装置である。
【００２４】
請求項１８記載の発明は、レーザーダイオードと、
分光器と、
前記レーザーダイオードから出射した光を測定対象物に導く励起光光学系と、
前記測定対象物から放たれた光を前記分光器に導く測定光光学系と、
前記レーザーダイオードを光源とし、前記測定対象物に照射される励起レーザー光の波長を制御する波長制御装置と、
前記分光器により分光された光の強度を検出し、スペクトルデータを出力する検出器と、
前記波長制御装置に波長制御指令を与え、前記検出器から前記スペクトルデータの入力を受けるとともに、前記演算手段として機能するコンピュータと、
を備え、
前記第１測定手段及び前記第２測定手段は、前記レーザーダイオード、前記分光器、前記励起光光学系、前記測定光光学系、前記波長制御装置及び前記検出器を共有して構成されてなる請求項１７に記載のラマン分光測定装置である。
【００２５】
請求項１９記載の発明は、前記コンピュータは、前記第１測定時の励起レーザー光の波長帯域が前記第２測定時の励起レーザー光の波長帯域に含まれるように、前記波長制御装置に波長制御指令を与える請求項１８に記載のラマン分光測定装置である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、狭線幅の励起レーザー光を照射して行う第１測定と、それより広い線幅の励起レーザー光を照射して行う第２測定との差分を取ることで、測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得ることができ、これにより蛍光が除去されラマンスペクトルのピーク構造が強調されたスペクトルを得ることができ、ラマン散乱光を精度良く分光測定することができる。
また、狭線幅の励起レーザー光であっても第２測定時にはこれを波長シフト制御することで疑似的に線幅を広くすることを行い、これにより第１測定と第２測定とで光源を共用化すること、従って単一光源を用いて実施することを可能とし、装置を簡素化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施形態に係り、(a)は第１測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフ、(b)は第１測定により得られたスペクトルの一例を示すグラフ、(c)は第２測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフ、(d) は第２測定により得られたスペクトルの一例を示すグラフ、(e)は(d)−(b)の差分による曲線（二次微分ラマンスペクトルの近時曲線）の一例を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態に係り、(a)は第１測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフ、(b)は第２測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態に係り、第２測定時の半導体レーザーの温度の時間変化の一例を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態に係り、(a)は第１測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフ、(b)は第２測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態に係り、第２測定時の半導体レーザーの温度の時間変化の一例を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施形態に係り、(a)は第１測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフ、(b)は第２測定時の励起レーザー光のスペクトルの一例を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態に係り、第２測定時の半導体レーザーの温度の時間変化の一例を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施形態に係り、第２測定時の半導体レーザーの温度の時間変化の例を示すグラフであり、（ａ）は直線的な変化の一例を、(b)は曲線的な変化の一例を示す。
【図９】(a)は中央に僅かなピークを持った曲線（破線）及びそのベースライン曲線（実線）を示すグラフ、(b)は(a)の破線から実線であるベースラインを除去した後のピーク構造を示す曲線（破線）と、これを２次微分した曲線（実線）を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施形態に係るラマン分光測定装置の構成ブロック図である。
【図１１】本発明の実施形態に係るラマン分光測定装置による処理手順を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に本発明の一実施形態につき図面を参照して説明する。以下は本発明の一実施形態であって本発明を限定するものではない。
【００２９】
まず、本発明のラマン分光測定方法の実施形態につき、図１から図９を参照して説明する。
本方法においては、まず図１(a)に示すスペクトル１０のような狭線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出して図１(b)に示すようなスペクトル１１を得る第１測定と、図１(c)に示すスペクトル２０のような第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射し、当該測定対象物から放たれた光を分光検出して図１(d)に示すようなスペクトル２１を得る第２測定と、を実施する。第１測定と第２測定の順序は問わない。
図１に示すように第１測定時の励起レーザー光の中心波長をλ１、半値全幅をΔλ１、第２測定時の励起レーザー光の中心波長をλ２、半値全幅をΔλ２とする。中心波長λ１と中心波長λ２とは実質的に等しく、また、Δλ１＜Δλ２であり、スペクトル１０の波長帯域がスペクトル２０の波長帯域に含まれる関係のものを適用する。
【００３０】
図１(b)に示すスペクトル１１には、ラマン散乱光のスペクトル、すなわち、ラマンスペクトルのほか蛍光のスペクトルなどが重畳して含まれている。ベース部１１Ｆは主に蛍光成分で、その上にラマンスペクトルによるピーク１１Ｒが現われる（図中では例として４つのピークを図示）。
同様に図１(d)に示すスペクトル２１には、ラマンスペクトルのほか蛍光のスペクトルなどが重畳して含まれている。ベース部２１Ｆは主に蛍光成分で、その上にラマンスペクトルによるピーク部２１Ｒが現われる。
第１測定及び第２測定が終了したら、第１測定によるスペクトル１１と第２測定によるスペクトル２１の差分を取ることにより、図１(e)に示すように測定対象物の二次微分ラマンスペクトルを近似的に得る。図１(e)に示す曲線Ｒは、（スペクトル２１）−（スペクトル１１）を実行して得られた二次微分ラマンスペクトルの近時曲線である。
【００３１】
さて、上述したように第１測定には、光源として狭線幅のレーザーを用いる。特に波長を容易に変化させられる分布帰還型(DFB)レーザーダイオード、分布反射型(DBR)レーザーダイオード、外部共振器型レーザーダイオードが好ましい。
第１測定の結果は、それ単独でラマンスペクトルとして評価可能であるが、ラマン散乱光と蛍光が重畳しているため、第１測定の結果から蛍光の寄与を除去する必要がある。そのために、第２測定を実施する。上述したように第２測定では、励起光の線幅Δλ２を第１測定の線幅Δλ１より大きく設定する。これにより、検出する測定光のうち、ラマン散乱光（ピーク２１Ｒ）は線幅が増加しブロードなスペクトル形状を与える。
第１測定の励起光の中心波長λ１と、第２測定の中心波長λ２とは、その差異による影響が測定できない程度に差異を小さくして実質的に同一の波長とみなせるように設定する。  
一方、蛍光は励起光の線幅の変化の影響を受けず、第１測定と第２測定で同一のスペクトル形状（ベース部１１Ｆとベース部２１Ｆ）を与える。この際、全体強度の変化は後に補正可能であり、形状の同一性に影響しない。
【００３２】
装置構成の簡略化のためには、同一の光源を用いて第１測定と第２測定を実施することが望ましい。しかし、一般にラマン分光測定に用いられるレーザー光源は線幅が狭いことが求められるため、元々線幅の狭いガスレーザーや、何らかの波長選択構造を有した半導体レーザーを用い、レーザー線幅を自由に変化させることが困難である。
そのため、第２測定は疑似的に線幅の広い光源を用いて実施する。すなわち、第１測定時の励起レーザー光の光源に半導体レーザーを用い、第２測定時の励起レーザー光の光源に半導体レーザーを用い、第２測定時には、測定対象物に照射される励起レーザー光を波長シフト制御することで、第１測定時より広い線幅の励起レーザー光を測定対象物に照射することを行う。
DFBレーザーダイオードやDBRレーザーダイオードでは、温度によって発振波長が変化するため、測定中にレーザーダイオードの温度を掃引することで疑似的に広線幅の励起光を作り出すことが可能である。すなわち、上記の波長シフト制御を、第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーの温度を制御することで行う。一般に高温になるにつれて発振波長は長波長側にシフトする。
また、外部にグレーティングによる有するレーザーにおいては、温度または機械的な動作によって発振波長を変化させられる。すなわち、第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーを外部共振器型レーザーダイオードとし、上記の波長シフト制御を、当該外部共振器型レーザーダイオードの外部共振器内の回折格子の角度を制御することで行う。
また、駆動電流を制御すること波長をシフト制御可能な半導体レーザーを適用することができる。すなわち、上記の波長シフト制御を、第２測定時の励起レーザー光の光源に用いる半導体レーザーの駆動電流を制御することで行う。
したがって、温度、回折格子の角度又は駆動電流の制御によって、疑似的に広線幅の励起光を作り出すことが可能である。
【００３３】
第２測定の結果から第１測定の結果を差し引くことで、第１測定と第２測定の間で差異の小さい蛍光は除去され、図１(e)に示すようにラマン散乱光の寄与のみを取り出すことができる。この際、第２測定の励起光を上記の通り設定したことにより、ラマン散乱光の寄与は、図１(e)に示す通り、正-負-正のスペクトル形状となる。
【００３４】
一般に、関数ｆ(λ)の２階差分は、 次式（１）で表される。
【００３５】
【数１】
2015059800.tif 000003
【００３６】
ここで、α、δλは定数である。
関数f(λ)のλは、図１での第１測定時の励起光の中心波長λ１に相当し、ｆ(λ１＋δλ)＋ｆ(λ１−δλ)＋αｆ(λ１)が第２測定によるスペクトルに、（２＋α）ｆ(λ１)が第１測定によるスペクトル相当する。
αとδλの自由度があるため第２測定はいくつかの測定条件が考えられる。
δλは、上記の差分式（１）が微分に近似できることが必要であるので、装置の測定分解能程度からその数倍であることが望ましい。ラマン分光測定において、多くの場合、δλは０．１〔ｎｍ〕から１〔ｎｍ〕程度である。そのことからも、良好な二次微分ラマンスペクトルの近時曲線Ｒを得るために、第１測定時の励起レーザー光の半値全幅Δλ１を０．１〔ｎｍ〕以下とし、第２測定時の励起レーザー光の半値全幅Δλ２を０．２〔ｎｍ〕以上２．０〔ｎｍ〕以下とすることが好ましい。また、第１測定によるスペクトル１１におけるラマンピーク１１Ｒ，１１Ｒ，・・・のうち、最も線幅の狭いピーク１１Ｒの半値全幅をｗとしたとき、第２測定時の励起レーザー光の半値全幅Δλ２を２ｗ以下とすることが好ましい。
【００３７】
α＝０のとき、第２測定のスペクトルは、ｆ(λ１＋δλ)＋ｆ(λ１−δλ)に相当し、図２(a)に示す第１測定時の励起レーザー光のスペクトル１０に対し、第２測定時に図２(b)に示すスペクトル２０（実線部）のように中心波長λ１の長波長側の設定波長(λ１＋δλ)に中心波長が制御された励起レーザー光と、短波長側の設定波長(λ１−δλ)に中心波長が制御された励起レーザー光との２つでの測定することに相当する。すなわち、これは第２測定時の複数の設定波長を２種類とする場合である。
そのため、第２測定時に温度の制御によって疑似的に広線幅の励起光を作り出すには半導体レーザーの温度は主として２つの値を選択する。すなわち、図３に示すように第１測定時の励起レーザー光を出射する半導体レーザーの温度をＴ１として、第２測定時に同半導体レーザーを用い、その温度をＴ２＜Ｔ１となる温度Ｔ２と、Ｔ３＞Ｔ１となる温度Ｔ３の２つに制御する。典型的な例としては、Ｔ１＝２７℃、Ｔ２＝２０℃、Ｔ３＝３４℃、またはＴ1 ＝２５℃、Ｔ２＝１５℃、Ｔ３＝３５℃であるがこれに限らない。
第２測定の測定中にＴ２とＴ３の間を複数回移動してもよい。すなわち、第２測定時の波長シフト制御を、中心波長が２度以上繰り返して同一波長となるように反復変化させることで行ってもよい。
なお、第２測定は一回の測定内で２つの温度を経ることで１つのスペクトルを得てもよいが、Ｔ２での測定とＴ３での測定を時分割で行いそれぞれスペクトルを得ることで第２測定を実行することもできる。後者の場合、分割して行って得られた複数のスペクトルを加算することで図１(d)に示すような第２測定によるスペクトル２１が得られる。このように第２測定を、設定波長毎に時分割でそれぞれスペクトルを得ることで実行することができる。また、半導体レーザーの温度を回折格子の角度又は半導体レーザーの駆動電流に代えて同様に実施することができる。
【００３８】
α＝１のとき、第２測定のスペクトルは、ｆ(λ１＋δλ)＋ｆ(λ１−δλ) ＋ｆ(λ１)に相当し、図４(a)に示す第１測定時の励起レーザー光のスペクトル１０に対し、第２測定時に図４(b)に示すスペクトル２０（実線部）のように設定波長λ１と、設定波長(λ１＋δλ)と、設定波長(λ１−δλ)とにそれぞれ中心波長が制御された励起レーザー光で測定するので、分布波長域内でおおよそ均等な強度を有する励起レーザー光で測定することに相当する。
この場合も、第１測定と第２測定とで同一の半導体レーザーを用い、温度、回折格子の角度又は駆動電流の制御によって、第１測定時の設定波長λ１に対し第２測定時には上下に波長シフト制御することで実施できる。図５は、半導体レーザーの温度で制御する場合の半導体レーザーの温度変化グラフの一例である。
０＜α＜１の範囲では、図４(b)において中心波長がλ１である中央のスペクトル（破線部）が０から１００％にあることに相当する。
【００３９】
α＞１のとき、第２測定のスペクトルは、ｆ(λ１＋δλ)＋ｆ(λ１−δλ) ＋αｆ(λ１)、に相当し（但しα＞１）、図６(a)に示す第１測定時の励起レーザー光のスペクトル１０に対し、第２測定時に図６(b)に示すスペクトル２０（実線部）のように設定波長λ１と、設定波長(λ１＋δλ)と、設定波長(λ１−δλ)とにそれぞれ中心波長値が制御され、設定波長λ１に最も長時間制御された励起レーザー光で測定するので、分布波長域内の中央に１つの強度ピークを有する励起レーザー光で測定することに相当する。
この場合も、第１測定と第２測定とで同一の半導体レーザーを用い、温度、回折格子の角度又は駆動電流の制御によって、第１測定時の設定波長λ１に対し第２測定時には上下に波長シフト制御することで実施できる。図７は、半導体レーザーの温度で制御する場合の半導体レーザーの温度変化グラフの一例である。
【００４０】
以上は、第２測定での励起レーザー光を代表的な３波長で波長掃引した際の測定の概略を示した。実際には、離散的な３波長を用いる必要はなく、（λ１−δλ）から（λ１＋δλ）の間を連続的に波長掃引しながら測定してもよい。すなわち、第２測定時の波長シフト制御を、異なる複数の設定波長の間で中心波長を連続的に変化させることで行うことで実施してもよい。図８は、半導体レーザーの中心波長の連続的な変化を半導体レーザーの温度で制御する場合の半導体レーザーの温度変化グラフの例である。半導体レーザーの温度を回折格子の角度又は半導体レーザーの駆動電流に代えて同様に実施することができる。また、この半導体レーザーの中心波長の連続的な変化を、周期的又は非周期的に繰り返す変化として実施してもよい。
【００４１】
以上のようにして得られた第１測定及び第２測定の結果(スペクトル)を用いて、前述の通り蛍光を除去することが可能である。すなわち、図１(e)に示すような二次微分ラマンスペクトルの近時曲線Ｒを得ることができる。
この二次微分ラマンスペクトルの近時曲線Ｒは、近似的に、測定対象物のラマンスペクトルの二次微分(二階差分)形状を示している。図９(a)は、中央に僅かなピークを持った曲線（破線）とそのベースライン曲線（実線）であり、この図９(a)の破線曲線から実線のベースライン曲線を差し引いた差分に相当する曲線が図９(b)に破線で示される。この図９(b)に破線で示される差分の曲線を２次微分した曲線が同じく図９(b)に実線で示される。図９にも示されるように、一般に二次微分スペクトルは以下の様な特徴を持つ。
（ａ１）重畳したスペクトル構造を分離し、ピーク構造の数や位置を検出しやすくする。
（ａ２）ベースラインを除去しピーク構造を強調する。
（ａ３）２次微分形状の強度は、元のスペクトルのピーク強度に比例する。
（ａ４）２次微分形状のピーク位置は、元のスペクトルのピーク位置に一致する。
したがって、本実施形態のラマン分光測定方法によって、第１測定と第２測定という２つの測定の結果の差分を取ることのみによって、
（ｂ１）ラマン信号に重畳する蛍光を除去すること、
（ｂ２）ラマン信号のピーク構造を強調し、ピーク位置、ピーク数を検出しやすくする
こと、
が可能となり、ラマン散乱光を精度良く分光測定することができる。
【００４２】
次に、以上のラマン分光測定方法を実施するラマン分光測定装置につき図１０及び図１１を参照して説明する。
図１０に示すようにラマン分光測定装置５０は、レーザーダイオード５１と、分光器５２と、励起光光学系５３と、測定光光学系５４と、波長制御装置５５と、検出器５６と、コンピュータ５７とを備える。
コンピュータ５７は、他の各部を制御し、第１測定を実行する第１測定手段及び第２測定を実行する第２測定手段として機能させる。波長制御装置５５としては、温度制御機器５５ａとペルチェ素子モジュール（ＴＥＣ）５５ｂとを備える。ペルチェ素子モジュール（ＴＥＣ）５５ｂによってレーザーダイオード５１の温度が変化しレーザーダイオード５１の発振波長がシフト変化するようにレーザーダイオード５１が実装されている。
コンピュータ５７は、温度制御プロトコル５７ａに従って波長制御装置に波長制御指令を（この場合温度制御機器５５ａに温度制御指令を）与えることによって、レーザーダイオード５１が出力する励起レーザー光を波長シフト制御し、第２測定時の広線幅の励起レーザー光を作り出させる。本実施形態に拘わらず、波長制御装置５５として回折格子の角度又は駆動電流を制御する装置を設けて、回折格子の角度又は駆動電流の制御によって第２測定時の広線幅の励起レーザー光を作り出させてもよい。
【００４３】
励起光光学系５３は、レーザーダイオード５１から出射した光を測定対象物６０に導く光学系であり、反射、屈折、集光などの機能を有した光学部品によって構成される。波長制御装置は、レーザーダイオード５１を光源とし、測定対象物６０に照射される励起レーザー光の波長を制御するものであり、本実施形態に拘わらず測定対象物６０に照射されるまでに制御すれば足りる。測定光光学系５４は、測定対象物６０から放たれた光を分光器５２に導く光学系であり、反射、屈折、集光などの機能を有した光学部品によって構成される。
励起光光学系５３及び測定光光学系５４のうち測定対象物６０に近い部分６１は、光ファイバーによって導光する構成とし、これを可撓管で覆って体内に挿入可能なプローブとしてもよいし、内視鏡に組み込んでもよい。また、前者の場合、内視鏡やカテーテルに形成されたチャネルに挿通可能な細径のプローブとすることもできる。
第１測定と第２測定のそれぞれにおいて、検出器５６は、分光器５２により分光された光の強度を検出し、スペクトルデータを出力する。コンピュータ５７は、検出器５６からスペクトルデータの入力を受ける。コンピュータ５７は、第１測定によるスペクトルデータと第２測定によるスペクトルデータの差分を取るデータ演算処理を実行するデータ演算手段５７ｂとして機能する。このデータ演算処理により、蛍光が除去された測定対象物６０の二次微分ラマンスペクトルが近似的に得られる。
【００４４】
次に、図１１のフローチャートを参照しつつ、ラマン分光測定装置５０によるラマン分光測定の処理手順につき説明する。
（第１測定）
まず、コンピュータ５７は、図示しない駆動装置を介してレーザーダイオード５１に駆動電流を印加しレーザーダイオード５１から励起レーザー光を出射させる（ステップＳ１）。
次に、コンピュータ５７は、温度制御プロトコル５７ａに従いレーザーダイオード５１の温度を第１測定の設定値に設定する（ステップＳ２）。ここでの設定値は、第１測定時の励起レーザー光の中心波長λ１を所定値にすることに対応する温度値である。
次に、コンピュータ５７は、検出器５６の露光を開始する（ステップＳ３）。これにより、測定対象物６０から放たれ分光器５２によって分光された光が検出器５６に入力され検出が開始される。
次に、コンピュータ５７は、所定の露光時間に達したことを条件に検出器５６の露光を終了する（ステップＳ４）。
次に、コンピュータ５７は、検出器５６が検出したデータをコンピュータ５７に読み込み、第１測定のスペクトルデータとして保存する（ステップＳ５）。
【００４５】
（第２測定）
次に、コンピュータ５７は、温度制御プロトコル５７ａに従いレーザーダイオード５１の温度を第２測定の開始設定値に設定する（ステップＳ６）。ここでの開始設定値は、第２測定時の励起レーザー光の中心波長λ２を第２測定の開始時の所定値にすることに対応する温度値である。
次に、コンピュータ５７は、検出器５６の露光を開始する（ステップＳ７）。これにより、測定対象物６０から放たれ分光器５２によって分光された光が検出器５６に入力され検出が開始される。
次に、コンピュータ５７は、レーザーダイオード５１の温度を第２測定の温度制御プロトコル５７ａに従って変化させる（ステップＳ８）。これにより、第２測定時の広線幅の励起レーザー光が作り出される。
次に、コンピュータ５７は、所定の露光時間に達したことを条件に検出器５６の露光を終了する（ステップＳ９）。
次に、コンピュータ５７は、検出器５６が検出したデータをコンピュータ５７に読み込み、第２測定のスペクトルデータとして保存する（ステップＳ１０）。
【００４６】
（データ演算処理）
次に、コンピュータ５７は、第１測定のスペクトルデータと第２測定のスペクトルデータから、検出器５６由来のベースライン等の除去や波長感度の補正等の一般的なデータ補正を実施する（ステップＳ１１）。
次に、コンピュータ５７は、第１測定のスペクトルデータと第２測定のスペクトルデータの強度を規格化する（ステップＳ１２）。
次に、コンピュータ５７は、第１測定のスペクトルデータと第２測定のスペクトルデータの差分をとり、これを２階差分データとして保存する（ステップＳ１３）。この２階差分データに基づき上述した二次微分ラマンスペクトルの近時曲線Ｒが構成される。
【００４７】
なお、上記のラマン分光測定方法を実施するためにコンピュータ５７は、第１測定時の励起レーザー光の波長帯域が第２測定時の励起レーザー光の波長帯域に含まれるように、波長制御装置５５に波長制御指令を与える。その他、ラマン分光測定装置５０によって実行される処理や適用し得る変形形態は、上記のラマン分光測定方法で説明したとおりである。
また、ステップＳ１２の規格化は、強度の異なる第１測定のスペクトルデータと第２測定のスペクトルデータのベース部の強度を揃えることを目的とする。具体的な方法は例えば以下の通り。
（１）各々、スペクトルデータの最大値を１、最小値を０とする。このとき、最大値は、ラマンピークが現れていない波長領域とする。
（２）各々、平均値を０、標準偏差を１とする。
【符号の説明】
【００４８】
１０   第１測定時の励起レーザー光のスペクトル
１１   第１測定により得られたスペクトル
１１Ｒ ラマンピーク
２０   第２測定時の励起レーザー光のスペクトル
２１   第２測定により得られたスペクトル
２１Ｒ ラマンピーク
５０   ラマン分光測定装置
５１   レーザーダイオード
５２   分光器
５３   励起光光学系
５４   測定光光学系
５５   波長制御装置
５５ａ 温度制御機器
５６   検出器
５７   コンピュータ
５７ａ 温度制御プロトコル
５７ｂ データ演算手段
６０   測定対象物
Ｒ     二次微分ラマンスペクトルの近時曲線
【図１】
2015059800.tif 000004
【図２】
2015059800.tif 000005
【図３】
2015059800.tif 000006
【図４】
2015059800.tif 000007
【図５】
2015059800.tif 000008
【図６】
2015059800.tif 000009
【図７】
2015059800.tif 000010
【図８】
2015059800.tif 000011
【図９】
2015059800.tif 000012
【図１０】
2015059800.tif 000013
【図１１】
2015059800.tif 000014