(57)【要約】【課題】迅速で安価なプローブ作製方法、プローブセット、及び表現型決定遺伝子検出方法を提供する。【解決手段】本発明のプローブ作製方法は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出するプローブの作製方法であって、前記特定の表現型決定遺伝子中の断片Ａと、他の表現型決定遺伝子中の当該断片Ａに対応する断片Ｂとを含む断片セットを、前記表現型決定遺伝子群の既知の配列情報に基づいて複数設定する断片設定工程と、前記断片Ａおよび前記断片ＢのＴｍ値を用いて複数の前記断片セットからプローブ候補の前記断片セットを選択するプローブ選択工程と、を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出するプローブの作製方法であって、
前記特定の表現型決定遺伝子中の断片Ａと、他の表現型決定遺伝子中の当該断片Ａに対応する断片Ｂとを含む断片セットを、前記表現型決定遺伝子群の既知の配列情報に基づいて複数設定する断片設定工程と、
前記断片Ａおよび前記断片ＢのＴｍ値を用いて複数の前記断片セットからプローブ候補の前記断片セットを選択するプローブ選択工程と、
を含むことを特徴とするプローブ作製方法。
【請求項２】
前記断片Ａおよび前記断片ＢのＴｍ値を換算するＴｍ値換算工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のプローブ作製方法。
【請求項３】
前記プローブ選択工程において、前記断片Ａおよび前記断片ＢのＴｍ値を用い、マハラノビスの汎距離による線形判別式に基づいて、複数の前記断片セットのうち、前記断片セットの相関係数のｐ値が相対的に低い前記断片セットを前記プローブ候補として選択することを特徴とする請求項１または２に記載のプローブ作製方法。
【請求項４】
前記プローブ選択工程において、
複数の前記断片セットのうち、ある前記断片セットに含まれる断片ＡのＴｍ値と、断片ＢのＴｍ値との差を、複数の前記断片セットについてそれぞれ求める工程と、
複数の前記断片セットのうち、ある前記断片セットについて、当該断片セットの５’末端からの位置を第１軸に、当該断片セットについての前記Ｔｍ値の差を第２軸にそれぞれプロットした場合に、前記Ｔｍ値の差の極大値を示す前記断片セットを選択する工程と、
を含むことを特徴とする請求項３に記載のプローブ作製方法。
【請求項５】
前記表現型は、ＲＮＡウイルスの細胞指向性であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ作製方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求項５に記載のプローブ作製方法。
【請求項７】
前記表現型決定遺伝子群は、前記ヒト免疫不全ウイルスの可変領域であることを特徴とする請求項６に記載のプローブ作製方法。
【請求項８】
前記断片Ａ及び前記断片Ｂの塩基数は１０〜３０であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のプローブ作製方法。
【請求項９】
前記Ｔｍ値は最近接塩基対法により求められることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のプローブ作製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプローブ作製方法を用いて得られたことを特徴とするプローブセット。
【請求項１１】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとを含むことを特徴とするプローブセット。
【請求項１２】
塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出する方法であって、
表現型決定遺伝子由来の核酸と、請求項１０又は１１に記載のプローブセットから選ばれる少なくとも一種類のプローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸を検出する検出工程を有することを特徴とする表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１３】
前記検出工程において蛍光色素を用いて前記二本鎖核酸を検出することを特徴とする請求項１２に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１４】
前記検出工程において、分光学的手法を用いて前記二本鎖核酸を検出することを特徴とする請求項１２に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１５】
前記検出工程は、融解曲線を用いて前記二本鎖核酸を検出することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の表現型決定遺伝子検出方法において、前記融解曲線から算出される前記二本鎖核酸のＴｍ値と、前記二本鎖核酸の形成に用いられたプローブのＴｍ値との差を算出する工程と、
算出されたＴｍ値の差と、マハラノビスの汎距離による線形判別式とに基づいて、特定の表現型決定遺伝子と、その他の表現型決定遺伝子を判別する工程と、
を含むことを特徴とする表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１７】
試料から二本鎖ＤＮＡを抽出する工程と、
前記二本鎖ＤＮＡから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する工程と、
前記断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する工程と、
前記プロモーターを付加された断片から、前記表現型決定遺伝子由来の核酸としてＲＮＡ鎖を合成する工程と、
を有することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１８】
試料から二本鎖ＤＮＡを抽出する工程と、
前記二本鎖ＤＮＡから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する工程と、
前記断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する工程と、
前記プロモーターを付加された断片から、ＲＮＡ鎖を合成する工程と、
逆転写反応により、前記ＲＮＡ鎖から当該ｍＲＮＡに相補するＤＮＡと前記ＲＮＡとの複合体を合成する工程と、
前記複合体から前記表現型決定遺伝子由来の核酸として一本鎖ＤＮＡ鎖を合成する工程と、
を有することを特徴とする請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項１９】
前記一本鎖ＤＮＡ鎖を合成する工程は、前記複合体を熱処理して、ＲＮａｓｅ処理する工程を有する請求項１７に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【請求項２０】
前記一本鎖ＤＮＡ鎖を合成する工程は、前記複合体をアルカリ処理する工程を有する請求項１７に記載の表現型決定遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ作製方法、プローブセット、及び表現型決定遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物において、表現型を決定する遺伝子が塩基配列の多様性を有している場合がある。例えば、ＲＮＡウイルス、特にＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ヒト免疫不全ウイルス）は、フィデリティ（正確性）の低い逆転写酵素を有しているため、非常に変異しやすいウイルスである。そのため、ＨＩＶは、遺伝子変異に伴い、抗ＨＩＶ薬に対する抵抗性を獲得する等、多様な表現型を獲得する。
【０００３】
近年、抗ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）薬として、ＣＣＲ５阻害薬が開発されている。ＨＩＶは、ＣＤ４陽性リンパ球に侵入する際、その細胞膜上にある補体受容体ＣＣＲ５（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）又はＣＸＣＲ４（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）に選択的に結合し、細胞内へ侵入する。ＣＣＲ５阻害薬は選択的にＣＣＲ５に結合し、その立体構造を変化させることによりＣＣＲ５指向性ＨＩＶの細胞内への侵入を阻害する。
【０００４】
このように、ＣＣＲ５阻害薬はＣＣＲ５に選択的に結合し、ＣＸＣＲ４には結合しないため、患者は、指向性検査（Ｔｒｏｐｉｓｍ ａｓｓａｙ）を受け、感染ウイルスが、ＣＣＲ５指向性ウイルスであることを確認してからＣＣＲ５阻害薬による治療を受ける必要がある。
【０００５】
指向性検査としては、ジェノタイプ検査及びフェノタイプ検査が挙げられる（非特許文献１参照）。
ジェノタイプ検査は、体内で増殖しているＨＩＶ のｅｎｖ領域の遺伝子解析を行い、得られた塩基配列をデータベースや一定のアルゴリズムと照合して感染ウイルスの指向性を評価する方法である。
フェノタイプ検査は、感染者ウイルス由来のｅｎｖ領域を増幅させ、この増幅した領域の遺伝子を有する感染性ウイルスを再構築し、ＣＣＲ５阻害薬存在下でのＨＩＶ由来のプロテアーゼ活性を測定することにより、感染ウイルスの指向性を評価する方法である。
ここで、ｅｎｖ領域とは、ウイルスを覆う殻となるタンパク質をコードする領域であり、該タンパク質は、宿主細胞表面の受容体に結合し、宿主細胞へウイルスの侵入を可能にする役割を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sing, T., Low, A.J., Beerenwinkel, N., Sander, O., Cheung, P.K., Domingues, F.S., Buch, J., Daumer, M., Kaiser, R., Lengauer, T., Harrigan, P.R.,Antivir Ther 12, 1097-1106(2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した指向性検査は、１週間から１か月程度の時間を要し、検査に高額な費用を要するため未だ改良の余地がある。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、本発明によれば迅速で安価なプローブ作製方法、プローブセット、及び表現型決定遺伝子検出方法を提供できる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、所定のプローブ選択工程を経ることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（４）を提供するものである。
【００１０】
（１）本発明の一実施態様におけるプローブ作製方法は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出するプローブの作製方法であって、前記特定の表現型決定遺伝子中の断片Ａと、他の表現型決定遺伝子中の当該断片Ａに対応する断片Ｂとを含む断片セットを、前記表現型決定遺伝子群の既知の配列情報に基づいて複数設定する断片設定工程と、前記断片Ａおよび前記断片ＢのＴｍ値を用いて複数の前記断片セットからプローブ候補の前記断片セットを選択するプローブ選択工程と、  を含むことを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるプローブセットは、先に記載のプローブ作製方法を用いて得られたことを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるプローブセットは、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとを含むことを特徴とする。
【００１１】
（４）本発明の一実施態様における表現型決定遺伝子検出方法は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出する方法であって、  表現型決定遺伝子由来の核酸と、先に記載のプローブセットから選ばれる少なくとも一種類のプローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸を検出する検出工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、迅速で安価なプローブ作製方法、プローブセット、及び表現型決定遺伝子検出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のプローブ作製方法における工程の一態様を示した図である。
【図２】本発明のプローブ作製方法における工程の一態様を示した図である。
【図３】本発明のプローブ作製方法における工程の一態様を示した図である。
【図４】本発明のプローブ作製方法における工程の一態様を示した図である。
【図５】本発明のプローブ作製方法における工程の一態様を示した図である。
【図６】本発明のプローブ作製方法における工程の一態様を示した図である。
【図７】実施例におけるＴｍ値の差をプロットした結果である。
【図８】実施例における線形判別式に基づく結果である。
【図９】実施例における融解曲線の測定結果である。
【図１０】実施例における融解曲線の測定結果である。
【図１１】実施例における融解曲線の測定結果である。
【図１２】実施例における融解曲線の測定結果である。
【図１３】実施例におけるＴｍ値の測定結果である。
【図１４】実施例における鋳型ＲＮＡの変異数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図１５】実施例における鋳型ＲＮＡの変異数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図１６】実施例における鋳型ＲＮＡの変異数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図１７】実施例における鋳型ＲＮＡの変異数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図１８】実施例における水素結合数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図１９】実施例における水素結合数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図２０】実施例における水素結合数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図２１】実施例における水素結合数とΔＴｍとの関係を示すグラフである。
【図２２】実施例における線形判別結果を示すグラフである。
【図２３】実施例における評価結果を示すグラフである。
【図２４】実施例における電気泳動の結果を示すグラフである。
【図２５】実施例における電気泳動の結果を示すグラフである。
【図２６】実施例における電気泳動の結果を示すグラフである。
【図２７】実施例における融解曲線の測定結果である。
【図２８】実施例におけるＴｍ値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
≪プローブ作製方法≫
［第１実施形態］
ＨＩＶ−１（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ１）は、宿主細胞内へ侵入する際に、ＣＣＲ５に選択的に結合するＣＣＲ５指向性ウイルス（以下、Ｒ５ウイルスともいう。）か、ＣＸＣＲ４に選択的に結合するＣＸＣＲ４指向性ウイルス（以下、Ｘ４ウイルスともいう。）かに大別される。
係る細胞指向性を規定する遺伝子群（以下、表現型決定遺伝子群ともいう。）としては、外被糖タンパク質の可変領域、特に第３可変領域（Ｖ３領域）が挙げられる。Ｖ３領域は、上述したｅｎｖ領域に含まれる遺伝領域である。ＨＩＶは、非常に変異しやすいウイルスであり、遺伝子変異によってもたらされるＶ３領域内のアミノ酸の変化は、ウイルスの細胞指向性などの表現型に影響を与える。従って、感染者の細胞内に存在するＶ３領域は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群といえる。
本実施形態では、ＲＮＡウイルスの細胞指向性、特にヒト免疫不全ウイルスの細胞指向性を決定する遺伝子を検出対象とする。
【００１５】
即ち、本実施形態のプローブ作製方法は、ＨＩＶ−１感染者のサンプル中に存在する細胞指向性を規定する遺伝子群から、Ｒ５ウイルス決定遺伝子を特異的に検出するプローブの作製方法である。
【００１６】
以下、本実施形態のプローブ作製方法における各工程について説明する。
本実施形態のプローブ作成方法は、断片設定工程と、プローブ選択工程とを含む。
断片設定工程は、特定の表現型決定遺伝子中の断片Ａと、他の表現型決定遺伝子中の当該断片Ａに対応する断片Ｂとを含む断片セットを、表現型決定遺伝子群の既知の配列情報に基づいて複数設定する。ここで、特定の表現型決定遺伝子とは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子である。この一例においては、特定の表現型決定遺伝子とは、Ｒ５ウイルスの表現型決定遺伝子である。また断片Ａとは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子の断片であり、この一例においては、Ｒ５ウイルスの表現型決定遺伝子の断片である。また、他の表現型決定遺伝子とは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子以外の表現型決定遺伝子である。この一例においては、他の表現型決定遺伝子とは、Ｘ４ウイルスの表現型決定遺伝子である。また断片Ｂとは、作成するプローブが特異的に検出する表現型決定遺伝子以外の表現型決定遺伝子の断片であり、この一例においては、Ｘ４ウイルスの表現型決定遺伝子の断片である。また、表現型決定遺伝子群の既知の配列情報とは、表現型決定遺伝子群に含まれる塩基対の配列情報であって、遺伝子データベース等に予め記憶されている配列情報である。この一例においては、表現型決定遺伝子群の既知の配列情報とは、ＨＩＶシーケンスデータベースに記憶されているＨＩＶ−１の遺伝子配列情報である。
【００１７】
ここで、断片設定工程における具体的な手順について説明する。断片設定工程において、ＨＩＶシーケンスデータベースに記憶されているＨＩＶ−１の遺伝子配列情報のうち、Ｒ５ウイルスのＶ３領域の遺伝子配列情報を取得する。次に、取得したＲ５ウイルスの遺伝子配列情報のうち、Ｖ３領域の末端から順に複数の塩基対を有する断片Ａを設定する。ここで、Ｖ３領域には約１００対の塩基対が含まれている。この断片設定工程において、このＶ３領域に含まれる約１００対の塩基対のうち、連続する複数の塩基対を、１つの断片Ａとして設定する。
【００１８】
ここで、連続する塩基対の数は例えば１０対から３０対である。すなわち、断片Ａ及び断片Ｂの塩基数は例えば１０から３０である。Ｖ３領域の一端の塩基対から他端の塩基対まで順に断片Ａを設定することにより、複数の断片Ａを設定する。
【００１９】
また、断片設定工程において、ＨＩＶシーケンスデータベースに記憶されているＨＩＶ−１の遺伝子配列情報のうち、Ｘ４ウイルスのＶ３領域の遺伝子配列情報を取得する。次に、取得したＸ４ウイルスの遺伝子配列情報のうち、Ｖ３領域の末端から順に複数の塩基対を有する断片Ｂを設定する。この断片Ｂについても、上述した断片Ａと同様にして、Ｖ３領域に含まれる約１００対の塩基対のうち、連続する複数（例えば１０対から３０対）の塩基対を、１つの断片Ｂとして設定する。Ｖ３領域の一端の塩基対から他端の塩基対まで順に断片Ｂを設定することにより、複数の断片Ｂを設定する。
【００２０】
プローブ選択工程は、断片Ａおよび断片ＢのＴｍ値を用いて複数の断片セットからプローブ候補の断片セットを選択する。ここで、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値とは、ＤＮＡの融解温度を含む。
このプローブ選択工程における具体的な手順について説明する。プローブ選択工程において、まず、ある断片ＡのＴｍ値（第１のＴｍ値）と、この断片Ａに対応する断片ＢとのＴｍ値（第２のＴｍ値）との差を求める。ここで、ある断片Ａに対応する断片Ｂとは、複数の断片Ｂのうち、ある断片Ａが示すＶ３領域の塩基対の位置と同じ位置の塩基対を示す断片Ｂである。一例として、Ｖ３領域に１００対の塩基対が含まれる場合に、Ｖ３領域の一端の塩基対を塩基対１とし、他端の塩基対を塩基対１００とする。この場合において、ある断片Ａが、塩基対１８から塩基対４５までの領域を示す断片であるとき、この断片Ａに対応する断片Ｂとは、複数の断片Ｂのうちの塩基対１８から塩基対４５までの領域を示す断片Ｂである。以下の説明において、ある断片のＶ３領域における塩基対の領域のうち小さい番号を有する塩基対の位置を、ある断片の開始位置と記載する。一例として、ある断片が、塩基対１８から塩基対４５までの領域を示す断片であるとき、塩基対１８を、この断片の開始位置と記載する。また、ある断片が、塩基対１８から塩基対４５までの領域を示す断片であるとき、この断片を、開始位置が塩基対１８である断片とも記載する。
【００２１】
次に、上述のようにして求めたＴｍ値の差を縦軸に、Ｖ３領域の一端からの断片の開始位置を横軸にして、断片Ａおよび断片Ｂの開始位置毎に、これらの断片のＴｍ値の差をプロットしたグラフを作成する。ここで、Ｖ３領域の一端とは、一例として、Ｖ３領域の５’末端である。次に、作成したグラフにおいて、Ｔｍ値の差が極大値をとる塩基対の位置と、開始位置とが一致する断片Ａおよび断片Ｂを、複数の断片Ａおよび複数の断片Ｂのなかから選択する。
すなわち、プローブ選択工程において、複数の断片セットのうち、ある断片セットに含まれる断片ＡのＴｍ値と、断片ＢのＴｍ値との差を、複数の断片セットについてそれぞれ求める工程と、複数の断片セットのうち、ある断片セットについて、当該断片セットの５’末端からの位置を第１軸に、当該断片セットについてのＴｍ値の差を第２軸にそれぞれプロットした場合に、Ｔｍ値の差の極大値を示す断片セットを選択する工程とを含む。
【００２２】
この断片セットの選択において、断片Ａおよび断片ＢのＴｍ値を用い、マハラノビスの汎距離による線形判別式に基づいて、複数の断片セットのうち、相関係数のｐ値が相対的に低い断片セットをプローブ候補として選択する。ここで、マハラノビスの汎距離による線形判別式とは、後述する式（２）である。
一例として、上述のようにして選択した複数の断片セットのそれぞれについて、相関係数のｐ値を求め、求めた相関係数のｐ値が低い方から所定数の断片セットを選択する。この相関係数のｐ値は、ＨＩＶ−１検体を第１群（ここでは、Ｘ４ウイルス株の群）と第２群（ここでは、Ｒ５ウイルス株の群）とに判別する際の正判別率を示す値であり、ｐ値が低いほど正判別率が高い。したがって、相関係数のｐ値が低い断片セットを用いれば、ある検体を高い正判別率によってＸ４ウイルス株の群と、Ｒ５ウイルス株の群とのいずれの群に属するかを判別することができる。また、検体が属する群を判別する際の断片セットが少ないほど、迅速かつ安価に判別することができる。
一例として、Ｔｍ値の差が極大値をとる断片セットが２０セットあり、その中から４セットの断片セットを選択する場合には、選択した２０セットの断片セットのそれぞれについて、相関係数のｐ値を求め、求めた相関係数のｐ値が低い方から４セットの断片セットを選択する。
【００２３】
なお、上述した、断片Ａおよび断片ＢのＴｍ値は、予め算出されていてもよく、次に示すＴｍ値換算工程において換算されることにより算出されてもよい。この場合、Ｔｍ値換算工程は、上述した断片設定工程において設定された複数の断片Ａ、および複数の断片Ｂのそれぞれについて、Ｔｍ値を換算する。また、この場合、Ｔｍ値は最近接塩基対法によって換算されてもよい。
【００２４】
本実施形態のプローブ作製方法により、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとを含むプローブセットが得られる。
【００２５】
［第２実施形態］
本実施形態のプローブ作製方法は、上述したＨＩＶ以外のウイルスの型判定に用いられる方法である。
本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、ＨＰＶ（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）においては、例えば、発癌性リスク決定遺伝子である。係る遺伝子を検出するプローブセットを用いることにより、ＨＰＶ感染者の感染ウイルスは、ＨＰＶ６，１１，４０，４２，４３，４４，５４，６１，７０,７２,８１,ＣＰ６１０８型等の低リスク型であるのか、 ＨＰＶ １６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６８，７３，８２型等の高リスク型であるのかを判別することができる。
また、本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、ＨＣＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ ｖｉｒｕｓ）においては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）感受性決定遺伝子である。係る遺伝子を検出するプローブセットを用いることにより、ＩＦＮ治療の効果予測をすることができる。ＨＣＶの遺伝子型としては、１ａ型、１ｂ型、１ｃ型、２ａ型、２ｂ型、２ｃ型、３ａ型、３ｂ型、４型、５ａ型、６ｂ型が挙げられ、遺伝子型が１ｂの場合は完全緩解率が５０％、１ｂ以外では８０から９０％に及ぶと判定されている。
【００２６】
［第３実施形態］
本実施形態のプローブ作製方法は、リボソームの小サブユニットｒＲＮＡ系統解析を利用したものである。本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、細菌等の原核生物においては、１６ＳｒＲＮＡであり、真菌等の真核生物においては、１８ＳｒＲＮＡである。
本実施形態に係る表現型とは、例えば敗血症等の感染症起因性をいう。本実施形態によれば、特定の感染症起因性を有する菌を特異的に検出するプローブを作製できる。
【００２７】
［第４実施形態］
本実施形態のプローブ作製方法は、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）のタイピングに用いられる方法である。
本実施形態に係る表現型決定遺伝子は、例えば、疾患発症リスク決定遺伝子である。係る遺伝子を検出するプローブセットを用いることにより、被験者のＨＬＡが糖尿病になりやすい型（Ｂ５４、ＤＱＢ１＊０４：０１、ＤＲＢ１＊０４：０５等)であるのか、腫瘍性大腸炎を発症しやすい型(ＤＲＢ１＊０９：０１、ＤＲ２、Ｂ５２等)、ベーチェット病にかかりやすい型(Ｂ５１)であるのか等を判別することができる。
【００２８】
≪表現型決定遺伝子検出方法≫
［第１実施形態］
本実施形態の表現型決定遺伝子検出方法は、塩基配列の多様性を有する表現型決定遺伝子群から、特定の表現型決定遺伝子を特異的に検出する方法である。
以下、一例として、ＨＩＶ−１感染者のサンプル中に存在する細胞指向性を規定する遺伝子群から、Ｒ５ウイルス決定遺伝子を特異的に検出する方法における各工程について説明する。
【００２９】
本実施形態の表現型決定遺伝子検出方法は、Ｒ５ウイルス決定遺伝子由来の核酸と、上述したプローブ作製方法の第１実施形態により得られたプローブセットから選ばれる少なくとも一種類のプローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸を検出する検出工程を有する。
Ｒ５ウイルス決定遺伝子由来の核酸としては、ＲＮＡ鎖であっても、一本鎖ＤＮＡであってもよい。先ず、ＲＮＡ鎖の合成方法について説明する。
【００３０】
（ＲＮＡ鎖の合成方法）
本実施形態において、先ず、試料から二本鎖ＤＮＡを抽出する。試料としては、例えば血清、リンパ球、喀痰、尿、髄液、胸液、腹水等が挙げられ、一例としてＨＩＶ−１由来の二本鎖ＤＮＡを抽出する観点からはリンパ球が好ましい。
例えば、血清から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。血清試料に緩衝液を加え、５０℃で一昼夜反応させた後、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）で細胞を溶解するとともに、ＲＮａｓｅでＲＮＡを消化する。次いで、タンパク質をプロテイナーゼＫで消化し、抽出液中のタンパク質をフェノール抽出で除去する。残液にエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿として回収する。
また、例えば、リンパ球から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ法でリンパ球分画を得たのちに、フェノール・クロロホルム法でＤＮＡを抽出する。赤血球の混入の多い検体は、１０倍量のＴＥ緩衝液を加えて溶血させ、１０，０００回転で１０分間遠心する。この操作を２回行い、ペレット試料とした後にＤＮＡを抽出する。
また、例えば、喀痰から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。  １Ｎ ＮａＯＨを等量の試料に加えて室温で１０分間混和した後、そのまま、あるいは１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を加えて、１００００回転で１０分間遠心を行う。ＰＢＳで２回洗浄後、得られた残渣を４０〜１００μＬのリゾチーム溶液で溶解する。その後、３７℃で３０分から２時間ほど反応させ、さらにプロテイナーゼＫを２００μｇ／ｍｌの濃度で加えて３７℃で一昼夜反応させる。試料中には細胞や夾雑物を多く含むため、ＤＮＡの抽出は一例としてフェノール・クロロホルム法を用いて行うことが好ましい。
また、例えば、尿、髄液、胸液、腹水から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。遠心操作で細胞成分をペレットにして試料とするか、または何ら濃縮操作をせずに直接ＰＣＲ検体としてもよい。赤血球の混入の多い試料は、例えば溶血操作を行う。これら試料からのＤＮＡ抽出法は一例としてフェノール・クロロホルム法を用いて行う。
【００３１】
次いで、前記二本鎖ＤＮＡから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する。核酸増幅反応としては、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００３２】
核酸増幅反応に用いられる試薬は、採用する核酸増幅反応に合わせて適当な核酸増幅反応用試薬を使用することが好ましい。例えば、核酸増幅反応としてＰＣＲを採用する場合には、ＰＣＲを構成する各反応に必要な試薬、即ちｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼが用いられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用い、一例として試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼや、プルーフリーディング（校正）機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらの試薬は市販されており、容易に入手可能である。
【００３３】
鋳型ＤＮＡや核酸増幅に必要な試薬等を含む水性成分は、核酸増幅反応に適した溶液として調製される。例えば、ＰＣＲ反応が良好に進行するように、トリス−塩酸等のバッファーを用いて、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０程度の溶液とすることが好ましい。
【００３４】
本実施形態では、表現型決定遺伝子を含む断片を例えばＰＣＲ反応で増幅可能な一対のプライマーセットが用いられる。
【００３５】
次いで、増幅された前記二本鎖ＤＮＡから表現型決定遺伝子を含む断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する。一例として、前記断片のプラス鎖の３’末端にハイブリダイズし得る配列の５’末端にプロモーターの配列を付加してなるプライマーを用いて上記核酸増幅反応を行う方法が挙げられる（図１参照）。プロモーターとしては、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター等が挙げられ、汎用性の観点からＴ７プロモーターが好ましい。
二本鎖ＤＮＡから表現型決定遺伝子を含む断片を増幅する工程と、プロモーターを付加する工程は同時に行われてもよい。即ち、二本鎖ＤＮＡから標的遺伝子を含む断片を増幅する際に、プロモーター配列を有するプライマーを用いて増幅反応を行ってもよい。
【００３６】
次いで、前記プロモーターを付加された断片から、前記表現型決定遺伝子由来の核酸としてＲＮＡ鎖を合成する（図２参照）。ＲＮＡ鎖合成における転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３７】
（一本鎖ＤＮＡの合成方法１）
次いで、Ｒ５ウイルス決定遺伝子由来の核酸の合成方法として、一本鎖ＤＮＡの合成方法について説明する。
本実施形態では、逆転写反応により、（ＲＮＡ鎖の合成方法）で得られた前記ＲＮＡ鎖から当該ＲＮＡに相補するＤＮＡを合成し、該ＤＮＡと前記ＲＮＡとの複合体を形成させる（図３参照）。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。逆転写されたＤＮＡはＲＮＡとの複合体を形成する。
【００３８】
次いで、形成したＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を熱処理してＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖とに解離させ、ＲＮａｓｅ処理により前記ＲＮＡ鎖を分解して一本鎖ＤＮＡとする。前記複合体から前記表現型決定遺伝子由来の核酸として一本鎖ＤＮＡ鎖を合成する工程としては、ＲＮａｓｅを添加して前記複合体を熱処理に付する工程が挙げられる。
ＲＮａｓｅとしては、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＴ２ 、ＲＮａｓｅＵ２ｉ、ＲＮａｓｅＶ１等が挙げられ、一例として汎用性の観点からＲＮａｓｅＡが好ましい。更に、例えば、安価であることから、ウシ膵臓由来ＲＮａｓｅＡが好ましい。
【００３９】
当該工程において、例えば、ＲＮａｓｅを添加して前記複合体を熱処理に付する（図４参照）。熱処理によりＤＮＡ−ＲＮＡ複合体からＤＮＡとＲＮＡを解離させると同時に、解離したＲＮＡを効率よく分解する観点から、加熱温度としては、例えば、６５℃〜１００℃、８０℃〜１００℃、９０℃〜９５℃である。処理時間としては、例えば、２秒〜１分、２秒〜３０秒、２秒〜６秒である。上記ＲＮａｓｅＡは特に耐熱性に優れているため、当該熱処理工程に好適に用いられる。
【００４０】
（一本鎖ＤＮＡの合成方法２）
また、前記一本鎖ＤＮＡ鎖を合成する工程は、上述したＲＮａｓｅ処理工程に代えて、前記複合体をアルカリ処理する工程を有していてもよい。
アルカリ処理に用いられるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム等のアルカリ土類金属水酸化物；炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩等が挙げられ、例えばアルカリ金属水酸化物であり、一例として水酸化ナトリウムである。
用いられる水酸化ナトリウムの濃度としては、例えば１ｍＭ〜１００ｍＭ、５ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭである。アルカリ処理におけるｐＨは、例えば１０〜１４、１２〜１４である。アルカリ処理における温度は、例えば５０〜８０℃、６０〜７０℃である。アルカリ処理における反応時間は、例えば５〜１２０分、１０〜３０分である。
当該工程を経ることにより、逆転写反応において未反応のＲＮＡやＲＮＡ誘導体等の不純物を容易に取り除くことができ、表現型決定遺伝子由来の核酸として、ＲＮＡ鎖に相補する一本鎖ＤＮＡ鎖を得ることができる。
【００４１】
（一本鎖ＤＮＡの合成方法３）
また、一本鎖ＤＮＡの合成方法としては、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が挙げられる。一例として図５に示されるように、試料から抽出した二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行う。この鋳型ＤＮＡの特定領域をＰＣＲ反応で増幅可能な一対のプライマーセットにおいて、一方のプライマーをビオチンで修飾する。係るプライマーセットを用いて反応させて得られた増幅産物である二本鎖のうち、ビオチン修飾プライマーが伸長してなる一方の鎖は５’末端にビオチンを有している。そのため、アビジン修飾磁気ビーズを用いることにより、ビオチン修飾一本鎖ＤＮＡのみを容易に回収することができる。また、一方のプライマーをアビジンで修飾し、ビオチン修飾磁気ビーズを用いてもよい。
また、当該合成方法においては、アビジン−ビオチン結合を利用することに限定されず、一方のプライマーをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、ビーズをアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを用いてもよい。
【００４２】
（一本鎖ＤＮＡの合成方法４）
また、一本鎖ＤＮＡの合成方法としては、非対称ＰＣＲを利用した方法が挙げられる。一例として図６に示されるように、試料から抽出した二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行う。この鋳型ＤＮＡの特定領域をＰＣＲ反応で増幅可能な一対のプライマーセット（プライマーＡ及びプライマーＢ）において、プライマーの分子数比に大差をつける。係るプライマーセットを用いて反応させて得られた増幅産物において、分子数の少ないプライマー（プライマーＢ）が伸長してなる一本鎖と、該一本鎖に対応して、分子数の多いプライマー（プライマーＡ）が伸長してなる一本鎖と、が二本鎖を形成する。しかし、プライマーＢの分子数を超えて増幅したプライマーＡが伸長してなる鎖は、一本鎖のままで存在する。
【００４３】
本実施形態の表現型決定遺伝子検出方法は、以上のようにして得られたＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡと、上述したプローブセットからから選ばれる少なくとも一種類のプローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸を検出する検出工程を有する。
【００４４】
検出工程としては、例えば蛍光色素を用いて前記二本鎖核酸を検出する工程が挙げられる。
蛍光色素を用いる工程として、一例として、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発するサイバーグリーン、ＳＹＴＯ９等の色素を用いる方法と、蛍光物質を結合させたプローブを用いる方法が挙げられる。蛍光物質としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８等が挙げられる。
【００４５】
蛍光色素を用いた検出工程としては、融解曲線を用いて前記二本鎖核酸を検出する工程が挙げられる。融解曲線とは、温度を低温から徐々に上げることにより、前記二本鎖核酸が一本鎖状態に変性するまでの蛍光強度を測定して得られる曲線をいう。融解曲線の負の一次微分曲線は温度変化に対する蛍光変化量を示すもので、変化量が最大のところがＴｍとなる。融解曲線を用いることで、設計したプローブの表現型決定遺伝子との親和性を定量化できる。
【００４６】
また、蛍光色素を用いた検出工程としては、各患者由来の上記表現型決定遺伝子を基板上にスポットし、係る基板を核酸マイクロアレイとして用い、各スポットにおけるプローブとの親和性を、蛍光強度を介して測定する工程も挙げられる。
【００４７】
蛍光色素を用いた検出工程は、感度が高いため、測定に必要とされる核酸試料が少量で済み、多検体同時測定が容易である点で優れている。
【００４８】
また、検出工程としては、分光学的手法を用いて前記二本鎖核酸を検出する工程が挙げられる。分光学的手法を用いる工程としては、上述した融解曲線を用いて前記二本鎖核酸を検出する工程が挙げられる。二重鎖の核酸の温度を上昇させ、一本鎖に解離する過程に伴う２６０ｎｍにおける吸光度変化を測定し、Ｔｍを決定することができる。
分光学的手法を用いた検出工程は、蛍光色素を用いる必要がないため、蛍光色素の影響を排除することができる。また、プローブを蛍光色素で修飾する必要がないため測定が容易である点で優れている。
【００４９】
また、Ｔｍ値の算出（換算）工程としては、上述した融解曲線から算出される二本鎖核酸のＴｍ値と、二本鎖核酸の形成に用いられたプローブのＴｍ値との差を算出する工程が挙げられる。また、表現型決定遺伝子を判別する工程としては、算出されたＴｍ値の差と、マハラノビスの汎距離による線形判別式とに基づいて、特定の表現型決定遺伝子と、その他の表現型決定遺伝子を判別する工程が挙げられる。
【００５０】
以上、本実施形態によれば、プローブと対象核酸との相互作用を解析することにより、ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を解析せずとも、対象核酸の配列解析ができる。
【００５１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
［ＨＩＶ指向性検査用プローブの設計］
米国ロスアラモス国立研究所のＨＩＶデータベースであるＨＩＶシークエンスデータベース（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）からＨＩＶ−１ｓｕｂｔｙｐｅＢの指向性が既に示されているＶ３領域の配列情報（６１２検体由来のＲ５ウイルス株及び４７検体由来のＸ４ウイルス株のＶ３領域の塩基配列情報）を取得した。
次いで、取得した塩基配列情報において、各塩基配列の５’末端から１６〜２６塩基の断片を設定し、各検体由来のウイルスにおいて対応する断片のＴｍ値を、最近接塩基法により、下記式（１）を用いて算出した。
【００５３】
【数１】
2015092847.tif 000002
【００５４】
式（１）中、ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計[ｋｃａｌ／ｍｏｌ] を表し、ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計［ｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ］ を表し、Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ・ｍｏｌ）を表し、Ｃｔは、核酸のｔｏｔａｌモル濃度［ｍｏｌ／ｌ］を表し、Ｎａ＋は、Ｎａ＋のモル濃度［ｍｏｌ／ｌ］を表す。
【００５５】
Ｒ５ウイルス株とＸ４ウイルス株の対応する断片（以下、断片セットともいう。）における算出したＴｍ値の差をプロットした。結果を図７に示す。図７の横軸は、Ｖ３領域の５’末端の塩基を１としたときの各断片の５’末端の塩基の番号（Ｖ３領域の各部位の位置）を表し、図７の縦軸は、Ｖ３領域の各部位におけるＴｍ値の差を表す。
図７のグラフにおいて、２０種類の断片セットが極大値を示し、これらの断片セットをプローブ候補とした。
【００５６】
プローブ候補２０種の断片セットについて、上述の式（１）に基づいて算出したＴｍ値を用い、下記式（２）で表されるマハラノビスの汎距離による線形判別式に基づいて、ｐ値を算出した。
【００５７】
【数２】
2015092847.tif 000003
【００５８】
式（２）中、ｘは多変数ベクトルを表し、￣Ｘｋ（エックス・バー・ケイ）は多変数ベクトルｘの平均を表し、Ｓｋ（エス・ケイ）は多変数ベクトルｘの共分散行列を表す。この式（２）は、Ｘ４ウイルス株の群を第１群とし、Ｒ５ウイルス株の群を第２群としたとき、ＨＩＶ−１の検体を多変数ベクトルｘによって表した場合に、Ｄ２２≧Ｄ１２であれば、この検体は第１群、すなわちＸ４ウイルス株の群に属し、Ｄ２２＜Ｄ１２であれば、この検体は第２群、すなわちＲ５ウイルス株の群に属することを示す。すなわち、次に示す式（３）のｚの正負によって、検体がＸ４ウイルス株の群に属するか、Ｒ５ウイルス株の群に属するかを判別することができる。
【００５９】
【数３】
2015092847.tif 000004
【００６０】
この式（３）は、次に示す式（４）のような一次式によっても表すことができる。
【００６１】
【数４】
2015092847.tif 000005
【００６２】
この式（４）は、検体がＸ４ウイルス株の群に属するか、Ｒ５ウイルス株の群に属するかを判別する判別式として用いることができる。このとき、２０種類の断片セットのうちから、相関係数のｐ値が相対的に低い断片セットを選択することにより、判別精度の低下を軽減しつつ判別式を簡素化することができる。ここでは、２０種類の断片セットについて、式（１）〜（４）を用いてｐ値をそれぞれ算出し、算出したｐ値のうち、ｐ値の低い方から４種類の断片セットをＨＩＶ指向性検査用プローブ（Ｘ１８、Ｘ３３、Ｘ７５、Ｘ８０）として選出した。この選択した４種類の断片セットによる判別結果を図８に示す。
算出したｐ値のうち、最も低いｐ値をとる４種類の断片セットをＨＩＶ指向性検査用プローブ（Ｘ１８、Ｘ３３、Ｘ７５、Ｘ８０）として選出した。
Ｘ１８は以下の配列を表す。
ＣＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＧＧ（配列番号１：２７ｍｅｒ）
Ｘ３３は以下の配列を表す。
ＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧ（配列番号２：２２ｍｅｒ）
Ｘ７５は以下の配列を表す。
ＴＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＧ（配列番号３：２０ｍｅｒ）
Ｘ８０は以下の配列を表す。
ＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＧ（配列番号４：２５ｍｅｒ）
【００６３】
［Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの抽出］
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にＨＩＶ患者（３６検体）の血液を重層し、室温、１５００ｒｐｍで４０分遠心分離をし、リンパ球層を採取した。
採取したリンパ球に、２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清；Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）含有ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）１０ｍＬを加え、室温、１２００ｒｐｍで１０分遠心分離をし、上清を除いた。沈澱を２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ５ｍＬに溶解したのち、室温、１０００ｒｐｍで１０分遠心分離をし、上清を除いた。
次いで、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて沈澱からＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した。詳細には、沈澱を２００μＬ  ＰＢＳに懸濁し、２０μＬ  ＱＩＡＧＥＮ  ｐｒｏｔｅａｓｅ及び、２００μＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬを加え、５６℃で１０分インキュベートしリンパ球を溶解した。これに、２００μＬエタノールを加えた後、溶液全量をスピンカラムに移し、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、このカラムに５００μＬ  ＢｕｆｆｅｒＡＷ１を加え、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。更に、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、このカラムに５００μＬ  ＢｕｆｆｅｒＡＷ２を加え、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。更に、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、１４０００ｒｐｍで１分間遠心した。スピンカラムを１．５ｍＬチューブに移した後、このカラムに２００μＬ  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１分間インキュベートし、８０００ｒｐｍで１分間遠心し、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ溶解液を回収した。
【００６４】
［１ｓｔＰＣＲ］
ＨＩＶ−１のＣ２Ｖ３領域約４２０ｂｐ（７３７７−６９５５）をＰＣＲにより増幅した。反応液を表１に記載の組成となるように調製し、９４℃で１分間保持した後、９４℃１０秒、４８℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを５サイクル行い、９４℃５秒、５２℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを２５サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（１）ｅｎｖ６９５５−Ｆ (２１ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＹＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡ−３’］（配列番号５）
（２）ｅｎｖ７３７７Ｌ−Ｒ (２６ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＹＡＣＡＡＴＴＡＡＡ−３’］（配列番号６）
【００６５】
【表１】
2015092847.tif 000006
【００６６】
［２ｎｄＰＣＲ］
１ｓｔＰＣＲで得られた反応液１μＬを用いて、ＨＩＶ−１のＣ２Ｖ３領域約３３０ｂｐ（７３３７−７００５）をＰＣＲにより増幅した。２ｎｄＰＣＲ用の反応液を表２に記載の組成となるように調製し、１ｓｔＰＣＲで得られた反応液１μＬを添加し、９４℃で１分間保持した後、９４℃５秒、４８℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを５サイクル行い、９４℃５秒、６０℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを３０サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（３）ｅｎｖ７００５−Ｆ (２０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＴＴＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＴＡＧＣＡＧＡ−３’］（配列番号７）
（４）ｅｎｖ７３３７Ｂ−Ｒ (２０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧ−３’］（配列番号８）
（５）ｅｎｖ７３３７Ｅ−Ｒ (２０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＡＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧ−３’］（配列番号９）
【００６７】
【表２】
2015092847.tif 000007
【００６８】
［３ｒｄＰＣＲ］
２ｎｄＰＣＲで得られた反応液５０μＬを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、５０μＬの溶解液を得た。この溶解液を水で１０倍希釈した後、３ｒｄＰＣＲ用の反応液を表３に記載の組成となるように調製し、上記１０倍希釈した溶解液１０μＬを添加し、９４℃で１分間保持した後、９４℃５秒、６０℃１０秒、７２℃１５秒の３ステップＰＣＲを３０サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。（６）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ (３０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡ−３’］（配列番号１０）
（７）ｅｎｖ−Ｔ７−Ｒ(４０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴ−３’］（配列番号１１）
【００６９】
【表３】
2015092847.tif 000008
【００７０】
３ｒｄＰＣＲにより、２ｎｄＰＣＲで得られた２本鎖ＤＮＡのマイナス鎖の５’末端にＴ７プロモーターを有する増幅産物が得られた。尚、本実施例においてはＰＣＲを３回に分けているが、まとめて１度に行ってもよい。
【００７１】
［ＲＮＡの合成］
３ｒｄＰＣＲにより得られたＤＮＡからＲｉｂｏＭＡＸ（商標名）Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）を用いて、ＲＮＡを合成した。
先ず表４に記載の組成となるように反応液を調製した後、３７℃で２時間反応させた。
【００７２】
【表４】
2015092847.tif 000009
【００７３】
上記反応後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１μｌ添加し、３７℃３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製を行った。
【００７４】
［融解曲線の測定１］
合成したＲＮＡを用いて、表５に記載の組成となるように反応液を調製した後、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標名）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて融解曲線の測定を行った。Ｒｕｎ  ｍｅｔｈｏｄは、６５℃１５分／Ｍｅｌｔ  ｃｕｒｖｅ  ｓｔａｇｅ／２０℃１分／９５℃１５秒であった。尚、２０℃から９５℃までの昇温を９０分かけて行った。
【００７５】
【表５】
2015092847.tif 000010
【００７６】
表５中、ＳＹＴＯ９は、ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（商標名）ＨＲＭマスターミックス試薬キットに含まれているＳＹＴＯ９  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを意味する。Ｘ１８を用いた場合の融解曲線の測定結果を図９〜１２に示す。図９は、鋳型として用いたＲＮＡの変異が０個の場合の結果であり、図１０は、鋳型として用いたＲＮＡの変異が１個の場合の結果であり、図１１は、鋳型として用いたＲＮＡの変異が２個の場合の結果であり、図１２は、鋳型として用いたＲＮＡの変異が多数の場合の結果である。図９〜１２に示すように、鋳型として用いたＲＮＡの変異が増えるにつれて融解曲線のピーク（Ｔｍ値）が左にシフトし、変異が多数の場合にはピークが消失することが確認された。
【００７７】
各ＨＩＶ指向性検査用プローブ（Ｘ１８、Ｘ３３、Ｘ７５、Ｘ８０）と患者由来の各ＲＮＡとを用いてＴｍ値を測定し、野生型Ｒ５株のＴｍ値との差を算出した。結果を図１３に示す。図１３中、ＩＤは各患者の検体番号を示す。尚、図１３中、Ｎ．Ｄ．は変異多数につきＴｍ値が求まらなかったことを意味する。
また、図１３に基づき、各プローブを用いた場合の鋳型ＲＮＡの変異数と上記Ｔｍ値の差（ΔＴｍ）との関係を示したグラフを図１４〜１７に示す。図１４〜１７に示すように、各グラフにおける相関係数は−０．８７、−０．８３、−０．７５、−０．７７であり、鋳型ＲＮＡの変異数とΔＴｍの間に相関があることが確認された。尚、Ｎ．Ｄ．の場合のΔＴｍを−２５℃と仮定した。
また、同様に、各プローブにおける水素結合数とΔＴｍとの関係を示したグラフを図１８〜２１に示す。図１８〜２１に示すように、各グラフにおける相関係数は−０．８５、−０．８２、−０．７８、−０．８７であり、水素結合数とΔＴｍの間に相関があることが確認された。尚、Ｎ．Ｄ．の場合のΔＴｍを−２５℃と仮定した。
【００７８】
［Ｔｍ値のマハラビノスの汎距離による線形判別］
各上記Ｔｍ値を用い、前記式（２）で表されるマハラノビスの汎距離による線形判別式に基づいて、前記式（３）、式（４）で表されるＺ値を算出した。線形判別結果を図２２に示す。図２２中、横軸はサンプル番号を示し、縦軸はＺ値を示す。図２２に示すように、Ｒ５ウイルスとＸ５ウイルスが精度よく判別されることが確認された。
また、指向性を識別するアルゴリズムＧｅｎｏ２ｐｈｅｎｏ（ｇ２ｐともいう）による判別結果との対比を図２３に示す。図２３に示すように、マハラビノスの汎距離による線形判別は、Ｇｅｎｏ２ｐｈｅｎｏによる判別結果とほぼ同じ結果を示すことが確認された。
【００７９】
［ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの合成］
上記［ＲＮＡの合成］で得られたＲＮＡを用いて、表６に記載の組成となるように反応液を調製した後、６５℃で５分間保持した後、氷上に２分おいた。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（８）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ (３０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡ−３’］（配列番号１０）
【００８０】
【表６】
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【００８１】
次いで、上記反応液に５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒを４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴを１μＬ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を１μＬ加え、５０℃で１５分反応させた後、５００ｍＭ  ＥＤＴＡを１μＬ加えて反応を停止させＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを合成した。
【００８２】
［一本鎖ＤＮＡの合成１（ＲＮａｓｅ処理）］
上記ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いて、表７に記載の組成となるように反応液を調製した後、９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持した。反応液のうち１０μについて、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、反応液中のＲＮＡが分解されていることを確認した。結果を図２４に示す。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
図２４中、左端のレーンから、ＲＮＡのみを泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持した後、泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅを加え、３７℃１５分保持した後、泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅを加え、９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持した後、泳動したものを示す。
図２４の右端のレーンに示されるように、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅを加え、９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持することによりＲＮＡが分解されていることが確認された。
【００８５】
［一本鎖ＤＮＡ（プラス鎖）の確認］
上記［一本鎖ＤＮＡの合成１（ＲＮａｓｅ処理）］で得られた一本鎖核酸がＤＮＡ（プラス鎖）であることを確認するために、表８に記載の組成となるように反応液を調製した後、９４℃で１分間保持した後、９４℃５秒、６０℃１０秒、７２℃１５秒の３ステップＰＣＲを１サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。反応液のうち２０μＬについて、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図２５に示す。
尚、表８中の２μＭ  Ｐｒｉｍｅｒは下記のいずれかの配列を示す。
（９）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ (３０ｍｅｒ、２μＭ)
［配列：５’−ＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡ−３’］（配列番号１０）
（１０）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｒ(３１ｍｅｒ、２μＭ)
［配列：５’−ＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴ−３’］（配列番号１２）
【００８６】
【表８】
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【００８７】
図２５中、左端のレーンから、ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡのみを泳動した未処理のもの（図２５中、未処理と表記）；２μＭ  Ｐｒｉｍｅｒに替えて水を加えた反応産物を泳動したもの（図２５中、なしと表記）；プライマー（ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ）を加えた反応産物を泳動したもの（図２５中、（＋）と表記）；プライマー（ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｒ）を加えた反応産物を泳動したもの（図２５中、（−）と表記）を示す。
図２５の右端のレーンに示されるように、プライマー（ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｒ）を加えた反応産物からバンドが検出されたことから、［一本鎖ＤＮＡの合成１（ＲＮａｓｅ処理）］で得られた一本鎖核酸がＤＮＡ（プラス鎖）であることが確認された。
【００８８】
［一本鎖ＤＮＡの合成２（アルカリ処理）］
上記ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに、終濃度１０ｍＭ  ＮａＯＨ、終濃度２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加え、６０℃で１５分反応させ、反応液について、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、反応液中の一本鎖がＤＮＡであることを確認した。結果を図２６に示す。
【００８９】
図２６中、左端のレーンから、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをアルカリ処理し、泳動したもの（未処理）；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをアルカリ処理し、ＤＮａｓｅを処理した後、泳動したもの（ＤＮａｓｅ）を示す。
図２６に示されるように、左端のレーンに見られたバンドが、ＤＮａｓｅ処理により消失したことから、アルカリ処理により得られた一本鎖核酸はＤＮＡであることが確認された。
【００９０】
［融解曲線の測定２］
合成した一本鎖ＤＮＡを用いて、表９に記載の組成となるように反応液を調製した後、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標名）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて融解曲線の測定を行った。Ｒｕｎ  ｍｅｔｈｏｄは、６５℃１５分／Ｍｅｌｔ  ｃｕｒｖｅ  ｓｔａｇｅ／２０℃１分／９５℃１５秒であった。尚、２０℃から９５℃までの昇温を９０分かけて行った。
【００９１】
【表９】
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【００９２】
表９中、ＳＹＴＯ９は、ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（商標名）ＨＲＭマスターミックス試薬キットに含まれているＳＹＴＯ９  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを意味する。Ｘ１８を用いた場合の融解曲線の測定結果を図２７に示す。図２７は、鋳型として用いたＤＮＡの変異が＿個の場合の結果であり、鋳型としてＲＮＡを用いた場合と同様の精度でＴｍ値が測定可能なことが確認された。
【００９３】
［分光学的手法による融解曲線の測定］
合成したｍＲＮＡ、及び一本鎖ＤＮＡをそれぞれ用いて、分光光度計（日本分光社製；Ｖ−６５０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて融解曲線の測定を行った。測定条件を以下に示す。
【００９４】
開始温度  ３０〜４０℃（予想されるＴｍ値によって変更）
目標温度  ６０〜７０℃（予想されるＴｍ値によって変更）
勾配  ２．０℃／ｍｉｎ
データ取込間隔  ０．３℃
測定開始条件  １０ｓｅｃ間設定温度±０．１℃以内になった時
スターラー  ０ｒｐｍ
測光モード Ａｂｓ
ＵＶ／Ｖｉｓ バンド幅 ２．０ ｎｍ
レスポンス Ｍｅｄｉｕｍ
測定波長 ２６０ ｎｍ
光源切換 ３５０ ｎｍ
光源 Ｄ２／ＷＩ
【００９５】
ＨＩＶ指向性検査用プローブとして、Ｘ１８、Ｘ３３、Ｘ７５、Ｘ８０をそれぞれ用いた時のＴｍ値のグラフを図２８に示す。図２８に示すように、各プローブを用いた時のＴｍ値の増減傾向は、［融解曲線の測定１］にてＳＹＴＯ９を用いて測定した場合の傾向と同様であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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