(57)【要約】【課題】評価したい蛋白質が転写を促進させる転写因子であるか否かを簡便に評価できる転写因子活性の評価方法を提供する。【解決手段】標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合させた遺伝子配列を宿主ゲノム中に導入する第一工程と、転写因子をコードする遺伝子配列を前記宿主に導入する第二工程と、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する第三工程とを含み、前記第二工程において、前記転写因子をコードする遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列が前記宿主に導入されていない転写因子活性の評価方法に関する。【選択図】図１
2015073521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合させた遺伝子配列を宿主ゲノム中に導入する第一工程と、転写因子をコードする遺伝子配列を前記宿主に導入する第二工程と、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する第三工程とを含み、
前記第二工程において、前記転写因子をコードする遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列が前記宿主に導入されていない転写因子活性の評価方法。
【請求項２】
前記標的プロモーター配列が植物由来である請求項１記載の転写因子活性の評価方法。
【請求項３】
前記転写因子をコードする遺伝子配列が植物由来である請求項１又は２記載の転写因子活性の評価方法。
【請求項４】
前記β−ガラクトシダーゼの酵素活性を基質による吸光度変化から測定する請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子活性の評価方法。
【請求項５】
前記基質がｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであり、４２０ｎｍの吸光度変化を測定する請求項４記載の転写因子活性の評価方法。
【請求項６】
前記宿主が酵母である請求項１〜５のいずれかに記載の転写因子活性の評価方法。
【請求項７】
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項６記載の転写因子活性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子活性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーターアッセイとは、例えば、プロモーターなどの転写開始に必要なＤＮＡ配列によってレポーター蛋白質をコードする遺伝子（以下、「レポーター遺伝子」という）から転写されたｍＲＮＡの合成量を直接または間接的に測定することで、標的となるプロモーターに結合する転写因子の活性等を間接的に測定する方法である。一般的に、レポーターアッセイでは、プロモーターの下流に特定のレポーター遺伝子を連結し、これをプラスミドとして、あるいはゲノム（染色体）に挿入することにより形質転換体を構築する。
【０００３】
レポーターアッセイにおいて、通常プロモーターの下流に連結した特定のレポーター遺伝子から合成されるｍＲＮＡを定量することは容易ではない。そこで、そのｍＲＮＡの情報を読み取って合成される蛋白質の量を測定対象にすることが多い。この際、合成された蛋白質の量を簡便に測定するためにレポーター蛋白質として酵素を用い、その酵素活性の値を最初のｍＲＮＡ合成量の相対値とみなす方法が一般的である。レポーターアッセイにおいては、最終的に測定される酵素活性が最初のプロモーターの転写活性と相関があると一般に受け入れられている。
【０００４】
レポーターアッセイを行うには、大きく分けて２つの構成が必要である。第一の構成要素としては、転写因子が結合することで、転写の開始及び制御する遺伝子配列の存在である。一般的に、転写開始に関与するプロモーター及び転写活性や転写抑制に関与するＤＮＡ配列を含むプロモーター、並びに該プロモーターの転写活性を促進や抑制するレセプター・コアクチベーターなどから構成される。第二の構成要素としては、転写因子の活性を測定可能にするための構成要素であり、一般的に、レポーター蛋白質が用いられる。
【０００５】
第一の構成要素は、測定する対象によって特異的であり、第二の構成要素は基本的に汎用性が高く、特定のレポーター蛋白質を用いることが可能である。
【０００６】
一方、転写因子の働きとしては、転写を促進させるもの（アクチベーター）と抑制するもの（リプレッサー）が存在するため、転写因子の結合能力を測定する際は、該転写因子の転写制御の働きを判別することも重要である。
【０００７】
ＤＮＡへの蛋白質の結合能力を測定する方法としては、酵母ワンハイブリッド法がよく用いられる。この方法では、酵母のゲノムに組み込んだ標的プロモーターの下流に、レポーター遺伝子を組み込んでおき、更に、標的プロモーターに結合可能か否かを評価したい蛋白質に該レポーター遺伝子を活性化することが可能な転写活性化ドメインを融合させた融合蛋白質を発現させる。そして、評価したい蛋白質が標的プロモーターに結合可能な蛋白質であれば、該蛋白質に融合された転写活性化ドメインにより、標的プロモーターの下流に組み込まれたレポーター遺伝子が活性化され、レポーター蛋白質が発現する。一方、評価したい蛋白質が標的プロモーターに結合可能な蛋白質でなければ、レポーター蛋白質は発現しない。そのため、例えば、レポーター蛋白質の活性を測定することで、評価したい蛋白質のＤＮＡに対する結合能力を評価することができる。
【０００８】
しかしながら、上記の方法ではレポーター遺伝子の転写を直接的に制御するのは、評価したい蛋白質に融合させた転写活性化ドメインである。すなわち、評価したい蛋白質が直接転写を制御していないため、評価したい蛋白質が標的プロモーターに結合可能か否かは明らかにすることはできるものの、該蛋白質が、転写を促進させるもの（アクチベーター）であるのか、転写を抑制するもの（リプレッサー）であるのかを判別することはできず、評価したい蛋白質が転写を促進させる転写因子であるか否かを簡便に評価できなかった。また、評価したい蛋白質と発現系で用いる宿主の生物間の違いにより、転写を行うＲＮＡポリメラーゼとそもそも結合がうまく機能するかどうかという問題もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記課題を解決し、評価したい蛋白質が転写を促進させる転写因子であるか否かを簡便に評価できる転写因子活性の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを用いたレポーターアッセイにおいて、種々の検討を行った結果、従来から用いられている転写活性化ドメインを介さずに、評価したい蛋白質（転写因子）により直接β−ガラクトシダーゼの転写を制御することにより、評価したい蛋白質（転写因子）が転写を促進させる転写因子であるか否かを簡便に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合させた遺伝子配列を宿主ゲノム中に導入する第一工程と、転写因子をコードする遺伝子配列を前記宿主に導入する第二工程と、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する第三工程とを含み、前記第二工程において、前記転写因子をコードする遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列が前記宿主に導入されていない転写因子活性の評価方法に関する。
【００１１】
前記標的プロモーター配列が植物由来であることが好ましい。
【００１２】
前記転写因子をコードする遺伝子配列が植物由来であることが好ましい。
【００１３】
前記β−ガラクトシダーゼの酵素活性を基質による吸光度変化から測定することが好ましい。
【００１４】
前記基質がｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであり、４２０ｎｍの吸光度変化を測定することが好ましい。
【００１５】
前記宿主が酵母であることが好ましい。
【００１６】
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合させた遺伝子配列を宿主ゲノム中に導入する第一工程と、転写因子をコードする遺伝子配列を上記宿主に導入する第二工程と、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する第三工程とを含み、上記第二工程において、上記転写因子をコードする遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列が上記宿主に導入されていない転写因子活性の評価方法であるので、評価したい蛋白質（転写因子）が転写を促進させる転写因子であるか否かを簡便に評価できる。
また、本発明の方法では、転写活性化ドメインを介さずに、レポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼを発現できるため、評価したい蛋白質（転写因子）が直接β−ガラクトシダーゼの転写を制御していることとなり、転写因子活性を正確に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】転写制御の様子を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の方法は、標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合させた遺伝子配列を宿主ゲノム中に導入する第一工程と、転写因子をコードする遺伝子配列を上記宿主に導入する第二工程と、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する第三工程とを含み、上記第二工程において、上記転写因子をコードする遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列が上記宿主に導入されていない転写因子活性の評価方法である。
【００２０】
本発明の方法では、まず標的プロモーター配列の下流にβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を宿主に導入する。次に、得られた形質転換体に転写因子活性を評価したい遺伝子配列を導入する。なお、これらの遺伝子配列の導入の順は、特に限定されない。また、本発明の方法では、転写因子活性を評価したい遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列は導入しない。そして、最後に、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する。例えば、得られた形質転換体の培養物を回収、破砕し、β−ガラクトシダーゼの酵素反応が進行し得る条件下で、当該酵素の基質と接触させた後、当該酵素の酵素活性を測定する。本発明の方法では、β−ガラクトシダーゼの活性に基づいて、宿主に導入した遺伝子が、転写を促進させる転写因子をコードする遺伝子であるか否かを簡便に評価できる。
また、上記転写因子が標的プロモーターに結合することで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写を開始でき、該転写因子とβ−ガラクトシダーゼとの相互作用により、転写活性化ドメインを介さずに直接転写を制御できるため、転写因子活性をβ−ガラクトシダーゼの酵素活性として正確に反映することができ、転写因子活性を正確に評価することもできる。
【００２１】
本発明の方法は、優れた転写因子活性を有する転写因子をスクリーニングする際の非常に有効なツールとなる。そのため、例えば、昨今、天然ゴムの枯渇が危惧されているが、天然ゴムの生合成経路に関与している蛋白質に対して良好な転写因子活性を有する転写因子を本発明の方法によりスクリーニングし、天然ゴムを産出するパラゴムノキ等の植物に、スクリーニングにより得られた転写因子を導入することにより天然ゴムの増産が可能となり、天然ゴムの枯渇の問題にも対応できる。
【００２２】
本明細書において、転写因子とは、プロモーター配列に結合し、該プロモーター配列の下流に位置する遺伝子の転写量を増加もしくは減少させる（好ましくは増加させる）活性を有する蛋白質のことを意味する（図１参照）。
また、転写活性化ドメインとは、転写因子の一部分で、プロモーター配列に直接結合はしないものの、他の蛋白質と融合蛋白質（図１では転写因子と融合蛋白質）を形成し、該融合蛋白質がプロモーター配列に結合することにより、該プロモーター配列の下流に位置する遺伝子の転写量を増加もしくは減少させる（好ましくは増加させる）活性を有する蛋白質のことを意味する（図１参照）。
なお、転写活性化ドメインの具体例としては、ＧＡＬ４  ＡＤ、ＶＰ１６等が挙げられる。
【００２３】
（第一工程）
本発明の第一工程では、標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合させた遺伝子配列を宿主ゲノム中に導入する。これにより、該標的プロモーターに特定の転写因子が特異的に結合することで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が転写される。
【００２４】
本発明の第一工程において、宿主のゲノム中に上記標的プロモーターとβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列の融合した遺伝子配列を導入するにあたり、上記標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合した遺伝子配列を持つプラスミド（ベクター）を構築することが好ましい。
【００２５】
上記標的プロモーター配列とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合した遺伝子配列を持つプラスミドの作製は、公知の方法を用いることができ、例えば、標的プロモーター配列及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列を任意のプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により該標的プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼそれぞれの遺伝子配列を有するＰＣＲ産物を作製する。そして、ライゲーション等の手法により、任意のベクターに導入することにより作製する。
【００２６】
上記標的プロモーターとしては、特に限定されないが、植物由来であることが好ましく、植物としては、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）等のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属；パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュなどが挙げられる。
【００２７】
β−ガラクトシダーゼとしては、その由来は特に限定されないが、下記［１］、［２］に示す遺伝子配列によりコードされるものが好ましい。
［１］配列番号１で表される塩基番号１−３１５６の塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基番号１−３１５６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−ガラクトシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
なお、本明細書において、β−ガラクトシダーゼとは、β−ガラクトシドを加水分解してガラクトースを生成する酵素を意味し、β−ガラクトシダーゼ活性とは、β−ガラクトシドを加水分解してガラクトースを生成する反応を触媒する能力を意味する。
【００２８】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００２９】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００３０】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００３１】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００３２】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１の配列番号で表される塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００３３】
導入する宿主としては、宿主内で上記標的プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が機能し、β−ガラクトシダーゼが発現すると宿主内で活性を有することができるものであれば特に限定されるものではないが、酵母等の真菌類；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌類；サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９等の昆虫細胞；アブラナ科等に属する植物などが挙げられるが、なかでも培養期間が短く、短期間で評価が行えるという点で、酵母が好ましい。
【００３４】
上記酵母としては、いずれの酵母であってもよいが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が挙げられ、取り扱いが簡便であるという点で、サッカロミセス・セレビシエが特に好ましい。
【００３５】
上記標的プロモーター配列及びβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列を融合した遺伝子配列を持つプラスミドの上記宿主のゲノム中への導入方法は、宿主それぞれによって様々な方法を用いることができる。
【００３６】
真菌類への導入方法は、真菌類にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、ＹＩｐ系などのベクター又は染色体中の任意の領域と相同なＤＮＡ配列を用いた染色体への置換・挿入型の形質転換法であっても良い。
【００３７】
細菌類への導入方法は、細菌類にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
動物細胞への導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３９】
昆虫細胞への導入方法は、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４０】
また、植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞などが用いることができ、植物への導入方法は、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等が挙げられる。
【００４１】
標的プロモーター配列及びβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列の融合遺伝子配列が宿主に導入されたことを確認する方法は、公知の方法を用いることができ、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション等が挙げられる。例えば、宿主からゲノムを抽出し、特定のプライマーを用いてＰＣＲを行う。該ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、ＰＣＲ産物を検出することで、標的プロモーター配列及びβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子配列の融合遺伝子配列が宿主のゲノム中に導入されたことを確認できる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。また、簡便な方法として、該遺伝子導入時に特定の抗生物質耐性遺伝子も同時に導入することで、該抗生物質含有培地で培養することでスクリーニングする方法でも行える。
【００４２】
（第二工程）
本発明の第二工程では、転写因子（評価したい蛋白質）をコードする遺伝子配列を上記宿主に導入する。第二工程では、転写因子をコードする遺伝子配列は上記宿主に導入されるものの、転写因子をコードする遺伝子配列と共に転写活性化ドメインをコードする遺伝子配列は上記宿主に導入されない。
これにより、従来から用いられている転写活性化ドメインを介さずに、評価したい蛋白質（転写因子）により直接β−ガラクトシダーゼの転写を制御することにより、評価したい蛋白質（転写因子）が転写を促進させる転写因子であるか否かを簡便に評価できる。また、転写因子活性を正確に評価することもできる。
【００４３】
本発明の第二工程において、宿主に転写因子をコードする遺伝子配列を導入するにあたり、転写因子をコードする遺伝子配列を持つプラスミド（ベクター）を構築することが好ましく、宿主内で該転写因子を発現するプラスミド（ベクター）を構築することがより好ましい。
【００４４】
上記転写因子をコードする遺伝子配列を持つプラスミドの作製は、公知の方法を用いることができ、例えば、転写因子をコードする遺伝子配列を任意のプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により該転写因子をコードする遺伝子配列を有するＰＣＲ産物を作製する。そして、ライゲーション等の手法により、任意のベクターに導入することにより作製する。
【００４５】
上記転写因子としては、特に限定されないが、植物由来であることが好ましく、植物としては、例えば、上記標的プロモーターの場合と同様の植物が挙げられる。
【００４６】
シロイヌナズナ由来の転写因子としては、下記［３］、［４］に示す遺伝子配列によりコードされるものが好ましい。
［３］配列番号３で表される塩基番号１−２０７０の塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号３で表される塩基番号１−２０７０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明において転写因子活性とは、該転写因子が認識して結合するプロモーターの下流に存在するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写を進める活性のことである。
【００４７】
ここでいう「ハイブリダイズする」、ストリンジェントな条件などは、第一工程で上述したことと同様である。
【００４８】
上記転写因子をコードする遺伝子配列の上記宿主への導入は、上記転写因子をコードする遺伝子配列を持つプラスミドを上記宿主内に導入することが好ましく、導入方法としては、第一工程で上述した方法と同様の方法を好適に用いることができる。
【００４９】
上記転写因子をコードする遺伝子配列が宿主に導入されたことを確認する方法は、公知の方法を用いることができ、第一工程で上述した導入の確認方法を用いることもできるが、より簡便な方法としては、例えば、上記転写因子をコードする遺伝子配列を持つプラスミドに特定の抗生物質耐性を有することができる遺伝子を組み込んだプラスミドを用いることで、該特定抗生物質耐性菌のみをスクリーニングすることでも確認できる。
【００５０】
（第三工程）
本発明の第三工程では、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価する。これは上記転写因子により転写、発現したβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を評価することで、上記転写因子の転写因子活性を間接的に示すことができる。
【００５１】
上記第一工程及び第二工程によって得られた形質転換体から発現されるβ−ガラクトシダーゼの酵素活性の測定は、形質転換体のまま酵素活性を測定してもよく、形質転換体を培養し、培養後の形質転換体を破砕後、宿主破砕物中に含まれるβ−ガラクトシダーゼを用いて酵素活性を測定してもよいが、より反応後の吸光度変化を正確に検出するという点で、培養後の形質転換体を破砕後、宿主破砕物中に含まれるβ−ガラクトシダーゼを用いて酵素活性を測定することが好ましい。
【００５２】
β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定するにあたり、上記第一工程及び第二工程によって得られた形質転換体を培養する場合、培養条件は、宿主の培養条件に合わせて一般的な条件により培養すればよいが、β−ガラクトシダーゼが失活しないために、培養温度は、好ましくは４〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃である。また、培地のｐＨは、好ましくは３．５〜６．５、より好ましくは５．５〜６．０である。培養時間は、β−ガラクトシダーゼの酵素活性が測定可能であればよく、好ましくは１〜１２０時間、より好ましくは１〜２４時間である。
【００５３】
β−ガラクトシダーゼの酵素活性の評価方法は、公知の方法を用いることができ、酵素により触媒された加水分解反応による基質の変化に基づいて評価できる。例えば、基質の減少量や生成物の増加量により評価できる。使用する基質としては、例えば５−クロロ−４−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトース（Ｘ−ｇａｌ）やｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）などが挙げられる。これらの基質は加水分解されることで前者は青色、後者は黄色を呈することから、酵素活性を基質による吸光度変化から測定することができる。なかでも後者のＯＮＰＧは４２０ｎｍにおける吸光度を測定することで、酵素活性を測定することができる。
【００５４】
β−ガラクトシダーゼの酵素活性の測定条件（酵素反応の条件）としては、反応温度は、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１５〜３０℃である。またｐＨは、好ましくは４．０〜９．０、より好ましくは６．０〜８．０である。反応時間は、好ましくは１〜３０時間、より好ましくは１〜２０時間である。
【００５５】
β−ガラクトシダーゼの酵素活性測定における基質の濃度は、基質に応じて適宜決定することができるが、例えばβ−ガラクトシダーゼを有する形質転換体の破砕物の濁度０．０５以上（６００ｎｍにおける吸光度）に対して、基質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）の終濃度は好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．５〜２．５ｍｇ／ｍＬである。
【実施例】
【００５６】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００５７】
（標的プロモーター配列の獲得）
ＭＳ培地上で無菌的に生育させたシロイヌナズナを採取し、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。下記に示すプライマー１及び２を用いてＰＣＲを行い、標的プロモーター配列であるシロイヌナズナのＡＲＲ６のプロモーター配列を有するＤＮＡ断片をクローニングした。
（プライマー１：配列番号５）
５’−ａａｇｃｔｔｇａｔｃａｔａｃａｃａｃａａｔｃａｃａａｃａｇｃ−３’
（プライマー２：配列番号６）
５’−ｇｇａｔｃｃｔｇａｔｃａａｃｇａａｔｇｔｔｇｇａｇｇ−３’
【００５８】
（標的プロモーター配列導入プラスミドの作製）
上記ＰＣＲで得られたシロイヌナズナのＡＲＲ６のプロモーター配列を有するＤＮＡ断片に変異導入がないことをシーケンス解析により確認後、上記ＰＣＲで得られたシロイヌナズナのＡＲＲ６のプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を、ｐＭＤ２０Ｔ（タカラバイオ）に挿入したｐＭＤ２０Ｔ−ＡＲＲ６ｐｒｏを構築した。
【００５９】
（標的プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の融合遺伝子配列導入プラスミドの構築）
上記ｐＭＤ２０Ｔ−ＡＲＲ６ｐｒｏ及びｐＹＥＳ３／ＣＴ／ＬａｃＺをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで制限処理することにより、ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）の直上に、シロイヌナズナのＡＲＲ６のプロモーター配列断片を組み込み、ｐＹＥＳ３−ＡＲＲ６  ｐｒｏｌａｃＺを構築した。
なお、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のｐＹＥＳ３／ＣＴ／ＬａｃＺに組み込まれているものを使用した。
【００６０】
（酵母ゲノムへ直接導入するための標的プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の融合遺伝子配列導入プラスミドの構築）
上記ｐＹＥＳ３−ＡＲＲ６  ｐｒｏｌａｃＺを鋳型に下記プライマー３及び４を用いたＰＣＲにより、ＳｐｅＩサイトからＣＹＣ１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌまでを増幅したＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片をｐＡＵＲ１０１  ＤＮＡ（タカラバイオ）に挿入したｐＡＵＲ１０１−ＡＲＲ６  ｐｒｏｌａｃＺを構築した。
（プライマー３：配列番号７）
５’−ｇｃａｔｇｃｃｇｇａｔｃｇｇａｃｔａｃｔａｇｃａｇｃ−３’
（プライマー４：配列番号８）
５’−ｇｔｃｇａｃｃａｔｔａａｔｇｃａｇｇｇｃｃｇｃａｇｃ−３’
【００６１】
（酵母ゲノムへの標的プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の融合遺伝子配列導入）
ｐＡＵＲ１０１−ＡＲＲ６  ｐｒｏｌａｃＺを用いて、エレクトロポレーション法により酵母（Ｗ３０３株）に導入した。該遺伝子導入酵母の選別は抗真菌抗生物質であるＡｕｒｅｏｂａｓｉｉｎ  Ａ（タカラバイオ）を含むＹＰＤ培地上で酵母を３０℃で培養することでスクリーニングを行い、第一形質転換酵母を得た。
【００６２】
（上記プロモーターを認識する転写因子をコードする遺伝子配列の獲得）
シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーを鋳型にし、下記プライマー５及び６を用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより、配列番号３で示されるＡｔ３ｇ１６８５７（ＡＲＲ１）のＤＮＡ断片が得られた。
（プライマー５：配列番号９）
５’−ｇｇａｔｃｃａａａａａａａｔｇａｔｇａａｔｃｃｇａｇｔｃａｃｇｇ−３’
（プライマー６：配列番号１０）
５’−ａｇｔａｃｔｔｃａａａｃｃｇｇａａｔｇｔｔａｔｃｇａｔｇｇ−３’
【００６３】
（上記プロモーターを認識する転写因子をコードする遺伝子配列導入プラスミドの作製）
上記で得られたＤＮＡ断片に変異導入がないことをシーケンス解析により確認後、得られたＤＮＡ断片をｐＭＤ２０Ｔに挿入し、ｐＭＤ２０Ｔ−ＡＲＲ１を構築した。
【００６４】
（上記プロモーターを認識する転写因子発現プラスミドの構築）
ｐＭＤ２０Ｔ−ＡＲＲ１及びｐ４２７ＴＥＦ（コスモバイオ）をＢａｍ  ＨＩとＳａｃ  Ｉで制限処理することにより、ＡＲＲ１遺伝子配列を挿入したｐＴＥＦ−ＡＲＲ１を構築した。
なお、上記すべての遺伝子挿入時のライゲーションはＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２を用いて行った。
【００６５】
（酵母への上記プロモーターを認識する転写因子発現プラスミドの導入）
ｐＴＥＦ−ＡＲＲ１を用いて、エレクトロポレーション法により上記形質転換酵母１（Ｗ３０３株）に導入した。該転写因子発現プラスミド導入酵母の選別は抗真菌抗生物質であるＡｕｒｅｏｂａｓｉｉｎ  Ａ（タカラバイオ）とＧ４１８（和光純薬工業）を含むＹＰＤ培地上で酵母を培養することでスクリーニングを行い、第二形質転換酵母を得た。
【００６６】
（形質転換酵母の獲得）
第一形質転換酵母及び第二形質転換酵母をそれぞれ３０℃で３日間培養することにより、形質転換酵母（Ｗ３０３（ＡＲＲ６ｐｒｏ））及び形質転換酵母（Ｗ３０３（ＡＲＲ６ｐｒｏ−ＡＲＲ１））を獲得した。
【００６７】
（β−ガラクトシダーゼの発現）
形質転換酵母（Ｗ３０３（ＡＲＲ６ｐｒｏ−ＡＲＲ１））をＡｕｒｅｏｂａｓｉｉｎ  Ａ（タカラバイオ）とＧ４１８（和光純薬工業）を含むＹＰＤ液体培地５ｍＬで３０℃にて一晩培養した。培養後、培養液の一部を新しいＡｕｒｅｏｂａｓｉｉｎ  Ａ（タカラバイオ）とＧ４１８（和光純薬工業）を含むＹＰＤ液体培地２０ｍＬで３０℃にてＯＤ６００＝０．５〜３．０になるまで培養した。また、比較例としては、形質転換酵母（Ｗ３０３（ＡＲＲ６ｐｒｏ））をＡｕｒｅｏｂａｓｉｉｎ  Ａ（タカラバイオ）を含むＹＰＤ液体培地５ｍＬで３０℃にて一晩培養し、培養後、培養液の一部を新しいＡｕｒｅｏｂａｓｉｉｎ  Ａ（タカラバイオ）を含むＹＰＤ液体培地２０ｍＬで３０℃にてＯＤ６００＝０．５〜３．０になるまで培養したものを用いた。
【００６８】
（β−ガラクトシダーゼの酵素反応）
培養後、培養液１ｍＬを採取し、遠心分離によりそれぞれの菌体を回収した。回収した菌体はＺバッファー（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２１．５ｇ（６０ｍＭ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６．２４ｇ（４０ｍＭ）、ＫＣｌ  ０．７５ｇ（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２４６ｇ（１ｍＭ））１００μＬに再懸濁した。その後凍結融解を３回繰り返すことにより、菌体を破砕し、Ｚバッファー７００μＬ、４ｍｇ／ｍＬ  ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ））溶液１６０μＬを加え、３０℃で反応させた。
【００６９】
（β−ガラクトシダーゼ酵素活性測定）
１Ｍ炭酸ナトリウム４００μＬを加え、反応を停止し、ＯＤ４２０を測定した。測定した値から、下記式を用いてβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を算出した。
酵素活性＝ＯＤ４２０×１０００／反応時間（分）／ＯＤ６００
【００７０】
【表１】
2015073521.tif 000003
【００７１】
表１より、転写因子とβ−ガラクトシダーゼの相互作用により、その他の物質を介さずにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写が行われていることが明らかとなった。これにより、宿主に導入した評価したい遺伝子が、転写を促進させる転写因子をコードする遺伝子であるか否かを簡便に評価でき、転写因子活性を正確に評価することもできることが裏付けられた。
【００７２】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のｐＹＥＳ３／ＣＴ／ＬａｃＺに導入されているβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のｐＹＥＳ３／ＣＴ／ＬａｃＺに導入されているβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列
配列番号３：シロイヌナズナ由来のＡＲＲ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：シロイヌナズナ由来のＡＲＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：プライマー１
配列番号６：プライマー２
配列番号７：プライマー３
配列番号８：プライマー４
配列番号９：プライマー５
配列番号１０：プライマー６
【図１】
2015073521.tif 000004
【配列表】
2015073521000001.app