(57)【要約】【課題】生体試料中の胃癌細胞の検出を高精度に検出できる胃癌細胞の検出方法、及び胃癌細胞検出キットを提供する。【解決手段】本発明の胃癌細胞の検出方法は、生体試料中の胃癌細胞の検出方法であって、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の胃癌細胞の検出方法であって、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を有することを特徴とする胃癌細胞の検出方法。
【請求項２】
前記ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程は、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う工程を有する請求項１に記載の胃癌細胞の検出方法。
【請求項３】
ＫＫ−ＬＣ−１検出キットとヘリコバクター・ピロリ感染検出キットを備えたことを特徴とする胃癌細胞検出キット。
【請求項４】
前記ＫＫ−ＬＣ−１検出キットは、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを含む請求項３に記載の胃癌細胞検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌細胞の検出方法、及び胃癌細胞検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌／精巣抗原は、癌細胞と精巣以外では発現が認められないタンパク質の総称である。
癌／精巣抗原の一つであるＫｉｔａｋｙｕｓｈｕ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（以下、ＫＫ−ＬＣ−１ともいう。）は、肺癌よりＴ細胞に認識される腫瘍抗原として同定されている（例えば、非特許文献１参照。）。従って、ＫＫ−ＬＣ−１は、免疫応答を介した肺癌の治療、診断及び予防の標的分子としては有用と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Identification of a new cancer/germline gene, KK-LC-1, encoding an antigen recognized by autologous CTL induced on human lung adenocarcinoma. Fukuyama T, Hanagiri T, Takenoyama M, Ichiki Y, Mizukami M, So T, Sugaya M, So T, Sugio K, Yasumoto K. Cancer Res. 2006 May 1;66(9):4922-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、一般的に癌／精巣抗原の発現率は４割以下であり、癌／精巣抗原を用いて癌細胞を高精度に検出する方法については未だ改良の余地がある。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生体試料中の胃癌細胞の検出を高精度に検出できる胃癌細胞の検出方法、及び胃癌細胞検出キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程と、を兼ね備えることで、生体試料中の胃癌細胞の検出を高精度に行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する胃癌細胞の検出方法、及び胃癌細胞検出キットを提供する。
【０００７】
（１）生体試料中の胃癌細胞の検出方法であって、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を有することを特徴とする胃癌細胞の検出方法。
（２）前記ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程は、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う工程を有する前記（１）に記載の胃癌細胞の検出方法。
（３）ＫＫ−ＬＣ−１検出キットとヘリコバクター・ピロリ感染検出キットを備えたことを特徴とする胃癌細胞検出キット。
（４）前記ＫＫ−ＬＣ−１検出キットは、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを含む前記（３）に記載の胃癌細胞検出キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生体試料中の胃癌細胞の検出を高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】胃癌症例の腫瘍部位における癌／精巣抗原の発現頻度を示す結果である。
【図２】ＫＫ−ＬＣ−１陽性患者及び陰性患者の血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ  ＩｇＧ価を示す結果である。
【図３】他の癌／精巣抗原陽性患者及び陰性患者の血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ  ＩｇＧ価を示す結果である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲをそれぞれ用いてＫＫ−ＬＣ−１の発現解析を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜胃癌細胞の検出方法＞
本発明の胃癌細胞の検出方法は、生体試料中の胃癌細胞の検出方法であって、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を有する。
【００１１】
［ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程］
ＫＫ−ＬＣ−１は、発明者らが肺癌から同定した抗原である。肺癌におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現頻度は、約３割〜４割であった（非特許文献１参照。）。
一方、実施例において後述するように、本発明者は、ＫＫ−ＬＣ−１が胃癌症例の約８割で発現していることを明らかにした。また、胃癌症例の腫瘍部位及び正常部位におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現パターンを分析したところ、ＫＫ−ＬＣ−１は、癌特異的に発現していることを明らかにした。
従って、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出することにより、生体試料中の胃癌細胞を高精度に検出することができる。
【００１２】
検出に用いる生体試料としては、特に限定されず、培養細胞であってもよいが、被験者から得られたものが好ましく、胃癌発症が疑われている発症被疑者、又は胃癌治療を受けている患者等の被験者の切除組織、胃癌細胞を含む血液、尿等から得られたものであることがより好ましい。
【００１３】
ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程としては、例えば、生体試料中のＫＫ−ＬＣ−１遺伝子を検出する工程が挙げられる。該工程は、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のフラグメント、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを、該生体試料からの抽出物とインキュベートする工程を含むことが好ましく、該生体試料からの抽出物のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又は該ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を含むことがより好ましい。
【００１４】
本発明において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドが数個〜数十個または数百個結合したものを意味する。
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子又はそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドの長さとしては、７塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、２０塩基以上が更に好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザー等によって合成される。
【００１５】
ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程としては、ＲＴ−ＰＣＲを行う工程を有することが好ましく、配列番号１（ＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＡＣＴＣＣＴＡＧＣＧＡＧＣ）で表されるプライマー及び配列番号２（ＴＴＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＴＧＡＧＧ）で表されるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行う工程を有することがより好ましい。
実施例において後述するように、本発明者は、ＫＫ−ＬＣ−１の発現解析に用いられていた従来のリアルタイムＰＣＲ法では、ゲノムＤＮＡを検出してしまう問題点を見出し、上記配列番号１及び２で表されるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、ＫＫ−ＬＣ−１をより高精度に検出できることを見出した。
【００１６】
配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを用いたＫＫ−ＬＣ−１の検出方法としては、一例として、（ａ）生体試料からｍＲＮＡを抽出する工程と、（ｂ）逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、（ｃ）配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＫＫ−ＬＣ−１のｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、を有するものが挙げられる。
以下、各工程について説明する。
【００１７】
まず、工程（ａ）において、生体試料からｍＲＮＡを抽出する。生体試料からのｍＲＮＡ抽出は、トリゾルを用いる等、定法により行うことができる。
【００１８】
次いで、工程（ｂ）において、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する。
逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
逆転写に用いられるプライマーの長さは、通常用いられるプライマーの長さと同様、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
また、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡは、鋳型となったｍＲＮＡとのハイブリッドを形成しているため、ＲＮａｓｅＨ等のＲＮａｓｅを用いて、工程（ｃ）の前に、予めｍＲＮＡを分解しておくことが好ましい。  
【００１９】
次いで、工程（ｃ）において、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＫＫ−ＬＣ−１のｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する。
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼとはプライマーがアニールした鋳型ＤＮＡと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素の総称である。
本発明に用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。
【００２１】
配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーは、ＫＫ−ＬＣ−１のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡのいずれも認識するが、ＰＣＲによる増幅産物の大きさからその違いを見分けることができる。従って、上記配列番号１及び２で表されるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、ＫＫ−ＬＣ−１の発現をより高精度に検出できる。
【００２２】
次いで、工程（ｄ）において、前記標的塩基配列の増幅産物を検出する。
工程（ｄ）における代表的な検出方法としては、標的塩基配列の増幅を電気泳動により評価する方法が挙げられる。この方法は、標的塩基配列の増幅産物及び核酸分子量マーカーに対して、電気泳動を行い、両者の泳動度を対比することにより、所定の分子量を有する標的塩基配列が増幅された否かを評価する方法である。
電気泳動による検出に用いる試薬としては、二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する臭化エチジウムやサイバーグリーンが好ましい。
【００２３】
工程（ｄ）におけるその他の検出方法としては、特に限定されるものではなく、蛍光色素等によるオリゴヌクレオチドの標識、高速液体クロマトグラフィー、マススペクトル、融解曲線分析、増殖曲線分析等が挙げられる。
【００２４】
蛍光色素等によるオリゴヌクレオチドの標識としては、例えば、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーの少なくともいずれか一方を、標識物質により標識しておく方法が挙げられる。かかる方法により、標識物質を指標として標的塩基配列の増幅を検出することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光色素、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素、抗体等が挙げられる。かかる標識物質を用いて、オリゴヌクレオチドを標識する位置については、特に限定するものではないが、伸長反応を阻害しないような位置が好ましい。
【００２５】
また、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程としては、例えば、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する特異的抗体を作製して、特異的抗体を使用したウエスタンブロット法、固相酵素免疫検定法(ＥＬＩＳＡ) 、免疫組織学的染色法等の免疫学的方法によりＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を検出する工程も挙げられる。
【００２６】
ウエスタンブロット法は、例えば、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を含有する生体試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲル中の分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜等のメンブレンに転写し、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を認識しうる抗体 (一次抗体) と反応させて免疫複合体を形成させ、該免疫複合体を標識した二次抗体を用いて検出する方法である。形成した免疫複合体と結合した標識二次抗体の標識量を測定することにより、生体試料中に存在するＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の量を測定できる。
【００２７】
免疫組織学的染色法は、例えば、スライドガラス上に固定された切除組織切片や細胞などを、抗ＫＫ−ＬＣ−１抗体と反応させて免疫複合体を形成させ、これと結合した標識二次抗体により検出するものである。
【００２８】
使用する特異的抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、特異的抗体は既知の抗体作製方法によって得ることができる。
ポリクローナル抗体の場合、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部に基づいて作製した合成ペプチドをウサギなどの非ヒト動物に免疫し、この動物の血清などから産生された抗体を常法により得ることができる。
モノクローナル抗体の場合、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部に基づいて作製した合成ペプチドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、脾臓などに含まれる抗体産生細胞を採取し、骨髄腫細胞と融合させて得たハイブリドーマ細胞より得ることができる。
また、形成した免疫複合体の検出は、二次抗体を用いる方法に代えて、一次抗体を予め同位体などで標識する方法を用いたものであってもよい。
【００２９】
［ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程］
ヘリコバクター・ピロリは、胃癌発生のｃｌａｓｓ１（確実に発癌誘導する）発癌物質としてＷＨＯ／ＩＡＲＣにより認定されている。また、本邦における胃癌患者の８０％以上は、ヘリコバクター・ピロリに感染していることが明らかとなっている（Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. Uemura N, Okamoto S, Yamamoto S, Matsumura N, Yamaguchi S, Yamakido M, Taniyama K, Sasaki N, SchlemperRJ. N Engl J Med. 2001 Sep 13;345(11):784-9.参照）。
実施例において後述するように、本発明者は、ＫＫ−ＬＣ−１を発現している胃癌症例で抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧが高値であることを見出した。従って、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程と、を兼ね備えることで、生体試料中の胃癌細胞を高精度に行うことができる。
【００３０】
検出に用いる生体試料としては、［ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程］で挙げたものに加えて、唾液、糞便等が挙げられる。
【００３１】
ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程としては、ヘリコバクター・ピロリの発現を検出する工程、又はその感染によって起こりうる炎症反応もしくは免疫応答を検出する工程が挙げられる。
【００３２】
ヘリコバクター・ピロリの発現を検出する工程としては、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程と同様に、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子を検出する工程、又は、ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質を検出する工程が挙げられる。
【００３３】
ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質としては、ウレアーゼＡ、ウレアーゼＢ等のウレアーゼ；ＦｌａＡ、ＦｌａＢ、ＦｌｉＤ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｇＭ等の鞭毛タンパク質；空胞化毒素（ＶａｃＡ）；毒素随伴タンパク質（ＣａｇＡ）；好中球活性化タンパク質（ＮａｐＡ）等が挙げられる。
【００３４】
ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子としては、上述したヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
これらのヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質、遺伝子の検出方法としては、ＫＫ−ＬＣ−１を検出する工程で述べた方法と同様のものが挙げれらる。
【００３５】
ヘリコバクター・ピロリ感染によって起こりうる炎症反応もしくは免疫応答を検出する工程としては、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を検出する工程、ヘリコバクター・ピロリ感染により、胃粘膜上皮細胞から放出されるＩＬ−８を検出する工程、ＩＬ−８が産生誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を検出する工程等が挙げられる。
【００３６】
また、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程としては、尿素試験法を用いて生ずる同位元素で標識されたＣＯ２を測定する工程も挙げられる。
具体的には、安定性同位元素又は放射性同位元素で標識した尿素を経口投与する。ヘリコバクター・ピロリのもつウレアーゼにより同位元素で標識した尿素が加水分解され、アンモニアと同位元素で標識されたＣＯ２が発生し、呼気から放出される。この呼気を採取し、同位元素で標識されたＣＯ２と自然界に存在するＣＯ２との比率により、ヘリコバクター・ピロリの存在を測定することができる。
【００３７】
＜胃癌細胞検出キット＞
本発明の胃癌細胞検出キットは、ＫＫ−ＬＣ−１検出キットとヘリコバクター・ピロリ感染検出キットを備えたものであり、具体的には、上述した＜胃癌細胞検出方法＞で、ＫＫ−ＬＣ−１及びヘリコバクター・ピロリの検出に用いられる試薬を含むものが挙げられる。
一例として、抗ＫＫ−ＬＣ−１抗体と抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧに対する抗体とを備えたＥＬＩＳＡキット；抗ＫＫ−ＬＣ−１抗体とヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質に対する抗体（例えば、抗ＣａｇＡ抗体）とを備えたＥＬＩＳＡキット等が挙げられる。
【００３８】
また、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子とヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子を検出するためのプライマーセットを含むものも挙げられる。一例として、本発明の胃癌細胞検出キットは、逆転写酵素と、逆転写用プライマーと、ＲＮａｓｅと、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子用プライマーと、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子用プライマーと、を有する。
増幅産物の大きさから、ゲノムＤＮＡの検出を排除できる観点から、胃癌細胞検出キット中のＫＫ−ＬＣ−１検出キットは、配列番号１で表されるプライマー及び配列番号２で表されるプライマーを含むことが好ましい。
このように、本発明の胃癌細胞検出方法に必要な試薬等をキット化することにより、生体試料中の胃癌細胞をより簡便にかつ高精度に検出をすることができる。
【実施例】
【００３９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
［胃癌における癌／精巣抗原の発現についての検討］
胃癌と診断され、胃の切除手術を受けた患者のうち、切除組織から癌部位の採取可能であった５５例について、癌／精巣抗原の発現を検討した。
胃癌切除手術直後、新鮮胃癌組織より腫瘍部位及び正常部位を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）に一晩浸漬した。浸漬した各部位をＲＮＡｌａｔｅｒより取り出し、５ｍｍ角の大きさに細切りし、−８０℃に保存した。
保存した部位をアルミホイルに包み、液体窒素に浸漬し完全に凍結させた後にハンマーで破砕した。破砕した組織からＥＺ１  ＲＮＡ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。詳細には、破砕した組織をＲＬＴ液に添加し、２３Ｇニードル付１ｍＬシリンジで完全に溶解させ、組織を溶解したＲＬＴ液よりＲＮＡを抽出した。オリゴｐ（ｄＮ）６ランダムプライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  
ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【００４１】
β−ａｃｔｉｎの発現量、並びに、他の癌／精巣抗原として、Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ（ＭＡＧＥ）Ａ１、Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ（ＭＡＧＥ）Ａ３、及びＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ−１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）の発現量をＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１、Ｈｓ００６０７０９７＿ｍ１、Ｈｓ２００３６６５３２＿ｍ１、Ｈｓ００２６５８２４＿ｍ１）を用いて測定した。
５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ
Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）、１μＬのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを含む２０μＬの反応液を作製し、ＨＴ−７９００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて反応回数４５サイクルのリアルタイムＰＣＲを実施した。
ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＮＹ−ＥＳＯ−１に関しては、Ｃｔ値が４５以下を結果として採用した。β―ａｃｔｉｎに関しては、Ｃｔ値が２８以下を結果として採用した。
β―ａｃｔｉｎのＣｔ値と各癌／精巣抗原のＣｔ値の差をΔＣｔとし、ΔＣｔの有無を各癌／精巣抗原の発現の有無とした。結果を図１に示す。
【００４２】
ＫＫ−ＬＣ−１に関しては、ＲＴ−ＰＣＲで発現を確認した。２μＬのｃＤＮＡ、０．２μＬのｒＴａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社）、１２５μＭｄＮＴＰ、及び５００ｎＭのＫＫ−ＬＣ−１特異的プライマー（配列番号１（ＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＡＣＴＣＣＴＡＧＣＧＡＧＣ）及び配列番号２（ＴＴＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＴＧＡＧＧ））を含む反応液を調製した。４０サイクルでの増幅の有無を確認した。
【００４３】
図１に示すように、胃癌症例の胃癌部位において、５５例中４１例（７５％）でＫＫ−ＬＣ−１の発現が認められた。それに対して、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、及びＮＹ−ＥＳＯ−１の発現は、それぞれ２０例（３６％）、２７例（４９％）、及び１１例（２０％）であった。
この結果から、ＫＫ−ＬＣ−１は、他の癌／精巣抗原よりも胃癌において高頻度に発現していることが明らかとなった。
【００４４】
血清採取可能であった２５症例について、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  ヘリコバクター・ピロリ
ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  Ｑｕａｎｔｉａｔｉｖｅ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）を用いて血清中のヘリコバクター・ピロリに対するＩｇＧを測定した。各癌／精巣抗原について、発現の有無で群分けし、群間における抗体価について比較した。結果を図２〜３に示す。
【００４５】
図２に示すように、ＫＫ−ＬＣ−１陽性患者及び陰性患者の血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ  ＩｇＧ価は、それぞれ６７．５±７．６Ｕ及び１５．８±７．５Ｕであり、ＫＫ−ＬＣ−１陽性の胃癌患者血清で高い値を示した（ｐ＝０．００４６）。
以上の結果から、ＫＫ−ＬＣ−１は胃癌において高頻度に発現しており、その発現はヘリコバクター・ピロリ感染に対するＩｇＧ産生と相関することが示された。
一方、図２に示すように他の癌／精巣抗原の発現と、ヘリコバクター・ピロリ感染に対するＩｇＧ産生との相関は見られなかった。
【００４６】
［ＲＴ−ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲの比較］
ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲをそれぞれ用いて、胃癌２９症例の腫瘍部におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現の検出精度を比較した。
〔リアルタイムＰＣＲ〕
β―ａｃｔｉｎの発現量、並びに、ＫＫ−ＬＣ−１の発現量をＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｈｓ０２３８６４２１＿ｇ１）を用いて測定した。
５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ
Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）、１μＬのＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを含む２０μＬの反応液を作製し、ＨＴ−７９００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて反応回数４５サイクルのリアルタイムＰＣＲを実施した。
ＫＫ−ＬＣ−１に関しては、Ｃｔ値が４５以下を結果として採用した。β―ａｃｔｉｎに関しては、Ｃｔ値が２８以下を結果として採用した。
β―ａｃｔｉｎのＣｔ値と各癌／精巣抗原のＣｔ値の差をΔＣｔとし、ΔＣｔの有無を各癌／精巣抗原の発現の有無とした。結果を図４に示す。図４中、ΔＣｔが−２５以上をＫＫ−ＬＣ−１の発現ありと判断した。
【００４７】
〔ＲＴ−ＰＣＲ〕
［胃癌における癌／精巣抗原の発現についての検討］で述べた実験条件に従って３４２ｂｐの増幅産物の有無でＫＫ−ＬＣ−１の発現の有無を判断した。結果を図４に示すように、リアルタイムＰＣＲによる  ＫＫ−ＬＣ−１の発現頻度は、ＲＴ−ＰＣＲにおける結果と比較すると高値であった。このプローブを用いたリアルタイムＰＣＲでは、ゲノムＤＮＡのコンタミネーションを検出してしまうおそれがあり、上記配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法による方が正確にＫＫ−ＬＣ−１の発現頻度を測定できることが示唆された。
【図１】
2015128418.tif 000002
【図２】
2015128418.tif 000003
【図３】
2015128418.tif 000004
【図４】
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【配列表】
2015128418000001.app