(57)【要約】【課題】アスコルビン酸／トコフェロール系と違って安定性が高く、それらと同等若しくはそれ以上の優れた抗酸化効果を発揮することができ各種の炎症や疾患の回復や改善に好適な抗酸化組成物およびこれを含む化粧品製剤を提供すること。【解決手段】抗酸化組成物はフラボノイド類と没食子酸との混合物を主たる成分とすることを特徴とし、化粧品製剤は当該抗酸化組成物を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイド類と没食子酸との混合物を主たる成分とすることを特徴とする抗酸化組成物。
【請求項２】
前記フラボノイド類はクェルセチンおよびミリセチンの少なくとも１種からなることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項３】
前記フラボノイド類と没食子とは、重量比で４／１から１／４、好ましくは３／１から１／３からなることを特徴とする請求項１または請求後２に記載の抗酸化組成物。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の抗酸化組成物を含むことを特徴とする化粧品製剤。
【請求項５】
前記抗酸化組成物を０．０００００１ｗｔ％から５．０ｗｔ％、好ましくは０．００００１ｗｔ％から２ｗｔ％、より好ましくは０．０００１ｗｔ％から０．５ｗｔ％含むことを特徴とする請求項４に記載の化粧品製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化組成物およびこれを含む化粧品製剤に係り、各種の炎症や疾患の回復や改善に好適な抗酸化組成物およびこれを含む化粧品製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オゾン層の減少により地上に降り注ぐ紫外線の量は年々増加してきており、紫外線障害に関心が高まっている。紫外線の影響を直接受ける皮膚では種々の活性酸素種（ＲＯＳ）が発生し、それらが皮膚の炎症や疾患、老化に関与するとされている。皮膚疾患に関連の深いＲＯＳには、スーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２)が知られており、さらには脂質ラジカル（非特許文献１参照）が報告されている。こうした生体内で発生したＲＯＳは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびチオレドキシンレダクターゼなどの抗酸化酵素や、グルタチオン、チオレドキシン、ビタミン類などの抗酸化物質、あるいはセルロプラスミン、トランスフェリン、フェリチン、アルブミンなどの抗酸化作用を有するさまざまなタンパク質によって通常は速やかに消去される。
【０００３】
しかしながら、生体内でＲＯＳの生成と消去のバランスが崩れて、酸化ストレス状態になると、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）から派生するヒドロキシラジカル（・ＯＨ）や過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などのより反応性の高いラジカル種および一重項酸素(１Ｏ２)が過剰に生成され、癌などの重篤な疾患だけでなく、前述した皮膚の炎症や疾患、老化が引き起こされる。そのため、優れた抗酸化組成物の開発が、化粧品、医薬品などの外用製剤を用いる工業分野で強く求められてきており、数多くの抗酸化剤が開発され、報告されている。例えば、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ），ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、トコフェロール（ビタミンＥ）などが汎用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】H.Masaki and H.Sakurai, J.Dermatol. Sci., 14,207-216(1997)
【非特許文献２】E.Niki, Annals New York Academy of Science, 498, 186-199(1987)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記の抗酸化剤のうち、一方の合成抗酸化剤であるＢＨＴおよびＢＨＡにおいては、ＢＨＴには変異原性が、ＢＨＡには発がん性が認められているために、これらの合成抗酸化剤は皮膚も含めた生体への安全性が疑問視されており、薬事法上においても配合量に制限があるという問題点があった。
【０００６】
前記の抗酸化剤のうち、他方の天然由来の抗酸化剤であるアスコルビン酸およびトコフェロールにおいては、例えば、生体膜の重要な抗酸化成分であるトコフェロールは、アスコルビン酸との相乗効果（いわゆるsparing action）により、高く、持続的な抗酸化効果が実現されると報告されている（非特許文献２参照）ように、安全性が高く、かつ優れた抗酸化効果を発揮するものである。しかしながら、これらの天然由来の抗酸化剤においては、例えば、化粧品あるいは医薬品製剤についてみると、水との共存系においてアスコルビン酸は熱や酸化に対して極めて弱く、不活性化ならびに分解を受けやすく、安定性に劣るという問題点があった。
【０００７】
従って、安全性・安定性が共に高い抗酸化組成物を有する化粧品製剤を設計することはきわめて困難なのが実情である。
【０００８】
こうした状況下において、天然由来の抗酸化剤であって、アスコルビン酸／トコフェロール系のように安全性が高く、同時に安定性に優れた抗酸化効果を有する抗酸化組成物が強く求められている。
【０００９】
本発明は、これらの点に鑑みてなされたものであり、アスコルビン酸／トコフェロール系と違って安定性が高く、それらと同等若しくはそれ以上の優れた抗酸化効果を発揮することができ各種の炎症や疾患の回復や改善に好適な抗酸化組成物およびこれを含む化粧品製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の課題を解決するために、本発明者らは、安定性が高く、アスコルビン酸／トコフェロール系と同等若しくはそれ以上の優れた抗酸化効果を発揮することのできる抗酸化組成物を得るべく、鋭意研究を重ねた結果、ヨーロッパ産ハーブの一種である西洋夏雪草（Filipendula Ulmaria Maximowicz）の花弁抽出物にスーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２)の優れた消去活性があることを見出した。
【００１１】
西洋夏雪草の花弁抽出物は次のようにして得た。５ｋｇの乾燥した西洋夏雪草の花弁をブレンダーにて粉砕し、これに５ｋｇの５０％含水エタノールを加え還流しながら加熱抽出した。その抽出物をろ過して得たろ液を減圧下で濃縮して花弁抽出物を得た。この花弁抽出物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）にて分析した結果、上記の優れた抗酸化効果を有する分画の主成分はフラボノイド類のクェルセチン（Quercetin：以下必要に応じて「ＱＴ」という）とポリフェノール類の没食子酸（Gallic acid：以下必要に応じて「ＧＡ」という）であることが分かった。そこで、ＧＡに対して天然由来の種々のフラボノイドを組み合わせることで優れた抗酸化効果を発揮することのできる抗酸化組成物が得られると考えて、課題を解決するべく更なる検討を行った。その結果、特にＱＴとＧＡの混合系、およびミリセチン（Myricetin：以下必要に応じて「ＭＴ」という）とＧＡの混合系にきわめて優れた抗酸化効果があることを見出した。
【００１２】
更に説明すると、ＱＴは、フラボノイドの一種で、配糖体（ルチン、クエルシトリンなど）または遊離した形で柑橘類、タマネギやソバをはじめ多くの植物に含まれている。ＱＴはルチン、ヘスペリジンと共にビタミン様物質（ビタミンＰ）の一部であり、その配糖体は様々な薬理作用を示すことが知られていると共に、強い抗酸化作用も示すことが知られている。
【００１３】
更に、ＭＴもフラボノイドの一種で、多くのブドウ、ベリー、果物、野菜、ハーブなどの植物に含まれている。ＭＴの研究においては、高ミリセチン摂取と前立腺がんの発生率の低下に相関があることが示されており、また高い抗酸化活性も有することが知られている。
【００１４】
そして、ＧＡは植物の葉、茎、根、および没食子、五倍子などに遊離の状態またはタンニンの構成成分として分布しており、ポリフェノールの一種として抗酸化作用を示すことも知られている。
【００１５】
このように、ＱＴ、ＭＴはそれぞれ単独で抗酸化作用を示すことは知られているが、そのレベルは他のフラボノイド類（イソフラボン、ガランギン、フィセチン、ケンフェロール、ルチン、タキシフォリン、カテキン、エピガロカテキン、ルテオリンなど）と比べて、結合しているＯＨ基の数が多いために構造上優れていると考えられるが、十分なレベルではなかった。また、ＧＡも単独で抗酸化作用を示すことは知られているが、そのレベルはフラボノイド類と比べると低いものであった。
【００１６】
しかしながら、本発明者らの鋭意研究の結果、フラボノイド類と没食子酸との混合系、具体的にはＱＴとＧＡの混合系、ＭＴとＧＡの混合系においては、ＱＴ、ＭＴ、ＧＡそれぞれ単独での抗酸化能に比べ、有意にそのレベルが上昇することを見出し、これまでにない抗酸化システムの構築が可能であることを発見した。しかも、これらの混合系は、アスコルビン酸／トコフェロール系のアスコルビン酸とは異なり、いずれも水系において化学的に安定であり、またその抗酸化能のレベルも優れていることも見出した。したがって、フラボノイド類と没食子酸との混合系、具体的にはＱＴとＧＡの混合系、ＭＴとＧＡの混合系を用いることにより、各フラボノイド類単独、各ポリフェノール類単独、さらにはアスコルビン酸／トコフェロール系より優れた抗酸化能を有すると共に、安定性・安全性に優れた抗酸化組成物を得ることが可能となり、本発明を完成させた。
【００１７】
更に、本発明の抗酸化組成物を利用することで、スーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２) の消去活性に優れた化粧品製剤を提供することが可能となり、本発明を完成させた。
【００１８】
このようにして完成された本発明の第１の態様の抗酸化組成物は、フラボノイド類と没食子酸との混合物を主たる成分とすることを特徴とする。
【００１９】
この第１の態様の抗酸化組成物により、天然由来の物質とされるフラボノイド類と没食子酸との混合系を用いることにより、各フラボノイド類単独、各ポリフェノール類単独、さらにはアスコルビン酸／トコフェロール系より優れた抗酸化効果を発揮することができると共に、安定性・安全性に優れた抗酸化組成物を提供することができる。
【００２０】
また、本発明の第２の態様の抗酸化組成物は、第１の態様において、前記フラボノイド類がクェルセチンおよびミリセチンの少なくとも１種からなることを特徴とする。
【００２１】
この第２の態様の抗酸化組成物により、フラボノイド類中において構造上特に優れているクェルセチンおよびミリセチンを用いるために、より優れた抗酸化効果を発揮することができる。
【００２２】
また、本発明の第３の態様の抗酸化組成物は、第１または第２の態様において、前記フラボノイド類と没食子酸とが、重量比で４／１から１／４、好ましくは３／１から１／３からなることを特徴とする。
【００２３】
この第３の態様の抗酸化組成物により、フラボノイド類と没食子酸との混合比を種々に選択して優れた抗酸化効果を発揮する抗酸化組成物を提供することができる。
【００２４】
更に、本発明の第１の態様の化粧品製剤は、第１から第３のいずれかの態様に記載の抗酸化組成物を含むことを特徴とする。
【００２５】
この第１の態様の化粧品製剤により、スーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２) の消去活性に優れた化粧品製剤を提供することができる。
【００２６】
また、本発明の第２の態様の化粧品製剤は、第１の態様において、前記抗酸化組成物を０．０００００１ｗｔ％から５．０ｗｔ％、好ましくは０．００００１ｗｔ％から２ｗｔ％、より好ましくは０．０００１ｗｔ％から０．５ｗｔ％含むことを特徴とする。
【００２７】
この第２の態様の化粧品製剤により、本発明の抗酸化組成物の微量添加によりスーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２) の消去活性に優れた化粧品製剤を提供することができる。
【発明の効果】
【００２８】
このように本発明は構成され作用するものであるから、アスコルビン酸／トコフェロール系と違って安定性が高く、それらと同等若しくはそれ以上の優れた抗酸化効果を発揮することができ、各種の炎症や疾患の回復や改善に好適な抗酸化組成物およびこれを含む化粧品製剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００３０】
＜抗酸化組成物＞
まず、本発明の抗酸化組成物について説明する。
【００３１】
本発明の抗酸化組成物は、フラボノイド類と没食子酸との混合物を主たる成分とする。
【００３２】
本発明の抗酸化組成物は、これらの主成分の他に、抗酸化を促進する成分や他の回避できない成分を含むことができる。
【００３３】
本発明において利用できるフラボノイド類としては、天然由来の物質であり、クェルセチン、ミリセチン、イソフラボン、ガランギン、フィセチン、ケンフェロール、ルチン、タキシフォリン、カテキン、エピガロカテキン、ルテオリン等から選択して用いるとよい。
【００３４】
その選択基準としては、結合しているＯＨ基の数が多いものとすることがよい。例えば、クェルセチン（下記の式（１）参照）およびミリセチン（下記の式（２）参照）とするとよい。
【００３５】
本発明において利用する没食子酸は、天然由来の物質であり、ポリフェノールの一種であり、下記の式（３）に示すものである。
【００３６】
【化１】
2015040230.tif 000002
【００３７】
【化２】
2015040230.tif 000003
【００３８】
【化３】
2015040230.tif 000004
【００３９】
本実施形態の抗酸化組成物は、天然由来の物質とされるフラボノイド類と没食子酸との混合系として形成されているので、各フラボノイド類単独、各ポリフェノール類単独、さらにはアスコルビン酸／トコフェロール系より優れた抗酸化効果を発揮することができると共に、安定性・安全性に優れたものとなる。
【００４０】
更に、本実施形態の抗酸化組成物中のフラボノイド類をクェルセチンおよびミリセチンの少なくとも１種によって形成すると、フラボノイド類中において構造上特に優れているクェルセチンおよびミリセチンを用いるために、より優れた抗酸化効果を発揮することができる。
【００４１】
更に、本実施形態の抗酸化組成物においては、フラボノイド類と没食子酸とを、重量比で４／１から１／４、好ましくは３／１から１／３の割合で混合させるとよい。これによりフラボノイド類と没食子酸との混合比を種々に選択して優れた抗酸化効果を発揮する抗酸化組成物を提供することができる。
【００４２】
＜化粧品製剤＞
本発明の化粧品製剤を説明する。
【００４３】
本実施形態の化粧品製剤は、本実施形態の抗酸化組成物、即ちフラボノイド類と没食子酸との混合物を主たる成分とする組成物等を含むことを特徴とする。
【００４４】
本実施形態の化粧品製剤の剤形としては任意であり、例えば、水溶液型、可溶化型、水性ゲル型、乳化型、リポソーム型、凍結乾燥型、スプレードライによる粉末型あるいは分散型等の剤形から使用目的に応じて選択するとよい。
【００４５】
本実施形態の化粧品製剤を用いると、フラボノイド類と没食子酸との混合物、具体的にはクェルセチンおよびミリセチンの少なくとも１種と没食子酸との混合物による優れた抗酸化効果が発揮されるので、化粧品製剤が適用された部位においてスーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２) の消去活性が発揮され、各種の炎症や疾患の回復や改善がなされることとなる。
【００４６】
更に、化粧品製剤中の抗酸化組成物の添加量は、例えば、０．０００００１ｗｔ％から５．０ｗｔ％、好ましくは０．００００１ｗｔ％から２ｗｔ％、より好ましくは０．０００１ｗｔ％から０．５ｗｔ％とするとよい。
【００４７】
本実施形態の化粧品製剤においては、抗酸化組成物の微量添加によりスーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２) の消去活性に優れた化粧品製剤を提供することができる。
【００４８】
更に、本実施形態の化粧品製剤としては前記の必須成分の他に、通常の化粧品製剤の基材として配合される成分、例えば、油脂類、炭化水素、ロウ類、脂肪酸、合成エステル類等、アルコール類、粉体、界面活性剤、増粘剤（高分子化合物、ゲル化剤）、保湿剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、酸化防止剤、色素、顔料、防腐剤、香料または水等を本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択して用いるとよい。
【００４９】
これらの成分中の主たる成分を更に説明する。
【００５０】
油脂類としては、ホホバ油、ヒマシ油、オリーブ油、大豆油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、ミンク油、タートル油等が挙げられる。
【００５１】
炭化水素類としては、流動パラフィン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン等が挙げられる。
【００５２】
ロウ類としては、ミツロウ、ラノリン、カルナバロウ、キャンデリラロウ等が挙げられる。
【００５３】
脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸等が挙げられる。
【００５４】
合成エステル類としては、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、オレイン酸エチル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、リンゴ酸ジイソステアリル、リノール酸エチル、２−エチルヘキサン酸セチル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル等が挙げられる。
【００５５】
油脂類、炭化水素、ロウ類、脂肪酸、合成エステル類は、通常あわせて皮膚化粧料あたり０〜５０ｗｔ％の割合で配合される。
【００５６】
アルコール類としては、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール等が挙げられる。アルコール類は、通常皮膚化粧料あたり０〜４０ｗｔ％の割合で配合される。
【００５７】
界面活性剤としては、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ラウリル硫酸ナトリウム、ピログルタミン酸イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ジアルキルスルホコハク酸、臭化セチルピリジニウム、塩化−ｎ−オクタデシルトリメチルアンモニウム、モノアルキルリン酸、ジアルキルリン酸、Ｎ−アシルグルタミン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン還元ラノリン、アルキルグルコシド、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム等が挙げられる。界面活性剤は、通常皮膚化粧料あたり０〜２０ｗｔ％の割合で配合される。
【００５８】
増粘剤（高分子化合物、ゲル化剤）としては、カルボキシビニルポリマー、メチルポリシロキサン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、カラギーンナン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。増粘剤は、通常皮膚化粧料あたり０〜５ｗｔ％の割合で配合される。
【００５９】
保湿剤としては、グリセリン、トレハロース、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、アルギニン、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン、ピログルタミン酸、アセチルグルタミン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、アテロコラーゲン、加水分解コラーゲン、加水分解エラスチン、加水分解ヒアルロン酸、リン脂質等が挙げられる。保湿剤は、通常皮膚化粧料あたり０〜４０ｗｔ％の割合で配合される。
【００６０】
顔料としては、酸化鉄、二酸化チタン、酸化亜鉛、カオリン、タルク等が挙げられる。顔料は、通常皮膚化粧料あたり０〜３０ｗｔ％の割合で配合される。
【００６１】
防腐剤としては、安息香酸、サリチル酸、デヒドロ酢酸あるいはそれらの塩類、パラオキシ安息香酸エステル類やフェノキシエタノールのフェノール類、クロルフェネシン等が挙げられる。防腐剤は、通常皮膚化粧料あたり０〜１．０ｗｔ％の割合で配合される。
【００６２】
香料は、通常の化粧品製剤に使用するものであればどのような香料を用いてもよい。
【００６３】
水としては、水道水、精製水、ミネラルウォーター、かん水、海水、海洋深層水、超純水、極地氷由来水、含鉱水等が挙げられる。水は任意の割合で配合される。
【００６４】
以下、本発明の実施例について、詳細に説明する。
【００６５】
実施例１から実施例５は本発明の抗酸化組成物を示し、実施例６は本発明の化粧品製剤を示す。
【００６６】
なお、本実施例により本発明が限定されるものではない。
【００６７】
［実施例１］ＴＢＡ法による抗酸化活性
＜実験手順＞
本実施例１においては、本発明の抗酸化組成物と比較例との抗酸化活性をＴＢＡ法によって測定して求めた。
ＴＢＡ法（福沢健治、寺尾純二、“脂質過酸化実験法”廣川書店（１９９０））は、２−チオバルビツール酸（ＴＢＡ）と過酸化脂質を反応させて、生じる赤色色素を蛍光スペクトル[励起波長 : ５１５ｎｍ, 蛍光波長 : ５５１ｎｍ]で定量することにより脂質の過酸化の程度を知る方法である。被酸化物質は角層細胞間脂質中に含有されるリノール酸を用いた。
【００６８】
以下に実験手順を示す。
(1)  リノール酸０．０３ｍＬを含有する試験試料（抗酸化剤（０．０５ｗ％）のエチレングリコール溶液）０．３２ｍＬを２５ｍＬメスフラスコに採り、アセトンでメスアップした。
抗酸化剤として、コントロール（抗酸化剤無添加）、ＱＴ単体、ＭＴ単体、ＧＡ単体、ＱＴ／ＧＡ（１／１重量比）、ＭＴ／ＧＡ（１／１重量比）、アスコルビン酸単体、トコフェロール単体、アスコルビン酸／トコフェロール（１／１重量比）を用意した。
(2)  (1)を１００μＬ分取し１０ｍＬねじ口瓶に移し、乾燥させた。
(3)  キャップをはずしたまま２時間ＵＶ照射した。ＵＶランプは、３２Ｗの低圧水銀ランプ（３２−ＬＢ：理工科学産業(株)）を使用した。
(4)  (3)に０．８％（ｗ／ｗ）ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）（ｉｎ  ＣＨ３ＣＯＯＨ）を０．３ｍＬ加え、次に８．１％（ｗ／ｗ）ＳＤＳ溶液を０．４ｍＬ加え、さらに１０％（ｗ／ｗ）ＣＨ３ＣＯＯＨ緩衝溶液（ｐＨ４．０）を３．０ｍＬ加えた。
(5)  (4)に０．５６％（ｗ／ｗ）ＴＢＡ溶液を４．３ｍＬ加えよく混合した。
(6)  (5)を容器に蓋を閉めて９５℃の沸騰水浴中で２時間加熱した。
(7)  (6)を放置して室温まで冷却し、その後遠沈管に３ｍＬ移した。
(8)  (7)にｎ−ブタノールを５ｍＬ加えて混合した後、室温で１０分間、遠心分離器（３０００ｒ．ｐ．ｍ．）にかけた。
(9)  上層のブタノール１ｍＬを０．５０μｍのメンブランフィルターでろ過した。
(10)  (9)にｎ−ブタノール７ｍＬを加え混合した後、石英セルに３ｍＬ移し、蛍光スペクトル測定を行った。[励起波長 : ５１５ｎｍ, 蛍光波長 : ５５１ｎｍ]
【００６９】
（結果）
結果は下記の表１および表２の通りである。
【００７０】
【表１】
2015040230.tif 000005
【００７１】
【表２】
2015040230.tif 000006
【００７２】
表１の結果から、抗酸化剤無添加のコントロールでは高い蛍光強度を示し、リノール酸の酸化の進行が認められたが、ＱＴ単体、ＭＴ単体とＧＡ単体ではその酸化の進行が抑えられ、ＱＴ／ＧＡ混合系とＭＴ／ＧＡ混合系では蛍光強度がさらに低く、強い抗酸化能を示すことが分かった。また、表１と表２の結果を比較すると、アスコルビン酸／トコフェロール混合系の蛍光強度は１４５であるのに対して、一方のＱＴ／ＧＡ混合系の蛍光強度は１／２以下の６０であり、他方のＭＴ／ＧＡ混合系の蛍光強度は１／３以下の４０であり、本実施例のＱＴ／ＧＡ混合系とＭＴ／ＧＡ混合系の方がアスコルビン酸／トコフェロール混合系よりも明らかに高い抗酸化能を示すことも認められた。
【００７３】
更に、ＱＴ／ＧＡ混合系、ＭＴ／ＧＡ混合系およびアスコルビン酸／トコフェロール混合系を９０℃で５時間加熱し、その後同様の方法で各抗酸化能を測定した。その結果、ＱＴ／ＧＡ混合系、ＭＴ／ＧＡ混合系の蛍光強度はそれぞれ６５、４２で表１の結果とほとんど変化を示さなかったが、アスコルビン酸／トコフェロール混合系の蛍光強度は１６５で表２の結果と比べて抗酸化能のレベルが低下した。このことから、熱安定性の観点からもＱＴ／ＧＡ混合系とＭＴ／ＧＡ混合系は、アスコルビン酸／トコフェロール混合系よりも明らかに優れていることが確認された。
【００７４】
［実施例２］Ｏ２−・消去活性
＜実験手順＞
本実施例２においては、本発明の抗酸化組成物と比較例とのＯ２−・消去活性を求めた。
Ｏ２−・は各活性酸素種の前駆体であり、Ｏ２−・を消去することによりさらなる活性酸素種の生成を抑制することが可能となることから、各抗酸化剤に対してＯ２−・消去活性を検討することは非常に重要である。
【００７５】
以下に実験手順を示す。
(1)  抗酸化剤０．０５ｗｔ％を含む試験試料（抗酸化剤のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液）２５ｍＬ（試料Ａ）に、超酸化カリウム（ＫＯ２）６．４ｍｇと１８−クラウン−６−エーテル１５．８ｍｇを加え、１５分間撹拌し、Ｏ２−・を発生させた（試料Ｂ）。
抗酸化剤として、コントロール（抗酸化剤無添加）、ＱＴ単体、ＭＴ単体、ＧＡ単体、ＱＴ／ＧＡ（１／１重量比）、ＭＴ／ＧＡ（１／１重量比）を用意した。
なお、アスコルビン酸単体、トコフェロール単体、アスコルビン酸／トコフェロール（１／１重量比）については、実施例１において抗酸化能が低いことが判明したので、Ｏ２−・消去活性も低いと判断して測定しないこととした。
(2)  ４．６ｍｌの２ｍＭニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液に試料Ａを０．１ｍｌ分散させた。
(3)  (2)に試料Ｂを０．３ｍＬ添加し、生じる青色沈殿物（ブルーホルマザン）に対してクロロホルム８ｍＬを加えた。これにより未反応のＮＢＴ層と生成したブルーホルマザン層の２層に試料溶液は分離した。
(4)  (3)よりブルーホルマザン層を０．１ｍＬ分取し、クロロホルム０．９ｍＬを添加して希釈後、吸光度を測定した。次いで、５３０−５７０ｎｍ付近に現れるピーク強度をコントロール（抗酸化剤無添加試験試料）と比較することでＯ２−・の定量を行った。
【００７６】
（結果）
結果は下記の表３の通りである。
【００７７】
【表３】
2015040230.tif 000007
【００７８】
表３の結果から、抗酸化剤無添加のコントロールに比べ、各抗酸化剤を添加した試験試料ではいずれも吸光度比が低くなっており、Ｏ２−・に対する高い消去能を有していることが分かる。特に、本実施例のＱＴ／ＧＡ混合系とＭＴ／ＧＡ混合系では吸光度比がさらに低く、強いＯ２−・消去能を示すことが認められた。
【００７９】
［実施例３］Ｈ２Ｏ２消去活性
＜実験手順＞
本実施例３においては、本発明の抗酸化組成物と比較例とのＨ２Ｏ２消去活性を求めた。
Ｈ２Ｏ２は、Ｏ２−・がＳＯＤにより分解された際に生成する活性酸素であり、比較的安定なため生体内で発生すると細胞膜を通過して拡散することが知られている。また、Ｈ２Ｏ２自体は反応性が高くないが、金属イオンの存在により容易に分解して・ＯＨを生成するため、反応性に富む・ＯＨの前駆体として酸化障害を考えるうえで重要である。
Ｈ２Ｏ２の定量は過酸化水素定量用キット（BIOXYTECH H2O2 Assay Kit[funakoshi]）を用いて行った。
以下に実験手順を示す。
(1)  １０−５ｍｏｌのＨ２Ｏ２水溶液を調製し、そこに抗酸化剤０．０５ｗｔ％を含む試験試料（抗酸化剤のエチレングリコール溶液）を添加する。
抗酸化剤として、コントロール（抗酸化剤無添加）、ＱＴ単体、ＭＴ単体、ＧＡ単体、ＱＴ／ＧＡ（１／１重量比）、ＭＴ／ＧＡ（１／１重量比）を用意した。
なお、アスコルビン酸単体、トコフェロール単体、アスコルビン酸／トコフェロール（１／１重量比）については、実施例１において抗酸化能が低いことが判明したので、Ｈ２Ｏ２消去活性も低いと判断して測定しないこととした。
(2)  (1)の溶液を１０分放置後、前述の過酸化水素定量用キットを用いて、５６０ｎｍにおける吸光度からＨ２Ｏ２を定量した。
【００８０】
（結果）
結果は下記の表４の通りである。
【００８１】
【表４】
2015040230.tif 000008
【００８２】
表４の結果から、抗酸化剤無添加のコントロールに比べ、各抗酸化剤を添加した試験試料ではいずれも吸光度比が低くなっており、Ｈ２Ｏ２に対する高い消去能を有していることが分かる。特に、本実施例のＱＴ／ＧＡ混合系とＭＴ／ＧＡ混合系では吸光度比がさらに低く、強いＨ２Ｏ２消去能を示すことが認められた。
【００８３】
［実施例４］・ＯＨ消去活性
＜実験手順＞
本実施例４においては、本発明の抗酸化組成物と比較例との・ＯＨ消去活性を求めた。
・ＯＨは、ＲＯＳのなかでは最も反応性が高く、最も酸化力が強い。しかも、糖質、タンパク質や脂質などあらゆる生体物質と反応する。この・ＯＨはＨ２Ｏ２への紫外線の照射や、酸性条件でＨ２Ｏ２と二価の鉄化合物を触媒的に反応させる方法（フェントン反応
）によって生成される。したがって、・ＯＨの消去活性を検討することは紫外線に対する皮膚も含めた生体防御の上で非常に重要である。
【００８４】
以下に実験手順を示す。
(1)  抗酸化剤０．０５ｗｔ％をｔｅｒｔ−ブチルアルコールに溶解させた（試料Ａ）。
抗酸化剤として、コントロール（抗酸化剤無添加）、ＱＴ単体、ＭＴ単体、ＧＡ単体、ＱＴ／ＧＡ（１／１重量比）、ＭＴ／ＧＡ（１／１重量比）を用意した。
なお、アスコルビン酸単体、トコフェロール単体、アスコルビン酸／トコフェロール（１／１重量比）については、実施例１において抗酸化能が低いことが判明したので、・ＯＨ消去活性も低いと判断して測定しないこととした。
(2)  ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型）にフェナジンメチルスルファートを加えることで・ＯＨを発生させた（試料Ｂ）。
(3)  試料Ｂを試料Ａに添加し、そこに、ｐ−ニトロソジメチルアニリンのｔｅｒｔ−ブチルアルコール溶液を加えた。
(4)  (3)の溶液の吸光度を４４０ｎｍの波長で測定し、抗酸化剤無添加のコントロールと比較することで・ＯＨを定量した。ｐ−ニトロソジメチルアニリンが・ＯＨと反応することで黄色から無色へと変化することを利用した測定方法である。
【００８５】
（結果）
結果は下記の表５の通りである。
【表５】
2015040230.tif 000009
【００８６】
表５の結果から、抗酸化剤無添加のコントロールに比べ、各抗酸化剤を添加した試験試料ではいずれも吸光度比が低くなっており、・ＯＨに対する高い消去能を有していることが分かる。特に、本実施例のＱＴ／ＧＡ混合系とＭＴ／ＧＡ混合系では吸光度比がさらに低く、強い・ＯＨ消去能を示すことが認められた。
【００８７】
［実施例５］１Ｏ２消去活性
＜実験手順＞
本実施例５においては、本発明の抗酸化組成物と比較例との１Ｏ２消去活性を求めた。
１Ｏ２は最も還元性の高いＲＯＳの一種であり、日常生活における紫外線暴露で継続的に発生すると考えられている（岡田富雄：しわ、たるみの原因となる活性酸素・フリーラジカル、皮膚の老化と活性酸素・フリーラジカル、フレグランスジャーナル社、東京、１９９６、ｐｐ.６９−８８）。皮膚表層および組織中で発生した１Ｏ２は速やかに皮脂中のスクワレンや不飽和脂肪酸を過酸化したり、真皮中のコラーゲンなどのタンパク質を変性する（Gilchrest, B.A., et al, Photochem.Photobiol., 63, 1-10(1996)）。しかしながら、Ｏ２−・に対するＳＯＤのように、生体中にはこの１Ｏ２を効率的に消去する機能は存在せず、外来性の抗酸化剤の作用で防御する必要がある。従って、１Ｏ２を効率よく消去する抗酸化システムが皮膚における酸化障害を予防する上で非常に重要とされている。
１Ｏ２消去活性は、ＭＴ／ＧＡ混合系に対してＭＴとＧＡとの混合比を変化させると共に、ＱＴ／ＧＡ混合系に対してＱＴとＧＡとの混合比を変化させて以下のような手順で測定した。
【００８８】
以下に実験手順を示す。
(1)  ＭＴ／ＧＡ総濃度およびＱＴ／ＧＡ総濃度が０．０５ｗｔ％の試験試料（抗酸化剤のエチレングリコール溶液）を用いて、一重項酸素（１Ｏ２）消去活性の測定をMukai等の方法（Kazuo Mukai, et al., J.Org.Chem. 56, 4188-4192(1991)）に従って行った。
ここで、各フラボノイド類（ＭＴとＱＴ）とＧＡとの混合比は、重量比で１００／０、８０／２０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、２０／８０、０／１００と変化させた。
評価反応系では、3-(1,4-epidioxy-4-methyl-1,4-dihydro-1-naphtyl)propionic acid (ＥＰ)を一重項酸素ドナーとし、2,5-diphenyl-3,4-benzofuran (ＤＰＢＦ)をアクセプターとするようにデザインされている。ＥＰは４０℃において持続的に１Ｏ２を発生し、１Ｏ２消去剤が反応中に共存しない場合、ＤＰＢＦと速やかに反応し、ＤＰＢＦの４１５ｎｍにおける吸光度を経時的に減少させる。１Ｏ２消去活性を有する成分が反応液に添加された場合、ＤＰＢＦの消化速度は低下し、その消化速度の低下と１Ｏ２消去剤の反応系中の濃度とは相対関係にある。従って、本評価条件において、ＭＴとＧＡを含まず溶媒のみで測定したブランクの減少速度から、ＤＰＢＦの自然減少速度を差し引いた値を１００とし、この減少速度のうちの１０％を低下させるために必要となる評価反応液中の１Ｏ２消去剤の量をＥＣ１０と表示する。この値が少ない方が１Ｏ２消去活性値が高いことを意味する。
(3)  ５０μＬのＥＰ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）と５０μＬのＤＰＢＦ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬのＭＴ／ＧＡ混合系およびＱＴ／ＧＡ混合系の各混合比に応じた試験溶液に加え、４０℃で加温した。
(4)  １Ｏ２消去活性をＤＰＢＦの吸収（４１５ｎｍ）の減少速度を分光光度計で測定することで算出した。
【００８９】
（結果）
結果は下記の表６（ＭＴ／ＧＡ混合系）および表７（ＱＴ／ＧＡ混合系）の通りである。
【００９０】
【表６】
2015040230.tif 000010
【００９１】
【表７】
2015040230.tif 000011
【００９２】
表６および表７の結果より、ＭＴとＧＡの混合比率およびＱＴとＧＡの混合比率に応じてＥＣ１０の値が変化していることが分かる。つまり、ＭＴとＱＴとＧＡがそれぞれ単独の場合には、カテキン、アスコルビン酸、トコフェロールやアスコルビン酸／トコフェロール混合系と同等、あるいは若干高い１Ｏ２消去活性を示すが、ＭＴとＧＡを組み合わせること並びにＱＴとＧＡを組み合わせることにより、極めて高い１Ｏ２消去活性を示すことが明らかとなった。特に、ＭＴ／ＧＡ（１／１重量比）は０．００００７であり、ＱＴ／ＧＡ（１／１重量比）は０．０００１０であり、共にアスコルビン酸／トコフェロール（１／１重量比）の０．００１４７に対して２０から１５倍という極めて高い１Ｏ２消去活性を示すことが明らかとなった。
【００９３】
更に、本実施例より本発明の抗酸化組成物において、フラボノイド類と没食子酸とを重量比で４／１から１／４、好ましくは３／１から１／３からすると優れた抗酸化効果を発揮することがわかった。
【００９４】
［実施例６］ＵＶ照射によるヒト皮膚酸化反応に対する抑制効果
＜実験手順＞
本実施例６においては、本発明の化粧品製剤と比較例とのＵＶ照射によるヒト皮膚酸化反応に対する抑制効果を求めた。
本実施例においては、化粧品製剤として本発明の抗酸化組成物中のＭＴ／ＧＡ（１／１重量比）対して実験した。これは本発明の抗酸化組成物中の他の物質、例えばＱＴ／ＧＡ（１／１重量比）においても同様の抑制効果が発揮させることがわかるためである
本実施例においては、健常男性（３名）の背部を用いて、ＵＶ照射によって発生する酸化反応に対する本発明のＭＴ／ＧＡ（１／１）系での抑制効果を評価した。
【００９５】
以下に実験手順を示す。
(1)  １０μｇのリノール酸を被験者背部の試験エリア（１０ｃｍ２）に塗布した。
(2)  ５０μＬのＭＴ／ＧＡの総濃度が０．０５ｗｔ％の試験試料美容液（成分は下記表８参照）を被験者背部の試験エリア（１０ｃｍ２）に塗布した。
【００９６】
【表８】
2015040230.tif 000012
【００９７】
(3)  ＵＶ（６０ｍＪ／ｃｍ２、２８５ｎｍ）をエリアに照射した。
(4)  照射から４時間後、エリア内の酸化物を３０ｍｌのアセトン：ジエチルエーテル（５０：５０）溶液でカップ法にて抽出した。
(5)  (4)の酸化物量はＴＢＡ法にて測定した。
【００９８】
（結果）
その結果、ＵＶ（６０ｍＪ／ｃｍ２、２８５ｎｍ、１ＭＥＤ）照射された被験者の背部区分の抗酸化剤を塗布されていない部分の抽出物中の酸化物量の測定値は、２．１４、２．２６、２．２０（平均２．２０ｎｍｏｌＭＤＡ（マロンジアルデヒド）／ｍＬ）であった。ＵＶ非照射区分の抽出物中の酸化物量の測定値は１．０５、１．２０、１．１４（平均１．１３ｎｍｏｌＭＤＡ／ｍＬ）であった。従って、ＵＶが照射されることにより照射されない部分に比べて、約２倍の脂質過酸化物が生成されていた。対照的に本発明のＭＴ／ＧＡ（１／１）試験試料を塗布した後にＵＶ照射した区分の抽出物中の酸化物量の測定値は１．１８、１．２５、１．１９（平均１．２１ｎｍｏｌＭＤＡ／ｍＬ）でＵＶ非照射区分とほぼ同様の値を示した。一方、０．０５％のＭＴ、ＧＡ単独での試験試料を塗布した後にＵＶ照射した区分の抽出物中の酸化物量の測定値は、ＭＴでは１．５７、１．９０、１．６９（平均１．７２ｎｍｏｌＭＤＡ／ｍＬ）、ＧＡでは１．９８、２．０１、１．８３（平均１．９４ｎｍｏｌＭＤＡ／ｍＬ）となり、ＭＴ／ＧＡ（１／１）系と抗酸化剤無しでＵＶ照射した区分の中間の値を示した。結果をまとめたものを表９に示す。
【００９９】
【表９】
2015040230.tif 000013
【０１００】
表９の結果より、ＭＴ／ＧＡ（１／１）系がＵＶ照射で生じる実際のヒト皮膚の過酸化反応を効果的に抑制できることが分かった。ＵＶ照射によって皮膚組織中に生成したＲＯＳが、皮脂中や角層細胞間脂質中に存在するスクワレンやリノール酸などの不飽和結合を有する脂質成分をラジカル化し、これらのラジカル成分がさらなる脂質成分の過酸化反応を誘引して皮膚表層の過酸化物増大をもたらすと考えられており（岡田富雄：しわ、たるみの原因となる活性酸素・フリーラジカル、皮膚の老化と活性酸素・フリーラジカル、フレグランスジャーナル社、東京、１９９６、ｐｐ.６９−８８）、本発明のＭＴ／ＧＡ（１／１）系はこの一連の酸化反応における一時反応産物であるＲＯＳを有効に消去することで、皮膚におけるＵＶの過酸化反応を抑制している。こうして、ＭＴ／ＧＡ（１／１）系は、皮膚の酸化を効率よく抑制することから、皮膚に存在する脂質の酸化により生じる皮表脂質や角層細胞間脂質構造の乱れを防御し、皮膚表面を含めた角質層全体のバリヤ機能・水分保持機能も防御できると考えられる。
【０１０１】
本実施例に示す本発明の化粧品製剤により、スーパーオキシドアニオンラジカル (Ｏ２−・)、ヒドロキシラジカル(・ＯＨ)、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)、一重項酸素(１Ｏ２) の消去活性に優れた化粧品製剤を提供することができることがわかり、更に化粧品製剤中における本発明の抗酸化組成物の添加量も必要に応じて調整できることがわかった。