(57)【要約】【課題】  クドア・セプテンクタータを特異的にかつ迅速かつ簡便に検出する方法を提供する。【解決手段】  クドア・セプテンプンクタータ胞子に対する第一及び第二のモノクローナル抗体を用い、固相に固定された前記第一のモノクローナル抗体と標識された前記第二のモノクローナル抗体とクドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質とを含む複合体を形成させる工程を含み、前記第一のモノクローナル抗体がクドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出され、Ｎ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する分子量約２３,０００のタンパク質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともクドア・ヤスナガイ、クドア・アマミエンシス、クドア・イワタイへの反応性が低く、クドア・セプテンプンクタータに高い反応性を示すモノクローナル抗体を用いて、免疫学的測定法により、試料中のクドア・セプテンプンクタータを検出することを特徴とするクドア・セプテンプンクタータの検出方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、クドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出されるＮ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する分子量約２３,０００のタンパク質に反応性を示すモノクローナル抗体である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６で寄託されたハイブリドーマ又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６７で寄託されたハイブリドーマから産生される抗体である請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記免疫学的測定法が、クドア・セプテンプンクタータ胞子に対する第一及び第二のモノクローナル抗体を用い、固相に固定された前記第一のモノクローナル抗体と標識された前記第二のモノクローナル抗体とクドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質とを含む複合体を形成させる工程を含み、
少なくとも前記第一のモノクローナル抗体が、少なくともクドア・ヤスナガイ、クドア・アマミエンシス、クドア・イワタイへの反応性が小さく、クドア・セプテンプンクタータに反応性を示すモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のモノクローナル抗体が、クドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出されるＮ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する分子量約２３,０００のタンパク質に反応性を示すモノクローナル抗体、又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６で寄託されたハイブリドーマから産生される抗体、又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６７で寄託されたハイブリドーマから産生される抗体である請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
クドア・セプテンクタータ胞子に対する第一及び第二のモノクローナル抗体を利用して試料中のクドア・セプテンクタータ胞子を検出するためのイムノクロマトグラフ用検査具であって、
第一のモノクローナル抗体が固定された判定領域を配置したクロマト用膜担体と、
標識された第二のモノクローナル抗体と、を含み、
前記第一のモノクローナル抗体が、少なくともクドア・ヤスナガイ、クドア・アマミエンシス、クドア・イワタイへの反応性が小さく、クドア・セプテンプンクタータに反応性を示すモノクローナル抗体であるイムノクロマトグラフ用検査具。
【請求項７】
前記第一のモノクローナル抗体及び前記第二のモノクローナル抗体が、異種のモノクローナル抗体である請求項６に記載のイムノクロマトグラフ用検査具。
【請求項８】
前記第一のモノクローナル抗体が、クドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出されるＮ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する分子量約２３,０００のタンパク質に反応性を示すモノクローナル抗体、又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６で寄託されたハイブリドーマから産生される抗体、又は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６７で寄託されたハイブリドーマから産生される抗体である請求項６又は７に記載のイムノクロマトグラフ用検査具。
【請求項９】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６又はＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６７で寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１０】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６又はＮＩＴＥＰ−０１７６７で寄託されたハイブリドーマから産生されるクドア・セプテンプンクタータに対するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クドア・セプテンプンクタータの迅速検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クドア・セプテンプンクタータ（Kudoa septempuctata）は、粘液胞子虫の一種であり、ヒラメの生食による食中毒の原因物質である。クドア・セプテンプンクタータの検出法として、リアルタイムＰＣＲによる方法（非特許文献１）やクドア・セプテンプンクタータに対するポリクロナール抗体を用いた方法（特許文献１）が知られている。
【０００３】
しかしながら、リアルタイムＰＣＲによる方法やポリクロナール抗体を用いた方法は特別な装置を必要とするだけでなく、検査の所要時間もそれぞれ３時間程度、１.５時間程度と判定に長時間を要する。
【０００４】
クドア・セプテンプンクタータは感染したヒラメ筋肉中で粘液胞子を形成する。しかし、これまでのところ、クドア・セプテンプンクタータの生態についての情報は十分ではなく、そのゲノム情報や食中毒の発症機序についての情報はほとんど知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−３６９４３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】平成２３年７月１１日付け厚生労働省食品安全部監視安全課長通知
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、クドア・セプテンクタータを特異的にかつ迅速かつ簡便に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る検出方法は、クドア・セプテンプンクタータに特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を用いた抗原抗体反応により、クドア・セプテンプンクタータを検出する方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、簡便な方法で確実かつ迅速にクドア・セプテンプンクタータによる汚染があるかどうかを知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明の一実施態様であるイムノクロマトグラフ用検査具の概略構成図である。
【図２】図２はハイブリドーマＫｓ２４-１５Ｇ１１の産生するモノクローナル抗体を用いてアフィニティー精製したクドア・セプテンプンクタータ抗原の電気泳動の結果を示す画像である。レーン１はマーカー、レーン２は同抗体によりアフィニティー精製したクドア・セプテンプンクタータ抗原を示す。
【図３】図３はハイブリドーマＫｓ２４-１５Ｇ１１の産生するモノクローナル抗体が認識する抗原のイムノブロッティングの結果を示す画像である。レーン１はマーカー、レーン２は同抗体によりアフィニティー精製したクドア・セプテンプンクタータ抗原を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る検出方法は、クドア・セプテンプンクタータの特定タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いた抗原抗体反応を利用する方法である。
【００１２】
本発明に係る方法が適用される試料は、クドア・セプテンプンクタータ胞子の存在、つまりクドア・セプテンクタータに汚染された可能性があるものであればよい。本発明の方法はクドア・セプテンプンクタータ胞子を検出する方法であるが、胞子の存在が検出できれば、クドア・セプテンプンクタータによる感染が明らかとなる。
【００１３】
クドア・セプテンプンクタータはヒラメから検出される寄生虫であり、試料が調製される検体はヒラメ又はヒラメを使用した食品である。試料は、例えば、ヒラメ又はヒラメを使用した食品そのままであるか、あるいはそれらの処理物であり得る。試料の調製の方法として、ヒラメなどの検体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や生理食塩水中でホモジナイズして上清を得る方法が例示される。
【００１４】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、少なくともクドア・ヤスナガイ（K.yasunagai）、クドア・アマミエンシス（K.amamiensis）、クドア・イワタイ（K.iwatai）への反応性が低く、クドア・セプテンプンクタータに高い反応性を示すモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、クドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出され、Ｎ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する分子量約２３,０００のタンパク質を認識する。
【００１５】
当該モノクローナル抗体は、クドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質、例えば上記アミノ酸配列を有するペプチドを、免疫原として接種したマウスの脾細胞とミエローマを融合させたハイブリドーマから産生され得る。ハイブリドーマは公知の方法で作出され得る。当該モノクローナル抗体は、例えば、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、２０１３年１２月２日付けで受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６で寄託されたハイブリドーマ（以下、「ハイブリドーマＫｓ２４-１５Ｇ１１」という。）から産生される抗体（以下「Ｋｓ２４-１５Ｇ１１抗体」という）であり得る。また、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、例えば、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、２０１３年１２月２日付けで受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６７で寄託されたハイブリドーマ（以下、「ハイブリドーマＫｓ１８-１１Ｈ５」という。）から産生される抗体（以下「Ｋｓ１８-１１Ｈ５抗体」という）であり得る。その他にも、少なくともクドア・ヤスナガイ、クドア・アマミエンシス、クドア・イワタイへの反応性が低く、クドア・セプテンプンクタータに高い反応性を示すモノクローナル抗体が利用され得る。
【００１６】
Ｋｓ２４-１５Ｇ１１抗体やＫｓ１８-１１Ｈ５抗体は、それぞれハイブリドーマＫｓ２４-１５Ｇ１１やハイブリドーマＫｓ１８-１１Ｈ５を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ヒポキサンチン・チミジン添加培地：ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．,  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ,  ＢＣ,  Ｃａｎａｄａ）などの培地で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養し、産生されたモノクローナル抗体を公知の方法で回収及び精製を行うことで得られる。本発明におけるモノクローナル抗体は、クドア・セプテンクタータ胞子と反応性を示す限り、そのフラグメント、及びそのキメラ抗体及びヒト化抗体等の改変抗体並びに変異抗体を含む。
【００１７】
免疫学的測定法（イムノアッセイ）は、抗原抗体反応を利用して物質を定性的又は定量的に検出する方法である。免疫学的測定法も公知であり、本発明で利用し得る方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）であり、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、均一系酵素免疫測定法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光法、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、イムノクトロマトグラフ法であり得る。
【００１８】
また、本発明では、免疫学的測定法の中でも、クドア・セプテンプンクタータ胞子に対する第一及び第二のモノクローナル抗体を用い、固相に固定された前記第一のモノクローナル抗体と標識された前記第二のモノクローナル抗体とクドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質を含む複合体を形成させる工程を含む、いわゆるサンドイッチ法を測定原理とする方法が好ましい。当該サンドイッチ法を測定原理とする方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマトグラフ法等であり得る。サンドイッチ法を適用することで、感度及び特異性が向上し、検出精度が高まる。なお、第二のモノクローナル抗体によって形成される複合体は、少なくとも第二のモノクローナル抗体が認識するクドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質を含むものであればよく、胞子全体を含むものであるか胞子の一部であるかを問わない。
【００１９】
サンドイッチ法による場合、第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体は同じ抗体であっても、異なる抗体であってもよい。第一のモノクローナル抗体は、前記Ｋｓ１８-１１Ｈ５抗体、又はクドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出され、Ｎ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する分子量約２３,０００のタンパク質を認識する抗体、例えば、前記Ｋｓ２４-１５Ｇ１１抗体が好ましく用いられる。クドア・セプテンプンクタータに対する特異性が高くなるからである。
【００２０】
第二のモノクローナル抗体も、クドア・ヤスナガイ、クドア・アマミエンシス、クドア・イワタイへの反応性が低く、クドア・セプテンプンクタータに高い反応性を示す抗体であり得る。例えば、前記Ｋｓ１８-１１Ｈ５抗体であり、又はクドア・セプテンプンクタータ胞子から抽出され、Ｎ末端にＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）のアミノ酸配列を有する約２３,０００のタンパク質を認識する抗体、例えば、前記Ｋｓ２４-１５Ｇ１１抗体であり得る。このとき、第一の抗体と同じ抗体を用いた場合、例えば、第一の抗体がＫｓ２４-１５Ｇ１１抗体である場合には、非特異的反応が認められる場合があるので、この場合には第二の抗体には、第一の抗体と異なる抗体、例えばＫｓ１８-１１Ｈ５抗体を組み合わせるのが好ましい。第一の抗体と組み合わされる第二の抗体は、検出感度や交差特性に応じて適宜決定され得る。また、第一の抗体又は第二の抗体の何れか一方はクドア・セプテンプンクタータ胞子に反応性を示すポリクローナル抗体でもあり得る。但し、第二の抗体としてのポリクローナル抗体の使用は、ＥＬＩＳＡに適用することが好ましい。
【００２１】
サンドイッチ法において、何れか一方の抗体（第一の抗体）は固相に固定される。固相の素材や形状は測定法に応じて当業者が適宜決定し得る。固相の素材として、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、スチレンン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレンン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン等の合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体、アガロースゲル、セルロース等の多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーン等の無機高分子化合物、さらには、これらの化合物にアミノ基、アミノアシル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基、ニトロ基等の官能基が導入された化合物が例示される。固相の形状として、例えば、マイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ディスク等の平板状、紙片状、ビーズ等の粒子状、試験管、チューブ等の管状、繊維状、膜状が例示される。これらの固相には公知の方法で第一の抗体が固定される。
【００２２】
第二の抗体を標識する標識物質も免疫学的測定法に用いられる公知の標識物質であればよく、例えば、放射性同位元素（１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等）、酵素（β−ガラクトシターゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光物質（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体等）、不溶性粒状マーカーが例示される。不溶性粒状マーカーは、それ自体が着色しており、目視で認識できる物質が好ましい。例えば、金コロイド、白金コロイド等のコロイド状金属粒子、顔料等で着色されたポリスチレンラテックス等の合成高分子粒子（着色合成高分子粒子）、重合染色粒子が例示される。
【００２３】
また、本発明では、操作が簡単で特別な装置を用いることなく短時間で精度良く検出できることから、イムノクロマトグラム法が好ましく用いられる。イムノクロマトグラム法は、クロマトグラフィーの原理を利用した方法で、第一の抗体が固定された膜状の固相（クロマト用膜担体）を用いた方法である。当該方法は、調製された試料と標識された第二の抗体との混合物（抗原と第二の抗体との複合物を含む）をクロマト用膜担体上で展開した上で、固相に固定した第一の抗体と抗原抗体反応を起こさせる方法である。
【００２４】
図１は本発明に係るイムノクロマト検査具の一例を示す概略図である。当該イムノクロマト検査具は、第一のモノクローナル抗体が固定された検査片１と、標識された第二のモノクローナル抗体とを有する。第二のモノクローナル抗体は、例えばプラスチック製ボトルなどの容器６などに入れられた形で提供され、検査片１と共にいわゆるキット製品を構成する。
【００２５】
検査片１は、第一のモノクローナル抗体が固定されたクロマト膜担体２と、展開後の余った試料を吸収する吸液部４を有する。吸液部４はクロマト膜担体２の片端部に備えられ、他方側の片端部は第二のモノクローナル抗体と試料中の抗原との接触により形成された複合体を含む溶液を接触させる接触部５となっている。クロマト膜担体２は長方形の紙片状であり、液体を展開することができ、かつ第一の抗体を担持できる材料、例えばろ紙、ニトロセルロースの多孔体やセルロースアセテート膜などのセルロース膜、アミノ基及び／又はカルボキシル基やアルキル基で置換されたアミノ基を有するナイロン膜などのナイロン膜、ＰＶＤＦ膜などから作製される。クロマト膜担体２は、ガラス板やプラスチック板のような基板上に備えられることもある。
【００２６】
吸液部４は、液体を吸収し、保持できる材料、例えばろ紙や綿布、ポリエチレンやポリプロピレンなどからなる多孔質プラスチック製の不織布などから作製される。この吸液部から接触部５側にやや離れた位置に、第一のモノクローナル抗体が固定された判定領域３が設けられる。
【００２７】
ヒラメなどの検体から調製された試料は、まず標識された第二のモノクローナル抗体が収められた容器６内で当該第二のモノクローナル抗体と接触して、試料中に存在するクドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質が第二のモノクローナル抗体と複合体を形成する。次に、当該容器６内の反応液に検査片１の接触部５を接触させると、移動相である反応液がクロマト膜担体２中を移動し、判定領域３の第一のモノクローナル抗体と接触する。こうして、試料中に存在するクドア・セプテンプンクタータの胞子由来タンパク質は、第一のモノクローナル抗体及び標識された第二のモノクローナル抗体を含む複合体を形成する。このとき、標識物質が金コロイドのような不溶性粒状マーカーであれば、判定領域の色が変化するので、目視で直ちにクドア・セプテンプンクタータの存在が確認できる。
【００２８】
本発明に係るイムノクロマト検査具は、前記のようにキット製品ではなく、第一のモノクローナル抗体と標識された第二のモノクローナル抗体とを一つの検査具に設けた検査具でもあり得る。この検査具は、例えば、ガラス板やプラスチック板のような基板と、試料を供給する試料供給部と、標識された第二のモノクローナル抗体を保持する標識保持部と、第一のモノクローナル抗体が固定された判定領域を有するクロマト膜担体と、吸液部を備え、基板上に、その片端部から他方片端部に向けて、試料供給部と標識保持部とが接触して配置されるとともに標識保持部とクロマト膜担体が接触して基板上に配置され、さらにクロマト膜担体と接触して吸液部が備えられたものである（図示せず）。このような検査具も公知であり、例えば、特許第５３０２００号に開示された検査具が例示される。この検査具では、試料供給部に供給された試料中の抗原が標識保持部と接触して、標識された第二の抗体との複合体が形成される。この複合体は、試料中の液体が移動相となってクロマト膜担体で展開され、複合体は判定領域に固定された第一のモノクローナル抗体と接触して判定領域の色が変化する。また、過剰の試料は吸液部で吸収される。
【００２９】
もっとも本発明のイムノクロマト検査具は、これらの態様に限定されず、公知である種々の態様の検査具も利用できるものであって、さらに別なモノクローナル抗体が固定された第二の判定領域を備えた検査具や、抗原抗体反応が正しく行われていることを判定可能にする対照領域（又は参照領域）を備えた検査具など、種々の態様を含むのは言うまでもない。
【００３０】
以上のように、本発明の検出方法は、特異性の高いモノクローナル抗体を用いているので、他のクドア属粘液胞子虫に交差反応を示すことが少なく、クドア・セプテンプンクタータを迅速かつ簡便に検出できる。
【００３１】
以下、下記の実施例に基づき本発明についてさらに詳細に説明するが、下記実施例はあくまでも例示であり、下記の実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【００３２】
（１）モノクローナル抗体の作製
Ａ．Kudoa septempuctata抗原の調製
K.septempuctata胞子を当該寄生虫が寄生したヒラメ筋肉から抽出した後、パーコール密度勾配遠心法にて胞子を精製し、−２０℃で凍結保存した。この凍結保存胞子を用いて、以下の３つの方法によりK.septempuctata抗原を調製した。
(ａ)未処理
ＰＢＳ(-)で２.０×１０７/ｍＬに調整した５００μＬのK.septempuctata胞子液を抗原とした。
（ｂ）超音波処理
ＰＢＳ(-)で２.０×１０７/ｍＬに調整した５００μＬのK.septempuctata胞子液を超音波で処理した液を抗原とした。
（ｃ）界面活性剤及び加熱処理
２％コール酸ナトリウム液で２.０×１０７/ｍＬに調整した５００μＬのK.septempuctata胞子液をボルテックスにより１分間混和した。その後、９５℃で１０分間加熱し、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。回収した遠心上清を抗原とした。
【００３３】
Ｂ．マウスの免疫
前記Ａ．に示した方法により調製した３種類の抗原をマウスにそれぞれ免疫した。
１群あたり３匹のＢＡＬＢ/ｃマウス（ＳＰＦ  ｇｒａｄｅ、雌、８週令）に、１匹あたり１００μＬのK.septempuctata抗原とアジュバント（ＴｉｇｔｅｒＭＡＸ  Ｇｏｌｄ：ＣｙｔＲｘ  Ｃｏ.,  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ,  ＧＡ,  ＵＳＡ）との等容量混合乳濁液を腹腔内へ接種した。さらに３、５、７及び１２週間後に、同じ抗原とアジュバント（ＴｉｇｔｅｒＭＡＸ  Ｇｏｌｄ）の等容量混合乳濁液をそれぞれのマウスの腹腔内に１００μＬずつ追加接種した。３回目の免疫から１週間後に、それぞれのマウスの尾静脈から採血し、血清抗体の力価を、ＥＬＩＳＡ（詳細は下記Ｃ．に記載）により測定した。ＥＬＩＳＡの結果、８,０００倍以上の希釈で最も高い血清抗体価を示したマウス（未処理のK.septempuctata胞子液を抗原とした３匹のマウスのうちの１匹）を選別した。
【００３４】
細胞融合の３日前に、選別した免疫マウスの腹腔内に、ＰＢＳ(-)で２.０×１０７個/ｍＬに調整した１００μＬのK.septempuctata胞子液を接種し、最終免疫とした。
【００３５】
Ｃ．ＥＬＩＳＡを用いた血清抗体価の測定
パーコール密度勾配遠心法にて精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０６/ｍＬに調整した胞子液３００μＬを超音波処理した後、ＰＢＳ(-)で１０倍希釈し、抗原液とした。調製した抗原液をマイクロタイタープレートのウエルに５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。抗原液を除去した後、ブロッキング液（２０％馬血清加ＰＢＳ(-)）を１ウエルあたり１５０μＬずつ加え、室温で１時間反応させた。ブロッキング液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)）で３回洗浄した。
【００３６】
次に、血清試料を２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で１,０００倍希釈し、さらにその２倍階段希釈液を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｎｔｉ-Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）-Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で２,０００倍に希釈したものを１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１時間反応させた。
【００３７】
反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの前記洗浄液で４回洗浄後、酵素基質（１-Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ-ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ.,  Ｍａｄｉｓｏｎ,Ｗ１,ＵＳＡ）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて室温で１０分間反応させた後、反応停止液（１Ｍ硫酸）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、吸光度自動測定装置を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３８】
Ｄ．細胞融合
免疫マウスの脾細胞とミエローマ細胞を融合させた。
マウスの最終免疫から３日後に、免疫マウスの脾臓を取り出し、シャーレ内のＰｒｅ-Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）中で洗浄した。洗浄後、Ｐｒｅ-Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の入った別のシャーレに脾臓を移し、ピンセットでホモジナイズした。
【００３９】
次に、脾臓のホモジナイズ液をナイロンメッシュで濾過し、均一な細胞懸濁液を得た。マウスリンパ球比重分離液（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ-Ｍ：Ｃｅｄａｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ.,  Ｏｎｔａｒｉｏ,  Ｃａｎａｄａ）を使って、細胞懸濁液から赤血球を除去した後、２５ｍＬのＰｒｅ-Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で３回遠心洗浄した（室温、１,５００ｒｐｍ、５分間）。
【００４０】
３回洗浄後に、２０ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に懸濁し、それをＰＢＳ(-)で１０倍希釈して細胞数を測定した（１匹の免疫マウスより１.３６×１０８個の脾細胞が得られた）。脾細胞懸濁液（１.３６×１０８個の脾細胞を２０ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に懸濁したもの）に２.７×１０７個のミエローマ細胞（Ｐ３-Ｘ６３-Ａｇ８.Ｕ１）を加えた後（細胞比、脾細胞：ミエローマ細胞＝５:１）、遠心した（室温、１,５００ｒｐｍ、５分間）。遠心後、血清成分を完全に除去するために、予め３７℃に保温した２５ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で３回遠心洗浄した（室温、１,５００ｒｐｍ、５分間）。
【００４１】
細胞沈渣を１０ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に浮遊させ、１２ｍＬ容丸底チューブに移して、遠心した（室温、１,５００ｒｐｍ、５分間）。細胞をタッピングで十分にほぐした後、１ｍＬの４０％ＰＥＧ溶液（４０ｇのＰＥＧ-４,０００を５０ｍＬのＰＢＳ(-)に溶解後、１０ｍＬのジメチルスルホキシドと１ｍＬのポリ-Ｌ-アルギニン塩酸塩水溶液（１ｍｇ/ｍＬ）を加えて、最後に１Ｎ塩酸を加えてｐＨを７.８に調整したもの）を、ピペットの先端で細胞を緩やかに撹拌しながら１分間かけて添加した。さらに１分間、ピペットの先端で細胞を緩やかに撹拌した。
【００４２】
これに１ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）をピペットの先端で細胞を緩やかに撹拌しながら１分間かけて添加した後、さらに１ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）をピペットの先端で細胞を緩やかに撹拌しながら１分間かけて添加した。続いて、７ｍＬのＦｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）をピペットの先端で細胞を緩やかに撹拌しながら（１ｍＬずつ７回に分けて）、３分間かけて添加した。これを遠心した後（室温、１,０００ｒｐｍ、５分間）、上清を除去した。細胞をタッピングで優しくほぐした後、１０ｍＬのＰｒｅ-Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に懸濁した。これを遠心した後（室温、１,０００ｒｐｍ、５分間）、上清を除去した。細胞をタッピングで優しくほぐした後、１０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に懸濁した。１０ｍＬの懸濁液を、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を加えた中フラスコに移した。そして、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１８時間培養した。
【００４３】
Ｅ．選択培養とクローニング
Ｄ．で得られた融合細胞を、下記手順に従って選択培養し、クローニングを行った。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で１８時間培養した５０ｍＬの融合細胞懸濁液を遠心した（室温、１,０００ｒｐｍ、５分間）。細胞沈渣をタッピングで優しくほぐした後、１０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に懸濁した。１０ｍＬの懸濁液を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ヒポキサンチン・チミジン・アミノプリテン添加寒天培地：ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を９０ｍＬ加えたボトルに移し、蓋を完全に閉めた後、なるべく泡立たないようにして、ボトルを数回転倒混和した。３７℃で１５分間静置した後、２５枚の６０ｍｍペトリディッシュにそれぞれ４ｍＬずつ分注した。これらを３７℃、５％ＣＯ２存在下で１０〜１４日間培養した。
【００４４】
Ｆ．コロニーの採取、陽性クローンの検出と選別
Ｅ．で得られた融合細胞のコロニーを採取し、ＥＬＩＳＡを用いて陽性クローンを検出し、選別した。
培養１０日〜１４日の間に、各ペトリディッシュから融合細胞コロニーを採取した。容量を２０μＬに設定した容量範囲が２〜２０μＬのマイクロピペットを用いて融合細胞を採取し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を２００μＬずつ加えた９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに移した。最終的に融合細胞を培養した２５枚のペトリディッシュから２,５９２個の融合細胞コロニーを採取した。ウエルに移植した融合細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で４〜６日間培養した。培養後、各培養上清に含まれる抗体価をＥＬＩＳＡ(詳細は下記Ｇ．の項に記載)で測定した。
【００４５】
ＥＬＩＳＡで高いＯＤ値を示した３６ウエルについて、それぞれの細胞懸濁液を、１ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を加えた２４ウエルプレートの各ウエルに移し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３〜４日間培養した。培養後、培養上清に含まれる抗体について、複数の方法で処理したK.septempuctata抗原に対する反応性ならびにヒラメ筋肉に対する反応性を、ＥＬＩＳＡ(詳細は下記Ｈ．の項に記載)を用いて検討した（表１参照）。
【００４６】
【表１】
2015127666.tif 000003
【００４７】
ＥＬＩＳＡの結果、ヒラメ筋肉には反応しないものの中で、様々な反応性を示す抗体が得られるように７ウエルを選別し、その中の融合細胞（ハイブリドーマ）を下記Ｉ．の項に示す方法で再クローニングした。７つのハイブリドーマをそれぞれ、Ｋｓ４-４Ｆ６、Ｋｓ１４-９Ｈ１２、Ｋｓ１８-１１Ｈ５、Ｋｓ２２-１５Ｄ３、Ｋｓ２４-１５Ｇ１１、Ｋｓ３０-２Ｃ１０、Ｋｓ３４-２５Ｂ１０と名付けた。また、これらのハイブリドーマから産生される抗体をそれぞれＫｓ４-４Ｆ６抗体（Ｋｓ４抗体）、Ｋｓ１４-９Ｈ１２抗体（Ｋｓ１４抗体）、Ｋｓ１８-１１Ｈ５抗体（Ｋｓ１８抗体）、Ｋｓ２２-１５Ｄ３抗体（Ｋｓ２２抗体）、Ｋｓ２４-１５Ｇ１１抗体（Ｋｓ２４抗体）、Ｋｓ３０-２Ｃ１０抗体（Ｋｓ３０抗体）、Ｋｓ３４-２５Ｂ１０抗体（Ｋｓ３４抗体）とした。
【００４８】
Ｇ．ＥＬＩＳＡによる培養上清中の抗体価の測定
Ｆ．の項で得られたハイブリドーマ培養上清中の抗体価を次の手順により測定した。パーコール密度勾配遠心法にて精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整した胞子液５００μＬを超音波処理した後、ＰＢＳ(-)で１０倍希釈し、抗原液とした。この抗原液を１ウエルあたり５０μＬずつ分注した９６ウエルマイクロタイタープレートを必要分用意し、４℃で一夜静置した。
【００４９】
抗原液を除去した後、ブロッキング液（２０％馬血清加ＰＢＳ(-)）を１ウエルあたり１５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。ブロッキング液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)）で３回洗浄した。培養上清を、２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で６倍希釈したものを１ウエルあたり５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｎｔｉ-Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）-Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．）を２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で２,０００倍に希釈したものを１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１時間反応させた。
【００５０】
反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、酵素基質（１-Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ-ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ.）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて室温で１０分間反応させた後、反応停止液（１Ｍ硫酸）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、吸光度自動測定装置を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５１】
Ｈ．複数の処理を行ったK.septempuctata抗原に対するハイブリドーマ産生抗体の反応性
Ｆ．の項で得られたハイブリドーマが産生する培養上清中の抗体について、複数の異なる処理をしたK.septempuctata抗原に対する反応性を下記手順に従って調べた。
ｉ）以下の方法に従い、K.septempuctata胞子並びにヒラメ筋肉を処理して調製した抗原液を、マイクロタイタープレートの各ウエル５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。
ａ．超音波処理
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整した胞子液５００μＬを超音波処理し、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。遠心上清を回収した後、沈渣を１.５ｍＬのＰＢＳ(-)に懸濁した。遠心上清及び沈渣懸濁液をそれぞれ抗原液とした。
ｂ．０.５％コール酸ナトリウム処理
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子を０.５％コール酸ナトリウム液で１.０×１０８/ｍＬに調整した胞子液４５μＬを、ボルテックスにより１分間混和し、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。遠心上清を回収し、ＰＢＳ(-)で１００倍希釈した。また、沈渣を４.５ｍＬのＰＢＳ(-)に懸濁した。遠心上清希釈液及び沈渣懸濁液を抗原液とした。
ｃ．０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ処理
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子を０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ液で１.０×１０８/ｍＬに調整した胞子液４５μＬを、ボルテックスにより１分間混和し、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。遠心上清を回収してＰＢＳ(-)で１００倍希釈した。また、沈渣を４.５ｍＬのＰＢＳ(-)に懸濁した。遠心上清希釈液及び沈渣懸濁液を抗原液とした。
ｄ．ホモジナイズ処理
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整した胞子液４５０μＬを、バイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．，  Ａｄａｃｈｉ-ｋｕ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ)にてホモジナイズし、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。遠心上清をＰＢＳ(-)で１０倍希釈したものを抗原液とした。
ｅ．加熱処理
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整した胞子液４５０μＬを、９５℃で１０分間加熱し、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。遠心上清を回収してＰＢＳ(-)で１０倍希釈し、抗原液とした。
ｆ．未処理（−２０℃凍結保存）
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０６/ｍＬに調整した胞子液を抗原液とした。
ｇ．未処理（４℃保存）
パーコール密度勾配遠心法により精製し、４℃で保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０６/ｍＬに調整した胞子液を抗原液とした。
ｈ．ヒラメ筋肉
K.septempuctata、K.thyrsites及びK.lateolabracisが感染していないことを確認したヒラメ筋肉１００ｍｇをバイオマッシャーＩＩ（Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．）にてホモジナイズした。９００μＬのＰＢＳ(-)を加えた後、遠心した（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）。遠心上清を回収して抗原液とした。
【００５２】
ｉｉ）抗原液を除去した後、ブロッキング液（２０％馬血清加ＰＢＳ(-)）を１ウエルあたり１５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。ブロッキング液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)）で３回洗浄した。
【００５３】
ｉｉｉ）Ｆ．の培養上清を、２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で６倍希釈したものを１ウエルあたり５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｎｔｉ-Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）-Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．）を２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で２,０００倍に希釈したものを１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１時間反応させた。
【００５４】
ｉｖ）反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、酵素基質（１-Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ-ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ.）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１０分間反応させた後、反応停止液（１Ｍ硫酸）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えてから、吸光度自動測定装置を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５５】
Ｉ．再クローニング
Ｆの項で選抜した７つのクローンについて、下記手順に従って、培養規模を拡大して培養を行った。
選別した７ウエル中のそれぞれのハイブリドーマクローンについて、細胞数を測定し、Ｐｒｅ-Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で細胞濃度３００個/ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０.５ｍＬの細胞懸濁液（細胞数１５０個）を９.５ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）と混合し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１５分静置した。１クローンにつき２枚の６０ｍｍペトリディッシュに４ｍＬずつ泡立たないようにして分注し、残りは廃棄した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で１０〜１４日間培養した。
【００５６】
１０〜１４日間の培養後、各ペトリディッシュのコロニーを肉眼で観察した。容量を２０μＬに設定した容量範囲が２〜２０μＬのマイクロピペットを用いて、各コロニーを採取し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を２００μＬずつ加えた９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに移した。コロニーは、大きいものから順に１クローンにつき２４個採取した。次に３７℃、５％ＣＯ２存在下で３〜４日間培養した。上清を採取し、前記Ｇ.の項に準じてＥＬＩＳＡを用いて抗体価を測定した。
【００５７】
培養上清の抗体価が高く、かつ細胞の増殖状態の良いものを、１クローンにつき１ウエル選別し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で細胞濃度１〜２×１０５個/ｍＬに調整して培養規模を拡大し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２日間培養した。培養後、適当量のＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で細胞濃度１〜２×１０５個/ｍＬに調整して培養規模を拡大し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２日間培養した。培養後、適当量のＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で細胞濃度１〜２×１０５個/ｍＬに調整して培養規模を拡大し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２日間培養した。培養後、さらにＨｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｐｒｅ-ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ(ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．)/Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）の５０％（容量比）混合液で細胞濃度１〜２×１０５/ｍＬに調整して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２日間培養した。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｐｒｅ-ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、順次、培養規模を拡大し、適当な時期に細胞を凍結保存した。
【００５８】
Ｊ．モノクローナル抗体の大量調製
下記手順に従って、再クローニングした７クローンを大量培養し、モノクローナル抗体を得た。
再クローニングした７クローンのそれぞれを、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｐｒｅ-ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて大量培養し、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で２回洗浄後、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で２×１０７/ｍＬに調整した細胞浮遊液を得た。
【００５９】
次に、１６匹の８週令のＢＡＬＢ/ｃマウスにプリスタン（２,６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン：Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．,  Ｂｕｎｋｙｏ-ｋｕ,  Ｔｏｋｙｏ,  Ｊａｐａｎ）をマウス1匹あたり５００μＬずつ腹腔内注射し、１週間後に再度５００μＬずつ腹腔内注射した。３日後に１ｍＬの前記調製した細胞浮遊液を腹腔内注射した（１クローンにつき２匹のマウスに注射した）。細胞浮遊液接種後７〜１２日の間に腹水が貯留して腹部が肥大したマウスから、注射器により腹水を採取した。マウス１匹当り５〜１０ｍＬの腹水が得られた。得られた腹水を遠心（４℃、３,０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を回収した。遠心上清に等容量の飽和硫酸アンモニア溶液（アンモニア水でｐＨ７.４に調整）を滴下して塩析を行った。遠心（４℃、１０,０００×ｇ、１０分間）後、上清を除去した後、塩析沈殿物を適当量のＰＢＳ(-)に溶解した。
【００６０】
Ｋ．モノクローナル抗体の精製
Ｊ．の項で大量調製したモノクローナル抗体を、下記手順に従って精製した。
塩析した抗体試料は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｇａｓｏｒｅカラムクロマトグラフィーにより精製を行った。Ｂｉｏ-ＳｃａｌＴＭ  Ｍｉｎｉ  Ａｆｆｉ-Ｐｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍＬ：ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．,  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ,  ＣＡ,  ＵＳＡ）をベッド体積の５倍容量の結合緩衝液（ｐＨ９.０：ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で洗浄した。タンパク質濃度１０ｍｇ/ｍＬの抗体試料を結合緩衝液と等容量の割合で混合し、その５ｍＬを前記カラムにアプライした。
【００６１】
ベッド体積の１５倍容量の結合緩衝液によりカラムを洗浄した後、ベッド体積の５倍容量の溶出緩衝液（ｐＨ３.０：ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によりマウスＩｇＧ画分を受器に溶出した。なお、溶出液のｐＨを中性に中和する目的で、溶出液１ｍＬ当り３０μＬの１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）を予め受器に分注した。
【００６２】
精製抗体画分は分子分画量が３０,０００の限外濾過装置(Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ-３０Ｋ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ,  ＭＡ,  ＵＳＡ：Ａｍｉｃｏｎ,Ｕｌｔｒａｃｅｌはそれぞれ登録商標)により濃縮した後、ＰＤ-１０カラム(ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ.,  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｌａｃｅ,  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ,  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ  ＨＰ７  ９ＮＡ,  Ｅｎｇｌａｎｄ)を用いたゲル濾過により溶媒をＰＢＳ(-)に置換した。得られた精製抗体溶液のタンパク質濃度をＰＢＳ(-)で１０ｍｇ/ｍＬに調整した後、−２０℃で凍結保存した。
【００６３】
Ｌ.精製モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ-ＳＨ（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ．  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．，  Ｋｏｔｏ-ｋｕ,  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、説明書に記された手順により精製したモノクローナル抗体にペルオキシダーゼを標識した。Ｋ．の項で精製したモノクローナル抗体溶液１０ｍｇ/ｍＬを２０μＬ使用し、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体の最終濃度が１ｍｇ/ｍＬとなるように溶出した。標識した抗体は−２０℃で凍結保存した。
【００６４】
（２）イムノクロマト法に有用なモノクローナル抗体の選別と選別した抗体のアイソタイプの決定
Ａ．Kudoa属粘液胞子虫に対するモノクローナル抗体の特異性検討
（１）で選別したモノクローナル抗体７種類について、Kudoa属粘液胞子虫に対する特異性を下記手順に従って調べた。
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃にて凍結保存したK.septempuctata胞子、K.thyrsites胞子、K.yasunagai胞子、K.neothunni胞子ならびにパーコール密度勾配遠心法による精製を行わずに凍結保存したK.lateolabracis胞子、K.iwatai胞子、K.amamiensis胞子をそれぞれＰＢＳ(-)で１.０×１０５/ｍＬに調整した。調製した胞子液４００μＬずつを超音波処理し、マイクロタイタープレートに１ウエルあたり５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。
【００６５】
抗原液を除去した後、ブロッキング液（２０％馬血清加ＰＢＳ(-)）を１ウエルあたり１５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。ブロッキング液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)）で３回洗浄した。
【００６６】
次に、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体を、２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で１,０００倍希釈したもの（抗体濃度１μｇ/ｍＬ）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１時間反応させた。反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、酵素基質（１-Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ-ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ.）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１０分間反応させた後、反応停止液（１Ｍ硫酸）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えてから、吸光度自動測定装置を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果は表２に示した。その結果、Ｋｓ３４抗体を除く他の抗体はK.septempuctataに対して高い反応性を示した。また、K.septempuctataに高い反応性を示した抗体の中で、Ｋｓ１４、Ｋｓ１８、Ｋｓ２４、Ｋｓ３０は、K.lateolabracis、K.yasunagai、K.iwatai、K.amaniensisに対して反応性が低いことが示された。なお、ヒラメ筋肉に寄生するとされるK.septempuctata、K.thyrsites及びK.lateolabracisの３種は鏡検法により鑑別が可能である。
【００６７】
【表２】
2015127666.tif 000004
【００６８】
Ｂ.サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）で選別した７種類のモノクローナル抗体について、精製モノクローナル抗体及びペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。モノクローナル抗体の組み合わせ４９通り全てについて、異なる３つの方法で処理したK.septempuctata抗原に対する反応性を検討した。
【００６９】
１０ｍｇ/ｍＬの精製モノクローナル抗体をＰＢＳ(-)で２００倍希釈した。抗体希釈液を１ウエルあたり５０μＬずつ分注し、４℃にて一晩静置し、固相化した。
【００７０】
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子を以下の方法に従って処理し、抗原とした。
ａ．加熱処理
ＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整したK.septempuctata胞子液２００μＬを、１００℃で１０分間加熱した後、２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で１０倍希釈した。
ｂ．０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ処理
０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ液で１.０×１０７/ｍＬに調整したK.septempuctata胞子液２００μＬを、バイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)でホモジナイズし、２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で１０倍希釈した。
ｃ．ホモジナイズ処理
ＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整したK.septempuctata胞子液２００μＬを、バイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)でホモジナイズした後、２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で１０倍希釈した。
【００７１】
抗体液を除去した後、ブロッキング液（２０％馬血清加ＰＢＳ(-)）を１ウエルあたり１５０μＬずつ加えて室温で１時間反応させた。ブロッキング液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)）で４回洗浄した。
【００７２】
次いでペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体を２０％馬血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ(-)で１,０００倍希釈した（抗体濃度１μｇ/ｍＬ）。その希釈液及び前記調製した抗原液を１ウエルあたり５０μＬずつ分注し、室温で１時間反応させた。反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μＬの洗浄液で４回洗浄後、酵素基質（１-Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ-ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ.）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えて、室温で１０分間反応させた後、反応停止液（１Ｍ硫酸）を１ウエルあたり５０μＬずつ加えてから、吸光度自動測定装置を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は表３及び表４に示した。
【００７３】
【表３】
2015127666.tif 000005
【００７４】
【表４】
2015127666.tif 000006
【００７５】
Ｃ．イムノクロマト法に適したモノクローナル抗体の組み合わせの決定
上記結果をもとに特異性が高く、反応性が異なる抗体としてＫｓ１４抗体、Ｋｓ１８抗体、Ｋｓ２４抗体の３つのモノクローナル抗体を選別した。イムノクロマト法を用いて選別したモノクローナル抗体の反応性を検討し、イムノクロマト法に適した組み合わせを決定した。
【００７６】
抗体固相化メンブレン（作製法は下記Ｄ．に記載）と金コロイド標識抗体（作製法は下記Ｅ．に記載）を作製した。次にイムノクロマト法(詳細はＦ．に記載)を実施し、K.septempuctata抗原に対する反応性及び非特異反応の有無について検討した。その結果を表５に示す。
【００７７】
【表５】
2015127666.tif 000007
【００７８】
その結果、陽性バンドが認められたもののうち、非特異反応が認められず、陽性バンドの色が最も濃い組み合わせは、固相化抗体がＫｓ２４抗体で、検出抗体がＫｓ１８抗体であった。これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＫｓ２４-１５Ｇ１１は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、２０１３年１２月２日付けで受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６６として寄託され、ハイブリドーマＫｓ１８-１１Ｈ５は、同特許微生物寄託センターに、同日付けで受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７６７として寄託された。また、上記の組み合わせ以外にも、表４、表５に示したように、例えばＫｓ４抗体−Ｋｓ４抗体、Ｋｓ１４抗体−Ｋｓ１４抗体、Ｋｓ１４抗体−Ｋｓ１８抗体、Ｋｓ１４抗体−Ｋｓ３０抗体、Ｋｓ１８抗体−Ｋｓ４抗体、Ｋｓ１８抗体−Ｋｓ１４抗体、Ｋｓ１８抗体−Ｋｓ１８抗体、Ｋｓ１８抗体−Ｋｓ２２抗体、Ｋｓ１８抗体−Ｋｓ３０抗体、Ｋｓ２２抗体−Ｋｓ４抗体、Ｋｓ２２抗体−Ｋｓ２２抗体、Ｋｓ２４抗体−Ｋｓ２２抗体、Ｋｓ３０抗体−Ｋｓ４抗体、Ｋｓ３０抗体−Ｋｓ１４抗体、Ｋｓ３０抗体−Ｋｓ２２抗体、Ｋｓ３０抗体−Ｋｓ３０抗体、Ｋｓ３４抗体−Ｋｓ３４抗体など、ＯＤ値が２.０以上となるような組み合わせ（何れも左側が第一の抗体、右側が第二の抗体である。）も、サンドイッチ法に利用し得る。
【００７９】
Ｄ．抗体固相化メンブレンの作製
以下の手順に従って、精製モノクローナル抗体をニトロセルロースメンブレンに固相化した。
精製したＫｓ１８抗体を５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８.５）を用いて、Ｋｓ１４抗体及びＫｓ２４抗体を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８.５）を用いて、２ｍｇ/ｍＬに希釈した。
【００８０】
次に、前記調製した各抗体希釈液を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒ＃７０１シリンジを用いて、Ｈｉ-Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ１３５メンブレン(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)にそれぞれ塗布した。その後、３７℃で１時間乾燥させた後、４℃で保存した。
【００８１】
Ｅ．モノクローナル抗体の金コロイド標識
以下の手順に従って、精製モノクローナル抗体に金コロイドを標識した。
９．０×１０１０/ｍＬの金コロイド溶液(Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ４０  ｎｍ：ＢＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｒｄｉｆｆ，  ＵＫ) ５ｍＬを１００ｍＭ炭酸カリウムでｐＨ９.０に調整した。１０ｍｇ/ｍＬのモノクローナル抗体を２ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ９.０)で０.２ｍｇ/ｍＬに希釈した。ｐＨ調整した金コロイド溶液を撹拌しながら、モノクローナル抗体希釈液をマイクロピペットで１滴ずつ計５００μＬ加えた後、室温で３０分間撹拌した。次に、撹拌した状態で、１０％ＢＳＡ加２ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ９.０)をマイクロピペットで１滴ずつ計５５０μＬ加え、さらに３０分間、室温で撹拌した。この液を６本の１．５ｍＬ容マイクロチューブに１ｍＬずつ分注し、遠心した後（室温、１０,０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を除去した。
【００８２】
遠心沈渣に１％ＢＳＡ加２ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ９.０)を４００μＬずつ加えてピペッティングして懸濁した後、１.５ｍＬ容マイクロチューブ６本分の懸濁液、合計２．４ｍＬを１本の１５ｍＬ容遠沈管に回収しよく混和した後、新たな１.５ｍＬ容マイクロチューブに８００μＬずつ分注した。遠心した後（室温、１０,０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を除去した。
【００８３】
遠心沈渣に、１ｍＬずつ１％ＢＳＡ加２ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液  (ｐＨ９.０)を加えてピペッティングにより懸濁した後、遠心した（室温、１０,０００  ｒｐｍ、１０分間）。上清を除去した後、すべての遠心沈渣を１ｍＬの１％ＢＳＡ、２０％グリセロール加トリス塩酸緩衝食塩水(ＴＢＳ)（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，  Ｏｔｓｕ，  Ｓｈｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）に懸濁し（抗体濃度１００μｇ/ｍＬ）、−２０℃で凍結した。
【００８４】
Ｆ．イムノクロマト法の実施
以下の手順に従い、イムノクロマト法を行った。
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０６/ｍＬに調整した胞子液３００μＬを、バイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)を用いてホモジナイズし、被検液とした。
【００８５】
９６ウエルマイクロプレートのウエル内で、被検液３０μＬと金コロイド標識モノクローナル抗体希釈液（−２０℃保存した金コロイド標識抗体溶液を２％ＢＳＡ、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ加ＰＢＳ(-)で１０倍希釈したもの）３０μＬを混合した。陰性対照にはＰＢＳ(-)３０μＬと抗体希釈液３０μＬの混合液を使用した。
【００８６】
ウエル内の混合液中に、抗体固相化メンブレンの先端を浸漬した。浸漬後１５分にバンドの濃さを観察し、その濃さに応じて、++、+、+ｗ、+ｗｗ、±、-の６段階表示をつけることにより判定した。
【００８７】
Ｇ．Ｋｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体のアイソタイプの決定
Ｋｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体のアイソタイプは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット(ＩｓｏＳｔｒｉｐ：Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ,  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ,  ＩＮ,  ＵＳＡ)を使用した。その結果、Ｋｓ２４抗体のアイソタイプはＩｇＧ１(λ)で、Ｋｓ１８抗体のアイソタイプはＩｇＧ１(κ)であった。
【００８８】
（３）Ｋｓ２４抗体の認識抗原の同定
Ａ．Ｋｓ２４抗体が認識するK.septempuctataの胞子由来タンパク質の精製
下記手順に従って、Ｋｓ２４抗体が認識する抗原をアフィニティー精製した。
ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰカラム(１ｍＬ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ.)に、５ｍｇのＫｓ２４抗体をカップリングした。パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.０×１０７/ｍＬに調整した胞子液３ｍＬを５００μＬずつ１.５ｍＬ容マイクロチューブに分注し、超音波処理した。その後、遠心し（４℃、１５,０００ｒｐｍ、５分間）、上清を回収した。上清を０.４５μｍフィルターにてろ過したものに１００μＬの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ液を加え、ＰＢＳ(-)にて１０ｍＬに調整した。調製した溶液をＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰにアプライし、説明書に従い、目的の抗原を精製した。
【００８９】
Ｂ．Ｋｓ２４抗体が認識する抗原のイムノブロッティングによる解析
下記手順に従って、Ｋｓ２４抗体が認識する抗原の分子量を調べた。
前記Ａ．で精製した抗原をＰＢＳ(-)にて２倍希釈したものに等量のメルカプトエタノール含有ＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプルバッファー（トリスＳＤＳ  β-ＭＥサンプル処理液：Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ．  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）を加えた後、１００℃で１０分間加熱してＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプルとした。２枚のＮｕ  ＰＡＧＥ  １２％  Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）を用いて、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを実施した。２枚のゲルのうち１枚のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、残り１枚をクマシーブリリアントブルー染色した。転写後のメンブレンは０.１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＴＢＳ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．)で洗浄後、ブロックエース(ＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，  Ｓｕｉｔａ,  Ｏｓａｋａ,  Ｊａｐａｎ)を用いてブロッキングした。
【００９０】
メンブレンを０.１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＴＢＳ(ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．，)で５分間、５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識したＫｓ２４抗体をＣａｎ  ｇｅｔ  ｓｉｇｎａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（ＴＯＹＯＢＯ  ＣＯ., Ｌｔｄ.,  Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）を用いて０.１μｇ/ｍＬに希釈し、室温で１時間反応させた。次にメンブレンを０.１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＴＢＳ(ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．)で５分間、５回洗浄した後、酵素基質(１-Ｓｔｅｐ  ＴＭＢ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  :  Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ.)を、室温で５分間反応させた。
【００９１】
メンブレンを大量の蒸留水で洗浄後、出現したバンドの位置をクマシーブリリアントブルー染色したゲルと比較した。また、分子量マーカー(プレシジョンＰｌｕｓプロテイン２色スタンダード：ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．)のバンドの移動距離を元に最少二乗法により検量線を作成し、出現したバンドの分子量を推定した。その結果、Ｋｓ２４抗体は、分子量約２３，０００のK.septempuctata胞子由来タンパク質を認識することが示された（図２及び３参照)。
【００９２】
この分子量約２３,０００のタンパク質のアミノ酸配列を分析したところ（北海道システム・サイエンス株式会社に依頼）、Ｎ末端のアミノ酸配列は、ＸＥＬＲＥ（但し、ＸはＡｌａ又はＳｅｒである）であることが示された。
【００９３】
Ｃ．Ｋｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体を用いたイムノクロマト法の検出感度の検討及び特異性の検討
ａ．Ｋｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体を用いたイムノクロマト法の検出感度の検討
下記手順に従って、本発明に係るＫｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体を用いたイムノクロマト法の検出感度を調べた。
パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃にて凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.２３×１０７/ｍＬに調整した胞子液１００μＬをバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズした後、ＰＢＳ(-)にて１０倍階段希釈し、被検液とした。
【００９４】
９６ウエルマイクロプレートのウエル内で、被検液３０μＬと金コロイド標識Ｋｓ１８抗体希釈液（−２０℃保存した金コロイド標識抗体溶液を２％ＢＳＡ、０.０１％ＴｒｉｔｏｎＸ加ＰＢＳ(-)で１０倍希釈したもの）３０μＬを混合した。陰性対照はＰＢＳ(-)３０μＬと抗体希釈液３０μＬの混合液を使用した。
【００９５】
ウエル内の混合液の中に、Ｋｓ２４抗体固相化メンブレンの先端を浸漬した。浸漬後１５分にバンドの濃さを観察し、その濃さに応じて、++、+、+ｗ、+ｗｗ、±、-の６段階表示をつけることにより判定した。その結果、K.septempuctata胞子液の胞子濃度が１.２３×１０５/ｍＬ以上の場合、陽性となることが判明した（表６参照）。
【００９６】
【表６】
2015127666.tif 000008
【００９７】
ｂ．Ｋｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体を用いたイムノクロマト法の特異性の検討
下記手順に従って、本発明のモノクローナル抗体Ｋｓ２４抗体及びＫｓ１８抗体を用いたイムノクロマト法の特異性の検討を行った。
【００９８】
下記に記した方法で処理したKudoa属粘液胞子虫胞子及びヒラメ筋肉抽出液を被検液とした。
ａ．パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.２３×１０６/ｍＬに調整した胞子液１００μＬをバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｂ．パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.septempuctata胞子をＰＢＳ(-)で１.２３×１０５/ｍＬに調整した胞子液１００μＬをバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｃ．パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.thyrsites胞子をＰＢＳ(-)で１.６×１０５/ｍＬに調整した胞子液１００μＬをバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｄ．パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.yasunagai胞子をＰＢＳ(-)で３.６×１０６/ｍＬに調整した胞子液１００μＬをバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｅ．パーコール密度勾配遠心法により精製し、−２０℃で凍結保存したK.neothunni胞子をＰＢＳ(-)で１.１×１０７/ｍＬに調整した胞子液１００μＬをバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｆ．パーコール密度勾配遠心法による精製を行わずに−２０℃で凍結保存したK.iwatai胞子をＰＢＳ(-)で２.３２×１０７/ｍＬに調整した胞子液１００μＬを、バイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｇ．パーコール密度勾配遠心法による精製を行わずに−２０℃で凍結保存したK.amamiensis胞子をＰＢＳ(-)にて７.７×１０６/ｍＬに調整した胞子液１００μＬを、バイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズしたもの
ｈ．K.septempuctata、K.thyrsites及びK.lateolabracisが感染していないことを確認したヒラメ筋肉１００ｍｇにＰＢＳ(-)２５０μＬを加えてバイオマッシャーＩＩ(Ｎｉｐｐｉ  Ｉｎｃ．)にてホモジナイズし、回収した上澄み液
【００９９】
９６ウエルマイクロプレートのウエル内で、被検液３０μＬと金コロイド標識Ｋｓ１８抗体希釈液（−２０℃保存した金コロイド標識抗体溶液を２％ＢＳＡ、０.０１％ＴｒｉｔｏｎＸ加ＰＢＳ(-)で１０倍希釈したもの）３０μＬを混合した。陰性対照にはＰＢＳ(-)３０μＬと抗体希釈液３０μＬの混合液を使用した。
【０１００】
ウエル内の混合液の中に、Ｋｓ２４抗体固相化メンブレンの先端を浸漬した。浸漬後１５分にバンドの濃さを観察し、その濃さに応じて、++、+、+ｗ、+ｗｗ、±、-の６段階表示をつけることにより判定した。
【０１０１】
その結果、ヒラメ筋肉に対する非特異的反応は認められなかったが、K.thyrsites、K.iwatai、K.amamiensisに対してK.septempuctataよりも弱い反応性を示した。（表７）。しかし、ヒラメ筋肉に寄生するとされるK.septempuctata、K.thyrsites及びK.lateolabracisの３種は鏡検法により鑑別が可能であること、K.iwatai及びK.amamiensis は鏡検法によりK.septempuctataとの鑑別が可能であることに加えてヒラメには寄生しないことから、本迅速検出法は、スクリーニング法として用いる現場即応型迅速検出法に十分に利用が期待される検出法であると考えられる。
【０１０２】
【表７】
2015127666.tif 000009
【０１０３】
表５の結果より、イムノクロマト法の第一の抗体にＫｓ１８抗体、第二の抗体にＫｓ１８抗体を使用した場合及び第一の抗体にＫｓ２４抗体、第二の抗体にＫｓ１４抗体を使用した場合も、クドア・セプテンプンクタータに対して反応性を示したことから当該組み合わせもクドア・セプテンプンクタータのスクリーニング法として利用し得る。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、ヒラメにおけるクドア・セプテンプンクタータの汚染を迅速かつ正確に判別する方法として利用できる。
【図１】
2015127666.tif 000010
【図２】
2015127666.tif 000011
【図３】
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【配列表】
2015127666000001.app