(57)【要約】【課題】肌関連酵素の活性と目元の肌状態との相関関係を明らかにし、簡便に、客観的に、高精度に、目元の肌状態を推定する方法を提供する。【解決手段】肌関連酵素の活性を指標として、目元の肌状態を推定する。肌関連酵素としては角層中の酵素が好ましく、前記酵素の活性が高い場合は、目元の肌状態が良いと推定されることが好ましい。また、角層中に存在する酵素の活性を指標として、目元用皮膚外用剤又はこれに配合する物質を評価することもできる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肌関連酵素の活性を指標として、目元の肌状態を推定する方法。
【請求項２】
前記肌関連酵素が角層中の酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素の活性が高い場合は、目元の肌状態が良いと推定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、カスパーゼ−１４である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肌状態が、シワ、ハリのなさ・たるみ、及びうるおいからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
多変量解析によって得られた推定式を用いて行われる、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
角層中に存在する酵素の活性を指標として試料を評価する方法であって、
角層中に存在する酵素を選択する工程、前記選択した酵素に試料を適用する工程、及び前記選択した酵素の活性を前記試料の適用前後で比較する工程を含み、
前記試料は目元用皮膚外用剤又は目元用皮膚外用剤に配合する物質である、評価方法。
【請求項８】
前記酵素活性が前記試料適用前よりも適用後の方が５％以上大きい場合に、該試料は目元の肌状態改善作用を有すると判定する、請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記角層に存在する酵素が、カスパーゼ−１４である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記肌状態が、シワ、ハリのなさ・たるみ、及びうるおいからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記皮膚外用剤が、化粧料又は医薬部外品である、請求項７から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記請求項８から１１の何れか一項に記載の方法により目元の肌状態改善作用を有すると判定された物質を含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目元の肌状態を推定する方法に関する。また、目元用皮膚外用剤又はこれに配合する物質の目元の肌状態改善作用を評価する方法、及び該方法により目元の肌状態の改善作用を有すると判定された物質を含有する皮膚外用剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
目元は表情や年齢が反映されやすく、顔の特徴を強く印象づける部位のひとつである。目元の皮膚は顔の他の部分、例えば頬部よりも薄く、また強い表情圧がかかるため、シワ、ハリのなさ・たるみ、うるおい等の肌状態の変化が生じやすい。そのため、スキンケアの方法を検討したり化粧品を選択したりするに際しては、特に注意を払う必要があり、目元の肌状態を的確に把握することは重要である。
一方、視覚的ハリ（見た目のハリ感）、視覚的うるおい(見た目のうるおい感）は、実
際の肌表面や内部の状態と関連すると考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
従来、目元の肌状態を把握する方法としては、目視で目元のシワ等を観察して判定する視覚的官能評価法が用いられてきた。
また、目元に特化したものではないが、肌状態の鑑別方法としては、皮膚から得たレプリカ画像や皮膚の拡大写真に画像処理を施して得た情報を利用する技術や（特許文献１、２）、共焦点レーザー顕微鏡により皮膚を直接観察して得た内部構造情報に基づく技術（特許文献３、４）等が知られている。
【０００４】
ところで、皮膚の角層中に存在する酵素が、皮膚の状態と何らかの関係を有するという報告がされている。例えば、特許文献５では、角層中のトリプシン様酵素活性とキモトリプシン様酵素活性が、肌荒れと関係を有することが示唆されている。
その他、皮膚中に存在している酵素として、角層形成、ＮＭＦ（Natural Moisture Factor）産生に関与する酵素としてカスパーゼ−１４（例えば、非特許文献２、３）、過酸
化水素の分解に関わり老化に伴い減少する酵素としてカタラーゼ（例えば、非特許文献３、４）、エネルギー産生に関わる酵素としてＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（例えば、非特許文献５）、角層細胞の皮膚での接着に関わり、角層剥離に関与する酵素としてカリクレイン−５（例えば、非特許文献６）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２３０１１７号公報
【特許文献２】特開２００８−６１８９２号公報
【特許文献３】特開２００４−３３７３１７号公報
【特許文献４】特開２００４−９７４３６号公報
【特許文献５】特開平８−６８７９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J.Soc.Cosmet.Chem.Jpnノート2011, 45(3)p212-217
【非特許文献２】Nature Cell Biology 2007(6) p666-674
【非特許文献３】機能性化粧品素材開発のための実験プロトコール集（シーエムシー出版）
【非特許文献４】Experimental Gerontology 2007(42) p924-929
【非特許文献５】J Cosmet Dermatol. 2012 (11) No.1 p3-8
【非特許文献６】Biol.Chem.2008（389）No.6 p669-680
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、肌関連酵素の活性と目元のシワ等の肌状態との関係性については知られていない。また、個人の目元の肌状態を客観的に的確に把握することや、目元の肌状態の改善を目的とする皮膚外用剤の需要は高い。
本発明は、かかる状況に鑑み、肌関連酵素の活性と目元の肌状態との相関関係を明らかにし、簡便に、客観的に、高精度に、目元の肌状態を推定する方法を提供することを目的とする。また、目元用皮膚外用剤又はこれに配合する物質の目元の肌状態改善作用を評価する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはこれまでに、角層中の酵素を活性化させると頬部の肌状態が改善されるという知見を見出しており、これに基づき酵素活性を指標として化粧料の油性成分の量を調整して肌状態改善作用を有する化粧料を調製する方法を発明している（特願２０１３−１５２２２５）。今回、上記課題を解決すべくさらに鋭意研究を進めたところ、目元の肌状態は頬部の角層中の酵素の活性と相関関係を有するという新たな知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
本発明の第一の態様は、肌関連酵素の活性を指標として、目元の肌状態を推定する方法である（以降、「本発明の推定方法」とも記す）。前記肌関連酵素は、角層中の酵素であることが好ましく、さらにはカスパーゼ−１４が好ましい。
また、本第一の態様においては、前記酵素の活性が高い場合は、目元の肌状態が良いと推定されることが好ましい。
また、前記肌状態は、シワ、ハリのなさ・たるみ、及びうるおいからなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。
また、本方法は、好ましくは多変量解析によって得られた推定式を用いて行われる。
【００１０】
本発明の第二の態様は、角層中に存在する酵素の活性を指標として試料を評価する方法であって、角層中に存在する酵素を選択する工程、前記選択した酵素に試料を適用する工程、及び前記選択した酵素の活性を前記試料の適用前後で比較する工程を含み、前記試料は目元用皮膚外用剤又は目元用皮膚外用剤に配合する物質である、評価方法である（以降、「本発明の評価方法」とも記す）。
本第二の態様においては、前記酵素活性が前記試料適用前よりも適用後の方が５％以上大きい場合に、該試料は目元の肌状態改善作用を有すると判定することが好ましい。
また、前記角層に存在する酵素は、カスパーゼ−１４であることが好ましい。
また、前記肌状態は、シワ、ハリのなさ・たるみ、及びうるおいからなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。
また、前記皮膚外用剤が、化粧料又は医薬部外品であることが好ましい。
【００１１】
本発明の第三の態様は、前述の第二の態様の評価方法により目元の肌状態改善作用を有すると判定された物質を含有する皮膚外用剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、肌関連酵素の活性を指標とする、簡便な、客観的な、高精度な、目元の肌状態を推定する方法が提供される。これにより、個人に合わせた目元のスキンケアの方法を検討したり化粧品を選択したりする際に有用な情報を得ることができ、該情報を目元の手入れに関するカウンセリングにも利用できる。
また、角層中に存在する酵素の活性という新たな指標により、目元用皮膚外用剤又はこ
れに配合する物質の目元の肌状態改善作用を適切に評価する方法が提供される。これにより、目元の肌状態の改善に有効な目元用皮膚外用剤の設計・製造に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カスパーゼ−１４活性と目元のシワとの相関関係を表すグラフである。
【図２】カスパーゼ−１４活性と目元のハリのなさ・たるみとの相関関係を表すグラフである。
【図３】カスパーゼ−１４活性と目元のうるおいとの相関関係を表すグラフである。
【図４】酵母エキス適用時のカスパーゼ−１４活性を示すグラフである（紫外線照射なし）。
【図５】酵母エキス適用時のカスパーゼ−１４活性を示すグラフである（紫外線照射あり）。
【図６】カスパーゼ−１４活性向上作用を有する酵母エキス含有皮膚外用剤適用前後の角層水分量の平均値を表すグラフである。
【図７】カスパーゼ−１４活性向上作用を有する酵母エキス含有皮膚外用剤適用前後の目元のシワ状態を表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第一の態様は、肌関連酵素の活性を指標として、目元の肌状態を推定する方法である。これは、本発明者らが新たに得た、目元の肌状態は頬部の角層中の酵素の活性と強い相関関係を有するという知見に基づく発明である。
【００１５】
本発明の推定方法において、肌関連酵素とは、表皮又は真皮に存在する酵素であって、肌の構成、ターンオーバー、バリア機能、水分保持等に何らかの関与をする酵素をいう。好ましくは、表皮の角層中に存在する酵素であることが好ましく、例えばカスパーゼ−１４、カリクレイン−５、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、トランスグルタミナーゼ等が挙げられ、これらのうちカスパーゼ−１４が特に好ましい。
本発明の推定方法においては、通常には、肌関連酵素の一種又は二種以上を指標として用いる。
【００１６】
本発明の推定方法において、肌関連酵素の活性は、既知の方法を適宜選択して測定することができる。
例えば、角層中の酵素の活性を測定する場合は、市販の粘着テープ等にて被験者から採取された角層細胞から酵素をバッファーにて抽出し、以下の測定方法に供することができる。なお、角層採取部位は特に限定されないが、肌への負担を考慮して頬部が好ましい。
【００１７】
酵素の活性を測定する具体的な方法を以下に示す。
例えば、カスパーゼ−１４の場合、ＭＣＡ基質にＮａＣｌ、Ｃｈａｐｓ、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ及びクエン酸ナトリウムを含有するバッファーに酵素液を混合し、１０分間３７℃においてインキュベートする。モノクロロ酢酸ナトリウム溶液で反応を停止し、蛍光強度（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４６０ｎｍ）で測定することができる。
カタラーゼの場合、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、酵素液を混合し、過酸化水素水を加え２５℃で反応させた後、過酸化水素に由来する２４０ｎｍの吸光度の減少を追跡し、過酸化水素の分子吸光度係数 により酵素活性を求めることができる。
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの場合、ＮＡＤＨを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２５℃で５分間予備加温後、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール水溶液を添加し、次いで、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈したＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ溶液を加え、反応を開始し、２５℃で６００ｎｍの吸光度を測定することで酵素活性を測定できる。
カリクレイン−５の場合、ＭＣＡ基質にＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ、Ｃｈａｐｓ、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ及びクエン酸ナトリウムを含有するバッファーに酵素液を添加し、１０分間３７℃においてインキュベートする。モノクロロ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．３）で反応を停止し、蛍光強度（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４６０ｎｍ）で測定することにより酵素活性を測定できる。
【００１８】
本発明の推定方法においては、推定式を用いることにより、酵素活性データより目元の肌状態を推定することができる。また、酵素活性が高い場合は、その被験者の目元の肌は良い状態にあると推定される。例えば、酵素活性測定値の統計量などから判断することができ、統計量の具体例としては、中央値、四分位点、平均値、その他統計分布における相対的位置などがあげられる。より具体的には、前述した条件でカスパーゼ−１４活性を測定したときに、活性値[強度比／ｍｇ（タンパク量あたりの蛍光強度比）]が中央値以上である場合、目元の肌状態が好ましいことを表すといえる。また、前述した条件でカスパーゼ−１４活性を測定した時に、活性値[強度比／ｍｇ（タンパク量あたりの蛍光強度比）]が中央値より小さい場合、目元の肌状態が悪いことを表すといえる。
また、例えば、測定対象者の酵素活性値を、２０〜６０代女性５０名以上の標準パネラーにおいて取得した酵素活性値の順位付けに照らし合わせたときに、好ましくは上位５０％以上、より好ましくは３０％以上に相当する場合は目元の肌状態が好ましいことを表し、好ましくは下位３０％以下、より好ましくは２０％以下に相当する場合は目元の肌状態が悪いことを表すといえる。
【００１９】
本明細書において、目元とは、目の周辺部位を指し、より具体的には上下瞼及び目尻並びにその周りの部位を指す。この部位の皮膚は顔の他の部分、例えば頬部よりも薄く、また強い表情圧がかかるため、シワ、ハリ・たるみ（弾力）、うるおい等の肌状態の変化が特に生じやすい。
【００２０】
本発明の推定方法により推定される目元の肌状態は、例えばシワ、ハリのなさ・たるみ、及びうるおいであり、通常には、上記肌状態の一種または二種以上である。これらは任意のパラメータで表すことができる。
本明細書において「シワ」は、皮膚表面に生じる溝状の筋目で、特に線状じわをいう。例えば、肌表面の画像解析や画像や実物の目視によりシワの数・長さ・太さ・深さをスコア化して表すことができる。
本明細書において「ハリのなさ・たるみ」は、肌のピンと張った感じが損なわれていること、または下方向へ垂れさがって見えることをいう。肌が水平方向または垂直方向に加えられた力に対して押し返す性質、あるいは変形するがその力が除かれれば元に戻ろうとする（復元する）性質の低下にも関連する。例えば、画像や実物の目視又は触診により肌の張った感じをスコア化して表わされる。また、例えば、皮膚の粘弾物性で表してもよい。
本明細書において「うるおい」は、肌に蓄えられた水分に由来する肌のみずみずしさや柔らかさをいう。例えば、角層水分量や水負荷試験で測定された角質水分保持能等で表される。また、例えば、画像や実物の目視又は触診により肌のかさつき又はみずみずしさ、柔らかさの感じをスコア化して表してもよい。
【００２１】
本発明の推定方法では、測定により得た肌関連酵素の活性値を、多変量解析によって得られた推定式に当てはめることにより、肌状態を表すパラメータを導くことによって解析を行うことが好ましい。前記推定式は、多変量解析のソフトウェアを利用して、肌関連酵素の活性値と肌状態パラメータとの相関分析及び回帰分析を行って作成できる。そのようなソフトウェアとして、装置に付属したソフトウェア、ＳＰＳＳ社やＳＡＳ社等の市販されているソフトウェアあるいはフリーソフトなどを用いることができ、特に制限されない。
また、推定式を作成するに際して測定標準となるパネラーは、特に限定されないが、好ましくは３０名以上、より好ましくは５０名以上、さらに好ましくは１００名以上であることが、解析の正確性を確保するため好ましい。また、年齢は２０〜６０代というように広範囲に偏りなく分布させることが好ましく、必要によっては年齢の要素を加味した推定式を作成してもよい。また、性別や人種もそろえて、例えば黄色人種の女性とすることが好ましい。
【００２２】
本発明の推定方法により、個人の肌関連酵素の活性を指標として、定量的な手法で、簡便に、客観的に、高精度に、目元の肌状態を推定することができる。そして、推定結果を個人に合わせた目元のスキンケアの方法を検討したり化粧品を選択したりする際の有用な情報としてカウンセリング等に供することができる。
【００２３】
本発明の第二の態様は、角層中に存在する酵素の活性を指標として試料を評価する方法であって、角層中に存在する酵素を選択する工程、前記選択した酵素に試料を適用する工程、及び前記選択した酵素の活性を前記試料の適用前後で比較する工程を含む方法である。ここで、前記試料は目元用皮膚外用剤又は目元用皮膚外用剤に配合する物質であり、前記皮膚外用剤は好ましくは化粧料又は医薬部外品である。
これもまた、本発明者らが新たに得た、目元の肌状態は頬部の角層中の酵素の活性と強い相関関係を有するという知見に基づく発明である。
【００２４】
本発明の評価方法において角層中に存在する酵素とは、角層中に存在し、肌の構成、ターンオーバー、バリア機能、水分保持等に何らかの関与をする酵素であれば特に制限されないが、例えばカスパーゼ−１４、カリクレイン−５、カタラーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、トランスグルタミナーゼ等が挙げられ、これらのうちカスパーゼ−１４が特に好ましい。
また、本発明の評価方法においては、通常には、肌関連酵素の一種又は二種以上を指標として用いる。
【００２５】
本発明の評価方法においては、前記選択した酵素に試料を適用する工程、及び前記選択した酵素の活性を前記試料の適用前後で比較する工程を行うことによって、酵素活性の変化を指標とする評価を行う。
具体的な手順を以下に説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
まず、角層に存在する酵素の酵素液を用意する。酵素液は、市販の粘着テープ等にて採取された角質細胞から酵素をバッファーに抽出することにより得てもよいし、その他任意の方法で入手した酵素をバッファー等に溶解することによって調製してもよい。なお、角質細胞から入手する場合、その採取部位は特に限定されないが、肌への負担を考慮して頬部が好ましい。
用意した酵素液の酵素活性を測定した後に試料を適用し、適当な時間、例えば３時間インキュベーションした後、試料適用後の酵素活性を測定して、適用前後での酵素活性の大小を比較する。あるいは、酵素液に試料を適用しない場合の酵素活性と、試料を適用した場合の酵素活性とを、インキュベーション後にそれぞれ測定して比較してもよい。なお、酵素活性の測定方法は、前述した本発明の推定方法での説明に準じる。
試料適用後の酵素活性が、前記試料適用前よりも大きい場合、好ましくはコントロールに対して５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上増加した場合に、前記被験物質は目元の肌状態を改善する作用を有すると判定する。
なお、本発明の評価方法において、目元の肌状態とは、前述した本発明の推定方法での説明に準じる。
【００２６】
本発明の評価方法に供する物質は、純物質、動植物由来の抽出物、微生物由来の抽出物
、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。以下に例示として記載するが、これらに限定されない。
動植物由来の抽出物又は発酵エキスは、動物、植物由来又は酵母等の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。
抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。このような抽出物としては、好ましくは陳皮エキスが例示できる。
微生物由来の抽出物としては、ヒートショックプロテインが含有される酵母エキスが好ましく例示でき、化粧料に配合されている市販の酵母エキスを用いることが出来る。その他、特開2013-180970にて示されているスフィンゴイド類及びＮ−アセチルスフィンゴシ
ン類、ビタミン類を用いることもできる。
【００２７】
本発明の評価方法で目元の肌状態改善作用を有すると判定された目元用皮膚外用剤は、目元の肌状態改善用の皮膚外用剤として優れた効果を有する。また、本発明の評価方法で目元の肌状態改善作用を有すると判定された目元用皮膚外用剤に配合する物質は、目元の肌状態改善用の皮膚外用剤に好適に利用できる。
したがって、本発明の評価方法により、目元の肌状態の改善に有効な目元用皮膚外用剤の設計・製造・評価が適切に行えるようになる。
【００２８】
本発明の第三の態様は、前述の第二の態様の評価方法により目元の肌状態改善作用を有すると判定された物質を含有する皮膚外用剤である。
皮膚外用剤としては、化粧料、医薬部外品、医薬品などが好適に例示でき、日常的に使用できることから、化粧料、医薬部外品がより好ましい。
このような皮膚外用剤は、常法に従って調製することができる。また、目元の肌状態改善効果を損なわない限り、他の任意成分を共に含有させることができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
＜実施例１＞カスパーゼ−１４活性に基づく目元の肌状態の推定
（１）酵素活性の測定
カスパーゼ−１４と肌状態の関連性を把握するため、５８名の健常者について洗顔後（メーク落とし・洗顔）、室温２２±２ ℃、湿度５０±５％の条件下にて安静にし、顔部
の角層細胞を採取し、酵素活性を測定した。
テープストリッピング法により、顔部の角層細胞を採取した。採取した角層は酵素抽出液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）にてホモジナイズし、１５０００ｒｐｍで遠心した上清を酵素液とした。酵素活性の算出に必要な蛋白濃度は、前記酵素液を、ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（同
仁化学）を用い測定した。
カスパーゼ−１４は、以下の方法にて測定した。すなわち、ＭＣＡ基質（０．２ｍＭ）２０μＬ、アッセイバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋６０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０１％Ｃｈａｐｓ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ＋２ｍＭ  ＤＴＴ＋１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）１６０μＬを小試験管中で１０分間３７℃においてインキュベートしブランクとした。同様に、ＭＣＡ基質（０．２ｍＭ）２０μＬ、アッセイバッファー（５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋６０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０1％Ｃｈａｐｓ＋５ｍＭ  Ｅ
ＤＴＡ＋２ｍＭ  ＤＴＴ＋１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）１６０μＬ中に酵素液３０μＬを加え、小試験管中で１０分間３７℃においてインキュベートし、サンプルとした。
ブランク、サンプルともに０．１Ｍモノクロロ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．３）で反応を停止し、蛍光強度（ＥＸ３７０ｎｍ、ＥＭ４６０ｎｍ）で測定し、酵素活性[蛍光強
度比／ｍｇ（タンパク量あたりの蛍光強度比）]を算出した。
【００３１】
（２）目元の肌状態のスコア化
肌状態として、シワ、ハリのなさ・たるみ、うるおいについて、上記健常者について洗顔後（メーク落とし・洗顔）、室温２２±２ ℃、湿度５０±５％の条件下にて安静にし
、顔画像を撮像した。その顔画像を肌状態の評価の専門家３名の合議により、目視評価で表１の５段階にスコア化した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
（３）解析
上記測定したカスパーゼ−１４活性値と目元のシワ、ハリのなさ・たるみ、うるおいの各スコアとを用いて、ＪＭＰ ｖｅｒ.６．０（ＳＡＳ）を使用して、相関分析及び回帰分析を行った（図１〜３）。これより、カスパーゼ−１４活性と目元の肌状態との間に有意な相関関係の存在が認められ、カスパーゼ−１４等の肌関連酵素の活性を指標として目元の肌状態の良し悪しを推定できることがわかる。
カスパーゼ−１４活性が低いと、ＮＭＦ産生機能が低いことが考えられ、その結果、肌の保水機能が低く、ハリのなさ・たるみが乏しくなり、シワが形成されやすいものと推察される。
一方、毛穴の目立ち等についても同様の検討を行ったところ、カスパーゼ−１４活性との有意な相関性は認められなかった。これより、いかなる目元の肌状態であってもカスパーゼ−１４の活性と有意に相関するわけではなく、カスパーゼ−１４活性を指標とすると特に好適にシワ、ハリのなさ・たるみ、及びうるおいを推定できるといえる。
【００３４】
＜実施例２＞カスパーゼ−１４活性に基づく物質の評価
健常人１名よりテープストリッピングにより、目元の角層細胞を採取した。
採取した角層は酵素抽出液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．１４Ｍ
ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）にてホモジナイズし、１５０００ｒｐｍで遠心した上清を酵素液とした。
酵素活性低下モデルとして、市販１２ウェルプレート（ 面積  約２ｃｍ2）に、実施例１に記載したアッセイバッファー１６０μＬを加え、さらに酵素液３０μＬを加え、酵素にダメージを与えるため紫外線（ＵＶＢ）を０又は２００ｍＪ／ｃｍ2となるように直接
照射した。その後、各酵素液に市販の通常化粧料で使用される酵母エキスを０、０．１、１．５、３．０又は６．０％添加し、３時間後のカスパーゼ−１４の酵素活性を実施例１と同様の方法で測定した。
【００３５】
図４に紫外線非照射の場合の、酵母エキス添加時の酵素活性の３回測定値の平均の、酵母エキス無添加時の酵素活性の３回測定値の平均を１００％としたときの相対値を示す。酵母エキスの添加により酵素活性が５％以上増加したことがわかる。
また、図５に紫外線照射の場合の、酵母エキス添加時の酵素活性の３回測定値の平均の、酵母エキス無添加時の酵素活性の３回測定値の平均を１００％としたときの相対値を示す。酵母エキスの添加により、ダメージを受けた酵素であっても、その活性が１０％以上増加したことがわかる。
実施例１で示された通り、カスパーゼ−１４活性は目元の肌状態と相関関係があることから、カスパーゼ−１４活性を増加させることが確認された酵母エキスは目元の肌状態を改善・向上させることが推認できる。実際に、酵母エキスが線維芽細胞増殖促進剤として使用できることが既に知られており（例えばWO2009/084742）シワ改善用途への使用が期
待でき、これらの結果は角層中に存在するカスパーゼ−１４等の酵素の活性を指標として試料を評価でき、さらには該酵素活性が増加した場合に該試料が目元の肌状態改善作用を有すると判定できることを示す。
【００３６】
＜実施例３＞カスパーゼ−１４活性を増加させる物質を含有する皮膚外用剤
実施例２の評価方法によりカスパーゼ−１４活性を増加させた酵母エキスを含有する皮膚外用剤の処方例を表２に示す。イ〜ニ成分を常法に従って混合し、皮膚外用剤１を調製した。皮膚外用剤１を３５〜４９ 歳の健康な女性２３名に対して１ヶ月間、朝晩使用し
てもらった。使用前及び使用１ヶ月後の目元の角層水分量及び目元の写真撮影を行った。図６に角層水分量の平均値を表すグラフ(使用前を１００％とする)を、図７に被験者の一人の目元の写真を示した。
その結果、本願発明の皮膚外用剤を１ヶ月間使用した場合、顕著な角層水分量の上昇、目元のしわの改善が確認された。
【００３７】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、肌関連酵素の活性を指標とする、簡便な、客観的な、高精度な、目元の肌状態を推定する方法が提供される。これにより、個人に合わせた目元のスキンケアの方
法を検討したり化粧品を選択したりする際に有用な情報を得ることができ、該情報を目元の手入れに関するカウンセリングにも利用できる。
また、角層中に存在する酵素の活性という新たな指標により、目元用皮膚外用剤又はこれに配合する物質の目元の肌状態改善作用を適切に評価する方法が提供される。これにより、目元の肌状態の改善に有効な目元用皮膚外用剤の設計・製造に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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