(57)【要約】【課題】  本発明は、生体組織由来の試料から、増殖性の高い細胞を高効率で取得することを目的とする。【解決手段】  本発明は、生体組織を分散させるための組成物であって、前記組成物の処方溶液におけるコラゲナーゼ活性が、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定して、０．３０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬであり、前記組成物の処方濃度におけるトリプシン活性が、ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定して、０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬである、組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織を分散させるための組成物であって、前記組成物の処方溶液におけるコラゲナーゼ活性が、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定して、０．３０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬであり、前記組成物の処方濃度におけるトリプシン活性が、ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定して、０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬである、組成物。
【請求項２】
薬剤評価のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
生体組織が、がん組織である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
生体組織由来の細胞の取得方法であって、生体組織由来の試料を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物で処理することを含む、方法。
【請求項５】
細胞の培養結果の評価方法であって、培養される細胞が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物で処理された細胞である、方法。
【請求項６】
細胞の培養結果が、２次元的な培養の結果である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞の培養結果が、３次元的な培養の結果である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
３次元的な培養が、滴塊状ゲル内において行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織を分散させるための組成物に関する。また、本発明は、滴塊状ゲルに包埋される細胞の培養結果の評価方法に関する。さらに、本発明は、生体組織由来の細胞の取得方法に関する。また、本発明は、上記の方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤は、正常細胞にも作用して強い副作用を示す場合があるものの、抗がん剤の奏効率は、一部を除いて５０％に満たず、抗がん剤の効き具合は、患者によって大きく異なることが知られている。したがって、がん患者が抗がん剤の投与による治療を受ける前に、投与を予定する抗がん剤が、そのがん患者に効くかどうかを評価し、効かない抗がん剤の不要投与を避け、患者の身体的、経済的負担を減らし、治療機会の逸失を避けることが求められる。
【０００３】
このような抗がん作用の評価方法として、生体を模した滴塊状ゲルにおいて、がん細胞を３次元で増殖させ、抗がん剤に接触させて、増殖結果を評価する方法が知られており（特許文献１〜１１）、滴塊状ゲルにおいて生体内と同様に増殖する細胞を取得することが求められている。
【０００４】
特許文献１〜７には、生体組織由来の試料から細胞を取得する際に用いる酵素として、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼなどを用いることが記載されている。また、特許文献９〜１１には、生体組織を、クロストリジウム中性プロテアーゼ、サーモライシン、およびディスパーゼからなる群より選択される１種以上のプロテアーゼ；ならびにコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、およびコラゲナーゼＩＶからなる群より選択される１種以上のコラゲナーゼを含む混合酵素で処理することの記載がある。
【０００５】
また、非特許文献１〜２１には、生体細胞を分散させる酵素が記載されている。これらの文献には、タイプＩコラゲナーゼ、タイプＩＩコラゲナーゼ、タイプＩＩＩコラゲナーゼ、タイプＩＶコラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼなどによって生体組織由来の試料を処理することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許２８７９９７８号公報
【特許文献２】特開平３−２８５６９６号公報
【特許文献３】特開平７−３１４７０号公報
【特許文献４】特開平７−２４１１９０号公報
【特許文献５】特開平１０−１１５６１２号公報
【特許文献６】特開２００３−９８５３号公報
【特許文献７】特開２００８−１１７９７号公報
【特許文献８】特開２００５−９５０５８号公報
【特許文献９】特開２０１０−２２７０８８号公報
【特許文献１０】特開２０１１−１１５１０６号公報
【特許文献１１】国際公開第２０１１／０９００６８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zhou, J, Belov, L., Solomon, M., Chan, C., Clarke, S. and Christopherson, R.: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing., J Vis Exp 55, e3322, 2011
【非特許文献２】Quintana, E., Shackleton, M., Foster, H., Fullen, D., Sabel, M., Johnson, T. and Morrison, S.: Phenotypic Heterogeneity Among Tumorigenic Melanoma Cells from Patients that is Reversible and Not Hierarchically Organized.,Cancer Cell Vol. 18,, , 510, 2010
【非特許文献３】Kim, M., Evans, D., Wang, H., Abbruzzese, J., Fleming, J. and Gallick, G.: Generation of Orthotopic and Heterotopic Human Pancreatic Cancer Xenografts in Immunodeficient Mice., Nat Protoc 4, 1670, 2009
【非特許文献４】Sauvageot, C., Weatherbee, J., Kesari, S., Winters, S., Barnes, J., Dellagatta, J., Ramakrishna, N., Stiles, C., Kung, A., Kieran, M. and Wen, P.: Efficacy of the HSP90 Inhibitor 17-AAG in Human Glioma Cell Lines and Tumorigenic Glioma Stem Cells.,Neuro Oncol Vol. 11,, , 109, 2009
【非特許文献５】Liu, R., Wang, X., Chen, G., Dalerba, P., Gurney, A., Hoey, T., Sherlock, G., Lewicki, J., Shedden, K. and Clarke, M.: The Prognostic Role of a Gene Signature from Tumorigenic Breast-Cancer Cells., N Engl J Med 356, 217, 2007
【非特許文献６】Nakashiro Koh-Ichi, Hara Shingo, Shinohara Yuji, Oyasu Miho, Kawamata Hitoshi, Shintani Satoru, Hamakawa Hiroyuki, Oyasu Ryoichi: Phenotypic switch from paracrine to autocrine role of hepatocyte growth factor in an androgen-independent human prostatic carcinoma cell line, CWR22R, Am J Pathol 165, 533-40, 2004
【非特許文献７】Nishio Jun, Iwasaki Hiroshi, Ishiguro Masko, Ohjimi Yuko, Fujita Chikako, Isayama Teruto, Naito Masatoshi, Oda Yoshinao, Kaneko Yasuhiko, Kikuchi Masahiro: Establishment of a new human synovial sarcoma cell line, FU-SY-1, that expresses c-Met receptor and its ligand hepatocyte growth factor, Int J Oncol 21, 17-23, 2002
【非特許文献８】Emenaker N, Calaf G, Cox D, Basson M and Qureshi N: Short chain fatty acids differentially modulate cellular phenotype and c-myc protein levels in primary human nonmalignant and malignant colonocytes, J Nutr 46, 96-105, 2001
【非特許文献９】MacLeod, R: Rapid Monolayer Primary Cell Culture from Tissue Biopsy,Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures Vol. 1,Doyle, A., Griffiths, J., and Newell, D., John Wiley and Sons Ltd, 3E:2.1, 1995
【非特許文献１０】Hague, A and Paraskeva, C: Colon Adenocarcinoma Cells,Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures Vol. 1,Doyle, A., Griffiths, J., and Newell, D., John Wiley and Sons, Ltd., 12C:1.1, 1995
【非特許文献１１】Beaupain, R., Mainquene, C., Brouty-Boye, D., Planchon, P., and Magniew, V.: "Normal" Breast Cells Adjacent to a Tumor Grown in Long-term Three Dimensional Culture, In Vitro Cell Dev Biol 29, 100, 1993
【非特許文献１２】Kruse, C., Mitchell, D., Kleinschmidt-DeMasteis, B., Franklin, W., Morse, H., Spector, E., and Lillehei, K.: Characterization of a Continuous Human Glioma Cell Line DBTRG-OSMG: Growth Kinetics, Karyotype, Receptor Expression and Tumor Suppressor Gene Analyses, In Vitro Cell Dev Biol 28, 609, 1992
【非特許文献１３】Emerman, J. and Wilkinson, D.: Routine Culturing of Normal, Dysplastic and Malignant Human Mammary Epithelial Cells from Small Tissue Samples, In Vitro Cell Dev Biol 26, 1186, 1990
【非特許文献１４】Boyd, J., Rinehart Jr., C., Walton, L., Siegal, G. and Kaufman, D.: Ultrastructural Characterization of Two New Human Endometrial Carcinoma Cell Lines and Normal Human Endometrial Epithelial Cells Cultured on Extracellular Matrix, In Vitro Cell Dev Biol 26, 701, 1990
【非特許文献１５】Sheela S, Riccardi VM, Ratner N: Angiogenic and invasive properties of neurofibroma Schwann cells, J Cell Biol 111, 645-53, 1990
【非特許文献１６】Sacks, P., Parnes, S., Gallick, G., Mansouri, Z., Lichtner, R., Satya-Prakash, K., Pathak, S, and Parsons, D.: Establishment and Characterization of Two New Squamous Cell Carcinoma Cell Lines Derived from Tumors of the Head and Neck, Cancer Res 48, 2858, 1988
【非特許文献１７】Brattain, M., Marks, M., McCombs, J., Finely, W., and Brattain, D.: Characterization of Human Colon Carcinoma Cell Lines Isolated From a Single Primary Tumour, Br J Cancer 47, 373, 1983
【非特許文献１８】Friedman, E., Higgins, P., Lipkin, M., Shinya, H., and Gelb, A.: Tissue Culture of Human Epithelial Cells from Benign Colonic Tumors, In Vitro 17, 632, 1981
【非特許文献１９】Leung, C., and Shiu, R.: Morphological and Proliferative Characteristics of Human Breast Tumor Cells Cultured on Plastic and in Collagen Matrix, In Vitro 18, 476, 1981
【非特許文献２０】Creasey, A., Smith, H., Hackett, A., Fukuyama, K., Epstein, W., and Madin, S.: Biological Properties of Human Melanoma Cells in Culture, In Vitro 15, 342, 1979
【非特許文献２１】Lasfargues, E.: Tissue Culture Methods/Applications, Kruse, P., and Patterson, M., Academic Press, 45, 1973
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の方法によって生体組織由来の試料から調製した細胞は、増殖させようとしても、しばしば期待どおりに増殖しないことがあった。また、生体からは組織由来の試料を少量しか取得できないことがあるため、試料からの細胞の取得効率が高いことが求められる。したがって、本発明は、生体組織由来の試料から、増殖性の高い細胞を高効率で取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討したところ、生体組織由来の試料を分散させるために用いる組成物に含まれ、組織の可溶化に寄与していると考えられるトリプシンが、コラゲナーゼやその他の有用酵素の働きを妨げていることを見出した。また、トリプシン活性が高い場合には、細胞毒性が高く、取得する細胞の増殖性を低下させていることを見出した。以上の発見をもとにさらに鋭意検討したところ、本発明者らは、従来用いられていた組成物とは異なり、トリプシン活性を抑制し、コラゲナーゼ活性を高く確保した組成物を用いて生体組織由来の試料を分散させることによって、増殖度の高い細胞を高効率で取得することができることを見出した。生体組織由来の試料の分散が不十分な場合には、細胞の取得効率が低い傾向があり、従来は、高いトリプシン活性を示す組成物を用いて、細胞分散が行われてきた。本発明は、逆に、トリプシン活性を低下させることによって、増殖度の高い細胞の取得効率を向上させることができることを見出したものであり、画期的である。
【００１０】
すなわち、本発明は、第１の態様において、生体組織を分散させるための組成物であって、前記組成物の処方溶液におけるコラゲナーゼ活性が、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定して、０．３０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬであり、前記組成物の処方溶液におけるトリプシン活性が、ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定して、０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬである、組成物を提供するものである。
【００１１】
また、本発見は、第２の態様において、薬剤評価のための、第１の態様に記載の組成物を提供するものである。
【００１２】
さらに、本発見は、第３の態様において、生体組織が、がん組織である、第１の態様または第２の態様に記載の組成物を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発見は、第４の態様において、生体組織由来の細胞の取得方法であって、生体組織由来の試料を、第１の態様〜第３の態様いずれか１に記載の組成物で処理することを含む、方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発見は、第５の態様において、細胞の培養結果の評価方法であって、培養される細胞が、第１の態様〜第３の態様のいずれか１に記載の組成物で処理された細胞である、方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、第６の態様において、細胞の培養結果が、２次元的な培養の結果である、第５の態様に記載の方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、第７の態様において、細胞の培養結果が、３次元的な培養の結果である、第５の態様に記載の方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、第８の態様において、３次元的な培養が、滴塊状ゲル内において行われる、第７の態様に記載の方法を提供するものである。
【００１８】
さらに、本発見は、第９の態様において、第４の態様または第５の態様に記載の方法を行うためのキットであって、第１の態様〜第３の態様のいずれか１に記載の組成物を含む、キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の組成物を用いて生体組織由来の試料を処理すれば、試料を効果的に分散することができ、周囲に付着する組織の量が少なく、かつ酵素毒性による傷害が少なく、生体内と同様に増殖する細胞を、高効率で取得することができる。特に、本発明の組成物を用いれば、硬がんなどの硬度の高い組織から増殖度の高い細胞を高効率で取得することができる。本発明の組成物を用いて取得された細胞を、立体的に増殖させれば、もしくは凝集塊を形成する３次元培養法にて培養すれば、細胞は生体内と同様に増殖するため、抗がん剤などの薬剤の評価や、遺伝子、タンパク質、糖鎖などの機能性高分子などの生体物質の解析などの各種の解析を行うことができる。さらに、本発明の組成物を用いて取得された細胞を滴塊状ゲルに包埋して培養すれば、より少量の細胞から各種解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、擬似間質組織の消化効率を対比する写真である。
【図２】図２は、ＨＣＴ−１１６細胞およびＰＣ−１４細胞に対する組成物の毒性を対比するグラフである。
【図３】図３は、酵素を含む組成物を用いて調製した細胞の増殖性を対比する写真である。
【図４】図４は、酵素を含む組成物による処理後の細胞の増殖性を対比するグラフである。
【図５】図５は、酵素を含む組成物による処理後の細胞の各種の薬剤に対する感受性を対比するグラフである。
【図６】図６は、実施例１の組成物と、比較例１の組成物についてのＴ／Ｃ（％）値の１対１プロットグラフである。
【図７】図７は、酵素を含む組成物を処理して得られた細胞を滴塊状ゲルにおいて培養した後に行ったニュートラルレッド染色の結果を対比する写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、生体組織を分散させるための組成物を提供する。本発明の組成物の処方濃度におけるコラゲナーゼ活性は、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定して、０．３０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、０．３０Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、０．３０Ｕ／ｍｇ〜１Ｕ／ｍｇである。ここで、ＦＡＬＰＧＡ分解活性測定の方法は、後述の試験例２において、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法として示されたプロトコールを用いて測定された値（Ｕ／ｍＬ）を、コラゲナーゼ活性とする。ＦＡＬＧＰＡは、Ｎ−（３−［２−フリル］アクリロイル）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａである。また、本発明の組成物の処方濃度におけるトリプシン活性は、ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定して、０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、０Ｕ／ｍＬ〜２０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬである。ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法は、後述の試験例２において、ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法として示されたプロトコールを用いて測定された値（Ｕ／ｍＬ）を、トリプシン活性とする。ＢＡＥＥは、Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチル塩酸塩である。処方濃度は、本発明の組成物を用いて生体組織を分散させる際の本発明の組成物の濃度である。
【００２２】
本発明の組成物は、市販のコラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼなどを混合して、混合物のコラゲナーゼ活性、およびトリプシン活性を、それぞれ、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法、およびＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定して、混合物におけるコラゲナーゼ活性、およびトリプシン活性が、所望の範囲となるように調整することによって、作製することができる。コラゲナーゼとしては、クロストリジウム由来、放線菌由来などのいずれのものを用いても良い。また、コラゲナーゼの精製度はいずれのものを用いても良いが、望ましくは粗精製のコラゲナーゼを含むことが望ましい。また、本発明の組成物には、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、サーモライシンなどの各種分解酵素を含んでいても良い。より好ましくはディスパーゼを含む。ディスパーゼは生体において細胞の足場となるＩＶ型コラーゲンやフィブロネクチンを分解することができるので、より効率的に細胞を取得することができる。また、本発明の組成物は、トリプシン活性を制御するために、トリプシン活性の阻害剤を含んでもよい。トリプシン活性の阻害剤としては、血清などが挙げられる。血清を用いることにより、本発明の組成物における細胞毒性を低減させることができる。
【００２３】
本発明の組成物は、生体組織由来の試料を処理して、当該試料を分散させ、細胞を取得するために用いることができる。生体としては、ヒトのほか、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、 ブタ、ヤギ、ウシ、サルなどの非ヒト哺乳動物などが挙げられる。生体組織としては、例えば、がん組織、正常組織などが挙げられる。がんとしては、例えば、消化器がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、がん性胸・腹膜炎、子宮頚がん、子宮体がん、卵巣がんなどが挙げられる。本発明の組成物は、特に、硬がんの消化および分散に適している。生体組織由来の試料は、例えば、手術材料の全部または一部、生検試料の全部または一部などが挙げられる。手術材料は、例えば、治療を目的とした外科切除術時に摘出される組織を用いることが出来る。また、病理診断や疾病の治療および経過予後の判定などを目的として、低侵襲的採取法によって試験切除的・試験穿刺的に採取される組織を用いることが出来る。低侵襲的採取法によって採取される組織としては、各種生検試料、胸腔鏡下あるいは腹腔鏡下材料、腹水、および、胸水などから得られる試料などが挙げられる。試料は、生体からの採取後、ハサミ、ピンセットおよびカミソリ等を用いた細切処理などの機械的分離処理を受けたものであってもよい。また、試料は、培地成分や抗生剤を含む洗浄液を用いて洗浄されたものであってもよい。また試料は、がん患者からの採取後のミンス処理によってペースト状態としたものであってもよい。
【００２４】
生体組織由来の試料の分散は、例えば、本発明の組成物と生体組織由来の試料を混合して、２５〜４０℃で、３分〜７２時間処理することによって行うことができる。より好ましくは、生体組織由来の試料の分散は、５分〜２４時間処理することによって行うことができる。混合時の生体組織由来の試料の含有量は、例えば、０．１〜５ｇ／１０ｍＬである。混合時におけるコラゲナーゼ活性は、ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定して、０．３０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、０．３０Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、０．３０Ｕ／ｍＬ〜１Ｕ／ｍＬである。ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法は、前述のとおりである。混合時におけるトリプシン活性は、ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定して、０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、０Ｕ／ｍＬ〜２０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、０Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬである。ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法は、前述のとおりである。
【００２５】
分散後、本発明の組成物と生体組織由来の試料との混合物から、任意の方法を用いて、細胞を取得することができる。本発明の組成物に含まれる酵素による細胞毒性を低下させ、取得する細胞の増殖性を向上させるために、生体組織由来の試料を含む分散後の混合物を、血清で処理することが好ましい。また、酵素の作用を低減する為にＥＤＴＡなどの金属キレート剤で処理しても良い。さらに、酵素を除くために、遠心分離によって酵素液を除いても良い。細胞の取得の際には、ナイロンメッシュ、セルストレーナーなどのろ過器を用いてろ過を行ってもよい。また、生体組織由来の試料を分散させた溶液を、培地上に播種し、培養を行い、増殖した細胞を選択的に取得してもよい。培養は、支持体で行ってもよい。生体組織由来の試料を播種する支持体は、細胞接着因子が層状に塗布されていてもよい。細胞接着因子としては、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン、ゼラチン、ペプチドおよびインテグリン等の細胞外基質を好ましく挙げることができ、これらは１種のみを用いても、２種以上併用してもよいが、細胞接着性や細胞伸展性がより向上するという点で、各種コラーゲンを用いることがより好ましく、各種コラーゲンの中でも、タイプＩコラーゲンやタイプＩＶコラーゲンを用いることが特に好ましい。支持体の表面に塗布する細胞接着因子は、滴塊状ゲルにおけるゲル化剤と同一でもよい。支持体に接着した細胞の取得は、例えば、血球、不要細胞成分などを含む培養液を除去した後、細胞の剥離剤を添加して、支持体に接着した細胞を剥離することによって行うことができる。細胞の剥離剤としては、例えば、ＥＤＴＡ−トリプシンなどが挙げられる。支持体に接着した細胞の剥離は、支持体に塗布物がある場合には、塗布物の剥離剤を添加することによって行ってもよい。支持体の塗布物がコラーゲンである場合、塗布物の剥離剤は、例えば、コラゲナーゼである。コラゲナーゼの添加によって細胞の剥離を行う場合、生細胞への作用よりも先に、生細胞が接着したコラーゲン・ゲル層自体を酵素分解することになり、生細胞への損傷が少ない。
【００２６】
本発明の組成物を用いて取得した細胞を、２次元的に培養し、または立体的に増殖させ、もしくは凝集塊を形成する３次元培養法にて培養し、培養結果を評価することにより、生体内における条件と同様の培養結果を評価することができる。本発明の組成物で処理された細胞を、３次元的に培養して得られた培養結果を評価することによって、より一層生体内における条件に類似した培養結果を得ることができる。３次元培養法には、たとえば、コラーゲンやマトリゲルなどの細胞外基質に包埋する方法、培養面が低接着性の培養器にて培養する方法、培養面がＵ底の培養器にて培養する方法、培養面に微少パターンを構成した培養器にて培養する方法、培養液滴中で培養する方法などがあるが、これらに限定されることはない。本発明の組成物を用いて取得された細胞を滴塊状ゲルに包埋して培養すれば、より少量の細胞から各種解析を行うことができる。滴塊状ゲルとしては、例えば、平面の基材上で凸表面を示す形状のものが挙げられる。滴塊状ゲルの容積の一例は、３〜３００μＬ、３〜１５０μＬ、５〜１００μＬ、１５〜５０μＬなどである。滴塊状ゲルの高さは、例えば、２ｍｍ以下である。滴塊状ゲルとしては、例えば、４００ｎｍの光に対して透過率１〜９５％の透明度を示すものが挙げられる。滴塊状ゲルの粘度は、取り扱いの容易さと、滴塊状ゲルとしての形状の維持を両立させる観点から、例えば、５０〜２０００センチポイズや、１００〜１０００センチポイズなどである。滴塊状ゲルは、ゲル化剤を含んでよい。ゲル化剤としては、酸可溶性タイプＩコラーゲンなどのコラーゲン；マトリゲルなどの細胞外基質、軟寒天などが挙げられる。滴塊状ゲルにおけるコラーゲンの含有量は、滴塊状ゲルとしての形状の維持を両立させる観点から、例えば、０．１〜２．０重量％である。さらに、滴塊状ゲルは、多糖類その他の細胞外基質などの高分子材料、血清培地などの培地成分などを含んでもよい。滴塊状ゲルは、例えば、緩衝液などによって、例えば、ｐＨ６．２〜７．６や、ｐＨ６．８〜７．４などに設定してもよい。滴塊状ゲルの塩強度またはイオン強度は、例えば、１００〜１８０ｍｍｏｌや、１４０〜１６０ｍｍｏｌなどである。
【００２７】
滴塊状ゲルは、生体組織由来の試料を本発明の組成物で処理して得られた細胞を包埋させて用いることができる。滴塊状ゲルへ包埋させる細胞の濃度は、例えば、１０２〜１０７細胞／ｍＬ、好ましくは、１０３〜１０６細胞／ｍＬである。細胞を包埋する滴塊状ゲルは、例えば、ゲル化剤を含む溶液と細胞などの成分を混合し、得られた混合液を氷冷し、ピペットを用いて、基材上に滴下し、３０〜４５℃において３０分〜２時間静置することによって作製することができる。基材は、滴塊状ゲルを固定できる表面を備えるものである。基材としては、例えば、ペトリ皿、マルチディッシュなどの培養皿；フラスコその他の通常の培養容器；ガラスやプラスチックの薄片状をなすカバースリップまたはセルディスクなどの培養プレート；などが挙げられる。基材は、細胞の培養結果の評価が容易である点で、好ましくは、光学的に透明である。滴塊状ゲルに包埋させた培養は、例えば、１〜１０日間、好ましくは、３〜８日間行う。
【００２８】
評価する培養結果としては、例えば、培養前後の生存細胞数の変化、培養前後の細胞内の産物の変化などが挙げられる。細胞内の産物としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、タンパク質などが挙げられる。細胞の培養に際して、滴塊状ゲルに対して薬剤を添加してもよい。この場合、培養前の細胞と培養後の細胞を比較することや、薬剤を添加して培養した細胞と薬剤を添加しないで培養した細胞を比較することによって、細胞に対する薬剤の影響を評価することができる。
【００２９】
薬剤評価としては、例えば、細胞に対する薬剤の作用を評価する方法であって、細胞を包埋する滴塊状ゲルに対して薬剤を含む溶液を接触させた後に、細胞を包埋する滴塊状ゲルと培地とを接触させて、細胞を包埋する滴塊状ゲルにおいて細胞を培養し、培養の結果を評価することを含む方法が挙げられる。
【００３０】
薬剤評価における薬剤としては、疾患に対する治療、予防、または改善剤が挙げられる。疾患としては、がんなどが挙げられる。がんに対する治療、予防、または改善剤としては、がん細胞に直接的に作用する抗がん剤のほか、がん細胞を直接的に攻撃するのではないが、生体内の免疫細胞やその他の薬剤との協働的な作用によって、がん細胞の増殖を抑制したり、がん細胞の活動を鈍らせたり、がん細胞を死滅させたりする機能を発揮する薬剤が挙げられる。抗がん剤としては、例えば、５−ＦＵなどの代謝拮抗剤；ＳＮ−３８などのイリノテカン系抗がん剤；ドセタキセルなどの微小管脱重合阻害薬；シスプラチン、ｌ−オキサリプラチンなどの白金製剤；などが挙げられる。他には、細胞増殖に関わる増殖因子およびその受容体、ならびに細胞増殖、細胞周期、アポトーシスおよびそのシグナル伝達に関わる分子または酵素などを選択的に修飾し、抗がん効果を得ようとする分子標的薬が挙げられる。例えば、トラスツズマブやセツキシマブ、ゲフィチニブなどの増殖因子受容体に作用するもの、イマチニブやクリゾチニブなどの融合遺伝子のシグナル伝達に作用するもの、ベバシズマブなどのがん組織の血管新生を抑制するものなどがある。他の薬剤としては、抗がん剤のプロドラッグ、抗がん剤もしくはそのプロドラッグの代謝に関連する細胞内代謝酵素活性を調整する薬剤、免疫療法剤などが挙げられる。
【００３１】
薬剤評価において評価される作用としては、例えば、当該細胞の由来する生体に対して当該薬剤を投与した場合に、当該生体において治療、予防、または改善が得られる可能性に関する作用が挙げられる。治療、予防、または改善の効果としては、例えば、疾患細胞の増殖の低下、細胞の傷害、組織の縮小などが挙げられる。
【００３２】
薬剤評価の方法において、滴塊状ゲルと薬剤を含む溶液との接触は、例えば、滴塊状ゲルが乾燥して平坦な乾燥物にならないように、基材上にある滴塊状ゲルに対して、薬剤を含む溶液を重層し、薬剤を含む溶液によって滴塊状ゲルの全体を覆うようにして行うことが好ましい。接触させる薬剤を含む溶液は、薬剤の他、血清培地などの培地を含んでよい。溶液における薬剤の濃度は、好ましくは、細胞の由来する生体に対して薬剤を投与した際の当該細胞近辺における薬剤濃度である。
【００３３】
薬剤を含む溶液との接触の後の細胞の培養は、細胞を包埋する滴塊状ゲルと培地とを接触させて行うが、接触させる培地は、好ましくは液体培地である。接触させる液体培地としては、線維芽細胞の増殖を抑制する点で、もしくは線維芽細胞の機能を維持、発現させる点で無血清培地が好ましい。液体培地との接触は、滴塊状ゲルが乾燥して平坦な乾燥物にならないように、液体培地によって滴塊状ゲルの全体を覆うことによって行うことが好ましい。培養を行う期間は、例えば、１〜１０日間、好ましくは、３〜８日間である。液体培地に接触させる滴塊状ゲルは、薬剤を含む溶液との接触の後、洗浄によって、薬剤を洗浄除去したものであってもよい。
【００３４】
薬剤評価は、細胞を包埋する滴塊状ゲルと培地を接触させて、培養を行い、培養の結果を評価することを含んでよい。この培養の結果の評価は、例えば、培養前後における生存細胞の数を比較することや、薬剤を添加して培養したときの生存細胞の数と薬剤を添加しないで培養したときの生存細胞の数を比較することによって行われる。生存細胞の数の計測は、顕微鏡による目視観察によって行うことができる。また、生存細胞の数の計測は、生細胞を選択的に染色する染色法を行い、染色による発色を測定することによって行ってもよい。生細胞を選択的に染色する染色法としては、ニュートラルレッド染色法などの細胞の食作用を利用した染色法、ラテックス粒子染色法、フルオレセインジアセート染色法などの細胞内の酵素活性を利用した染色法、その他の蛍光試薬を用いた染色法などが挙げられる。染色後の細胞は、ホルマリン固定などによって固定してもよい。これにより、染色剤の溶出を一時的に防止して、感度の高い染色を行うことができる。染色後の滴塊状ゲルは、乾燥させてもよい。これにより、変質や劣化を防ぐことができる。滴塊状ゲルの乾燥は、例えば、風乾や、１０〜５０℃程度の加熱による強制乾燥などによって行うことができる。染色による発色の測定は、染色後の滴塊状ゲルを、撮影し、撮影した画像を数値化して評価することによって行ってもよい。数値化後の評価は、染色された細胞の画像の形状に基づく数値の補正を含んでもよい。がん細胞は、塊状でしかも濃い画像をなし、線維芽細胞は、細い線維状で淡い画像をなす傾向があり、塊状の染色像の数値を選択する補正を行うことによって、生存するがん細胞を、より正確にかつ簡便に検出することができる。
【００３５】
この培養の結果の評価の他の方法は、例えば、培養前後や薬剤接触の有無における細胞の遺伝子発現変動を比較することによって行われる。遺伝子発現変動は、培養後の細胞内のｍＲＮＡ発現について、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法やＤＮＡチップを用いた方法など公知の方法によって解析することによって行うことができる。対象とする遺伝子としては、すべての遺伝子を比較してもよいし、薬剤のターゲットとなる分子やその機能に関わるもの、薬剤の代謝に関わるもの、細胞周期、細胞の生存や死に関わるものなどを個別にもしくは組み合わせて比較してもよい。遺伝子の解析に必要な薬剤を培養中に滴塊状ゲルに添加してもよい。
【００３６】
また、他の方法は、例えば、培養前後や薬剤接触の有無における細胞が発現している細胞表面抗原や受容体タンパク質、薬剤代謝酵素などのタンパク質を比較することによって行われる。タンパク質の検出には、免疫染色法やＥＬＩＳＡ法、酵素活性測定法など公知の技術を用いることができる。また、培養後の滴塊状ゲルを回収し固定、包埋した後、病理標本を作製し、免疫組織染色法によって比較してもよい。タンパク質の解析に必要な薬剤を培養中の滴塊状ゲルなどの培地に添加してもよい。
【００３７】
また、他の方法は、例えば、培養前後や薬剤接触の有無における細胞の有する変異遺伝子を比較することよって行われる。変異遺伝子の検出には、ＰＣＲやＤＮＡシークエンスなどの公知の遺伝子解析方法や、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションなど公知の技術を用いることができる。変異遺伝子の解析に必要な薬剤を培養中の滴塊状ゲルに添加してもよい。
【００３８】
本発明の組成物を用いた細胞の取得方法、および細胞の培養結果の評価方法は、本発明の組成物を含むキットを用いて行ってもよい。キットは、本発明の組成物のほか、コラーゲン溶液、および液体培地を含んでもよい。キットに含んでもよいコラーゲン溶液は、生体組織由来の試料から取得した細胞と混合して、滴塊状ゲルを作製するために用いられる。コラーゲン溶液に含まれるコラーゲンとしては、例えば、酸可溶性のタイプＩ型コラーゲンあるいはタイプＩＶ型コラーゲン、または、ペプシン可溶性のタイプＩ型コラーゲンあるいはタイプＩＩＩ型コラーゲンなどが挙げられる。キットに含んでもよい液体培地は、滴塊状ゲルにおいて細胞を培養するためのものである。液体培地は、濃縮培地であってよい。濃縮培地としては、例えば、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｄ−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＭＣＤＢ−１３１、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｍｅｄｉｕｍ−１９９などの哺乳類細胞培養基本培地が挙げられる。
【００３９】
さらに、キットは、再構成緩衝液を含んでよい。再構成緩衝液は、酸可溶性コラーゲン溶液を中和し、滴塊状ゲルを固化する。再構成緩衝液としては、例えば、ｐＨ７〜１０に調整した水酸化ナトリウム水溶液などが挙げられる。また、キットは、生体組織由来の試料を播種して培養する支持体を含んでよい。支持体の例としては、コラーゲン・ゲル・フラスコ、培養支持体用チューブなどが挙げられる。培養支持体用チューブとしては、チューブ容器の一部を容器の中心軸に対して緩やかな角度を有するように裁断した形であって表面積が０．０１〜２５．０ｃｍ２であるその平坦な裁断面を支持体とし該支持体の表面が細胞を接着させ培養する部分となっている平底チューブ容器などが挙げられる。キットは、滴塊状ゲルにおいて細胞を培養するための液体培地のほかに、支持体上の培養に用いる培地を含んでよい。支持体上の培養に用いる培地としては、生体組織由来の動物細胞に対する増殖作用および生理活性維持作用を有するとともに細菌に対する殺作用および／または増殖抑制作用を有する培養液が挙げられる。具体的には、例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２あるいはＤ−ＭＥＭ、または、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２混合液に牛胎児血清（ＦＢＳ）を５〜２０％となるように添加したものや、さらに各種成長増殖因子を加えたものなどが挙げられる。これらの培地は、抗生物質を含んでよい。
【００４０】
また、キットは、細胞の培養結果を評価するための細胞染色剤を含んでよい。細胞染色剤としては、例えば、ニュートラルレッドなどの細胞の食作用を利用した染色剤が挙げられる。ニュートラルレッドは、ライソゾームへの貪食作用を利用した細胞生活性との相関性が高い点で、好ましい。キットは、上記構成物品以外にも、他の構成物品を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
試験例１  抗がん剤感受性試験：
以下の試験例において、特に記載がない場合には、抗がん剤感受性試験は、以下の手順に従って行った。
【００４３】
１．検体洗浄：
がん患者における胃がん、大腸がん、膵臓がんなどの消化器がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、がん性胸・腹膜炎、子宮頚がん、子宮体がん又は卵巣がんなどの固形がん組織から検体を摘出する。以下の方法により、検体表面に付着する雑菌を取り除く。まず、１０ｃｍディッシュを３枚用意し、それぞれ抗生剤を加えた培地溶液（検体洗浄液）を２０ｍＬずつ入れる。検体を１枚目のディッシュの検体洗浄液中にて、検体表面を十分に濯ぎ洗いする。検体を２枚目、および３枚目のディッシュに移行させて、洗浄作業を行う。用いた検体洗浄液は、ＤＦ培養液（ＤＦ：ダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥ）培養液１容とＨａｍ’ｓＦ１２培養液１容の混合培養液）にペントシリン（富山化学社製、ペントシリン注射用）をベースメディウムに対して終濃度１ｍｇ／ｍＬ、カナマイシン（明治製菓製、硫酸カナマイシン注射液）を、ベースミディウムに対して終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、アンポテリシンＢ（和光純薬社製）を、終濃度２．５μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
【００４４】
２．組織の細切処理：
洗浄を行った検体を新しいディッシュに移し、ディッシュ上で、ハサミおよびピンセットを用いて、検体としての腫瘍組織を３〜５ｍｍ角程度となるよう手早く細切を行う。
【００４５】
３．組織のミンス処理：
細切処理を行った検体を、ディッシュ上で、持針器に挟んだカミソリ刃を用いて、細切した腫瘍組織をペースト状となるまでミンスを行う。ミンスした腫瘍組織にＤＦ培養液を２０ｍＬ加え、ＤＦ培養液とともに組織を５０ｍＬ遠心管へ回収する。さらにＤＦ培養液を１０ｍＬ加えて、培養皿に付着した組織を十分に回収する。卓上型遠心機にて４００×ｇにて３分間の遠心を行う。
【００４６】
４．組織分散：
遠心後、アスピレーションにより上清を除去する。遠心後の沈渣へＤＦ培養液を９ｍＬ添加し、遠沈管を振り混ぜて組織片をよくほぐす。酵素組成物に応じて１０％ＦＢＳ（ＦＢＳは牛胎児血清）を添加してもよい。処方濃度の１０倍濃度に調整した細胞分散用酵素組成物を１ｍＬ添加し、処方濃度の細胞分散溶液を調整する。３７℃恒温器内で１〜２時間程度、攪拌振盪を行う。
【００４７】
５．回収：
ＤＦ培養液を１０ｍＬ加えて２０ｍＬとし、４００×ｇにて３分間の遠心を行い、上清を除去する。上清を除去後、遠心管を軽く振り細胞集塊をほぐし、培地を１０ｍＬ添加した後、強くピペッティングを行い、細胞集塊をさらによくほぐす。ポアサイズ３００μｍのナイロンメッシュを用いて、細胞を含む懸濁液をろ過する。ＤＦ培養液を１０ｍＬ加え、遠心管とナイロンメッシュを十分に共洗いする。
【００４８】
６．予備培養：
回収処理で得た、細胞を遠心回収し、上清を吸引除去する。プライマスターキット（倉敷紡績株式会社製）の予備培養培地（ＰＣＭ−１）５ｍＬへ遠心後の細胞沈渣を懸濁させる。細胞を懸濁したＰＣＭ−１培養液を、コラーゲン・ゲル・フラスコ内へ播種する。ＣＯ２インキュベーター内に静置し、一晩培養を行う。一晩培養後、血球や不要細胞成分などを含む培養液を吸引除去する。コラーゲン・ゲル・フラスコへの腫瘍細胞の生着が観察される。
【００４９】
７．細胞回収：
コラーゲン・ゲル・フラスコ内の培養液を吸引除去し、ＤＦ培養液を５ｍＬ加えて洗浄後、ＤＦ培養液２ｍＬ加える。さらに、処方濃度の１０倍濃度に調整した細胞分散用酵素組成物を０．２ｍＬ添加して、処方濃度の酵素溶液を調整する。３７℃で１５〜３０分間振盪を行い、フラスコ内のコラーゲン・ゲルを溶解させる。コラーゲン・ゲル・フラスコから剥離した細胞を５０ｍＬ遠心管へ回収する。なお、フラスコへの細胞接着を認める場合、ＥＤＴＡ−トリプシン３ｍＬを加えて５分間振盪する。細胞の剥離を確認した後、１０％血清培地５ｍＬを加えてフラスコ内をよく共洗し、５０ｍＬ遠心管へ回収する。ＤＦ培養液を１０ｍＬ加えた後、細胞を遠心回収する。
【００５０】
８．包埋：
上清を除去し、遠心後の沈渣へ２ｍＬのＥＤＴＡ−トリプシン溶液を加えて３〜７分間処理した後、１０％血清培地を１０ｍＬ加えてピペッティングを行い、ポアサイズ１００μｍのナイロンメッシュで細胞懸濁液をろ過する。ＤＦ培養液を１０ｍＬ加え、遠心管とナイロンメッシュを十分に共洗いする。ろ液を遠心後、上清を吸引除去し、細胞を回収する。回収した細胞にコラーゲン溶液を混ぜる。細胞を混ぜたコラーゲン溶液を氷冷し、マイクロピペットを用いて、３０μＬ／ｄｒｏｐとなるよう、プレート上に１ウェルあたり３ｄｒｏｐずつ滴下する。３７℃のＣＯ２インキュベーター内にて１時間静置し、コラーゲン・ドロップをゲル化させる。ゲル化後、１０％ＦＢＳを含むＤＦ培地を３ｍＬ／ウェルずつ重層する。無血清培地（ＰＣＭ−２）でも良い。培地を重層した後、ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養を行う。
【００５１】
９．薬剤接触：
一晩の培養後に、所定の濃度になるように濃縮薬剤液を培地に添加混合する。ＣＯ２インキュベーター内で薬剤に応じて定められた時間の接触培養を行う。
【００５２】
１０．薬剤除去および培養：
薬剤接触終了後に培養液を吸引除去し、プライマスターキット（倉敷紡績株式会社製）の無血清培地（ＰＣＭ−２）を各ウェルに４ｍＬずつ重層し、以後５日間無血清培養を行う。
【００５３】
１１．評価：
無血清培養後、ニュートラルレッド（ＮＲ）溶液を各ウェルに４０μＬずつ添加する。ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベーションを行い、細胞染色を行う。ニュートラルレッド染色後は、染色液を含む培養液を吸引除去する。培養液を除去後、１０％中性ホルマリン溶液を４ｍＬずつ添加し、室温で約１時間、細胞固定を行う。細胞固定後、中性ホルマリン溶液を除去する。培養プレートを水道水に浸漬させ、２０分間、水洗を行う。水洗後、プレートの水分をよく切り、送風乾燥させる。ニュートラルレッド固定した細胞の画像解析処理を行う。画像解析処理は、特開平１０−１１５６１２（癌細胞の定量測定方法）に開示している画像解析処理方法を用いる。
【００５４】
試験例２
市販されているコラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼを混合して、トリプシン活性およびコラゲナーゼ活性が以下の表１に示すとおりの実施例１および比較例１の組成物を調製した。調製した組成物を、試験例１の４．の組織分散に用いた。
【００５５】
【表１】
2015092852.tif 000002
【００５６】
実施例１および比較例１の組成物のコラゲナーゼ活性は、以下のＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定した。
【００５７】
１．ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法：
以下の方法は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のウェブサイトに掲載されている（http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-collagenase-using-n-3-2furylacryloyl-leu-gly-pro-ala.html）。
（１）略語：
【表２】
2015092852.tif 000003
（２）原理：
コラゲナーゼの作用によりＦＡＬＧＰＡがＦＡＬとＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａに分解されるときのＦＡＬＧＰＡ由来の３４５ｎｍ吸光度（Ａ３４５ｎｍ）の減少変量を測定して活性を算出する。
【００５８】
（３）方法：
ａ．試薬：
（ａ）  試薬Ｂ  ５０ｍＭトリシン、１０ｍＭＣａＣｌ２、４００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５（２５℃）緩衝液：
トリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ０３７７）０．８９６ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ９８８８）２．３４ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ３８８１）０．１４７ｇを蒸留水８０ｍＬに溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２５６７）、または１Ｍ  ＨＣｌ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３１６２）にてｐＨ７．５（２５℃）に調整後、蒸留水で１００ｍＬにする。
（ｂ）  試薬Ｃ  １．０ｍＭ  Ｎ−（３−［２フリル］アクリロイル）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＦＡＬＧＰＡ）：
ＦＡＬＧＰＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ５１３５）９．６ｍｇをＡの溶液２０ｍＬに添加し、３０分以上撹拌して完全に溶解する。
（ｃ）  試薬Ｄ  蒸留水：
（ｄ）  試薬Ｅ  酵素溶液：
使用時の５〜１０倍濃度になるように、酵素を蒸留水に溶解する。
ｂ．条件：
反応液ｐＨ＝７．５、反応温度＝２５℃、吸光度＝Ａ３４５ｎｍ、光路長＝１ｃｍ
ｃ．反応液の試薬組成および操作：
【表３】
2015092852.tif 000004
試薬Ｂ  ２．９ｍＬを１ｃｍ光路長のセルに入れ、２５℃に加温する。Ａ３４５ｎｍが安定したら試薬Ｃ（空試験）もしくは試薬Ｄ（本試験）を０．１ｍＬ添加、直ちに混合し２５℃でＡ３４５ｎｍの低下を５分間記録する。
【００５９】
（４）活性単位の定義と算出方法
前記の条件下、ｐＨ７．５、２５°Ｃ、カルシウムイオンの存在下で１分間に１．０μｍｏｌｅのＦＡＬＧＰＡを加水分解する酵素量を１ＦＡＬＧＰＡ  ｕｎｉｔとする。ＦＡＬＧＰＡ  ｕｎｉｔは、以下の式によって求められる。
ＦＡＬＧＰＡ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＝  ｛（Ｅ１−Ｅ２）×３／（Ｆ×０．１）｝／０．５３
【００６０】
上記の式中の記号または数値は、以下を示す。
【表４】
2015092852.tif 000005
【００６１】
実施例１および比較例１の組成物のトリプシン活性は、以下のＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法によって測定した。
【００６２】
２．ＢＡＥＥ加水分解活性測定の方法：
以下の方法は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のウェブサイトに掲載されている（http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin.html）。
（１）略語：
ＢＡＥＥ  ＝  Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチル塩酸塩
（２）原理：
トリプシンの作用によりＢＡＥＥがＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンとエタノールに加水分解されるときの２５３ｎｍ吸光度（Ａ２５３ｎｍ）の増加変量を測定して活性を算出する。
【００６３】
（３）方法：
ａ．試薬：
（ａ）試薬Ａ  ６７ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（２５℃）緩衝液：
リン酸二水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ０７５１）０．８０４ｇを蒸留水８０ｍＬに溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２５６７）にてｐＨ７．６（２５℃）に調整後、蒸留水で１００ｍＬにする。
（ｂ）試薬Ｂ  ０．２５ｍＭ  Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチル塩酸塩：
Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチル塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ４５００）４．３ｍｇをＡの溶液５０ｍＬに添加し溶解する。
（ｃ）試薬Ｃ  蒸留水：
（ｄ）試薬Ｄ  酵素溶液：
使用時の５〜１０倍濃度になるように、酵素を蒸留水に溶解する。
ｂ．条件：
反応液ｐＨ＝７．６、反応温度＝２５℃、吸光度＝Ａ２５３ｎｍ、光路長＝１ｃｍ
ｃ．反応液の試薬組成および操作：
【表５】
2015092852.tif 000006
試薬Ｂ  ３．０ｍＬを１ｃｍ光路長のセルに入れ、２５℃に加温する。Ａ２５３ｎｍが安定したら試薬Ｃ（空試験）もしくは試薬Ｄ（本試験）を０．１ｍＬ添加、直ちに混合し２５℃でＡ２５３ｎｍの低下を５分間記録する。
ｄ．活性単位の定義と算出方法：
前記の条件下、ｐＨ７．６、２５℃、反応液量３．２ｍＬ、光路長１ｃｍにおいて、１分間にＡ２５３ｎｍを０．００１上昇させる酵素量を１ＢＡＥＥ  ｕｎｉｔとする。ＢＡＥＥ  ｕｎｉｔは、以下の式によって求められる。
ＢＡＥＥ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＝  （Ｅ１−Ｅ２）／｛０．００１×（Ｆ×０．１）｝
【００６４】
上記の式中の記号または数値は、以下を示す。
【表６】
2015092852.tif 000007
【００６５】
試験例３  酵素消化能の比較：
消化能を評価するため豚皮を用いて、実施例１の組成物と比較例１の組成物について、豚皮の消化効率を比較した。具体的には、細かくした豚皮に実施例１または比較例１の組成物０．１ｍＬと１０％ＦＢＳ入りＤＦ培地０．９ｍＬを混合し、３７℃で振蕩し、豚皮の大きさを観察した。０時間と２時間後の状態を図１に示す。
図１に示すように、実施例１の組成物においては、比較例１の組成物よりも良い消化結果が得られた。
【００６６】
試験例４
実施例１の組成物または比較例１の組成物を用いて、胃がん１０検体、および大腸がん１０検体のがん組織の消化反応を行い、未分解残渣量を目視確認して比較評価した。結果を以下の表７に示す。以下の表７において、実施例１は、実施例１の未分解残渣量が比較例１の未分解残渣量よりも少なかった検体の数を示し、比較例１は、比較例１の未分解残渣量が実施例１の未分解残渣量よりも少なかった検体の数を示す。同程度は、両者の未分解残渣量に大差がなかった検体の数を示す。
【００６７】
【表７】
2015092852.tif 000008
表７に示すように、実施例１の組成物は、比較例１の組成物と比較して、胃がん組織、および大腸がん組織に対して非常に優れた消化性を示した。このように、実施例１の組成物は、がん組織の種類によらずに、高い消化性を示した。
【００６８】
試験例５  株化細胞に対する細胞毒性の比較：
結腸がん由来のＨＣＴ−１１６細胞と肺がん由来のＰＣ−１４細胞を用いて、実施例１または比較例１の組成物による細胞毒性を比較した。具体的には、実施例１または比較例１の組成物に、約５０万個／ｍＬのＨＣＴ−１１６細胞またはＰＣ−１４細胞の懸濁液（１０％ＦＢＳ入りＤＦ培地）を混合し、３７℃でインキュベーションし、２時間おきに細胞数を確認した。
結果を図２に示す。図２は、０時間の細胞数を１００％とした細胞数％を縦軸にグラフにしたものである。図２に示すように、ＨＣＴ−１１６細胞については、実施例１の組成物の場合も、比較例１の組成物の場合も、酵素なしと同様に、細胞の増減はほとんどなかった。ＰＣ−１４細胞では、酵素なしでは細胞が増加し、実施例１の組成物の場合も、比較例１の組成物の場合も、わずかに細胞が増加し、初期細胞数を下回ることは認められなかった。このように、実施例１の組成物および比較例１の組成物は、細胞毒性に大差がなく、実施例１の組成物は、比較例１の組成物とほぼ同程度に細胞毒性が低かった。
【００６９】
試験例６
実施例１の組成物および比較例１の組成物を用いて、試験例１の２〜７に記載の方法によってがん組織からがん細胞を回収し、得られた癌細胞を試験例１の８および１０に記載の方法によって７日間コラーゲン・ゲル・ドロップ包埋培養した。培養翌日および培養７日後の細胞のニュートラルレッド（ＮＲ）による染色像を図３に示す。
図３に示すように、比較例１の組成物を用いた場合には、７日間の培養による増殖率は、３．５倍であったが、実施例１の組成物を用いた場合には、増殖率は、４．５倍であった。このように、実施例１の組成物を用いた場合には、比較例１の組成物を用いた場合よりも、コラーゲン・ドロップ中での培養に適した細胞が得られた。
【００７０】
試験例７  細胞回収量：
大腸がん、胃がん、肺がん組織を試験例１の２、３に記載の方法によってペースト状にした後２群に分割し、それぞれを実施例１の組成物または比較例１の組成物を用いて、試験例１の４、５に記載の方法によって癌細胞を回収し、試験例１の６に記載の方法にて一晩予備培養した後、試験例１の７に記載の方法にて細胞を回収し、生細胞数をトリパンブルー染色法にて測定した。測定した細胞数を以下の表８−１〜表８−３に示す。表８−１〜表８−３中、組織の重量は、細胞を回収するために用いたがん組織の１群あたりの重量を示す。回収細胞数比較は同一検体の実施例１の細胞数を比較例１の細胞数で除した値を示す。回収したペースト状の組織片中の細胞数と異なり、予備培養直後の細胞数を測定することにより、損傷を受けていない細胞の数を、より正確に測定することができる。
【００７１】
【表８−１】
2015092852.tif 000009
【表８−２】
2015092852.tif 000010
【表８−３】
2015092852.tif 000011
回収細胞数の相対的差異が２５%未満を同程度、２５%以上を一方が他方に対して多いとすると、表８に示すように、実施例１の組成物を用いた場合においては、比較例１の組成物を用いる場合よりも同程度もしくは多数の細胞をがん組織から回収することができた。
【００７２】
試験例８
１０被検体の胃がん組織、１０被検体の大腸がん組織、６被検体の肺がん組織、２被検体の乳がん組織および２被検体の膵臓がん組織から、実施例１の組成物または比較例１の組成物を用いて、試験例１の１〜５に記載の方法によって、がん細胞を回収した。回収したがん細胞を、コラーゲン・ゲル・フラスコ（倉敷紡績株式会社製）を用いて、試験例１の６に記載の方法によって予備培養した。予備培養後、試験例１の７に記載の方法によって、コラーゲン・ゲル・フラスコから細胞を回収した。回収した細胞の数を測定し、実施例１の場合と比較例１の場合の比較を行った。結果を、以下の表９に示す。表９中、実施例１は、実施例１の場合の回収細胞数が比較例１よりも２５%以上多かった被検体の数を示す。比較例１は、比較例１の場合の回収細胞数が実施例１よりも２５%以上多かった被検体の数を示す。同程度は、実施例１と比較例１の回収細胞数の相対的差異が２５%未満の被検体の数を示す。
【００７３】
【表９】
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表９に示すように、実施例１の組成物を用いた場合には、４種のがん細胞の全てについて、比較例１の組成物の場合と同等以上の細胞数を確保できた。また、実施例１の組成物を用いて回収する場合には、比較例１の組成物を用いる場合よりも、コラーゲン・ゲル・フラスコからの細胞回収時にフラスコに付着残存する細胞が少なく、効率的な回収作業ができた。
乳がんの組織からのがん細胞の回収の場合には、実施例１の組成物を用いた場合よりも、比較例１の組成物を用いた場合のほうが、酵素反応後の未分解残渣量は少なかった。しかしながら、コラーゲン・ゲル・フラスコからの細胞の回収量は、実施例１の組成物の場合のほうが多かった。このことから、実施例１の組成物は、乳がん組織を完全に消化させなくても、乳がん組織からがん細胞を露出させることができ、乳がん組織からがん細胞を効率的に回収することができると考えられる。
このように実施例１の組成物を用いた場合には、比較例１の組成物の場合よりも、がん細胞を、がんの種類によらずに効率的に回収することができた。
【００７４】
試験例９
培養細胞株として、結腸がん由来ＨＣＴ−１１６と肺がん由来ＰＣ−１４の２種類を用いて、培養細胞株の増殖性に関する実施例１の組成物および比較例１の組成物の影響を検証した。具体的には、比較例１または実施例１の組成物を含む酵素液に細胞株を２時間インキュベーションした後、試験例１の８および１０の工程によって、コラーゲン・ドロップ包埋培養を実施し、２４、４８、１２０時間後の細胞増殖性を検証した。
結果を図４に示す。図４に示すように、酵素未処理の場合、比較例１の場合、実施例１の場合において、細胞増殖性に相違は認められなかった。このように、実施例１の組成物を用いることにより、滴塊状ゲルにおいて好適な増殖性を示す細胞を取得することができた。
【００７５】
試験例１０  培養細胞を用いた抗がん剤感受性試験：
組織消化を想定して、結腸がん由来のＨＣＴ−１１６と肺がん由来のＰＣ−１４の細胞に、実施例１または比較例１の酵素組成物を２時間接触させた後、試験例１の方法によって抗がん剤感受性試験（ＣＤ−ＤＳＴ法）を行い、画像解析値を求めて、各種の薬剤感受性を比較した。
結果を図５に示す。図５中のＴ／Ｃ率（％）は、各薬剤濃度における１２０時間後の画像解析値を、薬剤なしの画像解析値で割った値である。未処理は、酵素液の処理をしない細胞を用いた場合の実験結果を示す。図５に示すように、ＨＣＴ−１１６、およびＰＣ−１４のいずれの細胞でも、実施例１の組成物を用いた場合において、５−ＦＵ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、およびＳＮ−３８に対する薬剤感受性は、比較例１の組成物の場合と同程度であった。また、ドセタキセルおよびオキサリプラチンについても、同様に、薬剤感受性を調べたところ、実施例１の組成物の場合、比較例１の組成物の場合、および未処理の場合において、薬剤感受性は、同程度であった。このように、実施例１の組成物を用いることにより、５−ＦＵ、ＣＤＤＰ、ＳＮ−３８、ドセタキセルおよびオキサリプラチンなどの各種抗がん剤に対して同等の薬剤感受性を示す細胞を得ることができた。
【００７６】
試験例１１
大腸がん細胞について、試験例１０と同様の方法によって求めた実施例１または比較例１を用いた場合のＴ／Ｃ（％）値の１対１プロットを行った。結果を図６に示す。
図６に示すように、プロットデータからは傾き１で高い相関性を認める回帰直線が得られた。このことから、大腸がんにおいては実施例１の組成物と比較例１の組成物とで同等の薬剤感受性評価ができるといえる。
【００７７】
試験例１２  抗がん剤感受性試験（ＣＤ−ＤＳＴ法）の成功率：
実施例１の組成物または比較例１の組成物を用いて、試験例１の方法によって、抗がん剤感受性試験（ＣＤ−ＤＳＴ法）を実施した。ＣＤ−ＤＳＴ法の実施は、それぞれ複数の被検体に対して行った。
その結果、一部の被検体の場合は、ＣＤ−ＤＳＴ法を完了できなかった。完了できなかった原因は、コロニー状のがん細胞増殖を認めず、画像解析による有効な数値データが得られなかったことにある。このような問題がなく、感受性試験の解析ができた被検体の数を、成功数とした。実施した被検体の数である実施数に対する成功数の割合を、成功率（％）とした。成功率などの数値結果を以下の表１０に示す。
【００７８】
【表１０】
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表１０に示すように、実施例１の組成物を用いる場合には、いずれのがんの種類についても、高いＣＤ−ＤＳＴ法の成功率が得られた。このことから、実施例１の組成物は、感受性試験に適した態様のがん細胞を回収するために有益であることが分かる。
【００７９】
試験例１３  胃がん症例のコラーゲン・ゲル・ドロップ培養細胞染色像の比較：
試験例１２のうち、胃がんの場合において、培養の結果、がん細胞の増殖が認められた３つの被検体について、増殖後の細胞のニュートラルレッドによる染色像を図７に示す。
図７に示すように、検体１については、実施例１のほうが濃染色されるがん細胞の増殖が良好であった。一方、比較例１は、画像解析による有効な数値データが得られず、ＣＤ−ＤＳＴ法が遂行しなかった。実施例１の場合には、より多くの細胞を回収することができたことも要因の一つと考えられる。
検体２、３については、同程度の細胞数を播種したが、１４４時間培養後の濃染色されるがん細胞の増殖性は、実施例１のほうが良好であった。検体２の比較例１の場合には、画像解析による有効な数値データが得られず、ＣＤ−ＤＳＴ法が遂行しなかったが、検体２の実施例１では有効な数値データが得られ、ＣＤ−ＤＳＴ法が完遂した。
以上のように、実施例１の組成物を用いた場合には、胃がん、大腸がん、乳がんなどの各種のがん組織から、抗がん剤感受性試験に適した態様で増殖する好適な細胞が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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