(57)【要約】  【課題】天然物由来成分であり、日常生活において、その摂取により効果が期待できる、安全でかつ効果的なインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤を提供する。  【解決手段】緑豆蛋白質を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤が提供される。緑豆蛋白質は８Ｓαグロブリンであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とする、インスリン抵抗性改善作用を有する食品。
【請求項２】
緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とするインスリン抵抗性改善剤。
【請求項３】
８Ｓαグロブリンを有効成分とすることを特徴とする、請求項２に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項４】
請求項２又は３いずれか１項に記載のインスリン抵抗性改善剤を含有することを特徴とする血中中性脂肪低減剤。
【請求項５】
請求項２又は３いずれか１項に記載のインスリン抵抗性改善剤を含有することを特徴とする血糖値改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン抵抗性改善作用を有する食品、インスリン抵抗性改善剤、並びに該インスリン抵抗性改善剤を含有する血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血中の糖や脂質の濃度を正常に保つに重要な役割を果たすホルモンがインスリンである。インスリンは、その標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織に対して、血中の過剰な糖や脂肪の吸収を促すことで、これらの血中濃度が正常に保たれるのである。インスリン標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリン感受性の低下（インスリン抵抗性の惹起）が様々な程度合わさることでインスリンの作用の低下が起こり、高血糖、脂質異常などの状態となる。これがメタボリックシンドロームである。
【０００３】
膵β細胞はこのインスリン抵抗性を代償するべく、インスリン分泌を増強し高インスリン血症となる。従って一定期間は、境界域での高血糖、脂質異常などの状態を保つことができる。この期間を代償期という。しかしこの状態が続くと、膵β細胞の疲弊・機能不全を来し不全期に陥り、インスリン分泌が低下し脂質異常症、糖尿病などの生活習慣病にまで進行してしまう（非特許文献１）。さらには動脈硬化およびそれに伴って発症する心血管病、脳血管病などの日本人の死因の３割にも達するリスクファクターに繋がる危険がある。
【０００４】
各臓器におけるインスリン作用の程度を表す指標が明らかとなっている。骨格筋では、細胞内に４型糖輸送担体（glucose transporter 4 : GLUT4）が発現しており、インスリンの骨格筋での糖の取り込みの増加は、インスリン刺激による細胞内プールからのGLUT4の形質膜に移動（トランスロケーション）を促されることによって生じる。よって、骨格筋でのGLUT4の膜移行の程度を見ることは、インスリン作用を知るうえで重要な指標となる（非特許文献２）。
【０００５】
肝臓におけるインスリン作用の見極めであるが、ステロール応答配列結合タンパク質(sterol regulatory element-binding protein : SREBP)が、その指標となりうる。SREBPはコレステロール代謝関連遺伝子や脂肪酸合成酵素遺伝子を制御する、細胞内の脂質合成の調節因子であり、３つのアイソフォームが知られている（SREBP-1a, -1c, -2）。このうち、SREBP-1cは脂肪酸やトリグリセリド合成系の酵素群の転写制御を行い、脂肪肝、脂質異常症さらには、これら脂質代謝異常を介して糖尿病と関連している。SREBP-1cが慢性的に活性化されると、脂肪合成の増加とともに細胞内でのインスリン作用の障害、つまりインスリン抵抗性の惹起につながると考えられている（非特許文献３）。
【０００６】
インスリン抵抗性改善剤として、チアゾリジン系薬剤がある。このチアゾリジン系薬剤のうち、ピオグリタゾンを用いた大規模臨床試験としてPRO active studyがあり、この試験ではプラセボ群に対して、ピオグリタゾン群では、インスリン治療を開始した症例は53%へと有意に減少したことが示されている（非特許文献４）。しかしながら、このピオグリタゾンについては、フランスにおいて膀胱がんの発症率を増加させたとの報告があり、米国FDAも膀胱がん患者へのピオグリタゾン投与は禁忌としている。また、同じチアゾリジン系薬剤のロシグリタゾンは、心血管イベントを増加させる可能性があるとして、欧州での販売は中止されている。このように、安全性に優れたインスリン抵抗性改善剤の開発は急務な課題と言える。
【０００７】
他方、８Ｓαグロブリンは、マメ科の一年生植物であるヤエナリ（学名：Vigna radiate）の種子である緑豆のタンパク質の主要構成成分である。ヤエナリはインドが原産地で、現在は主に東アジアから南アジア、アフリカ、南アメリカ、オースラリアで栽培されており、もやしや春雨の原料となるほか、餡、粥といった料理の材料として、アジアを中心に全世界で食されている。また、漢方薬のひとつとして、解熱、解毒、消炎作用があるとされているが、インスリン抵抗性、さらにそれに起因する脂質代謝や糖代謝の改善効果については、これまでに全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】春日雅人(2012)：糖尿病の成員と病態、春日雅人編「糖尿病学イラストレイテッド」、pp24-20, 羊水社、東京
【非特許文献２】Kono T et al, J.Biol.Chem., 257, 10942-10947 (1982)
【非特許文献３】Shimano H et al, Prog.Lipid Res., 40, 439-452 (2001)
【非特許文献４】Dormandy J A et al, Lancet, 366, 1279-1289 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的なインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、日常生活で摂取する食品素材の血中インスリン濃度に及ぼす関係について検討した結果、緑豆の貯蔵タンパク質である８Ｓαグロブリンが、良好なインスリン抵抗性改善効果、血中中性脂肪低減効果および血糖値改善効果を有することを見出し、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明の第一は、緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とする、インスリン抵抗性改善作用を有する食品を要旨とするものであり、本発明の第二は、緑豆蛋白質を有効成分とすることを特徴とするインスリン抵抗性改善剤を要旨とするものであり、また、本発明の第三は、その８Ｓαグロブリンを有効成分とすることを特徴とするインスリン抵抗性改善剤を要旨とするものである。本発明の第四は、前記したインスリン抵抗性改善剤を含有することを特徴とする血中中性脂肪低減剤を要旨とするものであり、本発明の第五は、前記したインスリン抵抗性改善剤を含有することを特徴とする血糖値改善剤を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的なインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤を提供することができ、その摂取により、近年問題となっているメタボリックシンドロームやそれが進行することによって発症に至る、糖尿病や脂質異常症といった生活習慣病の改善に極めて有用なものとなる。
【００１３】
すなわち、本発明により提供される安全かつ効率的なインスリン抵抗性改善剤の摂取により、高いインスリン値が非摂取に対して有意に低下することが期待できる。さらにそれぞれ高値であった血糖値（空腹時血糖値）および中性脂肪値が、それぞれの正常域（血糖値；70〜109 mg/dl、中性脂肪；30〜149 mg/dl）の範囲にまで低下することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】８Ｓαグロブリン添加による糖取り込み活性の図である。尚、a,b,cは、異なる記号間で有意差（p＜0.05, Tukey HSD）の存在を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のインスリン抵抗性改善剤に用いられる緑豆蛋白質とは、ヤエナリの種子である緑豆に含有されるタンパク質である。これらの中でも、主に発芽時の栄養源として利用される、種子組織の液胞中に蓄積された貯蔵タンパク質が好ましい。中でも、これら緑豆貯蔵タンパク質の主成分である８Ｓαグロブリンは、本効果を強く示すものであり、対象として最も好ましい。タンパク質の抽出方法や素材中における含量は、特に限定されるものではない。素材としての摂取量を抑える意味では、緑豆よりタンパク質を高純度で抽出することが好ましく、得られたタンパク質中に８Sαグロブリンが高純度で存在することが好ましい。
【００１６】
８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質の抽出するに当たり、ヤエナリのさやから取り出した緑豆をそのまま使用することができる。
【００１７】
８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を抽出する条件としては、原料である緑豆に対して水を３〜10倍量投入し、20〜60℃、pH６〜９の条件で２〜18時間、静置あるいは撹拌処理を行い、原料を磨砕しながら皮や繊維分を除去し、さらに沈殿するデンプンを除くことでタンパク質溶液を得る手法を例示することができる。
【００１８】
この溶液をそのまま殺菌・乾燥してもよいが、好ましくは、この溶液のpHを４〜５に調整して、タンパク質を等電点沈殿させ、この沈殿物を回収して、必要に応じてpHを調製し、殺菌することで、高純度の８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を抽出することができる。
【００１９】
本発明のインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤は、上記した８Ｓαグロブリンが有効量含有していればよく、その含有量は、後述した摂取量を考慮して適宜設定することができる。
【００２０】
本発明のインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤としては、粉末、顆粒、固形物、半流動物、流動物、液状物の形態で用いることができる。
【００２１】
医薬として用いる場合、投与方法としては経口投与用医薬が好ましい。具体的には散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。これら経口投与剤は、その形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤等を添加し、常法に従って製造することができる。これら経口投与剤への配合量は、一般に0.1〜100重量%、特に５〜80重量%が好ましい。また、投与量は、上記８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１〜１０ｇを、２〜数回に分けて投与するのが好ましい。
【００２２】
食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が挙げられる。かかる食品は、食品の種類に応じて一般に用いられる食品原料を添加し、常法に従って製造することができる。上記８Ｓαグロブリンの食品への配合量は、食品の種類によっても異なるが、一般に０．１〜１００％、特に５〜８０％が好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下に、本発明の有効性を実施例とともに示すが、これら例示によって本発明の技術思想が限定されるものではない。
○製造例１
緑豆を粉砕機にて粉状に粉砕した。粉砕緑豆粉に対して10倍量の50℃の温水を加え、随時pHを7.0に調整しながら１時間撹拌した。遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）し、得られた上澄液をpH5.0に調整して、再度遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）して得られた沈殿物を回収、加水後、pH7.0に中和して殺菌し、噴霧乾燥したものを８Ｓαグロブリンとした。このようにして得られた８ＳαグロブリンをSDS-ポリアクリルアミノゲル電気泳動に供し、その後タンパク質を染色し、全染色域の合計に対して、８Ｓαグロブリン由来のタンパク質として分子量48 kDaをメインに、72, 60, 26 kDaのタンパク質のバンドの染色度の測定から、純度として84.9%あり、以下の検討に十分耐えうる純度であることを確認した。
【００２４】
○製造例２
緑豆の表面を水洗浄後、１０倍量の水に一晩浸漬した。浸漬物を80メッシュの裏漉し器のついた磨砕装置に供し、皮と粗繊維を分離後、通過懸濁液を得る。懸濁液を遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）し、得られた上澄液をpH5.0に調整して、再度遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）して得られた沈殿物を回収、加水後、pH7.0に中和して殺菌し、噴霧乾燥したものを８Ｓαグロブリンとした。このようにして得られた８Ｓαグロブリンを上記同様にSDS-ポリアクリルアミノゲル電気泳動に供し、その後染色されたタンパク質のバンドの染色度の測定から、純度として82.6%あり、以下の検討に十分耐えうる純度であることを確認した。
【００２５】
○試験例１
ラットによるインスリン抵抗性改善効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として20重量%含んだものを用いた。具体的配合を下記表１に記す。
【００２６】
（表１）各試験群の飼料組成
2015059088.tif 000002
【００２７】
実験動物は、５週齢雄のウィスター系雄ラットを日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で４週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５%で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
【００２８】
４週間の試験期間内の飼料摂取量と体重の増加量を毎日測定した。下表2に結果を示す。
【００２９】
（表２）飼料摂取量と体重の推移
2015059088.tif 000003
【００３０】
食餌摂取量は８Ｓαグロブリン群が少ないものの、有意差は認められなかったが、試験終了時の体重および体重増加量は、８Ｓαグロブリン群で有意に低値であった。
【００３１】
試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。血液から遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、血糖値、インスリンおよび中性脂肪を測定した。得られた血糖値とインスリン値よりインスリン抵抗性指数（HOMA-IR：Homeostasis model assessment-Insulin Resistance）を算出した。その結果を表３に示す。
【００３２】
（表３）血糖値とインスリン値およびインスリン抵抗性指数の比較
2015059088.tif 000004
【００３３】
血糖値には差が認められなかったが、インスリンが有意に低下し、その結果、HOMA-IRも有意に低値であった。さらに血中中性脂肪値も有意に低下していた。
【００３４】
○試験例２
試験例１同様、ラットによるインスリン抵抗性改善効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として20重量%含んだものを用いた。具体的配合を下記表４に記す。
【００３５】
（表４）各試験群の飼料組成
2015059088.tif 000005
【００３６】
実験動物は、糖代謝機能の低下した糖尿病モデルである５週齢雄のGKラット（Gotoh-Kakizaki rats）を日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で３週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５%で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
【００３７】
３週間の試験期間内の飼料の摂取量と体重の増加量を毎日測定した。下表５に結果を示す。群間に有意な差は認められなかった。
【００３８】
（表５）飼料摂取量と体重の推移
2015059088.tif 000006
【００３９】
試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。血液から遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、血糖値およびインスリンを測定した。得られた血糖値とインスリン値よりインスリン抵抗性指数（HOMA-IR：Homeostasis model assessment-Insulin Resistance）を算出した。各臓器については臓器重量測定後、ドライアイスにて凍結し、-80℃に保管、適宜分析に供した。血液分析の結果を表６に示す。
【００４０】
（表６）血糖値とインスリン値およびインスリン抵抗性指数の比較
2015059088.tif 000007
【００４１】
上記試験にて得られた肝臓について、mRNA発現量の測定は以下のように行った。
肝臓から一定量のサンプルについて、ISOGEN（日本ジーン（株）製）を用いてRNAを抽出した。RNA量測定後、PrimeScriptTM RT reagent kit（タカラバイオ製）を用いて逆転写を行った。得られたcDNAを用いて相対定量RT-PCRを行った。RT-PCRは、Taqman(R)プライマー（アプライドバイオシステムズ製）およびABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムズ製）を用いて行った。増幅サイクルは、95℃/10分のdenaturationを行った後、95℃/30秒→60度/30秒→72度/20秒のサイクルを40サイクル行った。用いたTaqman（R)プライマーは、ターゲットとして、ステロール調節領域結合タンパク質1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，Rn01495769）を、housekeeping geneとしてβアクチン（Actb，Rn00667869）を用いた。測定結果を表７に示す。
【００４２】
（表７）肝臓におけるSREBP-1cの遺伝子発現の比較
2015059088.tif 000008
【００４３】
肝臓におけるインスリン抵抗性惹起に関係あるとされる因子であるSREBP-1cが、８Ｓαグロブリン群で、その遺伝子発現が有意に低下しており、インスリン抵抗性が８Ｓαグロブリン群で押えられていることが裏付けられた。
【００４４】
○試験例３
骨格筋細胞による、糖取り込み試験を行った。８Ｓαグロブリンについては、消化酵素であるペプシン（pH2.0）、トリプシン、キモトリプシン（ともにpH7.0）にてあらかじめ分解した消化８Ｓαグロブリンとして用いた。細胞はラット骨格筋L6細胞を用いた。２×104 cells/mlで96穴マイクロプレートに播種し、100 Units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン含有の10重量%FBSを含むDMEM培地にて前培養を行った。80〜100%コンフルエントに達したことを確認して分化誘導を開始した。分化誘導時は100 Units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン含有の２重量%HSを含むDMEM培地を使用した。培地交換は24時間または48時間ごとに行った。なお培養は、すべて37℃、５容量%CO2条件下で行った。分化誘導確認後、糖取り込み量の測定を行った。
【００４５】
分化したL6細胞を0.2％BSA含有無血清DMEMに作用させ脱感作した。その後、消化８Ｓαグロブリンあるいはコントロールとしてインスリンを37℃にて４時間作用させ、0.1重量%BSA含有KRHで二度洗浄し、1mMの2-Deoxy-D-glucoseを37℃にて20分間作用させた。再度0.1重量%BSA含有KRHで二度洗浄し、0.1N NaOH 50μlを入れて60℃にて10分間インキュベートして細胞を可溶化し、85℃で１時間乾燥させた。その後、0.1N HCl 50μlおよび200mM TEA buffer (pH8.1) 50μlをそれぞれ添加し細胞磨砕液とした。磨砕液のうち10μlを測定用プレートに入れ、測定用カクテル（200mM TEA buffer containing 200mM KCl (pH8.1), 0.4重量% BSA, 10mM NADP, Diaphorase 2units, Lmesenteriodes G6PDH 150units, 2mM Resazurin sodium salt）を100μlずつ添加して、37℃にて60〜80分間インキュベートした後、励起波長530nm、測定波長570nmにて蛍光測定した。測定結果を図1に示す。
【００４６】
骨格筋における血中の糖の取り込みが、インスリン添加同様、８Ｓαグロブリン添加により有意に上昇していた。この結果より、骨格筋において糖の取り込みに関係するGLUT4の形質膜に移動（トランスロケーション）が、８Ｓαグロブリンにより促されていることが裏付けられた。この結果は血糖値の低下を導くものである。
【図１】
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