(57)【要約】【課題】  ＲＴＫに対するチロシンキナーゼ阻害剤の、迅速なハイスループット・スクリーニング系を確立すること。【解決手段】  本発明のＲＴＫのチロシンキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法は、二量体化しているＲＴＫ細胞ドメインが細胞膜に局在して発現し、かつＧタンパク質接合シグナル伝達経路が恒常的に活性化されている形質転換酵母を作製して、かかる酵母に被検物質を添加して、前記接合シグナル伝達の応答を指標として、チロシンキナーゼ阻害活性を評価する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え酵母を用いた受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)におけるチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法が、
恒常的にリン酸化しているチロシン残基を細胞膜近傍領域内に有しているＲＴＫ細胞内ドメイン(ＲＴＫcyto)が細胞膜に局在して発現し、かつ同時に、前記リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質と、単独では細胞膜に局在することができないＧタンパク質γサブユニット変異体とを含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え酵母を用いることを特徴とする方法であって、
前記遺伝子組換え酵母に被検物質を接触させる工程、及び当該酵母におけるＧタンパク質シグナル伝達の応答量の減少もしくは消失を判定する工程を含む方法。
【請求項２】
前記遺伝子組換え酵母が、下記(１)〜(３)の工程により調製されている遺伝子組換え酵母であることを特徴とする、請求項１に記載の方法；
（１）ＲＴＫ細胞内ドメインのいずれかの末端に付加されている細胞膜局在化配列、及びリン酸化し得るチロシン残基を細胞膜近傍領域に有しているＲＴＫ細胞内ドメインを含む第１の融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、
（２）リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質、及び単独では細胞膜に局在することができないＧタンパク質γサブユニット変異体を含む第２の融合タンパク質を発現可能な第２の発現カセットを調製する工程、
（３）前記第１及び第２の発現カセットを酵母宿主に導入し、得られた遺伝子組換え酵母を培養する工程。
【請求項３】
前記工程(１)の「細胞膜局在化配列」が脂質修飾シグナルペプチド、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞膜構造タンパク質結合性ペプチドから選択されたペプチドであって、前記ＲＴＫ細胞内ドメインが有しているリン酸化し得るチロシン残基の位置が、前記「細胞膜局在化配列」が付加している側の最初のアミノ酸残基から数えて３００アミノ酸残基未満のいずれかの位置である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(３)において、第１及び第２の発現カセットの少なくとも一方を酵母宿主に導入する方法が、相同組換えにより染色体中に導入する方法であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子組換え酵母が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属し、選択性マーカーを少なくとも１つ保持する一倍体酵母であって、
当該酵母における被検物質の接触後のＧタンパク質シグナル伝達の応答量の減少もしくは消失を判定する工程が、以下の工程(４)及び(５)を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法；
（４）被検物質接触後の前記組換え酵母を、当該酵母と接合可能な型の野生型一倍体酵母と共に接合体のみが生育可能な選択培地で培養する工程、
（５）培養後の組換え酵母の増殖能の減少もしくは消失を、被検物質を接触させない場合の増殖能との比較により判定する工程。
【請求項６】
前記ＲＴＫが、そのアミノ酸配列内に恒常的に二量体化を引き起こす変異を有するＲＴＫ変異体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程(１)の第１の発現カセットが、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子配列と共に、二量体化ドメインの一方及び他方をコードする遺伝子配列のそれぞれが含まれるように構築された２種類の発現カセットからなることを特徴とする、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＴＫが、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＧＦＲが、そのアミノ酸配列における８３４位ロイシン残基がアルギニン残基に置換されており、恒常的に二量体を形成するＬ８３４Ｒ変異体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アダプタータンパク質がＧｒｂ２である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のスクリーニング方法で用いることのできる遺伝子組換え酵母であって、
恒常的にリン酸化しているチロシン残基を細胞膜近傍領域内に有しているＲＴＫ細胞内ドメインが細胞膜に局在して発現しており、かつ前記リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質と、単独では細胞膜に局在することができないＧタンパク質γサブユニット変異体とを含む融合タンパク質を発現していることを特徴とする、遺伝子組換え酵母。
【請求項１２】
前記遺伝子組換え酵母が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属し、選択性マーカーを少なくとも１つ保持する一倍体酵母であることを特徴とする、請求項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１３】
前記遺伝子組換え酵母が、さらに、シグナル応答性のプロモーター制御下でレポーター遺伝子を発現することが可能な遺伝子組換え酵母であることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１４】
受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)におけるチロシンキナーゼ阻害剤を同定、又はスクリーニングするためのキットであって、請求項１１〜１３のいずれかに記載の遺伝子組換え酵母を含むキット。
【請求項１５】
以下の(ａ)〜(ｃ)を含む請求項１４に記載のキット；
（ａ）請求項１２に記載の遺伝子組換え酵母、
（ｂ）前記酵母と異なる接合型の一倍体酵母、
（ｃ）接合体のみが生育可能な選択用培地。
【請求項１６】
以下の(ａ)及び(ｂ)を含む請求項１４に記載のキット；
（ａ）請求項１３に記載の遺伝子組換え酵母、
（ｂ）前記酵母細胞内でのレポーター遺伝子発現量を測定するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体チロシンキナーゼの細胞内ドメインを酵母で発現させ、該キナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、遺伝子組換え酵母、キット及びコンビネーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体チロシンキナーゼ(以降、「ＲＴＫ」とも表示する)は細胞増殖、分化、生存および代謝を制御する重要な調節因子であり、リガンドと結合するための細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインからなる類似の構造を共有する、約２０種の異なるＲＴＫファミリーが同定されている(非特許文献１)。リガンドの結合は受容体二量体化を誘導または安定化し、キナーゼ活性を増大させることにより、該受容体の細胞内ドメインに存在するチロシン残基の自己リン酸化を誘導する。上記リン酸化チロシン残基はＧｒｂ２，Ｓｈｃ、Ｓｒｃ、Ｃｂ１またはホスホリパーゼＣγのようなＳｒｃホモロジー２(以降、「ＳＨ２」とも表示する)ドメインなどを有するアダプタータンパク質の結合認識部位として機能する。これらのタンパク質は付加的なエフェクターを活性化受容体に動員し、それらが膜における情報伝達複合体の集合および細胞内生化学的シグナルカスケードの活性化を引き起こす。
【０００３】
ＲＴＫの活性およびそれらに媒介される細胞内シグナル伝達は、正常細胞では正確に調整され、厳しく制御される。一方、癌細胞の多くでは、ＲＴＫの変異または過剰発現が見出され、リガンドが存在しない場合でさえも、受容体二量体化の発生率を増大させている。多くの場合、これがＲＴＫの恒常的な活性化を促し、異常で、制御できない細胞増殖および腫瘍形成を導くことが知られている(図１Ａ)。
【０００４】
異常なＲＴＫのシグナル伝達を阻止するための一方法は、それらの固有のチロシンキナーゼ活性を選択的に妨害し、それによって受容体自己リン酸化および下流シグナルトランスジューサーの活性化を遮断する小分子薬の開発である(非特許文献２)。効果的なチロシンキナーゼ阻害剤の選択を考慮するための１つの重要な側面は、これらの化合物が細胞膜を透過し、必要な期間、細胞内環境で機能することが可能でなければならないことである。
さらに、潜在的な薬物候補になるためには、キナーゼ阻害剤は細胞毒性効果を示してはならない。したがって、ＲＴＫ活性を阻止することが可能な化合物の一次スクリーニングには生細胞を用いることが好ましい(特許文献１など)。
【０００５】
酵母とヒト細胞の間では、基本的な分子および細胞機序が高度に保存されているため、酵母細胞内においてヒトタンパク質の機能を再構成することがしばしば可能である。そのため酵母は、真核細胞のモデル生物として古くから利用されており(非特許文献３)、酵母を用いた「drug-target」スクリーニング系も開発されている(非特許文献４)。
また、酵母は、遺伝子操作が容易で、寒天培地・液体培地などで簡便に培養できることから、細胞機能の制御物質に対するハイスループット・スクリーニング系(以降、「ＨＴＳ」とも表記する)の構築にも有用な宿主である(特許文献２、３)。
【０００６】
さらに、酵母細胞は内因性の受容体チロシンキナーゼを持たないため、ＲＴＫの発現およびこれらの膜結合キナーゼの特異的阻害剤のスクリーニング系に酵母細胞を用いることで、バックグラウンドノイズをほぼ無視することが可能となる。
【０００７】
ＲＴＫの具体的な例としては、上皮増殖因子受容体(以降、「ＥＧＦＲ」とも表記する。)、血小板由来増殖因子受容体(ＰＤＦＧＲ)、血管内皮細胞増殖因子受容体(ＶＥＧＦＲ)、ヒト上皮成長因子受容体２(ＨＥＲ２)、ヒト上皮成長因子受容体３(ＨＥＲ３)、ヒト上皮成長因子受容体４(ＨＥＲ４)、ニューロトロフィン受容体などが挙げられる。とりわけＥＧＦＲは、腎癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、乳癌など、さまざまな癌細胞で過剰発現がみられ、腫瘍形成において基礎的な役割を果たしている。
【０００８】
近年、遺伝子組換え酵母を用いて、ＲＴＫの細胞外ドメインに作用する、アゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法(特許文献４)が開発された。この方法は、酵母のＲａｓシグナル伝達経路を改変して利用し、酵母細胞の増殖を指標として検出するものである(非特許文献５、６)。当該手法を応用すればチロシンキナーゼ阻害剤に対しても、ＨＴＳを実現することが可能であると予想されるが、この手法では、遺伝子組換え酵母の増殖能を判定する必要があるため、酵母の培養およびスクリーニングに少なくとも７日間を要する。寒天プレートを用いる通常の酵母を用いたスクリーニング方法の場合には、培養に要する期間が２日間程度であることを考慮すると、この手法は、判定までの時間がかかりすぎる点が大きな欠点となっている。
【０００９】
ＲＴＫのうちでも酵母細胞内で発現させることで強い細胞毒性を誘導し得るＰＤＦＧＲなど特定のＲＴＫの場合は、ＲＴＫの発現が酵母細胞に与える毒性を利用することで、チロシンキナーゼ阻害剤を同定する技術(特許文献１)が利用できる。しかし、典型的なＲＴＫであるＥＧＦＲのように、酵母細胞に対して明確な毒性を示さない(非特許文献５)ＲＴＫに対しては、この技術は適用できない。
【００１０】
以上のように、全てのＲＴＫに適用でき、かつ迅速なＲＴＫに対するチロシンキナーゼ阻害剤のスクリーニング法を開発することが強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００７−５０８８０１
【特許文献２】特開２００５−１７６６０５
【特許文献３】ＷＯ２００６／１０４２５４
【特許文献４】特開２００８−２４５５９２
【特許文献５】特開２０１１−１５５８３９
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ullrich A, et. al., 1990，Cell，Vol.61，203-212.
【非特許文献２】Levitzki A, 1999, Pharmacol Ther. Vol.82，231-239.
【非特許文献３】Botstein D, et. al., 1997, Science. Vol.277，1259-1260.
【非特許文献４】Hughes TR, 2002, Funct Integr Genomics. Vol.2，199-211.
【非特許文献５】Gunde T，et al.，2005，Biotechniques.， Vol.39，541-549.
【非特許文献６】Busti S，et al.，2008，Curr Genet.，Vol.53，153-162.
【非特許文献７】N. Fukuda et al.，2009，FEBS J., Vol.276，2636-2644
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、異常なＲＴＫのシグナル伝達を阻止するためのＲＴＫ阻害剤のスクリーニング系であって、ＥＧＦＲなど一般的なＲＴＫにも適用でき、かつ迅速なスクリーニング系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、従来のＲＴＫ阻害剤スクリーニング法で利用していた、酵母由来のＲａｓシグナル伝達経路に代えて、Ｇタンパク質を介した接合シグナル伝達経路を適用することに思い至った。
本発明者らは、以前、酵母細胞内のＧタンパク質による接合シグナル(フェロモンシグナル)伝達経路を利用したタンパク質間相互作用の検出方法を開発している(非特許文献７、特許文献５)。具体的には、タンパク質(Ａ)をＧタンパク質のγサブユニットの細胞膜結合能を欠損させた変異型(以降、「Ｇγcyto」とも表記する)と融合させた融合タンパク質(Ａ−Ｇγcyto)を細胞質で発現させ、タンパク質(Ａ)と相互作用するタンパク質(Ｂ)を細胞膜に発現させる(Ｂmem)。タンパク質(Ａ)とタンパク質(Ｂ)とが相互作用すると、Ａ−ＧγcytoとＧβからなる複合体(Ａ−Ｇβγcyto)が細胞膜に局在化し接合シグナル伝達が回復することを利用する。フェロモン応答的なプロモーターの下流にレポーター遺伝子を組み込むことで、タンパク質(Ａ)とタンパク質(Ｂ)との相互作用により回復した接合シグナル伝達をレポーター遺伝子の発現量として定量的に検出できる。非特許文献６などでは、タンパク質(Ａ)としてヒトＩｇＧのＦｃ部分を用い、タンパク質(Ｂ)として、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のプロテインＡ由来のＺドメインを用い、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰをレポーター遺伝子として蛍光強度をフローサイトメーター解析することで、結合定数８.０×１０3Ｍ-3という比較的弱い相互作用まで検出できている。
【００１５】
そこで、本発明者らは、酵母細胞内でＲＴＫのリン酸化チロシン残基と、Ｇタンパク質を融合させたアダプタータンパク質との相互作用により接合シグナル伝達経路を恒常的に活性化させた系を構築できれば、当該系に被検物質を作用させ阻害活性を測定することでＲＴＫ阻害剤候補物質をスクリーニングできると考えた。
そのために、遺伝子組換え酵母でチロシン基がリン酸化したＲＴＫの細胞内ドメイン(ＲＴＫcyto)を細胞膜に局在化させる一方で、リン酸化チロシン残基に結合可能で、かつ単独では細胞膜に局在することができないアダプタータンパク質を、Ｇγcytoと結合させた融合タンパク質を同一酵母細胞内で発現させるというストラテジーを考えた。具体的には、典型的なＲＴＫであるＥＧＦＲの細胞内ドメイン(ＥＧＦＲcyto)を酵母の細胞膜に局在化させ、かつ二量体化によるチロシン残基のリン酸化を行い、変異Ｇγcytoを含むＧｒｂ２−Ｇγcyto融合タンパク質を細胞質で発現させた。しかしながら、接合シグナル経路の活性化は全く観察できなかった。本発明者らは、さらに根気よくその原因の解明に勤め検討を重ねた結果、前記ストラテジーには問題が無く、Ｇタンパク質からエフェクター分子へのシグナル伝達は、Ｇタンパク質が細胞膜近傍に存在しなくては起こらないこと、及びそのためリン酸化チロシン残基と相互作用している融合体中のＧγと細胞膜との空間的距離が重要であることを解明した。
そして、結合時のＧｒｂ２−Ｇγcyto融合タンパク質の位置を最適に保つために、ＥＧＦＲcyto配列中のリン酸化チロシンの細胞膜からの位置を調整したところ、接合能を示す遺伝子組換え酵母の系を提供することができ、既知のＥＧＦＲ特異的チロシンキナーゼ阻害剤により接合能が消失することを確認した。さらに、両遺伝子を酵母ゲノムに組み込んで、安定して膜に局在するＥＧＦＲcyto及び遊離したＧｒｂ２−Ｇγcytoを発現する遺伝子組換え酵母を提供することもできた。
以上のことにより、酵母のＧタンパク質シグナル伝達経路を利用したＲＴＫ阻害剤のスクリーニングの系を確立することができ、本発明を完成するに到った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕  遺伝子組換え酵母を用いた受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)におけるチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法が、
恒常的にリン酸化しているチロシン残基を細胞膜近傍領域内に有しているＲＴＫ細胞内ドメイン(ＲＴＫcyto)が細胞膜に局在して発現し、かつ同時に、前記リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質と、単独では細胞膜に局在することができないＧタンパク質γサブユニット変異体とを含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え酵母を用いることを特徴とする方法であって、
前記遺伝子組換え酵母に被検物質を接触させる工程、及び当該酵母におけるＧタンパク質シグナル伝達の応答量の減少もしくは消失を判定する工程を含む方法。
〔２〕  前記遺伝子組換え酵母が、下記(１)〜(３)の工程により調製されている遺伝子組換え酵母であることを特徴とする、前記〔１〕に記載の方法；
（１）ＲＴＫ細胞内ドメインのいずれかの末端に付加されている細胞膜局在化配列、及びリン酸化し得るチロシン残基を細胞膜近傍領域に有しているＲＴＫ細胞内ドメインを含む第１の融合タンパク質を発現する第１の発現カセットを調製する工程、
（２）リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質、及び単独では細胞膜に局在することができないＧタンパク質γサブユニット変異体を含む第２の融合タンパク質を発現可能な第２の発現カセットを調製する工程、
（３）前記第１及び第２の発現カセットを酵母宿主に導入し、得られた遺伝子組換え酵母を培養する工程。
〔３〕  前記工程(１)の「細胞膜局在化配列」が脂質修飾シグナルペプチド、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞膜構造タンパク質結合性ペプチドから選択されたペプチドであって、
前記ＲＴＫ細胞内ドメインが有しているリン酸化し得るチロシン残基の位置が、前記「細胞膜局在化配列」が付加している側の最初のアミノ酸残基から数えて３００アミノ酸残基未満のいずれかの位置である、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕  前記工程(３)において、第１及び第２の発現カセットの少なくとも一方を酵母宿主に導入する方法が、相同組換えにより染色体中に導入する方法であることを特徴とする、前記〔２〕又は〔３〕に記載の方法。
〔５〕  前記遺伝子組換え酵母が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属し、選択性マーカーを少なくとも１つ保持する一倍体酵母であって、
当該酵母における被検物質の接触後のＧタンパク質シグナル伝達の応答量の減少もしくは消失を判定する工程が、以下の工程(４)及び(５)を含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法；
（４）被検物質接触後の前記組換え酵母を、当該酵母と接合可能な型の野生型一倍体酵母と共に接合体のみが生育可能な選択培地で培養する工程、
（５）培養後の組換え酵母の増殖能の減少もしくは消失を、被検物質を接触させない場合の増殖能との比較により判定する工程。
〔６〕  前記ＲＴＫが、そのアミノ酸配列内に恒常的に二量体化を引き起こす変異を有するＲＴＫ変異体であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕  前記工程(１)の第１の発現カセットが、第１の融合タンパク質をコードする遺伝子配列と共に、二量体化ドメインの一方及び他方をコードする遺伝子配列のそれぞれが含まれるように構築された２種類の発現カセットからなることを特徴とする、前記〔２〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕  前記ＲＴＫが、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)である、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕  前記ＥＧＦＲが、そのアミノ酸配列における８３４位ロイシン残基がアルギニン残基に置換されており、恒常的に二量体を形成するＬ８３４Ｒ変異体である、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  前記アダプタータンパク質がＧｒｂ２である、前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載のスクリーニング方法で用いることのできる遺伝子組換え酵母であって、
恒常的にリン酸化しているチロシン残基を細胞膜近傍領域内に有しているＲＴＫ細胞内ドメインが細胞膜に局在して発現しており、かつ前記リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質と、単独では細胞膜に局在することができないＧタンパク質γサブユニット変異体とを含む融合タンパク質を発現していることを特徴とする、遺伝子組換え酵母。
〔１２〕  前記遺伝子組換え酵母が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属し、選択性マーカーを少なくとも１つ保持する一倍体酵母であることを特徴とする、前記〔１１〕に記載の遺伝子組換え酵母。
〔１３〕  前記遺伝子組換え酵母が、さらに、シグナル応答性のプロモーター制御下でレポーター遺伝子を発現することが可能な遺伝子組換え酵母であることを特徴とする、前記〔１１〕又は〔１２〕に記載の遺伝子組換え酵母。
〔１４〕  受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)におけるチロシンキナーゼ阻害剤を同定、又はスクリーニングするためのキットであって、前記〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の遺伝子組換え酵母を含むキット。
〔１５〕  以下の(ａ)〜(ｃ)を含む前記〔１４〕に記載のキット；
（ａ）前記〔１２〕に記載の遺伝子組換え酵母、
（ｂ）前記酵母と異なる接合型の一倍体酵母、
（ｃ）接合体のみが生育可能な選択用培地。
〔１６〕  以下の(ａ)及び(ｂ)を含む前記〔１４〕に記載のキット；
（ａ）前記〔１３〕に記載の遺伝子組換え酵母、
（ｂ）前記酵母細胞内でのレポーター遺伝子発現量を測定するための装置。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、抗癌剤候補となる、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性の阻害物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。本発明により取得したＲＴＫ阻害剤候補物質は、細胞膜を透過し、必要な期間、細胞内環境で機能することが可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の評価方法の模式図：（Ａ）ヒト細胞中でのＥＧＦＲの生理機能を示す模式図。（Ｂ）ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性が、酵母Ｇタンパク質シグナル伝達経路を活性化させる原理を示す模式図。
【図２】Ｇタンパク質γサブユニット(Ｇγ)と細胞膜の空間的距離が、シグナル伝達へ与える効果：（Ａ）Ｇγを含む融合タンパク質の模式図(ＦＰはファルネシル基とパルミトイル基が付加される配列、ＭＰはミリストイル基とパルミトイル基が付加される配列を示す)。（Ｂ）接合体の形成数を指標とした、遺伝子組換え酵母のシグナル伝達レベルを示すグラフ。（Ｃ）Ｃ末端にＧＦＰを付加した前記融合タンパク質、を発現する遺伝子組換え酵母の蛍光強度を示すグラフ。
【図３】リン酸化ＥＧＦＲとＧｒｂ２−Ｇγ変異体(Ｇγcyto)を用いた、酵母Ｇタンパク質シグナル伝達経路の活性化：（Ａ）酵母細胞で発現させるＥＧＦＲ細胞内ドメインとＧｒｂ２−Ｇγcytoの模式図。（Ｂ）接合体の形成数を指標とした、遺伝子組換え酵母のシグナル伝達レベルを示すグラフ。
【図４】リン酸化ＥＧＦＲおよびＧｒｂ２−Ｇγcytoを共発現する、染色体組込み型遺伝子組換え酵母の作製：（Ａ）相同組換えを利用した染色体組込みの概略図。（Ｂ）Ｂ１Ｌ−ＧｒＧ(Ｇｒｂ２−Ｇγcyto発現酵母)が形成した接合体コロニーを示す写真(ＯＤ600＝０.５に調整した酵母懸濁液１ｍｌを塗布)。（Ｃ）Ｂ１Ｕ−ＧＬ(リン酸化ＥＧＦＲおよびＧｒｂ２−Ｇγcyto共発現酵母)が形成した接合体コロニーを示す写真(ＯＤ600＝０.５に調整した酵母懸濁液１ｍｌを塗布)。（Ｄ）リン酸化ＥＧＦＲの有無による接合体形成数の差を示すグラフ。
【図５】ＡＧ１４７８のチロシンキナーゼ阻害活性の評価：（Ａ）ＡＧ１４７８濃度と、Ｂ１Ｕ−ＧＬが形成した接合体数の関係を示すグラフ。（Ｂ）ＡＧ１４７８の有無による接合体形成数の比を示すグラフ(ＢＹ４７４１は天然のＧタンパク質シグナル伝達経路を有する酵母、Ｂ１Ｕ−ＧＬは導入したリン酸化ＥＧＦＲによりＧタンパク質シグナル伝達経路を活性化する酵母)。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．本発明の特徴について
本発明は、抗癌剤の開発を目的として、ヒトなど哺乳類の自己リン酸化型受容体である受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)が有するチロシンキナーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、自己のチロシンキナーゼ活性により、恒常的にリン酸化されたチロシン残基を有するＲＴＫの細胞内ドメインであって、当該チロシン残基の細胞膜からの距離が一定の範囲内にあるＲＴＫ細胞内ドメインを、酵母細胞の細胞膜に局在化するように発現させると共に、細胞膜結合活性能を欠失したＧタンパク質γサブユニットとアダプタータンパク質との融合タンパク質を発現させることで、Ｇタンパク質を介したシグナル伝達経路を活性化させる工程を含むことを特徴とする。この工程を含んでいる限り、当業者に公知のもののうち技術的に適用可能な全ての工程を包含することを排除しない。本発明の実施態様では、Ｇタンパク質を介したシグナル伝達経路として、接合シグナル伝達経路を利用する方法を示しているが、他にもグルコース応答シグナル伝達経路を利用することもできる。
本発明においては、これらのリン酸化されたチロシン残基を有するＲＴＫ細胞内ドメインと共に、アダプタータンパク質とＧγcytoとの融合タンパク質を共発現している遺伝子組換え酵母細胞を用いて、ＲＴＫのチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングする。その際のスクリーニングの形態は、接合体のみが生育可能な選択圧下での増殖判定などを用いることが好適であるが、当該シグナル伝達の応答を利用する工程である限り特に制限されない。他には、シグナル応答性のプロモーターの制御下に置いたＧＦＰなどレポーター遺伝子の発現の有無を観察する方法も簡便な判定法であり好ましい。
【００２０】
ここで、Ｇタンパク質を介した接合シグナル伝達経路は「フェロモンシグナル伝達経路」とも称される。１倍体酵母は対となる接合型の１倍体酵母に対してフェロモンを分泌し、相手のフェロモンを感知すると接合を促すシグナルを細胞内に伝達する。細胞膜上にはリガンドのフェロモンと結合するＧＰＣＲ(Ｇタンパク質共役型受容体)が存在しており、この受容体は細胞内のＧタンパク質(グアニンヌクレオチド結合タンパク質)と呼ばれるαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットからなる３量体のタンパク質と共役している。フェロモンが受容体に結合すると、Ｇタンパク質はαサブユニットとβγ複合体に解離する。αサブユニットとγサブユニットとはそれぞれ細胞膜に結合しているため、Ｇタンパク質の解離後においてもαサブユニットとβγ複合体は細胞膜に局在化する。βγ複合体のβサブユニットが細胞膜を介してエフェクターに作用することでシグナルが下流に伝達される。
一方、γサブユニットの細胞膜結合能を欠損させた変異体(Ｇγcyto)では、Ｇタンパク質の解離によってβγ複合体(Ｇβγcyto)が細胞質中に遊離してしまい、エフェクターに作用できなくなるため、シグナルが下流に伝達されなくなることが知られている(参考文献１および２参照)。
【００２１】
２．受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)及びその細胞内ドメインについて
（２−１）受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)
本発明で対象とする受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)は、哺乳動物由来ＲＴＫのうちでも特にヒト由来ＲＴＫを対象とするものであり、具体的には、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、血小板由来増殖因子受容体(ＰＤＦＧＲ)、血管内皮細胞増殖因子受容体(ＶＥＧＦＲ)、ヒト上皮成長因子受容体２(ＨＥＲ２)、ニューロトロフィン受容体などが例示できる。これらヒト由来のアミノ酸配列はいずれも既知であり、例えば、ＥＧＦＲ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＧ００７７２６)、ＰＤＧＦＲ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００２６０９)、ＶＥＧＦＲ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００２２５３)、ＨＥＲ２(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００１００５８６２)として商用データベースから入手可能である。
【００２２】
（２−２）受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の細胞内ドメイン(ＲＴＫcyto)について
本発明においては、本来のリガンドとの結合活性を持たないＲＴＫの細胞内ドメインを利用するが、必ずしもＲＴＫの細胞内ドメイン全長を発現させる必要はない。したがって、本発明において「ＲＴＫ細胞内ドメイン」というとき、天然のＲＴＫの細胞内ドメインに由来する「チロシンキナーゼドメイン」及び「リン酸化の対象となるチロシン残基」を含む領域(以下、当該領域を含むフラグメントであって、自己のチロシンキナーゼ活性によりリン酸化チロシン残基を生成し得るフラグメントを「機能的フラグメント」ともいう。)を少なくとも含むアミノ酸配列からなるタンパク質を指し、「ＲＴＫcyto」ともいう。当該「ＲＴＫcyto」としては、前記ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲ２などの細胞内ドメイン及びそれらの機能的フラグメントを好適に例示することができ、それぞれＥＧＦＲcyto、ＰＤＧＦＲcyto、ＶＥＧＦＲcyto、ＨＥＲ２cytoなどと表記することもある。典型的な「ＲＴＫcyto」としては、ＥＧＦＲの細胞内ドメイン(ＥＧＦＲcyto)を例示することができ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するヒトＥＧＦＲを特に好適に例示することができる。なお、自己のチロシンキナーゼ活性によりリン酸化チロシン残基を生成し得るＲＴＫcytoである限り、上記好適として例示したＲＴＫの細胞内ドメイン及びそれらの機能的フラグメントのアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異体、あるいは改変体を用いることもできる。なお、本発明において「１もしくは数個」とは、１〜５０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個であり、全長の塩基配列の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲内での変異があるか、または改変が施されていることを表す。
【００２３】
（２−３）ＲＴＫcytoを細胞膜に局在させる方法について
本発明においては、ＲＴＫcytoを細胞膜に局在して発現させる。ここで細胞膜に局在とは、対象とする分子が、細胞膜を構成する脂質またはタンパク質と結合している状態を指す。ＲＴＫcytoを細胞膜に局在して発現させる方法としては、ＲＴＫcytoに、細胞膜への局在化を促すアミノ酸配列(以降、「細胞膜局在化配列」とも表記する)を付加して発現させる方法が挙げられる。細胞膜局在化配列としては、脂質修飾を促す配列(ファルネシル化およびパルミトイル化を誘導するシグナルペプチドであるＦＰ配列、ミリストイル化およびパルミトイル化を誘導するシグナルペプチドであるＭＰ配列など)や、疎水性のアミノ酸残基からなる膜貫通ドメイン、細胞膜構造中に存在するタンパク質に結合性を有するペプチド(細胞膜構造タンパク質結合性ペプチド)などが挙げられる。
したがって、例えば、本発明における典型的なＲＴＫcytoのＥＧＦＲcytoの場合は、酵母細胞内で発現させることによって、細胞膜に局在し、かつ自己のチロシンキナーゼ活性によりリン酸化されるチロシン残基を有するＥＧＦＲcytoであって、かつ下記の(１)〜(２)のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質であると表すことができる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、
（２）配列番号１に示されるアミノ配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
【００２４】
３．ＲＴＫ細胞内ドメインのリン酸化されるチロシン残基の位置について
本発明のリン酸化されたチロシン残基を有するＲＴＫの細胞内ドメインの他の特徴として、ＲＴＫの細胞内ドメイン中での自己のチロシンキナーゼ活性によりリン酸化されたチロシン残基を有するＲＴＫの細胞内ドメインにおいて、当該リン酸化チロシン残基の細胞膜からの距離を細胞膜近傍の一定の範囲内(細胞膜近傍領域)に設定することで、リン酸化チロシン残基を認識するアダプタータンパク質と融合した膜結合能を持たないＧタンパク質γサブユニットが、細胞膜から当該距離の範囲内に存在することができ、細胞膜近傍のエフェクター因子にＧタンパク質シグナルを伝達することが可能となる点がある。
ここで、細胞膜近傍の一定の範囲内の距離は、細胞膜からリン酸化チロシン残基までの空間的距離によって規定され、その１つの指標としては、当該残基と、細胞膜への局在を促すアミノ酸配列との間のアミノ酸残基数を用いることができる。すなわち、ＲＴＫ細胞内ドメインのリン酸化チロシン残基の位置を、細胞膜近傍の一定の範囲内の距離、具体的には細胞膜への局在を促すアミノ酸配列から１〜３００アミノ酸残基未満、好ましくは１〜２００アミノ酸残基、より好ましくは５〜１５０アミノ酸残基、さらに好ましくは１０〜１２０アミノ酸残基、特に好ましくは２０〜６０アミノ酸残基の位置に存在させることが重要である。
【００２５】
そのための手法として、例えば、ＲＴＫ細胞内ドメインのＮ末側に細胞膜局在化配列(ＭＰ配列など)を付加する場合には、チロシンキナーゼドメインとリン酸化チロシン残基との間の配列を除去するか、リン酸化チロシン残基の位置をＮ末側に変更するなどの方法で距離を調整することができる。
他のより簡便で好ましい方法としては、通常のＲＴＫ細胞内ドメイン配列中でのリン酸化され得るチロシン残基の位置が、Ｃ末側の近傍に存在することを踏まえて、細胞膜局在化配列(ＦＰ配列など)をＲＴＫ細胞内ドメインのＣ末側に結合させることで、細胞膜局在化配列とリン酸化チロシン残基との間の距離を短縮することができる。例えば、本発明の実施例で用いた５４１残基のＥＧＦＲの細胞内ドメイン(ＥＧＦＲcyto)の場合、Ｎ末側からリン酸化チロシン残基までは４２３番目であるのに対して、Ｃ末側からは１１９番目であったので、Ｃ末側に細胞膜局在化配列のＦＰ配列を付加したことでシグナル応答を検出できている。
また、ＲＴＫ細胞内ドメインのＣ末側に細胞膜局在化配列を結合させることのメリットとして、Ｃ末側にはチロシンキナーゼドメインなどのような不可欠なドメインはない点がある。すなわち、Ｃ末側からであれば、適宜の数のアミノ酸残基を除去することが可能であるため、さらに最適な細胞膜までの距離に調整することが可能である。
【００２６】
４．本発明における、Ｇタンパク質シグナル伝達経路を活性化させる方法について
（４−１）ＲＴＫcytoのチロシン残基を恒常的にリン酸化する方法
本発明の方法では恒常的にリン酸化されたＲＴＫcytoを酵母の細胞膜に局在して発現させることが必要である。
本発明で用いるＲＴＫcytoは、細胞外のリガンド結合ドメインを欠失しているので、本来のリガンドの結合による二量体化は起こらない。したがって、恒常的にＲＴＫcytoをリン酸化するためには、ＲＴＫcytoを細胞外のリガンドに依存しない方法で二量体化しておく必要がある。
そのために、ＲＴＫの１部の配列を変異させて「恒常的に二量体を形成してリン酸化チロシン残基を有する変異体」とすることができる。ＲＴＫがこのような恒常的な二量体形成性の変異を起こすことが癌化メカニズムの主要な原因の１つであることからみて、癌細胞には、それぞれのＲＴＫに対応した前記変異体が存在している場合が多く、従来から多数の報告があるので、これら既知の変異体を用いることができる。例えば、ＥＧＦＲについては、Ｌ８３７Ｑ変異体、Ｙ８４５Ｅ変異体(参考文献３)などが報告されており、Ｈｅｒ４の場合もＩ７１２Ｑ変異体、Ｖ９５４Ｒ変異体(参考文献４)などが知られている。本発明の実施例では、ＥＧＦＲ変異体のうちの「Ｌ８３４Ｒ変異体」(参考文献５)を用いた。「Ｌ８３４Ｒ変異体」は、ＥＧＦＲの８３４位のロイシン残基がアルギニン残基に変異しており、恒常的に二量体を形成し、４２３位のチロシン残基がリン酸化されおり、本実施例２では、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoと表記されている。
その他のＲＴＫの細胞内ドメインを二量体化する方法としては、二量体化ドメイン(ｃ−Ｆｏｓロイシンジッパー、ｃ−ＪｕｎロイシンジッパーおよびＧｃｎ４ロイシンジッパーなど)を付加する方法を例示することができる。具体的には、ｃ−Ｆｏｓロイシンジッパーを付加したＲＴＫcytoと、ｃ−Ｊｕｎロイシンジッパーを付加したＲＴＫcytoとを共発現すればよい。
【００２７】
（４−２）アダプタータンパク質とＧタンパク質の変異γとの融合タンパク質について
本発明の方法では、リン酸化チロシン残基を細胞膜近傍に有するＲＴＫcytoを、遺伝子組換え酵母の細胞膜に局在させることに加えて、当該チロシン残基に結合することが可能なアダプタータンパク質を、Ｇγcytoと融合して発現させる。すなわち、ＲＴＫcytoのリン酸化チロシン残基に依存して、Ｇβγcyto複合体を細胞膜に局在させることで、遺伝子組換え酵母のＧタンパク質シグナルを下流へと伝達させる。
【００２８】
その際のアダプタータンパク質としては、単独では細胞膜に局在することができず、かつリン酸化チロシン残基を認識して、ＥＧＦＲと結合し得るタンパク質、である限り特に制限されないが、ＳＨ２ドメインを有するタンパク質を好適に例示することができ、Ｇｒｂ２，Ｓｈｃ、Ｓｒｃなどをさらに好適に例示することができる。それぞれの配列はいずれも既知であり、例えば、Ｇｒｂ２(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４１９４２)，Ｓｈｃ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００１２０２８５９)、Ｓｒｃ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ１９８２９１)として商用データベースから入手可能であり、それぞれの配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。例えば、本発明の実施例でアダプタータンパク質として用いたＧｒｂ２のアミノ酸配列(配列番号２)を特に好適に例示することができ、また、配列番号２に示された配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。
さらに、上記Ｇγcytoとしては、単独では細胞膜に局在することができず、かつ上述のアダプタータンパク質と融合して発現した際に、ＲＴＫcytoのリン酸化チロシン残基に依存して細胞膜近傍へと誘導されることで、下流のシグナル伝達系を活性化させ得るＧγcyto、である限り特に制限されないが、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＧγcytoを好適に例示することができる。また、上記好適として例示した配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加された配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。
【００２９】
５．本発明の適用可能な「酵母」及び遺伝子組換え法について
（５−１）本発明の適用可能な酵母について
本発明において、「酵母」とは、遺伝子組換えを行っていない野生型の酵母、および遺伝子組換え酵母を包含する。遺伝子組換え酵母が属する種は、宿主とした野生型の酵母の属する種と同一であるとする。
本発明に適用可能な「酵母」としては、サッカロミセス(Saccharomyces)属やシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属に属する酵母を好適に例示することができ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)やシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)に属する酵母をさらに好適に用いることができ、サッカロミセス・セレビシエに属する酵母を特に好適に用いることができる。
本発明では、Ｇタンパク質接合シグナル伝達経路の活性化を利用し、接合体の形成を指標とした増殖判定を用いることが好ましいため、ａ型もしくはα型の一倍体のサッカロミセス酵母であって、かつ少なくとも１つの選択マーカー(栄養要求性マーカー)を染色体上に保持するサッカロミセス酵母を用いることが特に好ましい。
【００３０】
（５−２）酵母の遺伝子組換えについて
本発明の方法では、ＲＴＫcyto遺伝子およびアダプタータンパク質−Ｇγcyto遺伝子(例えば、ＥＧＦＲcyto遺伝子およびＧｒｂ２−Ｇγcyto遺伝子)の発現カセットを調製して、該発現カセットを酵母細胞に導入することで、上記遺伝子を発現する遺伝子組換え酵母を作製する。ここで発現カセットとは、プロモーター、遺伝子およびターミネーターからなる配列を有するＤＮＡであり、かつ宿主細胞に導入したとき該遺伝子を発現可能なＤＮＡを指す。上記発現カセットを酵母へ導入する方法としては、エレクトロポレーション法、金属処理法、プロトプラスト法等の技術的に適用可能な当業者に公知の全ての方法を用いることができる。上記発現カセットの酵母への導入する方法としては、上記発現カセットをベクターに組み込んで、そのベクターを酵母へ導入する方法を用いることもできるが、安定的なスクリーニング系を提供するためには、相同組換えを利用して、上記発現カセットを酵母の染色体へ導入する方法が特に好ましい。上記ベクターとしては、酵母で自律複製可能なプラスミド(ＹＣｐタイプ、ＹＥｐタイプ、ＹＲｐタイプ)や人工染色体(ＹＡＣ)を、好適に例示することができる。
【００３１】
６．ＲＴＫ阻害剤スクリーニング
本発明のスクリーニングの対象となるＲＴＫのチロシンキナーゼ阻害剤とは、ＲＴＫ自身が有しているチロシンキナーゼ活性による自己リン酸化作用を阻害する物質を指し、単に「ＲＴＫ阻害剤」ということもある。
本発明のＲＴＫ阻害剤のスクリーニングの形態は、当該シグナル伝達の応答を利用する工程である限り特に制限されないが、接合体のみが生育可能な選択圧下での増殖判定などを用いることが好適である。
具体的には、メチオニンおよびリジンを含まないＳＤ固体培地上に酵母懸濁液を塗布することで、ａ型酵母(メチオニン要求性)およびα型酵母(リジン要求性)は増殖できず、かつ当該シグナル伝達の応答として形成した接合体(メチオニンおよびリジンを合成可能)のみが増殖してコロニーを形成する。ここで薬剤の添加により、接合体の形成が抑制された場合、当該薬剤がＲＴＫ阻害剤の候補となる。
他の手法としては、シグナル応答性のプロモーター(ＰFUS1、ＰFIG1、ＰAGA1など)の制御下に設けられたレポーター遺伝子を用い、レポーター遺伝子の発現量の変化を観察することを例示できる(参考文献６参照)。レポーター遺伝子としては、例えば、蛍光レポーター遺伝子(ＤｓＲｅｄ、ＧＦＰなど)、生育レポーター遺伝子(ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３、ＣＡＮ１など)、発色レポーター遺伝子(ｌａｃＺなど)、発光レポーター遺伝子(ｌｕｃなど)などが挙げられる。
【００３２】
７．図１Ｂに示された本発明の実施の態様
具体的な本発明の態様として、図１Ｂを参照して説明する。ただし、本発明は当該態様には限定されない。
内在性のＧγ遺伝子を破壊した１倍体の酵母を宿主として、ＥＧＦＲの細胞内ドメイン(ＥＧＦＲcyto)とＧｒｂ２−Ｇγcytoを共発現する遺伝子組換え酵母を作製する。ここで、１倍体とは、１セットのゲノムを有する酵母の個体をいう。Ｇｒｂ２−Ｇγcytoは、ＥＧＦＲcytoがリン酸化チロシン残基を有する場合にのみ、細胞膜に局在して、シグナルを下流へと伝達することができる。当該シグナル伝達経路が活性化された酵母は、有性生殖のための細胞融合、すなわち接合を引き起こす。したがって、当該遺伝子組換え酵母と接合可能な１倍体の酵母(以降、「接合パートナー」とも表記する)を、当該遺伝子組換え酵母と共培養することで、２倍体の酵母が形成される。ここで、２倍体とは、２セットのゲノムを有する酵母の個体をいう。このとき、当該遺伝子組換え酵母とは異なる選択マーカー遺伝子を、接合パートナーに予め保持させておくことで、形成される２倍体(以降、「接合体」とも表記する)の酵母を、１倍体の酵母と区別して選択することができる。
上記遺伝子組換え酵母に対して、被検化合物を添加すると、チロシンキナーゼ活性を阻害する化合物では、接合体の形成が起こらず、接合体のみ生育が可能な選択圧の下では、酵母の増殖が見られない(図１Ｂ、上段)。一方、当該化合物がチロシンキナーゼ活性を阻害できなければ、接合体が形成され、上述の選択圧下では、酵母の増殖が観察される(図１Ｂ、下段)。すなわち、酵母の増殖を指標として、ＥＧＦＲcytoに対するチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングする。
なお、本発明の方法により得られた化合物は、細胞膜を透過することができ、かつ細胞内環境で機能することが可能な化合物である。また、上述の「接合体を生成する工程」に先んじて、被検化合物の存在下で上記遺伝子組換え酵母を培養しておくことで、細胞毒性効果のない化合物のみを取得することが可能である。さらに、上述のスクリーニングによって得られた化合物を、野生型のＧγ遺伝子を有する１倍体の酵母に添加して、接合体の増殖を観察すれば、当該化合物が酵母の内在性タンパク質に作用しているか否かを判別することができる。このとき、接合体の形成を阻害しない化合物を選抜すれば、ＥＧＦＲｃｙｔｏのチロシンキナーゼドメインに対して、特異的に作用する化合物を取得することができる。
【００３３】
（参考文献）
参考文献１：Manahan CL, et．al., 2000, Mol Biol Cell.，Vol.11，957-968.
参考文献２：Fukuda N, et. al., 2009, FEBS J.，Vol.276，2636-2644.
参考文献３：Shan Y, et. al., 2012, Cell, Vol.149, 860-870.
参考文献４：Monsey J, et. al., 2010, J Biol Chem., Vol. 285, 7035-7044.
参考文献５：Zhang X, et. al., 2006, Cell.，Vol.125，1137-1149.
参考文献６：MacKay VL, et．al., 2004, Mol Cell Proteomics.，Vol.3，478-489.
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００３５】
（実験方法）
（１）培地の調製
１％(w/v)酵母エキストラクト、２％(w/v)ペプトンおよび２％(w/v)グルコースを含むＹＰＤ培地、０.６７％(w/v)アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson社製)及び２％(w/v)グルコースを含むＳＤ培地で酵母を培養した。ＳＤ培地には選択マーカー遺伝子に対応するアミノ酸および核酸を適宜添加した。２％(w/v)寒天をこれらの培地に添加してＹＰＤおよびＳＤの固体培地を調製した。
【００３６】
（２）酵母の調製
酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のメチオニン要求性ａ型(一倍体、ａ型)株ＢＹ４７４１(参考文献７参照)、リジン要求性α型(一倍体、α型)株ＢＹ４７４２(参考文献７参照)、及び以下の実施例で作製した酵母株、並びに酵母株に導入したプラスミドの情報を表１に示す。
【００３７】
（３）蛍光測定
配列番号４に示すアミノ酸配列を有する緑色蛍光タンパク質(以降、「ＧＦＰ」とも表記する)を、ＧγcytoおよびＧγcyto融合タンパク質、のＣ末端に付加して発現させることで、酵母細胞内における上記タンパク質の発現量を比較するための蛍光レポーターとして用いた。遺伝子組換え酵母を、ＳＤ培地を用いて３０℃で１８時間培養したのち、集菌および洗浄して滅菌水で再懸濁した。菌体濃度ＯＤ600＝５.０となるように調整した酵母懸濁液１００μＬの蛍光強度をマイクロプレートリーダーInfinite200(Tecan Japan社製)を用いて測定した。励起フィルタセンター波長を４８５ｎｍ(フィルタ帯域幅２０ｎｍ)に、蛍光フィルタセンター波長を５３５ｎｍ(フィルタ帯域幅２５ｎｍ)に設定し、ゲインを５０に固定して測定を行った。
【００３８】
（４）接合体増殖アッセイ
酵母の接合能を評価するため、ａ型およびα型の酵母の栄養要求性の違いを利用して、接合体のみが生育可能となるよう作成した寒天培地を用いて増殖アッセイを実施した。ａ型及びα型酵母株をそれぞれ初期菌体濃度ＯＤ600＝０.１で１ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、３０℃にて共培養した。菌体を回収して洗浄したのち、滅菌蒸留水に再懸濁した。１ｍＬの酵母の懸濁液を、接合体のみが生育することができる寒天培地上に塗布して、３０℃で２日間培養したのち、コロニー形成の有無およびコロニー数を調べた。測定したコロニー数を、塗布した菌体懸濁液のＯＤ600値で除することで、ＯＤ600＝１の菌体懸濁液１ｍＬ中に形成された接合体の細胞数を推算した。
【００３９】
（５）チロシンキナーゼに対する阻害活性の評価
野生型の市販ａ型一倍体酵母ＢＹ４７４１株及び、ＢＹ４７４１株を宿主として染色体上に、Ｃ末側にＦＰ配列が付加されたＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto遺伝子、及びＧｒｂ２−Ｇγcyto遺伝子が相同組換えにより挿入されたａ型酵母Ｂ１Ｕ−ＧＬ株を、ＥＧＦＲ特異的なチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８(4-(3-Chloroanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline：Ｗａｋｏ社製)を含むＹＰＤ培地で、１８時間培養した。培養したａ型酵母を、初期菌体濃度ＯＤ600＝０.１で、ＡＧ１４７８を含むＹＰＤ培地１ｍＬのＹＰＤ培地に播種した。さらに上記の培地に、初期菌体濃度ＯＤ600＝０.１で、α型酵母ＢＹ４７４２株を播種して、３０℃にて８時間共培養した。菌体を回収して洗浄したのち、滅菌蒸留水に再懸濁した。酵母の懸濁液を、接合体のみが生育することができる固体培地上に塗布して、３０℃で２日間培養したのち、形成したコロニーの数を調べた。また、使用する培地を、ＡＧ１４７８を含まないＹＰＤ培地に置き換えて、同様の試験を行い、ＡＧ１４７８の添加が、コロニーの形成数に与える影響を評価した。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）ミリストイル基およびパルミトイル基が付加されたＧγcytoの発現例
（１−１）Ｇγcyto遺伝子発現プラスミドの構築
図１Ｂに示すように、リン酸化されたＥＧＦＲcytoとＧｒｂ２の結合によって、Ｇγcytoは細胞膜近傍へと誘導されるが、このときＧγcytoが細胞膜に局在するエフェクターと接触できなければ、Ｇタンパク質シグナル伝達経路を活性化することはできない。そこで、残基数の異なるＥＧＦＲcyto由来のアミノ酸配列を複数用意し、図２Ａに示すＧγcyto融合タンパク質を作製することにより、Ｇγcytoと細胞膜との距離が、Ｇタンパク質シグナル伝達経路の活性化に及ぼす効果を評価した。なお、全てのＧγcyto融合タンパク質に対してそのＮ末端にＭＰ配列(配列番号５)を設けることで、当該配列がミリストイル化およびパルミトイル化されることにより細胞膜を構成する脂質分子と結合可能に設計した。
【００４２】
下記の操作において、ＤＮＡ断片の連結は、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて行った。ＰPGK1をプライマー１(配列番号６)及びプライマー２(配列番号７)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＨＹ−ＰＧＡ(参考文献８参照)を鋳型として増幅し、プラスミドｐＵＹ−ＧＧＡ(参考文献９参照)のＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＵＹ−ＰＧＡ(2μori,URA3,PPGK1-EGFP)とした。続いて、ＥＧＦＲ遺伝子をプライマー３(配列番号８)及びプライマー４(配列番号９)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐｃｏ１２−ＥＧＦＲ(文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣから提供された；参考文献１０、１１、１２および１３参照)を鋳型として増幅し、プラスミドｐＵＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位間に挿入し、ＥＧＦＲを含むプラスミドｐＵＹ−ＥＧＦＲ−Ｇとした。
ＥＧＦＲcytoをコードする配列を、プライマー５(配列番号１０)及びプライマー６(配列番号１１)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＵＹ−ＥＧＦＲ−Ｇを鋳型として増幅した。次に、Ｇγcyto遺伝子をプライマー７(配列番号１２)及びプライマー８(配列番号１３)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＨＹ−Ｇγｃ(参考文献８参照)を鋳型として増幅した。上述のように増幅した２つのＤＮＡ断片を連結して、プラスミドｐＵＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、ＭＰ配列とＥＧＦＲcyto及びＧγcyto(ＭＰ−ＥＧＦＲcyto−Ｇγcyto)を含むプラスミドｐＵＹ-ＥＣ−Ｇγｃとした。
プラスミドｐＵＹ-ＥＣ−Ｇγｃを鋳型として、プライマー９(配列番号１４)及びプライマー８、プライマー１０(配列番号１５)及びプライマー８、プライマー１１(配列番号１６)及びプライマー８、プライマー１２(配列番号１７)及びプライマー８、プライマー１３(配列番号１８)及びプライマー８、またはプライマー１４(配列番号１９)及びプライマー８、を用いてＤＮＡ断片を増幅し、プラスミドｐＨＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、それぞれＭＰ配列とＧγcytoとの間に長さを変えたＥＧＦＲのＣ末側のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を発現可能なＧγｃプラスミドｐＨＹ−ＥＣ２２−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ５０−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ１０８−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ２０１−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ３００−Ｇγｃ、およびｐＨＹ−ＥＣ４０１−Ｇγｃとした。
さらに、これら融合タンパク質のそれぞれに蛍光マーカーのＥＧＦＰを融合させるために、プラスミドｐＵＹ-ＥＣ−Ｇγｃを鋳型として、プライマー９及びプライマー１５(配列番号２０)、プライマー１０及びプライマー１５、プライマー１１及びプライマー１５、プライマー１２及びプライマー１５、プライマー１３及びプライマー１５、またはプライマー１４及びプライマー１５、を用いてＤＮＡ断片を増幅し、プラスミドｐＨＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位間に挿入し、それぞれプラスミドｐＨＹ−ＥＣ２２−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ５０−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ１０８−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ２０１−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ３００−ＧγｃＧ、およびｐＨＹ−ＥＣ４０１−ＧγｃＧとした。
【００４３】
（１−２）遺伝子組換え酵母の接合体増殖アッセイ
宿主細胞としてａ型表現型を示す一倍体酵母であるＭＣＦ−Ｂ１Ｌ(表１)を選択し、ｐＨＹ−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＭＰ−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ２２−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ５０−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ１０８−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ２０１−Ｇγｃ、ｐＨＹ−ＥＣ３００−Ｇγｃ、あるいはｐＨＹ−ＥＣ４０１−Ｇγｃ(表１)を酢酸リチウム法(参考文献１４参照)により導入した遺伝子組換え酵母を作製した。各遺伝子組換え酵母を接合パートナーとしてα型表現型を示す一倍体酵母ＢＹ４７４２と１.５時間共培養して、接合体増殖アッセイを行った。各遺伝子組換え酵母から形成された接合体の数(ＯＤ600＝１の菌体懸濁液１ｍＬ中に形成された接合体の細胞数)の測定結果を図２Ｂに示す。図中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００４４】
Ｇγcytoを単独で発現すると、細胞膜に局在できないため(参考文献８参照)、接合体は全く形成されなかった。一方、ＭＰ−Ｇγcytoは細胞膜に局在するため(参考文献８参照)、該融合タンパク質を発現する遺伝子組換え酵母は接合体を形成した。ＭＰ配列とＧγcytoとの間に、ＥＧＦＲ由来のアミノ酸配列を挿入した、Ｇγcyto融合タンパク質を発現する遺伝子組換え酵母では、挿入したアミノ酸配列の長さに応じて、接合体の形成数が変化した。ＥＣ２２−ＧγcytoまたはＥＣ５０−Ｇγcytoの場合では、ＭＰ−Ｇγcytoの場合と比べて、６〜７倍多くの接合体を形成した。ＥＣ１０８−Ｇγcyto、あるいはＥＣ２０１−Ｇγcytoを発現する遺伝子組換え酵母は接合体を形成したが、挿入したアミノ酸配列が長くなるにともなって、接合体の形成数が減少することが明らかとなった。ＥＣ３００−ＧγcytoあるいはＥＣ４０１−Ｇγcytoを発現する遺伝子組換え酵母では、接合体を全く形成しなかった。
【００４５】
（１−３）Ｇγcyto融合タンパク質の発現量の比較
(１−２)で用いたａ型のＭＣＦ−Ｂ１Ｌを宿主細胞として選択し、(１−２)で用いた各ベクターとはＥＧＦＰ遺伝子を含む点でのみ異なるｐＨＹ−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＭＰ−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ２２−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ５０−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ１０８−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ２０１−ＧγｃＧ、ｐＨＹ−ＥＣ３００−ＧγｃＧ、あるいはｐＨＹ−ＥＣ４０１−ＧγｃＧ(表１)を酢酸リチウム法により導入した遺伝子組換え酵母を創製した。各遺伝子組換え酵母をＳＤ培地で１８時間培養して、各遺伝子組換え酵母の蛍光強度を測定した結果を図２Ｃに示す。Ｃ末端に付加したＧＦＰの蛍光を指標として、各融合タンパク質の発現量を比較した。図中の破線は、宿主細胞の自家蛍光の値を示し、エラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００４６】
この結果、Ｇγcytoが最も発現量が高く、ＭＰ配列を付加することで発現量が半減することが示された。また、ＥＣ２２−Ｇγcyto、ＥＣ５０−Ｇγcyto、およびＥＣ１０８−Ｇγcytoは、ＭＰ−Ｇγcytoと同レベルの発現量を示したが、ＥＣ２０１−Ｇγcyto、ＥＣ３００−Ｇγcyto、およびＥＣ４０１−Ｇγcytoでは、アミノ酸残基数が増加するにともなって発現量が低下した。ただし、ＥＣ４０１−Ｇγcytoを発現する遺伝子組換え酵母でさえも、自家蛍光に比べて明らかに高い蛍光強度を示したことから、全てのＧγcyto融合タンパク質が酵母の細胞内で発現していることが示唆される。また、ＥＣ５０−Ｇγcyto、およびＥＣ１０８−Ｇγcytoは同レベルの発現量を示したにもかかわらず、接合体増殖アッセイにおいて、形成された接合体の数が大きく異なった(図２Ｂ)。このことより、ＭＰ配列とＧγcytoの間のアミノ酸残基数の増加が、Ｇβとエフェクターとの接触の障害となっており、かかるアミノ酸残基数が３００を超えると、Ｇγcytoが細胞膜へ誘導された場合でも、Ｇタンパク質シグナル伝達経路を活性化することができなくなることが明らかとなった。
【００４７】
図２Ａに示すＥＧＦＲcyto(５４１残基)のうち、Ｇｒｂ２が認識するリン酸化チロシン残基は、当該タンパク質のＮ末端から数えて４２３番目の残基であり、ＥＧＦＲcytoのＮ末端を細胞膜に結合させると、かかる残基が細胞膜から遠い位置に存在することになり、Ｇβγcytoとエフェクターとの接触を阻害する可能性が高い。一方、かかる残基は、Ｃ末端から数えた場合は１１９番目の残基であり、ＥＧＦＲcytoのＣ末端を細胞膜に結合させれば、かかる残基を細胞膜近傍領域に配置することができ、それによってＧｒｂ２をより細胞膜近傍へと誘導して、Ｇβγcytoとエフェクターとの接触を円滑化できると予想された。
そこで、次の実施例２では、ＥＧＦＲcytoのＣ末端にＦＰ配列を付加して、かかる配列のファルネシル化およびパルミトイル化によって、ＥＧＦＲcytoを細胞膜に局在させることを試みた。
【００４８】
（実施例２）恒常活性型変異体ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoの発現例
（２−１）ＥＧＦＲcyto遺伝子およびＧＲＢ２遺伝子発現プラスミドの構築
本実施例で遺伝子組換え酵母に発現させるＥＧＦＲcytoおよびＧｒｂ２−Ｇγcytoの模式図を図３Ａに示す。ここで、ＥＧＦＲ(ＷＴ)cytoは「野生型ＥＧＦＲの細胞内ドメイン」を、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoは「恒常的に二量体を形成してリン酸化チロシン残基を有する変異体」である「Ｌ８３４Ｒ変異体(参考文献５)」を、ＥＧＦＲ(ＫＡ)cytoは「チロシンキナーゼ活性をもたない変異体」である「Ｋ７２１Ａ変異体(参考文献１５)」を指す。なお各タンパク質は、Ｃ末端のＦＰ配列(配列番号２１)が脂質修飾されることにより、細胞膜に局在することができる。
【００４９】
ＥＧＦＲcyto遺伝子をプライマー１６(配列番号２２)及びプライマー１７(配列番号２３)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＵＹ-ＥＣ−Ｇγｃを鋳型として増幅し、プラスミドｐＵＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、ＥＧＦＲ(ＷＴ)cytoを発現可能なプラスミドｐＵＹ−ＥＣ−ＷＴとした。続いて、プラスミドｐＵＹ-ＥＣ−ＷＴを鋳型として、それぞれプライマー１６及びプライマー１８(配列番号２４)、およびプライマー１９(配列番号２５)及びプライマー１７を用いて、ＥＧＦＲ遺伝子を２つのＤＮＡ断片に分けて増幅し、プラスミドｐＵＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoを発現可能なプラスミドｐＵＹ−ＥＣ−ＬＲとした。さらに、プラスミドｐＵＹ-ＥＣ−ＷＴを鋳型として、それぞれプライマー１６及びプライマー２０(配列番号２６)、プライマー２１(配列番号２７)及びプライマー１７を用いて、ＥＧＦＲ遺伝子を２つのＤＮＡ断片に分けて増幅し、プラスミドｐＵＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＹ−ＥＣ−ＫＡとした。
【００５０】
次に、ヒトゲノムＤＮＡ(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を鋳型として、それぞれプライマー２２(配列番号２８)及びプライマー２３(配列番号２９)、プライマー２４(配列番号３０)及びプライマー２５(配列番号３１)、プライマー２６(配列番号３２)及びプライマー２７(配列番号３３)、プライマー２８(配列番号３４)及びプライマー２９(配列番号３５)、プライマー３０(配列番号３６)及びプライマー３１(配列番号３７)を用いて、増幅した５つのＤＮＡ断片を結合して、ＧＲＢ２遺伝子を構成し、プラスミドｐＨＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＨＹ−Ｇｒｂ２とした。
さらに、プラスミドｐＨＹ−Ｇｒｂ２を鋳型として、プライマー２２及びプライマー３２(配列番号３８)を用いて、ＧＲＢ２遺伝子を増幅した。続いて、プラスミドｐＨＹ−Ｇγｃｙｔｏを鋳型として、プライマー７及びプライマー８を用いて、Ｇγｃｙｔｏ遺伝子を増幅した。増幅したＧＲＢ２遺伝子及びＧγcyto遺伝子を連結して、プラスミドｐＨＹ−ＰＧＡのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入して、Ｇｒｂ２−Ｇγcyto融合タンパクを発現可能なプラスミドｐＨＹ−ＧｒＧとした。
【００５１】
（２−２）遺伝子組換え酵母の接合体増殖アッセイ
ＭＣＦ−Ｂ１Ｌを宿主細胞として選択し、図３Ｂに示す組み合わせで、ＥＧＦＲcytoおよび／またはＧｒｂ２−Ｇγcytoを発現する遺伝子組換え酵母を創製した。各遺伝子組換え酵母を接合パートナーＢＹ４７４２と１.５時間共培養して、接合体増殖アッセイを行った。各遺伝子組換え酵母から形成された接合体の数(ＯＤ600＝１の菌体懸濁液１ｍＬ中に形成された接合体の細胞数)の測定結果を図３Ｂに示す。図中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００５２】
この結果、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoおよびＧｒｂ２−Ｇγcytoを共発現する遺伝子組換え酵母のみが接合体を形成可能であることが明らかとなった。すなわち、図１Ｂに示すように、ＥＧＦＲcytoがリン酸化チロシン残基を有する場合にのみ、遺伝子組換え酵母のＧタンパク質シグナル伝達経路を活性化させることに成功した。
上述の遺伝子組換え酵母では、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoおよびＧｒｂ２−Ｇγcytoを発現させるために、２つのＹＥｐ型プラスミド、ｐＵＹ−ＥＣ−ＬＲおよびｐＨＹ−ＧｒＧ、を導入している。かかる細胞は、一方または両方のプラスミドを失うと、シグナル応答が得られなくなる。ＹＥｐ型プラスミドは、酵母１細胞当たりに数十コピー導入することが可能であり、導入した遺伝子を高発現させることが可能であるが、プラスミドの脱落が生じるため、長期的には、表現型の安定性の面において問題がある。そこで、上述の遺伝子を酵母の染色体に組み込むことで、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoおよびＧｒｂ２−Ｇγcytoを安定的に発現する、遺伝子組換え酵母の作製を試みた。
【００５３】
（２−３）染色体組込み型の遺伝子組換え酵母の作製
ＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＴHIS3をプライマー３３(配列番号３９)及びプライマー３４(配列番号４０)を用いて、ＰHIS3をプライマー３５(配列番号４１)及びプライマー３６(配列番号４２)を用いて、ＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＨＹ−ＧｒＧのＳｐｅＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＨＹ−ＧｒＧ−Ｈｐｔとした。
続いて、ｐＵＹ−ＰＧＡを鋳型として、ＵＲＡ３遺伝子をプライマー３７(配列番号４３)及びプライマー３８(配列番号４４)を用いて、ＰＣＲにより増幅した。また、ＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰSTE18をプライマー３９(配列番号４５)及びプライマー４０(配列番号４６)を用いて、ＴSTE18をプライマー４１(配列番号４７)及びプライマー４２(配列番号４８)を用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅したＵＲＡ３遺伝子、ＰSTE18、およびＴSTE18をプラスミドｐＫ６(参考文献９参照)のＰｖｕＩＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＧ−ＵＳｐｔとした。さらに、プラスミドｐＵＹ−ＥＣ−ＬＲを鋳型として、ＰPGK1−ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto−ＴADH1を、プライマー４３(配列番号４９)及びプライマー４４(配列番号５０)を用いて、ＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＵＧ−ＵＳｐｔのＸｈｏＩ−ＳａｃＩＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＵＧ−ＵＳｐｔ−ＬＲとした。
【００５４】
相同組換えを用いて、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto遺伝子およびＧｒｂ２−Ｇγcyto遺伝子を、酵母の染色体に導入する方法の概略を図４Ａに示す。
プラスミドｐＨＹ−ＧｒＧ−ＨｐｔをＳｐｅＩで消化して作成したＤＮＡ断片を用いて、ＭＣＦ−Ｂ１Ｌ株を宿主として、酢酸リチウム法により遺伝子組換え酵母を作製した。遺伝子組換え酵母は、ヒスチジンを欠くＳＤ培地で選択し、Ｇｒｂ２−Ｇγcytoを安定的に発現するＢ１Ｌ−ＧｒＧ株(表１)を得た。さらに、プラスミドｐＵＧ−ＵＳｐｔ−ＬＲをＳｐｅＩで消化して作成したＤＮＡ断片を用いて、Ｂ１Ｌ−ＧｒＧ株を酢酸リチウム法により形質転換した。遺伝子組換え酵母は、０.２ｍｇ／ｍＬのジェネティシン(Ｇ４１８)を含むＹＰＤ培地で選択し、恒常的二量体化によりチロシン基がリン酸化された状態のＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto及びＧｒｂ２−Ｇγcytoを安定的に共発現するＢ１Ｕ−ＧＬ株(表１)を得た。
【００５５】
（２−４）染色体組込み型遺伝子組換え酵母の接合体増殖アッセイ
Ｂ１Ｌ−ＧｒＧまたはＢ１Ｕ−ＧＬを、接合パートナーＢＹ４７４２と、８時間共培養して、滅菌水で洗浄したのち、接合体のみが生育可能なＳＤ固体培地に塗布して、３０℃で２日間培養した。図４Ｂは、Ｂ１Ｌ−ＧｒＧ(ＥＧＦＲcytoを発現しない遺伝子組換え酵母)とＢＹ４７４２を塗布して、２日間培養した固体培地の写真であり、接合体のコロニーは全く形成されなかった。一方、図４Ｃは、Ｂ１Ｕ−ＧＬ(ＥＧＦＲ(ＬＲ)cytoを発現する遺伝子組換え酵母)とＢＹ４７４２を塗布して、２日間培養した固体培地の写真であり、接合体のコロニー形成が観察された。
さらに、各染色体組込み型遺伝子組換え酵母から形成された接合体の数(ＯＤ600＝１の菌体懸濁液１ｍＬ中に形成された接合体の細胞数)の測定結果を図４Ｄに示す。図中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。この結果、プラスミドを用いた場合と同様に、ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto遺伝子およびＧｒｂ２−Ｇγcyto遺伝子を、酵母の染色体に導入することで、ＥＧＦＲcytoのチロシンキナーゼ活性により、Ｇタンパク質シグナル伝達経路の活性化が可能であることを確認した。
【００５６】
（実施例３）ＡＧ１４７８を用いたＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性の阻害例
（３−１）ＡＧ１４７８濃度の検討
Ｂ１Ｕ−ＧＬを、既知のＥＧＦＲ特異的チロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８(4-(3-Chloroanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline)を含む培地で、１８時間培養した。培養した酵母とＢＹ４７４２を、ＡＧ１４７８を含む新鮮培地に播種して、３０℃にて８時間共培養し、固体培地上に塗布して３０℃で２日間培養した。形成した接合体コロニーの数を調べた結果を図５Ａに示す。この結果、ＡＧ１４７８の用量依存的に、接合体数が減少することを確認した。また、終濃度２０μＭのＡＧ１４７８を添加した場合、接合体がほとんど形成されなかった。
【００５７】
（３−２）ＡＧ１４７８が酵母の内在タンパク質に及ぼす効果の判定
ＢＹ４７４１またはＢ１Ｕ−ＧＬに対して、０または２０μＭのＡＧ１４７８を添加して、接合体増殖アッセイを行った。各条件で形成した接合体のコロニー数を測定し、それぞれ、ＡＧ１４７８を添加しない場合の値を１００％として、ＡＧ１４７８の添加が接合体形成に与える効果を調べた。測定結果を図５Ｂに示す。
２０μＭのＡＧ１４７８を添加した場合、ＢＹ４７４１では接合体の形成が阻害されなかったが、Ｂ１Ｕ−ＧＬでは、接合体の形成数が０.６％以下に減少した。この結果より、ＡＧ１４７８は、酵母の内在タンパク質に対してではなく、ＥＧＦＲcytoのチロシンキナーゼに作用して、Ｇタンパク質シグナル伝達を阻害することが示された。
【００５８】
（参考文献）
参考文献７：Brachmann CB, et. al., 1998, Yeast. Vol14，115-132.
参考文献８：Fukuda N, et. al.，2013，PLoS One Vol.26，e70100.
参考文献９：Fukuda N, et. al.，2013，ACS Synth．Biol.，DOI: 10.1021/sb400016j
参考文献１０：Velu TJ, et. al., 1989，J Cell Biochem.，Vol.39，153-166.
参考文献１１：Shigesada K, et. al., 1985，Mol Cell Biol.，Vol.5，1735-1742.
参考文献１２：Clark AJ, et. al., 1986，Biochim Biophys Acta.，Vol.867,244-251.
参考文献１３：Velu TJ, et. al., 1987，Science.，Vol.238，1408-1410.
参考文献１４：Gietz D, et. al., 1992, Nucleic Acids Res. Vol20，1425.
参考文献１５：Honegger AM, et. al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA. Vol 86，925-929.
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、ＲＴＫを標的としたチロシンキナーゼ阻害剤に対する、簡便かつ迅速なハイスループット・スクリーニングが可能となる。本発明の方法により、取得された薬剤候補物質は、細胞膜を透過し、必要な期間、細胞内環境で機能することが可能であり、上記受容体を分子標的とした抗癌剤開発における、創薬シード化合物として利用することができる。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１  ：ＥＧＦＲ(Homo Sapiens)
配列番号２  ：Ｇｒｂ２(Homo Sapiens)
配列番号３  ：Ｇγcyto(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号４  ：ＧＦＰ
配列番号５  ：ＭＰ配列(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号６  ：プライマー１(Ｆ)ＰPGK1増幅
配列番号７  ：プライマー２(Ｒ)ＰPGK1増幅
配列番号８  ：プライマー３(Ｆ)ＥＧＦＲ遺伝子増幅
配列番号９  ：プライマー４(Ｒ)ＥＧＦＲ遺伝子増幅
配列番号１０：プライマー５(Ｆ)ＥＧＦＲcyto遺伝子増幅
配列番号１１：プライマー６(Ｒ)ＥＧＦＲcyto遺伝子増幅
配列番号１２：プライマー７(Ｆ)Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１３：プライマー８(Ｒ)Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１４：プライマー９(Ｆ)ＥＣ２２−Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１５：プライマー１０(Ｆ)ＥＣ５０−Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１６：プライマー１１(Ｆ)ＥＣ１０８−Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１７：プライマー１２(Ｆ)ＥＣ２０１−Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１８：プライマー１３(Ｆ)ＥＣ３００−Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号１９：プライマー１４(Ｆ)ＥＣ４０１−Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号２０：プライマー１５(Ｒ)Ｇγcyto遺伝子増幅
配列番号２１：ＦＰ配列(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号２２：プライマー１６(Ｆ)ＥＧＦＲcyto遺伝子増幅
配列番号２３：プライマー１７(Ｒ)ＥＧＦＲcyto遺伝子増幅
配列番号２４：プライマー１８(Ｒ)ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto遺伝子増幅
配列番号２５：プライマー１９(Ｆ)ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto遺伝子増幅
配列番号２６：プライマー２０(Ｒ)ＥＧＦＲ(ＫＡ)cyto遺伝子増幅
配列番号２７：プライマー２１(Ｆ)ＥＧＦＲ(ＫＡ)cyto遺伝子増幅
配列番号２８：プライマー２２(Ｆ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン１増幅
配列番号２９：プライマー２３(Ｒ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン１増幅
配列番号３０：プライマー２４(Ｆ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン２増幅
配列番号３１：プライマー２５(Ｒ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン２増幅
配列番号３２：プライマー２６(Ｆ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン３増幅
配列番号３３：プライマー２７(Ｒ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン３増幅
配列番号３４：プライマー２８(Ｆ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン４増幅
配列番号３５：プライマー２９(Ｒ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン４増幅
配列番号３６：プライマー３０(Ｆ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン５増幅
配列番号３７：プライマー３１(Ｒ)ＧＲＢ２遺伝子エクソン５増幅
配列番号３８：プライマー３２(Ｒ)ＧＲＢ２遺伝子増幅
配列番号３９：プライマー３３(Ｆ)ＴHIS3増幅
配列番号４０：プライマー３４(Ｒ)ＴHIS3増幅
配列番号４１：プライマー３５(Ｆ)ＰHIS3増幅
配列番号４２：プライマー３６(Ｒ)ＰHIS3増幅
配列番号４３：プライマー３７(Ｆ)ＵＲＡ３遺伝子増幅
配列番号４４：プライマー３８(Ｒ)ＵＲＡ３遺伝子増幅
配列番号４５：プライマー３９(Ｆ)ＰSTE18増幅
配列番号４６：プライマー４０(Ｒ)ＰSTE18増幅
配列番号４７：プライマー４１(Ｆ)ＴSTE18増幅
配列番号４８：プライマー４２(Ｒ)ＴSTE18増幅
配列番号４９：プライマー４３(Ｆ)ＰPGK1−ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto−ＴADH1増幅
配列番号５０：プライマー４４(Ｒ)ＰPGK1−ＥＧＦＲ(ＬＲ)cyto−ＴADH1増幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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