(57)【要約】      （修正有）【課題】薬物の効き目の短い半減期を延長させるための抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインＤＯＭ７ｈ−１１の改善された変異体、並びにこの変異体、組成物、核酸、ベクター及び宿主を含むリガンドおよび薬物抱合体の提供。【解決手段】ＤＯＭ７ｈ−１１と比較して、ＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を含み、かつ、ＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較して２〜８個の変化を有する、抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＯＭ７ｈ−１１（図１に示すＤＯＭ７ｈ−１１）の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体であって、ＤＯＭ７ｈ−１１と比較して、ＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を含み、かつ、ＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較して２〜８個の変化を有する、変異体。
【請求項２】
４９位（Ｋａｂａｔによる）がＬｅｕである、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
５０位（Ｋａｂａｔによる）がＡｌａまたはＴｒｐである、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
５１位（Ｋａｂａｔによる）がＰｈｅまたはＡｓｎである、請求項１、２または３に記載の変異体。
【請求項５】
ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号５）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号１）およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９（配列番号４）から選択される単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、あるいは、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列が請求項１〜４のいずれか一項に定義される変異をＦＷ２／ＣＤＲ２接合部に少なくとも１個有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項６】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（配列番号４１４）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、あるいは、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列が請求項１〜４のいずれか一項に定義される変異をＦＷ２／ＣＤＲ２接合部に少なくとも１個有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項７】
ＤＯＭ７ｈ−１１の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体であって、ＤＯＭ７ｈ−１１（図１に示す）と比較して３２位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）にＭｅｔを含み、かつ、ＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較して０〜４個の変化をさらに有する、変異体。
【請求項８】
ＤＯＭ７ｈ−１１（図１に示す）と比較して、ＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を含む、請求項７に記載の変異体。
【請求項９】
ＤＯＭ７ｈ−１１（図１に示す）と比較して、
４９位＝Ｌ、
５０位＝ＡまたはＷ、
５１位＝ＦまたはＮ、
８７位＝Ｈ、および
９１位＝Ｔ
から選択される少なくとも１個の変異を含む、請求項７に記載の変異体。
【請求項１０】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号１）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１８（配列番号３）およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９（配列番号４）から選択される単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、あるいは、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列が３２位にＭｅｔを有する、請求項７に記載の変異体。
【請求項１１】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（配列番号４１４）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、あるいは、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列が３２位にＭｅｔを有する、請求項７に記載の変異体。
【請求項１２】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約０．１〜約１００００ｎＭ、任意に約１〜約６０００ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１３】
表面プラズモン共鳴法によって測定される、約１．５×１０−４〜約０．１ｓｅｃ−１、任意に約３×１０−４〜約０．１ｓｅｃ−１の解離速度定数（Ｋｄ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴法によって測定される、約２×１０６〜約１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に約１×１０６〜約２×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１の会合速度定数（Ｋａ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１５】
表面プラズモン共鳴法で測定される、約０．１〜約１００００ｎＭ、任意に約１〜約６０００ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、カニクイザル（Cynomolgus monkey）ＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１６】
表面プラズモン共鳴法によって測定される、約１．５×１０−４〜約０．１ｓｅｃ−１、任意に約３×１０−４〜約０．１ｓｅｃ−１の解離速度定数（Ｋｄ）で、カニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１７】
表面プラズモン共鳴法によって測定される、約２×１０６〜約１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、任意に約１×１０６〜約５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１の会合速度定数（Ｋａ）で、カニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗ＳＡ変異体と、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部分とを含んでなる、多重特異性リガンド。
【請求項１９】
薬物（任意にＮＣＥ薬物）に抱合されており、任意に、前記選択された変異体がＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（配列番号４１４）またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号１）であってもよい、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗ＳＡ変異体単一可変ドメイン。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の変異体に融合されたポリペプチド薬物またはペプチド薬物を含んでなる融合タンパク質であって、任意に、前記選択された変異体がＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（配列番号４１４）またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号１）であってもよい、融合タンパク質。
【請求項２１】
前記変異体と前記薬物の間にリンカー（例えば、アミノ酸配列ＴＶＡ、任意にＴＶＡＡＰＳを含むリンカー）を含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の変異体、融合タンパク質またはリガンド、および薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含む、組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の変異体、請求項１８に記載の多重特異性リガンド、または請求項２０もしくは２１に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸。
【請求項２４】
ＤＯＭ７ｈ−１１−３（配列番号５）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２（配列番号１）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１８（配列番号３）およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９（配列番号４）のヌクレオチド配列から選択されるＤＯＭ７ｈ−１１変異体のヌクレオチド配列、または前記選択された配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸。
【請求項２５】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（配列番号４１４）のヌクレオチド配列、または前記選択された配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸。
【請求項２６】
請求項２３、２４または２５に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含んでなる、単離された宿主細胞。
【請求項２８】
患者における疾患または障害を治療または予防する方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の変異体の少なくとも１用量を前記患者に投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインＤＯＭ７ｈ−１１の改良型変異体、ならびにこの変異体、組成物、核酸、ベクターおよび宿主を含むリガンドと薬物の抱合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開番号第ＷＯ０４／００３０１９号および第ＷＯ２００８／０９６１５８号は、抗血清アルブミン（ＳＡ）結合部分、たとえば、薬学的に有用な半減期を有する抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）を開示する。これら公報は、単量体抗血清アルブミンｄＡｂ、ならびにこのようなｄＡｂ（たとえば抗血清アルブミンｄＡｂを含むリガンド、およびＴＮＦＲ１などの標的抗原に特異的に結合するｄＡｂ）を含む多重特異性リガンドを開示する。２種類以上の種に由来する血清アルブミン、たとえばヒト／マウス交差反応性抗血清アルブミンｄＡｂに特異的に結合する結合部分が開示されている。
【０００３】
国際公開番号第ＷＯ０５／１１８６４２号および国際公開番号第２００６／０５９１０６号は、薬物の半減期を増加させるために、抗ＳＡ結合部分、たとえば抗ＳＡ免疫グロブリン単一可変ドメインをある薬物に抱合するまたは結合させる概念を開示する。タンパク質、ペプチド、およびＮＣＥ（新規化学物質）薬物が開示され、例示されている。国際公開番号第ＷＯ２００６／０５９１０６号は、インスリン分泌促進薬、たとえばグリカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１などのインクレチンホルモンの半減期を増加させるためにこの概念の使用を開示する。
【０００４】
また、Ｈｏｌｔらの「効き目の短い薬物の半減期を延長するための抗血清アルブミンドメイン抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ｖｏｌ  ２１，  ｎｏ  ５，  ｐｐ２８３−２８８，２００８を参照されたい。
【０００５】
国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号は、ＤＯＭ７ｈ−１１を開示する。これは良好な抗血清アルブミンｄＡｂである。ＤＯＭ７ｈ−１１の変異体であり、かつ血清アルブミン、好ましくはヒトおよび非ヒト種に由来するアルブミンに特異的に結合する改善型ｄＡｂを提供することが好ましい。このｄＡｂは疾患の動物モデルにおける有用性ならびにヒトの治療および／または診断のための有用性を提供する。また、比較的中程度の親和性と高親和性の抗血清アルブミン結合残基（ｄＡｂ）の間の選択を提供することが好ましい。かかる部分は薬物に連結されることが可能であり、抗ＳＡ結合部分は想定される最終用途によって選択される。これにより抗ＳＡ結合部分の選択に基づいて、薬物を慢性徴候または急性徴候の治療および／または予防の目的に、より良く適合させることが可能になる。溶液中で単量体であるまたは実質的に単量体である抗ｄＡｂを提供することも好ましい。これは、ＴＮＲＦ１などの細胞表面受容体に拮抗させることを目的として、その受容体に特異的に連結するｄＡｂなどの結合部分に抗血清アルブミンｄＡｂが連結されるとき、特に有利になるであろう。多量体は細胞表面で受容体（たとえばＴＮＦＲ１）に結合および架橋結合するものを形成する可能性は低く、したがって、受容体アゴニズムおよび有害な受容体シグナリングの可能性が増加するので、抗血清アルブミンｄＡｂの単量体状態は、受容体が架橋結合する機会を減少させるのに有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様は、これらの課題を解決する。
この目的のために、本願発明者らは、意外なことだが、ＤＯＭ７ｈ−１１のＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）を標的にすることにより、有益な変異が得られることを見出した。
【０００７】
したがって、本発明の一態様では、ＤＯＭ７ｈ−１１の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体を提供する。ここで該変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、ＦＷ２／ＣＤＲ２接合物（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を含み、およびＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較すると、２〜８個の変化を有する。
【０００８】
一態様では、本発明はＤＯＭ７ｈ−１１の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体を提供する。ここで該変異体はＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、３２位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）でＭｅｔを含み、および該変異体はＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較すると、０〜４個の変化をさらに有する。
【０００９】
本発明のいずれかの態様の実施形態は、抗血清アルブミン親和性が良好なＤＯＭ７ｈ−１１の変異体を提供する。変異体の選択は、所望の治療的設定および／または予防的設定に従った半減期の調整を可能にする。たとえば、一実施形態では、血清アルブミンへの変異体の親和性は比較的高く、それにより慢性的もしくは持続的な疾患、状態、毒性または他の慢性的な徴候の治療および／または予防に有用な産物へ変異体を包含させることが有効となる。一実施形態では、血清アルブミンへの変異体の親和性は比較的低く、それにより急性の疾患、状態、毒性または他の急性の徴候の治療および／または予防に有用な産物へ変異体を包含させることが有効となる。一実施形態では、血清アルブミンへの変異体の親和性は中間程度であり、それにより急性的または慢性的疾患、状態、毒性または他の急性的または慢性的な徴候の治療および／または予防に有用な産物へ変異体を包含させることが有効となる。
【００１０】
血清アルブミンに対して適切に高い親和性および特異性を有する分子は、所望の治療効果を得るため、十分に長く循環にとどまると考えられる（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２，  ５２１−５２２  （２００４））。ここでも、高親和性の抗ＳＡ変異体は、その種の血清アルブミンの親和性とマッチして、血清循環にとどまるであろう（国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号）。ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）変異体（ＡｌｂｕｄＡｂは抗血清アルブミンｄＡｂまたは免疫グロブリン単一可変ドメインである）に融合した治療薬、ＮＣＥ、ペプチドまたはタンパク質の治療薬はいずれも、いったん循環に入ると、結果的にその標的上で長く作用し、長期持続する治療効果を示すことができる。このため、頻回投与を必要とせずに慢性疾患または持続性疾患を標的にすることが可能になり得る。
【００１１】
中親和性（しかしＳＡへの特異性）を有する変異体は、短時間（たとえば、数時間または数日間）、血清循環にとどまるだけであり、融合治療薬によって、急性疾患に関与する治療的標的を特異的に標的にすることが可能となる。
【００１２】
このように、適切なアルブミン結合親和性および／または血清半減期を有する抗ＳＡアルブミン変異体を選択することによって、抗ＳＡを含む産物を疾患の治療領域に合わせて調整することが可能になる。
【００１３】
本発明のある態様は、前述の抗ＳＡ変異体のいずれかと、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部分とを含む多重特異性リガンドを提供する。
【００１４】
本発明のある態様は、融合産物、たとえば、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたは上述のいずれかの変異体と（ＮＣＥのために融合もしくは抱合した）ＮＣＥ薬物を含む融合タンパク質またはペプチドもしくはＮＣＥ（新規化学物質）との融合薬物を提供する。ここで該変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（もしくはＤＯＭ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を有する変異体）またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２（もしくはＤＯＭ７ｈ−１１−１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を有する変異体）である。ＤＯＭ７ｈ−１１−１５およびＤＯＭ７ｈ−１１−１２は、融合産物においてこれらを有用にするパートナーに融合または抱合されるとき、親和性においてわずかな低下をもたらす。ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐは、１２位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）がセリンの代わりにプロリンであることを除いて、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５と同一である。これは、このドメイン抗体を含む融合タンパク質のタンパク質Ｌへの結合を低減させ、かつ精製を容易にすることを含み、国際公開番号第ＷＯ０８／０５２９３３号に記載された様々な利点を提供する。国際公開番号第ＷＯ０８／０５２９３３号の開示全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。同様に、本発明は、本明細書で開示するように、１２位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）がプロリンであることを除いて、以下に記載するアミノ酸配列を含むＤＯＭ７ｈ−１１変異体を提供する。本発明はまた、このＤＯＭ７ｈ−１１変異体を含む融合タンパク質、抱合体または組成物を提供する。
【００１５】
本発明の一態様は、ＤＯＭ７ｈ−１１の変異体を提供する。この変異体はＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、または該変異体のアミノ酸配列がＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を有するという条件で、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と比較すると最高４個の変化を有する。
【００１６】
本発明のある態様は、前述のいずれかの態様の変異体、融合タンパク質またはリガンド、および薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明のある態様は、患者の疾患または障害を治療または予防する方法を提供し、該方法は、本発明の実施形態のいずれかの態様によって前述の患者に変異体の少なくとも１用量を投与することを含む。
【００１８】
本発明のある態様は、本明細書で開示する抗血清アルブミンｄＡｂ（たとえばＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｈ−１１−３またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２ＰもしくはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と比較すると最高４個の変化を有するＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ）およびインクレチンまたはインスリン分泌促進剤（たとえばエキセンディン−４、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（６−３６））または国際公開番号第ＷＯ０６／０５９１０６号に開示されたいずれかのインクレチンもしくはインスリン分泌促進剤を含むポリペプチド融合体または抱合体を提供する。本発明および添付の特許請求の範囲への包含のために、本明細書にあたかも記述されたかのように、これらの薬剤は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１は、本発明のＤＯＭ７ｈ−１１変異体ｄＡｂのアミノ酸配列の配列比較である。特定の位置での「．」は、その位置でＤＯＭ７ｈ−１１において見出されたのと同じアミノを示す。ＣＤＲは、下線および太字のテキストで示す（第１の下線を引いた配列はＣＤＲ１であり、第２の下線を引いた配列はＣＤＲ２であり、および第３の下線を引いた配列はＣＤＲ３である）。
【図１Ｂ】図１は、本発明のＤＯＭ７ｈ−１１変異体ｄＡｂのアミノ酸配列の配列比較である。特定の位置での「．」は、その位置でＤＯＭ７ｈ−１１において見出されたのと同じアミノを示す。ＣＤＲは、下線および太字のテキストで示す（第１の下線を引いた配列はＣＤＲ１であり、第２の下線を引いた配列はＣＤＲ２であり、および第３の下線を引いた配列はＣＤＲ３である）。
【図２Ａ】図２は、ＤＯＭｈ７−１１の変異体の反応速度パラメータを示す。ＫＤ単位＝ｎＭ；Ｋｄ単位＝ｓｅｃ−１；Ｋａ単位＝Ｍ−１ｓｅｃ−１。記号Ａｅ−Ｂは、Ａ×１０−Ｂを意味し、およびＣｅＤはＣ×１０Ｄを意味する。下記の実施例によって裏付けられるように、種々の種における全反応速度範囲が示される。また任意の範囲を、特定の治療期（急性もしは慢性の徴候、状態または疾患の期間、および慢性および急性の両方で使用する「中間期」）での使用に提供する。これらを含む高親和性ｄＡｂおよび産物は慢性期に有用である。これらを含む中親和性ｄＡｂおよび産物は中間期に有用である。これらを含む低親和性ｄＡｂおよび産物は急性期に有用である。この点に関する親和性は、血清アルブミンへの親和性である。種々の実施例の抗血清ｄＡｂおよび融合タンパク質が収載されるが、これらは開示されるる範囲を裏付けている。実施例の多くは、ヒトおよび１種類または複数種類の非ヒト動物（たとえばヒトおよびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）および／またはマウス）において有利な反応速度を有する。これを含むｄＡｂまたは産物の選択は、治療的に処置されるべき期間（たとえば慢性期または急性期）に基づき、本発明に従って調整できる。
【図２Ｂ】図２は、ＤＯＭｈ７−１１の変異体の反応速度パラメータを示す。ＫＤ単位＝ｎＭ；Ｋｄ単位＝ｓｅｃ−１；Ｋａ単位＝Ｍ−１ｓｅｃ−１。記号Ａｅ−Ｂは、Ａ×１０−Ｂを意味し、およびＣｅＤはＣ×１０Ｄを意味する。下記の実施例によって裏付けられるように、種々の種における全反応速度範囲が示される。また任意の範囲を、特定の治療期（急性もしは慢性の徴候、状態または疾患の期間、および慢性および急性の両方で使用する「中間期」）での使用に提供する。これらを含む高親和性ｄＡｂおよび産物は慢性期に有用である。これらを含む中親和性ｄＡｂおよび産物は中間期に有用である。これらを含む低親和性ｄＡｂおよび産物は急性期に有用である。この点に関する親和性は、血清アルブミンへの親和性である。種々の実施例の抗血清ｄＡｂおよび融合タンパク質が収載されるが、これらは開示されるる範囲を裏付けている。実施例の多くは、ヒトおよび１種類または複数種類の非ヒト動物（たとえばヒトおよびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）および／またはマウス）において有利な反応速度を有する。これを含むｄＡｂまたは産物の選択は、治療的に処置されるべき期間（たとえば慢性期または急性期）に基づき、本発明に従って調整できる。
【図２Ｃ】図２は、ＤＯＭｈ７−１１の変異体の反応速度パラメータを示す。ＫＤ単位＝ｎＭ；Ｋｄ単位＝ｓｅｃ−１；Ｋａ単位＝Ｍ−１ｓｅｃ−１。記号Ａｅ−Ｂは、Ａ×１０−Ｂを意味し、およびＣｅＤはＣ×１０Ｄを意味する。下記の実施例によって裏付けられるように、種々の種における全反応速度範囲が示される。また任意の範囲を、特定の治療期（急性もしは慢性の徴候、状態または疾患の期間、および慢性および急性の両方で使用する「中間期」）での使用に提供する。これらを含む高親和性ｄＡｂおよび産物は慢性期に有用である。これらを含む中親和性ｄＡｂおよび産物は中間期に有用である。これらを含む低親和性ｄＡｂおよび産物は急性期に有用である。この点に関する親和性は、血清アルブミンへの親和性である。種々の実施例の抗血清ｄＡｂおよび融合タンパク質が収載されるが、これらは開示されるる範囲を裏付けている。実施例の多くは、ヒトおよび１種類または複数種類の非ヒト動物（たとえばヒトおよびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）および／またはマウス）において有利な反応速度を有する。これを含むｄＡｂまたは産物の選択は、治療的に処置されるべき期間（たとえば慢性期または急性期）に基づき、本発明に従って調整できる。
【図２Ｄ】図２は、ＤＯＭｈ７−１１の変異体の反応速度パラメータを示す。ＫＤ単位＝ｎＭ；Ｋｄ単位＝ｓｅｃ−１；Ｋａ単位＝Ｍ−１ｓｅｃ−１。記号Ａｅ−Ｂは、Ａ×１０−Ｂを意味し、およびＣｅＤはＣ×１０Ｄを意味する。下記の実施例によって裏付けられるように、種々の種における全反応速度範囲が示される。また任意の範囲を、特定の治療期（急性もしは慢性の徴候、状態または疾患の期間、および慢性および急性の両方で使用する「中間期」）での使用に提供する。これらを含む高親和性ｄＡｂおよび産物は慢性期に有用である。これらを含む中親和性ｄＡｂおよび産物は中間期に有用である。これらを含む低親和性ｄＡｂおよび産物は急性期に有用である。この点に関する親和性は、血清アルブミンへの親和性である。種々の実施例の抗血清ｄＡｂおよび融合タンパク質が収載されるが、これらは開示されるる範囲を裏付けている。実施例の多くは、ヒトおよび１種類または複数種類の非ヒト動物（たとえばヒトおよびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）および／またはマウス）において有利な反応速度を有する。これを含むｄＡｂまたは産物の選択は、治療的に処置されるべき期間（たとえば慢性期または急性期）に基づき、本発明に従って調整できる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書では、本発明は、明瞭かつ簡潔な明細書の記載を心がけ、実施形態を参照して記述されている。実施形態が本発明から逸脱することなく、さまざまに組み合わせまたは分割され得ることが意図されており、かつその点は理解されるべきである。
【００２１】
別段定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、当業者（たとえば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学の分野の）によって一般に理解されるのと同じ意味をもつ。分子遺伝学的方法および生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  Ｅｄ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を全体として参照されたい。これらは参照によって本明細書に組み込まれる）ならびに化学的方法については、標準的な技法が用いられる。
【００２２】
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）の拮抗剤」または「抗ＴＮＦＲ１拮抗剤」等は、ＴＮＦＲ１に結合して、ＴＮＦＲ１のある（すなわち１つまたは複数の）機能を抑制できる薬剤（たとえば分子、化合物）をいう。たとえば、ＴＮＦＲ１の拮抗剤は、ＴＮＦαによるＴＮＦＲ１への結合および／またはＴＮＦＲ１を介して媒介されるシグナル伝達を抑制することができる。したがって、ＴＮＦＲ１媒介プロセスおよび細胞応答（たとえば標準Ｌ９２９細胞毒性アッセイにおけるＴＮＦα誘発細胞死）は、ＴＮＦＲ１の拮抗剤によって抑制できる。
【００２３】
「患者」は、任意の動物、たとえば哺乳類、たとえば非ヒト霊長類（ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなど）、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、イヌ、ネコまたはブタである。一実施形態では、患者はヒトである。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「ペプチド」は、ペプチド結合を介して結合される、約２〜約５０個のアミノ酸をいう。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合される、少なくとも約５０個のアミノ酸をいう。ポリペプチドは、通常三次構造を含み、機能ドメインの形に折り畳まれる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、抗体は、自然に抗体を産生する任意の種に由来するか、または組換えＤＮＡ技術によって作製されたものか、あるいは血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されたものであるかに拘らず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥもしくは断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造の多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体）をいう。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「抗体の型式」とは、構造的に抗原への結合特異性を与えるため、１つまたは複数の抗体可変ドメインを組み込むことができる、任意の適切なポリペプチド構造をいう。種々の適切な抗体の型式は、当技術分野で既知であり、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体ならびにヘテロ二量体、前述のいずれかの抗原結合断片（たとえばＦｖ断片（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖなど）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（たとえば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、および前述の任意の修飾バージョン（たとえばポリエチレングリコールもしくは他の適切なポリマーの共有結合またはヒト化ＶＨＨによる修飾）がある。
【００２８】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、異なるＶ領域もしくはドメインとは独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）をいう。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有する型式（たとえば、ホモ多量体またはヘテロ多量体）に存在することができるが、ここで言う他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には必要とされていない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは当該追加の可変ドメインとは独立に抗原に結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」という用語は、本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」という用語は、本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同一である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（たとえば、国際公開番号第ＷＯ００／２９００４号に開示され、その開示内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）、テンジクザメおよびラクダ科の動物（Ｃａｍｅｌｉｄ）のＶＨＨｄＡｂなどの他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科の動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、自然には軽鎖が欠如する重鎖抗体を産生する。ＶＨＨはヒト化されてもよい。
【００２９】
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分から独立して三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。通常、ドメインはタンパク質の異なる機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能を失わずに付加、除去、または他のタンパク質へ移転される。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインを特徴づける配列を有する折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、これには、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン（たとえば、その１つまたは複数のループが、抗体可変ドメインを特徴づけていない配列で置き換えられている）、あるいは切断された抗体可変ドメインまたはＮ末端もしくはＣ末端の伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも完全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片が含まれる。 
【００３０】
本出願では、「予防」および「予防すること」という用語には、疾患または状態が誘発される前に行われる保護組成物の投与が含まれ。「治療」および「治療すること」には、疾患または状態の症状が現れた後に行われる保護組成物の投与が含まれ。「抑制」または「抑制すること」とは、疾患または状態の誘発現象の後のことではあるが、その疾患または状態の臨床的出現より前に行われる組成物の投与をいう。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「用量」という用語は、被験者に、一度（単位用量）に、または規定された時間間隔にわたり２回以上の投与で投与されるリガンドの量をいう。たとえば用量は、１日（２４時間）（１日量）、２日、１週間、２週間、３週間または１ヵ月以上の期間にわたり被験者に投与（たとえば単回投与によって、または２回以上の投与によって）されるリガンド（たとえば、標的抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量をいうことができる。投与間隔は任意の所望の時間量であり得る。
用量をいうとき、「薬学的に有効な」という用語は、所望の効果をもたらすためのリガンド、ドメインまたは薬学的に活性な薬剤の十分量を意味する。「有効」である量は、個体の年齢および全身症状、特定の薬物または薬学的に活性な薬剤等に応じて、被験者間で異なる。したがって、すべての患者に適用できる正確な「有効」量を特定することは、必ずしも可能でない。しかし、いずれの個体の場合でも、適切な「有効」量は、通常の実験方法を用いて当業者によって決定可能である。
【００３２】
薬物動態学的分析およびリガンド（たとえば単一可変ドメイン、融合タンパク質または多重特異性リガンド）の半減期の決定方法は、当業者にはよく知られているであろう。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ａ  ｅｔ．ａｌ：  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ  およびＰｅｔｅｒｓ  ｅｔ，ａｌ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）に見出すことができる。また、“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，  Ｍ  Ｇｉｂａｌｄｉ  ＆
Ｄ  Ｐｅｒｒｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ２ｎｄ  Ｒｅｖ．  ｅｘ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８２）を参照されたい。この文献は、ｔαおよびｔβ半減期ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態パラメータを説明している。任意に、本明細書で引用されるすべての薬物動態パラメータおよび値は、ヒトでの値であると判断してよい。任意に、本明細書で引用されるすべての薬物動態パラメータおよび値は、マウスまたはラットまたはカニクイザルでの値であると判断してよい。
【００３３】
半減期（ｔ１／２αとｔ１／２β）およびＡＵＣは、リガンドの血清濃度対時間の曲線から決定することができる。たとえば、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ、たとえばバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ９４０４０，  ＵＳＡから入手可能）を用いて、曲線をモデル化することができる。
２コンパートメントモデリングを用いるとき、第１相（α相）において、リガンドは、一部除去されるが、患者内で主として分布中である。第２相（β相）はリガンドが分布終了したときの相であり、リガンドが患者から除去されるにつれて、血清濃度は低下する。ｔα半減期は、第１相の半減期であり、ｔβ半減期は、第２相の半減期である。このように、一実施形態では、本発明と関連して、可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１５分（またはおよそ１５分）以上の範囲の半減期を有する。一実施形態では、この範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間もしくは１２時間（またはそれぞれおよその時間）である。さらに、または代わりに、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、最高１２時間（またはおよそ１２時間）の範囲のｔα半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６または５時間（もしくは約それぞれの）である。適切な範囲の例は、１〜６時間、２〜５時間、もしくは３〜４時間（またはそれぞれおよその時間範囲）である。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、２．５時間（またはおよそ２．５時間）以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明の可変ドメイン、融合タンパク質もしくはリガンドを提供する。一実施形態では、この範囲の下限は、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間（もしくはそれぞれおよその時間）である。さらに、または代わりに、ｔβ半減期は、最高２１日または２５日（もしくはおよそ２１日または２５日）である。一実施形態では、この範囲の上限は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日、１９日、２０日、２１日または２２日（もしくはそれぞれおよその時間、日）である。たとえば、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１２〜６０時間（またはおよそ１２〜６０時間）の範囲のｔβ半減期を有する。さらなる実施形態では、それは、１２〜４８時間（またはおよそ１２〜４８時間）の範囲である。さらなる実施形態では、それは、１２〜２６時間（またはおよそ１２〜２６時間）の範囲である。
【００３５】
２コンパートメントモデリングの使用の代わりに、当業者は、ノンコンパートメントモデリングの使用に精通しているかもしれない。このモデリングを用いて、終末半減期を決定することができる（本明細書で用いる場合、用語「終末半減期」は、ノンコンパートメントモデリングを用いて決定される終末半減期を意味する）。たとえばこの方法で曲線をモデル化するため、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ、たとえばバージョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ９４０４０，  ＵＳＡから入手可能）を用いることができる。この場合、一実施形態では、単一可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、少なくとも（もしくは少なくともおよそ）８時間、１０時間、１２時間、１５時間、２８時間、２０時間、１日、２日、３日、７日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日もしくは２５日の終末半減期を有する。一実施形態では、この範囲の上限は、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間または１２０時間（もしくは約それぞれの時間）である。たとえば終末半減期は、たとえばヒトにおいて８〜６０時間、または８〜４８時間、または１２〜１２０時間（もしくは約それぞれの範囲）である。
【００３６】
さらに、または上述の判断基準の代わりに、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ以上（またはおよそ１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ）の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する。一実施形態では、この範囲の下限は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ（もしくはそれぞれおよそ）である。さらに、または代わりに、本発明による可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、最高（またはおよそ）６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬの範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、この範囲の上限は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ（もしくは約それぞれの値）である。可変ドメイン、融合タンパク質またはリガンドは、以下からなる群から選択される範囲（またはおよそその範囲）のＡＵＣを有すれば有利である。すなわち１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、および１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ。
【００３７】
「表面プラズモン共鳴法」：ヒト血清アルブミンなどの特異抗原またはエピトープが、本明細書に記述する血清アルブミン結合リガンド（たとえば特異的ｄＡｂ）との結合に関して、カニクイザル血清アルブミンなどの別の抗原またはエピトープと競合するかどうかを、競合アッセイを用いて決定することができる。同様に、競合アッセイを用いて、標的抗原またはエピトープとの結合に関して、ｄＡｂなどの第１のリガンドがｄＡｂなどの第２のリガンドと競合するかどうかを決定することができる。本明細書で用いる場合、「競合する」という用語は、２つ以上の分子間の特異的結合相互作用を任意の程度まで妨げることができる分子、化合物、好ましくはタンパク質などの物質について言及される。「競合的に阻害しない」という語句は、分子、化合物、好ましくはタンパク質などの物質が、２つ以上の分子間の特異的結合相互作用を任意の測定可能な程度まで、またはかなりの程度まで妨げないことを意味する。２つ以上の分子間の特異的結合相互作用は、単一可変ドメインとその同族パートナーまたは標的との間の特異的結合相互作用を含むことが好ましい。干渉するまたは競合する分子は、別の単一可変ドメインであり得る。または構造的および／または機能的に同族のパートナーもしくは標的に類似する分子であり得る。
【００３８】
「結合部分」という用語は、異なるエピトープまたは抗原結合とは独立に、ある抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインをいう。結合部分は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であってもよく、または非免疫グロブリンタンパク質骨格、たとえば、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アドネクチン、アフィボディ、ａｖｉｍｅｒ、ＧｒｏＥＩ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択される骨格の誘導体で、天然リガンド以外のリガンドに結合する（本発明の場合、この部分は血清アルブミンに結合する）ドメインであってもよい。国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号を参照されたい。これは、タンパク質骨格の実施例と、抗原またはエピトープ特異的結合ドメインをレパートリーから選択する方法とを開示する（実施例１７〜２５を参照されたい）。国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号におけるこれらの特異的な開示は、あたかも本明細書に明示的に書かれ、かつ本発明とともに使用するためであるかのように、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。かかる開示のいずれの部分も本発明の請求項の１項または複数項に組み込まれ得ることが想定されている。
【００３９】
一態様では、本発明はＤＯＭ７ｈ−１１の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体を提供し、ここで該変異体はＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、ＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を含み、かつ該変異体はＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較すると、２〜８個の変化を有する。任意に、４９位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）は、Ｌｅｕである。さらに、または代わりに、５０位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）は、任意にＡｌａまたはＴｒｐである。さらに、または代わりに、５１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）は、任意にＰｈｅまたはＡｓｎである。一実施形態では、変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、４９位、５０位および５１位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）の各々で変異を含む。一実施形態では、変異体はＬＦＧモチーフを含み、Ｌは４９位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）であり、Ｌ、ＦおよびＧはそれぞれ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＧｌｙである。
【００４０】
一実施形態では、上述に定義されるように、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９から選択される単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列がＦＷ２／ＣＤＲ２接合部に少なくとも１個の変異を有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列がＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を有するという条件で、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−３から選択された単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列が４９位でＬ、５０位でＷおよび５１位でＮを有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２から選択される単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列が３２位でＭ、４９位でＬを有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｈ１１−１５Ｓ１２Ｐから選択される単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列が３２位でＭ、４９位でＬ、５０位でＡおよび５１位でＦを有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１８から選択された単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列が３２位でＭ、８７位でＨを有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１９から選択された単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列が３２位でＭ、４９位でＬおよび９１位でＴを有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。この段落のすべてのナンバリングはＫａｂａｔによる。
【００４１】
本発明のある態様は、ＤＯＭ７ｈ−１１の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン変異体を提供し、ここで該変異体はＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、３２位（Ｋａｂａｔによるナンバリング）でＭｅｔを含み、かつ該変異体はＤＯＭ７ｈ−１１のアミノ酸配列と比較すると、０〜４個の変化を有する。任意に、変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、ＦＷ２／ＣＤＲ２接合部（４９位〜５１位、Ｋａｂａｔによるナンバリング）に少なくとも１個の変異を含む。
【００４２】
本発明の任意の態様の一実施形態では、変異体はＤＯＭ７ｈ−１１と比較すると、以下から選択される少なくとも１個の変異を含む。
４９位＝Ｌ、
５０位＝ＡまたはＷ、
５１位＝ＦまたはＮ、
８７位＝Ｈ、および
９１位＝Ｔ。
【００４３】
一実施形態では、変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ、ＤＯＭ７ｈ−１１−１８、およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９から選択される単一可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列、または変異体のアミノ酸配列が３２位でＭｅｔを有するという条件で、選択されたアミノ酸配列と比較して最高４個までの変化を有するアミノ酸配列を含む。
【００４４】
一実施形態では、変異体は以下の速度論的特性うちの１つまたは複数を含む：
（ａ）変異体は、表面プラズモン共鳴法で決定された場合、０．１（またはおよそ０．１）〜１００００（またはおよそ１００００）ｎＭ、任意に１（またはおよそ１）〜６０００（またはおよそ６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｂ）変異体は、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、１．５×１０−４（またはおよそ）〜０．１ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に３×１０−４（またはおよそ）〜０．１ｓｅｃ−１（またはおよそ）の解離速度定数（Ｋｄ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｃ）変異体は、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、２×１０６（またはおよそ）〜１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に１×１０６（またはおよそ）〜２×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）の会合速度定数（Ｋａ）でヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｄ）変異体は、表面プラズモン共鳴法で決定された場合、０．１（またはおよそ０．１）〜１００００（またはおよそ）ｎＭ、任意に１（またはおよそ１）〜６０００（またはおよそ６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、カニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｅ）変異体が、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、１．５×１０−４（またはおよそ）〜０．１ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に３×１０−４（またはおよそ）〜０．１ｓｅｃ−１（またはおよそ）の解離速度定数（Ｋｄ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、前述の請求項のいずれかに記載の変異体；
（ｆ）変異体が、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、２×１０６（またはおよそ）〜１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に１×１０６（またはおよそ）〜５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）の会合速度定数（Ｋａ）でカニクイザルＳＡに特異的に結合する結合部位を含む、前述の請求項のいずれかに記載の変異体；（ｇ）変異体は、表面プラズモン共鳴法で決定された場合、０．１（またはおよそ０．１）〜１００００（またはおよそ）ｎＭ、任意に１（またはおよそ１）〜６０００（またはおよそ６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、ラットＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｈ）変異体は、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、２×１０−３（またはおよそ）〜０．１５ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に９×１０−３（またはおよそ）〜０．１４ｓｅｃ−１（またはおよそ）の解離速度定数（Ｋｄ）で、ラットＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｉ）変異体は、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、２×１０６（またはおよそ）〜１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に１×１０６（またはおよそ）〜３×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）の会合速度定数（Ｋａ）で、ヒトＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｊ）変異体は、表面プラズモン共鳴法で決定された場合、１（またはおよそ１）〜１００００（またはおよそ）ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、マウスＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；
（ｋ）変異体は、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、２×１０−３（またはおよそ）〜０．１５ｓｅｃ−１（またはおよそ）の解離速度定数（Ｋｄ）で、マウスＳＡに特異的に結合する結合部位を含む；および／または
（ｌ）変異体は、表面プラズモン共鳴法によって決定された場合、２×１０６（またはおよそ）〜１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）、任意に２×１０６（またはおよそ）〜１．５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１（またはおよそ）の会合速度定数（Ｋａ）で、マウスＳＡに特異的に結合する結合部位を含む。
【００４５】
任意に、変異体は、
Ｉ：（ａ）および（ｄ）によるＫＤ、（ｂ）および（ｅ）によるＫｄ、ならびに（ｃ）および（ｆ）によるＫａ；または
ＩＩ：（ａ）および（ｇ）によるＫＤ、（ｂ）および（ｈ）によるＫｄ、ならびに（ｃ）および（ｉ）によるＫａ；または
ＩＩＩ：（ａ）および（ｊ）によるＫＤ、（ｂ）および（ｋ）によるＫｄ、ならびに（ｃ）および（ｌ）によるＫａ；または
ＩＶ：ＩおよびＩＩによる反応速度；または
Ｖ：ＩおよびＩＩＩによる反応速度；または
ＶＩ：Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩによる反応速度。
【００４６】
本発明はまた、前述の態様または本発明の実施形態のいずれかの変異体を含むリガンドを提供する。たとえば、リガンドは二重特異的なリガンドであり得る（二重特異性リガンドに関して国際公開番号第ＷＯ０４／００３０１９号を参照されたい）。一態様では、本発明は、前述の本発明の態様または実施形態のいずれかの抗ＳＡ変異体と、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部位とを含む、多重特異性リガンド提供する。この結合部分は標的に特異的に結合し、たとえば、この結合部分は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ＦａｂｄＡｂまたは非免疫グロブリンタンパク質骨格を含む結合部分であり得る。かかる部分は、国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号に詳細に開示されている（実施例１７〜２５を参照されたい。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）。非免疫グロブリン骨格の実施例は、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ｓｐＡ）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、Ａｖｉｍｅｒ（商標）、アデネクチン、ＧｒｏＥＬおよびフィブロネクチンである。
【００４７】
一実施形態では、リンカーが抗標的結合部分と抗ＳＡ単一変異体の間に備えられ、該リンカーはアミノ酸配列ＡＳＴ、任意にＡＳＴＳＧＰＳを含む。別のリンカーは、国際公開番号第ＷＯ２００７／０８５８１４号（参照によって本明細書に組み込まれる）および国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号（１３５頁１２行目から１４０頁１４行目の節を参照されたい）に記載されている。リンカーについての開示およびすべての配列は、あたかも本明細書に明示的に書かれ、かつ本発明とともに使用するためであるかのように、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。この開示のいずれの部分も本明細書の請求項の１項または複数項に組み込まれ得ることが想定されている）に記述される。
【００４８】
多重特異性リガンドの一実施形態では、標的抗原は、ポリペプチド、タンパク質または核酸であってもよく、またはその一部であってもよい。これらは天然に存在するものであってもよいし、合成であってもよい。この点において、本発明のリガンドは、標的抗原に結合し、拮抗剤または作動薬（たとえばＥＰＯ受容体作動薬）として作用することもある。当業者は、その選択肢が広範で多様であることを理解するであろう。たとえば、それらは、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体であってもよく、サイトカイン受容体には、サイトカイン、酵素、酵素の補助因子、またはＤＮＡ結合タンパク質のための受容体が含まれる。適切なサイトカインおよび増殖因子としては、好ましくは限定されないが、以下が挙げられるが。ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−２、ＥｐｏＲ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミューラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄系前駆細胞抑制因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ランテス、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、ＣＤ４、ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５、Ｃ型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質３型（ＮＳ３）、ＴＮＦ−α、ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ、ＭＭＰ−１２、ＣＥＡ、ピロリ菌、ＴＢ、インフルエンザ、Ｅ型肝炎、ＭＭＰ−１２、いくつかの細胞上で過剰発現しインターナライジングする受容体（たとえば上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、腫瘍細胞上のＥｒＢｂ２受容体、インターナライジング細胞受容体、ＬＤＬ受容体、ＦＧＦ２受容体、Ｅ��ｂＢ２受容体、トランスフェリン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰｓｍＡｒ、細胞外基質タンパク質、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、α１−アンチトリプシン，組織因子プロテアーゼ阻害剤、ＰＤＫ１、ＧＳＫ１、Ｂａｄ、カスパーゼ−９、フォークヘッド、ヘリコバクターピロリの抗原、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの抗原、およびインフルエンザウイルスの抗原。このリストが決して網羅的でないことは明らかであろう。
【００４９】
一実施形態では、多重特異性リガンドは、本発明の抗血清アブルミンｄＡｂ変異体と、抗ＴＮＦＲ１結合部分、たとえば抗ＴＮＲＦ１ｄＡｂとを含む。任意に、このリガンドは、受容体の架橋結合の機会を減少させるため、抗ＴＮＦＲ１結合部分（たとえばｄＡｂ）だけを有す。一実施形態では、抗血清アルブミンｄＡｂ変異体は、ＤＯＭ７ｈ−１１−３またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐである。
【００５０】
一実施形態では、抗ＴＮＦＲ１結合部分は、国際公開番号第ＷＯ２００８／１４９１４８号に開示されるＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６である（そのＰＣＴ出願に開示されているように、該国際公開のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、あたかも本明細書に書かれ、かつ本発明とともに使用するためであるかのように、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。この開示のいかなる部分も本明細書の請求項の１項または複数項に組み込まれ得ることが想定されている）。一実施例では、多重特異性リガンドは、ＤＯＭ１ｈ−１３１−２０６のアミノ酸配列と、ＤＯＭ７ｈ−１１−３またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｊ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列とを含む、またはこれらから構成される。
【００５１】
一実施形態では、抗ＴＮＦＲ１結合部分またはｄＡｂは、同時係属米国特許出願ＵＳＳＮ６１／１５３，７４６に開示されるそのような部分またはｄＡｂであり、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。一実施形態では、抗ＴＮＦＲ１結合部分は、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６、ＤＯＭ１ｈ−５７４−７２、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１０９、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１３８、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１６２もしくはＤＯＭ１ｈ−５７４−１８０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または表３に開示される抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂのいずれかのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、多重特異性リガンドは、ＤＯＭ１ｈ−５７４−１５６のアミノ酸配列と、ＤＯＭ７ｈ−１１−３またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列とを含む、またはこれらから構成される。
【００５２】
一実施形態では、本発明のリガンドは、１つまたは複数のポリペプチドに直接もしくは間接的に融合された本発明の変異体を含む、融合タンパク質である。たとえば、この融合タンパク質は、国際公開番号第ＷＯ２００５／１１８６４２号（この開示は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるような本発明の変異体と、そのＰＣＴ出願に定義されるポリペプチド薬物とを含む「薬物融合体」であり得る。
【００５３】
本明細書で用いる場合、「薬物」とは、個体に投与され、該個体内で生物学的標的分子に結合および／またはその機能を変化させることによって薬効、治療効果または診断効果をもたらすことができる、任意の化合物（たとえば有機小分子、核酸、ポリペプチド）を言う。標的分子は、個体のゲノムによってコードされる内在性標的分子（たとえば個体のゲノムによってコードされる酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン）または病原体のゲノムによってコードされる外因性標的分子（たとえばウイルス、細菌、真菌、線虫または他の病原体のゲノムによってコードされる酵素）であり得る。本発明の抗血清アルブミンｄＡｂ変異体を含む融合タンパク質および抱合体で用いられる適切な薬物は、国際公開番号第ＷＯ２００８／１１８６４２号および第ＷＯ２００６／０５９１０６号に開示されている（これらの開示全体を参照し、かつあたかも特定薬物のリストが本明細書に明示的に書かれたかのようにこのリスト全体を本明細書に組み込む。かかる組み込みにより、本明細書の請求項に包含される特定薬物の開示が想定されている）。たとえば、薬物はグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）もしくは変異体、インターフェロンα２ｂもしくは変異体、またはエキセンディン−４もしくは変異体であり得る。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、国際公開番号第ＷＯ２００５／１１８６４２号および第ＷＯ２００６／０５９１０６号に定義されかつ開示される薬物抱合体を提供する。ここで薬物抱合体は、本発明の変異体を含む。一実施例では、薬物は変異体に共有結合している（たとえば変異体および薬物は単一ポリペプチドの一部として発現される）。あるいは、一実施例では、薬物は変異体と非共有結合、または会合する。薬物は、（たとえば、適切なリンカーおよび／または相補結合パートナー（たとえばビオチンおよびアビジン）の非共有結合を介して）、共有結合的または非共有結合的に、変異体と直接または間接的に結合され得る。相補結合パートナーを用いるとき、結合パートナーのうちの１つは、薬物に直接または適切なリンカー部分を介して共有結合させることができ、相補結合パートナーは変異体に直接または適切なリンカー部分を介して共有結合させることができる。薬物がポリペプチドまたはペプチドであるとき、薬物組成物は、該ポリペプチドまたはペプチド、薬物およびポリペプチド結合部分が連続したポリペプチド鎖の個々の部分である、融合タンパク質であり得る。本明細書で記述する場合、ポリペプチド結合部分およびポリペプチド薬物部分は、ペプチド結合を介して直接互いに結合させることができる。または適切なアミノ酸、またはペプチドもしくはポリペプチドのリンカーを介して連結できる。
【００５５】
血清アルブミンに特異的に結合する本発明の１つの単一可変ドメイン（単量体）、または２つ以上の単一可変ドメイン（本明細書で定義されるような多量体、融合タンパク質、抱合体、および二重特異的リガンド）を含むリガンドは、標識、タグ、追加の単一可変ドメイン、ｄＡｂ、抗体、抗体断片、マーカーおよび薬物（好ましくはこれらに限定されない）から選択される１つまたは複数の物質をさらに含むことができる。これらの物質の１つまたは複数を、単一可変ドメイン（免疫グロブリンの単一可変ドメインまたは非免疫グロブリンの単一可変ドメイン）を含むリガンドのＣＯＯＨ末端もしくはＮ末端のいずれかに、またはＮ末端およびＣＯＯＨ末端の両方に位置づけることができる。これらの物質の１つまたは複数は、１つの単一可変ドメイン（単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（本明細書で定義されるような多量体、融合タンパク質、抱合体、および二重特異的リガンド）を含むリガンドの血清アルブミンに特異的に結合する単一可変ドメインのＣＯＯＨ末端もしくはＮ末端、またはＮ末端およびＣＯＯＨ末端の両方に位置付けることができる。これらの末端の１つまたは両方に位置することができるタグの非限定的な例としては、ＨＡ、ｈｉｓまたはｍｙｃタグが挙げられる。１つまたは複数のタグ、標識および薬物を含む物質は、上述のように直接またはリンカーを介して血清アルブミンに結合する１つの単一可変ドメイン（単量体）または２つ以上の単一可変ドメイン（本明細書で定義されるように多量体、融合タンパク質、抱合体、および二重特異的リガンド）を含むリガンドに、結合させることができる。
【００５６】
本発明のある態様は、上述のように任意の変異体に（ＮＣＥのために）融合または抱合したポリペプチド薬物を含む、融合タンパク質またはペプチドとの融合体またはＮＣＥ（新規化学部物質）薬物との抱合体などの融合産物を提供する。ここで、変異体は任意に、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ（または、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５もしくはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸を有する変異体）またはＤＯＭ７ｈ−１１−１２（または、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５もしくはＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸を有する変異体）である。ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２ＰおよびＤＯＭ７ｈ−１１−１２は、パートナーと融合または抱合されるとき、親和性にわずかな低下が生じるだけであり、その結果、融合産物において有用なものとなる。
【００５７】
本発明は、本発明のいずれかの態様の変異体、融合タンパク質、抱合体またはリガンドおよび薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含む組成物を提供する。
【００５８】
また、本明細書に記述する変異体、融合タンパク質、抱合体またはリガンドたとえば、血清アルブミンに特異的に結合する、またはヒト血清アルブミンおよび少なくとも１種の非ヒト血清アルブミンもしくはその機能的活性断片の双方に特異的に結合する、本発明の１つの単一可変ドメイン（単量体）変異体または２つ以上の単一可変ドメイン（たとえば、本明細書に定義されるような多量体、融合タンパク質、抱合体、および二重特異性リガンド）変異体を含むリガンドのいずれかをコードする単離された核酸も、本明細書に包含される。また、本明細書に包含するのは、以下のとおりである。ベクターおよび／または発現ベクター；ベクターを含む宿主細胞、たとえば植物もしくは動物細胞および／またはベクターで形質転換された細胞系；１つまたは複数の変異体、融合タンパク質もしくは、血清アルブミンまたは前述のベクターによってコードされるそれらの断片に特異的に結合する１つの単一可変ドメイン（単量体）変異体または２つ以上の単一可変ドメイン変異体（たとえば、本明細書に定義されるように多量体、融合タンパク質、抱合体、および二重特異的リガンド）を含むリガンドを発現および／または産生する方法。この方法は、場合によっては、１つまたは複数の変異体、融合タンパク質またはリガンドもしくはそれらの断片が発現されるように宿主細胞を培養するステップと、血清アルブミンに特異的に結合する１つの単一可変ドメイン（単量体）変異体または２つ以上の単一可変ドメイン（たとえば、本明細書で定義されるような多量体、融合タンパク質、抱合体および二重特異的リガンド）変異体を含むリガンドを宿主細胞培地から任意に回収するステップとを含む。また、本明細書に記述するリガンドを、血清アルブミンおよび／または非ヒト血清アルブミンを含む血清アルブミン、および／または血清アルブミン以外の１つまたは複数の標的と接触させる方法も包含される。ここで標的は生物活性分子を含み、かつ動物タンパク質、上述のリストのサイトカイン類を含む。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ、ならびに本明細書に記述する任意の変異体、融合タンパク質またはリガンドを、個々の宿主動物または細胞にｉｎ  ｖｉｖｏおよび／もしくはｅｘ  ｖｉｖｏで投与するステップも含む。好ましくは、血清アルブミンおよび／または非ヒト血清成アルブミンに向けられた単一可変ドメイン（免疫グロブリンまたは非免疫グロブリン）と、血清アルブミン以外の１つまたは複数の標的に向けられた１つまたは複数のドメインとを含む本明細書に記述したリガンドの投与は、抗標的リガンドのｔβ半減期および／または終末半減期を含む半減期を増加させることになる。変異体、融合タンパク質または単一ドメインを含むリガンドまたはその機能的断片をコードする核酸分子も、本明細書で想定されている。発現ベクター類を含むが好ましくはこれらに限定されない核酸分子をコードするベクターは、これらの発現ベクターのうちの１つまたは複数を含む細胞系または生物に由来する宿主細胞同様、本明細書で想定されている。また、前述の核酸、ベクターおよび宿主細胞のいずれかを含むが好ましくはこれらに限定されない任意の変異体、融合タンパク質またはリガンドを産生す���方法も想定されている。
【００５９】
本発明のある態様は、本発明による変異体または本発明の多重特異性リガンドまたは本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００６０】
本発明のある態様は、ＤＯＭ７ｈ−１１−３、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐ，ＤＯＭ７ｈ−１１−１２、ＤＯＭ７ｈ−１１−１８およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９から選択されるＤＯＭ７ｈ−１１変異体のヌクレオチド配列、または前述の選択された配列と少なくとも７０、７５、８０，８５、９０，９５、９６、９７、９８、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００６１】
本発明のある態様は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。本発明のある態様は、前述のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【００６２】
ライブラリーベクター系の詳細については、単一可変ドメイン、二重特異性リガンドの特徴付け、二重特異性リガンドの構造、二重特異性リガンドの構築で用いる骨格、抗血清アルブミンｄＡｂおよび多重特異性リガンドおよび半減期を向上させたリガンドの用途、ならびに抗血清アルブミンｄＡｂを含む組成物および製剤を組み合わせる、国際公開番号第ＷＯ２００８／０９６１５８号を参照する。これらの開示は本発明の変異体、リガンド、融合タンパク質、抱合体、核酸、ベクター、宿主および組成物用を含む本発明の使用のためのガイダンスを提供するため、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本発明によるものではないＤＯＭ７ｈ−１４変異体の配列は、本出願と同日に提出される同時係属の米国特許仮出願、表題「改善型抗血清アルブミン結合変異体」に開示される。ＤＯＭ７ｈ-１４変異体のこれらの配列（同時係属出願中の配列番号１から１０）をあたかも本明細書に明示的に書かれたかのように参照によって本明細書に組み込む。
【００６４】
配列
【表１】
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【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３−１】
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【００６７】
【表３−２】
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【００６８】
【表３−３】
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【００６９】
【表３−４】
2015204831.tif 000007
【００７０】
【表３−５】
2015204831.tif 000008
【００７１】
【表３−６】
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【００７２】
【表３−７】
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【００７３】
【表３−８】
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【００７４】
【表３−９】
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【００７５】
【表３−１０】
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【００７６】
【表３−１１】
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【００７７】
【表３−１２】
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【００７８】
【表３−１３】
2015204831.tif 000016
【００７９】
【表３−１４】
2015204831.tif 000017
【００８０】
【表４−１】
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【００８１】
【表４−２】
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【００８２】
【表４−３】
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【００８３】
【表４−４】
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【００８４】
【表４−５】
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【００８５】
【表４−６】
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【００８６】
【表４−７】
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【００８７】
【表４−８】
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【００８８】
【表４−９】
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【００８９】
【表４−１０】
2015204831.tif 000027
【００９０】
【表４−１１】
2015204831.tif 000028
【００９１】
【表４−１２】
2015204831.tif 000029
【００９２】
【表４−１３】
2015204831.tif 000030
【００９３】
【表４−１４】
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【００９４】
【表４−１５】
2015204831.tif 000032
【００９５】
【表４−１６】
2015204831.tif 000033
【００９６】
【表４−１７】
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【００９７】
【表４−１８】
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【００９８】
【表４−１９】
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【００９９】
【表４−２０】
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【０１００】
【表４−２１】
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【０１０１】
【表４−２２】
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【０１０２】
【表５−１】
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【０１０３】
【表５−２】
2015204831.tif 000042
【０１０４】
【表５−３】
2015204831.tif 000043
【０１０５】
【表５−４】
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【０１０６】
【表５−５】
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【０１０７】
【表５−６】
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この表の中でｍｙｃタグが付いた分子が表示されている場合、これは実施例でのPK試験で用いたバージョンであった。
ｍｙｃタグが付いてない配列が表示されている場合、実施例でのPK試験はｍｙｃタグが付いた材料で行われなかった。すなわち、試験は、表示した非タグが付いた構築体で行われた。
【実施例】
【０１０８】
実験のセクションにおけるすべてのナンバリングは、Ｋａｂａｔによる（Ｋａｂａｔ，
Ｅ．Ａ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  （ＵＳ）
＆  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．免疫学的関心のタンパク質の配列、第５版（ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ，  １９９１））。
【０１０９】
ＤＯＭ７ｈ−１１およびＤＯＭ７ｈ−１４の変異体の誘導体を記述する。ＤＯＭ７ｈ−１４変異体は、本発明によるものではない。
【０１１０】
実施例１  Ｖｋ親和性成熟
選択：
ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）およびＲＳＡ（ラット血清アルブミン）の抗原をＳｉｇｍａから入手した（基本的に脂肪酸フリー、約９９％（アガロースゲル電気泳動法）、凍結乾燥した粉末、それぞれカタログ番号Ａ３７８２およびＡ６４１４）。
【０１１１】
上記２種類の抗原のビオチン化産物を、ＥＺ  Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３３１）を用いて作製した。ＰＤ１０脱塩カラムに試料を２回通して、遊離ビオチン試薬を除去し、続いて４℃で、１０００ｘ過剰量のＰＢＳに対して一晩透析を行った。得られた産物を質量スペクトルによって分析したところ、分子あたり１〜２ビオチンが観察された。
【０１１２】
親和性成熟ライブラリー：
エラープローンおよびＣＤＲの両ライブラリーを、ＤＯＭ７ｈ−１１およびＤＩＭ７ｈ−１４親ｄＡｂを用いて作製した（ＤＯＭ７ｈ−１１およびＤＯＭ７ｈ−１４の配列に関しては国際公開番号第ＷＯ２００８／０９１５８号を参照されたい）。ＣＤＲライブラリーをｐＤＯＭ４ベクター中で作製し、エラープローンライブラリーをｐＤＯＭ３３ベクター中で作製した（プロテア−ゼ処理の要否選択を可能にするために）。ベクターｐＤＯＭ４は、遺伝子ＩＩＩシグナルペプチド配列が酵母糖脂質アンカー型表面（ＧＡＳ）タンパク質シグナルペプチドに置き換えられているＦｄファージベクターの誘導体である。また、ベクターｐＤＯＭ４は、リーダー配列と遺伝子ＩＩＩの間にｃ−ｍｙｃタグを含み、このタグによって遺伝子ＩＩＩがインフレームに戻る。このリーダー配列は、ファージディスプレイベクターだけでなく他の原核生物発現ベクターでも十分に機能し、広く一般に使用することができる。ｐＤＯＭ３３は、ｃ−ｍｙｃタグが取り除かれているｐＤＯＭ４ベクターの修飾型バージョンであり、ｄＡｂ−ファージ融合体をプロテアーゼトリプシンに耐性にする。これは、プロテアーゼに対してより安定なｄＡｂを選択するファージ選択内で、トリプシンの使用を可能にする（国際公開番号第ＷＯ２００８／１４９１４３号を参照されたい）。
【０１１３】
エラープローン成熟ライブラリーのために、成熟対象ｄＡｂをコードするプラスミドＤＮＡをＧＥＮＥＭＯＲＰＨ（登録商標）ＩＩ  ＲＡＮＤＯＭ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ  ＫＩＴ（ランダム、ユニーク突然変異生成キット、Ｓｔｒａｇｅｎｅ）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。産物は、Ｓａｌ１およびＮｏｔ１で消化し、切断ファージベクターｐＤＯＭ３３との連結反応で用いた。
【０１１４】
ＣＤＲライブラリーのために、ＮＮＫまたはＮＮＳコドンを含む縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行い、親和性成熟対象ｄＡｂにおける必要な位置を多様化した。次いで、アセンブリＰＣＲを用いて、完全長の多様な挿入断片を生成した。この挿入断片はＳａｌ１およびＮｏｔ１で消化し、複数残基の突然変異生成のためにｐＤＯＭ４との連結反応で、および単一残基の突然変異生成のためにｐＤＯＭ５との連結反応で用いた。
ｐＤＯＭ５ベクターは、タンパク質発現がＬａｃＺプロモータによって促進されるｐＵＣ１１９ベース発現ベクターである。ＧＡＳ１リーダー配列（国際公開番号第ＷＯ２００５／０９３０７４号を参照されたい）は、単離した可溶性ｄＡｂが周辺質および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養上清に確実に分泌されるようにする。ｄＡｂは、このベクター中でクローン化したＳａｌI／ＮｏｔIであり、このベクターはＡｂのＣ末端にｍｙｃタグを付加する。ＳａｌIおよびＮｏｔIを用いるこのプロトコルは、Ｎ末端でＳＴアミノ酸配列の包含をもたらす。
【０１１５】
次いで、いずれかの方法によって生成される連結を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＢ１を電気穿孔法によって形質転換し、次いで形質転換した細胞を１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む２×ＴＹ寒天に播種し、＞５×１０７クローンサイズのライブラリーを得た。
【０１１６】
エラープローンライブラリーは、以下の平均変異率およびサイズを有した：ＤＯＭ７ｈ−１１（１ｄＡｂあたり２．５の変異）、サイズ：６．１×１０８、ＤＯＭ７ｈ−１４（１ｄＡｂあたり２．９の変異）、サイズ：５．４×１０８。
【０１１７】
各ＣＤＲライブラリーには、４つのアミノ酸多様性がある。ＣＤＲ１および３のそれぞれに対して２つのライブラリーを生成し、ＣＤＲ２に対しては１つのライブラリーを生成した。各ライブラリー内の多様化した位置は、以下のとおりである（ＶＫダミーＤＰＫ９配列に基づくアミノ酸）。
【０１１８】
【表６】
2015204831.tif 000047
【０１１９】
実施例２  選択戦略：
３つのファージ選択戦略をＶｋ  ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）（抗血清アルブミンｄＡｂ）親和性成熟に対して採用した。
１）ＨＳＡのみに対する選択：
ＨＳＡに対する選択を３回行った。すべての回でエラープローンライブラリーおよび各ＣＤＲライブラリーを個別のプールとして選択した。１回目の選択は、１ｍｇ／ｍＬをイムノチューブ上に受動的にコーティングしたＨＳＡに対して行った。２回目は、１００ｎＭのＨＳＡに対して行い、および３回目は１０ｎＭ（ＣＤＲ選択）または２０ｎＭまたは１００ｎＭ（エラープローンの選択）のＨＳＡに対して行った。両選択は、可溶性ライブラリーの選択としてを行った。続いて可溶性ライブラリーの選択として１．５ｎＭのＨＳＡに対するエラープローンライブラリーを用いて４回目の選択を行った。エラープローンライブラリーを０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．０で溶出して、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。およびＣＤＲライブラリーを１ｍｇ／ｍＬのトリプシンで溶出して、対数期ＴＧ１細胞に感染させた。各選択の３回目にスクリーニングのためにｐＤＯＭ５にサブクローニングした。可溶性ライブラリーの選択には、ビオチン化ＨＳＡを使用した。
【０１２０】
２）ＨＳＡに対するトリプシン選択：
親クローンと比較するとプロテアーゼ耐性が増加し、かつ潜在的に生物物理学的特性が改善したｄＡｂを選択するために、ファージ選択でトリプシンを使用した（国際公開番号第ＷＯ２００８／１４９１４３号を参照されたい）。４回の選択をＨＳＡに対して行った。エラープローンライブラリーの１回目の選択を、トリプシンなしで１ｍｇ／ｍＬを受動的にコーティングしたＨＳＡに対して行い、２回目の選択を、２０μｇ／ｍＬのトリプシンとともに１ｍｇ／ｍＬを受動的にコーティングしたＨＳＡに対して３７℃で１時間行い、３回目の選択を、ビオチン化ＨＳＡを用いる可溶性選択によって、２０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬのトリプシンとともに１００ｎＭのＨＳＡに対して３７℃で１時間行った。選択の最終回を、ビオチン化ＨＳＡを用いる可溶性選択によって、１００μｇ／ｍＬのトリプシンとともに１００ｎＭのＨＳＡに対して３７℃で終夜行った。
【０１２１】
３）ＨＳＡ（１回目）およびＲＳＡ（２〜４回回目）に対する交差選択：
１回目の選択は、１ｍｇ／ｍＬを受動的にコーティングしたＨＳＡに対して、または１μＭのＨＳＡ（可溶性選択）に対して行い、続いてビオチン化ＲＳＡに対する可溶性選択をさらに３回（１回目は１μＭの濃度で、２回目は１００ｎＭで、３回目は２０ｎＭ、１０ｎＭまたは１ｎＭで）行った。
【０１２２】
スクリーニング戦略および親和性の決定：
いずれの場合も選択後、適切な選択の回に由来するファージＤＮＡのプールを、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製し、このファージＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ１およびＮｏｔ１を用いて消化させ、次いで濃縮したＶ遺伝子をｐＤＯＭ５可溶性発現ベクター内の対応する部位に連結する。ｐＤＯＭ５はｍｙｃタグを有するｄＡｂを発現する（国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７７８９を参照されたい）。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ２１５１細胞を電気形質転換させ、次いでこれらの細胞を、抗生物質カルベニシリンを含有する寒天板上で終夜、増殖させる。結果として得たコロニーを抗原結合に関して個別に評価する。いずれの場合にも、ＨＳＡ、ＣＳＡ（カニクイザル血清アルブミン）、ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）およびＲＳＡとの結合に関して、少なくとも９６コロニーをＢＩＡｃｏｒｅ(商標)（表面プラズモン共鳴法）によって調べた。ＭＳＡ抗原はＳｉｇｍａから入手し（基本的に脂肪酸フリー、約９９％（アガロースゲル電気泳動法）、凍結乾燥粉末カタログ番号Ａ３５５９）、およびＣＳＡはＰｒｏｍｅｔｉｃ  ｂｌｕｅ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）の血清アルブミンから精製した。可溶性ｄＡｂ断片を、９６ウェルプレート中のＯＮＥＸ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）の細菌培養で、３７℃で終夜生成した。高密度ＨＳＡ，ＣＳＡ、ＭＳＡ、およびＲＳＡのＣＭ５チップに結合させるために、可溶性ｄＡｂを含む培養上清を遠心して、ＢＩＡｃｏｒｅで分析した。
解離速度スクリーニングによって、クローンがこれらすべての種の血清アルブミンに結合することがわかった。クローンを配列決定して、ユニークなｄＡｂ配列を明らかにした。
【０１２３】
選択したクローンの親（アミノ酸レベルで）に対する最少同一性は、９７．２％（ＤＯＭ７ｈ−１１−３：９７．２％、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２：９８．２％、ＤＯＭ７ｈ１１−１５：９６．３％、ＤＯＭ７ｈ−１１−１８：９８．２％、ＤＯＭ７ｈ−１１−１９：９７．２％）であった。
【０１２４】
選択したクローンの親（アミノ酸レベルで）に対する最少同一性は、９６．３％（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０：９６．３％、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８：９６．３％、ＤＯＭ７ｈ−１４−１９：９８．２％、ＤＯＭ７ｈ−１４−２８：９９．１％、ＤＯＭ７ｈ−１４−３６：９７．２％）であった。
【０１２５】
ユニークなｄＡｂを、２．５Ｌ振盪フラスコ中のＯｎｅｘ培地で、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８時間、細菌培養上清として発現させた。ｄＡｂは、培地から吸収によってタンパク質Ｌアガロースに精製し、続いて１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０を用いて溶出した。ＨＳＡ、ＣＳＡ、ＭＳＡおよびＲＳＡへの結合を、１μＭ，５００ｎＭおよび５０ｎＭｎの３濃度で精製タンパク質を用いてＢＩＡｃｏｒｅによって確認した。各血清アルブミンへのＡｌｂｕｄＡｂの結合親和性（ＫＤ）を決定するために、精製ｄＡｂを、５０００ｎＭから３９ｎＭのアルブミン濃度の範囲（５０００ｎＭ、２５００ｎＭ、１２５０ｎＭ、６２５ｎＭ、３１２ｎＭ、１５６ｎＭ、７８ｎＭ、３９ｎＭ）でＢＩＡｃｏｒｅによって分析した。
【０１２６】
【表７−１】
2015204831.tif 000048
【０１２７】
【表７−２】
2015204831.tif 000049
【０１２８】
ＤＯＭ７ｈ−１４由来のすべての変異体はマウス、ラット、ヒトおよびカニクイザルの血清アルブミンに対して交差反応性である。ＤＯＭ７ｈ−１４−１０は、親と比較するとラット、カニクザルおよびヒトの血清アルブミンに対する親和性が改善した。ＤＯＭ７ｈ−１４−２８は、ＲＳＡに対する親和性が改善している。ＤＯＭ７ｈ−１４−３６は、ＲＳＡ、ＣＳＡおよびＭＳＡに対する親和性が改善している。
【０１２９】
ＤＯＭ７ｈ−１１−３は、ＣＳＡおよびＨＳＡに対する親和性が改善した。ＤＯＭ７ｈ−１１−１２は、ＲＳＡ、ＭＳＡおよびＨＳＡに対する親和性が改善した。ＤＯＭ７ｈ−１１−１５は、ＲＳＡ、ＭＳＡ、ＣＳＡおよびＨＳＡに対する親和性が改善した。ＤＯＭ７ｈ−１１−１８およびＤＯＭ７ｈ−１１−１９は、ＲＳＡ、ＭＳＡおよびＨＳＡに対する親和性が改善した。
【０１３０】
実施例３  主要なＤＯＭ７ｈ−１１系統クローンのオリジン：
ＤＯＭ７ｈ−１１−３：ＣＤＲ２ライブラリー（Ｙ４９、Ａ５０、Ａ５１、Ｓ５３）を使用して、ＨＳＡに対して行った親和性成熟に由来する。１０ｎＭのＨＳＡでの３回の回収。
【０１３１】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１２：エラープローンライブラリーを使用してＨＳＡに対して行った親和性成熟に由来する。１００μｇ／ｍＬトリプシンとともに３回の回収（１００ｎＭ、ＨＳＡ)。
【０１３２】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１５：ＨＳＡに対して１回、続いて１ｎＭのＲＳＡによる３回の選択で、ＣＤＲ２ライブラリー（Ｙ４９、Ａ５０、Ａ５１、Ｓ５３）を使用してＲＳＡに対して３回の追加の選択を行った交差選択に由来する。
【０１３３】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１８：ＨＳＡに対して１回、続いてエラープローンライブラリーを使用してＲＳＡに対して３回の追加の選択を行った交差選択に由来する。２０ｎＭのＲＳＡでの３回の回収。
【０１３４】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１９：ＨＳＡに対して１回、続いてエラープローンライブラリーを使用してＲＳＡに対して３回の追加の選択を行った交差選択に由来する。５ｎＭのＲＳＡでの３回の回収。
【０１３５】
【表８】
2015204831.tif 000050
【０１３６】
実施例４  主要なＤＯＭ７ｈ−１４系統クローンのオリジン：
ＤＯＭ７ｈ−１４−１９：エラープローンライブラリーを使用して、ＨＳＡに対して行った親和性成熟に由来する。１００μｇ／ｍＬのトリプシンとともに３回の回収（１００ｎＭ，ＨＳＡ）。
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８、ＤＯＭ７ｈ−１４−２８、ＤＯＭ７ｈ−１４−３６：ＣＤＲ３ライブラリー（Ｙ９２、Ｙ９３、Ｔ９４、Ｎ９６）を使用してＨＳＡに対して行った親和性成熟に由来する。３回の回収。
【０１３７】
【表９】
2015204831.tif 000051
【０１３８】
実施例５  発現特性および生物物理学的特性
２．５Ｌの振盪フラスコ内のＯｎｅｘ培地で、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８時間培養した後、通常の細菌発現レベルを決定した。生物物理学的特性をＳＥＣ  ＭＡＬＬＳおよびＤＳＣによって決定した。ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱による分子ふるいクロマトグラフィー）は、溶液中の巨大分子の特徴づけのための非侵襲性手法である。手短に言えば、タンパク質（０．５ｍＬ／ｍｉｎのダルベッコＰＢＳバッファ中１ｍｇ／ｍＬの濃度）を、それらの流体力学的性質によって、分子ふるいクロマトグラフィー（カラム：ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＴＳＫ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のＳ２００）を用いて分離する。分離の後に、光を散乱させるタンパク質の性質を、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を使用して測定する。タンパク質が検出器を通る間に、散乱した光の強度を、角度関数として測定する。屈折率（ＲＩ）検出器を使用して決定されるタンパク質濃度とこの測定との組み合わせは、適切な式（解析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１２の整数部）を用いてモル質量の算出を可能にする。
【０１３９】
ＤＳＣ（示差走査熱測定法）：手短に言えば、タンパク質（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を１８０℃／時間の定率で加熱し、熱変性に付随する検出可能な熱変化を測定する。遷移中間点（ａｐｐＴｍ）を決定する。これは、タンパク質の５０％がその未変性コンホメーションであり、残りの５０％が変性する場合、温度として表される。ここで、試験される大部分のタンパク質は再度十分に折り畳まれないので、見かけの遷移中間点（ａｐｐＴｍ）がＤＳＣによって決定される。Ｔｍが高ければ高いほど、分子はより安定する。変性曲線を、非二状態方程式によって分析した。使用したソフトウェアパッケージは、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）ｖ７．０３８３であった。
【０１４０】
【表１０】
2015204831.tif 000052
【０１４１】
我々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において１５〜１１９ｍｇ／Ｌの範囲で、表９のすべてのクローンの発現レベルを観察した。
【０１４２】
ＤＯＭ７ｈ−１４およびＤＯＭ７ｈ−１１の変異体の場合、好ましい生物物理学的パラメータ（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳによって決定された場合溶液中で単量体の状態、およびＤＳＣによって決定された場合＞５５℃のａｐｐＴｍ）および発現レベルが親和性成熟の間、維持された。単量体状態は、二量体化および細胞表面受容体などの標的と架橋結合し得る産物のリスクを回避するので、有利である。
【０１４３】
実施例６  ラット、マウスおよびカニクイザルにおける血清半減期の決定：
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ７ｈ−１４−１８、ＤＯＭ７ｈ−１４−１９，ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２およびＤＯＭ７ｈ−１１−１５のＡｌｂｕｄＡｂをｐＤＯＭ５ベクターにクローン化した。各ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）に対して２０〜５０ｍｇの量を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させ、タンパク質Ｌ親和性樹脂を使用して細菌培養上清から精製し、次いで１００ｍＭのグリシン、ｐＨ２を用いて溶出した。これらのタンパク質をＱスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、１ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮し、ＰＢＳにバッファ交換し、次いでエンドトキシンを枯渇させた。ラットの薬物動態解析（ＰＫ）のために、１化合物あたり３匹のラットを用いて、ＡｌｂｕｄＡｂを２．５ｍｇ／ｋｇで単回静脈注入として投与した。血清試料を、０．１６時間、１時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間で採取した。血清レベルの分析を、下述の方法により抗ｍｙｃ  ＥＬＩＳＡによって行った。
【０１４４】
マウスＰＫのために、ＤＯＭ７ｈ−１１、ＤＯＭ７ｈ−１１−１２およびＤＯＭ７ｈ−１１−１５を３匹の被験マウスからなる用量群ごとに２．５ｍｇ／ｋｇで単回静脈注入し、次いで血清試料を１０分、１時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間で採取した。血清レベルの分析を、後述する方法により抗ｍｙｃ ＥＬＩＳＡによって行った。
【０１４５】
カニクイザルＰＫのために、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０およびＤＯＭ７ｈ−１１−１５を、１用量群あたり３匹のメスのカニクイザルに２．５ｍｇ／ｋｇで単回静脈注入し、次いで血清試料を０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、１４４時間、１９２時間、２８８時間、３３６時間、５０４時間で採取した。血清レベルの分析を、後述する方法により抗ｍｙｃ ＥＬＩＳＡによって行った。
【０１４６】
抗ｍｙｃ  ＥＬＩＳＡ法
血清中のＡｌｂｕｄＡｂ濃度を抗ｍｙｃ  ＥＬＩＳＡによって測定した。手短に言えば、ヤギ抗ｍｙｃポリクローナル抗体（１：５００；Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９１３２）を，Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に終夜コ−ティングし、５％ＢＡＳ／ＰＢＳ＋１％Ｔｗｅｅｎでブロックした。血清試料を、既知の濃度の標準溶液と一緒に希釈剤の範囲で加えた。次いで、ウサギポリクローナル抗Ｖｋ（１：１０００；社内試薬、血液試料をプールし、使用する前にタンパク質Ａ精製を行った）、さらに抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ抗体（１：１０，０００；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ２０７４）を用いて、結合したｍｙｃタグ付きＡｌｂｕｄＡｂを検出した。アッセイの各段階の間に、プレートを３×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で、続いて３×ＰＢＳで洗浄した。最終的な洗浄の後、ＴＭＢ（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ１−コンポーネントマイクロウェルペルオキシダーゼ基質、ＫＰＬ、カタログ番号５２−００−００）を加えて、発現を可能にした。
この発現を１ＭのＨＣｌで停止させ、次いで４５０ｎｍでの吸光度を使用してシグナルを測定した。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡの生データから、希釈係数を考慮に入れて標準曲線に対する補間によって未知の試料の濃度を確立した。各時点での平均濃度結果を反復値から決定し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ解析パッケージ（たとえばバ−ジョン５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ９４０４０，  ＵＳＡから入手可能）に入力した。
ノンコンパートメントモデルを使用してデータフィッティングを行い、ＰＫパラメータをソフトウェアによって推定して、終末半減期を得た。投与情報および時点を選択して、各ＰＫプロファイルの末相に反映させた。
【０１４８】
【表１１】
2015204831.tif 000053
＊ヒストリカルデータ
ラット、マウスおよびカニクイザルの試験に由来する薬物動態パラメータを、ノンコンパートメントモデルを使用して、フィッティングさせた。キー：ＡＵＣ：投与時間から無限大へ補外される曲線の下面積：ＣＬ：クリアランス;ｔ１／２：血中濃度が半減する時間;Ｖｚ：終末相に基づく分布量。
【０１４９】
ＤＯＭ７ｈ−１１−１２およびＤＯＭ７ｈ１１−１５は、親と比較するとラットおよびマウスにおいてＡＵＣおよびｆ１／２が改善した。ＤＯＭ７ｈ−１１−１５はまた、親と比較するとカニクイザルにおいてＡＵＣおよびｔ１／２が改善した。ＡＵＣ／ｔ１／２におけるこの改善は、血清アルブミンに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＫＤの改善と相関する。
【０１５０】
実施例７  ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）ＩＦＮ融合体：
クローン化および発現
単一ＡｌｂｕｄＡｂならびに親和性成熟したＶｋ  ＡｌｂｕｄＡｂをインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）に連結させて、ＡｌｂｕｄＡｂの有用なＰＫが融合タンパク質として維持されているかどうかを決定した。
インターフェロンα２ｂアミノ酸配列：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE（配列番号３７４）
インターフェロンα２ｂヌクレオチド配列：
TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA （配列番号３７５）
【０１５１】
ＴＶＡＡＰＳリンカー領域を介してＩＦＮα２ｂをＡｌｂｕｄＡｂに連結させた（国際公開番号第ＷＯ２００７／０８５８１４号を参照されたい）。この構築体を、ＳＯＥ−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，  ７７，  ｐ６１（１９８９）による単一オーバーラップ伸長）によってクローン化した。ＡｌｂｕｄＡｂおよびＩＦＮ配列のＰＣＲ増幅を、ＴＶＡＡＰＳリンカー領域で約１５塩基対のオーバーラップを有するプライマーを使用して、別々に行った。使用したプライマーは、以下の通りである．
【０１５２】
【表１２】
2015204831.tif 000054
【０１５３】
断片を別々に精製し、続いてフランキングプライマーだけを用いてＳＯＥ（単一オーバーラップ伸長）ＰＣＲ伸長反応で構築した。
【０１５４】
【表１３】
2015204831.tif 000055
【０１５５】
構築したＰＣＲ産物は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、その遺伝子をｐＤＯＭ５０内の対応する部位に連結した。ｐＤＯＭ５０は哺乳類発現ベクターであり、細胞培地への発現を促進するために導入されたＮ末端Ｖ−Ｊ２−ＣマウスＩｇＧ分泌リーダー配列を有するｐＴＴ５誘導体である。
リーダー配列（アミノ酸）：
METDTLLLWVLLLWVPGSTG  (配列番号３８２)
リーダー配列（ヌクレオチド）：
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCCACCGGGC  (配列番号３８３)
【０１５６】
プラスミドＤＮＡをＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｇａｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。２９３−Ｆｅｃｔｉｎによって１μｇＤＮＡ／ｍＬをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトして、無血清培地で増殖させた。タンパク質を培地中で５日間発現させ、次いでタンパク質Ｌ親和性樹脂を用いて培養上清から精製し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２で溶出させた。Ｑスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、これらのタンパク質を１ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮し、ＰＢＳにバッファ交換し、次いでエンドトキシンを枯渇させた。
【０１５７】
【表１４−１】
2015204831.tif 000056
【０１５８】
【表１４−２】
2015204831.tif 000057
【０１５９】
【表１４−３】
2015204831.tif 000058
【０１６０】
【表１４−４】
2015204831.tif 000059
【０１６１】
【表１４−５】
2015204831.tif 000060
【０１６２】
【表１４−６】
2015204831.tif 000061
【０１６３】
【表１４−７】
2015204831.tif 000062
【０１６４】
【表１４−８】
2015204831.tif 000063
【０１６５】
【表１４−９】
2015204831.tif 000064
【０１６６】
【表１４−１０】
2015204831.tif 000065
【０１６７】
【表１４−１１】
2015204831.tif 000066
【０１６８】
【表１４−１２】
2015204831.tif 000067
【０１６９】
【表１４−１３】
2015204831.tif 000068
【０１７０】
【表１４−１４】
2015204831.tif 000069
太文字で強調したアミノ酸およびヌクレオチドの配列はクローニング部位およびｍｙｃタグを表す。＊は、遺伝子の終端の終止コドンを表す。
【０１７１】
親和性の決定および生物物理学的特徴づけ：
ＡｌｂｕｄＡｂ−ＩＦＮα２ｂ融合タンパク質の各血清アルブミンに対する結合親和性（ＫＤ）を決定するために、ＨＢＳ−ＥＰ  ＢＩＡｃｏｒｅバッファ中、５０００ｎＭ〜３９ｎＭ（５０００ｎＭ、２５００ｎＭ、１２５０ｎＭ、６２５ｎＭ、３１２ｎＭ、１５６ｎＭ、７８ｎＭ、３９ｎＭ）の濃度の融合タンパク質を使用することによって、アルブミン（一級アミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化した；ＢＩＡｃｏｒｅ）上で、精製した融合タンパク質をＢＩＡｃｏｒｅによって分析した。
【０１７２】
【表１５−１】
2015204831.tif 000070
【０１７３】
【表１５−２】
2015204831.tif 000071
【０１７４】
ＩＦＮα２ｂがＡｌｂｕｄＡｂ変異体に連結するとき、すべての場合、血清アルブミンへのＡｌｂｕｄＡｂ結合の親和性は減少する。ＤＯＭ７ｈ−１４−１０およびＤＯＭ７ｈ−１１−１５は、親と比較すると種にかかわらず血清アルブミンへの改善された結合親和性を保持する。ＤＯＭ７ｈ−１１−１２も、親と比較すると種にかかわらず血清アルブミンへの改善された結合親和性を示す。
【０１７５】
【表１６】
2015204831.tif 000072
ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳによって検出された場合、Ｍ／Ｄは単量体／二量体の平衡を示す。
我々は、表１６のすべてのクローンに関してＨＥＫ２９３において１７．５〜５４ｍｇ／Ｌの範囲で発現を観察した。
ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４およびＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１の変異体の場合、好ましい生物物理学的パラメータおよび発現レベルが親和性成熟の間、維持された。
【０１７６】
ＡｌｂｕｄＡｂ−ＩＦＮα２ｂ融合体に対するＰＫの決定
ＡｌｂｕｄＡｂ−ＩＦＮα２ｂ融合体であるＤＭＳ７３２１（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４）、ＤＭ７３２２（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４−１０）、ＤＭＳ７３２３（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４−１８）、ＤＭ７３２４（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４−１９）、ＤＭＳ７３２５（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１）、ＤＭ７３２６（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２）、ＤＭ７３２７（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１５）を、ＨＥＫ２９３細胞中で２０〜５０ｍｇの量でｍｙｃタグを用いて発現させ、次いでタンパク質Ｌ親和性樹脂を用いて培養上清から精製して、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２を用いて溶出した。Ｑスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、これらのタンパク質を１ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮して、ダルベッコＰＢＳにバッファ交換し、次いでエンドトキシンを枯渇させた。
【０１７７】
ラットＰＫのために、ＩＦＮ−ＡｌｂｕｄＡｂを１化合物あたり３匹のラットを用いて２．０ｍｇ／ｋｇで単回静脈注入した。血清試料を、０．１６時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間で採取した。血清レベルの分析は、製造業者の説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＲＰＮ５９６０）に従って、ＥＡＳＹ  ＥＬＩＳＡによって行った。
【０１７８】
マウスＰＫのために、ｍｙｃタグを有するＤＭＳ７３２２（ＩＦＮα２Ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４−１０）、ＤＭＳ７３２５（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１）、ＤＭＳ７３２６（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１２）、ＤＭＳ７３２７（ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１−１５）を、３匹の被験マウスからなる用量群ごとに２．０ｍｇ／ｋｇで単回静脈注入し、次いで血清試料を１０分、１時間、８時間、２４時間、４８]時間、７２時間、９６時間で採取した。血清レベルの分析は、製造業者の説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＲＰＮ５９６０）に従ってＥＡＳＹ  ＥＬＩＳＡによって行った。
【０１７９】
【表１７−１】
2015204831.tif 000073
【０１８０】
【表１７−２】
2015204831.tif 000074
ラットおよびマウスの試験に由来する薬物動態パラメータを、ノンコンパートメントモデルを使用して、フィッティングさせた。キー：ＡＵＣ：投与時間から無限大へ補外した曲線の下面積；ＣＬ：クリアランス;ｔ１／２：血中濃度が半減する時間;Ｖｚ：終末相に基づく分布量。
【０１８１】
ＩＦＮα２ｂ−ＡｌｂｕｄＡｂをラットおよびマウスで試験した。ラットおよびマウスの両方においてすべてのＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１１変異体融合タンパク質が、親と比較するとｔ１／２が改善している。ｔ１／２におけるこの改善は、血清アルブミンに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＫＤの改善と相関する。ＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４−１０の変異体の場合、血清アルブミンに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＫＤにおけるこの改善も、ラットにおけるｔ１／２の改善と相関する。
【０１８２】
すべてのＩＦＮα２ｂ−ＡｌｂｕｄＡｂ融合タンパク質が、単一ＡｌｂｕｄＡｂと比較するとＲＡＳへの結合において５〜１０倍の減少を示す。この効果は、ＤＯＭ７ｈ−１１シリーズ（わずかに５倍の減少）よりもＤＯＭ７ｈ−１４シリーズに対してより明白（すなわち、１０倍の減少）である。
【０１８３】
実施例８  タンパク質、ペプチドおよびＮＣＥとのＡｌｂｕｄＡｂのさらなる融合体：
他の化学物質、すなわち、ドメイン抗体（ｄＡＢ）、ペプチドおよびＮＣＥに融合した種々のＡｌｂｕｄＡｂを試験した。結果を表１８に示す。
【０１８４】
【表１８−１】
2015204831.tif 000075
【０１８５】
【表１８−２】
2015204831.tif 000076
キー：ＤＯＭ１ｍ−２１−２３は抗ＴＮＦＲ１ｄＡｂであり、エキセンディン−４は３９個のアミノ酸長からなるペプチド（ＧＬＰ−１作動薬）である。ＮＣＥ、ＮＣＥ−ＧＧＧＧＳＣおよびＮＣＥ−ＴＶＡＡＰＳＣは後述する。
【０１８６】
以前、我々はｉｎ  ｖｉｖｏで抗ＴＮＦＲ１のＰＫ半減期を延ばすために、アルブミン結合ｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂ）を有する遺伝子融合体の使用を説明した（たとえば、国際公開番号第ＷＯ０４／００３０１９号、第ＷＯ２００６／０３８０２７号、第ＷＯ２００８／１４９１４８号を参照されたい）。これらのＰＣＴ出願におけるプロトコルを参照する。上記の表では、ＤＯＭ１ｍ−２１−２３は抗マウスＴＮＦＲ１ｄＡｂである。
【０１８７】
エキセンディン−４の遺伝子融合体または血清アルブミンに結合するＤＯＭ７ｈ−１４（もしくは他のＡｌｂｕｄＡｂ）を有する遺伝子融合体を作製するために、エキセンディン−４−リンカーＡｌｂｕｄＡｂ配列を、ｐＴＴ−５ベクター（ＣＮＲＣ，Ｃａｎａｄａから入手可能）にクローン化した。いずれの場合にも、エキセンディン−４はこの構築体の５’末端にあり、ｄＡｂは３’末端にあった。リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカーであった。エンドトキシンフリーＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ)内でアルカリ法（エンドトキシンフリープラスミドＧｉｇａキット、Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡから入手可能）を使用して調製し、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞（ＣＮＲＣ，Ｃａｎａｄａから入手可能）をトランスフェクトした。トランスフェクションは１．７５×１０６細胞／ｍＬでＨＥＫ２９３Ｅ細胞を含む２５０ｍＬ／フラスコに、フラスコあたり３３３ｕＬの２９３フェクチン（Ｉｎｖｏｔｒｏｇｅｎ）および２５０μｇのＤＮＡを用いて行い、３０℃で５日間発現させた。上清を遠心によって収集し、次いでタンパク質Ｌ上で親和性精製によって精製を行った。タンパク質を樹脂にバッチ結合させ、カラムに充填し、次いで１０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。タンパク質を５０ｍＬの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２で溶出し、次いでＴｒｉｓ、ｐＨ８で中和した。期待されるサイズのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で特定した。
【０１８８】
ＮＣＥのＡｌｂｕｄＡｂ融合体：
新規化学物質（ＮＣＥ）のＡｌｂｕｄＡｂ融合体を試験した。ＮＣＥ、小分子ＡＤＡＭＴＳ−４阻害剤をＰＥＧリンカー（ＰＥＧ４リンカー、すなわち、マレイミドの前の４ＰＥＧ分子）と、ＡｌｂｕｄＡｂへの抱合のためのマレイミド基とを用いて合成した。ＡｌｂｕｄＡｂへのＮＣＥの抱合は、アミノ酸のＲ１０８Ｃ位で設計されたシスチン残基、またはＡｌｂｕｄＡｂの末端で設計された５アミノ酸（ＧＧＧＧＳＣ）もしくは６アミノ酸（ＴＶＡＡＰＳＣ）スペーサを介して行った。手短に言えば、このＡｌｂｕｄＡｂをＴＣＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７７７２０）で還元し、ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ６．５により脱塩した。５倍モル過剰のマレイミド活性ＮＣＥを、１０％（ｖ／ｖ）最終濃度を超えないようにＤＭＳＯに加えた。この反応を室温で終夜、インキュベートし、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４になるように徹底的に透析した。
ＰＥＧリンカー：
【化１】
2015204831.tif 000077
【０１８９】
配列：
ＤＯＭ７ｈ−１４Ｒ１０８Ｃ：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKC (配列番号４１２) 
ヌクレオチド：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAATGC (配列番号４１３)
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０／ＴＶＡＡＰＳＣおよびＤＯＭ７ｈ−１４−１０／ＧＧＧＧＳＣ（すなわち、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０／Ｇ４ＳＣ）の配列については表５を参照されたい。
【０１９０】
ＮＣＥ−ＡｌｂｕｄＡｂ  ＤＯＭ７ｈ−１４１０ＧＧＧＧＳＣおよびＤＯＭ７ｈ−１４−１０ＴＶＡＡＰＳＣは、この化学物質に融合されるとき、ＢＩＡｃｏｒｅによって決定した場合、ＲＳＡへのｉｎ  ｖｉｔｒｏの親和性（ＫＤ）において５〜１０倍の減少を示す。これらの分子に関するＰＫデータは、まだ得られていない。
【０１９１】
ｄＡｂ−ＡｌｂｕｄＡｂ融合体：未融合ＡｌｂｕｄＡｂと比較すると、治療用ドメイン抗体に融合するとき、ＲＳＡに対して最も高い親和性を有する２つのＤＯＭ７ｈ−１１  ＡｌｂｕｄＡｂは、ＢＩＡｃｏｒｅによる場合、ＲＳＡへの親和性において２倍の減少する。ＤＯＭ７ｈ−１１クローンは、融合されるとき（２．８μＭ）も未融合のとき（約５μＭ）も、マイクロモルＫＤを示す。
【０１９２】
エキセンディン４−ＡｌｂｕｄＡｂ融合体：結合においてわずか４倍の減少を示すＤＯＭ７ｈ−１４−１０は別として、ＲＳＡへの結合能に関して、ＡｌｂｕｄＡｂをペプチドに融合する効果は、約１０倍である。しかし、この効果は、ＤＯＭ７ｈ−１１シリーズに対して現れるよりも、ＤＯＭ７ｈ−１４シリーズ（ＤＯＭ７ｈ−１４−１０を除く）に対してより明白である。
【０１９３】
上記のすべてのデータに関して、融合体のＴ１／２は、種のＳＡへの親和性の改善を増加させた。
【０１９４】
血清アルブミン結合に関してＡｌｂｕｄＡｂ−薬物融合体が０．１ｎＭ〜１０ｎＭの親和性範囲（ＫＤ）を示すとき、我々は通常、そのＡｌｂｕｄＡｂ治療薬を治療的に受け入れられる（疾患、状態または徴候の治療および／または予防のために）ものとして分類する。
【０１９５】
我々は、ＡｌｂｕｄＡｂおよびＡｌｂｕｄＡｂ融合体（タンパク質−ＡｌｂｕｄＡｂ、たとえばＩＦＮα２ｂ−ＤＯＭ７ｈ−１４−１０；ペプチド−ＡｌｂｕｄＡｂ、たとえばエキセンディン４−ＤＯＭ７ｈ−１４−１０；ｄＡｂ−ＡｌｂｕｄＡｂ、たとえばＤＯＭ１ｍ２１−２３−ＤＯＭ７ｈ−１１−１５；ＮＣＥ−ＡｌｂｕｄＡｂ、たとえばＡＤＡＭＴＳ−４−ＤＯＭ７ｈ−１４−１０）の治療域を以下のように定義する。慢性または急性の状態、疾患もしくは徴候の治療に有用である親和性（ＫＤ）の範囲が示される。また、「中間」として区分される親和性範囲も示され。この範囲内のＡｌｂｕｄＡｂおよび融合体は、慢性または急性の疾患、状態もしくは徴候に対して有用である。このように、血清アルブミンに対するＡｌｂｕｄＡｂまたは融合体の親和性を、治療を施されるべき疾患、状態または徴候に合わせて調整または選択することができる。上述のように、本発明は種々の親和性を有するＡｌｂｕｄＡｂを提供することにより、各ＡｌｂｕｄＡｂを「高親和性」、「中親和性」または「低親和性」と分類するのを可能にするので、当業者は治療に本発明の適切なＡｌｂｕｄＡｂを選択できるようになる。図２を参照されたい。
【０１９６】
実施例９  ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐの配列：ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR  （配列番号４１４）
【０１９７】
本発明のある態様は、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐのヌクレオチド配列、または当該選択された配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐは、以下の核酸配列（下線を引いたＣは（ＤＯＭ７ｈ−１１−１５をコードする核酸に対する）変化、すなわち１２位でプロリンになる変化を意味する）を用いて作製した。
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG (配列番号４１５)
【０１９８】
プライマーを用いてＳ１２Ｐ変異を導入し、ＰＣＲでの鋳型としてＤＯＭ７ｈ−１１−１５を用いることでＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐを構築した。このプライマー配列は以下のとおりである。
GCAACAGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGCCTGCATCTGTAGG  (配列番号４１６).
【０１９９】
本発明の代替態様は、配列番号４１５のヌクレオチド配列を含む核酸、または当該選択された配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を提供する。一実施形態では、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐは、インラインタンパク質の融合産物を作製するために、リンカー領域と、タンパク質またはペプチド薬物または単一可変ドメインまたは他の抗体断片をコードするＣ末端配列とを含むベクターによってコードされ、そのベクターから発現される。一実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＴＶＡ、たとえばＴＶＡＡＰＳを含む。本発明の他の態様は、核酸を含むベクター、およびそのベクターを含む単離された宿主細胞である。本発明はまた、患者の疾患または障害を治療または予防する方法を提供し、該方法はその患者にＤＯＭ７ｈ−１１−１５Ｓ１２Ｐの少なくとも１用量を投与するステップを含む。
【図１Ａ】
2015204831.tif 000078
【図１Ｂ】
2015204831.tif 000079
【図２Ａ】
2015204831.tif 000080
【図２Ｂ】
2015204831.tif 000081
【図２Ｃ】
2015204831.tif 000082
【図２Ｄ】
2015204831.tif 000083
【配列表】
2015204831000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月1日(2015.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一可変ドメインＤＯＭ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列（配列番号２）において、１０８番目のアミノ酸残基のシステイン残基への置換（Ｒ１０８Ｃ）を有するアミノ酸配列を含んでなる、抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
請求項１に記載の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメインと、ＳＡ以外の標的抗原に特異的に結合する結合部分とを含んでなる、多重特異性リガンド。
【請求項３】
薬物に抱合されている、請求項１に記載の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
薬物がＮＣＥ薬物である、請求項３に記載の抗血清アルブミン（ＳＡ）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５】
請求項１に記載の可変ドメインに融合されたポリペプチド薬物またはペプチド薬物を含んでなる、融合タンパク質。
【請求項６】
前記可変ドメインと前記薬物の間にリンカーを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが、アミノ酸配列ＴＶＡを含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーが、アミノ酸配列ＴＶＡＡＰＳを含、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の可変ドメイン、融合タンパク質または多重特異性リガンド、および薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤もしくはビヒクルを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の可変ドメイン、請求項２に記載の多重特異性リガンド、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含んでなる、単離された宿主細胞。
【請求項１３】
患者における疾患または障害を治療または予防するための医薬組成物であって、請求項１に記載の可変ドメインを含んでなる、医薬組成物。
【外国語明細書】
2015204831000001.pdf