(57)【要約】【課題】神経学的障害を治療するための治療薬であって、対流強化送達により視床に投与することができる治療薬を提供する。【解決手段】本発明によれば、治療用タンパク質をコードする核酸を含むウイルス粒子を含有する、皮質に関与する神経学的障害のための治療薬であって、ここで、該治療薬が対流強化送達（ＣＥＤ）により視床に投与され、該皮質に関与する神経学的障害が、外傷性脳損傷、卒中、酵素性機能不全障害、精神医学的障害、神経変性疾患、癲癇および認知障害からなる群から選択される治療薬が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質をコードする核酸を含むウイルス粒子を含有する、皮質に関与する神経学的障害のための治療薬であって、ここで、該治療薬が対流強化送達（ＣＥＤ）により視床に投与され、該皮質に関与する神経学的障害が、外傷性脳損傷、卒中、酵素性機能不全障害、精神医学的障害、神経変性疾患、癲癇および認知障害からなる群から選択される治療薬。
【請求項２】
前記ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、請求項２に記載の治療薬。
【請求項４】
前記皮質に関与する神経学的障害が、それぞれ第一および第二視床核から生じる視床皮質投射により神経支配される皮質ニューロンの少なくとも第一および第二の集団に関与し、ここで、視床核は異なる、請求項１に記載の治療薬。
【請求項５】
前記皮質に関与する神経学的障害が大脳皮質の１つより多い機能領域に関与する請求項１記載の治療薬。
【請求項６】
前記皮質に関与する神経学的障害が大脳皮質の１を超える小葉に関与する、請求項１に記載の治療薬。
【請求項７】
前記皮質に関与する神経学的障害が皮質と連結される第三のニューロン集団に関与する、請求項１に記載の治療薬。
【請求項８】
前記治療薬が視床の１を超える位置に投与される、請求項１に記載の治療薬。
【請求項９】
前記治療薬を投与するために１を超えるカニューレが用いられる、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１０】
前記治療薬が反復投与される、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１１】
視床に両側的に前記治療薬が投与される、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１２】
対応する視床核に両側的に前記治療薬が投与される、請求項１１に記載の治療薬。
【請求項１３】
前記治療用タンパク質が送達後少なくとも６ヶ月の間、脳中で産生される、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１４】
前記ＣＥＤがステッピングを含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１５】
前記治療薬が、トレーシング剤とともに投与される、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１６】
前記トレーシング剤がＭＲＩ造影増強剤である、請求項１５に記載の治療薬。
【請求項１７】
前記ＭＲＩ造影増強剤の組織分布がＭＲＩによって実時間でモニタリングされる、請求項１６に記載の治療薬。
【請求項１８】
霊長類における皮質に送達するための、治療用タンパク質をコードする核酸を含むウイルス粒子を含有する治療薬であって、ここで、該治療薬がＣＥＤにより視床に投与される送達することを含む治療薬。
【請求項１９】
前記治療薬が視床中の１を超える位置に投与される、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２０】
前記治療薬が１を超えるカニューレを用いて投与される、請求項１９に記載の治療薬。
【請求項２１】
前記治療薬が反復投与される、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２２】
前記ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２３】
前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される、請求項２２に記載の治療薬。
【請求項２４】
前記治療薬が、被験者の視床にカニューレの先端を挿入し、該カニューレをポンプに連結し、該ポンプを用いて該治療薬を皮質に送達することによって投与され、ここで、該治療薬は、ＣＥＤによって視床にカニューレを通じて投与され、それによって、該治療薬は、視床皮質投射により皮質に運搬される、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２５】
前記治療薬が、ＭＲＩ造影増強剤とともに投与される、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２６】
前記治療薬とＭＲＩ造影増強剤の組織分布が、ＭＲＩによって実時間でモニタリングされる、請求項２５に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／１４８，３０２号（２００９年１月２９日出願）（この記載内容は参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府の資金提供による研究開発の陳述）
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金５Ｒ０１ＮＳ５６１０７−２下で政府援助でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、皮質に関与する神経学的障害の治療方法であって、皮質に治療薬を送達することを包含する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
神経学的障害の有効な治療においては、罹患細胞集団への治療薬の送達に伴う問題が大きな妨げとなっていた。適切な送達は、皮質に関与する神経学的障害において特に問題をはらんでいる。
【０００５】
例えば、皮質に関与する神経学的障害を治療するための遺伝子治療用ベクターの使用は、大部分が、罹患領域における十分数の皮質ニューロンにベクターを有効に送達することの物理的制約のために、依然として難題である。多重直接皮質注入が小動物脳においては有効であり得る（例えば、Ｖｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５７（３）：３５５−３６４，２００５；およびＶｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（２２）：１８７４−１８８１，２００３）が、しかし脳組織の構造および容積は霊長類では増大するので、直接皮質注入により広範な皮質送達を達成することはほとんど不可能になる。特定の核の限局性標的化は定位的神経外科的注入により確実に達成され得るが、しかし霊長類大脳皮質の広範囲の渦巻き型配置はウイルスベクターの直接注入により容易に標的化されるわけではない。
【０００６】
ウイルスベクターの軸索および経シナプス輸送、ならびに注入部位に対して遠位の部位でのベクターコード遺伝子の発現が報告されている。例えば、Ａｕｂｏｕｒｇら（米国特許２００５／００３２２１９）は、脳梁および脳橋への組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の注入が、注入部位に連結される多数の部位、例えば前大脳皮質、嗅球、線条体、視床、視索核、下丘および脊髄での遺伝子発現を引き起こす、ということを開示している。さらに、Ｐａｓｓｉｎｉら（米国特許２００６／０１７１９２６）は、リソソーム蓄積症のマウスモデルにおける海馬への組換えＡＡＶの注入が、対側性歯状回、ＣＡ３領域、内側中隔および内嗅皮質における遺伝子発現を引き起こす、ということを開示している。しかしながら、報告された齧歯類モデルの各々において、皮質のある領域における限定発現のみが認められ、霊長類の脳における意図された輸送経路と対応する経路との相関は依然として不明である。
【０００７】
その結果として、ヒトの脳における広範な治療的分布を安全に達成するに際しての難しさが、大型皮質ドメインに衝撃を与える種々の神経学的障害、例えば外傷性脳損傷、卒中、酵素性機能不全障害および痴呆のための潜在的治療の開発を妨げてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
視床への治療薬の対流強化送達（ＣＥＤ）により、霊長類皮質内の治療薬の前例のない容積の分布が達成され得る、ということを本発明人らは見出した。本明細書中に開示される方法を用いて、治療薬の高レベルの且つ広範囲の皮質分布が、霊長類視床への１回投与の場合でさえ、達成され得る。その結果、神経学的障害、例えば外傷性脳損傷、卒中、酵素性機能不全障害、痴呆、および皮質の大きな領域に衝撃を与えるその他の神経学的障害は、ＣＥＤにより視床に治療的に接近可能である。ＣＥＤによる視床への送達は、皮質の多数の部位への直接且つ反復送達の必要をなくしたが、これは、多数の神経学的障害の治療を妨げていたものである。さらに、本発明の方法は、依然として機能的である順行性輸送を用いるが、一方、皮質ニューロンおよびそれにより助長される逆行輸送は多数の神経学的障害において危うくされ得る。さらに、治療薬は、視床送達により治療薬が供給される皮質ドメインと連結される第三の部位にさらに送達されて、従来の方法により治療され得る細胞集団および障害の範囲を増大し得る。
【０００９】
本発明は軸索輸送に関するが、しかし本発明は、視床に適切な手段により送達される場合に、皮質に治療薬を運搬するための霊長類視床皮質投射の従来観察されていない並外れた能力に由来する。小実験室動物および非視床皮質経路における輸送現象の実証（例えば米国特許２００６／０１７１９２６、米国特許２００５／００３２２１９）にもかかわらず、霊長類皮質の広範囲の領域に大量のウイルスベクターを順行送達し、大型皮質ドメイン中の配分の治療的関連容積を達成する霊長類視床皮質投射の本発明に開示される能力は、依然として不明である。さらに、本明細書中に詳述されるように、視床への治療用ベクターのＣＥＤは、皮質における高レベルの発現および広範囲の分布を助長し、特定の神経学的障害を治療するための罹患皮質領域への直接的皮質送達の必要を無くす視床レベルを達成する必要があると思われる。
【００１０】
したがって、一態様において、本発明は、「皮質性神経学的障害」と本明細書中で呼ばれる、皮質に関与する神経学的障害を治療するための方法を提供する。本方法は、ＣＥＤによる視床への治療薬の送達を包含する。
【００１１】
選択される皮質性神経学的障害は、皮質の大領域、好ましくは、皮質の１つより多い機能領域、好ましくは皮質の１つより多い小葉、全皮質を含めて全皮質までを包含するものである。選択される皮質性神経学的障害としては、外傷性脳損傷；卒中；酵素性機能不全障害；精神疾患、例えば外傷後ストレス症候群；神経変性疾患、例えばハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病；癲癇；ならびに認知障害、例えば痴呆、自閉症およびうつ病が挙げられるが、これらに限定されない。選択される酵素性機能不全障害としては、白質萎縮症、例えばカナバン病、ならびにリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、例えばニーマン・ピック病、ゴーシェ病、バッテン病、ファブリー病およびポンペ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
好ましい一実施形態では、皮質性神経学的障害は、それぞれ第一および第二視床核（この場合、視床核は異なる）から生じる視床皮質投射により神経支配される皮質ニューロンの少なくとも第一および第二の集団を伴う。
【００１３】
好ましい一実施形態では、皮質性神経学的障害は、大脳皮質の１つより多い機能領域に関与する。
【００１４】
好ましい一実施形態では、皮質性神経学的障害は、皮質の１つより多い小葉に関与する。
【００１５】
一実施形態では、皮質性神経学的障害は、皮質に連結される第三のニューロン集団に関与する。
【００１６】
好ましい一実施形態では、視床に送達される治療薬は、治療用核酸を含むウイルス粒子である。好ましい一実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子である。好ましい一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。
【００１７】
好ましい一実施形態では、ウイルス粒子は、治療用タンパク質をコードする核酸を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は酵素である。一実施形態では、治療用タンパク質は、増殖因子、例えばニューロトロフィン；ホルモン；免疫調節ペプチドおよびタンパク質、例えばサイトカイン；ならびに神経調節ペプチドからなる群から選択される。
【００１８】
一実施形態では、皮質性神経学的障害は、Ａ型ニーマン・ピック病であり、治療用タンパク質はヒト酸性スフィンゴミエリナーゼである。
【００１９】
好ましい一実施形態では、コード化治療用タンパク質は、送達後少なくとも６ヶ月間、脳中で産生される。
【００２０】
一実施形態では、視床に送達される治療薬は治療用タンパク質である。対象治療用タンパク質は、皮質への転位を可能にする。一実施形態では、治療用タンパク質は酵素である。一実施形態では、治療用タンパク質は、増殖因子、例えばニューロトロフィン；ホルモン；免疫調節ペプチドおよびタンパク質、例えばサイトカイン；ならびに神経調節ペプチドからなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態では、皮質性神経学的障害は、Ａ型ニーマン・ピック病であり、治療用タンパク質はヒト酸性スフィンゴミエリナーゼである。
【００２２】
一実施形態では、当該方法は、ＣＥＤによる視床への治療薬の１回注入を包含する。別の実施形態では、当該方法は、ＣＥＤによる視床への治療薬の１回より多い注入を包含する。
【００２３】
好ましい一実施形態では、治療薬は、視床中の１つより多い位置に送達される。一実施形態では、治療薬は、１つより多いカニューレを用いて、１つより多い位置に送達される。
【００２４】
好ましい一実施形態では、治療薬は、視床に両側的に送達される。
【００２５】
好ましい一実施形態では、治療薬は対応する視床核に両側的に送達される。
【００２６】
一実施形態では、当該方法はさらに、脳幹に治療薬を送達することを包含する。
【００２７】
一実施形態では、ＣＥＤによる送達はステッピングを包含する。
【００２８】
好ましい一実施形態では、トレーシング剤、好ましくはＭＲＩ造影増強剤が、治療薬注入液と同時送達されて、注入液の組織分布の実時間モニタリングを提供する。
【００２９】
一態様では、本発明は、霊長類における皮質への治療薬の送達方法であって、ＣＥＤにより視床に治療薬を送達することを包含する方法を提供する。
【００３０】
好ましい一実施形態では、治療薬は、視床中の１つより多い位置に送達される。一実施形態では、治療薬は、１つより多いカニューレを用いて、１つより多い位置に送達される。
【００３１】
好ましい一実施形態では、治療薬は、それぞれ第一および第二視床核（この場合、視床核は異なる）から生じる視床皮質投射により神経支配される皮質ニューロンの少なくとも第一および第二の集団に送達される。
【００３２】
好ましい一実施形態では、治療薬は、皮質の１つより多い機能領域に送達される。
【００３３】
好ましい一実施形態では、治療薬は、皮質の１つより多い小葉に送達される。
【００３４】
好ましい一実施形態では、治療薬は、治療用タンパク質をコードする核酸を含むウイルス粒子である。
【００３５】
好ましい一実施形態では、ウイルス粒子はＡＡＶ粒子である。好ましい一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択される。
【００３６】
一実施形態では、治療薬はタンパク質である。
【００３７】
好ましい一実施形態では、治療薬は、視床中の１つより多い位置に送達される。一実施形態では、治療薬は、１つより多いカニューレを用いて、１つより多い位置に送達される。
【００３８】
好ましい一実施形態では、治療薬は、視床に両側的に送達される。
【００３９】
好ましい一実施形態では、治療薬は対応する視床核に両側的に送達される。
【００４０】
一実施形態では、当該方法はさらに、脳幹に治療薬を送達することを包含する。
【００４１】
一実施形態では、ＣＥＤによる送達はステッピングを包含する。
【００４２】
好ましい一実施形態では、トレーシング剤、好ましくはＭＲＩ造影増強剤が、治療薬注入液と同時送達されて、注入液の組織分布の実時間モニタリングを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】視床中へのＡＡＶ２−ＧＤＮＦ注入後のＧＤＮＦタンパク質の分布。（Ａ）視床注入に対して同側の前頭前皮質においてＩＨＣ染色により検出されるＧＤＮＦ発現。（Ｂ、Ｃ）多数の非錐体ＧＤＮＦ陽性ニューロンが皮質領域８の多重層全体で見出された。（Ｄ、Ｇ）帯状皮質、前運動皮質および側方前頭前皮質におけるＧＤＮＦ  ＩＨＣ染色。（Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ）ＧＤＮＦを発現する前運動皮質の第ＶおよびＶＩ層（領域６）における錐体ニューロン。錐体ニューロン上の皮質層中で、強いＧＤＮＦ免疫陽性染色が明白である。（Ｊ）注入視床における強ＧＤＮＦ陽性染色、ならびに体性感覚皮質（領域３）および運動皮質（領域４）における皮質性ＧＤＮＦ発現。（Ｋ、Ｌ）体性感覚皮質の第ＶおよびＶＩ層におけるＧＤＮＦ陽性ニューロン。ＡＰ：ブレグマからの前方／後方距離（ｍｍ）。尺度バー：５００μｍ（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）、１００μｍ（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。
【図２】右視床中へのＡＡＶ２−ＧＤＮＦの注入後のＧＤＮＦ発現のレベル。（Ａ〜Ｆ）視床および皮質の両方におけるＧＤＮＦ分布の勾配を示すＧＤＮＦ  ＩＨＣ染色切片の擬似カラー画像。青色は、ＤＡＢ染色の最高強度を示し、赤色は最低強度を示す。パネルＡおよびＤの数字は、隣接組織ブロックから測定される脳の異なる領域におけるＧＤＮＦタンパク質（ＧＤＮＦ  μｇ／総タンパク質１ｍｇ）のレベルを表す。（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）高倍率の皮質は、第ＩＩＩ／ＩＶ層における高強度のＧＤＮＦ染色、ならびに第Ｖ／ＶＩ層錐体ニューロンにおけるＧＤＮＦの高細胞質性存在を示す。ＡＰ：ブレグマからの前方／後方距離（ｍｍ）。尺度バー：１０ｍｍ（Ａ、Ｄ）、５００μｍ（Ｂ、Ｅ）、１００μｍ（Ｃ、Ｆ）。
【図３】左視床へのＡＡＶ２−ＧＦＰの注入後のＧＦＰの皮質発現。個々のＧＦＰ免疫陽性ニューロンが、皮質の異なる領域内で見出された。（Ａ、Ｂ）皮質錐体ニューロンは、優勢型のＧＦＰ陽性ニューロンであった。錐体形態を有さないニューロン、例えば（Ｃ）籠様ニューロンおよび（Ｄ）グリア様細胞も、皮質中に見出された。（Ｅ、Ｆ）広範囲のＧＦＰ陽性繊維網状構造も、前頭皮質中に見出された。尺度バー：５００μｍ（Ａ、Ｅ）、１００μｍ（Ｂ、Ｃ）、５０μｍ（Ｄ、Ｆ）。
【図４】図３に示した動物のＡＡＶ２−ＧＦＰのＣＥＤ後の視床におけるＧＦＰ免疫染色。特定の視床核を形質導入し、これはＧＦＰの対応する皮質送達を生じた。
【図５】ＣＮＳ実質注入液送達のためのアレイＣＥＤ構成成分。（Ａ）頭蓋表面に配置された煙突式アレイ（Ｂ）を有するＮＨＰ脳を示すＴ２強調ＭＲ画像。これらの煙突式アレイは、ＣＮＳ実質中への効率的注入液送達のための還流耐性ステップ式カニューレ（Ｃ）をしっかり挿入するために利用される。
【図６】ＮＨＰ視床および脳幹における近実時間ＣＥＤの術中使用。ＭＲＩ上の対比分界として可視化されるＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡ／Ｇｄの注入は、標的化領域におけるカニューレ先端配置を示す（Ａ〜Ｂ；白色矢印）。逐次ＭＲ画像獲得で実証されるような時間の一関数としての注入液サイズの増大に留意。
【図７】視床（黒色記号）および脳幹（白色記号）におけるＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡとＧｄの同時注入。視床（黒丸、Ｎ＝１０；平均Ｖｉ：Ｖｄ比  ３．８６［ＳＥＭ±０．２５］）および脳幹（白丸、Ｎ＝６；平均Ｖｉ：Ｖｄ比  ３．３［ＳＥＭ±０．１７］）中への種々の量の注入液の１回送達。Ｖｉ対Ｖｄ間の線形関係（全体、Ｎ＝１６、Ｒ2＝０．９３）。視床と比較して、脳幹領域に送達されたＶｉの方が高い。これら２つの領域における比の間に有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。
【図８】反復視床および脳幹注入のＶｉ対Ｖｄ比較。Ｇｄのみ注入中の初期Ｖｉ：Ｖｄ送達パラメーター（中黒四角、Ｎ＝５；平均Ｖｉ：Ｖｄ比３．７４［ＳＥＭ±０．２５］、Ｒ2＝０．９６）を、後に、ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡ／Ｇｄからなる注入（中白四角、Ｎ＝５；平均Ｖｉ：Ｖｄ比３．７２［ＳＥＭ±０．２４］、Ｒ2＝０．９８）で再現した。治療薬を用いた場合または用いなかった場合の連続注入で、一貫した分布パターンが観察されたことに留意（全体、Ｎ＝１０、Ｒ2＝０．９６）。一次および二次注入間に有意差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。
【図９】視床および脳幹におけるｈＡＳＭおよびＨＡ染色の同時局在性。視床（Ａ〜Ｃ；左側、ｈＡＳＭ［０．６５２ｃｍ2］およびＨＡ［０．６１６ｃｍ2］；右側、ｈＡＳＭ［０．３０３ｃｍ2］およびＨＡ［０．２７７ｃｍ2］）ならびに脳幹（Ｄ〜Ｆ；ｈＡＳＭ［０．８１７ｃｍ2］およびＨＡ［０．７９０ｃｍ2］）注入領域におけるｈＡＳＭまたはＨＡエピトープに関して染色された類似の免疫反応性領域。黒線と白線の重なりは、各注入に関して測定された代表的な領域を表すことに留意（黒線＝抗ｈＡＳＭ；白線＝抗ＨＡ）。
【図１０】視床および脳幹におけるＡＡＶ注入および形質導入。視床および脳幹注入を表すＤＩＣＯＭ  ＭＲ画像（ＡおよびＥ）、ならびに対応するＭＲＩと解剖学的に整合する免疫染色脳（ＢおよびＦ）。高倍率画像は、各標的化領域（Ｃ−ＤおよびＧ−Ｈ）における有意のニューロン形質導入（ＨＡ発現）を含有する注入中心点を実証する。
【図１１】ｈＡＳＭ−ＨＡの皮質発現。（Ａ）視床への直接注入液送達は、前頭前葉皮質領域中への治療薬の広範な分布を明示した。（Ｂ）高倍率画像は、皮質ニューロンのＡＡＶ形質導入を示す（ＨＡ陽性）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
「皮質性神経学的障害」は、本明細書中で用いる場合、皮質に関与する神経学的障害を指す。皮質性神経学的障害は、（ｉ）視床に直接、解剖学的に連結される皮質中の細胞の一集団に関与し、および／または（ｉｉ）（ｉ）中の皮質細胞集団と直接、解剖学的に連結される細胞の一集団に関与する神経学的障害である。選択される皮質性神経学的障害は、皮質の大領域、好ましくは皮質の１つより多い機能的領域、好ましくは皮質の１つより多い小葉に、そして全皮質まで（全皮質を含む）に関与するものである。選択される皮質性神経学的障害としては、外傷性脳損傷；卒中；酵素性機能不全障害；精神医学的障害、例えば外傷後ストレス症候群；神経変性疾患、例えばハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病；癲癇；ならびに認知障害、例えば痴呆、自閉症およびうつ病が挙げられるが、これらに限定されない。選択される酵素性機能不全障害としては、例えば白質萎縮症、例えばカナバン病、ならびにリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、例えばニーマン・ピック病、ゴーシェ病、バッテン病、ファブリー病およびポンペ病が挙げられるが、これらに限定されない。障害のこの一覧は、例示的であって、限定的ではない。皮質性病態および神経解剖学的結合性に基づいた本発明による治療にどの神経学的障害が適しているかは、当業者には合理的に明らかになるであろう。
【００４５】
「皮質」は、本明細書中で用いる場合、大脳皮質を指す。
【００４６】
投与方法
本発明は、視床への治療薬の直接送達に関する。送達は、患者における治療薬の有効輸送を達成するために、対流強化送達（ＣＥＤ）により実行される。「患者」、「被験者」および「個体」という用語は、本明細書中では互換的に用いられ、そして大型哺乳類、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトを指す。「患者」は、齧歯類のような小型哺乳類を含まない。
【００４７】
「ＣＥＤ」とは、０．５μＬ／分より大きい速度での注入を意味する。ＣＥＤは、好ましくは、適切なカテーテルまたはカニューレ、好ましくはステップ式無還流カニューレを用いて実行される。当該方法は、標的視床組織に少なくとも近接してカニューレの先端を配置することを包含し、好ましくは先端は、視床中に挿入される。カニューレが配置された後、それは、カニューレ先端を通して標的視床組織に治療薬を送達するポンプに連結される。カニューレの先端からの圧力勾配は、注入の間、維持される。術中ＭＲＩ（ｉＭＲＩ）、ならびに注入をモニタリングするためのトレーシング剤の使用は、非常に好ましい。
【００４８】
標的視床集団に「近位の」とは、標的集団の有効距離内を意味する。特に、標的視床組織に対応したカニューレの配置に関して、近位は、ＣＥＤにより送達した場合に、注入液が標的組織に到達するような距離を指す。
【００４９】
好ましい一実施形態では、ＣＥＤは、０．５μＬ／分および１０μＬ／分の間の注入速度を包含する。
【００５０】
好ましい一実施形態では、ＣＥＤは、約０．５μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約０．７μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１．２μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１．５μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１．７μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２．２μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２．５μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２．７μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約３μＬ／分より大きい、ならびに好ましくは約２５μＬ／分未満、さらに好ましくは２０μＬ／分未満、さらに好ましくは約１５μＬ／分未満、さらに好ましくは約１２μＬ／分未満、さらに好ましくは約１０μＬ／分未満の注入速度を包含する。
【００５１】
好ましい一実施形態では、ＣＥＤは、送達中、「ステッピング」と呼ばれる流量の増分的増加を含む。好ましくはステッピングは、０．５μＬ／分〜１０μＬ／分の注入速度を包含する。
【００５２】
好ましい一実施形態では、ステッピングは、約０．５μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約０．７μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１．２μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１．５μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約１．７μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２．２μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２．５μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約２．７μＬ／分より大きい、さらに好ましくは約３μＬ／分より大きい、ならびに好ましくは約２５μＬ／分未満、さらに好ましくは２０μＬ／分未満、さらに好ましくは約１５μＬ／分未満、さらに好ましくは約１２μＬ／分未満、さらに好ましくは約１０μＬ／分未満の注入速度を包含する。
【００５３】
好ましい一実施形態では、ステップ式無還流カニューレは、カニューレを通して標的組織に制御速度で注入液を流すのに十分な圧力を生じるポンプと接合される。頭蓋内圧が脳組織を損傷しないよう適切なレベルに保持されるよう、任意の適切な流量が用いられ得る。１つより多いカニューレが用いられ得るが、しかし単一カニューレが好ましい。
【００５４】
送達は、治療されている皮質性神経学的障害にならびに患者応答に適している場合、１回以上実行され、これは当業者により容易に決定可能である。
【００５５】
一実施形態では、浸透は、促進剤の使用によりさらに増大される。促進剤は、標的組織への注入液の送達をさらに促し得る。送達される治療薬が治療用タンパク質である場合、促進剤は特に好ましい。特に好ましいのは、低分子量ヘパリンである。例えば、ＵＳＳＮ１１／７４０，１２４（２００７年４月２５日出願）（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）を参照。
【００５６】
非常に好ましい実施形態では、トレーシング剤、好ましくはＭＲＩ造影増強剤は、治療薬注入液と同時送達されて、注入液の組織分布の実時間モニタリングを提供する。例えば、Ｆｉａｎｄａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ，２００８  Ｎｏｖ  ２７（印刷に先立ち電子出版）参照。例えば、ＵＳＳＮ１１／７４０，５０８（２００７年４月２６日出願）ならびにＵＳＳＮ１１／７４０，１２４（２００７年４月２５日出願）（これらの記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）参照。トレーシング剤の使用は、送達の休止を知らせ得る。当該技術分野で既知のその他のトレーシングおよび画像形成手段も、注入液分布を追跡調査するために用いられ得る。
【００５７】
任意の適切な量の注入液が、このようにして投与され得る。適切な量は、過剰の望ましくない副作用を引き起こすことなく治療的に有効である量である。ウイルス粒子注入液に関しては、適切な量は、力価、感染力、標的組織の容積、活性作用物質の性質、ならびに当業者に認知されている付加的因子に依るであろう。Ｖi：Ｖd比は、好ましくは少なくとも１：１である。
【００５８】
ＣＥＤの方法に関するさらなる教示に関しては、例えばＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９６：３８１−３８９，２００５；Ｋｒａｕｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９６：１０４−１１１，２００５；Ｋｒａｕｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．，１６：２０−２６，２００５；米国特許出願公開番号２００６／００７３１０１；および米国特許第５，７２０，７２０号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中み組み込まれる）参照。Ｎｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｍａｒ．１，２００６；６６（５）：２８０１−６；Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊｕｎ．３０，２００６；１５４（１−２）：２２５−３２；Ｈａｄａｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｍａｒｃｈ  ２００６；１７（３）：２９１−３０２；およびＨａｄａｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．Ｊｕｌｙ  ２００６；１４（１）：６９−７８（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に組み込まれる）も参照されたい。
【００５９】
ＵＳＳＮ１１／７４０，５４８（２００７年４月２６日出願）（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）も参照。米国特許第６，９５３，５７５号（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）も参照されたい。
【００６０】
非常に好ましい一実施形態では、ＣＥＤの方法は、ＣＥＤ対応無還流ステップ式カニューレを用いて実行される。このような非常に好ましいカニューレは、Ｋｒａｕｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５；１０３（５）：９２３−９（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）に、ならびに米国特許出願公開番号ＵＳ２００６／０１３５９４５  Ａ１（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）および米国特許出願公開番号ＵＳ２００７／００８８２９５  Ａ１（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されている。さらに、本発明に用いるための好ましいカニューレに関しては、ＰＣＴ／ＵＳ０８／６４０１１を参照されたい。
【００６１】
本発明に用いるためのポンプ系の例としては、米国特許第７，３５１，２３９号；第７，３４１，５７７号；第６，０４２，５７９号；第５，７３５，８１５号および第４，６９２，１４７号に記載された埋め込み可能な系が挙げられる。
【００６２】
本発明の治療方法は、任意に、皮質性神経学的障害の存在の１つ以上の術前診断確定を包含する。実行される診断確定としては、好ましくは神経学画像診断が挙げられる。一実施形態では、診断確定は、遺伝子検査を包含する。当該方法は、好ましくは、標的化視床集団の位置を定位的に限定するための術前画像診断も包含する。
【００６３】
好ましい一実施形態では、当該方法は、付加的に、カニューレ位置決めをモニタリングするために、投与中の画像診断を包含する。一実施形態では、当該方法は、神経ナビゲーション系の使用を包含する（例えば米国特許出願公開番号２００２／００９５０８１（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）参照）。
【００６４】
一態様では、本発明は、ＣＥＤにより送達される場合、注入液分布の画像ベースのモニタリングから得られるデータの編集方法を提供する。データとしては、注入液の容積、分布の容積、神経解剖学的分布、遺伝子データ、注入パラメーター、カニューレパラメーターおよびカニューレ配置データが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明は、このようなデータを含むデータベースを提供する。一実施形態では、データベースは、皮質性神経学的障害を有する患者のＣＮＳにおける注入液の分布を説明するアルゴリズムを引き出すために有用であり、治療的送達をモデル化するために用いられ得る。
【００６５】
本発明の治療薬の組合せが本明細書中の方法に用いられ得る、と考えられる。例えば、１つより多い型のウイルス粒子が用いられ、ウイルス粒子注入液は有効量の第二治療薬とともに併用療法で投与され得る、と意図される。第二治療薬は、視床に送達されることもされないこともある。
【００６６】
治療薬が送達される特定の視床核は、治療されている皮質性神経学的障害に依っている。皮質集団が任意の所定の皮質性神経学的障害において罹患し、当該技術分野における神経解剖学的知識に基づいて視床核が標的にされるべきである、ということは当業者には明らかである。例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：８１１７−８１３２，２００２（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）参照。好ましい一実施形態では、治療薬は複数の視床核に送達される。このような送達は、１つ以上の注入カニューレを用いて実行され得る。相対的により多くの異なる皮質領域、および／またはこのような相対的に多くの異なる皮質範囲を神経支配する第三のＣＮＳ集団に関与する障害に関しては、特に治療薬が標的皮質範囲の外の皮質領域に望ましくない作用を及ぼし得る場合には、治療薬は標的皮質範囲を神経支配する１つ以上の選択視床核に送達され、それにより所望の皮質範囲への皮質分布を制限する。
【００６７】
一実施形態では、当該方法は、単一視床位置への治療薬の投与を包含する。別の実施形態では、当該方法は、１つより多い視床位置への治療薬の投与を包含する。一実施形態では、当該方法は、両側的に治療薬を投与することを包含する。好ましい一実施形態では、当該方法は、対応する視床核に両側的に治療薬を投与することを包含する。
【００６８】
皮質の罹患領域に突出する任意の視床核は、治療されている皮質性神経学的障害に適している場合、送達のために標的化され得る。好ましい一実施形態では、当該方法は、前核群、背内側、腹側、前腹側、腹外側、後外側腹側、後内側腹側、外側核群、正中核群、視床枕、外側または内側膝状核からなる群から選択される１つ以上の視床核への治療薬の送達を包含する。
【００６９】
一実施形態では、当該方法はさらに、脳幹への治療薬の投与を包含する。この実施形態は、皮質の神経学的障害がさらに脳幹に関与する場合、特に好ましい。例えば、脳幹への治療薬の付加的投与は、多数の皮質性神経学的障害、例えばリソソーム蓄積症の呼吸局面の治療のために望ましい。
【００７０】
視床送達のための治療用タンパク質
視床に送達され得る治療用タンパク質は、皮質への転位が可能である。一実施形態では、治療用タンパク質は酵素である。一実施形態では、治療用タンパク質は、増殖因子、例えばニューロトロフィン；ホルモン；免疫調節ペプチドおよびタンパク質、例えばサイトカイン；ならびに神経調節ペプチドからなる群から選択される。
【００７１】
好ましい一実施形態では、本発明の治療用タンパク質は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＴ−６、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＧＦ−１、ｂ−ＦＧＦ、ニュールツリン、ペルセフィン、アルテミン、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、カルジオトロピン、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＭＰ、ＦＧＦ２０、ＶＩＰ、ＰＤＧＦ、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）およびＨＧＦからなる群から選択される。
【００７２】
治療用タンパク質誘導体、例えば増殖因子誘導体は、治療用タンパク質に含まれる。
【００７３】
治療用タンパク質のさらなる考察に関しては、例えばＵＳＳＮ１１／７４０，１２４（２００７年４月２５日出願）（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）を参照。視床に送達される治療用タンパク質としては、下記のような治療用核酸によりコードされるタンパク質が挙げられるが、この場合、治療用タンパク質は皮質への転位を可能にする。
【００７４】
ウイルス粒子および遺伝子導入
一実施形態では、本発明の方法は、治療用タンパク質をコードする核酸を含むウイルス粒子による視床ニューロンの形質導入、視床ニューロンにおける治療用タンパク質の発現、ならびに皮質への治療用タンパク質の順行性輸送を包含する。
【００７５】
一実施形態では、本発明の方法は、皮質中のニューロンへ、治療用タンパク質をコードする核酸を含むウイルス粒子の順行性転位、皮質ニューロンの形質導入、ならびに皮質ニューロンにおける治療用タンパク質の発現を包含する。
【００７６】
一実施形態では、本発明の方法は、治療用タンパク質をコードする核酸を含む第一ウイルス粒子による視床ニューロンの形質導入、視床ニューロンにおける治療用タンパク質の発現、および皮質への治療用タンパク質の順行性輸送、ならびに皮質中のニューロンへの治療用タンパク質をコードする核酸を含む第二ウイルス粒子の順行性転位、皮質ニューロンの形質導入、および皮質ニューロンにおける治療用タンパク質の発現を包含する。
【００７７】
一実施形態では、当該方法はさらに、視床から治療薬を受容する皮質ニューロンが位置する皮質の領域と連結された第三のニューロン集団へのウイルス粒子および／または治療用タンパク質の転位を包含する。第三の部位は、対象視床核に直接連結されない終脳中の位置であり得る。特に好ましい実施形態では、第三部位は前脳基底核である。このような方法は、アルツハイマー病の治療のために非常に好ましい。
【００７８】
治療用核酸を保有し、そして治療薬（例えばコード化治療用タンパク質）が産生されるよう視床および／または皮質ニューロンを形質導入し得る任意のウイルス粒子が、本発明に用いられ得る。ウイルスが、皮質ニューロン中で治療薬を産生し得るが視床ニューロン中では産生し得ない場合、ウイルスは転位が可能でなければならない。ウイルスが視床ニューロン中で治療薬を産生し得るが皮質ニューロン中では産生し得ない場合、治療薬は皮質への転位が可能でなければならない。
【００７９】
本発明に用いるための好ましいウイルス粒子は、視床から皮質への転位が可能であるものである。
【００８０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、好ましいウイルス粒子に含まれる。ＡＡＶ１〜１１は、ハイブリッドとして含まれる（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＡＡＶ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００５  Ｊｕｎｅ；５（３）：２９９−３１０参照）。好ましいＡＡＶとしては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいのは、ＡＡＶ２である。本明細書中で用いる場合、「ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ（すなわち、治療用核酸を保有するよう工学処理されたもの）、ならびにネイティブＡＡＶを指す。組換えＡＡＶは、「ｒＡＡＶ」としても、本明細書中で言及される。
【００８１】
「遺伝子導入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞中に外来ＤＮＡを確実に挿入するための方法または系を指す。このような方法は、非組込み導入ＤＮＡの一過性発現、染色体外複製および導入レプリコン（例えばエピソーム）、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への導入遺伝物質の組込みを生じ得る。哺乳類細胞中への遺伝子導入のために、多数の系が開発されてきた。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）参照。
【００８２】
「ベクター」とは、適正な制御因子と関連する場合に複製可能である、そして細胞間で遺伝子配列を導入し得る、任意の遺伝因子、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を意味する。したがって、本用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００８３】
「組換えウイルス」とは、例えば、当該粒子中への非相同核酸構築物の付加または挿入により、遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
【００８４】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶ粒子」とは、完全ウイルス粒子、例えば野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質外被と関連した線状一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）、または組換えＡＡＶ粒子を意味する。この点で、相補的センス、例えば「センス」または「アンチセンス」鎖の一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、任意の一つのＡＡＶビリオン中に包装され得るし、両方の鎖は等しく感染性である。
【００８５】
時として「ｒＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶ粒子」として言及される「組換えＡＡＶビリオン」は、好ましくは、ＡＡＶ  ＩＴＲが両側に隣接する当該非相同ヌクレオチド配列にキャプシド形成するＡＡＶタンパク質殻からなる感染性複製欠陥ウイルスである。ｒＡＡＶビリオンは、それに導入されたＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能および補助機能を有した適切な宿主細胞中で産生され得る。このように、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のために感染性組換えビリオン粒子中にＡＡＶベクター（当該組換えヌクレオチド配列を含有する）を包装する必要があるＡＡＶポリペプチドをコードし得るようにされる。
【００８６】
「トランスフェクション」または「形質導入」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取込みに言及するために用いられ、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、「トランスフェクト」され、または「形質導入」された。多数のトランスフェクション技法は、一般的に、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照。このような技法を用いて、１つ以上の外因性ＤＮＡ分子、例えばヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子を、適切な宿主細胞中に導入し得る。
【００８７】
「宿主細胞」という用語は、例えばＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、補助機能ベクターまたは他の導入ＤＮＡの受容体として用いられ得るかまたは用いられてきた微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を意味する。本用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」は、本明細書中で用いる場合、一般的に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。天然の、偶発的または計画的な突然変異のため、単一親細胞の子孫は、形態が、あるいはゲノムまたは総ＤＮＡ相補体が元の親と必ずしも完全に同一であるというわけではない、と理解される。
【００８８】
本明細書中で用いる場合、「細胞株」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで連続または長期増殖および分裂が可能である細胞の集団を指す。しばしば、細胞株は、単一前駆細胞由来のクローン集団である。さらに、このようなクローン集団の保存または導入中に、核型において自発的なまたは誘導された変化が起こり得る、ということは当該技術分野で既知である。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または培養と精確に同一であるというわけではなく、言及される細胞株は、このような変異体を含む。
【００８９】
「非相同」という用語は、それが、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、常態では一緒に接合されない、および／または常態では特定細胞と関連しない配列を意味する。したがって、核酸構築物またはベクターの「非相同」領域は、事実上、他の分子と関連して見出されない別の核酸分子内またはそれと結合される核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の非相同領域は、事実上、コード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。非相同コード配列の別の例は、コード配列それ自体が事実上見出されない構築物である（例えば、ネイティブ遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞中に常態では存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために非相同であると考えられる。対立遺伝子変異または天然突然変異事象は、本明細書中で用いられるような非相同ＤＮＡを生じない。
【００９０】
「コード配列」または特定タンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンならびに３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより確定される。コード配列としては、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、ならびに合成ＤＮＡ配列も挙げられるが、これらに限定されない。転写終止配列は、通常は、コード配列に対して３’に配置される。
【００９１】
「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。本用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体、例えば４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリン（これらに限定されない）のいずれかを含む配列を取り込む。
【００９２】
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製の起点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等（これらに限定されない）を含み、これらは、受容体細胞中のコード配列の複製、転写および翻訳を集合的に提示する。選択コード配列が適切な宿主細胞中で複製され、転写され、翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
【００９３】
「プロモーター領域」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために本明細書中ではその普通の意味で用いられ、その場合、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する。
【００９４】
「操作可能的に連結される」とは、そのように記載される構成成分がそれらの通常の機能を実施するよう設定される因子の整列を指す。したがって、コード配列と操作可能的に連結される制御配列は、コード配列の発現を実行し得る。制御配列は、それらがその発現を指図するよう機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する非翻訳化且つ転写化配列はプロモーター配列とコード配列間に存在し得るし、プロモーター配列は、依然として、コード配列と「操作可能的に連結される」と考えられ得る。
【００９５】
「単離される」とは、ヌクレオチド配列に言及する場合、同一型の他の生物学的高分子の実質的非存在下で、指示された分子が存在する、ということを意味する。したがって、「特定ポリペプチドをコードする単離核酸分子」は、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に有さない核酸分子を指す；しかしながら、その分子は、組成物の塩基性特質に悪影響を及ぼさないいくつかの付加的塩基または部分を含み得る。
【００９６】
本出願全体を通して特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対比して「上流」、「下流」、「３’」または「５’」に置かれていると記載される場合、それは、当該技術分野で慣用的である、言及されているＤＮＡ分子の「センス」または「コード」鎖中の配列の位置である、と理解されるべきである。
【００９７】
「遺伝子」は、転写または翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る少なくとも１つのオープン・リーディング・フレームを含有するポリヌクレオチドを指す。本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかを用いて、それらが関連する遺伝子のより大きな断片または全長コード配列を同定し得る。大型断片配列の単離方法は、当業者に既知である。
【００９８】
２つの核酸断片は、本明細書中に記載されるように、「選択的にハイブリダイズする」と考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一である核酸配列は、完全に同一の配列が標的分子とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻止する。完全同一配列のハイブリダイゼーションの阻止は、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション検定（例えばサザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．参照）を用いて査定され得る。このような検定は、種々の程度の選択度を用いて、例えば低緊縮から高緊縮まで変わる条件を用いて、実行され得る。低緊縮条件が用いられる場合、非特異的結合の非存在は、非特異的結合事象の非存在下で、二次プローブが標的とハイブリダイズしないよう、一部程度の配列同一性をさえ欠く二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて査定され得る。
【００９９】
ハイブリダイゼーションを基礎にした検出系を利用する場合、標的核酸配列と相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択により、プローブおよび標的配列は「選択的にハイブリダイズする」か、または互いに結合して、ハイブリッド分子を形成する。「中等度の緊縮」条件下で標的配列と選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、典型的には、選択核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択核酸プローブの配列と約９０〜９５％より大きい配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび標的が特定程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で既知であるように確定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【０１００】
ハイブリダイゼーションのための緊縮条件に関しては、例えば以下の因子を変えることにより、特定の緊縮性を確立するために多数の等価の条件が用いられ得る、ということが当該技術分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応の温度および時間パラメーター、ならびに種々の洗浄条件。特定組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．参照）。
【０１０１】
核酸およびアミノ酸の「配列同一性」または「相同性」を確定するための技法も、当該技術分野で既知である。典型的には、このような技法は、遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、そしてこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを包含する。概して、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。それらの「同一性パーセント」を決定することにより、２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）が比較され得る。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であれ、アミノ酸配列であれ、２つの整列された配列間の正確な整合数を短い方の配列の長さで割って、１００を掛けた値である。核酸配列に関する近似のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化されたスコア行列を用いることにより、アミノ酸配列に適用され得る。配列の同一性パーセントを確定するためのこのアルゴリズムの実行例は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用出願においてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により提供されている。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  （１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明の状況において同一性パーセントを確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにより著作権取得され、Ｊｏｈｎ  Ｆ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）により配給されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。この一揃いのパッケージから、スミス・ウォーターマンアルゴリズムが用いられ得るが、この場合、スコア表のためにデフォルトパラメーターが用いられる（例えば、ギャップ開始ペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー１およびギャップ６）。得られたデータから、「整合」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性パーセントを算定するための他の適切な方法は、一般的に当該技術分野で既知であり、例えば別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターとともに用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて用いられ得る：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
【０１０２】
代替的には、相同性は、相同領域間に安定した二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズし、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）で消化して、消化断片のサイズを決定することにより確定され得る。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、上記の方法を用いて確定した場合、分子の限定長に亘って、配列が少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で用いる場合、実質的に相同であるとは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列と完全に同一であることを示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系に関して限定されるような緊縮条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を限定することは、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記参照。
【０１０３】
ウイルスベクターの構築
本発明の実行に有用な遺伝子送達ビヒクルは、分子生物学の技術分野で周知の方法を利用して構築され得る（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓ、上記参照）。本明細書中の記述は、例として意図されるものであって、それらに限定されない。典型的には、導入遺伝子を保有するウイルスベクターは、導入遺伝子（単数または複数）をコードするかまたはそれに対応するポリヌクレオチド、適切な調節因子、ならびに細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の産生のために必要な因子から組み立てられる。例えば、好ましい一実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが用いられる。
【０１０４】
一般的方法
ウイルスベクターのヌクレオチド構成成分を得るための好ましい方法は、ＰＣＲである。ＰＣＲのための一般的手法は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９１））で教示されている。各適用反応のためのＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。多数のパラメーターが、反応の成功に影響を及ぼす。これらのパラメーターに含まれるのは、アニーリング温度および時間、延長時間、Ｍｇ2+およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、鋳型およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度である。増幅後、その結果生じる断片は、アガロースゲル電気泳動により検出され、臭化エチジウム染色および紫外線照射により可視化され得る。
【０１０５】
ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素消化による。例えば、ヌクレオチド配列は、適切な認識制限酵素を用いた適切なベクターの消化により生成され得る。その結果生じる断片は、次に、適切な場合は一緒に結紮され得る。
【０１０６】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法を用いて、ベクターゲノム中に挿入される。例えば、挿入およびベクターＤＮＡは、適切な条件下で、制限酵素と接触されて、互いに対合し、リガーゼとつなぎ合わされ得る各分子上に相補的または平滑末端を作製し得る。代替的には、合成核酸リンカーが、ポリヌクレオチドの末端に結紮され得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ中の特定制限部位に対応する核酸配列を含有し得る。他の手段が、当該技術分野で既知であり、利用可能である。
【０１０７】
レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター
多数のウイルスベースの系が、遺伝子送達のために用いられてきた。例えば米国特許第５，５７６，２０１号（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）参照。例えば、レトロウイルス系が知られており、一般的に、ウイルスの遺伝子の全てを発現するが、しかし、プサイ配列として既知のパッケージングシグナルの欠失のため、それ自体のゲノムをパッケージし得ない組込み欠陥プロウイルス（「ヘルパー」）を有するパッケージング株を用いる。したがって、当該細胞株は、空ウイルス殻を産生する。産生株はパッケージング株から得られ、これは、ヘルパーのほかに、長い末端反復（ＬＴＲ）として知られているウイルスの複製およびパッケージングのためのｃｉｓで必要とされる配列を含むウイルスベクターを含有する。当該遺伝子は、ベクター中に挿入され、レトロウイルスヘルパーにより合成されるウイルス殻中にパッケージされ得る。組換えウイルスは、次に、単離され、被験者に送達される（例えば米国特許第５，２１９，７４０号参照）。代表的レトロウイルスベクターとしては、例えば米国特許第５，２１９，７４０号（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されるようなＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳＨＬおよびＬＨＬ２ベクターのようなベクター、ならびにこれらのベクターの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、当該技術分野で周知の技法により構築され得る。例えば米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９参照。
【０１０８】
アデノウイルス・ベースの系が遺伝子送達のために開発されており、本明細書中に記載される方法による送達に適している。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞に進入する二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、育て、操作するのが容易であり、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで広範な宿主範囲を示すために、遺伝子導入に特に良好に適合される。
【０１０９】
アデノウイルスは、静止状態ならびに複製中の標的細胞に感染する。宿主ゲノム中に組込むレトロウイルスと違って、アデノウイルスは、染色体外に存続して、挿入性突然変異誘発と関連した危険を最小限にする。ウイルスは、高力価で容易に産生され、安定であり、したがってそれは精製され、保存され得る。複製適格形態でも、アデノウイルスは低レベルの罹患率のみを生じ、ヒト悪性疾患と関連しない。したがって、これらの利点を用いるアデノウイルスベクターが開発されてきた。アデノウイルスベクターおよびそれらの使用についての説明に関しては、例えば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９；Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６を参照されたい。
【０１１０】
ＡＡＶ発現ベクター
好ましい一実施形態では、本発明の方法に用いられるウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶベクター」とは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味し、例としてはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ７等が挙げられるが、これらに限定されない。典型的ＡＡＶベクターは、全部または一部欠失されたＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を有し得るが、しかし機能性フランキングＩＴＲ配列を保持する。機能性ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングのために必要である。ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにｃｉｓで必要とされる少なくともそれらの配列を含む。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能性救済、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変更され得る。より多くのまたは種々のＡＡＶ血清型に関しては、例えば、Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１６：１７１０−１７１８，２００８（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。
【０１１１】
ＡＡＶ発現ベクターは、転写の方向、転写開始領域を含む制御因子、当該ＤＮＡおよび転写終止領域において操作可能的に連結される構成成分として提供するために既知の技法を用いて構築され得る。制御因子は、視床および／または皮質ニューロンにおいて機能的であるよう選択される。付加的制御因子が含まれ得る。操作可能的に連結される構成成分を含有する結果的に生じる構築物は、機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列と結合される（５’および３’）。
【０１１２】
「アデノ随伴ウイルス逆位末端反復」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製の起点として、ならびにウイルスに関するパッケージングシグナルとして、ｃｉｓで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端で見出される当該技術分野で認知されている領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と一緒になって、哺乳類細胞ゲノムからの効率的切出しおよび救出、ならびにそのゲノム中への、２つのフランキングＩＴＲ間に置かれたヌクレオチド配列の組込みを提供する。
【０１１３】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ−２配列に関しては、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”  ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，  ｅｄｓ．）参照。本明細書中で用いる場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、表された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、しかし、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変更され得る。付加的には、ＡＡＶ  ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し、例としてはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ７等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＡＡＶベクター中の選択ヌクレオチド配列と隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図されたように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの当該配列の切出しおよび救出を可能にし、そしてＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合、受容体細胞ゲノム中への非相同配列の組込みを可能にするよう機能する限り、必ずしも、同一ＡＡＶ血清型または単離物と同一であるかまたはそれらに由来する必要はない。
【０１１４】
ＡＡＶベクターで用いるための適切なＤＮＡ分子は、例えば受容体被験体から欠けるかまたは失われているタンパク質をコードする遺伝子、あるいは所望の生物学的または治療的作用を有するタンパク質（例えば、酵素または神経栄養因子）をコードする遺伝子を包含する。当業者は、治療されている神経学的障害に基づいて因子が適切であるか否かを決定し得る。
【０１１５】
選択ヌクレオチド配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏで被験者中でのその転写または発現を指図する制御因子と操作可能的に連結される。このような制御因子は、常態では選択遺伝子と関連する制御配列を含み得る。代替的には、非相同制御配列が用いられ得る。有用な非相同制御配列は、一般的に、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを包含する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、非ウイルス遺伝子、例えばネズミメタロチオネイン遺伝子由来の配列も、本明細書中での使用が見出される。このようなプロモーター配列は、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【０１１６】
一実施形態では、視床ニューロン中で操作可能であるプロモーターが用いられる。
【０１１７】
一実施形態では、皮質ニューロン中で操作可能であるプロモーターが用いられる。
【０１１８】
一実施形態では、視床および皮質ニューロンの両方で操作可能であるプロモーターが用いられる。
【０１１９】
本発明の目的のために、非相同プロモーター、ならびに他の制御因子、例えばＣＮＳ特異的および誘導性のプロモーター、エンハンサー等は、ともに、特別な用途を有する。非相同プロモーターの例としては、ＣＭＢプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、神経膠原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）が挙げられる。誘導性プロモーターの例は、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素症およびアウフィンのためのＤＮＡ応答性因子を包含する。
【０１２０】
そこから切り出される主要ＡＡＶオープン・リーディング・フレーム（「ＯＲＦ」）を有したＡＡＶゲノム中に選択配列（単数または複数）を直接挿入することにより、ＡＡＶ  ＩＴＲにより結合される当該ＤＮＡ分子を保有するＡＡＶ発現ベクターが構築され得る。複製およびパッケージング機能を可能にするのに十分なＩＴＲ部分が残存する限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失され得る。このような構築物は、当該技術分野で周知の技法を用いて設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；  国際公開ＷＯ  ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照されたい。
【０１２１】
代替的には、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ウイルスゲノムから、またはそれを含有するＡＡＶベクターから切り出され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されているような標準結紮技法を用いて、別のベクター中に存在する選択核酸構築物の５’および３’で融合され得る。例えば、結紮は、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ  ＮａＣｌ、そして４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ中で０°Ｃ（「粘着末端」結紮用）か、または１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ中で１４°Ｃ（「平滑末端」結紮用）で成し遂げられ得る。分子間「粘着末端」結紮は、通常は、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（総最終濃度５〜１００ｎＭ）で実施される。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、そこに記載されたいくつかのＡＡＶベクターは、寄託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６で、アメリカ培養細胞系統保存機関（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。
【０１２２】
さらに、１つ以上の選択核酸配列の５’および３’に整列されるＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むよう、キメラ遺伝子が合成的に生産され得る。哺乳類ＣＮＳ細胞中でのキメラ遺伝子配列の発現のための好ましいコドンが、用いられ得る。完全キメラ配列は、標準方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１参照。
【０１２３】
ｒＡＡＶビリオンを産生するために、既知の技法を用いて、例えばトランスフェクションにより、ＡＡＶ発現ベクターが適切な宿主細胞中に導入される。多数のトランスフェクション技法が、一般的に当該技術分野で知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７参照。特に適切なトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養細胞中への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、電気穿孔（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介性遺伝子導入（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０）、脂質媒介性形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、ならびに高速ミクロ射出粒子を用いた核酸送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）が挙げられる。
【０１２４】
本発明の目的のために、ｒＡＡＶビリオンを産生するための適切な宿主細胞としては、非相同ＤＮＡ分子の受容体として用いられ得るか、または用いられてきた微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞が挙げられる。当該用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」は、本明細書中で用いる場合、一般的に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。安定ヒト細胞株２９３（例えば寄託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３でアメリカ培養細胞系統保存機関から入手可能）からの細胞は、本発明の実行に好ましい。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）で形質転換され、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）を発現するヒト胚性腎臓細胞株である。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを産生するために特に便利なプラットホームを提供する。
【０１２５】
ＡＡＶヘルパー機能
ＡＡＶ  ＩＴＲにより隣接されるヌクレオチド配列を複製し、キャプシド形成して、ｒＡＡＶビリオンを産生するために、上記のＡＡＶ発現ベクターを含有する宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー機能を提供し得るようにされなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般的に、発現されてＡＡＶ遺伝子産物を提供し、次いでこれが、増殖的ＡＡＶ複製のためにトランスで機能し得るＡＡＶ由来コード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから失われている必要なＡＡＶ機能を補足するために本明細書中で用いられる。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要ＡＡＶ  ＯＲＦの一方または両方、すなわち，ｒｅｐおよびｃａｐコード領域、またはその機能的相同体を包含する。
【０１２６】
Ｒｅｐ発現産物は、多数の機能、例えばとりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合および切り込み；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の非相同）プロモーターからの転写の調節を保有することが示されている。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターから失われているトランスのＡＡＶ機能を補足するために本明細書中で用いられる。
【０１２７】
「ＡＡＶヘルパー構築物」という用語は、一般的に、当該ヌクレオチド配列の送達のために形質導入ベクターを産生するために用いられるべきものであるＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、一般に、ＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供して、溶解性ＡＡＶ複製に必要である失ったＡＡＶ機能を補足するために用いられる；しかしながら、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠き、それ自体を複製もパッケージもし得ない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。多数のＡＡＶヘルパー構築物、例えば、一般に用いられるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐｌＭ２９＋４５（ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする）が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５参照。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。例えば米国特許第５，１３９，９４１号参照。
【０１２８】
「ＡＡＶｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野で認識された領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、多数の機能、例えばＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合および切り込み；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の非相同）プロモーターからの転写の調節を保有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の説明に関しては、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１を参照されたい。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の適切な相同体としては、これもＡＡＶ−２ＤＮＡ複製を媒介することが知られているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０４：３０４−３１１）。
【０１２９】
「ＡＡＶ  ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野で認識された領域、またはその機能的相同体を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージするために集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。ＡＡＶ  ｃａｐコード領域の説明に関しては、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｎ．ａｎｄ  Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（上記）を参照されたい。
【０１３０】
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前またはそれと同時に、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞をトランスフェクトすることにより、宿主細胞中に導入される。したがってＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供して、増殖的ＡＡＶ感染に必要であるＡＡＶ機能喪失を補足するために用いられる。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠き、そしてそれ自体を複製もパッケージもし得ない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。多数のＡＡＶヘルパー構築物、例えば、一般に用いられるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐｌＭ２９＋４５（ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする）が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２９３６−２９４５参照。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。例えば米国特許第５，１３９，９４１号参照。
【０１３１】
ＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物はともに、１つ以上の任意の選択可能なマーカーを含有するよう構築され得る。適切なマーカーは、細胞が適切な選択培地中で増殖される場合、選択可能マーカーを含有する核酸構築物でトランスフェクトされた細胞に抗生物質耐性または感受性を付与し、それに色を与えるか、またはその抗原特性を変える遺伝子を包含する。本発明の実行に有用であるいくつかの選択可能マーカー遺伝子としては、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．から入手可能）に対する耐性を付与することにより、哺乳類細胞における選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする）が挙げられる。他の適切なマーカーは、当業者に既知である。
【０１３２】
ＡＡＶ補助機能
宿主細胞（またはパッケージング細胞）は、ｒＡＡＶビリオンを産生するために、非ＡＡＶ由来機能または「補助機能」を提供し得るようにもされなければならない。補助機能は、その複製のためにＡＡＶが依存している非ＡＡＶ由来ウイルスおよび／または細胞機能である。したがって、補助機能は、少なくとも、ＡＡＶ複製に必要とされる非ＡＡＶタンパク質およびＲＮＡ、例えばＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、ならびにＡＡＶキャプシドアセンブリーに関与するものを包含する。ウイルスベースの補助機能は、既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
【０１３３】
特に、補助機能は、当業者に既知の方法を用いて宿主細胞中に導入され、次いで宿主細胞中で発現され得る。一般に、補助機能は、非関連ヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。多数の適切なヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス；ヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス１および２型；ならびにワクシニアウイルスが既知である。非ウイルス性補助機能、例えば種々の既知の作因のいずれかを用いた細胞同期化により提供されるものも、本明細書中で用途を見出す。例えば、Ｂｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７を参照されたい。
【０１３４】
代替的には、補助機能は、補助機能ベクターを用いて提供され得る。補助機能ベクターは、１つ以上の補助機能を影響するヌクレオチド配列を包含する。補助機能ベクターは、宿主細胞中での効率的ＡＡＶビリオン産生を支持するために、適切な宿主細胞中に導入されることが可能である。補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。補助ベクターは、適切な制御因子および酵素と関連する場合、補助機能を提供するために宿主細胞中で転写されるかまたは発現され得る１つ以上の線状化ＤＮＡまたはＲＮＡ断片の形態でもあり得る。例えば、国際公開ＷＯ９７／１７５４８（１９９７年５月１５日公開）参照。
【０１３５】
補助機能を提供する核酸配列は、天然供給源から、例えばアデノウイルス粒子のゲノムから獲得されるか、あるいは当該技術分野で既知の組換えまたは合成方法を用いて構築され得る。この点では、アデノウイルス由来補助機能が広範に研究されており、補助機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が同定され、一部は特性化されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）“Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，ｉｎ  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．  Ｉ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．）、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．１５８：９７−１２９を参照されたい。具体的には、初期アデノウイルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅ２ａ、Ｅ４、ＶＡＩ  ＲＮＡ、そしておそらくはＥ１ｂが、補助プロセスに関与すると考えられる。Ｊａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５−１９２９。ヘルペスウイルス由来補助機能が記載されている。例えば、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２５：１１３。ワクシニアウイルス由来補助機能も記載されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）（上記）、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７参照。
【０１３６】
ヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染の、あるいは補助機能ベクターによる宿主細胞のトランスフェクションの結果として、ＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化してＡＡＶ  Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質を産生する補助機能が発現される。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（当該ＤＮＡを含む）を切り取る。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムを二倍にするのにも役立つ。発現されたＣａｐタンパク質はキャプシドに組み立てられ、そして組換えＡＡＶゲノムがキャプシド中にパッケージされる。したがって、増殖的ＡＡＶ複製が続いて起こり、ＤＮＡがｒＡＡＶビリオン中にパッケージされる。
【０１３７】
組換えＡＡＶ複製後、種々の慣用的精製方法、例えばＣｓＣｌ勾配を用いて、ｒＡＡＶビリオンが宿主細胞から精製され得る。さらに、感染を用いて補助機能を発現する場合、既知の方法を用いて、残留ヘルパーウイルスが不活性化され得る。例えば、約６０℃の温度に、例えば２０分以上の間、加熱することにより、アデノウイルスは不活性化され得る。ＡＡＶは極度に熱安定性であるが、一方、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるため、この処理は、ヘルパーウイルスのみを有効に不活性化する。
【０１３８】
その結果生じるｒＡＡＶは、次に、ＣＮＳへのＤＮＡ送達に用いる準備ができる。
【０１３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、ｒＡＡＶビリオンは製剤組成物に処方される。
【０１４０】
治療用核酸およびコード化タンパク質
【０１４１】
治療用核酸としては、直接的に治療的である核酸、ならびに治療薬、例えば治療用タンパク質を生じる核酸が挙げられる。
【０１４２】
治療用タンパク質は、生物学的に活性な変異体および断片を包含する。「変異体」という用語は、本明細書中で用いる場合、アミノ酸が欠失されたポリペプチド（「欠失変異体」）、挿入されたポリペプチド（「付加変異体」）または親タンパク質のアミノ酸配列内の残基と置換されたポリペプチド（「置換変異体」）が挙げられる。このような変異体は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変更を導入することにより調製される。欠失、挿入および置換の多数の組合せがなされ得るが、但し、最終的分子は生物学的に活性であると、当業者により理解されるであろう。
【０１４３】
治療用タンパク質としては、酵素；増殖因子、例えばニューロトロフィン；ホルモン；免疫調節ペプチドおよびタンパク質、例えばサイトカイン；ならびに神経調節性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
好ましい一実施形態では、本発明の治療用タンパク質は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＴ−６、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＧＦ−１、ｂ−ＦＧＦ、ニュールツリン、ペルセフィン、アルテミン、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、カルジオトロピン、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＭＰ、ＦＧＦ２０、ＶＩＰ、ＰＤＧＦ、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）およびＨＧＦからなる群から選択される。
【０１４５】
一実施形態では、治療用タンパク質は、視床中で産生され、大脳皮質中で放出され得る。
【０１４６】
用いられる治療用核酸の型は、治療されている神経学的障害に依る。神経学的障害は、皮質性病態および神経解剖学的縦連合に基づいた本発明による処置に適している、と当業者は理解するであろう。
【０１４７】
例えば、遺伝子療法は、神経学的障害（例えばカナバン病）において欠乏する酵素の産生を提供するウイルス粒子を用いて実行され得る。代替的には、遺伝子療法は、神経学的障害において危うくされるニューロン、例えばアルツハイマー病において皮質を刺激する前脳基底核のニューロンの一集団を持続するために、ニューロトロフィン、例えばＮＧＦの産生を提供するウイルス粒子を用いて実行され得る。
【０１４８】
代替的治療薬、例えばｓｉＲＮＡおよび遺伝子サイレンシングのための他の手段が本発明で用いられ得るが、これらに限定されない。
【０１４９】
製剤組成物および投与
製剤組成物は、治療的有効量、すなわち問題の障害の症候を低減するかまたは改善するのに十分な量、あるいは所望の利益を付与するのに十分な量の当該治療薬を含む。製剤組成物は、製薬上許容可能な賦形剤も含有する。このような賦形剤は、組成物を受容している個体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導しない、そして過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的作用物質を包含する。製薬上許容可能な賦形剤としては、ソルビトール、トゥイーン８０、ならびに液体、例えば水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。人工ＣＳＦも、本発明の方法に用いられ得る。製薬上許容可能な塩、例えば無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等がその中に含まれ得る。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が、このようなビヒクル中に存在し得る。製薬上許容可能な賦形剤の徹底的考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で利用可能である。
【０１５０】
最適製剤処方物は、当業者により決定される。上記症状を治療するための方法に関与する最終投与レジメンは、薬剤の作用を修飾する種々の因子を考察している主治医により決定される。試験が実行されると、種々の神経学的障害の治療のための適切な投与量レベルに関して、さらなる情報が出てくるであろう。
【０１５１】
製剤組成物は、他の薬剤、薬学的作用物質、担体、アジュバント、希釈剤等を含み得る。「製薬上許容可能な」とは、生物学的にまたは別の状況で望ましくないことのない物質を意味し、すなわち、当該物質は、如何なる望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく、またはそれが含有される製剤組成物の他の構成成分の何れとも有害に相互作用することなく、選択された作用物質と一緒に個体に投与され得る。
【０１５２】
好ましい一実施形態では、本発明の製剤組成物は、ＣＥＤにより被験者のＣＮＳに局所的に送達される。
【０１５３】
一実施形態では、製剤組成物は、促進剤を含む。促進剤は、標的組織への注入液の送達をさらに促進し得る。促進剤は、治療薬が治療用タンパク質である場合、特に好ましい。
【０１５４】
一旦、製剤組成物が処方されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、あるいは脱水または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存され得る。このような処方物は、直ぐに使用できる形態で、または例えば凍結乾燥され、投与前に再構成を要する形態で、保存され得る。
【０１５５】
本明細書の教示にかんがみて当業者に明らかなように、付加されなければならない治療薬の有効量は、経験的に決定され得る。投与は、１回用量投与で、治療の経過中に連続的にまたは間欠的に実行され得る。「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用または投薬で投与され得る。
【０１５６】
視床に送達される治療薬が治療用タンパク質である実施形態では、１回より多い用量投与が好ましい。例えばＵＳＳＮ１１／７４０，１２４（２００７年４月２５日出願）（この記載内容は参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。
【０１５７】
「被験者」、「個体」または「患者」という用語は、本明細書中で互換的に用いられ、大型哺乳類、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトを指し、小型哺乳類、例えば齧歯類を含まない。
【０１５８】
併用療法が意図される。例えば、ウイルスベクターが関与する方法では、１つより多い導入遺伝子が送達ウイルスベクターにより発現され得る、と理解されるべきである。代替的には、各々が１つ以上の異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターも、ＣＮＳに送達され得る。さらに、本発明の方法により送達される治療薬（ウイルスベクターを含めて）は、他の適切な組成物および治療薬と組合される、ということも意図される。
【０１５９】
送達装置
任意の対流強化送達装置が、治療薬の送達のために適切であり得る。好ましい一実施形態では、当該装置は、浸透ポンプまたは注入ポンプである。浸透および注入ポンプはともに、種々の供給元、例えばＡｌｚｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌｚａ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．から市販されている。典型的には、治療薬は、以下のようなＣＥＤ装置を介して送達される。カテーテル、カニューレまたは他の注入装置が、選定被験者のＣＮＳ組織中に挿入される。本明細書中の教示にかんがみて、挿入のための適切な位置を当業者は容易に決定し得る。位置決定は、選定された標的に注入装置を導くのを手助けするために、被験者の脳のＣＴおよび／またはＭＲＩ画像処理により得られる解剖地図を用いて、実行され得る。代替的には、送達のｉＭＲＩおよび実時間画像処理が実行され得る。
【０１６０】
本発明に用いるためのポンプ系の例としては、米国特許第７，３５１，２３９号；第７，３４１，５７７号；第６，０４２，５７９号；第５，７３５，８１５号および第４，６９２，１４７号に記載された埋め込み可能な系が挙げられる。
【０１６１】
本発明に用いるためのカテーテルの例は、ＰＣＴ／ＵＳ０８／６４０１１に記載されている。他のカテーテルの例は、本明細書中に記載されている。
引用文献は全て、その記載内容が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１６２】
実験
視床内ＡＡＶ２ベクター送達後の広範囲の導入遺伝子タンパク質発現−図１〜４
ＡＡＶ２−ＧＤＮＦは、免疫組織化学により視覚的に検出され、組織抽出物のＥＬＩＳＡにより定量され得る形質導入ニューロンからの神経膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の大量分泌を駆動する。対流強化送達による視床へのＡＡＶ２−ＧＤＮＦの注入後、広範なＧＤＮＦ免疫陽性染色が、注入部位と同側性の前頭皮質中で検出された。図１に示したように、ＧＤＮＦの発現は、前頭前葉野関連皮質領域（皮質域９および１０）から、前頭眼野（領域８）、前運動皮質（領域６）、一次体性感覚皮質野（領域３、１および２）を通って、一次運動皮質（領域４）に延び、帯状皮質（領域２３、２４、３２）およびブローカ野（領域４４、４５）における発現を包含した。皮質におけるＧＤＮＦ発現は灰白質に局在し、下層の白質路中ではＧＤＮＦ陽性染色を明瞭に欠いている。類似のパターンは視床において見出されたが、ここでは、ＧＤＮＦ発現は、注入標的化視床核の灰白質境界内にも含有され、非標的化領域中へのＡＡＶ２−ＧＤＮＦベクターの注入関連「漏出」または還流の証拠は認められなかった。ＧＤＮＦ染色は、分析された切片の何れの対側半球にも見出されなかった。個々のニューロン細胞体および細胞突起の強染色のほかに、ＧＤＮＦ染色は、前頭皮質の多重層を通して観察され、皮質層ＩＩＩおよびＩＶにおいて最高である強度勾配を有した（図２）。
【０１６３】
大きな皮質領域の肉眼的に明らかなＧＤＮＦ染色は、ＧＤＮＦ陽性ニューロン繊維および細胞体の存在と相関した；しかしながら、免疫染色の全体的強度は、顕微鏡検査した場合、特定領域のＧＤＮＦ陽性ニューロンの実数を反映せず、観察された広範な非細胞性染色は、分泌ＧＤＮＦを示す。皮質内のほとんどのＧＤＮＦ陽性ニューロンは、上にある層への軸索突起を伴う皮質層Ｖ／ＶＩ中に位置する錐体ニューロンとして形態学的に同定された（図１Ｅ、Ｆ）。ＧＤＮＦ陽性ニューロンの密度は、前皮質、例えば多数の非錐体ニューロンが層ＩＩ〜ＩＶで観察された前頭前皮質野８において、特に高かった（図１Ａ〜Ｃ）。
【０１６４】
視床、線条体および種々の皮質野に存在するＧＤＮＦタンパク質のレベルを、ＡＡＶ２−ＧＤＮＦ送達の６ヵ月後に定量した。ベクター注入視床中のＧＤＮＦは、１２〜４０ｎｇ／タンパク質１ｍｇ（対側半球＜０．６ｎｇ）の範囲であり、同側前頭皮質では１〜７ｎｇの範囲であった（ＧＤＮＦは対側皮質中では検出されなかった）。図２における値は、隣接冠状組織ブロックからのＧＤＮＦ定量とＧＤＮＦ免疫染色とのおよその相関を示す。
【０１６５】
ＡＡＶ２ベクターの視床皮質輸送ならびに皮質ニューロンの形質導入
ＡＡＶ２−ＧＦＰ送達後の形質導入細胞中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の細胞質発現および蓄積を利用して、ＮＨＰにおける視床注入後の形質導入ニューロンの局在化を査定した。ＧＦＰ発現を、視床および前頭皮質の両方で分析して、視床中のＡＡＶ２ベクターの分布とＡＡＶ２ベクターの視床皮質軸索輸送を示す皮質の特定領域におけるニューロンの形質導入との間の相関を調べた。
【０１６６】
視床内のＡＡＶ２−ＧＦＰ注入の分布を、ＧＦＰ免疫陽性ニューロンを含有する特定の視床核に関して、４つのＮＨＰ（ＩＤ番号Ｖ４２２、Ｖ６３２、Ｖ６５５およびＶ９９１）で査定した。カニューレ位置の差が小さいため、各動物は、ＧＦＰ染色の視床分布において多少の相違を示した（図４）。要するに、視床内のＡＡＶ２−ＧＦＰ形質導入はサルＶ４２２において最も広範囲に及び、前核中に嘴状に延びる外側腹側、前腹側および背側正中核全体を通したＧＦＰ発現を示した。サルＶ６３２は、前腹側から後腹側核に延びるＧＦＰ陽性ニューロンを有する、より後方の注入を示した。サルＶ６５５は、背側正中および外側腹側核内に主に含入されるＧＦＰ陽性ニューロンの限定分布を有した。サルＶ９９１は、ＡＡＶ２−ＧＦＰのわずかに外側寄りの注入を施され、内包でも観察されたＧＦＰ発現を伴う外側腹側及び前腹側核の形質導入を生じた。側脳室中へのカニューレ路を止めるベクター漏出／還流の証拠は、Ｖ６５５及びＶ９９１では観察されたが、しかし他の２つの動物では観察されなかった。この還流は、視床における形質導入のより小さな領域を生じた。
【０１６７】
ＧＦＰ陽性ニューロン細胞体および突起が明瞭に区別可能である前頭皮質の特定領域に関する前頭皮質の免疫組織化学的分析（図３Ａ、Ｂ）。ほとんどのＧＦＰ陽性ニューロンが、層Ｖ／ＶＩ中に存在する錐体ニューロンとして同定された。しかしながら、他のＧＦＰ陽性細胞は、籠形ニューロンおよび神経膠の形態を有して少数見出された（図３Ｅ、Ｆ）。さらに、ＧＦＰ染色が層ＩＶ中の繊維に局在する領域も観察した（図３Ｃ、Ｄ）。ＡＡＶ２−ＧＤＮＦ処置サルに対比して、全トランスジェニックタンパク質（ＧＦＰ）染色は、ニューロン構造に明らかに局在したが、これは、ＧＤＮＦの分泌および細胞外拡散と比較して、特にニューロン内のＧＦＰの細胞内蓄積を示す。
【０１６８】
４匹のサルからのＧＦＰ免疫染色冠状切片の系統的走査は、ＧＦＰ陽性ニューロンを含有する前頭皮質の特定領域を同定した。視床ニューロンのＡＡＶ−ＧＦＰ形質導入を用いた場合と同様に、皮質中のＧＦＰ陽性細胞の分布は、各サルに関してわずかに異なった（表１）。ＧＦＰ−陽性ニューロンの大多数が一貫して見出された主な領域は、二次運動皮質（領域６）および前頭眼野（領域８）であった。前帯状皮質（領域２４及び３２）も、各動物において、ＧＦＰ陽性ニューロンを含有した。さらに、ＧＦＰ陽性ニューロンは、他の皮質領域、例えば一次運動皮質（領域４）、体性感覚皮質（領域３および２）、後帯状皮質（領域２３および３１）ならびにブローカ野（領域４４および４５）においても見出された。表１に要約したように、サルＶ４２２は、前頭眼野およびブローカ野においてＧＦＰ陽性ニューロンのかなりの分布を有した。サルＶ６３２は、一次体性感覚皮質中でのＧＦＰ発現を有する唯一の動物であったが、しかし、ブローカ野においては如何なる発現も欠いていた。サルＶ６５５は、分析された皮質領域のほとんど全体でＧＦＰ陽性皮質ニューロンの散在性分布を示した。サルＶ９９１は、前帯状皮質、二次運動皮質および前頭眼野において見出されるだけのＧＦＰ陽性ニューロンを伴う限定的発現を有した。ＧＦＰ陽性細胞は、注入部位に対して対側の半球では観察さえされなかった。
【０１６９】
皮質から三次ＣＮＳ部位へのＧＤＮＦの転位−前脳基底核
本明細書中に記載される方法を用いて、ＡＡＶ２−ＧＤＮＦ送達の６ヵ月後に、前脳基底核中に存在するＧＤＮＦタンパク質のレベルを定量した。被験者は、図２に示したものであった。結果は：処置側＝０．９１ｎｇ  ＧＤＮＦ／タンパク質１ｍｇ；対側＝０．４５ｎｇ  ＧＤＮＦ／タンパク質１ｍｇ。この結果は、視床を介して皮質集団に送達された治療薬が、皮質に連結された三次ニューロン集団に輸送され得る、ということを確立した。
【０１７０】
アルツハイマー病の非ヒト霊長類モデルにおける視床皮質遺伝子送達後の皮質からの輸送による前脳基底核へのＮＧＦの送達
【０１７１】
ＮＧＦをコードする治療用核酸を含むＡＡＶ２粒子を、調製する。アルツハイマー病の当該技術分野で認知されたモデルとして、老齢非ヒト霊長類の視床にＡＡＶ２粒子を送達する。例えば、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ．ａｌ．，“Ａｇｅｄ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ：ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，１：２８７−２９６，１９９１参照。ＡＡＶ２は、好ましくは、前核、背側正中核、前腹側核、外側腹側核および後腹側核のうちの１つ以上に送達され、腹側核が好ましい。ＡＡＶ２粒子は視床ニューロンを形質導入し、ＮＧＦは皮質に転位される。ＡＡＶ２粒子も皮質、例えば帯状皮質に転位され、その中でニューロンを形質導入し、皮質中でＮＧＦを産生する。ＮＧＦおよび／またはＡＡＶ２粒子は、皮質から前脳基底核に転位され、その中のニューロン生存および／またはコリン作動性表現型を支持する。
【０１７２】
アルツハイマー病における視床皮質遺伝子送達後の皮質からの輸送による前脳基底核へのＮＧＦの送達
ＮＧＦをコードする治療用核酸を含むＡＡＶ２粒子を、調製する。ＡＡＶ２粒子は、アルツハイマー患者の視床への、好ましくは前核、背側正中核、前腹側核、外側腹側核および後腹側核のうちの１つ以上に送達され、腹側核が好ましい。ＡＡＶ２粒子は視床ニューロンを形質導入し、ＮＧＦは皮質に転位される。ＡＡＶ２粒子も皮質、例えば帯状皮質に転位され、その中でニューロンを形質導入し、皮質中でＮＧＦを産生する。ＮＧＦおよび／またはＡＡＶ２粒子は、皮質から前脳基底核に転位され、その中のニューロン生存および／またはコリン作動性表現型を支持する。
【０１７３】
この方法により、ＮＧＦの形態の栄養支持は、その生理学的標的、すなわち皮質を介して前脳基底核に送達される。皮質へのネイティブ前脳基底核神経支配は、それが補助的非生理学的部位からのニュートロフィン供給によるものであり得るので、転用されるというよりむしろ強化され（例えば神経発芽が増大され得る）、そして生存および／またはコリン作動性表現型が支持される。
【０１７４】
考察
ＡＡＶ２−ＧＤＮＦを視床中に注入し、前頭皮質中で高濃度のＧＤＮＦを観察した。皮質中のＧＤＮＦは、大多数の視床皮質軸索が神経支配することが知られている薄層ＩＩＩおよびＩＶにほとんど局在すると考えられた（３、４）が、これは、視床終末からの分泌を示す。細胞外ＧＤＮＦ染色のほかに、同一皮質領域内の多数の薄層Ｖ／ＶＩ錐体ニューロンもＧＤＮＦを含有したが、これは、ＡＡＶ２−ＧＤＮＦによる皮質ニューロンの形質導入を示唆する。前頭皮質中のＧＤＮＦ陽性ニューロンの多くは、ＡＡＶ２−ＧＤＮＦ注入部位から２０ｍｍに亘って位置したが、この距離は単にベクター注入により説明可能であるより有意に大きい距離であった。皮質及び視床の外側で検出される有意のＧＤＮＦ発現なしで、視床及び皮質間のこの特定の輸送は、ＧＤＮＦタンパク質およびＡＡＶ２ベクターの両方の軸索媒介性輸送を示唆した。
【０１７５】
ＧＤＮＦと違って、ＧＦＰは細胞質中に残存し、したがって直接的細胞性形質導入を示すため、ＡＡＶ２の軸索輸送を、ＡＡＶ２−ＧＦＰを用いてさらに調べた。ＧＤＮＦに関する皮質ニューロンの細胞質染色は、理論的には、分泌ＧＤＮＦの取込みに起因した可能性がある。各サルの前頭皮質中のＧＦＰ陽性ニューロンの局在化をマッピングし、各注入に関するＡＡＶ２−ＧＦＰベクターの観察された視床分布と関連する皮質細胞のこの形質導入を分析することにより、単一軸索突起に沿ったＡＡＶ２ベクターの能動輸送を示唆する視床皮質投射の既知の局所解剖学的組織化のうちのいくつかを推測し得た（５、６）。もっとも制限された視床注入では、ＧＦＰは、背側正中および外側腹側視床核のニューロン内に主に含有された。したがって、この制限された注入を出発参照として用いて、各被験者の二次運動皮質および前頭前皮質に在るＧＦＰ陽性ニューロンは、少なくとも一部は、内側視床核に連結している軸索突起および二次運動皮質に沿ったＡＡＶ２ベクター輸送に起因する、と推定された。内側核群のニューロンは、前頭皮質に遠心性投射を送ることが従来示されており、これは最新の観察と一致している（３、７）。前腹側および外側腹側視床核を形質導入するわずかに多くの前方注入は、二次運動皮質、帯状皮質および前頭眼野で観察されたＧＦＰ陽性細胞を伴う内側視床注入と非常によく似たパターンの皮質ＧＦＰ発現を生じた。視床皮質投射は非常に局所解剖学的に組織化されるが、しかし特に隣接視床構造から皮質結合にかなりの重複が存在する。前視床核へのＡＡＶ２−ＧＦＰ形質導入の広がりはブローカ野中のＧＦＰ陽性ニューロンを生じたが、一方、後腹側核へのより尾方への広がりは、一次体性感覚皮質および一次運動皮質中にＧＦＰ陽性ニューロンを生じた。
【０１７６】
視床皮質投射の位相的組織化と皮質形質導入の観察された領域との間の相関は、皮質へのＡＡＶ２の導入が順行性軸索輸送により媒介される、ということを示唆した。他のＡＡＶ血清型１および９の考え得る順行性輸送が、近年、マウス脳で観察された（１２）。しかしながら、相互投射ならびにマウス脳のサイズの小さいことが輸送メカニズムの明確な決定を妨げた。
【０１７７】
方法および材料−図１〜４
外科的送達
ヒトＧＤＮＦ  ｃＤＮＡを含有する組換えＡＡＶ２ベクター（ＡＡＶ２−ＧＤＮＦ）またはＧＦＰ  ｃＤＮＡを含有するもの（ＡＡＶ２−ＧＦＰ）を、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、われわれが以前記載した（１３）対流強化送達（ＣＥＤ）プロトコールにより、６匹の成体アカゲザルの右視床中に注入した。実験はすべて、米国国立衛生研究所ガイドラインに、ならびにサンフランシスコのカリフォルニア大学の動物実験委員会により認可されたプロトコールに従って実施した。
【０１７８】
ＡＡＶの産生
三重トランスフェクション技法（１４、１５）により、組換えＡＡＶ２−ＧＤＮＦ（ヒト神経膠由来神経栄養因子）を構築した。組換えバキュロウイルスを用いて、ＡＡＶ２−ＧＦＰを昆虫細胞で産生した（１６）。両ベクターにＣｓＣｌ勾配遠心分離を施して、空キャプシドを除去した。ＡＡＶ２−ＧＦＰおよびＡＡＶ２−ＧＤＮＦを、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）およびプルロニックＦ−６８（０．００１％ｖ／ｖ）中で１．０×１０13および１．１×１０13ベクターゲノム／ｍｌのストック濃度で得た。
【０１７９】
免疫組織化学
全前頭皮質にわたり、後方向で視床のレベルに延びるザンボニ固定４０μｍ冠状切片で、ＧＤＮＦ（１：５００、ＡＦ−２１２−ＮＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＧＦＰ（１：５００、ＡＢ３０８０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する抗体を用いた免疫染色を実施した。ＧＤＮＦおよびＧＦＰ免疫陽性ニューロンの局在化を、Ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（１７）を参照しながら分析して、皮質および視床における免疫染色の特定領域を同定した。
【０１８０】
ＧＤＮＦタンパク質ＥＬＩＳＡ
新鮮な凍結組織の３ｍｍ冠状ブロックからの組織パンチを、図１に示した隣接組織ブロックからのＧＤＮＦ免疫染色切片で示されるように、ＡＡＶ２−ＧＤＮＦ注入サルの多数の皮質、視床および線条体領域から採取した。ヒトＧＤＮＦに特異的な市販のＧＤＮＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｅｍａｘ  ＧＤＮＦ  ＥＬＩＳＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＷＩ）を用いるＥＬＩＳＡ検定により、発現されたＧＤＮＦタンパク質のレベルを定量した。
【０１８１】
【表１】
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【０１８２】
視床注入と同側の皮質中のＧＦＰ陽性ニューロン分布の表示。ＧＦＰ陽性皮質ニューロンの相対的分布：***大多数のニューロン；**少数のニューロン；*わずかな単離ニューロン。略号：ＡＮ  前核；ＭＤ  背側正中核；ＶＡ  前腹側核；ＶＬ  外側腹側核；ＶＰ  後腹側核。
【０１８３】
参考文献−図１〜４
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6. Brysch W, Brysch I, Creutzfeldt OD, Schlingensiepen R, & Schlingensiepen KH (1990) The topology of the thalamo-cortical projections in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). Exp Brain Res 81(1):1-17.
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10. Kaspar BK, Llado J, Sherkat N, Rothstein JD, & Gage FH (2003) Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model. Science 301(5634):839-842.
11. Killackey HP & Sherman SM (2003) Corticothalamic projections from the rat primary somatosensory cortex. J Neurosci 23(19):7381-7384.
12. Cearley CN & Wolfe JH (2007) A single injection of an adeno-associated virus vector into nuclei with divergent connections results in widespread vector distribution in the brain and global correction of a neurogenetic disease. J Neurosci 27(37):9928-9940.
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17. Paxinos G, Huang XF, & Toga AW (2000) The rhesus monkey brain in stereotaxic coordinates (Academic Press, San Diego).
【０１８４】
実施例：視床内ＡＡＶ２ベクター送達後の広範囲酵素発現
方法および材料−図５〜１１
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）被験者
４匹のＮＨＰ（カニクイザル）をこの試験に用い、最終注入処置を受けた後の時間に基づいて、５週（ｎ＝２）または９週生存（ｎ＝２）群に無作為化した。体重、神経学的欠損または悪臨床症候における差は、試験経過中は観察されなかった。動物の取扱いおよび手順は全て、ＵＣＳＦ動物実験委員会に従って実行した。ＮＨＰに２つの処置（すなわち、一方はガドテリドールのみ（ＮＨＰ＝４、視床に３回、脳幹に２回注入）を使用、もう一方はＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡ／ガドテリドール（ＮＨＰ＝４、視床に８回、脳幹に４回注入）を使用）を施した。
【０１８５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター構築
ＮＨＰ脳における導入遺伝子発現の免疫検出を促すために、ウイルスヘマグルチニン由来のＣ末端合成ヘマグルチニンエピトープを生じる配列のＡＳＭ  ｃＤＮＡの３’末端に含入することにより、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｈＡＳＭ）（前記［１７］）をコードするＡＡＶシャトルプラスミドを修飾した。次に、このシャトルプラスミドを用いて、フィラデルフィア小児病院（ＣＨＯＰ）のＶｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅで、ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡ（１．０×１０ｅ１２ｖｇ／ｍＬ）を製造した［２３］。
【０１８６】
ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡ注入
外科手術前に全ＮＨＰに基線ＭＲＩを施して、解剖学的ランドマークを可視化し、予定注入標的部位の定位座標を作成した。視床および脳幹中へのＣＥＤのために、ＭＲＩ対応プラスチックガイドカニューレアレイ（直径１２ｍｍ×高さ１４ｍｍ、２７個のアクセスホールあり）の定位的配置を、ＮＨＰに施した（図５）。各ガイドカニューレアレイをプラスチック製ネジおよび歯科用アクリル樹脂で頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレアレイの配置後、注入手順開始前の少なくとも２週間、動物を回復させた。注入当日、動物をイソフルラン（エラン；Ｏｈｍｅｄａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｃｏｒｎｅｒ，ＮＪ）で麻酔した。次に、各動物の頭部をＭＲＩ対応定位フレームに入れて、基線ＭＲＩを実施した。バイタルサイン、例えば脈拍およびＰＯ2を、手順全体を通してモニタリングした。要するに、注入系は、負荷ライン（注入液［すなわち、ＧｄのみまたはＡＡＶ／Ｇｄ］を含有）、鉱油を充填された注入ライン、およびトリパンブルー溶液を有する別の注入ラインに連結された溶融シリカ還流耐性カニューレ［１９、２４］で構成された。胴部にトリパンブルー溶液を充填した１ｍｌ注射器をＭＲＩ対応注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）上に載せて、送達カニューレを通る流体の流れを調節した。ＭＲＩ座標に基づいて、予め設置したガイドカニューレアレイを通して脳の標的化領域にカニューレを挿入した。各注入カニューレの長さを測定して、遠位先端がカニューレステップを３ｍｍ越えて延びるのを保証した。これによりカニューレの先端に近位の階段状デザインが作製されて、カニューレ路に沿った還流を最小限にしながら、ＣＥＤ中の流体対流を最大にした。脳への挿入中は、注入カニューレの陽圧を保持した。注入カニューレの配置を固定した後、ＣＥＤ手順を開始して、ほぼ実時間のＭＲＩデータを獲得した（実時間対流送達、ＲＣＤ）。試験全体を通して注入される全てのＮＨＰに関しては同一注入パラメーターを用いたが、但し、注入容量は３３〜１９９μＬの範囲であり、さらに具体的には、視床に関する注入容量は３３〜１６９μＬ、脳幹に関しては１２５〜１９９μＬの範囲であった。注入速度は以下のとおりであった：標的化領域にカニューレを下げる場合（組織が先端に進入するのを防ぐため）には、０．１μｌ／分を適用し、標的に到達したら、１０分間隔で、０．２、０．５、０．８、１．０および２．０μｌ／分に増大させた。注入の約１５分後、カニューレを脳から撤去した。ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡ処置前にガドテリドール単独注入を動物に実行し、約４週間後に、ＡＡＶを注入した。ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡを送達する視床および脳幹注入は全て、同一手順中は同時に実行した。
【０１８７】
磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）
ケタミン（ケタセット、７ｍｇ／ｋｇ、筋注）とキシラジン（ロンプン、３ｍｇ／ｋｇ、筋注）の混合物で、ＮＨＰを鎮静させた。鎮静後、各動物をＭＲＩ対応定位フレームに入れた。耳バーおよび眼バー測定値を記録し、静脈内ラインを確立した。次いで、ＭＲＩデータを得て、その後、動物を、そのホームケージ中で常態に戻り得るまで、閉鎖観察下で回復させた。ガドテリドール単独を送達するＣＥＤ注入に関するＭＲ画像（合計４）を、１．５Ｔ  Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍａｇｎｅｔｏｍ  Ａｖａｎｔｏ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で獲得した。三次元（３Ｄ）急勾配エコー（ＭＰ−ＲＡＧＥ）画像を、繰り返し時間（ＴＲ）＝２１１０ｍｓ、エコー時間（ＴＥ）＝３．６ｍｓ、ならびに１５°のフリップ角、励起回数（ＮＥＸ）＝１（反復３回）、マトリックス＝２４０×２４０、視野（ＦＯＶ）＝２４０×２４０×２４０および切片厚＝１ｍｍで得た。これらのパラメーターは、１ｍｍ3ボクセル体積を生じた。走査時間は約９分であった。
【０１８８】
ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ｈＡ／Ｇｄを送達するＣＥＤ注入に関するＭＲ画像（合計１２）を、床に平行に被験者の頭部に５インチ表面コイルを用いて、１．５Ｔ  Ｓｉｇｎａ  ＬＸスキャナー（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）で獲得した。スポイルド勾配エコー（ＳＰＧＲ）画像をＴ１強調し、そしてスポイルドグラスシーケンス、ＴＲ＝２１７０ｍｓ、ＴＥ＝３．８ｍｓ、ならびに１５°のフリップ角、ＮＥＸ＝４、マトリックス＝２５６×１９２、ＦＯＶ＝１６ｃｍ×１２ｃｍ、切片厚＝１ｍｍで得た。これらのパラメーターは、０．３９１ｍｍ3ボクセル体積を生じた。走査時間は約１１分であった。
【０１８９】
組織処理
ＰＢＳフラッシュと、その後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを用いて、ＮＨＰを経心臓還流して、脳を採取し、脳基質で６ｍｍ厚に冠状に薄片にした。脳薄片を４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で後固定して、３０％スクロース中で凍結保護した。滑走式ミクロトーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＨＭ  ４５０）を用いて、脳薄片を４０μｍ連続切片に切断し、これを次に組織学用に処理した。
【０１９０】
イムノペルオキシダーゼ染色
ＨＡタグに対するモノクローナル抗体を用いて、全てのＮＨＰ処理組織を、ヒト導入遺伝子の発現に関して免疫染色した。要するに、連続脳切片を、ヘマグルチニンエピトープに関して免疫染色した（マウス抗ＨＡ、１：１０，０００；クローン１６Ｂ１２、Ｃｏｖａｎｃｅ）。要約すると、切片をＰＢＳ（３×５分）で洗浄し、ＰＢＳ中の１％Ｈ2Ｏ2における内因性ペルオキシダーゼ活性に関してクエンチして（２０分）、前と同様にＰＢＳ中で再び洗浄した。切片をＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（登録商標）（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＢＳ９６６Ｇ）中で３０分間遮断して、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ緑色希釈液（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＰＤ９００）中でＨＡ一次抗体とともに一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳ中で切片を洗浄後、切片をＭａｃｈ−２−マウス−ＨＲＰポリマー中で１時間インキュベートし（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＭＨＲＰ５２０）、ＰＢＳ中で洗浄して、ＤＡＢで６分間展開させた（ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット、ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ＤＡＢ処理切片をＰＢＳ中で洗浄し、艶消しスライドガラス上に載せて、クレシルバイオレットで対比染色した。
【０１９１】
免疫蛍光染色
抗ＨＡ（マウスモノクローナル、１：２００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、ならびに抗ｌｂａ１（ウサギポリクローナル、１：１００、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）または抗ＮｅｕＮ（マウス、モノクローナル、１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する抗体のカクテルで、脳切片を免疫染色した。代替的には、抗ＨＡ（マウスモノクローナル、１：２００、Ｃｏｖａｎｃｅ）を、抗Ｓ１００（ウサギポリクローナル、１：１００、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）と組合せて用いた。要するに、切片を、０．１％トゥイーン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ、３×５分）で洗浄し、５０％エタノール中の１％Ｈ2Ｏ2における内因性ペルオキシダーゼ活性に関してクエンチして（３０分）、次いで、前と同様にＰＢＳ中で再び洗浄した。切片を２０％正常ウマ血清（ＮＨＳ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中で６０分間遮断して、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ（登録商標）緑色希釈液（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＰＤ９００）中で一次抗体カクテルの各々とともに、４℃で少なくとも１６時間、インキュベートした。一次抗体でインキュベート後、ＰＢＳＴ中で切片を洗浄し、ＰＢＳＴ中の二次抗体抗マウス−ＦＩＴＣ（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）および抗ウサギ−ＴＲＩＴＣ（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のカクテルとともに、室温で１時間インキュベートして、ＰＢＳ中で洗浄して、艶消しスライドガラス上で湿潤封入した。これらの切片を、ＤＡＰＩ含有固定培地とともにカバーガラスで覆った。
【０１９２】
注入容積（Ｖｉ）対分布容積（Ｖｄ）比
各視床および脳幹注入に関するＶｄを、ＯｓｉｒｉＸ（ＤＩＣＯＭ画像専用の画像診断ソフトウェア（ｖ３．６））で測定した。要するに、各ＤＩＣＯＭ上の可視化Ｇｄシグナルの領域として限定される当該領域（ＲＯＩ）を、ＲＯＩツールで手動で描いた。併合注入液（Ｇｄのみ、またはＡＡＶ−ｈＡＳＭ−ＨＡ／Ｇｄ）分布（Ｖｄ）の結果的に生じた３Ｄ再構成の容積を得て、それをＶｉで割ることにより、比を算定した。反復注入に関してＶｉ対Ｖｄ比を比較するために、等価Ｖｉで、ＤＩＣＯＭシリーズでＶｄを測定した。
【０１９３】
ＭＲ画像に転送されるＨＡ免疫染色の領域
クレシルバイオレットで対比染色した全ての組織学処理スライドを先ず走査することにより（エプソン１６６０フォトスキャナー、３００ｄｐｉ）、ＨＡ免疫染色領域の転移を実行した。次いで、注入領域当たりの免疫活性の程度および境界に基づいて、切片を手動で描いた。その結果生じた輪郭を、次に、透明用紙にコピーして、個別に、対応する基線ＭＲ画像と整合させて、Ｏｓｉｒｉｘ  ＲＯＩツールで手動で描いた。ある場合には（ＮＨＰ１２６０）、近実時間ＭＲ画像診断は右視床中の良好な分布を示したが、しかし導入遺伝子発現は検出されなかった、ということに留意されたい。したがって、この試験の組織学的態様からこの症例を除外した。この視床注入が如何なるニューロンも形質導入しなかった理由は不明であるが、しかしそれは手順［２５］中のベクター凝集のためかもしれないと推測する。
【０１９４】
ＨＡ陽性ニューロン性形質導入のパーセンテージ
ニューロンマーカー（抗ＮｅｕＮ）またはＨＡタグ（抗ＨＡ）に対して免疫染色された隣接切片（４０μｍ厚さに連続的に切りだした）において、全てＮＨＰ（Ｎ＝４）全体を通して標的領域につき、無作為化２０倍画像（６９７．６８×５２２．７２μｍ）を得た（２画像／注入部位）。これらの画像において、ＮｅｕＮおよびＨＡに対して染色されたニューロン細胞体を手動で計数し、それらの数値を表にして、注入領域（すなわち、視床および脳幹）当たりで集合的に分析した。ＮｅｕＮおよびＨＡ染色細胞体間の比較を、注入領域辺りのＨＡタグに関してニューロン陽性のパーセンテージとして表した。
【０１９５】
結果−図６〜１１
ＣＥＤの近実時間ＭＲ画像診断
カニューレ配置の術中ＭＲＩ画像診断およびＣＥＤのモニタリングの結果を、図６に示す。この場合、予定視床または脳幹構造中へのカニューレ先端の配置ならびに代用ＭＲトレーサーのモニタリングを、全ての症例で観察した（図６Ａ〜Ｂ）。これらの注入は、視床において同時に且つ両側的に実施し、その後、脳幹で１回注入した（図６Ａ〜Ｂ、白色矢印）。送達注入液の放射状対流が認められたが、漏出の徴候はなかった。
【０１９６】
注入容積対分布容積
視床および脳幹注入の両方に関して、ＶｉおよびＶｄ間に直接的線形関係が見出された（Ｒ2＝０．９３；図７）。領域当たりで示した場合、全ての注入（合計１６）に関する平均Ｖｉ対Ｖｄ比は以下の通りであった：視床（Ｎ＝１０）は３．８６±０．２５ＳＥＭであり、脳幹（Ｎ＝６）に関する比は３．３±０．１７ＳＥＭであって、これは、有意に異ならなかった（ｐ＝０．１４）。さらに重要なのは、同一解剖学的領域中へのＭＲＩトレーサーの反復注入が一貫した注入液分布を生じることを実証した点である（図８）。視床および脳幹注入の両方において類似の分布パターンおよびＶｉ対Ｖｄ比を観察したが、一次または二次送達間に統計学的有意性は認められなかった（ｐ＝０．９６）。視床に対する脳幹のサイズおよび容量のためにより多くの容積が脳幹領域に注入されたが、明らかな神経学的副作用は認められなかったということに留意されたい。
【０１９７】
ＨＡタグおよびｈＡＳＭ発現の比較
発現ｈＡＳＭを内因性ＮＨＰ  ＡＳＭと区別するために、ＨＡエピトープタグが必要とされ得る、と予測した。しかしながら、意外にも、抗ＨＡおよび抗ｈＡＳＭ染色は重なり合って、内因性ＡＳＭの明白な染色は認められないことが判明した（図９）。この結果は、ＡＡＶ２−ｈＡＳＭ−ＨＡがＡＳＭの発現を、免疫染色により容易に検出され得る生理学的レベルを超えるレベルに容易に駆動して、ＨＡタグを必要としない、ということを示す。ＭＲ画像に移されたこの比較略図（図９Ｃ、Ｆ）は、各免疫染色に関する形質導入領域を示す。
【０１９８】
ＡＡＶ形質導入および分布
高倍率画像で実証されるように、これらの領域中への標的化注入後、視床および脳幹において非常に高レベルの形質導入が達成された（図１０）。これらの画像は、ニューロンまたはニューロン様形態に類似する細胞プロフィールの形質導入を実証する。視床中へのＣＥＤ送達は、注入により直接的に標的化されなかった皮質領域へのこの導入遺伝子の指向性形質導入および全体的分布を生じた（図１１、表２）。これは、多数の皮質領域全体に分散されたＨＡ陽性細胞の検出により明白であった。
【０１９９】
導入遺伝子発現の効率
上首尾の注入を確定するに際しての別の重要な因子は、ＭＲＩトレーサーの分布とその結果生じる導入遺伝子発現領域との間の予測性である（表３、４）。ニューロンマーカー（抗ＮｅｕＮ）またはＨＡエピトープタグ（抗ＨＡ）に対して免疫染色された免疫染色細胞体のニューロン計数は、視床では、６８％までのニューロンがＨＡに対して陽性であり（ＳＥＭ±１１．３％）、脳幹では、８２％のニューロンが陽性である（ＳＥＭ±７．８％）ということを明示した。同様に、視床注入に関するＧｄ分布の領域と導入遺伝子発現の領域、およびＧｄ分布の領域との間の比較は８２％（ＳＥＭ±８．４％）重複を明示したが、一方、脳幹注入に関しては、その発現領域はＭＲトレーサー分布の領域をわずかに超える１１７％（ＳＥＭ±７．２％）であることが判明した。形質導入領域についてのより厳密な試験は、ベクターが特異的にニューロンを形質導入し、星状細胞または小グリア細胞では細胞形質導入は検出されない（データは示されていない）、ということを示した。形質導入が主にニューロンで観察されたという知見は、ニューロンに関するＡＡＶ２向性のために意外ではない。小グリア細胞活性化における適度の増大が直接注入領域で明らかであるが、しかしながらこの細胞活性化は直接対流領域に限定されており、処置ＮＨＰの皮質領域に置いては有意の免疫活性化は検出されなかった（データは示されていない）。
【０２００】
【表２】
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【０２０１】
形質導入の分布：×××−陽性細胞５０個以上；××−陽性細胞１０〜４９個；×−陽性細胞９個未満。
【０２０２】
【表３】
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【０２０３】
【表４】
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【０２０４】
ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ注入
上記の方法を用いて、３匹のアカゲザル（霊長類）の視床に、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ（１×１０12ｖｇ／ｍｌ）を注入した。ＡＡＶ２−ＡＡＤＣは、細胞内分子である芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードする。視床ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ注入後、穿刺経路から離れた異なる皮質領域で、ＡＡＤＣ染色が観察された（データは示されていない）。
【０２０５】
参考文献−図５〜１１
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全ての引用は、それら全体の内容が参照により明確に本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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