(57)【要約】【課題】環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異ＲＮＡを発現させることが可能な変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを提供すること。【解決手段】（ａ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列１の５’末端領域に変異を有する配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡａ、（ｂ）前記配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｂ、又は（ｃ）前記配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃを調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
（ａ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列１の５’末端領域に変異を有する配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡａ；
（ｂ）前記配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｂ；
（ｃ）前記配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃ；
【請求項２】
配列１の５’末端領域が、配列１の５’末端から５０塩基以内の領域であり、かつ、配列２の３’末端領域が、配列２の３’末端から５０塩基以内の領域であることを特徴とする請求項１記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項３】
ターミネータ配列が、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のターミネータ配列であることを特徴とする請求項１又は２記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項４】
プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項５】
プラスミドの複製開始点又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項６】
変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが２００〜５０００塩基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項７】
ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する方法であって、前記ＤＮＡが請求項１〜６のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする形質転換細胞の製造方法。
【請求項８】
細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項７記載の形質転換細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異ＲＮＡを発現させることが可能な変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタンパク質を細胞内に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等に広く用いられており、今日では欠かせない技術である。
【０００３】
細胞内で特定のタンパク質を発現させるためには、細胞内へタンパク質をコードする遺伝子を導入する方法が有用である。導入する遺伝子の運搬体としてはプラスミドベクターを利用した方法が広く利用されてきたが、プラスミドベクターを利用せずに線状二本鎖ＤＮＡを利用する方法も開発されている。
【０００４】
また、タンパク質の機能を調べる場合には、タンパク質をコードする遺伝子の様々な位置に置換、欠損、挿入等の変異を導入し、変異を導入した遺伝子を細胞内に導入して変異タンパク質を発現させ、変異による影響を調べる変異解析が行われている。
【０００５】
タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入する方法としては、近年、ＰＣＲ法を利用する方法が行われている。例えば、変異を導入しようとする位置よりも前方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセット、及び、後方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセットをそれぞれ用いて、目的遺伝子の前方領域と後方領域とをＰＣＲ法により増幅し、得られる前方領域の増幅断片と後方領域の増幅断片とを連結させる方法（特許文献１参照）が提案されている。
【０００６】
特許文献１記載の方法は、目的遺伝子に変異を有する線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能であるものの、作製した線状二本鎖ＤＮＡを用いて変異タンパク質を細胞内で発現させるには、ベクターに連結して環状化させる必要があった。
【０００７】
また、鋳型となる環状ＤＮＡ、前記鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも１組の変異導入用プライマー対、並びにＤＮＡポリメラーゼからなる混合液を調製し、調製した混合物をＰＣＲに供し、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物として増幅することを特徴とする部位特異的変異導入方法（特許文献２参照）が提案されている。
【０００８】
特許文献２に記載の方法は、ＤＮＡ断片が５’突出末端を有するようにする必要があること、及び、二本鎖ＤＮＡが環状構造をとることができるようにするため、用いるプライマー対は互いに９〜３０塩基のオーバーラップ領域を設け、そのオーバーラップ領域に変異を導入する部位を存在させる必要があること等、プライマーの設計にあたって制約があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２８７４１５号公報
【特許文献２】特開２００８−２７８８０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異ＲＮＡを発現させることが可能な変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一般的に細胞内で特定のタンパク質を発現させる場合には、プロモータ配列と、タンパク質をコードする遺伝子配列（構造遺伝子）と、ターミネータ配列とを順次有する配列を含む二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入する方法が用いられてきた。しかしながら、本発明者らは、線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入して細胞内でタンパク質を発現させる際には、用いる線状二本鎖ＤＮＡにおいて、プロモータ配列と、タンパク質をコードする遺伝子配列と、ターミネータ配列とを順次備える配列である必要はないことを自らの研究で見いだした。そこで、タンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記タンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製して細胞に導入したところ、細胞内でタンパク質が発現することを確認した。この技術を応用し、前記線状二本鎖ＤＮＡにおいて、タンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列、又はタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列に変異を有する変異タンパク質発現用の線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲで作製し、かかる変異タンパク質発現用の線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入したところ、細胞内で変異タンパク質が発現することを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］（ａ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列１の５’末端領域に変異を有する配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡａ；（ｂ）前記配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｂ；（ｃ）前記配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃ；の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［２］配列１の５’末端領域が、配列１の５’末端から５０塩基以内の領域であり、かつ、配列２の３’末端領域が、配列２の３’末端から５０塩基以内の領域であることを特徴とする上記［１］記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［３］ターミネータ配列が、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のターミネータ配列であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［４］プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［５］プラスミドの複製開始点又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［６］変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが２００〜５０００塩基であることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに関する。
【００１３】
また、本発明は、［７］ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する方法であって、前記ＤＮＡが上記［１］〜［６］のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする形質転換細胞の製造方法や、
［８］細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする上記［７］記載の形質転換細胞の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡは、環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異ＲＮＡを発現させることが可能である。また、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことで、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに更に変異を有する変異ＲＮＡ発現用の線状二本鎖ＤＮＡを作製することが簡易である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法の例１を示す図である。
【図２】本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法の例２を示す図である。
【図３】本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法の例３を示す図である。
【図４】本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法の例を示す図である。
【図５】参考例１及び実施例に用いたｐＥＧＦＰ−Ｃ１のマップを示す図である。
【図６】参考例１で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３〜Ｎｏ．ｏ−１０のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図７】参考例１で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３５〜Ｎｏ．ｏ−４０のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図８】参考例１で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３５〜Ｎｏ．ｏ−４０の配置図である。図中、「ＧＦＰ」はＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域、「Ｅ」はＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域、「ｔｅｒ」はＳＶ４０ターミネータ配列、「５ＣＧＣ」は配列番号１に示す配列、「ＣＭＶｐ」はＣＭＶプロモータ配列であり、ｏ−３６における−１０００〜−６００、ｏ−３７における−２０００〜−６００、ｏ−３８における−３０００〜−６００、ｏ−３９における−３７１７〜−６００、ｏ−４０における−６１５〜−６００はｐＥＧＦＰ−Ｃ１中の配列を示す。
【図９】参考例１で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３５〜Ｎｏ．ｏ−４０をヒト子宮頸部類上皮腫細胞（ＨｅＬａ細胞）に導入した結果であり、上が蛍光顕微鏡像、下が微分干渉顕微鏡像を示す図である。
【図１０】実施例、参考例２で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１５、Ｔ−１８、Ｔ−３８、Ｔ−３９のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】実施例、参考例２で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４５、Ｔ−４８、Ｔ−４３、Ｔ−４４の配置図を示す図である。
【図１２】実施例、参考例２で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４５、Ｔ−４８、Ｔ−４３、Ｔ−４４のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図１３】実施例、参考例２で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４５、Ｔ−４８、Ｔ−４３、Ｔ−４４をヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザル腎臓由来細胞（ＣＯＳ−７細胞）、ＮＩＨ由来のマウス胎仔由来線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）にそれぞれ導入した結果であり、右が微分干渉顕微鏡像、左が蛍光顕微鏡像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡとしては、
（ａ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列１（以下、単に「配列１」ということがある）の５’末端領域に変異を有する配列１’（以下、単に「配列１’」ということがある）と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域からなる配列２（以下、単に「配列２」ということがある）とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡａ；
（ｂ）前記配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２の３’末端領域に変異を有する配列２’（以下、単に「配列２’」ということがある）とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｂ；
（ｃ）前記配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃ；
の（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡであれば特に制限されず、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡは環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異ＲＮＡを発現させることが可能である。
【００１７】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡａとしては、配列１’の下流（３’末端側）にターミネータ配列が動作可能に連結され、ターミネータ配列の下流にプロモータ配列が動作可能に連結され、プロモータ配列の下流に配列２が動作可能に連結されているものであればよく、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｂとしては、配列１の下流にターミネータ配列が動作可能に連結され、ターミネータ配列の下流にプロモータ配列が動作可能に連結され、プロモータ配列の下流に配列２’が動作可能に連結されているものであればよく、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃとしては、配列１’の下流にターミネータ配列が動作可能に連結され、ターミネータ配列の下流にプロモータ配列が動作可能に連結され、プロモータ配列の下流に配列２’が動作可能に連結されているものであればよい。
【００１８】
本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡ配列であればよく、タンパク質をコードする遺伝子配列の他、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）発現配列、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列等の機能性核酸を発現するＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００１９】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質を発現する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質をコードする遺伝子配列を選択でき、タンパク質をコードする遺伝子配列としては、用途に合わせて全長の遺伝子配列でも、その一部でもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製した人工的な遺伝子でもよく、遺伝子における５’末端の開始コドン及び３’末端の停止コドンは、適宜、含んでも含んでいなくてもよい。
【００２０】
また、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質の発現をノックダウンする場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制できるｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、ｓｉＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現用線状二本鎖ＤＮＡ配列を選択することができる。さらに、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制できる核酸アプタマー発現用線状二本鎖ＤＮＡ配列やリボザイム発現用線状二本鎖ＤＮＡ配列を選択することができ、特定の遺伝子の転写を抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としてデゴイ発現配列を設定することができ、上記配列は、それぞれ標的ＲＮＡの配列やその転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて設計することができる。
【００２１】
本発明の配列１や配列２におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域としては、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の中央より５’末端にかけての部分に限らず、任意に設計することができ、例えば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の全長に対して９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％上流領域を挙げることができる。本発明の配列２の３’末端は、本発明の配列１の５’末端が結合すると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の全長が形成されるように設計されていればよく、例えば、配列１がＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域６０％を欠失した下流領域からなる配列である場合は、配列２はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流領域６０％からなる配列、すなわちＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流領域４０％を欠失した上流領域からなる配列となり、配列２の３’末端に配列１の５’末端が結合するとＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の全長が形成されるように設計される。なお、配列２の３’末端や配列１の５’末端は平滑末端であることが好ましい。
【００２２】
本発明において、配列１の５’末端領域には前記下流領域の５’末端が含まれ、配列２の３’末端領域には前記上流領域の３’末端が含まれる。また、本発明の配列１の５’末端領域としては、配列１の５’末端から２００塩基以内であればよいが、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製の容易性の点からは、好ましくは１５０塩基以内、より好ましくは１００塩基以内、さらに好ましくは５０塩基以内、最も好ましくは３０塩基以内の領域を例示することができ、配列２の３’末端領域としては、配列２の３’末端から２００塩基以内であればよいが、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製の容易性の点からは、好ましくは１５０塩基以内、より好ましくは１００塩基以内、さらに好ましくは５０塩基以内、最も好ましくは３０塩基以内の領域を例示することができる。
【００２３】
本発明において、「配列１の５’末端領域に変異を有する」における変異とは、配列１の５’末端領域（好ましくは５’末端を除く）のＤＮＡ配列に、１又は数個の塩基の置換、１又は数個の塩基の欠損、１又は数個の塩基の挿入等の変異を有することを意味し、「配列２の３’末端領域に変異を有する」における変異とは、配列２の３’末端領域（好ましくは３’末端を除く）のＤＮＡ配列に、１又は数個の塩基の置換、１又は数個の塩基の欠損、１又は数個の塩基の挿入等の変異を有することを意味する。また、配列１’又は配列２’に導入できる上記変異の数としては特に制限されず、１個でも、２以上、３以上、５以上、１０以上であってもよく、タンパク質等の発現向上や機能解析等、変異ＲＮＡを発現させる目的に応じて適宜設定することができる。なお、置換にはアミノ酸をコードするコドンの同義コドンへの置換も含まれ、欠損や挿入では、前述のように設計して形成されることになるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列が対応する変異を有する。
【００２４】
本発明において、ターミネータ配列としては、変異ＲＮＡの発現を行う目的、変異ＲＮＡの発現を行う細胞の種類、プロモータの種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類等によって適宜選択することができ、天然に存在するターミネータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したターミネータ配列であってもよい。人工的に合成したターミネータ配列としては、変異ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、天然に存在するターミネータ配列の部分配列であっても、そのＤＮＡ配列に置換、欠損、挿入を有するものであってもよい。
【００２５】
人工的に合成したターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、変異ＲＮＡの発現量を高める観点から、長さ４０〜２５０塩基、より好ましくは４０〜２００塩基、さらに好ましくは６０〜１２０塩基、中でも７０〜１２０塩基からなり、１番目の塩基がＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、又はＧ（グアニン）であり、２番目の塩基がＡ、Ｔ、又はＧであり、３番目の塩基がＴであり、４番目の塩基がＡであり、５番目の塩基がＡであり、６番目の塩基がＡであり、７番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ（シトシン）であり、８番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり、９番目の塩基がＡ、Ｇ、又はＣである、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列を好適に例示することができ、Ａ，（Ａ／Ｔ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｃ）の連続した９塩基の配列含むターミネータ配列をより好適に例示することができ、かかる連続した９塩基が１又は２以上含まれていてもよい。
【００２６】
このようなターミネータ配列としては、公知の文献（国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット）等に記載の配列を利用することができ、例えば、ラビットβ−グロビン（β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列の一部（即ちβ−グロビンターミネータ配列由来又はＳＶ４０ターミネータ配列由来）であって上記の長さ及び配列を有するものを好ましく挙げることができ、この中から、変異ＲＮＡの発現量を高めることができるものを適宜選択することが好ましい。
【００２７】
また、天然に存在するターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、ウィルスのターミネータ配列であっても、大腸菌、枯草菌等の原核生物のターミネータ配列であっても、酵母、マウス、ヒト、ラビット等の真核生物のターミネータ配列であってもよく、具体的には、ラビットβ−グロビン（Ｒａｂｂｉｔ  β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネータ配列、ＨＳＶ・ＴＫターミネータ配列、ＣＹＣ１ターミネータ配列、ＡＤＨターミネータ配列、ＳＰＡターミネータ配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネータ配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネータ配列、トウモロコシ由来のＺｅｉｎ遺伝子ターミネータ配列、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネータ配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子ターミネータ配列、ＬａｃＺアルファターミネータ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列等を挙げることができ、変異ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくはＳＶ４０のターミネータ配列やラビットβ−グロビンのターミネータ配列を挙げることができ、より好ましくはＳＶ４０のターミネータ配列を挙げることができる。
【００２８】
本発明において、プロモータ配列としては、変異ＲＮＡの発現を行う目的、変異ＲＮＡを発現させる哺乳動物等の細胞の種類やＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、ターミネータ配列等により適宜選択することができ、具体的には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列、ヒト伸長因子１−アルファ（ＥＦ１α）プロモータ配列、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモータ配列、アデノウィルス後期（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｌａｔｅ、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモータ配列、ＳＶ４０及びＨＴＬＶ−１  ＬＴＲの融合プロモータであるＳＲαプロモータ配列、ヒトユビキチンＣプロモータ配列、α−アクチンプロモータ配列、β−アクチンプロモータ配列、Ｕ６プロモータ配列、Ｈ１プロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が抑制されるＴｅｔ−Ｏｆｆプロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が誘導されるＴｅｔ−Ｏｎプロモータ配列、亜鉛等の金属や種々の刺激により誘導されるメタロチオネインプロモータ配列、活性酸素により誘導されるＡＲＥプロモータ配列を挙げることができ、変異ＲＮＡの発現量を高める観点からは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列を好適に例示することができ、変異ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、その部分配列であっても、ＤＮＡ配列の置換、欠損、挿入を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡとしては、プラスミドの複製開始点又は薬剤耐性遺伝子を含まないものが好ましく、プラスミドの複製開始点としては、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子等由来の複製開始点を挙げることができ、プラスミドの薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００３０】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおいて、配列１又は配列１’とターミネータ配列の間や、プロモータ配列と配列２又は配列２’の間には、シグナルペプチドやタグペプチドをコードする配列を備えることもできる。
【００３１】
シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等を好適に挙げることができ、タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等を好適に挙げることができる。
【００３２】
また、配列１又は配列１’とターミネータ配列の間、ターミネータ配列とプロモータ配列の間、プロモータ配列と配列２又は配列２’の間の少なくとも１つの間には、リンカー配列を備えることもできる。リンカー配列は、配列１又は配列１’とターミネータ配列、ターミネータ配列とプロモータ配列、プロモータ配列と配列２又は配列２’を連結する塩基配列であり、かかるリンカー配列中には、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製する工程で用いられる配列であって、長さとしては９〜４５塩基、好ましくは１２〜３０塩基であり、塩基としてはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が５０％以上、好ましくは８０％以上である配列（アニーリング配列）、例えば、長さが１５塩基で、シトシンとグアニンが１００％のＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣ（配列番号１）の配列を含むことができる。なお、前述のようにシグナルペプチドやタグペプチドをコードする配列を備える場合、リンカー配列はこれら配列の下流に順次備えることが好ましい。
【００３３】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さ（塩基）としては、変異ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくは２００〜５０００塩基、好ましくは２００〜３０００塩基、より好ましくは２００〜２０００塩基、さらに好ましくは２００〜１７００塩基を挙げることができる。
【００３４】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法としては特に制限されず、公知の融合ＰＣＲ法（例えば特開２００９−２６８３６０号公報）等のＰＣＲ法や、制限酵素処理とＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション法等により、配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２’の各配列を上記記載順に連結させて製造する方法や、配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２の各配列を上記記載順に連結させて製造する方法や、配列１’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２’の各配列を上記記載順に連結させて製造する方法を例示することができるが、ＰＣＲ法を用いた方法を好適に例示することができる。
【００３５】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法（ＰＣＲ法を用いた方法）の例１として、
（ｇ）配列１と、ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡｇを作製する工程；
（ｈ）リンカー配列と、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡｈを作製する工程；
（ｉ）線状二本鎖ＤＮＡｇ及び線状二本鎖ＤＮＡｈをテンプレートとして、線状二本鎖ＤＮＡｇにおける配列１の５’末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマーｉと、線状二本鎖ＤＮＡｈの配列２における３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマーｉを用いてＰＣＲを行う工程；
の工程（ｇ）〜（ｉ）を備えた変異ＲＮＡ発現用線状ＤＮＡを製造する方法を挙げることができる。図１に例１の概要を示す。
【００３６】
工程（ｇ）において、配列１と、ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡｇは、配列１と、ターミネータ配列とを順次備えた配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、配列１の５’末端領域のセンス鎖配列を含むフォワードプライマーｇと、リンカー配列とターミネータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えた配列を含んだリバースプライマーｇとを用いてＰＣＲを行うことにより作製が可能である。工程（ｈ）において、リンカー配列と、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡｈは、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、リンカー配列とプロモータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列とを順次備えた配列を含むフォワードプライマーｈと、配列２の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含んだリバースプライマーｈとを用いてＰＣＲを行うことにより作製が可能である。工程（ｇ）、（ｈ）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの長さは、ＰＣＲの可能な範囲で適宜選択することができ、プライマーの作製コストや設計の容易さの観点から、８塩基〜２５０塩基、好ましくは１０塩基〜２００塩基、より好ましくは１２塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１５塩基〜５０塩基を例示することができる。
【００３７】
工程（ｉ）において、前記フォワードプライマーｉ又は前記リバースプライマーｉの一方は変異を導入していないプライマーを用いてもよいが、テンプレートとなるＤＮＡにアニールできる限り、前記フォワードプライマーｉ又は前記リバースプライマーｉに複数の変異を有することや、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーに１又は２以上の変異を有することで、線状二本鎖ＤＮＡｇ及び線状二本鎖ＤＮＡｈをテンプレートとして、一回のＰＣＲで複数の変異を有する変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となる。
【００３８】
また、工程（ｉ）におけるフォワードプライマーｉ及びリバースプライマーｉの長さについては、上記工程（ｇ）、（ｈ）におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーの長さと同様である。なお、配列１の長さに応じて、フォワードプライマーｉにターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含んでもよく、また、配列２の長さに応じて、リバースプライマーｉにプロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含んでもよい。
【００３９】
前記ＰＣＲ法を用いた方法の例２として、
（ｊ）配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡｊを作製する工程；
（ｋ）線状二本鎖ＤＮＡｊをテンプレートとして、線状二本鎖ＤＮＡｊにおける配列１の５’末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマーｋと、線状二本鎖ＤＮＡｊの配列２における３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマーｋを用いてＰＣＲを行う工程；
の工程（ｊ）及び（ｋ）を備えた変異ＲＮＡ発現用線状ＤＮＡを製造する方法も挙げることができる。図２に例２の概要を示す。
【００４０】
工程（ｊ）において、配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡｊは、配列１とターミネータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、配列１とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、さらに、プロモータ配列と配列２とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、プロモータ配列と配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、前者の線状二本鎖ＤＮＡの３’末端に後者の線状二本鎖ＤＮＡの５’末端を公知の方法により連結することにより作製が可能である。
【００４１】
工程（ｋ）において、フォワードプライマーｋ又はリバースプライマーｋの一方は変異を有していないプライマーを用いてもよいが、テンプレートとなるＤＮＡにアニールできる限り、フォワードプライマーｋ又は前記リバースプライマーｋに複数の変異を有することや、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーに１又は２以上の変異を有することで、線状二本鎖ＤＮＡｊをテンプレートとして、一回のＰＣＲで複数の変異を有するＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となる。なお、配列１の長さに応じて、フォワードプライマーｋにターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含んでもよく、また、配列２の長さに応じて、リバースプライマーｋにプロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含んでもよい。工程（ｋ）におけるフォワードプライマーｋ及びリバースプライマーｋの長さについては、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法の例１の場合と同様である。
【００４２】
前記ＰＣＲ法を用いた方法の例３として、
（ｌ）プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、（Ａ）環状化配列ｆとプロモータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列とを順次備えた環状化用フォワードプライマーと、前記環状化配列ｆに相補的に結合可能な環状化配列ｒとターミネータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えた環状化用リバースプライマー、（Ｂ）ターミネータ配列の３’末端領域のセンス鎖配列とプロモータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列とを順次備えた環状化用フォワードプライマーと、ターミネータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなる環状化用リバースプライマー、（Ｃ）プロモータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなる環状化用フォワードプライマーと、プロモータ配列の５’末端領域のアンチセンス鎖配列とターミネータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えた環状化用リバースプライマー、の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの組み合わせのプライマーを用いてＰＣＲを行う工程；
（ｍ）工程（ｌ）で得られた線状二本鎖ＤＮＡにおける両末端の互いに相補的に結合可能な配列が自己結合することで線状二本鎖ＤＮＡが環状化した環状化二本鎖ＤＮＡを得る工程；
（ｎ）工程（ｍ）で得られた環状化二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、環状化二本鎖ＤＮＡ中のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の一部の配列のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含む線状化用フォワードプライマーと、前記線状化用フォワードプライマーがアニールするＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列中の５’末端の上流側に隣接する一塩基及び該一塩基の上流側のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の一部の配列のアンチセンス鎖配列に変異を導入した線状化用リバースプライマーを用いてＰＣＲを行う工程；
の工程（ｌ）〜（ｎ）を備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法を挙げることができる。
【００４３】
工程（ｌ）における環状化配列ｆや環状化配列ｒの塩基の長さとしては、９〜４５塩基、好ましくは１２〜３０塩基であり、塩基としてはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは１００％を好適に例示することができる。
【００４４】
工程（ｎ）においては、前記線状化用フォワードプライマー又は前記線状化用リバースプライマーの一方は変異を有していないプライマーを用いてもよいが、テンプレートとなるＤＮＡにアニールできる限り、線状化用フォワードプライマー又は線状化用リバースプライマーに複数の変異を有することや、前記線状化用フォワードプライマー及び前記線状化用リバースプライマーに１又は２以上の変異を有することで、工程（ｍ）で作製した環状化ＤＮＡをテンプレートとして、一回のＰＣＲで複数の変異を有するＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となる。
【００４５】
また、工程（ｎ）における線状化用フォワードプライマーは、環状化二本鎖ＤＮＡ中のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の一部の配列の長さに応じてターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含んでもよく、工程（ｎ）における線状化用リバースプライマーは、前記線状化用フォワードプライマーがアニールするＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列中の５’末端の上流側に隣接する一塩基及び該一塩基の上流側のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の一部の配列の長さに応じて、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含んでもよい。なお、工程（ｎ）における線状化用フォワードプライマーや線状化用リバースプライマーの長さについては、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法の例１の場合と同様である。
【００４６】
図３に、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法の例３において、工程（ｌ）で環状化配列ｆと、プロモータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列とを順次備えた環状化用フォワードプライマーと、前記環状化配列ｆに相補的に結合可能な環状化配列ｒとターミネータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えた環状化用リバースプライマーを用いた（Ａ）の組合せの場合の例を示す。
【００４７】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして変異を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入することが可能となる。本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法の例１としては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡａをテンプレートとして、
（１）配列１’の５’末端領域のセンス鎖配列を含むフォワードプライマー１’（以下、「フォワードプライマー１’ということがある」）と、配列２の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマー２Ｍ（以下、「リバースプライマー２Ｍということがある」）、
（２）配列１’の５末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマー１’Ｍ（以下、「フォワードプライマー１’Ｍということがある」）と、配列２の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むリバースプライマー２（以下、「リバースプライマー２ということがある」）、
（３）前記フォワードプライマー１’Ｍと、前記リバースプライマー２Ｍ、
のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせのいずれかを用いてＰＣＲを行う方法を挙げることができる。
【００４８】
また、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法の例２として、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｂをテンプレートとして、
（４）配列１の５末端領域のセンス鎖配列を含むフォワードプライマー１（以下、「フォワードプライマー１ということがある」）と、配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマー２’Ｍ（以下、「リバースプライマー２’Ｍということがある」）、
（５）配列１の５末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマー１Ｍ（以下、「フォワードプライマー１Ｍということがある」）と、配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むリバースプライマー２’（以下、「リバースプライマー２’ということがある」）、
（６）前記フォワードプライマー１Ｍと、前記リバースプライマー２’Ｍ、
のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせのいずれかを用いてＰＣＲを行う方法も挙げることができる。
【００４９】
さらに、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法の例３として、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃをテンプレートとして、
（７）前記フォワードプライマー１’と、前記リバースプライマー２’Ｍ、
（８）前記フォワードプライマー１’Ｍと、前記リバースプライマー２’、
（９）前記フォワードプライマー１’Ｍと、前記リバースプライマー２’Ｍ、
のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせのいずれかを用いてＰＣＲを行う方法も挙げることができる。
【００５０】
図４に、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡｃをテンプレートとして、前記（９）フォワードプライマー１’Ｍと、前記リバースプライマー２’Ｍを用いてＰＣＲを行い、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法を示す。
【００５１】
フォワードプライマー１’Ｍにおける、配列１’の５末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列としては、配列１’の５末端領域のセンス鎖配列が有する変異の位置と異なる位置に変異を導入した配列のほか、配列１’の５末端領域のセンス鎖配列が有する変異の位置と同じ位置に変異を導入した配列も含まれ、リバースプライマー２’Ｍにおける、配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列としては、配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列が有する変異の位置と異なる位置に変異を導入した配列のほか、配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列が有する変異の位置と同じ位置に変異を導入した配列も含まれる。
【００５２】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記フォワードプライマー１’としては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列１’の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーを好適に例示することができるが、配列１’の長さに応じて、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５３】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記リバースプライマー２Ｍとしては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列２の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列からなるリバースプライマーを好適に例示することができるが、配列２の長さに応じて、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５４】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記フォワードプライマー１’Ｍとしては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列１’の５’末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列からなるフォワードプライマーを好適に例示することができるが、配列１’の長さに応じて、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５５】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記リバースプライマー２としては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列２の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを好適に例示することができるが、配列２の長さに応じて、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５６】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記フォワードプライマー１としては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列１の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーを好適に例示することができるが、配列１の長さに応じて、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５７】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記リバースプライマー２’Ｍとしては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列からなるリバースプライマーを好適に例示することができるが、配列２’の長さに応じて、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５８】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記フォワードプライマー１Ｍとしては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列１の５’末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列からなるフォワードプライマーを好適に例示することができるが、配列１の長さに応じて、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含むこともできる。
【００５９】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記リバースプライマー２’としては、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおける配列２’の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを好適に例示することができるが、配列２’の長さに応じて、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むこともできる。
【００６０】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記フォワードプライマー１’、前記リバースプライマー２、前記フォワードプライマー１、前記リバースプライマー２’の長さとしては、好ましくは１２塩基〜１００塩基、より好ましくは１５塩基〜５０塩基を例示することができる。また、前記リバースプライマー２Ｍ、前記フォワードプライマー１’Ｍ、リバースプライマー２’Ｍ、前記フォワードプライマー１Ｍの長さとしては、配列１’、配列２、配列１又は配列２’中の変異を導入したい位置に応じて適宜長さを調節することができるが、好ましくは８塩基〜２５０塩基、より好ましくは１０塩基〜２００塩基、特に好ましくは１２塩基〜１００塩基、中でも１５塩基〜５０塩基を例示することができる。
【００６１】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法において、前記リバースプライマー２Ｍ、フォワードプライマー１’Ｍ、リバースプライマー２’Ｍ、フォワードプライマー１Ｍのそれぞれに含まれる変異の数は特に制限されないが、複数の変異を導入する場合には、１回のＰＣＲで複数の新たな変異を導入できる点から、テンプレートとなるＤＮＡにアニールする機能を失わない限り、１つのプライマー上に２以上の変異を含むことができ、３以上の変異を含むこともでき、５以上の変異を含むこともできる。
【００６２】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法を行う場合には、テンプレートとして用いる本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製する段階において、新たな変異を導入する塩基の位置が配列１若しくは配列１’の５’末端領域、又は配列２若しくは配列２’の３’末端領域に含まれるように、配列１、配列１’、配列２、又は配列２’を設計することが、新たな変異を導入するためのプライマー作製の容易性の観点から好ましい。
【００６３】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法を用いれば、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を簡易かつ短時間で導入することができる。さらに、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法によって得られた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに新たな変異を導入する方法を行うことを繰り返すことで、１回のＰＣＲ毎に１又は複数の新たな変異を導入することが可能となり、複数の変異を有する変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡが容易に作製できる。
【００６４】
本発明において、変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する方法としては、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する方法であれば特に制限されず、その方法としては、前記変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを哺乳動物等の細胞内に導入する一般的な方法であればよく、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）Tｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販のトランスフェクション試薬ならびに当技術分野で広く用いられている手法を挙げることができる。
【００６５】
本発明における変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する方法において、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを導入する細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母等を挙げることができ、好ましくは哺乳動物細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ等の哺乳動物由来の細胞であればよく、具体的には、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ヒト骨肉腫細胞（ＨＯＳ細胞）、培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１細胞）、ヒト白血球Ｔ細胞（ｊｕｒｋａｔ細胞）、ヒト乳癌培養樹立細胞（ＭＣＦ−７細胞）、ヒト肝臓ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、ヒト結腸癌由来細胞（ＣａＣＯ−２細胞）、ヒト骨芽細胞（ＳａＯＳ細胞）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）、サル腎由来細胞（ＣＶ−１細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−１細胞）、マウス由来線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）、マウス奇形腫細胞（Ｆ９細胞）、マウス骨芽様細胞（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞）、ラット副腎髄質褐色腫（ＰＣ−１２細胞）、ラット骨芽細胞様細胞（ＲＯＳ１７／２．８細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１細胞）等を挙げることができ、中でもＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞が好ましい。また、上記哺乳動物細胞には、株化Ｂリンパ芽球（ＥＢ３細胞）等の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、組織から採取した初代培養細胞も含まれる。
【００６６】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡは、細胞内で変異ＲＮＡを発現させるためのキットや、変異ＲＮＡを発現させる線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットとして提供することもでき、かかるキットには本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの他、バッファー、ｄＮＴＰｓ、コントロールテンプレート、説明書等を含んでもよい。また、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を疾患の治療効果を有するタンパク質を発現する配列や、疾患の原因又は進行に関わるタンパク質の発現抑制機能を有する配列とすることにより、ＤＮＡワクチンとして応用することができる。
【００６７】
［参考例１：配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製］
（リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製：図５）をテンプレートとして、表１に記載の配列番号２〜７に示されるフォワードプライマーと配列番号８に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３〜Ｎｏ．ｏ−８をそれぞれ作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３〜Ｎｏ．ｏ−８のアガロース電気泳動の結果を図６に示す。
【００６８】
【表１】
2015073514.tif 000002
【００６９】
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、表２に記載の配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１０に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−９を、配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１１に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−１０をそれぞれ作製した。ＰＣＲ反応は、上記と同様に行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−９〜Ｎｏ．ｏ−１０のアガロース電気泳動の結果を図６に示す。
【００７０】
【表２】
2015073514.tif 000003
【００７１】
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
下記表３中のテンプレート欄に記載した２種類の線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−３とＮｏ．ｏ−９、Ｎｏ．ｏ−４とＮｏ．ｏ−９、Ｎｏ．ｏ−５とＮｏ．ｏ−９、Ｎｏ．ｏ−６とＮｏ．ｏ−９、Ｎｏ．ｏ−７とＮｏ．ｏ−９、Ｎｏ．ｏ−８とＮｏ．ｏ−１０をそれぞれテンプレートとして、配列番号９に示すフォワードプライマーと配列番号８に示されるリバースプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３５〜Ｎｏ．ｏ−４０を作製した。ＰＣＲ反応は、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃５分のサイクルを３０回行った以外は、前述の線状二本鎖ＤＮＡの作製におけると同様に行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７に、配置図を図８に示す。なお、図８における数字は、図５に示すように、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰ遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合のｐＥＧＦＰ−Ｃ１上の塩基の位置を示し、例えば１０１８はｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰ遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合の下流側の１０１８番目の塩基を示し、−６００はｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰ遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合の上流側の６００番目の塩基を示す。線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３５〜ｏ−４０の長さは、Ｎｏ．ｏ−３５が１６３１塩基、Ｎｏ．ｏ−３６が２０３１塩基、Ｎｏ．ｏ−３７が３０３１塩基、Ｎｏ．ｏ−３８が４０３１塩基、Ｎｏ．ｏ−３９が４７４８塩基、Ｎｏ．ｏ−４０が１６３１塩基である。
【００７２】
【表３】
2015073514.tif 000004
【００７３】
（細胞への導入）
ＨｅＬａ細胞を４０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、上記で得られた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−３５〜Ｎｏ．ｏ−４０のそれぞれ３０ｐｍｏｌをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。
【００７４】
（結果）
蛍光顕微鏡の観察結果を図９に示す。線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４０、ｏ−３５、ｏ−３６では３００ｍｓの露光時間で緑蛍光が観察され、Ｎｏ．ｏ−３７、ｏ−３８、ｏ−３９では１ｓの露光時間で緑蛍光が少し観察された。上記結果より、配列１と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞内に導入することで、細胞内でＲＮＡが発現すること、及び、前記線状二本鎖ＤＮＡの長さが短いほど細胞内におけるＲＮＡ発現量が多いことが明らかとなった。
【実施例】
【００７５】
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１０に示されるリバースプライマー、及び、配列番号１２に示されるフォワードプライマーと配列番号１０に示されるリバースプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１８、Ｔ−３９を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート５０ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１８、Ｔ−３９のアガロース電気泳動の結果を図１０に示す。
【００７６】
（リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号１３に示されるフォワードプライマーと配列番号８に示されるリバースプライマー、及び、配列番号１３に示されるフォワードプライマーと配列番号１４に示されるリバースプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、リンカー配列と、ＣＭＰプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１５、Ｔ−３８を作製した。ＰＣＲ反応は上記と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１５、Ｔ−３８のアガロース電気泳動の結果を図１０に示す。
【００７７】
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域の５’末端領域に変異を有する配列１’と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
上記で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１５及びＴ−１８をテンプレートとして、配列番号１５に示されるフォワードプライマー及び配列番号１６に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域の５’末端領域に変異を有する配列１’と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４８を作製した。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４８の配置図を図１１（ｂ）に示し、アガロース電気泳動の結果を図１２に示す。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。
【００７８】
なお、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４８は、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１の５’末端領域において、配列番号１７に示されるＥＧＦＰのアミノ酸配列における６６番目のスレオニン（Ｔ）をコードする配列をセリン（Ｓ）をコードする配列に置換し、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２の３’末端領域において、ＥＧＦＰのアミノ酸配列における６９番目のバリン（Ｖ）をコードする配列をイソロイシン（Ｉ）をコードする配列に置換した配列であり、ＥＧＦＰタンパク質において、６６番目のスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に、６９番目のバリン（Ｖ）をイソロイシン（Ｉ）に置換すると、緑蛍光を発光する能力が失われることが知られている。
【００７９】
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
上記で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−３８及びＴ３９をテンプレートとして、配列番号１８に示されるフォワードプライマーと配列番号１２に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域の３’末端領域に変異を有する配列２’とを順次備えた変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４４を作製した。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４４の配置図を図１１（ｄ）に示し、アガロース電気泳動の結果を図１２に示す。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。なお、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４４はＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２の３’末端領域において、ＥＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１７）における１６３番目のリジン（Ｋ）をコードする配列をグルタミン（Ｑ）をコードする配列に置換し、１６４番目のバリン（Ｖ）をコードする配列をアラニン（Ａ）をコードする配列に置換した配列であり、ＥＧＦＰタンパク質において、１６３番目のリジン（Ｋ）をグルタミン（Ｑ）に、１６４番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換しても緑蛍光の発光能力は失われないことが知られている。
【００８０】
［参考例２：ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、リンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰ遺伝子における上流領域からなる配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製］
上記で作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−１５及びＴ１８をテンプレートとして、配列番号８に示されるフォワードプライマーと配列番号９に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、配列番号１に示すリンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４５を作製した。
【００８１】
また、作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−３８及びＮｏ．Ｔ３９をテンプレートとして配列番号１４に示されるフォワードプライマーと、配列番号１２に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列１と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、配列番号１に示すリンカー配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列２とを順次備えた非変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４３を作製した。線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４５とＴ−４３の配置図をそれぞれ図１１（ａ）、（ｃ）に示し、アガロース電気泳動の結果を図１２に示す。
【００８２】
ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。
【００８３】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をそれぞれ２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、上記で得られた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４５、Ｔ−４８、Ｔ−４３、Ｔ−４４のそれぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図１３に示す。
【００８４】
（結果）
図１３より、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４４を導入したＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のいずれにおいても緑蛍光が観察され、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内にそのまま導入すると、変異を有するＲＮＡが細胞内で発現していることが明らかとなった。また、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入した場合の変異ＲＮＡの発現量は、変異を有さないＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入した場合のＲＮＡ発現量と同程度であることが確認できた。さらに、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｔ−４８を導入した各細胞においては緑蛍光が観察されなかったことから、本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入すると、変異が有効に機能していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の変異ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡは、そのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異ＲＮＡを発現させることが可能であることから、細胞内におけるタンパク質の機能解析や、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等の分野において有利に使用することができる。
【図１】
2015073514.tif 000005
【図２】
2015073514.tif 000006
【図３】
2015073514.tif 000007
【図４】
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【図８】
2015073514.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
2015073514.tif 000013
【図１０】
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【図１１】
2015073514.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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