(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体への糖鎖付加の有無を識別可能な方法、及び当該方法で取得される抗体の提供。【解決手段】遺伝子組み換え技術により製造された、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質（ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつアミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチド）を不溶性担体に固定化して得られる、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着可能な吸着剤とした、糖鎖を有した抗体の精製方法、糖鎖付加の有無を識別する方法、及び糖鎖の分離方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる、糖鎖を有した抗体の吸着剤。
【請求項２】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドである、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項４】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（Ａ）から（Ｄ）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、請求項３に記載の吸着剤。
（Ａ）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（Ｂ）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（Ｃ）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（Ｄ）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
【請求項５】
糖鎖を有した抗体を含む溶液を請求項１から４のいずれかに記載の吸着剤に添加して当該吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した糖鎖を有した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、糖鎖を有した抗体の精製方法。
【請求項６】
請求項５に記載の精製方法で得られる抗体。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の吸着剤を用いて、抗体への糖鎖付加の有無を識別する方法。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
【請求項９】
請求項８に記載の分離方法で得られる糖鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体吸着剤ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法に関する。特に本発明は、抗体のうち糖鎖を有した抗体を特異的に吸着可能な吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた、糖鎖を有した抗体の精製方法および抗体への糖鎖付加の有無を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、モノクローナル抗体が有する特異性を利用した医薬（抗体医薬）の開発が進められている。抗体医薬で用いるヒトＩｇＧのうち、Ｆｃ領域の２９７番目のアスパラギン残基に付加するＮ型糖鎖の違いによりＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性が変化することが知られており、特に糖鎖の一種であるフコースを除去した抗体でＡＤＣＣ活性が向上することが報告されている（非特許文献１）。つまり抗体医薬において、抗体が有する糖鎖構造には重要な意味がある。しかしながら、抗体医薬は通常、動物細胞を宿主とした遺伝子組換え技術を用いて製造しており、宿主内で抗体に付加される糖鎖を制御することは困難である。また製造した抗体の糖鎖を分析するには多くの時間と労力が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｋａｗａ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６−３４７３，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、抗体への糖鎖付加の有無を識別可能な方法および当該方法で用いる材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＩｇＧに対するレセプター（Ｆｃγレセプター）の一つであるＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体への糖鎖付加の有無を識別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
（１）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる、糖鎖を有した抗体の
吸着剤。
【０００６】
（２）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、（１）に記載の吸着剤。
【０００７】
（３）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドである、（１）に記載の吸着剤。
【０００８】
（４）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（Ａ）から（Ｄ）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、（３）に記載の吸着剤。
（Ａ）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（Ｂ）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（Ｃ）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（Ｄ）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
（５）糖鎖を有した抗体を含む溶液を（１）から（４）のいずれかに記載の吸着剤に添加して当該吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した糖鎖を有した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、糖鎖を有した抗体の精製方法。
【０００９】
（６）（５）に記載の精製方法で得られる抗体。
【００１０】
（７）（１）から（４）のいずれかに記載の吸着剤を用いて、抗体への糖鎖付加の有無
を識別する方法。
【００１１】
（８）（１）から（４）のいずれかに記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
【００１２】
（９）（８）に記載の分離方法で得られる糖鎖。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の吸着剤においてリガンドとして用いる、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なお、本発明の吸着剤においてリガンドとして用いるヒトＦｃγＲＩＩＩａは、必ずしもヒトＦｃγＲＩＩＩａの全長（配列番号１）を用いる必要はなく、少なくとも配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドであればよい。さらに配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドであっても、本発明の吸着剤でリガンドとして用いるヒトＦｃγＲＩＩＩａに含まれる。また、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａには、６６番目のロイシン（Ｌｅｕ）がヒスチジン（Ｈｉｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）に、１４７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に、１５８番目のチロシン（Ｔｙｒ）がヒスチジン（Ｈｉｓ）に、または１７６番目のバリン（Ｖａｌ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換された変異体が知られているが、これらのアミノ酸置換が少なくともいずれか１つ生じたポリペプチドであっても本発明の吸着剤のリガンドとして用いるヒトＦｃγＲＩＩＩａに含まれる。
【００１５】
本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａは、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａをクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａに付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドをヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００１６】
本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドの作製方法の一例として、
（Ｉ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００１７】
本発明の吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
【００１８】
本発明の吸着剤を作製する際、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化させるのに用いる不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００１９】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃγＲＩＩＩａと不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）が例示できる。
【００２０】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００２１】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００２２】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００２３】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００２４】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００２５】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、糖鎖を有した抗体を精製するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、糖鎖を有した抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、糖鎖を有した抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な、糖鎖を有した抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ等のＦｃレセプターと親和性を有する、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製することができる。また糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、糖鎖を有した抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができ、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。
【００２６】
本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるには、糖鎖を有した抗体とリガンド（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に糖鎖を有した抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【００２７】
糖鎖を有した抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を精製する際、前記抗体が有する糖鎖構造の違いにより、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別することができる。識別可能な糖鎖の構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞といった動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母といった酵母を宿主として抗体を発現させたときに付加される糖鎖や、ヒト抗体が有する糖鎖や、化学合成法で抗体に付加した糖鎖があげられる。また本発明の吸着剤は、抗体が有する糖鎖構造の違いに基づき分離できることから、糖鎖そのものの分離にも利用できる。
【００２８】
なお本発明の吸着剤により抗体の糖鎖構造の違いを識別できると前述したが、当該吸着剤に用いるリガンドタンパク質として、ＦｃγＲＩＩＩａ以外のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲｎ）を用いた場合でも同様に糖鎖構造の違いを識別できる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に係る発明であり、前記吸着剤は、抗体のうち、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着するため、これまで困難であった、抗体への糖鎖付加の有無を簡便に識別することができる。また本発明の吸着剤を用いることで、糖鎖を有した抗体を特異的に精製することができるため、糖鎖を有した抗体を効率的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図２】糖鎖を有したヒトＩｇＧ１（糖鎖ありヒトＩｇＧ１）と糖鎖を除去したヒトＩｇＧ１（糖鎖除去ヒトＩｇＧ１）とでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を比較した図である。図中のレーン（１）は糖鎖ありヒトＩｇＧ１、レーン（２）は糖鎖除去ヒトＩｇＧ１である。
【図３】糖鎖ありヒトＩｇＧ１および糖鎖除去ヒトＩｇＧ１に対するヒトＦｃγＲＩＩＩａならびにプロテインＡの結合性を比較した図である。（Ａ）はヒトＦｃγＲＩＩＩａの結果であり、（Ｂ）はプロテインＡの結果である。
【図４】糖鎖ありヒトＩｇＧ１および糖鎖除去ヒトＩｇＧ１を本発明の吸着剤で分離した結果である。（１）は糖鎖ありヒトＩｇＧ１の結果であり、（２）は糖鎖除去ヒトＩｇＧ１の結果である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は当該実施例に限
定されるものではない。
【００３２】
実施例１  ヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００３３】
【表１】
2015083558.tif 000003
（２−２）二段階目のＰＣＲは、（２−１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００３４】
【表２】
2015083558.tif 000004
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３を抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３のうち、ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号２４（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００３５】
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３で発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００３６】
実施例２  糖鎖除去ヒトＩｇＧ１の調製
以下に示す方法で、ヒトＩｇＧ１からＮ型糖鎖の除去を行なった。
（１）ヒトＩｇＧ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製：３１−ＡＩ１７）の濃度が３ｍｇ／ｍＬとなるよう、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。
（２）（１）の希釈液１００μＬに１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）を１００μＬ加え、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（５００ｍＵ／μＬ（タカラバイオ社製：４４５０）を１０μＬ加えた後、３７℃で２４時間静置することでＩｇＧ１のＮ型糖鎖を除去した。
（３）あらかじめ１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−６５０Ｆ（東ソー社製：２２８０３）を１００μＬ充填したオープンカラム（バイオラッド社製）に、（２）の処理液をアプライした。
（４）５００μＬの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で３回洗浄後、１００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で７回
溶出することで、Ｎ型糖鎖を除去したヒトＩｇＧ１（以下単に、糖鎖除去したヒトＩｇＧ
１という）を精製した。なお当該溶出液は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を溶
出液の１／４量加えることで中和した。
（５）（４）で得られた糖鎖除去したヒトＩｇＧ１溶液に対し、等量のサンプルバッファー（２（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム、６（ｗ／ｖ）％β−メルカプトエタノール、１０（ｗ／ｖ）％グリセリンおよび０．００５（ｗ／ｖ）％ブロモフェノールブルーを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））を添加し加熱処理することで、糖鎖除去したヒトＩｇＧ１を還元処理した。
（６）５から２０％のグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（アトー社製）を用いた電気泳動にてヒトＩｇＧ１を分離した。なお比較として、糖鎖処理をしていないヒトＩｇＧ１（以下、糖鎖ありヒトＩｇＧ１という）水溶液（濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）についても（５）の記載と同様な還元処理を行ない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００３７】
結果を図２に示す。糖鎖除去ヒトＩｇＧ１の重鎖はＮ型糖鎖が除去されているため、糖鎖ありヒトＩｇＧ１の重鎖と比較し低分子量となるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそのことが確認できた（図２のレーン（２）参照）。つまり本実施例の方法で、Ｎ型糖鎖を除去したヒトＩｇＧ１が調製できることが確認できた。
【００３８】
実施例３  ヒトＦｃγＲＩＩＩａの大量調製
（１）実施例１（３）で得られたヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現可能な形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）（４）で回収した菌体を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、１００００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた破砕液に終濃度で２０ｍＭとなるようイミダゾールを添加後、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）５０ｍＬを充填したＸＫ  ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。
（７）平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．５Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出した。
（８）（７）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア社製）１０ｍＬを充填したＨＲ  １６／１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）でヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【００３９】
実施例４  ヒトＦｃγＲＩＩＩａの抗体への結合性測定
（１）実施例３で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａをリン酸緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭのＫＣｌおよび１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含むｐＨ７．４の緩衝液）にて透析することで緩衝液交換を行ない、２８０ｎｍの吸光度からヒトＦｃγＲＩＩＩａの濃度を測定した。
（２）（１）で濃度を測定したヒトＦｃγＲＩＩＩａを２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１０μｇ／ｍＬに希釈後、アミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア社製）を用いてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に固定化し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いてヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化量を測定した。結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化量は４８８．２ＲＵ（１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２）であった。またプロテインＡ（プロテノバ社製）についても同様に、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００で固定化量を測定した結果、固定化量は２９０．０ＲＵであった。
（３）糖鎖ありヒトＩｇＧ１および実施例２で調製した糖鎖除去ヒトＩｇＧ１をＨＢＳ−ＥＰ（＋）（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５（ｖ／ｖ）％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（ＧＥヘルスケア社製）を含む、ｐＨ７．４の溶液）にて１２８μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬに希釈した。
（４）（２）で作製したタンパク質固定化チップのうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化チップの場合は４μｇ／ｍＬから１２８μｇ／ｍＬの糖鎖ありヒトＩｇＧ１または糖鎖除去ヒトＩｇＧ１を流速３０μＬ／分で流し、プロテインＡ固定化チップの場合は１μｇ／ｍＬから１６μｇ／ｍＬの糖鎖ありヒトＩｇＧ１または糖鎖除去ヒトＩｇＧ１を流速３０μＬ／分で流して、ヒトＩｇＧ１とチップに固定化したタンパク質とを結合させた後、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００にて接触時間２１０秒、解離時間４００秒の条件で測定することで、ヒトＩｇＧ１とチップに固定化したタンパク質との結合性を測定した。
【００４０】
測定結果を図３に示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａは、糖鎖ありヒトＩｇＧ１に対しては結合性を有するが、糖鎖除去ヒトＩｇＧ１に対しては非常に結合しにくいことがわかる（図３（Ａ）参照）。つまり、この結果からヒトＦｃγＲＩＩＩａは抗体への糖鎖付加による違いを認識していることがわかる。一方、プロテインＡは、糖鎖あり／なしにかかわらずヒトＩｇＧ１に対して同様の結合性を有していることがわかる（図３（Ｂ）参照）。
【００４１】
実施例５  ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲルの作製
（１）実施例３で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａを、限外ろ過膜（ミリポア社製：アミコンウルトラ−１５）を用いて濃縮・緩衝液交換を行ない、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に２．６ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。
（２）担体である親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の水酸基に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを反応させてエポキシトヨパールゲルを調製した。
（３）（２）で調製したエポキシトヨパールゲル７０μＬをスピンカラム（バイオラッド）に入れ、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍＬで３回洗浄した。
（４）（１）で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液０．４ｍＬと０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．６ｍＬとを混合した溶液を、（２）のゲルに添加し、３５℃で３時間振とうした。
（５）（４）で調製したゲルを０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）０．２ｍＬで３回洗浄した後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄することでｐＨを中性付近に戻し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲル０．２ｍＬを調製した。
（６）（２）のゲルに添加した溶液および洗浄液中に含まれるタンパク質濃度を測定し、ゲルに固定化されたヒトＦｃγＲＩＩＩａ量を算出することで固定化率を計算したところ、添加したヒトＦｃγＲＩＩＩａの８４％がゲルに固定化されていた。
【００４２】
実施例６  ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲルを用いた抗体分離
（１）実施例５で作製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲルをＨＲ  １６／５カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、当該カラムを液体クロマトグラフィー装置ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルス社製）に接続した。
（２）（１）で作製したカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し、ヒトＩｇＧ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製：３１−ＡＩ１７）または実施例２で調製した糖鎖除去ヒトＩｇＧ１（溶液濃度はともに１ｍｇ／ｍＬ）を、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで０．１ｍＬ添加した。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出した。
【００４３】
結果を図４に示す。同量のＩｇＧ１を流しているにもかかわらず、糖鎖除去ヒトＩｇＧ１（図４（２）参照）は、糖鎖ありヒトＩｇＧ１（図４（１）参照）と比較し、ゲルに吸着せずに通過する抗体の量が多いことが確認できる。また糖鎖ありヒトＩｇＧ１では０．１Ｍのグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を添加した時、抗体が溶出された（図４（１）参照）が、糖鎖除去ヒトＩｇＧ１ではゲルにほとんど吸着しなかったため抗体が溶出されなかった（図４（２）参照）。つまり、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着できる性能を有しており、この性能を利用することで抗体への糖鎖付加の有無を識別できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の吸着剤は、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着するため、糖鎖を有した抗体を高純度に分離・精製できる。したがって本発明の吸着剤は、抗体医薬製造および品質管理に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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