(57)【要約】【課題】キチン質材料が有する肥料効果を高めた肥料、及び該肥料の製造方法を提供すること、及び植物の成長を促進させ、品質の高い農作物を得る方法の提供。【解決手段】キチン質材料と、高いキチン分解活性を有するパエニバチルス属の微生物の培養物との混合物を肥料として用いることにより上記課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を含む肥料。
【請求項２】
さらに還元剤を含む、請求項１に記載の肥料。
【請求項３】
キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物が甲殻類の外殻由来材料である、請求項１又は２に記載の肥料。
【請求項４】
キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物が、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有するパエニバチルス属の微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肥料。
【請求項５】
植物の発根促進用である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の肥料。
【請求項６】
植物の活力剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の肥料。
【請求項７】
米の食味値及び味度値を高めるための、請求項１〜４にいずれか１項に記載の肥料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の肥料で植物を処理することを含む植物の栽培方法。
【請求項９】
請求項７に記載の肥料でイネを処理することを含む、米の食味値及び味度値を高める方法。
【請求項１０】
キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を混合する工程を含む肥料の製造方法。
【請求項１１】
さらに還元剤を混合する工程を含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物が甲殻類の外殻由来材料である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物が、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有するパエニバチルス属の微生物である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物、並びに還元剤を混合する工程を含む、低分子化キチン及び／又はキトサンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を含有する肥料、並びにその製造方法に関する。本発明は、上記に加え還元剤を含有する肥料にも関連する。さらに、本発明は該肥料を使用して植物を栽培する方法、米の食味値及び味度値を高める方法、並びに低分子化キチン及び／又はキトサンの製造方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチルグルコサミンを構成単位とする天然高分子多糖であるキチンは、主としてカニ・エビなどの甲殻類や昆虫の外皮、菌類の細胞壁に多く含まれている。一方、グルコサミンを構成単位とするキトサンは、接合菌類の細胞壁等に含有されている。特に、キチンは地球上での年間生産量がセルロースに次ぐ生物資源（バイオマス）であり、種々の生理活性を有することから注目されている。しかしながら、キチンは強固な結晶構造を有し不溶性であることから有効利用が難しく、そのほとんどが濃アルカリ中で脱アセチル化し、より加工しやすいキトサンに変換した後、利用されている。
【０００３】
キチンを豊富に含むカニ殻は古くから農業に利用されており、肥料効果、病害発病抑制、土壌改良、連作障害防止、及び植物生長促進などの効果が知られている。植物病原微生物の約８割は真菌類であり、その細胞壁の構成成分にはキチン及びキトサンが多く含まれ、植物はこれらの成分を感知し植物体内における抗菌性化合物の生産を誘導すると考えられている（非特許文献１）。即ち、キチンを豊富に含むカニ殻を農業資材として使用した場合、土壌微生物によりカニ殻の主成分であるキチンが低分子化されて可溶性のオリゴ糖となり、このキチンオリゴ糖が病原微生物の細胞壁と同様の効果を発揮し、植物体内で抗菌性化合物の生産を促進し、病害発病抑制効果が生じると考えられている。これまでに、キチンカルシウムの粉末を含む肥料が、特許文献１〜３に開示されている。
一方で、キトサンについてもキチンと同様の効果が認められ、キトサンは粉末又は液体などの形態で農業資材として市販されている。
【０００４】
微生物を用いてキチン質（一般に、キチン及びキトサンを総称して「キチン質」と呼ぶ場合がある）を分解する方法としては、微生物を利用した発酵法が知られている。例えば、特許文献４には、キチン原料に、海洋低温細菌ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属するキチナーゼ生産菌の培養液を加えて培養を行い、その培養液中よりＮ−アセチルグルコサミンを回収することによりＮ−アセチルグルコサミンを製造する方法が開示されている。この細菌を用いることで、強酸を使用することなくキチン原料から１段階でＮ−アセチルグルコサミンを製造することができる。しかしながら、この細菌のキチン分解能力は、安定で強固な結晶構造を有するカニ殻由来のキチン（αキチン）では非常に低い。一方、準安定構造を有するイカ由来のキチン（βキチン）を用いた場合、その培養上清中のＮ−アセチルグルコサミン濃度は０．３ｍｇ／ｍｌであることが記載されている。
【０００５】
本願発明者は、以前にパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌及びその変異体、キチン分解活性を有するポリペプチド、並びにそれらの利用方法に関する発明を開示したが（特許文献５）、当該特許文献では、該パエニバチルス属細菌の農業資材としての活用に関しては示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−１６５１８３号公報
【特許文献２】特開平８−１５７３１０号公報
【特許文献３】特開平８−１５７８２１号公報
【特許文献４】特開２００４−０４１０３５号公報
【特許文献５】特開２００８−２５３２５２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】木元久ら、キチン・キトサン研究、Vol. 17、No.3、296-304、2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
カニ殻等のキチンを豊富に含む材料は、植物の耐病性を高め、成長を促進する非常に有用な肥料となり得るが、その使用に際して植物に対する効果が安定しないという課題が指摘されている。これは、キチンが強固な結晶構造を有し不溶性であることが一因となっていると考えられる。一方で、比較的加工のしやすいキトサンを肥料とすることもできるが、上述したように、キトサンを得るには濃アルカリ中でキチンを脱アセチル化する必要があるため、製造工程の煩雑さや環境負荷の高さを回避できない。また、アルカリ等の化学物質を用いて調製したキトサンは有機農業に適さない。
本発明では、これらの問題点を解決し、植物の耐病性を効率的に高め、成長を促進し、品質の高い農作物を得るための肥料を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、キチン質を豊富に含むカニ殻の粉末と、高いキチン分解活性を有するパエニバチルス属の微生物の培養物との混合物を土壌に散布することで植物の成長が促進し、品質の高い農作物が得られることを見出した。さらに、該混合物にアスコルビン酸などの還元剤を添加することでキチン分解活性が高まることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を含む肥料。
［２］さらに還元剤を含む、［１］に記載の肥料。
［３］キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物が甲殻類の外殻由来材料である、［１］又は［２］に記載の肥料。
［４］キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物が、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有するパエニバチルス属の微生物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の肥料。
［５］植物の発根促進用である、［１］〜［４］のいずれかに記載の肥料。
［６］植物の活力剤である、［１］〜［４］のいずれかに記載の肥料。
［７］米の食味値及び味度値を高めるための、［１］〜［４］のいずれかに記載の肥料。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の肥料で植物を処理することを含む植物の栽培方法。
［９］［７］に記載の肥料でイネを処理することを含む、米の食味値及び味度値を高める方法。
［１０］キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を混合する工程を含む肥料の製造方法。
［１１］さらに還元剤を混合する工程を含む、［１０］に記載の製造方法。
［１２］キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物が甲殻類の外殻由来材料である、［１０］又は［１１］に記載の製造方法。
［１３］キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物が、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有するパエニバチルス属の微生物である、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物、並びに還元剤を混合する工程を含む、低分子化キチン及び／又はキトサンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高分子のキチン質を効率的に低分子化し、キチン質の肥料としての有用性を高めることが可能である。該肥料を用いることで、植物の成長を促進し、農作物の収穫量を増やすことも可能である。また、該肥料を用いることで高い品質の農作物を得ることも可能である。さらに、本発明の方法によって、肥料として有用な、低分子化したキチン及び／又はキトサンを効率的に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、パエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５の培養上清にコロイド性キチンを添加し、さらにアスコルビン酸を添加又は無添加のときのキチン分解活性の強さを示す図である。
【図２】図２は、稲田へのカニ殻及びパエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５培養物の散布を示す図である。
【図３】図３は、（１）コントロールの畑で生育させたキュウリ、（２）カニ殻のみを供した畑で生育させたキュウリ、並びに（３）カニ殻及びパエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５培養物を供した畑で生育させたキュウリを示した図である。
【図４】図４は、（１）コントロールの畑で生育させたトマト、（２）カニ殻のみを供した畑で生育させたトマト、並びに（３）カニ殻及びパエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５培養物を供した畑で生育させたトマトを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を含む肥料を提供する。
【００１４】
キチン及びキトサンは、それぞれ、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンを糖単位とする多糖類であり、一般的に、Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し難溶性であるものがキチン、グルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し可溶性であるものがキトサンとされる。本明細書中、キチン及びキトサンを総称して、「キチン質」と記載する場合がある。
【００１５】
本発明に用いられるキチン質において、所望の効果が得られるのであれば、キチン質中のＮ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの比率は特に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンの割合がグルコサミンの割合よりも高いこと（即ち、キトサンよりキチンを豊富に含むこと）が好ましい。本願発明に使用されるキチン質中の、好ましいＮ−アセチルグルコサミンの割合は６０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは８０％（ｗ／ｗ）以上、最も好ましくは１００％（ｗ／ｗ）である。
【００１６】
本発明において使用されるキチン質又はキチン質含有物は、キチン質のみであってもよく、或いはキチン質とそれ以外の成分（タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、核酸、無機化合物、有機化合物、ミネラルなど）との混合物であってもよい。一態様において、本発明に用いられるキチン質又はキチン質含有物は、甲殻類の外殻由来材料であり、当該材料にはキチン質及びそれ以外の構成成分（タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、核酸、無機化合物、有機化合物、ミネラル等）が含まれる。
本願発明に使用し得るキチン質又はキチン質含有物は、所望の効果が得られるのであれば、どのような材料から得られたものであってもよいが、好ましくは生物から得られたものである。該生物としては、甲殻類、キノコ（例、マンネンタケ、マイタケ、ヒメマツタケ（アガリクスともいう）；例えば、Bull. Agr. Shizuoka Univ., No.38, p29-35 (1988)参照）、昆虫（例、ハエ、バッタ）、イカ（イカの中心にみられる硬い骨のような透き通った白い組織中にキチン質が含まれる）、カビ（例、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ユミケカビ（Ａｂｓｉｄｉａ））が挙げられる。本発明を実施する上で、該生物は、好ましくは甲殻類であり、例としてカニ、エビが挙げられる。カニとしては、例えば、ズワイガニ（例、越前ガニ、松葉ガニ）、タラバガニが挙げられる。キチン質は主として、甲殻類や昆虫の外骨格、キノコやカビなどの菌類の細胞壁に多く含まれるので、本発明においては、これらが、キチン質含有生物由来の材料として好適に用いられる。特に、甲殻類の外骨格はキチン質を、通常、９〜３２％（ｗ／ｗ、乾燥重量ベース）程度含み、該キチン質が実質１００％に近い割合でＮ−アセチルグルコサミンから構成されるので、本発明において最も好ましく使用され得る。
【００１７】
本発明で用い得る微生物は、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有し、所望の効果をもたらすものであれば特に限定されない。キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する好ましい微生物としては、パエニバチルス属の微生物が挙げられる。より好ましくは、パエニバチルス・フクイネンシス、最も好ましくは、パエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５が挙げられる。パエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５は、日本国特許第４２４３２６６号公報で開示され、平成１７年８月１７日に独立行政法人産業技術総合研究所に寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６２０で表される微生物である。
【００１８】
「キチン及び／若しくはキトサン分解能」とは、キチン及び／若しくはキトサンを分解し、低分子化する能力を意味する。キチン及び／若しくはキトサンの分解とは、高分子多糖であるキチン質の内部の結合を切断し、単糖〜オリゴ糖程度の大きさに低分子化することをいう。本発明で用いられる、低分子化したキチン質の好適な例として、２糖〜１０糖の糖、４糖〜８糖の糖などが挙げられる。
【００１９】
本発明に用いられる微生物は、モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素を産生可能であることが好ましい。本発明の肥料に還元剤を添加することにより、該還元剤は、キチン質の鎖にニックを入れるモノオキシゲナーゼの酵素活性を高め、結果的にキチン分解酵素によるキチンの分解活性を高め、その結果肥料の効果を高めることができるからである。当該微生物は、上記モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を天然に有している微生物であってもよいし、自体公知の遺伝子導入法によって該モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入された形質転換体であってもよい。好ましくは、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を天然に有している微生物であり、そのような微生物として、例えば、パエニバチルス属の微生物、セラチア属の微生物、エンテロコッカス属の微生物及びストレプトマイセス属の微生物が挙げられる。該微生物の好適な例は、パエニバチルス属の微生物であり、好ましくはパエニバチルス・フクイネンシスであり、最も好ましくはパエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５である。
【００２０】
本発明に用いられる微生物は、当業者に公知である方法により維持・増殖培養できる。本発明の微生物は、当該分野で用いられる栄養培地中で培養でき、このような培地の組成は、例えば、０．５％  トリプトファン、０．１％  肉エキス、０．１％  リン酸水素２ナトリウム、０．１％  硫酸マグネシウムであり得る。その他の培養条件としては、ｐＨ６．５〜８．０（好ましくはｐＨ７．２〜７．５）、好気性条件下、２０〜４５℃での培養条件が挙げられる。
【００２１】
本明細書中、用語「培養物」とは、微生物を培養することにより得られる結果物をいい、微生物、培地、微生物から分泌された成分等が含まれる。本発明に用いられる培養物は、上記方法により培養された微生物のみ、微生物の培養を行った後の培地、又は該微生物及び培地の両方のいずれであっても良い。
【００２２】
いくつかの態様において、本願発明の肥料は還元剤をさらに含む。還元剤が存在することで、キチン質の鎖にニックを入れるモノオキシゲナーゼの酵素活性が高まり、結果としてキチンの分解活性が高まることが本発明者らによって示された。従って、還元剤を肥料に含めることで、肥料中に含まれるキチン質の低分子化が亢進する。上述したように、キチン質の肥料効果は、キチン質が低分子化し可溶性となることで発揮されると考えられている。従って、本発明の肥料に還元剤を添加し、キチン質の低分子化を促進することで、より効果の高い肥料を得ることが可能となる。還元剤を含有する本発明の肥料の具体的な効果の例として、イネの苗の発根を促進する、米の収穫量を増大する、米の食味値及び味度値を高める、並びに植物の結実を促進する等が挙げられる。
本願発明に用いられ得る好ましい還元剤としては、アスコルビン酸等が挙げられる。該還元剤を肥料に混合する方法は、所望の効果が得られるのであれば特に限定されないが、一例として、還元剤を微生物の培養物中に添加する方法が挙げられる。該還元剤は、好ましくは、パエニバチルス属の微生物の培養物中に、より好ましくは、パエニバチルス・フクイネンシスの培養物中に、最も好ましくは、パエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５の培養物中に添加される。例えば、還元剤としてアスコルビン酸を培養物中に添加する場合、好ましい濃度としては、１〜１０ｍＭが挙げられる。その他の還元剤を使用する場合は、適宜濃度を設定することが可能である。
【００２３】
本発明の肥料を供する対象となる植物は、所望の効果が得られるものであれば特に限定されないが、例として、イネ科、ナス科、ウリ科に属する植物が挙げられる。具体的には、イネ、トマト、キュウリ、ナスに供されるのが好ましく、最も好ましいのは、イネである。
【００２４】
本発明の肥料は、キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を有効成分として含有し、さらに、いくつかの態様においては還元剤を有効成分としてさらに含む。該肥料は、これら有効成分の肥料効果を損なわないものであれば、希釈剤、賦形剤、安定化剤、保存剤などの肥料学的に許容される担体を更に含んでいてもよい。
【００２５】
また、本発明の肥料は、それぞれ単独で、又は他の有機肥料、無機肥料、化学肥料、発根促進剤、活力剤、殺菌剤、殺虫剤、除草剤、植物成長調製剤等との任意の組み合わせと共に使用することもできる。さらに、本発明の肥料は、植物の生育を促進する目的で使用されるのみならず、植物の保存中に細菌等から保護する目的にも使用され得る。
【００２６】
本発明の肥料に含まれる構成要素は、使用前に予め混合した状態で提供してもよいし、又は使用直前に混合するためにそれぞれの構成要素を個別に提供してもよい。或いは、これら構成要素をそれぞれ土壌に散布した後、耕起を行うなどして土壌中で混合してもよい。
【００２７】
本明細書中、用語「肥料」とは、植物を構成する成分を含み、その成分が栄養となって植物を成長させるもの、及び植物の持つ生理的機能を高め、それによって植物の生育を促進するものをいう。従って、本明細書中における肥料には、窒素、リン酸、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムといった植物の栄養分を土壌に補給することを目的とした肥料に加え、植物の生理的機能を高め、植物の良好な成長を促す発根促進剤や活力剤等も含まれる。また、本明細書における「肥料」には、より良い味を呈する農作物を産生するための、農作物の品質改善剤も含まれる。本明細書中、「品質改善剤」とは、農作物の品質を高め、味を向上させるために、対象となる植物に対し供される物をいう。向上させる対象となる味の指標としては、例えば、食味値、味度値、糖度、酸味度などが挙げられ、これらは当業者に公知である測定機器を使用して決定することができる。好ましくは、本発明の肥料は、発根促進剤、品質改善剤、又は活力剤であり、最も好ましくは発根促進剤又は品質改善剤である。
【００２８】
例えば、本発明の発根促進剤をイネの苗に対して使用した場合、その発根が促進され、根張りの良いイネを生育させることが可能である。イネの根張りを良くすることで、土壌中の栄養分の吸収を亢進しイネの生育を良好にすることができ、また、倒伏などのイネの収穫量を減ずる原因となる現象を防ぐことができる。
また、本発明の品質改善剤を、例えばイネに使用した場合、米の味を向上させることができる。米のおいしさを評価する方法の一例として、食味官能試験が挙げられる。本明細書中において、「食味官能試験」とは、米を食べたときの好ましさ（おいしさ）を比較評価しランク付けする方法、並びに外観、香り、味、口当り、粘り、及び柔らかさ等の各検査項目について評点を付けて評価する方法などを含む。さらに、米のおいしさを評価する方法として、理学的検査を行うことも可能である。理学的検査によれば、米に含まれる好ましい成分及び好ましくない成分の量を測定し、評価することができる。米のおいしさに関する理学的検査方法として、食味値及び味度値を測定する方法が挙げられる。
【００２９】
一態様において、本発明は、本発明の肥料で植物を処理することを含む植物の栽培方法を提供する。該植物としては、上記で挙げられた好ましい植物が例示される。植物の処理方法は、処理対象となる植物ごとに適宜設定することが可能であるが、例として、土壌散布や葉面散布が挙げられる。適切な処理の時期は対象となる植物の種類や状態によって決定することができ、例えば、植物を植える前の土壌に散布する、植物を植えた後に散布する、又は土壌に撒く前の種子に対し散布することができる。これらの処理方法及び時期はそれぞれ単独で、又は２以上の組み合わせで行うことができる。処理回数に関しても、植物の生育状況に応じて適宜決定することができる。
【００３０】
本発明の他の態様では、本発明の肥料でイネを処理することを含む、米の食味値及び味度値を高める方法を提供する。食味値とは、近赤外線による分析を行う食味計を使用して、米に含まれるアミロース、タンパク質、水分、脂肪酸化度の各成分を測定し、米のおいしさを総合的に評価した数値であり、通常、食味値を１００点満点で表示し、標準値を６０〜６５点に設定するという方法を採用する。食味計としては、例えば市販の食味分析計ＴＭ−３５００Ｐ（静岡製機株式会社）などが挙げられ、当業者に容易に入手可能である。
一方、味度値とは、米の表面を覆う保水膜の量を分析機器で測定し、数値化したものである。味度値は、トーヨー味度メーター（東洋ライス株式会社）等の市販の分析機器を使用し、当該分析機器の使用方法に従って測定することができる。
本発明の肥料でイネを処理することで、米の食味値及び味度値を高めることができる。本発明の肥料で処理することで得られる米の食味値としては、好ましくは７０以上であり、より好ましくは８０以上、最も好ましくは８５以上である。また、本発明の肥料で処理することで得られる米の好ましい味度値としては、例えば、７０以上、より好ましくは８０以上が挙げられる。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明は、キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、並びにキチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物を混合する工程を含む肥料の製造方法を提供する。該製造方法で用いられる物の定義は上述の通りである。
【００３２】
本発明の製造方法で用いられるキチン質中の、好ましいＮ−アセチルグルコサミン及びグルコサミンの比率、キチン質以外の成分やキチン質含有材料に関する好ましい態様に関しても上記に準じる。また、キチン質分解能を有する微生物についても上述の通りである。
【００３３】
当該製造方法における混合は植物や土壌に散布する前に行われてもよいし、又は本発明の肥料の各構成成分を、植物を植える前の土壌に対し個別に散布した後、耕起を行うなどして土壌中で混合してもよい。
【００３４】
本発明の肥料の製造方法で使用されるキチン質と微生物の培養物の量比は、キチン質として使用する材料、使用する微生物の種類、対象となる植物等に依存して適宜定めることができる。例えば、キチン質としてカニ殻を使用し、微生物の培養物としてパエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５の培養物（例えば、分光光度計による波長６００ｎｍでのＯＤ値が１．０〜１．５である培養液、又はその培養上清）を使用する場合、カニ殻と該微生物の培養物の好適な重量比として、１：０．５〜１：１が挙げられる。
【００３５】
本発明の製造方法では、還元剤を混合する工程をさらに含み得る。好ましい還元剤は上記の通りである。該還元剤を混合する方法は、所望の効果が得られるのであれば特に限定されないが、一例として、還元剤を微生物の培養物中に添加する方法が挙げられる。好ましい一態様において、該還元剤は、パエニバチルス属の微生物の培養物中に添加され、より好ましくは、パエニバチルス・フクイネンシスの培養物中に、最も好ましくは、パエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５の培養物中に添加される。例えば、還元剤としてアスコルビン酸を培養物中に添加する場合、好ましい濃度としては、１〜１０ｍＭが挙げられる。その他の還元剤を使用する場合は、適宜濃度を設定することが可能である。
【００３６】
他の態様において、本発明は、キチン及び／若しくはキトサン又はキチン及び／若しくはキトサン含有物、キチン及び／若しくはキトサン分解能を有する微生物の培養物、並びに還元剤を混合する工程を含む、低分子化キチン及び／又はキトサンの製造方法を提供する。該製造方法で用いられる物の定義は上述の通りであり、好ましい態様に関しても上記に例示される。
【００３７】
本発明者らは、還元剤が、モノオキシゲナーゼの活性化を通じてキチンの分解活性を高めることを見出した。当該知見に基づいた本発明によれば、農業資材として非常に有用である低分子化したキチン質を、酸やアルカリなどの環境負荷の高い物質を使用することなく、短時間で効率的に生産することが可能である。
【００３８】
本発明の製造方法におけるキチン質の低分子化反応は、所望の効果を得られるのであればいかなる反応条件下でも行いうるが、好ましくは、３０〜４０℃で、より好ましくは、３７℃で行われる。最適な反応時間は、キチン質の種類及び量、微生物の種類、微生物の培養物の量、並びに還元剤の種類及び量などに依存して適宜設定することができる。
【００３９】
本発明の製造方法により得られる好ましい低分子化キチン質としては、２糖〜１０糖のオリゴ糖、４糖〜８糖のオリゴ糖が挙げられる。当該製造方法により製造される低分子化キチン質は、活性炭−セライトカラムを用いたクロマトグラフィー法、ＨＰＬＣによる分取クロマトグラフィー法、擬似クロマト移動層などの当業者に公知の方法によって、低分子化反応を行った溶液中から精製することができる。
【００４０】
低分子化キチン質は農業資材としての有用性のみならず、動物の免疫力を高める、血圧を下げる、腸管におけるコレステロールの吸収を抑える、創傷治癒の促進など様々な生理活性を有していることが知られているので、本発明の方法により製造された低分子化キチン質は、農業利用以外の用途についても好適に使用され得る。
【００４１】
以下の実施例は、単に本発明をより具体的に例示するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１：キチン分解活性に及ぼす還元剤の影響
パエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５を０．５％  コロイダルキチン、０．５％  トリプトファン、０．１％  肉エキス、０．１％  リン酸水素２ナトリウム、０．１％  硫酸マグネシウムの培地中、３７℃で培養した後、培養液を８，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し菌体を沈め、培養上清を回収した。該培養上清に、最終濃度１％となるようにコロイド性キチン（和光純薬から購入したキチンをコロイド状に調製）を添加し、還元剤としてアスコルビン酸（最終濃度５ｍＭ）を添加するか、又は添加しないで、３７℃で２時間反応させた（図１）。反応後、反応液の濁度を目視で確認した。アスコルビン酸無添加（−）の反応液では、多くのコロイド性キチンが分解されず残存していたため、反応液が濁っていたのに対し、アスコルビン酸を添加した反応液では、コロイド性キチンがほぼ分解され液の透明度が高かった。
【００４３】
実施例２：稲田へのカニ殻及び微生物の散布方法と稲穂の成長試験
図２に示すように、イネの栽培用に３つの区画を用意し、１区画は粉末状にしたカニ殻（１ｋｇ）及びパエニバチルス・フクイネンシス  ＩＫ−５（本実施例において、単に「ＩＫ−５」と記載する場合がある）の培養液（１Ｌ）（本実施例において、ＩＫ−５の培養液は培地及びＩＫ−５の両者を含む）の混合物を散布、１区画はカニ殻粉末のみ（１ｋｇ）を散布、１区画はこれらを散布しないコントロールとした。
上記のように処理し、無化学肥料・無農薬で栽培したイネの稲穂を収穫し、イネの全長（７株の平均値）、１株当たりのイネの本数（６０株の平均値）、イネ１本当たりの稲穂数（イネ５０本の平均値）、イネ５０本当たりの稲穂重量、米１０００粒の重量を測定した結果を表１に示す。表１中のかっこ内の数字は、コントロールを１００とした相対値を示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
カニ殻及びＩＫ−５を散布した区画より得られたイネでは、イネの全長、１株当たりのイネの本数、及びイネ１本当たりの稲穂数で他の２区画のものよりも高い値を示し、イネ５０本当たりの稲穂重量及び米１０００粒の重量ではコントロールよりも高い値を示した。
【００４６】
実施例３：キュウリ及びトマトの成長試験
図３及び図４は、（１）コントロール（カニ殻及びＩＫ−５培養液散布無し）、（２）カニ殻のみ散布、又は（３）カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布、において３０日間栽培したキュウリ（図３）及びトマト（図４）の成長の度合いを示す。カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布したもので、キュウリ及びトマトの両方で最も早く果実の形成が確認された。
【００４７】
実施例４：イネの発根試験
２０ｃｍ×５０ｃｍを１区画とする区画内でイネの苗を栽培した。１区画はカニ殻（２０ｇ）及びＩＫ−５の培養液（２０ｍＬ）の混合物を散布、１区画はカニ殻（２０ｇ）を散布、１区画はこれらを散布しないコントロールとした。散布から２週間後、それぞれの区画の苗の発根した根２０本の乾燥重量を測定した結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布した苗では、他の２区画のものと比較して、発根が顕著に促進された。
【００５０】
実施例５：食味値及び味度値試験
上記表１で得られた米について、食味分析計ＴＭ−３５００Ｐ（静岡製機株式会社）を使用して食味値を、トーヨー味度メーター（東洋ライス株式会社）を使用して味度値を測定した。測定方法はそれぞれの機器のマニュアルに従って行った。測定の結果は表３に示す。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
食味値は、カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布したもの、並びにカニ殻のみ散布のものが同一の値で最も高かった。味度値については、カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布したものが、カニ殻のみ散布のものよりも高い値を示した。
【００５３】
参考例１：食味官能試験
同一の条件で炊飯した、（Ａ）コントロール（カニ殻及びＩＫ−５培養液散布無し）、（Ｂ）カニ殻のみ散布、又は（Ｃ）カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布して栽培したイネから得られた米を、１６名の試験員が試食をし、「一番おいしい」、「２番目においしい」、又は「一番おいしくない」の３つに順位付けを行った（表４）。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
カニ殻及びＩＫ−５培養液を散布のものが一番おいしいと回答した試験員が最も多いという結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、キチン質の肥料としての有用性を高めることが可能である。該肥料を用いることで、植物の成長を促進し、農作物の収穫量を増やし、さらに、高い品質の農作物を得ることも可能である。また、本発明の方法によって、肥料として有用な、低分子化したキチン及び／又はキトサンを効率的に得ることができる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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