(57)【要約】【課題】チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法の提供。【解決手段】共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ１タンパク質、共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ２タンパク質、共通ＣＨＩＫＶ−カプシドタンパク質、およびそれらのフラグメントと、これらをコードする核酸分子を開示する。ＣＨＩＫＶ−Ｅ１共通タンパク質、ＣＨＩＫＶ−Ｅ２共通タンパク質、ＣＨＩＫＶＥ３共通タンパク質、およびそれらのフラグメントを含む共通ＣＨＩＫＶのＥｎｖタンパク質と、これらをコードする核酸分子も同様に開示する。ＣＨＩＫＶ共通タンパク質を含む組成物および組み換えワクチンと、それらを使用する方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チクングニヤウィルスに対して、個体を予防的および／または治療的に免疫化するためのワクチンおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、米国仮出願第６１／０４２，６６１号の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
免疫療法とは、望ましい治療効果を与えるために、ヒトの免疫反応を調節することを言う。免疫治療薬とは、個体に投与された場合、望ましい免疫反応を高めることにより、望ましくない免疫反応に伴う症状を最終的に軽減させるまたは最終的に症状を緩和させるのに十分な、個体の免疫システムを調節する組成物のことを言う。いくつかの例では、免疫療法とは、個体が個体を免疫原に暴露するためのワクチンを投与された場合、個体が当該免疫原に対して免疫反応を生じさせるというワクチンプロトコルの一部であり、免疫治療薬とは、免疫反応を高める、および／または、特定の病気、感染症、もしくは疾患を治療もしくは予防するための望ましい免疫反応（細胞アームまたは体液アームなど）の一部を選択的に強化する、ものである。
【０００４】
ワクチンプロトコルは、増強した免疫反応を誘導するようにヒトの免疫反応を調節する薬剤の送達により改善され得る。個体が個体を免疫原に暴露するためのワクチンを投与された場合、個体が当該免疫原に対して免疫反応を生じさせる、といういくつかのワクチンプロトコルにおいては、免疫反応を高める、および／または、特定の病気、感染症または疾患を治療または予防するための望ましい免疫反応（細胞アームまたは体液アームなど）の一部を選択的に強化する薬剤が提供される。
【０００５】
ワクチンは、アレルゲン、病原体の抗原、またはヒトの疾患に関わる細胞に関連する抗原のような標的抗原に対して、個体を免疫化することに役立つ。ヒトの疾患に関わる細胞に関連する抗原は、ガン関連腫瘍の抗原および自己免疫疾患に関わる細胞に関連する抗原を含む。
【０００６】
そのようなワクチン設計において、ワクチン接種された個体の細胞に標的抗原を産生させるワクチンは、免疫システムの細胞アームを誘導するのに効果的であると認識されている。具体的には、弱毒生ワクチン、非病原性ベクターを使用する組み換えワクチン、およびＤＮＡワクチンは、それぞれがワクチン接種された個体の細胞に抗原を産生させ、結果として免疫システムの細胞アームを誘導する。一方、死ワクチンまたは不活化ワクチン、およびタンパク質のみを含むサブユニットワクチンは、効果的な体液性の反応を誘導するが、優れた細胞性の免疫反応は誘導しない。
【０００７】
細胞性の免疫反応は、病原体感染、ガンまたは自己免疫疾患の治療のために、病原体感染に対する防御を提供するため、および、効果的な免疫介在性治療を提供するためにしばしば必要とされる。従って、弱毒生ワクチン、非病原性ベクターを使用する組み換えワクチン、およびＤＮＡワクチンのように、ワクチン接種された個体の細胞に標的抗原を産生させるワクチンがしばしば好まれる。
【０００８】
チクングニヤウィルス（ＣＨＩＫＶ）は、熱帯のアフリカおよびアジアに常在するアルファウィルスであり、当該ウィルスは、通常はヤブカ属の感染した蚊が咬傷することによりヒトに感染する［１（非特許文献１）］。ＣＨＩＫＶにより引き起こされる疾患であるチクングニヤ熱は、１９５２〜１９５３年の間に、東アフリカにおいて、伝染病の形で最初に認められた［２（非特許文献２）］。ＣＨＩＫＶによるヒトの感染では、発熱、頭痛、発疹、倦怠感、吐き気、嘔吐、筋肉痛、重度の関節痛、そして時には急性の四肢の衰弱のような神経学的兆候、という特徴を持つシンドロームが引き起こされ得る。致命的な出血状態が伴うこともある。他の症状は、筋肉痛および後眼窩痛を含む。チクングニヤ疾患は、死に至ることは滅多にないが、かなりの羅患率を伴う。チクングニヤ病は、およそ１〜２週間の潜伏期間を有する。「チクングニヤ」という言葉は、この疾患に伴う重度の関節痛を患った患者の、身をよじった姿勢、という地域方言の表現に由来するものと考えられている［１〜３（非特許文献１〜３）］。
【０００９】
チクングニヤには、急激に衰弱させるような疾患をもたらし得るという伝染性の可能性があるため、その継続的な蔓延に基づき、発展途上国、先進国にとっての潜在的な脅威となっており、また新しく出現した流行地域の紛争地帯に兵士が配置されることによる軍事的な脅威を考慮すべきである。ＣＨＩＫＶの感染は、従業員におけるこの感染症の身体機能を奪うような症状が原因で、流行地域において常習的欠勤が起こり地元企業が影響を受ける、というように、経済的に著しい影響を与える。この経済的影響は、何週間または何ヶ月間も働くことができない個々の家族構成員において最も高い。衰弱させるような感染の後遺症という要因を背景にして、疾患を予防するための特効性の抗ウィルス治療薬、および現在入手可能などんなワクチンもないということは、新しいＣＨＩＫＶの発生を扱う、または制御するのに深刻な障害となっている。
【００１０】
ＣＨＩＫＶは、感染した蚊の咬傷により蔓延する。蚊は、ＣＨＩＫＶに感染した個体を食したときに感染するようになる。サル、および場合によっては他の野生動物も感染し得るが、それらのＣＨＩＫＶの保有宿主としての役割はまだ実証されていない。感染した蚊は、次に、咬傷するときに他のヒトにウィルスを撒き散らし得る。家庭用容器で繁殖し、ヒトに誘引される、攻撃的な日中性の噛み付き屋であるネッタイシマカ（黄熱蚊）は、ヒトに対するＣＨＩＫＶの最初のベクターである。ヒトスジシマカ（ヤブカ）もまた、アジアにおいてヒトに感染させる役割を果たし得るし、アフリカにおいては森林を住処とするさまざまな蚊の種類がウィルスに感染していることが確認されている［１１〜１７］。ＣＨＩＫ熱の流行は、ヒト―蚊―ヒトという伝染によって持続し、流行のサイクルは、デング熱および都市黄熱のサイクルと類似する。ＣＨＩＫ熱の大規模な発生が、インド洋のいくつかの島々およびインドにおいて最近報告されている［４〜７］。
【００１１】
２００４年の終わりから、チクングニヤウィルスは世界のさまざまな地域、大部分はインド洋の島々において、大規模な発生とともに再び姿を現し始めた。２００６年の初めに、冬期の低感染率の期間が過ぎて南半球の夏が到来すると、レユニオン島は爆発的な発生を被った。推定２６６,０００人の居住者（人口７７０,０００人）がＣＨＩＫＶに感染したことが報告され、２４８の死亡証明書は、ＣＨＩＫＶが死因となり得ることを示した［１０、１２］。妊娠中の女性における子宮内感染および垂直感染のエビデンスが報告されている［１２、１３、１７］。配列分析では、ウィルスの地理的にクラスター化された系統の存在が明らかになっている。部分的Ｅ１配列に基づいた系統発生分析では、ＣＨＩＫＶの３つの異なる系統群の存在が明らかとなった。１つは西アフリカの分離株、１つはアジアの分離株を含む別の分離株、そしてもう１つは東、中央、南アフリカの分離株のグループである［１５、１７］。
【００１２】
２００６年には、発生したと分かっている地域からヨーロッパ、カナダ、カリブ諸島（マルティニーク）、および南アメリカ（フランス領ギアナ）へ帰国する旅行者についても、ＣＨＩＫ熱の症例が報告されている［５〜９］。２００５年〜２００６年の間に、ＣＨＩＫ熱が流行しているまたは風土病であると分かっている地域からアメリカに到着した旅行者について、ＣＨＩＫ熱の１２の症例が、ＣＤＣ（疾病対策センター（米国））において、血清学的およびウィルス学的に診断された［１０］。
【００１３】
こうした感染は、公衆衛生に危機を招き、世界中の研究者達の注目を集めた。重要なことに、ほとんどのチクングニヤウィルス感染は、数週間または数ヶ月内に完全に解消される。しかし、ＣＨＩＫＶで誘導された関節痛が、慢性的な関節の疾患を発症させながら数年間続くという、実証された症例もある。長期間の後に感染が解消するという事実は、免疫システムが、最終的にこの感染を制御するために回復し得ることを裏付けている。さらに、このようなクリアランス表現型は、Ｔ細胞反応のクリアランスにおける役割を裏付ける。ホルマリン処理死ワクチン、Ｔｗｅｅｎ  ｅｔｈｅｒ不活化ウィルスワクチンおよび弱毒生ワクチンのようなチクングニヤに対するワクチンを開発する初期の試みはある程度成功したが、種々の理由で中止された［３（非特許文献３）］。加えて、これら全てのワクチンは、有益な細胞免疫を誘導せず、血清学的反応しか起こさないことが報告された。
【００１４】
インド洋およびレユニオン島における最近の流行の頻度は、そこでネッタイシマカが確認されていないため、恐らく新しいベクターがウィルスを運んでいることを示唆している。事実、近い種であるヤブカ、ヒトスジシマカがその犯人かもしれず、ＣＨＩＫウィルスの大流行の可能性について、世界の衛生コミュニティにおいて関心が高まっている。
【００１５】
従って、ＣＨＩＫＶを抑制する方法を開発するための手段が取られるべきである。残念ながら、これまでのところ、チクングニヤウィルスに対する特効性の治療法はなく、現在入手できるワクチンもない。最近の研究では、エンベロープＥ１−Ａ２２６の突然変異が、ヒトスジシマカのＣＨＩＫＶの感染率の著しい増加に直接関与していることが証明され、さらに１アミノ酸置換がベクターの特異性に影響し得ることが確認されている。この研究結果は、いかにしてこの突然変異ウィルスが、一般的な昆虫ベクターのいない地域での流行を引き起こしているかについて、もっともらしい説明をしている［１８］。チクングニヤに対する特効性のワクチンまたは特効性の抗ウィルス治療法はない。弱毒生ワクチンの試験が２０００年に実行されたが、プロジェクトに対する財政的支援が中止され、現在入手できるワクチンはない。しかし、この先行のワクチンに伴ういくつかの有害事象は十分に実証されており、従って、新しいワクチン戦略が開発されなければならない［３（非特許文献３）、５］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｈ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．Ｇ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９４年）第５８版、４９１〜５６２頁
【非特許文献２】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．、Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ（１９５５年）４９、２８〜３２頁
【非特許文献３】Ｐｏｗｅｒｓ，Ａ．Ｍ．およびＬｏｇｕｅ，Ｃ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００７年）第８８巻、９部、２３６３〜２３７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
２００５年〜２００７年の圧倒的な規模によると、チクングニヤの発生は、ＣＨＩＫＶに対する、安全で効果的なワクチンの必要性を浮き彫りにしている［６］。依然として、個体がＣＨＩＫＶ感染により感染することを防ぎ得るワクチンが必要である。依然として、ＣＨＩＫＶに感染した個体を治療するための効果的な治療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物に関する。
【００１９】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、またはその免疫原性フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物に関する。
【００２０】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質カプシド、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物に関する。
【００２１】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の共通配列、もしくはその相同配列、又はＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の各々に対して免疫反応を誘導する免疫原性アミノ酸配列をコードする、免疫原性共通フラグメントもしくはその相同配列、を含むキメラ遺伝子をコードする、単離された核酸分子を含む組成物に関する。
【００２２】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む、注射可能な医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む、注射可能な医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質カプシド、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む、注射可能な医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の共通配列、もしくはその相同配列、又はＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の各々に対して、免疫反応を誘導する免疫原性アミノ酸配列をコードする、免疫原性共通フラグメント、もしくはその相同配列、を含むキメラ遺伝子をコードする、単離された核酸分子を含む、注射可能な医薬組成物に関する。
【００２６】
本発明はさらに、ＣＨＩＫＶに対して個体に免疫反応を誘導する方法に関連し、当該方法は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００２７】
本発明はさらに、ＣＨＩＫＶに対して個体に免疫反応を誘導する方法に関連し、当該方法は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００２８】
本発明はさらに、ＣＨＩＫＶに対して個体に免疫反応を誘導する方法に関連し、当該方法は、ＣＨＩＫＶタンパク質カプシド、またはその免疫原性共通フラグメントの共通配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００２９】
本発明はさらに、ＣＨＩＫＶに対して個体に免疫反応を誘導する方法に関連し、当該方法は、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の共通配列、もしくはその相同配列、又はＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の各々に対して、免疫反応を誘導する免疫原性アミノ酸配列をコードする、免疫原性共通フラグメント、もしくはその相同配列をコードする、単離された核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００３０】
本発明はさらに、ＣＨＩＫＶタンパク質カプシド、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２の共通配列、もしくはその免疫原性共通フラグメントをコードするヌクレオチド配列、又はＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の共通配列、もしくはその相同配列、あるいはＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ１、ＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ２、およびＣＨＩＫＶタンパク質Ｅ３の各々に対して、免疫反応を誘導する免疫原性アミノ酸配列をコードする、免疫原性共通フラグメント、もしくはその相同配列をコードする、単離された核酸分子を含む組み換えワクチンに関連し、またＣＨＩＫＶに対して個体に免疫反応を誘導する方法に関連し、当該方法は、そのような組み換えワクチンを個体に投与することを含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される；
（項目１）
Ｅ１共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、およびＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントを含む共通ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖと、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質と、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質と、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
共通ＣＨＩＫＶカプシドタンパク質と、
共通ＣＨＩＫＶカプシドタンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
それらの相同物と、からなる群から選択される、１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子。
（項目２）
項目１に記載の核酸分子を含む組成物。
（項目３）
項目１に記載の２つの以上の核酸分子であって、前記組成物が２つ以上の異なる核酸分子を含む組成物。
（項目４）
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質、または共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質の免疫原性共通フラグメント、および共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質、または共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質免疫原性共通フラグメントと、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質、または共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質の免疫原性共通フラグメント、および共通ＣＨＩＫＶカプシドタンパク質、または共通ＣＨＩＫＶカプシドタンパク免疫原性共通フラグメントと、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質、または共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質免疫原性共通フラグメント、およびＣＨＩＫＶＥカプシドタンパク質、またはＣＨＩＫＶカプシドタンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質、または共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ１タンパク質の免疫原性共通フラグメント、共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質、または共通ＣＨＩＫＶ  Ｅ２タンパク質免疫原性共通フラグメント、およびＣＨＩＫＶカプシドタンパク質、またはＣＨＩＫＶカプシドタンパク質の免疫原性共通フラグメントと、をコードする核酸分子を含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
単離された核酸分子が、ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質をコードする、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記単離された核酸分子が、配列番号１または配列番号３を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記単離された核酸分子が、配列番号７もしくはその相同するタンパク質、または配列番号１０もしくはその相同するタンパク質をコードする、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
単離された核酸分子が、ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質をコードする項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記単離された核酸分子が、配列番号２または配列番号５を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記単離された核酸分子が、配列番号８もしくはその相同するタンパク質、または配列番号１１もしくはその相同するタンパク質をコードする、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記単離された核酸分子が、ＣＨＩＫＶカプシド共通タンパク質をコードする項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記単離された核酸分子が、配列番号３または配列番号６を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記単離された核酸分子が、配列番号９もしくはその相同するタンパク質、または配列番号１２もしくはその相同するタンパク質をコードする、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
単離された核酸分子が、共通ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖタンパク質をコードする、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記単離された核酸分子が、配列番号１４または配列番号１６をコードする、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
単離された核酸分子が、配列番号１３または配列番号１５を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記単離された核酸分子が、ＩｇＥリーダー配列をコードする、項目１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記核酸分子がプラスミドである、項目１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を含む、注射可能な医薬組成物。
（項目２０）
項目１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を、個体に投与することを含む、ＣＨＩＫＶに対して前記個体に免疫反応を誘導する方法。
（項目２１）
前記組成物が電気穿孔を使用して投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、およびＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントを含む共通ＣＨＩＫＶのＥｎｖタンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
ＣＨＩＫＶカプシド共通タンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
それらの相同物と、からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えワクチン。
（項目２３）
前記組み換えワクチンが、組み換えワクチンである、項目２４に記載の組み換えワクチン。
（項目２４）
項目２２に記載の組み換えワクチを個体に投与すること含む、ＣＨＩＫＶに対して前記個体に免疫反応を誘導する方法。
（項目２４）
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質免疫原性共通フラグメント、およびＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、を含む共通ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖタンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質免疫原性共通フラグメント、およびＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質、またはＣＨＩＫＶ  Ｅ３共通タンパク質の免疫原性共通フラグメント、を含む共通ＣＨＩＫＶのＥｎｖタンパク質に相同するタンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ１共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質と、
ＣＨＩＫＶ  Ｅ２共通タンパク質免疫原性共通フラグメントと、
ＣＨＩＫＶカプシド共通タンパク質と、
ＣＨＩＫＶカプシド共通タンパク質の免疫原性共通フラグメントと、
それらの相同物と、からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む組成物。
（項目２５）
項目２４に記載の組成物を含む、注射可能な医薬組成物。
（項目２６）
項目２４または項目２５に記載の組成物を個体に投与することを含む、ＣＨＩＫＶに対して個体に免疫反応を誘導する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】（Ａ）ＩｇＥ−リーダーＣＨＩＫＶ融合遺伝子を、ｐＶａｘ１ベクターにクローニングするストラテジーの概略図である。（Ｂ）Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１の二重消化を行い、それぞれ１４０３ｂｐ、１３５５ｂｐ、および８６９ｂｐサイズの大きさを生じたことが示される、ＣＨＩＫＶプラスミド（エンベロープＥ１、Ｅ２、およびカプシド）のリニアで特異的なバンドを示すアガロースゲルの写真である。
【図２】ＣＨＩＫＶ構築物の特徴の図である。（Ａ）合成された構築物の、Ｓ３５標識されたインビトロ翻訳を示す。抗原ＣＨＩＫＶ−Ｅ１、ＣＨＩＫＶ−Ｅ２、およびＣＨＩＫＶ−カプシドは、翻訳し、特異的なＥ１、Ｅ２、およびカプシドの抗体を使用してそれぞれ免疫沈降し、１２％ＳＤＳゲルに流し、そしてＸ線撮影に供した。抗原は、発現を裏付けながら予測された分子量で流れている。（Ｂ）ＢＨＫ−２１細胞におけるＣＨＩＫＶ−Ｅ１およびＣＨＩＫＶ−カプシドの構築物のウェスタンブロット分析の図である。トランスフェクション２日後、トランスフェクトされた細胞の溶解物を調製し、多クローン性ＣＨＩＫＶ−Ｅ１抗血清を用いて免疫ブロットを行った。これはマウスでの産生において、５２ｋＤａのＥ１タンパク質および３６ｋＤａのカプシドタンパク質の発現を示している。
【図３】抗体ＥＬＩＳＡを用いた図である。（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、示されるように２５μｇのｐＶａｘ１ベクターまたはＣＨＩＫＶプラスミドを用いて、２週間あけて２回免疫し、一週間後に屠殺した。血清を集め、ＣＨＩＫＶ−Ｅ１、ＣＨＩＫＶ−Ｅ２、またはＣＨＩＫＶ−カプシドに対するＩｇＧの総産生量の分析に供した。血清は、それぞれのＣＨＩＫＶペプチドを２μｇ／ｍｌでコーティングした９６ウェルプレートで３７℃で１時間インキュベートし、抗体は、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを使用して検出した。値は二組のウェルの平均値（±標準偏差）を示す。
【図４】エリスポットで測定されたインターフェロンγのエンベロープＥ１に対する反応の図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、２５μｇのｐＶａｘ１ベクターまたはｐＣＨＩＫＶ−Ｅ１を用いて、２週間あけて２回免疫し、一週間後に屠殺した。（Ａ）脾細胞を採取し、Ｒ１０（ネガティブコントロール）の存在下、または、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドであって、Ｅ１タンパク質の長さにわたる、４つのペプチドプールのうちの１つの１０μｇ／ｍｌの存在下で一晩培養した。ＣＨＩＫＶ−Ｅ１に対する反応は、積み重ねたグループの平均反応として示される。（Ｂ）脾細胞を採取し、Ｒ１０（ネガティブコントロール）の存在下、または、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドであって、Ｅ１タンパク質の長さにわたる、１８個のペプチドプールのうちの１つの１０μｇ／ｍｌの存在下で一晩培養した。スポット形成単位（ＳＦＵ）は、自動エリスポットリーダーにより計測され、生データは、百万個の脾細胞ごとのＳＦＵに標準化した。値は、３組のウェルの平均値を示す。
【図５】エリスポットにより測定されたインターフェロンγのＣＨＩＫＶエンベロープＥ２に対する反応の図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、２５μｇのｐＶａｘ１ベクターまたはｐＣＨＩＫＶ−Ｅ２を用いて、２週間あけて２回免疫され、一週間後に屠殺した。（Ａ）脾細胞を採取し、Ｒ１０（ネガティブコントロール）の存在下、または、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドであって、Ｅ２タンパク質の長さにわたる、４つのペプチドプールのうちの１つの１０μｇ／ｍｌの存在下で一晩培養した。ＣＨＩＫＶ−Ｅ２に対する反応は、積み重ねたグループの平均反応として示される。（Ｂ）脾細胞を採取し、Ｒ１０（ネガティブコントロール）の存在下、または、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドであって、Ｅ２タンパク質の長さにわたる、１８個のペプチドプールのうちの１つの１０μｇ／ｍｌの存在下で一晩培養した。スポット形成単位（ＳＦＵ）は、自動エリスポットリーダーにより計測し、生データは百万個の脾細胞ごとのＳＦＵに標準化した。値は、３組のウェルの平均値を示す。
【図６】エリスポットにより測定されたインターフェロンγのＣＨＩＫＶ−カプシドに対する反応の図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、２５μｇのｐＶａｘ１ベクターまたはｐＣＨＩＫＶ−カプシドを用いて、２週間あけて２回免疫し、一週間後に屠殺した。（Ａ）脾細胞を採取し、Ｒ１０（ネガティブコントロール）の存在下、または、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドであって、カプシドタンパク質の長さにわたる、４つのペプチドプールのうちの１つの１０μｇ／ｍｌの存在下で一晩培養した。ＣＨＩＫＶ−カプシドに対する反応を、積み重ねたグループの平均反応として示す。（Ｂ）脾細胞を採取し、Ｒ１０（ネガティブコントロール）の存在下、または、９アミノ酸が重複する１５ｍｅｒのペプチドであって、マトリックスカプシドタンパク質の長さにわたる、１８個のペプチドプールのうちの１つの１０μｇ／ｍｌの存在下で一晩培養した。スポット形成単位（ＳＦＵ）は、自動エリスポットリーダーにより計測し、生データは百万個の脾細胞ごとのＳＦＵに標準化した。値は、３組のウェルの平均値を示す。
【図７】実施例２で説明される評価法を使用して測定された、チクングニヤウィルスに対する患者および健常な個体の（ナイーブ）血清の中和抗体価を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「免疫原性共通フラグメント」は、２つ以上のＣＨＩＫＶ株に対して、交差防御を与えるのに十分な共通配列を含む、共通のＣＨＩＫＶタンパク質のフラグメントを意味し、当該交差防御は、対応する天然型の配列を使用しても起こらない。フラグメントは、一般的に１０以上のアミノ酸長である。ＣＨＩＫＶ−Ｅ１のいくつかの好ましい長さは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２５５、少なくとも２６０、少なくとも２６５、少なくとも２７０、少なくとも２７５、少なくとも２８０、少なくとも２８５、少なくとも２９０、少なくとも２９５、少なくとも３００、少なくとも３０５、少なくとも３１０、少なくとも３１５、少なくとも３２０、少なくとも３２５、少なくとも３３０、少なくとも３３５、少なくとも３４０、少なくとも３４５、少なくとも３５０、少なくとも３５５、少なくとも３６０、少なくとも３６５、少なくとも３７０、少なくとも３７５、少なくとも３８０、少なくとも３８５、少なくとも３９０、少なくとも３９５、少なくとも４００、少なくとも４０５、少なくとも４１０、少なくとも４１５、少なくとも４２０、少なくとも４２５、または少なくとも４３０である。ＣＨＩＫＶ−Ｅ１のいくつかの好ましい長さは、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、１００以下、１０５以下、１１０以下、１１５以下、１２０以下、１２５以下、１３０以下、１３５以下、１４０以下、１４５以下、１５０以下、１５５以下、１６０以下、１６５以下、１７０以下、１７５以下、１８０以下、１８５以下、１９０以下、１９５以下、２００以下、２０５以下、２１０以下、２１５以下、２２０以下、２２５以下、２３０以下、２３５以下、２４０以下、２４５以下、２５０以下、２５５以下、２６０以下、２６５以下、２７０以下、２７５以下、２８０以下、２８５以下、２９０以下、２９５以下、３００以下、３０５以下、３１０以下、３１５以下、３２０以下、３２５以下、３３０以下、３３５以下、３４０以下、３４５以下、３５０以下、３５５以下、３６０以下、３６５以下、３７０以下、３７５以下、３８０以下、３８５以下、３９０以下、３９５以下、４００以下、４１５以下、４２０以下、４２５以下、４３０以下、または４３５以下である。ＣＨＩＫＶ−Ｅ２のいくつかの好ましい長さは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２５５、少なくとも２６０、少なくとも２６５、少なくとも２７０、少なくとも２７５、少なくとも２８０、少なくとも２８５、少なくとも２９０、少なくとも２９５、少なくとも３００、少なくとも３０５、少なくとも３１０、少なくとも３１５、少なくとも３２０、少なくとも３２５、少なくとも３３０、少なくとも３３５、少なくとも３４０、少なくとも３４５、少なくとも３５０、少なくとも３５５、少なくとも３６０、少なくとも３６５、少なくとも３７０、少なくとも３７５、少なくとも３８０、少なくとも３８５、少なくとも３９０、少なくとも３９５、少なくとも４００、少なくとも４０５、少なくとも４１０、少なくとも４１５、または少なくとも４２０である。ＣＨＩＫＶ−Ｅ２のいくつかの好ましい長さは、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、１００以下、１０５以下、１１０以下、１１５以下、１２０以下、１２５以下、１３０以下、１３５以下、１４０以下、１４５以下、１５０以下、１５５以下、１６０以下、１６５以下、１７０以下、１７５以下、１８０以下、１８５以下、１９０以下、１９５以下、２００以下、２０５以下、２１０以下、２１５以下、２２０以下、２２５以下、２３０以下、２３５以下、２４０以下、２４５以下、２５０以下、２５５以下、２６０以下、２６５以下、２７０以下、２７５以下、２８０以下、２８５以下、２９０以下、２９５以下、３００以下、３０５以下、３１０以下、３１５以下、３２０以下、３２５以下、３３０以下、３３５以下、３４０以下、３４５以下、３５０以下、３５５以下、３６０以下、３６５以下、３７０以下、３７５以下、３８０以下、３８５以下、３９０以下、３９５以下、４００以下、４１５以下、４２２以下である。ＣＨＩＫＶ−カプシドのいくつかの好ましい長さは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、または少なくとも２５５である。ＣＨＩＫＶ−カプシドのいくつかの好ましい長さは、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、１００以下、１０５以下、１１０以下、１１５以下、１２０以下、１２５以下、１３０以下、１３５以下、１４０以下、１４５以下、１５０以下、１５５以下、１６０以下、１６５以下、１７０以下、１７５以下、１８０以下、１８５以下、１９０以下、１９５以下、２００以下、２０５以下、２１０以下、２１５以下、２２０以下、２２５以下、２３０以下、２３５以下、２４０以下、２４５以下、２５０以下、２５５以下、または２６０以下である。本明細書の段落で使用されるように、好ましいフラグメントの大きさは、２０〜４００、２０〜３０、４０〜１００などの大きさの範囲を与えるために、例えば、「少なくとも」の大きさとして説明される任意の数から「ｔ未満」の大きさとして説明される任意の数の範囲のような、「少なくとも」と「未満」との間の範囲のあらゆる順列を指すことを意図する。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子構築物」という用語は、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与された個体の細胞で発現を導くことができる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに、動作可能に連結された開始シグナルおよび終結シグナルを含む。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「発現可能な形態」という用語は、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするコード配列に、動作可能に連結された必須の調節エレメントを含む遺伝子構築物を指し、それにより、個体の細胞に存在する場合、コード配列が発現される。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という表現は、核酸分子が別の核酸分子にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列に依存しており、異なる環境においては異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定したイオン強度およびｐＨにおいて、特異的な配列のために熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定したイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度）である。標的配列は、一般的に過度に存在するため、Ｔｍにおいてプローブの５０％は平衡状態で使われる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、およびより長いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化試薬を添加することで達成されてもよい。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「相同」とは、２つの核酸配列間、または２つのアミノ酸配列間の配列相同性を指す。免疫原性の機能を保持するために十分に相同している、２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列は「相同」である。ヌクレオチドおよびアミノ酸についての配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Altschulら、Nuc.Acids Res., 1997, 25, 3389,当該内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる）、およびＰＡＵＰ*４.０b１０ソフトウェア（D.L.Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts）を使用して決定されてもよい。「類似性の割合」は、ＰＡＵＰ*４.０b１０ソフトウェア（D.L.Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts）を使用して算出される。共通配列の平均類似性は、系統樹の全ての配列と比較して算出される。手短に言えば、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａrｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似性を決定するのに適している（Altschulら、J.Mol.Biol., 1990, 215, 403-410,当該内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターから公的に入手できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。このアルゴリズムは、まず、クエリ配列にある長さＷの短いワードを同定することにより、データベース配列にある、同じ長さのワードと並んだときに、ある正の値の閾値スコアＴと適合するか、または満たす、高いスコアリング配列ペア（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、上記参照）。この最初の近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるために、サーチ開始のための種として作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットは各配列に沿って両方向に伸ばされる。各方向におけるワードヒットの伸長は、１）累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するとき、２）１個以上のネガティブスコアリング残基アラインメントに起因し、累積スコアがゼロ以下になるとき、または３）またはいずれかの配列の末端に到達するとき、に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoffら、Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919を参照、当該内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）（Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較）を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Karlinら、Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787,当該内容の全体は、参照により本明細書に組み込
まれる）、およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然発生する確率の指標を提供するものである。例えば、試験核酸を他の核酸と比較したときにおける最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０.１未満、より好ましくは約０.０１未満、最も好ましくは約０.００１未満である場合、核酸は他の核酸と類似しているとみなされる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、個体を免疫化するために使用され得るＣＨＩＫＶに対するＤＮＡワクチンが提供される。ワクチンは、体液性免疫および細胞性免疫の両方をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する。
【００３８】
いくつかの実施形態により、チクングニヤウィルス（ＣＨＩＫＶ）に対して交差反応性の免疫反応を誘導する能力を備えた免疫原を作製するため、ＣＨＩＫＶウィルスエンベロープＥ１、Ｅ２、およびコアタンパク質カプシドに対する共通構築物を設計した。これらの構築物について、ヒトに感染および死を引き起こした、１９５２年〜２００６年の間に単離されたチクングニヤウィルスから２１配列が選択された。各遺伝子について選択されたＤＮＡ配列は、サンプリングバイアスを避けるために、Ｓ２７株（最初の分離株）、およびレユニオン島で発生した分離株を含む、様々な国に及ぶ株の配列であった。ＤＮＡ配列は整列され、各位置にある最も共通するヌクレオチドが、合成配列のために選択された。推定されたアミノ酸配列は、アライメントのギャップの導入を導くために使用され、それにより、それらは読み枠を維持するコドン間に導入された。共通配列の作製後、ＩｇＥリーダー配列は、発現および分泌を高めるためにＮ末端に付加され、構築物は、コドンの至適化、および存在するコザック配列をより強い配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）に置換することにより至適化された（図１Ａ−配列番号１８）。分析について、発現の検証のために、ヒスチジンタグがＥ１およびカプシドの両方のＣ末端に付加された。次いで、これらの構築物は、分析、発現、および免疫原性の研究のため、先に説明したように細菌内で産生され、そして精製された[２１]。図１Ｂは、エンベロープＥ１、Ｅ２、およびカプシドのＤＮＡをコードする構築物の、アガロースゲル電気泳動を描写している。
【００３９】
別の実施形態により、ＣＨＩＫＶのウィルスエンベロープＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対するキメラの共通構築物を設計した。これらの構築物のために、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々の共通配列が作製され、各共通配列が別の配列、好ましくはプロテアーゼ切断部位をコードする配列に連結された。加えて、ＩｇＥリーダー配列は、発現および分泌を強化するため、Ｎ末端に付加された。
【００４０】
好ましい実施形態では、構築物は、ＩｇＥリーダー配列に連結されたＣＨＩＫＶのコード配列を含む。しかし、いくつかの実施形態では、ＣＨＩＫＶのコード配列は、ＩｇＥリーダー配列に連結されないが、任意に異なるリーダー配列に連結されてもよい。
配列番号１は、ＩｇＥリーダー配列に連結された共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００４１】
配列番号２は、ＩｇＥリーダー配列に連結された共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００４２】
配列番号３は、ＩｇＥリーダー配列に連結された共通ＣＨＩＫＶ−カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００４３】
配列番号４は、配列番号１に相当する共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ１タンパク質をコードするが、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を持たないヌクレオチド配列を指す。
【００４４】
配列番号５は、配列番号２に相当する共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ２タンパク質をコードするが、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を持たないヌクレオチド配列を指す。
【００４５】
配列番号６は、配列番号１３に相当する共通ＣＨＩＫＶ−カプシドタンパク質をコードするが、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を持たないヌクレオチド配列を指す。
【００４６】
配列番号７は、ＩｇＥリーダー配列を持つ共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ１タンパク質である、配列番号１によりコードされたアミノ酸配列を指す。
【００４７】
配列番号８は、ＩｇＥリーダー配列を持つ共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ２タンパク質である、配列番号２によりコードされたアミノ酸配列を指す。
【００４８】
配列番号９は、ＩｇＥリーダー配列を持つ共通ＣＨＩＫＶ−カプシドタンパク質である、配列番号３によりコードされたアミノ酸配列を指す。
【００４９】
配列番号１０は、ＩｇＥリーダー配列を持たない共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ１タンパク質である、配列番号４によりコードされたアミノ酸配列を指す。
配列番号１１は、ＩｇＥリーダー配列を持たない共通ＣＨＩＫＶ−Ｅ２タンパク質である、配列番号５によりコードされたアミノ酸配列を指す。
【００５０】
配列番号１２は、ＩｇＥリーダー配列を持たない共通ＣＨＩＫＶ−カプシドタンパク質である、配列番号６によりコードされたアミノ酸配列を指す。
【００５１】
配列番号１３は、コザック配列-ＩｇＥリーダー配列-ＣＨＩＫＶ−Ｅ３コード配列-切
断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ２コード配列-切断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ１コード配列-ストップシグナル-ストップシグナルである、共通Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列を指す。
配列番号１４は、ＩｇＥリーダー配列-ＣＨＩＫＶ−Ｅ３-切断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ２-切断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ１コード配列である、共通Ｅｎｖタンパク質配列である、配列番
号１３によりコードされたアミノ酸配列を指す。
【００５２】
配列番号１５は、ＩｇＥリーダー配列を持たずに、配列番号１３に相当する共通Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列を指す。例えば、ＣＨＩＫＶ-Ｅ３コード配列-切断部位-
ＣＨＩＫＶ−Ｅ２コード配列-切断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ１コード配列-ストップシグナル-ストップシグナル、である。
【００５３】
配列番号１６は、ＩｇＥリーダー配列を持たない共通Ｅｎｖタンパク質配列である、配列番号１５によりコードされたアミノ酸配列を指す。例えば、ＣＨＩＫＶ-Ｅ３-切断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ２-切断部位-ＣＨＩＫＶ−Ｅ１コード配列、である。
【００５４】
配列番号１７は、ＩｇＥリーダー配列のアミノ酸配列を指す。
配列番号１８は、好ましいコザック配列を指す。
【００５５】
共通タンパク質をコードする核酸分子が個体の細胞に取り込まれると、共通タンパク質をコードするヌクレオチド配列が細胞で発現され、それによりタンパク質は個体に送達される。本発明の態様は、プラスミド上の共通タンパク質のコード配列、またはそれを組み換えワクチンの一部としておよび弱毒化ワクチンの一部として送達する方法、を提供する。
本発明のいくつかの態様により、病原体、または異常な疾患関連の細胞に対して、予防的および／または治療的に個体を免疫化する組成物および方法が提供される。ワクチンは、弱毒生ワクチン、組み換えワクチン、又は核酸もしくはＤＮＡワクチンのような、任意の種類のワクチンでもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ、２つ、または３つ全ての共通タンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、同じ核酸分子に、２つの共通タンパク質のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２つの異なる核酸分子に、２つの共通タンパク質のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、同じ核酸分子に、３つの共通タンパク質のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２つのコード配列が同じ核酸分子にあり、３番目のコード配列が２番目の核酸分子にある３つの共通タンパク質のコード配列を含む。例えば、一つの核酸分子はＥ１およびＥ２のコード配列を含有し、もう一つはカプシドのコード配列を含む；一つの核酸分子はＥ１およびカプシドのコード配列を含有し、もう一つはＥ２のコード配列を含む、又は、一つの核酸分子はＥ２およびカプシドのコード配列を含有し、もう一つはＥ１のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、３つの異なる核酸分子があり、各々が異なるコード配列を含む、３つの共通タンパク質のコード配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを含む共通Ｅ１を含むコード配列は、配列番号１である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持たない共通Ｅ１のコード配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持つ共通Ｅ１タンパク質は、配列番号７またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、共通Ｅ１タンパク質は、配列番号１０またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持つ共通Ｅ１タンパク質は、配列番号７に対して８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持たない共通Ｅ１タンパク質は、配列番号１０に対して８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを含む共通Ｅ２を含むコード配列は、配列番号２である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持たない共通Ｅ２を含むコード配列は、配列番号５である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持つ共通Ｅ２タンパク質は、配列番号８またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、共通Ｅ２タンパク質は、配列番号１１またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持つ共通Ｅ２タンパク質は、配列番号７に対して８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持たない共通Ｅ１タンパク質は、配列番号１１に対して８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを含む共通カプシドを含むコード配列は、配列番号３である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持たない共通Ｅ１のコード配列は、配列番号６である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持つ共通Ｅ１タンパク質は、配列番号９またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、共通Ｅ１タンパク質は、配列番号１２またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持つ共通Ｅ１タンパク質は、配列番号９に対して８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーを持たない共通Ｅ１タンパク質は、配列番号１２に対して８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である。
【００５８】
重複した遺伝子が、単一の核酸分子または重複した核酸分子にあってもよい。例えば、一つの核酸分子はＥ１およびＥ２のコード配列を含有し、もう一つはカプシドのコード配列を含む；一つの核酸分子は、Ｅ１およびカプシドのコード配列を含有し、もう一つはＥ２のコード配列を含む、又は、一つの核酸分子は、Ｅ２およびカプシドのコード配列を含有し、もう一つはＥ１のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、３つの異なる核酸分子があり、各々が異なるコード配列を含む、３つの共通タンパク質のコード配列を含む。ワクチンは、Ｅ１、Ｅ２、およびカプシドについて、２つ以上の共通配列の組み合わせを含有してもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、単一のキメラ遺伝子として共に連結されたＥ１、Ｅ２、およびＥ３を含む、共通のＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖを含む。いくつかの実施形態では、個々の共通配列は、プロテアーゼの切断部位をコードする配列とともに互いに連結される。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるキメラ遺伝子の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１３またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１３またはそのフラグメントに対して、少なくとも８５％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１３またはそのフラグメントに対して、少なくとも９０％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１３またはそのフラグメントに対して、少なくとも９５％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１３またはそのフラグメントに対して、少なくとも９８％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１３またはそのフラグメントに対して、少なくとも９９％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１５またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１５またはそのフラグメントに対して、少なくとも８５％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１５またはそのフラグメントに対して、少なくとも９０％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１５���たはそのフラグメントに対して、少なくとも９５％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１５またはそのフラグメントに対して、少なくとも９８％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、個体におけるタンパク質の発現が、結果としてＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を生じさせるように十分な配列を含む、配列番号１５またはそのフラグメントに対して、少なくとも９９％相同の核酸配列を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、共に連結されたＥ１、Ｅ２、およびＥ３の共通アミノ酸配列をコードする、共通のＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖを含む。いくつかの実施形態では、個々の共通配列は、プロテアーゼの切断部位をコードする配列とともに互いに連結される。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子は、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導するＥ１、Ｅ２、およびＥ３の各々のフラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導するのに十分な配列を含む、配列番号１４またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１４またはそのフラグメントに対して、少なくとも８５％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１４またはそのフラグメントに対して、少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１４またはそのフラグメントに対して、少なくとも９５％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１４またはそのフラグメントに対して、少なくとも９８％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１４またはそのフラグメントに対して、少なくとも９９％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１６またはそのフラグメントに対して、少なくとも８５％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１６またはそのフラグメントに対して、少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１６またはそのフラグメントに対して、少なくとも９５％相同のアミノ���配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１６またはそのフラグメントに対して、少なくとも９８％相同のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共通タンパク質ＣＨＩＫＶ  Ｅｎｖは、それによりコードされたアミノ酸配列が免疫原性であり、また、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の各々に対して免疫反応を誘導する配列番号１４またはそのフラグメントに対して、少なくとも９９％相同のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
核酸分子は、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、組み換えアデノウィルス、組み換えアデノウィルスに関連したウィルス、および組み換えワクシニアウィルスのような、組み換えベクターを含む、いくつかの周知の技術のうち任意の技術を使用して送達されてもよい。
【００６２】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５,５９３,９７２号、米国特許第５,７３９,１１８号、米国特許第５,８１７,６３７号、米国特許第５,８３０,８７６号、米国特許第５,９６２,４２８号、米国特許第５,９８１,５０５号、米国特許第５,５８０,８５９号、米国特許第５,７０３,０５５号、米国特許第５,６７６,５９４に説明されており、そこに記載された優先出願は、各々が参照により本明細書に組み込まれる。これらの出願に説明された送達プロトコルに加え、ＤＮＡを送達する代替的な方法が、米国特許第４,９４５,０５０号、および米国特許第５,０３６,００６号に説明されており、この両方は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
投与法は、限定されないが、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内への投与および経口投与を含み、同様に、吸入剤または坐剤により局所的、経皮的に投与することも含み、又は、洗浄によって膣、直腸、尿道、口および舌下の組織のような粘膜組織に投与することを含む。好ましい投与法は、粘膜組織、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下への注入を含む。遺伝子構築物は、従来の注射器、無針注入装置、または「微粒子銃、遺伝子銃」を含む手段により投与され得るが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
別の投与法は、米国特許第５,２７３,５２５号、米国特許第５,４３９,４４０号、米国特許第５,７０２,３５９号、米国特許第５,８１０,７６２号、米国特許第５,９９３,４３４号、米国特許第６,０１４,５８４号、米国特許第６,０５５,４５３号、米国特許第６,０６８,６５０号、米国特許第６,１１０,１６１号、米国特許第６,１２０,４９３号、米国特許第６,１３５,９９０号、米国特許第６,１８１,９６４号、米国特許第６,２１６,０３４号、米国特許第６,２３３,４８２号、米国特許第６,２４１,７０１号、米国特許第６,３４７,２４７号、米国特許第６,４１８,３４１号、米国特許第６,４５１,００２号、米国特許第６,５１６,２２３号、米国特許第６,５６７,６９４号、米国特許第６,５６９,１４９号、米国特許第６,６１０,０４４号、米国特許第６,６５４,６３６号、米国特許第６,６７８,５５６号、米国特許第６,６９７,６６９号、米国特許第６,７６３,２６４号、米国特許第６,７７８,８５３号、米国特許第６,８６５,４１６号、米国特許第６,９３９,８６２号、および米国特許第６,９５８,０６０号に説明されるような、遺伝子構築物を送達するために電気穿孔法を使用することを含み、当該内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
ＤＮＡワクチンの送達を容易にするための好ましい電気穿孔装置および電気穿孔方法の例は、Draghia-Akliらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Smithらにより提出された米国特許公報第２００５／００５２６３０号に説明されるＤＮＡワクチンを含み、当該内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、好ましくは、ＤＮＡワクチンの送達を容易にするための電気穿孔装置および電気穿孔方法は、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された６０／９７８，９８２に対し、合衆国法典３５第１１９条（ｅ）に基づき優先権を主張する、同時係属中であり共有の、２００７年１０月１７日に出願された米国特許出願第１１／８７４０７２において提供され、これら全ては、全体で本明細書に組み込まれる。
【００６６】
以下は、電気穿孔技術を使用した実施形態の例であり、先に論じた特許の引用例において、より詳細に論じられている。電気穿孔装置は、ユーザにより入力されたプリセット電流と同様の定電流を作り出すパルスエネルギーを、哺乳類の所望の組織に送達するように構成され得る。電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形ロガー、入力素子、ステータス報告素子、通信ポート、メモリーコンポーネント、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の種々の要素を含み、また組み込むことができる。電気穿孔コンポーネントは電気穿孔装置の１つの要素として機能し得、他の要素は電気穿孔コンポーネントと通信する分離した要素（またはコンポーネント）である。いくつかの実施形態では、電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能し得、これは電気穿孔コンポーネントと分離した電気穿孔装置のさらに他の要素と通信できる。ワクチンを送達する電気穿孔技術の使用は、要素が１つのデバイスとして、または、お互いに通信する分離した要素として機能できるように、１つの電気機械装置または機械装置の部品として存在する電気穿孔装置の要素によって限定されない。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織に定電流を作り出すパルスエネルギーを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間配置において複数の電極を有する電極アレイを含み、電極アセンブリは、電気穿孔コンポーネントからパルスエネルギーを受け取り、電極を介して当該エネルギーを所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも１つは、パルスエネルギーを送達する間に中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、電気穿孔コンポーネントにインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、電気穿孔コンポーネントにより送達されたパルスエネルギーを調節して定電流を維持する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされた配列のもと、電極の制御を介して、分散パターンでエネルギーのパルスを送達することができ、プログラムされた配列は、ユーザにより電気穿孔コンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされた配列は、配列時に送達される複数のパルスを含み、ここで複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を備えた少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスに続くパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を備えた少なくとも２つの活性電極のうち、異なる１つにより送達される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのどちらかにより実行される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実行される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に生じるが、好ましくは、リアルタイム・フィードバックまたは瞬時的（例えば、応答時間を決定するために利用できる技術により決定されるように、実質的に瞬時的）である。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織のインピーダンスを測定し、インピーダンスをフィードバック機構に通信し、そしてフィードバック機構がインピーダンスに応答し、プリセット電流と同様な値で定電流を維持するようにエネルギーのパルスを適合させる。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達の間、定電流を継続的、瞬間的に維持する。
【００６９】
細胞に取り込まれると、遺伝子構築物（単数または複数）は、機能する染色体外分子として細胞で存在し続けることができる。ＤＮＡが細胞内に導入されてもよく、当該ＤＮＡは、一過性であることを原則に、プラスミド（単数または複数）の形態で存在する。代替的に、ＲＮＡが細胞に投与されてもよい。同様に、セントロメア、テロメア、および複製開始点を含む、線状のミニ染色体として遺伝子構築物を提供することを検討してもよい。遺伝子構築物は、対象に投与される、弱毒化生微生物または組み換え微生物ベクターにおける遺伝物質の一部を構成してもよい。遺伝子構築物は、遺伝物質が染色体外に残る、組み換えウィルスワクチンのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。エレメントは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルを含む。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現のために、しばしばエンハンサーが必要とされる。これらのエレメントが所望のタンパク質をコードし、調節エレメントが、投与される個体で操作できる配列に、操作可能に連結されることが必要である。
【００７０】
開始コドンおよび終止コドンは、一般的に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であるとみなされている。しかし、これらのエレメントが、遺伝子構築物が投与される個体で機能することが必要である。開始コドンおよび終止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。
【００７１】
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能しなければならない。
【００７２】
特にヒトのための遺伝子ワクチンの生産において、本発明を実施するための有利なプロモーターの例は、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）のプロモーター、ＢＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウィルス（ＭＶ）のプロモーター、モロニウィルス、ＡＬＶ、例えば、サイトメガロウィルス即時型初期プロモーターのようなサイトメガロウィルスのプロモーター（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）、ラオス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）由来のプロモーターと同様に、ヒトのアクチン、ヒトのミオシン、ヒトのヘモグロビン、ヒト筋肉のクレアチン、およびヒトのメタロチオネインのような、ヒト遺伝子由来のプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
特にヒトのための遺伝子ワクチンの生産において、本発明を実施するために有利なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化（ｂｇh−ポリＡ）シグナル、およびＬＴＲポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されるものではない。詳細には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれる、ｐＣＥＰ４プラスミド（InvitrogenSanDiego, Calif）にあるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用する。
【００７４】
ＤＮＡ発現に求められる調節エレメントに加え、別のエレメントがＤＮＡ分子に含められてもよい。そのような付加的なエレメントは、エンハンサーを含む。エンハンサーは、ヒトのアクチン、ヒトのミオシン、ヒトのヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、並びにＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶ由来のエンハンサーのような、ウィルスのエンハンサーを含む群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
遺伝子構築物は、細胞において染色体外でコンストラクトを維持し、複数のコンストラクトの複製物を産生させるため、哺乳類の複製開始点に備えることができる。Invitrogen（SanDiego, Calif）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、およびｐＲＥＰ４は、組み込みなしのエピソーム複製の大量の複製物を産生させる、エプスタイン・バールウィルスの複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コーディング領域を含んでいる。
【００７６】
免疫化の適用に関連するいくつかの好ましい実施形態では、核酸分子（単数または複数）が送達され、当該核酸分子は、共通タンパク質、および付加的に、そのような標的タンパク質に対して免疫反応をさらに強化するタンパク質の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような遺伝子の例は、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＩ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および欠失したシグナル配列を有し、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを付加的に含むＩＬ−１５を含むＩＬ−２８のような、別のサイトカインおよびリンホカインをコードする遺伝子である。
【００７７】
方法で使用される組成物はさらに、米国特許公報第２００３０１７６３７８号に対応する米国特許出願第１０/１３９,４２３号で説明されるように、そのようなタンパク質をコードする以下のタンパク質および／または核酸分子を１つ以上含有してもよく、当該内容は、参照により本明細書に組み込まれる。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原、または主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ抗原を含む主要組織適合遺伝子複合体抗原；Ａｐｏ−１、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含むがこれらに限定されないデスドメイン受容体；ＦＡＤＤ、ＦＡＰ−１、ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ、ＦＬＩＣＥ、およびＲＡＩＤＤを含むがこれらに限定されない、デスドメイン受容体と相互作用するタンパク質などのデスシグナル；またはＦＡＳ−ＬおよびＴＮＦを含むがこれらに限定されない、デスドメイン受容体と結合し、アポトーシスを惹起するリガンドを含むデスシグナル；ＦＡＤＤ、ＭＯＲＴ１、およびＭｙＤ８８を含むがこれらに限定されない、デスドメイン受容体と相互作用するメディエータ；昆虫およびヘビ毒、シュードモナス（Pseudomonas）毒素のような菌体内毒素、単鎖のトキシンを含むリシンのようにタンパク質を失活化させる二重鎖リボソーム、並びにゲロニンに限定されないが、これらのような細胞を死滅させるタンパク質を含むトキシン。
【００７８】
方法で使用される組成物はさらに、米国特許公報第２００７００４１９４１に一致する米国特許出願第１０/５６０,６５０号で説明されるように、そのようなタンパク質をコードする以下のタンパク質および／または核酸分子を１つ以上含有してもよく、当該内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５タンパク質配列に連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質のように、ＩＬ−１５タンパク質配列に連結された非ＩＬ−１５シグナルペプチドを含む融合タンパク質を含むＩＬ−１５、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ；ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、Ｆ４６１８１１、またはＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＣＤ３０、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、IＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ１Ｂ２、ＪＮＫ１Ｂ１、ＪＮＫ２Ｂ２、ＪＮＫ２Ｂ１、ＪＮＫ１Ａ２、ＪＮＫ２Ａ１、ＪＮＫ３Ａ１、ＪＮＫ３Ａ２、ＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂ２、ｐ４９スプライシングフォーム、ＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂ２、ｐ１００スプライシングフォーム、ＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂ２、ｐ１０５スプライシングフォーム、ＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂ５０Ｋ鎖前駆物質、ＮＦｋＢｐ５０、ヒトＩＬ−１α、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−４、マウスＩＬ−４、ヒトＩＬ−５、ヒトＩＬ−１０、ヒトＩＬ−１５、ヒトＩＬ−１８、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−β、ヒトインターロイキン１２、ＭａｄＣＡＭ−１、ＮＧＦＩＬ−７、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−Ｒ、Ｆａｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−４、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ、Ｐ１５０．９５、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ＣＤ３４、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、Ｅ−セレクチン、ＣＤ２、ＭＣＰ−１、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＦＬＴ、Ａｐｏ−１、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ）、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、ＩＣＥ、ＶＬＡ−１、およびＣＤ８６（Ｂ７．２）。
【００７９】
方法で使用される組成物はさらに、米国特許公報第２００７０１０４６８６号に対応する米国特許出願第１０/５６０,６５３号に説明されるように、そのようなタンパク質をコードする以下のタンパク質および／または核酸分子を１つ以上含んでもよく、当該内容は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、およびＴＡＰ２。
【００８０】
なんらかの理由により遺伝子構築物を受入れる細胞を除去することが望ましい場合、細胞破壊の標的として役割を果たす、追加のエレメントが付加されてもよい。発現できる形態でヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガングシクロビル（ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒ)を個体に投与することもでき、この薬剤は、ｔｋを産生する任意の細胞を選択的に死滅させ、それにより、遺伝子構築物とともに選択的な細胞を破壊する手段を提供する。
【００８１】
タンパク質の産生を最大化させるために、コンストラクトが投与される細胞における遺伝子の発現に適した調節配列を選択することができる。さらに、細胞で最も効率的に転写されるコドンが選択されてもよい。当業者は、細胞で機能するＤＮＡコンストラクトを作製することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、本明細書で説明される免疫調節タンパク質のためのＩｇＥシグナルペプチドが連結されたコード配列を作るように提供されてもよい。
【００８３】
本発明の１つの方法は、核酸分子を筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内、もしくは局所へ投与すること、または吸入、膣、直腸、尿道、頬側、および舌下からなる群から選択された粘膜組織の洗浄により投与することを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ポリヌクレオチドの機能的エンハンサー、または遺伝子ワクチン促進剤の投与と併せて細胞に送達される。ポリヌクレオチドの機能的エンハンサーは、米国特許第５,５９３,９７２号および米国特許第５,９６２,４２８号に説明され、当該各内容は参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチンの促進剤は、米国特許第５,７３９,１１８号に説明されており、当該内容は、参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子と併せて投与される共作用剤は、核酸分子との混合物として投与されてもよく、または核酸分子を投与する前か後に、混合せずに同時に投与されてもよい。加えて、トランスフェクション試薬、および／または複製剤、および／または炎症剤として機能し得、ポリヌクレオチドの機能的エンハンサーと一緒に投与され得る他の薬剤には、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５のような、成長因子、サイトカイン、およびリンホカインが含まれ、同様に、線維芽細胞増殖因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、モノホスホリルリピドＡ（ＷＬ）を含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンのようなベシクルが含まれる。ヒアルロン酸も当該遺伝子構築物と共に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質を、ポリヌクレオチドの機能的エンハンサーとして使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子は送達／取り込みを強化するために、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）を伴って提供される。
【００８５】
本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、約５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１０ｎｇ〜約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約０.１μｇ〜約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１μｇ〜約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５μｇ〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１００μｇ〜約２００μｇのＤＮＡを含む。
【００８６】
本発明による医薬組成物は、使用される投与法に応じて処方される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、当該組成物は無菌であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。好ましくは等張性の製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加物は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。いくつかの事例では、リン酸緩衝した生理食塩水のような等張液が好ましい。安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に追加される。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態によると、チクングニヤウィルスに対して免疫反応を誘導する方法が提供される。ワクチンは、弱毒生ワクチン、組み換えワクチン、または核酸もしくはＤＮＡワクチンでもよい。
【００８８】
核酸分子（単数または複数）が、プラスミドＤＮＡ、組み換えベクターの核酸分子として、または弱毒化ワクチンに提供した遺伝物質の一部として提供されてもよい。代替的に、いくつかの実施形態では、共通タンパク質はそれらをコードする核酸分子に加えて、またはそれらをコードする核酸分子の代わりに、タンパク質として送達されてもよい。
【００８９】
遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要とされる調節エレメントに、操作可能に連結された標的タンパク質、または免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明による、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現可能な形態を含む１つの構築物、および免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現可能な形態を含む１つの構築物を含む、遺伝子構築物の組み合わせが提供される。遺伝子構築物の組み合わせを含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（単数または複数）の生細胞への送達により、ＤＮＡまたはＲＮＡ、並びに標的タンパク質および１つ以上の免疫調節タンパク質の産物が発現する。標的タンパク質に対して強化された免疫反応が生じる。
【００９０】
遺伝子ワクチンを改善するため、免疫調節タンパク質のコード配列の発現できる形態を使用することに加え、本発明は、抗原をコードする外来性遺伝子を送達するため、改善された弱毒化生ワクチン、および組み換えベクターを使用する、改善されたワクチンに関する。外来性抗原を送達するための弱毒化生ワクチン、および組み換えベクターを使用するワクチンの例は、米国特許第４,７２２,８４８号、米国特許第５,０１７,４８７号、米国特許第５，０７７，０４４号、米国特許第５,１１０,５８７号、米国特許第５,１１２,７４９号、米国特許第５,１７４,９９３号、米国特許第５,２２３,４２４号、米国特許第５,２２５,３３６号、米国特許第５,２４０,７０３号、米国特許第５,２４２,８２９号、米国特許第５,２９４,４４１号、米国特許第５,２９４,５４８号、米国特許第５,３１０,６６８号、米国特許第５,３８７,７４４号、米国特許第５,３８９,３６８号、米国特許第５,４２４,０６５号、米国特許第５,４５１,４９９号、米国特許第５,４５３,３６４号、米国特許第５,４６２,７３４号、米国特許第５,４７０,７３４、および米国特許第５,４８２,７１３号に説明されており、当該内容の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。共通タンパク質、またはその免疫原性共通フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供され、当該ヌクレオチド配列は、発現を生じさせるようにワクチンにおいて機能できる調節配列に動作可能に連結される。遺伝子構築物は、本発明により改善されたワクチンを生産するため、弱毒化生ワクチンおよび組み換えワクチンに取り込まれる。
【００９１】
本発明は、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン、および組み換えワクチンを含むワクチン組成物の一部分として個体の細胞に遺伝子構築物を送達することを含む、個体を免疫化する改善された方法を提供する。遺伝子構築物は、発現を生じさせるようにワクチンにおいて機能できる調節配列に動作可能に連結される共通タンパク質、またはその免疫原性共通フラグメントコードするヌクレオチド配列を含む。ワクチンは、異なる株に対して交差防御を生じさせる。
【００９２】
実施例１
これよりＤＮＡワクチン・ストラテジーを用いて、ＣＨＩＫＶのワクチン設計のため、新しい共通性に基づいたアプローチのデータを提示する。ワクチンカセットは、いくつかの組み換えを備えたＣＨＩＫＶカプシド、およびエンベロープ特異的共通配列に基づき設計した。カプシド、エンベロープＥ１、およびＥ１の発現は、Ｔ７−ｃｏｕｐｌｅｄ転写／翻訳法、および免疫ブロット法を使用して評価した。ＣＨＩＫ-カプシド、Ｅ１およびＥ２をコードするプラスミドの筋肉注射を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化するために、適応する定電流の電気穿孔技術を使用した。エピトープマッピングを含む細胞性免疫反応の分析では、これらの構築物の電気穿孔が、強力な細胞性免疫および広範な細胞性免疫の両方を誘導することを実証している。加えて、抗体ＥＬＩＳＡは、これらの合成免疫原が未変性の抗原を識別できる、抗体価の高い抗体を誘導することができることを実証している。総合すると、これらのデータは、ワクチンカクテルの可能性における共通ＣＨＩＫ抗原の使用の研究をさらに裏付けている。
【００９３】
この研究では、ワクチンカセットは、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、コザック配列の追加、および置換した免疫ブログリンＥリーダー配列を含む、いくつかの修飾を備えたカプシド（Ｃａｐ）、エンベロープ（Ｅ１）およびエンベロープ（Ｅ２）の特異的共通配列に基づき設計した。ワクチンカセットは、特異的部位でＤＮＡワクチンベクターｐＶａｘ１内に導入した。ワクチンの構築物は、特異的な制限消化を使用し、またＴ７プロモーターのプライマーを用いてシーケンシングすることにより、インサートを調べた。最終的な構築物は、インビトロでの発現と同様にインビボにおけるウェスタンブロット法の使用の両方に基づき、効果的に発現した。このことは、ウィルスの構築物が正確に発現し、さらに免疫原性の研究が進んだことを裏付けている。
【００９４】
最近では、ＤＮＡワクチンの送達のためにＥＰを使用することが大いに関心を引いている。小動物モデル、および非ヒト霊長類におけるＩＭ免疫化＋ＥＰの最近の研究によると、細胞性、特に抗体反応の増強が相次いで報告されている[２０〜２２]。
【００９５】
物質および方法
細胞および動物
ＡＴＣＣから入手したＢＨＫ−２１細胞株を、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させ維持した。哺乳類のプラスミド発現ベクターｐＶａｘ１は、Invitrogen（Carlsbad,CA）から購入した。３〜４週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Jacksonlaboratories, Indianapolis, IN）をこれらの実験に使用し、３つの実験群に分けた（ｎ４）。全ての動物は、アメリカ国立衛生研究所（BethesdaMD,USA,）、ペンシルバニア大学（Philadelphia, PA, USA）、および研究機関の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従い、温度管理された光サイクルのある設備に収容した。
【００９６】
ＣＨＩＫＶのＤＮＡ構築物および合成
ＣＨＩＫＶコアおよびエンベロープ遺伝子は、ＣＨＩＫＶウィルス全てについてＮＣＢＩデータベースから集めた配列のうち予測される共通株を使用して、合成プライマーの合成、次いでＤＮＡ-ＰＣＲ増幅により設計した。共通配列は、コドンの最適化およびＲＮＡの最適化（GeneArt,Regensburg, Germany）を含め、発現のために最適化し、ｐＶａｘ１発現ベクター（Invitrogen）に挿入した。
【００９７】
インビトロおよびインビボにおける発現
構築物の発現は、ｐＶａｘ１バックボーンのＴ７プロモーター、およびＳ３５標識されたメチオニンＣＨＩＫＶ遺伝子を含むＴ７−ｂａｓｅｄ  ｃｏｕｐｌｅｄ転写／翻訳システム（Promega,Madison, WI）を使用して確認した。合成したタンパク質は、抗Ｅ１抗体、抗Ｅ２抗体、または抗Ｃａｐ抗体を使用して免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質は、１２％ＮｕＰａｇｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Invitrogen,CA）で電気泳動させ、続いて固定し、乾燥させた。取り込まれたＳ３５標識された遺伝子産物を検出するため、オートラジオグラフィーを行った。インビボ発現では、ＢＨＫ−２１細胞（１×１０６）はＣＨＩＫＶ構築物を用い、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション方法（Roche,NJ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、タンパク質（５０μg）をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（１２％）で分画し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad,Hercules,CA）に移した。免疫ブロット分析は、マウスで生じた特異的な抗血清を用いて行い、発現したタンパク質は、ホースラディッシュ・ペルオキシターゼと複合化したヤギ抗マウスＩｇＧを用い、ＥＣＬ検出システム（AmershamPharmaciaBiotech, Piscataway, NJ）を使用して視覚化した[１９]。
【００９８】
免疫化および電気穿孔
プラスミドＤＮＡを用いて刺激する動物に、標準的なプロトコルを使用した[２０]。４匹のマウスの群は、２〜３回、pＣＨＩＫＶ遺伝子（２５μg）を用いて、２週間あけて２回免疫化し、最後に免疫化した１週間後、屠殺した。全ての免疫処置は、インビボ電気穿孔（ＥＰ）（VGXPharmaceuticalsInc, Blue Bell, PA）により、総量１００μlを大腿四頭筋に送達させた。動物は、最後の免疫化の７日後に屠殺し、免疫分析のため、その後すぐに血清および脾臓を集めた。２回目の免疫化および３回目の免疫化のそれぞれ１週間後に、コントロールマウスおよび免疫化したマウスの両方の血液を得た。方形波パルスを全ての実験に使用し、出願人の研究室で設計され試験された定電流ＥＫＤを用いて送達した[２０〜２２]。３つの電極アレイ（３−ＥＡ）をマウス実験で使用した。３−ＥＡは、長い２辺が長さ０．５ｍｍで、底辺が長さ０．３ｍｍであり、非導電性プラスチックで共に保持された二等辺三角形構造の、３つのＥ２６−ゲージ固体ステンレス鋼に基づく電極でできている。マウス実験のための特異的なＥＰ条件では、定電流、０．１アンプ、３つのパルス（５２ミリ秒／パルス、パルス間４秒）を使用した。プラスミド注射とＥＰとの時間差は約２０秒であった。プラスミド投与／ＥＰについてイベントの順は以下の通りであった。使い捨ての電極アセンブリをハンドルのレセプタクルに設置し、ハンドルの開始ボタンを押して動物実験群の数を入力し、インシュリン注射器を使用して５０μlのＤＮＡ構築物（総量２５μgのＤＮＡ）プラスミドを注射し、すぐに注射部位を囲む区域に針を置き、ハンドルの開始ボタンを押し、４秒数えた後、パルスが送達される。電気穿孔に続いて５秒後、筋肉から静かにアレイを取り出す。全処置の間、全ての電極を完全に筋肉に挿入した[２１、２２]。全てのＤＮＡは、内毒素を含まないＱｉａｇｅｎカラムを使用して作った。全ての動物は、ペンシルバニア大学の温度管理した光サイクルのある設備に収容し、動物の世話は、アメリカ国立衛生研究所およびペンシルバニア大学のガイドラインに従った。
【００９９】
細胞性反応：エリスポット分析
エリスポット分析は、先に説明したように行った[２３]。手短にいえば、エリスポット９６ウェルプレート（Millipore）は、抗マウスＩＦＮ−γ  ｃａｐｔｕｒｅ  Ａｂでコートし、４℃で２４時間インキュベートした（R&DSystems）。翌日にプレートを洗浄し、１％ＢＳＡを用いて２時間ブロックした。免疫化したマウスから２０万個の脾細胞を各プレートに添加し、ＲＰＭＩ１６４０（ネガティブコントロール）、Ｃｏｎ  Ａ（ポジティブコントロール）、または特異的なペプチドＡｇｓ（１０μｇ／ｍｌ；Invitrogen）の存在下、５％ＣＯ２、３７℃で一晩刺激した。ペプチドプールは、１１アミノ酸で重複した１５ｍｅｒでできている。シミュレーション２４時間後、細胞を洗浄し、ビオチン化した抗マウスＩＦＮ−γ  Ａｂ（R&DSystems）を用いて、４℃で２４時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（R&DSystems）を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５−ブロモ−４−クロロ−３′インドリルホスファート  p-トルイジン塩、およびニトロブルーテトラゾリウムクロリド（色元素の色試薬；R&DSystems）を各ウェルに添加した。次いで蒸留水を用いてプレートをリンスし、室温で乾燥させた。スポットは自動エリスポットリーダー（CTLLimited）[２１〜２３]で数えた。
【０１００】
体液性免疫反応：抗体ＥＬＩＳＡ
ＣＨＩＫＶの各ＤＮＡ構築物に対し、各ＤＮＡの最初の注射後の抗体レベル、およびワクチン接種への体液性免疫反応を特定した。手短にいえば、９６ウェルの高結合性のポリスチレンプレート（Corning,NY）のプレートを、ＰＢＳで希釈した合成した特異的なペプチド（２μｇ／ｍｌ）を用いて、４℃で一晩コートした。翌日、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、ＰＢＳＴで、３％ＢＳＡを用いて１時間ブロックし、１：１００で希釈した、免疫化したマウスおよびナイーブマウスの血清を用いて、３７℃で１時間インキュベートした。結合したＩｇＧは、１:５,０００の希釈で、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ResearchDiagnostics,NJ）を使用して検出した。結合した酵素は、色素原基質溶液ＴＭＢ（R&D Systems）の添加により検出し、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬ３１２e  Ｂｉｏ−Ｋｉｎｅｔｉｃｓリーダーで、４５０ｎｍで読み取った。全ての血清サンプルは二重に試験した[２２]。
【０１０１】
結果
共通構築物の発現
３つのＣＨＩＫＶ共通構築物の発現は、複数の技術を使用して検証した。Ｓ３５標識されたインビトロ翻訳で産生したタンパク質を視覚化するため、Ｔ７−ｃｏｕｐｌｅｄ転写および翻訳分析をインビトロで行った。翻訳産物は、ヒスチジンタグ抗体を使用して免疫沈降し、ゲル分析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＸ線写真分析は、各構築物（エンベロープＥ１、Ｅ２、およびカプシド）が理論的に予測した分子量で流れることを示した（図２Ａ）。次に哺乳類の細胞内におけるこれらの構築物の発現の試験に努めた。ＢＨＫ−２１細胞へのトランスフェクションの後、３日後にタンパク質を抽出し、発現は特異的な多クローン性の抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した（図２Ｂ）。特異的な抗体を用いた免疫ブロットの結果、エンベロープＥ１構築物でトランスフェクトした細胞には５２ｋＤａのタンパク質を、カプシド構築物でトランスフェクトした細胞には３６ｋＤａのタンパク質を観察した。
【０１０２】
体液免疫性
本出願人は、致死性のＣＨＩＫウィルスから防御するための出願人の共通免疫原の強さは、免疫システムの細胞アームにあると仮説を立てている。さらに、非中和性抗体ではなく、交差反応性が疾患の重症度に対してある程度防御を提供できる。出願人の構築物が抗体反応を誘導するか決定するために、ＤＮＡ免疫がＥＬＩＳＡによる抗体反応に対して試験された後に、得られた血清から抗体価を決定するように、ＣＨＩＫで免疫化したマウスの血清に抗体ＥＬＩＳＡを行った。エンベロープＥ１構築物で免疫化したマウスの血清における抗Ｅ１特異的ＩｇＧ抗体は、ベクターコントロールで免疫化したマウスの血清における抗体よりも著しく高かった（図３Ａ）。同様に、エンベロープＥ２構築物およびカプシド構築物のそれぞれで免疫化したマウスの血清における、抗Ｅ２特異的ＩｇＧ抗体および抗カプシド特異的ＩｇＧ抗体は、ベクターコントロールで免疫化したマウスの血清における抗体よりも著しく高かった（図３Ｂおよび図３Ｃ）。これらの結果はさらに、プラスミド送達の代替的な手段、具体的には電気穿孔がＤＮＡワクチンの免疫原への抗体産物の反応を高めていることを裏付けた。
【０１０３】
細胞性免疫原性
ＣＤ８＋ＣＴＬ反応を誘導するＥ１、Ｅ２、およびカプシドの構築物の能力は、次にＩＦＮ−γのエリスポット分析により特定した。共通エンベロープの構築物Ｅ１、Ｅ２と同様に、カプシドワクチンは、３回の免疫化の後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて強いＩＦＮ−γ反応を誘導することができた（図４Ａ、図５Ａ、および図６Ａ）。細胞性免疫反応の分子的特徴は、エンベロープＥ１により誘導され、エンベロープＥ１全長にわたるペプチドのライブラリに対してエリスポット分析を行った。間に９アミノ酸が重複する７４個の１５ｍｅｒペプチドであって、Ｅ１タンパク質の１〜４３５残基にわたるペプチド、およびＥ２タンパク質の１〜４２３残基にわたるペプチドを使用した。エンベロープは、Ｅ１タンパク質（図４Ｂ）で優性エピトープＨＳＭＴＮＡＶＴＩを、およびＥ２タンパク質（図５Ｂ）でＩＩＬＹＹＹＥＬＹを誘導した。カプシドタンパク質についても同様に、カプシドタンパク質全長にわたるペプチドのライブラリに対してエリスポット分析を行った。間に９アミノ酸が重複する、カプシドタンパク質の１〜２６１残基にわたる、４５個の１５ｍｅｒペプチドを使用した。優性エピトープＡＣＬＶＧＤＫＶＭが、構築物のカプシド（図５Ｂ）により誘導された。興味深いことに、２２６Ａ−Ｖ突然変異体を保因する構築物ＣＨＩＫＶ−Ｅ１により誘導される優性エピトープは、新たに出現した突然変異ウィルスに対しても効果的に免疫反応を誘導できることを示唆している。この研究結果は、細胞選出過程を通して、免疫反応がウィルスの発生を見つけることができることを示唆しているかもしれない。
【０１０４】
考察
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで誘導された免疫反応の評価は、構築物が高度な免疫原性であり、ＩＦＮ−γ反応および増殖の期間、Ｔ細胞の免疫反応を誘発したことを示した。この研究で得たエリスポットのデータは、得られたスポットの数の観点に基づき、ＩＦＮ−γ反応の規模が広大であったことを示唆している。他の近い種であるアルファウィルスのエンベロープタンパク質およびカプシドが免疫原性であることは分かっているが、チクングニヤのエンベロープおよびカプシドタンパク質の免疫原性については、ほとんど情報がない。エンベロープＥ１およびカプシドの異なる領域に由来するマトリックスペプチドプールを用いた、脾細胞由来のＩＦＮ−γ産物の誘発により、Ｅ１およびカプシドタンパク質において、それぞれ、Ｔ細胞の優性エピトープＨＳＭＴＮＡＶＴＩおよびＡＣＬＶＧＤＫＶＭを同定した。ワクチン接種したマウスにおける総ＩｇＧレベルは、ワクチン接種せず抑制したマウスと比較して高まったことが判明し、これは強い体液性免疫反応の誘導を示唆している。誘導された抗体反応の種類、加えて、広範囲のチクングニヤウィルス攻撃に対する防御を促進するためのこれらのワクチンの能力をさらに分析するという、次の研究が現在進行中である。
【０１０５】
この研究は、これらの構築物が、ワクチン候補としてさらに研究され得ることを示唆している。しかしながら、この研究は、効果的な発現、および、マウスにおいてその後の電気穿孔を伴うワクチン構築物の筋肉注射後の免疫原性の実証に限定されているため、非ヒト霊長類モデルを含むもっと多くのモデルにおいて、その免疫原性を入念に評価することが重要である。前述の合成カセットの構築物は、チクングニヤウィルスの免疫生物学をさらに調査するのに便利なツールであろう。
【０１０６】
実施例２
評価は、臨床におけるヒトのＣＨＩＫＶの感染から、実行可能な迅速な診断を提供する中和抗体価を測定するように、および感染しやすい脊椎動物宿主の前臨床における血清調査への適用にむけて設計した。
【０１０７】
ＣＨＩＫＶは、ＲＴ−ＰＣＲにより同定した。ＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡミニキットを使用して患者の血清から抽出した。１ステップＲＴ−ＰＣＲ試験は、Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して行った。増幅産物は、ウィルスのエンベロープタンパク質Ｅ２をコードする遺伝子内で３０５ｂｐであった。細胞を観察すると、ＣＨＩＫＶが泡沫状の細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じさせ、円形の細胞が感染後（Ｐｉ）２４〜４８時間に見受けられる。
【０１０８】
マイクロ中和分析は以下の通り設計される。中和試験は、抗原および抗体の反応に基づく。既知のウィルス価を阻止する患者の血清に、ＣＨＩＫＶウィルスに関し、相同の抗体の存在を観察する。血清は連続して希釈し（典型的には、例えば、１:１０〜１:６４０）、血清中の抗体がウィルスを阻止するのに十分な環境および時間量のもと、既知の体価のＣＨＩＫＶを用いてインキュベートした。インキュベーション後、ウィルスが血清の抗体により中和されていない場合、細胞のウィルス感染に至る条件のもと、許容的な細胞に混合物を添加する。ウィルスの増殖を阻止する血清の最も高い希釈率が抗体価となる。細胞におけるウィルスの増殖の測定法として、ＣＰＥ（細胞変性効果）を使用してもよい。
【０１０９】
ＣＨＩＫＶ中和試験は、患者のサンプルを使用して行った。図７は、事前に免疫化し、ＤＮＡ免疫化したマウス血清の中和抗体価を示すグラフである。マウスは、Ｅ１、Ｅ２、カプシド、Ｅ１＋Ｅ２、またはベクターｐＶａｘをコードする構築物を用いて免疫化した。血清を連続して希釈し（１：１０〜１：６４０）、ＣＨＩＫＶ（１００ＴＣＩＤ５０）を用いて、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を９６ウェルの平底プレートのＶｅｒｏ細胞（１５,０００細胞／ウェル）に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下で、３７℃で５日間インキュベートした。ＣＰＥ（細胞変性効果）が１つも見受けられなかった最も高い体価を中和抗体価として記録した。
【０１１０】
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（非特許文献８）「ガンビアハマダラカおよびネッタイシマカにおける、オニョンニョンウィルスおよびチクングニヤウィルス分離株の異なる感染力」Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  ＨｙｇＨｙｇ  ７２（５）:６１６−２１、Ｖａｎｌａｎｄｉｎｇｈａｍ  ＤＬ、ＨｏｎｇＣ、Ｋｌｉｎｇｌｅｒ  Ｋ、Ｔｓｅｔｓａｒｋｉｎ  Ｋ、ＭｃＥｌｒｏｙ  ＫＬ、Ｐｏｗｅｒｓ  ＡＭ、Ｌｅｈａｎｅ  ＭＪ、Ｈｉｇｇｓ  Ｓ（２００５年）
（非特許文献９）「アフリカの遺伝子型により起こされたチクングニヤの大流行」Ｉｎｄｉａ、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ、１２；１５８０〜１５８３頁、Ｙｅｒｇｏｌ，Ｐ．Ｎ．ら（２００６年）
（非特許文献１０）「外国を旅行した旅行者において診断されたチクングニヤ熱−米国−２００５〜２００６年」ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ５５、１０４０〜１０４２頁、Ｗａｒｎｅｒ，Ｅ、Ｇａｒｃｉａ−Ｄｉａｚ，Ｊ、Ｂａｌｓａｍｏ，Ｇ、Ｓｈｒａｎａｔａｎ，Ｓ、Ｂｅｒｇｍａｎｎ,Ａ、Ｂｌａｕｗｅｔ，Ｌ、Ｓｏｈ
ａｉｌ，Ｍ、Ｂａｄｄｏｕｒ，Ｌ、Ｒｅｅｄ，Ｃおよび他執筆者（２００６年）
（非特許文献１１）「チクングニヤウィルスに対するネッタイシマカおよびヒトスジシマカ（ハエ目:カ科）の選択株の羅患性」Ｊ  Ｍｅｄ  Ｅｎｔｏｍｏｌ  ２９、４９〜５３頁、Ｔｕｒｅｌｌ，Ｍ．Ｊ、Ｂｅａｍａｎ，Ｊ，Ｒ、およびＴａｍｍａｒｉｅｌｌｏ，Ｒ．Ｆ（１９９２年）
（非特許文献１２）「チクングニヤウィルスの感染性ベクターとしてのヒトスジシマカ:別に現れる問題？」Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ６、４６３〜４６４頁、Ｒｅｉｔｅｒ，Ｐ、Ｆｏｎｔｅｎｉｌｌｅ，Ｄ、およびＰａｕｐｙ，Ｃ（２００６年）
（非特許文献１３）「主に発熱および多発性関節炎と関連するアルファウィルス」Ｆｉｅｌｄ  ＢＮ，  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，  Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭにより編集、Ｆｉｌｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、８４３〜８９８頁、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＲＥ、Ｐｅｔｅｒｓ  ＣＪ（１９９６年）
（非特許文献１４）「ウィルス感染におけるクロロキンの効果：古い薬は今日の疾患に対抗するか？」Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、３（１１）：７２２−７、Ｓａｖａｒｉｎｏ  Ａ、Ｂｏｅｌａｅｒｔ  ＪＲ、Ｃａｓｓｏｎｅ  Ａ、Ｍａｊｏｒｉ  Ｇ、Ｃａｕｄａ  Ｒ（２００３年）
（非特許文献１５）「チクングニヤウィルスにおける単一突然変異はベクター特異性および感染の可能性に影響を与える」ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ７；３（１２）：ｅ２０１、Ｔｓｅｔｓａｒｋｉｎ  ＫＡ、Ｖａｎｌａｎｄｉｎｇｈａｍ  ＤＬ、ＭｃＧｅｅ  ＣＥ、Ｈｉｇｇｓ  Ｓ（２００７年）
（非特許文献１６）「チクングニヤウィルス感染の分子学的および血清学的診断」Ｐａｔｈｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）;５５（１０）：４９０−４、Ｇｒｉｖａｒｄ  Ｐ、Ｌｅ  Ｒｏuｘ  Ｋ、Ｌａｕｒｅｎｔ  Ｐ、Ｆｉａｎｕ  Ａ、Ｐｅｒｒａｕ  Ｊ、Ｇｉｇａｎ  J、Ｈｏａｒａｕ Ｇ、Ｇｒｏｎｄｉｎ  Ｎ、Ｓｔａｉｋｏｗｓｋｙ  Ｆ、Ｆａｖｉｅｒ  Ｆ、Ｍｉｃｈａｕｌｔ  Ａ（２００７年）
（非特許文献１７）「フランス領ポリネシアのタヒチおよびモーレア諸島由来のネッタイシマカの集団のデング２型ウィルスに対する経口羅患性の変化」Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ６０：２９２〜２９９頁、Ｖａｚｅｉｌｌｅ−Ｆａｌｃｏｚ  Ｍ、Ｍｏｕｓｓｏｎ  Ｌ、Ｒｏｄｈａｉｎ  Ｆ、Ｃｈｕｎｇｕｅ  Ｅ、Ｆａｉｌｌｏｕｘ  ＡＢ（１９９９年）
（非特許文献１８）「レユニオン島（インド洋）の大流行由来の２つのチクングニヤ分離株は、蚊、ヒトスジシマカとは異なる感染パターンを示す」ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １１：１〜９頁、Ｍａｒｉｅ  Ｖａｚｅｉｌｌｅら（２００７年）
（非特許文献１９）「ＨＩＶ−１  Ｖｐｒおよびグルココルチコイド受容体複合体は、ＰＡＲＰ−１の核局在化を防ぐ機能獲得型の相互作用である」Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.  ８：１７０〜１７９頁、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ,Ｋ、Ａ．Ｙ．Ｃｈｏｏ、Ｗ．Ｘ．Ｚｏｎｇ、Ｍ．Ｍａｄｅｓｈ、Ｄ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ、Ａ．Ｐｒｅｍｋｕｍａｒ、Ｋ．Ｐ．Ｔｈｉｅｕ、Ｊ．Ｅｍｍａｎｕｅｌ、Ｓ．Ｋｕｍａｒ、Ｃ．Ｂ．ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＤ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ、２００６年
（非特許文献２０）「ブタにおいてプラスミドを筋肉内送達するための電気穿孔法パラメータの最適化」ｄｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２２（１２）：８０７−１、Ｋｈａｎ  ＡＳ、Ｓｍｉｔｈ  ＬＣ、Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ  ＲＶ、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＫＫ、Ｐｏｐｅ  ＭＡ、Ｂｒｏｗｎ  ＰＡ、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ  Ｒ（２００３年）
（非特許文献２１）「電気穿孔法による皮内／皮下の免疫化は、ブタおよびアカゲザルにおけるプラスミドワクチンの送達および効力を向上させる」Ｖａｃｃｉｎｅ  １７；２６（３）：４４０−８、Ｌａｕｒｅｎ  ＬＡ、Ｈｉｒａｏ  ＬＡ、Ｗｕ  Ｌ、Ｋｈａｎ  ＡＳ、Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ  Ａ、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ  Ｒ、Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ（２００８年）
（非特許文献２２）「トリインフルエンザに対する、新しいコンセンサスを基礎としたＤＮＡワクチンの免疫原性」２５（１６）：２９８４−９、Ｌａｄｄｙ  ＤＪ、Ｙａｎ  Ｊ、Ｃｏｒｂｉｔｔ  Ｎ、Ｋｏｂａｓａ  Ｄ、Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ、Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ（２００７年）
（非特許文献２３）「ＳＨＩＶ抗原およびＩＬ−１５プラスミドの同時免疫後のマカクにおけるサル／ヒト免疫不全ウィルス（ＳＨＩＶ）８９．６Ｐに対する防御」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、２０：１０４（４７）：１８６４８−５３、Ｂｏｙｅｒ  ＪＤ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＴＭ、Ｋｕｔｚｌｅｒ  ＭＡ、Ｖａｎｓａｎｔ  Ｇ、Ｈｏｋｅｙ  ＤＡ、Ｋｕｍａｒ  Ｓ、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  Ｒ、Ｗｕ  Ｌ、Ｓｉｄｈｕ  ＭＫ、Ｐａｖｌａｋｉｓ  ＧＮ、Ｆｅｌｂｅｒ  ＢＫ、Ｂｒｏｗｎ  Ｃ、Ｓｉｌｖｅｒａ  Ｐ、Ｌｅｗｉｓ  ＭＧ、Ｍｏｎｆｏｒｔｅ  Ｊ、Ｗａｌｄｍａｎｎ  ＴＡ、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ  Ｊ、Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ．（２００７年）
（非特許文献２４）「日本脳炎ウィルス由来のＢｅｉｊｉｎｇ−１株のＥタンパク質をコードするＤＮＡワクチンにより誘導された免疫学的分析」Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、５０（２）：９３−８、Ｆｅｎｇ  ＧＨ、Ｌｉｕ  Ｎ、Ｚｈｏｕ  Ｙ、ＺｈａｉＹＺ、ＬｉＸＭ、Ｄｏｕ  ＸＧ（２００７年）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月23日(2015.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
いくつかの実施形態により、チクングニヤウィルス（ＣＨＩＫＶ）に対して交差反応性の免疫反応を誘導する能力を備えた免疫原を作製するため、ＣＨＩＫＶウィルスエンベロープＥ１、Ｅ２、およびコアタンパク質カプシドに対する共通構築物を設計した。これらの構築物について、ヒトに感染および死を引き起こした、１９５２年〜２００６年の間に単離されたチクングニヤウィルスから２１配列が選択された。各遺伝子について選択されたＤＮＡ配列は、サンプリングバイアスを避けるために、Ｓ２７株（最初の分離株）、およびレユニオン島で発生した分離株を含む、様々な国に及ぶ株の配列であった。ＤＮＡ配列は整列され、各位置にある最も共通するヌクレオチドが、合成配列のために選択された。推定されたアミノ酸配列は、アライメントのギャップの導入を導くために使用され、それにより、それらは読み枠を維持するコドン間に導入された。共通配列の作製後、ＩｇＥリーダー配列は、発現および分泌を高めるためにＮ末端に付加され、構築物は、コドンの至適化、および存在するコザック配列をより強い配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）に置換することにより至適化された（図１Ａ）。分析について、発現の検証のために、ヒスチジンタグがＥ１およびカプシドの両方のＣ末端に付加された。次いで、これらの構築物は、分析、発現、および免疫原性の研究のため、先に説明したように細菌内で産生され、そして精製された[２１]。図１Ｂは、エンベロープＥ１、Ｅ２、およびカプシドのＤＮＡをコードする構築物の、アガロースゲル電気泳動を描写している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
配列番号１７は、ＩｇＥリーダー配列のアミノ酸配列を指す。
ＧＣＣＧＣＣＡＣＣは、好ましいコザック配列を指す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
細胞性免疫原性
ＣＤ８＋ＣＴＬ反応を誘導するＥ１、Ｅ２、およびカプシドの構築物の能力は、次にＩＦＮ−γのエリスポット分析により特定した。共通エンベロープの構築物Ｅ１、Ｅ２と同様に、カプシドワクチンは、３回の免疫化の後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて強いＩＦＮ−γ反応を誘導することができた（図４Ａ、図５Ａ、および図６Ａ）。細胞性免疫反応の分子的特徴は、エンベロープＥ１により誘導され、エンベロープＥ１全長にわたるペプチドのライブラリに対してエリスポット分析を行った。間に９アミノ酸が重複する７４個の１５ｍｅｒペプチドであって、Ｅ１タンパク質の１〜４３５残基にわたるペプチド、およびＥ２タンパク質の１〜４２３残基にわたるペプチドを使用した。エンベロープは、Ｅ１タンパク質（図４Ｂ）で優性エピトープＨＳＭＴＮＡＶＴＩ（配列番号１８）を、およびＥ２タンパク質（図５Ｂ）でＩＩＬＹＹＹＥＬＹ（配列番号１９）を誘導した。カプシドタンパク質についても同様に、カプシドタンパク質全長にわたるペプチドのライブラリに対してエリスポット分析を行った。間に９アミノ酸が重複する、カプシドタンパク質の１〜２６１残基にわたる、４５個の１５ｍｅｒペプチドを使用した。優性エピトープＡＣＬＶＧＤＫＶＭ（配列番号２０）が、構築物のカプシド（図５Ｂ）により誘導された。興味深いことに、２２６Ａ−Ｖ突然変異体を保因する構築物ＣＨＩＫＶ−Ｅ１により誘導される優性エピトープは、新たに出現した突然変異ウィルスに対しても効果的に免疫反応を誘導できることを示唆している。この研究結果は、細胞選出過程を通して、免疫反応がウィルスの発生を見つけることができることを示唆しているかもしれない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【外国語明細書】
2015083017000001.pdf