(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質又はペプチド内のアルギニン−プロリンの間を切断することが可能な新規酵素の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有し、アルギニン−プロリンの間を切断するプロテアーゼ。ニワトリ精子中に存在し、公共のデータベースに登録された配列情報との比較から、当該タンパク質がアクロシン又はアクロシン様タンパク質であるプロテアーゼ。前記プロテアーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ及び前記ＤＮＡを保有する微生物、並びに前記微生物を用いて、アルギニン−プロリンの間を切断するタンパク質・プロテアーゼを産出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有し、アルギニン−プロリンの間を切断するプロテアーゼ。
【請求項２】
等価なアミノ酸配列が、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と95％以上同一のアミノ酸配列である、請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるプロテアーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号５又は配列番号６に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号５又は配列番号６に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つアルギニン−プロリンの間を切断する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のプロテアーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えDNAを保有する微生物。
【請求項６】
以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、プロテアーゼの製造法：
（１）請求項５に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（２）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のプロテアーゼを有効成分とする酵素剤。
【請求項８】
アクロシンを有効成分とする、アルギニン−プロリンの間を切断する酵素剤。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のプロテアーゼ、或いは請求項７又は８に記載の酵素剤でタンパク質を処理することを特徴とする、タンパク質の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規プロテーゼに関する。詳しくは、タンパク質やペプチド内のアルギニン−プロリンの間を切断することが可能なプロテアーゼ及びその用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の限定分解は質量分析法（例えばペプチドマップ法）によるタンパク質の同定等に多用されている（例えば特許文献１、２を参照）。例えば、トリプシン、キモトリプシン、プロテアーゼV8等が限定分解に利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１４１３４０号公報
【特許文献２】特開２００２−３７２５１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
タンパク質を限定分解してペプチド断片を調製する際に、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸のカルボキシル末端側のペプチド結合を切断する酵素（トリプシン、キモトリプシンなど）が多用されるが、これらの酵素はアルギニンの次にプロリンが結合している場合は切断することができない。したがって、アルギニン−プロリンの部位は限定分解に利用することができない。プロリンは他のアミノ酸とは異なる立体構造を持つアミノ酸であり、プロリンを含むペプチド結合は既存の限定分解酵素では立体障害により基質とならないと推定される。アルギニン−プロリンの間を切断する酵素（プロテアーゼ）があれば、アルギニン−プロリンの部位も限定分解に利用でき、例えば、質量分析によるタンパク質の同定の精度や効率などの飛躍的な向上を望める。
そこで本発明の課題は、タンパク質又はペプチド内のアルギニン−プロリンの間を切断することが可能な新規酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
後述の実施例の欄で詳しく述べるように、本発明者らはニワトリの受精メカニズムに関する研究を進める中で、ニワトリの精子中には通常のトリプシン様セリンプロテアーゼでは切断されないアルギニン−プロリン間を切断するプロテアーゼが存在していることを発見した。検討を進めた結果、ニワトリの卵外被ZP1糖タンパク質の特定の領域にアルギニン−プロリン配列が多数存在することが明らかになるとともに、精子との反応によって当該配列が選択的に分解されることが判明した。即ち、アルギニン−プロリンの間を切断するプロテアーゼが精子中に存在することが裏づけられた。そこで、当該プロテアーゼの精製及び同定を試みた。その結果、２種類のタンパク質（プロテアーゼ）及びその遺伝子を同定することに成功した。また、公共のデータベースに登録された配列情報との比較から、当該タンパク質がアクロシン（Acrosin）又はアクロシン様（Acrosin-like）タンパク質であることが明らかとなった。一方、組換えZP1タンパク質を基質として、アクロシンを豊富に含むブタ精子の活性を評価したところ、基質特異性や比活性の相違はあるものの、ニワトリ精子と同様、トリプシンでは分解されない領域に対する分解活性が認められた。この事実は、アクロシンが、一般に、アルギニン−プロリンの間を切断するプロテアーゼとして有用であることを強く示唆する。
以下に示す発明は、主として上記の成果及び考察に基づく。
［１］配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有し、アルギニン−プロリンの間を切断するプロテアーゼ。
［２］等価なアミノ酸配列が、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と95％以上同一のアミノ酸配列である、［１］に記載のプロテアーゼ。
［３］以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるプロテアーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号５又は配列番号６に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号５又は配列番号６に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つアルギニン−プロリンの間を切断する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［４］［３］に記載のプロテアーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
［５］［４］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
［６］以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、プロテアーゼの製造法：
（１）［５］に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（２）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［７］［１］又は［２］に記載のプロテアーゼを有効成分とする酵素剤。
［８］アクロシンを有効成分とする、アルギニン−プロリンの間を切断する酵素剤。
［９］［１］又は［２］に記載のプロテアーゼ、或いは［７］又は［８］に記載の酵素剤でタンパク質を処理することを特徴とする、タンパク質の分解方法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】質量分析法による卵外被ZP糖タンパク質断片の検出。受精時に精子プロテアーゼの基質となる卵外被（ZP糖タンパク質からなる細胞外マトリクス）をニワトリ精子と15分間および30分間反応させ、in vitroでの卵外皮タンパク質の分解を調べた。反応後、遊離したプロテアーゼ分解物を分離して質量分析により切断部位を同定した。
【図２】質量分析法による卵外被ZP糖タンパク質断片の検出（続き）。同定された精子プロテアーゼによる分解断片（配列中の下線部分）。ZP1分子（配列番号７）の繰り返し配列領域が優先的に切断されており、そのすべてがRP（アルギニン−プロリン）の間で切断されている。
【図３】経時的な卵外被の分解。細胞分画によって調製した精子粗酵素溶液と卵外被を37℃で0時間から24時間反応させた。遠心分離（16,000xg、10 min、4℃）によって上清と沈殿に分け、CBB染色および免疫ブロット解析を行った。パネルAに阻害剤を加えない、精子粗酵素溶液のみでの結果を示す。経時的にZP1が分解される様子が見られた（図中の＊）。パネルBに阻害剤としてSBTIを加えた場合の結果を示す。ZP1の分解が遅れ、断片化は見られなくなった。
【図４】ニワトリおよびブタ精子粗酵素溶液の活性。窒素ガス破砕によって調製したニワトリおよびブタ精子粗酵素溶液の、トリプシン様活性における基質特異性を解析した。5種類のトリプシン様活性測定基質を用いた結果を示す。比較としてトリプシン（TPCK処理）を用いた結果を示す。ニワトリ精子粗酵素溶液はBoc-Glu(OBzl) -Gly-Arg-MCAを用いた場合、非常に高い活性を示した。一方ブタ精子粗酵素溶液は、酵素活性化処理の有無にかかわらず（不活性、活性化）、Z-Val-Val-Arg-MCAを用いた場合に一番高い活性を示した。ニワトリとブタを比較するとニワトリの方が比活性が高いという結果であった。
【図５】ニワトリ、ブタおよびラット精子粗酵素溶液の活性。氷上でZP1組換えタンパク質（Trx-ZP1 repeated region）114 ngと精子粗酵素溶液およびトリプシン溶液（図中に各溶液に含まれるタンパク質量を示した）を混合し(全量で40μl)、37℃で17時間インキュベートしたのち、その5μlを用いて免疫ブロット解析を行った。パネルAに使用した組換えタンパク質の模式図を示す。ZP1の配列にアルギニン−プロリンという配列は12か所存在している。パネルBに、ブタおよびニワトリ精子粗酵素溶液について、抗ZP1抗体を用いた免疫ブロット解析の結果を示す。ブタおよびニワトリ精子粗酵素溶液でZP1組換えタンパク質の断片化が見られ、ニワトリの精子粗酵素溶液を用いた方がより低分子化して細かく断片化していた（図中の＊）。一方、トリプシンでは断片化が見られなかった。使用した精子粗酵素溶液タンパク質量を比較するとニワトリはブタの1/7であった。パネルCに、ラット精子粗酵素溶液について免疫ブロット解析の結果を示す。活性は低いものの、ZP1組換えタンパク質の断片化が見られる（図中の＊）。以上の結果から、ニワトリ精子粗酵素溶液の比活性が高いことが推測された。
【図６】SBTI-agaroseによる精子プロテアーゼの精製・同定。SBTIによって活性が抑えられるニワトリ精子プロテアーゼの精製を行った。ニワトリ精子粗酵素溶液からSBTI-agaroseを用いてバッチ法で精製を行った。パネルAに精製を行った結果を示す。Sample buffer画分に2本のバンドが検出された。これらのバンドはザイモグラフィーの結果から、プロテアーゼ活性を有していることが明らかとなった。パネルBに抗quail Acrosin抗血清を用いた免疫ブロット解析の結果を示す。45kDaのバンドが検出された。パネルCに、45kDaおよび30kDaのバンドを質量分析に供した結果を示す。45kDaのバンドはAcrosin、30kDaのバンドはAcrosin-likeであると同定された。これらの配列を基に改めてcDNAクローニングを行い、45kDaのバンドをAcrosin-a、30kDaのバンドをAcrosin-bと命名した。
【図７】SBTI-agaroseによる精子プロテアーゼの精製・同定（続き）。SBTIによって活性が抑制されるニワトリ精子プロテアーゼの精製を行った。パネルAとは異なり酢酸溶液を用いてプロテアーゼを溶出した結果をパネルDに示す。酢酸溶液による溶出画分の内、E2、E3、E4およびE5にバンドが検出された。ゼラチンを基質としたザイモグラフィーの結果から、E2においては40kDaおよび30kDaプロテアーゼの存在が示唆された。パネルEに5種類の蛍光基質を用いた各画分のプロテアーゼ活性測定結果を示す。溶出画分E2、E3およびE4で活性が見られた。
【図８】SBTI-agaroseによる精子プロテアーゼの精製・同定（続き）。パネルFに溶出画分E2およびE3でみられたバンドの質量分析結果を示す。溶出画分2にみられた40kDaプロテアーゼはAcrosin-bの分子量が異なるものであることが明らかとなった。酢酸による溶出画分の内、前の5つ（E1〜E5）を用いて、卵外被の分解を行った。パネルGに反応溶液のpHを合わせず、酸性条件下で行った場合の結果を示す。酢酸によってpHが3〜5となっていた。E2を用いた場合、repeated regionの断片化と似たような結果が観察された（図中の＊）。したがって、E2画分に含まれるプロテアーゼが酸性条件下でアルギニン−プロリンを特異的に切断するものと推定された。E2画分には30kDaおよび40kDa Acrosin-bが存在していることから、Acrosin-bがZP1の繰り返し配列領域、アルギニン-プロリンの間を特異的に切断するプロテアーゼであると推定された。表中の配列は上から順に配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である、「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
【０００８】
単離された酵素の純度は特に限定されない。但し、純度の高いことが要求される用途への適用が予定されるのであれば、単離された酵素の純度は高いことが好ましい。天然材料に由来する場合の「純度が高い」酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約30％未満、好ましくは約20％未満、更に好ましくは約10％未満、より一層好ましくは約5％未満。最も好ましくは約1%未満である。天然材料に由来する夾雑タンパク質を実質的に含まない状態も典型的な「単離された状態」の一つである。
【０００９】
一方、遺伝子工学的手法によって調製された場合の「純度が高い」酵素では、夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約30％未満、好ましくは約20％未満、更に好ましくは約10％未満、より一層好ましくは約5％未満。最も好ましくは約1%未満である。使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態も典型的な「単離された状態」の一つである。
尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「アルギニン−プロリンの間を切断する酵素」と記載した場合は「単離された状態にある、アルギニン−プロリンの間を切断する酵素」を意味する。当該用語の代わりに使用される用語「本発明のプロテーゼ」や「本酵素」についても同様である。尚、本明細書では慣例の標記法に従い左端がアミノ末端、右端がカルボキシ末端となるようにペプチドを表記する。
【００１０】
本発明者らは、アルギニン−プロリンの間を切断する酵素（プロテアーゼ）がニワトリ精子中に存在することを見出すとともに、その単離・同定に成功した。当該成果に基づき、本発明は新規プロテアーゼ（以下、「本酵素」とも呼ぶ）及びそれをコードする遺伝子を提供する。
【００１１】
（新規プロテアーゼ）
一態様では、本発明のプロテアーゼは配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列有するという特徴を備える。配列番号１のアミノ酸配列は、アフィニティー精製後のサンプルをSDS-PAGEで分析した際（後述の実施例を参照）、45kDaのバンドとして認められたタンパク質（Acrosin-aと命名した）に対応する。配列番号２のアミノ酸配列は、同様に、30kDaのバントとして認められたタンパク質（Acrosin-bと命名した）に対応する。尚、配列番号１のアミノ酸配列にシグナルペプチドが付加された配列を配列番号３に、配列番号２のアミノ酸配列にシグナルペプチドが付加された配列を配列番号４にそれぞれ示す。
【００１２】
ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなり、アルギニン−プロリンの間を切断する活性を有するタンパク質（以下、「等価タンパク質」ともいう）を提供する。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではアルギニン−プロリンの間を切断する活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。「アルギニン−プロリンの間を切断する活性を有する」とは、タンパク質又はペプチド内のアルギニン−プロリン部位を切断できることを意味するが、その活性の程度は、特段問わない。但し、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。また、アルギニン−プロリンの間を切断できる限りにおいて、プロリンの代わりに他のアミノ酸がアルギニンと結合している場合にも分解活性を示すものであってもよい。尚、アルギニン−プロリンの間を切断する活性は、後述の評価法（蛍光合成基質又はZP1繰り返し配列領域組換えタンパク質を用いた測定方）で評価することができる。
【００１３】
「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はアルギニン−プロリンの間を切断する活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの「複数」とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価タンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。
【００１４】
好ましくは、アルギニン−プロリンの間を切断する活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって等価タンパク質を得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１５】
「等価タンパク質」が付加的な性質を有していてもよい。かかる性質として、例えば、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、至適pHが異なるという性質等が挙げられる。
【００１６】
ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
【００１７】
本酵素が、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
【００１８】
本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌や酵母）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００１９】
（新規プロテアーゼをコードするDNA）
本発明は本酵素に関連する核酸も提供する。即ち本酵素をコードする遺伝子、本酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、本酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号１又は２のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号５に示す塩基配列（配列番号１のアミノ酸配列をコードする）からなるDNA、及び配列番号６に示す塩基配列（配列番号２のアミノ酸配列をコードする）からなるDNAである。
【００２０】
本酵素をコードする遺伝子は典型的には本酵素の調製に利用される。本酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の本酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の本酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、本酵素をコードする遺伝子の用途は本酵素の調製に限られない。例えば、本酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは本酵素の変異体（改変体）をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
【００２１】
本発明において「アミノ酸配列をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を含む発現産物（タンパク質）が得られるDNA、即ち、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
【００２２】
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
【００２３】
本発明の他の態様では、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「等価核酸」ともいう。また、等価核酸を規定する塩基配列を「等価塩基配列」ともいう）が提供される。等価核酸の例として、本発明の本酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、本酵素に特徴的な酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2〜40塩基、好ましくは2〜20塩基、より好ましくは2〜10塩基である。配列番号５の塩基配列では１番塩基〜1065番塩基まで、配列番号６の塩基配列では331番塩基〜1368番塩基までがORF（オープンリーディングフレーム）であり、当該領域に対する大幅な改変は本来の活性を喪失させやすい。対照的に、ORF以外の部分は大幅な改変も許容し得る。
【００２４】
以上のような等価核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価核酸を得ることができる。
【００２５】
本発明の他の態様は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
【００２６】
本発明の更に別の態様は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその等価塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００２７】
本発明の更に他の態様は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
【００２８】
本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（本酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
【００２９】
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC18など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
【００３０】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
【００３１】
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００３２】
宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌（エシェリシア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ本酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
【００３３】
本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)〕、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は本酵素の生産に利用できる。
【００３４】
（新規プロテアーゼの製造法）
本発明の更なる局面は本酵素（プロテアーゼ）の製造法を提供する。本発明の製造法では上記の形質転換体を用いて本酵素を製造する。この製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（１））。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、プロテアーゼ）を回収する（ステップ（２））。培養液又は菌体よりプロテアーゼが回収される。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過（例えば珪藻土をろ過助剤としたろ過）、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、ビーズ処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。尚、各精製工程では原則としてプロテアーゼ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。
【００３５】
本酵素の精製度は特に限定されない。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００３６】
（酵素剤）
本酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００３７】
本酵素剤の一態様では、アクロシン（Acrosin）が一般にアルギニン−プロリンの間を切断し得るとの知見に基づき、アクロシンを有効成分として含有する。アクロシンの由来は特に限定されない。アクロシンの例として、ブタ由来のアクロシン（アミノ酸配列の例を配列番号３３（Acrosin precursor, Sus scrofa (pig), NCBI accession number NP_999198）に示す）、マウス由来のアクロシン（アミノ酸配列の例を配列番号３４（Acrosin precursor, Mus musculus (mouse) NCBI accession number NP_038483）に示す）、ラット由来のアクロシン（アミノ酸配列の例を配列番号３５（Acrosin precursor, Rattus norvegicus (rat) NCBI accession number NP_036622）に示す）、ウシ由来のアクロシン（アミノ酸配列の例を配列番号３６（Acrosin precursor, Bos taurus (cattle) NCBI accession number NP_776311）に示す）、ヒト由来のアクロシン（アミノ酸配列の例を配列番号３７（Acrosin precursor, Homo sapiens (human) NCBI accession number NP_001088）に示す）を挙げることができる。
【００３８】
（新規プロテアーゼの用途）
本発明の更なる局面は本酵素又は本酵素剤の用途を提供する。本酵素及び本酵素剤は様々な用途で利用可能である。本発明が提供する用途の一つはタンパク質の分解である。即ち、本酵素又は本酵素剤でタンパク質を処理することを特徴とするタンパク質分解方法を提供する。本酵素によって切断され得るアルギニン−プロリン部位を有する限り、分解対象となり得るタンパク質は特に限定されない。本明細書では、「タンパク質」と「ポリペプチド」を交換可能な用語として使用する。従って、用語「タンパク質」には、任意の長さの様々なポリペプチドが包含される。
【００３９】
反応条件（処理条件）は、本酵素の作用が発揮される限り特に限定されない。反応温度条件の例として30℃〜40℃、pH条件の例としてpH 3〜10を挙げることができる。
【実施例】
【００４０】
受精時に精子は、卵外被と呼ばれる卵細胞を覆う細胞外マトリクスを通過しなければならない。この時に精子が卵外被を構成するZP糖タンパク質を分解し、穴をあけることが推定されている。これまでの研究から、ニワトリでは精子との反応後、卵外被上に巨大な穴が観察されること、ニワトリ精子と卵外被を反応させるとZP糖タンパク質の断片化が起こることが明らかとなっている（Takeuchi Y. et al., Biol Reprod. 64, 822-830 (2001））しかし、正確なZP糖タンパク質の切断部位や断片化を引き起こす精子プロテアーゼは明らかとなっていない。そこで、以下の検討を行うことにした。
【００４１】
＜ZP糖タンパク質の切断部位の同定＞
１．材料と方法
（１）ニワトリ精子
凍結ニワトリ精液（精液原液の4倍希釈、約500μl、名古屋コーチン）を解凍し、MEM（SIGMA）を10 ml加え、遠心（700xg、5 min、4℃）した。上清を2 ml残すように吸い取り、沈殿を懸濁した。この溶液を精子懸濁液（精液原液の16倍希釈）として以下の実験で用いた。
【００４２】
（２）ニワトリ卵外被
産卵鶏卵巣より採取した黄色卵胞のうち、最も大きいもの（F1）の卵外被を用いた。まず、0.15 M NaCl/H2O（saline）で2回、0.65 M NaCl/H2Oで1回洗浄し、卵黄を洗い流した。次に50 mM EDTA/Saline（pH8.0）中で激しく振盪し、顆粒膜細胞層を分離した。卵外被は使用時まで-30℃で保存した。
【００４３】
（３）サンプルの調製
卵外被をスライドガラス（MATSUNAMI）上に広げ、MEM（Minimum Essential Medium Eagle；SIGMA）を30〜50μl加えた。そこに精子懸濁液あるいはMEMを10μl加え、37℃、5% CO2で15分間および30分間静置した。MEMを回収し、等量の0.2% TFA（トリフルオロ酢酸）を加えたものをサンプルとした。
【００４４】
（４）Zip Tipによる濃縮
ピペットマンP10（GILSON）にZipTipμ-C18 Pipette Tip（Millipore）を付け、10μlの100% アセトニトリルを出し切らないようにできるだけゆっくり10回ピペッティングしチップを湿潤化した。次に10μlの0.1% TFAで同様に10回ピペッティングし平衡化した。これらの処理後、サンプルを出し切らないようにゆっくり20回ピペッティングし、チップ先端のカラムに吸着させた。10μlの0.1% TFAを吸っては捨てることを10回繰り返し、カラムを洗浄した。最後にプロキープチューブ（タンパク質低吸着チューブ、Watson）に入れた0.1% TFA/50% アセトニトリル 5μlをゆっくり20回ピペッティングし、ペプチドを溶出させた。
【００４５】
（５）MALDI-TOF/MSによる質量分析
濃縮したペプチド抽出液を1μlずつ数回に分けてμFocus MALDI plate（Hudson surface technology）に全量アプライし、その上にマトリクス（5 mg/ml α-Cyano-4-hydroxyciannamic Acid（CHCA）、Wako）を1μlスポットした。自然乾燥によりマトリクスを結晶化させ、MALDI-TOF/MS；4700 Proteomic Analyzer（Applied Biosystems）にて測定した。4700 Proteomic Analyzerを用いた測定は、Positive ion reflector modeで800-4800 Daの範囲で行った。また、スタンダードとして4700 Proteomic Analyzer mass standard kit（Applied Biosystems）を用いた。
【００４６】
（６）ペプチドマスフィンガープリンティング法（PMF）およびタンデム質量分析法（MS/MS）による同定
測定後、Mascot（http://www.matrixscience.com/あるいはhttp://dh4pznbx/mascot/）を用いてデータベース検索を行い、分解断片の同定を行った。検索条件は以下のようにした。
Peptide Mass Fingerprint（MS）；Database：NCBInr、Taxonomy：Metazoa（Animals）、Enzyme：Trypsin/P or None、Max missed cleavages：1、Fixed modifications：none、Variable modifications：none、Peptide tol.：±0.25 Da、Mass values：MH+
MS/MS Ion Search（MS/MS）；Database：NCBInr、Taxonomy：Metazoa（Animals）、Enzyme：Trypsin/P or None、Max missed cleavages：1、Fixed modifications：none、Variable modifications：none、Peptide tol.：±0.25 Da、Mass values：MH+、MS/MS tol.：±0.25 Da、Protein Mass：Unrestricted、Peptide charge：1+、Instrument：MALDI-TOF-TOF
【００４７】
２．結果（図１、２）
切断部位の同定を試みた。射出精子と卵外被を反応させ、断片化によって遊離するペプチドを回収した。回収したペプチドを質量分析に供し、配列を解析した。配列の解析にはMascotを用いた。Mascotは各種パラメータを設定し、既存のデータベースに登録されているタンパク質中の配列と一致するかを検索する。初めに設定したパラメータでは、質量分析によってピークが検出されているにもかかわらず、既知の配列には全くヒットしなかった。受精に関わる精子プロテアーゼとしてこれまでに報告されてきたものはトリプシン様のセリンプロテアーゼであったため、最初のパラメータでは切断酵素としてトリプシンを選択していた。トリプシンを選択すると、アルギニンまたはリジンのカルボキシ末端側で切断されたペプチドとして検索を行う。この条件では全くヒットしなかったので、次に切断酵素を指定せずに検索を行った。すると、いくつかのピークがヒットした。ヒットした配列を持つペプチドはニワトリのZP糖タンパク質の一つであるZP1由来のものであり、これらのペプチドはすべてアルギニン−プロリンの間で切断されて生成したことが分かった。一般的にトリプシンなどのセリンプロテアーゼは、アルギニンまたはリジンの次（C末端側）にプロリンが存在すると切断効率が著しく低下することが知られている（Keil B. Specificity of proteolysis. Springer-Verlag(1992); Rodriguez J. et al., J Proteome Res. 7, 300-305(2008)）。そのため、Mascotにおいても、アルギニン−プロリンおよびリジン−プロリンを除いて検索するTrypsinと、それらも含めて検索するTrypsin/Pという二種類のパラメータが設定されている。この結果をふまえて、Trypsin/Pで再検索したところ、末端の配列を指定したことでより多くのピークがヒットし、そのすべてがアルギニン−プロリンの間で切断されていた。以上の結果から、ニワトリの精子中には通常のトリプシン様セリンプロテアーゼでは切断されない、アルギニン−プロリンの間を切断するプロテアーゼが存在していることが明らかとなった。また、ニワトリの卵外被ZP1糖タンパク質の特定の領域（繰返し配列領域）にアルギニン−プロリン配列が多数存在することも明らかとなった。
【００４８】
＜精子粗酵素溶液によるZP1糖タンパク質の分解＞
１．材料と方法
（１）精子粗酵素溶液の調製
ニワトリ精液（白色レグホン）を遠心分離（700xg、10 min、4℃）し、上清（精漿）および沈殿（精子）を得た。沈殿にHBS（20 mM HEPES；pH7.4、150 mM NaCl）を1 ml加え再懸濁した。遠心分離（700xg、10 min、4℃）し、沈殿にHBSを精液の4倍量加え再懸濁した。これを精子懸濁液とした。この精子懸濁液に1/100量の0.2 M PMSF（終濃度2 mM）および1/1000量の10 mg/ml ロイペプチン（終濃度10μg/ml）を加え、パール窒素ガス細胞破砕機（Parr）の中に入れた。細胞破砕機の目盛が450 psiになるまで窒素ガスを加え、4℃で30分間静置した。30分後、破砕機のバルブを緩め、急速に常圧に戻すことで精子を破砕した。得られた精子細胞破砕溶液を遠心分離（15,000xg、10 min、4℃）した。上清を超遠心用チューブに移し、ローター（TLA100.3、Beckman）にセットし超遠心分離（100,000xg、45 min、4℃）した（TL-100あるいはOptima TLX、Beckman）。上清を精子粗酵素溶液（S100）とした。
【００４９】
（２）酵素粗溶液による卵外被糖タンパク質の分解と卵外被からの遊離
湿重量50 mgの卵外被F1に、HBSを950μl加え超音波処理（output10、10s、氷上）後、65μlずつ分注した（湿重量1 mg当たりHBS 19μl）。そこに10倍希釈した精子粗酵素溶液を3.125μlずつ加えた。また0.4 mM SBTI（Soybean trypsin inhibitor、SIGMA）加えたもの（終濃度17μM）も用意した。それぞれを37℃で2、4、8、24時間インキュベートし、氷上で5分間静置することで反応を停止した。0時間インキュベートのサンプルについては精子粗酵素溶液を加えたときから氷上に静置した。反応停止後、遠心分離（16000xg、10 min、4℃）を行い上清と沈殿に分けた。沈殿には65μlのHBSを加え懸濁した。
【００５０】
（３）CBB染色
上清および沈殿3μl（湿重量48μg相当）に5x SDS-サンプルバッファー（+5% β-Me）を0.75μl加え、100℃で3分間加熱した。それぞれのサンプルを、12.5%アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分画後、CBB染色を行った。
【００５１】
（４）免疫ブロット解析
CBB染色サンプルの1/20量（湿重量2.4μg相当）のサンプルを、12.5%アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分画後、免疫ブロット解析を行った。使用した抗体を以下に示す。
一次抗体：マウス抗ZP1繰り返し配列領域抗血清（1:5,000）
二次抗体：POD-抗マウスIgG抗体（Cell Signaling）（1:10,000）
【００５２】
２．結果（図３）
ZP糖タンパク質（ZP1、97 kDa）の分解を残存するタンパク質断片のSDS-PAGE分析により経時的に観察した。上述したように、質量分析の結果から、ZP1の繰り返し配列を含む領域に多数存在するアルギニン−プロリン配列が選択的に分解されることが分かった。精子粗酵素溶液と卵外被（不溶性マトリクス）を反応させ、ZP1の繰り返し配列領域に対する特異抗体を用いて免疫ブロット解析を行ったところ、経時的な断片化・低分子化が観察された。酵素処理後の不溶性画分では45 kDaの分解断片が検出され、繰り返し配列領域はそれ以上分解されなかったが、可溶性画分の15〜40 kDaのラダー状の多様な分解断片は反応時間とともに更に低分子化して多くが検出限界以下の小さなペプチドにまで分解された。この反応系中に大豆トリプシンインヒビター（SBTI）を加えたところ、断片化が顕著に抑制された。ZP1は、可溶性画分においても繰返し配列領域を含む50 kDa以上の大きな分解断片として安定に残存した。したがってアルギニン−プロリン配列を切断する酵素は、通常のセリンプロテアーゼと同様に、SBTIで阻害されることが明らかとなった。
【００５３】
＜精子粗酵素溶液の酵素活性＞
１．材料と方法
（１）ブタ精子粗酵素溶液の調製および活性化
ブタ精液2 mlを遠心分離（200xg、10 min、28℃）し、上清（精漿）および沈殿（精子）を得た。沈殿にNCM (non-capacitating medium, 100 mM NaCl, 0.36 mM NaH2PO4・2H2O, 8.6 mM KCl, 23 mM HEPES, 0.5 mM MgCl2・6H2O, 11 mM glucose)を6 ml加え再懸濁した。遠心分離（200xg、10 min、28℃）し、沈殿に20 mM glycine-HCl(pH3.0)を2 ml加え再懸濁した。これを精子懸濁液とした。この精子懸濁液に1/100量の0.2 M PMSF（終濃度2 mM）および1/1000量の10 mg/ml ロイペプチン（終濃度10μg/ml）を加え、パール窒素ガス細胞破砕機（Parr）の中に入れた。細胞破砕機の目盛が450 psiになるまで窒素ガスを加え、4℃で30分間静置した。30分後、破砕機のバルブを緩め、急速に常圧に戻すことで精子を破砕した。得られた精子細胞破砕溶液を遠心分離（15,000xg、10 min、4℃）した。上清を超遠心用チューブに移し、ローター（TLA100.3、Beckman）にセットし超遠心分離（100,000xg、45 min、4℃）した（TL-100あるいはOptima TLX、Beckman）。上清を精子粗酵素溶液（S100）とした。
【００５４】
精子粗酵素溶液20 μlを0.1 M Tris-HCl (pH8.5) 180 μlに加え、室温で1時間静置した。静置後の溶液を活性化ブタ精子粗酵素溶液とした。
【００５５】
（２）ラット精子粗酵素溶液の調製
精巣上体より回収したラット精子をTYH培地(119.37 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.19 mM KH2PO4, 1.71 mM CaCl2・2H2O, 1.19 mM MgSO4・7H2O, 25.07 mM NaHCO3, 5.56 mM glucose)で懸濁、洗浄した。遠心分離(1000xg、10 min、4℃)し、沈殿（精子）を得た。沈殿に20 mM glycine-HCl(pH3.0)を500μl加え再懸濁した。以降を上記のブタ精子粗酵素溶液の調製法と同様に行った。
【００５６】
（３）活性の測定（蛍光合成基質）
Nuncフルオロヌンクプレート（Nunc）の各ウェルに、0.1 M Tris-HCl (pH8.5) 188μlと以下に示す蛍光合成基質（10 mMになるようにDMSOで溶解したもの）2μlを加えた（酵素溶液を加えた段階で終濃度100μM）。それぞれのウェルに適当に希釈した精子粗酵素溶液を10μl加え、37℃で30分間あるいは60分間静置した。静置後、蛍光/マイクロプレートリーダーFluoroskan Ascent（Thermo）を用いて励起波長355 nm、吸収波長460 nmの蛍光を測定した。以下の蛍光基質はすべて株式会社ペプチド研究所から購入した。
Boc-Glu (Obzl)-Gly-Arg-MCA (E-G-R)、Boc-Val-Pro-Arg-MCA (V-P-R)、Z-Val-Val-Arg-MCA (V-V-R)、Z-Leu-Arg-MCA (L-R)、Boc-Val-Leu-Lys-MCA (V-L-K)
【００５７】
（４）活性の測定（ZP1組換えタンパク質）
氷上でZP1繰り返し配列領域組換えタンパク質（Trx-ZP1 repeated region）114 ngと適当に希釈した精子粗酵素溶液およびトリプシン溶液を混合し、0.1 M Tris-HCl (pH8.5)を用いて全量を40μlとした。それぞれを37℃で17時間インキュベートしたのち、5μlを用いて免疫ブロット解析を行った。使用した抗体を以下に示す。
一次抗体：マウス抗ZP1繰り返し配列領域抗血清（1:5,000）、マウス抗Trx抗血清（1:5,000）
二次抗体：POD-抗マウスIgG抗体（Cell Signaling）（1:10,000）
【００５８】
（５）Bradford法によるタンパク質の定量
Coomassie (Bradford) Protein Assay Reagent（Thermo scientific）を用いて行った。標準曲線の作製には牛血清アルブミンを用いた。
【００５９】
２．結果（図４、５）
精子粗酵素溶液の酵素活性を測定した。ニワトリおよび比較対照としてブタおよびラットの精子粗酵素溶液を調製し、蛍光合成基質[N-末端側に異なるアミノ酸配列を持つアルギニンの4-Methyl-Coumaryl-7-Amide (MCA)]およびZP1繰返し配列領域組換えタンパク質[アルギニン−プロリン配列を持つ繰返し配列領域とチオレドキシンとの融合タンパク質]を基質として用いたプロテアーゼ活性測定を行った。蛍光合成基質を用いた解析では、ニワトリおよびブタで基質特異性が異なっていることが明らかとなった。一方、ラットの粗酵素液では活性が極めて低く特異性は明らかにできなかった。また、ZP1繰返し配列領域組換えタンパク質を用いた解析では、トリプシンではほとんど分解されないが、ニワトリ、ブタおよびラットの精子粗酵素溶液では卵外被と同様のラダー状の分解断片が生成した。また、ニワトリ精子粗酵素液を用いた場合の方が７倍量のブタ精子粗酵素液あるいは400倍量のラット粗酵素液を用いた場合よりも断片化・低分子化が進んでおり（残存する断片のバンド分子量が小さくバンド強度も薄い）、ニワトリ精子のプロテアーゼの方がアルギニン−プロリン配列の切断に対して高い比活性を持つことが示唆された。
【００６０】
＜新規精子プロテアーゼの精製と同定＞
１．材料と方法
（１）SBTIアガロースによる精子プロテアーゼの精製（SDS-PAGEサンプルバッファーによる溶出）
バッチ法により精製を行った。マイクロチューブにimmobilized soybean trypsin inhibitor resin（Thermo scientific、50%スラリー）50μlと1x SBTI Binding buffer（50 mM Tris-HCl；pH7.2、100 mM NaCl、10 mM CaCl2）100μlを加え4℃で15分間混和し、平衡化した。遠心分離（1,000xg、2 min、4℃）し、沈殿に精子粗酵素溶液（S100）100μlと、2x SBTI Binding buffer 100μlを加え、4℃で一晩混和した。遠心分離（1,000xg、2 min、4℃）し、上清を素通り（FT）画分とした。沈殿を1x SBTI Binding buffer 200μlで2回洗浄し、上清を回収した（洗浄画分、Wash1、Wash2）。沈殿（resin）に100μlの2.5x SDS-サンプルバッファー（非還元）を加え、SBTIに結合したタンパク質を回収した（Sample buffer）。各画分の1/20量を、12.5%アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分画後、銀染色および免疫ブロット解析を行った。使用した抗体を以下に示す。
一次抗体：マウス抗ウズラACR抗血清（採血3回目）（1:1,000）
二次抗体：POD-抗マウスIgG抗体（Cell Signaling）（1:5,000）
【００６１】
また、Sample buffer画分を除く各画分2μl（全体の1/100量）を用いて合成基質による酵素活性を測定した。Sample buffer画分は、5μl（全体の1/20量）を用いて0.1%ゼラチンを基質としたザイモグラフィーを行い、酵素活性を検出した。
【００６２】
（２）質量分析のためのCBB染色
Sample buffer画分40μl（全体の2/5量）を、12.5%アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分画後、CBB染色を行った。ただし、CBB染色液は未使用のものを用いた。
【００６３】
（３）ゲル内消化用サンプルの調製
適度な染色図が得られるまで脱色したゲルからライトボックス上で目的のバンドをスパーテルで切り出した。切り出したゲル片を1 mm角に刻んで1.5 mlチューブに移した。脱色液I（50% アセトニトリル/1 mM NH4HCO3）を1 ml加えて16℃で15分間攪拌した。攪拌後、ゲルを吸い込まないように脱色液を取り除いた。次に脱色液II（30% アセトニトリル/1 mM NH4HCO3）を1 ml加えて16℃で15分間攪拌した。この操作を繰り返して、ゲル片を完全に脱色した。脱色液を捨て、還元液（0.3% EDTA、15 mM DTT、2 mM NH4HCO3）を500μl加えて16℃で15分間攪拌した。攪拌後、還元液を捨て、アルキル化液（0.3% EDTA、0.1 M アクリルアミド、2 mM NH4HCO3）を500μl加えて、16℃で15分間攪拌した。攪拌後、アルキル化液を捨て、脱色液1を1 ml加えて16℃で30分間攪拌した。脱色液を入れ替えて同じ操作をあと3回繰り返した。脱色液を除いた後、100% アセトニトリルを100μl加えて16℃で5分間攪拌した。上清を除き、Speed Vacを用いて15分間真空にしてゲル片を乾燥させた。
【００６４】
（４）トリプシンによるゲル内消化
氷上で、乾燥させたゲル片に2 mM NH4HCO3で希釈した0.0125μg/μl trypsin（Trypsin Gold, Mass Spectometry Grade; Promega）溶液を5μl染み込ませ30分間静置した。静置後、10μlの2 mM NH4HCO3を加えた。余分な液を除き、37℃で一晩トリプシン消化を行った。消化物に抽出液I（0.1 % TFA）を50μl加えて16℃で20分間攪拌した。生成されたペプチド抽出液を新しい1.5 mlチューブに移し、Speed Vacにより濃縮した。残ったゲルに抽出II（0.1% TFA/50% acetonitril）を50μl加えて16℃で20分間攪拌した。ペプチド抽出液を先ほど回収・濃縮した液に加えて、再度Speed Vacにより濃縮した。ゲルに抽出液III（100% acetonitril）を50μl加えて16℃で20分間攪拌して、さらにペプチドを抽出した。ペプチド抽出液を先ほど回収・濃縮した液に加えてSpeed Vacにより3〜5μl程度になるように濃縮した。
【００６５】
（５）MALDI-TOF/MSによる質量分析
濃縮したペプチド抽出液を1μlずつ数回に分けてμFocus MALDI plate（Hudson surface technology）に全量アプライし、その上にマトリクス（5 mg/ml α-Cyano-4-hydroxyciannamic Acid（CHCA）、Wako）を1μlスポットした。自然乾燥によりマトリクスを結晶化させ、MALDI-TOF/MS;4700 Proteomic Analyzer（Applied Biosystems）にて測定した。4700 Proteomic Analyzerを用いた測定は、Positive ion reflector modeで800-5000 Daの範囲で行った。また、スタンダードとして4700 Proteomic Analyzer mass standard kit（Applied Biosystems）を用いた。
【００６６】
（６）タンデム質量分析法（MS2）による同定
測定後、Mascot（http://www.matrixscience.com/あるいはhttp://dh4pznbx/mascot/）を用いてデータベース検索を行い、分解断片の同定を行った。検索条件は以下のようにした。
MS/MS Ion Search（MS2）；Database：NCBInr、Taxonomy：Metazoa（Animals）、Enzyme：Trypsin、Max missed cleavages：1、Fixed modifications：Propionamide（C）、Variable modifications：Oxidation（M）、Peptide tol.：±0.25 Da、Mass values：MH+、MS/MS tol.：±0.25 Da、Protein Mass：Unrestricted、Peptide charge：1+、Instrument：MALDI-TOF-TOF
【００６７】
（７）cDNAクローニング
質量分析でヒットした推定（PREDICTED）:Acrosin（GI:363727327）および推定（PREDICTED）:Acrosin-like（GI:363727333）の塩基配列をもとにORFのcDNA断片を増幅するためのプライマーを作製しクローニングを行った。45kDaタンパク質については対応するcDNAが増幅されたが、30kDaタンパク質については増幅されなかった（おそらく登録されている推定（PREDICTED）D:Acrosin-like（GI:363727333）は間違った推定と判断される）。そこで、ORFの一部を増幅する種々のプライマーを調製してDNA断片を増幅した結果、ORFの中央付近の約500 bpのcDNA断片を増幅することができた。その配列をもとに、さらに上流および下流を増幅するプライマーを設計して、5’-RACE法および3’-RACE法を用いて30 kDaタンパク質をコードする完全長cDNAをクローニングした。塩基配列をデータベースに登録した（Accession number: AB769485）。
【００６８】
（８）SBTIアガロースによる精子プロテアーゼの精製（酢酸による溶出）
マイクロチューブにimmobilized soybean trypsin inhibitor resin（Thermo scientific、50%スラリー）200μlと1x SBTI Binding buffer（50 mM Tris-HCl; pH7.2、100 mM NaCl、10 mM CaCl2）500μlを加え4℃で15分間混和し、平衡化した。遠心分離（1,000xg、5 min、4℃）し、沈殿に精子粗酵素溶液（S100）100μlと、2x STI Binding buffer 100μlを加え、4℃で一晩タッピングしながら混和した。ピペットマンP1000用のチップにグラスウールを詰め、チューブとコックを装着しミニカラムを作製した。低温室でこのミニカラムにresinを移した。マイクロチューブに1x SBTI Binding bufferを200μl加え、残っていたresinを懸濁しカラムへ移した。1時間静置し、resinを沈ませた。コックを開け、素通り画分（FT）400μlを回収した。カラムに1x SBTI Binding bufferを500μl加え、250μlずつ回収した（洗浄画分、W1、W2）。カラムにSBTI Elution buffer（500 mM Acetic acid、10 mM CaCl2）を400μl加え、100μlずつ3本回収（溶出画分、E1〜E3）したのち、コックを閉じた。回収した溶液が酸性になっている事をpH試験紙によって確認し、さらにSBTI Elution bufferを600μl加えた。1時間静置後コックを開け、100μlずつ回収した（E4〜E10）。最後に、1x SDS-サンプルバッファー（非還元）を250μl加え、溶液を回収した。
【００６９】
（９）精製の確認
1 M Trisを用いてそれぞれのサンプルのpHを中性にしたのち、Inputおよび素通り画分は1/20量、洗浄画分は1/25量、溶出画分は1/10量、サンプルバッファーによる画分は1/12量を、12.5% アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分画後、銀染色および免疫ブロット解析を行った。使用した抗体を以下に示す。
一次抗体：マウス抗ウズラACR抗血清（採血3回目）（1:1,000）
二次抗体：POD-抗マウスIgG抗体（Cell Signaling）（1:5,000）
【００７０】
また、Inputおよび素通り画分は1/100量、洗浄画分は1/125量、溶出画分は1/40量、サンプルバッファーによる画分は1/48量を用いて0.1%ゼラチンを基質としたザイモグラフィーを行い、酵素活性を検出した。さらに、素通り画分および洗浄画分5μl、溶出画分1μl（Boc-Glu (Obzl)-Gly-Arg-MCA）、または素通り画分および洗浄画分10μl、溶出画分3μl（Boc-Val-Pro-Arg-MCA、Z-Val-Val-Arg-MCA、Z-Leu-Arg-MCA、Boc-Val-Leu-Lys-MCA）を用いて蛍光基質による活性を測定した。
【００７１】
（１０）溶出画分を用いた卵外被の分解
（ａ）pH未調整の場合
湿重量20 mgのF1卵外被を、0.15 M NaClおよび0.65 M NaCl 1 mlで洗浄した。洗浄後の卵外被にHBS(pH 7.4)を450μl加え超音波処理（output10、10s、氷上）後、75μlずつ6本に分注した。氷上でそれぞれに溶出画分（E1〜E5）あるいはSBTI Elution buffer（500 mM Acetic acid、10 mM CaCl2）を10μl加えた（終濃度は約60 mM acetic acidとなる）（1 mg（wet weight）/25μl）。40μl取り、遠心分離（16000xg、10 min、4℃）を行い上清と沈殿に分けた（0時間サンプル）。残りを37℃で16時間インキュベートし、氷上で5分間静置することで反応を停止した。反応停止後、遠心分離（16000xg、10 min、4℃）を行い上清と沈殿に分けた（16時間サンプル）。沈殿には上清と等量のHBSを加え懸濁した。
【００７２】
（ｂ）卵外被卵外被
上清および沈殿4μl（湿重量160μg相当）に5x SDS-サンプルバッファー（+5% β-Me）を1μl加え、100℃で3分間加熱した。それぞれのサンプルを、12.5% アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで分画後、CBB染色を行った。
【００７３】
２．結果（図６〜８）
新規精子プロテアーゼの精製を行った。大豆トリプシンインヒビターを用いたアフィニティー精製の結果、吸着タンパク質のSDS-PAGEサンプルバッファー溶出画分に2本のバンドが検出された。これらのバンドを質量分析に供したところ、45 kDaのバンドが推定（PREDICTED）:Acrosin（GI:363727327→GI:513157193）、30 kDaのバンドが推定（PREDICTED）:Acrosin-like（GI:363727333→GI:513157207）であると同定された。これらの配列情報はニワトリゲノムから推測された（エキソンをつなぎ合わせただけの）配列であると考えられたため、改めてcDNAクローニングを行い、塩基配列を決定した。45 kDaタンパク質のcDNA（配列番号５）は推定（PREDICTED）:Acrosinと一致した。一方、30 kDaタンパク質のcDNA（配列番号６）は推定（PREDICTED）:Acrosin-likeとは部分的に一致したものの明らかに異なる配列を含んでいたため、新規の遺伝子として登録した（未公開、Accession number: AB769485）。また、２つのcDNAの配列はいずれもほ乳類アクロシンと配列と類似性が見られたため、改めて45 kDaのバンドをAcrosin-a（配列番号１）、30 kDaのバンドをAcrosin-b（配列番号２）と命名した。質量分析によりそれぞれのタンパク質から２つのペプチド断片が同定され、それらのアミノ酸配列はcDNA塩基配列から推定されるアミノ酸配列の5.4％（Acrosin-a）および9.3%（Acrosin-b）をカバーしており、単離した２つのcDNAクローンは45 kDaおよび30kDaのセリンプロテアーゼをコードするものと判断した。次に精製した精子プロテアーゼが実際に活性を持っているかを確認した。同様にアフィニティー精製を行ったが、吸着タンパク質の溶出にはSDS-PAGEサンプルバッファーの代わりに酢酸を用いて、ZP1を基質としたアルギニン-プロリン切断酵素活性の測定を行った。それぞれの溶出画分を用いてZP1の分解を解析したところ、溶出画分2（E2）で反応上清画分にZP1特異的なラダー状の分解パターンが見られ、E2画分のみにアルギニン−プロリン切断酵素活性が存在すると判断した。溶出画分2に特異的なタンパク質（プロテアーゼ）は40 kDaのバンドのみであり、このバンドがアルギニン−プロリンの間を特異的に切断する酵素であると考えられた。この40 kDaのバンドを質量分析に供したところ、Acrosin-bの配列（上記の30 kDaのバンドと同じ２つのペプチド断片）が検出された。このことから、40 kDaおよび30 kDaのプロテアーゼはAcrosin-bのアイソフォームであると考えられた（おそらくプロセシングが異なるもの）。また、40 kDaという非還元条件SDS-PAGEによる推定分子量はcDNAから計算される理論分子量（36059.89；推定シグナルペペプチド部分を含まない）と大きく矛盾することはない。
【００７４】
以上の結果より、弱酸性条件下では、Acrosin-bの40kDaアイソフォームがZP1の繰り返し配列領域、アルギニン−プロリンの間を特異的に切断する活性を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明が提供する新規プロテアーゼは、アルギニン−プロリンの間を切断するという特徴的な活性を示す。既存のプロテアーゼに加えて本発明のプロテアーゼを使用することにより、例えば、質量分析法によるタンパク質の同定がより容易となる。本発明のプロテアーゼは、アルギニン−プロリン配列を持つタンパク質又は機能ドメインの探索や構造解析にも適用可能であり、研究用試薬としても有用である。
【００７６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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