(57)【要約】【課題】試料中のＣＹＰ３Ａ５＊３を検出する方法を見出すこと。【解決手段】薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型のうち、＊３アレルに関する多型部位を含む領域を特異的に増幅し得るように設計された一対のプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ３Ａ５の遺伝多型を検出できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＣＹＰ３Ａ５の遺伝多型を検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中のＣＹＰ３Ａ５＊３を検出する手段を含むことを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマーセットであって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマーセットを用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマーセットを含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号４に示される核酸配列からなる核酸プローブである、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、核酸プローブが末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブである、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行う、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
【請求項５】
配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、プライマーセット。
【請求項６】
配列番号４で示される塩基配列からなる、ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するためのプローブ。
【請求項７】
請求項５に示されるプライマーセットと、請求項６に示されるプローブとを組み合わせてなる、ＣＹＰ３Ａ５＊３検出用のプライマー・プローブのセット。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のプライマーセット、プローブ、または、プライマーセットとプローブとのセットを含む、ＣＹＰ３Ａ５＊３検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：以下、略して「ＳＮＰ」という場合がある）を検出する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物等の化学物質は、人体において、シトクロムＰ４５０による触媒作用によって無毒化される。このうち、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａサブファミリーは、既存薬物の半数以上の代謝に関与するといわれる重要な酵素である。ＣＹＰ３Ａサブファミリーには、互いに相同性が高い３つのタンパク質（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７）の存在が知られており、これらのタンパク質は互いに異なった遺伝子にコードされている。
【０００３】
成人肝臓に存在するＣＹＰ３Ａ４は、主要なＣＹＰ３Ａ酵素の一つであり、これまで検査された殆どすべての成人肝臓で検出されている。一方、ＣＹＰ３Ａ５は、成人肝臓の１０〜３０％のみで発現しているとの報告があり、その発現には多様性が認められている。ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５とは、約８５％のアミノ酸配列が一致しており、基質となる薬物（化学物質）も一部オーバーラップするが、同じ基質に対する触媒能力などの点において相違が認められる。両酵素が相補的に機能することによって多種多様な薬物の代謝が行われていると考えられている。
【０００４】
上記ＣＹＰ３Ａ酵素の活性には、著しい個体差が認められる。このことは、上記ＣＹＰ３Ａ酵素により代謝される薬物の有効性および安全性に少なからず影響を及ぼす。最近の研究では、上記ＣＹＰ３Ａの活性が個体間で多様性を有する理由は、遺伝的要因が全体の８０％を超えると報告されている。
【０００５】
さらに最近、上記ＣＹＰ３Ａ５酵素の遺伝子上の２つの一塩基多型（ＳＮＰ）が報告された（非特許文献１）。第１のＳＮＰは、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＣ００５０２０の塩基配列（即ち、上記ＣＹＰ３Ａ５のゲノムＤＮＡ配列）上の２２，８９３番目に存在する一塩基多型である。この２２，８９３番目の多型部位は、遺伝子のイントロン３上に位置し、この位置の塩基がＡ（アデニン）のアレルと、Ｇ（グアニン）のアレルとが存在する。このうち、上記２２，８９３番目の多型部位の塩基がＡであるアレルはＣＹＰ３Ａ５＊１と命名され、ＧであるアレルはＣＹＰ３Ａ５＊３と命名されている。第２のＳＮＰは、同アクセッション番号の塩基配列上の３０，５９７番目に存在する一塩基多型である。この３０，５９７番目の多型部位は、遺伝子のエクソン７上に位置し、この位置の塩基がＧ（グアニン）のアレルと、Ａ（アデニン）のアレルとが存在する。このうち、上記３０，５９７番目の多型部位の塩基がＧであるアレルはＣＹＰ３Ａ５＊１と命名され、ＡであるアレルはＣＹＰ３Ａ５＊６と命名されている。
【０００６】
上記ＣＹＰ３Ａ５＊３およびＣＹＰ３Ａ５＊６のアレルは、いずれも、スプライシング異常を引き起こし、フレームシフトによって途中ストップコドンが現れ、正常なＣＹＰ３Ａ５タンパク質をつくることができない。従って、例えばＣＹＰ３Ａ５＊３アレルのホモ接合体では、正常なＣＹＰ３Ａ５タンパク質は発現しない。正常なＣＹＰ３Ａ５タンパク質の発現には、少なくとも１つのＣＹＰ３Ａ５＊１アレルが必要である。
上記多型の検出方法としては、様々な種類の解析方法が考案されてきた。これらには、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ法、一塩基伸長法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等の解析方法がある。これらの解析方法は、単一の一塩基多型を複数の患者において解析する際には有用であるが、検出に要する時間が長くなるといった問題を抱えている。臨床応用を踏まえて単純な検出系でこのような一塩基多型解析を行うためには、多数の試料を迅速かつ簡便に検出可能な一塩基多型解析方法の考案が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｕｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００１；２７：３８３−３９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記論文によれば、上記ＣＹＰ３Ａ５タンパク質の肝臓および小腸における発現量は、以前の報告よりも遥かに高く、全ＣＹＰ３Ａ発現量の約５０％と報告されているが、ＣＹＰ３Ａ５の発現量が従来考えられていたよりも高いとすると、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多型は、ＣＹＰ３Ａが関与する薬物代謝における多様性を生む要因の一つになっていることが考えられる。
【０００９】
つまり、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多型が、ＣＹＰ３Ａ酵素の薬物代謝能の個体差を生み、これまで知られていたＣＹＰ３Ａ４が代謝酵素とされる薬物の血中濃度がばらつく要因の一つとなっている可能性がある。だとすれば、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多型は、ＣＹＰ３Ａによる薬物代謝の多様性を解明する上で非常に重要な意義を持っている。
【００１０】
ＣＹＰ３Ａ酵素による薬物代謝は薬物代謝において非常に重要な機能であることから、ＣＹＰ３Ａ５の上記２つの一塩基多型を検出する判定方法は重要である。ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の上記２つの一塩基多型を検出するための簡便で信頼性の高い判定方法があれば、例えば、１）新薬開発段階における臨床試験での利用、２）薬物代謝異常の原因を調べる検査・診断での利用、３）投与する薬の種類や薬の投与量を決定するための治療段階での利用、といった幅広い利用が期待できる。
【００１１】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型の簡便で信頼性の高い判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型のうち、＊３アレルに関する多型部位を含む領域を特異的に増幅し得るように設計された一対のプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ３Ａ５の遺伝多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１３】
［１］
試料中のＣＹＰ３Ａ５の遺伝多型を検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中のＣＹＰ３Ａ５＊３を検出する手段を含むことを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマーセットであって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマーセットを用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマーセットを含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
［２］
前記［１］に記載のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号４に示される核酸配列からなる核酸プローブである、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
［３］
前記［１］または［２］に記載のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、核酸プローブが末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブである、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
［４］
前記［１］〜［３］のいずれかに記載のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行う、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法。
［５］
配列番号２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、プライマーセット。
［６］
配列番号４で示される塩基配列からなる、ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するためのプローブ。
［７］
前記［５］に示されるプライマーセットと、前記［６］に示されるプローブとを組み合わせてなる、ＣＹＰ３Ａ５＊３検出用のプライマー・プローブのセット。
［８］
前記［５］〜［７］のいずれかに記載のプライマーセット、プローブ、または、プライマーセットとプローブとのセットを含む、ＣＹＰ３Ａ５＊３検出キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＣＹＰ３Ａ５＊３を特異的に検出することにより、ＣＹＰ３Ａ５の遺伝多型を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１における融解曲線分析時の蛍光強度変化量を示す。グラフ縦軸は蛍光強度変化量、横軸は温度を示す。（ＣＹＰ３Ａ５の遺伝子型がヘテロである場合）
【図２】実施例１における融解曲線分析時の蛍光強度変化量を示す。グラフ縦軸は蛍光強度変化量、横軸は温度を示す。（ＣＹＰ３Ａ５の遺伝子型がメジャーホモである場合）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明はＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するためのプライマーセット、前記プライマーセットを用いてＣＹＰ３Ａ５＊３を検出する方法、および前記方法を実施するためのキットに係る。
【００１７】
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３検出方法は、
（１）後述の核酸プライマーセットを用意する工程、
（２）被検核酸および前記核酸プライマーセットを含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程、
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程、および、
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程、
を含む。
【００１８】
［プライマーセット］
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３検出方法で用いる、前記（１）に記載のプライマーセットとしては、配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマーセットであって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマーセットが例示される。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列からなる核酸プライマーである。
【００１９】
上記の配列番号２は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。また、配列番号３は配列番号１で示される塩基配列の相補配列の一部分である。
【００２０】
本発明のプライマーセットは、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５遺伝子上の一塩基多型のうち、＊３アレルに関する多型部位を含む領域を特異的に増幅し得るように設計されている。ここで、上記「＊３アレルに関する多型部位」とは、上述のように、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ００５０２０の塩基配列（即ち、上記ＣＹＰ３Ａ５のゲノムＤＮＡ配列）上の２２，８９３番目に存在する多型部位を意味する。上記本発明のプライマーセットを用いることによって多型を含む領域を特異的に増幅させることが可能である。
【００２１】
［被検核酸］
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３検出方法において、被検核酸を含みうる試料は特に制限されない。例えば、血液、口腔粘膜擦過物などが挙げられる。試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。血液の場合、ｐＨ７．５以上の溶液に１〜１０％程度に希釈することで本発明の検出法に供することが可能である。
【００２２】
［核酸増幅法］
続いて、試薬に混合されたゲノムＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００２３】
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３の検出方法において、核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法は特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法があげられる。なお、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００２４】
ＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、非常に広く用いられている技術である。
【００２５】
増幅反応としては、最初の熱変形工程が８０〜１００℃で１０秒〜１５分、繰り返しの熱変形工程が８０〜１００℃で１〜３００秒、アニーリンクが４０〜８０℃で１〜３００秒、伸長反応工程が６０〜８５℃で１〜３００秒程度行い、この繰り返しを３０〜７０回繰り返すことが好ましい。
【００２６】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００２７】
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３検出方法において、プローブが含まれる反応系でＣＹＰ３Ａ５の核酸配列を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＣＹＰ３Ａ５核酸配列またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＣＹＰ３Ａ５の核酸配列と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００２８】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＣＹＰ３Ａ５核酸配列と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００２９】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００３０】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【００３１】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
【００３２】
例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー）なども利用できる。
【００３３】
また、さらに好適には、増幅反応における非特異的な反応を低減するためα型ポリメラーゼに対する抗体を用いること、または化学修飾により低温におけるポリメラーゼの活性をブロックさせることが望ましい。
【００３４】
［プローブと増幅産物との複合体形成］
増幅された領域に対し多型領域を含む相補的な配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることによって、多型部位の塩基に応じた融解曲線解析で特徴的な波形を得ることが可能である。本方法によって＊３アレルに関する一塩基多型を簡便かつ信頼性高く検出することができる。
【００３５】
上記蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いる方法は、Ｑプローブ法として報告されており一塩基多型の解析にも応用されている。しかし、ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出する場合、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５の塩基配列は非常に相同性が高いことから、「多型部位を含みかつＣＹＰ３Ａ５を特異的に増幅させることが可能であり、しかも、Ｑプローブ法が応用可能な増幅長を与えるプライマー」を設計することは非常に困難であった。
【００３６】
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３検出方法で用いる、前記（３）に記載のプローブとしては、配列番号４に示される核酸配列からなる核酸プローブが例示される。このプローブ内のシトシンに蛍光色素を標識することにより（例えば、末端のシトシンのうち少なくとも一つを蛍光色素で標識することにより）、Ｑプローブ法に使用することができる。
【００３７】
本発明者らの検討では、ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出において、検討に用いた複数のプローブの中で、本法で用いた配列のみが、ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出できるものとして唯一使用可能であった。
【００３８】
本発明のＣＹＰ３Ａ５＊３検出方法では、工程（２）において、得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００３９】
本発明において用いられる標識としては磁性体、電子伝達体、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などがある。磁性体としては、酸化鉄、二酸化クロム、コバルト、フェライトなどが挙げられる。電子伝達体としては、フェロセン、ＰＱＱ、レドックス化合物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）、放射性同位体（例えば，３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１３１Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
好ましい検出可能な標識は蛍光標識である。本明細書において用いる場合，“蛍光標識”とは，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，次により長い波長（放射周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，“ドナー蛍光団”との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
【００４０】
本明細書において用いる場合，“消光剤成分”との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）クエンチングにより，または蛍光共鳴エネルギー移動（“ＦＲＥＴ”）により作用する。
【００４１】
好適な蛍光成分としては，当該技術分野において知られる下記の蛍光団が挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，アクリジンおよび誘導体（アクリジン，アクリジンイソチオシアネート），Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ），５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ），４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ），Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド，アントラニルアミド，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＣＲ−６Ｇ，ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ，ブリリアントイエロー，クマリンおよび誘導体（クマリン，７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）），Ｃｙ２（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），Ｃｙ３．５（登録商標），Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ５．５（登録商標），シアノシン，４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ），５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ），７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソシアナトフェニル）−４−メチルクマリン，ジエチレントリアミン四酢酸，４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ，塩化ダンシル），４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ），４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．），エオシンおよび誘導体（エオシン，エオシンイソチオシアネート），エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ，エリスロシンイソチオシアネート），エチジウム，フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），フルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ），ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ），テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）），フルオレスカミン，ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６，マラカイトグリーンイソチオシアネート，４−メチルウンベリフェロン，オルトクレゾールフタレイン，ニトロチロシン，パラローザニリン，フェノールレッド，Ｂ−フィコエリスリン，Ｒ−フィコエリスリン，ｏ−フタルジアルデヒド，Ｏｒ���ｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標），ヨウ化プロピジウム，ピレンおよび誘導体（ピレン，酪酸ピレン，酪酸スクシンイミジル１−ピレン），ＱＳＹ（登録商標）７，ＱＳＹ（登録商標）９，ＱＳＹ（登録商標）２１，ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ），リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ），ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），リサミンローダミンＢ塩化スルホニル，ローダミン（Ｒｈｏｄ），ローダミンＢ，ローダミン１２３，ローダミングリーン，ローダミンＸイソチオシアネート，スルホローダミンＢ，スルホローダミン１０１，スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ），テトラメチルローダミン，テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ），リボフラビン，ロゾール酸，テルビウムキレート誘導体。
【００４２】
適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択する。有用な消光剤としては，例えば，ｔｈｅ  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）消光剤であるＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。
【００４３】
検出可能な標識は，核酸中に取り込ませるか，会合させるか，またはコンジュゲートさせることができる。標識は，種々の長さのスペーサーアームにより結合させて，立体傷害または他の有用なまたは望ましい特性に与える影響を低減させることができる（例えば，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４５−１５６（１９９５）を参照。）。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウム、エクオリンなどが挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えることがなければなにを用いても良い。また反応に影響がなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、３’末端、５’末端部位である。
【００４４】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール、有機溶媒等、従来公知のものがあげられる。反応液の調整の方法としては、具体的には、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが０．５〜５０ｐｍｏｌ、×１０の緩衝液が０．５〜５０μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで０．５〜５０μｌ、塩類が２５ｍＭ濃度液で０．１〜３０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが０．１〜３０ｎｇ程度であることが好ましい。
【００４５】
［検出方法］
検出方法としては、具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００４６】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜１００℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜２０分であり、好ましくは１秒〜１０分である。
【００４７】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００４８】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００４９】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜１０℃／秒である。
【００５０】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００５１】
［プライマー、プローブ、検出キット］
本発明はまた、上記で説明したＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するための方法において用いるプライマーセット、プローブ、または、該プライマーセットと該プローブとを組合せたセットに関する。
【００５２】
本発明はさらに、これらのプライマーセット、プローブ、または、該プライマーセットと該プローブとを組合せたセットを含む、ＣＹＰ３Ａ５＊３検出キットに関する。本発明のキットは、その構成において、プライマーセット、プローブ、または、該プライマーセットと該プローブとを組合せたセットであること以外については特に限定されない。たとえばＰＣＲ法など公知の方法において、プライマーおよび／またはプローブとして上記のものを適用すればよい。
【００５３】
本明細書で用いられる酵素の活性測定方法について、以下に記す。
［ＤＮＡ合成活性］
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００５４】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ  塩化マグネシウム
１５ｍＭ  ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ  キャリアーＤＮＡ
【００５５】
［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は以下のとおりである。５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【実施例】
【００５６】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５７】
実施例１  ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出
［ＣＹＰ３Ａ５を増幅するオリゴヌクレオチドの合成］  
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２，３、４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２、３、４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）、北海道システムサイエンス、日本遺伝子研究所等）に依頼した。
オリゴ２はセンス鎖であり、オリゴ３がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ４はプローブとして使用され、３’末端は蛍光標識される。
【００５８】
［ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出］  
ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト血液より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣＹＰ３Ａ５＊３を検出した。
【００５９】
［試薬］
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ２  ２ｐｍｏｌ、
オリゴ３  ２５  ｐｍｏｌ、
オリゴ４（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ４ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ
【００６０】
［増幅条件］
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒
【００６１】
［融解曲線解析による検出］
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、５７℃および６１℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記の通りであった。結果を表１、図１および図２に示す。
【００６２】
【表１】
2015128399.tif 000002
【００６３】
図１および図２のグラフから、ＣＹＰ３Ａ５＊３が存在する場合には、明らかなピークが得られることが確認された。図１で用いた試料と図２で用いた試料とは異なる遺伝子型を有しており、ＣＹＰ３Ａ５＊３のメジャーホモ（図２）とヘテロ（図１）の区別も可能である。
【００６４】
実施例２  ＣＹＰ３Ａ５を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２、３、５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２、３、５と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）、北海道システムサイエンス、日本遺伝子研究所等）に依頼した。
オリゴ２はセンス鎖であり、オリゴ３がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ５はプローブとして使用され、３’末端は蛍光標識される。
【００６５】
［ＣＹＰ３Ａ５の検出］
ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト血液より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣＹＰ３Ａ５＊３を検出した。
【００６６】
［試薬］
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ２  ２５ｐｍｏｌ、
オリゴ３  ２  ｐｍｏｌ、
オリゴ５（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ４ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ
【００６７】
［増幅条件］
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒
【００６８】
融解曲線解析による検出
【００６９】
【表２】
2015128399.tif 000003
【００７０】
ＣＹＰ３Ａ５のＤＮＡが存在する試料を用いた場合でも、オリゴ５を用いた場合は蛍光強度変化量が得られなかった。
【００７１】
実施例３  ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出
［ＣＹＰ３Ａ５を検出するオリゴヌクレオチドの合成］
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２、３、６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２、３、６と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）、北海道システムサイエンス、日本遺伝子研究所等）に依頼した。
オリゴ２はセンス鎖であり、オリゴ３がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ６はプローブとして使用され、３’末端は蛍光標識される。
【００７２】
［ＣＹＰ３Ａ５の検出］
ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト血液より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣＹＰ３Ａ５＊３を検出した。
【００７３】
［試薬］
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ２  ２ｐｍｏｌ、
オリゴ３  ２５  ｐｍｏｌ、
オリゴ６（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ４ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
ＤＮＡ溶液  １００ｎｇ
【００７４】
［増幅条件］
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒
【００７５】
融解曲線解析による検出
【００７６】
【表３】
2015128399.tif 000004
【００７７】
ＣＹＰ３Ａ５のＤＮＡが存在する試料を用いた場合でも、オリゴ６を用いた場合は蛍光強度変化量が得られなかった。
【００７８】
実施例４  ヒト血液希釈試料の検出
［ＣＹＰ３Ａ５＊３の検出］  
ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト血液をｐＨ８．５の緩衝液を用いて５０倍に希釈した試料液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりＣＹＰ３Ａ５＊３を検出した。
【００７９】
［試薬］
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ
オリゴ２  ２ｐｍｏｌ、
オリゴ３  ２５  ｐｍｏｌ、
オリゴ４（３’末端をＦＩＴＣにより標識）  ４ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液  １μｌ、
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μｌ、
ヒト血液５０倍希釈試料液  ２μＬ  
【００８０】
［増幅条件］
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒
【００８１】
［融解曲線解析による検出］
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、５７℃および６１℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記の通りであった。
【００８２】
【表４】
2015128399.tif 000005
【００８３】
ヒト血液希釈液からも検出は可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明をＣＹＰ３Ａ５＊３の検出に利用することで、薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ５の遺伝多型を検出することができる。
【図１】
2015128399.tif 000006
【図２】
2015128399.tif 000007
【配列表】
2015128399000001.app