(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）−ＰＣＲプライマーセットでは解析できないＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができる、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを提供する。【解決手段】特定の遺伝子配列からなる第１〜第４２ＰＣＲプライマーセット、から選択される少なくとも１種のＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とするＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。【選択図】図１
2015092853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び２に記載の塩基配列からなる第１ＰＣＲプライマーセット、配列番号３及び４に記載の塩基配列からなる第２ＰＣＲプライマーセット、配列番号５及び６に記載の塩基配列からなる第３ＰＣＲプライマーセット、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなる第４ＰＣＲプライマーセット、配列番号９及び１０に記載の塩基配列からなる第５ＰＣＲプライマーセット、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列からなる第６ＰＣＲプライマーセット、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなる第７ＰＣＲプライマーセット、配列番号１５及び１６に記載の塩基配列からなる第８ＰＣＲプライマーセット、配列番号１７及び１８に記載の塩基配列からなる第９ＰＣＲプライマーセット、配列番号１９及び２０に記載の塩基配列からなる第１０ＰＣＲプライマーセット、配列番号２１及び２２に記載の塩基配列からなる第１１ＰＣＲプライマーセット、配列番号２３及び２４に記載の塩基配列からなる第１２ＰＣＲプライマーセット、配列番号２５及び２６に記載の塩基配列からなる第１３ＰＣＲプライマーセット、配列番号２７及び２８に記載の塩基配列からなる第１４ＰＣＲプライマーセット、配列番号２９及び３０に記載の塩基配列からなる第１５ＰＣＲプライマーセット、配列番号３１及び３２に記載の塩基配列からなる第１６ＰＣＲプライマーセット、配列番号３３及び３４に記載の塩基配列からなる第１７ＰＣＲプライマーセット、配列番号３５及び３６に記載の塩基配列からなる第１８ＰＣＲプライマーセット、配列番号３７及び３８に記載の塩基配列からなる第１９ＰＣＲプライマーセット、配列番号３９及び４０に記載の塩基配列からなる第２０ＰＣＲプライマーセット、配列番号４１及び４２に記載の塩基配列からなる第２１ＰＣＲプライマーセット、配列番号４３及び４４に記載の塩基配列からなる第２２ＰＣＲプライマーセット、配列番号４５及び４６に記載の塩基配列からなる第２３ＰＣＲプライマーセット、配列番号４７及び４８に記載の塩基配列からなる第２４ＰＣＲプライマーセット、配列番号４９及び５０に記載の塩基配列からなる第２５ＰＣＲプライマーセット、配列番号５１及び５２に記載の塩基配列からなる第２６ＰＣＲプライマーセット、配列番号５３及び５４に記載の塩基配列からなる第２７ＰＣＲプライマーセット、配列番号５５及び５６に記載の塩基配列からなる第２８ＰＣＲプライマーセット、配列番号５７及び５８に記載塩基配列からなる第２９ＰＣＲプライマーセット、配列番号５９及び６０に記載の塩基配列からなる第３０ＰＣＲプライマーセット、配列番号６１及び６２に記載の塩基配列からなる第３１ＰＣＲプライマーセット、配列番号６３及び６４に記載の塩基配列からなる第３２ＰＣＲプライマーセット、配列番号６５及び６６に記載の塩基配列からなる第３３ＰＣＲプライマーセット、配列番号６７及び６８に記載の塩基配列からなる第３４ＰＣＲプライマーセット、配列番号６９及び７０に記載の塩基配列からなる第３５ＰＣＲプライマーセット、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなる第３６ＰＣＲプライマーセット、配列番号７３及び７４に記載の塩基配列からなる第３７ＰＣＲプライマーセット、配列番号７５及び７６に記載の塩基配列からなる第３８ＰＣＲプライマーセット、配列番号７７及び７８に記載の塩基配列からなる第３９ＰＣＲプライマーセット、配列番号７９及び８０に記載の塩基配列からなる第４０ＰＣＲプライマーセット、配列番号８１及び８２に記載の塩基配列からなる第４１ＰＣＲプライマーセット、配列番号８３及び８４に記載の塩基配列からなる第４２ＰＣＲプライマーセット、から選択される少なくとも１種のＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。
【請求項２】
前記第１〜第４２ＰＣＲプライマーセットを全て含むことを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを用いて、被検体から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとした筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子の塩基配列を決定することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列の解析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の解析方法により得られた筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列情報を用いて、既知の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列と比較することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；以下、「ＡＬＳ」と記載することがある。）疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット（以下、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを「ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット」と記載することがある。）に関する発明であって、特に、（１）従来から用いられているＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用のＰＣＲプライマーセット（以下、従来から用いられているＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用のＰＣＲプライマーセットを「ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット」と記載することがある。）と組み合わせてＰＣＲを行うことでＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析する、又は（２）ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットとは別にＰＣＲを行い、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及びＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いて得られた遺伝子配列情報を組合せてＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することで、従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析することができなかった遺伝子配列部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットに関する。また、本発明は、該ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いたＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及び前記解析方法により得られたＡＬＳ疾患関連遺伝子配列を用いたＡＬＳ疾患の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＳは、重篤な筋肉の萎縮と筋力低下をきたす神経変性疾患で、運動ニューロン病の一種である。ＡＬＳは、極めて進行が速く、人工呼吸器の装着による延命は可能であるものの、半数ほどが発症後３年から５年で呼吸筋麻痺により死亡する。ＡＬＳは進行性の重篤な疾患であるため、早期検査や早期治療が望まれる。
【０００３】
ＡＬＳの検査方法としては、例えば、脳脊髄液から単離した幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを調べる方法（特許文献１参照）、生体から分離した試料のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ１遺伝子及び／又はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ２遺伝子のコピー数を測定する方法（特許文献２参照）、ＺＮＦ５１２Ｂ遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて筋萎縮性側索硬化症を検査する方法（特許文献３参照）、等が知られている。
【０００４】
ＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析するためには、従来はＳａｎｇｅｒ法を活用したシークエンサーで１つ１つのＡＬＳ疾患関連遺伝子をＰＣＲ法で増幅した上で読んで行く必要があり、検査に時間が要するという問題があった。しかしながら、近年は次世代シークエンサーが開発され、複数のＰＣＲプライマーセットを用いてゲノム上の広い範囲を一回のシークエンスで読めるようになってきた。
【０００５】
ところで、次世代シークエンサーの開発により、遺伝子配列の解析速度は著しく向上し、また、解析に要する費用は低くなってきたものの、患者の全ゲノムを解析することは、依然として時間が必要で且つコストも要するため現実的ではない。そのため、一般的には、目的とする遺伝子の遺伝子配列を解析する場合には、マルチプレックスＰＣＲなどの技術を用いて、目的とする遺伝子の遺伝子配列のみを抽出する必要がある。現在、複数の会社から、ゲノム上の目的とする遺伝子を増幅して遺伝子配列を解析するためのＰＣＲプライマーセットが発売されており、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットについても入手することができる。
【０００６】
しかしながら、一般的に入手できるＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いた遺伝子配列解析では、ＡＬＳ疾患関連遺伝子の全ての配列を解析することができず、ＡＬＳ疾患の有無を検査するための方法としては不十分で、臨床の場で使用するには信頼性が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５２６７０５号公報
【特許文献２】特開２０１２−８５６３９号公報
【特許文献３】特開２０１１−５５７２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、入手可能なＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットは、公知のＡＬＳ疾患関連遺伝子２８種類の内、１２種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子に関しては全ての遺伝子配列を解析していないことを発見した。そして、前記１２種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子の未解析遺伝子配列部分を解析できる４２種類のＰＣＲプライマーセットを新たに設計し、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと組み合わせて用いることで、公知の２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を全て解析できること、及び、解析したＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列からＡＬＳ疾患を正確に検査できることを新たに見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の目的は、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット、該ＰＣＲプライマーセットを用いたＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及びＡＬＳ疾患の検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下に示す、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及びＡＬＳ疾患の検査方法に関する。
【００１１】
（１）配列番号１及び２に記載の塩基配列からなる第１ＰＣＲプライマーセット、配列番号３及び４に記載の塩基配列からなる第２ＰＣＲプライマーセット、配列番号５及び６に記載の塩基配列からなる第３ＰＣＲプライマーセット、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなる第４ＰＣＲプライマーセット、配列番号９及び１０に記載の塩基配列からなる第５ＰＣＲプライマーセット、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列からなる第６ＰＣＲプライマーセット、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなる第７ＰＣＲプライマーセット、配列番号１５及び１６に記載の塩基配列からなる第８ＰＣＲプライマーセット、配列番号１７及び１８に記載の塩基配列からなる第９ＰＣＲプライマーセット、配列番号１９及び２０に記載の塩基配列からなる第１０ＰＣＲプライマーセット、配列番号２１及び２２に記載の塩基配列からなる第１１ＰＣＲプライマーセット、配列番号２３及び２４に記載の塩基配列からなる第１２ＰＣＲプライマーセット、配列番号２５及び２６に記載の塩基配列からなる第１３ＰＣＲプライマーセット、配列番号２７及び２８に記載の塩基配列からなる第１４ＰＣＲプライマーセット、配列番号２９及び３０に記載の塩基配列からなる第１５ＰＣＲプライマーセット、配列番号３１及び３２に記載の塩基配列からなる第１６ＰＣＲプライマーセット、配列番号３３及び３４に記載の塩基配列からなる第１７ＰＣＲプライマーセット、配列番号３５及び３６に記載の塩基配列からなる第１８ＰＣＲプライマーセット、配列番号３７及び３８に記載の塩基配列からなる第１９ＰＣＲプライマーセット、配列番号３９及び４０に記載の塩基配列からなる第２０ＰＣＲプライマーセット、配列番号４１及び４２に記載の塩基配列からなる第２１ＰＣＲプライマーセット、配列番号４３及び４４に記載の塩基配列からなる第２２ＰＣＲプライマーセット、配列番号４５及び４６に記載の塩基配列からなる第２３ＰＣＲプライマーセット、配列番号４７及び４８に記載の塩基配列からなる第２４ＰＣＲプライマーセット、配列番号４９及び５０に記載の塩基配列からなる第２５ＰＣＲプライマーセット、配列番号５１及び５２に記載の塩基配列からなる第２６ＰＣＲプライマーセット、配列番号５３及び５４に記載の塩基配列からなる第２７ＰＣＲプライマーセット、配列番号５５及び５６に記載の塩基配列からなる第２８ＰＣＲプライマーセット、配列番号５７及び５８に記載塩基配列からなる第２９ＰＣＲプライマーセット、配列番号５９及び６０に記載の塩基配列からなる第３０ＰＣＲプライマーセット、配列番号６１及び６２に記載の塩基配列からなる第３１ＰＣＲプライマーセット、配列番号６３及び６４に記載の塩基配列からなる第３２ＰＣＲプライマーセット、配列番号６５及び６６に記載の塩基配列からなる第３３ＰＣＲプライマーセット、配列番号６７及び６８に記載の塩基配列からなる第３４ＰＣＲプライマーセット、配列番号６９及び７０に記載の塩基配列からなる第３５ＰＣＲプライマーセット、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなる第３６ＰＣＲプライマーセット、配列番号７３及び７４に記載の塩基配列からなる第３７ＰＣＲプライマーセット、配列番号７５及び７６に記載の塩基配列からなる第３８ＰＣＲプライマーセット、配列番号７７及び７８に記載の塩基配列からなる第３９ＰＣＲプライマーセット、配列番号７９及び８０に記載の塩基配列からなる第４０ＰＣＲプライマーセット、配列番号８１及び８２に記載の塩基配列からなる第４１ＰＣＲプライマーセット、配列番号８３及び８４に記載の塩基配列からなる第４２ＰＣＲプライマーセット、から選択される少なくとも１種のＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。
（２）前記第１〜第４２ＰＣＲプライマーセットを全て含むことを特徴とする上記（１）に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。
（３）上記（１）又は（２）に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを用いて、被検体から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとした筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子の塩基配列を決定することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列の解析方法。
（４）上記（３）に記載の解析方法により得られた筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列情報を用いて、既知の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列と比較することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患の検査方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、それぞれ新規なＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットである。したがって、例えば、ＡＬＳ疾患の発症頻度の高いＡＬＳ遺伝子の遺伝子配列のみを補足して解析できるＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを選択してＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと組み合わせる等、４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーから少なくとも１種以上の補足ＰＣＲプライマーセットを解析用途に応じて用いることができる。
更に従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットに加え、本発明の４２種類の補足ＰＣＲプライマーセットを全て組合せて用いることで、ＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができる。
本発明の補足ＰＣＲプライマーセットは、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと組み合わせてシークエンスを行うことができる。したがって、例えば、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及び４２種類の補足ＰＣＲプライマーセットを組合せてシークエンスを行うことで、一回のシークエンスでＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができる。
また、本発明のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットとは別にシークエンスを行うこともできる。そして、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及びＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いて得られた別々の遺伝子配列情報を組合せてＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができるので、既存のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットで得られた遺伝子配列情報に、後日ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットから得られた遺伝子配列情報を加えて再解析を行うことで、既存のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いて行ったＡＬＳ疾患の検査の精度を上げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、図面代用写真で、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明のＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及びＡＬＳ疾患の検査方法について詳しく説明する。
【００１５】
本発明のＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、被検体の遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＡＬＳ疾患関連遺伝子のエクソン部分の遺伝子を増幅し、遺伝子配列を解析するためのＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットに補足的に用いられるもので、例えば、以下の手順により作製することができる。
【００１６】
先ず、公知のＡＬＳ疾患関連遺伝子及びその遺伝子配列情報を入手する。表１は、入手したＡＬＳ疾患関連遺伝子の内、発病頻度等の観点から、発明者が特に検査すべき必要性が高いと判断して選択した２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子名、並びに当該遺伝子の染色体上の位置及び塩基数を示す。表１に示すＡＬＳ疾患関連遺伝子配列情報は、ＮＣＢＩが運営するヒトの遺伝性疾患のデータベースであるＯＭＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭ）、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から入手することができる。あるいは、“Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１２４：３３９−３５２、又は、「すべてがわかる  ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）・運動ニューロン疾患」（中山書店２０１３）等の文献から入手することができる。なお、表１に示す２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子以外にも、必要に応じてＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及びＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの作製に用いてもよい。また、不要な場合には使用せずに一部のみで解析を行っても良い。
【００１７】
【表１】
2015092853.tif 000003
【００１８】
次に、例えば、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＩｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  ｃｕｓｔｕｍ  ｐａｎｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｍｐｌｉｓｅｑ．ｃｏｍ／ｂｒｏｗｓｅ．ａｃｔｉｏｎ）に、上記２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子の塩基配列情報を入力することで、全エクソン領域をカバーするＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットをＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手する。また、上記のＩｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  ｃｕｓｔｕｍ  ｐａｎｅｌで設計したＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できないＡＬＳ疾患関連遺伝子及び解析できない塩基配列数についても同時に入手する。表２は、ＡＬＳ疾患関連遺伝子名及び塩基数、並びにＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットで解析できる塩基数、未解析塩基数及び解析率（解析塩基数／塩基数）を示す。
【００１９】
【表２】
2015092853.tif 000004
【００２０】
次に、表２に示す、解析率が１以外の、ＡＬＳ２、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＮＥＦＨ、ＴＡＦ１５、ＥＷＳＲ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＡＴＸＮ２、ＴＦＧ、ｄｏｒｆｉｎ、ＳＱＳＴＭ１について、未解析の塩基配列部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの設計を行う。設計に際しては、専門のソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３を用いて、（１）一塩基繰り返し配列が多数含まれる領域も解析できること、（２）各ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットのＴｍ値の差をできるだけ小さくすること、（３）２０〜２５ｍｅｒのプライマー長となるようにすること、（４）ＰＣＲ増幅産物の長さが可能な限り４００ｂｐ以下となること、等に留意しながら創意工夫をしながら複数のＰＣＲプライマーセット候補の設計を行う。ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、設計した塩基配列情報に基づき、市販されているＤＮＡ合成装置を用いて合成することで作製することができる。なお、上記の（１）〜（４）に留意して設計を行っても、実際にＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットの未解析塩基配列部分を解析できない場合もあることから、合成したＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットが実際に未解析塩基配列を解析できるのか確認を行うことでＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを作製する。
【００２１】
上記ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、混合して用いることで、一度の操作で被検体の遺伝子の塩基配列解析を行うことができる。なお、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットが増幅する増幅生産物長（塩基配列数）が、シークエンサーが解析できる塩基配列数より大きい場合は、当該ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットのみ別に解析をすることが好ましく、使用するシークエンサーに応じて、一度の操作で塩基配列解析を行うのか、別々に塩基配列解析を行うのか決めればよい。また、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いた解析とは別に解析を行い、得られた塩基配列情報を組合せて再解析することもできる。本発明の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、それぞれ新規なＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットであることから、病院等において、被検体から抽出した遺伝子をＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いて解析したデータがある場合、例えば、特にＯＰＴＮ遺伝子を正確に解析したい際には、第１及び第２ＡＬＳ補足プライマーセットを用いて同一被検体のＯＰＴＮ遺伝子の塩基配列を解析し、既存のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いて解析したデータと組み併せて再解析を行うことで、ＯＰＴＮ遺伝子に由来するＡＬＳ疾患を正確に検査することができる。
【００２２】
本発明のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ法としては、当該プライマーセットを用いて被検体の遺伝子を増幅することができれば特に制限は無いが、電気泳動の手間を省くことができ、迅速な測定が可能となることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２３】
ＡＬＳ疾患関連遺伝子の検査を行うための鋳型ＤＮＡは、被検体から先ず採血を行い、血中から白血球を抽出し、次いで、白血球から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用する。ゲノＤＮＡの抽出は、一般的な、フェノールおよびクロロホルムを用いた方法を用いてもよいし、あるいは、ＱＩＡＧＥＮ社などから販売されている、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔなど）を用いてもよい。更に、抽出したＤＮＡにＲＮＡ分解酵素を添加し、ＲＮＡを除去することで抽出したＤＮＡをクリーンアップしてもよい。
【００２４】
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡの解析は、次世代シークエンサーを用いて一度に塩基配列の解析を行えばよい。次世代シークエンサーとしては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｏｎ  ＰＧＭ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉｓｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒシリーズ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｒｏｃｈ  ＧＳｊｕｎｉｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ等が挙げられる。これら次世代シークエンサーの操作は、添付マニュアルに従って操作をすればよい。
【００２５】
また、次世代シークエンサーにより塩基配列を解析するためのＤＮＡライブラリ（ＰＣＲにより増幅した多様な長さを持ち、蛍光マーカーやビーズ等が付加しシークエンサーにより塩基配列を解析するためのＤＮＡ断片の混合物）は、各次世代シークエンサー用のＤＮＡライブラリ作成キットを用いればよい。例えば、上記Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ社の次世代シークエンサーを用いる場合は、Ｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｋｉｔ、Ｉｏｎ  ＰＧＭTM  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ４００  Ｋｉｔ、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑTM  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ  ２．０、Ｉｏｎ  ＰＧＭTM  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ４００  Ｋｉｔ等を用いて、添付のマニュアルに従ってＤＮＡライブラリを作成すればよい。
【００２６】
なお、次世代シークエンサーの多くは、現状ではＰＣＲ増幅産物の長さが４００ｂｐ程度までしか解析することができない。そのため、得られるＰＣＲ増幅産物の塩基長が４００ｂｐを超えるＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いる場合、得られたＰＣＲ増幅産物についてはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔなどのＤＮＡ精製キットで精製した後、超音波エネルギー等の照射により断片化した後に、ＤＮＡライブライを作成することが好ましい。断片化は、得られたＤＮＡを断片できるものであれば特に制限はなく、例えば、コバリス社のアコースティックソルビライザー等の装置を用いればよい。
【００２７】
上記の手順により解析した遺伝子配列情報を、既知のＡＬＳ疾患関連遺伝子配列と比較することで、被検体がＡＬＳに疾患しているか否か検査することができる。
【００２８】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞
〔ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の作製〕
ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒよりＡＬＳ２、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＮＥＦＨ、ＴＡＦ１５、ＥＷＳＲ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＡＴＸＮ２、ＴＦＧ、ｄｏｒｆｉｎ、ＳＱＳＴＭ１遺伝子の配列情報を入手した。Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＩｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  ｃｕｓｔｕｍ  ｐａｎｅｌに前記ＡＬＳ遺伝子群の配列情報を入力することで、前記ＡＬＳ遺伝子群の全エクソン領域をカバーするＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを設計するとともに、当該設計したＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できない塩基配列情報を同時に入手した。なお、Ｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  ｃｕｓｔｕｍ  ｐａｎｅｌは、同じ遺伝子配列情報を入力すれば、同じＰＣＲプライマーセットを入手することができるようになっている。次に、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトを使用して、前記入手したＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できない塩基配列部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の設計を行い、設計したＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の塩基配列に基づき、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補を合成した。
【００３０】
〔被検体のゲノムＤＮＡの調整〕
被検体から採血を行い、次いで、血中の白血球のみをＱｉａｇｅｎ社のＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにより抽出した。次に、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、抽出した白血球からゲノムＤＮＡを調整した。
【００３１】
〔ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの作製〕
合成したＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補を用いて、実際に未解析部分を増幅することができるのか確認を行った。先ず、ｄｏｒｆｉｎ遺伝子の未解析部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマー候補について、以下の手順で確認を行った。
（１）調整したゲノムＤＮＡと、
塩基配列：ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＡ
塩基配列：ＣＣＣＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡ
からなるｄｏｒｆｉｎ遺伝子用の補足ＰＣＲプライマーセット候補を、Ｔａｋａｒａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて増幅した。
（２）調整したゲノムＤＮＡと、
塩基配列：ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＡ
塩基配列：ＧＴＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣ
からなるｄｏｒｆｉｎ遺伝子用の補足ＰＣＲプライマーセット候補を、Ｔａｋａｒａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて増幅した。
（３）調整したゲノムＤＮＡと、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなるｄｏｒｆｉｎ遺伝子用の補足ＰＣＲプライマーセット候補を、Ｔａｋａｒａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて増幅した。
アガロースゲルで作製した電気泳動用ゲルのレーン１及び５に、サイズマーカーｐＨＹ  Ｍａｒｋｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を載せ、上記（１）の増幅産物をレーン２に、上記（２）の増幅産物をレーン３に、上記（３）の増幅産物をレーン４に載せ、電気泳動を行った。
【００３２】
図１は、電気泳動写真で、写真から明らかなように、同じｄｏｒｆｉｎ遺伝子の未解析部分を増幅するように設計した補足ＰＣＲプライマーセット候補であっても、（１）及び（２）の補足ＰＣＲプライマーセット候補は、未解析部分を増幅することはできなかった。そのため、他の補足ＰＣＲプライマーセットの候補についても、同様の手順で確認を行い、配列番号１〜８４に記載されている塩基配列の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを作製した。表３に、作製した合計４２組のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの配列番号及び塩基配列、並びに各ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットが増幅する増幅生産物長さを示す。
【００３３】
【表３】
2015092853.tif 000005
【００３４】
〔ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットによる未解析部分の解析〕
＜実施例２＞
実施例１で作製した４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの内、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなる第４ＰＣＲプライマーセット、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなる第７ＰＣＲプライマーセット、配列番号１５及び１６に記載の塩基配列からなる第８ＰＣＲプライマーセット、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなる第３６ＰＣＲプライマーセットを混合し、Ｔａｋａｒａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて増幅した。増幅後はＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｋｉｔで精製し、超音波装置（アコースティックソルビライザー  Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２２０；コバリス社製）を用いてＤＮＡを断片化した後、Ｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いて、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンサー（ライフテクノロジー社製）用のＤＮＡライブラリを作成した。上記４種類を除いた３８種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットについては、増幅後に精製及び超音波処理しなかった以外は、上記４種類と同様の手順でＤＮＡライブラリを作成した。
【００３５】
得られた２つのＤＮＡライブラリを混合した上で、Ｉｏｎ  ｏｎｅ  ｔｏｕｃｈ２  システムを用いてエマルジョンＰＣＲを行い、その後、Ｉｏｎ  ＰＧＭTM  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ４００  Ｋｉｔを用いて、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒでシークエンスの解析を行った。
【００３６】
表４はシークエンス結果の概要を示しており、表５は解析率を示している。表４に示すとおり、従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できない４２のアンプリコン及び当該アンプリコンに含まれる１，５１２個の未解析塩基配列について、本発明の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いて解析したところ、表５に示すように、１００％解析できた。なお、表４において、「Ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ」が４３であるのは、（１）１つのアンプリコンで２つのｔａｒｇｅｔ  ｒｅｇｉｏｎをカバーするもの、及び（２）１つのｔａｒｇｅｔ  ｒｅｇｉｏｎを複数のアンプリコンでカバーするもの、があり、その結果４３になったと思われる。
【００３７】
【表４】
2015092853.tif 000006
【００３８】
【表５】
2015092853.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明に係るＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットと従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを組合せて用いることで、ＡＬＳ疾患関連遺伝子の全ての遺伝子配列を解析することができる。したがって、ＡＬＳ疾患の検査の精度を向上することができ、医療機関や大学医学部などの研究機関等におけるＡＬＳ疾患検査及び研究に利用が可能である。
【図１】
2015092853.tif 000008
【配列表】
2015092853000001.app