(57)【要約】【課題】乳酸菌の生菌数が４週間程度にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持され、かつ、血圧降下作用を示すのに十分な程度にＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを含有した乳製品乳酸菌飲料を製造するための方法を提供する。【解決手段】乳製品原料にラクトバチルス・カゼイを植菌して培養し、そのラクトバチルス・カゼイの植菌から時間を空けて、培養物にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌してさらに１日〜２日間培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以上である乳製品乳酸菌飲料を製造する方法において、
乳製品原料にラクトバチルス・カゼイを植菌して培養し、そのラクトバチルス・カゼイの植菌から時間を空けて、培養物にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌し、さらに１日〜２日間混合培養することを特徴とする乳製品乳酸菌飲料の製造方法。
【請求項２】
乳製品原料にラクトバチルス・カゼイを植菌してから２０時間〜３０時間後にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌する請求項１に記載の乳製品乳酸菌飲料の製造方法。
【請求項３】
乳製品原料にラクトバチルス・カゼイを植菌してから２０時間〜２４時間後にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌する請求項２に記載の乳製品乳酸菌飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以上である乳製品乳酸菌飲料を製造するための方法、特に、乳酸菌の生菌数が４週間にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持され、かつ、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害活性を有するペプチドを含有した乳製品乳酸菌飲料を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた乳酸菌を含有した食品は、それを摂取することにより人間の消化器系のバランスを改善して病気の発生を未然に抑制することができるとされ、一般にプロバイオティクス食品と呼ばれる。このような食品の中で、乳製品乳酸菌飲料は、乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以上であると規定されており、賞味期限内においてその生菌数が維持される必要がある。一般に、乳製品乳酸菌飲料の賞味期限は２週間程度に設定されているので、この種の商品では、予備率を含めて３週間程度は上記生菌数を維持する必要がある。さらには、乳製品乳酸菌飲料の製造工程との関係上、４週間程度、上記生菌数を維持することが望ましい。従来の乳製品乳酸菌飲料では、乳酸菌として、耐酸性や乳酸生成能に優れたラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）が主に使用されてきた。
【０００３】
ところで、乳酸菌の中には、血圧降下作用を示すＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを産生するものが存在し、そのような乳酸菌としてラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）が知られている。このラクトバチルス・ヘルベティカスを使用し、この乳酸菌を獣乳培地中で培養することにより、ＡＣＥ阻害活性を有し血圧降下作用を示すペプチドを含有した発酵乳製品を製造する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
また、２種の乳酸菌を混合培養して乳酸菌飲料を製造することも行われている。例えば、乳を主成分とする脱脂乳等の培地でビフィドバクテリウム・ブルーベ（Bifidobacterium breve、ビフィズス菌とも呼ばれるヘテロ乳酸菌の一種）とラクトバチルス・カゼイとを混合培養して乳酸菌飲料を製造する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３０２８４１１号公報（第２−３頁）
【特許文献２】特開平５−２２７９４６号公報（第２−３頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示されているように、ラクトバチルス・ヘルベティカスを獣乳培地中で培養することにより、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを含んだ機能性発酵乳製品が得られる。ところが、ラクトバチルス・ヘルベティカスは、乳酸を培養早期に多量に産生し、その自ら産生した乳酸で菌が弱りまた死滅する。したがって、ラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて単独培養する方法では、乳酸菌の生菌数が４週間にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持されるような乳製品乳酸菌飲料を得ることは難しい。このため、ラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて培養した乳酸菌飲料は、殺菌処理した乳製品乳酸菌飲料（生菌数：０）などとして製品化されるのが一般的である。このような乳製品乳酸菌飲料（殺菌）は、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを含んだ機能性食品ではあるが、乳酸菌が生きて腸まで届き腸内で有益な働きをするプロバイオティクス食品ではない。
【０００７】
一方、ラクトバチルス・カゼイとラクトバチルス・ヘルベティカスの２種の乳酸菌を単に混合培養する方法では、菌が弱って、乳酸菌の生菌数が４週間にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持されるような乳製品乳酸菌飲料は得られない（後述する実験結果を参照）。また、単なる混合培養では、ラクトバチルス・ヘルベティカスの増殖が抑えられて十分な量のＡＣＥ阻害活性ペプチドが産生されない。
【０００８】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、乳酸菌の生菌数が４週間程度にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持され、かつ、血圧降下作用を示すのに十分な程度にＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを含有した乳製品乳酸菌飲料を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための手段として、ラクトバチルス・カゼイとラクトバチルス・ヘルベティカスとの２種の乳酸菌を、その植菌時期をずらして培養することにより、望むような性状・特質を備えた乳製品乳酸菌飲料が得られることを見出した。すなわち、請求項１に係る発明は、乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以上である乳製品乳酸菌飲料を製造する方法において、乳製品原料にラクトバチルス・カゼイを植菌して培養し、そのラクトバチルス・カゼイの植菌から時間を空けて、培養物にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌してさらに１日〜２日間培養することを特徴とする。
【００１０】
また、上記した乳製品乳酸菌飲料の製造方法において、ラクトバチルス・カゼイを植菌してからラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌するまでの時間、すなわちラクトバチルス・カゼイを単独培養する時間は、２０時間〜３０時間とすることが好ましく、２０時間〜２４時間とすることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
請求項１に係る発明の製造方法によると、まず、乳製品原料（培地）にラクトバチルス・カゼイを植菌して培養し、これにより培地中でラクトバチルス・カゼイが増殖する。ラクトバチルス・カゼイが或る程度増殖してから、ラクトバチルス・ヘルベティカスの植菌を行うが、ラクトバチルス・カゼイは、培養初期には乳酸を産生する量が比較的少ないので、ラクトバチルス・ヘルベティカスの増殖にそれほど悪影響を及ぼさない。そして、ラクトバチルス・ヘルベティカスの増殖に伴って、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが産生される。また、ラクトバチルス・ヘルベティカスの増殖に伴って乳酸が多量に産生されるため、ラクトバチルス・ヘルベティカスは、その乳酸で菌が弱りまた死滅し易くなる。一方、ラクトバチルス・カゼイは耐酸性があり、また、ラクトバチルス・ヘルベティカスの植菌時期から１日〜２日で培養を終了するので、培養終了した発酵物には、多量の元気な乳酸菌（生菌の大部分がラクトバチルス・カゼイであると考えられる）とＡＣＥ阻害ペプチドとが含まれる。
したがって、請求項１に係る発明の製造方法によると、乳酸菌の生菌数が４週間程度にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持され、かつ、血圧降下作用を示すのに十分な程度にＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを含有した乳製品乳酸菌飲料を得ることができる。
【００１２】
また、ラクトバチルス・カゼイを植菌してからラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌するまでの時間を２０時間〜３０時間とすることにより、より好ましくは２０時間〜２４時間とすることにより、ラクトバチルス・カゼイが適当に増殖した後にラクトバチルス・ヘルベティカスの植菌が行われるので、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスの２種の乳酸菌が共に良好に増殖する。したがって、請求項１に係る発明の上記効果がより確実に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】この発明に係る製造方法を用いて得られる乳製品乳酸菌飲料の保存性と、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを同時に植菌して得られる乳製品乳酸菌飲料の保存性とを対比させて示すグラフである。
【図２】ラクトバチルス・カゼイを単独培養した後にラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養する日数を変化させたときに、その日数と乳製品乳酸菌飲料の保存性との関係を示すグラフである。
【図３】この発明に係る製造方法を用いて得られた乳酸菌培養液を高血圧自然発症ラットに投与したときの収縮期血圧の変化を、注射用水を高血圧自然発症ラットに投与したときの収縮期血圧の変化と対比させて示すグラフである。
【図４】この発明に係る製造方法を用いて得られた乳酸菌培養液を高血圧自然発症ラットに投与したときの拡張期血圧の変化を、注射用水を高血圧自然発症ラットに投与したときの拡張期血圧の変化と対比させて示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、この発明の好適な実施形態について説明する。
この発明に係る方法では、乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以上である乳製品乳酸菌飲料を製造するために、ラクトバチルス・カゼイを単独培養した後、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養するようにする。このように単独培養と混合培養とを組み合わせることにより、乳酸菌の生菌数が４週間程度にわたって１，０００万／ｍｌ以上に維持されるとともに、ラクトバチルス・ヘルベティカスの増殖に伴って産生されるＡＣＥ阻害活性ペプチドを含有した乳製品乳酸菌飲料が得られる。
【００１５】
単独培養操作は、乳製品原料、例えば脱脂粉乳（スキムミルク）を水で溶解した溶液（培地）にラクトバチルス・カゼイを植菌して行われる。培養時の温度は、例えば３７℃とする。単独培養の時間（ラクトバチルス・カゼイを植菌してからラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌するまでの時間）は、２０時間以上とし、それより短いと、ラクトバチルス・カゼイの増殖が不十分となり、乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以上である乳製品乳酸菌飲料が得られなくなる。一方、単独培養時間が長くなり過ぎると、ラクトバチルス・カゼイが増殖し過ぎて、混合培養期におけるラクトバチルス・ヘルベティカスが増殖しにくくなり、この結果、乳製品乳酸菌飲料に含有されるＡＣＥ阻害活性ペプチドの量が不十分となる。このため、単独培養の時間は、４０時間以下、好ましくは３０時間以下とし、より好ましくは２４時間以下とする。したがって、単独培養時間は、２０時間〜４０時間、好ましくは２０時間〜３０時間、より好ましくは２０時間〜２４時間とする。
【００１６】
混合培養操作は、ラクトバチルス・カゼイの培養液にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌し単独培養期の温度をそのまま維持して行われる。この混合培養は、１日〜２日間行われる。混合培養の期間が１日より短いと、ラクトバチルス・ヘルベティカスが十分に増殖せず、乳製品乳酸菌飲料に含有されるＡＣＥ阻害活性ペプチドの量が不十分となる。一方、混合培養の期間が３日になると、ラクトバチルス・ヘルベティカスだけでなくラクトバチルス・カゼイも弱って死滅し、２週間以内に乳酸菌の生菌数が１，０００万／ｍｌ以下となってしまう。
【００１７】
上記したように単独培養後に混合培養して得られた乳酸菌培養液に、液糖、果糖、ブドウ糖などのシロップを添加してホモジナイズ（均質化）した混合液を、乳製品乳酸菌飲料（製品）とする。
【実施例】
【００１８】
次に、この発明の実施例について、比較例と対比しながら説明する。
脱脂粉乳を水で溶解した１０％溶液を液体培地として、その培地にラクトバチルス・カゼイを植菌し、３７℃の温度で１日間、ラクトバチルス・カゼイを培養した。ラクトバチルス・カゼイを植菌してから１日後に、培養液にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌し、さらに１日間、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養した。比較のために、上記と同様の培地にラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを同時に植菌し、３７℃の温度で２日間、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養した。
【００１９】
上記した操作により単独培養後に混合培養して得られた乳酸菌培養液、および、最初から混合培養して得られた乳酸菌培養液をそれぞれ０〜２８日間保存し、その保存期間内における乳酸菌の生菌数の変化を調べた。生菌数の測定は、ＧＹＰ寒天培地を用いた希釈平板培養法により行った。この結果を図１に示す。図１のグラフ中のＡが、単独培養−混合培養により得られた乳酸菌培養液における生菌数変化を示し、Ｂが、混合培養により得られた乳酸菌培養液における生菌数変化を示す。
【００２０】
図１のグラフに示した結果から明確に分かるように、単独培養−混合培養により得られた乳酸菌培養液では、生菌数の減少程度が極く僅かであり、４週間保存しても生菌数が１，０００万／ｍｌ以上に維持される。したがって、この乳酸菌培養液を使用して製品化される乳製品乳酸菌飲料は、十分な保存性を有することとなる。これに対し、混合培養により得られた乳酸菌培養液では、生菌数の減少が顕著であり、２週間程度の保存で生菌数が１，０００万／ｍｌ以下となってしまう。
【００２１】
次に、上記と同様の操作により単独培養後に混合培養して乳酸菌培養液を調製する場合において、ラクトバチルス・カゼイを植菌してから１日後にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌し、さらにラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養する期間を１日、２日間および３日間と変化させたときに、得られる乳酸菌培養液の保存性について調べた。この結果を図２に示す。図２のグラフ中のＣが、混合培養期間を１日として得られた乳酸菌培養液の生菌数変化を示し、Ｄが、混合培養期間を２日間として得られた乳酸菌培養液の生菌数変化を示し、Ｅが、混合培養期間を３日間として得られた乳酸菌培養液の生菌数変化を示す。
【００２２】
図２のグラフに示した結果から分かるように、混合培養期間を１日および２日間としたときに単独培養−混合培養により得られた乳酸菌培養液では、いずれについても生菌数の減少程度が極く僅かであり、４週間程度保存しても生菌数が１，０００万／ｍｌ以上に維持される。これに対し、混合培養期間を３日間にすると、単独培養−混合培養により得られた乳酸菌培養液では、生菌数の減少が顕著であり、１０日間程度の保存で生菌数が１，０００万／ｍｌ以下となってしまう。したがって、乳酸菌飲料の保存性の観点からみると、混合培養期間を１日〜２日間とするのが適当である。
【００２３】
また、上記と同様の操作により単独培養後に混合培養して乳酸菌培養液を調製する場合において、ラクトバチルス・カゼイを植菌してから１日後にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌し、さらにラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養する期間を１日、２日間および３日間と変化させたときに、得られる乳酸菌培養液におけるＡＣＥ阻害活性について調べた。ＡＣＥ阻害活性の測定は、測定用キット（（株）同仁化学研究所製、ＡＣＥ Ｋｉｔ−ＷＳＴ）を用いて行った。この結果を表１に示す。表１中の「ＩＣ５０（μｌ／ｍｌ）」は、ＡＣＥ活性を５０％阻害するために必要な濃度を表し、その数値が小さいほどＡＣＥ阻害活性が高いことを示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
表１に示した結果から分かるように、混合培養期間が１日でも、得られた乳酸菌培養液は或る程度高いＡＣＥ阻害活性を示すが、混合培養期間を２日間とした培養液の方がより高いＡＣＥ阻害活性を示し、混合培養期間を３日間とすると、培養液のＡＣＥ阻害活性がさらに高くなる。この結果より、乳酸菌飲料の機能性（ＡＣＥ阻害活性）の観点からみると、混合培養期間は１日でも十分であるが、２日〜３日間とする方がより好ましい。但し、上記した乳酸菌飲料の保存性や生産効率を考慮すると、混合培養時間を１日〜２日間とするのが適当である。また、２日間混合培養した後の乳酸菌培養液のｐＨも、乳製品乳酸菌飲料の製造時におけるタンパク質の安定化に必要なｐＨである３．６に達していた。
【００２６】
次に、上記と同様の操作により単独培養後に混合培養して乳酸菌培養液を調製する場合において、ラクトバチルス・カゼイを植菌してからラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌するまでの時間（ラクトバチルス・カゼイの単独培養時間）を１０時間〜４０時間で変化させたときに、得られる乳酸菌培養液におけるラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスの生菌数を測定した。ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスの混合培養時間は、いずれも４８時間とした。この結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
表２に示した結果より、単独培養時間が２０時間〜４０時間であれば、乳酸菌培養液におけるラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスの生菌数がそれぞれ１，０００万〜１億／ｍｌ以上となり、図２に示した保存日数に伴う生菌数の減少程度を考え合わせると、十分な生菌数の乳酸菌培養液が得られることが分かる。特に、ラクトバチルス・カゼイを２０時間〜３０時間単独培養した後にラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養すると、ラクトバチルス・カゼイの生菌数が１，０００万／ｍｌ以上、ラクトバチルス・ヘルベティカスの生菌数が1億／ｍｌ以上となる。さらに、ラクトバチルス・カゼイを２０時間〜２４時間単独培養した後にラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養すると、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスの生菌数がいずれも１億／ｍｌ以上となる。生産効率を考慮すると、単独培養時間は２０時間〜３０時間で十分であり、さらに、生産効率を良くするとともに乳酸菌飲料中の生菌数をより多くするためには、単独培養時間を２０時間〜２４時間とするのが好適である。なお、ラクトバチルス・ヘルベティカスは、時間の経過に伴って大部分が死滅するものと考えられる。
【００２９】
脱脂粉乳を水で溶解した１０％溶液を液体培地として、その培地にラクトバチルス・カゼイを植菌し、３７℃の温度で１日間、ラクトバチルス・カゼイを培養した後、培養液にラクトバチルス・ヘルベティカスを植菌し、さらに２日間、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを混合培養して乳酸菌培養液を調製した。
【００３０】
得られた乳酸菌培養液を高血圧自然発症ラットに投与し、この乳酸菌培養液の血圧降下作用について試験した。試験群および対照群はそれぞれ、６匹の１２週齢高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ／Ｉｚｍ系）を約１週間予備飼育し、約１７時間絶食させた。試験群には、上記で得られた乳酸菌培養液を４ｍｌ／ｋｇ（体重）の容量で強制単回経口投与し、投与してから４時間、８時間および２４時間経過後における収縮期血圧および拡張期血圧を測定した。また、対照群には、注射用水を４ｍｌ／ｋｇ（体重）の容量で強制単回経口投与し、投与してから４時間、８時間および２４時間経過後における収縮期血圧および拡張期血圧を測定した。収縮期血圧の変化を図３に示し、拡張期血圧の変化を図４に示す。図３のグラフ中のＦが試験群についての血圧変化を、Ｇが対照群についての血圧変化を示す。また、図４のグラフ中のＨが試験群についての血圧変化を、Ｉが対照群についての血圧変化を示す。
【００３１】
図３および図４に示した試験結果から分かるように、この発明に係る方法で製造された乳酸菌培養液を投与した試験群については、投与してから４時間経過後における収縮期血圧および拡張期血圧の降下がいずれも認められた。これに対し、注射用水を投与しただけの対照群については、投与後における収縮期血圧および拡張期血圧の変化はいずれも認められなかった。
【００３２】
上記操作で得られた乳酸菌培養液１００ｍｌに、液糖４６ｇに安定剤を１ｇの割合で添加して調製したシロップ２００ｍｌを混合し、ホモジナイズすることにより乳製品乳酸菌飲料（本発明製品）を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
この発明により、機能性を有する新たな乳製品乳酸菌飲料を提供することができ、この発明は、食品分野において大いに利用される可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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