(57)【要約】【課題】核酸増幅方法、核酸抽出用デバイス、核酸増幅反応用カートリッジ、及び核酸増幅反応用キットを提供する。【解決手段】核酸を含む試料に、カオトロピック物質を含有する吸着液および微粒子を混合して、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着工程と、前記核酸が吸着した微粒子を第１洗浄液で洗浄する洗浄工程と、前記微粒子に吸着した核酸を、溶出液中に溶出させる溶出工程と、前記溶出液中の核酸に対し、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、を含む核酸増幅方法であって、前記吸着液がアルコールを含み、第１洗浄液のｐＨが酸性である、核酸増幅方法とし、この方法を実施できる核酸抽出用デバイス、核酸増幅反応用カートリッジ、及び核酸増幅反応用キットとする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料に、カオトロピック物質を含有する吸着液および微粒子を混合して、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着工程と、
前記核酸が吸着した微粒子を第１洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
前記微粒子に吸着した核酸を、溶出液中に溶出させる溶出工程と、
前記溶出液中の核酸に対し、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
を含む核酸増幅方法であって、
前記吸着液がアルコールを含み、第１洗浄液のｐＨが酸性である、核酸増幅方法。
【請求項２】
前記アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記吸着液中のアルコール濃度が４０％以上５０％以下である、請求項１または２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
核酸を含む試料に、カオトロピック物質を含有する吸着液および微粒子を混合して、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着工程と、
前記核酸が吸着した微粒子を第２洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
前記第２洗浄液で洗浄後の前記核酸が吸着した微粒子を第１洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
前記微粒子に吸着した核酸を、溶出液中に溶出させる溶出工程と、
前記核酸を増幅する核酸増幅工程と、
を含む核酸増幅方法であって、
前記第２洗浄液がアルコールまたはアセトニトリルを含み、第１洗浄液のｐＨが酸性である、核酸増幅方法。
【請求項５】
前記アルコールが、メタノール、またはエタノールである、請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記アルコール濃度が７０％以上１００％以下である、請求項４または５に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）であり、
前記溶出液中に溶出した前記リボ核酸を逆転写し、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程を含み、
核酸増幅工程において増幅する核酸が、合成した前記ｃＤＮＡである、請求項１から５のいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
核酸増幅工程における反応系が、前記溶出液を５０％以上含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
核酸増幅工程における反応系が、前記溶出液である、請求項８に記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
長手方向を有し、
オイルからなる第１プラグ、
オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、
オイルからなる第３プラグ、
オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、
オイルからなる第５プラグ、
を、順に内部に備えたチューブと、
前記チューブの前記第１プラグが配置された側に接続及び連通可能で、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む容器と、を有する核酸抽出用デバイスであって、
前記吸着液はアルコールを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイス。
【請求項１１】
長手方向を有し、
オイルからなる第１プラグ、
オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、
オイルからなる第３プラグ、
オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、
オイルからなる第５プラグ、
を、順に内部に備えたチューブと、
前記チューブの前記第１プラグが配置された側に連通し、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む液溜部と、を有する核酸抽出用デバイスであって、
前記吸着液はアルコールを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイス。
【請求項１２】
前記アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項１０または１１に記載の核酸抽出用デバイス。
【請求項１３】
前記吸着液中のアルコール濃度が４０％以上５０％以下である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の核酸抽出用デバイス。
【請求項１４】
長手方向を有し、
オイルからなる第１プラグ、
オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第２洗浄液からなる第６プラグ、
オイルからなる第７プラグ、
オイルと相分離し、前記第２洗浄液で洗浄した前記核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、
オイルからなる第３プラグ、
オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、
オイルからなる第５プラグ、
を、順に内部に備えたチューブと、を有する核酸抽出用デバイスであって、
前記第２洗浄液はアルコール、またはアセトニトリルを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイス。
【請求項１５】
前記チューブの前記第１プラグが配置された側に接続可能で、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む容器、を有し、
前記吸着液はアルコールを含む、請求項１４に記載の核酸抽出デバイス。
【請求項１６】
前記チューブの前記第１プラグが配置された側に連通し、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む液溜部、を有し、
前記吸着液はアルコールを含む、請求項１４に記載の核酸抽出デバイス。
【請求項１７】
前記第１洗浄液に含まれるアルコールが、メタノール、またはエタノールである、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の核酸抽出用デバイス。
【請求項１８】
前記第１洗浄液中のアルコールの濃度が７０％以上１００％以下である、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の核酸抽出用デバイス。
【請求項１９】
核酸増幅反応用カートリッジであって、
請求項１０から１８までのいずれか１項に記載の核酸抽出用デバイスと、
前記チューブの前記第５プラグの配置された側に連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、
を備える、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２０】
核酸増幅反応における反応液が、前記核酸が溶出した溶出液を５０％以上含む、請求項１９に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２１】
核酸増幅反応における反応液が、前記溶出液である、請求項２０に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２２】
前記チューブの前記第１プラグが配置された側と連通し、前記チューブに前記微粒子を導入するタンクを備える、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２３】
請求項１４に記載の核酸抽出用デバイスと、前記チューブに前記微粒子を導入するタンクと、を備える核酸増幅反応用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法、核酸抽出用デバイス、核酸増幅反応用カートリッジ、及び核酸増幅反応用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている。また農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲは生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。ＰＣＲは、増幅の対象とする核酸（標的核酸）及び試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。ＰＣＲの熱サイクルとしては、２段階又は３段階の温度で熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００３】
一方、医療の現場におけるインフルエンザに代表される感染症の診断は、現状ではイムノクロマト等の簡易検査キットを用いることが主流である。しかしこのような簡易検査では、精度が不十分となる場合があり、より高い検査精度を期待できるＰＣＲを感染症の診断に適用することが望まれている。また、医療機関における一般外来等では、診察の時間が制限される関係から、検査に費やすことのできる時間は短時間に制限される。そのため、例えばインフルエンザの検査は、検査の精度を犠牲にして、簡易的なイムノクロマト等の検査により短時間化して行われているのが現状である。
【０００４】
このような事情から、医療の現場で、より高い精度を期待できるＰＣＲによる検査を実現するためには反応に要する時間を短縮する必要があった。ＰＣＲの反応を短時間で行うための装置として、例えば特許文献１には、反応液と、反応液と混和せず反応液よりも比重の小さい液体とが充填された生体試料反応用チップを、水平方向の回転軸の周りに回転させることで、反応液を移動させて熱サイクルを施す生体試料反応装置が開示されている（特許文献１）。また、ＰＣＲの一手法として、磁性ビーズを用いた方法（特許文献２）や、磁性ビーズを液滴の移動手段として用い、基板上の温度変化領域での液滴を移動させることによりＰＣＲの熱サイクルを行う方法（特許文献３）等の開示がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１３６２５０号公報
【特許文献２】特開２００９−２０７４５９号公報
【特許文献３】特開２００８−０１２４９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、核酸増幅方法、核酸抽出用デバイス、核酸増幅反応用カートリッジ、及び核酸増幅反応用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態に係る核酸増幅方法は、核酸を含む試料に、カオトロピック物質を含有する吸着液および微粒子を混合して、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着工程と、前記核酸が吸着した微粒子を第１洗浄液で洗浄する洗浄工程と、前記微粒子に吸着した核酸を、溶出液中に溶出させる溶出工程と、前記溶出液中の核酸に対し、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、を含む核酸増幅方法であって、前記吸着液がアルコールを含み、第１洗浄液のｐＨが酸性である、核酸増幅方法である。
【０００８】
本発明の他の実施形態に係る核酸増幅方法は、核酸を含む試料に、カオトロピック物質を含有する吸着液および微粒子を混合して、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着工程と、前記核酸が吸着した微粒子を第２洗浄液で洗浄する洗浄工程と、前記第２洗浄液で洗浄後の前記核酸が吸着した微粒子を第１洗浄液で洗浄する洗浄工程と、前記微粒子に吸着した核酸を、溶出液中に溶出させる溶出工程と、前記核酸を増幅する核酸増幅工程と、を含む核酸増幅方法であって、前記第２洗浄液がアルコールまたはアセトニトリルを含み、第１洗浄液のｐＨが酸性である、核酸増幅方法である。
【０００９】
上記いずれかの核酸増幅方法において、前記アルコールが、メタノールまたはエタノールであってもよい。また、前記吸着液中のアルコール濃度が４０％以上５０％以下であってもよい。また、前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）であり、前記溶出液中に溶出した前記リボ核酸を逆転写し、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程を含み、核酸増幅工程において増幅する核酸が、合成した前記ｃＤＮＡであってもよい。また、核酸増幅工程における反応系が、前記溶出液を５０％以上含んでもよく、特に核酸増幅工程における反応系が、前記溶出液であってもよい。
【００１０】
本発明の一実施形態に係る核酸抽出用デバイスは、長手方向を有し、オイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、オイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、オイルからなる第５プラグ、を、順に内部に備えたチューブと、前記チューブの前記第１プラグが配置された側に接続及び連通可能で、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む容器と、を有する核酸抽出用デバイスであって、前記吸着液はアルコールを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイスである。
【００１１】
本発明の他の実施形態に係る核酸抽出用デバイスは、長手方向を有し、オイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、オイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、オイルからなる第５プラグ、を、順に内部に備えたチューブと、前記チューブの前記第１プラグが配置された側に連通し、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む液溜部と、を有する核酸抽出用デバイスであって、前記吸着液はアルコールを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイスである。
【００１２】
上記いずれかの核酸抽出用デバイスにおいて、前記アルコールが、メタノールまたはエタノールであってもよい。また、前記吸着液中のアルコール濃度が４０％以上５０％以下であってもよい。
【００１３】
本発明のさらなる他の実施形態に係る核酸抽出用デバイスは、長手方向を有し、オイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第２洗浄液からなる第６プラグ、オイルからなる第７プラグ、オイルと相分離し、前記第２洗浄液で洗浄した前記核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、オイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、オイルからなる第５プラグ、を、順に内部に備えたチューブと、を有する核酸抽出用デバイスであって、前記第２洗浄液はアルコール、またはアセトニトリルを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイスである。ここで、前記チューブの前記第１プラグが配置された側に接続及び連通可能で、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む容器、を有し、前記吸着液はアルコールを含んでもよいが、あるいは、前記チューブの前記第１プラグが配置された側に連通し、前記核酸を前記微粒子に吸着させる吸着液を含む液溜部、を有し、前記吸着液はアルコールを含んでもよい。なお、前記第２洗浄液に含まれるアルコールが、メタノール、またはエタノールであってもよく、その濃度が７０％以上１００％以下であってもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジは、上記いずれかの核酸抽出用デバイスと、前記チューブの前記第５プラグの配置された側に連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、を備える、核酸増幅反応用カートリッジである。核酸増幅反応における反応液が、前記核酸が溶出した溶出液を５０％以上含んでもよく、核酸増幅反応における反応液が、前記溶出液であってもよい。また、前記チューブの前記第１プラグが配置された側と連通し、前記チューブに前記微粒子を導入するタンクを備えてもよい。
【００１５】
本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応用キットは、長手方向を有し、オイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第２洗浄液からなる第６プラグ、オイルからなる第７プラグ、オイルと相分離し、前記第２洗浄液で洗浄した前記核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、オイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、前記核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、オイルからなる第５プラグ、を、順に内部に備えたチューブと、を有する核酸抽出用デバイスであって、前記第２洗浄液はアルコール、またはアセトニトリルを含み、前記第１洗浄液はｐＨが酸性である、核酸抽出用デバイスと、前記チューブに前記微粒子を導入するタンクと、を備える核酸増幅反応用キット。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】一実施形態に係る核酸抽出用デバイスの要部を模式的に示す図である。
【図２】一実施形態に係る核酸抽出用デバイスの要部を模式的に示す図である。
【図３】一実施形態に係る核酸抽出用デバイスの要部を模式的に示す図である。
【図４Ａ】一実施形態に係る核酸抽出用デバイスを模式的に示す図である。
【図４Ｂ】一実施形態に係る核酸抽出用デバイスを模式的に示す図である。
【図５】一実施形態に係る核酸抽出用デバイスの要部を模式的に示す図である。
【図６】一実施形態に係る核酸抽出用カートリッジの核酸増幅反応用容器を模式的に示す図である。
【図７Ａ】一実施形態に係る核酸抽出用キットの一例を模式的に示す図である。
【図７Ｂ】一実施形態に係る核酸抽出用キットの一例を模式的に示す図である。
【図８】一実施形態に係る核酸抽出用カートリッジの一例を模式的に示す図である。
【図９】一実施形態の核酸抽出方法の変形例を説明するための模式図である。
【図１０】一実施形態に係る核酸抽出用装置の一例を示す斜視図である。
【図１１】一実施形態に係る核酸抽出用装置の一例を示す斜視図である。
【図１２】バッチ処理を用いた実験例１及び２の一結果を示すグラフである。
【図１３】核酸抽出用デバイスを用いた実験例３及び４の一結果を示すグラフである。
【図１４】核酸抽出用デバイスを用いた一実施例の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明のいくつかの実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の例を説明するものである。本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要素であるとは限らない。
【００１８】
１．核酸抽出用デバイス
本実施形態の核酸抽出用デバイス１０００は、チューブ部１００と、第１プラグ１０、第２プラグ２０、第３プラグ３０、第４プラグ４０及び第５プラグ５０と、を有する。
【００１９】
図１は、本実施形態の核酸抽出用デバイス１０００の要部を模式的に示す図である。
【００２０】
１．１．チューブ部
チューブ部１００は、核酸抽出用デバイス１０００の要部を構成している。核酸抽出用デバイス１０００は、チューブ部１００の他に、各種の構成を含んでもよい。核酸抽出用デバイス１０００は、例えば、図示しないが、チューブ部１００に接続される配管、容器、栓、継ぎ手、ポンプ、制御装置などを含んでもよい。
【００２１】
チューブ部１００は、内部に空洞を有し、当該空洞内に液体を長手方向に流通させることのできる筒状の部分である。チューブ部１００は、長手方向を有するが、屈曲してもよい。チューブ部１００の内部の空洞は、内部に収容される液体がチューブ部１００内でプラグ形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ部１００の内部の空洞の大きさや長手方向に垂直な断面の形状は、チューブ部１００の長手方向に沿って変化してもよい。液体がチューブ部１００内でプラグ形状を維持できるかどうかについては、チューブ部１００の材質、液体の種類等の条件に依存するので、チューブ部１００の長手方向に垂直な断面の形状は、液体がチューブ部１００内でプラグ形状を維持できる範囲内で適宜に設計される。
【００２２】
チューブ部１００の外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブ部１００の肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されない。チューブ部１００の内部の空洞の長手方向に垂直な断面が円形である場合、チューブ部１００の内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブ部１００の内径がこの範囲であると、チューブ部１００の材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすいので好ましい。
【００２３】
チューブ部１００の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、高分子、金属などとすることができる。なお、チューブ部１００の材質にガラスや高分子などの可視光において透明性を有する材質を選択すると、チューブ部１００の外部から内部（空洞内）を観察することができるので好ましい。また、チューブ部１００の材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブ部１００に磁性粒子を通過させる場合などに、チューブ部１００の外部から磁力を与えることによってこれを行うことが容易化されるためより好ましい。
【００２４】
チューブ部１００の内部には、第１のオイルからなる第１プラグ１０、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ２０、第１洗浄液と混和しない第２のオイルからなる第３プラグ３０、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した微粒子から核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ４０、及び溶出液と混和しない第３のオイルからなる第５プラグ５０を、この順で内部に備える。
【００２５】
１．２．第１プラグ、第３プラグ、及び第５プラグ
第１プラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０は、いずれもオイルからなる。第１プラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０のオイルは、互いに異なる種類のオイルであってもよいし、同じ種類のオイルであってもよい。オイルとしては、例えば、ジメチルシリコーンオイル等のシリコーン系オイル、パラフィン系オイル及びミネラルオイル並びにそれらの混合物から選択される一種を挙げることができる。また、第１プラグ１０、第２プラグ２０、第３プラグ３０、第４プラグ４０、及び第５プラグ５０の隣り合うプラグを形成する液体は、互いに混和しないように選択される。
【００２６】
第１プラグ１０と第３プラグ３０の間には、第２プラグ２０が配置される。第１プラグ１０の第２プラグ２０と反対側の領域には、他の液体のプラグが配置されてもよい。第１プラグ１０の中には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第１プラグ１０を通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。また、第１プラグ１０と第２プラグ２０の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第１プラグ１０から第２プラグ２０へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。同様に、第２プラグ２０と第３プラグ３０の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第２プラグ２０から第３プラグ３０へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。
【００２７】
第３プラグ３０と第５プラグ５０の間には、第４プラグ４０が配置される。第５プラグ５０の第４プラグ４０と反対側の領域には、他の液体のプラグが配置されてもよい。第３プラグ３０の中には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第３プラグ３０を通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。また、第３プラグ３０と第４プラグ４０の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第３プラグ３０から第４プラグ４０へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。同様に、第４プラグ４０と第５プラグ５０の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第４プラグ４０から第５プラグ５０へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。さらに、第５プラグ５０の中には、気泡や他の液体がないことが好ましい。
【００２８】
第１プラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０のチューブ部１００の長手方向における長さは、プラグが形成可能な範囲であれば、いずれも特に限定されない。第１プラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０のチューブ部１００の長手方向における具体的な長さとしては、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、粒子等の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。これらのうち第３プラグ３０のチューブ部１００の長手方向における長さを長くすると、第４プラグ４０をチューブ部１００の第５プラグ５０側の端から吐出する態様を採る場合に、第２プラグ２０を吐出しにくくすることができる。この場合、第３プラグ３０の具体的な長さとしては、１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下とすることができる。
【００２９】
第１プラグ１０及び第５プラグ５０は、チューブ部１００の少なくとも一方の端が開放されたとしても、第１洗浄液（第２プラグ２０）及び溶出液（第４プラグ４０）の、蒸発等の外気との物質交換や、外部からの汚染を防ぐ機能を有している。そのため、チューブ部１００の少なくとも一方の端が外気に開放されたとしても、第１洗浄液や溶出液の体積を一定に保つことができ、各液体の濃度の変動や汚染を抑制することができる。これにより、核酸抽出における核酸や各種の薬剤の濃度の精度を高めることができる。
【００３０】
また、第３プラグ３０は、第１洗浄液（第２プラグ２０）及び溶出液（第４プラグ４０）が互いに混合することを抑制する機能を有する。また第３プラグ３０は、より高粘度のオイルとすることにより、第１洗浄液（第２プラグ２０）との界面で、粒子等を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、第２プラグ２０の第１洗浄液のプラグから、オイルの第３プラグ３０に粒子等を移動させた場合に、粒子等に付着した水溶性の成分を第３プラグ３０（オイル）に、より持ち込まれにくくすることができる。
【００３１】
１．３．第２プラグ
第２プラグ２０は、チューブ部１００内の第１プラグ１０と第３プラグ３０との間の位置に配置される。第２プラグ２０は、核酸が結合した微粒子を洗浄する第１洗浄液からなる。第１プラグ１０を構成するオイル及び第３プラグ３０を構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。
【００３２】
第１洗浄液は、酸性溶液である。特に酸性水溶液であることが好ましく、含有する酸は特に限定されないが、クエン酸、酢酸、グリシン塩酸塩などの水溶液が好ましい。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）や、界面活性剤（Triton、Tween、SDSなど）等を含有してもよいが、カオトロピック物質を事実上含まない溶液であるほうが好ましい。ｐＨは、酸性であれば特に限定されないが、下限については、１以上であることが好ましく、２以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましく、４以上であることが最も好ましく、上限については、６以下であることが好ましく、５以下であることがさらに好ましく、４以下であることが最も好ましい。このような第１洗浄液を採用することにより、第１プラグの上流側で、核酸や核酸が吸着した粒子がアルコールを含む溶液と接しても、すなわち後述するアルコールを含む吸着液で核酸を抽出する場合や、アルコールを含む洗浄液で核酸が吸着した粒子を洗浄する場合であっても、第１洗浄液により核酸が吸着した粒子等を効率よく洗浄することができ、かつ下流へのアルコールの持ち込み、いわゆるアルコールのキャリーオーバーを防ぐことができる。
【００３３】
第２プラグ２０の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量等を指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第２プラグ２０の体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０μＬ以上５０μＬ以下とすることが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさらに好ましい。第２プラグ２０の体積が、この範囲であれば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合に粒子等の洗浄を十分に行うことができる。なお、粒子等の洗浄には、第２プラグ２０の体積は、より大きいことが好ましいが、チューブ部１００の長さや太さ、これに依存する第２プラグ２０のチューブ部１００の長手方向における長さ等を考慮して、適宜に設定することができる。
【００３４】
第２プラグ２０は、オイルのプラグによって分割されて複数のプラグから構成されてもよい。第２プラグ２０がオイルプラグで分割された複数のプラグからなる場合は、第１洗浄液のプラグが複数形成される。そのため、第２プラグ２０がオイルプラグで分割された場合には、洗浄の対象が水溶性物質であれば、分割された第１洗浄液によって到達する水溶性物質の濃度は、分割されていない同体積の第１洗浄液によって到達する水溶性物質の濃度よりも小さくなるためより好ましい。第２プラグ２０が分割される数は任意であるが、洗浄の対象が水溶性物質であれば、例えば、等体積で２分割すると、計算上は分割しない場合の１／４の濃度まで水溶性物質の濃度を低下させることができる。第２プラグ２０が分割される数は、例えば、チューブ部１００の長さや洗浄の対象等を考慮して適宜設定されることができる。
【００３５】
１．４．第４プラグ
第４プラグ４０は、チューブ部１００内の第３プラグ３０と第５プラグ５０との間の位置に配置される。第４プラグ４０は、核酸が結合した微粒子から核酸を溶出する溶出液からなる。
【００３６】
溶出液としては、例えば、滅菌水、蒸留水、イオン交換水等の精製された水、又はバッファーを用いることができる。溶出液を水又は水溶液とすれば、核酸が吸着した粒子等が溶出液に浸漬されることで、粒子等に吸着した核酸を溶出することができる。溶出液は、第３プラグ３０を構成するオイル及び第５プラグ５０を構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。
【００３７】
溶出液は、逆転写反応のために、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでもよく、ポリメラーゼ反応のために、さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでもよく、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブやＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいてもよい。さらに、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。また、逆転写酵素用緩衝液及び／又はＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液となるように、塩を含有することが好ましい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。ＤＮＡポリメラーゼも特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００３８】
ＤＮＡポリメラーゼ用プライマーは、検出するＤＮＡに対し、容易に適切な配列を決めることができる。通常、１種類のＤＮＡを増幅するために、５’側のプライマーと３’側のプライマーのプライマーペアを含めばよい。なお、複数種類のＤＮＡを増幅するために、異なる蛍光色素で標識された複数種のプライマーペアを含ませておくことによって、マルチプレックスＰＣＲにも対応可能である。その場合、適宜、ＴａｑＭａｎプローブも複数にすればよい。
【００３９】
反応液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。ＢＳＡまたはゼラチンの濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させても良い。
【００４０】
溶出液プラグ４０の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、溶出液プラグ４０の体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。溶出液プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、微粒子の体積を０．５μＬにしても、微粒子から核酸を十分溶出することができる。
【００４１】
１．５．核酸抽出用デバイスの構成等
本実施形態の核酸抽出用デバイスは、チューブ部１００と、第１プラグ１０、第２プラグ２０、第３プラグ３０、第４プラグ４０、及び第５プラグ５０と、を有するが、他の機能を付加する構成を含んでもよい。本実施形態の核酸抽出用デバイスは、以下に説明する構成の組み合わせや、各構成の変形形態を含んでもよい。
【００４２】
１．５．１．チューブ部の端部
図２は、核酸抽出用デバイスの変形例の一種である核酸抽出用デバイス１０１０を模式的に示す図である。本実施形態の核酸抽出用デバイスは、例えば、チューブ部１００の第５プラグ５０側の端が開放されていてもよい。すなわち、図２に示すように、核酸抽出用デバイス１０１０では、チューブ部１００の第５プラグ５０側の端が、開放された状態となっている。核酸抽出用デバイス１０１０によれば、チューブ部１００の第１プラグ１０側からチューブ部１００の内部に圧力を印加することにより、第５プラグ５０及び第４プラグ４０を順に吐出させることができる。これにより、核酸抽出用デバイス１０１０を用いて、例えばＰＣＲのための反応容器等に、標的核酸を含む溶出液（第４プラグ４０）を容易に分注することができる。
【００４３】
１．５．２．栓
図３は、核酸抽出用デバイスの変形例の一種である核酸抽出用デバイス１０２０を模式的に示す図である。本実施形態の核酸抽出用デバイスは、図示のように、例えば、チューブ部１００の第５プラグ５０側の端を封止する、脱着自在の栓１１０をさらに有してもよい。栓１１０は、例えば、ゴムやエラストマー、高分子等によりなることができる。栓１１０によってチューブ部１００が封止される場合、栓１１０は、第５プラグ５０と接してもよいし、第５プラグ５０と栓１１０の間に空気等の気体が配置されてもよい。また、栓１１０は脱着自在であるが、その機構は特に限定されない。図３の例では、栓１１０の一部がチューブ部１００の内部に挿入されて固定される態様を示しているが、栓１１０はキャップ状であってもよい。
【００４４】
核酸抽出用デバイス１０２０において、栓１１０が外された場合には、チューブ部１００の第５プラグ５０側の端が開放して、上述した図２の核酸抽出用デバイス１０１０の態様となり、核酸抽出用デバイス１０２０を用いて、例えばＰＣＲのための反応容器等に、標的核酸を含む溶出液（第４プラグ４０）を容易に分注することができる。また、栓１１０によってチューブ部１００の第５プラグ５０側の端が封止された状態（図３に示す状態）であれば、各プラグのチューブ部１００内での移動を抑制する効果が得られ、これにより、例えば、粒子等をチューブ部１００内で移動させる場合に、粒子等の移動に伴ってプラグが移動することを抑制することができる。
【００４５】
１．５．３．容器
図４Ａは、核酸抽出用デバイスの構成の一例である核酸抽出用デバイス１０３０を模式的に示す図である。図４Ａに例示するように、核酸抽出用デバイス１０３０は、チューブ部１００の第１プラグ１０側の上流端に内部を連通させて接続できる、脱着自在の容器１２０をさらに有している。
【００４６】
容器１２０は、独立した部材とすることができる。容器１２０は、内部に液体を収容することができる。容器１２０は、液体や固体を出し入れできる開口１２１を有する。また、図４Ａの例では、容器１２０の開口１２１が、チューブ部１００の第１プラグ１０側の端に内部を連通させて接続される態様となっている。また、容器１２０は、開口１２１を複数有してもよく、この場合の開口１２１の１つをチューブ部１００の第１プラグ１０側の端に内部を連通させて接続される態様としてもよい。
【００４７】
容器１２０の内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。容器１２０の開口１２１は、必要に応じて蓋１２２によって封止できる構造としてもよい。容器１２０の材質は、特に限定されず、高分子、金属等とすることができる。
【００４８】
容器１２０の開口１２１は、チューブ部１００の第１プラグ１０側の端に接続することができるが、容器１２０とチューブ部１００との間の接続は、内容物が漏出しない態様である限り特に限定されない。容器１２０とチューブ部１００とが接続された場合には、容器１２０の内部とチューブ部１００の内部とが連通することができる。また、容器１２０は、必要に応じてチューブ部１００から取り外すことができる。
【００４９】
核酸抽出用デバイス１０３０のように、容器１２０を備えることにより、容器１２０内において、例えば、粒子等と、吸着液と、試料と、を収容し、粒子等に核酸を吸着させることができる。その後、容器１２０をチューブ部１００の第１プラグ１０側の端に接続すれば、当該粒子等をチューブ部１００の第１プラグ１０側から容易にチューブ部１００内に導入できる状態とすることができる。
【００５０】
吸着液とは、核酸結合性固相担体である微粒子（例えば磁性粒子Ｍ）に核酸を吸着させる液体のことをいう。吸着液は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、吸着液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。吸着液は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。
【００５１】
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の微粒子への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。
【００５２】
この吸着液は、アルコール、又はアセトニトリルを含むことが好ましい。この場合、アルコール等の濃度は、特に限定されないが、下限については、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよいが、４０％以上であることが最も好ましい。上限については、８０％以下であってもよく、７０％以下であってもよく、６０％以下であってもよいが、５０％以下であることが最も好ましい。アルコールの種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノールなどが例示できる。吸着液にアルコール等を添加することにより、粒子等に核酸を吸着する効果を高め、核酸抽出用デバイスとしてみた場合には核酸の抽出効率を高めることが可能になる。
【００５３】
容器１２０は、チューブ部１００に接続していない状態で、振とうすることができ、容器１２０内の液体を十分に撹拌することができる。これにより、迅速に粒子等に核酸を吸着させることができる。容器１２０は、開口１２１を封止する蓋１２２を有してもよい。さらに容器１２０に導入する試料の量とチューブ部１００内の液体（特に第４プラグ４０）の体積とを適宜変更することによって、試料中の核酸を第４プラグ４０の溶出液において定量的に濃縮することもできる。
【００５４】
容器１２０の材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを選択すると、容器１２０をチューブ部１００に接続した状態で、容器１２０を変形させることにより、チューブ部１００の内部を加圧することができる。このようにすれば、第４プラグ４０の溶出液をチューブ部１００の第５プラグ５０側の端から吐出させる際に、チューブ部１００の第１プラグ１０側から圧力を印加することが容易である。これにより、例えばＰＣＲのための反応容器等に溶出液を分注することができる。
【００５５】
１．５．４．液溜部
図４Ｂは、核酸抽出用デバイスの構成の一例である核酸抽出用デバイス１０４０を模式的に示す図である。図４Ｂに例示するように、核酸抽出用デバイス１０４０は、チューブ部１００の第１プラグ１０側の端に、チューブ部１００に連通する液溜部１３０が形成されている。液溜部１３０の内部とチューブ部１００の内部とは連通している。
【００５６】
液溜部１３０は、内部に液体を収容することができる。液溜部１３０は、液溜部１３０内部に外部から物質を導入できる開口１３１を有する。液溜部１３０における開口１３１が形成される位置は特に限定されない。液溜部１３０は、開口１３１を複数有してもよい。液溜部１３０の内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。液溜部１３０の材質は、特に限定されず、高分子、金属等とすることができ、チューブ部１００の材質と同じであってもよい。
【００５７】
核酸抽出用デバイス１０４０のように、液溜部１３０を備えることにより、液溜部１３０内において、例えば、粒子等と、吸着液と、試料と、を収容し、粒子等に核酸を吸着させることができる。そして、当該粒子等をチューブ部１００の第１プラグ１０側から容易にチューブ部１００内に導入することができる。
【００５８】
また、液溜部１３０は、チューブ部１００とともに振とうすることができ、液溜部１３０内の液体を十分に撹拌することができる。これにより、迅速に粒子等に核酸を吸着させることができる。さらに液溜部１３０に導入する試料の量とチューブ部１００内の液体の体積とを適宜変更することによって、試料中の核酸を溶出液において定量的に濃縮することができる。
【００５９】
核酸抽出用デバイス１０４０のように液溜部１３０を有する場合、液溜部１３０の開口１３１を封止する、脱着自在の蓋１３２をさらに有してもよい。そして、液溜部１３０の材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを選択すると、液溜部１３０に蓋１３２を装着した状態で、液溜部１３０を変形させることにより、チューブ部１００の内部を加圧することができる。
【００６０】
このようにすれば、核酸が溶出された第４プラグ４０の溶出液をチューブ部１００の第５プラグ５０側の端から吐出させる際に、チューブ部１００の第１プラグ１０側から圧力を容易に印加することができる。これにより、容器１２０に試料を導入する工程から、例えばＰＣＲのための反応容器等に容易に溶出液を分注する工程までを行うことができる。また、蓋１３２を装着すれば、液溜部１３０をチューブ部１００とともに振とうする際の液漏れを抑制することができるため、より粒子等に核酸を吸着させる効率を向上させることができる。
【００６１】
１．５．５．第６プラグ及び第７プラグ
本実施形態の核酸抽出用デバイスは、チューブ部の内部に、第６プラグ及び第７プラグを有してもよい。図５は、チューブ部１００の内部に、第６プラグ６０及び第７プラグ７０を有する核酸抽出用デバイス１１００を模式的に示す図である。
【００６２】
核酸抽出用デバイス１１００は、上述の核酸抽出用デバイスのチューブ部１００の内部の第１プラグ１０と第２プラグ２０との間に、第１プラグ１０側から順に、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する第２洗浄液からなる第６プラグ６０、及び第４のオイルからなる第７プラグ７０を追加した構成を有している。
【００６３】
第６プラグ６０は、第２洗浄液からなる。第２洗浄液６０は、第１プラグを構成するオイル１０及び第７プラグを構成するオイル７０のいずれとも、混ぜた時に相分離する液体であればよい。第２洗浄液６０は、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１０ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。カオトロピック物質を含んでいてもかまわない。
【００６４】
さらに、この洗浄液は、洗浄効果を上げるため、アルコールを含むことが好ましい。特に、第１洗浄液を酸性溶液とする効果を高めるためには、少なくとも吸着液と第２洗浄液のいずれかがアルコールを含むのが好ましい。この場合、アルコール濃度は、特に限定されないが、下限については、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよいが、７０％以上であることが最も好ましい。アルコール濃度の上限については、９０％以下であってもよく、８０％以下であってもよいが、７０％以下であることが最も好ましい。アルコールの種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリルなどが例示できる。なお、核酸、及び核酸が吸着した粒子等の洗浄という観点では、上述の吸着液、又は第２洗浄液の少なくとも一方がアルコールを含めば、洗浄効果を高めることができるが、吸着液と第２洗浄液の双方がアルコールを含むと、さらに洗浄効果を高めることができるので好ましい。
【００６５】
第６プラグ６０の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量等を指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第６プラグ６０の体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０μＬ以上５０μＬ以下とすることが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさらに好ましい。第６プラグ６０の体積が、この範囲であれば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合に粒子等の洗浄を十分に行うことができる。なお、粒子等の洗浄には、第６プラグ６０の体積は、より大きいことが好ましいが、チューブ部１００の長さや太さ、これに依存する第６プラグ６０のチューブ部１００の長手方向における長さ等を考慮して、適宜に設定することができる。
【００６６】
第６プラグ６０は、オイルのプラグによって分割されて複数のプラグから構成されてもよい。第６プラグ６０がオイルプラグで分割された複数のプラグからなる場合は、各プラグの洗浄液の構成は、同じであっても異なっていても良く、特に限定されないが、上述のように、アルコールを含むのが好ましい。
【００６７】
第７プラグ７０は、隣り合う第６プラグ６０及び第２プラグ２０の液体と混和しないオイルからなる。第７プラグ７０のオイルは、第１プラグ１０、第３プラグ３０、及び第５プラグ５０のオイルと同じ種類のオイルであっても異なる種類のオイルであってもよい。オイルとしては、第１プラグ１０等において例示したと同様とすることができる。
【００６８】
第７プラグ７０の中には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第７プラグ７０を通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。また、第７プラグ７０と隣り合う第２プラグ２０及び第６プラグ６０との間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等がチューブ部１００内を移動できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。
【００６９】
第７プラグ７０のチューブ部１００の長手方向における長さは、プラグが形成可能な範囲であれば特に限定されない。第７プラグ７０のチューブ部１００の長手方向における具体的な長さとしては、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、粒子等の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。
【００７０】
また、第７プラグ７０は、第２洗浄液（第６プラグ６０）及び第１洗浄液（第２プラグ２０）が互いに混合することを抑制する機能を有する。また第７プラグ７０は、より高粘度のオイルとすることにより、第２洗浄液（第６プラグ６０）との界面で、粒子等を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、第６プラグ６０の第２洗浄液のプラグから、オイルの第７プラグ７０に粒子等を移動させた場合に、粒子等に付着した水溶性の成分を第７プラグ７０に、より持ち込まれにくくすることができる。
【００７１】
核酸抽出用デバイス１１００によれば、核酸が吸着された粒子等を、第２プラグ２０に加え、第６プラグ６０において洗浄することができる。これにより、粒子等の洗浄効率をさらに高めることができる。
【００７２】
また、核酸抽出用デバイス１１００においては、第６プラグ６０の第２洗浄液にカオトロピック剤を含有させてもよい。例えば、第２洗浄液にグアニジン塩酸塩を含有させると、第６プラグ６０において、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗浄することができる。第６プラグ６０にグアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。
【００７３】
そして、上述したように、第２プラグ２０の第１洗浄液を、酸性溶液とすることで、第６プラグ６０において粒子等に吸着したアルコールを、第２プラグ２０で効率よく洗浄することができ、溶出液や、その後の逆転写反応系や核酸増幅反応系に、アルコールの持ち込みを減少させることができる。
【００７４】
チューブ部１００の内部に、第６プラグ６０及び第７プラグ７０を有する核酸抽出用デバイス１１００であっても、上述した栓、容器、液溜部等を構成に付加することができ、上述と同様の効果が得られることは容易に理解されよう。
【００７５】
１．５．６．核酸増幅反応用容器
本発明の核酸抽出用デバイスは、チューブの下流端と連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器を備えた核酸増幅反応用カートリッジという構成としてもよい。図６に、核酸増幅反応用容器の構成の一例を示し、図８に、核酸増幅反応用カートリッジの全体構成の一例を示す。
【００７６】
図６Ａは、初期状態の説明図である。図６Ｂは、溶出液がチューブ２００から押し出された後の状態の説明図である。核酸増幅反応用容器２３０は、チューブ２００から押し出される液体を受け入れる容器であるとともに、熱サイクル処理時に溶出液２４９を収容する容器である。
【００７７】
核酸増幅反応用容器２３０は、シール形成部２３１及び流路形成部２３５を有する。シール形成部２３１は、チューブ２００が挿入されている部分であり、流路形成部２３５から溢れるオイルが外部に漏洩することを抑制する部位である。流路形成部２３５は、シール形成部２３１よりも下流側の部分であり、液滴状の溶出液２４９の移動する流路を形成する部位である。核酸増幅反応用容器２３０は、シール形成部２３１の上シール部２３４Ａと下シール部２３４Ｂの２箇所でチューブ２００に対して固定される。
【００７８】
シール形成部２３１は、オイル受容部２３２及び段差部２３３を有する。
【００７９】
オイル受容部２３２は、筒状の部位であり、流路形成部２３５から溢れ出るオイルを受容するリザーバーとして機能する。オイル受容部２３２の内壁と、チューブ２００の外壁との間には隙間があり、この隙間が、流路形成部２３５から溢れるオイルを受容するオイル受容空間２３２Ａとなる。
【００８０】
オイル受容部２３２の上流側の内壁がチューブ２００の環状の凸部と接触することによって、上シール部２３４Ａが形成される。上シール部２３４Ａは、空気の通過は許容しつつ、オイル受容空間２３２Ａのオイルが外部に漏洩することを抑制するシールである。上シール部２３４Ａは、オイルの表面張力によってオイルが漏洩しない程度に、通気口が形成されている。上シール部２３４Ａの通気口は、チューブ２００の凸部とオイル受容部２３２の内壁との間の隙間でも良いし、チューブ２００の凸部に形成した穴、溝又は切欠でも良い。また、オイルを吸収するオイル吸収材によって上シール部２３４Ａを形成しても良い。
【００８１】
段差部２３３は、オイル受容部２３２の下流側に設けられた段差のある部位である。段差部２３３の下流部の内径は、オイル受容部２３２の内径よりも小さい。段差部２３３の内壁は、チューブ２００の下流側の外壁と接触している。段差部２３３の内壁とチューブ２００の外壁が接触することによって、下シール部２３４Ｂが形成される。下シール部２３４Ｂは、流路形成部２３５のオイルがオイル受容空間２３２Ａへ流れることを許容しつつ、その流れに抵抗するシールである。下シール部２３４Ｂでの圧力損失によって、流路形成部２３５の圧力が外気圧よりも高くなるので、熱サイクル処理時に流路形成部２３５の液体が加熱されても、流路形成部２３５の液体に気泡が発生しにくい。
【００８２】
流路形成部２３５は、管状の部位であり、液滴状の溶出液２４９の移動する流路を形成する容器となる。流路形成部２３５にはオイルが充填されている。流路形成部２３５の上流側はチューブ２００の末端によって閉じられており、流路形成部２３５に向かってチューブ２００の末端が開口している。流路形成部２３５の内径は、チューブ２００の内径よりも大きく、溶出液２４９が球状になったときの外径よりも大きい。流路形成部２３５の内壁は、水溶性の溶出液２４９が付着しない程度の撥水性を有することが望ましい。
【００８３】
図６Ａに示すように、初期状態では、核酸増幅反応用容器２３０の流路形成部２３５にオイルが充填されている。オイルの界面は、オイル受容空間２３２Ａの比較的下流側に位置している。
【００８４】
図６Ｂに示すように、溶出液２４９がチューブ２０から押し出されても、流路形成部２３５には予めオイルが充填されているので、流路形成部２３５に気体は流入しない。
【００８５】
溶出液２４９がチューブ２００から押し出される前には、まず、チューブ２００の最も下流にあるオイルプラグ内のオイルが流路形成部２３５に流入し、流入分のオイルが流路形成部２３５からオイル受容空間２３２Ａに流れ込み、オイル受容空間２３２Ａのオイル界面が上昇する。このとき、下シール部２３４Ｂの圧力損失によって、流路形成部２３５の液体の圧力が高くなる。最も下流にあるオイルプラグがチューブ２００から押し出された後、溶出液２４９がチューブ２００から流路形成部２３５に流入する。溶出液プラグ２４９に増幅させる核酸と核酸増幅反応を行う試薬が含まれている場合、流入した溶出液プラグ２４９が、液滴状になり、そのままＰＣＲに用いられる。
【００８６】
このような一体型の核酸増幅反応用カートリッジは、例えば、特開２０１２−１１５２０８で原理が開示されているような回転式ＰＣＲ装置に対し、好適に用いることができる。
【００８７】
２．核酸抽出用キット
図７Ａは、本実施形態の核酸抽出用キットの一例を示す模式図である。図７Ａに例示した核酸抽出用キット２０００は、上述した核酸抽出用デバイスの要部を構成する部品を含む。「１．核酸抽出用デバイス」の項において説明した構成と同様の構成については、同じ符号を付して詳細な説明は省略する。
【００８８】
本実施形態の核酸抽出用キット２０００は、オイルからなる第１プラグ１０、オイルと混和しない第１洗浄液からなる第２プラグ２０、オイルからなる第３プラグ３０、オイルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０、及びオイルからなる第５プラグ５０、が当該順で内部に配置されたチューブ２００と、チューブ２００の第１プラグ１０側の端に内部を連通させて接続可能な容器１２０と、を含む。
【００８９】
チューブ２００は、核酸抽出用デバイス１０００のチューブ部１００の両端が開放された態様のものであり、内部に空洞を有し、当該空洞内に液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状を有する。チューブ２００の内部形状、外形形状、大きさ、性質、材質等は、核酸抽出用デバイス１０００のチューブ部１００と同様である。チューブ２００の内部に配置されるプラグは、核酸抽出用デバイス１０００のチューブ部１００に配置されるプラグと同様である。また、チューブ２００の両端は、脱着自在の栓１１０によって封止されてもよい。チューブ２００の両端が栓１１０によって封止されている場合、例えば、核酸抽出用キット２０００の保管、移送がより容易になる。さらに、チューブ２００の使用時に、栓１１０がチューブ２００の第５プラグ５０側の端を封止した状態とすれば、チューブ２００の内部で粒子等を移動させる際に、各プラグのチューブ２００内での移動を抑制することができるので、洗浄、抽出をさらに容易化することができる。その上、当該栓１１０は、脱着自在であるため、チューブ２００の第５プラグ５０側の端を開放することができ、核酸が溶出された第４プラグ４０の溶出液をチューブ２００の第５プラグ５０側の端から吐出させることが容易である。
【００９０】
容器１２０は、核酸抽出用デバイス１０００の項で説明した容器１２０と同様である。
【００９１】
図７Ａの例では、チューブ２００の両端が、脱着自在の栓１１０によって封止されている。また、核酸抽出用キット２０００は、容器１２０の開口１２１を脱着自在に封止する蓋１２２を含んでもよく、容器１２０の開口１２１が脱着自在の蓋１２２によって封止されてもよい。さらに、核酸抽出用キット２０００では、吸着液の成分の一部又は全部が容器１２０に収容されていてもよい。
【００９２】
また、核酸抽出用キット２０００では、容器１２０は、吸着液及び磁性粒子を収容していてもよい。このようにすれば、試料を容器１２０に導入した際、試料に含まれる核酸を磁性粒子に吸着させる工程を、容器１２０において行うことができる。これにより、他の容器を用意する必要がなく、さらに迅速にＰＣＲの前処理を行うことができる。またこの場合、容器１２０の開口１２１は、必要に応じて脱着自在の蓋１２２によって封止されてもよい。磁性粒子については後に詳述する。
【００９３】
また、容器１２０を、既に述べたように、可とう性を有する材質とすれば、容器１２０をチューブ２００に接続した状態で、容器１２０を変形させることにより、チューブ２００の内部を加圧することができる。このようにすれば、核酸が溶出された第４プラグ４０の溶出液をチューブ２００の第５プラグ５０側の端から吐出させる際に、チューブ２００の第１プラグ１０側から圧力を容易に印加することができる。これにより、例えばＰＣＲのための反応容器等に容易に溶出液を分注することができる。
【００９４】
核酸抽出用キット２０００には、チューブ２００及び容器１２０の他に、例えば、栓、蓋、取扱説明書、試薬、ケース等の他の構成が含まれてもよい。またここではチューブ２００内に５つのプラグが配置されている例を示したが、「１．６．核酸抽出用デバイス」の項において説明したと同様に、チューブ２００（チューブ部１００）内には、第６プラグ６０、第７プラグ７０等や、必要に応じてその他のプラグが配置されてもよいことは容易に理解されよう。
【００９５】
本実施形態の核酸抽出用キット２０００は、チューブ２００の第１プラグ１０側の端に内部を連通させて接続可能な容器１２０を有するため、容器１２０内において、粒子等と試料とを収容すれば、粒子等に核酸を吸着させることができ、容器１２０をチューブ２００の第１プラグ１０側の端に接続すれば、当該粒子等をチューブ２００の第１プラグ側から容易にチューブ２００内に導入することができる。また、本実施形態の核酸抽出用キット２０００は、容器１２０を有するため、容器１２０を振とうすることができ、容器１２０内の液体を十分に撹拌することができる。これにより迅速に粒子等に核酸を吸着させることができる。
【００９６】
また、チューブ２００に容器１２０を接続することにより、核酸が吸着された粒子等をチューブ２００の第１プラグ１０側の端から導入して、第４プラグ４０まで移動させることが容易である。これにより、核酸の抽出をきわめて短時間で容易に行うことができる。核酸抽出用キット２０００は、核酸が吸着された粒子等をチューブ２００内において移動させることによって、高い純度で核酸を含有する溶出液を得ることができる。そのため、核酸抽出用キット２０００によれば、ＰＣＲのための前処理に要する時間と手間を大幅に削減することができる。
【００９７】
３．核酸抽出方法
上述した核酸抽出用デバイス、核酸抽出用キット及びそれらの変形形態、並びに後述する核酸抽出用装置は、いずれも本実施形態の核酸抽出方法に好適に利用することができる。以下、本実施形態の核酸抽出方法の一例として、上述の核酸抽出用キット２０００を利用した方法を述べる。
【００９８】
本実施形態の核酸抽出方法は磁性粒子Ｍなどの微粒子及び吸着液が収容された可とう性を有する容器１２０に、核酸を含む試料を導入する工程と、容器１２０を揺動して核酸を磁性粒子Ｍに吸着させる工程と、オイルからなる第１プラグ１０、オイルと混和しない第１洗浄液からなる第２プラグ２０、オイルからなる第３プラグ３０、オイルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０及びオイルからなる第５プラグ５０、が当該順で内部に配置されたチューブ２００の第１プラグ１０側の端に、容器１２０内部とチューブ２００内部を連通させて容器１２０を接続する工程と、磁力を印加して容器１２０内部からチューブ２００内部を通過させて第４プラグ４０の位置まで、磁性粒子Ｍを移動させることによって、核酸を吸着した微粒子を第１洗浄液で洗浄し、第４プラグ４０の溶出液に対して微粒子から核酸を溶出させる工程と、を含む。
【００９９】
本実施形態の核酸抽出方法では、吸着液を用いて核酸を吸着させることのできる粒子であって、チューブ２００内を移動させることのできる粒子であれば、各種（例えばシリカ粒子、ポリマー粒子、磁性粒子等）の粒子を用いることができるが、以下に説明する核酸抽出方法の一実施形態では、磁性体を含有する粒子であって、粒子表面に核酸を吸着できる磁性粒子Ｍを使用する。なお、磁性粒子Ｍ以外の粒子等をチューブ内で移動させる場合は、例えば、重力や電位差を利用してこれを行うことができる。
【０１００】
本実施形態の核酸抽出方法では、容器１２０及びチューブ２００に磁力を透過する材質を選び、容器１２０及びチューブ２００の外部から磁力を印加することによって磁性粒子Ｍを容器１２０及びチューブ２００の内部で移動させる。
【０１０１】
試料には標的となる核酸が含まれている。以下、これを単に標的核酸ということがある。標的核酸は、本実施形態の核酸抽出方法によって試料から抽出され、溶出液に溶出された後、例えば核酸がｍＲＮＡであれば、ｃＤＮＡに逆転写され、ＰＣＲの鋳型として利用され、核酸がｃＤＮＡやゲノムＤＮＡであれば、そのままＰＣＲの鋳型として利用される。試料としては、血液、鼻腔粘液、口腔粘膜、各種の生体試料のほか、一部精製された核酸溶液などでもかまわない。
【０１０２】
３．１．容器に試料を導入する工程
容器１２０に試料を導入する工程は、例えば、綿棒に試料を付着させ、容器１２０の開口１２１から、当該綿棒を差し入れ、吸着液にこれを浸漬して行うことができる。また、試料は、ピペット等によって容器１２０の開口１２１から導入してもよい。また試料がペースト状や固体状であれば、例えば、容器１２０の開口１２１から匙やピンセット等により容器１２０の内壁に付着させたり投入してもよい。
【０１０３】
３．２．核酸を磁性粒子に吸着させる工程
核酸を吸着させる工程は、容器１２０を揺動させて行われる。この工程は、容器１２０の開口１２１を封止する蓋１２２があれば、これを用いて容器１２０を封止して行うとより効率的に行うことができる。この工程により、標的核酸は、カオトロピック剤の作用により、磁性粒子Ｍの表面に吸着される。この工程では、磁性粒子Ｍの表面には、標的核酸の他に標的核酸以外の核酸や蛋白質が吸着してもよい。
【０１０４】
容器１２０を揺動させる方法としては、ボルテックスシェイカーなどの装置を用いてもよいし、作業者の手で振り混ぜてもよい。また、磁性粒子Ｍの磁性を利用して、外部から磁場を与えながら容器１２０を揺動してもよい。容器１２０を揺動させる時間は、適宜設定されうるが、例えば容器１２０のおよその形状が、直径が２０ｍｍ高さが３０ｍｍ程度の円筒状である場合には、容器１２０を１０秒間手で振って揺動する程度で十分に撹拌され、核酸が磁性粒子Ｍの表面に吸着する。
【０１０５】
３．３．チューブに容器を接続する工程
次に図７Ｂに示すように、チューブ２００の第１プラグ１０側の端に容器１２０を接続する。チューブ２００内の各プラグは、第１プラグ１０側の栓１１０を外しても、第７プラグ７０側の栓１１０がなされているため、チューブ２００内を移動しにくくなっている。この工程は、チューブ２００の第１プラグ１０側の端に栓１１０が取り付けられている場合には該栓１１０を外して行う。そして、容器１２０及びチューブ２００は、内容物が漏出しないように接続され、容器１２０内部とチューブ２００の内部との間で内容物が流通可能なように連通される。
【０１０６】
３．４．磁性粒子を移動させる工程
上記工程を経ると、容器１２０内の核酸が吸着した磁性粒子Ｍがチューブ２００に流通できる状態となっている。核酸が吸着した磁性粒子Ｍをチューブ２００に導く手法としては、重力や遠心力を利用する方法を用いてもよく、特に制限されないが、本実施形態では容器１２０及びチューブ２００の外部から磁力を印加して行う。磁力は、例えば、永久磁石、電磁石等により印加することができるが、発熱等を生じない点で、永久磁石を用いて印加することがより好ましい。また、永久磁石を用いる場合には、作業者の手で磁石を動かして行ってもよいし、機械装置等を利用して行ってもよい。磁性粒子Ｍは、磁力によって引き寄せられる性質を有しているため、この性質を利用して、容器１２０及びチューブ２００と、永久磁石の相対的な配置を変化させて、容器１２０内からチューブ２００に移動させる。これにより、第１プラグ１０から順に、各プラグを通って、第４プラグ４０まで磁性粒子Ｍが移動される。磁性粒子Ｍが各プラグを通過するときの各プラグにおける滞在時間は特に限定されないし、同一プラグ内でチューブ２００の長手方向に沿って往復するようにして移動させてもよい。
【０１０７】
３．５．核酸を溶出させる工程
磁性粒子Ｍが第４プラグ４０に到達すると、溶出液の作用により、磁性粒子Ｍに吸着された核酸が、第４プラグ４０の溶出液に溶出する。本工程を経ると、試料から溶出液に対して核酸が溶出し、試料から核酸が抽出された状態となる。
【０１０８】
３．６．作用効果
本実施形態の核酸抽出方法によれば、核酸の抽出をきわめて短時間で容易に行うことができる。本実施形態の核酸抽出方法は、核酸が吸着された磁性粒子Ｍをチューブ２００内において移動させることによって、高い純度で核酸を含有する溶出液を得ることができる。本実施形態の核酸抽出方法によれば、ＰＣＲのための前処理に要する時間と手間を大幅に削減することができる。
【０１０９】
３．７．第４プラグをチューブから吐出させる工程
本実施形態の核酸抽出方法は、容器１２０を変形させて、第５プラグ５０及び第４プラグ４０をチューブ２００の容器１２０が接続した端と反対側の端から吐出させる工程を含んでもよい。
【０１１０】
本工程は「３．５．核酸を溶出させる工程」の後、容器１２０を変形させることで行うことができる。第４プラグ４０を吐出するときには第５プラグ５０が先に吐出される。なお、チューブ２００の第５プラグ５０側を封止している栓１１０は、本工程に先立って取り除き、チューブ２００の第５プラグ５０側の端を開放しておく。
【０１１１】
容器１２０に外力を加えて、内圧を高めるように変形させると、圧力によりチューブ２００の第１プラグ１０側から第５プラグ５０側へと各プラグが移動する。これにより、チューブ２００の第５プラグ５０側の端から、第５プラグ５０及び第４プラグ４０の順に吐出される。第３プラグ３０は、吐出されてもよいが、第２プラグ２０は吐出されないようにする。この場合、例えば、第３プラグ３０の体積を他のプラグよりも大きく設定し、第３プラグ３０のチューブ２００の長手方向の長さを大きくすれば、第２プラグ２０を吐出させてしまうことを防止しやすい。
【０１１２】
第４プラグ４０及び第５プラグ５０は、例えば、ＰＣＲのための反応容器に対して吐出される。そのため、ＰＣＲのための反応容器には、溶出液とオイルが分注されるが、通常オイルは、ＰＣＲの反応に影響を与えないため、例えば、ＰＣＲの反応容器にあらかじめ第５プラグ５０のオイルと同種のオイルを収容しておくこともできる。また、その場合、チューブ２００の先端がオイル内にある状態で本工程を行うと、標的核酸が含まれる溶出液を外気に接触させることなくＰＣＲの反応容器に導入することができる。本実施形態の核酸抽出方法が本工程を含む場合には、例えばＰＣＲのための反応容器等に、標的核酸を含む溶出液を容易に分注することができる。
【０１１３】
この溶出液を用いてｃＤＮＡを増幅させる場合、逆転写工程及び／または核酸増幅工程における反応系が、溶出した核酸を含む溶出液を多量に含めば、微量に含まれる核酸も増幅しやすくなる。従って、それらの反応系は、溶出液を５０％以上含むことが好ましく、７０％以上含むことがより好ましく、９０％以上含むことがさらに好ましく、１００％含むこと、すなわち、核酸を溶出するための溶出液に予め反応のための試薬を添加しておくことがもっとも好ましい。
【０１１４】
通常、反応系中の溶出液の割合が増えるほど、洗浄工程の直前に用いられる溶液、例えば吸着液及び／又は第２洗浄液に含まれるエタノールの持ち込みが、後の逆転写反応や核酸増幅反応を阻害し、最終的なｃＤＮＡの収量が下がるが、本発明の核酸増幅方法では、第１洗浄液を酸性溶液とすることにより、収量の低下を防止することができる。
【０１１５】
３．８．変形例
３．８．１．磁性粒子を移動させる工程の変形
図９は、本実施形態の核酸抽出方法の一変形形態を説明するための模式図である。
【０１１６】
上述の「３．４．磁性粒子を移動させる工程」では、磁性粒子Ｍに対して磁力を外部から印加することによって、磁性粒子Ｍを第１プラグ１０から各プラグを通過させて第４プラグ４０まで移動させると説明した。しかし、磁性粒子Ｍが第２プラグ２０に移動されたときに、外部から印加される磁力を変化させて、第２プラグ２０内で磁性粒子Ｍを振動させたり、拡散凝集を繰り返したりして行ってもよい。このようにすれば、第２プラグ２０の第１洗浄液による磁性粒子Ｍの洗浄効果を高めることができる。
【０１１７】
具体的には、図９のＡ、Ｂに示すように、磁力を印加する手段として、一対の永久磁石４１０を用いる場合には、永久磁石４１０によって容器１２０から磁性粒子Ｍを移動させ、第１プラグ１０を通過させて、第２プラグ２０まで磁性粒子Ｍが到達したときに、一方の永久磁石４１０をチューブ２００から遠ざけ、他方の永久磁石４１０を、チューブ２００に対して対向する側から近づけると、磁性粒子Ｍを第２プラグ２０内でチューブ２００の長手方向と交差する方向に振動させることができる（図中Ａ，Ｂの態様の繰り返し）。このようにすれば、第２プラグ２０の第１洗浄液による磁性粒子Ｍの洗浄効果を高めることができる。このような磁性粒子Ｍの洗浄は、第２プラグ２０を分割した場合や、チューブ２００内に第６プラグ６０が配置される場合に、複数の第２プラグ２０や、第６プラグ６０において適用してもよい。
【０１１８】
また、図９のＣに示すように、永久磁石４１０を単にチューブ２００から遠ざけることにより、第２プラグ２０内で磁性粒子Ｍを拡散させることができる。磁性粒子Ｍは、表面が親水性であるため、例えば第２プラグ２０において、磁力を弱めて拡散されたとしても、第１プラグ１０や第３プラグ３０のオイルには進入しにくいので、このような態様としてもよい。
【０１１９】
具体的には、永久磁石４１０によって容器１２０から磁性粒子Ｍを移動させ、第１プラグ１０を通過させて第２プラグ２０に磁性粒子Ｍが到達したときに、永久磁石４１０をチューブ２００から遠ざけ、第２プラグ２０内において磁性粒子Ｍを拡散させる。そして、磁性粒子Ｍを再び永久磁石４１０の磁力によって移動させ、第３プラグ３０を通過させて、第４プラグ４０に導くことができる。
【０１２０】
このような外部から印加される磁力を変化させて、磁性粒子Ｍを振動させたり、拡散凝集を繰り返したりする態様は、容器１２０内の吸着液に磁性粒子Ｍが存在する状態や、第４プラグ４０（溶出液）に磁性粒子Ｍが存在する状態において適用してもよい。
【０１２１】
３．８．２．核酸を溶出させる工程の変形
上述の「３．５．核酸を溶出させる工程」では、第４プラグ４０を加熱して行ってもよい。第４プラグ４０を加熱する方法としては、例えば、チューブ２００の第４プラグ４０に対応する位置に、ヒートブロック等の熱媒体を接触させる方法や、ヒーター等の熱源を用いる方法、電磁加熱による方法などを例示することができる。
【０１２２】
第４プラグ４０を加熱する場合には、第４プラグ４０以外のプラグも加熱されてもよいが、核酸が吸着された磁性粒子Ｍが、洗浄液のプラグに存在する状態では、当該プラグは加熱されないことが好ましい。第４プラグ４０を加熱する場合の到達温度としては、溶出の効率の観点及び溶出液にＰＣＲの酵素を含む場合に該酵素の失活を抑制する観点から、３５℃以上８５℃以下が好ましく、より好ましくは４０℃以上８０℃以下、さらに好ましくは４５℃以上７５℃以下である。
【０１２３】
核酸を溶出させる工程において、第４プラグ４０を加熱すると、磁性粒子Ｍに吸着された核酸を、溶出液に対して、より効率的に溶出させることができる。また、第１洗浄液又は第２洗浄液と、溶出液の組成が同一又は類似していても、洗浄液に対して溶出せずに磁性粒子Ｍに残って吸着している核酸を溶出液に対して溶出させることができる。すなわち、核酸が吸着した磁性粒子Ｍを第１洗浄液又は第２洗浄液によって洗浄した後でも、溶出液に対して核酸をさらに溶出させることができる。これにより、洗浄液の組成と、溶出液の組成が同一又は類似していても、十分な洗浄と、溶出液への十分な濃度での溶出とを両立させることができる。
【０１２４】
３．８．３．第４プラグをチューブから吐出させる工程の変形
上述の「３．７．第４プラグをチューブから吐出させる工程」を採用する場合、係る工程において、溶出液に対して吸着された核酸を溶出した磁性粒子Ｍは、第４プラグ４０内に存在してもよいが、さらに、磁力を印加することによって、第１プラグ１０、第２プラグ２０、第３プラグ３０のいずれかのプラグ、又は容器１２０の中まで移動させてから行ってもよい。このようにすれば、溶出液に磁性粒子Ｍが含まれない状態で、第４プラグ４０をチューブ２００から吐出することができる。また、磁性粒子Ｍを移動させる先は、第２プラグ２０又は容器１２０とすれば、磁力を取り去っても、第３プラグ３０のオイル内に磁性粒子Ｍが進入しにくいため、第４プラグ４０をチューブ２００から吐出することをより容易にすることができる。
【０１２５】
４．核酸抽出用装置
本実施形態に係る核酸抽出用装置は、上で説明した核酸抽出用デバイス、核酸抽出用キット及び核酸抽出方法に好適に適用することができる。以下では、核酸抽出用キット２０００を装着して核酸の抽出を行う核酸抽出用装置３０００を一実施形態として説明する。図１０は、本実施形態の核酸抽出装置３０００を模式的に示す斜視図である。
【０１２６】
本実施形態の核酸抽出用装置３０００は、長手方向を有し、オイルからなる第１プラグ１０、オイルと混和しない第１洗浄液からなる第２プラグ２０、オイルからなる第３プラグ３０、オイルと混和しない溶出液からなる第４プラグ４０、及びオイルからなる第５プラグ５０、が当該順で内部に配置されたチューブを装着する装着部３００と、装着部３００にチューブ２００が装着された場合に、チューブ２００の側面から磁力を印加する磁力印加部４００と、装着部３００及び磁力印加部４００の相対的な配置を、チューブ２００の長手方向に沿って変化させる移動機構５００と、を含む。
【０１２７】
核酸抽出用装置３０００の装着部３００に装着されるチューブ２００は、上述したチューブ２００である。核酸抽出用装置３０００は、チューブ２００を装着する装着部３００を有する。なお、チューブ２００内には、第１プラグ１０ないし第５プラグ５０が配置された例とするが、上述した第６プラグ６０、第７プラグ７０が配置されていてもよい。
【０１２８】
装着部３００は、チューブ２００を装着する部位である。装着部３００には、チューブ２００とともに、チューブ２００に接続された容器１２０が装着されてもよい。装着部３００は、チューブ２００及び必要に応じて容器１２０に対して、磁力印加部４００によって磁力が印加できる範囲で、構成や装着するための機構等を適宜設計することができる。装着部３００は、チューブ２００が可とう性を有して屈曲している場合などに、チューブ２００を直線状の形状に伸ばして装着することができるように構成されてもよい。また、図示の例では、装着部３００は、チューブ２００が沿うように配置される添え板３１０を有している。添え板３１０は、必須の構成ではないが、添え板３１０を設置すると、チューブ２００の振動等を抑制することができる場合がある。また、図示の例では、装着部３００は、クリップ機構３２０を有しており、これによりチューブ２００を２箇所で固定する態様となっている。
【０１２９】
装着部３００は、磁力印加部４００との位置関係を、チューブ２００の長手方向に対して相対的に変化するように構成される。従って、磁力印加部４００の移動を行わずに装着部３００を磁力印加部４００に対して相対的に移動させるように設計する場合には、図示のように、移動機構５００として、装着部３００を移動させる移動機構３６０を含んで構成される。また、磁力印加部４００が移動機構を含む場合には、装着部３００には移動機構３６０は不要な場合がある。図示の例では、装着部３００は、ヒンジ３３０、ガイドレール３４０、駆動ベルト３５０、図示せぬモーターを含んで構成されている。
【０１３０】
核酸抽出用装置３０００の例では、装着部３００は、１つ設けられているが、複数設けられてもよい。その場合は、磁力印加部４００も複数設けられることができるが、複数の装着部３００は、それぞれ独立していてもよいし、連動するように設けられてもよい。
【０１３１】
磁力印加部４００は、装着部３００にチューブ２００が装着された際に、チューブ２００及び必要に応じて容器１２０に磁力を印加する構成である。磁力印加部４００は、例えば、永久磁石、電磁石、あるいはこれらの組み合わせを含んで構成される。磁力印加部４００は、磁石等を少なくとも１つ備えるが、磁石等は複数備えられてもよい。磁力印加部４００に電磁石を用いず、永久磁石を用いると、発熱等が生じにくいため好ましい。永久磁石としては、例えば、ニッケル系、鉄系、コバルト系、サマリウム系、ネオジム系のものを用いることができる。
【０１３２】
磁力印加部４００は、容器１２０内及びチューブ２００内に存在する磁性粒子Ｍに対して磁力を印加する機能を有する。そして、装着部３００と磁力印加部４００との相対的な位置関係を変化させることによって、磁性粒子Ｍを容器１２０内及びチューブ２００内で移動させることができる。
【０１３３】
図示の例では、磁力印加部４００は、容器１２０及びチューブ２００を挟んで対向して設けられた一対の永久磁石４１０を有している。一対の永久磁石４１０の間は、チューブ２００の外径よりも大きい間隔で離間している。永久磁石４１０の極性の向く方向は、特に限定されない。磁力印加部４００は、装着部３００との位置関係を、チューブ２００の長手方向に対して相対的に変化するように構成される。従って、装着部３００の移動を行わずに磁力印加部４００を装着部３００に対して相対的に移動させるように設計する場合には、移動機構５００として、磁力印加部４００を移動させる移動機構を含んで構成される。
【０１３４】
また、図示の例では、磁力印加部４００は、一対の永久磁石４１０の一方がチューブ２００に接近すると他方がチューブ２００から離間するように配置されている。そして、モーター４２０によって、一対の永久磁石４１０がチューブ２００に接近離間するように振動させることができるようになっている。モーター４２０が駆動することにより、チューブ２００内でチューブ２００の長手方向と交差する方向に磁性粒子Ｍを往復移動させることができる。
【０１３５】
モーター４２０は、容器１２０やチューブ２００のどの位置に磁力を印加する場合でも、必要に応じて駆動することができる。しかし、永久磁石４１０の位置が、チューブ２００の第２プラグ２０、第４プラグ４０の位置にあるときに、駆動すればチューブ２００内での磁性粒子Ｍの洗浄効率や溶出効率を高めることができる。
【０１３６】
本実施形態の核酸抽出用装置３０００によれば、ＰＣＲのための前処理を自動化することが可能であり、前処理に要する時間と手間を大幅に削減することができる。また、本実施形態の核酸抽出用装置３０００によれば、磁力印加部４００を揺動させることができるため、核酸が吸着した磁性粒子Ｍの洗浄（精製）をより効率的に行うことができ、ＰＣＲの精度をさらに高めることができる。
【０１３７】
図１１は、核酸抽出用装置の変形例に係る核酸抽出装置３１００を模式的に示す斜視図である。核酸抽出装置３１００は、上述の核酸抽出装置３０００とは、加熱部６００を有する点で相違する以外は同様であり、作用機能の共通する部材については、同一の符号を付して説明を省略する。
【０１３８】
加熱部６００は、装着部３００にチューブ２００が装着された場合に、チューブ２００の一部を加熱する構成である。加熱部６００としては、例えば、熱源及びヒートブロック、ヒーター、電磁加熱用のコイルなどを例示することができる。加熱部６００の形状としては、チューブ２００を挿入することのできる形状や、チューブ２００の側面に接触する形状などであり、チューブ２００内の液体を加熱することができる限り任意である。
【０１３９】
加熱部６００によって加熱されるチューブ２００の部分は、チューブ２００の長手方向のうち、第４プラグ４０が存在する部分を含む。加熱部６００は、チューブ２００のその他の部分を加熱してもよいが、チューブ２００の長手方向のうち、第２プラグ２０が存在する部分は加熱しないようにすることが好ましい。
【０１４０】
図１１に示した核酸抽出装置３１００では、加熱部６００として、添え板３１０に並列して設けられた、チューブ２００の第４プラグ４０を含む位置を加熱するヒーター６１０が備えられている。ヒーター６１０は、チューブ２００の外周の半分程度に対して接触させる形状を有している。
【０１４１】
核酸抽出装置３１００は、第２プラグ２０の第１洗浄液及び第６プラグ６０の第２洗浄液の少なくとも一方による洗浄によって、磁性粒子Ｍに吸着した核酸の量が減少している場合でも、第４プラグ４０の溶出液に対して、十分な量の核酸を溶出させることができる。これにより、洗浄効果を高めることができるとともに、ＰＣＲのために十分な濃度の核酸を溶出液に対して溶出させることができる。
【０１４２】
５．バッチ処理
上述したような吸着液、第１洗浄液、溶出液を用い、そして任意に第２洗浄液を用いれば、上述したような核酸抽出用デバイスや核酸抽出用装置を用いないバッチ処理においても、逆転写反応や核酸増幅反応を効率よく行うことができるようになる。
【０１４３】
例えば１本のチューブに、核酸を含む試料を入れ、カオトロピック物質を含有する吸着液および微粒子を混合して、核酸を微粒子に吸着させる。その後、遠心して微粒子を沈殿させ、上清を捨てる。チューブに残っている、核酸を吸着した微粒子に、第１洗浄液を加えて微粒子を懸濁し、再度遠心して、上清を捨てることで、微粒子を洗浄する。第１洗浄液の前に、第２洗浄液で微粒子を洗浄してもよい。
【０１４４】
次に、チューブ内の微粒子に溶出液を加え、微粒子に吸着した核酸を、溶出液中に溶出させる。このようにして得られた溶出液を用い、核酸がｍＲＮＡの場合、逆転写してｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを増幅し、核酸がゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの場合、そのままＤＮＡを増幅することができる。
【０１４５】
６．実施例
６．１．実験例１及び２
本実施例では、バッチ処理を用いた実験例を説明する。
【０１４６】
＜ＲＮＡの単離＞
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器に、７００μＬの吸着液を入れ、そこに、インフルエンザＡ陽性検体（鼻腔ぬぐい液）を含んだ１４０μＬの溶液及び２５μＬの磁性微粒子（磁気ビーズは、直径１〜３μｍのシリカ表面を持ち、濃度４００ｍｇ／ｍＬの吸着液）を入れ、ボルテックスミキサーで５分間、十分に撹拌した。磁石で磁性ビーズを引き付け、吸着液を除去した。次に、洗浄液１を入れ、ボルテックスミキサーで１０秒間撹拌した。磁石で磁性微粒子と引き付け、洗浄液１を除去した。洗浄液Ａによる洗浄を２回行った後、洗浄液Ｂで、同様に２回洗浄を行った。洗浄液を除去後、磁性ビーズに溶出液として水を２７．５μＬ入れ、ボルテックスミキサーで、５秒間軽く撹拌した後、６５℃で３分間加熱した。最後に、磁性ビーズを磁石で引き付け、溶出液を回収し、ＲＮＡ溶液とした。
【０１４７】
［吸着液］
実験例１：  グアニジンチオシアン塩酸  ６０  ｗｔ％
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２．０    ％
トリス  ｐＨ７．２        ０．６ｗｔ％
実験例２：  グアニジンチオシアン塩酸  ３０  ｗｔ％
エタノール                ４５      ％
トリス  ｐＨ７．３        ０．３ｗｔ％
［洗浄液Ａ］
実験例１：  グアニジンチオシアン塩酸  ７０  ｗｔ％
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．７    ％
トリス  ｐＨ７．２        ２．６ｗｔ％
実験例２：  グアニジンチオシアン塩酸  ３０  ｗｔ％
エタノール                ５７      ％
［洗浄液Ｂ］
実験例１：  トリス  ｐＨ７．５        ３    ｗｔ％
実験例２：  トリス  ｐＨ７．０        ０．１ｗｔ％
エタノール                ７０      ％
【０１４８】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
次に、調製したＲＮＡ溶液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なおＲＴ−ＰＣＲはCDC protocol of realtime RTPCR for swine influenza A (H1N1)に従って実施した。具体的には、
０．８μＭフォワードプライマー
０．８μＭリバースプライマー
０．２μＭプローブ
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
を含む溶液を８μＬ調製し、そこに溶出液２μＬを加えて撹拌後、以下の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った。図１２にその結果を示す。
逆転写  ５０℃  ３０分
Taq活性化  ９５℃  ２分
ＰＣＲ  ９５℃  １５秒−５５℃  ３０秒  ５０サイクル
【０１４９】
実験例１と実験例２の結果を比較すると、実験例２の方がＲＴ−ＰＣＲの蛍光強度の立ち上がりが早くなった。このことは、吸着液及び洗浄液Ａと洗浄液Ｂにアルコールを添加した方が、ＲＮＡの回収効率が向上することを示す。なお、エタノールの代わりに、メタノールあるいはアセトニトリルを使用した場合も、同様に回収率の向上がみられた。
【０１５０】
６．２．実験例３及び４
＜ＲＮＡの単離＞
次に、図７に示す核酸抽出用キット２０００のうち、チューブ２００の内部に、第６プラグ６０ないし第７プラグ７０を有する核酸抽出用デバイスを使用し、ＲＮＡの抽出を行った。試薬は、実験例３が６．１．の実験例１と、実験例４が６．１．の実験例２と、それぞれ同じものを用いたが、溶出液には、予めＲＴ−ＰＣＲ用試薬を添加し、さらに０．２ｗｔ％の牛血清アルブミンを添加した。なお、各プラグの試薬量は以下の通りである。
第６プラグ：洗浄液１  ２８μＬ
第２プラグ：洗浄液２  ２２μＬ
第４プラグ：溶出液    １．６μＬ
第１、３、５、７プラグ：オイル    各１０μＬ
【０１５１】
核酸抽出用デバイスの操作方法を、以下に述べる。まず、容量３ｍＬのポリエチレン製容器１２０に、７００μＬの吸着液を入れた。そこに、インフルエンザＡ陽性検体（鼻腔ぬぐい液）を含む１４０μＬの溶液及び６．１．と同様の磁性微粒子１μＬを入れた。容器に蓋をして、３０秒間手で振って撹拌した。容器の蓋を外して、チューブの第１プラグ側に接続した。手で永久磁石を動かして、容器内の磁気ビーズをチューブ内に導入した。図９のように磁気ビーズを第６プラグまで搖動させながら移動させた。磁気ビーズがチューブ内の各プラグに存在した時間はおよそ以下の通りであった。なお、第５プラグにおいては、磁気ビーズを揺動させる等の操作は行わなかった。
第１、７、３プラグ：各３秒
第６プラグ：２０秒
第２プラグ：３０秒
第４プラグ：２０秒
【０１５２】
次に、チューブの第４プラグで、５０℃に加熱し、３０秒間揺動して、磁性ビーズから溶出液中にＲＮＡを抽出した。その後、磁気ビーズを永久磁石によって動かして、第６プラグまで退避させた。チューブの第５プラグ側の栓を取り外し、容器を手で変形させて、第５プラグを容器に吐出し、第４プラグを特開２０１２−１１５２０８で開示されているような回転式ＰＣＲ装置に吐出して、オイル中に液滴を形成させた。
【０１５３】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
得られたＲＮＡ溶液を用い、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。図１３にその結果を示す。
逆転写  ５０℃  ６０秒
Taq活性化  １００℃  １０秒
ＰＣＲ  １００℃  １０秒−５７℃  ３０秒  ５０サイクル
【０１５４】
実験例３では、正常にＤＮＡの増幅が観察されたにも関わらず、実験例４では、ＤＮＡの増幅が検出できなかった。これは、実験例４では吸着液及び洗浄液Ａと洗浄液Ｂにエタノールが入っており、そのキャリーオーバーがＰＣＲを阻害したと考えられた。
【０１５５】
６．３．実施例
＜ＲＮＡの単離＞
ＲＮＡの単離は、６．２．と同様の装置および手順を用い、以下の溶液を用いて行った。
［吸着液］        グアニジンチオシアン酸塩  ３０  ｗｔ％
エタノール                ４５      ％
トリス    ｐＨ７．３      ０．３ｗｔ％
［洗浄液Ｂ］
トリス    ｐＨ７．０      ０．１ｗｔ％
エタノール                ７０      ％
［洗浄液Ｃ］      クエン酸  ｐＨ４．０      ０．１ｗｔ％
【０１５６】
本実施例では、６．２．の洗浄液Ａに対応するプラグを省略し、代わりに、洗浄液Ｃのプラグを洗浄液Ｂのプラグの下流側に設けた。なお、実験２と同様の手順で、洗浄液Ａの有無でＲＴ−ＰＣＲを行った結果、ＲＮＡの回収効率は変化しないことを確認している。ただし、夾雑物が多いなど、より多くの洗浄を必要とする検体（試料）を使用する場合には、洗浄液Ａを使用してもよい。
【０１５７】
図１４に示したように、実験例４では認められなかった、ＤＮＡの増幅が観察された。このように、酸性溶液で洗浄工程を行うことによって、エタノールのキャリーオーバーによる逆転写反応及び／又は核酸増幅反応の阻害が回避できた。なお、本実施例において、洗浄液Ｂによる洗浄工程を省略しても、ＤＮＡの増幅が起きることは確認している。
【０１５８】
また、６．１のようなバッチ処理において洗浄液Ｃによる追加洗浄を行っても、実施例２と抽出効率、すなわちリアルタイムＰＣＲにおける増幅曲線の立ち上がりの早さは同等であることは確認している。すなわち、酸性洗浄液を用いることによって、エタノールを含む試薬による抽出効率を向上させ、エタノールの溶出液への持ち込みを防ぐという、２つの効果を達成することができた。
【０１５９】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１６０】
１０…第１プラグ、２０…第２プラグ、３０…第３プラグ、４０…第４プラグ、５０…第５プラグ、６０…第６プラグ、７０…第７プラグ、１００…チューブ部、１１０…栓、１２０…容器、１２１…開口、１２２…蓋、１３０…液溜部、１３１…開口、１３２…蓋、２００…チューブ、２３０…核酸増幅反応用容器、２３１…シール形成部、２３２…オイル受容部、２３２Ａ…オイル受容空間、２３３…段差部、２３４Ａ…上シール部、２３４Ｂ…下シール部、２３５…流路形成部、２４９…溶出液、３００…装着部、３１０…添え板、３２０…クリップ機構、３３０…ヒンジ、３４０…ガイドレール、３５０…駆動ベルト、３６０…移動機構、４００…磁力印加部、４１０…永久磁石、４２０…モーター、５００…移動機構、６００…加熱部、６１０…ヒーター、１０００，１０２０，１０３０，１０４０，１１００…核酸抽出用デバイス、２０００…核酸抽出用キット、３０００，３１００…核酸抽出用装置、Ｍ…磁性粒子
【図１】
2015073485.tif 000003
【図２】
2015073485.tif 000004
【図３】
2015073485.tif 000005
【図４Ａ】
2015073485.tif 000006
【図４Ｂ】
2015073485.tif 000007
【図５】
2015073485.tif 000008
【図６】
2015073485.tif 000009
【図７Ａ】
2015073485.tif 000010
【図７Ｂ】
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【図８】
2015073485.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015073485.tif 000015
【図１２】
2015073485.tif 000016
【図１３】
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【図１４】
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