(57)【要約】      （修正有）【課題】植物細胞におけるＺｐ１５遺伝子内に組み込まれている外因性核酸配列の１つ以上の産物（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ分子）を発現させるための方法及び組成物の提供。【解決手段】Ｚｐ１５遺伝子内への外因性核酸配列の取込みは、選択されたＺｐ１５遺伝子座におけるゲノムの標的二本鎖切断によって容易になり、切断が、選択されたＺｐ１５遺伝子座内の配列に結合するように遺伝子操作され、例えば、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質、又は前述のキメラ組み合わせ等のＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメイン又は切断ハーフドメインを含む融合タンパク質を用いることによってＺｐ１５遺伝子を標的とする外因性核配列の導入方法。【選択図】図３
2015226537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞のゲノム内に１つ以上の外因性核酸配列を組み込む方法であって、前記植物細胞のゲノムにおけるＺｐ１５遺伝子座においてまたは近隣において二本鎖切断を引き起こし、それによって前記Ｚｐ１５遺伝子座におけるまたは近隣における前記細胞のゲノム内への前記１つ以上の外因性配列を含むポリヌクレオチドの組込みをもたらす工程を含む方法。
【請求項２】
前記１つ以上の外因性配列の産物を発現させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二本鎖切断が、
（ａ）前記細胞内で第一の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第一の融合タンパク質は第一のジンクフィンガー結合ドメインおよび第一の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第一のジンクフィンガー結合ドメインは前記植物細胞のゲノム内のＺｐ１５遺伝子座におけるまたは近隣における第一の標的部位に結合するように遺伝子操作されている工程；ならびに
（ｂ）前記細胞内で第二の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第二の融合タンパク質は第二のジンクフィンガー結合ドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第二のジンクフィンガー結合ドメインは前記植物細胞のゲノム内のＺｐ１５遺伝子座におけるまたは近隣における第二の標的部位に結合し、前記第二の標的部位は前記第一の標的部位とは異なり、かつ前記第一の融合タンパク質の前記第一の標的部位への結合および前記第二の融合タンパク質の前記第二の標的部位への結合により、前記切断ハーフドメインは前記植物細胞のゲノムが前記Ｚｐ１５遺伝子座においてまたは近隣において切断されるように位置する工程
によって引き起こされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジンクフィンガー結合ドメインが表１に示した群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記切断ハーフドメインが天然に存在しているまたは天然には存在していないものである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖切断が、天然に存在しているまたは天然には存在していないメガヌクレアーゼ、ＩＩＳ型制限酵素、あるいは前記メガヌクレアーゼおよび前記ＩＩＳ型制限酵素を含む融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の外因性核酸配列が、コード配列、制御配列、またはＤＮＡ結合ドメインに対する標的部位を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記コード配列が、：除草剤抵抗性；除草剤耐性；害虫抵抗性；害虫耐性；病害抵抗性；病害耐性；ストレス耐性；ストレス抵抗性；酸化ストレスの変化；油分の収量増大；食物の含有量および構成の変化；見た目の変化；雄性不稔；ドライダウン；耐倒伏性；多産；デンプンの量または質の変化；油分の質の変化；タンパク質の質または量の変化；アミノ酸組成の変化、あるいはその組み合わせを与える産物をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが前記Ｚｐ１５遺伝子座内の配列に相同であるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記相同なヌクレオチド配列が前記外因性配列に隣接する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドがプロモーターをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の組み込まれた外因性配列が次世代の後代に伝達される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法によってＺｐ１５遺伝子座内に組み込まれた１つ以上の外因性配列を含む、植物または植物部位。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法によってＺｐ１５遺伝子座内に組み込まれた１つ以上の外因性配列を含む、種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援の研究の下でなされた発明に対する権利の声明
適用されない。
【０００２】
本開示は、植物ゲノム工学、特に植物Ｚｐ１５遺伝子内への導入遺伝子の標的組込みの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
バイオテクノロジーは、食糧生産に対して増大する世界的需要の課題に対処するために不可欠なツールとして台頭してきた。農業の生産性を向上させるための従来のアプローチ、例えば収穫量の増大または遺伝子操作による害虫抵抗性は、突然変異育種または形質転換による作物種のゲノム内への新規遺伝子の導入のいずれかに依存している。どちらの方法も本質的に非特異的であり、かつ比較的非効率的である。例えば、従来の植物形質転換法は、ゲノム内のランダムな位置に組み込む外因性ＤＮＡを送達する。したがって、所望の特性を備えた形質転換株を同定かつ単離するために、何千もの固有のランダム組込み事象を作出し、その後所望の個体をスクリーニングする必要がある。結果として、従来の植物特質の遺伝子操作は、労力を要し、多大な時間を要し、かつ予測不可能な仕事である。さらに、この組込みのランダム性によって、意図しないゲノム破壊による多面発現効果が生じているかどうかを予測するのが難しくなる。結果として、遺伝子操作された遺伝子または特質を備えた植物株の作出、単離、および特徴付けは、成功の確率が低く、極めて労力を要し、かつコストの大きい手法となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
標的遺伝子改変は、植物システムにおける従来的実施の合理的な課題を克服するものであり、ゆえに基礎的な植物生物学の研究および農業バイオテクノロジーのどちらにおいても、長年にわたる、しかしとらえどころのない目標である。しかしながら、イネにおける陽性−陰性の薬剤選択または事前に遺伝子操作された制限酵素部位の使用による「遺伝子ターゲティング」を除いて、すべての植物種における標的ゲノム改変は、モデルでも農作物でも、最近まで非常に困難であることが分かっている。Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（１０）：１０３０；Ｔｅｒａｄａら，（２００７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４４（２）：８４６；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら，（２００８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．６（１）：９３。
【０００５】
最近、ゲノムＤＮＡの標的切断のための方法および組成物が記載されている。そのような標的切断の事象を用いて、例えば、標的突然変異生成を誘発すること、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導すること、ならびに所定の染色体座位での標的組換えを容易にすることが可能である。例えば、米国特許公報第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００５００６４４７４号；および第２００６０１８８９８７号，ならびに国際公報ＷＯ２００７／０１４２７５を参照されたく、その開示は参照することによりあらゆる目的でそれらの全体として組み入れられているものとする。米国特許公報第２００８０１８２３３２号は植物ゲノムの標的改変のための非標準ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用について記載しており、また米国特許出願第１２／２８４，８８８号は植物ＥＰＳＰＳ遺伝子座内へのＺＦＮを介した標的組込みについて記載している。
【０００６】
しかしながら、植物およびその後代における安定的で遺伝的な遺伝子改変を確立するために、植物ゲノム内のさらなる遺伝子座内への安定的な標的組込みのための組成物および方法の必要性が依然として残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、植物細胞におけるＺｐ１５遺伝子内に組み込まれている外因性核酸配列の１つ以上の産物（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ分子）を発現させるための方法および組成物を提供する。本明細書に示されるように、Ｚｐ１５遺伝子座におけるまたは近隣における１つ以上の外因性配列の組込みによって、宿主植物は再生、開花、または種をつける能力を損なわないと考えられ、場合によっては、世代にわたった外因性配列の遺伝的伝達が可能になる。前記外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、および１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。例えば、除草剤耐性遺伝子をこの遺伝子座内に組み込んで、所望の除草剤抵抗性を備えた作物を生産することができる。Ｚｐ１５遺伝子座においてまたは近隣において外因性核酸を含有する細胞は、配偶子（生殖細胞系）にも寄与し得、ゆえに次世代の後代に伝達され得る。
【０００８】
Ｚｐ１５遺伝子内への外因性核酸配列の取込みは、選択されたＺｐ１５遺伝子座におけるゲノムの標的二本鎖切断によって容易になる。切断は、選択されたＺｐ１５遺伝子座内の配列に結合するように遺伝子操作された、例えば、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、または前述のキメラ組み合わせ等のＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質を用いることによってＺｐ１５遺伝子を標的とする。このような切断によって、切断部位におけるまたは近隣における外因性ポリヌクレオチド配列の組込みが刺激される。外因性配列の組込みは、相同性依存的および相同性非依存的メカニズムの両方によって進行し得る。
【０００９】
一実施形態において、Ｚｐ１５遺伝子における標的部位に結合する遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー）を本明細書において開示する。前記ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、表１に示した認識ヘリックスを含む任意の遺伝子操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み得る。本明細書に記載される任意のＤＮＡ結合ドメインは、機能ドメイン、例えば切断ドメインまたは切断ハーフドメインをさらに含んでもよい。いくつかの実施態様では、前記切断ハーフドメインは、ＦｏｋＩまたはＳｔｓＩ等のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼに由来するものであり得る。他の実施態様では、前記切断ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば改変されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼを含み得る。
【００１０】
別の実施形態において、Ｚｐ１５遺伝子座内に組み込まれた外因性配列を含む植物または種子を本明細書において開示する。ある実施態様では、前記外因性配列を植物の配偶子内に組み込む。
【００１１】
別の実施形態において、細胞内で外因性核酸配列の産物を発現させるための方法であって、前記方法は：（ａ）前記細胞内で第一の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第一の融合タンパク質は第一のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）および第一の切断ハーフドメインを含んでおり、前記ＤＮＡ結合ドメインは前記細胞のゲノムのＺｐ１５遺伝子における第一の標的部位に結合するように遺伝子操作されている工程；（ｂ）前記細胞内で第二の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第二の融合タンパク質は第二のＤＮＡドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第二のＤＮＡドメインは前記細胞のゲノムのＺｐ１５遺伝子における第二の標的部位に結合し、前記第二の標的部位は前記第一の標的部位とは異なる工程；ならびに（ｃ）前記細胞を外因性核酸配列およびＺｐ１５遺伝子における第一の配列に相同である第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させる工程であって、前記第一の融合タンパク質の前記第一の標的部位への結合、および前記第二の融合タンパク質の前記第二の標的部位への結合により、前記切断ハーフドメインは前記細胞のゲノムがＺｐ１５遺伝子内で切断されるように位置し、それによってＺｐ１５遺伝子における前記細胞のゲノム内への外因性配列の組込みおよび前記外因性配列の産物の発現がもたらされる工程；を含む方法を本明細書において開示する。
【００１２】
前記外因性核酸配列は、植物に所望の特質を付与する、１つ以上のプロモーターの有無にかかわらず、１つ以上の機能性ポリペプチド（例えば、ｃＤＮＡ）をコードする配列を含んでいてもよく、かつ／あるいは１つ以上のＲＮＡ配列を（例えば、１つ以上のｓｈＲＮＡ発現カセットによって）産生してもよい。そのような特質には、除草剤抵抗性または耐性；虫害抵抗性または耐性；病害抵抗性または耐性（ウイルス性、細菌性、菌性、線虫による）；乾燥、熱、低温、凍結、過度の湿気、塩分ストレスに対する抵抗性または耐性などのストレス耐性および／または抵抗性；酸化ストレス；収穫量の増加；食物の含有量および構成；見た目；雄性不稔；ドライダウン；耐倒伏性；多産；デンプンの量および質；油分の量および質；タンパク質の質および量；アミノ酸組成等が含まれるが、これに制限されない。もちろん、除草剤、害虫、病害（ウイルス性、細菌性、菌性、線虫による）または乾燥抵抗性、雄性不稔、ドライダウン、耐倒伏性、多産、デンプンの性質、油分の量および質を与えるもの、あるいは収穫量または栄養価を増加させるもの等の、任意の記載の任意の２つ以上の外因性核酸を所望どおりに利用してよい。ある実施態様では、前記核酸配列は、除草剤抵抗性タンパク質（例えば、ＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ）遺伝子、ＡＡＤ−１２遺伝子、またはホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）および／またはその機能性フラグメントをコードする配列を含む。組み込まれた配列の発現は、前記組み込まれた配列に操作可能に連結されたプロモーターによって促進され得る。あるいは、組み込まれた配列にはプロモーターがなく、転写は内在性Ｚｐ１５プロモーターによって促進される。
【００１３】
ある実施態様では、前記ポリヌクレオチドはＺｐ１５遺伝子における第二の配列に相同である第二のヌクレオチド配列をさらに含む。前記第二のヌクレオチド配列は、Ｚｐ１５遺伝子における前記第二の配列と同一であってもよい。さらに、第一および第二のヌクレオチド配列を含む実施態様では、前記第一のヌクレオチド配列はＺｐ１５遺伝子における第一の配列と同一であってよく、かつ前記第二のヌクレオチド配列はＺｐ１５遺伝子における第二の配列に相同であるが同一でないものであってよい。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、前記第一および第二のヌクレオチド配列は、外因性配列に隣接する。ある実施態様では、前記ポリヌクレオチドはプラスミドである。他の実施態様では、前記ポリヌクレオチドは線状のＤＮＡ分子である。
【００１４】
別の実施形態において、細胞のゲノムにおけるＺｐ１５遺伝子内に外因性配列を組み込むための方法であって、前記方法は：（ａ）前記細胞内で第一の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第一の融合タンパク質は第一のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）および第一の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第一のＤＮＡ結合ドメインは前記細胞のゲノムにおけるＺｐ１５遺伝子座における第一の標的部位に結合するように遺伝子操作されている工程；（ｂ）前記細胞内で第二の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第二の融合タンパク質は第二のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）および第二の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第二のＤＮＡ結合ドメインは前記細胞のゲノムにおけるＺｐ１５遺伝子座における第二の標的部位に結合し、前記第二の標的部位は前記第一の標的部位とは異なる工程；ならびに（ｃ）前記細胞を外因性核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させる工程であって、前記第一の融合タンパク質の前記第一の標的部位への結合、および前記第二の融合タンパク質の前記第二の標的部位への結合により、前記切断ハーフドメインは前記細胞のゲノムがＺｐ１５遺伝子座内で切断されるように位置し、それによってＺｐ１５遺伝子座内の前記細胞のゲノム内への外因性配列の相同性依存的組込みがもたらされる工程；を含む方法を本明細書において提示する。ある実施態様では、機能性ポリペプチドをコードする外因性配列をＺｐ１５遺伝子内に挿入する。
【００１５】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、前記第一および第二の切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩまたはＳｔｓＩに由来するものであり得る。さらに、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、少なくとも１つの融合タンパク質は、例えば前記切断ハーフドメインの必須のヘテロ二量体が形成されるような、前記切断ハーフドメインの二量化接触面のアミノ酸配列の変更を含み得る。
【００１６】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、植物細胞は単子葉性または双子葉性の植物細胞を含み得る。ある実施態様では、前記植物細胞は作物、例えばトウモロコシである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＺＦＮ対＃２５の一過性の発現を受けた細胞に由来するトウモロコシＨｉＩＩ  ｇＤＮＡからのＺｐ１５増幅産物についての例示的配列分析結果を表し（結合部位に下線）、期待される切断部位における６ｂｐのＮＨＥＪ挿入（太字）を示す。
【図２】図２は、ＺＦＮ対＃２４の一過性の発現を受けた細胞に由来するトウモロコシＨｉＩＩ  ｇＤＮＡからのＺｐ１５増幅産物についての例示的配列分析結果を表し（結合部位に下線）、期待される切断部位における３ｂｐの欠失を示す。
【図３】図３は、ｐＤＡＢ７４８９と称される構築物を図示した概略図である。
【図４】図４は、ＡＡＤ遺伝子をコードする例示的な除草剤耐性遺伝子発現カセットを図示した概略図である。
【図５】図５は、ｐＤＡＢ７４９０と称される構築物を図示した概略図である。
【図６−１】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−２】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−３】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−４】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−５】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−６】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−７】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図６−８】図６は、トウモロコシ野生型（ＷＴ）、Ｚｐ１５ドナーフラグメント、ならびに組み込まれたドナー配列に隣接している５’および３’境界領域を並べた、標的組込み（ＴＩ）事象のアラインメントを表す。
【図７】図７は、ｐＤＡＢ１０４１０１と称される構築物を図示した概略図である。
【図８】図８は、ＰＡＴ発現カセットを図示した概略図である。
【図９】図９は、ｐＤＡＢ１０４１０７と称される構築物を図示した概略図である。
【図１０】図１０は、ｐＤＡＢ１０４１０４と称される構築物を図示した概略図である。
【図１１】図１１は、ｐＤＡＢ１０４１０５と称される構築物を図示した概略図である。
【図１２】図１２は、ｐＤＡＢ１０４１０６と称される構築物を図示した概略図である。
【図１３】図１３は、ｐＤＡＢ１０４１００と称される構築物を図示した概略図である。
【図１４】図１４は、ｐＤＡＢ１０４１０３と称される構築物を図示した概略図である。
【図１５】図１５は、ｐＤＡＢ１０４１０２と称される構築物を図示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本開示は、トウモロコシの第６染色体上に位置する植物Ｚｐ１５遺伝子内への標的組込み（ＴＩ）のための方法および組成物に関する。ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー）およびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質を用いることによって、挿入された（ドナー）配列を外因性プロモーターに操作可能に連結させることができ、またはプロモーターがなくてもよい。プロモーターがない場合、組み込まれたオープン・リーディング・フレームの転写は、プロモーター特定の組織における内在性Ｚｐ１５遺伝子プロモーターによって生じ得る。プロモーターがないドナーの使用によって、前記ドナーのランダムな組込みの可能性および／または前記ドナー上に保持されたプロモーターによる内在性遺伝子の疑似活性化は低下する。
【００１９】
Ｚｐ１５遺伝子内への標的切断および組換えに有用な組成物は、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）とＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）とを含む融合タンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリペプチドとポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの組み合わせを含有する。ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のジンクフィンガー）を含んでいてよく、かつＺｐ１５遺伝子内の任意の配列に結合するように遺伝子操作されていてもよい。細胞内におけるそのような融合タンパク質の存在は、前記融合タンパク質のその（それらの）結合部位への結合および内在性Ｚｐ１５遺伝子内での切断をもたらす。
【００２０】
概要
当該方法の実施、ならびに本明細書に開示される組成物の調製および使用は、特に指定のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該技術分野の技術の範囲内にある関連分野における従来技術を利用する。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的に更新したもの；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００２１】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、代替可能に用いられ、線状または環状の構造で、かつ一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを表す。本開示上、これらの用語は、ポリマーの長さについて制限するものとして解釈されるべきではない。前記用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸塩部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において改変されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有し、すなわちＡの類似体はＴと塩基対合する。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために代替可能に用いられる。前記用語はまた、１つ以上のアミノ酸が化学的類似体または対応する天然に存在しているアミノ酸の改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２３】
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的、非共有相互作用を表す。全体としての相互作用が配列特異的であるならば、結合相互作用のすべての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、通常、１０-6Ｍ-1以下の解離定数（Ｋd）によって特徴付けされる。「親和性」とは結合の強度を表し、結合親和性の増大はより低いＫdと相関している。
【００２４】
「結合タンパク質」とは、別の分子に非共有的に結合し得るタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それはそれ自体に結合し得（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）、かつ／またはそれは１つ以上の異なるタンパク質の分子に結合し得る。結合タンパク質は、１種類より多い結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００２５】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）とは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介した配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。
【００２６】
ジンクフィンガー結合ドメインを、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。ジンクフィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の制限されない例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質とは、主に合理的基準に由来する設計／組成を有する天然には存在していないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換法則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を蓄積しているデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；および第６，５３４，２６１号を参照されたく、またＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【００２７】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質とは、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験に基づいた手法に主に由来して産生される天然には見られないタンパク質である。例えば、米国第５，７８９，５３８号；米国第５，９２５，５２３号；米国第６，００７，９８８号；米国第６，０１３，４５３号；米国第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７、およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００２８】
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく；線状、環状、または分岐したものであってよく；かつ一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい、任意の長さのヌクレオチド配列を表す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されたヌクレオチド配列を表す。ドナー配列は任意の長さであってよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長の間（またはその間のもしくはそれを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長の間（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長の間である。
【００２９】
「相同であり、同一でない配列」とは、第二の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列は前記第二の配列のものとは同一ではない第一の配列を表す。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、前記変異体遺伝子の配列に相同であり、かつ同一ではない。ある実施態様では、前記２つの配列間の相同性の程度は、通常の細胞メカニズムを利用することによってそれらの間で相同組換えが起こるのに十分である。２つの相同であり同一でない配列は任意の長さであってよく、その非相同性の程度は、１ヌクレオチド程度に小さくても（例えば、標的相同組換えによるゲノムの点変異の修正のための）または１０キロベース以上程度に大きくてもよい（例えば、染色体の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のための）。相同であり同一でない配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を用いることができる。
【００３０】
核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野において既知である。典型的に、そのような技術には、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第二のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較することが含まれる。このやり方でゲノム配列を決定および比較することもできる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な対応を表す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸またはアミノ酸配列にかかわらず、２つの並んだ配列間の正確な一致をより短い配列の長さで割って、１００をかけた数である。核酸配列のためのおおよそのアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）によって提供されている。このアルゴリズムを、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化されたスコア行列を用いることによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）による「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションにおいて提供されている。配列間の同一性または類似性パーセントを算出するのに適したプログラムは、当該技術分野において一般に既知であり、例えば、別のアラインメントプログラムはデフォルトパラメーターを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを、以下のデフォルトパラメーター：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待数＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０配列；分類＝高スコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いることによって使用することができる。これらのプログラムの詳細はインターネット上で見出すことができる。本明細書に記載される配列に関して、所望される配列同一性の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％、およびその間の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、なおいっそう好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００３１】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を、相同な領域間で安定した二重鎖が形成される条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化、および消化されたフラグメントの大きさの決定によって決定することができる。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、前述の方法を用いることによって決定される、少なくとも約７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、なおいっそう好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％の配列同一性を当該分子の既定の長さにわたって示す場合、互いに実質的に相同である。本明細書において使用するとき、実質的に相同であるとは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も表す。実質的に相同であるＤＮＡ配列を、特定のシステムに対して規定される、例えばストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前記参照；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００３２】
２つの核酸フラグメントの選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、前記分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害を、当該技術分野において周知であるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を用いることによって評価することができる。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性を用いることによって、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェントに変化する条件を用いることによって実施され得る。低ストリンジェントな条件を利用する場合、部分的な程度の配列同一性さえも欠いている第二のプローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いることによって、非特異的結合の事象がない場合、前記第二のプローブは標的にハイブリダイズしないというように、非特異的結合がないことを評価することができる。
【００３３】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用する場合、参照核酸配列に相補的である核酸プローブが選ばれ、次いで、適切な条件の選択によって前記プローブと前記参照配列が互いに選択的にハイブリダイズまたは結合して二重鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より高い配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと参照配列が特定程度の配列同一性を有する場合、プローブ／参照配列のハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件を、当該技術分野において既知であるように決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００３４】
ハイブリダイゼーションのための条件は当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が不一致のヌクレオチドを含有する合成物の形成を嫌う程度を表し、より高いストリンジェンシーは不一致の合成物に対するより低い許容度と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす要素は当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、および例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度を含むが、これに制限されない。当業者に既知であるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって上昇する。
【００３５】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件に関して、多数の同等の条件を利用し、例えば以下の要素：配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中における遮断物質の有無（例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーションの反応温度、および時間パラメーター、ならびに様々な洗浄条件を変えることによって、特定のストリンジェンシーを確立し得ることが当該技術分野において周知である。特定のハイブリダイゼーション条件のセットの選択は、当該技術分野における以下の標準的方法に従うことによって選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００３６】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを表す。本開示上、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば細胞内で二本鎖断裂の修復の間に起こるような交換の特殊な形態を表す。このプロセスは、ヌクレオチドの配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖断裂を受けたもの）のテンプレート修復に対する「ドナー」分子を用い、かつドナーから標的への遺伝情報の転移をもたらすため、「非交差型の遺伝子変換」または「短路の遺伝子変換」として様々に知られている。任意の特定の理論に束縛されることを望むことなく、そのような転移は、切断された標的とドナーとの間で形成するヘテロ二重鎖のミスマッチ修正、および／またはドナーを用いて標的の一部になるであろう遺伝情報を再合成する「合成依存的な鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴い得る。そのような特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチド内に組み入れられるような、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００３７】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の断裂を表す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含むが、これに制限されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断のいずれも可能であり、二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断によって、平滑末端または互い違いの末端の産生がもたらされ得る。ある実施態様では、標的二本鎖ＤＮＡ切断に融合ポリペプチドを用いる。
【００３８】
「切断ドメイン」には、ＤＮＡ切断に対する触媒活性を持つ１つ以上のポリペプチド配列が含まれる。切断ドメインは１つのポリペプチド鎖内に含有されていてもよく、あるいは２つ（またはそれ以上）のポリペプチドの会合によって切断活性が生じてもよい。
【００３９】
「切断ハーフドメイン」とは、第二のポリペプチド（同一または異なる）と連動して切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。
【００４０】
「クロマチン」とは、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。大部分の真核細胞のクロマチンはヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のそれぞれ２つを含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡ、ならびにヌクレオソームコア間に伸びる（生物に依存した可変長の）リンカーＤＮＡを含む。ヒストンＨ１の分子は、通常、リンカーＤＮＡと会合する。本開示上、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方のあらゆる種類の細胞内核タンパク質を包含することを意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソーム性クロマチンの両方を含む。
【００４１】
「染色体」とは、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合体であるその核型によって特徴付けされる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【００４２】
「エピソーム」とは、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例には、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムが含まれる。
【００４３】
「接近可能領域」とは、核酸中に存在する標的部位に前記標的部位を認識する外因性分子が結合し得る、細胞クロマチン内の部位である。任意の特定の理論に束縛されることを望むことなく、接近可能領域はヌクレオソーム構造内にパッケージされていないものであると考えられている。接近可能領域の独特の構造を、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感度によって検出できる。
【００４４】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合に十分な条件が存在するという条件で結合分子が結合するであろう核酸の部分を規定する核酸配列である。例えば、５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’という配列は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。
【００４５】
「外因性」分子とは、通常細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「細胞内での通常の存在」とは、前記細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば筋肉の胚発生の間だけ存在する分子は、成体の筋細胞に対して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘発された分子は、ヒートショックされていない細胞に対して外因性分子である。外因性分子には、例えば、任意のポリペプチドまたはそのフラグメントに対するコード配列、機能不全である内在性分子の機能型、または通常に機能する内在性分子の機能不全型が含まれ得る。さらに、外因性分子には、宿主細胞の内在性遺伝子のオルソログである別の種由来のコード配列が含まれ得る。
【００４６】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリーの手法によって生成されるような小分子、あるいはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、前記分子の任意の改変された誘導体、または１つ以上の前記分子を含む任意の複合体等の高分子であってよい。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であってよく、線状、分岐したもの、または環状であってよく、かつ任意の長さのものであってよい。核酸には、二重鎖を形成し得るもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これに制限されない。
【００４７】
外因性分子は、内在性分子と同じ種類の分子、例えば外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸には、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドまたはエピソーム、あるいは細胞内に通常存在しない染色体が含まれ得る。細胞内に外因性分子を導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質を介した転移（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子砲撃、リン酸カルシウム共沈殿、ナノ粒子による形質転換、ＤＥＡＥ−デキストランを介した転移、およびウイルスベクターを介した転移を含むが、これに制限されない。
【００４８】
一方、「内在性」分子とは、特定の環境条件下での特定の発生段階において特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸には、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体または他の細胞内小器官、あるいは天然に存在しているエピソーム性核酸が含まれ得る。さらなる内在性分子には、タンパク質、例えば転写因子および酵素が含まれ得る。
【００４９】
本明細書において使用するとき、「外因性核酸の産物」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば転写産物（ＲＮＡ等のポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【００５０】
「融合」分子とは、２つ以上のサブユニット分子が、例えば共有結合で連結している分子である。前記サブユニット分子は、同じ化学的分子種であってもよく、または異なる化学的分子種であってもよい。第一の種類の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、前記の融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これに制限されない。第二の種類の融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および小溝バインダーと核酸との間の融合が含まれるが、これに制限されない。
【００５１】
細胞内での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達によって、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達であって、前記ポリヌクレオチドが転写され、かつ転写産物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する送達によってもたらされ得る。トランススプライシング、ポリペプチドの切断、およびポリペプチドのライゲーションも、細胞内でのタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の別の部分で提供されている。
【００５２】
本開示上、「遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照されたい）、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域を含むものであって、そのような制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかは問わない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等の翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれに制限されない。
【００５３】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への転換を表す。遺伝子産物とは、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または他の任意の種類のＲＮＡ）、あるいはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されているＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００５４】
遺伝子発現の「調整」とは、遺伝子の活性の変化を表す。発現の調整には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これに制限されない。
【００５５】
「植物」細胞には、単子葉性（単子葉植物）または双子葉性（双子葉植物）植物の細胞が含まれるが、これに制限されない。単子葉植物の制限されない例には、トウモロコシ、イネ、オオムギ、オートムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナ、およびココナツ等の穀物用植物が含まれる。双子葉植物の制限されない例には、タバコ、トマト、ヒマワリ、コットン、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、大豆、キャノーラ（ナタネ）、およびアルファルファが含まれる。植物細胞は、植物の任意の部位に由来するもの、および／または植物の任意の発生段階に由来するものであってよい。
【００５６】
「対象の領域」とは、外因性分子に結合することが所望される、例えば遺伝子あるいは遺伝子の内部または隣接する非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えを目的とするものであってよい。対象の領域は、例えば染色体、エピソーム、細胞内小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、感染ウイルスゲノム内に存在し得る。対象の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列、またはイントロン等の転写される非コード領域内、あるいはコード領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。対象の領域は、１ヌクレオチド対程度に小さくても、または長さが最大２，０００ヌクレオチド対であっても、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
【００５７】
「作動性の連結」および「作動可能に連結された」（または「操作可能に連結された」）という用語は、並列の２つ以上の構成成分（配列エレメント等）に関して代替可能に用いられるものであって、前記構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、かつ少なくとも１つの前記構成成分が、少なくとも１つの他の構成成分に対して影響を及ぼす機能を媒介し得る可能性を与えるように配置されている。実例として、転写制御配列が１つ以上の転写制御因子の有無に応答してコード配列の転写のレベルを調節している場合、プロモーター等の転写制御配列はコード配列に作動可能に連結されている。転写制御配列は、一般にコード配列とシスで作動可能に連結されているが、直接的にそれに隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが連続していないとしても、コード配列に作動可能に連結されている転写制御配列である。
【００５８】
融合ポリペプチドに関して、「作動可能に連結された」という用語は、構成成分のそれぞれが他の構成成分と連結して、それがそのように連結されていなかった場合になすのと同じ機能を果たすという事実を表す。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合している融合ポリペプチドに関して、前記融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合し得、一方で切断ドメインが標的部位の付近でＤＮＡを切断し得る場合、前記ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと前記切断ドメインは作動性の連結の状態にある。
【００５９】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能性フラグメント」とは、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を維持しているタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能性フラグメントは、対応する天然型分子より多い、少ない、または同じ数の残基を保有し得、かつ／あるいは１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を判定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を判定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えばフィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって判定することができる。ＤＮＡ切断を、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。前記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力を、例えば共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝学的かつ生化学的相補性の両方によって判定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００６０】
標的部位
開示される方法および組成物には、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）およびＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー）を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー）が、植物Ｚｐ１５遺伝子座内の配列に結合することによって切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）の活性を前記配列の付近に向けさせ、それによってＺｐ１５内での切断（例えば、二本鎖断裂）を誘導する融合タンパク質が含まれる。本開示の別の部分で示すように、ジンクフィンガードメインは、実質的に任意の所望の配列に結合するように遺伝子操作されていてよい。したがって、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）は、植物Ｚｐ１５遺伝子内の１つ以上の配列に結合するように遺伝子操作されていてよい。ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）および切断ドメインを含む融合タンパク質（あるいは、それぞれがＤＮＡ結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質）の細胞内での発現は、Ｚｐ１５遺伝子における切断をもたらす。
【００６１】
ジンクフィンガードメインによる結合のためのＺｐ１５内の配列（例えば、標的部位）の選択は、例えば、選択された配列に結合するようにＺＦＰを設計するための方法も開示している共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号（２００２年９月１７日）に開示されている方法に従って達成され得る。ヌクレオチド配列の簡単な目視検査も標的部位の選択に用いることができることは当業者に明白であろう。したがって、標的部位選択のための任意の手段を、本明細書に記載される方法において用いることができる。
【００６２】
ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインに対して、標的部位は一般に複数の隣接する標的サブサイトから構成される。標的サブサイトとは、個々のジンクフィンガーによって結合される配列（通常、ヌクレオチドトリプレット、または隣接するクァドループレットと１ヌクレオチド重複し得るヌクレオチドクァドループレットのいずれか）を表す。例えば、ＷＯ０２／０７７２２７を参照されたい。ジンクフィンガータンパク質が最も接触する鎖を標的鎖、「主要な認識鎖」、または「主要な接触鎖」と呼ぶ場合、いくつかのジンクフィンガータンパク質は標的鎖内の３塩基トリプレットおよび非標的鎖上の第４の塩基に結合する。標的部位は、一般に少なくとも９ヌクレオチドの長さを有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかしながら、例えば４フィンガー結合ドメインの１２ヌクレオチド標的部位への結合、５フィンガー結合ドメインの１５ヌクレオチド標的部位への結合、または６フィンガー結合ドメインの１８ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明白であろうが、より大きな結合ドメイン（例えば、７、８、９フィンガー以上）のより長い標的部位への結合も可能である。
【００６３】
標的部位が３ヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば、交差鎖相互作用が生じる場合（例えば、米国特許第６，４５３，２４２号およびＷＯ０２／０７７２２７を参照されたい）、マルチフィンガー結合ドメインの１つ以上の個々のジンクフィンガーは、重複しているクァドループレットサブサイトに結合し得る。結果として、３フィンガータンパク質は、１０番目のヌクレオチドが末端フィンガーによって結合されるクァドループレットの一部である１０ヌクレオチド配列に結合し得、４フィンガータンパク質は、１３番目のヌクレオチドが末端フィンガーによって結合されるクァドループレットの一部である１３ヌクレオチド配列に結合し得る、等々。
【００６４】
マルチフィンガー結合ドメイン内の個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー配列の長さおよび性質も、標的配列への結合に影響を及ぼす。例えば、マルチフィンガー結合ドメイン内の隣接するジンクフィンガー間のいわゆる「非標準的リンカー」、「長いリンカー」、または「構造化リンカー」の存在によって、それらのフィンガーは直接に隣接していないサブサイトに結合することができる。そのようなリンカーの制限されない例は、例えば米国特許第６，４７９，６２６号およびＷＯ０１／５３４８０に記載されている。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインに対する標的部位内の１つ以上のサブサイトは、１、２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチドずつ互いに分離し得る。ほんの一例として、４フィンガー結合ドメインは、配列中に２つの連続する３ヌクレオチドサブサイト、介在ヌクレオチド、および２つの連続するトリプレットサブサイトを含む１３ヌクレオチド標的部位に結合し得る。
【００６５】
配列（例えば、標的部位）間の距離とは、互いに最も近隣の配列の端から測定される、２つの配列間に介在するヌクレオチドまたはヌクレオチド対の数を表す。
【００６６】
２つのジンクフィンガードメイン／切断ハーフドメイン融合分子の離れた標的部位への結合に切断が依存しているある実施態様では、前記２つの標的部位は向かい合ったＤＮＡ鎖上にあり得る。他の実施態様では、両方の標的部位は同じＤＮＡ鎖上にある。
【００６７】
ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に開示される方法において用いることができる。ある実施態様では、ＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒら，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１６０９−１６１４；Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｂ．：５６−６５；米国特許第６，４５３，２４２号。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、概して２、３、４、５、６、またはさらに多くのジンクフィンガーを含む。
【００６８】
典型的には、１つのジンクフィンガードメインは、長さが約３０アミノ酸である。構造研究によって、それぞれのジンクフィンガードメイン（モチーフ）は、２個のシステインおよび２個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位を介した特定の構造に保持された、２つのβシート（２個の不変のシステイン残基を含有するβターンに保持されている）およびαヘリックス（２個の不変のヒスチジン残基を含有している）を含有することが証明されている。
【００６９】
ジンクフィンガーには、標準的Ｃ2Ｈ2ジンクフィンガー（すなわち、亜鉛イオンが２個のシステインと２個のヒスチジン残基によって配位されているもの）、ならびに、例えばＣ3Ｈジンクフィンガー（亜鉛イオンが３個のシステイン残基と１個のヒスチジン残基によって配位されているもの）およびＣ4ジンクフィンガー（亜鉛イオンが４個のシステイン残基によって配位されているもの）等の非標準的ジンクフィンガーの両方が含まれる。植物における使用のための非標準的ＺＦＰに関するＷＯ０２／０５７２９３および米国特許公報第２００８０１８２３３２号も参照されたい。
【００７０】
遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在しているジンクフィンガータンパク質と比較して新規な結合特異性を有し得る。遺伝子操作法には、合理的設計および様々な種類の選択が含まれるが、これに制限されない。合理的設計には、例えばトリプレット（またはクァドループレット）ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーアミノ酸配列とを含むデータベースであって、それぞれのトリプレットまたはクァドループレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクァドループレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連付けされているデータベースを用いることが含まれる。
【００７１】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。
【００７２】
ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【００７３】
個々のジンクフィンガーは３ヌクレオチド（すなわち、トリプレット）配列（または、隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチド重複し得る４ヌクレオチド配列）に結合するため、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように遺伝子操作されている配列（例えば、標的配列）の長さは、遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数を決定することになる。例えば、フィンガーモチーフが重複サブサイトに結合しないＺＦＰについて、６ヌクレオチド標的配列は２フィンガー結合ドメインによって結合され；９ヌクレオチド標的配列は３フィンガー結合ドメインによって結合される、等々。本明細書で述べているように、標的部位における個々のジンクフィンガーに対する結合部位（すなわち、サブサイト）は、連続している必要はないが、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さおよび性質に依存して、１つまたは数個のヌクレオチドずつ分離され得る。
【００７４】
マルチフィンガージンクフィンガー結合ドメインにおいて、隣接するジンクフィンガーは、およそ５アミノ酸のアミノ酸リンカー配列（いわゆる「標準的」フィンガー間リンカー）によって、あるいは１つ以上の非標準的リンカーによって分離され得る。例えば、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。３つを上回るフィンガーを含む遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインについて、前記ジンクフィンガーの一部の間でのより長い（「非標準的」）フィンガー間リンカーの挿入は、それによって結合ドメインによる結合の親和性および／または特異性が増加し得るため、場合によっては所望され得る。例えば、米国特許第６，４７９，６２６号およびＷＯ０１／５３４８０を参照されたい。したがって、マルチフィンガージンクフィンガー結合ドメインを、非標準的フィンガー間リンカーの存在および位置に関して特徴付けすることができる。例えば、３つのフィンガー（２個の標準的フィンガー間リンカーによって接合している）、長いリンカー、および３つのさらなるフィンガー（２個の標準的フィンガー間リンカーによって接合している）を含む６フィンガージンクフィンガー結合ドメインは、２×３配置と表示される。同様に、２つのフィンガー（その間に標準的リンカーを有する）、長いリンカー、および２つのさらなるフィンガー（標準的リンカーによって接合している）を含む結合ドメインは、２×２配置と表示される。３つの２フィンガー単位（そのそれぞれにおいて、２つのフィンガーが標準的リンカーによって接合している）を含み、かつそれぞれの２フィンガー単位が隣接する２つのフィンガー単位と長いリンカーによって接合しているタンパク質は、３×２配置として表される。
【００７５】
マルチフィンガー結合ドメイン内の２つの隣接するジンクフィンガー間での長いまたは非標準的フィンガー間リンカーの存在によって、前記２つのフィンガーは、しばしば、標的配列における直接に連続していないサブサイトに結合する。したがって、標的部位におけるサブサイト間には１つ以上のヌクレオチドの差が存在し得、すなわち、標的部位はジンクフィンガーによって接触されていない１つ以上のヌクレオチドを含有し得る。例えば、２×２ジンクフィンガー結合ドメインは、１つのヌクレオチドによって分離された２つの６ヌクレオチド配列に結合し得、すなわち、それは１３ヌクレオチド標的部位に結合する。Ｍｏｏｒｅら，（２００１ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３２−１４３６；Ｍｏｏｒｅら，（２００１ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３７−１４４１、およびＷＯ０１／５３４８０も参照されたい。
【００７６】
先に言及しているように、標的サブサイトは、１つのジンクフィンガーによって結合される３または４ヌクレオチド配列である。ある目的のために、２フィンガー単位を「結合モジュール」と表示する。結合モジュールを、例えば、マルチフィンガータンパク質（一般に３つのフィンガー）との関連で、特定の６ヌクレオチド標的配列に結合する２つの隣接するフィンガーを選択することによって獲得することができる。あるいは、個々のジンクフィンガーを集合させることによってモジュールを構築することができる。ＷＯ９８／５３０５７およびＷＯ０１／５３４８０も参照されたい。
【００７７】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等が既知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、天然でない標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔら，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓら，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；米国特許公報第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００７８】
別の代替法として、ＤＮＡ結合ドメインはロイシンジッパータンパク質に由来してもよい。ロイシンジッパーとは、遺伝子発現に関連した重要な転写因子である多くの真核性制御タンパク質におけるタンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質のクラスである。ロイシンジッパーとは、動物、植物、酵母、等々を含むいくつかの界を越えて、これらの転写因子で共有されている共通の構造モチーフを表す。ロイシンジッパーは、ロイシン残基がαヘリックスのいたる所に均等に間隔をあけて配置され、それによって前記２つのポリペプチドのロイシン残基が最終的に前記ヘリックスの同じ面上にくることになる様式で特異的ＤＮＡ配列に結合する、２つのポリペプチド（ホモ二量体またはヘテロ二量体）によって形成される。ロイシンジッパーのＤＮＡ結合特異性を、本明細書に開示されるＤＮＡ結合ドメインに利用することができる。
【００７９】
いくつかの実施態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナスに由来するＴＡＬエフェクターからの遺伝子操作されたドメインである（Ｂｏｃｈら，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９，２００９年１０月（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）、ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９，２００９年１０月（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７）を参照されたい）。
【００８０】
切断ドメイン
前述のように、ＤＮＡ結合ドメインは、切断（ヌクレアーゼ）ドメインと関連していてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能を維持している一方で、そのＤＮＡ結合特異性を改変されていてもよい。さらに、ジンクフィンガータンパク質はまた、切断ドメインと融合して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成してもよい。本明細書に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから獲得され得る。切断ドメインが由来し得る例示的エンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これに制限されない。例えば、２００２−２００３カタログ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら，（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの制限されない例には、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３；およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。１つ以上のこれらの酵素（またはその機能性フラグメント）を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として用いることができる。
【００８１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位において）配列特異的に結合し得、かつ結合の部位においてまたは近隣においてＤＮＡを切断し得る。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から外れた部位でＤＮＡを切断し、かつ分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素のＦｏｋＩは、一方の鎖上にあるその認識部位から９ヌクレオチドの部位で、かつもう一方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの部位でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍら，（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍら，（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施態様では、融合タンパク質は、少なくとも１種のＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および遺伝子操作されていてもされていなくてもよい１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【００８２】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的ＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示上、開示される融合タンパク質に用いられたＦｏｋＩ酵素の一部は切断ハーフドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、それぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性のある切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含有する１つのポリヌクレオチド分子も用いることができる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた標的切断および標的配列変更に対するパラメーターは、本開示の別の部分で提供されている。
【００８３】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を維持している、または多量化（例えば、二量化）して機能性切断ドメインを形成する能力を維持しているタンパク質の任意の部分であってよい。
【００８４】
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている、共同所有の国際公報ＷＯ２００７／０１４２７５に記載されている。
【００８５】
切断特異性を増強させるために、切断ドメインを改変してもよい。ある実施態様では、切断ハーフドメインの変形型が利用され、これらの変形型は切断ハーフドメインのホモ二量化を最小限に抑えるまたは阻止する。そのような改変された切断ハーフドメインの制限されない例は、参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている、ＷＯ２００７／０１４２７５に詳細に記載されている。実施例も参照されたい。ある実施態様では、切断ドメインは、ホモ二量化を最小限に抑えるまたは阻止し、当業者に既知であり、かつ参照することによりそれらの全体として本明細書に組み入れられている、例えば米国特許公報第２００５００６４４７４および第２００６０１８８９８７号に記載されている遺伝子操作された切断ハーフドメイン（二量化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量化に影響を与えるための標的である。例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号；国際特許公報ＷＯ０７／１３９８９８；Ｍｉｌｌｅｒら，（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（７）：７７８−７８５を参照されたい。
【００８６】
必須のヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩのさらなる遺伝子操作された切断ハーフドメインも、本明細書に記載されるＺＦＮに用いることができる。一実施態様では、第一の切断ハーフドメインはＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基における変異を含み、かつ第二の切断ハーフドメインはアミノ酸残基４８６および４９９における変異を含む。
【００８７】
ある実施態様では、切断ドメインは、その両方が結合ドメイン、第一の切断ハーフドメイン、および第二の切断ハーフドメインを含む１つのポリペプチドの一部である、２つの切断ハーフドメインを含む。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを切断する機能を果たす限り、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。
【００８８】
一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む１つのタンパク質を用いることができる。前記２つの切断ハーフドメインは同じエンドヌクレアーゼ（または、その機能性フラグメント）に由来してもよく、あるいはそれぞれの切断ハーフドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性フラグメント）に由来してもよい。さらに、前記２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、２つの融合タンパク質のそれらそれぞれの標的部位への結合により、切断ハーフドメインが例えば二量化することによって機能性切断ドメインを形成し得る空間的方向に互いに切断ハーフドメインが位置付けられるように、互いに対して配置される。したがって、ある実施態様では、標的部位の近隣の端を、５〜８ヌクレオチドで、または１５〜１８ヌクレオチドで分離する。しかしながら、任意の整数値のヌクレオチドまたはヌクレオチド対を、２つの標的部位間に介在させることができる（例えば、２〜５０ヌクレオチド以上）。一般に、切断の地点は標的部位の間にある。
【００８９】
融合タンパク質
融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知である。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガードメイン）および制御または切断ドメイン（もしくは切断ハーフドメイン）、および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む融合タンパク質の設計および構築のための方法は、参照することによりそれらの全体として本明細書に組み入れられている、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号、ならびに米国特許出願公報第２００７／０１３４７９６号および第２００５／００６４４７４号に記載されている。ある実施態様では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築する。これらのポリヌクレオチドをベクター内に挿入することができ、かつ前記ベクターを細胞内に導入することができる（ベクターおよび細胞内にポリヌクレオチドを導入するための方法に関するさらなる開示のために、下記を参照されたい）。
【００９０】
本明細書に記載される方法のある実施態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガー結合ドメインおよびＦｏｋＩ制限酵素由来の切断ハーフドメインを含む融合タンパク質を含み、かつ２つのそのような融合タンパク質を細胞内で発現させる。細胞内での２つの融合タンパク質の発現は、前記２つのタンパク質の前記細胞への送達；１つのタンパク質および前記タンパク質の一方をコードする１つの核酸の前記細胞への送達；それぞれが前記タンパク質の一方をコードする２つの核酸の前記細胞への送達；または両方のタンパク質をコードする１つの核酸の前記細胞への送達によって生じ得る。さらなる実施態様では、融合タンパク質は、２つの切断ハーフドメインとジンクフィンガー結合ドメインとを含む１本のポリペプチド鎖を含む。この場合、１つの融合タンパク質が細胞内で発現し、かつ理論に束縛されることを望むことなく、前記切断ハーフドメインの分子内二量体の形成の結果としてＤＮＡを切断すると考えられている。
【００９１】
ある実施態様では、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合体）の構成成分を、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端の最も近隣にあり、かつ切断ハーフドメインがカルボキシ末端の最も近隣にあるように配置する。これは、ＦｏｋＩ酵素に由来するもの等の天然に存在している二量化切断ドメインにおける、ＤＮＡ結合ドメインがアミノ末端の最も近隣にあり、かつ切断ハーフドメインがカルボキシ末端の最も近隣にある、切断ドメインの相対的方向を反映する。これらの実施態様では、機能性ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフドメインの二量化は、融合タンパク質が向かい合ったＤＮＡ鎖上の部位に結合することによって引き起こされ、結合部位の５’末端は互いに隣接している。
【００９２】
さらなる実施態様では、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合体）の構成成分を、切断ハーフドメインが融合タンパク質のアミノ末端の最も近隣にあり、かつジンクフィンガードメインがカルボキシ末端の最も近隣にあるように配置する。これらの実施態様では、機能性ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフドメインの二量化は、融合タンパク質が向かい合ったＤＮＡ鎖上の部位に結合することによって引き起こされ、結合部位の３’末端は互いに隣接している。
【００９３】
その上さらなる実施態様では、第一の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端の最も近隣にある切断ハーフドメインおよびカルボキシ末端の最も近隣にあるジンクフィンガードメインを含有し、かつ第二の融合タンパク質を、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端の最も近隣にあり、かつ切断ハーフドメインがカルボキシ末端の最も近隣にあるように配置する。これらの実施態様では、両方の融合タンパク質は同じＤＮＡ鎖に結合し、カルボキシ末端の最も近隣にあるジンクフィンガードメインを含有する第一の融合タンパク質の結合部位が、アミノ末端の最も近隣にあるジンクフィンガードメインを含有する第二の融合タンパク質の結合部位の５’側に位置する。
【００９４】
開示される融合タンパク質のある実施態様では、ジンクフィンガードメインおよび切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）の間のアミノ酸配列を「ＺＣリンカー」と表示する。ＺＣリンカーは、前述のフィンガー間リンカーとは区別されるべきである。切断を最適化するＺＣリンカーの獲得に関する詳細については、例えば、米国特許公報第２００５００６４４７４号Ａ１および第２００３０２３２４１０号，ならびに国際特許公報ＷＯ０５／０８４１９０を参照されたい。
【００９５】
一実施態様では、本開示は、表１に示した１つ以上の認識ヘリックスアミノ酸配列を有するジンクフィンガータンパク質を含むＺＦＮを提供する。別の実施態様では、表１に示した１つ以上の認識ヘリックスを有するＺＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むＺＦＰ発現ベクターを本明細書において提供する。
【００９６】
標的組込み
開示される方法および組成物を用いて、植物の細胞クロマチンのＺｐ１５遺伝子におけるＤＮＡを切断することができ、それによって前記遺伝子座への外因性配列の安定的な標的組込みが容易になる。本明細書に記載されるように、内在性Ｚｐ１５遺伝子の機能の喪失は植物細胞に十分に許容され、かつこの遺伝子内に組み込まれた配列が広範に転写され、組み込まれた配列の遺伝的伝達のための生殖細胞系の改変を有する植物を作出する。したがって、Ｚｐ１５は外因性配列の標的組込みのための所望の部位である。
【００９７】
Ｚｐ１５内への標的組込みのために、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）を、所定の切断部位におけるまたは近隣における標的部位に結合するように遺伝子操作し、かつ操作されたＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを含む融合タンパク質を細胞内で発現させる。融合タンパク質のＤＮＡ結合（例えば、ジンクフィンガー）部分が標的部位へ結合すると、ＤＮＡは切断ドメインによって標的部位の近隣で好ましくは二本鎖断裂によって切断される。
【００９８】
Ｚｐ１５遺伝子座における二本鎖断裂の存在によって、相同組換えを介した外因性配列の組込みが容易になる。したがって、Ｚｐ１５遺伝子内に挿入されるべき外因性配列を含むポリヌクレオチドは、相同組換えを容易にするためにＺｐ１５遺伝子に相同な１つ以上の領域を含むことになる。
【００９９】
本明細書に記載されるように、対象の任意の配列（外因性配列）をＺｐ１５遺伝子座内に導入することができる。例示的外因性配列には、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター、エンハンサー、および他の制御配列（例えば、干渉ＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ発現カセット、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、および様々な種類の発現構築物）が含まれるが、これに制限されない。そのような配列は、標準的な分子生物学的技術（クローニング、合成、等々）を用いることによって容易に獲得され得、かつ／あるいは市販されている。
【０１００】
本明細書に記載される融合分子に加えて、選択されたゲノム配列の標的置換もまた、置換（またはドナー）配列の導入を伴う。ドナー配列を、融合タンパク質の発現の前に、同時に、またはそれに続いて、細胞内に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、それとそれが相同性を有するＺｐ１５ゲノム配列との間の相同組換え（または相同指向修復）を支持するのに十分なＺｐ１５との相同性を含有している。ドナーおよびゲノム配列の間のおよそ２５、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチド以上（または１０〜２，０００ヌクレオチド、もしくはそれ以上の間の任意の整数値）の配列相同性によって、それらの間の相同組換えが支持されることになる。ある実施態様では、ホモロジーアームは長さが１，０００塩基対未満である。他の実施態様では、ホモロジーアームは長さが７５０塩基対未満である。参照することにより本明細書に組み入れられている、米国仮特許出願第６１／１２４，０４７号も参照されたい。
【０１０１】
ドナー配列は、長さが１０〜５，０００ヌクレオチド（またはその間の任意の整数値のヌクレオチド）またはそれより長い範囲であってよい。典型的にドナー配列はそれが置換するゲノム配列と同一でないことは、容易に明白であろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に対して１つ以上の一塩基の変化、挿入、欠失、逆位、または転位を含有してよい。あるいは、ドナー配列は、２つの相同な領域が隣接した非相同的配列を含有してよい。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の対象の領域に相同でない配列を含有するベクターを含んでよい。一般に、ドナー配列の相同領域は、組換えが所望されるゲノム配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する。ある実施態様では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに依存して、１％〜１００％の間の任意の値の配列同一性が存在し得る。
【０１０２】
ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続領域を含有してよい。例えば、対象の領域に通常存在しない配列の標的挿入のために、前記配列は、ドナー核酸分子内に存在してよく、かつ対象の領域内の遺伝子配列に相同な領域によって隣接されていてもよい。
【０１０３】
ドナー分子は、Ｚｐ１５遺伝子座内に挿入されて、後の使用のための貯蔵物としての役割を果たすこともできる。例えば、内在性遺伝子に相同であるが対象の変異を含有しているドナー分子を、Ｚｐ１５遺伝子座内に挿入してもよい。次いで、内在性遺伝子座と対象の変異を含有するＺｐ１５遺伝子座内のドナー分子との両方を切断するであろう、前記内在性遺伝子に特異的なＺＦＮを導入することができる。ゲノムにおいて結果として生じるＤＳＢは、その後Ｚｐ１５遺伝子座から解放されたドナー分子に対する組込み部位になり得る。このようにして、当該方法はＺＦＮをコードする核酸およびそのドナー配列の両方の同時取込みに依存しないため、対象の任意の領域におけるドナー配列の標的組込みの効率を大幅に増加させることができる。
【０１０４】
ドナー分子は、Ｚｐ１５遺伝子座内に挿入されて、それに続く挿入のための標的部位としての役割を果たすこともできる。例えば、さらなるＺＦＮ設計物のための認識部位を含有するＤＮＡ配列から構成されるドナー分子を、Ｚｐ１５遺伝子座内に挿入してもよい。それに続き、さらなるＺＦＮ設計物を作出し、かつ細胞内で発現させてもよく、それによって、オリジナルのドナー分子は切断され、かつ修復または相同組換えによって改変される。このようにして、ドナー分子の反復組込みがＺｐ１５遺伝子座において生じ得る。
【０１０５】
ドナー配列の挿入の成功を判別するためのアッセイ（例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、制限酵素消化）を簡略化するために、Ｚｐ１５ゲノム配列と比較して、ある程度の配列の相違がドナー配列に存在してもよい。好ましくは、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の相違は、アミノ酸配列を変化させない、またはサイレントなアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響を及ぼさない変化）をもたらす。ドナーポリヌクレオチドは、場合によっては、対象の領域における部位に結合するＤＮＡ結合ドメインに対応する配列の変化を含有して、相同組換えによって細胞クロマチン内に導入されているドナー配列の切断を阻止することもできる。
【０１０６】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であってよく、かつ線状または環状の形態で細胞内に導入されてよい。線状の形態で導入された場合、ドナー配列の端を、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジオキシヌクレオチド残基を線状分子の３’末端に付加し、かつ／あるいは自己相補的オリゴヌクレオチドを一方または両方の端にライゲートさせる。例えば、Ｃｈａｎｇら，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓら，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法には、末端アミノ基の付加、ならびに、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミダート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修飾されたヌクレオチド間連結の使用が含まれるが、これに制限されない。
【０１０７】
ポリヌクレオチドを、例えば複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子等のさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、ナノ粒子、リポソーム、またはポロキサマー等の物質と複合体を形成した核酸として導入することができ、あるいは細菌またはウイルス（例えば、アグロバクテリウム、リゾビウム種、ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、メソリゾビウム・ロッティ、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス、およびキャッサバベインモザイクウイルス）によって送達することができる。例えば、Ｃｈｕｎｇら，（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１（１）：１−４を参照されたい。
【０１０８】
断裂に隣接したまたは周辺の領域との相同性を有する外因性ＤＮＡ分子の存在を伴った細胞配列における二本鎖断裂の存在は、ドナー分子から細胞（例えば、ゲノムまたは染色体）配列への配列情報の転移によって、すなわち、「遺伝子変換」としても既知である相同指向修復のプロセスによって断裂を修復する細胞メカニズムを活性化するようである。本出願人の方法は、Ｚｐ１５遺伝子等のパラロガス遺伝子を特異的に標的化する遺伝子操作されたＺＦＰの強力な標的化能を切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と有利に組み合わせるものであって、それによって標的配列の切断により外因性配列の挿入が所望されるゲノムの領域において二本鎖断裂が引き起されるものである。
【０１０９】
染色体配列の変更のために、十分量のドナー配列が所望の配列変更をもたらすためにコピーされてさえいれば、ドナーの全配列が染色体内にコピーされる必要はない。
【０１１０】
相同組換えによるドナー配列の挿入の効率は、細胞ＤＮＡにおける二本鎖断裂と組換えが所望される部位との間の距離に反比例する。言い換えれば、組換えが所望される部位に二本鎖断裂がより近い場合ほど、より高い効率の相同組換えが観察される。組換えの正確な部位があらかじめ定められていない（例えば、所望の組換え事象がゲノム配列の間隔にわたって生じ得る）場合には、ドナー核酸の長さおよび配列は、切断の部位とともに、所望の組換え事象が得られるように選択される。ゲノム配列における１つのヌクレオチド対の配列を変化させるように所望の事象を設計する場合には、細胞クロマチンはそのヌクレオチド対のいずれかの側上の１０，０００ヌクレオチド以内で切断される。ある実施態様では、切断は、配列を変化させるべきヌクレオチド対のいずれかの側上で、１，０００、５００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、または２ヌクレオチド、あるいは２〜１，０００ヌクレオチドの間の任意の整数値の範囲内で起こる。
【０１１１】
上で詳述されるように、それぞれがジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質に対する結合部位は、もう一方の結合部位の最も近隣にあるそれぞれの結合部位の端から測定して５〜８または１５〜１８ヌクレオチド離れて位置し得、かつ切断は前記結合部位間で起こる。切断されるゲノム配列はドナー配列によって置換されるため、切断が結合部位間の１つの部位または複数の部位で起こるかどうかは重要ではない。したがって、標的組換えによる１つのヌクレオチド対の配列の効率的な変更のために、結合部位間の領域の中間点は、そのヌクレオチド対の１０，０００ヌクレオチド以内、好ましくは１，０００ヌクレオチド以内、または５００ヌクレオチド以内、または２００ヌクレオチド以内、または１００ヌクレオチド以内、または５０ヌクレオチド以内、または２０ヌクレオチド以内、または１０ヌクレオチド以内、または５ヌクレオチド以内、または２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内、または対象のヌクレオチド対の地点にある。
【０１１２】
ある実施態様では、相同染色体はドナーポリヌクレオチドとしての役割を果たし得る。したがって、例えばヘテロ接合体における変異の修正は、１つの染色体上の変異配列に結合かつ切断するが、相同染色体上の野生型配列を切断しない融合タンパク質を遺伝子操作することによって達成され得る。変異を有する染色体上での二本鎖断裂は、切断された染色体に相同染色体由来の野生型配列がコピーされ、ゆえに野生型配列の２コピーが復元される、相同性に基づく「遺伝子変換」プロセスを刺激する。
【０１１３】
相同組換えに関与する遺伝子、例えば、ＲＡＤ５４エピスタシス群の植物遺伝子（例えば、ＡｔＲａｄ５４、ＡｔＲａｄ５１）、およびその産物が前述の遺伝子産物と相互作用する遺伝子等の発現を活性化するためのさらなるＺＦＰ−機能性ドメイン融合体の使用を含むが、これに制限されない標的組換えのレベルを増強し得る方法および組成物も提供される。例えば、Ｋｌｕｔｓｔｅｉｎ  Ｍ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００８  Ａｐｒ；１７８（４）：２３８９−９７を参照されたい。
【０１１４】
同様に、ＺＦＰ−機能性ドメイン融合体を本明細書に開示される方法および組成物と組み合わせて用いて、非相同末端の接合に関与する遺伝子（例えば、Ｋｕ７０／８０、ＸＲＣＣ４、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ４）の発現を抑制することができる。例えば、Ｒｉｈａら，（２００２）ＥＭＢＯ  ２１：２８１９−２８２６；Ｆｒｅｉｓｎｅｒら，（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３４：４２７−４４０；Ｃｈｅｎら，（１９９４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２４：１３５−１４２を参照されたい。ジンクフィンガー結合ドメインおよび機能性ドメインの間の融合体を用いた遺伝子発現の活性化および抑制のための方法は、例えば共同所有の米国特許第６，５３４，２６１号；第６，８２４，９７８号、および第６，９３３，１１３号に開示されている。さらなる抑制方法には、抑制されるべき遺伝子の配列を標的とした、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ）、またはｓｈＲＮＡが含まれる。
【０１１５】
相同組換えに関与する遺伝子産物の発現を活性化する代替法として、またはそれに加えて、Ｚｐ１５を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを有するこれらのタンパク質（またはその機能性フラグメント）の融合体を用いて、これらのタンパク質（組換えタンパク質）を対象の領域に誘導することができ、それによってそれらの局所的濃度を増加させ、さらに相同組換えプロセスを刺激することができる。あるいは、前述のような相同組換えに関与するポリペプチド（またはその機能性フラグメント）は、ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および組換えタンパク質（またはその機能性フラグメント）を含むトリプル融合タンパク質の一部であってよい。前述の方法および組成物に用いることができる、遺伝子変換および組換えに関連したクロマチン再構築に関与するさらなるタンパク質には、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｅｓａ１ｐ、Ｔｉｐ６０）、ヒストン・メチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄｏｔ１ｐ）、ヒストンキナーゼ、およびヒストンホスファターゼが含まれる。Ｂｈａｔら，（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３３：４５５−４６９も参照されたい。
【０１１６】
ジンクフィンガー／ヌクレアーゼ融合分子およびドナーＤＮＡ分子を含む細胞における標的組換えの効率のさらなる上昇は、相同性駆動による修復プロセスが最大限に活発である細胞周期のＧ2期にある細胞を遮断することによって達成される。そのような停止は、多くの方法で達成され得る。例えば、細胞を例えば細胞周期の進行に影響を与える薬剤、化合物、および／または小分子で処理して、Ｇ2期で細胞を停止させることができる。この種類の例示的分子には、微小管重合に作用する化合物（例えば、ビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール）、ＤＮＡと相互作用する化合物（例えば、シス−ジアンミン白金（ＩＩ）ジクロリド（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、シスプラチン、ドキソルビシン）、および／またはＤＮＡ合成に作用する化合物（例えば、チミジン、ヒドロキシウレア、Ｌ−ミモシン、エトポシド、５−フルオロウラシル）が含まれるが、これに制限されない。組換え効率のさらなる上昇は、クロマチン構造を変更して、ゲノムＤＮＡを細胞の組換え機構にさらに接近できるようにするヒストン・デアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ）の使用によって達成される。
【０１１７】
細胞周期の停止のためのさらなる方法には、例えば、当該タンパク質をコードするｃＤＮＡを細胞内に導入することによって、または当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を活性化する遺伝子操作されたＺＦＰを細胞内に導入することによって、ＣＤＫ細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質の過剰発現が含まれる。細胞周期の停止は、例えばＲＮＡｉ法を用いてサイクリンおよびＣＤＫの活性を阻害することによって（例えば、米国特許第６，５０６，５５９号）、あるいは例えばサイクリンおよび／またはＣＤＫ遺伝子等の細胞周期の進行に関与する１つ以上の遺伝子の発現を抑制する遺伝子操作されたＺＦＰを細胞内に導入することによっても達成される。遺伝子発現の制御のための遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質の合成のための方法について、例えば共同所有の米国特許第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１１８】
あるいは、ある場合において、標的切断はドナーポリヌクレオチドの非存在下で行われ（好ましくはＳ期またはＧ2期に）、かつ組換えは相同染色体間で起こる。
【０１１９】
発現ベクター
本明細書に記載されるような１つ以上の融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）をコードする核酸を、複製および／または発現のために、原核細胞または真核細胞内への形質転換用ベクター内にクローニングすることができる。ベクターは、原核細胞用ベクター、例えばプラスミドまたはシャトルベクター、昆虫細胞用ベクター、あるいは真核細胞用ベクターであってよい。融合タンパク質をコードする核酸を、植物細胞への投与のための発現ベクター内にクローニングすることもできる。
【０１２０】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）を発現させるために、前記融合タンパク質をコードする配列を、典型的には、転写を指令するプロモーターを含有する発現ベクター内にサブクローニングする。適切な細菌および真核生物プロモーターは、当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９；３rd  ｅｄ．，２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら，前記参照）に記載されている。ＺＦＰを発現させるための細菌発現システムは、例えば大腸菌、バチルス属菌、およびサルモネラ菌で利用可能である（Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）。そのような発現システム用のキットが市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現システムは当業者に周知であり、市販もされている。
【０１２１】
融合タンパク質をコードする核酸の発現を指令するのに用いられるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、宿主細胞に適した強力な構成的プロモーターは、典型的に融合タンパク質の発現および精製のために用いられる。
【０１２２】
対照的に、融合タンパク質を植物遺伝子の制御のためにインビボで投与する場合（下記の「植物細胞への核酸の送達」の章を参照されたい）、前記融合タンパク質の特定の使用に応じて、構成的または誘導可能なプロモーターのいずれかが用いられる。植物プロモーターの制限されない例には、シロイヌナズナのユビキチン−３（ｕｂｉ−３）（Ｃａｌｌｉｓら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５−１２４８６−１２４９３）；Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）のマンノピン・シンターゼ（Δｍａｓ）（Ｐｅｔｏｌｉｎｏら，米国特許第６，７３０，８２４号）；および／またはキャッサバベインモザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１：１１２９−１１３９）に由来するプロモーター配列が含まれる。実施例も参照されたい。
【０１２３】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的に転写単位、あるいは原核または真核のいずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要とされるすべてのさらなるエレメントを含有する発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば融合タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーター、および、例えば転写産物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要とされるシグナルを含有する。さらなるカセットのエレメントに、例えばエンハンサー、ヘテロスプライシングシグナル、および／または核局在化シグナル（ＮＬＳ）が含まれてもよい。
【０１２４】
遺伝情報を細胞内へ輸送するのに用いられる特定の発現ベクターは、融合タンパク質の使用目的、例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物等々での発現（下記の発現ベクターを参照されたい）に関して選択される。標準的な細菌用および動物用発現ベクターは当該技術分野において既知であり、例えば米国特許公報第２００５００６４４７４号Ａ１、ならびに国際特許公報ＷＯ０５／０８４１９０、ＷＯ０５／０１４７９１、およびＷＯ０３／０８０８０９に詳細に記載されている。
【０１２５】
標準的トランスフェクション法を用いて、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母、または昆虫の細胞株を作製することができ、次いでそれを標準的技術を用いることによって精製することができる（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，１９９０）を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的技術に従って行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら，ｅｄｓ．，１９８３）を参照されたい）。
【０１２６】
そのような宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入するための任意の周知の手法を用いてよい。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソーム型および組込み型の両方のウイルスベクター、ならびにクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞内に導入するための任意の他の周知の方法の使用が含まれる（例えば、前記のＳａｍｂｒｏｏｋら，を参照されたい）。用いられる特定の遺伝子操作手法は、最適なタンパク質を発現し得る宿主細胞内に少なくとも１つの遺伝子を上手く導入できさえすればよい。
【０１２７】
植物細胞への核酸の送達
前述のように、ＤＮＡ構築物を様々な従来技術によって所望の植物宿主内へ（例えば、そのゲノム内へ）導入することができる。そのような技術を見直すために、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３；およびＧｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８，２ｄ  Ｅｄ．），Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９を参照されたい。
【０１２８】
例えば、ＤＮＡ構築物を、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション等の技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接的に導入してもよく、あるいはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子砲撃等の微粒子銃法を用いて植物組織へ直接的に導入することができる（例えば、Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ構築物を、ナノ粒子による形質転換を介して植物細胞内に導入することもできる（例えば、参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１２／２４５，６８５号を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ構築物を適切なＴ−ＤＮＡ境界／隣接領域とつなぎ合わせて、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクター内に導入してもよい。バイナリーベクターを安全化および使用することを含む、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換技術は、科学文献に十分に記載されている。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６−４９８；およびＦｒａｌｅｙら，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４８０３を参照されたい。
【０１２９】
さらに、遺伝子移入は、非アグロバクテリウム性の細菌またはウイルス、例えばリゾビウム種、ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロッティ、メソリゾビウム・ロッティ、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス、およびキャッサバベインモザイクウイルス、および／またはタバコモザイクウイルス等を用いて達成され得る。例えば、Ｃｈｕｎｇら，（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１（１）：１−４を参照されたい。
【０１３０】
バイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）または共培養手法（Ｈｏｒｓｃｈら，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１）を用いることによって細胞を細菌に感染させる場合、アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主の毒性機能は、当該構築物および隣接マーカーを含有するＴ鎖の植物細胞ＤＮＡ内への挿入を指令すると考えられる。一般に、アグロバクテリウム形質転換システムは、双子葉植物を遺伝子操作するために用いられる（Ｂｅｖａｎら，（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ  １６：３５７−３８４；Ｒｏｇｅｒｓら，（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１８：６２７−６４１）。アグロバクテリウム形質転換システムを用いて、ＤＮＡを単子葉性の植物および植物細胞に形質転換ならびに移入することもできる。米国特許第５，５９１，６１６号；Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：３０３９−３０４１；Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−７６４；Ｇｒｉｍｓｌｅｙら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：１６７７−１７９；Ｂｏｕｌｔｏｎら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３１−４０；およびＧｏｕｌｄら，（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５：４２６−４３４を参照されたい。
【０１３１】
代替的な遺伝子移入および形質転換方法には、カルシウムを介した、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介した、またはエレクトロポレーションを介したネイキッドＤＮＡの取込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７１７−２７２２，Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９−１７７；Ｆｒｏｍｍら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４−５８２８；およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４−２７６）、ならびに植物組織のエレクトロポレーション（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５）が含まれるが、これに制限されない。植物細胞の形質転換のためのさらなる方法には、マイクロインジェクション、炭化ケイ素を介したＤＮＡの取込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒら，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ９：４１５−４１８）、ならびにマイクロプロジェクタイル砲撃（Ｋｌｅｉｎら，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８）が含まれる。
【０１３２】
開示される方法および組成物を用いて、外因性配列を植物細胞ゲノムにおける所定の位置（例えば、Ｚｐ１５遺伝子）内に挿入することができる。これは、植物ゲノム内に導入された導入遺伝子の発現はその組込み部位に決定的に依存するため有用である。したがって、例えば除草剤耐性、虫害抵抗性、栄養素、抗生物質、または治療用分子をコードする遺伝子を、標的組換えによってそれらの発現に有利な植物ゲノムの領域内に挿入することができる。
【０１３３】
前記の形質転換技術のいずれかによって作製される形質転換した植物細胞を培養して、形質転換した遺伝子型、ゆえに所望の表現型を有する植物全体を再生することができる。そのような再生技術は、典型的に、所望のヌクレオチド配列とともに導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存している、組織培養成長培地におけるある植物ホルモンの操作に依存する。培養したプロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら，“Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１２４−１７６，Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；およびＢｉｎｄｉｎｇ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｐｐ．２１−７３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８５に記載されている。植物のカルス、外植片、器官、花粉、胚、またはその一部から再生することもできる。そのような再生技術はＫｌｅｅら，（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６に大まかに記載されている。
【０１３４】
植物細胞に導入された核酸を用いて、実質的に任意の植物に所望の特質を与えることができる。多種多様な植物および植物細胞システムを、本開示の核酸構築物および前述の種々の形質転換法を用いることによって、本明細書に記載される所望の生理学的かつ農学的特徴のために遺伝子操作することができる。好ましい実施態様では、遺伝子操作のための標的植物および植物細胞には、その単子葉および双子葉植物、例えば穀類作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウキビ、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）を含む作物；顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹、および松の木（例えば、パインファー、トウヒ）；ファイトレメディエーションに用いられる植物（例えば、重金属を蓄積する植物）；油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）、ならびに実験的目的のために用いられる植物（例えば、シロイヌナズナ）等が含まれるが、これに制限されない。したがって、開示される方法および組成物は、アスパラガス属、カラスムギ属、アブラナ属、ミカン属、スイカ属、トウガラシ属、カボチャ属、ニンジン属、ムカシヨモギ属、ダイズ属、ワタ属、オオムギ属、アキノノゲシ属、ドクムギ属、トマト属、リンゴ属、キャッサバ属、タバコ属、オオアラセイトウ（Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ）属、イネ属、ワニナシ属、インゲンマメ属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、コムギ属、ブドウ属、ササゲ属、およびトウモロコシ属由来の種を含むが、これに制限されない広範囲にわたる植物を使用する。
【０１３５】
当業者であれば、外因性配列をトランスジェニック植物に安定的に組み込み、操作可能であると確認した後に、それを生殖交配によって他の植物内に導入することができるということを理解するであろう。多くの標準的な育種技術のうちのいずれかを、交配される種に応じて用いることができる。
【０１３６】
形質転換するＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる特質について、遺伝子操作された植物物質を選択またはスクリーニングすることによって、形質転換した植物細胞、カルス、組織、または植物を同定かつ単離することができる。例えば、形質転換する遺伝子構築物によって耐性を与えられている、阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地上で遺伝子操作された植物物質を成長させることによって、選択を行うことができる。さらに、組換え核酸構築物上に存在し得る任意の可視的マーカー遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによっても、形質転換した植物および植物細胞を同定することができる。そのような選択およびスクリーニング方法論は当業者に周知である。
【０１３７】
物理学的かつ生化学的方法を用いて、挿入した遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞の形質転換体を同定することもできる。これらの方法には、：１）組換えＤＮＡインサートの構造を検出かつ決定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出かつ調査するためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅプロテクション、プライマー伸長によるもしくは逆転写酵素によるＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイムの活性を検出するための酵素アッセイであって、そのような遺伝子産物は遺伝子構築物によってコードされているアッセイ；４）遺伝子構築物の産物がタンパク質である場合、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技術、免疫沈降、または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これに制限されない。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色等のさらなる技術を用いて、特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これらすべてのアッセイを行うための方法は当業者に周知である。
【０１３８】
本明細書に開示される方法を用いた遺伝子操作の効果を、例えば、対象の組織から単離したＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットによって観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在しているまたはｍＲＮＡの量が増加している場合、対応する導入遺伝子が発現していると推測することができる。遺伝子および／またはコードされたポリペプチドの活性を測定する他の方法を用いてもよい。用いられた基質、および反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、様々な種類の酵素アッセイを用いることができる。さらに、発現させたポリペプチドの量を、免疫化学的に、すなわちＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および当業者に周知の他の抗体に基づくアッセイ、例えば電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングのいずれかを伴う）等によって測定することができる。制限されない一例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＡＡＤ−１およびＰＡＴタンパク質の検出は、参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載されている。植物のある組織においてまたはある発生段階において、導入遺伝子を選択的に発現させることができ、あるいは実質的にすべての植物組織において、実質的にその生活環全体にわたって、導入遺伝子を発現させることができる。しかしながら、任意の組み合わせ発現様式も適用可能である。
【０１３９】
本開示はまた、前記のトランスジェニック植物の種子を包含するものであって、前記種子は導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。本開示はさらに、前記のトランスジェニック植物の後代、クローン、細胞株、または細胞を包含するものであって、前記後代、クローン、細胞株、または細胞は導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。
【０１４０】
融合タンパク質（例えば、ＺＦＮ）および融合タンパク質をコードする発現ベクターを、遺伝子制御、標的切断および／または組換えのために、植物に直接投与することができる。ある実施態様では、植物は複数のパラロガス標的遺伝子を含有する。植物が複数のパラロガス遺伝子を含有し得ることは既知である。したがって、１つ以上の異なる融合タンパク質または融合タンパク質をコードする発現ベクターを植物に投与して、植物における１つ以上のＺｐ１５遺伝子を標的とすることができる。
【０１４１】
有効量の投与は、処理される植物細胞と最大限に接触して融合タンパク質を導入するために通常用いられる経路のいずれかによるものである。ＺＦＰを、任意の適切な様式で、好ましくは許容可能なキャリアとともに投与する。そのようなモジュレーターを投与する適切な方法が使用可能で当業者に周知であり、また１つより多い経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路はしばしば別の経路より即時かつ効果的な反応を提供し得る。
【０１４２】
キャリアは、用いてもよく、投与される特定の組成物によって、ならびに前記組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、使用可能である多種多様なキャリアの適切な処方が存在する。
【実施例】
【０１４３】
以下は、本開示を実施するための特定の態様の実施例である。実施例は、例示を目的として提示されるものであって、決して本開示の範囲を制限することを意図されるものではない。
【０１４４】
用いた数（例えば、量、温度、等々）に関する正確性を確保するための努力はなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は当然許容されるべきである。
【０１４５】
実施例１：Ｚｐ１５標的遺伝子座の同定および特徴付け
公的に入手可能な遺伝子地図（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．ら，（２００４）ＮＡＲ  ３２：３９３−３９７；トウモロコシのインターネットのデータベース）およびトウモロコシのドラフトゲノム配列に基づき、第６染色体の短腕上にあるＺｐ１５遺伝子座を、位置およびＺｐ１５について入手可能な情報に基づくＺＦＮを用いた改変の標的として選択した。トウモロコシ由来の１５ｋＤのβゼインをコードする遺伝子（Ｚｐ１５）のゲノム構造および配列は、公に記載されかつ注釈が付されている（Ｗｏｏら，（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３（１０）：２２９７−２３１３）。Ｚｐ１５遺伝子に対する配列は、参照することにより本明細書に組み入れられている、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ３７１２６４に記載されている。
【０１４６】
Ｚｐ１５ゲノム配列を用いて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いたＴＩＧＲおよびトウモロコシＧＤＢデータベースへのクエリーを実行した。２つのコンティグ（ＡＺＭ５＿１６７８２およびＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．８７８５．１）を含むがこれに制限されない、Ｚｐ１５との重複相同性を有するいくつかの配列、ならびにいくつかのＥＳＴ（Ｍ７２７０８、Ｍ１３５０７、Ｍ１２１４７、ＡＹ１０３６４０、およびＡＦ３７１２６４）が同定された。これらの登録の配列ならびにＺｐ１５配列に基づき、プライマー３プログラム（Ｒｏｚｅｎ，Ｓ．およびＳｋａｌｅｔｓｋｙ，Ｈ．Ｊ．（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．Ｉｎ：Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ３６５−３８６；インターネット上でも利用可能）を用いることによって、複数の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしての使用のために設計した。
【０１４７】
これらのプライマーには、以下の正方向オリゴヌクレオチド：
Ｐ６７Ｆ  ５’−ＣＧＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号：１）
Ｐ６８Ｆ  ５’−ＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号：２）
Ｐ６９Ｆ  ５’−ＣＧＴＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：３）
Ｐ７３Ｆ  ５’−ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣ−３’（配列番号：４）
Ｐ７４Ｆ  ５’−ＴＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣ−３’（配列番号：５）
が含まれるが、これに制限されない。
【０１４８】
さらに、プライマーには、以下の逆方向オリゴヌクレオチド：
Ｐ７０Ｒ  ５’−ＡＴＧＴＧＴＧＴＣＧＴＣＴＴＡＣＴＧＣ−３’（配列番号：６）
Ｐ７１Ｒ  ５’−ＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＧＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号：７）
Ｐ７２Ｒ  ５’−ＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧ−３’（配列番号：８）
Ｐ７５Ｒ  ５’−ＣＴＡＴＡＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：９）
Ｐ７６Ｒ  ５’−ＣＴＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＴＣＧ−３’（配列番号：１０）
が含まれるが、これに制限されない。
【０１４９】
すべてのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成し、そこから購入した。トウモロコシ亜種Ｈｉ−ＩＩ由来のｇＤＮＡの増幅を、３０ｎｇのｇＤＮＡを用いてＰＣＲサーマルサイクラーで行った。Ｈｉ−ＩＩ由来のＺｐ１５遺伝子に相当する２，２１５ｂｐの増幅フラグメントを単離し、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングした。このフラグメントの配列分析により、トウモロコシ亜種Ｈｉ−ＩＩ由来のＺｐ１５のゲノム構造には、２つのエクソンおよび３１ｂｐの１つの小さなイントロン（配列番号：１２６）が含有されていることが明らかになった。Ｚｐ１５標的ＺＦＮの設計は、トウモロコシ亜種Ｈｉ−ＩＩ由来のＺｐ１５遺伝子のコード領域に集中させた。
【０１５０】
実施例２：トウモロコシＺｐ１５遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼの設計
ＺＦＮに対する発現ベクターを組み立てるために、ライブラリーアーカイブから選択したまたは新たに合成したＺＦＮコード遺伝子の任意の所定の対に対して適用可能である、段階的なモジュラークローニング方式を考案した。
【０１５１】
まず、Ｄｏｙｏｎら，（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（６）：７０２および米国特許出願第１２／２８４，８８７号に記載されているような酵母アッセイ選別を用いて、Ｚｐ１５標的ＺＦＮをスクリーニングした。簡潔には、Ｚｐ１５遺伝子座全体を出芽酵母ゲノムのＨＯ遺伝子座内に導入して、標的遺伝子内の種々の結合部位におけるＺＦＮ活性を直接比較し、Ｄｏｙｏｎらに記載されているようなレポーターアッセイ（ＭＥＬ１）を用いることによって、レポーター遺伝子においてＤＳＢを誘導し得るそれらの能力についてＺＦＮをスクリーニングした。
【０１５２】
これらのプロキシシステムアッセイの結果に基づき、試験された様々なＺＦＮ対がＺｐ１５内でＤＳＢを誘導し得ることが確認された。
【０１５３】
酵母プレスクリーニングに続き、次いでＺＦＮ対をトウモロコシ特異的発現ベクター内にサブクローニングした。米国特許公報第２００８０１８２３３２号に記載されているように、トウモロコシｏｐ−２に由来する再設計かつ合成された核局在化シグナル（ＮＬＳ）のセグメント、およびトウモロコシのコドンバイアスを使用しているＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含むベクターを、固有のＸｈｏＩ部位の下流に１ヌクレオチド（Ｃ）を挿入して改変し、追加のＳａｃＩ部位を創出した。同様のベクターを、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａリボソーム断続（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）配列を含むように改変した。個々のジンクフィンガータンパク質のＯＲＦをコードする遺伝子カセットを、これらのベクターのいずれかの中にＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を用いてクローニングし、続いて前記２つのベクターをＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いて組み合わせ、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ制限酵素認識部位が隣接した２つのＺＦＮコードドメインを含むカセットを含有する中間構築物を産生した。
【０１５４】
ＮｃｏＩ／ＳａｃＩカセットをこの中間構築物から制限酵素消化によって切り出し、トウモロコシのユビキチン−１遺伝子由来のプロモーター（Ｓｈａｒｒｏｃｋら，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１８（４）：６７５）、およびトウモロコシ根の選択的カチオン性ペルオキシダーゼ遺伝子由来のターミネーター配列（米国特許第７，１７９，９０２号）を含有する、プラスミド骨格のｐＤＡＢ３８７２内にライゲーションした。
【０１５５】
結果として生じたプラスミドには、ＺＦＮ遺伝子、さらにプラスミド維持のための関連する選択可能なマーカー、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製のＧＡＴＥＷＡＹ（商標）システムを用いた便利な操作のための隣接ａｔｔＬ部位が含まれる。このクローニング方式を用いて作製されたＺＦＮ構築物のそれぞれを、大腸菌ＤＨ５α細胞内に形質転換し、その後適切な選択の下で維持した。
【０１５６】
表１は、Ｚｐ１５遺伝子座内への標的組込み実験に用いた例示的なＺｐ１５を標的とするＺＦＮを示す。ＺＦＮに対するＤＮＡ標的配列を２列目に示し（ＤＮＡ標的部位を大文字で表示；接触しないヌクレオチドを小文字で表示）、３〜６列目は、前記タンパク質におけるジンクフィンガーのそれぞれ（Ｆ１〜Ｆ４）の認識領域のアミノ酸配列（ヘリックスの開始に対してアミノ酸−１〜＋６）を示す。また、表１の１列目にはそれぞれのタンパク質に対する識別番号を提示する。
【表１】
2015226537.tif 000003
【表２】
2015226537.tif 000004
【０１５７】
ＺＦＮをＣ２Ｈ２またはＣ３Ｈ骨格内に容易に挿入できること、および種々の配列を用いてジンクフィンガータンパク質と切断ドメインを接合することができることは明白であろう。米国特許公報第２００８０１８２３３２号、特にそのような配列に関する表６を参照されたく、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。
【０１５８】
実施例３：トウモロコシ細胞におけるＺＦＮを介したＺｐ１５の破壊
ＺＦＮ対によるＤＳＢの誘導を試験した。内在性Ｚｐ１５遺伝子の意図される標的部位においてＤＳＢを効率的に誘導し得るＺＦＮ対を同定した。ＺＦＮ誘導性断裂の部位において小さなＤＮＡ欠失／挿入をもたらすことが既知である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるＤＳＢ修復のエラーを起こしやすい性質を利用して、内在性Ｚｐ１５遺伝子標的部位に効率的に結合かつ切断するＺＦＮ対を選択した。
【０１５９】
ＺＦＮを培養トウモロコシ細胞で一過性に発現させ、予測される切断部位における標的遺伝子座の配列分析を行った。例えば、ＺＦＮ対＃２５（前記で示した１１７６８／１１７６６認識ヘリックス）をコードするプラスミドｐＤＡＢ７４６８を、参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１２／００１，９３９号に記載されているような、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介した形質転換によってトウモロコシＨｉ−ＩＩ細胞培養物内へ送達した。一過性の発現の２４時間または７２時間後のいずれかに、結果として生じた破壊されたＺＦＮ標的配列を、単離したゲノムＤＮＡから増幅し、プラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングした。ｇＤＮＡを酵素Ｂｓｕ３６Ｉを用いた制限酵素消化にかけ、その後にＺｐ１５標的配列の増幅およびＰＣＲ産物のプラスミドベクターｐＣＲ２．１内へのクローニングが続いた。クローン化された増幅産物の個々のコロニーを、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって分析し、その後にアガロースゲル電気泳動が続いた（制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉによる切断に対して耐性を示したクローン化された増幅産物は、ＺＦＮ切断部位に関連した制限酵素認識部位を破壊する変異を含有していると考えられた）。
【０１６０】
１９２クローンの直接配列分析によって、６ｂｐの挿入が明らかになった（図１）。別の実施例では、ＺＦＮ対＃２４（前記で示した１１７５３／１１７５０認識ヘリックス）をコードするプラスミドｐＤＡＢ７４６７を、トウモロコシ培養細胞物内に直接送達し、一過性の発現の２４時間または７２時間後のいずれかに、ＺＦＮ標的配列を増幅し、プラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングした。１９２クローンの直接配列分析によって、正確な切断部位における３ｂｐの欠失が明らかになった（図２）。ここに記載される挿入および欠失は、標的部位において誘導されたＤＳＢのＮＨＥＪ修復の結果であり、かつＺＦＮ２４および２５がトウモロコシ細胞内の内在性Ｚｐ１５遺伝子座において切断活性を有することを示す。
【０１６１】
ＺＦＮ２５または２８を用いて同じ手法を行ったが、コロニーを制限酵素消化によってスクリーニングする代わりに、１９２の独立したクローンを直接シークエンシングした。６ｂｐの挿入が検出された（図２、上）
【０１６２】
まとめると、これらのデータは、ＺＦＮへの一過性の暴露は培養トウモロコシ細胞内のＺｐ１５遺伝子座において標的ＤＳＢを誘導するのに十分であることを証明している。
【０１６３】
実施例４：Ｚｐ１５遺伝子座内への標的組込み
Ｚｐ１５における切断活性を有する設計されたＺＦＮが、外因性配列の組込みを促進し得るかどうかを試験するために、本発明者らは、例示的な外因性の除草剤耐性遺伝子であるスフィンゴモナス・ヘルビシドボランス由来のＡＡＤ−１（ＡＴＣＣ７００２９１）をコードする自律的遺伝子カセットを保持するドナーＤＮＡ分子を構築した。ＡＡＤ−１は、アリールオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ酵素をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤に対する耐性を与える（国際特許ＷＯ２００５／１０７４３７，ＷＯ２００８１４１１５４Ａ２）。当業者であれば、関連したＡＤＤ−１２遺伝子等の他の除草剤耐性遺伝子を含むが、これに制限されない他の外因性核酸を、ドナーＤＮＡ分子内に同様に組み入れることができるということを理解するであろう。この除草剤耐性遺伝子ドナーにおいて、プロモーター配列はＯ．サティバのアクチンに由来しており（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ４４２２１およびＸ６３８３０）、かつターミネーター配列はＺ．メイスのＬ．リパーゼに由来している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ３５９１３）。
【０１６４】
Ａ．ドナーＤＮＡ分子の構築
Ｚｐ１５に相同な領域を含有するドナー構築物を以下のように作製した。Ｚｐ１５遺伝子に対して相同な隣接部を含有するプラスミド骨格を、Ｚｐ１５遺伝子の対応する標的部位内への任意のドナーＤＮＡ配列の組込みが可能になるように遺伝子操作した。ここに例示したプラスミド骨格は、基本プラスミドベクターｐＢＣ  ＳＫ（−）ファージミド（３．４ｋｂｐ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に由来したものであった。この手法には４つの工程があった。
【０１６５】
第一に、３μｇのｐＢＣ  ＳＫ（−）をＳｐｅＩおよびＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化することによって、基本プラスミドを調製した。３．３ｋｂｐのＳｐｅＩ／ＳａｌＩ消化したサブクローニングベクターのｐＢＣ  ＳＫ（−）をゲルから切り出し、ＱＩＡＱＵＩＣＫゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。
【０１６６】
第二に、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
Ｚｐ１５ＨＲドナーＮｏｔＩ（２０５）Ｆ：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号：９７）
Ｚｐ１５ＨＲドナーＭｆｅＩ（１０２５）Ｒ：５’−ＣＡＡＴＴＧＣＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号：９８）
Ｚｐ１５ＨＲドナーＭｆｅＩ（１０２５）Ｆ：５’−ＣＡＡＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：９９）
Ｚｐ１５ＨＲドナーＳａｌＩ（２２７０）Ｒ：５’−ＧＴＣＧＡＣＣＧＡＴＡＣＴＧＡＴＧＣＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣ−３’（配列番号：１００）
を用いて、Ｚｐ１５から５’および３’相同隣接部を単離した。
【０１６７】
ＰＣＲ増幅反応を、ＬＡ  ＴＡＱ  ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）に備わった試薬を用いて行った。ＰＣＲ反応カクテルは、５μＬの１０×ＬＡ  ＰＣＲ（商標）バッファーＩＩ（Ｍｇ２+）、２０ｎｇの二本鎖テンプレート（Ｈｉ−ＩＩトウモロコシゲノムＤＮＡ）、１０ｐｍｏｌの正方向オリゴヌクレオチドプライマー、１０ｐｍｏｌの逆方向オリゴヌクレオチドプライマー、８μＬのｄＮＴＰミックス（２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ）、３３．５μＬのＨ2Ｏ、０．５μＬ（２．５単位）のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１滴のミネラルオイルからなるものであった。プライマーＺｐ１５ＨＲドナーＮｏｔＩ（２０５）ＦおよびＺｐ１５ＨＲドナーＭｆｅＩ（１０２５）Ｒを一反応に用い、プライマーＺｐ１５ＨＲドナーＭｆｅＩ（１０２５）ＦおよびＺｐ１５ＨＲドナーＳａｌＩ（２２７０）Ｒを第二の反応に用いた。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，４８サンプルＤＮＡサーマルサイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて、以下のサイクル条件：９４℃，４分間／１サイクル；９８℃  ２０秒間，６５℃  １分間，６８℃  １分間／３０サイクル；７２℃，５分間／１サイクル；４℃／ホールドの下でＰＣＲ反応を行った。１５μｌの各ＰＣＲ反応物を電気泳動し、増幅されたフラグメントを紫外線で可視化し、フラグメントの大きさを１ｋｂｐのＤＮＡラダーと比較することによって概算した。期待されるプラスミドクローンを、５’フラグメントについては８２５ｂｐ、または３’フラグメントについては１，２５０ｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断した。これらのフラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。次いで、精製したフラグメントをＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（登録商標）キットを用いてｐＣＲ２．１プラスミド内にクローニングし、化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショット（登録商標）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にメーカーのプロトコールに従って形質転換した。
【０１６８】
８２５ｂｐの５’フラグメントまたは１，２５０ｂｐの３’フラグメントを含有する個々のコロニーを、制限酵素消化およびシークエンシングデータによって同定かつ確認した。８２５ｂｐの５’フラグメントを含有するコロニーは、ＭｆｅＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の制限酵素消化によって確認された。１，２５０ｂｐの３’フラグメントを含有するコロニーは、ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いた制限酵素消化によって同定かつ確認された。期待されるプラスミドクローンを、３．９ｋｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて、８２５ｂｐ（５’フラグメント）または１，２５０ｂｐ（３’フラグメント）の挿入されたＤＮＡフラグメントの存在によって診断した。プラスミドクローンの二本鎖シークエンシング反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−クイックスタートキット（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、メーカーによって記載されるとおりに行った。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＤＴＲゲル濾過カートリッジ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、メーカーのプロトコールに記載されるとおりに精製した。シークエンシング反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＥＱ（商標）２０００  ＸＬ  ＤＮＡ分析システム上で分析し、ヌクレオチドの特徴付けをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ社，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて行った。Ｚｐ１５由来の５’および３’相同フラグメントの配列を、配列番号１２７および配列番号：１２８に示す。
【０１６９】
第三に、３’相同隣接部を、以下のように基本プラスミド内にライゲーションした。正確な３’相同隣接部配列を含有するクローンを制限酵素で消化し、ＤＮＡフラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。これらのフラグメントを、あらかじめＳｐｅＩ／ＳａｌＩ（前記参照）で消化された精製した基本プラスミド内に、１６℃のウォータバス中で１６時間のインキュベーションの条件下、２０μＬの反応容量中に５００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、１：５のベクター：インサートの割合でライゲーションした。その後、５μＬのライゲーション反応物をワンショット（登録商標）Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に形質転換し、抗生物質選択を含有する培地上にプレーティングした。推定コロニーを単離し、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化して、ライゲーションされた３’フラグメントを含有するクローンを同定した。
【０１７０】
第四に、５’相同隣接部を、３’相同隣接部を含有するプラスミド内にライゲーションした。前記の第三の工程で記載した３’相同隣接部を含有するプラスミドを、ＭｆｅＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限エンドヌクレアーゼで３７℃にて１時間消化した。３’相同隣接部を含有するＮｏｔＩ／ＭｆｅＩ消化されたプラスミドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。
【０１７１】
ＭｆｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いた制限酵素消化によって生成された５’相同隣接部ドナーの単離したフラグメントを作製し、１：５のベクター：インサートの割合および５００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた２０μＬのライゲーション反応液中で、３’相同隣接部を含有するプラスミドとライゲーションした。ライゲーション反応液を１６℃のウォータバス中で１６時間インキュベーションした。
【０１７２】
ライゲーションの後、５μＬのライゲーション反応物を、ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にメーカーの推奨どおりに形質転換した。個々のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、かつＮｏｔＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化して、５’相同隣接部ドナーの組み込まれたフラグメントを含有するプラスミドを同定した。結果として生じたプラスミドをｐＤＡＢ７４８９と命名した（図３）。
【０１７３】
プロモーターを含有する植物転写単位（ＰＴＵ）、除草剤耐性遺伝子、およびポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む除草剤耐性遺伝子発現カセットを構築した。前記プロモーター配列は、Ｏ．サティバのアクチンに由来する（ＭｃＥｌｒｏｙら，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，１６３−１７１；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ４４２２１およびＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ６３８３０）。前記除草剤耐性遺伝子は、アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤に対する耐性を与える（ＷＯ２００５／１０７４３７）、ＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ）遺伝子を含んでいた。利用した遺伝子のバージョンは、植物における発現に対してコドン最適化配列を含むバージョン＃３であった。ターミネーター配列は、Ｚ．メイスのＬ．リパーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ３５９１３のトウモロコシリパーゼｃＤＮＡクローン）に由来する。このトウモロコシ配列は、ＡＡＤ−１遺伝子に対する３’非翻訳領域／転写ターミネーター領域を含む。前記除草剤耐性遺伝子発現カセットを図４に示す。
【０１７４】
このカセットを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
ＯｓＡｃｔＡａｄ１ｖ．３ＺｍＬｉｐＭｆｅＩＦ  ５’−ＣＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：１０１）
ＯｓＡｃｔＡａｄ１ｖ．３ＺｍＬｉｐＭｆｅＩＲ  ５’−ＣＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号：１０２）
をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって標準的脱塩の条件下で合成し、０．１２５μｇ／μＬの濃度まで水で希釈した。
【０１７５】
ＰＣＲ増幅反応を、ＬＡ  ＴＡＱ  ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。ＰＣＲ反応カクテルは、５μＬの１０×ＬＡ  ＰＣＲ（商標）バッファーＩＩ（Ｍｇ２+）、２０ｎｇの二本鎖テンプレート（ｐＤＡＢ３８７８プラスミドＤＮＡ）、１０ｐｍｏｌの正方向オリゴヌクレオチドプライマー、１０ｐｍｏｌの逆方向オリゴヌクレオチドプライマー、８μＬのｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭ）、３３．５μＬのＨ2Ｏ、０．５μＬ（２．５単位）のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、１滴のミネラルオイルを含んでいた。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，４８サンプルＤＮＡサーマルサイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて、以下のサイクル条件：９４℃，４分間／１サイクル；９８℃  ２０秒間，５５℃  １分間，６８℃  ３分間／３０サイクル；７２℃，５分間／１サイクル；４℃／ホールドの下でＰＣＲ反応を行った。１５μｌの各ＰＣＲ反応物を、０．５％エチジウムブロマイドを補充した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中で１時間１００Ｖで電気泳動した。増幅されたフラグメントを紫外線で可視化し、フラグメントの大きさを１ｋｂｐのＤＮＡラダーと比較することによって概算した。
【０１７６】
期待されるＰＣＲ産物を、２．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメント（ＡＡＤ−１  ＰＴＵ）の存在によって診断した。これらのフラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。次いで、精製したフラグメントを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（登録商標）キット（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターを備えた）および化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショット（登録商標）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｐＣＲ２．１プラスミド内にクローニングした。
【０１７７】
個々のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、かつ制限酵素ＭｆｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化した。期待されるプラスミドクローンを、３．９ｋｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて、２，６７４ｂｐ（ＡＡＤ−１  ＰＴＵ）の挿入されたＤＮＡフラグメントの存在によって診断した。プラスミドクローンの二本鎖シークエンシング反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−クイックスタートキット（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、メーカーによって記載されるとおりに行った。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＤＴＲゲル濾過カートリッジ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、メーカーのプロトコールに記載されるとおりに精製した。シークエンシング反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＥＱ（商標）２０００  ＸＬ  ＤＮＡ分析システム上で分析し、ヌクレオチドの特徴付けをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ社，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて行った。
【０１７８】
正確な２，６７４ｂｐの配列を含有するクローン由来の制限酵素消化されたフラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。次いで、このフラグメントを、制限酵素ＭｆｅＩで消化され、かつその後脱リン酸化されている、精製したｐＤＡＢ７４８９（プラスミド骨格）とライゲーション反応でつなぎ合わせた。以下の条件下：１：５のベクター：インサートの割合、および１６℃のウォータバス中で１６時間のインキュベーションの条件下、２０μＬの反応容量中に５００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でライゲーションを行った。その後、５μＬのライゲーション反応物を、５０μｌの大腸菌ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内に形質転換し、メーカーによって記載される選択条件下でプレーティングした。
【０１７９】
個々のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、かつ制限酵素ＭｆｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化した。期待されるプラスミドクローンは、ＤＮＡフラグメント２，６７４ｂｐ（ＡＡＤ−１  ＰＴＵ）および５，４１３ｂｐ（ｐＤＡＢ７４８９ベクター）を含有していた。結果として生じたプラスミドをｐＤＡＢ７４９０と命名した（図５）。
【０１８０】
トウモロコシ亜種Ｈｉ−ＩＩの胚発生細胞培養物（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，（１９９１）Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｏｏｐ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ６５：９２−９３）を作製し、維持し、かつＺＦＮ２４およびドナー分子ｐＤＡＢ７４９０をコードするプラスミドの同時形質転換にかけた。カルス組織の形質転換および選択、ならびにその後の形質転換体の再生は、米国特許出願第１２／００１，９３９号に記載されており、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。形質転換および選択のプロトコールに関するさらなるガイダンスのために、Ｐｅｔｏｌｉｎｏら，（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．１９：７８１−７８６を参照されたい。開花後、植物を自己授粉またはトウモロコシ亜種ＤＡＳ５ＸＨ７５１と異種交配させた。結果として生じた後代種子を収穫し、乾燥させた。無傷の、稔性のトウモロコシ植物へのカルスの再生は、米国特許出願第１２／００１，９３９号、特に実施例２２に記載されており、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。
【０１８１】
Ｂ．Ｚｐ１５遺伝子座内へのＡＡＤ−１遺伝子カセットの標的組込み
除草剤耐性遺伝子カセットをコードする組み込まれたドナーＤＮＡ分子を含有する除草剤耐性事象のうち、前記事象のある割合は、ＺＦＮ誘導性二本鎖断裂の部位へのドナーＤＮＡの標的組込みの産物であると予想されている。これらの標的組込み事象を除草剤耐性遺伝子カセットのランダムな組込みに由来するものと区別するために、ゲノム特異的およびそれに続くゲノム特異的、さらにドナー特異的ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲに基づく遺伝子型同定ストラテジーを利用した。
【０１８２】
すべての除草剤耐性形質転換事象におけるＡＡＤ−１導入遺伝子の標的組込み対ランダムな組込みについての示差的遺伝子型同定を、Ｚｐ１５遺伝子座およびＡＡＤ−１遺伝子に特異的なＰＣＲに基づくアッセイを用いて行った。ここに提示される実施例では、すべてのオリゴヌクレオチドプライマーを、標準的脱塩の条件下でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成し、１００μＭの濃度まで水で希釈した。以下の正方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーのセット；
ＨＢ５０１ｆ：５’−ＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＣＡＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴ−３’（配列番号：１０３）
ＨＢ５０２ｒ：５’−ＧＡＧＧＴＣＣＴＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＴＣＧＧＣＡＧ−３’（配列番号：１０４）
を、ドナーＤＮＡ配列の境界の外側に位置するＺｐ１５遺伝子標的に特異的なｇＤＮＡにアニールするように設計した。
【０１８３】
正方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーの第二のセット：
ＨＢ５０３ｆ：５’−ＧＧＣＡＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡ−３’（配列番号：１０５）
ＨＢ５０４ｒ：５’−ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：１０６）
も、ドナーＤＮＡ配列の境界の外側のＺｐ１５遺伝子標的に特異的なｇＤＮＡにアニールするように設計し、しかしながら第一の対の中に入れ子にした。
【０１８４】
正方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを、ＡＡＤ−１除草剤耐性遺伝子のコード領域に対応するドナーＤＮＡに特異的にアニールするようにさらに設計した。
ＨＢ５０５ｆ：５’−ＡＧＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡ−３’（配列番号：１０７）
ＨＢ５０６ｆ：５’−ＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴ−３’（配列番号：１０８）
ＨＢ５０７ｒ：５’−ＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＡＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴ−３’（配列番号：１０９）
ＨＢ５０８ｒ：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＴ−３’（配列番号：１１０）
【０１８５】
２つの別個なプライマリー増幅反応を、Ｚｐ１５ゲノム領域で結合するプライマーおよびドナー分子を利用して行い、ゲノムとドナーとの間の組込みの境界にまたがるアンプリコンを生じた。第一の反応は、ゲノムとドナーとの間の５’境界に焦点を合わせ、プライマーセットＨＢ５０１ｆおよびＨＢ５０７ｒを用いた。第二の反応は、ドナーとゲノムとの間の３’境界に焦点を合わせ、プライマーセットＨＢ５０５ｆおよびＨＢ５０２ｒを用いた。形質転換したトウモロコシＨｉ−ＩＩ事象からゲノムＤＮＡを単離した。プライマリーＰＣＲ増幅反応を、ＬＡ  ＴＡＱ  ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）によって提供されている試薬を用いて行った。ＰＣＲ反応カクテルは、２．５μｌの１０×Ｌａ  Ｔａｑ  ＰＣＲ（商標）バッファー、４０〜２００ｎｇの二本鎖ゲノムＤＮＡテンプレート、１０μＭの正方向オリゴヌクレオチドプライマー、１０μＭの逆方向オリゴヌクレオチドプライマー、２μｌのｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭ）、１６．２５μｌのＨ2Ｏ、０．２５μｌ（１．２５単位）のＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼからなるものであった。Ｂｉｏ−Ｒａｄ，９６サンプルＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、以下のサイクル条件：９４℃，２分間／１サイクル；９４℃  ３０秒間，６２℃  ３０秒間，６８℃  ５分間／３０サイクル；４℃／ホールドの下でＰＣＲ反応を行った。
【０１８６】
続いて、プライマリーＰＣＲの反応産物を水で１：１００に希釈し、２つの別個なセカンドＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡとして用いた。セカンド反応も、Ｚｐ１５ゲノム領域で結合するプライマーおよびドナー分子を利用し、ゲノムとドナーとの間の組込みの境界にまたがるアンプリコンを生じる。特異的プライマーの同一性によって、増幅がゲノムとドナーとの間の５’または３’境界のいずれかに焦点を合わせるかが決定される。第一の反応は、ゲノムとドナーとの間の５’境界に焦点を合わせ、プライマーセットＨＢ５０３ｆおよびＨＢ５０８ｒを用いた。第二の反応は、ドナーとゲノムとの間の３’境界に焦点を合わせ、プライマーセットＨＢ５０６ｆおよびＨＢ５０４ｒを用いた。両方の反応は、以下の：２．５μｌの１０×Ｌａ  Ｔａｑ  ＰＣＲ（商標）バッファー、１μｌのテンプレート［１oＰＣＲ反応の１：５０希釈］、１０μＭの正方向オリゴヌクレオチドプライマー、１０μＭの逆方向オリゴヌクレオチドプライマー、２μｌのｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭ）、１６．２５μｌのＨ2Ｏ、０．２５μｌ（１．２５単位）のＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼからなるものであった。Ｂｉｏ−Ｒａｄ，９６サンプルＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、以下のサイクル条件：９４℃，２分間／１サイクル；９４℃  ３０秒間，６２℃  ３０秒間，６８℃  ５分間／３０サイクル；４℃／ホールドの下でＰＣＲ反応を行った。５’境界に対する２，１８０ｂｐまたは３’境界に対する２，９８０ｂｐの期待されるＰＣＲアンプリコンフラグメントが観察された。
【０１８７】
これらのフラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。続いて、精製したフラグメントを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（登録商標）キット（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターを備えた）および化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショット（登録商標）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｐＣＲ２．１プラスミド内にクローニングした。
【０１８８】
個々のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、かつ制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化した。期待されるプラスミドクローンを、３．９ｋｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて、適切な大きさの挿入されたＤＮＡフラグメントの存在によって診断した。
【０１８９】
プラスミドクローンの二本鎖シークエンシング反応を行い、ヌクレオチドの特徴付けおよびアラインメントをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ社，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて行った。
【０１９０】
Ｚｐ１５標的遺伝子内に挿入されたＡＡＤ−１ドナー遺伝子カセットの標的組込み事象（事象＃１４７）から得られた、選択した配列データを図６のアラインメントに示す。
【０１９１】
ゲノムとドナーとの間の５’または３’境界のいずれかに焦点を合わせたプライマリーＰＣＲ増幅産物を、同様にゲノムとドナーとの間の５’または３’境界のいずれかに焦点を合わせたセカンド増幅にかけた。これらのセカンド増幅産物に対応するクローン化フラグメントと、野生型Ｚｐ１５ゲノム配列、ならびに標的組込み事象の期待される配列とのアラインメントは、標的部位においてドナーＤＮＡの正確な組込みが起こったことをはっきりと示している。Ｚｐ１５ゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列、ゲノム／ドナーの境界、Ｚｐ１５相同隣接部に対応するドナー領域のヌクレオチド配列、および除草剤耐性カセットのヌクレオチド配列は、この事象に由来する複数のクローン化ＰＣＲ産物においてすべて保存されていた。したがって、この事象は、ＺＦＮを介した二本鎖断裂の相同性駆動による修復、および特定の遺伝子標的におけるドナーＤＮＡの標的組込みが起きているゲノムを表す。図６において、本発明者らは１つの代表的な単離した形質転換トウモロコシカルスから得られた配列アラインメントデータを示す（事象＃１４７）。
【０１９２】
固有の標的組込みの発生を表すさらなる形質転換事象が得られており、本明細書で教示された方法がトウモロコシカルスにおいて再現可能であることを証明している。
【０１９３】
実施例５：Ｚｐ１５遺伝子座内へのＰＡＴの標的組込み
本明細書に開示される標的遺伝子座内への選択された外因性ポリヌクレオチドの標的組込みのための方法のさらなる例示として、ＰＡＴをコードする自律的遺伝子カセットを保持するさらなるＤＮＡドナー分子を設計かつ構築し、内在性Ｚｐ１５標的遺伝子座内への外因性ドナー配列の組込みを試験した。この遺伝子座でＤＳＢを引き起こすために、内在性Ｚｐ１５遺伝子標的の特異的切断活性を有するＺＦＮを配置した。続いて、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のＰＡＴをコードする自律的遺伝子カセットを保持するドナーＤＮＡ分子およびＺｐ１５に相同な隣接配列を、Ｚｐ１５標的のＺＦＮ誘導性ＤＳＢ内に組み込んだ。ＰＡＴは、ホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ酵素をコードし、アセチル化によって除草活性化合物ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する耐性を与える（米国特許第５，６３３，４３４号）。ホスフィノトリシンは、除草剤のリバティ、バスタ、およびイグナイトの活性成分である。ＰＡＴコード配列を植物転写単位（ＰＴＵ）として構築し、Ｏ．サティバのアクチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ４４２２１およびＸ６３８３０）に由来するプロモーター配列、およびＺ．メイスのＬ．リパーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ３５９１３）に由来するターミネーター配列を含有させた。
【０１９４】
Ａ．ドナーＤＮＡ分子の構築
Ｚｐ１５に相同な領域を含有するＺｐ１５ドナー構築物を、以下のように合成して作製した。ｐＤＡＢ７４８９由来のヌクレオチド４５９５−５３４６（５’相同配列；配列番号：１１１）およびヌクレオチド２１−７９６（３’相同配列；配列番号１１２）を含むＺｐ１５相同領域を設計した。この相同領域は、５’および３’相同エレメントの間にＭｆｅＩクローニング部位、ならびに５’および３’末端にＮｏｔＩ制限酵素認識部位を含んでいた。このＤＮＡ配列（配列番号：１１３）を合成し、カナマイシン耐性ＣｏｌＥ１型プラスミドであるｐＭＫ内のＳａｃＩおよびＫｐｎＩクローニング部位（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ  Ａｇ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に挿入した。結果として生じたドナープラスミドはｐＤＡＢ１０４１０１と称され（図７）、Ｚｐ１５遺伝子の対応する標的部位内への対象の任意のＤＮＡ配列の組込みを可能にする、Ｚｐ１５遺伝子に対する相同隣接部を含有している。
【０１９５】
プロモーター、除草剤耐性遺伝子、およびポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含有する完全なＰＴＵを含む除草剤耐性遺伝子発現カセットを構築した。前記プロモーター配列は、Ｏ．サティバのアクチンに由来する（ＭｃＥｌｒｏｙら，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）。ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ４４２２１およびＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ６３８３０。前記除草剤耐性遺伝子はＰＡＴであった。前記終結配列は、Ｚ．メイスのＬ．リパーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ３５９１３のトウモロコシリパーゼｃＤＮＡクローン）に由来する。このトウモロコシ配列は、ＰＡＴ遺伝子に対する３’非翻訳領域／転写ターミネーター領域を含む。ＰＡＴ除草剤耐性遺伝子発現カセットを図８に示す。
【０１９６】
ＰＡＴ遺伝子カセットを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成されたプライマー：
ＤＣ００１  ５’−ＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号：１１４）
ＤＣ００２  ５’  −ＣＣＡＧＴＧＣＡＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧ−３’（配列番号：１１５）
を用いたＰＣＲによって、プラスミドｐＤＡＢ１０２２５６から増幅した。
【０１９７】
ＰＣＲ増幅反応を、ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、以下のサイクル条件：９８℃，３０秒間／１サイクル；９８℃  １０秒間，６０℃  ２０秒間，７２℃  ４５秒間／９サイクル；９８℃，１０秒間，７２℃  ６０秒間／２４サイクル；７２℃，１０分間／１サイクル；４℃／ホールドの下で行った。ＰＣＲ反応物を、１．０％ＴＡＥアガロースゲル中での電気泳動によって分析した。
【０１９８】
期待されるＰＣＲ産物を、２．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメント（ＰＡＴ  ＰＴＵ）の存在によって診断した。このフラグメントを切り出し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従ってゲルから精製した。次いで、精製したフラグメントを、ゼロブラントＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキットおよび化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショット（登録商標）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。
【０１９９】
個々のコロニーを選び、プラスミドＤＮＡを単離し、かつプラスミドＤＮＡ制限酵素消化および配列分析にかけた。クローン化したＰＡＴインサートをシークエンシングして、クローン化したＰＣＲ産物（配列番号：１１６）の同一性および配列忠実性を証明した。１つのそのようなプラスミドクローンをｐＤＡＢ１０４１０７と称し（図９）、続いて新しいＺｐ１５相同ドナーベクター内への挿入のためのＰＡＴ遺伝子カセットの供給源として用いた。
【０２００】
２．３ｋｂｐのＰＡＴ遺伝子フラグメントを、ＭｆｅＩを用いた消化によってｐＤＡＢ１０４１０７から回収し、その後にゲル電気泳動、切り出し、および精製が続いた。Ｚｐ１５相同ドナープラスミドｐＤＡＢ１０４１０１もＭｆｅＩで消化し、ゲルから精製した。ｐＤＡＢ１０４１０１内へのＰＡＴ遺伝子フラグメントのライゲーションによって、ＰＡＴ遺伝子が、示差的制限酵素消化によって決定される、Ｚｐ１５遺伝子配列に対する２つの方向のいずれかにあるＭｆｅＩ部位に挿入されているクローンが産生された。ｐＤＡＢ１０４１０４（図１０）は、Ｚｐ１５遺伝子と同じ転写方向に挿入されたＰＡＴ遺伝子を含んでいた。ｐＤＡＢ１０４１０５（図１１）は、Ｚｐ１５遺伝子に対して反対方向に挿入されたＰＡＴ遺伝子を含んでいた。
【０２０１】
Ｂ．さらなるドナーＤＮＡ分子の構築
ｐＤＡＢ７４８９内のＺｐ１５  ３’相同配列を切り取ることによって改変し、一方でｐＤＡＢ７４８９内のＺｐ１５  ５’相同配列は同じ状態のままである、Ｚｐ１５に相同な領域を含有する別のドナー構築物を作製した。切り取った３’相同領域を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成されたプライマー：
ＤＣ００３  ５’−ＣＴＡＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＴＴＡＡＡＴ−３’（配列番号：１１７）
ＤＣ００４  ５’  −ＣＴＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＣＧ−３’（配列番号：１１８）
を用いてＰＣＲによってｐＤＡＢ７４８９から作製した。
【０２０２】
ＰＣＲ増幅反応を、ＰＨＵＳＩＯＮホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、以下のサイクル条件：９８℃，３０秒間／１サイクル；９８℃  １０秒間，７２℃  １５秒間／３３サイクル；７２℃，５分間／１サイクル；４℃／ホールドの下で行った。ＰＣＲ反応物を、１．０％ＴＡＥアガロースゲル中での電気泳動にかけた。
【０２０３】
期待されるＰＣＲ産物を、０．８ｋｂｐのＤＮＡフラグメント（Ｚｐ１５  ３’相同）の存在によって診断した。このフラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてメーカーの指示書に従って精製した。次いで、精製したフラグメントを、ゼロブラントＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキットおよび化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショット（登録商標）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。
【０２０４】
個々のコロニーを選び、プラスミドＤＮＡの単離および制限酵素消化による確認にかけた。Ｚｐ１５  ３’相同インサートをシークエンシングして、クローン化したＰＣＲ産物（配列番号：１１９）の同一性および配列忠実性を証明した。１つのそのようなプラスミドクローンをｐＤＡＢ１０４１０６と称し（図１２）、続いてｐＤＡＢ７４８９内への置換のための新しいＺｐ１５  ３’相同配列の供給源として用いて、新しいＺｐ１５相同ドナーベクターを作出した。
【０２０５】
ｐＤＡＢ７４８９をＭｆｅＩおよびＳａｌＩで連続して消化し、４．２ｋｂｐのベクターフラグメントをゲルから精製した。ｐＤＡＢ１０４１０６もＭｆｅＩおよびＳａｌＩで消化し、切り取られたＺｐ１５  ３’相同配列を含む０．８ｋｂｐのフラグメントをゲルから精製した。これらのゲルから精製したフラグメントのライゲーションおよび形質転換によって、切り取ったＺｐ１５  ３’相同配列でオリジナルのＺｐ１５  ３’相同配列５が置換されたクローンが産生された。このプラスミドをｐＤＡＢ１０４１００と称し（図１３）、ＰＡＴ遺伝子のレシピエントとして用いた。
【０２０６】
ＰＡＴ遺伝子を、ＭｆｅＩを用いた消化によってｐＤＡＢ１０４１０７から取り出した。ゲル電気泳動の後、２．３ｋｂｐのＰＡＴ遺伝子フラグメントをゲルから精製した。Ｚｐ１５相同ドナープラスミドｐＤＡＢ１０４１００もＭｆｅＩで消化し、ゲルから精製した。ｐＤＡＢ１０４１００内へのＰＡＴ遺伝子のライゲーションによって、ＰＡＴ遺伝子が、示差的制限酵素消化によって決定される、Ｚｐ１５遺伝子に対する２つの方向のいずれかにあるＭｆｅＩ部位に挿入されているクローンが産生された。ｐＤＡＢ１０４１０３（図１４）は、Ｚｐ１５遺伝子と同じ転写方向に挿入されたＰＡＴ遺伝子を含んでいた。ｐＤＡＢ１０４１０２（図１５）は、Ｚｐ１５遺伝子に対して反対方向に挿入されたＰＡＴ遺伝子を含んでいた。
【０２０７】
Ｃ．トウモロコシの形質転換およびＺｐ１５標的ＰＡＴ挿入の回収
トウモロコシ亜種Ｈｉ−ＩＩの胚発生細胞培養物（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，（１９９１）Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｏｏｐ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ６５：９２−９３）を作製し、維持し、かつＺＦＮ２４およびドナー分子をコードするプラスミドの同時形質転換にかけた。ドナー分子には、ここに記載されるもの；ｐＤＡＢ１０４１０２、ｐＤＡＢ１０４１０３、ｐＤＡＢ１０４１０４、およびｐＤＡＢ１０４１０５が含まれる。カルス組織の形質転換および選択、ならびにその後の形質転換体の再生は、米国特許出願第１２／００１，９３９号、特に実施例１９に記載されており、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。形質転換および選択のプロトコールに関するさらなるガイダンスのために、Ｐｅｔｏｌｉｎｏら，（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．１９：７８１−７８６を参照されたい。開花後、植物を自己授粉またはＤＡＳ５ＸＨ７５１等のトウモロコシ亜種と異種交配させることができる。結果として生じた後代種子を収穫かつ乾燥させることができ、これらの種子由来の植物を分析して、標的組込み事象の遺伝性を証明することができる。無傷の、稔性のトウモロコシ植物へのカルスの再生は、米国特許出願第１２／００１，９３９号、特に実施例２２に記載されており、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。
【０２０８】
Ｄ．Ｚｐ１５を標的としたＰＡＴ挿入の同定
形質転換したカルス組織におけるＺｐ１５を標的としたＰＡＴ挿入を、ＰＣＲによって検出する。テンプレートゲノムＤＮＡを、周知かつ植物ＤＮＥＡＳＹキット（ＱＩＡＧＥＮ社，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）等のよく用いられる方法、またはＤｅｌｌａｐｏｒｔａ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら，（１９８３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１；１９−２１）の方法によって、カルス組織から抽出する。Ｚｐ１５遺伝子座内へのＡＡＤ−１標的組込みを検出するためにすでに用いられているＰＡＴ特異的プライマーとＺｐ１５隣接配列プライマーとの併用によって、５’および３’Ｚｐ１５相同領域におけるＰＡＴ標的挿入接合部の増幅がもたらされる。前記ＰＡＴ特異的プライマーは、：
ＤＣ０１３  ５’−ＣＡＡＴＣＧＴＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧ−３’  （配列番号：１２０）
ＤＣ０１４  ５’  −ＣＴＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＧＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＡＴＴＧ−３’（配列番号：１２１）
であってよい。具体的には、ドナーＤＮＡがＺｐ１５遺伝子に対して直列方向（ｄｉｒｅｃｔ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にＰＡＴ遺伝子を有する場合、ドナーＤＮＡ  ５’Ｚｐ１５相同配列に隣接するゲノム領域内のプライマーＨＢ５０１ｆまたはＨＢ５０３ｆを、ＰＡＴタンパク質コード領域内のプライマーＤＣ０１３（配列番号：１２０）とともに用いて、ＰＡＴ−Ｚｐ１５  ５’インサート接合部を検出する。同様に、ドナーＤＮＡがＺｐ１５遺伝子に対して非直列方向（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にＰＡＴ遺伝子を有する場合、プライマーＨＢ５０１ｆまたはＨＢ５０３ｆを、ＰＡＴタンパク質コード領域内のプライマーＤＣ０１４（配列番号：１２１）とともに用いて、ＰＡＴ−Ｚｐ１５  ５’インサート接合部を検出する。ドナーＤＮＡがＺｐ１５遺伝子に対して非直列方向にＰＡＴ遺伝子を有する場合、ＰＡＴ−Ｚｐ１５  ３’インサート接合部の検出のために、プライマーＨＢ５０２ｒまたはＨＢ５０４ｒをプライマーＤＣ０１３（配列番号：１２０）とともに用いて、インサート接合部を検出する。同様に、ドナーＤＮＡがＺｐ１５遺伝子に対して直列方向にＰＡＴ遺伝子を有する場合、プライマーＨＢ５０２ｒまたはＨＢ５０４ｒをプライマーＤＣ０１４（配列番号：１２１）とともに用いて、ＰＡＴ−Ｚｐ１５  ３’インサート接合部を検出する。
【０２０９】
ＰＣＲ増幅反応を、ＰＨＵＳＩＯＮホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、以下のサイクル条件：９８℃，３０秒間／１サイクル；９８℃  １０秒間，７２℃  １５秒間／３３サイクル；７２℃，５分間／１サイクル；４℃／ホールドの下で行う。ＴＡＥアガロースゲル電気泳動を用いて、ＰＣＲ産物を分解（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）かつ同定する。種々のＰＡＴ−Ｚｐ１５ドナーＤＮＡを用いることによって作製されたトランスジェニックカルスにおける、ＰＡＴ−Ｚｐ１５標的組込み事象由来のＰＣＲ産物に対して期待されるゲルフラグメントの大きさは、以下のとおり：
ＨＢ５０１ｆ／ＨＢ５０３ｆ＋ＤＣ０１３（５’）＝２．６ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０３），２．６ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０４）
ＨＢ５０１ｆ／ＨＢ５０３ｆ＋ＤＣ０１４（５’）＝１．６ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０５），１．７ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０２）
ＨＢ５０２ｒ／ＨＢ５０４ｒ＋ＤＣ０１３（３’）＝３．２ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０５），３．２ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０２）
ＨＢ５０２ｒ／ＨＢ５０４ｒ＋ＤＣ０１４（３’）＝１．２ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０３），１．２ｋｂｐ（ｐＤＡＢ１０４１０４）
である。
【０２１０】
５’および３’ＰＡＴ−Ｚｐ１５標的組込み接合部を含むＰＣＲ産物を、当業者に既知の標準的方法を用いることによってクローニングおよびシークエンシングする。例えば、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、ＴＯＰＯブラントクローニング（登録商標）キットおよび化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショット（登録商標）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯプラスミド内にクローニングする。
【０２１１】
次いで、クローン化した組込み接合部をシークエンシングして、ドナー形質転換ベクター内に組み入れられている５’および３’Ｚｐ１５相同配列を介した相同組換えによって、ＰＡＴ遺伝子がＺｐ１５遺伝子座においてトウモロコシゲノム内に挿入されたことを証明する。ＴＯＰＯベクター特異的プライマーＭ１３正方向およびＭ１３逆方向に加えて、ＰＡＴ遺伝子カセット特異的プライマーを用いて、標的組込みクローンの完全配列を得る。ＰＡＴタンパク質コード配列に特異的であるＰＣＲプライマーの配列番号：１２０および配列番号：１２１は、シークエンシングプライマーとしても用いられる。さらに、他のプライマーもシークエンシングに用いることができる。これらには、ＰＡＴカセットのイネアクチンプロモーターエレメントに特異的であるもの：
ＤＣ−Ｓ１  ５’−ＣＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＴＡＧＴＣＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１２２）
ＤＣ−Ｓ２  ５’−ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＣＣ-３’（配列番号：１２３）
およびＰＡＴタンパク質コード配列に特異的であるもの：
ＤＣ−Ｓ３  ５’−ＣＧＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡＡＴＧＧＴＴＡＡＣＧ−３’（配列番号：１２４）
ＤＣ−Ｓ４  ５’−ＧＣＣＣＡＧＣＧＴＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号：１２５）
を含むが、これに制限されない。
【０２１２】
実施例６：Ｚｐ１５遺伝子座におけるＡＡＤ−１標的組込みの遺伝性
Ｚｐ１５遺伝子座を標的とするＡＡＤ−１遺伝子カセットを保持するトランスジェニックカルス事象を作出した（事象１３８）。事象１３８のＴ0植物を再生し、雌性植物としてＤＡＳ５ＸＨ７５１雄性植物と交配させた。結果として生じたＴ1種子を植え付け、Ｔ1植物を成長させた。
【０２１３】
Ｔ1植物をＰＣＲによって分析して、ＡＡＤ−１−Ｚｐ１５標的組込みの発生を証明した。ＰＣＲ増幅反応を、ＰＨＵＳＩＯＮホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、以下のサイクル条件：９８℃，３０秒間／１サイクル；９８℃  １０秒間，７２℃  １５秒間／３３サイクル；７２℃，５分間／１サイクル；４℃／ホールドの下で行った。ＰＣＲ反応物を、１．０％ＴＡＥアガロースゲル中での電気泳動によって分析した。ゲノムＤＮＡをＴ1植物から抽出し、ＡＡＤ−１  Ｚｐ１５  ５’組込み接合部を検出するように設計されたネストプライマーを用いたＰＣＲ反応におけるテンプレートＤＮＡとして用いた。カルス事象１４７の分析で以前用いた同じプライマーを用いて、プライマリーおよびセカンドＰＣＲ反応を行った。プライマリーＰＣＲに対し、プライマーＨＢ５０１ｆおよびＨＢ５０７ｒを用いた。プライマリーＰＣＲによって、２．２ｋｂｐの期待される大きさにバンドが生じた。プライマリーＰＣＲ反応物のアリコートを１：１００希釈し、ネストプライマーＨＢ５０３ｆおよびＨＢ５０８ｒを用いたセカンドＰＣＲにおけるテンプレートとして用いた。セカンドＰＣＲによっても、２．２ｋｂｐの期待される大きさにバンドが生じた。
【０２１４】
２．２ｋｂｐのセカンドＰＣＲ産物を、ゼロブラントＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキットおよび化学的にコンピテントな大腸菌細胞であるワンショットＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってｐＣＲ−ブラントＩＩ−ＴＯＰＯ内にクローニングした。クローン化したＤＮＡを、隣接するベクター特異的プライマー（Ｍ１３正方向およびＭ１３逆方向）を用いてシークエンシングした。配列は、Ｚｐ１５遺伝子座におけるＡＡＤ−１の標的組込みに期待されるものと同一であることが判明した。
【０２１５】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照することによりあらゆる目的でそれらの全体として本明細書によって組み入れられているものとする。
【０２１６】
明確な理解のために、図解および実施例によって多少詳しく開示が提供されているが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、多様な変化および修正を実施し得ることは当業者に明白であろう。したがって、前述の記載および実施例は制限するものとして解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月23日(2015.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞のゲノム内に１つ以上の外因性核酸配列を組み込む方法であって、前記方法が：
１つ以上の外因性核酸配列を植物細胞に導入する工程、及び
切断ドメイン、及び以下の表１
【表１−１】
2015226537.tif 000027
【表１−２】
2015226537.tif 000028
の各行に示される認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を含む少なくとも１つの融合タンパク質を用いて、前記植物細胞のゲノムにおける内因性Ｚｐ１５遺伝子の二本鎖配列を切断し、それによって前記細胞のゲノム内への前記１つ以上の外因性配列を含むポリヌクレオチドの組み込みをもたらす工程を含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の外因性配列の産物を発現させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二本鎖切断が、
（ａ）前記細胞内で第一の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第一の融合タンパク質は第一のジンクフィンガー結合ドメインおよび第一の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第一のジンクフィンガー結合ドメインは前記植物細胞のゲノム内のＺｐ１５遺伝子座におけるまたは近隣における第一の標的部位に結合するように遺伝子操作されている工程；ならびに
（ｂ）前記細胞内で第二の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第二の融合タンパク質は第二のジンクフィンガー結合ドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第二のジンクフィンガー結合ドメインは前記植物細胞のゲノム内のＺｐ１５遺伝子座におけるまたは近隣における第二の標的部位に結合し、前記第二の標的部位は前記第一の標的部位とは異なり、かつ前記第一の融合タンパク質の前記第一の標的部位への結合および前記第二の融合タンパク質の前記第二の標的部位への結合により、前記切断ハーフドメインは前記植物細胞のゲノムが前記Ｚｐ１５遺伝子座においてまたは近隣において切断されるように位置する工程
によって引き起こされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記切断ハーフドメインが天然に存在しているまたは天然には存在していないものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖切断が、天然に存在しているまたは天然には存在していないメガヌクレアーゼ、ＩＩＳ型制限酵素、あるいは前記メガヌクレアーゼおよび前記ＩＩＳ型制限酵素を含む融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の外因性核酸配列が、コード配列、制御配列、またはＤＮＡ結合ドメインに対する標的部位を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記コード配列が、：除草剤抵抗性；除草剤耐性；害虫抵抗性；害虫耐性；病害抵抗性；病害耐性；ストレス耐性；ストレス抵抗性；酸化ストレスの変化；油分の収量増大；食物の含有量および構成の変化；見た目の変化；雄性不稔；ドライダウン；耐倒伏性；多産；デンプンの量または質の変化；油分の質の変化；タンパク質の質または量の変化；アミノ酸組成の変化、あるいはその組み合わせを与える産物をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが前記Ｚｐ１５遺伝子座内の配列に相同であるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記相同なヌクレオチド配列が前記外因性配列に隣接する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドがプロモーターをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の組み込まれた外因性配列が次世代の後代に伝達される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によってＺｐ１５遺伝子座内に組み込まれた１つ以上の外因性配列を含む、植物または植物部位。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によってＺｐ１５遺伝子座内に組み込まれた１つ以上の外因性配列を含む、種子。
【外国語明細書】
2015226537000001.pdf