(57)【要約】      （修正有）【課題】骨髄幹細胞の誘引性能に優れた骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法の提供。【解決手段】ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのうちの少なくとも１種を含む軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞などの中胚葉性組織の細胞へ分化し得る骨髄間葉系幹細胞、赤血球や白血球などの血液細胞へ分化し得る造血幹細胞などからなる骨髄幹細胞の誘引剤、および、骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引する骨髄幹細胞の誘引方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする骨髄幹細胞の誘引剤。
【請求項２】
請求項１記載の骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することを特徴とする骨髄幹細胞の誘引方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄幹細胞は、骨髄において生じた未だ分化していない細胞であり、様々な体内組織の細胞へ分化し得るものとして知られている。また、分化を誘導する分化誘導剤の影響を受けて、機能が失われた組織においてその組織細胞に分化することにより組織の機能を回復させ得るものとして注目されている。
【０００３】
具体的には、骨髄幹細胞は、例えば、炎症のある組織又は損傷を受けた組織へ血流にのって骨髄から移動した後に、分化誘導剤の影響を受けてその組織細胞へ分化し得るものとして注目されている。
【０００４】
ところで、従来、骨髄幹細胞を各種の細胞に分化させ得る分化誘導剤としては、様々なものが知られており、例えば、骨髄幹細胞を心臓の筋肉細胞に分化させ得る線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor  ＦＧＦ）や血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor  ＰＤＧＦ）などが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６３９６７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、この種の分化誘導剤は、骨髄幹細胞を所定の組織細胞へと分化させる性能を有するものの、骨髄幹細胞を誘引する性能、具体的には例えば、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞を所定の体内組織へ誘引する性能が、必ずしも十分なものではないという問題がある。
【０００７】
本発明は、上記の問題点等に鑑み、骨髄幹細胞の誘引性能に優れた骨髄幹細胞の誘引剤を提供することを課題とする。また、骨髄幹細胞の誘引性能に優れた骨髄幹細胞の誘引方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る骨髄幹細胞の誘引剤は、ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのうちの少なくとも１種を含むことを特徴としている。
【０００９】
本発明に係る骨髄幹細胞の誘引方法は、前記誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、骨髄幹細胞の誘引性能に優れるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】生体外における細胞誘引試験の様子を模式的に示した図。
【図２】生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。
【図３】生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。
【図４】生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明に係る骨髄幹細胞の誘引剤の実施形態について説明する。
【００１３】
本実施形態の骨髄幹細胞の誘引剤は、ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのうちの少なくとも１種を含むものである。
【００１４】
前記ボルケンシフラボン（タルボタフラボン）［Volkensiflavone（Talbotaflavone）］は、下記式（１）の分子構造を有する化合物である。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるボルケンシフラボンの濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１〜１００重量％が挙げられる。
【００１７】
前記骨髄幹細胞の誘引剤は、ボルケンシフラボン以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。
【００１８】
前記ボルケンシフラボンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、市販されているボルケンシフラボンを適当な溶媒に溶解させることにより製造することができる。
【００１９】
また、前記ボルケンシフラボンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、Garcinia vilersianaなどの植物におけるボルケンシフラボンを含む部分を抽出処理することにより製造することができる。
【００２０】
前記モレロフラボン「Morelloflavone」は、下記式（２）の分子構造を有する化合物である。
【００２１】
【化２】
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【００２２】
前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるモレロフラボンの濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１〜１００重量％が挙げられる。
【００２３】
前記骨髄幹細胞の誘引剤は、モレロフラボン以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。
【００２４】
前記モレロフラボンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、市販されているモレロフラボンを適当な溶媒に溶解させることにより製造することができる。
【００２５】
また、前記モレロフラボンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、Garcinia vilersianaなどを抽出処理することにより製造することができる。
【００２６】
前記ケンフェリトリン［Kaempferitrin］（又は、ケンフェロール−３，７−ジラムノシドともいう）は、下記式（３）の分子構造を有する化合物である。
【００２７】
【化３】
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【００２８】
前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるケンフェリトリンの濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１〜１００重量％が挙げられる。
【００２９】
前記骨髄幹細胞の誘引剤は、ケンフェリトリン以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。
【００３０】
前記ケンフェリトリンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、市販されているケンフェリトリンを適当な溶媒に溶解させることにより製造することができる。
【００３１】
また、前記ケンフェリトリンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、ゲンノショウコ（Geranium thunbergii）、セイロンニッケイ（Cinnamomum osmophloeum）、キャッツクロー（Uncaria guianensis）、フユボダイジュ（Tilia cordata）などの植物におけるケンフェリトリンを含む部分を抽出処理することにより製造することができる。
【００３２】
前記ケルセチン−３，７−ジラムノシド［Quercetin-3,7,-di-O-α-L-rhamnoside］は、下記式（４）の分子構造を有する化合物である。
【００３３】
【化４】
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【００３４】
前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるケルセチン−３，７−ジラムノシドの濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１〜１００重量％が挙げられる。
【００３５】
前記骨髄幹細胞の誘引剤は、ケルセチン−３，７−ジラムノシド以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。
【００３６】
前記ケルセチン−３，７−ジラムノシドを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、市販されているケルセチン−３，７−ジラムノシドを適当な溶媒に溶解させることにより製造することができる。
【００３７】
また、前記ケルセチン−３，７−ジラムノシドを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、ハマカヅラ（Bauhinia forficata）、エジプトイチジク（Ficus sycomorus）、Siparuna guianensis、フユボダイジュ（Tilia cordata）などの植物におけるケルセチン−３，７−ジラムノシドを含む部分を抽出処理することにより製造することができる。
【００３８】
なお、前記骨髄幹細胞の誘引剤は、ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのうちのいずれか１つを含んでいてもよく、いずれか２つ又は３つを含んでいてもよい。また、ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのいずれも含み得る。
【００３９】
続いて、本発明の骨髄幹細胞の誘引方法の実施形態について説明する。本実施形態の骨髄幹細胞の誘引方法は、前記骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引するものである。
【００４０】
骨髄幹細胞は、骨髄組織に含まれており、さらに骨髄組織内で分化したり又は血流にのって骨髄組織から他の体内組織へ移動したりし得る。
前記骨髄幹細胞としては、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞などの中胚葉性組織の細胞へ分化し得る骨髄間葉系幹細胞、赤血球や白血球などの血液細胞へ分化し得る造血幹細胞などが挙げられる。
前記骨髄幹細胞のなかでも骨髄間葉系幹細胞は、中胚葉性組織の細胞に分化するだけでなく、神経などの外胚葉性組織、肝臓などの内胚葉性組織の細胞へも分化し得る。本発明の誘引方法において誘引される骨髄幹細胞としては、誘引された後に、より多様な細胞に分化し得るという点で、骨髄間葉系幹細胞が好ましい。
【００４１】
前記骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、生体外において、又は生体において前記骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することができる。
【００４２】
具体的には、生体外での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、厚み方向に貫通する微細孔を有するメンブレン（膜）を備えた装置を用い、メンブレンの一方側に骨髄幹細胞を配し、他方側に前記骨髄幹細胞の誘引剤を配し、所定時間をおいて骨髄幹細胞をメンブレンの他方側へ誘引する方法などを実施することができる。
また、生体外での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、スライドグラス上に播種した骨髄幹細胞の一部を掻き取り、掻き取った部分に骨髄幹細胞の誘引剤を含む培地を塗布して骨髄幹細胞の培養条件下におくことにより、掻き取った部分へ骨髄幹細胞を誘引する方法などを実施することができる。
【００４３】
このような生体外での骨髄幹細胞の誘引方法は、比較的簡便に実施できることから、例えば、後述する生体での骨髄幹細胞の誘引方法における誘引剤の最適濃度を決定する目的で予備実験的に実施することができる。
【００４４】
なお、上記のような骨髄幹細胞の誘引方法における骨髄幹細胞の誘引の程度は、骨髄幹細胞を染色し、染色度を測定することにより評価できる。また、誘引された骨髄幹細胞を目視にて確認することにより評価できる。
【００４５】
一方、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、前記骨髄幹細胞の誘引剤を含む水性ゲルを通常のマウスの皮下に埋め込み、マウスの骨髄幹細胞をこのマウスの静脈に注入し、所定期間マウスを飼育することにより、骨髄幹細胞を水性ゲルに誘引する方法などを実施することができる。
また、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、マウスの骨髄幹細胞を、創傷モデルマウスの骨髄に移植するとともに、該マウスの創傷部に前記骨髄幹細胞の誘引剤を塗布することにより、創傷部に骨髄幹細胞を誘引する方法などを実施することができる。
【００４６】
なお、上記のような骨髄幹細胞の誘引方法における骨髄幹細胞の誘引の程度は、骨髄幹細胞として、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein，以下ＧＦＰともいう）を発現させたマウスの骨髄幹細胞を用いて、誘引された骨髄幹細胞における蛍光の強度を測定することにより評価できる。
【００４７】
さらに、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、所定の体内組織に骨髄幹細胞の誘引剤を含有させる処置を施し、その体内組織に骨髄幹細胞を誘引する方法などを実施することができる。
具体的には、誘引剤を皮膚に塗布することにより、骨髄幹細胞を表皮組織に誘引する方法などを実施することができる。より具体的には、例えば、皮膚の表皮組織（角質層など）に前記骨髄幹細胞の誘引剤を塗布などにより含有させて、血液中に存在する骨髄間葉系幹細胞を表皮組織に誘引する方法などを実施することができる。
なお、生体での誘引方法において骨髄幹細胞が誘引されて来る体内組織としては、表皮組織の他に、筋肉組織、軟骨組織、肝臓組織などの各種組織が挙げられる。
【００４８】
生体での骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、骨髄幹細胞を各種の組織細胞へ分化させる前に、骨髄幹細胞をその組織へ集積させる目的で実施することができる。
【００４９】
前記骨髄幹細胞の誘引方法は、ヒトの生体又はヒト以外の動物の生体において実施することができる。好ましくは、ヒトの生体において、具体的には例えば美容上の目的で、非治療的に実施する。
【００５０】
前記骨髄幹細胞の誘引方法においては、ボルケンシフラボン、モレロフラボン、ケンフェリトリン、及び、ケルセチン−３，７−ジラムノシドのうちの少なくとも１種が適当な濃度に希釈された誘引剤を用いることができる。希釈するための液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、骨髄幹細胞の培養液などを用いることができる。
例えば、ボルケンシフラボンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、好ましくは、１０〜１，０００μｇ／ｍＬのボルケンシフラボン濃度、より好ましくは、１００〜５００μｇ／ｍＬのボルケンシフラボン濃度にて使用される。
また、例えば、モレロフラボンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、好ましくは、１０〜１，０００μｇ／ｍＬのモレロフラボン濃度、より好ましくは、１００〜５００μｇ／ｍＬのモレロフラボン濃度にて使用される。
また、例えば、ケンフェリトリンを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、好ましくは、１０〜１，０００μｇ／ｍＬのケンフェリトリン濃度、より好ましくは、１００〜４００μｇ／ｍＬのケンフェリトリン濃度にて使用される。
また、例えば、ケルセチン−３，７−ジラムノシドを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、好ましくは、１０〜１，０００μｇ／ｍＬのケルセチン−３，７−ジラムノシド濃度、より好ましくは、１００〜４００μｇ／ｍＬのケルセチン−３，７−ジラムノシド濃度にて使用される。
【００５１】
本実施形態の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法に限定されるものではない。また、本発明では、一般の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【００５２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）
ボルケンシフラボン（Garcinia vilersianaから単離精製したもの）を５００μｇ／ｍＬ濃度となるように溶媒（ダルベッコ変法イーグル培地  ＤＭＥＭ）に溶解させ、ボルケンシフラボンを含む誘引剤を製造した。
【００５４】
（実施例２）
ボルケンシフラボンの濃度が２００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例１と同様にして誘引剤を製造した。
【００５５】
（実施例３）
ボルケンシフラボンの濃度が１００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例１と同様にして誘引剤を製造した。
【００５６】
（実施例４）
モレロフラボン（Garcinia vilersianaから単離精製したもの）を５００μｇ／ｍＬ濃度となるように溶媒（ＤＭＥＭ）に溶解させ、モレロフラボンを含む誘引剤を製造した。
【００５７】
（実施例５）
モレロフラボンの濃度が２００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例４と同様にして誘引剤を製造した。
【００５８】
（実施例６）
モレロフラボンの濃度が１００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例４と同様にして誘引剤を製造した。
【００５９】
（実施例７）
ケンフェリトリン（フユボダイジュ（Tilia cordata）から単離精製したもの）を４００μｇ／ｍＬ濃度となるように溶媒（ＤＭＥＭ）に溶解させ、ケンフェリトリンを含む誘引剤を製造した。
【００６０】
（実施例８）
ケンフェリトリンの濃度が２００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例７と同様にして誘引剤を製造した。
【００６１】
（実施例９）
ケンフェリトリンの濃度が１００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例７と同様にして誘引剤を製造した。
【００６２】
（実施例１０）
ケルセチン−３，７−ジラムノシド（フユボダイジュ（Tilia cordata）から単離精製したもの）を４００μｇ／ｍＬ濃度となるように溶媒（ＤＭＥＭ）に溶解させ、ケルセチン−３，７−ジラムノシドを含む誘引剤を製造した。
【００６３】
（実施例１１）
ケルセチン−３，７−ジラムノシドの濃度が２００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例７と同様にして誘引剤を製造した。
【００６４】
（実施例１２）
ケルセチン−３，７−ジラムノシドの濃度が１００μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例７と同様にして誘引剤を製造した。
【００６５】
製造した各実施例の骨髄幹細胞の誘引剤を使用し、生体外における細胞誘引試験による評価を行った。図１は、該評価方法の様子を模式的に示したものである。以下、図１を参照しながら評価方法の詳細を説明する。
【００６６】
＜生体外における細胞誘引試験＞
各実施例の骨髄幹細胞の誘引剤を試験用サンプルとして用意した。
一方、陰性対照サンプルとして、ＤＭＥＭ「ＦＢＳ（−）、Ｐ／Ｓ（−）」を用意した。
また、陽性対照サンプルとして、２０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（血小板由来成長因子  ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ社製）濃度のＤＭＥＭ溶液を用意した。
また、マウス骨髄間葉系幹細胞（以下、ｍＭＳＣともいう）をコンフルエントまで培養して回収し、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ「Ｐ／Ｓ（−）」で１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、細胞懸濁液を用意した。
なお、ＦＢＳは、１０％ウシ胎児血清を示し、Ｐ／Ｓは、１００ユニットペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを示している。また（−）の記号は、配合していないことを示している。
次に、複数の独立したウェルを備え、図１（ａ）に示すようにメンブレンＭによりウェルが上部ウェルＰと下部ウェルＱとに仕切られているボイデンチャンバーＢ（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用意した。各試験用サンプルのいずれか１種と陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルとが同一のボイデンチャンバーＢにおいて試験できるように設定し、該チャンバーＢの各下部ウェルに各サンプルをそれぞれ２８μＬずつアプライした。なお、ボイデンチャンバーＢのメンブレンＭとしては、商品名「Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製  細孔サイズ８μｍ）を用いた。
続いて、上部ウェルＰに上記細胞懸濁液を５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で４時間培養した（図１（ｂ）を参照）。
４時間培養後、図１（ｃ）に示すように、移動していないｍＭＳＣを付属のフィルターワイパーＲではぎ取り、メンブレンＭの下側へ移動したｍＭＳＣのみをディフ・クイック染色（Ｓｙｓｍｅｘ社製キットを使用）により染色した。
そして、染色像をデジタル化してコンピュータに取り込み、画像を黒と白に２値化すべく青色に染色された部分が白色になるように変換したうえで、各ウェル範囲内の輝度の平均値を画像編集ソフトウェア（商品名「フォトショップ」）の機能を用いて測定した。陰性対照サンプルおよび陽性対照サンプルにおける輝度を各試験用サンプルにおける輝度と比較することにより、骨髄幹細胞の誘引剤のｍＭＳＣ誘引活性を評価した。
なお、各試験サンプル、陽性対照サンプル、陰性対照サンプルについては、２回の測定結果を平均することにより、それぞれ測定値を算出した。
【００６７】
実施例１〜６の誘引剤における評価結果を輝度のグラフによって図２に示す。また、実施例７〜９の誘引剤における評価結果を同様に図３に示す。また、実施例１０〜１２の誘引剤における評価結果を同様に図４に示す。
図２〜図４から把握できるように、実施例の骨髄幹細胞の誘引剤は、骨髄幹細胞の誘引性能において特に優れている。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、所定の体内組織において骨髄幹細胞を分化させる前に、骨髄で生じた骨髄幹細胞を所定の体内組織に誘引するために使用される。即ち、例えば、所定の体内組織に誘引剤を含ませる処置をすることにより、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞をその体内組織に誘引して集積させる目的で好適に使用される。
【符号の説明】
【００６９】
Ｂ：ボイデンチャンバー、  Ｐ：上部ウェル、  Ｑ：下部ウェル、  Ｍ：メンブレン、  Ｒ：フィルターワイパー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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