(57)【要約】【課題】アルカリゲネス属細菌をコストを抑えて培養する培養方法を提供する。【解決手段】  窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を培養する培養方法である。炭素源としてメタノール及び有機酸を加えて馴養培養を行い、その後、炭素源として、メタノールのみを加えて本培養を行う。馴養培養は、複数回、好ましくは５回以上行われる。また、馴養培養におけるメタノールの混合割合は、０．２５容積％〜１５．０容積％であり、本培養におけるメタノールの混合割合は、０．２５容積％〜３．５容積％である。【選択図】図２
2015204816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を培養する培養方法であって、
前記炭素源としてメタノール及び有機酸を加えて馴養培養を行い、
その後、前記炭素源として、メタノールのみを加えて本培養を行う
ことを特徴とする培養方法。
【請求項２】
前記馴養培養は、複数回行われる
ことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記馴養培養は、５回以上行われる
ことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記馴養培養におけるメタノールの混合割合は、０．２５容積％〜１５．０容積％であり、
前記本培養におけるメタノールの混合割合は、０．２５容積％〜３．５容積％である
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記馴養培養において加えられる前記有機酸は、１Ｌあたり０．２〜１．４ｇである
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
前記本培養において、前記有機酸を１Ｌあたり０．０５ｇ〜１．０ｇ更に加える
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を培養する培養方法であって、
前記炭素源としてメタノール及び有機酸を加えて馴養培養を行い、その後、前記窒素源及び炭素源として、有機性廃液を嫌気性発酵処理したアンモニア態窒素を含む消化液とメタノールのみとを加えて本培養を行う
ことを特徴とする培養方法。
【請求項８】
窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を馴養培養する培養方法であって、
前記炭素源は、メタノール及び有機酸であり、
前記メタノールの混合割合は、０．２５容積％〜１５．０容積％であり、
前記有機酸は、１Ｌあたり０．２〜１．４ｇである
ことを特徴とする培養方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の培養方法で培養されたアルカリゲネス属細菌により、有害有機物の分解を行う
ことを特徴とする有害有機物分解方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の培養方法で培養された
ことを特徴とするアルカリゲネス属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養方法、有害有機物分解方法、及びアルカリゲネス属細菌に係り、特に添加するＣ源を改良した培養方法、有害有機物分解方法、及びアルカリゲネス属細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
下水や産業廃水等の窒素含有液に含有されるアンモニア態窒素は、湖沼等の水系における富栄養化の原因になること、水系における溶存酸素の低下の原因となること等の理由から、系外へ排出する前に除去すべき有害有機物である。
従来から、アンモニア態窒素を除去する方法として、微生物を利用して生物学的に硝化脱窒を行う生物学的硝化脱窒処理が知られている。
この硝化脱窒の処理では、まず、アンモニア態窒素が好気性独立栄養細菌である硝化菌で硝化処理される。
その後、硝化処理されて産生した硝酸性窒素及び亜硝酸性窒素が、嫌気性細菌である脱窒菌で脱窒処理されて、窒素（Ｎ2）に変換される。
【０００３】
このような硝化処理及び脱窒処理を一つの系で行うことが可能な微生物として、アルカリゲネス属（Alcaligenes）の細菌が知られている。
たとえば、特許文献１には、アルカリゲネス属（Alcaligenes）の細菌であるアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）No.4株（FERM P-18114）（以下、「ＡＦ４菌」という。）を用いて、１重量％〜６重量％の塩化ナトリウムを含む水性液中に存在するアンモニア態窒素化合物を窒素ガスに変換する方法の技術が記載されている。
特許文献１の技術では、ＡＦ４菌について、窒素源（以下「Ｎ源」という。）、炭素源（以下、「Ｃ源」という。）、無機塩類、微量栄養素等を添加して培養を行う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１９９８７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１の技術では、脱窒の際に、ＡＦ４菌のＣ源として、試薬単価（円／ｋｇ）が高い、酢酸やクエン酸等の炭素数Ｃが２以上（以下、「Ｃ２化合物」等という。）である有機酸を加える必要があった。
これに対して、アルカリゲネス属細菌のＣ源として、より安価である、炭素数Ｃが１の化合物（以下、「Ｃ１化合物」等という。）であるメタノール等を用いた場合、菌が増殖しないという問題があった。
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の問題を解消することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の培養方法は、窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を培養する培養方法であり、前記炭素源としてメタノール及び有機酸を加えて馴養培養を行い、その後、前記炭素源として、メタノールのみを加えて本培養を行うことを特徴とする。
本発明の培養方法は、前記馴養培養は、複数回行われることを特徴とする。
本発明の培養方法は、前記馴養培養は、５回以上行われることを特徴とする。
本発明の培養方法は、前記馴養培養におけるメタノールの混合割合は、０．２５容積％〜１５．０容積％であり、前記本培養におけるメタノールの混合割合は、０．２５容積％〜３．５容積％であることを特徴とする。
本発明の培養方法は、前記馴養培養において加えられる前記有機酸は、１Ｌあたり０．２〜１．４ｇであることを特徴とする。
本発明の培養方法は、前記本培養において、前記有機酸を１Ｌあたり０．０５ｇ〜１．０ｇ更に加えることを特徴とする。
本発明の培養方法は、窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を培養する培養方法であり、前記炭素源としてメタノール及び有機酸を加えて馴養培養を行い、その後、前記窒素源及び炭素源として、有機性廃液を嫌気性発酵処理したアンモニア態窒素を含む消化液とメタノールのみとを加えて本培養を行うことを特徴とする。
本発明の培養方法は、窒素源及び炭素源を加えてアルカリゲネス属（Alcaligenes）細菌を馴養培養する培養方法であって、前記炭素源は、メタノール及び有機酸であり、前記メタノールの混合割合は、０．２５容積％〜３．５容積％であり、前記有機酸は、１Ｌあたり０．２〜１．４ｇであることを特徴とする。
本発明の有害有機物分解方法は、前記培養方法で培養されたアルカリゲネス属細菌により、有害有機物の分解を行うことを特徴とする。
本発明のアルカリゲネス属細菌は、前記培養方法で培養されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、Ｃ源としてメタノール等に有機酸を加えて馴養培養を行い、その後、メタノールのみを加えて本培養を行うことで、Ｃ２化合物に比べて単価を低減可能なアルカリゲネス属細菌の培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施の形態に係る馴養培養の菌数変化を示すグラフである。
【図２】本発明の実施の形態に係る本培養の硫酸アンモニウム添加系列の菌数変化を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態に係る本培養のメタン発酵消化液系列の菌数変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜実施の形態＞
本発明の実施の形態に係る培養方法について説明する。
従来、アルカリゲネス属（Alcaligenes）の細菌にＮ源及びＣ源を加えて脱窒を行う場合、Ｃ源としてＣ２化合物である、例えば、酢酸ナトリウムと酢酸によるｐＨ５．６の２．２５Ｍ緩衝液を加えていたため、コストがかかっていた。しかしながら、アルカリゲネス属の細菌に、コストの安いＣ１化合物のメタノールを加えても増殖しなかった。
これに対して、本発明者らは、アルカリゲネス属細菌の増殖しない条件と、増殖する条件とを検討し、鋭意実験を行った。これにより、アルカリゲネス属細菌を、メタノール等のＣ１化合物を用いて培養する培養方法を確立し、本発明を完成させた。本発明の培養方法は、従来、アルカリゲネス属の細菌の培養に利用しえなかったメタノールに対して、馴養方法等を工夫した培養により、増殖及び脱窒を可能としたものである。本発明に係る培養方法は、当業者の技術常識では予想外の方式であり、脱窒の処理コストを削減可能という効果が得られる。
本実施形態のアルカリゲネス属細菌の培養は、主に下記のように行う：
・馴養培養において、Ｃ１化合物をＣ源として添加する。この際、少量の有機酸を全Ｃ源中数％加える。また、馴養培養は、複数回行い、特に５回以上行うことが好適である。
・本培養において、Ｃ源として、Ｃ１化合物を１００％添加する。この際、Ｃ１化合物の添加濃度は、培養液の体積に対して２．５％〜３．５％（ｖ／ｖ）未満とすることが好適である。また、少量の有機酸を加えることで、菌の増加速度を高められる。
以下、本実施形態の培養方法の詳細について説明する。
【００１１】
（微生物）
本発明の実施の形態に係る培養方法に使用可能な微生物としては、アルカリゲネス属（Alcaligenes）の各種の細菌を用いることが可能である。本実施形態の微生物の具体例として、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、アルカリゲネス・レータス（Alcaligenes latus）、Alcaligenes eutrophus、Alcaligenes viscolactis、Alcaligenes xylosoxidans等の細菌が挙げられるものの、これに限られない。また、本実施形態のアルカリゲネス・フェカリスの具体例としては、アルカリゲネス・フェカリスNo.4株（FERM P-18114）が挙げられる。
【００１２】
（培養方法の概要）
本実施形態の微生物の培養方法では、まず、培養液中のＣ源として、Ｃ１化合物に有機酸を更に加えて馴養培養を行い、その後、Ｃ源としてＣ１化合物のみを加えて本培養を行う。
【００１３】
（馴養培養の回数）
本実施形態の培養方法において、馴養培養は、複数回行われ、特に５回以上行われることが好ましい。一回の馴養培養では、本培養時にＣ１化合物のみをＣ源として加えた場合、本実施形態の微生物が増殖しないためである。また、２回以上の馴養培養では、本培養時に本実施形態の微生物を増殖させることができるものの、増殖速度を高めるために、特に、５回以上の馴養培養を行うことが好ましい。つまり、５回以上の馴養培養を行った本実施形態の微生物を、本培養すると、本実施形態の微生物を素早く増殖の対数期に移行させることができる。このため、増殖した微生物に、効率的に脱窒等の処理を行わせることが可能となる。なお、１０回以上の馴養培養を行っても、本実施形態の微生物が本培養で増殖する速度は、ほぼ変わらなくなる。
【００１４】
（Ｃ源の種類）
本実施形態の培養方法においては、馴養培養及び本培養において、Ｃ源として、主にＣ１化合物を用いる。Ｃ１化合物の具体例としては、例えば、メタノール、ギ酸の各種塩等が挙げられる。また、本実施形態のＣ源が主にメタノールの場合、Ｃ源として有機酸を更に加えて馴養培養を行う。この有機酸の具体例としては、例えば、酢酸及び酢酸塩、炭素数３以上（以下、「Ｃ３」等という。）以上のカルボン酸及びカルボン酸塩、クエン酸等のヒドロキシ酸及びヒドロキシ酸塩、フェノール類、その他の置換されていてもよい有機酸及び有機酸塩が挙げられるものの、これに限られない。酢酸塩としては、例えば、酢酸ナトリウムや酢酸カリウム等、酢酸のアルカリ金属塩等の塩を使用してもよい。また、本実施形態の本培養においては、Ｃ源として、メタノールのみを加えても、本実施形態の微生物を増殖させることが可能となる。また、本培養においても、後述するように、少量の有機酸を加えることで、本実施形態の微生物の増殖を早めることができる。
なお、Ｃ１化合物ではないものの、窒素化合物以外の他の有害有機物であるフェノール、エチレングリコール等をＣ源として更に有機酸を加えて馴養培養し、このフェノール、エチレングリコール等を主なＣ源として本培養に使用することも可能である。
また、Ｃ１化合物は先天的にＡＦ４菌が利用できないため、単なる馴養培養としてＣ１化合物のみを添加しても、ＡＦ４菌は増殖しない。しかしながら、上述したようにＣ１化合物に少量の有機酸を加えて増殖のスターターとすることで、馴養培養を行うことが可能である。実際に、下記で説明する実施例では、Ｃ１化合物を利用し得る状態となったことを示している。つまり、本発明において、その他のＣ源についても、アルカリゲネス属細菌が分解可能な生化学的カスケード等を本質的に備えている場合、当該Ｃ源に有機酸を少量加えて馴養培養することで、当該Ｃ源が使用可能になることが明らかである。
【００１５】
（Ｃ源の混合割合）
本実施形態の馴養培養におけるＣ１化合物の混合割合は、培養液全体に対して０．２５容積％〜１５．０容積％であることが望ましい。Ｃ源のうちＣ１化合物が０．２５容積％以下であると、Ｃ１化合物への十分な馴養ができず本培養で増殖が妨げられる。また、Ｃ１化合物が１５．０容積％以上であると、下記で説明する有機酸が加えられても、本実施形態の微生物の増殖の阻害要因となる。
また、本実施形態の本培養におけるＣ１化合物の混合割合は、培養液全体に対して０．２５容積％〜３．５容積％であることが好ましい。Ｃ１化合物が０．２５容積％以下であると培養時のＣ源が不足して増殖が妨げられる。また、Ｃ１化合物が３．５容積％以上であると、本実施形態の微生物の増殖が遅くなる要因となる。
【００１６】
また、本実施形態の馴養培養においてＣ１化合物に更に加えられる有機酸は、例えば、酢酸ナトリウムの場合、１Ｌあたり０．２ｇ〜１．４ｇであることが好ましい。本実施形態の馴養培養において、酢酸ナトリウムを加える量が１Ｌあたり０．２ｇ未満であると、本実施形態の微生物が増殖しない又は増殖速度が著しく遅くなり、１．４ｇ以上であるとｐＨ等が至適範囲から外れて本実施形態の微生物の増殖速度が遅くなるためである。具体的に、本実施形態の馴養培養では、全Ｃ源のうち、メタノールを８８質量％〜１００質量％程度、有機酸を０質量％〜１２質量％程度使用してもよい。なお、他の有機酸及びこの塩の場合は、ｐＨ及びモル比等において、酢酸ナトリウムと同程度の増殖速度となる量を加えることが好ましい。
また、本実施形態の本培養においては、主なＣ源であるＣ１化合物に対して、例えば、有機酸が酢酸ナトリウムの場合、１Ｌあたり０．０５ｇ〜１．０ｇを更に加えてもよい。これにより、本実施形態の微生物の増殖速度を増加させ、素早く増殖の対数期にさせることが可能となる。具体的には、本実施形態の本培養では、全Ｃ源のうち、メタノールを９０質量％〜１００質量％程度、有機酸は０質量％〜１０質量％程度使用してもよい。
【００１７】
（その他の栄養源）
また、本実施形態の馴養培養及び本培養において、Ｃ源の他の栄養源として、本実施形態の微生物が増殖するのに十分なＮ源、無機塩類、微量栄養素等を含む培養液を使用してもよい。この際、Ｃ源の他の栄養源として、従来から使用されているアルカリゲネス属細菌用の培地を使用してもよい。
また、本実施形態の本培養においては、Ｃ源を含む培養液として、硝化脱窒の処理の対象となる下水や産業廃水等の有機性廃液を嫌気性発酵処理したアンモニア態窒素を含む消化液を使用してもよい。また、この有機性廃液等が、本実施形態の微生物の増殖に必要なＣ源を含む栄養を既に含んでいる場合、滅菌等せずに、そのまま使用してもよい。また、本実施形態の本培養では、有機性廃液が硝化処理された硝酸性窒素及び亜硝酸性窒素等を含む溶液をＮ源として使用してもよい。つまり、本実施形態の馴養培養及び本培養においては、Ｃ源としてＣ１化合物及び有機酸を加えて馴養培養を行い、その後、Ｎ源及びＣ源として、有機性廃液を嫌気性発酵処理したアンモニア態窒素を含む消化液とＣ１化合物のみとを加えて本培養を行ってもよい。また、本実施形態の本培養では、硫酸アンモニウム（ＮＨ4）2ＳＯ4を、追加のＮ源として加えてもよい。また、アルカリゲネス属細菌により有用な化合物を生成させる場合、このための追加のＮ源、Ｃ源、その他の栄養素等を加えた培地を使用してもよい。
以下、Ｃ源とこれらの他の栄養源とを含む、本実施形態の微生物の培養用の溶液を、単に「培養液」という。
【００１８】
（馴養培養の培養条件）
本実施形態の馴養培養の培養温度は１５℃〜３７℃であり、好ましくは２８℃〜３２℃である。培養液のｐＨは５〜８であり、好ましくは中性付近である。また、本実施形態の馴養培養では、本実施形態の微生物を好気的な条件下で培養すればよい。この際、例えば本実施形態の微生物は、初期は旋回振動により振とうされ、その後、回転数約１００〜１２０ｒｐｍの水平振動で振とう培養されてもよい。
【００１９】
（本培養の培養条件）
本実施形態の本培養においては、本実施形態の微生物を嫌気的又は好気的な条件下で培養し、硝化脱窒を行わせ、アンモニア態窒素等の有害有機物を分解させることが可能である。
本実施形態の本培養においては、上記の馴養培養により培養された本実施形態の微生物を、従来の硝化脱窒装置を使用し、当該装置に好適な培養方法により、Ｃ源としてＣ１化合物のみ、又は、これに上記の少量の有機酸を更に加えて培養してもよい。
また、本実施形態の本培養におけるＣ源添加設備部分は、例えば、下記のような装置を備えることが可能である：
・Ｃ１化合物貯留槽（撹拝機付）
・Ｃ１化合物供給ポンプ
・各種配管
・計装設備
・原水槽、反応槽等
【００２０】
また、本実施形態の本培養においては、回分式培養の方式を使用しても、連続式培養の方式を使用してもよい。回分式培養においては、培養槽（排水処理槽）に必要な培養液を投入し、馴養培養により培養した微生物を接種し、例えば、微生物が十分に増殖するまで培養する。また、連続培養方式においては、培養液に、馴養培養により培養した微生物を接種し、当該微生物の濃度が特定の濃度に達した後、処理済みの培養液を抜き取って、当該培養槽に新たな培養液を供給してもよい。この際、例えば、大規模に硝化脱窒を行う場合、上記、特開２００８−２４０８６９号公報に記載の曝気式脱臭装置を用いることができる。このような装置では、有機性廃液等のアンモニア態窒素化合物の一部は、本実施形態の微生物に資化されて菌体の構成成分となり、アンモニア態窒素化合物の他の部分は脱窒の対象になる。この場合、本実施形態の本培養における脱窒速度は、例えば、２．０〜４．０ｋｇ−Ｎ／ｍ3／ｄ程度を保持可能であることが好ましい。
【００２１】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
従来、ＡＦ４菌のＣ源として使用してきたＣ２化合物、例えば、酢酸ナトリウムと酢酸によるｐＨ５．６の２．２５Ｍ緩衝液の溶液は、コストが高かった。たとえば、２０１４年度において、硝化脱窒処理用の酢酸ナトリウムの市場価格は、約２００円／ｋｇであった。
これに対して、Ｃ１化合物であるメタノールの市場価格は、約４０〜５０円／ｋｇであり、将来、２０円／ｋｇ程度になる可能性が指摘されている。このように、Ｃ１化合物を用いることで、硝化脱窒に必要なＣ源の単価を、酢酸と比較して１／４〜１／５程度に低減することができる。これにより、容易に有害有機物を分解することが可能となる。
また、Ｃ１化合物であるメタノールは、アルカリゲネス属細菌以外の菌を用いた硝化脱窒にも用いられている。このため、取り扱いのノウハウが蓄積されており、又、試薬の供給性も高く、容易に用いることが可能である。
【００２２】
また、従来のＡＦ４菌のＣ源として用いている酢酸ナトリウムは、アルカリ性であるため処理対象水中のＮＨ4−ＮがＮＨ3として放散する割合が高くなっていた。このため、連続試験中は、Ｈ2ＳＯ4等により、ｐＨを８．０前後まで低減する必要があった。しかしながら、酢酸は酸性であるため、ＮＨ4−Ｎに対して必要量（ＣＭ：約３〜７程度）添加すると処理対象水が酸性となってしまい、他の菌の増殖並びにＡＦ４菌の活性が低下してしまうという問題があった。
これに対して、Ｃ１化合物であるメタノールはｐＨ調整の必要がなく、処理対象水中のｐＨはＡＦ４菌に対して適正な範囲とすることが可能である。このため、ｐＨ調整の手間が減り、コストを削減できる。
【００２３】
なお、上述の実施の形態においては、硝化脱窒を行わせるＡＦ４菌の培養の例について記載したものの、それ以外のアルカリゲネス属細菌の培養についても応用可能である。
また、本実施形態の培養法で培養した微生物に硝化脱窒を行わせるのではなく、フェノールやエチレングリコール等の有害有機物を分解させることも可能である。
また、本実施形態の培養法で培養したアルカリゲネス属細菌により、酸性発酵等を行わせ、食品、化粧品、香料、医薬品等の有用な化合物を生成させることも可能である。
【実施例】
【００２４】
次に図面に基づき本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
【００２５】
〔馴養培養〕
（菌の用意）
下記の表１、表２に示す成分を含有する培地（以下、単に「合成培地」という。各試薬は和光純薬工業株式会社製）を、純水２００ｍＬに溶解させた坂口フラスコに、２５％グリセリン保存液中、−８０℃にて保存しておいたアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）Ｎｏ．４株（FERM P-18114）を、２ｍＬの接種量で接種し、Ｎ源として硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4、和光純薬工業株式会社製）、Ｃ源として酢酸ナトリウム（酢酸Ｎａ、和光純薬工業株式会社製）をＣ／Ｎの割合が５．０となるよう添加し、温度３０℃、回転数約１００ｒｐｍ（１分間に１００〜１２０往復）で２４時間培養して、接種用のＡＦ４菌を用意した。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
【表２】
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【００２８】
（培養液の用意）
上述の合成培地に、下記の表３に示す各量のＮ源、Ｃ源等を添加し、実施例１〜実施例５の各系列の培養液を用意した。具体的には、各系列において、Ｎ源として硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4、和光純薬工業株式会社製）、及びＣ源として酢酸及び／又はメタノール（和光純薬工業株式会社製 ）を添加し、添加割合を変化させた。実施例１〜実施例５については、酢酸の添加割合を変更し、全Ｃ源中のメタノール割合を８８％〜９９％の５ケースとした培養液を用意した。また、比較例１として、Ｃ源にメタノールのみを添加した培養液を用意した。つまり、比較例１は、実施例１とメタノール添加量は同じであるものの、比較試験として酢酸を添加せず、メタノールを全Ｃ源中の１００％となるよう添加したものである。
なお、表３において、「ｇ−Ｎ／Ｌ」は、１Ｌあたりの窒素分（Ｎ）のグラム数を、「ｇ−Ｃ／Ｌ」は、１Ｌあたりの炭素分（Ｃ）のグラム数を示す。また、表３では、（１）酢酸と（２）メタノールそれぞれに対して、Ｃ／Ｎの比率、全Ｃ源（１００％）中のＣ比についても示している。また、Ｎ源とＣ源との合計についてのＣ／Ｎ比についても示している。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
（培養方法）
馴養培養において、１回目は、上述の方法で用意された接種用のＡＦ４菌を、上述の実施例１〜実施例５、比較例１の培養液を含む坂口フラスコに２ｍＬの接種量で接種して合計２００ｍＬとし、温度３０℃、回転数約１００〜１２０ｒｐｍ、水平振動（初期は旋回振動）で、２４時間培養した。その後、２回〜１０回目の馴養培養では、前の馴養培養後の培養液を５００ｒｐｍ、１分で遠心分離し、沈殿したペレットを２ｍＬの合成培地で再懸濁し、それぞれ同じ組成の培養液に接種、合計２００ｍＬとして、同様に２４時間培養した。実施例１〜実施例５、比較例１とも、この馴養培養を合計で１０回、行った。
【００３１】
（菌数確認）
馴養培養において、実施例１〜実施例５、比較例１の各培養液について、接種用の菌の用意時と、１〜１０回の各馴養培養の終了時に菌数を確認した。この菌数の確認は、２４時間の馴養培養の終了後の溶液を１ｍＬ取得し、１／１０〜１／１０10の複数の希釈系列を作成して、アガープレート上でのコロニー数を目視して計測した。具体的には、上記の菌の用意時と同じＣ／Ｎが５．０の合成培地に１．５％アガーを加えたアガープレートそれぞれに、各希釈系列の培養液を１ｍＬずつ播種して１日、３０℃のインキュベーター内で培養し、その後、コロニー数を目視で計測し、ｃｆｕ（colony forming unit）を算出した。
【００３２】
〔本培養〕
（培養液の用意）
本培養においては、上述の合成培地にＮ源として硫酸アンモニウムを添加して本培養を行ったもの（以下、「硫酸アンモニウム添加系列」という。）と、Ｎ源としてメタン発酵消化液中のＮ成分を利用したもの（以下、「メタン発酵消化液系列」という。）の二種類の系列を用意して増殖実験を行った。
【００３３】
（硫酸アンモニウム添加系列）
下記の表４によると、硫酸アンモニウム添加系列においては、実施例６〜１０の各系列の培養液として、上述の合成培地に、表４に示す各割合でＮ源として硫酸アンモニウムを２．０ｇ（０．４２ｇ−Ｎ／Ｌ）、Ｃ源として酢酸及びメタノールを添加した。また、比較例２は、Ｃ源を添加しないネガティブ・コントロールの培養液である。
具体的に説明すると、実施例６は、メタノール添加量を１５ｍＬ／Ｌ（Ｃ／Ｎの割合が１０．５）とした系列である。実施例７は、実施例６のメタノール添加量と同量で、酢酸を０．５ｇ／Ｌ（Ｃ／Ｎの割合が０．３４）添加して比較した系列である。実施例８は、メタノールを３０ｍＬ／Ｌ添加したのみの系列である。実施例６と実施例８との違いは、メタノール添加量について、実施例６が１５ｍＬ／Ｌ（Ｃ／Ｎの割合が１０．５）に対して、実施例８が２倍量の３０ｍＬ／Ｌ（Ｃ／Ｎの割合が２１．０）とした点である。実施例９、実施例１０は、実施例８の比較試験として少量の酢酸を添加したものである。実施例９は１．０ｇ／Ｌ（Ｃ／Ｎの割合が０．６９）、実施例１０は０．５ｇ／Ｌ（Ｃ／Ｎの割合が０．３４）、添加した。
【００３４】
【表４】
2015204816.tif 000006
【００３５】
（メタン発酵消化液系列）
下記の表５によると、メタン発酵消化液系列においては、当業者に通常用いられている下水処理施設のメタン発酵消化液（個液分離なし）の原液１００ｍＬに、Ｃ源としてメタノール１００％として、その添加量を１０ｍＬ／Ｌ〜２．５ｍＬ／Ｌの範囲に変化させた実施例１１〜実施例１３、比較例３の各系列の培養液を用意した。各培養液のＮ源は、原液中のＮＨ4Ｎ−Ｎ（１．５ｇ−Ｎ／Ｌ）となる。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
（培養方法と菌数の確認）
本培養の硫酸アンモニウム添加系列の実施例６〜実施例１０、比較例２の各培養液を含む坂口フラスコに、５回、２４時間の馴養培養を行った時点の実施例４のＡＦ４菌を２ｍＬ接種し、合計で２００ｍＬとした。また、本培養のメタン発酵消化液系列の実施例１１〜１３、比較例３の各培養液については、同様に、５回、２４時間の馴養培養を行った時点の実施例４のＡＦ４菌を１ｍＬ加えて接種し、合計で１００ｍＬとした。接種後、実施例６〜実施例１３、比較例２〜３の各培養液を、上述の馴養培養と同様に、温度３０℃、回転数約１００〜１２０ｒｐｍ、水平振動（初期は旋回振動）で培養し、時間経過とともに菌数の挙動を確認した。具体的には、１日毎に各フラスコから１ｍＬずつ培養液を取得して、上述の馴養培養の希釈系列と同様のアガープレートにそれぞれ播種して、ｃｆｕを目視で測定した。なお、メタン発酵消化液系列においては、ＡＦ４菌は培養後にほぼモノカルチャーの状態となるため、コロニー数で菌数を算出可能である。加えて、各希釈系列の菌数確認においては、コロニーの形状や色等を目視、菌の再培養等により、ＡＦ４菌であることを確認した。
【００３８】
〔培養結果〕
（馴養培養の結果）
図１により、馴養培養の実施例１〜実施例５、比較例１において、メタノールと酢酸濃度を変化させた際の菌数確認の結果について説明する。
図１は、１回目〜１０回目の馴養培養において、測定した菌数を示すグラフである。図１の横軸は、菌の用意時を０（日）として、１回の馴養培養を２４時間（１日）として、１０回目までの経過時間（日数）を示す。縦軸は、算出された菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を示す。縦軸の「１．００Ｅ＋０２」等は、１．０×１０2等を示す値である。実施例１〜実施例５において、メタノールの割合がＣ源全体で９９％以下（８８％〜９９％）の場合には、ＡＦ４菌の増殖傾向が見られた。
しかしながら、比較試験として行った比較例１のように、５回目の馴養培養でメタノール１００％のみ添加した場合には、ＡＦ４菌の増殖は見られなかった。これは、メタノールによる増殖の阻害を受けて、菌数が減少したことが考えられる。ここで、比較例１のメタノール添加割合は、培養液に対して３．５容積％である。図示しないものの、メタノール阻害条件を把握するために比較した試験でも、同様に、培養液に対してメタノールのみ３．５容積％〜１５．０容積％添加した場合は、菌数の減少が見られた。
つまり、馴養培養における実施例１〜実施例５のように、メタノールだけを添加した場合ではＡＦ４菌が増殖しない量のメタノールに、少量の酢酸等の有機酸を添加して培養することで、菌を増殖させることが可能となる。この場合、実施例１〜実施例５では、酢酸を利用し消費されると、次にメタノールを利用することが可能になるのではないかと予想される。
【００３９】
（本培養、硫酸アンモニウム添加系列の結果）
図２により、本培養の硫酸アンモニウム添加系列の実施例６〜１０、比較例２においてメタノールと酢酸濃度を変化させた際の菌数確認の結果について説明する。
図２は、本培養の硫酸アンモニウム添加系列で測定した菌数を示すグラフである。実施例６〜実施例１０において、メタノール添加の割合がＣ換算で９６．８％以上でも増殖が見られた。なお、Ｃ源を添加していない比較例２では、菌の増殖は見られないため、グラフに示していない。また、メタノール添加量が同量の実施例６と実施例７とを比較すると少量酢酸を添加した実施例７はすぐに増殖して、１０7［ｃｆｕ／ｍＬ］以上の菌数となった。また、メタノールだけを添加した実施例６については、数日間増殖は見られないものの、５日目あたりから増殖傾向が見られた。同様にメタノールだけを添加した実施例８も、実施例６と同じ傾向を示し、１０日目あたりから、１０7［ｃｆｕ／ｍＬ］程度まで増殖した。実施例９、１０は、実施例８と比較すると、すぐに増殖を開始し、１０7［ｃｆｕ／ｍＬ］程度まで増殖した。
以上の結果をまとめると、本培養において、馴養培養を５回行った実施例４のＡＦ４菌は、メタノール１００％のみを添加しても増殖可能であった。また、メタノール１００％を添加するよりも、少量の酢酸を添加した方が、培養開始時点から増殖が見られた。これに対して、メタノール１００％添加した場合には、数日間増殖せず、一定の期間を経てから増殖する傾向が見られた。
【００４０】
なお、図示しない他の培養実験の結果によると、馴養培養の回数が５回未満のＡＦ４菌を本培養に使用した場合、いずれのメタノール及び酢酸の添加量の割合でも菌の増殖の速度が遅く、又、メタノールのみ添加した場合には菌が増殖しないこともあった。
また、馴養培養の回数が６回〜１０回のＡＦ４菌を本培養に使用した場合、菌の増殖の速度の傾向は、５回馴養培養したものと同様だった。
【００４１】
（本培養、メタン発酵消化液系列の結果）
図３により、本培養のメタン発酵消化液系列の実施例１１〜１３、比較例３においてメタノールと酢酸濃度を変化させた際の菌数確認の結果について説明する。
図３は、本培養のメタン発酵消化液系列で測定した菌数を示すグラフである。実施例１１〜１３、比較例３においては、すべてメタノールのみを添加したものの、添加量が異なっている。実施例１１〜１３は、十分なＣ源があったものとみられ、ＡＦ４菌の増殖が見られた。比較例３は、Ｃ源が全溶液中の０．２５容積％未満であり少なく、十分なＡＦ４菌の増殖が見られなかったため、グラフに示していない。
実施例１１〜１３については、本培養開始時の菌数は、１０5［ｃｆｕ／ｍＬ］であったが、各ケースとも４日目には１０7［ｃｆｕ／ｍＬ］程度まで増殖し、７〜９日目には１０8〜１０9［ｃｆｕ／ｍＬ］まで増殖したことが確認できた。原液の中には、他の菌も多数存在するが、培養条件及びコロニー形状等から判断すると、多数がＡＦ４菌と考えられる。このため、硫酸アンモニウム（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加した場合と同様に、メタノールをＣ源として利用し、ＡＦ４菌を増殖させられることが確認できた。よって、本実施例の馴養培養されたＡＦ４菌を用いて、Ｃ源としてメタノールを添加して、実際にメタン発酵消化液を脱窒することが可能となる。
【００４２】
（Ｃ１化合物により本実施形態の微生物が増殖する理由の考察）
本実施形態の微生物による代謝経路として、ＴＣＡ回路（Tricarboxylic Acid Cycle ）があり、その中で１モルのピルビン酸ＣＨ3ＣＯＣＯＯＨからは１５モルのＡＴＰが生成される。ＡＴＰは、全ての生物の細胞内に存在し、細胞の生命活動に必要なエネルギー源である。つまり、ＡＴＰが増加するということは、当回路が機能的に作用しＡＦ４菌がメタノールで増殖することの裏付けとなる。ただし、メタノール阻害濃度以上になるとＡＴＰも減少する。このため、本培養時のメタノールの添加濃度は、阻害濃度以下である３．５％（ｖ／ｖ）にすることが好適であると考えられる。
【００４３】
以上の馴養培養及び本培養の結果をまとめると、メタノールに少量の酢酸を添加した混合Ｃ源を用いて、複数回、好ましくは５回以上の馴養培養を行うことで、メタノールを利用する性質を有するＡＦ４菌を培養することが可能となる。これは、少量の酢酸を添加することで増殖のスターターの役割を果たし、それ以降メタノールを利用する現象が起きたと考えられる。
これらの結果から、馴養培養を行ったアルカリゲネス属の細菌を、下水や産業廃水等の消化処理後の液に投入して、菌を素早く増殖の対数期に移行させ、効率的に脱窒等により有害有機物を分解させることが可能となる。
また、メタノールは、抗菌性も有することから、増殖の阻害要因となることもある。上述の実施例では、培養液量に対して、メタノールを３．５％以上添加すると、ＡＦ４菌が増殖せず減少することが確認できた。このため、本実施例の結果から、メタノールをＣ源とする場合、添加Ｃ／Ｎを高めすぎない最適なメタノール添加量により、増殖速度を高めることが可能となる。
【００４４】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の培養方法は、アルカリゲネス属の細菌にＣ源としてメタノールを加えて増殖させ、硝化脱窒を行わせることでコストを削減し、産業上に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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