(57)【要約】【課題】植物リグナンを資化してエンテロラクトンおよびエンテロジオールを高収率で生産する腸内細菌の組み合わせおよびその利用を提供する。【解決手段】植物リグナンを資化してエンテロジオールを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌に加えてセコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせにより、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌により植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率でエンテロジオールを得ることが出来る。前記腸内細菌の組み合わせに加えて、エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌を含むことで、前記腸内細菌の組み合わせにより植物リグナンからエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率でエンテロラクトンを得ることが出来る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物リグナンを資化してエンテロジオールを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌と、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌とを含み、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌により植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロジオールを製造することが出来る前記腸内細菌の組み合わせ。
【請求項２】
セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌がＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＥｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせである、請求項１の組み合わせ。
【請求項３】
植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属するヒトの腸内細菌である、請求項１又は２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
植物リグナンを資化してエンテロラクトンを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせに加えて、エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌を含み、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせにより植物リグナンかエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロラクトンを製造することが出来る前記腸内細菌の組み合わせ。
【請求項５】
エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌が、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属に属するヒトの腸内細菌である、請求項４に記載の腸内細菌の組み合わせ。
【請求項６】
セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）において寄託された、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２１号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ−１２２０株、及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２０号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ. ＳＤＧ１１１０株であり、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８１９号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ１０２０株であり、又はエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌が受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８４１号（受領日２０１４年４月８日）のＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｓｐ. ＳＤＧ４２１０株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項７】
植物リグナンからエンテロラクトンへの収率が８０％以上である請求項４又は５に記載の組み合わせ。
【請求項８】
エンテロラクトン又はエンテロジオールの発酵生産のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の組み合わせを含む食品。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか１項に記載の組み合わせを含む医薬組成物。
【請求項１１】
植物リグナンを、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腸内細菌の組み合わせと共に培養することを特徴とする、エンテロジオールの製造方法。
【請求項１２】
植物リグナンを、請求項４または５に記載の腸内細菌の組み合わせと共に培養することを特徴とする、エンテロラクトンの製造方法。
【請求項１３】
セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）において寄託された、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２１号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ−１２２０株、及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２０号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ. ＳＤＧ１１１０株であり、植物リグナンからセコイソラリシレジノ−ルを生産する腸内細菌が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８１９号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ１０２０株であり、又はエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌が受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８４１号（受領日２０１４年４月８日）のＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｓｐ. ＳＤＧ４２１０株である、請求項１１または１２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物リグナンを資化してエンテロラクトンおよびエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物リグナンは植物に含まれている化合物群の一種であり、植物リグナンからはヒトの腸内菌叢の作用で、エンテロラクトンやエンテロジオールが産生される。エンテロラクトンやエンテロジオールは哺乳類リグナンとも呼ばれている。
閉経した女性において、リグナンの摂取量と女性乳癌リスクの低さとが相関することが報告されている（非特許文献１）。特に、血漿中のエンテロラクトン濃度が高い乳癌患者ほど、死亡率が低いことが報告されている（非特許文献２）。
また、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺がん細胞株）にエンテロラクトンを添加した場合、細胞増殖抑制を示し、エンテロラクトンが前立腺癌細胞抑制作用を示唆するデ−タが得られている。（非特許文献３）
さらに腎炎の治療のためのエンテロラクトンを有効成分として含む組成物が開示されている（特許文献１）。
このようにリグナンの中でも哺乳類リグナンは脂質代謝改善効果、癌予防を始めとして健康機能に多大な効用をもたらしていると考えられている。
植物リグナンを経口摂取した場合、腸内細菌により体内で結果的にエンテロラクトンやエンテロジオールが産生されることになるが、腸内細菌の活性には個人差があり、十分な効果が得られない場合がある。これに対し植物リグナンでなく、直接エンテロラクトンやエンテロジオールを摂取すればより確実にこれらの成分の効能を享受ことが可能である。
しかしながら化学合成的手法により植物リグナンをエンテロラクトンやエンテロジオールに変換することは容易ではない。従って植物リグナンを生物学的手法により高効率にエンテロラクトンを産生する方法が望まれている。
ここで、腸内細菌による植物リグナンからのエンテロラクトン及びエンテロジオールの産生については、代表的な植物リグナン、セコイソラリシレジノールジグルコシド(ＳＤＧ)からエンテロラクトンが産生される各代謝経路、つまりセコイソラリシレジノールジグルコシドからセコイソラリシレジノール、エンテロジオールを介しエンテロラクトンが産生される各経路に関与するヒト糞便中における腸内細菌を同定した結果が報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。しかしこれらの報告は代謝に関与する腸内細菌の解析を行うに留まるものであり、各代謝経路の産生効率などは不明である。
従って、植物リグナンから高効率にエンテロラクトン及びエンテロジオールを産生する方法はいまだ見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１７２９６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｍ. Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｎｕｔｒ. ９２巻１４１−１５３頁(２０１０)
【非特許文献２】Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ １８巻, １８５−１９３頁 (２０１１)
【非特許文献３】Ｍｏｌ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ ５２巻, ５６７−５８０頁 (２００８)
【非特許文献４】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｅｃｏｌ ５５巻, ４７１−４７８頁 ２００６
【非特許文献５】Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７１巻, ６０７７−６０８５頁  ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の課題は、植物リグナンから高収率にエンテロラクトン及びエンテロジオールを産生する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌に加えてセコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する特定の腸内細菌を組み合わせたところ、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌により植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率でエンテロジオールを得ることが出来ることを見いだした。
また、植物リグナンからエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせに加えてエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する特定の腸内細菌の組み合わせを含むことで、植物リグナンからエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせにより植物リグナンからエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率でエンテロラクトンを得ることが出来る前記腸内細菌の組み合わせを見いだし、本願発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）  植物リグナンを資化してエンテロジオールを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌と、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌とを含み、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌により植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率で、植物リグナンからエンテロジオールを製造することが出来る前記腸内細菌の組み合わせ。
（２）セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせがＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＥｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせである、前記（１）の組み合わせ。
（３）植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属するヒトの腸内細菌である、前記（１）又は（２）に記載の組み合わせ。
（４）植物リグナンを資化してエンテロラクトンを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組み合わせに加えて、エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌を含み、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組み合わせにより植物リグナンからエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロラクトンを製造することが出来る前記腸内細菌の組み合わせ。
（５）エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌が、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属に属するヒトの腸内細菌である、前記（４）に記載の腸内細菌の組み合わせ。
（６）セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）において寄託された、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２１号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ−１２２０株、及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２０号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ. ＳＤＧ１１１０株であり、植物リグナンからセコイソラリシレジノ−ルを生産する腸内細菌が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８１９号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ１０２０株であり、又はエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌が受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８４１号（受領日２０１４年４月８日）のＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｓｐ. ＳＤＧ４２１０株である、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（７）植物リグナンからエンテロラクトンへの収率が８０％以上である前記（４）又は（５）に記載の組み合わせ。
（８）エンテロラクトン又はエンテロジオールの発酵生産のための前記（１）〜前記（７）のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（９）前記（１）〜（８）いずれか１項に記載の組み合わせを含む食品。
（１０）前記（１）〜（８）いずれか１項に記載の組み合わせを含む医薬組成物。
（１１）植物リグナンを、前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の腸内細菌の組み合わせと共に培養することを特徴とする、エンテロジオールの製造方法。
（１２）植物リグナンを、前記（４）または前記（５）に記載の腸内細菌の組み合わせと共に培養することを特徴とする、エンテロラクトンの製造方法。
（１３）セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）において寄託された、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２１号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ−１２２０株、及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２０号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ. ＳＤＧ１１１０株であり、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８１９号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ１０２０株であり、又はエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌が受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８４１号（受領日２０１４年４月８日）のＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｓｐ. ＳＤＧ４２１０株である、前記（１１）または（１２）記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本願発明の腸内細菌の組み合わせを使用することにより、植物リグナンからエンテロラクトン及びエンテロジオールを高い収率で得ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】植物リグナンの一種であるセコイソラリシレジノールジグルコシドの腸内細菌による代謝経路を示したものである。
【図２】セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ） １２ｍｇ／ｌ、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ） １１ｍｇ／ｌ、エンテロジオール（ＥＤ） １３ｍｇ／ｌ及びエンテロラクトン（ＥＬ）１２ｍｇ／ｌを含む標準物質のＨＰＬＣ分析結果である。
【図３】ＳＤＧ１０２０株のみによってセコイソラリシレジノールジグルコシドを資化した場合のＨＰＬＣ分析結果である。
【図４】ＳＤＧ１０２０株、ＳＤＧ１１１０株及びＳＤＧ１２２０株の三株混合によってセコイソラリシレジノールジグルコシドを資化した場合のＨＰＬＣ分析結果である。
【図５】ＳＤＧ１０２０株、ＳＤＧ１１１０株、ＳＤＧ１２２０株及びＳＤＧ４２１０株の四株混合によってセコイソラリシレジノールジグルコシドを資化した場合のＨＰＬＣ分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
セコイソラリシレジノールジグルコシドの腸内細菌による代謝経路を図１に示す。セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）はまずセコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ）に代謝され、エンテロジオール（ＥＤ）を経てエンテロラクトン（ＥＬ）に代謝される。
【００１０】
本発明の第一の実施態様は、植物リグナンを資化してエンテロジオールを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌と、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌とを含み、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌により植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロジオールを製造することが出来る前記腸内細菌の組み合わせである。
上記本発明は、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌と、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌とを含む点に特徴を有しており、このような組み合わせとすることで、植物リグナンからセコイソラリシレジノ−ルを生産する腸内細菌により植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロジオールを製造することが出来るものである。つまり、各細菌はそれぞれ単独により各工程を行うことができることが知られているが、これらを組み合わせることにより、何らかの相互作用が生じて相乗効果が発揮され、各細菌単独による収率よりも顕著に高い収率でエンテロジオールを生産することができたものである
【００１１】
本発明の第二の実施態様は、植物リグナンを資化してエンテロラクトンを生産する為の腸内細菌の組み合わせであって、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌と、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌と、エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌とを含み、植物リグナンからエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせにより植物リグナンからエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロラクトンを製造することが出来る前記腸内細菌の組み合わせである。
上記本発明は、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌と、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌とエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌とを含む点に特徴を有しており、このような組み合わせとすることで、植物リグナンからエンテロジオールを生産する腸内細菌の組み合わせにより植物リグナンからエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率で植物リグナンからエンテロラクトンを製造することが出来るものである。つまり、各細菌はそれぞれ単独により各工程を行うことができることが知られているが、これらを組み合わせることにより、何らかの相互作用が生じて相乗効果が発揮され、各細菌単独による収率よりも顕著に高い収率でエンテロラクトンを生産することができたものである。
【００１２】
本発明の腸内細菌の組み合わせにおいて、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌は特に限定されず、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属やＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属するヒトの腸内細菌が挙げられるが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属するヒトの腸内細菌が好ましい。
【００１３】
本発明の腸内細菌の組み合わせにおいて、セコイソラリシレジノールからエンテロジオ−ルを生産する腸内細菌の組み合わせはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＥｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせである。
【００１４】
本発明の腸内細菌の組み合わせにおいて、エンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌は、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属に属するヒトの腸内細菌である。
【００１５】
本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌には以下の菌学的性質を有するものが含まれる。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌  (０.６−０.７×１.５−２.５μｍ)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリ−ム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:波状
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応  −
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋
【００１６】
本発明のＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌には以下の菌学的性質を有するものが含まれる。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌（０.７−０.８×１.５−２.０μm)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:全縁
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応  −
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋
【００１７】
本発明のＥｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属菌には以下の菌学的性質を有するものが含まれる。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌  (０.６−０.７×１.２−１.５μｍ)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:全縁
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応 ＋
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  −
【００１８】
本発明のＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属菌には以下の菌学的性質を有するものが含まれる。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌  (０.９−１.０×１.２−１.５μｍ)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:全縁
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応  −
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋W (反応弱い)
【００１９】
本発明の腸内細菌の組み合わせにおける腸内細菌の１例として、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールを生産する腸内細菌としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）において寄託された、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２１号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ−１２２０株、及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８２０号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ. ＳＤＧ１１１０株、植物リグナンからセコイソラリシレジノールを生産する腸内細菌としては、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８１９号（受領日２０１４年３月１２日）の Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ. ＳＤＧ１０２０株、又はエンテロジオールからエンテロラクトンを生産する腸内細菌としては受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ-０１８４１号（受領日２０１４年４月８日）のＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｓｐ. ＳＤＧ４２１０株があげられる。
【００２０】
本発明の腸内細菌の組み合わせによる植物リグナンからエンテロラクトンへの収率、すなわち出発原料である植物リグナンのモル数に対する生産されたエンテロラクトンのモル％は８０％以上であり、９０％以上であることが好ましく、９５％以上の割合であることがもっとも好ましい。
【００２１】
本発明の腸内細菌の組み合わせはエンテロラクトン又はエンテロジオールの発酵生産に使用できる。本発明において、「発酵生産」とは植物リグナン等の原材料と共に本発明の腸内細菌の組み合わせを含む微生物を共に培養する工程を含む生産方法を意味する。
【００２２】
本発明の他の態様として、植物リグナンを、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＥｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせを必須とする腸内細菌の組み合わせと共に培養することを特徴とする、エンテロジオ−ルの製造方法を提供する。本発明のエンテロジオ−ルの製造方法において、腸内細菌の組み合わせはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせを含むことが好ましい。
【００２３】
本発明の他の態様として、植物リグナンを、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属及びＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせを必須とする腸内細菌の組み合わせと共に培養することを特徴とする、エンテロラクトンの製造方法を提供する。本発明のエンテロラクトンの製造方法において、腸内細菌の組み合わせはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ属及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属及びＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属に属するヒトの腸内細菌の組み合わせを含むことが好ましい。
【００２４】
エンテロラクトン又はエンテロジオールの製造方法において、植物リグナンを腸内細菌の組み合わせと共に培養する方法としては、本発明の腸内細菌の組み合わせを含む培地に植物リグナンを添加し、通常静置若しくは撹拌培養により、例えば、温度２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４５℃で嫌気条件下培養する。植物リグナンは、例えば滅菌水に溶解し、終濃度０．０１〜１０ｍＭで添加することができる。本発明の腸内細菌の組み合わせの各初発菌数は、好ましくは１０5−１０10個／ｍｌ程度である。培養時間は、６〜１２０時間、好ましくは１２〜９６時間である。
【００２５】
本願発明において、植物リグナンとは植物に含まれている化合物群の一種であり、ベンゼン環（Ｃ６)に直鎖状プロパン(Ｃ３)が結合したＣ６-Ｃ３単位が２〜４単位結合した構造を有する。本願発明の製造方法において、植物リグナンは公知の方法で植物原料から抽出、精製することによって得ることができる。または公知の方法で化学合成により得ても良い。植物原料としては、陸上植物であれば特に制限されず、亜麻仁（亜麻種子）やゴマ、ライ麦、小麦、エン麦、大麦などの穀物、大豆などの豆類、チョウセンゴミシ果実のような一部の果実、ブロッコリー、ケールなどが挙げられる。植物リグナンは特に限定されないが、ピノレシノール、ラリシレシノール、セコイソラリシレシノール、マタイレシノール、ヒドロキシマタイレシノール、シリンガレシノール、セサミン、アルクチゲニンおよびそれらの配糖体を挙げることができ、好ましくはセコイソラリシレジノールおよびその配糖体であるセコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ）である。
【００２６】
ＳＤＧは化学合成により得ることが出来る他、亜麻種子から公知の方法で抽出、精製して得ることが出来る。
例えば、亜麻種子をミキサー、ホモジナイザーなどの粉砕機で粉砕する。用いる亜麻種子は国内産、外国産などの産地や栽培用、搾油用の品種を問わず使用でき、焙煎、非焙煎の処理の有無に関係なく原料として使用できる。また搾油工程で産生するアマニ粕を原料としても良い。粉砕物をn−ヘキサン等の脂溶性有機溶媒抽出分を除去し、脱脂物としても良い。ＳＤＧが抽出可能な低級アルコール（エタノール、メタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノールなど）、又はその含水アルコールで抽出し、必要であればケン化処理、中和を行い、吸着剤としてオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）、シリカゲルなどを使用して、分画、精製することが出来る。
【００２７】
本発明の他の態様として、本発明の腸内細菌の組み合わせを含む食品が提供される。本発明の食品において、腸内細菌の組み合わせの配合割合は、食品の形態や摂取継続性等に応じて適宜選択することができ、特に限定されない。
【００２８】
食品の形態としては、例えば、乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等が挙げられる。
【００２９】
前記食品には、糖類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、香料、またはこれらの混合物等の通常食品の添加物として用いられる添加物を添加することもできる。
【００３０】
本発明の他の態様として、本発明の腸内細菌の組み合わせを含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は当業者に公知の方法で医薬組成物として調製することにより製造することができる。例えば、本発明の腸内細菌の組み合わせを薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて混和することによって製剤化することができる。経口投与用には、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。本発明の腸内細菌の組み合わせを含む医薬組成物は、有効成分として腸内細菌の組み合わせの他に、薬理作用を有する他の公知の成分を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の腸内細菌の組み合わせを含む医薬組成物の経口摂取量は、投与期間やその継続性等に応じて所望の効果が得られるよう適宜選択できる。投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回に１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与することができる。
【実施例】
【００３２】
（菌の探索及び同定）
１．ヒト糞便（腸内細菌の混合物）をＧＡＭ糖分解液に１０倍希釈し、変法ＧＡＭ 寒天培地（日水製薬）で３７℃、８５時間、嫌気培養した。
２．得られたコロニー約１０００個について、ＧＡＭ糖分解培地にDMSOを加えてDMSO濃度１０％に調製し、−８０℃で保管し菌（コロニー）のストックを作成した。
３．菌のストックをＧＡＭ糖分解用半流動培地２００μlに接種し、セコイソラリシレジノールジグルコシド、（純度９８.３％、終濃度１２５μg／ml）を添加混合し、３７℃、８５時間、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで嫌気培養した。
４．反応終了後、半流動培地にメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて１mlに調製し、１８０秒間ボルテックスしたあと、フィルター濾過し、ろ液をフォトダイオードアレイ搭載のＨＰＬＣで分析し、エンテロジオール、エンテロラクトンの産生を確認した。
５．エンテロジオール、エンテロラクトンへの資化活性があった菌のストック約２０を選抜し、ＧＡＭ糖分解液で１０倍希釈し、変法ＧＡＭ 寒天培地（日水製薬）で嫌気培養（３７℃、８５時間）して増殖させた後、ＧＡＭ糖分解培地にDMSOを加えてDMSO濃度１０％に調製し、−８０℃で保管し、菌のストックを作成した。
６．５で得られた約２０の菌のストックから３つのストックの組合せを作製し、各組合せを培養することで、セコイソラリシレジノールからエンテロジオールへの変換を認めた菌の組合せを１組見つけた。その組み合わせに含まれる菌についてさらにスクリーニングを行い３種の菌（ＳＤＧ１０２０株、ＳＤＧ１１１０株及びＳＤＧ１２２０株）を同定した。さらに３菌のうち、ＳＤＧ１１１０株及びＳＤＧ１２２０株は活性が強く表現型が安定していた。
７．６．で得られた３種の菌をシングルコロニー化し、１菌種ずつＳＤＧと反応させるとそのうちの１つ（ＳＤＧ１０２０株）にＳＤＧの脱グルコシド活性が認められ、セコイソラリシレジノールへの変換が認められた。
８．６．で得られた３種の菌と、上記「５．」で選抜された約２０のコロニーの各１コロニーずつとを組み合わせて、エンテロジオールからエンテロラクトンへの変換活性のある菌を見出した（ＳＤＧ４２１０株）。
【００３３】
ＳＤＧ１０２０株、ＳＤＧ１１１０株、ＳＤＧ１２２０株及びＳＤＧ４２１０株は、変法ＧＡＭ寒天培地 (日水製薬)にて、培養後、顕微鏡による形態観察、変法ＧＡＭ寒天培地におけるコロニー性状観察、グラム染色、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸産生試験 (嫌気性菌用血液寒天平板発酵法)を行うともに、培養温度３０度、３７度、または４５度において生育試験を行った。
【００３４】
ＳＤＧ−１０２０株は以下の菌学的性質を有する。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌  (０.６−０.７×１.５−２.５μm)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調:クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:波状
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応 −
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して遺伝子解析を行い菌の同定を行った。ＤＤＢＪのデータベースでｂｌａｓｔｎを利用して相同性の高い菌を検索したところ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  sp. ＳＤＧ１０２０株はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ ｉｓｏｌａｔｅ Ｍ９１ (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ: ＡＹ６９９２８８ ) の １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４５０個のうち４５０個が一致した(１００％) よって本菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属すると考えられる。
【００３５】
ＳＤＧ−１２２０株は以下の菌学的性質を有する。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌（０.７−０.８×１.５−２.０μm)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:全縁
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度:バター様
カタラーゼ反応  −
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して遺伝子解析を行い菌の同定を行った。ＤＤＢＪのデータベースでｂｌａｓｔｎを利用して相同性の高い菌を検索したところ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ. ＳＤＧ−１２２０株は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ ＫＩＳＴ６１２ (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ: ＣＰ００２２７３) の １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４５５個と比較して４３２個が一致した(９４％) よって本菌は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する新規な菌種であると考えられる。
【００３６】
ＳＤＧ−１１１０株は以下の菌学的性質を有する。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌  (０.６−０.７×１.２−１.５μｍ)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:全縁
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応 ＋
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  −
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して遺伝子解析を行い菌の同定を行った。ＤＤＢＪのデータベースでｂｌａｓｔｎを利用して相同性の高い菌を検索したところ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ. ＳＤＧ１１１０株は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＤＳＭ ２２４３ (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ: ＣＰ００１７２６) の １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の４６７個と比較して４６６個が一致した(９９％) よって本菌は、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ 属に属すると考えられる。
【００３７】
ＳＤＧ−４２１０株は以下の菌学的性質を有する。
グラム陽性・陰性: グラム陽性桿菌  (０.９−１.０×１.２−１.５μｍ)
３０度、３７度及び４５度で生育
胞子の有無  −
運動性  −
変法ＧＡＭ寒天培地でのコロニー形態:
色調: クリーム色
形: 円形
隆起状態: レンズ状
周縁:全縁
表面の形状など:,スムーズ
透明度:不透明
粘稠度: バター様
カタラーゼ反応 −
オキシダ−ゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋W (反応弱い)
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して遺伝子解析を行い菌の同定を行った。ＤＤＢＪのデータベースでｂｌａｓｔｎを利用して相同性の高い菌を検索したところ、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｓｐ. ＳＤＧ４２１０株はＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ ｌｏｎｇｏｖｉｆｏｒｍｉｓ ＥＤ−Ｍｔ６１／ＰＹＧ−ｓ６T ( ＤＳＭ １７４５９T)(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ: ＤＱ１００４４９) の １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４３５個と比較して４３５個が一致した(１００％) よって本菌は、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属に属すると考えられる。
【００３８】
（資化能の検討）
上記の通り単離及び同定した腸内細菌について（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 sp.ＳＤＧ−１０２０株（２）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１０２０株、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属株 ｓｐ.ＳＤＧ−１１１０株及びＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１２２０株の三株混合（３）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 sp. ＳＤＧ−１０２０株、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１１１０株、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１２２０株及びＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属菌 ｓｐ. ＳＤＧ−４２１０株の四株混合の資化能を検討した。
各株それぞれ２×１０8〜1×１０9個を白金耳でＧＡＭ糖分解用半流動培地２００μlに接種し、９８.３％の純度のセコイソラリシレジノールジグルコシドを滅菌水に溶解し５ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを５μL添加し（終濃度１２５μｇ／ｍｌ＝１７４．５７μｍｏｌ／Ｌ）、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、８５時間インキュベーションを行った。反応終了後、メタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて１ｍＬに調整し、１８０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液をフォトダイオードアレイ搭載のＨＰＬＣで以下の条件で分析し、リグナン類の分析を行った。
【００３９】
ＨＰＬＣ 条件：
（移動相）メタノール:酢酸:水＝３４:０.５:６５.５
（カラム）資生堂カプセルパックＭＧ  ２４０ｍｍ×４.６ｍｍ
（検出器）ＪＡＳＣＯ ＰＤＡ ＭＤ−２０１８  検出波長２８０ｎｍ
（流量）１ｍＬ／ｍｉｎ
（カラム温度）４０度
【００４０】
セコイソラリシレジノールジグルコシド（ＳＤＧ） １２ｍｇ／ｌ、セコイソラリシレジノール（ＳＥＣＯ） １１ ｍｇ／ｌ、エンテロジオール（ＥＤ） １３ｍｇ／ｌ及びエンテロラクトン（ＥＬ） １２ｍｇ／ｌを含む標準物質のＨＰＬＣ分析結果を図２に、上記（１）〜（３）のＨＰＬＣ分析結果をそれぞれ図３〜５に示した。ＨＰＬＣ分析により検出された産生リグナン類（ＳＥＣＯ，ＥＤ及びＥＬ）の各モル濃度及びＨＰＬＣ分析結果を元に収率（初発セコイソラリシレジノールジグルコシドのモル数に対する得られたセコイソラリシレジノール、エンテロジオール又はエンテロラクトンのモル％）をまとめたものを以下の表１から３に示した。
【００４１】
【表１】
2015204784.tif 000003
初発SDG濃度174.57μmol/L, ND：非検出
【００４２】
【表２】
2015204784.tif 000004
初発SDG濃度174.57μmol/L, ND：非検出
【表３】
2015204784.tif 000005
初発SDG濃度174.57μmol/L, ND：非検出
【００４３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１０２０株は、単独でセコイソラリシレジノールジグルコシドから出発して５１．３％以上のセコイソラリシレジノール生産能を有した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１０２０株、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属株 sp.ＳＤＧ−１１１０株及びＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１２２０株の３株の組み合わせにより、セコイソラリシレジノールジグルコシドから出発して、７９.８％以上のエンテロジオール生産能を示した。この結果からＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１０２０株によりセコイソラリシレジノールジグルコシドからセコイソラリシレジノールを生産する収率よりも高い収率を得ることが出来ることが示された。またこの３株の組み合わせではエンテロラクトンは産生しなかった。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 ｓｐ. ＳＤＧ−１０２０株、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１１１０株、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１２２０株及びＬａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ属菌 ｓｐ. ＳＤＧ−４２１０株の４株の組み合わせにより、セコイソラリシレジノールジグルコシドから出発して、９５.６％以上のエンテロラクトン生産能を示した。この結果からＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１０２０株、Ｅｇgｅｒｔｈｅｌｌａ属株 sp.ＳＤＧ−１１１０株及びＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌 ｓｐ.ＳＤＧ−１２２０株の３株の組み合わせによりセコイソラリシレジノールジグルコシドからエンテロジオールを生産する収率よりも高い収率を得ることが出来ることが示された。
【図１】
2015204784.tif 000006
【図２】
2015204784.tif 000007
【図３】
2015204784.tif 000008
【図４】
2015204784.tif 000009
【図５】
2015204784.tif 000010