(57)【要約】【課題】出芽酵母においても正常に機能し得る選択マーカーとして用いることが可能な遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法を提供する。【解決手段】亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、特定のコドンによってコードされており、かつ、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、特定のコドンによってコードされている遺伝子を、出芽酵母へ導入する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であって、上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子、が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴とする、出芽酵母の選択的培養方法。
【請求項２】
上記タンパク質内に存在するアルギニンの５０％以上が、ＡＧＡのコドンによってコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の出芽酵母の選択的培養方法。
【請求項３】
上記タンパク質内に存在するアラニンの５０％以上が、ＧＣＴのコドンによってコードされていることを特徴とする、請求項１または２に記載の出芽酵母の選択的培養方法。
【請求項４】
上記遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードしていることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の出芽酵母の選択的培養方法：
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
上記遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の出芽酵母の選択的培養方法：
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
上記培養は、無殺菌条件下にて行われることを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の出芽酵母の選択的培養方法。
【請求項７】
上記培地は、無殺菌の培地であることを特徴とする、請求項１〜６の何れか１項に記載の出芽酵母の選択的培養方法。
【請求項８】
亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であって、
上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、
上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされていることを特徴とする遺伝子。
【請求項９】
上記タンパク質内に存在するアルギニンの５０％以上が、ＡＧＡのコドンによってコードされていることを特徴とする、請求項８に記載の遺伝子。
【請求項１０】
上記タンパク質内に存在するアラニンの５０％以上が、ＧＣＴのコドンによってコードされていることを特徴とする、請求項８または９に記載の遺伝子。
【請求項１１】
以下の（１）または（２）のタンパク質をコードしていることを特徴とする、請求項８〜１０の何れか１項に記載の遺伝子：
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
以下の（３）または（４）のＤＮＡからなることを特徴とする請求項８〜１１の何れか１項に記載の遺伝子：
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、各種生物（例えば、微生物、細胞など）が、バイオ燃料の生産をはじめ、様々な有用物質の生産に利用されている。有用物質を生産するための生物の培養では、一般的に、目的の生物ではない生物を排除して、目的の生物のみを純粋培養している。純粋培養によって、目的の生物ではない生物による有害な物質の生産を防止することができる。また、純粋培養によって、目的の生物の量を増やすことができ、その結果、より効率的な有用物質の生産を実現することができる。
【０００３】
上記生物としては、例えば、大腸菌に代表される原核生物や、酵母に代表される真核生物が用いられている。それぞれの生物には独自の利点があり、目的に応じて使い分けられている。
【０００４】
真核生物である酵母は、原核生物とは異なる特徴的な物質代謝経路等を備えており、有用物質の生産において非常に有用な微生物であるといえる。そして、酵母を用いた有用物質の生産の場合においても、一般的に、酵母を純粋培養することによって有用物質を生産している。
【０００５】
従来から、酵母を純粋培養するための方法として、薬剤耐性マーカーを用いる方法（例えば、非特許文献１参照）、および、栄養要求性マーカーを用いる方法（例えば、非特許文献２参照）が利用されている。
【０００６】
例えば、薬剤耐性マーカーを用いる方法では、酵母に対して、所望の遺伝子と共に、薬剤耐性遺伝子が導入される。このとき、薬剤耐性遺伝子が導入された酵母は、薬剤を含む培地中であっても生育することができるが、薬剤耐性遺伝子が導入されていない酵母や不要な微生物は、薬剤を含む培地中では生育することができない。
【０００７】
そこで、薬剤を含む培地を用いて培養を行うことによって、目的とする酵母のみを純粋培養することができる。なお、薬剤耐性遺伝子としては、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子などを挙げることができる。
【０００８】
一方、栄養要求性マーカーを用いる方法では、まず、特定のアミノ酸の代謝（例えば、特定のアミノ酸の生産）に必要な遺伝子を破壊した酵母（栄養要求性変異株）を作製する。なお、当該酵母は、特定のアミノ酸が存在しない培地中では生育できない。
【０００９】
次いで、当該酵母に対して、所望の遺伝子と共に、特定のアミノ酸の代謝に必要な遺伝子が導入される。このとき、特定のアミノ酸の代謝に必要な遺伝子が導入された酵母は、当該アミノ酸を含まない培地中であっても生育することができるが、当該遺伝子が導入されていない酵母や不要な微生物は、当該アミノ酸を含まない培地中では生育することができない。
【００１０】
そこで、特定のアミノ酸を含まない培地を用いて培養を行うことによって、目的とする酵母のみを純粋培養することができる。
【００１１】
しかしながら、薬剤耐性マーカーを用いる方法、および、栄養要求性マーカーを用いる方法には、多くの問題点が存在する。
【００１２】
具体的に、薬剤耐性マーカーを用いる方法では、薬剤を含む培地を用いる必要がある。この場合、薬剤によって、培地のコストが上がるという問題点を有している。また、薬剤の種類によっては、人体や環境にとって有害になり得るという問題点を有している。また、薬剤を含む培地は、廃棄するときに薬剤を除去または無毒化する処理を必要とする場合がある。当該処理は、生物の培養にかかるコストを上げ、かつ、生物の培養に必要な処理を複雑化させるという問題点を有している。
【００１３】
つまり、薬剤耐性マーカーを用いる方法は、簡便、安全、かつ低コストにて生物を選択的に培養することができないという問題を有している。
【００１４】
また、栄養要求性マーカーを用いる方法では、まず、特定のアミノ酸の代謝に必要な遺伝子を破壊した酵母（栄養要求性変異株）を作製する必要がある。しかしながら、実用化されている酵母の多くは多倍体の酵母であって、細胞の中に複数の染色体（換言すれば、特定のアミノ酸の代謝に必要な複数の遺伝子）が存在する。
【００１５】
この場合、栄養要求性変異株を作製するためには、複数の遺伝子の全てを破壊する必要があるが、このような栄養要求性変異株の取得は、非常に困難である。
【００１６】
つまり、栄養要求性マーカーを用いる方法は、簡便に生物を選択的に培養することができないという問題を有している。
【００１７】
そこで、従来から、酵母などの有用生物に関して、新たな選択マーカーを用いた純粋培養の開発が進められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Hashida-Okado T, Ogawa A, Endo M, Yasumoto R, Takesako K, Kato I. 1996. AUR1, a novel gene conferring aureobasidin resistance on Saccharomyces cerevisiae: a study of defective morphologies in Aur1p-depleted cells. Mol. Gen. Genet. 251:236-244.
【非特許文献２】Haas L O, Cregg J M, Gleeson M A. Development of an integrative DNA transformation system for the yeast Candida tropicalis. J Bacteriol. 1990 August; 172(8): 4571-4577.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、現在までに見出されている新たな選択マーカーは、酵母の中でも特に出芽酵母において正常に機能しないという問題点を有している。
【００２０】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、出芽酵母においても正常に機能し得る選択マーカーとして用いることが可能な遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとして用いて、目的の生物を選択的に培養する技術の開発を進めてきた（例えば、ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０７１５６９（本願出願時において未公開））。
【００２２】
具体的に、本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することによって、目的とする微生物を選択的に培養することに成功した。
【００２３】
しかしながら、研究の進展にともなって、本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物であっても、微生物の種類によっては選択マーカーが効率よく機能しない場合があることを見出した。具体的には、実用化されている酵母の多くが分類される出芽酵母の場合、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したとしても、選択マーカーが効率よく機能しないことを見出した（後述する実施例参照）。
【００２４】
選択マーカーが効率よく機能しない理由としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のような多くの仮説が考えられ、何れの仮説が正しいのか実証することは容易なことではなかった。
（ａ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子以外の遺伝子が必要である；
（ｂ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質に対する特定の修飾が必要（または、不要）である；
（ｃ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が転写される過程を効率よく進める必要がある；
（ｄ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が翻訳される過程を効率よく進める必要がある。
【００２５】
本発明者らは、多くの仮説の中でも、特に上記（ｃ）および（ｄ）に着目した。更に具体的に、本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の特定のコドンを改変することによって、出芽酵母の中でも、選択マーカーを機能させることができるのではないか、と考えた。
【００２６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を構成する多くの種類のアミノ酸の中でも特にアルギニンおよび／またはアラニンをコードするコドンが特定のコドンに置換された遺伝子を用いることによって、出芽酵母の中でも選択マーカーを機能させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２７】
つまり、本発明の出芽酵母の選択的培養方法は、上記課題を解決するために、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であって、上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子、が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴としている。
【００２８】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記タンパク質内に存在するアルギニンの５０％以上が、ＡＧＡのコドンによってコードされていることが好ましい。
【００２９】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記タンパク質内に存在するアラニンの５０％以上が、ＧＣＴのコドンによってコードされていることが好ましい。
【００３０】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードしていることが好ましい。つまり、
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００３１】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなることが好ましい。つまり、
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３２】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培養は、無殺菌条件下にて行われることが好ましい。
【００３３】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培地は、無殺菌の培地であることが好ましい。
【００３４】
本発明の遺伝子は、上記課題を解決するために、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であって、上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされていることを特徴としている。
【００３５】
本発明の遺伝子では、上記タンパク質内に存在するアルギニンの５０％以上が、ＡＧＡのコドンによってコードされていることが好ましい。
【００３６】
本発明の遺伝子では、上記タンパク質内に存在するアラニンの５０％以上が、ＧＣＴのコドンによってコードされていることが好ましい。
【００３７】
本発明の遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードしていることが好ましい。つまり。
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００３８】
本発明の遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなることが好ましい。つまり、
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入しても、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて増殖することができなかった出芽酵母を、当該培地中で増殖させることができるという効果を奏する。つまり、本発明は、従来は選択的に培養することができなかった出芽酵母を、選択的に培養することができるという効果を奏する。
【００４０】
本発明は、低コストにて出芽酵母の選択的な培養を行うことができるという効果を奏する。
【００４１】
例えば、薬剤耐性マーカーを用いる方法では、薬剤としてＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  ＡまたはＺｏｅｃｉｎなどを用いる。このとき、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含む培地では、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａの濃度が約０．１μｇ／ｍＬである必要があり、当該培地のコストが約４２０円／Ｌになる。また、Ｚｏｅｃｉｎを含む培地では、Ｚｏｅｃｉｎの濃度が約１００μｇ／ｍＬである必要があり、当該培地のコストが約３２２６円／Ｌになる。
【００４２】
一方、本願発明であれば、リン源として亜リン酸を含む培地を用いればよく、当該培地における亜リン酸の濃度を４１５μｇ／ｍＬとすれば、培地のコストが約３．３円／Ｌになる。
【００４３】
つまり、本願発明は、従来技術と比べて、培地の費用を１／１００以下に抑えることができるという効果を奏する。有用な物質の生産などでは、１０００Ｌ以上、または、１００００Ｌ以上という大量の培地を用いて出芽酵母を培養する場合が多々ある。本願発明であれば、培地にかかる膨大なコストを大幅に削減することができる。
【００４４】
本発明は、薬剤耐性マーカーを用いる方法とは異なり抗生物質などの薬剤を用いないので、使用後の培地中の薬剤を除去または無毒化する必要がない。それ故に、本発明は、使用後の培地を、安全かつ容易に廃棄することができるという効果を奏する。
【００４５】
例えば、出芽酵母などの真核生物の選択的培養に用いられる薬剤は、人体や環境にとって非常に有害である場合がある。本発明であれば、このような有害な薬剤の使用を避けることができる。
【００４６】
本発明は、栄養要求性マーカーを用いる方法とは異なり出芽酵母内の遺伝子を予め破壊しておく必要はない、それ故に、本発明は、簡便に出芽酵母の選択的培養を行うことができるという効果を奏する。
【００４７】
例えば、有用な出芽酵母には多倍体が多く、多倍体では、複数存在する遺伝子の全てを破壊することが困難であった。本願発明は、多倍体であっても、簡便に選択的培養を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例における、分裂酵母内にて野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるための発現ベクターの基本構成を示す図である。
【図２】実施例における、分裂酵母の増殖を示すグラフである。
【図３】実施例における、出芽酵母内にて野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるための発現ベクターの基本構成を示す図である。
【図４】実施例における、出芽酵母内にて、コドンが置換された亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるための発現ベクターの基本構成を示す図である。
【図５】実施例における、様々な形質転換体の増殖を示すグラフである。
【図６】実施例における、様々な形質転換体の増殖を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下に、本発明の実施形態の一例について説明する。なお、本発明は、以下に説示する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５０】
なお、本明細書において「Ａ〜Ｂ」と記載した場合には、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図するものとする。
【００５１】
〔１．出芽酵母の選択的培養方法〕
本発明の出芽酵母の選択的培養方法は、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴としている。
【００５２】
出芽酵母は、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて出芽酵母を培養した場合、出芽酵母は、増殖することができない。
【００５３】
しかしながら、本発明の遺伝子を出芽酵母に導入すれば、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合には亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現しなかった出芽酵母において、確実に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させることができる。
【００５４】
出芽酵母内において亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現すれば、当該出芽酵母内において、亜リン酸がリン酸へと変換される。そして、当該出芽酵母は、亜リン酸から生成されたリン酸を資化することによって、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中でも増殖することが可能になる。
【００５５】
つまり、本発明では、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、確実に選択的に培養することができる。
【００５６】
本明細書において、「出芽酵母の選択的培養方法」とは、目的の出芽酵母以外の生物の非存在下において、目的の出芽酵母のみを選択的に培養することを意味するが、更に、目的の出芽酵母以外の生物の存在下において、目的の出芽酵母を優先的に培養することをも意味する。
【００５７】
換言すれば、本発明の選択的培養方法においては、目的の出芽酵母のみが培養されることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではなく、目的の出芽酵母以外の生物に対して目的の出芽酵母が優先的に培養されていればよい。
【００５８】
生物の中で、亜リン酸を資化することができる生物の種類は、多くはない。それ故に、たとえ、目的の出芽酵母と、目的の出芽酵母以外の生物とが混在していたとしても、目的の出芽酵母のみが増殖することができる。そして、当該増殖の結果、目的の出芽酵母を優先的に培養することができる。
【００５９】
本発明の遺伝子の具体的な構成については、後述する〔２．遺伝子〕にて説明する。
【００６０】
また、選択的に培養される出芽酵母は、単一種類の出芽酵母であってもよいが、複数種類の出芽酵母であってもよい。
【００６１】
上記出芽酵母としては、多倍体の出芽酵母を用いることが可能である。例えば、上記出芽酵母は、二倍体またはそれよりも多くの染色体を有する出芽酵母であってもよく、三倍体またはそれよりも多くの染色体を有する出芽酵母であってもよく、四倍体またはそれよりも多くの染色体を有する出芽酵母であってもよい。
【００６２】
本発明では出芽酵母内の特定の遺伝子を予め破壊しておく必要が無いので、多倍体の出芽酵母であっても、選択的に、かつ、安価に培養することができる。
【００６３】
出芽酵母は、例えば、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり得る。
【００６４】
出芽酵母には実用化されている酵母の多くが分類されるが、出芽酵母は、分裂酵母と比較して、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現量が極めて低い（後述する実施例参照）。一方、本発明の遺伝子を用いた場合、出芽酵母において、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現量が高い。それ故に、本発明であれば、出芽酵母を、選択的に、かつ、安価に培養することができる。
【００６５】
出芽酵母へ遺伝子を導入する方法としては特に限定されず、適宜周知の方法を用いればよい。
【００６６】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養する。
【００６７】
ここで、「亜リン酸を唯一のリン源として含む培地」とは、亜リン酸以外のリン元素を供給する成分（例えば、リン酸、次亜リン酸、ホスフィン等）を実質的に含有していない培地を意味する。なお、「実質的に含有していない」とは、濃度が１０μＭ以下であること、更に具体的には濃度が１μＭ以下であること、更に具体的には濃度が０．１μＭ以下であること、更に具体的には濃度が０．０１μＭ以下であること、を意味する。
【００６８】
上記培地は、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地であれば、特に限定されるものではなく、生物の種類等に応じて適宜選択すればよい。ただし、リン源を亜リン酸のみにコントロールし易いとの観点から、完全合成培地が好ましい。例えば、モルホリノプロパンスルホン酸培地（ＭＯＰＳ培地）、ＥＭＭ最小培地、または、ＳＤＭ最小培地を用いることができるが、勿論、当該培地に限定されない。
【００６９】
上記培地における亜リン酸の濃度は特に限定されず、生物の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、培地中の亜リン酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍ、０．１ｍＭ〜９００ｍＭ、０．１ｍＭ〜８００ｍＭ、０．１ｍＭ〜７００ｍＭ、０．１ｍＭ〜６００ｍＭ、０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、０．１ｍＭ〜４００ｍＭ、０．１ｍＭ〜３００ｍＭ、０．１ｍＭ〜２００ｍＭ、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、０．１ｍＭ〜７５ｍＭ、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、０．１ｍＭ〜２５ｍＭ、０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜７．５ｍＭ、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、または、０．１ｍＭ〜１ｍＭであり得る。
【００７０】
コストを低減させるという観点から、上記亜リン酸の濃度は、低いほど好ましいといえる。
【００７１】
本発明では亜リン酸の資化能力を指標として出芽酵母を選択的に培養するので、上記培地には抗生物質が含まれている必要はない。このため、本発明の出芽酵母の選択的培養方法に適用される培地は、抗生物質を含有していない培地であり得る。勿論、必要に応じて、抗生物質を含有している培地を用いることもできる。
【００７２】
また、本発明の出芽酵母の選択的培養方法による効果は、培養スケールが大きくなればなるほど顕著となる。このため、本発明の出芽酵母の選択的培養方法は、１００Ｌ以上、より好ましくは１０００Ｌ以上、さらに好ましくは５０００Ｌ以上、最も好ましくは１００００Ｌ以上の培地を用いて実施されることが好ましい。
【００７３】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培養は、殺菌条件下にて行われてもよいし、無殺菌条件下にて行われてもよい。簡便かつ低コストにて培養を行うという観点からは、無殺菌条件下にて培養を行うことが好ましい。
【００７４】
生物の多くは、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて生物を培養した場合、多くの生物は、増殖することができない。それ故に、無殺菌条件下にて培養を行ったとしても、良好に目的の出芽酵母を選択的に培養することができる。更には、無殺菌条件下の培養を採用すれば、培養のスケールを容易に大きくすることができ、その結果、物質の大量生産等を容易に行うことができる。
【００７５】
殺菌条件下の培養とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理が、培養系（例えば、培養装置、培地に供給される気体（酸素等））に対して行われている条件にて培養することを意図する。また、殺菌条件下の培養には、閉鎖系の培養も包含される。
【００７６】
一方、無殺菌条件下の培養とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理が、培養系（例えば、培養装置、培地に供給される気体（酸素等））に対して一切行われていない条件にて培養することを意図する。また、無殺菌条件下の培養には、開放系の培養も包含される。
【００７７】
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培地は、殺菌された培地であってもよいし、無殺菌の培地であってもよい。簡便かつ低コストにて培養を行うという観点からは、無殺菌の培地を用いることが好ましい。
【００７８】
生物の多くは、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて生物を培養した場合、多くの生物は、増殖することができない。それ故に、無殺菌の培地を用いて培養を行ったとしても、良好に目的の出芽酵母を選択的に培養することができる。更には、無殺菌の培地を採用すれば、培養のスケールを容易に大きくすることができ、その結果、物質の大量生産等を容易に行うことができる。
【００７９】
殺菌された培地とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理を施された培地を意図する。
【００８０】
一方、無殺菌の培地とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理を施されていない培地を意図する。
【００８１】
〔２．遺伝子〕
以下に、本発明の遺伝子について説明する。なお、本明細書において、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
【００８２】
本発明の遺伝子は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（換言すれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質）をコードする遺伝子（換言すれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）であって、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子である。
【００８３】
また、本発明の遺伝子は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であって、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内に存在する全てのアルギニンをコードするコドンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧであり、上記遺伝子内に存在する全てのアラニンをコードするコドンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡである亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。
【００８４】
亜リン酸デヒドロゲナーゼは、以下の反応式に示すように、ＮＡＤ依存的またはＮＡＤＰ依存的に亜リン酸を酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、リン酸とを生成する酵素である。
【００８５】
ＨＰＯ３２−＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ    →  ＨＰＯ４２−+ＮＡＤＨ＋Ｈ＋
ＨＰＯ３２−＋ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ  →  ＨＰＯ４２−+ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋
出芽酵母は、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて出芽酵母を培養した場合、出芽酵母は増殖することができない。
【００８６】
更に、出芽酵母へ野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入しても、当該遺伝子は、出芽酵母内で正常に機能しない。
【００８７】
しかしながら、本発明の遺伝子を出芽酵母に導入すれば、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合には亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現しなかった出芽酵母において、確実に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させることができる。
【００８８】
出芽酵母内において亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現すれば、出芽酵母内において、亜リン酸がリン酸へと変換される。そして、当該出芽酵母は、亜リン酸から生成されたリン酸を資化することによって、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中でも増殖することが可能になる。換言すれば、本発明では、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、確実に選択的に培養することができる。
【００８９】
つまり、本発明の遺伝子は、出芽酵母を選択的に培養するための選択マーカーとして利用することができる。
【００９０】
なお、タンパク質が亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質であるか否かは、ＮＡＤ依存的またはＮＡＤＰ依存的な亜リン酸の酸化によって生成される、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、および／または、リン酸を検出することによって確認することができる。なお、ＮＡＤＨ、ＨＡＤＰＨおよびリン酸の検出方法は周知であるので、当該周知の方法にしたがってＮＡＤＨ、ＨＡＤＰＨおよびリン酸の各々を検出すればよい。
【００９１】
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質としては特に限定されず、周知の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質であればよい。
【００９２】
例えば、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は、以下の生物に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質、または、当該亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の変異型タンパク質であり得る。更に具体的に、上記変異型タンパク質は、以下の生物に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、であり得る。
【００９３】
上記生物としては、Ralstonia sp. 4506、Pseudomonas stutzeri WM88、Desulfotignum phosphitoxidans、Dietzia cinnamea、Methylobacterium extorquens、Comamonas testosterone、Acidovorax ebreus、Cupriavidus metallidurans、Cupriavidus metallidurans、Thioalkalivibrio sp.、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Marinobacter algicola、Marinobacter aquaeolei、Shewanella putrefaciens、Prochlorococcus sp.、Cyanothece sp.、Trichodesmium erythraeum、Nostoc sp.、Nodularia spumigena、Nostoc punmtiforme、Gallionella capsiferriformans、Burkholderia vietnamiensis、Acinetobacter radioresistens、Herminiimonas arsenicoxydans、Alcaligenes faecalis、および、Oxalobacter formigenesを挙げることができる。
【００９４】
更に具体的に、本発明の遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子であってもよい。つまり、
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００９５】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、具体的には、Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質である。
【００９６】
本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
【００９７】
また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内のアミノ酸であることが好ましく、１９個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１７個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１５個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１３個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１１個のアミノ酸であることが更に好ましく、１０個以内のアミノ酸であることが好ましく、９個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、７個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、５個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、３個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１個のアミノ酸であることが最も好ましい。
【００９８】
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００９９】
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
【０１００】
また、本発明の遺伝子には、以下の（５）のタンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子が包含されていてもよい。つまり、
（５）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【０１０１】
上述した相同性は、９０％以上であればよいが、９１％以上であることが更に好ましく、９２％以上であることが更に好ましく、９３％以上であることが更に好ましく、９４％以上であることが更に好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９６％以上であることが更に好ましく、９７％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【０１０２】
アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。
【０１０３】
更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
【０１０４】
本発明の遺伝子では、当該遺伝子がコードするタンパク質内に存在する全てのアルギニンを、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧという３種類のコドンによってコードしている。
【０１０５】
上述した３種類のコドンのうち、ＡＧＡというコドンが多いほど、生物内において、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を安定的に発現させることができる。
【０１０６】
各コドンの出現頻度は特に限定されないが、例えば、タンパク質内に存在するアルギニンのうちの１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上が、７０％以上、８０％以上、または、９０％以上が、ＡＧＡというコドンによってコードされ得る。
【０１０７】
本発明の遺伝子では、当該遺伝子がコードするタンパク質内に存在する全てのアラニンを、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡという３種類のコドンによってコードしている。
【０１０８】
上述した３種類のコドンのうち、ＧＣＴというコドンが多いほど、生物内において、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を安定的に発現させることができる。
【０１０９】
各コドンの出現頻度は特に限定されないが、例えば、タンパク質内に存在するアラニンのうちの１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または、９０％以上が、ＧＣＴというコドンによってコードされ得る。
【０１１０】
更に具体的に、本発明の遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなるものであってもよい。つまり、
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０１１１】
なお、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとは、具体的には、Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であり、配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡとは、Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
【０１１３】
本発明の遺伝子は、周知の方法によって作製することができる。例えば、周知の変異導入方法またはコドン変換方法にしたがって、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内の特定のコドンを別のコドンへ置換することによって、本発明の遺伝子を作製すればよい。
【実施例】
【０１１４】
＜１．亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子＞
実施例に用いたアリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子、および、これらの遺伝子がコードするタンパク質について、以下に説明する。
【０１１５】
まず、実施例に用いたアリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子、および、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子を列挙する。
【０１１６】
ａ）Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子（以下、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号２））；
ｂ）Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子（以下、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号３））；
ｃ）Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子（以下、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号５））；
ｄ）Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子（以下、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号６））；
ｅ）Klebsiella sp. 4507に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子（以下、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号８））。
【０１１７】
上記ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を変えないように、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子内のコドンを変更した遺伝子である。
【０１１８】
具体的に、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子内のアルギニンをコードするコドンである６個の「ＣＧＣ」、１個の「ＣＧＡ」および４個の「ＣＧＧ」の全てを、アルギニンをコードするコドンである「ＡＧＡ」に改変している。
【０１１９】
上記改変の結果、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、アルギニンをコードするコドンである４個の「ＣＧＴ」、１１個の「ＡＧＡ」および２個の「ＡＧＧ」を含んでいる。
【０１２０】
つまり、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約６４．７％（１１／１７）が「ＡＧＡ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約２３．５％（４／１７）が「ＣＧＴ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約１１．８％（２／１７）が「ＡＧＧ」によってコードされている。
【０１２１】
更に、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子内のアラニンをコードするコドンである１４個の「ＧＣＧ」の全てを、アラニンをコードするコドンである「ＧＣＴ」に改変している。
【０１２２】
上記改変の結果、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、アラニンをコードするコドンである２３個の「ＧＣＴ」、１０個の「ＧＣＣ」および１０個の「ＧＣＡ」を含んでいる。
【０１２３】
つまり、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約５３．４％（２３／４３）が「ＧＣＴ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約２３．３％（１０／４３）が「ＧＣＣ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約２３．３％（１０／４３）が「ＧＣＡ」によってコードされている。
【０１２４】
一方、上記ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子は、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を変えないように、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子内のコドンを変更した遺伝子である。
【０１２５】
具体的に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子内のアルギニンをコードするコドンである１２個の「ＣＧＣ」、２個の「ＣＧＡ」および７個の「ＣＧＧ」の全てを、アルギニンをコードするコドンである「ＡＧＡ」に改変している。
【０１２６】
上記改変の結果、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子は、アルギニンをコードするコドンである３個の「ＣＧＴ」、２２個の「ＡＧＡ」を含んでいる。
【０１２７】
つまり、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約８８％（２２／２５）が「ＡＧＡ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約１２％（３／２５）が「ＣＧＴ」によってコードされている。
【０１２８】
更に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子内のアラニンをコードするコドンである２２個の「ＧＣＧ」の全てを、アラニンをコードするコドンである「ＧＣＴ」に改変している。
【０１２９】
上記改変の結果、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子は、アラニンをコードするコドンである３２個の「ＧＣＴ」、１２個の「ＧＣＣ」および６個の「ＧＣＡ」を含んでいる。
【０１３０】
つまり、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約６４％（３２／５０）が「ＧＣＴ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約２４％（１２／５０）が「ＧＣＣ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約１２％（６／５０）が「ＧＣＡ」によってコードされている。
【０１３１】
ＲｓｐｔｘＤ遺伝子とＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子とは、単にコドンが異なるのみであって、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とは、同一である（配列番号４）。
【０１３２】
ＫｌｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号７）は、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）と、アミノ酸レベルで相同性が非常に高い（相同性：３３５／３３７＝９９．４％）。それ故に、後述する実施例では、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質の代わりとして、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質を酵母内にて発現させている場合もある。
【０１３３】
また、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子とＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子とは、単にコドンが異なるのみであって、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とは、同一である。
【０１３４】
野生型遺伝子のコドンを改変したＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子およびＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、周知のコドン置換法によって作製した。更に具体的には、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ依頼して、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子およびＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子を作製した。
【０１３５】
＜２．野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、分裂酵母の形質転換＞
＜２−１．発現ベクターの作製＞
分裂酵母（シゾサッカロミセスポンベ：Schizosaccharomyces pombe）内にて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるために、周知の方法にしたがって、上述したＫｌｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した。図１に、当該発現ベクターの基本構成を示す（Matsuyama et al. 2004, Yeast）。なお、図１の「ＲｓｐｔｘＤ」と記載した箇所に、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている。
【０１３６】
具体的に、上記発現ベクターとしては、異なるプロモーターを含む、３種類の発現ベクターを作製した。
【０１３７】
上記発現ベクターの１つ目は、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子の上流に強力なプロモーターが挿入されている発現ベクターであって、当該発現ベクターをｐｔｘＤ−１と呼ぶ。
【０１３８】
上記発現ベクターの２つ目は、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子の上流に、ｐｔｘＤ−１に含まれるプロモーターよりも弱いプロモーターが挿入されている発現ベクターであって、当該発現ベクターをｐｔｘＤ−４１と呼ぶ。
【０１３９】
上記発現ベクターの３つ目は、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子の上流に、ｐｔｘＤ−４１に含まれるプロモーターよりも弱いプロモーターが挿入されている発現ベクターであって、当該発現ベクターをｐｔｘＤ−８１と呼ぶ。
【０１４０】
上述した３種類の発現ベクターを用いて、分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombe KSP635（Leu-）を形質転換した。なお、形質転換の具体的な方法は、周知の方法にしたがった。具体的には、以下の方法にしたがった。
【０１４１】
＜２−２．形質転換＞
分裂酵母を３ｍＬのＹＰＡＤ培地（Bacto Yeast extract（１％）、Bacto peptone（２％）、グルコース（２％）、硫酸アデニン（４０ｍｇ））中で３０℃にて一晩培養した後、３００μＬの培養液を分取した。
【０１４２】
当該培養液を１００００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てて、沈殿物である分裂酵母を取得した。その後、当該分裂酵母を、滅菌水で一回洗浄した後、酢酸リチウム溶液（０．１Ｍ  酢酸リチウム、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）ｐＨ７．５）で一回洗浄した。分裂酵母が懸濁されている酢酸リチウム溶液を１００００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てて、沈殿物である分裂酵母を取得した。
【０１４３】
取得した分裂酵母を１００μＬの酢酸リチウム溶液に懸濁し、当該懸濁液に１μｇのＤＮＡ（発現ベクター）と２μＬのキャリアーＤＮＡ（Clontech社）とを加え、軽く混ぜた。
【０１４４】
上記懸濁液を１０分間室温にて静置させた後、当該懸濁液に５０％  ＰＥＧ（ポリエチレングリコール（平均分子量：ＭＷ３３５０）、５０％（ｗ／ｖ））を２６０μＬ加え、よく混合させた後、６０分間室温にて静置させた。
【０１４５】
上記懸濁液に４３μＬのＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を加え、よく混ぜた後、当該懸濁液を、５分間、４２℃に加熱した。
【０１４６】
その後、上記懸濁液を６０００ｒｐｍ、２分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てて、沈殿物である分裂酵母を取得した。当該分裂酵母を、更に滅菌水で２回洗浄して、試験に用いる分裂酵母を得た。
【０１４７】
＜２−３．酵母の培養＞
上記＜２−２．形質転換＞にて得られた分裂酵母を、２種類の液体培地中にて、３０℃にて培養した。
【０１４８】
２種類の液体培地の１つとして、リン源としてリン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地（フタル酸カリウム（３ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（５ｇ／Ｌ）、リン酸（１５ｍＭ）、ミネラルおよびビタミン類を含む）を用いた。
【０１４９】
２種類の液体培地の他方として、リン源として亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地（フタル酸カリウム（３ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（５ｇ／Ｌ）、亜リン酸（１５ｍＭ）、ミネラルおよびビタミン類を含む）を用いた。
【０１５０】
培養を開始してから経時的に液体培地をサンプリングし、当該液体培地のＯＤ６００を測定して、分裂酵母の増殖状況を確認した。
【０１５１】
＜２−４．試験結果＞
図２に、分裂酵母の増殖を表すグラフを示す。
【０１５２】
図２において「ｐｔｘＤ−１」は、ｐｔｘＤ−１を用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
また、図２において「ｐｔｘＤ−１（Ｐｉ）」は、ｐｔｘＤ−１を用いて形質転換された分裂酵母を、リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
【０１５３】
図２において「ｐｔｘＤ−４１」は、ｐｔｘＤ−４１を用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
【０１５４】
図２において「ｐｔｘＤ−８１」は、ｐｔｘＤ−８１を用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
【０１５５】
図２において「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されていない発現ベクターを用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
【０１５６】
図２に示すように、弱いプロモーターと野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との組み合わせの場合、分裂酵母は、亜リン酸を含む培地では増殖速度が遅いことが明らかになった。
【０１５７】
一方、図２に示すように、強いプロモーターと野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との組み合わせの場合、分裂酵母は、リン酸を含む培地の場合と同様に、亜リン酸を含む培地において増殖速度が速いことが明らかになった。
【０１５８】
以上のことは、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を分裂酵母の選択マーカーとして使用できることを示しているが、選択マーカーとして使用するためには、強力なプロモーターが必要であることも示している。
【０１５９】
また、このことは、分裂酵母における野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いたタンパク質の発現性能は十分ではあるものの、当該発現性能については、更なる改良の余地があることを示している。
【０１６０】
＜３．野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母の形質転換＞
＜３−１．発現ベクターの作製＞
出芽酵母（サッカロミセスセレビシエ：Saccharomyces cerevisiae）内にて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるために、周知の方法にしたがって、上述したＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した。図３に、当該発現ベクターの基本構成を示す。なお、図３に示すベクターは、出芽酵母用の発現ベクターであるＹＥｐ２４にＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入することによって作製されている。
【０１６１】
＜３−２．形質転換、および、酵母の培養＞
上述した＜２−２．形質転換＞に記載の方法にしたがって、図３に示す発現ベクターを用いて、出芽酵母を形質転換した。
【０１６２】
そして、上述した＜２−３．酵母の培養＞に記載の方法にしたがって、形質転換された出芽酵母を培養した。
【０１６３】
＜３−３．試験結果＞
図３に示す発現ベクター（換言すれば、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入された発現ベクター）にて形質転換された出芽酵母は、亜リン酸を含む培地では全く増殖できなかった。
【０１６４】
更に具体的には、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入された発現ベクターによって形質転換された出芽酵母は、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入された発現ベクターによって形質転換された分裂酵母と比較して、亜リン酸を含む培地における増殖能力が、はるかに劣っていた。
【０１６５】
＜４．コドンを置換した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母の形質転換−１＞
＜４−１．発現ベクターの作製＞
出芽酵母（サッカロミセスセレビシエ：Saccharomyces cerevisiae）内にて、コドンが置換された亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるために、周知の方法にしたがって、上述したＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子、または、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した。
【０１６６】
図４に、当該発現ベクターの基本構成を示す。なお、当該発現ベクターでは、図４に記載の「ＯＰＴｐｔｘＤ」の位置に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子、または、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている。
【０１６７】
＜４−２．形質転換、および、酵母の培養＞
上述した＜２−２．形質転換＞に記載の方法にしたがって、図４に示す発現ベクターを用いて、様々な出芽酵母の株を形質転換した。
【０１６８】
具体的に、上記株としては、当該分野において一般的に用いられているＷ３０３ａ、Ｋｙｏｋａｉ６、Ｋｙｏｋａｉ７、Ｋｙｏｋａｉ９、および、Ｓｈｏｃｈｕ  ＳＨ４を用いた。
【０１６９】
得られた出芽酵母の形質転換体を、リン源として亜リン酸を含んでいる、固体状のＳＤＭ最小培地（Yeast Nitrogen Base without Amino Acid and without Phosphate（Formedium）（５．８ｇ／Ｌ）、デキストロース（２％）、亜リン酸（７．５ｍＭ））上にて、３０℃にて１０日間培養した。
【０１７０】
＜４−３．試験結果＞
１０日間の培養の後、固体状のＳＤＭ最小培地上に出現したコロニーの数をカウントした。なお、各株に対して独立して３回の試験を行い、これらの３回の試験の平均値として、試験結果を算出した。
【０１７１】
以下の表に、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターによって形質転換された酵母の試験結果を示す。
【０１７２】
【表１】
2015128397.tif 000002
【０１７３】
表から明らかなように、コドンを置換した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて形質転換した酵母は、リン源として亜リン酸を含んでいる培地であっても、活発に増殖することができた。
【０１７４】
＜５．コドンを置換した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母の形質転換−２＞
＜５−１．発現ベクターの作製＞
上述した＜４−１．発現ベクターの作製＞に記載の方法にしたがって、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子、または、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクターを作製した。
【０１７５】
＜５−２．形質転換、および、酵母の培養＞
ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター（＜４−１＞参照）、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター（＜４−１＞参照）、および、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターの各々を用いて、出芽酵母の株の１つであるＷ３０３ａを形質転換した。
【０１７６】
得られた５種類の形質転換体を、リン源として亜リン酸を含んでいる、液体状のＳＤＭ最小培地（Yeast Nitrogen Base without Amino Acid and without Phosphate（Formedium）（５．８ｇ／Ｌ）、デキストロース（２％）、亜リン酸（７．５ｍＭ））中にて、３０℃にて培養した。そして、経時的にＳＤＭ最小培地をサンプリングし、当該ＳＤＭ最小培地のＯＤ６００（換言すれば、酵母の増殖）を測定した。
【０１７７】
＜５−３．試験結果＞
図５に、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、または、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換されている形質転換体の試験結果を示す。
【０１７８】
図５に示すように、これらの形質転換体は、リン源として亜リン酸を含んでいる培地では、全く増殖しなかった。
【０１７９】
図６に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、または、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換されている形質転換体の試験結果を示す。
【０１８０】
図６に示すように、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、または、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクターによって形質転換されている形質転換体は、リン源として亜リン酸を含んでいる培地において増殖することができた。
【０１８１】
なお、図５および６において「ＷＴ」は、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換されている形質転換体の試験結果を示している。
【産業上の利用可能性】
【０１８２】
本発明は、出芽酵母の選択的培養に利用することができる。
【０１８３】
更に具体的に、本発明は、バイオ燃料の生産をはじめとする、出芽酵母を利用した物質生産の分野において広く利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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