(57)【要約】【課題】  本発明は、食糧資源や農業資源を消費することなく、廃棄物として処分される生物の排泄物Ｘからグルコースを製造するグルコース製造方法を実現するとともに、植物の収穫量に左右されること無く安定的に低価格なグルコースを提供することを目的とする。【解決手段】  生物の排泄物Ｘ中のセルロースからグルコースを製造することを特徴とするグルコース製造方法およびこの方法により製造したグルコース。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の排泄物からグルコースを製造することを特徴とするグルコース製造方法。
【請求項２】
前記排泄物中のセルロースからグルコースを製造することを特徴とする請求項１に記載のグルコース製造方法。
【請求項３】
前記排泄物中のセルロースをセルロース分解酵素を用いてグルコースへ分解する分解工程を行うことを特徴とする請求項２に記載のグルコース製造方法。
【請求項４】
前記分解工程の前に、前記排泄物中のセルロースを粉砕する粉砕工程を行うことを特徴とする請求項３に記載のグルコース製造方法。
【請求項５】
前記粉砕工程において、前記排泄物中のセルロースを直径４０μｍ以下の微細粒状に粉砕することを特徴とする請求項４に記載のグルコース製造方法。
【請求項６】
生物の排泄物から請求項１乃至請求項５のいずれかのグルコース製造方法により製造されたことを特徴とするグルコース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の排泄物からグルコースを製造するためのグルコース製造方法およびこの方法により製造されたグルコースに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、グルコースは、石油燃料の代替燃料としてのバイオエタノールや高分子素材の原材料として工業用用途への利用が増加している。
【０００３】
従来、工業用のグルコースは、特許文献１に記載されているように、ジャガイモ類およびトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギまたは米などの穀類、もしくは、サトウキビやテンサイのような砂糖原料用の植物から製造されていた。
【０００４】
また、この他にも、特許文献２には、スギやヒノキなどの針葉樹またはブナやコナラなどの広葉樹からなる建築廃木材や間伐材、もしくは古紙などの木質系廃材中のセルロースからグルコースを製造することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５１９５５０号公報
【特許文献２】特開２００６−１４９３４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、穀類や砂糖原料用の植物などの糖質資源は、基本的には食糧資源として生産されているものであっても、今後、糖質資源の工業用用途が拡大すると、工業用資源として消費される可能性が有り、工業用資源としての消費量が増大すると市場における食料用としての糖質資源の価格が高騰して、家計を圧迫したり、発展途上国における飢餓の加速化が懸念される。
【０００７】
また、建築廃木材や間伐材もしくは古紙などの木質系廃材は、再度、割り箸や爪楊枝、新聞紙やトイレットペーパー、生分解性プラスチックなどへリサイクルができる有用な資源であり、この他にも、建築廃木材や間伐材は農業用資源としても用いることができる。さらに、木質系廃材などのセルロースには、分解を阻害する成分が含まれており、この阻害成分によってセルロースの糖化が困難であるという課題を有している。
【０００８】
ここで、日本国内においては、家畜として飼育されている乳牛や肉牛から年間約４０００万トンの牛糞および約１３００万トンの牛尿が排出されており、その殆どが堆積あるいは簡易的な堆肥化処理が施された後、処分されている。
【０００９】
本発明者等は、安定した供給量を得られるセルロース原料として、乳牛や肉牛などの家畜、より広義では、生物の排泄物中に含まれるセルロースを用いることに着目した。そして、当該排泄物からのグルコースを製造する方法について鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに到った。
【００１０】
そこで、本発明は、食糧資源や農業資源を消費することなく、廃棄物として処分される生物の排泄物からグルコースを製造するグルコース製造方法を実現するとともに、植物の収穫量に左右されること無く安定的に低価格なグルコースを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するべく、本発明のグルコース製造方法の第１の態様は、生物の排泄物からグルコースを製造することを特徴とする。また、本発明のグルコース製造方法の第２の態様は、前記排泄物中のセルロースからグルコースを製造することを特徴とする。さらに、本発明のグルコース製造方法の第３の態様は、前記排泄物中のセルロースをセルロース分解酵素を用いてグルコースへ分解する分解工程を行うことを特徴とする。
【００１２】
このような、本発明のグルコース製造方法の第１の態様乃至第３の態様においては、通常は廃棄物である生物の排泄物を用いることで、デンプン類などの食糧資源や木質系廃材などのリサイクル可能な資源を消費せずに、グルコースを製造することを可能とする。
【００１３】
本発明のグルコース製造方法の第４の態様は、前記分解工程の前に、前記排泄物中のセルロースを粉砕する粉砕工程を行うことを特徴とする。また、本発明のグルコース製造方法の第５の態様は、前記粉砕工程において、前記排泄物中のセルロースを直径４０μｍ以下の微細粒状に粉砕することを特徴とする。
【００１４】
このような、本発明のグルコース製造方法の第４の態様乃至第５の態様においては、粉砕工程を行うことにより、セルロース中の非結晶領域を露出させて、セルロース分解酵素による酵素分解を容易なセルロースとすることで、当該排泄物中のセルロースから高い収集率でグルコースを製造することができる。
【００１５】
本発明のグルコースは、生物の排泄物から第１の態様乃至第５の態様のいずれかのグルコース製造方法により製造されたことを特徴とする。
【００１６】
このような、本発明のグルコースにおいては、生物の排泄物という極めて安価で安定供給の望める原材料を用いることで、植物の収穫情勢などに左右されること無く安定的に低価格なグルコースを提供することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のグルコース製造方法によれば、食糧資源や農業資源を消費することなく、廃棄物として処分される生物の排泄物からグルコースを製造するグルコース製造方法を提供することを可能とする。
【００１８】
また、本発明のグルコースによれば、植物の収穫情勢に左右されること無く安定的に生産可能なグルコースを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のグルコース製造方法の実施形態における製造工程を示すフローチャート
【図２】本発明のグルコース製造方法の実施例の製造工程中における原料の光学顕微鏡観察像を示し、（ａ）は滅菌牛糞Ｄｓ、（ｂ）はセルロース原料Ｃ、（ｃ）は微細セルロース原料Ｃｆ
【図３】本発明のグルコース製造方法の実施例１における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ
【図４】本発明のグルコース製造方法の実施例２における各サンプル対して施した粉砕工程Ｓ３における粉砕粒度の大きさとグルコースの収集量の関連を示すグラフ
【図５】本発明のグルコース製造方法の実施例２における各サンプル対して施した粉砕工程Ｓ３における粉砕粒度の大きさとセルロースの結晶形の関連を示す粉末Ｘ線解析結果を示すグラフ
【図６】本発明のグルコース製造方法の実施例３における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ
【図７】本発明のグルコース製造方法の実施例４における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ
【図８】本発明のグルコース製造方法の実施例５における各サンプルのグルコース収集量を示すグラフ
【図９】本発明のグルコース製造方法の実施例６における各サンプルの実際のグルコース収集量を示すグラフ
【図１０】牛糞中の全糖量を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明のグルコース製造方法の具体的な実施形態を図１乃至図３を用いて詳しく説明する。
【００２１】
本発明のグルコース製造方法は、生物の糞や尿などの排泄物からグルコースを製造する方法である。
【００２２】
本発明のグルコース製造方法は、生物の排泄物中の多糖類であるセルロースをセルロース分解酵素によって分解し、単糖類であるグルコースを得る方法である。このため、排泄物を提供する生物は、多量のセルロースの含有が見込める草食性の動物であることが好ましい。このような、生物としては、例えば、ウシ、ブタ、トリ、ウサギ、ウマなどの家畜、ゾウ、サイ、キリン、ヒツジ、ヤギ、シカ、イノシシ、モルモット、ラット、マウスなどの観賞用の動物、カイコ、イナゴなどの昆虫、ブダイ、アイゴ、サザエなど海洋生物を適用することができる。
【００２３】
生物の排泄物は、液体成分としての尿と固形成分としての糞からなり、セルロースを含んでいるものであれば、液体成分および固形成分のいずれか一方もしくはその混合物を用いることができる。
【００２４】
また、特に、工業生産レベルで本発明のグルコース製造方法を実施する際には、ウシ、ブタ、トリ、ウサギなどの家畜として飼育されている草食性の動物や動物園などで観賞用として飼育されているゾウ、サイ、キリン、ヒツジ、ヤギなどの草食性の動物から提供される排泄物を用いることにより、まとまった量の排泄物を一カ所から安定的に、しかも容易に回収できるので、輸送費を抑えて安価なグルコースを提供することを可能とする。
【００２５】
セルロース分解酵素としては、セルロースの非結晶領域をランダムに切断し、セルロースの重合度を低下させるエンドグルカナーゼ、セルロースの結晶領域末端からセロビオース単位で分解するセロビオハイドロラーゼおよびセロビオースをグルコースに分解するβ−グルコシターゼの３種類の酵素を含むセルラーゼを用いることができる。
【００２６】
当該セルラーゼは、市販のセルラーゼや細菌もしくは植物等から抽出したものなど、特にその種類を限定するものではないが、セルロース分解に優れたトリコデルマ由来のセルラーゼを用いることにより、グルコースの収集率を向上させることができる。
【００２７】
このような、本発明のグルコース製造方法の具体的な実施形態においては、図１に示すように、回収した生物の排泄物Ｘを滅菌して滅菌排泄物Ｘｓとするための滅菌工程Ｓ１と、滅菌排泄物Ｘｓ中の余分な成分を除去してセルロース原料Ｃを得るための洗浄工程Ｓ２と、得られたセルロース原料Ｃを酵素分解に適した大きさに粉砕して微細セルロース原料Ｃｆとするための粉砕工程Ｓ３と、微細セルロース原料Ｃｆをセルロース分解酵素を用いて分解しグルコースを生成させるための酵素分解工程Ｓ４と、生成されたグルコースを所望の状態へ精製するためのグルコース精製工程Ｓ５とを行うようにされている。
【００２８】
特に、粉砕工程Ｓ３においては、得られる微細セルロース原料Ｃｆの直径が４０μｍ以下の粒径とされることが好ましく、このような、微細セルロース原料Ｃｆへと粉砕することで、基質となるセルロースの表面積が増加して、基質と分解酵素との触れあう頻度が増加し、その結果としてグルコースの生成量が増加してグルコースの収集量が増大するものと考えられる。また、基質となるセルロース中の一部について非結晶領域を露出させることにより、セルロース分解酵素による酵素分解が容易となり、グルコースの収集率を向上させるものと考えられる。
【００２９】
なお、滅菌工程Ｓ１、洗浄工程Ｓ２および粉砕工程Ｓ３は、回収した排泄物Ｘの状態に応じて適宜選択して組み合わせて行うことが可能であり、いずれも不要な場合には省略することができる。
【００３０】
また以上の工程以外にも、例えば、グルコースの収集率を向上させるために回収した排泄物Ｘを発酵させる発酵工程、イオン液体中に溶解させる、エチレンジアミンなどの塩基性溶媒に溶解させるなどして、排泄物Ｘに含まれるセルロースの流動性を向上させる液状化工程などを採用することができる。
【００３１】
このような、本発明のグルコース製造方法によれば、デンプン類や糖質原料などの食糧資源や木質系廃材などのリサイクル可能な資源を消費することなく、廃棄物である生物の排泄物Ｘからグルコースを製造することを可能とする。また、当該排泄物Ｘは、少なくとも家畜や観賞用など草食性の動物から安定的に安価で回収することで、工業生産レベルで本発明のグルコース製造方法を実施する場合においても、安定的にかつ安価でグルコースを製造することを可能とする。さらに、本発明のグルコース製造方法の方法により製造されたグルコースは、廃棄物から製造されることで、低価格で市場に提供することを可能とする。
【００３２】
以下に、本発明のグルコース製造方法の具体的な実施例を説明する。
【００３３】
＜実施例１＞
本実施例においては、生物の排泄物Ｘとして牛糞を用いて、図１に示す滅菌工程Ｓ１、洗浄工程Ｓ２、粉砕工程Ｓ３および酵素分解工程Ｓ４を行い、グルコースの生成を行った。それぞれの工程においては、以下のような処理を行った。
【００３４】
まず、滅菌工程Ｓ１においては、２００ｇの牛糞Ｄを深型シャーレに入れて、１２０℃の飽和水蒸気圧下で２０分間オートクレーブ処理を行って滅菌牛糞Ｄｓを得た。
【００３５】
そして、洗浄工程Ｓ２においては、５０ｇの滅菌牛糞Ｄｓに対して超純水（＞１８．２ＭΩｃｍ−１）１５０ｍＬを加えたものをミキサーにて５分間混合処理を行った後、遠心分離器にて２７０００Ｇ、４℃の条件下で１０分間の遠心分離を行い、滅菌牛糞Ｄｓ中の固形成分を分離する。当該固形成分に対して超純水１５０ｍＬを添加し、同条件にて再度、混合処理および遠心分離を行って滅菌牛糞Ｄｓ中のセルロース原料Ｃを得た。
【００３６】
粉砕工程Ｓ３においては、セルロース原料Ｃを乳鉢にて粉砕を行い、微細セルロース原料Ｃｆを得た。本実施例においては、乳鉢にてセルロース原料Ｃの粉砕を行っているが、公知の粉砕装置を用いて微細化を図り、次工程における酵素分解に適した大きさの微細セルロース原料Ｃｆを得るようにしてもよい。
【００３７】
ここで、滅菌工程Ｓ１により得られた滅菌牛糞Ｄｓ、洗浄工程Ｓ２により得られたセルロース原料Ｃおよび粉砕工程Ｓ３により得られた微細セルロース原料Ｃｆの粒径は、図２（ａ）に示すように滅菌牛糞Ｄｓは１ｍｍ以上、図２（ｂ）に示すようにセルロース原料Ｃは５００μｍ以下、そして、図２（ｃ）に示すように微細セルロース原料Ｃｆは４０μｍ以下であった。なお、図２は、滅菌牛糞Ｄｓ、セルロース原料Ｃおよび微細セルロース原料Ｃｓをそれぞれ光学顕微鏡を用いて観察したものである。
【００３８】
酵素分解工程Ｓ４においては、０．１ｇの微細セルロース原料Ｃｆに対して、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）を１０ｍＬ添加して１ｗｔ％基質分散液の調製を行い、２００μＬずつ２ｍＬマイクロチューブに分取した。セルロース分解酵素はトリコデルマ由来のセルラーゼとし、５００μｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  社製、コード：Ｃ９４２２−１０ＫＵ）／２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液のセルロース分解酵素溶液を用いた。２００μＬの１ｗｔ％基質分散液に対してセルロース分解酵素溶液５０μＬを添加して、５０℃の条件下で２４時間のインキュべーションを行った。
【００３９】
本実施例においては、牛糞Ｄからのグルコース収集量とウシのエサである干し草Ｈからのグルコース収集量とを比較するべく、干し草Ｈについても同様に、洗浄工程Ｓ２、粉砕工程Ｓ３および酵素分解工程Ｓ４を行ってグルコースを収集した。また、セルロースの粒径の違いによるグルコース収集量についても検討するべく、牛糞Ｄおよび干し草Ｈについて、洗浄工程Ｓ２後のセルロース原料Ｃおよび干し草Ｈ、粉砕工程Ｓ３後の微細セルロース原料Ｃｆおよび微細干し草Ｈｆの４種類のサンプルについて酵素分解工程Ｓ４を行ってグルコースを収集した。
【００４０】
なお、酵素分解工程Ｓ４を行うことにより生成されたグルコースの定量には、インキュベーションを行った後の各サンプルから、上澄み２μＬを１．５ｍＬμチューブに分取して、グルコースの試薬（ラボアッセイＴＭグルコース、和光純薬工業株式会社製）を３００μＬ添加し、３７℃の条件下で５分間のインキュベーションを行って十分に発酵させた後、マイクロプレート（９６穴）に２００μＬ分注して、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ１９０、モレキュラーデバイス社製）を用いて５０５ｎｍの波長にて吸光度の測定を行う。そして、乾燥時におけるサンプル１ｇあたりから得られるグルコース量Ｇ（ｍｇ／ｇ）をグルコース標準液を用いた検量線の傾きｋから、以下の数１を用いて算出した。ここで、数１において、Ａはサンプルの吸光度、Ｓは試料の溶液量、Ｍは乾燥時におけるサンプルの重量を表す。
【００４１】
【数１】
2015116183.tif 000003
【００４２】
本実施例においては、図３に示すように、乾燥時における各サンプル１ｇあたりから、セルロース原料Ｃについては８．１３ｍｇ、微細セルロース原料Ｃｆについては８２．１ｍｇ、干し草Ｈについては１０．４ｍｇ、微細干し草Ｈｆについては１４０ｍｇのグルコースが得られた。なお、図３に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。
【００４３】
特に、粉砕工程Ｓ３を行うことにより得られた微細セルロース原料Ｃｆおよび微細干し草Ｈｆを用いて酵素分解を行うことにより、粉砕工程Ｓ３を行わなかったセルロース原料Ｃおよび干し草Ｈを用いて酵素分解を行った場合よりも、１０倍以上のグルコース収集量が得られることが確認された。
【００４４】
上記の実施例から、本発明のグルコース製造方法を用いることにより、牛糞Ｄからグルコースを製造できることは明らかであり、干し草Ｈを用いた場合のグルコース収集量よりも４割程度少ないものの、牛糞Ｄは干し草Ｈの収穫量に左右されること無く安定的に供給することができるので、グルコースを安定的に製造することが可能である。
【００４５】
＜実施例２＞
本実施例においては、生物の排泄物Ｘとして牛糞の粉砕工程Ｓ３における粉砕粒度の大きさとグルコースの収集量の関連並びにセルロースの結晶形の変化を求めた。
【００４６】
実施例１と同様にして生物の排泄物Ｘとして牛糞１ｇに対して滅菌工程Ｓ１、洗浄工程Ｓ２および粉砕工程Ｓ３を施し、得られた微細セルロース原料Ｃｆをふるいを用いて５種類の粒径群に分画し、各粒径群に対して酵素分解工程Ｓ４を施してグルコースの生成を行った。粒径群は小径から大径の順に、５３μｍ未満、５３μｍ以上・９０μｍ以下、９０μｍ以上・１５０μｍ以下、１５０μｍ以上・３００μｍ以下および３００μｍ以上・５００μｍ以下の５種類とした。
【００４７】
同様のグルコース生成を３回行った平均値のグルコース収集量は図４に示す通りとなった。図４の結果より、基質となる生物の排泄物Ｘとして牛糞の粒子径の減少に伴ってグルコースの収集量が増加することがわかった。
【００４８】
生成したセルロースに対して粉末Ｘ線解析装置（ＰＨＩＬＩＰＳ  Ｘ‘  Ｐｅｒｔ  Ｐｒｏ（ＰＨＩＬＩＰＳ社製、ＣｕＫα線：０．１５４ｎｍ）を用いて回折角と強度（任意）との関係を測定して結晶形の変化を検証した。その結果は図５に示す通りとなった。図５の結果より、粉砕工程Ｓ３における乳鉢粉砕によってはセルロースの大部分は結晶形の変化がないことがわかった。
【００４９】
＜実施例３＞
本実施例においては、生物の排泄物Ｘとして牛糞、豚糞、馬糞、鶏糞および山羊糞を採用して、それぞれからのグルコースの収集量を求めた。
【００５０】
牛糞、豚糞、馬糞、鶏糞および山羊糞に対して実施例１と同様の条件によりそれぞれグルコース生成を３回行った平均値のグルコース収集量は図６に示す通りとなった。図６の結果より、基質となる生物の排泄物Ｘとして牛糞以外の草食動物の排泄物からもグルコースを収集できることがわかった。
【００５１】
＜実施例４＞
本実施例においては、遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３とした場合について説明する。なお、本実施例においては、図１に示す滅菌工程Ｓ１、洗浄工程Ｓ２、ミキサー、乳鉢または遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３および酵素分解工程Ｓ４を行い、グルコースの生成を行った。それぞれの工程においては、以下のような処理を行った。
【００５２】
まず、滅菌工程Ｓ１においては、２００ｇの牛糞Ｄを深型シャーレに入れて、１２０℃の飽和水蒸気下で２０分間オートクレーブ処理を行って滅菌牛糞Ｄｓを得た。
【００５３】
洗浄工程Ｓ２においては、滅菌牛糞Ｄｓ５０ｇをガーゼと超純水（＞１８．２ＭΩｃｍ−１）３Ｌとによってろ過洗浄を行った後、５０℃の条件下で１６時間乾燥処理を行った。得られた乾燥物に対して超純水１５０ｍＬを加えたものをミキサーにて１５０００ｒｐｍで１０分間混合粉砕処理を行い、得られた粉砕物を５０ｍＬずつ分注して、４℃、２７０００Ｇの条件下で１０分間高速遠心分離を行い、得られた沈殿物を５０℃の条件下で１６時間乾燥を行い滅菌牛糞Ｄｓ中のセルロース原料Ｃを得た（サンプルＣ）。
【００５４】
ミキサーを用いた粉砕工程Ｓ３においては、３ｇのセルロース原料Ｃに対して超純水２００ｍＬを添加し、ミキサーとして精密分散・乳化装置（エム・テクニック社製、リップシール式実験機）を用いて１０分間粉砕処理を行い、微細セルロース原料Ｃｆ１を得た（サンプルＣｆ１）。
【００５５】
乳鉢を用いた粉砕工程Ｓ３においては、３ｇのセルロース原料Ｃを３０分間乳鉢にて粉砕処理を行い、微細セルロース原料Ｃｆ２を得た（サンプルＣｆ２）。
【００５６】
また、遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３においては、３ｇのセルロース原料Ｃに対して超純水４０ｍＬを添加したものを、遊星ボールミル装置（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ７  ｃｌａｓｓｉｃ  ｌｉｎｅ）にて１０分間の粉砕と１０分間の休止を組み合わせた粉砕処理を計６回行った後、吸引ろ過を行って微細セルロース原料Ｃｆ３を得た（サンプルＣｆ３）。
【００５７】
そして、酵素分解工程Ｓ４においては、５０ｍｇのセルロース原料Ｃおよび微細セルロース原料Ｃｆ１〜Ｃｆ３（サンプルＣ、Ｃｆ１〜Ｃｆ３）に対して、それぞれ７２％濃度の硫酸０．５ｍＬを添加して３０℃の条件下にて１時間インキュベーションを行い、それぞれセルロース原料反応溶液を得た。得られたセルロース原料反応溶液と超純水１４ｍＬとをそれぞれ高耐圧チューブに入れ、１２１℃の条件下で１時間オートクレーブを行った後、炭酸カルシウム５ｇを加えて中和処理を行いグルコースを収集した。なお、得られたグルコースの定量には、実施例１に記載の方法を用い、算出結果を図７に示す。
【００５８】
図７における各サンプルについては、洗浄工程Ｓ２後のセルロース原料ＣをサンプルＣ、洗浄工程Ｓ２の後にミキサーを用いた粉砕工程Ｓ３によって得られた微細セルロース原料Ｃｆ１をサンプルＣｆ１、洗浄工程Ｓ２の後に乳鉢を用いた粉砕工程Ｓ３によって得られた微細セルロース原料Ｃｆ２をサンプルＣｆ２、そして、洗浄工程Ｓ２の後に遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３によって得られた微細セルロース原料Ｃｆ３をサンプルＣｆ３とし、それぞれのサンプルについて酵素分解処理を行って得られたグルコース収集量を示している。
【００５９】
本実施例においては、図７に示すように、乾燥時における各サンプルＣ、Ｃｆ１〜Ｃｆ３の１ｇ当たりから酵素分解処理後に得られたグルコース収集量であり、サンプルＣについては１．０９ｍｇ、サンプルＣｆ１については１５．０７ｍｇ、サンプルＣｆ２については４３．３０ｍｇ、サンプルＣｆ３については５１．２５ｍｇのグルコースがそれぞれ得られた。なお、図７に示す値は、３つの試料の平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。
【００６０】
この結果から、遊星ボールミルを用いて粉砕工程Ｓ３を行うことにより、グルコースの生成量が増加することが明らかとなった。これは、遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３後の微細セルロース原料Ｃｆ３の粒径が、ミキサーまたは乳鉢を用いた場合のものと比較して小さく表面積が増大するために、酵素と接触する部分が増大し、酵素分解が容易となってグルコースの生成量が増加したと考えられる。
【００６１】
＜実施例５＞
本実施例においては、洗浄工程Ｓ２後のセルロース原料Ｃに対して、アルカリ水熱処理工程を施した場合にいつて説明する。なお、本実施例においては、図１に示す滅菌工程Ｓ１、洗浄工程Ｓ２、粉砕工程Ｓ３および酵素分解工程Ｓ４に加えて、洗浄工程Ｓ２の後に水酸化ナトリウム溶液を用いたアルカリ水熱処理工程を行い、得られたセルロース原料を用いてグルコースの生成を行った。それぞれの工程においては、以下のような処理を行った。
【００６２】
まず、滅菌工程Ｓ１においては、２００ｇの牛糞Ｄを深型シャーレに入れて、１２０℃の飽和水蒸気下で２０分間オートクレーブ処理を行って滅菌牛糞Ｄｓを得た。
【００６３】
洗浄工程Ｓ２においては、５０ｇの滅菌牛糞Ｄｓをガーゼと超純水（＞１８．２ＭΩｃｍ−１）３Ｌとによってろ過洗浄を行った後、５０℃の条件下で１６時間乾燥処理を行った。得られた乾燥物に対して超純水１５０ｍＬを加えたものをミキサーにて１５０００ｒｐｍで１０分間混合粉砕処理を行い、得られた粉砕物を５０ｍＬずつ分注して、４℃、２７０００Ｇの条件下で１０分間高速遠心分離を行い、得られた沈殿物を５０℃の条件下で１６時間乾燥を行い滅菌牛糞Ｄｓ中のセルロース原料Ｃを得た。
【００６４】
そして、アルカリ水熱処理工程においては、１０ｇのセルロース原料Ｃに対して１％濃度の水酸化ナトリウム水溶液９０ｍＬを添加して１２０℃の飽和水蒸気下で５分間オートクレーブ処理を行った後、吸引ろ過し、アルカリ水熱処理済セルロース原料を得た。
【００６５】
本実施例における酵素分解工程Ｓ４においては、５０ｍｇのアルカリ水熱処理済セルロース原料に対して、７２％濃度の硫酸０．５ｍＬを添加して３０℃の条件下にて１時間インキュベーションしてセルロース原料反応溶液を得る。得られたセルロース原料反応溶液と超純水１４ｍＬを高耐圧チューブに入れ、１２１℃の条件下で１時間オートクレーブを行った後、炭酸カルシウム５ｇを加えて中和処理を行いグルコースを収集した（サンプルＡ）。
【００６６】
また、本実施例においては、アルカリ水熱処理工程と遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３との効果について検討するべく、アルカリ水熱処理工程によって得られたアルカリ水熱処理済セルロース原料を実施例４に記載の遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３によって粉砕処理を行い、得られた微細セルロース原料Ｃｆ４について酵素分解工程Ｓ４を行ってグルコースの収集を行った（サンプルＢ）。
【００６７】
さらに、アルカリ水熱処理工程の効果を検討するべく、比較用のサンプルとして、洗浄工程Ｓ２によって得られたセルロース原料Ｃについて酵素分解処理を行ってグルコースを収集したサンプルＡ’および実施例４においてセルロース原料Ｃに対して遊星ボールミルを用いた粉砕処理を施した微細セルロース原料Ｃｆ３について酵素分解処理を行ってグルコースを収集したサンプルＢ’を作製した。
【００６８】
実施例１に記載のグルコース定量方法を用いて、各サンプル中のグルコース量を算出したものを図８に示す。本実施例においては、図８に示すように、乾燥時における各サンプル１ｇ当たりから、アルカリ水熱処理工程後に得られたアルカリ水熱処理済セルロース原料を用いたサンプルＡについては４９．６４ｍｇ、洗浄工程Ｓ２後に得られたセルロース原料Ｃを用いたサンプルＡ’については１５．０７ｍｇ、アルカリ水熱処理工程後に遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３後の微細セルロース原料Ｃｆ４を用いたサンプルＢについては５８．５７ｍｇ、洗浄工程Ｓ２後に遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３後の微細セルロース原料Ｃｆ３を用いたサンプルＢ’については５１．２５ｍｇのグルコースが得られた。なお、図８に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。
【００６９】
この結果から、サンプルＡとサンプルＡ’のグルコース収集量の結果から、アルカリ水熱処理工程を行うことによってグルコースの収集量が大幅に増加することが明らかとなった。これは、アルカリ水熱処理によって、セルラーゼによるセルロースの分解を阻害するリグニンが除去され、セルロースが繊維化し、基質−酵素間の距離が接近するためであると考えられる。
【００７０】
また、サンプルＡ、サンプルＢおよびサンプルＢ’のグルコース収集量の結果から、アルカリ水熱処理と遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３とを組み合わせることにより、さらにグルコースの収集量を増大させることができることが明らかとなった。これは、アルカリ水熱処理による上述のような効果に加え、遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３によって、基質の粒子径を更に小さくすることができるので、基質の表面積の増大と基質−酵素間の距離の接近との相乗効果によるものであると考えられる。
【００７１】
＜実施例６＞
本実施例においては、粉砕工程Ｓ３を遊星ボールミルにて行うとともに、酵素分解工程Ｓ４を２種類の分解酵素を用いて行った場合について説明する。なお、本実施例においては、図１に記載の洗浄工程Ｓ２中におけるセルロース原料Ｃとなりうる微細成分および水溶性成分の流出を考慮して、洗浄工程Ｓ２を除く、滅菌工程Ｓ１、遊星ボールミルを用いた粉砕工程Ｓ３および後述する酵素分解工程Ｓ４を行い、グルコース生成を行った。それぞれの工程においては、以下のような処理を行った。
【００７２】
まず、滅菌工程Ｓ１においては、実施例４に記載の方法を用いて行い、セルロース原料Ｃを得た。
【００７３】
粉砕工程Ｓ３においては、４５ｍＬのジルコニア容器中に１．３３ｇのセルロース原料Ｃ（含水量８３．５％）に対して５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．０）を２０ｍＬ添加し、直径１０ｍｍのジルコニアボールを１８個封入したものを、遊星ボールミル装置にて１０分間の粉砕と１０分間の休止を組み合わせた粉砕処理を計６回行い、１ｗｔ％ボールミル処理基質溶液を得た。なお、遊星ボールミル装置での粉砕は、４５０ｒｐｍおよび６００ｒｐｍの２種類の回転数にて行った。
【００７４】
酵素分解工程Ｓ４においては、１．５ｍＬマイクロチューブに２００μＬの１ｗｔ％ボールミル処理基質溶液および５０μＬのセルロース分解酵素溶液を分取し、５０℃の条件下で２４時間のインキュベーションを行ってサンプルを作製し、実施例１に記載の方法を用いてグルコースの定量を行った。なお、セルロース分解酵素溶液としては、酵素をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、コード：Ｃ９４２２−１０ＫＵ）もしくはＭｅｉｓｅｌａｓｅ（Ｍｅｉｊｉ社製）とした、０．５，１，５，１０，５０または１００ｍｇ／ｍＬ酵素／５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いた。なお、セルロース分解酵素濃度は、２５０μＬ（１ｗｔ％ボールミル処理基質溶液＋セルロース分解酵素溶液）の反応系において５０μＬの酵素溶液が添加されていることから、使用したセルロース分解酵素の終濃度は当該反応系において０．１，０．２，１，２，１０または２０ｍｇ／ｍＬとなっている。以降、セルロース分解酵素濃度は、０．１，０．２，１，２，１０または２０ｍｇ／ｍＬとして説明する。
【００７５】
ここで、本実施例においては、用いる酵素の違いによるグルコースの生成量を明確とするべく、前述の酵素分解工程Ｓ４によって得られたサンプルから収集されたグルコース量をみかけのグルコース量とし、酵素中に含まれるグルコース量を当該みかけのグルコース量から差し引いた値を本実施例によって得られた実際のグルコース量として示す。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅを用いて得られたみかけのグルコース量、酵素中のグルコース量および実際のグルコース量を表１、Ｍｒｉｓｅｌａｓｅを用いて得られたみかけのグルコース量、酵素中のグルコース量および実際のグルコース量を表２に示す。なお、表１および表２に示す値は、３つの試料の平均値である。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
【表２】
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【００７８】
表１および表２に示すように、セルロース分解酵素の濃度が高いほどグルコースの収集量が多く、セルロース分解酵素として２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＭｅｉｓｅｌａｓｅを用いて６００ｒｐｍの回転数にて粉砕処理を行ったサンプルが最もグルコース収集量が多く、基質１ｇ当たり１５３．０ｍｇのグルコースが得られた。
【００７９】
セルロース分解酵素の違いによる実際に得られるグルコース量を比較するべく、表１および表２の実質的なグルコース量を図９に示す。なお、図９に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。本実施例においては、図９に示すように、いずれのセルロース分解酵素においても、粉砕工程Ｓ３において回転数４５０ｒｐｍでの粉砕処理よりも、回転数６００ｒｐｍでの粉砕処理の場合の方が、より多くのグルコースを収集できることが明らかとなった。
【００８０】
＜牛糞全糖量分析＞
ここで、牛糞Ｄを一般的な方法を用いて完全にグルコースまで分解することによって、牛糞Ｄ中に含まれる全グルコース量を明らかとするべく牛糞全糖量分析を行った。本分析においては、滅菌処理Ｓ１のみを行った滅菌牛糞Ｄｓを乾燥させたものを用いて分解処理を行った。以下に、詳しい牛糞分解工程を説明する。
【００８１】
２ｍｌマイクロチューブに５０ｍｇの乾燥させた滅菌牛糞Ｄｓおよび０．５ｍＬの７２％濃度の硫酸を封入し、ボルテックスミキサーにて３０℃の条件下で１時間攪拌する。次に、得られた滅菌牛糞Ｄｓの硫酸分解基質および１４ｍＬの純水を２０ｍＬの耐熱耐圧ネジ口ガラス試験管に封入して１２１℃の条件下にて１時間オートクレーブ処理を行う。
【００８２】
オートクレーブ処理後の上清液２ｍＬを１５ｍＬマイクロチューブに入れ、ｐＨが中性となるまで炭酸カルシウムを適当量添加して中和処理を行った後、高速遠心分離器を用いて１５０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行って牛糞分解溶液を得た。グルコース量の算出には、実施例１に記載のグルコースの試薬（ラボアッセイＴＭグルコース、和光純薬工業株式会社製）を用いて行い、得られた結果を図１０に示す。なお、図１０に示す値は、３つのサンプルの平均値であり、その標準偏差をエラーバーとして示している。
【００８３】
乾燥させた滅菌牛糞Ｄｓ１ｇ当たりから得られる牛糞全糖量は、図１０に示すように、２５３．７ｍｇであることが明らかとなった。
【００８４】
本発明のグルコース製造方法は、上記の実施形態および各実施例に限定されるものではなく、発明の特徴を損なわない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００８５】
１  グルコース製造方法
Ｓ１  滅菌工程
Ｓ２  洗浄工程
Ｓ３  粉砕工程
Ｓ４  酵素分解工程
Ｓ５  グルコース精製工程
Ｘ  排泄物
Ｘｓ  滅菌排泄物
Ｃ  セルロース原料
Ｃｆ  微細セルロース原料
Ｄ  牛糞
Ｄｓ  滅菌牛糞
Ｈ  干し草
Ｈｆ  微細干し草
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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