(57)【要約】【課題】神経系の細胞の生存を促進するためのＤＲ６およびｐ７５のアンタゴニストの使用の提供。【解決手段】本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーであるデスレセプター６（ＤＲ６）タンパク質に関するものであり、ここで、神経系の細胞にアポトーシスを調節するために重要であることが示された。さらに、ｐ７５はＤＲ６のリガンドであることが発見された。その結果、本発明は、ＤＲ６および／またはｐ７５アンタゴニストを用いてＤＲ６およびｐ７５の相互作用を阻害するための方法に関する。さらに、ここに記載されている方法は、必要に応じてｐ７５アンタゴニストと組み合わせてＤＲ６アンタゴニストを用いた神経系の細胞の生存を促進する方法および、必要に応じてｐ７５アンタゴニストと組み合わせてＤＲ６アンタゴニストの投与による神経変性状態を治療する方法を含む。【選択図】図３１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
本発明の分野
本発明は、神経生理学、神経学、および薬理学に関する。より特別には、本発明は、任意にｐ７５アンタゴニストとの組み合わせで、デスレセプター６（ＤＲ６）アンタゴニストを用いて神経系の細胞の生存を促進するための方法に関する。本発明はまた、任意にｐ７５アンタゴニストとの組み合わせで、ＤＲ６アンタゴニストの投与によって神経変性病態を治療する方法に関する。本発明はまた、ＤＲ６および／またはｐ７５のアンタゴニストを用いて、ＤＲ６とｐ７５との相互作用を防止する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
アポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞死）は、急性および慢性の両損傷を含めた神経系の数多くの疾患において重要な役割を担っていることが示されている。例えば、アポトーシスの役割は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（例えば、ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症）、多発性硬化症、ニューロン外傷、および脳虚血（例えば、脳卒中）において示されている。
【０００３】
多くの研究では、アポトーシスの分子レベルの機序を理解するよう注力されており、これらの研究は、デスレセプターと呼ばれる受容体ファミリーの発見をもたらした。細胞質デスドメインを特徴とする８個のデスレセプターがこれまで同定されている。デスレセプターは、２つの異なるファミリーへとグループ分けされている。第一のファミリーのメンバーは、アポトーシス性シグナル伝達を促進する死滅誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を動員する。第二のファミリーのメンバーは、異なるセットの分子を動員して、アポトーシス性シグナルを伝達する。興味深いことに、第二のファミリーのメンバーは、細胞生存シグナルも伝達する。
【０００４】
デスレセプター６（ＤＲ６）は、デスレセプターの第二のファミリーのメンバーである。ＤＲ６は広範に発現するが、異なる細胞種において異なって機能するように見える。ＤＲ６ｍＲＮＡは、心臓、脳、胎盤、膵臓、リンパ節、胸腺、および前立腺組織において観察されている。より低いレベルは、骨格筋、腎臓、および精巣を含めた他の細胞種において観察されているが、成体の肝臓または造血起源のいずれの株においても、これまでほとんどまったく発現が観察されていない。興味深いことに、ＤＲ６は、試験した細胞のサブセットでのみアポトーシスを誘導することができる。例えば、ＨｅＬ  Ｓ３子宮頚部癌細胞におけるＤＲ６の過剰発現は、デスドメインに依存した様式でアポトーシスを結果として生じた（非特許文献１）。加えて、非特許文献２）は、β‐アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がＤＲ６リガンドであることを示しており、ＡＰＰ断片のＤＲ６に対する結合が、ニューロン体および軸索の変性の引き金となることを示唆している。対照的に、ＤＲ６は、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌株）細胞において細胞死を誘導しなかった（非特許文献１）。ＤＲ６の発現およびシグナル伝達に対する細胞の応答を区別する特徴はまだ同定されていない。
【０００５】
アポトーシスを特異的に調節する薬剤は、ニューロン死を包含する疾患を治療するのに有用であり得、それは、例えば、ニューロンが、他の細胞種よりも再生する能力が低くあり得るからである。しかしながら、現に入手可能な抗アポトーシス剤は、特異性および選択性が低く、結果として、望ましくない副作用を生じる。このような副作用は、例えば作用の望ましい部位に特異的に抗アポトーシス剤を標的指向化することによって低下または回避し得る。あるいは、細胞種の特定のサブセットにおいて特異的に作用するＤＲ６などのデスレセプターの特徴付けは、より特異的な治療効果を提供する可能性を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐａｎら  ＦＥＢＳ  ４３１：３５１−３５６  （１９９８）
【非特許文献２】Ｎｉｋｏｌｅａｖら（Ｎａｔｕｒｅ  ４５７：９８１−９９０  （２００９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＤＲ６が、神経系の細胞におけるアポトーシスを特異的に誘導でき、かつｐ７５がＤＲ６についてのリガンドであるという発見に基づいている。また、抗ＤＲ６抗体を含めたＤＲ６およびｐ７５のアンタゴニストが、ＤＲ６とｐ７５との相互作用を阻害でき、かつ神経系の細胞の死滅を阻害できることも発見された。従って、ＤＲ６および／またはｐ７５のアンタゴニストは、ＤＲ６の発現または活性の調節が有利である治療法に有用であり得る。
【０００８】
本明細書に記載の発見に基づいて、ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合でき、神経系の細胞の生存を促進するような、単離された抗体またはその抗原結合断片が記載される。また、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進する、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片も記載される。また、ＤＲ６抗体には、ミエリン形成を促進する、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片も含まれる。いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害する。いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害するが、β‐アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対するＤＲ６の結合を阻害しない。
【０００９】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片と、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＤＲ６エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片である。
【００１０】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片であり、該抗体またはその断片は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択された参照モノクローナルＦａｂ抗体断片を、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を、ＤＲ６に対する結合から競合的に阻害する。
【００１１】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体またはその断片は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体のものと同一の抗原結合ドメインを含む。
【００１２】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であり、該抗体またはその断片の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号  ９７、配列番号１０７、配列番号１１７、および配列番号１２７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２  配列番号１１２、配列番号１２２、および配列番号１３２からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号  ９７、配列番号１０７、配列番号１１７、および配列番号１２７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２  配列番号１１２、配列番号１２２、および配列番号１３２からなる群から選択される参照アミノ酸配列と２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号  ９７、配列番号１０７、配列番号１１７、および配列番号１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２  配列番号１１２、配列番号１２２、および配列番号１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨおよびＶＬはそれぞれ、配列番号７および配列番号１２；配列番号１７および配列番号２２；配列番号２７および配列番号３２；配列番号３７および配列番号４２；配列番号４７および配列番号５２；配列番号５７および配列番号６２；配列番号６７および配列番号７２；配列番号７７および配列番号８２；配列番号８７および配列番号９２；配列番号９７および配列番号１０２；配列番号１０７および配列番号１１２；配列番号１１７および配列番号１２２；ならびに配列番号
１２７および配列番号１３２からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨおよびＶＬはそれぞれ、配列番号７および配列番号１２；配列番号１７および配列番号２２；配列番号２７および配列番号３２；配列番号３７および配列番号４２；配列番号４７および配列番号５２；配列番号５７および配列番号６２；配列番号６７および配列番号７２；配列番号７７および配列番号８２；配列番号８７および配列番号９２；配列番号９７および配列番号１０２；配列番号１０７および配列番号１１２；配列番号１１７および配列番号１２２；ならびに配列番号１２７および配列番号１３２からなる群から選択される参照アミノ酸配列と２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨおよびＶＬはそれぞれ、配列番号７および配列番号１２；配列番号１７および配列番号２２；配列番号２７および配列番号３２；配列番号３７および配列番号４２；配列番号４７および配列番号５２；配列番号５７および配列番号６２；配列番号６７および配列番号７２；配列番号７７および配列番号８２；配列番号８７および配列番号９２；配列番号９７および配列番号１０２；配列番号１０７および配列番号１１２；配列番号１１７および配列番号１２２；ならびに配列番号１２７および配列番号１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８配列番号１１８、および配列番号１２８からなる群から選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域１（ＶＨ‐ＣＤＲ１）アミノ酸配列と２個以下のアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ‐ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＶＨ‐ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８配列番号１１８、および配列番号１２８からなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、および配列番号１２９からなる群から選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域２（ＶＨ‐ＣＤＲ２）アミノ酸配列と４個以下のアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ‐ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＶＨ‐ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９、および配列番号１２９からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、および配列番号１３０からなる群から選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域３（ＶＨ‐ＣＤＲ３）アミノ酸配列と４個以下のアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０、および配列番号１３０からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２３、および配列番号１３３からなる群から選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ‐ＣＤＲ１）と４個以下のアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ‐ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＶＬ‐ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２３、および配列番号１３３からなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２４、および配列番号１３４からなる群から選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ‐ＣＤＲ２）と２個以下のアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ‐ＣＤＲ２アミノ酸を含む。一実施態様において、ＶＬ‐ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２４、および配列番号１３４からなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号１１５、配列番号１２５、および配列番号１３５からなる群から選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ‐ＣＤＲ３）アミノ酸配列と４個以下のアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。一実施態様においてＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号１１５、配列番号１２５、および配列番号１３５からなる群から選択される。
【００２７】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号８、９、および１０；配列番号１８、１９、および２０；配列番号２８、２９、および３０；配列番号３８、３９、および４０；配列番号４８、４９、および５０；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６８、６９、および７０；配列番号７８、７９、および８０；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９８、９９、および１００；配列番号１０８、１０９、および１１０；配列番号１１８、１１９、および１２０；ならびに配列番号１２８、１２９、および１３０からなる群から選択されるＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、該ＶＨ‐ＣＤＲの少なくとも１つにおける１個、２個、３個、または４個のアミノ酸置換を除く。
【００２８】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＨは、配列番号８、９、および１０；配列番号１８、１９、および２０；配列番号２８、２９、および３０；配列番号３８、３９、および４０；配列番号４８、４９、および５０；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６８、６９、および７０；配列番号７８、７９、および８０；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９８、９９、および１００；配列番号１０８、１０９、および１１０；配列番号１１８、１１９、および１２０；ならびに配列番号１２８、１２９、および１３０からなる群から選択されるＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１３、１４、および１５；配列番号２３、２４、および２５；配列番号３３、３４、および３５；配列番号４３、４４、および４５；配列番号５３、５４、および５５；配列番号６３、６４、および６５；配列番号７３、７４、および７５；配列番号８３、８４、および８５；配列番号９３、９４、および９５；配列番号１０３、１０４、および１０５；配列番号１１３、１１４、および１１５；配列番号１２３、１２４、および１２５；ならびに配列番号１３３、１３４、および１３５からなる群から選択されるＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、該ＶＬ‐ＣＤＲの少なくとも１つにおける１個、２個、３個、または４個のアミノ酸置換を除く。
【００３０】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片であり、該抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１３、１４、および１５；配列番号２３、２４、および２５；配列番号３３、３４、および３５；配列番号４３、４４、および４５；配列番号５３、５４、および５５；配列番号６３、６４、および６５；配列番号７３、７４、および７５；配列番号８３、８４、および８５；配列番号９３、９４、および９５；配列番号１０３、１０４、および１０５；配列番号１１３、１１４、および１１５；配列番号１２３、１２４、および１２５；ならびに配列番号１３３、１３４、および１３５からなる群から選択されるＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００３１】
先に記載した抗体またはその断片に関する種々の実施態様において、ＶＨフレームワーク領域および／またはＶＬフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである。
【００３２】
いくつかの実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、線形エピトープまたは非線形立体配座エピトープに結合する。
【００３３】
いくつかの実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、多価であり、少なくとも２つの重鎖および少なくとも２つの軽鎖を含む。
【００３４】
いくつかの実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、多選択性である。さらなる実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、二重特異性である。
【００３５】
先に記載した抗体またはその断片に関する種々の実施態様において、重鎖および軽鎖可変ドメインはマウスである。さらなる実施態様において、重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択されるモノクローナル抗体に由来する。
【００３６】
先に記載した抗体またはその断片に関する種々の実施態様において、重鎖および軽鎖可変ドメインは完全にヒトである。さらなる実施態様において、重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片に由来する。
【００３７】
種々の実施態様において、先に記載した抗体またはその断片はヒト化されている。
【００３８】
種々の実施態様において、先に記載した抗体またはその断片はキメラである。
【００３９】
種々の実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は霊長類化されている。
【００４０】
種々の実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は完全にヒトである。
【００４１】
ある実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ＡＢ）２断片、またはＦｖ断片である。ある実施態様において、先に記載した抗体は、一本鎖抗体である。ある実施態様において、抗体またはその断片は、ポリマーに抱合している。ある実施態様において、ポリマーは、ポリアルキレングリコールである。さらなる実施態様において、ポリアルキレンギコール（ｇｙｃｏｌ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００４２】
ある実施態様において、ある実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、ヒトκ定常領域およびヒトλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む。
【００４３】
ある実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、重鎖定常領域またはその断片を含む。さらなる実施態様において、重鎖定常領域またはその断片は、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４非糖部、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ１非糖部からなる群から選択される。
【００４４】
いくつかの実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、ＤＲ６ポリペプチドもしくはその断片、またはＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的に結合し、該参照モノクローナル抗体についての解離定数（ＫＤ）よりも小さなＫＤを特徴とする親和性を有する。さらなる実施態様において、解離定数（ＫＤ）は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下である。
【００４５】
いくつかの実施態様において、先に記載した抗体またはその断片は、マウスＤＲ６ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＤＲ６ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
【００４６】
加えて、本明細書に記載の方法は一般的に、神経系の細胞の生存を促進し、該細胞のアポトーシスを防止する方法に関する。ある実施態様において、方法は、神経系の細胞をＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む該細胞の生存を促進する方法を含む。いくつかの特定の実施態様において、神経系細胞の細胞は、脳細胞、脊髄細胞、またはそのような細胞に由来する細胞株など、中枢神経系の細胞である。いくつかの実施態様において、中枢神経系の細胞は、皮質ニューロン、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、またはアストロサイト、またはそのような細胞に由来する細胞株である。いくつかの実施態様において、中枢神経系の細胞は、ニューロン、例えば、皮質ニューロン、運動ニューロン、および後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、またはこのような細胞に由来する細胞株である。いくつかの実施態様において、細胞は、ミクログリアおよびマクログリア、またはこのような細胞に由来する細胞株を含めたグリア細胞である。マクログリア細胞の例には、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞（ｅｐｅｎｄｙｍｏｃｙｔｅ）、および放射状グリア細胞が挙げられる。いくつかの実施態様において、細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはこのような細胞に由来する細胞株などのこれらの細胞の前駆細胞である。いくつかの実施態様において、神経系の細胞は、末梢神経系細胞である。いくつかの実施態様において、末梢神経系細胞は、後根神経節ニューロン、シュワン細胞、またはこのような細胞に由来する細胞株である。
【００４７】
また、本明細書に記載の方法は、オリゴデンドロサイト細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞をＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進する方法も提供する。いくつかの実施態様において、方法は、治療有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む、オリゴデンドロサイトの死滅または分化の欠失と関連した病態を治療する方法である。
【００４８】
また、本明細書に記載の方法は、ニューロン細胞とオリゴデンドロサイト細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞との混合物をＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む、ミエリン形成を促進する方法も提供する。いくつかの実施態様において、方法は、治療有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む、髄鞘形成異常または脱髄と関連した病態を治療する方法である。
【００４９】
また、方法は一般的に、神経系の細胞の死滅と関連した病態を治療する方法にも関する。別の実施態様において、方法は、神経系の細胞の死滅と関連した病態を治療する必要のある哺乳類に、有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む、該病態を治療する方法である。いくつかの特定の実施態様において、神経系の細胞の死滅と関連した病態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（例えば、ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症）、多発性硬化症、ニューロン外傷、または脳虚血（例えば、脳卒中）であり得る。いくつかの特定の実施態様において、病態は神経因性疼痛である。
【００５０】
また、本明細書に記載の方法は、ＤＲ６ポリペプチドおよび／またはｐ７５ポリペプチドをＤＲ６アンタゴニストと、ｐ７５に対するＤＲ６の結合が阻害される条件下で接触させることを含む、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害する方法を含む。
【００５１】
先の方法に関する種々の実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、神経系の細胞の生存を負に調節するＤＲ６の能力に干渉する任意の分子であり得る。ある実施態様において、ＤＲアンタゴニストは、可溶性ＤＲ６ポリペプチド、ＤＲ６アンタゴニスト化合物、ＤＲ６アンタゴニスト抗体もしくはその断片、ＤＲ６アンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）、ＤＲ６アプタマー、または２つ以上のＤＲ６アンタゴニストの組み合わせからなる群から選択される。
【００５２】
ある実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストポリペプチドは、可溶性ＤＲ６ポリペプチドである。本明細書に記載のある可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、ＤＲ６細胞外ドメインまたは１つ以上のＤＲ６  ＴＮＦＲ様システインリッチなモチーフを含む可溶性ＤＲ６ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、ＤＲ６  ＴＮＦＲ様システインリッチなモチーフ、膜貫通ドメイン、デスドメイン、または細胞質ドメインのうちの１つ以上を欠失している。いくつかの実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストポリペプチドは、配列番号２（ＤＲ６）のアミノ酸１〜３４９；配列番号２のアミノ酸４０〜３４９；または配列番号２のアミノ酸４１〜３４９を含む。
【００５３】
いくつかの実施態様において、可溶性ＤＲ６アンタゴニストは、非ＤＲ６異種性ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様において、非ＤＲ６異種性ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片、血清アルブミンポリペプチド、標的指向化ポリペプチド、リポーターポリペプチド、および精製を容易にするポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、抗体Ｉｇポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃポリペプチドである。
【００５４】
代替的な実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、先に記載した抗体またはその断片である。他の実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、以下のドメインのうちの１つ以上を含むＤＲ６ポリペプチドに結合する抗体またはその断片である：（Ｉ）ＤＲ６細胞外ドメイン、および（ＩＩ）ＤＲ６  ＴＮＦＲ様システインリッチなモチーフ。加えて、ＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその断片は、本明細書に記載のＤＲ６ポリペプチドを含むポリペプチド内のエピトープに特異的に結合することができる。また、ＤＲ６アンタゴニストは、このような抗体の抗原結合断片または２つ以上の抗体もしくはその断片の組み合わせであり得る。
【００５５】
他の実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＤＲ６アンタゴニストポリヌクレオチドである。
【００５６】
追加的な実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストはＤＲ６アプタマーである。ＤＲ６アプタマーは、ＤＲ６に結合して神経系細胞の生存を促進しまたは細胞のアポトーシスを防止する低分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【００５７】
先の方法に関するいくつかの実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、（ａ）神経系の細胞に、発現制御配列との作用可能な会合を通じてＤＲ６アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および（ｂ）該ＤＲ６アンタゴニストを発現させること含む方法によって、対象に投与される。いくつかの実施態様において、神経系細胞は哺乳類にあり、該導入は、（ａ）該哺乳類に、発現制御配列との作用可能な会合を通じてＤＲ６アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む。いくつかの実施態様において、培養された宿主細胞は、治療されるべき哺乳類に由来する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、電気穿孔法、ウイルス形質導入、または直接的微量注入を介して、宿主細胞または神経系細胞に導入される。
【００５８】
ある実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、疾患、障害、または損傷の部位またはその近くで哺乳類に投与することのできるポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターとして投与される。ある実施態様において、ベクターは、アデノウイルスベクター、αウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、エプスタイン・バーウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター）パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター）、およびパルボウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施態様において、ベクターは、局所投与、眼内投与、および非経口投与（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、皮内、くも膜下腔内、腹腔内）からなる群から選択される経路によって投与される。
【００５９】
本明細書に記載の方法によると、ＤＲ６アンタゴニストは、ｐ７５アンタゴニストと併用して用いることができる。ｐ７５アンタゴニストは、同時にまたは順次に用いることができる。
【００６０】
また、本明細書に記載の方法には、ｐ７５に対するＤＲ６の結合が阻害される条件下で、ｐ７５ポリペプチドおよび／またはＤＲ６ポリペプチドをｐ７５アンタゴニストと接触させることを含む、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害する方法も含まれる。ｐ７５アンタゴニストは、（ｉ）ｐ７５アンタゴニスト化合物；（ｉｉ）ｐ７５アンタゴニストポリペプチド；（ｉｉｉ）ｐ７５アンタゴニスト抗体またはその断片；（ｉｖ）ｐ７５アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｖ）ｐ７５アプタマー；または（ｖｉ）該ｐ７５アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせであり得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体が神経系の細胞の生存を促進することができる単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目２）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体がオリゴデンドロサイトの増殖、分化又は生存を促進することができる単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目３）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体が髄鞘形成を促進することができる単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目４）
単離抗体又はその抗原結合断片であって、Ｍ５０−Ｈ０１、Ｍ５１−Ｈ０９、Ｍ５３−Ｅ０４、Ｍ５３−Ｆ０４、Ｍ６２−Ｂ０２、Ｍ６３−Ｅ１０、Ｍ６６−Ｂ０３、Ｍ６７−Ｇ０２、Ｍ７２−Ｆ０３及びＭ７３−Ｃ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又は１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１及び１Ｐ５Ｄ１０．２から成る群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＤＲ６エピトープに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目５）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、Ｍ５０−Ｈ０１、Ｍ５１−Ｈ０９、Ｍ５３−Ｅ０４、Ｍ５３−Ｆ０４、Ｍ６２−Ｂ０２、Ｍ６３−Ｅ１０、Ｍ６６−Ｂ０３、Ｍ６７−Ｇ０２、Ｍ７２−Ｆ０３及びＭ７３−Ｃ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又は１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１及び１Ｐ５Ｄ１０．２から成る群から選択される参照モノクローナル抗体がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目６）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片が、Ｍ５０−Ｈ０１、Ｍ５１−Ｈ０９、Ｍ５３−Ｅ０４、Ｍ５３−Ｆ０４、Ｍ６２−Ｂ０２、Ｍ６３−Ｅ１０、Ｍ６６−Ｂ０３、Ｍ６７−Ｇ０２、Ｍ７２−Ｆ０３及びＭ７３−Ｃ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片、又は１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１及び１Ｐ５Ｄ１０．２から成る群から選択される参照モノクローナル抗体と同一の抗原結合ドメインを含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目７）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７及び配列番号１２７から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目８）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１１２、配列番号１２２及び配列番号１３２から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目９）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７及び配列番号１２７から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１０）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１１２、配列番号１２２及び配列番号１３２から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１１）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７、配列番号１１７及び配列番号１２７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１２）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１１２、配列番号１２２及び配列番号１３２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１３）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬがそれぞれ、配列番号７と配列番号１２；配列番号１７と配列番号２２；配列番号２７と配列番号３２；配列番号３７と配列番号４２；配列番号４７と配列番号５２；配列番号５７と配列番号６２；配列番号６７と配列番号７２；配列番号７７と配列番号８２；配列番号８７と配列番号９２；配列番号９７と配列番号１０２；配列番号１０７と配列番号１１２；配列番号１１７と配列番号１２２；及び配列番号１２７と配列番号１３２から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１４）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬがそれぞれ、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号７と配列番号１２；配列番号１７と配列番号２２；配列番号２７と配列番号３２；配列番号３７と配列番号４２；配列番号４７と配列番号５２；配列番号５７と配列番号６２；配列番号６７と配列番号７２；配列番号７７と配列番号８２；配列番号８７と配列番号９２；配列番号９７と配列番号１０２；配列番号１０７と配列番号１１２；配列番号１１７と配列番号１２２；及び配列番号１２７と配列番号１３２から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１５）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬがそれぞれ、配列番号７と配列番号１２；配列番号１７と配列番号２２；配列番号２７と配列番号３２；配列番号３７と配列番号４２；配列番号４７と配列番号５２；配列番号５７と配列番号６２；配列番号６７と配列番号７２；配列番号７７と配列番号８２；配列番号８７と配列番号９２；配列番号９７と配列番号１０２；配列番号１０７と配列番号１１２；配列番号１１７と配列番号１２２；及び配列番号１２７と配列番号１３２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１６）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、２以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８及び配列番号１２８から成る群から選択される参照カバット重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１７）
前記ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８及び配列番号１２８から成る群から選択される項目１６の抗体又はその断片。
（項目１８）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、４以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９及び配列番号１２９から成る群から選択される参照カバット重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目１９）
前記ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９及び配列番号１２９から成る群から選択される項目１８の抗体又はその断片。
（項目２０）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、４以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０及び配列番号１３０から成る群から選択される参照カバット重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目２１）
前記ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号４０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０、配列番号１２０及び配列番号１３０から成る群から選択される項目２０の抗体又はその断片。
（項目２２）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、４以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２３及び配列番号１３３から成る群から選択される参照カバット軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目２３）
前記ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２３及び配列番号１３３から成る群から選択される項目２２の抗体又はその断片。
（項目２４）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、２以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２４及び配列番号１３４から成る群から選択される参照カバット軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目２５）
前記ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２４及び配列番号１３４ら成る群から選択される項目２４の抗体又はその断片。
（項目２６）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、４以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号１１５、配列番号１２５及び配列番号１３５から成る群から選択される参照カバット軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目２７）
前記ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１０５、配列番号１１５、配列番号１２５及び配列番号１３５から成る群から選択される項目２６の抗体又はその断片。
（項目２８）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号８と９と１０；配列番号１８と１９と２０；配列番号２８と２９と３０；配列番号３８と３９と４０；配列番号４８と４９と５０；配列番号５８と５９と６０；配列番号：６８と６９と７０；配列番号７８と７９と８０；配列番号８８と８９と９０；配列番号９８と９９と１００；配列番号１０８と１０９と１１０；配列番号１１８と１１９と１２０；及び配列番号１２８と１２９と１３０から成る群から選択されるが、ＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つにて１、２、３、又は４のアミノ酸置換は除く、ＶＨ−ＣＤＲ１とＶＨ−ＣＤＲ２とＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目２９）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号８と９と１０；配列番号１８と１９と２０；配列番号２８と２９と３０；配列番号３８と３９と４０；配列番号４８と４９と５０；配列番号５８と５９と６０；配列番号：６８と６９と７０；配列番号７８と７９と８０；配列番号８８と８９と９０；配列番号９８と９９と１００；配列番号１０８と１０９と１１０；配列番号１１８と１１９と１２０；及び配列番号１２８と１２９と１３０から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１とＶＨ−ＣＤＲ２とＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目３０）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号１３と１４と１５；配列番号２３と２４と２５；配列番号３３と３４と３５；配列番号４３と４４と４５；配列番号５３と５４と５５；配列番号６３と６４と６５；配列番号７３と７４と７５；配列番号８３と８４と８５；配列番号９３と９４と９５；配列番号１０３と１０４と１０５；配列番号１１３と１１４と１１５；配列番号１２３と１２４と１２５；及び配列番号１３３と１３４と１３５から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１とＶＬ−ＣＤＲ２とＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、ＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つにて１、２、３、又は４のアミノ酸置換を除く、単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目３１）
ＤＲ６ポリペプチドに特異的に結合することができる単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号１３と１４と１５；配列番号２３と２４と２５；配列番号３３と３４と３５；配列番号４３と４４と４５；配列番号５３と５４と５５；配列番号６３と６４と６５；配列番号７３と７４と７５；配列番号８３と８４と８５；配列番号９３と９４と９５；配列番号１０３と１０４と１０５；配列番号１１３と１１４と１１５；配列番号１２３と１２４と１２５；及び配列番号１３３と１３４と１３５から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１とＶＬ−ＣＤＲ２とＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合断片。
（項目３２）
ＶＨのフレームワーク領域が、５以下のアミノ酸置換を除いてヒト型である項目１〜３１のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目３３）
ＶＬのフレームワーク領域が、５以下のアミノ酸置換を除いてヒト型である項目１〜３２のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目３４）
ＤＲ６ポリペプチドの線形エピトープに結合する項目１〜３３のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目３５）
ＤＲ６ポリペプチドの非線形立体配置のエピトープに結合する項目１〜３３のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目３６）
抗体又はその断片が多価であり、少なくとも２本の重鎖と少なくとも２本の軽鎖を含む項目１〜３５のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目３７）
抗体又はその断片が多重特異性である項目１〜３６のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目３８）
抗体又はその断片が二重特異性である項目３７の抗体又はその断片。
（項目３９）
抗体又はその断片が二重特異性である項目１〜３８のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４０）
重鎖及び軽鎖の可変領域が、マウス起源である項目１〜３９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４１）
前記重鎖及び軽鎖の可変領域が、１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１及び１Ｐ５Ｄ１０．２から成る群から選択されるモノクローナル抗体に由来する項目４０の抗体又はその断片。
（項目４２）
重鎖及び軽鎖の可変領域が完全にヒト起源である項目１〜３９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４３）
前記重鎖及び軽鎖の可変領域が、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０及びＭ８０−Ｂ０３、Ｍ５０−Ｈ０１、Ｍ５１−Ｈ０９、Ｍ５３−Ｅ０４、Ｍ５３−Ｆ０４、Ｍ６２−Ｂ０２、Ｍ６３−Ｅ１０、Ｍ６６−Ｂ０３、Ｍ６７−Ｇ０２、Ｍ７２−Ｆ０３及びＭ７３−Ｃ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片に由来する項目４２の抗体又はその断片。
（項目４４）
ヒト化されている項目１〜３９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４５）
キメラである項目１〜３９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４６）
霊長類化されている項目１〜３９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４７）
完全にヒト型である項目１〜３９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４８）
Ｆａｂ断片である項目１〜４７のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目４９）
Ｆａｂ’断片である項目１〜４７のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５０）
Ｆ（ａｂ）２断片である項目１〜４７のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５１）
Ｆｖ断片である項目１〜４７のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５２）
単鎖抗体である項目１〜４７のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５３）
前記抗体又はその断片がポリマーに抱合される項目４８〜５２のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５４）
ポリマーがポリアルキレングリコールである項目５３の抗体又はその断片。
（項目５５）
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である項目５４の抗体又はその断片。
（項目５６）
ヒトκ定常領域とヒトλ定常領域から成る群から選択される軽鎖定常領域を含む項目１〜４９及び５２〜５５のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５７）
重鎖定常領域又はその断片を含む項目１〜４９及び５２〜５５のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目５８）
前記重鎖定常領域又はその断片が、ヒトのＩｇＧ４、ＩｇＧ４非糖部、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１非糖部から成る群から選択される項目５７の抗体又はその断片。
（項目５９）
前記参照モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤを特徴とする親和性にてＤＲポリペプチド若しくはその断片、又はＤＲ６変異ポリペプチドと特異的に結合することができる項目４〜５８のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目６０）
５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性にて、ＤＲ６ポリペプチド若しくはその断片又はＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的に結合することができる項目１〜５９のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目６１）
マウスのＤＲ６ポリペプチド又はその断片に比べてヒトのＤＲ６ポリペプチド又はその断片に優先的に結合することができる項目１〜６０のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目６２）
ｐ７５へのＤＲ６の結合を阻害する項目１〜６１のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目６３）
ＡＰＰへのＤＲ６の結合を妨害しない項目１〜６２のいずれか１項の抗体又はその断片。
（項目６４）
神経系の細胞の生存を促進する方法であって、前記細胞をＤＲ６拮抗物質に接触させることを含む方法。
（項目６５）
前記細胞が哺乳類のものであり、前記接触が、治療上有効な量のＤＲ６拮抗物質をそれが必要な哺乳類に投与することを含む項目６４の方法。
（項目６６）
対象において神経系の細胞の死と関連する症状を治療する方法であって、治療上有効な量のＤＲ６拮抗物質を投与することを含む方法。
（項目６７）
神経系の細胞が中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞である項目６４〜６６のいずれか１項の方法。
（項目６８）
ＣＮＳの細胞が、皮質ニューロン、運動ニューロン、オリゴデンドロサイト、小膠細胞及び星状細胞から成る群から選択される項目６７の方法。
（項目６９）
神経系の細胞が、末梢神経系（ＰＮＳ）の細胞である項目６４〜６６のいずれか１項の方法。
（項目７０）
ＰＮＳの細胞が、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン及びシュワン細胞から成る群から選択される項目６９の方法。
（項目７１）
神経系の細胞がニューロンである項目６４〜６６のいずれか１項の方法。
（項目７２）
ニューロンが、皮質ニューロン、ＤＲＧニューロン又は運動ニューロンである項目７１の方法。
（項目７３）
神経系の細胞がグリア細胞である項目６４〜６６のいずれか１項の方法。
（項目７４）
グリア細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞、星状細胞及び小膠細胞から成る群から選択される項目７３の方法。
（項目７５）
オリゴデンドロサイトの増殖、分化又は生存を促進する方法であって、オリゴデンドロサイト細胞又はオリゴデンドロサイト前駆細胞をＤＲ６拮抗物質に接触させることを含む方法。
（項目７６）
前記細胞が哺乳類のものであり、前記接触が、有効量のＤＲ６拮抗物質をそれが必要な哺乳類に投与することを含む項目７５の方法。
（項目７７）
オリゴデンドロサイトの死又は分化の欠如に関連する症状を治療する方法であって、治療上有効な量のＤＲ６拮抗物質を投与することを含む方法。
（項目７８）
髄鞘形成を促進する方法であって、ニューロン細胞とグリア細胞の混合物をＤＲ６拮抗物質に接触させることを含む方法。
（項目７９）
グリア細胞が、オリゴデンドロサイト細胞又はオリゴデンドロサイト前駆細胞である項目７８の方法。
（項目８０）
グリア細胞が、シュワン細胞である項目７８の方法。
（項目８１）
前記ニューロン細胞及び前記グリア細胞が、哺乳類のものであり、前記接触が、有効量のＤＲ６拮抗物質をそれが必要な哺乳類に投与することを含む項目７８〜８０のいずれか１項の方法。
（項目８２）
髄鞘形成不全又は脱ミエリン化に関連する症状を治療する方法であって、治療上有効な量のＤＲ６拮抗物質を投与することを含む方法。
（項目８３）
ｐ７５へのＤＲ６の結合を阻害する方法であって、ｐ７５へのＤＲ６の結合が阻害される条件下でＤＲ６ポリペプチド及び／又はｐ７５ポリペプチドをＤＲ６拮抗物質に接触させることを含む方法。
（項目８４）
ＤＲ６拮抗物質が可溶性ＤＲ６ポリペプチドである項目６４〜８３のいずれか１項の方法。
（項目８５）
可溶性ＤＲ６ポリペプチドが、
（ｉ）ＤＲ６ＴＮＦＲ−様のシステインリッチドメイン又はその断片、変異体若しくは誘導体、
（ｉｉ）ＤＲ６細胞外ドメイン又はその断片、変異体若しくは誘導体、
（ｉｉｉ）ＤＲ６細胞質ドメイン又はその断片、変異体若しくは誘導体、
（ｉｖ）ＤＲ６膜貫通ドメイン又はその断片、変異体若しくは誘導体、
（ｖ）ＤＲ６死のドメイン又はその断片、変異体若しくは誘導体、
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の前記ＤＲ６ドメイン又はその断片、変異体若しくは誘導体の少なくとも２つの組み合わせ
から成る群から選択されるＤＲ６領域を含む項目８４の方法。
（項目８６）
可溶性ＤＲ６ポリペプチドが、
（ｉ）ＤＲ６ＴＮＦＲ−様のシステインリッチドメイン、
（ｉｉ）ＤＲ６細胞外ドメイン、
（ｉｉｉ）ＤＲ６細胞質ドメイン、
（ｉｖ）ＤＲ６膜貫通ドメイン、
（ｖ）ＤＲ６死のドメイン、
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の前記ＤＲ６ドメインの少なくとも２つの組み合わせ
から成る群から選択される少なくとも１つのＤＲ６領域を欠く項目８４の方法。
（項目８７）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドが、ＤＲ６膜貫通ドメイン及びＤＲ６細胞質ドメインを欠く項目８４の方法。
（項目８８）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜４０；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜６４；
（Ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１０５；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸１〜１４５；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸１〜１８５；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１〜２１２；
（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３４９；
（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸４２〜６４；
（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸４２〜１０５；
（ｘ）配列番号２のアミノ酸４２〜１４５；
（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸４２〜１８５；
（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸４２〜２１２；
（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸４２〜３４９；
（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸６５〜２１２；
（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸６５〜３４９；
（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸６５〜１０５；
（ｘｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１０６〜１４５；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１４６〜１８５；
（ｘｉｘ）配列番号２のアミノ酸１８６〜２１２；
（ｘｘ）配列番号２のアミノ酸１０６〜２１２；
（ｘｘｉ）配列番号２のアミノ酸１０６〜３４９；
（ｘｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸１４６〜２１２；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１４６〜３４９；
（ｘｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸２１３〜３４９；
（ｘｘｖ）前記ポリペプチド断片の変異体又は誘導体、並びに
（ｘｘｖｉ）前記ポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体の少なくとも２つの組み合わせから成る群から選択されるポリペプチド断片を含む項目８４の方法。
（項目８９）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜３４９、又はアミノ酸４１〜３４９又はアミノ酸４２〜３４９を含む項目８４の方法
（項目９０）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドが、ＤＲ６ＴＮＦＲ様のシステインリッチモチーフ又はその断片、変異体若しくは誘導体を含む項目８４〜８９のいずれか１項の方法。
（項目９１）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドがさらに非ＤＲ６部分を含む項目８４〜９０のいずれか１項の方法。
（項目９２）
前記非ＤＲ６部分が、前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドに融合された異種ポリペプチドである項目９１の方法。
（項目９３）
異種ポリペプチドが、免疫グロブリン断片、血清アルブミン、ターゲティングタンパク質、リポータータンパク質、及び精製促進タンパク質から成る群から選択される項目９２の方法。
（項目９４）
前記異種ポリペプチドが免疫グロブリン断片である項目９３の方法。
（項目９５）
前記免疫グロブリン断片がヒンジとＦｃ領域を含む項目９４の方法。
（項目９６）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドがポリマーに抱合される項目９１〜９５のいずれか１項の方法。
（項目９７）
ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー及びポリペプチドから成る群から選択される項目９６の方法。
（項目９８）
ポリマーがポリアルキレングリコールである項目９７の方法。
（項目９９）
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である項目９８の方法。
（項目１００）
前記可溶性ＤＲ６ポリペプチドが１、２、３又は４のポリマーに抱合される項目９９の方法。
（項目１０１）
前記ポリマーの全分子量が５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである項目１００の方法。
（項目１０２）
前記ＤＲ６拮抗物質がＤＲ６抗体又はその断片を含む項目６４〜８３のいずれか１項の方法。
（項目１０３）
前記ＤＲ６抗体又はその断片が、項目１〜６３のいずれか１項の抗体又はその断片である項目１０２の方法。
（項目１０４）
前記ＤＲ６抗体又はその断片が、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸６５〜１０５；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１０６〜１４５；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１４５〜１８５；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸１８６〜２１２；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸６５〜１４５；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸６５〜１８５；
（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸６５〜２１２；
（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１０６〜１８５；
（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸１０６〜２１２；
（ｘ）配列番号２のアミノ酸１３４〜１８９；
（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸１３４〜１６８；
（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸１６８〜１８９；
（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１４６〜２１２；
（ｘｉｖ）前記ポリペプチドの変異体又は誘導体、及び
（ｘｖ）前記ポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体の２以上の組み合わせ
から成る群から選択されるポリペプチド断片から本質的に成るエピトープに特異的に結合する項目１０２の方法。
（項目１０５）
前記ＤＲ６拮抗物質がＤＲ６拮抗物質のポリヌクレオチドを含む項目６４〜８３のいずれか１項の方法。
（項目１０６）
前記ＤＲ６拮抗物質のポリヌクレオチドが
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び
（ｉｖ）小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
から成る群から選択される項目１０５の方法。
（項目１０７）
前記ＤＲ６拮抗物質のポリヌクレオチドが、ＤＲ６ｍＲＮＡに相補的な少なくとも１０の塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである項目１０６の方法。
（項目１０８）
前記ＤＲ６拮抗物質のポリヌクレオチドが、リボザイムである項目１０７の方法。
（項目１０９）
前記ＤＲ６拮抗物質のポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡである項目１０５の方法。
（項目１１０）
前記ｓｉＲＮＡが、ＡＧＡＡＡＣＧＧＣＵＣＣＵＵＵＡＵＵＡ（配列番号１６０）、ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＵＡＵＣＡＧＵＵ（配列番号１６１）、ＧＧＣＣＧＡＵＧＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＵ（配列番号１６２）、ＧＣＡＧＵＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＡ（配列番号：１６３）から成る群から選択される配列を含む項目１０９の方法。
（項目１１１）
前記ＤＲ６拮抗物質のポリヌクレオチドが、ｓｈＲＮＡである項目１０６の方法。
（項目１１２）
前記ＬＩＮＧＯ−１拮抗物質がアプタマーである項目６４〜８３のいずれか１項の方法。
（項目１１３）
接触させることが、（ａ）発現制御配列との操作可能な会合を介して前記ＤＲ６拮抗物質をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することと（ｂ）前記ＤＲ６拮抗物質を発現させること含む項目６４〜６５、６７〜７６又は７８〜８３のいずれか１項の方法。
（項目１１４）
（ａ）形質移入；
（ｂ）エレクトロポレーション；
（ｃ）形質導入；及び
（ｄ）直接的な微量注入から成る群から選択される方法によって前記ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する項目１１３の方法。
（項目１１５）
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターとして投与される項目１１３〜１１４のいずれか１項の方法。
（項目１１６）
前記発現ベクターがウイルスベクターである項目１１５の方法。
（項目１１７）
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びパルボウイルスベクターから成る群から選択される項目１１６の方法。
（項目１１８）
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純性ヘルペスウイルスベクター及びエプステイン・バーウイルスベクターから成る群から選択される項目１１７の方法。
（項目１１９）
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである項目１１７の方法。
（項目１２０）
前記レンチウイルスベクターがｐＬＬ３．７．である項目１１７の方法。
（項目１２１）
前記パルボウイルスベクターがアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである項目１１７の方法。
（項目１２２）
前記ＤＲ６拮抗物質が、局所投与、眼内投与、硝子体内投与、非経口投与、クモ膜下投与、硬膜下投与、皮下投与、又はカプセル埋め込みを介した投与から成る群から選択される経路によって投与される項目６６〜７４、７７、又は８１〜８２のいずれか１項の方法。
（項目１２３）
前記哺乳類が、中枢神経系の細胞死に関連する症状を有すると診断されている又は疑われている項目６５、７６又は８１のいずれか１項の方法。
（項目１２４）
前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（たとえば、筋萎縮性側索硬化）、多発性硬化症、ニューロンの外傷、及び脳虚血（たとえば、卒中）から成る群から選択される項目６６又は１２３の方法。
（項目１２５）
細胞がシュワン細胞であり、症状が神経障害性の痛みである項目６６の方法。
（項目１２６）
前記哺乳類が神経障害性の痛みを有すると診断されている又は疑われている項目８１の方法。
（項目１２７）
症状が神経障害性の痛みである項目８２の方法。
（項目１２８）
前記ＤＲ６拮抗物質がｐ７５拮抗物質と併用で使用される項目６４〜１２７のいずれか１項の方法。
（項目１２９）
ＤＲ６拮抗物質とｐ７５拮抗物質が同時に使用される項目１２８の方法。
（項目１３０）
ＤＲ６拮抗物質とｐ７５拮抗物質が順次使用される項目１２８の方法。
（項目１３１）
ｐ７５へのＤＲ６の結合を阻害する方法であって、ｐ７５へのＤＲ６の結合が阻害される条件下でｐ７５ポリペプチド及び／又はＤＲ６ポリペプチドをｐ７５拮抗物質に接触させることを含む方法。
（項目１３２）
ｐ７５拮抗物質が、（ｉ）ｐ７５拮抗物質化合物；（ｉｉ）ｐ７５拮抗物質ポリペプチド；（ｉｉｉ）ｐ７５拮抗物質抗体又はその断片；（ｉｖ）ｐ７５拮抗物質ポリヌクレオチド；（ｖ）ｐ７５アプタマー及び（ｖｉ）前記ｐ７５拮抗物質の２以上の組み合わせから成る群から選択される項目１３１の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】ＤＲ６は、発達中に調節され、中枢神経系において発現する。ＤＲ６の定量的ＰＣＲの結果を示すグラフ。Ｅ１８、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、および成体ラット脳（図１Ａ）および脊髄（図１Ｂ）由来のＤＲ６  ＭＲＮＡレベルは、Ｅ１８におけるＤＲ６  ＭＲＮＡレベル／ＤＲ６  ＭＲＮＡレベルの比として表される。抗ＤＲ６抗体を用いたウエスタンブロットに基づいた皮質（ＣＸ）、海馬（ＨＰ）、線条体（ＳＴ）、中脳（ＭＢ）、小脳（ＣＢ）、および脊髄（ＳＣ）におけるタンパク質発現（図１Ｃ）。オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、皮質ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの溶解物由来のＤＲ６およびＧＡＰＤＨのＲＴ‐ＰＣＲ（図１Ｄ）。
【図１Ｂ】ＤＲ６は、発達中に調節され、中枢神経系において発現する。ＤＲ６の定量的ＰＣＲの結果を示すグラフ。Ｅ１８、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、および成体ラット脳（図１Ａ）および脊髄（図１Ｂ）由来のＤＲ６  ＭＲＮＡレベルは、Ｅ１８におけるＤＲ６  ＭＲＮＡレベル／ＤＲ６  ＭＲＮＡレベルの比として表される。抗ＤＲ６抗体を用いたウエスタンブロットに基づいた皮質（ＣＸ）、海馬（ＨＰ）、線条体（ＳＴ）、中脳（ＭＢ）、小脳（ＣＢ）、および脊髄（ＳＣ）におけるタンパク質発現（図１Ｃ）。オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、皮質ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの溶解物由来のＤＲ６およびＧＡＰＤＨのＲＴ‐ＰＣＲ（図１Ｄ）。
【図１Ｃ】ＤＲ６は、発達中に調節され、中枢神経系において発現する。ＤＲ６の定量的ＰＣＲの結果を示すグラフ。Ｅ１８、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、および成体ラット脳（図１Ａ）および脊髄（図１Ｂ）由来のＤＲ６  ＭＲＮＡレベルは、Ｅ１８におけるＤＲ６  ＭＲＮＡレベル／ＤＲ６  ＭＲＮＡレベルの比として表される。抗ＤＲ６抗体を用いたウエスタンブロットに基づいた皮質（ＣＸ）、海馬（ＨＰ）、線条体（ＳＴ）、中脳（ＭＢ）、小脳（ＣＢ）、および脊髄（ＳＣ）におけるタンパク質発現（図１Ｃ）。オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、皮質ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの溶解物由来のＤＲ６およびＧＡＰＤＨのＲＴ‐ＰＣＲ（図１Ｄ）。
【図１Ｄ】ＤＲ６は、発達中に調節され、中枢神経系において発現する。ＤＲ６の定量的ＰＣＲの結果を示すグラフ。Ｅ１８、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、および成体ラット脳（図１Ａ）および脊髄（図１Ｂ）由来のＤＲ６  ＭＲＮＡレベルは、Ｅ１８におけるＤＲ６  ＭＲＮＡレベル／ＤＲ６  ＭＲＮＡレベルの比として表される。抗ＤＲ６抗体を用いたウエスタンブロットに基づいた皮質（ＣＸ）、海馬（ＨＰ）、線条体（ＳＴ）、中脳（ＭＢ）、小脳（ＣＢ）、および脊髄（ＳＣ）におけるタンパク質発現（図１Ｃ）。オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、皮質ニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトの溶解物由来のＤＲ６およびＧＡＰＤＨのＲＴ‐ＰＣＲ（図１Ｄ）。
【図２】ＤＲ６は、オリゴデンドロサイトにおいて発現する。Ａ２Ｂ５、Ｏ４、およびＭＢＰ陽性のオリゴデンドロサイトの溶解物に由来するＤＲ６およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のＲＴ‐ＰＣＲ（図２Ａ）。ＤＲ６  ＲＴ‐ＰＣＲを、逆転写酵素なしで，陰性対照として実施した（−ＲＴ  ＤＲ６）。Ａ２Ｂ５、Ｏ４、およびＭＢＰ陽性のオリゴデンドロサイトにおけるＤＲ６の発現を示すウエスタンブロット（図２Ｂ）。
【図３】ＤＲ６は、アルツハイマー病において調節される。アルツハイマー病脳および対照脳におけるＤＲ６  ＭＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲを示すグラフ。レベルは、アルツハイマー病脳ＭＲＮＡレベル／平均対照脳ＭＲＮＡレベルの比として表される。
【図４】ＤＲ６は、ニューロン損傷に応答して調節される。対照ニューロンおよび軸索切断に供したニューロンにおけるＤＲ６  ＭＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲを示すグラフ。ＤＲ６  ＭＲＮＡレベルは、軸索切断試料におけるＭＲＮＡレベル／対照試料におけるＭＲＮＡレベルの比として表される。
【図５Ａ】ＤＲ６の過剰発現は、ニューロンの死滅を誘導する。ＦＬ‐ＤＲ６を発現するレンチウイルスに感染した皮質ニューロンおよび対照皮質ニューロンの画像（図５Ａ）。未処理の細胞、全長ＤＲ６（ＤＲ６‐ＦＬ）のレンチウイルス、ドミナント・ネガティブＤＲ６（ＤＲ６‐ＤＮ）レンチウイルス、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞において実施した細胞生存率についてＸＴＴアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図５Ｂ）。未処理の細胞、ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＰＦレンチウイルスに感染した細胞におけるカスパーゼ３活性についてのアッセイにおいて測定された遊離ローダミンを示すグラフ（図５Ｃ）。抗活性型カスパーゼ３、抗βＩＩＩ‐チューブリン、および抗ＧＦＰ抗体を用いてプローブしたＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞のウエスタンブロット（図５Ｄ）。
【図５Ｂ】ＤＲ６の過剰発現は、ニューロンの死滅を誘導する。ＦＬ‐ＤＲ６を発現するレンチウイルスに感染した皮質ニューロンおよび対照皮質ニューロンの画像（図５Ａ）。未処理の細胞、全長ＤＲ６（ＤＲ６‐ＦＬ）のレンチウイルス、ドミナント・ネガティブＤＲ６（ＤＲ６‐ＤＮ）レンチウイルス、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞において実施した細胞生存率についてＸＴＴアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図５Ｂ）。未処理の細胞、ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＰＦレンチウイルスに感染した細胞におけるカスパーゼ３活性についてのアッセイにおいて測定された遊離ローダミンを示すグラフ（図５Ｃ）。抗活性型カスパーゼ３、抗βＩＩＩ‐チューブリン、および抗ＧＦＰ抗体を用いてプローブしたＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞のウエスタンブロット（図５Ｄ）。
【図５Ｃ】ＤＲ６の過剰発現は、ニューロンの死滅を誘導する。ＦＬ‐ＤＲ６を発現するレンチウイルスに感染した皮質ニューロンおよび対照皮質ニューロンの画像（図５Ａ）。未処理の細胞、全長ＤＲ６（ＤＲ６‐ＦＬ）のレンチウイルス、ドミナント・ネガティブＤＲ６（ＤＲ６‐ＤＮ）レンチウイルス、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞において実施した細胞生存率についてＸＴＴアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図５Ｂ）。未処理の細胞、ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＰＦレンチウイルスに感染した細胞におけるカスパーゼ３活性についてのアッセイにおいて測定された遊離ローダミンを示すグラフ（図５Ｃ）。抗活性型カスパーゼ３、抗βＩＩＩ‐チューブリン、および抗ＧＦＰ抗体を用いてプローブしたＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞のウエスタンブロット（図５Ｄ）。
【図５Ｄ】ＤＲ６の過剰発現は、ニューロンの死滅を誘導する。ＦＬ‐ＤＲ６を発現するレンチウイルスに感染した皮質ニューロンおよび対照皮質ニューロンの画像（図５Ａ）。未処理の細胞、全長ＤＲ６（ＤＲ６‐ＦＬ）のレンチウイルス、ドミナント・ネガティブＤＲ６（ＤＲ６‐ＤＮ）レンチウイルス、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞において実施した細胞生存率についてＸＴＴアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図５Ｂ）。未処理の細胞、ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＰＦレンチウイルスに感染した細胞におけるカスパーゼ３活性についてのアッセイにおいて測定された遊離ローダミンを示すグラフ（図５Ｃ）。抗活性型カスパーゼ３、抗βＩＩＩ‐チューブリン、および抗ＧＦＰ抗体を用いてプローブしたＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞のウエスタンブロット（図５Ｄ）。
【図６Ａ】ＤＲ６の過剰発現は、ＯＰＣの死滅を誘導する。ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞における細胞毒性％を示すグラフ（図６Ａ）。ロテノンで処理した細胞、およびＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、またはＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞における細胞生存率についてのＬＤＨアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図６Ｃ）。
【図６Ｂ】ＤＲ６の過剰発現は、ＯＰＣの死滅を誘導する。ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞における細胞毒性％を示すグラフ（図６Ａ）。ロテノンで処理した細胞、およびＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、またはＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞における細胞生存率についてのＬＤＨアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図６Ｃ）。
【図６Ｃ】ＤＲ６の過剰発現は、ＯＰＣの死滅を誘導する。ＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、およびＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞における細胞毒性％を示すグラフ（図６Ａ）。ロテノンで処理した細胞、およびＤＲ６‐ＦＬ、ＤＲ６‐ＤＮ、またはＧＦＰレンチウイルスに感染した細胞における細胞生存率についてのＬＤＨアッセイにおいて測定された吸光度を示すグラフ（図６Ｃ）。
【図７】ＤＲ６シグナル伝達経路の遮断は、オリゴデンドロサイトの生存および分化を促進する。抗ＭＢＰ、抗ＭＯＧ、抗ＧＦＰ、および抗βアクチン抗体を用いてプローブしたＤＲ６  ＦＬおよびＤＲ６  ＤＮに感染したオリゴデンドロサイト由来の細胞溶解物のウエスタンブロット（図７Ａ）。ＤＲ６  ＦＬおよびＤＲ６  ＤＮに感染したオリゴデンドロサイトにおけるＣＮＰａｓｅのレベルを測定するＥＬＩＳＡ（図７Ｂ）。
【図８】可溶性ＤＲ６は、全長ＤＲ６をニューロン細胞死を誘導することから遮断する。対照ヒトＦｃで処理した（上のパネル）、ＦＬ‐ＤＲ６に感染し、対照ヒト‐Ｆｃで処理した（中ほどのパネル）、およびＦＬ‐ＤＲ６に感染し、ＤＲ６‐Ｆｃで処理した（下のパネル）培養Ｅ１８大脳皮質ニューロンのタイムラプス画像（図８Ａ）。ＤＲ６‐Ｆｃまたは対照Ｆｃによる処理後の生存している細胞数を示すグラフ（図８Ｂ）。
【図９】可溶性ＤＲ６は、加齢したＤＲＧニューロンの生存およびＤＲ６‐ＦＬを発現するニューロンにおける神経突起の成長を促進する。ＤＲ６‐Ｆｃ、対照Ｆｃ、または無処理での処理後にニューロンが有する突起を示すグラフ（図９Ａ）。ＤＲ６‐Ｆｃ、対照Ｆｃ、または無処理での処理後にニューロンが有する大きくかつ複雑な突起を示すグラフ（図９Ｂ）。
【図１０】ＤＲ６誘発性ニューロン死は、ＤＲ６‐Ｆｃによって阻害される。抗活性型カスパーゼ３、抗ＧＦＰ、および抗β‐アクチン抗体を用いてプローブされた０、１、３、１０、または３０μｇ／ＭＬの組換え可溶性ＤＲ６（ＤＲ６  Ｆｃ）を含む培地においてインキュベートした未処理の細胞およびＤＲ６‐ＦＬレンチウイルス感染細胞に関するウエスタンブロット（図１０Ａ）。ＤＲ６‐Ｆｃでｈ粗離した培養物における活性型カスパーゼ３のレベルを示すグラフ（図１０Ｂ）。
【図１１】ＤＲ６  ＲＮＡｉは、ニューロンの生存を促進する。ＤＲ６または対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞に関するＬＤＨアッセイにおいて測定された細胞毒性％を示すグラフ（図１１Ａ）。ＤＲ６または対照ｓｉＲＮＡに曝露され、漸増濃度のＡβ４２（図１１Ｂ）、グルタミン酸塩（図１１Ｃ）、またはＴＮＦα（図１１Ｄ）で処理した細胞に関するＸＴＴアッセイにおいて測定された％細胞毒性を示すグラフ。
【図１２】ＤＲ６  ｓｉＲＮＡは、オリゴデンドロサイトの分化を促進する。対照ｓｉＲＮＡまたはＤＲ６  ｓｉＲＮＡで処理したオリゴデンドロサイトの溶解物由来のＤＲ６およびＧＡＰＤＨのＲＴ‐ＰＣＲ（図１２Ａ）。また、ＤＲ６  ＲＴ‐ＰＣＲ反応を逆転写酵素なしでも陰性対照として実施した（ＤＲ６‐ＲＴ）。抗ＭＢＰ、抗ＭＯＧ、および抗β‐アクチン抗体を用いてプローブしたＤＲ６  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞のウエスタンブロット（図１２Ｂ）。
【図１３】抗ＤＲ６抗体は、ラット、マウス、およびヒトＤＲ６に結合する。グラフは、抗ＤＲ６抗体（１Ｄ１０、２Ｆ２、および５Ｄ１０）が、ラット（図１３Ａ）、ヒト（図１３Ｂ）、またはマウスＤＲ６（図１３Ｃ）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から産生されるＤＲ６に結合する能力を評価するために実施したＦＡＣＳ分析を示す。
【図１４Ａ】抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は、オリゴデンドロサイトの分化を促進し、アポトーシスを阻害する。抗ＤＲ６抗体で処理したオリゴデンドロサイトの培養物におけるカスパーゼ３活性％を示すグラフ（図１４Ａ）。抗ＤＲ６抗体で処理したオリゴデンドロサイト培養物におけるＭＢＰ＋細胞％を示すグラフ（図１４Ｂ）。抗ＤＲ６抗体で処理し、ウサギ抗切断型カスパーゼ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗ＭＢＰ抗体（ＳＭＩ９４およびＳＭＩ９９，１：４０００，Ｃｏｎｖａｎｃｅ）、およびウサギ抗β‐アクチン抗体（１：２０００，Ｓｉｇｍａ）を用いてプローブした細胞培養物のウェエスタンブロット（図１４Ｃ）。
【図１４Ｂ】抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は、オリゴデンドロサイトの分化を促進し、アポトーシスを阻害する。抗ＤＲ６抗体で処理したオリゴデンドロサイトの培養物におけるカスパーゼ３活性％を示すグラフ（図１４Ａ）。抗ＤＲ６抗体で処理したオリゴデンドロサイト培養物におけるＭＢＰ＋細胞％を示すグラフ（図１４Ｂ）。抗ＤＲ６抗体で処理し、ウサギ抗切断型カスパーゼ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗ＭＢＰ抗体（ＳＭＩ９４およびＳＭＩ９９，１：４０００，Ｃｏｎｖａｎｃｅ）、およびウサギ抗β‐アクチン抗体（１：２０００，Ｓｉｇｍａ）を用いてプローブした細胞培養物のウェエスタンブロット（図１４Ｃ）。
【図１４Ｃ】抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は、オリゴデンドロサイトの分化を促進し、アポトーシスを阻害する。抗ＤＲ６抗体で処理したオリゴデンドロサイトの培養物におけるカスパーゼ３活性％を示すグラフ（図１４Ａ）。抗ＤＲ６抗体で処理したオリゴデンドロサイト培養物におけるＭＢＰ＋細胞％を示すグラフ（図１４Ｂ）。抗ＤＲ６抗体で処理し、ウサギ抗切断型カスパーゼ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗ＭＢＰ抗体（ＳＭＩ９４およびＳＭＩ９９，１：４０００，Ｃｏｎｖａｎｃｅ）、およびウサギ抗β‐アクチン抗体（１：２０００，Ｓｉｇｍａ）を用いてプローブした細胞培養物のウェエスタンブロット（図１４Ｃ）。
【図１５】抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は、共培養におけるオリゴデンドロサイト／ＤＲＧのミエリン形成を促進する。抗ＤＲ６抗体で処理し、マウス抗ＭＢＰ抗体（ＳＭＩ９４およびＳＭＩ９９，１：４０００，Ｃｏｎｖａｎｃｅ）、マウス抗ＭＯＧ抗体（１：５００）、およびウサギ抗β‐アクチン抗体（１：２０００，Ｓｉｇｍａ）を用いてプローブしたオリゴデンドロサイトおよびＤＲＧニューロンの共培養物のウエスタンブロット。
【図１６】抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は、ラット脳切片培養における再ミエリン形成を促進する。無処理ならびに生物活性脂質リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および抗ＤＲ６抗体による処理後の黒金染色強度を示すグラフ（図１６Ｂ）。
【図１７Ａ】抗ＤＲ６抗体は、ラット実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける機能的回復を促進する。ＭＯＧの注射の第１４日目に始まり、１週間に２回を２週間生じる抗ＤＲ６抗体で処理したＭＯＧ誘発性ＥＡＥラットにおけるＥＡＥスコア（ＥＡＥ疾患の機能的回復として測定）を示すグラフ。ＥＡＥスコアは、ＥＡＥ疾患の機能的回復として測定した。対照または抗ＤＲ６抗体で処理したラットＥＡＥモデルにおける神経伝達速度を示すグラフ。
【図１７Ｂ】抗ＤＲ６抗体は、ラット実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける機能的回復を促進する。ＭＯＧの注射の第１４日目に始まり、１週間に２回を２週間生じる抗ＤＲ６抗体で処理したＭＯＧ誘発性ＥＡＥラットにおけるＥＡＥスコア（ＥＡＥ疾患の機能的回復として測定）を示すグラフ。ＥＡＥスコアは、ＥＡＥ疾患の機能的回復として測定した。対照または抗ＤＲ６抗体で処理したラットＥＡＥモデルにおける神経伝達速度を示すグラフ。
【図１８】リンパ球および全血細胞数は、ＥＡＥラットにおける抗ＤＲ６抗体処理によって影響されない。ＥＡＥ研究の終了時（第３２日目）に決定された総リンパ球数（図１８Ａ）および全血細胞数（図１８Ｂ）を示すグラフ。
【図１９】ＤＲ６抗体は、ＥＡＥラットにおける脊髄へのＴ細胞の浸潤を阻害する。ＥＡＥマウスにおけるＴ細胞浸潤を可視化するために抗ＣＤ４抗体を用いて脊髄組織をＩＨＣ染色した結果を示すグラフ。染色は、ＥＡＥ研究の終了時に実施した。
【図２０】ＴＮＦαは、ニューロン死を促進し、ＤＲ６を上方制御する。ＴＮＦαによる処理後のアポトーシス性細胞％を示すグラフ（図２０Ａ）。ＴＮＦαによる処理後の細胞の総数に対するアポトーシス性細胞％（ＤＡＰＩ＋）を示すグラフ（図２０Ｂ）。ＴＮＦαによる処理後の細胞総数に対するＤＲ６＋細胞％（ＤＡＰＩ＋）を示すグラフ（図２０Ｃ）。
【図２１】ＴＮＦαは、ＤＲ６を上方制御し、ＮＦκＢシグナル伝達を通じてニューロン死を誘導する。ＴＮＦαで１８時間および２４時間処理し、抗ＤＲ６、抗ＮＦκＢ、抗ＩκＢα、および抗β‐アクチン抗体を用いてプローブした皮質ニューロンのウエスタンブロット（図２１Ａ）。ＴＮＦαによる処理後のＤＲ６の定量的な量を示すグラフ（図２１Ｂ）。ＴＮＦαによる処理後のＮＦκＢの定量的な量を示すグラフ（図２１Ｃ）。ＴＮＦαによる処理後のＩκＢαの定量的な量を示すグラフ（図２１Ｄ）。
【図２２】ＤＲ６  ＲＮＡｉは、ニューロンにおけるＮＦκＢ発現を低下させる。無処理ならびにＤＲ６  ＲＮＡｉおよび対照ＲＮＡｉによる処理後のＤＲ６  ＭＲＮＡレベルを示すグラフ（図２２Ａ）。ＴＮＦαにより処理し、さらにＤＲ６  ＲＮＡｉにより処理し、抗ＮＦκＢ、抗ＩκＢα、および抗β‐アクチン抗体を用いてプローブした皮質ニューロンのウエスタンブロット（図２２Ｂ）。無処理およびＤＲ６  ＲＮＡｉによる処理後のＮＦκＢの定量的な量を示すグラフ（図２２Ｃ）。無処理およびＤＲ６  ＲＮＡｉによる処理後のＩκＢαの定量的な量を示すグラフ（図２２Ｄ）。
【図２３】抗ＤＲ６抗体は、シュワン細胞のミエリン形成を促進する。抗ＤＲ６または対照抗体による処理後のシュワン細胞およびＤＲＧニューロンの共培養物におけるＭＢＰおよびβ‐アクチンレベルを示すウエスタンブロット（図２３Ａ）。共培養物におけるβ‐アクチンレベルと比較したＭＢＰレベルの定量化を示す棒グラフ（図２３Ｂ）。
【図２４】ＤＲ６およびリン酸化型ＡＫＴのレベルは反比例する。培養したラット皮質ニューロンにおけるＤＲ６、Ｐ‐ＡＫＴ、ＡＫＴ、およびβ‐アクチンレベルを示すウエスタンブロット。
【図２５】ＤＲ６およびｐ７５は相互作用する。ＤＲ６、ｐ７５、およびＴｒＫＡ（陰性対照）タンパク質の組み合わせを組換えで発現する細胞由来のＤＲ６の免疫沈降から結果として生じるＤＲ６およびｐ７５タンパク質レベルを示すウエスタンブロット（図２５Ａ）。ＤＲ６またはＰＶ９０（陰性対照）を組換えで発現する細胞の表面へのｐ７５の結合の定量化を示す棒グラフ（図２５Ｃ）。ヒト胎仔脊髄単離物由来のＤＲ６の免疫沈降から結果として生じるＤＲ６およびｐ７５タンパク質レベルを示すウエスタンブロット（図２５Ｂ）。
【図２６】ＤＲ６およびｐ７５は、マウス脳において同時発現する。マウス脳の種々の領域におけるＤＲ６およびｐ７５  ＭＲＮＡレベルの定量化を示す棒グラフ。
【図２７】ＤＲ６抗体５Ｄ１０は、ＤＲ６とｐ７５との相互作用を遮断する。抗ＤＲ６抗体２Ａ９および５Ｄ１０とともに免疫沈降するｐ７５およびＤＲ６タンパク質を示すウエスタンブロット（図２７Ａ）。対照ベクターまたはｐ７５をコードするベクターをトランスフェクトし、アルカリホスファターゼ‐ＤＲ６単独、または抗ＤＲ６抗体と組み合わせたアルカリホスファターゼ‐ＤＲ６のいずれかに曝露したＣＨＯ細胞を示す画像（図２７Ｂ）。
【図２８】ＤＲ６とｐ７５の相互作用を遮断する抗体は、ＤＲ６の  Ｃｙｓ３／Ｃｙｓ４ドメインに結合する。組換えＤＲ６欠失変異体の発現のレベルを示す棒グラフ（図２８Ａ）。抗ｍｙｃ抗体（陽性対照）、抗ＤＲ６抗体５Ｄ１０、および抗ＤＲ６抗体２Ａ９を用いて免疫沈降するｍｙｃＤＲ６融合タンパク質の量を示すウエスタンブロット（図２８Ｂ）。ＤＲ６欠失タンパク質と抗ＤＲ６抗体５Ｄ１０、２Ａ９、１Ｄ６、２Ｆ２、およびＡ４Ａとの相互作用の定量化を示す棒グラフ（図２８Ｃ）。ＭＯＰＣ‐２１は、マウスモノクローナル対照抗体を示す。
【図２９】ＤＲ６のＣｙｓ３／Ｃｙｓ４領域は、ｐ７５への結合にとって重要である。ＤＲ６と免疫沈降するＤＲ６欠失タンパク質およびｐ７５タンパク質の量を示すウエスタンブロット。
【図３０】抗ＤＲ６抗体５Ｄ１０およびＭ５３Ｅ０４は、ヒトＤＲ６に結合する。グラフは、ヒトおよびラットＤＲ６に結合する抗ＤＲ６抗体の能力を評価するために実施したＦＡＣＳ分析を示す。抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０の染色結果は、ヒトおよびラットＤＲ６タンパク質発現を示す。
【図３１】抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は、共培養物におけるオリゴデンドロサイト／ＤＲＧミエリン形成を促進する。抗ＤＲ６抗体（Ｍ５３Ｅ０４および５Ｄ１０）、抗ＬＩＮＧＯ‐１抗体（ＬＩ８１）、および対照抗体で処理し、抗ＭＢＰ抗体、抗ＭＯＧ抗体、および抗β‐アクチン抗体を用いてプローブしたオリゴデンドロサイトおよびＤＲＧニューロンの共培養物のウエスタンブロット。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、定義を含めて、本出願が優先される。文脈によって別段に必要とされない限り、単数形は、複数形を含むものとし、複数形は単数形を含むものとする。本明細書に言及されるすべての刊行物、特許、および他の引用文献は、各個々の刊行物または特許出願が、引用により組み込まれるよう具体的かつ個々に示されるかのように、すべての目的のために、それらのすべての内容の全体が引用により組み込まれる。
【００６３】
本明細書に記載のものと類似のまたは等価の方法および材料は、本明細書に記載の方法の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を下記に記載する。材料、方法、および実施例は、説明目的のみであり、制限するよう意図するものではない。本明細書に記載の抗体および方法に関する他の特徴および利点は、詳細な説明からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００６４】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を提供する。
【００６５】
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、該実体のうちの１つ以上を指すよう留意されるべきであり、例えば、「免疫グロブリン分子」（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すよう理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つの」は、本明細書で交換可能に用いることができる。
【００６６】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、任意の列挙された整数または整数の群の包含を示すが、任意の他の整数または整数の群の排除を示さない。
【００６７】
本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ））」もしくは「からなる（（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの変化形は、任意の列挙された整数または整数の群の包含を示すが、追加的な整数または整数の群は、具体的な方法、構造、または組成物に追加することはできない。
【００６８】
本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、任意の列挙された整数または整数の群の包含を示し、特定した方法、構造、または組成の基本的なまたは新規の特性を大幅に変更しない任意の列挙された整数または整数の群の任意の包含を示す。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な薬用量および期間での有効な量を指す。治療結果は、例えば、症状の低減、生存期間の延長、改良された可動性、またはそれに類するものであり得る。「治療有効量」は、所望の治療結果の任意の１つまたは複数の所望の治療結果の任意の組み合わせを達成することができる。治療結果は、「治癒」である必要はない。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するのに必要な薬用量および期間での有効量を指す。典型的には、予防用量は、疾患前に、またはより早期の段階において対象において用いられるので、予防有効量は、治療有効量よりも少ないであろう。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、非翻訳５’および３’配列を含めた全長ｃＤＮＡ配列、コード化配列、ならびに核酸配列の断片、エピトープ、ドメイン、および変異形のヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖もしくは一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成することができる。また、ポリヌクレオチドは、安定性または他の理由のために修飾された１つ以上の修飾された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖を含むことができる。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化した塩基およびイノシンなどの通常ではない塩基が挙げられる。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされ得、従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００７２】
ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターから構成することができ、２０個の遺伝子でコードされるアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を含むことができる。本明細書に記載のポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然の過程によって、または当技術分野で周知の化学修飾技術によってのいずれかで修飾することができる。このような修飾は、基本の教科書に、およびより詳細な研究書に、ならびに多数の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端を含めたポリペプチドにおけるいずれにでも生じることができる。同じ種類の修飾は、所与のポリペプチドにおけるいくつかの部位において、同じまたは異なる程度で存在することができる。また、所与のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含むことができる。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐することができ、該ポリペプチドは、分岐を有するまたは有さない環状であり得る。環状、分岐鎖、および分岐鎖環状ポリペプチドは、翻訳後天然過程から結果として生じることができ、または合成方法によって作製することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ‐リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ‐カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化など、タンパク質に対するアミノ酸の転移ＲＮＡ仲介性付加が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．Ｈ．    Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ．  １−１２  （１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６  （１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２  （１９９２）参照）。
【００７３】
用語「断片」、「変異形」、「誘導体」、および「類似体」は、デスレセプター６（ＤＲ６）アンタゴニストに言及する場合、神経系細胞生存を促進する任意のアンタゴニスト分子が含まれる。可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、ＤＲ６タンパク質分解性断片、欠失断片、および特に動物に送達されると作用部位により容易に到達する断片を含むことができる。ポリペプチド断片にはさらに、直鎖および３次元エピトープを含めた天然ポリペプチドの抗原性または免疫原性エピトープを含むポリペプチドの任意の部分を含む。可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、先に記載した断片を含めた変異体ＤＲ６領域、およびまた、アミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入により変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。対立遺伝子変異体などの変異体が天然に生じることができる。「対立遺伝子変異体」の意図するものは、生物体の染色体における所与の座を占有する遺伝子の代替的な形態である（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，  Ｌｅｗｉｎ，  Ｂ．，  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８５））。非天然に生じる変異形は、当技術分野で公知の変異原性技術を用いて生じることができる。可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。また、ＤＲ６アンタゴニストには、誘導体分子を含むことができる。例えば、可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、天然のポリペプチドでは認められない追加的な特徴を呈するよう変化したＤＲ６領域を含むことができる。例には、融合タンパク質およびタンパク質抱合体が挙げられる。
【００７４】
「ポリペプチド断片」は、ＤＲ６ポリペプチドの短いアミノ酸配列を指す。タンパク質断片は、「独立している」か、断片が領域の一部を形成するより大きなポリペプチド内に含むことができる。ポリペプチド断片の代表的な例には、例えば長さ約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸を含む断片が挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合分子」（「ＡＢＭ」）は、その最も広範な意味で、抗原性決定因子に特異的に結合する分子を指す。成熟した抗体の断片が抗原に特異的に結合することができることは当業者によって理解される。従って、抗原結合分子は、該用語が本明細書で使用される場合、標的抗原に特異的に結合する成熟した抗体の断片を含むが、これに限定されない。ＡＢＭは、定常領域を含む必要がない。特定の実施態様において、１つ以上の定常領域が存在する場合、定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一であり、例えば、少なくとも約８５〜９０％、または約９５％以上同一である。ＡＢＭは、糖鎖工学で操作して、抗体依存性細胞毒性を高めることができる。
【００７６】
抗体または免疫グロブリン。一実施態様において、本明細書に開示の治療方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニストは、「抗体」または「免疫グロブリン」分子、またはその免疫特異的断片、例えば、天然の抗体もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子と類似の様式で抗原に結合する操作した抗体分子もしくは断片である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書で交換可能に用いられる。本明細書で使用する場合、用語抗体または免疫グロブリンは、モノクローナル、ポリクローナル、および多選択性（例えば、二重特異性）抗体を含めた全抗体分子、ならびにＦｃ領域を有しかつ結合特異性を保有する抗体断片、ならびに免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含みかつ結合特異性を保有する融合タンパク質を含むよう意図される。また、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、および四重特異性抗体を含むがこれらに限定されない、結合特異性を保有する抗体断片も包含される（例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｒｉａｕ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ９：  １２９−１３４  （２００３）参照）。また、ヒト化抗体、霊長類化抗体、およびキメラ抗体も包含される。
【００７７】
下記により詳細に論じるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別することのできる５つの広範なクラスのポリペプチドを含む。５つのクラスはすべて、記載の方法において明確に有用であるが、以下の論議は一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量およそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は典型的には、「Ｙ」立体配置のジスルフィド結合によって結合し、ここで、軽鎖は、「Ｙ」の開口部で始まり、続いて可変領域を通じて重鎖を囲む。
【００７８】
軽鎖および重鎖の両方は、構造的および機能的相同性の領域へと分割される。用語「定常」および「可変」は機能的に用いられる。この点において、軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖の両部分の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することが認められるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤性移動度、Ｆｃ受容体結合、補体結合など、重要な生物学的特性を与える。慣例によって、定常領域ドメインの付番は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増大する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインは実際にそれぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００７９】
軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類される（κ、λ）。各重鎖クラスは、κまたはλのいずれかの軽鎖と結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生じる場合、ジスルフィド共有結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ立体配置の分岐末端におけるＮ末端から、各鎖の下部におけるＣ末端へと走っている。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらのうちにいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有することを認めるであろう。この鎖の性質により、抗体の「クラス」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定される。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、十分に特徴づけられており、機能的分化を与えることが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾されたバージョンは、本開示の点で当業者に容易に認められ、従って、本発明の範囲内である。
【００８０】
先に記載したとおり、可変領域によって、抗体は、抗原におけるエピトープを選択的に認識し特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインが、組み合わさって、３次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この４要素からなる抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖の各々における３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。いくつかの場合、例えば、ラクダ科種由来のまたはラクダ科免疫グロブリンに基づいて操作されたある免疫グロブリンにおいて、完全な免疫グロブリン分子は、軽鎖なしで重鎖のみからなることができる。例えば、Ｈａｍｅｒｓ  Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６  ４４８  （１９９３）を参照されたい。
【００８１】
天然の抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境における３次元立体配置を取る際に抗原結合ドメインを形成するよう特定的に配置されたアミノ酸の短い非隣接配列である。抗原結合ドメインにおけるアミノ酸の残りは、「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子間変動性がより少ない。フレームワーク領域は、主にβ‐シート立体配座を取り、ＣＤＲは、β‐シート構造を接続し、かついくつかの場合その一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用による正確な向きにＣＤＲを配置するよう提供する足場を形成するよう作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫応答性抗原におけるエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体の同族のエピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲとフレームワーク領域とをそれぞれ含むアミノ酸は、精確に定義されているので、当業者によって任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定することができる（それらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  （１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７  （１９８７）参照）。
【００８２】
当技術分野内で用いられおよび／または受け入れられている用語に関して２つ以上の定義がある場合、本明細書で用いられる用語の定義は、そうではない旨が明確に記載されていない限り、このような意味をすべて含むよう意図される。具体的な例は、重鎖および軽鎖の両ポリペプチドの可変領域内に認められる非隣接の抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”  （１９８３）によって、およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）によって、記載されており、これらは引用により本明細書に組み込まれており、ここで、定義には、互いに対して比較する場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義されおよび用いられる用語の範囲内であるよう意図される。先に引用した引用文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として下記の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する実際の残基数は、ＣＤＲの配列および大きさに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを成すかを日常的に決定することができる。
【表１】
2015127336.tif 000003
【００８３】
また、Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列についての付番システムも定義した。当業者は、配列自体以外の実験データに何ら頼ることなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔ付番」のシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”  （１９８３）によって示される付番システムを指す。別段の指定がない限り、Ｃ３５抗体またはその抗原結合断片、変異形、または誘導体における具体的なアミノ酸残基の位置の付番に対する引用は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う。
【００８４】
しかしながら、ラクダ科種において、ＶＨＨと呼ばれる重鎖可変領域は、完全なＣＤＲを形成する。ラクダ科ＶＨＨ可変領域と従来の抗体に由来する可変領域（ＶＨ）の間の主な差には、（ａ）ＶＨ軽鎖接触表面における、ＶＨＨにおける対応する領域と比較して、より疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合の頻繁な発生が含まれる。
【００８５】
一実施態様において、抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施態様において、抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施態様において、抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施態様において、抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施態様において、抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施態様において、抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲを含む。対象の抗原結合分子に含まれることのできる少なくとも１つのＣＤＲを含む典型的な抗体分子は、当技術分野で公知であり、典型的な分子は本明細書に記載される。
【００８６】
本明細書に記載の方法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片には、ポリクローナル、モノクローナル、多選択性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨのいずれかのドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生じる断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示の結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【００８７】
一本鎖抗体を含めた抗体断片は、可変領域単独を、または以下の完全体または一部との組み合わせで含むことができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。また、抗原結合断片は、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせも含むことができる。本明細書に開示の診断および治療方法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳類を含めた任意の動物起源に由来し得る。ある実施態様において、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。別の実施態様におおいて、可変領域は起源における軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）であり得る（例えば、サメ由来）。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ならびにヒト免疫グロブリンライブラリから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入した動物から単離した抗体、および下記に記載したような、および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号における内在性免疫グロブリンを発現しない抗体が含まれる。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、下記のうちの少なくとも１つを含む：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異形もしくは断片。例えば、結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施態様において、ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、結合しているポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部を欠失することができる（例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）。先に示したように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）が、天然の免疫グロブリン分子からアミノ酸配列が異なるように修飾することができることは、当業者によって理解されるであろう。
【００８９】
ある実施態様において、本明細書に開示の治療方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第二のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、本明細書に記載の方法において使用するための重鎖部分含有単量体は、同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含むことができ、例えば二重特異性抗体を形成する。
【００９０】
本明細書に開示の診断および治療方法において使用するための結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含むことができる。別の例において、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に一部およびＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に一部、およびＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジを含むことができる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。典型的には、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００９２】
免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非天然変異形をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列へと導入し、それにより１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失が、コードされるタンパク質へと導入されることによって作製することができる。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性変異誘発などの標準的な技術によって導入することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基においてなされる。
【００９３】
また、本明細書に開示の治療方法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片は、ポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関して記載されまたは明記することができる。例えば、結合親和性には、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫＤを有するものを含む。
【００９４】
本明細書に開示の治療方法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片は、本明細書に記載のとおり、ＤＲ６のアンタゴニストとして作用する。例えば、本明細書に記載の方法において使用するための抗体は、ＤＲ６ポリペプチドのアンタゴニストとして機能することができ、該ポリペプチドの抑制活性を遮断しまたは阻害する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗体」は、免疫応答性の領域または部位が、第一の種から得られまたは該種に由来し、かつ（未処置で、部分的な、または修飾されることができる）定常領域が、第二の種から得られる任意の抗体を意味するものとする。ある実施態様において、標的結合領域または部位は、非ヒト起源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来するであろうし、定常領域はヒトである。
【００９６】
本明細書で使用する場合、用語「操作された抗体」は、重鎖および軽鎖のいずれかまたはその両方における可変ドメインが、既知の特異性の抗体由来の１つ以上のＣＤＲを少なくとも部分的に置き換えることによって、および必要な場合、部分的なフレームワーク領域の置換および配列の変更によって変化する抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来する抗体と同じクラスまたはさらには同じサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲが、異なるクラスの抗体および／または異なる種由来の抗体に由来するであろうことは予見される。公知の特異性の非ヒト抗体由来の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域へと接ぎ合わされた操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と呼ばれる。いくつかの場合、１つの可変ドメインの別の可変ドメインに対する抗原結合能を移すために、ＣＤＲのすべてをドナー可変領域由来の完全なＣＤＲと置き換えることは必要ではない。むしろ、いくつかの場合、標的結合部位の活性を維持することが必要な該残基を移すことしか必要ではない。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号に示される説明を考慮すると、そのことは、慣例の実験を実施することによって、または機能的な操作されたもしくはヒト化抗体を得るための試行錯誤の試験によってのいずれかで、当業者の能力内に十分あるであろう。
【００９７】
本明細書で使用する場合、ヒト化したという用語は、非ヒト抗原結合分子、例えば、親分子の抗原結合特性を保有しまたは実質的に保有するが、ヒトにおいてほとんど免疫原性のないマウス抗体に由来する抗原結合分子を指すために用いられる。このことは、（ａ）全非ヒト可変ドメインをヒト定常領域へと接ぎ合わせ、キメラ抗体を作製すること、（ｂ）非ヒトＣＤＲのみをヒトフレームワークおよび定常領域へと、決定的なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性もしくは抗体機能を保有するのに重要なもの）を保持するとともにもしくは保持せずに接ぎ合わせること、または（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、それらを表面残基の置換によってヒト様セクションで「覆うこと」、を含めた種々の方法によって達成することができる。このような方法は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４４：６５−９２  （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ２８：４８９−４９８  （１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ３１（３）：１６９−２１７  （１９９４）に開示されており、それらはすべて、それらの内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。一般的に３つの相補性決定領域またはＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）が抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの各々にあり、それらは、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの各々における４つのフレームワークサブ領域（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）に隣接している：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ヒト化抗体に関する考察はとりわけ、米国特許第６，６３２，９２７号、および米国出願公開第２００３／０１７５２６９号において認められ得、これらは両方とも、それらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「連結した」、「融合した」、または「融合」は、交換可能に用いられる。これらの用語は、化学的な抱合または組換え手段を含めたどんな手段によっても、もう２つの要素または構成要素を互いに結合させることを指す。「インフレーム融合」は、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正確な読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するために２つ以上のＯＲＦを結合させることを指す。従って、結果として得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに相当する２つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（元のＯＲＦのセグメントは通常、天然にそのように結合するようにはなっていない。）。読み枠が従って、融合されたセグメントを通じて連続的となるが、セグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって物理的にまたは空間的に分離することができる。
【００９９】
ポリペプチドの文脈において、「線形的順序」または「配列」は、配列における互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続的である、アミノ末端からカルボキシル末端への方向におけるポリペプチドのアミノ酸の順序である。
【０１００】
本明細書で使用される用語「発現」は、遺伝子が、生化学物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを生じる過程を指す。過程には、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定発現の両方を含むが限定されない細胞内での遺伝子の機能的存在の任意の現れを含む。該過程には、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ＭＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびこのようなＭＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含むが、限定されない。最終的な所望の産物が生化学的である場合、発現には、該生化学物質および任意の前駆体の生成を含む。
【０１０１】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類対象である。哺乳類対象には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園動物、スポーツ用動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、仔猫、ウシなどのペット動物、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長類、イヌおよびオオカミなどのイヌ科、ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ類、ウシ、ブタ、およびヒツジなどの食品動物、シカおよびキリンなどの有蹄動物、などが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、哺乳類は、ヒト対象である。
【０１０２】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは低下を指す。これは、発現停止した遺伝子の配列とその二本鎖領域で相同であるｓｉＲＮＡによって開始する、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程である。遺伝子は、生物体に対して内在性または外来性であり得、染色体へと結合して存在し得、またはゲノムへと結合していないトランスフェクションベクターに存在し得る。遺伝子の発現は、完全にまたは部分的に阻害される。また、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害するとみなすこともでき、標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であり得る。
【０１０３】
デスレセプター６（ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１）
ＤＲ６が、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞を含めた神経系の細胞において発現し、ＤＲ６がこれらの細胞において細胞死を誘導することができることが発見された。
【０１０４】
ＤＲ６は、６５５個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ある実施態様において、ヒトポリペプチドは、配列番号１（受入番号：ＮＭ＿０１４４５２）のヌクレオチドを含むＭＲＮＡによってコードされる。ある実施態様において、ヒトＤＲ６ポリペプチド配列は、配列番号２（受入番号：Ｏ７５５０９）のアミノ酸を含む。また、マウスＤＲ６は、６５５アミノ酸ポリペプチドである。ある実施態様において、マウスＤＲ６は、配列番号３（受入番号：ＮＭ＿１７８５８９）のヌクレオチドを含むＭＲＮＡによってコードされる。ある実施態様において、マウスＤＲ６ポリペプチド配列は、配列番号４（受入番号：ＮＰ＿８４８７０４）のアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
表２は、配列番号２の配列に基づいたアミノ酸残基番号に従ったＤＲ６ドメインおよび他の領域を列挙する。当業者は、下記に列挙されたドメインの開始残基および終止残基は、用いるコンピュータモデリングプログラム、ドメインを決定するのに用いる方法、微小な配列変動などに応じて変動し得ることを認識するであろう。
【表２】
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【０１０６】
ｐ７５／ＴＮＲ１６
ｐ７５ニューロトロフィン受容体がＤＲ６のリガンドであることも発見された。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１６（ＴＮＲ１６またはＴＮＦＲＳＦ１６）または神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）としても知られるｐ７５は、４２７個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ヒトポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿００２４９８（配列番号１６５）であり、核酸配列は受入番号ＮＭ＿００２５０７（配列番号１６６）である。ｐ７５タンパク質は、ＤＲ６タンパク質と同様に、４つのＴＮＦＲシステインリッチなモチーフを含む細胞外領域、膜貫通領域、デスドメインを含む細胞内領域がある。ｐ７５が、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ‐３、およびＮＴ‐４に結合することができる低親和性受容体であることがすでに示されている（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：２２１−２２８  （２００４））。加えて、ｐ７５は、ＬＩＮＧＯ‐１／Ｎｏｇｏ‐６６受容体シグナル伝達の構成要素であり、換言すれば（Ｉｄ．）、ニューロン細胞の生存および死滅を仲介することができる。
【０１０７】
ＤＲ６およびｐ７５のアンタゴニストを使用する方法
一実施態様において、方法は、神経系の細胞をＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む、該細胞の生存を促進するための方法である。別の実施態様は、オリゴデンドロサイト細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進するための方法を提供する。別の実施態様は、ニューロン細胞とオリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆細胞との混合物をＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む、ミエリン形成を促進するための方法を提供する。さらに別の実施態様は、ＤＲ６のｐ７５に対する結合が阻害される条件下で、ＤＲ６ポリペプチドおよび／またはｐ７５ポリペプチドをＤＲ６アンタゴニストと接触させることを含む、ＤＲ６およびｐ７５の結合を阻害する方法を提供する。同様に、また、本明細書に記載の方法には、ＤＲ６ポリペプチドおよび／またはｐ７５ポリペプチドをｐ７５アンタゴニストと接触させることを含む、ＤＲ６のｐ７５に対する結合を阻害する方法が含まれる。
【０１０８】
ＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６アンタゴニストポリペプチド、ＤＲ６アンタゴニスト化合物、ＤＲ６抗体、ＤＲ６アンタゴニストポリヌクレオチド、ＤＲ６アプタマー、または２つ以上のＤＲ６アンタゴニストの組み合わせであり得る。追加的な実施態様には、治療有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む、神経系の細胞の死滅と関連した病態を治療するための方法が含まれる。
【０１０９】
ｐ７５アンタゴニストは、ｐ７５アンタゴニストポリペプチド、ｐ７５アンタゴニスト化合物、ｐ７５抗体、ｐ７５アンタゴニストポリヌクレオチド、ｐ７５アプタマー、または２つ以上のｐ７５アンタゴニストの組み合わせであり得る。追加的な実施態様には、治療有効量のＤＲ６アンタゴニストをｐ７５アンタゴニストと併用して投与することを含む、神経系の細胞の死滅と関連した病態を治療するための方法が含まれる。
【０１１０】
いくつかの特定の実施態様において、神経系細胞の死滅と関連した病態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（例えば、ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症）多発性硬化症、ニューロン外傷、または大脳虚血（例えば、脳卒中）であり得る。別の実施態様は、治療有効量のＤＲ６アンタゴニストを投与することを含む、ニューロン変性の疾患を治療するための方法を提供する。
【０１１１】
神経系の細胞には、中枢神経系（または「ＣＮＳ」）の細胞および末梢神経系の細胞（または「ＰＮＳ細胞」）の両細胞が含まれる。ＣＮＳ細胞には、脳における細胞および脊髄における細胞、ならびにこのような細胞に由来する細胞株が挙げられる。ＰＳ細胞には例えば、後根神経節ニューロン、シュワン細胞、運動ニューロン、およびこのような細胞に由来する細胞株が挙げられる。神経系の細胞には例えば、皮質ニューロン、運動ニューロン、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンなどのニューロン、およびこのような細胞に由来する細胞株が挙げられる。また、神経細胞には、ニューロン支持細胞またはミクログリアおよびマクログリアを含めたグリア細胞が挙げられる。マクログリア細胞の例には、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、および放射状グリア細胞が挙げられる。また、神経系の細胞には、オリゴデンドロサイト前駆細胞などのこれらの細胞の前駆細胞、およびこのような細胞に由来する細胞株が挙げられる。
【０１１２】
ＤＲ６アンタゴニストポリペプチド
本明細書で用いられるＤＲ６アンタゴニストには、天然のＤＲ６の生物学的機能を遮断し、阻害し、または干渉するＤＲ６アンタゴニストのポリペプチドが含まれる。具体的には、可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、可溶性ＤＲ６ポリペプチドの断片、変異体、または誘導体が挙げられる。先の表１は、ヒトＤＲ６ポリペプチドの種々のドメインを記載する。同様のドメイン構造は、他の種、例えば、マウスまたはラットＤＲ６のＤＲ６ポリペプチドについて推定することができる。可溶性ＤＲ６ポリペプチドは典型的には、ＤＲ６ポリペプチドの膜貫通ドメインを欠失し、任意に、ＤＲ６ポリペプチドの細胞質ドメインを欠失している。例えば、ある可溶性ヒトＤＲ６ポリペプチドは、ヒトＤＲ６の膜貫通ドメインを成す、配列番号２のアミノ酸３５１〜３６７を欠失する。別の可溶性ヒトＤＲ６ポリペプチドは、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方を欠失する（配列番号２のアミノ酸３５０〜６５５）。加えて、ある可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、ＤＲ６ポリペプチドのＴＮＦＲ様システインリッチモチーフおよび／または細胞外ドメイン全体（配列番号２のアミノ酸４０〜３４９、配列番号２の４０〜３５０、配列番号２の４１〜３４９、または配列番号２の４１〜３５０に相当）のうちの１つ以上を含む。当業者が認識するであろうように、ＤＲ６の細胞外ドメイン全体は、細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかにおいて追加的なまたはより少ないアミノ酸を含むことができる。可溶性アンタゴニストＤＲ６ポリペプチドは、シグナル配列を含むことができ、または含むことができない。
【０１１３】
本明細書に記載の方法において使用するための追加的な可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸１〜４０；配列番号２の１〜４１；配列番号２の６５〜１０５；配列番号２の１０６〜１４５；配列番号２の１４６〜１８５；および配列番号２の１８６〜２１２を含む、これらから本質的になる、もしくはこれらからなる可溶性ＤＲ６ポリペプチド；またはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
本明細書に記載の方法において使用するためのさらなる可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸１〜４０；配列番号２の１〜４１；配列番号２の１〜６４；配列番号２の１〜１０５；配列番号２の１〜１４５；配列番号２の１〜１８５；配列番号２の１〜２１２；配列番号２の１〜３４９を含む、これらから本質的になる、もしくはこれらからなる可溶性ＤＲ６ポリペプチド；またはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書に記載の方法において使用するためのなおもさらなる可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸４１〜６４；配列番号２の４１〜１０５；配列番号２の４１〜１４５；配列番号２の４１〜１８５；配列番号２の４１〜２１２；配列番号２の４１〜３４９；配列番号２の４１〜３５０；配列番号２の４２〜６４；配列番号２の４２〜１０５；配列番号２の４２〜１４５；配列番号２の４２〜１８５；配列番号２の４２〜２１２；配列番号２の４２〜３４９；および配列番号２の４２〜３５０を含む、これらから本質的になる、もしくはこれらからなるＤＲ６ポリペプチド；またはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書に記載の方法において使用するための追加的な可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸６５〜１０５；配列番号２の６５〜２１２；配列番号２の６５〜３４９；配列番号２の１０６〜１４５；配列番号２の１０６〜２１２；配列番号２の１０６〜３４９；配列番号２の１４６〜１８５；配列番号２の１４６〜２１２；配列番号２の１４６〜３４９；配列番号２の１８６〜２１２；配列番号２の１８６〜３４９；および配列番号２の２１３〜３４９を含む、これらから本質的になる、もしくはこれらからなる可溶性ＤＲ６ポリペプチド；またはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
また、変異体ＤＲ６ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチド由来の配列から変化することもできる。特に、あるアミノ酸置換は、ＤＲ６生物活性の実質上の損失がないまま、ＤＲ６配列へと導入することができる。典型的な実施態様において、変異体ＤＲ６ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、および／または配列番号２のアミノ酸４１〜３４９もしくは配列番号４の等価の断片からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号２または配列番号４の任意の所与の断片に由来する配列において異なる変異体ＤＲ６ポリペプチドには、１つ以上のアミノ酸置換（保存的もしくは非保存的）、１つ以上の欠失、および／または１つ以上の挿入を含むことができる。ある実施態様において、可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、例えば哺乳類におけるニューロンおよびＯＰＣなどのニューロン系の細胞の生存を促進する。
【０１１８】
可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４の少なくとも６の、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、またはそれより多くのアミノ酸の断片を含むことができる。加えて、可溶性ＤＲ６ポリペプチドまたはドミナント・ネガティブＤＲ６ポリペプチドは、少なくとも１の、例えば、５、１０、１５、または２０の保存的アミノ酸置換を含むことができる。また、配列番号２または配列番号４の参照ＤＲ６ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の可溶性ＤＲ６ポリペプチドの対応する断片も意図される。
【０１１９】
「ＤＲ６参照アミノ酸配列」または「参照アミノ酸配列」は、任意のアミノ酸置換を導入しない指定された配列を意味する。当業者が理解するであろうように、置換がない場合、「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
保存的置換には、以下の群内の置換が挙げられる：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性の）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。同じ群の別メンバーによる上記の極性、塩基性、または酸性の基の１つのメンバーの任意の置換は、保存的置換だと考えることができる。
【０１２１】
非保存的置換には、（ｉ）電気陽性側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）を有する残基がｅｌｅｃｔＤＲ６ｅｇａｔｉｖｅ残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）と置換され、または該残基によって置換される、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）と置換され、または該残基によって置換される、（ｉｉｉ）システィンまたはプロリンが任意の他の残基と置換され、またはその残基によって置換される、あるいは（ｉｖ）かさのある疎水性側鎖または芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）を有する残基が、より小さな側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）または側鎖のないもの（例えば、Ｇｌｙ）と置換され、またはこのようなものによって置換される置換が含まれる。
【０１２２】
当技術分野で公知のように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第二のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で論じられる際、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１１）など、当技術分野で公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア決定することができるが、該プログラムに限定されるわけではない。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたはその他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が例えば本明細書に記載の参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータがもちろん設定され、それにより同一性の％が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、参照配列におけるアミノ酸の総数の最大５％の相同性におけるギャップが許容される。
【０１２３】
当業者によって十分に理解されるであろうように、先に列挙したものなどのＤＲ６断片は、例えば、ＤＲ６ドメイン領域の代替的な推定に基づいたいずれかの末端（より長いかまたはより短いかのいずれか）において長さが例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸ほど変動することができる。加えて、先に列挙した任意の断片には、さらに、Ｎ末端における分泌シグナルペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸１〜４０、または配列番号２のアミノ酸１〜４１を含むことができる。また、本明細書のほかの箇所に記載したものなど、他の分泌シグナルペプチドも用いることができる。また、配列番号２、配列番号４、または本明細書に記載のそれらの断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である可溶性ＤＲ６ポリペプチドの対応する断片も意図される。
【０１２４】
本明細書に記載の方法において使用するための可溶性ＤＲ６ポリペプチドには、２つ以上の可溶性ＤＲ６ポリペプチドの任意の組み合わせを含むことができる。従って、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれもが企図される。本明細書に記載する２つ以上の可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、直接的に結合することができ、または適切なペプチドリンカーを介して結合することができる。このようなペプチドリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１２５】
本明細書に記載の方法において使用するための可溶性ＤＲ６ポリペプチドは、環状であり得る。可溶性ＤＲ６ポリペプチドの環化は、直鎖状ペプチドの立体配座の自由度を低下させ、結果的に、より構造的に拘束された分子を生じる。ペプチドの環化に関する多くの方法が、当技術分野で公知である。例えば、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の間のアミド結合の形成による「主鎖から主鎖への」環化である。「主鎖から主鎖への」環化法は、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）の間のジスルフィド架橋の形成を含む。本明細書に記載のある可溶性ＤＲ６ペプチドは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端の修飾を含み、環状ＤＲ６ポリペプチドを形成する。このような修飾には、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分およびビオチンを有するシステイン残基が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチド環化に関する他の方法は、ＬＩおよびＲｏｌｌｅｒ．    Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３：３２５−３４１  （２００２）に記載されており、そのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
本明細書に記載の方法において使用するための環状ＤＲ６ポリペプチドには、Ｃ１ＬＳＰＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｃ２（配列番号５）（式中、Ｘ１は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｘ２は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｘ３は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｃ１は任意に、結合する環化を促進する部分（例えば、アセチル基またはビオチン）を有し、Ｃ２は任意に、結合する環化を促進する部分（例えば、ＮＨ２部分）を有する。）が含まれるが、これに限定されない。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストポリペプチドは、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害する。いくつかの実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストポリペプチドは、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害するが、ＡＰＰに対するＤＲ６の結合を防止しない。
【０１２８】
ＤＲ６アンタゴニスト化合物
本明細書に記載の方法におけるＤＲ６アンタゴニストには、アンタゴニスト化合物の不在下におけるＤＲ６の活性と比較したＤＲ６の活性を阻害または低下させる任意の化学物質または合成化合物が含まれる。ＤＲ６アンタゴニスト化合物は、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害するものであり得る。また、ＤＲ６アンタゴニスト化合物は、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害するが、ＡＰＰに対するＤＲ６の結合を防止しないものでもあり得る。
【０１２９】
当業者は、本明細書の他の箇所に記載のアッセイを用いて、例えば神経系細胞の生存を修飾する化合物についてのスクリーニングによって、本明細書に記載の方法において有用であろうＤＲ６アンタゴニスト化合物についてスクリーニングおよび試験する方法を存じているであろう。
【０１３０】
ＤＲ６抗体またはその免疫特異的断片
また、本明細書に記載の方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニストには、ＤＲ６活性のアンタゴニストであるＤＲ６抗原結合分子、ＤＲ特異的抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。例えば、ニューロンにおいて発現するＤＲ６に対するあるＤＲ６抗原結合分子またはＤＲ６抗体の結合は、アポトーシスを阻害しまたは細胞の生存を促進する。
【０１３１】
ある実施態様において、抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ここで、抗体は、神経系の細胞の生存を促進する。ある実施態様において、抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ここで、抗体は、オリゴデンドロサイトの増殖、分化、または生存を促進する。ある実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ここで、抗体はミエリン形成を促進する。他の実施態様において、ＤＲ６抗体は、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。他の実施態様において、ＤＲ６抗体は、ｐ７５に対するＤＲ６の結合を阻害するが、ＡＰＰに対するＤＲ６の結合を防止しない抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
【０１３２】
ＤＲ６抗体には、先のいずれかのポリクローナル、モノクローナル、多選択性、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン欠失型抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生じる断片、抗イディオタイプ（抗ＩＤ）抗体（例えば、本明細書に記載の抗体に対する抗ＩＤ抗体を含む。）、およびエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【０１３３】
本明細書に記載の方法において使用するためのあるＤＲ６アンタゴニスト抗体は、特定のＤＲ６ポリペプチド断片またはドメイン、例えば、本明細書に記載のＤＲ６ポリペプチド、断片、変異体、または誘導体に特異的にまたは優先的に結合する。このようなＤＲ６ポリペプチド断片には、ＤＲ６の１つ以上のＴＮＦＲ様システインリッチなモチーフを含む、該モチーフから本質的になる、または該モチーフからなるＤＲ６ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。このような断片には例えば、配列番号２のアミノ酸６５〜１０５；配列番号２の１０６〜１４５；配列番号２の１４６〜１８５；配列番号２の１８６〜２１２；配列番号２の６５〜１４５；配列番号２の６５〜１８５；配列番号２の６５〜２１２；配列番号２の１０６〜１８５；配列番号２の１０６〜２１２；および配列番号２の１４６〜２１２を含む、これらから本質的になる断片が挙げられる。このような断片にはまた、配列番号２の１３４〜１８９；配列番号２の１６８〜１８９；および配列番号２の１３４〜１６８が挙げられる。また、配列番号２のアミノ酸６５〜１０５；配列番号２の１０６〜１４５；配列番号２の１４６〜１８５；配列番号２の１８６〜２１２；配列番号２の６５〜１４５；配列番号２の６５〜１８５；配列番号２の６５〜２１２；配列番号２の１０６〜１８５；配列番号２の１０６〜２１２；配列番号２の１４６〜２１２；配列番号２の１３４〜１８９；配列番号２の１６８〜１８９；および配列番号２の１３４〜１６８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の変異体ＤＲ６ポリペプチドの対応する断片も意図される。いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体、その抗原結合断片、変異体、または誘導体は、ＤＲ６と相互作用するためにＣｙｓ３およびＣｙｓ４の両領域を必要とする。
【０１３４】
他の実施態様において、抗体は、ＤＲ６の少なくとも１つのエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、こおこで、エピトープは、配列番号２または配列番号４の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号２または配列番号４の少なくとも７個の、少なくとも９個の、少なくとも約１５〜約３０のアミノ酸を含み、該アミノ酸から本質的になり、または該アミノ酸からなる。記載の配列番号２または配列番号４の所与のエピトープのアミノ酸は、連続的または直鎖であり得るが、そうである必要はない。ある実施態様において、ＤＲ６の少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面に発現するものとして、または例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合した可溶性断片として、ＤＲ６の細胞外ドメインによって形成される非直鎖状エピトープを含み、該エピトープから本質的になり、または該エピトープからなる。従って、ある実施態様において、ＤＲ６の少なくとも１つのエピトープは、配列番号２または配列番号４の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００の連続的なまたは非連続的なアミノ酸を含み、該アミノ酸から本質的になり、または該アミノ酸からなり、ここで、非連続的なアミノ酸は、タンパク質フォールディングを通じてエピトープを形成する。
【０１３５】
他の実施態様において、抗体は、ＤＲ６の少なくとも１つのエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ここで、エピトープは、先に記載の配列番号２または配列番号４の１、２、３、４、５、６、またはそれより多くの連続的なまたは非連続的なアミノ酸に加えて、タンパク質を修飾する追加的な部分を含み、該部分から本質的になり、または該部分からなり、例えば、炭水化物部分は、ＤＲ６抗体が、タンパク質の修飾されていないバージョンに対するよりも、修飾された標的タンパク質に対して高い親和性で結合するよう含まれることができる。あるいは、ＤＲ６抗体は、標的タンパク質の修飾されていないバージョンにまったく結合しない。
【０１３６】
ある態様において、抗体は、ＤＲ６ポリペプチドもしくはその断片、またはＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、親和性は、所与の参照モノクローナル抗体についての解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤを特徴とする。
【０１３７】
ある実施態様において、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、先に記載のＤＲ６または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、すなわち、関連していないまたはランダムなエピトープに結合するであろうよりも容易にこのようなエピトープに結合し；先に記載のＤＲ６または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合し、すなわち、関連する同様の相同的なまたは類似的なエピトープに結合するであろうよりも容易にこのようなエピトープに結合し；先に記載のＤＲ６または断片もしくは変異体に特異的にまたは優先的にそれ自体結合する参照抗体の結合を競合的に阻害し；あるいは、５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、または約１０−１５Ｍの解離定数ＫＤを特徴とする親和性で、先に記載のＤＲ６または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。特定の態様において、抗体またはその断片は、マウスＤＲ６ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＤＲ６ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。別の特定の態様において、抗体またはその断片は、１つ以上のＤＲ６ポリペプチドまたはその断片、例えば、１つ以上の哺乳類ＤＲ６ポリペプチドに優先的に結合する。
【０１３８】
抗体結合解離定数の文脈で使用する際の、用語「約」は、抗体親和性を測定するのに利用される方法における固有の変動を認める。例えば、用いた機器の精確さのレベル、測定した試料数に基づいた標準誤差、および丸め誤差に依存して、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含み得る。
【０１３９】
具体的な実施態様において、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、または１０−３秒−１以下のオフ速度（Ｋ（オフ））でＤＲ６ポリぺプチド、またはその断片もしくは変異体に結合する。あるいは、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（Ｋ（オフ））でＤＲ６ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。
【０１４０】
他の実施態様において、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン速度（Ｋ（オン））でＤＲ６ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。あるいは、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（Ｋ（オン））でＤＲ６ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。
【０１４１】
一実施態様において、ＤＲ６抗体には、あるモノクローナル抗体、ならびにその断片、変異体、および誘導体の少なくとも抗原結合ドメインが表３および４に示されるＤＲ６抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。表３は、ファージディスプレイライブラリから同定されたヒト抗ＤＲ６  Ｆａｂ領域を列挙する。表４は、ハイブリドーマに由来するマウス抗ＤＲ６抗体を列挙する。
【表３】
2015127336.tif 000005
【表４】
2015127336.tif 000006
【０１４２】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原におけるエピトープ（例えば、ＤＲ６のエピトープ）を特異的に結合する部位を含む。抗体の抗原結合ドメインには典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部と、免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部が含まれる。これらの可変領域によって形成された結合部位が、抗体の特異性を決定する。
【０１４３】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ＤＲ６抗体は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＤＲ６エピトープに特異的に結合する。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ＤＲ６抗体は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、および  Ｍ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、またはＤＲ６に対する結合由来の１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、ＤＲ６抗体は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナルの抗原結合ドメインと同一のものを含む。
【０１４６】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、２００７年１２月２１日出願の国際公開第ＷＯ２００８／０８００４５号に記載の３Ｆ４．４８、４Ｂ６．９．７、または１Ｅ５．５７からなる群から選択される抗体ではない。いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、ＤＲ６に対する３Ｆ４．４８、４Ｂ６．９．７、または１Ｅ５．５７の結合を競合的に阻害する抗体からなる群から選択される抗体ではない。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、ＤＲ６抗体は、アンタゴニスト抗体である。
【０１４８】
抗体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される。一旦、シグナル配列を有さない全長のＤＲ６の種々の断片に対するまたは全長のＤＲ６に対する抗体が作製されると、抗体または抗原結合断片が結合するのがＤＲ６のどのアミノ酸またはエピトープかを決定することを、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコールおよび当技術分野で公知の方法によって決定することができる（例えば、「Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｖ．２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９９６）に記載の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）。追加的なエピトープマッピングプロトコールは、Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｇ．    Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）において認められることができ、これらは両方ともそれらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。また、エピトープマッピングは、市販の手段によって実施することができる（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，  Ｉｎｃ．  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））。
【０１４９】
加えて、次に、ＤＲ６の任意の部分に結合する作製された抗体は、例えば、神経系の細胞の生存を促進し、神経の細胞の死滅と関連した病態を治療し、および神経系の細胞のアポトーシスを予防するＤＲ６のアンタゴニストとして作用する能力についてスクリーニングすることができる。抗体は、実施例において詳述した方法に従って、これらのおよび他の特性についてスクリーニングすることができる。本明細書に記載の抗体の他の機能は、本明細書の実施例において記載の他のアッセイを用いて試験することができる。
【０１５０】
一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニストは、抗体分子、またはその免疫特異的断片である。別段の記載がない限り、本明細書で使用される場合、抗体に対する参照における「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち抗原特異的断片を指す。
【０１５１】
一実施態様において、本明細書に記載の方法において使用するための結合分子または抗原結合分子は、合成定常領域を含み、ここで、１つ以上のドメインは、部分的にまたは完全に欠失している（「ドメイン欠失型抗体」）。本明細書に記載のある方法は、ＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片の投与を含み、この中で、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一断片が欠失しまたはさもなければ変化して、ほぼ同一の免疫原性の変化していない全抗体と比較した場合に、低いエフェクター機能などの所望の生化学的特徴、非共有結合的に二量体化する能力、作用部位において局在する高い能力、短い血清半減期、または増加した血清半減期を提供する。例えば、本明細書に記載の治療方法において使用するためのある抗体は、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠失するドメイン欠失型抗体である。
【０１５２】
ある実施態様において、適合性のある修飾された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠失型コンストラクトまたは変異体を含むであろう（ΔＣＨ２コンストラクト）。他の実施態様について、短い結合ペプチドは、欠失型ドメインと置換して、可変領域についての移動の可撓性および自由を提供することができる。当業者は、抗体の異化反応速度に関するＣＨ２ドメインの調節特性により、ある環境下で望ましくあり得ることを理解するであろう。ドメイン欠失型コンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用いて得ることができる（例えば、ＷＯ  ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２参照）。この典型的なベクターを操作して、ＣＨ２ドメインを欠失し、ドメイン欠失型ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供した。
【０１５３】
ある実施態様において、本明細書に開示の方法において使用するための修飾された抗体は、ミニボディである。ミニボディは、当技術分野に記載の方法を用いて作製することができる（例えば、参照、例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ参照）。
【０１５４】
一実施態様において、本明細書に開示の治療方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその断片は、単量体サブユニット間の結合を可能にする限り、数個のまたはさらには単一のアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一のアミノ酸の変異はＦｃ結合を実質的に低下させ、それにより意図される作用部位に対する局在を増大させるのに十分であり得る。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域のその部分を単純に欠失することが望ましくあり得る。定常領域のこのような部分的な欠失は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改善するとともに、対象の定常領域ドメインと関連した他の望ましい機能を未変化のままにすることができる。その上、先に言及したように、開示した抗体の定常領域は、結果として生じるコンストラクトの特性を高める１つ以上のアミノ酸の変異または置換を通じて合成的であり得る。この点において、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を乱すことが可能であり、それと同時に修飾された抗体の立体配座および免疫原性特性を実質的に維持することができる。さらに他の実施態様は、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含み、エフェクター機能などの望ましい特徴を高めまたは、より多くの細胞毒素もしくは炭水化物の結合を提供する。このような実施態様において、選択された定常領域ドメインに由来する具体的な配列を挿入または複製することが望ましくあり得る。
【０１５５】
本明細書に記載の治療方法において使用するためのあるＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片において、Ｆｃ部分は、当技術分野で公知の技術を用いてエフェクター機能を低下させるために変異させることができる。例えば、定常領域の修飾を用いて、高い抗原特異性または抗体可撓性による高い局在性を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾することができる。修飾に関して結果として生じる生理学的特性、生物学的利用率、および他の生化学的効果は、過度の実験をせずに周知の免疫学的技術を用いて容易に測定および定量化することができる。
【０１５６】
また、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む。）を含み、該変異体から本質的になり、または該変異体からなる抗体の使用も提供し、該抗体またはその断片は、ＤＲ６ポリペプチドに免疫特異的に結合する。当業者に公知の標準的な技術を用いて、結合分子をコードするヌクレオチド配列における変異を導入することができ、それらの技術には、アミノ酸置換を結果的に生じる部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性変異誘発が含まれるがこれらに限定されない。種々の実施態様において、変異体（誘導体を含む。）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３に対する５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の電荷を備えた側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。同様の電荷を備えた側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を備えたアミノ酸が挙げられる。あるいは、変異は、飽和変異誘発などによるコード化配列の全部または部分に沿って無作為に導入することができ、結果として生じる変異体は、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。
【０１５７】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみにおいて、またはＣＤＲ領域のみにおいて、変異を導入することは可能である。導入された変異は、サイレントまたは中性ミスセンス変異であり得、すなわち、抗原を結合する抗体の能力に何ら、またはほとんど影響がない。これらの種類の変異は、コドンの使用を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいは、非中性ミスセンス変異は、抗原を結合する抗体の能力を変化させることができる。最もサイレントかつ中性のミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域にある可能性が高いのに対し、最も非中性のミスセンス変異の位置は、ＣＤＲにある可能性が高いが、このことは絶対的な必要条件ではない。当業者は、抗原結合活性の変化のないこと、または結合活性における変化（例えば、抗原結合活性における改善、または抗体特異性の変化）などの望ましい特性を有する変異体分子を設計および試験することができるであろう。変異誘発の後、コード化したタンパク質は、慣例通りに発現することができ、コード化したタンパク質の機能的および／または生物学的活性は、本明細書に記載の技術を用いて、または当技術分野で公知の技術を慣例通りに改変することによって決定することができる。
【０１５８】
一実施態様において、抗体は、二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、または抗体、例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン欠失型抗体、または２つ以上のエピトープ、例えば、２つ以上の抗原または同一の抗原における２つ以上のエピトープに対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施態様において、二重特異性抗体は、ＤＲ６における少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、ＤＲ６のエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインと、第二の標的に特異的な２つの標的結合ドメインとを有する四価の抗体であり得る。従って、四価の二重特異性抗体は、各特異性について二価であり得る。
【０１５９】
本明細書に開示の診断法および治療法において使用するための抗体またはその免疫特異的断片の修飾した形態は、当技術分野で公知の技術を用いて全前駆体または親抗体から作製することができる。典型的な技術は、本明細書でより詳細に考察される。
【０１６０】
本明細書に開示の診断法および治療法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当技術分野で公知の技術を用いて作製または製造することができる。ある実施態様において、抗体分子またはその断片は、「組換えで産生され」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。抗体分子またはその断片を作製するための典型的な技術は、本明細書の他の箇所でより詳細に考察される。
【０１６１】
本明細書に記載の方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその断片は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって生成することができる。
【０１６２】
ポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の種々の手順によって産生することができる。例えば、ＤＲ６免疫特異的断片は、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない種々の宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を導入することができる。種々のアジュバントを用いて、宿主の種に応じて免疫学的応答を増大させることができ、該アジュバントには、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホール・リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。また、このようなアジュバントも当技術分野で周知である。
【０１６３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含めた、当技術分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のものを含むハイブリドーマ技術を用いて産生することができ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ５６３−６８１  （１９８１）に教示することができる（該引用文献は、それらのすべての内容の全体が引用により組み込まれる。）。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核クローン、原核クローン、またはファージクローンを含めた単一のクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法を指すのではない。従って、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマおよび組換え体の使用、ならびにファージディスプレイ技術を含めた、当技術分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製することができる。
【０１６４】
当技術分野で認識されるプロトコールを用いて、一例において、抗体は、関連抗原（例えば、精製済みＤＲ６抗原またはこのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって哺乳類において産生される。この免疫化は典型的には、活性化型脾細胞またはリンパ球由来の抗原応答性抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。結果として生じる抗体は、動物の血清から回収して、ポリクローナル調製物を提供することができるが、脾臓、リンパ節、または末梢血由来の個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質な調製物を提供することがしばしば望ましい。ある具体的な実施態様において、リンパ球は、脾臓から得られる。
【０１６５】
この周知の過程（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５  （１９７５））において抗原を注射された哺乳類由来の比較的短い寿命のまたは致死のリンパ球は、不死の腫瘍細胞株（例えば、ミエローマ細胞株）と融合して、従って、不死でありかつＢ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生することのできるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。結果として生じるハイブリッドは、単一の抗体の形成に特異的な遺伝子を含む各個々の系を用いた選択、希釈、および再増殖によって、単一の遺伝子系に分離される。該ハイブリドーマは、所望の抗原に対して均質である抗体を産生し、純粋な遺伝的系譜に関して、「モノクローナル」と呼ばれる。
【０１６６】
典型的には、このようにして調製されるハイブリドーマ細胞は、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培地において蒔種されおよび増殖される。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および増殖のための試薬、細胞株、および培地が、数多くの源から市販されており、標準化されたプロトコールが十分に確立されていることを認識するであろう。一般的に、ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ある実施態様において、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＺＡ）などのインビトロでのアッセイによって決定される。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングすることができ、標準的な方法によって増殖することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ５９−１０３  （１９８６））。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体が、例えば、プロテイン‐Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなどの従来の精製手順によって培地、腹水、または血清から分離することができることは、さらに認められるであろう。
【０１６７】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって生成することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断によって産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１６８】
また、当業者は、ＤＮＡコード抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）は、抗体ファージライブラリから得られ得ることを認識するであろう。特に、このようなファージを利用して、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリから発現する抗原結合ドメインを示すことができる（例えば、ヒトまたはマウス）。関心対象の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現させるファージは、抗原により、例えば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉した抗原を用いて、選択または同定することができる。これらの方法において用いられるファージは典型的には、ファージから発現したＩＤおよびＭ１３結合ドメインを含むフィラメント状ファージであり、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィドで安定化したＦｖ抗体ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えで融合される。典型的な方法は、例えば、欧州特許第３６８  ６８４  Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１  （２０００）；  Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：８０１  （２００２）；Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：２６８２  （２００１）；Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１５：１０６３  （２００２）に示されており、これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３  （１９９２））は、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｈｕｆｆｌｉｎｇ）、ならびに組み合わせ感染、および大ファージライブラリを構築するための戦略としてのインビボでの組換えによる高親和性ヒト抗体の産生を記載している。別の実施態様において、リボソームディスプレイを用いて、ディスプレイプラットフォームとしてのバクテリオファージを置き換えることができる（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：１２８７  （２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：３７５０  （２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１  （２００１）参照）。さらに別の実施態様において、細胞表面ライブラリは、抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１０７０１  （２０００）；  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１  （２０００））。このような手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ技術に対する代替物を提供する。
【０１６９】
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に表示される。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、リンパ組織のヒトもしくはマウスｃＤＮＡライブラリ）または合成ｃＤＮＡライブラリから増幅される。ある実施態様において、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーによって互いに接合され、ファージミドベクター（例えば、ＰＣＡＮＴＡＢ６またはＰＣｏＭＢ３ＨＳＳ）へとクローニングされる。ベクターは、大腸菌において電気穿孔され、大腸菌はヘルパーファージに感染する。これらの方法において用いたファージは典型的にはＦＤおよびＭ１３を含めたフィラメント状ファージであり、ＶＨまたはＶＬ領域は通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えで融合される。関心対象の抗原（例えば、ＤＲ６ポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識済み抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉した抗原を用いて、選択または同定することができる。
【０１７０】
抗体を作製するのに使用することのできるファージディスプレイ法に関する追加的な例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０  （１９９５）；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６  （１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：９５２−９５８  （１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８  （１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５７：１９１−２８０  （１９９４）；ＰＣＴ出願第  ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号に開示されているものが挙げられ、これらの各々のすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
先の引用文献において記載されるように、ファージ選択の後、ファージ由来の抗体コード領域を単離および使用して、ヒト抗体を含めた全抗体、またはその他の所望の抗原結合断片を生成することができ、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主において発現させることができる。例えば、また、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９  （１９９２）；およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４  （１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３  （１９８８）において開示されたものなど、当技術分野で公知の方法を用いた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えで産生する技術を採用することもできる（該引用文献は、それらのすべての内容の全体が引用により組み込まれる）。
【０１７２】
別の実施態様において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定することができる（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。ある実施態様において、単離またはサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの源として機能する。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターへと入れることができ、次に、これを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなくば免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞などの原核または真核宿主細胞へとトランスフェクトする。より特別には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載の通り合成的であり得る。）を用いて、引用により本明細書に組み込まれる１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎら、米国特許第５，６５８，５７０号に記載の製造抗体のための定常および可変領域配列をクローニングすることができる。本質的に、このことは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を必要とする。また、この目的に適したプライマーは、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。下記により詳細に論議されるであろうように、所望の抗体を発現する形質転換した細胞は、比較的多量で増殖して、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供することができる。
【０１７３】
具体的な実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を調べて、当技術分野で周知の方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の公知のアミノ酸配列との比較で、配列の高可変性（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）領域を決定することによって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定することができる。慣例通りの組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域内に、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入して、非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、天然のまたはコンセンサスフレームワーク領域、例えば、ヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについてはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９  （１９９８）参照）。ある実施態様において、フレームワーク領域とＣＤＲとの組み合わせによって生成したポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＤＲ６の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。さらなる実施態様において、１つ以上のアミノ酸置換が、フレームワーク領域内でなされ、例えば、抗原に対する抗体の結合を改善することができる。加えて、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に参加する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製して、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠失する抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変化が企図され、当技術分野の技術内である。
【０１７４】
ある実施態様において、本明細書に開示の治療方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、治療されるべき動物における、例えば、ヒトにおける有害な免疫応答を誘発しない。一実施態様において、本明細書に開示の治療方法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当技術分野で認識される技術を用いてその免疫原性を低下させるよう修飾される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化であり得、またはキメラ抗体を作製することができる。これらの種類の抗体は、非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来し、親抗体の抗原結合特性を保有するかまたは実質的に保有するが、ヒトにおける免疫原性は低い。このことは、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域へと接ぎ合わせて、キメラ抗体を生成すること、（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域へと、決定的なフレームワーク残基の保有とともにまたはそれなしで接ぎ合わせること、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様セクションで該ドメイン全体を「覆うこと」を含めた種々の方法によって達成することができる。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：６５−９２  （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９−４９８  （１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３１：１６９−２１７  （１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１９０，３７０号に開示されており、それらのすべての内容の全体引用により本明細書により組み込まれる。
【０１７５】
また、脱免疫化を用いて、抗体の免疫原性を低下させることもできる。本明細書で使用される場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の変化を含まむ（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２参照）。例えば、出発抗体由来のＶＨおよびＶＬ配列を分析して、各Ｖ領域由来のヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の重要な残基と関連して、エピトープの位置を示す。Ｔ細胞エピトープマップ由来の個々のＴ細胞エピトープを分析して、最終的な抗体の活性を変化させることのリスクが低い代替的なアミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組み合わせを含むある種々の代替的なＶＨおよびＶＬ配列を設計し、これらの配列をその後、ある範囲の結合ポリペプチド、例えば、本明細書に開示の診断法および治療法において使用するためのＤＲ６アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片へと組み込み、次に、それを機能について試験する。典型的には、１２〜２４の変異体抗体を生成および試験する。次に、修飾されたＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクターへとクローニングし、その後のプラスミドを細胞株へと導入して、全抗体を産生する。次に、抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較し、最適な変異体を同定する。
【０１７６】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体など、異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、それらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  （１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４  （１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２  （１９８９）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４  （１９８５）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８  （１９８４）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６３９７号を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する所望の抗原を結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換され、抗原結合を変化させ、例えば改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置における通常でないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、それらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）参照）。抗体は、例えばＣＤＲ接ぎ合わせ（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面修復（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８  （１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４  （１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３  （１９９４）））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた当技術分野で公知の種々の技術を用いてヒト化することができる。
【０１７７】
組換え抗体を生成するためのさらに別の高度に効率的な手段が、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：  １４５５−１４６０  （１９９２）によって開示される。具体的には、この技術は結果として、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含む霊長類化抗体の生成を生じる。この引用文献は、そのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。そのうえ、また、この技術は、これらの各々が引用により本明細書に組み込まれる、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号、および第５，７５６，０９６号にも記載されている。
【０１７８】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いた先に記載したファージディスプレイ法を含めた当技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、およびＷＯ  ９１／１０７４１も参照されたく；それらの各々のすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
また、ヒト抗体は、機能的内在性免疫グロブリンを発現できないが、内在性免疫グロブリン産生のできないヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生することもできる（例えば、それらの各々が引用により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号、および第５，５８９，３６９号参照）。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖接合領域のホモ接合性欠失が結果として、内在性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子複合体は、無作為に、またはマウス胚性幹細胞への相同的組換えによって導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによってヒト免疫グロブリン座の導入と別個に、または同時に非機能的にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生を防止する。修飾された胚性幹細胞を発展させ、胚盤胞へと微量注入して、キメラマウスを作出する。次に、キメラマウスを荒廃させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作出する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば所望の標的ポリペプチドの全部または部分を用いて、通常の様式で免疫化する。抗原指向性のモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、その後、クラスの切り替えおよび体細胞の変異を受ける。従って、このような技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術に関する概観については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３  （１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにこのような抗体を産生するためのプロトコールに関する詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／２４８９３；ＷＯ  ９６／３４０９６；ＷＯ  ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号を参照されたく、それらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．  （Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，  Ｃａｌｉｆ．）  ａｎｄ  ＧｅｎＰｈａｒｍ  （Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆ．）などの企業は、先に記載のものと同様の技術を用いて選択された抗原に対して指向するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０１８０】
ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を生成する別の手段は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８１１，５２４号に開示されている。また、これらのヒト抗体と関連した遺伝材料が、本明細書に記載の通り単離および操作することもできることは認められるであろう。
【０１８１】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３  （１９８８））。例えば、ＶＨＣＤＲ３のみが変動しないランダムライブラリからの選択を開示している米国特許第５，５６５，３３２号も参照されたい。
【０１８２】
あるいは、一本鎖抗体の産生について記載した技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２  （１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４  （１９８９））を使用することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結することによって形成され、結果として一本鎖抗体を生じる。また、大腸菌における機能的Ｆｖ断片の構築についての技術も使用することができる（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１  （１９８８））。一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用することのできる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８  （１９９１）；およびＳｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９  （１９９３）に記載されたものが挙げられる。
【０１８３】
別の実施態様において、リンパ球は、顕微操作および単離された可変遺伝子によって選択することができる。例えば、末梢血単核細胞は、免疫化した哺乳類から単離して、約７日間インビトロで培養することができる。培養物は、スクリーニング基準に適合する特定のＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性ウェル由来の細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによって、または該細胞を補体仲介性溶血性プラークアッセイにおいて同定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞はチューブへと顕微操作し得、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えばＲＴ‐ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、発現のために、抗体発現ベクターへとクローニングすることができ、細胞（例えば、真核または原核細胞）へとトランスフェクトすることができる。
【０１８４】
あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を用いて選択および培養することができる。このような技術は、種々の実験室マニュアルおよび主要な刊行物において記載されている。この点において、下記に記載の方法において使用するのに適した技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）に記載されており、補遺を含め、それらのすべての内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
本明細書に開示の治療法において使用するための抗体は、抗体の合成について当技術分野で公知の任意の方法によって、特に化学合成によって、または本明細書に記載の組換え発現技術によって産生することができる。
【０１８６】
抗原結合ＤＮＡ配列の対立遺伝子、変異体、および変異が本明細書に記載の方法において使用することができることはさらに認められるであろう。
【０１８７】
一実施態様において、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて同時にまたは別個にのいずれかで作製することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡならびにＤＮＡおよびアミノ酸の配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始することができる。先に考察したように、また、ＰＣＲを用いて、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することができる。この場合、ライブラリは、共通のプライマーまたは、マウス定常領域プローブなどのより大きな相同的プローブによってスクリーニングすることができる。
【０１８８】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する先の引用文献において詳細に示される標準的な周知の技術に従って制限マッピングおよび配列決定される、当技術分野で公知の技術を用いて、細胞から単離することができる。もちろん、ＤＮＡは、単離過程またはその後の分析の間の任意の時点で合成的であり得る。
【０１８９】
抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば、ＤＲ６アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。一旦、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの部分（例えば、重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む。）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当技術分野で周知の技術を用いた組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。また、プロモータに作用可能に連結された抗体分子またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも本明細書で考慮される。このようなベクターには、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ  ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにこのようなベクターへとクローニングすることができる。
【０１９０】
発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと転移し、次に、トランスフェクトした細胞は、従来技術によって培養され、本明細書に記載の方法において使用するための抗体を産生する。従って、また、異種性プロモータに作用可能に連結された抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞も、本明細書に記載される。二本鎖抗体の発現についてのある実施態様において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記に記載の通り、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現させることができる。
【０１９１】
種々の宿主‐発現ベクター系を利用して、本明細書の他の箇所に記載の方法において使用するための抗体分子を発現させることができる。
【０１９２】
宿主細胞は、２つの発現ベクター、すなわち、重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクターを用いて同時にトランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むことができる。あるいは、重鎖および軽鎖の両ポリペプチドをコードする単一のベクターを用いることができる。このような状況において、軽鎖は、重鎖の前に有利に配置され、過剰量の毒性のない重鎖を回避する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２  （１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：２１９７  （１９８０））。重鎖および軽鎖についてのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０１９３】
一旦、抗体分子が組換え発現すると、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばクロマトグラフィ（例えば、イオン交換、特にプロテインＡ後の特異的な抗原に対する親和性による親和性、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、吸収率較差溶解度によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製することができる。あるいは、抗体の親和性を増大させるための方法が、ＵＳ  ２００２  ０１２３０５７  Ａ１に開示されている。
【０１９４】
さらに、下記により詳細に記載されるように、本明細書に記載の任意のＤＲ６抗体または抗体断片を１つ以上のポリマーに抱合（共有結合）することができる。１つの特定の実施態様において、特異的エピトープ、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、または一本鎖抗体を認識する抗体断片は、ポリマーに抱合することができる。このような抱合に適したポリマーの例には、ポリペプチド、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる（下記により詳細に記載の通り）。一般的に用いられるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、最も頻繁に用いられる。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４、または５ＰＥＧポリマーは、ＤＲ６抗体またはその断片に抱合して、血清半減期を延ばすことができる。ＰＥＧ部分は、非抗原性であり、本質的に生物学的に不活性である。用いたＰＥＧ部分は、分岐または非分岐であり得る。
【０１９５】
ＤＲ６抗体をコードするポリヌクレオチド
本明細書に記載のポリヌクレオチドには、ＤＲ６抗体をコードする核酸分子、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。
【０１９６】
一実施態様において、ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであり、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つまたは重鎖可変領域のＶＨ‐ＣＤＲの少なくとも２つは、本明細に開示のモノクローナルＤＲ６抗体由来の参照重鎖ＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、またはＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＤＲ６抗体由来の参照重鎖ＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。従って、本実施態様によると、重鎖可変領域は、表５に示されるポリペプチド配列と関連したＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、またはＶＨ‐ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１９７】
別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであり、ここで、軽鎖可変領域のＶＬ‐ＣＤＲの少なくとも１つまたは軽鎖可変領域のＶＬ−  ＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書に開示のモノクローナルＤＲ６抗体由来の参照軽鎖ＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、またはＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＤＲ６抗体由来の参照軽鎖ＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。従って、本実施態様によると、軽鎖可変領域は、表５に示されるポリペプチド配列と関連したＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、またはＶＬ‐ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【表５】
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【０１９８】
当技術分野で公知のように、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドの間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸または核酸配列を、第二のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で考察される際、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１１）などだがこれに限定されない、当技術分野で公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が例えば参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータはもちろん、同一性の％が参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、かつ、参照配列におけるアミノ酸の総数の最大５％の相同性におけるギャップが許容されるよう設定される。
【０１９９】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。ある実施態様において、ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それによりコードされるアミノ酸配列を変化させずに変化する。例えば、配列は、所与の種における改善されたコドン使用のために変化して、スプライス位置または除去制限酵素部位を除去することができる。これらなどの配列の最適化は、実施例に記載されており、当業者によって周知であり、および慣例通りに実施される。
【０２００】
別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、ＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３領域が、表５に示すＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、該核酸からなる、単離されたポリヌクレオチドである。ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２０１】
いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであり、ここで、ＶＨポリペプチドは、配列番号８、９、および１０；配列番号１８、１９、および２０；配列番号２８、２９、および３０；配列番号３８、３９、および４０；配列番号４８、４９、および５０；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６８、６９、および７０；配列番号７８、７９、および８０；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９８、９９、および１００；配列番号１０８、１０９、および１１０；配列番号１１８、１１９、および１２０；ならびに配列番号１２８、１２９、および１３０からなる群から選択されるＶＨ‐ＣＤＲ１、ＶＨ‐ＣＤＲ２、およびＶＨ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＶＨ‐ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的に結合する。
【０２０２】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含み、ＶＨから本質的になり、またはＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＤＲ６エピトープに特異的にまたは優先的に結合し、あるいは、このようなモノクローナル抗体または断片がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する。
【０２０３】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含み、ＶＨから本質的になり、またはＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１  Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５  Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、ＤＲ６ポリペプチドもしくはその断片、またはＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
【０２０４】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２０５】
別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、ＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３領域が、表５に示されるＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドである。ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２０６】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドは、ＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３領域が、表５に示されるＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３群をコードするヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドである。ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであり、該ＶＬポリペプチドは、配列番号１３、１４、および１５；配列番号２３、２４、および２５；配列番号３３、３４、および３５；配列番号４３、４４、および４５；配列番号５３、５４、および５５；配列番号６３、６４、および６５；配列番号７３、７４、および７５；配列番号８３、８４、および８５；配列番号９３、９４、および９５；配列番号１０３、１０４、および１０５；配列番号１１３、１１４、および１１５；配列番号１２３、１２４、および１２５；ならびに配列番号１３３、１３４、および１３５からなる群から選択されるＶＬ‐ＣＤＲ１、ＶＬ‐ＣＤＲ２、およびＶＬ‐ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、該ＶＬ‐ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的に結合する。
【０２０８】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含み、ＶＬから本質的になり、またはＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＤＲ６エピトープに特異的にまたは優先的に結合し、あるいは、このようなモノクローナル抗体または断片がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する。
【０２０９】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含み、ＶＬから本質的になり、またはＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＤＲ６ポリペプチドもしくはその断片、またはＤＲ６変異体ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１０】
さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７からなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のＶＨをコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１１】
別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含み、該核酸配列から本質的になり、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１２】
さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、および１２６からなる群から選択される参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のＶＨコード核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１３】
別の態様において、ポリヌクレオチドは、ＶＨをコードする核酸配列を含み、該核酸配列から本質的になり、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドであり得、ここで、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７からなる群から選択される。また、ポリヌクレオチドは、ＶＨをコードする核酸配列を含み、該核酸配列から本質的になり、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドであり得、核酸の配列は、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、および１２６からなる群から選択される。ある実施態様において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１４】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含み、ＶＨから本質的になり、またはＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＤＲ６エピトープに特異的にまたは優先的に結合し、あるいは、このようなモノクローナル抗体または断片がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する。
【０２１５】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含み、ＶＨから本質的になり、ＶＨからなる抗体またはその抗原結合断片は、ＤＲ６ポリペプチドもしくはその断片、またはＤＲ６変異体ポリペプチドに、５×１０−２  Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１６】
さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、および１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する参照ＶＬポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のＶＬをコードする核酸を含み、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであり得る。さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、および１３１からなる群から選択される参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のＶＬコード核酸を含む、該核酸から本質的になり、または該核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１７】
別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、および１３２からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含み、該核酸配列から本質的になり、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、ＶＬをコードする核酸配列を含み、該核酸配列から本質的になり、または該核酸配列からなる単離されたポリヌクレオチドであり得、核酸の配列は、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、および１３１からなる群から選択される。ある実施態様において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、ＤＲ６に特異的にまたは優先的に結合する。
【０２１８】
ある実施態様において、先に記載のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含み、ＶＬから本質的になり、またはＶＬからなる抗体またはその抗原結合断片は、Ｍ５０‐Ｈ０１、Ｍ５１‐Ｈ０９、Ｍ５３‐Ｅ０４、Ｍ５３‐Ｆ０４、Ｍ６２‐Ｂ０２、Ｍ６３‐Ｅ１０、Ｍ６６‐Ｂ０３、Ｍ６７‐Ｇ０２、Ｍ７２‐Ｆ０３、およびＭ７３‐Ｃ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、または１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１、および１Ｐ５Ｄ１０．２からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＤＲ６エピトープに特異的にまたは優先的に結合し、あるいはこのようなモノクローナル抗体または断片がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する。
【０２１９】
特定の実施形態では、上述の１以上のポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含み、本質的にそれから成る、又はそれから成る抗体又はその抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性にて、ＤＲ６ポリペプチド若しくはその断片又はＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的に又は優先的に結合する。
【０２２０】
上述のポリヌクレオチドのいずれかは、たとえば、コードされるポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書で記載されるような抗体定常領域、又は本明細書で記載されるようなそのほかの異種ポリペプチドをコードする追加の核酸をさらに包含することができる。
【０２２１】
また、本明細書のほかでさらに詳細に記載されるように、組成物は、上述の１以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む組成物を包含する。一実施形態では、組成物は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む組成物を包含し、上記第１のポリヌクレオチドは本明細書で記載されるようなＶＨポリペプチドをコードし、上記第２のポリヌクレオチドは本明細書で記載されるようなＶＬポリペプチドをコードする。具体的には、組成物はＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含み、本質的にそれらから成り、それらから成るが、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドはそれぞれ、配列番号７と１２、１７と２２、２７と３２、３７と４２、４７と５２、５７と６２、６７と７２、７７と８２、８７と９２、９７と１０２、１０７と１１２、１１７と１２２、及び１２７と１３２から成る群から選択される参照ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるポリペプチドをコードする。又は代わりに、組成物は、配列番号６と１１、１６と２１、２６と３１、３６と４１、４６と５１、５６と６１、６６と７１、７６と８１、８６と９１、９６と１０１、１０６と１１１、１１６と１２１、及び１２６と１３１から成る群から選択される参照ＶＨとＶＬの核酸配列にそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＨポリヌクレオチドとＶＬポリヌクレオチドを含み、本質的にそれらから成り、それらから成る。特定の実施形態では、そのような組成物におけるポリヌクレオチドによってコードされるＶＨ及びＶＬを含む抗体又は抗原結合断片は、特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２２２】
本明細書で記載されるポリヌクレオチドはほかで記載されるようなポリヌクレオチドの断片も包含する。さらに、本明細書で記載されるような融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片及びそのほかの誘導体をコードするポリヌクレオチドも企図される。
【０２２３】
ポリヌクレオチドは当該技術で既知の任意の方法によって作製することができ、又は製造することができる。たとえば、抗体のヌクレオチド配列が既知であれば、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（たとえば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２  （１９９４）に記載されたように）から組み立てることができ、それには、手短には、抗体をコードする配列の部分を含有する重なり合ったオリゴヌクレオチドの合成と、それらオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結と、次いで連結したオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が関与する。
【０２２４】
或いは、ＤＲ６抗体をコードするポリヌクレオチド、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体は、好適な供給源からの核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが利用可能ではないが、抗体分子の配列が分かっている場合、抗体をコードする核酸は、配列の３’及び５’末端とハイブリッド形成可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、又は特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングし、該抗体若しくはそのほかのＤＲ６抗体をコードするｃＤＮＡライブラリから、たとえば、ｃＤＮＡクローンを特定することによって、好適な供給源（たとえば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、又は該抗体又はそのほかのＤＲ６抗体を発現している組織又は細胞、たとえば、抗体を発現するように選抜されたハイブリドーマから単離されたポリＡ＋ＲＮＡのような核酸から生成されるｃＤＮＡライブラリ）から化学的に合成する又は入手することができる。次いで、当該技術で周知の任意の方法を用いて、ＰＣＲによって生成された増幅核酸を複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０２２５】
ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体のヌクレオチド配列及び相当するアミノ酸配列がいったん決定すると、ヌクレオチド配列の操作について当該技術で周知の方法、たとえば、組換えＤＮＡ技法、部位特定変異誘発、ＰＣＲなど（たとえば、双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９０）  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９８）に記載された技法を参照）を用いてそのヌクレオチド配列を操作し、たとえば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を創出するために異なったアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
【０２２６】
ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未修飾のＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであることができる任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。たとえば、ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ，及び一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡから構成されることができ、ハイブリッド分子は、一本鎖、さらに通常では二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含む。さらに、ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域から構成され得る。ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性又はそのほかの理由で修飾された１以上の修飾された塩基又はＤＮＡ又はＲＮＡの主鎖も含有することができる。「修飾された」塩基には、たとえば、トリチル化塩基、及びイノシンのような稀な塩基が挙げられる。多様な修飾がＤＮＡ又はＲＮＡに為される；従って、「ポリヌクレオチド」は化学的に、酵素的に、又は代謝的に修飾された形態を包含する。
【０２２７】
免疫グロブリン（たとえば、免疫グロブリン重鎖部分又は軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、１以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように１以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作り出すことができる。部位特定変異誘発及びＰＣＲ介在性変異誘発のような常法によって変異を導入することができる。１以上の非必須アミノ酸残基にて保存的なアミノ酸置換を行うことができる。
ＤＲ６抗体ポリペプチド
【０２２８】
ＤＲ６抗体を構成する単離されたポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本明細書で記載される。ＤＲ６抗体は、免疫グロブリン分子に由来するＤＲ６−特異的抗原結合領域をコードするポリペプチド、たとえば、アミノ酸配列を含む。指定されたタンパク質に「由来する」ポリペプチド又はアミノ酸は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源を指す。特定の場合では、特定の出発ポリペプチド又はアミノ酸の配列に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列又はその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、その際、一部は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸から成り、又は出発配列の起源を有するとき、当業者に特定可能である。
【０２２９】
一実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成るポリペプチドであることができ、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ又は重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書で開示されるモノクローナルＤＲ６抗体からの参照の重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。或いは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の領域は、本明細書で開示されるモノクローナルＤＲ６抗体からの参照の重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、本実施形態によれば、重鎖可変領域は、上記表５に示される群に関係するＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。表５がカバットシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、ほかのＣＤＲの定義、たとえば、コチアシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲも記載される。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２３０】
別の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の領域は、表５に示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の群と同一であるポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２３１】
別の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の領域は、ＶＨ−ＣＤＲの任意の１つにおける１、２、３、４、５又は６のアミノ酸置換を除いて、表５に示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の群と同一であるポリペプチド配列を有する。さらに大きなＣＤＲ、たとえば、ＶＨ−ＣＤＲ３では、ＶＨ−ＣＤＲを含むＶＨがＤＲ６に特異的に又は優先的に結合する限り、ＣＤＲにて追加の置換が行われ得る。特定の実施形態では、アミノ酸置換は保存的である。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２３２】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の領域は、上記ＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１、２、３、４、５又は６のアミノ酸置換を除いて、配列番号８と９と１０；配列番号１８と１９と２０；配列番号２８と２９と３０；配列番号３８と３９と４０；配列番号４８と４９と５０；配列番号５８と５９と６０；配列番号６８と６９と７０；配列番号７８と７９と８０；配列番号８８と８９と９０；配列番号９８と９９と１００；配列番号１０８と１０９と１１０；配列番号１１８と１１９と１２０；及び配列番号：１２８と１２９と１３０から成る群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０２３３】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３の領域は、配列番号８と９と１０；配列番号１８と１９と２０；配列番号２８と２９と３０；配列番号３８と３９と４０；配列番号４８と４９と５０；配列番号５８と５９と６０；配列番号６８と６９と７０；配列番号７８と７９と８０；配列番号８８と８９と９０；配列番号９８と９９と１００；配列番号１０８と１０９と１１０；配列番号１１８と１１９と１２０；及び配列番号：１２８と１２９と１３０から成る群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０２３４】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７及び１２７から成る群から選択される参照ＶＨポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＨポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができる。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２３５】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７及び１２７から成る群から選択されるＶＨポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができる。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２３６】
特定の実施形態では、上述の１以上のＶＨポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る抗体又はその抗原結合断片は、Ｍ５０−Ｈ０１、Ｍ５１−Ｈ０９、Ｍ５３−Ｅ０４、Ｍ５３−Ｆ０４、Ｍ６２−Ｂ０２、Ｍ６３−Ｅ１０、Ｍ６６−Ｂ０３、Ｍ６７−Ｇ０２、Ｍ７２−Ｆ０３及びＭ７３−Ｃ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又は１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１及び１Ｐ５Ｄ１０．２から成る群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＤＲ６エピトープに特異的に又は優先的に結合する、或いはそのようなモノクローナル抗体がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する。
【０２３７】
特定の実施形態では、上述の１以上のＶＨポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る抗体又はその抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性にて、ＤＲ６ポリペプチド若しくはその断片又はＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的に又は優先的に結合する。
【０２３８】
別の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ又は軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書で開示されるモノクローナルＤＲ６抗体からの参照の軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。或いは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の領域は、本明細書で開示されるモノクローナルＤＲ６抗体からの参照の軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、本実施形態によれば、軽鎖可変領域は、上記表５に示されるポリペプチドに関係するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。表５がカバットシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、ほかのＣＤＲの定義、たとえば、コチアシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲｓも記載される。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２３９】
別の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の領域は、表５に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の群と同一であるポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２４０】
別の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の領域は、ＶＬ−ＣＤＲの任意の１つにおける１、２、３、４、５又は６のアミノ酸置換を除いて、表５に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の群と同一であるポリペプチド配列を有する。さらに大きなＣＤＲでは、ＶＬ−ＣＤＲを含むＶＬがＤＲ６に特異的に又は優先的に結合する限り、ＶＬ−ＣＤＲにて追加の置換が行われ得る。特定の実施形態では、アミノ酸置換は保存的である。特定の実施形態では、ＶＬを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２４１】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の領域は、上記ＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１、２、３、４、５又は６のアミノ酸置換を除いて、配列番号１３と１４と１５；配列番号２３と２４と２５；配列番号３３と３４と３５；配列番号４３と４４と４５；配列番号５３と５４と５５；配列番号６３と６４と６５；配列番号７３と７４と７５；配列番号８３と８４と８５；配列番号９３と９４と９５；配列番号１０３と１０４と１０５；配列番号１１３と１１４と１１５；配列番号１２３と１２４と１２５；及び配列番号：１３３と１３４と１３５から成る群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０２４２】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができ、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３の領域は、配列番号１３と１４と１５；配列番号２３と２４と２５；配列番号３３と３４と３５；配列番号４３と４４と４５；配列番号５３と５４と５５；配列番号６３と６４と６５；配列番号７３と７４と７５；配列番号８３と８４と８５；配列番号９３と９４と９５；配列番号１０３と１０４と１０５；配列番号１１３と１１４と１１５；配列番号１２３と１２４と１２５；及び配列番号：１３３と１３４と１３５から成る群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０２４３】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２及び１３２成る群から選択される参照ＶＬポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるＶＬポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができる。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２４４】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２及び１３２成る群から選択されるＶＬポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る単離されたポリペプチドであることができる。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２４５】
特定の実施形態では、上述の１以上のＶＬポリペプチドを含む、本質的にそれから成る抗体又はその抗原結合断片は、Ｍ５０−Ｈ０１、Ｍ５１−Ｈ０９、Ｍ５３−Ｅ０４、Ｍ５３−Ｆ０４、Ｍ６２−Ｂ０２、Ｍ６３−Ｅ１０、Ｍ６６−Ｂ０３、Ｍ６７−Ｇ０２、Ｍ７２−Ｆ０３及びＭ７３−Ｃ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又は１Ｐ１Ｄ６．３、１Ｐ２Ｆ２．１及び１Ｐ５Ｄ１０．２から成る群から選択される参照モノクローナルと同一のＤＲ６エピトープに特異的に又は優先的に結合し、或いはそのようなモノクローナル抗体又は断片がＤＲ６に結合するのを競合的に阻害する。
【０２４６】
特定の実施形態では、上述の１以上のＶＬポリペプチドを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る抗体又はその抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性にて、ＤＲ６ポリペプチド若しくはその断片又はＤＲ６変異体ポリペプチドに特異的に又は優先的に結合する。
【０２４７】
ほかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含み、本質的にそれから成り、又はそれから成るが、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドはそれぞれ、配列番号７と１２、１７と２２、２７と３２、３７と４２、４７と５２、５７と６２、６７と７２、７７と８２、８７と９２、９７と１０２、１０７と１１２、１１７と１２２、及び１２７と１３２から成る群から選択される参照ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬのポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は特異的に又は優先的にＤＲ６に結合する。
【０２４８】
上述のポリペプチドのいずれかはさらに、たとえば、コードされるポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書で記載されるような抗体定常領域、又は本明細書で記載されるようなそのほかの異種ポリペプチドのような追加のポリペプチドを包含することができる。さらに、ポリペプチドはほかで記載されるようなポリペプチド断片を包含する。さらに、ポリペプチドは、本明細書で記載されるような、融合ポリペプチド、Ｆａｂ断片、及びそのほかの誘導体を包含する。
【０２４９】
また、本明細書のほかでさらに詳細に記載されるように、本組成物は上述のポリペプチドを含む組成物を包含する。
【０２５０】
本明細書で開示されるようなＤＲ６抗体ポリペプチドは、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるように修飾することができるが当業者によって理解されるであろう。たとえば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸の配列は、出発配列に類似することができ、たとえば、出発配列に特定の比率の同一性を有することができ、たとえば、それは、出発配列に６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であることができる。
【０２５１】
さらに、保存的置換又は「非必須」アミノ酸領域での変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行うことができる。たとえば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸の配列は、１以上の個々のアミノ酸の置換、挿入又は欠失、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上の個々のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を除いて、出発配列と同一であり得る。指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸の配列は、１以上の個々のアミノ酸の置換、挿入又は欠失、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上の個々のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を除いて、出発配列と同一であり得る。ほかの実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸の配列は、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１５以下、又は２０以下の個々のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を除いて出発配列と同一であり得る。特定の実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸の配列は、出発配列に対して１〜５、１〜１０、１〜１５、又は１〜２０の個々のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する。
【０２５２】
特定のＤＲ６抗体ペプチドは、ヒトのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る。又はそれから成る。しかしながら、特定のＤＲ６抗体ペプチドは、別の哺乳類種に由来する１以上の連続したアミノ酸を含む。たとえば、ＤＲ抗体は、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分又は抗原結合領域を包含し得る。別の例では、非マウス抗体ポリペプチド、たとえば、ＤＲ抗体の抗原結合部位に、１以上のマウス由来のアミノ酸が存在し得る。別の実施形態では、ＤＲ６抗体の抗原結合部位は完全にマウスのものである。特定の治療応用では、ＤＲ特異的な抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは類似体は、抗体が投与される動物に対して免疫原性ではないように設計される。
【０２５３】
特定の実施形態では、ＤＲ６抗体ポリペプチドは、通常、抗体に伴わないアミノ酸配列又は１以上の部分を含む。例となる修飾は以下でさらに詳説される。たとえば、単鎖Ｆｖ抗体断片は、柔軟なリンカー配列を含むことができ、又は修飾されて官能部分（たとえば、ＰＥＧ、薬剤、毒素又は標識）を加えることができる。
【０２５４】
ＤＲ６抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成ることができる。融合タンパク質は、たとえば、少なくとも１つの標的結合部位を持つ免疫グロブリン抗原結合部位と、少なくとも１つの異種部分、すなわち、天然では天然に連結されない部分とを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は通常、融合ポリペプチドで一緒になる別々のタンパク質に存在することができ、又は、融合ポリペプチドにおける新しい配置に置かれる同一のタンパク質に通常存在することができる。融合タンパク質は、たとえば、化学合成によって、又はペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを創出し、翻訳することによって作り出すことができる。
【０２５５】
用語「異種」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用されるとき、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較される実体の残りとは明確に異なるな実体に由来することを意味する。たとえば、本明細書で使用されるとき、ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは類似体に融合される「異種ポリペプチド」は、同一種の非免疫グロブリンポリペプチド、又は異なった種の免疫グロブリン若しくは非免疫グロブリンのポリペプチドに由来する。
【０２５６】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術で定義されており、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、免疫グロブリンポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基によって置き換えることができる。別の実施形態では、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順及び／又は組成が異なる構造的に類似する鎖によって置き換えることができる。
【０２５７】
或いは、別の実施形態では、たとえば、飽和変異誘発によって、免疫グロブリンのコーディング配列のすべて又は一部に沿って変異を無作為に導入することができ、得られた変異体は、本明細書で開示される診断法及び治療法で使用するためにＤＲ６抗体に組み入れることができ、所望の抗原、たとえば、ＤＲ６に結合するその能力についてスクリーニングすることができる。
融合ポリペプチド及び抗体
【０２５８】
本明細書で開示される治療法で使用するためのＤＲ６ポリペプチド及び抗体はさらに、Ｎ又はＣ末端にて組換え的に異種ポリペプチドに融合することができる。たとえば、Ｄ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子及びたとえば、異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、又は毒素のようなエフェクター分子に組換え的に融合する、又は結合させることができる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；及び欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０２５９】
本明細書で開示される治療法で使用するためのＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体は、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに連結されたアミノ酸から構成され得るが、２０の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。
【０２６０】
ＤＲ６拮抗物質は、ＤＲ６機能を阻害するＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体の融合を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る融合タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体が融合される異種ポリペプチドは機能に関して有用であり、又は拮抗物質ポリペプチド又は抗体を標的とするのに有用である。特定の実施形態では、可溶性ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド、たとえば、細胞外ドメイン（配列番号２の１〜３４９又は４１〜３４９のアミノ酸に相当する）を含むＤＲ６ポリペプチド又はほかの可溶性ＤＲ６ポリペプチド断片、本明細書で開示される変異体若しくは誘導体は、異種ポリペプチド部分に結合されてＤＲ拮抗物質融合ポリペプチドを形成する。ＤＲ拮抗物質融合タンパク質及び抗体を用いて、種々の目的、たとえば、高い血清中半減期、改善された生体利用効率、特定の臓器又は組織の種類への生体内ターゲティング、改善された組換え発現の効率、改善された宿主細胞の分泌、精製の容易さ、及び高い結合力を達成することができる。達成される目的によって、異種部分は不活性であり得、又は生物学的に活性があり得る。また、試験管内で又は生体内で、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に安定的に結合されるように、又は切断可能であるようにそれを選択することができる。これらそのほかの目的を達成する異種部分は当該技術で既知である。
【０２６１】
ＤＲ６拮抗物質融合ポリペプチド又は抗体の発現への代替として、選択された異種部分を事前に形成し、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に化学的に結合することができる。ほとんどの場合、選択された異種部分は、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に融合されようと、抱合されようと同様に機能するであろう。従って、異種アミノ酸配列の以下の議論では、特に言及されない限り、異種配列は、融合タンパク質の形態で又は化学的抱合体としてＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に連結され得ることが理解されるべきである。
【０２６２】
ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体のような薬理学的に活性のあるポリペプチドは、生体内で迅速なクリアランスを示すことが多く、生体で治療上有効な濃度を達成するのは大用量を必要とする。さらに、約６０ｋＤａより小さなポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、腎臓毒性をもたらすことがある。ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体のような相対的に小さなポリペプチドの融合又は抱合を用いてそのような腎臓毒性のリスクを減らす又は回避することができる。治療用ポリペプチドの生体内の安定性、すなわち、血清中半減期を高めるための種々の異種アミノ酸配列、すなわち、ポリペプチド部分又は「担体」が知られている。
【０２６３】
その長い半減期、生体内での広い分布、及び酵素機能又は免疫機能の欠如のために、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡ断片が、異種部分として一般に用いられる。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１９０４−０８（１９９２）及びＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ、８９：３２４３−５２（１９９７）の教示のような方法及び物質の適用を介して、ＨＳＡを用いて、有意に高い、たとえば、１０倍〜１００倍高い生体内での安定性を示す一方で、ＤＲ６部分によって薬理学的活性を示すＤＲ６拮抗物質融合ポリペプチド又は抗体又はポリペプチド／抗体の抱合体を形成することができる。ＨＳＡのＣ末端をＤＲ６ポリペプチドのＮ末端に融合することができる。ＨＳＡは天然に分泌されるタンパク質なので、融合タンパク質が真核生物、たとえば、哺乳類の発現系で産生される場合、ＨＳＡのシグナル配列を活用して可溶性ＤＲ６融合タンパク質の分泌を細胞培養培地で得ることができる。
【０２６４】
特定の実施形態では、本明細書で記載される方法で使用するためのＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体はさらにターゲティング部分を含む。ターゲティング部分には、生体の特定の部分、たとえば、脳又はその中の区画への局在を方向付けるタンパク質やペプチドが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で記載される方法で使用するためのＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体は、脳のターゲティング部分に連結又は融合される。脳のターゲティング部分は、共有結合され（任意で切断可能である、たとえば、直接的な、翻訳的融合、又は直接若しくはスペーサ分子を介した化学結合）、又は非共有結合される（たとえば、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧなどのような可逆的相互作用を介した）。ほかの実施形態では、本明細書で記載される方法で使用するためのＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体が、１以上の脳のターゲティング部分に連結される。追加の実施形態では、脳のターゲティング部分は、本明細書で記載される方法で使用するための複数のＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に連結される。
【０２６５】
ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に会合する脳のターゲティング部分は、そのようなＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体の脳での送達を向上させる。タンパク質又は治療剤に融合すると、脳血管関門（ＢＢＢ）を介してタンパク質又は治療剤を送達する多数のポリペプチドが記載されている。非限定例には、単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ９５，  １２０１−１２１４）；ヒトのインスリン受容体に対するモノクローナル抗体、ｍＡＢ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  １２，  ８０７−８１６）；ヒトのトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ（に結合するＢ２、Ｂ６及びＢ８ペプチド（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４，  １１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体、ＯＸ２６（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５９，  ６６−７０）；並びに米国特許第６，３０６，３６５号が挙げられる。上記参考文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２６６】
ＤＲ６拮抗物質組成物の改善された脳への送達は、当該技術で定評のある多数の手段によって判定される。たとえば、脳のターゲティング部分に連結された、放射性標識した、酵素標識した、又は蛍光標識したＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体を動物に投与すること；脳の局在を判定すること；及び脳のターゲティング部分に会合していない同等の放射性標識したＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体との局在を比較すること。高いターゲティングを判定するそのほかの手段は上記参考文献に記載されている。
【０２６７】
シグナル配列は、小胞体の膜を横切ってタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。イムノフシンを構築するのに有用なシグナル配列には、抗体の軽鎖シグナル配列、たとえば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １２５：１９１−２０２  （１９８９））、抗体の重鎖シグナル配列、たとえば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４  （１９８０））が挙げられる。或いは、ほかのシグナル配列を使用することができる。たとえば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５  （１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔にて切断される。これは結果的にＦｃ領域とＤＲ６ペプチドを含有するイムノフシンタンパク質の分泌を生じる。
【０２６８】
一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＤＲ６ポリペプチドの間でタンパク質分解の切断部位をコードすることができる。そのような切断部位は、たとえば、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解切断を提供するので、標的タンパク質からＦｃドメインを分離する。有用なタンパク質分解の切断部位には、たとえば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、Ｘａ因子又はエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２６９】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み入れることができる。有用なベクターには、線形の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例となる発現ベクターは、イムノフシンＤＮＡの転写が、ヒトのサイトメガロウイルスのエンハンサ及びプロモータの制御下に置かれるｐｄＣである。たとえば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０８８：７１２（１９９１）；及びＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１：４９５−５００（１９９８）を参照のこと。ＤＲ６ポリペプチドをコードするＤＮＡによって適当な宿主細胞を形質転換し、又はそれに形質移入し、ＤＲポリペプチドの発現と分泌に用いることができる。通常使用される宿主細胞には、不死化したハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞及びＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０２７０】
一実施形態では、ＤＲポリペプチドは、ヒンジ及びＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖の定常領域のＣ末端部分に融合される。ＤＲ６−Ｆｃ融合の利点の可能性には、溶解性、生体内での安定性、多価性、たとえば、二量体化が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。或いは、それは、ＩｇＥ又はＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧのＦｃ領域、たとえば、ＩｇＧ１のＦｃ領域又はＩｇＧ４のＦｃ領域が一般に使用される。一実施形態では、化学的にＩｇＧのＦｃを定義するパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジで開始する配列（すなわち、残基２１６、カバットシステムに従って１１４である重鎖定常領域の最初の残基）、又はそのほかの免疫グロブリンの類似の部位を融合に使用する。融合が行われる正確な部位は決定的ではなく；特定の部位は周知であり、生物活性、分泌、又は分子の結合特性を最適化するために選択することができる。Ｆｃ融合をコードするＤＮＡを構築し、発現させる物質及び方法は当該技術で既知であり、それらを適用して過度の実験を行うことなくＤＲ６に融合を得ることができる。本明細書に記載される一部の方法は、Ｃａｐｔｏｎらの米国特許第５，４２８，１３０号及び同第５，５６５，３３５号に記載されたもののようなＤＲ６融合タンパク質を採用する。
【０２７１】
一部の実施形態では、完全に無傷で野生型のＦｃ領域は、本明細書で記載される方法で使用されるＦｃ融合タンパク質では不必要で、望ましくない可能性があるエフェクター機能を示す。従って、分泌カセットの構築中にＦｃ領域から特定の結合部位を削除することができる。たとえば、軽鎖との共発現は不必要なので、重鎖結合タンパク質、Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４  （１９８７））のための結合部位は、この部位がイムノフシンの十分な分泌を妨害しないようにＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから削除される。ＩｇＭにて存在するような膜貫通ドメイン配列も一般に削除される。
【０２７２】
特定の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃ領域が使用される。或いは、免疫グロブリンγ（γ−２、γ−３及びγ−４）のほかのサブクラスのＦｃ領域を分泌カセットで使用することができる。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１Ｆｃ領域には少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域が含まれる。一部の実施形態では、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域はＣＨ２欠失Ｆｃであり、それは、ヒンジ領域の一部とＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域を含まない。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、１：４７（１９９０）によって記載されている。一部の実施形態では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭの１つのＦｃ領域が使用される。
【０２７３】
ＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質は、幾つかの異なった立体配置で構築することができる。立体配置の１つでは、ＤＲ６ポリペプチドのＣ末端がＦｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合される。やや異なった立体配置では、短いポリペプチド、たとえば、２〜１０のアミノ酸が、ＤＲ６部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端の間に組み入れられる。そのようなリンカーは立体配座の自由度を提供し、それは、一部の状況では生物活性を改善することができる。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分にて保持されているのであれば、ＤＲ−ＦＣの融合は二量体化するので、二価の分子を形成する。単量体ＦＣ融合の均質な集団は、単一特異的な二価の二量体を生じる。それぞれ異なった特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合の混合物は、二重特異的な二価の二量体を生じる。
【０２７４】
可溶性のＤＲ６ポリペプチドを異種ペプチドに融合させて可溶性ＤＲ部分の精製又は同定を円滑にすることができる。たとえば、ヒスチジンのタグを可溶性ＤＲポリペプチドに融合させて市販のクロマトグラフィ媒体を用いた精製を円滑にすることができる。
【０２７５】
「リンカー」配列は、融合タンパク質にて２つのポリペプチドをコードする領域を分離する一連の１以上のアミノ酸である。典型的なリンカーは、少なくとも５アミノ酸を含む。追加のリンカーは少なくとも１０又は少なくとも１５のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸はリンカーが親水性であるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３６）は、それが十分な自由度を提供するので多数の抗体に広く適用可能である有用なリンカーである。そのほかのリンカーには、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３７）、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１３８）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号１３９）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（配列番号１４０）、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号１４１）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１４２）、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号１４３）及びＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号１４４）が挙げられる。さらに短いリンカーの例には上記リンカーの断片があげられ、さらに長いリンカーの例には、上記リンカーの組み合わせ、上記リンカーの断片の組み合わせ、及び上記リンカーと上記リンカーの断片との組み合わせが挙げられる。
【０２７６】
ＤＲ６ポリペプチドはポリペプチドタグに融合することができる。用語「ポリペプチドタグ」は本明細書で使用されるとき、ＤＲ６ポリペプチドに結合する、接続する又は連結することができ、ＤＲ６ポリペプチドを同定する、精製する、濃縮する又は単離するのに使用することができるアミノ酸の任意の配列を意味するように意図される。ポリペプチドタグのＤＲポリペプチドへの結合は、たとえば、（ａ）ポリペプチドタグをコードする核酸配列及び（ｂ）ＤＲ６ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を構築することによって生じることができる。例となるポリペプチドタグには、たとえば、翻訳後修飾が可能であるアミノ酸配列、たとえば、ビオチン化されるアミノ酸配列が挙げられる。ほかの例となるポリペプチドタグには、たとえば、抗体（又はその断片）又はそのほかの特異的結合試薬によって認識される及び／又は結合されることが可能であるアミノ酸配列が挙げられる。抗体（又はその断片）又はそのほかの特異的結合試薬によって認識される及び／又は結合されることが可能であるポリペプチドタグには、たとえば、「エピトープタグ」として当該技術で知られているものが挙げられる。エピトープタグは天然の又は人工的なエピトープタグであることができる。天然の及び人工的なエピトープタグは当該技術で既知であり、たとえば、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ又はポリヒスチジンペプチドのような人工的なエピトープが挙げられる。ＦＬＡＧペプチドには、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１４５）又はＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１４６）（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，  Ａ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１−３：４５５−４６５  （２００１））が挙げられる。Ｓｔｒｅｐエピトープは、配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４７）を有する。ＶＳＶ−Ｇエピトープも使用することができ、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）を有する。別の人工的なエピトープは、６つのヒスチジン残基を有するポリＨｉｓ配列である（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）（配列番号１４９）。天然に存在するエピトープには、モノクローナル抗体１２ＣＡ５によって認識されるインフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号１５０）（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２９：１７０−１７９  （１９９５））、及びモノクローナル抗体）９Ｅ１０によって認識されるヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）に由来する１１アミノ酸の配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ）（配列番号１５１）（Ｍａｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６２：１２９−１３４  （１９９５））が挙げられる。別の有用なエピトープは、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識されるトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅである（Ｓｔａｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２８３：２９８−３０２（１９９１））。
【０２７７】
特定の実施形態では、ＤＲ６ポリペプチドとポリペプチドタグは、連結アミノ酸配列を介して接続することができる。本明細書で使用されるとき、「連結アミノ酸配列」は、１以上のプロテアーゼによって認識される及び／又は切断されることが可能であるアミノ酸配列であることができる。１以上のプロテアーゼによって認識される及び／又は切断されることできるアミノ酸配列は当該技術で既知である。例となるアミノ酸配列は、以下のプロテアーゼによって認識されるものである：第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ，Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンギオテンシン変換酵素、マトリクスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメリシン、ゲラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、Ｃｉｒ及びＣｉｓ。前述のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は当該技術で既知である。特定のプロテアーゼによって認識される例となる配列は、たとえば、米国特許第５，８１１，２５２号に見い出すことができる。
【０２７８】
一部の方法では、可溶性ＤＲ６融合構築物を用いて細菌における可溶性ＤＲ６部分の産生を高める。そのような構築物では、可溶性ＤＲ６ポリペプチドのＮ末端融合相手として、通常高いレベルで発現され、及び／又は分泌される細菌タンパク質が採用される。たとえば、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ、６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１８７（１９９３）を参照のこと。
【０２７９】
好適な融合相手のアミノ末端及びカルボキシ末端にて可溶性ＤＲ６部分を融合することによって、二価又は四価の形態の可溶性ＤＲ６ポリペプチドを得ることができる。たとえば、可溶性ＤＲ６部分をＩｇ部分のアミノ末端とカルボキシ末端に融合して２つの可溶性ＤＲ６部分を含有する二価の単量体ポリペプチドを製造することができる。これら単量体の２つの二量体化の際、Ｉｇ部分のおかげで四価の形態での可溶性ＤＲ６タンパク質が得られる。そのような多価形態を用いて標的に対する高い結合親和性を達成することができる。可溶性ＤＲ６を直列に置いてコンカテマーを形成することによっても多価形態の可溶性ＤＲ６を得ることができ、それを単独で採用することができ、たとえば、Ｉｇ又はＨＳＡのような融合相手に融合することができる。
ＤＲ６拮抗物質抱合体
【０２８０】
本明細書で開示される治療方法で使用するためのＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体には、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体がＤＲ６の生物学的機能を阻害するのを共有結合が妨害しないように任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体が挙げられる。たとえば、限定の例示ではなく、たとえば、既知の保護基／ブロッキング基、タンパク分解切断、細胞性リガンド又はタンパク質への連結などによるグリコシル化、ペグ化、リン酸化、リン酸化、アミド化、誘導体化によってＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体を修飾することができる。特定の化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知の技法によって多数の化学修飾のいずれかを実施することができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的なアミノ酸を含有することができる。
【０２８１】
翻訳後プロセッシングのような天然の過程によって、又は当該技術で周知の化学修飾法によってＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体を修飾することができる。そのような修飾は、教科書に、及びさらに詳しい単行書に、並びに多作の研究文献によく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端若しくはカルボキシ末端を含むＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体のいずれかで、又は糖質のような部分で生じ得る。所与のＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体における幾つかの部位で、同一種類の修飾が、同一程度に又は異なった程度に存在し得ることが十分に理解されるであろう。また、所与のＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体は多数の種類の修飾を含有することができる。ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体は、たとえば、ユビキチン化の結果、分枝鎖であることができ、また、分枝を持つ若しくは持たない環状であることができる。環状の、分枝鎖の及び分枝鎖環状のＤＲ６拮抗物質ポリペプチド及び抗体は、翻訳後の天然のプロセッシングから生じ得るし、又は合成法によって作製することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡ介在性の、タンパク質へのアミノ酸の付加、たとえば、アルギン化及びユビキチン化が挙げられる。（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  （１９９３）；  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ．  １−１２  （１９８３）；  Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６  （１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２  （１９９２）を参照のこと）
【０２８２】
相当するアミノ反応性の基及びチオール反応性の基を含有する多数のクロスリンカーのいずれかを用いて、異種融合相手にＤＲ６拮抗物質ポリペプチドを連結することができる。好適なリンカーの例には、チオール反応性のマレイミドを挿入するアミン反応性のクロスリンカー、たとえば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ及びＧＭＢＳが挙げられる。そのほかの好適なリンカーは、チオール反応性のハロ酢酸基、たとえば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡを挿入する。スルフヒドリル基との反応のために保護された又は非保護のチオールを提供して還元可能な結合を生じるリンカーには、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ及びＳＡＴＰが挙げられる。そのような試薬は市販されている（たとえば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０２８３】
抱合は、可溶性ＤＲ６ポリペプチドのＮ末端又は血清アルブミンのチオール部分を含む必要はない。たとえば、遺伝子操作法を用いて可溶性ＤＲ６−アルブミンの融合を得ることができ、その際、可溶性ＤＲ６部分はそのＮ末端、Ｃ末端又はその双方にて血清アルブミン遺伝子に融合される。
【０２８４】
可溶性ＤＲ６ポリペプチド又はＤＲ６抗体は、１以上のポリマーがＤＲ６ポリペプチド又は抗体に抱合される（共有結合される）ポリペプチド又は抗体であることができる。そのような抱合に好適なポリマーの例には、ポリペプチド（上記で議論された）、糖ポリマー及びポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。通常、必然的ではないが、以下のうちの１以上を改善する目的でポリマーは可溶性ＤＲ６ポリペプチド又はＤＲ６抗体に抱合される：溶解性、安定性又は生体利用効率。
【０２８５】
ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体への抱合に一般に使用されるポリマーのクラスはポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、たとえば、１、２、３、４又は５のＰＥＧポリマーを各ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に抱合させて、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体単独に比べたとき、血清中の半減期を増やすことができる。ＰＥＧ部分は、非抗原性であり、本質的に生物不活性である。ＰＥＧ部分は分枝鎖又は非分枝鎖であることができる。
【０２８６】
ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に結合するＰＥＧ部分の数及び個々のＰＥＧ鎖の分子量は変化し得る。一般に、ポリマーの分子量が大きければ大きいほど、ポリペプチドに結合するポリマー鎖は少ない。普通、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に結合するポリマーの総質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。従って、ポリマー鎖一本が結合すれば、鎖の分子量は一般に２０〜４０ｋＤａである。２本の鎖が結合するのであれば、各鎖の分子量は一般に１０〜２０ｋＤａである。３本の鎖が結合するのであれば、分子量は一般に７〜１４ｋＤａである。
【０２８７】
ポリマー、たとえば、ＰＥＧは、ポリペプチド上の好適な、暴露された反応基を介してＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に連結することができる。暴露された反応基は、たとえば、Ｎ末端アミノ基又は内部リジン残基のイプシロンアミノ基又はその双方であることができる。活性化されたポリマーは、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体上の任意の遊離のアミノ基にて反応することができ、共有結合することができる。ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体（利用可能であれば）の遊離のカルボキシル基、好適に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された糖質部分及びメルカプト基をポリマー結合のための反応性の基として使用することもできる。
【０２８８】
抱合反応では、ポリペプチドの濃度に依存して、ポリペプチドのモル当たり、約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが通常採用される。普通、選択された比は、反応を最大化することと、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体の所望の薬理学活性を損ない得る副反応（非特異的であることが多い）を最小化することの間でバランスを取られたものである。特定の実施形態では、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体の少なくとも５０％の生物活性（たとえば、本明細書で記載される又は当該技術で既知であるアッセイのいずれかで明らかにされる）が保持される。さらなる実施形態では、ほぼ１００％が保持される。
【０２８９】
従来の化学法を用いてポリマーをＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体に抱合させることができる。たとえば、ポリアルキレングリコール部分をＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体のリジンイプシロンアミノ基に結合することができる。リジン側鎖への結合は、たとえば、ＰＥＧコハク酸スクシンイミジル（ＳＳ−ＰＥＧ）及びＰＥＧプロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ−ＰＥＧ）のようなＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルによって実施することができる。好適なポリアルキレングリコール部分には、たとえば、カルボキシメチル−ＮＨＳ及びノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販されている。追加のアミン反応性ＰＥＧリンカーは、スクシンイミジル部分について置換することができる。これらには、たとえば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、炭酸ベンゾトリアゾール、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、及び炭酸ＰＮＰが挙げられる。普通、条件を最適化して反応の選択性と程度を最大化する。反応条件のそのような最適化は当該技術の普通の技量の範囲内である。
【０２９０】
ペグ化は、当該技術で既知のペグ化反応のいずれかによって実施することができる。たとえば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３：４−１０（１９９２）、並びに欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照のこと。反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性の水溶性ポリマー）によるアシル化反応又はアルキル化反応を用いてペグ化を実施することができる。
【０２９１】
アシル化によるペグ化には、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させることが一般に関与する。ペグ化では、任意の反応性ＰＥＧ分子を採用することができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧは頻繁に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書で使用されるとき、「アシル化」には、限定しないで、治療用タンパク質とＰＥＧのような水溶性ポリマーとの間の以下の種類が含まれる：アミド、カルバメート、ウレタンなど。たとえば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応のパラメータは一般に、可溶性ＤＲ６ポリペプチドを損傷する又は不活化する温度、溶媒及びｐＨ条件を回避するように選択される。
【０２９２】
一般に、接続する結合はアミドであり、通常、得られる生成物の少なくとも９５％は、モノ−、ジ−又はトリ−ペグ化される。しかしながら、使用される特定の反応条件に依存した量で高い程度のペグ化を伴う一部の種を形成することができる。任意で、たとえば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、疎水性交換クロマトグラフィ及び電気泳動を含む従来の精製法によって、混合物、特に未反応の種から精製されたペグ化の種を分離する。
【０２９３】
アルキル化によるペグ化には一般に、還元剤の存在下でＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体と反応させることが関与する。さらに、実質的にＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体のＮ末端アミノ基のみでのペグ化、すなわち、モノ−ペグ化タンパク質を有利に得るように反応条件を操作することができる。モノ−ペグ化又は多重ペグ化のいずれかの場合で、ＰＥＧ基は通常、−ＣＨ２−ＮＨ基を介してタンパク質に結合する。特に−ＣＨ２−基を参照して、この種の結合は「アルキル」結合として知られる。
【０２９４】
Ｎ末端標的のモノ−ペグ化生成物を製造するための還元アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能である異なった種類の１級アミン基（リジン対Ｎ末端）の差次的反応性を活用する。反応は、リジン残基のイプシロンアミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基のそれとの間のｐＫａの差異を利用することができるｐＨにて行われる。そのような選択的な誘導体化によって、たとえば、アルデヒドのような反応性基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への結合は制御され：ポリマーとの抱合はタンパク質のＮ末端で優勢に生じ、たとえば、リジン側鎖アミノ基のようなそのほかの反応性基の有意な修飾は生じない。
【０２９５】
アシル化及びアルキル化の方法の双方で使用されるポリマー分子は水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは通常、修飾されて、本方法で提供されるとき、重合度を制御できるように、アシル化についての活性エステル又はアルキル化についてのアルデヒドのような単一反応性基を有する。例となる反応性のＰＥＧアルデヒドは、水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はそのモノ−Ｃ１〜Ｃ１０のアルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である（たとえば、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分枝鎖であることができ、又は非分枝鎖であることができる。アシル化反応については、選択されるポリマーは通常、単一の反応性エステル基を有する。還元アルキル化については、選択されるポリマーは通常、単一の反応性アルデヒド基を有する。一般に、水溶性ポリマーは、哺乳類の組換え発現系によって普通、さらに好都合に作られるので、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。
【０２９６】
ペグ化された可溶性のＤＲ６ポリペプチド又は抗体を調製する方法は一般に、（ａ）それによって分子が１以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下でＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体をポリエチレングリコール（たとえば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）と反応させる工程と、（ｂ）反応生成物を得る工程を含む。一般に、アシル化反応についての最適な反応条件は、既知のパラメータと所望の結果に基づいて個別的に決定される。たとえば、ＰＥＧとタンパク質のさらに大きな比は一般に、多重ペグ化生成物のさらに大きな比率をもたらす。
【０２９７】
モノ−ポリマー／可溶性ＤＲ６ポリペプチド又はＤＲ６抗体の実質的に均質な集団を製造する還元アルキル化には一般に、（ａ）還元アルキル化条件下にてポリペプチド又は抗体のＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするのに好適なｐＨで反応性ＰＥＧ分子と可溶性ＤＲ６タンパク質又はポリペプチドを反応させる工程と、（ｂ）反応生成物を得る工程が含まれる。
【０２９８】
モノ−ポリマー／可溶性ＤＲ６ポリペプチド又はＤＲ６抗体の実質的に均質な集団については、還元アルキル化反応の条件は、ポリペプチド又は抗体のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするものである。そのような反応条件は一般に、リジン側鎖のアミノ基とＮ末端アミノ基の間でｐＫａの差異を提供する。本明細書で記載される目的で、ｐＨは一般に３〜９、通常３〜６の範囲内である。
【０２９９】
可溶性ＤＲ６ポリペプチド又は抗体は、タグ、たとえば、タンパク分解によってその後放出される部分を含むことができる。従って、リジンとＮ末端の双方と反応する、たとえば、Ｔｒａｕｔの試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）のような低分子量リンカーで修飾されたＨｉｓタグを反応させ、次いでＨｉｓタグを放出することによって、リジン部分を選択的に修飾することができる。ポリペプチドはそのとき、たとえば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロ酢酸基、又は遊離の若しくは保護されたＳＨのようなチオール反応性の頭部基を含有するＰＥＧによって選択的に修飾され得る遊離のＳＨ基を含有する。
【０３００】
ＰＥＧの結合に特異的な部位を設定する任意のリンカーによってＴｒａｕｔの試薬を置き換えることができる。たとえば、Ｔｒａｕｔの試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ又はＳＡＴＰ  （Ｐｉｅｒｃｅ）によって置き換えることができる。同様に、マレイミド（たとえば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ又はＧＭＢＳ）、ハロ酢酸基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、又はビニルスルホン基を挿入し、遊離のＳＨを含有するＰＥＧと得られる生成物を反応させるアミン反応性リンカーとタンパク質を反応させてもよい。
【０３０１】
一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール部分をＤＲ６拮抗物質ポリペプチド又は抗体のシステイン基に結合させる。たとえば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロ酢酸基、又はチオール基を用いて結合を達成することができる。
【０３０２】
任意で、不安定な結合を介して、可溶性ＤＲ６ポリペプチド又は抗体をポリエチレングリコール部分に抱合させる。不安定な結合は、たとえば、生化学的な加水分解、タンパク分解又はスルフヒドリル切断によって切断することができる。たとえば、結合は、生体内（生理的な）条件下で切断することができる。
【０３０３】
不活性ポリマーと生物学的に活性のある物質を反応させるのに使用される好適な方法によって、反応性基がＮ末端のαアミノ基にあるのであれば、一般に約ｐＨ５〜８、たとえば、ｐＨ５、６、７又は８にて反応を行うことができる。一般に、工程には、活性化ポリマーを調製し、その後、活性化ポリマーとタンパク質を反応させて処方に好適な可溶性タンパク質を製造することが関与する。
【０３０４】
一部の実施形態では、抗体又はポリペプチドは、ＤＲ６抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体、及び異種ポリペプチドを含む融合タンパク質である。抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能に関して有用であり、又はＤＲ６ポリペプチドを発現する細胞を標的とするのに有用である。一実施形態では、融合タンパク質は、抗体の任意の１以上のＶＨ領域のアミノ酸配列又は抗体若しくはその断片若しくは変異体の任意の１以上のＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチドの配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。別の実施形態では、本明細書で開示される診断法及び治療法で使用するための融合タンパク質は、ＤＲ６特異抗体又はその断片、変異体若しくは誘導体の任意の１、２、３のＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列、又はＤＲ６特異抗体又はその断片、変異体若しくは誘導体の任意の１、２、３のＶＬ−ＣＤＲのアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチドの配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。一実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ６特異抗体又はその断片、変異体若しくは誘導体のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチドの配列を含み、融合タンパク質はＤＲ６の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ６特異抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列及びＤＲ６特異抗体又はその断片、誘導体若しくは変異体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチドの配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質のＶＨ及びＶＬの領域は、ＤＲ６の少なくとも１つのエピトープを特異的に結合する単一起源の抗体（又はｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）に相当する。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される診断法及び治療法で使用するための融合タンパク質は、ＤＲ６特異抗体の任意の１、２、３以上のＶＨ−ＣＤＲｓのアミノ酸配列及びＤＲ６特異抗体又はその断片、若しくは変異体の任意の１、２、３以上のＶＬ−ＣＤＲｓのアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチドの配列を含む。一部の実施形態では、２、３、４、５、６以上のＶＨ−ＣＤＲｓ又はＶＬ−ＣＤＲｓは、単一起源の抗体（又はｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）に相当する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も包含される。
ＤＲ６ポリヌクレオチド拮抗物質
【０３０５】
特定の実施形態は、ＤＲ６ポリヌクレオチド拮抗物質に細胞を接触させることによって神経系細胞の生存を促進する方法を含む。ポリヌクレオチド拮抗物質は、ＤＲ６拮抗物質ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドであることができる。ポリヌクレオチド拮抗物質はまた、ＤＲ６をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子であることもできる。ＤＲ６ポリヌクレオチド拮抗物質は、ＤＲ６の発現を妨げる（ノックダウン）。特定の実施形態では、ＤＲ６ポリヌクレオチド拮抗物質は、神経系細胞の生存を促進し、又は神経系細胞のアポトーシスを阻害する。ＤＲ６ポリヌクレオチド拮抗物質には、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＲＮＡｉが挙げられるが、これらに限定されない。通常、そのような結合分子は動物に別々に投与されるが（たとえば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０  （１９９１を参照）、そのような結合分子は、宿主によって取り込まれ、生体内で発現されるポリヌクレオチドから生体内でも発現される。また、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）も参照のこと。
【０３０６】
ＲＮＡｉは、標的とされるｍＲＮＡの発現を妨害するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）を介して特定のｍＲＮＡ（たとえば、ＤＲ６）と相互作用することによって標的とされる遺伝子を抑制する。次いで細胞による分解に対してｄｓＲＮＡ複合体が標的とされる。追加のＲＮＡｉ分子には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ；短鎖干渉ヘアピンも挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって接続された標的遺伝子のセンス配列とアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。ＰｏｌＩＩＩ又はＵ６プロモータを用いてＲＮＡｉについてのＲＮＡを発現させることができる。
【０３０７】
ＲＮＡｉには、「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的な相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が介在する（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，  ２００１）。ショウジョウバエの無細胞溶解物における生化学的な研究によって、ＲＮＡ−依存性の遺伝子スプライシングのメディエータは、２１〜２５ヌクレオチドの「小型干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡｓ）であることが示されている。従って、ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書で記載される方法で有利に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られるＲＮａｓｅによるｄｓＲＮＡの過程に由来する。ｓｉＲＮＡ二本鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と呼ばれる多重タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に動員されると思われる。特定の理論に束縛されることを望まない、ＲＩＳＣが標的ｍＲＮＡに導かれ、その際、ｓｉＲＮＡ二本鎖が配列特異的に相互作用して触媒的に切断に介在すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，  ２００１；  Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，  ２００１）。
【０３０８】
ＲＮＡｉを用いて、遺伝子の機能が解析され、非限定例のニューロン（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９，  ２００２）を含めて、哺乳類細胞において本質的な遺伝子が特定されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３，  ２００２；  Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５，  ２００１）。ＲＮＡｉはまた、たとえば、限定しないでポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０，  ２００２）やＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１，  ２００２）を含むウイルスの感染、複製及び／又は増殖を阻害すること又は阻止すること、及び癌遺伝子の発現を低減すること（ｅ．ｇ．，  ｔｈｅ  ｂｃｒ−ａｂｌ  ｇｅｎｅ；  Ｓｃｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｐ  ２６  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，  ２００２）のような治療法についても評価されている。ＲＮＡｉを用いて、哺乳類（マウス）及び両生類（アフリカツメガエル）の胚（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０，  ２００２；  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９，  ２００２）及び新生児マウス（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８，  ２００２）における遺伝子の発現を調節し、成熟トランスジェニックマウスにおいて移入遺伝子の発現を低減している（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９，  ２００２）。細胞培養及び生体内におけるｓｉＲＮＡの有効性及び特異性を判定する方法が記載されている（たとえば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４，  ２００２；  Ｌａｓｓｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３，  ２００２；  ａｎｄ  Ｌｅｉｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８，  ２００２を参照のこと）。
【０３０９】
限定しないでｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉに介在する分子は、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，  ２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解によって試験管内で（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，  ２００２）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる試験管内の転写によって（Ｄｏｎｚｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，  ２００２；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，  ２００２）、及びたとえば、大腸菌のＲＮａｓｅＩＩＩのようなヌクレアーゼを用いた二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，  ２００２）によって製造することができる。
【０３１０】
ｓｉＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングすることによっても形成することができ、通常、以下の一般構造を有し、それには、二本鎖部分と一本鎖部分が含まれる。
【表６】
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式中、Ｎ、Ｘ及びＹはヌクレオチドであり、ＸはＹに水素結合し、”：”は、２つの塩基間の水素結合を表し、ｘは１〜１００の間の値を有する自然数であり、ｍ及びｎは０〜１００の間の値を有する自然数である。一部の実施形態では、Ｎ、Ｘ及びＹは独立してＡ、Ｇ、Ｃ及びＴ又はＵである。天然に存在しない塩基及びヌクレオチドは、特に合成ｓｉＲＮＡの場合（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング）、存在することができる。二本鎖の中心区分を「コア」と呼び、測定の単位としての塩基対を有する。一本鎖部分はオーバーハングであり、測定の単位としてのヌクレオチドを有する。示されたオーバーハングは３’オーバーハングであるが、５’オーバーハングを持つ分子も熟考される。オーバーハングを持たないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０、ｎ＝０）、及びコアの一方ではオーバーハングを持つが、他方では持たないもの（たとえば、ｍ＝０でｎ≧１又はその逆）も熟考される。
【０３１１】
当初、ＲＮＡｉ技術は哺乳類の系に容易に適用できるとは思われなかった。これは、哺乳類では、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、その結果、アポトーシスカスケード及び細胞死を生じるからである（Ｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３，  １９９７）。さらに、ｄｓＲＮＡは哺乳類細胞にて干渉カスケードを活性化し、それも改変された細胞生理をもたらし得ることが長く知られていた（Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２５：３３３，  １９７１；  Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４１：５１７，  １９７２；  Ｌａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２，  １９６７；  Ｌｏｍｎｉｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８：５５，  １９７０；  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ９２：８６２，  １９６６）。しかしながら、ｄｓＲＮＡが介在するＰＫＲ及び干渉カスケードの活性化には約３０塩基対を超えるｄｓＲＮＡを必要とする。それに対して、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡが哺乳類細胞にてＲＮＡｉを引き起こすことが明らかにされた（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，  ２００１）。従って、実質的に長いｄｓＲＮＡを含まない短鎖ＲＮＡを調製することによって、長いｄｓＲＮＡに関連する望ましくない非特異的な効果を回避できることが期待される。
【０３１２】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ、１３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａら、Ｃｅｌｌ、９９：１２３−１３２，１９９９；及びＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
【０３１３】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６：９４８−９５８，  ２００２）は、ＲＮＡｉを達成する手段としてヘアピンに折り畳まれた小型ＲＮＡ分子を用いた。その結果、そのような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も、本明細書で記載される方法にて有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡの幹とループの長さは変化し、幹の長さは約２５〜約３０ｎｔのいずれかの範囲であることができ、ループの長さはサイレンシング活性に影響を及ぼさずに４〜約２５ｎｔの間の範囲であることができる。特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらのｓｈＲＮＡはＤＩＣＥＲのＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に類似しており、いずれにしても、特定の遺伝子の発現を阻害する同一の能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡはレンチウイルスベクター（たとえば、ｐＬＬ３．７）から発現することができる。
【０３１４】
アンチセンス技術を用いて、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡを介して、又は三重螺旋の形成を介して遺伝子の発現を制御することができる。アンチセンス技術は、たとえば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で議論されている。三重螺旋の形成は、たとえば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；及びＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）で議論されている。方法は、ポリヌクレオチドの相補的なＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。
【０３１５】
たとえば、ＤＲ６をコードするポリヌクレオチドの５’コーディング部分を用いて長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、それによって標的タンパク質の転写及び産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡとハイブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子の標的ポリペプチドへの翻訳を阻止する。
【０３１６】
一実施形態では、外因性の配列の転写によってＤＲ６遺伝子に特異的なアンチセンス核酸が細胞内で産生される。たとえば、ベクター又はその一部が転写されてアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生できる限り、エピソームのままであり、又は染色体に統合されるようになる。そのようなベクターは、当該技術において標準である組換えＤＮＡ技法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製及び発現に使用される、プラスミド、ウイルス及び当該技術で既知のものであることができる。アンチセンス分子の発現は、本明細書のほかで記載されるもののような脊椎動物、たとえば、ヒト細胞において作用する当該技術で既知のプロモータによることができる。
【０３１７】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は必要とされない。ＤＲ６をコードするＲＮＡの少なくとも一部に対する配列相補性は、ＲＮＡとハイブリッド形成でき、安定な二本鎖又は三本鎖を形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリッド形成する能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度と長さに依存する。一般に、ハイブリッド形成する核酸が大きければ大きいほど、それが含有し得る塩基のミスマッチが多く、さらに、安定な二本鎖（可能な場合、三本鎖）を形成する。当業者は、標準的な手順を用いてミスマッチの認容可能な程度を確かめ、ハイブリッド形成した複合体の融点を決定することができる。
【０３１８】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、たとえば、ＡＵＧ開始コドンまでの及びそれを含む５’非翻訳領域に相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害することに最も効率的に機能するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害することで有効であることが示されている。一般にＷａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。従って、５’−又は３’の非翻訳、非コーディングの領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスのアプローチで用いてＤＲ６の翻訳を阻害すればよい。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的であるオリゴヌクレオチドはＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡのコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のさほど効率的ではない阻害剤であるが、本明細書で記載される方法に従って使用されてもよい。アンチセンス核酸は通常、長さ少なくとも６ヌクレオチドであり、たとえば、長さ６〜約５０ヌクレオチドに及ぶオリゴヌクレオチドが挙げられる。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、及び少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０３１９】
本明細書で開示される治療法で使用するためのポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ又はそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された型であることができる。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、又はリン酸主鎖にて修飾されて、たとえば、分子の安定性、ハイブリッド形成などを改善することができる。オリゴヌクレオチドは、たとえば、ペプチド（たとえば、生体内でのターゲティング宿主受容体について）、又は細胞膜を横切る輸送を円滑にする剤（たとえば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５５３−６５５６  （１９８９）；  Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：６４８−６５２  （１９８７））；  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ８８／０９８１０，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，  １９８８を参照）、又は脳血管関門横切る輸送を円滑にする剤（たとえば、ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ８９／１０１３４，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｐｒｉｌ  ２５，  １９８８を参照）、ハイブリッド形成がきっかけとなる切断剤（たとえば、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６  （１９８８）を参照）、又はインターカレート剤（たとえば、  Ｚｏｎ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：５３９−５４９（１９８８）を参照）のようなそのほかの付加基を含むことができる。この目的で、オリゴヌクレオチドを別の分子、たとえば、ペプチド、ハイブリッド形成が誘発する架橋剤、輸送剤、ハイブリッド形成が誘発する切断剤などに抱合させることができる。
【０３２０】
本明細書で開示される治療法で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンタニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンタニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンのような、しかし、これらに限定されない少なくとも１つの修飾された塩基部分を含むことができる。
【０３２１】
本明細書で開示される治療法で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、たとえば、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含むこともできる。
【０３２２】
さらに別の実施形態では、本明細書で開示される治療法で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタル又はそれらの類縁体のような、しかし、これらに限定されない、少なくとも１つの修飾されたリン酸主鎖を含む。
【０３２３】
さらに別の実施形態では、本明細書で開示される治療法で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、普通の状況ではなく、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとの特定の二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：６６２５−６６４１（１９８７））。オリゴヌクレオチドは、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：６１３１−６１４８（１９８７））又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０３２４】
ポリヌクレオチドは、当該技術で既知の常法によって、たとえば、自動ＤＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているような）の使用によって合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された細孔ガラスポリマー支持体の使用によって調製することができる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：７４４８−７４５１（１９８８））。
【０３２５】
本明細書で開示される治療法で使用するためのポリヌクレオチド組成物はさらに、触媒ＲＮＡ又はリボザイムを含む（たとえば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４；  Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５  （１９９０）を参照）。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置にてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を有するということである。ハンマーヘッドリボザイムの構築と産生は当該技術で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）にさらに完全に記載されている。特定の実施形態では、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端に近く位置するように、すなわち、効率を高め、非機能的なｍＲＮＡの転写物の細胞内蓄積をできるだけ抑えるように、リボザイムが操作される。
【０３２６】
アンチセンスのアプローチにおけるように、本明細書で開示される診断法及び治療法で使用するためのリボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチドから構成することができ（たとえば、改善された安定性、ターゲティングなどのために）、生体内でＤＲ６を発現する細胞に送達することができる。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入のための上述の方法と同様に細胞に導入することができる。送達方法の１つには、たとえば、ｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモータのようなＤＲ６を構築する又はそれを誘導可能なプロモータの制御下にて、形質移入した細胞が十分な量のリボザイムを産生して内因性のＤＲ６メッセージを破壊し、翻訳を阻害するようにリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することが関与する。アンチセンス分子とは異なってリボザイムは触媒的なので、効率性にはさらに低い細胞内濃度が必要とされる。
ＤＲ６アプタマー拮抗物質
【０３２７】
別の実施形態では、本明細書で記載される方法で使用するためのＤＲ６拮抗物質は、アプタマーである。アプタマーは、独特の配列を有し、所望の標的（たとえば、ポリペプチド）に特異的に結合する特性を有し、所与の標的の特異的なリガンドであるヌクレオチド又はポリペプチドであることができる。ヌクレオチドアプタマーには、ＤＲ６に結合する二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡが挙げられる。特定の実施形態では、ＤＲ６アプタマー拮抗物質は、たとえば、哺乳類における、オリゴデンドロサイトの増殖、分化又は生存を促進し；オリゴデンドロサイトが介在するニューロンの髄鞘形成を促進し、脱ミエリン化を妨害する。
【０３２８】
核酸のアプタマーは、当該技術で既知の方法、たとえば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統発生法（ＳＥＬＥＸ）を用いて選択される。ＳＥＫＥＸは、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号及び同第６，６９９，８４３号に記載されたような標的分子への高い特異的結合を持つ核酸分子の試験管内評価についての方法である。アプタマーを特定する別のスクリーニング法は米国特許第５，２７０，１６３号（参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている。ＳＥＬＥＸの過程は、種々の二次元及び三次元の構造を形成する核酸の能力と、ほかの核酸分子及びポリペプチドを含めて、モノマーであろうとポリマーであろうと、事実上任意の化合物を伴ったリガンド（特異的結合対の）として作用するヌクレオチドモノマーの範囲内で利用可能な化学的多用途性に基づく。どんなサイズ又は組成の分子も標的として役立ち得る。
【０３２９】
ＳＥＬＥＸ法には、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同一の一般的な選択スキームを用いた、結合、区分化及び増幅の段階的な繰り返しによって所望の結合親和性と選択性を達成することが関与する。無作為化された配列の一部を含むことができる核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法には、結合に好都合な条件下で混合物を標的に接触させる工程；標的分子に特異的に結合したそれら核酸から未結合の核酸を区分化する工程；核酸−標的の複合体を解離する工程；核酸−標的の複合体から解離させた核酸を増幅して核酸のリガンドが濃縮された混合物を得る工程が含まれる。結合、区分化、解離及び増幅の工程は、所望なだけ多くのサイクルを介して繰り返し、標的分子に対する高い特異性の高い親和性の核酸を得る。
【０３３０】
ヌクレオチドアプタマーをたとえば、診断ツール又は特異的な阻害剤として用いて、細胞内のシグナル伝達及び輸送経路を分析することができる（Ｊａｍｅｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １：５４０−５４６  （２００１））。ヌクレオチドアプタマーの高い親和性と特異性によってそれらは創薬の良好な候補になる。たとえば、毒素リシンに対するアプタマーの拮抗物質が単離され、ナノモル範囲でのＩＣ５０を有する（Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４９３７−４９４２  （２０００））。ヌクレオチドアプタマーを感染性疾患、悪性腫瘍及びウイルス表面タンパク質に対して用いて細胞の感染性を低減することもできる。
【０３３１】
本明細書で記載される方法で使用するためのヌクレオチドアプタマーは、ほかのポリヌクレオチドについて本明細書で記載されるように、（たとえば、主鎖若しくは塩基を修飾することによって又はペプチドに結合することによって）修飾することができる。
【０３３２】
ＤＲ６のタンパク質構造を用いて、ＤＲ６に作用するアプタマーのＳＥＬＥＸ法を用いたスクリーニングによってＤＲ６が介在する過程を阻害するアプタマーの特定が可能になるであろう。
【０３３３】
本明細書で記載される方法で使用するためのポリペプチドアプタマーは、ＤＲ６に結合する能力について選択され、それによってＤＲ６の作用を阻止する無作為ペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、タンパク質の骨組の両端に結合する短い可変ペプチドドメインを含むことができる。この二重の構造的制約は、抗体に匹敵するレベルで（ナノモル範囲）ペプチドアプタマーの結合親和性を大きく高める。たとえば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｆら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７８（８）：４２６−４３０（２０００）を参照のこと。短い可変ペプチドの長さは通常、約１０〜２０アミノ酸であり、骨組は、良好な溶解性と緻密度特性を有する任意のタンパク質であることができる。骨組タンパク質の非限定例の１つは、細菌タンパク質、チオレドキシンＡである。たとえば、Ｃｏｈｅｎ，ＢＡら、ＰＮＡＳ，９５（２４）：１４２７２−１４２７７（１９９８）を参照のこと。
【０３３４】
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質の機能の優勢な阻害剤として作用するペプチド又は小型のポリペプチドである。ペプチドアプタマーは特異的に標的タンパク質に結合してその機能的能力を阻止する（Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９５：  １４，２６６−１４，２７１）。高い親和性と特異性で標的タンパク質に結合するペプチドアプタマーは、当該技術で既知の種々の技法によって単離することができる。ペプチドアプタマーは、酵母２ハイブリッドスクリーニング（Ｘｕ，  Ｃ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：１２，４７３−１２，４７８）又はリボゾームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：４９３７−４９４２）によって無作為ペプチドライブラリから単離することができる。それらはまた、ファージライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０）又は化学的に生成したペプチドライブラリからも単離することができる。さらに、ポリペプチドアプタマーは、リガンド調節ペプチドアプタマー（ＬｉＲＰＡｓ）の選択を用いて選択することができる。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＢｉｎｋｏｗｓｋｉ，ＢＦら、（２００５）Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．，１２（７）：８４７−８５５を参照のこと。ペプチドアプタマーを合成する困難な手段によってその使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑なものになっているが、それらは、限りない化学的多様性を有する。ポリヌクレオチドアプタマーはたった４個のヌクレオチド塩基しか利用しないので限定されるが、ペプチドアプタマーははるかに広いレパートリーを有する（すなわち、２０個のアミノ酸）。
【０３３５】
本明細書で記載される方法で使用するためのペプチドアプタマーは、本明細書のほかでそのほかのポリペプチドについて記載されるように修飾することができる（たとえば、ポリマーに抱合させる又はタンパク質に融合させる）。
ｐ７５拮抗物質
【０３３６】
本明細書で記載される方法に従って使用されるｐ７５の拮抗物質には、たとえば、（ｉ）ｐ７５拮抗物質化合物；（ｉｉ）ｐ７５拮抗物質ポリペプチド；（ｉｉｉ）ｐ７５拮抗物質抗体又はその断片；（ｉｖ）ｐ７５拮抗物質ポリヌクレオチド；（ｖ）ｐ７５アプタマー；及び（ｖｉ）２以上の上記ｐ７５拮抗物質の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、ｐ７５拮抗物質は、ｐ７５のＤＲ６との相互作用を阻害する。
【０３３７】
ｐ７５拮抗物質は当該技術で既知であり、当業者は、ｐ７５とＤＲ６の相互作用を阻害するｐ７５拮抗物質をどのようにスクリーニングし、調べるかを知っている。たとえば、ｐ７５の環状デカペプチド拮抗物質は、Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７８：１９３−１９９（２００４）に記載されており、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
ベクターと宿主細胞
【０３３８】
宿主発現系は、当該コーディング配列を製造し、その後精製することができる媒体を表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又は形質移入された際、その場でＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体を発現する細胞も表す。これらには、たとえば、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（たとえば、大腸菌、枯草菌）；ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，  Ｐｉｃｈｉａ）のような微生物；ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた又はそれを含有する組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系；或いは、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモータ（たとえば、メタロチオネインプロモータ）又は哺乳類ウイルスに由来するプロモータ（たとえば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築物を抱く哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は全体の組換え抗体分子を発現するための、たとえば、大腸菌のような細菌細胞又は真核細胞を、組換えＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体の分子の発現のために使用する。たとえば、ヒトのサイトメガロウイルスに由来する主要中間体初期遺伝子プロモータ因子のようなベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞は、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１  （１９８６）；  Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２  （１９９０））。
【０３３９】
細菌系では、発現されるＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体の分子の用途によって多数の発現ベクターを有利に選択することができる。たとえば、大量のそのようなタンパク質が製造されるべきである場合、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体の分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベルの発現を指向するベクターが望ましい可能性がある。そのようなベクターには、融合タンパク質が産生されるように、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列がＬａｃＺコーディング領域を持つフレームでベクターに個々に連結される大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：１７９１  （１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３１０１−３１０９  （１９８５）；  Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４：５５０３−５５０９  （１９８９））；などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）による融合タンパク質としての外来ペプチドを発現するのに使用される。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオンアガロースビーズへの吸着と結合に続く遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼの切断部位を含むように設計される。
【０３４０】
昆虫の系では、外来遺伝子を発現するベクターとしてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を通常使用する。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞にて増殖する。ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列をウイルスの非必須領域（たとえば、多角体遺伝子）に個々にクローニングすることができ、ＡｃＮＰＶプロモータ（たとえば、多角体プロモータ）の制御下に置く。
【０３４１】
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルス系発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、当該のＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体のコーディング配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、たとえば、後期プロモータ及び三連リーダー配列に連結することができる。次いでこのキメラ遺伝子を試験管内又は生体内の組換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、Ｅ１又はＥ３の領域）への挿入は結果的に、感染宿主にて生存でき、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体の分子を発現することができる組換えウイルスを生じる（たとえば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９  （１９８４）を参照）。挿入された抗体のコーディング配列の効率的な翻訳には特定の開始シグナルを必要とする。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、挿入全体の翻訳を確保するには、開始コドンは所望のコーディング配列の読み取りフレームに同調しなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源であってもよく、天然及び合成の双方であってもよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサ要素、転写ターミネータなどを含めることによって高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５１−５４４  （１９８７）を参照）。
【０３４２】
さらに、挿入された配列を調節し、又は所望の特定の方式で遺伝子産物を修飾し、処理する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）及び処理（たとえば、切断）はタンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセッシング及び修飾に特徴的で特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株又は宿主系を選択して発現される異種タンパク質の正しい修飾とプロセッシングを確保することができる。この目的で、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化及びリン酸化の正しいプロセッシングのための細胞機構を持つ真核細胞宿主を使用することができる。そのような哺乳類の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に乳癌細胞株、たとえば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、並びに正常な乳腺細胞株、たとえば、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４３】
長期にわたる組換えタンパク質の高い収率の産生のために、安定な発現が通常使用される。たとえば、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体を安定して発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御要素（たとえば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡと選択可能なマーカーによって宿主細胞を形質転換することができる。異種ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を栄養が豊富な培地で１〜２日間増殖させ、次いで選抜培地に移す。組換えプラスミドにおける選抜可能なマーカーは、選抜に対する耐性を付与し、細胞が安定的にプラスミドをその染色体に一体化するのを可能にし、増殖させて、次にはクローニングし、細胞株に増やすことができる増殖巣を形成させる。この方法を有利に使用して、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体の分子を安定して発現する細胞株を操作することができる。
【０３４４】
単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３  （１９７７））、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２  （１９９２））を含むが、これらに限定されない多数の選抜系を使用することができ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子をｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞にそれぞれ用いることができる。また、以下の遺伝子：メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５７  （１９８０）；  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５２７  （１９８１））；ミコフェノール酸に耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２  （１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６  （１９９３）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：１９１−２１７  （１９９３）；  ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５  （Ｍａｙ，  １９９３））；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７  （１９８４）についての選抜に基づく代謝拮抗物質耐性も使用することができる。使用することができる組換えＤＮＡ技術の当該技術にて一般に知られる方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
【０３４５】
ベクターの増幅によってＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体の発現レベルを高めることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｖｏｌ．  ３．  （１９８７）を参照）。ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質ポリペプチド又は抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増やす。増幅された領域は抗体遺伝子又はそのほかのポリペプチド遺伝子に関連するので、抗体又はそのほかのポリペプチドの産生も高められる（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２５７  （１９８３））。
【０３４６】
ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質、たとえば、可溶性のポリペプチド、抗体、拮抗物質ポリヌクレオチド、又はアプタマーをコードする核酸を含むベクターを用いて、本明細書に記載される方法で使用するための拮抗物質を製造することができる。そのような核酸が操作可能に連結されるベクター及び発現制御配列の選択は、所望の機能的特性、たとえば、タンパク質の発現及び形質転換される宿主細胞に左右される。
【０３４７】
操作可能に連結されたコーディング配列の発現を調節するのに有用な発現制御要素は当該技術で既知である。例には、誘導可能なプロモータ、構築プロモータ、分泌シグナル、及びそのほかの調節性要素が挙げられるが、これらに限定されない。誘導可能なプロモータが使用される場合、たとえば、宿主細胞の培地における栄養状況の変化、又は温度の変化によってそれを制御することができる。
【０３４８】
ベクターには、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌宿主細胞にて染色体外での組換えＤＮＡ分子の自律的な複製と維持を指示する能力を有するＤＮＡ配列を含めることができる。そのようなレプリコンは当該技術で周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターは、その発現がたとえば、薬剤耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子も含むことができる。細菌の薬剤耐性遺伝子の例は、アンピシリン又はテトラサイクリンに耐性を付与するものである。
【０３４９】
原核生物のレプリコンを含むベクターはまた、細菌の宿主細胞にてコーディング遺伝子配列の発現を指向するための原核生物又はバクテリオファージのプロモータも含むことができる。細菌の宿主に適合するプロモータの配列は通常、発現されるＤＮＡ断片の挿入のための好都合な制限部位を含有するプラスミドベクターにて提供される。そのようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、並びにｐＰＬ及びｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の好適な原核生物宿主を用いて、本明細書で記載される方法で使用されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させることができる。
【０３５０】
本明細書に記載される目的で、多数の発現ベクター系を採用することができる。たとえば、１つの部類のベクターは、たとえば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。そのほかには、内部リボゾーム結合部位を持つポリシストロン系の使用が関与する。さらに、形質移入した宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカーを導入することによって染色体にＤＮＡを統合した細胞を選抜することができる。マーカーは、栄養要求性の宿主に対して原栄養性を提供し、たとえば、銅のような重金属に対して殺菌耐性（たとえば、抗生剤）又は耐性を提供することができる。選抜可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結することができ、又は同時形質転換によって同一細胞に導入することができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は選抜可能なマーカー遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｎａｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７−３４１  （１９８２））。追加の要素は、ｍＲＮＡの最適合成に必要とされ得る。これらの要素には、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモータ、エンハンサ、及び停止シグナルを含めることができる。
【０３５１】
一実施形態では、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）と呼ばれるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ社が所有権を持つ発現ベクターを使用することができる。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモータ／エンハンサ、マウスのβグロビン主要プロモータ、ＳＶ４０の複製開始点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１とエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有する。このベクターは、ＣＨＯ細胞での形質移入に続いてＧ４１８を含有する培地での選抜及びメソトレキセート増幅によって、結果的に非常に高い発現を生じることが分かっている。当然、真核細胞で発現を誘発することができる任意の発現ベクターを使用することができる。好適なベクターの例には、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ＰＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡから入手可能）、並びにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。追加の真核細胞の発現ベクターは当該技術で既知であり、市販されている。通常、そのようなベクターは、所望のＤＮＡ断片の挿入のために好都合な制限部位を含有する。例となるベクターには、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧ及びｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、並びにＡＡＶベクターが挙げられる。そのほかの例となるベクター系は、たとえば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０３５２】
一般に、好適に高いレベルの拮抗物質を発現するものについて多数の形質転換された細胞をスクリーニングすることは、日常的な実験業務であり、たとえば、ロボット系によって実施することができる。
【０３５３】
哺乳類の宿主細胞の発現に頻繁に使用される調節性配列には、哺乳類細胞での高いレベルのタンパク質発現を指向するウイルス要素、たとえば、レトロウイルスのＬＴＲに由来するプロモータ及びエンハンサ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（たとえば、ＣＭＶプロモータ／エンハンサ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（たとえば、ＳＶ４０プロモータ／エンハンサ）、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄｍ１Ｐ）、ポリオーマ及び強力な哺乳類プロモータ、たとえば、天然の免疫グロブリン及びアクチンのプロモータが挙げられる。ウイルスの調節性要素及びその配列のさらなる記載については、たとえば、Ｓｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ，米国特許第４，５１０，２４５号；及びＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０３５４】
組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば、複製開始点）、及び選抜可能なマーカー遺伝子を運ぶことができる。選抜可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選抜を円滑にする（たとえば、Ａｘｅｌ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照）。たとえば、通常、選抜可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞にて、たとえば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメソトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する。頻繁に使用される選抜可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メソトレキセート選抜／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞について）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選抜について）が挙げられる。
【０３５５】
ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質をコードするベクターを好適な宿主細胞の形質転換に用いることができる。形質転換は任意の好適な方法によることができる。異種ＤＮＡの哺乳類細胞への導入の方法は当該技術で周知であり、デキストラン介在性の形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在性の形質移入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへの内包、ＤＮＡの核への直接微量注入が挙げられる。さらに、ウイルスベクターによって核酸分子を哺乳類細胞に導入することができる。
【０３５６】
本明細書で記載される方法で使用するためのＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質の発現のための宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であることができる。例となる真核生物の宿主細胞には、酵母及び哺乳類細胞、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１６５８）及び幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのほかの有用な真核生物宿主細胞には、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられる。例となる原核生物宿主細胞は、大腸菌及びストレプトマイセスである。
【０３５７】
宿主細胞の形質転換は、採用されるベクター及び宿主細胞に適した従来の方法によって達成することができる。原核生物宿主細胞の形質転換については、エレクトロポレーション及び塩処理法を採用することができる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４  （１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換については、エレクトロポレーション、カチオン脂質処理法及び塩処理法を採用することができる。たとえば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１３７３−７６（１９７９）を参照のこと。
【０３５８】
特定の実施形態では、タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は哺乳類起源であり；当業者は、そこで発現される所望の遺伝子産物に最適である特定の宿主細胞株を決定する能力があると評価されている。例となる宿主細胞株には、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を持つＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、及び２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は通常、商業的サービス、アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクションから、又は公開された文献から入手可能である。
【０３５９】
既知の技法を用いて、産生細胞株からのポリペプチドの発現を高めることができる。たとえば、特定の条件下で発現を高めるのにグルタミンシンターゼ（ＧＳ）系が一般に使用される。たとえば、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号及び同第０  ３２３  ９９７号、並びに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照のこと。
遺伝子治療
【０３６０】
オリゴデンドロサイトの生存、増殖及び分化を促進すること又はニューロンの髄鞘形成を促進することが治療上有益である、神経系の疾患、障害又は損傷の治療に対する遺伝子治療アプローチを用いて、哺乳類、たとえば、ヒト患者にて生体内でＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を産生することができる。これには、好適な発現制御配列に操作可能に連結された好適なＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質をコードする核酸の投与が関与する。一般に、これらの配列はウイルスベクターに組み入れられる。そのような遺伝子治療に好適なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプステインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、及び単純性ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであることができる。Ｅ１遺伝子又はＥ３遺伝子に欠失を有するアデノウイルスベクターが通常使用される。アデノウイルスベクターが使用される場合、ベクターは普通、選抜可能なマーカー遺伝子を有さない。
医薬組成物
【０３６１】
本明細書で記載される方法で使用されるＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質は、ヒトを含む哺乳類への投与のための医薬組成物に製剤化することができる。本明細書で記載される方法で使用される医薬組成物は、たとえば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、たとえば、ヒト血清アルブミン、リン酸塩のような緩衝液物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、たとえば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む薬学上許容可能な担体を含む。
【０３６２】
本明細書で記載される方法で使用される組成物は、任意の好適な方法、たとえば、非経口で、脳室内に、経口で、吸入スプレーによって、局所に、直腸内に、鼻内に、頬内に、膣内に、又は埋め込まれたリザーバを介して投与することができる。用語「非経口的」には、本明細書で使用されるとき、皮下の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、滑膜内の、胸骨内の、クモ膜下の、肝臓内の、病変内の、及び頭蓋内の注射又は点滴の技法が含まれる。上述のように、本明細書で記載される方法で使用されるＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質は、神経系細胞の生存を促進し、アポトーシスを妨げるように神経系で作用する。従って、本明細書で記載される特定の方法では、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質は、脳血管関門を通過するような方法で投与される。この通過は、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質自体の固有の物理化学的特性から、医薬製剤のそのほかの成分から、又は脳血管関門を突破する針、カニューレ又は外科機器のような機械的用具から生じることができる。ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質が脳血管関門を本来通過しない分子、たとえば、通過を促進する部分への融合である場合、投与の好適な経路は、たとえば、ＭＳの慢性病変への直接的なクモ膜下又は頭蓋内である。ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質が脳血管関門を本来通過する分子である場合、投与の好適な経路は以下に記載される種々の経路の１以上によることができる。
【０３６３】
本明細書で記載される組成物の無菌注射形態は水性又は油性の懸濁液である。これらの懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術で既知の技法に従って製剤化することができる。無菌の注射用製剤は、非毒性の非経口で許容できる希釈剤又は溶媒における、たとえば、１，３−ブタンジオールにおける懸濁液のような、無菌の注射用の溶液又は懸濁液であることもできる。採用することができる許容可能な媒体及び溶媒は、水、リンガー溶液及び等張の塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の非揮発性油は溶媒又は懸濁媒体として従来採用されている。この目的で、合成のモノ−又はジ−グリセリドを含む任意の非刺激性の非揮発性油を採用することができる。たとえば、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、特にポリオキシエチル化型での、たとえば、オリーブ油又はヒマシ油のような薬学上許容可能な天然の油のように注射用製剤で有用である。これらの油性の溶液又は懸濁液はまた、たとえば、カルボキシメチルセルロースのような長鎖アルコール性の希釈剤若しくは分散剤、又はエマルション及び懸濁剤を含む薬学上許容可能な投与形態の製剤で一般に使用される類似の分散剤を含有することもできる。薬学上許容可能な固形、液状又はそのほかの投与形態の製造に一般に使用されるＴｗｅｅｎやＳｐａｎのようなそのほかの一般に使用される界面活性剤、及びそのほかの乳化剤又は生体利用効率増強剤も製剤化の目的で使用することができる。
【０３６４】
非経口製剤は、単回用量ボーラス、輸液、又は維持用量を伴う負荷用量ボーラスであることができる。特定の固定した又は変動する間隔で、たとえば、１日に一回、又は「必要に応じて」を基本に、これらの組成物を投与することができる。
【０３６５】
本明細書で記載される方法で使用される特定の医薬組成物は、たとえば、カプセル、錠剤、水性の懸濁液又は溶液を含む許容可能な投与形態で経口投与することができる。特定の医薬組成物はまた、鼻内エアゾール又は吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、ベンジルアルコール若しくはそのほかの好適な保存剤、生体利用効率を高める吸収促進剤、及び／又は従来の可溶化剤若しくは分散剤を用いて生理食塩水における溶液として調製することができる。
【０３６６】
担体物質と組み合わせて単一の投与形態を作製することができるＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質の量は、治療される宿主、使用される拮抗物質の種類、及び特定の投与方式によって異なる。組成物は、単回用量として、複数回用量として、又は点滴にて確定された期間にわたって投与することができる。投与計画を調整して最適な所望の応答（たとえば、治療上の応答又は予防上の応答）を提供することができる。
【０３６７】
場合によっては、本明細書で記載される方法は、「治療上有効量」の又は「予防上有効量」のＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を使用する。そのような治療上又は予防上の有効量は、たとえば、個体の疾患状況、年齢、性別、及び体重のような因子に従って変化し得る。治療上又は予防上の有効量はまた、治療上有益な効果が毒性又は有害な効果を上回るものでもある。
【０３６８】
特定の患者についての特定の投与量及び治療計画は、使用される特定のＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食事、投与の時間、排泄の速度、薬剤の併用、及び治療される特定の疾患の重症度を含む種々の因子に左右される。医療従事者によるそのような因子の判断は当該技術の普通の技量の範囲内である。量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、及び所望の効果にも左右される。使用される量は、当該技術で周知の薬理学的な原理及び薬物動態原理によって決定することができる。
【０３６９】
本明細書で記載される方法では、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質は一般に、神経系に、脳室内に又はクモ膜下に、たとえば、慢性病変に直接投与される。本明細書で記載される方法に係る投与のための組成物は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量のＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質が投与されるように製剤化することができる。一部の実施形態では、投与量は０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。一部の実施形態では、投与量は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【０３７０】
ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質抗体による治療については、投与量は、たとえば、宿主の体重当たり０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ及びさらに普通には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であることができる。たとえば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、たとえば、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲の中間の用量も使用することができる。そのような用量を毎日、代替日に、毎週、又は経験的な分析によって決定されたほかの計画に従って対象に投与することができる。例となる治療は、複数回用量にて、たとえば、少なくとも６ヵ月間、延長された期間にわたる投与を必要とする。追加の例となる治療計画は、２週間に一回、１ヵ月に一回、又は３〜６ヵ月に一回の投与を必要とする。例となる投与スケジュールには、連続して毎日１〜１０ｍｇ／ｋｇ若しくは１５ｍｇ／ｋｇ、代替日に３０ｍｇ／ｋｇ、又は毎週６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。一部の方法では、異なった結合特異性を持つ２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与される各抗体の投与量は示された範囲内に入る。
【０３７１】
特定の実施形態では、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質抗体をコードする核酸分子によって対象を治療することができる。核酸の用量は、患者当たり、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ又は３０〜３００μｇのＤＮＡに及ぶ。感染性ウイルスベクターの用量は、用量当たり１０〜１００ビリオン以上で変化する。
【０３７２】
補助的に活性のある化合物も、本明細書で記載される方法で使用される組成物に組み入れることができる。たとえば、可溶性のポリペプチド又は融合タンパク質を１以上の追加の治療剤と共に同時製剤化することができ、及び／又は同時投与することができる。
【０３７３】
送達方法は、水溶液のボーラス注射又は制御放出系の埋め込みを含む、選択された標的組織へのＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質の好適な送達方法を包含する。制御放出の埋め込みの使用は、繰り返し注射の必要性を減らす。
【０３７４】
本明細書で記載されるＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を脳に直接点滴することができる。化合物の脳への直接的な点滴のための種々のインプラントが知られており、神経障害を持つヒト患者への治療化合物の送達で効果的である。それらには、ポンプを用いた脳への慢性的な点滴、定位固定で埋め込まれた一時的な間質性カテーテル、頭蓋内のカテーテルインプラント、及び外科的に埋め込まれた生分解性のインプラントが挙げられる。たとえば、Ｇｉｌｌら、上記；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、「Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ  Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；及びＢｒｅｍら、「Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【０３７５】
組成物はまた、化合物のために送達系又は支持系として機能する生体適合性の担体物質に分散されたＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を含むことができる。徐放性担体の好適な例には、たとえば、座薬やカプセルのような成形された物品の形態での半透過性のポリマーマトリクスが挙げられる。埋め込み可能な又は微量カプセルの徐放性マトリクスにはポリアクチド（米国特許第３，７７３，３１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６  （１９８５））、酢酸エチレンビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：１６７−２７７  （１９８１）；  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：９８−１０５  （１９８２））、又はポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０３７６】
本明細書で記載される方法の一部の実施形態では、脳の適当な領域への直接的な点滴によってＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質が投与される。たとえば、Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。代替の技法が利用可能であり、それを適用してＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を投与することができる。たとえば、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒ単位及びＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化単位を用いてカテーテル又はインプラントの定位固定の留置を達成することができる。１２０ｍＬのオムニパーク、３５０ｍｇ／ｍＬのヨウ素を注射し、２ｍｍの切片厚さでの造影コンピュータ断層（ＣＴ）走査は、三次元の多面的治療計画を可能にすることができる（ＳＴＰ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）。この機器によって、明瞭な標的の確認のためのＣＴ及びＭＲＩの標的情報を併せて、磁気共鳴画像化試験に基づいた計画が可能になる。
【０３７７】
ＧＥＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）との使用のために改変されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．，  Ｄｅｃａｔｕｒ，  ＧＡ）、及びＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）はこの目的で使用することができる。従って、埋め込みの朝、ＢＲＷ定位固定フレームの環状ベースリングを患者の頭部に取り付けることができる。ベースプレートに挟み付けたグラファイトの棒状ローカライザーフレームによって（標的組織の）領域を介して３ｍｍ間隔でＣＴ連続切片を得ることができる。ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間に位置するグラファイトの棒状画像のＣＴ座標を用いたＶＡＸ１１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｙｎａｒｄ，  Ｍａｓｓ）にてコンピュータ化治療計画プログラムを実行することができる。
【０３７８】
本明細書で記載されるような高い細胞死を伴う神経系障害の治療方法は通常、ヒトでの使用に先立って、所望の治療又は予防の活性について、許容できる動物モデルにて試験管内で次いで生体内で調べられる。トランスジェニック動物を含めて好適な動物モデルは当業者に知られるであろう。たとえば、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質の生存効果を明らかにする試験管内のアッセイが本明細書で記載される。アポトーシスに対するＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質の効果が実施例で記載されるように試験管内で調べられる。最終的に、ＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を発現するトランスジェニックマウスを創出することによって、又は本明細書で記載されるようにマウス若しくはラットのモデルに対してＤＲ６及び／又はｐ７５拮抗物質を投与することによって生体内の試験を実施することができる。
【０３７９】
本明細書で記載される実践は、特に示されない限り、当該技術の技量の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を採用する。そのような技法は文献によって完全に説明されている。たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ及びＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（２０００）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８８）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕら編；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（１９８６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ），第１版、Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）；並びにｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照のこと。
【０３８０】
抗体の操作の一般原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｂ．Ｌ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版、Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）二述べられている。タンパク質の操作の一般原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ら編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に述べられている。抗体及び抗体ハプテンの結合の一般原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；及びＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ及びＨａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に述べられている。さらに、当該技術で既知であり、具体的には記載されていない免疫における常法は一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），第２版、Ｊ．Ｄ．Ｐｏｕｎｄ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８），Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｂａｓｉｃ及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）並びにＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ編、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）として追随されている。
【０３８１】
免疫学の原理を述べている標準的な参考資料には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．；Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版、Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙら、Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎら、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９７）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版、Ｉ．Ｒｏｉｔｔら、Ｍｏｓｂｙ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００１）；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版；Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｈ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｓｅｔ），第１版、Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版、Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（２００２）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ及びＰｒａｃｔｉｃｅ，第３版、Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒら編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒら編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）が挙げられる。
【０３８２】
上記で引用した参考文献すべて、並びに本明細書で引用した参考文献すべては、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０３８３】
実施例
実施例１
ＤＲ６は神経系で発現される
【０３８４】
ＤＲ６タンパク質の発現について成熟マウスの大脳皮質及びラットの脊髄の組織切片を調べた。組織切片を先ず、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳにて３０分間透徹させ、次いで室温にて１時間、ブロッキング溶液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有するＰＢＳ）でインキュベートした。一次抗体の標識については、ウサギ抗ＤＲ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ１３１０６、１：２００）とマウス抗ニューロンクラスＩＩＩβチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＭＭＳ−４３５Ｐ、１：５００）を含有するブロッキング培地で切片を４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回すすいだ後、Ａｌｅｘａ５９４抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：５００）を含有する５％ＮＧＳ−ＰＢＳにて室温で１時間切片をインキュベートした。結果は、ＤＲ６とニューロンクラスＩＩＩβチューブリンの同時局在を示し、それは、ＤＲ６がニューロンで発現されることを示している（データは示さず）。
【０３８５】
神経系におけるＤＲ６の役割を理解するために、逆転写の後の定量的リアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＤＲ６のｍＲＮＡの発現レベルを評価して、それがラットの脳組織で発生上調節されているかどうかを判定した。胎齢１８日（Ｅ１８）、出生後１（Ｐ１）、７（Ｐ７）、１４（Ｐ１４）及び２１（Ｐ２１）日目にて及び成熟ラットから得た脳全体と脊髄のホモジネートからｍＲＮＡを抽出した。製造元の指示書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙＲＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてすべてのｍＲＮＡを抽出した。次いで精製ＲＮＡ（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＲ６のｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡは定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の鋳型として用いられ、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現システム（Ｍｘ３０００Ｐ）を用いてＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に設定されたＭｍ００４４６３６１＿ｍｌｐプレミックスプライマーを用い、ＤＲ６を定量した。図１Ａ〜Ｂに見られるように、ＤＲ６の発現レベルは、Ｅ１８では低く、出生後７又は１４日でピークに達し、その後、成熟後の脳及び脊髄の双方で低下した。発生上の転写特性は、抗ＤＲ６抗体を用いたウエスタンブロットに基づくタンパク質の発現特性に一致した（図１Ｃ）。ヒト及びラットの脳の組織切片の免疫組織化学染色は、βＩＩＩチューブリンのニューロンマーカーとの同時局在に基づいてヒト及びラットの双方のニューロンでＤＲ６が発現されることを明らかにした（データは示さず）。
【０３８６】
さらに、ＤＲ６のｍＲＮＡの発現について幾つかのほかの細胞種を調べた。ｍＲＮＡは、Ｐ２オリゴデンドロサイトの祖先細胞（ＯＰＣ）、Ｅ１８の皮質ニューロン、Ｐ２の小膠細胞及びＰ４２の大脳皮質星状細胞の精製した培養物から抽出した。製造元の指示書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙＲＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてすべてのｍＲＮＡを抽出した。次いで精製ＲＮＡ（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＲ６，及び対照としてのグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｃＤＮＡを生成した。図１Ｄは調べた４種の細胞すべてでＤＲ６が発現されることを示す。
【０３８７】
ＤＲ６の発現はオリゴデンドロサイト系列にて時間的に調節される。３つの異なったアプローチを用いてオリゴデンドロサイトにおけるＤＲ６発現を調べた。第１に、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行って、オリゴデンドロサイトの精製集団の３つの異なった段階（Ａ２Ｂ５、Ｏ４及びＭＢＰ）でのｍＲＮＡのレベルを決定した。図２Ａに示されるように、Ａ２Ｂ５＋、Ｏ４＋及びＭＢＰ＋のオリゴデンドロサイトで見い出される同等のｍＲＮＡレベルにてＤＲ６のｍＲＮＡはオリゴデンドロサイト系列の全段階で検出された。第２に、ウエスタンブロットを行ってオリゴデンドロサイトの３つの異なった段階におけるＤＲタンパク質のレベルを決定した。図２Ｂに示されるように、ＤＲタンパク質はオリゴデンドロサイトの３つの段階すべてで検出可能であった。興味深いことに、髄鞘形成前（Ｏ４＋）のオリゴデンドロサイト段階では、それより早い祖先Ａ２Ｂ５より５倍高く、成熟オリゴデンドロサイト（ＭＢＰ陽性）よりも１０倍高かったということは、髄鞘形成前のオリゴデンドロサイトが優勢なＤＲ６発現細胞であることを示唆している。第３に、オリゴデンドロサイトにおけるＤＲ６タンパク質の存在は、Ａ２Ｂ５＋、Ｏ４＋及びＭＢＰ＋のオリゴデンドロサイトが抗ＤＲ６抗体で染色されたことを示す免疫組織化学を用いて確認された（データは示さず）。再び、Ｏ４陽性細胞は、ＭＢＰ陽性細胞よりもはるかに強力な蛍光染色を示すということは、成熟オリゴデンドロサイトよりも髄鞘形成前の段階（Ｏ４陽性）でＤＲ６の発現が多いことを示唆する。競合するＤＲ６−Ｆｃの添加による抗ＤＲ６抗体の事前吸着によってシグナルは完全に取り除かれた。
実施例２
ＤＲ６はアルツハイマー病患者の脳で過剰発現される
【０３８８】
アルツハイマー病患者の脳におけるＤＲ６ｍＲＮＡのレベルを調べた。アルツハイマー病の４人の異なった供与者からの６つの瞬間凍結脳組織ブロックを用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。これらの結果を神経疾患のない２人の供与者からの３つの脳組織ブロックから得られたものと比較した。
【０３８９】
図３に示されるように、ＤＲ６は、３つの正常な脳試料と比較した際、アルツハイマーの試料（４人の個々の供与者から採取された前頭葉２、側頭葉１、基底神経節１及び未特定領域２）で１．２〜１．８倍高く発現される（図３）。上方調節されたＤＲ６がニューロン特異的であるかどうかを判定するために、免疫組織化学染色を実施した。αβアミロイド斑の中央での細胞はＤＲ陽性である。斑の近くの細胞がやや明るいＤＲ染色を有するということは、高いレベルのＤＲ６発現を示唆している。ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの作製及びＱ−ＰＣＲは実施例１に記載されたように行った。
実施例３
ＤＲ６は軸索切除後、上方調節される
【０３９０】
ＤＲ６のｍＲＮＡとタンパク質のレベルに対する軸索切除の影響を調べた。これらの実験については、以前記載されたように（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８：７４５−５１  （２００５））、胎児性ＤＲＧニューロンを調製した。手短には、先ず２週齢のＥ１６スプラーグ・ドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）からＤＲＧを取り出し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃で３０分間インキュベートした。次いで２０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する等量のＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を消化混合物に加えて反応を止めた。室温にて５分間の１，０００ｒｐｍでの遠心後に回収した細胞沈殿物を、大きな断片が見えなくなるまでプラスチック製のピペットを穏やかに通すことによって機械的にほぐした。１００μｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）によって被覆した４穴のチャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）の各ウェルの中央に約１×１０５個のニューロンをスポットにした。５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にて増殖培地（Ｂ２７補完物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１００ｎｇ／ｍＬの神経成長因子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する神経基本培地）で細胞を付着させた。翌朝、培地を新鮮な増殖培地で置き換え、２０μＭのフルオロデオキシウリジンで細胞を３日間処理して増殖するグリア細胞を除いた。その後、５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にて増殖培地で培養を維持し、３〜４日毎に新鮮な培地に交換した。
【０３９１】
これら培養した軸索に刃でダメージを与え、傷害後０、２４、及び４８時間に、製造元の指示書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙＲＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてｍＲＮＡを抽出した。図４に示されるように、定量によって、ＤＲ６ｍＲＮＡのレベルは、対照の無傷の軸索培養に比べて軸索切除後２４時間及び４８時間の双方で高いことが明らかにされた。
【０３９２】
ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの作製及びＱ−ＰＣＲは実施例１に記載されたように行った。
実施例４
ＤＲ６は脊髄傷害の後、病変部位での運動ニューロンで上方調節される
【０３９３】
脊髄傷害のモデルを創出するために、Ｊｉら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３３：  ３１１−２０  （２００６））によって記載されたようにラットの脊髄の背面半側切断を行った。脊髄組織を固定し、抗ＤＲ６抗体を用いて染色した。無傷のラットよりも脊髄傷害を持つラットで有意に高いレベルのＤＲ６陽性の運動ニューロンが検出された。
実施例５
ＤＲ６の過剰発現はニューロン死を誘導する
細胞培養
【０３９４】
細胞培養で増殖させた大脳皮質ニューロンを、ＤＲ６を発現するレンチウイルスに感染させ、細胞死に対する影響を調べた。Ｅ１８スプラーグ・ドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から大脳皮質ニューロンを調製した。手短には、Ｅ１８ラット胚から大脳皮質を取り出し、細片して、３７℃にて１０分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてインキュベートした。６０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）と１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後細胞を粉砕して反応を止めた。室温にて５分間、１，０００ｒｐｍでの遠心によって回収した細胞沈殿物を次いで、大きな断片が見えなくなるまでプラスチック製ピペットを穏やかに通して機械的にほぐした。細胞を播く前に、１００μｇ／ｍＬのポリＤ−リジン（Ｓｉｇｍａ）で組織培養プレートの表面すべてを被覆した。様々な実験設定でプレートに入れた密度は以下のとおりである：ウエスタンブロット用の１２穴プレートでは１×１０６個／ウェル、経時的画像化用の２４穴プレートでは１×１０５個／ウェル、並びにＬＤＨアッセイ、均質カスパーゼアッセイ及びＱ−ＰＣＲ分析についての９６穴プレートでは２×１０４個／ウェル。細胞は、５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にてＢ２７補完物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する神経基本培地で維持し、３〜４日毎に新鮮な培地に交換した。
タンパク質発現構築物
【０３９５】
完全長ＤＲ６（アミノ酸１〜６５５）をコードするＤＮＡをＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウイルスベクターのＮｏｔＩ部位に挿入した。レンチウイルスにおける完全長のヒトＤＲ６の配列を得、配列番号１５４の配列である。配列番号１５４のヌクレオチド１２４〜１５３はタンパク質の発現を確認するＭｙｃタグをコードしている。ヌクレオチド配列は、配列番号１５５の完全長ＭｙｃタグのヒトＤＲ６ポリペプチドをコードする。配列番号１５５のアミノ酸４２〜５１はＭｙｃタグである。
【０３９６】
ドミナント・ネガティブＤＲ６（アミノ酸１〜３７）をコードするＤＮＡをＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウイルスベクターのＮｏｔＩ部位に挿入した。レンチウイルスにおけるドミナント・ネガティブＤＲ６の配列は配列番号１５６として提供される。配列番号１５６のヌクレオチド１２４〜１５３はタンパク質の発現を確認するＭｙｃタグをコードしている。ドミナント・ネガティブヒトＤＲ６ポリペプチドのポリペプチド配列は配列番号１５７として提供される。配列番号１５７のアミノ酸４２〜５１はＭｙｃタグである。
感染
【０３９７】
得られたプラスミド及びＧＦＰ対照プラスミドによって２９３細胞に形質移入し、以前記載された（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３３：４０１−６  （２００３））ようにレンチウイルスを生成し、感染多重度（ＭＯＩ）１にてレンチウイルスを皮質ニューロンに感染させた。ＦＬ−ＤＲ６の異所性発現は、９２時間後、対照の感染細胞に比べて、細胞の形態及び細胞の計数によって視覚化されたように（図５Ａ）皮質ニューロンのアポトーシスを誘導した。
【０３９８】
生細胞すべてのミトコンドリア活性をモニターする並行培養におけるＸＴＴアッセイによって、ＤＲ６が誘導した細胞死をさらに検証した。ＸＴＴアッセイはミトコンドリア活性を測定することによって細胞数を決定する比色法である。ＦＬ−ＤＲ６を感染させた皮質ニューロンはＸＴＴの読み取りにて２倍の低下を示し、ＤＲ６の過剰発現が誘導したニューロン死が原因で生じた細胞数の有意な低下を反映していた（図５Ｂ）。死のドメイン（ＤＤ）が細胞死に必要とされるかどうかを判定するために、ＤＤを含有しないドミナント・ネガティブＤＲ６レンチウイルス（ＤＮ−ＤＲ６）を感染によって皮質ニューロンに導入した。図５Ｂに示されるように、ＤＮ−ＤＲ６が培養ニューロンにてアポトーシスを誘導できなかったということは、ＤＲ６死のドメインはニューロンの死の誘導に必須であることを示唆している。
【０３９９】
アポトーシスの鍵となるメディエータであるカスパーゼ−３に対するＤＲ６の影響も分析した。上述のように皮質ニューロンに感染させ、感染の４８時間後、細胞溶解物を回収した。蛍光測定均質カスパーゼアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ，  ０３００５３７２００１）を用いてカスパーゼ−３活性を測定した。感染後４８時間で細胞をアッセイした。図５Ｃに示されるように、未感染の細胞、ＧＦＰ対照レンチウイルスを感染させた細胞及びドミナント・ネガティブＤＲ６レンチウイルスを感染させた細胞に比べて、完全長のＤＲ６レンチウイルスを感染させた後、遊離のローダミンのレベルは２倍上昇した。このことは、ドミナント・ネガティブＤＲ６ではなく、ＤＲ６がカスパーゼ−３の活性を高めることを示している。
【０４００】
これらの結果はウエスタンブロットによって確認された。細胞溶解物をＰＡＧＥに供し、分離したタンパク質を抗ＤＲ６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で探査した。図５Ｄに示されるように、活性のあるカスパーゼ−３のレベルは、ドミナント・ネガティブＤＲ６レンチウイルス又はＧＦＰ対照レンチウイルスを感染させた細胞よりも完全長のＤＲ６レンチウイルスを感染させた細胞の方が高かった。それに対して、対照タンパク質（βＩＩＩ−チューブリン）のレベルは３種の感染すべてで類似していた。それぞれの感染におけるレンチウイルスによって産生されるＧＦＰの類似のレベルによって明らかにされたようにそれぞれの感染の有効性は、類似していた（図５Ｄを参照）。
【０４０１】
これの結果のそれぞれは、ＤＲ６が皮質ニューロンにおいて細胞死を誘導することができることを示唆している。
実施例６
ＤＲ６−ＦＬの過剰発現はＯＰＣの死を誘導する。
【０４０２】
オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の生存率に対するＤＲ６の影響も調べた。この実験では、以前記載されたように（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８：７４５−５１  （２００５））、濃縮したオリゴデンドロサイトの培養を調製した。手短には、Ｐ２スプラーグ・ドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から前脳を取り出し、細片し、０．０１％トリプシン（Ｓｉｇｍａ）と１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）にて３７℃で１５分間インキュベートした。ほぐした細胞を１００μｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジンの組織培養フラスコに入れ、２０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて３７℃で１０日間増殖させた。濃縮したオリゴデンドロサイトの祖先細胞を得るために、２００ｒｐｍにて３７℃で一晩フラスコを振盪し、９５％純度の集団を生じた。次いで、オリゴデンドロサイトの祖先細胞を２×１０４個／ウェルにて９６穴プレートに入れ、５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にて、１０ｎｇ／ｍＬの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＡＡ）と１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて維持した。
【０４０３】
次いで実施例５に記載されたように、ＧＦＰ、完全長ＤＲ６及びドミナント・ネガティブＤＲ６のレンチウイルスをＯＰＣに感染させ、感染の４８時間後、死細胞の数を評価した。未処理の細胞及び２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した細胞もそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として調べた。先ず、位相差顕微鏡を用いて細胞を可視化し、全細胞数と死細胞の数を数えた。死細胞の比率（％）を図６Ａにてグラフで表す。ドミナント・ネガティブＤＲ６レンチウイルス又はＧＦＰレンチウイルスを感染させた細胞に比べて、完全長ＤＲ６レンチウイルスによる感染は死細胞の比率の有意な上昇をもたらした。
【０４０４】
ＯＰＣの生存率に対するＤＲ６の影響は、ＸＴＴアッセイ及びＬＤＨアッセイを用いても評価した。ＸＴＴアッセイは実施例５に記載されたように実施した。陽性対照としてＮＡＤＨ阻害剤であるロテノンで細胞を処理した。図６Ｂに示されるように、ドミナント・ネガティブＤＲ６レンチウイルス又はＧＦＰレンチウイルスを感染させた細胞は似たようなレベルの細部生存率を示した。それに対して、ロテノンで処理した又は完全長ＤＲ６レンチウイルスを感染させた細胞は有意に低いレベルの細胞生存率を示した。
【０４０５】
ＬＤＨアッセイを用いて類似の結果が得られた。ＬＤＨは細胞溶解の際に放出される酵素なので、ＬＤＨ活性についての比色アッセイを用いて細胞の損傷を測定することができる。製造元の指示書に従って、細胞傷害性検出キット（ＬＤＨ，  Ｒｏｃｈｅ，  １１６４４７９３００１）を用いてＬＤＨアッセイを実施した。結果を図６Ｃにグラフで示すが、完全長ＤＲ６レンチウイルスによる感染は、ドミナント・ネガティブＤＲ６レンチウイルス又はＧＦＰレンチウイルスのいずれかによる感染に比べて有意に高い細胞傷害性を生じることを明らかにしている。
【０４０６】
これら実験のそれぞれは、完全長ＤＲ６が皮質ニューロンに加えてＯＰＣにおいて細胞死を誘導することができることを示唆している。
実施例７
ＤＲ６のシグナル伝達経路の遮断はオリゴデンドロサイトの生存と分化を促進する
【０４０７】
オリゴデンドロサイトの生存はその最終分化に決定的なので、ＤＲ６拮抗物質のオリゴデンドロサイトの生存、分化及び髄鞘形成を促進する能力を評価した。この課題に対処するために、ＤＲ６−ＤＮ（死のドメインの欠失）を用いてオリゴデンドロサイトにおけるＤＲ６の機能を遮断した。図７Ａに示されるように、ＤＲ６ＤＮを感染させた細胞は、マウス抗ＭＢＰ抗体（ＳＭＩ  ９４  ａｎｄ  ＳＭＩ  ９９，  １：４０００，  Ｃｏｎｖａｎｃｅ）、マウス抗ＭＯＧ抗体（１：５００）及びウサギ抗β−アクチン抗体（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）を用いてウエスタンブロット解析によって判定された、５倍高いレベルのＭＢＰ＋細胞、及び高いＭＢＰとＭＯＧのタンパク質を示した（図７Ａ）。レンチウイルスによる細胞の感染は、ＧＦＰタンパク質の同時発現マーカーのウエスタンブロットによる検出によって確認された（図７Ａ）。さらに、ＣＮＰａｓｅアッセイ（図７Ｂ）を行って、ＥＬＩＳＡ形式にて、未成熟及び成熟双方のオリゴデンドロサイトのマーカーであるＣＮＰａｓｅのレベルを測定した。図７Ｂに示されるように、ＤＲ６ＦＬを感染させたオリゴデンドロサイトは、対照に比べて低下したＣＮＰａｓｅ活性を発現した。それに対して、ＤＲ６ＤＮによるＤＲシグナル伝達経路の遮断は、ＣＮＰａｓｅ活性を高めた（図７Ｂ）。これらの結果は、内因性のＤＲ６がオリゴデンドロサイトの生存及び分化を負に調節するという考えを支持している。
実施例８
ＤＲ６が誘導するニューロン死はＤＲ６−Ｆｃによって覆される
【０４０８】
実施例５に記載されたように皮質ニューロンに完全長ＤＲ６レンチウイルスを感染させた。しかしここでは、漸増量の組換え可溶性ＤＲを補完した培地にてこれらの細胞をインキュベートした。ＤＲ６のアミノ酸１〜３４９をＦｃ配列に融合することによって組換え可溶性ＤＲを作製した。配列番号１５８のヌクレオチド配列をこの実験に用いた。配列番号１５８のヌクレオチド１〜１０４７はＤＲ６のアミノ酸をコードし、配列番号１５８のヌクレオチド１０５１〜１７３１はＦｃのアミノ酸をコードする。配列番号１５８のヌクレオチド１０４８〜１０５０はクローニングの手順のために挿入された。
【０４０９】
可溶性ＤＲ６ポリペプチドの配列は、配列番号１５９として提供される。配列番号１５９のアミノ酸１〜３４９はＤＲ６のアミノ酸である。配列番号１５９のアミノ酸３５１〜５７６はＦｃのアミノ酸であり、アミノ酸３５０はクローニング手順によって挿入されたアミノ酸である。
【０４１０】
可溶性ＤＲ６をコードする配列をレンチウイルスベクターに導入し、次いでこれを使用して２９３細胞から組換え可溶性ＤＲ６を産生させ、精製した。ＦＬ−ＤＲ６を発現するニューロンに対するＤＲ６−Ｆｃの生存効果を直接モニターするために、経時的画像化を得た。ＤＲ６−Ｆｃの存在下で、ＦＬ−ＤＲ６は皮質ニューロンの死を誘導できなかった（図８Ａ〜Ｂ）。
【０４１１】
ＤＲＧニューロンに対する可溶性ＤＲ６の効果も調べた。先ず、成熟スプラーグ・ドーリー系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）からＤＲＧニューロンを取り出し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃で３０分間インキュベートした。次いで２０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する等量のＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を消化混合物に加え、反応を止めた。室温にて５分間の１，０００ｒｐｍでの遠心によって細胞沈殿物を回収し、大きな断片が見えなくなるまでプラスチック製のピペットを穏やかに通すことによって機械的にほぐした。１００μｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）によって被覆した４穴のチャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）の各ウェルの中央に約１×１０５個のＤＲＧニューロンをスポットにした。５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にて増殖培地（Ｂ２７補完物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１００ｎｇ／ｍＬの神経成長因子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する神経基本培地）で細胞を付着させた。翌朝、培地を新鮮な増殖培地で置き換え、２０μＭのフルオロデオキシウリジンで細胞を３日間処理して増殖するグリア細胞を除いた。その後、５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にて増殖培地で培養を維持し、３〜４日毎に新鮮な培地に交換した。培養の７日後、対照Ｆｃ又は可溶性ＤＲ６−ＦｃのいずれかでＤＲＧを３日間処理した。４％パラホルムアルデヒドでＤＲＧを固定し、次いでマウス抗ニューロンクラスＩＩＩβ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ，  ＭＭＳ−４３５Ｐ，  １：５００）で染色した。可溶性ＤＲ６−Ｆｃは、作用を受けているニューロンの総数を増やした。さらに、大きく、複雑な作用を受けているニューロンの数は、可溶性ＤＲ６−Ｆｃで処理された際、増えた（図９Ａ〜Ｂ）。
【０４１２】
別の実験では、０、１、３、１０又は３０μｇ／ｍＬの可溶性ＤＲ６タンパク質を含有する培地で皮質ニューロンをインキュベートした。４８時間後、細胞溶解物を回収し、ウサギ抗切断カスパーゼ−３抗体（９１：１０００；  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて活性化されたカスパーゼ−３タンパク質のレベルを測定した。図１０Ａに示されるように、未感染細胞では、活性化カスパーゼ−３は検出できないが、完全長ＤＲ６レンチウイルスを感染させた細胞は、高いレベルの活性化カスパーゼ−３を示した。しかしながら、感染細胞が可溶性ＤＲ６を含有する培地でインキュベートされると、活性化カスパーゼ−３のレベルは低下した（図１０Ａ〜Ｂ）。細胞溶解物を抗ＧＦＰ及び抗β−アクチンによって探査し、それぞれ、感染の有効性、及び細胞溶解物の量と質を制御した。これらのデータは、ＤＲ６の発現の阻止がニューロンの生存と軸索の完全性を促進するという考えを支持している。
実施例９
アルツハイマー病の動物モデルにおける細胞死に対するＤＲ６−Ｆｃの効果
【０４１３】
アルツハイマー病のマウスモデル、たとえば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）  （Ｓｔｏｃｋ  ＃０４４６２）からのＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９マウス  （Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１３８６−１３９５  （２００６））を用いて生体内におけるＤＲ６−Ｆｃの効果を調べることができる。
【０４１４】
マウスを幾つかの処理群に分ける。最初の群を正常対照として用いる。各添加群をたとえば、頭蓋内注射又は全身性投与によってＤＲ６−Ｆｃで処理する。投与する量は、各処理群によって異なる。たとえば、群は、１日当たり、１、１０、２５、５０、７５、１００，２００、３００、４００又は５００μｇ／ｋｇ受け取ることができる。投与は１回の投与であることができ、又は特定の期間繰り返し生じることができる。投与は、アルツハイマー症状の発症前、症状の発症の遅延又は欠如が奏功する予防及び／又は治療を示すように生じることができる。或いは、投与は、症状の発症後（すなわち、７ヵ月齢にて）症状の低下又は欠如が奏功する治療を示すように始まることができる。
【０４１５】
たとえば、ウオーターマウスにおける処理マウスと未処理マウスを比較することによって生きたマウスで症候性に処理の有効性を評価することができる。また、屠殺したマウスの組織、たとえば、脳組織の分子分析、生化学分析及び組織学的分析によっても有効性を評価することができる。たとえば、脳の所定のサイズ及び領域におけるアポトーシス細胞、たとえば、皮質ニューロンの数を処理マウスと未処理マウスで比較することができる。たとえば、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ介在性のｄＵＴＰニック末端標識）アッセイ又は抗ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）染色を含む当該技術で既知の方法を用いてアポトーシス細胞の数を決定することができる。さらに、脳の所定のサイズ及び領域における生存している皮質ニューロンの総数を処理マウスと未処理マウスで比較することができる。
実施例１０
ＡＬＳの動物モデルにおける細胞死に対するＤＲ６−Ｆｃの影響
【０４１６】
たとえば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデルを用いて、たとえば、変異スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）を発現しているマウス、ラット、ハエ又は線虫を用いて生体内でのＤＲ６−Ｆｃの効果を調べることもできる。
【０４１７】
たとえば、非経口投与、皮下投与などのような投与方式によって、ＳＯＤ１（Ｇ３７Ｒ）を発現しているマウスをＤＲ６−Ｆｃで処理する。投与の量と時間は変えることができる。症状の発症の遅延又は欠如が奏功する予防及び／又は治療を示すようにＡＬＳ症状の発症前（すなわち、７〜９ヵ月齢）、投与を行うことができる。さらに、症状の低下又は増大の欠如が奏功する治療を示すように症状の発症後投与を始めることができる。
【０４１８】
たとえば、処理マウスと未処理マウスの筋肉強度又は寿命を比較することによって処理の有効性を症候性に評価することができる。有効性はまた、屠殺したマウスの組織、たとえば、運動ニューロンの切片の分子分析、生化学分析及び組織学的分析によっても評価することができる。たとえば、所定の位置、たとえば、脊髄に沿って、アポトーシス細胞、たとえば、運動ニューロンの数を処理マウスと未処理マウスで比較することができる。たとえば、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ介在性のｄＵＴＰニック末端標識）アッセイ又は抗ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）染色を含む当該技術で既知の方法を用いてアポトーシス細胞の数を決定することができる。さらに、脊髄の所定のサイズ及び領域における生存している運動ニューロンの総数を処理マウスと未処理マウスで比較することができる。
実施例１１
ＤＲ６ＲＮＡｉはニューロンの生存を促進する
【０４１９】
胎齢１８日のラットから新皮質ニューロンを取り出し、ラットニューロンヌクレオファクターキット（Ａｍａｘａ  Ｉｎｃ）を用いて２００ｎＭのＤＲ６ｓｉＲＮＡ又は混合対照ｓｉＲＮＡと共に３００万個の細胞で形質移入した。ＤＲ６ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから得られた４つのｓｉＲＮＡの混合物であった。４つのｓｉＲＮＡの配列は、ＡＧＡＡＡＣＧＧＣＵＣＣＵＵＵＡＵＵＡ（配列番号１６０）、ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＵＡＵＣＡＧＵＵ（配列番号１６１）、ＧＧＣＣＧＡＵＧＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＵ（配列番号１６２）、ＧＣＡＧＵＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＡ（配列番号１６３）であった。対照ｓｉＲＮＡの配列は、ＧＧＵＧＡＣＡＵＧＡＵＣＧＡＣＡＧＣＣＡＵ（配列番号１６４）であった。
【０４２０】
形質移入した細胞を９６穴プレートに入れ、６日間培養した。７日目に培養培地の半分（１００μＬ）を取り除き、異なった濃度のグルタミン酸塩、Ａβ４２又はＴＮＦαを含有する新鮮な神経基本培地１００μＬで置き換えた。各処理条件について３つ組培養を設定した。培養物を２４時間処理した。１００μＬの上清を各ウェルから取り出し、製造元の指示書に従って細胞傷害性キット（ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ）を用いてＬＤＨアッセイを実施した。図１１に示されるように、ＲＮＡｉを用いたＤＲ６のノックダウンは、新皮質ニューロンの生存を促進する。さらに、ＤＲ６の発現を低下させることは、Ａβ４２、グルタミン酸塩及びＴＮＦαが誘導するニューロンの細胞傷害性を減衰する。データはまた、ＲＮＡｉを用いたＤＲ６発現の阻止が、ニューロンの生存を促進し、ニューロンの死を妨げることを示唆している。
実施例１２
ｓｉＲＮＡによるＤＲ６シグナル伝達経路の遮断はオリゴデンドロサイトの分化を促進する
【０４２１】
オリゴデンドロサイトの生存、分化及び髄鞘形成に対するＤＲ６ＲＮＡｉによるＤＲ６拮抗作用の効果も評価した。これらの実験では、ＤＲ６ＲＮＡｉ又は対照ＲＮＡｉによってＡ２Ｂ５細胞に形質移入した。細胞を回収し、溶解物の半分をＲＴ−ＰＣＲに用い、１５％アガロースゲルによって解析した。細胞溶解物の残りをＭＢＰとＭＯＧのウエスタンブロットに用いた。図１２Ａ〜Ｂに示されるように、ＤＲ６ＲＮＡｉに暴露された細胞は２倍高いレベルのＭＢＰ＋細胞を示し、高いレベルのＭＢＰ及びＭＯＧのタンパク質がウエスタンブロット解析によって示された（図１２Ｂ）。ＧＦＰタンパク質の同時発現マーカーのウエスタンブロット検出によってレンチウイルスによる細胞の感染が確認された。これらのデータはさらに、内因性のＤＲ６がオリゴデンドロサイトの生存及び分化を負に調節するという考えを支持している。
実施例１３
ファージディスプレイに由来するＦａｂ抗体の生成
【０４２２】
組換えヒトＤＲ６の細胞外ドメインを用いて３．５×１０１０の独特のクローンを含有するヒトナイーブファージミドＦａｂライブラリ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  Ｍａｒ；２３（３）：３４４−８．）をスクリーニングした。ファージライブラリとのインキュベートに先立ってビオチン化ＡＰ−ＤＲ６タンパク質をストレプトアビジン被覆の磁気ビーズ上に捕捉した。以前記載されたように選抜を実施してＡＰ−ｐ７５での欠失によってＡＰ特異的な結合子を排除した（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  Ｍａｒ；２３（３）：３４４−８．）。３回のパンニングの後、４７９ｂｐの遺伝子ＩＩＩ株をＭｌｕＩ消化によって取り除き、ＴＧＩ細胞における可溶性Ｆａｂの発現についてベクターを再び連結した。２４９６個のクローンのＥＬＩＳＡ解析によって４９の固有の配列を含む２１２個の陽性クローンが得られた。固有のクローンを精製し、完全長のヒトＤＲ６で一過性に形質移入した２９３Ｅ細胞上での組換えヒトＤＲ細胞外ドメインへの結合をＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって単一濃度で再確認した。さらなる性状分析のためにこの解析から２４の固有のクローンを選択した。複数の濃度にて２４のＦａｂを調べ、ヒトＤＲ６−ＦｃにおけるＥＬＩＳＡによってＡＰ−ＤＲ６融合タンパク質に対するＤＲ６細胞外ドメインへの特異性を確認し、並びに、完全長ヒトＤＲ−６−２９３Ｅ細胞、完全長ラットＤＲ６−２９３Ｅ、及び未形質移入の２９３Ｅ細胞におけるＦＡＣＳによって種の交差反応性を調べた。特異性と交差反応性に基づいて１０のＦａｂを選択した。
実施例１４
マウス抗ヒトＤＲ６モノクローナル抗体可変ドメインのクローニング
【０４２３】
製造元の推奨するプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙミニキットを用いてマウスのハイブリドーマから細胞性の全ＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡのプライミングのためのランダムヘキサマーを用いて細胞性の全ＲＮＡから重鎖及び軽鎖の可変領域をＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。未処理のシグナル配列を持ったマウスの免疫グロブリン可変ドメインのＰＣＲ増幅のために、マウスの複数の免疫グロブリン遺伝子ファミリーのシグナル配列とハイブリッド形成する変性正方向プライマーと、マウスの定常ドメインの５’末端に特異的な単一逆方向プライマーを用いた。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、製造元の推奨するプロトコールに従ってＴＯＰＯクローニングキットを用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにサブクローニングした。複数の独立したサブクローンから挿入物を配列決定し、コンセンサス配列を確立した。演繹された成熟免疫グロブリンのＮ末端は、ハイブリドーマから精製された免疫グロブリンのエドマン分解によって決定されたものと一致した。特異的な亜群への割り振りは、カバットデータベースからのコンセンサス免疫グロブリン可変ドメイン配列を用いたＢＬＡＳＴ解析に基づく。カバットの定義を用いてＣＤＲを指定する。
【０４２４】
配列番号１０７として以下に示すのは、１Ｐ１Ｄ６．３成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲ（カバット定義）に下線を付す：
【化１】
2015127336.tif 000009
【０４２５】
これはマウスの亜群ＩＩ（Ａ）重鎖である。１Ｐ１Ｄ６．３重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４６６からの）のＤＮＡ配列は配列番号１０６として提供される。
【０４２６】
配列番号１１２として以下に示すのは、１Ｐ１Ｄ６．３成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線を付す：
【化２】
2015127336.tif 000010
【０４２７】
これはマウスの亜群Ｖκ軽鎖である。成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４６９からの）のＤＮＡ配列は配列番号１１１として提供される。
【０４２８】
配列番号１１７として以下に示すのは、１Ｐ２Ｆ２．１成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線を付す：
【化３】
2015127336.tif 000011
【０４２９】
これは、マウスの亜群ＩＩ（Ａ）重鎖である。ＣＤＲ２におけるＮ結合グリコシル化部位である可能性がある部位を上記二重下線として示したことに留意すること。１Ｐ２Ｆ２．１重鎖可変ドメインの（ＹＬ４６７からの）のＤＮＡ配列は配列番号１１６として提供される。
【０４３０】
１Ｐ１Ｄ６．３と１Ｐ２Ｆ２．１の重鎖は関連しており、タンパク質レベルで８９．４％の同一性を共有し、ＣＤＲ１とＣＤＲ３の配列が同一である。ＩｇＢＬＡＳＴ解析によってそれらは同一の組換え事象に由来したことが示唆されている。以下に示すのは、１Ｐ１Ｄ６．３（上）と１Ｐ２Ｆ２．１（下）の重鎖の整列である：
【化４】
2015127336.tif 000012
【０４３１】
配列番号１２２として以下に示すのは、１Ｐ２．Ｆ２．１成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線を付す：
【化５】
2015127336.tif 000013
【０４３２】
これはマウスの亜群Ｖκ軽鎖である。成熟軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４７０からの）ＤＮＡ配列は配列番号１２１として提供される。
【０４３３】
１Ｐ１Ｄ６．３と１Ｐ２Ｆ２．１の軽鎖は関連しており、タンパク質レベルで９２．５％の同一性を共有し、ＣＤＲ３の配列が同一である。ＩｇＢＬＡＳＴ解析によってそれらは同一の組換え事象に由来したことが示唆されている。以下に示すのは、１Ｐ１Ｄ６．３（上）と１Ｐ２Ｆ２．１（下）の軽鎖の整列である：
【表７】
2015127336.tif 000014
【０４３４】
配列番号１２７として以下に示すのは、１Ｐ５Ｄ１０．２成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線を付す：
【化６】
2015127336.tif 000015
【０４３５】
これはマウス亜群ＩＩＩ（Ｄ）重鎖である。１Ｐ５Ｄ１０．２重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４６８からの）のＤＮＡ配列は配列番号１２６として提供される。
【０４３６】
配列番号１３２として以下に示すのは、１Ｐ５Ｄ１０．２成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線を付す：
【化７】
2015127336.tif 000016
【０４３７】
これはマウス亜群ＶＩκ軽鎖である。１Ｐ５Ｄ１０．２軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ４７１からの）のＤＮＡ配列は配列番号１３１として提供される。
実施例１５
抗ＤＲ抗体はラット、マウス及びヒトのＤＲ６に結合する。
【０４３８】
ヒト、ラット又はマウスの完全長ＤＲ６をコードしたプラスミドＤＮＡ１０μｇで６００万個のＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入の３日後、２００μＬのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３（ＦＡＣＳ緩衝液）中のおよそ５０，０００個の細胞を解析した。細胞をペレットにし、ＦＡＣＳ緩衝液中での抗ＤＲ６抗体の連続希釈１５０μＬに再浮遊させた。時折撹拌しながら、試料を１時間氷上でインキュベートし、次いで３回洗浄した。ＰＥ−標識したヤギＦ（ａｂ）２抗ヒトＦａｂ（ＤｙａｘＦａｂについて）又は抗マウスＩｇＧ特異的な抗体（モノクローナル抗体について）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）によって結合したＤＲ６抗体を視覚化した。図１３に示されるように、結果は、５Ｄ１０及び１Ｅ６の抗体はそれぞれヒト、ラット及びマウスのＤＲ６に結合することを明らかにしている。５Ｄ１０及びＭ５３Ｅ０４を用いた結合アッセイの結果は図３０に示す。
実施例１６
抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断はオリゴデンドロサイトの分化を促進し、アポトーシスを阻害する
【０４３９】
オリゴデンドロサイトの生存におけるＤＲ６に機能の役割をさらに立証するために、抗ＤＲ６抗体を用いて、オリゴデンドロサイトの培養におけるＤＲ６の機能を遮断した。図１４Ａ〜Ｂに示されるように、抗ＤＲ６抗体による処理は、カスパーゼ３＋細胞を約３倍増やし（図１４Ａ）、ＭＢＰ＋細胞を１０倍増やした（図１４Ｂ）。これらの結果はウエスタンブロット分析（図１４Ｃ）によって確認され、そこでは、抗ＤＲ６抗体は、カスパーゼ３の産生を約３倍減らした。それに対して、ＭＢＰタンパク質の産生の１０倍の増大が、抗ＤＲ６抗体で処理した細胞培養で見られた（図１４Ｃ）。ＤＲ６抗体Ｍ５３Ｅ０４及び５Ｄ１０を用いたオリゴデンドロサイト−ＤＲＧ共培養アッセイの結果は図３１に示し、陽性対照としての抗ＬＩＮＧＯ−１抗体Ｌｉ８１を用いた結果と比較する。
実施例１７
抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断は共培養におけるオリゴデンドロサイト／ＤＲＧの髄鞘形成を促進する
【０４４０】
ＤＲ６の遮断が髄鞘形成を促進するという仮説を試験するために、ラットの一次オリゴデンドロサイトとＤＲＧニューロンの共培養を用いて髄鞘形成に対する抗ＤＲ６抗体の影響を確認した。そのような共培養は通常、抗ＤＲ６抗体の添加によって顕著に増強される髄鞘形成の低い基本レベルを示す。細胞当たり２の感染多重度（２ＭＯＩ）にてレンチウイルスを共培養物に感染させた。抗ＤＲ６抗体による１０日間の処理は、ＭＢＰ＋髄鞘を有する軸索の存在によって明らかなように強力な軸索の髄鞘形成を生じ、対照Ｉｇ処理した細胞培養よりも１０倍高かった。マウス抗ＭＢＰ抗体（ＳＭＩ９４及びＳＭＩ９９、１：４０００、Ｃｏｎｖａｎｃｅ）、マウス抗ＭＯＧ抗体（１：５００）及びウサギ抗βアクチン抗体（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）を用いたウエスタンブロット解析によって、抗ＤＲ６抗体は用量依存性に髄鞘形成を促進し、共培養に添加された抗ＤＲ６抗体の濃度が高ければ高いほど、高いレベルのＭＢＰ及びＭＯＧのタンパク質が産生されることが明らかにされている（図１５）。これらの検討は、ＤＲ６機能の遮断がオリゴデンドロサイトの生存、分化及び髄鞘形成を促進することを明らかにしている。
実施例１８
抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６の遮断はラットの脳細片培養にて再ミエリン化を促進する
【０４４１】
脳細片培養系は、脱ミエリン化の病理及び再ミエリン化のメカニズムの解析にとって強力な試験管内のモデルを提供する。生体活性脂質、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）によるＰ１７の脳細片の３日間の処理は、髄鞘形成についての黒金色の染色の非存在によって視覚化されるように急速でほぼ完全な脱ミエリン化を生じる（図１６Ａ）。ＬＰＣの除去後４日間、抗ＤＲ６抗体に暴露することによって、１５倍高い黒金色の染色を生じるが、対照抗体での処理は効果を有さなかった（図１６Ａ〜Ｂ）。我々は次に成熟ＬＰＣ誘導の脱ミエリン化モデルにて再ミエリン化が生体内で達成されうるかどうかを判定した。０日目に９週齢の若い成熟ラット（２５０グラム）の脊髄の脊柱にＬＰＣを注射し、３日後、抗ＤＲ６抗体を投与した。ＬＰＣ誘導の病変と再ミエリン化の程度は、次に黒金色の染色によって判定した。髄鞘を有する白色物は、黒金色染色の切片では暗赤色に見え、脱ミエリン化病変は淡赤色又は白色に見える。対照抗体で処理した動物（ｎ＝３）の切片は脱ミエリン化の広い領域を伴った大きな病変を示したが、ＬＰＣ注射の７日後の抗ＤＲ６処理群（ｎ＝３）では、大幅により小さな病変が見えた。抗ＤＲ６処理と対照の病変の黒金色染色のパターンは異なった。抗ＤＲ６処理の病変では、病変全体にわたってレース様の構造が存在し、再ミエリン化を示した。脳細片及び生体内でのリソレシチンの検討は双方共、抗ＤＲ６抗体によるＤＲ６機能の遮断が再ミエリン化を促進することを明らかにした。
実施例１９
抗ＤＲ６抗体はラットＥＡＥモデルにおける機能回復を促進する
【０４４２】
成熟９週齢のブラウンノルウェー系ラット（１５０ｇ）をイソフロウリンで麻酔し、次いで、尾の付け根に、１００μＬのＣＦＡ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．からの完全フロインドアジュバント）とＤＰＢＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，  ＬＣＣ）中ラットＭＯＧ（アミノ酸１〜１２５）のＮ末端配列に相当する１００μｇの組換えラットＭＯＧ１００μＬを含有する２００μＬのカクテル溶液を注射した。注射後１０〜１５日で動物はＥＡＥの兆候を発症した。ＭＯＧ注射の後、運動機能に基づく挙動試験によって各動物を評価した。脱ミエリン化の代用的臨床測定基準としてＥＡＥスコアを用いた。毎日ＥＡＥの臨床徴候についてラットをスコア化した。徴候は以下のようにスコア化した：等級０．５、尾の遠位不全麻痺；等級１、完全な尾の不全麻痺；等級１．５、尾の不全麻痺と後肢の軽い不全麻痺；等級２．０、片側の重度の後肢不全麻痺；等級２．５、両側の重度の後肢不全麻痺；等級３．０、完全な両側の後肢不全麻痺；等級３．５、完全な両側の後肢不全麻痺と一方の前肢の不全麻痺；等級４．０、完全な麻痺（四肢麻痺）、瀕死の状態又は死亡。１５日間の免疫の後、ラットを無作為に２群のうち一方に割り振った。ラットの一方の群（ｎ＝１０）には、アイソタイプ対照の抗体を注射し、別の群（ｎ＝１０）にはＤＲ６抗体を注射した。週に２回６ｍｇ／ｋｇにて合計５回の処理についてラットに注射した。ＥＡＥスコアを毎日測定し、対応のないｔ−検定（両側性）を用いて統計的有意性を評価した。図１７Ａに示されるように、ＤＲ６抗体で処理したラットにおけるＥＡＥスコアは対照動物に比べて有意に低かった。電気生理学的記録については、４０日間の免疫後、磁気皮質刺激（Ｍａｇｓｔｉｍ）によって運動電位（ＭＥＰ）を誘導し、腓腹筋（Ｃａｄｗｅｌｌ）から記録した。最初の発症は普通陰性であり、偏位は皮質ＭＥＰの潜在として理解された。図１７Ｂに示されるように、ＤＲ６処理ラットは、さらに速い神経伝導速度を示した。
実施例２０
抗ＤＲ６抗体で処理したＥＡＥラットではリンパ球数は影響を受けない
【０４４３】
ＥＡＥは、免疫成分と神経成分の双方が関与するので、脱ミエリン化の複合モデルである。４０日間のＭＯＧ免疫後、抗ＤＲ６抗体による処理がリンパ球に影響を及ぼすかどうかを判定するために、抗ＤＲ６抗体又は対照抗体で処理したＥＡＥラットの顔面静脈から末梢血を採取した。Ｈｅｍａｖｅｔを用いて全血の細胞数とサブセットの数を測定した。図１８に示されるように、全白血球におけるリンパ球数とリンパ球の比率は、対照抗体及び抗ＤＲ６抗体で処理した動物の間で有意な差異を示さなかった。
実施例２１
抗ＤＲ６抗体はＥＡＥラットにて脊髄へのＴ細胞の浸潤を阻害する
【０４４４】
抗ＤＲ６抗体がＴ細胞のＣＮＳへの浸潤に影響するかどうかを判定するために、ＭＯＧ免疫の６週後、ＥＡＥラットをＣＯ２で安楽死させ、次いで０．１Ｍリン酸緩衝液で潅流した。脊髄の腰椎領域を取り出し、４％のパラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、次いで０．１ＭのＰＢＳ中２５％のスクロースにてインキュベートした。１５μｍの縦横凍結切片（Ｌｅｃｉａミクロトーム）を切断し、抗ＣＤ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて標準の蛍光免疫組織化学法を実施した。Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡下で画像を撮影し、Ｏｐｅｎｌａｂを用いて解析した。図１９に示されるように、抗ＤＲ６抗体の全身性投与がＥＡＥラットの脊髄へのＴ細胞の浸潤を有意に低下させたということは、低下したＴ細胞の浸潤が抗ＤＲ６処理した動物におけるＥＡＥの徴候の重症度の低下（低いＥＡＥスコア）を少なくとも部分的に説明することを示唆している。
実施例２２
ＴＮＦαはＮＦκｂを介してニューロン死を促進する
【０４４５】
ＴＮＦは、ＮＦκＢ、カスパーゼ−３経路を活性化し、Ｉκｂタンパク質レベルを下方調節することによって腫瘍細胞でＤＲ６の発現を誘導し、アポトーシスを活性化させることが報告されている。ＴＮＦαが皮質ニューロンにてＤＲ６の発現を誘導するかどうかを判定するために、ニューロンをＴＮＦαによる２４時間の処理に暴露し、免疫組織化学染色を行った。結果はＤＲ６の発現が有意に増加することを明らかにした。ＴＮＦαはニューロン死を誘導し、ＤＲ６陽性細胞と上手く相関した（図２０Ａ〜Ｃ）。ウエスタンブロットによって検討は確認された（図２１Ａ）。ＴＮＦαによる処理は、２４時間処理の後、ＤＲ６発現で２倍の増大を誘導し、それは、ＮＦκＢの１０倍の増加及びＩκｂタンパク質の２倍の下方調節と相関した（図２１Ａ〜Ｄ）。ＤＲ６ＲＮＡｉ形質移入ニューロンはＤＲ６とＮＦκｂのレベルで２倍の低下を示した（図２２Ｂ及びＣ）。それに対して、ＤＲ６ＲＮＡｉ形質移入ニューロンはＩκｂタンパク質の発現で増加（２倍）を示した（図２２Ａ〜Ｄ）。（使用した対照及びＤＲ６ｓｉＲＮＡは実施例１１に記載されたものだった）。これらのデータはＤＲ６の上方調節がＮＦκｂの発現と相関し、Ｉκｂの発現と逆相関したことを示唆している。
実施例２３
ＤＲ６拮抗物質はＤＲＧ軸索のシュワン細胞髄鞘形成を促進する
【０４４６】
ＤＲ６拮抗物質がシュワン細胞に影響を及ぼすかどうかを判定するために、シュワン細胞とＤＲ６ニューロンの共培養に対する抗ＤＲ６抗体の効果を調べた。これらの実験では、Ｂ２７とＮＧＦを加えた神経基本培地と共に４穴スライドにＥ１６ラットのＤＲＧニューロン（５０，０００個／ウェル）を入れた。ＦＤＵＲで４〜６日間培養物を処理して分裂細胞を除いた。７日後、Ｂ２７とＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加えた神経基本培地でＤＲＧ細胞をさらに７〜１０日間処理した。次いで、Ｂ２７と１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを伴った神経基本培地中のＤＲＧニューロン（５０，０００個／ウェル）に精製したシュワン細胞を加えた。培地は毎週交換した。１０日後、共培養物を回収し、ＩＨＣ又はウエスタンブロットによってＭＢＰタンパク質についてアッセイした。ＩＨＣ染色とウエスタンブロット（図２３）は双方共、対照抗体で処理した培養物に比べて、抗ＤＲ６抗体で処理した培養物で高いレベルのＭＢＰタンパク質を示した。これらのデータはＤＲ６拮抗物質がニューロンのシュワン細胞の髄鞘形成を促進することを示している。
実施例２４
ＤＲ６はアポトーシス性皮質ニューロンで上方調節される
【０４４７】
新皮質ニューロンにおけるＤＲ６の発現を調べるために、先ず、Ｅ１８スプラーグ・ドーリー系（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）ラットからニューロンを分離した。手短には、Ｅ１８ラット胎児から大脳皮質を取り出し、細片して、３７℃にて１０分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてインキュベートした。２０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）と１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、細胞を粉砕して反応を止めた。細胞沈殿物を回収し、次いで、大きな断片が見えなくなるまでプラスチック製ピペットを穏やかに通して機械的にほぐした。１００μｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）によって事前に被覆した８穴スライドチャンバー（ＮＵＮＣ）に４×１０４個／ウェルにて細胞を入れた。５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にてＢ２７補完物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する神経基本培地で維持し、３〜４日毎に新鮮な培地に交換した。細胞を３週間培養し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳによって３０分間細胞を浸透させ、次いでブロッキング溶液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有するＰＢＳ）にて室温で３０分間インキュベートした。一次標識については、ウサギ抗ＤＲ６（１：２００、ｓｃ−１３１０６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びマウス抗ニューロンクラスＩＩＩβチューブリン（１：５００、ＭＭＳ−４３５Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ）を含有するブロッキング溶液にて細胞を４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで３回すすいだ後、Ａｌｅｘａ４８８抗ウサギＩｇＧ（１：５００）及びＡｌｅｘａ４８８抗マウスＩｇＧ（１：５００）二次抗体を含有する５％ＮＧＳ−ＰＢＳにて暗所において室温で１時間、細胞をインキュベートした。ＰＢＳＴによる３回の洗浄の後、ＤＡＰＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴ったフェード防止剤で細胞を標本化し、蛍光顕微鏡下で観察した。核の濃縮によって示されるアポトーシスは、培養での３週間後、新皮質ニューロンで見られた。ＤＲ６のレベルを、アポトーシスを受けた及び受けていないニューロンで比較した。ＤＲ６の発現レベルは、アポトーシスを受けていないニューロンに比べてアポトーシスを受けているニューロンで上方調節された。これらの結果は、ＤＲ６発現の増大が加齢ニューロンのアポトーシスに寄与し得ることを示唆している。
実施例２５
ＤＲ６拮抗物質は軸索の完全性を促進する
【０４４８】
新皮質ニューロンの軸索完全性に対するＤＲ６拮抗物質の効果を調べるために、実施例２４に記載されたように、Ｅ１８スプラーグ・ドーリー系（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）ラットからニューロンを分離し、５％ＣＯ２の湿った空気中、３７℃にてＢ２７補完物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する神経基本培地で培養した。培養の７日後、（５０μｇ／ｍＬ９の濃度のβ−アミロイド（凝集Ａβ−４２）及び１０μｇ／ｍＬの可溶性ＤＲ６−Ｆｃ又は１０μｇ／ｍＬの可溶性対照抗体のいずれかによって細胞を処理した。４８時間後、４％パラホルムアルデヒドでニューロンを固定し、実施例２４に記載されたようにマウス抗ニューロンクラスＩＩＩβチューブリン（１：５００、ＭＭＳ−４３５Ｐ、Ｃｏｖａｎｃｅ）で染色した。β−アミロイドによる処理は、未処理の対照に比べて、ニューロンの細胞死と軸索の分解を誘導した。しかしながら、可溶性ＤＲ６−Ｆｃの処理はβ−アミロイドが誘導した軸索の分解とニューロンの細胞死を有意に減衰した。可溶性ＤＲ６−Ｆｃの処理はまた、ニューロンの生存の増加と軸索のビーズ形成の低下をもたらした。これらの結果は、ＤＲ６拮抗物質が新皮質ニューロンに対するβ−アミロイドの負の効果を減らすことを示唆している。
実施例２６
ＤＲ６とＡＫＴの発現は逆相関する
【０４４９】
リン酸化されたＡＫＴ（ホスホ−ＡＫＴ）は周知の生存シグナルである。従って、ＤＲ６とホスホ−ＡＫＴの関係を新皮質ニューロンで調べた。これらの実験では、新皮質ニューロンを上述のように分離した。培養の３、７、１４及び２０日後、８０μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％もＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び１０％のグリセロール）にて新皮質ニューロンを４℃で３０分間溶解した。１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清をラムリ試料緩衝液で煮沸し、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ウサギ抗ホスホ−ＡＫＴ抗体（１：５００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ＡＫＴ抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ヤギ抗ＤＲ６抗体（１：１０００．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びウサギ抗β−アクチン抗体（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）によるウエスタンブロットで解析した。抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）及び抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて一次抗体を視覚化した。ＤＲ６の発現レベルは培養７日目で高く、培養２０日目で低かった（図２４）。それに対して、ホスホ−ＡＫＴのレベルは７日目では低く、２０日目で高かった（図２４）。ＤＲ６とホスホ−ＡＫＴのレベルの逆相関は、ＤＲ６がＡＫＴシグナル伝達経路を介して細胞死を誘導し得ることを示唆している。
実施例２７
ＤＲ６とｐ７５は複合体を形成する
【０４５０】
ｐ７５がＤＲ６と相互作用し得るかどうかを判定するために、（ｉ）ＤＲ６とｐ７５とＴｒｋＡ、（ｉｉ）ＤＲ６とＴｒｋＡ、（ｉｉｉ）ｐ７５とＴｒｋＡ、及び（ｉｖ）ＤＲ６とｐ７５を発現する組換え細胞株を作り出した。これらの実験では、ヒトＴｒｋＡは成熟ＴｒｋＡタンパク質（アミノ酸３４〜７９６）のＮ末端に融合したＦｌａｇタグと共に発現させた。ラットｐ７５は成熟ｐ７５タンパク質（アミノ酸３０〜４３１）のＮ末端に融合したＨｉｓタグとともに発現させ、ヒトＤＲ６は成熟ＤＲ６タンパク質（アミノ酸３２〜６５５）のＮ末端に融合したＭｙｃタグと共に発現させた。Ｍｙｃ抗体を用いて細胞溶解物からＤＲ６を免疫沈降させ、ＤＲ６とｐ７５のレベルを評価した。ウエスタンブロット（図２５Ａ）は、ＴｒｋＡの存在下又は非存在下でｐ７５がＤＲ６と共に同時免疫沈降したことを示している。
【０４５１】
さらに、ＤＲ６をコードするベクター又は陰性対照ベクター（ｐＶ９０）を含有する細胞をｐ７５への結合についてアッセイした。アルカリホスファターゼ／ｐ７５を細胞に添加し、細胞表面の結合を測定した。結果は図２５Ｂに示す。
【０４５２】
ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標）から得たヒト胎児脊髄から得られた試料を用いて同様の結果が得られた。免疫沈降実験はｐ７５がＤＲ６と同時免疫沈降することを明らかにした（図２５Ｃ）。
【０４５３】
これらのデータは細胞培養圧制にて及びヒト試料にての双方でＤＲ６とｐ７５が複合体を形成することを明らかにしている。
実施例２８
ＤＲ６とｐ７５の発現パターンは重なり合う
【０４５４】
ＤＲ６とｐ７５のｍＲＮＡの発現レベルは、Ａｌｌｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ
Ｂｒａｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって利用可能になっている公に利用可能なデータベースｍｏｕｓｅ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇから得られた。ＤＲ６とｐ７５は双方共、脳の種々の領域で高発現しており、発現レベルは良好に相関した（図２６）。これらの結果は、ＤＲ６とｐ７５が同時局在するので、生体内で一緒に相互作用し、機能することを示唆している。
実施例２９
ＤＲ６抗体はＤＲ６とｐ７５の相互作用を阻止することができる
【０４５５】
ＤＲ６抗体がＤＲ６とｐ７５の相互作用を阻止するかどうかを判定するために、２Ａ９抗ＤＲ６抗体又は５Ｄ１０抗ＤＲ６抗体を用いて細胞から組換えＤＲ６を免疫沈降した。ウエスタン解析は、双方の抗体がＤＲ６タンパク質を沈降できたが、ｐ７５は、２Ａ９抗体を用いた場合のみ、ＤＲ６と共に同時免疫沈降することを明らかにした（図２７Ａ）。従って、５Ｄ１０ＤＲ６抗体はＤＲ６とｐ７５との相互作用を妨害した。
【０４５６】
機能的アッセイによって、ＤＲ６とｐ７５との相互作用を妨害する５Ｄ１０の能力も確認した。このアッセイでは、対照ベクター又はｐ７５をコードするベクターを含有するＣＨＯ細胞をアルカリホスファターゼ−ＤＲ６と共にインキュベートし、結合についてアッセイした。ｐ７５を発現する細胞をＤＲ６とインキュベートした場合、高いレベルの表面結合が認められた。しかしながら、５Ｄ１０の添加は、ｐ７５を発現する細胞へのＤＲ６の結合を妨害した（図２７Ｂ）。これらの結果は、ＤＲ６抗体５Ｄ１０がｐ７５へのＤＲ６の結合を妨害し、細胞の生存を促進することができることを示している。
実施例３０
ＤＲ６のＴＮＦＲ−Ｃｙｓリピート３と４は、ＤＲ６−ｐ７５相互作用を妨害する抗体に結合する
【０４５７】
ＤＲ６−ｐ７５相互作用を妨害するＤＲ６抗体に結合するＤＲ６のドメインを特定するために、ＤＲ６欠失構築物を発現する細胞を作り出した。欠失構築物はＭｙｃのタグを付けた。調べた構築物には、配列番号２（＃１２３）のアミノ酸１６８−１８９；配列番号２（＃１２４）のアミノ酸１３４−１６８；配列番号２（＃１３４）のアミノ酸１０９−１３１；配列番号２（＃２３４）のアミノ酸４９−１０８；配列番号２（＃１２）のアミノ酸１３３−１８９；配列番号２（＃３４）のアミノ酸４９−１３１；及び配列番号２（＃２３）のアミノ酸４９−１０８と１６８−１８９の欠失が含まれた。
【０４５８】
ＦＡＣＳ解析を用いて欠失構築物のそれぞれが細胞で発現していることを明らかにした（図２８Ａ）。その後、組換え細胞から得られた試料を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＤＲ６抗体によって免疫沈降した。ウエスタンブロットによってｐ７５について免疫沈降物をアッセイし、その結果は、抗体５Ｄ１０がＤＲ６のＣｙｓ３とＣｙｓ４ドメイン（アミノ酸１３３〜１８９）に結合することを示した（図２８Ｂ）。抗体２Ａ９はＤＲ６のＣｙｓ１ドメイン（アミノ酸４９〜１３１）に結合する（図２８Ｂ）。ＤＲ６抗体のパネルのＤＲ６欠失構築物への結合もアッセイした（図２８Ｃ）。結果は、５Ｄ１０と４Ａ４はＤＲ６のＣｙｓ３とＣｙｓ４ドメインに結合し、２Ａ９，１Ｄ６及び２Ｆ２はＤＲ６のＣｙｓ１ドメインに結合することを明らかにした。
実施例３１
ＤＲ６のＴＮＦＲ−Ｃｙｓリピート３はｐ７５に結合する
【０４５９】
ｐ７５に結合するＤＲ６のドメインを特定するために、実施例３０に記載されたＤＲ６欠失構築物を発現する細胞をｐ７５への結合についてアッセイした。組換え細胞をｐ７５と共にインキュベートし、次いで抗Ｍｙｃ抗体を用いて細胞溶解物を免疫沈降させた。ウエスタンブロットによってｐ７５のレベルを評価し、結果は、ＤＲ６のＣｙｓ３とＣｙｓ４のドメイン（アミノ酸１３３〜１８９）の欠失がｐ７５と相互作用するＤＲ６の能力の低下を生じることを明らかにした。
【０４６０】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明として意図される特定の実施形態による範囲に限定されることはなく、機能的に同等である任意の組成物又は方法は本発明の範囲内である。実際、本明細書で示され、記載されるものに加えて本発明の種々の改変は、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０４６１】
本明細書で言及された出版物及び特許出願はすべて、各個々の出版物又は特許出願が参照によって具体的に且つ個々に組み入れられることが示されるかのように、同程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
【０４６２】
要旨及び要約の区分ではなく詳細な説明の区分は特許請求の範囲を解釈するのに使用されることが意図されることが十分に理解されるべきである。要旨及び要約の区分は本発明者（ら）によって熟考されたすべてではないが１以上の例となる実施形態を示すことができるので、本発明及び添付の特許請求の範囲を決して限定するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２６】
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【図３０】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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