(57)【要約】【課題】本発明は、工業用途を含む広範な用途における利用に耐え得るように、優れた耐熱性を有し、熱安定性が向上した変異型Ｇ６ＰＤＨを遺伝子工学的手法にて提供することを目的とする。【解決手段】イコノストック・メセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号３）において特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、優れた耐熱性を備えさせ、熱安定性を向上させ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、４１９番目、２２９番目、２３０番目、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、４１９番目、２２９番目、２３０番目、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチド、
(C)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、４１９番目、２２９番目、２３０番目、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチド。
【請求項２】
次の(1a)〜(14a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目が、メチオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(2a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目が、グルタミン酸に置換、
(3a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２３０番目が、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換、
(4a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目が、非極性アミノ酸又はセリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(5a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２７番目が、バリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(6a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８番目が、非電荷アミノ酸又はフェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(7a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目が、非極性アミノ酸又はセリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(8a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１９番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(9a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１２０番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(10a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目が、非電荷アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(11a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目が、ロイシン以外の非極性アミノ酸に置換、
(12a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７５番目が、非電荷アミノ酸又はフェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(13a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目が、非電荷アミノ酸又はアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、及び
(14a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目が、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換。
【請求項３】
次の(1a)〜(14a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１又は２に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目が、ロイシンに置換、
(2a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目が、グルタミン酸に置換、
(3a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２３０番目が、グルタミン酸に置換、
(4a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目が、アラニンに置換、
(5a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２７番目が、ロイシンに置換、
(6a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８番目が、チロシンに置換、
(7a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目が、アラニンに置換、
(8a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１９番目が、スレオニンに置換、
(9a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１２０番目が、プロリンに置換、
(10a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目が、アルギニンに置換、
(11a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目が、イソロイシンに置換、
(12a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７５番目が、チロシンに置換、
(13a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目が、グリシンに置換、及び
(14a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目が、トリプトファンに置換。
【請求項４】
次の(1b)〜(8b)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目が、他のアミノ酸に置換、
(2b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目、及び２３０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、及び２８番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目、１１９番目、及び１２０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目が、他のアミノ酸に置換、
(6b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目、及び１７５番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目が、他のアミノ酸に置換、及び
(8b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目が、他のアミノ酸に置換。
【請求項５】
次の(1b)〜(8b)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目がロイシンに置換、
(2b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目がグルタミン酸に置換、及び２３０番目がグルタミン酸に置換、
(3b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、及び２８番目がチロシンに置換、
(4b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、及び１２０番目がプロリンに置換、
(5b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目がアルギニンに置換、
(6b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目がイソロイシンに置換、及び１７５番目がチロシンに置換、
(7b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目がグリシンに置換、及び
(8b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目がトリプトファンに置換。
【請求項６】
次の(1c)〜(9c)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4c)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、２８８番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8c)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、及び
(9c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
【請求項７】
次の(1c)〜(9c)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(2c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(3c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２８８番目がグリシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(4c)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(5c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、及び４１９番目がロイシンに置換、
(6c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(7c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、２８８番目がグリシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(8c)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、及び
(9c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換。
【請求項８】
下記(A1)、(A2)、(B1)、(B2)、(C1)、又は(C2)に示されるポリペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
(A1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(B2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(C1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(C2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド。
【請求項９】
下記(A3)〜(A7)、(B3)〜(B7)、及び(C3)〜(C7)の中のいずれかに示されるポリペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
(A3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
【請求項１０】
下記(i)〜(xi)の中のいずれかに示されるポリペプチドである、請求項８又は９に記載のポリペプチド：
(i)  配列番号８６、８８、９０、９２、又は９４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)  配列番号８６における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(iii)  配列番号８８に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(iv)  配列番号９０に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(v)  配列番号９２に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(vi)  配列番号９４に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(vii)  配列番号８６における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号８６に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(viii)  配列番号８８に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号８８に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(iX)  配列番号９０に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号９０に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(x)  配列番号９２に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号９２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(xi)  配列番号９４に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号９４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
【請求項１２】
下記(i)又は(ii)に示すＤＮＡである、請求項１１に記載のＤＮＡ。
(i)  配列番号８５、８７、８９、９１、又は９３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
(ii)  グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号８５、８７、８９、９１、又は９３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１５】
宿主が大腸菌である、請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜請求項１０のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性を向上させた変異型グルコース−６−リン酸脱水素酵素に関する。また、本発明は、該酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、及び該形質転換体を用いる改変型Ｇ６ＰＤＨの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いた臨床検査薬は様々な体内分子の測定に利用されている。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９、以下「Ｇ６ＰＤＨ」と表記することもある）は、非特許文献１に心筋梗塞マーカーであるクレアチンキナーゼの定量（非特許文献１）や、糖尿病マーカーであるグルコースの定量（非特許文献２）に利用できることが知られている。
【０００３】
一方、生体内の触媒反応を模して、ブドウ糖等の特定の基質から電気を発生させる酵素燃料電池なる技術も開発され、従来用途に比べさらに高いレベルの触媒活性や安定性を要求される工業用途においても酵素が利用されつつある。例えば、非特許文献３には、Ｇ６ＰＤＨ等を電池の陰極に固定化し、ブドウ糖を燃料に０．３２２ｍＷｃｍ-2の出力が得られることが紹介されている。
【０００４】
上記に例示した用途において、従来、Ｇ６ＰＤＨとしては、ロイコノストック属細菌や酵母等の微生物から採取された酵素が主に用いられている。例えば、非特許文献４には、ロイコノストック属細菌のロイコノストック・メセンテロイデスのＧ６ＰＤＨ遺伝子配列、該遺伝子にコードされているアミノ酸配列が開示されている。また、特許文献１には、ロイコノストック属細菌のロイコノストック・メセンテロイドのＧ６ＰＤＨ遺伝子配列及び組換え大腸菌を用いた製造方法について開示されている。また、特許文献２には、ロイコノストック属細菌のロイコノストック・デキストラニクスのＧ６ＰＤＨ遺伝子配列及び組換え大腸菌を用いた製造方法について開示されている。
【０００５】
しかしながら、従来のＧ６ＰＤＨでは、安定性が不十分であり、診断薬用途として実用する上でその改良が望まれていた。そこで、これまでに、安定性が向上したＧ６ＰＤＨの探索が種々行われている。例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＧ６ＰＤＨ（特許文献３）、ラクトバチルス属由来のＧ６ＰＤＨ（特許文献４）、ペディオコッカス属由来のＧ６ＰＤＨ（特許文献５及び６）、及びアクイフェックス・エオリカス由来のＧ６ＰＤＨ（非特許文献５）は、優れた耐熱性や熱安定性を備えていることが報告されている。
【０００６】
更に、野生型のＧ６ＰＤＨに変異を導入することによって安定性を向上させることも検討されている。例えば、特許文献７には、ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、特定のアミノ酸置換を導入することにより、溶液状態における保存時の安定性を向上させ得ることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平５−５０３２２１号公報
【特許文献２】特公平５−８７２３４号公報
【特許文献３】特公昭６３−４３０７９号公報
【特許文献４】特公平３−９９５号公報
【特許文献５】特開平９−３１３１７４号公報
【特許文献６】特開平１０−２２５２９３号公報
【特許文献７】特開２００１−３７４８０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】臨床化学  第１９巻第２号  ｐ１８５−２０８
【非特許文献２】Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｌ．Ｂｏｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｎｎａ  Ｃ．  Ｍｅａｄ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ．ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５，１９７４，ｐ５８６−９０．
【非特許文献３】Ｚｈｕ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｅｐ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｕｅｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１，２０１２，ｐ１１０−５．
【非特許文献４】Ｗ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ．ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２６６，Ｎｏ．２０，１９９１，ｐ１３０２８−３４．
【非特許文献５】Ｒａｍｅｓｈ  Ｂ．Ｉｙｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｓｄＡ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ．Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，Ｖｏｌ．６，２００２，ｐ２８３−８９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述するように、Ｇ６ＰＤＨは、診断薬用途にとどまらず、酵素燃料電池のような工業用途への利用も模索されている。このような工業用途においては、耐熱性を向上させ、優れた熱安定性を備えさせることが望まれている。特許文献３〜７及び非特許文献５のように、従来、Ｇ６ＰＤＨの熱安定性の向上については、由来微生物の検討、変異の導入等の観点から検討されているものの、Ｇ６ＰＤＨの用途の多様化に伴って、熱安定性が向上したＧ６ＰＤＨの更なる開発が求められている。
【００１０】
そこで、本発明は、工業用途を含む広範な用途における利用に耐え得るように、優れた耐熱性を有し、熱安定性が向上した変異型Ｇ６ＰＤＨを遺伝子工学的手法にて提供することを目的とする。更に、本発明は、該変異型Ｇ６ＰＤＨの生産に必要な遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いる変異型Ｇ６ＰＤＨの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列において特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、優れた耐熱性を備えさせ、熱安定性を向上させ得ることを見出した。更に、ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列において特定の多重変異を導入することにより、基質特異性及び／又は触媒活性をも向上させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、４１９番目、２２９番目、２３０番目、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、４１９番目、２２９番目、２３０番目、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチド、
(C)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、４１９番目、２２９番目、２３０番目、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチド。
項２．  次の(1a)〜(14a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目が、メチオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(2a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目が、グルタミン酸に置換、
(3a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２３０番目が、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換、
(4a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目が、非極性アミノ酸又はセリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(5a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２７番目が、バリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(6a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８番目が、非電荷アミノ酸又はフェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(7a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目が、非極性アミノ酸又はセリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(8a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１９番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(9a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１２０番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(10a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目が、非電荷アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(11a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目が、ロイシン以外の非極性アミノ酸に置換、
(12a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７５番目が、非電荷アミノ酸又はフェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(13a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目が、非電荷アミノ酸又はアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、及び
(14a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目が、メチオニン以外の非極性アミノ酸に置換。
項３．  次の(1a)〜(14a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１又は２に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目が、ロイシンに置換、
(2a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目が、グルタミン酸に置換、
(3a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２３０番目が、グルタミン酸に置換、
(4a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目が、アラニンに置換、
(5a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２７番目が、ロイシンに置換、
(6a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８番目が、チロシンに置換、
(7a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目が、アラニンに置換、
(8a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１９番目が、スレオニンに置換、
(9a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１２０番目が、プロリンに置換、
(10a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目が、アルギニンに置換、
(11a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目が、イソロイシンに置換、
(12a)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７５番目が、チロシンに置換、
(13a)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目が、グリシンに置換、及び
(14a)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目が、トリプトファンに置換。
項４．  次の(1b)〜(8b)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目が、他のアミノ酸に置換、
(2b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目、及び２３０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、及び２８番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目、１１９番目、及び１２０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目が、他のアミノ酸に置換、
(6b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目、及び１７５番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目が、他のアミノ酸に置換、及び
(8b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目が、他のアミノ酸に置換。
項５．  次の(1b)〜(8b)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目がロイシンに置換、
(2b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２２９番目がグルタミン酸に置換、及び２３０番目がグルタミン酸に置換、
(3b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、及び２８番目がチロシンに置換、
(4b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、及び１２０番目がプロリンに置換、
(5b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目がアルギニンに置換、
(6b)配列番号３に示すアミノ酸配列における１７４番目がイソロイシンに置換、及び１７５番目がチロシンに置換、
(7b)配列番号３に示すアミノ酸配列における２８８番目がグリシンに置換、及び
(8b)配列番号３に示すアミノ酸配列における４６６番目がトリプトファンに置換。
項６．  次の(1c)〜(9c)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4c)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、２８８番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8c)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、及び
(9c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目、２７番目、２８番目、及び４６６番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
項７．  次の(1c)〜(9c)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(2c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(3c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２８８番目がグリシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(4c)配列番号３に示すアミノ酸配列における１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(5c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、及び４１９番目がロイシンに置換、
(6c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、１７４番目がイソロイシンに置換、１７５番目がチロシンに置換、２２９番目がグルタミン酸に置換、２３０番目がグルタミン酸に置換、２８８番目がグリシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(7c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、１１８番目がアラニンに置換、１１９番目がスレオニンに置換、１２０番目がプロリンに置換、１５９番目がアルギニンに置換、２８８番目がグリシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、
(8c)配列番号３に示すアミノ酸配列における４１９番目がロイシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換、及び
(9c)配列番号３に示すアミノ酸配列における２６番目がアラニンに置換、２７番目がロイシンに置換、２８番目がチロシンに置換、及び４６６番目がトリプトファンに置換。
項８．  下記(A1)、(A2)、(B1)、(B2)、(C1)、又は(C2)に示されるポリペプチドである、項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
(A1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、及び、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(B2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、及び、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(C1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(C2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド。
項９．  下記(A3)〜(A7)、(B3)〜(B7)、及び(C3)〜(C7)の中のいずれかに示されるポリペプチドである、項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
(A3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(A7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(B7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(C7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
項１０．  下記(i)〜(xi)の中のいずれかに示されるポリペプチドである、項８又は９に記載のポリペプチド：
(i)  配列番号８６、８８、９０、９２、又は９４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(ii)  配列番号８６における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(iii)  配列番号８８に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(iv)  配列番号９０に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(v)  配列番号９２に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(vi)  配列番号９４に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(vii)  配列番号８６における２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号８６に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(viii)  配列番号８８に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号８８に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(iX)  配列番号９０に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号９０に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド、
(x)  配列番号９２に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号９２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して、耐熱性及び基質特異性、又は耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド、
(xi)  配列番号９４に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸が変異されておらず、配列番号９４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
項１１．  項１〜項１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項１２．  下記(i)又は(ii)に示すＤＮＡである、項１１に記載のＤＮＡ。
(i)  配列番号８５、８７、８９、９１、又は９３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
(ii)  グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号８５、８７、８９、９１、又は９３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
項１３．  項１１又は１２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項１４．  項１３に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１５．  宿主が大腸菌である、項１４に記載の形質転換体。
項１６．  項１４又は１５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜項１０のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポリペプチドは、Ｇ６ＰＤＨ活性を備えつつ、耐熱性に優れており、熱安定性が向上しているので、診断薬や燃料電池等の幅広い分野で利用することができる。また、本発明のポリペプチドの一態様では、耐熱性のみならず、基質特異性及び／又は触媒活性も向上しており、極めて有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列のペアワイズアライメントの結果（Ｎ末端側）を示す。同じ塩基が整列された場合は、該塩基の真下に星印（＊）が並んでいる。該ペアワイズアライメントの結果は、図１と図２に分割して示しており、図１にはＮ末端側からのアライメント結果を示している。
【図２】配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列のペアワイズアライメントの結果（Ｃ末端側）を示す。同じ塩基が整列された場合は、該塩基の真下に星印（＊）が並んでいる。該ペアワイズアライメントの結果は、図１と図２に分割して示しており、図２にはＣ末端側からのアライメント結果を示している。
【図３】配列番号１の塩基配列がコードするアミノ酸配列と配列番号２の塩基配列がコードするアミノ酸配列のペアワイズアライメントの結果を示す。同じ塩基が整列された場合は、該塩基の真下に星印（＊）が並んでいる。
【図４】実施例７において精製酵素を電気泳動した結果を示す。左端の数値は、分子量（ｋＤａ）を示す。右端の矢印（←）は、単離された各Ｇ６ＰＤＨタンパク質のバンドを示している。
【図５】実施例７において熱処理なしの酵素活性を１００％としたときの各熱処理時間での残存活性を求め、横軸に熱処理時間、縦軸に残存活性（％）の対数をプロットしたグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１６】
本明細書における「Ｙ２４Ｉ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば「Ｙ２４Ｉ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から２４番目のアミノ酸Ｙを、アミノ酸Ｉに置換されていることを意味する。
【００１７】
本明細書における「Ｇ１４Ａ／Ｔ１５Ｓ」等の表現は、Ｇ１４Ａ及びＴ１５Ｓのアミノ酸置換を同時に導入している多重変異を意味する。
【００１８】
また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプチファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
【００１９】
本明細書において、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素を「野生型Ｇ６ＰＤＨ」と表記することもある。
【００２０】
また、本明細書において、Ｇ６ＰＤＨの活性１Ｕとは、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で、３．３３ｍＭのグルコース−６−リン酸水と３．３３ｍＭのＮＡＤＰ+の存在下で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＰＨを生成できる酵素量を示す。
【００２１】
１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨ、野生型Ｇ６ＰＤＨ）の変異体であって、Ｇ６ＰＤＨ活性を有し、野生型Ｇ６ＰＤＨよりも耐熱性が向上しているポリペプチドである。
【００２２】
Ｇ６ＰＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+ともいう）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+ともいう）を補酵素とするグルコース６リン酸脱水素酵素である。Ｇ６ＰＤＨは、補酵素に水素を添加する反応と共役してＤ−グルコース−６−リン酸の脱水素反応を触媒する酵素であり、ＥＣ１．１．４９に分類される酵素である。
【００２３】
本発明のポリペプチドの一態様として、下記(A)に示すポリペプチドが挙げられる。
(A)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２４】
前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列の２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目において置換するアミノ酸の種類については、特に制限されないが、好適な具体例として、下記の(1a)〜(14a)に示すアミノ酸置換の内、１つまたは複数が導入されているポリペプチドが挙げられる。
(1a)４１９番目（メチオニン）が、メチオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はプロリン、更に好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニン、特に好ましくはロイシンへの置換、
(2a)２２９番目（アスパラギン酸）が、グルタミン酸への置換。
(3a)２３０番目（スレオニン）が、アスパラギン酸又はグルタミン酸、好ましくはグルタミン酸への置換、
(4a)２６番目（セリン）が、非極性アミノ酸又はセリン以外の非電荷アミノ酸、好ましくはグリシン、バリン又はアラニン、更に好ましくはアラニンへの置換、
(5a)２７番目（バリン）が、バリン以外の非電荷アミノ酸、好ましくはアラニン、ロイシン又はイソロイシンへ、更に好ましくはロイシンへの置換、
(6a)２８番目（フェニルアラニン）が、非電荷アミノ酸又はフェニルアラニン以外の非極性アミノ酸、好ましくはチロシン、セリン又はトリプトファンへ、更に好ましくはチロシンへの置換、
(7a)１１８番目（セリン）が、非極性アミノ酸又はセリン以外の非電荷アミノ酸、好ましくはグリシン、バリン又はアラニン、更に好ましくはアラニンへの置換、
(8a)１１９番目（バリン）が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンへの置換、
(9a)１２０番目（アラニン）が、アラニン以外の非極性アミノ酸、好ましくはプロリンへの置換、
(10a)１５９番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸又は塩基性アミノ酸、好ましくはグルタミン、リジン又はアルギニンへ、更に好ましくはアルギニンへの置換、
(11a)１７４番目（ロイシン）が、ロイシン以外の非極性アミノ酸、好ましくはアラニン、バリン又はイソロイシン、更に好ましくはイソロイシンへの置換、
(12a)１７５番目（フェニルアラニン）が、非電荷アミノ酸又はフェニルアラニン以外の非極性アミノ酸、好ましくはチロシン、セリン又はトリプトファン、更に好ましくはチロシンへの置換、
(13a)２８８番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸又はアラニン以外の非極性アミノ酸、好ましくはグリシン又はバリン、更に好ましくはグリシンへの置換、及び
(14a)４６６番目（メチオニン）が、メチオニン以外の非極性アミノ酸、好ましくはトリプトファンへの置換。
【００２５】
前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列の２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目の中のアミノ酸残基の１つが置換された変異体であればよいが、これらのアミノ酸残基の２つ以上が置換された多重変異体であってもよい。前記(a)〜(c)のポリペプチドとして、耐熱性を効果的に向上させるという観点から、好ましくは下記の(1b)〜(8b)に示すアミノ酸置換を少なくとも１つ有するポリペプチドが挙げられる。
(1b)４１９番目（メチオニン）が、他のアミノ酸に置換、
(2b)２２９番目（アスパラギン酸）、及び２３０番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、及び２８番目（フェニルアラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)１１８番目（セリン）、１１９番目（バリン）、及び１２０番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)１５９番目（アラニン）が、他のアミノ酸に置換、
(6b)１７４番目（ロイシン）、及び１７５番目（フェニルアラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)２８８番目（アラニン）が、他のアミノ酸に置換、及び
(8b)４６６番目（メチオニン）が、他のアミノ酸に置換。
【００２６】
前記(1b)〜(8b)に示す各アミノ酸置換において、置換される他のアミノ酸の種類の具体例については、前記(1a)〜(14a)に示す通りである。
【００２７】
前記(1b)〜(8b)に示すアミノ酸置換の中でも、より優れた耐熱性を備えさせるという観点から、好ましくは(1b)、(2b)、(5b)、及び(7b)のアミノ酸置換、更に好ましくは(7b)のアミノ酸置換が挙げられる。
【００２８】
また、前記(A)のポリペプチドの中でも、格段に優れた耐熱性を有するポリペプチドの態様として、下記の(1c)〜(9c)に示すアミノ酸置換を少なくとも１つ有するポリペプチドが挙げられる。
(1c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、１１８番目（セリン）、１１９番目（バリン）、１２０番目（アラニン）、１５９番目（アラニン）、１７４番目（ロイシン）、１７５番目（フェニルアラニン）、２２９番目（アスパラギン酸）、２３０番目（スレオニン）、２８８番目（アラニン）、４１９番目（メチオニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、１５９番目（アラニン）、１７４番目（ロイシン）、１７５番目（フェニルアラニン）、２２９番目（アスパラギン酸）、２３０番目（スレオニン）、２８８番目（アラニン）、４１９番目（メチオニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、１１８番目（セリン）、１１９番目（バリン）、１２０番目（アラニン）、１５９番目（アラニン）、１７４番目（ロイシン）、１７５番目（フェニルアラニン）、２８８番目（アラニン）、４１９番目（メチオニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4c)１５９番目（アラニン）、１７４番目（ロイシン）、１７５番目（フェニルアラニン）、４１９番目（メチオニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、１１８番目（セリン）、１１９番目（バリン）、１２０番目（アラニン）、１５９番目（アラニン）、１７４番目（ロイシン）、１７５番目（フェニルアラニン）、２２９番目（アスパラギン酸）、２３０番目（スレオニン）、２８８番目（アラニン）、及び４１９番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、１１８番目（セリン）、１１９番目（バリン）、１２０番目（アラニン）、１５９番目（アラニン）、１７４番目（ロイシン）、１７５番目（フェニルアラニン）、２２９番目（アスパラギン酸）、２３０番目（スレオニン）、２８８番目（アラニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、１１８番目（セリン）、１１９番目（バリン）、１２０番目（アラニン）、１５９番目（アラニン）、２８８番目（アラニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8c)４１９番目（メチオニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、及び
(9c)２６番目（セリン）、２７番目（バリン）、２８番目（フェニルアラニン）、及び４６６番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
【００２９】
前記(1c)〜(9c)に示す各アミノ酸置換において、置換される他のアミノ酸の種類の具体例については、前記(1a)〜(14a)に示す通りである。
【００３０】
前記(1c)〜(9c)に示すアミノ酸置換の中でも、耐熱性を格段顕著に向上させるという観点から、好ましくは(1c)〜(8c)のアミノ酸置換、更に好ましくは(1c)〜(5c)のアミノ酸置換、より好ましくは(1c)、(2c)、(3c)、及び(5c)のアミノ酸置換、特に好ましくは(1c)、(3c)、及び(5c)のアミノ酸置換、最も好ましくは(1c)のアミノ酸置換が挙げられる。
【００３１】
また、前記(1c)〜(9c)に示すアミノ酸置換の中でも、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて比活性を向上させるという観点からは、好ましくは(2c)及び(4c)のアミノ酸置換が挙げられる。
【００３２】
更に、前記(1c)〜(9c)に示すアミノ酸置換の中でも、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて基質特異性を向上させるという観点からは、好ましくは前記(1c)〜(5c)のアミノ酸置換、更に好ましくは(1c)、(3c)及び(5c)のアミノ酸置換、特に好ましくは(1c)及び(3c)のアミノ酸置換が挙げられる。
【００３３】
前記(A)のポリペプチドの好適な具体例として、配列番号８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、及び１０２に示すアミノ酸配列、好ましくは配列番号８６、８８、９０、９２、及び９４に示すアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号８６に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号８８に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号９０に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号９２に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号９４に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌを導入したアミノ酸配列である。
配列番号９６に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号９８に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号１００に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
配列番号１０２に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、アミノ酸置換Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｍ４６６Ｗを導入したアミノ酸配列である。
【００３４】
また、本発明のポリペプチドの他の態様として、下記(B)及び(C)に示すポリペプチドが挙げられる。
(B)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチド。
(C)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチド。
【００３５】
以下、前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。
【００３６】
前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目の中の少なくとも１つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様は、前記(A)のポリペプチドの場合と同様である。
【００３７】
前記(B)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(B)のポリペプチドにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
【００３８】
また、前記(C)のポリペプチドにおける「配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
【００３９】
ここで、前記(C)のポリペプチドにおいて「配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」とは、配列番号３に示すアミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００４０】
また、前記(B)及び(C)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００４１】
なお、野生型Ｇ６ＰＤＨは、配列番号３のアミノ酸配列において、２４０番目のヒスチジン残基がＧ６ＰＤＨ活性に必要であることが知られている[Ｒｏｗｌａｎｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．１１，１９９４，ｐ１０７３−８７]。従って、前記(B)及び(C)のポリペプチドのアミノ酸配列において、２４０番目のヒスチジン残基は改変されずに保持されていることが好ましい。
【００４２】
前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、「配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上している」とは、下記条件にて加熱処理を行った場合に、Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率が、同条件で加熱処理を行った野生型Ｇ６ＰＤＨのＧ６ＰＤＨ活性の残存率よりも高いことを意味する。より具体的には、下記条件にて加熱処理を行った後のＧ６ＰＤＨ活性の残存率から、同条件で加熱処理を行った野生型Ｇ６ＰＤＨのＧ６ＰＤＨ活性の残存率を差し引いた値が１％以上、好ましくは３％以上、更に好ましくは５％以上であることを意味する。
【００４３】
〔加熱処理条件〕
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で４８℃に設定したウォーターバスで３０分間インキュベートすることにより加熱処理を行った後に、急冷する。
【００４４】
〔Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率の測定〕
本発明において、Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率（％）は、下記試薬を用いて、下記測定条件で吸光度変化を測定し、下記計算式に従って求められる値である。
【００４５】
（試薬）
５５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（３．３ｍＭ  塩化マグネシウム含有）  ｐＨ７．８
１００ｍＭ  ＮＡＤＰ+水溶液
１００ｍＭ  グルコース−６−リン酸水溶液
酵素活性測定試薬：上記トリス−塩酸緩衝液０．８１ｍＬ、ＮＡＤＰ+水溶液０．０３ｍＬ、グルコース−６−リン酸水溶液０．０３ｍＬを混合して酵素活性測定試薬とする。
酵素活性測定溶液：測定対象となるポリペプチドを所望の濃度に希釈するための溶液（以下、「酵素希釈液」ともいう）として、０．１％牛血清アルブミンを含有する５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を使用し、以下の活性値が０．１０〜０．２０Ｕ／ｍＬとなるように酵素の原液（以下、「酵素原液」ともいう）を希釈して酵素活性測定溶液とする。
【００４６】
（吸光度変化の測定条件）
酵素活性測定試薬０．８７ｍＬを分光光度計用セルに入れ、３０℃で５分間以上プレインキュベートする。酵素活性測定溶液０．０３ｍＬを添加してよく混合し、３０℃で予めインキュベートされた分光光度計で、３４０ｎｍの吸光度変化を６０秒間記録し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を測定する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに酵素希釈液を酵素活性測定試薬に混合して上記のように吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ／分）を測定する。
【００４７】
（Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率の算出）
先ず、上記で得られた吸光度変化（ΔＯＤ／分）の値から、下記の計算式に従ってＧ６ＰＤＨ活性値を求める。
【数１】
2015092872.tif 000002
なお、上記計算式の０．９０は酵素活性測定試薬と酵素活性測定溶液の液量（ｍＬ）、６．２２は本測定条件におけるＮＡＤＰ+の分子吸光係数（ｃｍ2／マイクロモル）、０．０３は酵素活性測定溶液の液量(ｍＬ)、１．０は酵素活性測定に使用する分光光度計用セルの光路長（ｃｍ）を示す。
次いで、上記で算出したＧ６ＰＤＨ活性値から、下記の計算式に従って、Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率（％）を求める。
【数２】
2015092872.tif 000003
【００４８】
前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、Ｇ６ＰＤＨ活性を有することを限度として、その比活性については、特に制限されないが、好ましくは２０Ｕ／ｍｇ−ポリペプチド以上、更に好ましくは４００Ｕ／ｍｇ−ポリペプチド以上が挙げられる。
【００４９】
ここで、Ｇ６ＰＤＨの比活性とは、Ｇ６ＰＤＨの活性をポリペプチド重量当たりの活性値で表現した値である。本発明において、Ｇ６ＰＤＨの比活性は下記試薬を用いて、下記測定条件で測定し、下記計算式に従って求められる値である。
〔Ｇ６ＰＤＨの比活性の測定〕
（試薬）
酵素活性測定試薬：前述する酵素活性測定試薬と同じ
酵素希釈液：前述する酵素希釈液と同じ
（測定条件）
必要に応じて酵素原液を酵素希釈液で希釈し、前述する吸光度変化の測定条件に従って１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を測定する。上記活性測定法により活性を求める。
（Ｇ６ＰＤＨの比活性の算出）
使用した酵素原液のポリペプチド濃度を、２８０ｎｍの吸光度において、１ＯＤ＝１ｍｇ／ｍＬとして計算する。また、上記で得られた吸光度変化（ΔＯＤ／分）の値から、前述する計算式に従ってＧ６ＰＤＨ活性値（Ｕ／ｍＬ）を求める。次いで、以下の計算式にしたがって、Ｇ６ＰＤの比活性を求める。
【数３】
2015092872.tif 000004
【００５０】
また、前述するように、前記(A)のポリペプチドの中でも、前記(2c)又は(4c)のアミノ酸置換を有するポリペプチドは、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて比活性が向上している。従って、前記(B)及び(C)のポリペプチドの中でも、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて比活性が向上しているポリペプチドとして、下記(B1)、(B2)、（C1）及び(C2)のポリペプチドが挙げられる。
(B1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド。
(B2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド。
(C1)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド。
(C2)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び比活性が向上しているポリペプチド。
【００５１】
前記(B1)、(B2)、（C1）及び(C2)のポリペプチドにおいて、「配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して比活性が向上している」とは、前述する条件にてＧ６ＰＤＨの比活性を測定し、野生型Ｇ６ＰＤＨの比活性を１００％として場合に、Ｇ６ＰＤＨの比活性が、１０１％以上、好ましくは１０２％以上、更に好ましくは１０５％以上であることを意味する。
【００５２】
また、前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、Ｇ６ＰＤＨ活性を有することを限度として、その基質特異性については、特に制限されないが、グルコース−６−リン酸以外の糖リン酸への反応性が低いものが好ましい。グルコース−６−リン酸以外の糖リン酸としては、具体的には、グルコース−１−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、６−ホスホグルコン酸、リボース−５−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１、６−二リン酸、マンノース−６−リン酸等が挙げられる。
【００５３】
また、前述するように、前記(A)のポリペプチドの中でも、前記(1c)〜(5c)のいずれかアミノ酸置換、好ましくは(1c)、(3c)又は(5c)のアミノ酸置換、更に好ましくは(1c)又は(3c)のアミノ酸置換を有するポリペプチドは、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて基質特異性が向上している。従って、前記(B)及び(C)のポリペプチドの中でも、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて基質特異性が向上しているポリペプチドとして、下記(B3)〜(B7)及び（C3）〜(C7)のポリペプチド、好ましくは(B3)、(B5)、(B7)、(C3)、(C5)、及び(C7)のポリペプチド、更に好ましくは(B3)、(B5)、(C3)、及び(C5)のポリペプチドが挙げられる。
(B3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(B4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(B5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(B6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(B7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(C3)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(C4)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(C5)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２８８番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(C6)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、１５９番目、１７４番目、１７５番目、４１９番目、及び４６６番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
(C7)  配列番号３に示すアミノ酸配列における、２６番目、２７番目、２８番目、１１８番目、１１９番目、１２０番目、１５９番目、１７４番目、１７５番目、２２９番目、２３０番目、２８８番目、及び４１９番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性及び基質特異性が向上しているポリペプチド。
【００５４】
前記(B3)〜(B7)及び（C3）〜(C7)のポリペプチドのポリペプチドにおいて、「配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して基質特異性が向上している」とは、グルコース−６−リン酸の代わりにフルクトース−６−リン酸を用いること以外は前述する条件にて比活性を測定し、野生型Ｇ６ＰＤＨの比活性を１００％として場合に、Ｇ６ＰＤＨの比活性が８０％以下、好ましくは７０％以下、更に好ましくは５０％以下、特に好ましくは２０％以下であることを意味する。
【００５５】
２．ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、野生型Ｇ６ＰＤＨをコードしているＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。
【００５６】
また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。その際、該ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を、使用する宿主のコドン利用頻度に最適化したＤＮＡを人工合成することもできる。
【００５７】
ここで、野生型Ｇ６ＰＤＨをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号１に示す塩基配列として知られており、ロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１２２９１株からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
【００５８】
また、野生型Ｇ６ＰＤＨをコードしている人工合成ＤＮＡとしては、例えば、配列番号２に示す塩基配列が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列（野生型Ｇ６ＰＤＨをコードしているＤＮＡ）において、コドン利用頻度を後述する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のコドン利用頻度に最適化した塩基配列である。
【００５９】
塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。
【００６０】
このようにして塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）又はＧＥＮＥＴＩＸ（ソフトウェア開発社製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のＧ６ＰＤＨ遺伝子のコード領域を特定することができる。
【００６１】
一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００６２】
更に、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。
【００６３】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、及び１０１に示す塩基配列が挙げられる。配列番号８５は、配列番号８６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号８７は、配列番号８８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号８９は、配列番号９０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号９１は、配列番号９２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号９３は、配列番号９４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号９５は、配列番号９６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号９７は、配列番号９８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号９９は、配列番号１００に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号１００は、配列番号１０２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。
【００６４】
また、本発明のＤＮＡには、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、又は１０１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
【００６５】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００６６】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
【００６７】
更に、本発明のＤＮＡは、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して耐熱性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、又は１０１に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。当該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。
【００６８】
ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００６９】
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
【００７０】
コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌のコドン利用頻度の一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
【００７１】
３．組換えベクター
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
【００７２】
本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【００７３】
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
【００７４】
ファージとしては、例えば、後述する大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１等が挙げられる。
【００７５】
プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びコスミドであるＳｕｐｅｒ  Ｃｏｓ  Ｉ等が挙げられる。
【００７６】
宿主としてシュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２、及びｐＣＮ５１等が挙げられる。更に、レトロウイルス及びワクシニアウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００７７】
４．形質転換体
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
【００７８】
形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母；ＣＯＳ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９等の昆虫細胞；アブラナ科等に属する植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根及び種子等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）、植物培養細胞等が挙げられる。これらの中でも大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＢＬ２１および大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲがより好ましい。
【００７９】
本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセル用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
【００８０】
本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
【００８１】
ＰＣＲ法よって本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製すればよい。
【００８２】
組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
【００８３】
更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００８４】
ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
【００８５】
その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
【００８６】
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００８７】
４．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
【００８８】
本発明の形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００８９】
培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。
【００９０】
窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。
【００９１】
炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
【００９２】
培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリぺプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、本発明のポリぺプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
【００９３】
培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主が変異型Ｇ６ＰＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
【００９４】
本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
【００９５】
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
【００９６】
上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
【００９７】
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
【００９８】
本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
【００９９】
前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
【実施例】
【０１００】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【０１０１】
実施例１：野生型Ｇ６ＰＤＨ遺伝子の取得
（１−１）野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡ塩基配列情報の取得
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下ＮＣＢＩとも示す、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の遺伝子配列データベースより、配列番号１に示すロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来Ｇ６ＰＤＨの塩基配列情報を入手した。なお、配列番号１の３’末端には終止コドン（ｔａａ）が含まれる。
【０１０２】
（１−２）野生型Ｇ６ＰＤＨの人工合成ＤＮＡの取得
配列番号１に示す塩基配列情報を材料に、人工遺伝子合成の受託サービス（オペロンバイオテクノロジー株式会社製）を利用して、配列番号２に示す人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡを入手した。
【０１０３】
具体的には、配列番号１に示す野生型Ｇ６ＰＤＨの塩基配列を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２株系のコドン利用頻度に最適化し、該ＤＮＡから合成されるＲＮＡの二次構造を回避し、該ＤＮＡの塩基配列中のＧＣ含量を最適化し、該ＤＮＡの塩基配列中の５’端に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）及び３’端の終止コドン下流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（ａａｇｃｔｔ）を含み、且つ該ＤＮＡのその他の塩基配列中にＮｃｏＩ認識配列及びＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含まないように設計し、配列番号２に示す人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを約２μｇ入手した。なお、配列番号２の３’末端には終止コドン（ｔａａ）が含まれる。
【０１０４】
図１及び図２に配列番号１及び２に示す塩基配列のＣｌｕｓｔａｌＷ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）による比較結果を示す。上述した設計思想により人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡ塩基配列は、もとのロイコノストック・メセントロイデス由来Ｇ６ＰＤＨの塩基配列に比べ２２．２％（１，４６１塩基中３２４塩基）異なる結果となった。配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列に比べコドン利用頻度を宿主の大腸菌に最適化し、ＲＮＡの二次構造を回避する等することにより、当該Ｇ６ＰＤＨの組換え大腸菌における発現量の増加が期待できる。
【０１０５】
一方、配列番号１及び２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列を、Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｆｉｎｄｅｒ（ＯＲＦ  Ｆｉｎｄｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｏｒｆ／）により調べた結果、いずれも配列番号３に示すアミノ酸配列をコードすることが示された。図３に配列番号１及び２に示される塩基配列がコードするアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌＷ２．０による比較結果を示す。図３が示す通り、それぞれのアミノ酸配列は互いに１００％完全に一致することから、該人工合成ＤＮＡにより、ロイコノストック・メセントロイデス由来野生型Ｇ６ＰＤＨが発現されることが示され、且つ該塩基配列を最適化させる等したことにより該野生型Ｇ６ＰＤＨの組換え大腸菌における発現量の増加が期待できる。
【０１０６】
実施例２：人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨの発現用組換えベクターの取得
（２−１）発現用組換えベクターの合成
発現ベクターにはｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を選択した。ｐＴｒｃ９９Ａは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）の上流にｔｒｃプロモーター配列、ＭＣＳの下流に転写終了シグナル配列を含有する。ＭＣＳ内には制限酵素ＮｃｏＩ認識配列（ｃｃａｔｇｇ）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（ａａｇｃｔｔ）が含まれ、ＮｃｏＩ認識配列はｔｒｃプロモーター配列に並列しているため、翻訳開始コドンのＡＴＧをもつＤＮＡ断片を結合させることにより、直接発現させることができる。
【０１０７】
ｐＴｒｃ９９Ａ及び実施例１に記載の人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡをそれぞれ１μｇずつとり、制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社製）により以下の条件で処理した。
【０１０８】
ＤＮＡを１μｇ、１０×Ｋバッファーを１０μＬ、ＮｃｏＩを３μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩを２μＬ、０．１％ＢＳＡを１０μＬ及び滅菌水で総量１００μＬとなるように混合して制限酵素処理液とし、それぞれ３７℃で２時間インキュベートした。
【０１０９】
次いで、制限酵素処理液に１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１２μＬ添加して混合し、分子量マーカー（５００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ：タカラバイオ株式会社製）とともに、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む１％アガロールゲル電気泳動に供してＤＮＡ断片をその分子量に従って分離した。電気泳動終了後のゲルを青色ＬＥＤトランスイルミネーター（オプトコード株式会社製）上に設置し、オレンジフィルタープレートを通して観察することにより二本鎖ＤＮＡ特異的な臭化エチジウムの蛍光を観察した。その結果、分離された約４，１００ｂｐのｐＴｒｃ９９Ａ断片、約１，５００ｂｐの人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡ断片が観察された。それぞれの断片をサージカルナイフ（フェザー安全剃刀株式会社製）で切り出し、プラスチックチューブに回収してそれぞれの重量を測定した。
【０１１０】
切り出したゲルから、Ｗｉｚａｒｄ（商標）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＶａｃ−Ｍａｎ（商標）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ（プロメガ株式会社製）を使用してそれぞれのＤＮＡ断片を抽出した。即ち、切り出したゲルに等量のＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、６０℃で１０分間インキュベートしてゲルを溶解させてシリカカラムにアプライし、吸引濾過により不要な溶媒を除去しつつＤＮＡ断片をシリカに吸着させた。０．７ｍＬと０．５ｍＬのＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回カラムを洗浄し、吸引濾過により除去した。次いで０．８ｍＬの８０％エタノール水溶液で２回カラムを洗浄し、吸引濾過により除去した。当該カラムをそれぞれプラスチックチューブにセットして１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心し、カラム内の余分なエタノールを完全に除去した。当該カラムをそれぞれ新しいプラスチックチューブにセットしてＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ水を２５μＬ添加し、１分間放置してシリカに吸収させた後、１５，０００ｒｐｍで１分間、遠心し、ＤＮＡ溶液を回収した。それぞれのＤＮＡ溶液を２μＬずつ、上記の方法により電気泳動し、ｐＴｒｃ９９Ａは約４，１００ｂｐ、人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨは約１，５００ｂｐの単一なバンドに精製されていることを確認した。
【０１１１】
精製したｐＴｒｃ９９Ａ断片の水溶液０．５μＬと人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡ断片の水溶液１．５μＬ及びＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を２μＬ混合し、１６℃で１時間インキュベートし、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの作用によりｐＴｒｃ９９Ａと人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡ断片のＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ突出末端同士を結合させた。
【０１１２】
（２−２）発現用組換えベクターの単離精製及び形質転換体の取得
１６℃で１時間インキュベートした上記反応溶液１μＬを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ株式会社製）１０μＬに添加して混合し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、４２℃で３０秒間インキュベートし、氷上で１分間インキュベートした後、ＳＯＣ培地を１００μＬ添加した。予めオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１．０％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製、０．５％酵母エキス：極東製薬工業株式会社製、１．０％塩化ナトリウム：ナカライテスク株式会社製、１．５％寒天：和光純薬工業株式会社製）に、上記のＳＯＣ培養液１１０μＬを添加して滅菌処理したガラス製コーンラージ棒で播種した。
【０１１３】
上記ＬＢ寒天培地を３７℃で２２時間培養することにより、組換え大腸菌の複数のコロニーを確認した。
【０１１４】
低い確率で制限酵素ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されずに残ったｐＴｒｃ９９Ａが混入している可能性が考えられたので、どのコロニーにＧ６ＰＤＨを結合したｐＴｒｃ９９Ａが含まれるか調べるために、該コロニーをコロニーＰＣＲに供した。
【０１１５】
即ち、表１に示す組成に調整したＰＣＲ反応溶液を調整して８連マイクロチューブに１０μＬずつ分注した。新しいＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）を準備し、上記の単一コロニーを白金針で回収してＬＢ寒天培地に植菌し、直後にＰＣＲ反応溶液を分注したチューブにも懸濁した。計８個の単一コロニーについてそれぞれ同じ操作を行った。ＬＢ寒天培地は３７℃で８時間インキュベートし、ＰＣＲ反応溶液はＰＣＲ反応｛９８℃（１０秒）、４６℃（３０秒）、６８℃（９０秒）を３０サイクル｝に供した。ＰＣＲ反応溶液にＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して電気泳動し、８コロニー中全てに約１，５００ｂｐのバンドが観察された。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
新しくＬＢ寒天培地に植菌した８クローンのうち１クローンを、予めオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地４ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間、振とう培養した。
【０１１８】
次いで、培養液を２ｍＬのプラスチックチューブに回収し、１５，０００ｒｐｍで１分間、遠心して培養上清を廃棄し、同じ操作を２回繰り返して組換え大腸菌体を回収し、該菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅTM  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用い、取扱説明書の手順に従って発現用組換えベクターを精製した。
【０１１９】
（２−３）発現用組換えベクターの塩基配列の確認
単離精製された発現用組換えベクターをシーケンシングの受託サービス（オペロンバイオテクノロジー株式会社）に供した。シーケンシングには、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター上流域に設定した配列番号６に示された塩基配列のオリゴヌクレオチド、人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨのＤＮＡ上に設定した配列番号７及び配列番号８に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ使用した。シーケンシングの結果、当該組換えベクターはｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ認識配列間に、配列番号２に示す人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨを結合した、設計の通りの構造であることが明らかになった。
【０１２０】
以下、上記の人工合成した野生型Ｇ６ＰＤＨを結合したｐＴｒｃ９９Ａを発現用組換えベクターｐＴｒｃＧ６ＰＤＨと記述する。また、以下、発現用組換えベクターｐＴｒｃＧ６ＰＤＨにより大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を、実施例４の野生型Ｇ６ＰＤＨの発現に使用した。
【０１２１】
実施例３：Ｇ６ＰＤＨ変異体の発現用組換えベクターの取得
（３−１）Ｇ６ＰＤＨ変異体の設計
耐熱性の変化したＧ６ＰＤＨ変異体を取得するために、表２に示す３８種類の変異体を設計した。
【０１２２】
即ち、配列番号３に示す野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列に対し、変異体１はＧ１４Ａ／Ｔ１５Ｓの変異、変異体２はＹ２４Ｉの変異、変異体３はＳ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙの変異、変異体４はＴ４５Ｆの変異、変異体５はＳ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐの変異、変異体６はＬ１４５Ｉ／Ｍ１４６Ｉ／Ｉ１４７Ｖ／Ｔ１５３Ｈ／Ｓ１５４Ｄ／Ｙ１５５Ｌの変異、変異体７はＤ１５６Ｅ／Ｔ１５７Ｓの変異、変異体８はＡ１５９Ｒの変異、変異体９はＬ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙの変異、変異体１０はＭ１８５Ｔの変異、変異体１１はＡ１９０Ｌの変異、変異体１２はＤ２００Ｅ／Ａ２０１Ｐ／Ａ２０２Ｌの変異、変異体１３はＤ２００Ｅの変異、変異体１４はＡ２０１Ｐの変異、変異体１５はＡ２０２Ｌの変異、変異体１６はＫ２０５Ｒ／Ｄ２０６Ｑの変異、変異体１７はＫ２０９Ｄ／Ｎ２１０Ｈの変異、変異体１８はＫ２０９Ｄの変異、変異体１９はＮ２１０Ｈの変異、変異体２０はＤ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅの変異、変異体２１はＬ２３４Ｒの変異、変異体２２はＩ２３８Ｖの変異、変異体２３はＴ２４２Ｍ／Ｍ２４３Ｌの変異、変異体２４はＫ２５３Ｐの変異、変異体２５はＡ２８８Ｇの変異、変異体２６はＥ３２９Ａの変異、変異体２７はＶ３３５Ｌの変異、変異体２８はＳ３７１Ｖの変異、変異体２９はＩ３７３Ｒ、変異体３０はＤ３７５Ｑの変異、変異体３１はＰ４１５Ａの変異、変異体３２はＭ４１９Ｌ／Ｉ４２０Ｌ／Ｈ４２１Ｌの変異、変異体３３はＭ４１９Ｌの変異、変異体３４はＩ４２０Ｌの変異、変異体３５はＨ４２１Ｌの変異、変異体３６はＳ４３８Ｅ／Ｉ４３９Ａの変異、変異体３７はＭ４６６Ｗの変異、変異体３８はＡ４７７Ｒ／Ｎ４７８Ｄの変異を導入することを決定した。
【０１２３】
本明細書におけるＹ２４Ｉ等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えばＹ２４Ｉとは、配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端のメチオニン（Ｍ）から数えて２４番目のチロシン（Ｙ）をイソロイシン（Ｉ）に置換することを意味する。また、本明細書におけるＧ１４Ａ／Ｔ１５Ｓ等の表現は、Ｇ１４Ａ及びＴ１５Ｓのアミノ酸置換を同時に導入していることを意味する。
【０１２４】
【表２】
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【０１２５】
（３−２）ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨへの部位特異的変異導入
上記の計３８種類のＧ６ＰＤＨ変異体の変異は、ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨのＧ６ＰＤＨ  ＤＮＡの塩基配列中に、それぞれ専用に設計した部位特異的変異導入用プライマーとＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用いた部位特異的変異導入法により導入した。該キットを用いた部位特異的変異導入は付属の取扱説明書に従って実施した。それに先立ち、部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドを受託合成サービス（オペロンバイオテクノロジー株式会社）により入手した。
【０１２６】
表２に、計３８種類のＧ６ＰＤＨ変異体の変異と部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドの組合せについて示す。
即ち、変異体１については配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２については配列番号１１及び配列番号１２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３については配列番号１３及び配列番号１４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体４については配列番号１５及び配列番号１６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体５については配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体６については配列番号１９及び配列番号２０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体７については配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体８については配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体９については配列番号２５及び配列番号２６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１０については配列番号２７及び配列番号２８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１１については配列番号２９及び配列番号３０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１２については配列番号３１及び配列番号３２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１３については配列番号３３及び配列番号３４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１４については配列番号３５及び配列番号３６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１５については配列番号３７及び配列番号３８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１６については配列番号３９及び配列番号４０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１７については配列番号４１及び配列番号４２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１８については配列番号４３及び配列番号４４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体１９については配列番号４５及び配列番号４６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２０については配列番号４７及び配列番号４８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２１については配列番号４９及び配列番号５０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２２については配列番号５１及び配列番号５２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２３については配列番号５３及び配列番号５４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２４については配列番号５５及び配列番号５６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２５については配列番号５７及び配列番号５８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２６については配列番号５９及び配列番号６０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２７については配列番号６１及び配列番号６２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２８については配列番号６３及び配列番号６４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体２９については配列番号６５及び配列番号６６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３０については配列番号６７及び配列番号６８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３１については配列番号６９及び配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３２については配列番号７１及び配列番号７２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３３については配列番号７３及び配列番号７４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３４については配列番号７５及び配列番号７６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３５については配列番号７７及び配列番号７８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３６については配列番号７９及び配列番号８０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３７については配列番号８１及び配列番号８２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異体３８については配列番号８３及び配列番号８４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
【０１２７】
上記の材料と方法で部位特異的変異導入操作を行なった３８種類の各反応溶液を１μＬずつとり、それぞれ大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル１０μＬに添加して混合し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで４２℃で３０秒間インキュベートし、氷上で１分間インキュベートした後、１００μＬのＳＯＣ培地をそれぞれ添加した。あらかじめオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に、上記のＳＯＣ培養液５０μＬをそれぞれ播種した。
【０１２８】
上記ＬＢ寒天培地をそれぞれ３７℃で２２時間培養することにより、組換え大腸菌の複数のコロニーを確認した。
【０１２９】
（３−３）部位特異的変異導入を施したｐＴｒｃＧ６ＰＤＨの単離精製
上述の３８種類の組換え大腸菌から単一なコロニーをそれぞれとり、予めオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地４ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間、振とう培養した。培養液から実施例２に記載の方法により３８種類の部位特異的変異導入を施した発現用組換えベクターをそれぞれ単離精製した。
【０１３０】
（３−４）部位特異的変異導入を施したｐＴｒｃＧ６ＰＤＨの塩基配列の確認
３８種類の部位特異的変異導入を施したｐＴｒｃＧ６ＰＤＨのシーケンシングを実施例２に記載の方法により実施した。シーケンシングには、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ使用した。
【０１３１】
シーケンシングの結果、配列番号２に示される塩基配列中に、表２に示す３８種類の変異のみがそれぞれ導入され、予期しない別の突然変異が導入されていないことを確認した。
【０１３２】
以下、表２に示す通り、変異１を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１と記述する。変異２を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２と記述する。変異３を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３と記述する。変異４を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４と記述する。変異５を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ５と記述する。変異６を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ６と記述する。変異７を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ７と記述する。変異８を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ８と記述する。変異９を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ９と記述する。変異１０を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１０と記述する。変異１１を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１１と記述する。変異１２を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１２と記述する。変異１３を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１３と記述する。変異１４を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１４と記述する。変異１５を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１５と記述する。変異１６を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１６と記述する。変異１７を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１７と記述する。変異１８を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１８と記述する。変異１９を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１９と記述する。変異２０を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２０と記述する。変異２１を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２１と記述する。変異２２を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２２と記述する。変異２３を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２３と記述する。変異２４を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２４と記述する。変異２５を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２５と記述する。変異２６を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２６と記述する。変異２７を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２７と記述する。変異２８を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２８と記述する。変異２９を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ２９と記述する。変異３０を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３０と記述する。変異３１を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３１と記述する。変異３２を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３２と記述する。変異３３を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３３と記述する。変異３４を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３４と記述する。変異３５を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３５と記述する。変異３６を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３６と記述する。変異３７を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３７と記述する。変異３８を導入した発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３８と記述する。
【０１３３】
以下、発現用組換えベクターｐＴｒｃＧ６ＰＤＨ１〜３８により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を、実施例４のＧ６ＰＤＨ変異体の発現に使用した。
【０１３４】
実施例４：野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ変異体の耐熱性の評価
（４−１）野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ変異体の発現解析
実施例２に記載のｐＴｒｃＧ６ＰＤＨ及び実施例３に記載のｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ１〜ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３８により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を培養することにより、野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ変異体を発現させた。
【０１３５】
即ち、それぞれの形質転換体の単一コロニーを２ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して３７℃で１６時間振とう培養し、該ＬＢ培養液０．２ｍＬをあらかじめオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業株式会社製）を含む５ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地（１．２％Ｔｒｙｐｔｏｎｅ：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製、２．４％酵母エキス：極東製薬工業株式会社製、０．４％グリセリン：ナカライテスク株式会社製、０．２３１％リン酸二水素カリウム：ナカライテスク株式会社製、１．２５４％リン酸水素二カリウム：ナカライテスク株式会社製）に植菌した。該培養液はそれぞれ３７℃で８時間培養した。
【０１３６】
培養後に培養液を１ｍＬずつ分取して１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心し、培養上清を除去して組換え大腸菌の菌体をそれぞれ得た。それぞれの菌体は、以下の活性測定使用時まで−３０℃のフリーザー内に保存した。
【０１３７】
凍結保存した菌体に１ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、超音波破砕機ＵＤ−２１Ｐ（株式会社トミー精工製）により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心し、上清を菌体破砕液として以下のＧ６ＰＤＨ変異体の耐熱性の評価に使用した。
【０１３８】
（４−２）Ｇ６ＰＤＨ変異体の耐熱性の評価
上述した方法、計算式に従って、野生型Ｇ６ＰＤＨ及び３８種類のＧ６ＰＤＨ変異体の酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を求めた。結果を表３の熱処理前活性の欄に示す。例えば変異体１２、変異体１４、変異体１７、変異体１９、変異体２１の結果のように、変異が導入されたことにより、野生型に比べて著しく活性が低下した変異体が見出された。
【０１３９】
一方で、変異体３、変異体８、変異体９、変異体１６、変異体２２、変異体２９、変異体３７の結果のように、変異が導入されたことにより、野生型に比べて活性が上昇した変異体が見出された。
【０１４０】
次いで、調整した菌体破砕液をそれぞれ０．５ｍＬずつ分取し、４８℃に設定したウォーターバスで３０分間熱処理後、氷上で急冷した。熱処理後の酵素活性を上述の方法に従ってもとめた。結果を表３の熱処理後活性の欄に示す。得られた熱処理前後の活性値から、熱処理後の残存活性を以下の式に従って計算した。結果を表３の残存活性の欄に示す。
【０１４１】
【数４】
2015092872.tif 000007
【０１４２】
【表３】
2015092872.tif 000008
【０１４３】
表３の結果より、変異体３、変異体５、変異体８、変異体９、変異体２０、変異体２５、変異体３２、変異体３３、変異体３７は、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて高い残存活性を示した。
【０１４４】
従って、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ（変異体５）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ（変異体２０）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）、Ｍ４１９Ｌ／Ｉ４２０Ｌ／Ｈ４２１Ｌ（変異体３２）、Ｍ４１９Ｌ（変異体３３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）は、それぞれＧ６ＰＤＨの耐熱化に寄与することが新たに見出された。以下、これらの変異をまとめて耐熱化変異ともいう。
【０１４５】
実施例５：耐熱化変異を複数導入したＧ６ＰＤＨ多重変異体の発現用組換えベクターの取得
（５−１）多重変異体の設計
実施例４において見出された耐熱化変異を組み合わせることにより、さらなる耐熱性の向上が期待される。
【０１４６】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ（変異体５）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ（変異体２０）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）、Ｍ４１９Ｌ（変異体３３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体３９とする。
【０１４７】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ（変異体２０）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）、Ｍ４１９Ｌ（変異体３３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４０とする。
【０１４８】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ（変異体５）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）、Ｍ４１９Ｌ（変異体３３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４１とする。
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ｍ４１９Ｌ（変異体３３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４２とする。
【０１４９】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ（変異体５）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ（変異体２０）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）及びＭ４１９Ｌ（変異体３３）を組合せた多重変異体を、変異体４３とする。
【０１５０】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ（変異体５）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ（変異体９）、Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ（変異体２０）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）、及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４４とする。
【０１５１】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ（変異体５）、Ａ１５９Ｒ（変異体８）、Ａ２８８Ｇ（変異体２５）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４５とする。
【０１５２】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｍ４１９Ｌ（変異体３３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４６とする。
【０１５３】
以下、野生型Ｇ６ＰＤＨにおける変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ（変異体３）及びＭ４６６Ｗ（変異体３７）を組合せた多重変異体を、変異体４７とする。
【０１５４】
（５−２）ＰＣＲによる部位特異的多重変異導入
上記の９種類のＧ６ＰＤＨ多重変異体（変異体３９〜変異体４７）の変異は、Ｇ６ＰＤＨ  ＤＮＡの塩基配列中に、実施例３で設計した部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応による部位特異的変異導入法により導入した。
【０１５５】
９種類のＧ６ＰＤＨ多重変異体の部位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドの組合せについて以下に示す。
【０１５６】
即ち、変異体３９については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号５８、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１５７】
変異体４０については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号５８、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１５８】
変異体４１については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１５９】
変異体４２については、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６０】
変異体４３については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号５８、配列番号７３及び配列番号７４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６１】
変異体４４については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号５８、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６２】
変異体４５については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、配列番号５７、配列番号５８、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６３】
変異体４６については、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６４】
変異体４７については、配列番号１３、配列番号１４、配列番号８１及び配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１６５】
変異体３９から変異体４７について、それぞれ表４に示す組成に調整したＰＣＲ反応溶液を調整した。
【０１６６】
【表４】
2015092872.tif 000009
【０１６７】
ＰＣＲ反応条件を｛９８℃（１０秒）、４８℃（３０秒）、６８℃（９０秒）を１５サイクル｝としてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動により５００ｂｐ〜２，０００ｂｐ程度の濃いスメアバンドが観察された。
【０１６８】
前記ＰＣＲ反応溶液を用いて、それぞれ表５に示す組成に調整したＰＣＲ反応溶液を調製した。
【０１６９】
【表５】
2015092872.tif 000010
【０１７０】
ＰＣＲ反応条件を｛９８℃（１０秒）、４８℃（３０秒）、６８℃（９０秒）を１２サイクル｝としてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動により約１，５００ｂｐ程度のバンドが観察された。該ＰＣＲ反応溶液をそれぞれエタノール沈殿に供し、合成されたＤＮＡを精製した。
【０１７１】
（５−３）Ｇ６ＰＤＨ多重変異体の発現用組換えベクターの合成
実施例２に記載した方法と同様に、Ｇ６ＰＤＨ多重変異体ＤＮＡをそれぞれ制限酵素ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、予め該制限酵素により切断したｐＴｒｃ９９ＡへＴ４リガーゼにより結合させた。
【０１７２】
（５−４）Ｇ６ＰＤＨ多重変異体の発現用組換えベクターの単離精製及び形質転換体の取得
実施例２に記載した方法と同様に、上記リガーゼ反応溶液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、コロニーＰＣＲによりインサートチェックを行って陽性クローンを取得し、液体培養した該組換え大腸菌のクローンから発現用組換えベクターをそれぞれ精製した。
【０１７３】
（５−５）Ｇ６ＰＤＨ多重変異体の塩基配列の確認
９種類のＧ６ＰＤＨ多重変異体のシーケンシングを実施例２に記載の方法により実施した。シーケンシングには、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ使用した。
【０１７４】
シーケンシングの結果、配列番号２に示される塩基配列中に、所望の変異のみがそれぞれ導入され、予期しない別の突然変異が導入されていないことを確認した。
【０１７５】
配列番号８５に、変異体３９の塩基配列を示す。配列番号８７に、変異体４０の塩基配列を示す。配列番号８９に、変異体４１の塩基配列を示す。配列番号９１に、変異体４２の塩基配列を示す。配列番号９３に、変異体４３の塩基配列を示す。配列番号９５に、変異体４４の塩基配列を示す。配列番号９７に、変異体４５の塩基配列を示す。配列番号９９に、変異体４６の塩基配列を示す。配列番号１０１に、変異体４７の塩基配列を示す。
【０１７６】
また、配列番号８５に示す塩基配列がコードする変異体３９のアミノ酸配列を配列番号８６に示す。配列番号８７に示す塩基配列がコードする変異体４０のアミノ酸配列を配列番号８８に示す。配列番号８９に示す塩基配列がコードする変異体４１のアミノ酸配列を配列番号９０に示す。配列番号９１に示す塩基配列がコードする変異体４２のアミノ酸配列を配列番号９２に示す。配列番号９３に示す塩基配列がコードする変異体４３のアミノ酸配列を配列番号９４に示す。配列番号９５に示す塩基配列がコードする変異体４４のアミノ酸配列を配列番号９６に示す。配列番号９７に示す塩基配列がコードする変異体４５のアミノ酸配列を配列番号９８に示す。配列番号９９に示す塩基配列がコードする変異体４６のアミノ酸配列を配列番号１００に示す。配列番号１０１に示す塩基配列がコードする変異体４７のアミノ酸配列を配列番号１０２に示す。
【０１７７】
以下、変異体３９の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３９と記述する。変異体４０の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４０と記述する。変異体４１の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４１と記述する。変異体４２の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４２と記述する。変異体４３の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４３と記述する。変異体４４の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４４と記述する。変異体４５の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４５と記述する。変異体４６の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４６と記述する。変異体４７の発現用組換えベクターの名称をｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４７と記述する。
【０１７８】
発現用組換えベクターｐＴｒｃＧ６ＰＤＨ３９〜４７により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を、実施例６のＧ６ＰＤＨ多重変異体の耐熱性評価に使用した。
【０１７９】
実施例６：野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の耐熱性の評価
（６−１）野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の発現解析
実施例２に記載のｐＴｒｃＧ６ＰＤＨ及び実施例５に記載のｐＴｒｃＧ６ＰＤＨ３９〜ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４７により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を培養することにより、野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ変異体を発現させた。
【０１８０】
形質転換体の取得及び液体培養による発現解析は、実施例４に記載した方法と同様に実施した。
【０１８１】
得られた形質転換体の培養液をそれぞれ１ｍＬずつ分取して１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心し、培養上清を除去して組換え大腸菌の菌体をそれぞれ得た。それぞれの菌体は以下の活性測定使用時まで−３０℃のフリーザー内に保存した。
【０１８２】
凍結保存した菌体に１ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、超音波破砕により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心し、上清を菌体破砕液として以下のＧ６ＰＤＨ多重変異体の耐熱性の評価に使用した。
【０１８３】
多重変異体の耐熱性と単独で変異を導入した変異体の耐熱性を比較する目的で、変異体３３についても同様に実験した。
【０１８４】
（６−２）Ｇ６ＰＤＨ多重変異体の耐熱性の評価
実施例４に記載の方法に従って、野生型Ｇ６ＰＤＨ、変異体３３及び９種類のＧ６ＰＤＨ多重変異体の熱処理後の残存活性を求めた。熱処理は、４７℃、５２℃、５５℃においてそれぞれ実施した。結果を表６に示す。
【０１８５】
【表６】
2015092872.tif 000011
【０１８６】
表６の結果より、Ｇ６ＰＤＨ多重変異体３９〜変異体４７は、４７℃の熱処理において野生型Ｇ６ＰＤＨに比べ高い耐熱性を有していることが明らかになった。
【０１８７】
変異体４４〜変異体４７は変異体３３に比べて耐熱性が低いことが明らかになった。変異体４４〜変異体４７は変異体３３を構成する「Ｍ４１９Ｌ」を含んでいない。従って、変異Ｍ４１９Ｌが野生型Ｇ６ＰＤＨの耐熱化に大きく寄与することが示された。
一方で、特に変異体３９、変異体４０、変異体４１、変異体４２、変異体４３は５２℃、５５℃の熱処理において野生型Ｇ６ＰＤＨ、変異体３３及び他の多重変異体に比べ高い残存活性を示した。これらの変異体は上記変異「Ｍ４１９Ｌ」を含むが、他の耐熱化変異と同時に導入されたかという点で変異体３３と異なる。
【０１８８】
従って、配列番号３に示される野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗ（変異体３９）の組合せ、変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗ（変異体４０）の組合せ、変異Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗ（変異体４１）の組合せ、変異Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｍ４１９Ｌ／Ｍ４６６Ｗ（変異体４２）の組合せ、Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ／Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ／Ａ１５９Ｒ／Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ／Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ／Ａ２８８Ｇ／Ｍ４１９Ｌ（変異体４３）の組合せは、それぞれを単独に導入した変異体に比べ、特段に耐熱性が優れることが明らかとなった。
【０１８９】
上記多重変異による更なる耐熱化への寄与は、本実施例の変異３９〜変異４３に限定されるものではなく、Ｓ２６Ａ／Ｖ２７Ｌ／Ｆ２８Ｙ、Ｓ１１８Ａ／Ｖ１１９Ｔ／Ａ１２０Ｐ、Ａ１５９Ｒ、Ｌ１７４Ｉ／Ｆ１７５Ｙ、Ｄ２２９Ｅ／Ｔ２３０Ｅ、Ａ２８８Ｇ、Ｍ４１９Ｌ及びＭ４６６Ｗの組合せにおいて、変異３９〜変異４３と同等の耐熱性を有する変異体が得られることは容易に推測できる。
【０１９０】
変異体３９〜変異体４３の耐熱性・比活性などの諸性質を野生型Ｇ６ＰＤＨと比較するため、実施例７に記載する大量発現と酵素精製を実施した。
【０１９１】
実施例７：野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の調整
（７−１）野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の大量発現
実施例２に記載のｐＴｒｃＧ６ＰＤＨ及び実施例５に記載のｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ３９〜ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨＭ４３により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を培養することにより、野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体を大量発現させた。
【０１９２】
即ち、それぞれの形質転換体の単一コロニーを２ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して３７℃で１６時間振とう培養し、該ＬＢ培養液をあらかじめオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業株式会社製）を含む５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地へ植菌した。該培養液はそれぞれ３７℃で１６時間培養した。
【０１９３】
上記で得られた培養液を１５，０００×ｇで２０分間、遠心し、培養上清を除去して組換え大腸菌の菌体をそれぞれ得た。それぞれの菌体は以下の精製時まで−３０℃のフリーザー内に保存した。
【０１９４】
（７−２）野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の精製
該菌体に４０ｍＬの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）を添加して菌体を懸濁し、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を１５，０００×ｇで３０分間、遠心して破砕液上清を得た。
【０１９５】
破砕液上清に含まれるタンパク質を、あらかじめ２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐTMＱ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に吸着させ、０．０Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配によりＧ６ＰＤＨ活性画分を溶出させた。
得られたＧ６ＰＤＨ活性画分に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、１５，０００×ｇで３０分間、遠心した。上清にＧ６ＰＤＨ活性画分が含まれることを確認して該上清を回収した。
【０１９６】
上記で得られた上清中のタンパク質を、６０％飽和硫安とした２０ｍＭ  リン酸緩衝液(ｐＨ６．４)であらかじめ平衡化した６ｍＬのＲＥＳＯＵＲＣＥTM  １５ＰＨＥカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に吸着させ、６０％から０％の硫酸アンモニウムの濃度勾配によりＧ６ＰＤＨ活性画分を溶出させた。
【０１９７】
上記Ｇ６ＰＤＨ活性画分を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（商標）−３０Ｋ（メルク株式会社製）を用いて濃縮した。以下、透析・濃縮されたＧ６ＰＤＨ活性画分を精製酵素とした。
【０１９８】
（７−３）精製酵素の純度の確認
精製された野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の純度を確認するため、それぞれの精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。同時に泳動した分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＰｒｏｔｅｉｎTM  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ製）を使用した。図４に電気泳動結果を示す。
【０１９９】
いずれの精製酵素も夾雑タンパク質は全く観察されず、比活性等を測定するのに十分な純度を有していることが確認された。かくして得られたＧ６ＰＤＨ多重変異体３９〜４３及び野生型Ｇ６ＰＤＨを以下に使用した。
【０２００】
実施例８：野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の精製酵素を用いた各種性能評価
（８−１）比活性及びミカエリス・メンテン定数の測定
発明を実施するための形態〔Ｇ６ＰＤＨの比活性の測定〕に記載した方法に従って、野生型Ｇ６ＰＤＨ、変異体３９、変異体４０、変異体４１、変異体４２、変異体４３の比活性を求めた。結果を表７の比活性の欄に示す。
【０２０１】
基質グルコース−６−リン酸へのミカエリス・メンテン定数の測定は、以下の方法に従って実施した。
【０２０２】
（試薬）
・５５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（３．３ｍＭ  塩化マグネシウム含有）  ｐＨ７．８
・１００ｍＭ  ＮＡＤＰ+水溶液
・１５０ｍＭから０．１ｍＭに調整したグルコース−６−リン酸水溶液（グルコース−６−リン酸水溶液は、それぞれ１５０ｍＭ、１２５ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ、３．１３ｍＭ、１．５６ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭにあらかじめ調整した。）
・酵素活性測定試薬：上記トリス−塩酸緩衝液を０．８１ｍＬ、ＮＡＤＰ+水溶液を０．０３ｍＬ、任意の濃度のグルコース−６−リン酸水溶液を０．０３ｍＬ、を混合して調整した。
酵素活性測定試薬と酵素活性測定溶液の混合液中のグルコース−６−リン酸終濃度は、それぞれ５．０００ｍＭ、４．１６７ｍＭ、３．３３３ｍＭ、２．５００ｍＭ、１．６６７ｍＭ、０．８３３ｍＭ、０．４１７ｍＭ、０．２０８ｍＭ、０．１０４ｍＭ、０．０５２ｍＭ、０．０２６ｍＭ、０．０１３ｍＭ、０．００７ｍＭ、０．００３ｍＭである。
【０２０３】
（測定条件）
酵素活性測定試薬０．８７ｍＬを分光光度計用セルに入れ、３０℃で５分間以上プレインキュベートした。希釈して濃度を揃えた酵素活性測定溶液０．０３ｍＬを添加してよく混合し、３０℃で予めインキュベートされた分光光度計で、３４０ｎｍの吸光度変化を６０秒間記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を測定した。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに酵素希釈液を酵素活性測定試薬に混合して上記のように吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ／分）を測定した。
【０２０４】
各グルコース−６−リン酸濃度における（ΔＯＤ／分）の値は２回ずつ測定した。ブランク測定は、各グルコース−６−リン酸濃度に調整した酵素活性測定試薬毎に実施した。
【０２０５】
また、補酵素ＮＡＤＰ+へのミカエリス・メンテン定数の測定は、以下の方法に従って実施した。
【０２０６】
（試薬）
・５５ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（３．３ｍＭ  塩化マグネシウム含有）  ｐＨ７．８
・１５０ｍＭから０．１ｍＭに調整したＮＡＤＰ+水溶液（ＮＡＤＰ+水溶液は、それぞれ１５０ｍＭ、１２５ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ、３．１３ｍＭ、１．５６ｍＭ、０．７８ｍＭ、０．３９ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭにあらかじめ調整した。）
・１５０ｍＭ  グルコース−６−リン酸水溶液
・酵素活性測定試薬：上記トリス−塩酸緩衝液を０．８１ｍＬ、任意の濃度のＮＡＤＰ+水溶液を０．０３ｍＬ、グルコース−６−リン酸水溶液を０．０３ｍＬ、を混合して調整した。
酵素活性測定試薬と酵素活性測定溶液の混合液中のＮＡＤＰ+終濃度は、それぞれ５．０００ｍＭ、４．１６７ｍＭ、３．３３３ｍＭ、２．５００ｍＭ、１．６６７ｍＭ、０．８３３ｍＭ、０．４１７ｍＭ、０．２０８ｍＭ、０．１０４ｍＭ、０．０５２ｍＭ、０．０２６ｍＭ、０．０１３ｍＭ、０．００７ｍＭ、０．００３ｍＭである。
【０２０７】
（測定条件）
基質グルコース−６−リン酸へのミカエリス・メンテン定数の測定と同様に実施した。
【０２０８】
（ミカエリス・メンテン定数の算出方法）
ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア及びそのＥｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（株式会社ヒューリンクス）を用いてミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ値）を算出した。計算モードは以下の通りに設定した。
Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：１
Ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｔｕｄｙ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ：２
Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｆｉｔ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｌ
Ｅｑｕａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ
Ｅｑｕａｔｉｏｎ  Ｃｏｄｅ：Ｖｍａｘ＊Ｓ／（Ｋｍ＋Ｓ）
【０２０９】
以上の方法により、野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の、基質グルコース−６−リン酸へのミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ  ｆｏｒ  Ｇ６Ｐ）及び補酵素ＮＡＤＰ+へのミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ  ｆｏｒ  ＮＡＤＰ+）を算出した。結果を表７のＫｍ  ｆｏｒ  Ｇ６Ｐの欄、及びのＫｍ  ｆｏｒ  ＮＡＤＰ+欄に示す。
【０２１０】
【表７】
2015092872.tif 000012
【０２１１】
表７より、変異体４０、変異体４２は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて比活性が高いことが明らかになった。
【０２１２】
高い耐熱性を有しつつ比活性が高いことは、産業利用上、有用であると考えられる。一方、変異体３９、変異体４１、変異体４３は、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて比活性が低下していることが判明した。基質Ｇ６ＰへのＫｍ値の大幅な増加が原因と推察される。また、変異体３９、変異体４１、変異体４３は、補酵素ＮＡＤＰ+へのＫｍ値は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて減少していた。
【０２１３】
（８−２）耐熱性の評価１
精製酵素を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈して以下の実験を行なった。
調整した希釈精製酵素をそれぞれ０．５ｍＬずつ分取して２．０ｍＬプラスチックチューブに分注し、うち１本を氷上で保存、残りを任意の温度で３０分間、熱処理し、すぐさま氷冷した。熱処理温度は、３７℃、３９℃、４０．５℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４９℃、５１℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃及び５９℃の１８点とした。野生型Ｇ６ＰＤＨ及び変異体３９〜４３について、それぞれ９点以上を測定した。
【０２１４】
熱処理なしのＧ６ＰＤＨ活性を１００％としたときの各熱処理温度での残存活性を求めた。結果を表８に示す。
【０２１５】
【表８】
2015092872.tif 000013
【０２１６】
更に、表８のデータから、グラフソフトを用いて横軸に処理温度、縦軸に残存活性をプロットし、残存活性が減少するシグモイド曲線を描画した。また、残存活性が５０％になるときの熱処理温度（以下、Ｔｍ50という）を求めた。更に、変異体３９〜変異体４３のＴｍ50から野生型Ｇ６ＰＤＨのＴｍを差し引いた値をΔＴｍ50とした。結果を表９に示す。
【０２１７】
【表９】
2015092872.tif 000014
【０２１８】
表９の結果より、ΔＴｍ50の値から、変異体４３＞変異体３９＞変異体４１＞変異体４０＞変異体４２の順に、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて耐熱性が高いことが確認された。
【０２１９】
（８−３）耐熱性の評価２
精製酵素を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈して以下の実験を行なった。
調整した希釈精製酵素をそれぞれ０．５ｍＬずつ分取して２．０ｍＬプラスチックチューブに分注し、うち１本を氷上で保存、残りを６０℃で任意の時間、熱処理し、すぐさま氷冷した。熱処理時間は２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分の１３点とし、野生型Ｇ６ＰＤＨ及び変異体３９〜４３はそれぞれ４点以上測定した。
【０２２０】
熱処理なしの酵素活性を１００％としたときの各熱処理時間でのＧ６ＰＤＨの残存活性を求めた。横軸に熱処理時間、縦軸に残存活性（％）の対数をプロットしてグラフを作成した（図５）。
【０２２１】
また、各グラフから近似曲線を求めた。それぞれの近似曲線は以下の式によって表すことができる。
【０２２２】
【数５】
2015092872.tif 000015
【０２２３】
ここで、ｙを残存活性（％）、ｘを熱処理時間（分）、ｙmax及びｋの値は定数である。
【０２２４】
野生型Ｇ６ＰＤＨ及び変異体３９〜４３の近似式をそれぞれ表１０に示す。
【０２２５】
【表１０】
2015092872.tif 000016
【０２２６】
得られた近似式から、熱処理温度６０℃において、残存活性ｙが５０（％）になるときの時間（以下、Ｔ1/2という）を算出した。同時に、野生型Ｇ６ＰＤＨのＴ1/2を１．０としたときの変異体３９〜４３のＴ1/2を＊Ｔ1/2として求めた。結果を表１１に示す。
【０２２７】
【表１１】
2015092872.tif 000017
【０２２８】
表１１の結果から、上述の表９に示したΔＴｍ50の結果と同様に、変異体４３＞変異体３９＞変異体４１＞変異体４０＞変異体４２の順に、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて耐熱性が高いことが確認された。
【０２２９】
更に、上述した６０℃の熱処理条件において、変異体３９は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて２２４倍、変異体４０は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて３３倍、変異体４１は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて９５倍、変異体４２は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて１０倍、変異体４３は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて６２６倍安定であることが明らかになった。
【０２３０】
実施例９：野生型Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６ＰＤＨ多重変異体の基質特異性の評価
Ｇ６ＰＤＨ多重変異体がグルコース−６−リン酸以外の糖リン酸に反応するように改変されていないか調べるため、以下の実験を行なった。
【０２３１】
補酵素にＮＡＤＰ+、基質にグルコース−６−リン酸を用いたときの比活性を１００％としたときの、グルコース−１−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、６−ホスホグルコン酸、リボース−５−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１、６−二リン酸、マンノース−６−リン酸を基質としたときの比活性を、野生型Ｇ６ＰＤＨ及び変異体３９〜変異体４３について求めた。
【０２３２】
いずれの測定も、基質として前記糖リン酸を使用したこと以外は、発明を実施するための形態〔Ｇ６ＰＤＨの比活性の測定〕に従い、各基質の終濃度を３．３３３ｍＭの条件で実施した。測定結果を表１２に示す。
【０２３３】
【表１２】
2015092872.tif 000018
【０２３４】
表１２の結果より、変異体３９〜変異体４３は、野生型Ｇ６ＰＤＨが反応しない基質に反応するような改変は起こっていないことを確認できた。一方で、野生型Ｇ６ＰＤＨはフルクトース−６−リン酸に対グルコース−６−リン酸で７．９％反応した。驚くべきことに、変異体３９〜変異体４３ではその値が、それぞれ０．８％、２．７％、０．８％、４．１％、１．３％と野生型の７．９％に比べて減少しており、変異体３９〜変異体４３は野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて基質特異性が向上していることが確認された。
【０２３５】
上記の結果は、変異体３９〜変異体４３に導入された多重変異が基質特異性に悪影響を及ぼす可能性を調査する過程で発見された、全く予期されなかった結果である。
【０２３６】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更及び修正を加えることができることは、当業者にとって明らかである。
【図１】
2015092872.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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