(57)【要約】【課題】  試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、一定温度、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法、および当該方法を利用した試薬を提供すること。【解決手段】  ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）に加えて、前記プロモータ配列を有したプライマーに対して５’末端側の位置にある第三のプライマー、および／または鎖置換活性を有する酵素をさらに含んだ、前記標的核酸の増幅試薬により、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、を含む前記標的核酸の増幅試薬であって、
第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および／または鎖置換活性を有する酵素をさらに含む、前記増幅試薬。
【請求項２】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、を含む前記標的核酸の増幅試薬であって、
第二のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相補的な配列を有する第三のプライマー、および／または鎖置換活性を有する酵素をさらに含む、前記増幅試薬。
【請求項３】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１または２に記載の増幅試薬。
【請求項４】
鎖置換活性を有する酵素がＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼのいずれかである、請求項１から３のいずれかに記載の増幅試薬。
【請求項５】
増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを、請求項１から４のいずれかに記載の増幅試薬にさらに含んでなる、標的核酸の検出試薬。
【請求項６】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項７】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）第二のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相補的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項８】
以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項９】
ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、請求項６から８のいずれかに記載の標的核酸の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる標的核酸を特異的に増幅する方法、および当該方法を利用した核酸増幅試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より核酸増幅方法としてＰＣＲ法が用いられている。しかしながら、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があるため、自動化の際、反応工程の省力化や反応装置の低コスト化の点で問題があった。さらに標的核酸がＲＮＡの場合には、逆転写反応を行なう必要があり、さらに煩雑であった。
【０００３】
ＲＮＡを標的核酸とした増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）が知られている。これれらの増幅法は、一定温度で核酸を増幅することができるため、自動化の際、反応工程の省力化や反応装置の低コスト化が容易な点で好ましい。しかしながら、これらの増幅法は標的核酸がＤＮＡの場合、増幅が困難であった。
【０００４】
特許文献５には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する鎖置換活性を利用した、ＤＮＡを標的核酸とした、ＮＡＳＢＡ法による核酸の増幅および検出法を開示している。しかしながら、特許文献５に開示の方法は、３７℃で２時間インキュベーションして標的核酸を増幅後、一旦−２０℃で凍結し、その後ＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法により標的核酸を検出する方法であり、非常に煩雑な方法である。また最小検出感度も１０６コピー／テストであり、感度の面からも不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特許第３００２２５９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、一定温度、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法、および当該方法を利用した試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、等温で標的核酸の増幅が可能な系に新たなプライマーおよび／または鎖置換活性を有する酵素を添加することで、一定温度で、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、を含む前記標的核酸の増幅試薬であって、
第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および／または鎖置換活性を有する酵素をさらに含む、前記増幅試薬である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、を含む前記標的核酸の増幅試薬であって、
第二のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相補的な配列を有する第三のプライマー、および／または鎖置換活性を有する酵素をさらに含む、前記増幅試薬である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、前記第一または第二の態様に記載の増幅試薬である。
【００１２】
また本発明の第四の態様は、鎖置換活性を有する酵素がＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼのいずれかである、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の増幅試薬である。
【００１３】
さらに本発明の第五の態様は、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の増幅試薬にさらに含んでなる、標的核酸の検出試薬である。
【００１４】
さらに本発明の第六の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第七の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）第二のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相補的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第八の態様は、以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
さらに本発明の第九の態様は、ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、前記第六から第八の態様のいずれかに記載の標的核酸の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明における標的核酸とは、試料中に含まれる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのうち、本発明の増幅試薬および増幅方法により増幅される領域のことをいう。なお、本発明の増幅試薬および増幅方法において、後述する第三のプライマーを添加する場合は、第三のプライマーの５’末端側から第一または第二のプライマーの５’末端側までの領域も標的核酸に含まれる。
【００１７】
本発明において、相補的な配列を有するとは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、相同的な配列を有するとは、標的核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。
【００１８】
本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。なお第一または第二のプライマーに付加するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列は、本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した配列を用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合の一例として、配列番号１３に記載の配列からなるＴ７プロモータがあげられる。
【００１９】
本発明ではＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素も含んでいる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体は、前述した三つの酵素活性の全てを有しているため好ましく、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が好ましい。
【００２０】
本発明の増幅試薬および増幅方法は、等温増幅系に第三のプライマーおよび／または鎖置換活性を有する酵素をさらに添加することを特徴とする。
【００２１】
本発明における第三のプライマーは、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加するプライマーが第一のプライマーの場合、第一のプライマーに対して５’末端側（標的核酸における５’末端側）に位置し、かつ標的核酸の一部と相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドのことをいい、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加するプライマーが第二のプライマーの場合、第二のプライマーに対して５’末端側（標的核酸における３’末端側）に位置し、かつ標的核酸の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのことをいう。なお、第三のプライマーから第一または第二のプライマーまでの塩基長さは適宜決定すればよいが、第三のプライマーの５’末端側から第一または第二のプライマーの５’末端側までの長さが１３０塩基以下であると好ましく、１１０塩基以下であるとより好ましく、９０塩基以下であるとさらに好ましい。なお、第三のプライマーは本発明の核酸増幅系に複数種類添加してもよく、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加してもよい。第三のプライマーの添加量は、第一または第二のプライマーの添加量に対し少なければよく、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／１０以下である。
【００２２】
本発明において鎖置換活性を有する酵素とは、鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素のことをいい、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７またはＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶウイルス逆転写酵素、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼなどがあげられる。またヘリカーゼも、鎖置換効果、すなわち、同じ配列の核酸合成と結びつけられた核酸の置換を生じることから、本発明における鎖置換活性を有する酵素として用いることができる。さらにＲｅｃＡや一本鎖結合蛋白質も、本発明における鎖置換活性を有する酵素として用いることができる。中でも、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよび９６−７  ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼがより好ましい。鎖置換活性を有する酵素の添加量は適宜決定すればよいが、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、０．５Ｕ以上添加すればよく、１．５Ｕ以上添加すると好ましい。
【００２３】
本発明の増幅試薬を用いた標的核酸の増幅方法は、鋳型核酸の形態により異なる。鋳型核酸が標的核酸の相補鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ａ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（Ａ−２）第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、（Ａ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ａ−３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ａ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ａ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ａ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ａ−５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ａ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ａ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ａ−７）（Ａ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が標的核酸の相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｂ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−２）第二のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相補的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、（Ｂ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｂ−３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｂ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｂ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｂ−５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｂ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｂ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｂ−７）（Ｂ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が一本鎖ＲＮＡの相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｃ−１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｃ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−４）第一のプライマーに対して５’末端側の位置にある標的核酸の一部と相同的な配列を有する第三のプライマー、および鎖置換活性を有する酵素を用いて、（Ｃ−３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｃ−５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｃ−４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｃ−５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｃ−７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、（Ｃ−６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ−８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−９）（Ｃ−８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。
【００２４】
本発明の増幅試薬および増幅方法で増幅した標的核酸（ＲＮＡ転写産物）を検出することで、試料中に含まれる標的核酸の有無を検出することができるが、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをあらかじめ本発明の増幅試薬に添加し、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定すると、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の増幅試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）に加えて、前記プロモータ配列を付加したプライマーに対して５’末端側の位置にある第三のプライマー、および／または鎖置換活性を有する酵素をさらに含むことを特徴としている。本発明により、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法であっても、標的核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、一定温度、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に標的核酸を増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例４から１３で使用したプライマー類および標的核酸の塩基配列と、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０での領域を示した図である。配列番号２は配列番号１の５’末端側に、配列番号４は配列番号３の５’末端側に、配列番号６は配列番号５の５’末端側に、配列番号８は配列番号７の５’末端側に、配列番号１０は配列番号９の５’末端側に、それぞれＴ７プロモータ配列（配列番号１３）を付加したものである。
【図２】図１に示したプライマー類と標的核酸との位置関係を示した図である。
【図３】実施例１４で使用したプライマー類および標的核酸の塩基配列を示した図である。
【図４】図３に示したプライマー類と標的核酸との位置関係を示した図である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。なお本実施例で使用したプライマー類および標的核酸の塩基配列を図１および図３に、プライマー類と標的核酸との位置関係を図２および図４にそれぞれ示す。
【００２８】
実施例１  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ溶液の調製
ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社より購入した不活化ウイルスより、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従い抽出することで、ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を得た。抽出試料中に含まれるＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数は、抽出効率を１００％とし、１ＩＵを約６コピーとして計算した。
【００２９】
実施例２  二本鎖ＤＮＡの調製
（１）鋳型として実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、プライマーとして配列番号１５および配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を、それぞれ用いて、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑのマニュアルに従いＰＣＲを行ない、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０の塩基番号２７４５から１８００までに相当する領域のポリヌクレオチドを増幅した。
（２）ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて増幅したＰＣＲ産物を精製し、二本鎖ＤＮＡを調製した。二本鎖ＤＮＡの定量は、２６０ｎｍの紫外部吸収を測定することで行なった。
【００３０】
実施例３  インターカレーター性蛍光色素標識プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））に従い、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち５’末端から５番目のＴの位置、および配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち５’末端から１０番目のＡの位置に、インターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを標識することで、インターカレーター性蛍光色素標識プローブを調製した。
【００３１】
実施例４  等温増幅法を用いたＨＢＶ  ＤＮＡの検出
等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１０００コピー／５μＬ、５００コピー／５μＬ、３００コピー／５μＬ、１００コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００３２】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２または４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブ）（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。
【００３３】
開始液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
３．８ｗｔ％  グリセロール
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
９５ｍＭ  塩化カリウム
１０．５％  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲ用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００３４】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１に示す。第一のプライマーとして、配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた場合はＨＢＶ  ＤＮＡを１００コピー／テストまで、配列番号４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた場合にはＨＢＶ  ＤＮＡを３００コピー／テストまで、それぞれ検出することができた。しかしながら、いずれの場合も、１０コピー／テストのＨＢＶ  ＤＮＡは検出できなかった。
【００３５】
【表１】
2015116136.tif 000002
【００３６】
実施例５  置換プライマーを添加した等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出
置換プライマー（本発明における第三のプライマーに相当）を添加した等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１００コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００３７】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ、０．９μＭまたは０．５μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０μＭ、０．１μＭまたは０．５μＭ  置換プライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００３８】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．５を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表２に示す。置換プライマーを添加することでＨＢＶ  ＤＮＡ  １００コピー／テストの検出時間が向上していることがわかる。なお第一のプライマーと置換プライマーをモル比として１０対１添加したときが最も検出時間が速かった。
【００３９】
【表２】
2015116136.tif 000003
【００４０】
実施例６  置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出
置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１０００コピー／５μＬ、または１００コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１６μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに鎖置換酵素溶液１μＬおよび前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。なお鎖置換酵素は、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μＬ）、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μＬ）、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μＬ）、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ（１２Ｕ／μＬ）のいずれかを用いた。
【００４１】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００４２】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表３に示す。鎖置換酵素をさらに添加することで、１００コピー／テストのＨＢＶ  ＤＮＡの検出時間は、置換プライマーのみを添加した時（実施例５）と比較し、同等またはさらに向上していることがわかる。特に鎖置換酵素としてＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼまたは９６−７  ＤＮＡポリメラーゼを用いたとき、検出時間の向上が著しいことがわかる。
【００４３】
【表３】
2015116136.tif 000004
【００４４】
実施例７  置換プライマーおよび／または鎖置換酵素の添加による等温増幅法への影響
置換プライマーおよび鎖置換酵素の添加の有無による等温増幅法を用いたＨＢＶ  ＤＮＡ検出への影響を調べた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１００コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００４５】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（以下、必要に応じ添加）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４）
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００４６】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表４に示す。置換プライマーの添加により、ＨＢＶ  ＤＮＡの検出時間が向上し、さらに鎖置換酵素を添加するとＨＢＶ  ＤＮＡの検出時間および検出感度がさらに向上することがわかる。
【００４７】
【表４】
2015116136.tif 000005
【００４８】
実施例８  置換プライマーによる等温増幅法への影響
実施例７に記載の置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した系のうち、置換プライマーを替えたことによる等温増幅法を用いたＨＢＶ  ＤＮＡ検出への影響を調べた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて３０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００４９】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号３から１０のいずれか）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００５０】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表５に示す。置換プライマーとして、
配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、
配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、
配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、および
配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果と配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときの結果、
が、それぞれ、ほぼ同様の結果（検出時間）であることから、Ｔ７プロモータ配列（配列番号１３）の有無による、置換プライマーへの影響はないことがわかる。
【００５１】
【表５】
2015116136.tif 000006
【００５２】
実施例９  鎖置換酵素の濃度検討
実施例７に記載の置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した系における鎖置換酵素の最適濃度を検討した。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１００コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００５３】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
０．８Ｕ、１Ｕ、２Ｕ、４Ｕまたは８Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００５４】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表６に示す。鎖置換酵素を０．８Ｕ以上添加していれば１００コピー／テストのＨＢＶ  ＤＮＡを５分以内に検出できるが、鎖置換酵素を２．０Ｕ以上添加すると１０コピー／テストのＨＢＶ  ＤＮＡを５分以内に検出できるため、より好ましいといえる。
【００５５】
【表６】
2015116136.tif 000007
【００５６】
実施例１０  ＡＭＶ逆転写酵素の濃度
実施例７に記載の置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した系におけるＡＭＶ逆転写酵素の最適濃度を検討した。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１００コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００５７】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
０．８Ｕ、１．６Ｕ、２．４Ｕ、３．２Ｕ、６．４Ｕ、８．６Ｕ、９．６Ｕまたは１９．２Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００５８】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表７に示す。１００コピー／テストの結果でＡＭＶ逆転写酵素の添加量が０．８Ｕから９．６Ｕまでは検出時間に差がないことから、ＡＭＶ逆転写酵素の添加量は０．５Ｕから１０Ｕまでの間であればよいことがわかる。
【００５９】
【表７】
2015116136.tif 000008
【００６０】
実施例１１  置換プライマーを複数種類用いたことによる等温増幅法への影響
実施例６に記載の反応系（置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した系）において、置換プライマーを複数種類添加することによる、等温増幅法を用いたＨＢＶ  ＤＮＡ検出への影響を調べた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて３０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００６１】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
各０．０２５μＭから０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４、６、８および１０の中から組み合わせて使用）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
０．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００６２】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表８に示す。置換プライマーを複数種類添加しても、検出性能への影響はほとんどないことがわかる。なお置換プライマーを添加しない系では、３０コピー／テストのＨＢＶ  ＤＮＡは検出できなかった。
【００６３】
【表８】
2015116136.tif 000009
【００６４】
実施例１２  鎖置換酵素を使用した等温増幅法による合成一本鎖ＤＮＡの検出
合成一本鎖ＤＮＡを標的核酸としたときの、等温増幅法による前記標的核酸の検出を試みた。
（１）配列番号１４に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成し、注射用水を用いて１０６コピー／５μＬ、１０５コピー／５μＬ、１０４コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈して、合成一本鎖ＤＮＡ試料を調製した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに（１）で調製した一本鎖ＤＮＡ試料５μＬを添加した。
【００６５】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
０．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００６６】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表９に示す。合成一本鎖ＤＮＡの検出感度は１０２コピー／テストであった。
【００６７】
【表９】
2015116136.tif 000010
【００６８】
実施例１３  鎖置換酵素を使用した等温増幅法による二本鎖ＤＮＡの検出
二本鎖ＤＮＡを標的核酸としたときの、等温増幅法による前記標的核酸の検出を試みた。
（１）実施例２で調製した二本鎖ＤＮＡを、注射用水を用いて１０４コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈して、二本鎖ＤＮＡ試料を調製した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに（１）で調製した二本鎖ＤＮＡ試料５μＬを添加した。
【００６９】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号４）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号１２）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１１）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
０．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００７０】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１０に示す。二本鎖ＤＮＡの検出感度は１０２コピー／テストであった。一方（２）に記載の反応液の組成から、置換プライマーと鎖置換酵素を除いた系で同様の検出を試みたが、二本鎖ＤＮＡの検出感度は１０４コピー／テストであった。すなわち、置換プライマーおよび鎖置換酵素を等温増幅系に添加することで、二本鎖ＤＮＡの検出感度が大幅に向上することがわかる。
【００７１】
【表１０】
2015116136.tif 000011
【００７２】
実施例１４  鎖置換酵素を使用した等温増幅法によるＲＮＡの検出
一本鎖ＲＮＡを標的核酸としたときの、等温増幅法による前記標的核酸の検出を試みた。
（１）一本鎖ＲＮＡとしてサバイビンｍＲＮＡ（配列番号２２）を用いた。サバイビンｍＲＮＡを注射用水を用いて１００コピー／５μＬ、または３０コピー／５μＬとなるよう希釈し、ＲＮＡ試料を調製した。
（２）以下の組成の反応液を０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに（１）で調製したＲＮＡ試料５μＬを添加した。なお切断用オリゴヌクレオチドとは、標的核酸における第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な配列を有したオリゴヌクレオチドである。切断用ヌクレオチドおよびＡＭＶ逆転写酵素が有するリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性により、前記第一のプライマーとの相同領域の５’末端側のＲＮＡを切断することで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として効率的に機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成することができる。
【００７３】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号１８）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号２１）
３６ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号２０）（実施例３で調製）
６７ｍＭ  トレハロース
０．８Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（以下、必要に応じ添加）
０．２μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（以下、シザープローブ）（配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのうち３’末端側の水酸基をアミノ基で修飾）
０．１μＭ  置換プライマー（配列番号１７）
２Ｕ  ９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、実施例４（３）に記載の組成からなる開始液８μＬを添加した。
（４）実施例４（４）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００７４】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１１に示す。一本鎖ＲＮＡの検出においても置換プライマーおよび／または鎖置換酵素を添加することで、検出感度が向上していることがわかる。なお、置換プライマーおよび鎖置換酵素を添加した場合は、シザープローブの添加がなくとも３０コピー／テストの一本鎖ＲＮＡが検出できることがわかる。
【００７５】
【表１１】
2015116136.tif 000012
【図１】
2015116136.tif 000013
【図２】
2015116136.tif 000014
【図３】
2015116136.tif 000015
【図４】
2015116136.tif 000016
【配列表】
2015116136000001.app