(57)【要約】【課題】エキソソームを高精度に検出することができるとともに、検出されたエキソソームのサイズの分布を計測することができる分析用基板を提供する。【解決手段】分析用基板は、基板１０と、基板１０の表面に凹状に形成され、検出対象であるエキソソーム５に存在する抗原５１と結合する抗体３が固定されるピット１２が、サイズ毎にそれぞれ配列される複数のピット列群２０とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板の表面に凹状に形成され、検出対象であるエキソソームに存在する抗原と結合する抗体が固定されるピットが、前記エキソソームの径に基づくサイズ毎にそれぞれ配列される複数のピット列群と
を備えることを特徴とする分析用基板。
【請求項２】
前記複数のピット列群は、最小サイズの前記ピットが配列される第１ピット列群と、２番目に小さなサイズの前記ピットが配列される第２ピット列群とを有し、
前記第２ピット列群のピットのサイズは、前記第１ピット列群のピットのサイズの２倍未満であることを特徴とする請求項１に記載の分析用基板。
【請求項３】
前記第１ピット列群のピットは、前記エキソソームの最小径に対応するサイズを有することを特徴とする請求項２に記載の分析用基板。
【請求項４】
前記複数のピット列群は、最大サイズの前記ピットが配列される第３ピット列群と、２番目に大きなサイズの前記ピットが配列される第４ピット列群とを更に有し、
前記第４ピット列群のピットのサイズは、前記第３ピット列群のピットのサイズの１／２より大きいことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析用基板。
【請求項５】
前記第３ピット列群のピットは、前記エキソソームの最大径に対応するサイズを有することを特徴とする請求項４に記載の分析用基板。
【請求項６】
前記基板は円盤状であり、
前記複数のピット列群は、それぞれ、前記ピットが円周方向に配列されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析用基板。
【請求項７】
基板の表面に、検出対象であるエキソソームに存在する抗原と結合する抗体が固定される凹状のピットを、前記エキソソームの径に基づくサイズ毎にそれぞれ配列されるように形成すること
を含むことを特徴とする分析用基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種の細胞が分泌するエキソソームを分析するための分析用基板及び分析用基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析する免疫学的検定（immunoassay）が知られている。免疫学的検定を用いた分析方法として、エキソソームの脂質二重膜に存在する膜タンパク質である抗原に特異的に結合する抗体を認識することにより分析することが開示されている（特許文献１参照）。エキソソームは、液体中で概略として球体であり、直径約３０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の様々なサイズを有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９２３８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の技術は、定量されたエキソソームのサイズに関する情報を得ることができない。免疫学検定において、検出されたエキソソームのサイズは、疾病の発見、治療の効果等をより詳細かつ正確に診断する際の有用な情報になり得る。
【０００５】
上記問題点を鑑み、本発明は、エキソソームを高精度に検出することができるとともに、検出されたエキソソームのサイズの分布を計測することができる分析用基板及び分析用基板の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、基板（１０）と、基板（１０）の表面に凹状に形成され、検出対象であるエキソソーム（５）に存在する抗原（５１）と結合する抗体（３）が固定されるピット（１２ａ〜１２ｃ）が、エキソソーム（５）の径に基づくサイズ毎にそれぞれ配列される複数のピット列群（２０ａ〜２０ｃ）とを備える分析用基板であることを要旨とする。
【０００７】
本発明の第２の態様に係る分析用基板は、第１の態様に係る分析用基板おいて、複数のピット列群（２０ａ〜２０ｃ）は、最小サイズのピット（１２ａ）が配列される第１ピット列群（２０ａ）と、２番目に小さなサイズのピット（１２ｂ）が配列される第２ピット列群（２０ｂ）とを有し、第２ピット列群（２０ｂ）のピット（１２ｂ）のサイズは、第１ピット列群（２０ａ）のピット（１２ａ）のサイズの２倍未満であることを特徴とする。
【０００８】
本発明の第３の態様に係る分析用基板は、第２の態様に係る分析用基板おいて、第１ピット列群（２０ａ）のピット（１２ａ）は、エキソソーム（５）の最小径に対応するサイズを有することを特徴とする。
【０００９】
本発明の第４の態様に係る分析用基板は、第１〜第３のいずれかの態様に係る分析用基板おいて、複数のピット列群（２０ａ〜２０ｃ）は、最大サイズのピット（１２ｃ）が配列される第３ピット列群（２０ｃ）と、２番目に大きなサイズのピットが配列される第４のピット列群とを更に有し、第４ピット列群（２０ｄ）のピット（１２ｄ）のサイズは、第３ピット列群（２０ｃ）のピット（１２ｃ）のサイズの１／２よりも大きいことを特徴とする。
【００１０】
本発明の第５の態様に係る分析用基板は、第４の態様に係る分析用基板おいて、第３ピット列群（２０ｃ）のピット（１２ｃ）は、エキソソーム（５）の最大径に対応するサイズを有することを特徴とする。
【００１１】
本発明の第６の態様に係る分析用基板は、第１〜第５のいずれかの態様に係る分析用基板おいて、基板（１０）は円盤状であり、複数のピット列群（２０ａ〜２０ｃ）は、それぞれ、ピット（１２ａ〜１２ｃ）が円周方向に配列されることを特徴とする。
【００１２】
本発明の第７の態様は、基板（１０）の表面に、検出対象であるエキソソーム（５）に存在する抗原（５１）と結合する抗体（３）が固定される凹状のピット（１２ａ〜１２ｃ）を、エキソソーム（５）の径に基づくサイズ毎にそれぞれ配列されるように形成することを含む分析用基板の製造方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、エキソソームを高精度に検出することができるとともに、検出されたエキソソームのサイズの分布を計測することができる分析用基板及び分析用基板の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１実施形態に係る分析用基板を説明する模式的な斜視図である。
【図２】本発明の第１実施形態に係る分析用基板を説明する部分拡大斜視図である。
【図３】（ａ）は、本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備える第１ピット列群を説明する平面図である。（ｂ）は、第２ピット列群を説明する平面図である。（ｃ）は、第３ピット列群を説明する平面図である。
【図４】本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備えるピットにエキソソームが捕捉される様子を説明する、基板の円周方向から見た拡大断面図である。
【図５】本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備えるピットに抗体を固定する様子を説明する拡大断面図である。
【図６】本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備えるピットに抗体を固定する様子を説明する拡大断面図である。
【図７】本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備えるピットに捕捉されたエキソソームを検出する様子を説明する拡大断面図である。
【図８】（ａ）は、本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備える第１ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。（ｂ）は、第２ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。（ｃ）は、第３ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。
【図９】本発明の第１実施形態に係る分析用基板が備える複数のピット列群それぞれにおいて捕捉されたエキソソームの検出量を説明する図である。
【図１０】本発明の第１実施形態に係る分析用基板を用いて検出されたエキソソームのサイズの分布を説明する図である。
【図１１】（ａ）〜（ｃ）及び（ｅ）は、本発明の第１実施形態に係る分析用基板の製造方法を説明する基板の円周方向から見た部分断面図である。（ｄ）は、本発明の第１実施形態に係る分析用基板の製造方法を説明する部分斜視図である。
【図１２】本発明の第２実施形態に係る分析用基板を説明する模式的な斜視図である。
【図１３】（ａ）は、本発明の第２実施形態に係る分析用基板が備える第１ピット列群を説明する平面図である。（ｂ）は、第２ピット列群を説明する平面図である。（ｃ）は、第４ピット列群を説明する平面図である。（ｄ）は、第３ピット列群を説明する平面図である。
【図１４】（ａ）は、本発明の第２実施形態に係る分析用基板が備える第１ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。（ｂ）は、第２ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。（ｃ）は、第４ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。（ｄ）は、第３ピット列群に捕捉されるエキソソームを説明する拡大断面図である。
【図１５】本発明の第２実施形態に係る分析用基板が備える複数のピット列群それぞれにおいて捕捉されたエキソソームの検出量を説明する図である。
【図１６】本発明の第２実施形態に係る分析用基板を用いて検出されたエキソソームのサイズの分布を説明する図である。
【図１７】本発明の他の実施の形態に係る分析用基板を説明する斜視図である。
【図１８】本発明の他の実施の形態に係る分析用基板を説明する斜視図である。
【図１９】本発明の他の実施の形態に係る分析用基板を説明する部分斜視図である。
【図２０】本発明の他の実施形態に係る分析用基板が備えるピットに捕捉されたエキソソームがビーズと結合する様子を説明する、基板の円周方向から見た拡大断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に、図面を参照して、本発明の第１及び第２実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付し、重複する説明を省略している。但し、図面は模式的なものであり、寸法の関係や比率等は現実のものとは異なり、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれる。また、以下に示す第１及び第２実施形態は、本発明の技術的思想を具体化するための基板や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成要素の形状、組成、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００１６】
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態に分析用基板は、図１に示すように、基板１０と、基板１０の表面にそれぞれ形成された複数のピット列群２０ａ〜２０ｃとを備える。基板１０は、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）等の光ディスクと同等の寸法を有する円盤状である。基板１０は、中央部に貫通孔を有していてもよい。
【００１７】
基板１０は、図２に示すように、円盤状の支持基板１０１と、支持基板１０１の片面に成膜されたレジスト膜１０２とから構成される。支持基板１０１は、一般の光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂ではなく、疎水性を有する樹脂材料からなる。支持基板１０１の樹脂材料は、例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスチレン等の芳香族炭化水素樹脂、脂環式ポリオレフィン等、分子構造内に極性基を有さない炭化水素から構成される樹脂材料を採用可能である。
【００１８】
レジスト膜１０２は、例えば、ＰＴＭ（Phase Transition Mastering）技術に用いられる二酸化タングステン（ＷＯ２）等の無機材料からなり、厚さが３０〜１００ｎｍ程度である。
【００１９】
複数のピット列群２０ａ〜２０ｃは、図２及び図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、基板１０の表面に凹状に形成されたピット１２ａ〜１２ｃが、サイズ毎にそれぞれ配列される。ピット１２ａ〜１２ｃ（以下、総称する場合において単に「ピット１２」という。）は、図４に示すように、露出された支持基板１０１の表面に、検出対象であるエキソソーム５に存在する抗原５１と特異的に結合する抗体３が疎水効果により固定される。抗体３の大きさは、例えば数ｎｍ程度である。ピット１２において露出した支持基板１０１の表面は、凹状に形成されてもよい。
【００２０】
第１実施形態に係る分析用基板は、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９等、エキソソーム５に存在する膜貫通型の膜タンパク質である抗原５１の検出に用いることができる。抗原５１は、抗体３と特異的に結合することにより、疾病等の指標となるバイオマーカーとして用いられる。
【００２１】
基板１０のレジスト膜１０２は、ピット１２以外の領域に形成され、ピット１２に対して高さが高いランド１１を構成する。例えば、ピット１２の深さは、検出対象のエキソソーム５のサイズに対応する深さとすることにより、エキソソーム５をピット１２内に好適に捕捉することができる。
【００２２】
ランド１１の表面は、抗体３の固定を防止する固定防止面として機能する。なお、本発明において「抗体３の固定を防止する」とは、ランド１１に抗体３を全く結合させないことに加えて、ランド１１が、少なくともピット１２よりも抗体３を結合しづらく構成されることを含む。
【００２３】
複数のピット列群２０ａ〜２０ｃは、図１及び図３に示すように、ピット１２ａが配列される第１ピット列群２０ａと、ピット１２ｂが配列される第２ピット列群２０ｂと、ピット１２ｃが配列される第３ピット列群２０ｃとを有する。第１ピット列群２０ａ、第２ピット列群２０ｂ及び第３ピット列群２０ｃは、互いに間隙を有するように、内周側から外周側に順に同心円状に配置される。
【００２４】
ピット１２ａ〜１２ｃは、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃそれぞれにおいて、基板１０の内周側から外周側にスパイラル状に、基板１０の円周方向Ｄｔに配列される。ピット１２ａ〜１２ｃは、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃそれぞれにおいて、半径方向Ｄｒにおいて隣接するピット１２ａ〜１２ｃとピッチＰを有するように配列される。ピッチＰは、例えば３２０ｎｍ程度である。ピット１２は、平面パターンが円形、楕円形等である。平面パターンが円形であるピット１２は、１つのピット１２に複数のエキソソーム５が捕捉されることを低減することができる。
【００２５】
第１ピット列群２０ａは、ピット１２ａ〜１２ｃの中で最小サイズＳａを有するピット１２ａが配列される。エキソソーム５は、一般に、液体中で概略として球体であり、直径約３０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の様々なサイズを有する。この為、サイズＳａは、検出対象であるエキソソーム５の最小径に対応するようにしてもよい。サイズＳａは、例えば、ピット１２ａの直径、短径等であり、約３０ｎｍ〜８０ｎｍ程度である。ピット１２ａは、ピット１２ａに入り込めないサイズのエキソソーム５を捕捉しない。
【００２６】
第２ピット列群２０ｂは、ピット１２ａ〜１２ｃの中で２番目に小さなサイズＳｂ（Ｓｂ＞Ｓａ）のピット１２ｂが配列される。サイズＳｂは、例えば、ピット１２ｂの直径、短径等であり、約８０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度である。ピット１２ｂは、ピット１２ｂに入り込めないサイズのエキソソーム５を捕捉しない。サイズＳｂは、例えば、サイズＳａの２倍未満（Ｓｂ＜２Ｓａ）とすることにより、１つのピット１２ｂに複数のエキソソーム５が結合されることを低減することができる。
【００２７】
第３ピット列群２０ｃは、ピット１２ａ〜１２ｃの中で最大サイズＳｃ（Ｓｃ＞Ｓｂ＞Ｓａ）のピット１２ｃが配列される。サイズＳｃは、例えば、ピット１２ｃの直径、短径等であり、約１５０ｎｍ〜２００ｎｍ程度である。ピット１２ｃは、ピット１２ｃに入り込めないサイズのエキソソーム５を捕捉しない。サイズＳｃは、検出対象であるエキソソーム５の最大径に対応するようにしてもよい。
【００２８】
なお、エキソソーム５の直径とは、エキソソーム５の粒径を任意の測定方法で測定した値を意味する。測定方法としては、例えば、ナノ粒子トラキング法を用いた、エキソソーム５が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡でエキソソーム５の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法がある。
【００２９】
乾式の測定方法では、エキソソーム５の形態を保ったまま乾式で観測可能とするために、エキソソーム５を含む試料に対して細胞を観測する手法に準じた処理を施す。具体的には、試料を基体上に固定し、低濃度のエタノールから純度１００％のエタノールまで、ステップごとにエタノールの濃度を高くして数ステップをかけてエタノールの含浸を繰り返す。これによって、試料中の水分がエタノールへと置換されて脱水される。次に、試料を、エタノールに可溶な合成樹脂を含む溶液で含浸することによって、エタノールを合成樹脂に置換する。そして、合成樹脂に置換された試料を薄片化して観測する。
【００３０】
また、エキソソーム５を含む試料を急速冷凍することにより、エキソソーム５の形態を保ったまま脱水して観測可能な試料とすることもできる。
【００３１】
−抗体の固定方法−
以下、図５及び図６を参照して、第１実施形態に係る分析用基板のピット１２に抗体３を固定する方法の一例を説明する。
【００３２】
先ず、図５に示すように、抗体３を含む緩衝溶液３０を基板１０のランド１１及びピット１２に分注し、振盪機により基板１０を振盪させる。緩衝溶液３０に含まれる抗体３は、疎水効果により、疎水性を有するピット１２の露出した支持基板１０１の表面に固定される。ランド１１の表面は、レジスト膜１０２によって固定防止面として機能するため、ランド１１の表面には抗体３が結合しない。よって、ピット１２以外の領域であるランド１１にエキソソーム５が固定さることはほとんどない。
【００３３】
次に、図６に示すように、基板１０は、抗体３を含む緩衝溶液３０が排出された後、緩衝溶液で洗浄される。これにより、ピット１２に固定されなかった抗体３を含む緩衝溶液３０が除去され、ピット１２にのみ抗体３が固定された分析用基板が完成する。
【００３４】
−エキソソームの検出及び試料分析方法−
以下、本発明の第１実施形態に係る分析用基板によって、図７に示すように捕捉したエキソソーム５を検出し、試料を分析する方法の一例を説明する。
【００３５】
先ず、オペレータは、検出対象のエキソソーム５を含む試料液を、基板１０の各ピット列群２０ａ〜２０ｃに所定量ずつ分注し、振盪機により基板１０を振盪させる。試料液に含まれるエキソソーム５の抗原５１は、ピット１２に固定された抗体３との抗原抗体反応により、抗体３と特異的に結合する。これにより、エキソソーム５は、ピット１２に結合し、捕捉される。
【００３６】
図７に示す左右のピット１２のうち、右側のピット１２にはエキソソーム５が捕捉されており、左側のピット１２にはエキソソーム５が捕捉されていない。図７に示す左右のピット１２に、順次光ピックアップの集光レンズ７によってレーザ光Ｌを集光させて、ピット１２にスポットＳを形成させたとする。レーザ光Ｌの反射光を検出することにより、ピット１２におけるエキソソーム５の有無を判定し、各ピット列群２０ａ〜２０ｃのエキソソーム５を計数することができる。
【００３７】
図８（ａ）に示すように、第１ピット列群２０ａのピット１２ａは、ピット１２ａでのみ捕捉可能なサイズ（小サイズ）のエキソソーム５ａを捕捉する。図８（ｂ）に示すように、第２ピット列群２０ｂのピット１２ｂは、エキソソーム５ａと、ピット１２ａで捕捉できず、ピット１２ｂで捕捉可能なサイズ（中サイズ）のエキソソーム５ｂとを捕捉する。図８（ｃ）に示すように、第３ピット列群２０ｃのピット１２ｃは、エキソソーム５ａと、エキソソーム５ｂと、ピット１２ｂで捕捉できず、ピット１２ｃで捕捉可能なサイズ（大サイズ）のエキソソーム５ｃとを捕捉する。
【００３８】
例えば、図９に示すように、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃの各ピット１２ａ〜１２ｃに捕捉されたエキソソーム５ａ、エキソソーム５ａ，５ｂ、エキソソーム５ａ〜５ｃを検出して計数した結果が求められる。なお、図９に示す検出量は、各ピット１２ａ〜１２ｃについて計数されたエキソソーム５の数を正規化したデータである。
【００３９】
図９に示す各検出量から、検出されたエキソソーム５ａ〜５ｃのサイズの分布を求めることができる。小サイズのエキソソーム５ａの量は、ピット１２ａで検出されたエキソソーム５ａの量とする。中サイズのエキソソーム５ｂの量は、ピット１２ｂで検出されたエキソソーム５ａ，５ｂと、ピット１２ａで検出されたエキソソーム５ａとの差分とする。大サイズのエキソソーム５ｃの量は、ピット１２ｃで検出されたエキソソーム５ａ〜５ｃと、ピット１２ｂで検出されたエキソソーム５ａ，５ｂとの差分とする。
【００４０】
結果として、図１０に示すように、検出されたエキソソーム５ａ〜５ｃは、中サイズのエキソソーム５ｂ、大サイズのエキソソーム５ｃ、小サイズのエキソソーム５ａの順で量が多く含まれることが分かる。
【００４１】
抗原抗体反応は、所定の割合で平衡することが知られている。第１実施形態に係る分析用基板では、試料液の濃度等にもよるが、例えば、それぞれ３０％程度のエキソソーム５ａ〜５ｃが、ピット１２ａ〜１２ｃに捕捉される。よって、ピット１２ａ〜１２ｃにおける各検出量の差分から検出されたエキソソーム５ａ〜５ｃのサイズの分布を求めることができ、試料中に含まれるエキソソーム５ａ〜５ｃをサイズの分布を知ることができる。
【００４２】
−分析用基板の製造方法−
以下、図１１（ａ）〜図１１（ｅ）を参照して、本発明の第１実施形態に係る分析用基板の製造方法の一例を説明する。
先ず、図１１（ａ）に示すように、表面に凹凸のない平坦面を有する疎水性の支持基板１０１を形成する。
【００４３】
次に、図１１（ｂ）に示すように、支持基板１０１の片面に、例えば５０ｎｍの厚さとなるように、真空蒸着等により二酸化タングステン（ＷＯ２）を成膜することにより、レジスト膜１０２を形成する。支持基板１０１及びレジスト膜１０２は、基板１０を構成する。支持基板１０１の片面に形成されたレジスト膜１０２の表面は、抗体３の固定を防止する固定防止面を構成する。
【００４４】
次に、基板１０は、図１１（ｃ）に示すように、可動ステージ８０上に配置された後、図１１（ｄ）に示すように、レーザ光Ｌを照射される。基板１０は、可動ステージ８０により回転され、レジスト膜１０２により構成されたランド１１に、フォーカスサーボ及びトラッキングサーボをかけられたレーザ光Ｌを照射される。レーザ光Ｌは、集光レンズ９により集光されることにより、ランド１１にスポットＳを形成する。レジスト膜１０２は、レーザ光Ｌにより感光し、ピット１２が形成される領域が、アモルファス構造であるＷＯ２から結晶構造である三酸化タングステン（ＷＯ３）に改質される。
【００４５】
レジスト膜１０２は、ピット１２ａ〜１２ｃが、サイズ毎に配列されるように、ピット１２ａ〜１２ｃが形成される領域にレーザ光Ｌを照射される。ピット１２ａ〜１２ｃのサイズＳａ〜Ｓｃは、例えば、レーザ光Ｌの強度を調節することにより変更可能である。
【００４６】
次に、基板１０がアルカリ現像溶液に浸漬され、図１１（ｅ）に示すように、感光したレジスト膜１０２が、溶解し、除去される。これにより、ピット１２ａ〜１２ｃにおいて疎水性の支持基板１０１が露出され、エキソソーム５に存在する抗原５１と特異的に結合する抗体３が固定されるピット１２ａ〜１２ｃが形成される。また、支持基板１０１は、ピット１２ａ〜１２ｃ以外の領域であるランド１１において、固定防止面を構成するレジスト膜１０２に被覆される。
【００４７】
アルカリ現像溶液に浸漬する時間が長いと、感光していないレジスト膜１０２まで溶解されるため、ピット１２の領域のレジスト膜１０２のみが除去されるように浸漬の時間が調整される。アルカリ現像溶液のｐＨにもよるが、例えば２０分から1時間程度で感光したレジスト膜１０２は除去される。感光したレジスト膜１０２が除去された後、基板１０は、純水で洗浄され、乾燥される。
【００４８】
なお、ピット１２ａ〜１２ｃにおいて露出した支持基板１０１の表面は、ピット１２ａ〜１２ｃの深さがエキソソーム５ａ〜５ｃの対応するように、例えば、レジスト膜１０２をマスクとして用いたドライエッチング等により凹状に形成されても構わない。
【００４９】
本発明の第１実施形態に係る分析用基板によれば、抗体３が、疎水性であるピット１２ａ〜１２ｃのみに固定され、表面が固定防止面であるランド１１には固定されない。よって、抗原５１を有するエキソソーム５ａ〜５ｃは、ピット１２ａ〜１２ｃの内側に位置し、ランド１１に位置しにくいため、エキソソームを高精度に検出することができる。
【００５０】
また、第１実施形態に係る分析用基板によれば、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃにおいて、ピット１２ａ〜１２ｃがサイズＳａ〜Ｓｃ毎に配列されるので、検出されたエキソソームのサイズの分布を計測することができる。
【００５１】
また、第１実施形態に係る分析用基板によれば、ピット１２ｂのサイズＳｂまたはピット１２ｃのサイズＳｃが、ピット１２ａのサイズＳａの２倍未満とされることにより、１つのピット１２に複数のエキソソーム５が捕捉されることを低減できる。よって、本発明の第１実施形態に係る分析用基板によれば、より高精度に、検出されたエキソソームのサイズの分布を計測することができる。
【００５２】
また、第１実施形態に係る分析用基板は、光ディスクとして形成されることにより、光ピックアップにより光ディスクを再生する再生装置と同等の装置により、高精度に検出対象を検出可能である。よって、本発明の第１実施形態に係る分析用基板によれば、分析装置の小型化及び低価格化が可能となるとともに、低濃度から高濃度の試料まで、高精度に定量性の高い検出を行うことができる。
【００５３】
（第２実施形態）
第１実施形態において、３つのピット列群２０ａ〜２０ｃを備える分析用基板を説明したが、ピット列群の数は３つに限るものではなく、目的に応じて複数設定することが可能である。第２実施形態に係る分析用基板は、図１２に示すように、基板１０と、基板１０の表面にそれぞれ形成された４つのピット列群２０ａ〜２０ｄとを備える。第２実施形態において説明しない他の構成、作用及び効果は、第１実施形態と実質的に同様であり重複するため省略する。
【００５４】
４つのピット列群２０ａ〜２０ｄは、図１３（ａ）〜（ｄ）に示すように、基板１０の表面に凹状に形成されたピット１２ａ〜１２ｄが、サイズ毎にそれぞれ配列される。複数のピット列群２０ａ〜２０ｄは、第１ピット列群２０ａ、第２ピット列群２０ｂ及び第３ピット列群２０ｃの他、ピット１２ｄが配列される第４ピット列群２０ｄを更に有する。第１ピット列群２０ａ、第２ピット列群２０ｂ、第４ピット列群２０ｄ及び第３ピット列群２０ｃは、互いに間隙を有するように、内周側から外周側に順に同心円状に配置される。
【００５５】
ピット１２ｄは、第４ピット列群２０ｄにおいて、基板１０の内周側から外周側にスパイラル状に、基板１０の円周方向Ｄｔに配列される。ピット１２ｄは、第４ピット列群２０ｄにおいて、半径方向Ｄｒにおいて隣接するピット１２ｄとピッチＰを有するように配列される。ピット１２ｄは、平面パターンが円形、楕円形等である。
【００５６】
ピット１２ｄは、図１３（ｃ）に示すように、ピット１２ａ〜１２ｄのうち２番目に大きなサイズＳｄを有する（Ｓｃ＞Ｓｄ＞Ｓｂ＞Ｓａ）。サイズＳｄは、例えば、ピット１２ｄの直径、短径等であり、約１００ｎｍ〜１５０ｎｍ程度である。ピット１２ｄは、ピット１２ｄに入り込めないサイズのエキソソーム５を捕捉しない。サイズＳｄは、例えば、ピット１２ａ〜１２ｄの中で最大サイズＳｃの１／２より大きく、最大サイズＳｃより小さい（１／２Ｓｃ＜Ｓｄ＜Ｓｃ）とすることにより、それぞれ１つのピット１２ｃに複数のエキソソーム５が結合されることを低減することができる。
【００５７】
図１４（ａ）に示すように、第１ピット列群２０ａピット１２ａは、ピット１２ａでのみ捕捉可能なサイズのエキソソーム５ａを捕捉する。図１４（ｂ）に示すように、第２ピット列群２０ｂのピット１２ｂは、エキソソーム５ａと、ピット１２ａで捕捉できず、ピット１２ｂで捕捉可能なサイズのエキソソーム５ｂとを捕捉する。図１４（ｃ）に示すように、第４ピット列群２０ｄのピット１２ｄは、エキソソーム５ａと、エキソソーム５ｂと、ピット１２ｂで捕捉できず、ピット１２ｄで捕捉可能なサイズのエキソソーム５ｄとを捕捉する。図１４（ｄ）に示すように、第３ピット列群２０ｃのピット１２ｃは、エキソソーム５ａと、エキソソーム５ｂと、エキソソーム５ｄと、ピット１２ｄで捕捉できず、ピット１２ｃで捕捉可能なサイズのエキソソーム５ｃとを捕捉する。
【００５８】
例えば、図１５に示すように、複数のピット列群２０ａ〜２０ｄの各ピット１２ａ〜１２ｄに捕捉されたエキソソーム５ａ、エキソソーム５ａ，５ｂ、エキソソーム５ａ，５ｂ，５ｄ及びエキソソーム５ａ〜５ｄを検出して計数した結果が求められる。なお、図１５に示す検出量は、各ピット１２ａ〜１２ｄについて計数されたエキソソーム５の数を正規化したデータである。
【００５９】
図１５に示す各検出量から、検出されたエキソソーム５ａ〜５ｄのサイズの分布を求めることができる。サイズＳａのエキソソーム５ａの量は、ピット１２ａで検出されたエキソソーム５ａの量とする。サイズＳｂのエキソソーム５ｂの量は、ピット１２ｂで検出されたエキソソーム５ａ，５ｂと、ピット１２ａで検出されたエキソソーム５ａとの差分とする。サイズＳｄのエキソソーム５ｄの量は、ピット１２ｄで検出されたエキソソーム５ａ，５ｂ，５ｄと、ピット１２ｂで検出されたエキソソーム５ａ，５ｂとの差分とする。サイズＳｃのエキソソーム５ｃの量は、ピット１２ｃで検出されたエキソソーム５ａ〜５ｄと、ピット１２ｄで検出されたエキソソーム５ａ，５ｂ，５ｄとの差分とする。
【００６０】
結果として、図１６に示すように、検出されたエキソソーム５ａ〜５ｄは、サイズＳｂのエキソソーム５ｂ、サイズＳｄのエキソソーム５ｄ、小サイズのエキソソーム５ａ、サイズＳｃのエキソソーム５ｃの順で量が多く含まれることが分かる。
【００６１】
本発明の第２実施形態に係る分析用基板によれば、より詳細なサイズ間隔で多くのピット列群を設定することにより、更に詳細にエキソソームのサイズの分布傾向を計測することができる。
【００６２】
（その他の実施形態）
上記のように、本発明を第１及び第２実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【００６３】
例えば、既に述べた第１実施形態において、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃが同心円状に配置される例を説明したが、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃは、他の形状に配置されてもよい。例えば、複数のピット列群２０ａ〜２０ｃは、図１７に示すように、基板１０の表面に、基板１０と同心円状の帯状の領域に、それぞれ部分的に配置されるようにしてもよい。同様に、第２実施形態において、複数のピット列群２０ａ〜２０ｄは、図１８に示すように、基板１０の表面に、基板１０と同心円状の帯状の領域に、それぞれ部分的に配置されるようにしてもよい。
【００６４】
また、既に述べた第１及び第２実施形態において、分析用基板は、図１９に示すように、基板１０の表面において内周側から外周側にスパイラル状に形成された凹状のグルーブ１３を更に備えるようにしてもよい。この場合、例えば、ランド１１及びグルーブ１３が形成された支持基板１０１にレジスト膜１０２を成膜した後、グルーブ１３の底部にピット１２を形成すればよい。
【００６５】
また、既に述べた第１及び第２実施形態において、固定防止面は、レジスト膜１０２で形成する例を説明したが、これに限らず、他の方法で固定防止面を形成してもよい。例えば、ランド１１が表面処理されることにより、撥水性または親水性とされることで抗体３を結合しづらくてもよい。
【００６６】
また、エキソソーム５の有無の違いによる反射光量の変化量を大きくするために、例えば図２０に示すように、捕捉されたエキソソーム５に対し、エキソソーム５と特異的に結合する抗体６１が表面に固定されたビーズ６を結合させることで光ピックアップでの反射光量の変化を増幅させてもよい。ビーズ６は、表面がグリシジルポリメタクリレート等の樹脂材料６２で被覆された直径約２００ｎｍのポリスチレンビーズ等のラテックスビーズを採用可能である。ビーズは、内部にフェライト等の磁性微粒子６３を含有してもよい。磁性微粒子６３をコアに含有するビーズ６は、反応液中に浮遊する間に磁石により吸引可能であり、抗体３側に吸引されることにより、抗体３に捕捉されたエキソソーム５との反応を短時間に行うことができる。抗体６１は、エキソソーム５の膜表面に発現している抗原５１に特異的に結合する抗体であれば、基板１０に固定された抗体３と同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
【００６７】
その他、第１及び第２実施形態等の上述の構成を相互に応用した構成等、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【符号の説明】
【００６８】
３  抗体
５，５ａ〜５ｃ  エキソソーム
１０  基板
１１  ランド
１２，１２ａ〜１２ｃ  ピット
１３  グルーブ
２０ａ〜２０ｃ  ピット列群
５１  抗原
１０１  支持基板
１０２  レジスト膜（固定防止面）
【図１】
2015127690.tif 000003
【図２】
2015127690.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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