(57)【要約】【課題】極めて容易にしかも高精度でがんの悪性度解析を行う。【解決手段】細胞核染色された細胞を計測する計測部と、前記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部と、前記ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求め、前記弱領域細胞の総数と、前記強領域細胞の総数と全細胞数の少なくとも一方に基づいてがんの悪性度を判定する判定手段とを具備する。【選択図】図７
2015083994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞核染色された細胞を計測する計測部と、
前記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部と、
前記ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求め、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ（前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く）に基づいてがんの悪性度を判定する判定手段と
を具備する細胞解析装置。
【請求項２】
判定手段は、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項３】
判定手段は、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、
（式１）＝全細胞数−（前記弱領域細胞の総数＋前記強領域細胞の総数）
を算出し、
前記強領域細胞の総数と（式１）との比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項１に記載の細胞解析装置。
【請求項４】
細胞核染色された細胞を計測して、蛍光強度のヒストグラムを得るステップと、
前記ヒストグラムのデータから、正常細胞のピークを検出するステップと、
前記ピークよりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求めるステップと、
前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ（前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く）に基づいてがんの悪性度を判定する判定する判定ステップと
を具備する細胞解析方法。
【請求項５】
判定ステップでは、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項４に記載の細胞解析方法。
【請求項６】
判定ステップでは、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、
（式１）＝全細胞数−（前記弱領域細胞の総数＋前記強領域細胞の総数）
を算出し、
前記強領域細胞の総数と（式１）との比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項４に記載の細胞解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞解析装置及び細胞解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、病理標本作成の後に細胞検査士や病理医によって組織切片による病理診断が行われている。
【０００３】
標本作成や細胞検査士や病理医による診断のためには熟練した技術が必要であり、更に、技術の差により診断結果に違いが生じる虞もある。また、組織摘出から診断を行うまでには、組織固定・切片作成・染色といった手技が必要であり、細胞検査士等を一定時間拘束する。このため、診断までの手技を自動化することが求められている。
【０００４】
更に、手術中に摘出した組織が腫瘍か正常組織か判別することも腫瘍の部位や術式によって必要であり、細胞診断や凍結切片による迅速診断が行われているが、通常の病理診断と比較して、より高度な技術・診断精度が要求される。
【０００５】
また、病理医にとっては術中一定時間拘束される摘出した固形組織のがん細胞迅速診断を、自動でより客観的に行う装置があれば、非常に有用であると考えられる。更に、腫瘍断端の組織の解析を行うことは、迅速病理診断では一断面でしか診断できなかったものが、組織中の細胞全体を解析出来ることにつながり、このような装置の開発及び提供が望まれている。
【０００６】
そこで、従来においては、フローサイトメトリー法を用いて、フローセルを流れる測定試料から蛍光を検出して、測定対象細胞の大きさを反映した値と、測定対象細胞の核の大きさを反映した値とに基づいて測定対象細胞の異常を判定するようにした細胞分析装置が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１０３６８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記のような病理診断の分野における現状に鑑みてなされたもので、その目的は、フローサイトメータによる測定結果を応用して、極めて容易にしかも高精度でがんの悪性度解析を行うことが可能な細胞解析装置及び細胞解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞解析装置は、細胞核染色された細胞を計測する計測部と、前記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部と、前記ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求め、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ（前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く）基づいてがんの悪性度を判定する判定手段とを具備する。
【００１０】
本発明に係る細胞解析装置では、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する。
【００１１】
本発明に係る細胞解析装置では、判定手段は、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、全細胞数−（前記弱領域細胞の総数＋前記強領域細胞の総数）を算出し、前記強領域細胞の総数と（式１）との比に基づいてがんの悪性度を判定する。
【００１２】
本発明に係る細胞解析方法は、細胞核染色された細胞を計測して、蛍光強度のヒストグラムを得るステップと、前記ヒストグラムのデータから、正常細胞のピークを検出するステップと、前記ピークよりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求めるステップと、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ（前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く）に基づいてがんの悪性度を判定する判定する判定ステップとを具備する。
【００１３】
本発明に係る細胞解析方法では、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する。
【００１４】
本発明に係る細胞解析方法では、判定ステップでは、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、（式１）＝全細胞数−（前記弱領域細胞の総数＋前記強領域細胞の総数）を算出し、前記強領域細胞の総数と（式１）との比に基づいてがんの悪性度を判定する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ（前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く）に基づいてがんの悪性度を判定するので、フローサイトメータにより得られた結果を用いて容易に、がんの悪性度を解析可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る方法により解析を行う診断システムの概略構成図。
【図２】本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器を示す側面図。
【図３】本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器の要部断面図。
【図４】本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器を示す組立斜視図。
【図５】本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器の組織取り込みの過程を示す斜視図。
【図６】本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器を用いた細胞浮遊液生成過程を示す工程図。
【図７】フローサイトメータによる蛍光強度のヒストグラムの一例を示す図。
【図８】本発明に係る細胞解析装置の実施形態による動作を説明するためのフローチャート。
【図９】本発明に係る細胞解析装置の実施形態において用いたスレッショルドを示す図。
【図１０】病理診断によるがん悪性度解析結果をプロットした図。
【図１１】図９について、平均値と標準偏差を求めて示した図。
【図１２】図１０についてスレッショルドの境界線と共に示した図。
【図１３】病理診断の結果と、本発明に係る細胞解析装置の実施形態による解析結果の対比を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下添付図面を参照して、本発明に係るがんの細胞解析装置及びその方法の実施例を説明する。各図において、同一の構成要素には同一の符号を付して重複する説明を省略する。細胞単離機器２と本発明の細胞解析装置の実施形態に係るがん悪性度解析装置４を用いて構成される診断システム１を図１に示す。悪性度解析装置４はフローサイトメータ６とコンピュータ７により構成される。言うまでもなく、それぞれ別の装置とせずにフローサイトメータ６にコンピュータ７の機能を持たせてもよい。図２に示すように、細胞単離機器２は、試薬を入れるための容器２０に挿入された状態で自動細胞前処理装置５にセットされる。
【００１８】
図３に示すように、細胞単離機器２は、透明あるいは半透明であって試薬と反応しない樹脂性の筒体２１と底蓋部３１を備える。筒体２１は、上側部に厚肉帯部２２を有し、厚肉帯部２２における外径は、試薬が入れられる試験管などの容器２０の内径とほぼ同一であり、容器２０の口部内壁に接触した状態で挿入される。
【００１９】
図３、図４に示すように、筒体２１の厚肉帯部２２の外壁には、筒体２１の直径を挟んで対称な位置に摘片２３、２４が設けられている。摘片２３と厚肉帯部２２との間には、容器２０における開口部の端部２０ａが入り込み挟持される挟持溝２３ａが形成されている。この挟持溝２３ａは、容器２０と嵌合した細胞単離機器２の装着姿勢を確認するための嵌合部として機能する。
【００２０】
摘片２４は摘片２３とは異なる形状を有しており、容器２０に挿入された状態の細胞単離機器２は、例えば摘片２４が自動細胞前処理装置５の固定孔５１に挿入されてセットされる。固定孔５１には、フォトインタラプタや近接スイッチなどのセンサが備えられている。センサは、摘片２４が適切に挿入されたか否かを検出する信号を制御部へ送出し、制御部は不適切な場合にアラームを発生する。このため、摘片２４と摘片２３とによって、自動細胞前処理装置５に対する細胞単離機器２の誤セットを防止可能となっている。
【００２１】
筒体２１の下端部はやや細径のスリーブ端部２５となっており、傾斜面によって切り取られた形状を有している。この筒体２１におけるスリーブ端部２５の傾斜面には、網２６が張設されている。この網２６は、例えば樹脂あるいは金属性であり、例えば４０μメッシュ径の粗さを有し、スリーブ端部２５の傾斜面にウエルダーなどにより張設される。
【００２２】
摘片２４が自動細胞前処理装置５の固定孔５１にセットされたとき、網２６の最低部分が手前側に位置し、図１に示される自動細胞前処理装置５のノズル５４が下降した状態では、ノズル５４の先端が網２６の最低部分に近接することになる。ノズル５４には、その先端から長手方向（図１の縦方向）にスリット５４ａが形成されており、後に説明するピッペッティングのときに、微細化された組織がノズル５４に詰まってピッペッティングが妨げられる不具合を防止するようにノズルの先端に切込みが入った形で構成されている。
【００２３】
スリーブ端部２５の最下端部には組織取得手段であるスプーン２７が突出して形成されている。スプーン２７は、スリーブ端部２５から真直ぐに下方へ延びる柄部２７ａと、柄部２７ａの先端からほぼ直角に筒体２１における内径側へ折れ曲がった掻取部２７ｂとを有し、掻取部２７ｂの中央部２７ｂｂは凹状容器形状に形成され、組織を掻き取ると共に掻き取った組織を保持する場合に作業が容易な形状となっている。組織取得手段は、このような要件が満たされるものであれば、スプーン形状に限定されない。
【００２４】
筒体２１の厚肉帯部２２における直下の外壁には、空気抜用の孔２８が形成されており、液が底側から貯液されてゆく場合に、筒体２１と容器２０との間隙２９に存在する空気が上記孔２８を介して筒体２１の上側開口部から抜ける。このため、適切なピペッティングの処理が確保される。
【００２５】
底蓋部３１は、筒状の本体部３２と半球形殻体３３とにより構成された有底管である。本体部３２の開口端部３４は、筒体２１におけるスリーブ端部２５の傾斜面に一致させた傾斜面となっている。開口端部３４の内壁部３５は、上記筒体２１におけるスリーブ端部２５が挿入される薄肉の内壁となっている。
【００２６】
本体部３２の上部側と下部側には、それぞれ内外を繋ぐ孔３６、３７が形成されている。孔３６、３７は、筒体２１におけるスリーブ端部２５が底蓋部３１へ挿入された状態においても内外を繋ぎ、本体部３２へ流入した液を筒体２１と容器２０との間隙２９に流出させ、また、ピッペティングによる細胞浮遊液の吸引の場合には、筒体２１と容器２０との間隙２９から液を呼び戻すように働くものである。
【００２７】
更に、ピッペティングによって発生した気泡により組織の撹拌が妨げられることがある。その場合、孔３６、３７があることによって、気泡を孔３６から抜くとともに孔３７から液を呼び込むことができる。さらには網２６が傾斜していることにより、孔３６からの脱気が効率よく行うことができる。
【００２８】
半球形殻体３３の外壁には、容器２０の壁に当接して姿勢を安定させる脚部３８が設けられている。脚部３８は、概ね三角形形状であり、容器２０の底壁や内側壁に当接して、厚肉帯部２２と協働し、容器２０内において細胞単離機器２を揺動させることなく、安定した状態で保持する。脚部の形状は、三角形形状に限られることはなく、細胞単離機器２を安定した状態で保持可能であればどのような形状でも良い。
【００２９】
以上の通りに構成された細胞単離機器２を用いて細胞浮遊液を得る場合には、容器２０に細胞処理薬３０を入れたものを用いる。この細胞処理薬３０としては、例えば、10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機（KYOWA VAC RLE−52ES：共和真空技術製）を用い凍結乾燥させた試薬を用いることができる。この試薬については、本願の発明者らが既に出願済みの特願２００９−２４４７０２号に詳細を譲る。勿論、試薬は凍結乾燥したものに限られるものではなく、また、液体の試薬の場合には、自動細胞前処理装置５から供給するようにしても良い。更に試薬にデキストリンを添加してもよい。
【００３０】
解析対象である組織６１を図５に示すようにシャーレ６２に入れて、適量を筒体２１のスプーン２７によって掻き取り、スプーン２７に載せた状態において底蓋部３１を筒体２１に結合する。次に、上記細胞処理薬３０が入っている容器２０に細胞単離機器２を挿入して嵌合する。このように、細胞単離機器２によって、ピンセットなど他の器具を用いずに、容易に組織を掻き取り、測定キットにセットすることができる。
【００３１】
次に、図１に示した自動細胞前処理装置５の例えば上下にスライドする蓋５２を開けて、固定孔５１に細胞単離機器２の摘片２４を挿入すると共に、容器２０の底部を位置決孔５３に挿入して、容器２０が適切に支持されるようにセットする。
【００３２】
この後、自動細胞前処理装置５の蓋５２を閉めると、自動細胞前処理装置５は前処理の動作を図６に示すように行う。まず、自動細胞前処理装置５はノズル５４を降下させて２ｍｌの希釈液であるリン酸緩衝液を吐出する（Ｓ１１）。次に、ノズル５４を上昇させてノズル５４から自動細胞前処理装置５の吸引吐出機構部に空気層を生成する（Ｓ１２）。
【００３３】
再び、ノズル５４を下降させて試薬３０とリン酸緩衝液と組織６１が混合された細胞浮遊液５５を出し入れするピペッティングを所要時間行う（Ｓ１３）。この所要時間は、脳腫瘍組織の測定においては５分程度で十分な結果が得られた。次に、ノズル５４を下降させた状態において試料としての細胞浮遊液５５を吸引してフローサイトメータ６による測定をスタートさせる（Ｓ１４）。吸引される細胞浮遊液は、網２６を介してろ過されたものを得ることができる。
【００３４】
自動細胞前処理装置５は、測定が終了すると、例えば警報音等により終了を報知するので、操作者は、自動細胞前処理装置５の蓋５２を開けて細胞単離機器２がセットされた状態の容器２０を取り出し、全てを医療廃棄物のダストボックス５６へ廃棄する（Ｓ１５）。
【００３５】
自動細胞前処理装置５により吸引された細胞浮遊液は、悪性度解析装置４を構成するフローサイトメータ６に送られる。フローサイトメータ６は細胞浮遊液を用いて、単離・細胞核染色された細胞を計測して、イベント毎の蛍光信号のピーク値と積分値により図示しないスキャッタグラムを得る。このスキャッタグラムに適切なゲート処理を行い、シングル細胞と思われるイベントから蛍光強度積分値のヒストグラムを得る。このヒストグラムは、図示しないＬＣＤなどの表示器に表示される。このように、フローサイトメータ６は、細胞核染色された細胞を計測する計測部及び上記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部として機能する。
【００３６】
このヒストグラムは、図７に示すようである。Ｐ１は、Ｇ０／Ｇ１期細胞群によるピークであり、Ｐ２はＤＮＡ量が正常とは異なる腫瘍細胞を指すＤＮＡ Aneuploidyの細胞群によるピークであり、Ｐ３はＧ２／Ｍ期細胞群によるピークである。フローサイトメータ６により得られた蛍光強度のヒストグラムに係るデータはコンピュータ７へ送られる。
【００３７】
コンピュータ７には、判定手段が備えられている。判定手段は、ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞数を求め、この強領域細胞数と前記ヒストグラムに基づいてがんの悪性度を判定する。
【００３８】
フローサイトメータ６とコンピュータ７の判定手段によって構成される悪性度解析装置４による動作は、図８に示されるフローチャートによる示すことができる。蛍光強度のヒストグラムを作成する（Ｓ２１）は、フローサイトメータ６によって行われる。
【００３９】
次に、判定手段により、ヒストグラムのデータから正常細胞のピーク検出が行われる（Ｓ２２）。即ち、図７に示したＧ０／Ｇ１期細胞群によるピークＰ１を求め、その終了点ＰＦを確定する。具体的には、細胞数が所定数（例えば１０）以下となるポイントをサーチする。
【００４０】
次に、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞数Ｓを求める（Ｓ２３）。図７においては、ＰＦよりも右側に示されている領域Ｒに分布する細胞数を求める。更に、蛍光強度のヒストグラムにおける全細胞数Ａを求め（Ｓ２４）、ここでは強領域細胞数Ｓと全細胞数Ａの比（Ｓ／Ａ）をスレッショルドＴＨと比較し、悪性度を得てコンピュータ７の表示器や図示しないプリンタから出力する（Ｓ２５）。
【００４１】
スレッショルドＴＨを図９に示す。これは、次のようにして得たものである。実際に病理診断を行い、正常とグレード（grade）２〜４に分けて強領域細胞数Ｓの比（Ｓ／Ａ）をプロットすると図１０のように分布が得られた。この結果について、正常とグレード（grade）２〜４とのそれぞれの平均値と標準偏差を求めると図１１のように求まる。求められたそれぞれの平均値と標準偏差を用いて計算を行い、上記図９のスレッショルドＴＨを得たものである。
【００４２】
図１０に示されている病理診断の結果による分布に対し、スレッショルドＴＨの境界値Ｋ１（６．１％）、Ｋ２（２０．６％）、Ｋ３（４０％）を図示すると図１２のようになる。病理診断の結果としてえられた正常（０）及びグレード（grade）２〜４について、本実施形態に係る細胞解析方法を実施して得られた結果を図の横方向に分解して示した表が図１３（ａ）である。つまり、病理診断の結果が正常（０）である４６ケースを、本実施形態では、正常（０）が３６ケースとグレード２が１０ケースであるとの解析結果になったことを示す。これにより、図１３（ｂ）の「True negative」に示すように、本実施形態では７８％の確率で正常と判断し、図１３（ｂ）の「False positive」に示すように、２２％の確率で悪性度ありと判定することが確かめられた。
【００４３】
また、病理診断でグレード２〜４の１０９ケースについて、本実施形態では図１３（ｂ）の「False negative」に示すように、５％の確率で正常と判定し、図１３（ｂ）の「True positive」に示すようにグレード２〜４であると判定することが確かめられた。
【００４４】
尚、上記の実施形態で用いたスレッショルドＴＨは、対象とする組織等により適宜変更し得るものである。また、上記では強領域細胞数Ｓと全細胞数Ａの比（Ｓ／Ａ）を用いて判定を行ったが、正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞数Ｗを求め、弱領域細胞数Ｗと強領域細胞数Ｓとの比に基づき重み付けをして判定を行うようにしても良い。この処理は、別言すれば判定手段の判定を弱領域細胞数により補正することを意味する。その他、全細胞数Ａ、強領域細胞数Ｓ、弱領域細胞数Ｗを組み合わせて差分を得て、これを用いて悪性度を判定する等の様々の手法を採用することができる。
【００４５】
ここでは、がんの悪性度の判定は、正常及びグレードの判定を説明したが、単にがん細胞の有無の判定に用いることができることは言うまでもない。
【符号の説明】
【００４６】
２  細胞単離機器
４  悪性度解析装置
５  自動細胞前処理装置
６  フローサイトメータ
７  コンピュータ
２０  容器
２１  筒体
２６  網
２７  スプーン
３８  脚部
【図１】
2015083994.tif 000003
【図２】
2015083994.tif 000004
【図３】
2015083994.tif 000005
【図４】
2015083994.tif 000006
【図５】
2015083994.tif 000007
【図６】
2015083994.tif 000008
【図７】
2015083994.tif 000009
【図８】
2015083994.tif 000010
【図９】
2015083994.tif 000011
【図１０】
2015083994.tif 000012
【図１１】
2015083994.tif 000013
【図１２】
2015083994.tif 000014
【図１３】
2015083994.tif 000015