(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内（細胞中など）でのビタミンＣの挙動を解明しうるバイオイメージングにおいて、従来法よりも応答高速化・高感度化された、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供する。前記目的の為、新規レドックス応答性蛍光プローブ、並びにそれを用いたレドックス分子の検出法及び定量法の提供。【解決手段】アルブミン、特にウシ血清アルブミン等の生体分子、及びニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体を含む複合体からなる蛍光プローブ、並びにそれを用いた生体内外におけるビタミンＣの検出法及び定量法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子；及び
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンを含む複合体からなるレドックス応答性蛍光プローブ。
【請求項２】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式Ｉ：
【化１３】
2015083549.tif 000015
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はアリールスルファニル基であるか、あるいはニトロキシドラジカルであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在し、
また、窒素原子を含む置換基は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい〕
で表される化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩ：
【化１４】
2015083549.tif 000016
〔式中、
Ｘ、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はアリールスルファニル基であるか、あるいはニトロキシドラジカルであり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４であり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、あるいは単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在し、
また、窒素原子を含む置換基は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい〕
で表される化合物である、請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｍが、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素から選択される原子であり、１又は２個の軸配位子Ｌが存在する、請求項２又は３に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩＩ：
【化１５】
2015083549.tif 000017
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルであり、他方は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はアリールスルファニル基であるか、あるいはニトロキシドラジカルであり；
Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、あるいは単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基であり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である〕
で表される錯体である、請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｘが、Ｎである、請求項２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
Ｌ、Ｌ1又はＬ2、あるいはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8におけるニトロキシドラジカルが、下記式ＩＶ：
【化１６】
2015083549.tif 000018
〔式中、
Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・に隣接する２つの原子は、炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成し、；
Ｚは、結合、又はスペーサーである〕
である、請求項２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である、請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項９】
環原子と一緒になって形成されるニトロキシドラジカルを含む環が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）又は２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）である、請求項２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項１０】
生体分子が、アルブミンである、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項１１】
試料中のレドックス分子を検出する方法であって、
（１）励起光の照射下、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブと、試料とを接触させる工程；及び
（２）発光をモニターする工程、を含む方法。
【請求項１２】
試料中のレドックス分子を定量する方法であって、
（１）励起光の照射下、請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブと、試料とを接触させる工程；
（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び
（３）試料中のレドックス分子の濃度を決定する工程、を含む方法。
【請求項１３】
生体内のレドックス分子を検出する方法であって、
（１）請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブを、被験動物（ヒトを除く）に投与する工程；及び
（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程、を含む方法。
【請求項１４】
レドックス分子が、ビタミンＣである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子；及びニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンを含む複合体からなるレドックス応答性蛍光プローブ、並びにそれを用いたレドックス分子の検出法及び定量法に関する。具体的に本発明は、アルブミンとニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体とからなる複合体を含む蛍光プローブ、並びにそれを用いた生体内外におけるビタミンＣの検出法及び定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＣ（アスコルビン酸）は、水溶性ビタミンの一種であり、広く植物界に分布するが、とくに果物類、緑黄色野菜類などに多く含まれていることが知られている。ビタミンＣは、生体内において重要な役割を果たしており、その例として（１）アミノ酸生合成への利用、（２）副腎からのホルモン分泌、（３）脂肪酸をミトコンドリアに運ぶための担体であるＬ−カルニチンの合成などが挙げられる。また、結合組織でコラーゲンを生成する際に必要とされるため、ビタミンＣ不足により壊血病の症状（歯のぐらつき・血管の脆弱化・皮膚からの出血・怪我の回復や免疫機能の低下・軽度の貧血など）を呈するようになる。
【０００３】
ヒトはビタミンＣを体内で合成することができないため、必要量をすべて食品などを通じて外部から摂取しなければならない。さらにビタミンＣは、レドックス分子の一種であり、強力な抗酸化活性を有することが知られている。したがって、抗酸化ビタミンとして、又は食品添加物である酸化防止剤として、加工・健康食品などへの添加が広く行なわれている。
【０００４】
食品又は生体由来試料中のビタミンＣの検出法及び定量法としては、例えば、ＨＰＬＣ法、ヒドラジン比色法及びインドフェノール法などが従来から用いられている。その他、アスコルビン酸酸化酵素の存在下、還元型アスコルビン酸と酸素から酸化型アスコルビン酸と過酸化水素を生成する反応と、生成した過酸化水素と色源体とをパーオキシダーゼの存在下に反応させて色素を生成する反応とを同一反応系で行わせ、生成する色素を定量することによって試料中のアスコルビン酸を定量する方法（例えば、特許文献１参照）や、ビタミンＣを含む試料にｏ−フェニレンジアミンを加え、この試料に偏光性をもたせた励起光を照射し、これにより生じる蛍光の偏光度を測定し、その測定値に基づきビタミンＣを定量する方法（例えば、特許文献２参照）などが報告されている。しかしながら、これらの定量法には、前処理等の操作が煩雑である、定量に多くの時間を要する、及び／又は精度に劣るなどの問題点が依然として存在する。
【０００５】
さらに近年、ビタミンＣと老化の関係が注目されているだけでなく、ビタミンＣの高濃度投与ががん治療に効果的であることが報告されている。例えば、がん治療に関しては２００５年に発表された「Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells（薬理学的濃度のアスコルビン酸はがん細胞を選択的に殺す）」という論文が注目されており、高濃度のビタミンＣを点滴することががん治療に有効であるという結果が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、生体内でのビタミンＣの正確な挙動についてははっきりと解明されていないという現状があり、バイオイメージング技術などを利用して、その生体内機能を解明することが強く期待されている。しかしながら、上記のいずれの方法を用いても、ビタミンＣのバイオイメージングへの応用は不可能である。
【０００６】
バイオイメージングへの応用可能性のある方法として、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法が挙げられ、例えば、ダンシル基、ピリル基のような蛍光発色団とニトロキシドラジカルからなるデュアル分子を蛍光プローブとして用いる方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、かかる蛍光プローブは、励起光・蛍光ともに生体組織透過性の低い波長領域（６５０nm以下）であるため、蛍光バイオイメージングへの応用は困難である。
【０００７】
本発明者らは、これまでにポルフィリン又はフタロシアニンの光物理的性質について報告してきた（例えば、非特許文献３〜５参照）。その中で、ニトロキシドラジカルにフタロシアニンの蛍光を強く消光する働きがあることを明らかにした（例えば、非特許文献６〜９参照）。一方、ニトロキシドラジカルは、ビタミンＣ（やその他の少数の反応活性物質）と反応して不対電子を失う（ラジカルではなくなる）ことも知られている。本発明者らはこれらの点に注目し、ビタミンＣとの反応による発光強度増大から、ビタミンＣ濃度を定量・検出できるのではないかと考え、研究を重ねてきた。その結果、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなるレドックス応答性蛍光プローブ及びそれを含有するリポソーム製剤、並びにそれらを用いる発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を見出した（例えば、特許文献３参照）。該リポソーム製剤は、細胞内における様々な還元物質の影響受けず、ビタミンＣを特異的に検出及び定量できることなどから、ビタミンＣの蛍光バイオイメージングへの応用が期待されるものであったが、ビタミンＣとリポソームに取り込まれたポルフィリン又はフタロシアニンとが反応しづらく、応答速度や感度の改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４０７３９６３号
【特許文献２】特開平１１−３２６２０７号公報
【特許文献３】特開２０１０−２４１７９４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Qi chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (38), 13604-13609 (2005)
【非特許文献２】E. Lozinsky et al., J. Biochem. Biophys. Methods 38, 29-42 (1999)
【非特許文献３】K. Ishii et al., The Porphirin Handbook; ed by K. Kadish, R. M. Smith and R. Guilard, Academic Press, Volume 16, 1-42 (2003)
【非特許文献４】H. Miwa, K. Ishii et al., Chem. Eur. J. 10, 4422-4435 (2004)
【非特許文献５】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 109 (26), 5781-5787 (2005)
【非特許文献６】K. Ishii et al., J. Porphyrins Phthalocyanines 3, 439-443 (1999)
【非特許文献７】K. Ishii et al., J. Am. Chem. Soc. 123 (4), 702-708 (2001)
【非特許文献８】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 105 (28), 6794-6799 (2001)
【非特許文献９】K. Ishii et al., J. Phys. Chem. A 108 (16), 3276-3280 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来法の問題点を克服しうる、新規なレドックス分子の検出法及び定量法を提供すること、特に、研究目的の生体内（細胞中など）でのビタミンＣの挙動を解明しうるバイオイメージングにおいて、従来法よりも応答高速化・高感度化された、発光によるビタミンＣの検出法及び定量法を提供することである。本発明の目的はまた、かかる方法において有用な新規蛍光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち本発明は、以下１〜１４に挙げるような、生体分子；及びニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンを含む複合体からなるレドックス応答性蛍光プローブ、並びにそれらを用いる発光によるレドックス分子、特にビタミンＣの検出法及び定量法を提供するものである。
【００１２】
１．生体分子；及びニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンを含む複合体からなるレドックス応答性蛍光プローブ。
２．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式Ｉ：
【００１３】
【化１】
2015083549.tif 000002
【００１４】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はアリールスルファニル基であるか、あるいはニトロキシドラジカルであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在し、
また、窒素原子を含む置換基は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい〕
で表される化合物である、上記１に記載の蛍光プローブ。
３．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩ：
【００１５】
【化２】
2015083549.tif 000003
【００１６】
〔式中、
Ｘ、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｍは、Ｈ2であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子であり；
Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、１又は２個の軸配位子Ｌが存在していてもよく、ここでＬは、独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はアリールスルファニル基であるか、あるいはニトロキシドラジカルであり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４であり；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、あるいは単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよいが；
但し、化合物には少なくとも１個のニトロキシドラジカルが存在し、
また、窒素原子を含む置換基は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい〕
で表される化合物である、上記１又は２に記載の蛍光プローブ。
４．Ｍが、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素から選択される原子であり、１又は２個の軸配位子Ｌが存在する、上記２又は３に記載の蛍光プローブ。
５．ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、下記式ＩＩＩ：
【００１７】
【化３】
2015083549.tif 000004
【００１８】
〔式中、
Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）であり；
Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルであり、他方は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基又はアリールスルファニル基であるか、あるいはニトロキシドラジカルであり；
Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、あるいは単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基であり；
ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である〕
で表される錯体である、上記１〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
６．Ｘが、Ｎである、上記２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
７．Ｌ、Ｌ1又はＬ2、あるいはＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8におけるニトロキシドラジカルが、下記式ＩＶ：
【００１９】
【化４】
2015083549.tif 000005
【００２０】
〔式中、
Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成し、；
Ｚは、結合、又はスペーサーである〕
である、上記２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
８．ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である、上記１〜７のいずれかに記載の蛍光プローブ。
９．環原子と一緒になって形成されるニトロキシドラジカルを含む環が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）又は２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）である、上記２〜６のいずれかに記載の蛍光プローブ。
１０．生体分子が、アルブミンである、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブ。
１１．試料中のレドックス分子を検出する方法であって、
（１）励起光の照射下、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブと、試料とを接触させる工程；及び
（２）発光をモニターする工程、を含む方法。
１２．試料中のレドックス分子を定量する方法であって、
（１）励起光の照射下、上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブと、試料とを接触させる工程；
（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び
（３）試料中のレドックス分子の濃度を決定する工程、を含む方法。
１３．生体内のレドックス分子を検出する方法であって、
（１）上記１〜９のいずれかに記載の蛍光プローブを、被験動物（ヒトを除く）に投与する工程；及び
（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程、を含む方法。
１４．レドックス分子が、ビタミンＣである、上記１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のレドックス分子、特にビタミンＣを定量する方法の基本的な操作は、試料と蛍光プローブとを接触させ、発光強度時間変化を測定するだけという簡単なものであり（錯体濃度すら正確に調整する必要はない）、且つ精度良く定量することができる。発光強度時間変化で定量しているので、試料は溶液であっても懸濁液であってもよい。したがって、ＨＰＬＣ法に必要な機器調整や試料前処理、インドフェノール法の滴定など煩雑な操作は必要ない。
【００２２】
特に、本発明の生体内のレドックス分子、特にビタミンＣを検出する方法では、（１）蛍光プローブに含まれるニトロキシドラジカルを有するフタロシアニンが細胞内に到達すること、（２）蛍光プローブ（還元体）の励起光・蛍光の波長は、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）にあること、（３）ニトロキシドラジカルの還元により、十分な発光強度の増大が確認されたこと、（４）従来のリポソーム製剤と比較して、アルブミン−フタロシアニン複合体からなる蛍光プローブにより、応答速度及び感度の改善が確認されたことなどから、バイオ蛍光イメージングへの応用が期待できる。すなわち、蛍光顕微鏡で発光増大時間変化を追うことによって、生体内ビタミンＣ濃度分布を知ることができ、さらにはビタミンＣの生体内の働きを知るためのツールとしての利用が期待される。また、アルブミン−フタロシアニン複合体とすることにより、ビタミンＣ以外の反応活性物質（鉄二価イオン、スーパーオキサイドなど）によって発光強度に影響が及ばないことから選択性の面で有利と期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】製造例１で得られた錯体であり、本発明のニトロキシドラジカルを有するフタロシアニン錯体の代表的な例：Ｒ１及びＲ２である。
【図２】本発明の発光によるビタミンＣの検出法及び定量法の反応模式図である。
【図３】実施例１のＢＳＡ−Ｒ２複合体を用いたビタミンＣ定量実験で得られた、発光強度時間変化を示したグラフである。
【図４】実施例２のＢＳＡ−Ｒ２複合体の動的挙動及び分布試験で得られた、マウス腹側におけるＢＳＡ−Ｒ２複合体の尾静脈投与による蛍光強度の経時変化を示した画像である。
【図５】実施例２のＢＳＡ−Ｒ２複合体の動的挙動及び分布試験で得られた、マウス腹側におけるＢＳＡ−Ｒ２複合体の尾静脈投与３時間後のビタミンＣ投与による蛍光強度の経時変化を示した画像である。
【図６】実施例２のＢＳＡ−Ｒ２複合体の動的挙動及び分布試験で得られた、マウス腹側におけるＢＳＡ−Ｒ２複合体の尾静脈投与２４時間後のビタミンＣ投与による蛍光強度の経時変化を示した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンは、その化学構造の一部に（例えば、軸配位子として、ポルフィリン又はフタロシアニン環への縮合環として、あるいはポルフィリン又はフタロシアニン環上の置換基として）ニトロキシドラジカルを含むポルフィリン又はフタロシアニンを意味する。本発明において「ポルフィリン」及び「フタロシアニン」という用語は、各々「ポルフィリン又はその誘導体」及び「フタロシアニン又はその誘導体」を意味する。したがって、本発明の「ポルフィリン」及び「フタロシアニン」いう用語は、ポルフィリン及びフタロシアニンと共に、サブポルフィリン、テトラベンゾポルフィリン、テトラナフトポルフィリン、Ｎ−混乱ポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラアザポルフィリン、サブフタロシアニン、ナフタロシアニン、スーパーフタロシアニンのような類縁体、及びそれらの置換誘導体を含む。本発明の化合物は、ニトロキシドラジカルの不対電子を失う（ラジカルではなくなる）と、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）での発光強度の増大を示す。
【００２５】
本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンは、好ましくは、下記式Ｉ：
【００２６】
【化５】
2015083549.tif 000006
【００２７】
で表される化合物であり、より好ましくは、下記式ＩＩ：
【００２８】
【化６】
2015083549.tif 000007
【００２９】
で表される化合物である。式Ｉ又はＩＩにおいて、Ｘは、Ｎ又はＣＲ′（ここで、Ｒ′は、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、アリール基又は含窒素ヘテロシクリル基である）を意味する。Ｘは、好ましくはＮである。
【００３０】
式Ｉ又はＩＩにおいて、Ｍは、Ｈ2（すなわち、メタルフリー）であるか、あるいは周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子、例えば、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｔｈ又はＵから選択される原子である。好ましくは、Ｍは、周期表第２族、又は第１２〜１５族の元素、例えばＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｉｎ又はＳｎから選択される原子である。
【００３１】
より好ましくは、Ｍが周期表第１４族の元素から選択される原子であり、特に好ましくは、ＭがＳｉであり、２個の軸配位子Ｌが存在する化合物、すなわち、下記式ＩＩＩ：
【００３２】
【化７】
2015083549.tif 000008
【００３３】
で表される錯体である。式ＩＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉ又はＩＩと同義であるが、好ましくはＮである。すなわち、ニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体が特に好ましい。
【００３４】
式Ｉ又はＩＩにおいて、ニトロキシドラジカルは、Ｍが周期表第２〜４族、又は第８〜１５族の元素から選択される原子である場合、軸配位子Ｌとして存在していてもよく、あるいは式Ｉにおいて、ポルフィリン又はフタロシアニン環上の置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7又はＲ8として存在してもよい。また式ＩＩＩの化合物において、軸配位子Ｌ1及びＬ2の一方は、ニトロキシドラジカルである。そのような軸配位子又は置換基としてのニトロキシドラジカルは、＞Ｎ−Ｏ・を含む基であればよいが、好ましくは、下記式ＩＶ：
【００３５】
【化８】
2015083549.tif 000009
【００３６】
で表されるものである。式ＩＶにおいて、Ｙは、Ｎと一緒になって、５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成する。ニトロキシドラジカルは、好ましくは、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）、２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ（ＰＲＯＸＹＬ）、４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ（ＤＯＸＹＬ）又はニトロニルニトロキシド（ＮＮ）から選択される５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環構造を含む基である。
【００３７】
【化９】
2015083549.tif 000010
（式中、Ｒは、Ｃ1-18−アルキル基などを意味する）
【００３８】
式ＩＶにおいて、Ｚは、結合であるか、又は−Ｏ−、−（ＣＨ2）1-18−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−若しくは−ＣＯＮＨ−、−ＳｉＲ″2−、−ＰＲ″−、−Ｓ−、１，２，３−トリアゾールジイル又はそれらの組み合わせなどの錯体中心原子Ｍ又はポルフィリン又はフタロシアニン環へのスペーサーである。ここで、Ｒ″は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基又はアリール基である。
【００３９】
別の態様として、式Ｉ又はＩＩにおいて、ニトロキシドラジカルは、ポルフィリン又はフタロシアニン環への縮合環として存在してもよい。すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4、Ｒ5とＲ6、及び／又はＲ7とＲ8が、「それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい」とは、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4、Ｒ5とＲ6、及び／又はＲ7とＲ8が、それらが結合する炭素原子と一緒になって形成した芳香環若しくは含窒素ヘテロ環において、さらに該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になって、＞Ｎ−Ｏ・基を含む５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成することを意味する。好ましい環は、前記のＴＥＭＰＯ、ＰＲＯＸＹＬ、ＤＯＸＹＬ又はＮＮで示されるような５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環である。特に好ましくは、ＴＥＭＰＯ又はＰＲＯＸＹＬである。
【００４０】
同様に、式ＩＩにおいて、「ｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい」とは、各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及び／又はＲｄが、その２個の隣接する環原子と一緒になって、＞Ｎ−Ｏ・基を含む５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環（ここで、＞Ｎ−Ｏ・基に隣接する２つの原子は、炭素原子であり、そして含窒素ヘテロ環は、追加のＮ若しくはＯ原子を含んでいてもよい）を形成することを意味する。好ましい環は、前記のＴＥＭＰＯ、ＰＲＯＸＹＬ、ＤＯＸＹＬ又はＮＮで示されるような５〜６員の飽和若しくは部分不飽和の含窒素ヘテロ環である。特に好ましくは、ＴＥＭＰＯ又はＰＲＯＸＹＬである。そのような式ＩＩの化合物の例としては、以下：
【００４１】
【化１０】
2015083549.tif 000011
【００４２】
（式中、Ｍは、前記と同義である）が挙げられる。かかる化合物は、例えば、Anthony G. M. Barrett, et al., Tetrahedron 63 (24), 5244-5250 (2007) に記載の方法に従って、調製することができる。
【００４３】
本発明の式Ｉにおいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、互いに独立して、水素原子、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、又はニトロキシドラジカルであるか、あるいは
Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、
Ｒ5及びＲ6は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、又は
Ｒ7及びＲ8は、それらが結合する炭素原子と一緒になって、芳香環若しくは含窒素ヘテロ環を形成し、該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいは該芳香環若しくは含窒素ヘテロ環の２個の隣接する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよい。
また、窒素原子を含む置換基（例えば、ジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基又は含窒素ヘテロシクリル基など）は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。
【００４４】
上記「Ｒ1及びＲ2は、それらが結合する炭素原子と一緒になって芳香環又は含窒素ヘテロ環を形成し」とは、Ｒ1及びＲ2が、それらが結合するピロール環部分の２個の炭素原子と一緒になって、芳香環、例えば、ベンゼン又はナフタレン環を形成するか、あるいは含窒素ヘテロ環、例えば、ピリジン又はピラジン環のような、少なくとも１個、好ましくは１又は２個の窒素原子を含む、５〜６員の飽和、部分不飽和又は不飽和環を形成することを意味する。「Ｒ3及びＲ4」、「Ｒ5及びＲ6」、「Ｒ7及びＲ8」についての同様の記載も前記と同義である。
【００４５】
本発明の式ＩＩの化合物は、本発明の式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2、Ｒ3及びＲ4、Ｒ5及びＲ6、並びにＲ7及びＲ8が、各々それらが結合する炭素原子と一緒になってベンゼン環を形成したものに相当する。したがって、式ＩＩにおいて、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、あるいは単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基であるか、あるいはｎが２である場合、２個の隣接する各Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それらが結合する環原子と一緒になってニトロキシドラジカルを含む環を形成してもよく、ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である。
また、窒素原子を含む置換基（例えば、ジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基又は含窒素ヘテロシクリル基など）は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。
【００４６】
本発明の式ＩＩＩの錯体は、さらに本発明の式ＩＩにおいて、Ｍが、少なくとも一方がニトロキシドラジカルである軸配位子Ｌ1及びＬ2を有するＳｉ（ケイ素）であるものに相当する。したがって、式ＩＩＩにおいて、Ｒａ′、Ｒｂ′、Ｒｃ′及びＲｄ′は、互いに独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、あるいは単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基であり、ｎは、互いに独立して、０、１、２、３又は４である。
また、窒素原子を含む置換基（例えば、ジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基又は含窒素ヘテロシクリル基など）は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。
【００４７】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、他に記載のない限り、「ハロゲン原子」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。好ましくは、塩素である。
【００４８】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルキル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、炭素数１〜１８の直鎖状又は分岐鎖状飽和炭化水素基を意味する。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、デシル、ドデシル、オクタデシルが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8−アルキル基が挙げられる。
【００４９】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルコキシ基」という用語は、酸素原子を介して結合する前記「Ｃ1-18−アルキル基」、すなわちＣ1-18−アルキル−Ｏ−基を意味する。例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｎ−ヘプチルオキシ、ｎ−オクチルオキシ、デシルオキシ、ドデシルオキシ、オクタデシルオキシなどが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8−アルコキシ基が挙げられる。
【００５０】
同様に、他に記載のない限り「トリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基」という用語において、かかる基に存在する３個の「Ｃ1-18−アルキル」部分は、同一であっても異なっていてよく、前記「Ｃ1-18−アルキル基」から選択される。そのようなトリ（Ｃ1-18−アルキル）シリルオキシ基の例としては、トリメチルシリルオキシ、トリエチルシリルオキシ、トリ−ｉｓｏ−プロピルシリルオキシ、トリ−ｎ−ヘキシルシリルオキシ、デシル−ジメチルシリルオキシ、ジメチル−オクタデシルシリルオキシなどが挙げられる。
【００５１】
同様に、他に記載のない限り「Ｃ1-18−アルキルアミノ基」及び「ジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基」という用語において、かかる基に存在する「Ｃ1-18−アルキル」部分は、前記「Ｃ1-18−アルキル基」から選択される。後者の場合、２個の「Ｃ1-18−アルキル」部分は、同一であっても異なっていてもよい。そのような「Ｃ1-18−アルキルアミノ基」の例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ｎ−ヘキシルアミノ、ｎ−オクチルアミノ、ドデシルアミノ、オクタデシルアミノなどが挙げられる。「ジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基」の例としては、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルイソプロピルミノ、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ジ−ｎ−ヘキシルアミノ、ジ−ｎ−オクチルアミノ、ジドデシルアミノ、ジオクタデシルアミノなどが挙げられる。
【００５２】
同様に、他に記載のない限り「−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル」という用語は、−Ｓ−Ｃ1-18−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ1-18−アルキル及び−Ｓ（Ｏ）2−Ｃ1-18−アルキルを含むことを意味する。好ましくは、−Ｓ−Ｃ1-8−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ1-8−アルキル及び−Ｓ（Ｏ）2−Ｃ1-8−アルキル、例えば、メチルチオ、エチルチオなどが挙げられる。また「−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8ＯＨ」という用語は、オキシエチレン（ＯＣＨ2ＣＨ2）単位が１〜８である、ヒドロキシ（ポリ）エチレンオキシド基を意味する。さらに「−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル」という用語は、オキシエチレン（ＯＣＨ2ＣＨ2）単位が１〜８である、アルキルエーテル（ポリ）エチレンオキシド基を意味する。好ましくは、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）2-4Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、例えば３，６，９−トリオキサデシルオキシなどが挙げられる。
【００５３】
同様に、他に記載のない限り「アリール基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、炭素数６〜１４の芳香族単環及び多環式炭化水素の一価の基を意味する。例としては、フェニル、ナフタチル、アントリル、フェナントリルなどが挙げられる。好ましいアリール基としては、フェニル又はナフチルが挙げられる。また「アリールオキシ基」という用語は、酸素原子を介して結合する前記「アリール基」、すなわちアリール−Ｏ−基を意味し、「アリールスルファニル基」という用語は、硫黄原子を介して結合する前記「アリール基」、すなわちアリール−Ｓ−基を意味する。例としては、フェノキシ、フェニルスルファニルなどが挙げられる。これらの「アリール基」はいずれも、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されていてもよい。また、Ｎを含む置換基（例えば、ジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基又は含窒素ヘテロシクリル基など）は、窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。
【００５４】
同様に、他に記載のない限り「含窒素ヘテロシクリル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、少なくとも１個、好ましくは１又は２個の窒素原子を含む、５〜６員の飽和、部分不飽和又は不飽和環の一価の基を意味する。例としては、ピロリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニルなどが挙げられる。「含窒素ヘテロシクリル基」は、非置換であるか、又はハロゲン原子、ヒドロキシ基、スルホ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｃ1-18−アルキル基、Ｃ1-18−アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ1-18−アルキルアミノ基若しくはジ（Ｃ1-18−アルキル）アミノ基、−Ｓ（Ｏ）0-2−Ｃ1-18−アルキル、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8−ＯＨ、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）1-8Ｏ−Ｃ1-6−アルキル、アリール基、含窒素ヘテロシクリル基、及び単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基から選択される１つ以上の置換基により置換されていてもよく、あるいは少なくとも１個の窒素原子へのプロトン又はＣ1-8−アルキル基の付加によりオニウムを形成してもよい。好ましい含窒素ヘテロシクリル基としては、ピリジル、ピラジニル又はまたはそのオニウム化合物（例えば、Ｎ−メチルピリジニウミル）が挙げられる。
【００５５】
同様に、他に記載のない限り「アシル基」という用語は、単独で、又は他の用語との組み合わせにおいて、−Ｃ（＝Ｏ）−を介して結合する前記「Ｃ1-18−アルキル基」、「アリール基」又は「含窒素ヘテロシクリル基」、すなわちＣ1-18−アルキル−Ｃ（＝Ｏ）−基、アリール−Ｃ（＝Ｏ）−基又は含窒素ヘテロシクリル−Ｃ（＝Ｏ）−基を意味する。例としては、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ラウリル、ステアロイル、ベンゾイル、ニコチノイル、イソニコチノイルなどが挙げられる。
【００５６】
同様に、他に記載のない限り「単糖、多糖又はクラウンエーテルを含む基」という用語は、Ｓ−、Ｎ−、Ｃ−及びＯ−グリコシド結合を介して結合する単糖（例えば、グルコース、ガラクトースなど）、二糖（例えば、スクロース、ラクトースなど）若しくはオリゴ糖などの多糖、あるいは直接または−Ｏ−、−Ｓ−などのスペーサーを介して結合する（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−）ｎで表されるクラウンエーテル（ｎ＝４〜８）を意味する。
【００５７】
本発明の蛍光プローブに用いられるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンの代表的な例を、以下の表１に示す。
【００５８】
【化１１】
2015083549.tif 000012
【００５９】
【表１】
2015083549.tif 000013
【００６０】
また、本発明の蛍光プローブに用いられるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンのその他の例として、以下の化合物が挙げられる。
【化１２】
2015083549.tif 000014
【００６１】
本発明の代表的な例として上記に挙げたフタロシアニナトケイ素錯体Ｒ１〜Ｒ６、Ｒ２ｃＳ及びＲ２ｃＮは、上記の非特許文献６〜９に記載の方法、又は下記の実施例に記載した手順に従って製造することができる。また、当業者であれば、これらの方法と技術常識に準じて、本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン、特に式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに包含される化合物を製造することができる。
【００６２】
本発明の蛍光プローブは、生体分子と、かかるニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンとを含む複合体からなる。生体分子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡ断片、生体原アミン、生体活性脂質、脂肪、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドなどの、当該分野において公知のものを挙げることができる。好ましくは、本発明の蛍光プローブは、本発明のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、又はウシ血清アルブミン等のアルブミンに担持された複合体である。ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンを生体分子、例えばアルブミンに担持させる方法としては、物理的に吸着させる方法、化学的に結合させる方法が挙げられる。物理的に吸着させる方法は、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンの疎水部分とアルブミンの疎水部分による、いわゆる疎水結合により行なわれ、通常両者を混合するだけで担持させることができる。化学的に結合させる方法は、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン上の官能基とアルブミン上の官能基との化学反応による共有結合や水素結合により行なわれる。例えば、水溶性カルボジイミドのようなカップリング剤を添加することにより、ニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニン上の官能基とアルブミン上の官能基との間にアミド結合を形成させることにより、担持させることができる。
【００６３】
本発明の発光によるレドックス分子の検出法及び定量法は、（１）波長６５０nm以上の励起光の照射下、本発明の蛍光プローブと、試料とを接触させる工程；及び（２）発光をモニターする工程、を含む。ここで試料は、レドックス分子（例えば、ビタミンＣ）を含有する（とされる）検体を、水、緩衝液、又はメタノールのようなレドックス分子（例えば、ビタミンＣ）を溶解しうる有機溶媒、あるいはそれらの混合物を用いて適切な濃度の溶液又は懸濁液として調製するか、あるいは検体が液体の場合は、そのまま又は適切な前処理に付して調製すればよい。
【００６４】
本発明の発光によるレドックス分子の検出法及び定量法は、本発明の蛍光プローブに含まれているニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンが、レドックス分子（例えば、ビタミンＣ）と接触し、ニトロキシドラジカルが還元され、不対電子を失った環元体に変換されることにより（すなわち、ニトロキシドラジカルによる蛍光消光作用の消失により）起こる発光強度の増大をモニターする（図２の反応模式図を参照）。本発明の特徴の一つは、発光強度の増大が、生体組織透過性の高い領域（＞６５０nm）で起こることである。したがって、通常、励起光は、波長６５０nm以上、好適には還元体の励起極大波長付近に設定し、発光もまた、還元体の蛍光極大波長付近に設定してモニターすればよい。
【００６５】
本発明のレドックス分子の定量法はさらに（２）発光をモニターし、発光強度の時間変化を測定する工程；及び（３）試料中のレドックス分子の濃度を決定する工程を含む。本発明者らは、発光強度の時間変化から算出される反応速度定数と、レドックス分子（例えば、ビタミンＣ）濃度との間に相関関係があることを見出した（上記特許文献３参照）。なおビタミンＣは２電子還元剤であるが、１電子目の還元が律速段階であるので、例えばメタノール中での１個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンとビタミンＣとの反応は、二次反応（擬一次反応）、２個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンからなる蛍光プローブとビタミンＣとの反応は、逐次反応と解することができる。一方、本発明のアルブミンと、１又は２個のニトロキシドラジカルを有するポルフィリン又はフタロシアニンとからなる複合体を含む蛍光プローブを用いた場合、当業者であれば、得られた発光強度の時間変化を適切な反応速度式を用いて解析することにより、速度定数を適宜算出することができる。このように、本発明のレドックス分子の定量法は、発光強度の時間変化の解析から速度定数を算出し、検量線を用いて濃度を求めることができる。このように、本発明のレドックス分子の定量法は、発光強度の時間変化の解析から速度定数を算出し、検量線を用いて濃度を求めることができるという、非常に簡便なものである。
【００６６】
さらに本発明のレドックス分子の検出法又は定量法は、生体内のレドックス分子、例えば、ビタミンＣを検出する方法へ応用することが可能である。本発明の生体内のビタミンＣを検出する方法は、（１）本発明の蛍光プローブを、被験動物に投与する工程；及び（２）波長６５０nm以上の励起光を被験動物に照射し、発光をモニターする工程を含む。本発明者らは、蛍光プローブに含まれるニトロキシドラジカルを軸配位子として有するフタロシアニナトケイ素錯体が、生体内でビタミンＣと反応し、生体組織透過性の高い領域で発光強度増大を示すことを確認した。したがって、本発明の蛍光プローブは、ビタミンＣのバイオ蛍光イメージングへの応用が十分に期待できる。
【実施例】
【００６７】
製造例１：錯体Ｒ１及びＲ２（図１あるいは表１参照）の製造
ジヒドロキシ（テトラ−ｔｅｒｔ−ブチルフタロシアニナト）ケイ素（ＳｉＰｃ（ＯＨ）2）（Ｒ０：上記表１参照）は、Macromolecules, 11 (1), 186-191 (1978)の方法に従って入手できる。ＳｉＰｃ（ＯＨ）2（５０ｍｇ）及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール−１−オキシル（４３０ｍｇ、Cat.-No. 176141、Sigma-Aldrich Co.より購入；以下、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯという）をトルエン中、塩化カルシウム（２ｇ）の存在下に４８時間加熱還流した。得られた混合物を冷却後、塩基性アルミナ及びゲルろ過クロマトグラフィー（Bio-Beads SX-1、Bio-Radより購入）による精製後、錯体Ｒ１及びＲ２をそれぞれ４０％及び１５％の収率で得た。
【００６８】
Ｒ１の元素分析（Ｃ57Ｈ66Ｎ9Ｏ3Ｓｉ）：
計算値  Ｃ，７１．８２；  Ｈ，６．９８；  Ｎ，１３．２２％
実測値  Ｃ，７０．８４；  Ｈ，７．０８；  Ｎ，１２．４４％
Ｒ２の元素分析（Ｃ66Ｈ82Ｎ10Ｏ4Ｓｉ）：
計算値  Ｃ，７１．５６；  Ｈ，７．４８；  Ｎ，１２．６５％
実測値  Ｃ，７０．９８；  Ｈ，７．０５；  Ｎ，１２．５１％
【００６９】
製造例２：ＢＳＡ−Ｒ２複合体の製造
製造例１で得られた錯体Ｒ２（０．７ｍｇ）及び、ガラスビーズ（５００ｍｇ、株式会社東新理興より購入）を純水で希釈した２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Cat.-No. 9002-93-1、関東化学株式会社より購入）溶液中で３０分間超音波をかけた。得られた溶液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００ｍｇ、A-4503、Sigma-Aldrich Co.より購入）を加え３時間撹拌した。その後、限外濾過(１０，０００ＭＷＣＯ、Sartorius Stedim Biotechより購入)を行い、濾過（φ０．４５μｍ、Merck Millipore Ltd.より購入）による精製後、ＢＳＡ−Ｒ２複合体を得た。
【００７０】
実施例１：ＢＳＡ−Ｒ２複合体を用いたビタミンＣ定量実験（ＰＢＳ水溶液中）
〔実験手順〕
（１）製造例１で得られたＢＳＡ−Ｒ２複合体の、７．０×１０-6MＰＢＳ溶液を調製した。
（２）ビタミンＣの、１mM、１００μM、１０μMのＰＢＳ溶液を調製した。
（３）ガラスセルに上記（１）で得られた溶液１．８mlとマイクロ攪拌子を入れてスターラー（９００r.p.m）で攪拌した。
（４）攪拌したまま、励起光としてヤマキ社製ダイオードレーザー（ＬＤＸ−２６１５−６５０−ＴＯ３、波長６５０nm）を照射し、日本分光社製分光器（ＣＴ−２５ＴＰ）と浜松ホトニクス社製光電子増倍管（Ｒ９２８）を用いて、６９５nmの発光をモニターしながら、上記（２）で得られたビタミンＣＰＢＳ溶液０．２mlを加え、発光強度時間変化を測定した。このとき、光ファイバーがマイクロ攪拌子の乱反射を捉えないように角度や位置関係を調節した。
【００７１】
〔実験結果〕
ＰＢＳ水溶液中におけるビタミンＣ添加前後の蛍光強度時間変化を図３に示す。ビタミンＣ添加前から、わずかな蛍光強度の増加が観測されるが、これは親水部に存在するＴＥＭＰＯラジカルの反応（不対電子の消失またはＴＥＭＰＯ自身の脱離）を反映していると考えられる。ビタミンＣ添加後、蛍光強度は増加した。ビタミンＣ が１μＭという低濃度の時でさえ、ビタミンＣ添加前の時間変化から予想されるベースラインに対して有意な増加が観測された。ｍＭオーダーの実験であったこれまでのリポソーム（上記特許文献３参照）と比較し、１０００倍高感度化することに成功した。
【００７２】
実施例２：ＢＳＡ−Ｒ２複合体の動的挙動及び分布試験
〔実験手順〕
事前に無蛍光飼料で飼育し自家蛍光を抑えてマウス（Balb/cヌード：メス）に、製造例２で得られたＢＳＡ−Ｒ２複合体を２００μＬ尾静脈より投与した。同一個体を用いて、投与前、投与直後、１時間、３時間、６時間、８時間、１０時間を小動物蛍光イメージング装置（IVIS Lumina II パーキンエルマー社）を用いて腹側より経時的に観察を行った（図４）。
さらに、外因性のビタミンＣ投与よる影響を観察するために、製造例２で得られたＢＳＡ−Ｒ２複合体を投与後、３時間および２４時間で、ビタミンＣを尾静脈投与し、同様に同一個体を用いて腹側より経時的に観察を行った（図５；３時間後ビタミンＣ投与、図６；２４時間後ビタミンＣ投与）。
【００７３】
〔実験結果〕
蛍光シグナルは、経時的に増加し投与後３時間で腸付近において強い蛍光が確認された（図４）。３時間でビタミンＣを投与した場合は、投与していない場合に比べて顕著な違いは見られなかった（図４）。一方、投与後２４時間でビタミンＣを投与した場合は、投与１時間後に腸付近で蛍光強度が増加し、３時間後には減少していることが確認された（図５）。さらに、観察後マウスを開腹し、各臓器を摘出し蛍光観察を行ったところ、他臓器に比べ腸（とりわけ、盲腸付近）で強いシグナルを確認した。当該試験における投与量においては、マウスの死亡は確認されなかったため、致死に至るような毒性は無いことが判明した。イメージング装置を用いた撮像の結果、蛍光プローブ由来と思われる蛍光シグナルが主に腸ならびに肝臓にて観察され、ビタミンＣ投与による蛍光シグナルの増加が示唆されたため、生体内におけるレドックス応答を可視化することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の方法は、ビタミンＣの検出及び定量に有用である。特に本発明の方法は、ビタミンＣの挙動を解明しうるバイオイメージングにおいて、従来法よりも応答高速化・高感度化されたものである。したがって、これまで不可能だったより精確な生体内におけるビタミンＣの検出、すなわち研究目的の生体内（細胞中など）でのビタミンＣの蛍光バイオイメージングの実現が期待され、ビタミンＣの生体内機能解明を飛躍的に進めることが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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