(57)【要約】【課題】            前がん病変組織の癌化可能性を、組織学的異型度にかかわらず高精度で予測することである。【解決手段】        前がん病変組織の癌化可能性を試験する方法であって、対象から得た前がん病変組織におけるＰＩＴＸ１の発現が低下している場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いとする方法、ならびに前がん病変組織の癌化可能性を試験するためのキットであって、前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる手段を必須として含むキット。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前がん病変組織の癌化可能性を試験する方法であって、対象から得た前がん病変組織におけるＰＩＴＸ１の発現が低下している場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いとする方法。
【請求項２】
前がん病変組織中のＰＩＴＸ１陽性細胞率が３０％以下である場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いとする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前がん病変組織が扁平上皮組織の前がん病変組織である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前がん病変組織の癌化可能性を試験するためのキットであって、前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる手段を必須として含むキット。
【請求項５】
前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる手段が、ＰＩＴＸ１に特異的な抗体である請求項４記載のキット。
【請求項６】
前がん病変組織が扁平上皮組織の前がん病変組織である請求項４または５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前がん病変組織の癌化可能性を調べるための方法ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに様々な遺伝子が癌の発症と関わっていることが報告されている。そしてこれらの遺伝子のいくつかは癌の診断マーカーとして使用されている。そして今後の医療現場においては、癌の予防ならびに適切な早期治療に重点が置かれる傾向にある。このような状況下で、前がん病変（以下において異形成ともいう）の癌化可能性を調べることは非常に重要である。
【０００３】
前がん病変組織の癌化可能性については、組織学的異型度が高いほど癌化可能性が高いといわれている。しかしながら、例外的なケースも多く見られるのが現状である。したがって、前がん病変組織の癌化可能性を、組織学的異型度にかかわらず高精度で予測することが、癌の予防ならびに適切な治療方針の選択の見地から必須である。
【０００４】
例えば、Ｋｉ−６７の発現と癌の悪性度には正の相関関係が認められており、乳ガンのタイプ分類において重要な評価項目とされている。しかしＫｉ−６７が前がん病変組織の癌化可能性の予測において有効に用いられているとはいえない。最近になって、Paired-like homeodomain 1 遺伝子（以下、ＰＩＴＸ１と略称）が癌抑制遺伝子であることが報告されたが（非特許文献１）、ＰＩＴＸ１の発現と前がん病変組織の癌化可能性との関連性については全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Qi DL, Ohhira T, Fujisaki C, Inoue T, Ohta T, Osaki M, Ohshiro E, Seko T, Aoki S, Oshimura M & Kugoh H.  Identification of PITX1 as a TERT suppressor gene located on human chromosome 5. Mol. Cell Biol., 31(8), 1624-1636, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような状況に鑑みれば、本発明の解決課題は、前がん病変組織の癌化可能性を、組織学的異型度にかかわらず高精度で予測することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはＰＩＴＸ１が新規な癌抑制遺伝子であることを発見したが、この遺伝子の発現と前がん病変組織の癌化可能性との関連性については不明であった。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＰＩＴＸ１の発現が低下している前がん病変組織の癌化可能性が高いこと、しかもＰＩＴＸ１遺伝子の発現を指標とした場合に、組織学的異型度によらず前がん病変組織の癌化を正確に予測できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のものを提供する。
（１）前がん病変組織の癌化可能性を試験する方法であって、対象から得た前がん病変組織におけるＰＩＴＸ１の発現が低下している場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いとする方法。
（２）前がん病変組織中のＰＩＴＸ１陽性細胞率が３０％以下である場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いとする（１）記載の方法。
（３）前がん病変組織が扁平上皮組織の前がん病変組織である（１）または（２）記載の方法。
（４）前がん病変組織の癌化可能性を試験するためのキットであって、前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる手段を必須として含むキット。
（５）前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる手段が、ＰＩＴＸ１に特異的な抗体である（４）記載のキット。
（６）前がん病変組織が扁平上皮組織の前がん病変組織である（４）または（５）記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、前がん病変組織の癌化可能性を高精度かつ簡便に予測することができる。しかも本発明は、前がん病変組織の癌化を組織学的異型度によらず高精度で予測できるという利点も有する。したがって、本発明は、癌の予防ならびに適切な治療方針の選択に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、正常口腔粘膜試料（Ａ）、癌化しなかった口腔上皮異形成試料（Ｂ）、癌化した口腔上皮異形成試料（Ｃ）、口腔扁平上皮癌試料（Ｄ）における免疫組織化学的ＰＩＴＸ１染色像を示す。
【図２】図２は、正常口腔粘膜、口腔上皮異形成および口腔扁平上皮癌におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５であることを示す。
【図３】図３は、癌化しなかった口腔上皮異形成および癌化した口腔上皮異形成におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率（左）、ならびに癌化しなかった口腔上皮異形成および癌化した口腔上皮異形成におけるＫｉ−６７陽性細胞率（右）を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５であることを示す。
【図４】図４は、軽〜中等度の口腔上皮異形成であって癌化しなかったものと癌化したものにおけるＰＩＴＸ１陽性細胞率（左）、ならびに高度の口腔上皮異形成であって癌化しなかったものと癌化したものにおけるＰＩＴＸ１陽性細胞率（右）を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、前がん病変組織の癌化可能性とＰＩＴＸ１発現との間に有意な関連性を見いだし、本発明を完成した。すなわち、ＰＩＴＸ１の発現が低下している前がん病変組織の癌化可能性が高いこと、しかもＰＩＴＸ１遺伝子の発現を指標とした場合に、組織学的異型度によらず前がん病変組織の癌化を正確に予測できることを見いだした。このような知見は全く予想外のもので、しかも非常に有用なものであった。前がん病変組織の癌化可能性を高精度で予測できる本発明を用いれば、癌の予防のみならず、初期癌に対しても的確な治療方針を立てることができ、治癒率をさらに高めることができる。
【００１１】
したがって本発明は、１つの態様において、前がん病変組織の癌化可能性を試験する方法であって、対象から得た前がん病変組織におけるＰＩＴＸ１の発現が低下している場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いとする方法を提供するものである。
【００１２】
異形成は、組織の形態変化の一種であり、細胞の大きさ、形態、配列の異常および核の大きさや形態が正常では見られない状態になるもので前がん病変と考えられている。異形成すなわち前がん病変のほぼ１０％が癌化するといわれている。前がん病変はあらゆる組織において生じうるが、上皮組織や造血組織に生じることが多く、特に扁平上皮組織に多く生じる。したがって、本発明により癌化可能性を試験する好ましい前がん病変組織は扁平上皮組織の前がん病変組織である。扁平上皮組織は口腔（舌を含む）、咽頭、食道、声帯、気管、気管支、喉頭、肛門、女性の外陰部、膣、子宮頚部、子宮膣部などに存在する。本発明に用いる前がん病変組織はいずれの組織に由来するものであってもよいが、好ましくは上記の組織に由来するものである。例えば、本発明を用いて癌化可能性を試験する前がん病変組織は、白板症や扁平苔癬および紅斑症などの口腔内の組織であってもよい。組織からの試料の採取についても当業者に公知の方法にて行うことができる。
【００１３】
本発明おいては、前がん病変組織中のＰＩＴＸ１発現が低下している場合に、前がん病変組織が癌化する可能性が高いと判定する。ＰＩＴＸ１発現の程度を調べる手段・方法も当業者に公知であり、いずれの手段・方法を用いてもよい。例えば、免疫組織化学的方法（ＰＩＴＸ１抗体を用いる抗体染色）を用いてＰＩＴＸ１発現の程度を調べることができる。ＰＩＴＸ１抗体の作成方法は当業者に公知であり、ＰＩＴＸ１抗体は市販もされている。ＰＩＴＸ１抗体を用いる抗体染色を用いて前がん病変の癌化を調べる場合、前がん病変組織試料中のＰＩＴＸ１陽性細胞率が３５％以下、好ましくは３３％以下、さらに好ましくは３０％以下であると、前がん病変組織が癌化する可能性が高いと判定することができる。
【００１４】
さらに本発明は、もう１つの態様において、前がん病変組織の癌化可能性を試験するためのキットであって、前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる手段を必須として含むキットを提供する。本発明のキットについても、上記の試験方法に関する説明があてはまる。前がん病変組織中のＰＩＴＸ１の発現を調べる好ましい手段・方法としては、ＰＩＴＸ１に特異的な抗体を用いる免疫染色が挙げられるが、これに限定されない。
【００１５】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は例示説明であって、本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００１６】
Ｉ．実験材料および方法
１．実験の概要
正常口腔粘膜を有する２６人の対象、口腔上皮異形成を有する１０６人の患者およびＰＩＴＸ１および口腔扁平上皮癌を有する９７人の患者の口腔から得た組織試料におけるＫｉ−６７の発現を免疫組織化学的方法により評価した。試料中のＰＩＴＸ１陽性細胞率およびＫｉ−６７陽性細胞率を計算した。
【００１７】
２．組織試料
鳥取大学医学部の承認を得て、上記対象から試料を得た。得られた試料を１０％緩衝化ホルマリンにて固定し、パラフィン中に包埋した。得られたパラフィンブロックを４μｍの切片にスライスした。口腔扁平上皮癌および口腔上皮異形成の組織学的診断をＷＨＯの基準に従って行って口腔粘膜の癌および前がん状態の分類を行った。
【００１８】
３．免疫組織化学的方法
すべての標本を１０％緩衝化ホルマリンにて固定し、パラフィン中に包埋した。３ミクロン厚の切片およびHistofine SAB-PO(R)免疫組織化学染色キット（Nichirei, Tokyo, Japan）を用いて免疫組織化学的分析を行った。ＰＩＴＸ１に対するウサギポリクローナル抗体（1:800; Abcam, Cambridge, MA）およびＫｉ−６７に対するマウスモノクローナル抗体（1:50; MIB-1, Dako, Glostrup, Denmark）を１次抗体として用いた。簡単に説明すると、パラフィン包埋切片をキシレンで脱パラフィンし、除々に水和させた。切片をメタノール中０．３％過酸化水素に浸漬することにより内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間オートクレーブすることにより抗体を回収した。次に、切片を各１次抗体と４℃で一晩反応させた後、上述のキットに含まれている２次抗体とビオチンストレプトアビジン複合体にて３７℃で３０分処理した。免疫反応をジアミノベンジジンにて可視化し、ヘマトキシリンにて組織切片を対比染色した。
【００１９】
４．免疫組織化学的知見の評価
ＰＩＴＸ１およびＫｉ−６７の発現を評価するために、最も強く染色された領域を高倍率視野で観察し、各抗体に関して陽性細胞のパーセンテージを決定した。正常口腔粘膜、異形成および扁平上皮癌の各試料について１０００個以上の上皮あるいは癌細胞を調べ、そのなかの陽性細胞のパーセンテージを陽性細胞率（％）と定義した。以下において、ＰＩＴＸ１またはＫｉ−６７陽性細胞率を平均値±標準偏差として表示する。
【００２０】
５．統計学的分析
ＰＩＴＸ１陽性細胞率またはＫｉ−６７陽性細胞率と癌化の相関を、Pearsonの検定法によって計算した。Studentのｔ検定またはMann-WhitneyのＵ検定を用いて２つのカテゴリーの変数間の比較を行った。Ｐ値は０．０５未満である場合に数値を有意であるとみなした。
【００２１】
ＩＩ．結果
１．正常口腔粘膜、口腔上皮異形成および口腔扁平上皮癌におけるＰＩＴＸ１発現
免疫組織化学的解析を行って、正常口腔粘膜の基底細胞層から表層にかけてＰＩＴＸ１陽性細胞が分布していることが示された（図１Ａ）。また、多くの癌化しなかった口腔上皮異形成試料中にもＰＩＴＸ１陽性細胞が存在することが示された（図１Ｂ）。癌化した口腔上皮異形成試料には部分的に非常に弱い核染色が観察されるのみであった（図１Ｃ）。また、口腔扁平上皮癌試料においては、陽性細胞は乏しかった（図１Ｄ）。
【００２２】
正常口腔粘膜、口腔上皮異形成および口腔扁平上皮癌におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率を図２にまとめた。口腔正常粘膜では７２．８±６．５％、口腔上皮異形成では５２．３±９．２４％、口腔扁平上皮癌においては４．８±４．２５％であった。口腔上皮異形成におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率は正常口腔粘膜におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率よりも有意に低かったが、口腔扁平上皮癌におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率よりも有意に高かった。
【００２３】
２．異形成の癌化の予測マーカーとしてのＰＩＴＸ１発現の低下
１０６人の患者の口腔上皮異形成のうち癌化したのは１２例（１１．３％）であった。癌化しなかった口腔上皮異形成ではＰＩＴＸ１陽性細胞が確認された（図１Ｂ）が、癌化した口腔上皮異形成ではＰＩＴＸ１陽性細胞は部分的で非常に弱いものであった（図１Ｃ）。癌化しなかった口腔上皮異形成におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率と癌化した口腔上皮異形成におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率を比較した結果を図３（左）に示す。癌化しなかった口腔上皮異形成におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率は５２．３±８．４０％であるのに対し、癌化した口腔上皮異形成におけるＰＩＴＸ１陽性細胞率は２９．４±９．４０％と有意に低かった。ＰＩＴＸ１発現が低かったことと異形成の癌化は有意に相関していることが判明した。
【００２４】
腫瘍の悪性度の指標として知られるＫｉ−６７陽性細胞率についても同じ試料を用いて調べた。異形成が癌化しなかった場合（Ｋｉ−６７陽性細胞率１８．７±５．０７％）と癌化した場合（２０．３±３．９９％）とで陽性細胞率に有意差は見られなかった（図３（右））。これらの結果から、ＰＩＴＸ１陽性細胞率を指標とすることによって、より正確に異形成の癌化を予測できることが示された。
【００２５】
３．組織学的異形度とＰＩＴＸ１発現との関係
口腔異形成の症例を軽〜中等度異形成と高度異形成に分けた。軽〜中等度異形成であって癌化しなかった症例ではＰＩＴＸ１陽性細胞率は５２．６±０．９４％であったのに対し、軽〜中等度異形成であって癌化した症例ではＰＩＴＸ１陽性細胞率は３３．３±４．８５％であった（図４（左））。高度異形成であって癌化しなかった症例ではＰＩＴＸ１陽性細胞率は５３．４±２．７５％であったのに対し、高度異形成であって癌化した症例ではＰＩＴＸ１陽性細胞率は２６．１±３．５３％であった（図４（右））。これらの結果から、ＰＩＴＸ１陽性細胞率を指標とすることによって、組織学的異形度の相違にかかわらず正確に異形成の癌化予測が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、前がん病変組織の癌化可能性を高精度かつ簡便に予測する方法およびキットを提供するので、診断薬の分野、癌の研究試薬の分野などに利用可能である。
【図１】
2015040847.tif 000002
【図２】
2015040847.tif 000003
【図３】
2015040847.tif 000004
【図４】
2015040847.tif 000005