(57)【要約】      （修正有）【課題】次世代シークエンサーにより得られた相対的な定量データから元の試料における絶対定量のデータを得ることを可能とし、また、次世代シークエンサーにより得られたPCR後の相対的な存在比率が、元の試料における個々の微生物群の存在比率を正確に反映するものであるかどうかを検証することを可能とする手段の提供。【解決手段】特定な配列の塩基配列からなる核酸において大文字で示されたその部分配列を少なくとも１つ含む部分配列であって、その両端に、大文字で示された部分配列に隣接する小文字で示された部分配列の、大文字で示された部分配列から連続する少なくとも１５以上の塩基配列からなる部分を含むことを特徴とする部分配列からなる核酸、若しくはその相補配列からなる核酸であって、かつ標準核酸試料として用いるための核酸。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸、又は下記の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列において大文字で示されたその部分配列を少なくとも１つ含む部分配列であって、その両端に、大文字で示された部分配列に隣接する小文字で示された部分配列の、大文字で示された部分配列から連続する少なくとも２０以上の塩基配列からなる部分を含むことを特徴とする部分配列からなる核酸、若しくはその相補配列からなる核酸であって、かつ標準核酸試料として用いるための核酸。
（配列１）
【化１】
2015204813.tif 000016
（配列２）
【化２】
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（配列３）
【化３】
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（配列４）
【化４】
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（配列５）
【化５】
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（配列６）
【化６】
2015204813.tif 000021
（配列７）
【化７】
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（配列８）
【化８】
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（配列９）
【化９】
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（配列１０）
【化１０】
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（配列１１）
【化１１】
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（配列１２）
【化１２】
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（配列１３）
【化１３】
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【請求項２】
請求項１に記載の核酸が組み込まれたベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸が組換えベクターが導入された形質転換微生物。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸を核酸標準物質として含有する標準核酸試料。
【請求項５】
請求項１に記載の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列において大文字で示されたその部分配列の任意の位置の少なくとも１５塩基連続した部分配列又はその相補配列を含む１本鎖核酸からなる、核酸標準物質検出用のプローブ。
【請求項６】
請求項１に記載の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列において小文字で示されたその部分配列の任意の位置の少なくとも１５塩基連続した部分配列又はその相補配列を含む１本鎖核酸からなる、16S rRNA遺伝子の部分配列の増幅用のプライマー。
【請求項７】
試料中に含まれる微生物の16S rRNA遺伝子をユニバーサルプライマーを用いてPCR増幅し、網羅的に定量する方法であって、
当該試料に請求項１に記載の核酸であって、当該ユニバーサルプライマーにより増幅される核酸を一定量加えてPCR増幅し、増幅後の当該核酸および試料中に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子を定量し、
増幅後の当該核酸の定量結果と増幅前に試料に加えた当該核酸の量の比率に基づき、増幅後の試料中に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子の定量結果から、増幅前の試料に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子の量を算出することを含む、方法。
【請求項８】
増幅後の請求項１に記載の核酸および試料中に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子の定量が、次世代シークエンサーまたはマイクロアレイを用いて行われる、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト検査試料の構成微生物群の評価や、バイオレメディエーションサイトの土壌・地下水や廃水処理プロセスにおける活性汚泥等、環境試料の構成微生物群を網羅的に定量するための技術等へ応用可能な測定技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球の自然環境は多様であり、多様な微生物が生息している。微生物はあらゆる環境中に存在しており、海洋、湖沼、河川、湿地、土壌といった自然環境中にはもちろんのこと、ヒトや、ウシなどの動物、昆虫の腸内環境や、さらには住宅やオフィスといった人間の生活空間にも微生物を見出すことができる。しかも、そこに存在する微生物群は、多種多様な微生物から構成されていることがほとんどである。
【０００３】
このような環境中の微生物群の解析にあたっては、それらの持つ核酸分子の塩基配列を標的とした解析技術が広く利用されている。特に環境微生物のモニタリングにおいては、約1500塩基から構成されている16S rRNA遺伝子配列が指標遺伝子として最も広く利用されている。核酸(DNAあるいはRNA)を環境試料から直接抽出し、そこに含まれる16S rRNA遺伝子配列を解析することで、対象とする環境の微生物群を網羅的に理解することができる。このような塩基配列情報に基づいた微生物群の解析においては、抽出したDNAをPCRで増幅することから始める。その試料にどのような微生物が存在するかを網羅的に調べたい場合には、ユニバーサルプライマー(非特許文献１参照)を用いて、その環境中に存在する微生物の16S rRNA遺伝子配列を全て増幅する。得られた増幅産物には個々の微生物由来の16S rRNA遺伝子配列が含まれているので、その増幅産物をクローニング法やDGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)法などで解析することで、どのような種類の微生物が存在するかということを把握することができる。
【０００４】
近年、次世代シークエンサーと呼ばれる超ハイスループット技術が普及しつつあり、この技術では数十万から数十億の核酸分子の塩基配列情報が一度の解析で得られるようになっており、その低コスト化も進んでいる。この次世代シークエンサーの技術の最も革新的な点は、塩基配列を決定することだけでなく、特定の塩基配列を持つ核酸分子の存在量を分子レベルでカウントすることが可能であるという点である。すなわち、16S rRNA遺伝子配列に基づいた解析においても、特定の16S rRNA遺伝子配列を持つ微生物の存在量を把握することができる。(非特許文献２参照)
また、マイクロアレイを用いても、PCR増幅後の特定の16S rRNA遺伝子配列を持つ微生物の存在量を把握することができる。
【０００５】
しかしながら、ここで得られる測定結果(各微生物分類群の存在量)は、PCRにより増幅され、カウントされた全ての塩基配列の数に対して、特定の微生物群由来の配列がどの程度の割合で検出されたのかを示す相対的な定量結果である。
また、PCRによる増幅は、増幅される配列や増幅に至る手順などにより、増幅度が一定でない可能性もあるため、上記相対的な定量結果についても、その測定精度を管理することが必要であるが、その管理方法については未整備な状態であり、測定の信頼性確保のための精度管理技術が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５２２９８９５号(発明の名称：核酸標準物質)
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Youssef N et al., 2009, Applied and Environmental Microbiology, Vol.16, 5227-5236
【非特許文献２】Caporaso JG et al., 2012, The ISME Journal, Vol.6, 1621-1624
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、次世代シークエンサーやマイクロアレイなどの方法で環境中の微生物相を網羅的に解析することができるが、その解析結果は、個々の微生物群に由来する塩基配列のPCR後の相対的な存在比率に関するデータを得るにとどまり、PCR以前の元の試料に個々の微生物群に由来する塩基配列がどれだけの絶対量含まれていたか示すものではなく、また、当該PCR後の相対的な存在比率が元の試料における相対的な存在比率を正確に反映するものであるかどうかを確認することもできない。
本発明は、次世代シークエンサーやマイクロアレイにより得られた相対的な定量データから元の試料における絶対定量のデータを得ることを可能とし、また、次世代シークエンサーやマイクロアレイにより得られたPCR後の相対的な存在比率が、元の試料における個々の微生物群の存在比率を正確に反映するものであるかどうかを検証することを可能とする手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、微生物の16S rRNA遺伝子を定量するための新たな内部標準遺伝子を開発した。
試料中の核酸配列の濃度を知るために、濃度の決まっている標準核酸配列を試料に添加する手法はすでに知られており、例えば特許文献１のような自然界に存在しない非天然の核酸標準物質などが開発されている。しかし、特許文献１の核酸標準物質はその全てが非天然の塩基配列で構成されているため、環境中の微生物の解析に用いられるようなユニバーサルプライマーでは増幅することができない。
また、従来の微生物の16S rRNA遺伝子定量用の標準遺伝子としては、特定の微生物の16S rRNA遺伝子を利用した配列が定量PCRなどの外部標準として用いられていた。しかしながら、外部標準は、定量する遺伝子種に応じてそれぞれ用意する必要がある。また、競合PCR法などにおいては特定の微生物の16S rRNA遺伝子の内部配列を人為的に修正した配列が用いられていた。
これに対し、本発明の内部標準遺伝子は、既知の微生物のほとんど全ての16S rRNA遺伝子配列を増幅することができるユニバーサルプライマーで増幅され、かつ既知の微生物のどれとも相同性の低い配列を有するように設計されている。すなわち、本発明の内部標準遺伝子配列は、微生物検出・定量用の汎用的なPCRプライマーで増幅することが可能であり、かつ現存する微生物の16S rRNA遺伝子配列とは異なる人工的な遺伝子配列で構成されている。
【００１０】
具体的には、本発明の内部標準遺伝子は、後述の配列１〜１３に示す構造に基づくものである。
配列１〜１３は、微生物の16S rRNA遺伝子配列に基づいて設計されたものであり、配列中の小文字で表した部分は、各微生物においてよく保存されている塩基配列である。16S rRNA遺伝子配列のPCRによる増幅に用いるユニバーサルプライマーは通常これらの部分の配列に基づいて設計される。配列１〜１３においては、これらの部分はそのままとし、それ以外の大文字で表された部分を現存する微生物の16S rRNA遺伝子配列とは異なる人工的な配列としている。
本発明の内部標準遺伝子は、配列番号１〜１３の塩基配列において大文字で示されたその部分配列を少なくとも１つ含む部分配列であって、その両端に、大文字で示された部分配列に隣接する小文字で示された部分配列の、大文字で示された部分配列から連続する少なくとも１５以上の塩基配列からなる部分を含む配列からなるものであり、これにより、小文字の部分に対応するユニバーサルプライマーにより、試料中の各微生物の16S rRNA遺伝子配列と同様にPCRによる増幅が可能であり、かつ、次世代シークエンサーやマイクロアレイによる定量に際し、大文字の部分の相違により各微生物の16S rRNA遺伝子配列と識別することができる。
【００１１】
各種の微生物に由来する16S rRNA遺伝子配列を含む対象試料に、本発明の内部標準核酸配列を特定の濃度あらかじめ添加し、その核酸配列が、PCRによる増幅後、シークエンサーの解析によってどのくらいの存在量で検出されたかを算出し、その結果をもとに、元の対象試料中の、特定の微生物に由来する16S rRNA遺伝子配列の存在量を定量することができる。
例えば、このような内部標準核酸配列を複数種用意し、これらを所定の異なる量、対象試料に加えてPCR増幅し、シークエンサーの解析により、それぞれのカウント数を検出し、これと最初に対象試料に加えたそれぞれの内部標準核酸配列の量とから作成した検量線を用いることにより、対象試料に含まれる特定の微生物群由来の配列のPCR増幅後のカウント数から、元の試料に含まれる当該配列の量を知ることができる。
また、PCR増幅とシークエンサーによる解析により、当該検量線が直線とならないなどの結果が生じた場合は、当該PCR増幅に至る手順等に何らかの不都合があることが明らかとなる。したがって、本発明の内部標準核酸配列を用いることにより、次世代シークエンサーによる定量測定の信頼性確保のための精度管理に必要な情報を得ることができる。
このように、微生物の16S rRNA遺伝子を次世代シークエンサーやマイクロアレイにより定量する際に、本発明の内部標準遺伝子配列を試料に添加して用いることによって、環境中の微生物相を絶対定量することができ、また、複数種類の内部標準遺伝子をあらかじめ決められた存在比で混合した核酸標準物質カクテルを試料に添加し、想定される存在比とシークエンサーやマイクロアレイでの測定結果の定量性を比較することで、次世代シークエンサーやマイクロアレイなどのデータの品質管理を実現することができる。
【００１２】
すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
〈１〉下記の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列からなる核酸、又は下記の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列において大文字で示されたその部分配列を少なくとも１つ含む部分配列であって、その両端に、大文字で示された部分配列に隣接する小文字で示された部分配列の、大文字で示された部分配列から連続する少なくとも１５以上の塩基配列からなる部分を含むことを特徴とする部分配列からなる核酸、若しくはその相補配列からなる核酸であって、かつ標準核酸試料として用いるための核酸。
（配列１）
【化１】
2015204813.tif 000003
（配列２）
【化２】
2015204813.tif 000004
（配列３）
【化３】
2015204813.tif 000005
（配列４）
【化４】
2015204813.tif 000006
（配列５）
【化５】
2015204813.tif 000007
（配列６）
【化６】
2015204813.tif 000008
（配列７）
【化７】
2015204813.tif 000009
（配列８）
【化８】
2015204813.tif 000010
（配列９）
【化９】
2015204813.tif 000011
（配列１０）
【化１０】
2015204813.tif 000012
（配列１１）
【化１１】
2015204813.tif 000013
（配列１２）
【化１２】
2015204813.tif 000014
（配列１３）
【化１３】
2015204813.tif 000015
〈２〉〈１〉に記載の核酸が組み込まれたベクター。
〈３〉〈２〉に記載の核酸が組み込まれたベクターが導入された形質転換微生物。
〈４〉〈１〉に記載の核酸を核酸標準物質として含有する標準核酸試料。
〈５〉〈１〉に記載の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列において大文字で示されたその部分配列の任意の位置の少なくとも１５塩基連続した部分配列又はその相補配列を含む１本鎖核酸からなる、核酸標準物質検出用のプローブ。
〈６〉〈１〉に記載の配列１〜１３のいずれかに示される塩基配列において小文字で示されたその部分配列の任意の位置の少なくとも１５塩基連続した部分配列又はその相補配列を含む１本鎖核酸からなる、16S rRNA遺伝子の部分配列の増幅用のプライマー。
〈７〉試料中に含まれる微生物の16S rRNA遺伝子をユニバーサルプライマーを用いてPCR増幅し、網羅的に定量する方法であって、
当該試料に〈１〉に記載の核酸であって、当該ユニバーサルプライマーにより増幅される核酸を一定量加えてPCR増幅し、増幅後の当該核酸および試料中に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子を定量し、
増幅後の当該核酸の定量結果と増幅前に試料に加えた当該核酸の量の比率に基づき、増幅後の試料中に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子の定量結果から、増幅前の試料に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子の量を算出することを含む、方法。
〈８〉増幅後の〈１〉に記載の核酸および試料中に含まれる各微生物に由来する16S rRNA遺伝子の定量が、次世代シークエンサーまたはマイクロアレイを用いて行われる、〈７〉に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
PCRにより増幅された16S rRNA遺伝子配列を次世代シークエンサーやマイクロアレイなどの方法で分析することで、環境中の微生物相を網羅的に解析することはできるが、その解析結果は個々の微生物群の相対的な存在比率に関するデータを得るにとどまる。
本発明の標準遺伝子は、既知の微生物のほとんど全ての16S rRNA遺伝子配列を増幅することができるユニバーサルプライマーで増幅され、かつその増幅産物の内部配列が既知の微生物のいずれとも相同性が低い人工配列になっている。
本発明の標準遺伝子を、正確に濃度を決めた、微生物定量用内部標準遺伝子として用いることで、次世代シークエンサーやマイクロアレイなどの方法で得られた相対的な定量データを絶対定量のデータへと変換することが可能となる。また、複数種類の本発明の標準遺伝子をあらかじめ決められた存在比で混合した核酸標準物質カクテルを試料に添加し、想定される存在比とシークエンサーでの測定結果の定量性を比較することで、次世代シークエンサーやマイクロアレイなどのデータの品質管理に利用することも可能である。
このような次世代シークエンサーやマイクロアレイなどを利用した微生物の網羅的解析に利用可能な微生物の16S rRNA遺伝子定量用の内部標準遺伝子配列はこれまで存在しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】16S rRNA遺伝子定量用標準配列のリード数と初期に添加したコピー数の関係。
【図２】標準遺伝子を用いて算出した、土壌サンプル内微生物の門レベルでの各系統分類群の遺伝子コピー数。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１５】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
土壌中に存在する環境微生物群の網羅的な定性・定量的解析を行うために16S rRNA遺伝子定量用の標準遺伝子配列(配列番号１，２，３，４，５)を用いた。当該標準遺伝子配列をそれぞれ含むプラスミド５種類を制限酵素処理後精製してQubit(R) Assay Kit(Life Technologies)を用いて濃度を測定し、コピー数を計算した。配列番号１:配列番号２:配列番号３:配列番号４:配列番号５=1:0.3:10:20:30の比率のコピー数を含むように混合した標準溶液を作製した。
採取した土壌0.47gに対して合計5.0×108コピー(土壌1g当たり約10.6×108コピー)の標準溶液を直接添加した後に、FastDNA spin kit for soil(MP Biomedicals)を用いてDNAを抽出した。抽出DNAを鋳型としてバクテリアおよびアーキアの16S rRNA遺伝子のV4領域を対象としたユニバーサルプライマーセット(U519-U802)を用いてPCRを行い、次世代シークエンサー(Roche GS FLX)を用いて超並列シークエンシングを行った。得られた塩基配列データはQIIMEを利用して解析を行った。
塩基配列データから得られた16S rRNA遺伝子定量用標準遺伝子配列のリード数と当該標準遺伝子のDNA抽出前に添加したコピー数から標準曲線を作成した(図１)。図１に示すように、得られた標準曲線は一定勾配の直線状となり、次世代シークエンサーの塩基配列データから得られた16S rRNA遺伝子定量用標準遺伝子配列のリード数と当初試料に添加した標準遺伝子の濃度は高い相関関係があることが確認された。
次いで、次世代シークエンサーにより得られた塩基配列データに基づき、16S rRNA遺伝子定量用標準遺伝子を添加した土壌由来の微生物の16S rRNA遺伝子配列のリード数を門レベルでの系統分類群毎に算出し、当該リード数と上記標準曲線とを用いて、土壌1g当たりに含まれる微生物の門レベルでの各系統分類群の16S rRNA遺伝子コピー数を算出した(図２)。この結果、測定した試料にはProteobacteria門、Acidobacteria門、Actinobacteria門等の系統群が多く存在することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明の標準遺伝子は、環境中の微生物相解析を必要とする分野、例えば、バイオレメディエーションサイトでの微生物の消長解析や廃水処理プロセスでの活性汚泥内微生物相解析に用いることができる。また、食品や医療現場における病原性微生物などの検出・定量にも利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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