(57)【要約】【課題】  基質に糖を炭素−炭素結合させその糖で二置換のC配糖体を人工的に簡易に生成させる酵素活性を有する新規な配糖化酵素、それを利用し配糖化して糖で二置換のC配糖体を製造する方法を提供する。【解決手段】  配糖化酵素は、柑橘類又は豆類に由来するものであって、フェニルプロパノイド及びフェニルアセトフェノンから選ばれる基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ糖を炭素−炭素結合させその糖で二置換のC配糖体を生成させる酵素活性を、有している。配糖化方法は、配糖化酵素をコードするDNAを、有する配糖化酵素遺伝子を利用して、二置換のC配糖体を生成させるものである。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類又は豆類に由来する配糖化酵素であって、
フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ糖を炭素−炭素結合させその糖で二置換されたC配糖体を生成させる酵素活性を、有することを特徴とする配糖化酵素。
【請求項２】
前記基質が、水酸基でフェニル基の水素を置換していてもよいもので、フラボノイド及びジヒドロカルコンから選ばれる前記フェニルプロパノイド類であり、又はアセトフェノン及びα−フェニルアセトフェノンから選ばれる前記アセトフェノン類であることを特徴とする請求項１に記載の配糖化酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち前記酵素活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列とのいずれかを有することを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の配糖化酵素。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の配糖化酵素をコードするDNAを、有することを特徴とする配糖化酵素遺伝子。
【請求項５】
前記DNAが、配列表の配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列と、配列表の配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列のうちコードする前記配糖化酵素の前記酵素活性が保持される範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換及び／又は付加した改変塩基配列とのいずれかを有することを特徴とする請求項４に記載の配糖化酵素遺伝子。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載された配糖化酵素をコードするcDNA。
【請求項７】
請求項５〜６のいずれか１項に記載の配糖化酵素遺伝子を組み込んでいることを特徴とするプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドが宿主細胞に導入されて成ることを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
前記宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８〜９のいずれか１項に記載の形質転換体と、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質と、糖とを、共にインキュベーションする工程を含むことにより、前記基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ前記糖を炭素−炭素結合させて、その糖で二置換のC配糖体を生成させて、前記基質を配糖化することを特徴とする糖で二置換されたC配糖体の製造方法。
【請求項１１】
前記基質が、それのフェニル基の水素を水酸基で置換していてもよいもので、フラボノイド及びジヒドロカルコンから選ばれる前記フェニルプロパノイド類であり、又はアセトフェノン及びα−フェニルアセトフェノンから選ばれる前記アセトフェノン類であることを特徴とする請求項１０に記載の配糖化方法。
【請求項１２】
請求項９〜１０のいずれか１項に記載の配糖化方法により製造されたもので、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ糖が炭素−炭素結合しており、その糖で二置換された配糖体であることを特徴とする糖で二置換のC配糖体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の糖で二置換のC配糖体を有効成分として含有しており、飲食品、医薬品、サプリメント、及び飼料から選ばれるのいずれかであることを特徴とするC配糖体含有製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質に糖を炭素−炭素結合させて糖で二置換されたC配糖体を生成させる新規な配糖化酵素に関する。更にその配糖化酵素を発現させる配糖化酵素遺伝子、配糖化酵素をコードするcDNA、配糖化酵素遺伝子を組み込んでいるプラスミド並びにそれを導入した形質転換体、及び形質転換体を用いた新規な配糖化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
配糖体は、糖以外の基質（アグリコン）と、単糖又はオリゴ糖とが結合した成分群であり、主に植物や微生物中に二次代謝産物として産生、蓄積される。この際、植物や微生物中では、配糖化酵素による糖転移反応（配糖化）が行われている。これら配糖化酵素を用いた配糖体の製造方法について、報告がなされている（特許文献１、２）。
【０００３】
多くの配糖体は、糖が基質のヒドロキシ基に結合したO配糖体であるが、カルボキシ基に結合したカルボキシ配糖体、アミノ基に結合したN配糖体、チオール基に結合したS配糖体、ニトリルの隣の水酸基に結合した青酸配糖体など、様々なものが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
上記に挙げた配糖体は、いずれも基質と糖との結合にヘテロ原子を介して配糖化したものである。一方、その他の配糖体として、基質の炭素原子に糖の炭素原子が直接共有結合したC配糖体と呼ばれる配糖体も、広く存在する。
【０００５】
C配糖体は、その特徴的な炭素−炭素結合様式により、グルコシダーゼや酸による加水分解を受けないため、O配糖体などと比較して、非常に安定である。
【０００６】
C配糖体は、微生物や植物、昆虫などの生物で形成される二次代謝産物で自然界に分布している。それらは、鉄輸送担体や抗生物質、抗酸化物質、誘因物質、摂食抑制物質など、生体内で多様な機能を示すことが知られている（非特許文献２、３）。
【０００７】
C配糖体を生合成する配糖化酵素については、２００９年にイネにおけるＣ配糖化酵素OsCGTを部分精製し、その遺伝子が同定されており（非特許文献４）、それを使用した配糖化方法について、報告がされている（非特許文献５、６）。また、最近トウモロコシにおける新規なC配糖化酵素について、報告がされている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１７４５０７号公報
【特許文献２】特開２００９−３４０２８号公報
【特許文献３】特開２００６−２３８８２８号公報
【特許文献４】特開２００６−２３８８２９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wang X., Structure, mechanism and engineering of plant natural product glycosyltransferases, FEBS. Letters. 583 (2009) 3303-3309.
【非特許文献２】Hultin P.G., Bioactive C-glycosides from bacterial secondary metabolism, Curr. Top. Med. Chem., 5 (2005) 1299-1331.
【非特許文献３】Franz G., Grun M., Chemistry, Occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants, Planta Med., 47 (1983) 131-140.
【非特許文献４】Brazier-Hicks M., Evans K.M., Gershater M.C., Puschmann H., Steel P G, Edwards R, The C-glycosylation of flavonoids in cereals, J. Biol. Chem., 284 (2009) 17926-17934.
【非特許文献５】Bungaruang L., Gutmann A., Nidetzky B., Lelioir Glycosyltransferases and Natural Product Glyxosylation: Biocatalytic Synthesis of the C-Glucoside Nothofagin, a Major Antioxidant of Redbush Herbal Tea, Adv. Synth. Catal., 355 (2013) 1-8.
【非特許文献６】Brazier-Hicks M., Edwards R., Metabolic engineering of the flavone-C-glycoside pathway using polyprotein technology, Metabolic Engineering., 16 (2013) 11-20.
【非特許文献７】Falcone Ferreyra M. L., Rodriguez E., Casas M. I., Labadie G., Grotewold E., Casati P., Identification of a bifunctional maize C- and O-glucosyltransferase, J. Biol. Chem., 288 (2013) 31678-31688.
【非特許文献８】Kim B.G., Kim H.J., Ahn J.H., Production of bioactive flavonol rhamnosides by expression of plant genes in Escherichia coli., J. Agric Food Chem., 60 (2012) 11143-11148
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記に挙げたC配糖体は、いずれも基質に１つの糖が結合した一置換の配糖体についての報告である。複数の糖が結合した配糖体、特に基質に二つの糖が結合した二置換のC配糖体（以下、di-C配糖体ともいう。）については、これまでビセニン-2（vicenin-2）などが報告され、その有用性が研究されているが、それら二置換のC配糖体へ誘導する配糖化酵素遺伝子の同定、またそれを使用した二置換のC配糖体の生成技術については、報告がない。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、基質に糖を炭素−炭素結合させその糖で二置換されたC配糖体を人工的に簡易に生成させる酵素活性を有する新規な配糖化酵素、それを利用し配糖化して糖で二置換のC配糖体を製造する方法、及びその方法により製造された糖で二置換のC配糖体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究の結果、柑橘類、豆類の特定の植物において、フラボノイドやジヒドロカルコンのようなフェニルプロパノイド類などの特定の基質の二つの炭素原子に、特異的に二つの糖をそれぞれ炭素−炭素結合させる配糖化酵素遺伝子の同定に成功し、合わせて、この配糖化酵素遺伝子を、特定の宿主細胞に導入することによって、効率的に二つの糖が結合した糖で二置換されたC配糖体を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
即ち請求項１に記載の本発明は、柑橘類又は豆類に由来する配糖化酵素であって、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ糖を炭素−炭素結合させ、その糖で二置換されたC配糖体を生成させる酵素活性を有することを特徴とする配糖化酵素である。
【００１４】
また、請求項２に記載の本発明は、前記基質が、それのフェニル基の水素を水酸基で置換していてもよいもので、フラボノイド及びジヒドロカルコンから選ばれる前記フェニルプロパノイド類であり、又はアセトフェノン及びα-フェニルアセトフェノンから選ばれる前記アセトフェノン類であることを特徴とする請求項１に記載の配糖化酵素である。
【００１５】
また、請求項３に記載の本発明は、配列表の配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち前記酵素活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列とのいずれかを有することを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の配糖化酵素である。
【００１６】
また、請求項４に記載の本発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の配糖化酵素をコードするDNAを、有することを特徴とする配糖化酵素遺伝子である。
【００１７】
また、請求項５記載の本発明は、前記DNAが、配列表の配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列と、配列表の配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列のうちコードする前記配糖化酵素の前記酵素活性が保持される範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換及び／又は付加した改変塩基配列とのいずれかを有することを特徴とする請求項４に記載の配糖化酵素遺伝子である。
【００１８】
また、請求項６記載の本発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載された配糖化酵素をコードするcDNAである。
【００１９】
また、請求項７に記載の本発明は、請求項５〜６のいずれか１項に記載の配糖化酵素遺伝子を組み込んでいることを特徴とするプラスミドである。
【００２０】
また、請求項８に記載の本発明は、請求項７に記載のプラスミドが宿主細胞に導入されて成ることを特徴とする形質転換体である。
【００２１】
また、請求項９に記載の本発明は、前記宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体である。
【００２２】
また、請求項１０に記載の本発明は、請求項８〜９のいずれか１項に記載の形質転換体と、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質と、糖とを、共にインキュベーションする工程を含むことにより、前記基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ前記糖を炭素−炭素結合させて、その糖で二置換されたC配糖体を生成させて、前記基質を配糖化することを特徴とする糖で二置換されたC配糖体の製造方法である。
【００２３】
また、請求項１１に記載の本発明は、前記基質が、それのフェニル基の水素を水酸基で置換していてもよいもので、フラボノイド及びジヒドロカルコンから選ばれる前記フェニルプロパノイド類であり、又はアセトフェノン及びα−フェニルアセトフェノンから選ばれる前記アセトフェノン類であることを特徴とする請求項１０に記載の配糖化方法である。
【００２４】
また、請求項１２に記載の本発明は、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の配糖化方法により製造されたもので、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質の骨格中の２炭素原子にそれぞれ糖が炭素−炭素結合しており、その糖で二置換された配糖体であることを特徴とする糖で二置換のされたC配糖体である。
【００２５】
また、請求項１３に記載の本発明は、請求項１２に記載の糖で二置換されたC配糖体を有効成分として含有しており、飲食品、医薬品、サプリメント、及び飼料から選ばれるのいずれかであることを特徴とするC配糖体含有製品である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る新規の配糖化酵素、及びそれを利用した糖で二置換されたC配糖体の製造方法により、フラボノイドやジヒドロカルコンのようなフェニルプロパノイド類、又はアセトフェノンやα−フェニルアセトフェノンのようなアセトフェノン類である特定の基質の２炭素原子にそれぞれ二つの糖が炭素−炭素結合した糖で二置換されたC配糖体を製造することができる。
【００２７】
この製造方法によれば、特定のアミノ酸配列の配糖化酵素やそれを発現する配糖化酵素遺伝子により、糖で二置換のC配糖体を簡便に得ることができる。この製造方法で、配糖化酵素をコードするDNAを有する配糖化酵素遺伝子、それを含むプラスミドや組換えベクター、又はそれらを宿主細胞に導入している形質転換体を用いることにより、基質特異的かつ作用特異的に、高純度で効率良く、糖で二置換されたC配糖体を得ることができる。
【００２８】
本発明の糖で二置換されたC配糖体は、抗酸化物質、誘因物質、摂食抑制物質、甘味料、香味料又は抗腫瘍物質などとして、生体内で多様な機能・薬効を発現するので、有効成分として飲食品、医薬品、サプリメント、飼料に含有させた組成物にして、C配糖体含有製品を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】pCR4Blunt-TOPO_CuCGTのプラスミド図である。
【図２】pET-28a_CuCGTのプラスミド図である。
【図３】CuCGTを用いた2-ヒドロキシピノセンブリンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図４】CuCGTを用いた2-ヒドロキシピノセンブリンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図５】CuCGTを用いたフロレチンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図６】CuCGTを用いたフロレチンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図７】CuCGTを用いた2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図８】CuCGTを用いた2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図９】CuCGTを用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図１０】CuCGTを用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図１１】CuCGTを用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの2番目の反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図１２】FcCGTを用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図１３】FcCGTを用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図１４】FcCGTを用いたフロレチンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図１５】FcCGTを用いたフロレチンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図１６】MtrCGT1を用いた2-ヒドロキシピノセンブリンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図１７】MtrCGT1を用いた2-ヒドロキシピノセンブリンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図１８】MtrCGT1を用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図１９】MtrCGT1を用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図２０】GmCGT2を用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図２１】GmCGT2を用いた2-ヒドロキシナリンゲニンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図２２】GmCGT2を用いたフロレチンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図２３】GmCGT2を用いたフロレチンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図２４】FeCGTaを用いた2-ヒドロキシピノセンブリンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図２５】FeCGTaを用いた2-ヒドロキシピノセンブリンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【図２６】FeCGTaを用いたフロレチンの反応物を、HPLCで分析した結果のスペクトルである。
【図２７】FeCGTaを用いたフロレチンの反応物を、LC-MSで分析した結果のマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明に係る配糖化酵素、それの遺伝子・cDNA・プラスミド・組換えベクター・形質転換体と、それらによる糖で二置換されたC配糖体の製造方法を実施するための形態について説明する。
【００３１】
配糖化酵素で産生されるもので、基質の炭素原子に二つの糖が結合したC配糖体は、基質即ち非糖成分であるアグリコンの２か所の炭素原子に、単糖又はオリゴ糖のような糖が炭素−炭素結合した構造を持つ糖で二置換された化合物である。このような糖で二置換されたC配糖体は、既知の化合物では例えば、ビセニン-2が挙げられる。ビセニン-2については、これまで甘味料、香味料としての利用が報告されている（特許文献３、４）。
【００３２】
本発明に係る配糖化酵素は、柑橘類、豆類などの植物から抽出、精製された配糖化酵素であり、その代表例として、配列表の配列番号１〜４のいずれかで示される４５０〜５００個程度のアミノ酸配列を有するたんぱく質を挙げることができる。
【００３３】
本発明に係る配糖化酵素は、基質の炭素原子の２か所に糖を結合する配糖化活性を有するたんぱく質であれば、配列表の配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した改変アミノ酸配列を有するたんぱく質であってもよい。
【００３４】
「１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した」とは、例えば当業者にとり周知のKunkel法などの適切な方法で、欠失、置換及び／又は付加が可能な数のアミノ酸が、欠失、置換及び／又は付加されることを意味している。
【００３５】
本発明に係る配糖化酵素の例として、配列表の配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と、８０%以上、好ましくは９０%以上、さらに好ましくは９５%以上の相同性を有する改変アミノ酸配列を有するたんぱく質が挙げられる。
【００３６】
「柑橘類」とは、ミカン科ミカン亜科ミカン連に属する植物を意味しており、ミカン属以外の植物、例えばキンカン属などの植物も含むものと解する。柑橘類の例としては、例えば、ウンシュウミカン、オレンジ、ハナユ、キンカン、イヨカン、カボス、キシュウミカン、キノット、グレープフルーツ、コウジ、サンボウカン、ジャバラ、スダチ、ダイダイ、タチバナ、タンゴール、ナツミカン、ハッサク、ヒュウガナツ、ヒラミレモン、ブンタン、ポンカン、ライム、レモン、ユズが挙げられる。上記の柑橘類の内、本発明において特に好ましい例は、ウンシュウミカン、オレンジ、ハナユ、キンカンである。
【００３７】
「豆類」とは、マメ科の植物を意味している。豆類の例としては、例えば、ダイズ、ツルマメ、ギンヨウアカシア、クサネム、ネムノキ、イタチハギ、ヤブマメ、ゲンゲ、ハマナタマメ、ハネセンナ、タヌキマメ、エニシダ、アメリカデイゴ、ハマエンドウ、ヤマハギ、ウマゴヤシ、タルウマゴヤシ、クズ、クララ、ヤハズエンドウ、ソラマメ、アズキ、フジが挙げられる。上記の豆類の内、本発明において特に好ましい例は、タルウマゴヤシ、ダイズである。
【００３８】
配糖化酵素で二置換されたC配糖体を生成させるための基質は、水酸基や炭素数１〜６の低級アルコキシ基やハロゲン原子のような置換基を有していてもよいフェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類が挙げられる。
【００３９】
「フェニルプロパノイド類」とは、１-フェニルプロパン骨格から派生する有機化合物の総称であり、そのフェニル骨格に由来するフェニル基にフェノール性水酸基を有していてもよく、そのプロパン骨格に由来し鎖状又はヘテロ環状の一部を成すプロピル基、プロペニル基、プロピオニル基、トリメチレン基、プロペニレン基等の三炭素基に水酸基を有していてもよく、それら水酸基の一部又は全てをエーテル化したメトキシ基のようなアルコキシ基を有していてもよい。
【００４０】
「フラボノイド」とは、ポリフェノールの一種であり、２個のベンゼン環を３つの炭素鎖で結びつけた骨格を持つ有機化合物を意味している。フラボノイドの例としては、例えば、フラボン、フラボノール、フラバノン、イソフラボン、カテキン、アントシアニン、タンニン及びこれらの誘導体が挙げられる。上記のフラボノイドの内、本発明において特に好ましい例は、フラバンを基礎骨格として有する有機化合物であって、その２位に水酸化を受け，開環構造を取ることが可能な2-ヒドロキシフラバノン類が挙げられ、更に好ましい例は、2-ヒドロキシピノセンブリン、2-ヒドロキシナリンゲニン、2-ヒドロキシエリオジクチオールが挙げられる。
【００４１】
「ジヒドロカルコン」とは、カルコンの関連化合物で、1,3-ジフェニル-1-プロパノンを骨格とする有機化合物を意味する。ジヒドロカルコンの例としては、例えば、2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロアセトフェノン、フロレチン、フロリジン、3',5'-ジヒドロキシ-2',4',6'-トリメトキシジヒドロカルコン、メチルリンデロン、5-ヒドロキシ-6,7,8-トリメトキシフラボン、2'-ヒドロキシ-3',4',5',6'-テトラメトキシジヒドロカルコンが挙げられる。上記のジヒドロカルコンの内、本発明において特に好ましい例は、フロレチン、フロリジンが挙げられる。
【００４２】
「アセトフェノン類」とは、アセトフェノン骨格を有しカルコンやフラバノン（例えば２-ヒドロキシフラバノン）の部分骨格を有するもので、そのフェニル基がフェノール性水酸基を有していてもよく、そのアセチル基がフェノール性水酸基で置換され得るα-フェニル基を有していてもよい有機化合物である。アセトフェノン類の例としては、水酸基で置換されていてもよいアセトフェノン、例えば2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンのようなアセトフェノン；α-フェニルアセトフェノン、例えば2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンが挙げられる。
【００４３】
これら基質の中でも、２-ヒドロキシピノセンブリン、2-ヒドロキシナリンゲニン、２-ヒドロキシエリオジクチオール、2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロアセトフェノン、フロレチン、フロリジンが好ましい。これらの基質の中でも、2-ヒドロキシナリンゲニンのように容易に脱水し得る水酸基を有するフラボノイドやジヒドロカルコンでも、対応する糖で二置換されたC配糖体を生成することができる。
【００４４】
本発明に係る配糖化酵素遺伝子は、基質の炭素原子の２か所に糖を結合する配糖化活性を有する配糖化酵素をコードするDNAを有する遺伝子であり、その代表例として、配列表の配列番号５乃至８で示されるいずれかの塩基配列を挙げることができる。
【００４５】
本発明に係る配糖化酵素遺伝子が有するDNAは、コードする配糖化酵素の活性が保持される範囲であれば、配列表の配列番号５乃至８に記載のいずれかの塩基酸配列において、１個又は２個以上の塩基が欠失、置換及び／又は付加した塩基配列を有するDNAからなる改変塩基配列であってもよい。
【００４６】
「コードする」とは、本発明に係る配糖化酵素を、連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は、本発明に係る配糖化酵素を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含んでいる。
【００４７】
本発明に係るプラスミドは、例えば、本発明に係る配糖化酵素遺伝子が挿入された組換えベクターであり、その代表例として、配列表の配列番号５乃至８で示されるいずれかの塩基配列で示される遺伝子が挿入された組換えベクターを挙げることができる。
【００４８】
このような組換えベクターにおいては、本発明に係るcDNAが、その目的とするたんぱく質を発現可能な形式で導入することが可能な限り、その種類は限定されず、代表的な例として、ウイルス、大腸菌プラスミドが挙げられる。
【００４９】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るプラスミドが組換えベクターとして、所望のたんぱく質が発現可能な形態で導入された細胞をいう。本発明における形質転換体となる宿主細胞は、本発明に係る配糖化酵素を製造可能な原核細胞又は真核細胞であれば特に限定されることはないが、その代表例として、大腸菌、酵母が挙げられる。
【００５０】
「形質転換」とは、ある細胞に外来性のDNAを導入することによって、その細胞（宿主細胞）が永久的な遺伝子変化を起こすことを意味している。「形質転換体」とは、宿主細胞、宿主細胞の祖先の細胞、それの継代培養の細胞が、組換えDNA技術によって、所望のたんぱく質をコードするDNAを含む組換えベクターが導入された細胞であることを意味する。
【００５１】
次に、本発明に係る配糖化酵素遺伝子及び配糖化方法についてより具体的に説明する。本発明に係る配糖化酵素遺伝子は、例えば、以下の工程を経て得ることが可能である。
【００５２】
（cDNAの製造）
はじめに、本発明に係る配糖化酵素遺伝子を含む植物から全RNA(totalRNA)を抽出する。totalRNAの抽出は、当該植物を乳鉢等で破砕し、抽出バッファーと混濁、遠心分離等により行うことができる。植物からtotalRNAを抽出することは、当業者であれば、公知の方法を適宜選択することができる。
【００５３】
抽出されたtotalRNAから、本発明に係る配糖化酵素遺伝子に関連する箇所を選択し、配糖化酵素cDNAを製造する。cDNAの製造は、逆転写酵素を添加して逆転写を行って得られるcDNAに対するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって行うことができる。逆転写反応、およびPCR反応を行う際に使用するプライマー、逆転写酵素、PCR酵素、反応条件等は、当業者であれば、公知のものを適宜選択することができる。
【００５４】
（組換えベクターの製造）
前述の前工程により製造されたcDNAを、所定のベクターに導入することで本発明に係る組換えベクターを製造する。本発明において、使用するベクターの種類は特に限定されることはないが、大腸菌にたんぱく質を発現させるベクターが好適であり、pET-28a(＋)ベクターが特に好適である。ベクターへの導入方法については、当業者であれば、公知の方法を適宜選択可能である。
【００５５】
（形質転換体の製造）
前述の前工程により製造された組換えベクターを、所定の宿主細胞に導入することにより、本発明に係る配糖化酵素を発現する形質転換体を製造する。宿主細胞は特に限定されないが、原核細胞が好適であり、大腸菌が特に好適である。組換えベクターの宿主細胞への導入方法については、当業者であれば、公知の方法を適宜選択可能である。
【００５６】
（配糖体の製造）
本発明に係る配糖体の製造は、配糖化酵素遺伝子を導入された形質転換体を、フェニルプロパノイド類やアセトフェノン類、とりわけフラボノイドやジヒドロカルコンやα-フェニルアセトフェノンのような基質と共に培養することで行われる。この際、事前に前記形質転換体中において、配糖化酵素を産生させた後に、基質と反応させることも可能である。形質転換された細胞を使用して目的とするたんぱく質を発現させる方法、また目的とするたんぱく質を発現させた形質転換体を用いて、目的とする反応を行う方法については、当業者であれば、公知の方法を適宜選択可能である。
【００５７】
本発明に係る配糖体は、本発明に係る配糖化酵素遺伝子を導入された形質転換体と基質とを共培養し、その都度回収するバッチ処理により製造することが可能であり、また別の方法として、本発明に係る配糖化酵素遺伝子を導入された形質転換体の培養液に、基質を適宜添加して、逐次回収する連続処理によっても製造することが可能である。この際、添加可能な基質の量は、当該基質の溶解度に依存する。
【００５８】
本発明に係るC配糖体含有製品は、前記のような糖で二置換のC配糖体を有効成分として所定量を含有しているもので、例えば液状、粉末状、カプセル状、錠状、塊状、ゲル状のような任意の形状の飲食品、医薬品、サプリメント、又は飼料である。
【実施例】
【００５９】
以下に、本発明の実施の形態について、さらに詳細に説明する。
【００６０】
（実施例１）
＜使用機器＞
本実施例においては、振とう機としてバイオシェーカーBR-23FP（タイテック社製）を使用した。また、遠心分離機としてhimac CF-15R（日立製作所社製）を使用した。目的とするRT-PCR反応にはT-100サーマルサイクラー（Bio-Rad社製）を使用した。得られた糖で二置換されたC配糖体の分析にはLC/MS ACQUITY（登録商標） UPLC SQD SYSTEM（Waters社製）を使用した。DNAの配列の決定には、DNAシークエンサーABI3100（Life Technology社製）を使用した。
【００６１】
＜ミカン属植物の配糖化酵素遺伝子の獲得＞
ウンシュウミカンの葉（2g）を液体窒素下で凍らせて、乳鉢・乳棒を用いて破砕し、抽出バッファー（(100mM Tris-HCl(トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩)(pH9.0)、100mM NaCl、10mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)(pH8.0)）10mL、10%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)１mL、14M メルカプトエタノール 50μL、フェノール (pH9.0) 10mLの混合液に、よく混濁した。
【００６２】
その後、混濁液を、振とう機で10分間、15℃で振とうした後、クロロホルム・イソアミルアルコール混液 10mLを加え、10分間振とうし、遠心分離機を用いて9,000rpm.で10分間、15℃で遠心し、上清を回収した。
【００６３】
回収された上清に対し、フェノール (pH9.0)を7.5ml加え、振とう機で10分間、15℃で振とうし、クロロホルム・イソアミルアルコール混液7.5mlを加え、10分間、15℃で振とうした。その後、9,000rpm.で10分間、15℃で遠心し、上清を回収した。その後、回収された上清に対して3M酢酸ナトリウムを上清の1/10量加え、氷上に30分間静置した。
【００６４】
遠心分離機を用いて、12,000rpm.で15分間、4℃で遠心した後、上清を回収し、イソプロパノールを20ml加え、‐20℃で20分間静置した。12,000rpm.で20分間、4℃で遠心し、上清を取り除き、70％エタノールを加え、12,000rpm.で3分間、4℃で遠心した。上清を取り除いた後、ＴＥバッファー(10mM Tris-HCl (pH8.0)、1mM EDTA (pH8.0))(400μL)を加え、10分間、4℃で振とうし、沈殿を完全に溶解させ、1/4量の10M LiClを加え、‐20℃で2時間静置した。
【００６５】
静置した上清を15,000rpm.で10分間、4℃で遠心し、上清を除去後、70%エタノールを加え、12,000rpm.で3分間、4℃で遠心した。その後上清を更に除去し、沈殿を純水100μLで溶解し、これをtotalＲＮＡとした。
【００６６】
＜cDNAの製造＞
得られたtotalＲＮＡ（500ng）にdT-T3 プライマーを1μL添加し、合計6μLとして、65℃、10分間静置した。その後、5×RT buffer（TOYOBO社製） 4μL、2.5mM dNTP 8μL、滅菌水0.8 μL、RNase inhibitor（RNase阻害剤、Invitrogen社製） 0.2μL、酵素としてリバトラエース（逆転写酵素、TOYOBO社製）（登録商標）1μLを加え、42℃、1時間RT反応を行った。生成物に、抽出バッファー180 μLを加え、合計200μLとして、これをcDNA溶液とした。また、使用したプライマーを配列表の配列番号１０に示す。
【００６７】
（配列番号１０）
5'- attaaccctcactaaagggttttttttttttttttvv-3'
【００６８】
cDNA溶液をテンプレートとして、プライマー  CuCGT_Fw_NdeとCuCGT_Rv_Xhoの組合せで、Phusion DNAポリメラーゼ(Finnzyme社製)を用いてPCR反応（Initial denaturation 98℃,30秒、denaturation 98℃, 10秒、Annealing 60℃、Extension 72℃、45秒の40サイクル）を行った。その後、得られたPCR産物を、pCR4Blunt-TOPOベクター（Invitrogen社製）にTOPOクローニングし、DH5αにヒートショック法により形質転換した。得られた菌からプラスミド抽出を行い、pCR4Blunt-TOPO_CuCGT（ウンシュウミカン）を獲得し、塩基配列を決定した。得られたウンシュウミカンの葉由来の配糖化酵素遺伝子CuCGTの塩基配列を配列表の配列番号５に示す。得られたpCR4Blunt-TOPO_CuCGTを図１に示す。また、使用したプライマーを配列表の配列番号１１、１２に示す。
【００６９】
（配列番号１１）
5'-gtcatatgtc agattccggc ggctttg-3'
（配列番号１２）
5'-gactcgagtt aatgggtgttgttgttgcac-3'
【００７０】
＜組換えベクターの製造＞
得られたpCR4Blunt-TOPO_CuCGTを制限酵素（NdeＩXhoＩ）処理し、pET-28a(+)ベクターとライゲーションした。DH5αに形質転換し、コロニーPCRによって導入断片を確認した後、プラスミド抽出を行い、pET-28a_CuCGT(ウンシュウミカン)を獲得した。得られたpET-28a_CuCGTを図２に示す。
【００７１】
＜形質転換体の製造＞
次にこのプラスミドを用いてRosetta2(DE3)（Novagen社製）を形質転換し、たんぱく質発現用大腸菌とした。
【００７２】
＜2-ヒドロキシピノセンブリンのdi-C配糖体の製造＞
得られた形質転換体を用いて配糖体の製造を行った。製造は、非特許文献８に記載の方法を参照して行った。前工程で製造した形質転換体（pET-28a_CuCGT／Rosetta2（DE3））を、LB培地200 mLに植菌して22℃で振とう培養した。この際、終濃度0.4 mMとなるように IPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)を添加して一晩振とう培養し、たんぱく質発現誘導を行いウンシュウミカン由来の配糖化酵素を得た。得られた配糖化酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００７３】
その後、たんぱく質発現誘導を行った形質転換体を集菌し、20 mLのM9培地（2%のグルコースを含む）にOD600=3.5に合わせて懸濁した。得られた懸濁液に、基質（終濃度200μMの2-ヒドロキシピノセンブリン）を添加し、30℃で培養した。なお、2-ヒドロキシピノセンブリンの構造式を下記に示す。
【００７４】
【化１】
2015204752.tif 000003
【００７５】
基質と培養した液の上清をHPLCで分析した。分析条件は、固定相をオクタデシルシリル(ODS)カラム(2.1×50 mm: ACQUITY（登録商標） BEH C18、Waters社製)、移動相を溶媒A(0.1%ギ酸/超純水)と溶媒B(0.1%ギ酸/メタノール)のグラジエントとした。分析メソッドは溶媒B:20% 0.5分、B:20%-60% 2分、B:60% 2分、B:20% 2分を使用した。測定の流速は0.25 mL/min、温度は40℃、検出波長は290nmで分析した。
【００７６】
分析結果を図３に示す。図３中、上図は反応前（0分後）のスペクトルを示し、下図は反応後2時間経過した後のスペクトルを示す。図３から、基質が反応し、di-C配糖体が製造されたことが認められる。上図中のピークは、2-ヒドロキシピノセンブリンのものである。下図中、左側のピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリン（分子量 596）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=595を示す。また、下図中、右側のピークが、mono-C配糖体の6-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリン（分子量 434）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=433を示す。di-C配糖体である6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリンの構造式を以下に示す。
【００７７】
【化２】
2015204752.tif 000004
【００７８】
図４は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データは、6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリンの構造式を支持する。
【００７９】
反応液に１Ｍとなるように塩酸を加え、60度で2時間作用させると、6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリンが6,8-ジ-C-グルコシルクリシンに変換された。6,8-ジ-C-グルコシルクリシンの構造式を以下に示す。
【００８０】
【化３】
2015204752.tif 000005
【００８１】
（実施例２）
実施例１と同様の形質転換体を用いて、フロレチンのdi-C配糖体を製造した。使用機器、使用した組換えベクター、使用した形質転換体、製造された配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。
【００８２】
図５は、本実施例による生成物をHPLCにより分析した結果を示す。図中、フロレチンよりもリテンションタイムが短い、生成物の二つのピークのうち、より速いピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチン（分子量 598）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=597を示す。また、生成物の二つのピークのうち、より遅いピークは、mono-C配糖体の3'-C-グルコシルフロレチン（ノソファジン、分子量 436）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=435を示す。di-C配糖体である3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチンの構造式を以下に示す。
【００８３】
【化４】
2015204752.tif 000006
【００８４】
図６は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データは、3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチンの構造式を支持する。
【００８５】
（実施例３）
実施例１と同様の形質転換体を用いて、2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンのdi-C配糖体を製造した。使用機器、使用した組換えベクター、使用した形質転換体、製造された配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。
【００８６】
図７は、本実施例で製造された生成物のHPLC分析結果を示す。上図は、本実施例に係る形質転換体と基質を培地へ投与した直後、下図は、投与後２時間後の代謝物をHPLC（OD290nm）で検出した結果を示す。また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。下図のスペクトルの二つのピークのうち、リテンションタイムがより速いピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の3',5'-ジ-C-グルコシル-2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノン（分子量 568）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=567を示す。また、生成物の二つのピークのうち、リテンションタイムがより遅いピークは、mono-C配糖体の3'-C-グルコシル-2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノン（分子量 406）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=405を示す。di-C配糖体である3',5'-ジ-C-グルコシル-2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンの構造式を以下に示す。
【００８７】
【化５】
2015204752.tif 000007
【００８８】
図８は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データは、3',5'-ジ-C-グルコシル-2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンの構造式を支持する。
【００８９】
（実施例４）
ウンシュウミカンから単離された配糖化酵素遺伝子を使用して、2-ヒドロキシナリンゲニンの配糖体の製造を行った。使用機器、使用試薬、実験方法等、実施例１と同様である。
【００９０】
図９は、本実施例で製造された配糖体のHPLC分析結果のスペクトルを示す。上図は、本実施例に係る形質転換体と基質を培地へ投与した直後、下図は、投与後２時間後の代謝物をHPLC（OD290nm）で検出した結果を示す。また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。上図中、メインピークは、アピゲニンのものである。下図中、各メインピークは、リテンションタイムの速い順に、6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量  612）、ビニセン-2（分子量  594）、ビテキシン（分子量  432）、イソビテキシン（分子量  432）である。
【００９１】
図１０は、HPLC分析において最初に溶離した生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。図１０から、2-ヒドロキシナリンゲニンのdi-C配糖体（m/z=611）が製造されていることが認められる。
【００９２】
図１１は、本実施例における生成物についての、２番目に溶離した生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。図１１から、ビセニン-2（m/z=593）が製造されていることが認められる。
【００９３】
6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニンの構造式を以下に示す。
【化６】
2015204752.tif 000008
【００９４】
ビセニン-2の構造式を以下に示す。
【化７】
2015204752.tif 000009
【００９５】
（実施例５）
キンカンから単離された配糖化酵素遺伝子を使用して、2-ヒドロキシナリンゲニンの配糖体の製造を行った。使用機器、プライマーを含む使用試薬、実験方法等、実施例１と同様である。キンカン由来の配糖化酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。また、キンカン由来の配糖化酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
【００９６】
図１２は、本実施例で製造された配糖体のHPLC分析結果のスペクトルを示す。上図は、本実施例に係る形質転換体と基質を培地へ投与した直後、下図は、投与後４時間後の代謝物をHPLC（OD290nm）で検出した結果を示す。また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。上図中、メインピークは、2-ヒドロキシナリンゲニンのものである。下図中、各メインピークは、リテンションタイムの速い順に、6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量612）、6-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量450）である。これらは酸処理による脱水により、それぞれビセニン-2、ビテキシンおよびイソビテキシンに変換可能である。
【００９７】
図１３は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。図１３から、2-ヒドロキシナリンゲニンのdi-C配糖体（m/z=611）が製造されていることが認められる。
【００９８】
（実施例６）
キンカンから単離された配糖化酵素遺伝子を使用して、フロレチンの配糖体の製造を行った。使用機器、プライマーを含む使用試薬、実験方法等は、実施例１と同様である。
【００９９】
図１４は、本実施例による生成物をHPLCにより分析した結果を示す。図１４中、フロレチンよりもリテンションタイムが短い、生成物の二つのピークのうち、より速いピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチン（分子量 598）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=597を示す。また、生成物の二つのピークのうち、より遅いピークは、mono-C配糖体の3'-C-グルコシルフロレチン（ノソファジン、分子量 436）のものである。
【０１００】
図１５は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データは、3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチンの構造式を支持する。
【０１０１】
（実施例７）
タルウマゴヤシから単離された配糖化酵素遺伝子MtrCGT1を使用して、2-ヒドロキシピノセンブリンの配糖体の製造を行った。
【０１０２】
タルウマゴヤシの葉を、0.4 g採取し、液体窒素で凍らせて乳鉢ですり潰し、Sepasol-RNA I SuperG（ナカライテスク社製）を用いてtotal RNAを抽出した。
【０１０３】
得られたtotalRNA（500 ng）にdT-T3 プライマーを1μL添加し、合計6μLとして、65℃、10分間静置した。その後、5×RT buffer 4μL、2.5mM dNTP 8μL、滅菌水0.8μL、RNase out（Invitrogen社製） 0.2μL、酵素として、リバトラエース（TOYOBO社製）（登録商標）1μLを加え、42℃、1時間RT反応を行った。生成物に、抽出バッファー180μLを加え、合計200μLとして、これをcDNAとした。
【０１０４】
作製したcDNAをテンプレートとして、配列表の配列番号１３と１４に示すプライマーをそれぞれ用いてPCRを行った。
【０１０５】
（配列番号１３）
5'-cggatccatgtctgatgaagttgttcatgt-3'
（配列番号１４）
5'-cctcgagttaattgttgacattgtttttcc-3'
【０１０６】
PCR産物を、pCR4Blunt-TOPOベクター（Invitrogen社製）にTOPOクローニングし、DH5αにHeat shock法により形質転換した。得られたコロニーからそれぞれプラスミド抽出を行い、pCR4Blunt-TOPO_ MtrCGT1（タルウマゴヤシ）を獲得した。
【０１０７】
DNAシークエンス（DNAシークエンサーABI3100、Life Technology）による確認した後、制限酵素（NdeＩ、XhoＩ）処理し、pET-28a(+)ベクターとライゲーションした。単離された配糖化酵素遺伝子の塩基配列を配列番号７（MtrCGT1）に示す。また、タルウマゴヤシ由来の得られた配糖化酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。
【０１０８】
DH5αに形質転換し、プラスミド抽出を行い、pET-28a_MtrCGT1（タルウマゴヤシ）を獲得した。
【０１０９】
製造されたプラスミドpET-28a_MtrCGT1を用いてRosetta2(DE3)（Novagen社製）を形質転換し、コロニーPCRによりプラスミドの導入を確認して、本実施例における形質転換体を製造した。
【０１１０】
製造された形質転換体を用いて、2-ヒドロキシピノセンブリンのdi-C配糖体の製造を行った。実験方法は実施例１と同様であり、また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。
【０１１１】
図１６は、本実施例で製造された配糖体のHPLC分析結果のスペクトルを示す。図１１中、上図は、本実施例に係る形質転換体と基質を培地へ投与した直後、下図は、投与後４時間後の代謝物をHPLC（OD290nm）で検出した結果を示す。また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。なお、併せてLC-MSにより生成物を同定した。上図中、メインピークは、2-ヒドロキシピノセンブリンのものである。実施例１と同様に、下図中、左側のピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリン（分子量 596）のものであり、右側のピークが、mono-C配糖体の6-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリン（分子量434）のものであり、それぞれ同定された。図から、2-ヒドロキシピノセンブリンのdi-C配糖体が製造されていることが認められる。
【０１１２】
図１７は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データ（m/z=595）は、6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリンの構造式を支持する。
【０１１３】
（実施例８）
タルウマゴヤシから単離された配糖化酵素遺伝子を使用して、2-ヒドロキシナリンゲニンの配糖体の製造を行った。使用機器、プライマーを含む使用試薬、実験方法等は、実施例７と同様である。
【０１１４】
図１８は、本実施例で製造された配糖体のHPLC分析結果のスペクトルを示す。図１８中、上図は、本実施例に係る形質転換体と基質を培地へ投与した直後、下図は、投与後４時間後の代謝物をHPLC（OD290nm）で検出した結果を示す。また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例１と同様である。上図中、メインピークは、2-ヒドロキシナリンゲニンのものである。実施例５と異なり、本例は酸処理していない例を示した。下図中、左側のピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量 612）のものであり、右側のピークが、mono-C配糖体の6-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量450）のものであり、それぞれ同定された。図１８から、2-ヒドロキシナリンゲニンのdi-C配糖体が製造されていることが認められる。
【０１１５】
上記のHPLCと併せて、LC-MSにより生成物を同定した。図１９は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。図１９から、2-ヒドロキシナリンゲニンのdi-C配糖体が製造されていることが認められる。
【０１１６】
（実施例９）
ダイズから単離された配糖化酵素遺伝子を使用して、2-ヒドロキシナリンゲニンの配糖体の製造を行った。実験機器、実験手順は、実施例７と同様である。使用したプライマーを配列番号１５、１６に示す。抽出された配糖化酵素遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。また、ダイズ由来の配糖化酵素（GmCGT2）のアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示す。
【０１１７】
（配列番号１５）
5'-ggtcatatgtctgtttctgaacgtgttg-3'
（配列番号１６）
5'-ggctccgagtcaagtagcttgagaattcctc-3'
【０１１８】
図２０は、本実施例で製造された配糖体のHPLC分析結果のスペクトルを示す。上図は、本実施例に係る形質転換体と基質を培地へ投与した直後、下図は、投与後４時間後の代謝物をHPLC（OD290nm）で検出した結果を示す。また、製造されたdi-C配糖体の分析方法は、実施例７と同様である。上図中、メインピークは、2-ヒドロキシナリンゲニンのものである。下図中、各メインピークは、リテンションタイムの速い順に、6,8-ジ-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量612）、6-C-グルコシル-2-ヒドロキシナリンゲニン（分子量 450）であり、それぞれネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=611、m/z=449を示す。
【０１１９】
図２１は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。図２１から、2-ヒドロキシナリンゲニンのdi-C配糖体が製造されていることが認められる。
【０１２０】
（実施例１０）
ダイズから単離された配糖化酵素遺伝子を使用して、フロレチンの配糖体の製造を行った。使用機器、プライマーを含む使用試薬、実験方法等、実施例９と同様である。
【０１２１】
図２２は、本実施例による生成物をHPLCにより分析した結果を示す。図２２中、フロレチンよりもリテンションタイムが短い、生成物の二つのピークのうち、より速いピークは、本実施例で製造されたdi-C配糖体の3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチン（分子量 598）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=597を示す。また、生成物の二つのピークのうち、より遅いピークは、mono-C配糖体の3'-C-グルコシルフロレチン（ノソファジン、分子量 436）のものである。
【０１２２】
図２３は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データは、3',5'-ジ-C-グルコシルフロレチンの構造式を支持する。
【０１２３】
（実施例１１）
得られたdi-C配糖体を前記の配合量で含有させて、C配糖体含有製品を得た。
【０１２４】
（実施例１２）
ソバ（Fagopyrum esculentum）子葉から単離された配糖化酵素遺伝子(FeCGTa)を使用して、C配糖体の製造を行った。本実施例において製造される配糖体は、本発明に係るdi-C配糖体ではなく、基質に１つの糖が結合した一置換のmono-C配糖体であるが、従来知られる配糖化技術と比較して、大腸菌の形質転換体を用いることで簡便な方法である点、配糖化酵素遺伝子としてFeCGTaを使用することで、90%を超える高効率な変換を可能にする点で新規である。このソバ由来の配糖化酵素遺伝子を使用したmono-C配糖体もしくはdi-C配糖体の製造方法は、新規な発明を構成することも可能である。本実施例においては、使用機器、使用試薬等は、実施例７と同様である。使用したプライマーを配列番号１７、１８に示す。抽出された配糖化酵素遺伝子（FeCGTa）の塩基配列を配列表の配列番号９に示す。具体的な方法としては、FeCGTaをpET28a(+)に導入したプラスミドで大腸菌Rosetta2(DE3)の形質転換を行った。その後、得られた形質転換体を LB培地で培養し、IPTGを添加して22℃でたんぱく質発現誘導を行った。
【０１２５】
（配列番号１７）
5'- ccggcatatgatgggagatttaacaacttc -3'
（配列番号１８）
5'- cctcgagaattcaacgtttaagacttccga -3'
【０１２６】
図２４は、本実施例により、FeCGTaを用いた形質転換体と2-OHピノセンブリンとの反応物をHPLCにより分析した結果を示す。図２４中、2-ヒドロキシピノセンブリンよりもリテンションタイムが短いピークは、本実施例で製造されたmono-C配糖体の6-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリン（分子量 434）のものであり、ネガティブスキャンモード（ES-）のLC-MS分析でm/z=433を示す。また、図２４においては、投与された基質の90%以上が配糖体に変換されていることが認められる。
【０１２７】
図２５は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。このLC-MS分析データは、6-C-グルコシル-2-ヒドロキシピノセンブリンの構造式を支持する。
【０１２８】
本実施例においては、基質として2-ヒドロキシピノセンブリンを使用したが、FeCGTaを用いた配糖体の製造方法においては、フロレチン、2-ヒドロキシナリンゲニン、2-フェニル-2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノンのmono-C配糖体も、高効率に製造することが可能である。図２６は、FeCGTaを用いてフロレチンの配糖体を製造した際のHPLCによる分析結果を示す。図２７は、HPLC分析において生成物を質量分析（MS）検出器のネガティブスキャンモード（ES-）により検出したマススペクトルを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明の配糖化酵素は、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類をアグリコンとする、糖で二置換されたdi-C配糖体を、効率的に製造するのに用いられる。
【０１３０】
本発明の配糖化酵素遺伝子やcDNAは、プラスミドに組み込ませたり、それを導入した形質転換体にしたりして、糖で二置換されたC配糖体の製造方法に用いられる。
【０１３１】
本発明の糖で二置換のC配糖体は、有効成分として飲食品、医薬品、サプリメント、飼料に含有させて、抗腫瘍作用等、様々な薬効を発現するC配糖体含有製品のために、用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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