(57)【要約】【課題】新たな変形性関節症予防治療薬の提供。【解決手段】３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とする変形性関節症予防及び／又は治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とする変形性関節症予防及び／又は治療薬。
【請求項２】
３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とするII型コラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とするＮｏｔｃｈシグナル伝達因子産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな変形性関節症予防治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は、関節のクッションの役目を果たす軟骨や半月板が長期間に少しずつすり減り変形することで起こる関節症であり、加齢、肥満、激しい運動、悪い姿勢などが代表的なリスクファクターである。治療法として、運動療法、手術療法、薬物療法などがある。薬物療法としては、ヒアルロン酸及びその修飾体（特許文献１〜３）の関節内注射、コンドロイチン硫酸産生促進剤（特許文献４）、消炎鎮痛剤の投与等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公平５−７４５７１号公報
【特許文献２】国際公開第００／５３１９４号
【特許文献３】特開２００７−２９１１３３号公報
【特許文献４】特開２００９−２７４９５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の変形性関節症予防治療薬は、対症療法であるか、又は一時的に軟骨成分を補充するものであり、長期に渡って軟骨成分を再生させるものではなかった。
従って、本発明の課題は、長期に渡って関節の軟骨成分を再生し得る新たな変形性関節症の予防治療薬を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者は、軟骨成分の産生促進、軟骨組織の骨化の分解を抑制等の作用に着目して種々検討した結果、生体内硫酸基供与体である３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩が半月板切除変形性関節症モデルにおいて関節の伸展角の抑制を顕著に改善し、また全く予想外に、軟骨成分の一つであるII型コラーゲンの産生を促進し、また軟骨組織の骨化や分解に関与するＮｏｔｃｈ経路のシグナル伝達因子の産生を抑制することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とする変形性関節症予防及び／又は治療薬を提供するものである。
また、本発明は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とするII型コラーゲン産生促進剤を提供するものである。
さらに、本発明は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩を有効成分とするＮｏｔｃｈシグナル伝達因子産生抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（以下、ＰＡＰＳという）又はその塩を投与することにより、関節の軟骨成分の一種、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるアグリカンの産生を促進し、またII型コラーゲンの産生を促進し、軟骨組織におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達因子の産生を抑制する結果、変形性関節症の症状を顕著に改善することができる。さらには、このようにアグリカンやII型コラーゲンといった軟骨成分の産生促進と、軟骨組織の骨化・分解の抑制という２つの作用を同時に兼ね備えた変形性関節症予防及び／又は治療薬は、従来全く知られていなかったものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】変形性関節症モデルラットにおける関節伸展角に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図２】アグリカンの発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図３】II型コラーゲンの発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図４】Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子（ＨＥＳ１）の発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図５】Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子（ＪＡＧ１）の発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の変形性関節症予防及び／又は治療薬の有効成分は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）又はその塩である。ＰＡＰＳは、生体内の硫酸基供与体であり、国際公開第２００６／０８０３１３号、特開２００２−７８４９８号公報等に記載の方法で製造することができる。また、その安定な塩は、国際公開第２００７／０５８２７８号に開示されている。当該ＰＡＰＳは、育毛剤（国際公開第２０１２／０５７３３６号）、保湿剤（特開２０１２−２０１６６５号公報）等として有用であることが知られているが、軟骨成分に対する作用は何ら報告されていない。ＰＡＰＳの塩としては、ナトリウム塩などの金属塩、アンモニウム塩および各種アミン化合物塩、アミノ酸塩、イミダゾール塩等が挙げられ、とくに国際公開第２００７／０５８２７８号に記載のトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン等のアミン化合物塩が好ましい。
【００１０】
後記実施例に示すように、半月板切除変形性関節症モデルを用いた評価において、ＰＡＰＳは用量依存的に関節伸展角の抑制を改善した。従って、ＰＡＰＳは、変形性関節症の種々の症状、例えば関節の痛み、関節の動き等を改善する効果を有する。
【００１１】
また、関節軟骨培養細胞において、ＰＡＰＳはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるアグリカンの産生を促進する効果、II型コラーゲン遺伝子発現を亢進させる効果を有していた。ＰＡＰＳは、軟骨成分のプロテオグリカン以外に、タンパク質であるII型コラーゲンの産生も促進する。
【００１２】
ＰＡＰＳは、軟骨細胞において変形性関節症病態の悪化を促進するＮｏｔｃｈ経路のシグナル伝達因子の発現を抑制した。Ｎｏｔｃｈシグナルは、軟骨組織の骨化や、アグリカナーゼなど軟骨組織の分解酵素の発現を促進するシグナル経路であり（PNAS Vol.110, No.5 p.1875-1880）、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子の具体例としては、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１，３，４、Ｊａｇｇｅｄ−１，２）やＮｏｔｃｈレセプター（Ｎｏｔｃｈ１〜４）、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子（Ｈｅｓ、Ｍｙｃ、ｐ２１ｆａｍｉｌｙ）等を挙げることができる。本試験で検討したＪａｇｇｅｄ−１（ＪＡＧ１）はＮｏｔｃｈシグナルの活性化に、Ｈｅｓ１は軟骨組織の骨化および軟骨組織の分解酵素の誘導に関連する遺伝子であることが知られている。軟骨の骨化および軟骨組織の分解は、いずれも変形性関節症を引き起こす重要な要因である。一方、ＰＡＰＳを投与することによって、これらに関わるシグナル伝達因子の発現を抑制することができ、結果的に軟骨組織への損傷を抑制する効果を有することがわかる。
【００１３】
すなわち、ＰＡＰＳ又はその塩は、（１）軟骨組織の構成成分自体の産生を促進する効果（アグリカン等のプロテオグリカンと、II型コラーゲン）、（２）軟骨の骨化や軟骨組織の分解を抑制する効果（Ｎｏｔｃｈシグナル関連）というメカニズムによって、変形性関節症の症状を改善する可能性が高いことがわかった。
【００１４】
本発明の変形性関節症予防及び／又は治療薬、II型コラーゲン産生促進剤、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達因子産生抑制剤は、ヒトを含む哺乳類の医薬品として使用することができる。
【００１５】
本発明の医薬の投与法は、注射によるのが好ましい。投与量は、ＰＡＰＳとして、１日あたり０．００１〜０．５μｍｏｌ／ｋｇ程度が好ましい。また投与回数は、週１〜４回程度が好ましい。
【００１６】
本発明において、ＰＡＰＳ又はその塩を注射で投与する場合、水性注射剤、水性懸濁注射剤、脂肪乳剤、リポソーム注射剤等が好ましい。
水性注射剤、水性懸濁注射剤においては、ＰＡＰＳ又はその塩を、精製水と混合し、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、保存剤などを加え、混合して、必要に応じて加熱しながら溶解乃至懸濁させ、滅菌して注射剤容器に充填密封し、水性注射剤、水性懸濁注射剤とする。水性注射剤は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、関節腔内等に投与することができる。また、水性懸濁注射剤は皮下、筋肉内、皮内、関節腔内等に投与することができる。
水溶性あるいは水膨潤性高分子としては、ゼラチン、セルロース誘導体、アクリル酸誘導体、ポビドン、マクロゴール、ポリアミノ酸誘導体、多糖体類が好ましく、ゼラチン類では精製ゼラチン、セルロース誘導体では、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２２０８、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、アクリル酸誘導体としては、アミノアクリルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマー、ポリアミノ酸誘導体としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸が好ましい。多糖体としては、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストリンが特に好ましい。水溶性あるいは水膨潤性高分子の添加量は、ＰＡＰＳ又はその塩の量、並びに水溶性あるいは水膨潤性高分子の性質、分子量、適用部位によって異なるが概ね製剤全量に対し、０．０１％〜１０質量％の範囲で使用可能である。
ｐＨ調整剤には、人体に無害な酸あるいはアルカリが用いられ、界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。また、浸透圧調整剤には、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、防腐剤にはパラベン類が、保存剤にはアスコルビン酸や亜硫酸塩類が例示される。これらの使用量は、特に限定はないが、その作用がそれぞれ発揮できる範囲で用いられる。また、必要に応じ塩酸プロカイン等の局所麻酔剤、ベンジルアルコール等の無痛化剤、キレート剤、緩衝剤、あるいは水溶性有機溶剤等を加えてもよい。
脂肪乳剤は例えば、適当な油脂に乳化剤とＰＡＰＳ又はその塩を配合し、精製水を加えて、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、保存剤などを加え、適当な乳化装置で乳化し、滅菌して注射剤容器に充填密封することによって調製することができる。脂肪乳剤は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、関節腔内等に投与することができる。
使用する油脂は、植物性油脂あるいは合成油脂が好ましく、例えば大豆油、トウモロコシ油、椿油、ゴマ油、綿実油、サフラワー油、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピルが挙げられる。乳化剤は、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、脂肪酸を用いることができる。水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、保存剤などは前記のものを用いることができる。
リポソーム注射剤は、例えば、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、コレステロール等の脂質を適当な有機溶媒に溶解してフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターで有機溶媒を除去することにより脂質の皮膜を形成する。そこにエスクレチン、その誘導体あるいはその薬理的に許容される塩を溶解した水溶液を加え、必要に応じて、水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、保存剤などを加え、激しく振盪、攪拌することによりできた乳濁液を滅菌して注射剤容器に充填密封することによって調製することができる。リポソーム製剤は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、関節腔内等に投与することができる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００１８】
（実施例１）変形性関節症モデルラットにおける変形性関節症改善作用
動物の飼育に関しては、自由摂餌（固型飼料ＣＥ−２，日本クレア）、自動給水、１２時間明暗サイクルで行った。ＳＤラット（日本クレア産）（雄性、６−７週齢）を自由摂餌（固形飼料ＣＥ−２，日本クレア）、自動給水、１２時間明暗サイクルの環境下で１４週齢になるまで馴化飼育した。ペントバルビタールを生理食塩水に溶解させ、１００ｍｇ／ｋｇの容量でラットに腹腔内注射して麻酔した後、右後肢ひざ関節周囲の体毛を剃毛し、７０％エタノールで除菌後、内側半月板を切除した。内側半月版切除後の１週間、１日おきに抗生物質（０．５ｍｇ／ｍｌ sulfomethoxazole，０．１ｍｇ／ｍｌ trimethoprim）を飲水に混ぜて摂取させた。内側半月板切除の１１日後から、生理食塩水に溶解させて調製した以下に示す４種類の被検物質を１回５０μｌ、週２回、４週間、関節内注射により投与した。第１群（ｎ＝１１）には対照として生理食塩水を投与した。第２群（ｎ＝１２）には０．１ｍＭ  ＰＡＰＳ，４Ｎａを投与した。第３群（ｎ＝１３）には１ｍＭ  ＰＡＰＳ，４Ｎａを投与した。第４群（ｎ＝１０）には陽性対照として０．５ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸を投与した。投与期間終了後、過剰量のペントバルビタール麻酔を行ってマウスを安楽死させた後、右後肢を切除し、関節胞を傷つけずに筋肉を除去した後、膝の関節伸展角を測定した。膝の関節伸展角測定結果を図１に示す。
【００１９】
半月板切除を行っていない左後肢膝関節の伸展角度は平均で１５２°だったのに対し、第１群の右後肢膝関節の伸展角度は、１３９°であり、変形性関節症により膝関節の稼動範囲が制限されていることが確認された。第２群（０．１ｍＭ  ＰＡＰＳ群）、第３群（１ｍＭ  ＰＡＰＳ群）の稼動範囲は、それぞれ１４１°、１４３°であり、対照と比較してＰＡＰＳの容量依存的に大きくなっており、第３群の伸展角度は、第１群の同値と比較して統計学的に有意に大きく（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定にてｐ値＜０．０５）、ＰＡＰＳの変形性関節症改善効果が認められた。さらに、１ｍＭ  ＰＡＰＳ群の伸展角度は、陽性対照群であるヒアルロン酸群の同値の１４２°よりも大きく、ヒアルロン酸よりも優れた変形性関節症改善作用が認められた。
【００２０】
（実施例２）軟骨細胞の軟骨基質産生促進作用
日本ホワイト（雄性，３ｋｇ）に過剰量のペントバルビタール麻酔を行って安楽死させ、大腿骨骨端、頚骨骨端および膝蓋骨を採取し、氷冷した１％アンピシリン、１％ストレプトマイシン含有ダルベッコ変法ＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）にて洗浄後、実体顕微鏡下で、マイクロサージェリーの手法で関節軟骨を単離した。関節軟骨を細切した後、０．０５％hyaluronidase（Sigma）を含むＤ−ＭＥＭに懸濁し、３７℃にて１０分間処理した。次いで、酵素液を吸引除去した後、軟骨片を０．２％trypsin（Gibco）に懸濁し、３７℃にて３０分間処理した。さらに、酵素液を吸引除去した後、軟骨片を０．２％collagenase type II（Worthington Biochemical）に懸濁し、３７℃にて３時間処理した。酵素処理液をステンレスフィルター（１５０μｍ）でろ過した後、ＰＢＳにて３回洗浄し、ウサギ硝子軟骨由来軟骨細胞を調製した。軟骨細胞を１％アンピシリン、１％ストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン（Invitrogen），１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｄ−ＭＥＭに懸濁し、４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度になるようにcollagen coat plateに播種し、３７℃に調温した炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％）中で培養した。confluentになるまで培養した後、緩衝塩類溶液で２回洗浄した後、血清不含Ｄ−ＭＥＭに置換し、各種濃度のＰＡＰＳおよび対照として生理食塩水を添加した。被検物質添加の４時間後培地を除き、細胞からRNeasy Mini kit（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して総ＲＮＡを抽出した。この総ＲＮＡを鋳型として、ReverTra Ace(R) qPCR RT Kit（東洋紡）を使用して逆転写反応液を調製し、逆転写反応液およびGoTaq(R) qPCR Master Mix（Promega）、リアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System（タカラバイオ）を用いてによるリアルタイムＰＣＲにより軟骨基質であるアグリカンおよびII型コラーゲン、内部標準としてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を測定した。同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、対照群とアグリカンおよびII型コラーゲン発現量を比較した。結果を図２及び図３に示す。
【００２１】
図２及び図３に示すとおり、アグリカンおよびII型コラーゲンｍＲＮＡ発現量はＰＡＰＳ添加によって濃度依存的かつ顕著に亢進した。以上の結果から、ＰＡＰＳは非常に優れた軟骨基質産生促進作用を有することが認められた。
【００２２】
（実施例３）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子の発現抑制作用
実施例２と同様の手法で軟骨細胞培養、ＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｈｅｓ１および内部標準としてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を測定した。同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨの発現量の値で補正を行った後、対照群と発現量を比較した。結果を図４及び図５に示す。
図４及び図５に示すとおり、ＨＦＳ１及びＪａｇｇｅｄ−１（ＪＡＧ１）のｍＲＮＡ発現量はＰＡＰＳ添加によって濃度依存的かつ顕著に低下した。以上の結果から、ＰＡＰＳは非常に優れたＮｏｔｃｈシグナル伝達因子の発現抑制作用を有することが認められた。
【図１】
2015020948.tif 000002
【図２】
2015020948.tif 000003
【図３】
2015020948.tif 000004
【図４】
2015020948.tif 000005
【図５】
2015020948.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月30日(2014.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
そこで、本発明者は、軟骨成分の産生促進、軟骨組織の骨化または分解の抑制等の作用に着目して種々検討した結果、生体内硫酸基供与体である３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその塩が半月板切除変形性関節症モデルにおいて関節の伸展角の抑制を顕著に改善し、また全く予想外に、軟骨成分の一つであるII型コラーゲンの産生を促進し、また軟骨組織の骨化や分解に関与するＮｏｔｃｈ経路のシグナル伝達因子の産生を抑制することを見出し、本発明を完成した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【図１】変形性関節症モデルラットにおける関節伸展角に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図２】アグリカンの発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図３】II型コラーゲンの発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図４】Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子（Ｈｅｓ１）の発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【図５】Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子（Ｊａｇ１）の発現に対するＰＡＰＳの効果を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ＰＡＰＳは、軟骨細胞において変形性関節症病態の悪化を促進するＮｏｔｃｈ経路のシグナル伝達因子の発現を抑制した。Ｎｏｔｃｈシグナルは、軟骨組織の骨化や、アグリカナーゼなど軟骨組織の分解酵素の発現を促進するシグナル経路であり（PNAS Vol.110, No.5 p.1875-1880）、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子の具体例としては、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１，３，４、Ｊａｇｇｅｄ−１，２）やＮｏｔｃｈレセプター（Ｎｏｔｃｈ１〜４）、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子（Ｈｅｓ、Ｍｙｃ、ｐ２１ｆａｍｉｌｙ）等を挙げることができる。本試験で検討したＪａｇｇｅｄ−１（Ｊａｇ１）はＮｏｔｃｈシグナルの活性化に、Ｈｅｓ１は軟骨組織の骨化および軟骨組織の分解酵素の誘導に関連する遺伝子であることが知られている。軟骨の骨化および軟骨組織の分解は、いずれも変形性関節症を引き起こす重要な要因である。一方、ＰＡＰＳを投与することによって、これらに関わるシグナル伝達因子の発現を抑制することができ、結果的に軟骨組織への損傷を抑制する効果を有することがわかる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
（実施例２）軟骨細胞の軟骨基質産生促進作用
日本ホワイト（雄性，３ｋｇ）に過剰量のペントバルビタール麻酔を行って安楽死させ、大腿骨骨端、頚骨骨端および膝蓋骨を採取し、氷冷した１％アンピシリン、１％ストレプトマイシン含有ダルベッコ変法ＭＥＭ培地（Ｄ−ＭＥＭ）にて洗浄後、実体顕微鏡下で、マイクロサージェリーの手法で関節軟骨を単離した。関節軟骨を細切した後、０．０５％hyaluronidase（Sigma）を含むＤ−ＭＥＭに懸濁し、３７℃にて１０分間処理した。次いで、酵素液を吸引除去した後、軟骨片を０．２％trypsin（Gibco）に懸濁し、３７℃にて３０分間処理した。さらに、酵素液を吸引除去した後、軟骨片を０．２％collagenase type II（Worthington Biochemical）に懸濁し、３７℃にて３時間処理した。酵素処理液をステンレスフィルター（１５０μｍ）でろ過した後、ＰＢＳにて３回洗浄し、ウサギ硝子軟骨由来軟骨細胞を調製した。軟骨細胞を１％アンピシリン、１％ストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン（Invitrogen），１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｄ−ＭＥＭに懸濁し、４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度になるようにcollagen coat plateに播種し、３７℃に調温した炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％）中で培養した。confluentになるまで培養した後、緩衝塩類溶液で２回洗浄した後、血清不含Ｄ−ＭＥＭに置換し、各種濃度のＰＡＰＳおよび対照として生理食塩水を添加した。被検物質添加の４時間後培地を除き、細胞からRNeasy Mini kit（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して総ＲＮＡを抽出した。この総ＲＮＡを鋳型として、ReverTra Ace(R) qPCR RT Kit（東洋紡）を使用して逆転写反応液を調製し、逆転写反応液およびGoTaq(R) qPCR Master Mix（Promega）、リアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System（タカラバイオ）を用いてによるリアルタイムＰＣＲにより軟骨基質であるアグリカンおよびII型コラーゲン、内部標準としてＧａｐｄｈのｍＲＮＡ発現量を測定した。同一サンプルにおけるＧａｐｄｈの発現量の値で補正を行った後、対照群とアグリカンおよびII型コラーゲン発現量を比較した。結果を図２及び図３に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
（実施例３）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達因子の発現抑制作用
実施例２と同様の手法で軟骨細胞培養、ＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｈｅｓ１および内部標準としてＧａｐｄｈのｍＲＮＡ発現量を測定した。同一サンプルにおけるＧａｐｄｈの発現量の値で補正を行った後、対照群と発現量を比較した。結果を図４及び図５に示す。
図４及び図５に示すとおり、Ｈｅｓ１及びＪａｇｇｅｄ−１（Ｊａｇ１）のｍＲＮＡ発現量はＰＡＰＳ添加によって濃度依存的かつ顕著に低下した。以上の結果から、ＰＡＰＳは非常に優れたＮｏｔｃｈシグナル伝達因子の発現抑制作用を有することが認められた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2015020948.tif 000007
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2015020948.tif 000008