(57)【要約】【課題】  蒸発乾燥法を用いた、長期保存可能なＡＭＶ逆転写酵素を含む核酸増幅試薬を提供すること。【解決手段】  ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む（好ましくは、（１）ＲＮＡポリメラーゼ、（２）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸（３）標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド、のいずれか一つ以上をさらに含む）溶液を蒸発乾燥して得られる核酸増幅試薬により、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液を蒸発乾燥して得られる、核酸増幅試薬。
【請求項２】
さらに以下の（１）から（３）のいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の核酸増幅試薬。
（１）ＲＮＡポリメラーゼ
（２）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸
（３）標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド
【請求項３】
溶液中に含まれるトレハロースの濃度が６０ｍＭから６００ｍＭの間である、請求項１または２に記載の核酸増幅試薬。
【請求項４】
ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとＲＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド三リン酸とリボヌクレオチド三リン酸と標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドとを含む溶液を蒸発乾燥して得られる核酸増幅試薬に、前記標的核酸を含む試料を添加し、塩類を含む核酸増幅開始液を添加後、核酸増幅反応を行なうことで前記標的核酸を検出する方法。
【請求項５】
核酸増幅反応がＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法のいずれかである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長期保存可能な核酸増幅試薬に関する。特に本発明は、長期保存可能なＡＭＶ逆転写酵素を含む核酸増幅試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、公衆衛生、食品検査の分野では、試料中に含まれる細胞、細菌、真菌、ウイルスなどに由来するＤＮＡやＲＮＡ（標的核酸）を検出するための検査が実施される。一般的に試料中に含まれる標的核酸は微量なため、試料中に含まれる標的核酸を検出する際は通常、核酸増幅反応により標的核酸を増幅してから検出する。核酸増幅反応の例としては、ＰＣＲ法（特許文献１から３参照）、ＬＡＭＰ法（非特許文献１参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４および５参照）、ＴＭＡ法（特許文献６参照）、ＴＲＣ法（特許文献７および非特許文献２参照）があげられる。これら核酸増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの核酸合成酵素が必須である。
【０００３】
試料中に含まれる標的核酸を核酸増幅反応により増幅するための試薬（核酸増幅試薬）に求められる性能の一つとして、長期保管による増幅性能の差異がないことがあげられる。しかしながら核酸増幅試薬に含まれる核酸合成酵素は、室温や冷蔵条件下で酵素活性が著しく低下することが知られている。そのため、核酸増幅試薬の製造、輸送、および貯蔵においては、核酸合成酵素の活性をいかに保持するかが重要な課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号公報
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号公報
【特許文献３】米国特許第４９６５１８８号公報
【特許文献４】特許２６５０１５９号公報
【特許文献５】特許３１５２９２７号公報
【特許文献６】特許３２４１７１７号公報
【特許文献７】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献８】ＷＯ９８／００５３０号
【特許文献９】ＷＯ９６／２４６６４号
【特許文献１０】ＷＯ８７／００１９６号
【特許文献１１】特許第３０６８８３６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈａｉ  Ｈ．Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２，１９５６−６１（２００４）
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献３】Ｆｒａｎｋｓ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｍ．，４（９），３８−５５（１９９１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
分子生物学の分野で用いられる酵素の安定貯蔵法としては、メルカプトエタノールやジチオスレイトールなどのＳＨ基保護剤とグリセロールとを含む緩衝液からなる不凍液中で、−２０℃の条件下に貯蔵するのが一般的であり、この方法で数ヶ月は酵素活性を保持したまま貯蔵することができる。しかしながら室温や冷蔵条件下では、前述した不凍液中であっても著しく酵素活性が低下することが知られている。そのため、この方法で核酸増幅試薬を供給者から最終使用者へと輸送する際には、冷凍輸送などにより酵素の劣化を防ぐ必要がある。
【０００７】
室温または冷蔵条件下での酵素の劣化を防ぐための方法として、凍結乾燥法がよく用いられる。凍結乾燥法は、被乾燥物（主に酵素）と、賦形剤（主に糖類）とを含む溶液を凍結させ（凍結工程）、低温・高真空下で氷相を昇華させ（一次乾燥工程）、徐々に温度を上昇させることで残留水分を除去する（二次乾燥工程）ことで酵素の乾燥体を得る方法である。この方法により得られた酵素の乾燥体は長期間の貯蔵安定性を示す。凍結乾燥法による核酸合成酵素の安定化についてはいくつか報告されており、例えば
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）からなる酵素群と、キャリアタンパク質、二糖類、二糖類誘導体および糖重合体からなる賦形剤とを含む凍結乾燥体（特許文献８参照）や、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＭＭＬＶ逆転写酵素からなる酵素群と、トレハロースからなる賦形剤とを含む凍結乾燥体（特許文献９参照）、
があげられる。いずれの凍結乾燥体も、冷蔵温度以上で数ヶ月間、核酸合成酵素としての活性が保持されることが示されている。
【０００８】
前述したように凍結乾燥法は室温や冷蔵条件下での酵素の安定化に有用である。しかしながら凍結工程における酵素と氷晶表面との接触や共存物質の濃縮、ならびに乾燥工程における酵素周辺の水分子の離脱により、酵素の高次構造が変化するため、酵素によっては当該変化により活性が低下することが知られている。この問題を解決するため、凍結工程を必要としない乾燥法による酵素活性の低下を防ぐ方法も報告されている。例えば、
酵素、血清、抗体、抗原等などの生理活性物質と、トレハロースからなる賦形剤とを含む溶液を、室温・大気圧下で乾燥する方法（風乾法）（特許文献１０参照）や、
前記生理活性物質と、フィコールなどの糖類誘導体からなる賦形剤とを含む溶液を、室温以上・大気圧の９０％以下の条件で乾燥する方法（蒸発乾燥法）（非特許文献３および特許文献１１参照）、
があげられる。これら乾燥法は凍結を必要としないことから、凍結乾燥法の凍結工程における酵素の損傷を防ぐことができる点で有用である。しかしながら、これら乾燥法では、乾燥時に被乾燥物が室温以上に長時間曝露されるため、被乾燥物が核酸合成酵素の場合、その酵素活性の劣化が懸念される。特に核酸合成酵素の一つであるＡＭＶ逆転写酵素の、蒸発乾燥法による安定化の報告例はない。
【０００９】
そこで本発明の目的は、蒸発乾燥法を用いた、長期保存可能なＡＭＶ逆転写酵素を含む核酸増幅試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明の第一の態様は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液を蒸発乾燥して得られる、核酸増幅試薬である。
【００１２】
また本発明の第二の態様は、さらに以下の（１）から（３）のいずれか一つ以上を含む、前記第一の態様に記載の核酸増幅試薬である。
（１）ＲＮＡポリメラーゼ
（２）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸
（３）標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド
また本発明の第三の態様は、溶液中に含まれるトレハロースの濃度が６０ｍＭから６００ｍＭの間である、前記第一または第二の態様に記載の核酸増幅試薬である。
【００１３】
さらに本発明の第四の態様は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとＲＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド三リン酸とリボヌクレオチド三リン酸と標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドとを含む溶液を蒸発乾燥して得られる核酸増幅試薬に、前記標的核酸を含む試料を添加し、塩類を含む核酸増幅開始液を添加後、核酸増幅反応を行なうことで前記標的核酸を検出する方法である。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、核酸増幅反応がＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法のいずれかである、前記第四の態様に記載の方法である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の核酸増幅試薬は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液を蒸発乾燥することで得られる。ここでいう蒸発乾燥とは、被乾燥物の溶液（つまりＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液）を減圧下におき、当該被乾燥物がガラス状態または高い粘度を示す液体になるまで水分を蒸発させることをいい、大気圧下で水分を蒸発させる風乾や、被乾燥物の溶液を凍結させてから減圧下で乾燥させる凍結乾燥とは異なる方法である。蒸発乾燥の条件に特に限定はなく、一例として、１０ｋＰａから５８０ｋＰａの減圧条件下、２０℃から４０℃で３時間から２４時間乾燥させた後、４０℃から６０℃で１時間から５時間乾燥させる方法があげられる。なお蒸発乾燥条件の好ましい一例として、１０ｋＰａから２０ｋＰａの減圧条件下、２０℃から３０℃で１１時間から２４時間乾燥させた後、４０℃から５５℃で１時間から４時間乾燥させる方法があげられる。また蒸発乾燥を行なう際、被乾燥物周辺の環境湿度を低値に維持すると、効率的に被乾燥物溶液中の水分を蒸発できる点で好ましいが、特に環境湿度に関する限定はない。なお蒸発乾燥後は、吸湿を防ぐため、本発明の核酸増幅試薬を収容した容器を直ちにアルミシールなどにより密封すると好ましい。
【００１７】
本発明の核酸増幅試薬は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースを少なくとも含んでいればよく、賦形剤として通常用いられる糖類、水溶性高分子、タンパク質などをさらに含んでもよい。糖類としては、スクロース、グルコース、マルチトール、マンニトール、リボース、キシロース、ラクトース、ガラクトース、ソルビトール、マルトトリオース、フルクトースが例示できる。水溶性高分子としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、フィコール（商品名）、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールが例示できる。タンパク質としては、ウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチドが例示できる。
【００１８】
本発明の核酸増幅試薬に、ＡＭＶ逆転写酵素以外の核酸増幅に必要な酵素をさらに含んでもよく、具体的には、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素などの逆転写酵素や、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼや、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＦｒａｇｍｅｎｔなどのＤＮＡポリメラーゼや、ＲＮａｓｅＨなどの核酸分解酵素、ならびにこれら酵素の誘導体が例示できる。なお本発明の核酸増幅試薬が、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といったＲＮＡを増幅する反応を用いて核酸を増幅する試薬の場合、本発明の核酸増幅試薬にＲＮＡポリメラーゼが含まれていると好ましい。なおＡＭＶ逆転写酵素や前述した酵素には保存安定性のためグリセロールやエチレングリコールが含まれていることが多いが、グリセロールやエチレングリコールは蒸気圧が高く、本発明の核酸増幅試薬を製造する際、蒸発乾燥の妨げとなるため、あらかじめ透析などにより除去すると好ましい。
【００１９】
本発明の核酸増幅試薬に、核酸増幅に必要な基質をさらに含んでもよい。具体的には、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、およびこれらの誘導体が例示できる。なお本発明の核酸増幅試薬が、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といったＲＮＡを増幅する反応を用いて核酸を増幅する試薬である場合、本発明の核酸増幅試薬にデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸が含まれていると好ましい。
【００２０】
本発明の核酸増幅試薬に、標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。ここでいう標的核酸とは少なくとも１種類以上の細胞、細菌、真菌、ウイルスなどに由来したＤＮＡやＲＮＡをいう。標的核酸の一例としては、肝炎ウイルス（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、ＨＩＶ、ＨＰＶ、抗酸菌、エンテロウイルス、ノロウイルス、淋菌、クラミジア属菌、マイコプラズマ属菌、レジオネラ属菌、ビブリオ属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌などに由来したＤＮＡ／ＲＮＡや、細胞中に含まれる腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ｓｕｒｖｉｖｉｎなど）由来のＤＮＡ／ＲＮＡがあげられる。標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドとは、前記標的核酸またはその相補鎖と特異的にハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、逆転写酵素やポリメラーゼにより標的核酸の増幅が可能なオリゴヌクレオチドのことをいう。なお本発明の核酸増幅試薬が、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といったＲＮＡを増幅する反応を用いて核酸を増幅する試薬である場合、標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドの５’末端側に、核酸増幅反応で用いるＲＮＡポリメラーゼが認識し得るプロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるときは、Ｔ７プロモーター）を含んでもよい。
【００２１】
本発明の核酸増幅試薬に、標的核酸またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドに標識物質を標識して得られる検出用プローブをさらに含んでもよい。標識物質としては、酵素、インターカレーター性蛍光色素やマイナーグルーブバインダー性蛍光色素などの蛍光色素、放射性同位元素、発光色素など、公知の物質が使用できる。中でも、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸またはその相補鎖とハイブリダイズすることで、前記インターカレーター性蛍光色素部分が前記ハイブリダイズした部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ（特許文献７および非特許文献２参照）は、核酸増幅反応の過程で標的核酸の検出を行なうことができ、標的核酸を含む試料を核酸増幅反応に必要な試薬とともに容器に投入するだけで標的核酸の増幅と検出を同時に実施できるため、特に好ましい。インターカレーター性蛍光色素としては特に限定はなく、オキサゾールイエローやチアゾールオレンジなどのシアニン色素、ヘミシアニン色素、エチジウムブロマイド、メチルレッドなどのアゾ色素、またはこれらの誘導体が例示できる。例えばチアゾールオレンジは、二本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５４０ｎｍの蛍光（励起波長５００ｎｍ）が顕著に増加する色素である。インターカレーター性蛍光色素の標識は、オリゴヌクレオチドプローブの末端、リン酸ジエステル部位または塩基部位に適当なリンカーを介してオリゴヌクレオチドを標識すればよい。なお、核酸増幅反応の過程で検出を行なう場合、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端側の水酸基を修飾しておくと、伸長を防止できる点で好ましい。
【００２２】
本発明の核酸増幅試薬は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液を蒸発乾燥することで得られる。当該溶液に含まれるトレハロースの濃度については特に限定はないが、少なくともトレハロース濃度７５．８ｍＭから５００ｍＭの範囲では、２１日間の貯蔵（貯蔵条件：温度４０℃、相対湿度５％以下）による試薬性能の大きな劣化がみられなかった（後述の実施例参照）ことから、６０ｍＭから６００ｍＭまでの範囲内であれば好ましいといえる。
【００２３】
本発明の核酸増幅試薬が、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとＲＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド三リン酸とリボヌクレオチド三リン酸と標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドとを含む溶液を蒸発乾燥して得られた試薬の場合、当該核酸増幅試薬に前記標的核酸を含む試料を添加し、塩類を含む核酸増幅開始液を添加後、一定の温度条件下で反応させることで、前記標的核酸を増幅し検出することができる。標的核酸を含む試料としては特に限定はなく、喀痰、胃液、血液、尿、便、体腔液、組織、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液などの生体由来試料や、当該生体由来試料から抽出された細胞、細菌、真菌、ウイルスなどに由来したＤＮＡやＲＮＡを含む溶液が例示できる。なお標的核酸を含む試料は、あらかじめ核酸増幅反応を妨害する物質を除去すると好ましい。
【００２４】
核酸増幅開始液に含まれる塩類としては、マンガン塩、マグネシウム塩などの二価金属塩や、カリウム塩、ナトリウム塩などの一価金属塩、ならびにこれらの組み合わせが例示できる。なお核酸増幅開始液に、二重鎖融解温度調整剤を含んでもよい。二重鎖融解温度調整剤とはＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖、ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖などの二本鎖核酸が一本鎖核酸に熱変性する温度（Ｔｍ値）を変化させる物質をいい、具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、尿素、ポリアミン、ホルムアミド、アセトアミド、イオン性液体、界面活性剤、ならびにこれらの組み合わせがあげられる。
【００２５】
なお必要に応じて、内部標準核酸、当該核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドを、本発明の核酸増幅試薬または前記核酸増幅開始液に含んでもよい。
【００２６】
本発明の核酸増幅試薬を用いて行なう核酸増幅反応は、逆転写反応を必要とする方法であれば特に限定はされず、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法があげられる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の核酸増幅試薬は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液を蒸発乾燥して得ることができ、冷蔵温度以上（例えば１０℃から４５℃）で貯蔵しても、長期間ＡＭＶ逆転写酵素の活性を維持可能である。したがって本発明の核酸増幅試薬は、運送および貯蔵において極めて有用である。また本発明の核酸増幅試薬は、標的核酸を含む試料と塩類を含む核酸増幅開始液を添加し、一定の温度条件で反応させることで、核酸増幅反応が行なえるため、標的核酸の検出が非常に簡便に行なえる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の核酸増幅試薬の拡大写真である。
【実施例】
【００２９】
以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３０】
実施例１  トレハロースとＡＭＶ逆転写酵素とを含む蒸発乾燥体の保存安定性
トレハロースとＡＭＶ逆転写酵素とを含む蒸発乾燥体の保存安定性を以下の方法で評価した。
（１）下記の組成からなる、トレハロースとＡＭＶ逆転写酵素とを含んだ被乾燥溶液Ａを調製し、市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に１５μＬ／ｔｕｂｅで分注した。なお、ＡＭＶ逆転写酵素は１．０Ｍのトレハロースを含む１５Ｕ／μＬのＡＭＶ逆転写酵素溶液（トレハロース（＋）、表１）を０．４３μＬ／ｔｕｂｅ添加し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは０．５Ｍのトレハロースを含む１００Ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（トレハロース（＋）、表２）を１．４２μＬ／ｔｕｂｅ添加して調製した。また下記の組成のうち、トレハロース濃度は、ＡＭＶ逆転写酵素溶液（トレハロース（＋））およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（トレハロース（＋））からのトレハロースの持ち込みを含んだ値である。
【００３１】
被乾燥溶液Ａの組成（濃度は核酸増幅反応時（容量：３０μＬ）の最終濃度）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
３７．９ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭまたは２５０ｍＭ  トレハロース（各酵素液から持ち込まれるトレハロースを含む）
６０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
２５ｎＭ  チアゾールオレンジ標識プローブ（配列番号４、非特許文献２に記載の方法を基づき作製）
１４２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
【００３２】
【表１】
2015092870.tif 000002
【００３３】
【表２】
2015092870.tif 000003
（２）比較例として、下記の組成からなる、ＡＭＶ逆転写酵素を含みトレハロースを含まない被乾燥溶液Ｂを調製し、市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に１５μＬ／ｔｕｂｅで分注した。なお、ＡＭＶ逆転写酵素は３５Ｕ／μＬのＡＭＶ逆転写酵素溶液（トレハロース（−）、表１）を０．１８μＬ／ｔｕｂｅ添加し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは１００Ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（トレハロース（−）、表２）を１．４２μＬ／ｔｕｂｅ添加して調製した。
【００３４】
被乾燥溶液Ｂの組成（濃度は核酸増幅反応時（容量：３０μＬ）の最終濃度）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
６０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ（配列番号１）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
２５ｎＭ  チアゾールオレンジ標識プローブ（配列番号４、非特許文献２に記載の方法を基づき作製）
１４２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
（３）（１）で調製した被乾燥溶液Ａを分注したＰＣＲ用チューブ、および（２）で調製した被乾燥溶液Ｂを分注したＰＣＲ用チューブを、それぞれアルミラックにセットし、棚式凍結乾燥機（ＡｄＶａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ  ＥＬ−８５、Ｖｉｒｔｉｓ社製）に入れて蒸発乾燥を行なった。蒸発乾燥は、減圧度が１２ｋＰａから１４ｋＰａになるように制御のもと、棚温度２５℃で１２時間、続いて棚温度５０℃で２時間、行なった。
（４）蒸発乾燥後、ＰＣＲ用チューブを取り出して、蒸発乾燥体が吸湿しないよう、直ちにアルミシールにて密封した。得られた蒸発乾燥体は透明フィルム状であった（図１）。（５）（４）で密封した蒸発乾燥体を含むＰＣＲ用チューブを、温度４０℃、相対湿度（ＲＨ）５％以下の条件で一定期間貯蔵した。
（６）一定期間貯蔵後のＰＣＲ用チューブに、標的核酸（１０３コピーの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ）を含む溶液１５μＬを添加し、４６℃で５分間静置することで蒸発乾燥体を溶解させた。
（７）下記の組成からなる核酸増幅開始溶液Ａ  １５μＬを（６）の溶解液に添加し、撹拌した。
【００３５】
核酸増幅開始溶液Ａ（濃度は核酸増幅反応時（容量：３０μＬ）の最終濃度）
１０．５％  ＤＭＳＯ
６．５％  グリセロール
２１．０ｍＭ  塩化マグネシウム
８３．０ｍＭ  塩化カリウム
（８）（７）のＰＣＲ用チューブを、直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４６℃で核酸増幅反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長５００ｎｍ、蛍光波長５４０ｎｍ）を経時的に３０分間検出した。核酸増幅に必要な因子溶液を添加した時点を反応開始時間として、蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）が１．２になった時点の反応時間を検出時間とした。
【００３６】
【表３】
2015092870.tif 000004
結果を表３に示す。ＡＭＶ逆転写酵素を含みトレハロースを含まない溶液（被乾燥溶液Ｂ）を蒸発乾燥して得られた蒸発乾燥体（トレハロース濃度０ｍＭ）では、貯蔵期間によらず、核酸増幅反応が進行せず未検出となった。一方、トレハロースとＡＭＶ逆転写酵素とを含んだ溶液（被乾燥溶液Ａ）を蒸発乾燥して得られた蒸発乾燥体では、２１日間貯蔵しても、核酸増幅反応が進行し検出できた。従って、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとを含む溶液を蒸発乾燥して得られる蒸発乾燥体（本発明の核酸増幅試薬）により、ＡＭＶ逆転写酵素を長期間保存できることがわかる。特にトレハロース濃度が１００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２００ｍＭ（いずれも核酸増幅反応時の最終濃度）のときは、２１日間貯蔵しても０日目とほぼ同等の検出時間を維持していることから、本発明の核酸増幅試薬を製造する際、ＡＭＶ逆転写酵素を含む溶液に、トレハロースを１００ｍＭから４５０ｍＭ（核酸増幅反応時の最終濃度で５０ｍＭから２２５ｍＭに相当）の間となるよう添加した上で蒸発乾燥させると、より好ましい。
【００３７】
実施例２  水溶性高分子を含むＡＭＶ逆転写酵素の蒸発乾燥体の調製
本発明の核酸増幅試薬にさらに水溶性高分子を含んだときの、保存安定性への影響を評価した。
（１）下記の組成からなる、トレハロースとＡＭＶ逆転写酵素と水溶性高分子を含む被乾燥溶液Ｃを調製し、市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に１５μＬ／ｔｕｂｅで分注した。なお、ＡＭＶ逆転写酵素は１．０Ｍのトレハロースを含む１５Ｕ／μＬのＡＭＶ逆転写酵素溶液（トレハロース（＋）、表１）を０．６３μＬ／ｔｕｂｅ添加し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは０．５Ｍのトレハロースを含む１００Ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（トレハロース（＋）、表２）を１．４２μＬ／ｔｕｂｅ添加して調製した。また下記の組成のうち、トレハロース濃度は、ＡＭＶ逆転写酵素溶液（トレハロース（＋））およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（トレハロース（＋））からのトレハロースの持ち込みを含んだ値であり、水溶性高分子は（ａ）０．２５％  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（商品名）、（ｂ）１．００％  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（商品名）、（ｃ）０．２５％  デキストラン  ２００ｋＤａ、（ｄ）１．００％  デキストラン  ２００ｋＤａ、（ｅ）０．２５％  ポリビニルピロリドン  Ｋ９０、のいずれかである（濃度はいずれも核酸反応時の終濃度）。
【００３８】
被乾燥溶液Ｃの組成（濃度は核酸増幅反応時（容量：３０μＬ）の最終濃度）
９．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１５０ｍＭ  トレハロース（各酵素液から持ち込まれるトレハロースを含む）
６０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
５０ｎＭ  チアゾールオレンジ標識プローブ（配列番号４、非特許文献２に記載の方法を基づき作製）
１４２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
水溶性高分子（上記参照）
（２）実施例１（３）に記載の方法で蒸発乾燥を行ない、アルミシールにて密封した。得られた蒸発乾燥体は実施例１と同様、透明フィルム状であった。
（３）（２）で作製した、密封した蒸発乾燥体を含むＰＣＲ用チューブを、温度１３℃、相対湿度（ＲＨ）９５％以上の条件で一定期間貯蔵した。
（４）一定期間貯蔵後のＰＣＲ用チューブに、標的核酸（１０３コピーの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ）を含む溶液１５μＬを添加し、４６℃で５分間静置することで蒸発乾燥体を溶解させた。
（５）下記の組成からなる核酸増幅開始溶液Ｂ  １５μＬを（５）の溶解液に添加し、撹拌した。
【００３９】
核酸増幅開始溶液Ｂ（濃度は核酸増幅反応時（容量：３０μＬ）の最終濃度）
１０．０％  ＤＭＳＯ
５．０％  グリセロール
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化ナトリウム
（６）実施例１（８）と同様な方法で核酸増幅反応を行ない、標的核酸を検出した。
【００４０】
【表４】
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結果を表４に示す。本発明の核酸増幅試薬は１４日間貯蔵しても、０日目とほぼ同等の検出時間を維持していることから、本発明の核酸増幅試薬は高湿度条件下においても、ＡＭＶ逆転写酵素を長期間保存できることがわかる。また水溶性高分子をさらに含んだ本発明の核酸増幅試薬の、２１日間貯蔵後の結果は、水溶性高分子を含まない本発明の核酸増幅試薬よりも検出時間が速くなっており、検出性能の低下が抑えられていることがわかる。
【図１】
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【配列表】
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