(57)【要約】【課題】より低侵襲の方法を用いて、修復及び／又は再生すべき障害部位及びその近傍に局在させることができ、更に、障害部位に使用する際に、圧迫による障害を生じる可能性が低く、好ましくは圧迫による障害を生じない、組織修復及び／又は再生促進材を提供する。【解決手段】高分子材料の粉（又は粒）と細胞を混合して得られる液状の形態の組織修復及び／又は再生促進材は、より低侵襲の方法を用いて、より容易に、障害部位及びその近傍に局在させることが可能であり、更に、対象臓器に使用する際に、障害を生じる可能性は低く、好ましくは障害を生じる可能性がない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子材料の粉と細胞を含む液状の組織修復及び／又は再生促進材。
【請求項２】
高分子材料は、生分解性高分子及びポリエステルから選択される少なくとも１種を含む請求項１に記載の促進材。
【請求項３】
細胞は、血液に由来する細胞及び幹細胞から選択される少なくとも１種を含む請求項１又は２に促進材。
【請求項４】
ゲル化剤を、更に含む請求項１〜３のいずれかに記載の促進材。
【請求項５】
組織及び臓器の修復又は再生用の請求項１〜４のいずれかに記載の促進材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、障害部位の修復及び／又は再生を促進するための組織修復及び／又は再生促進材、その製造方法、及びおよびそれを用いる障害部位の治癒及び／又は治療の促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創傷の治癒のために、白血球及び血小板等の細胞が産生するさまざまな成長因子を投与する方法及び、更にそのような成長因子を産生する血小板等の細胞を投与する方法が報告されている。更に、その方法に使用する創傷治癒促進材も報告されている（特許文献１［背景技術］、特許文献２、特許文献３参照）。
【０００３】
そのような創傷治癒促進材の一つとして、特許文献１は、シート状多孔質体（より具体的には不織布）を使用して、細胞を捕捉することで得られる創傷治癒促進材を開示する。より具体的には、シート状多孔質体に細胞浮遊液を濾過または接触させることにより、シート状多孔質体に少なくとも白血球および／または血小板を捕捉することで得られる、少なくとも白血球および／または血小板が表面に存在するシート状多孔質体を、創傷治癒促進材として開示する（特許文献１［請求項１］等参照）。
【０００４】
特許文献１のシート状多孔質体を用いる創傷治癒促進材は、線維芽細胞の増殖を向上させ、皮膚の再生に関わる成長因子を産生することにより、皮膚の創傷治癒を促進する優れた効果を奏する。この創傷治癒促進材は、潰瘍等の皮膚の障害部位の局所にとどまり、皮膚修復の細胞ソースを提供するとともに、その細胞から産生される成長因子及びサイトカイン等の修復因子を、その皮膚障害部位で、その局所にとどまることによって高濃度で産生及び供給することができる。さらに、単に成長因子を医薬として投与する方法と比較して、皮膚障害部位とのクロストークにより、皮膚の障害部位が修復及び再生する過程で必要度が変化する成長因子類の種類および量に合わせて、適切な量の適切な成長因子類をその局所で産生して供給できるというメリットがある。
【０００５】
しかし、本発明者らは、そのシート状多孔質体を、皮膚すなわち体表ではなく、体内の臓器、例えば、腎臓等の内臓の組織修復及び／又は再生のために、障害部位を有する対象臓器に使用する場合、シート状多孔質体をその臓器の表面に貼り付けなければならないので、開腹又は開胸などの手術が必要となり、患者の身体に大きな負担がかかる可能性を認めた。
更に、本発明者らは、体内の臓器内に、例えば腎被膜下に、そのシート状多孔質を埋め込むと、腎実質が圧迫されて障害を生じた病理像が認められる場合があることも見出した。
【０００６】
従って、開腹や開胸等の侵襲的手術と比較して、より低侵襲の方法を用いて、対象臓器に使用することができ、更に、対象臓器に埋め込むことによる障害を緩和し、好ましくはたとえ対象臓器に埋め込んだとしても障害を生じない組織修復及び／又は再生促進材が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４８４７１２９号
【特許文献２】ＷＯ２００５／０２３２８７
【特許文献３】ＷＯ２０１１／１２３７７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたもので、その課題は、より低侵襲の方法を用いて、修復及び／又は再生すべき障害部位及びその近傍に局在させることができる、組織修復及び／又は再生促進材であって、好ましくは促進材に含まれる細胞と障害部位とのクロストークにより、組織修復及び／又は再生に必要な成長因子類を、障害部位が必要とする時期に、必要な量で提供するとともに、修復及び／又は再生のための細胞ソースを提供できる組織修復及び／又は再生促進材を提供することである。
更に、本発明の課題は、細胞を捕捉した不織布などの多孔質シートを、たとえば腎被膜下などに挿入することによる、臓器の圧迫による障害を生じる可能性を緩和し、好ましくは障害を生じない、組織修復及び／又は再生促進材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、高分子材料の粉（又は粒）と細胞を混合して得られる液状の組成物は、当該細胞からの成長因子類の産生を促進することを見出した。更に、この組成物を用いて、開胸及び開腹などの手術と比較して、カテーテルや内視鏡などのより低侵襲の方法を用いて、より容易に、障害部位及びその近傍に該液状組成物を局在させることが可能であることを見いだした。更にまた、障害部位に使用する際に、圧迫による障害を生じる可能性は低く、好ましくは圧迫による障害を生じないことを見出して、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、一の要旨において、
高分子材料の粉と細胞を含む液状の組織修復及び／又は再生促進材を提供する。
かかる促進材は、障害部位を有する組織及び臓器を修復し又は再生するために好適に使用することができる。
【００１１】
本発明の一の態様において、高分子材料は、生分解性高分子及びポリエステルから選択される少なくとも１種を含む促進材を提供する。
本発明の他の態様において、細胞は、血液に由来する細胞及び幹細胞から選択される少なくとも１種を含む促進材を提供する。
本発明の好ましい態様において、ゲル化剤を、更に含む促進材を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、高分子材料の粉と細胞を含む液状の組成物なので、開腹又は開胸などの手術をすることなく、カテーテルや内視鏡等のより低侵襲の方法を用いて、より容易に、より短時間で、障害部位及びその近傍に局在させることができ、全身および障害部位を有する組織及び臓器に与える負担がより小さい。従って、本発明の液状の組織修復及び／又は再生促進材を使用すると、圧迫による障害を生じる可能性を減少させることができ、好ましくは圧迫による障害をなくすことができる。
更に、本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、好ましくは、高分子材料と細胞との相互作用によって、さまざまな成長因子及びサイトカイン等の組織修復及び／又は再生に必要な因子（以下、「成長因子類」ともいう）の産生を亢進することができる。
【００１３】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、高分子材料が、生分解性の高分子材料から選択される少なくとも１種を含む場合、障害部位及びその近傍に局在させた後の、残留性が低減し、好ましくは障害部位の修復又は再生後に、高分子材料は吸収されて、消失することができる。
また、高分子材料が、ポリエステルから選択される少なくとも１種を含む場合、細胞からの成長因子類の産生がより亢進する。
【００１４】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、細胞が、血液に由来する細胞から選択される少なくとも１種を含む場合、自家細胞が容易に取得でき、自己由来の組織修復及び／又は再生促進材を容易に作成することができる。
更に、本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、細胞が、幹細胞から選択される少なくとも１種を含む場合、成長因子類の供給源としての機能がより向上するとともに、組織修復及び／又は再生のための細胞ソースとしての機能が、より向上する。
【００１５】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、ゲル化剤を、更に含む場合、障害部位及びその近傍での局在性が、より向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例１の組織修復及び／又は再生促進材に含まれるポリ乳酸の粉の中の、１００粒の投影面積に対する個数を示す。
【図２】図２は、実施例２の組織修復及び／又は再生促進材に含まれるＰＥＴの粉の中の、１００粒の投影面積に対する個数を示す。
【図３】図３は、実施例１の組織修復及び／又は再生促進材のＶＲＧＦ生産量と、粉末状ポリ乳酸を含まない細胞のみのＶＥＧＦ産生量との比（促進材のＶＥＧＦ産生量／細胞のみのＶＥＧＦ産生量）を示す。
【図４】図４は、カテーテルをラットの残存腎被膜下に入れて、実施例７の組織修復及び／又は再生促進剤を注入する様子を示す。
【図５】図５は、カテーテルをラットの残存腎被膜下に入れて、実施例７の組織修復及び／又は再生促進剤を注入する様子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、高分子材料の粉と細胞を含み、液状の形態を有する。
本発明に係る「高分子材料」とは、生体内に注入しても有害な作用を示さず、本発明が目的とする組織修復及び／又は再生促進材を得ることができる材料である限り特に限定されるものではない。高分子材料は、生体適合性を有すればよく、必ずしも生分解性を有する必要はない。
【００１８】
高分子材料として、例えば、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン）、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン等の生分解性を有さない高分子を例示することができる。生体内への留置又は植え込み製品がすでに存在するポリエチレンテレフタレートなどのポリエステルなどが好ましい。
高分子材料は、生体適合性を有することが好ましく、適度の親水性を有することが、細胞との混和性と、成長因子類の産生亢進を確保するために好ましい。
【００１９】
更に、高分子材料として、例えば、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリリンゴ酸及びポリ−ε−カプロラクトン等）、及び多糖類（例えば、セルロース、ポリアルギン酸、キチン及びキトサン等）等の生分解性高分子を含むことが好ましい。高分子材料として生分解性高分子を使用すると、より生体適合性が高く、組織修復及び／又は再生後に、吸収され消失する組織修復及び／又は再生促進材を得ることができ、好ましい。
生分解性高分子として、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、キチン及びキトサンから選択される少なくとも一種を含むことがより好ましい。
【００２０】
高分子材料は、ポリエステルから選択される少なくとも一種を含むことが好ましい。この場合、得られる組織修復及び／又は再生促進材の成長因子類の産生亢進がより向上し、好ましい。そのようなポリエステルとして、上述した生分解性を有さないポリエステル及び生分解性を有するポリエステルを例示できる。
ポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート及びポリ乳酸からなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
高分子材料は、既知の方法で製造することができるが、市販のものを使用することができる。
更に、高分子材料は、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００２１】
高分子材料の「粉」とは、固体の高分子材料が細かく砕かれたもの（又は物質）をいい、本発明の組織修復及び／又は再生促進材を得られる限り特に制限されるものではない。
高分子材料を溶融し、小さな粒としたもの、更に、紡糸により短い繊維状のものとしたものなども本発明の高分子材料の粉として用いることができる。
粉の粒の投影面積は、後述する実施例で記載する測定方法を用いて、０．１〜１，０００，０００μｍ２（（μｍ）２）であることが好ましく、０．２〜１００，０００μｍ２であることがより好ましく、０．５〜１０，０００μｍ２であることが特に好ましく、１〜３，０００μｍ２であることが最も好ましい。
また、粉の粒の投影面積の平均値は、０．５〜２０００μｍ２であることが好ましく、１〜１５００μｍ２であることがより好ましく、２〜８００μｍ２であることが特に好ましい。
【００２２】
高分子材料を粉にする方法は、本発明が目的とする組織修復及び／又は再生促進材を得られる限り特に限定されることはなく、一般的な粉砕方法を使用することができる。そのような粉砕方法として、例えば、不織布などの繊維状材料またはチップ状材料を、常温でボールミルで粉砕する方法、及び液体窒素で冷却しつつボールミルで粉砕する方法（凍結粉砕）等を例示することができる。冷凍粉砕法等が好ましい。
【００２３】
「細胞」とは、一般に、膜構造に包まれ、内部に生命活動を行う器官を持ち、自己再生と複製をするための遺伝情報とそれを発現させるための機能を備える、生物体の構造上及び機能上の基本単位をいうが、本発明にかかる「細胞」とは、更に、組織の修復及び再生に関与し得る成長因子類を生ずることができ、本発明が目的とする組織修復及び／又は再生促進材を得ることができるものであれば、特に制限されるものではない。本発明の促進材にかかる細胞には、血小板などの非有核細胞も含まれる。拒絶反応抑制の点から、修復及び／又は再生すべき対象となる組織（又は臓器）（治療対象）と同種の細胞であることが好ましく、自家細胞であることが更に好ましい。
【００２４】
促進材にかかる細胞として、例えば、白血球（例えば、好中球及び末梢血単核球など）及び血小板などの血液由来の細胞（有核及び無核細胞を含む）、骨髄、脂肪、胎盤、羊膜及び月経血などに由来する幹細胞、とくに、間葉系幹細胞、体性幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞などの幹細胞等を例示することができる。細胞が、血液由来の細胞を含む場合、自家細胞を容易に取得でき、自己由来の組織修復及び／又は再生促進材を容易に作成することができるので好ましい。細胞が、幹細胞から選択される少なくとも１種を含む場合、成長因子類の供給源としての機能がより向上するとともに、組織修復及び／又は再生のための細胞ソースとしての機能が、より向上するので好ましい。
促進材にかかる細胞は、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００２５】
ここで「成長因子」とは、血液の凝固及び炎症細胞の遊走から始まり、対象組織及び／又は臓器を構成する細胞の増殖、細胞外マトリックスの合成、血管の新生及びそれらの再構築に至る組織修復及び／又は再生の諸現象を、複雑な細胞間ネットワーク関係の存在下、直接的または間接的に制御する物質をいい、本発明の組織修復及び／又は再生促進材を得られる限り、特に制限されるものではない。
【００２６】
成長因子として、例えば、ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor：血小板由来成長因子）、ＦＧＦ（Fibroblast Growth Factor：線維芽細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor：血管内皮増殖因子）、ＴＧＦ−β（Transforming Growth Factor：形質転換性成長因子）及びＥＧＦ（Epidermal Growth Factor：上皮成長因子）を例示することができ、更に、インターロイキン類及びケモカイン類等を例示することができる。
【００２７】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、高分子材料の粉と細胞を含む。
細胞が幹細胞（特に、間葉系幹細胞）である場合、粉と細胞の比（粉／細胞）は、０．０１〜１０ｍｇ／１０４cellsであることが好ましく、０．１〜３ｍｇ／１０４cellsであることがより好ましく、０．５〜２．５ｍｇ／１０４cellsであることが特に好ましく、１〜２ｍｇ／１０４cellsであることが最も好ましい。
細胞が血液に由来する細胞（特に、白血球）である場合、粉と細胞の比（粉／細胞）は、０．５〜１０００μｇ／１０４cellsであることが好ましく、１〜２００μｇ／１０４cellsであることがより好ましく、２〜５０μｇ／１０４cellsであることが特に好ましい。
細胞が幹細胞（特に、間葉系幹細胞）である場合、粉と細胞の比（粉／細胞）は、０．０１〜１０ｍｇ／１０４cellsであることが、組織修復及び／又は再生促進材の成長因子類の産生亢進が向上するので、好ましい。
細胞が血液に由来する細胞（特に、白血球）の場合、粉と細胞の比（粉／細胞）は、０．５〜１０００μｇ／１０４cellsであることが、組織修復及び／又は再生促進材の成長因子類の産生亢進が向上するので、好ましい。
【００２８】
高分子材料の粉は、細胞と、十分に混合されることが好ましく、接触することがより好ましい。更に、細胞は、粉に少なくともその一部分が付着し、粉の上に存在することが特に好ましい。細胞が、粉の上に存在する場合、粉は、細胞に足場を与えることとなるので、好ましく、更に、粉は、細胞の成長因子等の産生を刺激し得るのでより好ましい。
細胞が、粉の上に存在する場合、粉が、細胞の成長因子等の産生を刺激し得る理由は、材料表面の官能基と細胞との間の、静電相互作用、疎水性相互作用及び親水性相互作用などが考えられるが、このような理由により、本発明は何ら制限されるものではない。
【００２９】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、液状なので、液状成分を含む。
ここで「液状成分」とは、本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材に流動性を与えることができ、粉と細胞をその中に含み、分散させることができ、細胞の生命活動の維持に悪影響を与えないものであれば、特に制限されるものではない。液状成分は、細胞の生命活動の維持をサポートし、組織修復及び／又は再生促進材が使用される対象となる組織及び臓器等に悪影響を与えないものが好ましい。
【００３０】
液状成分として、例えば、生理食塩水などの等張液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのｐＨの緩衝機能を有する等張液、細胞の培地、及び血漿等を例示することができる。液状成分は、等張であれば、液状成分の種類に、特に制限されることはない。
本発明の組織修復及び／又は再生促進材は、液状成分を含み、流動性を有する。
粉と細胞は、この液状成分中に、均一に安定に分散することが好ましいが、たとえ液状成分から分離したとしても、使用するときに、容易に分散し、少なくとも使用時に分散状態を保つことができれば、使用することができる。
【００３１】
液状成分に含まれる粉は、カテーテル内などを流れる程度の流動性をもつ、本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材を得られる限り、その量は特に制限されない。
【００３２】
液状成分に含まれる細胞は、カテーテル内などを流れる程度の流動性をもち、対象組織及びその近傍で修復及び／又は再生効果を発揮できる限り、その量は特に制限されない。
【００３３】
液状成分は、組織修復及び／又は再生促進材に悪い影響を与えない限り、その他の成分を含むことができる。そのようなその他の成分として、抗凝固剤（例えば、クエン酸及びクエン酸塩、ヘパリン、低分子ヘパリン及びヘパリノイド等のヘパリン類、及びフサン（ＦＵＴ）等）、加水分解酵素阻害剤（例えば、ＦＯＹ及びアルガトロバン等）、細胞外マトリックスを構成する成分（例えば、コラーゲン及びラミニン等）等を例示することができる。
【００３４】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、高分子材料の粉、細胞及び液状成分を、混合して得ることができる。必要に応じて、その他の成分を混合して良い。混合の順序及び混合方法等は、適宜選択することができる。目的とする組織修復及び／又は再生促進材を得ることができる限り、特に制限されるものではない。
【００３５】
得られる組織修復及び／又は再生促進材は、製造後、直ちに使用することができるが、しばらく保管後に使用することもできる。その細胞の生育に適する温度等で保管することができるが、直ちに使用することが、細胞のバイアビリティ維持、および、無菌性の維持の観点から好ましい。
【００３６】
本発明は、障害部位を有する組織及び／又は臓器を修復し及び／又は再生するための、本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材を含む、組織及び／又は臓器治療材を提供する。
更に、本発明は、障害部位を有する組織及び／又は臓器を修復し及び／又は再生するために、本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材を対象部位に適用する、治療方法を提供する。
【００３７】
本発明の組織修復及び／又は再生促進材は、液状なので、例えば、シリンジ、カテーテル及び回路（チューブ）等の流体を取り扱うことが可能な器具を用いて、使用することができる。本発明の促進材を取り扱い、治療することが可能である限り、特にその器具について制限されることはない。従って、対象組織及び臓器に適用するために、開腹や開胸などの手術をする必要は無く、例えば、内視鏡及びカテーテル等の、生体により負担の小さい、より低侵襲の方法を用いて、本発明の促進材を取り扱い、治療することができる。
【００３８】
本発明に係る組織修復及び／又は再生促進材は、液状なので、対象組織及び臓器に、塗布又は塗工することで、治療することができる。従って、促進材を貼付したり、縫合したり、更に、被膜下スペースに押し入れる必要がないので、対象組織及び臓器に余分な圧迫（又は負担）をかけることはなく、その圧迫による障害を生じる可能性を緩和し、好ましくは圧迫による障害を生じなくすることができる。
【００３９】
本発明に係る液状の組織修復及び／又は再生促進材の粘度は、対象組織及び臓器によって、種々選択することができるが、一般的には、液状成分が有する程度の粘度であって良い。
組織修復及び／又は再生促進材を対象組織又は臓器に適用した後、ゲル化剤を加えて、組織修復及び／又は再生促進材をゲル化させることができる。ゲル化した組織修復及び／又は再生促進材は、その粘度が上昇して、より長期間、対象組織又は対象臓器及びその近傍にとどまることができる。従って、より長期間、組織修復及び／又は再生促進材の効果が持続する治療が可能となる。
そのようなゲル化剤として、例えば、コラーゲン、ゼラチン、細胞外マトリックス混合物（例えば、マトリゲル（登録商標）（コーニング社）等）、フィブリン、多糖類（例えば、アガロース等）、及びコンドロイチン等を例示できる。本発明が目的とするゲル化した組織修復及び／又は再生促進材を得られる限り、ゲル化剤は、特に制限されることはない。
【００４０】
本発明の組織修復及び／又は再生促進材は、促進材を利用可能な組織及び臓器であれば、特に制限されることなく使用して、それらを修復し及び／又は再生することができる。
ここで「組織」とは、同一の形態と機能を有する細胞、基底膜及び結合組織などの集合体を意味し、本発明の促進材で治療すべき障害部位を有する。
更に、「障害部位」とは、何らかの理由により、組織が本来有する機能を発現するために困難を有する部位を意味し、その理由には、例えば、内的又は外的要因によって生じる傷、硬化、壊死、潰瘍及び細胞脱落等が含まれる。障害を有する限り、障害部位は、特に制限されることはない。
【００４１】
特定の機能を有する数種の組織の集合体であって、生物個体の特定の空間に局在して、形態的及び機能的に独立性を有する部分を「器官」という。「器官」の中で、高等動物の胸部及び腹部内の器官を「臓器」という。
「器官」として、例えば、血管、皮膚及び臓器等を例示することができ、「臓器」として、例えば、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、胃、大腸、小腸、肺及びその周辺部分（気胸部位など）、及び腹膜等を例示することができる。
【００４２】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、これらの例は、本発明を説明するためのものであり、本発明は実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕ポリ乳酸の粉とヒト脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ポリ乳酸の粉を以下の方法で製造した。ポリ乳酸（ＰＬＡ）製不織布（旭化成せんい株式会社、平均繊維径１．８μｍ、嵩密度３３ｇ／ｃｍ３）を、冷凍粉砕機（吉田製作所製のＪＦＣ−３００（製品名））を用いて粉砕した。粉砕したポリ乳酸を、光学顕微鏡（オリンパス社製のＣＫＸ４１（製品名））を用いて観察し、画像を顕微鏡デジタルカメラ（オリンパス社ＤＰ７３（製品名））で取り込んだ。ソフトウェア（オリンパス社製のCellSens Standard（製品名））を用いて、上述の粉末状ポリ乳酸の１００粒の投影面積を計測した。その値は、平均：２０１．１μｍ２、標準偏差：３８０．２μｍ２、最小値：１．３６μｍ２、最大値：２３２１．０７μｍ２であった。投影面積に対する個数を図１に示す。
一方、ヒト脂肪由来幹細胞（LONZA社製のＡＤＳＣ（製品名））を、ヒト脂肪由来幹細胞専用培地キット（LONZA社製のＡＤＳＣ−ＧＭ Bulletkit（製品名））で、培養した。培養後、細胞を培養ディッシュから剥がし、この細胞の専用培地で細胞懸濁液を作成した。細胞数はディスポーザブル血球計算盤（Digital Bio社製のC-Chip（製品名））で測定した。
この細胞懸濁液と、上述の調整した粉末状ポリ乳酸を混合して、組織修復及び／又は再生促進材を得た。粉末状ポリ乳酸とヒト脂肪由来幹細胞との混合比を変えることで、５種類の促進材を得た。混合比（ポリ乳酸／細胞）は、０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ及び２．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓであった。
【００４４】
〔実施例２〕ポリエチレンテレフタレートの粉とヒト脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ポリエチレンテレフタレートの粉を以下の方法で製造した。ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製の不織布（旭化成せんい株式会社製、平均繊維径１．２μｍ、嵩密度４０ｇ／ｃｍ３）を、実施例１に記載した方法と同様の方法で粉砕し、得られた粉状ＰＥＴの１００粒の投影面積を測定した。結果は、その値は、平均：３７１．５μｍ２、標準偏差：２２２７．２μｍ２、最小値：２．３２μｍ２、最大値：２１７０１．７９μｍ２であった。投影面積に対する個数を図２に示す。
実施例１に記載した方法と同様の方法で得たヒト脂肪由来幹細胞懸濁液と、上述の粉末状ＰＥＴを混合して、組織修復及び／又は再生促進材を得た。粉末状ＰＥＴとヒト脂肪由来幹細胞との混合比を変えることで、４種類の促進材を得た。混合比（ＰＥＴ／細胞）は、０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ及び１．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓであった。
【００４５】
〔実施例３〕ポリ乳酸の粉とラット脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ラット脂肪由来幹細胞（ｒ−ＡＳＣ、Ｃｙａｇｅｎ社）を脂肪由来幹細胞培養用培地(Ｃｙａｇｅｎ社)にて培養し、実施例１と同様にして、この細胞の専用培地を用いて、ラット脂肪由来幹細胞懸濁液を作成した。このラット脂肪由来幹細胞懸濁液と、実施例１で得た粉末状ポリ乳酸を混和し組織修復・再生促進材を得た。混合比（ＰＬＡ／細胞）は、０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ及び１．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓであった。
【００４６】
〔実施例４〕ポリエチレンテレフタレートの粉とラット脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
実施例３と同様にして、ラット脂肪由来幹細胞（ｒ−ＡＳＣ、Ｃｙａｇｅｎ社）の細胞懸濁液を作成した。このラット脂肪由来幹細胞懸濁液と、実施例２で得た粉末状ＰＥＴを混和し組織修復・再生促進材を得た。混合比（ＰＥＴ／細胞）は、０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ及び１．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓであった。
【００４７】
〔実施例５〕ポリ乳酸の粉とヒト骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ヒト間葉系幹細胞（h-MSC、LONZA社）をヒト間葉系幹細胞専用培地キット(MSCGM Bulletkit、LONZA社)にて培養し、実施例１と同様にしてh-MSC細胞懸濁液を作成した。このヒト間葉系幹細胞懸濁液と、実施例１で得た粉末状ポリ乳酸を混和し組織修復・再生促進材を得た。細胞と粉末状ポリ乳酸の割合は０．２５ｍｇ／１０４cells、０．５ｍｇ／１０４cells、１．０ｍｇ／１０４cells、１．５ｍｇ／１０４cellsの４種とした。
【００４８】
〔実施例６〕ポリエチレンテレフタレートの粉とヒト骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ヒト間葉系幹細胞（h-MSC、LONZA社）をヒト間葉系幹細胞専用培地キット(MSCGM Bullet kit、LONZA社)にて培養し、実施例1と同様にしてh-MSC細胞懸濁液を作成した。このヒト間葉系幹細胞懸濁液と、実施例２で得た粉末状ポリエチレンテレフタレートを混和し組織修復・再生促進材を得た。細胞と粉末状ポリエチレンテレフタレートの割合は０．２５ｍｇ／１０４cells、０．５ｍｇ／１０４cells、１．０ｍｇ／１０４cells、１．５ｍｇ／１０４cellsの４種とした。
【００４９】
〔実施例７〕ポリ乳酸の粉とラット骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ラット間葉系幹細胞（ＬＯＮＺＡ社製のｒ−ＭＳＣ（製品名））を、ラット間葉系幹細胞専用培地キット（ＬＯＮＺＡ社製のＲＡｔ ＭＳＣＧＭ Bulletkit（製品名）)を用いて、実施例１に記載した方法と同様の方法を用いて、ラット間葉系幹細胞懸濁液を作成した。このラット間葉系幹細胞懸濁液と、実施例１で得た粉末状ポリ乳酸を混合して、組織修復及び／再生生促進材を得た。ポリ乳酸と細胞との混合比を変えることで、４種類の促進材を得た。混合比（ポリ乳酸／細胞）は、０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ及び１．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓであった。
【００５０】
〔実施例８〕ＰＥＴの粉とラット骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
実施例７に記載した方法と同様の方法を用いて得たラット間葉系幹細胞（ｒ−ＭＳＣ）の懸濁液と、実施例２で得た粉末状ＰＥＴを混合して、組織修復及び／又は再生促進材を得た。粉末状ＰＥＴと細胞との混合比を変えることで、４種類の促進材を得た。混合比（ＰＥＴ／細胞）は、０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ及び１．５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓであった。
【００５１】
〔実施例９〕ポリ乳酸の粉とヒト血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
健常人ボランティアから、末梢血を採取した。採血管はＥＤＴＡ２Ｋ入採血管（ＢＤ社製のＢＤバキュティナ採血管（製品名））を用いた。末梢血の血球数は自動血球計算装置（シスメックス社製のpoch-100iV Diff（製品名））を用いて、ヒトモードで測定した。白血球の数は、６，８００個／μＬ、血小板の数は２７．３×１０４個／μＬであった。末梢血を２０００×Ｇで５分間遠心分離し、バフィーコート層を採取して、白血球及び血小板画分を得た。最終濃度が２％となるように牛胎児血清（ギブコ社製）(略称ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ））と、抗生物質（ＷＡＫＯ社製のペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ（一般名））を添加した基本培地  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＷＡＫＯ社製のＤ−ＭＥＭ（略称））と、この白血球及び血小板画分を混合した。白血球の数が９００個／μＬであり、血小板の数が４．５×１０４個／μＬである懸濁液を得た。
この白血球懸濁液と、実施例１で得た粉末状ポリ乳酸を混合して、組織修復及び／再生生促進材を得た。ポリ乳酸と白血球との混合比を変えることで、４種類の促進材を得た。混合比（ポリ乳酸／白血球）は、０．５ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓ、２．０ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓ及び３．０ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【００５２】
〔実施例１０〕ＰＥＴの粉とヒト血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
実施例９で得たヒト白血球及び血小板画分を含む懸濁液（白血球数が９００個／μＬであり、血小板数が４．５×１０４個／μＬである）と、実施例２で得た粉末状ＰＥＴを混合して、組織修復及び／再生生促進材を得た。ＰＥＴと白血球との混合比を変えることで、４種類の促進材を得た。混合比（ＰＥＴ／白血球）は０．５ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓ、１．０ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓ、２．０ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓ及び３．０ｍｇ／９×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【００５３】
〔実施例１１〕ポリ乳酸の粉とラット血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
ＳＤラット（オス）(日本チャールスリバー社)の尾静脈より、末梢血を採取した。採血管はEDTA2K入採血管（BDバキュティナ採血管、BD社）を用いた。末梢血の血球数は自動血球計算装置（シスメックス社製のpoch-100iV Diff（製品名））を用いて、ラットモードで測定した（白血球数：１０，８００個／μＬ、血小板数：１４３．４×１０４個／μＬ）。
末梢血を２０００×Ｇで５分間遠心し、バフィーコート層を採取し白血球及び血小板画分を得た。最終濃度が２％となるように牛胎児血清（ FBS 、ギブコ社）と、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB、WAKO社）を添加した基本培地 Dulbecco's Modified Eagle Medium （D-MEM、WAKO社）と、この白血球及び血小板画分を混和した（白血球数：５，３００個／μＬ、血小板数：６２．０×１０４個／μＬ）。この細胞懸濁液と、実施例１で得た粉末状ポリ乳酸を混合して、組織修復及び／再生生促進材を得た。混合比（ＰＬＡ／白血球）は、１．０ｍｇ／５３×１０５ｃｅｌｌｓ、２．０ｍｇ／５３×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【００５４】
〔実施例１２〕：ポリエチレンテレフタレートの粉とラット血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
実施例１１で得たラット白血球及び血小板画分の細胞懸濁液（白血球数：５，３００個／μＬ、血小板数：６２．０×１０４個／μＬ）と、実施例２で得た粉末状ポリエチレンテレフタレートとを混合して、組織修復及び／再生生促進材を得た。混合比（ＰＥＴ／白血球）は、１．０ｍｇ／５３×１０５ｃｅｌｌｓ、２．０ｍｇ／５３×１０５ｃｅｌｌｓであった。
【００５５】
〔実施例１３〕
ポリ乳酸の粉とヒト脂肪由来幹細胞を含み、ゲル化剤を更に含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
実施例１で得た、ポリ乳酸の粉とヒト脂肪由来幹細胞を含む促進材（ポリ乳酸／細胞数：０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ）に、コラーゲン（新田ゼラチン社製）を、コラーゲンの濃度が３．０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。このコラーゲンを含む促進材は、室温では約７分でゲル化した。
【００５６】
〔実施例１４〕
ポリ乳酸の粉とラット骨髄由来間葉系幹細胞を含み、ゲル化剤を更に含む組織修復及び／又は再生促進材の製造
実施例７で得た、ポリ乳酸の粉とラット間葉系幹細胞を含む促進材（ポリ乳酸／細胞数：０．２５ｍｇ／１０４ｃｅｌｌｓ）に、コラーゲン（新田ゼラチン社製）を、コラーゲンの濃度が３．０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。このコラーゲンを含む促進材は、室温では約７分でゲル化した。
【００５７】
〔試験例１〕ポリ乳酸の粉とヒト脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材から、血管内皮細胞増殖因子の産生
実施例１の組織修復及び／又は再生促進材を細胞培養プレート上で培養した後、細胞から産生される血管内皮細胞増殖因子の濃度を測定した。
具体的には、直径１５．４ｍｍの２４ウェル細胞培養プレート（ＴＰＰ社製）を用いて、実施例１の組織修復及び／又は再生促進材を細胞培養プレートの各ウェルに１ｍＬずつ入れた。５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター内で３日間、細胞を培養した。その後、培養上清を回収し、成長因子として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の濃度を測定した。尚、測定はＳＲＬ社に依頼した。
比較対照として、ヒト脂肪由来幹細胞のみ（ポリ乳酸の粉を含まない）を培養して、回収された培養上清を用いた。成長因子産生の評価は、１つの促進材について３回行った。実施例１の測定結果を表１−１に示した。
【００５８】
【表１−１】
2015112262.tif 000002
細胞無添加の培養前培養液：２０ｐｇ／ｍＬ以下
【００５９】
更に、実施例１の促進材については、念のため、もう一度新たなヒト脂肪由来幹細胞を専用培地で培養したこと、及び実施例１で製造したポリ乳酸の粉を使用したこと、ポリ乳酸／細胞比の一部を変更したこと以外は、同様の方法を用いて、実施例１−２の促進材を製造した。その後、上述した方法と同様の方法で評価した。その測定結果を表１−２に示した。
【００６０】
【表１−２】
2015112262.tif 000003
細胞無添加の培養前培養液：２０ｐｇ／ｍＬ以下
【００６１】
表１及び表１−２に示すように、実施例１の組織修復及び／又は再生促進材は、ヒト脂肪由来幹細胞のみ（高分子材料の粉を含まない）を培養した場合と比較して、血管内皮細胞増殖因子の産生能が亢進した。粉末状ポリ乳酸を含まない、細胞のみのＶＥＧＦ産生量を１．０、即ち基準とするときの、各組織修復及び／又は再生促進材のＶＥＧＦ産生量の比（促進材のＶＥＧＦ産生量／細胞のみのＶＥＧＦ産生量）を図３に示す。ヒト脂肪由来幹細胞１×１０４Cells当たりポリ乳酸１ｍｇを含む組織修復及び／又は再生促進材が最も産生能が高いことが分かった。
【００６２】
〔試験例２〕ＰＥＴの粉とヒト脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材から、ＶＥＧＦの産生
実施例２の組織修復及び／又は再生促進材を、試験例１に記載した方法と同様の方法を使用して、細胞のＶＥＧＦの産生を評価した。実施例２の測定結果を表２に示した。
【００６３】
【表２】
2015112262.tif 000004
細胞無添加の培養前培養液：２０ｐｇ／ｍＬ以下
【００６４】
表２に示すように、実施例２の組織修復及び／又は再生促進材は、ヒト脂肪由来幹細胞のみ（ＰＥＴを含まない）と比較して、ＶＥＧＦの産生能が高かった。ヒト脂肪由来幹細胞１×１０４Cells当たりＰＥＴ０．２５ｍｇ含む組織修復及び／又は再生促進材が、最も産生能が高かった。
【００６５】
〔試験例３〕ＰＥＴの粉とラット脂肪由来幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材から、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の産生
実施例３の組織修復及び／又は再生促進材を、試験例１に記載した方法と同様の方法を使用して、細胞のＨＧＦの産生を評価した。
具体的には、ラットのＨＧＦの濃度測定は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製）を用いた。比較対照としては、培養前の培養液、および、ラット脂肪由来幹細胞のみ（ポリ乳酸の粉を含まない）を培養し、回収された培養上清を用いた。実施例３の結果を表３に示した。
【００６６】
【表３】
2015112262.tif 000005
細胞無添加の培養前培養液：２０ｐｇ／ｍＬ以下
【００６７】
表３に示すように、実施例３の組織修復及び／又は再生促進材は、ラット脂肪由来幹細胞のみ（ＰＥＴを含まない）と比較して、HＥＧＦの産生能が高かった。ヒト脂肪由来幹細胞１×１０４Cells当たりＰＥＴ０．５ｍｇ含む組織修復及び／又は再生促進材が、最も産生能が高かった。
【００６８】
〔試験例４〕ＰＥＴの粉とラット血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材から、ＶＥＧＦの産生
実施例１２（ラット血液細胞、ポリエチレンテレフタレート）にて調製した組織修復及び／又は再生促進材を細胞培養プレート上で培養し、細胞から産生される血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の濃度を検討した。ラットVEGFの濃度測定は市販のELISA キット（IBL社）を用いた。インキュベーター内での培養日数は２日間とした。
比較対照としては、培養前の培養液およびラット血液細胞のみを培養し、回収された培養上清を用いた。結果を表４に示す。
【００６９】
【表４】
2015112262.tif 000006
細胞無添加の培養前培養液：３１．２５ｐｇ／ｍＬ以下
【００７０】
表４に示す通り、実施例１２で作製した組織修復及び／又は再生促進材は、ラット血液細胞のみを培養した場合と比較して、血管内皮細胞増殖因子の産生能が亢進していた。ポリエチレンテレフタレート２ｍｇに対してラット白血球５３×１０５Cellsの組織修復及び／又は再生促進材が最も産生能が高いことが分かった。
【００７１】
〔試験例５〕ＰＥＴの粉末とヒト血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材から、ＶＥＧＦの産生
実施例１０の組織修復及び／又は再生促進材を、試験例４に記載した方法と同様の方法を使用して、細胞のＶＥＧＦの産生を評価した。比較対照としては、培養前の培養液およびヒト血液細胞のみを培養し、回収された培養上清を用いた。実施例１０の結果を表５に示した。
【００７２】
【表５】
2015112262.tif 000007
細胞無添加の培養前培養液：２０ｐｇ／ｍＬ以下
【００７３】
表５に示す通り、実施例１０で作製した組織修復及び／又は再生促進材は、ヒト血液細胞のみを培養した場合と比較して、血管内皮細胞増殖因子の産生能が亢進していた。ＰＥＴ３ｍｇに対してヒト白血球９×１０５Cellsの組織修復及び／又は再生促進材が最も産生能が高いことが分かった。
【００７４】
〔試験例６〕ポリ乳酸の粉とヒト血液細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材から、ＶＥＧＦの産生
実施例９の組織修復及び／又は再生促進材を、試験例５と同様にして、細胞培養プレート上で培養した後、細胞から産生される血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の濃度を測定した。
比較対照として、培養前の培養液およびヒト血液細胞のみ（ポリ乳酸の粉を含まない）を培養して、回収された培養上清を用いた。実施例９の結果を表６に示した。
【００７５】
【表６】
2015112262.tif 000008
細胞無添加の培養前培養液：２０ｐｇ／ｍＬ以下
【００７６】
表６に示す通り、実施例９で作製した組織修復及び／又は再生促進材は、ヒト血液細胞のみを培養した場合と比較し、血管内皮細胞増殖因子の産生能が亢進していた。ポリ乳酸３ｍｇに対してヒト白血球９×１０５Cellsの組織修復及び／又は再生促進材が最も産生能が高いことが分かった。
【００７７】
〔試験例７〕ポリ乳酸の粉とラット間葉系幹細胞を含む組織修復及び／又は再生促進材の注入
実施例７の組織修復及び／又は再生促進材０．３ｍｌを、１ｍｌシリンジ（テルモ社製）に入れ、カテーテル（外径１７G、内径１９G、ハッピーキャス、メディキット社）を接続した。慢性腎不全モデルとして、２８週令のオスＳＤラット（日本チャールスリバー社）を用いた。  ラット用内視鏡の代替として、ラットの背側部を数ｍｍ切開し、残存腎が見えるようにし、カテーテルを残存腎被膜下に入れて実施例７の組織修復及び／又は再生促進剤を注入した。注入の様子を図４及び図５に示す。
【００７８】
〔試験例８〕ポリ乳酸の粉とラット間葉系幹細胞を含み、ゲル化剤を更に含む組織修復及び／又は再生促進材の注入
実施例１４のコラーゲンを含む組織修復及び／又は再生促進材を、１ｍｌシリンジ（テルモ社製）に入れ、カテーテル（外径１７G、内径１９G、ハッピーキャス、メディキット社）を接続した。カテーテルを、２８週令のオスＳＤラット（日本チャールスリバー社）の腎表面にゆっくりと塗布した。腎臓表面にゲル化剤入りの組織修復・再生促進材が留まることが目視で確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、液状の組織修復及び／又は再生促進材を提供する。本発明に係る液状の組織修復及び／又は再生促進材は、組織及び臓器に使用して、それらの修復又は再生を促進することができる。かかる促進材は、液状なので、内視鏡及びカテーテル等のより低侵襲の方法を用いて、対象組織及び臓器に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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