(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の予防または治療用の化合物を選択するためのインビトロ法、原発腫瘍を有する患者において、転移性癌または進行性癌、特に予後の悪い神経芽腫の存在を予測するためのインビトロ法、及び癌の予防または治療用の化合物を選択するためのキットを提供する。【解決手段】化合物のニューロトロフィン３と、または細胞外ドメインもしくはＴｒｋＣ受容体と相互作用する能力、および／または腫瘍細胞、特に、神経芽腫で発現されるＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成を阻害する能力に基づいて抗癌化合物をスクリーニングするためのインビトロ法。また、ニューロトロフィン３の発現レベルの測定に基づいて、転移性癌もしくは予後の悪い癌の存在を予測するため、または抗癌処置の有効性を決定するための方法。さらに、腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する神経芽腫または癌を処置するための薬剤としてのキットおよび化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の予防または治療用の化合物の選択方法であって、以下の工程を含んでなる、方法：
ａ）ニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片とを含む培地を取得する工程（ここで、
該ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片とは、ともに特異的に相互作用して結合対を形成することができ、および／または
該ニューロトロフィン３またはその断片は、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成を誘導できる）、
ｂ）該培地と、供試化合物とを接触させる工程、
ｃ）ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用の阻害を測定し、および／または
該化合物が該ＴｒｋＣ受容体またはその断片の二量体形成または多量体形成、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成を阻害するか否かを判定する工程、および
ｄ）工程ｃ）の測定が、該化合物の存在下でニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用に有意な阻害を示す場合、および／または
工程ｃ）における判定が、該化合物の存在下で該ＴｒｋＣ受容体またはその断片の二量体形成または多量体形成、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成に有意な阻害を示す場合
に、その化合物を選択する工程。
【請求項２】
前記の予防または治療される癌が、腫瘍細胞がニューロトロフィン３を発現もしくは過剰発現するか、または高い比（ニューロトロフィン３／ＴｒｋＣ受容体）を発現する癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の予防または治療される癌が神経芽腫である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記の予防または治療される癌が転移性癌または進行性癌、特に予後の悪い癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）において、前記ＴｒｋＣ受容体はヒトＴｒｋＣ受容体またはその断片、特に少なくともＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインを含む断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外断片がヒトＴｒｋＣまたは１９９５年７月２７日付けのＧｅｎｂａｎｋ  Ａ．Ｎ．ＡＡＢ３３１１１に示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、その天然変異体の最初の４２９個のアミノ酸残基を含むＮ末端断片を少なくとも含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）において、
該ＴｒｋＣ受容体断片が、ニューロトロフィン３と相互作用することができるＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその一部を含んでなるか、またはそのものであり、および／または
該ＴｒｋＣ受容体断片が、ニューロトロフィン３の存在下で二量体または多量体を形成することができるＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインまたはその一部を含んでなるか、またはそのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）において、前記ニューロトロフィン３または／および前記ＴｒｋＣ受容体が哺乳類、特にマウス、ラットまたはヒト由来のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ニューロトロフィン３または／および前記ＴｒｋＣ受容体および／または供試化合物が直接または間接的に測定可能なマーカーにより標識される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）において
ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用の阻害の測定がイムノアッセイ（特に、ＥＬＩＳＡまたはイムノラジオ・メトリック・アッセイ（ＩＲＭＡ））、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって行われ、および／または
該ＴｒｋＣ受容体またはその断片、特に細胞内ドメインの二量体形成もしくは多量体形成またはその阻害が免疫沈降またはＦＲＥＴにより行われる、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）において、前記培地が、それらの表面膜で、内因性のＴｒｋＣ受容体または組換え型のＴｒｋＣ受容体、特に少なくとも組換えＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインを発現する細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）において、前記培地が組換えＴｒｋＣ受容体を発現する細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において、前記培地が、前記ＴｒｋＣ受容体をそれらの膜表面で内因的に発現し、かつニューロトロフィン３を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含み、ならびに工程ｃ）において、供試化合物の存在下でのニューロトロフィン３と、そのＴｒｋＣ受容体との間の相互作用の阻害が、その供試化合物の存在により誘導されるアポトーシスまたは細胞死により測定される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）において、前記培地が、転移性腫瘍細胞、特にＩＭＲ３２細胞、ＣＬＢ−Ｇｅ１細胞、およびＣＬｂ−Ｖｏｌ細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌の予防または治療用の化合物の選択方法であって、以下の工程を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法：
ａ）内因性のまたは組換え型のＴｒｋＣ受容体、または少なくともその細胞内ドメインを含んでなるその断片を発現する哺乳類細胞、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくはそのＴｒｋＣ受容体細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成を呈する細胞またはそのＴｒｋＣ受容体細胞内ドメインがニューロトロフィン３の存在下で二量体または多量体を形成することができる細胞を取得する工程、
ｂ）該培地と、供試化合物とを接触させる工程（場合により、この培地はさらに、ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるニューロトロフィン３またはその断片を含んでもよい）、
ｃ）該ＴｒｋＣ受容体細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成が供試化合物の存在下で阻害されるか否かを判定する工程、
ｄ）場合により、供試化合物の存在が該哺乳類細胞の細胞死を誘導するか否かを判定する工程、および
ｅ）工程ｃ）における判定が、該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成の有意な阻害を示す場合、および／または工程ｄ）における判定が該哺乳類細胞の細胞死を示す場合に、その化合物を選択する工程。
【請求項１６】
原発腫瘍を有する患者において、原発腫瘍細胞を含む該患者の生検から、転移性癌、進行性癌または予後の悪い癌の存在を予測するためのインビトロ法であって、以下の工程を含んでなる、方法：
（ａ）該生検におけるニューロトロフィン３発現レベルまたは該生検における、ニューロトロフィン３発現レベルと、ＴｒｋＣ受容体発現レベルとの比を測定する工程。
【請求項１７】
非転移性原発腫瘍生検または非進行性癌生検におけるニューロトロフィン３の発現に比べて、前記生検におけるニューロトロフィン３発現レベルの増加が、転移性癌または進行性癌の存在を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
供試生検と、非転移性参照生検との間のニューロトロフィン３発現の比が２を超えることが、転移性癌の存在を示す、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者に対する抗癌処置の有効性をインビトロで判定するため、またはＮＴ−３：ＴｒｋＣ結合の阻害に基づいて特定の抗癌処置に応答し得る患者のインビトロでの選択方法であって、以下の工程を含んでなる、方法：
（ａ）該被処置患者の原発腫瘍生検を取得する工程、および
（ｂ）該生検におけるニューロトロフィン３発現レベルを測定する工程（ここで、該抗癌処置の有効性は該生検において測定されたニューロトロフィン３発現レベルの量の低下と相関しているか、または選択された該特定の抗癌処置に応答し得る患者が、処置前にそれらの生検で測定されたニューロトロフィン３発現レベルの量が対照患者のニューロトロフィン３発現レベルの量を有意に超え、かつ場合により、ニューロトロフィン３発現レベルが該特定の処置後に低下した患者である）。
【請求項２０】
前記癌がニューロトロフィン３の過剰発現を誘導し、および／または転移性癌または進行性癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定されるニューロトロフィン３発現産物が、特に定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ法により測定される、ニューロトロフィン３をコードするＲＮＡである、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
測定されるニューロトロフィン３の発現レベルが、特に前記ニューロトロフィン３タンパク質を特異的に認識することができる特異的抗体を用いた方法によるニューロトロフィン３タンパク質レベルの測定である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
原発腫瘍が神経芽腫の原発腫瘍である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
癌の予防または治療用の化合物を選択するためのキットであって、
ニューロトロフィン３タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるＴｒｋＣ受容体タンパク質またはその断片、好ましくは組換えタンパク質と、
該ＴｒｋＣ受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるニューロトロフィン３タンパク質またはその断片、好ましくは組換えタンパク質と
を含んでなる、キット。
【請求項２５】
癌の予防または治療用の化合物を選択するためのキットであって、
ＴｒｋＣ受容体を発現し、かつニューロトロフィン３を発現または過剰発現する腫瘍細胞、特に腫瘍細胞系統に由来する、好ましくは確立された神経芽腫細胞からなる群から選択される、好ましくはＣＬＢ−Ｇｅ１およびＩＭＲ−３２細胞から選択される細胞、および場合により、
ＴｒｋＣ受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるニューロトロフィン３タンパク質またはその断片、好ましくは組換えニューロトロフィン３タンパク質
を含んでなる、キット。
【請求項２６】
下記からなる群から選択される、薬剤としての化合物：
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により選択された化合物、
ニューロトロフィン３と、ＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができ、および／またはＴｒｋＣ受容体またはその断片、特にＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成を阻害することができる、ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片、またはニューロトロフィン３と結合することができるＴｒｋＣの細胞外ドメインを少なくとも含んでなる可溶型ＴｒｋＣ受容体、
特異的にニューロトロフィン３またはＴｒｋＣ受容体に対する、特に、ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるニューロトロフィン３断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
好ましくはインビボで、細胞内でＮＴ３の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸。
【請求項２７】
患者において、ニューロトロフィン３依存性受容体により誘導されるアポトーシスを回避する選択的優位性を獲得した腫瘍細胞のアポトーシスまたは細胞死を、好ましくはニューロトロフィン３レベルを引き上げることによって、誘導するための処置方法であって、それを必要とする患者において、この腫瘍細胞の選択的優位性を阻害することができる化合物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２８】
患者において癌を予防または治療するための方法であって、それを必要とする患者に請求項２６に記載の化合物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２９】
ヒトを含む哺乳類において癌の予防または治療用の薬剤の製造のための、請求項２６に記載の化合物の使用。
【請求項３０】
前記癌が、転移性癌、進行性癌、または予後の悪い癌である、請求項２８もしくは２９に記載の方法または使用。
【請求項３１】
前記癌が神経芽腫である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３２】
前記癌の原発腫瘍細胞がニューロトロフィン３を発現または過剰発現する、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３３】
患者において転移性癌、進行性癌、または予後の悪い癌を識別するためのマーカーとしてのニューロトロフィン３発現のレベルの使用。
【請求項３４】
前記癌が神経芽腫である、請求項３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明の対象は、化合物のニューロトロフィン３（ＮＴ−３またはＮＴ３）と、または細胞外ドメインもしくはＴｒｋＣ受容体と相互作用する能力、および／または腫瘍細胞、特に神経芽腫で発現されるＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成を阻害する能力に基づいて抗癌化合物をスクリーニングするためのインビトロ法に関する。本発明は、またニューロトロフィン３の発現レベルの測定に基づいて、転移性癌もしくは予後の悪い癌の存在を予測するため、または抗癌処置の有効性を決定するための方法に関する。本発明は、さらに腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する神経芽腫または癌を処置するための薬剤としてのキットおよび化合物を含んでなる。
【０００２】
背景技術
ＴｒｋＣ／ＮＴ−３受容体／リガンド対は、ニューロン死が神経栄養因子の制限の際の生存シグナルの欠如による不履行(defalt)によって起こるとする従来の神経栄養説の一部と考えられている。ここで、本発明者らは、ＴｒｋＣは依存性受容体であり、それ自体、不死化細胞においてＮＴ−３の非存在下でカスパーゼ依存性のアポトーシス細胞死を誘導し、ＮＴ−３が存在すればアポトーシス誘導活性は阻害されることを示す。このＴｒｋＣのアポトーシス誘導活性は、カスパーゼの媒介によってＴｒｋＣの細胞内ドメインが切断され、アポトーシス誘導断片が放出されることによるものである。この断片は、カスパーゼ−９依存性のメカニズムを介してアポトーシスを誘導する。最後に、本発明者らは、ＮＴ−３の離脱により引き起こされる後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの死が、ＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性が拮抗作用を受ける場合に阻害されることを示す。従って、ＮＴ−３の非存在下でのこのニューロン死は、生存シグナルの欠如のためばかりでなく、非結合型のＴｒｋＣ依存性受容体の能動的なアポトーシス誘導活性のためでもある。
【０００３】
従来の神経栄養説では通常、ニューロンの生存がニューロトロフィンなどの神経栄養因子に依存すると提案している（１，２）。また、この説は、これらの神経栄養因子が制限を受けた際に誘発される死が生存シグナルの欠如によるものであると述べている（３）。ニューロトロフィンには、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５が含まれる（２）。これらのタンパク質は、特に、過剰に産生されてそれらの標的に十分結合することができないニューロンの発達上の多大な損害を制御することで、神経系の発達に極めて重要であることが示されている。現在の神経栄養モデルには、主要なニューロトロフィン受容体、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣが、ニューロトロフィンが結合した際にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびＲａｓ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路を介して生存シグナルを生成することが含まれている（３）。この結合は自然に生じるニューロンのアポトーシス死を阻害すると考えられる。しかしながら、この説の弱点は、発達中のニューロンの「不履行のアポトーシス状態」の分子の性質が理解されていないということである。ニューロンに、細胞死シグナルが能動的に生成されるメカニズムが存在する可能性がある。リガンドが結合した際に、腫瘍壊死受容体ファミリーの細胞死受容体はカスパーゼの活性化と多くの細胞種の細胞死を誘発するが、神経系にそれらが関与している証拠はほとんどない。しかしながら、最近、リガンドが利用できるか否かによって、いくつかの受容体が全く反対の二つのシグナル伝達経路を誘発する（すなわち、リガンドが存在すれば、これらの受容体は分化、誘導(guidance)または生存の陽性シグナルを伝達し、リガンドが存在しなければ、アポトーシス細胞死の能動的なプロセスを誘導する）ということを裏付ける所見があった。これらの受容体は依存性受容体と呼ばれ、ｐ７５ｎｔｒ、ＤＣＣ(deleted in colorectal cancer)、ＵＮＣ５Ｈ、Ｐａｔｃｈｅｄ、Ｎｅｏｇｅｎｉｎ、およびチロシンキナーゼ受容体ＲＥＴ（４−１０）が含まれる。個々のリガンドの非存在下で見られるこれらの受容体のアポトーシス誘導活性は、神経系の発達中のニューロンの移動または局在の十分なテリトリーを指示するためにも重要であるが、さらに重要なことに、成体において腫瘍成長を調節するとも推測されている。この活性はインビボにおいて、発達中の脊髄における依存性受容体Ｐａｔｃｈｅｄおよび神経上皮細胞の生存（４）、ならびに結腸直腸の腫瘍形成におけるｎｅｔｒｉｎ−１受容体ＤＣＣおよび／またはＵＮＣ５Ｈ（５）に関して具体的に示されている。この後者の場合では、ｎｅｔｒｉｎ−１受容体は、リガンドが制限されている状況で増殖している腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにより腫瘍の進行、すなわち、原発腫瘍の成長または転移性を阻害する腫瘍サプレッサーであることが示されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ＮＴ−３に対する主要な同族受容体であるタンパク質チロシンキナーゼ受容体ＴｒｋＣもまた依存性受容体であり、この依存性受容体ＴｒｋＣがアポトーシスを調節することにより神経芽腫において腫瘍サプレッサーとして振る舞うという証拠を提供する。そして、進行性の腫瘍細胞にとっての選択的優位性は、ＴｒｋＣをダウンレギュレーションする（これに関しては、ＴｒｋＣの発現は予後(pronosis)の良い神経芽腫に関連している）か、または本発明者らの仮説であるＮＴ−３の自己分泌過剰発現させるかのいずれかである。
【０００５】
この問題は基礎知識として重要なだけでなく、治療法として極めて重要であり、実際に、これらのＮＴ−３が高い腫瘍においてニューロトロフィン(neurothophin)３とＴｒｋＣ依存性受容体との間の細胞外相互作用を阻害することは、ＮＴ−３の過剰発現に関連するか、または高い比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）を示す腫瘍に対して腫瘍退縮を誘発するための興味深い戦略となる。
【０００６】
このような癌の処置に使用することができる新たな化合物を特定および特性決定するための簡単かつ一貫した手段を提供することが特に望ましい。
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、神経芽腫細胞などのＮＴ−３を発現する腫瘍細胞において、ＴｒｋＣ−ＮＴ３結合に拮抗作用を及ぼし得る化合物の存在下でインキュベートすると、ＴｒｋＣがアポトーシスを誘導することを実証した。予備的な結果によれば、原発腫瘍の発生の軽減および転移性の抑制が示され、このような化合物は治療において転移性(metastasic)腫瘍の細胞死を誘発するため、従って、ＮＴ−３の過剰発現に起因する癌または高い比（ＮＴ３：ＴｒｋＣ）を示す癌の治療および／または予防のための有効な薬剤として使用可能であることが実証される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ−１Ｇ：ＴｒｋＣは依存性受容体である。ＨＥＫ２９３Ｔ（Ａ〜Ｃ）または１３．Ｓ．２４（Ｄ〜Ｇ）細胞をｍｏｃｋプラスミド（Ｍｏｃｋ）または発現プラスミドＴｒｋＡ、ＴｒｋＢもしくはＴｒｋＣでトランスフェクトした。（Ａ）トリパンプルー排除により測定されたＴｒｋＣによる細胞死誘導。標準偏差を示す（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴｒｋＣはカスパーゼ活性の上昇を誘導した（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質の切断により測定）。一般的かつ強力なカスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ−ｆｍｋも使用した。（Ｃ）ＴｒｋＣは、抗活性型カスパーゼ−３抗体を用いた免疫染色により測定されるように、カスパーゼ−３活性化を誘導する。代表的な画像を示す。定量値を標準偏差とともに示す（ｎ＝３）。（Ｄ）トランスフェクト細胞をＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋで標識した。対照として、キナーゼ不活性型（図４Ｃ参照）ＴｒｋＣ（ＴｒｋＣ  Ｄ６７９Ｎ）もトランスフェクトした。代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＴｒｋＣはカスパーゼの活性化を誘導するが、ＴｒｋＡとＴｒｋＢはｍｏｃｋトランスフェクションと同様に振る舞うことに注意。（Ｅ〜Ｇ）Ｍｏｃｋ  １３．Ｓ．２４細胞またはラット（ＥおよびＦ）／ヒト（Ｇ）  ＴｒｋＣでトランスフェクトされた１３．Ｓ．２４細胞を漸増用量のＮＴ−３（示されているようにラットＴｒｋＣでは０．５、１、２．５、５、１０、および５０ｎｇ／ｍｌ、ヒトＴｒｋＣでは１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。（Ｅ）トリパンプルー排除により測定されたＴｒｋＣによる細胞死の誘導（上）。ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化を抗ホスホＡｋｔおよび抗ホスホＥｒｋを用いた免疫ブロットにより示す（下）。Ａ  ローディング対照を全Ｅｒｋに対する免疫ブロットにより示す。（Ｆ）ＮＴ−３は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を用いることにより測定した際、ＴｒｋＣにより誘導されるカスパーゼ活性を阻害する。ウエスタンブロットにより示されるように、試験条件が異なってもＴｒｋＣ発現のレベルは同等であることに注意。（Ｇ）１３．Ｓ．２４細胞では、ラットＴｒｋＣではなくヒトＴｒｋＣが発現された。細胞死は活性カスパーゼ−３で標識された細胞を数えることにより測定した。比はｍｏｃｋトランスフェクションで検出されたものに対する各条件の活性カスパーゼ−３−陽性細胞として表す。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図２】図２Ａ−２Ｄ：ＴｒｋＣはカスパーゼ基質である。（Ａ）ＴｒｋＣはインビトロにおいて主としてカスパーゼ−３により切断される。ＴｒｋＣならびにＴｒｋＡおよびＴｒｋＢの、インビトロで翻訳された細胞内ドメインを、カスパーゼの非存在下または精製カスパーゼ−３またはカスパーゼ−８（０．３μＭ）とともにインキュベートした。オートラジオグラフを示す。（Ｂ）アスパラギン酸残基６４１および４９５が切断部位である。下のオートラジオグラフに示されるように、ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ４９５／Ｄ６４１Ｎ変異型はカスパーゼ−３により切断されない。（Ｃ）１３．Ｓ．２４細胞においてｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下または非存在下で、片方の（ＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ、ＴｒｋＣ  Ｄ６４１Ｎ）、または両方の（ＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎ）の切断部位にＴｒｋＣ野生型または変異型が発現した。（Ｄ）半分離ＤＲＧを、未処理で（−）、またはＢＡＦを含んでもしくは含まずにＮＴ−３もしくはＴｒｋＣ阻止抗体ＡＦ１４０４とともに一晩放置した。ＣおよびＤでは、ＴｒｋＣ  Ｃ末端に対する抗体を用いたウエスタンブロットにより、切断断片が見られた。Ｄの上は全長ＴｒｋＣを示し、Ｄの真ん中は２０ｋＤａ断片を示す。Ｄの下はローディング対照を示し、アクチンを表している。
【図３】図３Ａ−３Ｉ：ＴｒｋＣ切断はアポトーシス誘導ドメインを放出する。（Ａ−Ｄ）ＴｒｋＣの一つまたは二つのカスパーゼ切断部位の突然変異はＴｒｋＣのアポトーシス誘導活性を阻害する。（Ａ）Ｍｏｃｋプラスミド（Ｍｏｃｋ）、ＴｒｋＣ、またはＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎでトランスフェクトされた１３．Ｓ．２４細胞を、抗ＨＡ（ＨＡ−ＴｒｋＣ）抗体を用いたウエスタンブロット、ＳＩ  図５Ａのような膜局在に関するＦＡＣＳ分析、および図ＩＤのようなカスパーゼ活性の測定に関するＦＡＣＳ分析によって分析した。（Ｂ）単一または二重カスパーゼ部位変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、図１Ｂのように、カスパーゼ活性を細胞溶解液におけるＤＥＶＤ−ＡＦＣ切断により測定した。（ＣおよびＤ）トリパンプルー排除（Ｃ）またはＳＩ  図５Ｂ（Ｄ）のようなＤＮＡ縮合により測定した際、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎ変異体はアポトーシス誘導性ではない。標準偏差を示す（ｎ＝３）。（Ｅ）ＴｒｋＣは８２５個のアミノ酸からなる。カスパーゼ切断部位はこの受容体の細胞質領域のＤ４９５とＤ６４１に位置する。ＥＣ、細胞外ドメイン、ＩＣ、細胞内ドメイン、ＴＫ、チロシンキナーゼドメイン、ＬＲＲ、ロイシンリッチリピート、Ｉｇ、Ｉｇドメイン、Ｃ−ｒｉｃｈ：システインリッチドメイン、ＴＭ、トランスメンブランドメイン。（ＦおよびＧ）図１ＤのようなＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋに基づくカスパーゼ活性アッセイ（Ｆ）またはトリパンプルー排除（Ｇ）により測定されるように、カスパーゼ切断により放出された断片（４９６〜６４１）は、１３．Ｓ．２４神経芽細胞で発現された場合、強力な細胞死インデューサーである。標準偏差を示す（ｎ＝３）。（Ｈ）一次感覚ニューロンをＮＴ−３で維持し、ｍｏｃｋプラスミド（Ｍｏｃｋ）またはＴｒｋＣ  ４９６−６４１をコードするプラスミドでマイクロインジェクションを行った。７２時間後に生存ニューロンを数え、最初にマイクロインジェクションを行ったニューロンに対するパーセンテージとして表した。平均値の標準誤差を示す（ｎ＝３）。（Ｉ）１３．Ｓ．２４細胞を、ＴｒｋＣ  ４９６−６４１（またはエンプティーベクター）と、エンプティーベクター（Ｍｏｃｋ）、Ｂｃｌ−２またはドミナントネガティブ（ＤＮ）カスパーゼ−２、−８もしくは−９のいずれかの発現プラスミドで同時トランスフェクトした。図１Ｄのように、カスパーゼ活性を測定することによりアポトーシスを測定した。カスパーゼ活性を、それぞれの同時トランスフェクション（Ｍｏｃｋ、Ｂｃｌ２、Ｃａｓｐ２ＤＮ、Ｃａｓｐ８ＤＮ、およびＣａｓｐ９ＤＮ）で、ＴｒｋＣ  ４９６−６４１トランスフェクト集団と対照トランスフェクト集団の間の比で表す。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図４】図４Ａ−４Ｇ：ＮＴ−３欠如時のＤＲＧニューロンの死滅はＴｒｋＣのアポトーシス誘導活性によるものである（ＡおよびＢ）。ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１ＮはＴｒｋＣのドミナントネガティブ変異体として働く。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｍｏｃｋプラスミド（Ｍｏｃｋ）、ｍｏｃｋプラスミドを伴うＴｒｋＣ発現プラスミド、またはＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎ発現プラスミドでトランスフェクトした。ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎのドミナントネガティブ効果をトリパンプルー排除（Ａ）または図ＩＢのようなカスパーゼ活性アッセイ（Ｂ）により測定した。標準偏差を示す（ｎ＝３）。（Ｃ）１０ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３存在下または非存在下、ＰＢＫ阻害剤（ＬＹ２９４００２、１０μＭ）もしくはＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６、１０μＭ）を添加して、または添加せずに、１３．Ｓ．２４神経芽細胞をＴｒｋＣ野生型もしくはＴｒｋＣキナーゼデッド型（ＴｒｋＣＤ６７９Ｎ）でトランスフェクトするか、またはＴｒｋＣとドミナントネガティブ変異体ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎとで同時トランスフェクトした。ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化を、それぞれ抗ホスホＡｋｔ抗体および抗ホスホＥｒｋ抗体を用いたウエスタンブロットにより可視化した。ＡｋｔキナーゼおよびＥｒｋキナーゼのレベルを、それぞれ膜を抗全Ａｋｔ抗体または抗全Ｅｒｋ抗体で再プロービングすることにより示した。ＴｒｋＣの免疫ブロットも示す。ＦＡＣＥ−Ａｋｔ  ＥＬＩＳＡ(Active Motif, Carlsbad, CA)を用いた場合にも同様の結果が得られた。（ＤおよびＥ）感覚ニューロンをＮＴ−３またはＮＧＦで維持し、ｍｏｃｋプラスミド（Ｍｏｃｋ）、あるいはＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎ（Ｄ）またはキナーゼデッド型ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎ／Ｄ６７９Ｎ、Ｒｅｔのドミナントネガティブ変異体（すなわち、Ｒｅｔ  ＩＣ  Ｄ７０７Ｎ）もしくはＴｒｋＣ  ＩＣ（Ｅ）をコードするプラスミドでマイクロインジェクションを行い、ＮＴ−３またはＮＧＦを伴わずにさらに増殖させた。７２時間後に生存ニューロンを数え、最初にマイクロインジェクションを行ったニューロンに対するパーセンテージとして表した。ＤおよびＥに示す実験は別々に行った。（Ｆ）ＤおよびＥと同様に、感覚ニューロンをＮＴ−３で維持し、内因性ＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡおよびＴｒｋＣまたはＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎのいずれかでマイクロインジェクションを行い、ＮＴ−３の非存在下でさらに増殖させた。７２時間後に生存ニューロンを数え、最初にマイクロインジェクションを行ったニューロンに対するパーセンテージとして表した。平均値の標準誤差を示す（ｎ＝３）。（Ｇ）ＴｒｋＣまたはＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎでトランスフェクトした１３．Ｓ．２４細胞においてＡｋｔ／Ｅｒｋのリン酸化を測定したこと以外はＣと同様。
【図５】図５Ａ−５Ｃ：ＴｒｋＣは依存性受容体として振る舞う。１３．Ｓ．２４（ＡおよびＣ）またはＨＥＫ２９３Ｔ（Ｂ）細胞をｍｏｃｋ（Ｍｏｃｋ）、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢまたはＴｒｋＣ発現プラスミドでトランスフェクトした。（Ａ）ＨＡタグの付いたＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣの膜局在を、抗ＨＡ抗体（ａＨＡ−ＰＥ）を用いたＦＡＣＳ分析により測定した。（Ｂ）トランスフェクト細胞を、ホルムアミド中７５℃で細胞をインキュベートした後に抗一本鎖ＤＮＡ抗体で標識した。アポトーシス細胞のＤＮＡを７５℃で変性させ、フローサイトメトリーにより分析した。ＦＩＴＣ−抗体で染色した細胞のパーセンテージを示し、内部標準偏差を示す。（Ｃ）ＮＴ−３はＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスを阻害する。１３．Ｓ．２４細胞をｍｏｃｋまたはＴｒｋＣでトランスフェクトし、トランスフェクション３時間後および２４時間後にＮＴ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）またはｚＶＡＤ−ｆｍｋを加えた。Ｂのように、細胞を抗一本鎖ＤＮＡ抗体で標識することにより測定した場合、ＮＴ−３はＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスを阻害する。
【図６】図６Ａ−６Ｄ：ＴｒｋＣの切断はカスパーゼ−３またはｐ７５ｎｔｒに依存せず、ヒトＴｒｋＣでも起こる。（ＡおよびＢ）ＴｒｋＣを１３．Ｓ．２４細胞に、一般的なカスパーゼ阻害剤ＢＡＦもしくは特異的カスパーゼ−３阻害剤ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（Ａ）のいずれかの存在下もしくは非存在下でトランスフェクトするか、あるいはカスパーゼ−３ドミナントネガティブ（Ｃａｓｐ３ＤＮ）（Ｂ）で同時トランスフェクトした。また、対照として、この変異体において消失した切断バンドを示すためにＴｒｋＣＤ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎもトランスフェクトした。（Ｃ）ヒトまたはラットＴｒｋＣ発現構築物を１３．Ｓ．２４細胞にトランスフェクトした。ヒトならびにラットＴｒｋＣを認識するＣ末端に対する抗体を用いたところ、切断断片が見られ、矢印で示す。ラットＴｒｋＣ（Ａ）で示されるように、ヒトＴｒｋＣも一般的なカスパーゼ阻害剤ＢＡＦの存在下でもはや切断されない。（Ｄ）１３．Ｓ．２４細胞をＴｒｋＣでトランスフェクトするか、またはＴｒｋＣおよびｐ７５ｎｔｒで同時トランスフェクトし、ＴｒｋＣの切断をＣと同様に分析した。ｐ７５ｎｔｒ免疫ブロットにより検出された高レベルのｐ７５ｎｔｒの存在がＴｒｋＣ切断に対して有意な影響を示さないことに注意。さらに、ｐ７５ｎｔｒを発現することができないＤａｏｙ細胞におけるＴｒｋＣトランスフェクションも、同様のカスパーゼ依存性のＴｒｋＣ切断の出現と関連している（データは示されていない）。
【図７】依存性受容体の概念を示す図である。
【図８】依存性受容体としてのＴｒｋＣを示す図である。
【図９】神経芽腫（ＮＢ）の標的としてのＴｒｋＣを示す図である。
【図１０】２６のＮＢ腫瘍サンプルからのＮＴ−３およびＴｒｋＣ  ＲＮＡを定量的ＰＣＲにより測定した。
【図１１】ヒト腫瘍細胞系統のスクリーニング：ＲＴ−ＰＣＲによるＮＴ−３発現の定量。数種のＮＢ細胞系統をＮＴ−３およびＴｒｋＣの発現を測定することによりスクリーニングした。ＣＬＢ−Ｇｅ１およびＣＬＢ−Ｖｏｌ．Ｍｏ細胞系統をそれらの高いＮＴ−３発現により選択し、ＩＭＲ３２細胞を陰性対照細胞系統として選択した。確認は免疫化学によって行われた。
【図１２】ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡはＣＬＢ−Ｇｅ１細胞のアポトーシスを誘導する。
【図１３】ＮＴ−３とＴｒｋＣの相互作用の干渉はＮＴ−３の高いＮＢ細胞のアポトーシスを誘導し、ＮＴ−３阻止抗体（ＡＦ  １４０４）はＮＴ−３発現ＮＢ細胞系統および病期４の患者サンプルにおいてアポトーシスを誘導する。
【図１４】ＮＴ−３とＴｒｋＣの相互作用の干渉は、ＴｒｋＣを介してアポトーシスを誘発する。ＴｒｋＣドミナントネガティブ（ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎ）のトランスフェクションはＡＦ１４０４により誘導されるアポトーシスを遮断する。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｆ：ひな鳥モデルにおいて、ＮＴ−３／ＴｒｋＣ相互作用の阻害は、腫瘍の進行と、ＮＴ−３発現ＮＢ細胞の転移性とを軽減し、ＮＴ−３／ＴｒｋＣの遮断はＮＢの成長と転移を阻害する。（Ａ）Ｂ〜Ｅで用いたひな鳥実験モデルを表す図である。１０日目にＣＡＭにＩＭＲ３２またはＣＬＢ−Ｇｅ２細胞を移植し、α  ＴｒｋＣ抗体またはイソ型抗体（対照抗体）を１１日目および１４日目に加えた。１７日目に腫瘍および肺を採取した。（Ｂ−Ｃ−Ｄ）原発腫瘍成長およびアポトーシスに対するα  ＴｒｋＣ抗体の効果である。（Ｂ）非処理ＣＡＭまたはイソ型抗体（対照抗体）もしくはα  ＴｒｋＣ抗体のいずれかで処理したＣＡＭに生じたＣＬＢ−Ｇｅ２原発腫瘍の代表的な画像である。（Ｃ）Ｂに記載した個々の原発腫瘍の代表的なＴＵＮＥＬ染色画像。Ｂ．スケールバーは１００μｍに相当する。（Ｄ）非処理腫瘍に対する原発腫瘍の大きさを示す定量分析である。（Ｅ）肺転移性に対するα  ＴｒｋＣ抗体の効果。α  ＴｒｋＣ抗体もしくはイソ型抗体のいずれかの腫瘍内注射（１１日目および１４日目）または非処理から２日後の、ＩＭＲ３２またはＣＬＢ−Ｇｅ２細胞が浸潤した肺を持つ胚のパーセンテージ。（Ｆ）原発腫瘍に対するＮＴ−３  ｓｉＲＮＡおよびＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡの効果。１０日目にＣＡＭにＣＬＢ−Ｇｅ２細胞を移植し、１１日目および１４日目に漿尿膜管にＮＴ−３、ＴｒｋＣまたはスクランブルｓｉＲＮＡを静注した。１７日目に原発腫瘍を採取した。ＤおよびＦでは、エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示し、＊は非処理腫瘍と比較して両側マン−ホイットニー検定により算出したｐ＜０．０５を示す。Ｅでは、＊はカイ２乗検定により算出したｐ＜０．０１を示す。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｄ：ＮＴ−３は病期４のＮＢの大部分で発現する。（Ａ）全８６人の病期４  ＮＢ患者の腫瘍からの全ＲＮＡに対してＱ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＮＴ−３発現および比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）（２０人の病期４  ＮＢ患者を図１７に示す）である。中央値に相当する値の２倍より多いＮＴ−３を発現する腫瘍のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＮＴ−３発現の低い（左のパネル）および高い（右のパネル）病期４患者からの腫瘍生検および骨髄分離細胞に対する代表的なＮＴ−３免疫組織化学（それぞれ図１Ａに点線のグレーの矢印と黒い矢印に相当する）である。挿入：抗体無しの対照を表す。（Ｃ）ＮＢ細胞系統の一部においてＱ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＮＴ−３発現および比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）である。ＨＰＲＴ発現を内部対照として用いた。（Ｄ）ＣＬＢ−Ｇｅ２、ＣＬＢ−Ｖｏ１Ｍｏ、およびＩＭＲ３２細胞に対する代表的なＮＴ−３免疫組織化学である。挿入：一次抗体無しの対照である。右上のパネル、一次抗体とともに過剰量の組換えＮＴ−３（ｒ−ＮＴ−３）を加えた場合のＮＴ−３の免疫染色である。上の二つのパネルは膜の透過処理無し（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００無し）で行った免疫組織化学を示し、下の二つのパネルは細胞の透過処理（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００有り）後に行ったことに注意。
【図１７】ＮＴ−３は病期１、２、３、４のＮＢの大部分で発現する。全部で６９人のＮＢ患者（病期１が１４人、病期２が２２人、病期３が１３人、病期４が２０人）の腫瘍からの全ＲＮＡに対してＱ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＮＴ−３およびＴｒｋＣ発現。中央値に相当する値の２倍より多いＮＴ−３を発現する腫瘍のパーセンテージを示す（上のパネル）。ＨＰＲＴ発現を内部対照として用いた。下のパネルに比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）を示す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｆ：ＮＴ−３自己分泌ループの乱れはＮＢの細胞死を誘発する。（Ａ）スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｓｃｒ．）またはＮＴ−３  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＮＴ−３）でトランスフェクトして２４時間後のＣＬＢ−Ｇｅ２細胞系統に対するＮＴ−３免疫染色。挿入：一次抗体無しの対照である。（Ｂ−Ｃ）非トランスフェクト細胞（対照）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｓｃｒ）もしくはＮＴ−３  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＮＴ−３）のいずれかでトランスフェクトした後、相対的カスパーゼ−３活性アッセイ（Ｂ）またはＴｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイ（Ｃ）を用い、ＩＭＲ３２およびＣＬＢ−Ｇｅ２細胞系統における細胞死誘導を定量した。（Ｄ−Ｅ）（α  ＴｒｋＣ）で処理した細胞または抗ＴｒｋＣ抗体を含まない細胞（対照）で、相対的カスパーゼ−３活性アッセイ（Ｄ）またはＴＵＮＥＬアッセイ（Ｅ）を用いてＣＬＢ−Ｇｅ２、ＣＬＢ−Ｖｏ１ＭｏまたはＩＭＲ３２細胞系統の細胞死誘導を定量した。ＴＵＮＥＬアッセイに関して、ＴＵＮＥＬ染色の代表的な視野を示す（上のパネル：対照細胞、下のパネル：α  ＴｒｋＣ（「α  ＴｒｋＣ」は抗ＴｒｋＣ抗体のこと）で処理した細胞）。（Ｆ）外科生検から直接分離し、処理の存在下（＋）または非存在下（−）で２４時間平板培養した病期４のＮＢ腫瘍細胞に対するα  ＴｒｋＣ抗体の効果。Ｂ〜Ｆにおいて、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示し、＊は対照と比較して両側マン−ホイットニー検定を用いることで算出したｐ＜０．０５を示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂ：ＮＴ−３／ＴｒｋＣ干渉は神経芽腫の細胞死を促進する。（Ａ）（α  ＴｒｋＣ）抗ＴｒｋＣ抗体、ＴｒｋＣ細胞外ドメイン（Ｆｃ−ＴｒｋＣ−ＥＣ）またはイソ型対照（対照抗体）のいずれかで処置した細胞において、相対的カスパーゼ−３活性アッセイによりＣＬＢ−Ｇｅ２またはＩＭＲ３２細胞系統の細胞死誘導を定量した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示し、＊は対照と比較して両側マン−ホイットニー検定を用いることで算出したｐ＜０．０５を示す。（Ｂ）病期４のＮＢ患者から採取した腫瘍生検および骨髄から抽出したｃＤＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによりＮＴ−３およびＴｒｋＣ発現を増幅し、アガロースゲル上で可視化した。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｅ：ＮＴ−３／ＴｒｋＣ干渉はＴｒｋＣのアポトーシス誘導活性を促進する。（Ａ）ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞をエンプティーベクター（対照）またはドミナントネガティブＴｒｋＣ−ＩＣ  Ｄ６４１Ｎをコードするプラスミドのいずれかでトランスフェクトし、２４時間α  ＴｒｋＣ  抗体有り（＋）または無し（−）で処理した。スライド上にプレーティングした細胞のＴＵＮＥＬ標識により、細胞死を測定した。ＴｒｋＣ−ＩＣＤ６４１Ｎ発現を抗末端ＴｒｋＣウエスタンブロットにより管理した（下のパネル）。右のパネルに代表的な画像を示す。（Ｂ）ＴｒｋＣ  １３．Ｓ．２４を発現しない嗅覚神経芽細胞に対するウエスタンブロットによりＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡの有効性を評価した。細胞をアポトーシスを誘導しないエンプティーベクター（対照）または切断不能ＴｒｋＣ  Ｄ９４５Ｎ  Ｄ６４１Ｎ二重変異体、およびスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｓｃｒ．）またはＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＴｒｋＣ）でトランスフェクトした。（Ｃ）スクランブルｓｉＲＮＡ、ＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡ、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡまたはＴｒｋＣとＮＴ−３  ｓｉＲＮＡの混合物のいずれかでトランスフェクトした後、相対的カスパーゼ−３活性アッセイを用いてＣＬＢ−Ｇｅ２細胞系統の細胞死誘導を定量した。（Ｄ）血清の非存在下、２μｇ／ｍｌのα  ＴｒｋＣ抗体、２０ｎＭのＬｙ２９４０２、１００ｎＭのＵ０１２６または１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ３で処理して１６時間後に、ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞のホスホ−Ａｋｔおよびホスホ−Ｅｒｋレベルをウエスタンブロットにより測定した。（Ｅ）一般的なカスパーゼ阻害剤ＢＡＦの存在下または非存在下、α  ＴｒｋＣ阻止抗体で処理した細胞（または無処理）に対する、抗ＴｒｋＣ抗体を用いたウエスタンブロットによるＴｒｋＣ切断バンド（２０ｋＤａ、矢印で示す）の検出。ＡおよびＣにおいて、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示し、＊は対照と比較して両側マン−ホイットニー検定を用いることで算出したｐ＜０．０５を示す。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｂ：ＮＴ−３／ＴｒｋＣ干渉はＴｒｋＣのアポトーシス誘導活性を促進する。（Ａ）ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞をエンプティーベクター（対照）またはドミナントネガティブＴｒｋＣ−ＩＣ  Ｄ６４１Ｎをコードするプラスミドでトランスフェクトし、２４時間α  ＴｒｋＣ抗体で処理（＋）するか、または無処理とした（−）。トリパンプルー排除により細胞死を測定した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示し、＊はカイ二乗検定で算出したｐ＜０．０１を示す。（Ｂ）ＩＭＲ３２細胞をｐｃＤＮＡ対照ベクター、ＢａｘまたはＴｒｋＣ発現構築物で一次的にトランスフェクトし、細胞死をＴｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイ（左のパネル）またはＴＵＮＥＬ染色（右のパネル）を用いて測定した。代表的な画像を示す（下のパネル）。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示し、＊は両側マン−ホイットニー検定により算出したｐ＜０．０５を示す。
【図２２】乳癌におけるＮＴ−３の発現特性を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調べた。８２の腫瘍生検から抽出した全ＲＮＡを用い、ＱＲＴ−ＰＣＲを行った。それらは腫瘍が乳房に局在している患者（Ｎ０）、液化リンパ節だけが関与している患者（Ｎ＋Ｍ０）、および診断で遠位の転移を有する患者（Ｍ＋）から得られたものである。特異的ヒトＮＴ−３プライマーおよびヒトＨＭＢＳ遺伝子（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）に相当するプライマーを用いた。  ここでは、ＨＭＢＳが、記載されているように(de Kok JBら (2005))、正常組織と乳房腫瘍組織間でｍＲＮＡレベルに若干の違いを示すことから、これを参照として用いた。  ＮＴ−３発現レベルの中央値を各サンプル群（Ｎ０、Ｎ＋Ｍ０およびＭ＋）で算出した。表は中央値の２倍に相当するレベルでＮＴ−３を発現するサンプルの数およびパーセンテージを示す。
【発明の具体的説明】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、癌の予防または治療用の化合物を選択するためのインビトロ法を対象とし、該方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）ニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片とを含む培地を取得する工程（ここで、
該ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片とは、共に特異的に相互作用して結合対を形成することができ、および／または
該ニューロトロフィン３またはその断片は、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成を誘導できる）、
ｂ）該培地と、供試化合物とを接触させる工程、
ｃ）ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用の阻害を測定し、および／または
該化合物が該ＴｒｋＣ受容体またはその断片の二量体形成または多量体形成、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成を阻害するか否かを判定する工程、および
ｄ）工程ｃ）の測定が、該化合物の存在下でニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用に有意な阻害を示す場合、および／または
工程ｃ）における判定が、該化合物の存在下で該ＴｒｋＣ受容体またはその断片の二量体形成または多量体形成、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成に有意な阻害を示す場合
に、その化合物を選択する工程。
【００１０】
本願において、ニューロトロフィン３とそのＴｒｋＣ受容体の間の相互作用とは、好ましくはニューロトロフィン３レベルが高いために、ニューロトロフィン３依存性受容体により誘導されるアポトーシスを回避する選択的優位性を腫瘍細胞にもたらす相互作用を表すものとする。
【００１１】
従って、この相互作用の阻害は、例えば、特に、競合的リガンド（該ＴｒｋＣ受容体の細胞外膜ドメインに対する抗体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体など）の存在下、またはニューロトロフィン３と特異的複合体を形成することができる化合物（そのＴｒｋＣ受容体の可溶性細胞外膜ドメインまたはその一部）の存在下で、ニューロトロフィン３とそのＴｒｋＣ受容体との結合を完全にまたは部分的に阻害することによって得ることができる。
【００１２】
好ましい実施形態においては、本発明による方法は、予防または治療される癌が、腫瘍細胞がニューロトロフィン３を発現もしくは過剰発現するか、または高い比（ＮＴ３：ＴｒｋＣ）を示す癌であることを特徴とする。
【００１３】
別の好ましい実施形態においては、本発明による方法は、予防または治療される癌が神経芽腫または乳癌であることを特徴とする。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、予防または治療される癌が転移性癌、進行性癌(aggressive cancer)、または予後の悪い癌であることを特徴とする。
【００１５】
別の好ましい実施形態においては、本発明による方法は、工程ａ）において、
該ＴｒｋＣ受容体断片が、ニューロトロフィン３と相互作用することができるＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその一部、好ましくは、ヒト(humant)ＴｒｋＣまたは１９９５年７月２７日付けのＧｅｎｂａｎｋ  Ａ．Ｎ．ＡＡＢ３３１１１に示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するその天然変異体の最初の４２９個のアミノ酸残基を含むＮ末端断片を少なくとも含んでなる細胞外断片を含んでなるか、またはそのものであり、および／または
該ＴｒｋＣ受容体断片が、ニューロトロフィン３の存在下で二量体または多量体を形成することができるＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインまたはその一部を含んでなるか、またはそのものである
ことを特徴とする。
【００１６】
別の好ましい実施形態においては、本発明による方法は、前記ニューロトロフィン３または／および前記ＴｒｋＣ受容体が哺乳類、特に、マウス、ラット、またはヒト、好ましくは、ヒトに由来することを特徴とする。
【００１７】
別の好ましい実施形態においては、本発明による方法は、前記ニューロトロフィン３または／および前記ＴｒｋＣ受容体および／または供試化合物が直接または間接的に測定可能なマーカーにより標識されることを特徴とする。
【００１８】
別の好ましい実施形態においては、本発明による方法は、工程ｃ）において
ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用の阻害の測定がイムノアッセイ（特に、ＥＬＩＳＡまたはイムノラジオ・メトリック・アッセイ（ＩＲＭＡ））、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって行われ、および／または
該ＴｒｋＣ受容体またはその断片、特に、細胞内ドメインの二量体形成もしくは多量体形成またはその阻害が免疫沈降またはＦＲＥＴにより行われること
を特徴とする。
【００１９】
別の特に好ましい実施形態においては、本発明による方法は、工程ａ）において、前記培地が、それらの表面膜で、内因性のまたは組換え型のＴｒｋＣ受容体、特に該ＴｒｋＣ受容体の組換え細胞外ドメインを発現する細胞を含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましい実施形態においては、前記組換えＴｒｋＣ受容体は、また前記ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインも含んでなる。
【００２１】
別の特に好ましい実施形態においては、本発明による方法は、工程ａ）において、前記培地が、前記ＴｒｋＣ受容体をそれらの膜表面で内因的に発現し、かつニューロトロフィン３を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含むこと、ならびに工程ｃ）において、供試化合物の存在下でのニューロトロフィン３と、そのＴｒｋＣ受容体との間の相互作用の阻害が、その供試化合物の存在により誘導されるアポトーシスまたは細胞死により測定される、好ましくは、以下の実施例に示されるようなトリパンプルー染色法を用いて分析されることを特徴とする。
【００２２】
好ましい実施形態においては、前記腫瘍細胞は、ＣＬＢ−Ｇｅ１またはＩＭＲ３２細胞系統などの確立された神経芽腫細胞系統からなる群から選択される。
【００２３】
本発明はまた、癌の予防または治療用の化合物を選択するためのインビトロ法も対象とし、該方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）内因性のまたは組換え型のＴｒｋＣ受容体、または少なくともその細胞内ドメインを含んでなるその断片を発現する哺乳類細胞、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくはそのＴｒｋＣ受容体細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成を呈する細胞またはそのＴｒｋＣ受容体細胞内ドメインがニューロトロフィン３の存在下で二量体または多量体を形成することができる細胞を取得する工程、
ｂ）該培地と、供試化合物とを接触させる工程（場合により、この培地はさらに、ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるニューロトロフィン３またはその断片を含んでもよい）、
ｃ）該ＴｒｋＣ受容体細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成が供試化合物の存在下で阻害されるか否かを判定する工程、
ｄ）場合により、供試化合物の存在が該哺乳類細胞の細胞死を誘導するか否かを判定する工程（例えば、トリパンブルー法による）、および
該化合物が該ＴｒｋＣ受容体またはその断片の二量体形成または多量体形成、特に該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成を阻害するか否かを判定する工程、および
ｅ）工程ｃ）の測定が、該化合物の存在下でニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用の有意な阻害を示す場合、および／または
工程ｃ）における判定が、該ＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインの二量体形成または多量体形成の有意な阻害を示す場合、および／または工程ｄ）における判定が該哺乳類細胞の細胞死を示す場合に、その化合物を選択する工程。
【００２４】
第２の態様において、本発明は、原発腫瘍を有する患者において、原発腫瘍細胞を含む該患者の生検から、転移性癌または進行性癌、特に予後の悪い神経芽腫の存在を予測するためのインビトロ法を対象とし、該方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）該生検におけるニューロトロフィン３発現レベルまたは比（ＮＴ３：ＴｒｋＣ）を測定する工程。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明による予測方法は、工程ａ）において、非転移性原発腫瘍生検または非進行性癌生検におけるニューロトロフィン３の発現に比べて、前記生検におけるニューロトロフィン３発現レベルの増加が、転移性癌または進行性癌の存在を示すことを特徴とする。
【００２６】
より好ましい実施形態では、本発明による予測方法は、転移性または進行性癌の存在に関して、供試生検と非転移性または非進行性参照生検の間のニューロトロフィン３発現の比が２を超える、好ましくは、２．５を超える、３を超える、３．５を超える、４を超える、４．５を超える、および５を超えることを特徴とする。
【００２７】
第３の態様において、本発明は、患者に対する抗癌処置の有効性をインビトロで判定するため、またはＮＴ−３：ＴｒｋＣ結合の阻害に基づいて特定の抗癌処置に応答し得る患者の選択方法を対象とし、該方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）該被処置患者の原発腫瘍生検を取得する工程、および
（ｂ）該生検におけるニューロトロフィン３発現レベルを測定する工程（ここで、該抗癌処置の有効性は該生検において測定されたニューロトロフィン３発現レベルの量の低下と相関しているか、または選択された該特定の抗癌処置に応答し得る患者が、処置前にそれらの生検で測定されたニューロトロフィン３発現レベルの量が対照患者のニューロトロフィン３発現レベルの量を有意に超えている、かつ場合により、ニューロトロフィン３発現レベルが該特定の処置後に低下した患者である）。
【００２８】
好ましい実施形態においては、患者に対する抗癌処置の有効性をインビトロで判定するため、または特定の抗癌処置に応答する患者の選択方法は、該癌がニューロトロフィン３の過剰発現を誘導したこと、および／または転移性癌または進行性癌であることを特徴とする。
【００２９】
好ましい実施形態においては、患者に対する抗癌処置の有効性をインビトロで予測するため、または判定するための方法は、測定されるニューロトロフィン３発現産物が、特に定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ法により測定される、ニューロトロフィン３をコードするＲＮＡであること、または測定されるニューロトロフィン３の発現レベルが、特に該ニューロトロフィン３タンパク質を特異的に認識することができる特異的抗体を用いた方法によるニューロトロフィン３タンパク質レベルの測定であることを特徴とする。
【００３０】
好ましい実施形態においては、患者に対する抗癌処置の有効性をインビトロで予測するため、または判定するための方法は、原発腫瘍がＮＴ−３を過剰発現するか、または高い比（ＮＴ３：ＴｒｋＣ）を示す癌からなる群から選択される癌、好ましくは、神経芽腫または乳癌の原発腫瘍であることを特徴とする。
【００３１】
別の態様において、本発明は、癌の予防または治療用の化合物を選択するためのキットを対象とし、該キットは、
ニューロトロフィン３タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるＴｒｋＣ受容体タンパク質またはその断片、好ましくは組換えタンパク質と、
該ＴｒｋＣ受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるニューロトロフィン３タンパク質またはその断片、好ましくは組換えタンパク質と
を含んでなる。
【００３２】
前記ＴｒｋＣ受容体もまた、好ましくは、マウス、ラット、またはヒトなどの哺乳類に由来するＴｒｋＣ群から選択されることが好ましい。
【００３３】
好ましい実施形態では、前記キットは、ＴｒｋＣ受容体を発現し、かつニューロトロフィン３を発現または過剰発現する腫瘍細胞、特に、好ましくは、ＣＬＢ−Ｇｅ１またはＩＭＲ３２細胞系統などの神経芽腫細胞系統からなる群から選択される転移性腫瘍細胞系統由来の細胞を含んでなる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、からなる群から選択される、薬剤としての化合物を含んでなる：
ニューロトロフィン３と、ＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができ、および／またはＴｒｋＣ受容体またはその断片の二量体形成または多量体形成を阻害すること、特にＴｒｋＣ受容体の細胞内ドメインを阻害することができる、ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片を含んでなる化合物、
特異的にニューロトロフィン３またはＴｒｋＣ受容体に対する、特にＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインに対する、または該ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるニューロトロフィン３断片に対するモノクローナル（ヒト化可能）またはポリクローナル抗体、
ＮＴ−３タンパク質を認識し、それと結合することができるＴｒｋＣ受容体の可溶性細胞外ドメイン、および
細胞において、好ましくはインビボでＮＴ３の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸。
【００３５】
ニューロトロフィン３またはＴｒｋＣ受容体などの哺乳類、例えばヒト、のアミノ酸配列は当業者によく知られている。これらのアミノ酸配列の例は、特定のドメインの場所とともに、ヒトニューロトロフィン３はＡＡＡ５９９５３（１９９５年１月５日付け）またはヒトＴｒｋＣはＡＡＢ３３１１１としてＧｅｎｂａｎｋに見出すことができる。
【００３６】
好ましくは、本発明の化合物では、ＴｒｋＣ受容体またはその断片の細胞外ドメインは、最初の３００個のＮ末端アミノ酸残基、好ましくは、３５０個、３７５個、４００個、４１０個、４２０個、および４２９個のアミノ酸残基を含んでなる。より好ましくは、ＮＴ３およびＴｒｋＣは、マウス、ラット、またはヒトなどの哺乳類に由来する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、患者、好ましくは、転移性神経芽腫または転移性乳癌患者において、転移性癌を識別するためのマーカーとしてのニューロトロフィン３の発現レベルの使用に関する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、患者において、ＴｒｋＣ依存性受容体により誘導されるアポトーシスを回避する選択的優位性を獲得した腫瘍細胞のアポトーシスまたは細胞死を、好ましくは、ニューロトロフィン３レベルを引き上げることによって誘導するための処置方法であって、それを必要とする患者に、ニューロトロフィン３と、そのＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を阻害することができる化合物、ＴｒｋＣ受容体の二量体形成または多量体形成を阻害することができる化合物、本発明による、または本発明の方法により選択された化合物を投与することを含んでなる方法に関する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、患者において癌を予防または治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本発明による、または本発明の方法により選択された化合物を投与することを含んでなる方法に関する。
【００４０】
本発明はまた、ヒトを含む哺乳類において癌の予防または治療用の薬剤の製造のための本発明による、または本発明の方法により選択された化合物の使用も含んでなる。好ましくは、前記癌は転移性癌または進行性癌である。
【００４１】
より好ましくは、処置方法において、または本発明による化合物の使用において、前記癌は神経芽腫および乳癌からなる群から選択される。
【００４２】
より好ましくは、処置方法において、または本発明による化合物の使用において、前記癌の原発腫瘍細胞はニューロトロフィン３を発現または過剰発現する。
【００４３】
本明細書において「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ニューロトロフィン３タンパク質またはその受容体と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。
【００４４】
好ましくは、この抗体はＴｒｋＣに特異的であり、ＴｒｋＡまたはＢ受容体は認識しない。このＴｒｋＣに対する抗体の特異性と他のＴｒｋファミリーメンバーとの交差反応性が無いという証拠は、ＴｒｋＡ、Ｂ、またはＣを発現するＨＥＫ  ２９３細胞などの哺乳類組換え細胞の免疫組織化学分析によるか、または免疫ブロット法によって示すことができる。
【００４５】
「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにキメラ抗体またはヒト化抗体を含む。
【００４６】
単離されたニューロトロフィン３タンパク質またはＴｒｋＣ受容体タンパク質、またはその特定の断片を免疫原として、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準技術を用い、このようなタンパク質と結合する抗体を作製することができる。また、少なくとも一つの抗原決定基を含むこれらのタンパク質の任意の断片を用いてこれらの特異的抗体を作製することもできる。
【００４７】
一般に、タンパク質免疫原を用い、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、またはその他の哺乳類）に免疫原を感作させることにより抗体を作製することができる。適当な適当な免疫原調製物には前記タンパク質またはその断片を含むことができ、さらに、フロイントの完全または不完全アジュバントなどのアジュバント、または類似の免疫刺激剤を含んでもよい。
【００４８】
よって、本発明に従って用いられる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体（ニューロトロフィン３タンパク質もしくはそのＴｒｋＣ受容体と選択的に結合することができる、またはニューロトロフィン３タンパク質もしくはそのＴｒｋＣ受容体アミノ酸配列のうち少なくともアミノ酸８〜１０個の連続するスパンを含んでなるエピトープ含有ポリペプチドと選択的に結合する抗体）のいずれかが含まれる。
【００４９】
ニューロトロフィン３タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出および定量するために好ましい薬剤は、このｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリダイズすることができる、標識された核酸プローブまたはプライマーである。この核酸プローブは少なくとも１０、１５、３０、５０、または１００ヌクレオチドの長さであって、ストリンジェント条件下でそのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。核酸プライマーは少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチドの長さであって、ストリンジェント条件下でそのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその相補的配列と特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。
【００５０】
ニューロトロフィン３タンパク質を検出および定量するために好ましい薬剤は、このタンパク質と特異的に結合することができる抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナルであってもよいし、より好ましくは、モノクローナルである。完全な抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用可能である。プローブまたは抗体に関して「標識された」とは、そのプローブまたは抗体と検出可能な物質をカップリングさせる（すなわち、物理的に結合させる）ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含するものとする。間接的標識の例としては、蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出可能なビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。
【００５１】
例えば、候補ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションが挙げられる。候補タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、および免疫蛍光法が挙げられる。候補ｃＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００５２】
本発明がニューロトロフィン３タンパク質のレベルを定量するためのキットを包含する場合、そのキットはこれらのタンパク質を定量可能な標識された化合物または薬剤を含み得る。該薬剤は好適な容器にパッケージングすることができる。このキットはさらに、ニューロトロフィン３タンパク質またはニューロトロフィン３転写物のレベルを定量するためにこのキットを使用することに関する使用説明書を含んでなってもよい。
【００５３】
本発明の方法のある実施形態では、ニューロトロフィン３転写物の検出には、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいはまた連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran et al., 1988, Science 241:23-1080、およびNakazawa et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:360-364参照）、あるいはまた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおけるプローブ／プライマーの使用が含まれる。この方法は、患者から細胞のサンプルを採取する工程、そのサンプルの細胞から核酸（例えばｍＲＮＡ）を単離する工程、場合により、ｍＲＮＡを対応するｃＤＮＡに変換する工程、その核酸サンプルを、ニューロトロフィン３ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でニューロトロフィン３またはｍＲＮＡまたはそれらの対応するｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させる工程、および増幅産物の存在を定量する工程を含み得る。当然のことながら、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、検出核酸を定量するために用いられるいずれかの技術と組み合わせて増幅工程として用いるのが望ましい場合がある。
【００５４】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも一つのプローブ核酸または１セットの本明細書に記載のプライマーもしくは抗体試薬を含んでなるパッケージングされた診断キットを使用することにより実施することができ、これは例えば患者を追跡または診断するために臨床条件下で便宜に使用することができる。
【００５５】
最後に、本発明は、転移性癌または進行性癌（好ましくは、この癌はＮＴ３の過剰発現に関連する癌からなる群から選択され、好ましくは、神経芽腫である）を予防または治療することを意図した薬剤を製造するための、ニューロトロフィン３タンパク質をコードする核酸に特異的なアンチセンスまたはｉＲＮＡ（干渉ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００５６】
干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がその相補的配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制する現象である。以来、ｉＲＮＡは多くの生物に関して有用な研究ツールとなっている。ｄｓＲＮＡが遺伝子発現を抑制するメカニズムは完全には理解されていないが、実験データは重要な洞察を示している。この技術は哺乳類細胞において遺伝子機能を研究するためのツールとして大きな可能性を持ち、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）に基づく薬理剤の開発に至る可能性がある。
【００５７】
患者に投与する場合、本発明の化合物は、場合により薬学上許容されるビヒクルを含んでもよい組成物の成分として投与するのが好ましい。この組成物は経口または他のいずれの便宜な経路で投与してもよく、別の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。投与は全身投与でも局所投与でもよい。例えば、リポソームへのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、カプセル剤などの様々な送達系が知られ、選択された本発明の化合物またはその薬学上許容される塩を投与するために使用することができる。
【００５８】
投与方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、大脳内、腟内、経皮、直腸、吸入、または局所投与が挙げられる。投与様式は医師の判断に任される。ほとんどの場合、投与は血流へのまたは直接原発腫瘍への化合物の放出をもたらす。
【００５９】
本発明による化合物、または本発明による方法により選択された化合物を含んでなる組成物も本発明の一部をなす。これらの組成物は、患者に適切に投与される形態となるよう、好適な量の薬学上許容されるビヒクルをさらに含むことができる。「薬学上許容される」とは、規制機関が認可していること、または動物、哺乳類、より詳しくはヒトに関する国の、もしくは認知されている薬局方に挙げられていることを意味する。「ビヒクル」とは、本発明の化合物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を意味する。このような製薬ビヒクルは、水などの液体、および石油、動物、植物、または合成起源のものを含む油（落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）であり得る。製薬ビヒクルは生理食塩水、ゼラチン、デンプンなどであってもよい。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、および着色剤を用いてもよい。生理食塩水溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射液用の液体ビヒクルとして使用可能である。好適な製薬ビヒクルとしてはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水などの賦形剤が挙げられる。試験化合物組成物は所望により、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。本発明の組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、散剤、徐放性処方物、坐剤、エマルション、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態または使用に好適な他のいずれかの形態を採ることができる。前記組成物は一般に、経口投与または静脈内投与向けにヒトに適した医薬組成物として常法に従って処方される。該処置に有効な有効化合物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、場合によりインビトロまたはインビボアッセイを用いて、最適な用量範囲を特定することができる。厳密な使用量はまた、投与経路および疾病の重篤度によっても異なり、医師の判断と患者の状況に応じて決定されなければならない。しかしながら、経口、鼻腔内、皮内、または静脈内投与の好適な用量範囲は一般に約０．０１ミリグラム〜約７５ミリグラム／体重ｋｇ／日、より好ましくは約０．５ミリグラム〜５ミリグラム／体重ｋｇ／日である。
【００６０】
本発明を以上の実施形態に関して記載してきたが、以上の記載および以下の実施例は例示であって本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点および改変も、本発明が属する技術分野の熟練者には自明であろう。
【実施例】
【００６１】
材料および方法
Ａ）細胞培養、トランスフェクション手順、および受容体発現
従前に記載されているように（４）、リポフェクタミンプラス(Invitrogen, Carlsbad, CA)を製造者の説明書に従って用い、ヒト胎児腎臓２９３Ｔおよび嗅覚神経芽１３．Ｓ．２４細胞の一時的トランスフェクションを行った。ＨＥＫ２９３Ｔおよび１３．Ｓ．２４細胞をＤＭＥＭ(Invitrogen)で、１３．Ｓ．２４細胞の場合には０．１％ゲンタマイシンを加えて培養した。組換えヒトＮＴ−３はPreproTech(Rocky Hill, NJ)から購入し、トランスフェクション２４時間後に培養培地３に加えた。Santa Cruz Biotechnology (sc-139、 Santa Cruz, CA)から購入した抗Ｃ末端抗体を用いたウエスタンブロットにより、トランスフェクション２４時間後にＴｒｋＣ発現を測定した。Ｔｒｋ受容体の原形質膜局在をＦＡＣＳ分析により調べた。要するに、１０６個の細胞をトランスフェクトし、抗ＨＡ抗体（１／１００、Sigma, St. Louis, MO）および抗ウサギＰＥ（１／１００、Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）で順次標識した。検出はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて行った。
【００６２】
Ｂ）部位特異的突然変異誘導、プラスミドの構築およびｓｉＲＮＡの設計
ＰＣＭＸ−ラットＨＡ−ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣプラスミドはS. Meakin (The Robarts Research Institute, London, ON, Canada)から譲渡されたものであった。ＴｒｋＣ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片をｐＣＤＮＡ３ベクター(Invitrogen)へクローニングした。ＴｒｋＣ  ＩＣを、以下のプライマー：フォワード5’-CACC ATG AAC AAG TAC GGT CGA CGG TC-3’およびリバース5’-CTG GAC ATT CTT GGC TAG TGG-3’を用いたＰＣＲにより、ディレクショナルｐＣＤＮＡ３．１(Invitrogen)にサブクローニングした。ＴｒｋＣ変異体は、以下のプライマー：D641N:5’-GCG ATG ATC CTT GTG AAT GGA CAG CCA CGC CAG G-3’および5’-CCT GGC GTG GCT GTC CAT TCA CAA GGA TCA TCG C-3’、Ｄ４９５Ｎ：5’-ACA CCT TCA TCG CTG AAT GCT GGG CCG GAT AC-3’および5’-GTA TCC GGC CCA GCA TTC AGC GAT GAA GGT GT-3’、D679N:5’-CTT TGT GCA CCG AAA CCT GGC CAC CAGG-3’および5’-CCT GGT GGC CAG GTT TCG GTG CAC AAA G-3’を用い、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ(Qiagen, Valencia, CA)によって得た。Ｒｅｔ  ＩＣ  Ｄ７０７Ｎもまた従前に記載されている（７）。種々のＴｒｋＣドメインを発現する構築物を、以下のプライマー：４９６−６４２断片：フォワード5’-CACC ATG GCT GGG CCG GAT ACA GTG G-3’、リバース5’-TCA ATC CAC AAG GAT CAT CGC ATC-3’、４９６−８２５断片：フォワード5’-CACC ATG GCT GGG CCG GAT ACA GTG G-3’、リバース5’-CTA GCC AAG AAT GTC CAG GTA G-3’、６４２−８２５断片：フォワード5’-GGC CTG GCG TGG CTG TCA ATC CAC AAG GAT CAT C-3’、リバース5’-CTA GCC AAG AAT GTC CAG GTA G-3’を用いたＰＣＲにより、ディレクショナルｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ｐＣＤＮＡ３中のラットＴｒｋＣを鋳型として用いた。ｐＬｅｎｔｉ−ヒトＴｒｋＣはfrom P. Sorensen (University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada)およびB. Nelkin (The Johns Hopkins University, Baltimore, MD)から厚意により譲渡されたものであった。ヒトＴｒｋＣを、以下のプライマー：フォワード5’-CG CACC ATG GAT GTC TCT CTT TGC CCAG-3’、リバース5’-GCG TCT AGA CTA GCC AAG AAT GTC CAG GTA G-3’を用いたＰＣＲにより、ディレクショナルｐＣＤＮＡ３．１(Invitrogen)にサブクローニングした。ｐＬｅｎｔｉ−ヒトＴｒｋＣを鋳型として用いた。カスパーゼ−２、−８および−９を発現する構築物のドミナントネガティブ変異体およびＢｃｌ２ベクターは従前に記載されている（１１、３４）。ＤＲＧにおけるＴｒｋＣ発現を低下させるため、３種類のｓｉＲＮＡ二重らせんの混合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いた。これらの３種類の二重らせんは全て、ＴｒｋＣの３’ＵＴＲ領域を標的とし、内因性のＴｒｋＣを無効にしたが、注入したプラスミドの産物は無効にしなかった。用いたプライマーは、１Ｓ：UCUCAACUCCUUUCUUCCAUUおよび１ＡＳ：UGGAAGAAAGGAGUUGAGAUU、２Ｓ：CUCAAGUGCCUGCUACACAUAおよび２ＡＳ：UGUGUAGCAGGCACUUGAGUA、３Ｓ：GCAUUUAUACUCUGUUGCCUCおよび３ＡＳ：GGCAACAGAGUAUAAAUGCUCであった。
【００６３】
Ｃ）細胞死分析
従前に記載されているように（６）、細胞死を、トリパンプルー染色法を用いて分析した。トランスフェクション直後にｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ(TEBU-bio, Le Perray en Yvelines Cedex, France、 ２０ｍＭ)またはＢＡＦ［Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｍｅ）フルオロメチルケトン、Sigma-Aldrich、２０ｍＭ］カスパーゼ阻害剤を培養培地に加えた。細胞死の程度を、種々のトランスフェクト細胞集団におけるトリパンプルー陽性細胞のパーセンテージとして表す。相対的カスパーゼ活性は、（８）に記載されているように、ＤＥＶＤＡＦＣ切断の蛍光測定により決定した。抗カスパーゼ−３抗体（細胞シグナル伝達）を用いた免疫染色は（４）に記載されている。フローサイトメトリー分析によるカスパーゼ活性の染色は次のようにして行った：７’１０５個のトランスフェクト細胞を採取し、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（５ｍＭ、CaspACE, Promega）を含有する２００ｍｌの染色溶液に再懸濁させた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析のために３００ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。一本鎖ＤＮＡに対するモノクローナル抗体によるアポトーシス細胞の検出は、抗ｓｓＤＮＡ／ＡＰＯＳＴＡＴＮ  Ｆ７−２６  抗ｓｓＡＤＮ抗体(AbCys SA, Paris, France)を用いて行った。３０万個のトランスフェクト細胞を採取し、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、メタノール中、１５〜２０℃で１〜３日固定した。次に、固定細胞をペレットとし、２５０ｍｌのホルムアミドに再懸濁させ、室温で５分間維持した。次に、チューブを７５℃に予熱した水浴に１０分間浸漬した。これらのチューブにＰＢＳ中１％の脱脂粉乳２０ｍｌを加え、次にこれらをボルテックスにかけ、室温で１５分間維持した。遠心分離の後、細胞ペレットを１００ｍｌのモノクローナル抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。次に、細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、１００ｍｌのフルオレセインコンジュゲート抗マウスＩｇＭに再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析のために１００ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。フローサイトメトリー分析では、染色された細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences)およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ分析ソフトウエア用い、それぞれ４８８ｎｍと５２５〜５５０ｎｍ（ＦＬ１フィルター）の励起および発光設定にして数えた。
【００６４】
Ｄ）インビトロ転写／翻訳およびカスパーゼ切断反応
精製カスパーゼは厚意によりGuy Salvesen (The Burnham Institute, La Jolla, CA)から譲渡されたものであった。インビトロ転写／翻訳およびカスパーゼ−３または−８を伴うインキュベーションは従前に記載（６）されているようにして行った。
【００６５】
Ｅ）細胞系統およびＤＲＧにおける切断の観察
１３．Ｓ．２４におけるＴｒｋＣの切断を観察するため、細胞を採取する２時間前に培養培地にＭＧ１３２（１ｍＭ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕａｌａ、Sigma-Aldrich）を加えた。次に、細胞をＷａｎｇバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ＫＯＨ／１０ｍＭ  ＫＣｌ／１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭナトリウムＥＤＴＡ／１ｍＭナトリウムＥＧＴＡ／０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ／１ｍＭ  ＤＴＴ／５ｍｇ／ｍｌペプスタチン／１０ｍｇ／ｍｌロイペプチン／２ｍｇ／ｍｌアプロチニン）にポッタライズした(potterised)。次に、タンパク質を、抗ＴｒｋＣ抗体（ｓｃ−１３９、Santa Cruz Biotechnology）を用いたウエスタンブロットにより分析した。インビボでＴｒｋＣ切断を測定するため、Ｅ１０．５  ＯＦ１マウス胚を鋭利なタングステン針で切開して脊髄、原体節およびＤＲＧ前駆体を単離し、次にこれらをＤＭＥＭ  Ｆ−１２(Invitrogen)で部分的に分離した。これらのサンプルをＮＴ−３（PreproTech、１０ｎｇ／ｍｌ）またはＢＡＦ（Sigma-Aldrich、２０ｍＭ）、またはＮＴ−３阻止抗体ＡＦ  １４０４（R&D, Minneapolis, MN、１／１００）のいずれかの存在下または非存在下、３７℃で振盪しながら一晩インキュベートした。その後、これらのサンプルをそのままＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーに溶解させ、１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上でタンパク質を分離した。フィルターを抗ＴｒｋＣ抗体でプローブした。この実験を３回繰り返したところ、同様の結果であった。
【００６６】
Ｆ）ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ経路の活性化
細胞を、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０ｍＭ、１０分、Sigma-Aldrich）またはＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（１０ｍＭ、１５分、Promega, Madison, WI）の存在下または非存在下、種々の濃度のＮＴ−３（Preprotech、１０分）で刺激し、または無刺激とした。細胞を以下のバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／０．１％βメルカプトエタノール／１％Ｔｒｉｔｏｎ（１００倍）／５０ｍＭフッ化ナトリウム／５ｍＭピロリン酸ナトリウム／１０ｍＭβグリセロホスフェート／０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に溶解させた。次に、タンパク質を、抗Ｅｒｋ抗体(Cell Signaling, Technology Danvers, MA)、抗ホスホ−Ｅｒｋ抗体(Cell Signaling)、抗Ａｋｔ抗体(Stressgen, La Jolla, CA)または抗ホスホ−Ａｋｔ抗体(New England Biolabs, Ipswich, MA)を用いたウエスタンブロットにより分析した。
【００６７】
Ｇ）感覚ニューロンの分離および培養
後根神経節（ＤＲＧ）を、本質的に三叉神経ニューロンに関して記載されているように（７）、ＮＭＲＩ染色マウス胚から調製し、１％トリプシン(Worthington, Biochemicals Freehold, NJ)で１５分間処理し、機械的に分離した。プレプレーティングにより非ニューロン細胞を除去し、ニューロンを、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＮＴ−３(PeproTech)または３０ｎｇ／ｍｌの２．５ＳマウスＮＧＦ(Promega)を含むポリオルニチン−ラミニン−コーティングディッシュで増殖させた。ＮＴ−３の培養では、細胞を３回も播種した。５日目の培養物をマイクロインジェクションに用いた。ＮＴ−３を欠損させるために、これらの培養物をＮＴ−３不含培養培地で３回、穏やかに洗浄した。ＮＧＦを除去するために、これらの培養物をＮＧＦ不含培地で１回洗浄し、機能遮断抗ＮＧＦ抗体(Roche, Indianapolis, IN)を加えた。
【００６８】
Ｈ）マイクロインジェクション
本質的に記載されているように（４）、これらのニューロンのマイクロインジェクションを行った。要するに、発現プラスミド（５０ｎｇ／ｍｌ）をニューロンの核に注入し（１点の実験当たり２５〜８０ニューロン）、ニューロンを神経栄養因子無しでさらに増殖させた。この手順で生き残った最初のニューロンを４〜６時間後に数えた。７２時間後に生きている健康なニューロンを数え、最初のニューロンに対するパーセンテージとして表した。３回の独立した実験の結果を平均値±ＳＥＭで表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびpost hoc TuckeyのＨＳＤ検定(post hoc Tuckey's honestly significant difference test)により分析した。Ｐ＜０．０５で帰無仮説を棄却した。ニューロンでＴｒｋＣを無効にするには、三つのＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡ二重らせんを終濃度６ｍＭとして合わせた。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃ−３７００７、Santa Cruz Biochemicals, Santa Cruz, CA）も６ｍＭ濃度で注入した。ＴｒｋＣプラスミドは５０ｎｇ／ｍｌ、ＧＦＰプラスミドは５ｎｇ／ｍｌとした。注入した培養物をＮＴ−３とともに一晩増殖させた後、ＮＴ−３を除去し、７２時間後、生きている蛍光ニューロンを数えた。
【００６９】
Ｉ）細胞実験の手順（特に、例えば７〜１０）
ａ）ヒトＮＢ腫瘍サンプルおよび生物学的注釈
親の同意の後、外科的ヒト神経芽腫腫瘍材料がすぐに冷凍された。材料および注釈は、ＮＢ処理に関する国のリファレンス機関、すなわち、Centre Leon Berard (Lyon, France)およびInstitut Gustave Roussy (Villejuif, France)の双方の生物学的遺伝資源センターから入手した。
ｂ）細胞系統、トランスフェクション手順、試薬
ヒト神経芽腫細胞系統はCentre Leon BerardおよびInstitut Gustave Roussyの腫瘍バンドから入手した。ＣＬＢ−Ｇｅ２、ＣＬＢ−Ｖｏ１ＭｏおよびＩＭＲ３２細胞系統を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ培地(Gibco)で培養した。ＣＬＢ−Ｇｅ２およびＩＭＲ３２細胞を、リポフェクタミン２０００試薬(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。すぐに腫瘍生検および骨髄細胞を分離し、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ培地(Gibco)で培養した。嗅覚神経芽細胞１３．Ｓ．２４を培養し、従前に記載されているように（３６）トランスフェクトした。抗ＴｒｋＣ阻止抗体（α  ＴｒｋＣ）はR&D Systemsから得た（ＡＦ  １４０４）。ヒトＴｒｋＣの細胞外ドメインに相当する組換えＴｒｋＣ／Ｆｃキメラ（Ｆｃ−ＴｒｋＣ−ＥＣ）はR&D Systemsから得た（３７３−ＴＣ）。ＢＡＦ［Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｍｅ）フルオロメチルケトン］カスパーゼ阻害剤（２０ｍＭ）はSigma-Aldrichから得た。
ｃ）プラスミド構築物、ｓｉＲＮＡ
ＴｒｋＣドミナントネガティブ変異体ＴｒｋＣ−ＩＣ  Ｄ６４１Ｎおよび切断不能ＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎは従前に記載されている（３６）。スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ−３７００７）およびＮＴ−３  ｓｉＲＮＡ（ｓｃ−４２１２５）はSanta Cruz Biotechnologyから入手した。ＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡはSigma-Aldrich（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１９２１４５およびＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１９２１４５＿ＡＳ）から入手した。
ｄ）細胞死アッセイ
２×１０５個の細胞を血清不足培地で増殖させ、２μｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＣ抗体（R&D Systems  ＡＦ１４０４）もしくは２μｇ／ｍｌのＦｃ−ＴｒｋＣ−ＥＣ（R&D Systems  ３７３−ＴＣ）で処理する（または無処理）か、あるいはＣＬＢ−Ｇｅ２細胞ではリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を、またはＩＭＲ３２細胞(Invitrogen)ではリポフェクタミンプラスを用い、ｓｉＲＮＡまたはＴｒｋＣ構築物をトランスフェクトした。処置／トランスフェクションの２４時間後に、従前に記載されているように（６）トリパンプルー排除によるか、またはＴｏｘｉＬｉｇｈｔバイオアッセイキット(Lonza)を用いて細胞死を分析した。従前に記載されているように（６）、Clontech (USA)からのＡｐｏＡｌｅｒｔ  ＣＰＰ３２キットを用いてカスパーゼ−３活性を測定することによってアポトーシスを測定した。ＤＮＡ断片化を検出するため、ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞をポリ−Ｌリシンをコーティングしたスライドで増殖させ、処置／トランスフェクションの２４時間後に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。ＩＭＲ３２でトランスフェクトされた細胞をＰＦＡ固定前に細胞遠心した(cytospun)。従前に記載されているように（３９）、３００Ｕ／ｍＬのＴＵＮＥＬ酵素（３００Ｕ／ｍＬ）および６μＭのビオチン化ｄＵＴＰ(Roche Diagnostics)を用いてTerminal deoxynucleodityl transferase mediated dUTP-biotin Nick End Labelling (TUNEL)を行った。
ｅ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
神経芽腫サンプルにおけるＮＴ−３およびＴｒｋＣ発現をアッセイするため、組織学的に定性された腫瘍生検（未熟神経芽細胞＞６０％）から、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡＩＩキット(Macherey-Nagel)を用いて全ＲＮＡを抽出し、２００ｎｇを、１ＵのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素(Invitrogen)、１ＵのＲＮアーゼ阻害剤(Roche Applied Science)および２５０ｎｇのランダムヘキサマー(Roche Applied Science)を用いて逆転写した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡＩＩキット(Macherey-Nagel)を用いてヒト細胞系統から全ＲＮＡを抽出し、１μｇを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット(BioRad)を用いて逆転写した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０装置(Roche)にて、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎ  Ｉキット(Roche)を用い、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、プライマー：ＴｒｋＣ：フォワード5’-AGCTCAACAGCCAGAACCTC-3’およびリバース5’-AACAGCGTTGTCACCCTCTC-3’、ＮＴ−３：フォワード5’-GAAACGCGATGTAAGGAAGC-3’およびリバース5’-CCAGCCCACGAGTTTATTGT-3’を用いて行った。神経芽腫において変動が最小の発現を示す遍在発現ヒトＨＰＲＴ遺伝子を内部対照として用いた（以下のプライマー：フォワード5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’およびリバース5’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’を使用）。三つのプライマー対全てについて、ポリメラーゼを９５℃で１０分間活性化した後、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒および７２℃で５秒の３５サイクルを行った。
ｆ）免疫組織化学および免疫ブロット
８×１０４個の細胞をカバーガラス上で細胞遠心し、４％ＰＦＡで固定した。次に、これらのスライドを室温で１時間、ヒトＮＴ−３を認識する抗体（１／３００、ＳＣ−５４７）とともにインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水ですすいだ後、これらのスライドをＡｌｅｘａ−４８８−ロバ抗ウサギ抗体(Molecular Probes)とともにインキュベートした。核をＨｏｅｃｈｓｔ染色(Sigma)で可視化した。
ＴｒｋＣ構築物の発現および内因性ＴｒｋＣ切断を、抗Ｔｒｋ抗体（ｓｃ−１１、Santa Cruz Biotechnology）を用いたウエスタンブロットにより測定し、従前に記載されているように（３６）、抗α−アクチン（１３Ｅ５、Cell Signaling）をローディング対照として用いた。２μｇ／ｍｌの抗ＴｒｋＣ抗体（R&D Systems  ＡＦ１４０４）、２０ｎＭのＬｙ２９４０２(Sigma)、１００  ｎＭのＵ０１２６(Sigma)または１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ３(Abcys)を含む血清不含培地で１６時間培養した後、ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞のホスホ−Ａｋｔおよびホスホ−Ｅｒｋレベルを、抗ホスホ−Ａｋｔ（４０５８、Cell Signaling）およびホスホ−Ｅｒｋ１＆Ｅｒｋ２（Ｅ７０２８、Sigma）を用いたウエスタンブロットにより測定した。
ｇ）ＮＢ進行および転移のニワトリモデル
４０μＬの完全培地に懸濁させた１０７個の神経芽腫細胞を１０日目（ｄａｙ  １０）のひな鳥漿尿膜（ＣＡＭ）に播種した。１１日目および１４日目に、２μｇの抗ＴｒｋＣ抗体または無関連のイソ型抗体（Santa Cruz Biotechnology  ｓｃ−１２９０）を腫瘍に注入した。ｓｉＲＮＡ処理としては、１１日目および１４日目に、３μｇのスクランブルＴｒｋＣまたはＮＴ−３  ｓｉＲＮＡを漿尿膜管に注入した。１７日目に、腫瘍を摘出し、面積を、Ａｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４．６ソフトウエアを用いて測定した。原発腫瘍に対するアポトーシスを測定するため、それらを４％ＰＦＡで固定した後、３０％スクロースで一晩処理することによって低温保護し、Ｃｒｙｏｍｏｕｎｔ(Histolab)に包埋した。腫瘍のクリオスタット切片(Roche Diagnostics)に対してＴＵＮＥＬ染色を行い、核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。転移性を評価するため、腫瘍担持胚から肺を採取し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅキット(Macherey Nagel)を用い、ゲノムＤＮＡを抽出した。転移性は、以下のプライマー：フォワード５’−ＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴ−３’およびリバース５’−ＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡ−３’を用いたヒトＡｌｕ配列のＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ検出によって定量した。ひな鳥グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）特異的プライマー：フォワード５’−ＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧ−３’、リバース５’−ＧＧＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＣＧ−３’を対照として用いた。両プライマー対とも、９５℃で２分間のポリメラーゼ活性化、次いで、９５℃で３０秒、６３℃で３０秒および７２℃で３０秒の３０サイクルにより、転移性浸潤を評価した。接種を行わなかったひな鳥胚の肺から抽出したゲノムＤＮＡを用いて閾値を求めた。
【００７０】
実施例１：ＴｒｋＣは依存性受容体である
本発明者らは、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫは、「ヒト胎児腎臓」を表す）または不死化嗅覚神経芽細胞１３．Ｓ．２４細胞で全長ラットＴｒｋＣを一時的に発現させた。ＴｒｋＣ発現は、これらの細胞がＴｒｋＣコード構築物［参考資料（ＳＩ）  図５ならびに図１Ａおよび１Ｆ］でトランスフェクトされた場合にのみ検出された。図１Ａに示されるように、細胞死誘導はＴｒｋＣの発現と関連があった。ＴｒｋＣ発現が（ｉ）カスパーゼ活性の上昇［細胞溶解液でのＤＥＶＤ−ＡＦＣ切断の測定（図１Ｂ）、抗活性カスパーゼ−３抗体で染色された細胞の定量（図１Ｃ）、または生細胞におけるＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋカスパーゼ基質の切断の測定（図１Ｄ）により決定される］および（ｉｉ）ＤＮＡ縮合の増加［抗一本鎖ＤＮＡ抗体で染色された細胞のパーセンテージ（ＳＩ  図５Ｂ）により測定］を誘導したことから、ＴｒｋＣにより誘導される細胞死はアポトーシスと定義された。このアポトーシスは、一般的なカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋまたはｂｏｃ−アスパルチル（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ）を加えた際に、ＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスを完全に阻害することから、カスパーゼ依存性である（図１Ｂ、データは示されていない）。興味深いことに、このような細胞死促進効果は、ＴｒｋＣの代わりにＴｒｋＡまたはＴｒｋＢが発現される場合には、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣが同等のレベルで細胞膜に与えられる場合であっても（ＳＩ  図５Ａ、データは示されていない）、見られない（図１Ｄ）。アポトーシスの誘導がＴｒｋＣの異常な自己活性化により引き起こされる可能性を排除するために、ＴｒｋＣ野生型の代わりにキナーゼデッド変異体であるＴｒｋＣ  Ｄ６７９Ｎを発現させた。ＮＴ−３に応答してＥｒｋまたはＡｋｔのリン酸化を誘導することができない（図４Ｃ参照）この変異体は、ＴｒｋＣ野生型と同等のアポトーシス誘導活性を示す（図１Ｄ）。よって、ＴｒｋＣ発現は、ＴｒｋＣキナーゼ活性により引き起こされるものではないアポトーシス細胞死を誘発する。
本発明者らは、次に、ＮＴ−３の存在がＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性に影響を及ぼすか否かを評価した。ＴｒｋＣにより媒介される細胞死［トリパンプルー排除アッセイ（図１Ｅ）、カスパーゼ活性（図１Ｆ）またはＤＮＡ縮合（ＳＩ  図５Ｃ）により測定］は、従来ＴｒｋＣの下流で正のシグナル伝達を誘発したＮＴ−３濃度の範囲内で用いたＮＴ−３により、用量依存的に阻害された［すなわち、ＡｋｔまたはＥｒｋのリン酸化により測定（図１Ｅ）］。ゆえに、ＮＴ−３はＴｒｋＣにより媒介されるアポトーシスを遮断する。さらに、この依存作用はラットＴｒｋＣに限定されず、ヒトＴｒｋＣもまた、ＮＴ−３が存在しなければ細胞死を誘発する（図１Ｇ）。これらのデータを考え合わせると、ＴｒｋＣが依存性受容体として働くことが示される。
【００７１】
実施例２：ＴｒｋＣ細胞内ドメインはカスパーゼにより切断される
ＴｒｋＣにより誘導される細胞死の分子機構を解明するために、本発明者らはさらにカスパーゼの関与を分析した。依存性受容体ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ、Ｐａｔｃｈｅｄ、およびＲＥＴは細胞死の誘導に事前のカスパーゼ切断を必要とすることが示されている（４、６〜８）。従って、本発明者らは、ＴｒｋＣの細胞内ドメインがカスパーゼにより切断可能か否かを分析した。ＴｒｋＣの細胞内領域は少なくとも３７２個のＣ末端アミノ酸を包含する。このドメインをインビトロで翻訳し、その産物を精製活性カスパーゼ−３またはカスパーゼ−８とともにインキュベートした。図２Ａは、ＴｒｋＣの細胞内ドメインはインビトロでカスパーゼ−３によって切断されるが、カスパーゼ−８によっては切断されないことを示す。同じ実験条件で、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＢ細胞内ドメインは、カスパーゼ−３によって有意に切断できなかった（図２Ａ）。ゆえに、ＴｒｋＣはインビトロでカスパーゼ、特に、カスパーゼ−３様カスパーゼによって切断される。活性カスパーゼ−３とともにインキュベートすると、見掛けの相対分子量１９、１５および６ｋＤａで移動する切断産物が検出されるが、このことは少なくとも二つの切断部位の存在を示唆する。これらのカスパーゼ切断部位を、好ましいＰ４およびＰ１’位（９）とカスパーゼ切断断片の見掛けの相対サイズに基づく変異体を構築することによりマッピングした。一方、ＴｒｋＣの細胞内ドメイン内の種々のアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基の突然変異はカスパーゼ−３切断に影響はなく、Ａｓｐ−６４１のＡｓｎへの突然変異は、１９および１５ｋＤａ断片の出現を完全に抑制した（図２Ｂ）。次に、もう一つのカスパーゼ部位は、二重変異体Ｄ６４１ＮおよびＤ４９５Ｎが完全にカスパーゼ−３切断耐性であったことから、Ａｓｐ−４９５に位置決定された（図２Ｂ）。よって、ＴｒｋＣは、Ａｓｐ−４９５およびＡｓｐ−６４１に位置する二つの部位でカスパーゼにより切断される。興味深いことに、これらのアスパラギン酸残基はひな鳥、ラット、マウスおよびヒトＴｒｋＣで保存されていることが明らかであるが、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＢに対応する位置が見つからなかった。ＴｒｋＣのＣ末端エピトープに対して作製された抗体を用い、ＴｒｋＣを発現する１３．Ｓ．２４細胞に対して免疫ブロットを行ったところ、細胞を一般的なカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（図２Ｃ）およびＢＡＦ（ＳＩ  図６Ａ）で処理した場合には検出できなかった二つのバンド（それぞれ３５および２０ｋＤａ前後）が明らかになった。ヒトＴｒｋＣを１３．Ｓ．２４細胞で発現させた場合にもこれらの同じ二つのバンドが見られた（ＳＩ  図６Ｃ）。さらに、Ｄ４９５Ｎの突然変異は３５ｋＤａ断片の出現を阻害し（Ｄ６４１Ｎの突然変異は２０ｋＤａバンドの非存在と関連している）、１３．Ｓ．２４細胞で発現された二重変異体はこれら二つの断片のいずれを示すこともできない（図２Ｃ）。よって、これら二つのバンドは、Ａｓｐ−４９５およびＡｓｐ−６４１においてＴｒｋＣの内因的カスパーゼ切断から生じる二つのＴｒｋＣ断片に相当する。興味深いことに、この二つの部位におけるカスパーゼ切断はＴｒｋ共受容体ｐ７５ｎｔｒの過剰発現によっては影響を受けない（��Ｉ  図６Ｄ）。ＴｒｋＣ切断カスパーゼの性質はまだ分かっていない。実際、インビトロでカスパーゼ−３がＴｒｋＣを切断するならば、おそらく細胞でＴｒｋＣを切断するのはカスパーゼ−３だけではなく、カスパーゼ−３阻害剤ＤＥＶＤ−ｆｍｋおよびカスパーゼ−３のドミナントネガティブ変異体の使用はどちらも、１３．Ｓ．２４細胞におけるＴｒｋＣのカスパーゼ依存性切断を遮断することができない（ＳＩ  図６Ａおよび６Ｂ）。カスパーゼによるＴｒｋＣの切断が自然に生じるか否かを測定するために、胚性マウス後根神経節（ＤＲＧ）を部分的に分離し、１０ｎｇ／ｍｌ  ＮＴ−３の存在下、またはカスパーゼ阻害剤ＢＡＦを伴ってもしくは伴わずにＴｒｋＣ阻止抗体の存在下で一晩維持した。通常の培養条件では２０ｋＤａのバンドが検出されたが、このＴｒｋＣ断片はＮＴ−３またはＢＡＦを伴った場合に消失したのに対し、阻止抗体が存在すると増強された（図２Ｄ）。これらのデータを考え合わせると、細胞不含条件、トランスフェクト細胞およびＤＲＧにおいて、ＴｒｋＣはカスパーゼによって切断されることが裏付けられる。
【００７２】
実施例３：ＴｒｋＣのカスパーゼ切断によりＴｒｋＣアポトーシス誘導ドメインが放出される
カスパーゼによるＴｒｋＣタンパク質の切断の機能的重要性を評価するために、本発明者らは、１３．Ｓ．２４細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞で全長ＴｒｋＣ  Ｄ６４１Ｎ変異体、ＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ変異体またはＴｒｋＣ  Ｄ６４１Ｎ／Ｄ４９５Ｎ二重変異体を発現させ、トリパンプルー排除アッセイおよびカスパーゼ活性またはＤＮＡ縮合の測定により細胞死を評価した（図３Ａ〜３Ｄ）。著しくは、カスパーゼ部位の突然変異は１箇所だけでも２箇所でも、ＴｒｋＣの発現レベルおよび血漿膜への局在に影響を及ぼさないが（図３Ａ、データは示されていない）、ＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性を阻害するには十分であった（図３Ｂ〜３Ｄ）。これらの結果を考え合わせると、ＴｒｋＣのカスパーゼ切断はＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性の前提条件であることが示唆される。本発明者らは、次に、この切断がアポトーシス誘導ドメイン（すなわち、依存性ドメイン）の放出または露出を可能とするか否かを調べた。ＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性を排除するにはＡｓｐ−４９５の後に位置する領域の欠失で十分であった（データは示されていない）。本発明者らは、次に、１３．Ｓ．２４細胞で完全な細胞内ドメイン、第二のカスパーゼ切断部位Ａｓｐ−６４１の後に位置する領域、または二つのカスパーゼ切断部位の間に含まれる断片を発現させた。図３Ｆおよび３Ｇに示されるように、Ａｓｐ−４９５とＡｓｐ−６４１の間に位置する断片の発現（図３Ｅ）はアポトーシスを誘発するのに十分であったが、６４２−８２５断片はアポトーシス誘導活性を示すことができなかった。興味深いことに、ＴｒｋＣ細胞内ドメインの発現はアポトーシスを誘導できず、全長ＴｒｋＣはアポトーシス誘導したが、このことはカスパーゼ切断とその後の細胞死誘導がトランスメンブランＴｒｋＣを必要とすることを示唆している（図３Ｆおよび３Ｇ）。さらに、２箇所のカスパーゼ切断から生じる断片（すなわちＴｒｋＣ ４９６−６４１）が細胞を死に至らせるのに対し、Ａｓｐ−４９５における１箇所のカスパーゼ切断から生じる断片（例えば、ＴｒｋＣ  ４９６−８２５）は細胞を死に至らせないという事実は、ＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性を排除するには１箇所のカスパーゼ切断部位の突然変異だけで十分であるという知見と合わせると、ＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスには両方でのカスパーゼ切断が必要であるという論点を裏付ける（図３Ｆ）。
【００７３】
この断片がさらなる生物学的状況下でアポトーシスを誘導するか否かを測定するために、本発明者らは、このＴｒｋＣの依存性ドメイン（ＴｒｋＣ  ４９６−６４１）の発現が一次ニューロンを発現するＴｒｋＣにおいてアポトーシスを誘導するか否かを分析した。本発明者らは、ＮＴ−３とともに５日間培養維持した胚性マウスＤＲＧニューロン、そして対照としてＮＴ−３欠損したものを分析した（図４も参照）。図３Ｈに示されるように、マイクロインジェクションによるこのドメインの発現はＮＴ−３で維持したＤＲＧニューロンでアポトーシスを誘導し、ゆえに、ＮＴ−３が与える生存シグナル伝達を上回る。ＮＴ−３がＤＲＧにおいてカスパーゼ依存性のＴｒｋＣ切断を阻害する（図２Ｄ）ということと考え合わせると、この知見は、非結合型のＴｒｋＣがカスパーゼにより切断され、その結果、ＴｒｋＣによるアポトーシス誘導性断片が放出されるという考察を裏付ける。放出された断片がどのようにアポトーシスを誘導するかはまだ分かっていない。しかしながら、興味深いことに、この断片の細胞死誘導は、別の依存性受容体であるＤＣＣによる細胞死誘導（６）と似ていることに着目される。実際、ＴＮＦまたはＦａｓにより誘導される細胞死を遮断することが知られているカスパーゼ−８のドミナントネガティブ変異体が発現しても、ＴｒｋＣ−４９６−６４１により誘導される細胞死を阻害することができなかった（図３Ｉ）ので、ＴｒｋＣ依存性ドメインにより誘導される１３．Ｓ．２４細胞の細胞死は細胞死受容体経路に依存していないことが明らかである。同様に、ＴｒｋＣ依存性ドメインにより誘導される細胞死は、別のイニシエーターカスパーゼ、カスパーゼ−２のドミナントネガティブ変異体によっては阻害されなかった（図３Ｉ）。これに対し、カスパーゼ−９ドミナントネガティブ変異体は、ＴｒｋＣ依存性ドメインにより誘導される細胞死を完全に阻害した（図３Ｉ）。カスパーゼ−９が必要であるということは、むしろミトコンドリアアポトーシス経路の関与を示唆した。さらに、Ｂｃｌ２が過剰発現した際に１３．Ｓ．２４細胞の細胞死の阻害は見られなかった（図３Ｉ）ことから、この放出ドメインはミトコンドリア依存性経路によっては死に至らないことが示唆される。この知見は、Ｂｃｌ−ＸＬ過剰発現がＮＴ−３の離脱と関連した培養ＤＲＧニューロンの死滅を遮断することができなかったという知見と一致している（L.-Y.Y. and U.A.,未発表データ）。しかしながら、この知見は、固有受容ニューロンの生存を示すＮＴ−３／Ｂａｘ二重ノックアウトマウスの表現型によっては裏付けられず、インビボではニューロン死の調節がもっと複雑であることが示唆される（１０）。ＴｒｋＣ依存性ドメインが細胞を死に至らせるのに用いているメカニズムに関する、インビボおよびインビトロでのより詳細な研究がまだ行われていないとしても、ＴｒｋＣにより誘導される細胞死が、（ｉ）カスパーゼによるＤＣＣ切断、（ｉｉ）アポトーシス誘導依存性ドメインの放出／露出、および（ｉｉｉ）このドメインとカスパーゼ−９との相互作用とカスパーゼ−９の活性化を必要とするＤＣＣにより誘導される細胞死（１１）と関連があるということは興味深い。しかしながら、ＴｒｋＣ��依存性ドメインがカスパーゼ−９を動員し、そのようなカスパーゼ活性化複合体を介してアポトーシスを活性化するか否かはまだ分かっていない。
【００７４】
実施例５：ＴｒｋＣの依存性受容体活性は感覚ニューロンの死滅の前提条件である
次に、本発明者らは、ここで記載するＴｒｋＣアポトーシス誘導活性がＮＴ−３離脱の後の一次ニューロンの死滅に何らかの関連を持つか否かを検討した。依存性受容体Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）でも見られたように、本発明者らはまず、変異型のＴｒｋＣ［すなわち、カスパーゼ部位Ｄ６４１に突然変異を有するＴｒｋＣの細胞内ドメイン（ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎ）］の発現が、全長ＴｒｋＣにより誘導される細胞死を完全に阻害することに気づいた（図４Ａおよび４Ｂ）。ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎの発現はＰｔｃまたはＢａｘにより誘導されるアポトーシスには影響を及ぼさなかった（データは示されていない）ことから、このドミナントネガティブ効果は特異的なものであった。よって、ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎは、ＴｒｋＣによるアポトーシス誘導活性に特異的なドミナントネガティブ変異体として働く。Ｄ６４１Ｎ突然変異は理論上、完全な受容体から細胞内領域が分離した際にＴｒｋＣキナーゼドメインの異所活性化をもたらし、その結果として増強された生存シグナル伝達がアポトーシスを回避する可能性もある。この可能性を排除するために、本発明者らはＴｒｋＣをトランスフェクトした１３．Ｓ．２４細胞においてＮＴ−３処理に応答したＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化を分析した。図４Ｃに示されるように、ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎドミナントネガティブ変異体が存在すると、ＮＴ−３の非存在下でもＥｒｋ／Ａｋｔの活性化を誘導しないし、ＮＴ−３依存性ＴｒｋＣにより媒介されるＥｒｋ／Ａｋｔの活性化に干渉もしない。よって、ＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎは、生存シグナル伝達の増強によって細胞死を回避するのではなく、代わりに、リガンドが離脱したＴｒｋＣにより活性化された細胞死シグナル伝達との干渉によって細胞死を回避する。
【００７５】
内因性のＴｒｋＣに対するＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎの抗アポトーシス効果を確認するために、本発明者らは胚性マウスからＤＲＧを分離し、ＮＴ−３の存在下で５日間、感覚ニューロンを培養した。対照ニューロンは、ＴｒｋＡを活性化するＮＧＦを用いて維持した。ＮＧＦまたはＮＴ−３いずれかの離脱は、７２時間後に数えると、約６０〜７０％のニューロンに死滅をもたらす。本発明者らは、ＮＴ−３またはＮＧＦで維持したニューロンをＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎまたはｍｏｃｋベクターのいずれかでマイクロインジェクションし、ＮＴ−３またはＮＧＦを除去した。図４Ｄに示されるように、ドミナントネガティブ変異体はＮＴ−３が欠損したニューロンの生存を劇的に高めたが、ＮＧＦが欠損したニューロンの死滅には影響を及ぼさなかった。興味深いことに、Ｄ６４１Ｎに突然変異のないＴｒｋＣの細胞内ドメインをコードする構築物をマイクロインジェクションしても、ＮＴ−３が欠損したニューロンの生存に影響を及ぼさなかった（図４Ｅ）。よって、ＮＴ−３が欠損したニューロンに対するＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎの抗アポトーシス作用は異所性ＴｒｋＣ細胞内ドメインの過剰発現によるものではなく、強制的なＴｒｋＣキナーゼ触媒活性を有する可能性がある。チロシンキナーゼドメインの役割を特異的に排除するために、本発明者らは、さらなるキナーゼ不活性化突然変異Ｄ６７９Ｎ（この突然変異は、ＮＴ−３に応答してＥｒｋまたはＡｋｔを活性化するＴｒｋＣの能力を無効にする、図４Ｃ参照）を持つＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎをマイクロインジェクションした。図４Ｅに示されるように、このキナーゼ不活性化突然変異は、ＮＴ−３が欠損したニューロンにおけるＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎの細胞死抑制活性を無効にし、このことは、ここにはチロシンキナーゼ触媒活性は関与しないことを示す。さらに、別の依存性受容体であるＲｅｔのドミナントネガティブ変異体（Ｒｅｔ  ＩＣ  Ｄ７０７Ｎ）を、ＮＴ−３が欠損した（またＮＧＦが欠損した）ニューロンにマイクロインジェクションしても細胞死を阻害できなかった（図４Ｅ）ことから、ＮＴ−３が欠損したニューロンに対するＴｒｋＣ  ＩＣ  Ｄ６４１Ｎの抗アポトーシス作用は受容体特異的である。ＮＴ−３欠如時に見られた細胞死が非結合型のＴｒｋＣの内因的アポトーシス誘導活性に関連しているか否かをさらに検討するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡのマイクロインジェクションにより内因性のＴｒｋＣを阻害し、異所性の野生型ＴｒｋＣまたは２箇所のカスパーゼ部位ＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１Ｎが突然変異したＴｒｋＣを発現させるという置換試験を行った。対照実験として、対照ｓｉＲＮＡをマイクロインジェクションしても、ＮＴ−３欠如時の一次ニューロンの死滅に有意な影響は無かった（データは示されていない）。さらに、図４Ｆに示されるように、対照の状況と同様に、内因性のＴｒｋＣを異所性のＴｒｋＣで置き換えることは、ＮＴ−３の欠如に応答した一次ニューロンの死滅に関連している。他方、内因性のＴｒｋＣをＴｒｋＣカスパーゼ傷害変異体で置換すると、ＮＴ−３離脱時の細胞死誘導が阻害された（図４Ｆ）。さらに、野生型ＴｒｋＣとＴｒｋＣ  Ｄ４９５Ｎ／Ｄ６４１ＮはＮＴ−���は非存在下または存在下で同様のＡｋｔ／Ｅｒｋリン酸化パターンを示す（図４Ｇ）ことから、この作用は、ＴｒｋＣ陽性シグナル伝達を有するカスパーゼ部位の突然変異の干渉によるものではない。これらのデータを考え合わせると、ＮＴ−３欠如時に見られる細胞死は生存シグナルの欠如のためだけでなく、非結合型のＴｒｋＣにより誘発される能動的な細胞死刺激のためでもあることが証明される。
【００７６】
考察
インビボにおいて、種々の発達段階で、多くのニューロンが生理学的に死に至り、このプロセスではニューロトロフィンとそれらの受容体が重要な役割を果たす。発達中の感覚神経節では、ＮＴ−３依存性ニューロンが過剰産生される。余分なニューロンは、プログラムされた細胞死の間にＮＴ−３欠乏により除去される。この線に沿って、マウスにおけるＮＴ−３の過剰発現はＤＲＧにおけるニューロンの数を増加させる（１２〜１４）。従来の考察では、これらのニューロンの死滅は、ニューロトロフィン受容体のキナーゼ活性化の欠如に起因する生存シグナル（すなわち、ＭＡＰＫおよび／またはＰＩ３Ｋ経路）の欠如によると提案されている。しかし、本発明者らの研究から、余分な、ＴｒｋＣを発現するＮＴ−３感受性ニューロンは、これらの生存シグナルの欠如のためだけでなく、本明細書に記載する非結合型のＴｒｋＣにより誘発されるアポトーシス誘導経路によっても死滅すると推測したくなる。この仮説に合う一つの興味深いヒントが、ニューロトロフィンおよびそれらの個々の受容体に対する種々のノックアウトマウスから得られたデータによって与えられる。実際、マウスにおけるＴｒｋＡまたはＮＧＦの不活性化は、出生時に同じ量の感覚ニューロン（すなわち、侵害受容ニューロン）の欠如をもたらす（１５）。同様に、ＴｒｋＢまたはＢＤＮＦのいずれかの不活性化は、同等の機械受容ニューロンの欠如をもたらす（１６、１７）。他方、ＴｒｋＣが無効となった新生児はＤＲＧニューロンの３０％の欠如を示し、ＮＴ−３−／−新生児は７０％の欠如を示す（１８、１９）。ニューロトロフィンがキナーゼ依存性のシグナル伝達によって正の方向にのみ働くという従来の考察に合う説明を探すことで論争が持ち上がり、現在、二つの仮説が提案されている。Farinasら（２０、２１）は、ＮＴ−３−／−マウスにおけるＤＲＧニューロンの損失の増大が、ＮＴ−３のＴｒｋＡおよびＴｒｋＢを介したシグナル伝達能により説明されることを示唆している（２０〜２２）。あるいは、Ernforsら（１７）は、この作用が、種々の部分集団が確立される前の神経節形成の初期に、大多数がＴｒｋＣを発現するニューロン前駆体の死滅によるものであることを提案している（２４）。さらに、ＴｒｋＣとＮＴ−３不活性化の間のこの矛盾に関する別の有力な説明は、ＴｒｋＣの独立受容体の側面に関連しているのかもしれない。実際、依存性受容体の共通の特徴として、依存性受容体のリガンドの不活性化は受容体の不活性化よりも、より著しい表現型と関連しているはずとの仮説が立てられている。この矛盾は依存性受容体ｎｅｏｇｅｎｉｎに関してさらに示されている（２５）。ＴｒｋＣの場合、ＴｒｋＣ変異型マウスで見られるニューロン死はＴｒｋＣの正の／キナーゼシグナル伝達の欠如の結果である可能性があり、ＮＴ−３変異体で見られるニューロン死は正の経路の欠如とＴｒｋＣの構成的アポトーシス誘導活性の双方の結果であると考えられる。もし二重ＮＴ−３／ＴｒｋＣ変異型マウスがＮＴ−３変異型マウスよりも重篤度の低い表現型を示せば、このような考察はそれ自体証明されるであろう。この可能性はさらに検討する必要がある。
【００７７】
生存シグナルの欠如および非結合型のＴｒｋＣにより誘発される能動的なアポトーシス誘導シグナルの相対的重要性を理解するにはさらなるインビボデータが必要であるのは明らかとしても、この研究は、神経栄養因子の欠如が生存シグナルの欠如に等しく、「不履行による死滅」をもたらすと仮定する神経栄養説にゆがみをもたらす。ゆえに、本発明者らは、単に生存シグナルの欠如だけでは生理学的なニューロン死を説明するのに十分でないことを提案する。神経栄養の支えが不十分な場合に「内在的なアポトーシス状態」を作り出すには、能動的なアポトーシス誘導活性もまた必要である。場合によっては、この能動的なアポトーシス誘導シグナルは、プロセシングを受けていないプロＮＧＦによるｐ７５ｎｔｒの刺激（２６、２７）、またはＦａｓリガンドのＦａｓ受容体への結合（２８）などの依存性受容体に依存しないメカニズムによって提供される。しかしながら、いくつかの場合では、本明細書でＮＴ−３依存性感覚ニューロンにおいて示したように、このようなアポトーシス誘導活性は非結合型の依存性受容体ＴｒｋＣにより媒介される可能性がある。
【００７８】
しかしながら、アポトーシス誘導性となるのにカスパーゼ切断を必要とするＴｒｋＣは、それ自体でアポトーシスを誘発するには不十分であり、むしろ、一次アポトーシス刺激の下流で増幅因子として働くということが立証できる。実際、どのようにして受容体がアポトーシスを誘発するとともに、それがアポトーシス誘導分子を作り出すために、アポトーシスのエフェクターであると考えられているカスパーゼによる切断を必要とするのだろう。一つの可能性は、このプロセスがカスパーゼでないプロテアーゼにより誘発された後、カスパーゼ切断により増大するということである。これらの受容体を介してカスパーゼ増幅ループを作り出すに十分なカスパーゼを局部的に活性化することによって細胞死経路を誘発するには、カスパーゼでないプロテアーゼによる数回の切断事象だけで十分であろう。あるいは、カスパーゼが非アポトーシス細胞では完全に不活性であり、アポトーシス誘導刺激時にのみ多大に活性化されることを示唆するこの新旧のドグマは誤っているかもしれない。最近の発見によれば、カスパーゼチモーゲンは若干のプロテアーゼ活性を示す（２９）が、細胞は活性カスパーゼの増幅を妨げる、ＩＡＰタンパク質などの内因性カスパーゼ阻害剤を発現することが示されている。同様に、細胞死誘導のない局部的なカスパーゼの活性化も現在記載されている（３０、３１）。よって、細胞死誘導はカスパーゼ誘発よりもむしろカスパーゼ増幅によって起こる可能性があり、このことは細胞運命の決定におけるカスパーゼ活性化／阻害の細胞制御の重要性の裏付けとなり、すなわち、細胞死誘導は低い／局部的なカスパーゼ活性化（すなわち、細胞分化のような細胞に対する「正の」インプットを有し得る）（３０）から高い／分布したカスパーゼ活性化へと移行する結果であると考えられる。従って、低い／局部的なカスパーゼ活性化と高い／分布したカスパーゼ活性化の間のバランスは、ＩＡＰなどの内因性カスパーゼ阻害剤により、また、依存性受容体ＴｒｋＣなどの内因性のカスパーゼ増幅因子によって調節される可能性がある。
【００７９】
興味深いことに、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＢにより余儀なくされる発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または１３．Ｓ．２４細胞のアポトーシス死を誘導することができなかった。さらに、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＢはインビトロでカスパーゼにより切断されない。よって、ＴｒｋＣは原型の依存性受容体であるが、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＢはそうではなく、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣのように近縁の受容体であっても、細胞生存／細胞死に関して全く異なる活性を獲得し得ることを示唆する。リガンドが結合した際に生存を誘導するだけの、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＢのような一面(mono-sided)受容体の他、ＴｒｋＣのような両面(two-sided)受容体は生存と死の両方を制御する。両面のＴｒｋＣ／ＮＴ−３対は神経系の発達中に重要な役割を果たすと推測したくなる。ＮＴ−３の結合時にＴｒｋＣにより活性化される正のシグナル伝達経路は細胞分化、増殖または生存に重要であるのに対し、ＮＴ−３の非存在下でＴｒｋＣにより誘発される負のシグナル伝達経路は胚発生および成体組織のホメオスタシスで正常なアポトーシスによる細胞の除去の一部であり得る。
【００８０】
ＴｒｋＣはまた腫瘍形成、特に髄芽細胞腫の形成にも関与している。特に、小児髄芽細胞腫によるＴｒｋＣの高い発現は有利な臨床転帰と関連があり、この効果はＴｒｋＣのアポトーシス誘発能と関連している可能性があると提案されている。実際、ＴｒｋＣの過剰発現はヌードマウスにおける髄芽細胞腫細胞系統の大脳内異種移植片の成長を阻害し、個々の腫瘍細胞によるＴｒｋＣ発現は一次髄芽細胞腫生検検体内のアポトーシスと高い相関がある（３２、３３）。これまで、この意味はそのリガンドＮＴ−３により活性化される受容体に関する従来の図式の下で考えられてきたとしても、髄芽細胞腫発生におけるＴｒｋＣの依存性受容体側の重要性を考えることには価値がある。さらに、ＴｒｋＣチロシンキナーゼ受容体を用いて本明細書で示されたデータ（おそらく他のいくつかのチロシンキナーゼ受容体にも適用できる）もまた、受容体のキナーゼ活性との干渉による生存経路の阻害に基づく一般的な抗癌戦略についての問題を浮上させる。本発明者らのデータによれば、キナーゼ活性の阻害は腫瘍細胞の死滅を効率的に誘発するには十分でないと思われる。よって、キナーゼ阻害とこれらのチロシンキナーゼ依存性受容体のアポトーシス誘導活性の刺激の両方に基づく同時処置が、これまでに見られている腫瘍耐性のいくつかを迂回し得る、より魅力があって効率的な治療戦略として浮かび上がる。
【００８１】
実施例６：ＮＴ−３／ＴｒｋＣ相互作用の阻害は神経芽腫細胞のアポトーシスを誘発し、原発腫瘍の成長および転移の阻害に関連する
実施例１〜５において、本発明者らは、ニューロトロフィン受容体ＴｒｋＣが依存性受容体であり、それ自体、そのリガンドであるニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）の非存在下でアポトーシス死を誘導することを示した。この活性はカスパーゼにより媒介される、ＴｒｋＣの細胞内ドメインの切断によるものであり、これによってアポトーシス誘導断片の放出が可能となる。依存性受容体は、リガンドの利用能の範囲を超えて、増殖または移動する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにより腫瘍サプレッサーとして働くと提案されている。そして、腫瘍細胞の選択的優位性は、受容体発現を消失させること（この線で、ＴｒｋＣ発現は神経芽腫（ＮＢ）の良好な予後と関連づけられている）またはリガンドの過剰発現を獲得することのいずれかである。本発明者らはここで、いくつかのＮＢにおいてＮＴ−３がアップレギュレーションされ得るか否かと、ＮＴ−３のこの自己分泌産生が腫瘍阻害を誘発するツールとして使用可能か否かを検討した。
【００８２】
１）方法
本発明者らは、２６のヒト神経芽腫生検のＴｒｋＣおよびＮＴ−３発現をＱ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、進行性および転移性の高いＮＢ（病期４）が最も高いＮ比（Ｔ３／ＴｒｋＣ）を示すことを見出した（図１０）。本発明者らは、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲに基づき、ＮＴ−３レベルの高い二つの細胞系統（ＣＬＢ−Ｖｏ１とＣＬＢ−Ｇｅ１）および対照として、一つのＮＴ−３陰性細胞系統（ＩＭＲ３２細胞）を選択し（図１１の左のパネル）、このタンパク質レベルをＮＴ−３免疫細胞化学により確認した（図１１の右のパネル）。本発明者らは、これらの細胞を、ＴｒｋＣ−ＮＴ３結合に拮抗するＮＴ−３抗体（ＡＦ１４０４）の存在下でインキュベートし、細胞死誘導をトリパンブルー排除およびカスパーゼ３活性化により測定した。本発明者らはまた、原発腫瘍の成長と転移を評価するために、ニワトリ胚における神経芽腫発生モデルを設定した。このモデルでは、本発明者らは腫瘍をＴｒｋＣ阻止抗体で処理した。このようにして、本発明者らは、そのリガンドともはら相互作用できない場合に、神経芽腫の制御機構としてのＴｒｋＣアポトーシス誘導活性を分析した。
【００８３】
２）結果
ＴｒｋＣは、ＴｒｋＣ阻止抗体の存在下でインキュベートした際のＮＴ−３発現神経芽腫細胞系統においてアポトーシスを誘導するが、ＮＴ−３陰性細胞に対する効果は持たない。同様の結果が病期４のＮＢを持つ患者から直接培養したＮＢでも得られた。また、予備的な結果が、抗体処置した際に原発腫瘍発生の軽減およびインビボにおける転移の阻害を示したが、対照抗体による処置では効果は見られなかった。
【００８４】
実施例７：進行性神経芽腫の大部分でＮＴ−３が発現する
本発明者らは、ＮＴ−３およびその受容体ＴｒｋＣの発現レベルの比較において特別な関心を持って病期４のＮＢの着目した。本発明者らは、まず、１０６の病期４  ＮＢ腫瘍のパネルにおいてＮＴ−３およびＴｒｋＣの発現をＱ−ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＮＴ−３は相当な割合の病期４のＮＢでアップレギュレートされている（図１６Ａおよび図ｌ７）。３８％の腫瘍が、ＮＴ−３発現に中央値に比べて少なくとも２倍の増加を示し、２０％を超えるものが５倍の増加を示した（図１６Ａの上のグラフ）。ＮＴ−３レベルの高い腫瘍は高い比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）を示し、腫瘍におけるＮＴ−３の獲得という見方を裏付けている（図１６Ａの下のグラフ）。ＮＴ−３レベルを予後および病期４  ＮＢの異なるサブカテゴリー、すなわち、病期４Ｓ（１歳未満またはそれ以降に診断された病期４）と比較しても有意な差は見られず、ＮＴ−３のアップレギュレーションは病期４のＮＢの大部分において腫瘍の進行性と転移性とは独立に起こる選択的獲得であることが示唆される。同様の結果が、病期１、２または３のＮＢでも得られた（図１７）。ＮＴ−３の発現はｍＲＮＡレベルで検出されただけでなく、タンパク質レベルでも免疫組織化学により検出された（図１６Ｂ）。ＮＴ−３の過剰発現は病期４のＮＢの３８％に見られたが、主として病期４のＮＢ腫瘍材料に由来するＮＢ細胞系統の一部にも見られた（図１６Ｃ）。三つのヒトＮＢ細胞系統、すなわち、ＣＬＢ−Ｇｅ２、ＣＬＢ−Ｖｏ１ＭｏおよびＩＭＲ３２をさらに研究した。メッセンジャーレベル（図１６Ｃ）およびタンパク質レベル（図１６Ｄ）の双方において、三つの細胞系統は総てＴｒｋＣを発現するが（データは示されていない）、ＣＬＢ−Ｇｅ２と、ＣＬＢ−Ｖｏ１Ｍｏとは高レベルのＮＴ−３を発現するのに対し、ＩＭＲ３２細胞ではＮＴ−３がかろうじて検出された。興味深いことに、細胞の透過処理をせずにＣＬＢ−Ｇｅ２細胞でＮＴ−３免疫染色を行ったところ、明らかな膜染色が示され、進行性のＮＢで見られた高いＮＴ−３含量がＮＢ細胞におけるＮＴ−３の自己分泌発現と関連していることを示唆する。
【００８５】
実施例８：神経芽腫におけるＮＴ−３の発現は生存選択的に優位である
依存性受容体のパラダイムから予測されるように、ＣＬＢ−Ｇｅ２およびＣＬＢ−Ｖｏ１Ｍｏ細胞で見られるＮＴ−３の自己分泌発現が腫瘍細胞の生存に選択的優位性を与えるか否かを検討するために、この自己分泌ループの破壊に応答した細胞死を分析した。第一のアプローチとして、ＮＴ−３をＲＮＡ干渉によりダウンレギュレーションした。ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞のＮＴ−３  ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、免疫組織化学により見られるように、ＮＴ−３タンパク質の有意な現象に関連していた（図１８Ａ）。カスパーゼ活性アッセイ（図１８Ｂ）またはＴｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイ（図１８Ｃ）により測定した際、スクランブルしたｓｉＲＮＡはＩＭＲ３２およびＣＬＢ−Ｇｅ２細胞の製造に影響を及ぼさなかったが、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡトランスフェクションはＣＬＢ−Ｇｅ２細胞死と関連していた（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。これに対し、ＩＭＲ３２細胞の生存は、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡの処置後も影響を受けなかった（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
【００８６】
第二のアプローチとして、本発明者らは、ＮＴ−３が内因性のＴｒｋＣと結合しないようにするために、従前に記載されている阻止ＴｒｋＣ抗体(Tauszig-Delamasureら, 2007)を用いた。図１８Ｄおよび１８Ｅに示されるように、カスパーゼ−３活性アッセイ（図１８Ｄ）およびＴＵＮＥＬ染色（図１８Ｅ）により測定した際、抗ＴｒｋＣの添加はＣＬＢ−Ｇｅ２およびＣＬＢ−Ｖｏ１Ｍｏのアポトーシス細胞死を誘発した。この抗ＴｒｋＣ抗体はＩＭＲ３２細胞に対しては効果が無かったので、この効果はＮＴ−３／ＴｒｋＣの阻害に特異的であった。阻止ＴｒｋＣ抗体を用いる代わりに、ＮＴ−３の捕捉にＴｒｋＣの組換えエクトドメインを用いた場合にも、同様のＣＬＢ−Ｇｅ２細胞死誘導が見られた（図１９Ａ）。ＴｒｋＣ／ＮＴ−３の相互作用の阻害に関連したＮＢ細胞死が新鮮な腫瘍にも拡張可能か否かを調べるため、腫瘍および浸潤を受けた対応する骨髄の外科生検を部分的に分離し、さらに抗ＴｒｋＣ抗体とともにインキュベートした。この原発腫瘍および転移新生物はＮＴ−３とＴｒｋＣの双方を発現し（図１９Ｂ）、抗ＴｒｋＣ抗体に応答した細胞死の増加（カスパーゼの活性化により測定される）が検出された（図１８Ｆ）。
【００８７】
実施例９：ＮＴ−３／ＴｒｋＣ相互作用への干渉はＴｒｋＣ媒介性の細胞死を誘発する
ＮＴ−３／ＴｒｋＣ相互作用への干渉に関連した細胞死を理解するには二つの異なる筋道がある。従来の神経栄養説によれば、観察された細胞死は、ＮＴ−３／ＴｒｋＣの相互作用、すなわち、ＴｒｋＣのキナーゼ活性を介して活性化されるＭＡＰＫまたはＰＩ３Ｋ経路により誘発される生存シグナルの欠如に起因する「不履行」による死であり得る。依存性受容体の概念は、また違った、ＴｒｋＣの発現が通常、良好な予後因子であるという事実により適合する見方を与える。このシナリオでは、ＮＴ−３とＴｒｋＣ間の相互作用の遮断は、アポトーシスを能動的に誘発する非結合型のＴｒｋＣをもたらす。これら二つの可能性の選択を行うための第一のアプローチとして、ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞をＴｒｋＣのドミナントネガティブ変異体でトランスフェクトした後に抗ＴｒｋＣ抗体の処置によってＮＢ細胞死を誘発した。このドミナントネガティブ変異体ＴｒｋＣ−ＩＣ  Ｄ６４１Ｎは、そのキナーゼ依存性のシグナル伝達に影響を及ぼすことなく非結合型ＴｒｋＣのアポトーシス誘導シグナル伝達を特異的に阻害することが分かっている（３６）。このドミナントネガティブ変異体の発現は抗ＴｒｋＣにより媒介されるＣＬＢ−Ｇｅ２細胞死を完全に阻止する（図２０Ａおよび図２１Ａ）。この知見をさらに裏付けるため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡによってＴｒｋＣがダウンレギュレーションされた状態で、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡに関連したＣＬＢ−Ｇｅ２細胞死の程度を評価した。図２１Ｂおよび２１Ｃに示されるように、ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞におけるＴｒｋＣのダウンレギュレーションは、従来からの生存シグナル伝達経路の欠如によって予測されるように、細胞死との関連はなく、このダウンレギュレーションはＮＴ−３  ｓｉＲＮＡにより誘導される細胞死を完全に阻止し、従って、ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞で見られるＮＴ−３のアップレギュレーションは、ＴｒｋＣそれ自体により誘発されるアポトーシス誘導シグナル伝達を阻害することが証明される。この線に沿えば、ここでＥＲＫまたはＡｋｔのリン酸化の測定（図２１Ｄ）により例示されるように、ＣＬＢ−Ｇｅ２に阻止ＴｒｋＣ抗体を加えても従来の生存経路の低下には関連しない。さらに、ＴｒｋＣカスパーゼ切断はＴｒｋＣ阻止抗体によって増強される（図２１Ｅ）。実際、従前に記載されているように、ＴｒｋＣおよび依存性受容体は一般にカスパーゼにより切断され、この切断はそれらのアポトーシス誘導活性の前提条件である（３６、３７）。図２１Ｅに示されるように、対照条件でも基礎レベルのＴｒｋＣ切断が検出されるが、阻止抗体の添加はＴｒｋＣ切断の増加と関連しており、この切断は一般的かつ強力なカスパーゼ阻害剤ＢＡＦの添加により阻止される。これらのデータを考え合わせると、ＮＢ細胞に見られるＮＴ−３のアップレギュレーションは依存性受容体ＴｒｋＣにより誘発されるアポトーシス誘導シグナル伝達を阻害することが証明される。興味深いことに、ｗｈｉｌｅ  ＣＬＢ−Ｇｅ２細胞はＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスを阻害するためにＮＴ−３のアップレギュレーションを選択したが、ＩＭＲ３２細胞はＮＴ−３を発現せず、なお、進行性のＮＢに由来している。よって、本発明者らは、依存性受容体の仮説から予���されるように、ＩＭＲ３２細胞が違った手段によってＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスに対する耐性を選択しているのか否かを調べた。図２２Ｂに示されるように、一般的細胞死インデューサーであるＢａｘの一時的トランスフェクションはＩＭＲ３２のアポトーシスと関連しているが、ＴｒｋＣの一時的トランスフェクションではＩＭＲ３２細胞死を誘発できなかった。よって、ＮＢの大部分はＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスを回避するためにＮＴ−３をアップレギュレートしていたが、他のＮＢ細胞は、ＴｒｋＣ細胞死シグナル伝達の不活性化を含む他の手段によってこの細胞死経路を逆に選択していた。
【００８８】
実施例１０：ＮＴ−３／ＴｒｋＣ相互作用への干渉はＮＢの予後および転移を阻害する
本発明者らは、次に、ＮＴ−３発現の高いＮＢ細胞においてインビボにおけるＮＴ−３／ＴｒｋＣへの干渉を用いてＮＢの予後および転移を限定／阻害することができるか否かを評価した。１０日齢のひな鳥胚の漿尿膜（ＣＡＭ）におけるＮＢ細胞の移植が、原発部位（すなわちＣＡＭ内）での腫瘍成長ならびに二次部位での腫瘍浸潤および転移（すなわち肺への転移）の双方を再現するニワトリモデルが開発されている（３８、図１５Ａ）。第一のアプローチでは、ＣＬＢ−Ｇｅ２またはＩＭＲ３２細胞を１０日齢のＣＡＭに付加し、これらの胚を１１日目と１４日目に抗ＴｒｋＣまたは無関連の抗体で処置した。その後、１７日齢のひな鳥の原発腫瘍成長および肺への転移を分析した。図１５Ｂおよび１５Ｄに示されるように、抗ＴｒｋＣ抗体による処置は、特にＣＬＢ−Ｇｅ２移植ＣＡＭで原発腫瘍の大きさを有意に小さくしたが、無関連のイソ型抗体は影響を及ぼさなかった。この大きさの減退は、抗ＴｒｋＣで処置した腫瘍におけるＴＵＮＥＬ染色の増強により示されるように（図１５Ｃ）、腫瘍細胞のアポトーシスの増加と関連していた。さらに重要なことには、〜図１５Ｅに示されるように、抗ＴｒｋＣはＣＬＢ−Ｇｅ２移植胚における肺転移形成も軽減した（ＩＭＲ３２移植胚ではそうではない）。
【００８９】
見られた抗腫瘍効果が特にＮＴ−３とＴｒｋＣの相互作用の阻害によるものか否かを分析するため、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡの静注を繰り返した際のＣＬＢ−Ｇｅ２移植ＣＡＭの原発腫瘍成長を分析した。図１５Ｆに示されるように、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡ注射は、スクランブルｓｉＲＮＡに比べて原発腫瘍の大きさを有意に小さくした。興味深いことに、ＮＴ−３  ｓｉＲＮＡの代わりにＴｒｋＣ  ｓｉＲＮＡを用いた場合には、スクランブルｓｉＲＮＡを超える有意な変化は見られなかった。この結果は、ＮＴ−３結合の回避またはＮＴ−３の阻害のいずれかの後に見られる腫瘍退縮効果が、従来の細胞内の生存促進シグナル伝達の欠如の結果とは対照的に、非結合型のＴｒｋＣにより媒介される能動的な細胞死シグナル伝達によるものであるという見方を強めるものである。
【００９０】
実施例１１：転移性乳癌ではＮＴ−３が過剰発現される（図２２参照）
図２２は、転移性乳癌の５８％でＮＴ−３が過剰発現することを示す。
依存性受容体ＴｒｋＣは、ＮＢ細胞の生存能および浸潤能を調節する条件付き腫瘍サプレッサーとして働く。この能力は特に、リガンドの利用能に応じてアポトーシスを誘導する。本発明者らは、予後の悪いＮＢで、癌細胞に選択的優位性を与え得る高い比（ＮＴ−３：ＴｒｋＣ）の発現を見出した（これにより癌細胞はＴｒｋＣにより誘導されるアポトーシスを回避できる）。ＮＢは最も多い小児固形腫瘍の一つでなりながら、分子的基礎はほとんど理解されておらず、そのヘテロ性のために依然として治療は外科術と化学療法によっている。ＮＴ−３の結合を阻止することによりＮＴ−３またはＴｒｋＣをターゲティングすれば、予後の悪いＮＢ、特に、比（ＮＴ−３：ＴｒｋＣ）の高いＮＢに代替／補助療法がもたらされる。
これらの結果はまた、ＴｒｋＣ−ＮＴ３結合に拮抗し得る化合物が、細胞、特に神経芽腫におけるＴｒｋＣ／ＮＴ−３受容体／リガンド対のアポトーシス活性の変化に起因する癌、特に神経芽腫を治療および／または予防するための薬剤の可能性のある薬剤として使用できることを証明する。ＴｒｋＣ−ＮＴ３に拮抗するこれらの化合物はこれらの癌細胞のアポトーシス死を誘導する。
【００９１】
これらのデータを総て考え合わせると、一部のＮＢは高い比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）に関連したＮＴ−３の自己分泌産生を示すという見方が裏付けられる。この高い比（ＮＴ−３／ＴｒｋＣ）が、ＮＴ−３が制限された／存在しない状況で癌細胞により獲得される選択的優位性を与える可能性がある。
【００９２】
ここで、本発明者らは、自己分泌ＮＴ−３発現が大多数の腫瘍細胞が、ＮＴ−３濃度が制限された領域で起こると考えられるＴｒｋＣ誘導型の細胞死を迂回するために発達させたメカニズムである。興味深いことに、このＮＴ−３の存在に対する依存性はＴｒｋＣに特異的であると思われ、この依存性を低下させるにはＴｒｋＣのドミナントネガティブで十分である（図２０Ａ）ので、他のＴｒｋ受容体、すなわち、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＢは関与しない。結論として、ＮＴ−３の高い発現は、ＮＴ−３／ＴｒｋＣの相互作用の破壊による細胞死誘導に基づく処置に応答し得ると推定されるＮＢ患者の新たなマーカーとなる。
【００９３】
ＮＴ−３を発現する腫瘍細胞に対する阻止抗体のインビトロ細胞死効果と、インビボ抗腫瘍効果とは、このような治療アプローチに応答し得る癌のより大きなスクリーンを呼ぶ。よって、これらの結果から、ＮＴ−３またはＴｒｋＣのいずれかを阻止することによりＮＴ−３およびその依存性受容体ＴｒｋＣの間の相互作用を阻害することに基づく処置が、第一処置として、または標準化学療法と併用して、ＮＴ−３レベルの高い進行性のＮＢに罹患している患者の大多数に利益をもたらすことは明らかである。
【００９４】
参考文献
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2015092170.tif 000003
2015092170.tif 000004
【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月14日(2015.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の予防または治療用の化合物の選択方法であって、前記の予防または治療される癌が、腫瘍細胞がニューロトロフィン３を発現もしくは過剰発現するか、または高い比（ニューロトロフィン３／ＴｒｋＣ受容体）を発現する癌である、以下の工程を含んでなる、方法：
ａ）ニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片とを含む培地を取得する工程（ここで、該ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片とは、ともに特異的に相互作用して結合対を形成することができる）、
ｂ）該培地と、供試化合物とを接触させる工程、
ｃ）ニューロトロフィン３またはその断片と、該ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用の阻害を測定する工程、および
ｄ）工程ｃ）の測定が、該化合物の存在下でニューロトロフィン３またはその断片と、ＴｒｋＣ受容体またはその断片との間の相互作用に有意な阻害を示す場合に、その化合物を選択する工程。
【請求項２】
前記の予防または治療される癌が乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の予防または治療される癌が、転移性乳癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記の予防または治療される癌が転移性癌または進行性癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記の予防または治療される癌が、予後の悪い癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）において、前記ＴｒｋＣ受容体はヒトＴｒｋＣ受容体またはその断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）において、前記ＴｒｋＣ受容体は、少なくともＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインを含む断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外断片がヒトＴｒｋＣまたは１９９５年７月２７日付けのＧｅｎｂａｎｋ  Ａ．Ｎ．ＡＡＢ３３１１１に示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、その天然変異体の最初の４２９個のアミノ酸残基を含むＮ末端断片を少なくとも含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）において、前記培地が、それらの表面膜で、内因性のＴｒｋＣ受容体または組換え型のＴｒｋＣ受容体を発現する細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）において、前記培地が、それらの表面膜で、少なくとも組換え型のＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインを発現する細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）において、前記培地が組換え型のＴｒｋＣ受容体を発現する細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）において、前記培地が、前記ＴｒｋＣ受容体をそれらの膜表面で内因的に発現し、かつニューロトロフィン３を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含み、ならびに工程ｃ）において、供試化合物の存在下でのニューロトロフィン３と、そのＴｒｋＣ受容体との間の相互作用の阻害が、その供試化合物の存在により誘導されるアポトーシスまたは細胞死により測定される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
原発腫瘍を有する患者において、原発腫瘍細胞を含む該患者の生検から、転移性癌、進行性癌または予後の悪い癌の存在を予測するためのインビトロ法であって、以下の工程を含んでなる、方法：
（ａ）該生検におけるニューロトロフィン３発現レベルまたは該生検における、ニューロトロフィン３発現レベルと、ＴｒｋＣ受容体発現レベルとの比を測定する工程、
ここで、非転移性原発腫瘍生検または非進行性癌生検におけるニューロトロフィン３の発現に比べて、前記生検におけるニューロトロフィン３発現レベルの増加が、転移性癌または進行性癌の存在を示す。
【請求項１４】
供試生検と、非転移性参照生検との間のニューロトロフィン３発現の比が２を超えることが、転移性癌の存在を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌が乳癌である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者に対する抗癌処置の有効性をインビトロで判定するため、またはＮＴ−３：ＴｒｋＣ結合の阻害に基づいて特定の抗癌処置に応答し得る患者のインビトロでの選択方法であって、以下の工程を含んでなる、方法：
（ａ）事前に得られた該患者からの原発腫瘍生検における、ニューロトロフィン３発現レベルを測定する工程（ここで、該抗癌処置の有効性は該生検において測定されたニューロトロフィン３発現レベルの量の低下と相関しているか、または選択された該特定の抗癌処置に応答し得る患者が、処置前にそれらの生検で測定されたニューロトロフィン３発現レベルの量が対照患者のニューロトロフィン３発現レベルの量を有意に超え、かつ場合により、ニューロトロフィン３発現レベルが該特定の処置後に低下した患者である）。
【請求項１７】
原発腫瘍が、ＮＴ−３を過剰発現するか、または高い比（ＮＴ３：ＴｒｋＣ）を示す癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌が乳癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
測定されるニューロトロフィン３発現産物が、ニューロトロフィン３をコードするＲＮＡである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
測定されるニューロトロフィン３発現産物が、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ法により測定される、ニューロトロフィン３をコードするＲＮＡである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
測定されるニューロトロフィン３の発現レベルが、ニューロトロフィン３タンパク質レベルの測定である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
測定されるニューロトロフィン３の発現レベルが、前記ニューロトロフィン３タンパク質を特異的に認識することができる特異的抗体を用いた方法によるニューロトロフィン３タンパク質レベルの測定である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
下記からなる群から選択される化合物を含む、腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する癌の処置に使用するための薬剤：
ニューロトロフィン３と、ＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができるＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片、またはニューロトロフィン３と結合することができるＴｒｋＣの細胞外ドメインを少なくとも含んでなる可溶型ＴｒｋＣ受容体を含む化合物、
特異的にニューロトロフィン３またはＴｒｋＣ受容体に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
細胞内でＮＴ３の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸。
【請求項２４】
下記からなる群から選択される化合物を含む、腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する癌の処置に使用するための薬剤：
ニューロトロフィン３と、ＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができるＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片、またはニューロトロフィン３と結合することができるＴｒｋＣの細胞外ドメインを少なくとも含んでなる可溶型ＴｒｋＣ受容体を含む化合物、
ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるニューロトロフィン３断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
細胞内でＮＴ３の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸。
【請求項２５】
下記からなる群から選択される化合物を含む、腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する癌の処置に使用するための薬剤：
ニューロトロフィン３と、ＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができるＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片、またはニューロトロフィン３と結合することができるＴｒｋＣの細胞外ドメインを少なくとも含んでなる可溶型ＴｒｋＣ受容体を含む化合物、
特異的にニューロトロフィン３またはＴｒｋＣ受容体に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
インビボで、細胞内でＮＴ３の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸。
【請求項２６】
下記からなる群から選択される化合物を含む、腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する癌の処置に使用するための薬剤：
ニューロトロフィン３と、ＴｒｋＣ受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができるＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片、またはニューロトロフィン３と結合することができるＴｒｋＣの細胞外ドメインを少なくとも含んでなる可溶型ＴｒｋＣ受容体を含む化合物、
ＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたはＴｒｋＣ受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるニューロトロフィン３断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
インビボで、細胞内でＮＴ３の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）核酸。
【請求項２７】
腫瘍細胞によりニューロトロフィン３を過剰発現する癌が乳癌である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の薬剤。
【外国語明細書】
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