(57)【要約】      （修正有）【課題】任意の原核生物において、生体内で又は生体外でタンパク質をＯ−グリコシル化する方法の提供。【解決手段】原核生物に少なくともＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、及びＯ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子を含むＤＮＡを所望の順序で導入するステップを含み、前記原核生物において、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素はグリカンとタンパク質との共有結合を促進して、Ｏ−グリコシル化タンパク質を生成する方法。【効果】この方法は、様々な疾患の治療のための新しいワクチン及び治療薬をデザインして生産するためのアプローチを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物に、少なくとも
（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、および（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子を含むＤＮＡを所望の順序で導入するステップを含み、
前記原核生物において、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がグリカンとタンパク質との共有結合を促進する、Ｏ−グリコシル化タンパク質の製造方法。
【請求項２】
脂質キャリア上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡを導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）中でｐｇｌＬまたはその相同体によって発現されるタンパク質によってもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｉｌＥを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成する遺伝子がｐｇｌＬまたはその相同体であり、Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子がｐｉｌＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
グリカンが多糖類である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
グリカンが還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子が、グリコシル基転移酵素、またはグリカンのアセンブルおよび輸送に必要な酵素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
原核生物に、少なくとも
（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するｐｇｌＬを含むＤＮＡ、（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するｐｉｌＥを含むＤＮＡ、および（ｃ）脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡを所望の順序で導入するステップを含み、
前記原核生物において、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がグリカンとタンパク質との共有結合を促進してＯ−グリコシル化タンパク質を製造する、グリカンによるＯ−グリコシル化タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
ｐｇｌＬを含むＤＮＡが、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｇｌＬまたはその相同体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｐｉｌＥを含むＤＮＡが、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｉｌＥである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
グリカンが多糖類である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
グリカンが還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子がグリコシル基転移酵素またはグリカンのアセンブルおよび輸送に必要な酵素を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
原核生物と、当該原核生物中に存在する少なくとも以下の構成要素、
（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するＤＮＡ、
（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するＤＮＡ、および
（ｃ）脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡ
とを含み、
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がグリカンとタンパク質との共有結合を促進する、Ｏ−グリコシル化タンパク質の製造システム。
【請求項２２】
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するＤＮＡがｐｇｌＬまたはその相同体であり、Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するＤＮＡがｐｉｌＥである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
グリカンが多糖類である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２６】
グリカンが還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２７】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２８】
遺伝子がグリコシル基転移酵素またはグリカンのアセンブルおよび輸送に必要な酵素を含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２９】
原核生物と、当該原核生物中に存在する少なくとも以下の構成要素、
（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するｐｇｌＬを含むＤＮＡ、
（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するｐｉｌＥを含むＤＮＡ、および
（ｃ）脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡ
とを含み、
オリゴ糖転移酵素がグリカンとタンパク質との共有結合を促進する、Ｏ−グリコシル化タンパク質の製造システム。
【請求項３０】
ｐｇｌＬを含むＤＮＡがナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｇｌＬまたはその相同体である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
ｐｉｌＥを含むＤＮＡがナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｉｌＥである、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３２】
原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３３】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３４】
グリカンが多糖類である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３５】
グリカンが還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３６】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３７】
遺伝子がグリコシル基転移酵素またはグリカンのアセンブルおよび輸送に必要な酵素を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３８】
（ａ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質、および（ｂ）脂質担体に結合したグリカンをＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素の存在下で反応させるステップを含み、
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がグリカンを脂質担体からタンパク質に転移する、Ｏ−グリコシル化タンパク質の製造方法。
【請求項３９】
グリコシル化されるタンパク質がＰｉｌＥであり、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がＰｇｌＬである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
グリコシル化されるタンパク質、および脂質担体に結合したグリカン、およびオリゴ糖転移酵素の双方が、原核生物のブロス培養物から単離されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）ｐｉｌＥの発現産物であるＰｉｌＥタンパク質、および（ｂ）脂質担体に結合したグリカンをｐｇｌＬの発現産物であるオリゴ糖転移酵素の存在下で反応させるステップを含み、
オリゴ糖転移酵素がグリカンを脂質担体からタンパク質に転移する、Ｏ−グリコシル化タンパク質の製造方法。
【請求項４５】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
グリコシル化されるタンパク質、脂質担体に結合したグリカン、およびオリゴ糖転移酵素の双方が、原核生物のブロス培養物から単離されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法およびシステムによって製造されるＯ−グリコシル化タンパク質を含むワクチン。
【請求項４８】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法およびシステムによって製造されるＯ−グリコシル化タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項４９】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法およびシステムによってＯ−グリコシル化タンパク質を製造するためのＰｇｌＬタンパク質およびＰｉｌＥタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２００６年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／８７２，４０３号明細書の優先権を主張する。この出願は参照によってその教示の全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明はタンパク質グリコシル化の分野、より具体的には原核生物におけるタンパク質のＯ−グリコシル化方法およびそのシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質のグリコシル化は、生物の基本的な過程である。グリコシル化の発生頻度の分析により、自然界の全タンパク質の過半数が最終的には糖タンパク質であろうことが予測されている。これらの付加炭水化物なしでは、多くのタンパク質機能が異常となる。複合糖質は、細胞接触を通じた細胞間情報伝達、転移（身体中の癌細胞拡散）、ウィルスおよび細菌の接着、および細胞への毒素結合に関与する。炭水化物生物学の役割に関わる理解は、基礎衛生研究および製薬産業にとって重要である。
【０００４】
組み換え糖タンパク質は、今日の生物工学薬品における有効成分化合物の主要な部分を占めている。治療用糖タンパク質の例としては、組み換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）、β−インターフェロン、および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が挙げられる。生物学的機能が通常タンパク質構成要素によって定まるのに対し、炭水化物は、分子安定性、血清半減期、溶解性、生体内活性、免疫原性など、多くのタンパク質特性に影響しうる。例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞中で産生されるｈＨｕＥＰＯは、慢性腎不全、ＨＩＶ感染症及びある種の癌に付随する貧血をはじめとする、多数の類型の貧血を治療するために臨床で使用されている。ｒＨｕＥＰＯは、末端糖としてシアル酸を含有する数個のオリゴ糖鎖を含有する。ｒＨｕＥＰＯからシアル酸残基を除去すると、迅速なクリアランスのために、生体内で実質的にｒＨｕＥＰＯが不活性になる。この例は、組み換え糖タンパク質が生物学的活性を示すためには、炭水化物が規定の構造およびパターンを有することが重要であることを示している。
【０００５】
これまでに、組み換え糖タンパク質を発現させるために、哺乳類、昆虫、および酵母細胞が使用されている。これらの細胞は、全てタンパク質をグリコシル化する能力を有するが、それらはヒト細胞とは異なるグリコシル化パターンを示す。タンパク質グリコシル化は真核細胞における必須過程であり、非常に複雑な糖修飾が異なる細胞区画内で起きるので、高等生物におけるタンパク質グリコシル化の操作は非常に困難である。したがって、これらの種類の細胞を使用すると、異なる炭水化物構造およびパターンを有する糖タンパク質が生成されることが多く、上述のような重大な特性変化が起こりうる。これらの異なる炭水化物構造およびパターンは、実際、完全に不活性であり治療薬の生産に役に立たない組み換え糖タンパク質の生成につながりうる。したがって、生体内および生体外の双方で、特定の炭水化物構造およびパターンを有する組み換え糖タンパク質を製造するのに使用できる方法およびシステムに対する必要性がある。
【０００６】
最近まで糖タンパク質は、真核細胞だけの特徴であると考えられていた。タンパク質グリコシル化は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）では自然には起きないが、その他の細菌においては一般的な現象である。細菌はそれらのグリコシル化システムの操作に耐えることができ、したがって糖鎖工学のための完璧なツールボックスを構成する。
【０００７】
タンパク質グリコシル化は、（ｉ）グリカンのアセンブル、および（ｉｉ）タンパク質へのグリカン付着の２つの主要ステップからなる。ほとんどの場合、複数のグリカンはそれぞれ異なるグリコシル基転移酵素によって脂質担体上に逐次アセンブルされる。この脂質担体は生物により異なる。例えば、制限は意図されないが、脂質担体は、真核細胞の小胞体膜中のドリコール−ピロリン酸や、細菌の内膜中のウンデカプレノール−ピロリン酸（Ｕｎｄ−ＰＰ）でありうる。グリカンが脂質担体上にアセンブルされると、それらは標的タンパク質に転移される。選択されたアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド基にグリカンが付着する過程はＮ−グリコシル化と称される。Ｏ−グリコシル化の過程では、グリカンは選択されたセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基上の水酸基に付着する。脂質担体からタンパク質へのグリカンの転移は、オリゴ糖転移酵素（ＯＴａｓｅ）と称される酵素によって行われる。
【０００８】
結合型ワクチンの生産において、糖タンパク質は免疫応答の誘発を促して様々な病原体や病気に対する保護を提供するワクチンとして使用される。これらのワクチンでは、グリカンがタンパク質へ付着することによりグリカンの免疫原性増大が促される。今や多くの技術を利用してこのようなワクチンが生産できる（非特許文献１〜３）。しかし、目下利用できる大部分の技術を使用する場合、タンパク質上のグリカンが付着する部位を制御することはできない。さらに、グリカンとタンパク質との比率を制御することは、かなり困難である。このような困難性により結合型ワクチンの性質が不均一となり、保健監督官庁から使用認可を得ようとする際に問題となる。結合型ワクチンの組成は変動しうり、正確に再現することが困難であることが多い。したがって、より制御された様式でグリカンをタンパク質に付着させて結合型ワクチンの生産の改善に使用できる、新しい方法およびシステムに対する必要性がある。
【０００９】
Ｃａｓｔｒｉｃらは、Ｏ−グリコシル化された組み換えタンパク質を製造するために細菌を使用することを開示している（特許文献１）。特許文献１では、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の異種的にグリコシル化された（heterologously glycosylated）線毛を含む、グラム陰性細菌感染症に対する多価ワクチンが開示されている。このワクチンを製造するために、特許文献１では、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のピリン構造遺伝子であるｐｉｌＡと、Ｏ抗原反復単位のピリンサブユニットへの付着の役割を担うタンパク質をコードする緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の遺伝子であるｐｉｌＯとを含有するベクターのグラム陰性細菌中への導入を教示する。ひとたび発現されると、ＰｉｌＯは宿主グラム陰性細菌のＯ抗原反復単位をピリンタンパク質ＰｉｌＡに付加できる。次にＯ−グリコシル化ピリンが、形質転換された細菌の培養物から精製できる。しかしこの方法およびシステムには、多くの重大な不都合および制限がある。Ｃａｓｔｒｉｃによって教示されるシステムは、オリゴ糖転移酵素ＰｉｌＯの使用に完全に依存する。この制限はいくつかの重大な不都合をもたらす。第一にＰｉｌＯの使用は、糖タンパク質上に転移できるＯ抗原反復単位のタイプを厳しく制限する。実際にはＰｉｌＯは、当業者によりオリゴ糖類として一般に知られている小型グリカン（すなわち２〜１０個の単糖類を有するグリカン）のみを転移できる。第二にＰｉｌＯは、グリコシル化されるタンパク質中の内部グリコシル化部位にグリカンを転移できない。実際にはＰｉｌＯは、グリカンをセリン残基にのみ転移することが示されており、それはタンパク質のＣ末端残基でなくてはならない（非特許文献４）。これは明らかに、Ｃａｓｔｒｉｃによって教示されるシステムを使用してグリコシル化できるタンパク質に大きな制限を課す。さらにこれらの困難さは、当業者により多糖類として一般に知られている大型グリカン（すなわち１０個を超える単糖類を有するグリカン）をＰｉｌＯが転移できないために、特定のワクチンまたは治療薬の生産を妨げうる。第三にＰｉｌＯを発現して精製することは、非常に困難である。これはこのシステムを使用して、ワクチン製造のために大量のグリコシル化生成物を生成しようとする際に、重大な制限をもたらす。
【００１０】
特許文献１でＣａｓｔｒｉｃによって教示されるシステムおよび方法は、いくつかのその他の制限を有する。組み換え糖タンパク質の製造は、生体内システムに限定される。さらにオリゴ糖転移酵素とグリコシル化されるタンパク質の双方が、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来でなくてはならない。これらの不都合は、主にワクチンまたはその他の治療薬の製造にとって非常に問題が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，８７２，３９８号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．２００５  Ａｎ．Ａｃａｄ．Ｂｒａｓ．Ｃｉｅｎｃ．７７（２）：２９３−３２４
【非特許文献２】Ｓｏｏｄ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｆａｔｔｏｍ，Ａ．１９９８  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ７（３）：３３３−３４７
【非特許文献３】Ｓｌｏｖｉｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｋｅｄｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｒａｇｕｐａｔｈｉ，Ｇ．２００５  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８３（４）：４１８−４２８
【非特許文献４】Ｃａｓｔｒｉｃ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ  ２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６；２６４７９−２６４８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって上に列挙したいくつかの問題を回避しながら、生体内または生体外の様式で多様な原核生物を使用して、タンパク質を容易にＯ−グリコシル化するのに使用できる方法およびシステムに対する必要性が生じている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の広義の態様に従って、原核生物においてタンパク質をグリカンでＯ−グリコシル化する方法が提供される。本方法は、少なくとも（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、およびＯ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子を含むＤＮＡを原核生物に所望の順序で導入するステップを含む。ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素はグリカンとタンパク質との共有結合を促進して、Ｏ−グリコシル化タンパク質を製造する。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはその任意の組み合わせを含む。一態様では、グリカンは還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む。別の態様では、ガラクトースがグリカンの還元末端に存在する。脂質担体は、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、およびその合成均等物などのポリプレノールピロリン酸である。
【００１５】
本発明の別の広義の態様に従って、原核生物においてグリカンによりＯ−グリコシル化タンパク質を製造する方法が提供され、本方法は、原核生物中に、少なくとも（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するｐｇｌＬを含むＤＮＡ、（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するｐｉｌＥを含むＤＮＡ、および（ｃ）脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡを所望の順序で導入するステップを含む。ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素は、グリカンとタンパク質との共有結合を促進してＯ−グリコシル化タンパク質を生成する。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類またはその任意の組み合わせを含む。一態様では、グリカンは還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む。別の態様ではガラクトースがグリカンの還元末端に存在する。脂質担体は、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、およびその合成均等物などのポリプレノールピロリン酸である。
【００１６】
本発明の別の広義の態様に従って、原核生物と、生物中に存在する少なくとも次の構成要素、（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するＤＮＡ、（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するＤＮＡ、および（ｃ）脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡ、とを含む、Ｏ−グリコシル化タンパク質を製造するシステムが提供される。ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素は、グリカンとタンパク質との共有結合を促進してＯ−グリコシル化タンパク質を生成する。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはその任意の組み合わせを含む。一態様では、グリカンは還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む。別の態様では、ガラクトースがグリカンの還元末端に存在する。脂質担体は、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、およびその合成均等物などのポリプレノールピロリン酸である。
【００１７】
本発明の別の広義の態様に従って、原核生物と、生物中に存在する少なくとも次の構成要素、（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するｐｇｌＬを含むＤＮＡ、（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するｐｉｌＥを含むＤＮＡ、および（ｃ）脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡ、とを含むＯ−グリコシル化タンパク質を製造するシステムが提供される。オリゴ糖転移酵素は、グリカンとタンパク質との共有結合を促進してＯ−グリコシル化タンパク質を生成する。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはその任意の組み合わせを含む。一態様では、グリカンは還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む。別の態様では、ガラクトースがグリカンの還元末端に存在する。脂質担体は、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、およびその合成均等物などのポリプレノールピロリン酸である。
【００１８】
本発明の別の広義の態様に従って、（ａ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質と、（ｂ）脂質担体に結合したグリカンとをＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素の存在下で反応させるステップを含む、Ｏ−グリコシル化タンパク質を製造する方法が提供される。ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素は、グリカンを脂質担体からタンパク質に転移する。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはその任意の組み合わせを含む。一態様では、グリカンは還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む。別の態様では、ガラクトースがグリカンの還元末端に存在する。脂質担体は、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、およびその合成均等物などのポリプレノールピロリン酸である。
【００１９】
本発明の別の広義の態様に従って、（ａ）ｐｉｌＥの発現産物であるＰｉｌＥタンパク質と、（ｂ）脂質担体に結合したグリカンとをｐｇｌＬの発現産物であるオリゴ糖転移酵素の存在下で反応させるステップを含む、Ｏ−グリコシル化タンパク質を製造する方法が提供される。オリゴ糖転移酵素は、グリカンを脂質担体からタンパク質に転移する。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはその任意のその組み合わせを含む。一態様では、グリカンは還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む。別の態様では、ガラクトースがグリカンの還元末端に存在する。脂質担体は、限定されるものではないが、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、およびその合成均等物などのポリプレノールピロリン酸である。
【００２０】
本発明の別の広義の態様に従って、本明細書に記載された方法およびシステムによって製造される、ワクチンの生産に使用できるＯ−グリコシル化タンパク質が提供される。これらの方法およびシステムを使用して、タンパク質に付加できるグリカンのタイプ、転移されるグリカンの長さ、グリカンの還元末端に位置する糖のタイプ、タンパク質上のグリカンの位置または使用できる生物のタイプに制限をもたらすことなく、Ｏ−グリコシル化タンパク質を調製できることから、それらは特に有利である。
【００２１】
本発明は、その構成および操作様式の双方に関して、以下の説明および様々な実施態様の添付図を参照して最も良く理解され、そこでは同種の番号がいくつかの図にわたって使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）によって生成されるＮ−グリカンの模式図である。
【図１Ｂ】髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）によって生成されるピリングリカンの模式図である。
【図１Ｃ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって生成されるＯ７抗原の模式図である。
【図１Ｄ】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｏ１１によって生成されるピリングリカンの模式図である。
【図１Ｅ】ネズミチフス菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）によって生成されるグリカンの模式図である。
【図２Ａ】非グリコシル化およびグリコシル化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＭＣ）ピリンを生成する全細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４抽出物のウエスタンブロット分析である。ピリンは、ＳＭ１抗ピリンモノクローナル抗体（上側パネル）またはＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカン抗血清Ｒ１２（下側パネル）によって検出された。Ｒ１２は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉグリカンを特異的に認識する抗血清である（Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８（５５９９）：１７９０−１７９３）。レーン１：ｐＡＭＦ３（ＭＣピリンを発現する）およびｐＡＭＦ５（ＰｇｌＬを発現する）。レーン２：ｐＡＭＦ３、ｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔ、およびｐＥＸＴ２２（クローニングベクター）。レーン３：ｐＡＭＦ３（ＭＣピリンを発現する）、ｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔ、およびｐＡＭＦ５（ＰｇｌＬを発現する）。プラスミドｐＡＣＹＣｐｇｌは、常態ではＣ．ｊｅｊｕｎｉにおけるＮ−グリコシル化中に転移されるグリカンの合成のために必要な酵素の全てをコードするｐｇｌ遺伝子座を保有する（図１Ａ）（Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ、前出）。その誘導体ｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔは、ＰｇｌＢオリゴ糖転移酵素を不活性化する変異を有する。上側矢印はグリコシル化生成物を示し、下側矢印は非グリコシル化生成物を示す。
【図２Ｂ】変異Ｓ６３ＡおよびＴ６２Ａのピリングリコシル化に対する影響を示すウエスタンブロット分析である。ピリンはＳＭ１抗ピリンモノクローナル抗体（上側パネル）またはＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカン抗血清Ｒ１２（下側パネル）によって検出された。全てのレーンは、ｐＡＭＦ５、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔを発現する細胞に対応する。レーン１：ｐＰｉｌＥＴ６２Ａ。レーン２：ｐＰｉｌＥＳ６３Ａ。レーン３：ｐＡＭＦ６。上側矢印はグリコシル化生成物を示し、下側矢印は非グリコシル化生成物を示す。
【図３】β脱離に対する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＭＣ）グリコシル化ピリンの感受性を示すウエスタンブロット分析である。この実験では、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉグリカンでグリコシル化されたピリンを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４細胞の抽出物を使用した（図３Ａ）。対照としてＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカンでＮ−グリコシル化されたＡｃｒＡを含有する同一株の抽出物を使用した（図３Ｂ）。全細胞を収集して、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合し（４％  ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）、９５℃で１０分間加熱した。サンプルを１５％ゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、帯状に切断した。タンパク質の脱グリコシル化、β脱離に対するアルカリ処置の影響をＲ１２グリカン特異的抗体を使用して４０℃で１６時間のインキュベーション後に検出した。ひとたびＰＶＤＦ膜に転移させたら、サンプルを異なる濃度の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で処理した。レーン１：ＮａＯＨによる処理なし。レーン２：０．０５５ＭのＮａＯＨによる処理。レーン３：０．０７ＭのＮａＯＨによる処理。レーン４：０．０９ＭのＮａＯＨによる処理。
【図４Ａ】グリコシル化ＭＣピリンのプロティナーゼＫ消化から予期された断片化パターンである。×印四角はＤＡＴＤＨ（２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシヘキソース）を表す。白抜き四角はＨｅｘＮＡｃを表す。黒丸はヘキソースを表す。
【図４Ｂ】ＭＣピリンのプロティナーゼＫ消化に起因する、ペプチド６３ＳＡＧＶＡ６７に付着したＤＡＴＤＨ（ＨｅｘＮＡｃ）５Ｈｅｘに対応するｍ／ｚ  ９０５．８２＋における二重荷電したグリコペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルである。糖断片、および糖断片があるペプチドに加えて、図４Ａに示す一般的なペプチド断片イオン（ｙ３およびｂ４）が観察される。×印四角はＤＡＴＤＨ（２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシヘキソース）を表す。白抜き四角はＨｅｘＮＡｃを表す。黒丸はヘキソースを表す。
【図５Ａ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳΦ８７４中で生成される３種の異なる形態の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７  ＬＰＳのレクチンブロット分析である。Ｏ７抗原の糖の１つであるラムノースに対して特異的なレクチンが使用された。レーン１：野生型。レーン２：ｗｚｙ（ポリメラーゼ）変異体。レーン３：ｗｚｚ（鎖長制御因子）変異体。右の数字はリピドＡ−コアに付着するＯ７の反復単位数を示す。
【図５Ｂ】ＰｇｌＬ（左パネル）およびＰｉｌＯ（右パネル）が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＭ３株（ＳΦ８７４のリガーゼ−欠損誘導体）において、異なる長さのＯ７抗原をそれらのそれぞれのピリンに転移する能力を実証するウエスタンブロット分析である。抗ＭＣピリンモノクローナル抗体を使用して、図５Ａに示す３種のＯ抗原バージョンを含有する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＭＣ）ピリンを検出した。ＰｇｌＬは完全に重合したＯ７抗原をＭＣピリン（レーン２）に転移できた。２個以上の反復単位を含有するＯ抗原も同様に豊富であるという観察にもかかわらず、２個の反復単位までのＯ抗原を含有する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンだけがｗｚｚ変異株（レーン８）中に検出された（図５Ａのレーン３参照）。レーン１〜４：ｐＡＭＦ５（ＰｇｌＬを発現する）およびｐＡＭＦ６（ＭＣピリンを発現する）。さらにレーン２はｐＪＨＣＶ３２（野生型Ｏ７抗原）を含有し、レーン３はｐＪＨＣＶ３２−１３４（Ｏ７  ｗｚｙ変異体）を含有し、およびレーン４はｐＪＨＣＶ３２−１３６（Ｏ７  ｗｚｚ変異体）を含有する。レーン５〜８：ｐＰＡＣ４６（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンおよびＰｉｌＯを発現する）。さらにレーン６はｐＪＨＣＶ３２を含有し、レーン７はｐＪＨＣＶ３２−１３４を含有し、レーン８はｐＪＨＣＶ３２−１３６を含有する。
【図６】セリン６３の変異がグリコシル化を無効化することを示すウエスタンブロット分析である。ｗｚｚ変異株由来のＯ７抗原は、ＭＣピリンのＳ６３Ａ変異株に転移されない（レーン４）。変異Ｎ６０Ａ（レーン１）、Ｎ６１Ａ（レーン２）、およびＴ６２Ａ（レーン３）において、グリコシル化は影響を受けない。非グリコシル化（レーン５）およびＯ７抗原でグリコシル化された野生型ピリン（レーン６）を比較のために含める。レーン１〜４はプラスミドｐＡＭＦ５およびｐＪＨＣＶ３２：：Ｔｎ３ＨｏＨｏ１−１３４を含有する。レーン１：ｐＰｉｌＥＮ６０Ａ。レーン２：ｐＰｉｌＥＮ６１Ａ。レーン３：ｐＰｉｌＥＴ６２Ａ。レーン４：ｐＰｉｌＥＳ６３Ａ。レーン５：ｐＡＭＦ６、ｐＥＸＴ２１、およびｐＪＨＣＶ３２：：Ｔｎ３ＨｏＨｏ１−１３４。レーン６：ｐＡＭＦ６、ｐＡＭＦ５、およびｐＪＨＣＶ３２：：Ｔｎ３ＨｏＨｏ１−１３４。
【図７Ａ】ＭＣピリンのグリコシル化が、Ｗｚｘ（レーン１）、ｐｇｌがコードするＰｇｌＫ（レーン３）、またはｔｒａｎｓでコードされるＰｇｌＫ（レーン４）のいずれかの機能性フリッパーゼの存在下でのみ起きることを示すウエスタンブロット分析である。ＭＣピリンに対する抗体を使用して、ウエスタンブロットによって細胞抽出物を分析した。レーン１：ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔを含有するＣＬＭ２４株。レーン２：プラスミドｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＫｍｕｔで形質転換されたＳＣＭ７。レーン３：ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌを含有するＳＣＭ７。レーン４：ＰｇｌＫをｔｒａｎｓで発現する、ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、ｐＡＣＹＣｐｇｌＫｍｕｔ、およびｐＣＷ２７で形質転換されたＳＣＭ７。レーン５：ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、ｐＡＣＹＣｐｇｌＫｍｕｔ、およびｐＭＬＢＡＤ（クローニングベクター）で形質転換されたＳＣＭ７。株およびプラスミドの詳細は表１−１〜１−４に示す。矢印は、機能性ＷａａＬ（リガーゼ）およびフリッパーゼが存在する株における、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉオリゴ糖類を含有するＬＰＳの存在を示す。
【図７Ｂ】ＭＣピリンのグリコシル化が、Ｗｚｘ（レーン１）、ｐｇｌがコードするＰｇｌＫ（レーン３）、またはｔｒａｎｓでコードされるＰｇｌＫ（レーン４）のいずれかの機能性フリッパーゼの存在下でのみ起きることを示すウエスタンブロット分析である。グリカン特異的Ｒ１２抗血清を使用して、ウエスタンブロットによって細胞抽出物を分析した。レーン１：ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔを含有するＣＬＭ２４株。レーン２：プラスミドｓｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＫｍｕｔで形質転換されたＳＣＭ７。レーン３：ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌを含有するＳＣＭ７。レーン４：ＰｇｌＫをｔｒａｎｓで発現する、ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、ｐＡＣＹＣｐｇｌＫｍｕｔ、およびｐＣＷ２７で形質転換されたＳＣＭ７。レーン５：ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、ｐＡＣＹＣｐｇｌＫｍｕｔ、およびｐＭＬＢＡＤ（クローニングベクター）で形質転換されたＳＣＭ７。株およびプラスミドの詳細は表１−１〜１−４にある。矢印は、機能性ＷａａＬ（リガーゼ）およびフリッパーゼが存在する株における、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉオリゴ糖類を含有するＬＰＳの存在を示す。
【図８Ａ】サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｏ抗原を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９細胞中の抗ピリンを使用したウエスタンブロット分析である。このブロットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、還元末端にガラクトースを有する多糖類でピリンがグリコシル化できることを示す。レーン１〜３はｐＰＲ１３４７およびｐＡＭＦ８を含有する。さらにレーン１：ｐＰｉｌＥＳ６３Ａ。レーン２：ｐＡＭＦ９。レーン３：ｐＰｉｌＥＴ６２Ａ。レーン４：ｐＰＲ１３４７、ｐＡＭＦ９、およびｐＥＸＴ２０。
【図８Ｂ】サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中のピリングリコシル化の再構成。左パネル：ｐＡＭＦ９で形質転換されたネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ３７４９株。レーン１：ｐＥＸＴ２０。レーン２：ｐＡＭＦ８。このパネルはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞における多糖類の転移を示す。中央パネル：ｐＡＭＦ９で形質転換されたｗｚｙポリメラーゼ遺伝子中に変異を有するネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ９０１株（レーン３および４の双方）。レーン３：ｐＥＸＴ２０を含有する。レーン４：ｐＡＭＦ８を含有する。右パネル：ｐＡＭＦ９で形質転換されたｗｚｙポリメラーゼ遺伝子中に変異を有するチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）。レーン５：ｐＥＸＴ２０。レーン６：ｐＡＭＦ８。中央および右パネルは、異なるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株中へのオリゴ糖類の転移を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に記載された材料、化合物、組成物、および方法は、開示されている主題の具体的な態様の下記詳細な説明および実施例と、図とを参照して、より容易に理解され得る。
【００２４】
本材料、化合物、組成物、および方法を開示して述べる前に、特定の合成法または特定の試薬などはもちろん変動しうるため、下述の態様はそれらに限定されるものではないものと理解されたい。また本明細書で使用される用語法は、特定の態様について述べるためだけのものであり、制限は意図されないものと理解されたい。
【００２５】
またこの明細書全体を通じて、様々な公報が参照される。これらの公報の開示は、開示されている事項に関連する現状技術について、より完全に述べるためにその全体を参照によって本明細書に援用する。開示されている参考文献はまた、参考文献が頼りにされる文章において論じられるそれらの中に含まれる題材について、個々に具体的に、参照によって本明細書に援用する。
【００２６】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの言葉のその他の形態は、含むことを意味するがこれに限定されるものではなく、例えばその他の添加剤、構成要素、整数、またはステップを除外することは意図されない。
【００２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲における用法では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に断りのない限り複数の指示対象を含む。したがって例えば「作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、このような２つ以上の作用物質の混合物を含む。
【００２８】
本発明は、生体内または生体外でタンパク質をＯ−グリコシル化するための方法およびシステムの発見に関する。生体内での方法およびシステムは、任意の原核生物に、少なくとも（ｉ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するＤＮＡ、および（ｉｉ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するＤＮＡを所望の順序で導入するステップを含む。一実施態様では、これらの方法およびシステムは、原核生物に内在性でありグリコシル化に必要である、脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要なタンパク質をコードする遺伝子に依存する。別の実施態様では、これらの方法およびシステムは、脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要なタンパク質をコードする外来性遺伝子を原核生物中に導入するステップをさらに含む。これらの方法およびシステムを使用して、タンパク質に付加できるグリカンのタイプ、転移されるグリカンの長さ、グリカンの還元末端に位置する糖のタイプ、タンパク質上のグリカンの位置または使用できる生物のタイプに制限をもたらすことなく、Ｏ−グリコシル化タンパク質を調製できることから、それらは特に有利である。
【００２９】
生体外での方法およびシステムは、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素をＯ−グリコシル化されるタンパク質と共に、および脂質結合グリカンと共に、適切な緩衝液中でインキュベートするステップを含む。
【００３０】
本発明の目的では、グリカンはタンパク質に転移できる（例えば共有結合的に付着する）任意の糖を含む。グリカンは、単糖類、オリゴ糖類、および多糖類を含む。上述のようにオリゴ糖類は２〜１０個の単糖類を有するグリカンである。多糖類は１０個を超える単糖類を有するグリカンである。多糖類は、Ｏ抗原、カプセル、および菌体外多糖を含む群から選択できる。もちろん当業者は、その他のタイプの多糖類もまた使用してもよいことを理解するであろう。
【００３１】
本発明において有用なグリカンとしては、ヘキソース、ヘキソースのＮ−アセチル誘導体、オリゴ糖類、および多糖類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。制限を意図しないその他の例としては、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＬＴ２、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のグリカン（図１参照）が挙げられる。一実施態様では、グリカンの還元末端の単糖類は、ヘキソースまたはヘキソースのＮ−アセチル誘導体である。一態様では、ヘキソースはガラクトースでありうる。一態様では、ヘキソースのＮ−アセチル誘導体は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ），２−アセトアミド−２，６−ジデオキシヘキソース（ＦｕｃＮＡｃ）、およびＤＡＴＤＨ（２，４−ジアセトアミド−２，４−，６−トリデオキシヘキソース）を含む群から選択できる。
【００３２】
本発明のＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素としては、以下の特性を含むオリゴ糖転移酵素が挙げられる。すなわち、（ａ）タンパク質のセリンまたはスレオニン残基にグリカンを転移する能力、（ｂ）緩やかなグリカン特異性により、異なる長さを有するグリカンおよび異なるタイプの単糖類を転移する能力、および（ｃ）Ｏ−グリコシル化においてタンパク質に多糖類を転移する能力である。一態様では、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素はまた、Ｏ−グリコシル化されるタンパク質中の内部グリコシル化部位にグリカンを転移する能力も有することができる。一態様ではＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素はまた、原核生物のぺリプラズム中でタンパク質をＯ−グリコシル化する能力も有することができる。
【００３３】
一実施態様では、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素は、ピリン−グリコシル化遺伝子Ｌ（ｐｇｌＬ）またはその相同体（homologue）によって発現されるタンパク質である。もちろん当業者は、相同体が配列に違いを有してもよいが、機能には大きな違いがないタンパク質であることを理解するであろう。一態様では、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）または淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ））において、ｐｇｌＬまたはその相同体によって発現されるタンパク質は、本発明で有用なオリゴ糖転移酵素を生成できる。本発明で有用なＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素の発現のための髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のｐｇｌＬのゲノム配列の例としては、ＭＣ５８（登録番号ＡＡＦ４１０２４）（Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８０９−１８１５）、Ｚ７４９１（Ｐａｒｋｈｉｌｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：５０２−５０６）、およびＦＡＭ１８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｎ＿ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ／ｓｅｒｏ．ｓｈｔｍｌ）由来のＰｇｌＬが挙げられるが、これらに限定されるものではない。淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）由来のＰｇｌＬは、ＰｇｌＯ（登録番号ＮＧＯ０１７８）と称されている（Ａａｓ，Ｆ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：６０７−６２４）。
【００３４】
本発明の一実施態様では、生体内での方法およびシステムを使用して、Ｏ−グリコシル化タンパク質が調製される。これらの方法およびシステムを使用して、あらゆるタイプの原核生物中でＯ−グリコシル化タンパク質を製造できる。原核生物の選択は大きく変動できる。一実施態様では、原核生物はグラム陰性細菌である。使用できるグラム陰性細菌としては、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属由来の細菌種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の特定の実施態様では、使用される原核生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用は多くの利点を有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ワクチンおよび治療薬のデザインにおいて使用されており、生体内Ｏ−グリコシル化反応を行うのに良好な宿主細胞である。もちろん当業者には明白なように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用は本明細書で列挙されない多くのその他の利点を有する。
【００３６】
別の実施態様では、使用される原核生物はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の使用もまた、多くの利点を有する。例えば、制限は意図されないが、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）には多くの用途があり、弱毒性ワクチンを製造するのにこの種が使用される。さらにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、還元末端にガラクトースを有する内在性グリカンを常に生成する。当業者は、これが次にワクチン生産を大幅に促進することを理解するであろう。
【００３７】
本発明のタンパク質の生体内Ｏ−グリコシル化のための方法は、一般に少なくとも（ｉ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成するＤＮＡ、および（ｉｉ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成するＤＮＡの組み込みを伴う。上で考察したように、一実施態様では、これらの方法およびシステムは、脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な内在性遺伝子であって、タンパク質のグリコシル化に必要であるタンパク質をコードする原核生物の内在性遺伝子に依存している。別の実施態様では、これらの方法およびシステムは、脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要なタンパク質をコードする外来性遺伝子を原核生物中に導入するステップをさらに含む。
【００３８】
原核生物中へのこれらのＤＮＡ断片の組み込みは、当該技術分野で知られているいくつかの技術のいずれかを使用して実施できる。当業者は、これらの技術が、あらゆる組み換えＤＮＡコンストラクトで宿主細胞を安定して形質移入しまたは形質転換するのに使用できるあらゆる方法を含むことを理解するであろう。例えば、制限は意図されないが、本発明の目的で、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）で列挙され述べられている技術のいずれかが、ＤＮＡ断片を原核生物中に導入するのに容易に使用できる。
【００３９】
選択された原核生物中に挿入されたＤＮＡ断片は、一般的に遺伝子または遺伝子の一部（その切断産物および／または変異体を含む）でありＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素と、グリコシル化されるタンパク質と、いくつかの実施態様では脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要なタンパク質とを生成するために使用される。これらのＤＮＡ断片は、多種多様な異なる手法で生成できる。各ＤＮＡ断片は、例えば、制限は意図されないが、ポリヌクレオチドが由来する領域内の塩基配列によって提供される情報に基づく、化学合成またはＤＮＡ複製または逆転写または転写をはじめとする任意の方法で作出されてもよい。さらに意図される用途に矛盾がないことが当該技術分野で知られている方法で、所望の配列の領域に相当する異なる領域の組み合わせを変更してもよい。最後に各ＤＮＡ断片の起源は、意図される用途に応じて、同一原核生物、または異なる原核生物に由来することができる。
【００４０】
本発明の一実施態様では、各ＤＮＡ断片は、上述のようにベクターおよびＤＮＡ断片を含む組み換えＤＮＡ分子に関連する。ベクターは、当該技術分野で知られているあらゆる広義の宿主範囲発現ベクターなどのプラスミドの形態を取ることができる。もちろん当業者は、場合によっては用途によって、単一のプラスミドに２以上のＤＮＡ断片を含めることが有益でありうることを理解するであろう。さらに上で考察したように、いくつかの実施態様では、必要とされるタンパク質のいくつかは原核生物に内在性の遺伝子によってコードされる。これらの実施態様では、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、原核生物のゲノムに存在する。
【００４１】
本発明の方法およびシステムでは、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素が、所望のグリカンと、グリコシル化されるタンパク質中に存在するセリンまたはスレオニン残基の水酸基との共有結合形成を促進する。ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素をコードするＤＮＡ断片は、多種多様な異なるシステムおよび生物から得ることができる。もちろん上述のように、目的用途のために当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、これらの配列のいずれかを改変してもよい。
【００４２】
本発明の方法およびシステムでは、グリコシル化されるタンパク質は、広範なタンパク質から選択できる。本発明の一実施態様では、使用されるＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８（登録番号ＡＡＦ４１０２４）からの遺伝子ｐｇｌＬから作られる場合、グリコシル化されるタンパク質を生成するＤＮＡ断片は、遺伝子ｐｉｌＥ（登録番号ＡＡＦ４０４９７）またはその相同体を含有する。ｐｉｌＥまたはその相同体の遺伝子は、多種多様な異なる生物から選択できる。一態様では、ｐｉｌＥのためのＤＮＡ断片はナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）または淋菌（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ））から選択される。もちろん上述のように、目的用途のために当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、これらの配列を改変してもよい。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８（登録番号ＡＡＦ４０４９７）からの遺伝子ｐｉｌＥによって発現されるタンパク質を使用する場合、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８（登録番号ＡＡＦ４１０２４）からの遺伝子ｐｇｌＬによって発現されるＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素によって、成熟タンパク質のＳｅｒ６３がグリコシル化される。もちろん当業者には理解されるように、どのタンパク質が選択されるかによって、グリコシル化部位は異なってもよい。
【００４３】
本発明の別の実施態様では、グリコシル化されるタンパク質は、グリコシル化のための決定因子を含有するハイブリッドタンパク質などの変性タンパク質であってもよい。理論による拘束は望まないが、本発明の目的では、グリコシル化のための決定因子は、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素によってグリコシル化部位として認識される部位である。例えば、制限は意図されないが、ハイブリッドタンパク質は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製されてもよく、そこで得られるタンパク質は、２種の異なるタンパク質からのグリコシル化決定因子を含有する。もちろん当業者はまた、多くのその他のハイブリッドタンパク質が作製できることも理解する。
【００４４】
さらなる本発明の実施態様では、グリコシル化されるタンパク質はピリンタンパク質ではない。ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素によって認識されるグリコシル化決定因子を含むあらゆるタンパク質が、本発明の方法およびシステムに含まれることが意図される。
【００４５】
生体内グリコシル化のために使用される第３のＤＮＡ断片は、脂質担体上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含む。上で考察したように、本発明で有用なグリカンとしては、ヘキソース、ヘキソースのＮ−アセチル誘導体、オリゴ糖類、および多糖類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一態様では、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を使用する場合、上述のように還元末端にヘキソースまたはヘキソースのＮ−アセチル誘導体を有する多糖類すなわちグリカンで、タンパク質をＯ−グリコシル化することが可能である。還元末端にヘキソースまたはヘキソースのＮ−アセチル誘導体を有する多糖類すなわちグリカンによるタンパク質のＯ−グリコシル化は、非常に有利である。例えば、制限は意図されないが、後で考察されるように、このようなグリカンでＯ−グリコシル化されたタンパク質を生成する能力は、ワクチンおよび治療薬の開発のために非常に有用である。
【００４６】
本発明の一実施態様では、１つ以上の生物からのグリカンを生成する遺伝子を含有するＤＮＡ断片もまた使用できる。例えば、制限は意図されないが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのグリカンを生成する役割を担う遺伝子が本発明で使用できる（図１参照）。これらの遺伝子は、グリカンのアセンブルおよび転位にさらに関与することができる。これらの遺伝子としては、グリカンのアセンブルおよび輸送に必要なグリコシル基転移酵素およびその他の酵素をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の特定の態様では、原核生物の選択次第で、生体内グリカン合成はまた、ポリプレノールピロリン酸キャリアまたはその合成均等物などの脂質担体への糖単位の付着を伴ってもよい。例えば、制限は意図されないが、ポリプレノールピロリン酸キャリアとして、ウンデカプレノールピロリン酸（またはウンデカプレノール−ＰＰ）が選択されてもよい。あるいは、これらの酵素を生成する１つ以上の遺伝子を導入することも可能である。理論による拘束は望まないが、Ｏ−グリコシル化は生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））のぺリプラズム中で起きると考えられる。当業者には理解されるように、上述のこれらの遺伝子ならびにその他のＤＮＡ断片を導入することにより、任意の原核生物におけるＯ−グリコシル化タンパク質の製造が初めて可能になる。
【００４８】
上述の生体内での方法およびシステムを使用して、大規模量のＯ−グリコシル化タンパク質を製造することが可能である。上述のＤＮＡ断片で形質転換された原核生物は、当該技術分野で知られている様々な方法を使用して生育させることができる。例えば、制限は意図されないが、これらの原核生物をブロス培養物中で生育させて、Ｏ−グリコシル化タンパク質を製造することができ、Ｏ−グリコシル化タンパク質を単離できる。Ｏ−グリコシル化タンパク質の単離は、当該技術分野で知られている様々な方法を使用して実施できる。例えば、制限は意図されないが、レクチン親和クロマトグラフィーを使用してもよい（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９（２２）：８０８８−８０９８）。
【００４９】
上述の方法はグリコシル化タンパク質の生体内製造に有用であるが、本発明の別の実施態様は、Ｏ−グリコシル化タンパク質の生体外製造方法および製造システムを提供する。一実施態様では、本方法はｐｉｌＥ（登録番号ＡＡＦ４０４９７）の発現産物であるＰｉｌＥタンパク質と、ウンデカプレノール−ＰＰキャリアに付着したグリカンとをＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素の存在下で反応させるステップを含む。一態様では、ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８（登録番号ＡＡＦ４１０２４）からのｐｇｌＬ遺伝子から発現されたＰｇｌＬである。
【００５０】
当業者は、目的用途のために当該技術分野で知られている方法を使用して、ｐｉｌＥおよびｐｇｌＬをコードするＤＮＡ断片が、改変または切断されたものでよいことを理解するであろう。これらのＤＮＡ断片は、上で考察したように生物中で発現でき、双方のタンパク質は当該技術分野で知られている技術を使用して精製できる。例えば、制限は意図されないが、ｐｇｌＬから生成されるオリゴ糖転移酵素は、当該技術分野で知られている技術を使用して、可溶化された膜画分から精製される。
【００５１】
生体外でＯ−グリコシル化タンパク質を製造するために、様々な原核生物によって発現されるタンパク質およびグリカンと共に、オリゴ糖転移酵素をインキュベートできる。もちろん当業者は理解するであろうように、タンパク質およびグリカンは同一原核生物起源でなくてもよい。当業者には理解されるように，インキュベーション条件は大幅に変動できる。例えば、制限は意図されないが、約６から約８のｐＨを有する緩衝液中でタンパク質およびグリカンをインキュベートしてもよい。一態様では、緩衝液はリン酸緩衝食塩水であってもよい。別の態様では、緩衝液はｐＨ７．５のトリス−ＨＣｌ  ５０ｍＭであってもよい。
【００５２】
次にグリコシル化タンパク質を精製して、当該技術分野で知られている技術によって特性決定できる。例えば、制限は意図されないが、Ｏ−グリコシル化タンパク質の生体外製造のために、Ｋｏｗａｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４：１１４８−１１５０）で開示されている技術を本発明で適応できる。
【００５３】
本発明で製造されるグリコシル化タンパク質は、有効量のＯ−グリコシル化タンパク質がこのような処置を必要とする対象に投与される、いくつかの疾患を治療するための治療薬として使用できる。これらの疾患の例としては、自己免疫障害、ＨＩＶおよびＣ型肝炎感染症、結核、カンジダ症、レーシュマニア症、および様々な細菌感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらにいくつかのグリカンは、ヒト集団の一部に影響するいくつかの自己免疫疾患を治療する潜在用途を有することが示されている。
【００５４】
本発明で製造されるグリコシル化タンパク質はまた、有効量のタンパク質がこのような処置を必要とする対象に投与される場合、ワクチンとして、または疾患予防のための医薬組成物中で使用することもできる。したがって本明細書に記載された、いくつかの異なるＯ−グリコシル化タンパク質を製造する方法は、創薬において非常に有用なことが分かるであろう。
【００５５】
続く実施例において、以下の材料と方法を使用した。これらの材料と方法は例示のみを目的とし、本発明の範囲をどのようにも制限するものではないと解釈される。当業者は、本発明の範囲に影響することなくいくつかの改変および置換ができることを理解するであろう。より具体的には、これらとしては下に列挙される特定の技術および反応条件の改変および置換が挙げられる。
【００５６】
細菌株、プラスミド、および生育条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１２４４細胞は、３７℃でＬＢ培地上に生育させることができる。１００μｇ／ｍＬトリメトプリム、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、８０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および１００μｇ／ｍＬアンピシリンを必要に応じて培地に添加した。使用できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ならびにＤＨ５αプラスミドを表１−１〜１−４に列挙する。もちろん当業者は、表１−１〜１−４に列挙されないその他の株およびプラスミドもまた使用してもよいことを理解するであろう。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【００６１】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８のｐｉｌＥ、およびｐｇｌＬのクローニングおよび発現
ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、および、オリゴヌクレオチドＰｉｌＥＥｃｏＲＩ（配列番号：１）およびＰｉｌＥＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号：２）を使用して、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８のゲノムＤＮＡからｐｉｌＥ遺伝子（登録番号ＡＡＦ４０４９７）を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＥＸＴ２０およびｐＥＸＴ２１の同一部位にクローニングして、ｐＡＭＦ３およびｐＡＭＦ６をそれぞれ構築した。
【００６２】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８をテンプレートとして、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社製のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドＰｇｌＬＥｃｏＲＩ（配列番号：３）およびＰｇｌＬＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈｉｓ（配列番号：４）を用いたＰＣＲによって、ｐｇｌＬ遺伝子（登録番号ＡＡＦ４１０２４）を増幅した。ＰｇｌＬＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｓはＣ末端で１０ｘＨｉｓをコードする。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＳＰＯＲＴ１の同一部位に挿入してｐＡＭＦ４を生成した。ｐＡＭＦ４をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐｇｌＬ遺伝子を含有する断片をｐＥＸＴ２２の同一部位にライゲートして、ｐＡＭＦ５を作り出した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとオリゴヌクレオチドＰｉｌＥＥｃｏＲＩおよびＰｉｌＥＳａｌＩ−Ｈｉｓ（配列番号：５）を使用し、テンプレートとしてｐＡＭＦ３を使用してｐｉｌＥ−６Ｈｉｓを増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＥＸＴ２０およびｐＥＸＴ２１の同一部位に挿入してｐＡＭＦ７およびｐＡＭＦ１４を構築した。ｐＡＭＦ８は次のように構築した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼと、オリゴヌクレオチドＰｇｌＬＥｃｏＲＩおよびＰｇｌＬＳａｌＩ（配列番号：６）を使用し、テンプレートとしてｐＡＭＦ４を使用してｐｇｌＬを増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＥＸＴ２０の同一部位に挿入してｐＡＭＦ８を構築した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＡＭＦ７の挿入、およびｐＭＬＢＡＤの同一部位への挿入は、Ｈｉｓ６標識ＰｉｌＥを発現するｐＡＭＦ９を生成した。
【００６３】
ウエスタンブロット分析
当該技術分野で知られている技術を使用して、ウエスタンブロッティングを実施した。ニトロセルロース膜上のタンパク質の存在を抗体および／またはレクチンで検出した。表２は、本研究で使用された抗体およびレクチンに関する情報を提供する。もちろん当業者は、表２に列挙されない異なる抗体およびレクチンもまた使用してよいことを理解するであろう。
【００６４】
ダイズ凝集素（ＳＢＡ）レクチンブロット法を使用して、カンピロバクターグリカンでグリコシル化ピリンを検出した。タンパク質をニトロセルロース膜上に転移して、０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により室温で１時間ブロックした。ブロックした膜をビオチン−抱合型ＳＢＡと共に室温で１時間インキュベートし、洗浄してからホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合抗ビオチンと共にさらに１時間インキュベートした。ＧＥＡｍｅｒｓｈａｍ社製のＥＣＬキットを使用してブロットを現像した。Ｌ−ラムノース−結合イソレクチンであるＳＴＬ３によって、Ｏ７抗原サブユニットを構成するリポ多糖類（ＬＰＳ）を検出した（Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ．ら，２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５（６）：１３２８−３８）。Ｏ７  ＬＰＳの異なる変異型を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓφ８７４細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合して、Ｒｏｃｈｅ社製のプロティナーゼＫによってタンパク質を消化した。ＬＰＳをニトロセルロース膜上に転写し、ＢＳＡでブロックしてＳＴＬ３と共にインキュベートした。膜を抗ＳＴＬ３ポリクローナル抗体、および抗ウサギ抗体と共に、室温でそれぞれ１時間インキュベートした。ブロットを先に述べたようにして現像した。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
アフィニティークロマトグラフィーを使用したグリコシル化ピリンの精製
ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ１４（Ｃ末端６ＸＨｉｓ標識ｐｉｌＥを発現する、表１−１〜１−４）、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＭ３中で、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉグリカンでグリコシル化されたＭＣ５８株からのピリン（ｐｉｌＥ遺伝子によってコードされる）を生成した。ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を培養物に添加して、細胞を静止期に収集した。０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液１）でペレットを洗浄し、Ｒｏｃｈｅ社製の完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する同一緩衝液に再懸濁した。細胞をフレンチプレスによって破壊し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞残骸を除去した。膜を超遠心（２００，０００×ｇで２時間）によって分離し、２％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を含有する緩衝液１（緩衝液２）に再懸濁した。懸濁液を遠心分離し（２００，０００×ｇで１時間）、次にイミダゾールを最終濃度２０ｍＭで上清に添加した。２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液２であらかじめ平衡化したＱｉａｇｅｎ社製のＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムに溶液を注入し、同一緩衝液で洗浄して非結合タンパク質を除去した。２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液２を使用して、結合タンパク質をカラムから溶出した。１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．８％ＤＤＭを含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５（緩衝液３）中で、溶出液を４℃で一晩透析した。緩衝液３で平衡化したＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社製のＳＢＡ−アガロースカラムにタンパク質溶液を注入した。カラムを緩衝液３で洗浄して非結合タンパク質を除去し、０．５Ｍ  Ｄ−ガラクトースを含有する緩衝液３でタンパク質を溶出した。タンパク質画分を収集して−２０℃で保存した。
【００６７】
Ｏ−グリカンのβ脱離
この実験では、Ｏ−グリコシル化されたＰｉｌＥを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＬＭ２４株を使用した。この株は、ｐＡＭＦ５、ｐＡＭＦ６、およびｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔで形質転換された。全細胞を収集して、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）と混合し、９５℃で１０分間加熱した。サンプルを１０％ゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。タンパク質をポリビニリデンフッ化物（ＰＶＤＦ）膜に転写して、帯状に切断した。帯状膜を異なる濃度の水酸化ナトリウム（０．０５５、０．０７、０．０９Ｍ）で処理した。Ｒ１２グリカン特異的抗体を使用して、４０℃で１６時間のインキュベーション後に、タンパク質の脱グリコシル化（すなわちβ脱離）に対するアルカリ処理の影響を検出した。
【実施例】
【００６８】
本発明をより完全に理解するために、次の実施例を示す。これらの材料と方法は例示のみを目的とし、本発明の範囲をどのようにも制限するものではないと解釈される。さらにこれらの実施例が本発明の均等物および変法の除外を意図しないことは、当業者には明白である。
【００６９】
（実施例１）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＰｇｌＬの機能発現
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中のｐｇｌＬの変異誘発は非グリコシル化ピリンの生成をもたらした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＰｇｌＬを発現させ、ｐｉｌＥ遺伝子によってコードされる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ピリンのグリコシル化に関して分析した。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ピリン遺伝子ｐｉｌＥを発現するプラスミドｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔおよびｐＡＭＦ３をＣＬＭ２４細胞に形質転換した。プラスミドｐＡＣＹＣｐｇｌは、常態ではＣ．ｊｅｊｕｎｉのＮ−グリコシル化中に転移されるグリカンの合成に必要な全ての酵素をコードするｐｇｌ遺伝子座を保有する（図１Ａ）（４）。その誘導体ｐＡＣＹＣｐｇｌＢｍｕｔは、ＰｇｌＢオリゴ糖転移酵素を不活性化する変異を有する。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ピリンに対するモノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって、成熟前および成熟ピリンに対応すると推定される２つのバンドが全細胞抽出物中に検出された（図２Ａの上側パネル参照）。これらの細胞を、ＰｇｌＬをコードするプラスミドｐＡＭＦ５でさらに形質転換すると、モノクローナル抗ピリン抗血清およびＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカン特異的Ｒ１２抗血清の双方で、電気泳動移動度がより小さいバンドがさらに検出され（図２Ａのレーン３参照）、ピリンがグリコシル化されたことが示唆された。グリコシル化ピリンの存在はＰｇｌＬ依存性であるため、ＰｇｌＬはＯＴａｓｅ活性を有すると結論された。ＰｇｌＬによってこの実験で転移されたＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカンの構造は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ピリン（図１Ｂ）に見られる三糖とは異なり、ＰｇｌＬがまた緩和された糖特異性も有することが示唆される。
【００７０】
Ｏ−結合グリカンは、弱アルカリ性条件下でβ脱離反応によってタンパク質から放出できる。それに反してＮ−グリカンは、これらの条件下ではタンパク質から分離されない。ピリンとＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカンとの間の結合は、β脱離の影響を受けやすかった（図３参照）。グリコシル化ピリンを含有する全細胞抽出物をＰＶＤＦ膜に転移して、Ｄｕｋら（１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：９８−１０２）によって記載されたプロトコールに従って、異なる濃度のＮａＯＨで処理した。タンパク質結合グリカンをＲ１２抗血清で検出した。ピリンとグリカンとの間の結合がアルカリ不安定性であるのに対し、Ｎ−グリコシル化されたＡｃｒＡはアルカリ処理に対して抵抗を示し（図３Ｂ）、予期されたようにピリンが実際にＯ−グリコシル化されたことが確認された。
【００７１】
これは、Ｓ６３の変異がグリコシル化を止めるという事実によって、さらに支持される（図２Ｂのレーン２）。Ｏ−グリコシル化のさらなる支持は、質量分析法によって同定されるように、ペンタペプチドＳ６３ＡＧＶＡ６７がＣ．ｊｅｊｕｎｉグリカンに付着したという観察によって提供される（図４）。
【００７２】
（実施例２）
ＰｇｌＬが多糖類を転移できるのに対し、ｐｉｌＯは短い炭水化物のみを転移する
Ｏ抗原重合、そして我々が示したようにピリングリコシル化は、どちらも細菌ぺリプラズムで起きる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＰｉｌＯによる重合Ｏ７抗原の転移（図１Ｃ）を試験した。ＳΦ８７４株（表１−１）は完全な内在性Ｏ抗原クラスターを包含する欠失を保有する。Ｏ−結合多糖類を作り出すために、ＳΦ８７４株中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ７抗原合成に必要な遺伝子クラスターを含有するプラスミドを導入した。異なるプラスミドを使用して、３種の異なるＯ７抗原変異体を生成した。野生型Ｏ７抗原（０７ＷＴ、図５Ａのレーン１参照）；単一Ｏ７サブユニットのみを生成するＯ抗原ポリメラーゼ（Ｏ７ｗｚｙｍｕｔ）変異体（図５Ａのレーン２参照）；および改変された長さ分布のＯ抗原を生成する、Ｏ−鎖長制御因子（ＯＴ  ｗｚｚｍｕｔ）遺伝子中の変異体（図５Ａのレーン３参照）（２０）。ｗａａＬ遺伝子を欠くＳΦ８７４株の誘導体であるＳＣＭ３株（表１−１）中で、ＰｉｌＯがＯ７抗原の３種の変異体を転移する能力が観察された。ｗｚｙ変異体中では、Ｏ７抗原の単一サブユニットがピリンに転移された（図５Ｂのレーン７）。野生型Ｏ７抗原中でのＯ７抗原の転移は検出不能であったが（図５Ｂのレーン６）、ｗｚｚ変異体中では２個までのＯ抗原サブユニットがピリンに転移された（図５Ｂのレーン８）。ｗｚｚ変異体は２、３、および４個のＯ反復単位を含有する同様の量の鎖を生成するが（図５Ａのレーン３）、３個以上の反復性サブユニットを含有するＯ抗原鎖は、ピリンに転移されなかった。したがってＰｉｌＯは、２個を超える反復性サブユニットを含有するＯ抗原グリカンを転移できない。ＰｉｌＯによって転移できる短鎖の形成がＷｚｚ活性によって低下したことから、野生型Ｏ７株中ではグリコシル化ピリンは検出されなかった。それに反してＰｇｌＬは、短いＯ７抗原、および完全に重合したＯ７抗原も転移できた（図５Ｂのレーン５〜８）。
【００７３】
Ｎ６０、Ｎ６１、およびＴ６２の変異はグリコシル化に影響しないので、図６は多糖類がセリン残基に転移されたことを示すのに対し、変異Ｓ６３Ａは多糖類のＰｉｌＥへの転移を完全に止めた。
【００７４】
（実施例３）
Ｕｎｄ−ＰＰ−グリカンのぺリプラズムへの転移はＰｉｌＯおよびＰｇｌＬ活性に必要である。
【００７５】
Ｏ抗原、ペプチドグリカン、菌体外多糖、およびカプセル生合成においては、ならびにＣ．ｊｅｊｕｎｉ中でのタンパク質Ｎ−グリコシル化においては、ウンデカプレノールピロリン酸（Ｕｎｄ−ＰＰ）基質がフリッパーゼの作用によってぺリプラズム中へ転移、すなわち「フリップ」される（Ａｌａｉｍｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，  前出）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＭ７株は全ての既知のフリッパーゼを欠いており、近年、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉグリコシル化系のフリッパーゼであるＰｇｌＫ（表１−２〜１−３）を特性決定するのに使用されている（Ａｌａｉｍｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，前出）。この株を使用して、ピリングリコシル化が起きる細胞区画を同定した。ｐＰＡＣ４６およびｐＡＣＹＣｐｇｌまたはｐＡＣＹＣｐｇｌＫ（表１）をＳＣＭ７細胞に導入した。無傷のｐｇｌクラスターを保有する細胞中で、ピリングリコシル化を検出した。ｐＡＣＹＣｐｇｌＫは、ｐｇｌＫ遺伝子中に非極性変異を有する。ピリンは、フリッパーゼが存在しない、ｐＡＣＹＣｐｇｌＫを保有するＳＣＭ７細胞中ではグリコシル化されず、したがってＵｎｄ−ＰＰ−グリカンのぺリプラズム中への転移は妨げられた（図７Ａおよび７Ｂのレーン２参照）。ＰｇｌＬ活性は、細胞中の機能性フリッパーゼ存在下のみで検出された。したがってＰｇｌＬ依存グリコシル化にはＵｎｄ−ＰＰ−結合オリゴ糖類の転移が必要であり、ＰｇｌＬ活性がぺリプラズムに局在することが示唆される。
【００７６】
（実施例４）
ＰｇｌＬは還元末端にヘキソースを保有するグリカンをピリンに転移できる
異なる血清型（すなわちネズミチフス菌（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびチフス菌（Ｔｙｐｈｉ））からのサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）Ｏ抗原は、還元末端にヘキソースがある反復するサブユニットから構成される（図１）。ＰｇｌＬが還元末端にヘキソースを含有するグリカンを転移できるかどうかを試験するために、ネズミチフス菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｏ抗原の合成に必要な酵素をコードする、プラスミドｐＰＲ１３４７を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（表１）中でＰｇｌＬおよびＰｉｌＥを同時発現させた。抗ピリンを使用したウエスタンブロット分析は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でこのＯ抗原がＰｇｌＬによってＰｉｌＥに転移できることを示した（図８Ａのレーン２参照）。ＰｇｌＬの対応する空ベクターによる置換は、非グリコシル化ピリンの発現をもたらした（図８Ａのレーン４）。さらにピリン変異体Ｔ６２Ａもまた、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｏ抗原（図８Ａのレーン３）でグリコシル化されたのに対し、ピリン変異体Ｓ６３Ａはグリコシル化を止めた（図８Ａのレーン１）。これは還元末端にガラクトースを含有するグリカンが、ＰｉｌＥ中のセリン残基に付着できることを実証する。
【００７７】
さらにＰｇｌＬおよびＰｉｌＥの双方が存在すれば、元の宿主Ｓ．エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）中でピリンのグリコシル化が達成できる（図８Ｂのレーン２）。ＰｇｌＬをコードするプラスミドの対応する空ベクターによる置換は、非グリコシル化ピリンをもたらす（図８Ｂのレーン１）。ＰｇｌＬはまた、ネズミチフス菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のＷｚｙ変異体中（図８Ｂのレーン４）、およびチフス菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）のＷｚｙ変異体中（図８Ｂのレーン６）で生成されるＯ抗原に単一サブユニットを転移できる。図８Ｂ中の矢印は、単一Ｏ抗原サブユニットによるグリコシル化ピリンの位置を示す。レーン３および５は、その中でＰｇｌＬを発現するプラスミドが対応する空ベクターによって置換されている、グリコシル化のネガティブコントロールである。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１：PilEEcoRI プライマー
配列番号２：PilEHindIII プライマー
配列番号３：PglLEcoRI プライマー
配列番号４：PgILHindIII プライマー
配列番号５：PilLEsalI-His プライマー
配列番号６：PglLSalI プライマー
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月2日(2015.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物に、少なくとも
（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、および（ｃ）脂質キャリア上へのグリカンのアセンブルに必要な遺伝子を含むＤＮＡを所望の順序で導入するステップを少なくとも含み、
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がグリカンとタンパク質との共有結合を促進してＯ−グリコシル化されたタンパク質を生成する、原核生物においてグリカンによってタンパク質をＯ−グリコシル化する方法。
【請求項２】
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）中でｐｇｌＬによって発現されるタンパク質によってもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｉｌＥを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
原核生物がナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、またはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属由来の細菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グリカンがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＬＴ２または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
グリカンが還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ガラクトースが還元末端に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子が、グリコシル基転移酵素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法で生成されたＯ−グリコシル化されたタンパク質を含むワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法で生成されたＯ−グリコシル化されたタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法でＯ−グリコシル化されたタンパク質を生成するための、ＰｇｌＬタンパク質及びＰｉｌＥタンパク質の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月17日(2015.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物に、少なくとも
（ａ）ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、（ｂ）Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子を含むＤＮＡ、および（ｃ）脂質キャリア上へのグリカンのアセンブルに必要なグリコシル基転移酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡを所望の順序で導入するステップを少なくとも含み、
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素がグリカンとタンパク質との共有結合を促進してＯ−グリコシル化されたタンパク質を生成する、原核生物においてグリカンによってタンパク質をＯ−グリコシル化する方法。
【請求項２】
ＰｇｌＬ様オリゴ糖転移酵素が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）中でｐｇｌＬによって発現されるタンパク質によってもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｏ−グリコシル化されるタンパク質を生成する遺伝子が、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のｐｉｌＥを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
原核生物がナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、またはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属由来の細菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
グリカンがカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＬＴ２または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
グリカンが還元末端にヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソース誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ガラクトースが還元末端に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
脂質担体が、ウンデカプレノールピロリン酸、ドリコールピロリン酸、またはその合成均等物を含むポリプレノールピロリン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
原核生物がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法で生成されたＯ−グリコシル化されたタンパク質を含むワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法で生成されたＯ−グリコシル化されたタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法でＯ−グリコシル化されたタンパク質を生成するための、ＰｇｌＬタンパク質およびＰｉｌＥタンパク質の使用。