(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を簡易に付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を簡易に導入することができる、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを提供することにある。【解決手段】ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製する。また、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータのセンス鎖配列とプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列を順次備えたフォワードプライマーを作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ；
【請求項２】
ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列が、タンパク質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする請求項１記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項３】
ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項４】
プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列又はヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項５】
プラスミドの複製開始点、又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項６】
（ａ）におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流、又は、（ｂ）におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流に、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項７】
ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが２００〜５０００塩基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ。
【請求項８】
ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたことを特徴とするフォワードプライマー。
【請求項９】
ターミネータ配列のセンス鎖配列が、長さ３０〜２５０塩基であり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とする請求項８記載のフォワードプライマー。
【請求項１０】
ターミネータ配列のセンス鎖配列が、配列番号３又は４で示される配列であることを特徴とする請求項８又は９記載のフォワードプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、該ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタンパク質を細胞内に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等に広く用いられており、今日では欠かせない技術である。細胞内で特定のタンパク質を発現させるためには、細胞内へタンパク質をコードする遺伝子を導入する方法が有用であり、導入する遺伝子等のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の運搬体としてプラスミドベクターを使用した方法が広く利用されている。
【０００３】
一方、これまでに正確性の高いＤＮＡポリメラーゼが開発されたことから、ＰＣＲ法によりタンパク質をコードする遺伝子を数時間で合成することが可能になった。そこで、タンパク質をコードする遺伝子を含む線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入する方法も検討されている。この方法により、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡが十分に発現すれば、従来の手間と時間のかかるプラスミド構築を、簡便で迅速なＰＣＲ法による線状二本鎖ＤＮＡの作製に替えることが可能となり、大幅な時間の短縮、ハイスループット化が期待できる。
【０００４】
線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞内に導入し、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる場合に用いる線状二本鎖ＤＮＡとしては、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列等のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、ターミネータ配列を順次備える線状二本鎖ＤＮＡが用いられているが、細胞内でのＲＮＡの発現は簡便かつ十分なものではなかった。また、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列、発現マーカーをコードするＤＮＡ配列、ターミネータ配列、ポリアデニレーションシグナル配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製する方法が提案されているが（特許文献１参照）、各配列の両端に制限酵素サイト又はアニーリング配列をそれぞれ組み込み、ＰＣＲ法により該ＤＮＡ断片を構築し、次いでその５’末端にリン酸を付加するか制限酵素により突出末端を作製してセルフライゲーションにより環状化を行う必要がある等、作業が煩雑でかつ時間がかかるという問題があり、さらに、作製したＤＮＡ断片も、線状二本鎖ＤＮＡとしてではなく、環状化して動物細胞に導入するものであった。
【０００５】
本発明者らは、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、線状二本鎖ＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマーや、このプライマーを用いて、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と前記連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法により作製し、これを細胞内に導入してＲＮＡを発現させることを提案した（特許文献２参照）。
【０００６】
この特許文献２の手法により、複雑な操作を必要とせず、簡便かつ迅速にＲＮＡ発現用の線状二本鎖ＤＮＡを作製することができ、該線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入することにより、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを簡便かつ十分に発現させることが可能となった。しかしながら、あくまでプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えたものであるため、タンパク質にシグナルペプチド又はタグペプチドを付与する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とプロモータ配列又はターミネータ配列との間にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入する必要があり、作業が煩雑になるという問題が残っていた。さらに、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対して変異を導入する場合にも、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にプロモータ配列、下流にターミネータ配列を備えていることから、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入する作業が煩雑になるという問題も残っていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１４１０２５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、ＲＮＡ発現用の線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入することにより細胞内でＲＮＡを簡便かつ目的に応じて十分に発現させることができるようになったものの、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等において、発現するタンパク質にシグナルペプチド、タグペプチド等のペプチドを付与する場合や、変異を導入する場合は、該線状二本鎖ＤＮＡの作製について改良すべき点が残されていた。
【０００９】
本発明の課題は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を簡易に付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を簡易に導入することができる、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、タンパク質をコードする遺伝子配列の下流にターミネータ配列が結合されていない線状二本鎖ＤＮＡと、ターミネータ配列を有する線状二本鎖ＤＮＡとを用いて、細胞内でＲＮＡを発現させることを鋭意検討したなかで、プロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを複数作製した。その過程で、ターミネータ配列とプロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞に導入したところ、驚くことに細胞内で遺伝子が発現することを見いだした。
【００１１】
これまでの技術常識では、細胞内で遺伝子を発現させるには、プロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備える二本鎖ＤＮＡを細胞に導入する必要があったが、前記結果から、細胞に導入する線状二本鎖ＤＮＡとしては、必ずしもプロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えることが必須ではないと考え、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列、ターミネータ配列の配置を様々に組み合わせて実験を行ったところ、ターミネータ配列とプロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡや、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入した場合に細胞内で遺伝子が発現することを見いだし、加えて、かかる線状二本鎖ＤＮＡは、シグナルペプチドやタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を簡易に付与できること、シグナルペプチドやタグペプチドを付与しても細胞内で遺伝子が発現すると共にシグナルペプチドやタグペプチドが有効に機能すること、ＲＮＡ発現用ＤＮＡに変異を簡易に導入できること等、非常に有用であることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、［１］（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、又は（ｂ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、に示されるターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［２］ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列が、タンパク質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする上記［１］記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［３］ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［４］プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列又はヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［５］プラスミドの複製開始点、又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［６］（ａ）におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流、又は、（ｂ）におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流に、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えたことを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［７］ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが２００〜５０００塩基であることを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに関する。
【００１３】
また、本発明は、［８］ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたことを特徴とするフォワードプライマーや、
［９］ターミネータ配列のセンス鎖配列が、長さ３０〜２５０塩基であり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とする上記［８］記載のフォワードプライマーや、
［１０］ターミネータ配列のセンス鎖配列が、配列番号３又は４で示される配列であることを特徴とする上記［８］又は［９］記載のフォワードプライマーに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡによれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することが簡易となる。即ち、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に付与する場合は、前述の（ａ）の態様によれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列の間に挿入する必要はなくＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流にこれを連結するのみでよく、また、前述の（ｂ）の態様によれば、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の間に挿入する必要はなくＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にこれを連結するのみでよく、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に簡易に付与することができる。この効果は、特にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を変えてその発現をそれぞれ検討する場合や目的に応じて上記ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を変える場合により大きいものとなる。さらに、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入する場合は、前述の（ａ）の態様によれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のアンチセンス鎖配列に変異を有する配列を含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけでよく、前述の（ｂ）の態様によれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のセンス鎖配列に変異を有する配列を含むフォワードプライマー用いてＰＣＲを行うだけでよい。
【００１５】
また、本発明によれば、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することも簡易にできるようになる。即ち、前述の（ａ）の態様では、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流にターミネータ配列を連結する必要がなく、（ｂ）の態様では、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にプロモータ配列を連結する必要がないため、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製しておくことで、特にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を変えてその発現をそれぞれ検討する場合は、対応するＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを簡易に作製することができる。
【００１６】
さらに、ターミネータ配列のセンス鎖配列とプロモータ配列にアニールする配列を順次備えた本発明のフォワードプライマーにより、複雑な操作を必要とせず、簡易かつ迅速に、ターミネータ配列の下流にプロモータ配列を順次備えた配列を含むＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となり、シグナルペプチド、タグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を付与することやＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することが簡易にできるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１、３、５、７に用いたｐＥＧＦＰ−Ｃ１のマップを示す図である。
【図２】（ａ）実施例１において作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−３をヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入して観察した結果であり、写真の左が微分干渉顕微鏡像、右が蛍光顕微鏡像を示す図である。（ｂ）実施例１において作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−１をＨＥＫ２９３細胞に導入して観察した結果であり、写真の左が微分干渉顕微鏡像、右が蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図３】実施例２で作製した、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ）、及び、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ）のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図４】（ａ）実施例２で作製した、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧの配置図である。（ｂ）実施例２における、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したトータルタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果を示す図である。（ｃ）実施例２において、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧをＨＥＫ２９３細胞に導入して観察した蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図５】実施例３で作製した、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）、及び、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＣＡＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸ）のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図６】（ａ）実施例３における、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＣＡＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に導入して観察した結果であり、左写真が微分干渉顕微鏡像、右写真が蛍光顕微鏡像を示す図である。（ｂ）実施例３における、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に導入して観察した結果であり、左写真が微分干渉顕微鏡像、右写真が蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図７】実施例４で作製した、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ）、及び、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図８】実施例４で作製した、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ、βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃを各ＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ導入し、分泌型ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。
【図９】実施例４で作製した、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ、βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃを各ヒト子宮頸部類上皮腫細胞（ＨｅＬａ細胞）にそれぞれ導入し、分泌型ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。
【図１０】実施例４で作製した、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ、βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃを各アフリカミドリザル腎臓由来細胞（ＣＯＳ−７）細胞にそれぞれ導入し、分泌型ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。
【図１１】実施例４で作製した、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ、βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃを各ＮＩＨ由来のマウス胎仔由来線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）にそれぞれ導入し、分泌型ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。
【図１２】（ａ）実施例５で作製した、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１、ｊ−４のアガロース電気泳動の結果を示す図である。（ｂ）実施例５で作製した、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１４、ｊ−２１のアガロース電気泳動の結果を示す図である。（ｃ）実施例５で作製した、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ２−１のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図１３】実施例５、７で用いたｐＫＭ４２６のマップを示す図である。
【図１４】（ａ）実施例５で作製した、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１４（ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）をＨＥＫ２９３細胞（上段）及びＨｅＬａ細胞（下段）にそれぞれ導入して観察した結果であり、右が微分干渉顕微鏡像、左が蛍光顕微鏡像を示す図である。（ｂ）実施例５で作製した、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ２−１（ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）をＨＥＫ２９３細胞（上段）及びＨｅＬａ細胞（下段）にそれぞれ導入した結果であり、（１）及び（２）それぞれ右が微分干渉顕微鏡像、左が蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図１５】実施例６で用いたｐＫＭ５９３のマップを示す図である。
【図１６】実施例６で作製した、β−グロビンターミネータ配列と、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ）、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ）、及び、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータとを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−βＧｌｏｂｉｎ（１２１−２２０））のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図１７】実施例６において、ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ、ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−βＧｌｏｂｉｎ（１２１−２２０）、β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃを各ＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入してルシフェラーゼを測定した結果を示す図である。
【図１８】（ａ）実施例７で作製した、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−１１、Ｎｏ．ｏ−１３〜Ｎｏ．ｏ−１６のアガロース電気泳動の結果を示す図である。（ｂ）実施例７で作製した、線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−１７〜Ｎｏ．ｏ−２１のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図１９】実施例７で作製した、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図２０】実施例７で作製した、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７の配置図である。図中、Ｓｕ９はミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ＥＧＦＰはＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列、ｔｅｒはＳＶ４０ターミネータ、５ＣＧＣはシトシンとグアニンが１００％のＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣからなる配列、ＣＭＶｐはＣＭＶプロモータであり、ｏ−４３における−１０００〜−６００、ｏ−４４における−２０００〜−６００、ｏ−４５における−３０００〜−６００、ｏ−４６における−３７１７〜−６００はｐＥＧＦＰ−Ｃ１中の配列を示す。
【図２１】実施例７で作製した、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７を各ＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入して観察した結果であり、上が蛍光顕微鏡像、下が微分干渉顕微鏡像を示す図である。
【図２２】実施例８で作製した、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａのアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図２３】実施例８における、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａ、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したトータルタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡとしては、（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（以下、「本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１」ということがある）や、（ｂ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（以下、「本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２」ということがある）であれば特に制限されず、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞に導入するだけで、細胞内でＲＮＡを発現させることが可能であるものであればよい。本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１としては、ターミネータ配列の下流（３’末端側）にプロモータ配列が動作可能に連結され、さらに前記プロモータ配列の下流にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列が動作可能に連結されているものであればよく、また、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２としては、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流にターミネータ配列が動作可能に連結され、前記ターミネータ配列の下流にプロモータ配列が動作可能に連結されているものであればよい。
【００１９】
また、本発明のフォワードプライマーとしては、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたことを特徴とするフォワードプライマーであれば特に制限されず、ここで、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたものとしては、ターミネータ配列のセンス鎖配列の下流にプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列が連結されているものであればよい。
【００２０】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや本発明のフォワードプライマーにおけるターミネータ配列としては、ＲＮＡの発現を行う目的、ＲＮＡ発現を行う細胞の種類、プロモータの種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類等によって適宜選択することができ、天然に存在するターミネータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したターミネータ配列であってもよいが、複雑な操作を必要とせずに簡易かつ迅速に本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するには、人工的に合成したターミネータ配列を選択することが好ましい。人工的に合成したターミネータ配列は、変異ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、天然に存在するターミネータ配列の部分配列であっても、そのＤＮＡ配列に置換、欠損、挿入を有するものであってもよい。
【００２１】
人工的に合成したターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、十分なＲＮＡ発現量を目的に応じて得る観点から、１番目の塩基がＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、又はＧ（グアニン）であり、２番目の塩基がＡ、Ｔ、又はＧであり、３番目の塩基がＴであり、４番目の塩基がＡであり、５番目の塩基がＡであり、６番目の塩基がＡであり、７番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ（シトシン）であり、８番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり、９番目の塩基がＡ、Ｇ、又はＣである、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列を好適に例示することができ、この９塩基として、Ａ，（Ａ／Ｔ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むものをより好適に例示することができ、かかる連続した９塩基は１又は２以上含まれていてもよい。また、人工的に合成したターミネータ配列の長さとしては、上記観点に沿う限り特に制限されないが、本発明のフォワードプライマーにおいては、好ましくは３０〜２５０塩基、より好ましくは４０〜２００塩基、さらに好ましくは６０〜１２０塩基からなるのがよい。
【００２２】
このようなターミネータ配列としては、公知の文献（国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット）等に記載の配列を利用することができ、例えば、ラビットβ−グロビン（Ｒａｂｂｉｔ  β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列（配列番号１）又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列（配列番号２）の一部であって上記の長さ及び配列を有するものを好ましく挙げることができ、この中から、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて十分なＲＮＡ発現量が得られるものを適宜選択することが好ましい。例えば、ラビットβ−グロビンターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜１９０番目の塩基配列（配列番号３）や、ラビットβ−グロビンターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜１８０番目、１２１〜２００番目、１２１〜２２０番目、１３０〜１９０番目の塩基配列、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１３０〜２０８番目の塩基配列（配列番号４）や、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜２２０番目、１３０〜２２０番目の塩基配列等をより好ましく挙げることができる。
【００２３】
また、天然に存在するターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、ウィルスのターミネータ配列であっても、大腸菌、枯草菌等の原核生物のターミネータ配列であっても、酵母、マウス、ヒト、ラビット等の真核生物のターミネータ配列であってもよく、具体的には、ラビットβ−グロビン（Ｒａｂｂｉｔ  β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネータ配列、ＨＳＶ・ＴＫターミネータ配列、ＣＹＣ１ターミネータ配列、ＡＤＨターミネータ配列、ＳＰＡターミネータ配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネータ配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネータ配列、トウモロコシ由来のＺｅｉｎ遺伝子ターミネータ配列、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネータ配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子ターミネータ配列、ＬａｃＺアルファターミネータ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列等を挙げることができ、十分なＲＮＡ発現量を目的に応じて得る観点からは、好ましくはラビットβ−グロビンターミネータ配列（配列番号１）やＳＶ４０ターミネータ配列（配列番号２）を挙げることができる。
【００２４】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや本発明のフォワードプライマーにおけるプロモータ配列としては、十分なＲＮＡの発現を得る目的、ＲＮＡを発現させる哺乳動物等の細胞の種類やＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、ターミネータ配列等により適宜選択することができ、具体的には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモータ配列、アデノウィルス後期（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｌａｔｅ、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモータ配列、ＳＶ４０及びＨＴＬＶ−１  ＬＴＲの融合プロモータであるＳＲαプロモータ配列、ヒトユビキチンＣプロモータ配列、α−アクチンプロモータ配列、β−アクチンプロモータ配列、Ｕ６プロモータ配列、Ｈ１プロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が抑制されるＴｅｔ−Ｏｆｆプロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が誘導されるＴｅｔ−Ｏｎプロモータ配列、亜鉛等の金属や種々の刺激により誘導されるメタロチオネインプロモータ配列、活性酸素により誘導されるＡＲＥプロモータ配列を挙げることができ、ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくはＣＭＶプロモータ配列、ヒト伸長因子ＥＦ１αプロモータ配列、より好ましくはＣＭＶプロモータ配列を好適に挙げることができ、ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、その部分配列であっても、ＤＮＡ配列の置換、欠失、挿入を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡ配列であればよく、タンパク質をコードする遺伝子配列の他、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）発現配列、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列等の機能性核酸を発現するＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００２６】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質を発現する場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質をコードする遺伝子配列を選択することができ、タンパク質をコードする遺伝子配列としては、用途に合わせて全長の遺伝子配列でも、その一部でもよく、変異が導入されていてもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製した人工的な遺伝子でもよく、遺伝子における５’末端の開始コドン及び３’末端に停止コドンは適宜含んでいても含んでいなくてもよい。
【００２７】
また、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質の発現をノックダウンする場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制できるｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、ｓｉＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、アンチセンスオリゴヌクレオチドを選択することができる。また、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制できる核酸アプタマー発現配列や、リボザイム発現配列を選択することができ、特定の遺伝子の転写を抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としてデゴイ発現配列を設定することができ、上記配列は、それぞれ標的ＲＮＡの配列、及び、その転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて人工合成することができる。また、疾患の治療効果を有するタンパク質を発現する配列や、疾患の原因又は進行に関わるタンパク質の発現抑制機能を有する配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とすることにより、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをＤＮＡワクチンとして応用することができる。
【００２８】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡとしては、プラスミドの複製開始点、又は薬剤耐性遺伝子を含まないものが好ましく、プラスミドの複製開始点としては、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子等の複製開始点を挙げることができ、薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００２９】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡは、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流、又は、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えることができる。シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等を好適に挙げることができ、タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等を好適に挙げることができる。
【００３０】
また、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおいては、ターミネータ配列とプロモータ配列の間、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列の少なくとも一方にはリンカー配列を備えることもできる。リンカー配列は、ターミネータ配列とプロモータ配列、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列を連結する配列であり、長さとしては、十分なＲＮＡの発現量を得る観点からは、好ましくは１０００塩基以内、より好ましくは３００塩基以内、さらに好ましくは１００塩基以内、中でも３０塩基以内を挙げることができ、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の任意の塩基から構成される。
【００３１】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さ（塩基）としては、ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくは２００〜５０００塩基、より好ましくは２００〜３０００塩基、さらに好ましくは２００〜１７００塩基を挙げることができる。
【００３２】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法としては特に制限されず、フュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０）等のＰＣＲ法や制限酵素処理とＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション法により、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次有するように連結させる方法や、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列を順次有するように連結させる方法を例示することができるが、ＰＣＲ法を用いた方法を好適に例示することができる。
【００３３】
例えば、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡをテンプレートとすれば、本発明のフォワードプライマーと、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域の配列のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１を簡易かつ迅速に作製することが可能となる。テンプレートとして用いるプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡは、線状二本鎖ＤＮＡでも環状ＤＮＡでもよい。
【００３４】
また、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡがない場合には、まず、本発明のフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域の配列のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーとを用いてプロモータ配列をテンプレートとしてＰＣＲを行うことでターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製し、次に、作製した前記線状二本鎖ＤＮＡにおけるターミネータ配列の上流、又は作製した前記線状二本鎖ＤＮＡにおけるプロモータ配列の下流にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を常法により連結させることで本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することができる。
【００３５】
この他、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、長さとしては９〜４５塩基、好ましくは１２〜２４塩基であり、塩基としてはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が５０％以上、好ましくは８０％以上であり、より好ましくはシトシンとグアニンが１００％のＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣ（配列番号５：５ＣＧＣ）からなるアニーリング配列を含むリンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡと、該アニーリング配列を含むリンカー配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、得られた２つの線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーでＰＣＲを行う方法や、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と該アニーリング配列を含むリンカー配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡと、該アニーリング配列を含むリンカー配列とターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、得られた２つの線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーでＰＣＲを行う方法も挙げることができる。
【００３６】
ターミネータ配列として１００塩基を超えるように長い配列を用いる場合には、まずはターミネータ配列の下流の配列のセンス鎖配列とプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列を順次備えた本発明のフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いて、プロモータ配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ターミネータ配列の下流の配列とプロモータ配列を順次備えた配列からなる線状二本鎖ＤＮＡを作製する。また、別途ターミネータ配列の全長を有する線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ等により作製する。次に上記で得られたターミネータ配列の下流の配列とプロモータ配列を順次備えた配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ及びターミネータ配列の全長を有する線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域の配列のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーとプロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製することもできる。その後、作製した線状二本鎖ＤＮＡにおけるターミネータ配列の上流又は作製した線状二本鎖ＤＮＡにおけるプロモータ配列の下流に、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を常法により連結させることで本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することができる。
【００３７】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグペプチド、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等のタグペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモータ活性を増強するエンハンサー配列等をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流に簡易に付与することが可能となる。
【００３８】
例えば、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１をテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、付与するシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列のアンチセンス鎖配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えたリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１の下流（３’末端側）にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を付与することや、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２をテンプレートとして、付与するシグナルペプチド、タグペプチド等をコードするＤＮＡ配列のセンス鎖配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列にアニールする配列とを順次備えたフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２の上流（５’末端側）にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を付与することが可能となる。
【００３９】
さらに、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に置換、付加、欠損等の変異を簡易に導入することが可能となる。例えば、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１をテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を有する配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することができ、また、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２をテンプレートとして、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域のセンス鎖配列に変異を有する配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することができる。
【００４０】
本発明のフォワードプライマーは人工的に化学合成したり、かかるフォワードプライマーのＤＮＡ配列をテンプレートにＰＣＲ法にて増幅したり、遺伝子工学的手法にて、かかるフォワードプライマーのＤＮＡ配列を組み込んだプラスミドを大腸菌等を用いて増幅し、制限酵素等を用いて切り出すこと等によって作製することができる。
【００４１】
本発明のフォワードプライマーにおける、ターミネータ配列のセンス鎖配列の長さとしては、好ましくは３０〜２５０塩基、より好ましくは４０〜２００塩基、さらに好ましくは６０〜１２０塩基を挙げることができる。
【００４２】
本発明のフォワードプライマーは、ＰＣＲ反応を阻害しない限りは、標識分子配列、タグペプチド、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでもよく、また、同位体等で標識や修飾を受けたＤＮＡ分子であってもよい。かかる標識分子としては、蛍光色素、化学物質等を挙げることができ、タグペプチドとしてはＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等を挙げることができ、シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチドを挙げることができる。
【００４３】
本発明のフォワードプライマーにおけるプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列の長さとしては、好ましくは５塩基〜５０塩基、より好ましくは１０塩基〜３０塩基、特に好ましくは１５塩基〜２５塩基を挙げることができ、プロモータとして機能しうる配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含有していればよく、必ずしもプロモータ配列の５’末端の塩基を含む必要はない。
【００４４】
本発明のフォワードプライマーは、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットとして提供することもでき、かかるキットには本発明のフォワードプライマーの他、バッファー、ｄＮＴＰｓ、コントロールテンプレート、説明書等を含んでもよい。
【００４５】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内にそのまま導入することでＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造することができる。本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販のトランスフェクション試薬ならびに当技術分野で広く用いられている手法を用いることができる。
【００４６】
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する場合において、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを導入する細胞としては、哺乳動物細、植物細胞、昆虫細胞、酵母等を挙げることができ、好ましくは哺乳動物細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ由来の細胞を挙げることができ、特に好ましくはヒト、マウス由来の細胞を好適に挙げることができる。
【００４７】
本発明においてＲＮＡ発現を行う細胞株としては、好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ヒト骨肉腫細胞（ＨＯＳ細胞）、培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１細胞）、ヒト白血球Ｔ細胞（ｊｕｒｋａｔ細胞）、ヒト乳癌培養樹立細胞（ＭＣＦ−７細胞）、ヒト肝臓ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、ヒト結腸癌由来細胞（ＣａＣＯ−２細胞）、ヒト骨芽細胞（ＳａＯＳ細胞）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）、サル腎由来細胞（ＣＶ−１細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−１細胞）、マウス由来線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）、マウス奇形腫細胞（Ｆ９細胞）、マウス骨芽様細胞（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞）、ラット副腎髄質褐色腫（ＰＣ−１２細胞）、ラット骨芽細胞様細胞（ＲＯＳ１７／２．８細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１細胞）等を挙げることができ、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を挙げることができ、株化Ｂリンパ芽球（ＥＢ３細胞）等の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、組織から採取した初代培養細胞等でもよい。
【００４８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（１）］
（実施例：β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号６(ｐＥＧＦＰ−６００)に示されるフォワードプライマーと配列番号７（ｐＥＧＦＰ＋７２０ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−１を作製した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のマップを図１に示す。
【００５０】
次に、ｐＴＲＩＥＸ−３  Ｈｙｇｒｏ  β−ｇａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をテンプレートとして、配列番号８（ｈＧｌｕｃＣ（２８）−ＧｌｏｂｉｎｐＡ＋２１）に示されるフォワードプライマーと配列番号９（ｐＥＧＦＰ−５７３ｃ−βＧｌｏｂｉｎｐＡ＋５００ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列（配列番号１）の塩基番号２１番目〜５００番目の配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−２を作製した。
【００５１】
ＰＣＲ反応は、ＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート５０ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて，９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。
【００５２】
さらに前記作製した２種類の線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｉ−１及びＮｏ．ｉ−２をテンプレートとして、配列番号８に示されるフォワードプライマーと配列番号７に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−３を作製した。ＰＣＲ反応は、前記と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。
【００５３】
（比較例：ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号７に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−１を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも前記と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。
【００５４】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記作製した、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−３、及び、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｉ−１それぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。
【００５５】
（結果）
β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを導入した細胞では緑蛍光が観察されたが（図２（ａ）右写真）、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを導入した細胞では緑蛍光が観察されなかった（図２（ｂ）右写真）。前記結果より、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することで、細胞内でＲＮＡが発現することが明らかとなった。
【実施例２】
【００５６】
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、β−グロビンターミネータ配列のセンス鎖配列と、ＣＭＶプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えた配列番号１０（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）−ｅＣＭＶ−６００）に示されるフォワードプライマーと、配列番号１１（９Ｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋６８７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を作製した。
【００５７】
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１をテンプレートとして、配列番号１０に示されるフォワードプライマーと配列番号１２（９Ｃ−ＤＹＫＤＤＤＤＫｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋６８７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ）を作製した。
【００５８】
ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図３（１）、（２）に示す。
【００５９】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、作製したβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙそれぞれ１００ｎｇを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入した。β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧの配置図を図４（ａ）に示す。
【００６０】
（ウェスタンブロッティングによるｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＬＡＧ発現の確認）
β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞から常法にしたがってトータルタンパク質を抽出した。得られたトータルタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後、分離したタンパク質をメンブレンにトランスファーした。このメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした後、洗浄バッファーにて洗浄を行なった。洗浄したメンブレンに、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体である１Ｅ６（和光純薬工業社製）、Ｍ２（シグマアルドリッチ社製）、ＦＬＡ−１（ＭＢＬ社製）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体であるＲＦＰポリクローナル抗体（ＭＢＬ社製）を添加してインキュベートした後に洗浄した。洗浄したメンブレンに、２次抗体ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）又は、ＨＲＰ−抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を添加した。メンブレン上の発色の様子を観察した結果を図４（ｂ）に示す。
【００６１】
（結果）
図４（ｂ）において、右レーン（ＦＬＡＧ）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質、左レーン（−）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果である。右レーンでは抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（ａｎｔｉ−ＲＦＰ）のいずれを用いてもバンドが検出され、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧを導入したＨＥＫ２９３細胞においてＦＬＡＧペプチドを融合したｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が存在していることが明らかとなった。
【００６２】
一方、左レーンでは抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体を用いた場合のみにバンドが検出され、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＨＥＫ２９３細胞においてはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が存在していることが明らかとなった。さらに、ＨＥＫ２９３細胞にβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧを導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した結果、赤色蛍光が観察され（図４（ｃ））、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が細胞内で発現していることが確認された。
【００６３】
前記結果より、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現すること、及び、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡの下流にタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を簡易に付与することが可能であることが明らかとなった。さらに、本発明のフォワードプライマーを用いることで、簡便かつ迅速にターミネータ配列の下流にプロモータ配列を順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することができることが明らかとなった。
【実施例３】
【００６４】
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＣＡＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列を順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号１０に示されるフォワードプライマーと配列番号１３（３ＣＧＣ９−ＣＣＴＩＣｃ−ｐＥＧＦＰ＋７１７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＣＡＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図５（２）に示す。
【００６５】
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号１０に示されるフォワードプライマーと配列番号１４（ＥＧＦＰ＋７１７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図５（１）に示す。
【００６６】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、作製したｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸ、及びｐＥＧＦＰそれぞれ１００ｎｇを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により細胞に導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸを細胞に導入して観察した結果を図６（ａ）、ｐＥＧＦＰを細胞に導入して観察した結果を図６（ｂ）に示す。
【００６７】
（結果）
ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸを導入した細胞においては、ゴルジ・細胞膜が存在する場所に緑蛍光が観察され、ＥＧＦＰタンパク質がゴルジ・細胞膜が存在する場所に局在して発現していることが確認された。一方、ｐＥＧＦＰを導入した細胞においては、細胞全体に緑蛍光が観察された。
【００６８】
前記結果より、ターミネータ配列とプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現すること、及び、シグナルペプチドが有効に機能していることが明らかとなった。
【実施例４】
【００６９】
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（２）］
（プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと、配列番号１５（Ｇｌｕｃ＋５５８ｔｔａＣ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（１）に示す。
【００７０】
（ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、ＳＶ４０ターミネータ配列のセンス鎖配列とＣＭＶプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えた配列番号１６（ＳＶ４０ｐＡ（１３０−２０８）−ｅＣＭＶ−６００）に示されるフォワードプライマーと配列番号１５に示されるリバースプライマーを用いて、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１３０番目〜２０８番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（３）に示す。
【００７１】
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、β−グロビンターミネータ配列のセンス鎖配列とＣＭＶプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えた配列番号１７（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）−ｅＣＭＶ−６００）に示されるフォワードプライマーと配列番号１５に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（５）に示す。
【００７２】
（ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
まず、ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号１８（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ＋１４０ｃ−Ｇｌｕｃ＋５５８ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１４０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−ＳＶ４０  １２１−１４０）を作製した。次に、作製したＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−ＳＶ４０  １２１−１４０をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号１９（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ（１２１−２２０）ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜２２０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（２）に示す。
【００７３】
（ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
まず、ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号２０（βＧｌｏｂｉｎｐＡ（１２１−１４０）ｃ−ｈＧｌｕｃ＋５５８ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１４０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ１２１−１４０）を作製した。次に、作製したＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ１２１−１４０をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号２１（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）ｃＷＴ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲ反応は、それぞれ実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（４）に示す。
【００７４】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をそれぞれ２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記で得られた、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒそれぞれ４０ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをＢｉｏＬｕｘ  Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とＣｅｎｔｒｏ  ＬＢ９６０（ベルトールド社製）を用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた場合におけるルシフェラーゼの測定をそれぞれ図８〜１１に示す。
【００７５】
（結果）
Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ及びβｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃを導入することにより、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のすべてにおいてルシフェラーゼ活性が測定され、それぞれの細胞内でルシフェラーゼ遺伝子が発現していることが明らかとなった。特にβｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃにおいては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞を用いた場合には、従来の二本鎖ＤＮＡで用いられている配列の順である、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ）よりもルシフェラーゼ量が高い値であった。
【００７６】
前記結果より、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現することが明らかとなり、特に、ターミネータ配列としてβ−グロビンターミネータ配列、プロモータ配列としてＣＭＶプロモータ配列を用い、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、又はＣＯＳ−７細胞に導入することで、細胞内においてＲＮＡを高発現させることが可能であることが明らかとなった。
【実施例５】
【００７７】
［ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号２２（６ＡＣ−ｐＥＧＦＰ−６００）に示されるフォワードプライマーと配列番号２３（ＣＭＶｐＣ）に示されるリバースプライマーを用いて、６ＡＣ（ａｃａｃａｃａｃａｃａｃ）−ＣＭＶプロモータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−１）を作製した。次に、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号２４（ｐＥＧＦＰ＋１）に示されるフォワードプライマーと配列番号２５（ｅＣＭＶ−５７１６００ｃ−ｐＥＧＦＰ＋１０１８ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列上流側３０塩基とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−４）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。さらに前記作製した２種類の線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１及びＮｏ．ｊ−４をテンプレートとして、配列番号２４に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−１４：ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。作製したそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１、ｊ−４、ｊ−１４のアガロース電気泳動の結果をそれぞれ図１２（ａ）、図１２（ｂ）に示す。
【００７８】
［シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号２２に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、６ＡＣ−ＣＭＶプロモータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−１）を作製した。次に、図１３に示すＫｍ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＫＭ４２６をテンプレートとして、配列番号２６（ｅＣＭＶ−３０−ＮｃＳｕ９＋１）に示されるフォワードプライマーと配列番号２５に示されるリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列の上流側３０塩基とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−２１）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分秒のサイクルを３０回行った。
【００７９】
さらに、前記作製した２種類の線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１及びｊ−２１をテンプレートとして、配列番号２７（ＮｃＳｕ９＋１）に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ２−１：ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートとして  Ｎｏ．ｊ−1及びＮｏ．ｊ−２１それぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。
【００８０】
作製したそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−２１、ｊ２−１のアガロース電気泳動の結果をそれぞれ図１２（ｂ）、図１２（ｃ）に示す。
【００８１】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞をそれぞれ２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ２−１及びｊ−１４それぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図１４に示す。
【００８２】
（結果）
図１４（ａ）は、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ−１４（ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）をＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入した場合、図１４（ｂ）は、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｊ２−１（ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）をＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入した場合の蛍光観察結果を示す。ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐを導入した細胞においては、細胞内全体に緑蛍光が観察され（図１４（ａ））、ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐを導入した細胞においては、細胞内のミトコンドリアが存在する所に緑蛍光が観察された（図１４（ｂ））。
【００８３】
前記結果より、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、及び、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現すること及びシグナルペプチドが有効に機能していることが明らかとなった。
【実施例６】
【００８４】
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（３）］
（参考例６−１：ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
図１５に示すｐＫＭ５９３をテンプレートとして、配列番号２８(ＥＦｌαｐ−１１００)に示されるフォワードプライマーと配列番号２９（ｈＣＬｕｃ＋１６６２ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃６分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図１６（２）に示す。
【００８５】
（参考例６−２：ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータとを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＫＭ５９３をテンプレートとして、配列番号２８に示されるフォワードプライマーと配列番号３０（βｇｌｏｂｉｎｐＡ１２１−２２０ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜２２０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−２２０））を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃６分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図１６（３）に示す。
【００８６】
（実施例：β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列と、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＫＭ５９３をテンプレートとして、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列のセンス鎖配列とＥＦ１αプロモータ配列にアニールする配列とを順次備えた配列番号３１（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）−ＥＦｌａｐ−１１００）に示されるフォワードプライマーと、配列番号２９に示されるリバースプライマーを用いて、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃６分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図１６（１）に示す。
【００８７】
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記で得られた、ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ、ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−βＧｌｏｂｉｎ（１２１−２２０）、β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃそれぞれ２７ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によりＨＥＫ２９３細胞に導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをＣＬ-Ｓ１０００  Ｃｌｕｃ発光基質１０００（ＡＴＴＯ社製）とＧＬＯＭＡＸ２０／２０  ＬＵＭＩＮＯＭＥＴＥＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。ルシフェラーゼの測定を図１７に示す。
【００８８】
（結果）
ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−２２０）、及び、β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃのいずれも、ＨＥＫ２９３細胞においてルシフェラーゼ活性が測定され、それぞれの細胞内でルシフェラーゼ遺伝子が発現していることが明らかになった。
【００８９】
前記結果より、プロモータの種類を問わずに、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現することが明らかとなった。
【実施例７】
【００９０】
［ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さの違いによる発現量の影響］
（ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、表１に記載の配列番号６、３２、３３、３４、３５、３６、３７に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列を含む線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−１１、Ｎｏ．ｏ−１３〜Ｎｏ．ｏ−１８を作製した。次に、Ｋｍ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＫＭ４２６をテンプレートとして、表２に記載の配列番号２６に示されるフォワードプライマーと配列番号２５、３８、３９に示されるリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−１９〜Ｎｏ．ｏ−２１を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−１１、Ｎｏ．ｏ−１３〜Ｎｏ．ｏ−１６のアガロース電気泳動の結果を図１８（ａ）Ｎｏ．ｏ−１７〜Ｎｏ．ｏ−２１のアガロース電気泳動の結果を図１８（ｂ）に示す。
【００９１】
【表１】
2015073512.tif 000002
【００９２】
【表２】
2015073512.tif 000003
【００９３】
さらに、表３中のテンプレート欄に記載した２種類の線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−１１及びＮｏ．ｏ−１９、Ｎｏ．ｏ−１３及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１４及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１５及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１６及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１７及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１８及びＮｏ．ｏ−２１それぞれ５ｐｇずつをテンプレートとして、表３の配列番号２７に示すフォワードプライマーと配列番号２３に示すリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７を作製した。それぞれのＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃１５秒、７４℃５分のサイクルを４０回行った。作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７のアガロース電気泳動の結果を図１９に、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７の配置図を図２０に順番に示す。
【００９４】
【表３】
2015073512.tif 000004
【００９５】
なお、図２０における数字は、図１に示すように、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合のｐＥＧＦＰ−Ｃ１上の塩基の位置を示し、例えば１０１８はｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合の３’末端側の１０１８番目の塩基を示し、−６００はｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合の５’末端側の６００番目の塩基を示す。
【００９６】
（細胞への導入）
ＨｅＬａ細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記で得られたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．ｏ−４１〜ｏ−４７それぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図２１に示す。
【００９７】
Ｎｏ．ｏ−４１、４７、４２，４３を導入した細胞では１６０ｍｓの露光時間で緑蛍光が観察されたが、Ｎｏ．ｏ−４４、４５、４６を導入した細胞では１ｓの露光時間で緑蛍光が少し観察された。前記結果より、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが短いほどＲＮＡ発現量が多く、また、ｏ−４１でも緑蛍光が観察されたことから、ターミネータとプロモータがリンカー配列を介さずに直接連結していてもよいことが明らかとなった。
【実施例８】
【００９８】
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、表４の配列番号１０に示されるフォワードプライマーと、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａをそれぞれ作製した。なお、Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａは、それぞれＦＬＡＧのペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫにおける１アミノ酸がアラニン（Ａ）に変異したペプチドであるＡＹＫＤＤＤＤＫ、ＤＡＫＤＤＤＤＫ、ＤＹＡＤＤＤＤＫ、ＤＹＫＡＤＤＤＫ、ＤＹＫＤＡＤＤＫ、ＤＹＫＤＤＡＤＫ、ＤＹＫＤＤＤＡＫ、ＤＹＫＤＤＤＤＡをコードするように変異を有するＤＮＡ配列を備えている。
【００９９】
【表４】
2015073512.tif 000005
【０１００】
ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図２２に示す。
【０１０１】
（細胞への導入）
実施例２に記載の方法と同様に、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａ、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ導入した。
【０１０２】
（ウェスタンブロッティングによるｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＬＡＧ発現の確認）
実施例２に記載の方法と同様に、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａ、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞からトータルタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図２３に示す。図２３において、１Ｄａ、２Ｙａ、３Ｋａ、４Ｄａ、５Ｄａ、６Ｄａ、７Ｄａ、８Ｋａレーンが、それぞれ作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ  Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果、左から２番目のレーン（ＦＬＡＧ）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、一番左レーン（−）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果である。
【０１０３】
（結果）
図２３において、１Ｄａ、２Ｙａ、３Ｋａ、４Ｄａ、５Ｄａ、６Ｄａ、７Ｄａ、８Ｋａレーンそれぞれにおいて抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（ａｎｔｉ−ＲＦＰ）のいずれを用いてもバンドが検出されたが、バンドのパターンがＦＬＡＧレーンと異なっていた。上記結果から、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うだけでタグペプチドをコードするＤＮＡ配列に簡易に変異を導入することが可能であること、及び、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入すると、細胞内に変異を有するＦＬＡＧペプチドが存在していることが明らかとなった。したがって、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡも同様に、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流に簡易に変異を導入することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明によると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡの上流又は下流にシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列等を付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡに変異を導入することが簡易となることから、細胞内におけるタンパク質の機能解析や、細胞を用いた有用タンパク質の生産等の分野において有用である。
【図１】
2015073512.tif 000006
【図２】
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【図３】
2015073512.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2015073512.tif 000018
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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