(57)【要約】【課題】  獣毛繊維製品に使用されている獣毛種をその遺伝子情報に基づいて鑑別する、簡便に実施できる効率の良い方法を提供する。【解決手段】  1)被検獣毛繊維製品を細切または破砕する工程、2)破砕した試料へ還元剤を含む緩衝液であるDNA抽出液を加え、加熱する工程、3)システインプロテアーゼによりタンパク質を分解する工程、4)タンパク質分解後の反応液上清を変性、遠心分離、限外濾過して、DNAを単離する工程を含む、獣毛繊維製品からDNAを抽出する工程、5)単離されたDNAを鋳型として、複数の動物種に共通するDNA断片を増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットと、目的とする動物種に特異的なDNA断片を増幅可能な鑑別用プライマーセットを用いたPCR反応を行う工程、および6)電気泳動法により、増幅されたDNA断片を確認する工程を含む獣毛繊維の鑑別方法を提供する。当該方法においてヤク、カシミヤ、ヒツジの鑑別に用いられるプライマーを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）  被検獣毛繊維製品を細切または破砕する工程、
２）  破砕した試料へ還元剤を含む緩衝液であるＤＮＡ抽出液を加え、加熱する工程、
３）  システインプロテアーゼによりタンパク質を分解する工程、および
４）  タンパク質分解後の反応液上清を変性、遠心分離、限外濾過して、ＤＮＡを単離する工程を含む、獣毛繊維製品からＤＮＡを抽出する方法。
【請求項２】
酵素処理を２回に分けて行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ抽出液が、１００ｍＭ以上のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ以上のＥＤＴＡ、１２０ｍＭ以上のジチオトレイトール、０．４％以上のラウリル硫酸ナトリウムを含むものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
１）  被検獣毛繊維製品を２ｍｍ以下のサイズとなるように細切または破砕する工程、
２）  破砕した試料へ還元剤を含む緩衝液であるＤＮＡ抽出液を加え、６０℃±５℃に加熱する工程、
３）  システインプロテアーゼによりタンパク質を分解する工程、
４）  タンパク質分解後の反応液上清を変性、遠心分離、限外濾過して、ＤＮＡを単離する工程
５）  単離されたＤＮＡを鋳型として、複数の動物種に共通するＤＮＡ断片を増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットと、目的とする動物種に特異的なＤＮＡ断片を増幅可能な鑑別用プライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行う工程、および
６）  電気泳動法により、増幅されたＤＮＡ断片を確認する工程
を含む獣毛繊維の鑑別方法。
【請求項５】
ヤク、カシミヤおよび／またはヒツジ由来の獣毛繊維製品を鑑別する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号１のカシミヤミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、またはその相補鎖上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、下記条件を満たすＰＣＲプライマー：
１）該オリゴヌクレオチドの配列が、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、ならびにその相補鎖上に無い、
２）該オリゴヌクレオチドの３’末端と、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端が相違する、
３）該オリゴヌクレオチドの長さが１７塩基以上３５塩基以下である、
４）該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が４０％以上６０％以下である、および
５）該オリゴヌクレオチドのＴｍが４５℃以上７２℃以下である。
【請求項７】
さらに下記要件の１以上を満たす請求項６記載のＰＣＲプライマー：
６）該オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が、その相補鎖のタンパク質をコードするコドンの３番目の塩基でない、
７）該オリゴヌクレオチドが配列番号１の配列のＤ−ｌｏｏｐ領域ではない、
８）該オリゴヌクレオチドの３’末端がピリミジン塩基である場合、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端がプリン塩基である場合、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はピリミジン塩基である、
９）該オリゴヌクレオチドの３’末端はＴ塩基ではない、および
１０）該オリゴヌクレオチドの３’末端から１０塩基分のＧＣ含量が４０−６０％である。
【請求項８】
請求項７記載のＰＣＲプライマーの３’末端から２または３番目の塩基が下記である、あるいは下記となるようミスマッチを導入したＰＣＲプライマー：
該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がピリミジン塩基である場合、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドの対応する部位の塩基がプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がプリン塩基である場合、該オリゴヌクレオチド配列に対応するヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列上の対応するオリゴヌクレオチド部分の対応する部位の塩基がピリミジン塩基である。
【請求項９】
請求項６または７に記載のプライマーであって配列番号１のＤＮＡ塩基配列およびその相補鎖上のそれぞれのプライマーを下記条件となるよう組み合わせて得られるカシミヤ鑑別用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【請求項１０】
配列番号３０〜３９からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号４６〜５５からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項９記載のカシミヤ鑑別用プライマーセット。
【請求項１１】
請求項８記載のプライマーをフォーワードプライマーとし、請求項６または７に記載のプライマーをリバースプライマーとして下記条件となるよう組み合わせて得られるカシミヤ鑑別用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【請求項１２】
配列番号４０〜４５からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号４６〜５５からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項１１記載のカシミヤ鑑別用プライマーセット。
【請求項１３】
ヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）ミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、またはその相補鎖上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、下記条件を満たすＰＣＲプライマー：
１）該オリゴヌクレオチドの配列が、カシミヤ（配列番号）およびヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、ならびにその相補鎖上に無い、
２）該オリゴヌクレオチドの３’末端と、カシミヤ(配列番号１)およびヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端が相違する、
３）該オリゴヌクレオチドの長さが１７塩基以上３５塩基以下である、
４）該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が４０％以上６０％以下である、および
５）該オリゴヌクレオチドのＴｍが４５℃以上７２℃以下である。
【請求項１４】
さらに下記要件の１以上を満たす請求項１３記載のＰＣＲプライマー：
６）該オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が、その相補鎖のタンパク質をコードするコドンの３番目の塩基でない、
７）該オリゴヌクレオチドが配列番号１の配列のＤ−ｌｏｏｐ領域ではない、
８）該オリゴヌクレオチドの３’末端がピリミジン塩基である場合、カシミヤ(配列番号１)およびヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端がプリン塩基である場合、カシミヤ(配列番号１)およびヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はピリミジン塩基である、
９）該オリゴヌクレオチドの３’末端はＴ塩基ではない、および
１０）該オリゴヌクレオチドの３’末端から１０塩基分のＧＣ含量が４０−６０％である。
【請求項１５】
請求項１３記載のＰＣＲプライマー３’末端から２または３番目の塩基が下記である、あるいは下記となるようミスマッチを導入したＰＣＲプライマー：
該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がピリミジン塩基である場合、カシミヤ(配列番号１)およびヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１））のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドの対応する部位の塩基がプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がプリン塩基である場合、該オリゴヌクレオチド配列に対応するカシミヤ(配列番号１)およびヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列上の対応するオリゴヌクレオチド部分の対応する部位の塩基がピリミジン塩基である。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のプライマーであってヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）ミトコンドリアＤＮＡ塩基配列およびその相補鎖上のそれぞれのプライマーを下記条件となるよう組み合わせて得られるヤク鑑別用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【請求項１７】
配列番号５６〜６６からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号７２〜８２からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項１６記載のヤク鑑別用プライマーセット。
【請求項１８】
請求項１５記載のプライマーをフォーワードプライマーとし、請求項１３または１４に記載のプライマーをリバースプライマーとして下記条件となるよう組み合わせて得られるヤク鑑別用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【請求項１９】
配列番号６７〜７１からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号７２〜８２からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項１８記載のヤク鑑別用プライマーセット。
【請求項２０】
ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）ミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、またはその相補鎖上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、下記条件を満たすＰＣＲプライマー：
１）該オリゴヌクレオチドの配列が、カシミヤ（配列番号）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、ならびにその相補鎖上に無い、
２）該オリゴヌクレオチドの３’末端と、カシミヤ(配列番号１)およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端が相違する、
３）該オリゴヌクレオチドの長さが１７塩基以上３５塩基以下である、
４）該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が４０％以上６０％以下である、および
５）該オリゴヌクレオチドのＴｍが４５℃以上７２℃以下である。
【請求項２１】
さらに下記要件の１以上を満たす請求項２０記載のＰＣＲプライマー：
６）該オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が、その相補鎖のタンパク質をコードするコドンの３番目の塩基でない
７）該オリゴヌクレオチドが配列番号１の配列のＤ−ｌｏｏｐ領域ではない、
８）該オリゴヌクレオチドの３’末端がピリミジン塩基である場合、カシミヤ(配列番号１)およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端がプリン塩基である場合、カシミヤ(配列番号１)およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はピリミジン塩基である、
９）該オリゴヌクレオチドの３’末端はＴ塩基ではない、および
１０）該オリゴヌクレオチドの３’末端から１０塩基分のＧＣ含量が４０−６０％である。
【請求項２２】
請求項２１記載のＰＣＲプライマー３’末端から２または３番目の塩基が下記である、あるいは下記となるようミスマッチを導入したＰＣＲプライマー：
該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がピリミジン塩基である場合、カシミヤ(配列番号１)およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドの対応する部位の塩基がプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がプリン塩基である場合、該オリゴヌクレオチド配列に対応するカシミヤ(配列番号１)およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列上の対応するオリゴヌクレオチド部分の対応する部位の塩基がピリミジン塩基である。
【請求項２３】
請求項２０または２１いずれかに記載のプライマーであってヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）ミトコンドリアＤＮＡ塩基配列およびその相補鎖上のそれぞれのプライマーを下記条件となるよう組み合わせて得られるヒツジ鑑別用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【請求項２４】
配列番号８３〜９１からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号９８〜１０６からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項２３に記載のヒツジ鑑別用プライマーセット。
【請求項２５】
請求項２３記載のプライマーをフォーワードプライマーとし、請求項２０または２１に記載のプライマーをリバースプライマーとして下記条件となるよう組み合わせて得られるヒツジ鑑別用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【請求項２６】
配列番号９２〜９７からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号９８〜１０６からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項２５に記載のヒツジ鑑別用プライマーセット。
【請求項２７】
下記： 
ポジティブコントロールプライマーセット１
positive control 1：forward  actgggattagataccccactatgc  (配列番号２)
positive control 1：reverse  ggtgacgggcggtgtgt  (配列番号１６)
ポジティブコントロールプライマーセット２：
positive control 2：forward  ccaaactgggattagataccccactatgc  (配列番号３)
positive control 2：reverse  agggtgacgggcggtgtgt  (配列番号１７)
ポジティブコントロールプライマーセット３
positive control 3：forward  trcttccaaycagtgaaattgacct  (配列番号４)
positive control 3：reverse  ctcttgtcctttcgtactgggag  (配列番号１８)
ポジティブコントロールプライマーセット４
positive control 4：forward  trcttccaaycagtgaaattgacct  (配列番号５)
positive control 4：reverse  agatagaaaccgacctggattrctc  (配列番号１９)
ポジティブコントロールプライマーセット５
ISC_pca_06:forward  gaagctgctgcctgatactgac  （配列番号１１）
ISC_pca_06:reverse  gtcctttttgagttcattcgtaggctag  （配列番号２５）
ポジティブコントロールプライマーセット６
ISC_PCa_05:forward  atgatacatgagccaaaatccacttcgc  (配列番号１０)
ISC_PCa_05:reverse  cctagttgtatggggtatgccatatgag  (配列番号２４)
からなる群から選択される、ポジティブコントロールプライマーセット。
【請求項２８】
下記：
カシミヤプライマーセット１
cashmere 1：forward  catagccaccctaatgatcctaaat  (配列番号３０)
cashmere 1: reverse  tgagaagttgaggctgttatcg  (配列番号４６)
カシミヤプライマーセット２
cashmere 2：forward  caagaagtagaaacggtctgaactatc  (配列番号３１)
cashmere 2：reverse  gggaactgctcatgagtgtagaacg  (配列番号４７)
カシミヤプライマーセット３
cashmere 3：forward  gcatttattgacctcccaacc  (配列番号３２)
cashmere 3：reverse  cataatatagacctcgtccgatatgtatg  (配列番号４８)
カシミヤプライマーセット４
cashmere 4：forward  gcttctatcggcagtacatagtacattt  (配列番号３３)
cashmere 4：reverse  gacagcacagttatgtgtgagc  (配列番号４９)
カシミヤプライマーセット５
ISC_CHe02：forward  gtggtagctatttttatctgggctt  (配列番号３５)
ISC_CHe02：reverse  gctttattttagcactagaaaccgc  (配列番号５１)
カシミヤプライマーセット６
ISC_CHe01：forward  gaaatcatatgatgaggccggatgttag  （配列番号３４)
ISC_CHe01：reverse  cccttgcactaacaagcatcagtc  （配列番号５０）
からなる群から選択される、請求項９記載のカシミヤ鑑別用プライマーセット。
【請求項２９】
下記：
ヤクプライマーセット１
yak 1：forward  ctttcacagccatttatagcacc  (配列番号５６)
yak 1：reverse   caaggtggagaatttgaaggc  (配列番号７２)
ヤクプライマーセット２
yak 2：forward  cagccatttatagcacccgt  (配列番号５７)
yak 2：reverse  ggcgtttgaggggtagtg  (配列番号７３)
ヤクプライマーセット３
yak 3：forward  gattttctaccctaattaacatcaacg  (配列番号５８)
yak 3：reverse  ttgtagggaagtatcctagcaagg  (配列番号７４)
ヤクプライマーセット４
yak 4：forward  gtcataatcagttctcactgactacttg  (配列番号５９)
yak 4：reverse  aagcctgaggatagagggatg  (配列番号７５)
ヤクプライマーセット５
yak 5：forward  gtttcattttaactcaacagctctgt  (配列番号６０)
yak 5：reverse  caataggacagaggtgttgagc  (配列番号７６)
ヤクプライマーセット６
yak 6：forward  ctcatacaagcacaatagatgca  (配列番号６１)
yak 6：reverse  tggcagtacaactcgattatcg  (配列番号７７)
ヤクプライマーセット７
ISC_BGe02：forward  gataccgcggccgttaaacag  (配列番号６３)
ISC_BGe02：reverse  actcctagccccaatactggactaa  (配列番号７９)
からなる群から選択される、請求項１４記載のヤク鑑別用プライマーセット。
【請求項３０】
下記：
ヒツジプライマーセット１
wool 1：forward  gttatgattagcacccactgattg  (配列番号８３)
wool 1：reverse  gttatgagtatggaggctattggatt  (配列番号９８)
ヒツジプライマーセット２
wool 2：forward  caacccactacctaaaatttaattatcc  (配列番号８４)
wool 2：reverse   agtaaggttgtactaatgaggatcgtg  (配列番号９９)
ヒツジプライマーセット３
wool 3：forward  cataccagtaccatagacgcg  (配列番号８５)
wool 3：reverse   tctacttctagtaaacgcagttctcct  (配列番号１００)
ヒツジプライマーセット４
ISC_OVe03：forward  ggagtgcacccaggaaagattc  (配列番号８８)
ISC_OVe03：reverse  ccaaccgaaactgttaactcataaggag  (配列番号１０３)
ヒツジプライマーセット５
ISC_OVe02：forward  ctcctcgcacaagtttaagtcagtaa  （配列番号８７）
ISC_OVe02：reverse  ccatagggtcttctcgtcttgttg  （配列番号１０２）
からなる群から選択される、請求項１９記載のヒツジ鑑別用プライマーセット。
【請求項３１】
ポジティブコントロール用プライマーセットが配列番号２〜１５からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号１６〜２９からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる、請求項５記載の方法。
【請求項３２】
カシミヤ鑑別用プライマーセットとして、請求項９〜１２および２８いずれかに記載のプライマーセットを用いる、請求項５または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヤク鑑別用プライマーセットとして、請求項１６〜１９および２９いずれかに記載のプライマーセットを用いる、請求項５、３１および３２いずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ヒツジ鑑別用プライマーセットとして、請求項２３〜２６および３０いずれかに記載のプライマーセットを用いる、請求項５、３１〜３３いずれかに記載の方法。
【請求項３５】
標準獣毛繊維、
配列番号２〜１５からなる群から選択されるフォーワードプライマーと、配列番号１６〜２９からなる群から選択されるリバースプライマーを組み合わせてなる１以上のポジティブコントロールプライマーセット、および
下記Ａ〜Ｂより選択される１以上の鑑別用プライマーセット：
Ａ）請求項９〜１２および２８いずれかに記載のカシミヤ鑑別用プライマーセット
Ｂ）請求項１６〜１９および２９いずれかに記載のヤク鑑別用プライマーセット、および
Ｃ）請求項２３〜２６および３０いずれかに記載のヒツジ鑑別用プライマーセット
を含む、獣毛繊維の鑑別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣毛繊維製品に使用されている獣毛種をその遺伝子情報に基づいて鑑別する方法に関する。具体的には本発明は、獣毛繊維製品よりＤＮＡを抽出する方法、抽出されたＤＮＡに基づいて、獣毛繊維製品の獣毛種を鑑別する方法、該方法に有用なプライマー、並びに該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
獣毛繊維の中でも高級品とされるカシミヤ繊維については、他の繊維を用いた偽装が多く、しばしば問題となる。カシミヤの鑑別について、現在の規格であるＪＩＳＬ１０３０では光学顕微鏡を用いた目視により行うこととされている。この規格は獣毛繊維の形状、スケールの形状、太さ、光沢やぬめり感などの獣毛繊維の構造を観察する形態学的判別により獣毛種を鑑別する方法である。
【０００３】
しかしながら獣毛繊維は動物の毛に由来する天然繊維であることから、繊維形状が均一でなく、また、表面加工されることによって外観の形状が変化し、動物種を判定する上で特徴となる構造が消失することが多い。顕微鏡による形態学的観察により獣毛繊維の種類を鑑別するには、専門的な知識と経験が必要である。このような経験に頼らざるを得ない鑑別法ではなく、より客観性の高い鑑別ができる方法が求められている。
【０００４】
客観的な鑑別のため、試料中に含まれるＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ塩基配列に基づいて獣毛種の鑑定を行う方法が提案されている。１９８０年代には、獣毛の外側を覆うキューティクルからのＤＮＡの抽出が報告されており、１ｇ程度の獣毛からＤＮＡが抽出されていた。しかし、この方法では、使用する獣毛の量が多く、獣毛繊維製品の一部から試料を得ることから多量の用いる検査は難しいことや、またマイルドな条件での洗浄でも外側のキューティクルがはがれてしまうことなど、検査方法としての実用性は低い。
【０００５】
Ｈａｍｌｙｎらの方法（非特許文献２）では、キューティクルだけでなく、獣毛内部も含め獣毛全体からＤＮＡを抽出している。しかしながら、非特許文献２の方法では一部のサンプルでの抽出効率が低く、特に染色など加工を施した獣毛サンプルからの回収が難しい。
【０００６】
Ｎｅｌｓｏｎらの方法（非特許文献３）では、キューティクルを分離し、キューティクルからＤＮＡを抽出している。しかしながらキューティクルは洗浄などではがれ易く、加工品では検査が難しいという欠点がある。
【０００７】
獣毛繊維はケラチンを主としたタンパク質を主成分とし、生体組織としては強固な部類に入り、水に不溶である。これはペプチド鎖がジスルフィド結合によって保持されていることに由来する。また、カシミヤや羊毛などの獣毛繊維はスケールに覆われており、表面は疎水性である。
【０００８】
一般的に獣毛繊維製品には染色加工された獣毛繊維が用いられている。主な染料としては酸性染料、含金染料、酸性媒染染料、羊毛用反応染料などが用いられているが、いずれも獣毛繊維から染料が容易に脱落しないよう強固に結合されている。また、精練、縮充、染色助剤（ｐＨ調整剤や均染剤など）など、多くの薬剤の使用や加工工程を経て獣毛繊維製品は生産される。したがって、生物材料としての観点からは、獣毛繊維製品に含まれる獣毛繊維はかなりのダメージを受けており、また、種々の不純物を含むことから、加工された獣毛繊維製品からのＤＮＡの単離、精製は非常に困難である。
【０００９】
ＰＣＲ法によってＤＮＡを鑑別し、これによって獣毛繊維を鑑別するためには、獣毛繊維から一定量のＤＮＡを抽出すること、およびＰＣＲ法が阻害されないように不純物を除去すること（精製）が必要である。鑑別に用いるＤＮＡを抽出するためにはＤＮＡに損傷を与えないような温和な条件によって獣毛繊維を溶解する必要があるため、従来の技術では強い加工がなされた獣毛繊維製品からＤＮＡを抽出することが難しい。加工された獣毛繊維製品を試料とした場合、ＤＮＡ鑑別法を適用できないものが数多くある。
【００１０】
公表されている獣毛繊維のＤＮＡ鑑別法に関する文献は、獣毛繊維の種類の鑑別に重点を置いたものであり、獣毛繊維からＤＮＡを抽出する方法の詳細を示すものはほとんど無い。ＤＮＡの抽出工程の効率化および抽出効率の向上を目的とした所謂ＤＮＡ抽出・精製キットが市販されているが、市販のものは未加工の毛を対象としたものである。加工された獣毛繊維製品を対象としたＤＮＡ抽出・精製キットは市販されておらず、その技術も公表されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第４４７２２９３号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Alexandre Hassanin et al., J Mol Evol (2009) 68:293-310
【非特許文献２】Max M. Houck ed., Woodhead Publishing in Textiles: Number 84, First published 2009, DNA analysis in the identification of animal fibers in textile"Identification of textile fibers" Woodhead Publishing Limited (Cambridge, England)
【非特許文献３】Nelson, G. et al., Textile Research Journal, 62 (1992) 590-595.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、獣毛繊維製品に含まれる獣毛種の鑑別のために獣毛繊維製品からＤＮＡを抽出する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、獣毛繊維製品に含まれる獣毛を、動物種に固有のＤＮＡ塩基配列を用いることにより客観的に鑑別するための方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、当該方法において好適に用いられる、新規プライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、
１）  被検獣毛繊維製品を２ｍｍ以下のサイズとなるように細切または破砕する工程、
２）  破砕した試料へ還元剤を含む緩衝液であるＤＮＡ抽出液を加え、６０℃±５℃に加熱する工程、
３）  システインプロテアーゼによりタンパク質を分解する工程、および
４）  タンパク質分解後の反応液上清を変性、遠心分離、限外濾過して、ＤＮＡを単離する工程
を含む、獣毛繊維製品からＤＮＡを抽出する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、
５）  本発明の方法により抽出されたＤＮＡを鋳型として、複数の動物種に共通するＤＮＡ断片を増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットと、目的とする動物種に特異的なＤＮＡ断片を増幅可能な鑑別用プライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行う工程、および
６）  電気泳動法により、増幅されたＤＮＡ断片を確認する工程
を含む獣毛繊維の鑑別方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号１のカシミヤミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、またはその相補鎖上の連続したＤＮＡ塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、下記条件を満たすＰＣＲプライマー： 
１）該オリゴヌクレオチドの配列が、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、ならびにその相補鎖上に無い、
２）該オリゴヌクレオチドの３’末端と、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端が相違する、
３）オリゴヌクレオチドの長さが１７塩基以上３５塩基以下である、
４）ＧＣ含量が４０％以上６０％以下である、および
５）Ｔｍが４５℃以上７２℃以下である、
を提供する。
【００１７】
本発明は、配列番号１のカシミヤミトコンドリアＤＮＡ塩基配列およびその相補鎖上の連続する塩基配列オリゴヌクレオチドである上記プライマーを下記となるよう組み合わせて得られる、配列番号１のカシミヤ上の断片を特異的に増幅させるＰＣＲ用プライマーセット：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である、
を提供する。
【００１８】
本発明はまたヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の連続したＤＮＡ塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、ヤクおよびカシミヤよりヒツジを鑑別するために用いられるＰＣＲプライマーを提供する。
【００１９】
本発明はさらにヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の連続したＤＮＡ塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、ヒツジおよびカシミヤよりヤクを鑑別するために用いられるＰＣＲプライマーを提供する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の獣毛繊維の鑑別方法に用いうるキットを提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＤＮＡの抽出方法により、獣毛繊維製品、特に染色加工等、加工の程度の高い獣毛繊維製品からでもＤＮＡを効率よく抽出し、ＰＣＲ法により増幅可能な試料を提供することができる。
本発明の獣毛繊維の鑑別方法により、安価かつ入手容易な装置を用いて、獣毛繊維製品の客観的な鑑別が可能となる。特に本発明のプライマーセットを用いることにより、カシミヤ、ヤク、ヒツジ（ウール）について交差反応の恐れなく、確実に鑑別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】プライマー評価試験１の電気泳動結果を示す写真。
【図１Ｂ】プライマー評価試験１の電気泳動結果を示す写真。
【図２】プライマー評価試験２の電気泳動結果を示す写真。
【図３Ａ】プライマー評価試験３の電気泳動結果を示す写真。
【図３Ｂ】プライマー評価試験３の電気泳動結果を示す写真。
【図４Ａ】プライマー評価試験４の電気泳動結果を示す写真。
【図４Ｂ】プライマー評価試験４の電気泳動結果を示す写真。
【図５Ａ】プライマー評価試験５の電気泳動結果を示す写真。
【図５Ｂ】プライマー評価試験５の電気泳動結果を示す写真。
【図６Ａ】プライマー評価試験６の電気泳動結果を示す写真。
【図６Ｂ】プライマー評価試験６の電気泳動結果を示す写真。
【図７Ａ】プライマー評価試験７の電気泳動結果を示す写真。
【図７Ｂ】プライマー評価試験７の電気泳動結果を示す写真。
【図８Ａ】プライマー評価試験８の電気泳動結果を示す写真。
【図８Ｂ】プライマー評価試験８の電気泳動結果を示す写真。
【図９Ａ】プライマー評価試験９の電気泳動結果を示す写真。
【図９Ｂ】プライマー評価試験９の電気泳動結果を示す写真。
【図１０Ａ】プライマー評価試験１０の電気泳動結果を示す写真。
【図１０Ｂ】プライマー評価試験１０の電気泳動結果を示す写真。
【図１１】プライマー評価試験１１の電気泳動結果を示す写真。
【図１２Ａ】プライマー評価試験１２の電気泳動結果を示す写真。
【図１２Ｂ】プライマー評価試験１２の電気泳動結果を示す写真。
【図１３Ａ】プライマー評価試験１３の電気泳動結果を示す写真。
【図１３Ｂ】プライマー評価試験１３の電気泳動結果を示す写真。
【図１４】プライマー評価試験１４の電気泳動結果を示す写真。
【図１５Ａ】プライマー評価試験１５の電気泳動結果を示す写真。
【図１５Ｂ】プライマー評価試験１５の電気泳動結果を示す写真。
【図１６Ａ】プライマー評価試験１６の電気泳動結果を示す写真。
【図１６Ｂ】プライマー評価試験１６の電気泳動結果を示す写真。
【図１７】プライマー評価試験１７の電気泳動結果を示す写真。
【図１８】比較例１のＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す写真。
【図１９】比較例２のＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す写真。
【図２０】実施例２のＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す写真。
【図２１】ネガティブコントロールの電気泳動結果を示す写真。
【図２２】プライマー評価試験１８の電気泳動結果を示す写真。
【図２３】プライマー評価試験１９の電気泳動結果を示す写真。
【図２４】プライマー評価試験１９の電気泳動結果を示す写真。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明においては、被検獣毛繊維製品試料を採取してこれを用いる。試料は、試験を行う繊維製品を代表するものとなるよう採取する。試験を行う繊維製品が部品で構成されている等、素材が部分により異なる場合は、他部分の繊維が混入しないよう十分注意を払う。採取した試験試料については、必要に応じて界面活性剤並びに水を用いて洗浄するとよい。
【００２４】
獣毛繊維製品試料は１試料につき３０ｍｇ以上、好ましくは４０〜２００ｍｇ採取する。試料の量の上限は特に無いが、多すぎると試薬が多量に必要となり、また獣毛繊維製品の損傷範囲が増えるので好ましくない。本発明の方法によれば、比較的少量の試料より、ＰＣＲ法による鑑別に耐えうるＤＮＡ試料を得ることができる。
【００２５】
採取した試料を細切する。細切は、ハサミで行ってもよいし、あるいは破砕機を用いて行ってもよい。細切は繊維長が２ｍｍ以下となるようにする。細切して切断面を大きくすることにより、ＤＮＡの抽出効率を上げ、使用する試料の量を減らすことが可能となる。ハサミで切り刻む場合には５分以上、約１０分間切り刻めば、２ｍｍ以下の細切片を得ることができる。
【００２６】
破砕機を用いる場合は、ハサミで適当に切断した後に、破砕ボールと共に容器に投入して振とうする方法などが例示される。破砕ボールとしては、市販のものを用いれば良く、例えばジルコニア製の５ｍｍ径のボールが例示される。
【００２７】
例えば、試料２００ｍｇをハサミで適当に切断し、切断後の試料５０ｍｇと８個のジルコニア製破砕ボール（φ５ｍｍ）をチューブに入れ、ミキサーミル、例えばＭＭ−４００(Retsch Co., Ltd.、ハーン、ドイツ）にセットし、３０（１／ｓ）、７ｍｉｎにて破砕処理を行えばよい。
【００２８】
破砕した試料を次いで熱処理する。熱処理は破砕した試料とＤＮＡ抽出液を容器へ投入し、随時軽く攪拌しながら５５〜６５℃、好ましくは６０℃±３℃の温度にて１０〜６０分、好ましくは１５〜３０分、より好ましくは約２０分加熱する。
【００２９】
ＤＮＡ抽出液は、緩衝液に還元剤を添加した液体を用いる。還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、ヨードアセトアミドが例示され、ジチオトレイトールが特に好適に用いられる。還元剤がジチオトレイトールの場合、ＤＮＡ抽出液中の濃度を１２０ｍＭ以上、好ましくは１２０〜１２００ｍＭ、より好ましくは１５０〜６００ｍＭとする。
【００３０】
ＤＮＡ抽出液に用いられる緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、トリシン、ＴＥＳ、ＥＰＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液が例示され、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが特に好適に用いられる。緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌの場合、ＤＮＡ抽出液中の濃度を１００ｍＭ以上、好ましくは１００ｍＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１２５ｍＭ〜５００ｍＭとする。高濃度の緩衝液中にてＤＮＡを抽出することによって、獣毛繊維の溶解に伴い溶出する染料等の影響を防止することができる。
【００３１】
ＤＮＡ抽出液には好ましくは界面活性剤を含有する。界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンおよびＣＴＡＢが例示され、ラウリル硫酸ナトリウムが特に好適に用いられる。界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウムの場合、ＤＮＡ抽出液中の濃度を０．４％以上、好ましくは０．４〜４％、より好ましくは０．５〜２％とする。このように高濃度の界面活性剤をＤＮＡ抽出液に配合することによって、タンパク質の分解が促進される。
【００３２】
ＤＮＡ抽出液には好ましくはキレート剤を含有する。キレート剤としてはＥＤＴＡ、８−ヒドロキシキノリン、フェナントロリンが例示され、ＥＤＴＡが特に好適に用いられる。キレート剤がＥＤＴＡである場合、ＤＮＡ抽出液中の濃度を２０ｍＭ以上、好ましくは２０ｍＭ〜２００ｍＭ、より好ましくは２５ｍＭ〜１００ｍＭとする。
【００３３】
ＤＮＡ抽出液中での加熱終了後、システインプロテアーゼをＤＮＡ抽出液へ添加して、タンパク質を分解する。システインプロテアーゼとしては、パパインが例示される。パパイン処理は、試料５０ｍｇに対して５〜５０ユニット、好ましくは２０±４ユニットとなるような量を用いて行う。パパイン処理は、加熱後の容器へパパインを投入して、軽く振とうしながら、４５〜５５℃、好ましくは約５０℃に１０〜２０時間維持する。好適にはパパイン処理は２段階で行う。パパイン処理を二段階で行う場合には、まず半量のパパイン酵素を添加し、４５〜５５℃にて軽く振とうしながら３０分〜２時間、好ましくは約１時間維持する。次いで残りの半量のパパイン酵素を添加し、同じ温度で１０〜１５時間、好ましくは１２時間〜１５時間、軽く振とうしながら維持する。
【００３４】
システインプロテアーゼ処理終了後、タンパク質の変性処理を行う。タンパク質の変性処理はシステインプロテアーゼ処理後の試料を過塩素酸ナトリウムにて処理した後、クロロホルム／イソアミルアルコール混合液にて処理することによって行えばよい。
【００３５】
タンパク質変性処理終了後、遠心分離を行い上清を得る。得られる上清を限外濾過用フィルターを装着した限外濾過用フィルターユニットへ投入する。
【００３６】
限外濾過用フィルターはＤＮＡ精製用のものであれば特に限定されず、例えばアミコンウルトラアミコンウルトラ−０．５デバイス（ＮＭＷＬ：１００Ｋ）（メルクミリポア社、ＭＡ、米国）など市販のものを用いればよい。
【００３７】
限外濾過して得られたＤＮＡを回収し、ＰＣＲ反応を行う。
【００３８】
ＰＣＲ反応は従来知られている方法にて行えばよい。獣毛繊維の鑑別のためには、獣毛繊維製品と同じ条件で標準獣毛サンプルからＤＮＡを抽出、精製し、得られたＤＮＡを用いて同じ条件にてＰＣＲ反応を行い、結果を比較すればよい。
【００３９】
ＰＣＲ反応は、獣毛繊維製品に使われていると予測される各動物種に特異的なＤＮＡ断片を増幅可能な鑑別用プライマーセットと、予測される各動物種のそれぞれに共通するＤＮＡ断片を増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットを用いて行う。具体的には一つの反応液にて１のポジティブコントロールプライマーセットと１の鑑別用プライマーセットを用いてＰＣＲを実施する。
【００４０】
ＰＣＲ反応は試料ＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鑑別用プライマーセット、ポジティブコントロールプライマーセットおよび基質ヌクレオチドを反応用緩衝液へ投入し、ＰＣＲ増幅のための温度サイクルを繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはミスマッチ修復機能を有していないものが好適に用いられる。温度サイクルは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとプライマーセットの性質により最適なものを適宜定めればよい。例えば９５℃３０秒、６０−６８℃３０秒、７２℃３０秒の温度サイクルを３５回繰り返すことが例示される。ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲ反応装置を用いて行えばよい。
【００４１】
ＰＣＲ反応終了後、増幅された試料をアガロースゲル電気泳動にかけて、ＤＮＡ増幅産物を検出する。電気泳動の際に、ゲル電気泳動用マーカーを同時に電気泳動にかけ、各増幅産物のサイズの指標とすればよい。
【００４２】
ＰＣＲ反応において、被検獣毛繊維製品より抽出されたＤＮＡから増幅されるＤＮＡ断片が、標準獣毛繊維より抽出されたＤＮＡから増幅されるＤＮＡ断片と同じサイズである場合に、当該被検獣毛繊維製品は当該標準獣毛繊維の獣毛種であると確認できる。
【００４３】
本発明はさらに、獣毛繊維製品の鑑別に用いうるプライマーを提供する。本発明のプライマーセットは、カシミヤ（配列番号１）、ヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡのゲノム塩基配列を比較して、その差異を利用して設計したものである。このうち、カシミヤのミトコンドリアＤＮＡは本発明者らが初めて決定した。本発明の各動物種に特異的なＤＮＡ断片を増幅可能な鑑別用プライマーは、ＰＣＲ反応においてそれぞれの動物種に特異的にＤＮＡ断片を増幅する。本発明のポジティブコントロールプライマーは、少なくともカシミヤ、ヒツジ（ウール）およびヤク由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応において、同一のＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００４４】
カシミヤのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列は本発明者らが最初に決定した。カシミヤは一般財団法人ボーケン品質評価機構所有のChinese white、Wulateおよびカシミヤ近縁の、MohairおよびSiberian whiteを用いた。ＤＮＡの抽出は本発明の方法に準じて行った。配列決定は従来より知られている方法を組み合わせて行った。得られたカシミヤのミトコンドリア配列を配列番号１に示す。
【００４５】
本発明の鑑別用のプライマーは、配列番号１のカシミヤのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、ヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列それぞれを他の２つから鑑別することを目的に設計した。具体的には、下記条件を満たすように設計した：
（１）  プライマーの３’末端が、検出対象と非検出とすべき対象の対応する部位との間で塩基に違いがあること、
（２）  Ｔｍが４５℃以上であること、
（３）  長さが１７塩基以上３５塩基以下であること、
（４）  ＧＣ含有量が４０−６０％であること、
（５）  フォーワードとリバースのプライマーのＴｍの差が２度以下であること、および
（６）  増幅の長さが１５０−５００塩基であること。
【００４６】
さらにＰＣＲによる鑑別を容易とするために、下記条件のいずれか１以上を満たすプライマーが好ましい：
（７）プライマーの３’末端の塩基が、タンパク質をコードするコドンの３番目に対応するものでないこと、
（８）プライマーがＤ−ｌｏｏｐ領域に結合するものでないこと、
（９）プライマーの３’末端と非検出対象とのミスマッチがｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ（Ｒ−Ｒ／Ｙ−Ｙ）であること、
（１０）プライマーの３’末端がＴ塩基でないこと、
（１１）プライマーの３’末端１０塩基のＧＣ％が４０〜６０％であること、
（１２）Ｔｍがアニーリング温度−（５±２）℃であること、および
（１３）３’末端から２−３番目に（９）と同様のミスマッチを設けること。
【００４７】
本明細書ならびに請求の範囲において、Ｔｍは計算によって得られる融解温度を示す。Ｔｍはプログラミング言語であるＰｅｒｌ用に記述されたモジュール（Ｐｒｉｍｅｒ．ｐｌ）を用いて計算される値である（Triinu Koressaar and Maido Remm, Bioinformatics, Vol. 23 no. 10 2007, pages 1289-1291）。本願請求の範囲ならびに明細書において採用した計算式は、ＰＣＲプライマー設計用プログラムであるＰｒｉｍｅｒ３にて採用されているものと同じである。Ｔｍは４５℃以上、７２℃以下であることが好ましい。また、アニーリング温度−（５±２）℃とすることが好ましい。
【００４８】
プライマーの３’末端の塩基が、非検出とすべき対象の対応する部分にてｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ（Ｒ−Ｒ／Ｙ−Ｙ）なミスマッチを有していることが好ましいが、さらに鑑別の選択性をあげるため、プライマーの３’末端から２〜３番目にもｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ（Ｒ−Ｒ／Ｙ−Ｙ）なミスマッチを導入することが好ましい。ミスマッチは、他の条件を満たす配列に人為的に導入してもよい。人為的なミスマッチを導入することによって、検出対象での増幅の効率が多少下がるが、非検出対象の動物種の場合はさらに影響が強く、偽陽性が見られなくなることもある。
【００４９】
上記要件を満たすように設計したプライマーとして、例えばカシミヤのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列（配列番号１）、ヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列の情報に基づき、カシミヤをヤクおよび羊毛から鑑別するために用いられるプライマーは下記となる。
【００５０】
配列番号１のカシミヤミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、またはその相補鎖上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、下記条件を満たすＰＣＲプライマー：
１）該オリゴヌクレオチドの配列が、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列、ならびにその相補鎖上に無い、
２）該オリゴヌクレオチドの３’末端と、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端が相違する、
３）該オリゴヌクレオチドの長さが１７塩基以上３５塩基以下、好ましくは３０塩基以下である、
４）該オリゴヌクレオチドのＧＣ含量が４０％以上６０％以下である、および
５）該オリゴヌクレオチドのＴｍが４５℃以上７２℃以下である。
【００５１】
さらに好適なプライマーとしては、上記に加えて下記のうちの１以上の要件を満たすものである：
６）該オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基が、その相補鎖のタンパク質をコードするコドンの３番目に対応する塩基でない、
７）該オリゴヌクレオチドが配列番号１の配列のＤ−ｌｏｏｐ領域ではない、
８）該オリゴヌクレオチドの３’末端がピリミジン塩基である場合、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端がプリン塩基である場合、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分の３’末端はピリミジン塩基である、
９）該オリゴヌクレオチドの３’末端はＴ塩基ではない、および
１０）該オリゴヌクレオチドの３’末端から１０塩基分のＧＣ含量が４０−６０％である。
【００５２】
また、より選択性を向上させるため、フォーワードまたはリバースのいずれかのプライマーを下記となるよう選択する、あるいは下記となるようミスマッチを導入したプライマーも好適に用いられる：
該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がピリミジン塩基である場合、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドの対応する部位の塩基がプリン塩基であり、該オリゴヌクレオチドの３’末端から２または３番目の塩基がプリン塩基である場合、該オリゴヌクレオチド配列に対応するヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列上の対応するオリゴヌクレオチド部分の対応する部位の塩基がピリミジン塩基である。
【００５３】
「ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）およびヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）のミトコンドリアＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の該オリゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド部分」とは、配列番号１と、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）またはヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）の塩基配列同士、またはその相補鎖同士をアライメントし、配列番号１またはその相補鎖上の当該オリゴヌクレオチド配列に対応する、ヒツジ、およびヤクそれぞれのオリゴヌクレオチド部分を意味する。アライメントは公知のプログラム、例えばＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴを用いて行えばよい。
【００５４】
プライマーは下記となるよう配列番号１のＤＮＡ塩基配列およびその相補鎖上のそれぞれのプライマーを組み合わせてプライマーセットとして用いることができる：
１）増幅の長さが１５０〜５００塩基である、および
２）Ｔｍの差が２℃以下である。
【００５５】
なお上記においては、カシミヤを鑑別するためのプライマーを説明したが、羊毛（ヒツジ）およびヤクを鑑別するためのプライマーとしては、それぞれのＤＮＡ塩基配列またはその相補鎖上の連続した配列であって、他の２つの塩基配列との関係が上記と同様であるオリゴマーを用いることができる。
【００５６】
本明細書ならびに請求の範囲において、カシミヤ（配列番号１）、ヤク（ＮＣ＿００６３８０．３）、ヒツジ（ＮＣ＿００１９４１．１）上の増幅対象配列の５’側となるプライマーをフォーワードプライマーとし、３’側となるプライマーをリバースプライマーとする。具体的なプライマーとしては、下記が例示される。
【００５７】
ポジティブコントロール用プライマー（フォーワード）
【表１】
2015073478.tif 000002
【００５８】
【表２】
2015073478.tif 000003
【００５９】
ポジティブコントロール用プライマー（リバース）
【表３】
2015073478.tif 000004
【００６０】
【表４】
2015073478.tif 000005
【００６１】
カシミヤ用プライマー（フォーワード）
【表５】
2015073478.tif 000006
【００６２】
【表６】
2015073478.tif 000007
【００６３】
カシミヤ用プライマー(フォーワード、大文字がミスマッチ)
【表７】
2015073478.tif 000008
【００６４】
カシミヤ用プライマー（リバース）
【表８】
2015073478.tif 000009
【００６５】
【表９】
2015073478.tif 000010
【００６６】
ヤク用プライマー(フォーワード)
【表１０】
2015073478.tif 000011
【００６７】
【表１１】
2015073478.tif 000012
【００６８】
ヤク用プライマー(フォーワード、大文字がミスマッチ)
【表１２】
2015073478.tif 000013
【００６９】
ヤク用プライマー（リバース）
【表１３】
2015073478.tif 000014
【００７０】
【表１４】
2015073478.tif 000015
【００７１】
ヒツジ用プライマー（フォーワード）
【表１５】
2015073478.tif 000016
【００７２】
【表１６】
2015073478.tif 000017
【００７３】
ヒツジ用プライマー（フォーワード、大文字がミスマッチ）
【表１７】
2015073478.tif 000018
【００７４】
ヒツジ用プライマー（リバース）
【表１８】
2015073478.tif 000019
【００７５】
【表１９】
2015073478.tif 000020
【００７６】
本発明において、フォーワード、リバースそれぞれのプライマーから下記条件を満たす組み合わせを選択してプライマーセットとして用いればよい：
フォーワードとリバースのプライマーのＴｍの差が２度以下であること、および
増幅の長さが１５０−５００塩基であること。
【００７７】
なお、ミスマッチを導入したプライマーはフォーワードかリバースの一方のみとすべきである。両方にミスマッチを導入したものを使用するとＰＣＲ反応が進行しないことがある。
【００７８】
具体的プライマーセットとしては下記が例示される。下記のうち、先に記載するものがフォワードプライマーで後に記載するのがリバースプライマーである。
ポジティブコントロールプライマーセット：
配列番号２と１６、配列番号３と１７、配列番号４と１８、配列番号５と１９、配列番号６と２０、配列番号７と２１、配列番号８と２２、配列番号９と２３、配列番号１０と２４、配列番号１１と２５、配列番号１２と２６、配列番号１３と２７、配列番号１４と２８、配列番号１５と２９。
【００７９】
カシミヤ用プライマーセット：
配列番号３０と４６、配列番号３１と４７、配列番号３２と４８、配列番号３３と４９、配列番号３４と５０、配列番号３５と５１、配列番号３６と５２、配列番号３７と５３、配列番号３８と５４、配列番号３９と５５、配列番号４０と５０、配列番号４１と５１、配列番号４２と５２、配列番号４３と５３、配列番号４４と５４、配列番号４５と５５。
【００８０】
ヤク用プライマーセット：
配列番号５６と７２、配列番号５６と７２、配列番号５８と７４、配列番号５９と７５、配列番号６０と７６、配列番号６１と７７、配列番号６２と７８、配列番号６３と７９、配列番号６４と８０、配列番号６５と８１、配列番号６６と８２、配列番号６７と７８、配列番号６８と７９、配列番号６９と８０、配列番号７０と８１、配列番号７１と８２。
【００８１】
ヒツジ用プライマーセット
配列番号８３と９８、配列番号８４と９９、配列番号８５と１００、配列番号８６と１０１、配列番号８７と１０２、配列番号８８と１０３、配列番号８９と１０４、配列番号９０と１０５、配列番号９１と１０６、配列番号９２と１０１、配列番号９３と１０２、配列番号９４と１０３、配列番号９５と１０４、配列番号９６と１０５、配列番号９７と１０６。
【００８２】
本発明はさらに、標準獣毛繊維、当該標準獣毛繊維の動物種に特異的な１以上の鑑別用プライマーセット、１以上のポジティブコントロールプライマーセットを含む、獣毛繊維の鑑別用キットを提供する。
【００８３】
本発明のキットには、さらにシステインプロテアーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ゲル電気泳動マーカー、その他ＰＣＲ反応用試薬、タンパク質変性剤、限外濾過膜の１以上を含んでいてもよい。
【００８４】
以下、本発明の方法に使用する機器、装置および試薬、並びに試験の手順の具体的な例を示す。下記手順はあくまで一例であり、本願発明の範囲は下記に限定されることはない。
【００８５】
１  機器等
１．１  ピペット、０−２０μｌ（±０．２０μｌ）、２０−２００μｌ（±１．６０μｌ）、２００−１０００μｌ（±８μｌ）を取り測れるもの。
【００８６】
１．２  マイクロチューブ。市販品としてはエッペンドルフチューブまたは同等の機能をもつもの。２ｍｌ（精製用）、０．２ｍｌ（ＰＣＲ用）。ＰＣＲ用としてはＰＣＲ装置に適したものを用いる。
【００８７】
１．３  マイクロチューブ用キャップロック
【００８８】
１．４  ヒートブロック、マイクロチューブ装着用穴があり、約８０℃（±１．０℃）まで加熱可能なもの。
【００８９】
１．５  振盪攪拌機  ５０℃までの温度に加熱維持でき、マイクロチューブを約５００ｒｐｍ以上にて攪拌可能なもの
【００９０】
１．６  振とう機、マイクロチューブを固定でき、約５００ｒｐｍ以上にて振とう可能なもの。振とう機は３０ｒｐｍ以上でマイクロチューブを回転させることができる、マイクロチューブ回転機にて置き換えることができる。
【００９１】
１．７  遠心分離機  １４０００ｒｐｍ以上で回転可能、温度が０℃〜室温まで設定可能、マイクロチューブおよび遠心分離式限外濾過用ユニットを装着可能なもの。
【００９２】
１．８  遠心分離式限外濾過用ユニット、１００ｋＮＭＷＬ（Nominal Molecular Weight Limit）以上の分子量の分子を捕捉できるもの。
【００９３】
１．９  ＰＣＲ反応装置、温度・時間プログラムが可能なもの。
【００９４】
１．１０  ＵＶ照射装置
【００９５】
１．１１  写真撮影装置
【００９６】
１．１２  アガロースゲル染色用容器（タッパーウエア）
【００９７】
１．１３  アガロースゲル電気泳動試験において、アガロースゲルにウエルを付与するためのコーム
【００９８】
１．１４  獣毛繊維を混合、細断するためのミキサーミル
【００９９】
２  試薬等
２．１  純水
【０１００】
２．２  クロロホルム／イソアミルアルコール混合試薬
最上位グレードの１００％クロロホルムおよびイソアミルアルコールを用いて調製
−クロロホルム：９６００μｌ
−イソアミルアルコール：４００μｌ
【０１０１】
２．３  過塩素酸ナトリウム溶液
−過塩素酸ナトリウム  ６．１ｇ
純水を添加して１０ｍｌとする。
【０１０２】
２．４  １ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン［分子量１２１．１４］１２．１グラムを８００ｍｌの純水に溶解後、ＨＣｌを滴下して、ｐＨ８．０に調整する。純水を加えて１０００ｍｌとする。
【０１０３】
２．５  ５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ
ＥＤＴＡＮａ２・２Ｈ２Ｏ（ＥＤＴＡの２ナトリウム塩２水和物）１８６．１ｇを８００ｍｌの純水に溶解後、ＮａＯＨを加えて、ｐＨ８．０に調整する。純水を加えて１０００ｍｌとする。
【０１０４】
２．６  ＤＮＡ抽出液Ａ
−１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （２．４）：５ｍｌ
−５００ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（２．５）：２ｍｌ
−ラウリル硫酸ナトリウム (SLS) (C12H25SO4Na)：０．２ｇ
−ショ糖：１．２ｇ
−塩化ナトリウム：１７０ｍｇ
−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）：９２０ｍｇ
純水を加えて１０ｍｌとする。
【０１０５】
２．７  緩衝液Ｂ
−１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２．４）：１ｍｌ、
−ＥＤＴＡ  （２．５）：０．２ｍｌ
純水を加えて１００ｍｌとする。
【０１０６】
２．８  タンパク質分解酵素溶液（パパイン酵素液）
パパインを１０ｕｎｉｔ／２０μｌとなるよう純水に溶解する。
【０１０７】
２．９  耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼを用いる。例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼが好適に用いられる。
【０１０８】
２．１０  獣毛種Ａ  プライマー１
フォワード、カシミヤ、ヤク、ヒツジ鑑別用プライマー。
【０１０９】
２．１１  獣毛種Ａ  プライマー２
リバース、カシミヤ、ヤク、ヒツジ鑑別用プライマー。
【０１１０】
２．１２  ヌクレオチド基質
ＰＣＲグレードの核酸基質
【０１１１】
２．１３  ポリメラーゼ用緩衝液
耐熱性ポリメラーゼに適した緩衝液。市販の耐熱性ポリメラーゼにおいて推奨されるものを用いればよい。
【０１１２】
２．１４  塩化カリウム
ＰＣＲ反応安定用試薬。
【０１１３】
２．１５  塩化マグネシウム
ＰＣＲ反応安定用試薬。
【０１１４】
２．１６  ゲル電気泳動マーカー
ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ断片のおよそのサイズを決めるために用いられる１００〜５００ｂｐのＤＮＡからの断片、例えばｐｈｉＸ１７４ファージＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｃｌｌにて消化して得られるＤＮＡ断片または１００ｂｐラダー。
【０１１５】
２．１７  アガロース
ＤＮＡ電気泳動グレードの寒天
【０１１６】
２．１８  電気泳動のローディング用溶液
−グリセロール：３６ｇ
−５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（２．５）：６ｍｌ
−ブロモフェノールブルー：０．２５ｇ
−キシレンシアノール：０．２５ｇ
純水を加えて１００ｍｌ  とする。
１／６量以上をサンプルに加えてから、ゲルにローディングする。
【０１１７】
２．１９  電気泳動用緩衝溶液
−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩基(Trizma base)：２４２ｇ
−酢酸（氷酢酸）：５７.１ｍｌ
−ＥＤＴＡ・２Ｎａ  ：  ７.４３ｇ
純水で溶解し、１Ｌになるように純水を添加し、次いで純水で５０倍に希釈して用いる。
【０１１８】
２．２０  ＤＮＡ染色剤、エチジウムブロマイド
５μｇ／ｍｌになるように電気泳動用の緩衝液（２．１９）に溶解させたもの。
【０１１９】
２．２１  ポジティブコントロールプライマーセット
カシミヤ、ヤク、ヒツジの全てに共通して存在するＤＮＡ塩基配列を増幅させるプライマーセット。
【０１２０】
３  試料採取
３．１  試験試料は、試験を行う繊維製品を代表するものであるように、採取する。試験を行う繊維製品が部品で構成されている等の場合は試料採取部分について報告書に記載する。部品で構成されているような繊維製品を取り扱う場合、他部分の繊維が混入しないよう十分注意を払う。
【０１２１】
試験繊維製品の試料数は２として、試験を行う。異なる結果が得られた場合は再度試料数２により試験を実行する。
【０１２２】
４  試験方法
４．１  全般
カシミヤ、ヤク、ヒツジの被検対象獣毛繊維鑑別用のプライマーをそれぞれ用いる試験を並行して実施する。
【０１２３】
４．２  試料の細断
獣毛繊維製品より採取した試料１００ｍｇをハサミ、ミキサーミルまたは他の装置により繊維長が２ｍｍ  以下の長さになるよう、細断する。次いで、裁断した試料５０  ｍｇを２．０ｍｌのマイクロチューブ（エッペンドルフチューブまたは同等の市販品）へ投入する。
【０１２４】
４．３  ＤＮＡ抽出
１）  試料を投入したマイクロチューブにＤＮＡ抽出液Ａ（２．６）を６００μｌ添加する。
２）  試料が完全に濡れるようにマイクロチューブに蓋をし、手で転倒させ攪拌する。
３）キャップロックでマイクロチューブの蓋が開かないように固定し、ヒートブロックで６０℃、２０分間加熱する。加熱開始３分後、６分後、９分後、１５分後にヒートブロックから一時的に取り出し手で転倒撹拌を行い、加熱を２０分まで続ける。
４）２０分経過後、マイクロチューブをヒートブロックから取り出し、試験室環境で、室温に下がるまで放冷する。次いで、
５）マイクロチューブへ１０ユニットのパパイン溶液（２．８）を加え、振とう攪拌装置に保持させ、５０℃まで加熱する。その後１時間、５００ｒｐｍで振盪しながら５０℃にて保持する。
６）更に、１０ユニットのパパイン溶液（２．８）を加え、５０℃で１２時間、５００ｒｐｍで振盪しながら保持する。１２時間を超えてもよい。その後室温まで冷却する。
【０１２５】
４．４  ＤＮＡ精製
１）４．３（６）でパパイン処理終了後のマイクロチューブへ過塩素酸ナトリウム溶液（２．３）を３００μｌ投入し、新たなマイクロチューブへ移して振とう機（１．６）で１０分間５００ｒｐｍにて攪拌する。
２）当該マイクロチューブへクロロホルム／イソアミルアルコール（２．２）を３００μｌ投入し、良く混ざるように振とう機で１０分間撹拌する。攪拌速度としては回転型振とう機の場合は５００ｒｐｍ、往復式振とう機の場合には１００ｒｐｍ、垂直回転機の場合には３０ｒｐｍなどが例示される。
３）上記２）の処理後のマイクロチューブを３３００×ｇにて1分間遠心分離する。次いでピペットを用いて上清を５００μｌ採取し、別の新たなマイクロチューブへ投入する。
４）３）のマイクロチューブへクロロホルム／イソアミルアルコール（２．２）を５００μｌ投入し、１０秒間手で転倒させ攪拌、次いで良く混ざるように上記２）の振とう機にて１０分間撹拌する。
５）４）のマイクロチューブを遠心分離機で５５００×ｇ、１分間、室温の環境下で遠心分離する。上清４００μｌをピペットを用いて更に別のマイクロチューブへ投入する。
６）５）の上清が入ったマイクロチューブを遠心分離機で１３０００×ｇ、７分間、４℃の環境下で遠心分離し、その後、その上清液３５０μｌを遠心分離式限外濾過用ユニットに適用する。廃液受け皿として更に別のマイクロチューブをユニットの下に取り付ける。
７）この遠心分離式限外濾過用ユニットを遠心分離機で１４０００×ｇ、１２分間、４℃で遠心し、メンブレン上に濃縮されたＤＮＡ溶液を残し、マイクロチューブに濾過された液体を捨てる。
８）マイクロチューブを再び、濾過用ユニットに装着する。
９）濃縮されたＤＮＡ溶液が残っている遠心分離式限外濾過用ユニットに緩衝液Ｂ（２．７）を４５０μｌ添加し、１４０００×ｇ、１０分間、４℃の条件下で遠心分離し、濾過された廃液を捨てる。
１０）上記８）と９）の操作を２回以上、ＤＮＡを精製する。
１１）遠心分離式限外濾過用ユニットに残った濃縮されたＤＮＡ溶液へ緩衝液Ｂ（２．７）２０μｌを添加する。
１２）ＤＮＡ溶液回収のため、フィルターユニットの上部に新たな別のマイクロチューブを反転させて取り付ける。
１３）このユニットを取り付けたマイクロチューブを反転、正立させ、遠心分離機に取り付けて、１０００×ｇ、２分間、４℃で遠心分離してＤＮＡ溶液を回収する。得られる精製ＤＮＡをこれ以降の分析に使用する。
【０１２６】
４．５  ＤＮＡの増幅（ＰＣＲ反応）
４．５．１
反応液組成
−  試験試料ＤＮＡ（４．４（１３））：        ２μｌ
−  耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：            １−１．５ユニット
−  獣毛Ａ  鑑別用プライマー１(フォーワード)：１μｍｏｌ／ｌ
−  獣毛Ａ  鑑別用プライマー２(リバース)：１μｍｏｌ／ｌ
−  ポジティブコントロールプライマー１(フォーワード)：０．５μｍｏｌ／ｌ
−  ポジティブコントロールプライマー２(リバース)：０．５μｍｏｌ／ｌ
−  基質ヌクレオチド  ｄＡＴＰ，  ｄＴＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ：各２００μｍｏｌ
−  ポリメラーゼ反応用緩衝液（２．１３）：ポリメラーゼを供給するメーカーの推奨に従う。
−  塩、  ＫＣｌ：５０ｍｍｏｌ／ｌ
−  塩化マグネシウム：１．５ｍｍｏｌ
純水を加えて総量５０μｌとする。
【０１２７】
４．５．２  ＰＣＲ反応条件（PCR増幅装置設定）
【表２０】
2015073478.tif 000021
【０１２８】
４．５．３  ＰＣＲ増幅試験方法
１）ＰＣＲ用マイクロチューブに４．５．１の試験試料並びに試薬をマイクロピペットを使用して投入し、５０μｌの反応液を作成する。
２）マイクロチューブを４．５．２の条件に設定したＰＣＲ増幅装置に装着する。
３）増幅サイクル回数は３５サイクルまでとする。
４）反応終了後、マイクロチューブを取り出し、使用まで冷蔵庫で４℃で保存する。
【０１２９】
４．６  ＤＮＡ増幅物の検出と確認
４．６．１準備
１）アガロース０．９ｇを  ２００ｍｌ三角フラスコに入れ、電気泳動用緩衝液（２．２１）を６０ｍｌ加える。加熱してアガロースを完全に溶かす。ゲル作成台に注ぎコームをセットする。室温に３０分以上放置し、ゲルを硬化させる。
２）コームを慎重に抜き取り、ゲルのウエルを作成する。ゲルを電気泳動装置にセットする。電気泳動用緩衝溶液をゲルの上面がつかる程度（ゲル表面から３−５ｍｍ）に投入する。
【０１３０】
４．６．２  電気泳動試験
１）マイクロピペットにてＰＣＲ反応後の液（４．５．３（４））１０μｌを取り、新しいマイクロチューブへ投入する。
２）ＰＣＲ反応液の入ったマイクロチューブに２μｌの電気泳動用ローディング用緩衝溶液（２．１８）を加え、ピペッティングにより混合する。
３）マイクロピペットを使用し、ゲルのウエルへ２）の溶液を投入する。
４）ゲルの１つのウエルへゲル電気泳動マーカー５μｌを添加する。
５）電圧１００Ｖ±５０Ｖにて電気泳動する。電気泳動用緩衝液中の染料が全体の２／３のところまで移動した時点で止める。
６）ゲルを取り出し、容器（タッパーウエア  １．１３）へ投入し、エチジウムブロマイド溶液を１００ｍｌ添加して５分置く。次いでＳ／Ｎ比の向上のために、ゲルを純水に２分間浸漬してゲル中の過剰な染料を除去する。
７）容器よりヘラでゲルを取り出し、写真撮影装置（１．１１）の上に設置する。紫外線照射し、ＤＮＡが確認されたら写真を撮影する。
【０１３１】
５．  検証用試料の作成
検証用試料作成は次のとおりとする。
【０１３２】
５．１  抽出工程以降の非増幅性検証（陰性確認）
４．３のＤＮＡ抽出工程を獣毛繊維試料を加えずに実施し、続いて精製、増幅、電気泳動並びに検出工程を実施する。１回の試験毎に１回行い、検出工程でＤＮＡ増幅が無いことを確認。増幅があれば、工程の洗浄、薬剤の取り換えが必要である。
【０１３３】
５．２  抽出工程以降の増幅性検証（陽性確認）
鑑別対象の獣毛（例えばカシミヤ、ヒツジ、ヤク）の標準獣毛繊維につきＤＮＡの抽出、精製、増幅、電気泳動並びに検出工程を実施する。増幅にはポジティブコントロールプライマーセットを用いる。１回の試験毎に１回行い、検出工程でＤＮＡが増幅されることを確認。
【０１３４】
５．３  ＰＣＲ工程以降の増幅性検証
５．２の試験が陰性である場合、ＰＣＲ工程に問題があるかどうかの確認のために実施する工程であり、通常は行わない。予め標準獣毛繊維より抽出されたＤＮＡとポジティブコントロールプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅工程を実行する。
【０１３５】
５．４  ＰＣＲ工程以降の非増幅性検証（ネガティブコントロール）
５．１の検証試験が陽性である場合に実施する。ＰＣＲ反応液にＤＮＡを添加せずにＰＣＲ増幅工程を実行する。増幅が無いことを確認する。増幅が認められる場合には、ＰＣＲ工程条件、薬剤の確認。
【０１３６】
５．５  ４．４の精製ＤＮＡ溶液へ、ＤＮＡと当該ＤＮＡを特異的に増幅させるプライマーを投入してＰＣＲ増幅工程を実施する。精製ＤＮＡ溶液中にＰＣＲ阻害物質が含まれていないかどうかを確認する。
【０１３７】
工程検証用試験方法
【表２１】
2015073478.tif 000022
【０１３８】
６  判定
判定は、検証試料の結果を含めて下表のように判断する。結論が出ない場合は、再度やり直す。
１）検証法１から５の検証試験でＤＮＡを含んでいるのに増幅されない場合、ＤＮＡを含んでいないのに増幅された場合、本試験は成立しない。
２）検証試験が全て正常の場合、試験で使用したプライマーで試験対象の獣毛のＤＮＡの増幅が検出された場合は、試験試料にその獣毛があると同定できる。
３）検証試験が全て正常の場合、試験で使用したプライマーで試験対象の獣毛のＤＮＡの増幅が検出されない場合は、試験試料にその獣毛がないと判定できる。
４）試験試料に他の動物種の獣毛がないと保証するものではないので、各獣毛種、カシミヤ、ヤク、羊について順次試験を続行する。
【０１３９】
判定方法
【表２２】
2015073478.tif 000023
【実施例１】
【０１４０】
カシミヤ、ヤク、羊それぞれのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列より設計した本発明のプライマーセットを用いて、各標準獣毛繊維より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。下記において特に記載のない部分は発明を実施するための形態に記載の条件にて実施した。
【０１４１】
使用した装置は下記の通りである。
PCR装置：アプライドバイオシステムズ 2720 サーマルサイクラー  （アプライドバイシステムズ）
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：AmpliTaq Gold 360 Master Mix  （アプライドバイシステムズ）
マーカー：Tracklt 100bp DNA Ladder  （インビトロジェン）
ＤＮＡ抽出液：カシミヤ、モヘヤ、羊、ヤクのＤＮＡは、標準獣毛繊維である組成１００％の原毛から抽出したものを用いた。
【０１４２】
【表２３】
2015073478.tif 000024
【０１４３】
ＰＣＲ反応条件
酵素活性化：９４℃×５分      １サイクル
増幅：９４℃×３０秒  →  ６０℃×３０秒  →  ７２℃×３０秒    ３５サイクル
伸長反応：７２℃×５分    １サイクル
保存：４℃
【０１４４】
本発明のカシミヤ、ヤク並びに羊毛鑑別用プライマーセットまたは全ての動物種のDNAを増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットを用いて上記反応条件Ａ〜Ｅのいずれかの組成の反応液を調製し、ＰＣＲ反応を上記条件にて行った。試料としては各動物種由来のＤＮＡの抽出液を用いた。ネガティブコントロールとしては、上記反応液組成にＤＮＡ抽出液を添加しないものを作成して、同様にＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動後にＤＮＡのバンドをエチジウムブロマイドにて染め、ＵＶ光にて可視化して写真撮影をした。
【０１４５】
プライマー評価試験１：
ポジティブコントロールプライマーセット１の評価
Positive control 1：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control 1：Reverse  GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件A
【０１４６】
結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表２４および２５に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤ、モヘヤ、羊毛、ヤク、アルパカ、キャメル、アンゴラの全ての試料のＤＮＡを増幅しており、ポジティブコントロールプライマーセット１はポジティブコントロールとして有用である。
【０１４７】
【表２４】
2015073478.tif 000025
＊ＮＣ  ネガティブコントロール
【０１４８】
【表２５】
2015073478.tif 000026
【０１４９】
プライマー評価試験２：
ポジティブコントロールプライマーセット２の評価
Positive control２：Forward  CCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号３)
Positive control２：Reverse  AGGGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１７)
ＰＣＲ反応液組成：条件A
結果を図２並びに表２６に示す。ポジティブコントロールプライマーセット２はカシミヤ、モヘヤ、羊毛およびヤク全てのＤＮＡ試料を増幅しており、ポジティブコントロールとして有用である。
【０１５０】
【表２６】
2015073478.tif 000027
【０１５１】
プライマー評価試験３：
ポジティブコントロールプライマーセット３の評価
Positive control３：Forward  TRCTTCCAAYCAGTGAAATTGACCT  (配列番号４)
Positive control３：Reverse  CTCTTGTCCTTTCGTACTGGGAG  (配列番号１８)
ＰＣＲ反応液組成：条件B
【０１５２】
結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表２７および２８に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤ、羊毛、ヤク、アルパカ、キャメル、アンゴラの全ての試料のＤＮＡを増幅しており、ポジティブコントロールプライマーセット３はポジティブコントロールとして有用である。
【０１５３】
【表２７】
2015073478.tif 000028
【０１５４】
【表２８】
2015073478.tif 000029
【０１５５】
プライマー評価試験４：
ポジティブコントロールプライマーセット４の評価
Positive control４：Forward  TRCTTCCAAYCAGTGAAATTGACCT  (配列番号５)
Positive control４：Reverse  AGATAGAAACCGACCTGGATTRCTC  (配列番号１９)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｂ
【０１５６】
結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表２９および３０に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤ、羊毛、ヤク、アルパカ、キャメル、アンゴラの全ての試料のＤＮＡを増幅しており、ポジティブコントロールプライマーセット４はポジティブコントロールとして有用である。
【０１５７】
【表２９】
2015073478.tif 000030
【０１５８】
【表３０】
2015073478.tif 000031
【０１５９】
プライマー評価試験５：
カシミヤプライマーセット１の評価
Cashmere 1：Forward  CATAGCCACCCTAATGATCCTAAAT  (配列番号３１)
Cashmere 1: Reverse  TGAGAAGTTGAGGCTGTTATCG  (配列番号４６)
Positive control 1:Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control 1：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１６０】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてカシミヤプライマーセット１をポジティブコントロール用プライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット１を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１６１】
結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表３１および３２に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤプライマーセット１ではカシミヤ、モヘヤのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット１のバンドは全ての動物種において認められた。
【０１６２】
【表３１】
2015073478.tif 000032
【０１６３】
【表３２】
2015073478.tif 000033
【０１６４】
プライマー評価試験６：
カシミヤプライマーセット２の評価
Cashmere２：Forward  CAAGAAGTAGAAACGGTCTGAACTATC  (配列番号３１)
Cashmere２：Reverse  GGGAACTGCTCATGAGTGTAGAACG  (配列番号４７)
Positive control 1：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control 1：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１６５】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてカシミヤプライマーセット２をポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１６６】
結果を図６Aおよび図６Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表３３および３４に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤプライマーセット２ではカシミヤ、モヘヤのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは全ての動物種において認められた。
【０１６７】
【表３３】
2015073478.tif 000034
【０１６８】
【表３４】
2015073478.tif 000035
【０１６９】
プライマー評価試験７：
ヤクプライマーセット１の評価
ヤクプライマーセット１
Yak 1：Forward  CTTTCACAGCCATTTATAGCACC  (配列番号５７)
Yak 1：Reverse  CAAGGTGGAGAATTTGAAGGC  (配列番号７３)
ポジティブコントロールプライマーセット１
Positive control：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  （配列番号２）
Positive control：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１７０】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてヤクプライマーセット１を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１７１】
結果を図７Aおよび図７Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表３５および３６に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ヤクプライマーセット１のバンドはヤクのみについて認められたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは全ての動物種において認められた。
【０１７２】
【表３５】
2015073478.tif 000036
【０１７３】
【表３６】
2015073478.tif 000037
【０１７４】
プライマー評価試験８：
ヤクプライマーセット２
Yak２：Forward  CAGCCATTTATAGCACCCGT  （配列番号５７）
Yak２：Reverse   GGCGTTTGAGGGGTAGTG  (配列番号７３)
ポジティブコントロールプライマーセット１
Positive control：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１７５】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてヤクプライマーセット２を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１７６】
結果を図８Aおよび図８Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表３７および３８に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ヤクプライマーセット２のバンドはヤクのみについて認められたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは全ての動物種において認められた。
【０１７７】
【表３７】
2015073478.tif 000038
【０１７８】
【表３８】
2015073478.tif 000039
【０１７９】
プライマー評価試験９：
ヤクプライマーセット３：
Yak３：Forward  GATTTTCTACCCTAATTAACATCAACG  (配列番号５８)
Yak３：Reverse  TTGTAGGGAAGTATCCTAGCAAGG  (配列番号７４)
ポジティブコントロールプライマーセット1
Positive control：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control：Reverse  GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１８０】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてヤクプライマーセット３を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１８１】
結果を図９Aおよび図９Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表３９および４０に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ヤクプライマーセット３のバンドはヤクのみについて認められたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは全ての動物種において認められた。
【０１８２】
【表３９】
2015073478.tif 000040
【０１８３】
【表４０】
2015073478.tif 000041
【０１８４】
プライマー評価試験１０：
ヤクプライマーセット４：
Yak４：Forward  GTCATAATCAGTTCTCACTGACTACTTG  （配列番号５９）
Yak４：Reverse   AAGCCTGAGGATAGAGGGATG  (配列番号７５)
ポジティブコントロールプライマーセット1
Positive control：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  （配列番号２）
Positive control：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  （配列番号１６）
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１８５】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてヤクプライマーセット４を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１８６】
結果を図１０Aおよび図１０Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表４１および４２に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ヤクプライマーセット４のバンドはヤクのみについて認められたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは全ての動物種において認められた。
【０１８７】
【表４１】
2015073478.tif 000042
【０１８８】
【表４２】
2015073478.tif 000043
【０１８９】
プライマー評価試験１１：
ヤクプライマーセット５：
Yak５：Forward  GTTTCATTTTAACTCAACAGCTCTGT  (配列番号６０)
Yak５：Reverse  CAATAGGACAGAGGTGTTGAGC  (配列番号７６)
ポジティブコントロールプライマーセット1
Positive control 1：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control 1：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｃ
【０１９０】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてヤクプライマーセット５を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１９１】
結果を図１１に示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表４３に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ヤクプライマーセット５のバンドはヤクのみについて認められたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは試験した全ての動物種において認められた。
【０１９２】
【表４３】
2015073478.tif 000044
【０１９３】
プライマー評価試験１２：
カシミヤプライマーセット３
Cashmere３：Forward  GCATTTATTGACCTCCCAACC  (配列番号３２)
Cashmere３：Reverse   CATAATATAGACCTCGTCCGATATGTATG  (配列番号４８)
ポジティブコントロールプライマーセット1
Positive control 1：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control 1：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｄ
【０１９４】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてカシミヤプライマーセット３を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１９５】
結果を図１２Aおよび図１２Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表４４および４５に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤプライマーセット３ではカシミヤのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは試験した全ての動物種において認められた。
【０１９６】
【表４４】
2015073478.tif 000045
【０１９７】
【表４５】
2015073478.tif 000046
【０１９８】
プライマー評価試験１３：
ウールプライマーセット１
Wool 1：Forward  GTTATGATTAGCACCCACTGATTG  (配列番号８３)
Wool 1：Reverse   GTTATGAGTATGGAGGCTATTGGATT  (配列番号９８)
ポジティブコントロールプライマーセット1
Positive control 1：Forward  ACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号２)
Positive control 1：Reverse   GGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１６)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｄ
【０１９９】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてウールプライマーセット１を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット1を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０２００】
結果を図１３Aおよび図１３Bに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表４６および４７に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ウールプライマーセット１ではウールのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは試験した全ての動物種において認められた。
【０２０１】
【表４６】
2015073478.tif 000047
【０２０２】
【表４７】
2015073478.tif 000048
【０２０３】
プライマー評価試験１４：
ウールプライマーセット２
Wool２：Forward  CAACCCACTACCTAAAATTTAATTATCC  (配列番号８４)
Wool２：Reverse   AGTAAGGTTGTACTAATGAGGATCGTG  (配列番号９９)
ポジティブコントロールプライマーセット２
Positive control２：Forward  CCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号３)
Positive control２：Reverse  AGGGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１７)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｅ
【０２０４】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてウールプライマーセット２を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット２を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０２０５】
結果を図１４に示す。図の各レーンは左から順に表４８に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ウールプライマーセット２ではウールのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット２のバンドは試験した全ての動物種において認められた。
【０２０６】
【表４８】
2015073478.tif 000049
【０２０７】
プライマー評価試験１５：
ウールプライマーセット３
Wool３：Forward  CATACCAGTACCATAGACGCG  (配列番号８５)
Wool３：Reverse   TCTACTTCTAGTAAACGCAGTTCTCCT  (配列番号１００)
ポジティブコントロールプライマーセット２
Positive control２：Forward  CCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号３)
Positive control２：Reverse  AGGGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１７)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｅ
【０２０８】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてウールプライマーセット３を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット２を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０２０９】
結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。各図の各レーンは左から順に表４９および５０に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ウールプライマーセット３ではウールのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット２のバンドは試験した全ての動物種において認められた。
【０２１０】
【表４９】
2015073478.tif 000050
【０２１１】
【表５０】
2015073478.tif 000051
【０２１２】
プライマー評価試験１６：
カシミヤプライマーセット４
Cashmere４：Forward  GCTTCTATCGGCAGTACATAGTACATTT  (配列番号３３)
Cashmere４：Reverse   GACAGCACAGTTATGTGTGAGC  (配列番号４９)
ポジティブコントロールプライマーセット２
Positive control２：Forward  CCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号３)
Positive control２：Reverse  AGGGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１７)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｅ
【０２１３】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてカシミヤプライマーセット４をポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット２を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０２１４】
結果を図１６Aおよび図１６Ｂに示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表５１および５２に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤプライマーセット４ではカシミヤ、モヘヤのＤＮＡは増幅されたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット２のバンドは全ての動物種において認められた。
【０２１５】
【表５１】
2015073478.tif 000052
【０２１６】
【表５２】
2015073478.tif 000053
【０２１７】
プライマー評価試験１７：
ヤクプライマーセット６
Yak６：Forward  CTCATACAAGCACAATAGATGCA  (配列番号６１)
Yak６：Reverse  TGGCAGTACAACTCGATTATCG  (配列番号７７)
ポジティブコントロールプライマーセット２
Positive control２：Forward  CCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGC  (配列番号３)
Positive control２：Reverse  AGGGTGACGGGCGGTGTGT  (配列番号１７)
ＰＣＲ反応液組成：条件Ｄ
【０２１８】
表２３の反応液組成において、プライマーとしてヤクプライマーセット６を、ポジティブプライマーとしてポジティブコントロールプライマーセット２を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０２１９】
結果を図１７に示す。図の各レーンは左から順に表５３に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、ヤクプライマーセット５のバンドはヤクのみについて認められたが、その他の試料については増幅されなかった。なお、ポジティブコントロールプライマーセット1のバンドは試験した全ての動物種において認められた。
【０２２０】
【表５３】
2015073478.tif 000054
【実施例２】
【０２２１】
カシミヤ原毛、黒ニット、黒織物の３点の獣毛繊維より下記実施例並びに比較例の方法にてＤＮＡを抽出した。
【０２２２】
２００ｍｇの試料をハサミで切り刻み、２ｍｌ容チューブ（eppendolf  DNA Lo-Band tube 2.0mlエッペンドルフ社製）に５０ｍｇ投入した。８個のジルコニア製破砕ボールφ５ｍｍ（レッチェ社製）をチューブに入れ、振とう粉砕機（ＭＭ−４００  レッチェ社製）を用いて３０回／ｓ、７ｍｉｎで破砕処理を行った。
【０２２３】
破砕された試料が入ったチューブにDTT Sucrose buffer（Dithiothreitol（SIGMA）600mM、Tris HCl  500mM、EDTA  100mM、pH8.0、NaCl(SIGMA)  300mM、ラウリル硫酸ナトリウム（SIGMA）  2％、Sucrose（Wako）  350mM）を６００μｌ加え、キャップロック（キャップロック（１．５ｍｌ用）アズワン社製）を用いてチューブの蓋が開かないように固定し、ドライサーモユニット（ＤＴＵ−Ｍｉｎｉ  タイテック社製）を用いて６０℃で２０分間加熱した。加熱の際、３分後、６分後、９分後、１５分後に１０秒間転倒撹拌し、均一に混ぜた。
【０２２４】
チューブにパパイン（Papain from papaya latex  シグマ社製）を１０ユニット加え、バイオシェーカー（BioShaker M・BR-022UP  タイテック社製）を用いて５０℃で１時間、約５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。１時間処理後、チューブにパパインを更に１０ユニット加え、５０℃で１２時間以上、約５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。酵素処理後の溶解液に、５Ｍ Sodium Perchlorateを３００μl入れ、１０分間穏やかに撹拌した。ＣＩＡ（クロロホルム／イソアミルアルコール＝２４：１）を３００μｌ入れ、１０分間転倒撹拌し、マイクロミニ遠心機（eppendorf社製）を用いて３３００Ｇ、１分間、常温で遠心分離し、５００μｌの上清を新しいチューブに入れた。ＣＩＡを５００μｌ入れ、１０分間転倒撹拌し、５５００Ｇ、１分間、常温で遠心分離し、４００μｌの上清を新しいチューブに入れた。
【０２２５】
微量高速冷却遠心機（ＭＸ−３００  ＴＯＭＹ社製）を用いて１３０００Ｇ、７分間、４℃で遠心分離し、３５０μｌの上清をフィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍｌ  １００Ｋ  ミリポア社製）に入れた。フィルターユニットを１４０００Ｇ、１２分間、４℃で遠心し、チューブ内の液体を捨て、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をフィルターユニットに４５０μｌ入れ、１４０００Ｇ、１０分間、４℃で遠心し、チューブ内の液体を捨てた。精製を確実に行うため、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌによる精製を更に２回繰り返した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌをフィルターユニットに２０μｌ入れ、新しいチューブにフィルターを反転させて取り付け、１０００Ｇ、２分間、４℃で遠心し、ＤＮＡ抽出液を回収した。
【０２２６】
（比較例１）
市販されているＤＮＡ抽出キットを用いて獣毛繊維試料よりＤＮＡを抽出した。なお、ＤＮＡ抽出キットには、illustra Nucleon Genomic DNA Extraction Kits（GE Healthcare社製）を用いた。
【０２２７】
１００ｍｇの試料をハサミで切り刻み、２ｍｌ容チューブに２５ｍｇ入れた。Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ（キットに付属）を０．３５ｍｌとプロテイナーゼＫ（キットに付属）を１８μｌをチューブに加え、５０℃で１２時間以上インキュベートした。酵素処理後の溶解液を５５００ｒｐｍ、５分間、常温で遠心分離し、上清を新しいチューブに入れた。Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ（キットに付属）を１００μｌ入れ、７分間穏やかに撹拌した。クロロホルムを６００μｌ入れ、７分間転倒撹拌した。Ｎｕｃｌｅｏｎ  ｒｅｓｉｎ（キットに付属）を１５０μｌ入れ、マイクロミニ遠心機を用いて２０００ｒｐｍ、１分間、常温で遠心分離し、上清を新しいチューブに入れた。マイクロミニ遠心機を用いて１２０００ｒｐｍ、５分間、常温で遠心分離し、上清をフィルターユニットに入れた。フィルターユニットを１４０００Ｇ、１２分間、４℃で遠心し、チューブ内の液体を捨て、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をフィルターユニットに４５０μｌ入れ、１４０００Ｇ、１０分間、４℃で遠心し、チューブ内の液体を捨てた。精製を確実に行うため、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌによる精製を更に２回繰り返した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌをフィルターユニットに２０μｌ入れ、新しいチューブにフィルターを反転させて取り付け、１０００Ｇ、２分間、４℃で遠心し、ＤＮＡ抽出液を回収した。
【０２２８】
（比較例２）
特許文献１に記載の方法によりＤＮＡを抽出した。
１００ｍｇの試料をハサミで切り刻み、２ｍｌ容チューブに５０ｍｇ入れた。チューブに１ｍｌのＤＮＡ抽出液（ＤＴＴ  ５ｍＭ、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６０ｍＭ、ｐＨ８．０、ラウリル硫酸ナトリウム  １％、ＰＥＧ−４００（ＳＩＧＭＡ）  ０．１％）と１０ＵｎｉｔのプロテイナーゼＫを加え、バイオシェーカーを用いて５０℃で１時間、約５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。酵素処理後の溶解液をマイクロミニ遠心機を用いて１２０００ｒｐｍ、５分間、常温で遠心分離し、５００μｌの上清を新しいチューブに入れた。フェノールを３００μｌ入れ、１５分間転倒撹拌した。更にクロロホルムを３００μｌ入れ、５分間転倒撹拌し、マイクロミニ遠心機を用いて２０００ｒｐｍ、１分間、常温で遠心分離し、４００μｌの上清を新しいチューブに入れた。０℃で１５分間保冷後、１２０００ｒｐｍ、５分間、常温で遠心分離し、３５０μｌの上清をフィルターユニットに入れた。フィルターユニットを１４０００Ｇ、１２分間、４℃で遠心し、チューブ内の液体を捨て、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をフィルターユニットに４５０μｌ入れ、１４０００Ｇ、１０分間、４℃で遠心し、チューブ内の液体を捨てた。精製を確実に行うため、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌによる精製を更に２回繰り返した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌをフィルターユニットに２０μｌ入れ、新しいチューブにフィルターを反転させて取り付け、１０００Ｇ、２分間、４℃で遠心し、ＤＮＡ抽出液を回収した。
【０２２９】
ＤＮＡ抽出量の比較
ＤＮＡの量をリアルタイムＰＣＲ法にて測定した。  ＰＣＲ条件は下記の通りである：
【０２３０】
PCR装置：ViiA 7 Real Time PCR System （Applied Biosystems）
ＰＣＲ反応液：
水  ２０μl
TaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems）  ２５μl
プライマー（Fwd：50μM）  １μl
プライマー（Rev：50μM）  １μl
TaqMan probe（12.5pmol/μl）  １μl
ＤＮＡ抽出液  ２μｌ
【０２３１】
ＰＣＲの反応条件：
５０℃×２分      １サイクル
９５℃×１０分      １サイクル
９５℃×１５秒  →  ６０℃×１分    ４０サイクル
【０２３２】
プライマー：
yagi F 874：5'-TTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCA-3'(配列番号１０７)
yagi R 953：5'-TTAATAGGCTTGAGTGCATTGTATTTACT-3'(配列番号１０８)
【０２３３】
プローブ：
yagi T 901：5'-FAM-ACACACCGCCCGTCACCCTCC-TAMRA-3'(配列番号１０９)
【０２３４】
結果を表５４と表５５に示す。
【表５４】
2015073478.tif 000055
【０２３５】
【表５５】
2015073478.tif 000056
※：本プライマーとプローブによるPCRの増幅効率を９５％として算出。
【０２３６】
染色等の加工がなされていない原毛については、いずれの方法であっても獣毛繊維からＤＮＡを抽出することができるが、黒ニット、黒織物と試料に対する加工度が上がるに従い、実施例により抽出可能なＤＮＡ量と格段の差がつくようになった。比較例１の抽出方法では、弱い加工の試料（黒ニット）であっても顕著にＤＮＡの抽出量が低下した。また、比較例２では、弱い加工の試料（黒ニット）からはＤＮＡが抽出されているが、強い加工の試料（黒織物）からはＤＮＡがほとんど抽出できなかった。実施例の方法では、従来ＤＮＡの抽出が難しかった試料においてもＤＮＡが抽出されている。
【０２３７】
獣毛繊維の鑑別（定性PCR）
上記の試料の内、最もＤＮＡの抽出量が少ない黒織物のＤＮＡ抽出液を用いて、定性PCRを行った。
【０２３８】
PCR装置：Applied Biosystems 2720 サーマルサイクラー  （アプライドバイシステムズ）
使用酵素：AmpliTaq Gold 360 Master Mix  （アプライドバイシステムズ）
マーカー：Tracklt 100bp DNA Ladder  （Invitrogen）
【０２３９】
ＰＣＲ反応液：
水  ２０μl
AmpliTaq Gold 360 Master Mix  ２５μl
プライマー（Fwd：50μM）  １μl
プライマー（Rev：50μM）  １μl
ポジティブプライマー（Fwd：50μM）  ０．５μl
ポジティブプライマー（Rev：50μM）  ０．５μl
ＤＮＡ抽出液  ２μｌ
【０２４０】
ＰＣＲの反応条件：
９５℃×５分      １サイクル
９５℃×３０秒  →  ６２℃×３０秒  →  ７２℃×３０秒    ３５サイクル
７２℃×５分    １サイクル
４℃    １サイクル
【０２４１】
プライマー：
ポジティブコントロールプライマーセット５
ISC_PCa06：Forward  gaagctgctgcctgatactgac (配列番号１１)
ISC_PCa06：Reverse   gtcctttttgagttcattcgtaggctag  (配列番号２５)
カシミヤプライマーセット５
ISC_CHe02：Forward  gtggtagctatttttatctgggctt  (配列番号３５)
ISC_CHe02：Reverse  gctttattttagcactagaaaccgc  (配列番号５１)
ヒツジプライマーセット４
ISC_OVe03：Forward  ggagtgcacccaggaaagattc  (配列番号８８)
ISC_OVe03：Reverse  ccaaccgaaactgttaactcataaggag  (配列番号１０３)
ヤクプライマーセット７
ISC_BGe02：Forward  gataccgcggccgttaaacag  (配列番号６３)
ISC_BGe02：Reverse   actcctagccccaatactggactaa  (配列番号７９)
【０２４２】
上記の方法によって測定した結果を図１８から図２１に示す。図１８は比較例１、図１９は比較例２、図２０は実施例、図２１はネガティブコントロール、すなわちＤＮＡ抽出液を投入せずにＰＣＲを実施した結果である。図１８〜２０では各レーンは左からマーカー、カシミヤ鑑別用プライマー、羊鑑別用プライマー、ヤク鑑別用プライマーをポジティブコントロールプライマーと共に用いてＰＣＲを実施した結果を示す。図２１は左より順にカシミヤ、羊、ヤクそれぞれの鑑別用プライマーであり、一番右がマーカーである。
【０２４３】
比較例１または２の方法で抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行った図１８および１９では、各バンドはぼんやりとしか確認できない、もしくはポジティブコントロールプライマーの増幅が認められないが、実施例の結果である図２０では、ポジティブコントロールプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片、並びにカシミヤ鑑別用プライマーにより増幅されたＤＮＡ断片のいずれもがはっきり確認できた。
【実施例３】
【０２４４】
ＤＮＡ抽出液の緩衝剤、キレート剤、還元剤、界面活性剤の濃度の影響を検証するため、表５６に記載の各組成の濃度が異なるＤＮＡ抽出液を用いて、実施例２とは別の黒織物と黒ニット(以下それぞれ黒織物２、黒ニット２とする)の２点の獣毛繊維の溶解液のpHおよびこれら試料２点より抽出されたＤＮＡ量を測定した。
【０２４５】
【表５６】
2015073478.tif 000057
【０２４６】
実施例２の方法と同様に、２００ｍｇの試料をハサミで切り刻み、２ｍｌ容チューブに５０ｍｇ投入した。８個のジルコニア製破砕ボールφ５ｍｍをチューブに入れ、振とう粉砕機を用いて３０回／ｓ、７ｍｉｎで破砕処理を行った。
【０２４７】
破砕された試料が入ったチューブに表５６に記載のＤＮＡ抽出液を６００μｌ加え、キャップロックを用いてチューブの蓋が開かないように固定し、ドライサーモユニットを用いて６０℃で２０分間加熱した。加熱の際、３分後、６分後、９分後、１５分後に１０秒間転倒撹拌し、均一に混ぜた。
【０２４８】
チューブにパパインを１０ユニット加え、バイオシェーカーを用いて５０℃で１時間、約５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。１時間処理後、チューブにパパインを更に１０ユニット加え、５０℃で１２時間以上、約５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。
【０２４９】
酵素処理後の溶解液を１滴採取し、コンパクトpHメーター（B-212 HORIBA製）を用いて溶解液のpHを測定した。
【０２５０】
結果を表５７に示す。
【表５７】
2015073478.tif 000058
【０２５１】
pH測定に使用した残りの酵素処理後の溶解液を用いて、実施例２の方法により溶解液を精製・濃縮し、ＤＮＡ抽出液を回収した。
【０２５２】
ＤＮＡ抽出量の比較
上記実施例３で得たＤＮＡ抽出液のＤＮＡの量を、実施例２に記載のリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。
【０２５３】
結果を表５８に示す。
【表５８】
2015073478.tif 000059
【０２５４】
染色されている獣毛繊維は、獣毛繊維の溶解に伴って染料等（染色や加工工程で使用される染料、酸、均染剤、無機塩、アルカリ、染色堅ろう度向上剤、防縮加工剤、縮充加工剤を含む）が溶解液中に溶出する。溶出した染料等は酵素活性を阻害するため、染色された獣毛繊維から酵素を用いてＤＮＡを抽出するためには、ＤＮＡ抽出液に一定以上のｐＨ緩衝作用とキレート作用が必要となる。表５７の結果に示すように、ＤＮＡ抽出液中の緩衝剤の濃度が減少されることに伴い、溶解液のｐＨは低下する。
【０２５５】
本発明で用いるＤＮＡ抽出液は、緩衝剤やキレート剤のみではなく、高濃度の界面活性剤と還元剤を含むことによって、獣毛繊維の溶解を補助する機能を持つ。表５８の結果に示すように、得られるＤＮＡの抽出量はＤＮＡ抽出液1/4とＤＮＡ抽出液1/8を境に顕著に増加する。本プライマーとプローブによるPCRの増幅効率を９５％として算出した場合、約８倍以上のＤＮＡの抽出量の増加が認められる。Dithiothreitol 150mM、Tris HCl 125mM、EDTA 25mM、pH8.0、NaCl 75mM、ラウリル硫酸ナトリウム 0.5％、Sucrose 87.5mM以上を含むＤＮＡ抽出液を用いることによって、従来ＤＮＡの抽出が難しかった染色された試料においてもＤＮＡを抽出することが可能となった。
【実施例４】
【０２５６】
プライマー評価試験１８：
カシミヤ、ヤク、羊それぞれのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列より設計した本発明のプライマーセットを用いて、各標準獣毛繊維より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。下記において特に記載のない部分は発明を実施するための形態に記載の条件にて実施した。
【０２５７】
使用した装置は下記の通りである。
PCR装置：DICE-TP600  （タカラバイオ）
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：AmpliTaq Gold 360 Master Mix  （アプライドバイシステムズ）
マーカー： 100bp DNA Ladder  （インビトロジェン）
ＤＮＡ抽出液：カシミヤ、羊、ヤクのＤＮＡは、標準獣毛繊維である組成１００％の原毛から抽出したものを用いた。
【０２５８】
反応液組成は以下の通りである。
−  試験試料ＤＮＡ（４．４（１３））： 1μｌ
−  獣毛Ａ  鑑別用プライマー１(フォーワード)：１μｍｏｌ／ｌ
−  獣毛Ａ  鑑別用プライマー２(リバース)：１μｍｏｌ／ｌ
−  ポジティブコントロールプライマー１(フォーワード)：０．５μｍｏｌ／ｌ
−  ポジティブコントロールプライマー２(リバース)：０．５μｍｏｌ／ｌ
−  AmpliTaq Gold 360 Master Mix  ２５μｌ
純水を加えて総量５０μｌとした。
【０２５９】
ＰＣＲ反応条件：
酵素活性化：９４℃×５分      １サイクル
増幅：９４℃×３０秒  →  ６２℃×３０秒  →  ７２℃×３０秒    ３５サイクル
伸長反応：７２℃×５分    １サイクル
保存：４℃
【０２６０】
本発明のカシミヤ、ヤク並びにヒツジ毛鑑別用プライマーセットまたは全ての動物種のＤＮＡを増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を上記条件にて行った。ネガティブコントロールとしては、上記反応液組成にＤＮＡ抽出液を添加しないものを作成して、同様にＰＣＲ反応を行った。
【０２６１】
ＰＣＲ反応終了後、得られたＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動後にＤＮＡのバンドをエチジウムブロマイドにて染め、ＵＶ光にて可視化して写真撮影をした。
【０２６２】
ポジティブコントロール用のプライマーとしては、全てPCa06(配列番号１１と２５)のプライマーセットを用いた。
【０２６３】
結果を図２２に示す。それぞれの図の各レーンは左から順に表５９に示す試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤ、ヒツジ毛、ヤクそれぞれの鑑別用プライマーセットは対応する試料由来のＤＮＡのみを増幅した。また、ポジティブプライマーセットはネガティブコントロール以外の全ての試料由来のＤＮＡを増幅した。
【０２６４】
【表５９】
2015073478.tif 000060
＊NC:ネガティブコントロール
＊NA: Not applicable
【実施例５】
【０２６５】
プライマー評価試験１９：
カシミヤ、ヤク、羊それぞれのミトコンドリアＤＮＡ塩基配列より設計した本発明のプライマーセットを用いて、各標準獣毛繊維より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。下記において特に記載のない部分は実施の形態に記載の条件にて実施した。
【０２６６】
使用装置は実施例４と同じものを用いた。反応液組成は以下の通りである。
−  試験試料ＤＮＡ（４．４（１３））： 1μｌ
−  獣毛Ａ  鑑別用プライマー１(フォーワード)：１μｍｏｌ／ｌ
−  獣毛Ａ  鑑別用プライマー２(リバース)：１μｍｏｌ／ｌ
−  AmpliTaq Gold 360 Master Mix  ２５μｌ
純水を加えて総量５０μｌとした。
【０２６７】
ポジティブコントロール用のプライマーは、獣毛鑑別用プライマーとは混在させず、別の増幅試験を行った。反応組成は上記と同様で、獣毛鑑別用プライマーの代わりに、ポジティブコントロールプライマーを以下のように加えた。
−  ポジティブコントロールプライマー１(フォーワード)：０．５μｍｏｌ／ｌ
−  ポジティブコントロールプライマー２(リバース)：０．５μｍｏｌ／ｌ
なお、ポジティブコントロール用のプライマーとしては、全てPCa05(配列番号１０と２４)のプライマーセットを用いた。
【０２６８】
ＰＣＲ反応条件は実施例４と同一とした。表６０および表６１に示すカシミヤ、ヤク並びにヒツジ毛鑑別用プライマーセットまたは全ての動物種のＤＮＡを増幅可能なポジティブコントロールプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を上記条件にて行った。ネガティブコントロールとしては、上記反応液組成にＤＮＡ抽出液を添加しないものを作成して、同様にＰＣＲ反応を行った。さらに、抽出工程以降の非増幅性検証（５．１）、すなわち獣毛繊維試料を加えずにＤＮＡ抽出工程、精製行程を実施して試料を作成し、同様にＰＣＲ反応を実施した。
【０２６９】
結果を図２３と図２４に示す。それぞれの図の各レーンは表６０および表６１に示す各試料に対応する。増幅が認められた試料に丸を付した。本試験において、カシミヤ、ヒツジ毛、ヤクそれぞれの鑑別用プライマーセットは対応する試料由来のＤＮＡのみを増幅した。また、ポジティブプライマーセットはネガティブコントロールならびに抽出工程以降の非増幅性検証以外、全ての試料由来のＤＮＡを増幅した。
【０２７０】
【表６０】
2015073478.tif 000061
【０２７１】
【表６１】
2015073478.tif 000062
＊NC：ネガティブコントロール
＊NA: Not applicable
【図１Ａ】
2015073478.tif 000063
【図１Ｂ】
2015073478.tif 000064
【図２】
2015073478.tif 000065
【図３Ａ】
2015073478.tif 000066
【図３Ｂ】
2015073478.tif 000067
【図４Ａ】
2015073478.tif 000068
【図４Ｂ】
2015073478.tif 000069
【図５Ａ】
2015073478.tif 000070
【図５Ｂ】
2015073478.tif 000071
【図６Ａ】
2015073478.tif 000072
【図６Ｂ】
2015073478.tif 000073
【図７Ａ】
2015073478.tif 000074
【図７Ｂ】
2015073478.tif 000075
【図８Ａ】
2015073478.tif 000076
【図８Ｂ】
2015073478.tif 000077
【図９Ａ】
2015073478.tif 000078
【図９Ｂ】
2015073478.tif 000079
【図１０Ａ】
2015073478.tif 000080
【図１０Ｂ】
2015073478.tif 000081
【図１１】
2015073478.tif 000082
【図１２Ａ】
2015073478.tif 000083
【図１２Ｂ】
2015073478.tif 000084
【図１３Ａ】
2015073478.tif 000085
【図１３Ｂ】
2015073478.tif 000086
【図１４】
2015073478.tif 000087
【図１５Ａ】
2015073478.tif 000088
【図１５Ｂ】
2015073478.tif 000089
【図１６Ａ】
2015073478.tif 000090
【図１６Ｂ】
2015073478.tif 000091
【図１７】
2015073478.tif 000092
【図１８】
2015073478.tif 000093
【図１９】
2015073478.tif 000094
【図２０】
2015073478.tif 000095
【図２１】
2015073478.tif 000096
【図２２】
2015073478.tif 000097
【図２３】
2015073478.tif 000098
【図２４】
2015073478.tif 000099
【配列表】
2015073478000001.app