(57)【要約】      （修正有）【課題】ｐ５３ファミリーのキメラ分子による遺伝子治療などを提供する。【解決手段】ｐ６３由来の転写活性化ドメインをコードする核酸配列、ｐ６３由来のＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列およびｐ５３由来のオリゴマー化ドメインをコードする核酸配列を含むキメラ遺伝子および／またはキメラタンパク質を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤、アポトーシス誘導剤、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤。
【請求項２】
キメラタンパク質が、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む転写活性化ドメイン、配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン、および配列番号１８０のアミノ酸配列を含むオリゴマー化ドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子発現誘導剤。
【請求項３】
キメラタンパク質が核移行シグナルまたはその部分配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子発現誘導剤。
【請求項４】
キメラタンパク質が、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子発現誘導剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、アポトーシス誘導剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、医薬組成物。
【請求項７】
細胞増殖性疾患の処置のための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス関連遺伝子の発現誘導方法。
【請求項９】
ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
【請求項１０】
ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、アポトーシス誘導剤。
【請求項１１】
ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、細胞増殖性疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項１２】
ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
【請求項１３】
配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質もしくはその機能的変異体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含む核酸構築物またはベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸分子、および／または、請求項１５に記載の核酸構築物および／またはベクターを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子および／またはキメラタンパク質を含む、遺伝子発現誘導剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
がん抑制遺伝子ｐ５３は、ＤＮＡ損傷などに関連する転写因子をコードする。ｐ５３におけるがんに関連する変異は、主としてＤＮＡ結合ドメインにおけるミスセンス変異である。典型的には、これら変異は全長の変異タンパク質（変異ｐ５３）を発現し、ｐ５３の標的遺伝子のトランス活性化を不能にする。野生型の活性が失われることに加え、多くのｐ５３変異体は、残りの野生型対立遺伝子から発現する野生型ｐ５３を不活性化し、ドミナントネガティブなタンパク質として機能する。議論の余地はあるものの、がん細胞における変異型ｐ５３の存在は侵襲性腫瘍に関連するため、予後の悪化にも関連する。
【０００３】
外来性のｐ５３の発現は、細胞周期の進行を妨げ、アポトーシスを誘導することによって、がん細胞の増殖を阻害する。多くのがんにおいて、ｐ５３の消失は腫瘍の発達だけではなく、化学療法抵抗性をも引き起こす。したがって、腫瘍細胞への野生型ｐ５３の再導入は、増殖阻害経路を活性化し、腫瘍細胞の化学療法への感受性を増加させる。実際に、ｐ５３遺伝子治療がいくつかのがんに対して効果的であることが証明されている。しかしながら、ＭＤＭ２の増幅、ｐ１４ＡＲＦ変異による不活性化、またはＨＰＶ陽性子宮頸癌におけるＨＰＶ Ｅ６がん遺伝子は、ｐ５３の増殖抑制経路を障害するため、ｐ５３遺伝子治療の効果を妨げる。
【０００４】
ｐ５３遺伝子ファミリーは、ｐ５３、ｐ６３（別名ｐ５１）およびｐ７３の３つのメンバーからなる。Ｎ末端の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）、中央コアの配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＣ末端のオリゴマー化ドメイン（ＯＬＤ）の３つのドメインにおいて、これらファミリーは相同性を共有する。しかしながら、ｐ５３ファミリーメンバーは、転写制御および転写後制御の特徴的なパターンを示す。ｐ５３は比較的高レベルで広範に転写され、正常な細胞におけるｐ５３タンパク質の量は、主にそのタンパク分解によって制御される。ｐ５３タンパク質の分解は、ｐ５３をユビキチン化するＭＤＭ２を介して行われる。ｐ５３のＮ末端におけるアミノ酸残基のリン酸化は、そのＤＮＡ結合活性に影響を与えないが、ＭＤＭ２に対する親和性に影響するため、続くタンパク分解に影響を与える。
【０００５】
ｐ６３の構造は、ｐ５３の構造より複雑である。ｐ６３遺伝子は、２つの異なるプロモーターの使用および選択的スプライシングの結果、Ｎ末端およびＣ末端が異なる複数のアイソフォームとして発現する。ｐ６３アイソフォームは、２つのＮ末端の１つを有すると考えられる。１つは転写活性があり（ＴＡ）、もう１つはＮ末端が欠失している（ΔＮ）。加えて、Ｃ末端はアイソフォーム間で異なり、特に、ｐ６３αアイソフォームは、急激に活性を減少させるＣ末端領域を含む。ｐ６３アイソフォーム間の機能的差異は、選択的プロモーターおよび選択的スプライシングの異なる制御が原因である。
【０００６】
これまでに、ｐ５３の変異体として、ｐ５３のＳｅｒ−４６をフェニルアラニンで置換した変異ｐ５３が、がん細胞において野生型ｐ５３よりも効率的にアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献１）。また、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子も知られており、ｐ５１、ｐ５３およびｐ７３のＴＡＤ、ＤＢＤおよびＯＬＤをそれぞれ組み換えることにより、野生型ｐ５３よりも優れた転写活性能を獲得し得ることが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３５４４８８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nakayama et al., Cancer Sci. 2006 Jul;97(7):633-41.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１では、ｐ６３（ｐ５１）由来のＴＡＤを有するキメラでは転写活性能が低い傾向にあるなど、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子およびキメラタンパク質の有用性は、特定の組み合わせのキメラに限定されていた。また、腫瘍抑制におけるＴＡｐ６３およびＴＡｐ７３の機能は不明であり、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子およびキメラタンパク質によるアポトーシス誘導の効果に関するデータも記載されていない。したがって、ｐ５３遺伝子治療に用いられ得るｐ５３ファミリーのキメラは、実用化に向けての改善の余地があり、臨床使用にも優れた抗腫瘍剤の開発が求められる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、ＴＡＤ、ＤＢＤおよびＯＬＤがそれぞれｐ６３、ｐ６３およびｐ５３由来のｐ５３ファミリーのキメラ（ｐ６３−５３Ｏ）が、予想外にも優れたアポトーシス効果を奏することや、その変異体であるキメラタンパク質（ＳＨｐ５３）が、特定のアポトーシス関連遺伝子を特異的に活性化することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤。
［２］キメラタンパク質が、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む転写活性化ドメイン、配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン、および配列番号１８０のアミノ酸配列を含むオリゴマー化ドメインを含む、［１］に記載の遺伝子発現誘導剤。
［３］キメラタンパク質が核移行シグナルまたはその部分配列を含む、［１］または［２］に記載の遺伝子発現誘導剤。
【００１２】
［４］キメラタンパク質が、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載の遺伝子発現誘導剤。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、アポトーシス誘導剤。
［６］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、医薬組成物。
【００１３】
［７］細胞増殖性疾患の処置のための、［６］に記載の医薬組成物。
［８］ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス関連遺伝子の発現誘導方法。
［９］ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
【００１４】
［１０］ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、アポトーシス誘導剤。
［１１］ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、細胞増殖性疾患の処置のための医薬組成物。
［１２］ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
【００１５】
［１３］配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質もしくはその機能的変異体。
［１４］［１３］に記載のキメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子。
［１５］［１４］に記載の核酸分子を含む核酸構築物またはベクター。
［１６］［１５］に記載の核酸分子、および／または、［１５］に記載の核酸構築物および／またはベクターを含む組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の遺伝子発現誘導剤は、ＴＡＤ、ＤＢＤおよびＯＬＤが、それぞれｐ６３、ｐ６３およびｐ５３由来のｐ５３ファミリーキメラ遺伝子またはキメラタンパク質を含み、アポトーシス関連遺伝子の発現を誘導する。したがって、がん細胞などにおいて、優れたアポトーシス誘導効果を示す。本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、転写活性能を高めると考えられるｐ６３由来のＯＬＤを有さず、野生型ｐ５３よりも効率的にアポトーシス関連遺伝子を誘導する。
【００１７】
本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、カスパーゼ−３を活性化させてアポトーシスを促進し、in vivoにおいても優れた抗腫瘍効果を奏する。また、野生型ｐ５３よりも効率的にアポトーシスを誘導することから、従来のｐ５３治療よりも副作用を抑えることができ、臨床での有用性が期待される。さらに、本発明の遺伝子発現誘導剤は、遺伝子治療に用いることができ、かかる場合には化学療法や放射線治療などの他の処置法との併用も可能となる。
【００１８】
本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、アポトーシス関連遺伝子を誘導することができ、例えば、ｐ５３ＡＩＰ１（ＴＰ５３ＡＩＰ１）の発現を誘導することにより、アポトーシスを促進することができる。また、本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、ＣＡＳＰ１０およびＰＹＣＡＲＤなどのアポトーシス関連遺伝子の発現を誘導することもできる。さらに、新規なアポトーシス関連遺伝子として今回同定されたＫＣＮＫ３の発現を誘導することができ、特徴的な遺伝子発現パターンおよび新規なアポトーシス経路によって、細胞増殖を抑制することができる。また、本発明のキメラタンパク質は、核移行シグナルを含むことによって、効率的に核へ移行し、転写を活性化することができる。
【００１９】
本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、ｐ５３ヌルがん細胞または野生型がん細胞だけではなく、ドミナントネガティブ効果を有するｐ５３変異体を保持するがん細胞においても、効果的にアポトーシスを促進することができる。これにより、ｐ５３治療に耐性を示すがんの治療が可能となり、従来のｐ５３遺伝子治療を大幅に改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、Ａｄ−ｐ５３遺伝子ファミリーのアポトーシス効果の比較を示した図である。
【図２ＡＢ】図２ＡＢは、Ａｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの併用によって増加したアポトーシスの誘導を示した図である。
【図２ＣＤ】図２ＣＤは、ＭＫＮ４５細胞において、Ａｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの併用によって増加したアポトーシスの誘導を示した図である。
【図３】図３は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッド分子の模式図を示した図である。
【００２１】
【図４】図４は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドの細胞内局在を示した図である。
【図５ＡＢ】図５ＡＢは、ＰＡＲＰタンパク質の切断およびカスパーゼ−３の活性を示した図である。
【図５ＣＤ】図５ＣＤは、ＭＫＮ４５細胞におけるＰＡＲＰタンパク質の切断およびカスパーゼ−３の活性を示した図である。
【図６】図６は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性発現後のアポトーシス細胞のフローサイトメトリー解析を示した図である。
【００２２】
【図７】図７は、皮下に移植されたヒトがんの異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示した図である。
【図８】図８は、ＭＫＮ４５異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示した図である。
【図９】図９は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性トランスフェクション後のヒトがん細胞株におけるｐ５３標的およびアポトーシス関連タンパク質の発現を示した図である。
【図１０】図１０は、ｐ６３−５３Ｏハイブリッドによるｐ５３ＡＩＰ１の効率的なトランス活性化を示した図である。
【００２３】
【図１１】図１１は、ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡのｐ６３−５３Ｏによるアポトーシスの誘導との拮抗を示した図である。
【図１２Ａ−Ｄ】図１２Ａ−Ｄは、スーパーハイブリッドｐ５３のがん細胞におけるアポトーシスの強い誘導を示した図である。
【図１２Ｅ−Ｇ】図１２Ｅ−Ｇは、スーパーハイブリッドｐ５３のがん細胞におけるアポトーシスの強い誘導を示した図である。
【図１３】図１３は、ｐ５３（ダークグレー）、ｐ６３γ（ライトグレー）、６３−５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの模式図である。
【００２４】
【図１４】図１４は、ｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの構造をＰＣＲ法およびウェスタンブロット法で確認したことを示した図である。
【図１５】図１５は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３−５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドによる各種がん細胞におけるアポトーシス誘導の比較を示した図である。
【図１６】図１６は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３−５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドタンパク質の細胞内局在を示した図である。
【図１７】図１７は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３−５３ＯおよびＳＨｐ５３による特異的ｐ５３ＡＩＰ１発現誘導を示した図である。
【００２５】
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＳＨｐ５３により誘導される遺伝子発現プロファイリングを示した図である。
【図１８Ｂ−Ｄ】図１８Ｂ−Ｄは、ＳＨｐ５３により誘導される遺伝子発現プロファイリングを示した図である。
【図１９】図１９は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示した図である。
【図２０】図２０は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示した図である。
【００２６】
【図２１】図２１は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示した図である。
【図２２】図２２は、スーパーハイブリッドｐ５３特異的な標的遺伝子のトランス活性化の制御を示した図である。
【図２３】図２３は、ＳＨｐ５３が特異的に結合する部位を持つ標的遺伝子を示した図である。
【図２４】図２４は、特定の標的遺伝子の発現制御によるスーパーハイブリッドｐ５３のアポトーシスの誘導を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中に別記しないかぎり、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して用いられる用語およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。一般的に、別記のないかぎり、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的な、および専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology - 4th Ed., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); および Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げらる。
本明細書に引用した刊行物、特許出願、特許などの資料の全ては、その全体を本明細書に援用する。
【００２８】
酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当該技術分野において通常なされているとおりに、または本明細書に記載のとおりに行うものとする。本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達、ならびに対象の処置に用いるものとする。
【００２９】
ここで、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に別様に指示しないかぎり、複数の指示対象を含むよう用いることとする。例または別様に示されている場合を除き、本出願で用いる成分、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合において用語「約」で修飾されるものと解される。したがって、反対のことが示されないかぎり、この出願に記載の数的パラメーターは近似値であり、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変動し得る。さらに、特に別記しないかぎり、用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的に用いるものとする。
【００３０】
本発明の一側面は、（ｉ）ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質および／またはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子（以下で、「キメラ分子」と総称することもある）を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤または発現誘導用組成物、（ｉｉ）上記キメラ分子の、前記発現誘導剤または発現誘導用組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するための上記キメラ分子、および（ｉｖ）ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するための有効量の上記キメラ分子を含む組成物に関する。
【００３１】
本発明のキメラタンパク質（「ハイブリッドタンパク質」と称することもある）は、ｐ５３とｐ６３とのキメラタンパク質である。したがって、典型的にはｐ５３およびｐ６３の部分からなり、キメラタンパク質のＮ末端側領域がｐ６３由来の部分で構成され、Ｃ末端領域がｐ５３由来の部分で構成される。ヒトｐ５３およびｐ６３の核酸配列は、それぞれ、アクセッション番号（受入番号）NM_000546およびAB016072として、アミノ酸配列は、それぞれアクセッション番号NP_000537およびBAA32592として、GenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手できる。ｐ５３およびｐ６３の配列はまた、配列番号１９３および１９５（核酸配列）、配列番号１９４および１９６（アミノ酸配列）として本明細書に示してある。他の動物の配列もまた、公的に利用可能なデータベース、例えばGenBankなどで見出すことができる：NM_001003210（イヌのｐ５３）、NM_001009294（ネコのｐ５３）、XM_545249（イヌのｐ６３）。本発明におけるｐ５３およびｐ６３は、それぞれ独立して、いずれの生物種に由来するものでもよいが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなどを含む哺乳動物、特にヒトに由来するものであってもよい。本明細書においては、特に別記しない限り、アミノ酸や塩基の位置は、ヒトｐ５３およびｐ６３、より具体的には、配列番号１９３〜１９６に記載のアミノ酸または塩基配列に依拠するものとする。
【００３２】
ｐ５３およびｐ６３において、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインの３つの機能的ドメインを含む構造は種々の生物種間で保存されている。ヒトｐ５３およびｐ６３の各ドメイン構造は既知である（例えば、特開2000-354488、Scoumanne A. et al., Cancer Biol Ther. 2005 Nov;4(11):1178-85、Tafvizi A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 11;108(2):563-8、Natan E et al., J Mol Biol. 2011 Jun 10;409(3):358-68、Khoury MP & Bourdon JC, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Mar;2(3):a000927など）。ヒトｐ６３の転写活性化ドメインは、典型的には配列番号１９６の１〜５９位、特に１〜５８位、ヒトｐ６３のＤＮＡ結合ドメインは、典型的には配列番号１９６の１２４〜３２３位、特に１２４〜３１９位、さらには１４２〜３２３位、１４２〜３２１位もしくは１４２〜３１９位、ヒトｐ５３のオリゴマー化ドメインは、典型的には配列番号１９４の３１８〜３６３位、特に３１８〜３５９位、３１９〜３５９位もしくは３２２〜３５９位、さらには３１９〜３６３位、３２５〜３６３位、３２５〜３５５位、３２６〜３５６位もしくは３２６〜３５５位である。他の生物種における各ドメインの位置は知られているか、ドメイン構造が知られている生物種の配列とのアラインメントや、欠失変異体や置換変異体等を用いた実験等により決定することができる。本発明の一態様において、転写活性化ドメインは配列番号１９６の１〜５８位（配列番号１６２）、ＤＮＡ結合ドメインは配列番号１９６の１２４〜３１９位（配列番号１６６）、およびオリゴマー化ドメインは配列番号１９４の３２２〜３５９位（配列番号１９８）である。本発明の別の態様において、転写活性化ドメインは配列番号１９６の１〜５８位（配列番号１６２）、ＤＮＡ結合ドメインは配列番号１９６の１２４〜３１９位（配列番号１６６）、およびオリゴマー化ドメインは配列番号１９４の３１９〜３５９位（配列番号１７８）である。
【００３３】
本発明のキメラタンパク質は、野生型ｐ５３およびｐ６３における、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインの３つの機能的ドメインの間、およびオリゴマー化ドメインのＣ末端側に存在する配列を全て含んでも、部分的に含んでも、または、全く含まなくてもよい。本発明の一態様においては、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間に少なくとも１個、例えば、１〜６１個のアミノ酸を含む。このアミノ酸はｐ５３由来またはｐ６３由来のものであってよく、２個以上のアミノ酸を含む場合は、さらにｐ５３由来のアミノ酸とｐ６３由来のアミノ酸の両方を含んでいてもよい。より具体的には、本発明のキメラタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間にｐ６３の３２０位からＣ末端側の３３個までのアミノ酸および／またはｐ５３の３１９位からＮ末端側の２８個までのアミノ酸を含んでもよい。例えば、本発明のキメラタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間に、（１）ｐ５３の３０５〜３１７位のアミノ酸、（２）ｐ５３の２９０〜３１７位のアミノ酸、（３）ｐ６３の３２０〜３３５位のアミノ酸、（４）ｐ６３の３２０〜３５２位のアミノ酸、（５）（１）〜（４）のアミノ酸の任意の組合わせ（すなわち、（１）と（３）、（１）と（４）、（２）と（３）、および、（２）と（４）の組合わせ）を含んでもよい。この場合、（１）または（２）のアミノ酸は、典型的にはオリゴマー化ドメインのＮ末端に連結し、（３）または（４）のアミノ酸は、典型的にはＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に連結している。
【００３４】
本発明の一態様において、キメラタンパク質は、オリゴマー化ドメインのＣ末端にｐ５３の３６０位からＣ末端側の３４個までのアミノ酸、例えば、限定されずに、３６０位の１個のアミノ酸、３６０〜３６２位の３個のアミノ酸、３６０〜３９３位の３４個アミノ酸が連結している。本発明の一態様において、キメラタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間、および、オリゴマー化ドメインのＣ末端に、上記のいずれかの少なくとも１個のアミノ酸を含む。本発明の一態様において、キメラタンパク質は、ｐ５３由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）配列またはその一部の配列を含む。ｐ５３由来の核移行シグナルは、３０５〜３２１位のアミノ酸（配列番号１９０）であり、その一部としては、例えば、３１９〜３２１位のアミノ酸が挙げられる。
【００３５】
本発明の特定の態様において、キメラタンパク質は、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の特定の態様において、キメラタンパク質は、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００３６】
上記のキメラタンパク質の機能的変異体には、（ｉ）本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列に対し１個または２個以上、例えば、１個または数個（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸の変異を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉ）本発明のキメラタンパク質の全長アミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉｉ）本発明のキメラタンパク質の全長をコードする核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体などが含まれる。
【００３７】
本明細書で用いる用語「ストリンジェントな条件」は、当該技術分野で周知のパラメータを指す。核酸のハイブリダイゼーションのためのパラメータは、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)やAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)などの標準的なプロトコルに記載されている。
【００３８】
具体的には、本明細書で用いるストリンジェントな条件は、３．５×ＳＳＣ、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４  ２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％およびＥＤＴＡ２ｍＭを含むハイブリダイゼーションバッファによる、６５℃でのハイブリダイゼーションを意味する。上記成分のうち、ＳＳＣはｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムであり、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡをトランスファーしたメンブレンを、室温にて２×ＳＳＣで、次いで６８℃までの温度にて０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、市販のハイブリダイゼーションバッファ、例えば、ExpressHyb(R)緩衝溶液（Clontech Corp.製）等を用いて、メーカーによって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用してもよい。
【００３９】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、利用可能な他の条件、試薬等があるが、当業者はかかる条件を熟知していると考えられるため、本明細書にはこれらに関する具体的な記載はない。しかしながら、対象となる核酸分子もしくはタンパク質の変異体をコードする核酸が明確に同定されるよう、条件を操作することは可能である。
【００４０】
前記キメラタンパク質の機能としては、例えば、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導、アポトーシスの誘導、細胞の増殖抑制などが挙げられる。キメラタンパク質がこれらの機能を有するか否かは、任意の既知の技法、例えば、下記の実施例に記載された技法などによって確認することができる。
【００４１】
本発明の一態様において、キメラタンパク質の機能的変異体は、１個または２個以上、例えば１個または数個の保存的なアミノ酸置換を有してもよい。保存的なアミノ酸置換は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基の互換性に依拠して決定することができる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、水酸基含有側鎖を有する中性アミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換グループは、限定されずに、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンなどである。
【００４２】
保存的なアミノ酸置換は、キメラタンパク質の転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインの３つの機能的ドメインの少なくとも１つに存在しても、上記の機能的ドメイン以外の部分、例えば、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間、オリゴマー化ドメインのＣ末端側に存在してもよい。本発明の一態様において、１個または２個以上の変異、例えば、アミノ酸の欠失、置換、付加は、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間、オリゴマー化ドメインのＣ末端側から選択される個所に存在する。
【００４３】
上記のキメラタンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸分子は、上述のキメラタンパク質またはその機能的変異体のアミノ酸配列に依拠して決定することができる。例えばヒトのｐ５３およびｐ６３のキメラタンパク質をコードする核酸分子については、ヒトのｐ５３およびｐ６３の核酸配列（配列番号１９３および１９５）に依拠して、キメラタンパク質に含まれるｐ５３およびｐ６３タンパク質の各部分に対応する核酸配列を決定することができる。上記核酸分子の具体的配列としては、例えば、配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７および１５９からなる群から選択される核酸配列を含むか、これからなるものが挙げられる。本発明の遺伝子発現誘導剤に用いることのできる核酸分子は、上記核酸分子の縮重物、すなわち、遺伝子コドンの縮重により上記核酸分子と核酸配列は異なるが、それと同じアミノ酸配列のタンパク質をコードするものを含む。
【００４４】
上記のキメラ分子は、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導する。本発明における遺伝子発現の誘導とは、典型的には、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した場合と比較して、当該遺伝子の転写産物またはタンパク質の発現上昇をもたらすことをいう。本発明における発現上昇は、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上であってもよい。
【００４５】
上記のキメラ分子は、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤのほか、例えば、表７〜８に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現をさらに誘導してもよい。本発明の一態様において、誘導される遺伝子は、ＡＧＲＮ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＱＰ３、ＡＲＨＧＡＰ２３、ＡＳＢ１７、ＢＡＩ１、Ｃ１５ｏｒｆ５２、Ｃ３ｏｒｆ４５、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＡＳＰ１０、ＣＤＨ３、ＣＩＴＥＤ１、ＣＬＤＮ１９、ＣＯＬ１６Ａ１、ＤＤＲ１、ＤＬＧＡＰ１、ＤＬＸ３、ＤＭＢＸ１、ＤＹＳＦＩＰ１、ＥＧＲ２、ＦＢＰ２、ＦＧＦ１、ＧＡＳＴ、ＧＰＲ８９Ａ、ＧＲＨＬ３、ＧＲＲＰ１、ＨＶＣＮ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＴＧＡ３、ＫＡＴＮＡＬ２、ＫＣＮＡ２、ＫＣＮＫ３、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ３４、ＬＨＸ１、ＭＡＬＬ、ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＬ７、ＮＣＲＮＡ００１７３、ＮＥＦＨ、ＮＥＦＬ、ＮＰＰＣ、ＮＴＦ４、ｐ５３ＡＩＰ１、ＰＬＣＤ４、ＰＹＣＡＲＤ、ＳＥＣ１４Ｌ５、ＳＥＺ６、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＲＬ、ＳＴＡＲ、ＳＹＴＬ３、ＴＬＸ１、ＴＭＥＭ１２１、ＴＰ７３、ＴＰ７３、ＴＴＹＨ２、ＷＮＴ７ＢおよびＺＮＦ３６５からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のキメラ分子は、当該技術分野において既知の任意の手法により製造することができる。本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子（キメラ遺伝子）は、限定されずに、例えば、オーバーラップ伸長法（例えば、Heckman KL & Pease LR., Nat Protoc 2007; 2: 924-932、Ogasawara Y et al., J Biol Chem 1994; 269: 29785-29792など参照）などのＰＣＲを用いた手法で製造することができる。この手法においては、第１の遺伝子の配列に相補的な部分と、第２の遺伝子の配列に相補的な部分とを含むハイブリッドプライマー、例えば、限定されずに、ｐ６３のＤＮＡ結合ドメインとそのＣ末端側に続く部分とを含む部分の配列またはそのＣ末端部分の配列に相補的な部分と、ｐ５３のオリゴマー化ドメインとそのＮ末端側に続く部分とを含む部分の配列またはそのＮ末端部分の配列に相補的な部分とを含むハイブリッドプライマーなどを利用することができる。本発明のキメラタンパク質は、限定されずに、例えば、既知の手法で得たキメラ遺伝子を、適切な宿主細胞に導入して発現させ、得られたタンパク質を既知の手法、例えば、１次元または２次元ゲル電気泳動法や、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、アフィニティカラム法などで精製することなどにより得ることができる。
【００４７】
本発明のキメラ分子の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０で用いることができる。
【００４８】
上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
【００４９】
遺伝子発現に必要な制御配列の詳細な性質は、生物種または細胞種によって異なってもよいが、一般的には、少なくとも、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、各々転写および翻訳の開始に関与する５’非転写、および５’非翻訳配列を含み得る。特に、かかる５’非転写制御配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含み得る。制御配列はまた、エンハンサー配列か、または所望の上流のアクチベーター配列を含んでもよい。上記核酸構築物およびベクターは、任意に５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切な核酸構築物およびベクターの選択および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内にある。 
【００５０】
特に有用な制御配列は、種々の哺乳動物、ウイルス、微生物、および昆虫遺伝子由来のプロモーター領域を包含する。このプロモーター領域は、対象となる遺伝子の転写の開始を指令し、そして対象となる遺伝子を含むＤＮＡの全ての転写をもたらす。有用なプロモーター領域は、ＣＡＧプロモーター、レトロウイルスのｄＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサー／プロモーター領域、ＲＳＶのＬＴＲプロモーター、ｌａｃプロモーター、およびアデノウイルスから単離されたプロモーターを包含するが、真核生物、原核生物、ウイルス、または微生物細胞での遺伝子発現に有用な、当業者に公知の他の任意のプロモーターを用いることもできる。 
【００５１】
真核生物細胞内で、遺伝子およびタンパク質を発現するのにとりわけ有用なその他のプロモーターは、哺乳動物細胞プロモーター配列およびエンハンサー配列、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導されるものを包含する。典型的にはＳＶ４０などのウイルスのウイルス複製起点に隣接して見出される、ウイルスの初期および後期プロモーターが、特に有用である。特定の有用なプロモーターの選択は、その細胞系、および、特定の細胞系内部で対象となるタンパク質または核酸を発現させるために使用する核酸構築物についての、他の様々なパラメータに依存する。さらに、本発明において有用な充分高いレベルで、標的細胞に遺伝子を発現させることが知られている任意のプロモーターを選択することができる。例えば、標的細胞（がん細胞など）に特異的なプロモーターを採用することにより、遺伝子を特定の標的細胞で効率的に発現させることができる。組織特異的プロモーターとしては、限定されずに、例えば、ＧＦＡＰプロモーター（脊髄、海馬、線状体のニューロン）、ＭＣＫプロモーター（筋肉など）、ＮＳＥプロモーター（ＣＮＳなど）、デスミンプロモーター（心筋、骨格筋など）、ＲｈＭＬＶプロモーター（骨）、オステオカルシンプロモーター（骨）等が挙げられる（Howarth JL et al., Cell Biol Toxicol. 2010 Feb;26(1):1-20等参照）。
【００５２】
本発明の核酸分子は、かかる制御配列と作動可能に連結されていることが好ましい。核酸が制御配列に作動可能に連結されているとは、制御配列の作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生等されるように、該核酸と制御配列とが配置されていることを意味する。より具体的には、核酸分子のコード配列と、核酸構築物やベクターの制御配列とが、当該コード配列の発現または転写が、当該制御配列の影響または支配下にあるように位置される様式で連結されている場合、「作動可能に」連結されている。当該コード配列を機能的なタンパク質に翻訳することが望まれる場合には、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列におけるプロモーターによる誘導の結果、当該コード配列の転写が生じ、また当該２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導する結果とならず、（２）当該コード配列の転写を指示するための当該プロモーターの能力を妨害せず、あるいは（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合には、「作動可能に」連結されている。したがってプロモーター領域は、当該プロモーター領域が、結果として得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列を転写できれば、作動可能にコード配列に連結されていることになる。
【００５３】
本発明における「ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するための有効量」は、上記遺伝子の発現を、例えば、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した場合と比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上増大させる量であり、野生型ｐ５３またはｐ６３との比較実験などにより容易に決定することができる。
【００５４】
上記のキメラ分子は、単一の種類を用いても、１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。異なる種類の遺伝子の発現を誘導することができるキメラ分子を組み合わせることで、より多くの遺伝子を誘導することが可能となる。また、実施例に示すとおり、本発明のキメラ分子が誘導する遺伝子群は、野生型ｐ５３およびｐ６３が誘導するものと一部重複するものの、大部分異なっているため、野生型のｐ５３、ｐ６３、さらにはｐ７３（以下、野生型ｐ５３ファミリー分子と総称することもある）などと組み合わせて用いることもできる。
【００５５】
本発明はまた、（ｉ）上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤を含む、アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物、（ｉｉ）上記キメラ分子の、前記アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスを誘導するための上記キメラ分子、および（ｉｖ）アポトーシスを誘導するための有効量の上記キメラ分子を含む組成物に関する。本発明のこの側面におけるキメラ分子の存在態様などは、特に別記しない限り、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。
【００５６】
上記のキメラタンパク質および／またはその機能的変異体によって発現誘導される遺伝子には、アポトーシス関連遺伝子が含まれる。かかる遺伝子としては、限定されずに、例えば、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤ遺伝子等が挙げられる。ｐ５３ＡＩＰ１は、ｐ５３が誘導するアポトーシスにおける重要な因子であることが知られており（例えば、Oda K et a., Cell. 2000 Sep 15;102(6):849-62）、ＣＡＳＰ１０は、細胞死誘導シグナル複合体（ＤＩＳＣ）によるアポトーシスを開始するカスパーゼ−１０をコードする（Tibbetts MD et al., Nat Immunol 2003; 4: 404-409）。ＰＹＣＡＲＤは、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）をコードし、アポトーシス、免疫応答およびがん発生に重要な役割を担う（Masumoto J et al., J Biol Chem 1999; 274: 33835-33838）。ＫＣＮＫ３はこれまでアポトーシスとの関連性は知られていなかったが、今回本発明者によってアポトーシスの誘導に関与することが初めて明らかとなった。また、上記の核酸分子を細胞に導入することにより種々の細胞においてアポトーシスが誘導されることもこれまで知られていなかったが、本発明者の実験により今回初めて明らかとなった。
【００５７】
本発明におけるアポトーシスの誘導は、細胞に上記キメラ分子を導入した後、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化、ＰＡＲＰタンパク質の切断などのアポトーシス特有の現象の検出、ｓｕｂ−Ｇ１にある細胞の割合の測定、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。本発明におけるアポトーシスの誘導は、典型的には、上記キメラ分子を導入していない状態よりも高く、好ましくは、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した状態よりも高い。アポトーシス誘導の増大の程度は、例えば、キメラ分子を導入していない状態、あるいは、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した状態と比べ、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上であってもよい。
【００５８】
本発明における「アポトーシスを誘導するための有効量」は、例えば、アポトーシスを、キメラ分子を導入していない状態、あるいは、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した状態と比べて、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上増大させる量であり、上記状態との比較実験などにより容易に決定することができる。
【００５９】
本発明のキメラ分子は、単一の種類を用いても、１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。異なる種類の遺伝子の発現を誘導することができるキメラ分子を組み合わせることで、より多くの遺伝子が誘導され、アポトーシスをより強く誘導することが期待される。また、実施例に示すとおり、本発明のキメラ分子が誘導する遺伝子群は、野生型ｐ５３およびｐ６３が誘導するものと一部重複するものの、大部分異なっており、野生型ｐ５３およびｐ６３ではほとんど誘導されないアポトーシス促進性遺伝子（ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３、ＰＹＣＡＲＤなど）を誘導することができるため、野生型ｐ５３ファミリー分子などと組み合わせて用いることで、アポトーシスをより強く誘導することが期待される。
【００６０】
本発明はまた、上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤を含む医薬組成物に関する。上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤は、特定の遺伝子の発現や、アポトーシスを誘導することができるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
【００６１】
上記医薬組成物は、限定されずに、上記のキメラ分子によって発現が誘導される遺伝子や、アポトーシスの誘導がその処置に有用な疾患、例えば、前記遺伝子の発現異常に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などの処置に用いることができる。したがって、本発明はまた、（ｉ）上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤を含むアポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物、（ｉｉ）上記キメラ分子の、アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための上記キメラ分子、および（ｉｖ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための有効量の上記キメラ分子を含む医薬組成物に関する。本発明のこの側面におけるキメラ分子の存在態様などは、特に別記しない限り、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。
【００６２】
細胞増殖性疾患としては、限定されずに、例えば、良性腫瘍または悪性腫瘍、過形成症、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、過形成瘢痕、扁平苔癬および黒子症などを含む。本発明の一態様において、細胞増殖性疾患はがんである。
【００６３】
本発明が対象とするがんとしては、限定されずに、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。なお、本発明では、「がん」は、上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍を含む。本発明におけるがんは、身体の任意の部位、例えば、脳、頭頚部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、肛門、腎、尿管、膀胱、前立腺、陰茎、精巣、子宮、卵巣、外陰、膣、皮膚、横紋筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節等のリンパ系、リンパ液などに存在し得る。
【００６４】
本発明が対象とするがんの一態様は、ｐ５３に変異を有するがん細胞から構成されるがんである。ｐ５３の変異としては、例えば、ｐ５３の欠失や、ｐ５３におけるアミノ酸置換が挙げられる。ｐ５３におけるアミノ酸置換としては、限定されずに、例えば、ヒトｐ５３における、Ｇ１１７Ｅ、Ｐ１５２Ｔ、Ｔ１５５Ｉ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１７５Ｈ、Ｐ１７７Ｓ、Ｐ１７７Ｆ、Ｐ１７７Ｈ、Ｈ１７９Ｙ、Ｅ１８０Ｋ、Ｒ１８１Ｇ、Ｒ１８１Ｈ、Ｎ２３９Ｓ、Ｓ２４１Ｔ、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｙ、Ｇ２４４Ｓ、Ｇ２４５Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｍ２４６Ｌ、Ｐ２５０Ｌ、Ｌ２５７Ｐ、Ｄ２５９Ｖ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、Ｖ２７４Ｆ、Ｇ２７９Ｅ、Ｇ２７９Ｖ、Ｇ２７９Ｒ、Ｄ２８１Ｎ、Ｄ２８１Ｅ、Ｒ２８２Ｑ、Ｅ２８６Ｋなどのアミノ酸置換が挙げられる（Willis et al., Oncogene 2004; 23:2330-8、Blagosklonny et al., Faseb J 2000; 14:1901-7、Monti et al., Oncogene 2002; 21:1641-8参照）。がん細胞が上記変異を有するか否かは、がん細胞のｐ５３遺伝子を解析することで決定することができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤、ビタミンなどをさらに含んでもよい。
抗腫瘍剤としては、限定されずに、例えば、イホスファミド、ニムスチン（例えば、塩酸ニムスチン）、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン（例えば、塩酸ゲムシタビン）、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ−１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン（例えば、塩酸イダルビシン）、エピルビシン（例えば、塩酸エピルビシン）、ダウノルビシン（例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン）、ドキソルビシン（例えば、塩酸ドキソルビシン）、ピラルビシン（例えば、塩酸ピラルビシン）、ブレオマイシン（例えば、塩酸ブレオマイシン）、ペプロマイシン（例えば、硫酸ペプロマイシン）、ミトキサントロン（例えば、塩酸ミトキサントロン）、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン（例えば、塩酸イリノテカン）、ビノレルビン（例えば、酒石酸ビノレルビン）、ドセタキセル（例えば、ドセタキセル水和物）、パクリタキセル、ビンクリスチン（例えば、硫酸ビンクリスチン）、ビンデシン（例えば、硫酸ビンデシン）、ビンブラスチン（例えば、硫酸ビンブラスチン）等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン（例えば、クエン酸タモキシフェン）、トレミフェン（例えば、クエン酸トレミフェン）、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン（例えば、リン酸エストラムスチン）等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼなどが挙げられる。
【００６６】
抗炎症剤としては、限定されずに、ステロイド系抗炎症剤（プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等）や非ステロイド系抗炎症剤（アセチルサリチル酸、ロキソプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、スプロフェン、トルメチン、カルプロフェン、ベノキサプロフェン、ピロキシカム、ベンジダミン、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ジフルニサール、アザプロパゾン等）、炎症性サイトカインの発現を抑制するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸などの物質、および／または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などが挙げられる。
【００６７】
ビタミンとしては、限定されずに、ＶＡ（レチノール）、ＶＢ１（チアミン）、ＶＢ２（リボフラビン）、ＶＢ３（ナイアシン）、ＶＢ５（パントテン酸）、ＶＢ６（ピリドキシン）、ＶＢ７（ビオチン）、ＶＢ９（葉酸）、ＶＢ１２（シアノコバラミン）、ＶＣ（アスコルビン酸）、ＶＤ（カルシフェロール）、ＶＥ（トコフェロール）およびＶＫ（フィロキノン）、ならびにこれらの誘導体およびアナログなどが挙げられる。
【００６８】
本発明の遺伝子発現誘導剤、アポトーシス誘導剤、医薬組成物などに関し、ｐ５３は、アポトーシス促進性遺伝子の発現を誘導するが、同時にアポトーシス抑制遺伝子の発現も誘導する。アポトーシス抑制遺伝子としては、例えば、限定されずに、ｐ２１（NM_000389）、ＳＦＮ（ストラチフィン、１４−３−３シグマ、NM_006142）、Ｇａｄｄ４５（NM_001924）、ｐ３００（ＥＰ３００、NM_001429）、ＢＴＧ２（ＴＩＳ２１、NM_006763）、ＣＡＶ１（NM_001753）、ＤＵＳＰ５（NM_004419）、ＥＧＦＲ（NM_005228）、ＨＧＦ（ＳＦ、NM_000601）、ＭＥＴ（NM_000245）、ＰＣＮＡ（NM_002592）、ＰＬＡＧＬ１（ＺＡＣ、BC074814）、ＳＥＳＮ１（ＰＡ２６、AF033120）、ＳＨ２Ｄ１Ａ（ＳＡＰ、NM_002351）、ＴＧＦＡ（NM_003236）、ＰＣＢＰ４（NM_020418）、ＲＲＭ２Ｂ（NM_015713）、ＳＴＥＡＰ３（NM_001008410）、ＡＲＩＤ３Ａ（Ｅ２ＦＢＰ１、NM_005224）、Ｃ１３ｏｒｆ１５（ＲＧＣ３２、NM_014059）、ＣＣＮＧ１（NM_004060）、ＣＣＮＫ（NM_003858）、ＤＤＢ２（NM_000107）、ＤＤＩＴ４（ＲＥＤＤ１、NM_019058）、ＧＭＬ（NM_002066）、ＧＰＸ１（NM_000581）、ＨＲＡＳ（ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ、NM_176795）、ＩＢＲＤＣ２（NM_182757）、ＭＥＴ（NM_000245）、ＭＳＨ２（NM_000251）、ＰＬＫ２（ＳＮＫ、NM_006622）、ＲＢ１（NM_000321）、Ｓ１００Ａ２（NM_005978）、ＴＰ５３ｉ３（Ｐｉｇ３、NM_004881）、ＴＲＩＭ２２（Ｓｔａｆ５０、NM_006074）、ＶＣＡＮ（ＣＳＰＧ２、NM_004385）などの細胞周期停止に関与する遺伝子（Riley et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9(5):402-12、特にその補足情報を参照。括弧内の番号は、GenBankアクセッション番号を示す）、ＭＤＭ２（GenBankアクセッション番号：NM_002392、NM_006878、NM_006879、NM_006881、NM_006882）などのユビキチンリガーゼ等が挙げられる。
【００６９】
また、変異型ｐ５３ファミリータンパク質を有する細胞においては、これがドミナントネガティブ変異体として作用し、上記キメラタンパク質やその機能的変異体の効果を妨げることがある。ｐ５３ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体としては、限定されずに、例えば以下の変異を有するヒトｐ５３が挙げられる：Ｇ１１７Ｅ、Ｐ１５２Ｔ、Ｔ１５５Ｉ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１７５Ｈ、Ｐ１７７Ｓ、Ｐ１７７Ｆ、Ｐ１７７Ｈ、Ｈ１７９Ｙ、Ｅ１８０Ｋ、Ｒ１８１Ｇ、Ｒ１８１Ｈ、Ｎ２３９Ｓ、Ｓ２４１Ｔ、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｙ、Ｇ２４４Ｓ、Ｇ２４５Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｍ２４６Ｌ、Ｐ２５０Ｌ、Ｌ２５７Ｐ、Ｄ２５９Ｖ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、Ｖ２７４Ｆ、Ｇ２７９Ｅ、Ｇ２７９Ｖ、Ｇ２７９Ｒ、Ｄ２８１Ｎ、Ｄ２８１Ｅ、Ｒ２８２Ｑ、Ｅ２８６Ｋ（上記Willis et al., 2004、Blagosklonny et al., 2000、Monti et al., 2002参照）。
【００７０】
したがって、キメラ分子を、遺伝子発現の誘導、アポトーシスの誘導、細胞増殖性疾患の処置などに使用する際に、これらのアポトーシス抑制遺伝子やドミナントネガティブ変異体の発現を同時に抑制することで、キメラ分子の効果を高めることが可能となる。したがって、上記キメラ分子は、上記のアポトーシス抑制遺伝子やドミナントネガティブ変異体の発現を阻害する物質（例えば、アポトーシス抑制遺伝子やドミナントネガティブ変異体に対するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、もしくはアポトーシス抑制タンパク質のドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクター）と併用することが可能である。
【００７１】
ｐ５３ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体の発現を阻害する核酸分子に関し、核酸分子は変異体遺伝子のコード領域を標的としてもよいが、その非翻訳領域、特にｐ５３ファミリーｍＲＮＡの３’ＵＴＲを標的とし、全ての内因性ドミナントネガティブタンパク質を特異的にノックダウンする一方、本発明の剤または組成物から発現される、コード領域だけを含むであろうキメラ分子や、外因性の野生型ｐ５３ファミリータンパク質を無傷のままとすることができる。
【００７２】
本発明の遺伝子発現誘導剤、アポトーシス誘導剤、医薬組成物などにおいて、２種以上のキメラ分子および／または野生型ｐ５３ファミリー分子を組み合わせて用いる場合、２種以上の分子を単一の組成物に含めても、複数の組成物に別々に含ませ、それらを組み合わせて用いてもよい。例えば、核酸分子であれば、２種以上の核酸分子を単一の核酸構築物またはベクターに組み込んでも、それぞれ１種類ずつの核酸分子を含む複数種の核酸構築物またはベクターの組合わせとして調製してもよい。２種以上の核酸分子を単一の核酸構築物またはベクターに組み込む場合、各核酸分子は共通の制御配列の制御下にあっても、同一種の複数の制御配列の制御下にあっても、複数種の異なる制御配列の制御下にあってもよい。共通の制御配列の制御下にある場合、ある核酸分子は発現するが、別の核酸分子は発現しないといった状況が生じる可能性が少なくなる。したがって、この態様は、同時に発現しないと効果が得られないか、悪影響が生じるような核酸分子を組み合わせて用いる場合に有用である。一態様において、本発明の核酸分子はWO 2009/125607に記載の核酸構築物またはベクターに担持させることができる。この核酸構築物およびベクターは、所望の遺伝子と、望まない遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコシストロニックに発現することができる。
【００７３】
本発明の種々の態様において、上記のキメラ分子は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。これらの担体は、所望の標的細胞または標的組織に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０〜２００μｍ、特に７５〜１５０μｍなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＶＥＧＦＲ、αｖβ３、ＶＣＡＭ−１、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47、Ranganathan R et al., Int J Nanomedicine. 2012;7:1043-60）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５−５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６−５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７−５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ−１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）、レチノール、レチノイン酸などのレチノイド（WO 2008/120815）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。
【００７４】
他の標的化方法としては、例えば、磁性ナノ粒子などの磁性担体を用いる方法（例えば、Charles L., Oncotarget. 2012 April; 3(4): 365-370など参照）、ｐＨ応答性ナノ粒子などのｐＨ応答性担体を用いる方法（例えば、Gao W., Mol Pharm. 2010 December 6; 7(6): 1913-1920など参照）、蛍光担体を用いる方法（例えば、Jiang S. et al., J R Soc Interface. 2010 Jan 6;7(42):3-18など参照）、細胞外活性化ナノ粒子などの細胞外活性化担体を用いる方法（例えば、Gullotti E. et al., Mol Pharm. 2009 Jul-Aug; 6(4): 1041-1051など参照）などが挙げられる。
【００７５】
本発明の剤や組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。
【００７６】
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
【００７７】
本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の剤または組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の剤または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
【００７８】
したがって、本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種剤または組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種剤または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
【００７９】
本発明の一側面は、本発明のキメラ分子を用いる方法に関する。
本発明のこの一側面における一態様は、本発明のキメラ分子または遺伝子発現誘導剤を用いる遺伝子発現誘導方法に関する。本発明の遺伝子発現誘導方法は、本発明のキメラ分子または遺伝子発現誘導剤を、細胞内に導入する工程を含んでもよい。具体的な導入方法については、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。本方法で誘導することができる遺伝子としては、例えば、表７〜８に記載のものが挙げられる。本発明の一態様において、誘導される遺伝子は、ＡＧＲＮ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＱＰ３、ＡＲＨＧＡＰ２３、ＡＳＢ１７、ＢＡＩ１、Ｃ１５ｏｒｆ５２、Ｃ３ｏｒｆ４５、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＡＳＰ１０、ＣＤＨ３、ＣＩＴＥＤ１、ＣＬＤＮ１９、ＣＯＬ１６Ａ１、ＤＤＲ１、ＤＬＧＡＰ１、ＤＬＸ３、ＤＭＢＸ１、ＤＹＳＦＩＰ１、ＥＧＲ２、ＦＢＰ２、ＦＧＦ１、ＧＡＳＴ、ＧＰＲ８９Ａ、ＧＲＨＬ３、ＧＲＲＰ１、ＨＶＣＮ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＴＧＡ３、ＫＡＴＮＡＬ２、ＫＣＮＡ２、ＫＣＮＫ３、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ３４、ＬＨＸ１、ＭＡＬＬ、ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＬ７、ＮＣＲＮＡ００１７３、ＮＥＦＨ、ＮＥＦＬ、ＮＰＰＣ、ＮＴＦ４、ｐ５３ＡＩＰ１、ＰＬＣＤ４、ＰＹＣＡＲＤ、ＳＥＣ１４Ｌ５、ＳＥＺ６、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＲＬ、ＳＴＡＲ、ＳＹＴＬ３、ＴＬＸ１、ＴＭＥＭ１２１、ＴＰ７３、ＴＰ７３、ＴＴＹＨ２、ＷＮＴ７ＢおよびＺＮＦ３６５からなる群から選択される。
【００８０】
本方法の一態様において、キメラ分子または遺伝子発現誘導剤は、遺伝子発現誘導に有効な量で細胞に投与される。遺伝子発現誘導に有効な量については、遺伝子発現誘導剤について上記したとおりである。本方法は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。本方法は、標的細胞において特定の遺伝子の発現を調節することなどに用いることができる。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明のキメラ分子またはアポトーシス誘導剤を用いるアポトーシス誘導方法に関する。本発明のアポトーシス誘導方法は、本発明のキメラ分子、遺伝子発現誘導剤またはアポトーシス誘導剤を、細胞内に導入する工程を含んでもよい。具体的な導入方法については、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。本方法の一態様において、キメラ分子または各種剤は、アポトーシス誘導に有効な量で細胞に投与される。アポトーシス誘導に有効な量については、アポトーシス誘導剤について上記したとおりである。本方法は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。本方法は、異常に増殖している細胞、例えばがん細胞などでアポトーシスを誘導することなどに用いることができる。
【００８２】
本発明のさらなる態様は、本発明のキメラ分子または医薬組成物を用いる疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法は、本発明のキメラ分子、各種剤または医薬組成物を対象に投与する工程を含む。投与される対象は、典型的には本発明のキメラ分子等による処置を必要としている。かかる対象としては、限定されずに、例えば、上記のキメラ分子によって発現が誘導される遺伝子や、アポトーシスの誘導がその処置に有用な疾患、例えば、前記遺伝子の発現異常に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などを患っているか、これらの疾患を有すると診断されたか、これらの疾患を発症するリスクが高い対象である。したがって、本発明の処置方法は、本発明のキメラ分子、各種剤または医薬組成物による処置を必要としている対象を同定する工程をさらに含んでもよい。細胞増殖性疾患の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。
【００８３】
本発明の処置方法においては、本発明のキメラ分子または医薬組成物を、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することができる。ｐ５３の変異または欠失が、がんの予後不良および化学療法や放射線に対する耐性に関連していることから（Clarke et al., Oncogene 1994; 9:1767-73、Merritt et al., Cancer Res 1994; 54:614-7、Poeta et al., N Engl J Med 2007; 357:2552-61、Patocs et al., N Engl J Med 2007; 357:2543-51）、本発明のキメラ分子により、化学療法や放射線治療に対するがんの感受性が改善することが期待される。疾患の処置において、本発明のキメラ分子または医薬組成物と併用し得る作用物質、例えば、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤、ビタミンなどは、医薬組成物に関して上記したとおりである。また、本発明の処置方法は、放射線治療などの物理療法や外科手術などの外科的治療などと併用することができる。
【００８４】
本発明の処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【００８５】
本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００８６】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００８７】
今回本発明者により、本発明のキメラタンパク質が、表７に記載の広範な種類の遺伝子を誘導することが明らかになった。したがって、本発明のキメラタンパク質は、これらの遺伝子またはその組合せが誘導する、アポトーシスや細胞増殖阻害以外の作用をもたらすことができる。したがって、本発明はまた、上記キメラ分子を含む、上記作用を提供するための組成物、上記キメラ分子の上記作用を提供するための組成物の製造における使用、上記作用を提供するための上記キメラ分子、上記作用を提供するための有効量の上記キメラ分子を含む組成物、ならびに、上記キメラ分子の上記作用を提供するための使用にも関する。
【００８８】
本発明の一側面は、ＫＣＮＫ３タンパク質および/またはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸分子（以下、ＫＣＮＫ３関連分子と総称することがある）の新規な用途に関する。ＫＣＮＫ３は、ＴＷＩＫ関連酸感受性カリウムチャンネル（ＴＡＳＫ−１）をコードし、細胞の膜電位の維持などに関与していることが知られており（Bayliss DA et al., Trends Pharmacol Sci 2008; 29: 566-575、Heitzmann D et al., EMBO J 2008; 27: 179-187、Bautista DM et al., Nat Neurosci 2008; 11: 772-779）、結腸直腸がん患者の手術後の生存期間の長さと関連していることが報告されているものの（Cavalieri D et al., Oncol Res. 2007;16(11):535-48）、アポトーシスとの関連性についてはこれまで知られていなかった。今回本発明者によってアポトーシスの誘導に関与することが初めて明らかとなった（実施例参照）。
【００８９】
したがって、本発明の一態様は、（ｉ）ＫＣＮＫ３関連分子を含む、アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物、（ｉｉ）ＫＣＮＫ３関連分子の、前記アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスを誘導するためのＫＣＮＫ３関連分子、および（ｉｖ）アポトーシスを誘導するための有効量のＫＣＮＫ３関連分子を含む組成物に関する。
【００９０】
ＫＣＮＫ３の核酸配列およびアミノ酸配列は種々の生物種について知られており、例えば、ヒトＫＣＮＫ３の核酸配列およびアミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号NM_002246（配列番号２０１）およびNP_002237（配列番号２０２）などとして入手可能である。ＫＣＮＫ３タンパク質の機能的変異体は、（ｉ）ＫＣＮＫ３タンパク質のアミノ酸配列に対し１個または２個以上、例えば、１個または数個（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸の変異（例えば、保存的なアミノ酸置換）を有し、アポトーシス誘導能を有する変異体、（ｉｉ）ＫＣＮＫ３タンパク質の全長アミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、アポトーシス誘導能を有する変異体、（ｉｉｉ）ＫＣＮＫ３タンパク質の全長をコードする核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、アポトーシス誘導能を有する変異体などが含まれる。
【００９１】
アポトーシスの誘導は、細胞に上記変異体を導入した後、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化、ＰＡＲＰタンパク質の切断などのアポトーシス特有の現象の検出、ｓｕｂ−Ｇ１にある細胞の割合の測定、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。
ＫＣＮＫ３タンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸分子は、既知のＫＣＮＫ３遺伝子の核酸配列（例えば、ヒトＫＣＮＫ３については配列番号２０１）に依拠して決定することができる。本発明のアポトーシス誘導剤に含まれる核酸分子は、既知の核酸配列に基づく核酸分子の縮重物、すなわち、遺伝子コドンの縮重により上記核酸分子と核酸配列は異なるが、それと同じアミノ酸配列のタンパク質をコードするものを含む。
ＫＣＮＫ３関連分子のアポトーシス誘導に関する種々の態様は、原則的に本発明のキメラ分子に関して上記したとおりである。
【００９２】
本発明の別の態様は、（ｉ）ＫＣＮＫ３関連分子を含むアポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物、（ｉｉ）ＫＣＮＫ３関連分子の、アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のためのＫＣＮＫ３関連分子、および（ｉｖ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための有効量のＫＣＮＫ３関連分子を含む医薬組成物に関する。ＫＣＮＫ３関連分子を含む、アポトーシス細胞増殖性疾患の処置のための医薬組成物。
ＫＣＮＫ３関連分子の、アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置に関する種々の態様は、原則的に本発明のキメラ分子に関して上記したとおりである。
【００９３】
本発明の別の態様は、ＫＣＮＫ３関連分子またはこれを含むアポトーシス誘導剤を用いるアポトーシス誘導方法に関する。本発明のアポトーシス誘導方法は、本発明のＫＣＮＫ３関連分子またはこれを含むアポトーシス誘導剤を、細胞内に導入する工程を含んでもよい。具体的な導入方法については、キメラ分子を含む遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。本方法の一態様において、ＫＣＮＫ３関連分子またはこれを含むアポトーシス誘導剤は、アポトーシス誘導に有効な量で細胞に投与される。アポトーシス誘導に有効な量については、キメラ分子を含むアポトーシス誘導剤について上記したとおりである。本方法は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。本方法は、異常に増殖している細胞、例えばがん細胞などでアポトーシスを誘導することなどに用いることができる。
【００９４】
本発明の別の態様は、ＫＣＮＫ３関連分子を用いた疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法は、ＫＣＮＫ３関連分子、またはこれを含む剤もしくは医薬組成物を対象に投与する工程を含んでもよい。投与される対象は、典型的にはＫＣＮＫ３関連分子による処置を必要としている。かかる対象としては、限定されずに、例えば、アポトーシスの誘導がその処置に有用な疾患、例えば、細胞増殖性疾患などを患っているか、これらの疾患を有すると診断されたか、これらの疾患を発症するリスクが高い対象である。したがって、本発明の処置方法は、ＫＣＮＫ３関連分子による処置を必要としている対象を同定する工程をさらに含んでもよい。細胞増殖性疾患の具体例は、キメラ分子を含む医薬組成物に関して上記したとおりである。
【００９５】
本発明の一側面は、ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質またはその機能的変異体であって、配列番号１５２のアミノ酸配列からなるキメラタンパク質を除くもの、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子、当該核酸分子を含む核酸構築物またはベクター、前記核酸分子、および／または、前記核酸構築物および／またはベクターを含む組成物に関する。キメラタンパク質およびその機能的変異体、およびこれらをコードする核酸分子、核酸構築物、ベクターおよび組成物の種々の態様は、配列番号１５２のアミノ酸配列からなるキメラタンパク質および配列番号１５１の核酸配列からなる核酸分子が含まれないことを除き、キメラ分子について上記したとおりである。
【００９６】
本発明の一態様において、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質もしくはその機能的変異体が提供される。本発明の機能的変異体は、（ｉ）配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し１個または２個以上、例えば、１個または数個（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸の変異（例えば、保存的アミノ酸置換）を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉ）配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉｉ）配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５３、１５５、１５７および１５９からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体などが含まれる。
【００９７】
今回本発明者により、異なる種類のｐ５３ファミリータンパク質の転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインを組み合わせることで、野生型ｐ５３ファミリータンパク質とは異なる遺伝子発現誘導プロファイルを有するキメラタンパク質を作製できることが明らかとなった。したがって、本発明はまた、（ｉ）２種以上のｐ５３ファミリータンパク質に由来する転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインを組み合わせてなるキメラタンパク質を得る工程、（ｉｉ）得られたキメラタンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルを決定する工程、（ｉｉｉ）得られたキメラタンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルを、野生型ｐ５３ファミリータンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルと比較する工程、（ｉｖ）野生型ｐ５３ファミリータンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルとは異なる遺伝子発現誘導プロファイルを有するキメラタンパク質を選択する工程を含む、野生型ｐ５３ファミリータンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルとは異なる遺伝子発現誘導プロファイルを有するキメラタンパク質の製造方法、スクリーニング方法または探索方法にも関する。
【００９８】
本発明におけるｐ５３ファミリータンパク質としては、限定されずに、例えば、ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３を含む。したがって、本発明の一態様において、工程（ｉ）で得られるキメラタンパク質は、限定されずに、例えば、下表から選択されるドメインの組合わせを有する。下表において、例えばキメラタンパク質１は、ｐ５３に由来する転写活性化ドメイン、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合ドメインおよびｐ６３に由来するオリゴマー化ドメインを含む。
【表１】
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【００９９】
遺伝子発現誘導プロファイルは、上記キメラタンパク質またはこれをコードする核酸分子を細胞に導入し、所定時間後に発現が誘導された遺伝子を、例えば、本願実施例に記載の手法で決定することによって得られる、発現が上昇した（誘導された）遺伝子および／または発現が低下した遺伝子および／または発現が変わらなかった遺伝子の組合せを意味する。発現の上昇、低下などは、上記キメラタンパク質またはこれをコードする核酸分子を導入しない対照細胞との比較などにより決定することができる。
【実施例】
【０１００】
以下の例で本発明をより詳細に説明するが、これらの例は例証を目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
材料と方法（例１〜例６）
細胞株および細胞培養
使用した１１のヒトがん細胞株は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)またはJapanese Collection of Research Bioresources (Osaka, Japan)から購入した。細胞はすべて、各寄託者によって推奨される条件下で培養した。
【０１０１】
ｐ５３およびＴＡｐ６３γのハイブリッド分子の構築
全長のｐ５３またはＴＡｐ６３γを含むｐＣＭＶ−Ｔａｇ２プラスミドは、Sasaki et al., 2011およびSasaki et al., 2009に記載されている。ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドは、オーバーラップ伸長法（overlapping extension method）を用いて、ｐ５３およびＴＡｐ６３γの３つのドメインを入れ替えて作製した。Ｎ末端でのＦＬＡＧエピトープ標識法を可能とするために、これら遺伝子をインフレームで構築した。同一性を確認するために、ハイブリッド分子をコードするｃＤＮＡの配列決定を行った。
【０１０２】
複製欠損型組み換えアデノウイルスの産生、精製および感染の手順は、Sasaki et al., 2008に記載される。複製欠損型Ｅ１欠失Ａｄ５ベクターｐＪＭ１７（Microbix Biosystem）をバックボーンとして用い、対応する遺伝子をヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下で発現させた。プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）でのアデノウイルスの力価を、２９３Ｔ細胞感染後のプラーク形成アッセイによって決定した。感染多重度（ＭＯＩ）を、感染した細胞の総数に対する導入されたｐ．ｆ．ｕ．総数の比として定義した。実験の再現性を確認するために、２組の試料でアデノウイルスの力価測定を行った。細菌のＬａｃＺ遺伝子（Ａｄ−ＬａｃＺ）またはＧＦＰ遺伝子（Ａｄ−ＧＦＰ）を含むコントロールについては、Sasaki et al., 2011、Sasaki et al., 2009およびSasaki et al., 2008に記載のものを使用した。
【０１０３】
アポトーシスの検出
細胞を５×１０５細胞／フラスコの密度でＴ２５フラスコに播種した。２４時間後、１％ＦＣＳを含む培地１ｍＬ中で精製したウイルスとともに細胞をインキュベートし、１０分毎に軽く攪拌した。フローサイトメトリー解析のために、細胞をトリプシン処理によって回収し、感染後に様々な時間で遠心分離することによりペレット化した。ペレット化した細胞を９０％の冷エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ  Ａ（５００ユニット／ｍＬ）で処理し、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ）で染色した。試料は、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton-Dickinson）で分析した。実験を少なくとも３回繰り返し、各試料につき５０，０００例を分析した。データは、ＭｏｄＦＩＴプログラム（Becton-Dickinson）を用いて分析した。
【０１０４】
ＴＵＮＥＬアッセイのために、細胞を４ウェルチャンバースライド（Nalge Nunc）に、５×１０４細胞／ウェルで播種した。上述のようにウイルスを感染し、２４時間後にパラホルムアルデヒドで３０分間固定後、製造業者の指示書に従って、DeadEnd Fluorometric TUNEL system (Promega)を用いてＴＵＮＥＬ反応を行った。蛍光顕微鏡で観察するために、核をＤＡＰＩ（Sigma）で対比染色し、グリセロール−ゼラチンにマウントした。
【０１０５】
カスパーゼ−３アッセイキット（BioVision）を、製造業者のプロトコルに従って用い、カスパーゼ活性を比色法により測定した。これらキットは、ｐ−ニトロアニリドで標識した合成テトラペプチドを用いる。簡潔に述べると、キットに含まれる溶解緩衝液中で細胞を溶解し、上清を収集し、ジチオスレイトールおよび基質を含む反応緩衝液にて３７℃でインキュベートし、マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによりカスパーゼ活性を決定した。
【０１０６】
イムノブロット解析
イムノブロット解析を、Sasaki et al., 2011に記載のように行った。本実施例において、免疫ブロット法に用いた主要な抗体は以下のとおりである。
マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Sigma）、マウス抗ヒトｐ２１ｍＡｂ（ＥＡ１０、Oncogene Research）、マウス抗ヒトＭＤＭ２ｍＡｂ（ＳＭＰ１４、Santa Cruz Biotechnology）、マウス抗ヒトＰＡＲＰｍＡｂ（BD Pharmingen）、マウス抗ヒトカスパーゼ−９ｍＡｂ（BD Transduction Laboratory）、マウス抗ヒトカスパーゼ−３ｍＡｂ（BD Transduction Laboratory）、ウサギ抗ヒトｐ５３ＡＩＰ１ポリクローナルＡｂ（AnaSpec）、およびマウス抗ヒトアクチンｍＡｂ（Chemicon）
【０１０７】
ノーザンブロットおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ノーザンブロット分析のために、２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで、全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に移した。ＲＮＡがインタクトであり、同量でロードされて適切に移されたことを確認するため、エチジウムブロマイドで可視化した。ハイブリダイゼーションを、以前に記載した方法で行った(Sasaki et al., 2009)。ｐ５３ＡＩＰ１（ヌクレオチド（ｎｔ）３４５〜５５４）およびｐ２１（ｎｔ１１〜４２９）のためのｃＤＮＡプローブを、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、これらの同一性を確認するために配列決定を行った。
【０１０８】
リアルタイムＰＣＲ用に、全ＲＮＡをSuperScript III（Invitrogen）を用いてランダムプライマーで逆転写した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、製造業者のプロトコルに従って、TaqMan Gene Expressionアッセイおよび7900HT Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて行った。
【０１０９】
相対的な遺伝子発現レベルはΔΔＣｔ法を用いて定量し、一定に発現するハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対する標的遺伝子の発現比を計算した。用いたプライマー／プローブのセットは次とおりである。
ｐ５３ＡＩＰ１（Ｈｓ００２２３１４１＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）
値をそれぞれのコントロールに対して正規化し、３つの独立した実験の平均値±標準誤差として示した。
【０１１０】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびルシフェラーゼアッセイ
Sasaki et al., 2011およびSasaki et al., 2009に記載のとおり、ＣｈＩＰをChIP Assay Kit(Upstate Biotechnology)を用いて行った。沈殿したｐ５３ＡＩＰ１プロモーターＤＮＡの量を、ｐ５３のコンセンサス結合部位にまたがるオリゴヌクレオチド（センス鎖：５’−ＴＧＧＧＴＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧ−３’（配列番号２））を用いてＰＣＲにより決定した。ＭＤＭ２プロモーターに特異的なオリゴヌクレオチド（センス鎖：５’−ＧＴＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖：５’−ＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号４））をポジティブコントロールとして用いた。いずれの場合においても、３０サイクルで増幅を行った。
【０１１１】
ルシフェラーゼアッセイ用に、ｐ５３のヒトｐ５３ＡＩＰ１遺伝子におけるコンセンサス結合配列（５’−ＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧ−３’；配列番号５）およびこの配列の変異型（５’−ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＧ−３’；配列番号６）を合成し、ｐＧＬ３−プロモーターベクター(Promega)における最小プロモーターの上流に挿入した。得られたコンストラクトを、それぞれｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ＰＲＯおよびｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｐｒｏ−ｍｕｔと命名した。また、この結合部位を含む１００ｂｐの断片をｐＧＬ３−ベーシックベクターにクローニングしてコンストラクトをそれぞれ作製し、ｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｂａおよびｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｂａ−ｍｕｔと命名した。
【０１１２】
ヒトｐ２１遺伝子内のｐ５３ファミリーメンバーのコンセンサス結合配列（ｐＧＬ３−Ｐ２１、５’−ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧ−３’(el-Deiry et al., 1993；配列番号７）およびＪＡＧ１遺伝子内のｐ５３ファミリーメンバーのコンセンサス結合配列（ｐＧＬ３−ＪＡＧ１、５’−ＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＴ−３’(Sasaki et al., 2002；配列番号８））ならびにそれらの変異体もまた合成し、ｐＧＬ３−プロモーターベクター(Promega)の最小プロモーターの上流に挿入した。ルシフェラーゼアッセイは、Sasaki et al., 2011およびSasaki et al., 2009に記載されるように行った。
【０１１３】
動物モデル
すべての動物を、病原体フリーの条件下で維持し、札幌医科大学の動物実験委員会(Animal Care and Use Committee of Sapporo Medical University)のガイドラインに従って処理した。株化した腫瘍における治療効果を評価するため、メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに２×１０６個のＳＷ４８０細胞を右側腹部に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに、５×１０９ｐ．ｆ．ｕ（１００μＰＢＳ中）の表示したアデノウイルスで、マウスを１日１回、３または４日連続で腫瘍内投与した。各治療群は８匹のマウスを含む。
【０１１４】
それらの６匹のマウスを腫瘍形成のモニタリングに使用した。他の２匹のマウスは、ＴＵＮＥＬ解析のために処置５日後に屠殺した。腫瘍体積を、式：Ｖ（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２を用いて算出し、ここでａは長径(largest dimension)あり、ｂは短径(perpendicular diameter)である。２つの群の差は、２５日目にStudentｔ検定によって決定した。In vivoにおけるＴＵＮＥＬ解析のために、パラフィン包埋組織切片は、キシレン中で５分間脱パラフィンし、勾配エタノールで再水和し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。プロテイナーゼＫで組織を透過処理した後、４％パラホルムアルデヒドで再固定した。ＴＵＮＥＬ反応は、DeadEnd Fluorometric TUNEL System (Promega)を用いて、製造業者の指示書に従って行った。組織をＤＡＰＩで対比染色した。それぞれの腫瘍について、３つの異なるスライドを調べた。
【０１１５】
図面の説明
図１は、Ａｄ−ｐ５３遺伝子ファミリーのアポトーシス効果の比較を示す。
（上段）１１種のｐ５３野生型（ｗｔ）および４種のｐ５３欠失（ｄｅｌ）のがん細胞株を、表示のＭＯＩのアデノウイルスで４８時間感染させ、各集団におけるｓｕｂ−Ｇ１の核の割合を定量化するため、細胞内ＤＮＡ含量をヒストグラム解析で決定した。実験を３回繰り返し、平均の百分率で表した。
【０１１６】
（下段）ｐ５３が野生型のＨＣＴ１１６細胞およびＮＵＧＣ４細胞を、４８時間アデノウイルスで感染し、続いてアポトーシスをＴＵＮＥＬ解析で評価した。ＴＵＮＥＬ解析のため、４ウェルチャンバースライドに細胞を５×１０４細胞／ウェルでプレートした(Nalge Nunc International, Naperville, IL)。２４時間後、細胞は上述のとおりに処理した。ＴＵＮＥＬ反応は、製造業者の指示書に従い、DeadEnd Fluorometric TUNEL system(Promega)を用いて行った。核は、ＤＡＰＩ(Sigma)で対比染色し、蛍光顕微鏡で観察するためにグリセロール−ゼラチンにマウントした。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の平均百分率を示す。
【０１１７】
図２は、Ａｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの併用によって増加したアポトーシスの誘導を示す。
（Ａ）アポトーシス誘導におけるＡｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの相乗的効果を調べた。ＭＫＮ４５細胞およびＳＷ４８０細胞を、別々に２００ＭＯＩのＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γで、またはそれぞれ表示したＭＯＩの２つのベクターを併用して感染させた。感染後４８時間で細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した。アポトーシス細胞はｓｕｂ−Ｇ１画分（％）を形成する。
（Ｂ）ＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞，およびＳＷ４８０ヒト大腸癌細胞を、表示したＭＯＩのＡｄ−ｐ５３および／またはＡｄ−ｐ６３γで感染させた。感染の４８時間後に、アポトーシスをＰＡＲＰ切断によって分析した。
（Ｃ）ＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞は、表示したＭＯＩのＡｄ−ｐ５３および／またはＡｄ−ｐ６３γで感染させた。感染後４８時間で、アポトーシスをＴＵＮＥＬ解析によって分析した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の平均百分率を示す。
【０１１８】
（Ｄ）ヒトがんの皮下異種移植片におけるＡｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの併用効果を実証した。ＭＫＮ４５細胞（部位あたり２×１０６個）をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、マウスは５×１０９ｐ．ｆ．ｕ．（ＰＢＳ１００μＬ中）の表示したアデノウイルスで、１日目、２日目、３日目および４日目に１回ずつ、４回直接の腫瘍内注射を受けた。マウスを４つの処置群に無作為に分け、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γでの処置、またはＡｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γでの連続併用処置（１日目および３日目にＡｄ−ｐ５３、および２日目および４日目にＡｄ−ｐ６３γ）をそれぞれ施した。６匹のマウスが各処置群に含まれる。腫瘍形成は３週間まで毎週評価した。
【０１１９】
図３は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッド分子の模式図を示す。野生型ｐ５３タンパク質（白）および野生型ＴＡｐ６３γタンパク質（黒）をＮ末端で並べた。矢印は接合位置を示す。ＴＡＤ（トランス活性化ドメイン）、ＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）およびＯＬＤ（オリゴマー化ドメイン）を表示し、各転写物のドメイン構造を示す。
【０１２０】
ｐ６３−５３Ｏ：ＴＡｐ６３γのＭｅｔ１からＬｙｓ３５２までの残基およびｐ５３のＬｙｓ３１９からＡｓｐ３９３までの残基、
ｐ６３−５３Ｄ：ＴＡｐ６３γのＭｅｔ１からＳｅｒ１４１までの残基、ｐ５３のＰｈｅ１１３からＡｒｇ２８９までの残基およびＴＡｐ６３γのＬｙｓ３２１からＰｒｏ４４８までの残基
ｐ５３−６３Ｔ：ＴＡｐ６３γのＭｅｔ１からＳｅｒ１４１までの残基およびｐ５３のＰｈｅ１１３からＡｓｐ３９３までの残基
ｐ５３−６３Ｏ：ｐ５３のＭｅｔ１からＰｒｏ３１８までの残基およびＴＡｐ６３γのＬｙｓ３５３からＰｒｏ４４８までの残基
ｐ５３−６３Ｄ：ｐ５３のＭｅｔ１からＧｌｙ１１２までの残基、ＴＡｐ６３γのＰｈｅ１４２からＡｒｇ３２０までの残基およびｐ５３のＬｙｓ２９０からＡｓｐ３９３までの残基
ｐ６３−５３Ｔ：ｐ５３のＭｅｔ１からＧｌｙ１１２までの残基およびＴＡｐ６３γのＰｈｅ１４２からＰｒｏ４４８までの残基
水平方向のバーは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を表す。細胞中のタンパク質の核への移行は、ＰＳＯＲＴ ＩＩソフトウェア解析によるＮＬＳスコアとして予測した（右）。
【０１２１】
図４は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドの細胞内局在を示す。ＭＫＮ４５細胞を、ｐ５３、ＴＡｐ６３γ、ｐ６３−５３Ｏ、ｐ６３−５３Ｄまたはｐ５３−６３Ｄを発現するＦＬＡＧタグ化ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２ベクターで、一過性にトランスフェクションした。２４時間後、ＦＬＡＧ Ｍ２抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次抗体（緑）を用いて免疫蛍光標識を行った。核はＤＡＰＩ染色（青）で検出した。
【０１２２】
図５は、ＰＡＲＰタンパク質の切断およびカスパーゼ−３の活性を示す。
（Ａ）ＰＡＲＰタンパク質の切断は免疫ブロットで検出した。ＳＷ４８０細胞、Ｈ１２９９細胞およびＭＫＮ４５細胞を１００ＭＯＩ（ＳＷ４８０細胞およびＭＫＮ４５）または２５ＭＯＩ（Ｈ１２９９）のアデノウイルスで４８時間感染させ、これら細胞からの２０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９およびβ−アクチンを検出する免疫ブロットを示す。
【０１２３】
（Ｂ）カスパーゼ−３アッセイキットを用い、製造業者のプロトコルに従ってカスパーゼ−３活性を測定した。ＭＫＮ４５細胞をアデノウイルスで感染させて回収し、感染の４８時間後に溶解した。カスパーゼ−３のペプチダーゼ活性は、ペプチド基質ＤＥＶＤ−ｐＮＡの切断によって測定した。
（Ｃ）ＭＫＮ４５細胞は、表示したＭＯＩのアデノウイルスで４８時間感染させ、２０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ−３およびβ−アクチンを検出する免疫ブロットを示す。
（Ｄ）ＭＫＮ４５細胞は、表示したＭＯＩのアデノウイルスで４８時間感染させた。カスパーゼ−３活性は、感染後４８時間で測定した。
【０１２４】
図６は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性発現後のアポトーシス細胞のフローサイトメトリー解析を示す。細胞を表示したＭＯＩのアデノウイルスで感染させた。感染の４８時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーにより分析した。３つの独立した実験を行い、１つの実験の代表的なデータを示した。ｓｕｂ−Ｇ１細胞の百分率を下段に示す。
【０１２５】
図７は、皮下に移植したヒトがんの異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示す。
（Ａ）ＳＷ４８０細胞（部位当たり２×１０６個）をヌードマウスへ皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、マウスに３日連続で、組み換えアデノウイルスを皮下注射した。各群には６匹のマウスが含まれる。データポイントは、平均の腫瘍サイズを示す。
（Ｂ）ＳＷ４８０細胞異種移植片におけるＴＵＮＥＬアッセイを、（Ａ）に記載の処置後５日目に行った。アポトーシスの増加が、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏで処置した異種移植片で検出された（緑色の細胞）。核のＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。
【０１２６】
図８は、ＭＫＮ４５異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示す。
（ａ）ＭＫＮ４５細胞（部位あたり２×１０６個）をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、マウスに３日間連続で組み換えアデノウイルスを腫瘍内注射した。６匹のマウスが各群に含まれる。データポイントは、平均腫瘍サイズを示す。
（ｂ）ＭＫＮ４５異種移植片におけるＴＵＮＥＬアッセイは、（ａ）に記載の処置の５日後に行った。各処置条件からの代表的な画像を示す。核のＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。
【０１２７】
図９は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性トランスフェクション後のヒトがん細胞株におけるｐ５３標的およびアポトーシス関連タンパク質の発現を示す。Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈ１２９９細胞およびＳＷ４８０細胞は、２５ＭＯＩのアデノウイルスで２４時間感染させ、１０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ｐ２１、ＭＤＭ２、サバイビン、サイクリンＢ１、Ｎｏｘａ、Ｂａｘ、ＰＵＭＡ、ＪＡＧ１、ｐ５５ＣＤＣおよびアクチンのレベルを、免疫ブロットによって測定した。
【０１２８】
使用した一次抗体は、以下のとおりである。マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）(Sigma)、マウス抗ヒトｐ２１ｍＡｂ(EA10, Oncogene Research)、マウス抗ヒトＭＤＭ２ｍＡｂ(SMP14, Santa Cruz Biotechnology)、ラビット抗ヒトサバイビンポリクローナル抗体(S8191, Sigma)、マウス抗ヒトサイクリンＢ１ ｍＡｂ(GNS1, Santa Cruz Biotechnology)、ラビット抗ヒトＢＡＸポリクローナルＡｂ(P19, Santa Cruz Biotechnology)、マウス抗ヒトＮｏｘａ ｍＡｂ(114C307, Oncogene Research)、ラビット抗ヒトＰＵＭＡポリクローナルＡｂ(BD Transduction Laboratory)、ラビット抗ヒトＪＡＧ１ポリクローナル抗体(H-144, Santa Cruz Biotechnology)、マウス抗ヒトｐ５５ＣＤＣ ｍＡｂ(E-7, Santa Cruz Biotechnology)およびマウス抗ヒトアクチンｍＡｂ(Chemicon)
【０１２９】
図１０は、ｐ６３−５３Ｏハイブリッドによるｐ５３ＡＩＰ１の効率的なトランス活性化を示す。
（Ａ）４種のヒトがん細胞株を、５０または１００ＭＯＩのアデノウイルスで感染させ、細胞を感染の２４時間後に回収した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを行った。全ＲＮＡ（１０μｇ）を各レーンにロードし、同じフィルターをヒトｐ５３ＡＩＰ１およびｐ２１のｃＤＮＡで再ハイブリダイズした。２８ＳリボソームＲＮＡ（２８Ｓ）のエチジウムブロマイド染色を下段のパネルに示す。等量のＲＮＡが各レーンにロードされたことが確認される。
（Ｂ）ｐ６３−５３Ｏは、in vivoにおいて、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のｐ５３−ＲＥと効率的に相互作用する。「材料と方法」に記載のようにＣｈＩＰアッセイを行った。
【０１３０】
（Ｃ）ｐ６３−５３Ｏは、ｐ５３−ＲＥを含むｐ５３ＡＩＰ１プロモーターを効率的に誘導する。ＳＷ４８０細胞に、ｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｐｒｏ、ｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｂａ、ｐＧＬ３−ｐ２１またはｐＧＬ３−ＪＡＧ１と、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２コントロールベクター、ｐ５３、ＴＡｐ７３β、ＴＡｐ６３γ、ｐ６３−５３Ｏまたはｐ６３−５３Ｄとを同時導入した。ルシフェラーゼ活性は、「材料と方法」に記載のように、感染の２４時間後に定量した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された２つの標準偏差を表す。
【０１３１】
図１１は、ｐ６３−５３Ｏによるアポトーシス誘導のｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡによる拮抗を示す。
（Ａ）ｐ５３ＡＩＰ１ ｍＲＮＡの発現は、ｓｉＲＮＡによって抑制された。ＳＷ４８０細胞を、３日連続で２４時間毎にコントロールまたはｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡで感染させた。最後のｓｉＲＮＡトランスフェクションの１８時間後に、ｐ５３ＡＩＰ１ ｍＲＮＡの抑制をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
（Ｂ）上述のとおり、ＳＷ４８０細胞を、コントロールまたはｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡで感染させた。最後のｓｉＲＮＡトランスフェクションの８時間前に、細胞を１００ＭＯＩのＡｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｐ６３−５３Ｏで感染させた。ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質の量を、免疫ブロットによって測定した。アポトーシスは、カスパーゼ−３の切断（上段パネル）およびカスパーゼ−３活性（下段パネル）によって調べた。
【０１３２】
例１：ｐ５３ファミリーのアポトーシス促進能
ｐ５３の機能を回復させる遺伝子治療は、ヒトがん治療用に臨床的に試験されている。しかしながら、いくつかのがんはｐ５３に対して耐性である。大腸癌細胞株において、ＴＡｐ６３γおよびＴＡｐ７３βは、ｐ６３およびｐ７３のすべてのアイソフォームの中で最も強いアポトーシス促進能を有する。アデノウイルスベクターを用いて、ｐ５３、ＴＡｐ６３γおよびＴＡｐ７３βを５６のがん細胞株へ導入し、フローサイトメトリーを用いて細胞死およびアポトーシスに対するそれらの効果を比較した。
【０１３３】
ｓｕｂ−Ｇ１画分（％）は、アポトーシス細胞を含む。いくつかの細胞株では、ｐ５３、ｐ７３βまたはｐ６３γに応じてアポトーシスが生じたが、約２５％の細胞株は、ｐ５３ファミリーメンバーによって誘導されるアポトーシスに対して、少なくとも幾分かの耐性を示した。興味深いことに、ＴＡｐ６３のアポトーシスの効果は、内在性の野生型ｐ５３対立遺伝子を有するがん細胞株２２種のうち１５種（６８．２％）において、野生型ｐ５３のものよりも大きかった（表２および図１）。
【０１３４】
表２は、Ａｄ−ｐ５３ファミリー遺伝子のアポトーシス効果の比較を示す。
【表２−１】
2015226468.tif 000003
【０１３５】
【表２−２】
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【０１３６】
アデノウイルス媒介性導入の４８時間後におけるｓｕｂ−Ｇ１細胞の百分率を示す。実験は３回繰り返され、平均百分率が示される。ｗｔ＝ｐ５３野生型；ｍｕｔ＝ｐ５３変異型；ｄｅｌ＝ｐ５３欠失
【０１３７】
ｐ５３、ｐ７３βまたはｐ６３γを単独で導入してもアポトーシスを誘導しなかったＭＫＮ４５胃癌細胞およびＳＷ４８０大腸癌細胞を、２００ＭＯＩのＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γで、または２つの組み換えアデノウイルスをそれぞれ表示したＭＯＩで併用して感染させた。感染の４８時間後に細胞を回収し、アポトーシスをフローサイトメトリー、カスパーゼ活性化およびＴＵＮＥＬアッセイによって分析した。ｐ５３およびＴＡｐ６３γの遺伝子発現において、アポトーシス促進性の相乗作用が観察された（図２Ａ〜Ｃ）。
【０１３８】
ヒトがんの異種移植片増殖に対するＡｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの併用処置の効果も調べた。ＭＫＮ４５細胞をヌードマウスに皮下注射して腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、アデノウイルスの腫瘍内直接注射を１日当たり４回、１日目、２日目、３日目および４日目に行った。マウスを４つの処置群に無作為に分け、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γでの処置、またはＡｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γでの連続併用処置（１日目および３日目にＡｄ−ｐ５３、および２日目および４日目にＡｄ−ｐ６３γ）をそれぞれ施した。
【０１３９】
ＭＫＮ４５異種移植片の増殖は、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γ単独の処置と比較して、併用処置によって有意に抑制された（図２Ｄ）。したがって、Ａｄ−ｐ５３およびＡｄ−ｐ６３γの同時処置により、in vitroおよびin vivoにおいて、抗腫瘍性の強い相乗効果が生じることが示された。
【０１４０】
例２：ｐ５３−ｐ６３ハイブリッド遺伝子の構築
ｐ５３ファミリーの腫瘍抑制活性を増強させるために、ｐ５３およびｐ６３の機能の制御差を利用するハイブリット遺伝子のセットを作製した。６種のハイブリッドタンパク質は、３つの機能的ドメインからなり、各ドメインはそれぞれｐ５３またはＴＡｐ６３γに由来する。例えば、「ｐ５３−６３Ｏ」は、ｐ５３のＮ末端ドメインおよび中央ドメインを含むハイブリッドタンパク質であって、インフレームでｐ６３のＣ末端ドメインを融合させたものであり、「ｐ５３−６３Ｄ」は、ｐ６３の中央ドメインを含むハイブリッドｐ５３タンパク質である。
【０１４１】
６種のハイブリッドタンパク質の組成を図３に示す。６種のハイブリッドの中で、ｐ６３−５３Ｄは、典型的なＮＬＳモチーフを欠失しているため、主に細胞質へ局在する。他の５種のハイブリッドは、ｐ５３およびＴＡｐ６３γを模倣し、ＮＬＳの存在と一致して主に核に局在する（図４）。３種のハイブリッド分子（ｐ５３−６３Ｏ、ｐ６３−５３Ｄおよびｐ６３−５３Ｔ）は、ｐ６３のＣ末端ドメインを含むが、内在性の変異型または野生型のｐ５３とはオリゴマー形成することができない。ｐ６３のＮ末端ドメインを含むｐ５３−６３Ｔおよびｐ６３−５３Ｄは、ｐ５３の中央ＤＮＡ結合ドメインを含むとしても、ＭＤＭ２に結合することや、プロテアソーム分解が起こらないことが予測される。
最後に、異なるＴＡｐ６３アイソフォームの独特のＣ末端（α、βおよびγ）が、遺伝子発現のトランス活性化能力を調整すると考えられることから、ｐ５３−６３Ｄ、ｐ５３−６３Ｔおよびｐ６３−５３Ｏは、ｐ６３の転写活性を変化させると考えられた。
【０１４２】
例３：ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性発現後のアポトーシスプロファイル
ｐ５３およびＴＡｐ６３γとの比較におけるハイブリッドの抗がん活性を評価するために、ＦＬＡＧタグ化ヒトｐ５３（Ａｄ-ｐ５３）、ＴＡｐ６３γ（Ａｄ−ｐ６３γ）またはｐ５３−ｐ６３ハイブリッド（Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏ、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｄ，Ａｄ−ｐ５３−６３Ｔ、Ａｄ−ｐ５３−６３Ｏ、Ａｄ−ｐ５３−６３ＤおよびＡｄ−ｐ６３−５３Ｔ）を発現する組み換えアデノウイルスベクターを作製した。
【０１４３】
アデノウイルス媒介遺伝子送達の相対的効率は、２５〜２００ＭＯＩでのＡｄ−ＧＦＰ感染後のＧＦＰ陽性細胞の割合として定量化した。ＧＦＰの発現によって決定された遺伝子導入効率によれば、各細胞株は適切なＭＯＩでアデノウイルスに感染した。図５Ａに示されるように、ＭＫＮ４５（胃癌）およびＨ１２９９（肺癌）などのいくつかのがん細胞株において、ハイブリッドが同程度で発現しているかどうかを測定した。その後、ヒトがん細胞株のパネルにおいて、アポトーシスの誘導をフローサイトメトリーによって分析した。細胞をアデノウイルスで４８時間感染させた後、細胞内ＤＮＡ含量を分析した。これらデータは、集団あたり合計５×１０４個の細胞において、ｓｕｂ−Ｇ１の核（アポトーシス細胞）の割合を示すヒストグラムにまとめられる。
【０１４４】
Ａｄ−ＧＦＰで感染した細胞株においては、有意なアポトーシス画分は観察されなかった。重要なこととして、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏは、試験した４種の細胞株すべての中で、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γよりも効率的にアポトーシスを誘導した（図６）。１４の癌細胞株において、フローサイトメトリーによってアポトーシスの誘導を分析した。Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏは、試験した１４の細胞株のすべてにおいて、ｐ５３野生型、変異型、欠失のいずれの状態にも関わらずアポトーシスを誘導した（表３）。
【０１４５】
表３は、ｐ５３−ｐ６３ハイブリッド間におけるアポトーシス効果の比較を示す。
【表３】
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【０１４６】
アデノウイルス媒介性導入の４８時間後におけるｓｕｂ−Ｇ１細胞の百分率を示す。実験は３回繰り返され、平均百分率が示される。ｗｔ＝ｐ５３野生型；ｍｕｔ＝ｐ５３変異型；ｄｅｌ＝ｐ５３欠失
【０１４７】
ＤＮＡ修復に関与する酵素ＰＡＲＰは、カスパーゼ−３によって切断され、切断されたＰＡＲＰ（８５ｋＤａ、未切断タンパク質で１１６ｋＤａ）の存在はアポトーシスの特徴とみなされる。ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドによるアポトーシスの誘導は、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ−３／９の切断（図５Ａ）ならびにカスパーゼ−３活性（図５Ｂ）によって確認された。これら観察は、フローサイトメトリーの結果と一致した。
【０１４８】
また、ＭＫＮ４５細胞を４８時間、５０ＭＯＩからの様々な希釈倍率でアデノウイルスに感染させ、ＰＡＲＰ切断およびカスパーセ−３活性について分析した。Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏを５０ＭＯＩで感染させた後のＰＡＲＰ切断およびカスパーゼ−３活性のレベルは、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γを２００ＭＯＩで感染させた後のものと同様であった（図５Ｃ、Ｄ）。
【０１４９】
例４：皮下に移植したヒト異種移植片増殖に対するｐ５３−ｐ６３ハイブリッドアデノウイルスの腫瘍内注射の治療効果
アデノウイルスベクターのin vivo投与の効果を調べた。ヌードマウスにおけるヒトＳＷ４８０細胞の異種移植片を樹立した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ｐ５３、Ａｄ−ｐ６３γまたはＡｄ−ｐ６３−５３Ｏを５×１０９ｐ．ｆ．ｕで含む１００μＬの腫瘍内注射を各マウスに３回与え、腫瘍サイズをモニタリングした。
【０１５０】
Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γでの処置と比較して、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏでの処置によって、ＳＷ４８０異種移植片増殖が有意に抑制された（ｐ＜０．００１：図７Ａ）。２５日目のアデノウイルス処置マウスの平均腫瘍体積は、Ａｄ−ｐ５３については３５０ｍｍ３、Ａｄ−ｐ６３γについては３３１ｍｍ３、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏについては１０２ｍｍ３、Ａｄ−ＬａｃＺについては８６９ｍｍ３であった。特に、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏ処置は、腫瘍を有するマウス３３％（２／６）において、完全な腫瘍退縮を誘導した。このin vivoでの結果は、in vitroで観察された特異性と相関した。
加えて、各処置群由来の動物２匹を処置５日目で安楽死させ、それらの腫瘍をin situ ＴＵＮＥＬ分析用に回収した。Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−ｐ６３γで処置した場合と比較して、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏで処置したＳＷ４８０異種移植片において、アポトーシスの顕著な増加が観察された（図７Ｂ）。ｐ５３−ｐ６３ハイブリッドと同様の治療効果が、ＭＫＮ４５異種移植片において観察された（Ｐ＜０．００１、図８）
【０１５１】
例５：ハイブリッドｐ６３−５３Ｏによるｐ５３ＡＩＰ１の効率的な転写誘導
ハイブリッドｐ６３−５３Ｏは、ＴＡｐ６３のＭｅｔ１からＬｙｓ３５２の残基およびｐ５３のＬｙｓ３１９からＡｓｐ３９３を含む。本発明のハイブリッドは、ＴＡｐ６３のＴＡＤおよびＤＢＤならびにｐ５３のＯＬＤを含む。ｐ６３−５３Ｏハイブリッドのアポトーシス促進活性の上昇が、全般的な転写活性化によるものかどうかを決定するため、特定のがん細胞において、ｐ２１、ＭＤＭ２、サバイビン、Ｎｏｘａ、ＢａｘおよびＰｕｍａを含むｐ５３標的遺伝子の誘導を免疫ブロットによって調べた（図９）。ｐ６３−５３Ｏハイブリッドは、試験した３種の細胞株すべてにおいて、ｐ５３標的遺伝子のサブセットを誘導したが、誘導の度合いはｐ５３またはＴＡｐ６３γのものほど顕著ではなかった。これら結果は、本発明のハイブリッドは、単に一般的なｐ５３標的遺伝子の転写活性の増加によって作用するものではないことを示唆する。
【０１５２】
ハイブリッドｐ６３−５３Ｏによって特異的に制御されるアポトーシス促進性の標的遺伝子を同定するため、Affymetrix Genechip解析が行われ、Ａｄ−ｐ５３、Ａｄ−ｐ６３γまたはＡｄ−ｐ６３−５３ＯでトランスフェクションしたＳａｏｓ−２ヒト骨肉腫細胞の発現パターンを比較した。データはＧＥＯデータベース（ＧＳＥ３５５１２）で入手可能である。ｐ５３媒介の細胞死応答の重要な標的であるｐ５３ＡＩＰ１が、候補遺伝子として同定された。ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子は、ｐ６３−５３Ｏでトランスフェクションした細胞において、ｐ５３またはＴＡｐ６３γでトランスフェクションした細胞と比較して、再現性よく、少なくとも４倍の発現上昇があった。
ｐ５３ＡＩＰ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて、Ｓａｏｓ−２、Ｈ１２９９、ＤＬＤ１およびＳＷ４８０のヒトがん細胞株のノーザンブロット解析を行った。図１０Ａに示されるように、Ａｄ−ｐ６３−５３Ｏに感染後、試験した細胞株すべてにおいて、ｐ５３ＡＩＰ１の最も強い誘導が観察された。
【０１５３】
次に、in vivoにおいて、ｐ６３−５３Ｏハイブリッドタンパク質が、Oda et al., 2000によって特徴付けられるｐ５３応答エレメント（ｐ５３−ＲＥ）を含むヒトｐ５３ＡＩＰ１プロモーター領域に効率的に結合することができるかを決定するため、クロマチン免疫染色法（ＣｈＩＰ）を使用した。ＣｈＩＰアッセイでは、特定の抗体を用い、結合するゲノムＤＮＡとともにＤＮＡ結合タンパク質を免疫沈降させる。Ａｄ−ｐ５３、Ａｄ−ｐ６３γ、Ａｄ−ｐ６３−５３ＯまたはＡｄ−ｐ６３−５３Ｄで感染したＳＷ４８０細胞を分析した。Ａｄ−ｐ５３、Ａｄ−ｐ６３γ、Ａｄ−ｐ６３−５３ＯまたはＡｄ−ｐ６３−５３Ｄで感染したＳＷ４８０細胞のホルムアルデヒド架橋抽出物から、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＤＮＡ−タンパク質複合体を免疫沈降した。
【０１５４】
免疫沈降複合体内の候補配列の存在量をＰＣＲによって定量化した。図１０Ｂに示されるように、ｐ６３−５３Ｏは、ｐ５３またはＴＡｐ６３よりも効率的にｐ５３ＡＩＰ１プロモーターにリクルートされていた（上段、レーン１２）。ＣｈＩＰアッセイのためのポジティブコントロールとして、ＭＤＭ２プロモーターを分析した。予想通りに、ｐ５３、ＴＡｐ６３γおよびｐ６３−５３Ｏは、ＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３結合部位と共に免疫沈降した（図１０Ｂ、下段、レーン８、１０および１２）。これら結果は、ＳＷ４８０細胞において、ｐ６３−５３Ｏハイブリッドタンパク質が、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターに効率的に結合することを示す。
【０１５５】
ｐ６３−５３Ｏの転写増強活性をさらに評価するため、レポーターアッセイを行った。ｐＧＬ３プロモーターベクター（ｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｐｒｏ）中のＳＶ４０最小プロモーターの上流に、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子内のｐ５３−ＲＥを含むゲノム断片をクローニングして、異種レポーターベクターを構築した。また、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のｐ５３−ＲＥに対応する１００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＧＬ３ベーシックベクター（ｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｂａ）中にクローニングした。
ｐ６３−５３Ｏは、両方のｐ５３ＡＩＰ１ルシフェラーゼレポーターを活性化したが、ｐ５３およびＴＡｐ６３γは、ｐ５３ＡＩＰ１の転写をより低い効率で活性化した（図１０Ｃ）。さらに、ｐ５３ＡＩＰ１のｐ５３−ＲＥにおける点変異（ｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｐｒｏ−ｍｕｔおよびｐＧＬ３−ｐ５３ＡＩＰ１−ｂａ−ｍｕｔ）は、ｐ６３−５３Ｏによるトランス活性化を消滅させた。
【０１５６】
ｐ２１のｐ５３−ＲＥ（ｐＧＬ３−ｐ２１）または既知のＴＡｐ６３標的であるＪＡＧ１（ｐＧＬ３−ＪＡＧ１）を、ｐＧＬ３プロモーターベクター中へクローニングしてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ｐＧＬ３−ｐ２１のルシフェラーゼ活性は、ｐ５３で同時導入した細胞において、ｐ６３−５３Ｏで同時導入した場合よりも高かった。対照的に、ＴＡｐ６３γおよびＴＡｐ７３βは、ＪＡＧ１ルシフェラーゼレポーターを効率的に活性化した（図１０Ｃ）。これら結果は、ＣｈＩＰデータと併せて、ｐ６３−５３Ｏハイブリッドが効率的にｐ５３ＡＩＰ１をトランス活性化することを示す。
【０１５７】
例６：ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡは、ｐ６３−５３Ｏのアポトーシス効果を拮抗する
ｐ６３−５３Ｏのヒトがんでのアポトーシス促進効果におけるｐ５３ＡＩＰ１の重要性を決定するため、ｐ５３媒介アポトーシスに比較的に耐性のＳＷ４８０細胞において、ｐ５３ＡＩＰ１発現をノックダウンするｓｉＲＮＡを使用した。いずれのヒト遺伝子に対しても配列相同性がないｓｉＲＮＡをコントロールとして使用し、細胞を３日連続で２４時間毎にｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。
【０１５８】
図１１Ａに示されるように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞において、ｐ５３ＡＩＰ１ ｍＲＮＡの減少を実証した。最後のトランスフェクションから８時間後に、細胞はＡｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｐ６３−５３Ｏで４８時間感染させ、免疫ブロットおよびカスパーセ−３アッセイを行った。ＳＷ４８０細胞のｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡでの前処理は、ｐ６３−５３Ｏ媒介のｐ５３ＡＩＰ１の誘導をタンパク質レベルで強力に抑制した（図１１Ｂ）。さらに、ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡは、ｐ６３−５３Ｏのアポトーシス促進効果と拮抗した（図１１Ｂ）。
これら結果は、本発明のハイブリッドタンパク質のアポトーシス効果が、少なくとも部分的に、ｐ５３ＡＩＰ１活性を介することを示唆する。すなわち、本発明のハイブリッドは、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写を効率的に活性化し、アポトーシスを誘導した。
【０１５９】
材料と方法（例７〜例１０）
細胞培養およびトランスフェクション
使用したヒト胃癌細胞（ＭＫＮ−４５）、ヒト膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１）、ヒト肝細胞癌細胞（ＨＬＦおよびＨｕＨ−７）、ヒト結腸腺癌細胞（ＳＷ４８およびＳＷ４８０）およびヒト骨肉腫細胞（Ｇ−２９２、ＨＯＳ、Ｓａｏｓ−２およびＵ−２ ＯＳ）は、American Type Culture CollectionまたはJapanese Collection of Research Bioresourcesから購入した。トランスフェクションは、すべてLipofectamine 2000(Lifetechnologies)を用いて行った。
【０１６０】
プラスミド、組み換えアデノウイルスおよびｓｉＲＮＡ
それぞれＦＬＡＧタグ化した、ｐ５３、ｐ６３γ(Sasaki et al., 2009)およびｐ５３とｐ６３γとのハイブリッド変異体（ｐ６３γの１〜３５１アミノ酸およびｐ５３の３１８〜３９３アミノ酸を含む６３−５３Ｏならびにｐ６３γの１〜３５２アミノ酸およびｐ５３の２９０〜３９３アミノ酸を含むスーパーハイブリッドｐ５３（ＳＨｐ５３））を、それぞれｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５／ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(Lifetechnologies)に挿入した。アデノウイルスを産生するために、ｃＤＮＡおよびＬａｃＺ遺伝子をｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター(Lifetechnologies)へ導入した。Fast-Trap Adenovirus Purification and Concentration Kit (Millipore)を用いて、組み換えアデノウイルスを精製した。
【０１６１】
ヒトのＣＡＳＰ１０（５’−ｒＧｒＣＵＵｒＣＵｒＧｒＡＵＵｒＡＵＵｒＧｒＡＵＵｒＣｒＡＴＴ−３’；配列番号９）、ＫＣＮＫ３（５’−ｒＣｒＧＵｒＧＵｒＡｒＣｒＧＵＵＵｒＧｒＣｒＡＵｒＣＵｒＣＵＴＴ−３’；配列番号１０）、ＰＹＣＡＲＤ（５’−ｒＣｒＣｒＧｒＣｒＣｒＧｒＡｒＧｒＧｒＣＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＡｒＡＴＴ−３’；配列番号１１）を標的とするｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡを、ＳＩＧＭＡ社から購入した（ＲＮＡのヌクレオチドを「ｒＮ」で示す。）。
【０１６２】
抗体
実験に使用した抗体は、以下のとおりである。
抗ＦＬＡＧ抗体(Ｍ２、Sigma)、抗カスパーゼ−３抗体(８Ｇ１０、Cell Signaling)、抗ＰＡＲＰ−１抗体(Ｈ−２５０、Santa Cruz Biotechnology)、抗トリメチルヒストンＨ３（Ｌｙｓ４）（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）抗体(ＭＣ３１５、MILLIPORE)、抗アクチン抗体(ＭＡＢ１５０１Ｒ、Millipore)およびＨＲＰ標識二次抗体(Santa Cruz Biotechnology)
【０１６３】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを、以前に報告したとおりに行った(Kashima et al., 2009)。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分の初期変性ステップ後、９４℃で３０秒、６５℃（ＣＡＳＰ１０）、５９℃（ＣＤＫＮ１Ａ）、６３℃（ＫＣＮＫ３，ＰＹＣＡＲＤおよびＴＰ５３）、５５℃（ＦＬＡＧ−ＴＰ６３）または５５℃（ＧＡＰＤＨ）で３０秒、および７２℃で３０秒をそれぞれ２６サイクル（ＣＡＳＰ１０）、２５サイクル（ＣＤＫＮ１Ａ）、２９サイクル（ＫＣＮＫ３）、３５サイクル（ＰＹＣＡＲＤ）、２５サイクル（ＴＰ５３）、１８サイクル（ＦＬＡＧ−ＴＰ６３）または１６サイクル（ＧＡＰＤＨ）で行うことを含む。
【０１６４】
オリゴヌクレオチドのプライマー配列は、以下のとおりである。
ＣＡＳＰ１０センス（５’−ＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡ−３’；配列番号１２）およびアンチセンス（５’−ＧＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴＣ−３’；配列番号１３）、ＫＣＮＫ３センス（５’−ＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＴＣ−３’；配列番号１４）およびアンチセンス（５’−ＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＡＧＡＡＣＡＴ−３’；配列番号１５）、ＰＹＣＡＲＤセンス（５’−ＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣ−３’；配列番号１６）およびアンチセンス（５’−ＴＣＧＣＧＡＴＡＡＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴ  −３’；配列番号１７）、ＴＰ５３センス（５’−ＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＡＧ−３’；配列番号１８）およびアンチセンス（５’−ＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣ−３’；配列番号１９）、ＦＬＡＧ−ＴＰ６３センス（５’−ＣＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡ−３’；配列番号２０）およびアンチセンス（５’−ＧＧＡＣＡＣＧＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＧ−３’；配列番号２１）、ならびにＧＡＰＤＨセンス（５’−ＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴ−３’；配列番号２２）およびアンチセンス（５’−ＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ−３’；配列番号２３）
【０１６５】
ＣＤＫＮ１Ａ用のオリゴヌクレオチドプライマーは、以前に報告されている (Idogawa et al., 2009)。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルの電気泳動によって可視化した。
【０１６６】
免疫蛍光顕微鏡
免疫蛍光顕微鏡は、以前に報告したとおりに行った(Kashima et al., 2009)。簡潔に述べると、細胞を４ウェルチャンバースライド上で培養し、トランスフェクションした。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＦＬＡＧ抗体とともにインキュベートした後、Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体とともにインキュベートした。標識した細胞は、BZ-8100（KEYENCE）蛍光顕微下で調べた。
【０１６７】
ＴａｑＭａｎ低密度アレイ
TaqMan Low Density Array (LDA)は、96 TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)からなり、表４に記載のとおり、９３のｐ５３標的遺伝子および３の内因性コントロール遺伝子（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨ）を含み、３８４ウェルフォーマットに設計され、マイクロ流体カードにスポットされている（１アッセイあたり４つ）。選択した遺伝子の発現は、ＬＤＡとして製造業者の指示書に従って分析した。
【０１６８】
【表４−１】
2015226468.tif 000006
【０１６９】
【表４−２】
2015226468.tif 000007
【０１７０】
【表４−３】
2015226468.tif 000008
【０１７１】
【表４−４】
2015226468.tif 000009
【０１７２】
【表４−５】
2015226468.tif 000010
【０１７３】
【表４−６】
2015226468.tif 000011
【０１７４】
【表４−７】
2015226468.tif 000012
【０１７５】
【表４−８】
2015226468.tif 000013
【０１７６】
【表４−９】
2015226468.tif 000014
【０１７７】
【表４−１０】
2015226468.tif 000015
【０１７８】
クロマチン免疫沈降−配列決定解析
クロマチン免疫沈降−配列決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）解析を、以前に報告したとおりに行った(Suzuki et al.)。まず、ＨｕＨ−７細胞をアデノウイルスベクターで感染させた。２４時間後、細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。SOLiD ChIP-seq manualに記載のように、クロマチン試料について、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体を用いてＣｈＩＰを行い、SOLiD3 Plus system(Applied Biosystems)を用いて大規模なパラレルシークエンスを行った。質が悪いか、一意的に位置づけられなかった配列の読み込みは、研究から除外した。ピークは、Model-based Analysis for ChIP-seq (MACS) software(Zhang et al., 2008)を用いて同定し、カリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）のゲノムブラウザを用いて可視化した。ゲノム位置は、International Human Genome Sequencing Consortiumによって作成されたＵＣＳＣｈｇ１８(National Center for Biotechnology Information Build 36.1, March 2006)に基づく。
【０１７９】
マイクロアレイ解析
２７，９５８のEntrez gene RNAおよび７，４１９のlarge intergenic non-coding RNA(lincRNA)を、SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (Agilent Technologies)を用いて解析した。マイクロアレイデータは、GeneSpring GX ver. 11 (Agilent Technologies)を用いてさらに解析された。
【０１８０】
ｐ５３結合部位の予測
ｐ５３結合部位は、ｐ５３スキャンアルゴリズム(Smeenk et al., 2008)を用いてコンピューターで予測した。
【０１８１】
クロマチン免疫沈降−ＰＣＲ
タンパク質をＤＮＡと架橋するため、アデノウイルス感染の２４時間後に、ＨｕＨ−７細胞を１０分間１％ホルムアルデヒドで固定した。クロマチン試料を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、４℃で１６時間免疫沈降した。ＣｈＩＰは、MAGnify ChIP system(Lifetechnologies)を用いて行った。ＰＣＲプライマーを表５に示す。
【０１８２】
表５は、使用したプライマー配列およびＣｈＩＰ−ＰＣＲ産物のサイズを示す。
【表５−１】
2015226468.tif 000016
【０１８３】
【表５−２】
2015226468.tif 000017
【０１８４】
【表５−３】
2015226468.tif 000018
【０１８５】
【表５−４】
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【０１８６】
【表５−５】
2015226468.tif 000020
【０１８７】
【表５−６】
2015226468.tif 000021
【０１８８】
フローサイトメトリー
１００万個の細胞を６ｍｍプレートまたはＴ２５フラスコで培養し、アデノウイルスで感染させた。以前の報告のように(Ogi et al., 2005)、細胞を４８時間後にフローサイトメトリーに供した。データは、FlowJo softwareを用いて解析した。
【０１８９】
カスパーゼ−３活性の測定
カスパーゼ−３活性を、caspase-3 assay kit(Biovision)を用い、製造業者の指示書に従って比色定量アッセイにより測定した。
【０１９０】
In vivo腫瘍形成アッセイ
５週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ／ｎｕマウスにおいて、２×１０６個のＭＫＮ−４５細胞または３×１０６個のＳＷ４８０細胞を１００μＬの無菌ＰＢＳ中に再懸濁し、続いてこれら細胞を２１ゲージの針を用いて動物の側腹部へ注射した。キャリパーを用いて３日毎に腫瘍サイズをモニタリングし、発達する腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗ）をＶ＝（ｗ２×ｌ）／２の式を用いて体積に変換した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき、１００μＬ当たり５×１０８プラーク形成単位（ｐ.ｆ.ｕ.）の各精製アデノウイルスを、２６ゲージの針を用いて３日間毎日腫瘍内投与した。
【０１９１】
図面の説明
図１２は、スーパーハイブリッドｐ５３のがん細胞におけるアポトーシスの強い誘導を示す。
（Ａ）ＦＬＡＧ−ｐ５３コンストラクト（ダークグレー）、ＦＬＡＧ−ｐ６３γコンストラクト（ライトグレー）、ＦＬＡＧ−６３−５３コンストラクトＯおよびＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３コンストラクトの模式図。ＴＡ：トランス活性化ドメイン、ＤＢ：ＤＮＡ結合ドメイン、ＯＬ：オリゴマー化ドメイン。水平のバーは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を示す。ＮＬＳスコアを、ＰＳＯＲＴ  ＩＩプログラムを用いて計算し、右側に示した。矢印は、ＲＴ−ＰＣＲ解析に用いたプライマーの位置を示している。
【０１９２】
（Ｂ）ＳＷ４８０細胞に、図１２Ａに記載の表示のベクターをトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。図１２Ａに表示のＦＬＡＧ配列特異的フォワードプライマー、ＴＰ６３配列プライマーならびにＴＰ５３特異的フォワードおよびリバースプライマーを、ＦＬＡＧ−ＴＰ６３およびＴＰ５３をそれぞれ検出するために用いた。
【０１９３】
（Ｃ）ＳＷ４８０細胞を、表示したベクターでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクション後、全細胞のライセートを、表示の抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。＊は、非特異的なバンドを示している。
（Ｄ）Ｓａｏｓ−２細胞を、表示したベクターでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、抗ＦＬＡＧ抗体（緑）を用いて免疫細胞化学を行った。ＤＡＰＩ染色によって核を検出した（青色）。
（Ｅ）Ｇ−２９２細胞、Ｕ−２ ＯＳ細胞、ＭＫＮ−４５細胞、ＨＬＦ細胞、ＨＯＳ細胞、ＨｕＨ−７細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＳＷ４８細胞およびＳＷ４８０細胞を表示した組み換えアデノウイルスで感染させ、感染の４８時間後にフローサイトメトリーによって分析した。Ｓｕｂ−Ｇ１における細胞の百分率を示す。
【０１９４】
（Ｆ）アデノウイルス感染の４８時間後に、カスパーゼ−３活性ならびにカスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−１切断をアッセイした。カスパーゼ−３活性の測定は３回行い、平均値と標準偏差を示す。
（Ｇ）「材料と方法」に記載されるように、ヌードマウスにＳＷ４８０細胞およびＭＫＮ−４５細胞を皮下注射した。表示のアデノウイルスベクターを、１、２および３日目に腫瘍内に注射した（矢印）。データは、アデノウイルスを注射した５つの独立した腫瘍の平均体積を表している。１日目の体積を１として、各腫瘍の体積を１日目の体積に対する相対値として表す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【０１９５】
図１３は、ｐ５３（ダークグレー）、ｐ６３γ（ライトグレー）、６３−５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの模式図を示す。ＴＡ：トランス活性化ドメイン、ＤＢ：ＤＮＡ結合ドメイン、ＯＬ：オリゴマー化ドメイン。水平なバーは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を示す。ＮＬＳスコアをＰＳＯＲＴ  ＩＩプログラムを用いて計算した。
【０１９６】
図１４は、ｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの構造をＰＣＲ法およびウェスタンブロット法で確認したことを示す。
（Ａ）Ｆｌａｇ−ＳＨｐ５３およびＲＴ−ＰＣＲプライマー位置（矢印）の模式図である。ダークまたはライトグレーのバーは、それぞれｐ５３およびｐ６３由来の配列を示す。
【０１９７】
（Ｂ）ＳＷ４８０細胞は、表示した図１３に記載のＦｌａｇ−タグ化コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｆｌａｇ−ＴＰ６３、ＴＰ５３およびＦｌａｇ−ＴＰ５３を検出するために、それぞれ（Ａ）に表示されるＦｌａｇ配列特異的フォワードプライマーおよびＴＰ６３配列プライマーおよびＴＰ５３特異的なフォワードおよびリバースプライマーを使用した。
（Ｃ）ＳＷ４８０細胞は、表示したベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全細胞ライセートを、表示した抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。
【０１９８】
図１５は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３−５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドによる各種がん細胞におけるアポトーシス誘導の比較を示す。
Ｇ−２９２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＫＮ−４５細胞、Ｕ−２ ＯＳ細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＨＯＳ細胞およびＳＷ４８０細胞を、表示した組み換えアデノウイルスで感染し、感染の４８時間後にフローサイトメトリーによって解析した。ｓｕｂ−Ｇ１における細胞の百分率を示す。各細胞のＴＰ５３遺伝子型を、ＷＴ（野生型）、ｎｕｌｌまたはＭＵＴ（変異体）として示す。
【０１９９】
図１６は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３−５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドタンパク質の細胞内局在を示す。
Ｓａｏｓ−２細胞を、表示のベクターでトランスフェクトした。２４時間トランスフェクションした後、抗ＦＬＡＧ抗体（緑）を用いて免疫細胞化学を行った。核はＤＡＰＩ染色（青）を介して検出した。
【０２００】
図１７は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３−５３ＯおよびＳＨｐ５３による特異的ｐ５３ＡＩＰ１発現誘導を示す。
ＭＫＮ−４５細胞、Ｕ−２ ＯＳ細胞、Ｇ−２９２細胞およびＳＷ４８０細胞を、表示のアデノウイルスで感染させ、感染の２４時間後に、各遺伝子に特異的なプライマーを用いて遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって解析した。ＴＰ５３の遺伝子型を括弧内に示す。
【０２０１】
図１８は、ＳＨｐ５３により誘導される遺伝子発現プロファイリングを示す。
（Ａ）Ｈｕｈ−７細胞を、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染させた。全ＲＮＡを、感染２４時間後にＴＲＩｚｏｌ（Lifetechnologies）を用いて単離し、ｐ５３標的遺伝子の誘導はＬＤＡを用いて定量し、ＧＡＰＤＨで正規化した。実験を３回行った。平均値および標準偏差を示す。
（Ｂ）Ｈｕｈ−７細胞を、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３は、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染した。感染２４時間後、全ＲＮＡを単離し、遺伝子発現はマイクロアレイを用いて分析した。発現上昇した遺伝子を＞１０の比で同定し、解析した。ベン図は、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の感染により、別個に制御されているものとして同定された遺伝子群の交わりを表示する。遺伝子数および典型的な発現上昇した遺伝子を示す。
【０２０２】
（Ｃ）ヒートマップは、階層的クラスタリングにより分析された発現上昇した遺伝子（図１８Ｂ）を示し、ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３特異的に誘導された遺伝子クラスターを同定した（ボックス、表６）。ＳＨｐ５３標的遺伝子を同定するために、模式図に示すように追加のフィルタリングを行った。遺伝子数が表示される。（Ｃ）遺伝子を特異的に制御するＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３における推定ｐ５３の結合部位（ＢＳ）同定のためのストラテジー（Ｄ）Ｈｕｈ−７細胞におけるＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３特異的に発現上昇する遺伝子およびこれらのｐ５３ＢＳの選択のためのフローチャート
【０２０３】
図１９〜２１は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示す。
ＭＫＮ−４５細胞、Ｕ−２ ＯＳ細胞、Ｇ−２９２細胞、ＨｕＨ−７細胞およびＳＷ４８０細胞を、表示したアデノウイルスで感染させ、遺伝子発現を、感染の２４時間後にＴａｑＭａｎ  ＬＤＡによって解析した。遺伝子発現の相対レベルを、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対する標的遺伝子の発現比率を算出するΔΔＣｔ法を用いて定量した。Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３によって特異的に誘導される遺伝子を示した。各細胞のＴＰ５３遺伝子型を括弧内に示した。プライマー／プローブのセットを、表４に示す。
【０２０４】
図２２は、スーパーハイブリッドｐ５３特異的な標的遺伝子のトランス活性化の制御を示す。
（Ａ）〜（Ｃ）ＣＡＳＰ１０遺伝子（Ａ）、ＫＣＮＫ３遺伝子（Ｂ）およびＰＹＣＡＲＤ遺伝子（Ｃ）のｐ５３ＢＳ候補の位置および配列（灰色のバー）を転写開始部位に相対的に示す。エクソンおよびイントロンを、それぞれ白いボックスまたは太字のバーで示す。ヒトおよびマウスの配列ならびに相同性を示す。コンセンサスｐ５３結合配列（ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ；配列番号２４、Ｒ：プリン、Ｃ：シトシン、Ｗ：アデニンまたはチミン、Ｇ：グアニン、Ｙ：ピリミジン）と比較してマッチした、またはミスマッチしたヌクレオチドを、それぞれ大文字または小文字で示す。相同性をアスタリスクで示す。
【０２０５】
（Ｄ）〜（Ｆ）Ｈｕｈ−７細胞をＡｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３は、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染させ、感染の２４時間後に抗ＦＬＡＧ抗体またはコントロールＩｇＧを用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを行った。ＣｈＩＰサンプルおよび１０％のインプットＤＮＡを、ｐ５３ＢＳ、ＣＡＳＰ１０−３０９０または+４８９（Ｄ）、ＫＣＮＫ３+１２６９または+１４３２（Ｅ）またはＰＹＣＡＤ+１２６９または+１４３２（Ｆ）をそれぞれ含む領域を標的にした特異的なプライマーで増幅した。
【０２０６】
（Ｇ）〜（Ｉ）ＨｕＨ−７細胞またはＳＷ４８０細胞を、野生型ｐ５３ＢＳ（ＷＴ）または表示した部位が変異した配列（ｍｕｔ）を含むレポーター、またはＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３発現ベクターを有するまたはモック（−）のｐＧＬ３プロモーターの空ベクターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて決定した。実験は３回行った。平均値および標準偏差を示す。モックでトランスフェクションした試料を１とした。＊＊Ｐ＜０．０１
【０２０７】
図２３は、ＳＨｐ５３が特異的に結合する部位を持つ標的遺伝子を示す。
Ｈｕｈ−７細胞を、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−Ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染させ、感染後２４時間で抗ＦＬＡＧ抗体またはコントロールＩｇＧを用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを行った。ＣｈＩＰサンプルおよび１０％のインプットＤＮＡを、各遺伝子のｐ５３ＢＳを含む領域を標的とした特異的なプライマーで増幅した。ｐ５３ＢＳおよびプライマー配列を表５に記載した。
【０２０８】
図２４は、特定の標的遺伝子の発現制御によるスーパーハイブリッドｐ５３のアポトーシスの誘導を示す。（Ａ）〜（Ｂ）ＨｕＨ−７細胞およびＳＷ４８０細胞を、ＣＡＳＰ１０に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＳＰ１０、Ａ）、ＫＣＮＫ３に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＫＣＮＫ３、Ｂ）またはＰＹＣＡＲＤに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＹＣＡＲＤ、Ｃ）、またはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション後４時間で、細胞をＡｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染させた。感染の２４時間後に全ＲＮＡを単離し、各遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより解析した（上）。感染の４８時間後に、ｓｕｂ−Ｇ１の百分率をフローサイトメトリーによって分析した（下）。
【０２０９】
（Ａ）ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３およびＲＴ−ＰＣＲプライマーの位置（矢印）の模式図を示す。ダークまたはライトグレーのバーは、ｐ５３およびｐ６３に由来する配列をそれぞれ示す。（Ｂ）ＳＷ４８０細胞を、図１３に記載する表示のＦＬＡＧタグ化したコンストラクトでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。図１４に表示のＦＬＡＧ配列特異的フォワードプライマー、ＴＰ６３配列プライマーならびにＴＰ５３特異的フォワードおよびリバースプライマーを、ＦＬＡＧ−ＴＰ６３、ＴＰ５３およびＦＬＡＧ−ＴＰ５３をそれぞれ検出するために用いた。（Ｃ）ＳＷ４８０細胞を、表示したベクターでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、全細胞ライセートを、表示した抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。
【０２１０】
例７：がん細胞におけるスーパーハイブリッドｐ５３の誘導
ｐ５３に基づく新規ながん治療のためのスクリーニングによって、ｐ６３γのＴＡＤおよびＤＢＤならびにｐ５３のＯＬＤを組み合わせたｐ５３ファミリーのハイブリッド遺伝子「６３−５３Ｏ」（図１２Ａ）が、強力な腫瘍抑制遺伝子であることを見出した。６３−５３Ｏハイブリッドのアデノウイルス（Ａｄ）媒介遺伝子導入は、ＴＰ５３ＡＩＰ１のトランス活性化によって、in vitroおよびin vivoの両方においてアポトーシスを強く誘導した。
【０２１１】
６３−５３Ｏハイブリッドのアポトーシス促進活性を増強させるため、一連のハイブリッド遺伝子の誘導体を作製した（図１３、表６および図１４）。いくつかのがん細胞において、ｐ６３γの１〜３５２番目のアミノ酸とｐ５３の２９０〜３９３番目のアミノ酸を融合したハイブリッドが、ｐ５３、ｐ６３γまたは他のハイブリッド遺伝子と比較して、アポトーシスを強く誘導したことが示された（図１２Ｅおよび図１５）。
【表６】
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【０２１２】
したがって、当該ハイブリッドを、「スーパーハイブリッドｐ５３（ＳＨｐ５３）」と命名し、そのアポトーシス促進活性を評価するためにさらに分析を行った。ＳＷ４８０細胞を、ＦＬＡＧ−ｐ５３、ＦＬＡＧ−ｐ６３γ、ＦＬＡＧ−６３−５３ＯまたはＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３発現ベクターで感染させた。ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３のｍＲＮＡおよびタンパク質は、他の遺伝子と同様に発現し（図１２Ｂおよび図１２Ｃ）、同様のデータがＨＥＫ２９３細胞においても得られた。各タンパク質の細胞内局在は、免疫細胞化学によって分析した（図１２Ｄ）。
【０２１３】
図１２Ｄに示すように、ＦＬＡＧ−ｐ５３、ＦＬＡＧ−ｐ６３γ、ＦＬＡＧ−６３−５３ＯおよびＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３は、核に局在した。ＮＬＳスコアと一致して、ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の核移行が最も強く観察された（図１２Ａおよび図１２Ｄ）。これら遺伝子のアデノウイルス媒介性導入によって誘導されたアポトーシス促進効果は、核移行およびＮＬＳスコアと一致する傾向にあった（図１３〜１６）。これは、ｐ５３ファミリーおよびハイブリッド遺伝子の核移行が、アポトーシス促進機能に必要であることを示唆する。
【０２１４】
アポトーシス性細胞死を示すｓｕｂ−Ｇ１画分の増加は、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３によって誘導され、それはＴＰ５３遺伝子型とは関係なく、ほとんどのがん細胞において他の分子よりも大きく誘導されることが、フローサイトメトリー分析で明らかになった（図１２Ｅおよび図１５）。６３−５３Ｏハイブリッドの標的であるＴＰ５３ＡＩＰ１の発現もまた、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３によって誘導され（図１７）、ＴＰ５３ＡＩＰ１は、６３−５３ＯおよびＳＨｐ５３の共通の標的であることが示された。これらデータは、Ａｄ−ＳＨｐ５３が、アポトーシス促進活性を通じて、がん治療のための新規で潜在的な標的であることを示唆する。
【０２１５】
Ａｄ−ＳＨｐ５３のin vitroおよびin vivoのアポトーシス促進活性を確認するため、カスパーゼ−３活性およびＰＡＲＰ−１タンパク質の切断を測定し（図１２Ｆ）、腫瘍形成の異種移植モデルで試験した（図１２Ｇ）。カスパーゼ−３は、多様なアポトーシス経路における切断によって活性化し、活性化したカスパーゼ−３は、ＰＡＲＰ−１を切断する。したがって、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−１の切断は、アポトーシスの特徴とみなされる。
【０２１６】
ＭＫＮ−４５、ＨｕＨ−７、ＰＡＮＣ−１およびＳＷ４８０細胞のＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３での感染は、カスパーゼ−３活性およびＰＡＲＰ−１切断の両方を最も大きく増加させた（図１２Ｆ）。これは、アデノウイルス媒介のＳＨｐ５３遺伝子導入が、がん細胞において強くアポトーシスを促進したことを確認するものである。
【０２１７】
さらに、ＳＨｐ５３のin vivoにおける治療上の効果と相関するin vitroでのアポトーシスへの効果を測定するために、腫瘍形成の異種移植モデルにおいて、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３ベクターの活性を調べた。ＳＷ４８０およびＭＫＮ−４５細胞を、ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍体積が一定の大きさに達したとき、アデノウイルスを１日目、２日目および３日目に腫瘍へ直接注射した（図１２Ｇ、矢印）。
【０２１８】
Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３とともに注射したＳＷ４８０由来およびＭＫＮ−４５由来の腫瘍体積は、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３またはＡｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γを注射した腫瘍体積よりも小さかった（図１２Ｇ）。すなわち、これら結果は、アデノウイルス媒介のＳＨｐ５３遺伝子導入が、ｐ５３耐性がん患者に対して有利であり、新規のがん遺伝子治療となり得ることを示す。
【０２１９】
例８：スーパーハイブリッドｐ５３によって誘導される遺伝子発現プロファイル
がん細胞におけるＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３誘導アポトーシスの分子的基盤を明らかにするため、ＳＨｐ５３によって特異的に制御される標的遺伝子をスクリーニングした。最初に、ＴａｑＭａｎに基づくハイスループットリアルタイムＰＣＲであるＴａｑＭａｎ低密度アレイ（Low Density Array；ＬＤＡ）を用いて、特にアポトーシスに関連する９３種の既知のｐ５３標的遺伝子の発現を調べた。ＴＰ５３ＷＴ細胞（ＭＫＮ−４５細胞およびＵ−２ ＯＳ細胞）、ヌル細胞（Ｇ−２９２細胞）および変異細胞（ＨｕＨ−７細胞およびＳＷ４８０細胞）を、Ａｄ−ＬａｃＺ、ＦＬＡＧ−ｐ５３、ＦＬＡＧ−ｐ６３γおよびＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染させ、感染の２４時間後に遺伝子発現レベルを定量した。
【０２２０】
Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３およびＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入では、ｐ５３の最も有名な標的遺伝子の一つであるＣＤＫＮ１Ａがそれぞれ同程度誘導されたが、いくつかのがん細胞において、１８種の遺伝子（ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＱＰ３、ＣＡＳＰ１０、ＣＳＴ１１、ＥＧＲ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＪＡＧ２、ＫＣＮＡ２、ＰＧＡ５、ＰＬＣＤ４、ＰＹＣＡＲＤ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＴＴＹＨ２、ＩＣＡＭ２、ＴＮＸＢ、ＴＰ７３およびＬＲＤＤ）が、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入によって、有意に高い誘導を示した（図１７、図１８Ａ、および図１９〜２１）。
【０２２１】
第二のアプローチでは、ＳＨｐ５３によって制御される遺伝子をゲノムワイドにスクリーニングするため、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染したＨｕＨ−７細胞において、２７，９５８種のＥｎｔｒｅｚ  ｇｅｎｅ  ＲＮＡおよび７，４１９種のｌｉｎｃＲＮＡを含む遺伝子発現マイクロアレイ（Agilent Technologies社）で解析を行った。Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γおよびＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３でそれぞれ感染したすべての細胞において、ＣＤＫＮ１Ａの発現上昇が検出された（図１８Ａ）。これは、ＬＤＡの結果とも一致する（図２１）。
【０２２２】
総遺伝子数だけではなく、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３感染によって特異的に発現上昇した遺伝子数が、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３またはＡｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γ感染によって発現上昇した遺伝子数よりも多かった。これは、ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３が、ＦＬＡＧ−ｐ５３またはＦＬＡＧ−ｐ６３γとは異なるトランス活性化活性を得たことを示唆する（図１８Ｂ）。階層的クラスタリング解析は、ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３特異的に発現上昇した２３８種の遺伝子を同定した（図１８Ｃおよび表７）。
【０２２３】
表７は、階層的クラスタリング解析によって同定されたＦｌａｇ−ＳＨｐ５３特異的に制御される遺伝子を示す。
【表７−１】
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【０２２４】
【表７−２】
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【０２２５】
【表７−３】
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【０２２６】
【表７−４】
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【０２２７】
興味深いことに、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の感染によって誘導された遺伝子発現のパターンは、ＨｕＨ−７細胞においてそれぞれ異なっていた。これは、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３が、ＤＮＡ結合ドメインはｐ６３γに由来するが、新規なトランス活性化活性を有することを示唆する。ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の推定標的遺伝子群を得るために、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入によって誘導される遺伝子であって、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３またはＡｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γよりも少なくとも１０倍発現量の多い遺伝子を抽出した。ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３によって発現上昇する潜在的な遺伝子として、６４種の遺伝子が同定された（図１８Ｃおよび表８）。
【０２２８】
表８は、マイクロアレイ解析によって同定された推定Ｆｌａｇ−ＳＨｐ５３遺伝子を示す。
【表８−１】
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【０２２９】
【表８−２】
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【０２３０】
第三のアプローチでは、ＳＨｐ５３特異的に発現上昇する遺伝子をさらにゲノムワイドに同定するために、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染したＨｕＨ−７細胞において、活性型の遺伝子プロモーターを標識する抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体を用いてクロマチン免疫沈降シーケンス（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）解析を行った。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ解析は、５７種のＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３特異的なＨ３Ｋ４ｍｅ３標識化ＲｅｆＳｅｑ遺伝子を同定した（表９）。ＴＴＹＨ２を除いて、他の５６種の遺伝子を、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入によって発現上昇する遺伝子候補としてさらに同定した。
【０２３１】
表９は、Ａｄ−Ｆｌａｇ−ＳＨｐ５３導入細胞において特異的に検出されたＨ３Ｋ４ｍｅ３標識化遺伝子のリストである。
【表９】
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【０２３２】
ＳＨｐ５３によって転写的に制御され得る遺伝子を同定するために、これら遺伝子におけるｐ５３結合部位（ＢＳ）を３種のスクリーニングアプローチで同定し、ｐ５３スキャンアルゴリズム（Smeenk et al., 2008）を用いてin silico解析で探索した後、図１８Ｄに示すように２つの独立した基準によって選別した。コンセンサスｐ５３ＢＳは、０〜２１ｂｐのスペーサー配列で区切られた１０ｂｐのモチーフ（ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ；配列番号２４）の２つのコピーからなる（Ｒ：アデニンまたはグアニン、Ｃ：シトシン、Ｗ：アデニンまたはチミン、Ｇ：グアニン、Ｙ：シトシンまたはチミン）。よく保存されたＣまたはＧを変更することは、ｐ５３に対する応答性を劇的に減少させ得るため (Menendez et al., 2009)、これらコアＣ／Ｇを保存したｐ５３ＢＳを精製した（図１８Ｄ）。スペーサー長のバリエーションが特定のレベルの機能を維持するために重要なメカニズムであることもまた示唆されており、実際、検証されたヒトｐ５３ＢＳのほとんどが、３塩基より小さいスペーサーを有している (Menendez et al., 2009)。
【０２３３】
したがって、０〜２塩基のスペーサーを有するｐ５３ＢＳを選択した。さらに、転写開始部位（ＴＳＳ）からのｐ５３ＢＳの位置および距離は、任意の推定ｐ５３ＢＳを受け入れるための閾値を決定するのに役立つ。遺伝子におけるｐ５３ＢＳは、最も一般的には、遺伝子の５’プロモーター−エンハンサー領域またはイントロン１に位置し、ＤＮＡにおける機能的低親和性ｐ５３ＢＳはＴＳＳの周りにのみ存在する (Riley et al., 2008)。したがって、遺伝子のＴＳＳの−５ｋｂｐと＋１０ｋｂｐとの間に位置するｐ５３ＢＳを選択した。
【０２３４】
別のアプローチとして、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの配列比較解析は推定ｐ５３ＢＳの検索に役立つことから (Maruyama et al., 2006)、オーソロガス遺伝子におけるヒトとマウスとの間の保存性をコンピューター検索に適用した。これとともに、推定ＳＨｐ５３標的遺伝子を同定するために２つの基準を適応した。
遺伝子は、１）ＴＳＳの−５ｋｂｐと＋１０ｋｂｐとの間に位置し、完全に保存されたコアＣ／Ｇ、３以下のミスマッチ、および２以下のスペーサーを含むｐ５３ＢＳ、ならびに２）ＴＳＳの−５ｋｂｐと１０ｋｂｐとの間に位置し、完全に保存されたコアＣ／Ｇ、５以下のミスマッチ、およびオーソロガス遺伝子におけるヒトとマウスとの間の５０％以上の相同性を含むｐ５３のＢＳを有していた（図１８Ｃ）。これらアプローチを使用して、６３種のＳＨｐ５３特異的標的遺伝子候補における１３３箇所の推定ｐ５３ＢＳを同定した（図１８Ｄおよび表１０）。
【０２３５】
表１０は、スーパーハイブリッドｐ５３の標的遺伝子候補を示す。
【表１０】
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【０２３６】
略記：ｐ５３ＢＳ、ｐ５３結合部位；ＣｈＩＰ＋、結合；ＣｈＩＰ−、非結合；Ｎ．Ａ．、未評価；ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、クロマチン免疫沈降−配列決定；ＬＤＡ、ＴａｑＭａｎ低密度アレイ
【０２３７】
例９：スーパーハイブリッドｐ５３による特定の標的遺伝子トランス活性化の制御
in silico解析によって予測されたｐ５３ＢＳへ直接結合することによって、これら候補遺伝子がＳＨｐ５３によって転写的に制御されたかを評価するために、ＨｕＨ−７細胞を、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−Ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γまたはＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３に感染させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＣｈＩＰ解析を行った。６３種のＳＨｐ５３特異的標的遺伝子のうち、細胞増殖、アポトーシスに関与していることが報告されている２６種において、コンピューター予測によって同定されたｐ５３ＢＳ候補を含むＤＮＡ断片に対してのＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３タンパク質特異的な相互作用を評価し、１９種の遺伝子において確認がされた。これは、これらアプローチが機能的ｐ５３ＢＳの検索において信頼できるものであることを示唆する（表１０、図２２および図２３）。
【０２３８】
さらに、これらｐ５３ＢＳが転写制御に関与し得るかどうかを決定するために、ＣｈＩＰ解析によって確認されたＡＰＯＢＥＣ２、ＣＡＳＰ１０およびＰＹＣＡＲＤのＷＴｐ５３ＢＳを含むオリゴヌクレオチド、または非活性型変異体（ｍｕｔ）を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングした。その後、得られたコンストラクトを、ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３有りまたは無しで、ＴＰ５３変異を有するＨｕＨ−７細胞またはＳＷ４８０細胞にトランスフェクションした。変異の配列とは異なり、ＷＴｐ５３ＢＳは、レポーターコンストラクトにＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３に応答性を与え、これは、モックトランスフェクションした細胞と比較しても少なくとも２倍のルシフェラーゼ活性の増加となる（図２２）。図１８Ａに示すように、これら遺伝子のＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３特異的な誘導が、リアルタイムＰＣＲによって確認された（図１８Ａ）。つまり、これら知見は、ゲノムワイドなスクリーニングによって同定されたＳＨｐ５３特異的に発現上昇した遺伝子のほとんどが、ｐ５３ＢＳに直接結合することによって転写的に制御され得ることを示唆する（表１０）。
【０２３９】
例１０：スーパーハイブリッドｐ５３は特定の標的遺伝子の発現を制御することによりアポトーシスを誘導する
いくつかのがん細胞において、Ａｄ−ＳＨｐ５３がアポトーシスおよびを特定の標的遺伝子の転写を強く誘導したことから（図１２Ａおよび図１８Ａ）、ハイブリッドが、ＳＨｐ５３特異的標的遺伝子のトランス活性化を介してアポトーシス促進活性を獲得したと考えた。この考えを評価するために、ＳＨｐ５３特異的にトランス活性化した遺伝子をノックダウンし、フローサイトメトリーでＡｄ−ＳＨｐ５３媒介アポトーシスを解析した。
【０２４０】
ＨＵＨ−７細胞、ＳＷ４８０細胞を、Ａｄ−ＬａｃＺ、ＡＤ−ＦＬＡＧ−ｐ５３、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ６３γまたはＡＤ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で感染した後、ヒトＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３、ＳＥＺ６、ＳＬＣＯ２ＢもしくはＰＹＣＡＲＤを含むＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３特異的に制御された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。ＳＥＺ６またはＳＬＣＯ２Ｂとは異なり、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤがアポトーシス応答性遺伝子として同定された（図２４）。コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞における他のアデノウイルスと比較して、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３またはＰＹＣＡＲＤがＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入によって強く誘導された一方で、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、これらの３種の遺伝子の発現上昇が、各ｓｉＲＮＡ媒介のノックダウン細胞において５０％以上阻害されたことを実証した（図２４、上段）。
【０２４１】
ＰＹＣＡＲＤ遺伝子には、エクソン１、２および３ならびにエクソン１および２からなる２種の選択的スプライシングバリアントがあるところ、短い型の発現がＡｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入によって有意に誘導された。これは、ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３が、短い型のＰＹＣＡＲＤのみをトランス活性化することを示唆する。コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞において、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３の導入によって誘導されたアポトーシス性細胞死を示すｓｕｂ−Ｇ画分における増加は、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３またはＡｄ−ＦＬＡＧ−６３γのものより大きく、図１２Ｅと一致する（図１２Ｅおよび図２４、下段）。Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３で誘導されるアポトーシスは、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３またはＰＹＣＡＲＤをノックダウンした細胞において有意に抑制されたが、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ｐ５３またはＡｄ−ＦＬＡＧ−ｐ６３γで誘導されるアポトーシスは、これらｓｉＲＮＡのトランスフェクションによっては影響を受けなかった（図２４、下段）。これらデータは、Ａｄ−ＦＬＡＧ−ＳＨｐ５３は、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤなどのアポトーシス促進性遺伝子を介してアポトーシスを誘導することを示唆する。
【０２４２】
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【産業上の利用可能性】
【０２５７】
以上に述べたとおり、本発明のｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子および／またはキメラタンパク質を含む遺伝子発現誘導剤などによって、腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、ｐ５３遺伝子治療を改善する医薬などの提供を可能とする。
【図１】
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【図２ＡＢ】
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【図２ＣＤ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｄ】
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【図１２Ｅ−Ｇ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ−Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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