(57)【要約】【課題】本発明は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く、夾雑物を多く含む検体におけるＬ−リジンも高い正確性をもって測定が可能になる上に、一般的な大腸菌で発現可能であり効率的に生産できる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素、当該変異型酵素を用いたＬ−リジンの測定方法、および当該変異型酵素を含むＬ−リジン測定用キットを提供することを目的とする。また、本発明は、一般的な大腸菌中でも発現することが可能であり、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の効率的な製造が可能になる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子、当該変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子と抗生物質耐性遺伝子との結合体、当該遺伝子または当該遺伝子結合体を含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。【解決手段】本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、特定のアミノ酸配列を有するものであり、Ｌ−リジンに対する基質特異性が非常に高いことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかの変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素。
（１）  野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号２）において、第２８６位のヒスチジンがアルギニンまたはリジンに置換されているアミノ酸配列を有する変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第２８６位を除く領域中で１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下である変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素；または
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して６５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下である変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２８６位のアミノ酸の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列において、第２８６位のヒスチジンがアルギニンに置換されている請求項１に記載の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素。
【請求項３】
下記（１’）〜（３’）の何れかの変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子。
（１’）  野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）において、第２７６位のアデニンがグアニンに、第６７５位のチミンがシトシンに、第８５７位のアデニンがグアニンに、第１５９３位のアデニンがグアニンに、第１６５０位のアデニンがグアニンに、第１６９８位のシトシンがチミンに、第１９３８位のチミンがグアニンに置換されている塩基配列を有する変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子；
（２’）  上記（１’）に規定される塩基配列において、上記第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位を除く領域中で１以上の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、且つ、少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なものである変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子；または
（３’）  上記（１’）に規定される塩基配列に対して６５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つ、少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なものである変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（但し、上記（１’）に規定される塩基配列における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の置換は、（３’）においてさらに変異しないものとする）。
【請求項４】
請求項３に記載の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の塩基配列において終止コドンＴＡＧが欠失しており、当該位置にブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子が結合していることを特徴とするＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体。
【請求項５】
変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子とブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子がペプチドリンカーをコードする遺伝子を介して結合している請求項４に記載のＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体。
【請求項６】
ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子がフレオマイシン耐性遺伝子である請求項４または５に記載のＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体。
【請求項７】
フレオマイシン耐性遺伝子が配列番号３の塩基配列を有する請求項６に記載のＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体。
【請求項８】
Ｌ−リジンを測定するための方法であって：
（Ａ）水と酸素の存在下、請求項１または２に記載の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素と検体とを混合する工程；および
（Ｂ）上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素によるＬ−リジンの脱アミノ化反応により生成する２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒド、アンモニアまたは過酸化水素を測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を含むことを特徴とするＬ−リジン測定用キット。
【請求項１０】
さらに、ペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ用発色剤の組合せ、アンモニア検出薬、ＮＡＤ+とアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼとの組合せの少なくとも一つを含む請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項３に記載の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子または請求項４〜７のいずれかに記載のＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く且つ製造が容易な変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素、一般的な大腸菌を用いた当該変異型酵素の製造が可能になる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子、当該変異型酵素を用いたＬ−リジンの測定方法、Ｌ−リジンの測定用キットなどに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジンはタンパク質構成アミノ酸の一つであるが、体内で生産できない必須アミノ酸である。Ｌ−リジンを含むアミノ酸の濃度は、生体内では恒常性が維持されているが、先天性代謝異常や内臓疾患によりその血中濃度が大きく変動する。Ｌ−リジンに限らず、生体内のアミノ酸濃度は疾病を検出する有用な手段となり得る。このため、１種類もしくは多種類のアミノ酸の血中濃度を測定することにより、特定の疾病を検出することが可能となる（特許文献１および非特許文献１）。
【０００３】
近年、アミノ酸の定量法として酵素を用いる方法が多数知られている。酵素を用いる方法は、機器分析的手法と比べ安価で簡易的に行うことができるという利点がある。定量用酵素としては、例えば、酸化酵素や脱水素酵素が多く用いられる。酸化酵素を用いる場合、アミノ酸に酸化酵素を作用させることで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼで検出し、定量する方法が挙げられる（特許文献２）。この検出および定量には、比色法、蛍光法、電極法のいずれの方法も利用可能である。
【０００４】
Ｌ−リジンの定量法としても酵素を用いる方法が知られている。例えば、酸化酵素による定量には、Ｌ−リジンα−酸化酵素［ＥＣ  １．４．３．１４］が用いられてきた。トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のＬ−リジンα−酸化酵素は、他のＬ−アミノ酸酸化酵素に比べて基質特異性が高く、市販もされていることから、酵素センサなどの素子に利用されてきた（非特許文献２，非特許文献３および非特許文献４）。
【０００５】
また、海洋バクテリアであるマリノモナス・メディテラネア（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）ＮＢＲＣ１０３０２８T株由来のＬ−リジンε−酸化酵素を用いたＬ−リジン定量方法が報告されている（特許文献３および非特許文献４）。当該Ｌ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子ｌｏｄＡを大腸菌に組み込んで当該酵素を合成するには、その発現補助タンパク質遺伝子であるｌｏｄＢも必要である（非特許文献５）。
【０００６】
また、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＬ−リジンモノオキシゲナーゼにＬ−リジン酸化酵素活性があるという報告がある（非特許文献６および非特許文献７）。この酵素は、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニンを基質とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２９５１３号パンフレット
【特許文献２】特開昭５５−４３４０９号公報
【特許文献３】特開２０１１−４３３９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８１，ｐｐ．３０７−３１４（２００９）
【非特許文献２】Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，Ｂ，１２６，ｐｐ．４２４−４３０（２００７）
【非特許文献３】Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３９１，ｐｐ．１２５５−１２６１（２００８）
【非特許文献４】Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４０６，ｐｐ．１９−２３（２０１０）
【非特許文献５】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ＤＯＩ  １０．１００７／Ｓ００２５３−０００１３−０５１６８−００２５３（２０１３）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，ｐｐ．２５７９−２５８６（１９７４）
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，ｐｐ．２５８７−２５９２（１９７４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、様々な生物由来のＬ−リジン酸化酵素が知られているが、そのほとんどが基質特異性の十分なものでははなく、Ｌ−リジン以外のアミノ酸も酸化してしまうものであることから、Ｌ−リジンの定量に使用しても、例えば特に血漿のように様々な化合物を含む検体中のＬ−リジンを正確に測定できるものではなかった。
【００１０】
唯一、Ｌ−リジンに対する基質特異性が高いＬ−リジン酸化酵素として、海洋性バクテリアであるマリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株が産生する野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素が知られている。しかし当該酵素は一般的な大腸菌などでの異種発現が困難であり、生産性に問題があった。
【００１１】
詳しくは、タンパク質を構成する２０種の天然アミノ酸に対しては６１種のコドンが対応しており、生物によりその使用頻度が異なる。よって、マリノモナス・メディテラネアのような細菌の遺伝子を大腸菌などの異種細胞に導入するような場合には、導入遺伝子に異種細胞で使用頻度の少ないコドンが含まれていると、そのコドンに対応するｔＲＮＡが不足し、早期の翻訳終了、フレームシフト変異、誤ったアミノ酸への変異、異種細胞の生育阻害、導入プラスミドベクターの不安定化などの問題が起こる。特許文献３には、Ｌ−リジンε−酸化酵素を得る方法として、その遺伝子を異種細胞へ導入して形質転換する方法が例示されてはいるが、実施例で実際に行なわれている方法は、Ｌ−リジンε−酸化酵素の産生菌であるマリノモナス・メディテラネアの培養液から単離精製する方法である。非特許文献５には、異種細胞を用いてＬ−リジンε−酸化酵素を得る方法が開示されているが、使用された細胞は使用頻度の低いコドンに対応するｔＲＮＡを高発現させた特殊な大腸菌（メルク社製，製品名「Ｒｏｓｅｔｔａ」）である。これまで、一般的な大腸菌を用いてＬ−リジンε−酸化酵素を製造した先例はないし、本発明者らの実験でも、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素やその変異体の遺伝子を一般的な大腸菌に導入しても遺伝子は発現せず、これら酵素を得ることはできなかった。
【００１２】
そこで本発明は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く、夾雑物を多く含む検体におけるＬ−リジンも高い正確性をもって測定が可能になる上に、一般的な大腸菌で発現可能であり効率的に生産できる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素、当該変異型酵素を用いたＬ−リジンの測定方法、および当該変異型酵素を含むＬ−リジン測定用キットを提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、一般的な大腸菌中でも発現することが可能であり、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の効率的な製造が可能になる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子、当該変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子と抗生物質耐性遺伝子との結合体、当該遺伝子または当該遺伝子結合体を含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために、海洋性バクテリアであるマリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株が産生する野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素に変異を導入したところ、当該野生型酵素と同様にＬ−リジンに対して極めて高い基質特異性を示す変異型酵素を得ることに成功した。また、従来公知のＬ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子は、野生型、変異型ともに、おそらくはコドンの使用頻度の違いを原因として、一般的な大腸菌における異種発現が難しく、形質転換法を用いた効率的な製造ができなかった。しかし、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素の遺伝子に特定の変異を導入することにより、一般的な大腸菌でも発現が可能になることを見出した。
【００１５】
本発明は、下記（１）〜（３）の何れかの変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素に関する。
【００１６】
（１）  野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号２）において、第２８６位のヒスチジンがアルギニンまたはリジンに置換されているアミノ酸配列を有する変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第２８６位を除く領域中で１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下である変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素；または
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して６５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下である変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２８６位のアミノ酸の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【００１７】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素としては、配列番号２のアミノ酸配列において、第２８６位のヒスチジンがアルギニンに置換されているアミノ酸配列を有するものが好ましい。かかる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素のＬ−リジンに対する野生型と同様の高い基質特異性は、本発明者らの実験により確認されている。
【００１８】
また、本発明は、下記（１’）〜（３’）の何れかの変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子に関する。
【００１９】
（１’）  野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）において、第２７６位のアデニンがグアニンに、第６７５位のチミンがシトシンに、第８５７位のアデニンがグアニンに、第１５９３位のアデニンがグアニンに、第１６５０位のアデニンがグアニンに、第１６９８位のシトシンがチミンに、第１９３８位のチミンがグアニンに置換されている塩基配列を有する変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子；
（２’）  上記（１’）に規定される塩基配列において、上記第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位を除く領域中で１以上の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、且つ、少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なものである変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子；または
（３’）  上記（１’）に規定される塩基配列に対して６５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つ、少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なものである変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（但し、上記（１’）に規定される塩基配列における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の置換は、（３’）においてさらに変異しないものとする）。
【００２０】
さらに、本発明に係るＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体は、本発明に係る上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の塩基配列において終止コドンＴＡＧが欠失しており、当該位置にブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子が結合していることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る上記Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体としては、変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子とブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子がペプチドリンカーをコードする遺伝子を介して結合しているものがより好ましい。両遺伝子間にリンカー遺伝子が存在すると、両遺伝子の発現タンパク質がペプチドリンカーで連結されることになり、両タンパク質の高次構造が互いに影響され難くなるという効果が得られる。
【００２２】
本発明に係る上記Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体において、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子としてはフレオマイシン耐性遺伝子を挙げることができ、当該フレオマイシン耐性遺伝子としては配列番号３の塩基配列を有するものを挙げることができる。これらフレオマイシン耐性遺伝子を有するＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体の効果は、後記の実施例により実証されている。
【００２３】
本発明に係るＬ−リジンの測定方法は、（Ａ）水と酸素の存在下、本発明に係る上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素と検体とを混合する工程；および、（Ｂ）上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素によるＬ−リジンの脱アミノ化反応により生成する２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒド、アンモニアまたは過酸化水素を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明に係るＬ−リジン測定用キットは、本発明に係る上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明に係る上記Ｌ−リジン測定用キットとしては、さらに、ペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ用発色剤の組合せ、アンモニア検出薬、ＮＡＤ+とアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼとの組合せの少なくとも一つを含むものが好ましい。
【００２６】
本発明に係るベクターは、本発明に係る上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子または上記Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体を含むことを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る上記ベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が野生型と同様に極めて高く、他のアミノ酸に対して酸化酵素活性を示さないか或いはほとんど示さないことから、他のアミノ酸など多くの夾雑物を含む試料においても、Ｌ−リジンを精度良く、簡便かつ迅速に測定することが可能となる。また、従来、Ｌ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子は異種発現が難しく、同酵素の産生株の培養液などから単離精製するか、或いは特殊な大腸菌に導入して形質転換するしかなかった。しかし本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子は、一般的な大腸菌においても発現可能であることから、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の通常の形質転換法による製造が可能になる。よって本発明は、疾病の診断などのためのＬ−リジンの測定を産業的に可能にするものとして、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子を用いて変異型酵素遺伝子ライブラリーから発現したものを選別するスクリーニング方法の概要を示している。
【図２】図２は、マリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T由来の野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素と、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素との遺伝子配列のアライメントを示している。
【図３】図３は、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の製造に用いたプラスミドの構成を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の発現におけるｌｏｄＢの影響を示すためのグラフである。
【図５】図５は、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。レーンＡが本発明変異型酵素、レーンＢが分子量マーカーを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）は、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号２）において、第２８６位のヒスチジンがアルギニンまたはリジンに置換されているアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００３１】
上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）において、配列番号２に示すアミノ酸配列は、微生物株分与機関Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｊａｐａｎ（ＮＢＲＣ）から分譲されたマリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株が生産するＬ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子をクローニングすることにより得られたものである。
【００３２】
Ｌ−リジンε−酸化酵素は、以下のとおり、水と酸素の存在下、Ｌ−リジンのεアミノ基を脱アミノ化し、（Ｓ）−２−アミノアジピン酸−６−ヘミアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素である。
【００３３】
【化１】
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【００３４】
本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。また、例えば、後述するように、Ｃ末端側にブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子が発現したペプチドが結合してもよいし、また、その間にペプチドからなるリンカー基が存在していてもよい。
【００３５】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（２）は、上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第２８６位を除く領域中で１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下であることを特徴とする。
【００３６】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（２）において、「第２８６位を除く領域」とは、変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）のアミノ酸配列中、第１〜２８５位および第２８７位以降の領域をいう。
【００３７】
なお、変異の導入によりアミノ酸配列のアミノ酸数や塩基配列の塩基数が変化する場合においても、配列同一性が６５％以上である場合には、変異導入後の配列において、変異導入前の特定位置に相当する位置を特定することは当業者にとり容易である。具体的には、アミノ酸配列または塩基配列の多重アラインメント用プログラムで比較すべき配列をアライメントし、位置を決定することが可能である。
【００３８】
また、「１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１以上」の範囲は、欠失等を有するＬ−リジンε−酸化酵素が、Ｌ−リジンに対する基質特異性が高い酸化酵素活性を有する限り特に限定されるものではない。「１以上」の範囲は、変異型酵素（２）のＬ−リジンに対する基質特異性が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、１個程度であることができる。
【００３９】
本発明において「Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下である」とは、対象となる酵素を用い、基質化合物として２０種の天然アミノ酸とＬ−オルニチンを使って同一の条件で上記酵素反応を行い、Ｌ−リジン以外のアミノ酸を基質化合物とした場合の酵素活性値をＬ−リジンを基質化合物とした場合の酵素活性値で除した場合の割合が５％以下であることをいう。
【００４０】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（３）は、上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して６５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンを基質とした場合に対するＬ−リジン以外のアミノ酸を基質とした場合の相対活性が５％以下であることを特徴とする（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２８６位のアミノ酸の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【００４１】
本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して６５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、変異型酵素がＬ−リジンに対して高い基質特異性を示す限り特に限定されない。前記アミノ酸配列の配列同一性は６５％以上であれば特に限定されないが、好ましくは６８％以上、７０％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、より一層好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。本発明において「配列同一性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が同一性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
【００４２】
本発明において、「但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２８６位のアミノ酸の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする」における「変異」とは、具体的にはアミノ酸残基の欠失、置換および／または付加を意味する。つまり、上記Ｌ−リジンε−酸化酵素（３）のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）のアミノ酸配列における第２８６位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が、当該変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）のアミノ酸残基における第２８６位のアミノ酸残基と同一のアルギニンまたはリジンであることを意味する。
【００４３】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）〜（３）は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く、その他の天然アミノ酸およびＬ−オルニチンに対しては酵素活性をほとんど示さないか全く示さない。
【００４４】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）は、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）において、第２７６位のアデニンがグアニンに、第６７５位のチミンがシトシンに、第８５７位のアデニンがグアニンに、第１５９３位のアデニンがグアニンに、第１６５０位のアデニンがグアニンに、第１６９８位のシトシンがチミンに、第１９３８位のチミンがグアニンに置換されている塩基配列を有することを特徴とする。
【００４５】
上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）において、配列番号１に示す塩基配列は、微生物株分与機関Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｊａｐａｎ（ＮＢＲＣ）から分譲されたマリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株が生産するＬ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００４６】
本発明において遺伝子が「（特定の）塩基配列を有する」とは、その遺伝子の塩基配列が特定された塩基配列を含んでいればよく、且つ、その遺伝子を大腸菌ＢＬ２１株など一般的な大腸菌に導入した場合でも良好に発現できることを意味する。その遺伝子において特定された塩基配列以外の配列としては、例えば、後述するように、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子や、また、両遺伝子の発現ペプチドを結合するペプチドリンカー基をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００４７】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（２’）は、上記（１’）に規定される塩基配列において、上記第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位を除く領域中で１以上の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列を有し、且つ、少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なものであることを特徴とする。
【００４８】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（２’）において、「第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位を除く領域」とは、Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）の塩基配列中、第１〜２７５番目、第２７７〜６７４番目、第６７６〜８５６番目、第８５８〜１５９２番目、１５９４〜１６４９番目、１６５１〜１６９７番目、１６９９〜１９３７番目、および第１９３９番目以降の領域をいう。
【００４９】
また、「１以上の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列」における「１以上」の範囲は、欠失等を有するＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子が、一般的な大腸菌において発現可能であり、且つその発現酵素がＬ−リジンに対する高い基質特異性を有するものであれば特に限定されるものではない。「１以上」の範囲は、変異型酵素遺伝子（２’）の異種発現性が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、１個程度であることができる。
【００５０】
本発明において「少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なもの」とは、対象となる遺伝子を大腸菌ＢＬ２１株に導入して形質転換した場合、当該遺伝子が発現して本発明に係るＬ−リジンε−酸化酵素が得られることをいう。その生成量は特に制限されないが、分析機器で痕跡量認められる程度では十分でなく、少なくとも単離精製できる程度が好ましい。
【００５１】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（３’）は、上記（１’）に規定される塩基配列に対して６５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つ、少なくとも大腸菌ＢＬ２１株に導入した場合に発現可能なものであることを特徴とする（但し、上記（１’）に規定される塩基配列における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の置換は、（３’）においてさらに変異しないものとする）。
【００５２】
本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（３’）において、「上記（１’）に規定される塩基配列に対して６５％以上の配列同一性を有する塩基配列」における「配列同一性」は、対象となる遺伝子を大腸菌ＢＬ２１株に導入して形質転換した場合、発現して本発明に係るＬ−リジンε−酸化酵素が得られれば特に限定されない。前記塩基配列の配列同一性は７１％以上であれば特に限定されないが、好ましくは６８％以上、７０％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、より一層好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。本発明において「配列同一性」という語は、２以上の塩基配列の互いに対する塩基の同一性の程度を指す。従って、ある二つの塩基配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類の塩基配列が同一性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
【００５３】
本発明において、「但し、上記（１’）に規定される塩基配列における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の置換は、（３’）においてさらに変異しないものとする」における「変異」とは、具体的には塩基の欠失、置換および／または付加を意味する。つまり、上記Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（３’）の塩基配列において、配列同一性の判断の基準となる変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）の塩基配列における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の塩基に対応する塩基が、当該変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）の塩基における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の塩基と同一であることを意味する。
【００５４】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）は、大腸菌ＢＬ２１株など一般的な大腸菌に導入して形質転換した場合に良好に発現して、本発明に係るＬ−リジンε−酸化酵素が産生される。その生成量は特に制限されないが、分析機器で痕跡量認められる程度では十分でなく、単離精製できる程度が好ましい。少なくとも、一般的な大腸菌において、配列番号１の塩基配列を有する野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子よりも発現量は多く、変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素が得られる。
【００５５】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子は、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子と直接またはリンカー遺伝子を介して結合しているものが好ましい。具体的には、かかるＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子−抗生物質耐性遺伝子結合体は、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の塩基配列において終止コドンＴＡＧが欠失しており、当該位置にブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子が、直接、またはリンカー遺伝子を介して結合していることを特徴とする。
【００５６】
一般的な大腸菌による発現系では、コドンの使用頻度の問題から導入遺伝子が発現しなかったり、所望のペプチドが得られなかったり、大腸菌が生育しなくなったり、導入プラスミドベクターが不安定化するといった問題があり、本発明者らの実験的知見によれば、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子や、ランダム変異導入ライブラリーの変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子のほとんども、一般的な大腸菌では発現しなかった。しかし、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）は一般的な大腸菌においても発現できる。また、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子も、一般的な大腸菌による発現系において発現できるのみならず、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）に結合しても、その発現を阻害しなかった。さらに、所望の遺伝子と抗生物質耐性遺伝子を別々に大腸菌に導入すると、上記のコドン使用頻度の問題などから所望の遺伝子が発現せず抗生物質耐性遺伝子のみが発現し、所望の遺伝子が発現していない細胞が抗生物質含有培地において生育するという事態が起こり得る。しかし、上記のように終止コドンを除去して両遺伝子を直接またはリンカー遺伝子を介して結合すれば、ブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子の発現ペプチドが直接またはペプチドリンカーを介して結合した変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）〜（３）が生成し、本発明遺伝子が発現した大腸菌細胞のみがブレオマイシン系抗生物質耐性を示すことになり、当該大腸菌を選別することが可能になる。
【００５７】
ブレオマイシン系抗生物質は、ＤＮＡ切断グリコペプチドであり、例えば、ブレオマイシン、フレオマイシン、タリソマイシンおよびペプロマイシンを挙げることができる。フレオマイシンをコードする遺伝子としては、配列番号３の塩基配列を有するものを挙げることができる。
【００５８】
変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素（１）〜（３）とブレオマイシン系抗生物質耐性遺伝子の発現ペプチドとの間のペプチドリンカーのアミノ酸残基数は特に制限されないが、好ましくは３０残基以下であり、より好ましくは２０残基以下であり、さらにより好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下である。ペプチドリンカーをコードする遺伝子の塩基配列は、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列から容易にデザインできる。
【００５９】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、上記（１）から（３）に規定される範囲に属するものである限りその由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬ−リジンε−酸化酵素の遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）に変異原を与えることにより本発明の変異型酵素を産生し得る変異体を獲得して、当該変異体が産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。
【００６０】
但し、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、遺伝子工学技術により効率的に製造することが好ましい。具体的には、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）を調製し、各種ベクターに組み込むことにより、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を発現させることができる。
【００６１】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）を作製するに当たり、配列番号１に示される塩基配列における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の遺伝子を上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）のとおり置換するため、或いは変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（２’）の塩基配列において塩基の欠失、置換および／または付加を施すため、或いは変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（３’）の塩基配列において配列番号１の遺伝子配列と所定の同一性を有する核酸を準備するために、例えばエラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換および／または挿入を行った後、一般的な大腸菌における異種発現性を確認するなどして選別すればよい。このようにして作製した本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を適当な発現系に導入することにより、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を製造することができる。
【００６２】
本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を製造するために利用可能な発現系としては、特に限定されるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、例えば、細菌や真菌類（例えば、酵母類）などの微生物などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。本発明では、宿主細胞として、特に一般的な大腸菌を用いることができる。ここで、「一般的な大腸菌」とは、形質転換に用いられる一般的な大腸菌であり、ＢＬ２１株やその派生株など、プロテアーゼ欠損株やコンピテントセルを含むが、使用頻度の高いコドンに対応するｔＲＮＡを高発現させたものなど、特殊な処理をされたものは含まないものとする。
【００６３】
特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を発現させる場合には、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）をベクターに組み込む工程、当該ベクターによって宿主細胞を形質転換する工程、形質転換させた宿主細胞を培養する工程、培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集する工程を含む製造方法により調製することができる。
【００６４】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）、当該遺伝子を含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体は、本発明の一態様である。これら遺伝子、ベクターおよび形質転換体は、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素のアミノ酸配列が決定されれば、当業者であれば常法に従って調製可能である。
【００６５】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）の取得方法は特に限定されない。例えば、後記の実施例に記載の通り、マリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株から単離した野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（配列番号１）をコードする核酸を材料として本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を取得してもよいし、或いは本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素ないし配列番号２に記載のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を各種細菌から単離し、当該遺伝子をコードする核酸を調製して、上記第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の塩基に対応する塩基の置換を行って、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）を製造してもよい。また、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）は、配列番号１に記載の塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号１に記載の塩基配列と一定の同一性を有する公知の塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と一定の同一性を有する公知のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００６６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、菌分譲機関から分譲されたマリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株由来の野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素のアミノ酸配列であるが、当該Ｌ−リジンε−酸化酵素には一定の相同性を示す遺伝子が多数知られている。例えば、かかる細菌由来の相同遺伝子に対応する酵素として、表１に示すものが知られている。
【００６７】
【表１】
2015073443.tif 000003
【００６８】
野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の塩基配列と、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）の塩基配列についてアライメント解析を行った結果を図２に示す。図２において、白抜きで示される位置のアミノ酸が上記本発明遺伝子（１’）における第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位の位置である。
【００６９】
本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（１’）〜（３’）は、具体的には、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて変異を導入した後、一般的な大腸菌での異種発現性を確認することにより特定できる。また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから、本発明遺伝子を製造する上で、部位特異的な変異を導入するために有用である。
【００７０】
例えば、配列番号１に記載した塩基配列または配列番号２に示すアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてマリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株を含む細菌のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素をコードする遺伝子を製造するための材料となる核酸を準備することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。
【００７１】
また、ＰＣＲ法により本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を製造するための材料を取得することもできる。例えば、マリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株を含む細菌のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１の塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。増幅されたＤＮＡ断片は、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を製造するための材料として用いることができる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることにより得られたベクターも本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を製造するための材料として用いることができる。
【００７２】
上述の通り準備した本発明遺伝子製造用材料において、上記第２７６位、第６７５位、第８５７位、第１５９３位、第１６５０位、第１６９８位および第１９３８位に対応する位置に各種変異導入法を用いて塩基の置換を施し、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子、または当該核酸を含むベクターを製造することができる。なお、上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知である。また、特別に塩基配列をデザインしたプライマーを用いたＰＣＲ法により、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の変異を導入することも可能である。
【００７３】
本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子は、適当なベクター中に挿入した状態で使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて、上記遺伝子には、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
例えば、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
【００７５】
また、上記ベクターにおいて、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子は、必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を含むベクターは、さらに、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。本発明に係る組換えベクターは、さらに、当該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００７６】
本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を含むベクターは、さらに選択マーカーを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンもしくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００７７】
さらに、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を適当な宿主に導入することによって、本発明の形質転換体を作製することができる。本発明のベクターを導入される宿主細胞は、細胞内で本発明のベクターが複製されるものであれば任意の細胞でもよい。さらに、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を発現する形質転換体を作製する場合には、ベクターの複製に加えて、言うまでもなく本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の発現が可能となる任意の細胞である。このような宿主細胞の例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられ、使用頻度の低いコドンに対応するｔＲＮＡを高発現させた特殊な大腸菌など特殊な処理をされた大腸菌を除く一般的な大腸菌が好ましい。
【００７８】
例えば、細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌や大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法やその他の公知方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００７９】
上記の形質転換体は、本発明のベクターの複製を可能にする条件下、或いは本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子の発現と本発明酵素の生成を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を生成させた場合、形質転換体の培養物（形質転換体および培養培地を含む）から、本発明の変異型酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離精製法を用いればよい。例えば、本発明の変異型酵素が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。当該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等の樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ法、Ｓ−セファロース  ＦＦ（ファルマシア社製）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィ法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィ法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティクロマトグラフィ法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を精製標品として得ることができる。
【００８０】
以下、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を用いたＬ−リジンの測定方法を説明する。
【００８１】
本発明に係るＬ−リジンの測定方法は：
（Ａ）水と酸素の存在下、上記の本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素と検体とを混合する工程；および
（Ｂ）上記変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素によるＬ−リジンの脱アミノ化反応により生成する２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒド、アンモニアまたは過酸化水素を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００８２】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高いため、血液試料など夾雑物を多く含む検体においても、Ｌ−リジンを正確に測定することが可能になる。
【００８３】
上記本発明方法には、検体中におけるＬ−リジンの有無を判断するための検出方法と、検体中におけるＬ−リジンの濃度や量を測定する定量方法などが含まれるものとする。以下、本発明方法を実施の順番に従って説明する。
【００８４】
酵素反応工程（工程Ａ）
本工程では、水と酸素の存在下、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素と検体とを混合する。前記反応式に示すように、本発明に係る酵素反応においては、酸素を電子受容体としＬ−リジンのε位の脱アミノ化が進行し、（Ｓ）−２−アミノアジピン酸−６−ヘミアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素が生成する。従って本発明における測定方法では、溶媒である水の存在下、試料溶液に含まれるＬ−リジンの他、Ｌ−リジンε−酸化酵素と酸素が含まれていれば上記反応は進行する。
【００８５】
本発明方法で用いる水は、超純水、純水、精製水、蒸留水、イオン交換水など、上記酵素反応を阻害しないものであれば特に制限されない。また、検体が水を含むものであれば、その水を利用することができる。水の使用量は、検体の形態や検体中のＬ−リジン濃度などにより適宜調整することができ、また、予備実験により決定してもよい。
【００８６】
酸素は、反応液に含まれる溶存酸素で十分であるが、必要に応じて、空気など酸素を含む混合気体や酸素自体を反応液中に吹き込んでもよい。
【００８７】
本発明方法での測定対象となる検体は、Ｌ−リジンを含む可能性のある試料であり、Ｌ−リジンの有無を判断すべきものや、Ｌ−リジンの濃度や量を測定すべきものであれば特に制限されない。例えば、血液、血清、血漿、臓器の一部のホモジェネート、尿などの生体試料を挙げることができる。さらに、例えば、生体試料に本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を作用させて生じる、いかなる生成物を定量することで検体中のＬ−リジンの濃度を測定するのか等により、検体は適宜選択することができる。例えば、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清や血漿などが例として挙げられる。
【００８８】
生体試料などのように検体が様々な成分を含むものであり、その中に正確な測定を損なうものが含まれる場合には、検体からその様な成分を除去するよう前処理することもできる。
【００８９】
本発明により測定可能なＬ−リジン濃度は、使用するＬ−リジンε−酸化酵素や、後述する工程（Ｂ）で用いる測定方法などに依存する。例えば、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼとのカップリングにより呈色させ、エンドポイント法でＬ−リジンを測定する場合、試料中のＬ−リジン濃度としては、例えば、０ｍＭ以上、１ｍＭ以下が適当である。この範囲より高濃度の検体につき測定する場合には、適量の水を加えて反応溶液中のＬ−リジン濃度をこの範囲に調整することが好ましい。
【００９０】
本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は、Ｌ−リジン以外の天然アミノ酸に対しては、ほとんど又は全く活性を示さない。かかる特性により、Ｌ−リジンの測定に適している。また、マリノモナス・メディテラネアＮＢＲＣ１０３０２８T株由来の野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素のＬ−リジンに対するＫｍ値は０．００２ｍＭであり、Ｌ−リジン量が比較的少ない（０〜１ｍＭ程度）生体試料などを対象としても使用可能である。このような観点から、反応液における本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の混合量は、１０ｍＵ／ｍＬ以上、１００ｍＵ／ｍＬ以下程度の範囲に調整することが適当である。
【００９１】
さらに、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素などに加えて、好ましくは、反応液のｐＨを当該酵素の至適ｐＨを考慮したｐＨに調整することができる緩衝液を添加することができる。
【００９２】
反応液のｐＨは、Ｌ−リジンε−酸化酵素に加えて、ペルオキシダーゼとのカップリング反応による比色定量に酵素を用いる場合には、使用する酵素とその他の試薬の安定性、可溶性が許す範囲においていずれのｐＨでも可能であるが、好ましくはその酵素の至適ｐＨ付近で反応を行うことが望ましい。特に本発明の変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素を用いる場合は、例えば反応液のｐＨを６．０以上、８．０以下に調整することが好ましい。
【００９３】
本工程の反応条件は、使用する酵素などに応じて適宜調製すればよいが、例えば、４℃以上、８０℃以下程度で１分間以上、１０時間以下程度反応させればよい。
【００９４】
測定工程（工程Ｂ）
本工程（Ｂ）では、上記反応後の反応液中に存在する本発明のＬ−リジンε−酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種を測定する。かかる反応生成物としては、上記反応式のとおり、Ｌ−リジンの脱アミノ化生成物である（Ｓ）−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、アンモニア、過酸化水素を挙げることができる。
【００９５】
本発明においては、測定にはエンドポイント法を用いることができるが、この他に反応の初速度を用いる初速度法を用いることもできる。
【００９６】
本発明のＬ−リジンε−酸化酵素によって触媒される反応で生じる（Ｓ）−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素過酸化水素の産生量は、反応によって消費されたＬ−リジンと化学量論的に等モルであることから、Ｌ−リジンの測定に適している。
【００９７】
生成した過酸化水素は、例えば、ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法等の公知の方法で定量することができる。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは、過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、発色法を採用した場合の発色剤としては、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであればよく、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを用いる場合には、４−アミノアンチピリン：フェノールなどが挙げられる。西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる過酸化水素の定量のための反応は以下に示す通りである。
【００９８】
Ｈ2Ｏ2  ＋  ４−アミノアンチピリン  ＋  フェノール  →  赤色発色化合物（４−アミノアンチピリンとフェノールの重合物）  ＋  Ｈ2Ｏ
上記生成物である過酸化水素は、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサを用いて測定することもできる。過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼをＢＳＡ（牛血清アルブミン）とともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。
【００９９】
定量に用いられる生成物がアンモニアである場合、アンモニアはアンモニア検出薬を用いて測定することができる。例えば、遊離するアンモニウムイオンをインドフェノール（インドフェノール青法等）やｏ−フタル酸アルデヒド等の検出試薬を用いて定量する方法が挙げられる。また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる酵素法も利用できる。インドフェノール青法の原理は、アンモニア窒素が次亜塩素酸塩と反応しモノクロラミンを生成し、さらにモノクロラミンとフェノールとが反応して生ずるインドフェノール青の吸光度を測定することでアンモニア窒素を定量するものである。ｏ−フタル酸アルデヒドを用いる方法は、アンモニアとｏ−フタル酸アルデヒドから生じる蛍光物質を測定する方法である。また、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性により２−オキソグルタル酸とアンモニアからグルタミン酸が生じるのに伴いＮＡＤＨがＮＡＤ+に変換されることを利用して行う方法である。
【０１００】
また、Ｌ−リジンの脱アミノ化生成物（（Ｓ）−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒド）は、例えばＨＰＬＣなどにより測定することができる。或いは、（Ｓ）−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒドを例えばアルコールデヒドロゲナーゼやアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いて酸化し、ＮＡＤ（Ｐ）+の消費量やＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加量を測定する方法が挙げられる。
【０１０１】
生じた生成物を定量する反応は、一般的に酵素反応が可能な４〜８０℃の範囲で、その酵素の至適温度を考慮して適宜決定される。例えば、生成した過酸化水素を西洋わさび由来ペルオキシダーゼで測定する場合、好ましくは、常温付近、例えば５℃〜４０℃で実施することが望ましい。また、反応液のｐＨは、使用する酵素およびその他の試薬の安定性、可溶性が許す範囲においていずれのｐＨでも可能であるが、好ましくはその酵素の至適ｐＨ付近で行うことが望ましい。特に西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合は、中性付近（ｐＨ６〜８）が望ましい。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【０１０３】
実施例１：本発明酵素の調製
（１）  フレオマイシン耐性遺伝子（ｚｅｏＲ）の増幅
フレオマイシン耐性遺伝子（配列番号３）を増幅するためのＰＣＲ反応液として、滅菌水（ＭｉｌｌｉＱ）３４μＬ、プライマー１（配列番号５，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマー２（配列番号７，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，製品名「ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−」，１Ｕ／μＬ水溶液）１μＬ、１０×ＰＣＲバッファー、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ水溶液５μＬ、２５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液２μＬ、およびクローニングベクターとしてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１μＬを混合した。プライマー１とプライマー２には、それぞれ制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩのための切断部位を設けた。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９４℃で２分間、（ｉｉ）９４℃で１５秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６８℃で２分間とし、（ｉ）と（ｉｉ）を３０サイクル繰返した。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて抽出した。
【０１０４】
（２）  フレオマイシン耐性遺伝子のベクターへの組換え
上記ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物５μＬに、制限酵素（ＳａｃＩ  ０．５μＬとＥｃｏＲＩ  ０．５μＬ）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。制限酵素処理した当該遺伝子５μＬと、同様に制限処理したプラスミドベクターｐＵＣ１９  １μＬ、およびライゲーションキット（ニッポン・ジーン社製，製品名「２×ライゲーションＭｉｘ」）６μＬを混合し、１６℃で３０分間インキュベートすることにより、プラスミドベクターｐＵＣ１９にフレオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセル５０μＬに上記ライゲーション反応液５μＬを加え、ヒートショック法で形質転換を行った。ヒートショック法の手順は以下の通りである。大腸菌コンピテントセル５０μＬに対し、プラスミド５μＬを混合し、６０分間氷上静置した。その後、４２℃で９０秒間のヒートショックを行った後、ＬＢ液体培地を１ｍＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（１．０％ポリペプトン，０．５％イースト抽出物、および１．０％塩化ナトリウム）に生育したコロニーから数株選抜してプラスミドを抽出し、０．７％アガロース電気泳動により、ゼオシン耐性遺伝子のインサートの有無を確認した。フレオマイシン耐性遺伝子を挿入したｐＵＣ１９プラスミドベクターを、以下「ｐＵＣ１９ｚｅｏＲ」と示す。
【０１０５】
（３）  Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）を含む染色体ＤＮＡの取得
Ｌ−リジンε−酸化酵素の産生能を有する海洋性細菌であるマリノモナス・メディテラネア（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）ＮＢＲＣ１０３０２８T株を、従属栄養培地（Ｄｉｆｃｏ社製，製品名「Ｍａｒｉｎｅ  ｂｒｏｔｈ  ２２１６」）５ｍＬに植菌し、２５℃、１７０ｒｐｍで４８時間培養した。培養後、５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、菌体を得た。ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて、目的とする染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を得た。
【０１０６】
（４）  ＰＣＲによるＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）の増幅
Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）を増幅するためのＰＣＲ反応液として、滅菌水（ＭｉｌｌｉＱ）２８．５μＬ、上記（３）で得た染色体ＤＮＡ  １μＬ、プライマー３（配列番号８，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマー４（配列番号８，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、ポリメラーゼ（タカラバイオ社製，製品名「ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ」，５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．５μＬ、１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ2+ｆｒｅｅ）５μＬ、２５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液５μＬ、およびｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ８μＬを混合した。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５５℃で５秒間、（ｉｖ）６８℃で３分間とし、（ｉ）と（ｉｉ）を３０サイクル繰返した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて抽出した。
【０１０７】
（５）  Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）のベクターへの組換え
制限酵素ＸｂａＩで処理した上記（２）のｐＵＣ１９ｚｅｏＲ  １μＬ、上記（４）で得たＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子のＰＣＲ産物３μＬ、およびクローニングキット（タカラバイオ社製，製品名「５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｅｍｉｘ」）１μＬを混合して５０℃で１５分間反応させることにより、ゼオシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミドベクターｐＵＣ１９ｚｅｏＲにＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）を導入した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセル５０μＬに、５μＬの上記反応液を加え、ヒートショック法で形質転換を行った。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に生育したコロニーから数株選抜してプラスミドを抽出し、０．７％アガロース電気泳動により、Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）の導入の有無を確認した。なお、本組換え大腸菌が産生するＬ−リジンε−酸化酵素は、Ｃ末端側にフレオマイシン耐性遺伝子発現ペプチドが付加した融合タンパク質として生成されるように発現用プラスミドベクターを構築した。ここで得られたｌｏｄＡ導入プラスミドベクターを、以下「ｐＵＣ１９ｚｅｏＲ−ｌｏｄＡ」と示す。
【０１０８】
（６）  Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）へのランダム変異導入
上記（５）で得られたｐＵＣ１９ｚｅｏＲ−ｌｏｄＡの水溶液１０μＬを、ヒートショック法により、ランダム突然変異導入用大腸菌ＸＬ−１  Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入して形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で４８時間培養し、生育したコロニーを１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にコンラージ棒を用いて懸濁し、菌体を回収した。プラスミドベクターを抽出し、変異型酵素ライブラリーとした。
【０１０９】
（７）  ｌｏｄＡ発現補助タンパク質遺伝子（ｌｏｄＢ）の増幅
Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）の発現を促進するためのｌｏｄＡ発現補助タンパク質遺伝子（ｌｏｄＢ）を増幅するためのＰＣＲ反応液として、滅菌水（ＭｉｌｌｉＱ）２８．５μＬ、上記（３）で得た染色体ＤＮＡ  １μＬ、プライマー５（配列番号１０，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマー６（配列番号１１，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、ポリメラーゼ（タカラバイオ社製，製品名「ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ」，５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．５μＬ、１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ2+ｆｒｅｅ）５μＬ、２５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液５μＬ、およびｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ８μＬを混合した。プライマー５とプライマー６には、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩのための切断部位を設けた。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５５℃で５秒間、（ｉｖ）６８℃で２分間とし、（ｉ）と（ｉｉ）を３０サイクル繰返した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて抽出した。
【０１１０】
（８）  ｌｏｄＡ発現補助タンパク質遺伝子（ｌｏｄＢ）のベクターへの組換え
上記（７）のＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物５μＬに、制限酵素ＮｃｏＩ  ０．５μＬとＰｓｔＩ  ０．５μＬを加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。制限酵素処理した当該遺伝子  ５μＬと、同様に制限処理したプラスミドベクターｐＣＤＦ  １μＬ、およびライゲーションキット（ニッポン・ジーン社製，製品名「２×ライゲーションＭｉｘ」）６μＬを混合し、１６℃で３０分間インキュベートすることにより、プラスミドベクターにＬ−リジンε−酸化酵素発現補助タンパク質遺伝子（ｌｏｄＢ）を組み込んだ。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセル５０μＬに、上記ライゲーション反応液５μＬを加え、ヒートショック法で形質転換を行った。ヒートショック法の手順は以下の通りである。大腸菌コンピテントセル５０μＬに対し、プラスミド５μＬを混合し、６０分間氷上静置した。その後、４２℃で９０秒間のヒートショックを行った後、ＬＢ液体培地を１ｍＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＬＢ培地に生育したコロニーから数株選抜してプラスミドを抽出し、０．７％アガロース電気泳動により、Ｌ−リジンε−酸化酵素発現補助タンパク質遺伝子（ｌｏｄＢ）のインサートの有無を確認した。ｌｏｄＡ発現補助タンパク質遺伝子（ｌｏｄＢ）を挿入したプラスミドベクターｐＣＤＦを、以下「ｐｐＣＤＦ−ｌｏｄＢ」と示す。
【０１１１】
（９）  変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素ライブラリーからの活性型酵素発現プラスミドベクターの選別
上記（８）で得られたプラスミドベクターｐＣＤＦ−ｌｏｄＢを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に上記（８）と同様の条件のヒートショック法により導入し、形質転換した。１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＬＢ培地に生育したコロニーを用いて、大腸菌ｌｏｄＢ発現株のコンピテントセルを作成した。上記（６）で得られた変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素ライブラリーを上記大腸菌ｌｏｄＢ発現株に同様のヒートショック法により導入し、形質転換した（図３を参照）。２５μｇ／ｍＬのフレオマイシンと０．５μｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地に生育したコロニーを、２５μｇ／ｍＬのフレオマイシンと０．５μｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地に植菌し、２５℃で２４時間培養した。
【０１１２】
Ｌ−リジンε−酸化酵素の変異型遺伝子（ｌｏｄＡ）が発現することで、フレオマイシン耐性遺伝子も変異型Ｌ−リジンε酸化酵素に融合した形で共発現し、そのプラスミドベクターを有する株がフレオマイシン耐性能を示すようになる。変異型Ｌ−リジンε酸化酵素遺伝子が発現しない、もしくは、当該遺伝子の発現タンパク質が不溶性である場合には、フレオマイシン耐性能は示さない。目的タンパク質が発現することで、Ｃ末端側のフレオマイシン耐性遺伝子が発現し、フレオマイシン耐性能を有する。このことから、フレオマイシンを含む培地で選別することで、変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素の取得に成功した。
【０１１３】
得られたコロニーをランダムに選び、ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列を解読した結果、多くのコロニーのＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子の塩基配列において、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素の遺伝子の塩基配列（配列番号１）に対して、第２７６位のアデニンがグアニンに、第６７５位のチミンがシトシンに、第８５７位のアデニンがグアニンに、第１５９３位のアデニンがグアニンに、第１６５０位のアデニンがグアニンに、第１６９８位のシトシンがチミンに、第１９３８位のチミンがグアニンに置換されていた。配列番号１の塩基配列の第８５７位の変異により、野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号２）に対して第２８６位のみヒスチジンがアルギニンに置換されていたが、その他６点の変異に関しては、サイレント変異によるものであった（図２）。
【０１１４】
試験例１：酵素活性測定
上記実施例１で得られた変異型Ｌ−リジンε酸化酵素の酵素活性を調べるために、Ｌ−リジンε−酸化酵素活性を測定した。具体的には、マイクロプレートに、氷上、表２の組成を有するＬ−リジンε−酸化酵素測定用発色液１００μＬ、１００ｍＭ  Ｌ−リジン水溶液水溶液１００μＬ、および１Ｕ酵素水溶液５０μＬを加え、３０℃で反応させた。また、対照（ブランク）として、Ｌ−リジン水溶液の代わりに同量の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液を添加して同様に反応させた。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
反応開始から、０、０．５、１、１．５、２、３、４、５時間後に試料を取得し、マイクロプレートリーダーで５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１７】
得られた吸光度変化により、下記計算式に基づきＬ−リジンε−酸化酵素活性を算出した。なお、上記条件において、１分間に１マイクロモルの基質を与える酵素量を１Ｕとした。
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤtest−ΔＯＤblank）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍＬ）｝
３．１（ｍＬ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍＬ）：酵素サンプル液量
【０１１８】
野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を導入した本大腸菌発現系から得られた粗酵素液の酵素活性を測定したが、活性は見られなかった。野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素自体は酸化酵素活性を有するはずであるので、ｚｅｏＲの発現によりフレオマイシン耐性は表われたが、コドンの使用頻度などの問題で野生型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子は発現できなかったと考えられる。ｐＥＴ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＥＴＤｕｅｔ発現ベクターでも同様の実験を行ったが、活性が見られなかった。それに対して、本発明に係る変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素遺伝子を大腸菌に導入した場合には、粗酵素液の酵素活性が見られ、０．７５１Ｕ／ｍｇの比活性が認められた。
【０１１９】
試験例２：ｌｏｄＢとの共発現によるＬ−リジンε−酸化酵素活性への影響
ｌｏｄＢとの共発現による酵素活性への影響を調べるために、ｂｌａｎｋ（ｐＵＣ１９ｚｅｏＲとｐＣＤＦ）、ｌｏｄＡのみ（ｐＵＣ１９ｚｅｏＲ−ｌｏｄＡ）、ｌｏｄＢのみ（ｐＣＤＦ−ｌｏｄＢ）およびｌｏｄＡとｌｏｄＢの共発現（ｐＵＣ１９ｚｅｏＲ−ｌｏｄＡとｐＣＤＦ−ｌｏｄＢ）の各々のプラスミドベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、酵素活性を測定した。結果を図４に示す。
【０１２０】
図４に示される通り、ｌｏｄＡとｌｏｄＢの共発現の時においてのみ変異型Ｌ−リジンε−酸化酵素は酵素活性を示したことから、ｌｏｄＢが本発明酵素の発現に重要であることが明らかとなった。
【０１２１】
実施例２：本発明酵素の調製
（１）  大腸菌発現株からのＬ−リジンε−酸化酵素遺伝子（ｌｏｄＡ）の精製
（ｉ）  Ｌ−リジンε−酸化酵素発現大腸菌の培養
上記で得られた本発明に係る変異型酵素の詳細な特性を明らかにするために、酵素を精製した。上記実施例１（９）で得られた発現株［大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＵＣ１９ｚｅｏＲ−ｌｏｄＡ，ｐＣＤＦ−ｌｏｄＢ］を、２５μｇ／ｍＬのフレオマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．５ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地２Ｌ（５００ｍＬ×２Ｌ容バッフル付きフラスコ４個）に植菌後、２５℃で３６時間培養した。
【０１２２】
（ｉｉ）  無細胞抽出液の調製
上記培養液を６，０００×ｇで５分間遠心分離後、上清を取り除き、残渣に対し５倍量の１．０Ｍリン酸カリウム緩衝液を加えて懸濁後、超音波ホモジナイザーにて細胞を破砕した。この破砕液を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。
【０１２３】
（ｉｉｉ）  硫安分画
上記で得られた無細胞抽出液に終濃度１５％になるように硫酸アンモニウムを添加し、氷上で３０分間撹拌した後に、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清に終濃度が３０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、氷上で３０分間撹拌した後に、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離、沈殿物に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁後、同緩衝液で一晩透析を行った。
【０１２４】
（ｉｖ）  陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
２０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）により平衡化した陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア社製，「Ｑセファロース樹脂」）１００ｍＬをカラムに充填し、上記（ｉｉｉ）で得た酵素液を吸着させた。５００ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液でカラムを洗浄した後、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍＬおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍＬを用いて、グラジエントにより溶離液のＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて１０ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。
【０１２５】
（ｖ）  疎水クロマトグラフィ
活性が得られたフラクションに、終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、これを酵素液とした。２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化した疎水吸着樹脂（ＧＥヘルスケア社製，「Ｏｃｔｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂」）１００ｍＬをカラムに充填し、活性フラクションを吸着させた。２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍＬでカラムを洗浄した後、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液２５０ｍＬおよび２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液２５０ｍｌを用いて、グラジエントにより硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。活性が確認された非吸着画分を５Ｌの同緩衝液（×２回）で、一晩透析を行った。
【０１２６】
（ｖｉ）  ゲル濾過クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）
０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００」）を用い、中圧高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）で酵素を精製した。サンプルループに、限外濾過チューブ（ミリポア社製，「セントリコン」）により濃縮した酵素液２００μＬを注入し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液を用いて、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍＬ）から活性が認められたフラクションを集め、一晩透析した。透析した後、限外濾過チューブ（ミリポア社製，「セントリコン」）を用いて酵素液を２００μＬまで濃縮した。以上の精製状況を、表３にまとめる。
【０１２７】
【表３】
2015073443.tif 000005
【０１２８】
（２）  Ｌ−リジンε−酸化酵素の分子量測定
３６％アクリルアミド５．２５ｍＬ、０．６８Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）８．２５ｍＬ、１％ＳＤＳ  １．５８ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ  １８７μＬ、２％ＡＰＳ  ５６２．５μＬの組成を有するゲルに、３６％ポリアクリルアミド０．５ｍＬ、０．１７９Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）３．５ｍＬ、１％ＳＤＳ  ０．５ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ  １２５μＬ、２％ＡＰＳ  ３７５μＬの組成を有する濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ，１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４０μＬ，水３６０μＬ，２−メルカプトエタノール２００μＬ，１０％ＳＤＳ  ２００μＬ）と等量混合した精製酵素サンプル１０μＬを、ランニング緩衝液（トリス３．０ｇ，グリシン１４．１ｇ，ＳＤＳ  １０ｇ）中、３０ｍＡで電気泳動を行った。その後、ゲルをタンパク染色液（ＣＢＢ２．５ｇ，メタノール５００ｍＬ，酢酸５０ｍＬ，水４５０ｍＬ）で１時間染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。
【０１２９】
分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）としては、以下のものを用いた。
β−ガラクトシダーゼ  （１１６，２５０）
ホスフォリラーゼ  （９７，４００）
血清アルブミン  （６６，２００）
オボアルブミン  （４５，０００）
カルボニックアンヒドラーゼ  （３１，０００）
トリプシンインヒビター  （２１，５００）
リゾチーム  （１４，４００）
図５に、得られた電気泳動ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示す。
【０１３０】
試験例３：各アミノ酸に対する酵素活性
本発明に係る変異型酵素の基質特異性を調べるために、Ｌ−リジンの代わりに表４のアミノ酸を用いた以外は上記試験例１と同様にして、酵素活性を測定した。また、Ｌ−リジンについても再度実験を行った。
【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
結果としては、本発明に係るＬ−リジンε−酸化酵素は、Ｌ−リジンを基質として酸化する一方で、他のほとんどのアミノ酸を基質とせず、酵素活性を全く示さなかった。上記アミノ酸の中では、唯一、Ｌ−オルニチンをわずかに基質とするのみであった。Ｌ−リジンに対する酵素活性を１００とした場合のＬ−オルニチンに対する相対活性を表５に示す。
【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
以上の結果のとおり、本発明に係るＬ−リジンε−酸化酵素は、Ｌ−リジンに対して極めて高い特異性を示すことから、Ｌ−リジンの定量に非常に有用であることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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