(57)【要約】      （修正有）【課題】アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエをそれぞれ種レベルで迅速かつ正確に検出する方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる２種類のオリゴヌクレオチド。特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる２種類のオリゴヌクレオチド。少なくとも１種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、及び下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Aspergillus westerdijkiae）それぞれを種レベルで検出する、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウスを種レベルで検出する、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで検出する、請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
検出を行うために、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエからなる群より選ばれる少なくとも１種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出する、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
β−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅する、請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
前記アスペルギルス・オクラセウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）である、請求項１〜５のいずれか１項記載の検出方法。
（ｅ）配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列。
【請求項７】
前記アスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）である、請求項１〜５のいずれか１項記載の検出方法。
（ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列。
【請求項８】
下記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、下記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、又は下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Aspergillus westerdijkiae）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Aspergillus westerdijkiae）の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、請求項８記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）がそれぞれ、下記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）で表される核酸にハイブリダイズすることができ、アスペルギルス・オクラセウスを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、請求項８又は９記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
（ｅ）配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）で表される核酸の一部を増幅でき、アスペルギルス・オクラセウスを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）がそれぞれ、下記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）で表される核酸にハイブリダイズすることができ、アスペルギルス・ウェスタジキアエを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、請求項８又は９記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
（ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）で表される核酸の一部を増幅でき、アスペルギルス・ウェスタジキアエを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むアスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Aspergillus westerdijkiae）検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス・オクラセウス（Aspergillus ochraceus）及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Aspergillus westerdijkiae）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カビの二次代謝産物で動物やヒトに毒性を示すものを真菌毒と呼ぶ。また、カビが食品や飼料上で繁殖して毒素を生産し、その食品や飼料を摂取することにより毒素が生体に入り障害を引き起こしたり、その可能性を持つ場合、その毒素をマイコトキシンと呼ぶ。
オクラトキシンＡはマイコトキシンの１種である。オクラトキシンＡが動物やヒトの生体内に入ると、肝臓及び腎臓に強い毒性を示すことが知られている。したがって、農産物におけるオクラトキシンＡによる汚染実態の解明は、食品衛生上重要な課題の１つである。
【０００３】
オクラトキシンＡを産生し、飲食品事故の原因菌として報告されている菌類として、アスペルギルス（Aspergillus）属に属する多くの菌種が挙げられる。例えば、生コーヒー豆からは３０〜５０％の割合で菌類が検出される。そして、検出される菌類には、オクラトキシンＡを産生する菌種が含まれることが知られている。このうち、生コーヒー豆から検出され、オクラトキシンＡによる飲食品事故の原因菌として報告されているアスペルギルス属に属する菌種として、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエが知られている。
したがって、食品衛生上の観点から、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの迅速かつ正確な検出が極めて重要である。
【０００４】
アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法、及び他の種との識別方法は、培養を用いた形態学的な種分類が主となっている。この方法は形態学的な特徴が確認できるまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには加熱や薬剤などによる損傷菌体等は形態形成能を失うケースが存在し、それら菌体は長期間培養を行っても特徴的な形態を形成しないことから、検出・識別結果の正確性に問題があった。
このようにアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に長期間を要し、さらには他の種との識別結果の正確性に問題がある形態学的な同定方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。
【０００５】
このような要求に対して、遺伝子工学的手法を採用し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを迅速かつ正確に検出する方法が提案されている。例えば、非特許文献１〜５には、アスペルギルス・オクラセウスのゲノムＤＮＡ中の内部転写スペーサー領域の特定部位を増幅することにより、アスペルギルス・オクラセウスを検出する方法が記載されている。また、非特許文献１及び６には、アスペルギルス・ウェスタジキアエのゲノムＤＮＡ中のβ−チューブリン遺伝子や内部転写スペーサー領域の特定部位を増幅することにより、アスペルギルス・ウェスタジキアエを検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jessica  Gil-Serna  et  al.，International  Journal  of  Food  Microbiology（2009），vol．136，p．83-87
【非特許文献２】Daniele  Sartori  et  al.，Research  in  Microbiology（2006），vol．157，p．350-354
【非特許文献３】Jessica  Gil-Serna  et  al.，International  Journal  of  Food  Microbiology（2009），vol．131，p．162-167
【非特許文献４】Belen  Patinoa  et  al.，International  Journal  of  Food  Microbiology（2005），vol．104，p．207-214
【非特許文献５】Holger  Schmidt  et  al.，System．Appl．Microbiol．（2003），vol．26，p．138-146
【非特許文献６】Luis  Gustavo  Morello  et  al.，International  Journal  of  Food  Microbiology（2007），vol．119，p．270-276
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１〜６記載の発明は、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエと、アスペルギルス属に属するその他の菌種とを区別し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを検出する方法である。しかし、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペルギルス・アフィニス（Aspergillus affinis）など、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエと極めて近縁の菌種と区別してアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを検出することについては、非特許文献１〜６に記載の技術はまだ満足できるものではなかった。
【０００８】
さらに、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを始めとするアスペルギルス属に属する菌類は、菌種によりオクラトキシンＡの産生能が異なる。すなわち、アスペルギルス属に属する菌類は、菌種により毒性がが大きく異なる。したがって、飲食品業界などにおいて、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエをそれぞれ種レベルで迅速かつ正確に検出することが必要となる。
【０００９】
本発明は、飲食品業界などにおいて問題となるアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエをそれぞれ種レベルで迅速かつ正確に検出する方法の提供を課題とする。また、本発明は、分類学上アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの近縁種とされる菌種と区別してアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを検出する、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法の提供を課題とする。また、本発明は、擬陽性の結果を生じさせることなく、高精度でのアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの検出が可能な、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法の提供を課題とする。さらに、本発明は、これらの方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のように、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエとアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの近縁種とを区別し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの種レベルで検出する方法が報告されていない一因として、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの遺伝子のデータベースが現在のところ脆弱であることが挙げられる。そして、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの種レベルで保存されている遺伝子領域が正確に解析されていないために、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出するための高感度のオリゴヌクレオチドの設計等が困難となっていることなどが原因であると考えられる。
【００１１】
このような課題に鑑み、本発明者等は、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づく分子系統分類学的手法を用いて、鋭意検討を行った。その結果、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれのβ−チューブリン遺伝子の中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する部位（以下、「可変部位」ともいう）が存在することを見出した。また、これらの可変部位をターゲットとすることでアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出できることを見出した。さらに、これらの可変部位をターゲットとすることで、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの近縁種とされる菌種に対し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを区別して検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【００１２】
本発明は、下記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、及び下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出する、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
【００１３】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、又は前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出方法は、飲食品の汚染原因菌の１種である上記のアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。また、本発明の検出方法は、分類学上アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの近縁種とされる菌種と区別して、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエを検出することができる。また、本発明の検出方法は、擬陽性の結果を生じさせることなく、高精度でアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを検出することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、これらの方法に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アスペルギルス属菌類のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づいて作成した、アスペルギルス属菌類の分子系統樹を示す図である。
【図２】実施例１における、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いて増幅したポリメラーゼ連鎖反応（以下、単に「ＰＣＲ」ともいう）産物の電気泳動図である。
【図３】実施例１における、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図４】実施例１における、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例１における、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図６】実施例２における、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図７】実施例２における、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図８】実施例２における、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図９】実施例２における、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）を用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の検出方法は、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわち本領域に存在するアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれに特異的な塩基配列部位（可変部位）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出を行い、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出する方法である。ここで、「可変部位」とは、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中で塩基変異が蓄積しやすい部位であり、この部位の塩基配列は他菌種との間で大きく異なる。
【００１７】
本発明における「アスペルギルス・オクラセウス」とは、アスペルギルス属に分類される不完全菌類の１種である。アスペルギルス・オクラセウスの生育至適温度は２５〜３０℃であり、培地上で生育すると薄黄色のコロニーを形成する。なお、アスペルギルス・オクラセウスが形成する子嚢胞子の耐熱性は低い。
また、本発明における「アスペルギルス・ウェスタジキアエ」とは、アスペルギルス属に分類される不完全菌類の１種である。アスペルギルス・ウェスタジキアエの生育至適温度は２５〜３０℃であり、培地上で生育すると薄黄色のコロニーを形成する。なお、アスペルギルス・ウェスタジキアエが形成する子嚢胞子の耐熱性は低い。
また、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエは豆類、特に生コーヒー豆などの飲食品に対する危害菌として知られている。
【００１８】
本明細書において、「β−チューブリン」とは微小管を構成するタンパク質である。また、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。
【００１９】
本明細書における「種」とは、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列について分子系統分類学的手法を用いて作成した分子系統樹に基づいて分類した菌種群を意味する。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining  method）、最大節約法（Maximum  parsimony）、最尤法（Maximum  likelihood  estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted  Pair  Group  Method  with  Arithmetic  mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。
【００２０】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２１】
本発明の検出方法は、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中のそれぞれの可変部位に対応する核酸で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることを特徴とする。
本発明者等は、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、β−チューブリン遺伝子の塩基配列中に同一種内では保存性が高いが異なる種間で塩基配列の保存性が低く、種によって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエは種固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。
【００２２】
本発明の検出方法は、下記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、及び下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を使用してアスペルギルス・オクラセウスを種レベルで検出し、同定することにより、アスペルギルス・オクラセウスの特異的な検出が可能となる。また、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を使用することで、アスペルギルス・オクラセウスの近縁種とされる菌種と区別して、アスペルギルス・オクラセウスの検出が可能となる。さらに、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を使用することで、擬陽性の結果を生じさせることなくアスペルギルス・オクラセウスの検出が可能となる。
また、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を使用してアスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで検出し、同定することにより、アスペルギルス・ウェスタジキアエの特異的な検出が可能となる。また、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を使用することで、アスペルギルス・ウェスタジキアエの近縁種とされる菌種と区別して、アスペルギルス・ウェスタジキアエの検出が可能となる。さらに、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を使用することで、擬陽性の結果を生じさせることなくアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出が可能となる。
【００２３】
アスペルギルス・オクラセウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位を配列番号５に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号５に記載の塩基配列は、アスペルギルス・オクラセウスＣＢＳ５４７．６５株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
前記オリゴヌクレオチド（ａ）（本明細書において、「Aoch_F2」ともいう）及び前記オリゴヌクレオチド（ｂ）（本明細書において、「Aoch_R1」ともいう）はそれぞれ、配列番号５に記載の塩基配列のうち４１位〜６２位までの領域及び３４７位〜３６６位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はアスペルギルス・オクラセウスが固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いて、アスペルギルス・オクラセウスを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればアスペルギルス・オクラセウスに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、アスペルギルス・オクラセウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無を確認することによりアスペルギルス・オクラセウスを検出することが可能となる。
【００２４】
本発明において、アスペルギルス・オクラセウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）であることが好ましい。さらに、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いて、下記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｅ）配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる塩基配列、配列番号５に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列。
【００２５】
アスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位を配列番号６に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号６に記載の塩基配列は、アスペルギルス・ウェスタジキアエＣＢＳ１１２８０３株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。
前記オリゴヌクレオチド（ｃ）（本明細書において、「Awes_F1」ともいう）及び前記オリゴヌクレオチド（ｄ）（本明細書において、「Awes_R2」ともいう）はそれぞれ、配列番号６に記載の塩基配列のうち２３位〜４２位までの領域及び３３４位〜３５４位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は種間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はアスペルギルス・ウェスタジキアエが固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）を用いて、アスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればアスペルギルス・ウェスタジキアエに特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、アスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無を確認することによりアスペルギルス・ウェスタジキアエを検出することが可能となる。
【００２６】
本発明において、アスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）であることが好ましい。さらに、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）を用いて、下記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）で表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる塩基配列、配列番号６に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列。
【００２７】
本発明の検出方法に用いる前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）は、配列番号１又は２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）は、アスペルギルス・オクラセウスの種レベルでの検出に使用できれば、配列番号１又は２に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）には、配列番号１又は２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつアスペルギルス・オクラセウスの種レベルでの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
また、本発明の検出方法に用いる前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）は、配列番号３又は４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）は、アスペルギルス・ウェスタジキアエの種レベルでの検出に使用できれば、配列番号３又は４に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）には、配列番号３又は４に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつアスペルギルス・ウェスタジキアエの種レベルでの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号３又は４に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
本発明において、塩基配列の相同性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２８】
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００２９】
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、アスペルギルス・オクラセウス又はアスペルギルス・ウェスタジキアエの遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００３０】
前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス又はアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸の存在を確認し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、Loop  mediated  isothermal  amplification（ＬＡＭＰ）法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００３１】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プローブ及び／又は核酸プライマーとして用いることができる。
【００３２】
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
【００３３】
本発明の検出方法において、アスペルギルス・オクラセウスを種レベルで検出するために、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
また、本発明の検出方法において、アスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで検出するために、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００３４】
検体中のアスペルギルス・オクラセウスを種レベルで検出するためには、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。また、検体中のアスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで検出するためには、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。
上記核酸プローブはアスペルギルス・オクラセウス又はアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位と特異的にハイブリダイズする。よって、検体中のアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを迅速かつ正確に種レベルで検出することができる。
ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００３５】
本発明の検出方法において、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出を行うため、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエからなる群より選ばれる少なくとも１種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００３６】
本発明において、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）（好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、アスペルギルス・オクラセウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列（好ましくは、前記塩基配列（ｅ）及び（ｆ）のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、アスペルギルス・オクラセウスを種レベルで検出するのが好ましい。ここで、本発明における「アスペルギルス・オクラセウス」は、分類学上の分類及びオクラトキシンＡの産生能の有無に関わらず、配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を有するものの他、配列番号５に記載の塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、の塩基配列、又は、配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をβ−チューブリン遺伝子として有するものも包含する。
前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）は、ＰＣＲによって前記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）で表される核酸又はその一部を増幅でき、アスペルギルス・オクラセウスを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対をアスペルギルス・オクラセウス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
【００３７】
本発明において、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）（好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、アスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列（好ましくは、前記塩基配列（ｇ）及び（ｈ）のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、アスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで検出するのが好ましい。ここで、本発明における「アスペルギルス・ウェスタジキアエ」は、分類学上の分類及びオクラトキシンＡの産生能の有無に関わらず、配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を有するものの他、配列番号６に記載の塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、の塩基配列、又は、配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をβ−チューブリン遺伝子として有するものも包含する。
前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）は、ＰＣＲによって前記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）で表される核酸又はその一部を増幅でき、アスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対をアスペルギルス・ウェスタジキアエ検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
【００３８】
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行う。また、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０℃以上（好ましくは５２℃以上、より好ましくは５３℃以上、さらに好ましくは５５℃以上）６５℃以下（好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５９℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行う。さらに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行う。そして、これら熱変性反応、アニーリング反応及び伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
また、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行う。また、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０℃以上（好ましくは５２℃以上、より好ましくは５３℃以上、さらに好ましくは５５℃以上）６５℃以下（好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５９℃以下）で５秒以上（好ましくは１０秒以上）１２０秒以下（好ましくは６０秒以下）行う。さらに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行う。そして、これら熱変性反応、アニーリング反応及び伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル以上３５サイクル以下行う。
【００３９】
本発明において、遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体に検出対象菌類が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にアスペルギルス・オクラセウスが含まれる場合、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約330bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。また、検体にアスペルギルス・ウェスタジキアエが含まれる場合、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約340bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。このような操作を行うことにより、検体に検出対象菌類が含まれているかを確認することができる。また、約330bp又は約340bpのサイズでＤＮＡ断片が生成することは、検体にアスペルギルス・オクラセウス又はアスペルギルス・ウェスタジキアエが存在することを意味する。したがって、このようなＤＮＡ断片の生成を確認することで、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することなく、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出が可能となる。
【００４０】
本発明において、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いて検体中のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を決定し、該部分塩基配列が前記塩基配列（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに含まれるか否かを確認することで、前記塩基配列（ｅ）〜（ｈ）のいずれかで表される核酸の存在を確認しアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出することもできる。すなわち、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いて検体中のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と前記塩基配列（ｅ）〜（ｈ）のいずれかとを比較し、その一致又は相違に基づいて前記塩基配列（ｅ）〜（ｈ）のいずれかで表される核酸の存在を確認しアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの種レベルの検出を行うこともできる。例えば、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記塩基配列（ｅ）及び（ｆ）のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記塩基配列（ｅ）及び（ｆ）のいずれかとを比較し、前記塩基配列（ｅ）及び（ｆ）のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記塩基配列（ｅ）及び（ｆ）で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をアスペルギルス・オクラセウスと同定することができる。また、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記塩基配列（ｇ）及び（ｈ）のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記塩基配列（ｇ）及び（ｈ）のいずれかとを比較し、前記塩基配列（ｇ）及び（ｈ）のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記塩基配列（ｇ）及び（ｈ）で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をアスペルギルス・ウェスタジキアエと同定することができる。このようにして、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで迅速かつ正確に検出することもできる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００４１】
本発明において、増幅反応に用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
【００４２】
本発明において使用される検体は適宜決定することができ、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体、飲食品又はその原材料の包装容器等を用いることができる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであればよい。また、検体に分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を行ってもよい。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００４３】
本発明のアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ検出キットは、前記本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド対を核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ検出キット、使用並びに方法を開示する。
【００４５】
＜１＞下記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、及び下記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出する、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１に記載の塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、でありかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載の塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、でありかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号３に記載の塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、でありかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号４に記載の塩基配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、でありかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
【００４６】
＜２＞前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウスを種レベルで検出する、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜３＞前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで検出する、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞検出を行うために、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで検出する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の検出方法。
＜５＞β−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅する、前記＜４＞項記載の検出方法。
＜６＞前記アスペルギルス・オクラセウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の検出方法。
（ｅ）配列番号５に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる塩基配列、配列番号５に記載の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、の相同性を有しかつアスペルギルス・オクラセウスの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列。
＜７＞前記アスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の検出方法。
（ｇ）配列番号６に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列。
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる塩基配列、配列番号６に記載の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、の相同性を有しかつアスペルギルス・ウェスタジキアエの検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列。
【００４７】
＜８＞前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）からなるオリゴヌクレオチド対、又は前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）からなるオリゴヌクレオチド対。
【００４８】
＜９＞前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、前記＜８＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１０＞前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）がそれぞれ、前記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）で表される核酸にハイブリダイズすることができ、アスペルギルス・オクラセウスを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜８＞又は＜９＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１１＞前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記塩基配列（ｅ）又は（ｆ）で表される核酸の一部を増幅でき、アスペルギルス・オクラセウスを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜１０＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１２＞前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）がそれぞれ、前記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）で表される核酸にハイブリダイズすることができ、アスペルギルス・ウェスタジキアエを検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜８＞又は＜９＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１３＞前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記塩基配列（ｇ）又は（ｈ）で表される核酸の一部を増幅でき、アスペルギルス・ウェスタジキアエを検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜１２＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１４＞前記＜８＞〜＜１３＞のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエ検出キット。
【００４９】
＜１５＞アスペルギルス・オクラセウス検出用核酸プライマーとしての、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）の使用。
＜１６＞アスペルギルス・オクラセウス検出用核酸プライマーの製造のための、前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）の使用。
＜１７＞前記オリゴヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）をアスペルギルス・オクラセウス検出用核酸プライマーとして使用する方法。
＜１８＞アスペルギルス・ウェスタジキアエ検出用核酸プライマーとしての、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）の使用。
＜１９＞アスペルギルス・ウェスタジキアエ検出用核酸プライマーの製造のための、前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）の使用。
＜２０＞前記オリゴヌクレオチド（ｃ）及び（ｄ）をアスペルギルス・ウェスタジキアエ検出用核酸プライマーとして使用する方法。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
試験例１  アスペルギルス属に属する菌類の分子系統樹の作成
下記の方法により、アスペルギルス属に属する菌類各種（アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・ウェスタジキアエ、アスペルギルス・メレウス、アスペルギルス・アフィニス、アスペルギルス・クレテンシス（Aspergillus cretensis）、ネオペトロマイセス・ムリカタス（Neopetromyces muricatus）、アスペルギルス・アウリコマス（Aspergillus auricomus）、アスペルギルス・ネオブリゲリ（Aspergillus neobridgeri）、アスペルギルス・ロゼオグロブロサス（Aspergillus roseoglobulosus）、アスペルギルス・サルフレウス（Aspergillus sulphureus）、アスペルギルス・ブリゲリ（Aspergillus bridgeri）、アスペルギルス・ペルシ（Aspergillus persii）、アスペルギルス・スクレロチオラム（Aspergillus sclerotiorum）、アスペルギルス・エレガンス（Aspergillus elegans）、アスペルギルス・ステイニ（Aspergillus steynii）、アスペルギルス・シュードエレガンス（Aspergillus pseudoelegans）、アスペルギルス・インシュリコラ（Aspergillus insulicola）、アスペルギルス・オクラセオペタィフォルミ（Aspergillus ochraceopetaliformi）、及びアスペルギルス・ロブスタス（Aspergillus robustus））のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。
【００５２】
ポテトデキストロース寒天（PDA）斜面培地（培地、Difco社製）にて２５℃で３日間暗所培養した菌体から、Ｇｅｎとるくん（商品名、タカラバイオ社製）を使用しＤＮＡを抽出した。
抽出したＤＮＡを鋳型とし、Bt2aプライマー（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：配列番号７）とBt2bプライマー（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：配列番号８）を使用し（Glass  and  Donaldson，Appl.，Environ.，Microbiol.，61，p．1323-1330，1995参照）、PuRe  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（GE  Health  Care  UK  LTD)を用いてＰＣＲを行った。増幅条件は、変性温度９５℃、アニーリング温度５９℃、伸長温度７２℃の３５サイクルとした。Auto  SegTM  G-50（Amersham  Pharmacia  Biotech）を使用してＰＣＲ産物を精製した。さらに、ＰＣＲ産物は、BigDye  terminator  Ver．3.1（商品名、Applied  Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetic  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC  Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
【００５３】
シークエンシング解析により決定した各菌類のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列、及びDNA  data  bank  of  Japan（DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）から入手した各菌類のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal  X（http://www.clustal.org/）を用いて系統解析を実施した。そして、系統解析結果をもとに、ソフトウェアNJ-plotを用いて分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
【００５４】
図１に示すように、アスペルギルス・メレウスは、アスペルギルス・オクラセウスと極めて近縁性の高い菌種であることがわかる。また、アスペルギルス・メレウス及びアスペルギルス・アフィニスは、アスペルギルス・ウェスタジキアエと極めて近縁性の高い菌種であることがわかる。さらに、アスペルギルス・オクラセウスとアスペルギルス・ウェスタジキアエは、互いに近縁性の高い菌種であることがわかる。
【００５５】
試験例２  アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエに特異的なβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の解析
上記の方法により決定したアスペルギルス属菌類各種や、各種菌類の公知のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal  W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行った。そして、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列領域のうち、３’末端がアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれに特異的な配列であり、ＧＣ含量が概ね３０〜８０％となり、自己アニールの可能性が低く、Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、という４つの条件を満たす部分領域の検討を行った。その結果、アスペルギルス・オクラセウスに特異的な塩基配列（Aoch_F2：aggatcatcttcgataccttag（配列番号１）、Aoch_R1：ctttgtacggggcgtttcga（配列番号２））を決定した。また、アスペルギルス・ウェスタジキアエに特異的な塩基配列（Awes_F1：tggcagtctgggctatctga（配列番号３）、Awes_R2：gggcgtttcggataggtgaag（配列番号４））を決定した。
【００５６】
実施例１
（１）プライマーの設計
試験例２で決定したアスペルギルス・オクラセウスに特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Aoch_F2プライマー）及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Aoch_R1プライマー）を設計し、北海道システムサイエンス社に合成依頼し（脱塩精製品、０．２μｍｏｌスケール）、購入した。
【００５７】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる菌類、すなわちアスペルギルス・オクラセウスとその類縁菌、及び生活環境菌として、表１〜４に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、などを入手し、使用した。
各菌株をポテトデキストロース培地（商品名：パールコアポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で３日間培養した。
【００５８】
【表１】
2015195774.tif 000002
【００５９】
【表２】
2015195774.tif 000003
【００６０】
【表３】
2015195774.tif 000004
【００６１】
【表４】
2015195774.tif 000005
【００６２】
培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（タカラバイオ社製Ｇｅｎとるくん（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を抽出し精製した。ＤＮＡ溶液の濃度は２ｎｇ／μＬに調製した。
【００６３】
（３）アスペルギルス・オクラセウスの検出
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液２μＬ、２ｐｍｏｌ／μＬに濃度調整したAoch_F2プライマー及びAoch_R1プライマーをそれぞれ２μＬ、及び滅菌蒸留水を１９μＬを、Pure  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（商品名、ＧＥヘルスケア社製）のチューブ内に投入し、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（商品名、タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分間の処理後、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
【００６４】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２．５μＬを分取してローディングバッファーと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１００Ｖ、３０分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド液に浸漬しＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図２〜５に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図２は表１に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図３は表２に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図４は表３に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図５は表４に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ  Load  100bp  molecular  Ruler（商品名、BIO  RAD社製）を用いた。
【００６５】
その結果、アスペルギルス・オクラセウスのゲノムＤＮＡを含む試料では、約330bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、アスペルギルス・オクラセウス以外のアスペルギルス属菌類、及び生活環境菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、本発明によれば、アスペルギルス・オクラセウスを種レベルで特異的に検出することができる。
【００６６】
実施例２
（１）プライマーの設計
試験例２で決定したアスペルギルス・ウェスタジキアエに特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Awes_F1プライマー）及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Awes_R2プライマー）を設計し、北海道システムサイエンス社に合成依頼し（脱塩精製品、０．２μｍｏｌスケール）、購入した。
【００６７】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる菌類、すなわちアスペルギルス・ウェスタジキアエとその類縁菌、及び生活環境菌として、表５〜８に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、などを入手し、使用した。
各菌株をポテトデキストロース培地（商品名：パールコアポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で３日間培養した。
【００６８】
【表５】
2015195774.tif 000006
【００６９】
【表６】
2015195774.tif 000007
【００７０】
【表７】
2015195774.tif 000008
【００７１】
【表８】
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【００７２】
培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（タカラバイオ社製Ｇｅｎとるくん（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を抽出し精製した。ＤＮＡ溶液の濃度は２ｎｇ／μＬに調製した。
【００７３】
（３）アスペルギルス・ウェスタジキアエの検出
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液２μＬ、２ｐｍｏｌ／μＬに濃度調整したAwes_F1プライマー及びAwes_R2プライマーをそれぞれ２μＬ、及び滅菌蒸留水を１９μＬを、Pure  TaqTM  Ready-To-Go  PCR  Beads（商品名、ＧＥヘルスケア社製）のチューブ内に投入し、２５μＬのＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（商品名、タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分間の処理後、(i)９５℃、１分間の熱変性反応、(ii)５９℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
【００７４】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から２．５μＬを分取してローディングバッファーと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１００Ｖ、３０分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド液に浸漬しＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図６〜９に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図６は表５に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図７は表６に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図８は表７に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図９は表８に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ  Load  100bp  molecular  Ruler（商品名、BIO  RAD社製）を用いた。
【００７５】
その結果、アスペルギルス・ウェスタジキアエのゲノムＤＮＡを含む試料では、約340bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、アスペルギルス・ウェスタジキアエ以外のアスペルギルス属菌類、及び生活環境菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、本発明によれば、アスペルギルス・ウェスタジキアエを種レベルで特異的に検出することができる。
【００７６】
上記の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の存在を確認することができ、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを種レベルで特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、種レベルでより迅速かつより正確にアスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを検出することが可能である。
また、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、分類学上アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれの近縁種とされる菌種と区別して、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを検出することが可能である。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、擬陽性の結果生じることなく、アスペルギルス・オクラセウス及びアスペルギルス・ウェスタジキアエそれぞれを検出することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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