(57)【要約】【課題】宿主細胞中での二官能性アルカンの産生のための方法を提供すること。【解決手段】特に、本発明の複数の態様は、宿主細胞中での炭水化物原料からの二官能性アルカンの産生と関係がある遺伝子の構成要素を記載する。さらに具体的には、本発明の複数の態様は、２−ケトピメリン酸を介する、アジピン酸、アミノカプロン酸、カプロラクタム、およびヘキサメチレンジアミンの産生のための代謝経路を記載する。本発明のいくつかの態様は、α−ケトグルタル酸塩からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の複数の態様は、宿主細胞中での二官能性アルカンの産生のための方法に関する。特に、本発明の複数の態様は、宿主細胞中での炭水化物原料からの二官能性アルカンの産生と関係がある遺伝子の成分を記載する。さらに具体的には、本発明の複数の態様は、２−ケトピメリン酸を介する、アジピン酸、アミノカプロン酸、カプロラクタム、ヘキサメチレンジアミンの産生のための代謝経路を記載する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
原油は、重要な化学物質およびポリマーの合成のためのナンバーワンの出発原料である。石油は次第に希少かつ高価になっているので、生きている微生物またはそれらの精製された酵素を使用する化学物質の産生における再生可能原料の生物学的処理に関心が集まりつつある。生物学的処理、特に、発酵は、何世紀にもわたり飲料を製造するために使用されている。過去５０年間にわたり、微生物は、抗生物質、ビタミン、およびアミノ酸のような化合物を製造するために商業的に使用されてきた。しかし、工業用化学物質の製造のためのその使用または微生物はそれほど広まっていない。微生物が、従来の化学的手法により製造することが困難であるかまたはコストがかかる特定の化合物に経済的経路を提供できる可能性があることが、ごく最近になって理解された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明の複数の態様は、α−ケト酸からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生のための、代謝改変（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）宿主細胞に関する。ここでは、α末端官能基とω末端官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ３の群より選択され、ｎは、４〜８の範囲の整数であり、代謝改変宿主細胞は、少なくとも１つの生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されている。いくつかの実施形態においては、核酸は、２種類以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。代謝改変宿主細胞は、原核生物細胞であり得る。例えば、いくつかの実施形態においては、代謝改変宿主細胞は、嫌気性原核生物細胞である。代謝改変宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ、Ｂ．ｆｌａｖｕｍ、およびＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍからなる群より選択され得る。
【０００４】
好ましい実施形態においては、α−ケト酸はα−ケトグルタル酸塩であり、これは、α−ケトアジピン酸塩、α−ケトピメリン酸塩、またはα−ケトスベリン酸塩に変換される。好ましい実施形態においては、宿主細胞は、ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼ、およびホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む。ホモクエン酸シンターゼは、ＡｋｓＡ、ＮｉｆＶ、ｈｃｓ、およびＬｙｓ２０／２１からなる群より選択され得る。ホモアコニターゼは、ＡｋｓＤ／Ｅ、ＬｙｓＴ／Ｕ、Ｌｙｓ４、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大／小サブユニット、およびそれらのホモログからなる群より選択され得る。ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＡｋｓＦ、Ｈｉｃｄｈ、Ｌｙｓ１２、２−オキソスベリン酸シンターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらのホモログからなる群より選択され得る。
【０００５】
好ましい実施形態においては、α，ω−二官能性アルカンは６個の炭素原子を有し、アミノカプロン酸、アジピン酸塩、ヘキサメチレンジアミン、６−ヒドロキシヘキサミン、１，６−ヘキサンジオール、６−アミノヘキサナール、６−アミノヘキサノール、および６−ヒドロキシヘキサン酸塩からなる群より選択される。
【０００６】
本発明の複数の態様は、α−ケトピメリン酸塩からのアジピン酸の産生のための代謝改変宿主細胞に関し、上記宿主細胞は、デカルボキシラーゼ酵素およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、デカルボキシラーゼ酵素は、２−ケトデカルボキシラーゼであり、α−ケトピメリン酸塩のアジピン酸塩セミアルデヒドへの変換を触媒し、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、アジピン酸塩セミアルデヒドのアジピン酸への変換を触媒する。２−ケトデカルボキシラーゼは、２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ｋｇｄ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）、アミノ基転移（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｅｄ）アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ｍｄｌＣ）、２−ケトアルギニンデカルボキシラーゼ（ａｒｕＩ）、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｆｏｍ２）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素（ＰＤＣ６、ＰＤＣ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素２（ＰＤＣ５、ＰＤＣ１、ＰＤＣ６、Ａｒｏ１０、ＫｉｖＤ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）、およびそれらのホモログの群より選択され得る。いくつかの実施形態においては、デカルボキシラーゼは、２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ｋｇｄ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）、アミノ基転移アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ｍｄｌＣ）、２−ケトアルギニンデカルボキシラーゼ（ａｒｕＩ）、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｆｏｍ２）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素（ＰＤＣ６、ＰＤＣ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素２（ＰＤＣ５、ＰＤＣ１、ＰＤＣ６、Ａｒｏ１０、ＫｉｖＤ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）、およびそれらのホモログと比較した場合に、少なくとも３０％の同一性を有する。好ましい実施形態においては、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ＣｈｎＥ）およびそれらのホモログである。他の実施形態においては、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ＣｈｎＥ）に対して少なくとも３０％の同一性を有する。
【０００７】
本発明の複数の態様は、α−ケトピメリン酸塩からのアミノカプロン酸の産生のための代謝改変宿主細胞に関し、上記宿主細胞は、アミノトランスフェラーゼ酵素およびデカルボキシラーゼをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態においては、２−アミノトランスフェラーゼは、α−ケトピメリン酸塩の２−アミノピメリン酸塩への変換を触媒し、デカルボキシラーゼは、２−アミノピメリン酸塩のアミノカプロン酸への変換を触媒する。アミノトランスフェラーゼは、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ−１（ＡＡＤＡＴ）、アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＬｙｓＮ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｂおよびｄａｐｄｈ）、ならびにそれらのホモログからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態においては、デカルボキシラーゼは、グルタミン酸デカルボキシラーゼである。いくつかの実施形態においては、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、Ｇａｄ６／７、ＧａｄＡ、ＧａｄＢ、およびｌｙｓＡからなる群より選択される遺伝子または遺伝子の断片によりコードされる。いくつかの実施形態においては、デカルボキシラーゼは、α−ケトピメリン酸塩のアジピン酸塩セミアルデヒドへの変換を触媒し、アミノトランスフェラーゼは、アジピン酸塩セミアルデヒドのアミノカプロン酸への変換を触媒する。ケトデカルボキシラーゼは、２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ｋｇｄ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）、アミノ基転移アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ｍｄｌＣ）、２−ケトアルギニンデカルボキシラーゼ（ａｒｕＩ）、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｆｏｍ２）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素（ＰＤＣ６、ＰＤＣ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素２（ＰＤＣ５、ＰＤＣ１、ＰＤＣ６、Ａｒｏ１０、ＫｉｖＤ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）、およびそれらのホモログの群より選択され得る。アミノトランスフェラーゼは、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、Ｌｙｓ６デヒドロゲナーゼ、オルニチン−オキソ酸トランスアミナーゼ、リジンアミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（ＬＹＳ９およびＬＹＳ１）、またはそれらの任意の相同タンパク質からなる群より選択され得る。
【０００８】
本発明の複数の態様は、アミノカプロン酸からのヘキサメチレンジアミンの産生に関し、宿主細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアミノトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態においては、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、アミノカプロン酸の６−アミノヘキサナールへの変換を触媒し、アミノトランスフェラーゼは、６−アミノヘキサナールの６−ヘキサメチレンジアミンへの変換を触媒する。好ましい実施形態においては、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＡＬＤＨ酵素（ＥＣ１．２．１−）である。いくつかの実施形態においては、アミノトランスフェラーゼは、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ−１（ＡＡＤＡＴ）、アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＬｙｓＮ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｂ、ｄａｐｄｈ）、およびそれらの相同タンパク質からなる群より選択され得る。
【０００９】
本発明の複数の態様は、α−ケトピメリン酸塩からのヘキサメチレンジアミンの産生のための代謝改変宿主細胞に関し、上記宿主細胞は、アミノトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびデカルボキシラーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態においては、アミノトランスフェラーゼは、α−ケトピメリン酸塩の２−アミノピメリン酸塩への変換を触媒し、レダクターゼは、２−アミノピメリン酸塩の２−アミノ−７−オキソヘプタン酸塩への変換を触媒し、デヒドロゲナーゼは、２−アミノ−７−オキソヘプタン酸塩の２，７−ジアミノヘプタン酸塩への変換を触媒し、そしてデカルボキシラーゼは、２，７−ジアミノヘプタン酸塩のヘキサメチレンジアミン（ｈｅｘａｍａｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）への変換を触媒する。アミノトランスフェラーゼは、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ−１（ＡＡＤＡＴ）、アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＬｙｓＮ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｂ、ｄａｐｄｈ）、およびそれらの変異体からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態においては、レダクターゼは、アミノアジピン酸レダクターゼまたはそのホモログである。いくつかの実施形態においては、アミノアジピン酸レダクターゼは、Ｓｃ−Ｌｙｓ２によりコードされる。いくつかの実施形態においては、デヒドロゲナーゼは、サッカロピンデヒドロゲナーゼまたはそのホモログであり、Ｓｃ−Ｌｙｓ９またはＳｃ−Ｌｙｓ１、あるいはそれらの変異体によりコードされる。デカルボキシラーゼは、リジンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびそれらの変異体からなる群より選択され得る。
【００１０】
本発明のいくつかの態様は、α−ケトピメリン酸塩からの６−ヒドロキシヘキサン酸塩の産生のための代謝改変宿主細胞に関する。上記宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む。本発明の他の複数の態様は、６−ヒドロキシヘキサン酸塩からの１，６−ヘキサンジオールの産生のための代謝改変宿主細胞に関し、上記宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む。アルコールデヒドロゲナーゼは、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ＡＤＨＩＶデヒドロゲナーゼ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ、ＡＤＨ６、およびそれらのホモログから選択され得る。
【００１１】
本発明の複数の態様は、α−ケトグルタル酸塩からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生方法に関し、ここでは、α末端官能基とω末端官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ３の群より選択され、ｎは、４〜７の範囲の整数であり、α，ω−二官能性Ｃｎアルカンを産生するために十分な条件下で上記宿主細胞を培養する工程；およびα，ω−二官能性Ｃｎアルカンを分離する工程を含む。
【００１２】
いくつかの態様においては、本発明は、ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．３．−）、ホモアコニターゼ（ＥＣ  ２．３．３．１４）、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．−）、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態においては、代謝改変宿主細胞は、α−ケトグルタル酸塩から、α−ケトアジピン酸塩、α−ケトピメリン酸塩、α−ケトスベリン酸塩、またはこれらの組み合わせを産生する。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞は、α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．−）およびデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．−）、ならびにこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、改変宿主細胞は、Ｃｎジカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、４〜７の範囲の整数である。例えば、上記改変宿主細胞は、アジピン酸塩を産生する。他の実施形態においては、上記改変宿主細胞は、Ｃｎヒドロキシカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、４〜７の範囲の整数である。例えば、改変宿主細胞は、６−ヒドロキシヘキサン酸塩を産生する。他の実施形態においてはなお、改変宿主細胞は、Ｃｎアルカンジオールを産生し、ここでは、ｎは、４〜７の範囲の整数であり、例えば、１，６−ヘキサンジオールを産生する。
【００１３】
本発明のいくつかの態様においては、α−ケトグルタル酸塩から、α−ケトアジピン酸塩、α−ケトピメリン酸塩、α−ケトスベリン酸塩、またはこれらの組み合わせを産生する改変宿主細胞は、α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．−）、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  １．４．１．−）、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、およびこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。好ましい実施形態においては、上記改変宿主細胞は、アミノカプロン酸を産生する。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞はさらに、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含み、ＣｎアミノアルデヒドまたはＣｎジアミノアルカンを産生し、ここでは、ｎは、４〜７の範囲の整数である。例えば、上記改変宿主細胞は、ヘキサメチレンジアミンまたは６−ヒドロキシヘキサミンを産生する。
【００１４】
いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞は、アミノアジピン酸トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．−）、およびこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記宿主細胞は、Ｃｎアミノカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、４〜７の範囲の整数である。例えば、特許請求の範囲の改変宿主細胞は、アミノカプロン酸を産生する。
【００１５】
本発明のいくつかの態様は、α−ケト酸からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生のための改変宿主細胞に関する。上記改変宿主細胞は、α−アミノアジピン酸−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）、アミノアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．５．１．−）、リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１８）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７）、およびこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞は、ＣｎアミノアルデヒドまたはＣｎジアミノアルカンを産生し、ここでは、ｎは、４〜７の範囲の整数である。例えば、改変宿主細胞は、ヘキサメチレンジアミンを産生する。本発明のいくつかの態様においては、改変宿主細胞はさらに、３−オキソアシル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）、脂肪酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．−）、デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、エノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．９）、およびこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態においては、上記改変宿主細胞は、Ｃｎジカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数である。例えば、上記改変宿主細胞は、アジピン酸塩を産生する。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞はさらに、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含み、Ｃｎヒドロキシカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、例えば、６−ヒドロキシヘキサン酸塩を産生する。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞は、Ｃｎアルカンジオールを産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、例えば、１，６−ヘキサンジオールを産生する。
【００１６】
本発明のいくつかの態様は、α−ケト酸からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生のための改変宿主細胞に関する。上記宿主細胞は、３−オキソアシル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）、脂肪酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．−）、デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、エノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．９）、およびこれらの組み合わせから選択され、α−アミノアジピン酸−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１６）、アミノアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．５．１．−）、リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１８）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７）、およびこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列、アルデヒドデヒドロゲナーゼより選択される少なくとも１つのポリペプチド、ならびに、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  １．４．１．−）およびアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記宿主細胞は、Ｃｎアミノカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、例えば、アミノカプロン酸を産生する。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞はさらに、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  １．４．１．−）およびアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、ならびにこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞は、１，ｎ−ジアミノアルカンを産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、例えば、ヘキサメチレンジアミンを産生する。他の実施形態においては、上記改変宿主細胞は、ｎ−アミノアルコールを産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、例えば、６−アミノヘキサノールを産生する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様は、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．７）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）、グルタミン酸塩セミアルデヒドムターゼ（ＥＣ  ５．４．３．８）、３−オキソアシル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）、脂肪酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．−）、デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、エノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．９）、およびこれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む、改変宿主細胞に関する。いくつかの実施形態においては、上記改変宿主細胞は、ｎ−アミノカルボン酸を産生し、ここでは、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、例えば、アミノカプロン酸を産生する。
【００１８】
本発明のいくつかの態様は、α−ケトグルタル酸塩からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生方法に関する。ここでは、α末端官能基とω末端官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ３の群より選択され、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、上記方法は、α，ω−二官能性Ｃｎアルカンを産生するために十分な条件下で上記改変宿主細胞を培養する工程；およびα，ω−二官能性Ｃｎアルカンを分離する工程を含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
α−ケト酸からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生のための代謝改変宿主細胞であって、ここでは、α末端官能基とω末端官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ３の群より選択され、ｎは、４〜８の範囲の整数であり、該代謝改変宿主細胞は、少なくとも１つの生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変される、宿主細胞。
（項目２）
前記核酸が、２つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３）
前記細胞が原核生物細胞である、項目１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目４）
前記細胞が嫌気性原核生物細胞である、項目１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目５）
前記細胞が、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｃ．ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ、Ｂ．ｆｌａｖｕｍ、およびＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍからなる群より選択される、項目１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目６）
前記α−ケト酸がα−ケトグルタル酸塩であり、α−ケトアジピン酸塩、α−ケトピメリン酸塩、またはα−ケトスベリン酸塩に変換される、項目１に記載の代謝改変宿主細胞。（項目７）
前記宿主細胞が、ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼ、およびホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む、項目６に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目８）
前記ホモクエン酸シンターゼが、ＡｋｓＡ、ＮｉｆＶ、ｈｃｓ、およびＬｙｓ２０／２１からなる群より選択される、項目７に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目９）
前記ホモアコニターゼが、ＡｋｓＤ／Ｅ、ＬｙｓＴ／Ｕ、Ｌｙｓ４、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大／小サブユニット、およびそれらのホモログからなる群より選択される、項目７に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１０）
前記ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼが、ＡｋｓＦ、Ｈｉｃｄｈ、Ｌｙｓ１２、２−オキソスベリン酸シンターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらのホモログからなる群より選択される、項目７に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１１）
前記α，ω−二官能性アルカンが６個の炭素原子を有し、アミノカプロン酸、アジピン酸塩、ヘキサメチレンジアミン、６−ヒドロキシヘキサミン、１，６−ヘキサンジオール、６−アミノヘキサナール、６−アミノヘキサノール、および６−ヒドロキシヘキサン酸塩からなる群より選択される、項目７に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１２）
α−ケトピメリン酸塩からのアジピン酸の産生のための、項目１に記載の代謝改変宿主細胞であって、該宿主細胞がさらに、デカルボキシラーゼ酵素およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする核酸を含む、宿主細胞。
（項目１３）
前記デカルボキシラーゼ酵素がα−ケトピメリン酸塩のアジピン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する２−ケトデカルボキシラーゼであり、そして前記アルデヒドデヒドロゲナーゼがアジピン酸セミアルデヒドのアジピン酸への変換を触媒する、項目１２に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１４）
前記２−ケトデカルボキシラーゼが、２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ｋｇｄ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）、アミノ基転移アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ｍｄｌＣ）、２−ケトアルギニンデカルボキシラーゼ（ａｒｕＩ）、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｆｏｍ２）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素（ＰＤＣ６、ＰＤＣ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素２（ＰＤＣ５、ＰＤＣ１、ＰＤＣ６、Ａｒｏ１０、ＫｉｖＤ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）、およびそれらのホモログの群より選択される、項目１２に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１５）
前記デカルボキシラーゼが、２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ｋｇｄ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）、アミノ基転移アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ｍｄｌＣ）、２−ケトアルギニンデカルボキシラーゼ（ａｒｕＩ）、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｆｏｍ２）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素（ＰＤＣ６、ＰＤＣ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素２（ＰＤＣ５、ＰＤＣ１、ＰＤＣ６、Ａｒｏ１０、ＫｉｖＤ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）、およびそれらのホモログと比較した場合に、少なくとも３０％の同一性を有する、項目１４に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１６）
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ＣｈｎＥ）およびそのホモログである、項目１２に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１７）
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、前記６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ＣｈｎＥ）に対して少なくとも３０％の同一性を有する、項目１２に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目１８）
α−ケトピメリン酸塩からのアミノカプロン酸の産生のための項目１に記載の代謝改変宿主細胞であって、該宿主細胞が、アミノトランスフェラーゼ酵素およびデカルボキシラーゼをコードする核酸をさらに含む、宿主細胞。
（項目１９）
前記２−アミノトランスフェラーゼが、α−ケトピメリン酸塩の２−アミノピメリン酸塩への変換を触媒し、そして前記デカルボキシラーゼが、２−アミノピメリン酸塩のアミノカプロン酸への変換を触媒する、項目１８に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２０）
前記アミノトランスフェラーゼが、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ−１（ＡＡＤＡＴ）、アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＬｙｓＮ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｂおよびｄａｐｄｈ）、およびそれらのホモログからなる群より選択される、項目１９に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２１）
前記デカルボキシラーゼがグルタミン酸デカルボキシラーゼである、項目１９に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２２）
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが、Ｇａｄ６／７、ＧａｄＡ、ＧａｄＢ、およびｌｙｓＡからなる群より選択される遺伝子または遺伝子の断片によりコードされる、項目２０に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２３）
前記デカルボキシラーゼが、α−ケトピメリン酸塩のアジピン酸セミアルデヒドへの変換を触媒し、そして前記アミノトランスフェラーゼが、アジピン酸セミアルデヒドのアミノカプロン酸への変換を触媒する、項目１８に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２４）
前記ケトデカルボキシラーゼが、２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ｋｇｄ）、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖＤ）、アミノ基転移アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ｍｄｌＣ）、２−ケトアルギニンデカルボキシラーゼ（ａｒｕＩ）、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｆｏｍ２）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素（ＰＤＣ６、ＰＤＣ１）、ピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素２（ＰＤＣ５、ＰＤＣ１、ＰＤＣ６、Ａｒｏ１０、ＫｉｖＤ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）、およびそれらのホモログの群より選択される、項目２３に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２５）
前記アミノトランスフェラーゼが、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、Ｌｙｓ６デヒドロゲナーゼ、オルニチン−オキソ酸トランスアミナーゼ、リジンアミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（ＬＹＳ９およびＬＹＳ１）、またはそれらの任意の相同タンパク質からなる群より選択される、項目２３に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２６）
アミノカプロン酸からのヘキサメチレンジアミンの産生のための項目１８に記載の代謝改変宿主細胞であって、該宿主細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアミノトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、宿主細胞。
（項目２７）
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、アミノカプロン酸の６−アミノヘキサナールへの変換を触媒し、そして前記アミノトランスフェラーゼが、６−アミノヘキサナールの６−ヘキサメチレンジアミンへの変換を触媒する、項目２６に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２８）
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼがＡＬＤＨ酵素（ＥＣ  １．２．１−）である、項目２７に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目２９）
前記アミノトランスフェラーゼが、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ−１（ＡＡＤＡＴ）、アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＬｙｓＮ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｂ、ｄａｐｄｈ）、およびそれらの相同タンパク質からなる群より選択される、項目２７に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３０）
α−ケトピメリン酸塩からのヘキサメチレンジアミンの産生のための、項目１に記載の代謝改変宿主細胞であって、該宿主細胞が、アミノトランスフェラーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびデカルボキシラーゼをコードする核酸をさらに含む、宿主細胞。
（項目３１）
前記アミノトランスフェラーゼが、α−ケトピメリン酸塩の２−アミノピメリン酸塩への変換を触媒し、前記レダクターゼが、２−アミノピメリン酸塩の２−アミノ−７−オキソヘプタン酸塩への変換を触媒し、前記デヒドロゲナーゼが、２−アミノ−７−オキソヘプタン酸塩の２，７−ジアミノヘプタン酸塩への変換を触媒し、そして前記デカルボキシラーゼが、２，７−ジアミノヘプタン酸塩のヘキサメチレンジアミンへの変換を触媒する、項目３０に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３２）
前記アミノトランスフェラーゼが、α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ−１（ＡＡＤＡＴ）、アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＬｙｓＮ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｂ、ｄａｐｄｈ）、およびそれらの変異体からなる群より選択される、項目３１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３３）
前記レダクターゼが、アミノアジピン酸レダクターゼまたはそのホモログである、項目３１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３４）
前記アミノアジピン酸レダクターゼがＳｃ−Ｌｙｓ２によりコードされる、項目３３に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３５）
前記デヒドロゲナーゼが、サッカロピンデヒドロゲナーゼまたはそのホモログである、項目３１に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３６）
前記サッカロピンデヒドロゲナーゼが、Ｓｃ−Ｌｙｓ９もしくはＳｃ−Ｌｙｓ１、またはそれらの変異体によりコードされる、項目３５に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３７）
前記デカルボキシラーゼが、リジンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびそれらの変異体からなる群より選択される、項目３０に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目３８）
α−ケトピメリン酸塩からの６−ヒドロキシヘキサン酸塩の産生のための、項目６に記載の代謝改変宿主細胞であって、該宿主細胞が、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸をさらに含む、宿主細胞。
（項目３９）
６−ヒドロキシヘキサン酸塩からの１，６−ヘキサンジオールの産生のための、項目３８に記載の代謝改変宿主細胞であって、該宿主細胞が、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸をさらに含む、宿主細胞。
（項目４０）
前記アルコールデヒドロゲナーゼが、６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、ＡＤＨＩＶデヒドロゲナーゼ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ、ＡＤＨ６、およびそれらのホモログより選択される、項目３８に記載の代謝改変宿主細胞。
（項目４１）
α−ケトグルタル酸塩からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生方法であって、α末端官能基とω末端官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ３の群より選択され、ｎは、４〜７の範囲の整数であり、α，ω−二官能性Ｃｎアルカンを産生するために十分な条件下で項目１に記載の宿主細胞を培養する工程；および該α，ω−二官能性Ｃｎアルカンを分離する工程を含む、方法。
（項目４２）
ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．３．−）、ホモアコニターゼ（ＥＣ  ２．３．３．１４）、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．−）、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む、改変宿主細胞。
（項目４３）
α−ケトグルタル酸塩から、α−ケトアジピン酸塩、α−ケトピメリン酸塩、α−ケトスベリン酸塩、またはそれらの組み合わせを産生する、項目４２に記載の改変宿主細胞。
（項目４４）
α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．−）およびデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．−）、ならびにそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目４３に記載の改変宿主細胞。
（項目４５）
ｎが４〜７の範囲の整数であるＣｎジカルボン酸を産生する、項目４４に記載の改変宿主細胞。
（項目４６）
ｎが４〜７の範囲の整数であるＣｎヒドロキシカルボン酸を産生する、項目４４に記載の改変宿主細胞。
（項目４７）
前記宿主細胞がアジピン酸塩を産生する、項目４５に記載の改変宿主細胞。
（項目４８）
前記宿主細胞が６−ヒドロキシヘキサン酸塩を産生する、項目４６に記載の改変宿主細胞。
（項目４９）
ｎが４〜７の範囲の整数であるＣｎアルカンジオールを産生する、項目４４に記載の改変宿主細胞。
（項目５０）
前記宿主細胞が１，６−ヘキサンジオールを産生する、項目４９に記載の改変宿主細胞。（項目５１）
α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．−）、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  １．４．１．−）、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目４３に記載の改変宿主細胞。
（項目５２）
前記宿主細胞がアミノカプロン酸を産生する、項目５１に記載の改変宿主細胞。
（項目５３）
アミノアジピン酸トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目４３に記載の改変宿主細胞。
（項目５４）
前記宿主細胞が、ｎが４〜７の範囲の整数であるＣｎアミノカルボン酸を産生する、項目５３に記載の改変宿主細胞。
（項目５５）
前記宿主細胞がアミノカプロン酸を産生する、項目５４に記載の改変宿主細胞。
（項目５６）
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目５１に記載の改変宿主細胞。
（項目５７）
前記宿主細胞が、ｎが４〜７の範囲の整数であるＣｎアミノアルデヒドまたはＣｎジアミノアルカンを産生する、項目５６に記載の改変宿主細胞。
（項目５８）
前記宿主細胞がヘキサメチレンジアミンを産生する、項目５７に記載の改変宿主細胞。
（項目５９）
前記宿主細胞が６−ヒドロキシヘキサミンを産生する、項目５７に記載の改変宿主細胞。（項目６０）
α−アミノアジピン酸−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．１６）、アミノアジピン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３１）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．５．１．−）、リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１８）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７）、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目４３に記載の改変宿主細胞。
（項目６１）
前記宿主細胞が、ｎが４〜７の範囲の整数であるＣｎアミノアルデヒドまたはＣｎジアミノアルカンを産生する、項目６０に記載の改変宿主細胞。
（項目６２）
前記宿主細胞がヘキサメチレンジアミンを産生する、項目６０に記載の改変宿主細胞。
（項目６３）
３−オキソアシル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）、脂肪酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．−）、デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、エノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．９）、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目４３に記載の改変宿主細胞。
（項目６４）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数であるＣｎジカルボン酸を産生する、項目６３に記載の改変宿主細胞。
（項目６５）
前記宿主細胞がアジピン酸塩を産生する、項目６３に記載の改変宿主細胞。
（項目６６）
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目６３に記載の改変宿主細胞。
（項目６７）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数であるＣｎヒドロキシカルボン酸を産生する、項目６６に記載の改変宿主細胞。
（項目６８）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数であるＣｎアルカンジオールを産生する、項目６６に記載の改変宿主細胞。
（項目６９）
前記宿主細胞が６−ヒドロキシヘキサン酸塩を産生する、項目６７に記載の改変宿主細胞。
（項目７０）
前記宿主細胞が１，６−ヘキサンジオールを産生する、項目６８に記載の改変宿主細胞。（項目７１）
アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  １．４．１．−）およびアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）より選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目６６に記載の改変宿主細胞。
（項目７２）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数であるＣｎアミノカルボン酸を産生する、項目７１に記載の改変宿主細胞。
（項目７３）
前記宿主細胞がアミノカプロン酸を産生する、項目７２に記載の改変宿主細胞。
（項目７４）
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）、アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  １．４．１．−）、およびアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、ならびにそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目７３に記載の改変宿主細胞。
（項目７５）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数である１，ｎ−ジアミノアルカンを産生する、項目７４に記載の改変宿主細胞。
（項目７６）
前記宿主細胞がヘキサメチレンジアミンを産生する、項目７５に記載の改変宿主細胞。
（項目７７）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数であるｎ−アミノアルコールを産生する、項目７４に記載の改変宿主細胞。
（項目７８）
前記宿主細胞が６−アミノヘキサノールを産生する、項目７７に記載の改変宿主細胞。
（項目７９）
アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．７）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３）、グルタミン酸セミアルデヒドムターゼ（ＥＣ  ５．４．３．８）、３−オキソアシル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）、脂肪酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．−）、デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）、エノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．９）、およびそれらの組み合わせより選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性核酸配列をさらに含む、項目４３に記載の改変宿主細胞。
（項目８０）
前記宿主細胞が、ｎが５〜８の範囲の整数であるｎ−アミノカルボン酸を産生する、項目７９に記載の改変宿主細胞。
（項目８１）
前記宿主細胞がアミノカプロン酸を産生する、項目７９に記載の改変宿主細胞。
（項目８２）
α−ケトグルタル酸塩からのα，ω−二官能性Ｃｎアルカンの産生方法であって、ここでは、α末端官能基とω末端官能基は、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ３の群より選択され、ｎは、５〜８の範囲の整数であり、α，ω−二官能性Ｃｎアルカンを産生するために十分な条件下で項目４２に記載の宿主細胞を培養する工程；および該α，ω−二官能性Ｃｎアルカンを分離する工程を含む、方法。
【００１９】
（図面の簡単な説明）
本発明は、本願の一部を構成する以下の詳細な説明と図面からより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１は、アジピン酸の生合成経路を示す。工程ａ〜ｌは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉによるコエンザイムＢの生合成経路による２−ケト伸長経路を記載する。表示した工程ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｍ、およびｎは、以下に記載する基質から生成物への変換を示す。
【図１−２】図１は、アジピン酸の生合成経路を示す。工程ａ〜ｌは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉによるコエンザイムＢの生合成経路による２−ケト伸長経路を記載する。表示した工程ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｍ、およびｎは、以下に記載する基質から生成物への変換を示す。
【図２】図２は、α−ケト酸Ｃｎから出発する二官能性アルカンＣ（ｎ−１）の生物学的産生についての流れ図を示す。
【図３】図３は、２−ケトピメリン酸塩から出発する二官能性ヘキサンの生物学的産生についての流れ図を示す。
【図４】図４は、α−ケト酸Ｃｎから出発する二官能性アルカンＣｎの生物学的産生についての流れ図を示す。
【図５】図５は、２−ケトアジピン酸塩から出発する二官能性ヘキサンＣｎの生物学的産生についての流れ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合は、以下の用語および語句は、以下に示す意味を有するものとする。特に明記されない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２２】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、状況が明白に示されていない限りは、複数の言及を含む。
【００２３】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的であり、開かれた意味で使用され、さらに要素が含まれ得ることを意味している。
【００２４】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むが、限定されない」を意味するように使用される。「含む」および「含むが限定されない」は互換的に使用される。
【００２５】
本明細書中に記載される全ての刊行物は、引用により本明細書中に組み入れられる。本明細書中で議論される刊行物は、本発明の出願日以前のそれらの開示のためだけに提供される。いずれも、本明細書においては、本発明の以前にそのような刊行物が先行しているとの理由から本発明に権利が与えられないことの認識と解釈されるべきではない。
【００２６】
本発明の複数の態様は、迅速な、費用のかからない、そして環境的に責任を持てる方法で目的の有機脂肪族化合物を産生するための方法および材料を提供する。そのため、本発明は、多数の商業的および工業的ニーズを満たす。用語「有機分子」は、例えば、炭素および水素から主に構成される任意の分子、例えば、アルカンなどを示す。目的の有機化合物（例えば、二官能性アルカン、ジオール、ジカルボン酸など）は、石油および炭化水素に通常由来するプラスチック、ナイロン、および他の製品を合成するために使用することができる。本発明の複数の態様は、炭化水素鎖Ｃｎが、炭化水素鎖ＣｎまたはＣｎ＋１（式中、ｎは、約１〜約８までの数、例えば、約２〜約５まで、または約３〜約４までの数）から導かれる、二官能性ｎ−アルカンの合成に関する。好ましい実施形態においては、二官能性ｎ−アルカンは、α−（ｎ＋１）ケト酸またはｎケト酸から誘導される。
【００２７】
本発明の複数の態様は、微生物中での目的の二官能性アルカンの産生に関し、微生物中での炭水化物源からの二官能性アルカンの産生のための方法を提供する。本明細書中で使用される場合は、「二官能性アルカン」は、２つの官能基を有しているアルカンをいう。用語「官能基」は、例えば、その基およびそれに結合する分子の化学的特性を決定する方法で配置された複数の原子の一群をいう。官能基の例としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）、およびアミン基（−ＮＨ２）などが挙げられる。「アルコール」は、例えば、その中の１つ以上の水素原子が−ＯＨ基で置き換えられたアルキル部分をいう。用語「第１級アルコール」は、例えば、その中の−ＯＨ基が、末端炭素原子または鎖端にある（ｃｈａｉｎ−ｅｎｄｉｎｇ）炭素原子に結合されるアルコール、例えば、１−ブタノール、１−ヘキサノールなどをいう。用語「第２級アルコール」は、例えば、その中の−ＯＨ基が、１つの水素原子と２つの他の炭素原子が結合した炭素原子に結合されるアルコール、例えば、２−ブタノール、２−ヘキサノールなどをいう。用語「第３級アルコール」は、例えば、その中の−ＯＨ基が、３つの他の炭素原子が結合した炭素原子に結合されるアルコール、例えば、メチルプロパノール（ｔｅｒｔ−ブタノール）などをいう。「アミン」は、例えば、その中の１つ以上の水素原子が−ＮＨ２基によって置き換えられているアルキル部分をいう。「カルボニル化合物」は、例えば、カルボニル基Ｃ＝Ｏを含む有機化合物、例えば、アルデヒド（これは、一般式ＲＣＯＨを有する）；ケトン（これは、一般式ＲＣＯＲ'を有する）；カルボン酸（これは、一
般式ＲＣＯＯＨを有する）；および、エステル（これは、一般式ＲＣＯＯＲ'を有する）
をいう。
【００２８】
上記方法は、目的の以下の二官能性アルカンのうちの１つ、特に、アジピン酸、アミノカプロン酸、ＨＭＤ、６−ヒドロキシヘキサン酸塩を産生することができる微生物を組み込む。目的の他の二官能性アルカンとしては、１，３−プロパンジオール、グリセロール、アクリル酸、カダベリン、３−ヒドロキシプロピオン酸、ペンタメチレンジアミン、マレイン酸、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸、グルタル酸、およびスベリン酸などが挙げられる。例えば、アジピン酸およびその中間体（例えば、ムコン酸およびアジピン酸塩セミアルデヒド）について；カプロラクタムおよびその中間体（例えば、６−アミノカプロン酸）について；ヘキサン１，６ジアミノヘキサンまたはヘキサンメチレンジアミン（ｈｅｘａｎｅｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）について；３−ヒドロキシプロピオン酸およびその中間体（例えば、マロン酸塩セミアルデヒド）については、いくつかの化学合成経路が記載されているが、少数の生物学的経路が、これらの有機化学物質のいくつかについて開示されているだけである。したがって、本発明の複数の態様は、改変した代謝経路、単離した核酸または改変した核酸、ポリペプチドまたは改変したポリペプチド、宿主細胞または遺伝子改変宿主細胞、持続可能な原料から二官能性アルカンを産生するための方法および材料を提供する。出発点に適している炭素源としては、炭水化物および合成の中間体が挙げられる。細胞が代謝することができる炭水化物の例としては、糖、デキストロース、トリグリセリド、および脂肪酸が挙げられる。代謝経路による中間体生成物、例えば、ピルビン酸塩、オキサロ酢酸塩、２−ケトグルタル酸塩もまた、出発点として使用することができる。本発明の複数の態様は、天然の基質もしくは非天然の基質に対して活性または改善された活性を有しているか、あるいは、広範な基質特異性（例えば、基質無差別性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）のような触媒無差別性（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ））を有している酵素をコードする、改変したポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。用語「ポリペプチド」、ならびに用語「タンパク質」および「ペプチド」は、本明細書中では互換的に使用され、アミノ酸のポリマーを示し、これには、例えば、遺伝子産物、自然界に存在しているタンパク質、ホモログ、オルトログ、パラログ、断片、および他の等価物、上記の変異体およびアナログが含まれる。用語「酵素活性を有しているポリペプチド」は、反応の完了の際にそれ自体が分解または変化することなく、他の物質の化学反応を触媒する任意のポリペプチドをいう。典型的には、酵素活性を有しているポリペプチドは、１種類以上の基質からの１種類以上の生成物の形成を触媒する。本発明のいくつかの態様においては、いくつかの酵素の触媒無差別性の特性は、タンパク質改変と組み合わせられ得、新規の代謝経路への適用と生合成への適用において開発され得る。いくつかの実施形態においては、既存の酵素が、有機生合成における使用のために改変される。いくつかの好ましい実施形態においては、目的の二官能性ｎ−アルカンの産生に関係がある酵素としては、２−アミノ−デカルボキシラーゼ、２−ケ��デカルボキシラーゼ、末端−アミノトランスフェラーゼ、２−アミノトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノ−アルデヒドデヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびデヒドラターゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、酵素の反応機構は、新しい反応を触媒するように、基質特異性を変化させる、拡大する、または改善するように変化させられ得る。当業者は、酵素構造（例えば、結晶構造）がわかっている場合には、酵素の特性を、合理的な再設計による改変できることを理解するものとする（米国特許出願第２００６０１６０１３８号、同２００８００６４６１０号、および同２００８０２８７３２０号（これらは、これらの全体が引用により組み入れられる）を参照のこと）。酵素特性の改変または改善は、ポリペプチド鎖への、酵素の構造−機能および／または別の分子との相互作用（例えば、基質対異常な基質（ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ））を実質的に混乱させ得る改変の導入により生じ得る。ポリペプチドのいくつかの領域が酵素活性にとって重要であり得ることは当該分野で周知である。例えば、触媒に関係している、および／または基質結合ドメイン中のアミノ酸の組成の小さな撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）が、酵素機能に重要な影響を有する。いくつかのアミノ酸残基は、酵素の二次構造または三次構造の維持に重要な位置に存在し得、したがって、これらはまた、改変された場合には、酵素特性に目に見える変化をも生じる。いくつかの実施形態においては、潜在的な経路の構成要素は、上記のいずれかの変異体である。このような変異体は、無作為な変異誘発により生じさせることができるか、または、例えば、変化した基質特異性、増大した酵素活性、より大きな安定性などを有している、酵素活性の産生のための合理的設計により生じさせることができる。したがって、いくつかの実施形態においては、所望される特性を有している酵素を生じる、参照であるもとの酵素（ｐａｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ）に対する改変の数には、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸、参照である酵素を構成しているアミノ酸の総数の１０％まで、アミノ酸の総数の２０％まで、アミノ酸の総数の３０％まで、アミノ酸の総数の４０％まで、またはアミノ酸の総数の５０％までが含まれ得る。
【００２９】
当業者は、本明細書中で説明する改変経路が、限定ではないが、種特異的遺伝子に関して記載され、これには、核酸配列もしくはアミノ酸配列のホモログまたはオルトログが含まれることを理解する。ホモログおよびオルトログの配列は、当該分野で公知の方法を使用してアラインメントした場合には、比較的高い程度の配列同一性／類似性を持つ。
【００３０】
本発明の複数の態様は、新しい代謝能力または新しい代謝経路を持つように改変した、新しい微生物または「遺伝子改変した（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」微生物もしくは宿主細胞に関する。本明細書中で使用される場合は、用語「遺伝子改変した」微生物は、言及される種の野生型株においては通常は見られない少なくとも１つの遺伝的変化を有している微生物をいう。いくつかの実施形態においては、遺伝子改変した（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）微生物は、代謝経路の中の重要な点にある少なくとも１つの特定の酵素を発現するもしくは過剰発現するように、および／または他の酵素の合成を阻害して、代謝の障害を克服するかもしくは回避するように改変される。用語「代謝経路」は、１つの酵素反応の生成物が次の酵素反応の基質になる、一続きの２つ以上の酵素反応をいう。代謝経路の各工程では、中間体化合物が形成され、続く工程の基質として利用される。これらの化合物は、「代謝中間体」と呼ばれ得る。各工程の生成物は「代謝物」とも呼ばれる。
【００３１】
本発明の複数の態様は、改変した代謝経路を設計し、作製するための方法を提供する。本発明のいくつかの態様においては、１種類以上の入手可能であり、かつ持続可能な基質から目的の生成物を作製するための代替え経路が、目的の１種類以上の宿主細胞または微生物の中で作製され得る。当業者は、目的の二官能性アルカンを作製するための改変経路に複数の酵素が含まれ得、したがって、この経路からの流出が、目的の生成物の産生に最適ではない場合があることを理解するものとする。結果として、本発明のいくつかの態様においては、流出は、その経路の複数の酵素の活性レベルを互いに関係して調節することにより、最適になるように平衡化される。そのような調節の例は、本出願を通じて提供される。
【００３２】
本発明の複数の態様は、遺伝子改変した宿主細胞または微生物を提供し、そしてα−ケト酸から二官能性ｎ−アルカンを産生するためにそれらを使用する方法を提供する。宿主細胞は、本明細書中で使用される場合は、インビボまたはインビトロの真核生物細胞、原核生物細胞、または単細胞性の物質（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｙ）として培養された多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株）をいう。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのような細菌）であり得、また、真核生物細胞（例えば、酵母、哺乳動物細胞、または昆虫細胞）でもあり得る。例えば、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、マイコバクテリウム属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、または他の適している細菌細胞）、古細菌（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、もしくはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、または他の適している原始細胞）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｃｈｉａ種、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、または他の適している酵母種）であり得る。真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞は、遺伝子改変することができるか、または遺伝子改変されており（「組み換え体宿主細胞」、「代謝を改変した細胞」、または「遺伝子改変した細胞」とも呼ばれる）、核酸（例えば、１つ以上の生合成経路の遺伝子産物または改変経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター）についてのレシピエントとして使用される。真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞はまた、核酸で遺伝子改変したもとの細胞の子孫も示す。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、その代謝特性について選択され得る。例えば、選択またはスクリーニングが特定の代謝経路と関係がある場合は、これは、関連する経路を有する宿主細胞を使用することが有利になると考えられる。そのような宿主細胞は、この宿主細胞が、その経路の１種類以上の中間体または生成物を処理するか、または移入するか、または送り出すことを可能にする特定の生理学的適応性を有し得る。しかし、他の実施形態においては、目的の特定の経路と関係がある酵素を発現しない宿主細胞が、遺伝子エレメントの適切なセットを使用してその経路に必要な構成要素の全てを同定することができるように選択され得、これにより、記宿主細胞に依存せずに１つ以上の不明な工程（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｓｔｅｐ）を提供し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態においては、嫌気性の細菌性生物が代謝改変される。本明細書中で使用される場合は、嫌気性生物は、増殖のために酸素を必要としない（すなわち、嫌気性条件）任意の生物である。有利には、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂ．ｆｌａｖｕｍ、またはＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ細胞であり得る。これらの株は、現在、細菌発酵プロセスを使用してアミノ化合物を作製するために工業的に使用されている。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍは、アミノ酸の産生に広く使用されている（例えば、Ｌ−グルタミン酸塩、Ｌ−リジン、Ｅｇｇｌｅｇｉｎｇ  Ｌら、２００５、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００３４】
本発明の代謝改変細胞は、改変した代謝経路に関係がある酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換することにより作製される。本明細書中で使用される場合は、用語「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「遺伝子構築物」は互換的に使用され、合成のヌクレオチド塩基、天然のものではないヌクレオチド塩基、または変化したヌクレオチド塩基を必要に応じて含む、ＲＮＡもしくはＤＮＡの一本鎖または二本鎖のポリマーを意味する。ヌクレオチド配列には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡの１つ以上のセグメントが含まれ得る。好ましい実施形態においては、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを変化させることなく、宿主細胞の典型的なコドン使用法を反映するようにコドン最適化される。特定の実施形態においては、用語「コドン最適化」または「コドン最適化された」は、特定の宿主細胞中での発現を増強するために、その核酸によりコードされるポリペプチドの配列を改変することなく、核酸配列のコドンの中身を改変することをいう。特定の実施形態においては、この用語は、ポリペプチドの発現レベルを制御する（例えば、発現レベルを増大させるかまたは低下させるかのいずれか）ための１つの手段として、核酸配列のコドンの中身を改変することを含むように意味される。したがって、本発明の複数の態様は、改変した代謝経路と関係がある酵素をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、代謝改変細胞は、以下に記載する工程を実施するために必要な酵素活性を有している１つ以上のポリペプチドを発現し得る。例えば、特定の細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または５つより多い核酸配列を含み得、これらは各々、α−ケト酸の二官能性アルカンへの変換を実施するために必要なポリペプチド（複数可）をコードする。あるいは、１つの核酸分子は、１つ、または２つ以上のポリペプチドをコードし得る。例えば、１つの核酸分子は、２つ、３つ、４つ、またはさらには５つの異なるポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。本明細書中に記載する本発明に有用な核酸配列は、様々な供給源から、例えば、ｃＤＮＡ配列の増幅、ＤＮＡライブラリー、デノボ合成、ゲノムセグメントの切り出しにより、得ることができる。そのような供給源から得た配列は、その後、所望される改変を有している核酸配列を生じさせるための標準的な分子生物学および／または組み換えＤＮＡ技術を使用して改変することができる。核酸配列の改変のための例示的な方法としては、例えば、連結、相同組み換え、部位特異的組み換え、またはそれらの様々な組み合わせと必要に応じて組み合わせた、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、欠失、挿入、置換、制限酵素を使用した配列の複数の部分の交換が挙げられる。他の実施形態においては、核酸配列は、合成の核酸配列であり得る。合成のポリヌクレオチド配列は、米国特許第７３２３３２０号に、シリアルナンバー１１／８０４９９６号を有している同時係属中の出願の中に、ならびに米国特許公開第１００６／０１６０１３８号および同２００７／０２６９８７０号（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れ���れる）に記載されている様々な方法を使用して産生され得る。
【００３５】
細菌細胞、植物細胞、および動物細胞についての形質転換方法は当該分野で周知である。一般的な細菌の形質転換方法としては、エレクトロポレーションおよび化学的改変が挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、遺伝子改変される宿主細胞は、適切な媒体中でインビトロで培養された場合に、目的の生成物または中間体を、少なくとも０．１ｇ／ｌ、少なくとも１ｇ／ｌ、または少なくとも１０ｇ／ｌのレベルで産生するように遺伝子改変される。当業者は、遺伝子改変宿主細胞により産生される目的の生成物またはその代謝中間体のレベルを、様々な方法で制御できることを理解するものとする。いくつかの実施形態においては、発現レベルは、改変経路と関係がある１種類以上の酵素をコードする核酸配列のコピー数により制御される（例えば、高コピー数の発現ベクター対中コピー数または低コピー数の発現ベクター）。好ましくは、核酸配列は、ベクターを使用して細胞に導入される。低コピー数の発現ベクターは、一般的には、細胞１つあたり２０未満のコピー数を提供する（例えば、細胞１つあたり、１〜約５、５〜約１０、１０〜約１５、１５〜約２０コピーの発現ベクター）。原核生物細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）に適している低コピー数の発現ベクターとしては、ｐＡＹＣ１８４、ｐＢｅｌｏＢａｃ１１、ｐＢＲ３３２、ｐＢＡＤ３３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳおよびその誘導体、ｐＳＣ１０１、ＳｕｐｅｒＣｏｓ（コスミド）、ならびにｐＷＥ１５（コスミド）が挙げられるが、これらに限定されない。中コピー数の発現ベクターは、一般的には、細胞１つあたり約２０〜約５０の発現ベクターのコピー、または細胞１つあたり約２０〜８０の発現ベクターのコピーを提供する。原核生物細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）に適している中コピー数の発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＡＤ２４、およびＣｏｌＥ１複製起点を含有しているベクター、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。高コピー数の発現ベクターは、一般的には、細胞１つあたり約８０〜約２００、またはそれより多くの発現ベクターのコピーを提供する。原核生物細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）に適している高コピー数の発現ベクターとしては、ｐＵＣ、ＰＣＶ１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、およびｐＴＺベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の複数の態様は、改変経路に関係があるポリペプチドをコードする核酸またはその部分配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態においては、上記発現カセットは、転写エレメント（例えば、プロモーター）に、およびターミネーターに作動可能であるように連結された核酸を含み得る。本明細書中で使用される場合は、用語「カセット」は、そのヌクレオチド配列中に存在する１つ以上の調節配列に作動可能に連結されるように特定の遺伝子が挿入されると、上記特定の遺伝子を発現することができるヌクレオチド配列をいう。したがって、例えば、発現カセットには、宿主細胞中で発現される所望される異種遺伝子が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、１つ以上の発現カセットが、公知の組み換え技術によりベクターに導入され得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素による所望される核酸配列の転写を開始し、制御するヌクレオチドの配列である。いくつかの実施形態においては、プロモーターは誘導性であり得る。他の実施形態においては、プロモーターは、構成的であり得る。原核生物宿主細胞中での使用に適しているプロモーターの限定ではない例としては、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃオペロンプロモーターなどが挙げられる。原核生物細胞中での使用に適している強いプロモーターの限定ではない例としては、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ５、Ｔ７、Ｔｒｃ、Ｔａｃなどが挙げられる。真核生物細胞中での使用に適しているプロモーターの限定ではない例としては、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。終結制御領域もまた、好ましい宿主の生来の様々な遺伝子に由来し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態においては、改変経路の第１の酵素は、第１のプロモーターの制御下にあり得、そして改変経路の第２の酵素は、第２のプロモーターの制御下にあり得る。ここでは、第１のプロモーターと第２のプロモーターは、異なる強さを有する。例えば、第１のプロモーターが第２のプロモーターより強い場合があり、また第２のプロモーターが第１のプロモーターより強い場合もある。結果として、第１の酵素のコピー数を増大させることにより、および／または第１の酵素が作動可能であるように連結されるプロモーターの強度を、第２の酵素が作動可能であるように連結されるプロモーターの強度と比較して増大させることにより、改変経路における第２の酵素のレベルと比較して、第１の酵素のレベルが増大させられ得る。いくつかの他の実施形態においては、改変経路の複数の酵素が、同じプロモーターの制御下にあり得る。他の実施形態においては、リボゾーム結合部位の変更が、その経路の異なる酵素の相対的な翻訳および発現に影響を及ぼす。リボソーム結合部位の変更は、その経路の酵素の相対的発現を制御するために単独で使用することができ、また、これらもまた遺伝子発現レベルに影響を及ぼす上記プロモーターの改変およびコドン最適化と合わせて使用することもできる。
【００３９】
１つの例示的な実施形態においては、潜在的経路の酵素の発現は、上記経路の酵素が反応混合物中で作用する基質の存在に依存し得る。例えば、ＡからＢへの変換を触媒する酵素の発現が、媒体中のＡの存在下で誘導され得る。そのような経路の酵素の発現は、誘導を引き起こす化合物を添加することによるか、または生合成経路のプロセスの間の化合物の自然な生成（例えば、インデューサーは、所望される生成物を生じるための生合成プロセスの間に生じる中間体であり得る）によるかのいずれかで、誘導され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、コンピューターで実行される設計技術が、目的の有機分子を生成するための代替え経路を作製するために使用され得る。いくつかの実施形態においては、データベースにはゲノムについての情報が含まれ、それらのリンクを、新規の代謝経路を設計するために利用することができる。データベースの例は、ＭｅｔａＣｙｃ（代謝経路および酵素のデータベース、ミネソタ大学の生体触媒／生体分解のデータベース（有機化合物についての微生物による触媒反応および生分解経路のデータベース）、ＬＧＡＮＤ（代謝物および他の化合物、代謝反応および他の反応を表す基質−生成物の関係についての情報を提供し、酵素分子についての情報を示す複合的データベース）である。経路の構成要素についてのデータベースにはまた、予想される機能、推測される機能、または機能が不明である複数の構成要素が含まれ得る。これには、定義されていない組成を有し得る定義された機能の擬似成分（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）もまた含まれ得る。いくつかの実施形態においては、１つのプログラムが、公になっている（例えば、特許権の範囲に含まれていない、および／またはライセンス料の支払いの対象ではない）ドメインの中にある調節エレメントおよび／または機能的エレメントの組み合わせを設計することができる。自由に利用できる遺伝子エレメントのデータベースが作製され得、そして／または代替え経路を生じるように組み合わせることができる核酸配列の供給源として使用され得る。既知の機能的エレメントおよび／または調節エレメント（例えば、様々な種に由来するもの）の様々な組み合わせを含む代替え経路を設計し、組立て、そして／または試験することができる。酵素エレメント領域中にバリエーションを含むライブラリーが、異なるタイプの酵素の、あるいは同じ酵素の異なる変異体の相対的効果を解明するために使用され得る。調節エレメント領域中にバリエーションを含むライブラリーが、複数の遺伝子のセットのうちの最適な発現レベルまたは調節制御を解明するために使用され得る。
【００４１】
様々な経路をコードする複数の核酸が組立てられ得る。いくつかの実施形態においては、様々な改変経路の機能的特性が、宿主細胞または生物を、適切な組立た核酸で形質転換し、改変した生物の特性をアッセイすることにより、インビボで試験され得る。いくつかの実施形態においては、様々な改変経路の機能的特性が、組立てた核酸から発現された成分を単離し、インビトロシステムにおいて複数の構成要素の適切な組み合わせを試験することにより、インビトロで試験され得る。
【００４２】
（Ｉ．２−ケト酸（Ｃ５〜Ｃ８）の産生のための改変したコエンザイムＢ合成経路）
本発明の複数の態様は、コエンザイムＢの生合成に関係があるα−ケト酸鎖の伸長反応を介した二官能性ｎ−アルカンの産生のための新規の改変経路を提供する（図１を参照のこと）。本明細書中で使用される場合は、α−ケト酸、または２−オキソ酸、または２−ケト酸は、互換的に使用され、カルボン酸基に隣接するケトン官能基を含む有機酸を意図する。コエンザイムＢの生合成と関係があるα−ケト酸鎖の伸長反応（２−オキソ酸の伸長とも呼ばれる）は、α−ケトグルタル酸塩（Ｃ５鎖）とアセチルＣｏＡをα−ケトスベリン酸塩（Ｃ８鎖）（コエンザイムＢ（７−メルカプトヘプタノイルスレオニンホスフェート）の前駆体）と、おそらくはビオチンに変換する生合成経路をいうように本明細書中で使用される。多くの生物は、酵素ＰＥＰカルボキシラーゼによりＰＥＰから、またはビオチン依存性酵素であるピルビン酸カルボキシラーゼによりピルビン酸塩からのいずれかにより産生されたオキサロ酢酸塩により、α−ケトグルタル酸塩を合成することができる。α−ケトグルタル酸塩はクレブス回路の重要な中間体であり、α−ケト酸伸長の経路への入力として働く。α−ケト酸伸長のコエンザイムＢ経路には、以下の工程を触媒する酵素が含まれる：
（１）ホモクエン酸塩を形成させるためのα−ケトグルタル酸塩とアセチルＣｏＡの縮合（例えば、例えばＡｋｓＡ、ＮｉｆＶ、Ｈｃｓ、Ｌｙｓ  ２０／２１のようなホモクエン酸シンターゼの作用による）。
（２）中間体として働くシスホモアコニット酸塩を用いる（２Ｒ，３Ｓ）ホモイソクエン酸塩への脱水および水和（例えば、例えばＡｓｋＤ／Ｅ、ＬｙｓＴ／Ｕ、Ｌｙｓ４、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼのようなホモアコニターゼの作用による）。
（３）α−ケトアジピン酸塩への（２Ｒ，３Ｓ）ホモイソクエン酸塩の酸化的脱カルボキシル化（例えば、例えばＡｋｓＦ、Ｈｉｃｄｈ、Ｌｙｓ１２、２−オキソスベリン酸シンターゼ、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼのようなホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼの作用による）。
【００４３】
その後、得られるα−ケトアジピン酸塩（Ｃ６鎖）について、２セットの連続するα−ケト酸鎖伸長反応を行い、中間体としてのα−ケトピメリン酸塩と、α−ケトスベリン酸塩を得る。この一連の反応により得られるα−ケトスベリン酸塩について、その後、非酸化的脱カルボキシル化を行い、コエンザイムＢの前駆体である７−オキソヘプタン酸を形成させる。
【００４４】
α−ケト酸の伸長経路の１つの十分に特性決定された例は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのコエンザイムＢ生合成経路である。この経路には、図１の工程ａ−１を触媒する３種類の酵素が存在する。ＡｋｓＡ（工程ａ、ｅ、およびｉを触媒する）は、ホモクエン酸シンターゼである。ＡｋｓＤ／Ｅ（工程ｂ、ｃ、ｆ、ｇ、ｊ、ｋを触媒する）は、ＡｋｓＤとＡｋｓＥのヘテロ四量体であり、ホモアコニターゼである。ＡｋｓＦ（工程ｄ、ｈ、およびｌを触媒する）は、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼである。これらの酵素は全て、複数の反応工程を触媒することが示されており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＡｋｓＤ／Ｅは、両方のヒドロリアーゼ反応を触媒することが今日までに示された唯一のホモアコニターゼである（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８；Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０００；Ｄｒｅｖｌａｎｄら、ＪＢＣ，２００８）。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉが、好熱性メタン産生菌であり、全てのＡｋｓ酵素が５０〜６０℃で特性決定されていることに留意しなければならない。いくつかの実施形態においては、３７℃で増殖する他のメタン産生菌に由来する代替えのＡｋｓホモログが使用され得る。そのようなＡｋｓホモログが同定されており、これには、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２遺伝子ａｋｓＡ（ＭＭＰ０１５３）、ＭＭＰ１４８０、ＭＭＰ０３８１、およびａｋｓＦ（ＭＭＰ０８８０）が含まれる。
【００４５】
α−ケトグルタル酸塩（Ｃ５）で出発する経路は、伸長ラウンドの回数に応じて様々な以下の中間体を有する：α−ケトアジピン酸塩（Ｃ６）、α−ケトピメリン酸塩（Ｃ７）、およびα−ケトスベリン酸塩（Ｃ８）。結果として、本発明のいくつかの態様においては、所望される生成物の炭化水素鎖の長さ（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７）に応じて、伸長されない（二官能性ブタンの産生について）、わずか１回の伸長ラウンド（例えば、二官能性ペンタンの産生について、工程ａ〜ｄ）、２回の伸長（例えば、二官能性ヘキサンの産生について、工程ａ〜ｈ）、または３回の伸長（例えば、二官能性ヘプタンの産生について、工程ａ〜ｌ）が必要とされ得る。したがって、炭化水素鎖の長さに応じて、２−ケトアジピン酸塩中間体またはケトピメリン酸塩中間体のいずれかの利用できる度合いを最大にすることが望ましい場合があることが理解されるものとする。いくつかの実施形態においては、２−ケトアジピン酸塩中間体の利用できる度合いを最大にするために、工程ａ〜ｄを維持し、工程ｅ〜ｌを排除することが所望される。他の実施形態においては、ケトピメリン酸塩中間体の利用できる度合いを最大にするために、工程ａ〜ｈを維持し、工程ｉ〜ｌを排除することが所望され得る。
【００４６】
上記のように、各伸長工程には、３種類の酵素（アシルトランスフェラーゼまたはアシルトランスフェラーゼホモログ、ホモアコニターゼまたはホモアコニターゼホモログ、およびホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼまたはホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼホモログ）のセットが含まれる。各伸長工程の第１の反応は、アシル基を、運搬される（ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）アルキル基に変換するアセチルトランスフェラーゼ酵素により触媒される。いくつかの実施形態においては、アシルトランスフェラーゼ酵素はホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．３．３．１４）である。ホモクエン酸シンターゼ酵素は、以下の化学反応を触媒する：
【００４７】
【数１】
2015221054.tif 000002
生成物である（Ｒ）−２−ヒドロキシブタン−１，２，４−トリカルボン酸塩は、ホモクエン酸塩としても知られている。いくつかのホモクエン酸シンターゼ（例えば、ＡｋｓＡ）が、広範な基質範囲を有し、アセチルＣｏＡを用いるオキソアジピン酸塩とオキソピメリン酸塩の縮合を触媒することが示されている（Ｈｏｗｅｌｌら、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３７巻，ｐｐ１０１０８−１０１１７）。本発明のいくつかの態様は、オキソグルタル酸塩に対して、またはオキソグルタル酸塩とオキソアジピン酸塩に対して基質特異性を有しているホモクエン酸シンターゼを提供する。好ましいホモクエン酸シンターゼは、ＥＣ番号２．３．３．１４により知られている。一般的には、適している酵素の選択のためのプロセスには、他の生物からホモログを検索することによって自然界での多様性のうちから酵素を検索すること、および／または、人工的な多様性を作製し、検索すること、そして選択した酵素の特異性および活性を持つ変異体を選択することが含まれ得る。候補のホモクエン酸シンターゼ、候補のホモアコニターゼ、および候補のホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼを表１に列挙する。
【００４８】
【表１】
2015221054.tif 000003
いくつかの実施形態においては、上記経路の第１の工程は、ホモクエン酸シンターゼＮｉｆＶまたはＮｉｆＶホモログにより触媒されるように改変される。ＮｉｆＶのホモログは、以下を含むがこれらに限定されない様々な生物中で見られる：Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、フランキア属の種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．）（株ＦａＣｌ）、アナベナ属の種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）（株ＰＣＣ  ７１２０）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｆｒａｎｋｉａ  ａｌｎｉ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ（株Ｚ−２９０１／ＤＳＭ  ６００８）、アナベナ属の種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）（株ＰＣＣ  ７１２０）、Ｆｒａｎｋｉａ  ａｌｎｉ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、アゾアルクス属の種（Ａｚｏａｒｃｕｓ  ｓｐ．）（株ＢＨ７２）、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ、ブラディリゾビウム属の種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）（株ＯＲＳ２７８）、ブラディリゾビウム属の種（株ＢＴＡｉ１／ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（株ＡＴＣＣ  ８５２７／ＤＳＭ  ５５５／ＮＣＩＭＢ  １０６８０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（株ＡＴＣＣ  ８５２７／ＤＳＭ  ５５５／ＮＣＩＭＢ  １０６８０），Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ５５２１、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ（株Ｒ１／ＬＭＧ  １９４２４）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ（株ＬＭＧ  １９４２４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（株Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ／タイプＢ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（株Ａｌａｓｋａ  Ｅ４３／タイプＥ３）、シネココックス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（株ＪＡ−２−３Ｂ'ａ（２−１３））（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ  Ｂ−Ｐｒｉｍｅ）、シネココックス属の種（株ＪＡ−３−３Ａｂ）（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ  Ａ−Ｐｒｉｍｅ）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ。ＮｉｆＶは、基質としてオキソグルタル酸塩（酵素工程ａ）およびオキソアジピン酸塩（酵素工程ｅ）を使用することが示されているが、オキソピメリン酸塩を基質として使用することは明らかにされていない（Ｚｈｅｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７９巻，ｐｐ５９６３−５９６６）。結果として、ホモクエン酸シンターゼＮｉｆＶを含む改変した２−ケト−伸長経路は、２−ケト伸長経路の工程ｉ〜ｌを排除し、２−ケトピメリン酸塩中間体の利用できる度合いを最大にする。
【００４９】
いくつかの実施形態においては、上記経路の第１の工程は、ホモクエン酸シンターゼＬｙｓ  ２０またはＬｙｓ  ２１により触媒されるように改変される。Ｌｙｓ  ２０とＬｙｓ  ２１は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのリジン生合成経路の第１の工程に関与している２種類のホモクエン酸シンターゼイソ酵素である。Ｌｙｓ
２０のホモログまたはＬｙｓ  ２１のホモログは、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのように、様々な生物の中に見られる。Ｌｙｓ  ２０およびＬｙｓ  ２１酵素は、基質としてオキソグルタル酸塩を使用するが、オキソアジピン酸塩またはオキソピメリン酸塩は使用しないことが示されている。結果として、Ｌｙｓ  ２０／２１を含む改変した２−ケト伸長経路は、２−ケト伸長経路において工程ｅ〜ｌを排除し、２−オキソアジピン酸塩の利用できる度合いを最大にする。いくつかの実施形態においては、アセチルコエンザイムＡと基質としてのα−ケト酸を含む反応を触媒する酵素が、ａ−ケト酸をホモクエン酸塩に変換するために使用される（例えば、ＥＣ  ２．３．３．−）。Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ  ａｒｃｈａｅａは、ＡｋｓＡの３種類の密接に関係しているホモログを含む：２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ）、およびシトラリンゴ酸（２−メチルリンゴ酸）シンターゼ（ＣｉｍＡ）（これは、アセチル−ＣｏＡをピルビン酸塩とともに縮合する）。この酵素は、メタン産生菌において、およびおそらくはスレオニンデヒドラターゼを欠失している他の種において、イソロイシンの生合成に関係していると考えられる。いくつかの実施形態においては、アシルトランスフェラーゼ酵素は、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｍｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（例えば、ＬｅｕＡ、ＥＣ  ２．３．３．１３）、またはシトラリンゴ酸シンターゼ（例えば、ＣｉｍＡ、ＥＣ  ２．３．１．１８２）である。
【００５０】
ケト伸長経路の第２の工程は、ホモアコニターゼ酵素により触媒される。ホモアコニターゼ酵素は、水和（ｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ）および脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ）反応を触媒する：
【００５１】
【数２】
2015221054.tif 000004
【００５２】
【化１】
2015221054.tif 000005
いくつかの実施形態においては、ホモアコニターゼは、ＡｋｓＤ／Ｅ、ｌｙｓＴ／Ｕ、またはｌｙｓ４、あるいはそれらのホモログまたは変異体である。ホモアコニターゼＡｋｓＤ／ＥおよびｌｙｓＴ／Ｕは、それぞれ、２つのポリペプチドＡｋｓＤとＡｋｓＥ、ｌｙｓＴとｌｙｓＵからなることが示されている。
【００５３】
各ケト伸長サイクルの最後の工程は、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される。ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ  １．１．１．８７）は、以下の化学反応を触媒する酵素である：
【００５４】
【数３】
2015221054.tif 000006
いくつかの実施形態においては、ホモクエン酸デヒドロゲナーゼとして、ＡｋｓＦ、Ｈｉｃｄｈ、ｌｙｓ１２、およびＬｅｕＢ（ＥＣ１．１．１．８５）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｅｕＢは、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．８５）（ＩＭＤＨ）であり、これは、細菌および真菌においてロイシンの生合成の第３の工程（３−イソプロピルリンゴ酸塩の２−オキソ−４−メチル吉草酸塩への酸化的脱カルボキシル化）を触媒する。２−ケトイソ吉草酸が、３工程の伸長サイクルを通じて、ロイシンの生合成経路のＬｅｕＡ（２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ）、ＬｅｕＣ、ＬｅｕＤ（３−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ複合体）、およびＬｅｕＢ（３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）により、２−ケトイソカプロン酸塩に変換されることが示されている。当業者は、これらの酵素が広範な基質特異性を有し（Ｚｈａｎｇら（２００８）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓを参照のこと）、α−ケト酸伸長反応を触媒し得ることを理解するものとする。いくつかの実施形態においては、ＬｅｕＡ、ＬｅｕＣ、ＬｅｕＤ、およびＬｅｕＢは、α−ケトグルタル酸塩のα−ケトアジピン酸塩への伸長、およびα−ケトアジピン酸塩のα−ケトピメリン酸塩への伸長を触媒する。
【００５５】
（ＩＩ．α−ケト酸（Ｃ５〜Ｃ８）からの二官能性アルカン（Ｃ４〜Ｃ７）の産生のための改変経路）
図２に示すように、組み換え体微生物を用いるα−ケト酸源からの二官能性アルカンの産生のための潜在的経路がいくつか存在する。本発明の複数の態様は、α−ケト中間体の、二官能性ブタン分子、二官能性ペンタン分子、二官能性ヘキサン分子、二官能性ヘプタン分子への生物学的変換に関する。目的の二官能性ブタン分子としては、１，４−ブタンジオール、１−ヒドロキシブタノエート、コハク酸、１，４−ジアミノブタン、４−アミノブタナール、および４−アミノブタノールが挙げられるが、これらに限定されない。目的の二官能性ペンタン分子としては、１−ヒドロキシペンタン酸塩、１，５−ペンタンジオール、グルタル酸塩、カダベリン（ペンタン−１，５−ジアミン）、５−アミノペンタナール、および５−アミノペンタノールが挙げられるが、これらに限定されない。目的の二官能性ヘキサン分子としては、１−ヒドロキシヘキサン酸塩、１，６−ヘキサンジオール、アジピン酸塩、ヘキサメチレンジアミン、アミノカプロン酸、６−アミノヘキサナール、および６−アミノヘキサノールが挙げられるが、これらに限定されない。目的の二官能性ヘプタン分子としては、１−ヒドロキシヘプタン酸塩、１，７−ヘプタンジオール、ピメリン酸、１，７−ジアミノヘプタン、７−アミノヘプタナール、および７−アミノヘプタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、二官能性アルカンの産生のための第１の潜在的経路には、第１のα−ケト酸脱カルボキシル化（酵素工程Ｉ）が含まれる。本発明のいくつかの態様は、非酸化的脱カルボキシル化によりカルボキシル基を除去するための方法を開示する。これは、α−ケト酸デカルボキシラーゼと実質的に類似する生物学的活性を有しているタンパク質を宿主細胞中で発現させて、カルボン酸セミアルデヒドを生じさせることにより行われる。用語「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」（ＫＤＣ）は、α−ケト酸のカルボン酸セミアルデヒドと二酸化炭素への変換を触媒する酵素をいう。特定の目的のいくつかのＫＤＣは、以下のＥＣ番号により知られている：ＥＣ  ４．１．１．１；ＥＣ  ４．１．１．８０、ＥＣ  ４．１．１．７２、４．１．１．７１、４．１．１．７、４．１．１．７５、４．１．１．８２、４．１．１．７４（以下の表２を参照のこと）。いくつかのＫＤＣは広い基質範囲を有するが、他のＫＤＣは、より基質特異性が高い。ＫＤＣは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび細菌を含むが、これらに限定されない多数の供給源から入手することができる。いくつかの例示的な実施形態においては、使用されるＫＤＣとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のＫｉｖＤ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ６８４Ｊ７）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＲＯ１０（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０６４０８）、ＰＤＣ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０６１６９）、ＰＤＣ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１６４６７）、ＰＤＣ６（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２６２６３）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴｈｉ３、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のｋｇｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ  ５０４６３）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来のｍｄｌｃ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２０９０６）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のａｒｕｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＡＡＧ０８３６２）、Ｓ．ｗｅｄｍｏｒｅｎｓｉｓ由来のｆｏｍ２（ＵｎｉＰｒｏｔ
Ｑ５６１９０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｃｕｌｕｍ由来のＰｄｃ、Ｅ．ｃｏａｃａｅ由来のｉｐｄＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２３２３４）、または同じ微生物種もしくは他の微生物種由来の他の任意の相同タンパク質。いくつかの実施形態においては、ケト酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ番号ＥＣ  ４．１．１．１により知られているピルビン酸デカルボキシラーゼである。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸のアセトアルデヒドと二酸化炭素への脱カルボキシル化を触媒する酵素である。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび細菌を含むがこれらに限定されない多数の供給源から入手することができる（米国特許第２００８０００９６０９号（これは引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。いくつかの実施形態においては、α−ケト酸デカルボキシラーゼは、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼＫｉｖＤであり、これは、自然界においては、α−ケトイソ吉草酸塩のイソブチルアルデヒドと二酸化炭素への変換を触媒する。いくつかの実施形態においては、α−ケト酸デカルボキシラーゼは、分岐鎖のα−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ番号４．１．１．７２）である。当業者は、いくつかのＫＤＣが広範な基質範囲を有することが示されているので、基質特異性が、遺伝子の供給源を選択する際の重要な考慮事項であり得ることを理解するものとする。したがって、いくつかの実施形態においては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素は、ピルビン酸塩よりも、α−ケトスベリン酸塩、α−ケトピメリン酸塩、α−ケトアジピン酸塩、またはα−ケトグルタル酸塩に対して嗜好性を示すように改変される。好ましくは、改変した酵素は、ピルビン酸塩を少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍上回る嗜好性の増大を示す。
【００５７】
好ましい実施形態においては、組み換え体宿主細胞中で発現されたＫＤＣは、α−ケトスベリン酸塩のピメリン酸セミアルデヒドへの変換、またはα−ケトピメリン酸塩のアジピン酸セミアルデヒドへの変換、またはα−ケトアジピン酸塩のグルタル酸セミアルデヒドへの変換、またはα−ケトグルタル酸塩のコハク酸セミアルデヒドへの変換を触媒する。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、カルボン酸セミアルデヒド（例えば、コハク酸セミアルデヒド、グルタル酸セミアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒド、および／またはピメリン酸セミアルデヒド）は、アルデヒド官能基をアルコール官能基に変換する（酵素工程１、図２）アルコールデヒドロゲナーゼにより、ヒドロキシルカルボン酸（ヒドロキシルブタン酸塩、ヒドロキシペンタン酸塩、ヒドロキシヘキサン酸塩、ヒドロキシヘプタン酸塩）に変換される。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ  １．１．１．１およびＥＣ  １．１．１．２）は、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元を伴う、ケトンとアルデヒドのアルコールへの可逆的還元を触媒する。いくつかの実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼとしては、ａｄｈＡまたはａｄｈＢ（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ由来）、ブタノールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来）、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、およびＡＤＨＩＶアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来）、またはＡＤＨ６（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、ヒドロ−カルボン酸は、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを使用する（酵素工程２、図２および図３）脱水素に供され、アルカンジオール（例えば、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、および／または１，７−ヘプタンジオール）が生じる。
【００６０】
アルデヒドＮＡＤ（＋）デヒドロゲナーゼ活性およびアルコールＮＡＤ（＋）デヒドロゲナーゼ活性は、２種類の異なるポリペプチドにより行われ得るか、または、１種類のポリペプチド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の多官能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）（Ｇｏｏｄｌｏｖｅら、Ｇｅｎｅ  ８５：２０９−１４，１９８９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３３５０４）により行われ得る。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）＋）（ＥＣ  １．２．１．−）活性またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（＋））（ＥＣ  １．２．１．３）活性を有しているポリペプチドは、残っているカルボン酸をアルコールに還元するために、アルコールデヒドロゲナーゼと組み合わせて使用することができ、これによりアルカンジオールが生じる。そのようなポリペプチドをコードする核酸は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むがこれに限定されない様々な種から得ることができる。
【００６１】
他の実施形態においては、カルボン酸セミアルデヒド（例えば、コハク酸セミアルデヒド、グルタル酸セミアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒド、ピメリン酸セミアルデヒド）は、アルデヒドデヒドロゲナーゼの使用を通じて、ジカルボン酸（例えば、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、および／またはピメリン酸に変換される（酵素工程３、図２および図３）。
【００６２】
本発明の１つの態様においては、アミノカルボン酸の産生のために、最初のα−ケト酸脱カルボキシル化工程に続いて、１−アミノトランスフェラーゼ酵素工程（酵素工程４、図２および図３）が行われる。特に、この改変経路を使用して合成することができる目的の生成物としては、アミノカプロン酸、アミノブタン酸、アミノヘプタン酸、および／またはアミノペンタン酸が挙げられる。いくつかの実施形態においては、酵素工程４は、カルボン酸セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼを含む。カルボン酸セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ活性を有している酵素は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓを含むがこれらに限定されない多数の供給源から入手することができる。アミノトランスフェラーゼ反応を触媒することができる例示的な酵素は、オルニチン−オキソ酸トランスアミナーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｒｏｄＤ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ由来のＯＡＴ、ＥＣ  ２．６．１．１３）、アルギニン分解酵素オルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１３）、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓまたはＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ由来のリジン−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３６）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓの４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａの４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのサッカロピンデヒドロゲナーゼＬＹＳ９およびＬＹＳ１（それぞれ、ＥＣ  １．５．１．１０および１．５．１．７）、あるいは、同じ微生物種または他の微生物種由来の任意の相同タンパク質である。
【００６３】
目的のジアミノアルカンまたはアミノアルコールの産生のための２つの潜在的経路には、アルデヒドデヒドロゲナーゼを使用するアミノカルボン酸のアミノアルデヒドへの変換（酵素工程５、図２および図３）、それに続く酵素工程６または酵素工程７が含まれる。別の実施形態においては、２−アミノジカルボン酸は、２−アミノデカルボキシラーゼに供され得（酵素工程８）、これによりアミノカルボン酸が生じる。いくつかの実施形態においては、酵素工程８につづいて、アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒される脱水素工程が行われる（酵素工程５）。得られるアミノアルデヒド代謝物は、２つの異なる酵素工程の基質として使用され得る。酵素工程６には、１−アミノトランスフェラーゼが含まれ、アミノ−アルデヒドのジアミノアルカンへの変換を触媒する。あるいは、アルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素工程７は、アミノ−アルデヒドのアミノ−アルコールへの変換を触媒する。酵素工程６には、アミノトランスフェラーゼ酵素が含まれ、ジアミノアルカン（例えば、ヘキサメチレンジアミン（ＨＤＤ）、カダベリン（すなわち、ペンタメチレンジアミン）、ジアミノブタン、および／またはジアミノヘプタン（ｄｉｍａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｅ））を生じる。酵素工程７には、アルコールデヒドロゲナーゼが含まれ、アミノブタノール、アミノペンタノール、アミノヘキサノール（すなわち、６−ヒドロキシヘキサミン（６ＨＨ））、およびアミノヘプタノールを生じる。
【００６４】
第２の潜在的経路には、第１の２−アミノトランスフェラーゼ（酵素工程ＩＩ、図２および図３）が含まれ、これにより２−アミノジカルボン酸が生じる。アミノトランスフェラーゼ活性を発現する好ましい候補の目的の遺伝子としては、ｌｙｓＮ（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．７）をコードする）およびホモログ（例えば、ｋａｔ２）；ａａｄａｔ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのアミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）をコードする）、ＡＡＤＡＴ（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのアミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼをコードする）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノトランスフェラーゼ活性を有している代替えの酵素としては、ｄｄｈ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ由来、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）をコードする）およびｄａｐｄｈ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１６）をコードする）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を発現する候補の遺伝子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１５）、例えば、ｇａｄＡ／Ｂ（Ｅ．ｃｏｌｉのイソ型Ａまたはイソ型Ｂをコードする）、ＧＡＤ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）、ＧＡＤ１／２（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来）、ＧＡＤ１／２（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ由来）、およびそれらのホモログ、あるいは、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、例えば、ＬｙｓＡ（ＥＣ  １．１．１．２０、Ｅ．ＣｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）、またはＡＴ５Ｇ１１８８０（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来）、またはＡＴ３Ｇ１４３９０（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来）。
【００６５】
（ＩＩＩ．α−ケトピメリン酸塩からのＣ６二官能性アルカンの産生のための改変経路）
本発明の複数の態様は、目的のＣ６二官能性アルカンの産生のための改変経路に関する。特に、本発明の複数の態様は、アジピン酸、アミノカプロン酸（カプロラクタム酸の安定な前駆体）、ヘキサメチレンジアミン、および６−ヒドロキシヘキサン酸塩の産生に関する（図３）。当業者は、Ｃ６二官能性アルカンの生物学的産生のためには、アジピン酸塩セミアルデヒドへの生物学的変換（工程ｍ）に２−ケトピメリン酸の利用できる度合いを最大にするために、工程ｉ〜ｌを排除することが所望されることを理解するものとする。いくつかの実施形態においては、ＡｋｓＡは、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ由来の酵素ＮｉｆＶで置き換えられ、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ由来の酵素ＮｉｆＶは、２−ケトグルタル酸塩および２−ケトアジピン酸塩の両方に対して作用するが、２−ケトピメリン酸塩に対しては作用しないことが示されている（Ｈｏｗｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８；Ｈｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０００；Ｄｒｅｖｌａｎｄら、ＪＢＣ，２００８）。そのような置換は、２−ケト酸伸長経路の工程ｉ〜ｌを排除する。当業者は、所望される生成物の炭化水素鎖の長さに応じて、わずか１回の伸長ラウンド（例えば、工程ａ〜ｄ）が必要とされる場合があることを理解するものとする。いくつかの例示的な実施形態においては、一般的な可塑剤であり、ポリエステルの前駆体である、式ＨＯ２Ｃ（ＣＨ２）３ＣＯ２Ｈを持つグルタル酸（ペンタン二酸の名称もある）は、２−ケトグルタル酸塩から生物学的に産生することができ、２−ケトグルタル酸塩は、１回の伸長ラウンドに供され、ケトアジピン酸塩を生じる。グルタル酸は、ポリマー（例えば、ポリエステルポリオールおよびポリアミド）の産生に使用される。いくつかの実施形態においては、１ラウンドの伸長を可能にするために、ＨｃｓおよびＬｙｓ  ２０／２１酵素（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのリジン生合成経路由来）は、グルタル酸の生物学的産生のために２−ケトアジピン酸の利用できる度合いを最大にするために、工程ｅ〜ｌを排除することを可能にし得る。
【００６６】
（Ａ．アジピン酸の産生のための改変経路）
（１．アジピン酸の概要）
２００５年のアジピン酸についての世界的需要は、２７０万メートルトンであった。歴史的には、アジピン酸の需要は、毎年２％増えており、２００９年中には２〜３％の増大が予想される。アジピン酸は、常に、米国で生産される上位５０種の化学物質のうちの１つにランク付けされている。米国内のアジピン酸の９０％近くが、ナイロン−６，６の生産に使用される。アジピン酸の他の用途としては、潤滑剤樹脂（ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ  ｒｅｓｉｎｓ）、ポリエステルポリオール、および可塑剤の生産、ならびに、食品酸味料としての用途が挙げられる。
【００６７】
３種類の主要な商業用生産プロセスが存在する：シクロヘキサンプロセス、シクロヘキサノールプロセス、ブタジエンカルボニル化プロセス。アジピン酸を合成するための主要な工業用プロセスは、ＫＡと記載するシクロヘキサノン（ケトン）とシクロヘキサノール（アルコール）の混合物を得るために、最初の、シクロヘキサンの空気酸化を利用する（例えば、米国特許第５２２１８００号を参照のこと）。ＫＡを得るためのフェノールの水素化もまた商業的に使用されているが、このプロセスは、全てのアジピン酸の生産のわずか２％の割合しか占めない。両方の方法により生産されたＫＡは、硝酸で酸化されて、アジピン酸を生じる。ＮＯ２、ＮＯ、およびＮ２Ｏを含有する還元された窒素酸化物が副生成物として生じ、様々なレベルでリサイクルされて硝酸に戻される。これは、アジピン酸への非合成の生物学的経路を改変するために、工業的により関心が高まっており、環境に有益となりつつある。多数の微生物経路が記載されている。野生型および変異体生物は、再生可能原料（例えば、グルコースおよび他の炭化水素）をアジピン酸に変換することが示されている（例えば、国際公開第９５０７９９６号、および米国特許第５２７２０７３号、同第５４８７９８７号、および同第５６１６４９６号を参照のこと）。同様に、ニトリラーゼ活性を持つ生物は、ニトリルを、アジピン酸を含むカルボン酸に変換することが示されている（例えば、米国特許第５６２９１９０号を参照のこと）。さらに、野生型生物は、シクロヘキサン、およびシクロヘキサノール、および他のアルコールを、アジピン酸に変換するために使用されている（例えば、米国特許第６，７９４，１６５号；および米国特許出願公開第２００３０８７４０３号および同２００２０１２７６６６号を参照のこと）。例えば、１つの酵素経路においては、シクロヘキサノールがアジピン酸に変換され、上記酵素経路は、アシネトバクターから単離された、ヒドロキシルアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；エノイルＣｏＡヒドラターゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ａｃｙｌＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｅａｓｅ）、ユビキノンオキシドレダクターゼ（ｕｂｉｑｕｎｏｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、モノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む。シクロヘキサノールのアジピン酸への変換のための別の酵素経路は、中間体であるシクロヘキサノール、シクロヘキサノン、２−ヒドロキシシクロヘキサノン、ε−カプロラクトン、６−ヒドロキシカプロン酸を含むと示唆されている。この経路におけるいくつかの特異的な酵素活性が明らかにされており、これには、以下が含まれる：シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ関連シクロヘキサノンオキシゲナーゼ、ε−カプロラクトンヒドロラーゼ、およびＮＡＤ（ＮＡＤＰ）関連６−ヒドロキシカプロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｔａｎａｋａら、Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ（１９７７）、５５（２）、６２−７）。代替えの酵素経路は、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、１−オキサ−２−オキソシクロヘプタン、６−ヒドロキシヘキサン酸塩、６−オキソヘキサン酸塩、およびアジピン酸塩を含むことを必要条件とされている（Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７５，６０（１），１−７）。
【００６８】
したがって、解決するべき問題は、石油のような環境的に考えて慎重に扱うべき（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）出発原料への依存を回避するだけではなく、非石油化学のものである、高価ではない、再生可能資源を効率よく使用できるようにする、アジピン酸の合成経路を提供することである。大量のエネルギーの投入の必要を回避し、毒性の副生成物の形成を最少にする、アジピン酸の合成経路を提供することがさらに所望される。
【００６９】
（２．α−ケトピメリン酸塩経路を介するアジピン酸の生物学的産生）
本発明のいくつかの態様は、２−ケトピメリン酸塩の、アジピン酸塩セミアルデヒド（または６−オキソヘキサン酸塩）への脱カルボキシル化、およびアジピン酸を産生するためのアジピン酸セミアルデヒドの脱水素に関する。いくつかの実施形態においては、公開されているＭｅｔａＣｙｃデカルボキシラーゼ反応を全て、候補である２−ケトピメリン酸デカルボキシラーゼについてスクリーニングした。酵素および活性のリストを、基準（ｉ）２−ケトカルボン酸塩に対して実証した活性、および（ｉｉ）タンパク質配列情報の利用できる度合いに基づいて作製した（表２を参照のこと）。いくつかの実施形態においては、表２に列挙する酵素を、提案する改変経路において、全ての２−ケト酸（すなわち、２−ケトピメリン酸塩、２−ケトアジピン酸塩、および２−ケトグルタル酸塩）に対するデカルボキシラーゼ活性についてスクリーニングする。
【００７０】
【表２−１】
2015221054.tif 000007
【００７１】
【表２−２】
2015221054.tif 000008
【００７２】
【表２−３】
2015221054.tif 000009
【００７３】
【表２−４】
2015221054.tif 000010
好ましい実施形態においては、アジピン酸塩セミアルデヒドのアジピン酸塩への変換（工程ｎ）は、ＣｈｎＥ酵素またはＣｈｎＥ酵素のホモログを使用して触媒される。ＣｈＮＥは、ＮＡＤＰ＋関連６−オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ酵素であり、アシネトバクター属の種のシクロヘキサノール分解経路における６−オキソヘキサン酸塩のアジピン酸塩への脱水素を触媒することが示されている（Ｉｗａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９，６５（１１）：５１５８−５１６２を参照のこと）。別の実施形態においては、α−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．２６，例えば、ＡｒａＥ）は、アジピン酸塩セミアルデヒドをアジピン酸塩に変換する。
【００７４】
（Ｂ．カプロラクタムの産生のための改変経路）
（１．カプロラクタムの概要）
カプロラクタムは、合成繊維、特に、ナイロン６の製造に主に使用され、ナイロン６は、毛ブラシ、繊維硬化剤（ｔｅｘｔｉｌｅ  ｓｔｉｆｆｅｎｅｒｓ）、膜コーティング、合成皮革、プラスチック、可塑剤、賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）の製造、ポリウレタンの架橋、およびリジンの合成にも使用される。全世界で約２５億トンのナイロン６が、毎年生産されている。ナイロン６の生産は、単量体ε−カプロラクタムの開環重合により行われる。ε−カプロラクタムの生産のための出発化合物はベンゼンであり、ベンゼンは、シクロヘキサンまたはフェノールのいずれかに変換され、いずれかの化合物が、シクロヘキサノンを介してシクロヘキサノンオキシムに変換され、その後、この中間体が硫酸の中で加熱される。したがって、解決するべき問題は、石油のような環境的に考えて慎重に扱うべき出発原料への依存を回避するだけではなく、非石油化学のものである、高価ではない、再生可能資源を効率よく使用できるようにする、カプロン酸の合成経路を提供することである。大量のエネルギーの投入の必要を回避し、毒性の副生成物の形成を最少にする、カプロン酸の合成経路を提供することがさらに所望される。
【００７５】
（２．カプロラクタムの産生のための改変経路）
本発明の複数の態様は、α−ケトピメリン酸塩からアミノカプロン酸を生物学的に産生するための２つの改変経路に関する。第１の潜在的経路には、最初の、ケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（酵素工程ＩＩ、図２および図３）が、続いて、アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（酵素工程８）が含まれる。ケトピメリン酸アミノトランスフェラーゼ活性を発現する目的の候補の遺伝子としては、ｌｙｓＮ（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．７）をコードする）およびホモログ（例えば、ｋａｔ２）；ａａｄａｔ（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのアミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼをコードする）およびＡＡＤＡＴ（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのアミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼをコードする）が挙げられるが、これらに限定されない。候補の酵素および活性のリストを、基準（ｉ）グルタル酸塩の存在下で、２−オキソピメリン酸塩の２−アミノピメリン酸への変換を実証したかまたは変換する能力がある、ならびに、（ｉｉ）タンパク質配列情報の利用できる度合いに基づいて作製した（表３を参照のこと）。
【００７６】
【表３−１】
2015221054.tif 000011
【００７７】
【表３−２】
2015221054.tif 000012
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を発現する候補の遺伝子としては、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄＡ／Ｂ（Ｅ．ｃｏｌｉのイソ型Ａまたはイソ型Ｂをコードする）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＤ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＧＡＤ１／２、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＧＡＤ１／２）およびそれらのホモログが挙げられるが、これらに限定されない。候補の酵素および活性のリストを、基準（ｉ）ケトグルタル酸塩の存在下で、２−アミノピメリン酸の６−アミノヘキサン酸への変換を実証したか、変換する能力がある、および（ｉｉ）タンパク質配列情報の利用できる度合いに基づいて作製した（表４を参照のこと）。
【００７８】
【表４−１】
2015221054.tif 000013
【００７９】
【表４−２】
2015221054.tif 000014
第２の潜在的経路には、最初にケトピメリン酸デカルボキシラーゼ（酵素工程Ｉ）が、続いて、アジピン酸セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ（酵素工程４）が含まれる。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、脱カルボキシル化を触媒する酵素は、ＫｉｖＤ酵素（上記のようなもの）またはＫｉｖＤ酵素のホモログである。いくつかの実施形態においては、第２の改変経路で使用されるアジピン酸セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：オルニチン−オキソ酸トランスアミナーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｒｏｄＤ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ由来のＯＡＴ、ＥＣ  ２．６．１．１３）、アルギニン分解酵素オルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１３）、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓまたはＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ由来のリジン−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３６）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓの４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａの４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのサッカロピンデヒドロゲナーゼＬＹＳ９およびＬＹＳ１（それぞれ、ＥＣ  １．５．１．１０および１．５．１．７）、または同じ微生物種もしくは他の微生物種に由来する任意の相同タンパク質。
【００８１】
【表５−１】
2015221054.tif 000015
【００８２】
【表５−２】
2015221054.tif 000016
（Ｃ．ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤ）の産生のための改変経路）
本発明の複数の態様は、α−ケトピメリン酸塩からヘキサメチレンジアミンを生物学的に産生するための改変経路に関する。ヘキサメチレンジアミンは、ほとんどが、ナイロン６，６、ナイロン６，１０、ナイロン６，６６の生産に使用され、ナイロン６，６とナイロン６，１０は、様々な種のナイロン樹脂およびナイロン繊維にすることができる。
【００８３】
図２および図３に示すように、第１の改変経路は、上記に記載したアミノカプロン酸改変経路（酵素工程Ｉと、これに続く酵素工程４、または酵素工程ＩＩと、これに続く酵素工程８）において、２−ケトピメリン酸塩のアミノカプロン酸への第１の脱カルボキシル化を含む。いくつかの実施形態においては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素が発現され、これは、アミノカプロン酸の６−アミノヘキサナール中間体への変換を触媒し（酵素工程５）、１−アミノトランスフェラーゼ酵素が発現され、これは、６−アミノヘキサナールのＨＭＤへの変換を触媒する（酵素工程６）。あるいは、改変経路は、上記に記載した脱水素およびアミノ転移酵素反応の前に、リン酸化工程（キナーゼを使用する）を含む。当業者は、上記リン酸化工程と脱水素工程が、リジン経路のアスパラギン酸塩セミアルデヒドの合成に含まれるリン酸化工程（アスパルトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．４）により触媒される）および脱水素工程（ＥＣ  １．２．１．１１酵素により触媒される）と同様であることを理解するものとする。第２の改変経路にしたがうと、α−ケトピメリン酸塩から産生した２−アミノピメリン酸塩（酵素工程ＩＩ、図３）のヘキサメチレンジアミンへの変換は、酵素工程９、１０、または１１と、酵素工程１２からなり、これは、リジン生合成ＩＶ経路において特性決定された酵素または相同である酵素を組み合わせる。この経路には、以下の基質から生成物への変換が含まれる：
・酵素工程９：アミノアジピン酸レダクターゼまたはホモログ酵素（例えば、Ｓｃ−Ｌｙｓ２、ＥＣ  １．２．１．３１）により触媒されるような、２−アミノピメリン酸塩から２−アミノ−７−オキソヘプタン酸塩（または、２−アミノピメリン酸塩−７−セミアルデヒド）への変換；
・酵素工程１０または酵素工程１１：例えば、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（例えば、Ｓｃ−Ｌｙｓ９（ＥＣ  １．５．１．１０）、またはＳｃ−Ｌｙｓ１（ＥＣ  １．５．１．７））により触媒されるような、アミノ−７−オキソヘプタン酸塩から２，７−ジアミノヘプタン酸塩への変換；
・酵素工程１２：例えば、リジンデカルボキシラーゼまたはオルニチンデカルボキシラーゼにより触媒されるような、１，７−ジアミノヘプタン酸塩からヘキサメチレンジアミンへの変換。
【００８４】
当業者は、α−ケトアジピン酸塩から出発すると、同様の経路が、カダベリンの産生を導くことを理解するものとする。
【００８５】
（Ｄ．６−ヒドロキシヘキサン酸塩（６ＨＨ）の産生のための改変経路）
本発明の１つの態様は、上記のアジピン酸改変経路の中間体であるアジピン酸塩セミアルデヒドからの６−ヒドロキシヘキサン酸塩（６ＨＨ）の生物学的産生のための改変経路を開示する。６ＨＨは、環化させてカプロラクトンとすることができるか、または直接重合してポリエステルプラスチック（ポリヒドロキシアルカノエート  ＰＨＡ）とすることができる、６−カーボンヒドロキシアルカン酸塩（６−ｃａｒｂｏｎ  ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）である。いくつかの実施形態においては、アジピン酸塩セミアルデヒドは、単純な水素化により６ＨＨに変換され、そしてこの反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）により触媒される。この酵素は、オキシドレダクターゼのファミリー、特に、アクセプターとしてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を用いて、ドナーのＣＨ−ＯＨ基に対して作用するものに属する。いくつかの実施形態においては、以下の化学反応を触媒する６−ヒドロキシヘキサン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２５８）が使用される。
【００８６】
【数４】
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他のアルコールデヒドロゲナーゼとしては、ａｄｈＡまたはａｄｈＢ（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ由来）、ブタノールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来）、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、およびＡＤＨＩＶアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
（Ｅ．１，６−ヘキサンジオールの産生のための改変経路）
本発明の１つの態様は、上記に記載したアジピン酸改変経路の中間体であるアジピン酸塩セミアルデヒドからの、１，６−ヘキサンジオールの生物学的産生のための改変経路を開示する。１，６−ヘキサンジオールは、化学工業に有用な中間体である。これは、様々なポリマーの合成において用途（例えば、ポリウレタンエラストマーおよびポリマー性可塑剤用のポリエステルの生産）があり、ガソリンの精製にも使用される。
【００８８】
いくつかの実施形態においては、アジピン酸塩セミアルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼ（酵素工程１、図２）によって６−ヒドロキシヘキサン酸塩に変換され、その後、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼの作用により１，６−ヘキサンジオールに変換される（酵素工程２、図２）。
【００８９】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ  １．１．１．１および１．１．１．２）は、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元を伴う、ケトンとアルデヒドのアルコールへの可逆的還元を触媒する。いくつかの実施形態においては、アルコールデヒドロゲナーゼとして、ａｄｈＡまたはａｄｈＢ（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ由来）、ブタノールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来）、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、およびＡＤＨＩＶアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来）、ＡＤＨ６（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
アルデヒドＮＡＤ（＋）デヒドロゲナーゼ活性およびアルコールＮＡＤ（＋）デヒドロゲナーゼ活性は、２種類の異なるポリペプチドにより行われ得るか、または１つのポリペプチド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の多官能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１０）（Ｇｏｏｄｌｏｖｅら、Ｇｅｎｅ  ８５：２０９−１４，１９８９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３３５０４））により行われ得る。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（Ｐ）＋）（ＥＣ  １．２．１．−）活性またはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ（＋））（ＥＣ  １．２．１．３）活性を有しているポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むがこれに限定されない様々な種から得ることができる。
【００９１】
（Ｆ．６−アミノヘキサノールの産生のための改変経路）
いくつかの実施形態においては、Ｃｎ  ω−アミノアルコールは、γ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３または１．２．１．１９または１．２．１．４７）およびアルコールデヒドロゲナーゼを共役させることにより、炭素数が４〜７であるＣｎ末端アミノ酸から作製することができる。好ましい実施形態においては、６−アミノヘキサノールが、γ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．３または１．２．１．１９または１．２．１．４７）と上記アルコールデヒドロゲナーゼを、アミノカプロン酸の代謝経路と共役させることにより、アミノカプロン酸から作製される。
【００９２】
（ＩＶ．α−ケト酸（Ｃ５〜Ｃ８）からの二官能性アルカン（Ｃ５〜Ｃ８）の産生のための改変経路）
図５に示すように、組み換え体微生物を用いるα−ケト酸（Ｃｎ）供給源からの二官能性アルカン（Ｃｎ）の産生のためのいくつかの潜在的経路が存在する。本発明の複数の態様は、α−ケト中間体の二官能性ペンタン分子、二官能性ヘキサン分子、二官能性ヘプタン分子、二官能性オクタン分子への生物学的変換に関する。目的の二官能性ペンタン分子としては、１−ヒドロキシペンタン酸塩、１，５−ペンタンジオール、グルタル酸塩、カダベリン（ペンタン−１，５−ジアミン）、５−アミノペンタナール、および５−アミノペンタノールが挙げられるが、これらに限定されない。目的の二官能性ヘキサン分子としては、１−ヒドロキシヘキサン酸塩、１，６−ヘキサンジオール、アジピン酸塩、ヘキサメチレンジアミン、アミノカプロン酸、６−アミノヘキサナール、および６−アミノヘキサノールが挙げられるが、これらに限定されない。目的の二官能性ヘプタン分子としては、１−ヒドロキシヘプタン酸塩、１，７−ヘプタンジオール、ピメリン酸、１，７−ジアミノヘプタン、７−アミノヘプタナール、および７−アミノヘプタノールが挙げられるが、これらに限定されない。目的の二官能性オクタン分子としては、１，４−オクタンジオール、１−ヒドロキシオクタン酸塩、カプリル酸、１，４−ジアミノオクタン、４−アミノオクタナール、および４−アミノオクタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明の１つの態様は、二官能性アルカンの産生のための第１の改変経路に関し、これは、上記のように、２−アミノトランスフェラーゼ（酵素工程ＩＩ）を含む。第１の改変経路にしたがうと、α−ケト酸Ｃｎの二官能性Ｃｎアルカンへの変換は、以下の酵素および、基質から生成物への変換を含む酵素工程ＩＩ、２１、２２、２３、ならびに上記工程５、６、および７からなる：
・酵素工程ＩＩ：例えば、２−アミノトランスフェラーゼまたはホモログ酵素（例えば、ｌｙｓＮ（ＥＣ  ２．６．１．７）、ｋａｔ２；ａａｄａｔおよびＡＡＤＡＴ）により触媒されるような、α−ケト酸Ｃｎから２−アミノ−１，ｎ−ジカルボン酸への変換。
【００９４】
・酵素工程２１：例えば、アミノアルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、２−アミノ−１，ｎ−ジカルボン酸から（ｎ−１）−アミノ−ｎ−オキソカルボン酸への変換。
【００９５】
・酵素工程２２：２−アミノアルデヒドムターゼにより触媒されるような、（ｎ−１）−アミノ−ｎ−オキソカルボン酸から（ｎ−１）−オキソ−ｎ−アミノカルボン酸への変換。例示的な実施形態においては、アミノアルデヒドムターゼは、グルタミン酸−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＥＣ  ５．４．３．８）である。グルタミン酸−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ（ＧＳＡＭ）は、ポルフィリンの生合成経路において記載されており、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタン酸塩から５−アミノレブリン酸塩への反応を触媒する。
【００９６】
【化２】
2015221054.tif 000018
いくつかの実施形態においては、アミノアルデヒドムターゼには、ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ由来、ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、およびａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（遺伝子ｈｅｍｌ）由来のグルタミン酸−１−セミアルデヒド２，１−アミノムターゼ、ならびに、例えば、シネココックス属の種由来のｇｓａ遺伝子によりコードされるポリペプチドが含まれる。
【００９７】
・酵素工程２３：３種類の酵素により触媒される、（ｎ−１）オキソ−ｎ−アミノカルボン酸からｎ−アミノカルボン酸への変換：ケトン基を第２級アルコール基に変換するデヒドロゲナーゼ（工程２３ａ）脱水素化に続いて、第２級アルコール基のアルケンへの変換を触媒するデヒドラターゼ（工程２３ｂ）、およびアルケンのアルカンへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ（工程２３ｃ）により触媒されるような脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔａｔｉｏｎ）が行われる。
【００９８】
・酵素工程５：アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ  １．２．１．３）により触媒され、続いて、酵素工程６または酵素工程７のいずれかが行われる、ｎ−アミノカルボン酸からｎ−アミノアルデヒドへの変換。
【００９９】
・酵素工程６：アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１およびＥＣ  １．１．１．２）により触媒される、ｎ−アミノカルボン酸からｎ−アミノアルコールへの変換。
【０１００】
・酵素工程７：１−アミノトランスフェラーゼによる触媒される、ｎ−アミノアルデヒドから１，ｎ−ジアミノアルカンへの変換。
【０１０１】
本発明の別の複数の態様は、同じ長さのα−ケト酸（Ｃ５〜Ｃ８）からの目的の二官能性アルカン（Ｃ５〜Ｃ８）の生物学的産生のための第２の経路に関する。第２の改変経路には、第１のα−ケトンの除去工程（酵素工程ＩＩＩ）が含まれる。いくつかの実施形態においては、ケトンの除去反応は３工程の酵素反応であり、これには、ケトン基の第２級アルコールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼ；第２級アルコールのアルケンへの変換を触媒するデヒドラターゼ、およびアルケンのアルカンへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼが含まれる。１つの例示的な実施形態においては、第１のデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、および第２のデヒドロゲナーゼの共役した活性（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）により、α−ケトアジピン酸塩からアジピン酸が合成される。いくつかの実施形態においては、第１のデヒドロゲナーゼと第２のデヒドロゲナーゼは同一である。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、デヒドロゲナーゼは、脂肪酸生合成のスーパー経路（ｓｕｐｅｒｐａｔｈｗａｙ）における以下の反応を触媒することが示されている、３−オキソアシル−［アシル−キャリアタンパク質］レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）である：
【０１０３】
【化３】
2015221054.tif 000019
いくつかの実施形態においては、デヒドロゲナーゼは、β−ケトアシル−［アシル−キャリア−タンパク質］レダクターゼ（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のＦａｂＧ遺伝子）、脂肪酸シンターゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦａｓ２遺伝子）、または脂肪酸シンターゼ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＦＡＳＮ遺伝子）である。
【０１０４】
いくつかの実施形態においては、デヒドラターゼは、以下の反応を触媒する、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．５９）である：
【０１０５】
【化４】
2015221054.tif 000020
３−ヒドロキシオクタノイル−［アシル−キャリア−タンパク質］デヒドラターゼとしては、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来の３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のＦａｂＡ遺伝子）、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のＦａｂＺ遺伝子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの実施形態においては、第２のデヒドロゲナーゼは、エノイルアシルキャリアタンパク質レダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．９）、例えば、以下の反応を触媒することが示されているエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のｆａｂＩ遺伝子）である。
【０１０７】
【化５】
2015221054.tif 000021
いくつかの実施形態においては、第１のデヒドロゲナーゼと第２のデヒドロゲナーゼは同一である（脂肪酸シンターゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦａｓ２遺伝子またはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＦＡＳＮ遺伝子）。
【０１０８】
二官能性アルカンの産生には、酵素工程３０と、これに続く目的の中間体または最終生成物に応じた様々な酵素工程が含まれる。ｎ−ヒドロキシカルボン酸および１，ｎ−アルカンジオールの産生のための生物学的な改変経路には、１種類以上のアルコールデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドデヒドロゲナーゼが含まれる。１つの実施形態においては、上記改変経路は、酵素工程３０と、これに続く酵素工程１および２、または酵素工程３０と、これに続く以下に記載し、図４および図５に説明するような酵素工程３１を含む。いくつかの実施形態においては、ｎ−アミノカルボン酸、ｎ−アミノアルデヒド、ｎ−アミノアルコール、または１，ｎ−ジアミノアルカンの産生のための、生物学的な改変経路には、１種類以上のアミノトランスフェラーゼ（酵素工程４および６）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（酵素工程５）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（酵素工程７）が含まれる。例示的な実施形態においては、アミノカプロン酸が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（酵素工程３０）、これに続き、アミノトランスフェラーゼ（酵素工程４）を含む改変経路により、６−オキソヘキサン酸塩から産生される。アミノカプロン酸は、続いて、アルデヒドデヒドロゲナーゼにより（酵素工程５）、これに続いて、アミノトランスフェラーゼ（酵素工程６）により、ヘキサメチレンジアミンに変換することができる。上記酵素工程および、基質から生成物への変換を以下に列挙し、図４および図５に説明する：
・酵素工程３０：アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、ジカルボン酸からカルボン酸セミアルデヒドへの変換；
・酵素工程１：アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、カルボン酸セミアルデヒドからヒドロキシルカルボン酸への変換；
・酵素工程２：アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、ヒドロキシカルボン酸から１，ｎ−アルカンジオールへの変換。
【０１０９】
・酵素工程３１：アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、カルボン酸セミアルデヒドから１，ｎ−アルカンジオールへの変換。
【０１１０】
・酵素工程４：アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、カルボン酸セミアルデヒドからｎ−アミノカルボン酸へ、さらにｎ−アミノアルデヒドへの変換；
・酵素工程６：１−アミノトランスフェラーゼにより触媒されるような、ｎ−アミノアルデヒドから１，ｎ−ジアミノアルデヒドへの変換；
・酵素工程７：アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるような、ｎ−アミノアルデヒドからｎ−アミノアルコールへの変換。
【０１１１】
（スクリーニング技術）
本明細書中に記載する方法にしたがい、経路の開発のための反応物の混合は、細胞の増殖および／またはインキュベーションが可能な任意の容器の中で行うことができる。例えば、反応物の混合は、バイオリアクター、細胞培養フラスコまたはプレート、マルチウェルプレート（例えば、９６、３８４、１０５６ウェルマイクロタイタープレートなど）、培養フラスコ、発酵槽、または細胞増殖もしくはインキュベーションのための他の容器の中で行われ得る。
【０１１２】
スクリーニングは、選択マーカーの発現の検出により行うことができ、検出マーカーは、いくつかの遺伝的状況においては、このマーカーを発現している細胞が生存することを可能にし、他の細胞は死滅する（またはその逆）。効率的なスクリーニング技術が、本明細書中に記載する方法を使用する新規の経路の効率的な開発を提供するために必要である。好ましくは、酵素経路により産生される化合物についての適切なスクリーニング技術により、目的の特性についての迅速な、感度の高いスクリーニングが可能となる。視覚的（比色の（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ））アッセイがこの観点から最適であり、適切な光吸収特性を持つ化合物に容易に適用される。より高性能のスクリーニング技術としては、例えば、高スループットＨＰＬＣ−ＭＳ分析、ＳＰＭＥ（固相微量抽出（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ））、およびＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析法（Ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ））が挙げられる（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｄ．Ｒ．Ｋｎａｐｐ；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９７９を参照のこと）。場合によっては、スクリーニングロボットが、自動注入および迅速な試料の分析のために、ＨＰＬＣ−ＭＳシステムに接続される。これらの技術により、実質的に任意の所望される化合物の高スループットの検出および定量が可能である
。
【０１１３】
目的の生物学的に産生された生成物は、当該分野で公知の方法を使用して、発酵媒体または細胞抽出物から単離され得る。例えば、固体または細胞の破片が、遠心分離または濾過により除去され得る。目的の生物学的生成物は、蒸留、液体−液体抽出、膜蒸発（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）、吸着により、または当該分野で公知の任意の方法を使用して、単離され得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態においては、目的の生成物の同定は、ＨＰＬＣを使用して行われ得る。例えば、標準的な試料が、媒体中で既知量の有機生成物（例えば、アジピン酸、アミノカプロン酸）を用いて調製される。産生されたアジピン酸の保持時間を、その後、信頼できる標準物の保持時間と比較することができる。いくつかの実施形態においては、目的の生成物の同定は、ＧＣ−ＭＳを使用して行われ得る。その後、分解された試料は、質量選択検出器（ｍａｓｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）により分析され、以前の質量スペクトル、および信頼できる標準物の保持時間と比較される。
【０１１５】
いくつかの実施形態においては、細胞抽出物が、酵素活性についてスクリーニングされ得る。例えば、オキソヘキサン酸デヒドロゲナーゼ活性が、ＤｏｎｏｇｈｕｅおよびＴｒｕｄｇｉｌｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７５，６０：１−７）に記載されているように、３４０ｎｍでの吸光度の増加率を測定することにより検出され得る。
【０１１６】
本発明の方法の実施では、特に明記されない限りは、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学、工学（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ロボット工学、光学、コンピューターソフトウェア、および組み込みの従来技術が利用される。これらの技術および手法は、一般的には、当該分野での従来の方法、および当該技術分野の範囲内である様々な一般的な参考文献にしたがって行われる。そのような技術は、文献の中で十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４６８３１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）、およびＬａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｍｅｔａｌ−ｌｉｇａｎｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ，Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．補遺、第１０巻（１９９６）２１３−２４頁（蛍光技術について）、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｇｕｉｄｅ  ５  Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ．ＲＴＭ．Ｉｒｖｉｎｅ  Ｃａｌｉｆ．（一般的な光学的方法について）、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  Ｔｈｅｏｒｙ，Ｓｎｙｄｅｒ  ＆  Ｌｏｖｅ（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ発行）、およびＦｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙ��ｔｅｍｓ  ｂｙ  Ｐｅｔｅｒ  Ｃｈｅｏ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ発行）（光ファイバー理論および材料について）。
【０１１７】
（等価物）
本発明は、特に、代謝工学のための組成物および方法を提供する。本発明の特別な実施形態が議論されているが、上記明細書は例であり、限定的ではない。本発明の多くのバリエーションが、本明細書を参照して当業者に明らかとなる。本発明の範囲全体は、等価物および本明細書のそれらの範囲全体とともに、そのようなバリエーションとともに、本特許請求の範囲を参照することにより決定されるものとする。
【０１１８】
（参照による引用）
以下に列挙する項目を含む本明細書中に記載した全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、あたかも引用により具体的かつ個別に組み入れられたかのように、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。矛盾する場合は、本明細書中のあらゆる定義を含む本出願を優先するものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
2015221054000001.pdf