(57)【要約】      （修正有）【課題】癌性物質である２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（ＰｈＩＰ）と抗癌剤であるマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を投与したときの小核含有網赤血球の発生率、即ち、染色体異常の発生率を抑制する安全性の高い新規の成分を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤の提供。【解決手段】温州みかんの果実、果皮、じょうのう膜から溶剤で抽出した温州みかん抽出物を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤。該温州みかん抽出物はノビチレン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
温州みかん抽出物を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤。
【請求項２】
前記温州みかん抽出物はノビチレン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を含有することを特徴とする請求項１に記載の染色体異常誘発抑制剤。
【請求項３】
ノビチレン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体異常の誘発を抑制する作用を有し、特に、構造が異常であるような染色体の生成を抑制する作用を有する新規の成分に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的要因または変異原性物質等により、染色体を有するあらゆる生物に種々の染色体異常が発生し得ることが知られている。染色体異常により染色分体又は染色体が切断されることで、それらの一部が分離して微小な染色体断片を生じることが知られており、このような染色体断片に核膜が形成されたものを小核（ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｕｓ）と呼んでいる。
【０００３】
小核を検出する試験は、染色体の構造異常の検出に適切であり、染色体の数的異常誘発性物質も検出できる可能性があると考えられている。
小核の研究は、主に抹消血もしくは骨髄中の赤血球が用いられ、正常時は小核を含む赤血球の出現頻度が低いが、有害な薬剤等の刺激により劇的に小核の出現頻度が増加する（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，
Ｊ.Ｔ.ら、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、２、５０９−５１４、１９８０）。従って、小核の出現とその出現頻度は、何らかの遺伝的要素、有害物質、ウイルス等の影響により、遺伝子に傷を負ってしまうような染色体異常が起ったことを示す指標となり得る。小核試験は、遺伝学的な変異原性の有無や程度を試験する変異原性試験に寄与している。小核の研究は、さらに、形状、大きさ、ＤＮＡ量といった小核そのものの細胞学的解析を中心に発展している。小核が形成に関する試験と並行して、分裂中期の細胞の全ての染色体に関する核型分析を行った場合には、染色体の種類および染色体異常の種類を小核の出現と関連付けることができる（Ｇｕｔｔｅｎｂａｃｈ，Ｍ．ら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２１１、１２７−１３２、１９９４、Ｅ．Ｆａｕｔｈら、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ１３、２３５−２４１、１９９８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2006-089452号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景の下、本発明者は、癌性物質である2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン（PhIP）と抗癌剤であるマイトマイシンC（MMC）を投与したときの小核含有網赤血球の発生率、即ち、染色体異常の発生率が、温州みかんの抽出物及びそれに含有されるノビチレン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンの摂取により減少することを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明は、安全性の高い新規の成分を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための技術的特徴は以下のとおりである。
１．温州みかん抽出物を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤。
２．前記温州みかん抽出物はノビチレン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を含有することを特徴とする請求項１に記載の染色体異常誘発抑制剤。
３．ノビチレン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に本発明の詳細を説明する。
本発明の染色体異常誘発抑制剤は、温州みかん抽出物を有効成分として用いることを特徴とする。
温州ミカンはミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、カンキツ属（Ｃｉｔｒｕｓ）の植物で、日本、東南アジア、中国などで栽培され、食されている。本発明においては産地等には限定されない。
【０００９】
本発明の染色体異常誘発抑制剤の抽出原料には、温州ミカン果実またはその一部など部位に制限はないが、廃棄物再利用の観点から、果皮や果汁絞り粕が好ましい。
【００１０】
温州ミカンの果実、果皮、じょうのう膜から染色体異常誘発抑制剤を抽出するための溶媒としてはｎ−ヘキサン、エーテル、アセトン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、１、３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、水等を使用することができる。これらの溶媒を２種以上混合してもよい。また、ＣＯ２ガスによる超臨界抽出法でもよい。望ましくは、エタノール溶液に１０〜９０％（ｗｔ／ｗｔ）のｎ−ヘキサンを含有する混合溶媒として用いると、有効成分が効率よく抽出され、食品使用における安全面の上でも好ましい抽出溶媒である。抽出用の水の種類は、特に限定されず、水道水、蒸留水、ミネラル水、アルカリイオン水、深層水等を使用することができる。
【００１１】
温州ミカンの果実、果皮、じょうのう膜から染色体異常誘発抑制剤を抽出する温度としては、例えばエタノール溶液に１０〜９０％（ｗｔ／ｗｔ）のｎ−ヘキサンを含有する混合溶媒を使用する場合、抽出温度２０〜６８℃、望ましくは２０〜５０℃程度で行うとよい。抽出温度が低すぎると、有効成分が抽出されにくくなり、また、抽出温度が高すぎると、ｎ−ヘキサンが蒸発してしまうためである。
【００１２】
温州ミカンの果実、果皮、及びじょうのう膜から染色体異常誘発抑制剤の抽出方法としては、連続抽出、浸漬抽出、向流抽出、超臨界抽出など任意の方法を採用することができ、室温ないし還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
【００１３】
温州ミカンの果実、果皮及び、じょうのう膜から染色体異常誘発抑制剤の具体的な抽出方法を示すと、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料（温州ミカン果実、果皮、じょうのう膜）を投入し、攪拌しながら有効成分を溶出させる。抽出原料はそのままでもよいが、あらかじめ粉砕しておくと抽出効率がよい。例えば、抽出溶媒としてエタノール溶液に１０〜９０％（ｗｔ／ｗｔ）のｎ−ヘキサンを含有する混合溶媒を用いる場合には、抽出原料の３〜１００倍量程度（重量比）の抽出溶媒を使用し、３０分〜２時間程度抽出を行う。溶媒中に有効成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことによって抽出液を得る。その後、常法に従って抽出液に希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施し、染色体異常誘発抑制剤を得る。
【００１４】
本発明は、ノビチレン、３−メトキシノビノチン、及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を含有することが好ましい。
【００１５】
ノビチレンは下記化学式（１）に示す化合物であり、温州みかんの他にポンカン等に含有されることが知られている。
【化１】
2015048327.tif 000002
【００１６】
ノビチレンの含有量は特に限定されないが、染色体異常誘発抑制剤の全質量を１００％とした場合において０．０７〜０．３％、更には
０．１〜０．２％とすることが好ましい。
【００１７】
また、３−メトキシノビノチンは下記化学式（２）に示す化合物である。
【化２】
2015048327.tif 000003
【００１８】
３−メトキシノビノチンの含有量は特に限定されないが、染色体異常誘発抑制剤の全質量を１００％とした場合において０．４〜１．８％、更には０．６〜１．０％とすることが好ましい。
【００１９】
タンゲレチンは下記化学式（３）に示す化合物である。
【化３】
2015048327.tif 000004
【００２０】
タンゲレチンの含有量は特に限定されないが、染色体異常誘発抑制剤の全質量を１００％とした場合において０．０７〜０．３％、更には
０．１〜０．２％とすることが好ましい。
【００２１】
本発明は、ノビチレン、３−メトキシノビノチン、及びタンゲレチンのうちの少なくも１種を有効成分とすることを特徴とする。
これらを得る方法は特に限定されないが、ポンカン、シークワーサ、温州みかん等から抽出することができる。また、市販品（例えば和光純薬製）を用いても良い。
【００２２】
本発明の染色体異常誘発抑制剤は、各種飲食品の素材として使用することができる。飲食品としては、例えば、食用油（サラダ油）、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（味噌、醤油等）、スープ類、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）をはじめとする一般食品や、健康食品（錠剤、カプセル等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）が挙げられる。これらの飲食品に本発明の染色体異常誘発抑制剤を適宜配合するとよい。
【００２３】
これら飲食品には、その種類に応じて種々の成分を配合することができ、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等の食品素材を使用することができる。さらに、健康維持機能をもった本染色体異常誘発抑制剤には、他の抗酸化物質や健康食品素材などの配剤、例えば、抗酸化物質（還元型アスコルビン酸（ビタミンC）、ビタミンE、還元型グルタチン、トコトリエノール、ビタミンＡ誘導体、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、フコキサンチン、尿酸、ユビキノン、コエンザイムＱ10、葉酸、ニンニクエキス、アリシン、セサミン、リグナン類、カテキン、イソフラボン、カルコン、タンニン類、フラボノイド類、クマリン、イソクマリン類、ブルーベリーエキス）、健康食品素材（V.（ビタミン）A、V.B1、V.B2、V.B6、V.B1２、V.C、V.D、V.E、V.P、コリン、ナイアシン、パントテン酸、葉酸カルシウム、EPA、オリゴ糖、食物繊維、スクアレン、大豆レシチン、タウリン、ドナリエラ、プロテイン、オクタコサノール、DHA、卵黄レシチン、リノール酸、ラクトフェリン、マグネシウム、亜鉛、クロム、セレン 、カリウム、ヘム鉄、カキ肉エキス、キトサン、キチンオリゴ糖、コラーゲン、コンドロイチン、ウコン、カンゾウ、クコシ、ケイヒ、サンザシ、生姜、霊芝、シジミエキス、スッポン、カンゾウ、クコシ、ケイヒ、サンザシ、生姜、霊芝、オオバコ、カミツレ、カモミール、セイヨウタンポポ、ハイビスカス、ハチミツ、ボーレン、ローヤルゼリー、ライム、ラベンダー、ローズヒップ
、ローズマリー、セージ、ビフィズス菌、フェーカリス菌、ラクリス、小麦胚芽油、ゴマ油、シソ油、大豆油、中鎖脂肪酸、アガリクス、イチョウ葉エキス、ウコン、コンドロイチン、玄米胚芽エキス、レイシ、タマネギ、DHA、EPA、DPA、甜茶、冬虫夏草、ニンニク、蜂の子、パパイヤ、プーアル、プロポリス、メグスリの木、ヤブシタケ、ロイヤルゼリー、ノコギリヤシ、ヒアルロン酸、コラーゲン、ギャバ、ハープシールオイル、サメ軟骨、グルコサミン、レシチン、ホスファチジルセリン、田七ニンジン、桑葉、大豆抽出物、エキナセア、エゾウコギ、大麦抽出物、オリーブ葉、オリーブ実、ギムネマ、バナバ、サラシア、ガルシニア、キトサン、セントジョーンズワート、ナツメ、ニンジン、パッションフラワー、ブロッコリー、プラセンタ、ハトムギ、ブドウ種子、ピーナッツ種皮、ビルベリー、ブラックコホシュ、マリアアザミ、月桂樹、セージ、ローズマリー、ラフマ、黒酢、ゴーヤー、マカ、紅花、亜麻、ウーロン茶、花棘、カフェイン、カプサイシン、キシロオリゴ糖、グルコサミン、ソバ、シトラス、食物繊維、プロテイン、プルーン、スピルリナ、大麦若葉、核酸、酵母、椎茸、梅肉、アミノ酸、深海鮫抽出物、ノニ、カキ肉、スッポン、シャンピニオン、オオバコ、アセロラ、パイナップル、バナナ、モモ、アンズ、メロン、イチゴ、ラズベリー、オレンジ、フコイダン、メシマコブ、クランベリー、コンドロイチン硫酸、亜鉛、鉄、セラミド、シルクペプチド、グリシン、ナイアシン、チェストツリー、L-システイン、赤ワイン葉、ミレット、ホーステール、ビオチン、センテラアジアティカ、ハスカップ、ピクノジェノール、フキ、ルバーブ、クローブ、ローズマリー、カテキン、プーアル、クエン酸、ビール酵母、メリロート、ブラックジンガー、ショウガ、ガジュツ、ナットウキナーゼ、ベニコウジ、トコトリエノール、ラクトフェリン、シナモン、韃靼ソバ、ココア、ユズ種子エキス、シソの実エキス、ライチ種子エキス、月見草エキス、黒米エキス、α−リポ酸、生コーヒー豆エキス）なども配合することができる。
【００２４】
本発明の染色体異常誘発抑制剤が配合された飲食品を製造する具体的な方法としては、例えば、染色体異常誘発抑制剤を粉末セルロースとともにスプレードライまたは凍結乾燥し、これを粉末、顆粒、打錠または溶液にすることで容易に飲食品（インスタント食品等）に含有させることができる。また、染色体異常誘発抑制剤を、例えば、油脂、エタノール、グリセリンあるいはこれらの混合物に溶解して液状にし、飲料に添加するか、固形食品に添加することが可能である。必要に応じてアラビアガム、デキストリン等のバインダーと混合して粉末状あるいは顆粒状にし、飲料に添加するか固形食品に添加することも可能である。
【００２５】
本発明の染色体異常誘発抑制剤を飲食品に配合する場合の配合量としては、美容や健康維持等が主な目的であるので、飲食品に対して有効成分（温州みかん抽出物）の含量が飲食品の全質量の１〜２０wt％であるのが好ましい。
【００２６】
本発明の染色体異常誘発抑制剤は、内服薬（医薬品および医薬部外品等を含む。）等の素材として用いてもよい。即ち、内服薬製剤用の原料に、本発明の染色体異常誘発抑制剤を適宜配合して製造することができる。本発明の染色体異常誘発抑制剤に配合しうる製剤原料としては、例えば、賦形剤（ブドウ糖、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等）、結合剤（蒸留水、生理食塩水、エタノール水、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（アルギン酸ナトリウム、カンテン、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、アラビアゴム末、ゼラチン、エタノール等）、崩壊抑制剤（白糖、ステアリン、カカオ脂、水素添加油等）、吸収促進剤（第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等）、吸着剤（グリセリン、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、硅酸等）、滑沢剤（精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等）などが挙げられる。
【００２７】
本発明による染色体異常誘発抑制剤の投与方法は、一般的には、錠剤、丸剤、軟・硬カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤、液剤等の形態で経口投与することができるが、非経口投与であってもよい。非経口剤として投与する場合は、溶液の状態、または分散剤、懸濁剤、安定剤などを添加した状態で、ハップ剤、ローション剤、軟膏剤、チンキ剤、クリーム剤などの剤形で適用することができる。
【００２８】
投与量は、投与方法、病状、患者の年齢等によって変化し得るが、大人では、通常、１日当たり有効成分（温州みかん抽出物）として０．５〜５０００ｍｇ、子供では通常０．５〜３０００ｍｇ程度投与することができる。
染色体異常誘発抑制剤の配合比は、剤型によって適宜変更することが可能であるが、通常、経口または粘膜吸収により投与される場合は約０．３〜１５．０wt％、非経口投与による場合は、０．０１〜１０wt％程度にするとよい。なお、投与量は種々の条件で異なるので、前記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
【実施例】
【００２９】
以下に、本発明を具体化した実施例について説明する。尚、本実施例は、本発明を限定するものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内での変更は可能である。
【００３０】
実施例
原料としての温州ミカン果実、果皮、じょうのう膜を用いた。まず、原料を粉砕し、エタノール溶液に５０％（ｗｔ／ｗｔ）のｎ−ヘキサンを含有する混合溶媒で５０℃において２時間抽出した。これをろ過し、そのろ液を減圧蒸留し、抽出液を得た。その後デキストリンと抽出液とを質量比（抽出液：デキストリン）＝３０：７０で混合し、スプレードライを行い、本実施例の温州みかん抽出物（実施例１：染色体異常誘発抑制剤）を得た。この温州みかん抽出物のノビチレン、３−メトキシノビノチン、及びタンゲレチンの含量は、それぞれノビチレン０．１５％、３−メトキシノビノチン０．８９％、タンゲレチン０．１４％であった
【００３１】
試験例：温州みかん抽出物における染色体異常誘発抑制作用の評価
1．試料
温州みかん抽出物（実施例１）、PhIP 塩酸塩（和光純薬工業株式会社）、MMC（和光純薬工業株式会社）、飼料（粉末、固形）CE-2 （日本クレア株式会社）を使用した。
【００３２】
２．実験動物
ICR マウス（日本エスエルシー株式会社）、雄、7 週齢を使用し、5 匹/群とした。
【００３３】
３．飼料調製
（１）温州みかんエキス 5%含有飼料（みかんエキス5%飼料）
温州みかんエキス-P
50 g に飼料（粉末）CE-2 250 g を加えて、混和し均一にした。
（２）温州みかんエキス 10%含有飼料（みかんエキス10%飼料）
温州みかんエキス-P
100 g に飼料（粉末）CE-2 200 g を加えて、混和し均一にした。
【００３４】
４．染色体異常誘発物質溶液の調製
（１）PhIP 溶液
PhIP 塩酸塩の一定量を秤量し、滅菌済み生理食塩水に溶解した。
（２）MMC 溶液
MMCの一定量を秤量し、滅菌済み生理食塩水に溶解した。
【００３５】
５．温州みかんエキス摂取
温州みかんエキス摂取群では、PhIP もしくはMMC を投与する2 日前から小核試験終了時まで、みかんエキス 5%飼料もしくは、みかんエキス 10%飼料をマウスに自由摂取させた。対照群では、PhIP もしくはMMC を投与する2 日前から小核試験終了時まで飼料（固形）CE-2 をマウスに自由摂取させた。
【００３６】
６．小核試験
PhIP 投与直前を0 時間として、温州みかんエキス（5%、10%）摂取群及び対照群の合計3 群のマウス尾静脈から血液5 μL を採取し、アクリジンオレンジを塗布したスライドガラス上に広げカバーガラスで覆い標本を作製した。PhIP が50mg/kg 体重となるよう全群のマウスにPhIP 溶液を腹腔内した。PhIP 投与24、48、72 時間後に同様に血液を採取し、標本を作製した。MMC の作用に対する抑制効果を試験するときは、同様にMMC 投与直前（0 時間）と投与24、48、72時間後に標本を作製した。なお、MMC は1 mg/kg 体重となるようMMC 溶液を腹腔内に投与した。標本は24 時間冷蔵保存後、蛍光顕微鏡により1 個体あたり網赤血球1000 個を観察し、小核含有網赤血球をカウントした。その結果を表１（PhIP）及び表２（MMC）に示す。
【００３７】
７．統計処理
みかんエキス摂取群における小核含有網赤血球の発生率を対照群におけるそれと比較した。t 検定を行い、P<0.05及びP<0.01
の場合に有意と判定した。
【００３８】
【表１】
2015048327.tif 000005
【００３９】
【表２】
2015048327.tif 000006
【００４０】
結果及び試験例１における実施例の効果
（２）PhIP による染色体異常誘発に対する温州みかん抽出物の抑制効果
表1に示すように、対照群、温州みかん抽出物5%摂取群及び温州みかん抽出物10%摂取群のいずれにおいてもPhIP 投与により、投与48 時間後まで小核含有網赤血球の発生率は増加し、72 時間後では減少した。PhIP 投与24
時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において0.98 であったのに対し、温州みかん抽出物5%飼料摂取群では0.66（P<0.05）に、温州みかん抽出物10%飼料摂取群では0.56（P<0.01）に有意に減少した。また、PhIP 投与48 時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において2.14 であったのに対し、温州みかん抽出物5%飼料摂取群では1.78（P<0.05）に、温州みかん抽出物10%飼料摂取群では1.40（P<0.01）に有意に減少した。以上のようにPhIP による染色体異常誘発に対し、温州みかん抽出物が用量依存的に抑制効果を示すことがわかった。
【００４１】
（２）MMC による染色体異常誘発に対するみかんエキスの抑制効果
表2に示すように、対照群、温州みかん抽出物5%摂取群及び温州みかん抽出物10%摂取群のいずれにおいてもMMC 投与により、投与48 時間後まで小核含有網赤血球の発生率は増加し、72 時間後では減少した。MMC 投与24
時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において1.52 であったのに対し、温州みかん抽出物5%飼料摂取群では0.94（P<0.01）に、温州みかん抽出物10%飼料摂取群では0.42（P<0.01）に有意に減少した。また、MMC 投与48 時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において1.96 であったのに対し、温州みかん抽出物5%飼料摂取群では1.36（P<0.05）に、温州みかん抽出物10%飼料摂取群では1.06（P<0.01）に有意に減少した。以上のようにMMC による染色体異常誘発に対し、温州みかん抽出物 が用量依存的に抑制効果を示すことがわかった。
【００４２】
試験例２：ノビレチン、３−メトキシノビノチン及びタンゲレチンにおける染色体異常誘発抑制作用の評価
１．試料
ノビレチン（実施例２：静岡県立大学から分与）、３−メトキシノビノチン（実施例３：ヘプタメトキシフラボン，和光純薬工業株式会社）、タンゲレチン（INDOFINE Chemical Company Inc.）、PhIP塩酸塩（和光純薬工業株式会社）、飼料（粉末、固形）CE-2 （日本クレア株式会社）を使用した。
【００４３】
２．実験動物
ICRマウス（日本エスエルシー株式会社）、雄、7週齢を使用し、5匹/群とした。
【００４４】
３．飼料
（１）ノビレチン 0.01%含有飼料
ノビレチン 40 mgに飼料（粉末）CE-2 400 gを少量ずつ加えて、混和し均一にした。
（２）ノビレチン 0.02 %含有飼料
ノビレチン 80 mgに飼料（粉末）CE-2 400 gを少量ずつ加えて、混和し均一にした。
（３）へプタメトキシフラボン 0.01%含有飼料
へプタメトキシフラボン 20 mgに飼料（粉末）CE-2 200 gを少量ずつ加えて、混和し均一にした。
（４）へプタメトキシフラボン 0.02 %含有飼料
へプタメトキシフラボン 40 mgに飼料（粉末）CE-2  200 gを少量ずつ加えて、混和し均一にした。
（５）タンゲレチン 0.01%含有飼料
タンゲレチン 35 mgに飼料（粉末）CE-2 350 gを少量ずつ加えて、混和し均一にした。
（６）タンゲレチン 0.02 %含有飼料
タンゲレチン 70 mgに飼料（粉末）CE-2 350 gを少量ずつ加えて、混和し均一にした。
【００４５】
４．染色体異常誘発物質溶液の調製
PhIP塩酸塩40.67 mgを秤量し、滅菌済み生理食塩水7 mLに溶解した。
【００４６】
飼料摂取
ノビレチン、へプタメトキシフラボン及びタンゲレチン摂取群では、PhIPを投与する2日前から小核試験終了時まで、へプタメトキシフラボン及びタンゲレチン0.01%含有飼料もしくは、へプタメトキシフラボン及びタンゲレチン0.02%含有飼料をマウスに自由摂取させた。対照群では、PhIPを投与する2日前から小核試験終了時まで飼料（固形）CE-2をマウスに自由摂取させた。
【００４７】
2-6  小核試験
PhIP投与直前を0時間として、ノビレチン、へプタメトキシフラボン及びタンゲレチン0.01%含有飼料摂取群、0.02%含有飼料摂取群及び対照群の合計４群のマウス尾静脈から血液5 μLを採取し、アクリジンオレンジを塗布したスライドガラス上に広げカバーガラスで覆い標本を作製した。PhIPが50 mg/kg体重となるよう全群のマウスにPhIP溶液を腹腔内した。PhIP投与24、48、72時間後に同様に血液を採取し、標本を作製した。標本は24時間冷蔵保存後、蛍光顕微鏡により1個体あたり網赤血球1000個を観察し、小核含有網赤血球をカウントした。その結果を表３（ノビレチン投与群等）、表４（へプタメトキシフラボン投与群等）、及び表５（タンゲレチン）に示す。
【００４８】
【表３】
2015048327.tif 000007
【００４９】
【表４】
2015048327.tif 000008
【００５０】
【表５】
2015048327.tif 000009
【００５１】
2-7  統計処理
ノビレチン、へプタメトキシフラボン及びタンゲレチン摂取群における小核含有網赤血球の発生率を対照群におけるそれと比較した。t検定を行い、P<0.05及びP<0.01の場合に有意と判定した。
【００５２】
結果及び試験例２における実施例の効果
（１）PhIPによる染色体異常誘発に対するノビレチンの抑制効果
表３に示すように、対照群、ノビレチン 0.01%含有飼料摂取群及びノビレチン0.02%含有飼料摂取群のいずれにおいてもPhIP投与により、投与48時間後まで小核含有網赤血球の発生率は増加し、72時間後では減少した。PhIP投与24時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において1.30%であったのに対し、ノビレチン0.02%含有飼料摂取群で0.76%  （P<0.01）に有意に減少した。また、PhIP投与48時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において2.42%であったのに対し、ノビレチン0.02%含有飼料摂取群では1.42% （P<0.01）に有意に減少した。一方、ノビレチン0.01%含有飼料摂取群ではPhIP投与24時間後、48時間後のいずれにおいても対照群と比べ小核含有網赤血球の発生率の減少はみられなかった。以上のようにPhIPによる染色体異常誘発に対し、ノビレチン0.02%含有飼料摂取群において抑制効果が認められた。
【００５３】
（２）PhIPによる染色体異常誘発に対するヘプタメトキシフラボンの抑制効果
表４に示すように、対照群、ヘプタメトキシフラボン 0.01%含有飼料摂取群及びヘプタメトキシフラボン0.02%含有飼料摂取群のいずれにおいてもPhIP投与により、投与48時間後まで小核含有網赤血球の発生率は増加し、72時間後では減少した。PhIP投与24時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において1.44%であったのに対し、ヘプタメトキシフラボン0.01%含有飼料摂取群で0.88%  （P<0.01）に、ヘプタメトキシフラボン  0.02%含有飼料摂取群では1.06%  （P<0.05）に有意に減少した。また、PhIP投与48時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において2.66%であったのに対し、ヘプタメトキシフラボン0.01%含有飼料摂取群では1.50% （P<0.01）に有意に減少した。ヘプタメトキシフラボン0.02% 含有飼料摂取群では2.24%に減少した。以上のようにPhIPによる染色体異常誘発に対し、ヘプタメトキシフラボンが抑制効果を示した。
【００５４】
（３）PhIPによる染色体異常誘発に対するタンゲレチンの抑制効果
表５に示すように、対照群、タンゲレチン 0.01%含有飼料摂取群及びタンゲレチン0.02%含有飼料摂取群のいずれにおいてもPhIP投与により、投与48時間後まで小核含有網赤血球の発生率は増加し、72時間後では減少した。PhIP投与24時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において1.44%であったのに対し、タンゲレチン0.01%含有飼料摂取群で1.50%、タンゲレチン  0.02%含有飼料摂取群では1.32%であり，タンゲレチン摂取による小核含有網赤血球の発生率の低下はみられなかった。一方、PhIP投与48時間後における小核含有網赤血球の発生率は、対照群において2.88%であったのに対し、タンゲレチン0.01%含有飼料摂取群では2.10% （P<0.05）に、タンゲレチン0.02%含有飼料摂取群では1.74% （P<0.05）に有意に減少した。以上のようにPhIPによる染色体異常誘発に対し、タンゲレチンが用量依存的に抑制効果を示すことがわかった。
【００５５】
［配合例］
本発明による染色体異常誘発抑制剤の配合例を示す。
配合例１：チューインガム 
砂糖                                  ５３．０wt％
ガムベース                            ２０．０
グルコース                            １０．０
水飴                                  １６．０
香料                                    ０．５
染色体異常誘発抑制剤                    ０．５
１００．０wt％
【００５６】
配合例２：グミ
還元水飴                              ４０．０wt％
グラニュー糖                          ２０．０
ブドウ糖                              ２０．０
ゼラチン                                ４．７
水                                      ９．６８
オレンジ果汁                            ４．０
オレンジフレーバー                      ０．６
色素                                    ０．０２
染色体異常誘発抑制剤                    １．０    
１００．０wt％
【００５７】
配合例３：キャンディー
砂糖                                  ５０．０wt％
水飴                                  ３３．０
水                                    １４．４
有機酸                                  ２．０
香料                                    ０．２
染色体異常誘発抑制剤                    ０．４    
１００．０wt％
【００５８】
配合例４：ヨーグルト（ハード・ソフト）
牛乳                                  ４１．５wt％
脱脂粉乳                                ５．８
砂糖                                    ８．０
寒天                                    ０．１５
ゼラチン                                ０．１
乳酸菌                                  ０．００５
染色体異常誘発抑制剤                    ０．４    
香料                                    微量
水                                      残余      
１００．０wt％
【００５９】
配合例５：清涼飲料
果糖ブドウ糖液糖                      ３０．０wt％
乳化剤                                  ０．５
染色体異常誘発抑制剤                    ０．３
香料                                    適量
精製水                                  残余      
１００．０wt％
【００６０】
配合例６：錠菓
砂糖                                  ７６．４wt％
グルコース                            １９．０
ショ糖脂肪酸エステル                    ０．２
染色体異常誘発抑制剤                    ０．５
精製水                                  ３．９      
１００．０wt％
【００６１】
配合例７：ソフトカプセル
玄米胚芽油                            ４７．０wt％
ユズ種子油                            ４０．０
乳化剤                                １２．０
染色体異常誘発抑制剤                    １．０    
１００．０wt％
【００６２】
配合例８：錠剤
乳糖                                  ５４．０wt％
結晶セルロース                        ３０．０
澱粉分解物                            １０．０
グリセリン脂肪酸エステル                ５．０
染色体異常誘発抑制剤                    １．０    
１００．０wt％
【００６３】
配合例９：化粧クリーム
スクワラン                            ２０．０wt％
ミツロウ                                ５．０
精製ホホバ油                            ５．０
グリセリン                              ５．０
グリセリンモノステアレート              ２．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン-
モノステアレート                        ２．０
染色体異常誘発抑制剤                    ２．０
防腐剤                                  適量
香料                                    適量
精製水                                  残余        
１００．０wt％
【００６４】
配合例１０：化粧水
エタノール                              ５．０wt％
グリセリン                              ２．０
1,3−ブチレングリコール
２．０
ポリエチレンオレイルエーテル            ０．５
クエン酸ナトリウム                      ０．１
クエン酸                                ０．１
染色体異常誘発抑制剤                    ０．１
精製水                                  残余        
１００．０wt％
【００６５】
配合例１１：ボディージェル
マカデミアナッツ油                      ２．０wt％
ミリスチン酸オクチルドデシル          １０．０
メチルフェニルポリシロキサン            ５．０
ベヘニルアルコール                      ３．０
ステアリン酸                            ３．０
バチルアルコール                        １．０
モノステアリン酸グリセリル              １．０
テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット  ２．０
水素添加大豆リン脂質                    １．０
セラミド                                ０．１
パルミチン酸レチノール                  ０．１
防腐剤                                  適量
ツボクサエキス                          １．０
染色体異常誘発抑制剤                    １．０
１、３−ブチレングリコール              ５．０
精製水                                  残余        
１００．０wt％
【００６６】
配合例１２：乳液
スクワラン                              ４．０wt％
ワセリン                                ２．５
セタノール                              ２．０
グリセリン                              ２．０
親油型モノステアリン酸グリセリン        １．０
ステアリン酸                            １．０
Ｌ−アルギニン                          １．０
染色体異常誘発抑制剤                    ０．５
水酸化カリウム                          ０．１
香料                                    微量
精製水                                  残余        
１００．０wt％
【００６７】
配合例１３：浴用剤（液状）
プロピレングリコール                  ５０．０wt％
エタノール                            ２０．０
硫酸ナトリウム                          ５．０
染色体異常誘発抑制剤                    ０．５
ラノリン                                ０．５
アボガド油                              ０．５
色素                                    １．５
香料                                  ２２．０        
１００．０wt％
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上により、本発明は、染色体異常の誘発を抑制し、且つ安全性の高い新規の成分を有効成分とする染色体異常誘発抑制剤を提供することができる。