(57)【要約】【課題】検体中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン酸残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチド（ビッグアンジオテンシン−２５）を特異的、且つ、高感度に測定する手段を提供すること。【解決手段】下記式（Ｉ）で表されるペプチド：  Xaa1-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Ala-Xaa2  （Ｉ）（式（Ｉ）において、Xaa1はシステインまたは芳香族アミノ酸を表し、Xaa2は芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、またはカルボン酸アミドを有するアミノ酸を表す。但し、Xaa1がシステインであり、且つ、Xaa2がアスパラギンであるペプチドを除く。）、当該ペプチドを用いる、検体中のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法。【選択図】図２
2015212237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるペプチド。
Xaa1-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Ala-Xaa2（Ｉ）（配列番号２）
（式（Ｉ）において、Xaa1はシステインまたは芳香族アミノ酸を表し、Xaa2は芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、またはカルボン酸アミドを有するアミノ酸を表す。但し、Xaa1がシステインであり、且つ、Xaa2がアスパラギンであるペプチドを除く。）
【請求項２】
Xaa1がシステイン、チロシン、またはフェニルアラニンであり、Xaa2がチロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、またはアスパラギンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Xaa1がチロシンであり、Xaa2がアスパラギンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
検体中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチド（以下、ビッグアンジオテンシン−２５という）の免疫学的測定法であって、検体中のビッグアンジオテンシン−２５を、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、および、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドと反応させることを特徴とする方法。
【請求項５】
抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが、標識物質が結合した標識化ペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
検体中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチド（以下、ビッグアンジオテンシン−２５という）の免疫学的測定法であって、グリコシダーゼ処理された検体を、担体に固定化された配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体と反応させることを特徴とする方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、請求項７に記載の方法。
（１）検体をグリコシダーゼ処理し、検体中のビッグアンジオテンシン−２５のＮ−結合型糖鎖を切断する工程；
（２）（１）の工程で生成した、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５と、担体に固定化された配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体とを反応させて、担体上に、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体と、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５とからなる免疫複合体１を生成させる工程；
（３）（２）の工程で生成した免疫複合体１と、アンジオテンシンIIに結合する抗体とを反応させ、担体上に、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（４）（３）の工程で生成された担体上の免疫複合体２と、それ以外の物質とを分離する工程；および、
（５）（４）の工程で得られた担体上の免疫複合体２の生成量を測定する工程。
【請求項９】
アンジオテンシンIIに結合する抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
検体が尿である、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
検体中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチド（以下、ビッグアンジオテンシン−２５という）の免疫学的測定用試薬であって、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、および、請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する試薬。
【請求項１２】
抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
ペプチドが、標識物質が結合した標識化ペプチドである、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１４】
検体中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチド（以下、ビッグアンジオテンシン−２５という）の免疫学的測定用試薬であって、グリコシダーゼ、担体に固定化された配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体を含有する試薬。
【請求項１５】
アンジオテンシンIIに結合する抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、請求項１４に記載の試薬。
【請求項１６】
検体が尿である、請求項１１〜１５のいずれかに記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチド（以下、ビッグアンジオテンシン−２５といい、Ｂａｎｇ−２５と略記することもある）の免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、および当該測定法または当該測定用試薬に用いる新規ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
レニン・アンジオテンシン系（Renin-Angiotensin System：RAS）は、血圧および体液バランスにおいて重要な役割を果たしており、腎臓疾患または循環器疾患の発症や進展に深く関与している。循環液中のRASの機序において、まず、主に肝臓で合成される４５２個のアミノ酸からなるアンジオテンシノーゲンが、腎臓から分泌されるレニンによって、アンジオテンシンI(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)に変換される。続いて、アンジオテンシンIは、肺毛細血管に存在するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によって、アンジオテンシンII(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)に変換される。アンジオテンシンIIは、その受容体であるアンジオテンシンII受容体に結合することによって、血管の収縮、アルドステロンの分泌、ナトリウムの再吸収を促し、血圧上昇を惹起する。また、最近では、アンジオテンシンII由来のペプチドであるアンジオテンシン（１−７）(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro)、アンジオテンシンIII(Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)、アンジオテンシンIV(Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)の報告もある（非特許文献１、２）。
【０００３】
本発明者らは、これまでに、アンジオテンシンIよりＣ末端側に２アミノ酸長い１２アミノ酸からなり、アンジオテンシノーゲンのＮ末端のアミノ酸１から１２番目に相当するポリペプチド（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile）（特許文献１）、ならびに、アンジオテンシノーゲンのＮ末端のアミノ酸１から２５番目に相当するポリペプチド（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Asn-Glu-Ser-Thr-Cys-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Ala-Asn）、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖を付加したポリペプチド、すなわち、ビッグアンジオテンシン−２５（Ｂａｎｇ−２５）を見出した（非特許文献３）。また、本発明者らは、アンジオテンシノーゲンのＮ末端のアミノ酸１から１２番目に相当するポリペプチドに結合する抗体を用いたラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）を構築し、尿中Ｂａｎｇ−２５濃度を測定する方法を開発した（非特許文献４）。しかしながら、当該抗体は、Ｂａｎｇ−２５以外に、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、アンジオテンシン（１−７）、アンジオテンシンIII、アンジオテンシンIV等にも結合することから、試料中のＢａｎｇ−２５を特異的に測定できないという問題があった。また、ラジオイムノアッセイ法は操作が煩雑で有り、測定時間が長いという問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−７４８２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Science,Vol.184, pp.994-996 (1974)
【非特許文献２】Am. J. Physiol., Vol.268, pp.302-308 (1995)
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.29 pp.757-762 (2013)
【非特許文献４】Circ J. 2014;78 (Suppl I):abstract No. OE-329 page No.999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、検体中のビッグアンジオテンシン−２５を特異的、且つ、高感度に測定する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アンジオテンシノーゲンのＮ末端のアミノ酸１８から２５番目に相当する配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの特定の置換体と、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（以下、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体という）とを用いる免疫学的測定法により、検体中のビッグアンジオテンシン−２５を特異的に、且つ、高感度に測定できるという知見を見いだした。本発明者らはまた、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と、アンジオテンシンIIに結合する抗体とを用いる、検体中のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法において、担体に固定化したビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、グリコシダーゼ処理した検体を用いることにより、ビッグアンジオテンシン−２５を特異的に、且つ、高感度に測定できるという知見を見いだした。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１６］に関する。
［１］  下記式（Ｉ）で表されるペプチド。
Xaa1-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Ala-Xaa2  （Ｉ）（配列番号２）
（式（Ｉ）において、Xaa1はシステインまたは芳香族アミノ酸を表し、Xaa2は芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、またはカルボン酸アミドを有するアミノ酸を表す。但し、Xaa1がシステインであり、且つ、Xaa2がアスパラギンであるペプチドを除く。）
［２］  Xaa1がシステイン、チロシン、またはフェニルアラニンであり、Xaa2がチロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、またはアスパラギンである、［１］に記載のペプチド。
［３］  Xaa1がチロシンであり、Xaa2がアスパラギンである、［２］に記載のペプチド。
［４］  検体中のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法であって、検体中のビッグアンジオテンシン−２５を、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、［１］〜［３］のいずれかに記載のペプチドと反応させることを特徴とする方法。
［５］  抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、［４］に記載の方法。
［６］  ペプチドが、標識物質が結合した標識化ペプチドである、［４］に記載の方法。
［７］  検体中のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法であって、グリコシダーゼ処理された検体を、担体に固定化されたビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体と反応させることを特徴とする方法。
［８］  以下の工程を含む、［７］に記載の方法。
（１）検体をグリコシダーゼ処理し、検体中のビッグアンジオテンシン−２５のＮ−結合型糖鎖を切断する工程；
（２）（１）の工程で生成した、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５と、担体に固定化されたビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体とを反応させて、担体上に、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５とからなる免疫複合体１を生成させる工程；
（３）（２）の工程で生成した免疫複合体１と、アンジオテンシンIIに結合する抗体とを反応させ、担体上に、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（４）（３）の工程で生成された担体上の免疫複合体２と、それ以外の物質とを分離する工程；および、
（５）（４）の工程で得られた担体上の免疫複合体２の生成量を測定する工程。
［９］  アンジオテンシンIIに結合する抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、［７］または［８］に記載の方法。
［１０］  検体が尿である、［４］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］  検体中のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定用試薬であって、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、［１］〜［３］のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する試薬。
［１２］  抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、［１１］に記載の試薬。
［１３］  ペプチドが、標識物質が結合した標識化ペプチドである、［１１］に記載の試薬。
［１４］  検体中のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定用試薬であって、グリコシダーゼ、担体に固定化されたビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体を含有する試薬。
［１５］  アンジオテンシンIIに結合する抗体が、標識物質が結合した標識化抗体である、［１４］に記載の試薬。
［１６］  検体が尿である、［１１］〜［１５］のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、検体中のビッグアンジオテンシン−２５を特異的、且つ、高感度に検出する免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、および当該測定法または当該測定用試薬に用いる新規ペプチドが提供される。本発明の免疫学的測定法により、腎臓疾患および循環器疾患を早期、且つ、簡便に診断することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と、配列番号３、４、７で表されるアミノ酸配列からなる各ペプチドとの反応性を示す。
【図２】配列番号３、５、６、８、９で表されるアミノ酸配列からなる各ペプチドを競合物質として用いて検体中のビッグアンジオテンシン−２５を競合法で測定した際の、検体中のビッグアンジオテンシン−２５濃度とB/B0の関係を表すグラフである。●は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、■は配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、×は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、▲は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、◆は配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをそれぞれ用いた結果を表す。
【図３】サンドイッチ法での検体中のビッグアンジオテンシン−２５濃度と吸光度の関係を表すグラフである。▲はグリコシダーゼ処理しない場合の結果を、●はグリコシダーゼ処理した場合の結果をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜ペプチド＞
本発明の新規ペプチドとしては、下記式（Ｉ）で表されるペプチドが挙げられる。
Xaa1-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Ala-Xaa2（Ｉ）（配列番号２）
（式（Ｉ）において、Xaa1はシステインまたは芳香族アミノ酸を表し、Xaa2は芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、またはカルボン酸アミドを有するアミノ酸を表す。但し、Xaa1がシステインであり、且つ、Xaa2がアスパラギンであるペプチドを除く。）
【００１２】
Xaa1における芳香族アミノ酸としては、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン等が挙げられ、チロシン、フェニルアラニン等が好ましい。Xaa2における芳香族アミノ酸としては、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン等が挙げられ、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられ、カルボン酸アミドを有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン等が挙げられる。
【００１３】
本発明における配列番号２で表されるアミノ酸配列の具体例としては、配列番号５で表されるアミノ酸配列、配列番号６で表されるアミノ酸配列、配列番号８で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列等が挙げられ、配列番号５で表されるアミノ酸配列が好ましい。
【００１４】
本発明のペプチドは、有機合成化学的方法、遺伝子工学的方法、固相法等の通常の方法によって合成できる。
【００１５】
本発明のペプチドは、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を用いる、本発明のビッグアンジオテンシン−２５の競合法による免疫学的測定法において、競合物質として用いることができる。
【００１６】
＜免疫学的測定法＞
本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法は、ビッグアンジオテンシン−２５とビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体との抗原抗体反応において、本発明のペプチドを競合物質として用いる競合法による免疫学的測定法である。また、本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法は、グリコシダーゼ処理した検体を用い、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体とアンジオテンシンIIに結合する抗体を用いるサンドイッチ法による免疫学的測定法である。
【００１７】
本発明の測定法の具体例として、競合法として以下の測定方法１および２、サンドイッチ法として以下の測定方法３の方法が挙げられるが、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法において、検体中のビッグアンジオテンシン−２５濃度は、免疫複合体の生成量により決定され、下記の測定方法ではいずれも免疫複合体の生成量は、免疫複合体中の標識量として測定される。
【００１８】
・測定方法１
以下の（１）〜（４）の工程を順次行う測定方法。
（１）検体中のビッグアンジオテンシン−２５を、標識化競合物質、および、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と反応させて、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体、および、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体とビッグアンジオテンシン−２５とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（２）ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化競合物質から分離する工程；
（３）ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識量を測定する工程；および、
（４）ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識量を、予め作成したビッグアンジオテンシン−２５濃度と標識量との間の関係を示す検量線に照らし合わせて、検体中のビッグアンジオテンシン−２５の濃度を決定する工程。
【００１９】
測定方法１において、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体は、担体に固定化されていることが好ましい。工程（１）の反応は、後述の水性媒体中で行われることが好ましい。工程（１）の反応における反応温度は、当該免疫複合体を生成し得る反応温度であれば特に制限はなく、例えば０〜５０℃であり、４〜４０℃が好ましい。また、工程（１）の反応における反応時間は、当該免疫複合体を生成し得る反応時間であれば特に制限はなく、例えば１分間〜２４時間であり、５分間〜２０時間が好ましい。工程（３）における標識量の測定は後述の方法により行うことができる。
【００２０】
・測定方法２
以下の（１）〜（４）の工程を順次行う測定方法。
（１）検体中のビッグアンジオテンシン−２５を、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体に標識物質が結合した標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、競合物質と反応させて、標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と競合物質とからなる免疫複合体、および、標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体とビッグアンジオテンシン−２５とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（２）標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体とビッグアンジオテンシン−２５とからなる免疫複合体から分離する工程；
（３）標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と競合物質とからなる免疫複合体中の標識量を測定する工程；および、
（４）標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と競合物質とからなる免疫複合体中の標識量を、予め作成したビッグアンジオテンシン−２５濃度と標識量との間の関係を示す検量線に照らし合わせて、検体中のビッグアンジオテンシン−２５の濃度を決定する工程。
【００２１】
測定方法２において、競合物質は、担体に固定化されていることが好ましい。工程（１）の反応は、後述の水性媒体中で行われることが好ましい。工程（１）の反応における反応温度は、当該免疫複合体を生成し得る反応温度であれば特に制限はなく、例えば０〜５０℃であり、４〜４０℃が好ましい。また、工程（１）の反応における反応時間は、当該免疫複合体を生成し得る反応時間であれば特に制限はなく、例えば１分間〜２４時間であり、５分間〜２０時間が好ましい。工程（３）における標識量の測定は後述の方法により行うことができる。
【００２２】
測定方法１および２において使用される標識化競合物質としては、標識化された本発明のペプチドが用いられる。本発明のペプチドを標識化する方法は、本発明のペプチドと後述の標識物質とを用いて、後述の方法により作製することができる。
【００２３】
・測定方法３
以下の（１）〜（６）の工程を含む測定方法。
（１）検体をグリコシダーゼ処理し、検体中のビッグアンジオテンシン−２５のＮ−結合型糖鎖を切断する工程；
（２）（１）の工程で生成した、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５と、担体に固定化されたビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体とを反応させて、担体上に、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５とからなる免疫複合体１を生成させる工程；
（３）（２）の工程で生成した免疫複合体１と、アンジオテンシンIIに結合する抗体に標識物質が結合した標識化抗アンジオテンシンII抗体とを反応させ、担体上に、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５、および、標識化抗アンジオテンシンII抗体からなる免疫複合体２を生成させる工程；
（４）（３）の工程後の担体を洗浄し、担体上の免疫複合体２と、それ以外の物質とを分離する工程；
（５）（４）の工程で得られた担体上の免疫複合体２中の標識量を測定する工程；および、
（６）（５）の工程で測定された標識量を、予め作成したビッグアンジオテンシン−２５濃度と標識量との間の関係を示す検量線に照らし合わせて、検体中のビッグアンジオテンシン−２５の濃度を決定する工程。
【００２４】
測定方法３の工程（１）におけるグリコシダーゼ処理に用いられるグリコシダーゼとしては、本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法を可能にするグリコシダーゼであれば特に制限は無く、例えばＮ−結合型糖鎖を切断するグリコシダーゼ、Ｏ−結合型糖鎖を切断するグリコシダーゼ等が挙げられ、Ｎ−結合型糖鎖を切断するグリコシダーゼが好ましい。Ｎ−結合型糖鎖を切断するグリコシダーゼの具体例（市販品）としては、例えばPeptide-N-Glycosidase F（PNGase F）（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社、シグマ・アルドリッチ社等）、Endoglycosidase H（Endo H）（コスモ・バイオ社）、EndoglycosidaseHf（Endo Hf）（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社）、Endoglycosidase D（コスモ・バイオ社）、Endoglycosidase F1（コスモ・バイオ社）、Endoglycosidase F2（コスモ・バイオ社）、Endoglycosidase F3（コスモ・バイオ社）等が挙げられる。また、Ｎ−結合型糖鎖を切断するグリコシダーゼとしては、生物由来であっても、組み換え遺伝子産物（リコンビナントタンパク質）であってもよい。
【００２５】
工程（２）と工程（３）との間に担体の洗浄工程が含まれていてもよい。工程（２）と工程（３）は順次行われても、同時に行われてもよい。工程（２）の反応、および、工程（３）の反応は、後述の水性媒体中で行われることが好ましい。工程（２）の反応、および、工程（３）の反応における反応温度は、各工程で免疫複合体を生成し得る反応温度であれば特に制限はなく、例えば０〜５０℃であり、４〜４０℃が好ましい。また、工程（２）の反応、および、工程（３）の反応における反応時間は、各工程で免疫複合体を生成し得る反応時間であれば特に制限はなく、例えば１分間〜２４時間であり、５分間〜２０時間が好ましい。工程（５）における標識量の測定は後述の方法により行うことができる。
【００２６】
また、工程（３）において、アンジオテンシンIIに結合する抗体に標識物質が結合した標識化抗アンジオテンシンII抗体の代わりに、標識物質が結合していないアンジオテンシンIIに結合する抗体を用いることもできる。その場合には、工程（３）の後、担体上で、免疫複合体２と、アンジオテンシンIIに結合する抗体に結合する抗体（第三抗体）に標識物質が結合した標識化第三抗体とを反応させ、担体上に、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、Ｎ−結合型糖鎖が切断されたビッグアンジオテンシン−２５、アンジオテンシンIIに結合する抗体、および、標識化第三抗体からなる免疫複合体３を生成させ、免疫複合体３中の標識量を測定することにより、検体中のビッグアンジオテンシン−２５濃度を決定することができる。
【００２７】
測定方法１および２の工程（２）は、反応溶液を除去した後、担体を洗浄することにより容易に行うことができる。すなわち、抗原抗体反応後に反応溶液を除去し、担体を洗浄液により洗浄することにより、担体上に生成した免疫複合体と未反応の標識体（標識化抗体、標識化競合物質）とを分離することができる。
【００２８】
洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５  ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含有する１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ７．２、以下、ＰＢＳと記す）、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等をあげることができる。当該界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
【００２９】
測定方法１において、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体が担体に固定化されていない場合は、（３）の工程で標識化競合物質に結合せず、当該抗体に結合する結合性物質を固定化した担体を添加して、免疫複合体を担体に結合させた後、反応溶液を除去し、さらに担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質とを分離することができる。また、標識化競合物質に結合せず、当該抗体に結合する結合性物質を固定化した担体の存在下で、（１）の工程の免疫複合体を生成させる反応を行い、免疫複合体の生成と免疫複合体の担体への固定化を同時に行った後、反応溶液を除去し、さらに担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。標識化競合物質に結合せず、当該抗体に結合する結合性物質としては、例えば、当該抗体の定常領域と結合する抗体等が挙げられる。
【００３０】
＜検体＞
本発明における検体としては、本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法を可能にする検体であれば特に制限は無く、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、腹水、リンパ液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿、血清、尿等が好ましい。また、本発明における検体としては、前処理された検体であってもよい。前処理としては、本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法を可能にする前処理であれば特に制限は無く、例えば、前記したグリコシダーゼ処理等が挙げられる。
【００３１】
＜ビッグアンジオテンシン−２５＞
本発明の免疫学的測定法におけるビッグアンジオテンシン−２５は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加したアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されたＮ−結合型糖鎖ペプチドである。
【００３２】
ビッグアンジオテンシン−２５中のＮ−結合型糖鎖は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加されたアミノ酸配列からなるペプチドの１４位のアスパラギンに付加する糖鎖であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド、または、当該アミノ酸配列の１８位のシステイン残基にさらにシステインが付加されたアミノ酸配列からなるペプチドにレニン抵抗性を付与する活性を有する限り、特に制限はない。ビッグアンジオテンシン−２５中のＮ−結合型糖鎖は、ガラクトース（Gal）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、およびマンノース（Man）を含み、糖鎖の非還元末端に、Ｎ−アセチルノイラミン酸等のシアル酸が結合していてもよい。また、グルコース（Glu）、フコース（Fuc）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、グルクロン酸（GlcA）、イズロン酸（IdoA）、キシロース（Xyl）、ガラクツロン酸（GlcA）等を含んでいてもよい。糖鎖が分岐する場合、分岐数は、典型的には二本であるが、三本以上であってもよい。
【００３３】
上記Ｎ−結合型糖鎖の好ましい例としては、下記式（II）、（III）、または（IV）のいずれかに示されるＮ−結合型糖鎖が挙げられる。
【化１】
2015212237.tif 000003
（上記式（II）、（III）、（IV）中、Galはガラクトース、Manはマンノース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン、Neu5AcはＮ−アセチルノイラミン酸を示す。）
【００３４】
＜抗体および標識化抗体＞
本発明の免疫学的測定法に用いられる、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できる。本発明における、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体は、通常の抗体製造方法により取得することができ、例えば配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、動物（マウス、ラット、ウサギ等）に免疫することにより取得することができる。本発明における、アンジオテンシンIIに結合する抗体としては、アンジオテンシンIIに結合し得る抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できる。また、本発明における、アンジオテンシンIIに結合する抗体は、通常の抗体製造方法により取得することができ、例えばアンジオテンシンIIを、動物（マウス、ラット、ウサギ等）に免疫することにより取得することができる。また、本発明に用いる抗体としては、抗体断片を包含する。具体的には、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体断片が挙げられる。
【００３５】
本発明における標識化抗体は、本発明に用いられるビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体またはアンジオテンシンIIに結合する抗体と後述の標識物質とを用いて、後述の方法により作製される。
【００３６】
＜担体＞
本発明の免疫学的測定法に用いられる担体は、本発明の免疫学的測定法に用いられる抗体または競合物質を安定に保持できるものであれば特に制限はない。担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられる。例えば、１枚に９６ウェルを有するポリスチレン製のマイクロタイタープレート等が好ましい。
【００３７】
＜抗体または競合物質の担体への固定化＞
本発明の免疫学的測定法において、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質の担体への固定化方法としては、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質が担体上に安定に保持される方法であれば特に制限はなく、例えば物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用等、公知の方法が挙げられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。例えば、ポリスチレン製免疫測定用マイクロタイタープレートを担体として使用する場合には、プレート内のウェルに抗体または競合物質の溶液を添加して、１時間から２４時間、４℃〜３０℃でインキュベートすることにより、物理吸着させ固定化する方法をあげることができる。
【００３８】
ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質は、直接、担体に固定化してもよいし、間接的に担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばアビジンを固定化した担体に、ビオチン化した抗体または競合物質を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質を担体に固定化する方法が挙げられる。また、担体に、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体に特異的に結合する抗体または競合物質に特異的に結合する抗体を固定化し、この抗体を介してビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質を担体に固定化してもよい。あるいは、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質は、リンカーを介した共有結合により担体に固定化してもよい。
【００３９】
リンカーとしては、例えば、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質の官能基と担体の側鎖の官能基の両者と共有結合できる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体または競合物質が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、担体の側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基を同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。抗体または競合物質の官能基および担体がその表面に保持している官能基としては例えば、カルボキシ基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
【００４０】
＜標識物質＞
本発明の免疫学的測定法における、標識化抗体、すなわち、標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、アンジオテンシンIIに結合する抗体に標識物質が結合した標識化抗アンジオテンシンII抗体、ならびに、標識化競合物質に使用される標識物質は、本発明のビッグアンジオテンシン−２５の免疫学的測定法を可能とする標識物質であれば特に制限はなく、例えば酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。
【００４１】
酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
【００４２】
蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン  イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ−イソチオシアナート）等が挙げられる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。
【００４３】
発光物質としては、例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたものが好ましい。
【００４４】
放射性同位元素としては、例えば、3H、14C、35S、32P、125I、131I等が挙げられる。
タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、His-His-His-His-His-His）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala）等が挙げられる。
【００４５】
本発明における標識化抗体および標識化競合物質は、標識化抗体および標識化競合物質を調製し得る方法であれば如何なる方法でも調製することができ、例えば標識される抗体または競合物質が有する官能基と、標識物質が有する官能基との間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等が挙げられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることにより、標識物質を抗体および競合物質に共有結合させることができる。
【００４６】
リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］等のカルボジイミド化合物を用いる方法等が挙げられる。この場合、ＮＨＳまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
【００４７】
リンカーとしては、例えば、標識物質と抗体とをそれぞれの官能基を介して結合させうる分子であれば如何なる分子でもよい。好ましい態様は、例えば、抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の側鎖の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子であり、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基であることが好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基が挙げられる。
【００４８】
放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、例えば文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990）記載の方法等が挙げられる。
【００４９】
＜標識量の測定＞
免疫複合体中の標識量の測定方法は、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合、或いは凝集等により生じる濁度（吸光度）変化量の場合、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により測定することができる。
【００５０】
標識物質が酵素である場合、標識量は、酵素活性を測定することにより定量することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
【００５１】
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
【００５２】
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００５３】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００５４】
蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【００５５】
発光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。
【００５６】
酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等が挙げられる。
【００５７】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法等によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］またはその類似化合物等が挙げられる。蛍光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。
【００５８】
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
【００５９】
標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の場合は、当該標識物質に特異的に結合する物質を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識体と、免疫複合体中の標識化抗体または標識化競合物質を構成している当該標識物質とを結合させ、当該標識物質に特異的に結合する物質を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うことができる。標識物質に特異的に結合する物質としては、標識物質に特異的に結合する抗体、また標識物質がビオチンの場合は、アビジンやストレプトアビジン等が挙げられる。また、標識物質に特異的に結合する物質（標識物質に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジン等）を用いて、免疫複合体中の標識物質と結合させた後、標識物質に特異的に結合する物質に結合する抗体、例えば、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素で標識したものを結合させ、これらの抗体を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うこともできる。
【００６０】
これらの検出に用いる抗体、アビジンまたはストレプトアビジンや標識物質に特異的に結合する抗体、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、あるいはＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメントでもよい。
【００６１】
＜水性媒体およびその他の共存物＞
本発明における水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
【００６２】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。
【００６３】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
【００６４】
本発明の免疫学的測定法においては、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を共存させることができる。
金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。
塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。
蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。
蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等が挙げられる。
【００６５】
＜免疫学的測定用試薬＞
本発明の免疫学的測定用試薬は、本発明の免疫学的測定法に使用され得るものである。本発明の免疫学的測定用試薬の具体例として、以下の試薬１〜３が挙げられるが、本発明は、これらの試薬に限定されるものではない。
【００６６】
・試薬１
(a)ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、(b)本発明のペプチド（競合物質）に標識物質が結合した標識化ペプチド（標識化競合物質）を含有する試薬。
ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体は、担体に固定化されていることが好ましい。
・試薬２
(a)ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体に標識物質が結合した標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、(b)本発明のペプチド（競合物質）を含有する試薬。
本発明のペプチド（競合物質）は、担体に固定化されていることが好ましい。
・試薬３
(a)グリコシダーゼ、(b)担体に固定化されたビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、および、(c)アンジオテンシンIIに結合する抗体に標識物質が結合した標識化抗アンジオテンシンII抗体を含有する試薬。
【００６７】
上記試薬１は、上記測定方法１に使用される試薬であり、上記試薬２は、上記測定方法２に使用される試薬である。また、上記試薬３は、上記測定方法３に使用される試薬である。上記試薬３におけるグリコシダーゼは、検体の前処理用に使用される。
【００６８】
本発明の免疫学的測定用試薬の形状は、本発明の免疫学的測定法を可能とする形状であれば特に制限はない。試薬の形状としては、例えば液状、凍結状態または凍結乾燥状態等の形状が挙げられる。凍結乾燥状態の試薬を使用する場合には、測定前に前述の水性媒体等で溶解して測定に供する。
【００６９】
本発明の免疫学的測定用試薬において使用されるビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、アンジオテンシンIIに結合する抗体、ペプチド（競合物質）、グリコシダーゼ、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体に標識物質が結合した標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、アンジオテンシンIIに結合する抗体に標識物質が結合した標識化抗アンジオテンシンII抗体、標識化ペプチド（標識化競合物質）としては、例えば、それぞれ、前述のビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、アンジオテンシンIIに結合する抗体、ペプチド（競合物質）、グリコシダーゼ、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体に標識物質が結合した標識化ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体、アンジオテンシンIIに結合する抗体に標識物質が結合した標識化抗アンジオテンシンII抗体、標識化ペプチド（標識化競合物質）を挙げることができる。また、本発明の免疫学的測定用試薬は、必要に応じて、前述の水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を含有することができる。
【００７０】
また、本発明の免疫学的測定用試薬は、キットの形態で保存、流通されてもよい。キットとしては、２試薬系、３試薬系等の形態が挙げられるが、キットを構成する各試薬中の構成要素は、当業者が適宜選択することができる。
【００７１】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００７２】
［実施例１］配列番号３〜９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの合成
α-アミノ基がＦｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）基で保護されたアミノ酸を用意し、表面がアミノ基で修飾されたポリスチレン（担体）に、Ｃ末端となるアミノ酸のカルボキシル基を固定させた。Ｃ末端となるアミノ酸が固定化された当該担体と、２０％ピペリジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ナカライテスク社製）溶液とを混合し、Ｆｍｏｃ基を除去し、アミノ基を脱保護した。その後、ＤＭＦで洗浄し、脱保護により生じた副生成物を除去した。洗浄後の当該溶液と、Ｃ末端から２番目に結合させるべきアミノ酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（東京化成工業社製）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（東京化成工業社製）を含むＮ−メチルピロリドン（東京化成工業社製）溶液とを混合し、Ｃ末端となるアミノ酸とＣ末端から２番目に結合させるべきアミノ酸とを縮合させ、ジペプチドを生成させた。その後、未反応のアミノ酸を洗浄除去した。Ｃ末端から３番目以降のアミノ酸について、順次、上記と同様の操作を行い、目的のアミノ酸数のペプチドを合成した。アミノ酸鎖の伸長操作が終了した後、アミノ酸鎖をトリイソプロピルシランと純水とを含むトリフルオロ酢酸の混合液で処理して、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖官能基の保護基を脱保護した。
【００７３】
［実施例２］ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体の各ペプチドに対する反応性
（１）ペプチド固相化プレートの作製
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをＰＢＳ溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム（関東化学社製）を含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、１ウェル当たり５０μＬずつ、９６穴マイクロタイタープレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に分注した。２５℃で２４時間静置後、ブロッキング液［１％ＢＳＡ（ＢＯＶＯＧＥＮ社製）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（関東化学社製）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液］で洗浄し、ブロッキング液を３００μL加え、２５℃で２４時間静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、乾燥し、配列番号３のペプチドが固相化されたプレートを作製した。
【００７４】
同様の方法で、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる各ペプチドが固相化されたプレートを調製した。
【００７５】
（２）ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体のペルオキシダーゼ標識
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫したウサギから得られた抗血清を、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを固定化したペプチドカラムを用いて精製し、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を得た。ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体２００μg分を使用し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（同仁化学研究所社製）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識し、ＰＯＤ標識ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を得た。
【００７６】
（３）ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体の各ペプチドに対する反応性
（１）で作製した、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがそれぞれ固相化されたプレートの各ウェルに、ＰＯＤ標識抗体希釈液（０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で１００００倍に希釈したＰＯＤ標識ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を５０μＬ添加して、２５℃で１時間静置した。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）（ナカライテスク社製）を各ウェル１００μＬ添加し、２５℃で３０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸（関東化学社製）を１００μＬ添加し、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。この他、陰性コントロールとして、ペプチドを固相化せず、（１）に記載された手順に従い、ブロッキングのみ実施したプレートを作製し、前述した方法と同様の手順でアッセイを実施し、吸光度を測定した。測定した吸光度を表１と図１に示した。ここで得られる吸光度が高いほど、ペプチドと結合しているビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体が多いことを意味しており、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体のペプチドに対する反応性が高いことを示す。
【００７７】
【表１】
2015212237.tif 000004
【００７８】
表１および図１に示したように、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと反応するが、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端の１アミノ酸を欠損させた配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、および、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端の１アミノ酸を欠損させた配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとは反応しなかった。すなわち、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとの結合には、Ｎ末端のシステイン、またはＣ末端のアスパラギンが必須であることが判明した。
【００７９】
［実施例３］各ペプチドを競合物質として用いた際の試料中のビッグアンジオテンシン−２５（Ｂａｎｇ−２５）の検出感度
検体希釈液（０．１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）を用いてＢａｎｇ−２５（ペプチド研究所社製）を希釈し、０、０．１６、１．２５、２．５０、５．００、１０．００ｎｇ／ｍＬのＢａｎｇ−２５溶液を調製した。実施例２で調製した、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、および配列番号９でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるペプチドが固相化されたそれぞれのプレートの各ウェルに、各濃度のＢａｎｇ−２５溶液、および、前記のＰＯＤ標識抗体希釈液で１００００倍に希釈したＰＯＤ標識ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を、それぞれ５０μＬずつ添加して２５℃で１時間静置した。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）を各ウェル１００μＬ添加し、２５℃で３０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ添加し、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。この際、各濃度のＢａｎｇ−２５溶液（０．１６〜１０．００ｎｇ／ｍＬ）を添加した時の吸光度（Ｂ）を、Ｂａｎｇ−２５を全く含まない溶液（検体希釈液）を添加したときの吸光度（Ｂ０）を１００％としたときの相対的な値（Ｂ／Ｂ０（％））として算出した（表２）。また、Ｂａｎｇ−２５濃度を横軸、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各濃度のＢａｎｇ−２５溶液の測定結果をプロットした図を、図２に示した。
【００８０】
【表２】
2015212237.tif 000005
【００８１】
競合法において、Ｂ／Ｂ０（％）が１００％の時、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と試料中のＢａｎｇ−２５とが結合しておらず、試料中のＢａｎｇ−２５を検出できないことを示し、Ｂ／Ｂ０（％）が低いほど、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体と試料中のＢａｎｇ−２５とが結合し、Ｂａｎｇ−２５の検出感度が高いことを示している。表２および図２に示したように、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを競合物質として固相化した場合、１０ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｎｇ−２５溶液のＢ／Ｂ０（％）が９５％であり、１０ｎｇ／ｍＬのＢａｎｇ−２５を検出できなかった。一方、配列番号５、配列番号６、配列番号８、および配列番号９でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるペプチドを競合物質として固相化した場合、１０ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｎｇ−２５溶液を測定したときのＢ／Ｂ０（％）は、４６％、７３％、７７％、６５％であり、配列番号３のペプチドを競合物質として固相化した場合と比べ、試料中のＢａｎｇ−２５の検出感度が高かった。また、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを競合物質として固相化した場合、０．１６ｎｇ／ｍＬ  Ｂａｎｇ−２５溶液のＢ／Ｂ０（％）は、８４％であり、０．１６ｎｇ／ｍＬのＢａｎｇ−２５を検出できた。以上のことより、競合物質として配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸を置換した配列番号５、配列番号６、配列番号８、または配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる各ペプチドを競合物質として用いることで、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いたときに比べて、高感度でＢａｎｇ−２５を検出できることが判明した。
【００８２】
［実施例４］希釈直線性試験（競合法）
免疫測定法において、生体試料（尿等）中の測定対象物の測定の正確さを評価する方法の１つに希釈直線性試験がある。この方法を用いて、本発明の方法が尿中のＢａｎｇ−２５濃度を正しく測定できているか否かを評価した。
【００８３】
尿検体を検体希釈液（０．１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）にて、２倍、４倍、８倍に希釈し、２倍希釈尿検体、４倍希釈尿検体、および８倍希釈尿検体を調製した。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが固相化されたプレートの異なるウェルに、原液尿検体（１倍希釈尿検体）、調製した各希釈尿検体、および実施例３で用いた各濃度のＢａｎｇ−２５溶液（キャリブレーター）を、それぞれ２５μＬずつ分注した。続いて、検体希釈液を各ウェルに２５μＬずつ分注した。さらに、ＰＯＤ標識抗体希釈液で１００００倍に希釈したＰＯＤ標識ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を、各ウェルに５０μＬずつ添加して２５℃で１時間静置した。これ以後は、実施例３と同じ作業を実施し、Ｂ／Ｂ０（％）を算出した。Ｂａｎｇ−２５濃度を横軸、各濃度のＢａｎｇ−２５を含むキャリブレーターのＢ／Ｂ０（％）を縦軸にプロットして作成した検量線を用い、原液尿検体および希釈尿検体中のＢａｎｇ−２５濃度を算出した。また、下記式（１）に従い、原液尿検体（１倍希釈検体）中のＢａｎｇ−２５濃度を２倍、４倍、８倍希釈した際の理論濃度に対する対理論濃度を算出した。その結果を表３に示す。
【００８４】
【数１】
2015212237.tif 000006
【００８５】
【表３】
2015212237.tif 000007
【００８６】
対理論濃度が１００％に近い程、測定が正確であることを意味する。表３に示した通り、８５〜１００％と良好な対理論濃度が得られたことから、本発明の方法により尿中のＢａｎｇ−２５を正確に測定できることが判明した。
【００８７】
［実施例５］サンドイッチ法でのＢａｎｇ−２５検出感度
（１）抗アンジオテンシンII抗体のペルオキシダーゼ標識
アンジオテンシンIIを免疫したウサギから得られた抗血清を、アンジオテンシンIIを固定化したペプチドカラムを用いて精製し、抗アンジオテンシンII抗体を得た。抗アンジオテンシンII抗体２００μg分を使用し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔを用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識し、ＰＯＤ標識抗アンジオテンシンII抗体を得た。
【００８８】
（２）抗体固相化プレートの作製
ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体を、終濃度５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、固相用の９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに５０μＬずつ添加した。２５℃で２４時間静置後、前記のブロッキング液で洗浄し、ブロッキング液を３００μL加え、２５℃で２４時間静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、乾燥し、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体が固相化されたプレートを作製した。
【００８９】
（３）サンドイッチ法でのＢａｎｇ−２５検出感度
前記の検体希釈液を用いて、０、０．０３、０．０６、０．１３、０．２５、０．５０、１．００、２．００ｎｇ／ｍＬの各濃度に希釈したＢａｎｇ−２５溶液（グリコシダーゼ処理していない試料）、および、各濃度のＢａｎｇ−２５溶液に、終濃度が５Ｕ/ｍＬになるようにＰＮＧａｓｅＦ（グリコシダーゼ；シグマ・アルドリッチ社製）を添加し、３７℃で３時間反応させた試料（グリコシダーゼ処理した試料）を調製した。調製したグリコシダーゼ処理していない試料、および、グリコシダーゼ処理した試料を、プレートの異なるウェルに５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４，１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した後、各ウェルに、前記のＰＯＤ標識抗体希釈液で１００００倍に希釈したＰＯＤ標識抗アンジオテンシンII抗体を５０μＬ添加して、２５℃で１時間静置した。洗浄液で各ウェルを３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）を各ウェル１００μＬ添加し、２５℃で３０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ添加し、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。吸光度の測定結果を表４に、Ｂａｎｇ−２５濃度を横軸、吸光度を縦軸にとり、各濃度のＢａｎｇ−２５溶液の測定結果をプロットした図を、図３に示した。
【００９０】
【表４】
2015212237.tif 000008
【００９１】
サンドイッチ法においては、吸光度が高いほど、Ｂａｎｇ−２５の検出感度が高いことを示している。表４および図３に示されている様に、グリコシダーゼ処理したＢａｎｇ−２５溶液を試料として用いた方が、グリコシダーゼ処理しないＢａｎｇ−２５溶液を試料として用いた場合に比べて吸光度が高かった。従って、グリコシダーゼ処理した試料を用いるサンドイッチ法により、Ｂａｎｇ−２５を高感度に検出できることが判明した。
【００９２】
［実施例６］希釈直線性試験（サンドイッチ法）
サンドイッチ法を用いる、本発明の尿中のＢａｎｇ−２５の免疫学的測定法の正確さを希釈直線性試験で評価した。
尿検体を前記の検体希釈液にて、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍に希釈し、２倍希釈尿検体、４倍希釈尿検体、８倍希釈尿検体、１６倍希釈尿検体、および３２倍希釈尿検体を調製した。原液尿検体（１倍希釈尿検体）、および、調製した各希釈尿検体に、終濃度が５Ｕ/ｍＬになるようにＰＮＧａｓｅＦを添加し、３７℃で３時間反応させた。また、実施例５で用いたＰＮＧａｓｅＦ処理した各濃度のＢａｎｇ−２５溶液をキャリブレーターとして用いた。実施例５で作製した、ビッグアンジオテンシン−２５Ｃ末抗体が固相化されたプレートの異なるウェルに、ＰＮＧａｓｅＦ処理した尿検体、およびキャリブレーターを、それぞれ２５μＬずつ分注した。続いて、検体希釈液を各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で１時間静置した。これ以後は、実施例５と同じ手順でアッセイを実施し、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。Ｂａｎｇ−２５濃度を横軸、各濃度のＢａｎｇ−２５を含むキャリブレーターの吸光度を縦軸にプロットして作成した検量線を用い、原液尿検体および希釈尿検体中のＢａｎｇ−２５濃度を算出した。下記式（１）に従い、原液尿検体（１倍希釈尿検体）中のＢａｎｇ−２５濃度を２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍希釈した際の理論濃度に対する対理論濃度を算出した。その結果を表５に示す。
【００９３】
【数２】
2015212237.tif 000009
【００９４】
【表５】
2015212237.tif 000010
【００９５】
対理論濃度が１００％に近い程、測定が正確であることを意味する。表５に示した通り、１００〜１１４％と良好な対理論濃度が得られたことから、本発明のサンドイッチ法を用いる免疫学的測定法により、尿中のＢａｎｇ−２５を正確に測定できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明により、検体中のビッグアンジオテンシン−２５を特異的、且つ、高感度に検出する免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、および当該測定法または当該測定用試薬に用いる新規ペプチドが提供される。本発明の免疫学的測定法により、腎臓疾患および循環器疾患を早期、且つ、簡便に診断することが可能になる。本発明は、腎臓疾患や循環器疾患等の診断薬およびキットの製造分野に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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