(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘパリン結合性増殖因子であるＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦリセプターとの結合を強力に阻害して抗腫瘍剤として有用なポリペプチドの提供。【解決手段】ジフテリア毒素（ＤＴ）の変異である、CRM197のRドメインを含むポリペプチドであって、前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換又は欠失され、CRM197のAドメイン、Tドメイン及びRドメインを含むCRM197改変体であるポリペプチド、及び、該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤。【選択図】図１
2015137247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRM197のRドメインを含むポリペプチドであって、前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換されたポリペプチド。
【請求項２】
前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位及び472位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換された、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
CRM197のRドメインにおいて、H391K、R460H、G466D、D467A、V468T、R472K、D507N、H520Kからなる群から選ばれる少なくとも1種を含む請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがCRM197のAドメイン、Tドメイン及びRドメインを含むCRM197改変体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを含む抗腫瘍剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドに抗腫瘍剤が結合されている、請求項５に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド及び抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
HB-EGFは、ヘパリン結合性の増殖因子である。EGFファミリーの増殖因子には、HB-EGFの他にEGF、transforming growth factor(TGF-α)、amphiregulin(AR)、epiregulin等があり、これらの分子はEGFリセプター及びそのファミリー(ErbBファミリー)分子に結合して、リセプターのリン酸化を促す。具体的にはHB-EGFは、EGFリセプター(ErbB1)およびErbB4に結合する。そのHB-EGFは種々の組織で発現しているが、肺、骨格筋、心臓でmRNAの高い発現が認められている。さらに種々の癌組織や炎症部位に高発現することも報告されている。HB-EGFは、繊維芽細胞、平滑筋細胞あるいはケラチノサイトの増殖をよく促進することが報告されている。また、HB-EGFは生体の形態形成や再生に重要な役割を果たすだけでなく、がん細胞の増殖や浸潤、転移、抗癌剤耐性にも密接に関わることが報告されている。HB-EGFは細胞膜上で膜結合型分子（proHB-EGF）として合成され、細胞表面のプロテアーゼによって切断されて分泌型のHB-EGF(sHB-EGF)を作り出す。このsHB-EGFが主として増殖因子として働くが、proHB-EGFが膜結合型で増殖因子として働く例も報告されている。(非特許文献1−３)。
【０００３】
ジフテリア菌が産生するジフテリア毒素(DT)は、アミノ酸535個、分子量が約58.4kDaのタンパク質である。DTは、フラグメントＡとフラグメントＢから構成される。一方、立体構造的に見ると、DTは触媒ドメイン（Ｃドメイン）、膜貫通ドメイン（Ｔドメイン）、受容体結合ドメイン（Ｒドメイン）から成っている。また、フラグメントＡはＣドメインに相当し、フラグメントＢはＴドメインとＲドメインから構成されている(図1)。DTは、そのRドメインでproHB-EGFに結合後、細胞内に侵入し、酸性小胞に到達する。この時Tドメインが酸性小胞の膜に挿入され、Ｃドメインの小胞膜通過を促進させる。最終的に、そのＣドメインが細胞質に到達し、ペプチド伸長因子(EF2)をADP-リボシル化することでEF2を不活化し、結果的に細胞のタンパク質合成を阻害する。（非特許文献４）
【０００４】
CRM197(Cross reaction material)は、DTにおいてG52Eの変異を有するものであり、この変異によりADPリボシル化活性が不活化されているため、DTとしての毒性は失われているが、そのRドメインはDTと同じであるので、DTと同様にproHB-EGFに結合する。DTおよびCRM197のRドメインはproHB-EGFのEGF様ドメインに結合する。したがってDTおよびCRM197はsHB-EGFにも結合する。DTやCRM197がsHB-EGFに結合すると、そのsHB-EGFはEGFリセプターに結合できなくなり、結果的にsHB-EGFの細胞増殖作用を抑制する。したがってCRM197はHB-EGF阻害剤として用いることができる。（非特許文献５、特許文献１，２）
【０００５】
CRM197のHB-EGF阻害作用を利用してCRM197を抗がん剤として開発する研究が進められている。これまでの非臨床試験ではCRM197はヌードマウスに接種されたヒト癌細胞の腫瘍形成を強く抑制することが報告されており、さらにCRM197を有効成分とする抗がん剤の臨床試験が実施されている。(非特許文献６、７)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2006-232761
【特許文献２】特開2004-155776
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Raab, G. and M. Klagsbrun, Heparin-binding EGF-like growth factor. Biochim Biophys Acta, 1997. 1333(3): p. F179-99.
【非特許文献２】Iwamoto, R., et al., Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential for heart function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(6): p. 3221-6.
【非特許文献３】Higashiyama, S., et al., The membrane protein CD9/DRAP 27 potentiates the juxtacrine growth factor activity of the membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor. J Cell Biol, 1995. 128(5): p. 929-38.
【非特許文献４】Collier, R.J., Understanding the mode of action of diphtheria toxin: a perspective on progress during the 20th century. Toxicon, 2001. 39(11): p. 1793-803.
【非特許文献５】Mitamura, T., et al., Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J Biol Chem, 1995. 270(3): p. 1015-9.
【非特許文献６】Miyamoto, S., et al., Heparin-binding EGF-like growth factor is a promising target for ovarian cancer therapy. Cancer Res, 2004. 64(16): p. 5720-7.
【非特許文献７】Miyamoto, S., et al., Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor as a novel targeting molecule for cancer therapy. Cancer Sci, 2006. 97(5): p. 341-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、HB-EGFとEGFレセプターとの結合をさらに強力に阻害するポリペプチド及び抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、CRM197よりもHB-EGFに対してより強くHB-EGFの増殖因子作用を抑制する分子の作製を検討し、CRM197のＲドメインの特定の位置のアミノ酸を置換させることで、HB-EGFとEGFレセプターとの結合をより強く阻害できることを見出した。
【００１０】
本発明は、以下のポリペプチド及び抗腫瘍剤を提供するものである。
項１．  CRM197のRドメインを含むポリペプチドであって、前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換されたポリペプチド。
項２．  前記Rドメインの391位、460位、466位、467位、468位及び472位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換された、項1に記載のポリペプチド。
項３．  CRM197のRドメインにおいて、H391K、R460H、G466D、D467A、V468T、R472K、D507N、H520Kからなる群から選ばれる少なくとも1種を含む項1又は2に記載のポリペプチド。
項４．  前記ポリペプチドがCRM197のAドメイン、Tドメイン及びRドメインを含むCRM197改変体である、項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
項５．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを含む抗腫瘍剤。
項６．  項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドに抗腫瘍剤が結合されている、項５に記載の抗腫瘍剤。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】CRM197の一次構造。CRM197はフラグメントＡ及びフラグメントＢからなり、フラグメントＢは、構造的にＴ（膜貫通）ドメインとＲ(受容体結合)ドメインに分けられる。
【図２】CRM197または組換えRドメインタンパク質によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。DER細胞を10 ng/mlのHB-EGFと種々の濃度のCRM197または組換えRドメインタンパク質の存在下に40時間培養して細胞数をカウントした。(A)CRM197とMBP-R(WT)の比較。(B)MBP-R(WT)とR(WT)の比較。.
【図３】MBP-R変異体によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。増大した抑制作用を有する変異体の比較。図中のMBP-R(466-468)はMBP-R(G466D/D467A/V468T)を表す。
【図４】MBP-R変異体によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。(A)V468T変異体、(B)D507N変異体、(C)H520K変異体。
【図５】DER細胞のTGF-α-依存性増殖に対するCRM197又はMBP-R変異体の効果. DER細胞を3ng/mlのTGF-αと種々の濃度のCRM197, MBP-R(WT)またはMBP-R変異体の存在下に培養した。図中のMBP-R(466-468)はMBP-R(G466D/D467A/V468T)を表す。
【図６】BRL細胞(A-C)及びBRLH細胞(D, E)の3D培養での増殖に対するR-ドメイン変異体の抑制作用。(A-C)組換えHB-EGFで刺激されたBRL細胞に対するMBP-R変異体の効果。CRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R変異体(各5μM)及び組換えHB-EGF(30ng/ml)を培養培地に加え、3D条件下に培養した。(D, E)MBP-R変異体のBRLH細胞増殖に対する効果。BRLH細胞をCRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R変異体(各5μM)の存在下に培養した。図中の466-468はG466D/D467A/V468Tを表す。N.Sは有意でないことを示す。*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005。
【図７】CRM197変異体によるDER細胞のHB-EGF依存性増殖の抑制。DER細胞を10 ng/mlのHB-EGFと種々の濃度のCRM197又はCRM197(R460H)の存在下で40時間培養し、細胞数をカウントした。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、CRM197の番号は、配列番号1のアミノ酸配列においてシグナル配列（1〜25）を除いた26位のアミノ酸（Gly)を1番として番号付けしている。
【００１３】
配列番号1において、CRM197の3つのドメインは、以下のアミノ酸からなる：
Ｃドメイン：1-193
Ｔドメイン：194-379
Ｒドメイン：380-535
【００１４】
本発明のポリペプチドは、CRM197のＲドメインの391位、460位、466位、467位、468位、472位、507位及び520位からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸が置換されている。好ましい置換の位置は、391位、460位、466位、467位、468位及び472位である。最も好ましい置換は、H391K、R460H、G466D/D467A/V468T、R472K、D507N、H520Kである。
【００１５】
CRM197のRドメインを含むポリペプチドにおける特定位置のアミノ酸の置換の導入は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに対しSite-Directed Mutagenesis System Mutan（登録商標）-Super Express Kmキット(TAKARA BIO Inc.)等を用いて行なう部位特異的変異、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic Press, New York, 1990）、ＳＯＥ（splicing by overlap extension）−ＰＣＲ法（Gene,77,61,1989）等により遺伝子に対して特定の塩基を別の塩基に置換することで行うことができる。
【００１６】
CRM197のアミノ酸配列は配列番号１で示され、CRM197をコードするDNA配列は、配列番号２で示される。ポリペプチドの置換などの変異導入は、配列番号２のＤＮＡ配列を利用して行うことができる。
【００１７】
上記のアミノ酸置換の変異導入の位置は変異を導入していない野生型(WT)RドメインよりもHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する活性の強い位置であるが、上記以外にこのような阻害活性にほとんど或いは全く影響しない位置のアミノ酸をさらに置換又は欠失させた変異体も、野生型Ｒドメインよりも優れた阻害活性を有する限り本発明のポリペプチドに包含される。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、上記の特定位置のアミノ酸が置換したＲドメイン(改変型Rドメイン)を含み、Ｒドメインのみからなっていてもよく、さらにCRM197のTドメイン、Cドメインなどが連結されていてもよい。従って、本発明のポリペプチドは、改変型Ｒドメインを含む改変型CRM197であってもよい。実施例に示されるように、マルトース結合タンパク質(MBP)と改変型Ｒドメインが連結されたMBP-RはRドメインと同様な阻害活性を有するので、Rドメインに他のタンパク質を結合させても阻害活性は変わらないので、他のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドを改変型RドメインのN末端又はC末端に結合させたポリペプチドは広く本発明のポリペプチドに包含される。このようなポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて製造することができる。
【００１９】
また、本発明のポリペプチドは公知の抗腫瘍剤を化学的に結合させてもよい。本発明のポリペプチドに結合される公知の抗腫瘍剤としては、タキソール、タキソテール、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、エトポシド、ＣＰＴ−１１、カンプトスター、エポシロン、タモキシフェン、メトキシトレキサート、５ＦＵ、テモゾロミド、シクロホスファミド、ＳＣＨ６６３３６、Ｒ１１５７７７、Ｌ７７８，１２３、ＢＭＳ２１４６６２、イレッサ、タルセバ、ＥＧＦＲに対する抗体、グリーベック、イントロン、アラ−Ｃ、アドリアマイシン、シトキサン、ゲムシタビン）、ウラシルマスタード、クロロメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃなどが挙げられる。
【００２０】
本発明の抗腫瘍剤は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌などの癌治療に有効である。
【００２１】
本発明の抗癌剤は、EGFファミリーの増殖因子の中でもとりわけHB-EGFの発現が亢進している癌の治療に有効である。
【００２２】
本発明の抗癌剤は、上記有効成分をそのまま、または、薬学的に許容される医薬用担体と組合せて製剤化することができる。
【００２３】
前記治療薬は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することができる。
【００２４】
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、剤形はこれらに限定されることはない。
【００２５】
前記治療薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
【００２６】
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００２７】
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
【００２８】
前記本発明の治療薬に含まれる有効成分の量は、治療薬の製剤形態または投与経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約０．０００１％から７０％の範囲から適宜選択して決定することができる。
【００２９】
本発明の治療薬は、ヒトを含む哺乳動物、特にヒトに投与することができる。
【００３０】
本発明の治療薬の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、成人一日あたりの有効成分の量として、１μgから１００ｍｇ程度、より好ましくは１０μgから１０ｍｇ程度、さらに好ましくは１００μｇから５ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、１週間に１度ずつ６−８週にわたって投与してもよいし、又は一日おきに２−３週間にわたって投与してもよいし、又は１０日から１４日間毎日投与してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００３２】
実施例１
材料と方法
試薬
組換えHB-EGF及びTGF-αはR&D Systems (MN, U.S.A.)から入手した。ヘパリン結合ドメインを欠失したC-末端His-タグ化HB-EGFを文献（Takazaki, R., et al., J Biol Chem, 2004. 279(45): p. 47335-43）に記載のように精製した。
【００３３】
細胞及び培養
DER細胞は外因性ヒトEGFR cDNAを骨髄由来リンパ芽球性32D細胞に導入することにより確立した[Iwamoto, R., K. Handa, and E. Mekada, J Biol Chem, 1999. 274(36): p. 25906-12.]。DER細胞は既報のように維持した。Buffaloラット肝(BRL)細胞及び外因性ヒトHB-EGFを発現するBRL細胞(BRLH)を既報のように確立し、維持した（Mizushima, H., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 23): p. 4277-86）。
【００３４】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合Rドメイン
PCRにより増幅した全Rドメイン(残基380-535)のcDNAをpGEX-3ベクター(GE Healthcare)のBamHI-EcoRI部位に挿入し、E.coli JM109を形質転換した。単一コロニーを50μg/mlアンピシリンを含有する40 mlのLB培地(LB-amp)に接種し、37℃で終夜増殖した。プレ培養培地を500 mlの新鮮なLB-ampに接種し、37℃で細菌の対数増殖期に到達するまで増殖した。これに0.4 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて37℃で２時間培養し、培養液を遠心分離し、大腸菌を集めた。0.2 mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)を含有する溶液A(20 mM Tris-HCl, pH8.0, 30 mM NaCl, 10mM EDTA)で洗浄した大腸菌を再び遠心分離により集め、リゾチーム(40 μg/ml)を含有する溶液Aで氷上１時間溶解した。細菌溶解物にTriton-X100(0.53%)及びNaCl(100 mM)を加えて１５分間氷上でインキュベートし、さらに0.2 mM PMSFの存在下で20秒間(氷上で２回)超音波処理した。遠心分離により、上清をグルタチオン-セファロース4Bゲル(GE Healthcare)と4℃で終夜インキュベートした。ゲルを溶液Aで洗浄し、結合したタンパク質を溶離バッファー(100 mM Tris-HCl, pH8.0, 6 mMグルタチオン)で溶離した。
【００３５】
チオレドキシン(TRX)-融合Rドメイン
RドメインのcDNAをpThioHisベクター(Invitrogen, CA, U.S.A.)のXhoI-EcoRI部位にクローニングし、E.coli JM109を形質転換した。ThioHis-融合タンパク質を製造元の指示書に従いHis-Patch ThioFusionTM発現システム(Invitrogen)を用いて精製した。
【００３６】
マルトース結合タンパク質(MBP)-融合Rドメイン
RドメインcDNAをpMAL-p2ベクター(New England BioLabs Inc.MA, U.S.A)のBamHI-PstI部位にクローニングし、E.coli JM109を形質転換した。PCRに使用したプライマーは以下のものである(クローニング用の制限酵素部位は下線で示す)：
Fw,  5'-GCAGGATCCCCCGCGTATTCTCCGGGG-3',
Rv,  5'-CGCTGCAGTCAGCTTTTGATTTCTAG-3'.
さらにRドメインをMBPから分離するために、PreSicission Protease(GE Healthcare)認識配列(LEVLFQ/GP)をコードするオリゴヌクレオチドをpMAL-p2ベクターのBamHI部位に挿入した。
【００３７】
単一コロニーを40 mlのLB-ampに接種し、37℃で終夜増殖した。プレ培養物を500 mlの新鮮なLB-ampに接種し、対数増殖期に到達するまで37℃で培養し、さらに1mM IPTGを加えて37℃で３時間培養した。細菌を遠心分離により集め、バッファーB(20 mM HEPES, pH7.3, 150 mM NaCl)で洗浄した。細菌を遠心分離により再度集め、バッファーBに再懸濁し、超音波破砕した。細菌溶解物を遠心分離により清澄にし、上清をアミロース樹脂(New England BioLabs)と終夜4℃で混合した。樹脂をバッファーBで洗浄し、結合したタンパク質を100 mMマルトースを含有するバッファーBで溶離した。融合タンパク質からRドメインの遊離は、PreSicission Proteaseとインキュベートして行った。遊離されたMBP及びPreSicission Proteaseはアミロース樹脂及びグルタチオン-セファロース4Bとインキュベートすることにより除去した。
【００３８】
MBP-Rドメイン変異体
MBP-Rドメイン変異体をPCRを用いた部位特異的突然変異により構築した。使用したオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。MBP-Rドメイン変異体をコードするプラスミッドをE.coli JM109に導入し、形質転換した。MBP-Rドメイン変異体は上記の方法で精製した。
【００３９】
増殖抑制アッセイ
DER細胞(1×104細胞)を、種々の濃度のMBP-Rドメインタンパク質の存在下又は非存在下に４０時間10%牛胎児血清(FBS)、組換えHB-EGF(10 ng/ml)、ヘパリン(10 μg/ml), ペニシリンG(100U/ml), ストレプトマイシン(100 μg/ml)を含有するRPMI1640/10% FCS培地で培養した。MBP-Rドメインタンパク質の濃度は0.22, 0.67, 2, 6.1, 18.5, 55.5及び167μMであった。培養は96-ウェルプレート(100 μl培地/ウェル)を用いて行った。DER細胞数を細胞カウント試薬SF(Nacalai Tesque, Japan)を用い製造元のマニュアルに従い測定した。全ての実験は３回行い、データは平均±s.dで示す。
【００４０】
コラーゲンゲル培養
氷冷ウシI型コラーゲン(Nitta Gelatin; 3 mg/ml), 2.2%(w/v)NaHCO3, 0.2 M HEPES及び50 mM NaOHを含む再構成バッファー、10X DMEM-F12(1:1)培地及び血清フリーDMEM(5×106 細胞/ml)に懸濁した細胞を8:1:1:0.1比で混合し、24-ウェルディッシュ(0.5 ml/ウェル)に既報のように注いだ（Mizushima, H., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 23): p. 4277-86）。37℃で30分のインキュベート後、コラーゲンゲルをCRM197, MBP-R(WT)、MBP-R(変異体)のいずれかを含有する1 ml DMEM-FBSで覆い、１週間培養した。細胞数をカウントするために、コラーゲンゲルを溶解するまでHBS(+)(10 mM HEPES, pH7.2, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2及び1 mM MgCl2)中37℃で0.5 mlの0.5%(w/v)細菌コラゲナーゼ(Invitrogen, CA, U.S.A.)とインキュベートし、細胞を遠心分離により集めた。細胞を固定し、クリスタルバイオレット溶液(0.1%クリスタルバイオレット, 0.1 Mクエン酸)で染色し、核の数をボルテックス後に顕微鏡下でカウントした。全ての実験は３回行い、データは平均±s.dで示す。
【００４１】
表面プラズモン共鳴
Biacore T200及びセンサーチップNTA(GE Healthcare)をこの分析に使用した。HB-EGF及びRドメイン変異体のカップリング定数を製造元の指示書に従い測定した。Ni2+を10μl/mlの流量で60秒間センサーチップ上で捕捉し、続いてヘパリン結合ドメインを欠失したC-末端His-タグ化組換えHB-EGF(Δ・・-EGF-His)を１８０秒間捕捉した。このセンサーチップに種々の濃度のCRM197, MBP-R(WT)又はMBP-R(変異体)を30μl/mlの流量で600秒間作用させ結合反応を行った。次に解離を30μl/mlの流量で600秒間モニターした。KD及びKA値をBiacore Software(GE Healthcare)を用いて計算した。
【００４２】
三親接合法によるCRM197変異体を発現するC. diphtheriaeの確立
CRM197遺伝子及びそのプロモーターをC. diphtheriae C7hm723(β197)株（Kanei, C., T. Uchida, and M. Yoneda, Infect Immun, 1977. 18(1): p. 203-9.）のゲノムDNAからPCRにより得た。使用したプライマーを以下に示す(クローニング用の制限酵素部位は下線で示す)：
Fw, 5'-GCGAGATCTTTAGGATAGCTTTACCTAATTATTTTATG-3',
Rv, 5'-CGCCATGCGGCCGCTCAGCTTTTGATTTCAAAAAATAGCG-3'.
増幅したDNAをpK-PIMベクター(Oram, M., Woolston, J. E., Jacobson, A. D., Holmes, R. K. & Oram, D. M. Bacteriophage-based vectors for site-specific insertion of DNA in the chromosome of Corynebacteria. Gene 391, 53-62, (2007).)のBglII-NotI部位に挿入しした。CRM197(R460H)変異体をpK-PIM/CRM197を用いた部位特異的突然変異により構築した。DH10B/pK-PIM, HB101/prk2013及びC. diphtheriaeをそれぞれ37℃で終夜プレ培養し、次にDH10B:HB101:C. diphtheriaeC7(-)=1:1:8の比で混合した。細菌混合物のペレットをBrain Heart Infusion (BHI)寒天プレートに加え、30℃でインキュベートした。細菌混合物をBHI培地で希釈し、ナリジクス酸(20 μg/ml)及びカナマイシン(5 μg/ml)を含有する複合BHI寒天プレートで30℃で16時間インキュベートした。さらに分離したコロニーを20 μg/mlナリジクス酸及び5μg/mlカナマイシンを加えたBHI培地で培養し、pK-PIMを組み込まれたジフテリア菌を得た。
【００４３】
CRM197及びCRM197変異体の調製と精製
CRM197及びCRM197変異体は既報のように調製及び精製した（Uchida, T., A.M. Pappenheimer, Jr., and R. Greany, J Biol Chem, 1973. 248(11): p. 3838-3844）。
【００４４】
結果
CRM197の組換えRドメインの調製及びHB-EGF-阻害活性
３種類の発現-精製タグ(GST, TRX及びMBP)と融合したCRM197のRドメインを構築し、大腸菌で発現した。GST-R(WT), TRX-R(WT)及びMBP-R(WT)と名付けられたこれらの融合タンパク質は標準的手順又は製造元の指示書に従い調製及び精製した。MBP-融合タンパク質は、構築された融合タンパク質の中で純度及び安定性が最もよかったので、MBP-Rドメインをさらなる検討に使用した。
【００４５】
最初に、DER細胞増殖アッセイ系を用いて、MBP-R(WT)がHB-EGF-依存性細胞増殖を抑制するかをどうかを検討した。DER細胞はIL-3-依存性32D細胞に由来し、ヒトEGFRを安定発現し、EGFRリガンドを含有する培地で増殖し得る。IL-3がないと、DER細胞はEGFR-リガンド依存性-細胞増殖を示す。従って、HB-EGF存在下でのDER細胞増殖アッセイはHB-EGF-特異的様式で試験サンプルのHB-EGF-阻害活性の検出を可能にする。MBP-R(WT)は用量依存性様式でDER細胞の増殖を抑制した(図2A)。しかしながら、その阻害活性はCRM197よりも低かった。細胞数が50%減少する濃度であるID50値は, CRM197及びMBP-R(WT)について各々1.2及び7.9 nMであった。MBP-R(WT)がCRM197よりも低い阻害活性を示す理由として、HB-EGFとRドメインとの相互作用をMBPタグが立体障害により抑制する可能性が考えられたが、これは正しくないことがわかった。MBPタグをMBP-R(WT)からPreSicission Protease(GE Healthcare)により除去し、R(WT)を精製した。R(WT)及びMBP-R(WT)は類似した阻害活性を示し(図2B)、これよりMBPタグはRドメインの阻害活性を妨げないことが示された。
【００４６】
Rドメイン変異体の阻害活性及び増大した阻害活性を有するRドメイン変異体の特徴付け
HB-EGF細胞増殖活性に対するRドメイン変異体の阻害活性を評価するために、DER細胞を一定量のHB-EGFと種々の濃度のRドメイン変異体タンパク質存在下に培養した。代表的データを図3及び図4に示す。MBP-R変異体のID50値を表2に列挙する。
【００４７】
６つのRドメイン変異体タンパク質がMBP-R(WT)より高い阻害活性を示した。CRM197と比較した各変異体のID50値は以下の通りである。CRM197、1.2 nM; MBP-R(R460H), 2.5 nM; MBP-R(H391K), 3.1 nM; MBP-R(R472K), 3.2 nM; MBP-R(D507N), 4.5 nM; MBP-R(H520K), 6.0 nM; MBP-R(V468T), 6.2 nM; MBP-R(WT), 7.9 nM。
【００４８】
次に多重変異を有する変異体（MBP-R(G466D/D467A/V468T)）を作製しその阻害活性についても検討した。結果を図3、4及び表3に示す。MBP-R(G466D/D467A/V468T)変異体のID50値は2.6 nMであり、多重変異によって顕著に阻害活性の上昇が認められた。
【００４９】
これらのRドメイン変異体の阻害活性がHB-EGFに特異的であるかを調べるために、DER細胞をTGF-α及びRドメイン変異体の存在下で培養した。これらの変異体のいずれもDER細胞の増殖に影響せず(図5)、これらのRドメイン変異体タンパク質は細胞毒性なしにHB-EGFを特異的に抑制することが示された。
【００５０】
3次元(3D)培養におけるHB-EGF-依存性細胞増殖に対する4つのRドメイン変異体の効果
HB-EGFによる細胞増殖作用は3D-培養条件で特に顕著に表れる（Mizushima, H., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 23): p. 4277-86.）。そこで、本発明者はコラーゲンゲルを用いた3D-培養条件下でBRL細胞を培養し、BRL細胞のHB-EGF-依存性増殖に対する4つのRドメイン変異体の阻害活性を調べた。4つのRドメイン変異体、MBP-R(H391K)、MBP-R(G466D/D467A/V468T), MBP-R(R460H), MBP-R(R472K)は、MBP-R(WT)よりも効果的に組換えHB-EGFにより誘導されるBRL細胞増殖を抑制した(図6A-C, 表2)。さらに、これらの変異体はMBP-R(WT)と比較して外因性プロHB-EGFを過剰発現するBRLH細胞の増殖をより強く抑制した(図6D, E, 表4)。これらの結果は、MBP-R(WT)と比較した4つのRドメイン変異体のより高い阻害活性は、特定の細胞型又は培養条件に特異的ではないことを示す。
【００５１】
HB-EGFに対するRドメイン変異体の親和性定数
4つのRドメイン変異体が野生型Rドメインと比較してHB-EGFに対する増大した親和性を得ているかを調べるために、該変異体の親和性定数を製造元の指示書に従いBiacoreを用いて求めた。センサーチップ上に捕捉される組換えHB-EGFに対するMBP-Rドメインタンパク質の結合を測定し、結合速度定数及び解離速度定数から親和性定数を計算した。タンパク質の親和性定数値を以下に示す:CRM197, 9.22×108 M-1; MBP-R(R460H), 6.09×108 M-1; MBP-R(G466D/D467A/V468T), 4.44×108M-1; MBP-R(R472K), 4.42×108 M-1; MBP-R(H391K), 3.17×108 M-1; MBP-R(WT), 2.99×108 M-1 (表 4)。親和性定数値はID50値とほぼ相関する。これらの結果は、HB-EGFに対する増大した親和性が4つの変異体の阻害活性の原因であることを示す。
【００５２】
HB-EGFに対するCRM197変異体の阻害活性
MBP-R(WT)は全長CRM197より低い細胞増殖阻害活性を示し、これは全分子構造が完全な阻害作用を示すのに必要であることを示唆する。従って、本発明者はC. diphtheriae株においてR460H変異を有する全長CRM197を上記のように再構成及び調製し、CRM197の阻害活性と比較した。CRM197(R460H)はDER細胞のHB-EGF-依存性増殖を野生型CRM197より効果的に阻害した(図7)。CRM197及びCRM197(R460H)のID50値は各々1.02 nM及び0.72 nMであった(表5)。
【００５３】
MBP-Rドメイン変異体で観察されたように、CRM197の親和性定数がR460H変異により向上するかを調べるために、Biacoreを用いてCRM197とCRM197(R460H)の親和性定数を比較した。CRM197及びCRM197(R460H)の親和性定数は、各々9.80×108 M-1及び1.63×109 M-1であった(表5)。これらの結果はHB-EGFに対するCRM197の阻害活性は、変異により増大することを示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
使用したFwプライマーの相補的なオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用した。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
* HB-EGF 阻害は、5 μM のCRM197又はMBP変異体を加えたときの％として示す。 
【００６０】
【表５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【配列表】
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