(57)【要約】【課題】代表的な腸管出血性大腸菌であるＯ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の識別を再現性よく行うことを可能とする。【解決手段】微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析し、得られたマススペクトル上におけるマーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取り、前記質量電荷比に基づいて前記試料がＯ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１を含むか否かを判定する方法であって、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５及びリボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つと、酸ストレスシャペロンＨｄｅＢと、ＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳとを用いる。【選択図】図１
2015184020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取るステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記試料に大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれるか否かを判定するステップと、
を有し、
前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５又はリボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つと、酸ストレスシャペロンＨｄｅＢと、ＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳとを用いることを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項２】
a)被検微生物を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取るステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記被検微生物が大腸菌Ｏ１５７であるか否かを判定するステップと、
を有し、
前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５又はリボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項３】
前記マーカータンパク質として更に酸ストレスシャペロンＨｄｅＢを用いることを特徴とする請求項２に記載の微生物の識別方法。
【請求項４】
a)被検微生物を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取るステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記被検微生物が大腸菌Ｏ２６又はＯ１１１であるか否かを判定するステップと、
を有し、
前記マーカータンパク質としてＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳを用いることを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項５】
a)微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取る読取ステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記試料に、大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれるか否かを判定する判定ステップと、
を有し、
前記判定ステップが、前記マススペクトル上にリボソームタンパク質Ｓ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５、又はＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳがそれぞれ大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１に特有の変異を有する場合の質量電荷比のピークの少なくとも一つが存在するか、前記マススペクトル上に酸ストレスシャペロンＨｄｅＢの質量電荷比のピークが存在しない場合に、前記試料に大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれると判定することを特徴とする微生物の識別方法。
【請求項６】
コンピュータに請求項１〜５のいずれかに記載の各ステップを実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用した微生物の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物の種類を識別する手法の１つとしてＤＮＡ塩基配列に基づく相同性解析が知られており、微生物の分類・同定等に広く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。この手法では、まず、被検微生物からＤＮＡを抽出してｒＲＮＡ遺伝子等の全生物に高い保存性で存在している領域のＤＮＡ塩基配列を決定する。次に、このＤＮＡ塩基配列を用いて、既知微生物のＤＮＡ塩基配列データを多数収録したデータベースを検索し、前記被検微生物のＤＮＡ塩基配列と高い類似性を示す塩基配列を選出する。そして、該塩基配列が由来する生物種を、前記被検微生物と同一種又は近縁種であると判定する。
【０００３】
しかしながら、こうしたＤＮＡ塩基配列を利用した手法では、被検微生物からのＤＮＡ抽出やＤＮＡ塩基配列の決定などに比較的長い時間を要するため、迅速な微生物同定を行うのが困難であるという問題があった。
【０００４】
そこで、近年では被検微生物を質量分析して得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法が用いられるようになりつつある。質量分析によれば、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易であるため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能となる。この手法では、まず、被検微生物から抽出したタンパク質を含む溶液や被検微生物の懸濁液等をＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析）等のソフトなイオン化法を用いた質量分析装置によって分析する。なお「ソフトな」イオン化法とは、高分子量化合物の分解を生じにくいイオン化法をいう。そして、得られたマススペクトルパターンを、予めデータベースに多数収録された既知微生物のマススペクトルパターンと照合することにより、被検微生物の同定を行う。こうした手法はマススペクトルパターンを各微生物に特異的な情報（すなわち指紋）として利用するため、フィンガープリント法と呼ばれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2006-191922号公報
【特許文献２】特開2007-316063号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）」, 米国, 第78巻, pp.1004-1014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上述の質量分析を用いたフィンガープリント法による微生物同定では、種レベルでの同定は可能であっても、より下位の分類レベルである亜種、病原型、又は株等のレベルでの識別は一般に困難とされている。更に、フィンガープリント法では、マススペクトル上に現れる各ピークの一つ一つが何のタンパク質に由来するかが特定されておらず、同定の理論的根拠や信頼性の点に課題を有していた。そこで、この課題を解消するため、微生物菌体を質量分析して得られるピークの約半分がリボソームタンパク質由来であることを利用し、質量分析で得られるピークの質量電荷比を、リボソームタンパク質遺伝子の塩基配列情報を翻訳したアミノ酸配列から推測される計算質量と関連づけることで該ピークの由来となるタンパク質の種類を帰属する手法が開発されている（特許文献２参照）。この手法によれば、質量分析を用いて理論的根拠に基づいた信頼性の高い微生物同定を行うことが可能となる。
【０００８】
但し、微生物の分類レベル（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株など）によって質量に違いが出るピークは異なるため、例えば、病原型や株レベルでの識別を再現性よく行うためには、同定対象とする病原型や株レベルでの識別に利用可能なマーカーピークを選択することが必要となる。例えば、特許文献２では、Pseudomonas putida及びその類縁細胞を同定・識別するためのバイオマーカータンパク質として２３種類のリボソームサブユニットタンパク質（Ｌ５、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２８、Ｌ３０、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ１０、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１７、Ｓ１９、Ｓ２０、及びＳ２１）が利用可能であることが開示されている。
【０００９】
ところで、ベロ毒素 (Verotoxin)又は志賀毒素 (Shigatoxin) と呼ばれる毒素を産生する腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli：ＥＨＥＣ）としてＯ１５７、Ｏ２６、及びＯ１１１などと呼ばれる病原型の大腸菌が知られている。これらは激しい腹痛や下痢と共に重篤な合併症を起こし死に至る場合もあるため、食中毒等が発生した際には病原菌がこのＥＨＥＣであるか否かを迅速に判別する必要がある。しかし、ＥＨＥＣとその他の大腸菌のように、互いにごく近縁の微生物を高い再現性で識別可能なマーカータンパク質を選定するのは一般に困難であり、ＥＨＥＣの識別に好適に利用可能なマーカータンパク質は未だ確立されていないのが現状である。
【００１０】
本発明は上記の点を鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１を再現性よく、また迅速に識別することのできるマーカータンパク質を選定し、これを用いた微生物の識別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、質量分析によって被検微生物がＯ１５７か否かを判定するためのマーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５、及び酸ストレスシャペロンＨｄｅＢが好適に利用できること、及び質量分析によって被検微生物がＯ２６又はＯ１１１であるか否かを判定するためのマーカータンパク質としてＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳが好適に利用できることを発見し、本発明に至った。
【００１２】
すなわち、上記課題を解決するために成された第１発明に係る微生物の識別方法は、
a)微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取るステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記試料に大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれるか否かを判定するステップと、
を有し、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５又は、リボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つと、酸ストレスシャペロンＨｄｅＢと、ＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳとを用いることを特徴としている。
【００１３】
上記マーカータンパク質のうち、Ｓ１５とＬ２５の質量電荷比は、Ｏ１５７でそれぞれm/z 10166.6, 10676.4であり、その他の大腸菌でそれぞれm/z 10138.6, 10694.4である。一方、Ｈ−ＮＳの質量電荷比は、Ｏ２６及びＯ１１１ではm/z 15425.4であり、その他の大腸菌ではm/z 15409.4又はm/z 15882.0である。このように、上記各マーカータンパク質は、Ｏ１５７とその他の大腸菌、並びにＯ２６及びＯ１１１とその他の大腸菌とでそれぞれ異なる質量電荷比を示す。また、ＨｄｅＢは、Ｏ１５７以外の大腸菌では質量電荷比がm/z 9066.2であり、Ｏ１５７では同タンパク質に相当するピークが観測されない。このため、前記試料を質量分析して得られたマススペクトル上において、これらのマーカータンパク質に相当するピークの質量電荷比の値（又はピークの有無）を読み取ることにより、前記試料にＯ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１が含まれるか否かを判定することができる。具体的には、前記マススペクトル上におけるマーカータンパク質Ｓ１５及び／又はＬ２５の質量電荷比がＯ１５７における同タンパク質の質量電荷比（m/z 10166.6, 10676.4）と一致していた場合（又は前記その他の大腸菌における同タンパク質の質量電荷比と一致しなかった場合）に前記試料にはＯ１５７が含まれると判定する。但し、Ｏ１５７に属する菌株の一部では、Ｓ１５及びＬ２５に変異を有しないものも存在するため、より確実な判定を行うため、更にマーカータンパク質としてＨｄｅＢを使用する。前記マススペクトル上におけるＳ１５及び／又はＬ２５の質量電荷比がＯ１５７における同タンパク質の質量電荷比と一致しなかった場合（又は前記その他の大腸菌における同タンパク質の質量電荷比と一致した場合）であっても、該マススペクトル上にＨｄｅＢに相当するピークが存在しなかった場合は、該試料にＯ１５７株が含まれると判定する。また、前記試料のマススペクトル上におけるマーカータンパク質Ｈ−ＮＳの質量電荷比がＯ２６及びＯ１１１における同タンパク質の質量電荷比と一致していた場合（又は前記その他の大腸菌における同タンパク質の質量電荷比と一致しなかった場合）には前記試料にＯ２６又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれると判定する。
【００１４】
また、上記課題を解決するために成された第２発明に係る微生物の識別方法は、
a)被検微生物を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取るステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記被検微生物が大腸菌Ｏ１５７であるか否かを判定するステップと、
を有し、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１５又はリボソームタンパク質Ｌ２５の少なくともいずれか一つを用いることを特徴としている。
なお、前記第２発明に係る微生物の識別方法においては、前記マーカータンパク質として更に酸ストレスシャペロンＨｄｅＢを用いることが望ましい。
【００１５】
また、上記課題を解決するために成された第３発明に係る微生物の識別方法は、
a)被検微生物を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取るステップと、
b) 前記質量電荷比に基づいて前記被検微生物が大腸菌Ｏ２６又はＯ１１１であるか否かを判定するステップと、
を有し、前記マーカータンパク質としてＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳを用いることを特徴としている。
【００１６】
また、上記課題を解決するために成された第４発明に係る微生物の識別方法は、
a)微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトル上における、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比を読み取る読取ステップと、
b)前記質量電荷比に基づいて前記試料に、大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれるか否かを判定する判定ステップと、
を有し、
前記判定ステップが、前記マススペクトル上にリボソームタンパク質Ｓ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５、又はＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳがそれぞれ大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１に特有の変異を有する場合の質量電荷比のピークの少なくとも一つが存在するか、前記マススペクトル上に酸ストレスシャペロンＨｄｅＢの質量電荷比のピークが存在しない場合に、前記試料に大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１の少なくとも一つが含まれると判定することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
上記第１発明又は第４発明に係る微生物の識別方法によれば、前記試料が代表的な腸管出血性大腸菌であるＯ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１を含むか否かを再現性よく且つ迅速に判別することが可能となる。また、上記第２発明に係る微生物の識別方法によれば、被検微生物がＯ１５７であるか否かを再現性よく且つ迅速に判別することが可能となる。また、上記第３発明に係る微生物の識別方法によれば、被検微生物がＯ２６又はＯ１１１であるか否かを再現性よく且つ迅速に判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの要部を示す構成図。
【図２】本発明に係る微生物の識別方法の手順の一例を示すフローチャート。
【図３】実施例で使用した菌株名の一覧を示す図の前半部分。
【図４】実施例で使用した菌株名の一覧を示す図の後半部分。
【図５】実施例で使用したプライマーの一覧を示す図の前半部分。
【図６】実施例で使用したプライマーの一覧を示す図の後半部分。
【図７】実施例で使用した菌株における各タンパク質の計算質量の一覧を示す図の前半部分。
【図８】実施例で使用した菌株における各タンパク質の計算質量の一覧を示す図の後半部分。
【図９】Ｏ１５７とその他の大腸菌におけるタンパク質ＨｄｅＢ及びＳ１５、Ｌ２５のマススペクトル。
【図１０】Ｏ２６、Ｏ１１１、及びＯ１５７におけるタンパク質Ｈ−ＮＳのマススペクトル。
【図１１】実施例における各タンパク質の計算質量のプロファイルを示す図。
【図１２】実施例で得られた系統樹を示す図。
【図１３】Ｏ１５７、Ｏ２６、及びＯ１１１とその他の大腸菌におけるタンパク質Ｓ１５、Ｌ２５、ＨｄｅＢ、及びＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸配列の相違を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１は本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの全体図である。
【００２０】
この微生物識別システムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
【００２１】
ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。
【００２２】
微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び下位分類決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４及び第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５よりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。
【００２３】
図１においては、亜種・株決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、及び下位分類判定部３９が示されている。これはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が下位分類決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、下位分類決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物識別を行うプログラム等を利用することができる。
【００２４】
また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、種決定プログラム３３、及び下位分類決定プログラム３５、第１データベース３４、及び第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理及び／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。
【００２５】
記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法及び質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。
【００２６】
前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を4,000〜15,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。なお、リボソームタンパク質群は細胞内で大量に発現しているため、前記閾値を適切に設定することにより、質量リストに記載される質量電荷比の大部分をリボソームタンパク質由来のものとすることができる。そして、以上により抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養環境を規格化しておくことが望ましい。
【００２７】
記憶部３０の第２データベース３６には、既知微生物を種よりも下位の分類（亜種、病原型、血清型、株など）で識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物が大腸菌Ｏ１５７か否かを判定するためのマーカータンパク質に関する情報として、少なくともリボソームタンパク質Ｓ１５、Ｌ２５にそれぞれ対応した質量電荷比範囲、及びＯ１５７におけるＳ１５、Ｌ２５の質量電荷比の値（それぞれm/z 10166.6, 10676.4）と、酸ストレスシャペロンＨｄｅＢに対応した質量電荷比範囲が記憶されている。更に、第２データベース３６には、被検微生物が大腸菌Ｏ２６又はＯ１１１であるか否かを判定するためのマーカータンパク質に関する情報として、ＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳに対応した質量電荷比範囲、及びＯ２６及びＯ１１１におけるＨ−ＮＳの質量電荷比の値（m/z 15425.4）が記憶されている。
【００２８】
第２データベース３６に記憶するマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ−末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ−末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。
【００２９】
本実施形態に係る微生物識別システムを用いたＯ１５７、Ｏ２６、及びＯ１１１の識別手順についてフローチャートを参照しつつ説明を行う。
【００３０】
まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。
【００３１】
スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップＳ１０１）。
【００３２】
次に、種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップＳ１０２）。種決定プログラム３３は、続いてステップＳ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物が属する生物種を特定する（ステップＳ１０３）。そして、この生物種が大腸菌でなかった場合（ステップＳ１０４でNoの場合）は、該生物種を被検微生物の生物種として表示部２３に出力し（ステップＳ１１６）、識別処理を終了する。一方、前記生物種が大腸菌であった場合（ステップＳ１０４でYesの場合）は、続いて下位分類決定プログラム３５による識別処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中に大腸菌を含むことが判定されている場合は、マススペクトルを用いた種決定プログラムを利用せずに、下位分類決定プログラム３５に進めばよい。
【００３３】
下位分類決定プログラム３５では、まず下位分類判定部３９がマーカータンパク質であるリボソームタンパク質Ｓ１５及びＬ２５の質量電荷比の値をそれぞれ第２データベース３６から読み出す（ステップＳ１０５）。続いてスペクトル取得部３７が、ステップＳ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲に現れるピークを各マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る（ステップＳ１０６）。その後、下位分類判定部３９が、この質量電荷比と前記第２データベース３６から読み出した各マーカータンパク質の質量電荷比の値を比較して両者が所定の許容誤差範囲内で一致するか否かを判断する（ステップＳ１０７）。その結果、両者が一致した場合には、被検微生物はＯ１５７であると判定し（ステップＳ１０９）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップＳ１１６）。
【００３４】
なお、Ｏ１５７の殆どの菌株ではマーカータンパク質Ｓ１５及びＬ２５の質量シフトが観測されるが、一部のＯ１５７株（GTC 14550とGTC 14553の２株）については、これらのマーカータンパク質の質量シフトが観測されない（詳細は後述する）。そのため、上記ステップＳ１０７において質量電荷比が一致しなかった場合には、更にマーカータンパク質として酸ストレスシャペロンＨｄｅＢを用いた判定を行う。ＨｄｅＢは多くの大腸菌でm/z 9066.2にピークを生じるが、Ｏ１５７ではこのピークが観測されない。そこで、上記ＨｄｅＢを用いた判定では、下位分類判定部３９が、ＨｄｅＢに関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲の情報を読み出し、前記被検微生物のマススペクトル上で該質量電荷比範囲にピーク（すなわちＨｄｅＢのピーク）が存在するか否かを判断する（ステップＳ１０８）。その結果、該質量電荷比範囲にピークが存在しなかった場合は、該被検微生物はＯ１５７であると判定し（ステップＳ１０９）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップＳ１１６）。
【００３５】
一方、前記質量電荷比範囲にピークが存在した場合には、被検微生物はＯ１５７でないと判定し（ステップＳ１１０）、続いて、該被検微生物がＯ２６又はＯ１１１であるか否かの判定を行う。具体的には、下位分類判定部３９がマーカータンパク質であるＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳの質量電荷比の値を第２データベース３６から読み出す（ステップＳ１１１）。続いてm/z読み取り部３８が、ステップＳ１０１で作成された被検微生物のマススペクトル上において、前記マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲に現れるピークを該マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る（ステップＳ１１２）。その後、下位分類判定部３９が、この質量電荷比と前記第２データベース３６から読み出したマーカータンパク質の質量電荷比の値を比較して両者が所定の許容誤差内で一致するか否かを判断する（ステップＳ１１３）。その結果、両者が一致した場合には、被検微生物はＯ２６かＯ１１１であると判定し（ステップＳ１１５）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップＳ１１６）。一方、両者が一致しなかった場合には、被検微生物はＯ２６及びＯ１１１のいずれでもないと判定し（ステップＳ１１４）、以上の識別結果、すなわち被検微生物はＯ１５７、Ｏ２６、及びＯ１１１以外の大腸菌である旨を表示部２３に出力する（ステップＳ１１６）。
【００３６】
なお、ここではマーカータンパク質の質量電荷比としてＯ１５７（又はＯ２６及びＯ１１１）における質量電荷比、すなわち該マーカータンパク質がＯ１５７（又はＯ２６及びＯ１１１）に特有の変異を有する場合の質量電荷比を第２データベース３６に記憶させておき、被検微生物を質量分析して得られたマススペクトル上における該マーカータンパク質に対応するピークの質量電荷比が、前記変異を有する場合の質量電荷比と一致した場合に被検微生物はＯ１５７（又はＯ２６かＯ１１１）であると判断するものとした。しかしながら、これとは逆に、前記変異がない場合のマーカータンパク質の質量電荷比を第２データベース３６に記憶させておき、被検微生物を質量分析して得られたマススペクトル上における該マーカータンパク質に対応するピークの質量電荷比が、前記変異がない場合のマーカータンパク質の質量電荷比と一致しなかった場合に被検微生物はＯ１５７（又はＯ２６かＯ１１１）であると判断するようにしてもよい。
【００３７】
以上、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ説明を行ったが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容される。
【００３８】
例えば、上記実施形態では説明の都合上、被検微生物がＯ１５７であるか否かの判定を行った後に、被検微生物がＯ２６又はＯ１１１であるか否かの判定を行うものとしたが、これらの判定を逆の順序で行ったり、同時に行ったりするようにしてもよい。また、上記判定のいずれか一方のみを行うものとしてもよい。
【００３９】
また、上記実施形態では、被検微生物がＯ１５７であるか否かを判定するためのマーカータンパク質として、リボソームタンパク質Ｓ１５及びＬ２５、並びに酸ストレスシャペロンＨｄｅＢの３種類を用いるものとした。しかしながら、ほとんどのＯ１５７では前記リボソームタンパク質の両方に質量電荷比のシフト（質量シフト）が見られ、且つＨｄｅＢの質量ピークが観測されない。一方、他の大腸菌では前記リボソームタンパク質のいずれも質量シフトが見られず、且つＨｄｅＢの質量ピークが観測される。従って、これらのマーカータンパク質のうち、いずれか一つ又は二つだけを用いて被検微生物がＯ１５７か否かの判定を行うことも可能である。
【００４０】
また、Ｏ１５７の中でも一部の菌株ではタンパク質ＹｄａＱに相当するm/z 8325.6のピークが観測され、Ｏ１５７の他の菌株では同タンパク質に相当するピークが観測されない。そのため、上記のマーカータンパク質Ｓ１５、Ｌ２５、ＨｄｅＢに加えて該ＹｄａＱを補助的なマーカータンパク質として使用することにより、Ｏ１５７に属する菌株のより詳細な識別を行うことも可能である。
【００４１】
上述した通り、Ｏ１５７とその他の大腸菌、並びにＯ２６及びＯ１１１とその他の大腸菌との間における前記各マーカータンパク質の質量シフト（又はＯ１５７におけるマーカータンパク質ＨｄｅＢの質量ピークの消失）は、これらのマーカータンパク質のＤＮＡ塩基配列に生じた点変異、及びそれによるアミノ酸残基の変化に起因している。そこで、被検微生物について前記マーカータンパク質のＤＮＡ塩基配列又はアミノ酸配列を解読し、前記の点変異又はアミノ酸残基の変化が生じている箇所の塩基又はアミノ酸残基の種類から該被検微生物がＯ１５７、Ｏ２６、又はＯ１１１であるか否かを識別することも可能である。Ｏ１５７とその他の大腸菌との間、並びにＯ２６及びＯ１１１とその他の大腸菌との間における前記各マーカータンパク質のＤＮＡ塩基配列又はアミノ酸配列の相違箇所を図１３に示す。なお、同図のＨ−ＮＳの表において「その他の大腸菌」とは、非Ｏ２６・Ｏ１１１菌株のうちNBRC 13893以外のものを意味する。NBRC 13893については同図に示していないが、アミノ酸コード領域中に１２塩基の挿入が見られた。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明におけるマーカータンパク質の選定手順及び本発明の効果を実証するために行った実験について説明を行う。
【００４３】
（１）菌株及び培養条件
タンパク質質量データベースを構築するために、Ｏ１５７、Ｏ２６、及びＯ１１１菌株を２７株と、その他の大腸菌２３株の合わせて５０菌株を使用した（図３、４）。これらの株は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ, 病原菌部門, 岐阜大学, 岐阜市, 日本）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ＡＴＣＣ, ロックビル, メリーランド州, 米国）、ジャパン・コレクション・オブ・マイクロオルガニズムズ（Japan Collection of Microorganisms, ＪＣＭ, 独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター, つくば市, 日本）、及び独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ, 木更津市, 日本）から購入した。また、一部の菌株（WT-141, WT-351, 及びWT-352）は野外より単離した。培養には、ニュートリエントブロス（Becton Dickinson, Franklin Lakes, ニュージャージー州, 米国）又はＬＢブロス（ナカライ, 京都市, 日本）を使用した。また、本発明に係る微生物識別方法の効果を実証するための盲検試験（blind test）に大腸菌１３株を使用した。これらは、1996年〜2010年に食品試料から単離され、従来の技術によりＯ１５７であると識別された菌株であり、それぞれjfrc 01-13と命名した（図４参照）。
【００４４】
（２）タンパク質質量データベースの構築
リボソームサブユニットタンパク質及びバイオマーカー候補のタンパク質のアミノ酸配列を、米国の国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ）のデータベースより入手した。各タンパク質の計算質量の算出には、スイス生物情報科学機構により提供されるExPASyプロテオミクスサーバーのCompute pI/Mw tool を使用した。このとき、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合には、Ｎ−末端メチオニンが切断されるものとして前記計算質量を算出した。なお、ゲノム未解読の株については、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質、及びバイオマーカー候補のタンパク質のＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンシングにより決定した。具体的には、リボソームタンパク質遺伝子の領域（〜5kbp）及びバイオマーカータンパク質の領域を、それぞれＮＣＢＩのデータベースより入手した大腸菌ゲノム解読株の対象領域の上流及び下流のコンセンサス配列に基づいて設計したプライマーを使用し、高正確性（high fidelity）ＤＮＡポリメラーゼであるKOD plus（東洋紡，大阪, 日本）を用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によって増幅した。ＤＮＡシークエンシングは、Big Dye ver. 3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド・バイオシステムズ, Foster City, カリフォルニア州）を用いて行った。ＰＣＲ及びＤＮＡシークエンシングに使用したプライマーを図５及び図６に示す。
以上で得られた上記５０菌株の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１〜２６に示す。各配列番号に対応する配列の概要は以下の通りである。
配列番号１：Ｏ１５７におけるＳ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２：その他の大腸菌１（NBRC13893以外の非Ｏ１５７菌株）におけるＳ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号３：その他の大腸菌２（NBRC13893）におけるＳ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号４：Ｏ１５７におけるＳ１５のアミノ酸配列。
配列番号５：前記その他の大腸菌１におけるＳ１５のアミノ酸配列。
配列番号６：前記その他の大腸菌２におけるＳ１５のアミノ酸配列。
配列番号７：Ｏ１５７におけるＬ２５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号８：その他の大腸菌３（NBRC 15034, NBRC 14237,ATCC BAA-1743, JCM16575以外の非Ｏ１５７菌株）におけるＬ２５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号９：その他の大腸菌４（NBRC 15034, NBRC 14237,ATCC BAA-1743, JCM16575）におけるＬ２５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１０：Ｏ１５７におけるＬ２５のアミノ酸配列。
配列番号１１：前記その他の大腸菌３におけるＬ２５のアミノ酸配列。
配列番号１２：前記その他の大腸菌４におけるＬ２５のアミノ酸配列。
配列番号１３：Ｏ１５７におけるＨｄｅＢのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１４：その他の大腸菌５（上記５０菌株の内の非Ｏ１５７菌株全て）におけるＨｄｅＢのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１５：Ｏ１５７におけるＨｄｅＢのアミノ酸配列。
配列番号１６：前記その他の大腸菌５におけるＨｄｅＢのアミノ酸配列。
配列番号１７：Ｏ２６及びＯ１１１におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１８：その他の大腸菌６（NBRC 3301, NBRC 3972, NBRC 13891, GTC 14518, GTC 14529, GTC 14603）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１９：その他の大腸菌７（NBRC 3548, NBRC 12734, GTC 14602, NBRC 13168, GTC 14530, GTC 14601）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２０：その他の大腸菌８（NBRC 14237, NBRC 15034）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２１：その他の大腸菌９（NBRC 13893）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２２：その他の大腸菌１０（上記その他の大腸菌６〜９以外の非Ｏ２６・Ｏ１１１菌株）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２３：Ｏ２６及びＯ１１１におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２４：前記その他の大腸菌６におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２５：前記その他の大腸菌７におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２６：前記その他の大腸菌８におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２７：前記その他の大腸菌９におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２８：前記その他の大腸菌１０におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
【００４５】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定
寒天培地上のコロニーの菌体、又は液体培地から遠心分離により回収した菌体を使用した。コロニーは鋼製プレートに直接載置し、液体培地から回収した菌体はTMA-Iバッファ（10 mM Tris-HCl ph 7.8, 30 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 6mM 2-メルカプトエタノール）で洗浄し、同バッファに懸濁した状態で鋼製プレートに載置した。鋼製プレート上にて約107 cfuの菌体を、50 v/v％アセトニトリル、1 v/v％トリフルオロ酢酸溶液中に20 mg/mLのシナピン酸（和光純薬工業製）又はα-シアノ-4-ヒドロキシけい皮酸（ＣＨＣＡ）を含んで成る1 μlのマトリックス溶液と十分に混合した。混合液はサンプルプレートに滴下し、自然乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定にはAXIMA微生物同定システム（島津製作所, 京都市, 日本）を使用し、ポジティブリニアモード、スペクトルレンジ2000m/z〜200000m/zにて試料の測定を行った。上述の計算質量を測定された質量電荷比と許容誤差500 ppmでマッチングし、適宜修正を施した。
【００４６】
以上の結果、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質のうち、図７及び図８に示されていないもの、すなわちＳ１０、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｓ１９、Ｌ２２、Ｓ３、Ｌ１６、Ｌ２９、Ｓ１７、Ｌ１４、Ｌ５、Ｓ８、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ３０、Ｌ３６、Ｓ１１、Ｓ４、及びＬ１７については計算質量がいずれの菌株でも同一であった。また、Ｌ２４、Ｓ５、及びＳ１３は、その計算質量からバイオマーカーの候補と考えられたが、質量差が小さかったり、分子量が大きすぎたりしたためにピーク形状が不明瞭であり、安定的なバイオマーカーとしては不適当であった。一方、リボソームタンパク質Ｓ１５とＬ２５については、GTC 14550とGTC14553を除く全てのＯ１５７の菌株において、他の大腸菌（例えばＫ−１２グループ）と比べて特有且つ明確な質量シフトが観測された（図９参照）。また、同図に示すように、これらのタンパク質のピークの強度及び鮮鋭度はＯ１５７と他の大腸菌とを区別するのに十分なものであった。このことは、マトリックス溶液にシナピン酸を用いた場合でもＣＨＣＡを用いた場合でも同様であり、更にコロニーから直接採取した菌体を用いた場合でも液体培地から抽出してギ酸に懸濁した菌体を用いた場合でも同様であった。これらタンパク質のＤＮＡ塩基配列によると、Ｏ１５７に特異的な、リボソームタンパク質Ｓ１５におけるＡ２３９Ｇの点変位がＱ８０Ｒのアミノ酸残基の変化を生じており、その結果、該タンパク質のm/zが10138.6から10166.6に変化していた。同様に、Ｏ１５７に特異的な、リボソームタンパク質Ｌ２５におけるＧ１５０Ａの点変位がＭ５０Ｉのアミノ酸残基の変化を生じており、その結果、該タンパク質のm/zが10694.4から10676.4に変化していた。なお、これら２つのリボソームタンパク質は、NBRC 13893, NBRC 15034, NBRC 14237, ATCC BAA-1743,及びJCM16575の計算質量においても質量シフトが見られた（図７及び図８参照）が、シフト量が非常に小さいため実際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析ではこれらは他の大腸菌と区別できなかった。
【００４７】
なお、非ＥＨＥＣ株では酸ストレスシャペロンＨｄｅＢに対応するm/z 9066.2のピークが観測されるのに対し、本実験に使用した全てのＯ１５７菌株においてこのピークは観測されなかった。このことは非特許文献１の記載と一致している。ＨｄｅＢ遺伝子のＤＮＡ塩基配列によると、開始コドンと考えられるＡＴＧの領域が、全てのＯ１５７菌株で点変異によりＡＴＡとなっているのに対し、大腸菌の他の菌株ではＡＴＧのままであることが確認された。このことはＨｄｅＢのピークがＯ１５７だけで欠落していることとよく一致している。
【００４８】
また、Ｏ２６及びＯ１１１についてはＤＮＡ結合タンパク質Ｈ−ＮＳに対応するピークにおいて他の大腸菌と比べて特有且つ明確な質量シフトが観測された（図７、図８及び図１０参照）。配列解析によると、Ｏ２６及びＯ１１１のＨ−ＮＳタンパク質においてＡ８１Ｓのアミノ酸置換が観察された。なお、非ＥＨＥＣ株であるNBRC 13893においてもＨ−ＮＳタンパク質の質量シフトが観測され（図８参照）、配列解析によると、同菌株ではＨ−ＮＳ遺伝子のコード領域中に１２塩基の挿入がみられた。但し、同菌株におけるＨ−ＮＳの質量電荷比は15882.0であり、Ｏ２６及びＯ１１１の質量電荷比（m/z 15425.4）と大きく異なるため、両者は容易に区別可能である。
【００４９】
更に、タンパク質ＹｄａＱに相当するm/z 8325.6のピークについても菌株によって観測されないものがあった（図７及び図８参照）。このことから、同タンパク質もそれに相当するピークの有無に基づいて大腸菌を分類するための補助的なバイオマーカーとして利用できると考えられる。
【００５０】
（４）クラスター解析
まず、タンパク質の質量パターンを、ＳＡＲＡＭＩＳ（登録商標、Spectral Archive and Microbial Identification System）を用いて解析し、全ての菌株が大腸菌であることを確認した。続いて、各菌株のマススペクトル上のピークの質量電荷比が変異のないバイオマーカータンパク質の質量電荷比と一致したものを「１」、一致しなかったものを「２」又は「３」（２と３は互いに異なる質量電荷比であることを示す）、バイオマーカータンパク質に相当するピークが存在しなかったものを「０」として図１１に示すようなプロファイルデータを作成した。このデータをPASTソフトウェア（自然史博物館, オスロ大学, ノルウェー）にインポートし、キムラアルゴリズムを用いて近接結合法によってクラスター解析を行った。更に、FigTree ver. 1.4.0ソフトウェアを用いて系統樹（図１２）を作成した。その結果、図１２から明らかなように、Ｏ１５７の菌株はいずれもＡグループ又はＢグループ、すなわち「Ｏ１５７グループ」に正しく分類された。更に、Ｏ２６の菌株及びＯ１１１の菌株は、該菌株で検出されたm/z 15425.4のピークと他の大腸菌株で検出されたm/z 15409.4のピークとの明らかな質量電荷比の違いにより、Ｄグループ又はＥグループに分類された（図１０）。また、タンパク質ＹｄａＱに相当するm/z 8325.6のピークの有無によっても更に詳細なグループ分けが可能である。
【００５１】
（５）天然単離大腸菌の識別
以上で選出されたバイオマーカーを用いた微生物識別の効果を実証するため、牛肉、豚肉、ネギ等の食料品から単離され、選択培地によりＯ１５７であると識別された大腸菌１３株についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を行った。その結果、これらの株はいずれもリボソームタンパク質Ｓ１５とＬ２５において典型的な質量シフトを示し、且つ酸ストレスシャペロンＨｄｅＢに相当するピークが欠失していたことから、いずれもＯ１５７グループに正しく分類された。具体的には、１１株がＡグループに分類され、jfrc 06とjfrc 08の２株はタンパク質ＹｄａＱに相当するピークの欠失によりＢグループに分類された。この結果から、本発明に係るバイオマーカータンパク質により天然のＯ１５７株をその生成日（generated date）および生成場所に関わらず識別できることが示唆された。Ｏ１５７のゲノム解読株であるFRIK2000, EC4206, EC4045, EC4196, EC4076, EC4113, EC4486, EC869, EC4501, EC508, EC4024, FRIK966, EC4115, TW14588, TW14359 及び EC4042についても、バイオマーカータンパク質の計算質量パターンが「Ｏ１５７グループ」のものと同一であるため、同様に本発明の手法により識別可能と考えられる。このことは、リボソームタンパク質Ｓ１５とＬ２５における質量シフトが天然で産生された殆どのＯ１５７株に共通していることを示唆しており、このことから本発明に係る識別手法は天然単離株に広く適用できると考えられる。
【符号の説明】
【００５２】
１０…質量分析部
１１…イオン化部
１２…ＴＯＦ
１３…引き出し電極
１４…検出器
２０…微生物判別部
２１…ＣＰＵ
２２…メモリ
２３…表示部
２４…入力部
２５…Ｉ／Ｆ
３０…記憶部
３１…ＯＳ
３２…スペクトル作成プログラム
３３…種決定プログラム
３４…第１データベース
３５…下位分類決定プログラム
３６…第２データベース
３７…スペクトル取得部
３８…m/z読み取り部
３９…下位分類判定部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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