(57)【要約】      （修正有）【課題】トリアシルグリセロールの光学異性体を簡単な装置構成で分離する方法を提供する。【解決手段】超臨界流体を含む移動相が送液される分析流路中にトリアシルグリセロールを含む試料を注入し、アミロース誘電体が充填された分析カラムを用いてトリアシルグリセロールの光学異性体を分離する。なお、移動相にはモディファイアとしてメタノールを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界流体を含む移動相が送液される分析流路中にトリアシルグリセロールを含む試料を注入し、該試料を分離剤としてアミロース誘電体が充填された分析カラムに通液させてトリアシルグリセロールの光学異性体を分離する分離方法。
【請求項２】
前記移動相はモディファイアとしてメタノールを含む請求項１に記載の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアシルグリセロールを分離する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、アミノ酸の光学異性体を分離することができる技術が開発されたことにより、脳神経系における生理機能解析や病態解明、疾患バイオマーカー探索、発酵食品の成分解析（酢酸菌、乳酸菌などの微生物代謝産物）など、基礎化学から健康・美容分野にわたる様々な領域に応用され始め、これまで明らかにされていなかった多くの知見が得られるようになっている。
【０００３】
光学異性体をもつ物質としてトリアシルグリセロールがある。トリアシルグリセロール（以下、ＴＡＧ）とは、１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールである。動物の体内脂肪組織に蓄えられる脂肪や食品中の油脂、植物油などを構成する脂質の大部分は中性脂肪であり、その中性脂肪に圧倒的に多く含まれているのがＴＡＧである。このＴＡＧは、光学活性体であることが知られているが、分離が容易でないため、その詳細な生理機能については明らかにされていない。ＴＡＧを容易に分離する方法を確立することにより、アミノ酸の光学異性体の分離と同様に、種々の分野において新たな知見が得られることが期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２７８０２７３号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０７５９７４号パンフレット
【特許文献３】特開平５−２６４５２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料中の物質を分離する方法としては、液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーが知られている。液体クロマトグラフィーは、分離剤の充填された分析カラムに試料を通すことにより、各物質に対する分離剤の保持力の差異によって所望の物質を分離することができる。
【０００６】
しかし、通常の液体クロマトグラフィーでは光学活性体であるＴＡＧを容易に分離することはできない。ＴＡＧを分離するには分析カラムの分離性能を高める必要がある。液体クロマトグラフィーの分離性能は分析カラムの長さが長いほど高くなるが、長さの長い分析カラムは高価な上、分析カラムの長さが長くなると移動相を送液するための送液圧力が高くなることから、分析カラムを長くしたり分析カラムを直列に連結したりするには限度がある。かかる理由により、ＴＡＧを液体クロマトグラフィーで分離することは容易ではない。
【０００７】
ＴＡＧのような分離しにくい物質を分離する方法として、リサイクル液体クロマトグラフィーが知られている（例えば、特許文献１参照。）。リサイクル液体クロマトグラフィーは、分析カラムを通過した分離の不十分な成分を含む溶離液を分析カラムに戻して再度の分離（リサイクル分離という）を目的物質の分離が達成されるまで繰り返し行なうというものである。
【０００８】
しかし、ＴＡＧを分離するためには、多くの回数にわたってリサイクル分離を行なう必要があるため、分離に長時間を要する。また、分析カラムを通過した溶離液を再度分析カラムへ戻すというリサイクルシステムが装置に必要なため、装置構成が複雑になる。また、ＴＡＧは一般に有機溶媒に溶けるため、リサイクル液体クロマトグラフィーで分離した後のＴＡＧの精製が容易ではない。
【０００９】
そこで、本発明は、ＴＡＧの光学異性体を簡単な装置構成で分離して精製することができるようにすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、超臨界流体を含む移動相が送液される分析流路中にＴＡＧを含む試料を注入し、該試料を分離剤としてアミロース誘電体が充填された分析カラムに通液させてＴＡＧの光学異性体を分離する分離方法である。すなわち、本発明では、ＴＡＧの分離を超臨界流体クロマトグラフィーを用いて行なう。
【００１１】
超臨界流体クロマトグラフィーは、二酸化炭素などに一定の温度及び圧力をかけて超臨界流体とし、その超臨界流体を溶媒として行なうクロマトグラフィーである。超臨界流体は液体と気体の両方の性質をもち、液体よりも拡散性が高く粘性が低いという特徴がある。超臨界流体クロマトグラフィーは、種々の特性を有する流体を移動相として使用することができるため、分離が困難な光学異性体の分離への利用も提案されている（例えば、特許文献２参照。）また、超臨界流体は粘性が低いため、複数の分析カラムを直列に連結して分離性能を高めることができる（例えば、特許文献３参照。）。
【００１２】
上記分離方法において、モディファイアとして例えばメタノールを用いることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、ＴＡＧを超臨界流体クロマトグラフィーにより分離するので、分析カラムの連結によって分離性能を高めることができ、リサイクル液体クロマトグラフのように装置の流路構成を複雑にすることなく、１本の流路で短時間での分離が可能となる。超臨界流体クロマトグラフィーの移動相である超臨界流体は常温・大気圧下で気化するため、液体クロマトグラフに比べて分析カラムで分離した成分の精製が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】超臨界流体クロマトグラフの一実施例を概略的に示す流路図である。
【図２】１本の分析カラムを備えた超臨界クロマトグラフでのｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧの分析結果を示すクロマトグラムであり、（Ａ）は移動相流量を３ｍＬ／ｍｉｎに設定したときのクロマトグラム、（Ｂ）は移動相流量を１ｍＬ／ｍｉｎに設定したときのクロマトグラム、（Ｃ）は移動相流量を０．６ｍＬ／ｍｉｎに設定したときのクロマトグラムである。
【図３】２本の分析カラムを備えた超臨界クロマトグラフでの分析結果を示すクロマトグラムであり、（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラム、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラム、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラムである。
【図４】４本の分析カラムを備えた超臨界クロマトグラフでの分析結果を示すクロマトグラムであり、（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラム、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラム、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラムである。
【図５】図４の分析よりも分離部の温度を低く設定して４本の分析カラムを備えた超臨界クロマトグラフで分析を行なったときの分析結果を示すクロマトグラムであり、（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラム、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラム、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを試料として注入したときのクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１を用いて、本発明の分離方法の実施に用いる超臨界流体クロマトグラフの一例を説明する。
【００１６】
液体状態の二酸化炭素をポンプ６により送液する二酸化炭素送液流路２と、モディファイアとしてメタノールをポンプ１０により送液するモディファイア送液流路４がミキサ１４に接続されている。ミキサ１４には分析流路１６が接続されている。分析流路１６上には、この分析流路１６に試料を注入する試料注入部（オートサンプラ）１８、分離部２０、圧力制御バルブ２２及び質量分析計（ＭＳ）２４が配置されている。分離部２０は、分離剤としてアミロース誘電体が充填された分析カラムを備えている。分離部２０は１本の分析カラムによって構成することもできるが、目的に応じて複数本の分析カラムを直列に連結して構成することもできる。
【００１７】
二酸化炭素とメタノールはミキサ１４で混合され、移動相として分析流路１６に導入される。分析流路１６は圧力制御バルブ２２によって内圧が７ＭＰａ以上に制御され、分析流路１６に導入された移動相は超臨界流体の状態となる。試料注入部１８により注入された試料は超臨界流体となった移動相によって分離部２０に搬送され、成分ごとに分離され、圧力制御バルブ２２を経て質量分析計２４に導入される。
【００１８】
かかる超臨界流体クロマトグラフを用いてＴＡＧの分離を行なった結果について以下に説明する
【００１９】
図２はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧ（ラセミ体の1,2-distearoyl-3-oleoyl-glycerol）を１００ｐｐｍの濃度で含む試料を分析流路に注入して質量分析計２４で得られたクロマトグラムであり、（Ａ）は移動相の流量を３ｍＬ／ｍｉｎ、（Ｂ）は移動相の流量を１ｍＬ／ｍｉｎ、（Ｃ）は移動相の流量を０．６ｍＬ／ｍｉｎに設定したときのクロマトグラムをそれぞれ示している。
【００２０】
この分析において、分離剤としてアミロース誘電体（３−クロロフェニルカルバマテ）をシリカゲル担体に固定化した固定相を分離剤として備えた内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍの分析カラム（株式会社ダイセルの製品ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＤ−３／ＳＦＣ）１本によって分離部２０を構成し、分離部２０の温度（カラムオーブン温度）を３５℃に設定した。移動相は、モディファイアであるメタノール（ギ酸アンモニウム（ＨＣＯＯＮＨ4）を０．１％含有）の濃度を０％〜１０％の範囲で時間変化させてグラジエント分析を行なった。
【００２１】
図２の（Ａ）〜（Ｃ）の各クロマトグラムについてｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧの分離度Ｒを次式により求めた。なお、次式は互いに隣接するピークＰ1とＰ2の分離度を示すものであり、Ｗ1はピークＰ1のベースラインにおけるピーク幅、Ｗ2はピークＰ2のベースラインにおけるピーク幅、ｔ1はピークＰ1の保持時間、ｔ2はピークＰ2の保持時間（ｔ2＞ｔ1）である。
2015175747.tif 000002
【００２２】
移動相の流量が３ｍＬ／ｍｉｎのときの分離度Ｒ＝０．８０４となり、移動相の流量が１ｍＬ／ｍｉｎのときの分離度Ｒ＝１．６７４となり、移動相の流量が０．６ｍＬ／ｍｉｎのときの分離度Ｒ＝１．８３４となった。日本薬局方では、ピークの完全分離は「分離度１．５以上」と定義されている。このことから、図２Ａ〜図２Ｃの分析結果によれば、上記の分析条件下ではｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧは移動相の流量を１ｍＬ／ｍｉｎ以下にすることで完全に分離することができることがわかる。
【００２３】
図３は図２の分析で用いた分析カラムを２本使用し、それらを直列に連結して分離部２０を構成して分析を行なったときのクロマトグラムである。（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧ（ラセミ体の1,2-dipalmitoyl-3-oleoyl-glycerol）を２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧ（ラセミ体の1,2-dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol）を２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを１００ｐｐｍの濃度で含む試料をそれぞれ分析して得られたクロマトグラムである。分離部２０の温度（カラムオーブン温度）は３５℃であり、移動相の流量は１ｍＬ／ｍｉｎである。移動相の組成は図２の分析と同様に、モディファイアであるメタノール（ギ酸アンモニウム（ＨＣＯＯＮＨ4）を０．１％含有）の濃度を０％〜１０％の範囲で時間変化させてグラジエント分析を行なった。
【００２４】
図３の分析結果によれば、（Ａ）ｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧと（Ｂ）ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧについては、分離はみられるものの完全分離（分離度Ｒが１．５以上）には至っていない。一方で、ｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧの分離度Ｒは３．８３３となり、分離部２０以外の条件が同じ条件である図２Ｂの分析結果（Ｒ＝１．６７４）に比べてさらに分離が進んでいることがわかる。このことから、２本の分析カラムを連結することによって分離部２０の分離性能が向上していることが確認された。
【００２５】
図４は図２及び図３の分析で用いた分析カラムを４本使用し、それらを直列に連結して分離部２０を構成して分析を行なったときのクロマトグラムである。図３の分析と同様に、（Ａ）はｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧを２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｂ）はｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧを２ｐｐｍの濃度で含む試料、（Ｃ）はｒａｃ−ＳＳＯ−ＴＡＧを１００ｐｐｍの濃度で含む試料をそれぞれ分析して得られたクロマトグラムである。分離部２０の温度（カラムオーブン温度）は３５℃であり、移動相の流量は１ｍＬ／ｍｉｎである。移動相の組成は図２の分析と同様に、モディファイアであるメタノール（ギ酸アンモニウム（ＨＣＯＯＮＨ4）を０．１％含有）の濃度を０％〜１０％の範囲で時間変化させてグラジエント分析を行なった。
【００２６】
図４の分析結果から、（Ａ）ｒａｃ−ＰＰＯ−ＴＡＧと（Ｂ）ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧの分離度がそれぞれ２．１５６、１．４７１となり、図３の分析よりも向上していることがわかる。このように、図１に示した超臨界流体クロマトグラフでは、必要に応じて複数本の分析カラムを直列に連結して分離性能を向上させることができるので、液体クロマトグラフでは分離の困難なＴＡＧを、装置構成を複雑化させることなく分離することができる。
【００２７】
図５は図４の分析条件のうち分離部２０の温度を２５℃に低下させて分析を行なって得られたクロマトグラムである。この分析結果から、図４の分析では完全分離に至っていなかった（Ｂ）ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧの分離度が１．８２９に向上し、完全分離に至っていることが確認された。これらの結果により、ｒａｃ−ＯＯＰ−ＴＡＧのような分離しにくいＴＡＧであっても、連結する分析カラムの本数や分離部２０の温度を調節することによって完全に分離できることが確認された。
【符号の説明】
【００２８】
２      二酸化炭素送液流路
４      モディファイア送液流路
６，１０      ポンプ
８      二酸化炭素
１２      メタノール（モディファイア）
１４      ミキサ
１６      分析流路
１８      試料注入部
２０      分離部
２２      圧力制御バルブ
２４      質量分析装置
【図１】
2015175747.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2015175747.tif 000006
【図５】
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