(57)【要約】【課題】標本に対してエバネッセント光を偏りなく照射し、標本を精度よく蛍光観察する。【解決手段】標本Ｓに対向して配置される対物レンズ１７と、光源１から発せられたレーザ光を対物レンズ１７の瞳位置Ｅに集光させるリレー光学系１１と、対物レンズ１７の焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、光源１からのレーザ光の位相を変調可能なＬＣＯＳ−ＳＬＭ５と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５により瞳位置Ｅにおける瞳の中心位置からずれた位置にレーザ光を集光させて標本Ｓにエバネッセント光を照射させるよう所定の変調パターンを設定する制御部７とを備える蛍光観察装置１００を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に対向して配置される対物レンズと、
光源から発せられた照明光を前記対物レンズの瞳位置に集光させるリレー光学系と、
前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、前記光源からの照明光の位相を変調可能な位相変調部と、
該位相変調部により前記瞳位置における瞳の中心位置からずれた位置に照明光を集光させて前記標本にエバネッセント光を照射させるよう所定の位相変調パターンを設定する制御部とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記制御部が、前記瞳位置における光軸に対して交差する方向の所望の位置に照明光を集光させる前記所定の位相変調パターンを設定する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記制御部が、前記瞳位置における光軸に対して交差する方向の複数の位置に照明光を同時に集光させる前記所定の位相変調パターンを設定する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記制御部が、前記瞳位置における光軸を囲むように環状に照明光を集光させる前記所定の位相変調パターンを設定する請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記制御部が、前記瞳位置における光軸に対して直交および／または沿う方向の照明光の集光位置を補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節する請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記制御部が、前記光源から前記対物レンズまでの光路に配設されたレンズの収差および／または前記光路中の反射部材の面精度による波面の乱れによる照明光の集光性能の劣化を補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節する請求項５に記載の蛍光観察装置。
【請求項７】
波長が異なる照明光を発生可能な前記光源を備え、
前記制御部が、前記光源から発せられる照明光の波長に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節する請求項５に記載の蛍光観察装置。
【請求項８】
瞳位置が異なる複数の前記対物レンズを備え、
前記制御部が、照明光の光路に配置された前記対物レンズの瞳位置に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節する請求項５に記載の蛍光観察装置。
【請求項９】
互いに異なる波長特性を有し、照明光を反射または透過させる一方、照明光が照射されることにより前記標本から戻る戻り光を透過または反射して前記照明光の光路から分岐させる複数の分岐部を備え、
前記制御部が、照明光の光路に配置された前記分岐部に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節する請求項５に記載の蛍光観察装置。
【請求項１０】
前記標本の周囲の温度を測定する温度測定部を備え、
前記制御部が、前記温度測定部により測定された温度に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節する請求項５に記載の蛍光観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、カバーガラスと標本との境界面でレーザ光を全反射させることによりカバーガラスから染み出すエバネッセント光を用いて、標本を蛍光観察する蛍光観察装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。
【０００３】
特許文献１に記載の蛍光観察装置は、光源から発せられたレーザ光をガルバノメータにより偏向することで、対物レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置を瞳の中心からずらしてレーザ光を全反射させてエバネッセント光を発生させるようになっている。また、特許文献２に記載の蛍光観察装置は、レーザ光を導光する光ファイバの出射位置を移動させることで、対物レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置を瞳の中心からずらして全反射させてエバネッセント光を発生させるようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４９３４２８１号公報
【特許文献２】特許第４５６３６９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１，２の蛍光観察装置では、対物レンズの瞳位置においてレーザ光の集光位置を１方向にしか移動することができないため、標本に対して１方向から染み出すエバネッセント光しか照射することができない。そのため、エバネッセント光の照射に偏りが生じ、標本を精度よく蛍光観察することができないという不都合がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本に対してエバネッセント光を偏りなく照射し、標本を精度よく蛍光観察することができる蛍光観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本に対向して配置される対物レンズと、光源から発せられた照明光を前記対物レンズの瞳位置に集光させるリレー光学系と、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、前記光源からの照明光の位相を変調可能な位相変調部と、該位相変調部により前記瞳位置における瞳の中心位置からずれた位置に照明光を集光させて前記標本にエバネッセント光を照射させるよう所定の位相変調パターンを設定する制御部とを備える蛍光観察装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、光源から発せられた照明光が位相変調部により所定の位相変調パターンに基づいて位相変調されて、リレー光学系により対物レンズの瞳位置における瞳の中心位置からずれた位置に集光させられることで、標本において照明光が全反射されてエバネッセント光が照射される。これにより、標本におけるエバネッセント光が達した局所的な領域から戻る戻り光に基づき、バックグランドが非常に暗くコントラストが高い蛍光観察を行うことができる。
【０００９】
この場合において、対物レンズの瞳位置での照明光の集光位置が位相変調部の所定の位相変調パターンにより決まるので、制御部により、標本に対して周囲から略均等にエバネッセント光が発生するように照明光を集光させる位相変調パターンを設定すれば、標本に対してエバネッセント光を偏りなく照射し、標本を精度よく蛍光観察することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記制御部が、前記瞳位置における光軸に対して交差する方向の所望の位置に照明光を集光させる前記所定の位相変調パターンを設定することとしてもよい。
このように構成することで、標本に対して所望の方向からエバネッセント光を発生させることができる。したがって、標本に対してエバネッセント光を所望の方向から偏りなく照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記制御部が、前記瞳位置における光軸に対して交差する方向の複数の位置に照明光を同時に集光させる前記所定の位相変調パターンを設定することとしてもよい。
このように構成することで、標本に対して複数の方向からエバネッセント光を発生させることができる。したがって、標本に対してエバネッセント光を複数の方向から偏りなく照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００１２】
上記発明においては、前記制御部が、前記瞳位置における光軸を囲むように環状に照明光を集光させる前記所定の位相変調パターンを設定することとしてもよい。
このように構成することで、標本に対して周方向全域からエバネッセント光を発生させることができる。したがって、標本に対してエバネッセント光を周方向全域から偏りなく照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００１３】
上記発明においては、前記制御部が、前記瞳位置における光軸に対して直交および／または沿う方向の照明光の集光位置を補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節することとしてもよい。
このように構成することで、対物レンズの瞳位置における光軸に対して直交する方向や沿う方向の集光位置がずれた場合でも、標本に対するエバネッセント光の照射方向を修正し精度よく蛍光観察することができる。
【００１４】
上記発明においては、前記制御部が、光源から前記対物レンズまでの光路に配設されたレンズの収差および／または前記光路中の反射部材の面精度による波面の乱れによる照明光の集光性能の劣化を補正するよう前記位相変調パターンを調節することとしてもよい。
【００１５】
制御部により、光源から対物レンズまでの光路に配設されたリレー光学系の収差や反射部材の面精度による波面の乱れによる照明光の集光性能の劣化を補正することで、照明光を効率よく全反射させて標本に対してノイズが少ないエバネッセント光を照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００１６】
上記発明においては、波長が異なる照明光を発生可能な前記光源を備え、前記制御部が、前記光源から発せられる照明光の波長に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節することとしてもよい。
【００１７】
照明光の波長が変わると照明光の色収差により集光位置がずれることがある。このように構成することで、標本の蛍光物質に応じて適切な波長の照明光に変更しつつ、いずれの照明光を照射させる場合でも、照明光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。これにより、標本に対してノイズが少ないエバネッセント光を照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００１８】
上記発明においては、瞳位置が異なる複数の前記対物レンズを備え、前記制御部が、照明光の光路に配置された前記対物レンズの瞳位置に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節することとしてもよい。
【００１９】
このように構成することで、標本に応じて適切な倍率の対物レンズに変更しつつ、いずれの対物レンズを用いる場合でも、照明光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。これにより、標本に対してノイズが少ないエバネッセント光を照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００２０】
上記発明においては、互いに異なる波長特性を有し、照明光を反射または透過させる一方、照明光が照射されることにより前記標本から戻る戻り光を透過または反射して前記照明光の光路から分岐させる複数の分岐部を備え、前記制御部が、照明光の光路に配置された前記分岐部に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節することとしてもよい。
【００２１】
このように構成することで、検出する戻り光の波長に応じて適切な分岐部に変更しつつ、いずれの分岐部を用いる場合でも、照明光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。これにより、標本に対してノイズが少ないエバネッセント光を照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【００２２】
上記発明においては、前記標本の周囲の温度を測定する温度測定部を備え、前記制御部が、前記温度測定部により測定された温度に応じて集光位置のずれを補正するよう前記所定の位相変調パターンを調節することとしてもよい。
【００２３】
このように構成することで、標本の周囲の温度が変化した場合でも、照明光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。これにより、標本に対してノイズが少ないエバネッセント光を照射し、標本を高精度に蛍光観察することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、標本に対してエバネッセント光を偏りなく照射し、標本を精度よく蛍光観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１実施形態に係る蛍光観察装置を示す概略構成図である。
【図２】図１の蛍光観察装置により全反射照明観察する場合の対物レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置の一例を示す図である。
【図３】本発明の第１実施形態に係る蛍光観察装置の比較例として、従来の蛍光観察装置により全反射照明観察する場合の対物レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置の一例を示す図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係る蛍光観察装置を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る蛍光観察装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１００は、図１に示されるように、レーザ光（照明光）を発生する光源１と、光源１から発せられたレーザ光を所定の変調パターン（位相変調パターン）に基づいて位相変調するＬＣＯＳ−ＳＬＭ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｏｎ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  −  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、空間光位相変調器、位相変調部）５と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の所定の変調パターンを設定する制御部７と、レーザ光をリレーするリレー光学系１１と、リレー光学系１１によりリレーされるレーザ光から０次光をカットするカットフィルタ１３と、標本Ｓに対向して配置され、リレー光学系１１によりリレーされたレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を含む戻り光を集光する対物レンズ１７とを備えている。
【００２７】
符号３は、光源１からのレーザ光をＬＣＯＳ−ＳＬＭ５に向けて反射する反射ミラー（反射部材）を示し、符号９は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５からのレーザ光をリレー光学系１１に向けて反射する反射ミラー（反射部材）を示している。符号Ｅは、対物レンズ１７の瞳位置を示している。
標本Ｓは、蛍光色素により染色されてスライドガラス等のガラス板１５上に載置されている。
【００２８】
また、蛍光観察装置１００には、対物レンズ１７により集光された戻り光をレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー１９と、レーザ光の光路から分岐された戻り光の内、レーザ光の反射光を除去して蛍光を通過させるバリアフィルタ２１と、標本Ｓの画像を取得するＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）２７とが備えられている。符号２３は、バリアフィルタ２１を通過した蛍光をＣＣＤ２７の撮像面に結像させる結像レンズを示し、符号２５は反射ミラーを示している。
【００２９】
ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５は、２次元的に配列された多数の微小変調素子（図示略）を備えており、これら微小変調素子ごとに入射した光に与える位相変化量を個々に制御することができるようになっている。また、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５は、対物レンズ１７の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されている。このＬＣＯＳ−ＳＬＭ５は、制御部７により設定された所定の変調パターンに基づき、入射したレーザ光の波面形状を微小変調素子ごとに位相変調により変化させて出射するようになっている。
【００３０】
例えば、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５は、所定の変調パターンに応じて、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおけるレーザ光の集光位置を光軸に交差する方向に移動させたり、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおいて複数箇所にレーザ光を同時に集光させたりすることができるようになっている。
【００３１】
制御部７は、全反射照明観察する場合において、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５により、図１に示すように、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける瞳の中心からずれた位置にレーザ光を集光させてガラス板１５からエバネッセント光を染み出させる変調パターンを設定するようになっている。本実施形態においては、図２に示すように、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける瞳の中心から光軸に直交する方向に互いに等しい距離だけ離間し周方向に等間隔をあけた所望の４箇所にレーザ光を同時に集光させるパターンを例示して説明する。図２において、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおけるレーザ光の集光位置を符号Ｋで示す。図３においても同様である。
【００３２】
ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５により、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける瞳の中心から光軸に直交する方向にレーザ光の集光位置をずらすことで、標本Ｓのガラス板１５に対してレーザ光が斜めに入射してガラス板１５内で全反射され、ガラス板１５の標本側界面から標本Ｓ側に染み出すエバネッセント光が標本Ｓに照射される。
【００３３】
ダイクロイックミラー１９は、リレー光学系１１によりリレーされたレーザ光を対物レンズ１７に向けて反射する一方、対物レンズ１７により集光されてレーザ光の光路を戻る戻り光を透過させてバリアフィルタ２１に入射させるようになっている。
【００３４】
このように構成された蛍光観察装置１００の作用について説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１００により標本Ｓを全反射照明観察する場合は、制御部７により全反射照明する変調パターンをＬＣＯＳ−ＳＬＭ５に設定し、光源１からレーザ光を発生させる。
【００３５】
光源１から発せられたレーザ光は、図１に示すように、反射ミラー３を介してＬＣＯＳ−ＳＬＭ５により位相変調されて反射された後、反射ミラー９、リレー光学系１１、カットフィルタ１３およびダイクロイックミラー１９を介して対物レンズ１７の瞳位置Ｅに集光する。対物レンズ１７の瞳位置Ｅの中心に集光する０次光はカットフィルタ１３によりカットされている。
【００３６】
この場合に、レーザ光は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の変調パターンに応じて、図２に示すように、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおいて瞳の中心から光軸に直交する方向に互いに等しい距離だけ離間し周方向に等間隔をあけた所望の４箇所（図２の符号Ｋ参照。）に同時に集光させられる。そして、対物レンズ１７から標本Ｓのガラス板１５に対してレーザ光が斜め入射してガラス板１５と標本Ｓの界面で全反射され、ガラス板１５から染み出るエバネッセント光が標本Ｓに局所的に照射される。
【００３７】
エバネッセント光が標本Ｓに局所的に照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、対物レンズ１７、ダイクロイックミラー１９、結像レンズ２３および反射ミラー２５を介してＣＣＤ２７により撮影される。これにより、ＣＣＤ２７において標本Ｓにおけるエバネッセント光が達したごく浅い領域の蛍光像を取得し、バックグランドが非常に暗くコントラストが高い蛍光観察を行うことができる。
【００３８】
この場合において、対物レンズ１７の瞳位置Ｅでのレーザ光の集光位置がＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の所定の変調パターンにより決まるので、制御部７により、標本Ｓに対して周囲から略均等にエバネッセント光が発生するようにレーザ光を集光させる変調パターンを設定することで、標本Ｓに対してエバネッセント光を偏りなく照射することができる。
【００３９】
本実施形態においては、図２に示すように、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける瞳の中心から光軸に直交する方向に互いに等しい距離だけ離間し周方向に等間隔をあけた所望の４箇所（図２の符号Ｋ参照。）にレーザ光を同時に集光させることで、標本Ｓに対して周囲の４箇所からエバネッセント光を偏りなく照射することができる。
【００４０】
なお、本実施形態に係る蛍光観察装置１００の比較例として、従来の蛍光観察装置のように、ガルバノメータによりレーザ光を偏向して対物レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置を瞳の中心からずらす構成では、図３に示すように、対物レンズの瞳位置においてレーザ光の集光位置（図３の符号Ｋ参照。）を１方向にしか移動することができない。そのため、標本に対して１方向から染み出すエバネッセント光しか照射することができず、エバネッセント光の照射に偏りが生じることとなる。
【００４１】
以上説明したように、本実施形態に係る蛍光観察装置１００によれば、制御部７により、標本Ｓに対して周囲から略均等にエバネッセント光が発生するようにレーザ光を集光させる変調パターンを設定することで、標本Ｓに対してエバネッセント光を偏りなく照射し、これにより標本Ｓを精度よく蛍光観察することができる。
【００４２】
本実施形態は以下のように変形することができる。
すなわち、本実施形態においては、制御部７が、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける瞳の中心から光軸に直交する方向にずれた複数の位置にレーザ光を同時に集光させる変調パターンを設定することとした。一変形例としては、制御部７が、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける光軸を囲むように環状にレーザ光を同時に集光させる変調パターンを設定することとしてもよい。
【００４３】
このようにすることで、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５により、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおいて光軸を囲む環状にレーザ光を同時に集光させてガラス板１５内で全反射させ、標本Ｓに対して周方向の全域からエバネッセント光を発生させることができる。したがって、標本Ｓに対してエバネッセント光を周方向全域から偏りなく照射し、標本Ｓをより高精度に蛍光観察することができる。
【００４４】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る蛍光観察装置について説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置２００は、図４に示すように、光源１、対物レンズ１７およびダイクロイックミラー１９に代えて、波長が異なるレーザ光を発生可能な光源１０１と、瞳位置Ｅが異なる複数の対物レンズ１７Ａ，１７Ｂと、互いに異なる波長特性を有する複数のダイクロイックミラー（分岐部）１９Ａ，１９Ｂと、標本Ｓの周囲の温度を測定する温度測定器（温度測定部）１２９とを備え、制御部７が、設定したＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の所定の変調パターンを調節する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る蛍光観察装置１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００４５】
光源１０１は、６３５ｎｍのレーザ光を発生する第１光源部３１Ａと、５１５ｎｍのレーザ光を発生する第２光源部３１Ｂと、４８８ｎｍのレーザ光を発生する第３光源部３１Ｃと、４０５ｎｍのレーザ光を発生する第４光源部３１Ｄとを備えている。
【００４６】
また、光源１０１には、各光源部３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄから発せられたレーザ光の光路を合成する反射ミラー３３，４１およびダイクロイックミラー３５，３７，３９と、出射するレーザ光の波長を切り替えるＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ、音響光学素）４３とが備えられている。
【００４７】
反射ミラー３３は、第１光源部３１Ａから発せられたレーザ光をダイクロイックミラー３５に向けて反射するようになっている。ダイクロイックミラー３５は、第１光源部３１Ａから反射ミラー３３を介して入射するレーザ光を透過する一方で、第２光源部３１Ｂから発せられたレーザ光を反射して、これらの光路を合成するようになっている。ダイクロイックミラー３７は、第１光源部３１Ａおよび第２光源部３１Ｂからのレーザ光を透過する一方で、第３光源部３１Ｃからのレーザ光を反射して、これらのレーザ光の光路を合成するようになっている。ダイクロイックミラー３９は、第１光源部３１Ａ〜第３光源部３１Ｃからのレーザ光を合成する一方で、第４光源部３１Ｄからのレーザ光を反射して、これらの光路を合成するようになっている。反射ミラー４１は、ダイクロイックミラー３９により光路が合成された第１光源部３１Ａ〜第４光源部３１Ｄからのレーザ光をＡＯＴＦ４３に向けて反射するようになっている。
【００４８】
複数の対物レンズ１７Ａ，１７Ｂは、レボルバ１８により、レーザ光の光路上に選択的に配置可能に支持されている。
複数のダイクロイックミラー１９Ａ，１９Ｂは、それぞれバリアフィルタ２１とともにターレット２０により保持されている。これら各ダイクロイックミラー１９Ａ，１９Ｂとバリアフィルタ２１の組は、ターレット２０により戻り光の光路上に選択的に配置することができるようになっている。
【００４９】
制御部７は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の所定の変調パターンを設定した上で、さらに、リレー光学系１１の収差や反射ミラー３，９の面精度など、光源１０１から対物レンズ１７までの間に配置されたレンズの収差や反射部材の面精度に従い、その収差や面精度に応じた波面の乱れによるレーザ光の集光性能の劣化（集光スポットの広がり）を補正するよう変調パターンを調節するようになっている。また、制御部７は、光源１０１から発せられるレーザ光の波長に従い、その波長に応じたレーザ光の集光位置のずれを補正するよう変調パターンを調節するようになっている。また、制御部７は、レーザ光の光路に配置された対物レンズ１７Ａ，１７Ｂの瞳位置Ｅに従い、その瞳位置Ｅに応じたレーザ光の集光位置のずれを補正するよう変調パターンを調節するようになっている。また、制御部７は、レーザ光の光路に配置されたダイクロイックミラー１９Ａ，１９Ｂの波長特性に従い、その波長特性に応じたレーザ光の集光位置のずれを補正するよう変調パターンを調節するようになっている。さらに、制御部７は、温度測定器１２９により測定された温度に従い、標本Ｓの周囲の温度の変化に応じたレーザ光の集光位置のずれを補正するよう変調パターンを調節するようになっている。
【００５０】
このように構成された蛍光観察装置２００の作用について説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置２００により標本Ｓを全反射照明観察する場合は、制御部７により全反射照明する所定の変調パターンをＬＣＯＳ−ＳＬＭ５に設定し、レボルバ１８によりいずれかの対物レンズ１７Ａ，１７Ｂを光路上に配置するとともに、ターレット２０によりいずれかのダイクロイックミラー１９Ａ，１９Ｂを光路上に配置する。
【００５１】
次いで、光源１０１において、ＡＯＴＦ４３により、いずれかの光源部３１Ａ，３１Ｂ，３１Ｃ，３１Ｄから発生させたレーザ光を出射する。光源１０１から発せられたレーザ光は、反射ミラー３、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５、反射ミラー９、リレー光学系１１およびカットフィルタ１３を介して、光路上のダイクロイックミラー１９Ａ（１９Ｂ）により反射される。
【００５２】
そして、レーザ光は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の変調パターンに応じて光路上の対物レンズ１７Ａ（１７Ｂ）の瞳位置Ｅにおける瞳の中心から光軸に直交する方向にずれた位置に集光し標本Ｓとガラス板１５との界面で全反射される。これにより、ガラス板１５から染み出るエバネッセント光が標本Ｓに局所的に照射される。
【００５３】
エバネッセント光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、光路上の対物レンズ１７Ａ（１７Ｂ）、光路上のダイクロイックミラー１９Ａ（１９Ｂ）、バリアフィルタ２１、結像レンズ２３および反射ミラー２５を介してＣＣＤ２７により撮影される。これにより、ＣＣＤ２７において標本Ｓにおけるエバネッセント光が達したごく浅い領域の蛍光像が取得される。
【００５４】
この場合において、リレー光学系１１の収差や反射ミラー３，９の面精度など、光源１０１から対物レンズ１７までの間に配置されたレンズの収差や反射部材の面精度による波面の乱れによりレーザ光の集光性能に劣化が生じたり、光源１０１から発せられるレーザ光の波長に応じて集光位置にずれが生じたり、レーザ光の光路に配置された対物レンズ１７Ａ（１７Ｂ）の瞳位置Ｅに応じてレーザ光の集光位置にずれが生じたり、レーザ光の光路に配置されたダイクロイックミラー１９Ａ（１９Ｂ）に応じてレーザ光の集光位置にずれが生じたり、あるいは、標本Ｓの周囲の温度の変化によってレーザ光の集光位置にずれが生じたりすると、制御部７によりレーザ光の集光性能の劣化や集光位置のずれを補正するようＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の変調パターンが調節される。
【００５５】
したがって、本実施形態に係る蛍光観察装置２００によれば、標本Ｓを全反射照明観察する場合において、制御部７により、リレー光学系１１の収差や反射ミラー３，９の面精度による波面の乱れによるレーザ光の集光性能の劣化を解消し、レーザ光を効率よく全反射させることができる。
【００５６】
また、光源１０１により標本Ｓの蛍光物質に応じて適切な波長のレーザ光に変更しつつ、いずれのレーザ光を照射する場合でも、レーザ光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。また、標本Ｓに応じて適切な倍率の対物レンズ１７Ａ，１７Ｂに変更しつつ、いずれの対物レンズ１７Ａ，１７Ｂを用いる場合でも、レーザ光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。また、検出する戻り光の波長に応じて適切な波長特性のダイクロイックミラー１９Ａ，１９Ｂに変更しつつ、いずれのダイクロイックミラー１９Ａ，１９Ｂを用いる場合でも、レーザ光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。さらに、標本Ｓの周囲の温度が変化した場合でも、レーザ光を位置ずれなく所望の位置に集光させて効率よく全反射させることができる。これにより、標本Ｓに対してノイズが少ないエバネッセント光を照射し、標本Ｓを高精度に蛍光観察することができる。
【００５７】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【００５８】
また、上記各実施形態においては、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける瞳の中心から光軸に交差する方向にずれた所望の複数の位置にレーザ光を同時に集光させる変調パターンや、対物レンズ１７の瞳位置Ｅにおける光軸を囲むように環状にレーザ光を同時に集光させる変調パターンを例示して説明したが、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５の位相変調パターンに従い標本Ｓに対してエバネッセント光を偏りなく照射することができればよく、これに限定されるものではない。
【００５９】
また、カットフィルタ１３をレーザ光の光路に対して挿脱する挿脱機構を設けてもよい。挿脱機構によりカットフィルタ１３を光路から離脱させ、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ５による位相変調を行わないように制御することで、光源１，１０１からのレーザ光を対物レンズ１７の瞳位置Ｅの中心に集光させて通常の落射照明観察を行うことができる。
【符号の説明】
【００６０】
１，１０１    光源
３    反射ミラー（反射部材）
５    ＬＣＯＳ−ＳＬＭ（位相変調部）
７    制御部
９    反射ミラー（反射部材）
１１    リレー光学系
１７，１７Ａ，１７Ｂ    対物レンズ
１９Ａ，１９Ｂ    ダイクロイックミラー（分岐部)
１２９    温度測定器（温度測定部）
１００，２００    蛍光観察装置
Ｅ    瞳位置
Ｓ    標本
【図１】
2015141244.tif 000003
【図２】
2015141244.tif 000004
【図３】
2015141244.tif 000005
【図４】
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