(57)【要約】【課題】廃棄されていた柑橘類の外果皮および抽出粕の有効利用を図り、脂質の生体内沈着抑制剤を提供する。【解決手段】  柑橘類由来の物質、特に柚子の果汁部分を除いた外果皮、または果汁部分を搾汁後、該搾汁粕をノルマルヘキサンなどの有機溶媒により抽出して得られる抽出物を除いた抽出粕を含む飼料を給餌することにより、体重増加を抑え、血中中性脂肪濃度および内臓脂肪量を減少するので、動物、特に魚類の生体内における脂質沈着を抑制する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類由来の物質を含むことにより、動物の生体内に沈着される脂質を抑制する脂質の生体内沈着抑制剤であって、
前記物質が前記柑橘類の果汁部分を除いた外果皮であることを特徴とする脂質の生体内沈着抑制剤。
【請求項２】
前記外果皮は、冷凍乾燥後、粉末化して得られる外果皮であることを特徴とする請求項１記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
【請求項３】
前記物質が前記柑橘類の果汁部分を搾汁後、該搾汁粕を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を除いた、抽出粕であることを特徴とする請求項１記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
【請求項４】
前記有機溶媒がｎ−ヘキサンであることを特徴とする請求項３記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
【請求項５】
前記柑橘類が柚子であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
【請求項６】
前記動物が養魚類であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
【請求項７】
動物の生体内に沈着される脂質を抑制する、脂質の生体内沈着抑制剤を含む飼料であって、
前記生体内沈着抑制剤が請求項１から請求項６のいずれか１項記載の脂質の生体内沈着抑制剤であることを特徴とする飼料。
【請求項８】
前記飼料が養魚用飼料であることを特徴とする請求項７記載の飼料。
【請求項９】
血中中性脂肪濃度および内臓脂肪量を減少させることのできる動物の飼育方法であって、
過剰給餌により肥満誘導を行なう工程と、
請求項７記載の飼料を給餌する工程とを含むことを特徴とする飼育方法。
【請求項１０】
飼育対象動物の脂肪量を所定の脂肪量に調節することができる動物の飼育方法であって、
飼育対象動物の脂肪量をモニタリングするモニタリング工程と、
前記モニタリング工程後に飼料を給餌する給餌工程とを備え、
前記モニタリングされた脂肪量が前記所定の脂肪量より多い場合は、前記給餌工程において請求項７記載の飼料の給餌量を前記モニタリング時より増加し、前記モニタリングされた脂肪量が前記所定の脂肪量より少ない場合は、前記給餌工程において請求項７記載の飼料の給餌量を前記モニタリング時より減少させることを特徴とする飼育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂質の生体内沈着抑制剤、飼料および飼育方法に関し、特に魚類の体内に沈着する脂質を抑制できる生体内沈着抑制剤、この生体内沈着抑制剤を含む飼料、およびこの飼料を用いた飼育方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
柑橘類の一種である柚子（ゆず）は、果実類の中でも耐寒性が強く、極東でも自生出来る数少ない種である。日本では東北以南で広く栽培されている常緑小高木である。柚子にはビタミンＣが多く含まれることが知られており、また、柚子特有の甘酸っぱい香りは日本人好みであり、古くから果汁は調味料、果皮は香辛料・薬味として、さらに、日本では入浴にも用いられてきた。
【０００３】
柚子は果肉部の外周囲が果皮部で覆われており、搾汁後の搾り滓に含まれている油溶性成分を溶媒抽出して柚子精油を得ることができるが、それでも搾り滓の大部分は廃棄処分されている。
【０００４】
近年、養殖業では柚子果汁を添加した飼料をブリに投与した結果、ブリの成長を損なうことなく血合筋の褐変を抑制したこと、および、飼料に含まれる柚子の香気成分がブリの筋肉中に移行し蓄積することも明らかにされている（非特許文献１）。また、柚子皮全体をすり潰したものをブリの飼料に混ぜ、上記同様の肉質改善効果が確認されている（非特許文献２）。
【０００５】
養殖魚の鮮度維持・肉質改善を目的として、香辛料類を添加した飼料が開発されている。例えば、ミカン科等の香辛料を添加したことを特徴とする養殖魚用飼料（特許文献１）、ミカン科等の植物，それらの抽出物およびそれらの抽出残渣からなる食肉およびその副生成物よりなる味の劣化防止飼料用組成物または鮮度保持飼料用組成物（特許文献２）、グアバを必須成分として、それとともに香辛料（ミカン科に由来する香辛料を含む）を含む養魚用飼料（特許文献３）が知られている。
【０００６】
養殖魚の市場価格は、その養殖魚の重量で決まる場合が多い。そのため、体重の増えるような餌として、高タンパク質、高脂質の飼料が与えられることが多い。その結果、脂肪を多く含んだ肥満状態の養殖魚となりやすく、また、脂の中に餌由来の成分が混入するため、それが臭みとなって養殖魚の体内に蓄積され、刺身にしたときにも独特の養殖臭さが出たり、煮物にしたときに脂がたくさん出てきたり、味が悪くなったりする等の問題がある。天然物に比較して養殖物の魚は肉質が悪いという認識がなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−２２９８３０号公報
【特許文献２】特開平１１−２９９４３１号公報
【特許文献３】特許第３９２６１９３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】深田陽久等、日本水産学会誌、76(4)，678-685 (2010)
【非特許文献２】Haruhisa Fukada,et al.,Journal of aquatic food product technology、発行準備中  2013.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、クエン酸やビタミンＣを含む果汁を搾汁し、さらに柚子精油が抽出された後の抽出粕は、廃棄されることが多かった。
本発明は、このような問題に対処するためになされたもので、廃棄されていた上記柚子の外果皮および抽出粕の有効利用を図る。また、この柚子外果皮および抽出粕を含む脂質の生体内沈着抑制剤の提供を目的とする。
本発明は、内臓脂肪を減少させることで肉質を改善することができる養魚用飼料、およびこの飼料を用いた飼育方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る脂質の生体内沈着抑制剤は、柑橘類由来の物質を含むことにより、動物の生体内における脂質沈着を抑制する脂質の生体内沈着抑制剤であって、
上記物質が上記柑橘類の果汁部分を除いた外果皮であり、特に冷凍乾燥後、粉末化して得られる外果皮であることを特徴とする。
上記物質が上記柑橘類の果汁部分を搾汁後、該搾汁粕を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を除いた、抽出粕であることを特徴とする。該有機溶媒がｎ−ヘキサンであることを特徴とする。
上記柑橘類が柚子であることを特徴とする。
上記動物が養魚類であることを特徴とする。
本発明の飼料は上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されていることを特徴とする。特に養魚用飼料であることを特徴とする。
本発明の飼育方法は、血中中性脂肪濃度および内臓脂肪量を減少させることのできる動物の飼育方法であって、過剰給餌により肥満誘導を行なう工程と、上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されている飼料を給餌する工程とを含むことを特徴とする。
本発明の他の飼育方法は、飼育対象動物の脂肪量を所定の脂肪量に調節することができる動物の飼育方法である。この飼育方法は、飼育対象動物の脂肪量をモニタリングするモニタリング工程と、このモニタリング工程後に飼料を給餌する給餌工程とを備え、上記モニタリングされた脂肪量が上記所定の脂肪量より多い場合は、上記給餌工程において上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されている飼料の給餌量をモニタリング時より増加し、上記モニタリングされた脂肪量が上記所定の脂肪量より少ない場合は、上記給餌工程において上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されている飼料の給餌量をモニタリング時より減少させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の脂質の生体内沈着抑制剤は、柑橘類由来の抽出粕より得られるので、動物類、特に養殖されている魚類に対して肉質改善効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】投与実験条件を示す図である。
【図２】柚子の外果皮を給餌する群および抽出粕を給餌する群の体重増加を示す図である。
【図３】柚子の外果皮を給餌する群および抽出粕を給餌する群の血中中性脂肪濃度を示す図である。
【図４】柚子の外果皮を給餌する群および抽出粕を給餌する群のアルテミア数を示す図である。
【図５】柚子の外果皮を給餌する群および抽出粕を給餌する群の内臓脂肪量を示す図である。
【図６】柚子の外果皮を給餌する群および抽出粕を給餌する群の肝臓組織を示す図である。
【図７】オーラプテンを給餌する群の体重増加を示す図である。
【図８】オーラプテンを給餌する群の血中中性脂肪濃度を示す図である。
【図９】オーラプテンを給餌する群のアルテミア数を示す図である。
【図１０】オーラプテンを給餌する群の内臓脂肪量を示す図である。
【図１１】オーラプテンを給餌する群の肝臓組織を示す図である。
【図１２】肝臓からの各ｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図１３】内臓脂肪組織からの各ｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
高タンパク質、高脂質の飼料が与えられて太らせられた養殖魚に対して、本発明の養魚用飼料を２週間程度与えることで、脂肪だけが抜き取られた筋肉質の魚を養殖することができた。本発明はこのような知見に基づくものである。
【００１４】
本発明に使用できる柑橘類としては、柚子、伊予柑や温州ミカンなどのミカン類、レモン、オレンジ、グレープフルーツ等が挙げられる。これらの中でも柚子が好ましい。柚子は、生産および消費量共に日本が最も多く、国内では高知県が生産量第１位である。柚子特有の甘酸っぱい香りは日本人好みであり、果汁は調味料、果皮は香辛料・薬味として利用されている。柚子は果肉部の外周囲が外果皮部で覆われており、搾汁後の果汁は約２０質量％であり、搾り滓は約８０質量％である。
【００１５】
柑橘類由来の物質としては、上記外果皮、後述する抽出粕、上記外果皮と抽出粕との混合物が挙げられる。ここで外果皮は柚子の果汁を搾汁した後の搾汁粕であってもよい。
【００１６】
上記外果皮または柚子の果汁を搾汁した後の搾汁粕は、冷凍させ粉砕して冷凍粉砕物とする前処理を施すことが好ましい。
例えば、柚子の外果皮または柚子を搾汁した後の搾汁粕を搾汁直後に冷凍する。冷凍温度としては−５℃〜−３０℃、好ましくは−１５℃〜−２０℃である。冷凍することにより、搾汁粕の変質や腐敗を防ぐことができる。また、香り成分などの揮発性成分の揮散を防ぐことができる。
【００１７】
また、上記搾汁粕は、前処理、抽出工程を室温以下で行なうことにより、搾汁粕に含まれている油溶性物質そのままを回収する。そのため、前処理においても抽出を容易にするための熱処理、加熱乾燥処理等は行なわないことが好ましい。
溶媒抽出前に冷凍物を粉砕して冷凍粉砕物とする。粉砕は撹拌ミルで行なうことができる。粉砕後の大きさは５ｍｍ以下が好ましい。搾汁粕の場合、搾汁粕自身が繊維状態であるので、冷凍後、粉砕しない場合もある。
【００１８】
抽出溶媒としては有機溶媒抽出が挙げられる。有機溶媒としては、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ジクロロメタン、１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエテン、ブタン、プロパン、ノルマルヘキサン等が挙げられる。これらの中で食品製造においても使用可能なノルマルヘキサンが搾汁粕から低温抽出に用いる溶媒として好ましい。
【００１９】
ノルマルヘキサンは、食品衛生試験法で試験された結果、食品添加物規格に合格しているノルマルヘキサンを使用することができる。この食品添加物用ノルマルヘキサンは、屈折率（２０℃）が１．３７４〜１．２８６、比重が０．６５９〜０．６８７、留分が６４〜７０℃で９５容量％以上留出等の特性を有し、例えば、ノルマルヘキサンが６１．２質量％、３−メチルペンタンが１９．９質量％、メチルシクロペンタンが１０．４質量％、２−メチルペンタンが８．０質量％、シクロヘキサンが０．５質量％、ペンタンおよび２，２−ジメチルブタンが痕跡量の添加物用ノルマルヘキサンである。
また、ノルマルヘキサン１００質量％の試薬を用いることができる。
【００２０】
上記ノルマルヘキサン抽出物を除いた抽出粕は、残留するノルマルヘキサンを除去するために約１００℃で数十分間加熱することが好ましい。
上記柚子の外果皮、ノルマルヘキサン抽出粕を食事負荷による肥満モデルゼブラフィッシュに投与して、血中中性脂肪および内臓脂肪量を測定することにより、脂質沈着を抑制する効果について評価した。
【００２１】
ゼブラフィッシュは小型の魚類であり、脊椎動物の一種である。ゼブラフィッシュは脂質関連疾患のための脂質代謝モデルとして使用されている。これは、ゼブラフィッシュにおける、リポタンパク質による脂肪およびコレステロールの血漿中での輸送、および、内臓、皮下、筋肉内含脂肪細胞内へのトリアシルグリセロール（ＴＧ）としての貯蔵が人間と類似しているためである。また、新規ヒト疾患モデルとして有用な食餌性肥満ゼブラフィッシュ（ＤＩＯ）が三重大学で生み出され、人間の肥満に対する抗肥満効果を検証するために使用されている。
【００２２】
果肉を除いた新鮮な柚子の外果皮は、細片にスライスして−２０℃の温度で保管した。上記柚子の抽出粕は、１００℃で２０分間加熱して残留するノルマルヘキサンを除去した後、−２０℃の温度で保管した。
上記外果皮および抽出粕は、凍結乾燥・粉砕して、篩目７００μｍの篩を通過する顆粒にして評価試験に供した。
また、オーラプテンを０．１質量％、０．２質量％それぞれ含有するグルテン顆粒を準備し、使用前に気密容器内に４℃で保存した。オーラプテンは柚子の外果皮に豊富に含まれるプレニルオキシクマリンの一種である。柚子の外果皮に含まれるこのオーラプテンが脂質の生体内沈着抑制に関与しているのかどうかを調べるためにオーラプテン入りグルテン顆粒を準備した。
オーラプテンの含有量は乾燥重量で、柚子の外果皮が０．１〜０．３ｍｇ／ｇ、ノルマルヘキサン抽出粕が０．０７５〜０．１ｍｇ／ｇである。このため、柚子の外果皮に含まれている量の約５．５〜約１６．７倍量に相当するオーラプテン量（０．１質量％）、同約１１〜約３３倍量に相当するオーラプテン量（０．２質量％）となる。
【００２３】
ゼブラフィッシュは生後３ヶ月齢のＡＢstrainのメス個体を用いた。実験は、温度２８℃、昼：夜のサイクルが１４時間：１０時間に設定された標準実験条件下で行なった。投与実験条件を図１に示す。
実験開始最初の４週間は給餌制限を行なった（図１のＡ領域）。ゼブラフィッシュは、２リットルの水槽にそれぞれ１５匹ずつ無作為に入れられ、市販の乾燥ドライフードを１日に１回、２Ｌ水槽内の１５匹のゼブラフィッシュに約５０ｍｇ与えた。
【００２４】
給餌制限後、過剰給餌を２週間続けた（図１のＢ領域）。給餌制限を受けたゼブラフィッシュは、その後の評価試験のために５匹ずつ６つの群に分け、それぞれ２Ｌ水槽内に入れた。６つのグループ分けは以下の通りである。なお、（  ）内は図２〜図１１において表される記号である。
（１）肥満誘導を行なわない群＝コントロール群（ｎｏｎ−ＤＩＯ）、
（２）肥満誘導を行なう群（ＤＩＯ）、
（３）肥満誘導を行なうと共に柚子の外果皮を給餌する群（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）、
（４）肥満誘導を行なうと共に柚子のノルマルヘキサン抽出粕を給餌する群（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）、
（５）肥満誘導を行なうと共にオーラプテンを０．１質量％含有するグルテン顆粒を給餌する群（ＤＩＯ＋ＬＡ）、
（６）肥満誘導を行なうと共にオーラプテンを０．２質量％含有するグルテン顆粒を給餌する群（ＤＩＯ＋ＨＡ）。
図２〜図６は上記（１）（２）を比較対象とした、（３）柚子外果皮、（４）柚子のノルマルヘキサン抽出粕の結果を、図７〜図１１は上記（１）（２）を比較対象とした、（５）オーラプテンを０．１質量％含有、（６）オーラプテンを０．２質量％含有の結果を示したものである。
【００２５】
図１のＢ領域において、上記（１）の群には、新たに孵化したアルテミアを１日に１回（５ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌した。
同様に、上記（２）〜（６）の群には、新たに孵化したアルテミアを１日に３回（６０ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌した。
アルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ） とは、節足動物 甲殻亜門 鰓脚綱 サルソストラカ亜綱 無甲目 ホウネンエビモドキ科 の属名である。１科１属であり、所属する９種の総称ともなっている。
【００２６】
その後、以下の給餌を４週間続けた（図１のＣ領域）。給餌中は水槽内の水流を２時間停止した。なお、水槽内の残留餌は１日に１回水槽から除去され、その量が記録された。
上記（１）の群（ｎｏｎ−ＤＩＯ群）には、新たに孵化したアルテミアを１日に１回（５ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌した。
上記（２）の群（ＤＩＯ群）には、新たに孵化したアルテミアを１日に３回（６０ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌した。
上記（３）の群（（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群）には、アルテミアを１日に３回（６０ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌する２０分前に、柚子の外果皮顆粒（６ｍｇ／ｇ／ｄａｙに相当する）を給餌した。
上記（４）の群（（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群）には、アルテミアを１日に３回（６０ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌する２０分前に、柚子のノルマルヘキサン抽出粕顆粒（６ｍｇ／ｇ／ｄａｙに相当する）を給餌した。
上記（５）の群（（ＤＩＯ＋ＬＡ）群）には、アルテミアを１日に３回（６０ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌する２０分前に、オーラプテンを０．１質量％含有するグルテン顆粒（１０μｇ／ｇ／ｄａｙに相当する）を給餌した。
上記（６）の群（（ＤＩＯ＋ＨＡ）群）には、アルテミアを１日に３回（６０ｍｇｃｙｓｔｓ／ｆｉｓｈ／ｄａｙに相当する）給餌する２０分前に、オーラプテンを０．２質量％含有するグルテン顆粒（２０μｇ／ｇ／ｄａｙに相当する）を給餌した。
【００２７】
実験開始より、肥満誘導を開始した図１に示すＢおよびＣ領域の週末毎に以下の項目を測定した。
（ａ）ゼブラフィッシュの体重
体重はゼブラフィッシュを２-フェノキシエタノール５００ｐｐｍを含む水槽中で麻酔させた後、体表面の水分を柔らかいティッシュペーパーで拭き取って測定した。体重測定結果を図２および図７に示す。ｎｏｎ−ＤＩＯ群およびＤＩＯ群と比較して、図２は（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群の体重変化を示す図であり、図７は（ＤＩＯ＋ＬＡ）群および（ＤＩＯ＋ＨＡ）群の体重変化を示す図である。
【００２８】
（ｂ）血中中性脂肪濃度
血中中性脂肪濃度は、給餌６週後のゼブラフィッシュから採取された血液より和光Ｌ型ＴＧキット（和光純薬）を用いて測定した。血中中性脂肪濃度測定結果を図３および図８に示す。ｎｏｎ−ＤＩＯ群およびＤＩＯ群と比較して、図３は（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群の結果であり、図８は（ＤＩＯ＋ＬＡ）群および（ＤＩＯ＋ＨＡ）群の結果である。
【００２９】
（ｃ）アルテミア数
肥満誘導開始後、アルテミアの給餌量を給餌前後の「アルテミア数」として測定した。新たに孵化したアルテミアを水容器内に均一に分散させて、次いでこの溶液の１ｍｌに含まれるアルテミア数を実体顕微鏡で測定した。測定は３回繰り返し平均値を求めた。１つの水槽当たりこのアルテミア溶液を上記（１）の群に２．５ｍｌ、上記（２）〜（６）の群に１０ｍｌそれぞれ給餌した。それぞれの水槽の合計アルテミア数を計算した。アルテミアを給餌２時間後に、ゼブラフィッシュが食べ残したアルテミア量をアルテミア数として算出して、それぞれの水槽に最初に供給したアルテミア数から差し引いてアルテミアの給餌量を測定した。ｎｏｎ−ＤＩＯ群およびＤＩＯ群と比較して、図４は（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群の結果であり、図９は（ＤＩＯ＋ＬＡ）群および（ＤＩＯ＋ＨＡ）群の結果である。
【００３０】
（ｄ）内臓脂肪量
採血後のゼブラフィッシュを氷の上で死亡させて、３ＤマイクロＣＴスキャンにより、内臓脂肪量を測定した。測定は３ＤマイクロＸ線ＣＴ「Ｒ_ｍＣＴ２」（株式会社リガク製）を用いて行なった。内臓脂肪量の測定は、腹腔に限定され、腹腔の初期点は擬鎖骨から肛門に設定した。結果を図５および図１０に示す。ｎｏｎ−ＤＩＯ群およびＤＩＯ群と比較して、図５は（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群の結果であり、図１０は（ＤＩＯ＋ＬＡ）群および（ＤＩＯ＋ＨＡ）群の結果である。
【００３１】
（ｅ）肝臓組織のオイルレッドＯ染色
脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を確認するため、オイルレッドＯ染色を以下の方法で行なった。
内臓脂肪量測定後のゼブラフィッシュの腹壁を剥離して、ホルムアルデヒド溶オイルレッドＯ染色を行なった。４００倍の顕微鏡で可視化した結果を図６および図１１の左側にそれぞれ示す。ｎｏｎ−ＤＩＯ群およびＤＩＯ群と比較して、図６は（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群の結果であり、図１１は（ＤＩＯ＋ＬＡ）群および（ＤＩＯ＋ＨＡ）群の結果液で固定した。固定された肝臓組織を単離後凍結により切片を得て、常法によりである。また、図６および図１１の結果を画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ Ｊで赤色の面積を測定する方法により定量化した結果を同時に図６および図１１の右側に棒グラフでそれぞれ示す。棒グラフ内の数値はピクセル数を表す。
【００３２】
（ｆ）ＲＮＡの抽出と定量的リアルタイムＰＣＲ
動物の体内において脂質代謝に関与する酵素群の遺伝子の発現量を定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。結果を図１２および図１３に示す。図１２は肝臓からのトータルＲＮＡの結果であり、図１３は内臓脂肪組織からのトータルＲＮＡの結果である。ｍＲＮＡ発現量はＤＩＯ群におけるｍＲＮＡ発現量を基準としてその相対値で表した。
【００３３】
ゼブラフィッシュは、開腹後直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）３ｍｌを含む試験管に移されて４℃で保存された。肝臓および内臓脂肪組織を微細な鉗子を用いて解剖してＲＮＡ抽出を行なった。肝臓からのトータルＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて抽出し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。内臓脂肪組織からのトータルＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ（東洋紡社製）を用いてＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライド  バイオシステム社）およびＡＢＩ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｒｙｓｔｅｍ（アプライド  バイオシステム社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより遺伝子の発現量を測定した。
【００３４】
測定した遺伝子は、脂肪酸デノボ合成のための重要な２つの酵素である脂質合成酵素（ＦＡＳＮおよびＡＣＣ）の遺伝子、Ｃ４からＣ１２直鎖アシル−ＣｏＡｓへのβ酸化の初期反応の触媒となるミトコンドリアβ酸化酵素（ＡＣＤＡＭ）の遺伝子、長鎖脂肪酸のβ酸化に必要とされているペルオキシソームβ酸化酵素（ＡＣＯＸ１）の遺伝子、β酸化を制御する核内受容体蛋白質（ＰＰＡＲα）の遺伝子、レプチンシグナル伝達を抑制する蛋白質（ＳＯＣＳ３）の遺伝子、抗脂肪分解作用を有する蛋白質（ＡＤＩＰＯＱ）の遺伝子、１８Ｓ  リボソーム小サブユニットＲＮＡ（１８Ｓ ｒＲＮＡ）である。
遺伝子増幅に用いたフォーワードプライマーおよびリバースプライマーの配列をＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号と共に表１に示す。
ターゲット遺伝子のＣｔ値は１８Ｓ ｒＲＮＡに対して規準化し、ΔＣｔ法により計算した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
上記評価試験の結果、柚子の外果皮および抽出粕が給餌された肥満モデルゼブラフィッシュは、給餌されなかった肥満モデルゼブラフィッシュ（ＤＩＯ群）に対して高い抗肥満効果を示した。
図２に示すように、（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群は、ＤＩＯ群よりも明らかに体重増加が少なかった。ＤＩＯ群と対比して、特に（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群はスチューデントのｔ分布による統計的検定において５％の有意水準で有意であった。なお、肥満誘導を行なわないｎｏｎ−ＤＩＯ群は１％の有意水準で有意であった。＊印は５％、＊＊は１％の有意水準をそれぞれ表す。
【００３７】
図３に示すように、（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群は、ＤＩＯ群よりも明らかに血中中性脂肪濃度が少なかった。ＤＩＯ群と対比して、特に（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群およびｎｏｎ−ＤＩＯ群はスチューデントのｔ分布による統計的検定において５％の有意水準で有意であった。
【００３８】
図２および図３の結果より、柚子の外果皮および抽出粕は、ゼブラフィッシュの肥満を抑制していることが分かった。なお、図４に示すように、ＤＩＯ群、（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群との間で給餌実験中のアルテミア数に変化が見られないことから、ほぼ同量の給餌がなされ、ゼブラフィッシュの食欲抑制がなかった。また、摂食行動における目視観察において、ゼブラフィッシュに顕著な異常や、その行動に大きな違いはなかった。
【００３９】
図５に示すように、柚子の外果皮または抽出粕を含む餌が与えられたゼブラフィッシュの内臓脂肪量はＤＩＯ群よりも明らかに減少していた。ＤＩＯ群と対比して、特に（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群はスチューデントのｔ分布による統計的検定において５％の有意水準で有意であった。
【００４０】
図６に示すように、上記内臓脂肪量はＤＩＯ群と対比して、肝臓における脂質蓄積を大幅に減少させた。
【００４１】
柚子の外果皮または抽出粕による脂質沈着を抑制する効果は、柚子に豊富に含まれるオーラプテンに起因するのではないかとの予測の基に、オーラプテンを配合した餌を給餌した（ＤＩＯ＋ＬＡ）群および（ＤＩＯ＋ＨＡ）群について、上記柚子の外果皮および抽出粕と同様の実験を行なった。図７〜図１１に示すように、オーラプテンを配合したことにより、ＤＩＯ群に比較して、脂質沈着を抑制する効果は僅かに見られたが、柚子の外果皮および抽出粕のように統計的に有意な結果は得られなかった。
柚子は、オーラプテン以外にも、食物繊維、フェノール、フラボノイドやカロチノイドなど異なる化学的および薬理学的機能を持ついくつかの成分を含有している。柚子の外果皮または抽出粕の脂質沈着を抑制する効果は、これら成分の相乗的な結果と考えられる。
【００４２】
本発明の抗肥満作用を更に追求すべく、遺伝子解析により脂肪分解関連遺伝子群の発現が活性化されているかどうかについて評価した。
図１２に示すように、ＤＩＯ群と対比して、（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群および（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｏｍａｃｅ）群の６週間給餌後の肝臓における遺伝子群は、脂肪分解関連遺伝子群の発現が活性化されていた。特に（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群は、ミトコンドリア脂肪酸β酸化経路に関与するＡＣＡＤＭ、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化経路に関与するＡＣＯＸ１、β酸化を制御する核内受容体蛋白質であるＰＰＡＲα遺伝子の発現量が統計的にも有意であった。このように、柚子の外果皮または抽出粕は脂肪酸β酸化に密接に関連しており、脂質沈着を抑制する効果が実証された。
【００４３】
図１３に示すように、ＤＩＯ群と対比して、（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群の６週間給餌後の内臓脂肪組織における遺伝子群は、ＡＣＯＸ１、抗脂肪分解作用を有する蛋白質であるＡＤＩＰＯＱのｍＲＮＡ発現量が増加し、その増加量は統計的にも有意であった。
以上、遺伝子解析において、（ＤＩＯ＋ｙｕｚｕ ｐｅｅｌ）群は、肝臓および内臓脂肪組織における脂質蓄積の減少をもたらすことが実証された。
【００４４】
上記実験ではゼブラフィッシュを用いたが、ゼブラフィッシュは、リポタンパク質による脂肪およびコレステロールの血漿中での輸送、および、内臓、皮下、筋肉内含脂肪細胞内へのトリアシルグリセロール（ＴＧ）としての貯蔵が哺乳類と類似しているため、人間やマウスなどゼブラフィッシュと同じ研究成果が得られることが知られており、柚子の外果皮または抽出粕投与による上記効果は養殖魚だけではなく、ブロイラーや豚、牛などの家畜にも適用できる。
適用にあたり、柚子の外果皮または抽出粕を含むことで、脂質の生体内沈着抑制剤を含む飼料とすることができる。
飼料としては、柚子の外果皮または抽出粕を直接養殖魚に与えてもよいが、魚粉、小麦粉、馬鈴薯澱粉、酵母、ミネラル、ビタミン類、アミノ酸などを併用することができる。
【００４５】
本発明の飼育方法において、過剰給餌により肥満誘導を行なう工程は、高タンパク質、高脂質の飼料、例えばカゼイン、牛脂やラードを主成分とする餌等を過剰に給餌することにより、肥満誘導を行なう工程である。肥満誘導された、例えば養殖魚に対して、上記過剰給餌をしながら、上記本発明の飼料を給餌する工程を備えることにより、血中中性脂肪濃度および内臓脂肪量を減少させた養殖魚とすることができる。
【００４６】
また、本発明の他の飼育方法は、飼育対象動物の脂肪量を所定の脂肪量に調節することができる方法である。この方法において、飼育対象動物の脂肪量をモニタリングするモニタリング工程としては血液検査などを行なう工程が挙げられる。この血液検査より脂肪量が目的とする脂肪量より多い場合は、給餌工程において上記本発明の飼料の給餌量をそれまでの給餌量増加する。また、脂肪量が目的とする脂肪量より多い場合は、給餌工程において上記本発明の飼料の給餌量をそれまでの給餌量より減少するか、または全体の給餌量自体を少なくする。このようにして、市場ニーズに合った養殖動物の飼育方法が得られる。
【実施例】
【００４７】
三重県内の真鯛養殖場において、肥満誘導された真鯛に、柚子の外果皮を乾燥粉末化して、粉末配合飼料に４．５質量％配合して、３匹の真鯛にそれぞれ同量ずつ給餌した。給餌開始後２週間および４週間後の養殖魚の脂肪量を測定した。なお、脂肪量は内臓を魚体から取り出した後、手作業で内臓器官と脂肪をわけて、当該脂肪の重量を測定した。対照は、柚子の外果皮を含まない粉末配合飼料のみを実施例と同量ずつ３匹の真鯛にそれぞれ給餌した。その結果、平均体長約３３ｃｍ 、平均体重約１１００ｇの真鯛の脂肪率は、柚子の外果皮を配合した群で２週間給餌後３．６質量％、４週間給餌後１．７６質量％であり、対照群で２週間給餌後６．５質量％、４週間給餌後５．０４質量％であった。柚子の外果皮配合飼料を給餌した真鯛の脂肪率は対照群に比較して減少し、脂肪量を減少させた筋肉質の真鯛を養殖することができた。
【００４８】
なお、上記説明では乾燥粉末化として冷凍乾燥法を用いたが、この方法以外にも、通常の熱乾燥、真空乾燥など用いてもよい、脂質の生体内沈着抑制剤の形態として粉末、粒状以外にも、抽出物のエキスを含む液状でもよい。さらに、飼育動物の種類によって給餌に耐えられるのであれば、乾燥工程をはぶいて、柑橘類の果汁部分を除いた外果皮などを、飼育動物の状態に応じて、量を制御しながら餌に混入することも本発明の範囲である。また、給餌の方法として、通常の餌に混在させる期間を設ける方法で説明したが、通常の餌と、脂質の生体内沈着抑制剤のみを定期的に入れ替える給餌法としてもよいし、当初から通常の餌に混在させ、肥満状態を見ながら、徐々に脂質の生体内沈着抑制剤を増やし、血液検査などのモニターにより、脂質の生体内沈着抑制剤の量を制御するのも、本発明の応用の範囲である。上記したように血液検査などのモニターにより、脂質の生体内沈着抑制剤の量を制御することで、ユーザや市場の好みに応じた肉質の養殖動物や魚類を作ることもできる。すなわち、本発明の飼育方法を用いれば、飼育動物の脂肪量をコントロールすることができる。例えば冬場は脂肪量の多い養殖動物を、夏場は脂肪量の少ない養殖動物を提供する等、市場ニーズに合った養殖動物の飼育方法が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の脂質の生体内沈着抑制剤は、天然物である柚子の外果皮または抽出粕の投与であるので、安全に多くの動物に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【配列表】
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