(57)【要約】【課題】修飾核酸などの生物学的部分を細胞に送達して非ヒト脊椎動物におけるタンパク質発現を誘導、低減又は調節するための製剤、組成物、キット及び方法を提供する。【解決手段】目的のポリペプチドを、それを必要としている非ヒト脊椎動物対象の細胞において産生する方法は、目的のポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。上記目的のポリペプチドは、グレリンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリペプチドを、それを必要としている非ヒト脊椎動物対象の細胞において産生する方法であって、前記目的のポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記目的のポリペプチドは、グレリンである、方法。
【請求項２】
前記医薬組成物が製剤化された製剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記製剤が、生理食塩水製剤又は脂質製剤から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記製剤が、静脈内、筋肉内、皮下、及び局所からなる群から選択される経路によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記医薬組成物が、１日１回、１日２回、１日３回、隔日、３日毎、毎週、隔週、３週間毎、毎４週、及び毎月からなる群から選択されるスケジュールで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記医薬組成物が複数回投与により投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト脊椎動物が、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ヘラジカ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、マウス、ラバ、ブタ、ウサギ、ラット、トナカイ、ヒツジ、水牛、ヤク、及びニワトリからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
目的の第１のポリペプチドを、それを必要としている非ヒト脊椎動物対象の細胞において産生するためのキットであって、前記目的の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含み、前記目的の第１のポリペプチドは、グレリンであるキット。
【請求項１０】
目的の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記目的の第２のポリペプチドが前記目的の第１のポリペプチドと異なる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記非ヒト脊椎動物が、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ヘラジカ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、マウス、ラバ、ブタ、ウサギ、ラット、トナカイ、ヒツジ、水牛、ヤク、及びニワトリからなる群から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記核酸が、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト脊椎動物用の修飾核酸分子及び／又は増強核酸分子を設計、調製、製造及び／又は製剤化するための組成物、方法、プロセス、キット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用物質及び／又は生物活性物質などの活性薬剤を非ヒト脊椎動物、特に家畜に投与する方法及び装置は、経口投与用及び注射用並びにポアオン製剤及びスポットオン製剤を含む手段による局所投与用の錠剤、溶液を含め、当該技術分野において公知である。反芻動物への活性薬剤の投与では、カプセルなどの製剤が、第一胃に置かれて保持されるように適合されている。こうした製剤は、種々の期間にわたる第一胃への治療用物質及び／又は生物活性物質の徐放を提供する。かかる製剤は、胃腸管からの吸収が可能な物質の投与に限り適切である。しかしながら、かかる製剤は、治療剤及び／又は生物活性剤が１種又は複数の動物に対して潜在的に毒性を有し得る場合、抗寄生虫薬又は抗生物質などの薬剤の投与によって１種又は複数の動物に治療剤及び／又は生物活性剤に対する耐性が生じ得るか、又は治療剤及び／又は生物活性剤が１種又は複数の動物における生理学的状態の変化を誘発して当該の１種又は複数の動物の健康（ウェルビーイング）に潜在的に影響を与え（ｃｈａｒｍｉｎｇ）得る場合、望ましくない。
【０００３】
現在、獣医学適用におけるタンパク質ベースの投与治療薬、例えば成長因子、サイトカイン及び抗体は、免疫原性、効力及びコストに関する懸念が高まっている。例えば、導入されるＤＮＡが、いくらかの頻度で宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、宿主細胞のゲノムＤＮＡに変化及び／又は損傷をもたらし得る。或いは、細胞に導入される異種デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が娘細胞に（その異種ＤＮＡが染色体に組み込まれたか否かを問わず）又は子孫に遺伝し得る。
【０００４】
加えて、正確に送達され、且つ損傷又は宿主ゲノムへの組込みがないとしても、コードされたタンパク質が作られるまでには、複数の工程が生じなければならない。ＤＮＡは細胞内に入った後、核に輸送され、そこでＲＮＡに転写されなければならない。次にＤＮＡから転写されたＲＮＡが細胞質に侵入し、そこでタンパク質に翻訳されなければならない。投与されたＤＮＡからタンパク質に至るまでのこれらの複数のプロセシング工程により、機能タンパク質が産生されるまでの時間に遅れが生じるのみならず、各工程は、細胞にエラー及び損傷が起こる機会を意味する。さらに、ＤＮＡは高頻度で細胞に侵入しても発現しないか、又は妥当な速度若しくは濃度で発現しないため、細胞においてＤＮＡ発現を達成するのは難題であることが知られている。これは、ＤＮＡが一次細胞又は修飾された細胞株に導入される場合に、特に問題となり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、目的のポリペプチドをコードする（例えば、修飾ｍＲＮＡ又は修飾核酸）とともに、当該技術分野における問題の１つ以上を回避する構造的及び／又は化学的特徴を有する核酸ベースの化合物又はポリヌクレオチドを提供することにより、これらの懸念を解消する。上記構造的及び／又は化学的特徴とは、例えば、構造的及び機能的完全性を保持しつつ核酸ベースの治療薬の製剤化及び送達を最適化すること、発現の閾値を克服すること、発現率、半減期及び／又はタンパク質濃度を改善すること、タンパク質局在を最適化すること、並びに、免疫応答及び／又は分解経路などの有害な生体反応を回避することに有用な特徴である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、修飾核酸又は増強核酸分子を設計、調製、製造及び／又は製剤化するための、組成物、方法、プロセス、キット及び装置が記載される。
本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、この説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、目的のポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することにより、必要としている非ヒト脊椎動物対象の細胞、組織又は体液において目的のポリペプチドを産生する方法を提供する。医薬組成物は、限定はされないが、生理食塩水などの中に製剤化されても、及び／又は脂質製剤であってもよい。製剤は、限定はされないが、静脈内、筋肉内、皮下及び局所などの経路により投与され得る。製剤は、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日毎、毎週、隔週、３週間毎、毎４週、及び毎月から選択されるスケジュールで投与され得る。さらに、製剤は頻回投与により投与され得る。
【０００８】
一実施形態では、非ヒト脊椎動物は、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ヘラジカ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、マウス、ラバ、ブタ、ウサギ、ラット、トナカイ、ヒツジ、水牛、ヤク、シロハラインコ、カナリア、アマサギ、ニワトリ、オウミガメインコ、コッカトゥー、コニュア、ハト（ｄｏｖｅ）、アヒル、フィンチ、ガチョウ、ラブバード、コンゴウインコ、インコ、オウム、パロットレット、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ピオヌス、ナナクサインコ、シチメンチョウ、イグアナ、トカゲ、ヘビ、ウミガメ、カメ、アシナシイモリ、カエル、イモリ、サンショウウオ、及びヒキガエルから選択され得る。さらなる実施形態において、非ヒト脊椎動物は、トランスジェニック、ノックイン及び／又はノックアウトマウスであってよいマウスである。
【０００９】
一実施形態では、目的のポリペプチドは、限定はされないが、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液又は尿道球腺液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸水及び腹水、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水、膵液、副鼻洞腔の洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ  ｃａｖｉｔｙ）液、及び臍帯血などの体液に提供され得る。
【００１０】
一実施形態では、目的のポリペプチドは、限定はされないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織、胸腺及び筋肉などの組織に提供され得る。
本発明で考慮される目的のポリペプチドとしては、限定はされないが、インスリン、ネコインターフェロン、エリスロポエチン、シクロスポリン、チモシンβ−４、アルギニンバソプレシン、ウシソマトトロピン、オキシトシン、グレリン、ゴナドレリン、妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ＥＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧＲＨａ）、膵酵素、Ｃｒｅリコンビナーゼ、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、ＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦを挙げることができる。
【００１１】
一実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の修飾を有する核酸を含む。これらの修飾と
しては、限定はされないが、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、必要としている非ヒト脊椎動物の細胞、組織及び／又は体液において目的の第１のポリペプチドを産生するためのキットを提供する。さらなる実施形態において、このキットは、目的の第２のポリペプチドをコードし得る第２の核酸を含み得る。目的の第２のポリペプチドは目的の第１のポリペプチドと同じであっても、又は異なってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
治療薬、診断用薬、試薬には、及び生物学的アッセイには、インビボ又はエキソビボのいずれでも、細胞の内部に核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）を送達すること、例えば核酸の細胞内翻訳及びコードされるポリペプチドの産生を生じさせることが、大いに有益である。特に、非ヒト脊椎動物に対する非組込み核酸の送達及び機能が重要である。
【００１４】
本明細書には、非ヒト脊椎動物対象において目的の生物学的部分として機能することが可能なポリペプチドをコードする核酸の設計、調製、製造及び／又は製剤化のための組成物（医薬組成物を含む）及び方法が提供される。本明細書に記載されるとおり、このような核酸は、それが導入される細胞集団の自然免疫活性を低下させ、ひいては当該の細胞集団におけるタンパク質産生効率を高める能力を有する。
【００１５】
修飾核酸
本発明は、１つ以上の修飾ヌクレオシド（「修飾核酸」と称される）を含むｍＲＮＡなどのＲＮＡを含めた核酸を提供し、これは、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘発することがないなどの有用な特性を有する。これらの修飾核酸は、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内保持、及び接触した細胞の生存度を増強するとともに、低下した免疫原性を備えるため、これらの特性を有するこれらの核酸は、本明細書では「増強核酸」と称される。
【００１６】
用語「核酸」は、その広義の意味において、オリゴヌクレオチド鎖に包含されるか、又は包含されることができる任意の化合物及び／又は物質を含む。本発明において用いられる例示的な核酸としては、限定はされないが、本明細書に詳細に記載される、ＤＮＡ、メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＲＮＡ、それらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重へリックス形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター等の１つ以上が挙げられる。
【００１７】
核酸に対する修飾
翻訳可能領域と、１つ、２、又は３つ以上の異なるヌクレオシド修飾とを含む修飾核酸が提供される。一部の実施形態では、修飾核酸は、対応する非修飾核酸と比べて、その核酸が導入される細胞における分解の低下を示す。例示的な核酸としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＨＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、又はこれらのハイブリッドが挙げられる。好ましい実施形態において、修飾核酸はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。本明細書に記載されるとおり、本発明の核酸は、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導することがない。
【００１８】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジンを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−
メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、及び４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジンを含む。
【００２０】
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンを含む。
【００２１】
具体的な実施形態において、修飾ヌクレオシドは、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン又は５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−プソイドウリジンである。
【００２２】
【化１】
2015193649.tif 000002
【００２３】
α−チオ置換リン酸部分の提供により、非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性が付与される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡはヌクレアーゼ耐性が増加し、そのため細胞環境における半減期が長くなる。ホスホロチオエート結合型の核酸はまた、細胞の自然免疫分子の結合／活性化が弱まるため、自然免疫応答を低下させることも予想される。
【００２４】
特定の実施形態では、例えばタンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合に、細胞に導入される修飾核酸は細胞内で分解することが望ましい。従って、本発明は、分解ドメインを含む修飾核酸を提供し、この分解ドメインは、細胞内部で標的化された形で作用を受けることが可能である。
【００２５】
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−ア
ザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンを含む。
【００２６】
修飾核酸の任意選択の構成成分
さらなる実施形態において、修飾核酸は他の任意選択の構成成分を含んでもよく、それらは一部の実施形態で有益となり得る。それらの任意選択の構成成分としては、限定はされないが、非翻訳領域、コザック配列、イントロンヌクレオチド配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、キャップ及びポリＡテールが挙げられる。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／又は３’ＵＴＲが提供されてもよく、ここでは一方又は両方が、独立して、１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。かかる実施形態において、ヌクレオシド修飾は翻訳可能領域にも存在し得る。また、コザック配列を含む核酸も提供される。
【００２７】
加えて、核酸から切り出されることが可能な１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写はされるが翻訳はされない。５’ＵＴＲは転写開始部位を始端として開始コドンまで続くが、但し開始コドンは含まない；一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳の点でＵＴＲが果たす調節的な役割に関して、一連の証拠が増えつつある。ＵＴＲの調節的な特徴を本発明の修飾核酸に取り込むことにより、分子の安定性を増加させることができる。また、この特定の特徴を取り込むと、修飾核酸が誤って望ましくない器官部位に誘導された場合における転写物の制御されたダウンレギュレーションを確実にすることもできる。
【００２８】
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外移行に関わることでｍＲＮＡの安定性を増加させ、及びｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（Ｃａｐ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰがポリ（Ａ）結合タンパク質と会合することによる成熟した環状ｍＲＮＡ種の形成を介して、細胞におけるｍＲＮＡ安定性及び翻訳コンピテンシーに関与する。このキャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの間の５’近位イントロン除去の除去を補助し得る。
【００２９】
内因性ｍＲＮＡ分子は５’末端がキャッピングされることができ、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端の転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合が生じ得る。この５’−グアニル酸キャップは次にメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基が生じ得る。ｍＲＮＡの５’末端の終端及び／又は終端前の転写ヌクレオチドのリボース糖も、場合により２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’−デキャッピングでは、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子が分解の標的となり得る。
【００３０】
ＩＲＥＳ配列
さらに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む核酸が提供される。ＩＲＥＳは唯一のリボソーム結合部位として作用することもでき、又はｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の一つとして機能することもできる。１つ以上の機能リボソーム結合部位を含むｍＲＮＡは、独立してリボソームにより翻訳されるいくつかのペプチド又はポリペプチドをコードし得る（「多シストロン性ｍＲＮＡ」）。核酸がＩＲＥＳを含んで提供される場合、さらに場合により第２の翻訳可能領域が提供される。本発明により用いられ得るＩＲＥ
Ｓ配列の例としては、限定なしに、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）又はコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
【００３１】
ポリＡテール
ＲＮＡプロセシングの間、安定性を増加させるため、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写後直ちに、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次にポリＡポリメラーゼがアデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、１００〜２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。
【００３２】
概して、本発明のポリＡテールの長さは３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡテールは３５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド又はそれより長い）。
【００３３】
これに関連してポリＡテールは、長さが修飾核酸と比べて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％長くてもよい。ポリＡテールはまた、それが属する修飾核酸に対する割合として設計されてもよい。これに関連して、ポリＡテールは、修飾核酸の全長又はポリＡテールを差し引いた修飾核酸の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％又はそれ以上であってもよい。
【００３４】
目的のポリペプチド
本発明は、非ヒト脊椎動物に対する治療用途の目的のポリペプチド又はその断片をコードする修飾核酸及び増強核酸を提供する。目的のポリペプチドとしては、限定はされないが、全ポリペプチド、複数のポリペプチド又はポリペプチドの断片を挙げることができ、これらは独立して、１つ以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片又は前述のいずれかの変異体によりコードされ得る。本明細書で使用されるとき、用語「目的のポリペプチド」は、本発明の修飾核酸及び増強核酸によりコードされるように選択される任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合にペプチド結合によって互いに連結されるアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズのタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ある場合には、コードされるポリペプチドは約５０アミノ酸より小さく、このときポリペプチドはペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、又は少なくとも５アミノ酸残基長であり得る。従って、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同性、オルソログ、パラログ、断片及びその他の前述の均等物、変異体、及び類似体が含まれる。ポリペプチドは単一の分子であってもよく、又は多分子複合体、例えば二量体、三量体若しくは四量体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖又は多鎖ポリペプチド、例えば抗体又はインスリンを含んでもよく、且つ会合又は連結されてもよい。最も一般的には、ジスルフィド結合は多鎖ポリペプチドで見られる。用語ポリペプチドはまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用し得る。
【００３５】
用語「ポリペプチド変異体」は、アミノ酸配列がその天然配列又は参照配列と異なる分
子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然配列又は参照配列と比較したとき、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。通常、変異体は、天然配列又は参照配列と少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、天然配列又は参照配列と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同）であり得る。
【００３６】
一部の実施形態では、「変異模倣体」が提供される。本明細書で使用されるとき、用語「変異模倣体」は、活性化配列を模倣し得る１つ以上のアミノ酸を含むものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−スレオニン及び／又はホスホロ−セリンに対する模倣体として機能し得る。或いは、変異模倣体は、模倣体を含む失活又は不活性化産物をもたらしてもよく、例えば、フェニルアラニンはチロシンに対して不活性化置換として作用し得る；又はアラニンはセリンに対して不活性化置換として作用し得る。
【００３７】
「相同性」は、それがアミノ酸配列に適用されるとき、配列をアラインメントし、且つ必要であればギャップを導入して、最大パーセント相同性が達成されるようにした後の、第２の配列のアミノ酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸配列における残基の割合として定義される。アラインメントの方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知されている。相同性は同一性パーセントの計算に依存するが、値は、その計算に導入されるギャップ及びペナルティによって異なり得ることが理解される。
【００３８】
「相同体」とは、それがポリペプチド配列に適用されるとき、第２の種の第２の配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、親又は出発ポリペプチドの特性の１つ以上をなお維持する１つ以上のアミノ酸変化、例えばアミノ酸残基の置換、付加又は欠失だけ異なるポリペプチド変異体を含むことが意図される。
【００３９】
本発明は、変異体及び誘導体を含めたポリペプチドベースの数種類の組成物を企図する。これらには、置換、挿入、欠失及び共有結合性変異体及び誘導体が含まれる。用語「誘導体」は、用語「変異体」と同義語として用いられるが、概して、参照分子又は出発分子と比べて何らかの形で修飾された及び／又は変化した分子を指す。
【００４０】
従って、参照配列に対して置換、挿入及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を含むポリペプチド、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列をコードする修飾核酸及び増強核酸は、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列タグ又はアミノ酸、例えば１つ以上のリジンを、本発明のペプチド配列に（例えば、Ｎ末端側又はＣ末端側に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの精製又は局在化に用いられ得る。リジンを用いると、ペプチド溶解度を増加させ、又はビオチン化を可能にすることができる。或いは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ端側及びアミノ端側領域に位置するアミノ酸残基は、場合により欠失させて、トランケート配列を提供してもよい。或いは、例えば、可溶性の、又は固体支持体と連結されたより大きい配列の一部としての配列の発現など、配列の用途に応じて特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端又はＮ末端残基）を欠失させてもよい。
【００４１】
「置換変異体」は、ポリペプチドに関する場合、天然又は出発配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている単一置換であってもよく、又は同じ分子において２つ以上のアミノ酸が置換されている多重置換であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、配列中に通常存在するアミノ酸を同様のサイズ、電荷、又は極性の異なるアミノ酸に換える置換を指す。保存的置
換の例としては、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基を別の非極性残基の代わりとする置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びグリシンとセリンとの間など、ある極性（親水性）残基を別のものの代わりとする置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニン又はヒスチジンなどの塩基性残基を別のものの代わりとする置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸などのある酸性残基を別の酸性残基の代わりとする置換が、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基をシステイン、グルタミン、グルタミン酸又はリジンなどの極性（親水性）残基の代わりとする置換及び／又は極性残基を非極性残基の代わりとする置換が挙げられる。
【００４３】
「挿入変異体」は、ポリペプチドに関する場合、天然又は出発配列の特定の位置にあるアミノ酸に直接隣接して挿入された１つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接する」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基又はα−アミノ官能基のいずれかに結合されていることを意味する。
【００４４】
「欠失変異体」は、ポリペプチドに関する場合、天然又は出発アミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域に１つ以上のアミノ酸を有し得る。
【００４５】
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドに関する場合、タンパク質性又は非タンパク質性有機誘導体化剤による天然又は出発タンパク質の修飾、及び／又は翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、標的とされるタンパク質のアミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応する能力を有する有機誘導体化剤と反応させることによるか、又は選択された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾のハーネシング機構により導入される。得られる共有結合誘導体は、生物学的活性、免疫測定法、又は組換え糖タンパク質のイムノアフィニティー精製のための抗タンパク質抗体の調製に重要な残基の同定を目的とするプログラムにおいて有用である。かかる修飾は当該技術分野の通常の技術の範囲内であり、必要以上に実験を行うことなく実施される。
【００４６】
特定の翻訳後修飾は、組換え宿主細胞が発現したポリペプチドに作用する結果である。グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、高頻度で翻訳後に脱アミド化されて対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。或いは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明において産生されるポリペプチドに存在し得る。
【００４７】
他の翻訳後修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）著、「タンパク質：構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．）、サンフランシスコ、７９〜８６頁（１９８３年））。
【００４８】
特徴のいずれかが、本発明の修飾核酸及び増強核酸によりコードされるべきポリペプチドの所望の構成成分として同定又は定義された後、それらの特徴のうちいくつかの操作及び／又は修飾のいずれかを、移動、交換、反転、欠失、ランダム化又は複製により実施し得る。さらに、特徴の操作は、本発明の分子に対する修飾と同じ結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメインの欠失が関わる操作は、まさに完全長未満の分子をコードするように核酸を修飾したような分子の長さの変化をもたらし得る。
【００４９】
修飾及び操作は、限定はされないが部位特異的突然変異誘発などの、当該技術分野において公知の方法により達成することができる。得られる修飾分子は、次に、本明細書に記載されるもの又は当該技術分野において公知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイなどの、インビトロ又はインビボアッセイを用いて活性について試験され得る。
【００５０】
当業者により認識されるとおり、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、この発明の目的のポリペプチドの範囲内にあるものと見なされる。例えば、本明細書には、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸長又は１００アミノ酸長より長い参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸残基だけ短いが、他は同一であるポリペプチド配列を意味する）が提供される。別の例では、本明細書に記載される配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、又は約１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を、本発明において利用することができる。特定の実施形態では、本発明において利用されるポリペプチドは、本明細書に提供又は参照される配列のいずれかに示されるとおりの突然変異を２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上を含む。
【００５１】
一実施形態では、目的のポリペプチドは、抗体、小分子、アゴニスト、アンタゴニスト、細胞内、細胞間及び／又は細胞外タンパク質をコードし、それを結合し、それを会合し、及び／又はそれと相互作用し得る。非限定的な例としては、受容体、酵素、チャネル、ポア、足場タンパク質、細胞骨格タンパク質、転写因子、ヒストン、脂質、例えばリン脂質、糖脂質、脂肪酸、ステロイド、コレステロール及びコレステロール由来のホルモン、抗体、小胞、エンドソーム、エキソソーム、シナプス小胞、シグナル伝達分子、例えばジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトールリン酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、リポキシン、成長因子、サイトカイン及び神経伝達物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、窒素含有塩基、糖類、グリカン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、多糖類、リポ多糖、インテグリン、カドヘリン及び代謝産物が挙げられる。
【００５２】
コードされるポリペプチド
本発明は、目的のポリペプチドをコードし得る修飾核酸及び増強核酸を提供する。目的のポリペプチドは、限定はされないが、様々な疾患及び障害の治療及び／又は予防における非ヒト脊椎動物用の治療剤としての用途など、本明細書に記載されるとおり、様々な用途を有する。コードされる目的のポリペプチドは、非ヒト脊椎動物の細胞、組織及び／又は体液に位置し得る。体液としては、限定はされないが、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液又は尿道球腺液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸水及び腹水、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便液、膵液、副鼻洞腔の洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ  ｃａｖｉｔｙ）液、及び臍帯血を挙げることができる。コードされる目的のポリペプチドは、限定はされないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織、胸腺及び筋肉などの組織に観察され得る。
【００５３】
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、様々なポリペプチド、その変異体及び／又は機能断片をコードし得る。本発明で考慮されるコードポリペプチドの非限定的な例としては、インスリン、ネコインターフェロン、エリスロポエチン、シクロスポリン、チモシンβ−４、アルギニンバソプレシン、ウシソマトトロピン、オキシトシン
、グレリン、ゴナドレリン、妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ＥＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧＲＨａ）、膵酵素、Ｃｒｅリコンビナーゼ、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、ＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦが挙げられる。
【００５４】
インスリン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、インスリンポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。インスリンをコードする核酸は、糖尿病の治療及び／又は予防に有用であり得る。インスリンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、イヌ及びネコが挙げられる。
【００５５】
ネコインターフェロン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ネコインターフェロンポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。ネコインターフェロンをコードする核酸は、主としてイヌに感染する伝染性ウイルスであるイヌパルボウイルスの治療及び／又は予防に有用であり得る。このウイルスは、イヌからイヌ接触により、又は汚染された糞便との接触を介して伝播し得る。修飾核酸又は増強核酸はまた、汚染された糞便、水入れ、餌入れ及び／又は装身具との接触により伝染し得るネコ伝染性腹膜炎の治療においても有用であり得る。ネコインターフェロンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、イヌ及びネコが挙げられる。現在、タンパク質ベースのネコインターフェロン治療薬としては、ビルバゲン（登録商標）・オメガ（Ｖｉｂｒａｇｅｎ  Ｏｍｅｇａ）（ビルバック（Ｖｉｒｂａｃ））が挙げられる。
【００５６】
エリスロポエチン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ヒトエリスロポエチンポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。エリスロポエチンをコードする核酸は、慢性腎不全又は腎疾患の治療及び／又は予防に有用であり得る。この疾患は高齢のネコによく見られ、多くの場合に進行性疾患であり、進行速度のばらつきには大きな幅があり得る。エリスロポエチンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ネコが挙げられる。
【００５７】
シクロスポリン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、シクロスポリンポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。シクロスポリンは１１アミノ酸の環状タンパク質であり、非リボソーム酵素のシクロスポリンシンターゼを使用して合成され得る。シクロスポリンをコードする核酸は、イヌにおけるアレルギー性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎の治療及び／又は予防に有用であり得る。シクロスポリンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、イヌが挙げられる。現在、タンパク質ベースのシクロスポリン治療薬としては、アトピカ（登録商標）（Ａｔｏｐｉｃａ）（ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））が挙げられる。
【００５８】
チモシンβ−４
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ウマチモシンβ−４ポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。チモシンβ−４は筋量の増加及び赤血球の増加を促進し得るため、チモシンβ−４をコードする核酸は、非ヒト脊椎動物におけ
る脱力の治療及び／又は予防に有用であり得る。チモシンβ−４をコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ウマが挙げられる。チモシンβ−４を含有する治療薬としては、ＴＢ−５００（ＤＢジェネティクス（ＤＢ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））が挙げられる。
【００５９】
アルギニンバソプレシン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、アルギニンバソプレシンポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。ウシアルギニンバソプレシンのプロリンリッチなＣ末端部分を用いて畜牛の白血症（ウシ白血症及びウシ白血病としても知られる）を治療及び／又は予防し得る。
【００６０】
ウシソマトトロピン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ウシソマトトロピンポリペプチド、その変異体又は機能断片に対するものであり得る。ウシソマトトロピンをコードする核酸は、乳牛の産乳量を増加させるのに有用であり得る。ウシソマトトロピンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、雌ウシが挙げられる。ウシソマトトロピンを含有する治療薬としては、ポジラック（Ｐｏｓｉｌａｃ）（エランコアニマルヘルス（Ｅｌａｎｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ））が挙げられる。
【００６１】
オキシトシン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、オキシトシンポリペプチド、その変異体又は機能断片に対するものであり得る。オキシトシンをコードする核酸は、乳牛の産乳量の増加において、及び急産の補助として、有用であり得る。オキシトシンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、雌ウシが挙げられる。オキシトシンの精製溶液は市販されている（ベトテク（ＶｅｔＴｅｋ））。
【００６２】
グレリン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ニワトリグレリンポリペプチド、その変異体又は機能断片に対するものであり得る。グレリンをコードする核酸は、ニワトリにおいて血漿中成長ホルモン濃度及びコルチコステロン値を増加させるのに有用であり得る。オキシトシンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ニワトリが挙げられる。
【００６３】
ゴナドレリン
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ゴナドレリンポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。ゴナドレリンをコードする核酸は、卵胞嚢胞、並びに排卵及び受胎障害の治療及び／又は予防に有用であり得る。ゴナドレリンをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ウシ及びウサギが挙げられる。現在、タンパク質ベースのゴナドレリン治療薬としては、シストレリン（Ｃｙｓｔｏｒｅｌｉｎ）（メリアル（Ｍｅｒｉａｌ））、フェルタジル（Ｆｅｒｔａｇｙｌ）（インターベット−シェリング・プラウ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  −  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））、ファクトレル（Ｆａｃｔｒｅｌ）（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））が挙げられる。
【００６４】
妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及びウマ絨毛性ゴナドトロピン（ＥＣＧ）
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ＰＭＳＧ又はＥＣＧポリペプチド、その変異体又は機能断片、又はそれらの組み合わせをコードし得る。ＰＭＳＧ又はＥＣＧをコードする核酸は、繁殖障害の治療及び／又は予防並びに繁殖及び繁殖可能な発情周期の管理に有用であり得る。ＰＭＳＧ又はＥＣＧをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ウシ、ウマ、及びブタを含む様々な家畜動物が挙げられる。現在、タンパク質ベースのＰＭＳＧ又はＥＣＧ治療薬としては、ホリゴン（Ｆｏｌｌｉ
ｇｏｎ）／クロノゲストＰＭＳＧ（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｇｅｓｔ  ＰＭＳＧ）（インターベット−シェリング・プラウ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  −  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））が挙げられる。
【００６５】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ｈＣＧポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。ｈＣＧをコードする核酸は、繁殖及び／又は受胎障害の治療及び／又は予防に有用であり得る。ｈＣＧをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ウシ、ウマ、及びブタを含む様々な家畜動物が挙げられる。現在、タンパク質ベースのｈＣＧ治療薬としては、コルロン（Ｃｈｏｒｕｌｏｎ）（インターベット−シェリング・プラウ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  −  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））が挙げられる。
【００６６】
ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧＲＨａ）
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、ＧＲＨａポリペプチド、その変異体又は機能断片をコードし得る。ＧＲＨａをコードする核酸は、卵巣機能不全症による低受精率の治療及び／又は予防、並びに排卵誘発及び受胎率の向上に有用であり得る。ＧＲＨａをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ウマ、雌ウシ及びウサギが挙げられる。現在、タンパク質ベースのＧＲＨａ治療薬としては、レセプタル（Ｒｅｃｅｐｔａｌ）（インターベット−シェリング・プラウ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  −
Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））が挙げられる。
【００６７】
膵酵素
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、１つ又は複数の膵ポリペプチド酵素、並びに、その変異体又は機能断片をコードし得る。膵酵素としては、限定はされないが、リパーゼ、プロテアーゼ、及びアミラーゼが挙げられる。膵酵素をコードする核酸は、膵酵素の欠乏の治療及び／又は予防に有用であり得る。膵酵素をコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、ネコ、イヌ及び家畜が挙げられる。現在、タンパク質ベースの膵酵素治療薬としては、ビオカーゼ（Ｖｉｏｋａｓｅ）（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））が挙げられる。
【００６８】
Ｃｒｅリコンビナーゼ
一実施形態では、本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸は、Ｃｒｅリコンビナーゼポリペプチド、並びに、その変異体又は機能断片をコードし得る。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸は、研究及び医薬開発に使用されるトランスジェニックマウスモデルにおいて有用であり得る。ｌｏｘＰ配列により挟まれたＤＮＡ領域を含む細胞においてＣｒｅリコンビナーゼを発現させると、その挟まれたＤＮＡ領域の欠失が生じる。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする核酸を投与し得る種としては、限定はされないが、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、アフリカツメガエル及びニワトリが挙げられる。現在は、Ｃｒｅ発現動物系統との交雑育種又はＣｒｅ遺伝子のウイルスデリバリーが必要である。
【００６９】
ポリペプチドライブラリ
一実施形態では、修飾核酸及び増強核酸を用いて、ヌクレオシド修飾を含むポリヌクレオチドライブラリを作成し得る。ポリヌクレオチドは、個々に、抗体、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、及び当該技術分野において公知の他のポリペプチドなどのポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、標的細胞宿主に直接導入するのに好適な形態のｍＲＮＡであり、ひいてはその宿主がコードポリペプチドを合成する。
【００７０】
特定の実施形態では、各々が異なる１つ又は複数のアミノ酸修飾を備えた、タンパク質
若しくは抗体の複数の変異体又はその機能断片が作製及び試験されることにより、抗原親和性、細胞株の作製における収率、薬物動態、安定性、生体適合性、及び／又は生物学的活性、又は発現レベルなどの生物物理学的特性の点で最良の変異体が決定される。かかるライブラリは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個、又は１０９個を超える候補変異体（１つ以上の残基の置換、欠失、及び１つ以上の残基の挿入を含む）を含み得る。
【００７１】
ポリペプチド−核酸複合体
正しいタンパク質翻訳は、ｍＲＮＡに会合する多数のポリペプチド及び核酸の物理的な凝集を伴う。本発明により、１つ以上のヌクレオシド修飾（例えば、少なくとも２つの異なるヌクレオシド修飾）を有する翻訳可能なｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡに結合した１つ以上のポリペプチドとを含むタンパク質−核酸複合体が提供される。概して、これらのタンパク質は、複合体が導入される細胞の自然免疫応答を防止又は低減するのに有効な量で提供される。
【００７２】
翻訳不可能な修飾核酸
本明細書に記載されるとおり、実質的に翻訳不可能な配列を有するｍＲＮＡが提供される。かかるｍＲＮＡは、哺乳動物対象に投与される場合にワクチンとして有効であり得る。
【００７３】
また、１つ以上の非コード領域を含む修飾核酸も提供される。かかる修飾核酸は一般に翻訳されないが、リボソームタンパク質又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの１つ以上の翻訳機構成分に結合したり、それを隔離したりして、それにより細胞におけるタンパク質発現を有効に低下させることが可能である。修飾核酸には、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が含まれ得る。
【００７４】
修飾核酸合成
本発明において用いられる核酸は、限定はされないが、化学合成、概してインビトロ転写と称される酵素合成、より長い前駆体の酵素切断又は化学切断等を含む任意の利用可能な技術により調製され得る。ＲＮＡの合成方法は当該技術分野において公知である（例えば、ゲイトＭ．Ｊ．（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．）（編）「オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）［オックスフォードシャー州］、ワシントンＤ．Ｃ．：ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８４年；及びヘルデヴァインＰ．（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．）（編）「オリゴヌクレオチド合成：方法と応用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２８８巻、クリフトンＮ．Ｊ．（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）著、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州：ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、２００５年を参照のこと；これらはいずれも参照により本明細書に援用される）。
【００７５】
修飾核酸は、分子の全長に沿って一様に修飾される必要はない。核酸の様々な位置に異なるヌクレオチド修飾及び／又は骨格構造が存在してもよい。当業者は、ヌクレオチド類似体又は他の１つ又は複数の修飾が核酸の任意の１つ又は複数の位置に、核酸の機能が実質的に低下することがないようにして位置し得ることを理解するであろう。修飾はまた、５’末端又は３’末端の修飾であってよい。核酸は、最小でも１％及び最大で１００％修飾されたヌクレオチドを含み、又は任意の中間にある割合、例えば少なくとも５０％修飾されたヌクレオチド、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチド、又は少なくとも９０％
修飾されたヌクレオチドを含み得る。
【００７６】
概して、本発明の修飾ｍＲＮＡの長さは３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ＲＮＡ分子は３５ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、長さは少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５０００ヌクレオチドであり、又は５０００ヌクレオチドより長い。
【００７７】
医薬組成物
本発明は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤との組み合わせでの修飾核酸又は増強核酸を提供する。医薬組成物は、場合により、１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質を含み得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２１版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【００７８】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知の、又は今後開発される任意の方法により調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分と結び付ける工程と、次に、必要である場合及び／又は望ましい場合、生成物を所望の単回又は複数回用量単位に分割、成形及び／又は包装する工程とを含む。
【００７９】
本発明における医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、及び／又は複数の単回
単位用量として調製、包装、及び／又は販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別的な量である。活性成分の量は、概して対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、及び／又はかかる投薬量の好都合な分割量、例えばかかる投薬量の２分の１又は３分の１に等しい。
【００８０】
本発明における医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／又は任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティ、サイズ、及び／又は状態に応じて異なり、さらには組成物が投与されるべき経路に応じて異なり得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【００８１】
修飾核酸の製剤
リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避するように改変されているリボ核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む核酸）の有効量を含む製剤が提供される。リボ核酸は、概して、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することにより、（１）安定性を増加させ；（２）細胞トランスフェクションを増加させ；（３）持続又は遅延放出（例えば、修飾核酸又は増強核酸のデポー製剤からの）を可能にし；（４）体内分布を変化させ（例えば、修飾核酸又は増強核酸を特定の組織又は細胞型に標的化する）；（５）インビボでのコードタンパク質の翻訳を増加させ；及び／又は（６）インビボでのコードタンパク質の放出プロファイルを変化させることができる。あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散又は懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤などの従来の賦形剤に加えて、本発明の賦形剤としては、限定なしに、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、急速排泄型脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、修飾核酸又は増強核酸をトランスフェクトされた細胞（例えば対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。従って、本発明の製剤は、各々が併せて修飾核酸又は増強核酸の安定性を増加させ、修飾核酸又は増強核酸による細胞トランスフェクションを増加させ、修飾核酸又は増強核酸によりコードされるタンパク質の発現を増加させ、及び／又は修飾核酸又は増強核酸によりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である１つ以上の賦形剤を含むことができる。
【００８３】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知の、又は今後開発される任意の方法により調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分と結び付ける工程を含む。
【００８４】
医薬製剤はさらに、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよく、本明細書で使用されるときこれは、限定はされないが、所望の特定の剤形に適するとおりのあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散又は懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤などを含む。医薬組成物の製剤化用の様々な賦形剤及び組成物の調製技法が、当該技術分野において公知である（「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州、２００６年を参照のこと；参照により本明細書に援用される）。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内にあると考えられ得るが、但し、任意の望ましくない生物学的効果を生じるか、又はその他有害な形で医薬組成物の任意の他の１つ又は複数の構成成分と相互作用するなどにより、任意の従来の賦形剤媒体が物質又はその誘導体と不適合であり得る場合は除く。
【００８５】
医薬組成物の製造に用いられる薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定はされないが、不活性希釈剤、表面活性剤及び／又は乳化剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、及び／又は油が挙げられる。かかる賦形剤は、場合により本発明の医薬製剤に含まれ得る。
【００８６】
リピドイド
リピドイドの合成については広範に記載されており、これらの化合物を含む製剤は、修飾核酸又は増強核酸の送達に特に適している（マーン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ）、２０１０年、第２１巻、１４４８〜１４５４頁；シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ）、２０１０年、第２６７巻、９〜２１頁；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００８年、第２６巻、５６１〜５６９頁；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、１８６４〜１８６９頁；ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、１２９９６〜３００１頁を参照のこと；これらは全て、全体として本明細書に援用される）。
【００８７】
これらのリピドイドは、げっ歯類及び非ヒト霊長類において二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子の有効な送達に用いられているが（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００８年、第２６巻、５６１〜５６９頁；フランク−カメネツキー（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００８年、第１０５巻、１１９１５〜１１９２０頁；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２００９年、第１７巻、８７２〜８７９頁；ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、１８６４〜１８６９頁；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、１００５〜１０１０頁を参照のこと；これらは全て、全体として本明細書に援用される）、本開示は、一本鎖修飾核酸又は増強核酸の送達におけるそれらの製剤化及び使用について記載する。複合体、ミセル、リポソーム又は粒子は、これらのリピドイドを含有するように調製することができ、従って、コードタンパク質の産生によって判断するとき、局所的及び／又は全身的投与経路によるリピドイド製剤の注射後に、修飾核酸又は増強核酸の有効な送達をもたらすことができる。修飾核酸又は増強核酸のリピドイド複合体は、限定はされないが、静脈内、筋肉内、又は皮下経路を含めて、様々な手段によって投与することができる。
【００８８】
核酸のインビボ送達は、限定はされないが、製剤組成、粒子ペグ化の性質、負荷度、オリゴヌクレオチド対脂質比、及び粒度などの生物物理学的パラメータを含む多くのパラメータに影響を受け得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ）、２００９年、第１７巻、８７２〜８７９頁；本明細書において全体として参照により援用される）。例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長の小さい変化がインビボ効力に大きい影響をもたらし得る。限定はされないが、ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；別名９８Ｎ１２−５、ムルガイア（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４０１巻、６１頁、２０１０年を参照のこと）、Ｃ１２−２００（誘導体及び変異体を含む）、及びＭＤ１を含む種々のリピドイドを含む製剤を、インビボ活性について試験することができる。
【００８９】
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と称されるリピドイドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２００９年、第１７巻、８７２〜８７９頁により開示され、全体として参照により援用される。
【００９０】
本明細書で「Ｃ１２−２００」と称されるリピドイドは、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、１８６４〜１８６９頁及びリュー（Ｌｉｕ）及びファン（Ｈｕａｎｇ）著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、６６９〜６７０頁により開示され；これらは双方とも、本明細書において全体として参照により援用される。リピドイド製剤は、修飾核酸又は増強核酸に加えて３個或いは４個又はそれ以上の構成成分を含む粒子を含み得る。例として、特定のリピドイドを含む製剤には、限定はされないが９８Ｎ１２−５が含まれ、これは、４２％のリピドイド、４８％のコレステロール及び１０％のＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有し得る。別の例として、特定のリピドイドを含む製剤には、限定はされないがＣ１２−２００が含まれ、これは、５０％のリピドイド、１０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧを含有し得る。
【００９１】
一実施形態では、全身静脈内投与用にリピドイドと共に製剤化される修飾核酸又は増強核酸は、肝臓を標的とし得る。例えば、修飾核酸又は増強核酸を使用した、且つ４２％の９８Ｎ１２−５、４８％のコレステロール、及び１０％のＰＥＧ−脂質の脂質モル組成を含む、最終重量比が約７．５対１の総脂質対修飾核酸又は増強核酸、ＰＥＧ脂質に対してＣ１４アルキル鎖長、平均粒度が約５０〜６０ｎｍの、最終的な最適化された静注製剤は、肝臓に９０％より高い製剤の分布をもたらし得る（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２００９年、第１７巻、８７２〜８７９頁を参照のこと；本明細書において全体として援用される）。別の例において、Ｃ１２−２００（米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書及び国際公開第２０１０１２９７０９号を参照のこと、本明細書において全体として参照により援用される）リピドイドを使用した静注製剤は、５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２−２００／ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を有し、重量比が７対１の総脂質対修飾核酸又は増強核酸、且つ平均粒度が８０ｎｍであってよく、これは修飾核酸又は増強核酸を肝実質細胞に送達するのに有効であり得る（参照により本明細書に援用されるラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、１８６４〜１８６９頁を参照のこと）。別の実施形態では、ＭＤＩリピドイド含有製剤を使用して、修飾核酸又は増強核酸をインビボで肝実質細胞に有効に送達することができる。筋肉内経路又は皮下経路に最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型及び製剤が細胞外マトリックスを通って血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。有効な肝実質細胞送達のためには、内皮窓のサイズに起因して１５０ｎｍ未満の粒度が望ましいこともあるが（参照により本明細書に援用されるアキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２００９年、第１７巻、８７２〜８７９頁を参照のこと）、他の細胞型、例えば限定はされないが、内皮細胞、骨髄性細胞、及び筋細胞への製剤の送達に対するリピドイド製剤化された修飾核酸又は増強核酸の使用は、同様のサイズ制限を受けないこともある。骨髄性細胞及び内皮などの、他の非肝実質細胞にインビボでｓｉＲＮＡを送達するためのリピドイド製剤の使用が、報告されている（本明細書において全体として参照により援用されるアキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００８年、第２６巻、５６１〜５６９頁；ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、
１００５〜１０１０頁；チョー（Ｃｈｏ）ら著、アドバンスト・ファンクショナル・マテリアルズ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．）、２００９年、第１９巻、３１１２〜３１１８頁；第８回国際ユダ・フォークマン会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ州、２０１０年１０月８〜９日を参照のこと）。単球などの骨髄性細胞への有効な送達、リピドイド製剤は同様の構成成分モル比を有し得る。異なる比のリピドイド及び他の構成成分、例えば限定はされないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＭＧを使用して、修飾核酸又は増強核酸の製剤を、限定はされないが、肝実質細胞、骨髄性細胞、筋細胞等の種々の細胞型への送達に最適化してもよい。例えば、構成成分モル比は、限定はされないが、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）、３８．５％のコレステロール、及び％１．５のＰＥＧ−ＤＭＧを含み得る（ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、１００５〜１０１０頁を参照のこと；本明細書において全体として参照により援用される）。核酸を皮下送達又は筋肉内送達のいずれかによって細胞（限定はされないが、脂肪細胞及び筋細胞など）に局所送達するためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に望ましい全ての製剤構成成分を必要しないこともあり、従ってリピドイド及び修飾核酸又は増強核酸のみを含むこともある。
【００９２】
リピドイドは修飾核酸又は増強核酸による細胞トランスフェクションを増加させ得る；及び／又はコードタンパク質の翻訳を増加させ得るため、異なるリピドイドの組み合わせを用いることにより、修飾核酸又は増強核酸に誘導されるタンパク質産生の効力を改善し得る（本明細書において全体として参照により援用されるホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、１６８８〜１６９４頁を参照のこと）。
【００９３】
リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸の医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層で構成され得る人工的に調製された小胞であり、栄養素及び医薬製剤の投与用送達媒体として用いられ得る。リポソームは、限定はされないが、直径が数百ナノメートルであり得るとともに狭い水性の区画によって分離された一連の同心の二重層を含み得る多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍ未満であり得る小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）など、種々のサイズであり得る。リポソーム設計は、限定はされないが、オプソニン又はリガンドを含んでもよく、それにより非健常組織に対するリポソームの付着を向上させ、又は限定はされないがエンドサイトーシスなどのイベントを活性化し得る。リポソームは低い又は高いｐＨを含んでもよく、それにより医薬製剤の送達を向上させ得る。
【００９４】
リポソームの形成は、限定はされないが、封入される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞を分散させる媒体の性質、封入物質の有効濃度及びその潜在的毒性、小胞の適用中及び／又は送達中に関与する任意のさらなるプロセス、目的の適用に対する小胞の至適サイズ、多分散性及び有効期間、並びに安全且つ効率的なリポソーム産物のバッチ間再現性及び大量生産の可能性などの、物理化学的特性に依存し得る。
【００９５】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定なしに、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソームから形成されるリポソーム、マリナ・バイオテック（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ボセル（Ｂｏｔｈ
ｅｌｌ）、ワシントン州）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、及びＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書；本明細書において全体として参照により援用される）、及び限定はされないが、ヤンセン・バイオテック・インコーポレイテッド（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ホーシャム（Ｈｏｒｓｈａｍ）、ペンシルベニア州）のＤＯＸＩＬ（登録商標）などの小分子薬物を送達し得るリポソームなどのリポソームを含み得る。
【００９６】
一実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定なしに、過去に記載がある、且つインビトロ及びインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示されている安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ）又は安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるリポソームなどのリポソームを含み得る（ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、２７１〜２８１頁；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、１４３８〜１４４７頁；ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ）、２００５年、第２２巻、３６２〜３７２頁；モリッシー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２巻、１００２〜１００７頁；ツィンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、１１１〜１１４頁；ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ）、２００５年、第１０７巻、２７６〜２８７頁；センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１０年、第２８巻、１７２〜１７６頁；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）、２００９年、第１１９巻、６６１〜６７３頁；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、１２５〜１３２頁を参照のこと；これらは全て、全体として本明細書に援用される）。ホイーラー（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる元の製造方法はデタージェント透析法であったが、これは後にジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより改良されており、自発的小胞形成法と称される。リポソーム製剤は、修飾核酸又は増強核酸に加えて３〜４つの脂質構成成分から構成される。例として、リポソームは、限定はされないが、ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより記載されるとおり、５５％のコレステロール、２０％のジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、及び１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができる。別の例として、特定のリポソーム製剤は、限定はされないが、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）らにより記載されるとおり、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及び３０％のカチオン性脂質を含有してもよく、ここでカチオン性脂質は、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、又は１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
【００９７】
リポソーム製剤は、限定はされないが、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ペグ化の性質、全構成成分の比及びサイズなどの生物物理学的パラメータにより影響され得る。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら（センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１０年、第２８巻、１７２〜１７６頁）による一例では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を
変えると、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより効果的に送達することができた（バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第１９巻、２１８６〜２２００頁；参照により本明細書に援用される）。
【００９８】
一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸は、限定なしに、サイレンス・セラピューティクス（Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）、英国）のアトゥプレックス（ＡＴＵＰＬＥＸ）（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム及び他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）（ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ州）のステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はプロタミンベースの標的及び非標的核酸送達など、リポプレックスとして製剤化されてもよい（アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００８年、第６８巻、９７８８〜９７９８頁；ストランバーグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、７６〜７８頁；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、１２２２〜１２３４頁；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、１３６０〜１３７０頁；グートビール（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、プルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第２３巻、３３４〜３４４頁；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、ミクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、２８６〜２９３頁、ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）、２００９年、第３２巻、４９８〜５０７頁；ワイデ（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）、２００８年、第３１巻、１８０〜１８８頁；パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、１２８５〜１２９４頁；フォティン−ムレチェク（Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、２０１１年、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第３４巻、１〜１５頁；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２３巻、７０９〜７１７頁；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年６月；第１０４巻、４０９５〜４１００頁；ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、１２５〜１３２頁；これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）。
【００９９】
一実施形態では、また、限定はされないが、肝実質細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、及び白血球を含め、インビボで種々の細胞型を受動的又は能動的に標的とするようにかかる製剤を構築し、又は組成物を変化させてもよい（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、１３５７〜１３６４頁；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）２００５年、第２３巻、７０９〜７１７頁；ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）、２００９年、第１１９巻、６６１〜６７３頁；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、ミクロバスキュラー・リサーチ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ）、２０１０年、第８０巻、２８６〜２９３頁；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、１２２２〜１２３４頁；サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、１３６０〜１３７０頁；グートビール（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、プルモナリー・ファーマ
コロジー・アンド・セラピューティクス（Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第２３巻、３３４〜３４４頁；バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、２１８６〜２２００頁；フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）及びカリス（Ｃｕｌｌｉｓ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２００８年、第５巻、２５〜４４頁；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、６２７〜６３０頁；ピア（Ｐｅｅｒ）及びリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第１８巻、１１２７〜１１３３頁；これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）。肝細胞に対する製剤の受動的標的化の一例には、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子製剤が含まれ、これらはアポリポタンパク質Ｅに結合し、インビボでこれらの製剤の肝実質細胞への結合及び取込みを促進することが示されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、１３５７〜１３６４頁；本明細書において全体として参照により援用される）。製剤はまた、限定はされないが、葉酸塩、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及び抗体標的化手法により例示されるとおりの、その表面上での種々のリガンドの発現を介して選択的に標的化され得る（コールハトカー（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ディスカバリー・テクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第８巻、１９７〜２０６頁；ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）及びトーチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）著、フロンティア・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ）、２０１１年、第１６巻、１３８８〜１４１２頁；ユー（Ｙｕ）ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー（Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ）、２０１０年、第２７巻、２８６〜２９８頁；パティル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリティカル・レビュー・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリア・システム（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ）、２００８年、第２５巻、１〜６１頁；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、２７０８〜２７１４頁、チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２００８年、第５巻、３０９〜３１９頁；アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、１３５７〜１３６４頁；スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、２０１２年、第８２０巻、１０５〜１１６頁；ベン−アリー（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ）ら著、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）���２０１２年、第７５７巻、４９７〜５０７頁；ピア（Ｐｅｅｒ）、２０１０年、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、第２０巻、６３〜６８頁；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、４０９５〜４１００頁；キム（Ｋｉｍ）ら著、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、２０１１年、第７２１巻、３３９〜３５３頁；スブラマニヤ（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１８巻、２０２８〜２０３７頁；ソン（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００５年、第２３巻、７０９〜７１７頁；ピア（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、６２７〜６３０頁；ピア（Ｐｅｅｒ）及びリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第１８巻、１１２７〜１１３３頁；これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）。
【０１００】
一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸は、固体脂質ナノ粒子として製剤化されてもよい。固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＳＬＮ）
は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球形であってもよい。ＳＬＮは、脂溶性分子を可溶化することのできる固体脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤及び／又は乳化剤と共に安定化し得る。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２００８年、第２巻、第８号、１６９６〜１７０２頁を参照のこと；本明細書において全体として参照により援用される）。
【０１０１】
リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用すると、これらの製剤は修飾核酸又は増強核酸による細胞トランスフェクションを増加させる；及び／又はコードタンパク質の翻訳の増加させる能力を有し得るため、修飾核酸又は増強核酸に誘導されるタンパク質産生の効力が向上し得る。一つのかかる例には、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にする脂質封入の使用が関わる（ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２００７年、第１５巻、７１３〜７２０頁；本明細書において全体として参照により援用される）。また、リポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用すると、修飾核酸又は増強核酸の安定性が増加し得る。
【０１０２】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコア−シェルナノ粒子
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、天然及び／又は合成ポリマーを使用して製剤化することができる。送達に用いられ得るポリマーの非限定的な例としては、限定はされないが、ミラス（ＭＩＲＵＳ）（登録商標）バイオ（Ｂｉｏ）（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）及びロシュ・マディソン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ）（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）のダイナミックポリコンジュゲート（Ｄｙｎａｍｉｃ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）（商標）製剤、フェーズＲＸ（ＰＨＡＳＥＲＸ）（商標）ポリマー製剤、例えば、限定なしに、スマルト・ポリマー・テクノロジー（ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（商標）（シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ）、ワシントン州）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、バイカル（Ｖｉｃａｌ）（サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）のバクスフェクチン（ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）アジュバント、キトサン、カランド・ファーマシューティカルズ（Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（パサディナ（Ｐａｓａｄｅｎａ）、カリフォルニア州）のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーが挙げられる。
【０１０３】
これらのポリマー手法の多くは、インビボでのオリゴヌクレオチドの細胞質への送達における効力が実証されている（ドフジュロール（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、１２５〜１３２頁にレビューされている；本明細書において全体として参照により援用される）。核酸のロバストなインビボ送達を生じた（この場合低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を伴い得られている）２つのポリマー手法は、ダイナミックポリコンジュゲート及びシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達手法のうちの一つ目はダイナミックポリコンジュゲートを使用するもので、マウスにおいてインビボでｓｉＲＮＡを有効に送達し、肝実質細胞における内因性の標的ｍＲＮＡをサイレンシングすることが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、１２９８２〜１２８８７頁）。この特定の手法は多成分ポリマー系であり、その重要な特徴としては、核酸、この場合ｓｉＲＮＡがジスルフィド結合を介して共有結合的にカップリングされる膜活性ポリマーが挙げられ、そこにＰＥＧ基（電荷遮蔽用）及びＮ−アセチルガラクトサミン基（肝実質細胞標的化用）の双方がｐＨ感受性結合を介して連結される（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、１２９８２〜１２８８７頁）。ポリマー複合体は、肝実質細胞に結合してエンドソームに侵入すると、低ｐＨ環境で分解し、ポリマーがその正電荷を露出するこ
とで、ポリマーからのエンドソームエスケープ及びｓｉＲＮＡの細胞質放出が起こる。Ｎ−アセチルガラクトサミン基をマンノース基に置き換えることにより、アシアロ糖タンパク質受容体発現肝実質細胞から類洞内皮細胞及びクッパー細胞に標的を変更可能であることが示されている。別のポリマー手法には、トランスフェリン標的シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用が関わる。このナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞におけるＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の標的サイレンシングを実証しており（フー−リースコバン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ）ら著、カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、２００５年、第６５巻、８９８４〜８９８２頁）、このナノ粒子に製剤化されたｓｉＲＮＡは非ヒト霊長類において十分に忍容された（ハイデル（Ｈｅｉｄｅｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、５７１５〜２１頁）。これらの送達戦略の双方とも、標的化した送達及びエンドソームエスケープ機構の両方を用いた合理的な手法を取り入れている。
【０１０４】
ポリマー製剤は、修飾核酸又は増強核酸の持続放出又は遅延放出を（例えば、筋肉内注射又は皮下注射後に）可能にすることができる。修飾核酸又は増強核酸の放出プロファイルを変化させることにより、例えば、長期間にわたるコードタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤の使用によりまた、修飾核酸又は増強核酸の安定性も増加し得る。生分解性ポリマーは、これまで、修飾核酸又は増強核酸以外の核酸を分解から保護するために用いられており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている（ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、１２９８２〜１２８８７頁；サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２０１０年、第７巻、１４３３〜１４４６頁；コンバーチン（Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ）ら著、バイオマクロモレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１０年１０月１日；チュー（Ｃｈｕ）ら著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ）、２０１２年１月１３日；マンガニエロ（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１２年、第３３巻、２３０１〜２３０９頁；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、２７０８〜２７１４頁；シンハ（Ｓｉｎｇｈａ）ら著、ヌクレイック・アシッド・セラピューティクス（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ）、２０１１年、第２巻、１３３〜１４７頁；ド・フジュロール（ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１９巻、１２５〜１３２頁；シャファート（Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ）及びワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００８年、第１６巻、１１３１〜１１３８頁；チャツルベディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２０１１年、第８巻、１４５５〜１４６８頁；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマシューティクス（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ）、２００９年、第６巻、６５９〜６６８頁；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、１０６７〜１０７０頁；本明細書において全体として参照により援用される）。
【０１０５】
ポリマー製剤はまた、限定はされないが、葉酸塩、トランスフェリン、及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）により例示されるとおりの、種々のリガンドの発現により、選択的に標的化されることもできる（ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオマクロモレキュルズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、２７０８〜２７１４頁；ロゼマ（Ｒｏｚｅｍａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、１２９８２〜１２８８７頁；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、モレキュラー・ファーマシューティクス（Ｍｏｌ  Ｐ
ｈａｒｍ）、２００９年、第６巻、６５９〜６６８頁；デイビス（Ｄａｖｉｓ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６４巻、１０６７〜１０７０頁；本明細書において全体として参照により援用される）。
【０１０６】
本発明の修飾核酸及び増強核酸はまた、ポリマー、脂質、及び／又は他の生分解性薬剤、例えば限定はされないが、リン酸カルシウムなどの組み合わせを使用して、ナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、コア−シェル、ハイブリッド、及び／又は多層構造に組み合わされてもよく、それによりナノ粒子の微調整が可能となり、ひいては修飾核酸及び増強核酸の送達が増強され得る（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ）、２００６年、第５巻、７９１〜７９６頁；フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００８年、第２９巻、１５２６〜１５３２頁；デコカー（ＤｅＫｏｋｅｒ）ら著、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ）、２０１１年、第６３巻、７４８〜７６１頁；エンドレス（Ｅｎｄｒｅｓ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、７７２１〜７７３１頁；スー（Ｓｕ）ら著、モレキュラー・ファーマシューティクス（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ）、２０１１年６月６日、第８巻、第３号、７７４〜８７頁；本明細書において全体として参照により援用される）。
【０１０７】
脂質及び／又はポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボで修飾核酸及び増強核酸を送達することが示されている。一実施形態では、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子（これはまたアニスアミドなどの標的リガンドも含有し得る）を使用して、本発明の修飾核酸及び増強核酸を送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてｓｉＲＮＡを有効に送達するために、脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子が用いられた（リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ）、２０１０年、第１４２巻、４１６〜４２１頁；リー（Ｌｉ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ）、２０１２年、第１５８巻、１０８〜１１４頁；ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第２０巻、６０９〜６１５頁）。この送達系は、標的化されたナノ粒子と、エンドソームエスケープを増強する構成成分であるリン酸カルシウムとの双方を組み合わせることにより、ｓｉＲＮＡの送達を改善する。
【０１０８】
一実施形態では、リン酸カルシウムをＰＥＧ−ポリアニオンブロック共重合体と共に使用して、修飾核酸及び増強核酸を送達してもよい（カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ）、２００４年、第９７巻、３４５〜３５６頁；カジカワ（Ｋａｚｉｋａｗａ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ）、２００６年、第１１１巻、３６８〜３７０頁）。
【０１０９】
一実施形態では、ＰＥＧ−電荷変換型ポリマー（ピテラ（Ｐｉｔｅｌｌａ）ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１年、第３２巻、３１０６〜３１１４頁）を使用して、本発明の修飾核酸及び増強核酸を送達するナノ粒子を形成してもよい。ＰＥＧ−電荷変換型ポリマーは、酸性ｐＨでポリカチオンに切断されることにより、ひいてはエンドソームエスケープを増強して、ＰＥＧ−ポリアニオンブロック共重合体を改善し得る。
【０１１０】
コア−シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコア及び様々なシェルを合成するハイスループット手法にさらに焦点が置かれてきた（ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、１２９９６〜１３００１頁）。ナノ粒子のコア及びシェルの
双方の構成成分における化学組成を変化させることにより、ポリマーナノ粒子の複合体化、送達、及びインターナリゼーションを正確に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールとナノ粒子との共有結合後、マウス肝実質細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達し得る。
【０１１１】
一実施形態では、中間のＰＬＧＡ層とＰＥＧを含有する外側の中性脂質層とを含む中空脂質コアを使用して、本発明の修飾核酸又は増強核酸が送達されてもよい。非限定的な例として、ルシフェラーゼ発現腫瘍を有するマウスでは、従来のリポプレックスと比較したとき、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子がルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが決定された（シャイ（Ｓｈｉ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ）、２０１１年、第５０巻、７０２７〜７０３１頁）。
【０１１２】
ペプチド及びタンパク質
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、ペプチド及び／又はタンパク質と共に製剤化することにより、修飾核酸又は増強核酸による細胞のトランスフェクションを増加させることができる。一実施形態では、ペプチド、例えば限定はされないが、細胞透過性ペプチド並びに細胞内送達を可能にするタンパク質及びペプチドを使用して、医薬製剤を送達してもよい。本発明の医薬製剤と共に用い得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を促進するポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポルタン、又はｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドが挙げられる（例えば、キャロン（Ｃａｒｏｎ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）第３巻、第３号、３１０〜８頁、２００１年；ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）、「細胞透過性ペプチド：プロセス及び応用（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、ボーカラトーン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州、２００２年）；エル−アンダルッシ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら著、カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）、第１１巻、第２８号、３５９７〜６１１頁、２００３年；及びデエー（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンス（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ．）、第６２巻、第１６号、１８３９〜４９頁、２００５年を参照のこと、これらは全て、参照により本明細書に援用される）。組成物はまた、細胞透過性薬剤、例えばトランスフェクション剤、及びリポソームを含むように製剤化することもでき、これにより細胞内空間への組成物の送達が増強される。
【０１１３】
具体的な一実施形態では、修飾核酸及び増強核酸をトランスフェクション剤（又はその混合物）と混合又は混和することができ、得られた混合物を用いて細胞がトランスフェクトされる。好ましいトランスフェクション剤としては、限定はされないが、カチオン性脂質組成物、特に一価及び多価のカチオン性脂質組成物、より詳細には、リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）、リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（登録商標）、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（商標）、セルフェクチン（ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、及びＤＯＳＰＥＲ、及びデンドリマー組成物、特にＧ５〜Ｇ１０デンドリマー、例えば高密度の星型デンドリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、グラフト化デンドリマー、及びデンドリグラフトとして知られるデンドリマー及びスーパーフェクト（ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ）（登録商標）が挙げられる。第２の具体的な実施形態では、膜融合性（ｆｕｓａｇｅｎｉｃ）ペプチド若しくはタンパク質、運搬若しくは輸送ペプチド若しくはタンパク質、受容体リガンドペプチド若しくはタンパク質、又は核移行ペプチド若しくはタンパク質及び／又はこれらの修飾類似体（例えば、スペルミン修飾ペプチド若しくはタンパク質）又はそれらの組み合わせを含め、１つ以上のトランスフェクション増強ペプチド、
タンパク質、又はタンパク質断片の混合物が、細胞に導入される修飾核酸及び増強核酸と混合及び複合体化され、場合によりトランスフェクション剤と混和され、得られた混合物を用いて細胞がトランスフェクトされる。さらに、トランスフェクション剤の構成成分（例えば、脂質、カチオン性脂質又はデンドリマー）を選択されたペプチド、タンパク質、又はタンパク質断片に直接、又は連結基若しくはスペーサー基を介して共有結合的にコンジュゲートしてもよい。この実施形態では、膜融合性（ｆｕｓａｇｅｎｉｃ）、膜透過性、運搬又は輸送ペプチド又はタンパク質、又は細胞標的化の働きをするものが、特に有益である。ペプチド−又はタンパク質−トランスフェクション剤複合体は、修飾核酸及び増強核酸と組み合わされ、トランスフェクションに用いられる。
【０１１４】
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、ペプチド及び／又はタンパク質、例えば限定はされないが、エイルロン・セラピューティクス（Ａｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ州）及びパーメオン・バイオロジクス（Ｐｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ州）のペプチド及び／又はタンパク質と複合体化して細胞内送達を可能にしてもよい（クロニカン（Ｃｒｏｎｉｃａｎ）ら著、ＡＣＳケミカル・バイオロジー（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、２０１０年、第５巻、７４７〜７５２頁；マクノートン（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００９年、第１０６巻、６１１１〜６１１６頁；ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）著、ケミカル・バイオロジー・アンド・ドラッグ・デザイン（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ）、２００９年、第７３巻、３〜６頁；ベルディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）及びヒリンスキ（Ｈｉｌｉｎｓｋｉ）著、メソッヅ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ）、２０１２年、第５０３巻、３〜３３頁；これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される）。
【０１１５】
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１のドメインと第２のドメインとを含み得る。第１のドメインは過剰荷電ポリペプチドを含み得る。第２のドメインはタンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、限定はされないが、抗体及びその機能的断片、足場タンパク質、又はペプチドが含まれる。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーに対する細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、修飾核酸又は増強核酸が導入され得る細胞から分泌されることが可能であり得る。
【０１１６】
含有ペプチド又はタンパク質の製剤を使用して、修飾核酸又は増強核酸による細胞トランスフェクションを増加させ、修飾核酸又は増強核酸の体内分布を（例えば、特定の組織又は細胞型を標的化することにより）変化させ、及び／又はコードタンパク質の翻訳を増加させることができる。
【０１１７】
細胞
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、エキソビボで細胞にトランスフェクトすることができ、その細胞が、続いて対象に移植される。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾ＲＮＡを肝臓及び骨髄性細胞に送達するため赤血球を含み、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）において修飾ＲＮＡを送達するためビロソームを含み、及び修飾ＲＮＡを送達するため、限定はされないがマックスサイト（ＭＡＸＣＹＴＥ）（登録商標）（ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）及びエリテック（ＥＲＹＴＥＣＨ）（登録商標）（リヨン（Ｌｙｏｎ）、仏国）などの電気穿孔細胞を含み得る。修飾核酸以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子及び電気穿孔細胞の使用例は、実証されている（ゴッドフリン（Ｇｏｄｆｒｉｎ）ら著、エキスパート・オピニオン・オンバイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第１２巻、１２７〜１３３頁；ファング（Ｆａｎｇ）ら著、エキスパート・オピニオン・オン
バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ）、２０１２年、第１２巻、３８５〜３８９頁；フー（Ｈｕ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、１０９８０〜１０９８５頁；ルンド（Ｌｕｎｄ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ
Ｒｅｓ）、２０１０年、第２７巻、４００〜４２０頁；ハックリーデ（Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・リポソーム・リサーチ（Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ）、２００７年、第１７巻、３９〜４７頁；クシ（Ｃｕｓｉ）著、ヒューマン・ワクチン（Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ）、２００６年、第２巻、１〜７頁；ド・ジョンジュ（ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、４００〜４１１頁；これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される）。
【０１１８】
本発明の修飾核酸及び増強核酸の細胞ベースの製剤を使用して、細胞トランスフェクション（例えば、細胞担体における）を確実にし、修飾核酸又は増強核酸の体内分布を（例えば、細胞担体を特定の組織又は細胞型に標的化させることにより）変化させ、及び／又はコードタンパク質の翻訳を増加させることができる。
【０１１９】
細胞への核酸の導入については、ウイルス媒介性及び非ウイルス媒介性の技術を含め、様々な方法が当該技術分野において公知であり、且つ好適である。典型的な非ウイルス媒介性技術の例としては、限定はされないが、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）又は細胞融合が挙げられる。
【０１２０】
ソノポレーション、すなわち細胞超音波処理の技法は、細胞原形質膜の透過性を改良するための音波（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション法は当業者に公知であり、インビボでの核酸の送達に用いられる（ユン（Ｙｏｏｎ）及びパク（Ｐａｒｋ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２０１０年、第７巻、３２１〜３３０頁；ポステマ（Ｐｏｓｔｅｍａ）及びギリヤ（Ｇｉｌｊａ）、カレント・ファーマシューティカル・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２００７年、第８巻、３５５〜３６１頁；ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）及びベッティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２００７年、第１４巻、４６５〜４７５頁；全て本明細書において全体として参照により援用される）。ソノポレーション法は当該技術分野において公知であり、また、例えば細菌に関連するものとして米国特許出願公開第２０１００１９６９８３号明細書に、及び他の細胞型に関連するものとして、例えば米国特許出願公開第２０１００００９４２４号明細書に教示され、これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０１２１】
電気穿孔技法もまた当該技術分野において周知されており、インビボで、及び臨床的に、核酸の送達に用いられる（アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、２６７〜２８０頁；キアレッラ（Ｃｈｉａｒｅｌｌａ）ら著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、２８１〜２８６頁；ホフマン（Ｈｏｊｍａｎ）著、カレント・ジーン・セラピー（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、２０１０年、第１０巻、１２８〜１３８頁；全て本明細書において全体として参照により援用される）。一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸は電気穿孔によって送達されてもよい。
【０１２２】
ヒアルロニダーゼ
本発明の修飾核酸及び増強核酸の筋肉内又は皮下局所注射は、ヒアルロナンの加水分解
を触媒するヒアルロニダーゼを含むことができる。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによってヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより組織透過性を高める（フロスト（Ｆｒｏｓｔ）著、エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２００７年、第４巻、４２７〜４４０頁；本明細書において全体として参照により援用される）。ヒアルロニダーゼは、その分散及びトランスフェクト細胞により産生されるコードタンパク質の全身分布を速めるのに有用である。或いは、ヒアルロニダーゼを使用して、筋肉内投与又は皮下投与された本発明の修飾核酸又は増強核酸に曝露される細胞の数を増加させることができる。
【０１２３】
コンジュゲート
本発明の修飾核酸及び増強核酸には、コンジュゲート、例えば、担体又は標的基に共有結合的に連結した、又は共になって融合タンパク質（例えば標的基と治療用タンパク質又はペプチドとを有するもの）を産生する２つのコード領域を含む修飾核酸又は増強核酸が含まれる。
【０１２４】
一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸は、核酸結合基、例えば限定はされないが、ポリアミン、より詳細にはスペルミンにコンジュゲートされてもよい。核酸結合基が次に細胞に導入されてもよく、又は、トランスフェクション剤（又はその混合物）と混和されて、次に得られた混合物を用いて細胞がトランスフェクトされてもよい。
【０１２５】
本発明のコンジュゲートとしては、限定はされないが、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの、天然に存在する物質が挙げられる。リガンドはまた、組換え分子又は合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、限定はされないが、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体、又はポリホスファジンが挙げられ、ポリアミノ酸はそれらである。ポリアミンの例としては、以下が挙げられる：ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はアルファヘリックスペプチド。
【０１２６】
特にＲＮＡとの、ポリヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書
；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書；同第６，２９４，６６４号明細書；同第６，３２０，０１７号明細書；同第６，５７６，７５２号明細書；同第６，７８３，９３１号明細書；同第６，９００，２９７号明細書；同第７，０３７，６４６号明細書が挙げられ；これらの各々は、本明細書において参照により援用される。
【０１２７】
コンジュゲートはまた、標的基、例えば細胞又は組織標的剤、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する、レクチン、糖タンパク質、脂質、又はタンパク質、例えば抗体も含むことができる。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであってもよい。
【０１２８】
標的基は、タンパク質、例えば糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的な親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であってもよい。標的基にはまた、ホルモン及びホルモン受容体も含まれ得る。標的基にはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、又はアプタマーなどの非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、又はｐ３８
ＭＡＰキナーゼのアクチベータであってもよい。
【０１２９】
標的基は、特定の受容体を標的化することが可能な任意のリガンドであってよい。例としては、限定なしに、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが挙げられる。詳細な実施形態において、標的基はアプタマーである。アプタマーは修飾されていなくてもよく、又は本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有してもよい。
【０１３０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、限定はされないがロックド核酸と同様の修飾など、化学修飾を含み得る。
サンタリス（Ｓａｎｔａｒｉｓ）のものなどの、ロックド核酸（ＬＮＡ）の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、以下が挙げられる：米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号
明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；及び同第７，３９９，８４５号明細書、これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０１３１】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらの各々は本明細書において参照により援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、１４９７〜１５００頁に見出すことができる。
【０１３２】
本発明で取り上げる一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有する修飾核酸又は増強核酸、及び他の修飾骨格、特に上記で参照される米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで天然のリン酸ジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、及び上記で参照される米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げるポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｏｔｉｄｅｓ）は、上記で参照される米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格を有する。
【０１３３】
２’位の修飾もまた、送達に役立ち得る。好ましくは、２’位の修飾はポリペプチドコード配列に位置せず、すなわち翻訳可能領域に位置しない。２’位の修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／又はテール付加領域に位置してもよい。２’位の修飾は、以下のうちの１つを２’位に含むことができる：Ｈ（すなわち、２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい。好適な例示的修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の実施形態では、修飾核酸又は増強核酸は、以下のうちの１つを２’位に含み得る：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入剤、薬物動態学的特性を改善する基、又は薬力学的特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる）（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベチカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、４８６〜５０４頁）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。別の例示的修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の例に記載されるとおりの、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、同様に本明細書の以下の例に記載されるとおりの、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。他の修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾がまた
、他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位又は２’−５’連結ｄｓＲＮＡ及び５’末端ヌクレオチドの５’位に作製されてもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの各々は、本明細書において参照により援用される。
【０１３４】
さらに他の実施形態では、修飾核酸又は増強核酸は、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートされてもよい。細胞透過性ペプチドはまた、シグナル配列を含んでもよい。本発明のコンジュゲートは、安定性が増加し；細胞トランスフェクションが増加し；及び／又は体内分布が変化する（例えば、特定の組織又は細胞型に標的化される）ように設計することができる。
【０１３５】
賦形剤
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよく、賦形剤は、本明細書で使用されるとき、特定の望ましい剤形に適するとおりの、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散又は懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを含む。レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州、２００６年；参照により本明細書に援用される）に、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤及びその公知の調製技法が記載される。任意の望ましくない生物学的効果を生じたり、又はその他、医薬組成物の任意の他の１つ又は複数の構成成分と有害な形で相互作用したりするなど、任意の従来の賦形剤媒体が物質又はその誘導体と適合しない場合を除き、その使用は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１３６】
一部の実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋である。一部の実施形態では、賦形剤はヒトでの使用及び獣医学用途が承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は医薬品グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／又は国際薬局方の基準に適合する。
【０１３７】
医薬組成物の製造に用いられる薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定はされないが、不活性希釈剤、分散剤及び／又は造粒剤、表面活性剤及び／又は乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、及び／又は油が挙げられる。かかる賦形剤は、場合により医薬組成物中に含めることができる。
【０１３８】
例示的な希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マン
ニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉末糖等、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１３９】
例示的な造粒剤及び／又は分散剤としては、限定はされないが、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーゴム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材産物、海綿、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（スターチ１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミウニムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第４級アンモニウム化合物等、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４０】
例示的な表面活性剤及び／又は乳化剤としては、限定はされないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド粘土（例えばベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミウニムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸重合体、及びカルボキシビニル重合体）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ツイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、及びソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えばクレモフォール（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（ＰＬＵＯＲＩＮＣ）（登録商標）Ｆ  ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４１】
例示的な結合剤としては、限定はされないが、デンプン（例えばトウモロコシデンプン及びデンプンペースト）；ゼラチン；糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然及び合
成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイルランドコケの抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ゴム、ガッティゴム、イサゴール（ｉｓａｐｏｌ）殻の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸アルミウニムマグネシウム（ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標））、及びカラマツアラビノガラクタン（ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；等；及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４２】
例示的な保存剤としては、限定はされないが、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、及び／又は他の保存剤を挙げることができる。例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル（ａｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／又は亜硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／又はエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗微生物性保存剤としては、限定はされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／又はチメロサールが挙げられる。例示的な抗真菌性保存剤としては、限定はされないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／又はソルビン酸が挙げられる。例示的なアルコール保存剤としては、限定はされないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、及び／又はフェニルエチルアルコールが挙げられる。例示的な酸性保存剤としては、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／又はフィチン酸が挙げられる。他の保存剤としては、限定はされないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デターオキシムメシレート（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌ）（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ゲルモール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ゲルマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、カトン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、及び／又はユーキシル（ＥＵＸＹＬ）���登録商標）が挙げられる。
【０１４３】
例示的な緩衝剤としては、限定はされないが、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウ
ム、ペンタン酸、リン酸水素カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化カルシウムリン酸、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール等、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４４】
例示的な潤滑剤としては、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｎａｔｅ）、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４５】
例示的な油としては、限定はされないが、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、カシス種子（ｂｌａｃｋ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｅｅｄ）油、ルリヂサ油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、カラウェー油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、カカオ脂、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、イヴニングプリムローズ油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール、ゴード油、菜種油、ヘーゼルナッツ油、ヒッソプ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、リツェアクベバ油、マカダミアナッツ（ｍａｃａｄｅｍｉａ  ｎｕｔ）油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ種子油、カボチャ種子油、菜種油、米糠油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクワナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セイバリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン油、ダイズ油、ヒマワリ油、チャノキ油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、クルミ油、及びコムギ胚芽油が挙げられる。例示的な油としては、限定はされないが、ステアリン酸ブチル、トリカプリル酸グリセリル、カプリル酸トリグリセリド、シクロメチコーン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４６】
配合者の判断により、賦形剤、例えばカカオ脂及び坐薬ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、及び／又は芳香剤が、組成物中に存在し得る。
薬学的に許容可能な担体
一部の実施形態では、製剤は薬学的に許容可能な担体を含み得る。薬学的に許容可能な担体により、細胞を含む標的組織に実質的に修飾核酸又は増強核酸の有効量が保持され得る。
【０１４７】
修飾核酸の送達
本開示は、ドラッグデリバリーの科学において起こり得る進歩を考慮して、任意の適切な経路による治療用、製薬用、診断用又はイメージング用のうち任意の修飾核酸又は増強核酸の送達を包含する。送達は、裸の（ｎａｋｅｄ）送達又は製剤化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）送達であってよい。
【０１４８】
裸の送達
本発明の修飾核酸又は増強核酸は、細胞に裸で送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「裸の」は、トランスフェクションを促進する薬剤を含まない修飾核酸又は増強核酸を送達することを指す。例えば、細胞に送達される修飾核酸又は増強核酸は、修飾を含まなくてもよい。裸の修飾核酸又は増強核酸は、当該技術分野において公知の、及び本
明細書に記載される投与経路を用いて細胞に送達され得る。
【０１４９】
製剤化された送達
本発明の修飾核酸又は増強核酸は、本明細書に記載される方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されていても及び／又は修飾されていなくてもよいリボ核酸を含有し得る。製剤は、限定はされないが、細胞透過剤、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生体侵食性又は生体適合性ポリマー、溶媒、及び持続放出送達デポーをさらに含み得る。製剤化された修飾核酸又は増強核酸は、当該技術分野において公知の、及び本明細書に記載される投与経路を用いて細胞に送達され得る。
【０１５０】
一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸などの改変されたリボヌクレオチドを含有するインビボデポーを生成するための組成物が提供される。例えば、この組成物は、生体侵食性生体適合性ポリマーと、ポリマーを可塑化してそれと共にゲルを形成するのに有効な量で存在する溶媒と、改変リボ核酸とを含有する。特定の実施形態ではこの組成物はまた、本明細書に記載されるとおりの細胞透過剤も含む。他の実施形態では、この組成物はまた、ポリマーと混合可能な、従ってチキソトロープ組成物を形成するのに有効なチキソトロープ剤のチキソトロピー量も含有する。さらに組成物は、安定化剤、充填剤、キレート剤、又は緩衝剤を含む。
【０１５１】
一実施形態では、修飾核酸又は増強核酸などの改変リボ核酸を、患者における環境（すなわち臓器又は組織部位）に投与するためなど、持続放出送達デポーが提供される。かかるデポーは、概して改変リボ核酸と可動（フレキシブル）鎖ポリマーとを含有し、ここで改変リボ核酸及び可動鎖ポリマーは双方とも、架橋マトリックスタンパク質の多孔質マトリックスの中に封入されている。通常、細孔径は１ｍｍ未満、例えば９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満である。通常、可動鎖ポリマーは親水性である。通常、可動鎖ポリマーは分子量が少なくとも５０ｋＤａ、例えば７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、又は５００ｋＤａ超である。通常、可動鎖ポリマーは、マトリックスタンパク質の固定長の１０％未満、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１％又は１％未満の固定長を有する。通常、可動鎖ポリマーは、マトリックスタンパク質の電荷と同様の電荷を有する。一部の実施形態では、可動鎖ポリマーは、架橋マトリックスタンパク質のマトリックスの有効細孔径を、改変リボ核酸が侵入可能な細胞を含む周囲組織への改変リボ核酸のマトリックスからの拡散を持続させることが可能なサイズに変化させる。
【０１５２】
組成物はまた、限定はされないが、直接浸かる又は浴びる、カテーテルを介する、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／又はドロップによる、組成物を被覆又は含浸した繊維材料又は生分解性材料などの基材を使用することによるなど、当該技術分野のいくつかの方法のいずれかで、臓器又は組織に直接送達するように製剤化されてもよい。
【０１５３】
細胞内核酸送達方法
本発明の方法は、特にエキソビボでの、又は培養下での、細胞集団への核酸送達を増強する。例えば、複数の宿主細胞（例えば、酵母又は哺乳動物細胞などの真核細胞）を含有する細胞培養物を、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、場合により翻訳可能領域とを有する修飾核酸、又は増強核酸を含有する組成物に接触させる。組成物はまた、概して、トランスフェクション試薬又は修飾核酸若しくは増強核酸の宿主細胞への取込み効率を増加させる他の化合物も含有する。修飾核酸又は増強核酸は、対応する非修飾核酸と比べて、細胞集団における保持性の増強を示し得る。修飾核酸又は増強核酸の保持性は、非修飾核酸の保持性より高い。一部の実施形態では、それは、非修飾核酸の保持性と比べて少な
くとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％又は２００％超高い。かかる保持性の利点は、修飾核酸又は増強核酸による１ラウンドのトランスフェクションで実現されてもよく、又はトランスフェクションラウンドを繰り返した後に達成されてもよい。
【０１５４】
一部の実施形態では、増強核酸は１つ以上のさらなる核酸と共に標的細胞集団に送達され得る。かかる送達は同時であってもよく、又は増強核酸が、その１つ以上のさらなる核酸の送達前に送達されてもよい。さらなる１つ以上の核酸は修飾核酸であっても、又は非修飾核酸であってもよい。増強核酸が最初に存在しても細胞集団の自然免疫応答は実質的に誘発されないこと、さらには、非修飾核酸が後に存在することによって自然免疫応答が活性化されることはないことが理解される。この点で、標的細胞集団に存在することが望ましいタンパク質が非修飾核酸から翻訳される場合、増強核酸それ自体は翻訳可能領域を含まなくてもよい。
【０１５５】
修飾核酸の投与
本明細書に記載されるとおり、本発明の核酸を含む組成物は、筋肉内、経動脈、腹腔内、静脈内、鼻腔内、皮下、内視鏡、経皮、及び／又は髄腔内投与向けに製剤化される。本明細書に記載されるとおり、一部の実施形態では、組成物は、長時間放出用のデポーに製剤化される。概して、特定の臓器又は組織（「標的組織」）が投与の標的とされ得る。
【０１５６】
本発明の一部の態様において、核酸（特にポリペプチドをコードするリボ核酸）は、空間的に標的組織の内部に又はそれに近接して保持される。有利には、保持性が、１つ以上の標的細胞に侵入する組成物中に存在する核酸の量を計測することにより決定され得る。例えば、対象に投与された核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％又は９９．９９％超が、投与後所定時間経った時点で細胞内に存在する。例えば、リボ核酸とトランスフェクション試薬とを含有する水性組成物を使用して、哺乳動物対象への筋肉内注射を実施してもよく、及び筋細胞に存在するリボ核酸の量を計測することにより、組成物の保持性が決定される。
【０１５７】
一実施形態では、組成物、特に組成物の１つ又は複数の核酸成分が実質的に標的組織に保持される、すなわち組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％又は９９．９９％超が標的組織に保持されるような条件下で、標的組織（これは１つ以上の標的細胞を含む）を組成物に接触させることにより、哺乳動物対象の標的組織に組成物を提供する方法が提供される。有利には、保持性が、１つ以上の標的細胞に侵入する組成物中に存在する核酸の量を測定することにより決定され得る。例えば、対象に投与された核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％又は９９．９９％超が、投与後所定時間経った時点で細胞内に存在する。例えば、リボ核酸とトランスフェクション試薬とを含有する水性組成物を使用して、哺乳動物対象への筋肉内注射が実施されてもよく、及び筋細胞に存在するリボ核酸の量を測定することにより、組成物の保持性が決定され得る。
【０１５８】
治療剤が投与される対象は、疾患、障害、又は有害な状態に罹患しているか、又はそれを発症するリスクがある。それらに基づき対象を同定、診断、及び分類する方法が提供され、これには、臨床診断、バイオマーカー値、ゲノムワイド関連分析（ＧＷＡＳ）、及び当該技術分野において公知の他の方法が含まれ得る。
【０１５９】
特定の実施形態では、投与された修飾核酸が、組換えポリペプチドが翻訳される細胞に実質的に存在しない機能的活性を提供する１つ以上の組換えポリペプチドの産生を誘導す
る。例えば、欠損している機能的活性は、酵素的、構造的、又は遺伝子調節的性質のものであってよい。
【０１６０】
他の実施形態では、投与された修飾核酸が、組換えポリペプチドが翻訳される細胞に実質的に存在しないあるポリペプチド（又は複数のポリペプチド）を置き換える１つ以上の組換えポリペプチドの産生を誘導する。このように存在しない原因は、コード遺伝子又はその調節経路の遺伝子突然変異であり得る。或いは、組換えポリペプチドは、その細胞内、細胞の表面上に存在する、又は細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、その内因性タンパク質の活性は、例えば内因性タンパク質の突然変異により活性又は局在化に変化が生じるため、対象にとって有害である。加えて、組換えポリペプチドは、直接的又は間接的に、その細胞内、細胞の表面上に存在する、又は細胞から分泌される生物学的部分の活性に拮抗する。拮抗を受ける生物学的部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、又は小分子毒素が挙げられる。
【０１６１】
修飾核酸の使用
治療剤
非ヒト脊椎動物、特に哺乳動物における疾患又は病態を治療又は予防するための組成物、方法、キット、及び試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、修飾核酸、修飾核酸又はそれらの修飾核酸から翻訳されたポリペプチドを含む細胞、修飾核酸から翻訳されたポリペプチド、及び、修飾核酸又はそれらの修飾核酸から翻訳されたポリペプチドを含む細胞に接触させた細胞を含む。
【０１６２】
本明細書に記載される修飾核酸を使用して細胞集団において組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が提供される。かかる翻訳は、インビボ、エキソビボ、培養下、オンビボ、又はインビトロであってもよい。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する組成物の有効量と接触させる。この集団は、核酸が細胞集団の１つ以上の細胞に局在化して組換えポリペプチドが細胞において核酸から翻訳されるような条件下で接触させる。
【０１６３】
組成物の有効量は、少なくとも一部では、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特性（例えば、サイズ、及び修飾ヌクレオシドの程度）、及び他の決定要因に基づき提供される。一般に、組成物の有効量は、細胞における効率的なタンパク質産生、好ましくは対応する非修飾核酸を含有する組成物と比べてより効率的なタンパク質産生を提供する。効率の増加は、細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合）の増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳時間の増加により実証されるとおり）、又は宿主細胞の自然免疫応答の低下により実証され得る。
【０１６４】
本発明の修飾核酸及び増強核酸は、対応する非修飾核酸と比べて、細胞集団における保持性の増強を示す。修飾核酸又は増強核酸の保持性は、非修飾核酸の保持性より高い。一部の実施形態では、それは、非修飾核酸の保持性と比べて少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％又は２００％超高い。かかる保持性の利点は、修飾核酸又は増強核酸による１ラウンドのトランスフェクションで実現されてもよく、又はトランスフェクションラウンドを繰り返した後に達成されてもよい。
【０１６５】
一部の実施形態では、増強核酸は１つ以上のさらなる核酸と共に標的細胞集団に送達され得る。かかる送達は同時であってもよく、又は増強核酸は、その１つ以上のさらなる核酸の送達前に送達される。さらなる１つ以上の核酸は修飾核酸であっても、又は非修飾核酸であってもよい。増強核酸が最初に存在しても細胞集団の自然免疫応答は実質的に誘発
されないこと、さらには、非修飾核酸が後に存在することによって自然免疫応答が活性化されることはないことが理解される。この点で、標的細胞集団に存在することが望ましいタンパク質が非修飾核酸から翻訳される場合、増強核酸それ自体は翻訳可能領域を含まなくてもよい。
【０１６６】
免疫応答の回避
本明細書に記載されるとおり、本発明の修飾核酸の有用な特徴は、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答を低下させ、阻止する能力であり得る。細胞又は細胞集団における免疫応答のタイトレーション、阻止、低減又は排除の実施方法が提供される。一部の実施形態では、細胞を、翻訳可能領域と少なくとも１つのヌクレオシド修飾とを含む第１の外因性核酸の第１の用量を含有する第１の組成物と接触させてもよく、第１の外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答レベルを決定してもよい。続いて、細胞を、第１の外因性核酸の第２の用量を含む第２の組成物と接触させ、この第２の用量は、第１の用量と比較してより少量の第１の外因性核酸を含有する。或いは、細胞は、第２の外因性核酸の第１の用量と接触させる。第２の外因性核酸は、第１の外因性核酸と同じであっても又は異なってもよい１つ以上の修飾ヌクレオシドを含有し得るか、或いは、第２の外因性核酸は修飾ヌクレオシドを含有しなくてもよい。細胞を第１の組成物及び／又は第２の組成物と接触させる工程は、１回以上繰り返され得る。加えて、細胞におけるタンパク質産生（例えばタンパク質翻訳）の効率が、場合により決定されてもよく、細胞は、目標のタンパク質産生効率に到達するまで、第１及び／又は第２の組成物で繰り返し再トランスフェクトされ得る。
【０１６７】
用語「自然免疫応答」は、一般にウイルス起源又は細菌起源の、外因性一本鎖核酸に対する細胞性応答を含み、これにはサイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出の誘導、並びに細胞死が関与する。自然細胞性免疫応答の間、タンパク質合成もまた低下する。細胞の自然免疫応答は消失させることが有利であるが、本発明は、インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答を完全には消失させることなく、かかる応答を実質的に低下させる修飾ｍＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、免疫応答は、対応する非修飾核酸により誘発される免疫応答と比較したとき、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、又は９９．９％超低下する。かかる低下は、１型インターフェロンの発現若しくは活性レベル又はＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）などのインターフェロンによって調節される遺伝子の発現により計測することができる。自然免疫応答の低下はまた、細胞集団に修飾ＲＮＡを１回以上投与した後の細胞死の減少によって計測することもできる；例えば、細胞死は、対応する非修飾核酸で観察される細胞死頻度と比べて１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超少ない。さらに、細胞死が影響を及ぼすのは、修飾核酸と接触した細胞の５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％又は０．０１％未満であり得る。
【０１６８】
本発明は、標的細胞集団に対する、例えば、インビトロ、エキソビボ、又はインビボでの修飾核酸の反復的な導入（例えば、トランスフェクション）を提供する。細胞集団を接触させる工程は、１回以上（２、３、４、５回又は５回より多く）繰り返されてもよい。一部の実施形態では、細胞集団を修飾核酸と接触させる工程は、細胞集団における所定のタンパク質翻訳効率を達成するのに十分な回数が繰り返される。核酸修飾により提供される標的細胞集団の細胞傷害性の低下を考えると、多種多様な細胞型でかかる反復的なトランスフェクションを実現することが可能である。
【０１６９】
抗体の産生
本発明は、本発明の方法のいずれか一つにより産生される抗体及びかかる抗体の断片を提供する。抗体は、免疫グロブリンの種々のサブクラス又はアイソタイプのいずれか、例
えばＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、又は他のサブクラスのいずれであってもよい。本発明により調製され得る例示的な抗体分子及び断片には、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子のうちパラトープ（抗体の抗原結合部位）を含む部分が含まれる。抗体のうちパラトープを含むかかる部分には、当該技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として知られる部分が含まれる。
【０１７０】
抗体ポリペプチド変異体
変異抗体ポリペプチドをコードする核酸が提供され、これは参照ポリペプチド配列と一定の同一性を有するか、或いは同様の又は異なる結合特性を有する。当該技術分野において周知されるとおりの用語「同一性」は、配列を比較することにより決定するときの、２つ以上のペプチドの配列間の関係を指す。当該技術分野では、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数により決定するときの、ペプチド間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（それがある場合）による２つ以上の配列のうちより短い配列間の同一マッチ率が尺度となる。関連するペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。かかる方法としては、限定はされないが、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォマティクス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９３年；「配列データのコンピュータ解析」、第１部、グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）及びグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９４年；「分子生物学の配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ヘイネ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）及びデベローＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９１年；及びカリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マセマティクス（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ）、第４８巻、１０７３頁（１９８８年）に記載されるものが挙げられる。
【０１７１】
本発明の方法により得られる抗体は、免疫動物に由来する、非ヒト抗体由来の１つ又は複数の可変領域配列と、ヒト抗体由来の１つ又は複数の定常領域配列とを含むキメラ抗体であってもよい。加えて、抗体はまた、免疫動物に由来する非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域とを含むヒト化抗体であってもよい。
【０１７２】
一部の実施形態では、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと同じ又は同程度の活性を有する。或いは、変異体は、参照ポリペプチドと比べて変化した（例えば増加又は減少した）活性を有する。概して、本明細書に記載される、及び当業者に公知の配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定するとき、本発明の特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、その特定の参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０１７３】
当業者により認識されるとおり、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、本発明の範囲内にあると考えられる。例えば、本明細書には、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸長の、又は１００アミノ酸長より長い、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（すなわち、参照ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基だけ短いが、他は同じであるポリペプチド配列）が提供される。別の例において、本明細書に記載される配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、又は約１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を、本発明において利用することができる。特定の実施形態では、本発明において利用されるタンパク質配列は、本明細書において提供又は参照される配列のいずれかに示されるとおりの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の突然変異を含む。
【０１７４】
抗体産生方法
本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスで産生される抗体タンパク質産物を増強するのに有用である。複数の宿主細胞を含む細胞培養においては、本明細書に記載される修飾ｍＲＮＡを導入することにより、対応する非修飾核酸と比べてタンパク質産生効率が増加する。かかるタンパク質産生効率の増加は、例えば、細胞トランスフェクションの増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少、及び／又は宿主細胞の自然免疫応答の低下を示すことにより実証し得る。タンパク質産生はＥＬＩＳＡにより計測することができ、タンパク質活性は、当該技術分野において公知の様々な機能アッセイにより計測することができる。タンパク質産生は連続法又はフェドバッチ法で生じさせ得る。
【０１７５】
細胞培養及び増殖
本発明の方法では、細胞は培養される。細胞は、懸濁液中で、又は付着培養物として培養されてもよい。細胞は、例えば、バイオリアクター、細胞バッグ、ウェーブバッグ、培養プレート、フラスコ及び当業者に周知されている他の容器を含め、様々な容器で培養され得る。細胞は、ＩＭＤＭ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１２４４０−５３）又は化学限定培地製剤を含む任意の他の好適な培地で培養されてもよい。温度及び大気組成などの、細胞培養に好適な周囲条件もまた、当業者に周知されている。本発明の方法は、タンパク質産生に用いるのに好適な任意の細胞で用いられ得る。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物、微生物、藻類及び真菌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター又は雌ウシ細胞である。例えば、細胞は、限定はされないが、ヒーラ（ＨｅＬａ）、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨＥＫ  ２９３Ｔ、ベロ（Ｖｅｒｏ）、カコ（Ｃａｃｏ）、カコ２（Ｃａｃｏ−２）、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫＩＳＶ、ＣＨＯ−Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、ＨｕＨ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む任意の樹立細胞株由来であってよい。特定の実施形態では、細胞は、真菌細胞、例えば、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）細胞、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、ディクチオステリウム属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）細胞、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）細胞、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞からなる群から選択される細胞である。特定の他の実施形態では、細胞は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はＢＬ２１細胞である。本方法によりトランスフェクトされる一次及び二次細胞は、様々な組織から得ること
ができ、培養下で維持され得る全ての細胞型を含むことができる。例えば、本方法によりトランスフェクトされ得る一次及び二次細胞には、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋細胞及びこれらの体細胞型の前駆体が含まれる。一次細胞は、同種又は別種のドナー（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）から得ることができる。
【０１７６】
疾患及び病態の治療薬
欠損した又は異常なタンパク質活性により特徴付けられる疾患の症状を、欠損したタンパク質活性を補充し、又は異常なタンパク質活性を解消することによって治療又は予防するための方法が提供される。本発明の化合物は、ウイルスＤＮＡベクターと比較して、修飾ｍＲＮＡを導入した後速やかにタンパク質産生が始まるため、敗血症、脳卒中、及び心筋梗塞などの急性疾患の処置において特に有利である。さらに、本発明の修飾ｍＲＮＡの転写調節の欠如は、タンパク質産生の正確なタイトレーションを達成できる点で有利である。
【０１７７】
本発明の態様は、組成物が標的組織に実質的に保持されるような条件下で、標的組織（１つ以上の標的細胞を含む）を組成物に接触させることによる、哺乳動物対象の標的組織に組成物を提供する方法に関する。一実施形態では、組成物は、リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避するように改変されたリボ核酸の有効量を含み、ここでリボ核酸は、少なくとも１つの標的細胞において目的のポリペプチドが産生されるような条件下で目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。概して、組成物は細胞透過剤を含み（「裸の」核酸（細胞透過剤又は他の薬剤を含まない核酸など）もまた企図されるが）、及び薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
【０１７８】
標的組織の所定容積中に含まれる細胞の実質的な割合で目的のポリペプチドを産生するために（概して、所定容積に隣接する組織又は標的組織の遠位には目的のポリペプチドの有意な産生を誘導することなしに）、必要な組成物の用量が決定される。この決定に続き、決定された用量が非ヒト脊椎動物対象の組織中に直接導入される。
【０１７９】
非ヒト脊椎動物対象に存在する細胞又は細胞集団の分化状態を変化させる方法が提供される。かかる方法は、ｉ）複数の異なるリボ核酸であって、各々が、リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避し、且つ目的のポリペプチドをコードする（それにより複数の異なるポリペプチドを産生する）ように改変されたリボ核酸を、細胞透過剤、及び薬学的に許容可能な担体と共に含有する組成物を提供する工程を含む。組成物の単位量は、目的とする複数の異なるポリペプチドを、組織の所定容積中に含まれる細胞の実質的な割合で産生するように決定され得る。この方法は、ｉｉ）組織の所定容積中に含まれる細胞の実質的な割合で目的の種々のポリペプチドを産生するのに必要な組成物の用量を決定する工程をさらに含む。目的の種々のポリペプチドは、所定容積に隣接する組織中の細胞の有意な割合（５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１％又は１％未満）の分化状態は変化させることなく、それらのタンパク質産生細胞の有意な量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％又は９５％超）の分化状態を変化させるのに影響を及ぼし得る量で産生されてもよい。この方法は、ｉｉｉ）非ヒト脊椎動物対象の組織に組成物の用量を直接導入する工程をさらに含む。
【０１８０】
本発明の態様は、必要としている非ヒト脊椎動物対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法に関する。ここでは、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する組成物の有効量が、本明細書に記載される送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞
に局在化し、且つその細胞において核酸から組換えポリペプチドが翻訳されるような量及び他の条件下で提供される。核酸を局在化させる細胞、又は細胞が存在する組織は、１ラウンド又は２ラウンド以上の核酸投与で標的化され得る。
【０１８１】
本明細書に記載される組換えタンパク質は、細胞内、潜在的には核などの特定の区画内に局在化するように改変されてもよく、又は細胞から分泌されるか若しくは細胞の原形質膜に移行するように改変される。
【０１８２】
本発明の他の態様は、非ヒト脊椎動物対象に対する修飾核酸を含む細胞の移植に関する。非ヒト脊椎動物対象への細胞の投与は、局在移植（例えば、局所又は皮下投与）、臓器送達又は全身注入（例えば、静脈内注射又は吸入）など、薬学的に許容可能な担体における細胞の製剤化と同様に、当業者に公知である。
【０１８３】
診断用薬剤
非ヒト動物における疾患又は病態を検出するための組成物、方法、キット、及び試薬が提供される。本発明の診断用薬剤は、修飾核酸、修飾核酸又はそれらの修飾核酸から翻訳されたポリペプチドを含む細胞、修飾核酸から翻訳されたポリペプチド、及び、修飾核酸又はそれらの修飾核酸から翻訳されたポリペプチドを含む細胞に接触させた細胞を含む。
【０１８４】
本明細書に記載される修飾核酸を使用して、細胞集団における組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が提供される。かかる翻訳は、インビボ、エキソビボ、又は好ましくは、培養下又はインビトロであってよい。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する組成物の有効量に接触させる。集団は、核酸が細胞集団の１つ以上の細胞に局在化し、且つ細胞において核酸から組換えポリペプチドが翻訳されるような条件下で接触させる。
【０１８５】
組成物の有効量は、少なくとも一部では、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特性（例えば、サイズ、及び修飾ヌクレオシドの程度）、及び他の決定要因に基づき提供される。一般に、組成物の有効量は、細胞における効率的なタンパク質産生、好ましくは対応する非修飾核酸を含有する組成物と比べてより効率的なタンパク質産生を提供する。効率の増加は、細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合）の増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳時間の増加により実証されるとおり）、又は宿主細胞の自然免疫応答の低下により実証され得る。
【０１８６】
本明細書に記載されるとおり、本発明の修飾核酸の有用な特徴は、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答を低下させる能力である。細胞又は細胞集団における免疫応答のタイトレーション、低減又は排除の実施方法が提供される。一部の実施形態では、細胞を、翻訳可能領域と少なくとも１つのヌクレオシド修飾とを含む第１の外因性核酸の第１の用量を含有する第１の組成物と接触させて、第１の外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答レベルを決定する。続いて、細胞を、第１の外因性核酸の第２の用量を含む第２の組成物と接触させ、この第２の用量は、第１の用量と比較してより少量の第１の外因性核酸を含有する。或いは、細胞は、第２の外因性核酸の第１の用量と接触させる。第２の外因性核酸は、第１の外因性核酸と同じであっても又は異なってもよい１つ以上の修飾ヌクレオシドを含有し得るか、或いは、第２の外因性核酸は修飾ヌクレオシドを含有しなくてもよい。細胞を第１の組成物及び／又は第２の組成物と接触させる工程は、１回以上繰り返され得る。加えて、細胞におけるタンパク質産生（例えば、タンパク質翻訳）の効率が場合により決定され、細胞は、目標のタンパク質産生効率に到達するまで、第１及び／又は第２の組成物で繰り返し再トランスフェクトされ得る。
【０１８７】
タンパク質産生
当業者に公知のトランスフェクション、電気穿孔、カチオン性剤、ポリマー、又は脂質ベースの送達分子の方法により、一過性トランスフェクト細胞を生じさせてもよい。修飾された一過性のＲＮＡを、従来のバッチ様工程又は適切であるならば連続フロースルー工程のいずれかで、培養細胞に導入することができる。本発明の方法及び組成物を使用して、１つ以上の目的のタンパク質の産生が増加した細胞を作製し得る。細胞には、１つ以上のＲＮＡをトランスフェクトするか、又はその他導入することができる。細胞には、２つ以上のＲＮＡコンストラクトを同時に又は逐次的にトランスフェクトしてもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を複数ラウンド用いることにより、目的の１つ以上のＲＮＡ又はタンパク質の発現が増加した細胞を得てもよい。例えば、本明細書に記載される方法により目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする１つ以上のＲＮＡコンストラクトで細胞をトランスフェクトし、単離してもよい。次に単離された細胞を、目的のＲＮＡ又はタンパク質をコードする１つ以上の他のＲＮＡによるさらなるトランスフェクションラウンドに供し、再び単離してもよい。この方法は、例えば、タンパク質の複合体、同じ又は関連する生物学的経路のＲＮＡ又はタンパク質、互いの上流又は下流で作用するＲＮＡ又はタンパク質、互いに対して調節、活性化又は抑制する働きを有するＲＮＡ又はタンパク質、機能又は活性が互いに依存しているＲＮＡ又はタンパク質、又は相同性（例えば、配列、構造、又は機能上の相同性）を共有するＲＮＡ又はタンパク質の発現が増加した細胞を生じさせるのに有用である。例えば、この方法を用いて、免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の発現が増加した細胞株を生じさせてもよい。免疫グロブリンタンパク質は、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ免疫グロブリンタンパク質であってよい。詳細な実施形態においてＲＮＡは、免疫グロブリンタンパク質又はその抗原結合断片、例えば免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、単鎖Ｆｖ、抗体の断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、又は（Ｆａｂ’）２、又は免疫グロブリンの抗原結合断片をコードする。
【０１８８】
一部の実施形態では、組織中の細胞により産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加し得る。好ましくは、このタンパク質産生の増加は、空間的に標的組織内の細胞に制限されていてもよい。従って、哺乳動物対象の組織における目的のタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避するように改変されていてもよい、且つ目的のポリペプチドをコードするリボ核酸を含有する組成物が提供されてもよく、この組成物は、組成物の単位量が、標的組織の所定容積中に含まれる細胞の実質的な割合で目的のポリペプチドを産生するように決定されていることを特徴とし得る。一部の実施形態では、組成物は複数の異なるリボ核酸を含み、ここでリボ核酸の１つ又は２つ以上が、リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避するように改変され、且つリボ核酸の１つ又は２つ以上が目的のポリペプチドをコードする。場合により、組成物はまた、リボ核酸の細胞内送達を補助する細胞透過剤も含有する。
【０１８９】
タンパク質の単離及び／又は精製
当業者は、培養細胞から目的のタンパク質を精製又は単離する適切な方法の決定を容易に行うことができる。概してこれは、親和性結合又は非アフィニティー精製を用いる捕捉方法によって行われる。目的のタンパク質が培養細胞により分泌されない場合、上記に記載したとおりの精製又は単離前に、培養細胞の溶解が実施され得る。目的のタンパク質を含む清澄化していない細胞培養液を、細胞培養培地成分、並びに、消泡化合物や他の栄養素及び補助剤などの細胞培養添加剤、細胞、細胞残屑、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、及びウイルスなどと共に本発明において使用することができる。さらにこの方法は、必要であれば、バイオリアクターそれ自体で行うことができる。流体は、所望の刺激、例えばｐＨ、温度又は他の刺激特性に予めコンディショニングされてもよく、或いは流体は、１つ又は複数のポリマーの添加時にコンディショニングすることができ、又は１つ又は複数のポリマーを、ポリマーをその流体に可溶化するのに必要な刺激条件の必要なパラメータに
適切にコンディショニングされている担体液体に添加することができる。１つ又は複数のポリマーを流体と共に完全に循環させた後、刺激（ｐＨ、温度、塩濃度等の変化）が加えられ、所望のタンパク質及び１つ又は複数のポリマーが溶液から析出する。残りの流体からポリマー及び１つ又は複数の所望のタンパク質が分離され、場合により１回以上洗浄されて、閉じ込められた、又は緩く結合している夾雑物が取り除かれる。次に、１つ又は複数のポリマーから所望のタンパク質が、溶出などにより回収される。好ましくは、溶出は、所望のタンパク質の溶出中にポリマーがその固体（析出した）形態のままで、不純物を全てそこに保持するような一連の条件下で行われる。或いは、ポリマー及びタンパク質並びに任意の不純物は、水又は緩衝液などの新しい流体中に可溶化することができ、タンパク質が、親和性、イオン交換、疎水性、又はポリマー又は不純物と比べてタンパク質に対して選好性及び選択性を有する他の何らかの種類のクロマトグラフィーを用いて回収される。次に溶出したタンパク質が回収され、必要であれば、さらなる処理工程、従来のバッチ様工程又は適切であるならば連続フロースルー工程のいずれかに供される。
【０１９０】
加えて、潜在的に関係のある細胞株又は細胞株のコレクションにおける特定のポリペプチド、特に改変タンパク質、例えば既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異体の発現を最適化することが有用である。一実施形態では、複数の標的細胞型を提供し、且つ改変ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを複数の標的細胞型の各々と独立して接触させることにより、標的細胞における改変タンパク質の発現を最適化する方法が提供される。加えて、タンパク質産生効率が増加するように培養条件を変えてもよい。続いて、複数の標的細胞型における改変ポリペプチドの存在及び／又はレベルを検出及び／又は定量化することにより、効率的な標的細胞及びそれに関連する細胞培養条件を選択して、改変ポリペプチドの発現を最適化することが可能となる。かかる方法は、改変ポリペプチドが１つ以上の翻訳後修飾を含むか、又は実質的な三次構造を有する場合に、これらは効率的なタンパク質産生を複雑にすることが多い状況であり、特に有用である。
【０１９１】
本発明に係る方法はまた、有利には、抗体又はその断片の産生にも用いることができる。かかる断片には、例えばＦａｂ断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ：抗原結合性断片）が含まれる。Ｆａｂ断片は、両鎖の可変領域が隣接する定常領域によって一体に保持されているものからなる。
【０１９２】
目的のタンパク質は、好ましくは培養培地から分泌ポリペプチドとして回収され、又はそれは、分泌シグナルなしに発現する場合、宿主細胞溶解物から回収することができる。目的のタンパク質は、目的のタンパク質の実質的に均質な調製物が得られる方法で他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から精製する必要がある。最初の工程として、培養培地又はライセートから細胞及び／又は粒子状の細胞残屑が除去される。その後、目的の産物が夾雑可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えば、イムノアフィニティーカラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）クロマトグラフィー、シリカ又はＤＥＡＦなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによって精製される。一般に、宿主細胞が異種発現するタンパク質をどのように精製すればよいかを当業者に教示する方法は、当該技術分野において公知である。かかる方法は、例えば（ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）及びアンガル（Ａｎｇａｌ）、１９９５年）又は（ロバート・スコープス（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓｃｏｐｅｓ）、１９８８年）により記載されている。
【０１９３】
標的部分
本発明の実施形態において、修飾核酸は細胞の表面上にタンパク質結合パートナー又は受容体を発現するように提供され、これは、インビボで、或いはインビトロで、細胞を特定の組織空間に標的化させる、又は特定の部分と相互作用する働きをする。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体及びその機能的断片、足場タンパク質、又はペプチドが含
まれる。加えて、修飾核酸を用いることにより、脂質、炭水化物、又は他の生物学的部分の合成及び細胞外局在を誘導することができる。
【０１９４】
細胞の分化状態を変化させる
非ヒト脊椎動物対象に存在する細胞又は細胞集団の分化状態を変化させる方法が提供される。かかる方法は、ｉ）複数の異なるリボ核酸であって、各々が、リボ核酸が侵入する細胞の自然免疫応答を回避し、且つ目的のポリペプチドをコードする（それにより複数の異なるポリペプチドを産生する）ように改変されるリボ核酸を、細胞透過剤、及び薬学的に許容可能な担体と共に含有する組成物を提供する工程を含む。組成物の単位量は、目的とする複数の異なるポリペプチドを、組織の所定容積中に含まれる細胞の実質的な割合で産生するように決定され得る。この方法は、ｉｉ）組織の所定容積中に含まれる細胞の実質的な割合で目的の種々のポリペプチドを産生するのに必要な組成物の用量を決定する工程をさらに含む。目的の種々のポリペプチドは、所定容積に隣接する組織中の細胞の有意な割合（５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１％又は１％未満）の分化状態は変化させることなく、それらのタンパク質産生細胞の有意な量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％又は９５％超）の分化状態を変化させるのに影響を及ぼし得る量で産生されてもよい。この方法は、ｉｉｉ）哺乳動物対象の組織に組成物の用量を直接導入する工程をさらに含む。
【０１９５】
インビトロ翻訳
本発明の態様は、必要としている哺乳動物対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法に関する。ここでは、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する組成物の有効量が、本明細書に記載される送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞に局在化し、且つ細胞において核酸から組換えポリペプチドが翻訳されるような量及び他の条件下で提供される。核酸を局在化させる細胞、又は細胞が存在する組織は、１ラウンド又は２ラウンド以上の核酸投与で標的化され得る。
【０１９６】
局在化
本明細書に記載される組換えタンパク質は、細胞内、潜在的には核などの特定の区画内に局在化するように改変されてもよく、又は細胞から分泌されるか若しくは細胞の原形質膜に移行するように改変される。
【０１９７】
細胞の移植
本発明の他の態様は、修飾核酸を含む細胞を非ヒト脊椎動物対象に移植することに関する。哺乳動物対象への細胞の投与は、局在移植（例えば、局所又は皮下投与）、臓器送達又は全身注入（例えば、静脈内注射又は吸入）など、薬学的に許容可能な担体における細胞の製剤化と同様に、当業者に公知である。
【０１９８】
動物モデル
一実施形態では、修飾核酸及び増強核酸を非ヒト脊椎動物の動物モデルにおいて使用する、又はそれの作成に使用するための組成物、方法、キット、及び試薬が提供される。動物モデルにおいて使用される非ヒト脊椎動物の非限定的な例としては、霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、アフリカツメガエル、魚及びニワトリが挙げられる。一実施形態では、非ヒト脊椎動物が本発明の修飾核酸及び増強核酸で処置されてもよく、これは生物医学研究に有用であり得る。別の実施形態では、非ヒト脊椎動物を本発明の修飾核酸及び増強核酸で処置することにより、医薬開発用に分析され得る化合物をスクリーニング及び／又は試験し得る。
【０１９９】
一部の実施形態では、増強核酸は、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、ノックインマウス又はその他の遺伝的に操作されたマウスに送達され得る。かかる送達は、非天然タンパク質の発現、天然タンパク質の過剰発現、タンパク質発現の低減に、及び／又は他の遺伝子操作に有用であり得る。
【０２００】
ノックインモデル
一部の実施形態では、増強核酸を送達することにより、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌなどの、一過性ノックイン動物が作り出され得る。従来、ノックインモデルには、動物のゲノム内の特定の遺伝子座にポリヌクレオチド、遺伝子、複数の遺伝子及び／又は遺伝子断片を挿入することが関わる。かかる標的化した挿入により、挿入部位にある他の遺伝子の破壊を回避することができる。これは、所望のＤＮＡインサートを、標的種のゲノムのノンクリティカルな遺伝子座に対応する核酸配列に隣接させることにより達成され得る。受精胚に挿入すると、相同組換えのプロセスにより、ノンクリティカルな遺伝子座の部位に外来遺伝子を挿入することが可能となる。
【０２０１】
本発明によれば、修飾ｍＲＮＡ又は増強核酸分子を使用して、一過性ノックイン動物モデルが作り出され得る。この実施形態において、目的のタンパク質は、それをコードする核酸分子を介して送達される。従って、コードタンパク質が翻訳されている限り常に、動物におけるタンパク質発現が一過性に評価され得る。この実施形態により、生物系における１つ以上のタンパク質の効果についての制御された経時的研究が可能となる。
【０２０２】
さらなる実施形態において、遺伝子は、ノックイン細胞が容易に同定可能となるように促進する蛍光性又は化学的レポーターであってもよい。別の実施形態では、ノックイン遺伝子は、別の遺伝子の転写産物を標的化してノックダウンする核酸をコードしてもよい。
【０２０３】
ノックアウトモデル
一部の実施形態では、修飾核酸又は増強核酸が、限定はされないがマウス及びラットなどの、ノックアウト動物に送達されてもよい。ノックアウトマウス及び／又はラットは、ＤＮＡ、遺伝子、複数の遺伝子又は遺伝子の一部のセグメントをそのゲノムから欠失させたマウスである。こうした動物は、ノックイン動物とほぼ同じように作り出されるが、ＤＮＡインサートの隣接領域が、ノックアウトされる遺伝子の隣接領域と相同な配列を含む。次にこのインサートがゲノムＤＮＡに置き換わり、遺伝子の発現がノックアウトされる。さらなる実施形態において、インサートは蛍光性又は化学的レポーター遺伝子を含み、標的遺伝子が欠失している細胞の同定を容易にし得る。
【０２０４】
トランスジェニックモデル
一部の実施形態では、修飾核酸及び増強核酸がトランスジェニックマウス及び／又はラットに送達されてもよい。ノックイン及びノックアウト動物と同様に、トランスジェニック動物は、さらなる遺伝物質、又は導入遺伝子が導入されている動物である。ノックイン及びノックアウトモデルと異なり、さらなる遺伝物質はランダムな部位に組み込まれてもよく、従って組込みが、ときに別の遺伝子を破壊する。導入遺伝子を使用して、天然タンパク質を発現又は過剰発現させ、外来タンパク質を発現させ、所望のプロモーターの制御下にある所与の遺伝子を発現させ、阻害因子を発現させ、又はＲＮＡを発現させることにより、別の遺伝子の発現をノックダウンすることができる。
【０２０５】
非限定的な例として、修飾核酸又は増強ヌクレオチドを送達することによって発現するタンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼであってもよい。Ｃｒｅリコンビナーゼの送達は組織特異的又は細胞特異的であってよく、ｌｏｘＰ部位により挟まれた少なくとも１つのＤＮＡ領域を含む操作されたゲノムを有するノックイン動物又はトランスジェニック動物に送達され得る。ＤＮＡ領域を含む細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼの発現は、特定のＤ
ＮＡセグメントの除去、ひいてはノックアウトを促進し得る。
【０２０６】
ワクチン産生
一部の実施形態では、増強核酸が、卵をワクチン産生に用い得る特殊な無菌ニワトリに送達されてもよい。ワクチン製造者は無菌受精鶏卵を使用してヒト及び獣医学ワクチンを産生する。本発明の修飾核酸及び／又は増強核酸を特殊な無菌ニワトリに送達することは、非天然タンパク質の発現、天然タンパク質の過剰発現、タンパク質発現の低減に、又はニワトリの無菌状態を維持し、その健康を向上させ及び／又は産卵を増強する他の目的に有用であり得る。
【０２０７】
キット
本発明は、本発明の方法を好都合に及び／又は効果的に実施するための様々なキットを提供する。典型的にキットは、使用者による１例又は複数の対象の複数回の処置の実施及び／又は複数回の実験の実施を可能にするのに十分な量及び／又は数の構成要素を含み得る。
【０２０８】
一態様において、本発明は、本発明の修飾核酸又は増強核酸を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つ以上の機能抗体又はその機能断片を含む。
前記キットはタンパク質産生用であってよく、翻訳可能領域を含む第１の修飾核酸又は増強核酸を含む。キットは、包装及び説明書及び／又は製剤組成を形成する送達剤をさらに含み得る。送達剤は、生理食塩水、緩衝液、リピドイド又は本明細書に開示される任意の送達剤を含み得る。
【０２０９】
一態様において、本発明は、タンパク質産生用キットを提供し、これは以下を含む：翻訳可能領域を含む修飾核酸又は増強核酸（標的細胞に導入されたとき翻訳可能領域によりコードされるタンパク質を所望量産生するのに有効な量で提供される）；阻害性核酸を含む第２の修飾核酸又は増強核酸（細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される）；並びに包装及び説明書。
【０２１０】
一態様において、本発明は、タンパク質産生用キットを提供し、これは、翻訳可能領域を含む修飾核酸又は増強核酸であって、細胞ヌクレアーゼによる分解の低下を示す修飾核酸又は増強核酸、並びに包装及び説明書を含む。
【０２１１】
一態様において、本発明は、タンパク質産生用キットを提供し、これは、翻訳可能領域を含む修飾核酸又は増強核酸であって、細胞ヌクレアーゼによる分解の低下を示す修飾核酸又は増強核酸、及び第１の修飾核酸又は増強核酸の翻訳可能領域の翻訳に好適な哺乳動物細胞を含む。
【０２１２】
定義
約：本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載される値の±１０％を意味する。
併用で投与される：本明細書で使用されるとき、用語「併用で投与される」又は「併用投与」は、２つ以上の薬剤が対象に同時に、又は対象に対する各薬剤の効果が重複し得るような間隔内で投与されることを意味する。一部の実施形態では、それらの薬剤は、互いの約６０分、３０分、１５分、１０分、５分、又は１分以内に投与される。一部の実施形態では、薬剤の投与は、併用効果（例えば、相乗効果）が実現されるように、互いに十分に近い間隔が空けられる。
【０２１３】
動物：本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指し、そのうち脊椎動物が、脊索動物門の好ましい亜門である。詳細な実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は哺
乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、又はブタ）である。一部の実施形態では、動物としては、限定はされないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び魚類が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、又はクローンである。
【０２１４】
目的の抗原又は所望の抗原：本明細書で使用されるとき、用語「目的の抗原」又は「所望の抗原」には、本明細書に記載される抗体並びにその断片、突然変異体、変異体、及び変性体が免疫特異的に結合した本明細書に提供されるタンパク質及び他の生体分子が含まれる。特に、所望の抗原又は目的の抗原は、例えば、限定はされないが、インスリン、ネコインターフェロン、エリスロポエチン、シクロスポリン、チモシンβ−４、アルギニンバソプレシン、ウシソマトトロピン、オキシトシン、グレリン、ゴナドレリン、妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（ＥＣＧ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧＲＨａ）、膵酵素、Ｃｒｅリコンビナーゼ、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω又はＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦα及びＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦである。
【０２１５】
近似的に：本明細書で使用されるとき、用語「近似的に」又は「約」は、目的の１つ以上の値に適用されるとき、記載される基準値と同程度である値を指す。特定の実施形態では、用語「近似的に」又は「約」は、特に指定されない限り、又はその他文脈上明らかでない限り、記載される基準値のいずれの（より大きい又はより小さい）方向にも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満の範囲内に含まれる値の範囲を指す（かかる数が可能な値の１００％を超えることになる場合を除く）。
【０２１６】
〜と会合された：本明細書で使用されるとき、用語「〜と会合された」、「コンジュゲートされた」、「連結された」、「付着された」、及び「繋留された」は、２つ以上の部分に関して用いられるとき、それらの部分が、直接、或いは連結剤として働く１つ以上のさらなる部分を介して、互いに物理的に結び付けられ又はつながり、それにより十分に安定した構造を形成し、従ってその構造が用いられる条件下、例えば生理学的条件下でそれらの部分が物理的に結び付いたまま保たれることを意味する。
【０２１７】
生物学的に活性：本明細書で使用されるとき、語句「生物学的に活性」は、生体系及び／又は生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されたとき、当該の生物に対して生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると見なされる。詳細な実施形態において、核酸が生物学的に活性である場合、当該の核酸のうち、全核酸の少なくとも１つの生物学的活性を共有する部分は、典型的には「生物学的に活性」な部分と称される。
【０２１８】
保存された：本明細書で使用されるとき、用語「保存された」は、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のうち、比較される２つ以上の関連する配列の同じ部分において変化なく出現する、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチド又はアミノ酸は、配列の他の部分に現れるヌクレオチド又はアミノ酸と比べてより関連性の高い配列のなかで保存されているものである。
【０２１９】
一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存された」と言われる。一部の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、又は約９９％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である場合、「保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、又は約９９％同一である場合、「保存された」と言われる。
【０２２０】
細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば非ヒト脊椎動物細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、又はそれらの組み合わせを死滅させるか、又はそれに対して有害な、毒性の、若しくは致命的な効果を引き起こすことを指す。
【０２２１】
送達：本明細書で使用されるとき、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ又はペイロードを送達する行為又は様式を指す。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、少なくとも一部において、標的細胞への修飾核酸のインビボ送達を促進する任意の物質を指す。
【０２２２】
検出可能標識：本明細書で使用されるとき、「検出可能標識」は、Ｘ線撮影、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当該技術分野において公知の方法により容易に検出される別の実体と付着し、それで取り込まれ、又はそれと会合する１つ以上のマーカー、シグナル、又は部分を指す。検出可能標識としては、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びハプテン、量子ドットなどが挙げられる。検出可能標識は、本明細書に開示されるペプチド又はタンパク質の任意の位置に位置し得る。検出可能標識は、アミノ酸、ペプチド、若しくはタンパク質の中にあっても、又はＮ末端若しくはＣ末端に位置してもよい。
【０２２３】
改変された：本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、構造的であれ、又は化学的であれ、出発点の、野生型の、又は天然の分子から変化する特徴又は特性を有するように設計されるとき、「改変されて」いる。
【０２２４】
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下のイベントの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の（例えば転写による）産生；（２）ＲＮＡ転写物の（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）プロセシング；（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳；及び（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【０２２５】
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」には、少なくとも修飾核酸と送達剤とが含まれる。
断片：「断片」は、本明細書で使用されるとき、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含み得る。
【０２２６】
機能性の：本明細書で使用されるとき、「機能性の」生体分子は、それを特徴付ける特性及び／又は活性を示す形態の生体分子である。
相同性：本明細書で使用されるとき、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば核酸分子間（例えばＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子間）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である場合、互いに「相同」であると見なされる。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％類似している場合、互いに「相同」であると見なされる。用語「相同の」は、必然的に、少なくとも２つの配列間（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間）の比較を指す。本発明において、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチにわたり少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、又は少なくとも約９０％同一である場合、相同であると見なされる。一部の実施形態では、相同ヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の一意に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けられる。ヌクレオチド配列を相同であると見なすためには、互いに対するこれらのアミノ酸の同一性及び近似間隔の両方を考慮しなければならない。６０ヌクレオチド長未満のヌクレオチド配列について、相同性は、少なくとも４〜５個の一意に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力により決定される。本発明において、２個のタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチにわたり少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、又は少なくとも約９０％同一である場合、相同であると見なされる。
【０２２７】
同一性：本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子間（例えばＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子間）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つの核酸配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較を目的として２つの配列をアラインメントすることにより（例えば、最適なアラインメントのため第１及び第２の核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、及び比較を目的として非同一配列を無視することができる）、実施することができる。特定の実施形態では、比較を目的としてアラインメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドに占有されている場合、そのときこれらの分子は当該の位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一の位置の数の関数であり、ギャップは、２つの配列の最適アラインメントのために導入が必要なものである。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォマティクス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミスＤ．Ｗ．（
Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９３年；「分子生物学の配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ヘイネＧ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第Ｉ部、グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、及びグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９４年；及び「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）及びデベローＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトンプレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９１年に記載されるような方法を用いて決定することができ；これらの各々は、本明細書において参照により援用される。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）及びミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、第４巻、１１〜１７頁）のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、或いは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのギャッププログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列を使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法としては、限定はされないが、カリロＨ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）、及びリップマンＤ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭジャーナル・オブ・アプライド・マセマティクス（ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ）、第４８巻、１０７３頁、１９８８年（参照により本明細書に援用される）に開示されるものが挙げられる。同一性を決定する技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デベローＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第１号、３８７頁、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ  アルチュールＳ．Ｆ．（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、４０３頁、１９９０年）が挙げられる。
【０２２８】
遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物の量を低下させることを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドであってもよい。典型的には、ｍＲＮＡレベルの低下により、それから翻訳されるポリペプチドのレベルが低下する。発現レベルは、ｍＲＮＡ又はタンパク質を計測する標準的な技術を用いて決定され得る。
【０２２９】
インビトロ：本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）の体内ではなく、人工環境、例えば、試験管又は反応槽内、細胞培養下、ペトリ皿内等で起こるイベントを指す。
【０２３０】
インビボ：本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）の体内で起こるイベントを指す。
単離された：本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、（１）当初産生されたとき（天然であれ、又は実験状況であれ）にはそれが結び付いていた構成成分の少なくとも一部から分離されている、及び／又は（２）人間によって産生、調製、及び／又は製造された物質又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、それらが当初結び付いていた他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、
約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、それが実質的に他の構成成分を含まない場合、「純粋」である。
【０２３１】
家畜：本明細書で使用されるとき、「家畜」は、食品などの材料、労働力、並びに繊維及び化学品などの派生製品を生産するために農業環境で飼育される家畜動物を指す。概して、家畜には、潜在的な農業的意義を有するあらゆる哺乳類、鳥類及び魚類が含まれる。例えば、家畜には、四足の食肉処理用動物、例えば限定はされないが、去勢ウシ、若雌ウシ、雌ウシ、子ウシ、雄ウシ、畜牛、ブタ及びヒツジが含まれ得る。
【０２３２】
修飾された：本明細書で使用されるとき「修飾された」は、本発明の分子の変化した状態又は構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的方法を含め、多くの方法で修飾され得る。一実施形態では、本発明の修飾核酸分子は、例えば、それが天然のリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するとき、非天然のヌクレオシド及び／又はヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造などの非標準のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるものの、「修飾された」ものとは見なされない。
【０２３３】
天然に存在する：本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」は、人工的な補助なしに自然中に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書に記載されるとおり、「非ヒト脊椎動物」には、野生種及び家畜化された種を含め、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を除くあらゆる脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例としては、限定はされないが、哺乳類、例えば限定はされないが、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ヘラジカ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、マウス、ラバ、ブタ、ウサギ、ラット、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤク；鳥類、例えば限定はされないが、シロハラインコ、カナリア、アマサギ、ニワトリ、オウミガメインコ、コッカトゥー、コニュア、ハト（ｄｏｖｅ）、アヒル、フィンチ、ガチョウ、ラブバード、コンゴウインコ、インコ、オウム、パロットレット、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ピオヌス、ナナクサインコ、及びシチメンチョウ；爬虫類、例えば限定はされないが、イグアナ、トカゲ、ヘビ、ウミガメ、カメ；両生類、例えば限定はされないが、アシナシイモリ、カエル、イモリ、サンショウウオ、及びヒキガエルが挙げられる。
【０２３４】
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレームに終止コドンを含まない配列を指す。
【０２３５】
パラトロープ（ｐａｒａｔｒｏｐｅ）：本明細書で使用されるとき、「パラトロープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
薬学的に許容可能な：語句「薬学的に許容可能な」は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症のない、妥当なリスク対効果比に見合ったヒト及び動物の組織との接触における使用に好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指して用いられる。
【０２３６】
薬学的に許容可能な賦形剤：語句「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分であり（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解可能な媒体）、且つ患者において実質的に非毒性且つ非炎症性の特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば以下を挙げることができる：抗接着剤、抗
酸化剤、結合剤、被覆剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、塗膜形成剤又は被覆剤、香味、芳香剤、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤又は分散剤、甘味料、及び水和水。例示的な賦形剤としては、限定はされないが、以下が挙げられる：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトール。
【０２３７】
薬学的に許容可能な塩：本開示はまた、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、ここで親化合物は、既存の酸部分又は塩基部分をその塩形態に（例えば遊離塩基基を好適な有機酸と反応させて）変換することにより修飾されている。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定はされないが、アミンなどの塩基性残基の無機塩又は有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、並びに非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミン陽イオン、例えば限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば非毒性の無機酸又は有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、塩基部分又は酸部分を含む親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。概して、かかる塩は、遊離酸又は塩基形態のこれらの化合物を、水中又は有機溶媒中、又は両者の混合物中の適切な塩基又は酸の化学量論量と反応させることにより、調製することができる；概して、非水性媒体、例えばエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルベニア州、１９８５年、１４１８頁、「製薬用塩：特性、選択、及び使用」、Ｐ．Ｈ．シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）及びＣ．Ｇ．ウェルムート（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、及びベルゲ（Ｂｅｒｇｅ）���著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、１〜１９頁（１９７７年）に見出され、これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０２３８】
薬学的に許容可能な溶媒和物：用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子に取り込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に許容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、又はその混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、又は沈殿により調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と称される。
【０２３９】
予防する：本明細書で使用されるとき、用語「予防する」は、感染、疾患、障害及び／又は病態の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／又は病態の１つ以上の症状、特徴、又は臨床徴候の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／又は病態の１つ以上の症状、特徴、又は徴候の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の疾患、障害及び／又は病態からの進行を部分的又は完全に遅延させること；及び／又は感染、疾患、障害、及び／又は病態に関連する病変が発生するリスクを低下させることを指す。
【０２４０】
目的のタンパク質：「目的のタンパク質」又は「所望のタンパク質」には、本明細書に提供されるもの並びにその断片、突然変異体、変異体、及び変性体が含まれる。特に、所望のタンパク質／ポリペプチド又は目的のタンパク質は、例えば限定はされないが、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω又はＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦα及びＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦである。
【０２４１】
試料：本明細書で使用されるとき、用語「試料」は、その組織、細胞又は構成部分（例えば、限定はされないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、尿、膣液及び精液を含む体液）の一部を指す。試料には、全生物、又はその組織、細胞若しくは構成部分の一部、又はその画分若しくは部分量、限定はされないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側切片、気道、腸管、及び尿生殖路、涙液、唾液、乳、血球細胞、腫瘍、臓器から調製されるホモジネート、ライセート又は抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質又は核酸分子などの細胞成分を含有し得る栄養ブイヨン又はゲルなどの媒体を指す。
【０２４２】
類似性：本明細書で使用されるとき、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば核酸分子間（例えばＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子間）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いのパーセント類似性の計算は、同一性パーセントの計算と同じようにして実施することができるが、但し、パーセント類似性の計算は、当該技術分野において理解されるとおり保存的置換を考慮する。
【０２４３】
対象：本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「患者」は、本発明における組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的で投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類などの哺乳類）が挙げられる。
【０２４４】
実質的に：本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の全て又はほぼ全ての範囲又は程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が完結する及び／又は完全性に至る又は絶対的な結果を達成若しくは回避することは、あるにしても、まれであることを理解するであろう。従って用語「実質的に」は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を取り込むために使用される。
【０２４５】
〜に罹患している：疾患、障害、及び／又は病態「に罹患している」非ヒト個体又は集団は、疾患、障害、及び／又は病態と診断されているか、又はその１つ以上の症状を示している。
【０２４６】
〜に罹り易い：疾患、障害、及び／又は病態「に罹り易い」個体は、疾患、障害、及び／又は病態と診断されたことがなく、及び／又はその症状を呈していないこともある。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病態（例えば、癌）に罹り易い個体は、以下の１つ以上によって特徴付けられ得る：（１）疾患、障害、及び／又は病態の発生に関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、及び／又は病態の発生に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／又は病態に関連するタンパク質及び／又は核酸の発現及び／又は活性の増加及び／又は減少；（４）疾患、障害、及び／又は病態の発生に関連する習慣及び／又は生活様式；（５）疾患、障害、及び／又は病態の家族歴；及び（６）疾患、障害、及び／又は病態の発生に関連する微生物への曝露及び／又は感染。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病態に罹り易い個体においては、疾患、障害、及び／又は病態が発生することになる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病態に罹り易い個体において疾患、障害、及び／又は病態は発生しない。
【０２４７】
治療剤：用語「治療剤」は、対象に投与されると、治療的、診断的、及び／又は予防的効果を及ぼし、及び／又は所望の生物学的及び／又は薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【０２４８】
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、及び／又は病態に罹患しているか、又はそれに罹り易い対象に投与されたとき、感染、疾患、障害、及び／又は病態を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、及び／又はその発症を遅延させるのに十分である送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断用薬剤、予防剤等）の量を意味する。
【０２４９】
治療上有効な転帰：本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な転帰」は、感染、疾患、障害、及び／又は病態に罹患しているか、又はそれに罹り易い対象において、感染、疾患、障害、及び／又は病態を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、及び／又はその発症を遅延させるのに十分である転帰を意味する。
【０２５０】
治療する：本明細書で使用されるとき、用語「治療する」は、特定の感染、疾患、障害、及び／又は病態の１つ以上の症状又は特徴を部分的又は完全に軽減し、寛解させ、改善し、緩和し、その発症を遅延させ、その進行を阻止し、その重症度を低下させ、及び／又はその発生率を低下させることを指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長、及び／又は広がりを阻止することを指し得る。治療は、疾患、障害、及び／又は病態に関連する病変が発生するリスクを低下させることを目的として、疾患、障害、及び／又
は病態の徴候を呈していない対象、及び／又は疾患、障害、及び／又は病態の初期徴候のみを呈する対象に投与され得る。
【０２５１】
単位用量：本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、概して、対象に投与され得る活性成分の投薬量、及び／又はかかる投薬量の好都合な分割量、例えばかかる投薬量の２分の１又は３分の１などに等しい。
【０２５２】
修飾されていない：本明細書で使用されるとき、「修飾されていない」は、修飾される前の核酸を指す。
均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、又はルーチン程度の実験を用いて確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の詳細な説明に限定されることが意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。
【０２５３】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、そうでない旨が示されない限り、又はその他文脈上明らかでない限り、１つ又は２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバー間に「又は」を含むクレーム又は記載は、そうでない旨が示されない限り、又はその他文脈上明らかでない限り、群メンバーの１つ、２つ以上、又は全てが所与の製品又は方法に存在する、それにおいて用いられる、又はその他それに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、その群の正確に１つのメンバーが所与の製品又は方法に存在する、それにおいて用いられる、又はその他それに関連する実施形態を含む。本発明は、群メンバーの２つ以上、又は全てが所与の製品又は方法に存在する、それにおいて用いられる、又はその他それに関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、列挙されるクレームの１つ以上からの１つ以上の限定、要素、節、記述的用語等が別のクレームに導入される全ての変形、組み合わせ、及び並べ替えを包含することが理解されるべきである。例えば、別のクレームに従属する任意のクレームを、同じ基本クレームに従属する任意の他のクレームに見られる１つ以上の限定を含むように改変することができる。さらに、クレームが組成物を記載する場合、特に指示されない限り、又は矛盾若しくは不一致を生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される任意の目的のための組成物の使用方法が包含され、且つ本明細書に開示される作製方法又は当該技術分野において公知の他の方法の任意のものによる組成物の作製方法が包含されることが理解されるべきである。
【０２５４】
要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式で提示される場合、要素の各サブ群もまた開示され、且つ任意の１つ又は複数の要素を群から除いてもよいことが理解されるべきである。概して、本発明、又は本発明の態様が特定の要素、特徴等を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と言及される場合、一部の本発明の実施形態又は本発明の態様がかかる要素、特徴等からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）、又はそれから本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）ことが理解されなければならない。簡潔にするため、それらの実施形態を本明細書においてこのとおりの言葉で具体的に示すことはしていない。また、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は開放型であることが意図され、さらなる要素又は工程の包含が可能であることが注記される。
【０２５５】
範囲が与えられる場合、端点は含まれる。さらに、特に指示されない限り、又はその他文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値が、文脈上特に明確に指定されない限りその範囲の下限値の単位の１０分の１に至るまでの、本発明の種々の実施形態における示された範囲内の任意の特定の値又は部分的な範囲をとることができることが理解されるべきである。
【０２５６】
加えて、先行技術の範囲に含まれる本発明の任意の詳細な実施形態は、クレームの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は当業者に公知であると見なされるため、それらは、その除外が本明細書に明示的に示されない場合であっても除外され得る。本発明の組成物の任意の詳細な実施形態（例えば、任意のタンパク質；任意の核酸；任意の作製方法；任意の使用方法等）は、先行技術の存在との関連性の有無を問わず、何らかの理由で任意の１つ以上のクレームから除外され得る。
【０２５７】
引用出典、例えば、本明細書に引用される参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用が明示的に示されない場合であっても、参照により本願に援用される。引用出典と本願との記載に対立が生じた場合、本願の記載に統括するものとする。
【０２５８】
（実施例）
実施例１．修飾ｍＲＮＡ産生
本発明に係る修飾核酸（修飾ｍＲＮＡ）は、標準的な実験室的方法及び材料を用いて作製され得る。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には、強力なコザック翻訳開始シグナルを含み得る５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び／又は、鋳型によるポリＡテール付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得るα−グロビン３’ＵＴＲによって挟まれ得る。修飾ｍＲＮＡは、細胞の自然免疫応答を低下させるように修飾されてもよい。細胞性応答を低下させる修飾には、プソイドウリジン（ψ）及び５−メチル−シチジン（５ｍｅＣ又はｍ５Ｃ）が含まれ得る（カリコＫ（Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ）ら著、イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第２３巻、１６５〜７５頁、２００５年、カリコＫ（Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）、第１６巻、１８３３〜４０頁、２００８年、アンダーソンＢＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＲ）ら著、ＮＡＲ、２０１０年を参照のこと；参照により本明細書に援用される）。
【０２５９】
ＯＲＦはまた、様々な上流又は下流付加（例えば限定はされないが、β−グロビン、タグ等）も含むことができ、限定はされないがＤＮＡ２．０（メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）、カリフォルニア州）などの最適化サービスに注文してもよく、ＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位を含み得る。コンストラクトを入手後、それを再構成し、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し得る。
【０２６０】
本発明には、ＮＥＢ  ＤＨ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が用いられる。形質転換は、１００ｎｇのプラスミドを使用してＮＥＢの指示に従い実施される。プロトコルは以下のとおりである：
１．ＮＥＢ  ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の試験管を氷上で１０分間解凍する。
【０２６１】
２．１ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡが含まれる１〜５μｌを細胞混合物に添加する。試験管を４〜５回慎重に軽く振り、細胞とＤＮＡとを混合する。ボルテックスはしない。
【０２６２】
３．混合物を氷上に３０分間置く。混合はしない。
４．正確に３０秒間、４２℃の熱ショック。混合はしない。
５．氷上に５分間置く。混合はしない。
【０２６３】
６．９５０μｌの室温のＳＯＣを混合物中にピペッティングする。
７．３７℃で６０分間置く。激しく振盪（２５０ｒｐｍ）するか、又は回転させる。
８．選択プレートを３７℃に加温する。
【０２６４】
９．試験管を軽く振ったり、反転させたりすることにより、細胞を完全に混合する。
１０．５０〜１００μｌの各希釈物を選択プレートに広げ、一晩３７℃でインキュベートする。
【０２６５】
或いは、３０℃で２４〜３６時間又は２５℃で４８時間インキュベートする。
次に単一コロニーを使用することにより、適切な抗生物質を用いた５ｍｌのＬＢ増殖培地に接種し、次に５時間増殖させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次にこれを使用して２００ｍｌの培養培地に接種し、同じ条件下で一晩増殖させる。
【０２６６】
プラスミド（最大８５０μｇ）を単離するため、製造者の指示に従いインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア（ＨｉＰｕｒｅ）マキシプレップキット（カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）を使用して、マキシプレップを実施する。
【０２６７】
インビトロ転写（ＩＶＴ）用のｃＤＮＡを作成するため、初めにＸｂａＩなどの制限酵素を用いてプラスミドを線状化する。典型的なＸｂａＩによる制限消化は、以下を含み得る：プラスミド１．０μｇ；１０×緩衝液１．０μｌ；ＸｂａＩ  １．５μｌ；ｄＨ２Ｏ最大１０μｌ；３７℃で１時間インキュベートする。実験室規模（＜５μｇ）で実施する場合、反応は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）を製造者の指示どおり使用してクリーンアップする。より大規模な精製は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）などのより大きい負荷容量を備える製品で行う必要があり得る。クリーンアップ後、線状化したベクターを、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動を用いた分析により線状化を確認する。
【０２６８】
実施例２：ｃＤＮＡ作成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡを調製するためのＰＣＲ手順を、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）、マサチューセッツ州）による２×カパ・ハイファイ（ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ）（商標）ホットスタート・レディミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）を使用して実施する。このシステムは、２×カパ・レディミックス（ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇを含み；及び２５．０μｌにｄＨ２Ｏ希釈される。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、次に５８℃で１５秒間、次に７２℃で４５秒間、次に７２℃で５分間、次に終了まで４℃である。
【０２６９】
本発明のリバースプライマーは、ｍＲＮＡのポリＡ１２０のためのポリＴ１２０を組み込んでいる。より長い又はより短いポリ（Ｔ）トラクトを含む他のリバースプライマーを使用して、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの長さを調整することができる。
【０２７０】
インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）を製造者の指示どおり使用して、反応物をクリーンアップする（最大５μｇ）。より大きい反応物には、より大容量の製品を使用したクリーンアップが必要となり得る。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用してｃＤＮＡを定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析してｃＤＮＡが予想されたサイズであることを確認する。次にｃＤＮＡを配列解析に供してから、インビトロ転写反応に進む。
【０２７１】
実施例３．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応では、修飾ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は修飾ＲＮＡが産生される。入力のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物を、天然及び非天然のＮＴＰを使用してインハウスで作製する。
【０２７２】
典型的なインビトロ転写反応は、以下を含む：
１．鋳型ｃＤＮＡ  １．０μｇ
２．１０×転写緩衝液（４００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）２．０μｌ
３．カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）７．２μｌ
４．ＲＮアーゼ阻害剤  ２０Ｕ
５．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
６．ｄＨ２Ｏ最大２０．０μｌ、及び
７．３７℃で３時間〜５時間インキュベーション。
【０２７３】
翌日にクリーンアップするため、粗ＩＶＴ混合物を４℃で一晩保存してもよい。次に１ＵのＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼを使用して元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間インキュベートした後、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン（Ａｕｓｔｅｎ）、テキサス州）を製造者の指示に従い使用して、ｍＲＮＡを精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用してＲＮＡを定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、及びＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。
【０２７４】
実施例４．ｍＲＮＡの酵素的キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングを以下のとおり実施し、ここで混合物は、ＩＶＴ  ＲＮＡ６０μｇ〜１８０μｇ及びｄＨ２Ｏ最大７２μｌを含む。混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させた後、直ちに氷に移す。
【０２７５】
次にプロトコルは、１０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ  ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮアーゼ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（２８μｌまで）の混合；及び６０μｇのＲＮＡに対して３０分間又は１８０μｇのＲＮＡに対して最大２時間の３７℃でのインキュベーションを含む。
【０２７６】
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン（Ａｕｓｔｅｎ）、テキサス州）を製造者の指示に従い使用して、ｍＲＮＡを精製する。クリーンアップ後、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州）を使用してＲＮＡを定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適切なサイズであること、及びＲＮＡの分解が起こらなかったことを確認する。ＲＮＡ産物はまた、配列決定用のｃＤＮＡを作成する逆転写ＰＣＲを実行することにより、配列決定してもよい。
【０２７７】
実施例５．ポリＡテール付加反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物をクリーンにする前にポリＡテール付加反応を実施しなければならない。これは、キャップ付きＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮア
ーゼ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テール付加緩衝液（０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ  ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより行われる。ポリＡテールが既に転写物にある場合には、テール付加反応は省いて、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（オースティン（Ａｕｓｔｅｎ）、テキサス州）（最大５００μｇ）によクリーンアップに直接進んでもよい。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは酵母において発現する組換え酵素である。
【０２７８】
本明細書において実施及び記載される研究については、ポリＡテールは、１６０ヌクレオチド長を含むようにＩＶＴ鋳型においてコードされる。しかしながら、ポリＡテール付加反応の処理能力又は完全性から必ずしも正確に１６０ヌクレオチドにはならない場合もあることは理解されなければならない。従って約１６０ヌクレオチドの、例えば、約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４又は１６５のポリＡテールは本発明の範囲内にある。
【０２７９】
実施例６．リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤化
修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、製造者のプロトコルに従い５’−グアノシンキャップ構造を生じさせる以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用して、インビトロ転写反応中に同時に完了させ得る：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ）、マサチューセッツ州）。修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生じさせるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ）、マサチューセッツ州）を使用して、転写後に完了してもよい。ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を使用してキャップ１構造を生じさせてもよく、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルが生じる。キャップ１構造と、続く２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’側の終わりから３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化から、キャップ２構造を生じさせてもよい。キャップ２構造と、続く２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’側の終わりから４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化から、キャップ３構造を生じさせてもよい。酵素は、好ましくは組換え供給源に由来する。
【０２８０】
哺乳動物細胞にトランスフェクトされたとき、修飾ｍＲＮＡは１２〜１８時間又は１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間又は７２時間超の安定性を有する。