(57)【要約】      （修正有）【課題】除タンパク等の前処理をしなくても生体成分の分析を行うことができる、クロマトグラフィー用充填剤を提供する。【解決手段】細孔を有するシリカゲル担体の表面に、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヘキサジメチリンブロマイドより選ばれる親水性高分子物質が結合し、細孔中には炭素鎖及び金属、又は金属が結合している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔を有するシリカゲル担体の表面にメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びヘキサジメチリンブロマイドより選ばれる親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖及び金属が、又は金属が、結合されたクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
親水性高分子物質が分子量１０００から２００００００である請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
炭素鎖が、シアノ基、アリル基、アリール基、アミノ基、カルボン酸基、スルフォン酸基若しくは硫酸基で修飾されていてもよい直鎖状又は分岐を有する炭素鎖である請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
直鎖状又は分岐を有する炭素鎖の炭素数が１から３０である請求項３に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
親水性高分子物質が化学修飾を施した親水性高分子物質である請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
化学修飾がジオール化、還元化又はグルタール化である請求項５に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム。
【請求項８】
請求項１に記載した充填剤を充填したクロマトグラフィー用カラムに全血、血漿又は血清を注入し微量成分を分析又は分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、更に詳しくは血清等に存在する微量成分を直接分析できるクロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の物質の分離若しくは定性・定量分析などに高速液体クロマトグラフィーが広く用いられているが、その分離能力は接続されるカラムに大きく依存するため種々のカラムが開発、市販されている。中でも、特に広く用いられているのはシリカゲルなどの担体に炭素鎖を結合したカラムで、一般に逆相カラムと称されている。
【０００３】
高速液体クロマトグラフィーにおける分析方法は高分離能、高感度であるため、生体成分、例えば血漿中の低分子化合物の定量などに使用されることが多い。しかしながら、血漿中のアルブミンなどの生体成分は、特に逆相カラムを使用した場合、カラムに吸着しやすくカラム分離能の低下や溶媒送液圧の上昇をもたらすため、血漿蛋白質などを除去するための前処理が必要であった。この逆相カラムの欠点を克服するため、多孔性のシリカゲル担体の内部のみを化学修飾したカラムが提案されている（非特許文献１参照。）。
【０００４】
細孔を有する担体の表面にメチルセルロースなどの親水性高分子を結合させ、さらに細孔中に炭素鎖を結合させたクロマトグラフィー用充填剤も提案されている（特許文献１参照。）。この充填剤を用いたカラムを利用することにより、全血、血漿または血清をそのまま注入して分析することができる。つまり、生体試料中の低分子化合物の分析を行うと、除タンパク等の前処置が不要となり、直接生体成分の分析を行うことができ、分析法が簡便になり、分析時間も短くなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６９２９７４１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Anal. Chem. 1985, Vol. 57, p1757-1763
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
提案の充填剤又はカラムは、生体成分の妨害を除去し、しかも十分な保持力と分離力を持っている。しかし、細孔内に単に炭素鎖を結合させただけであるので、高極性化合物の保持が充分でなく、うまく分析できないことがある。
【０００８】
本発明は、生体試料中の低分子化合物、特に、これまで分析が困難であった高極性の塩基性化合物に対しても、除タンパク等の前処理をしなくても、直接に生体成分の分析を行うことができる充填剤と、そのような充填剤を充填したカラムを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、細孔を有する担体の表面に親水性高分子物質が結合し、細孔中に炭素鎖及び金属、又は金属が結合している。細孔中に炭素鎖及び金属が結合しているとは、細孔中に炭素鎖が化学的に結合し、さらに金属成分が高濃度に導入されていることを意味する。細孔中に金属が結合しているとは、細孔中に金属成分が高濃度に導入されていることを意味する。高濃度に導入された金属成分は、分離特性に影響を与えるように積極的に利用するためのものである。本発明の充填剤は、新たな分離特性をもったクロマトグラフィー用充填剤である。
【００１０】
本発明のカラムは、本発明の充填剤を充填したカラムであり、新たな分離特性をもったクロマトグラフィー用カラムである。
【００１１】
本発明における細孔を有する担体とは、シリカゲル、セルロース、アガロース又は合成ポリマー等を意味し、その粒子径は通常２〜１００μｍである。担体は表面から陥没した多数の細孔をもつため大きな比表面積をもつ。担体の比表面積は５０〜８００ｍ2／ｇ、より好ましくは２００〜４００ｍ2／ｇである。
【００１２】
親水性高分子物質とは、ヒドロキシル基等の親水性基を有する分子量１０００から２００００００の高分子物質であり、具体的にはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン又はヘキサジメチリンブロマイド等を挙げることができる。
【００１３】
本発明において、「担体の表面に親水性高分子物質が結合する」とは、実質的に担体の細孔中には親水性高分子が結合しておらず、担体表面に親水性高分子物質が物理的又は化学的に結合していることを意味する。
【００１４】
本発明における、親水性高分子物質は、その官能基の一部又は全部が化学的修飾されていてもよい。化学的修飾とは例えば、ジオール化、還元化又はグルタール化である。ジオール化とは、メタクリロキシ環の環状部位を希硫酸等で酸処理することにより２つのヒドロキシ基を生成させる反応等を意味する。
【００１５】
本発明おける、細孔中に結合した炭素鎖は、シアノ基、アリル基、アリール基、アミノ基、カルボン酸基、スルフォン酸基、硫酸基等で修飾されていてもよい直鎖状又は分岐を有する炭素鎖であり、炭素鎖は、担体とエステル結合、エーテル結合、アミド結合等の化学的な結合をしている。炭素鎖を修飾するには例えば、炭素鎖を有するシリル化剤をトルエン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン等の有機溶媒に溶解し、この溶液中に細孔に炭素鎖が結合したシリカゲルを入れ炭素鎖を化学的に修飾する方法等がある。
【００１６】
炭素鎖は、直鎖状でも分岐を有していてもよく、炭素鎖の炭素数は１から３０である。炭素鎖は、それを含む化合物より得られ、例えば、Ｃ４−１２を有するクロロシラン、イオン交換基を導入する材料である。オクタデシルトリクロロシランを含む。これら炭素鎖が担体中の表面に開いている細孔に化学的結合する。細孔径は、５０〜５００Åが良い。
【００１７】
本明細書において、上記「金属」は、「金属塩」、「金属イオン」、「金属アコイオン」等と特に別の記載をしない限り、金属塩を構成する金属イオン及び当該金属イオンに由来する金属（例えば、ＦｅＣｌ3におけるＦｅ）を含む概念である。上記「金属」は、少なくとも充填剤の使用時には、水又は水溶液に浸漬された担体において、金属イオンを与えると考えられる。本明細書において、「金属イオン」は、金属アコイオンを含む概念である。本明細書において、担体に対する「結合」とは、担体構成分子の三次元構造による捕捉のほか、吸着、水素結合等の分子間力による相互作用をも含む概念であり、本明細書における、担体に対する「固定化」と実質的に同義である。
【００１８】
導入された金属成分としてはＡｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ又はＡｇなどがあげられる。それらの金属成分は金属イオンとして高濃度に導入されている。高濃度に導入された金属成分とは、５０ｐｐｍ以上に含まれる金属イオンであり、不純物として含まれる金属イオンのことではない。そして、そのような５０ｐｐｍ以上に含まれる金属イオンは、２種類以上であってもよい。
【００１９】
通常、液体クロマトグラフの充填剤に使用されているシリカゲル内の金属不純物濃度は合計で３０ｐｐｍ以下となるように管理されている。本発明においては、担体に対し、金属不純物よりも高濃度に金属を導入する。したがって、５０ｐｐｍ以上の金属濃度は、担体に導入した金属のみならず、担体に予め不純物として含まれる金属をも含むものであってよく、担体に不純物として含まれる金属の種類及び導入した金属の種類の全ての合計である。金属は担体に飽和状態となる濃度で結合しているのが好ましい。飽和状態とは、シリカゲル外表面および細孔内面に保持される金属量が最大限度に達している状態、すなわち担体にこれ以上金属が導入できない状態である。担体に対して金属イオンが過剰になるように添加するだけで、所期の目的を達成させる分離媒体を調製することができる。
【００２０】
本発明はシリカゲルの残留金属不純物に起因する問題を解決するものでもあるので、そのような問題をもつ担体はシリカゲルに限らずシリカゲルを成分として含む担体も含む。シリカゲルを成分として含むそのような担体としては、無機／有機ハイブリッド粒子を挙げることができる。
【００２１】
本発明にかかるクロマトグラフィー用充填剤は以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含み、又はさらに（Ｃ）を含んで製造する。
（Ａ）シリカゲル又はシリカゲルを成分として含む担体をＡｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれた少なくとも１種の金属の金属塩水溶液に浸漬する工程。
（Ｂ）親水性高分子を加え、結合させる工程。
（Ｃ）炭素鎖を含む官能基を結合させる工程。
【００２２】
得られるクロマトグラフィー用充填剤は金属成分を含んでいるので、塩基性成分に特異的な保持を示す。塩基性成分に特異的な保持を持たせる方法としてはイオン交換基を結合させることが考えられるが、ここではシリカゲルと金属を加熱処理するだけで、同様の効果が得られている。また、充填剤表面の親水性高分子により、生体試料中の蛋白質などの高分子種は充填剤表面の親水性高分子により排除され、細孔中の炭素鎖又は金属に到達することなくカラムを通過する。一方、低分子化合物は充填剤表面の親水性高分子物質を通り抜け、充填剤細孔に達し、細孔中の炭素鎖又は金属により保持される。したがって、生体試料中の蛋白質などの高分子種の影響を受けずに低分子化合物に対してのみ十分な保持力と分離能を有する分析が可能となる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明にかかるクロマトグラフィー用充填剤を用いて生体試料中の低分子化合物、特に、これまで分析が困難であった高極性の塩基性化合物に対し、除タンパク等の前処理が不要となり、直接生体成分の分析を行うことができ、分析法が簡便になり、分析時間も短くなる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】一実施例のカラムがトラップカラムとして実装された液体クロマトグラフを示す流路構成図である。
【図２Ａ】牛血清溶液のみのクロマトグラムである。
【図２Ｂ】牛血清溶液に１２成分を添加した試料溶液のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一実施例のクロマトグラフィー用充填剤は、例えば次のようにして製造することができる。
【００２６】
シリカゲル（粒子径：５０μｍ、細孔径：１２ｎｍ）に０．２％（ｗ／ｖ）の塩化アルミニウム・六水和物水溶液を加え、約１２時間撹拌する。その後、グラスフィルターで金属を含むシリカゲルをろ過し、水、メタノールで洗浄する。その後、１５０℃で２時間乾燥させた後、１０００℃で２時間加熱する。
【００２７】
このシリカゲルに０．２％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン（分子量：３００００）アセトニトリル溶液を加え、約１０時間撹拌する。その後、ろ過し、アセトニトリルで洗浄する。最後に、１５０℃で約２時間乾燥させる。
【００２８】
一実施例のクロマトグラフィー用カラムは、一実施例の充填剤がチューブに充填されたものである。このカラムは例えばトラップカラムとして、液体クロマトグラフの一構成要素として使用することができる。
【００２９】
一実施例のカラムをトラップカラム１６として液体クロマトグラフに備えた例を図１に示す。そのトラップカラム１６は、流路切換え機構を構成する六方バルブ３０の２つのポート間に接続されている。
【００３０】
バルブ３０の他のポートには、トラップカラム１６に分析対象成分を捕捉させ夾雑物などを排出するためのトラップ用溶媒を供給する流路３５が接続されている。その流路３５には、溶媒３６Ａを供給するポンプ３８Ａからなる流路と、溶媒３６Ｂを供給するポンプ３８Ｂからなる流路が並列に接続されている。流路３５には試料溶液を注入するインジェクタ４０と、インジェクタ４０に並列に配置された希釈ライン４１が設けられている。
【００３１】
バルブ３０のさらに他のポートには液体クロマトグラフの分析カラム３２が接続されている。分析カラム３２はカラムオーブン（図示せず。）に収容されて一定温度に保たれている。分析カラム３２の下流には分析カラム３２から溶出した分析対象成分を検出する紫外可視分光光度計などの検出器３４が接続されている。分析カラム３２はトラップカラム１６よりも長く、分析カラム３２内にはトラップカラム１６とは異なる別の充填剤が充填されている。分析カラム３２の充填剤は、特に限定されず、例えば、シリカゲルに官能基としてＯＤＳ（オクタデシルシリル）基が結合された逆相クロマトグラフィー用カラムである。
【００３２】
トラップカラム１６に捕捉された分析対象成分を溶出して分析カラム３２に導くために、バルブ３０のさらに他のポートには分析用溶媒を供給する流路４５が接続されている。その流路４５は、２種類の溶媒によるグラジエント分析を行うことができるように、溶媒４２Ａを供給するポンプ４４Ａからなる流路と、溶媒４２Ｂを供給するポンプ４４Ｂからなる流路が並列に接続されている。
【００３３】
バルブ３０のさらに他のポートは液を排出するドレイン用ポートとなっている。
【００３４】
トラップカラムに試料溶液とともに供給する溶媒は、何種類を用いてもよく、例えば１〜５種類の溶媒を用いることができる。かかる溶媒としては、試料成分に適切であれば特に限定されないが、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液等が挙げられ、必要に応じ、アセトニトリル、メタノール、エタノール等の有機溶媒との混合液（体積比は、有機溶媒：水＝９０：１０〜１：９９が好ましく、８０：２０〜２０：８０がより好ましい。）を用いることができる。上記溶媒の供給は、例えば０．５〜２０ｍＬ／分、好ましくは１〜１０ｍＬ／分の流量により、例えば０．２〜１０分間、好ましくは１〜５分間行う。
【００３５】
図１における液体クロマトグラフ装置では、トラップとして溶媒３６Ａ又は３６Ｂがそれぞれのポンプ３８Ａ又は３８Ｂにより供給され、インジェクタ４０から試料溶液が注入される。試料溶液はトラップカラム１６を経てドレインへ流れる。その間に分析対象成分がトラップカラム１６に捕捉され、夾雑物が排出される。トラップ中も液体クロマトグラフの分析流路を安定化させるために、流路４５から分析カラム３２へ溶媒を一定流量で流す。
【００３６】
トラップ終了後、バルブ３０が切り換えられ、流路４５から分析用溶媒がトラップカラム１６を経て分析カラム３２に流される。これにより、トラップカラム１６に捕捉されていた分析対象成分が分析用溶媒により溶出されて分析カラム３２に導入される。分析カラム３２で分離された分析対象成分は検出器３４で検出される。分析用溶媒によるグラジエント分析は、行わなくてもよいが、図１における液体クロマトグラフ装置では、ポンプ４４Ａと４４Ｂを時間的に調節することにより、その混合比を変化させ、グラジエント分析を行うことができる。
【００３７】
具体的な例を示す。トラップカラム１６は、ステンレス製のカラム管（長さ１０ｍｍ、内径４．６ｍｍ）に一実施例の充填剤を充填したものである。
【００３８】
トラップ用の移動相の溶媒Ｍ３として５ｍｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液（水／アセトニトリル＝９５／５）（ｐＨ９）を使用し、溶媒Ｍ４として０．１％酢酸水溶液（ｐＨ４）を使用する。移動相として溶媒Ｍ３を１分間流した後、溶媒Ｍ４を１分間流す。流速は３ｍＬ／分である。
【００３９】
分析カラム３２としてＯＤＳカラム（ULTRON VX-ODS：長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ、シリカゲル粒径５μｍ）を使用し、カラム温度を４０℃とする。
【００４０】
分析用移動相の溶媒Ｍ１としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の０．１％水溶液を使用し、溶媒Ｍ２としてトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルと水の混合液（体積比６：４）を使用する。これらの溶媒は、１ｍＬ／分の流量で、グラジエント溶離モードで導入する。グラジエント動作は、この液体クロマトグラフの動作を制御する制御部（図示略）によりグラジエントプログラムに従って実行される。グラジエント条件は表１の通りである。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
検出器３４では２８０ｎｍでの紫外線吸光度を測定する。
【００４３】
測定対象の化合物として、ドネペジル塩酸塩、アゼラスティン塩酸塩、アテノロール、サルプリド、トリメトプリム、メトプロロール酒石酸塩、アルプレノロール塩酸塩、イミプラミン塩酸塩、安息香酸、ケトプロフェン、メチルパラベン及びプロピルパラベンの１２種類を取りあげ、これらをまとめて水／メタノール＝（７／３）溶液に溶解した。たんぱく質と共存する化合物を調べるために、牛血清にこれらの成分を含む上記の溶液を添加したものを試料とした。測定対象の化合物の濃度は、これらの１２成分を含む牛血清中のそれぞれの化合物の濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。
【００４４】
インジェクタ４０への試料注入量は１００μＬとした。試料としては、測定対象の化合物を含む上記の試料溶液のほかに、比較のために測定対象の化合物を含まない牛血清も測定した。
【００４５】
図１の液体クロマトグラフにおいて、インジェクタ４０から注入された試料溶液および牛血清は、希釈ライン４１により希釈されながら、移動相Ｍ３、移動相Ｍ４によりトラップカラム１６に導入され、目的成分のみが保持される。牛血清中のたんぱく質等はトラップカラム１６には保持されず、系外に排出される。
【００４６】
トラップカラム１６に保持された目的成分は六方バルブ３０が切り換えられることにより、溶媒Ｍ１、Ｍ２からなる移動相によりトラップカラム１６から溶出し、分析カラム３２に導入される。分析カラム３２で分離された目的成分は検出器３４で検出される。
【００４７】
一実施例のトラップカラム１６を使用して得られた測定結果を図２Ａと図２Ｂに示す。図２Ａは牛血清のみのクロマトグラム、図２Ｂは牛血清に１２成分を添加した試料溶液のクロマトグラムである。横軸は保持時間、縦軸は吸光度に対応する検出器の出力電圧である。
【００４８】
牛血清を注入しても、分析カラム３２の圧力上昇や性能の劣化は確認できなかったので、トラップカラム１６に試料を注入することにより、牛血清中のたんぱく質は系外に排出されたことがわかる。
【００４９】
図２Ａは牛血清に含まれる成分のうち、このトラップカラム１６に保持されるものを示している。図２Ｂのクロマトグラムのピークから図２Ａのクロマトグラムに含まれるピークを除いたものが牛血清に添加された成分のうちのこのトラップカラム１６に保持されるものである。
【００５０】
図２Ｂの結果から、１２成分のうち塩基性の８成分のみが選択的にトラップカラムに保持され、他の酸性成分および中性成分は系外に排出されたことがわかる。このことから、この充填剤及びそれを充填したカラムは、塩基性を示す成分が多い医薬品、とりわけ血清などの試料を分析するには最適であることがわかる。
【符号の説明】
【００５１】
１６      トラップカラム
３２      分析カラム
３０      六方バルブ
３４      検出器
３５      トラップ用移動相を供給する流路
４０      インジェクタ
４１      希釈ライン
４５      分析用移動相を供給する流路
【図１】
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【図２Ａ】
2015206738.tif 000005
【図２Ｂ】
2015206738.tif 000006