(57)【要約】【課題】コイル塞栓術に必要なコイルの柔軟性を維持しつつ、動脈瘤内の器質化により動脈瘤の破裂を抑制可能なコイルを提供する。【解決手段】リポソームに封入されたスタチンを金属製の素線材に担持してなる動脈瘤器質化用コイル。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームに封入されたスタチンを金属製の素線材に担持してなる動脈瘤器質化用コイル。
【請求項２】
コイルが、白金、タングステン、金、コバルト、クロム、チタン、タングステン、ニオブ、アルミニウム、タンタル、鉄、ニッケルから選択される金属又は２種以上の金属の合金から構成される、請求項１に記載のコイル。
【請求項３】
スタチンが、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン及びロスバスタチンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項１又は２に記載のコイル。
【請求項４】
脳動脈瘤の治療用である、請求項１〜３のいずれかに記載のコイル。
【請求項５】
動脈瘤内に留置されたときにコイルが周辺組織で被覆化される、請求項１〜４のいずれかに記載のコイル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈瘤器質化用コイルに関する。
【背景技術】
【０００２】
脳動脈瘤の治療は、開頭クリッピング術とカテーテルを用いたコイル塞栓術で行われている。欧米では70%以上が、我が国では現在30%程度がカテーテルを用いたコイル塞栓術で行われている。コイル塞栓術の低侵襲性から我が国においても年々コイル塞栓術の比率が増加しており、市場規模も拡大している。しかし、クリッピング術に比べて、コイル塞栓術は再治療率が高く(非特許文献１)、特に大きい動脈瘤では、再開通による再治療率は58％にもなると報告されている(非特許文献２)。再開通は再破裂に繋がり、せっかく救命し得た方が再び瀕死の状態に陥るため早急に対策を取る必要がある。
【０００３】
現在までに種々の器質化コイルが研究されてきた。例えばポリグリコール酸/ポリ乳酸(PGLA)の繊維を追加したコイル(非特許文献３)では、その効果が限定的であるうえに、操作性に難点がある。
【０００４】
特許文献1は、スタチン被覆したコイルを開示しているが、このスタチン被覆コイルは、血流中或いはヘパリンを含む生理食塩水を充填したカテーテル中でコイル表面のスタチンが溶出若しくは剥離して、動脈瘤内に留置される時点では十分量のスタチンがコイル表面に存在しないため、動脈瘤の器質化は起こらず、動脈瘤の破裂を完全に抑制することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2013-537046
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lancet. 2002: 360: 1267
【非特許文献２】AJNR, 2003 Feb;24(2):257
【非特許文献３】J Neurosurg. 2007 Jul;107(1):109-20
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、コイル塞栓術に必要なコイルの柔軟性を維持しつつ、動脈瘤内の器質化により動脈瘤の破裂を抑制可能なコイルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の動脈瘤器質化用コイルを提供することを目的とする。
項１．  リポソームに封入されたスタチンを金属製の素線材に担持してなる動脈瘤器質化用コイル。
項２．  コイルが、白金、タングステン、金、コバルト、クロム、チタン、タングステン、ニオブ、アルミニウム、タンタル、鉄、ニッケルから選択される金属又は２種以上の金属の合金から構成される、項１に記載のコイル。
項３．  スタチンが、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン及びロスバスタチンからなる群から選択される少なくとも一種である項１又は２に記載のコイル。
項４．  脳動脈瘤の治療用である、項１〜３のいずれかに記載のコイル。
項５．  動脈瘤内に留置されたときにコイルが周辺組織で被覆化される、項１〜４のいずれかに記載のコイル。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコイルは、動脈瘤内に留置されると、コイルによる血栓形成だけでなく、動脈瘤内の器質化が促進され、動脈瘤開口部の再開通が阻止される。動脈瘤内の器質化により瘤開口部の内皮化も生じるためコイルコンパクションの問題はなく、本発明のコイルを用いた塞栓術により動脈瘤、特に脳動脈瘤の破裂は効率よく抑制される。
【００１０】
本発明のコイルは、動脈瘤の器質化に大変優れているので、動脈瘤の直径が15mm以上、特に25mm以上の大きな動脈瘤であっても瘤内の器質化とそれによる再開通の阻止が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】脳動脈瘤治療の現状
【図２】コイルの柔軟性を失わないスタチン担持方法
【図３】スタチン封入リポソーム担持コイル
【図４】脂質に対して仕込んだ薬剤量を増加させていった場合に、取り込まれる薬剤量が直線的に増加することを示す図である。横軸が脂質に対する仕込んだ薬剤量をmol比で、縦軸を脂質に対して取り込まれた薬剤量をmol比で表している。
【図５】(A) 表面プラズモン共鳴(SPR)測定結果から、白金表面でDNAハイブリダイゼーションによってリポソームが固定化されたことを示す。グラフは横軸が時間(min)、縦軸が共鳴角を表しており、共鳴角の増減は金表面への物質の吸着脱離と対応している。(B) 蛍光退色後回復観察(FRAP)を行うことにより、蛍光を退色させた部分(図中央)が10分経過しても蛍光の回復が見られないことから、リポソームが白金表面に球状の状態で固定化されたことを示している。
【図６】コイル表面への接着・コイル柔軟性の確認
【図７】リポソームからのスタチンの徐放
【図８】脳動脈瘤モデルの器質化促進効果
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者が開発したリポソームに薬剤（スタチン）を封入した動脈瘤治療用のコイルは、コイルの柔軟性、操作性を失うことなく薬剤を担持可能である。
【００１３】
本発明のコイルは、動脈瘤の治療に使用される。動脈瘤としては、胸部大動脈瘤、腹部大動脈瘤、内臓器動脈瘤、末梢動脈瘤、脳動脈瘤、冠動脈瘤が挙げられ、脳動脈瘤が本発明のコイルによる好適な治療対象である。
【００１４】
本明細書において、「コイル」とは、動脈瘤のコイル塞栓術に使用されるものである。例えば脳動脈瘤のコイル塞栓術は、局所麻酔下に大腿動脈にカテーテルを挿入し、カテーテルを頸部の動脈まで誘導後、その管の中にマイクロカテーテルを通して、先端を脳動脈瘤内まで送り込み、マイクロカテーテル内の金属製の素線材をマイクロカテーテルの先端から動脈瘤内に送り込み、図１に示すように動脈瘤内で巻回させて動脈瘤内に詰め込み、素線材を切り離して留置する。本明細書に記載される「コイル」とは、マイクロカテーテル内の細長い線状の素線材と動脈瘤内で巻回された糸巻き状の物体の両方を含む。従って、本発明のコイルは、素線材を内部に配置した動脈瘤治療用のマイクロカテーテルを包含する。
【００１５】
コイルがマイクロカテーテル内の素線材の場合、素線材の直径は、２０〜１２０μｍ程度、好ましくは３０〜６０μｍ程度である。この素線材を、らせん状又は糸巻き状に巻回して動脈瘤内に留置される場合、「コイル」の大きさは動脈瘤のサイズにより決まるが、例えば、直径１００〜３０００μｍ程度のコイルを形成することができる。１つの動脈瘤内に１つ又は複数のらせん状又は糸巻き状のコイルを留置することができる。
【００１６】
コイルを構成する金属は、例えば、白金、タングステン、金、コバルト、クロム、チタン、タングステン、ニオブ、アルミニウム、タンタル、鉄、ニッケルから選択される少なくとも１種の金属及びこれらの金属の組み合わせでできる合金を例示することができ、好ましい金属は、白金、ステンレス鋼、タンタル、タンタル合金、白金−タングステン合金、白金−金合金、金、金合金、コバルトベースクロム合金であり、白金、白金−タングステン合金、ステンレス鋼、白金−金合金がより好ましく、白金−タングステン合金及び白金−金合金が最も好ましい。
【００１７】
コイルの表面にはリポソームに封入されたスタチンが担持される。ここで、スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の働きを阻害することによって、血液中のコレステロール値を低下させる薬物を意味し、このような作用を有する限り、現在販売され、あるいは公知である物質と将来開発される物質の両方を包含し得る。本発明に係る「スタチン」には、薬理学的に許容されるスタチン類化合物が含まれる。そのようなスタチン類として、具体的には、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンが挙げられる。
【００１８】
上記コイル表面に担持されるスタチンの量は、本発明が目的とする血管治療材料を得ることができる限り限定されることはないが、０．１μｇ〜５００μｇ／１０ｍｍ・コイル（素線材）であることが好ましく、５〜６０μｇ／１０ｍｍ・コイル（素線材）であることがより好ましい。
【００１９】
リポソームの粒径は、30〜800nm程度、好ましくは50〜600nm程度、特に100〜400nm程度である。本発明で使用されるリポソームは、多重層リポソーム、一枚膜リポソームのいずれであってもよい。リポソームは超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法などにより作製され、リン脂質、糖脂質、ステロール類、グリコール類、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質（例えばＰＥＧ-リン脂質）などから選ばれる脂質が含まれる。
【００２０】
リポソームはコイル表面にリポソーム含有溶液を塗布し、乾燥させる方法で吸着（担持）させてもよい。また、リポソームとコイルは、適当なスペーサーを介して共有結合で結合(担持)させてもよく、核酸(DNA、RNA)のハイブリダイゼーションを利用して担持させてもよい(図2，3)。金、白金などの金属製のコイル表面は、SH基を有する化合物と反応させて(金属)-S結合を形成し得る。HS-(スペーサー)-R（Rはカルボキシル基（COOH）、アミノ基（NH2）、モノアルキルアミノ基、エステル基等の反応性官能基）で示される化合物を金属コイルと反応させて、(金属)-S-(スペーサー)-Rを作製し、R基とリポソームを構成する脂質とをスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いて結合させ、末端の脂質をリポソームの構成要素とすることで、リポソームをコイルに担持することができる。上記Rで表されるエステル基としては、アルコキシカルボニル基(メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブトキシカルボニルなど)、アリールオキシカルボニル基(フェノキシカルボニル)、アラルキルオキシカルボニル基(ベンジルオキシカルボニルなど)等が挙げられ、モノアルキルアミノ基はメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノブチルアミノなどが挙げられる。
【００２１】
スタチンは、リポソームに封入される。本明細書において、「封入」とは、リポソームとスタチンが一体化される(一体的に動く)  ことを意味し、リポソームにスタチンを封入する場合、リポソームの脂質膜表面(内表面、外表面)に吸着もしくは結合する場合、脂質膜の内部にスタチンを包含する場合、スタチンが脂質膜の内部に存在する場合などが含まれる。スタチンのリポソーム中の封入率は、１〜６０％、好ましくは５〜５５％、より好ましくは１０〜５０％、さらに好ましくは１５〜４５％、特に好ましくは２０〜４５％、最も好ましくは２５〜４０％である。
【００２２】
本発明のリポソームを構成する脂質膜に含まれる好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。
【００２３】
その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または合成した炭素鎖n（nは3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、カルジオリピン、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、卵黄レシチン、水素添加卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加大豆レシチンなどが挙げられる。より好ましくは、飽和脂肪酸を構成成分とする脂質である。
【００２４】
本発明のリポソームを構成する脂質膜の構成成分として、電荷を有する脂質を含めてもよく、アニオン性脂質として、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどが挙げられる。
【００２５】
本発明のリポソームを構成する脂質膜のアニオン性構成成分として、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが挙げられる。リポソームの脂質膜を構成するアニオン性の脂質膜成分には、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどの負に荷電したリン脂質のほかに、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジン酸、ジセチルリン酸(DCP)、ジラウリルリン酸、ジミリスチルリン酸、ホスファチジルグリセロールリン酸などを挙げることができる。
【００２６】
カチオン性脂質としては、例えば3β-［N-（N’、N’-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC-chol）、1、2-ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、N、N-ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-［1-（2、3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N、N、N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、2、3-ジオレイルオキシ-N-［2（スペルミン−カルボキサミド）エチル］-N、N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）及びN-［1-（2、3-ジミリスチルオキシ）プロピル］-N、N-ジメチル-N-（2-ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）、さらにジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステル、またはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなども挙げられる。
【００２７】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００２８】
リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、脂質膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、デスモステロール、チモステロール、スチグマステロール、ラトステロール、ラノステロール、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、コレスタノール、またはビタミンＤ類などが挙げられる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例及び比較例を例示して本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、これらの実施例は単なる例にすぎず、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
本研究ではスタチンの一種であるピタバスタチンを封入したリポソームを作製し、両親媒性高分子である単鎖オリゴDNA-ポリエチレングリコール-脂質複合体(ssDNA-PEG-脂質)とコイル表面に固定されたssDNA’間の塩基対形成を利用して、リポソームをコイル表面に固定化し、その器質化能の向上を図った。
【００３１】
（１）材料と方法
卵黄ホスファチジルコリンとピタバスタチンをメタノールに溶解し、溶媒を除去した後に水和させリポソームを作製した。リポソームを孔径0.8μm、0.22 μmのフィルターを通して粒径を整えた。ゲル濾過カラムを通した後にリポソームが溶出する分画を回収し(図２)、HPLC測定により、リポソームに封入されたピタバスタチン量を決定した(図４)。
【００３２】
末端にマレイミド基を有するPEG-脂質(PEG 分子量:5000)と、5’末端にチオール基を有する20残基のデオキシアデニル酸(oligo(dA)20-SH)を反応させ、ssDNA-PEG-lipidを合成した(図３)。
【００３３】
oligo(dT)20-SHを白金コイル表面に固定化し、oligo(dA)20-PEG-脂質をリポソームに導入し、両者を作用させることでリポソームをコイル表面に固定化した(図３)。塩基対形成による白金表面へのリポソームの固定化は、表面プラズモン共鳴法(SPR)を用いて決定した(図５)。図５(A)において、SH-oligo(dT)20は、白金表面に自己組織化単分子膜(SAM)を形成させるためにSH-oligo(dT)20を導入させたところ共鳴角の増加がみられたことから、白金表面にDNAとしてチミン(T)が提示できたことを示している。BSA は、リポソームを導入すると白金表面でDNAのついていないスペースに非特異的な吸着が起こるため、それを防ぐためにウシ血清アルブミン(BSA)を導入させたところ共鳴角の増加がみられたことから、白金表面をBSAでブロッキングできたことを示している。oligo(dA)20-lipoomeは、白金表面に呈示したチミン(T)と相補的な関係にあるアデニン(A)を修飾したリポソームを導入することによってDNAハイブリダイゼーションにより白金表面へのリポソームの固定化を試みている。oligo(dA)20-lipoomeを導入した際に共鳴角の増加が見られることからリポソームが白金表面へ固定化されたことがわかる。また、DNAを修飾していないリポソームを導入しただけでは共鳴角の増加が見られないことから、この系ではDNAハイブリダイゼーションなしでは白金表面へリポソームが固定化されないことを示している。図５（ｂ）において、蛍光標識したリポソームを基板上に播種した際にリポソームが割れて脂質二重膜をした場合には、一部に強い光を当て消光させた時に脂質の流動に伴い退色した部分の蛍光が回復するが、蛍光標識したリポソームが球状に基板上に存在している場合は脂質膜の流動が伴わないため蛍光の回復が見られない。したがって、今回の系では蛍光を退色させた部分の回復が見られなかったため、リポソームが白金表面に球状の状態で固定化されたことを示している。
【００３４】
蛍光ラベル化したリポソームを固定化し、強い励起光を当て一部を消光させた後に、脂質流動にともなう蛍光の回復の観察から、白金基板に固定化したリポソームの状態を推察した。リポソームのコイル表面への接着とリポソーム担持後にもコイルの柔軟性は変化しないことを確認した（図６）。
【００３５】
さらに、リポソーム固定化コイルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸漬し、所定時間後PBSをHPLCで分析することで、スタチンの徐放量を決定した(図７)。
【００３６】
脳動脈瘤モデルはWistarラット(10-13週齢,♂)の外頸動脈遠位端を結紮することで作製した。脳動脈瘤にスタチン含有リポソーム固定化コイルを埋め込み、2週間後にモデル瘤部の組織を摘出し、HE染色とマッソントリクローム染色を行った。器質化割合はImage Jを用いて測定した(図８)。
【００３７】
（２）結果
ピタバスタチンの仕込み量の増加と共に、リポソームへの封入量は線形に増加した(図４)。ピタバスタチンの封入率が33.8％のリポソームを調整し、以下の実験に用いた。
【００３８】
oligo(dT)20-SHを固定化した白金表面に、oligo(dA)20-PEG-脂質で修飾したリポソームを作用させると、SPR共鳴角の増加が見られた（図２）。一方、未修飾のリポソームでは、共鳴角は増加しなかった。このように、oligo(dT)20とoligo(dA)20間の塩基対形成により白金表面にリポソームを固定化できることが示された。白金蒸着ガラス基板に蛍光標識リポソームを固定化し、その一部に励起光を照射し消光させた。10分後観察したところ蛍光の回復は見られなかった(図 2.(B))。これは、リポソームが白金基板上で割れて脂質膜を形成したのではなく、球状を保ちながら固定化されていることを示している。
【００３９】
ピタバスタチン含有リポソームを固定化した白金コイルをPBSに浸漬したところ、ピタバスタチンは時間経過に伴う徐放が見られた(図７)。
【００４０】
試料を埋め込み後2週間の動脈瘤モデルの器質化率を図８に示した。ラットの脳動脈瘤にピタバスタチンを封入したリポソーム固定化コイルを埋めたときには、脳動脈瘤内部は94％が器質化された。これに対して、ピタバスタチンを封入していないリポソーム固定化コイルや未修飾のコイルでは、それらの器質化率はそれぞれ52％と40％であった。以上の実験結果は、スタチンを封入したリポソーム固定化コイルが脳動脈瘤の器質化に有効であることを示唆している。
【００４１】
（３）結論
ssDNA-PEG-脂質を用いることで、ピタバスタチン含有リポソームを白金コイル表面に球状を維持した状態で固定化することができた。このコイルはラット動脈瘤モデルで、効率的に瘤内を器質化出来ることを示した。より治療効率の高い脳動脈瘤治療デバイスとして期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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