(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌剤として有用な新規ジテルペン、及び該ジテルペンを含有すプロポリス抽出物の提供。【解決手段】ナンヨウスギ科及びイイギリ科の植物を起源とするプロポリス原塊から抽出した式（１）で示されるジテルペン、及び該ジテルペンを含有すプロポリス抽出物。2015205824.tif 000013【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）に示される構造を有する新規ジテルペン。
【化１】
2015205824.tif 000010
【請求項２】
原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物であって、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを固形分中に１．５質量％以上含有するプロポリス抽出物。
【化２】
2015205824.tif 000011
【請求項３】
請求項１に記載の新規ジテルペン又は請求項２に記載のプロポリス抽出物を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項４】
請求項１に記載の新規ジテルペンの製造方法において、
原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を含む新規ジテルペンの製造方法。
【請求項５】
前記抽出処理する工程の後に、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程を含む請求項４に記載の新規ジテルペンの製造方法。
【請求項６】
原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られ、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを含有するプロポリス抽出物の評価方法において、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とするプロポリス抽出物の評価方法。
【化３】
2015205824.tif 000012
【請求項７】
前記プロポリス抽出物中の抽出成分について、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程、次に前記一般式（１）に示される新規ジテルペンを検出する工程を含む請求項６に記載のプロポリス抽出物の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば特定の植物を起源植物として作られたプロポリス原塊から得られる新規ジテルペン及びその製造方法、抗癌剤、プロポリス抽出物、並びに新規ジテルペンを用いたプロポリス抽出物の評価方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
プロポリスは、巣の防御及び補強等を目的として、ミツバチが採取した植物の滲出液、新芽、及び樹脂等にミツロウを混ぜて作られる膠状ないしは蝋状の物質である。このプロポリスは、ミツバチが原料として巣箱周辺の種々の植物を採取して生産されるため、多種多様な成分を含有している。
【０００３】
プロポリスは、抗菌効果や抗炎症効果を有していることが古くから知られている。また、プロポリスの主要な生理活性として、抗酸化作用及び免疫賦活作用が知られている。そのため、プロポリスは、医薬品或いは健康食品の素材として古くから用いられてきた。プロポリス中に含まれる有効成分としては、極性の高い有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、さらには極性の低いテルペノイド類等の非常に多様な種類の有効成分が確認されている。
【０００４】
ところで、プロポリスの産地としては、例えば中国、ブラジル、アルゼンチン、ウルグアイ等の南米諸国、ハンガリー、ブルガリア等のヨーロッパ、カナダ等の北米、オーストラリア、ニュージーランド等のオセアニアが産地となっている。近年、非特許文献１に開示されるように多くの研究者により産地別プロポリスの含有成分の相違に関する研究が進められている。これらの産地ごとにおける成分の相違は起源植物の種類によって異なってくるものと考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】田澤茂実ら：生薬学雑誌、５４（６），３０６−３１３，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的とするところは、様々な分野に適用することができる新規ジテルペン及びその製造方法、抗癌剤、プロポリス抽出物、並びに新規ジテルペンを用いたプロポリス抽出物の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ブラジル・パラナ州産のブラウンプロポリス原塊から新規ジテルペンを得たことに基づくものである。
上記目的を達成するために、本発明の一態様では、下記一般式（１）に示される構造を有する新規ジテルペンが提供される。
【０００８】
【化１】
2015205824.tif 000002
また、本発明の別の一様態では、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物であって、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを固形分中に１．５質量％以上含有することを特徴とするプロポリス抽出物が提供される。
【０００９】
【化２】
2015205824.tif 000003
また、前記新規ジテルペン又は前記プロポリス抽出物を有効成分として含有する抗癌剤が提供される。
【００１０】
また、本発明の別の一様態では、前記新規ジテルペンの製造方法において、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を含む新規ジテルペンの製造方法が提供される。前記抽出処理する工程の後に、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程を含むことが好ましい。
【００１１】
また、本発明の別の一様態では、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られ、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを含有するプロポリス抽出物の評価方法において、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とすることを特徴とするプロポリス抽出物の評価方法が提供される。
【００１２】
【化３】
2015205824.tif 000004
前記プロポリス抽出物中の抽出成分について、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程、次に前記一般式（１）に示される新規ジテルペンを検出する工程を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、新規ジテルペン等を様々な分野に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ブラウンプロポリス抽出液中の新規ジテルペン成分について、1H-NMRスペクトルの測定結果を示すデータ。
【図２】ブラウンプロポリス抽出液中の新規ジテルペン成分について、13C-NMRスペクトルの測定結果を示すデータ。
【図３】ブラウンプロポリス抽出液中の新規ジテルペン成分について、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）を用い、Positiveモードでの質量分析の結果を示すデータ。
【図４】ブラウンプロポリス抽出液中の新規ジテルペン成分について、赤外線吸収スペクトル（IR）の測定結果を示すデータ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（第１の実施形態）
以下、本発明の新規ジテルペンを具体化した第１の実施形態を説明する。
本実施形態の新規ジテルペンは、下記一般式（１）で示される構造を有する化合物である。
【００１６】
【化４】
2015205824.tif 000005
一般式（１）に示される新規ジテルペンは、１８，１９−エポキシ−２−オキソクレロダ−３，１２，１４−トリエン−６，１８，１９−トリオール１８，１９−ジアセタート６−ベンゾエート（18,19-Epoxy-2-Oxocleroda-3,12,14-triene-6,18,19-triol 18,19-diacetate 6-benzoate）（Ｃ31Ｈ36Ｏ8、分子量５３６）である。一般式（１）に示される新規ジテルペンは、カセアリン系のクレロダン骨格を有している。本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、高い抗癌作用を有している。そのため、一般式（１）に示される新規ジテルペンを有効成分として含有する抗癌剤として、好ましく適用することができる。抗癌剤は、抗癌作用を効果・効能とする医薬品、医薬部外品、飲食品、化粧品、研究用試薬等の形態で適用され得る。
【００１７】
次に、本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンの製造方法について説明する。
一般式（１）に示される新規ジテルペンの製造方法は、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を備えてなる。
【００１８】
一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ブラジル・パラナ州産ブラウンプロポリス原塊から見出された。ブラジル・パラナ州産ブラウンプロポリスは、主にブラジル・パラナ州に生息するナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られていると考えられている。ナンヨウスギ科の植物として、具体的にはナンヨウスギ属（アラウカリア）が挙げられ、より具体的には、Araucaria angustifolia（パラナマツ）及びAraucaria heterophyllaが挙げられる。一般式（１）に示される新規ジテルペンは、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリアを主たる起源植物としているブラジルのサンパウロ州やミナスジェライス州原産のグリーンプロポリス原塊中には含有されていない。
【００１９】
プロポリス原塊中の起源植物にナンヨウスギ科又はイイギリ科を含有させるためは、例えばプロポリス採集用に工夫されたミツバチの巣箱をナンヨウスギ科又はイイギリ科の植物群に程近い場所等に配置することにより達成することができる。ミツバチの蜜及び花粉やプロポリスの原料を採取する範囲は数キロ（半径約２〜５キロ以内）であるためその範囲内をナンヨウスギ科又はイイギリ科で占めることが好ましい。ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊は、目視においてブラウン色を呈することが好ましい。
【００２０】
プロポリス原塊からの一般式（１）に示される新規ジテルペンの抽出方法は、公知の抽出法、例えば親水性有機溶媒又は水／親水性有機溶媒の混合溶媒を用いた抽出法、超臨界抽出法等が用いられる。これらの中で一般式（１）に示される新規ジテルペンを効率よく抽出することができる観点から、水／親水性有機溶媒の混合液を用いた抽出法が好ましく適用される。本実施形態において用いられる親水性有機溶媒としては、水に溶解する性質を有するエタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールのほか、アセトンやエーテル類、クロロホルム等を適宜選択して使用することができる。これらの親水性有機溶媒を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、生体へ適用することを考えればエタノールが最も好ましい。
【００２１】
前記溶媒を用いて抽出する場合、抽出処理前に採取時に混入するゴミ等の夾雑物を除去し、粗粉砕することが好ましい。例えば、水／親水性有機溶媒の混合液又は親水性有機溶媒においてエタノールを用いる場合、その濃度は、好ましくは５０〜１００容量％、より好ましくは７０〜１００容量％、最も好ましくは９５容量％である。エタノール濃度が５０容量％以上の場合には、有効成分の抽出率をより向上させることができる。エタノールの配合割合を高めることにより一般式（１）に示される新規ジテルペンの抽出効率をより高めることができる。エタノール溶媒の使用容量は、プロポリス原塊の質量に対して好ましくは１〜２０倍量、より好ましくは２〜１０倍量である。エタノール溶媒の使用容量が１倍量以上の場合には、目的成分の抽出率をより向上させることができる。一方、エタノール溶媒の使用容量が２０倍量以下の場合には、装置をより大きくする必要がなく、濃縮等の工程の処理時間をより短縮することができ、作業性をより向上させることができる。
【００２２】
抽出温度は抽出溶媒の種類により適宜設定されるが、２〜４０℃であることが好ましい。抽出温度が２℃以上の場合には、有効成分の抽出率をより向上させることができる。一方、抽出温度が４０℃以下の場合には、ロウ成分の抽出をより抑制することができ、抽出後の濾過性をより向上させることができる。また、揮発性の高い抽出溶媒の場合、溶媒の蒸発をより抑制することができる。なお、抽出操作は、前記抽出温度で攪拌しながら所定時間、例えば３時間以上行えばよい。そして、上記の抽出条件で有効成分を十分に抽出した後、濾紙濾過、珪藻土濾過などの濾過処理を行うことにより溶媒抽出物を得ることができる。
【００２３】
プロポリス原塊から抽出溶媒を用いて抽出処理する工程を経た場合、例えば該溶媒抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いてさらに分離する工程を経ることにより、一般式（１）に示される新規ジテルペンを分離・精製することができる。抽出又は精製工程における分離・精製の程度は、精製された一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とすることにより、又は各種成分分析することにより行うことができる。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えばガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、具体的にはシリカゲル担体を用いることが抽出成分の分離効率が優れる観点から好ましい。シリカゲル担体として、表面がオクタデシルシリル基（ＯＤＳ）等により表面修飾されたものを使用してもよい。
【００２４】
本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンによれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、高い抗癌作用を有している。したがって、抗癌作用を目的とした医薬品等の各種用途に好ましく適用することができる。
【００２５】
（２）好ましくは、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出することができる。したがって、容易且つ安定的に原料を入手することができる。また、得られた一般式（１）に示される新規ジテルペンは、安全に各種用途に適用することができる。
【００２６】
（３）好ましくは、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊を抽出原料として、抽出溶媒を用いて得られた抽出物を、さらに各種クロマトグラフィを用いて分離・精製することにより得ることができる。したがって、安価に精製物を入手することができる。
【００２７】
（４）好ましくは、抽出溶媒として親水性有機溶媒又は水／親水性有機溶媒の混合溶媒が用いられる。したがって、より効率的に一般式（１）に示される新規ジテルペンを抽出することができる。
【００２８】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態において、抽出原料としてナンヨウスギ科又はイイギリ科以外の起源植物が混合されたプロポリス原塊を使用してもよい。プロポリス原塊中に少なくとも起源植物としてナンヨウスギ科又はイイギリ科が含有されていれば、抽出原料として使用することができる。かかる抽出原料を使用した場合に得られる抽出物においても一般式（１）に示される新規ジテルペンが含有されているものと思料される。
【００２９】
・上記プロポリス抽出物を得た後の抽出残渣に、さらに抽出溶媒を添加して複数回抽出処理してもよい。抽出残渣を再利用することにより、回収率を高めることができる。
・上記実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ヒトに適用される医薬品、飲食品等に対して適用することができるのみならず、家畜等の飼養動物に対する飼料、薬剤等に適用してもよい。
【００３０】
・上記実施形態において、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から入手することができる。しかしながら、公知の化学合成法を用いて化学的に合成してもよい。
【００３１】
・本実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、抗癌剤等として、各種用途に適用することができる。一般式（１）に示される新規ジテルペンは、精製されたものを使用してもよく、プロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られたプロポリス抽出物から、さらに一般式（１）に示される新規ジテルペンをターゲットとして含有比率を高めた精製途中のプロポリス抽出物を使用してもよい。一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有比率を高めたプロポリス抽出物とは、新規ジテルペンを固形分中に１．５質量％以上、好ましくは３質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上、最も好ましくは主成分として一般式（１）に示される新規ジテルペンが含有されている。主成分とは、例えば固形分中の新規ジテルペンが最も含有比率の高い成分である場合、及び固形分中に新規ジテルペンが５０質量％以上含有する場合を示す。
【００３２】
上記一般式（１）に示される新規ジテルペンをターゲットとして含有比率を高めた精製途中のプロポリス抽出物は、プロポリス原塊から単に抽出溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物（新規ジテルペンを固形分中に約１質量％含有）よりも、新規ジテルペンの含有比率が増加している。そのため、単に抽出溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物とは組成が異なっている。また、上記プロポリス抽出物は、一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有比率が増加しているため、一般式（１）に示される新規ジテルペン由来の抗癌作用等の生理作用の増強を期待することができる。
【００３３】
・上記実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンは、優れた抗癌作用を有する。上記実施形態の一般式（１）に示される新規ジテルペンを含有する抗癌剤を実験用・研究用試薬として適用してもよい。抗癌作用が関係する生理作用のメカニズムの解明等を目的として用いることができる。
【００３４】
・上記実施形態において、一般式（１）に示される新規ジテルペンは、好ましくは抗癌剤として適用される。しかしながら、一般式（１）に示される新規ジテルペンの使用は、抗癌剤に限定されるものではない。
【００３５】
・上記実施形態において、一般式（１）に示される新規ジテルペン又は一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有比率を高めたプロポリス抽出物を、医薬品、医薬部外品、飲食品、化粧品、研究用試薬等の形態で適用する場合、各形態の剤型は特に限定されず、公知のものを適宜採用することができる。また、公知の添加剤を適宜配合して構成してもよい。
【００３６】
（第２の実施形態）
以下、本発明のプロポリス抽出物の評価方法を具体化した第２の実施形態を説明する。
本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法は、原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いて得られたプロポリス抽出物の評価方法において、上記一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とすることを特徴とする。一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とするとは、例えばプロポリス抽出物中における新規ジテルペンの存在の有無、含有量、及び特定成分に対する含有比率等を求めることによりプロポリス抽出物の品質を確認することをいう。
【００３７】
より具体的には、まず原料としてのナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から抽出溶媒を用いてプロポリス抽出物を得る工程が行われる。次に、好ましくは抽出物中の抽出成分について、１又は２以上のクロマトグラフィを用いて分離する工程が行われ、最後に、一般式（１）に示される新規ジテルペンを検出する工程が行われる。プロポリス原塊から抽出溶媒を用いてプロポリス抽出物を得る工程、及び抽出物中の抽出成分について、クロマトグラフィを用いて分離する工程は、第１の実施形態に記載される方法を適宜採用することができる。
【００３８】
一般式（１）に示される新規ジテルペンを検出する工程は、各クロマトグラフィにより分離された成分について、公知の方法を用いて定性することにより行われる。例えば、分離された成分は、核磁気共鳴装置等を用いて構造決定を行うことにより定性することができる。また、予め成分が同定された精製品と比較することにより定性・定量することができる。また、抽出成分の分離手段として薄層クロマトグラフィを用いる場合、発色試薬として、例えば硫酸、ドラーゲンドルフ、トリテルペン発色試薬、塩化第二鉄、ブロモクレゾールグリーン等を使用することにより、成分パターンを可視化し、Ｒｆ値から定性することもできる。
【００３９】
第２の実施形態のプロポリス抽出物の評価方法によれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法は、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊を抽出原料として、該抽出原料から抽出溶媒を用いて得られた抽出物の確認作業において、一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標とするものである。
【００４０】
ところで、プロポリス原塊は、そのままの状態では摂取しにくいことから、従来より、例えば親水性有機溶媒を用いた抽出方法、水を用いた抽出方法、及び超臨界抽出法により、プロポリス原塊に含まれる有用成分が抽出され、該抽出物が各種用途に適用されている。従来より、例えば親水性有機溶媒を用いて抽出された抽出物の確認作業は、全ての抽出成分を分離し、定性及び定量することは困難であることから、主要抽出成分であるｐ−クマル酸、ケルセチン、又は桂皮酸誘導体等を指標として、その化合物を検出することにより確認が行われていた。また、水を用いて抽出された抽出物は、主要抽出成分であるクロロゲン酸類等を指標として、その化合物を検出することにより確認が行われていた。
【００４１】
本発明において、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から、その特徴成分である一般式（１）に示される新規ジテルペンを精製・同定した。したがって、かかる一般式（１）に示される新規ジテルペンを指標成分として、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊から得られた溶媒抽出物の確認作業を行うことができる。
【００４２】
（２）本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法は、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊自体、又はそこから抽出された一般式（１）に示される新規ジテルペンを販売する際に、一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有の有無又は含有量を確認する際に適用することができる。また、ナンヨウスギ科又はイイギリ科を起源植物として作られるプロポリス原塊の製品、又はそこから抽出された一般式（１）に示される新規ジテルペンの製品において、一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有又は所定含有量を規格・保証する場合、その製品の規格・保証の確認工程において適用することができる。
【００４３】
（３）本実施形態のプロポリス抽出物の評価方法として、プロポリス抽出物中に一般式（１）に示される新規ジテルペンが含有していることを確認することにより、プロポリスが一般式（１）に示される新規ジテルペンを起源植物として構成されていることを証明することができる。また、プロポリス抽出物中における一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有量を測定することにより、プロポリス原料中の上記構成起源植物の純度（比率）を推認することができる。
【００４４】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態において、クロマトグラフィにより分離された一般式（１）に示される新規ジテルペンは、抽出物の主要成分として、例えば定量分析、及び抽出効率の確認作業に適用してもよい。
【実施例】
【００４５】
以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（試験例１：ブラジル・パラナ州産のブラウンプロポリス原塊から新規ジテルペンの分離・精製）
プロポリス原塊として、プロポリス採集用に工夫されたミツバチの巣箱を半径数キロ以内の周辺植物としてナンヨウスギ科又はイイギリ科が含まれる群生地に数日設置することにより得られたブラジル・パラナ州産のブラウンプロポリス原塊を使用した。
【００４６】
得られたブラウンプロポリスの原塊１００ｇに９５％エタノール３００ｍＬ加えて、一昼夜、室温（約２５℃）で３回攪拌しながら抽出した。得られたエタノール抽出液をろ紙（アドバンテック東洋製Ｎｏ．２）で吸引ろ過して残渣を除去し、プロポリス抽出物を得た。
【００４７】
次に、上記プロポリス抽出物（濃縮乾固物:５３．０１ｇ）を、オープンカラムクロマトグラフィ（内径６．５ｍｍ×長さ３２０ｍｍ）に付した。クロマトグラフィ担体としてシリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製）を使用した。溶離溶媒として、多段階グラジエントにより、クロロホルム：メタノール＝１００：０（３９００ｍＬ）→４９：１（６００ｍＬ）→９：１（６００ｍＬ）→１：１（６００ｍＬ）→０：１００（８００ｍＬ）として溶出させた。溶出成分は、特定量ずつ分取し、全７画分を得た。
【００４８】
目的の成分を確認するために、これらの画分をそれぞれ薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ：ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ254、メルク社製）にて展開した。展開溶媒として、クロロホルム：メタノール＝９：１を使用した。発色試薬として、２０％硫酸を使用した。発色試薬を噴霧後、１０５℃のホットプレート上で加熱し呈色させ、成分パターンを可視化し、７画分を得た。それぞれフラクションＡ〜Ｇとする。
【００４９】
上記フラクションＤ（乾固後１２．０７ｇ）について、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィ（内径６．５ｍｍ×長さ３２０ｍｍ）に付した。溶離溶媒として、多段階グラジエントにより、ヘキサン：アセトン＝１０：１（２１００ｍＬ）→５：１（７００ｍＬ）→３：１（８００ｍＬ）→１：１（５００ｍＬ）→１００％アセトン（５００ｍＬ）と順次変更し、最後に１００％メタノールで回収した。溶出成分は、特定量ずつ分取し、全８画分を得た。それぞれフラクションＤ−１〜８とする。
【００５０】
さらに、フラクションＤ−４について、分取用逆相ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分離処理を行い、全３画分を得た。それぞれフラクションＤ−４−１〜３とする。
さらに、フラクションＤ−４−２（乾固後１１５．２１ｍｇ）について、再度同条件にてＨＰＬＣで再精製処理を行った。得られた全３画分のうち（フラクションＤ−４−２−１〜３）、フラクションＤ−４−２−３より、新規クレロダン系ジテルペン５１．８４ｍｇを得た。
【００５１】
ＨＰＬＣ機器：PU980，UV970（日本分光社製）
カラム：Develosil HG-5（内径１０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、野村化学社製）
移動相：Ａ液（水）、Ｂ液（アセトニトリル）
６０％Ｂ液（０分）→１００％Ｂ液（６０分）→１００％Ｂ液保持（１０分）グラジエント
流速：４ｍＬ／分
検出波長：２０５ｎｍ
（試験例２：新規ジテルペンの構造解析）
（ａ）核磁気共鳴装置（NMR）を用いた構造決定
単離精製した成分について、核磁気共鳴装置（300MHz、VARIAN社製）を用いた構造決定を行った。溶媒として重クロロホルム（CDCl3）を使用した。1H-NMRスペクトルの測定結果を示すデータを図１と表１にそれぞれ示す。13C-NMRスペクトルの測定結果を示すデータを図２と表１にそれぞれ示す。HMBC及びH-H COSYの測定結果を示すデータを表１にそれぞれ示す。
【００５２】
【表１】
2015205824.tif 000006
（ｂ）質量分析による分子量の測定
単離精製した成分について分子量を測定した。分子量はエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS）を採用し、LC-MS/MS（ウォータズ社製、G2-QTOFシステム）を用いて行った。その結果を図３に示す。
【００５３】
その結果、Positiveモードでm/z 554.27（M＋NH4）＋に、ピーク示したことにより分子量５３６であることを確認した。
（ｃ）赤外線吸収スペクトル
単離精製した成分について赤外線吸収スペクトル（IR）を測定した。赤外線吸収スペクトルは赤外分光光度計（600-IR、Agilent社製）を用いた。結果を図４に示す。縦軸が透過率、横軸が波数（wavenumber [cm-1]）を示す。その結果、IR（KBr）νmax, 2970, 1761, 1722cm-1に吸収を確認した。
【００５４】
（ｄ）その他の測定
単離精製した成分について旋光度（optical rotation）と融点を測定した。旋光度は旋光計（HORIBA SEPA-500、堀場製作所社製）、融点は融点測定器を用いた。その結果、[α]20D=+46°（c 0.01, MeOH）、融点（mp）115-115.5℃であった。
【００５５】
以上の結果より、単離精製した成分は、下記一般式（２）で表されるカセアリン系のクレロダン骨格を有するジテルペンであり、１８，１９−エポキシ−２−オキソクレロダ−３，１２，１４−トリエン−６，１８，１９−トリオール１８，１９−ジアセタート６−ベンゾエート（18,19-Epoxy-2-Oxocleroda-3,12,14-triene-6,18,19-triol 18,19-diacetate 6-benzoate）（Ｃ31Ｈ36Ｏ8、分子量５３６）と決定した。尚、下記一般式（２）中においてＡｃはアセチル基を示す。炭素のナンバリングを併せて示す。
【００５６】
【化５】
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（試験例３：ブラジル産プロポリス中の成分分析）
試験例１において得られたブラジル・パラナ産ブラウンプロポリスのエタノール抽出液中の、下記表２に記載される主な成分について、下記の条件にて定量分析を行った。
【００５７】
同様に、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリアを主たる起源植物としているブラジル・ミナスジェライス州原産のグリーンプロポリスについても、試験例１と同様の方法にてエタノール抽出液を得て、下記表２に記載される主な成分について、下記の条件にて定量分析を行った。
【００５８】
ＨＰＬＣ機器：UPLC（ACQUITY UPLC H-Class, Waters社製）、PDA（ACQUITY UPLC PDA）
カラム：ACQUITY BEH C18（内径２．１ｍｍ×長さ５０ｍｍ、Waters社製）
移動相：Ａ液（水＋０．１％リン酸）、Ｂ液（アセトニトリル＋０．１％リン酸）
３０％Ｂ液（０分）→８０％Ｂ液（１０分）→８０％Ｂ液（１４分）のグラジエント
カラム温度：４０℃
流速：０．４ｍＬ／分
検出波長：PDA１９５〜４００ｎｍ（１９５，２３０，２４０ｎｍにて定量）
定量結果を、表２に示す。
【００５９】
【表２】
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表２に示されるように、エタノール抽出液において、ブラジル産グリーンプロポリスには、新規ジテルペンは含有されていないことが確認された。尚、ブラジル・パラナ産ブラウンプロポリスのエタノール抽出液中には、一般式（１）に示される新規ジテルペンが約１質量％（固形分）程度含有されている。本試験例においては、上記エタノール抽出液中に１．２７質量％（固形分）含有されていた。
【００６０】
（試験例４：一般式（１）に示される新規ジテルペンの癌細胞増殖抑制活性の評価）
癌細胞株として４種類の株、LNCaP（ヒト前立腺癌由来）、MCF-7（ヒト乳癌由来）、DLD-1（ヒト大腸癌由来）及びA549（ヒト肺癌由来）を用いた。LNCaP、MCF-7及びDLD-1は１０％の非働化FBSを含むRPMI-1640を、A549は１０％の非働化FBSを含むDMEMをそれぞれ培地として用い、３７℃、５％CO2雰囲気下で培養した。細胞数の測定は、テトラゾリウム塩（WST-8）の還元による発色を利用したCell Counting kit-8（CCK-8）を用いて行った。
【００６１】
各癌細胞を１．０×１０４cells/well（A549は０．５×１０４cells/well）で９６ウエルプレートに播種した。２４時間の培養後、下記表３に示される化合物又はプロポリスを培地に添加した。７２時間の培養後、培地を除去し、１０％CCK-8溶液を含む各細胞の培地を加え、３７℃、５％CO2雰囲気下で１時間の発色反応を行った。反応液の吸光度（４５０ｎｍと６３０ｎｍ）を測定し、細胞生存率を算出した。細胞生存率からソフトGraphPad Prism 5.02Jを用いて、癌細胞増殖を５０％阻害する濃度（IC50）及びその幾何平均値を算出した。各被験物質に対する３回の繰り返し試験におけるIC50の幾何平均値の結果を表３に示す。
【００６２】
【表３】
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表３に示されるように、いずれの被験物質も４種類の癌細胞株に対し、増殖抑制作用を示した。中でも本発明の新規ジテルペンは非常に強い抗癌作用を示した。
【００６３】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。
（ａ）原料としてのナンヨウスギ科及びイイギリ科から選ばれる少なくとも一種を起源植物として作られるプロポリス原塊からエタノールを含有する溶媒を用いて得られるプロポリス抽出物に対し、下記一般式（１）に示される新規ジテルペンの含有量を増加させた新規ジテルペン高含有プロポリス抽出物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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