(57)【要約】  【課題】  特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法を提供する。  【解決手段】  特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入した後、細胞を培養し、培養した細胞を単離する。このようにして、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料が作製される。【選択図】  図１
2015195735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法であって、
前記特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入する導入ステップと、
前記細胞を培養する培養ステップと、
前記培養した細胞を単離する単離ステップと、
を備えることを特徴とする標準試料製造方法。
【請求項２】
前記導入ステップでは、前記細胞として出芽酵母を用いて、人工合成遺伝子を用いた相同組替えにより前記ＤＮＡ断片を前記出芽酵母の染色体に導入し、
前記培養ステップでは、前記出芽酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して同調培養を行い、
前記単離ステップでは、前記出芽酵母をＧ１期で固定して単離を行い、単離した前記出芽酵母の１細胞には１コピーの対象配列が含まれている、請求項１に記載の標準試料製造方法。
【請求項３】
前記相同組替えのターゲットとしてＹＥＲ０５３Ｃの遺伝子を用いる、請求項２に記載の標準試料製造方法。
【請求項４】
前記単離ステップでは、先端角度が２０度から３０度の角度範囲内に設定されたキャピラリーを用いて、１ウェルに１細胞ずつ分取する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の標準試料製造方法。
【請求項５】
前記標準試料は、核酸であり、前記核酸には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の標準試料製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、臨床診断や法医学検査、食品分析など幅広い分野において核酸分析技術として利用されている。近年、ＰＣＲ検査を含めた様々な分析について、分析結果の信頼性を保証することが求められており、ＩＳＯ１７０２５をはじめとする国際規格が作成されている。国際的な商業活動においては、こうした国際規格を満たした分析により商品の品質管理が行われていることが取引の可否につながる場合もあり、分析の信頼性保証に関連する技術は産業的にも重要性が高まっている。
【０００３】
ＩＳＯ１７０２５では、分析の質の管理のために、分析法の妥当性確認が要求されている。分析法の妥当性確認とは、使用する分析法の性能を客観的に評価し、使用する目的に応じて基準を満たしていることを確認することである。性能評価を行う項目としては、特異性や検出限界などが挙げられる。ＰＣＲ法は、その技術的特性から１分子からの核酸増幅が可能とされているが、ＰＣＲを用いた個別の分析法は、反応液の組成やＰＣＲ装置の性能に応じて１分子からの検出が可能とは必ずしもいうことができないため、分析法毎にＰＣＲ分析の検出限界の評価が必要となっている。ＰＣＲ分析の検出限界の評価には、従来、標的配列を含むプラスミド核酸やゲノム核酸を一定濃度に希釈した核酸試料が用いられてきた。具体的には、プラスミド核酸やゲノム核酸が理論的に１〜数分子含まれる程度まで希釈した核酸溶液試料をＰＣＲで分析し、検出の有無もしくは検出率を調べることで検出限界濃度が評価されている。しかし、１〜数分子のレベルまで希釈された試料を用いる場合、最終的にＰＣＲの反応液中に添加される標的核酸の分子数はサンプリングの偶然性により一定ではなく、反応液ごとに大きなばらつきを持つことになる。このため、ＰＣＲ分析における検出限界濃度を正確に評価することはこれまで非常に困難となっていた。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの過程で核酸増幅に対応した蛍光を適時検出する技術で、反応液中の初発鋳型核酸分子数の定量測定が可能なことから、ウィルスや微生物、遺伝子組換え農産物の定量検査などに用いられてきている。リアルタイムＰＣＲによる定量的な分析においては、測定結果と標的核酸の分子数を関連付ける検量線が作成される。従来、この検量線作成にはＰＣＲの標的塩基配列を含むプラスミド核酸もしくはゲノム核酸を段階的に希釈した溶液試料群が標準試料として用いられてきた。しかし、１〜数分子程度と低分子数の試料を用いる場合には、最終的にＰＣＲの反応液中に添加される標的核酸の分子数は大きなばらつきを持つことになる。このため、低分子数側まで正確に分子数を規定することが可能な検量線を安定的に作成することは困難であった。
【０００５】
またＰＣＲ法が使われる、遺伝子の塩基配列等を標的として検出する遺伝子関連検査の工程には、測定前のプロセス（プレアナリシス）、測定プロセス、測定後プロセスの３つのプロセスがある。また、遺伝子関連の測定プロセスでは、ＰＣＲ法を含め、多様な遺伝子解析技術が用いられるが、その測定精度は検体採取から検査材料の前処理までの測定プロセス（プレアナリシス）における作業要因に最も大きく影響することが知られている。このため、測定前のプロセス（プレアナリシス）では、いくつかの課題のうち、物理的性状、化学的性状、増殖阻害因子となる干渉物質の存在等、特に検体の性状が多様であるにも関わらず、客観的に評価する方法がないことが、測定の前の核酸抽出工程に影響し、測定精度低下となっていることが知られている（非特許文献１）。そこで、できるだけ、実検体に近い状態の核酸溶液試料が、定性限界、定量限界を決めるための、分子数を規定した核酸溶液試料として望まれている。
【０００６】
以上の通り、ＰＣＲの標的となる核酸の分子数を厳密に規定した核酸溶液試料は、ＰＣＲを用いた分析法における検出限界の評価やリアルタイムＰＣＲの検量線作成を正確に実施するために必要とされている。
【０００７】
そこで、これまでに、１分子という低濃度から、分子数を厳密に規定した核酸溶液試料の作製方法、装置については、いくつかの例が知られている。例えば、限界希釈法により、１分子の標準物質を作成できることが知られている。限界希釈法では、ほとんどのサンプルには核酸が含まれず、わずかに確率的に１分子の核酸が含まれる溶液ができるような条件で希釈し後から１分子の核酸を含む溶液を選択する方法である。また、ゲーティングナノポアデバイスを用いる方法も発明者を含むグループによって開発されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】遺伝子関連検査  検体品質管理マニュアル（承認文書）  特定非営利活動法人ＪＣＣＬＳ日本臨床検査標準協議会
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、いずれも合成核酸を希釈、あるいは分子数測定により分注する手法を用いており、通常検査に用いる核酸のように、もともと細胞（特に核内）に保持されており、細胞の分裂や代謝の継続過程における、生物学的な修飾を受けた、所望の分子数の分子（もし細胞内の１分子であれば、１分子）を取り囲む細胞の内容物を含んだ核酸サンプルを作製することは不可能であった。
【００１０】
このような背景から、細胞内に保持されている状態に近い状態であり、かつ分子数を厳密に規定した標準試料を製造する方法が切望されていた。
【００１１】
反応液中の初発鋳型核酸分子数の定量測定が可能なリアルタイムＰＣＲによる定量的な分析においては、測定結果と標的核酸の分子数を関連付ける検量線が作成される。従来、この検量線作成にはＰＣＲの標的塩基配列を含む核酸を段階的に希釈した溶液試料群が標準試料として用いられてきたが、１〜数分子程度と低分子数の試料を用いる場合には、最終的にＰＣＲの反応液中に添加される標的核酸の分子数は大きなばらつきを持つため、低分子数側まで正確に分子数を規定することが可能な検量線を安定的に作成することは困難であった。また、測定精度に大きく影響する測定プロセス（プレアナリシス）を含めた精度管理を実施するために必要な標準試料の要件としては、物理的性状、化学的性状、増殖阻害因子となる干渉物質の存在等が、実検体に近い、細胞の中に保持され、化学的修飾や、細胞と核酸分子の数の比を反映した様々な因子を含む状態の核酸溶液試料が、定性限界、定量限界を決めるための、分子数を規定した核酸溶液試料として望まれていたが、これまで提案されてきた方法では、合成核酸を用いていたために、作製することは事実上不可能であった。
【００１２】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたもので、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料を製造することのできる標準試料製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の標準試料製造方法は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料の製造方法であって、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入する導入ステップと、細胞を培養する培養ステップと、培養した細胞を単離する単離ステップと、を備えている。
【００１４】
また、本発明の標準試料製造方法では、導入ステップで、細胞として出芽酵母を用いて、人工合成遺伝子を用いた相同組替えによりＤＮＡ断片を出芽酵母の染色体に導入し、培養ステップで、出芽酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して同調培養を行い、単離ステップで、出芽酵母をＧ１期で固定して単離を行い、単離した出芽酵母の１細胞には１コピーの対象配列が含まれてもよい。
【００１５】
また、本発明の標準試料製造方法では、相同組替えのターゲットとしてＹＥＲ０５３Ｃの遺伝子を用いてもよい。
【００１６】
また、本発明の標準試料製造方法では、単離ステップでは、先端角度が２０度から３０度の角度範囲内に設定されたキャピラリーを用いて、１ウェルに１細胞ずつ分取してもよい。
【００１７】
また、本発明の標準試料製造方法では、標準試料は、核酸であり、核酸には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施例における標準試料製造方法の説明図である。
【図２】本発明の一実施例における導入遺伝子のコピー数確認の説明図である。
【図３】本発明の一実施例におけるＧ０／Ｇ１期の同調確認の説明図である。
【図４】本発明の一実施例におけるマニピュレータによる１細胞の採取法の説明図である。
【図５】本発明の一実施例において作製された標準試料の確認の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態の標準試料製造方法について、図面を用いて説明する。本実施の形態の標準試料製造方法は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を検出する遺伝子検査に用いられ、食品検査や医療分野の診断等に利用される。なお、本発明の実施の形態の標準試料製造方法は、以下の構成及び方法によって実現できるが、ここに示す構成および方法だけに限るものではない。
【００２１】
本実施の形態によれば、細胞への対象遺伝子の導入と細胞の分取を組み合わせることによって、細胞における修飾や細胞の内容物を反映した標準試料を製造することができる。この場合、所定のコピー数の遺伝子配列をもつＤＮＡ断片を細胞に導入することにより、標準試料が作製される。使用する細胞は、培養、遺伝導入が可能で、細胞周期を制御できる細胞であれば如何なるものでも良い。ただし、通常２倍体の場合には、対象分子は、最小で２倍体となるため、１分子の対象を得るためには、細胞周期上、同調できるステージの中に１倍体の時期がある細胞を用いる必要がある。細胞の選択は、実検体の生物種に近いものや、取り扱いが簡易な酵母のような細胞など、標準試料の利用目的に合わせて選択することが可能である。細胞を培養する培養液についても、対象となる細胞が増殖するのに適した培地を選択することができる。
【００２２】
本実施の形態において、標準試料を構成するための検出対象は、標準試料の用途に合わせて選択することが可能である。対象として扱う遺伝子配列は、単一である必要はなく、複数の遺伝子配列をタンデムに連結した核酸断片を用いることができる。また、細胞のゲノムへの導入を考慮して、相同組換えのターゲットとなる配列も、タンデムに連結することが必要であり、これらの要素からなる人口合成遺伝子を用いることができる。さらに、これらは、自然界に存在する遺伝子配列をＰＣＲ法を用いて増幅したものや、制限酵素などを用いて切り出し、精製したものを用いてもよい。
【００２３】
対象遺伝子および相同組換えのターゲット遺伝子配列を持つ核酸を用いた相同組換えによる組換え細胞の作製には、相同組換えのターゲットを、ゲノム内でのコピー数ならびに、生育に影響を与えるかどうかを考慮して選択することが望ましい。当該核酸の細胞内への導入、すなわち形質転換は、市販の試薬を用いて実施することができる。また、場合にはよっては、エレクトロポーレーション法など、電気的な手法を用いることも可能である。
【００２４】
細胞周期をそろえる同調は、細胞に適したものを選択することができる。例えば、低血清培養法や、二重チミジン同調法、チューブリン重合阻害剤による同調などが考えられる。また、細胞によってはその細胞に特異的な手法を用いることが可能である。例えば、出芽酵母の場合、α−ファクターと呼ばれる性ホルモン（フェロモン）によって、同調させることが可能である。
【００２５】
１細胞の分取は、シングルセルソーター（例えば、PERFLOW（登録商標）Sort：古河電工）や、マイクロマニピュレータによって行うことが可能である。酵母であれば、実体顕微鏡を用い、キャピラリーの先端（ＩＤ＝１０−２０μｍ）に吸引し、予めスライドガラス上に滴下した同調培養用の培養液の中に吐出、マイクロピペットで１細胞の酵母とともに当該液滴をマイクロプレートのウェルに移動することで実施することが可能である。
【００２６】
このようにして作成した試料は、生きた細胞であり、その中に所望の分子数の検出対象が含まれており、１分子から所望の数の分子数までの細胞を、遺伝子関連検査の実検体と近い形で分取し、提供することが可能となる。
【００２７】
本実施の形態によれば、従来のように合成核酸の分子数を分取し、測定するのではなく、細胞に１コピーを導入し、１コピーであることを確認したうえで、細胞周期を止め、細胞を所望の数分取し、細胞の個数を規定することによって分子数を同時に規定する手法を用いて標準試料を作成する。そのため、これまでは不可能であった、ごく微量のかつ実検体の状態に近い核酸を含む標準物質の安定供給が可能になる。このような、１分子標準物質が実用化されれば、市販されているＰＣＲ装置の、検体を用いた検出能力の評価が可能となる。また、ＰＣＲ検査においては、実検体を用いた場合に近い環境下での検知下限や定量下限の絶対的評価が可能となる。
【実施例】
【００２８】
以下実施例により、詳しく本発明を説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本実施例では、細胞の例として、出芽酵母を用いて、標準試料の作製を実施した。出芽酵母w303-1a (MATa, ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100)を１コピーの標的ＤＮＡ配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した（図１参照）。培地は、ＹＤＰ培地：１％（ｗ／ｗ）バクトイーストエキストラクト，２％（ｗ／ｗ）バクトペプトン，２％（ｗ／ｗ）グルコースを用いた。
【００３０】
検出対象のモデルとして、人工遺伝子を構築した。標的配列はOver lapping PCRにより、ゼオシン耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子およびＹＥＲ０５３Ｃの相同領域がタンデムに並ぶように作出し、相同組換え用人工遺伝子を合成した（図１参照）。
【００３１】
人工合成遺伝子を用いた相同組換えによる酵母組換え体の作製には、相同組換えのターゲットとして、Mitochondrial phosphate transporter like protein（ＹＥＲ０５３Ｃ）の遺伝子を用いた。ＹＥＲ０５３Ｃは出芽酵母の中でシングルコピーであり、かつ遺伝子破壊を行っても酵母の生育に影響を与えないことが既に明らかにされている（Takabatake, R., et al. J. Biochem., 129(5): 827-33, 2001）。ＹＥＲ０５３Ｃの遺伝子座を相同組換えによる酵母染色体へ導入するターゲットとして、１コピー標的ＤＮＡ配列を酵母染色体に導入した（図２参照）。
【００３２】
細胞分裂の際に、ＤＮＡが複製されるため、それを防ぐ目的で、酵母細胞の同調化を行った。一晩培養した酵母細胞をＯＤ６００＝０．１に稀釈し、２８℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３になった時点で、５μｇ／ｍｌになるようにα−ファクター（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA）を添加し、さらに３時間培養続け、酵母はＧ０／Ｇ１期に同調された。細胞周期同調酵母の培養液に終濃度２０％になるようにグリセロールを添加し、−８０℃で保存した。
【００３３】
同調細胞の細胞周期の確認は、下記の通り実施した。SYTOX Green Nucleic Acid Stain（Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR）で酵母を染色し、フローサイトメトリーで分析を行った。集菌した約５×１０６個の酵母をＭｉｌｌｉＱ水で一回洗浄し、４００μｌのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁した後、９５０μｌのエタノールを加えた。−２０℃で一晩固定した酵母を８００μｌの５０ｍＭクエン酸 ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、５００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ RNase A（Nippon Gene, Tokyo, Japan）／５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）に懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを添加し、５０℃で２時間インキュベートした。処理した酵母を１０秒間超音波分散し、６μｌの５ｍＭ SYTOX Green Nucleic Acid Stainを加えて、遮光下３０分間染色した。セルアナライザーＥＣ８００（Sony Biotechnology Inc. Tokyo, Japan)を用い、励起波長４８８ｎｍで細胞周期の分析を行い、Ｇ０／Ｇ１期に同調していることを確認した（図３参照）。
【００３４】
酵母細胞を１細胞分取するには、以下の方法を用いた。すなわち、Ｇ０／Ｇ１期に同調された酵母を１／１５ Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁し、１０秒間超音波分散した。１／１５ Ｍ ＰＢＳで二度洗浄した後、４０００ｇで５分間遠心し、５ｍＬの５μｇ／ｍｌ α−ファクター／１／１５ Ｍ ＰＢＳに懸濁した。細胞懸濁液をシャーレ（５０×９ｍｍ BD Falcon Petri dishes、BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)）に注ぎ、実体顕微鏡（M205 FA, Leica）での観察下、マニピュレータ操作により、キャピラリーの先端（ＩＤ＝１５μｍ）に吸引し、予めスライドガラス上に滴下した１８μｌの５μｇ／ｍｌ α−ファクター／Ｈ2０に吐出し、マイクロピペットで１細胞の酵母とともに当該液滴をマイクロプレートのウェルに移動した。この場合、キャピラリーの先端角度は、２０度から３０度の角度範囲内に設定されていることが望ましい（図４参照）。このマイクロプレートが、標準試料となる。
【００３５】
標準試料の確認は、一細胞からリアルタイムＰＣＲによって標的配列を増幅して実施した。１ウェル当たりに６２０ｎｇ Zymolase T100（105 kU/g, Nakalai Tesque, Kyoto, Japan）を添加し、３５℃で９０分間インキュベートし、細胞壁を分解した。Universal Master Mix（ABI）を用い、１６．７×１０-6μｍｏｌプライマーと６．５×１０-6μｍｏｌ FAM/TAMRA TaqManプローブを加え、ABI PRISM 7900HTリアルタイムＰＣＲシステムで、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、５０℃ ２分、９５℃ ３０秒を１サイクル、９５℃ ３０秒、５９℃ ６０秒を５０サイクルである。５ｎｇ／μｌ ColE1（Nippon Gene Co., Tokyo, Japan）溶液で稀釈した標準プラスミドpTRPWRKYを鋳型としてＰＣＲを行い、検量線の作成に用いた。これにより、検量線を作成でき、標準試料としての要件が確認された（図５参照）。
【００３６】
以上詳述したように、この構成を使うことによって、１分子から所望の数の分子数までの分子数を、遺伝子関連検査の実検体と近い形で分取し、提供することが可能な標準試料が実現可能であることが示された。
【００３７】
以上、本発明の実施の形態を例示により説明したが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではなく、請求項に記載された範囲内において目的に応じて変更・変形することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上のように、本発明にかかる標準試料製造方法は、特定のコピー数の対象配列を有するＤＮＡ断片と同じ対象配列を有する標準試料を製造できるという効果を有し、食品検査や医療診断のための遺伝子検査等に用いられ、有用である。
【符号の説明】
【００３９】
１  ターゲット配列を導入した細胞（酵母）
２  酵母染色体
３  ターゲット配列を導入した領域
４  培養容器（シャーレ）
５  培地
６  マニピュレータ（キャピラリー）
７  回収容器（マイクロチューブ）
８  溶液
【図１】
2015195735.tif 000003
【図２】
2015195735.tif 000004
【図３】
2015195735.tif 000005
【図４】
2015195735.tif 000006
【図５】
2015195735.tif 000007