(57)【要約】【目的】ケイヒ酸誘導体を含有することを特徴とする皮膚外用剤、しわ改善剤、コラーゲン産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤及びアクチンフィラメント構築促進剤を提供する。【構成】本発明のケイヒ酸誘導体は、優れたしわ改善作用、コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制作用及びアクチンフィラメント構築促進作用などの薬効を有し、安定性にも優れていた。また、ケイヒ酸誘導体を含有する皮膚外用剤は、安全で優れたしわ形成防止・改善作用を示した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とする皮膚外用剤。（式中、置換基Ｒ１、Ｒ２は、水素、水酸基及びメトキシ基から選択される。置換基Ｒ３は、水酸基又はアセチル基である。）
【化１】
2015221768.tif 000008
【化２】
2015221768.tif 000009
【化３】
2015221768.tif 000010
【請求項２】
請求項１記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするしわ改善剤。
【請求項３】
請求項１記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
請求項１記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
【請求項５】
請求項１記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするアクチンフィラメント構築促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な老化防止作用に優れた皮膚外用剤、しわ改善剤、コラーゲン産生促進剤、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤及びアクチンフィラメント構築促進剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、紫外線、乾燥、寒冷、熱、薬物等のさまざまな物理的及び化学的ストレスに日々さらされている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、さまざまな皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つに、しわがある。しわには、表皮性のしわと、真皮性のしわの二種類が存在することが知られている。表皮性のしわは小じわと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質層中の水分量が低下することによって一時的に生じるしわである。小じわの改善方法としては、保湿効果を有する化粧品の使用が一般的である。一方、真皮性のしわは、太陽光線に含まれる紫外線や加齢によって形成されるしわである。その形成メカニズムとしては、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下や、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の増加によるコラーゲンの分解促進が挙げられる。
【０００３】
乾燥に起因する表皮性のしわと真皮性のしわでは、組織学的形態、発症メカニズム、治療方法が異なり、紫外線や加齢により生じる真皮性のしわは、保湿効果を有する化粧品の使用によって改善させることはできない。したがって、紫外線や加齢により生じる真皮性のしわの改善には、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能を高める成分やＭＭＰなどのコラーゲン分解酵素の産生や活性を阻害する成分が用いられてきた。
【０００４】
また、コラーゲンの生成促進は、皮膚の真皮性のしわを改善するだけでなく、皮膚の創傷治癒の改善、骨粗鬆症、関節炎、腱鞘炎等の治療、高血圧の防止などにも有効である。
【０００５】
ＭＭＰは、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン（動脈、腱、皮膚など弾性組織の特殊成分をなす構造タンパク質）等の基質を分解する。従って、ＭＭＰに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。さらにＭＭＰはガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等の種々の病態での細胞外基質の分解に関与していることが報告されている。よって、ＭＭＰの阻害活性を有すれば、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の治療及び改善に有用である。
【０００６】
一方、近年皮膚のハリには、皮膚中の線維芽細胞に存在する張力繊維（アクチンフィラメント）が関与し、アクチンフィラメントの構築による線維芽細胞の形態がコラーゲンの産生やＭＭＰの産生に関与しているメカニズムが明らかにされ、アクチンフィラメントの構築促進物質が皮膚のしわ・たるみの改善に有用であることが示唆されている。
【０００７】
これまでに、紫外線によって生じる真皮性のしわを改善することを目的として、加水分解アーモンドを有効成分とする皮膚のしわ形成防止・改善剤（特許文献１）、ジョチョウケイ、テンキシ及びキセンウの抽出物を有効成分とする紫外線照射に起因するしわの改善剤（特許文献２）が報告されている。また、コラーゲンの産生促進剤としては、Ｎ−ベンゾイルグリシルグリシンからなるコラーゲン産生促進剤（特許文献３）、ＭＭＰ活性阻害剤としては、Ｃｒａｎｅｓｂｉｌｌ及びＤｏｇｗｏｏｄ Ｂａｒｋ Ａｍｅｒｉｃａｎから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤（特許文献４）が報告されている。アクチンの産生促進剤として、γ−グルタミルトランスペプチダーゼを阻害する化合物を有効成分とすることを特徴とする、皮膚線維芽細胞のα−平滑筋アクチン産生促進剤（特許文献５）が報告されている。
【０００８】
一方、本発明に係るケイヒ酸誘導体は公知の物質である（非特許文献１〜６）。しかし、該ケイヒ酸誘導体に抗老化効果、しわ改善効果、コラーゲン産生促進効果、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制効果、アクチンフィラメント構築促進効果などを有することは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１１９１２５号公報
【特許文献２】特開２００６−１９９６１１号公報
【特許文献３】特開２０１４−５５１１６号公報
【特許文献４】特開２０１４−５２２２号公報
【特許文献５】特開２０１２−６２２６６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７，  ４５１−４５４（１９８８）
【非特許文献２】Ｈ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，  ３６，  ２４３０−２４４６（１９８８）
【非特許文献３】Ｈ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，  ４３，  ６４−７０（１９８８）
【非特許文献４】Ｈ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，  ３６，  ４８４１−４８４８（１９８８）
【非特許文献５】Ｙ．Ｍｉｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２８，  ３４５３−３４５８（１９８９）
【非特許文献６】Ｙ．Ｓａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，  ３９，  ２３６２−２３６８（１９９１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような状況において為されたものであり、しわ形成の予防又は改善、新規なコラーゲン産生促進、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制作用を有する成分、アクチンフィラメントの構築を促進する成分、並びに、当該成分を含有する皮膚外用剤や内用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、多くの化合物について前記のような美容や医薬に関する各種評価系へのスクリーニングを実施してきた。その過程において、本発明者らは鋭意検討した結果、ケイヒ酸誘導体が優れたコラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制作用及びアクチンフィラメント構築促進作用をもち、安定性においても優れていることを見出した。さらにケイヒ酸誘導体を含有する皮膚外用剤が、安全で安定であり、しわ改善作用に優れ、内用剤などの医薬用途においても優れることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の皮膚外用剤または内用剤は下記のとおりである。
【００１４】
[１]下記一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とする皮膚外用剤。（式中、置換基Ｒ１、Ｒ２は、水素、水酸基及びメトキシ基から選択される。置換基Ｒ３は、水酸基又はアセチル基である。）
【化１】
2015221768.tif 000002
【化２】
2015221768.tif 000003
【化３】
2015221768.tif 000004
[２][１]記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするしわ改善剤。
[３][１]記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
[４][１]記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
[５][１]記載の一般式（１）〜（３）で表される、ケイヒ酸誘導体を一種又は二種以上含有することを特徴とするアクチンフィラメント構築促進剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のケイヒ酸誘導体は、優れたしわ改善作用、コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制作用及びアクチンフィラメント構築促進作用を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において貢献できるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明について詳細に述べる。
【００１７】
上記の一般式（１）〜（３）において、置換基Ｒ１、Ｒ２は、水素（−Ｈ）、水酸基（−ＯＨ）及びメトキシ基（−ＯＣＨ３）から選択される。置換基Ｒ３は、水酸基又はアセチル基（−Ａｃ、−ＣＯＣＨ３）である。また、一般式の（１）〜（３）の各置換基による物質の中から、一種又は二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
一般式（１）〜（３）に示される、ケイヒ酸誘導体の例としては、下記の物質などがあげられる。ただし、本発明は、これらの物質に限定されない。
【表１】
2015221768.tif 000005
【００１９】
本発明に用いるケイヒ酸誘導体の由来については、特に問わないが、一例として、ユリ科ユリ属に属する植物から単離することができ、例えば、ユリ科ユリ属カサブランカより抽出・単離精製できる。
【００２０】
カサブランカとは、ヤマユリ、カノコユリ、タモトユリ等を原種とするオリエンタルハイブリッドとよばれる園芸品種で、広く販売されている。
【００２１】
抽出部位は特に限定されず、すべての部位を用いることができる。抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。
【００２２】
抽出する溶媒としては、例えば、水、エタノール、メタノール等の水溶性溶媒の単独あるいは混合液などが挙げられる。
【００２３】
本発明で用いるケイヒ酸誘導体は、ダイヤイオンＨＰ−２０、ＯＤＳゲル等によるカラムクロマトグラフィーや分取高速液体クロマトグラフィー等を用いることにより、上記抽出物から精製することができる。本発明で用いるケイヒ酸誘導体は、必ずしも精製品である必要はなく粗精製品でもよく、また、溶媒を含む状態でもよい。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤または内用剤には、ケイヒ酸誘導体をそのまま使用しても良く、その効果を損なわない範囲内で、外用剤や内用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を配合することができる。
【００２５】
本発明のケイヒ酸誘導体は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリ−ム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデ−ション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、錠菓、飲料等が挙げられる。
【００２６】
本発明に用いるケイヒ酸誘導体の含有量は、外用の場合、皮膚外用剤全量に対し、固形物に換算して０．００００１重量％以上、好ましくは０．０００１〜１重量％の含有が良い。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて含有した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。一方、内用の場合、投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人１人当たりの１日の量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ〜１ｇがより好ましい。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【００２７】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるケイヒ酸誘導体の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す部とは重量部を、％とは容量％を示す。
【実施例１】
【００２８】
製造例１  レガロシド  Ｉ
カサブランカの花３０ｇに４００ｇの水を加え２時間熱水で抽出した。濾過後、得られた抽出液を濃縮乾固し、熱水抽出物を８．７ｇ得た。この抽出物の水可溶画分をカラムクロマトグラフィー（カラム：ダイヤイオンＨＰ−２０  ６ｃｍφ×４０ｃｍ、溶出液：０〜１００％エタノール水溶液）に供した。５０％エタノール溶出画分を集め、エタノールを留去後、分取高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５  ２×２５ｃｍ、溶出液：５０％メタノール水溶液）を用いて精製した。そして該当画分を集めメタノール留去後凍結乾燥することによってレガロシド  Ｉを０．６４ｇ得た。レガロシドＩは、ＭＳスペクトルおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを文献記載のスペクトルデータと比較することにより構造を確認した。そのデータを下記に示す。
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）４６０（Ｍ＋ＮＨ４）＋、４４３（Ｍ＋Ｈ）＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、δ）  ７．６０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．７Ｈｚ）、７．５８（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、６．８０（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、６．４１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．７Ｈｚ）、５．２２（１Ｈ、ｍ）、４．３５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１．９、３．２Ｈｚ）、４．２３（１Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝１１．９、６．９Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）３．９６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１０．９、５．５Ｈｚ）、３．６９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１０．９、５．５Ｈｚ）、３．６７（１Ｈ、ｂｒｄ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ）、３．３９（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈ２Ｏ  ｓｉｇｎａｌ）、３．１３（１Ｈ、ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、３．１１−３．０９（２Ｈ、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）、２．９６（１Ｈ、ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）２．０２（３Ｈ、ｓ）
【００２９】
製造例２  レガロシド  Ａ
製造例１と同様にレガロシド  Ａ（表１の物質４）を単離し、文献記載のスペクトルと比較して構造を確認した。
【００３０】
製造例３  レガロシド  Ｂ
製造例１と同様にレガロシド  Ｂ（表１の物質７）を単離し、文献記載のスペクトルと比較して構造を確認した。
【００３１】
比較製造例１  ユリ熱水抽出物
カサブランカの花３０ｇに４００ｇの水を加え２時間熱水で抽出した。濾過後、得られた抽出液を濃縮乾固し、熱水抽出物を８．７ｇ得た。
【実施例２】
【００３２】
処方例１  化粧水
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    ０．１
２．１，３−ブチレングリコール                                    ８．０
３．グリセリン                                                    ２．０
４．キサンタンガム                                                ０．０２
５．クエン酸                                                      ０．０１
６．クエン酸ナトリウム                                            ０．１
７．エタノール                                                    ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）                ０．１
１０．香料                                                          適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００３３】
比較例１  従来の化粧水１
処方例１において、レガロシド  Ｉを精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。
【００３４】
比較例２  従来の化粧水２
処方例１において、レガロシド  Ｉをユリ熱水抽出物（比較製造例１）に置き換えたものを従来の化粧水とした。
【００３５】
処方例２  クリーム
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    ０．０５
２．スクワラン                                                    ５．５
３．オリーブ油                                                    ３．０
４．ステアリン酸                                                  ２．０
５．ミツロウ                                                      ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル                                  ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ３．０
８．ベヘニルアルコール                                            １．５
９．モノステアリン酸グリセリン                                    ２．５
１０．香料                                                          ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル                                      ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール                                    ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３６】
比較例３  従来のクリーム
処方例２において、レガロシド  Ｉを精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
【００３７】
処方例３  乳液
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    ０．０５
２．スクワラン                                                    ５．０
３．オリーブ油                                                    ５．０
４．ホホバ油                                                      ５．０
５．セタノール                                                    １．５
６．モノステアリン酸グリセリン                                    ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）    ２．０
９．香料                                                          ０．１
１０．プロピレングリコール                                          １．０
１１．グリセリン                                                    ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３８】
処方例４  ゲル剤
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    ０．１
２．エタノール                                                    ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）                ０．１
５．香料                                                          適量
６．１，３−ブチレングリコール                                    ５．０
７．グリセリン                                                    ５．０
８．キサンタンガム                                                ０．１
９．カルボキシビニルポリマー                                      ０．２
１０．水酸化カリウム                                                ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００３９】
処方例５  パック
処方                                                                部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    ０．１
２．レガロシド  Ａ（製造例２）                                    ０．１
３．レガロシド  Ｂ（製造例３）                                    ０．１
４．ポリビニルアルコール                                        １２．０
５．エタノール                                                    ５．０
６．１，３−ブチレングリコール                                    ８．０
７．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
８．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）                ０．５
９．クエン酸                                                      ０．１
１０．クエン酸ナトリウム                                            ０．３
１１．香料                                                          適量
１２．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１２を均一に溶解し製品とする。
【００４０】
処方例６  ファンデーション
処方                                                              部
１．レガロシド  Ａ（製造例２）                                    ０．００１
２．ステアリン酸                                                  ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）  １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ２．０
５．セタノール                                                    １．０
６．液状ラノリン                                                  ２．０
７．流動パラフィン                                                ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル                                      ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム                          ０．１
１０．ベントナイト                                                  ０．５
１１．プロピレングリコール                                          ４．０
１２．トリエタノールアミン                                          １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
１４．二酸化チタン                                                  ８．０
１５．タルク                                                        ４．０
１６．ベンガラ                                                      １．０
１７．黄酸化鉄                                                      ２．０
１８．香料                                                          適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００４１】
処方例７  浴用剤
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｂ（製造例３）                                    ０．１
２．炭酸水素ナトリウム                                          ５０．０
３．黄色２０２号（１）                                            適量
４．香料                                                          適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。
【００４２】
処方例８  軟膏
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    １．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）              ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン                                  １０．０
４．流動パラフィン                                                ５．０
５．セタノール                                                    ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
７．プロピレングリコール                                        １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００４３】
比較例４  従来の軟膏
処方例８において、レガロシド  Ｉを精製水に置き換えたものを従来の軟膏とした。
【００４４】
処方例９  錠剤
処方                                                              部
１．レガロシド  Ｉ（製造例１）                                    ３．０
２．乾燥コーンスターチ                                          ２７．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム                        ２０．０
４．微結晶セルロース                                            ４０．０
５．ポリビニルピロリドン                                          ７．０
６．タルク                                                        ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成形する。成形した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００４５】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【実施例３】
【００４６】
実験例１ 紫外線によるコラーゲンの産生低下及び分解促進の抑制試験
正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を６０ｍｍディッシュに播種し、コンフルエントになるまで培養した。その後、最終濃度が１及び１０μｇ／ｍｌになるようにケイヒ酸誘導体を加え、２４時間培養した。比較用の試料は、ユリの熱水抽出物（比較製造例１）を用いた。培地を除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＵＶＢ領域の紫外線３０ｍＪ／ｃｍ２（東芝ＦＬ−２０Ｓ・Ｅランプ）を照射した。通常の培地に戻し、さらに２４時間培養後、ＲＮＡｉｓｏ（ＴＡＫＡＲＡ）にて細胞から総ＲＮＡを抽出し、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（インビトロジェン）を用い、ＲＴ−ＰＣＲ法にてタイプＩコラーゲンおよびＭＭＰ１ ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃にて２分間初期変性を行った後、９５℃：１５秒、６０℃：３１秒を１サイクルとして４０サイクル行った。内部標準としては、β−アクチンを用いた。タイプＩコラーゲンおよびＭＭＰ１ ｍＲＮＡ発現量は、β−アクチン ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。なお、タイプＩコラーゲン、ＭＭＰ１及びβ−アクチン ｍＲＮＡ発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【００４７】
タイプＩコラーゲン用のプライマーセット
ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号１）
ＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２）
ＭＭＰ１用のプライマーセット
ＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣ（配列番号３）
ＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣ（配列番号４）
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号５）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号６）
【００４８】
実験結果を表２に示した。紫外線照射により線維芽細胞におけるタイプＩコラーゲン ｍＲＮＡ発現は低下した。この低下は、ケイヒ酸誘導体の添加により顕著に抑制された。ユリの熱水抽出物（比較製造例１）も紫外線照射による線維芽細胞におけるタイプＩコラーゲン ｍＲＮＡ発現低下を抑制したが、その効果は、ケイヒ酸誘導体の方が顕著に高かった。また、紫外線照射により線維芽細胞におけるＭＭＰ１ ｍＲＮＡ発現は促進された。この促進は、ケイヒ酸誘導体の添加により顕著に抑制された。ユリの熱水抽出物（比較製造例１）も紫外線照射による線維芽細胞におけるＭＭＰ１ ｍＲＮＡ発現促進を抑制したが、その効果は、ケイヒ酸誘導体の方が顕著に高かった。これらの結果は、ケイヒ酸誘導体が、紫外線による真皮線維芽細胞におけるコラーゲンの産生低下及び分解促進を抑制することにより、従来技術では認められないような優れた紫外線による皮膚のしわの形成を防止・改善効果を有することを示している。
【００４９】
【表２】
2015221768.tif 000006
【００５０】
実験例２ アクチンフィラメント構築促進剤
コラーゲン溶液（新田ゼラチン、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｐ−１）を用いてコラーゲンコートしたカバースリップ上に線維芽細胞を播種し、２４時間培養した。細胞が接着したところで、ＰＢＳ存在下でＯｐｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｕｌｅｘ（ウシオ電機）にて１０Ｊ／ｃｍ２のＵＶ−Ａを２４時間おきに３回照射した。最後の紫外線照射後に、試料を含む無血清培地に交換し、さらに２４時間培養した。その後、細胞内のアクチンフィラメントをＴＲＩＴＣ−Ｐａｌｌｏｉｄｉｎ（ＳＩＧＭＡ）を用いて染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。撮影した蛍光画像をＲＧＢ成分に分解し、Ｒ値（０〜２５５）が３０以上の画素を抽出し、アクチンフィラメントの構築量を、細胞あたりの面積として算出した。
【００５１】
実験結果を表３に示した。紫外線照射によって、細胞あたりのアクチンフィラメントに相当する蛍光面積は有意に減少した。ユリの熱水抽出物により、アクチンフィラメントの減少は抑制された。しかし、本発明のケイヒ酸誘導体を１および１０μｇ／ｍｌ添加することにより、その減少は顕著に抑制された。以上の結果から、ケイヒ酸誘導体には、紫外線による細胞のアクチンフィラメント構築の低下を格段に抑制する効果があることが示された。
【００５２】
【表３】
2015221768.tif 000007
【００５３】
実験例３ 使用試験
処方例８及び比較例４の軟膏を調製し、顔面に真皮性しわ（小じわではない）を有する女性被験者（４０−５０代）を対象に１ヶ月間の使用試験を実施した。各々の軟膏をそれぞれ６名の被験者の頬部に朝晩１日２回使用させた。試験終了後のしわの改善度を、以下に示す判定基準にて視覚評価することにより、「しわに対する改善効果」を判定した。
（判定基準）
有効 ：真皮性しわ（小じわではない）がかなり目立たなくなった
やや有効：真皮性しわ（小じわではない）が以前より目立たなくなった
効果なし：変化なし
【００５４】
その結果、処方例８及び比較例４の軟膏を比較すると、ケイヒ酸誘導体を含有する軟膏に、明らかに真皮性しわの改善効果が認められた。なお、試験期間中、皮膚のトラブルは無く、安全性についても問題はなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上のことからケイヒ酸誘導体は、優れたコラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制作用及びアクチンフィラメント構築促進作用を有し、安定性にも優れていた。さらに、ケイヒ酸誘導体を含有する皮膚外用剤は、安全で優れたしわ改善作用を示した。よって、本発明のケイヒ酸誘導体を含有する皮膚外用剤は、しわ形成防止・改善作用として特に有効である。
【配列表】
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