(57)【要約】【課題】  非天然型生理活性ポリペプチドを作製すること。【解決手段】  当該方法は、α−アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有した生理活性ポリペプチド又はその生理活性断片を選択するステップ、及び、前記生理活性ポリペプチドの配列に一致するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを作製するステップを含むが、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％が、β−アミノ酸残基と置換され、前記α−アミノ酸残基は、繰り返しパターンで分配される。【選択図】  図１Ｂ
2015193648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然型生理活性ポリペプチドを作製する方法であって：
（ａ）α−アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有した生理活性ポリペプチド又はその生理活性断片を選択するステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片の配列に一致するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを作製するステップであり、
（ｉ）前記合成ポリペプチドにおいて、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％が、β−アミノ酸残基と置換され、
（ｉｉ）前記合成ポリペプチドにおいて、前記β−アミノ酸残基及び前記α−アミノ酸残基は、繰り返しパターンで分配され、さらに、
（ｉｉｉ）前記合成ポリペプチドは、約１０残基から約１００残基までの長さを有し、少なくとも２つのβ−アミノ酸残基を含む、ステップ；
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の（ｉ）は、前記α−アミノ酸残基のうち少なくとも１つを、β２及びβ３炭素原子を包含する環を介して環状にされた少なくとも１つのβ−アミノ酸残基と置換するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の（ｉ）は、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％を、β２及びβ３炭素原子を包含する環を介して環状にされたβ−アミノ酸残基と置換するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）の（ｉ）は、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％をβ−アミノ酸残基と置換するステップを含み、前記β−アミノ酸残基のうち少なくとも１つが、そのβ２及びβ３炭素原子にて未置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の（ｉ）は、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％をβ−アミノ酸残基と置換するステップを含み、前記β−アミノ酸残基のうち全てが、そのβ２及びβ３炭素原子にて置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の（ｉ）は、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％をβ−アミノ酸残基と置換するステップを含み、各β−アミノ酸残基が、置換する前記α−アミノ酸残基と同じ側鎖を少なくとも１つ有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質分解耐性の非天然型生理活性ポリペプチドを作製する方法であって：
（ａ）α−アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有した生理活性ポリペプチド又はその生理活性断片を選択するステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片の配列に一致するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを作製するステップであり、
（ｉ）前記合成ポリペプチドにおいて、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％が、類似性のβ−アミノ酸残基と置換され、
（ｉｉ）各類似性のβ−アミノ酸残基は、置換する前記α−アミノ酸残基と同じ側鎖を少なくとも１つ有し、
（ｉｉｉ）前記合成ポリペプチドにおいて、前記β−アミノ酸残基及び前記α−アミノ酸残基は、繰り返しパターンで分配され、さらに、
（ｉｖ）前記合成ポリペプチドは、約１０残基から約１００残基までの長さを有し、少なくとも２つのβ−アミノ酸残基を含む、ステップ；
を含む方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドによってとられる折り畳み構造において、前記繰り返しパターンは、前記非天然型ポリペプチドがらせん形構造をとる場合に、前記β−アミノ酸残基を前記折り畳み分子構造の一側面に沿って一直線をなすように配置する、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の非天然型生理活性ポリペプチドを作製する方法。
【請求項９】
β−アミノ酸残基及びα−アミノ酸残基の前記繰り返しのパターンは、（ααααααβ）、（αααααβ）、（ααααβ）、（αααβ）、（ααβ）、（ααβαααβ）、（ααβαβαβ）、及び、（αβ）からなる群から選択される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の非天然型生理活性ポリペプチドを作製する方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）は、約２０残基から約５０残基を有する合成ポリペプチドを作製するステップを含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の非天然型生理活性ポリペプチドを作製する方法。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ番号：４〜１１及び２５〜３０に示された一次アミノ酸配列を含む単離された非天然型ポリペプチド。
【請求項１２】
ヒト細胞に対するヒト免疫不全ウイルスの融合を阻害する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ番号：４〜１１及び２５〜３０に示された一次アミノ酸配列を含む単離された非天然型ポリペプチドにヒト細胞を接触させるステップを含む方法。
【請求項１３】
ヒト細胞に対するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の融合を阻害する方法であって：
（ａ）α−アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＩＶ融合に必要な天然の生理活性ポリペプチド又はその生理活性断片を選択するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片の配列に一致するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを作製するステップであり、
（ｉ）前記合成ポリペプチドにおいて、ステップ（ａ）の前記生理活性ポリペプチド又は断片に存在する前記α−アミノ酸残基のうち約１４％から約５０％が、β−アミノ酸残基と置換され、
（ｉｉ）前記合成ポリペプチドにおいて、前記β−アミノ酸残基及び前記α−アミノ酸残基は、繰り返しパターンで分配され、さらに、
（ｉｉｉ）前記合成ポリペプチドは、約１０残基から約１００残基までの長さを有し、少なくとも２つのβ−アミノ酸残基を含む、ステップ；並びに、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記合成ポリペプチドにヒト細胞を接触させるステップ；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ及びベータアミノ酸残基を含むポリペプチド化合物を作製する方法、該方法により生成された化合物、及び、ヒトを含めた動物における疾患を治療する薬剤的に活性な作用物質としての前記化合物の使用を対象としている。
【背景技術】
【０００２】
多くの天然に存在する生理活性化合物は、α−アミノ酸に基づく蛋白質又はペプチド（すなわち、１つのアミノ酸のα−カルボキシル基が、隣接するアミノ酸のα−アミノ基にアミド結合によって連結されるα−アミノ酸の配列）である。近年、新たな薬剤的に活性の医薬物質の発見へのアプローチは、ペプチドのライブラリーを合成するため、続いて、所望の結合活性等の所望の活性を有するライブラリー内の化合物を評価するためにされてきた。しかし、α−アミノ酸ペプチドは、特に、ｉｎ  ｖｉｎｏで不十分に吸収される且つ蛋白質分解を受けやすい場合が多いため、薬剤的使用に対して完全に満足のいくものであるというわけではない。
【０００３】
β−アミノ酸、及び、β−アミノ酸から合成されるペプチドに対する多くの研究が、科学及び特許の文献で報告されてきた。例えば、本発明の共同発明者Ｓａｍｕｅｌ  Ｈ．Ｇｅｌｌｍａｎにより率いられたグループによって行われた、“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １４−ｈｅｌｉｃａｌ  Ｂｅｔａ−Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｍｕｒｒａｙ＆Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５）７（８），１５１７−１５２０；“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２，２−Ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ”，Ｈｕｃｋ＆Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００５）７０（９），３３５３−６２；“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｔｒｙ  ｂｙ  Ｂｅｔａ−Ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｐｏｔｏｃｋｙ，Ｍｅｎｏｎ，＆Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００５）１２７（１１）：３６８６−７；“Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  １１−ｈｅｌｉｘ  ｉｎ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ”，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｃｈｏｉ，Ｇｕｚｅｉ，＆Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００５），１２７（３８），１３１３０−１、及び、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ”，Ｍｕｒｒａｙ，Ｆａｒｏｏｑｉ，Ｓａｄｏｗｓｋｙ，Ｓｃａｌｆ，Ｆｒｅｕｎｄ，Ｓｍｉｔｈ，Ｃｈｅｎ，＆Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００５），１２７（３８），１３２７１−８０を含む研究を参照されたい。スイス、チューリッヒのＤｉｅｔｅｒ  Ｓｅｅｂａｃｈにより率いられた別のグループも、ベータポリペプチドの分野において大規模に発表した。例えば、Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７９：９１３−９４１；及び、Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７９：２０４３−２０６６を参照されたい。それら２つの研究論文のうち１つ目の文献において、Ｓｅｅｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．は、βヘキサペプチド、すなわち、（Ｈ−β−ＨＶａｌ−β−ＨＡｌａ−β−ＨＬｅｕ）２−ＯＨの合成及び特徴づけを記載している。興味深いことに、この研究論文は、βペプチドの構造に対する従来技術の報告は、矛盾し且つ「部分的に議論の余地のある」もの���あることに特に注目している。２番目の研究論文において、Ｓｅｅｂａｃｈ等は、上記のβヘキサペプチドの二次構造、及び、二次構造に対する残基の変化による作用を調査している。
【０００４】
Ｄａｄｏ  ａｎｄ  Ｇｅｌｌｍａｎ（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１０５４−１０６２は、β−アラニン及びγ−アミノ酪酸の誘導体における分子内水素結合を記載している。この研究論文は、ポリマーの主鎖上の最も近い隣接するアミド基間での分子内水素結合が好まれない場合にβペプチドはα−アミノ酸ポリマーと類似の様式で折り畳まることを仮定している。
【０００５】
Ｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７（１０）：１５７５−１５７８は、Ｃ−１β−カルボキシレート及びＣ−２α−アミノ基を介してＤ−グリコシルアミン誘導体が互いに連結されたβペプチドの糖質類縁体を報告している。この化合物の種類には、「カルボペプトイド」という慣用名が与えられた。
【０００６】
組み合わせライブラリーを生じる方法に関して、いくつかのレビューが入手可能である。例えば、Ｅｌｌｍａｎ（１９９６）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１３２−１４３及びＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４１１−４４８を参照されたい。
【０００７】
βポリペプチドに関する近年の特許文献では、例えば、“Ｂｅｔａ−Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”と題された米国公開特許出願第２００８／０１６６３８８号；“Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｂｅｔａ２−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｖｉａ  Ｏｒｇａｎｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ”と題された第２００８／００５８５４８号；“Ｂｅｔａ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”と題された第２００７／０１５４８８２号；“Ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ”と題された第２００７／０１２３７０９号；及び、“Ｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓａｍｅ”と題された第２００７／００８７４０４号を参照されたい。“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”と題された米国公開特許出願第２００３／０２１２２５０号も参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、蛋白質分解耐性の非天然型生理活性ポリペプチドを作る方法を対象としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
当該方法は、本質的にα−アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する生物学的又は薬剤的に活性のポリペプチド又はその生理活性断片（「標的」）を選択するステップを含む。次に、標的のα−アミノ酸に一致するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドが作製される。しかし、合成ポリペプチドにおいて、標的に存在するα−アミノ酸残基の約１４％から約５０％がβ−アミノ酸残基と置換される。より好ましくは、標的に存在するα−アミノ酸残基の約２０％から約５０％がβ−アミノ酸残基と置換される。そのβ−アミノ酸残基は、合成ポリペプチドのアミノ酸配列を通してβ−アミノ酸残基及びα−アミノ酸残基が繰り返しパターンで分配されるように合成ポリペプチドに配置される。結果として生じる非天然型ポリペプチドは、好ましくは約１０から約１００残基の長さ、より好ましくは約２０から約５０残基の長さを有する。少なくとも２つの残基がβ−アミノ酸残基であることが好ましい。
【００１０】
本発明の１つの見解において、標的におけるα−アミノ酸残基のうち少なくとも１つが、β２及びβ３炭素原子を包含する環を介して環状にされた少なくとも１つのβ−アミノ酸残基と置換される。本発明の別の見解においては、挿入されたβ−アミノ酸残基の大部分又は全てが、β２及びβ３炭素原子を包含する環を介して環状にされる。本発明の別の見解では、β−アミノ酸残基のうち少なくとも１つは、そのβ２及びβ３炭素原子で未置換である。あるいは、β−アミノ酸残基のうち全てを、そのβ２及びβ３炭素原子にて（直鎖、分枝、又は、環状の置換基と）置換することができる。
【００１１】
本発明の別の見解において、標的に存在するα−アミノ酸残基の約１４％から約５０％がβ−アミノ酸残基と置換され、各β−アミノ酸残基は、置換するα−アミノ酸残基と同じ側鎖を少なくとも１つ有する。従って、この見解において、当該方法は、擬態される標的を選択するステップ、続いて、標的の配列に一致するアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを作製するステップを含むが、標的に存在するα−アミノ酸残基の約２０％から約５０％が類似性のβ−アミノ酸残基と置換される。この本発明の見解では、各類似性のβ−アミノ酸残基は、置換するα−アミノ酸残基と同じ側鎖を少なくとも１つ有する。ここでも、β−アミノ酸残基及びα−アミノ酸残基は、合成ポリペプチドのアミノ酸配列において繰り返しのパターンで分配される。
【００１２】
ＳＥＱ  ＩＤ番号：４〜１１、１６〜２２、及び、２５〜３０において示された一次アミノ酸配列を含む単離された非天然型ポリペプチドも本発明に含まれる。これらの非天然型ポリペプチドは、ヒト細胞に対するヒト免疫不全ウイルスの融合を阻害する方法に使用することができる。当該方法は、ＳＥＱ  ＩＤ番号：４〜１１、１６〜２２、及び、２５〜３０において示された一次アミノ酸配列を含む単離された非天然型ポリペプチドにヒト細胞を接触させ、それによって、細胞がその細胞膜を介したＨＩＶの進入に耐性になるステップを含む。
【００１３】
本発明の別の見解は、ヒト細胞に対するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の融合を阻害する方法を対象としている。当該方法は、第一に、α−アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し且つｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＩＶ融合に必要な天然の生理活性ポリペプチド又はその生理活性断片を選択するステップを含む。次に、前記生理活性ポリペプチド又はその断片の配列に一致するアミノ酸配列を有した合成ポリペプチドが作製される。合成ポリペプチドにおいて、生理活性ポリペプチド又は断片に存在するα−アミノ酸残基の約１４％から約５０％がβ−アミノ酸残基と置換される。さらに、合成ポリペプチドにおいて、β−アミノ酸残基及びα−アミノ酸残基が、繰り返しのパターンで分配される。次に、ヒト細胞がその合成ポリペプチドに接触される。
【００１４】
本発明における全ての実施形態において、繰り返しのパターンがβ−アミノ酸残基を、らせん形構造をとる非天然型ポリペプチドにおけるらせんの一側面上で一直線をなすように置くことが（要求されないけれども）全般的に好ましい。すなわち、非天然型ポリペプチドがらせん形構造をとる場合に、ポリペプチドによってとられた折り畳み構造において、α−及びβ−残基の繰り返しのパターンがβ−アミノ酸残基を、折り畳み分子構造の一側面に沿って一直線をなすように配置する。β−アミノ酸残基及びα−アミノ酸残基の繰り返しのパターンは、（ααααααβ）、（αααααβ）、（ααααβ）、（αααβ）、（ααβ）、（ααβαααβ）、（ααβαβαβ）、及び、（αβ）等、長さが２から７残基のパターンであり得る。長さが２から７残基のα−及びβ−アミノ酸残基の独特なパターン全てが本発明の範囲内にあることは明白である。
【００１５】
すでに知られているか又は将来開発されるポリペプチド合成のいかなる手段も介してポリペプチド化合物を作製するために当該方法を使用することができる。最新のペプチド合成方法を使用し、本発明の方法に従い作製されたポリペプチドは、全般的に、約１００残基長未満、より好ましくは、全残基が約１０から約５０、さらに好ましくは、全残基が約２０から約５０である。これらの記述された範囲外の範囲も本発明の範囲内である。Ａｂｇｅｎｔ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）等、多くの商業的なサービスが、約１００残基までのペプチド合成を提供している。
オリゴマーに沿った側鎖の配列は、病状に対して所望の生理活性を有した原型αペプチド（標的）に基づいていることが好ましい。所望の化合物の特性を最適化するために、側鎖の配列は、α／βペプチドの主鎖上への翻訳後に変えることもできる。
【００１６】
非天然型α／βペプチドの主鎖に導入された各β残基は、２つの主鎖炭素（β３又はβ２）のうちの１つの炭素又は主鎖炭素のうちの両方の炭素にて側鎖を有することができる。側鎖も、その２つの主鎖炭素を接続する環を介して環状にすることができる。
【００１７】
本発明において特に注目すべきは、側鎖を有するβ−残基との原型標的配列内のα−残基の置換が、オリゴマーに沿った側鎖の配列を乱すことなく主鎖に対する改変を可能にするということである。環状β−残基は主鎖を堅くし、らせん形構造を促進する。
【００１８】
主鎖の改変によりオリゴマーに与えられたプロテアーゼ耐性を最大にするために、β−残基は配列の全長に沿って均等に一定の間隔で置かれることが好ましい。規則正しく繰り返す主鎖のパターンの例として、それだけに限られないが、（ααααααβ）、（αααααβ）、（ααααβ）、（αααβ）、（ααβ）、（ααβαααβ）、（ααβαβαβ）、及び、（αβ）が挙げられる。
【００１９】
最終化合物における所望の特性には、一般に病状の起源又は悪化に関与する、特に、ヒト細胞内へのＨＩＶの侵入に関与する蛋白質間相互作用を調節する能力、並びに、（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期、体内分布の改善等）標的αペプチド配列に関する改善された薬物動態学的及び薬力学的特性が含まれる。らせん形構造は必要ではないけれども、最終化合物のうち多くが、溶液においてらせん形構造をとる。
【００２０】
数値範囲は、本明細書において使用される場合、明確に開示されていようとなかろうと、その範囲内に含まれる全ての数及び数の部分集合を含むよう意図される。さらに、これらの数値範囲は、その範囲内のいかなる数又は数の部分集合も対象とした請求項に対する支持を提供するとして解釈されるべきである。例えば、１から１０という開示は、２から８、３から７、５、６、１から９、３．６から４．６、３．５から９．９等という範囲を支持するとして解釈されるべきである。
【００２１】
本発明における単数形の特徴又は限定への言及は全て、言及されている文脈によって逆に特定又は明確に意味していない限り、対応する複数形の特徴又は限定を含むべきであり、逆もまた同様である。
【００２２】
本明細書において使用される方法又は工程段階の組み合わせ全ては、その組み合わせが言及されている文脈によって逆に特定又は明確に意味していない限り、いかなる順でも試みることができる。
【００２３】
本発明の方法、化合物、及び、組成物は、本明細書に記載された本発明の重要な要素及び限定、並びに、本明細書に記載されたか、さもなければ、合成有機化学において有用ないかなる追加の又は任意の成分、構成要素、若しくは限定も含む、上記のものから成る、又は、本質的に上記のものから成り得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】αペプチド１〜３、及び、α／βペプチド４〜１１の配列を描写している。ボールド体の残基は、そのα−アミノ酸の対応物に対応するβ３−残基を示し、ボールド体で下線が引かれた残基は、環状にされたβ−アミノ酸残基ＡＣＰＣ（Ｘ）及びＡＰＣ（Ｙ）である。
【図１Ｂ】α−アミノ酸、対応するβ３−アミノ酸類似体、及び、環状のβ−残基ＡＣＰＣ（Ｘ）及びＡＰＣ（Ｚ）の構造を描写している。
【図２Ａ】３つのＮＨＲセグメント及び２つのＣＨＲセグメントから構成されるｇｐ４１−５蛋白質を描写している。
【図２Ｂ】競合ＦＰアッセイにおいてトレーサーとして使用される蛍光ＣＨＲペプチドを描写している（Ｆｌｕ＝５−カルボキシフルオレスセイン）。
【図２Ｃ】ｇｐ４１−５によって形成される５ヘリックスバンドルとＦｌｕ−ＣＨＲペプチドとの相互作用の概略図である。
【図３Ａ】ＮＨＲペプチド１とＣＨＲ類似体３との間で形成された複合体の円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。実線は、２５℃にてＰＢＳ中２０μＭという全濃度の、示されたオリゴマーの１：１の混合物に対して観察されたスペクトルである。点線は、個々の構成要素のＣＤからの１：１の相互に作用しない混合物に対して計算されたスペクトルである。
【図３Ｂ】ＮＨＲペプチド１とＣＨＲ類似体４との間で形成された複合体の円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。実線は、２５℃にてＰＢＳ中２０μＭという全濃度の、示されたオリゴマーの１：１の混合物に対して観察されたスペクトルである。点線は、個々の構成要素のＣＤからの１：１の相互に作用しない混合物に対して計算されたスペクトルである。
【図３Ｃ】ＮＨＲペプチド１とＣＨＲ類似体５との間で形成された複合体の円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。実線は、２５℃にてＰＢＳ中２０μＭという全濃度の、示されたオリゴマーの１：１の混合物に対して観察されたスペクトルである。点線は、個々の構成要素のＣＤからの１：１の相互に作用しない混合物に対して計算されたスペクトルである。
【図３Ｄ】ＮＨＲペプチド１とＣＨＲ類似体９とで形成された複合体の円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。実線は、２５℃にてＰＢＳ中２０μＭという全濃度の、示されたオリゴマーの１：１の混合物に対して観察されたスペクトルである。点線は、個々の構成要素のＣＤからの１：１の相互に作用しない混合物に対して計算されたスペクトルである。
【図４Ａ】αペプチド１と３とで新たに特徴づけした複合体の結晶構造において観察した６ヘリックスバンドル（図４Ａ）、及び、αペプチド１と２とで以前に特徴づけされた複合体（Ｃｈａｎ，Ｆａｓｓ，Ｂｅｒｇｅｒ，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｃｅｌｌ  １９９７，８９，２６３−２７３）の結晶構造において観察した６ヘリックスバンドル（図４Ｂ）の比較である。２つの構造体間のＣα原子のＲＭＳＤは、０．７Åである。
【図４Ｂ】αペプチド１と３とで新たに特徴づけした複合体の結晶構造において観察した６ヘリックスバンドル（図４Ａ）、及び、αペプチド１と２とで以前に特徴づけされた複合体（Ｃｈａｎ，Ｆａｓｓ，Ｂｅｒｇｅｒ，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｃｅｌｌ  １９９７，８９，２６３−２７３）の結晶構造において観察した６ヘリックスバンドル（図４Ｂ）の比較である。２つの構造体間のＣα原子のＲＭＳＤは、０．７Åである。
【図４Ｃ】１＋３の複合体の結晶構造を描写している。
【図４Ｄ】２．８Åの分解能まで解析された、１＋１０の複合体の結晶構造を描写している。
【図４Ｅ】２．８Åの分解能まで解析された、１＋８の複合体の結晶構造を描写している。
【図４Ｆ】全てαペプチドヘリックスバンドルで形成された１＋３の、１＋１０によって形成されたものとのオーバーレイを描写している。
【図４Ｇ】全てαペプチドヘリックスバンドルで形成された１＋３の、１＋８によって形成されたものとのオーバーレイを描写している。
【図５Ａ】円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。２５℃にてＰＢＳ中２０μＭ濃度での、ＮＨＲペプチド１並びにＣＨＲペプチド３、４、５、８、及び、１０に対する重畳されたＣＤデータを描写している。
【図５Ｂ】円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。２５℃にてＰＢＳ中２０μＭという全濃度の、示された１：１の混合物のＣＤスペクトル（実線）を、個々の構成要素のＣＤ測定からの１：１の相互に作用しない混合物に対して計算されたスペクトル（点線）と共に描写している。
【図５Ｃ】円二色性（ＣＤ）スペクトルを描写している。ＰＢＳ中２０μＭ濃度での、示された複合体に対する２２２ｎｍでの温度依存性の分子楕円率を描写している。
【図６】ＰＢＳ中全ペプチドが２０μＭという濃度での、１＋３、１＋４、１＋５、及び、１＋９の１：１の混合物に対する２２２ｎｍでの温度依存性の分子楕円率を描写したグラフである。
【図７Ａ】Ｐｕｍａ  ＢＨ３ペプチド（１）及びα／βペプチド類似体２〜８の一次配列を描写している（灰色の丸及びボールド体の文字はβ３残基を示している）。枠で囲まれた残基は、配列相同性に基づく結合にとって最も重要な疎水性位置を示している。
【図７Ｂ】１のヘリカルホイール図を描写している。枠で囲まれた残基は、配列相同性に基づく結合にとって最も重要な疎水性位置を示している。
【図７Ｃ】図７Ｂと同じ向きで描かれた１〜８の概略図を提示している。白及び灰色の丸は、それぞれα残基及びβ３残基によって占領された７価の原子の位置を示している。
【図７Ｄ】ジェネリックのα−アミノ酸及びジェネリックのβ３−アミノ酸の構造を提示しており、「Ｒ」置換基は、慣習的に「側鎖」と呼ばれている。
【図８】化合物１〜８によるＢｃｌ−ｘＬ又はＭｃｌ−１に結合した蛍光標識したＢａｋ  ＢＨ３ペプチドの置換に対する阻害定数を描写したヒストグラムである。折れたバーは、アッセイにおいて識別可能なものよりも堅固に結合する化合物を示している。８に対する値は、どちらの蛋白質に対しても１００μＭよりも弱かった。
【図９Ａ】図９Ｄにおいて構造が示されている３の蛋白質分解安定性を描写している。ＴＢＳ中２０μＭペプチドの溶液を、室温にて１０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫでインキュベートした。簡単な指数関数型減衰への適合から生じる曲線を用いて時間依存的な分解のデータを描写している。
【図９Ｂ】図９Ｄにおいて構造が示されている４の蛋白質分解安定性を描写している。ＴＢＳ中２０μＭペプチドの溶液を、室温にて１０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫでインキュベートした。簡単な指数関数型減衰への適合から生じる曲線を用いて時間依存的な分解のデータを描写している。
【図９Ｃ】図９Ｄにおいて構造が示されている１０の蛋白質分解安定性を描写している。ＴＢＳ中２０μＭペプチドの溶液を、室温にて１０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫでインキュベートした。簡単な指数関数型減衰への適合から生じる曲線を用いて時間依存的な分解のデータを描写している。
【図９Ｄ】化合物３、４、及び、１０の構造を示しており、示された時点にて質量分析によって観察された蛋白質分解の生成物も描写している。鉛直線は、示された残基間の主鎖アミド結合の加水分解と一致した１つ又は両方の生成物のＭＡＬＤＩ−ＭＳによる観察を示している。
【図１０Ａ】ｇｐ４１由来の融合阻止ペプチドの濃度の関数として、示されたウイルス株によるＴＺＭ−ｂｌ細胞の感染の阻害を描写したグラフである。各データポイントは、３つの独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。ＮＬ４−３感染の阻害を描写している。
【図１０Ｂ】ｇｐ４１由来の融合阻止ペプチドの濃度の関数として、示されたウイルス株によるＴＺＭ−ｂｌ細胞の感染の阻害を描写したグラフである。各データポイントは、３つの独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。ＣＣ１／８５感染の阻害を描写している。
【図１０Ｃ】ｇｐ４１由来の融合阻止ペプチドの濃度の関数として、示されたウイルス株によるＴＺＭ−ｂｌ細胞の感染の阻害を描写したグラフである。各データポイントは、３つの独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。ＨＣ４感染の阻害を描写している。
【図１０Ｄ】ｇｐ４１由来の融合阻止ペプチドの濃度の関数として、示されたウイルス株によるＴＺＭ−ｂｌ細胞の感染の阻害を描写したグラフである。各データポイントは、３つの独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。ＤＪ２５８感染の阻害を描写している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下の略語は本明細書を通して使用される。
Ａｃ２Ｏ＝無水酢酸、酢酸オキシド（ａｃｅｔｉｃ  ｏｘｉｄｅ）、アセチルアセテート
ＡＣＰＣ＝ｔｒａｎｓ−２−アミノシクロペンタンカルボン酸
ＡＰＣ＝ｔｒａｎｓ−３−アミノピロリジン−４−カルボン酸
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ＝ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
β−Ｇａｌ＝β−ガラクトシダーゼ
ＣＤ＝円二色性
ＣＨＲ＝Ｃ末端７アミノ酸繰り返し
ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸
ＦＫＢＰ＝ＦＫ５０６−結合蛋白質
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルホルミル
ＦＰ＝蛍光偏光
Ｈａｌｏｇｅｎ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス
ＨＯＢＴ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ｉＰｒ２ＥｔＮ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ＝マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＮＨＲ＝Ｎ末端７アミノ酸繰り返し
ＮＭＰ＝１−メチル−２−ピロリジノン
ＰＴＨ１Ｒ及びＰＴＨ２Ｒ＝副甲状腺ホルモン受容体１及び２
ＲＭＳＤ＝標準偏差
ＲＴＫｓ＝受容体チロシンキナーゼ
ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子
ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水
ＴＢＳ＝トリス緩衝食塩水
Ｔｒｉｓ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＮＢＳ＝２，４，６−トリニトロベンゼン−スルホン酸。
【００２６】
本明細書では、他に示されていない限り、「本発明の化合物」等の用語は、塩の形状の化合物だけでなく遊離塩基の形状の化合物、また、固体相に結合した時の化合物も含む。アミン置換基等の塩基性置換基が存在する場合、塩の形状は、例えば二塩化水素化物等の酸付加塩であり得る。塩は、それだけに限らないが、鉱酸及び有機酸から得られるものを含み、明白に、例えば、塩酸塩及び臭化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｄｅｓ）、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メチレンビス−ｂ−ヒドロキシナフトアート、ゲンチジン酸塩、イセチオン酸塩、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルホン酸塩、キナ酸塩等を含む。塩基付加塩には、アルカリ若しくはアルカリ土類金属の塩基、又は、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎメチルモルホリン等、従来の有機塩基から得られるものが含まれる。他の適した塩は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｃｈ，Ｅｄｓ．，（Ｃｏｐｙ  Ｒｉｇｈｔ）２００２，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｉｔｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ（Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：ｐ．１−１９（Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７）において見られ、どちらの文献も、全内容を本出願において援用する。
【００２７】
本発明のβペプチドのβ−アミノ酸残基は、特徴的にβ−アミノ−ｎ−プロピオン酸の誘導体であり、一般的に、主鎖における位置番号２の炭素原子（β２炭素）にて、及び／又は、位置番号３の炭素原子（β３炭素）にてさらに置換され、例えば、Ｎ末端アミノ窒素原子にてさらに置換することができる。β２、β３、及び、アミノ置換基は、１から４３個の炭素原子を有する置換基を含むことができ、任意にカルボニル（すなわち−Ｃ（Ｏ）−）基を有するＯ、Ｎ、又はＳから選択される４個までのヘテロ原子によって任意に割り込まれ、さらに、ハロ、ＮＯ２、−ＯＨ、Ｃ１−４アルキル、−ＳＨ、−ＳＯ３、−ＮＨ２、Ｃ１−４アシル、Ｃ１−４アシルオキシ、Ｃ１−４アルキルアミノ、Ｃ１−４ジアルキルアミノ、トリハロメチル、−ＣＮ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、又は、Ｃ１−４アルキルスルホニルから選択される６個までの置換基によって任意に置換される。
【００２８】
β−アミノ酸残基のβ２及び／又はβ３炭素原子上の置換基は、例えば、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）２ＣＨ３、−ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ｐＯＨ−フェニル、−ＣＨ２−インドール、−ＣＨ２−ＳＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨＯＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＨ２−イミダゾール、−ＣＨ−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２等、天然のα−アミノ酸のα−炭素原子に存在する置換基を含む群から選択することができか、又は、蛋白新生のα−アミノ酸プロリンにおいて見られるように、隣接するＮＨ基と共にピロリジン環を画定する。
【００２９】
本発明に従って、本発明の化合物は所望の特性を有することが判ってきた。例えば、３個以上が環状にされた残基を約７個又はそれ以上有する本明細書に記載された化合物は、安定したらせん形構造を溶液において形成することができる。また、本明細書に記載された化合物は、ペプシン等のペプチダーゼの作用に対して、対応するαペプチドよりもはるかに優れた安定性を有する。本明細書に記載された化合物は、それ自体では、対応するαペプチドよりも例えば血清半減期等のより長い半減期を同様に示すと思われている。
【００３０】
本発明は、例えば、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が単一の異性体の形状から成る等、純な異性体の形状の本発明の化合物、並びに、これらの形状の混合物を含む。本発明の化合物は、個々の鏡像異性体の形状でもあり得るか、又は、ラセミ化合物若しくはジアステレオ混合物若しくはいかなる他の可能な異性体の混合物の形状でもあり得る。
【００３１】
本発明の化合物は、本明細書に記載された合成化学手順だけでなく、α−アミノ酸ペプチドを作製するために使用することができる手順に類似の他の手順によっても調製することができる。そのような手順は、例えばＢｏｃ方法もＦｍｏｃ方法も使用した、溶液の手順も固体相の手順も含む。このように、本明細書に記載された化合物は、第１のβ−アミノ酸残基のβ−アミノ基若しくはその前駆物質と第２のβ−アミノ酸残基又はα−アミノ酸残基のα−カルボキシル基若しくはその前駆物質との間でアミド結合が形成される連続するアミド結合形成手順によって調製することができる。アミド結合形成ステップは、所望のα／βポリペプチドを与えるよう要求される間は何度でも、特定のα−アミノ酸残基及び／若しくはβ−アミノ酸残基、並びに／又はその前駆物質を用いて繰り返すことができる。また、２つ、３つ、又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチド（α又はβ）は、より大きなα／βペプチドを生じるよう共に結合させることができる。環状の化合物は、前に合成した直鎖状のポリペプチドのＮ末端とＣ末端との間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。
【００３２】
β３−アミノ酸を、対応するα−アミノ酸から、例えばＮにより保護されたα−アミノ酸のアーント・アイシュタート増炭反応によってエナンチオ選択的に生成することができる。従来、そのような増炭の後には、Ｗｏｌｆｆ転位の活性ジアゾケトン中間体のβ−アミノ酸残基との結合が続く場合がある。
【００３３】
本明細書に記載された方法を使用して、特定の薬剤的使用を示した所望の活性、特に生物学的活性を有した化合物をスクリーニングするのに使用するための別々の化合物コレクション又は化合物のライブラリーを確立することができる。
【００３４】
従って、本発明は、本明細書に記載された複数の化合物を含む、別々の（一般的に２から約１０００個の化合物を含む）化合物コレクション、及び、（一般的に２０乃至１００から例えば１００，０００個以上の化合物等、何十万個もの化合物を含む）化合物のライブラリーも含む。
【００３５】
所望の生物学的活性を有した化合物は、以下に記述される適切なスクリーニングアッセイを使用して同定することができる。
【００３６】
ＨＩＶ蛋白質ｇｐ４１は、エンベロープウイルスの哺乳類細胞に対する融合に関与する蛋白質の種類の標準的な例である。ウイルス−細胞融合の間、ｇｐ４１Ｎ末端は宿主細胞の膜内に入り込み、三量体の蛋白質は、Ｎ末端７アミノ酸繰り返し（ＮＨＲ）領域の３つのコピー及びＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲ）領域の３つのコピーから構成される６へリックスバンドルの形成を含めた徹底的な構造転位を経る。ｇｐ４１の６ヘリックスバンドルの形成は、ウイルス−細胞融合には必要不可欠なステップであり、従って、合理的に設計された抗ウイルス物質を使用して妨害するという目的にとって魅力的な工程である。本発明の有用性及び機能性を実証するために、ｇｐ４１に類似性ではあるがα−及びβ−残基の混合物から構成される非天然型ポリペプチド（α／βペプチド）を作製し、ＨＩＶ−細胞融合の阻害薬として作用することを示した。
【００３７】
例えば化合物１及び２等、ｇｐ４１ＮＨＲ又はＣＨＲ配列に基づくいくつかのαペプチド（それぞれＳＥＱ  ＩＤ番号：１及び２、図１Ａを参照）を融合阻害薬として調査した。最も突出した例は、ＣＨＲ領域から得られる（“ＦＵＺＥＯＮ”という登録商標の下、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．により販売される）３６−残基のαペプチド薬剤エンフビルチドである。α−ヘリックス様式で３つの鍵となるＣＨＲ疎水性側鎖を表示するよう意図された、小分子、環状ペプチド、テルフェニル、及び、βペプチドを含めた短いα−ヘリックス模倣物を使用して、いくつかのグループを、ｇｐ４１の６ヘリックスバンドル形成を阻害するよう試した。しかし、これらの分子は、細胞ベースのアッセイにおいて控えめな抗ＨＩＶ活性（エンフビルチドに対してＩＣ５０＞１μＭ  ｖｓ．〜１ｎＭ）のみを表示する。同様の結果が、内部の架橋結合によってα−らせん性に向けて化学的に前もって処置した比較的短いαペプチドを用いて見られた。
【００３８】
原型αペプチド配列の鍵となる構造的及び機能的特性を模倣するα／βペプチドフォルダマーを系統的に展開することによって、類似性のαポリペプチドよりも蛋白質分解に対して安定した非天然型生理活性ポリペプチドが生じるということを本発明は発見した。本明細書において「配列ベースの設計」と呼ばれる当該方法は、β−アミノ酸残基全般、好ましくは置換されたα−残基の側鎖を生じるβ３−アミノ酸残基との標的配列を通じたα−残基の系統的置換を含む。図１Ｂを参照されたい。α→β改変によって、親αペプチドからの側鎖配列は維持されながらペプチド主鎖の化学的組成が変わる。配列ベースの設計の系統的使用によって、アポトーシスに関与する蛋白質様四次組立体の形成及び蛋白質らせん体の擬態等の複雑な行動を示すα／βペプチドが生じる。ｇｐ４１により媒介されるＨＩＶ−細胞融合を、その標的が非常に生物医学的に重要なものであるため、配列ベースの主鎖改変の有用性及び機能性を実証するモデルシステムとして選択した。要するに、他の治療的に重要な標的に対しても繰り返すことができる合理的且つ系統的な方法を使用して設計された、ｇｐ４１により媒介されるＨＩＶ−細胞融合を阻害する薬理学的に活性な作用物質は信じられないほど有用である。当該方法は、より短時間で、試験及びエラーが少なく、合理的に指揮された様式で薬理学的に活性な作用物質を設計する手段を提供する。
【００３９】
化合物２等の天然のｇｐ４１  ＣＨＲ配列に基づくαペプチドは広範に調査されてきており、いくつかのグループは、合理的な変異誘発によるＣＨＲ  αペプチドの結合親和性及び生物学的安定性を改善する試みを発表した。本発明の有用性及び機能性を実証するために、最近報告されたｇｐ４１  ＣＨＲ類似体のαペプチド３（ＳＥＱ  ＩＤ番号：３、図１Ａを参照）を、α→β改変に対する起始点として選んだ。αペプチド３は、
操作されたらせん内部の塩橋及びＸｘｘ→Ａｌａ置換によってらせん傾向を強めるよう意図された側鎖変異を多数含む。以前の研究において、３は、細胞培養において高められた抗ウイルス効力を示し、野生型ＣＨＲ配列に基づくペプチドに対する半減期を増やした。３における変異は、ｇｐ４１  ＮＨＲ領域とのその結合相互作用の構造的性質を改変するよう意図しなかったけれども、６ヘリックスバンドル構造が不変であったというさらなる実験的証拠を求めた。αペプチド１と３との共結晶を、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって得て、その構造を２．０Åの分解能まで解析した（表１及び図４Ａを参照）。結果として生じる６ヘリックスバンドルは、天然のＮＨＲ＋ＣＨＲペプチド複合体によって形成されるものと本質的に同一である。図４Ａ（１＋３共結晶）と図４Ｂ（１＋２共結晶）とを比較されたい。
【００４０】
【表１】
2015193648.tif 000003
配列ベースの設計に使用するために本発明者等が調査した様々な異なるα／β主鎖パターンの中で、最も広範に研究したのはααβαααβの繰り返しであった。α−ヘリックスの２残基繰り返しに対して調整されるこのパターンは、らせん一巻きあたりにβ残基を１つ置き、らせんの一表面に沿ってβ−残基の「ストライプ」を生じる。ααβαααβ主鎖により形成されたらせんがα−ヘリックスに非常に類似していることが、結晶構造によって示されてきた。３のα→β改変での最初の試みにおいて、１１個のβ３−残基をααβαααβパターンに組み込んだ（α／βペプチド４、ＳＥＱ  ＩＤ番号：４、図１Ａを参照）。これによって、ｇｐ４１  ＮＨＲコアへの結合に関与する疎水性の面とは反対の位置を占める非自然型残基が生じた。
【００４１】
ｇｐ４１に対するαペプチド３及びα／β類似体の親和性を決定するために、最近報告されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの競合蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを利用した。該アッセイは、ｇｐ４１融合中間体の蛋白質モデルを使用する。図２Ａ、２Ｂ、及び、２Ｃを参照されたい。モデル蛋白質ｇｐ４１−５は、短い軟性ループによって連結された３つのＮＨＲセグメント（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１２）及び２つのＣＨＲセグメント（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１３）から構成される。図２Ａを参照されたい。ｇｐ４１−５コンストラクトは折り重なって、フルオレセインによりラベルされたＣＨＲαペプチドに対する結合部位を１つ有した５ヘリックスバンドルを形成する。フルオレセインによりラベルされたＣＨＲαペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４）は、図２Ｂに示されている。この蛍光リガンドの置換によって、競合ＦＰにおける読み取りが提供される。その反応は図２Ｃにおいて概略的に描写されており、０．４ｎＭの置換定数（Ｋｄ）を有した。
【００４２】
【表２】
2015193648.tif 000004
αペプチド３は、アッセイにおける検出の限界（Ｋｉ＜０．２ｎＭ）を下回るｇｐ４１−５に対する結合親和性を競合ＦＰ実験において示した（表２を参照）。α／βペプチド類似体４（ＳＥＱ  ＩＤ番号：４）は、測定可能な親和性を示したが、原型α配列よりも１０，０００倍弱くモデル蛋白質に結合した。本発明者等による未発表の研究によって、３のＮ末端付近で見つかるＷ‐‐Ｗ‐‐‐ＩモチーフがＮＨＲ結合にとって重大な意味を持つということが提案された。（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１５６１３−７も参照されたい）。従って、純なα主鎖上にこれらの鍵となる疎水性側鎖を示したα／βペプチド４のキメラ誘導体（すなわち、それぞれオリゴマー５及び６、ＳＥＱ  ＩＤ番号：５及び６）はｇｐ４１−５に対してより強い結合を示すということを仮定した。実際、ＦＰアッセイにおいてｎＭよりも下の親和性を有してｇｐ４１−５に結合された（α＋α／β）ペプチド５は、親αペプチド３から識別可能である。５におけるα／βセグメントをＮ末端（α／βペプチド６）の方へ延ばすことによって、結合親和性は減少される。
【００４３】
ｇｐ４１ＣＨＲ領域等の生物医学的に重要性がある配列の配列ベースのα→β改変における根本的な動機付けのうちの１つは、蛋白質分解に対して高められた耐性を表示しながら親αペプチドの機能を模倣するオリゴマーを生じることである。本明細書に示されているように、ααβαααβ主鎖は、プロテアーゼに対して有用なレベルの耐性を与えるが、キメラオリゴマーにおける長いαペプチドセグメントは、プロテアーゼによって効果的に切断される。
【００４４】
β残基が配列を通して組み込まれた、ｇｐ４１ＣＨＲ領域のα／βペプチド類似体を生じるために、順応性のある置換又は未置換のβ２−及び／又はβ３−残基を、ｔｒａｎｓ−２−アミノシクロペンタンカルボン酸（ＡＣＰＣ）及びｔｒａｎｓ−２−アミノピロリジンカルボン酸ＡＰＣ、図１Ｂを参照、並びに、全内容を本出願において援用する米国特許第６，０６０，５８５号及び第６，６１３，８７６号に記載されたもの等の環状にされたβ残基と置換した。β−アミノ酸残基におけるＣα−Ｃβ結合の環による制約は、ねじれの自由を制限し、多様なβペプチド及びα／βペプチドにおける折りたたみを促進する。キメラ（α＋α／β）ペプチド６（ＳＥＱ  ＩＤ番号：６）における３つのβ３−ｈＡｌａ残基のＡＣＰＣとの置換は、６と比較してｇｐ４１−５に対する結合において４０倍の改善を示すα／βペプチド７（ＳＥＱ  ＩＤ番号：７）を生じた。同じβ３−ｈＡｌａ→ＡＣＰＣ置換を、オリゴマー４（ＳＥＱ  ＩＤ番号：４）に適用し、８（ＳＥＱ  ＩＤ番号：８）を生じた。α／βペプチド８は、４よりも５０倍高いｇｐ４１−５に対する親和性を示した。結合をさらに改善するために、８における３つのβ３−ｈＡｒｇ残基を、ＡＣＰＣのカチオン性類似体であるＡＰＣに変異させて９（ＳＥＱ  ＩＤ：９）を生成した。満足なことに、α／βペプチド９は、その高い程度のβ−残基含有量を考慮に入れると印象的であるｇｐ４１−５結合親和性（Ｋｄ＝９ｎＭ）を示した。
【００４５】
αペプチド３は、細胞培養におけるＨＩＶ−細胞融合の強力阻害剤であると示されてきた。本明細書に記載の研究では、競合ＦＰ実験において最良のα／βペプチド類似体に対して得たｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果を３に有利に比較した。ｇｐ４１ＣＨＲの模倣物を、次に、生物学的環境においてｇｐ４１により媒介された膜融合を阻止する能力に対して検査した。より生物学的に重要性を持つ状況においてフォルダマーを選択するαペプチド３の効力を比較するために、前記の細胞間融合アッセイを利用した。この実験では、２つの株化細胞が共培養される。１つの株化細胞は、（ｇｐ１２０＋ｇｐ４１を生じるために細胞プロテアーゼによって処理される）ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、及び、Ｔａｔ（ＨＩＶ転写活性化因子）を発現する。その他の株化細胞は、ＣＤ４（ＨＩＶの主要な細胞表面受容体）を発現し、（Ｔａｔによる活性化に感受性がある）ＨＩＶ末端反復配列に先行される酵素β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）に対する遺伝子を生じる。Ｅｎｖにより媒介された細胞間融合はβ−Ｇａｌを発現し、化学発光酵素試験によって定量化することができる。化合物３、４、５、及び、９を、上記のアッセイにおいてｇｐ４１により媒介された膜融合を乱す能力に対して検査した。結果（表２）は、最良のフォルダマーである化合物５及び９（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ番号：５及び９）がαペプチド３から識別不能なＩＣ５０値を有するということを示した。
【００４６】
選択α／βペプチドのｇｐ４１ＮＨＲ領域との相互作用を、円二色性（ＣＤ）分光法によってさらに調査した。３、４、５、８、９、及び、１０のＣＤスペクトルを、単独でも（図５Ａを参照）、ＮＨＲαペプチド１との１：１の混合物においても（それぞれ、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び、３Ｄを参照）測定した。重畳されたスペクトルに対する図５Ｂ及び５Ｃも参照されたい。単離したＣＨＲ類似体は、変化するらせん性の程度を示した。αペプチド３（図３Ａ）は、ＰＢＳ中２０μＭにて有意ならせん含有量を示し、それは、すでに発表されたデータと一致した。７つのβ３→環状βの置換を有したα／βペプチド９（図３Ｄ）は強度のＣＤ最小値を明らかにし、それは、よく折り畳まれたα／βペプチドのらせんと一致した。ＮＨＲ＋ＣＨＲペプチドの各１：１の混合物に対する観察されたＣＤスペクトル（図３Ａ〜３Ｄ、実線）を、混合する前の対応する個々のオリゴマーに対して観察されたスペクトルを平均することによって計算されたもの（図３Ａ〜３Ｄ、点線）に比較した。競合ＦＰアッセイにおいてｇｐ４１−５に対してｎＭ又はより優れた親和性を示したα／βペプチド５及び９（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ番号：５及び９）は、ＮＨＲαペプチド１と混合された場合に、どちらも有意な程度の誘発らせん性を示した。これとは対照的に、ＦＰによりｇｐ４１−５に対して単に控えめな親和性を有したαペプチド３は、１との実質的にゼロの協同的相互作用を示した。よく折り畳まれた混合物間（１＋３、１＋５、及び、１＋９、それぞれ、図３Ａ、３Ｃ、及び、３Ｄ）でのＣＤの符号（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の大きさは類似しているが、２０８及び２２２ｎｍでの強度の比は、β残基の含有量の関数として変化する（β−残基が多い程、２２２ｎｍでの追従される強度ピークは低くなる）。よく折り畳まれたＮＨＲ／ＣＨＲの複合体（１＋３、１＋５、及び、１＋９）はそれぞれ、協同的な熱転移を示し（図６を参照）、Ｔｍ値は、競合ＦＰによるｇｐ４１−５に対する親和性における相対的な差と相関する。
【００４７】
（ｇｐ４１モデルに利用したααβαααβパターンを含んだ）混合されたα／β主鎖は、ペプチドベースのＨＩＶ融合阻害剤の深刻な欠点であるプロテアーゼによる分解に対する耐性を与えることができるということが示されてきた（データは省略）。乱交雑のセリンプロテアーゼプロテイナーゼＫによる分解に対するαペプチド３並びにα／βペプチド４及び９の安定性を検査した。蛋白質分解アッセイの条件下で、αペプチド３を数分内に完全に分解し、配列内の少なくとも１０個の異なるアミド結合の加水分解から産物を生じた。シンプルなα→β３の置換を有したα／βペプチド４が、原型αペプチド３と比較して、安定性において２０倍の改善を示した。α／βＣＨＲ類似体９は、αペプチド３と比較して、安定性においてさらに優れた改善（２８０倍）を示した。α／βペプチド９の４と比較した蛋白質分解安定性における相対的な改善は、ＣＤによって観察されるように、おそらくその固有のらせん性の差から生じる。
【００４８】
本発明は、従って、α−アミノ酸原型の生理活性を保持するが細胞培養において且つｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質分解に抵抗する非天然型α／βポリペプチドを生じるために系統的なα→β改変を利用する方法である。ｇｐ４１モデルにおいて示されているように、本発明に従ってなされたＨＩＶｇｐ４１ＣＨＲ領域における系統的なα→βの改変によって、本来のαペプチドと比較して強力な効力及び高められた蛋白質分解安定性を有したα／βペプチド類似体が生じる。前記発見によって、親のαペプチド配列の構造及び機能を模倣するオリゴマーを作る一般的な方法として、配列ベースの主鎖改変の範囲が確立される。
【００４９】
ｇｐ４１モデルは、どのようにして本発明が特定の環境において作用するかということの例証として本明細書において示されている。当該方法は、いかなるαポリペプチドも標的又は原型として使用して繰り返すことができ、それらのαポリペプチドは、本発明の方法に従って作製された対応するα／βポリペプチドにより模倣されることになる。
【００５０】
従って、例えば、本発明の方法を使用して合理的な根拠でα／βポリペプチドを作製し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とその受容体との相互作用を標的にすることによって関節リウマチを治療することができる。この蛋白質間相互作用の考察のために、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇｈｒａｙｅｂ，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，＆Ｍａｉｎｉ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８４：４３３−４３９を参照されたい。同様に、本発明の方法を使用して合理的な根拠でα／βポリペプチドを作製し、ガラニンとその受容体との相互作用を標的にすることによって中枢神経系及び末梢神経系の障害を治療することができる。ガラニン及びその受容体、並びに、この相互作用を使用して薬物標的を設計することの適合性に関する考察のために、例えば、Ｍｉｔｓｕｋａｗａ，Ｌｕ，＆Ｂａｒｔｆａｉ（２００８）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（Ｊｕｎｅ２００８）６５（１２）：１７９６−１７８０５を参照されたい。
【００５１】
本発明を使用して合理的な根拠でα／βポリペプチドを作製し、副甲状腺ホルモンとその受容体（ＰＴＨ１Ｒ及びＰＴＨ２Ｒ）との相互作用を標的にすることによって骨代謝及びカルシウム代謝に関する障害を治療することもできる。例えば、Ｕｓｄｉｎ，Ｂｏｎｎｅｒ，＆Ｈｏａｒｅ（２００２），“Ｔｈｅ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ２（ＰＴＨ２）ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｒｅｃｅｐｔ．Ｃｈａｎｎｅｌｓ８（３−４）：２１１−２１８；及び、Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｊｕｐｐｎｅｒ，＆Ｇａｒｄｅｌｌａ（１９９９），“Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＰＴＨ  ａｎｄ  ＰＴＨｒＰ：ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７（５Ｐｔ．２）：Ｆ６６５−６７５を参照されたい。
【００５２】
本発明を使用して合理的な根拠でα／βポリペプチドを作製し、トロンビン反応等のセリンプロテアーゼ反応に関する障害を治療することもできる。例えば、一連のαポリペプチドトロンビン阻害剤を記載した欧州特許ＥＰ１１４１０２２号を参照されたい。類似の立体構造をとり、（ｇｐ４１システムのケースにおいて実証されているように）非常に類似の抗トロンビン活性を有するが、細胞培養において且つｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質分解に対してはるかに乏しい感受性を有するα／βポリペプチドを作製するために本発明を使用することができる。
【００５３】
本発明を使用して合理的な根拠でα／βポリペプチドを作製し、例えばＥＰＨ受容体とそのエフリンリガンドを標的にすることによって腫瘍の発症又は進行を阻害することもできる。ＥＰＨ受容体とそのエフリンリガンドは、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の最大のサブファミリーを構成し、動物の発達に関与する細胞シグナル経路の構成要素である。ＥＰＨシグナル伝達は、いくつかの器官において観察される発癌の工程においても重要な役割を果たす。これらの受容体は、細胞接着及び細胞形態、細胞遊走、並びに、血管新生を含めた、腫瘍形成及び転移に直接関連する広範囲の工程に関与する。従って、ＥＰＨ発現及びシグナル伝達活性は、腫瘍形成工程において決定的なシステムである。例えば、Ｃａｓｔａｎｏ，Ｄａｖａｌｏｓ，Ｓｃｈｗａｒｔｓ＆Ａｒａｎｇｏ（Ａｕｇ２００８）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２３（８）：１０１１−１０２３を参照されたい。このように、本発明の方法を使用して、合理的な根拠で、エフリンリガンドを模倣するα／βポリペプチドを作製することができる。
【００５４】
適した薬物の候補が同定されると、その生物学的及び／又は薬理学的な活性を、いかなる数の周知及び工業的に受け入れられたアッセイを使用しても検定することができる。
【００５５】
本明細書に記載された化合物の抗炎症及び免疫抑制の活性は、以下の類似のアッセイ：ＩＬ−１β分泌阻害、ＬＰＳによる発熱、ＴＨＰ−１細胞からのサイトカイン放出、及び、機能性ＩＬ−１拮抗のアッセイ、並びに、ラットにおけるカラゲニン誘発足蹠浮腫のアッセイ（欧州特許ＥＰ０６０６０４４号及び欧州特許ＥＰ０６１８２２３号に記載）；マクロフィリン結合、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、ＩＬ−６により媒介された増殖、限局性移植片対宿主（ＧｖＨ）反応、ラットにおける腎同種移植片反応、ラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、フロイントアジュバント関節炎、ＦＫＢＰ結合、ステロイドによる増強、並びに、Ｍｉｐ及びＭｉｐ様因子阻害のアッセイ（国際公開ＷＯ９４／０９０１０号、欧州特許ＥＰ０２９６１２３号、及び、欧州特許ＥＰ０２９６１２２号に記載）によって決定される。
【００５６】
本明細書に記載された化合物の中枢神経系（ＣＮＳ）の活性は、以下の類似のアッセイ：Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３７，５９５−６０１（１９８８）及び欧州特許ＥＰ０６４１７８７号に記載の方法を含めたセロトニンＩＤ（５ＨＴ１０）受容体刺激薬アッセイ；５ＨＴ３受容体刺激薬アッセイ（英国特許ＧＢ２２４０４７６号及び欧州特許０１８９００２号に記載）；ラットにおけるアポモルヒネ誘発の苦痛のアッセイ、並びに、ドーパミン受容体（Ｄ１及びＤ２）結合アッセイ等の、精神障害及びパーキンソン病の治療における活性に対するアッセイ（英国特許ＧＢ２０２０６１１５Ｂ号に記載）；ドーパミン受容体拮抗薬活性に対するアッセイ（統合失調症及び関係疾患に関連、欧州特許ＥＰ０４８３０６３号及び欧州特許ＥＰ０５４４２４０号に記載）；老年認知症及びアルツハイマー病に関する活性に対するアッセイ（欧州特許ＥＰ０５３４９０４号に記載）；脳虚血に関する活性に対するアッセイ（欧州特許ＥＰ０４３３２３９号に記載）、及び、単離されたモルモットの回腸における蠕動反射等の消化管運動に関するアッセイ、並びに、（特に５−ＨＴ４受容体での）抗セロトニン作動性効果のアッセイ（欧州特許ＥＰ０５０５３２２号に記載）によって決定される。
【００５７】
骨代謝及びカルシウム代謝に関する本明細書に記載された化合物の活性は、国際公開ＷＯ９４／０２５１０号、英国特許ＧＢ２２１８１０２Ｂ号、及び、国際公開ＷＯ８９／０９７８６号に記載されたアッセイのような（又はそのようなアッセイに類似の）アッセイによって決定される。
【００５８】
喘息及び他のアレルギー及び炎症性の状態に関する本明細書に記載された化合物の活性は、以下のアッセイ手順：ＰＤＥアイソザイム阻害、ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）による好酸球活性化の阻害、ＴＮＦα分泌の阻害、ＳＲＳ−Ａ産生の阻害、モルモットにおける菌体内毒素（ＬＰＳ）誘発致死、マウスにおけるアラキドン酸誘発刺激性皮膚炎、ヒト気管支の緩和、ＳＲＳ−Ａ誘発気管支収縮の抑制、ボンベシン誘発気管支収縮の抑制、アカゲザルにおけるメタコリン（ＭｅＣＨ）誘発気管支収縮の抑制、及び、モルモットにおける気道運動亢進の抑制のアッセイ（欧州特許ＥＰ０６６４２８９号、国際公開ＷＯ９４／１２４９３号、英国特許ＧＢ２２１３４８２号に記載）によって決定される。
【００５９】
本明細書に記載された化合物のセリンプロテアーゼ（例えばトロンビン）阻害活性は、国際公開ＷＯ９４／２０５２６号に記載されたアッセイ等を使用して決定される。本明細書に記載された化合物の糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬活性は、Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７０（３），５３１−５３９（１９９３）及びＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７０（５），８３８−８４７（１９９３）、並びに、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（９），６８００−６８０８（１９９３）によって記載されたアッセイ手順を使用して決定される。
【００６０】
本明細書に記載された化合物の抗癌活性は、欧州特許ＥＰ０２９６１２２号に記載された抗腫瘍活性のアッセイ、又は、例えば英国特許ＧＢ２２３９１７８号に記載された治験手順によって決定される。対象の化合物の多剤耐性（ＭＤＲ）−逆転活性は、欧州特許ＥＰ０２９６１２２号に記載されたアッセイによって決定される。
【００６１】
上記の特許文献及び他の刊行物の関連技術は、全内容を本出願において援用する。これらのアッセイにおいて適切なレベルの活性を有する、本発明に従い作製された化合物は、対応する治療又は病状に関する医薬品として有用である。
【００６２】
このように、本発明は、医薬品として使用するための本明細書に記載された化合物、及び、ＨＩＶウイルスによる感染を含めた、本明細書に記載されたアッセイのいずれにも関連するいかなる疾患も治療するための薬物の製造に対する前記化合物の使用を含む。本発明は、医薬品として本発明の方法に従い作製された化合物の使用、及び、効果的な量の前記化合物を薬剤的に受け入れ可能な希釈剤又はキャリアと共に含む医薬品組成物も含む。
【００６３】
本発明の化合物は、固体相合成技術を使用して合成することができる。
【００６４】
従って、Ｆｍｏｃ−Ｎにより保護されたβ−アミノ酸を使用して、オルソ−クロロ−トリチルクロリド樹脂上に、標準状態下での従来の手動の固体相合成手順によりポリ−α／βペプチドを合成することができる。
【００６５】
オルソ−クロロ−トリチル樹脂を用いたＦｍｏｃ−β−アミノ酸のエステル化は、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９８９），３０，３９４３の方法に従い行うことができる。前記樹脂（１５０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌＣｌ）は、２ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２において１０分間で膨張する。次に、ＣＨ２Ｃｌ２及びｉＰｒ２ＥｔＮ中のＦｍｏｃにより保護されたβ−アミノ酸の溶液が連続して添加され、その懸濁液は、アルゴン下で４時間混ぜ合わされる。後に、前記樹脂はろ過され、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ｉＰｒ２ＥｔＮ（１７：２：１、３ｘ３分）、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３分）、ＤＭＦ（２ｘ３分）、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３分）、及び、ＭｅＯＨ（２ｘ３分）で洗浄される。樹脂の置換は、３００ｎｍでのジベンゾフルベン付加物の吸光度を測定することによって、３ｍｇの試料で決定される。Ｆｍｏｃ基は、Ａｒ通気下でＤＭＦ中２０％ピペリジン（４ｍｌ、２ｘ２０分）を使用して取り除かれる。次に、前記樹脂はろ過され、ＤＭＦ（６ｘ３分）で洗浄される。各結合ステップに対して、ＤＭＦ（２ｍｌ）及びｉＰｒ２ＥｔＮ（９当量）中β−アミノ酸（３当量）、ＢＯＰ（３当量）、及び、ＨＯＢＴ（３当量）の溶液が、前記樹脂に連続して添加され、その懸濁液はＡｒ下で１時間混ぜ合わされる。結合反応のモニタリングが、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いて行われる（Ｗ．Ｓ．Ｈａｎｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７１，２６０）。陽性のＴＮＢＳテストの（不完全な結合を示す）場合、懸濁液はさらに１時間反応させておく。次に、以下のＦｍｏｃ脱保護ステップに先立ち、前記樹脂はろ過され、ＤＭＦ（３ｘ３分）で洗浄される。最後のＦｍｏｃ保護基の除去後、前記樹脂は、ＤＭＦ（６ｘ３分）、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３分）、Ｅｔ２Ｏ（３ｘ３分）で洗浄され、真空下で３時間乾かされる。最後に、Ａｒ下でＣＨ２Ｃｌ２中２％ＴＦＡ（２ｍｌ、５ｘ１５分）を使用して、ペプチドが前記樹脂から切断される。溶媒が除去され、油性の残基はエーテルにおいて粉砕され、未精製のα／βポリペプチドが生じる。前記化合物は、ＨＰＬＣによってさらに精製される。
【００６６】
本明細書に記載された化合物の経口バイオアベイラビリティは、標準的な手順を使用してラットにおいて決定される。絶対的な経口バイオアベイラビリティは、約１％であると予想される。
【００６７】
α／βペプチドが溶液において示す安定した構造、酵素分解に対するその安定性、及び、その励ましになる薬物動態特性を考慮すると、本発明の化合物は、有用な医薬品を提供する可能性を有する。
【００６８】
上記のように、ｇｐ４１ＣＨＲ由来のαペプチドである３を、α→β改変に対する起始点として使用した（図１Ａ）。Ｔ−２６３５としても知られるαペプチド３は、野生型ｇｐ４１ＣＨＲ領域と比較して５０％変異され、α−らせん傾向を高めるよう意図された、Ｘｘｘ→Ａｌａ置換と操作されたｉ→ｉ＋４塩橋との組み合わせを有する。αペプチド３は、α−アミノ酸配列の改変を介したｇｐ４１ＣＨＲαペプチドの抗ウイルス効力を改善することにおける、現在までに報告された最も成功した例のうちの一つを表している。初期の研究は、３において最適化された側鎖配列で始まった。さらに、α→β残基置換という形状の主鎖組成物における変化を調査した。α／βペプチド４では、３におけるα−残基の部分集合がβ３−残基によって置換され、置換されたα−残基の側鎖を生じている（図１Ｂを参照）。従って、α／βペプチド４は、非天然型主鎖上に示される３に存在する側鎖の配列を有している。４のβ３残基は、ααβαααβパターンに組み込まれ、折り畳み後、らせんの一側面にそって走るβ−残基のストライプを生じる。この設計は、らせんの外周に沿って分子表面まで４の遠位にβ−ストライプを置き、６ヘリックスバンドル内のｇｐ４１ＮＨＲ領域三量体に対して納まる。
【００６９】
ｇｐ４１の６ヘリックスバンドルの蛋白質モデルに基づく競合蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを使用して、３及び４を比較した（詳細については実施例を参照）。前記アッセイによって、３つのＮＨＲセグメント及び２つのＣＨＲセグメントを有する操作された５−ヘリックスバンドル蛋白質ｇｐ４１−５からの蛍光標識したＣＨＲαペプチドの置換が測定される。ｇｐ４１−５蛋白質コンストラクトに対する親和性は、ＣＨＲ−模倣の作用物質の、ＨＩＶ−細胞融合のすぐ前に形成されるｇｐ４１プレヘアピン中間体に結合する能力と相関する。予想されるように、αペプチド３は、ｇｐ４１−５に対して非常に密接に結合する（Ｋｉ＜０．２ｎＭ；表１）。しかし、類似性のα／βペプチド４は、ｇｐ４１−５に対して、３よりも１０，０００倍弱い親和性のみを表示する。この蛋白質ベースのアッセイにおけるα／βペプチド４の控えめな効力は、比較できる実験におけるいくつかの小分子及びペプチド模倣薬により表示されたものに匹敵する。
【００７０】
３と４との結合における劇的な差を理解する、及び、ｇｐ４１に対するα／βペプチドの親和性を改善する試みにおいて、キメラα／βペプチド５及び６を調製及び特徴づけた。５も６も、純粋なαセグメントをＮ末端及びにて、及び、α／βセグメントをＣ末端にて有する。これらのオリゴマーは、αペプチド３及びα／βペプチド４のキメラである。α／βペプチド５は、ｇｐ４１−５に対して非常に高い親和性を表示し、αペプチド３のものと区別がつかない。しかし、（６のように）α／βセグメントをＮ末端の方向に延ばすことによって、親和性の有意な損失が生じる。α→β３改変に対するＮ末端セグメントの感受性は、この領域における側鎖、特に、３のＴｒｐ３、Ｔｒｐ６、及び、Ｉｌｅ１０に対応するものがＮＨＲ三量体に対するＣＨＲ結合において重大な役割を果たすことを示したデータと一致する（２９）。
【００７１】
α／βペプチド５及び６は、４に対するｇｐ４１擬態における改善を表しているが、蛋白質分解に対する耐性を最大限にするために、α／βペプチド配列を通してβ−残基を置くことが望ましい。しかし、各α→β３の置換は、主鎖に対して軟性の結合を加え、らせん形成に関連するコンホメーションエントロピーのペナルティーを増やすはずである。１１個のα→β３置換から生じる４の折り畳まれていない状態の、３に対してより大きいコンホメーションエントロピーは、これら２つのオリゴマー間のｇｐ４１−５に対する結合親和性における大きな差を説明する。β−残基はこの安定性の減少の原因であるけれども、これらの残基は、その化学的構造によってユニークに可能にされる構造的に予め組織化する手段を提供する。環状β−残基の取り込み（例えば、ＡＣＰＣ及びＡＰＣ、図１Ｂ）は、Ｃα−Ｃβ主鎖のねじれを抑圧し、その結果、主鎖のアミド水素結合を破壊することなく折り畳み傾向を高めることができる。
【００７２】
ｇｐ４１擬態の状況における構造的に予め組織化することの影響を、β３−残基の部分集合を環状の類似体と置換することによって探索した。第１の比較は、３つのβ３−ｈＡｌａ残基がＡＣＰＣによって置換されるα／βペプチド７、６の類似体を含んだ（図１Ａ及び１Ｂ）。β３−ｈＡｌａもＡＣＰＣも非極性であり、この類似性は、側鎖配列から現れる物性を維持すると予想した。６と比較した場合の、７によって表示されるｇｐ４１−５に対する３０倍高い親和性は、残基ベースで堅くなることが、ペプチド模倣フォルダマーを発展させるための配列ベースの設計に対して有用な補完物であるという仮説を支持している。オリゴマー７における２つのβ３−ｈＡｌａ残基のＡＰＣ、ＡＣＰＣの複素環類似体との置換によって、ｇｐ４１−５に対して非常に高い親和性を示したα／βペプチド８が生じる。α／βペプチド８におけるＡＰＣ３６は、ｇｐ４１−５に含まれたＮＨＲ領域とかみ合うＣＨＲ配列の領域内にある。この観察は、７及び８の類似のＫｉ値を説明することができる。環状β−残基の好ましい寄与のさらなる証拠が、オリゴマー４、９、及び１０の比較から生じ、該オリゴマーのそれぞれは、配列を通してβ−残基を有する。α／βペプチド９を、４つのβ３−ｈＡｌａ→ＡＣＰＣ置換によって４から生じ、Ｋｉを４５倍改善した。１０を生じるための、９の３つのβ３−ｈＡｌａ残基のＡＰＣとの置換は、さらに１０倍までＫｉを改善する。完全に軟性のα／βペプチド４に対して、堅くされた類似体１０（Ｋｉ＝９ｎＭ）は、３８０倍までのｇｐ４１−５に対する高められた結合を示している。
【００７３】
ＣＨＲαペプチド３並びにα／βペプチド類似体４、５、８、及び１０と、ｇｐ４１ＮＨＲ領域から得られたペプチド（１）との相互作用を、円二色性（ＣＤ）分光法によって調査した。ＮＨＲαペプチド１は、ｇｐ４１ＣＨＲαペプチドと混ぜ合わされた場合に６−ヘリックスバンドルを形成し、この６−ヘリックスバンドルは、ウイルス侵入の間にｇｐ４１によりとられた後融合の状態を表すと考えられている。αペプチド３は、ＰＢＳ中２０μＭにて有意ならせん含有量を示し、すでに発表されたデータと一致した（図５Ａ）。α／βペプチド４は、類似の条件下で有意ならせん度を示さなかった。しかし、７つのβ３→環状β置換を有する類似体１０は、強度のＣＤ最小値を示し、よく折り畳まれたα／βペプチドヘリックスと一致した（図５Ａ）。各１：１のＮＨＲ＋ＣＨＲペプチドの混合物に対する観察したＣＤスペクトル（図３Ａ乃至３Ｄ、及び、５Ｂ、実線）を、対応する個々のオリゴマーに対するスペクトルを平均することによって計算されたもの（図３Ａ乃至３Ｄ、及び、５Ｂ、点線）と比較した。競合ＦＰアッセイにおいてｇｐ４１−５に対して高い親和性を表示したα／βペプチド５、８、及び１０はそれぞれ、ＮＨＲαペプチド１と混ぜ合わされた場合に、有意な程度の誘発らせん度を示し、６−ヘリックスバンドルの形成と一致した。対照的に、ｇｐ４１−５に対して控えめな親和性のみを有するα／βペプチド４は、１との実質的にゼロの相互作用を示した。よく折り畳まれた混合物間（１＋３、１＋５、１＋８、及び、１＋１０）でのＣＤの符号（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の大きさは類似しているが、２０８及び２２２ｎｍでの強度の比は、β−残基の含有量の関数として変化する（β−残基の含有量が多い程、２２２ｎｍでの関連する強度ピークは低くなる）。この傾向は、混ぜ合わされたα／β主鎖を有するらせん形オリゴマーに対する以前の研究と一致している。１＋３、１＋５、１＋８、及び、１＋１０によって形成された複合体はそれぞれ、非常に協同的な熱転移を示した（図５Ｃを参照）。Ｔｍ，ａｐｐ値における傾向（すなわち、見かけのＴｍ）は、競合ＦＰアッセイにおける３、５、８、及び１０の間でのｇｐ４１−５に対する親和性における差と相関し、すなわち、ｇｐ４１−５に対する結合が強い程、関連するＮＨＲペプチド１との組立体はより安定する。
【００７４】
結晶構造
Ｘ線結晶学を利用して、ＮＨＲαペプチド１によって形成されたヘテロマーの６−ヘリックスバンドルをＣＨＲαペプチド３、キメラＣＨＲα／βペプチド８、又は、ＣＨＲα／βペプチド１０と比較した（表３を参照）。
【００７５】
【表３】
2015193648.tif 000005
2015193648.tif 000006
αペプチド３を生じる天然のＣＨＲ配列に対する変異は、ｇｐ４１ＮＨＲ領域とのその結合相互作用の性質を改変するよう意図しなかったけれども、６−ヘリックスバンドル構造は、１及び天然のＣＨＲ配列によって形成されたものと比較して不変であった直接的証拠を求めた。αペプチド１と３との共結晶を得て、その構造を２．０Åの分解能まで解析した。図４Ａを参照されたい。結果として生じる６ヘリックスバンドルは、天然のＣＨＲ配列を有する１＋２に対するものと本質的に同一である（図４Ｂを参照）。標準偏差（ｒｍｓｄ）は、Ｃα原子に対して０．７３Åである。
【００７６】
１＋１０の複合体の結晶も得て、その構造を２．８Åの分解能まで解析した。図４Ｄを参照されたい。αペプチド１及びα／βペプチド１０は結合して、１＋３により形成される組立体と類似の６−ヘリックスバンドルを形成する（並べての比較を可能にするために図４Ｃにおいて複写）。α／βペプチド１０のみを有した結晶（図示せず）も得た。１０の構造のみを２．１Åの分解能まで解析し、１＋１０によって形成された６−ヘリックスバンドルのｇｐ４１ＮＨＲ三量体とかみ合う残基を疎水性の中心部が含む平行の三量体ヘリックスバンドルを明らかにした。結晶状態のα／βペプチド１０の自己集合は、すでに観察した原型αペプチド３の作用に相当し、溶液において自己集積化すると示された。
【００７７】
１＋１０及び１＋３の構造の中心部ＮＨＲ三量体は、非常に一致している（ＮＨＲ残基３〜３０に対して０．６５ÅＣαｒｍｓｄ）。２つのバンドルがＮＨＲ三量体を介して並べられた場合、ＣＨＲヘリックスはＣ末端セグメントにおいて非常に接近して一列に並ぶ（残基１６〜３３に対して０．８４ÅＣαｒｍｓｄ）が、Ｎ末端付近でそれる（残基２〜１５に対して４．２ÅＣαｒｍｓｄ）。この分岐は、α／βペプチド１０と比較してαペプチド３のより高次のらせん形を反映している。１０によって形成されたらせんの分岐部分は、ＣＨＲαペプチドにおいて安定した６−ヘリックスバンドルの形成に不可欠である２つのＴｒｐ残基を有する。１＋１０の構造において、Ｔｒｐ３及びＴｒｐ５の側鎖は、電子密度において分離されず、高度の乱れを示唆している。さらに、１＋３の複合体のＣＨＲＴｒｐ５を包むＮＨＲ残基Ｌｙｓ２９及びＴｒｐ２６の側鎖において著しい乱れを観察した。図４Ｆ及び４Ｇは、全てαペプチドヘリックスバンドルで形成された１＋３の、１＋１０によって形成されたものとのオーバーレイ（図４Ｆ）、及び、１＋８によって形成されたものとのオーバーレイ（図４Ｇ）を描写している。
【００７８】
６−ヘリックスバンドル形成におけるｇｐ４１ＣＨＲ領域Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅモチーフのよく確立された役割が与えられると、α／βペプチド１０のＮ末端セグメントが１＋１０の複合体の結晶構造のＮＨＲ結合ポケットにかみ合わないという観察は、興味あるものである。α／βペプチド１０における最初の１０個の残基の除去により、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅモチーフが存在しないオリゴマー１１が生じる（図１Ａを参照）。１＋１０の結晶構造に基づき推測することができるように、１０のＮ末端領域が溶液内でのＮＨＲ三量体に対する結合に関与していなかった場合、１０に匹敵するｇｐ４１−５に対する親和性を１１は示すはずである。しかし、α／βペプチド１１は、ｇｐ４１−５に対して測定可能な親和性を示さず（Ｋｉ＞１０μＭ）、１０のＮ末端セグメントは溶液におけるｇｐ４１−５に対する高親和性の結合に不可欠であることを示している。
【００７９】
１＋３の複合体と１＋１０の複合体のＣＨＲ領域Ｎ末端セグメントの差によって動機づけられ、αペプチド３とα／βペプチド１０とのキメラであるＣＨＲα／βペプチド８との複合体におけるＮＨＲペプチド１の構造を調査した。１＋８の複合体を結晶化し、その構造を２．８Åの分解能まで解析した。図４Ｅを参照されたい。α／βペプチド１０と比較して、キメラα／βペプチド８は、よりもはるかに接近して、１＋３によって形成された全てαペプチドの６−ヘリックスバンドル内のＣＨＲヘリックス（３）と一列に並ぶ（図４Ｃ、残基２〜３３に対して１．４ÅＣαｒｍｓｄ）。８のＮ末端セグメントにおけるＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅモチーフの側鎖は、ＮＨＲ中心部三量体上の結合ポケット内への予想されたパッキングを示している（データは示さず）。この結果及び先の切られたα／βペプチド１１の作用に基づき、１０のＮ末端部分と１＋１０の複合体におけるＮＨＲ三量体との直接接触の欠如は結晶パッキングの人為産物であることが推測される。
【００８０】
抗ウイルス活性
生物学的状況におけるαペプチド３並びにα／βペプチド４、５、及び１０の活性を評価するために、二組の実験を行った。第一の実験は、ｇｐ４１により媒介されるＨＩＶ−細胞間融合のモデルを作るために一般的に使用される、ＨＩＶ−１クローンＨｘＢ２のｅｎｖ遺伝子の実験に基づく細胞間融合アッセイにおいてオリゴマーを比較した。（Ｄｅｎｇ  ＹＱ，Ｚｈｅｎｇ  Ｑ，Ｋｅｔａｓ  ＴＪ，Ｍｏｏｒｅ  ＪＰ，＆Ｌｕ  Ｍ（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（１４）：４３６０−４３６９）細胞間融合アッセイの結果（表４）は、α／βペプチド５及び１０がαペプチド３と区別がつかないＩＣ５０値を有し、一方、α／βペプチド４ははるかに効果的ではないことを示した。化合物３、４、５、及び１０を、次に、株化細胞ＴＺＭ−ｂ１のＨＩＶ感染を防ぐ能力について評価した。（Ｗｅｉ  ＸＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔ−２０）ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４６（６）：１８９６−１９０５）これらの研究は、１つのＴ細胞系統適応株（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｄａｐｔｅｄ  ｓｔｒａｉｎ）及び３つの一次分離株（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ）を利用し、株のうち２つはＸ４向性であり、その他２つはＲ５向性である。
【００８１】
【表４】
2015193648.tif 000007
感染力アッセイの結果（表４、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、及び１０Ｄ）は、異なる補助受容体を使用する３、５、及び１０間でのＨＩＶ−１株に対する類似の生物学的効力を示している。この発見は、ｇｐ４１の保存領域とのペプチド相互作用を介した侵入において必要且つ共有のステップのブロッキングを示している。ここで報告した化合物間で、細胞ベースのアッセイにおいてｇｐ４１−５への結合に対するＫｉとＩＣ５０との値の間に不完全な相関関係があることに注目することができる。例えば、ｇｐ４１−５に対する１０の親和性は、５の親和性の４５倍を超えたが、１０に対するＩＣ５０値は、５に対するものよりも低い場合があった。この矛盾に対していくつかあり得る理由が存在する。ｇｐ４１−５に存在するＣＨＲ領域とＮＨＲ領域との配列の差、及び、検査したウイルスに存在するＣＨＲ領域とＮＨＲ領域との配列の差が、ｇｐ４１−５結合親和性と一部の株に対する抗ウイルス活性との間に、他の株と比較してより優れた相関関係を生じる場合がある。さらに、ｇｐ４１へのＣＨＲペプチドの結合に対する会合速度は、平衡結合親和性であるよりも相対的な抗ウイルス効力の優れた前兆であることがこれまでに示唆されてきた。（Ｓｔｅｇｅｒ  ＨＫ＆Ｒ大ｔＭＪ（２００６）Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｔｏ  ＨＩＶ−１  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１（３５）：２５８１３−２５８２１）１０において堅くされた主鎖は、ｇｐ４１とのその会合速度を、５の会合速度と比較して変えることができる。ｇｐ４１由来の融合阻害剤に対する感受性は、ビリオン内に取り込まれたＥｎｖの量、ＣＤ４及び補助受容体とのＥｎｖ相互作用の強さ、融合工程の動態学及びエネルギー論、並びに、抑制ペプチドに対する結合部位におけるアミノ酸の異形を含めた、ウイルスの株の間で異なる多くの因子によって影響を受け得る。概して、抗ウイルスアッセイの結果は、ＣＨＲ由来のα／βペプチドが複雑な生物学的環境においてｇｐ４１を効果的に模倣するという仮定を強く支持している。
【００８２】
蛋白質分解感受性
蛋白質間相互作用のフォルダマー拮抗薬を開発するための重要な動機づけは、蛋白質分解に対する感受性を減少することの見込みである。蛋白質分解酵素による急速な破壊は、αペプチド薬物の臨床的使用に対する重要な欠点を表している。乱交雑のセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫによる分解に対するαペプチド３並びにα／βペプチド４及び１０の感受性を比較した。アッセイ条件の下、αペプチド３を数分以内に完全に分解し（図９Ａ）、質量分析によって、配列内の少なくとも１０個の異なるアミド結合の加水分解が明らかになった（図９Ｄ、一番上の配列）。排他的にα→β３置換を有したα／βペプチド４は、原型αペプチド３と比較して、安定性において２０倍の改善を示した。図９Ｂ及び図９Ｄの真ん中の配列を参照されたい。堅くされたα／βペプチド１０は、αペプチド３と比較して、安定性においてさらに優れた改善（２８０倍）を示した。図９Ｃ及び図９Ｄの一番下の配列を参照されたい。α／βペプチド４と比較した場合のα／βペプチド１０のより優れた安定性はおそらく、ＣＤによって検出される１０のより高いらせん傾向から生じる。質量分析によってα／βペプチド１０に対して観察した少数の蛋白質分解産物（図９Ｄ）は、混ぜ合わされたα／β主鎖におけるβ−残基が隣接するアミドを蛋白質切断から保護する傾向がある、以前の観察を支持している。
【００８３】
多くの蛋白質が、非常に選択的な相互作用に関与する表面を示す。蛋白質間相互作用によって媒介される情報の流れは、個々の細胞及び生物全体の通常の機能にとって不可欠であり、そのような相互作用は、疾患においても鍵となる役割を果たし得る。特定の蛋白質間複合体の形成を阻害するためのストラテジーをつきとめるための重要な動機付けがある。臨床レベルにて、このゴールに最も成功したアプローチは、操作された蛋白質又は蛋白質断片、すなわち、蛋白質標的自体として同じ構成要素から構成された分子の使用を含む。本発明の方法の動機づけ仮定は、蛋白質によって表示された認識表面を、蛋白質様立体構造をとる且つ蛋白質様側鎖を表示する非天然型オリゴマーを用いて模倣することができるというもの、並びに、そのようなオリゴマーは天然の蛋白質間会合の阻害剤として機能するというものである。天然の蛋白質配列は、洗練された機能を有する非天然型主鎖を有した折り畳まれたオリゴマーを設計するための論理的な起始点である。ここで提示されるデータは、広範囲に研究されたウイルス感染工程の状況においてこれらの仮説に対して強力な支持を与える。
【００８４】
本明細書に提示された結果は、長いα−らせんセグメントであるＨＩＶ蛋白質ｇｐ４１のＣＨＲ領域を、α−及びβ−アミノ酸残基から構成されるオリゴマーによって構造的及び機能的に模倣することができるということを示している。意図された結合パートナーを用いた強力な会合、細胞ベースのアッセイにおけるＨＩＶ感染の強力な阻害、及び、蛋白質切断に対する耐性を含めた好ましい特性の概要を明らかにするα／βペプチドを生じるよう、二段階工程が要求された。第一の設計段階は、親ペプチド配列における選択されたα−残基の、本来の側鎖を保持する類似のβ−残基との置換を含む。第二の設計段階は、軟性のβ３−残基の、環状に予め組織化されたβ−残基との選択的な置換を含む。これらの改変は、最初のα→β３改変を用いて不可避で導入された有害な主鎖屈曲性を取り除くよう意図されている。
【００８５】
ｇｐ４１ＣＨＲセグメントの効果的なα／βペプチド模倣物を生じるために二段階アプローチを使用することは、異なる及び本質的に簡略な蛋白質認識システムにおける本発明者等の以前の発見に照らして注目すべきことである。Ｂｃｌ−２蛋白質ファミリーにおいて蛋白質間相互作用を媒介するＢＨ３領域の短いα−らせんセグメントの模倣は、この設計アプローチの第一段階、原型配列を通じた簡単なα→β３置換のみを要求した。（Ｈｏｒｎｅ  ＷＳ，Ｂｏｅｒｓｍａ  ＭＤ，Ｗｉｎｄｓｏｒ  ＭＡ，＆Ｇｅｌｌｍａｎ  ＳＨ（２００８）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  α／β−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｌｄａｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｍｉｍｉｃ  ＢＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４７（１５）：２８５３−２８５６）これとは対照的に、ｇｐ４１−５に対して控えめな親和性のみを示したα／βペプチド４は、天然のｇｐ４１ＣＨＲ領域及び関連する配列において別のα／β３主鎖パターンを探索することによって設計された一連のα／βペプチドの間で同定された最も強力なｇｐ４１模倣物であった。
【００８６】
本明細書において報告された結果は、蛋白質間認識事象に関与するα−ヘリックスを模倣する非天然型オリゴマーを開発する初期の試みと比較して実質的な進歩を表している。以前の研究は、一般的に２から４つのらせん回転のみである比較的短いα−らせん標的に限定されていた。これらの前の研究において発展されたオリゴマーの有効性は、一般的に控えめ（ＩＣ５０値は、１μＭよりも大きいもの）である。さらに、大部分の以前に研究されたシステムにおいて、効果的な阻害が、小分子拮抗薬を用いて可能になってきた。本明細書における結果は、合理的に設計されたオリゴマーを用いて長いα−ヘリックス（〜１０回転）を構造的及び機能的に模倣することができるということがデータによって示されているため特徴的である。現在まで、小分子を用いてｇｐ４１の６−ヘリックスバンドル組立体を破壊する試みは比較的不成功に終わっていた。
【００８７】
天然の蛋白質において進化的にコードされた洗練された認識シグナルを「読む」ことができる非天然型オリゴマーを設計することの価値が、本発明の研究によって実証されている。α／βペプチドによるＨＩＶ感染性の強力な阻害は、機能的なフォルダマーの開発において重要な進展である。
【実施例】
【００８８】
試薬
ペプチド合成において使用される保護されたα−アミノ酸及び樹脂を、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．社及びＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙの完全所有子会社）から購入した。保護されたβ３−アミノ酸を、ＰｅｐＴｅｃｈ社（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から購入した。環状にされたβ−残基、Ｆｍｏｃ−ＡＣＰＣ及びＦｍｏｃ−ＡＰＣ（Ｂｏｃ）を、すでに記載されたように調製した。Ｌｅｅ，ＬｅＰｌａｅ，Ｐｒｏｔｅｒ，ａｎｄ  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，３５９７−３５９９；ＬｅＰｌａｅ，Ｕｍｅｚａｗａ，Ｌｅｅ，ａｎｄ  Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，５６２９−５６３２．２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を、ＡｎａＳｐｅｃ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。５−カルボキシフルオレスセインを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，ＵＳＡ）から購入した。他の試薬全てを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）又はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）から購入し、受け入れたままの状態で使用した。
【００８９】
合成
全てのペプチドを、“ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ”ブランドの樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）で調製した。αペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社、Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）で標準的なＦｍｏｃ固体相ペプチド合成方法によって調製した。α／βペプチドを、Ｓｙｎｅｒｇｙ４３２Ａ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で自動化されたＦｍｏｃ固体相ペプチド合成によって調製した。α／βペプチドを、マイクロ波補助Ｆｍｏｃ固体相ペプチド合成によって手動でも調製した。Ｅｒｄｅｌｙｉ  ａｎｄ  Ｇｏｇｏｌｌ（２００２）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １１：１５９２−１５９６．８：２：１のＤＭＦ／ＤＩＥＡ／Ａｃ２Ｏを用いた処理によって、各ペプチドのＮ末端にキャップ状の構造を付加した。樹脂を徹底的に洗浄し（３ｘＤＭＦ、３ｘＣＨ２Ｃｌ２、３ｘＭｅＯＨ）、次に、真空下で乾燥させた。全てのペプチドを、９４：２．５：２．５：１のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／エタンジチオール／トリイソプロピルシランを用いた処理によって樹脂から切断した。前記樹脂をろ過し、さらなるＴＦＡで洗浄して、乾燥窒素流の下で混合ろ液を２ｍＬまで濃縮させた。粗ペプチドを、冷たいエーテル（４５ｍＬ）の添加によって切断混合物から沈殿させた。前記混合物を遠心分離してデカントし、さらに、残りの固体を窒素流の下で乾燥させた。逆相ＨＰＬＣによってｐｒｅｐ−Ｃ１８カラムで、０．１％ＴＦＡ水溶液と０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液との勾配を使用してペプチドを精製した。最終生成物の正体及び純度を、それぞれＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び分析用ＨＰＬＣによって確認した。原液の濃度を、ＵＶ吸光度によって決定した。Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｃ．；Ｖｏｎｈｉｐｐｅｌ，Ｐ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９，１８２，３１９−３２６．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック〔Ｍ＋Ｈ〕＋，ｍ／ｚ）：  １：ｏｂｓｄ．＝４１６２．６，ｃａｌｃ．＝４１６２．４；  ２：ｏｂｓｄ．＝４２８８．７，ｃａｌｃ．＝４２８８．０；  ３：ｏｂｓｄ．＝４４５５．０，ｃａｌｃ．＝４４５５．３；  ４：ｏｂｓｄ．＝４６０９．９，ｃａｌｃ．＝４６０９．５；  ５：ｏｂｓｄ．＝４５２６．１，ｃａｌｃ．＝４５２５．４；  ６：ｏｂｓｄ．＝４５５２．７，ｃａｌｃ．＝４５５３．４；  ７：ｏｂｓｄ．＝４６３１．６，ｃａｌｃ．＝４６３１．４；  ８：ｏｂｓｄ．＝４５１６．５，ｃａｌｃ．＝４５１５．３；  ９：ｏｂｓｄ．＝４７１３．０，ｃａｌｃ．＝４７１３．５；  １０：ｏｂｓｄ．＝４５３９．９，ｃａｌｃ．＝４５３９．４；  １１：ｏｂｓｄ．＝３２９９．４，ｃａｌｃ．＝３２９９．８。
【００９０】
Ｆｌｕ−Ｃ３８の合成
遊離なＮ末端を有した全長Ｃ３８ペプチド（ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ；ＳＥＱ  ＩＤ番号：２３）を有する“ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ”ブランドの樹脂を、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）で標準的なＦｍｏｃ固体相ペプチド合成方法によって２５μｍｏｌスケールで調製した。合成に続き、樹脂をガラス注射器まで移した。５−カルボキシフルオレスセイン（２８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ・Ｈ２Ｏ（１１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（０．７５ｎＬ）に溶解した。ジイソプロピルカルボジイミド（１２μＬ、０．０７５ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じる溶液を、ペプチドを有する樹脂まで移した。反応容器をホイルで覆い、振盪機上に一晩置いた。前記樹脂を、ＤＭＦ（３ｘ）で洗浄し、新たな試薬を用いて結合反応を繰り返した。次に、前記樹脂をＤＭＦ（３ｘ）、２０％ピペリジン（２ｘ）、ＤＭＦ（３ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ）、及び、ＭｅＯＨ（３ｘ）で洗浄した。Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．；Ｍａｄｅｒ，Ｏ．；Ｊｕｎｇ，Ｇ．；Ｂｒｏｃｋ，Ｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００３，１４，６５３−６６０．上記のように、粗ペプチドを切断及び精製した。水溶液中で調製した原液を、可視吸光度によって定量化した（ｐＨ８にてε４９４＝６８，０００Ｍ−１ｃｍ−１）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック〔Ｍ＋Ｈ〕＋，ｍ／ｚ）：ｏｂｓｄ．＝５０８９．３，ｃａｌｃ．＝５０８９．３。
【００９１】
結晶化
１μＬの結晶化原料（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｏｃｋ）と１μＬの貯蔵緩衝液（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｂｕｆｆｅｒ）を混ぜ合わせた後に、０．７ｍＬ緩衝液で室温にて平衡化することによって懸滴を調製した。１＋３の複合体及び１＋８の複合体の原液を、水中全ペプチドが２．２ｍＭという最終濃度まで、それぞれのペプチドの濃縮された原料を１：１の比で混ぜ合わせることによって調製した。１＋３の結晶を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、１Ｍ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４を含む貯蔵緩衝液から得た。１＋８の複合体の結晶を、０．４Ｍ  Ｌｉ２ＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１２％ｖ／ｖＰＥＧ８０００、２０％ｖ／ｖグリセロールを含む貯蔵緩衝液で成長させた。１＋１０の複合体を結晶化する初期の試みにおいて、水中全ペプチドが０．７６ｍＭという最終濃度までそれぞれのペプチドの濃縮された原料を１：１の比で混ぜ合わせることによって原液を調製した。この方法で調製した１＋１０の原料は、完全に可溶性であるというわけではなかった。しかし、結果として生じる粘性の懸濁液は、０．５Ｍ  硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、ｐＨ７．５、３０％ｖ／ｖ２−メチル−２，４−ペンタンジオールから構成される望ましい緩衝液から、α／βペプチド１０の結晶のみをもたらした。続く１＋１０の結晶化の試みに対して、水中全ペプチドが１３０μＭで１：１のペプチド混合物を再び折り畳むことによって、複合体の原液を調製し、続いて、１０ｋＤａ分子量のカットオフ膜を介して、４℃での遠心分離によって１．１ｍＭまで濃縮した。１＋１０の結晶を、この方法で調製した原料、及び、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、２５％ｗ／ｖＰＥＧ３３５０から構成される貯蔵緩衝液から得た。
【００９２】
Ｘ線データコレクション及び構造決定
全ての結晶を液体窒素において急速冷凍した。冷凍に先立ち、１＋３の複合体の結晶を、０．０８Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、１．６Ｍ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、２０％ｖ／ｖグリセロールの中に簡単に浸した。１０の結晶及び１＋８の結晶を、結晶化ドロップから直接冷凍した。冷凍に先立ち、１＋１０の複合体の結晶は、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、２５％ｗ／ｖＰＥＧ３３５０、２０％ｖ／ｖグリセロール内に簡単に浸した。１＋３の複合体及び１＋８の複合体に対する回折データを、Ｃｕ  Ｋα放射線を使用してＢｒｕｋｅｒ  Ｘ８  Ｐｒｏｔｅｕｍ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ，Ｉｎｃ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＵＳＡ）で収集し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｕｍ２ソフトウェアパッケージを用いて処理した。１０の結晶及び１＋１０の複合体の結晶に対する回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅａｍ  ｂｅａｍｌｉｎｅ  ２１−ＩＤ−Ｇにて収集し、ＨＫＬ−２０００ブランドのソフトウェア（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．社、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて処理した。ＣＣＰ４ソフトウェアスイートを使用して構造決定を実行した。Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ４（１９９４）Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ−Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，Ｓｅｃｔ  Ｄ  ５０：７６０−７６３．分子置換を、Ｐｈａｓｅｒソフトウェア（ＭｃＣｏｙ  ＡＪ，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ  ＲＷ，Ｓｔｏｒｏｎｉ  ＬＣ，＆Ｒｅａｄ  ＲＪ（２００５）Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆａｓｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，Ｓｅｃｔ  Ｄ６１：４５８−４６４）、又は、Ｍｏｌｒｅｐソフトウェア（Ｖａｇｉｎ  Ａ＆Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  Ａ（１９９７）ＭＯＬＲＥＰ：Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ３０（６）：１０２２−１０２５）を用いて実行した。自動化された精製に対するＲｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ＧＮ，Ｖａｇｉｎ  ＡＡ，＆Ｄｏｄｓｏｎ  ＥＪ（１９９７）Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，Ｓｅｃｔ  Ｄ  ５３：２４０−２５５）、手動のモデル構成に対するＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  Ｐ＆Ｃｏｗｔａｎ  Ｋ（２００４）Ｃｏｏｔ：Ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，Ｓｅｃｔ  Ｄ  ６０：２１２６−２１３２）、及び、自動化された水構成及び自由原子密度改変に対するＡＲＰ／ｗＡＲＰの組み合わせによって精製を成し遂げた。（Ｌａｍｚｉｎ  ��Ｓ＆Ｗｉｌｓｏｎ  ＫＳ（１９９３）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，Ｓｅｃｔ  Ｄ  ４９：１２９−１４７）１＋３の複合体の構造を、発表されたｇｐ４１六量体構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＡＩＫ）から得たサーチモデルを用いて解析した。Ｃｈａｎ  ＤＣ，Ｆａｓｓ  Ｄ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＪＭ，＆Ｋｉｍ  ＰＳ（１９９７）Ｃｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｇｐ４１  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＨＩＶ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ  ８９（２）：２６３−２７３．α／βペプチド１０の構造を、１＋３の複合体からのＣＨＲヘリックスをサーチモデルとして用いて解析した。２つのサーチモデルである、１＋３の複合体からのＮＨＲヘリックス及びα／βペプチド１０のみの構造からのＣＨＲヘリックスを用いて、１＋１０の複合体の構造を解析した。２つのサーチモデルである、１＋３の複合体からのＮＨＲヘリックス、並びに、１＋３及び１＋１０の構造体から調製したキメラＣＨＲヘリックスを用いて１＋８の複合体の構造を解析した。ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、分子グラフィックスを調製した。
【００９３】
プロテアーゼ安定性
ペプチドの原液を、ＴＢＳ中（ＵＶ吸光度に基づく）２５μＭの濃度で調製した。プロテイナーゼＫの溶液を、ＴＢＳ中（重量対容積に基づく）５０μｇ／ｍＬの濃度で調製した。各蛋白質分解反応に対して、４０μＬのペプチド原料を、１０μＬのプロテイナーゼＫ原料と混ぜ合わせた。室温にて反応を進めさせ、１００μＬの１％ＴＦＡ水溶液を添加することによって所望の時点にて反応を停止させた。１２５μＬの結果として生じる反応停止された反応を、分析用逆相ＨＰＬＣ上に注入し、０．１％ＴＦＡ水溶液と０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液との勾配で作動させた。存在する開始ペプチドの量は、２２０ｎｍでのピークの積分によって定量化した。各時点に対して２度反応を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍブランドのソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して時間依存的なペプチド濃度を指数関数型減衰に適合させることによって、半減期を決定した。一部の時点に対する未精製の試料を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析し、観察した生成物を使用して、反応の間に切断されたアミド結合を同定した。
【００９４】
ｇｐ４１−５の発現、精製、及び、再折り畳み
本明細書に使用されるｇｐ４１−５コンストラクトの配列は以下である。
【００９５】
【数１】
2015193648.tif 000008
ｇｐ４１−５の発現、精製、及び、再折り畳みを、以前に記載されたように実行した。Ｆｒｅｙ，Ｇ．；Ｒｉｔｓ−Ｖｏｌｌｏｃｈ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｑ．；Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．；Ｃｈｅｎ，Ｂ．；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６，１０３，１３９３８−１３９４３．Ｐｒｏｆ．Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって提供されたｇｐ４１−５プラスミドの試料を、電気穿孔によってＥ．Ｃｏｌｉ細胞（Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）株、Ｎｏｖａｇｅｎ社）内に形質移入した。５０μｇ／ｍＬアンピシリン（ｇｐ４１−５プラスミドにより提供される耐性）、及び、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）株に含まれる稀なｔＲＮＡに対してプラスミドにより提供される耐性）を追加した２０ｍＬ  ＬＢにおいて、単一のコロニーを一晩増殖させた。５００ｍＬの抗生物質追加ＬＢに、５ｍＬのオーバーナイトスターターカルチャーを混入した。０．７５のＯＤ６００まで３７℃で細胞を増殖させ、後に、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって誘発した。前記細胞を、さらに３７℃で３時間増殖させ、次に、４℃にて１５分間１２，０００ｇで遠心分離した。その細胞ペレットを氷冷の氷酢酸に溶解し、定期的に攪拌させながら４５分間氷の上に放置した。その懸濁液を、４℃にて１５分間３９，０００ｇで遠心分離した。上澄みをデカントして凍結乾燥した。粗蛋白質を、調製用のＨＰＬＣによって、０．１％ＴＦＡ水溶液と０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液との勾配により溶出されるＣ１８カラムで精製した。精製した蛋白質を凍結乾燥し、再折り畳みまで４０℃にて貯蔵した。再折り畳みには、精製したｇｐ４１−５（〜２ｍｇ）を、１０ｍＬの６Ｍ  塩化グアニジウムに溶解した。結果として生じる溶液を、０．１Ｍ  グリシン  ｐＨ３．６（１ｘ）に対して、続いて、ＰＢＳ（２ｘ）に対して室温にて透析した。遠心分離によって沈殿物を除去し、結果として生じる蛋白質をさらに精製することなく使用した。
【００９６】
蛍光偏光
蛍光偏光アッセイを、室温にて黒色のポリスチレンプレートにおいて行った。全ての測定を２ウェルで行った。アッセイ緩衝液を、２０ｎＭ  ホスフェート、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＮａＮ３、０．５ｍｇ／ｍＬ  “Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８”ブランドのポリオキシアルキレンエーテル界面活性剤から構成した。ｇｐ４１−５に対するＦｌｕ−Ｃ３８の結合親和性を、３８４−ウェルプレートにおいて、（競合ＦＰ実験の条件を模倣するよう添加された）１％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯを有したアッセイ緩衝液における１つのウェルあたりの最終容積が５０μＬになるまで、増加する濃度の蛋白質により固定された濃度のラベルされたペプチド（０．２ｎＭ）を滴定することによって測定した。全てのウェルにおいて二度行った。そのプレートを３０分間平衡化させ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１００プレートリーダーで分析した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、データをＦＰ直接結合モデルに適合させた。Ｒｏｅｈｒｌ，Ｍ．Ｈ．Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｙ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４，４３，１６０５６−１６０６６．トレーサーのＫｄを、０．４±０．１ｎＭであるように決定した。測定した結合親和性は、ｇｐ４１−５／Ｆｌｕ−ＣＨＲ相互作用に対して以前に報告されたものよりもいくらかきつかった（Ｋｄ＝３ｎＭ）が、以前の研究は、はるかに高い濃度のトレーサー（５ｎＭ）を直接結合実験において利用していた。直接結合ＦＰ実験において正確に決定することができるＫｄ値の下限は、利用されるトレーサーの濃度にほぼ等しい。Ｒｏｅｈｒｌ，Ｗａｎｇ＆Ｗａｇｎｅｒ，ｓｕｐｒａ。
【００９７】
競合蛍光偏光アッセイを、黒い９６−ウェルプレートにおいて行った。２ｎＭ  ｇｐ４１−５、１ｎＭ  Ｆｌｕ−Ｃ３８の溶液をＦＰアッセイ緩衝液において調製し、９６−ウェルプレート内に配列した（１００μＬ／ウェル）。ＤＭＳＯにおいて段階希釈のペプチド阻害剤を含有する第二の原料プレートを調製した。ペプチド原液を、アッセイプレートまで移した（１つのウェルあたり１μＬ）。各アッセイプレートは、以下の３つの対照：（１）１００μＬアッセイ緩衝液＋１μＬＤＭＳＯ；（２）非結合性のトレーサー対照として１００μＬの１ｎＭ  Ｆｌｕ−Ｃ３８＋１μＬ  ＤＭＳＯ；（３）結合性のトレーサー対照として１００μＬの２ｎＭ  蛋白質／１ｎＭ  トレーサー溶液＋１μＬ  ＤＭＳＯ；のそれぞれも４つのウェルにおいて含んだ。全ての実験条件を二度実行し、各ペプチドを２〜３の独立した実験においてアッセイした。データ分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて行った。各実験からのＲａｗ  ｍＰデータを、Ｓ字状の用量反応に適合し、曲線の一番上と一番下に対して、結果として生じるパラメータに基準化した。全ての実験が、少なくとも１つの化合物を含み、検査した最も高い濃度にて完全な阻害を示した。各オリゴマーにおける多数の独立した実行からの基準化されたデータを組み合わせて、唯一の浮遊パラメータとしてＫｉを有したＦＰ競合結合に対して正確な分析用表現に世界的に適合させた。競合ＦＰ実験において測定可能なＫｉに対する下界は、トレーサーのＫｄに基づき０．２ｎＭであると考慮した。Ｒｏｅｈｒｌ，Ｗａｎｇ，＆Ｗａｇｎｅｒ，ｓｕｐｒａを参照されたい。
【００９８】
円二色性分光法
円二色性測定を、Ａｖｉｖ  ２０２ＳＦ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで実行した。各ペプチドの試料を、ＰＢＳ中２０μＭの濃度で調製した。１：１ペプチド混合物の溶液を、それぞれのペプチド測定に使用する同じ２０μＭの原料から等しい容積を混ぜ合わせることによって調製した。スペクトルを、１ｍｍセルにおいて、１ｎｍのステップサイズ及び５秒の平均時間で記録した。全てのスペクトルは、同じセルにおいて測定される緩衝液に対してバックグラウンド補正される。熱融解（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔ）を、各温度変化の間に１０分の平衡時間を設けて５度の上昇で実行した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、熱変性データを、単純な二状態の折り畳みモデル（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．；Ｍｅｅｋｅｒ，Ａ．Ｋ．；Ｆｒｅｉｒｅ，Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，２７，４７６１−４７６８）に適合させた。
【００９９】
プロテアーゼ安定性
ペプチドの原液を、ＴＢＳ中（ＵＶ吸光度に基づき）２５ｕＭの濃度で調製した。プロテイナーゼＫの溶液を、ＴＢＳ中（重量対容積に基づき）５０μｇ／ｍＬの濃度で調製した。各蛋白質分解反応に対して、４０μＬのペプチド原料を、１０μＬのプロテイナーゼＫ原料と混ぜ合わせた。室温にて反応を進めさせ、１００μＬの１％ＴＦＡ水溶液を添加することによって所望の時点にて反応を停止させた。１２５μＬの結果として生じる反応停止された反応を、分析用逆相ＨＰＬＣ上に注入し、存在する開始ペプチドの量を、２２０ｎｍでのピークの積分によって定量化した。各時点に対して２度反応を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して時間依存的なペプチド濃度を指数関数型減衰に適合させることによって、半減期を決定した。一部の時点に対する未精製の試料を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析し、観察した生成物を使用して、反応の間に切断されたアミド結合を同定した。
【０１００】
抗ウイルスアッセイ
ＣＨＯ細胞において発現されたＨＩＶ−１クローンＨＸＢ２の外被糖蛋白質に基づき、Ｕ３７３−ＭＡＧＩ細胞を標的として用いる細胞間融合アッセイを、以前に記載されたように実行した。（Ｄｅｎｇ  ＹＱ，Ｚｈｅｎｇ  Ｑ，Ｋｅｔａｓ  ＴＪ，Ｍｏｏｒｅ  ＪＰ，＆Ｌｕ  Ｍ（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（１４）：４３６０−４３６９）。Ｕ３７３−ＭＡＧＩ標的細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の基礎レベルを測定することによって判定されるように、α／βペプチド全てが５μＭにて細胞毒性を示さなかった。ＨＩＶ−１感染性の阻害を、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ（末端反復配列）の制御下でＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、及び、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するＴＺＭ−ｂ１（ＪＣ５３ＢＬ）細胞で測定した。（Ｗｅｉ  ＸＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔ−２０）ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４６（６）：１８９６−１９０５）。４つのＨＩＶ−１株：クレイドＢのＸ４−向性Ｔ細胞系統適応分離株ＩＩＩＢ由来のクローンであるＮＬ４−３；クレイドＢのＸ４一次分離株であるＨＣ４（Ｔｒｋｏｌａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ４−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｓａｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（３）：１８７６−１８８５）；Ｒ５一次分離株、ＣＣ１／８５（クレイドＢ）（Ｃｏｎｎｏｒ  ＲＩ，Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ＫＥ，Ｃｅｒａｄｉｎｉ  Ｄ，Ｃｈｏｅ  Ｓ，＆Ｌａｎｄａｕ  ＮＲ（１９９７）Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｓｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５（４）：６２１−６２８）；及び、別のＲ５一次分離株、ＤＪ２５８（クレイドＡ）（Ｌｏｕｗａｇｉｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−１  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｏｒｉｇｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９（１）：２６３−２７１）；のＰＢＭＣにおいて生成されるウイルスストックを使用した。
【０１０１】
手短に言えば、播種の前日に、１０５細胞／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの密度でＴＺＭ−ｂ１細胞を播いた。５０μｌの段階的に希釈されたペプチド（又は対照として培養液のみ）を各ウェルに添加した。次に、５０μｌのウイルス、４０  ＴＣＩＤ５０又はバックグラウンドの対照として培養液のみを各ウェルに添加した。３日目に、光学顕微鏡によってウェルを検査した。細胞培養密度及び細胞形態に対して、ペプチドを有するウェル及びペプチドを有さないウェルを比較した。高濃度のペプチドが使用された際に毒性のサインは識別されなかった。次に、感染力を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従い、相対光ユニットにおいて定量化した。実験を３回行った。検査ウェルの信号を、阻害剤のない対照ウェルの信号に、どちらもバックグラウンドを差し引いた後、基準化した。感染性の％阻害を、ｌｏｇ１０濃度の阻害剤の関数としてｎＭで表した。４パラメータＳ字状関数を、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）においてデータに適合させた。前記適合に対するＲ２値は、ＮＬ４−３に対して０．９５〜１．０；ＨＣ４に対して０．９８〜１．０；ＣＣ  １／８５に対して０．９５〜０．９８；及び、ＤＪ２５８に対して０．９２〜０．９８であった。最後に、３つの繰り返し実験のそれぞれの適合からＩＣ５０値の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを計算した。結果は、図１０Ａ（ＮＬ４−３）、１０Ｂ（ＣＣ１／８５）、１０Ｃ（ＨＣ４）、及び、１０Ｄ（ＤＪ２５８）においてグラフを用いて描写されている。
【０１０２】
ＢＨ３領域を模倣するα／βペプチドの配列ベースの設計
上記のように、蛋白質上の特異的部位に堅固及び選択的に結合する分子を設計することは、分子認識において重要な挑戦であると考えられる。従って、適切な分子を同定するための系統的アプローチは、紛れもない利点である。この実施例は、天然の蛋白質結合領域にわたった系統的な主鎖の改変（すなわち、配列ベースの設計）を使用して、標的蛋白質の表面に堅固及び選択的に結合するα／βペプチドフォルダマーを迅速に生じることができるということを示すよう提供されている。この実施例においては、配列ベースの設計アプローチを使用して、蛋白質Ｂｃｌ−ｘＬのＢＨ３認識クレフトに対するα／βペプチドフォルダマーリガンドを開発した。Ｂｃｌ−ｘＬは、プログラムされた細胞死経路を制御する、及び、抗アポートシスメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）もアポトーシス促進メンバー（例えば、Ｂａｋ、Ｂａｄ、Ｐｕｍａ）も含むＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。Ａｄａｍｓ＆Ｃｏｒｙ（２００７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：１３２４−１３３７を参照されたい。
【０１０３】
この実施例は、本発明者等及び他の者によって以前に追求されたフォルダマーリガンドに対する構造ベースの設計アプローチとは基本的に異なるＢＨ３認識クレフトに対するα／βペプチドリガンドの配列ベースの設計を記述している。そのアプローチは、規則的に一定の間隔で配置されたα−残基の部分集合を、本来の側鎖を有するβ−残基と置換することを含む。各αからβへの置換は、余分なメチレンユニットを主鎖内に導入する。利用される置換戦略の副生成物として立体構造の模倣は達成されるけれども、この配列ベースのアプローチは、αペプチド原型の折り畳み構造を再現することを直接の目的としない。先の実施例に示されているように、配列ベースの設計を使用して、αペプチド原型からヘリックスバンドルフォルダマー四次構造を生じることができるということは実証された。この実施例では、当該方法が、αらせんＢＨ３領域の蛋白質結合作用を模倣するために使用される。抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーの蛋白質に堅固に結合するフォルダマーを生じるためには、配列ベースの設計が構造ベースの設計よりも効率的であること、及び、配列ベースの設計は蛋白質分解に対して有意な耐性を表示するα／βペプチドを与えることができるということを結果は実証している。
【０１０４】
Ｐｕｍａは、抗アポトーシスのファミリーメンバーに乱交雑に結合するＢｃｌ−２相同体である。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：３９３−４０３を参照されたい。Ｐｕｍａ  ＢＨ３領域に一致する２６−残基のαペプチド（１’）を、異なるα／βペプチド主鎖上に表示された同じ側鎖の一次配列を有した７つのα／βペプチド類似体（２’〜８’）と共に調製した。図７Ａを参照されたい。各α／βペプチドは、一側面に沿って走る疎水性側鎖のよく発達した「ストライプ」を有するαヘリックスを形成するαペプチド配列の間で共通の７価の原子のパターンから得たααβαααβ主鎖繰り返しを有した。図７Ｂを参照されたい。最近の結晶構造は、ααβαααβ主鎖によってαヘリックス様立体構造の形成が可能になっていることを実証されている。Ｈｏｒｎｅ，Ｐｒｉｃｅ，Ｋｅｃｋ，＆Ｇｅｌｌｍａｎ（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：４１７８−４１８０を参照されたい。α／βペプチド２’〜８’は、全てのあり得るααβαααβ主鎖パターンを有したＰｕｍａ  ＢＨ３配列の異性体を表している。これらのオリゴマーは、β−残基の帯がらせんの外周を移動する一連のＰｕｍａ類似体としてみなすことができる。図７Ｃを参照されたい。
【０１０５】
化合物１’〜８’を、２つの異なるＢｃｌ−２ファミリーの標的、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１に結合する能力に対して検査した。各化合物に対する阻害定数（Ｋｉ）を、蛍光標識されたＢａｋ−ＢＨ３ペプチドをトレーサーとして用いて競合蛍光偏光（ＦＰ）アッセイによって決定した（図８を参照）。Ｐｕｍａ−ＢＨ３ペプチド（１’）は、これらのＦＰアッセイを用いて測定することができる親和性よりも堅固なＢｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１に対する親和性を示し、それは以前の研究と一致した。α／βペプチド２’〜８’に対するＫｉ値は、１００μＭから１ｎＭ未満まで異なる。β−残基取り込みの位置における変化は、Ｂｃｌ−ｘＬに対しては１００，０００倍及びＭｃｌ−１に対しては７００倍を超える等、各蛋白質に対する親和性をかなり変える。
【０１０６】
どちらの蛋白質標的に対しても、４’は、Ｂｃｌ−ｘＬに対してはＫｉ＜１ｎＭ及びＭｃｌ−１に対してはＫｉ＝１５０ｎＭで、最も堅固に結合するフォルダマーである。Ｐｕｍａ  ＢＨ３配列内の決定的な疎水性残基にてβ−改変を有するα／βペプチド５’がＢｃｌ−ｘＬに対してナノモルの親和性を示すということは注目すべきでことである。β−残基取り込みの位置が、これらの蛋白質標的に対する親和性に加えて、Ｐｕｍａ由来のα／βペプチド異性体の間でＢｃｌ−ｘＬ対Ｍｃｌ−１選択性に強く影響を与えるということが、これらのデータによって実証される。例えば、３’は、前記２つの蛋白質に対して等しい親和性を示しているが、５’は、Ｍｃｌ−１よりもＢｃｌ−ｘＬに対して４０００倍を超える選択性を表示している。ＦＰ競合アッセイから得た親和性及び選択性に関する結論の妥当性を、Ｎ末端アセチル基がＢＯＤＹＰＹ−ＴＭＲフルオロフォアと置換された類似体を用いた直接結合ＦＰ測定を行うことによって、αペプチド１’及びα／βペプチド４’及び５’に対して検査した。直接結合によって決定されるＫｄ値は、競合データから得たＫｉ値と一致した（表５を参照）。Ｋｄ対Ｋｉの絶対値における差は、直接結合モードで測定された親和性に対する付加されたフルオロフォアの控えめな寄与を反映する場合がある。
【０１０７】
【表５】
2015193648.tif 000009
Ｐｕｍａ  ＢＨ３領域の特定のα／β類似体は天然の蛋白質パートナーに高い親和性で結合することができるということを確立すると、そのα／βペプチドが蛋白質分解酵素によって認識及び処理されるかどうかを決定するために実験を行った。αペプチド１’並びにα／βペプチド４’及び５’を、広範な基質特性を有した２つのプロテアーゼ：（１）疎水性の残基に対するＣ末端を切断する傾向がある非特異的なセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ、及び、（２）個々のアミノ酸に蛋白質を消化する攻撃的なエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼとの混合物である“ＰＲＯＮＡＳＥ”ブランドのプロテイナーゼに対するその感受性に対して検査した。（“ＰＲＯＮＡＳＥ”は、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．社、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ．の登録商標である）。表３に提示した結果によって、ααβαααβ主鎖は蛋白質分解に対する実質的な耐性を与えることができると示されている。Ｂｃｌ−ｘＬにもＭｃｌ−１にも堅固に結合するα／βペプチド４’は、αペプチド１’と比較して、プロテイナーゼＫに対して４０００倍を超える安定性の改善、及び、“ＰＲＯＮＡＳＥ”ブランドのプロテイナーゼに対して１００倍を越える安定性の改善を示した。質量分析による切断産物の分析は、β−残基が近くのアミド結合を蛋白質分解から保護する傾向があるということを示し、それは、単離されたαからβ３の挿入に対する以前の報告と一致した。α／βペプチド５’は、蛋白質分解に対する感受性が異性体４’よりも高いが、それにもかかわらず５’は、αペプチド１’と比較して有意な改善を示している。
【０１０８】
以前の研究は、ＢＨ３由来のαペプチドのαらせん傾向が抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー蛋白質に対する親和性の重要な決定要因であり得ることを示唆してきた。従って、円二色性（ＣＤ）分光法を利用して、この実施例において記述した堅固な結合のα／βペプチド（４’及び５’）の２つ及び最も弱い結合の類似体（７’）の１つの間にある立体構造の差を探索した。４’、５’、及び、７’に対するＣＤスペクトルの定性比較は、これら３つの異性体間での結合親和性における大きな差はらせん傾向の差によって説明することはできないと示している。これら３つのα／βペプチドのそれぞれが、ほぼ２０２ｎｍにてＣＤ最小値を示しており、１つの残基あたりの楕円率は、水溶液において−１３，０００から−１５，０００ｄｅｇ  ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１である。ααβαααβ主鎖におけるらせん形成は、２０６ｎｍでの強いＣＤ最小値によって反映され、最大の大きさは、約−４０，０００ｄｅｇ  ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１である。このように、水溶液における４’、５’、及び、７’のみに対するＣＤデータは、比較的低い母集団のらせん状態を示唆している。同様に、水溶液におけるＰｕｍａ  αペプチド１に対するＣＤ符号（〔θ〕２２２＝−１０，０００  ｄｅｇ  ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１  ｒｅｓ−１）は、ほとんどないαらせん含有量を示唆している。いかなる特定の機構にも限定されることなく、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１に対するＢＨ３領域αペプチドの結合後のαらせん形成の誘導に対する確立された前例に基づき、本発明者等は、４’及び５’等のα／βペプチドが、蛋白質パートナーへの結合後にらせん立体構造をとるよう誘発されることを仮定している。
【０１０９】
配列ベースの設計の簡単な原理を使用してらせんαペプチドリガンドを、蛋白質標的に対して匹敵する結合親和性及び実質的に改善された蛋白質分解安定性を有したα／βペプチドに変換することができるということが本明細書において報告した研究によって実証されている。本明細書において開示及び請求された戦略は、蛋白質間相互作用のフォルダマーベースの阻害剤の開発に対する以前の研究からの重要な発展である。本明細書に記述された配列ベースのアプローチは、α−ヘリックスのフォルダマー模倣物を生じる構造ベースのアプローチよりも効率的であると、これらの実施例によって示されてきた。
【０１１０】
要するに、一次配列情報に基づき完全に設計した一連のちょうど７つのα／βペプチドを評価することによって、すでに記載されたキメラα／β＋αリガンドのうち、Ｂｃｌ−ｘＬに対する親和性において最良のものに対抗する化合物が生じる。Ｓａｄｏｗｓｋｙ，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｌｅｅ，Ｕｍｅｚａｗａ，Ｗａｎｇ，Ｔｏｍｉｔａ  ａｎｄ  Ｇｅｌｌｍａｎ（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １２７：１１９６６−１１９６８；Ｓａｄｏｗｓｋｙ，Ｆａｉｒｌｉｅ，Ｈａｄｌｅｙ，Ｌｅｅ，Ｕｍｅｚａｗａ，Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ−Ｃｏｌｅｓｋａ，Ｗａｎｇ，Ｈｕａｎｇ，Ｔｏｍｉｔａ，ａｎｄ  Ｇｅｌｌｍａｎ（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１３９−１５４；及び、Ｓａｄｏｗｓｋｙ，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｏｍｉｔａ，ａｎｄ  Ｇｅｌｌｍａｎ（２００７）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８：９０３−９１６を参照されたい。さらに、最良のα／βペプチドは、構造ベースの設計を介して同定されるオリゴマーによって標的にされない生物医学的に重要なＢｃｌ−２ファミリー蛋白質であるＭｃｌ−１に対して控えめによく結合する。ペプチド配列にわたった多数の系統的なα−残基からβ−残基への置換（Ｐｕｍａ  ＢＨ３領域では２６位置のうち７つの置換）の実行は、蛋白質分解性に安定な生理活性のオリゴマーの設計における前例を超えて有意な進歩を構成する。この置換パターンの一見解は抗アポトーシス蛋白質に対する結合という点で耐用性がよいという発見は、驚くべき及び注目すべきことである。
【０１１１】
本明細書において例示した配列ベースの設計は、商業的に入手可能なα−及びβ−アミノ酸モノマー、並びに、標準的な自動化されたペプチド合成方法を用いて実行することができる。従って、他の者にとって同様に試みることはわかりやすいことである。
【０１１２】
キメラα＋α／βフォルダマーの比較
以下のペプチド１２、１３、及び、８は、リードα／βフォルダマー１０のキメラα＋α／βフォルダマーである。これらのペプチドを、Ｎ末端付近の領域におけるベータ置換の効果を決定するために作製した。ベータ残基を、７価の原子に沿って「ｆ」及び「ｃ」位置において順次差し引いた。αからβへの置換の効果を、以前に報告した蛍光偏光（ＦＰ）競合アッセイを用いてモニターした。（Ｆｒｅｙ，Ｇ．；Ｒｉｔｓ−Ｖｏｌｌｏｃｈ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｑ．；Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．；Ｃｈｅｎ，Ｂ．；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｇｐ４１  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＨＩＶ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００６，１０３，１３９３８−４３）。ゆるやかに増加する、結合減少の効果をβ置換が有していることを結果は示唆している。
【０１１３】
キメラα＋α／βフォルダマー、Ｎ末端付近の「ｆ」及び「ｃ」位置からのβ残基の差し引き：
【０１１４】
【数２】
2015193648.tif 000010
ボールド体の残基は、
【０１１５】
【化１】
2015193648.tif 000011
である。
ボールド体で下線が引かれた残基は、Ｘは、
【０１１６】
【化２】
2015193648.tif 000012
であり、
Ｚは、
【０１１７】
【化３】
2015193648.tif 000013
である。
Ｋｉ（ｎＭ）：
化合物１０＝９
化合物１２＝８
化合物１３＝０．８
化合物８＝０．３。
【０１１８】
β置換がペプチドの一領域において結合を破壊したかどうかを決定するために、ベータのストライプにおいて置換された異なるアルファセグメントを用いてα＋α／βキメラペプチドを合成した。着目した領域は、ペプチドのＮ末端８、中間１４、及び、Ｃ末端１５の付近であった。アルファセグメントを導入することによってフォルダマーの結合は増えたが、Ｋｉは全て非常に類似したことをＦＰデータは示し、β置換はらせんの全長にわたって結合をゆっくり破壊し、特定の領域では違ったことを示唆した。
【０１１９】
キメラα＋α／βフォルダマー、Ｎ末端、中間、及び、Ｃ末端領域におけるαセグメントの差し引き：
【０１２０】
【数３】
2015193648.tif 000014
Ｋｉ（ｎＭ）：
化合物８＝０．３
化合物１４＝１．４
化合物１５＝０．２。
【０１２１】
フォルダマー１０は、折り畳みにおいて寄与するよう環状の残基がＣα−Ｃβねじれ角を効果的に制限したが、他の手段はらせんを制限するよう使用することができることを示した。α残基の塩橋は、αヘリックスを予め形成することに効果的であった。Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．；Ｋｏｄａｍａ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｓ．；Ｋａｊｉｗａｒａ，Ｋ．；Ｉｚｕｍｉ，Ｋ．；Ｓａｋａｇａｍｉ，Ｙ．；Ｏｉｓｈｉ，Ｓ．；Ｏｈｋｕｂｏ，Ｔ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．；Ｏｔａｋａ，Ａ．；Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．；Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００９，４１，８９１−９を参照されたい。別の設計戦略は、ｉ＋４位置におけるグルタメートのストライプと相互作用するアルギニンのストライプをｉ位置に置き、αらせん構造を支持した。Ｂｕｒｋｈａｒｄ，Ｐ．；Ｍｅｉｅｒ，Ｍ．；Ｌｕｓｔｉｇ，Ａ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，２０００，９，２２９４−２３０１を参照されたい。
【０１２２】
以下のペプチド１７は、らせんを予め組織化する塩橋を形成するベータ残基の能力を検査した。「ｆ」及び「ｃ」位置がベータ置換に最も協力的であったことは以前に発見したため、ｉとｉ＋４との相互作用を最大化するよう、β−ｈＡｒｇを「ｆ」位置に置き、β−ｈＧｌｕを「ｃ」位置に置いた。ペプチド１６を、環状のベータ残基も塩橋ベータ残基もベータストライプにおいて相乗的に作用したかどうかを検査するために作製した。ＦＰデータは、α／βフォルダマー１６及び１７がフォルダマー１に対してほぼ等しい阻害剤であったことを示唆した。
【０１２３】
【数４】
2015193648.tif 000015
Ｋｉ（ｎＭ）：
化合物１０＝９
化合物１６＝３
化合物１７＝１１。
【０１２４】
これらの結果は、化合物１７がいかなる環状にされた残基も有さないことにおいて有意である。いかなる基本的機構又は現象にも限定されないけれども、立体構造の安定性は、らせん構造の一側面に沿ってイオン対を取り込むことによって達成されるように思われる。
【０１２５】
本出願は、２００８年１０月１７日に出願した米国仮特許出願第６１／１０６，２０５号、及び、２００９年７月２９日に出願した米国仮特許出願第６１／２２９，３２５号に基づく優先権を主張するものであり、全内容を本出願において援用する。
【０１２６】
政府基金に関する記述
本発明は、以下の機関：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＧＭ５６４１４及びＣＡ１１９８７５により与えられた米国政府の支援のもとに行われた。米国政府は本発明においてある種の権利を有している。
【図１Ａ】
2015193648.tif 000016
【図１Ｂ】
2015193648.tif 000017
【図２Ａ】
2015193648.tif 000018
【図２Ｂ】
2015193648.tif 000019
【図２Ｃ】
2015193648.tif 000020
【図３Ａ】
2015193648.tif 000021
【図３Ｂ】
2015193648.tif 000022
【図３Ｃ】
2015193648.tif 000023
【図３Ｄ】
2015193648.tif 000024
【図４Ａ】
2015193648.tif 000025
【図４Ｂ】
2015193648.tif 000026
【図４Ｃ】
2015193648.tif 000027
【図４Ｄ】
2015193648.tif 000028
【図４Ｅ】
2015193648.tif 000029
【図４Ｆ】
2015193648.tif 000030
【図４Ｇ】
2015193648.tif 000031
【図５Ａ】
2015193648.tif 000032
【図５Ｂ】
2015193648.tif 000033
【図５Ｃ】
2015193648.tif 000034
【図６】
2015193648.tif 000035
【図７Ａ】
2015193648.tif 000036
【図７Ｂ】
2015193648.tif 000037
【図７Ｃ】
2015193648.tif 000038
【図７Ｄ】
2015193648.tif 000039
【図８】
2015193648.tif 000040
【図９Ａ】
2015193648.tif 000041
【図９Ｂ】
2015193648.tif 000042
【図９Ｃ】
2015193648.tif 000043
【図９Ｄ】
2015193648.tif 000044
【図１０Ａ】
2015193648.tif 000045
【図１０Ｂ】
2015193648.tif 000046
【図１０Ｃ】
2015193648.tif 000047
【図１０Ｄ】
2015193648.tif 000048
【配列表】
2015193648000001.app