(57)【要約】【課題】白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤、造血幹細胞移植前処置剤及び効果判定方法を提供すること。【解決手段】ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害する作用を有することから、白血病治療剤等として有用である。また、前記白血病治療剤等によって、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の治療又は造血幹細胞移植に有用である。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の治療剤であって、
ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病治療剤。
【請求項２】
前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の白血病治療剤。
【請求項３】
前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病であることを特徴とする請求項１又は２に記載の白血病治療剤。
【請求項４】
第２の白血病治療剤と併用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の白血病治療剤。
【請求項５】
前記第２の白血病治療剤が、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄｏｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ又はｉｄａｒｕｂｉｃｉｎであることを特徴とする請求項４に記載の白血病治療剤。
【請求項６】
ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖阻害剤であって、
ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項７】
前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項８】
前記白血病細胞が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病を罹患しているヒト又はヒト以外の動物の細胞であることを特徴とする請求項６又は７に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項９】
第２の白血病細胞増殖阻害剤又は第２の白血病治療剤と併用されることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項１０】
前記第２の白血病細胞増殖阻害剤が、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｍｅｌｐｈａｌａｎ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はｅｔｏｐｏｓｉｄｅであることを特徴とする請求項９に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項１１】
前記第２の白血病治療剤が、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄｏｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ又はｉｄａｒｕｂｉｃｉｎであることを特徴とする請求項９又は１０に記載の白血病細胞増殖阻害剤。
【請求項１２】
ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の造血幹細胞移植前処置剤であって、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する造血幹細胞移植前処置剤。
【請求項１３】
前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項１２に記載の造血幹細胞移植前処置剤。
【請求項１４】
前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の造血幹細胞移植前処置剤。
【請求項１５】
第２の造血幹細胞移植前処置剤と併用されることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の造血幹細胞移植前処置剤。
【請求項１６】
前記第２の造血幹細胞移植前処置剤が、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｂｕｓｕｌｆａｎ、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ又はＶＰ１６であることを特徴とする請求項１５に記載の造血幹細胞移植前処置剤。
【請求項１７】
白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法であって、
ヒト又はヒト以外の動物の白血病細胞におけるＦＡＳＮの酵素活性を測定する第１の工程と、
ＦＡＳＮ阻害剤と前記白血病細胞とを接触させる第２の工程と、
第２の工程後の白血病細胞におけるＦＡＳＮの酵素活性を測定する第３の工程と、
を含むことを特徴とする効果判定方法。
【請求項１８】
前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項１７に記載の効果判定方法。
【請求項１９】
前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病であることを特徴とする請求項１７又は１８に記載の効果判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤、造血幹細胞移植前処置剤及び効果判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血器腫瘍には、多くの疾患特異的な染色体異常が知られている。染色体異常は、染色体転座の結果融合遺伝子が形成され異常なキメラタンパク質が生成されるｆｕｓｉｏｎ型と、癌関連遺伝子そのものに変異が入ったｎｏｎ-ｆｕｓｉｏｎ型とに大別される。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）でもｆｕｓｉｏｎ型とｎｏｎ-ｆｕｓｉｏｎ型が存在し（非特許文献１）、ｆｕｓｉｏｎ型であるＮＵＰ９８融合遺伝子やＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合遺伝子を有する急性骨髄性白血病は、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ等の化学療法に対して抵抗性を有し、予後不良であるといわれている（非特許文献２）。
近年においては、骨髄性白血病治療剤として、イマチニブ（グリベック）（特許文献１）や全トランス型レチノイン酸（ベサノイド）（非特許文献３）が開発されている。
【０００３】
しかし、現在までに、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子又はＡＦ１０融合遺伝子を有する骨髄性白血病及びリンパ性白血病に対して、特異的な治療方法は存在しない。また、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子又はＡＦ１０融合遺伝子を有する骨髄性白血病、骨髄異形成症候群及びリンパ性白血病に対する治療標的も明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００１−５１０１９２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. N.Engl.J.Med. 368, 2059-2074 (2013)
【非特許文献２】Chou WC, et al. Acute myeloid leukemia bearing t(7;11)(p15;p15) is a distinct cytogenetic entity with poor outcome and a distinct mutation profile: comparative analysis of 493 adult patients. Leukemia 23, 1303-1310 (2009).
【非特許文献３】Kakizuka, A. et al. Chromosomal translocation t(15;17) in human acute promyelocytic leukemia fuses RARαwith a novel putative transcription factor, PML. Cell 66, 663-674 (1991).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤、造血幹細胞移植前処置剤及び効果判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＦＡＳＮ（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、脂肪酸合成酵素）阻害剤がＮＵＰ９８融合遺伝子又はＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
[１] ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の治療剤であって、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病治療剤；
[２]前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５(4-Methylene-2-octyl-5-oxotetrahydrofuran-3-carboxylic acid、以下同様。)、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする前記[１]に記載の白血病治療剤；
[３]前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病であることを特徴とする前記[１]又は[２]に記載の白血病治療剤；
[４]第２の白血病治療剤と併用されることを特徴とする前記[１]〜[３]のいずれかに記載の白血病治療剤；
[５]前記第２の白血病治療剤が、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄｏｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ又はｉｄａｒｕｂｉｃｉｎであることを特徴とする前記[４]に記載の白血病治療剤；
【０００９】
[６]ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖阻害剤であって、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病細胞増殖阻害剤；
[７]前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする前記[６]に記載の白血病細胞増殖阻害剤；
[８]前記白血病細胞が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病を罹患しているヒト又はヒト以外の動物の細胞であることを特徴とする前記[６]又は[７]に記載の白血病細胞増殖阻害剤；
[９]第２の白血病細胞増殖阻害剤又は第２の白血病治療剤と併用されることを特徴とする前記[６]〜[８]のいずれかに記載の白血病細胞増殖阻害剤；
[１０]前記第２の白血病細胞増殖阻害剤が、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｍｅｌｐｈａｌａｎ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はｅｔｏｐｏｓｉｄｅであることを特徴とする前記[９]に記載の白血病細胞増殖阻害剤；
[１１]前記第２の白血病治療剤が、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄｏｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ又はｉｄａｒｕｂｉｃｉｎであることを特徴とする前記[９] 又は[１０]に記載の白血病細胞増殖阻害剤；
【００１０】
[１２]ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の造血幹細胞移植前処置剤であって、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する造血幹細胞移植前処置剤；
[１３]前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする前記[１２]に記載の造血幹細胞移植前処置剤；
[１４]前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病であることを特徴とする前記[１２]又は[１３]に記載の造血幹細胞移植前処置剤；
[１５]第２の造血幹細胞移植前処置剤と併用されることを特徴とする前記[１２]〜[１４]のいずれかに記載の造血幹細胞移植前処置剤；
[１６]前記第２の造血幹細胞移植前処置剤が、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｂｕｓｕｌｆａｎ、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ又はＶＰ１６であることを特徴とする前記[１５]に記載の造血幹細胞移植前処置剤；
【００１１】
[１７]白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法であって、ヒト又はヒト以外の動物の白血病細胞におけるＦＡＳＮの酵素活性を測定する第１の工程と、ＦＡＳＮ阻害剤と前記白血病細胞とを接触させる第２の工程と、第２の工程後の白血病細胞におけるＦＡＳＮの酵素活性を測定する第３の工程と、を含むことを特徴とする効果判定方法；
[１８]前記ＦＡＳＮ阻害剤が、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする前記[１７]に記載の効果判定方法；
[１９]前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病であることを特徴とする前記[１７]又は[１８]に記載の効果判定方法；
【００１２】
[２０]白血病治療剤を製造するためのＦＡＳＮ阻害剤の使用；
[２１]白血病細胞増殖阻害剤を製造するためのＦＡＳＮ阻害剤の使用；
[２２] 造血幹細胞移植前処置剤を製造するためのＦＡＳＮ阻害剤の使用等である。
【００１３】
なお、本発明において「阻害」とは、ＦＡＳＮ阻害剤を、ヒト若しくはヒト以外の動物又は白血病細胞に投与又は添加等することにより、白血病細胞の増殖を抑制すること、白血病細胞の増殖を停止させること、又は白血病細胞を死滅させることをいい、前記白血病細胞は、以下「発明を実施するための形態」の「薬理作用」の項に記載する細胞のことをいう。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤、造血幹細胞移植前処置剤及び効果判定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ２ドメインが再播種能に重要であることを調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８融合遺伝子を示した図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体が結合するタンパク質を精製した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９とＦＡＳＮとが結合するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、ＦＡＳＮの発現をノックダウンするとＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９を発現している細胞のコロニー形成が抑制されるかどうかを調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９がＦＡＳＮの酵素活性を阻害するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０又はＣＡＬＭ−ＡＦ１０を発現した細胞においてｏｒｌｉｓｔａｔが前記細胞のコロニー形成を阻害するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０又はＣＡＬＭ−ＡＦ１０を発現した細胞においてＣ７５及びｃｅｒｕｌｅｎｉｎが前記細胞のコロニー形成を阻害するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図９】本発明の一実施例において、ＮＵＰ９８を有する白血病細胞におけるＦＡＳＮのタンパク質の発現レベルは増加していないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、前記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施例において特に説明がない場合には、市販の試薬キットや測定装置はそれらに添付のプロトコールを用いる。
【００１７】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図及び範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変及び修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１８】
＝＝薬理作用＝＝
（１）白血病治療剤及び白血病細胞増殖阻害剤
ＦＡＳＮは、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子から翻訳されたタンパク質と結合する。また、ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害する作用を有する。
一方、ＦＡＳＮ阻害剤は、本明細書の実施例に記載の通り、正常な造血細胞や、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子又はＡＦ１０融合遺伝子以外の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害しない。
【００１９】
従って、ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病又は白血病細胞に対する白血病治療剤又は白血病細胞増殖阻害剤等として有用である。また、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病治療剤及び白血病細胞増殖阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の治療又は白血病細胞の増殖阻害に有用である。
【００２０】
ここで、ＮＵＰ９８融合遺伝子を有する白血病を罹患しているヒトは、急性骨髄性白血病を罹患しているヒトのうち、１〜２％であることが知られている（Sheryl M, et al., NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights, 2011 118;:6247-6257）。また、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合遺伝子を有する白血病を罹患しているヒトは、Ｔ細胞急性リンパ性白血病を罹患しているヒトのうち、１０％であることが知られている（Vahid Asnafi, et al., CALM-AF10 is a common fusion transcript in T-ALL and is specific to the TCR gamma delta lineage, 2003 102: 1000-1006）。
従って、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病治療剤及び白血病細胞増殖阻害剤は、数％から１０％しか存在しないＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子有する白血病の治療においても有用である。
【００２１】
また、ＮＵＰ９８融合遺伝子又はＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合遺伝子を有する急性骨髄性白血病は、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ等の化学療法に対して抵抗性を有し、予後不良であるといわれている（Chou WC, et al. Acute myeloid leukemia bearing t(7;11)(p15;p15) is a distinct cytogenetic entity with poor outcome and a distinct mutation profile: comparative analysis of 493 adult patients. Leukemia 23, 1303-1310 (2009)）。
従って、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する白血病治療剤及び白血病細胞増殖阻害剤は、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ等の化学療法に対して抵抗性を有し、一般に予後不良といわれていた患者に対して、生存率を上昇させることができる。
【００２２】
（２）造血幹細胞移植前処置剤
前記の通り、ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害する作用を有する。
一方、ＦＡＳＮ阻害剤は、本明細書の実施例に記載の通り、正常な造血細胞や、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子又はＡＦ１０融合遺伝子以外の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害しない。
【００２３】
従って、ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病又は白血病細胞に対する造血幹細胞移植前処置剤等としても有用である。また、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する造血幹細胞前処置剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病に対する造血幹細胞移植の前処置に有用である。
【００２４】
また、ＮＵＰ９８融合遺伝子やＣＡＬＭ−ＡＦ１０融合遺伝子を有する急性骨髄性白血病は、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ等の化学療法に対して抵抗性を有し、予後不良であるといわれている（Chou WC, et al. Acute myeloid leukemia bearing t(7;11)(p15;p15) is a distinct cytogenetic entity with poor outcome and a distinct mutation profile: comparative analysis of 493 adult patients. Leukemia 23, 1303-1310 (2009)）。
従って、ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する造血幹細胞移植前処置剤は、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ等の化学療法に対して抵抗性を有し、一般に予後不良といわれていた患者に対して、造血幹細胞移植前の処置を徹底して行うことができ、造血幹細胞移植の成功率を上昇させることができる。
【００２５】
なお、本発明における「白血病」とは、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は急性リンパ性白血病等のことをいい、本発明における「白血病細胞」とは、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群若しくは急性リンパ性白血病に罹患している個体内の白血病細胞、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群若しくは急性リンパ性白血病に罹患している個体から採取した細胞、又は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群若しくは急性リンパ性白血病由来の培養細胞等のことをいう。
【００２６】
＝＝ＦＡＳＮ阻害剤＝＝
本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤に含まれるＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖を阻害する目的、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病を治療する目的、又は、造血幹細胞移植の前に行われる移植前処置を行う目的であれば、どのようなものでもよい。
ＦＡＳＮ阻害剤の具体例としては、例えば、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ、ＦＡＳＮ特異的なｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
【００２７】
＝＝本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤の利用＝＝
ＦＡＳＮ阻害剤を有効成分として含有する本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤は、ヒト又はヒト以外の動物における医薬や、実験用の試薬等、どのようなものに用いてもよい。
【００２８】
本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、液剤、散布剤、スプレー剤、塗布剤、貼付剤、噴霧剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの薬剤は、固形、液状、ゲル状、粉末状、ゼリー状、油状、ペースト状、泡状、クリーム状等の形状にしてもよい。
【００２９】
例えば、本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤を医薬として用いる場合、その製剤化は、従来使用されている添加物を用いて、既存の方法で行うことができる。なお、前記添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、溶剤、安定剤、基剤、湿潤剤、保存剤等の既存の添加物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤を医薬として用いる場合は、それらの投与方法としては、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病に罹患したヒト又はヒト以外の動物に、経口投与、腹腔内又は静脈内へ注射又は点滴により非経口投与する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
また、本発明の白血病治療剤及び白血病細胞増殖阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病に罹患したヒト又はヒト以外の動物から白血病細胞を採取し、前記白血病細胞に直接的又は間接的に投与又は添加してもよい。なお、本発明の白血病治療剤又は白血病細胞増殖阻害剤を投与又は添加した後の白血病細胞は、白血病細胞を採取した動物に戻してもよい。
【００３２】
本発明の造血幹細胞移植前処置剤は、造血幹細胞移植の前に行われる移植前処置として使用してもよい。例えば、造血幹細胞移植を必要とする、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病に罹患したヒト又はヒト以外の動物に、本発明の造血幹細胞移植前処置剤を単独で又は以下に記載する第２の造血幹細胞前処置剤と併用して投与してもよい。
【００３３】
本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤を実験用の試薬として用いる場合は、それらの投与方法としては、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病に罹患したヒト以外の動物に、経口投与、腹腔内又は静脈内へ注射又は点滴により非経口投与する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
また、本発明の白血病治療剤及び白血病細胞増殖阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病に罹患したヒト以外の動物から白血病細胞を採取し、前記白血病細胞に直接的又は間接的に投与又は添加してもよい。なお、本発明の白血病治療剤又は白血病細胞増殖阻害剤を投与又は添加した後の白血病細胞は、白血病細胞を採取したヒト以外の動物に戻してもよい。
【００３５】
前記ヒト以外の動物としては、例えば、サル、チンパンジー、イヌ、ウサギ、モルモット、マウス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
さらに、本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤は、第２の白血病治療剤、第２の白血病細胞増殖阻害剤又は第２の造血幹細胞移植前処置剤と併用してもよい。第２の白血病治療剤の具体例としては、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ｄｏｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ又はｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ等が、第２の白血病細胞増殖阻害剤の具体例としては、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｍｅｌｐｈａｌａｎ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はｅｔｏｐｏｓｉｄｅ等が、また、第２の造血幹細胞移植前処置剤の具体例としては、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｂｕｓｕｌｆａｎ、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ又はＶＰ１６等が挙げられる。特に、本発明の白血病治療剤、白血病増殖阻害剤及び造血幹細胞前処置剤は、ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ及びｄｏｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎの少なくとも一方の白血病治療剤と併用することが望ましい。
なお、本発明の白血病治療剤、白血病細胞増殖剤又は造血幹細胞前処置剤と、第２の白血病治療剤、第２の白血病細胞増殖阻害剤又は第２の造血幹細胞前処置剤との併用方法は、特に限定されない。
【００３７】
＝＝白血病治療剤、白血病増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法＝＝
白血病治療剤、白血病増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法には、ヒト又はヒト以外の動物の白血病細胞におけるＦＡＳＮのｍＲＮＡ、タンパク質又は酵素活性を測定する第１の工程と、ＦＡＳＮ阻害剤と前記白血病細胞とを接触させる第２の工程と、第２の工程後の白血病細胞におけるＦＡＳＮのｍＲＮＡ、タンパク質又は酵素活性を測定する第３の工程とを含む。
ＦＡＳＮ阻害剤の具体例としては、例えば、ｏｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ、ＦＡＳＮ特異的なｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
【００３８】
例えば、ヒト又はヒト以外の動物の白血病細胞におけるＦＡＳＮのｍＲＮＡ、タンパク質又は酵素活性を測定し、ＦＡＳＮ阻害剤と前記白血病細胞とを接触させ、前記白血病細胞におけるＦＡＳＮのｍＲＮＡ、タンパク質又は酵素活性が減少した場合、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の治療効果はある、白血病細胞の増殖阻害に効果がある、又は造血幹細胞移植の前処置は有効であると判定することができ、一方、前記白血病細胞におけるＦＡＳＮのｍＲＮＡ、タンパク質又は酵素活性が同一又は増加した場合、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病の治療効果はない、白血病細胞の増殖阻害に効果はない、又は造血幹細胞移植の前処置は有効でないと判定することができる。
【００３９】
ここで、ＦＡＳＮのｍＲＮＡの測定は、ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等の既存の方法により行うことができ、ＦＡＳＮのタンパク質の測定は、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング等の既存の方法により行うことができ、また、ＦＡＳＮの酵素活性の測定は、脂肪酸合成量又はＮＡＤＰＨ消費量を測定する等の既存の方法により行うことができる。特に、本発明の、白血病治療剤、白血病増殖阻害剤及び造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法は、ＦＡＳＮの酵素活性を測定することが好ましい。
【００４０】
本発明の、白血病治療剤、白血病増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法は、本発明の白血病治療剤、本発明の白血病増殖阻害剤又は本発明の造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定してもよいし、本発明以外の白血病治療剤、本発明以外の白血病増殖阻害剤又は本発明以外の造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定してもよい。
【００４１】
本発明の、白血病治療剤、白血病増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤の効果又は有効性を判定する方法を用いれば、白血病の治療効果、白血病細胞の増殖阻害効果、又は造血幹細胞移植の前処置の有効性を効率よく判定することができ、無駄な治療を排除したり、後の治療方針を早急に決定したりすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例及び図を用いてより具体的に説明する。
＜実施例１＞
ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ２ドメインが再播種能に重要であることを調べた。
まず、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型（配列番号１）、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９ＦＧ１ドメイン欠損体（１-１４９アミノ酸欠損体）（配列番号２）及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９ＦＧ１ドメイン欠損体（２２６-４６９アミノ酸欠損体）（配列番号３）（以下、本実施例において、配列番号２及び配列番号３の欠損体を「ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体」ともいう。）のｃＤＮＡをレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３４４０１）に制限酵素を用いて組み込み、各々のレトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング細胞に当業者において公知のリポフェクション法を用いてトランスフェクションした。その後、３７℃、 ５％ ＣＯ２条件下で２４時間培養し、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ (Ｇｉｂｃｏ)に１０％ ＦＣＳを加えた培養液で培地交換し、３２℃、５％ ＣＯ２条件下で培養し、トランスフェクションから４８時間後の培養液の上清をウイルス液とした。
【００４３】
次に、Ｃ５７ＢＬ/６Ｊマウスからシリンジ（２５Ｇ）を用いて骨髄細胞を採取し、前記骨髄細胞から密度遠心分離法で単核球分画を分離し、前記単核球とＣＤ１１７ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ)とを４℃で３０分間反応させ、ＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ (Ｍｉｌｅｔｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ)を用いて未分化な骨髄細胞を精製した。
【００４４】
その後、この骨髄細胞と前記ウイルス液とを混ぜ、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で２４時間ウイルス感染させて、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及び変異体を未分化な骨髄細胞に発現させた。この骨髄細胞をメチルセルロース培地 (Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（Ｍ３２３４； Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ/ｍｌ ＩＬ-３ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ/ｍｌ ＳＣＦ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ/ｍｌ ＧＭ-ＣＳＦ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）)に蒔き、３７℃、５％ ＣＯ２条件下でコロニーを形成させ、播種を繰り返し行い、再播種能を評価した。
【００４５】
その結果を図１に示す。
図１に示すように、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ２ドメインを欠損させると、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９の再播種能が失われた。
この結果から、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ２ドメインがＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９の再播種能に必須であることが明らかとなった。
【００４６】
＜実施例２＞
ＮＵＰ９８融合遺伝子の一部は、図２に記載の通りである。そのうち、本実施例では、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９融合遺伝子を用いた。
【００４７】
本実施例で使用するＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型複合体及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異型複合体を精製し、それぞれに含まれるタンパク質について調べた。
具体的には、ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＣＳを加えた培養液で培養（３７℃、５％ ＣＯ２条件下）した２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、以下、本実施例において同様。）にＦＬＡＧ-ｔａｇ（配列番号４、以下、本実施例において同様。）のついたＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体のｃＤＮＡを挿入したベクター（配列番号５）を当業者において公知のリポフェクション法でトランスフェクションした。これらの細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１％ ＮＰ-４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）にＣｏｍｐｌｅｔｅ （Ｒｏｃｈｅ）を溶かしたもので可溶化した。その可溶画分からＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体を可溶画分の１/２００量のａｎｔｉ-ＦＬＡＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｍ２）-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｂｅａｄｓ （Ｓｉｇｍａ)で精製し、精製物をｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ （Ｗａｋｏ）を用いたＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離後、それぞれのタンパク質複合体に含まれるタンパク質についてマススペクトロメトリー（ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて調べた。
【００４８】
その結果を図３に示す。
その結果、ＦＡＳＮは、再播種能があったＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ１ドメイン欠損体の複合体には含まれるタンパク質として同定されたが、再播種能がないＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ２ドメイン欠損体の複合体には含まれないタンパク質として同定された。
この結果から、ＦＡＳＮはＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９の再播種能に必須なＦＧ２ドメインを介してＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９と複合体を形成することが示唆された。
【００４９】
＜実施例３＞
次に、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９とＦＡＳＮとが結合するかどうかを調べた。
ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＣＳを加えた培養液で培養（３７℃、５％ ＣＯ２条件下）した２９３ＦＴ細胞にＦＬＡＧ-ｔａｇのついたＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体とＨＡ-ｔａｇ（配列番号６、以下、本実施例において同様。）のついたＦＡＳＮ ｃＤＮＡ(ＮＭ＿００４１０４．４)をベクター（配列番号５）に組み込み、それらを当業者において公知のリポフェクション法を用いて共トランスフェクションさせた。これら細胞を実施例２に記載の方法で可溶化した。その可溶画分からＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体を可溶画分の１/２００量のａｎｔｉ-ＦＬＡＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｍ２）-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｂｅａｄｓ（Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫沈降した。免疫沈降物を当業者において公知のウェスタンブロッティング法で解析した。また、抗ＨＡ抗体(３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ)を用いて、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９変異体に結合するＦＡＳＮを検出した。
【００５０】
その結果を図４に示す。
その結果、ＦＡＳＮは、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９野生型及びＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ１ドメイン欠損体には強く結合し、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９のＦＧ２ドメイン欠損体にはほとんど結合しないことが明らかとなった。
この結果から、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９はＦＧ２ドメインを介してＦＡＳＮと結合することで、ＦＡＳＮの機能に影響を及ぼすことが示唆された。
【００５１】
＜実施例４＞
ＦＡＳＮの発現をノックダウンするとＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９を発現している細胞のコロニー形成が抑制されるかどうかを調べた。
まず、ＦＡＳＮ特異的なｓｈＲＮＡをｐＬＫＯ.１ベクターに組み込んだもの (ＴＲＣＮ０００００７５７０３, ＴＲＣＮ００００００７５７０６； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を既存の方法 (Dull T, et al., A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system, 1998 72:8463-8471) にならい、ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＣＳを加えた培養液で培養（３７℃、５％ ＣＯ２条件下）した２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションし、２４時間後、ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）に３０％ ＦＣＳを加えた培養液で培地交換し、トランスフェクションした後４８時間後の上清をレンチウイルス液とした。
【００５２】
実施例１に記載の方法と同様の手法を用いて、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９を発現させ不死化した骨髄細胞と調製したレンチウイルス液とを混ぜ、８μｇ/ｍｌ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを加えて、３２ ℃下１，２００ｘｇで２時間遠心し、細胞にレンチウイルスを感染させた。その細胞をＳｔｅｍＰｒｏ-３４ ＳＦＭ （ＧＩＢＣＯ） に２．５％ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （Ｇｉｂｃｏ)、２ｍＭ Ｌ-ｇｌｕｔａｔａｍｉｎｅ （Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ/ｍｌ ＩＬ-３ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５０ｎｇ/ｍｌ ＳＣＦ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ)、１０ ｎｇ/ｍｌ ＯＳＭ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ)、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ)及び０．１％ ｔｙｌｏｓｉｎ （Ｓｉｇｍａ）を添加した培地で、一晩、３７ ℃、５％ ＣＯ２条件下で培養し、次の日８μｇ/ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で実施例１に記載のメチルセルロース培地を用いてウイルス感染させた細胞を３日間培養した。その後、できたコロニーをＰＢＳを用いてはがしてメチルセルロース培地に再播種し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養することでコロニー形成能を評価した。
【００５３】
また、ＦＡＳＮのｍＲＮＡ発現量については、コロニー形成細胞からＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ)で精製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)でｃＤＮＡに逆転写して、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｓｅｔｓ： Ｆａｓｎ（Ｍｎ００６６２３１９＿ｍ１）とＴｂｐ （Ｍｍ００４４６９７３＿ｍ１)を用いてｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲで評価した。Ｔｂｐの発現量をコントロールとした。タンパク質発現量については、コロニー形成細胞を可溶化し、抗ＦＡＳＮ抗体 (Ｃ２０Ｇ５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ)、抗ｔｕｂｕｌｉｎ抗体 (Ｈ２３５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ)を用いて、当業者において公知のウェスタンブロッティング法で解析した。
【００５４】
その結果を図５に示す。
図５に示すようにＦＡＳＮの発現をノックダウンすると（図５右）、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９を発現させたマウス骨髄細胞のコロニー形成能が阻害される（図５左）ことが明らかとなった。
この結果から、ＦＡＳＮを抑制することはＮＵＰ９８融合遺伝子を有する白血病細胞の増殖阻害につながることが示唆された。
【００５５】
＜実施例５＞
次に、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９がＦＡＳＮの酵素活性を阻害するかどうかを調べた。
２９３ＦＴ細胞にＦＬＡＧ-ｔａｇのついたＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９とＦＬＡＧ-ｔａｇのついたＦＡＳＮをそれぞれ実施例２に記載の方法と同様の手法を用いて発現させ、その細胞の可溶化物からそれぞれのタンパク質を精製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで１００μｌ反応液 (０．２Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ ６．６、１ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ)に精製した３０μｇ ＦＬＡＧ-ＦＡＳＮ、１５マイクロｇ ＦＬＡＧ-ＮＵＰ９８-ＨＯＸＡ９、６ ｎｍｏｌ Ａｃｅｔｙｌ-ＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ）、４８ｎｍｏｌ ＮＡＤＰＨ （Ｓｉｇｍａ）、３０ ｎｍｏｌ Ｍａｌｏｎｙｌ-ＣｏＡ （Ｓｉｇｍａ）を混ぜた。３７℃下でＮＡＤＰＨの消費量を３４０ｎｍの吸光度を測定する (Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ことにより、ＦＡＳＮの酵素活性に与えるＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９の影響を調べた。
【００５６】
その結果を図６に示す。
その結果、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９を加えるとＮＡＤＰＨ消費量が減る、すなわちＦＡＳＮの酵素活性が抑制されることが明らかとなった。
この結果からＮＵＰ９８融合遺伝子を有する白血病細胞ではＦＡＳＮの酵素活性が抑制されていることが予想された。
【００５７】
＜実施例６＞
ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０、及びＣＡＬＭ−ＡＦ１０を発現した細胞においてＯｒｌｉｓｔａｔ、Ｃ７５、ｃｅｒｕｌｅｎｉｎが前記細胞のコロニー形成を阻害するかどうかを調べた。
図７及び図８に示す各種融合遺伝子（ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０、ＡＭＬ１−ＴＭＧ８、ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＯＺ−ＴＩＦ２）を実施例１に記載の方法と同様の手法を用いてマウス骨髄細胞に導入し、メチルセルロース培地に再播種が可能な白血病細胞化した細胞と、未分化な正常マウス骨髄細胞をメチルセルロース培地に蒔き、０μＭ〜３０μＭ Ｏｒｌｉｓｔａｔ （Ｓｉｇｍａ)、０μＭ〜３０μＭ Ｃ７５ （Ｓｉｇｍａ)、及び０μＭ〜３０μＭ ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ （Ｓｉｇｍａ)存在下でのコロニー形成能を調べた。
【００５８】
その結果を図７及び図８に示す。
その結果、ｏｒｌｉｓｔａｔは、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０、及びＣＡＬＭ−ＡＦ１０を発現した細胞において、そのコロニー形成能を強く阻害した。一方、ｏｒｌｉｓｔａｔは、その他の融合遺伝子（ＡＭＬ１−ＴＭＧ８、ＭＬＬ−ＥＮＬ、ＭＯＺ−ＴＩＦ２）によるコロニー形成能及び正常な造血細胞（ｃ-ｋｉｔ陽性細胞）において、そのコロニー形成能をあまり阻害しなかった（図７左）。
また、実施例３に記載の方法と同様の手法を用いてＦＬＡＧ-ｔａｇのついたＣＡＬＭ-ＡＦ１０を２９３ＦＴ細胞に発現させて、ＣＡＬＭ-ＡＦ１０とＦＡＳＮの結合を免疫沈降法で調べた。
その結果、ＣＡＬＭ−ＡＦ１０もＦＡＳＮと結合することが明らかとなった（図７右）。
さらにｏｒｌｉｓｔａｔと同様にＦＡＳＮ阻害剤として知られるＣ７５やｃｅｒｕｌｅｎｉｎも、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０、及びＣＡＬＭ−ＡＦ１０によるコロニー形成能を抑制した（図８）。
【００５９】
これらの結果は、ＦＡＳＮ阻害剤がすべての白血病細胞の増殖を阻害するのではなく、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子又はＡＦ１０融合遺伝子を有する白血病細胞においてのみその増殖を阻害する作用を有し、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子又はＡＦ１０融合遺伝子を有しない白血病細胞や正常な造血細胞においてはその増殖を阻害する作用を有しないことを示した。
【００６０】
これより、ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子、ＣＡＬＭ融合遺伝子及びＡＦ１０融合遺伝子の少なくとも一方の融合遺伝子を有する白血病又は白血病細胞に対する白血病治療剤、白血病細胞増殖阻害剤又は造血幹細胞移植前処置剤等として有用であることが示唆された。
【００６１】
＜実施例７＞
ＮＵＰ９８を有する白血病細胞におけるＦＡＳＮのタンパク質の発現レベルは増加していないことを調べた。
実施例１に記載の方法と同様の手法を用いて、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８−ＤＤＸ１０、ＭＯＺ-ＴＩＦ２で不死化したマウス骨髄細胞及び正常な未分化な骨髄細胞が形成したコロニーを回収し、細胞を可溶化し、実施例４に記載の方法と同様の手法を用いてＦＡＳＮのタンパク質の発現レベルをウェスタンブロッティング法で調べた。
【００６２】
その結果を図９に示す。
ＦＡＳＮ阻害剤は、ＮＵＰ９８融合遺伝子をもつ白血病細胞に有効であったが、図９に示すように、これらの細胞でＦＡＳＮのタンパク質が過剰発現していることはなかった。
この結果から、ＮＵＰ９８融合遺伝子をもつ白血病細胞にＦＡＳＮ阻害剤が有効であったのは、ＦＡＳＮのタンパク質が過剰発現しているからではないことが明らかとなった。実施例５に記載の結果と併せて考えると、低く抑えられているＮＵＰ９８融合遺伝子をもつ白血病細胞のＦＡＳＮの活性をさらにＦＡＳＮ阻害剤で阻害することは、治療に効果的であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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