(57)【要約】【課題】ＳＩ−ＨＤＬの取得方法、ＳＩ−ＨＤＬの評価方法、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法並びに前記化合物を含むＳＩ−ＨＤＬ増加薬及び家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）治療薬の提供。【解決手段】大動脈の腸間膜動脈に接続する箇所の上側と下側を結紮したヒト以外の哺乳動物において、潅流液を、前記哺乳動物の大動脈から腸間膜動脈を経て小腸に潅流し、リンパ管から小腸潅流液を得る工程を有することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの取得方法；取得した小腸由来ＨＤＬを定量または定性分析することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの評価方法；（ａ）ヒト以外の哺乳動物に対して被験化合物投与を行う工程、（ｂ）被験化合物投与動物および対照動物から、それぞれ請求項１または２に記載の方法により小腸由来ＨＤＬを得る工程、（ｃ）得られた小腸由来ＨＤＬを定量する工程、及び（ｄ）被験化合物投与動物の小腸由来ＨＤＬ量と対照動物の小腸由来ＨＤＬ量を比較し、小腸由来ＨＤＬ量を増加させる被験化合物を選択する工程を有するＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法；当該スクリーニング方法で得られたＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含むＳＩ−ＨＤＬ増加薬又は家族性高コレステロール血症治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大動脈の腸間膜動脈に接続する箇所の上側と下側を結紮したヒト以外の哺乳動物において、潅流液を、前記哺乳動物の大動脈から腸間膜動脈を経て小腸に潅流し、リンパ管から小腸潅流液を得る工程を有することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの取得方法。
【請求項２】
ヒト以外の哺乳動物が、大動脈、腎動脈、及び腹腔動脈を結紮されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法で取得した小腸由来ＨＤＬを定量または定性分析することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの評価方法。
【請求項４】
小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ヒト以外の哺乳動物に対して被験化合物投与を行う工程、
（ｂ）被験化合物投与動物および対照動物から、それぞれ請求項１または２に記載の方法により小腸由来ＨＤＬを得る工程、
（ｃ）得られた小腸由来ＨＤＬを定量する工程、及び
（ｄ）被験化合物投与動物の小腸由来ＨＤＬ量と対照動物の小腸由来ＨＤＬ量を比較し、小腸由来ＨＤＬ量を増加させる被験化合物を選択する工程
を有することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項４に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含むことを特徴とする小腸由来ＨＤＬ増加薬。
【請求項６】
小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
2015141137.tif 000013
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載の増加薬。
【請求項７】
小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする請求項６に記載の増加薬。
【請求項８】
請求項４に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含むことを特徴とする家族性高コレステロール血症治療薬。
【請求項９】
小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化２】
2015141137.tif 000014
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする請求項８に記載の治療薬。
【請求項１０】
小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする請求項９に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小腸由来ＨＤＬの取得方法、小腸由来ＨＤＬの評価方法、小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法並びに前記化合物を含む小腸由来ＨＤＬ増加薬及び前記化合物を有効成分とする家族性高コレステロール血症の用治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂質異常症の治療のために、抗動脈硬化作用に着目した治療方法として、ＬＤＬ（low-density lipoprotein）コレステロールを減らす治療方法と、ＨＤＬ（high-density lipoprotein）コレステロールを向上（増大又は増加）させる方法が挙げられる。
【０００３】
脂質の代謝或いは脂質の生化学は非常に複雑であり、脂質異常症の抜本的な治療方法は確立されていないが、ＨＤＬコレステロールを向上させる方法として、抗動脈硬化作用の中でも、コレステロールの逆転送作用に着目して、ＨＤＬコレステロールの増大を目的としたコレステロールエステル転送蛋白（CETP）阻害薬が開発されていた。このようなＣＥＴＰ阻害薬としては、アナセトラピブ（anacetrapib）、ダルセトラピブ（dalcetrapib）、トルセトラピブ（torcetrapib）、エヴァセトラピブ（Evacetrapib）等が知られている（特許文献１、２）。
【０００４】
しかしながら、これらの薬剤では、ＨＤＬ−コレステロールを上げ、ＬＤＬ−コレステロールを下げることはできたが、期待に反して心血管疾患の発生率及び死亡率が増加したことが報告されている（非特許文献１）。そのため、新しい薬剤の開発が望まれていた。
【０００５】
また、ＨＤＬは、肝臓及び小腸で合成されることが知られており、従来ＨＤＬ研究において、小腸由来ＨＤＬの採取方法は麻酔下の動物の腸リンパ管にカニューレを挿管してリンパ液を採取し、液中に存在するＨＤＬを解析する方法が採用されていた。
【０００６】
しかしながら、この方法を用いて、小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法は開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５０６６４６号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１１６９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Barter PJ, et al., The New England Journal of Medicine 2007; Vol.357, No.21:pp.2109-2122
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、小腸由来ＨＤＬ（以下、「ＳＩ−ＨＤＬ」ともいう。）の取得方法及び評価方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物を含むＳＩ−ＨＤＬ増加薬を提供することを目的とする。また、本発明は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物を含む家族性高コレステロール血症治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マウスを用いた実験系によって小腸特異的なＨＤＬを取得できることを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］大動脈の腸間膜動脈に接続する箇所の上側と下側を結紮したヒト以外の哺乳動物において、潅流液を、前記哺乳動物の大動脈から腸間膜動脈を経て小腸に潅流し、リンパ管から小腸潅流液を得る工程を有することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの取得方法。
［２］ヒト以外の哺乳動物が、大動脈、腎動脈、及び腹腔動脈を結紮されていることを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］前記［１］または［２］に記載の方法で取得した小腸由来ＨＤＬを定量または定性分析することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの評価方法。
［４］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ヒト以外の哺乳動物に対して被験化合物投与を行う工程、
（ｂ）被験化合物投与動物および対照動物から、それぞれ請求項１または２に記載の方法により小腸由来ＨＤＬを得る工程、
（ｃ）得られた小腸由来ＨＤＬを定量する工程、及び
（ｄ）被験化合物投与動物の小腸由来ＨＤＬ量と対照動物の小腸由来ＨＤＬ量を比較し、小腸由来ＨＤＬ量を増加させる被験化合物を選択する工程
を有することを特徴とするスクリーニング方法。
［５］前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含むことを特徴とする小腸由来ＨＤＬ増加薬。
［６］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
2015141137.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）で表される化合物であることを特徴とする前記［５］に記載の増加薬。
［７］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［６］に記載の増加薬。
［８］前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含むことを特徴とする家族性高コレステロール血症治療薬。
［９］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化２】
2015141137.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする前記［８］に記載の治療薬。
［１０］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［９］に記載の治療薬。
【００１２】
［１１］前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの家族性高コレステロール血症を治療するための使用。
［１２］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化３】
2015141137.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする前記［１１］に記載の使用。
［１３］前記化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［１２］に記載の使用。
［１４］家族性高コレステロール血症を治療するための医薬を製造するための、前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの使用。
［１５］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化４】
2015141137.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする前記［１４］に記載の使用。
［１６］前記化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［１５］に記載の使用。
［１７］前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを患者に投与する工程を含むことを特徴とする家族性高コレステロール血症を治療する方法。
［１８］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化５】
2015141137.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする前記［１７］に記載の方法。
［１９］前記化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［１８］に記載の方法。
［２０］前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの小腸由来ＨＤＬ及び／又は血漿中のＨＤＬを増加させるための使用。
［２１］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化６】
2015141137.tif 000007
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする前記［２０］に記載の使用。
［２２］前記化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［２１］に記載の使用。
［２３］小腸由来ＨＤＬ及び／又は血漿中のＨＤＬを増加させるための医薬を製造するための、前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの使用。
［２４］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化７】
2015141137.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
で表される化合物であることを特徴とする前記［２３］に記載の使用。
［２５］前記化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［２４］に記載の使用。
［２６］前記［４］に記載のスクリーニング方法で得られた小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを患者に投与する工程を含むことを特徴とする小腸由来ＨＤＬ及び／又は血漿中のＨＤＬを増加させる方法。
［２７］小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物が、下記式（Ｉ）
【化８】
2015141137.tif 000009
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）
表される化合物であることを特徴とする前記［２６］に記載の方法。
［２８］前記化合物が、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールであることを特徴とする前記［２７］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ取得方法は、ＳＩ−ＨＤＬを高収率で取得することができる。取得したＳＩ−ＨＤＬを用いて、ＳＩ−ＨＤＬを種々の方法で評価することができる。また、本発明によって、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加薬は、小腸でのＨＤＬ合成を促進させることができる。さらに、本発明によって、血漿中のＨＤＬ濃度を向上させることができ、家族性高コレステロール血症を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、従来のＳＩ−ＨＤＬの測定方法を表す。
【図２】図２は、本発明のＳＩ−ＨＤＬの測定方法の一態様を表す。
【図３】図３Ａ，Ｂ，Ｃは、本発明のＳＩ−ＨＤＬの測定方法の一態様を表す。Ｄは、潅流時間ごとのＳＩ潅流液のフラクションを表す。
【図４】図４は、ＳＩ潅流液のＦＰＬＣ及びウエスタンブロッティングの結果を示す。Ａ及びＢがＦＰＬＣの結果を示す。Ｃがウエスタンブロッティングの結果を表す。
【図５】図５は、実施例２のＨＤＬの測定結果を表す。
【図６】図６は、実施例３のプロテオーム解析の結果を表す。
【図７】図７は、実施例４の血漿ＨＤＬとＳＩ−ＨＤＬの電子顕微鏡での観察結果を表す。
【図８】図８は、肝臓潅流液を得る方法の概略図を示す。
【図９】図９は、実施例４の電子顕微鏡の観察結果に基づいて、各ＨＤＬの粒子径（長径）のヒストグラムを表す。左がＳＩ−ＨＤＬを表し、中央が肝臓由来ＨＤＬを表し、右が血漿ＨＤＬを表す。
【図１０】図１０は、実施例４のＦＰＬＣの結果に基づいて算出した各ＨＤＬの脂質組成分析の結果を表す。
【図１１】図１１は、実施例４のウエスタンブロッティングの結果を示す。上段がＳＩ潅流液と肝臓潅流液を表し、下段がＦＰＬＣのＨＤＬ部分のみのフラクションを表す。
【図１２】図１２は、実施例５のＳＩ−ＨＤＬの測定結果を表す。各レーンの下の数値は、スカイライトバイオテック社に委託し、ＨＰＬＣ解析して、定量したＨＤＬ−Ｃの値を表す。
【図１３】図１３は、実施例６のＳＩ−ＨＤＬの測定結果を表す。
【図１４】図１４は、実施例７及び８のｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＩ−ＨＤＬの測定結果を表す。
【図１５】図１５は、実施例９のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物のＨＤＬに対する影響を測定した結果を表す。図中、ＹＴ３２はエルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールを表す。
【図１６】図１６は、実施例１０の、潅流液のＡＢＣＡ１の発現量、血漿中の中性脂肪（ＴＧ）の測定結果、及び肝臓の写真を表す。
【図１７】図１７は、実施例１１の血漿中のコレステロールの測定結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のＳＩ−ＨＤＬの取得方法は、大動脈の腸間膜動脈に接続する箇所の上側と下側を結紮したヒト以外の哺乳動物において、潅流液を、前記哺乳動物の大動脈から腸間膜動脈を経て小腸に潅流し、リンパ管から小腸潅流液を得る工程を有することを特徴とする。
【００１６】
従来のＳＩ−ＨＤＬの取得方法（大動脈を結紮しない方法）を図１に示す。図１の従来法では、大動脈中の血液は、門脈６と腸リンパ管７へ流入する。大動脈中の血液には、肝臓由来のＨＤＬが多く含まれることから、従来法で、腸リンパ管７から採取した液には、肝臓由来ＨＤＬが多く含まれる。一方、図２に示す本発明の方法では、腸間膜動脈の分枝部の大動脈の上下を結紮することによって大動脈からの血液の流入を完全に遮断している。従って、腸リンパ管７から採取した潅流液には、小腸由来の成分（ＨＤＬを含む）のみが含まれる。
【００１７】
本発明者らは、以下の知見により上記を確認した。すなわち、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス及びＡＢＣＡ１（ATP-binding cassette transporter-A1）ＫＯマウスから、それぞれ本発明の方法で小腸リンパ潅流液を得、ＨＤＬおよびＡｐｏ ＡＩウエスタンブロットで測定したところ、ＡＢＣＡ１ ＫＯマウスの小腸リンパ潅流液中には、ＨＤＬは存在しなかった（実施例２、図５Ａ参照）。次に、ＡＢＣＡ１ ＫＯマウスを用いて、図２に示すとおり各動脈を結紮した系を組んだうえで、大動脈から野生型マウスの血漿を潅流したところ、腸リンパ管から採取した液中にＨＤＬが多く含まれていた。したがって、このＨＤＬは野生型マウスの血漿中のＨＤＬがリンパ管に流入したものであることがわかった（実施例２、図５Ｂ参照）。すなわち、大動脈を結紮せずに麻酔下のマウスの腸リンパ管にカニューレを挿管してリンパ液を採取する従来の方法（図１）で得られるＨＤＬには、血液中のＨＤＬが大量に含まれることが明らかとなり、従来のＳＩ−ＨＤＬ取得方法はＳＩ−ＨＤＬの取得に適していなかったことが示された。
【００１８】
さらに、本発明者らは、マウス血清のＨＤＬ、本発明の方法で取得したマウス小腸リンパ潅流液のＨＤＬ、従来の方法で取得したマウス小腸リンパ液のＨＤＬ及びマウス肝臓リンパ潅流液のＨＤＬを用いて、プロテオーム解析を行ったところ、本発明の方法で取得したマウス小腸リンパ潅流液のＨＤＬには、ＳＩ−ＨＤＬ特異的ピークが存在すること、従来の方法で取得したマウス小腸リンパ液のＨＤＬの解析結果は、マウス肝臓リンパ潅流液のＨＤＬの解析結果と類似していることを確認した。
以上の知見から、本発明の方法は小腸由来ＨＤＬの取得に適していることが明らかとなり、過去に例のない優れた発明が完成するに至った。
【００１９】
本発明において、ヒト以外の哺乳動物としては、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタ等が挙げられる。また、ヒト以外の哺乳動物には、遺伝子改変動物や、各種疾患モデル動物が含まれる。
【００２０】
本発明において、動脈の結紮は、腸間膜動脈の周囲に行われていればよい。腸間膜動脈としては、上腸間膜動脈、下腸間膜動脈があるが、上腸間膜動脈が好ましい。
【００２１】
腸間膜動脈の周囲の結紮は、例えば、大動脈の上腸間膜動脈が接続する箇所の上側（頭部側）と下側（足側）であればよい。結紮によって、小腸を単離する。また、図２に示されるように、大動脈、腎動脈、及び腹腔動脈を結紮してもよい。大動脈以外に、腹腔動脈及び腎動脈も結紮する場合、大動脈の結紮箇所は、例えば、腎動脈の下部に１箇所、腹腔動脈の上部に１箇所としてもよい。結紮方法は、公知の方法を用いることができる。本工程では、結紮した後、前記モデル動物の小腸において、腹部大動脈、門脈及び小腸リンパ管に潅流液の循環用チューブを挿管し、大動脈から潅流を開始する。腹部大動脈におけるチューブの挿管位置は、結紮した範囲内であれば、特に限定されない。挿管チューブの材質は、特に限定されず、公知のものを使用することができる。
【００２２】
本発明において、腹部大動脈に挿管された給液管に供された潅流液は、腸間膜動脈を経由して小腸を還流し、門脈に挿管された排出管及びリンパ管に挿管された排出管から、排出される。小腸潅流液は、門脈に挿管された排出管及びリンパ管に挿管された排出管の両方から採取してもよく、いずれか一方から採取してもよい。いずれか一方から採取する場合は、リンパ管に挿管された排出管から採取することが好ましい。
【００２３】
潅流液の流速は、特に限定されない。腸間膜動脈への潅流液の流入速度は、例えば、約０．１〜１．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、約０．２〜０．８ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。リンパ管における潅流液の排出速度は、例えば、約１００〜４００μＬ／ｈｒが好ましく、約２００〜２５０μＬ／ｈｒがより好ましい。門脈における潅流液の排出速度は、例えば、約５〜５０ｍＬ／ｈｒが好ましく、約２０〜２５ｍＬ／ｈｒがより好ましい。
【００２４】
本発明における潅流液は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば、イーグルＭＥＭ培地、ダルベッコの改良イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＳＦＭ−１０１培地等の細胞培養用試薬；リンガー液、ハンクス液（Hanks’ Balanced Salt Solution; HBSS）、生理的食塩緩衝液等が挙げられる。これらは、単独又は２種以上を混合して用いてもよい。また、潅流液には、本発明の効果を妨げない限り、必要に応じて、添加剤（例えば、ウシ血清アルブミン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム等）を加えてもよい。
【００２５】
本発明における潅流液は、市販品を用いることができる。ＤＭＥＭ培地としては、特に限定されず、例えば、ナカライテスク社製のＤＭＥＭ培地（DMEM(4.5g/l Glucose) with L-Gln, without Sodium Pyruvate, liquid（製品名、製品番号：08459）、DMEM(4.5g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid（製品名、製品番号：08458）等が挙げられる。前記リンガー液としては、特に限定されず、例えば、乳酸リンガー液（Darrow）、酢酸リンガー液、ブドウ糖加乳酸リンガー液（Butler、Talbot、ソリタ−Ｔ１号、ソリタ−Ｔ２号、ソリタ−Ｔ３号、ソリタ−Ｔ４号）等が挙げられる。他の市販品としては、例えば、ブドウ糖の入っていない製品（ラクテック、ヴィーンＦ等）、酢酸が含まれる製品（フィジオ140、ヴィーンD）、炭酸が含まれる製品（ビカーボン）等が挙げられる。前記ハンクス液としては、特に限定されず、例えば、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まないもの(HBSS(-))と含むもの(HBSS(+))等が挙げられる。前記生理的食塩緩衝液としては、特に限定されず、例えば、生理食塩水溶液（例えば、０．９％生理食塩水溶液等）、ブドウ糖液（例えば、５％ブドウ糖液）、ＳＴ１、ＳＴ３、ＫＮ１Ａ、ＫＮ１Ｂ等が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法により得られる小腸潅流液（以下、「ＳＩ潅流液」ともいう。）には、小腸特異的なＨＤＬ（ＳＩ−ＨＤＬ）が多く含まれ、血清由来のＨＤＬ及び肝臓由来のＨＤＬは、ほとんど混入しないことが確認されている。すなわち、本発明の方法により得られるＳＩ潅流液には実質的に血清由来のＨＤＬ及び肝臓由来のＨＤＬは含まれず、ＳＩ−ＨＤＬのみが含まれると言える。
【００２７】
本発明の他の態様としては、上記本発明の取得方法で取得した小腸由来ＨＤＬを定量または定性分析することを特徴とする小腸由来ＨＤＬの評価方法が挙げられる。小腸由来ＨＤＬを定量分析する方法として、例えば、ＨＤＬの脂質含量測定、アポ蛋白測定などが挙げられる。また、小腸由来ＨＤＬを定性分析する方法として、例えば、含有脂質定性、アポ蛋白の定性などが挙げられる。小腸由来ＨＤＬの評価対象としては、遺伝子改変動物（例えばマウス、ラット、ウサギ等）、自然発症病態モデル動物（例えばマウス、ラット、ウサギ等）などが挙げられる。
【００２８】
本発明の他の態様としては、（ａ）ヒト以外の哺乳動物に対して被験化合物投与を行う工程、（ｂ）被験化合物投与動物および対照動物から、それぞれ請求項１または２に記載の方法によりＳＩ−ＨＤＬを得る工程、（ｃ）得られたＳＩ−ＨＤＬを定量する工程、及び（ｄ）被験化合部Ｔ細胞投与動物のＳＩ−ＨＤＬ量と対照動物のＳＩ−ＨＤＬ量を比較し、ＳＩ−ＨＤＬ量を増加させる被験化合物を選択する工程を有することを特徴とする小腸由来ＨＤＬ増加作用を有する化合物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００２９】
（ａ）工程では、ヒト以外の哺乳動物に対して被験化合物投与を行う。被験化合物投与の時期、期間等は特に限定されず、用いる被験化合物に応じて適宜設定すればよい。好ましくは、哺乳動物に対して、ＳＩ−ＨＤＬを取得する日より数日（少なくとも３日以上、好ましくは５日以上）前から、毎日連続して投与する。被験化合物の投与量は、動物の種類によっても異なり、適宜選択できる。被験化合物の投与から数日（少なくとも３日以上、好ましくは５日以上）後に、被験化合物を投与した動物からＳＩ−ＨＤＬを取得する。
【００３０】
（ｂ）工程では、上記で説明したＳＩ−ＨＤＬの取得方法に従って、被験化合物投与動物および被験化合物投与を行っていない対照動物から、それぞれＳＩ−ＨＤＬを取得する。
【００３１】
（ｃ）工程では、前記（ｂ）工程において得られたそれぞれのＳＩ−ＨＤＬを定量する。ＳＩ−ＨＤＬの定量方法は、特に限定されず、公知のタンパク質の定量方法を用いることができる。このような定量方法としては、例えば、液体クロマトグラフ−質量分析法（Liquid Chromatography / Mass Spectrometry）が挙げられる。公知の装置（例えば、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS：Liquid  Chromatograph  Mass  Spectometry）等）を用いることができる。液体クロマトグラフとしては、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等が挙げられる。
【００３２】
（ｄ）工程では、被験化合物投与動物のＳＩ−ＨＤＬ量と対照動物のＳＩ−ＨＤＬ量を比較し、小腸由来ＨＤＬ量を増加させる被験化合物を選択する。被験化合物投与動物のＳＩ−ＨＤＬ量が対照動物のＳＩ−ＨＤＬ量より多ければ、該被験化合物は、ＳＩ−ＨＤＬの量を増加させる化合物と判断する。
【００３３】
本発明におけるＳＩ−ＨＤＬは、少なくともアポリポ蛋白ＡＩＶ（Apo AIV）を含むＨＤＬである。ＳＩ−ＨＤＬに含まれるアポリポ蛋白ＡＩＶ（Apo AIV）は、例えば、上記のＳＩ−ＨＤＬ定量方法（例えば、ＦＰＬＣを用いた液体クロマトグラフ-質量分析法）で得られるＨＤＬのフラクションについてウエスタンブロッティングを行うことで確認できる。
【００３４】
また、本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含むＳＩ−ＨＤＬ増加薬が挙げられる。ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、特に限定されないが、下記式（Ｉ）
【化９】
2015141137.tif 000010
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、Ｒ３は水素原子又は水酸基であり、----は二重結合又は単結合であることを表す）で表される化合物が好ましい。
【００３５】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加薬は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物を有効成分として含んでいればよく、実質的にＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物のみからなるものであってもよい。
【００３６】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物は、小腸由来ＨＤＬ値を向上させることができる化合物（前記スクリーニング方法において、ＳＩ−ＨＤＬの量を増加させる被験化合物）であれば、特に限定されないが、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（Ｉ）で表される植物ステロール誘導体が好適に挙げられる。前記アルキル基としては、直鎖、分枝状もしくは環状であってよく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、シクロペンチルメチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基が挙げられる。
【００３７】
前記植物ステロール誘導体としては、特に限定されないが、例えば、エルゴステロール（Ergosterol）誘導体、ブラシカステロール（Brassicasterol）誘導体、カンペステロール（Campesterol）誘導体、β−シトステロール（β-Sitosterol）誘導体、スティグマステロール（Stigmasterol）誘導体、ポリフェラスタン（Poriferastane）誘導体等が好ましい。このような化合物のうち、下記式
【化１０】
2015141137.tif 000011
で表されるエルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオール、下記式
【化１１】
2015141137.tif 000012
で表されるエルゴスタン−１α，３β−ジオールがより好ましく、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用が特に優れる点から、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。これらのＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３８】
これらの化合物は、公知の方法で製造することができ、例えば、Tachibana, Y., and Tsuji, M. (1993) in Studies in Natural Products Chemistry(Rahman, A. U., ed) Vol. 11, pp. 379-408, Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdamや特開２００４−３２３３６０号公報等に記載方法で製造することができる。
【００３９】
本発明の式（Ｉ）の化合物のプロドラッグとしては、本発明の式（Ｉ）の化合物のヒドロキシがアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化された化合物（例えば、本発明の式（Ｉ）の化合物のヒドロキシがアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物等）等が挙げられる。これらの化合物は、自体公知の方法によって本発明の式（Ｉ）の化合物から製造することができる。
【００４０】
また、本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含む家族性高コレステロール血症治療薬が挙げられる。ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、特に限定されないが、前記式（Ｉ）で表される化合物が好ましい。
【００４１】
本発明の家族性高コレステロール血症治療薬は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物を有効成分として含んでいればよく、実質的にＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物のみからなるものであってもよい。
【００４２】
本発明の上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを含む薬剤は、家族性高コレステロール血症等の原発性高コレステロール血症及び低ＨＤＬ血症（例えば、HDL値が40(mg/dl)以下）の治療に有効である。前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、上記ＳＩ−ＨＤＬ増加薬と同様に、植物ステロール誘導体が好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオール及びエルゴスタン−１α，３β−ジオールがより好ましく、血中のＨＤＬ濃度上昇作用に優れ、かつ血漿中の中性脂肪の量をほとんど増加させない点から、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００４３】
家族性高コレステロール血症（Familial Hypercholesterolemia:FH）には、ヘテロ接合型とホモ接合型が含まれる。本発明の家族性高コレステロール血症治療薬は、ヘテロ接合型及びホモ接合型のいずれにも有効である。本発明の家族性高コレステロール血症治療薬は、難病指定されている家族性高コレステロール血症（ホモ接合型）に対して治療効果を有する点で、極めて有用である。
【００４４】
本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグは、当該技術分野においてよく知られる１つ又は複数（２つ以上）の薬学的に許容される担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等一般的に用いられる製剤化方法により、ＳＩ−ＨＤＬ増加薬、家族性高コレステロール血症治療薬、低ＨＤＬ血症治療薬、血漿中のＨＤＬ増加薬として、製剤化することができる。
【００４５】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加薬、家族性高コレステロール血症治療薬、低ＨＤＬ血症治療薬、血漿中のＨＤＬ増加薬は、通常、医薬組成物として、全身的又は局所的に、経口又は非経口の形で投与される。
【００４６】
これらを経口投与するためには、本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグを、１つ又は複数（２つ以上）の薬学的に許容される担体とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、顆粒剤、散剤、軟カプセル、硬カプセル等の固形製剤；溶液、懸濁液、注射剤、シロップ等の液状製剤；ゲル、スラリー等半固形製剤等の剤形に製剤化することができる。
【００４７】
これらを非経口で投与するためには、本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグを、１つ又は複数（２つ以上）の薬学的に許容される担体とともに、注射用溶液、懸濁液、乳化剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグを水性溶液、好ましくはハンクス液（Hanks’ Balanced Salt Solution; HBSS）、リンガー(Ringer)液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、前記医薬組成物は、油性又は水性のビヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。或いは、組成物を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグを粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。座剤処方は、本発明の式（Ｉ）の化合物をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグは、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００４８】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加薬、家族性高コレステロール血症治療薬、低ＨＤＬ血症治療薬、血漿中のＨＤＬ増加薬の投与対象としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ等）が挙げられる。
【００４９】
本発明に用いる「薬学的に許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤又は半固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等が挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して用いてもよい。これらの含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されない。
【００５０】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００５１】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加薬、家族性高コレステロール血症治療薬、低ＨＤＬ血症治療薬、血漿中のＨＤＬ増加薬において、本発明の式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグの単位製剤あたりの含有量は、製剤の形態によって相違するため、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常製剤全体に対して約０．０１〜１００重量％であり、好ましくは約０．１〜５０重量％であり、さらに好ましくは約０．５〜２０重量％である。
【００５２】
本発明のＳＩ−ＨＤＬ増加薬及び家族性高コレステロール血症治療薬の投与量及び投与回数は、剤形、投与経路及び投与対象（例えば、ヒトの患者）の症状、年齢、体重によって異なり限定されない。投与量は、例えば、式（Ｉ）の化合物又はそのプロドラッグを、１日あたり体重１ｋｇあたり、通常約０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であり、好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜８０ｍｇの範囲である。投与回数は、例えば、１日に１回〜数回（２回又は３回以上）投与することができる。また、注射剤として使用する場合、例えば、静脈への単回投与（１回から数回（２回又は３回以上））であってもよく、静脈への持続投与で行ってもよい。
【００５３】
本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの家族性高コレステロール血症を治療するための使用が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。これらの化合物を使用することにより、家族性高コレステロール血症を治療することができる。
【００５４】
本発明の他の態様としては、家族性高コレステロール血症を治療するための医薬を製造するための、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの使用が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００５５】
本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを患者に投与する工程を含むことを特徴とする家族性高コレステロール血症を治療する方法が挙げられる。投与工程は、上記のＳＩ−ＨＤＬ増加薬及び家族性高コレステロール血症治療薬と同様である。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００５６】
本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグのＳＩ−ＨＤＬを増加させるための使用が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００５７】
本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの血漿中のＨＤＬを増加させるための使用が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００５８】
本発明の他の態様としては、ＳＩ−ＨＤＬを増加させるための医薬を製造するための、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの使用が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００５９】
本発明の他の態様としては、血漿中のＨＤＬを増加させるための医薬を製造するための、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグの使用が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００６０】
本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを患者に投与する工程を含むことを特徴とするＳＩ−ＨＤＬを増加させる方法が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００６１】
本発明の他の態様としては、上記スクリーニング方法で得られるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグを患者に投与する工程を含むことを特徴とする血漿中のＨＤＬ−Ｃを増加させる方法が挙げられる。上述のように、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物としては、前記式（Ｉ）で表されるＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物又はそのプロドラッグが好ましく、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが特に好ましい。
【００６２】
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
【実施例】
【００６３】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
【００６４】
［実施例１］
＜ＳＩ潅流液の取得＞
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（６〜１２週齢、雄性、日本エスエルシー社）を材料に用いた。飼育には個別金属ケージを使用し、室温２２±２℃、明暗調節下（明期：7：00〜19：00）の動物飼育室で行った。飲料水には水道水を用いた。ＡＩＮ−９３Ｍ（標準食餌、オリエンタル酵母工業社製）を飼料として、離乳直後からアドリブ（自由摂食）とした。なお、実験動物の飼育・管理は、「大阪大学動物実験規定」と「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準（平成18年４月28日，環境省告示第88号）」に従って実施した。
前記マウスにおいて、大動脈の腹腔動脈より上部と腎動脈より下部で結紮し、大動脈に接続する腹腔動脈及び腎動脈も図２に示されるように結紮した。その後、図３Ａ〜Ｃに示されるように、腹部大動脈、門脈及び小腸リンパ管に潅流液の循環用チューブを挿管した。次いで、ＤＭＥＭ培地（製品名；DMEM(4.5g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid、製品番号：08458、ナカライテスク社製）５００ｍｌにウシ血清由来アルブミン（BSA、製品番号：A6003、シグマ−アルドリッチ社製）０．１５ｇを添加して潅流液を調製した。得られた潅流液を、大動脈から前記マウスの小腸に潅流し、リンパ管からＳＩ潅流液を得た。腸間膜動脈への潅流液の流入速度は、０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。門脈からの潅流液の排出速度は、２０〜２５ｍＬ／ｈｒであった。リンパ管からの潅流液の排出速度は、２００〜２５０μＬ／ｈｒであった。図３Ｄに示されるように、潅流時間に応じてフラクション１〜９を得た。
【００６５】
＜ＳＩ−ＨＤＬの定量＞
得られたＳＩ潅流液を、ＦＰＬＣ及びウエスタンブロッティングで測定した。測定結果を図４に示す。図４Ａ及びＢがＦＰＬＣの結果を示し、図４Ｃがウエスタンブロッティングの結果を示す。図４Ｂに示されるように、ＨＤＬが検出された。
【００６６】
肝臓では、アポリポ蛋白B-100(Apo B100)及びアポリポ蛋白B-48(Apo B48)が生成されるが、小腸では、アポリポ蛋白B-48(Apo B48)のみが生成される。図６ＣのＳＩ潅流液のＨＤＬのウエスタンブロッティングの結果（右端）では、肝臓由来のApo B100が見られず、Apo B48のみが観察されたため、ＳＩ潅流液で得られたＨＤＬは、小腸特異的なＨＤＬ（ＳＩ−ＨＤＬ）であり、肝臓由来のＨＤＬは混入してないことが確認された。すなわち、本発明によって、ＳＩ−ＨＤＬを取得できることが明らかとなった。
【００６７】
［実施例２］
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス及びＡＢＣＡ１（ATP-binding cassette ttransporter-A1）ＫＯマウスから、それぞれ実施例１の方法で小腸リンパ潅流液を得た。各潅流液中のＨＤＬおよびＡｐｏ ＡＩをウエスタンブロットで測定した。
また、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスから採取した血液から血漿を得、潅流液に代えて当該血漿を、実施例１と同様に動脈を結紮したＡＢＣＡ１ ＫＯマウスの大動脈から注入して、小腸リンパ管および門脈からそれぞれ潅流した血漿を回収した。小腸リンパ管から回収した潅流液、門脈から回収した潅流液及び動脈から注入した血漿について、ＨＤＬおよびＡｐｏ Ｂをウエスタンブロットで測定した。
【００６８】
結果を図５に示す。図５ＡからＡＢＣＡ１ ＫＯマウスの小腸リンパ潅流液中には、Ａｐｏ ＡＩは存在するが、ＨＤＬは存在しないことがわかる。一方、図５Ｂから、野生型マウスの血漿を潅流した場合には、小腸リンパ管から回収した潅流液中にＨＤＬが検出されたことから、このＨＤＬは野生型マウスの血漿中のＨＤＬであることがわかる。この結果から、従来のＳＩ−ＨＤＬ取得方法、すなわち、大動脈を結紮せずに麻酔下のマウスの腸リンパ管にカニューレを挿管してリンパ液を採取する方法で得られるＨＤＬには、血液中のＨＤＬが大量に含まれることが明らかとなった。したがって、従来のＳＩ−ＨＤＬ取得方法はＳＩ−ＨＤＬの取得に適していなかったことが示された。
【００６９】
［実施例３］
マウス血清のＨＤＬ、実施例１のマウス小腸リンパ潅流液のＨＤＬ、マウス小腸リンパ液のＨＤＬ（従来の方法；麻酔下のマウスの腸リンパ管にカニューレを挿管してリンパ液を採取）及びマウス肝臓リンパ潅流液のＨＤＬを用いて、プロテオーム解析を行った。具体的には、マウス血清、実施例１のマウス小腸リンパ潅流液、マウス小腸リンパ液及びマウス肝臓リンパ潅流液から、超遠心分離機を用いて、ＨＤＬ（比重：1.063-1.210 g/mL）を分離して、マウス血清のＨＤＬ、実施例１のマウス小腸リンパ潅流液のＨＤＬ、マウス小腸リンパ液のＨＤＬ（従来の方法）及びマウス肝臓リンパ潅流液のＨＤＬのサンプルについて、トリプシン処理した後、脱塩カラムで脱塩処理した。次いで、各サンプルについて、質量分析機器（製品名：QSTAR Elite、ABSciex社製）で測定を行った。
【００７０】
結果を図６に示す。図６から、ＳＩ−ＨＤＬ特異的ピーク（図６右上の矢印）が血清中にも存在することが確認された。また、図６左下図及び図６右下図を比べると、従来のＳＩ−ＨＤＬの測定方法で得られる腸リンパ液には、小腸由来以外の体循環からのＨＤＬ（特に肝臓由来ＨＤＬ）が混入していることが明らかである。
【００７１】
［実施例４］
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（６〜１２週齢、雄性、日本エスエルシー社）から採取した血液から得られた血漿と、上記実施例１で得られたＳＩ潅流液のそれぞれについて、超遠心分離機（Optima MAX-XP（商品名、ベックマン・コールター社製）、TLA 120.2 rotor （商品名、ベックマン・コールター社製））を用いて、ＨＤＬ（比重：1.063-1.210 g/mL）を分離して、電子顕微鏡で観察した。結果を図７に示す。また、肝臓由来ＨＤＬについては、図８に示すような公知の方法で肝臓潅流液を得て、該肝臓潅流液について、超遠心分離機を用いて、ＨＤＬ（比重：1.063-1.210 g/mL）を分離して、電子顕微鏡で観察した。前記肝臓潅流液は、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（６週齢、雄性、日本エスエルシー社）を用いて、Sugano Tら、J Biochem, 1978、83、995-1007又は昭和医学会雑誌１９８３年第４３巻第３号第３８９−３９６頁の第３９０頁記載のFig.1に記載の方法で得た。
各ＨＤＬについて、電子顕微鏡を用いて観察視野中の約２００個のＨＤＬ粒子の長径を測定し、ヒストグラムを作成した。結果を図９に示す。図９の結果から、ＳＩ−ＨＤＬは、肝臓由来ＨＤＬ（Ｌ−ＨＤＬ）及び血漿ＨＤＬに比べて小さいことが明らかとなった。
【００７２】
ＳＩ−ＨＤＬ、肝臓由来ＨＤＬ及び血漿ＨＤＬについて、ＦＰＬＣを行った。ＦＰＬＣの結果から脂質組成を分析した結果を図１０に示す。図中、ＴＧは中性脂肪を表し、ＦＣは遊離型コレステロールを表し、ＣＥはコレステロールエステルを表し、ＰＬはリン脂質を表す。また、「SI-HDL fasting」は、実施例１の結紮前のマウスを２４時間絶食状態にしたマウスを使用して得られたＳＩ潅流液を用いたことを表し、「SI-HDL Ad lib」は、自由給餌であったマウスを使用して得られたＳＩ潅流液を用いたことを表す。
図１０から、肝臓由来ＨＤＬ及び血漿ＨＤＬに比べて、ＳＩ−ＨＤＬの脂質組成は、ＴＧ含量が多い（約２０％以上）ことが明らかとなった。
【００７３】
また、実施例１のＳＩ潅流液と、上記のようにして得た肝臓潅流液とをウエスタンブロッティングで比較した。結果を図１１上段に示す。図１１上段の結果から、ＳＩ潅流液は、アポリポ蛋白ＡＩＶ（Apo AIV）を含むことが確認された。さらに、ＦＰＬＣでＨＤＬを含むフラクションについて、さらにウエスタンブロッティングを行った。結果を図１１下段に示す。図１１下段の結果から、ＳＩ−ＨＤＬは、アポリポ蛋白ＡＩＶ（Apo AIV）を含むことが確認された。
【００７４】
［実施例５］
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（６〜１２週齢、雄性、日本エスエルシー社）及びＡｐｏＥ  ＫＯマウス（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ、６〜１２週齢、雄性、日本エスエルシー社）を用いて、ＳＩ−ＨＤＬを測定した。前記Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスは、高脂肪食群（ｎ＝３）とコントロール群（ｎ＝３）に分けた。前記高脂肪食群には、離乳直後からＡＩＮ−９３Ｍ（標準食餌、オリエンタル酵母工業社製）を自由摂食させたのち、ＨＦＤ−６０（商品名、カロリー比で脂肪分６０％、オリエンタル酵母工業社製）を１０週目から４週間、自由摂食させた。前記コントロール群は、離乳直後からＡＩＮ−９３Ｍ（標準食餌、オリエンタル酵母工業社製）を自由摂食させた。前記コントロール群は、２４時間絶食させた群と自由給餌群に分けた。ＡｐｏＥ  ＫＯマウスには、ＡＩＮ−９３Ｍ（標準食餌、オリエンタル酵母工業社製）を離乳直後から自由摂食させた。
実施例１のマウスを、前記マウスに変更した以外は、実施例１と同様にして、ＳＩ潅流液を得た。得られたＳＩ潅流液中のＨＤＬをウエスタンブロットで測定した。結果を図１２に示す。２４時間絶食させたマウス及びＡｐｏＥ  ＫＯマウスでは、ＳＩ−ＨＤＬが検出されなかった（図１２左端図及び右端図）。
【００７５】
［実施例６］
実施例１において、マウスを、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（６〜１２週齢、雄性、日本エスエルシー社）に加えて、ＬＤＬ受容体（以下、「ＬＤＬＲ」ともいう。）ＫＯマウス（米国ジャクソン研究所）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＳＩ潅流液を得た。得られたＳＩ潅流液中のＨＤＬおよびＡｐｏ ＡＩをウエスタンブロットで測定した。結果を図１３右に示す。図中、ＬＤＬＲ  ＫＯマウスはＬＤＬ受容体ＫＯマウスを表す。本発明の測定方法を用いた図１３右から、ＬＤＬＲ  ＫＯマウスでは、小腸において、ほとんどＨＤＬが産生されないことが明らかとなった。
上記と同様の２種のマウスから得た血漿及び従来法（腸リンパに針を刺して液を採取する方法）で得たリンパ液では、図１３左に示すように、ＬＤＬＲ  ＫＯマウスでもＨＤＬが産生されているように観察された。
よって、本発明の測定方法で、小腸由来ＨＤＬを正確に測定できることが確認された。
【００７６】
［実施例７］
＜ＳＩ潅流液の取得＞
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（６〜１２週齢、雄性、日本エスエルシー社）を実施例１と同様に飼育した後、被験化合物投与群には、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールを、２５０ｍｇ／ｋｇで５日連続強制経口投与した。５日目の投与をした次の日、実施例１と同様にして、マウスを結紮した。被験化合物非投与群は、被験化合物投与群の化合物投与前と同様に、飼育を続け、被験化合物投与群と同日に実施例１と同様にして、マウスを結紮した。次に、ＤＭＥＭ培地（製品名；DMEM(4.5g/l Glucose) with L-Gln, without Sodium Pyruvate, liquid、製品番号：08459、ナカライテスク社製）５００ｍｌにＬ−グルタミン（製品番号：16919-84、ナカライテスク社製）２９２ｍｇ、ピルビン酸ナトリウム（製品番号：29806-54、ナカライテスク社製）５５ｍｇ及びウシ血清由来アルブミン（BSA、製品番号：A6003、シグマ−アルドリッチ社製）０．１５ｇを添加して潅流液を調製した。得られた潅流液を、被験化合物投与群及び被験化合物非投与群のマウスに対して、大動脈から前記マウスの小腸に潅流し、リンパ管からＳＩ潅流液を得た。腸間膜動脈への潅流液の流入速度は、０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。門脈からの流液の排出速度は、２０〜２５ｍＬ／ｈｒであった。リンパ管からの潅流液の排出速度は、２００〜２５０μＬ／ｈｒであった。
【００７７】
＜ＳＩ−ＨＤＬの定量＞
得られたＳＩ潅流液を、ＦＰＬＣで測定した。測定結果を図１４に示す。
【００７８】
＜ＳＩ−ＨＤＬの比較工程＞
図１４の左図のコントロール（被験化合物非投与群）及び中央のエルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオール投与群（被験化合物投与群）を比較すると、中央の矢印の部分に示されるように、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールの投与によって、ＳＩ−ＨＤＬの量を増加させたことが明らかとなった。
【００７９】
［実施例８］
エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールの代わりに、Ｔ０９０１３１７（Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−［４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル］−ベンゼンスルホンアミド、ＣＡＳ＃［２９３７５４−５５−９］；ＷＯ００／５４７５９）を１０ｍｇ／ｋｇで５日連続強制経口投与した以外は、実施例４と同様にして、Ｔ０９０１３１７もＳＩ−ＨＤＬの量を増加させたことが明らかとなった（図１４左端図及び右端図参照）。
【００８０】
上記結果から、本発明のスクリーニング方法は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物を取得できることが確認できた。また、図１４から、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオール及びＴ０９０１３１７は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物であることが確認できた。
【００８１】
［実施例９］
ＬＤＬ受容体欠損型のヒト結腸癌由来細胞株Ｃａｃｏ−２（RIKEN CELL BANK、理研バイオリソースセンター）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールの影響を評価した。Ｃａｃｏ−２細胞の培養方法は、Ohama T, Hirano K, et al.  Biochem Biophys Res Commun 2002: 296; 625-630.に記載の方法を用いた。具体的には、前記Ｃａｃｏ−２細胞を、ＭＥＭ（２０％ＦＣＳ）培地に播種し、標準プロトコールで培養したのち、０．４μｍの孔を有する直径２４ｍｍのポリカーボネートTranswellフィルター(Corning Costar, Cambride, MA)に、細胞密度  250,000 cells/cm2で播種し、培養した。前記フィルターに播種した際に、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールを１０μＭ添加し、４８時間培養したのち、ＦＰＬＣでＨＤＬを測定した。コントロールとして、前記化合物を加えない以外は、同様に培養した培養液についても、ＦＰＬＣでＨＤＬを測定した。結果を図１５Ｂに示す。また、ＡＢＣＡ１の発現についても評価した。結果を図１５Ａに示す。図中、LPDSはリポ蛋白質除去血清を表す。さらに、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールの代わりに、Ｔ０９０１３１７を１００ｎＭ添加して、Ｔ０９０１３１７の、ＡＢＣＡ１の発現についても評価した。結果を図１５Ａに示す。
【００８２】
図１５右に示されるように、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールを用いると、ＨＤＬが増加することが確認された。
【００８３】
［実施例１０］
ＡＩＮ−９３Ｍ（標準食餌、オリエンタル酵母工業社製）を自由摂食させたＬＤＬ受容体ＫＯマウス（米国ジャクソン研究所製）に、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールを２５０ｍｇ／ｋｇ又はＴ０９０１３１７を１０ｍｇ／ｋｇをPolyethylene glycol/Tween 80 (4: 1)に溶解して、５日間連続経口投与した。Polyethylene glycol/Tween 80 (4: 1)のみを投与したものをコントロール（図１６中、Vehicle）とした。前記連続投与後、実施例１と同様にマウスを結紮し、ＳＩ潅流液を得た。また、前記連続投与後、実施例４と同様に、肝臓潅流液を得た。肝臓及び小腸におけるＡＢＣＡ１の発現量を、肝臓潅流液及びＳＩ潅流液を用いて測定した。結果を図１６Ａに示す。また、前記連続投与後、マウスから血液を採取し、各化合物を投与した場合の血漿中の中性脂肪量を測定した。結果を図１６Ｂに示す。さらに、潅流液を得たのち、マウスの肝臓を摘出した。図１６Ｃに摘出した肝臓の写真を示す。Ｔ０９０１３１７を投与した肝臓は脂肪肝となっていた。
【００８４】
この結果から、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールは、血漿中の中性脂肪量を増加させるという副作用がほとんどないことが明らかになった。
【００８５】
［実施例１１］
ＬＤＬ受容体ＫＯマウスに対する、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオール（ＹＴ３２）とＴ０９０１３１７の血漿中のＨＤＬに対する効果を測定した。ＡＩＮ−９３Ｍ（標準食餌、オリエンタル酵母工業社製）を自由摂食させたＬＤＬ受容体ＫＯマウス（米国ジャクソン研究所製）に、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールを２５０ｍｇ／ｋｇ又はＴ０９０１３１７を１０ｍｇ／ｋｇを Polyethylene glycol/Tween 80 (4: 1)に溶解して、５日間連続経口投与した。Polyethylene glycol/Tween 80 (4: 1)のみを投与したものをコントロール（図１７中、Vehicle）とした。前記化合物の投与後、マウスから血液を採取し、ＨＰＬＣで分画して、酵素法（遊離型コレステロールが、コレステロールオキシダーゼ(COD)によって酸化分解されてＨ２Ｏ２を生成し、生成したＨ２Ｏ２にペルオキシダーゼ(POD)が作用すると、４−アミノアンチピリン(4-AA)とＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(HDAOS)を酸化縮合するため、生じるキノン色素を比色測定(505nm)する。）でコレステロールを定量した。コレステロールの測定は、スカイライトバイオテックに委託した。結果を図１７Ａ及びＢに示す。
【００８６】
図１７Ａ中、ＴＣは総コレステロール量を表し、Ｎｏｎ  ＨＤＬ−Ｃは、ＨＤＬ−Ｃ以外のコレステロール（例えば、カイロミクロン、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ等）を表す。図１７Ａから、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールは、ＨＤＬを増加させるが、ＨＤＬ−Ｃ以外は上昇させないことが明らかになった。図１７Ｂは、図１７ＡのＨＤＬ−Ｃの拡大図である。
【００８７】
図１７Ｂから、エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールが血漿ＨＤＬ量を十分に上昇させることが明らかとなった。上記のように、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）では、ＬＤＬ受容体活性が正常の２０％以下であり、ＬＤＬ受容体ＫＯマウスは、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）モデルマウスである。エルゴスタ−２２−エン−１α，３β−ジオールは、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）で起こるＨＤＬ量の減少に対して、血漿ＨＤＬ量を向上させることができ、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）に対する治療効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、ＳＩ−ＨＤＬの取得方法及び評価方法として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、ＳＩ−ＨＤＬ増加作用を有する化合物を取得するのに有用である。さらに、本発明は、ＳＩ−ＨＤＬ増加薬及び家族性高コレステロール血症治療薬として有用である。
【符号の説明】
【００８９】
１    大動脈
２    腹腔動脈
３    腸間膜動脈
４    腎動脈
５    小腸
６    門脈
７    リンパ管
８    結紮
９    門脈からの排出管
１０  大動脈への流入管
１１  リンパ管からの排出管
【図１】
2015141137.tif 000015
【図２】
2015141137.tif 000016
【図３】
2015141137.tif 000017
【図４】
2015141137.tif 000018
【図５】
2015141137.tif 000019
【図６】
2015141137.tif 000020
【図７】
2015141137.tif 000021
【図８】
2015141137.tif 000022
【図９】
2015141137.tif 000023
【図１０】
2015141137.tif 000024
【図１１】
2015141137.tif 000025
【図１２】
2015141137.tif 000026
【図１３】
2015141137.tif 000027
【図１４】
2015141137.tif 000028
【図１５】
2015141137.tif 000029
【図１６】
2015141137.tif 000030
【図１７】
2015141137.tif 000031