(57)【要約】【課題】本発明は、哺乳動物卵細胞抽出液による無細胞細再構成系を用いた、クロマチンの前核への誘導方法を提供する。【解決手段】  本発明は、  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、クロマチンから前核を誘導する方法である。（ａ）クロマチンと、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中のクロマチンが前核に分化したかどうかを確認する第３工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、クロマチンから前核を誘導する方法。
（ａ）クロマチンと、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、
（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、
（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中のクロマチンが前核に分化したかどうかを確認する第３工程
【請求項２】
前記クロマチンが精子核クロマチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む哺乳動物由来の精子の受精能力を調べる方法。
（ａ）精子細胞膜を透過化した精子と、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、
（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、
（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中の精子が前核に分化したかどうかを確認する第３工程
【請求項４】
前記第１工程及び／又は第２工程のインキュベート時間が０〜９０分間であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
卵抽出液を調製するための器具を含む、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物由来の卵抽出液を用いた無細胞再構築系に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物における受精の過程は、精子と卵細胞の接触に始まり、雌雄両前核の融合によって完了する。この過程において、精子核クロマチンはプロタミンによって高度に凝縮された状態から、プロタミンが卵細胞由来のヒストンに置き換わり、その後、様々なタンパク質や転写因子がゲノムに結合し、精子核クロマチンの大規模な再構築が行われる。
これまでに、このような受精後の精子核クロマチンの再構築を試験管内で再現する方法として、アフリカツメガエル卵から調製した卵抽出液を用いた、無細胞系を利用する技術が開発されている。このような無細胞系は、精子核クロマチンの構造変化とその調節機構の解明を行う上で、学術研究上、非常に有用なツールとして利用されてきたが、学術的利用以外にも、家畜の精子の受精能力の判定、あるいは、所望のクロマチンDNAを含む人工細胞の開発などの産業的な利用にも期待がもたれている。
【０００３】
しかしながら、現在までのところ、哺乳動物においては、このような無細胞系は開発されていない。また、カエルなどの両生類と哺乳類（哺乳動物）とでは、クロマチンの高次構造が異なっており、哺乳動物における精子核クロマチンのリモデリング機構を詳しく解析するには、哺乳動物の卵抽出液を使用した無細胞系を構築する必要がある。
これまでに、本願の発明者らは、機能的なマウス卵抽出液を作成するには卵細胞を賦活化（活性化）する必要があること、遠心分離によって得られた卵抽出液は精子核クロマチン再構築の初期過程に関与する透明画分と核膜形成に関与する不透明画分に分けられることを明らかにし、精子核を透明画分で処理した後に不透明画分で追加処理(第２処理)することで、膨大化した前核まで誘導できること、透明画分で処理する際に、不透明画分を加えると精子核の形態変化が誘導されないことを報告してきた（非特許文献１〜３）。
【０００４】
上述のように、発明者らが報告してきた方法により、哺乳動物由来の卵無細胞抽出液を用いて、in vitroにて、精子核クロマチンを前核へ誘導することが可能であることが明らかとなった。
しかしながら、前核までの誘導率があまり高くなく、家畜の精子の機能を評価など実用化には、より高い効率で前核まで誘導し得る方法を開発する必要があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Inoueら, J Mamm Ova Res, 28:S28, 2011.
【非特許文献２】Inoueら, J Reprod Dev, 58 Suppl:j195, 2011.
【非特許文献３】Inoueら, J Mamm Ova Res, 29:S58, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、哺乳動物の卵抽出液を用いて、クロマチン、例えば、精子核クロマチンから効率的に前核にまで誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
マウスから得た未受精卵の透明体を除去し、賦活化処理した後、卵を粉砕し、遠心分離（遠心分離；3,800 g、20分、4℃)すると、脂肪層の次の層に透明画分、その下層に不透明画分、最下層に雌染色体を含む画分に分離される。発明者らは、膜を透過化した精子核を透明画分で処理した後、第２処理として、透明画分及び不透明画分で処理を行ったところ、約50%程度の精子核が前核にまで誘導されることを確認していた。
しかし、精子の受精能力の判定等を行うためには、より効率的に雄性前核（精子前核）を誘導する方法が必要であった。
そこで、発明者らは、第３処理として、さらに、不透明画分、又は、不透明画分及び透明画分の混合物を、第２処理後の試料に添加したところ、前核の誘導率は、約60%程度にまで上昇することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）である。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、クロマチンから前核を誘導する方法。
（ａ）クロマチンと、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、
（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、
（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中のクロマチンが前核に分化したかどうかを確認する第３工程
（２）前記クロマチンが精子核クロマチンであることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む哺乳動物由来の精子の受精能力を調べる方法。
（ａ）精子細胞膜を透過化した精子と、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、
（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、
（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中の精子が前核に分化したかどうかを確認する第３工程
（４）前記第１工程及び／又は第２工程のインキュベート時間が０〜９０分間であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（５）卵抽出液を調製するための器具を含む、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、クロマチン、例えば、精子核のクロマチンから前核を効率的に誘導することが可能となった。その結果、例えば、家畜等の精子の受精能力を予め調べることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法を説明した図である。哺乳動物としてマウスを例にとり、卵抽出液及び精子核クロマチンの準備の流れ、卵抽出液を用いて精子核クロマチンを前核に誘導する工程を示す。
【図２】マウス由来の精子のマウス受精卵中における分化の過程と、精子核クロマチン（尾部を除去し精子細胞膜を透過化した精子）に対して本発明の処理を行った場合の精子核クロマチンの分化の過程を模式的に示した図である。
【図３】第２工程まで行った場合の精子核クロマチンの分化の過程を観察した結果を示す。ａには、第２工程までの処理の流れを模式的に示した。ｂは、第２工程までの処理を行った場合の精子核クロマチンの分化の各過程（脱凝縮、核膜前駆小胞のクロマチン表面への集合、核膜前駆小胞同士の融合、前核の形成及び前核の膨大化）の誘導率を示した。
【図４】第３工程まで行った場合の精子核クロマチンの分化の過程を観察した結果を示す。ａには、第３工程までの処理の流れを模式的に示した。ｂは、第２工程までの処理を行った場合の精子核クロマチンの分化の各過程（脱凝縮、核膜前駆小胞のクロマチン表面への集合、核膜前駆小胞同士の融合、前核の形成及び前核の膨大化）の誘導率を示した。
【図５】本発明の方法によって形成された前核について、その構造的な特徴を検討した結果である。ａは、本発明の方法によって誘導した雄性前核の顕微鏡写真である。ｂは、テキサスレッドコンジュゲートの分子量70,000と分子量10,000のデキストランが前核に入るかどうか検討した結果である。ｃは、前核をヘキスト33342（DNA）、抗ラミンA/C抗体（ラミンA/C）及び抗ヌクレオポリン抗体（mAb414）で染色した結果である。スケールバーは20μm。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、第１の形態は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、クロマチンから前核を誘導する方法である。
（ａ）クロマチンと、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、
（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、
（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中のクロマチンが前核に分化したかどうかを確認する第３工程
【００１２】
本発明の方法の概要を図１に示す。本発明においては、クロマチンと哺乳動物由来の未受精卵を準備する。ここで、哺乳動物とは、特に限定はされず、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギなど実験に用いられる動物の他、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜動物、その他、イヌ、ネコ、霊長類、ヒトなど、あらゆる哺乳動物を包含する概念である。
また、クロマチンとは、真核細胞内に存在するDNAとタンパク質との複合体のことである。クロマチンは、通常、ヒストンなどの塩基性タンパク質にDNAが巻き付いたヌクレオソーム構造をとっているが、精子核のクロマチンは、ヒストンではなくプロタミンとDNAからなる。本明細書中で言及されるクロマチンは、そのDNAは染色体DNAに限定されず任意のDNAが含まれていてもよく、また、クロマチンを構成するタンパク質は、ヒストン、プロタミンの他、他の塩基性タンパク質であって、ヌクレオソーム構造を構築するタンパク質であれば、特に限定されない。
本発明に使用するクロマチンとしては、例えば、精子細胞膜を透過化した精子核クロマチンなどを挙げることができる。
【００１３】
また、本発明は、クロマチンを前核にまで誘導する方法である。前核は、受精に際し、雄由来の染色体と雌由来の染色体が合一する前段階の核のことで、例えば、精子由来の前核を雄性前核、卵細胞由来の前核を雌性前核と称する。前核は、通常、一倍体核である。ただし、まれに雌雄の染色体が核膜形成前に非常に接近してしまうと、両者を含む２倍の前核ができ、これも前核と称される場合がある。さらに、前核が形成されているかどうかについては、後述するように、ヌクレオポリンが存在する機能的な核膜孔が形成されていること、核膜の裏打ちタンパク質、例えば、ラミンA/Cが存在すること、内包するクロマチンが脱凝縮していることなどを指標に確認することもできる。
一般に、前核に含まれるDNAは雄又は雌由来の染色体DNAであるが、本発明においては、上記前核の特徴を有するものであれば、含まれるDNAは染色体DNAに限定されないものとする。
【００１４】
本発明で使用する無細胞再構築系を調製するためには、哺乳動物の未受精卵から調製する抽出液を準備する必要がある。
未受精卵の採卵は、各動物種に適する方法によって行うことができる。例えば、血清性腺刺激ホルモン（pregnant mare serum gonadotropin:PMSG）、絨毛性ゴナドトロピン（chorionic gonadotropin:CG）などを対象哺乳動物に注射して、人為的に、過剰排卵状態を誘起し、未受精卵を採卵することができる。これらのホルモン剤の投与量は、当業者により、哺乳動物の種類、体重等に応じて適宜選択することができる。採取した未受精卵は、透明体を除去して使用する。もちろん、自然排卵された未受精卵であってもよい。
透明体の除去は、当該技術分野において周知の方法を使用することができ、例えば、レーザーなどを使用する方法や微細ガラス管を用いて物理的に剥がす方法の他，酸性タイロードやSH基を有する還元剤（DTTなど）などで未受精卵を処理し、透明体を除去することができる。
次に、透明体を除去した未受精卵は、人工的に賦活化する。賦活化は、in vivoにおいて、未受精卵に精子が受精することによって生じる卵細胞内の状況を人為的に再現するための処理である。未受精卵の人為的な賦活化の方法としては、例えば、カルシウムイオノフォアやエタノール処理、電気刺激など卵の細胞質内カルシウム濃度を上昇させる方法の他、６−ジメチルアミノプリンや、ピューロマイシン、シクロヘキシミドなどのタンパク質合成阻害剤で処理し、MPF（maturation-promoting factor）の合成を阻害する方法などを挙げることができる。
【００１５】
賦活化した卵から抽出液を調製する方法についても、当該技術分野で周知の方法を適宜使用することができるが、適当な方法として、例えば、物理的に卵を粉砕し、粉砕後の卵を遠心して、卵の抽出液を調製する方法などを挙げることができる。遠心により卵抽出液を調製する場合、上層から、透明画分、不透明画分、雌性染色体を含む画分の３つの画分に分離されるように、遠心条件を調節することが望ましい。また，脂肪顆粒の多い哺乳類（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ，ブタなどの家畜動物）では，上層から、脂肪画分、透明画分、不透明画分、雌性染色体を含む画分の４つの画分に分離されるように，遠心条件を調製することが望ましい。不透明画分は、透明画分よりも粘度が高い。遠心条件は、使用する卵の量、使用する遠心分離機により異なるが、当業者においては、予め予備的な実験を行うことで、容易に決定することができる。
ここで、脂肪画分を含む４層の画分を調製する場合、通常の遠心チューブを用いて遠心してもよいが、哺乳動物の未受精卵は非常に小さく、採取される量も少ないことが多いため、通常の遠心チューブは大きすぎて、各画分を調製することが困難な場合が生じ得る。このような場合に、効率良く各画分を調製するためには、例えば、発明者らが考案したように、通常の遠心に使用する遠心チューブに適当なアダプターを用いて先端を閉鎖した微細ガラス管を遠心チューブ内に固定し、ガラス管内に卵を充填して、卵をガラス管内で粉砕した後、遠心することにより、４層の画分を調製することが可能である。またヘマトクリット管の片方をシール用のパテなどで閉じ，卵を充填後にヘマトクリット管用の遠心機によって分画することができる。
上述の通り、脂肪顆粒の少ない哺乳動物由来の未受精卵は、遠心によって、３つの画分に分離することができる。図１に記載されているように、ガラス管を使用して卵を粉砕し、遠心すると、ガラス管の中で、３つの画分に分離される。最下層は、雌染色体を含む画分、中間層は、不透明な画分（不透明画分と称する）、最上層は透明な画分（透明画分と証する）である。また、脂肪顆粒の多い動物種・個体では、透明画分のさらに上層に脂肪の層が形成される４つの画分に分離される。本明細書においては、「卵抽出液」とは、基本的には、透明画分と不透明画分を混合したもののことを指す。この定義と異なる用法の場合には、説明を行う。
卵を遠心により潰して抽出液を調製する場合、例えば、2,000 x g〜4,000 x g、より好ましくは、3,000 x g〜4,000 x g、特に好ましくは、3,700 x gで、例えば、10分間〜20分間、好ましくは、15分間程度、温度は、低温、例えば、４℃程度が好ましい。
透明画分、不透明画分は、使用直前に調製することが望ましいが、場合によっては、予め調製したものを4℃で保存し、調製後2時間以内に使用することもできる。
【００１６】
本発明において使用するクロマチンは哺乳動物細胞から調製したもの、あるいは、適当な方法による任意のクロマチンを調製して使用してもよい（任意のDNAからクロマチンを調製する方法は、例えば、アフリカツメガエル卵抽出液を用いる方法として、Glikin GC. 1984, Cell.37:33-41、ショウジョウバエ胚抽出液を用いる方法として、Ito T. 1997, Cell.90:145-155,1997、及びクロマチン形成因子ACFによる方法として、 Ito T. 1999, Genes&Dev. 13:1529-1539などに記載される方法を挙げることができる）。本発明で使用されるクロマチンとして、例えば、哺乳動物の精子の細胞膜を透過性化したものを使用することができる。哺乳動物の精子は、射精精液あるいは精巣上体から回収することができる（例えば、Fraser L.R, 1984 J.Reprod.Fertil.72:373-384,1984などを参照のこと）。本発明の方法においては、好ましくは、採取した精子を適当な緩衝液等（例えば、PBSなど）で洗浄後、頭部と尾部を切離し、頭部を使用する。頭部と尾部の切り離しは、特に限定はしないが、超音波処理などによって行うことができる。その後、精子細胞膜を還元剤、例えば、DTTなどで処理し、透過性化する（図１参照のこと）。
精子細胞膜を透過性化した精子（精子核クロマチン）は、使用するまで4℃で保存することができるが、24時間以内に使用することが望ましい。また、-20℃あるは-80℃にて冷凍保存することができるが、１週間以内に使用することが好ましい。
【００１７】
次に、精子核クロマチンから前核を誘導する方法について説明を行う（図１参照のこと）。
まず、調製した透明画分に精子核クロマチンを加え、インキュベートする。この場合、卵細胞１個に対し精子核クロマチン１個の割合、すなわち、約200plの透明画分あたり、精子核クロマチン１個の割合になるように加える。透明画分に対し、インキュベート中に乾燥しないように適当な処置をすることが望ましい。乾燥を防ぐ方法として、例えば、透明画分が大気と接触する部分を、オイル（ミネラルオイルなど）などで覆うなどの処理を行ってもよい。精子核クロマチンを加えた透明画分は、例えば、35℃〜39℃、好ましくは、37℃にて、約5%のCO2気相下でインキュベートする（第１工程）。第１工程のインキュベート時間は、0〜90分程度、好ましくは、約30分程度である。
【００１８】
第１工程の処理を行った後、卵抽出液（透明画分＋不透明画分）又は不透明画分を、第１工程後の混合物に添加してインキュベートを行う（第２工程）。第２工程において添加する卵抽出液又は不透明画分の量は、第１工程の透明画分の量と等量〜６倍量程度、好ましくは、４倍量程度である（約800pl）。第２工程でのインキュベーションは、例えば、約5%のCO2気相下、35℃〜39℃、好ましくは、37℃にて、0〜90分程度、好ましくは、約30分程度行う。第２工程において添加する卵抽出液又は不透明画分は、新たに調製したものが望ましい。
第２工程の処理後、さらに、卵抽出液（透明画分＋不透明画分）又は不透明画分を、第２工程後の混合物に添加してインキュベートを行う（第３工程）。第３工程において添加する卵抽出液又は不透明画分の量は、第１工程の透明画分の量と等量〜3倍量程度、好ましくは、２倍量程度である（約400pl）。第３工程でのインキュベーションは、例えば、約5%のCO2気相下、35℃〜39℃、好ましくは、37℃にて、0〜90分程度、好ましくは、約30分程度行う。第３工程において添加する卵抽出液又は不透明画分は、新たに調製したものが望ましい。
第３工程のインキュベーション後、前核が形成される。前核が形成されたかどうかは、核としての特徴を備えているかどうかを基準に判断することができる。例えば、ヌクレオポリンが存在する機能的な核膜孔が形成されていること、核膜の裏打ちタンパク質、例えば、ラミンA/Cが存在すること、内包するクロマチンが脱凝縮していることなどを確認することで、判断できる。
【００１９】
本発明の第２の形態は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む哺乳動物由来の精子の受精能力を調べる方法である。
（ａ）精子細胞膜を透過化した精子と、哺乳動物由来の賦活化した卵から作製した卵抽出液の透明画分を混合し、該混合物をインキュベートする第１工程、
（ｂ）第１工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートする第２工程、
（ｃ）第２工程後の混合物に、さらに、卵抽出液又は不透明画分を添加し、該混合物をインキュベートし、該混合物中の精子が前核に分化したかどうかを確認する第３工程
哺乳動物を繁殖させる場合、受精能力を有する精子を使用することが重要となる。この受精能力を判断する上で、受精後の精子から雄性前核が誘導されるかどうかを１つの判断要素にすることができる。本発明は、哺乳動物由来の精子が前核まで誘導されるかどうかを予め調べるための方法を提供する。
具体的には、上記第１の形態のクロマチンとして、精子細胞膜を透過性化した精子、精子核クロマチンを使用して、上記（ａ）〜（ｃ）の工程を行い、前核への誘導率を確認する。前核への誘導率の良し悪しの判断は、例えば、前核への誘導が良好であることがすでに明らかである精子をポジティブコントロールとして、その精子の前核への誘導率と比較することなどにより行うことが可能である。
【００２０】
本発明の第３の形態は、クロマチンから前核を誘導する方法及び哺乳動物由来の精子の受精能力を調べる方法を実施するために使用するキットである。本発明のキットには、未受精卵の採卵を行うために用いる各種ホルモン（例えば、PMSG、CGなど）、精子の細胞膜を透過性化するための試薬（例えば、ストレプトリシンO、DTTなど）、未受精卵の透明体を除去するための試薬（例えば、酸性タイロード、DTTなどの還元剤）、未受精卵の賦活化に用いる試薬（例えば、カルシウムイオノフォア、６−ジメチルアミノプリンや、ピューロマイシン、シクロヘキシミドなど）、場合によっては、未受精卵を活性するための電極などが含まれる。また、本発明のキットは、卵抽出液を調製するための器具、例えば、卵抽出液の調製のために行う遠心に用いるアダプターや、少量の卵から抽出液を調製するためのガラス管を含んでいてもよい。遠心用のアダプターは、例えば熱硬化性樹脂や熱可逆性樹脂を用いてガラス管の型取りをして熱を加えて硬化させる、あるいはシリコン等によって型取りした後、液性樹脂を流し込み硬化させる、金属から切り出して研磨するといったことにより作成することができ。使用するガラス管は、例えば、ヘマトクリット管などの微細ガラス管をプラーにより先端を細くした後、マイクロフォージによって先端を閉じることにより作成することができる。さらに、本発明の方法を実施するために使用する緩衝液（PBSなど）、クロマチンと卵抽出液をインキュベートする間の乾燥を防ぐためのミネラルオイルなども本発明のキットに含まれていてもよい。
【００２１】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
本発明のクロマチンとしてマウス由来の精子の細胞膜を透過性化した精子核クロマチンを使用し、卵抽出液としてマウス未受精卵から調製したものを用いる場合を例に、本発明の概要を図１に示した。以下に具体的に説明する。
【００２３】
１．実験方法
１−１．精子核クロマチンの準備
使用する精子は、BALB/c×C57BL/6 F1（BBF1）雄マウス（20-24週齡）の１匹の精巣上体尾部より回収し、1mLのPBSに懸濁後、遠心（10,000rpm、1分間、室温）することで洗浄した。次いで、200μLのPBSに精子を懸濁し、4℃にてソニケーション(BioRuptor UCD-200，strength H, on 0.5sec,off 2.5sec, 10cycles)により頭部と尾部を切り離した。遠心分離（100,00rpm, 1分間, RT）後、上清を捨て、沈殿に回収した精子頭部を、ストレプトリシンO（1unit/mL）を加えた500μLのPBSに懸濁後、15分間（4℃）処理し、その後1,000μL のPBSで１回洗浄し、2mM ジチオトレイトール（DTT）を加えた500μLのPBSで15分間（37℃）処理することで、精子細胞膜を透過性化させた。PBSで２回洗浄後、使用するまで４℃で保存した。
【００２４】
１−２．卵抽出液の調製
卵抽出液の調製には、ICR又はBALB/cA x C57BL/6J F1 (BBF1)雌マウス（8-10週齡）に0.5UのPMSGを腹腔内投与後、48時間後に、0.5UのhCGを投与する過剰排卵誘起処置により得た未受精卵を用いた。得られた卵細胞を、酸性タイロード（pH2.3）により透明体を除去し、電気刺激によって賦活化した。電気刺激には、0.5mm 幅の平行ワイヤー電極チャンバーを用い、電極間をM2培地（SIGMA社）で満たし、電極間の中央に卵細胞を静置し，200V/mm、 99μsecの電気刺激を0.5sec間隔で４回付加した（BEX LF101、ベックス社）。電気刺激後、サイトカラシンB（5μg/mL）を含むM2溶液内に5分間静置した。次いで、プラーで引いたガラス管の先端をマイクロフォージで加工して閉じた微細ガラス管に卵細胞を詰めて、更にATP regenerating system (1mM ATP, 20mM クレアチンリン酸，20U/mL クレアチンキナーゼ，1mM GTP)を加え、ハンドメイドで作成したアダプターを装着した1.5mLエッペンドルフチューブにガラス管を装填し、卓上遠心機にて軽く遠心し（2,000g / １５秒間 / 室温）、卵細胞をペレット化した。遠心後、上清を捨て、内径50μmのガラス管にて卵細胞をピペティングすることで粉砕した後、遠心分離（3,700g / 15分間 / 4℃）して、卵抽出液（約0.5 nL/卵）を作成した。遠心分離した卵細胞の画分は、上層の透明画分、中間層の不透明画分、下層の雌染色体画分の３画分であった。得られた画分の内、上層の透明画分及び中間層の不透明画分を混合したものを卵抽出液とする。この抽出液には染色体が含まれておらず、100個以上の未受精卵より卵抽出液の取得が可能である。卵抽出液は、使用する直前に調製した。なお、時間の制約がある場合、予め調製した卵抽出液を４℃で保存しておき、調製２時間以内には使用した。
【００２５】
１−３．精子核クロマチンの連続卵抽出液処理法
培養皿上に、マウスピースを用いたガラスキャピラリーを用いて透明画分の微小滴を作成し、直ちに乾燥を防ぐためミネラルオイルを被せた。卵細胞１個に対して精子核クロマチンが１個になるように精子核クロマチンを培養皿上の卵抽出液微小滴に加え、37?C、5%CO2気相下、30分間静置した（第１工程）。次に、第１工程に用いた卵抽出液の２倍量の卵細胞を用いた卵抽出液を新たに作成し、第１工程の処理後の精子核クロマチン−卵抽出液溶液へ加え、37℃、5%CO2気相下、30分間静置した（第２工程）。さらに、第１工程で用いた卵抽出液の等量の卵細胞を用いた卵抽出液を新たに作成し、第２工程の処理後の精子-卵抽出液溶液へ加え、37℃、5%CO2気相下、30分間静置した（第３工程）。
上記第３工程を行うことで、精子核クロマチンを効率良く雄性前核まで誘導することができたので、その結果を以下に説明する。
【００２６】
２．結果
２−１．精子核クロマチンの変化について
マウス由来の精子のマウス受精卵中における変化と、精子核クロマチン（尾部を除去し精子細胞膜を透過化した精子）に対して本発明の処理を行った場合の変化を図２にまとめた。
受精後卵中において、受精後約３０分程度で精子核クロマチンの脱凝縮が起こり、４５分程度で受精卵由来のヒストンが精子核クロマチンに取り込まれ、約９０分後に小胞及びヌクレオポリンの精子核クロマチンへの結合が生じ、約１２０分後に小胞の融合、約１５０分後に前核の形成、約１８０分後に前核の膨大化が生じる。
他方、精子核クロマチンを用いて本発明の方法を実施すると、精子核クロマチンと透明画分を混合してから約３０分後にクロマチンの脱凝縮が起こり、約３０分後から４０分後の間にヒストンの取り込み、約４５分後に小胞及びヌクレオポリンの精子核クロマチンへの結合が生じ、約９０分後に小胞の融合、約１２０分後に前核の形成、約１５０分後に前核の膨大化が生じる。
【００２７】
２−２．第２工程まで行った場合と、第３工程まで行った場合の前核の誘導率の比較
本発明においては、これまでに発明者らが報告した第２工程までの処理により誘導した前核の誘導率を向上させるべく、鋭意研究を行った結果、第２工程の処理の後、さらに、第３工程の処理を行うことで、前核の誘導率を顕著に向上させることに成功した。
第２工程までの処理で誘導される前核の誘導率と、さらに第３工程の処理を行った場合に誘導される前核の誘導率の比較を行ったので、その結果を以下に示す。
図３ａに示すように、第２工程において、不透明画分又は卵抽出液で処理した場合の精子核クロマチンの分化の核過程（脱凝縮、核膜前駆小胞のクロマチン表面への集合、核膜前駆小胞同士の融合、前核の形成及び前核の膨大化）の誘導率を図３ｂに示した。この結果、第１工程の透明画分の２倍量の不透明画分又は卵抽出液（透明画分＋不透明画分）を加えて第２工程の処理を行った場合には、精子核クロマチンからの膨大化した前核までの誘導率は、約５０％程度であった。
これに対し、図４ｂは、第２工程において第１工程の透明画分の２倍量の卵抽出液で処理し、さらに、第３工程において第１工程の透明画分の２倍量の透明画分又は不透明画分を加えて処理を行った場合の精子核クロマチンの分化の各過程の誘導率を示す。この結果、第３工程の処理を行った場合には、精子核クロマチンからの膨大化した前核までの誘導率は、約６０％程度にまで向上していた。
【００２８】
第３工程までの処理を行った結果形成された雄性前核の顕微鏡写真を図５に示す。図５ａ左図において、形成された前核を矢頭と矢印で示している。図５ａ右図には、図５ａ左図の矢印で示した前核の拡大図である。
このように形成された前核に機能的な核膜が形成されているかどうかを確認した。通常、低分子量の物質は、核膜孔を通って核内に移行できるが、高分子の物質は、核膜孔が通過できず、核内に輸送されない。そこで、誘導した雄性前核をテキサスレッドコンジュゲートの低分子デキストラン（10,000 MW：分子量）及び高分子デキストラン（70,000 MW）で処理してみたところ、低分子デキストラン処理では、前核も含めてほぼ均一に染色されているのに対し、高分子デキストラン処理では、前核の部分だけ黒っぽく抜けているのが分かる。従って、低分子デキストランのみ前核内へ移行したと考えられ、このことから、本発明の方法で誘導した前核には、核膜孔を有する核膜が形成されていると考えられる（図５ｂ）。 さらに、核膜の裏打ちタンパク質であるラミンA/C、ならびに一部のヌクレオポリンの免疫染色をしたところ、染色像が確認された。
以上の結果から、第３工程の処理を行うことで、精子核クロマチンから前核を誘導する効率が明らかに向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の方法を用いれば、クロマチンを前核まで効率よく誘導することが可能となある。本技術は、例えば、家畜の繁殖などの産業分野において、用いる精子の受精能力を予め評価するために利用されることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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