(57)【要約】【課題】抗炎症剤として有用な化合物及びこれを用いた抗炎症剤を提供すること。こと。【解決手段】セネガル産プロポリスから得ることができるスチルベン化合物を有効成分とする抗炎症剤。【選択図】図７
2015193558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セネガル産プロポリスから得ることができるスチルベン類縁化合物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項２】
スチルベン類縁化合物が、式１〜３であらわされるいずれかの物質である（１）記載の抗炎症剤。
【化１】
2015193558.tif 000012
式１
【化２】
2015193558.tif 000013
式２
【化３】
2015193558.tif 000014
式３
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スチルベン類縁化合物を有効成分とする抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スチルベン(stilbene)とは、エチレンエチレン構造をはさんで２つのベンゼン環が結合した芳香族化合物である。色素や染料としてアゾ染料が著名である。また天然に存在するスチルベン化合物として、フタバガキ科植物のヴァテリア・インディカに含まれるスチルベン４量体やレスベラトロールが知られている（特許文献１）
【０００３】
本発明者らは、天然物由来の化合物の生理機能を研究する過程で、セネガル産のプロポリスに天然では、従来知られていないスチルベン化合物を見出し、この利用を検討している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１７３４９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、抗炎症剤として有用な化合物及びこれを用いた抗炎症剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、セネガル産のプロポリスから強い抗炎症作用を有するスチルベン類縁化合物を単離し、これを抗炎症剤として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の構成である。
（１）セネガル産プロポリスから得ることができるスチルベン化合物を有効成分とする抗炎症剤。
（２）スチルベン化合物が、式１〜３であらわされるいずれかの物質である（１）記載の抗炎症剤。
【化１】
2015193558.tif 000003
式１
【化２】
2015193558.tif 000004
式２
【化３】
2015193558.tif 000005
式３
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、抗炎症剤として有効な化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ポプラ、バッカリス、セネガル産プロポリスのエタノール抽出物のＨＰＬＣパターンを示す。
【図２】セネガル産プロポリスの溶媒抽出物のＨＰＬＣパターンを示す。
【図３】分取クロマトで分離したフラクション６、１０、１１のＨＰＬＣパターンを示す。
【図４】実施例で得られる分画物を取得する工程の模式図である。
【図５】実施例で得た分画物のＤＰＰＨ試験による抗酸化効果を測定したグラフである。
【図６】実施例で得た分画物の抗炎症作用を示すグラフである。
【図７】抗炎症作用の試験における細胞死を確認した結果を示すグラフである。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲ法によるｉＮＯS発現抑制作用を試験した結果を示すグラフである。
【図９】ニトロプルシドを用いたＮＯラジカル捕捉能を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ＮＯラジカル捕捉能が陽性であった化合物の濃度依存性を試験したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、式１〜３で表される化合物を有効成分とする発明である。
本発明の化合物は、公知の物質であって、各種植物から単離することができ、本発明者が本明細書に開示するようにセネガル産のプロポリスから溶媒抽出及びクロマトグラフィーで単離することができる。
本発明の抗炎症剤は、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどのペット小動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜に投与することができる。
【００１１】
本発明の抗炎症剤は、式１〜３で表される化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能性の誘導体と、１以上の製薬上許容される担体を含む。製薬上許容される担体とは、一般的に、本発明の有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体または液体の、増量剤、希釈剤またはカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒または分散媒体などが挙げられる。
【００１２】
本発明の抗炎症剤は、経口あるいは非経口により、例えば、皮膚に、皮下に、粘膜に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膣内に、肺に、脳内に、眼に、および鼻腔内に投与される。
経口投与製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ペレット剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤および吸入剤などが挙げられる。
非経口投与製剤としては、坐剤、保持型浣腸剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤、注射剤、口腔洗浄剤ならびに軟膏、クリーム剤、ゲル剤、制御放出パッチ剤および貼付剤などの皮膚外用剤などが挙げられる。
【００１３】
本発明の抗炎症剤は薬学分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。
【実施例】
【００１４】
実施例１
セネガル産プロポリスからの各化合物の単離と同定
（１）ＨＰＬＣパターン
セネガル共和国のファティック州フンジュンで、2012年5月に採取されたプロポリスの原塊のエタノール抽出物を下記条件で、HPLCにより分析し、これまでよく知られているポプラやバッカリス由来のプロポリスのクロマトパターンと比較した。図１（Ｃ）にセネガル産プロポリスのHPLC分析の結果を示した。なお（Ａ）は公知のポプラ由来プロポリス、（Ｂ）はバッカリス由来のプロポリスである。
〈HPLC〉条件
Column   ： SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (4.6mm i.d. × 250mm)
Gradient ：(A) H2O (0.1% TFA), (B) MeCN (0.1% TFA)
(B) 20-100% (0-45min)
Detection：270 nm         
Flow rate：1.0 mL/min
【００１５】
HPLC分析の結果より、セネガル産プロポリスは、これまでよく知られているポプラやバッカリス由来のプロポリスとは、全く異なるピークパターンを示すことを確認した。
【００１６】
（２）セネガル産プロポリスのエタノール抽出と液液分配抽出
セネガル産プロポリスの原塊41.2gを細かく砕き、EtOH 500mLに浸し、1日間室温で撹拌抽出した。その後、吸引濾過を用いて不溶固形物質を除き、得られた抽出液を減圧濃縮した。抽出物の収量は29.0gであった。
このEtOH抽出物は、300mLの純水に混濁し、300mLヘキサンを加えた。分液ロートを用いて混和させた後上層を回収し、再び300mLのヘキサンを加えて同操作を行った。回収した上層をヘキサン抽出物とした。次に、酢酸エチルをヘキサンと同様の操作で分配し、上層を酢酸エチル抽出物、下層を水抽出物とした。それぞれの収量は、ヘキサン抽出物 (7.0g)、水抽出物 (0.8g)、酢酸エチル抽出物 (8.8g) であった。
それぞれの抽出物を、以下の条件でHPLC分析した結果を図２に示す。（Ａ）はヘキサン層、（Ｂ）は水層、（Ｃ）酢酸エチル層のパターンを示す。
〈HPLC〉条件
Column    ： SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (4.6mm i.d. × 250mm)
Gradient  ：(A) H2O (0.1% TFA), (B) MeCN (0.1% TFA)
(B) 20-100% (0-45min)
Detection ：270nm
Flow rate ：1.0mL/min            
【００１７】
(３) 酢酸エチル抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる粗分画
酢酸エチル抽出物8.8 gを適量のSilica gel 60にコーティングし、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Silica gel CC) により、以下の条件で粗分画を行い、11個のフラクション (Fr.1〜11) に分画した。
〈Slica gelカラムクロマト条件〉
Column tube       Glass column (20mm i.d. × 320mm) 
Stationary phase  Silica gel 60N
Mobile phase    （１） CHCl3 : MeOH = 10 : 0 (140mL)
（２） CHCl3 : MeOH = 9.9 : 0.1 (100mL)
（３） CHCl3 : MeOH = 9.8 : 0.2 (100mL)
（４） CHCl3 : MeOH = 9.5 : 0.5 (100mL)
（５） CHCl3 : MeOH = 9 : 1 (50mL)
（６） CHCl3 : MeOH = 5 : 5 (50mL)
（７） CHCl3 ：MeOH = 0 : 10 (140mL)
【００１８】
(４) 分取用HPLCによる分画
Fr. 6, 10, 11を、下記の溶媒条件で分析用HPLCを用いて分析した結果を図３に示す。
次いで分取用逆相HPLCを用いてFr. 6を以下の条件でさらにFr. 6-1〜6に分画した。
〈Preparative HPLC 条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN = 65 : 35 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００１９】
分取用逆相HPLCを用いてFr. 10を以下の条件でさらにFr. 10-1〜9に分画した。
〈Preparative HPLC条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN = 55: 45 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００２０】
分取用逆相HPLCを用いてFr. 11を以下の条件でさらにFr. 11-1〜6に分画した。
〈Preparative HPLC 条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN = 70 : 30 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００２１】
(５) 分取HPLCによる主構成成分の単離および精製
Fr. 11-2, 3, 4, 5及び10-2を下記条件で精製し、Compound 1, 2, 3, 4, 5をそれぞれ0.9, 11.3, 5.4, 3.9, 22.9 mg得た。
〈Preparative HPLC条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN = 70 : 30 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００２２】
Fr. 6-1, 2を下記条件で精製し、Compound 6及び7を74.4及び19.6mg得た。
〈Preparative HPLC 条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN =65 : 35 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
Fr. 6-3 を下記条件で精製し、Compound 8を58.0 mg得た。
【００２３】
〈Preparative HPLC条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN =62 : 38 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００２４】
Fr. 6-4 を下記条件で精製し、Compound 9を24.1 mg得た。
〈Preparative HPLC 条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN = 60 : 40 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００２５】
Fr. 6-5 を下記条件で精製し、Compound 10を9.2 mg得た
〈Preparative HPLC 条件〉
Column    : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (20mm i.d.× 250mm)
Solvent     H2O : MeCN =50 :  50 (0.1% TFA)
Flow rate : 10mL/min
Detection : 270nm
【００２６】
以上の分画を模式的に図４に示した。
【００２７】
（６）単離した化合物の構造解析
単離したCompound 1-10の構造を決定するため、各種機器分析を行った。Acetone-d6を溶媒として、1H-NMR、13C-NMR、HSQCおよびHMBC等のNMR測定を行った。またCompound 2, 3, 6, 7, 9に関しては、INADEQUATEもしくは、1,1-ADEQUATEのNMR測定を行った。また、各化合物のHRESIMS分析を行ったため、その条件を下に示す。
Compound 2-4, 7-10は下記条件で、MS分析を行った。
〈HRESIMS〉
Scan mode             full MS scan 
Ion source            ESI (Positive, Negative)       
Spray voltage         3.5kV (Positive), 2.0kV (Negative)
Capillary temperature 350℃      
Compound 1は下記条件で、MS分析を行った。
〈HRESIMS〉
Scan mode             full MS scan 
Ion source            ESI (Positive, Negative)       
Spray voltage         2.7kV (Positive), 2.0kV (Negative)
Capillary temperature 250℃      
Compound 5は下記条件で、MS分析を行った。
〈HRESIMS〉
Scan mode             full MS scan 
Ion source            ESI (Positive, Negative)       
Spray voltage         2.0kV (Positive), 2.0kV (Negative)
Capillary temperature 250℃
Compound 6は下記条件で、MS分析を行った。
〈HRESIMS〉
Scan mode             full MS scan 
Ion source            ESI (Positive, Negative)       
Spray voltage         4.0kV (Positive), 3.0kV (Negative)
Capillary temperature 400℃      
【００２８】
以下上記分析等によってスチルベン類縁化合物として決定されたCompound ４（式１）、Compound ８（式２）、 Compound１０（式３）の化合物の構造式の決定について説明する。 
Compound ４の構造解析
Compound ４の理化学的性質は、Molecular formula   C16H18O5、HR-ESI-MS (m/z)   found: 289.10740 (M-H)-、calcd.: 289.10760 (M-H)-であった。
HRESIMS分析の結果より、Negativeモードでm/z 289.10740に (M-H)- の分子イオンピークが観測されたことより、分子式をC16H18O5と推定した。
Acetone-d6 中における1H-NMRスペクトルにおいて、δ 6.38, δ 6.54, δ 6.71は芳香族のプロトン、δ 3.72及び δ 3.79はメトキシ基のプロトンと推定された。
13C-NMRスペクトルにおいて、16本のシグナルが観測された。
HSQCスペクトルによりプロトンとカーボンの相関が明らかになった。さらに、HMBCスペクトル、NOESYスペクトルより、プロトンとカーボンのHMBC相関及びプロトン間のNOEが見られた。同様にして構造解析を行い、本化合物は、2つのベンゼン環を持つ化合物であり、それらは2つのメチレンによって結合されていると推測した。
以上のことより、本化合物は、骨格をdihydrostilbeneに持つ、化合物であることを導き出すことができた。
以上のことより、本化合物の構造を式１のとおり決定した。
【００２９】
【化１】
2015193558.tif 000006
式１
【００３０】
本化合物は、4-[2-(3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-1,2-benzenediolであると同定した。
【００３１】
Compound ８の構造解析
Compound ８の理化学的性質はMolecular formula  C17H20O5  、HR-ESI-MS (m/z)  found: 305.13770 (M+H)+、calcd.: 305.13890 (M+H)+であった。
HRESIMS分析の結果より、Positiveモードでm/z 305.13770に (M+H)+ の分子イオンピークが観測されたことより、分子式をC17H20O5と推定した。
Acetone-d6 中における1H-NMRスペクトルにおいて、δ 6.41, δ 6.43, δ 6.66, δ 6.76, δ 6.83は芳香族のプロトン、δ 3.75及び δ 3.80はメトキシ基のプロトンと推定された。
13C-NMRスペクトルにおいて、17本のシグナルが観測された。
HSQCスペクトルによりプロトンとカーボンの相関が明らかになった。さらに、HMBCスペクトル、NOESYスペクトルより、プロトンとカーボンのHMBC相関及びプロトン間のNOEが見られた。これらのシグナルから、本化合物は、Compound４と似た構造を持つ化合物であることが考えられた。
同様にして構造解析を行い、dihydrostilbene骨格の化合物であることが推定され、以上のことより、本化合物の構造を式２のように導き出すことができた。
【００３２】
【化２】
2015193558.tif 000007
式２
【００３３】
本化合物を5-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]-2,3-dimethoxy-phenol (慣用名: Combretastatin B-2)であると同定した。
【００３４】
Compound １０の構造解析
Compound １０の理化学的性質は、Molecular formula C18H20O5、HR-ESI-MS (m/z)   found: 317.13756 (M+H)+-、calcd.: 317.13890 (M+H)+であった。HRESIMS分析の結果より、Positiveモードでm/z 317.13756に (M+H)+ の分子イオンピークが観測されたことより、分子式をC18H20O5と推定した。
Acetone-d6 中における1H-NMRスペクトルにおいて、δ 6.62, δ 6.78, δ 6.87, δ 6.88は芳香族のプロトン、δ 6.43とδ 6.49はカップリング定数 (J = 12.2Hz) より、二重結合のcis位のプロトン、δ 3.67, δ 3.71, δ 3.83はメトキシ基のプロトンと推定された。
13C-NMRスペクトルにおいて、18本分のシグナルが観測された。
HSQCスペクトルによりプロトンとカーボンの相関が明らかになった。さらに、HMBCスペクトル、NOESYスペクトルより、プロトンとカーボンのHMBC相関及びプロトン間のNOEが見られた。これらのシグナルから、本化合物は、これまでの化合物と似た構造を持つ化合物であることが考えられた。
同様にして構造解析を行い、2つのベンゼン環を持つと推定され、それらはcis位の二重結合によってつながることから、本化合物は、cis-stilbene骨格の化合物であることが推定された。以上のことより、本化合物の構造を式３のように導き出すことができた。
【００３５】
【化３】
2015193558.tif 000008
式３
【００３６】
本化合物は5,6-dimethoxy-2,3,7-phenanthrenetriolであると同定した
【００３７】
実施例２．各化合物の抗酸化活性試験
セネガル産プロポリスから単離したCompound 1-10に関して、DPPHを用いて抗酸化活性試験を行った。
（１）DPPHラジカル捕捉活性試験
試料をEtOHに溶解し、この溶液20μLに0.1mM DPPH/EtOH溶液を150μL加えて撹拌した。遮光状態で、1時間後に517nmにおける吸光度を測定した。試料は、最終濃度を50-1000μMの範囲で調製した。そして、測定結果から、下記の計算式に従い、ラジカル捕捉活性率を求め、EC50を算出した。また、ポジティブコントロールとして、Troloxを用いた。
計算方法
DPPHラジカル捕捉活性率(%) = {(Ac−As) / Ac} ×100
Ac：コントロールの吸光度      
As：試料の吸光度
EC50は、直線性 (R2=0.99以上) のある3点をプロットし、そこから50%のラジカル捕捉活性を示す時の濃度を求めた。
【００３８】
（２）結果
250μMでのDPPHラジカル捕捉率を図５に、またラジカル補足のEC50値を表１にそれぞれ示す。また、ポジティブコントロールであるTroloxのEC50は、147.0μM (36.8μg/mL) であった。
本発明のCompound １、 Compound ２、 Compound３、Compound ５、Compound ６、Compound ７、Compound ９の化合物はいずれも抗酸化作用を有していた。
【００３９】
【表１】
2015193558.tif 000009
【００４０】
実施例３．抗炎症活性試験
（１）試験方法
J774.1細胞を、10% FBS (ウシ胎児血清) と1% penicillin/streptomycinを添加したRPMI-1640培地で培養した。細胞数が1.0×106cells/mLとなるように、RPMI培地 (+FBS)で調製し、96穴プレートに100μL/wellずつ播種した。細胞を5% CO2, 37℃インキュベーター内で24時間培養後、濃度の異なる各試料にlipopolysaccharide (LPS) 10μg/mLを添加した培地100μLを添加し、培養した。また、試料は、DMSOに溶解したものを、培地に対して0.1%以下で添加した。
NO産生は、細胞を24時間培養後、グリースアッセイによって評価した。各ウェルの培養液の上清100μLを、別の96穴プレートに移した後、グリース試薬 (1% スルファニルアミド、0.1% N-L-ナフチルエチレンジアミン、2.5% H3PO4) 100 μLを添加し、550nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。それらを、コントロール(0.1% DMSO添加の時) に対する相対値として、NO産生率 (%) を算出した。ポジティブコントロールとして、quercetinを用いた。
（２)J774.1細胞を用いた細胞生存率の測定
また同時に、WST-8を用いて細胞生存率の測定を行った。テトラゾリウム塩WST-8は、高感度水溶性ホルマザンを生成する発色基質であり、細胞内脱水素酵素によって還元され発色する。この時の吸光度を測定することにより、生きている細胞数を測定する。本試験では、グリースアッセイのために上清を回収した後の残渣 (細胞) に対し、WST-8を5μL/wellずつ添加し、30分間、37℃でインキュベートした。その後、吸光度プレートリーダーで450nmの時の吸光度を測定した。それらを、コントロール (0.1% DMSO添加の時) に対する相対値として、細胞生存率 (%) を算出した。
【００４１】
（３）結果
表２にIC50値、図６には0.5, 5, 50μg/mLの濃度でのNO産生率を示す。また図７には細胞生存率を示す。ポジティブコントロールとして、quercetinを用い、このIC50は18.9μMであった。本発明のCompound １、 Compound ２、 Compound３、Compound ５、Compound ６、Compound ７、Compound ９の化合物はいずれも強い抗炎症作用を有していた。また高濃度でも細胞生存率が高いことが明らかとなった。
【００４２】
【表２】
2015193558.tif 000010
【００４３】
実施例４  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いたiNOS遺伝子発現量の測定
（１）試験方法
マウス由来J774.1細胞（理化学研究所バイオソースセンターより入手）を、10% FBS (ウシ胎児血清) と1% penicillin/streptomycinを添加したRPMI-1640培地で培養した。細胞数が1.0×106cells/mLとなるように、RPMI培地 (+FBS) で希釈し、24穴プレートに1 mL/wellずつ播種した。細胞を5% CO2、37℃インキュベーター内で24時間培養後、濃度の異なる各試料にLPS 1μg/mlを添加した培地1 mLを添加し、培養した。試料は、DMSOに溶解したものを0.1%以下で用いた。
総RNAは、細胞を24時間培養後、RNA抽出キット(NucleoSpin：商品名 RNA II) を用いて抽出した。その後、逆転写反応キット (PrimeScript商品名 RT reagent Kit) を用いて、cDNAを合成した。逆転写反応は、37℃、15分間 (逆転写反応)、 85℃、5秒間 (逆転写酵素失活) で行った。
次に、リアルタイムPCRキット (SYBR：商品名 Premix Ex Tag II) を用いて、iNOSの発現量を測定した。リファレンス遺伝子として、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) の発現量を測定し、補正した。用いたプローブの塩基配列を下記に示す。またPCR反応は下記のプロトコルで行った。
【００４４】
Hold (初期変性)
1サイクル
95℃、30秒間
2Step PCR
40サイクル
95℃、5秒間、60℃、30秒間
Dissociation
iNOS    (F) CCGATTTAGAGTCTTGGTGAAAGTG (配列１)
(R) CTGACCCGTGAAGCCATGA（配列2）
GAPDH   (F) CGTGTTCCTACCCCCAATGT（配列３）
(R) ATGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT（配列4）
【００４５】
（２）結果
図８にリアルタイムRT-PCRによるiNOSの発現率の結果を示す。NO産生を強く抑制した8種類の化合物（Compound 1、2、5、6、7、8、9、10）のiNOSの発現を、リアルタイムRT-PCRを用いて確認したところ、8種類全ての化合物がiNOSの発現を抑制していた。
【００４６】
実施例５．ニトロプルシド (SNP) を用いたNOラジカル捕捉能の測定
（１）試験方法
SNPを溶液に溶かすことで発生するNOラジカルを、グリース試薬で検出した。SNPをリン酸緩衝液 (PBS) pH7.4に溶かし、10mM SNP-PBSを作成した。DMSOに溶かした濃度の異なる試料を添加し、撹拌しながら、180分間、25℃、水浴内でインキュベートした。その後、30分のインターバルを置いたのち、試料0.1mLに対して、0.1mLのグリース試薬で発色させ、550nmで吸光度を測定した。また、ポジティブコントロールとして、quercetinを用いた。
【００４７】
（２）結果
表３及び図９、図１０に、10 mM SNP-PBSを用いたNOラジカル捕捉率の結果を示す。表３はIC50値、図９は200μMの濃度での活性、図１０は、活性が見られた化合物に関する濃度依存的な活性の変化を示す。
また、ポジティブコントロールとしてquercetinを用いた。そのNO産生捕捉活性率は200μMの濃度で48.6±1.7%であった。そして、200μMの濃度で、Compound 2-6にquercetinと同等の活性がみられた。同じ骨格を持つCompound 3と7 、Compound 4と8を比較すると、catechol構造を持つCompound 3あるいは4の方がNOラジカルを強く捕捉していた。このことから、iNOS発現の結果とは逆となり、catechol構造の存在により活性が高まることが示唆された。dihydrophenanthrene骨格の化合物であるCompound 2, 5, 6, 9に関して、Compound 5, 6はcatechol構造を持たないのにも関わらず高い活性がみられ、Compound 9は活性がみられなかった。Compound 2-10の中で、Compound 2-6のような極性の高い化合物において、NOラジカルの捕捉活性がみられた。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
以上の試験結果から、本発明のCompound １、 Compound ２、 Compound３、Compound ５、Compound ６、Compound ７、Compound ９の化合物はいずれも抗炎症剤として有用であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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