(57)【要約】【課題】本発明の目的は、細胞内酸素濃度と一緒に、細胞周辺環境の酸素濃度測定を容易に測定することである。【解決手段】前記課題は、リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ、又は［１］〜［６］のいずれかに記載の酸素透過性ビーズを、酸素濃度測定対象に載置する工程；及び酸素透過性ビーズに励起光を照射し、リン光性色素分子のリン光寿命又はリン光強度を測定する工程；を含む酸素濃度の測定方法によって解決することができる。本発明によれば、液体又は気体中の酸素濃度を容易に測定することができる。【選択図】図１
2015175681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ。
【請求項２】
酸素濃度測定用である、請求項１に記載の酸素透過性ビーズ。
【請求項３】
リン光性色素分子が、白金錯体、パラジウム錯体、イリジウム錯体、ルテニウム錯体、及びオスミウム錯体からなる群から選択される金属錯体である、請求項１又は２に記載の酸素透過性ビーズ。
【請求項４】
前記白金錯体又はパラジウム錯体の配位子が、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体である、請求項３に記載の酸素透過性ビーズ。
【請求項５】
前記酸素透過性ビーズが、ポリマービーズ又はゲルビーズである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酸素透過性ビーズ。
【請求項６】
前記ポリマービーズがポリスチレンビーズであり、そしてリン光性色素分子が、オクタエチルポルフィリン白金錯体（Pt（II）-Octaethylporphyrin）である、請求項５に記載の酸素透過性ビーズ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の酸素透過性ビーズを、酸素濃度測定対象に載置する工程；及び
酸素透過性ビーズに励起光を照射し、リン光性色素分子のリン光寿命又はリン光強度を測定する工程；
を含む酸素濃度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ及びそれを用いた酸素濃度の測定方法に関する。本発明によれば、液体又は気体中の酸素濃度を容易に測定することができる。
【背景技術】
【０００２】
酸素は好気呼吸を行う生物にとって非常に重要な分子である。これらの生物では、解糖系、クエン酸サイクル、電子伝達系などによって炭水化物を二酸化炭素と水に分解する。この過程で、酸素は最終電子受容体として働き、生命活動に用いるエネルギーの生産に重要な役割を果たしている。一方、酸素は高い毒性を持つ活性酸素種の生成にも関わっている。活性酸素種は、呼吸の過程で生じ、腫瘍形成や神経欠陥、早老などの障害の原因と考えられている。このように、酸素は生体で重要な役割を担っており、様々な疾患ともかかわりが深い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・ポルフィリンズ・アンド・フタロシアニンズ（Journal of Porphyrins and Phthalocyanines）」（カナダ）２００７年、第１１巻、ｐ．１６０−１６４
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・マテリアルズ・サイエンス（Journal of Materials Science）」（ドイツ）２０１３年、第３８巻、ｐ．４２７１−４２８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、細胞内にリン光性色素を取り込ませ、色素のリン光寿命を利用した顕微鏡下での酸素濃度イメージング法を開発することによって、細胞内の酸素濃度を測定することを可能にした（非特許文献１）。しかしながら、細胞周辺環境の酸素濃度測定については、適当な方法が開発されていなかった。例えば、細胞周辺環境の酸素濃度を測定する方法として、電極電流を利用した酸素センサーを用いる方法がある。電極電流を利用した酸素センサーとして、半導体表面への酸素分子の吸着による電気抵抗の変化を測定する半導体酸素センサー、ジルコニアの酸素イオン導電性を利用したジルコニア酸素センサー、酸素分子の電極での電気化学的還元による電流値を測定するクラーク型酸素電極などがある（非特許文献２）が、これらの酸素センサーは、局所的な酸素濃度しか測定できなかった。また、細胞培養用のプレートの底部にリン光性色素を塗布し、蛍光プレートリーダーによって、培地中の溶存酸素を測定できるセンサープレートが販売されている（ＰｒｅＳｅｎｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ）。しかしながら、このプレートでは、リン光強度が酸素濃度のみではなく、リン光性色素の濃度にも依存するため、正確な濃度測定ができなかった。
本発明の目的は、細胞内酸素濃度と一緒に、細胞周辺環境の酸素濃度測定を容易に測定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、細胞周辺環境の酸素濃度測定について、鋭意研究し、細胞培地にリン光性色素を存在させ、酸素濃度の測定を行うことを考えた。しかしながら、細胞に少量のリン光性色素を取り込ませた場合は、細胞はすぐには死滅しないが、意外なことに培地にリン光性色素を存在させると、細胞が急速に死滅することがわかった。
本発明者は、細胞周辺環境の酸素濃度測定について、更に鋭意研究した結果、驚くべきことに、リン光性色素分子を酸素透過性ビーズに含有させ、リン光性色素分子からのリン光寿命を測定することによって、細胞周辺環境の酸素濃度を、細胞を死滅させることなく測定できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ、
［２］酸素濃度測定用である、［１］に記載の酸素透過性ビーズ、
［３］リン光性色素分子が、白金錯体、パラジウム錯体、イリジウム錯体、ルテニウム錯体、及びオスミウム錯体からなる群から選択される金属錯体である、［１］又は［２］に記載の酸素透過性ビーズ、
［４］前記白金錯体又はパラジウム錯体の配位子が、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体である、［３］に記載の酸素透過性ビーズ、
［５］前記酸素透過性ビーズが、ポリマービーズ又はゲルビーズである、［１］〜［４］のいずれかに記載の酸素透過性ビーズ、
［６］前記ポリマービーズがポリスチレンビーズであり、そしてリン光性色素分子が、オクタエチルポルフィリン白金錯体（Pt（II）-Octaethylporphyrin）である、［５］に記載の酸素透過性ビーズ、及び
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の酸素透過性ビーズを、酸素濃度測定対象に載置する工程；及び酸素透過性ビーズに励起光を照射し、リン光性色素分子のリン光寿命又はリン光強度を測定する工程；を含む酸素濃度の測定方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のリン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズによれば、細胞周辺環境の酸素濃度を、細胞を死滅させることなく測定することができる。例えば、酸素消費が盛んな受精卵の周辺環境の酸素濃度も、受精卵に影響を与えずに測定することができる。また、前記ビーズを局所に散置することによって、それぞれの局所環境における酸素濃度を測定することができる。
更に、本発明のリン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズは、液体中の酸素濃度だけでなく、気体中の酸素濃度を測定することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】リン光の発生における光励起一重項状態（Excited Single state）、光励起三重項状態（Excited Triplet state）、及び基底状態（Ground State）、並びに酸素による消光との関係を模式的に示した図である。
【図２】本発明におけるリン光寿命の測定に用いる共焦点光学顕微鏡のシステム、及び時間相関単一光子係数法によるリン光寿命の測定について、説明した図である。
【図３】リン光性色素分子としてＰｔＯＥＰ、ビーズの原料としてポリスチレン（ＰＳ）を用いて得られた、ポリスチレンビーズ（ａ：ＰＳ濃度１．１ｍｇ／ｍＬ）及びポリスチレンビーズ（ｂ：ＰＳ濃度１．３ｍｇ／ｍＬ）の写真及び粒子径分布を示したグラフである。
【図４】本発明の酸素センシングビーズを用いて、０、１、５、１０、１５、及び２０％の酸素濃度における、共焦点光学システムによるリン光寿命イメージング画像を示した図である。
【図５】２０℃〜４０℃の温度範囲における、酸素センシングビーズの酸素濃度測定の温度依存性について検討したグラフである。
【図６】本発明の酸素センシングビーズを用い、外部からの高い酸素濃度の培地を添加した場合の酸素濃度の変化を測定したグラフである。
【図７】褐色脂肪細胞を用いた細胞内酸素濃度イメージングと、細胞周辺環境の酸素濃度のイメージングを同時に行った結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ
本発明のリン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズは、励起光を照射し、リン光の強度又は寿命を測定することにより、酸素濃度の測定に用いることができる（以下、「リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ」を、便宜的に「酸素センシングビーズ」と称することがある）。なお、本発明のリン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズは、前記のように酸素濃度の測定に用いることができるが、これ以外の用途に用いることを、なんら制限するものではない。
【０００９】
ピレン又はピレンブタン酸などの多環式芳香族炭化水素、トリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）などの金属錯体、ポルフィリン又はフタロシアニンなどの複素環式化合物色素分子は、光の吸収によって光励起状態となる。図１に示すように、色素分子は励起光によって光励起され、光励起一重項状態（Excited Single state）になる。光励起一重項状態の色素分子は、無放射遷移または光を放出して基底状態（Ground State）に戻る。このときの光が蛍光であり、その寿命は１０−１０〜１０−７ｓと非常に短い。一方、ある種の分子は光励起一重項状態から系間交差を経て光励起三重項状態（Excited Triplet state）となる。光励起三重項状態から基底状態へ遷移するときに放出する光がリン光である。三重項状態から、一重項状態への遷移は禁制遷移であるためその確率は低く、リン光寿命は蛍光寿命よりも長い（１０−５〜１０−２ｓ）という特徴がある。そのため、光励起三重項状態にある分子は、他の分子との間で電子移動、エネルギー移動などが進行する。例えば、光励起三重項状態の色素分子が酸素との間でエネルギー移動が進行すると、一重項酸素が生成する。この酸素分子へのエネルギー移動にともない、励起分子は基底状態へ戻る（消光）。このような消光現象が起こると、リン光強度やリン光寿命は減少する。すなわち、酸素が存在するとリン光が消光されることを利用して、酸素濃度を測定することが可能である。
【００１０】
《リン光性色素分子》
本発明の酸素センシングビーズに含まれるリン光性色素分子は、光励起によりリン光を放出する限りにおいて、限定されるものではないが、ピレン若しくはピレンブタン酸などの多環式芳香族炭化水素、ポルフィリン若しくはフタロシアニンなどの複素環式化合物色素分子、シリコーン錯体、あるいは白金錯体、パラジウム錯体、イリジウム錯体、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、アルミニウム錯体、銅錯体、ロジウム錯体、銀錯体、金錯体、亜鉛錯体、レニウム錯体、ユーロピウム錯体又はそれらの混合物を挙げることができるが、特には白金錯体、又はパラジウム錯体が好ましい。
【００１１】
例えば、白金錯体、又はパラジウム錯体の配位子としては、ポルフィリン若しくはポルフィリン誘導体、又はピリジン誘導体を挙げることができるが好ましくはポルフィリン誘導体である。ポルフィリン若しくはポルフィリン誘導体白金錯体（以下、まとめて「ポルフィリン白金錯体」と称する）、又はポルフィリン若しくはポルフィリン誘導体パラジウム錯体（以下、まとめて「ポルフィリンイリジウム錯体」と称する）は、常温でリン光を発生することができる。従って、細胞周辺環境の酸素濃度を測定する観点から、ポルフィリン白金錯体又はポルフィリンイリジウム錯体が好ましい。
ポルフィリン誘導体としては、白金又はパラジウムと配位し、錯体を形成できる限りにおいて、限定されるものではないが、テトラベンゾポルフィリン、テトラナフトポルフィリン、テトラアントラポルフィリン、テトラフルオロフェニルポルフィリン、メソーテトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィリン、又はオクタエチルポルフィリンを挙げることができる。これらの配位子と、白金又はパラジウムとからなる金属錯体をリン光性色素分子として用いることができるが、例えば本発明の酸素センシングビーズを後述の液中乾燥法により調製する観点からは、有機溶媒に溶解しやすいポルフィリン誘導体が好ましく、例えば下記式（１）で表されるＰｔ（ＩＩ）−オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）が好ましい。
【化１】
2015175681.tif 000003
【００１２】
一方、細胞内の酸素濃度を測定する場合には、水溶性のポルフィリン白金錯体又はポルフィリンイリジウム錯体が好ましい。水溶性のポルフィリン白金錯体として、例えば下記式（２）で表されるＰｔ（ＩＩ）−メソ−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＰｔＴＣＰＰ）を挙げることができる。
【化２】
2015175681.tif 000004
【００１３】
例えば、イリジウム錯体の配位子としては、２−フェニルピリジン誘導体、ビピリジン誘導体を挙げることができる。
【００１４】
例えば、ルテニウム錯体の配位子としては、ビピリジン誘導体、フェナンスロリン誘導体を挙げることができる。
【００１５】
例えば、オスミウム錯体の配位子としては、ビピリジン誘導体、フェナンスロリン誘導体、カルボニル誘導体を挙げることができる。
【００１６】
《酸素透過性ビーズ》
前記リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズは、酸素透過性である限りにおいて限定されるものではないが、ポリマービーズ、又はゲルビーズを挙げることができるが、ポリマービーズ、又はゲルビーズは、生体適合性が高いため、本発明に好ましく用いることができる。なお、本明細書において、ゲルビーズはシリカゲル又はアルミナを含む。
【００１７】
前記ポリマービーズの原料となるポリマーとしては、ポリスチレン、臭化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリ塩化ビニルベンジル、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリスルホン、ポリトリメチルシリルプロピン及びそれらの組み合わせ、並びにコポリマーからなる群より選択されるポリマーを挙げることができるが、好ましくはポリスチレン、又はポリトリメチルシリルプロピンである。
【００１８】
《リン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズの製造方法》
本発明のリン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズは、リン光性色素分子をビーズに含有させることを除いては、公知の方法によって製造することができる。
【００１９】
例えば、ポリマービーズの調整法としては、液中乾燥法、コアセルベーション法、噴霧乾燥法、in situ重合法、又は界面重合法を挙げることができ、低コストかつ短時間でビーズを調製することができることから液中乾燥法が好ましい。
【００２０】
液中乾燥法は、低沸点の有機溶媒にポリマーおよび芯物質を溶解し、親水性コロイドまたは活性剤を含む連続相中に加えて安定なO/Wエマルジョンを形成させた後に、減圧または加熱によって有機溶媒を除去して皮膜を作る方法である。具体的には、ビーズを形成するポリマーを溶解した溶液を、相溶性のない溶媒に添加・混合する。その後、ポリマーを溶解している溶媒を蒸発・除去することによって、溶解していたポリマーが析出しながら球状のビーズが形成することができる。
【００２１】
コアセルベーション法は、相分離とそれに基づく界面化学的な変化を利用する方法である。例えば、ビーズ壁を形成する物質を油相に溶解し、ここに芯物質となる水相をはげしい攪拌によって微小滴とし分散させる。このようなW/O分散系の油相にカプセル壁物質をよく溶かすことのできない液体（貧溶媒）を注入することによって、壁物質の溶解度が低下し、壁物質が微小滴をとり囲むように析出し、ビーズを形成することができる。
【００２２】
噴霧乾燥法は、芯物質（微粒子の固体や液体）を，ビーズ壁となる物質を溶かした液体に投入し、噴霧状にして，熱風中に吹き出す。これによって、ビーズ壁物質を溶かしている液体が蒸発するためにビーズ壁物質が残り，ビーズを形成することができる。
【００２３】
界面重合法は界面における重合反応をビーズ形成に利用するものである。例えば、油溶性モノマーとしては酸クロライド、セバコイルクロライド、テレフタル酸クロライド、水溶性モノマーとしてポリアミン、ポリフェノールを用い、ビーズ壁物質としてポリアミドやポリエーテルを用いて重合反応を起こすことによってビーズを形成することができる。
【００２４】
In situ重合法は、外殻用樹脂の原料モノマー、開始剤等を、分散相の内相または外相の一方から供給し、重合により外殻を形成してビーズを得ることができる。
【００２５】
本発明のビーズの粒径（直径）は、酸素濃度の測定ができる限りにおいて、特に限定されるものではなく、酸素濃度を測定する局所環境に応じて、適宜決定することができる。例えば、細胞内の酸素濃度と培地の酸素濃度とを同時に測定したい場合は、細胞程度の大きさを有していることが好ましく、例えば直径７μｍ以上が好ましい。また、６μｍ以下のビーズは、培地中では動きやすいため、リン光寿命の測定が困難になる場合がある。この点からも直径７μｍ以上のビーズが好ましい。また、粒径の上限は、特に限定されるものではないが、酸素透過性の観点から１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下が更に好ましい。
【００２６】
ビーズに含まれるリン光性色素分子の含有量（濃度）は、リン光性色素分子の種類、及び酸素濃度を測定する局所環境に応じて適宜、変更することが可能であるが、例えば細胞内の酸素濃度と培地中の酸素濃度を比較する場合は、同程度のりん光の発光強度が得られることが好ましい。このようなりん光強度とするために、リン光性色素分子の含有量（濃度）を調節することは、過度の負担なく行うことができる。
【００２７】
本明細書における「酸素透過性」は、酸素濃度の測定が可能な限りにおいて、特に限定されるものではない。
【００２８】
［２］酸素濃度の測定方法
本発明の酸素濃度の測定方法は、前記酸素透過性ビーズを、酸素濃度測定対象に載置する工程；及び酸素透過性ビーズに励起光を照射し、リン光性色素分子のリン光強度又はリン光寿命を測定する工程；を含む。
【００２９】
《載置工程》
本発明の酸素濃度の測定方法においては、酸素透過性ビーズを、酸素濃度測定対象に載置する。
本明細書において「酸素透過性ビーズを、酸素濃度測定対象に載置する」とは、酸素透過性ビーズを測定対象に置くことを意味し、例えば測定対象が細胞培養用培地であれば、細胞培養用培地に投入することを意味し、酸素透過性ビーズの周囲の培地の酸素濃度を測定することができる。また、例えば測定対象が密封された気体であれば、その気体中に投入することを意味し、酸素透過性ビーズの周囲の気体の酸素濃度を測定することができる。
【００３０】
酸素濃度測定対象は、特に限定されることはなく、例えば液相又は気相の酸素濃度を測定することが可能である。液相としては、細胞培養用培地を挙げることができる。
【００３１】
《測定工程》
測定工程においては、酸素透過性ビーズに励起光を照射し、リン光性色素分子のリン光寿命又はリン光強度を測定する。
リン光寿命の測定は、例えばＺ軸分解能を有する共焦点光学顕微鏡を用いて行うことができる。図２に示すように、酸素透過性ビーズにパルスレーザーにより励起光を照射し、リン光の寿命を検出器によって検出する。具体的には、リン光寿命の測定は、時間相関単一光子係数法を用いて行う。時間相関単一光子係数法は、一回の励起事象による光子一個の発光確率分布が、励起によって発する全光子の時間軸上での実際の強度分布になるという概念に基づく寿命測定法である。パルス光源を単一光子係数レベルになるように光量を調節し、試料を励起し、生じた光子を光電子増倍管（ＰＭＴ）で検出する。このとき、パルス光源と同期した信号がスタート信号、ＰＭＴで光子を検出したときに出る信号がストップ信号となる。時間電圧変換器（ＴＡＣ）は、この二つの信号を検出し、その時間に比例した大きさの電圧パルスを出力する。この電圧パルスを波高分析器（ＰＨＡ）で検出することで、光子の到着時間を求める。こうして得られた光子到着時間確率分布を解析し、リン光寿命を導き出すことができる。
【００３２】
リン光強度の測定は、一般的な蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。リン光寿命の測定と同じように、酸素透過性ビーズを励起し、リン光の強度を検出器によって検出する。
【００３３】
本発明の酸素濃度の測定方法における測定温度は、特に限定されるものではなく、測定環境に応じて、所望の測定温度で測定することができる。例えば、細胞培養における培地の酸素濃度を測定する場合、一般的に培養温度として、１０〜４０℃程度の温度範囲を用いること多く、そのような測定温度で測定する。後述の実施例に示すように、本発明の酸素濃度の測定方法は温度変化の影響を受けにくいものであり、広い範囲の測定温度で、酸素濃度を測定することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
《実施例１》
本実施例では、リン光性色素分子としてＰｔ（ＩＩ）−オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）を、ビーズの原料としてポリスチレン（ＰＳ）を用いて、液中乾燥法により、酸素センシングビーズを調製した。
ジクロロメタンに、ＰｔＯＥＰを終濃度が６．５μＭ、ＰＳの終濃度が１．１ｍｇ／ｍＬ又は１．３ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、ＰｔＯＥＰ−ＰＳ混合溶液を得た。１Ｌビーカーに、５ｇ／ＬのＰＶＡ水溶液７００ｍＬ及びジクロロメタン１３０ｍＬを加え激しく攪拌した。この撹拌によって、ＰｔＯＥＰ及びＰＳの混合溶液からのジクロロメタンの蒸発速度を制御した。前記ＰＶＡ−ジクロロメタン溶液に、ＰｔＯＥＰ−ＰＳ混合溶液１０ｍＬを液滴が生じる速度で素早く滴下した。遮光下で２０時間攪拌することによって、懸濁液中のジクロロメタンを蒸発させた。遠心分離（３５００ｘｇ、５ｍｉｎ）により沈殿物を回収し、ＲＯ水で洗浄することによってＰｔＯＥＰを内包したポリスチレンビーズを得た。図３（ａ）にＰＳ濃度が１．１ｍｇ／ｍＬで得られたポリスチレンビーズ（ａ）を示し、図３（ｂ）にＰＳ濃度が１．３ｍｇ／ｍＬで得られたポリスチレンビーズ（ｂ）を示す。
ポリスチレンビーズ（ａ）の粒子径は２−１０μｍに分布し、平均粒子径は４μｍであった。ポリスチレンビーズ（ｂ）の粒子径は２−１２μｍに分布し、平均粒子径は７μｍだった。ＰＳの濃度を変化させることにより、粒子径を制御することができた。顕微鏡での観察から、６μｍ以下の粒子は溶液添加などの外部刺激により動きやすく、外部刺激に応答した細胞内の酸素濃度変化を観察するためには適さないと考えられた。このため、実施例２以降では、平均粒子径７μｍの酸素センシングビーズを使用した。
【００３６】
《実施例２》
本実施例では、実施例１で製造した酸素センシングビーズを用いて、細胞培養用の培地の酸素濃度を測定した。
細胞培養ステージにＲＯ水を注入し、酸素濃度を０、１、５、１０、１５、及び２０％に調整した。酸素濃度０％は、細胞培養ステージ内に１００％窒素ガス噴射下により制御し、１〜２０％の酸素濃度はガス混合装置を用いて制御した。なお、ＣＯ２濃度は５％に制御した。
細胞培養ステージに酸素センシングビーズを投入し、以下の共焦点光学システムにより、リン光寿命を測定した。
（共焦点光学システム）
Becker&Hickl社製2チャンネル共焦点ガルバノスキャナーユニット（DCS-120sci）、ガルバノスキャナー電源・信号増幅ユニット（GDA-120）、シングルフォトンカウンティングPMT検出器（HPM-100-40）、ピコ秒パルス半導体レーザー（BDL-405-SMC）、時間相関シングルフォトンカウンティングユニット（SIMPLE-TAU-150-DX）、イメージ解析用ソフトウェア（SPC-image）、ガルバノスキャナー制御モジュール（GVD-120）、検出器制御モジュール（DCC-100）、ケーブル、接続BOXセット（CSET-DCS-BOX-150）、対物レンズ用ピエゾアクチュエーター（Miops100PLSG-TII）
【００３７】
ＲＯ水中での酸素センシングビーズの各酸素濃度でのリン光寿命イメージを図４に示した。本共焦点光学システムによるリン光寿命イメージング画像では、リン光寿命に応じた疑似カラーで表現され、リン光寿命が短寿命のものは赤く、長寿命のものは青く表現されている。図４の画像は、リン光寿命が１０−７０μｓの箇所を赤色〜青色で表示しており、リン光寿命が短寿命であるほど酸素濃度が高いことを示している。従って、リン光寿命イメージング画像では、高酸素濃度の領域は赤く、低酸素濃度の領域は青く表現されている。図４に示されているように、低酸素下のビーズは青く、酸素濃度が上昇するにしたがって赤くなり、本発明によって、液体中の酸素濃度が測定可能であること示された。
【００３８】
《実施例３》
本実施例では、酸素センシングビーズの酸素濃度測定の温度依存性について検討した。
ＲＯ水の温度を２０℃〜４０℃の範囲としたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。なお、酸素濃度は大気圧の２０％とした。結果を図５に示す。
２０〜４０℃の温度範囲において、酸素センシングビーズのリン光寿命は温度に依存しなかった。すなわち、酸素センシングビーズを用いた酸素濃度測定は、２０〜４０℃の温度域では、温度に依存しない測定が可能である。従って、薬剤添加などの際に微小な温度変化があっても、酸素センシングビーズを用いた酸素濃度測定法は有効である。
【００３９】
《実施例４》
本実施例では、外部からの培地を添加する場合の酸素濃度の変化を測定した。すなわち、あらかじめ低酸素にした培地内に、新たに培地を添加することによる培地内酸素濃度変化を測定した。酸素センシングビーズを含む培地を添加した８ウエルカバーグラスチェンバーを、５％ＣＯ２、１０％Ｏ２に制御した細胞培養ステージ内で１時間インキュベートした。このチェンバーの培地に、細胞培養ステージ内でインキュベートしていない培地を送液した。リン光寿命の測定は、実施例２の操作を繰り返した。結果を図６に示す。
送液により、培地内の酸素センシングビーズのリン光寿命は一時的に短くなり、その後長くなった。この結果から、培地内酸素濃度は空気飽和の培地の送液により、酸素濃度が一端上昇し、その後、時間経過に従い初期の酸素濃度に戻っていった。これらの結果から、低酸素化においた培地に、大気下の培地を新たに添加することで酸素濃度が上昇することを、本発明の酸素センシングビーズでモニタリングすることが可能であった。
【００４０】
《実施例５》
本実施例では、褐色脂肪細胞を用い、細胞内酸素濃度イメージングと、細胞周辺環境の酸素濃度のイメージングを同時に行った。
ディープフリーザーで保存した３代目ラット褐色脂肪前駆体細胞を、コラーゲンコートした８ウエルカバーグラスチェンバーに細胞密度２ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２で播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。培養１日後、増殖培地に培地交換し、９０％コンフルエントになったことを確認し、更に分化誘導用培地に培地交換した。分化誘導用培地には、増殖用培地に２５μＭデキサメタゾン、１０μｇ／ｍＬインシュリンを添加したものを用いた。分化誘導用培地で２日間培養後、維持培地に交換した。維持培地には、増殖用培地に１０μｇ／ｍＬインシュリンを添加したものを用いた。維持培地に交換後、５〜７日間培養を行い実験に使用した。
分化誘導を行った褐色脂肪細胞の中で、十分脂肪滴を蓄積させた細胞を用いた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で二回洗浄した後、１０μＭのＰｔ（ＩＩ）−メソ−テトラキス（カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＰｔＴＣＰＰ）を含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地（高グルコース）を各ウエルに３５０μＬずつ添加し、２時間、３７℃、５％ＣＯ２環境下でインキュベートした。その後、ＰｔＴＣＰＰ含有培地を捨て、再びＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地を２００μＬ添加した。さらに１ｍｇ／ｍＬ酸素センシングビーズ含有ＤＭＥＭ培地５０μＬを添加し、褐色脂肪細胞及び酸素センシングビーズのリン光寿命を観察した。リン光寿命の測定は、実施例２と同じように行った。結果を図７に示す。
【００４１】
図７の左の写真には、酸素センシングビーズ、分化の進んだ褐色脂肪細胞、及び分化が進んでいない褐色脂肪細胞が確認される。分化の進んだ褐色脂肪細胞は、細胞内部に脂肪滴が蓄積されており、分化が進んでいない褐色脂肪細胞は脂肪滴がないのが分かる。脂肪滴にはＰｔＴＣＰＰは取り込まれず、発光が見られず黒く抜けているが、細胞内および酸素センシングビーズからのリン光が観察された。また、分化が進んでおらず脂肪滴がない細胞に比べ、分化が進み大きな脂肪滴を蓄積している細胞は、リン光寿命が長くなっている。この結果から、分化が進んでいる細胞は細胞内酸素濃度が低くなることが分かった。また、細胞近傍の酸素センシングビーズのリン光寿命は１５−１７μｓであった。この値は、２０％Ｏ２下の培地中の酸素センシングビーズのリン光寿命と等しく、褐色脂肪細胞を培養している培地中の酸素濃度は、２０％Ｏ２下での培地内酸素濃度と変わらなかった。従って、細胞周辺環境酸素濃度イメージング及び細胞内酸素濃度イメージングの同時測定法が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のリン光性色素分子を含む酸素透過性ビーズ及びそれを用いた酸素濃度の測定方法により、細胞培養用の培地などの液体又は気体中の酸素濃度を容易に測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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