(57)【要約】      （修正有）【課題】対象において異常なモエシン活性化と関連している障害または病的状態である呼吸器系または臓器の線維症、すなわち肺線維症、嚢胞性線維症、硬変、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、クローン病、ケロイド、全身性硬化症または進行性塊状線維症を治療するための組成物の提供。【解決手段】モエシン阻害剤としてヒトモエシンのＣ末端テールドメインと結合する単離抗体を含む組成物、または第２の治療薬であるサイトカインとともに対象に投与される該組成物。【選択図】図３
2015221810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において異常なモエシン活性化と関連している障害または病的状態を治療するための組成物であって、モエシン阻害剤としてヒトモエシンのＣ末端テールドメインと結合する単離抗体を含み、前記障害または病的状態が呼吸器系または臓器の線維症と関連している組成物。
【請求項２】
臓器の線維症が、肺線維症、嚢胞性線維症、硬変、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、クローン病、ケロイド、全身性硬化症または進行性塊状線維症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
障害または病的状態が、肺動脈性肺高血圧症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
有効量の、モエシン阻害剤との組合せ使用に適した第２の治療薬とともに対象に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
第２の治療薬が、サイトカインである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
サイトカインが、炎症促進性サイトカインである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
炎症促進性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１またはＩＬ−６である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
モエシン阻害剤が、上皮または内皮細胞の増殖を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
モエシン阻害剤が、上皮または内皮細胞のアポトーシスを促進する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
対象において異常なモエシン活性化と関連している障害または病的状態を治療するための医薬組成物であって、モエシン阻害剤としてヒトモエシンのＣ末端テールドメインと結合する単離抗体および担体を含み、前記障害または病的状態が呼吸器系または臓器の線維症と関連している医薬組成物。
【請求項１１】
第２の治療薬をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
第２の治療薬が、サイトカインである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
サイトカインが、炎症促進性サイトカインである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
炎症促進性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１またはＩＬ−６である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、概して、分子生物学および医薬の分野に関する。より具体的には、本願は、モエシン活性および関連状態をモジュレートするための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜組織化伸張スパイクタンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を表すモエシンは、膜結合細胞内タンパク質であり、最初、ウシ子宮において同定され、ヘパリンの可能性ある受容体として特性決定された。Ｌａｎｋｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２５１：８３１〜４２頁（１９８８年）。全長天然ヒトモエシンは、５７７個のアミノ酸を有し、約７５ｋＤの分子量を有する。マウスモエシンと約９８．３％配列同一性を共有している。Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｓｃｉ．１０３：１３１〜１４３頁（１９９２年）。
【０００３】
さらなる研究によって、モエシンは、エズリン−ラディキシン−モエシン（ＥＲＭ）タンパク質ファミリーのメンバーとして特性決定された。これらは、主に細胞質において発現され、アクチンリッチな細胞表面構造において濃縮されるタンパク質である。ＥＲＭタンパク質の配列および構造解析によって、それらが高度の種間および分子間相同性を共有することが示された。ＥＲＭタンパク質は、３つのドメイン：バンド４．１タンパク質とのその相同性のためにＦＥＲＭドメイン（バンド４．１、エズリン、ラディキシン、モエシン（ｂａｎｄ  ｆｏｕｒ−ｐｏｉｎｔ−ｏｎｅ，  ｅｚｒｉｎ，  ｒａｄｉｘｉｎ，  ｍｏｅｓｉｎ）相同性ドメイン）と呼ばれるＮ末端ドメインと、中央のヘリックスドメインと、Ｃ末端のテールドメインとを有する。Ｃ末端テールドメインが、Ｆ−アクチンと結合する一方で、Ｎ末端ＦＥＲＭドメインは、細胞膜において接着分子との結合に関与している。Ｌｏｕｖｅｔ−Ｖａｌｌｅｅ（２０００年）。
【０００４】
ＥＲＭタンパク質の機能は、Ｎ末端ＦＥＲＭドメインとＣ末端テールドメインの間の分子内相互作用によって調節される。Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  １０１：２５９〜７０頁（２０００年）；Ｌｏｕｖｅｔ−Ｖａｌｌｅｅ（２０００年）。ＥＲＭタンパク質は、活性の点で２つの状態：休止状態および活性状態で存在する。活性形態は、細胞間相互作用に関与しており、休止形態は、細胞質中に存在する。これらの２つの状態間の相違は、タンパク質のコンホメーションに応じて異なる。休止形態では、ＦＥＲＭドメインは、テールドメインと堅く結合しており、各ドメイン上のその他の分子の結合部位を相互にマスクしている。中央のヘリックスドメインは、柔軟に屈曲するものとして働き、２つの末端ドメインが届き、結合することを可能にする。休止モエシンは、堅く結合された構造が開くと活性化され、ＦＥＲＭドメインは、特異的な膜タンパク質と結合することによって膜に付着し、Ｃ末端テールドメインの最後の３４個の残基は、アクチンフィラメントと結合する。
【０００５】
テールドメイン内には、モエシンの位置５５８にトレオニン残基が存在し（Ｔｈｒ５５８）（ラディキシンの位置５６４およびエズリンの５６７）、そのリン酸化は、ＥＲＭタンパク質の活性化において主要な役割を果たすとわかっている。Ｐｅａｒｓｏｎら．（２０００年）。Ｔｈｒ５５８のリン酸化によって、リン脂質の存在下で、ＦＥＲＭ／テール相互作用が弱くなり、相対的ドメイン上の膜タンパク質およびＦ−アクチン結合部位を露出させる。さらに、活性化ＦＥＲＭドメインはまた、Ｒｈｏシグナル伝達経路にも関与している。Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３３７１〜５頁（１９９７年）。モエシンでは、Ｔｈｒ５５８は、ｒｈｏ関連コイルドコイル形成プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）によってリン酸化されると考えられている。Ｏｓｈｉｒｏら．Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４６６３〜６頁（１９９８年）。Ｔｈｒ５５８リン酸化を引き起こすとわかっているその他のプロテインキナーゼとして、それだけには限らないが、ＰＫＣ、ＰＩＰ５ＫＩａ、Ｐ３８およびＳｌｉｋが挙げられる。Ｈｉｐｆｎｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８：２２４３〜８頁（２００４年）。
【０００６】
モエシンおよびその他のＥＲＭタンパク質の存在および機能は、多数の生理学的状態ならびに病的状態に関与している。それらは、細胞膜とアクチン細胞骨格間の構造的リンカーとして作用し、微絨毛の形成、細胞間接着、細胞形状の維持、細胞移動度および膜輸送において役割を果たす。その後の研究によって、それらが、Ｒｈｏ経路、ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ経路およびＣＤ１４経路を含めた多数のシグナル伝達経路にも関与していることが示された。Ｌｏｕｖｅｔ−Ｖａｌｌｅｅ、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９２：３０５〜１６頁（２０００年）；Ｔｈｏｍｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：３２１５頁（１９９９年）。モエシンは、ある特定の癌の成長および転移において役割を果たすと示唆されている。
【０００７】
モエシンはまた、自己免疫疾患とも関連している。Ｗａｇａｔｓｕｍａらは、関節リウマチ（ＲＡ）の患者における抗ＥＲＭ自己抗体の検出を報告した。Ｗａｇａｔｓｕｍａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１１７１〜６頁（１９９６年）。試験された７１人の患者の血清のうち、２４サンプル（３３．８％）が、組換えＥＲＭ抗原のうち少なくとも１種と反応し、１０サンプル（１４％）が、組換えモエシンだけと反応した。しかし、その研究は、抗ＥＲＭ抗体の存在と、疾患の期間またはステージなどの臨床症状の間に有意な相関を見出さなかった。さらに、原発性シェーグレン症候群（ＰＳＳ）および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）などのその他の自己免疫疾患の患者から得た血清は、３種のＥＲＭタンパク質との反応性を全く示さなかった。
【０００８】
Ｔａｋａｍａｔｓｕらは、後天性再生不良性貧血（ＡＡ）の患者の血清におけるモエシンに対する特異的抗体の検出を報告した。Ｔａｋａｍａｔｓｕら、Ｂｌｏｏｄ  １０９：２５１４〜２０頁（２００７年）。ＥＬＩＳＡを使用して、６７人中２５人（３７％）のＡＡ患者において、高力価の抗モエシン抗体が示された。さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、ＡＡ患者から得た抗モエシン抗体が、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインを誘導することが示され、このことは、疾患の病態生理におけるその役割を示唆した。Ｅｓｐｉｎｏｚａら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕ．２１：９１３〜２３頁（２００９年）；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：７０３頁（２００９年）。
【０００９】
複数の生理学的および病的状況におけるヒトモエシンタンパク質の複雑な重要な機能を考えると、モエシン活性をモジュレートできる臨床的に関連する分子実体ならびにそれを製造し使用する方法を探索することが望ましい。本明細書に記載された本願は、これらの利益およびその他の利益を提供する。
【００１０】
特許出願および刊行物を含めた、本明細書において引用されるすべての参考文献は、その全文が参照により組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてモエシン活性をモジュレートするための組成物および方法を提供する。一実施形態では、モエシン機能は、モエシン活性化の阻害によってモジュレートされる。モエシンモジュレーターは、癌、線維症および呼吸器障害などのモエシンの異常な活性化と関連している障害および病的状態を治療するために治療上使用できる。一実施形態では、モエシンモジュレーターは、ヒトモエシンの
Ｃ末端テールドメインと結合する単離抗体である。一実施形態では、モエシンテールドメインとの抗体の結合は、テールドメイン内のＴｈｒ５５８のリン酸化に干渉するか、または遮断し、それによって、モエシンが活性化されるのを遮断する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様では、モエシンモジュレーターは、ヒトモエシンのＣ末端テールドメイン（配列番号１）の少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を有する末端切断型モエシン断片を含む。このような断片は、Ｔｈｒ５５８リン酸化のための天然モエシンの、そのプロテインキナーゼとの相互作用に、競合結合によって干渉し、それによって、天然モエシンが活性化されるのを遮断できる。
【００１３】
ヒトモエシンのＣ末端テールドメインアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＨＶＡＥＰＡＥＮＥＱＤＥＱＤＥＮＧＡＥＡＳＡＤＬＲＡＤＡＭＡＫＤＲＳＥＥＥＲＴＴＥＡＥＫＮＥＲＶＱＫＨＬＫＡＬＴＳＥＬＡＮＡＲＤＥＳＫＫＴＡＮＤＭＩＨＡＥＮＭＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲＩＤＥＦＥＳＭ（配列番号１）
【００１４】
一実施形態では、モエシン断片モジュレーターは、Ｔｈｒ５５８部位の周囲の残基、例えば、配列ＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ（配列番号２）を含む。
【００１５】
一態様では、モエシンモジュレーターは、ヒトモエシンのＴｈｒ５５８のリン酸化に干渉できる小分子化合物を含む。このような小分子阻害剤は、Ｔｈｒ５５８部位と直接結合し、遮断する場合も、コンホメーション変化または障害（ｈｉｎｄｒａｎｃｅｓ）を引き起こすモエシン上の位置と結合する場合もあり、それによって、Ｔｈｒ５５８部位をプロテインキナーゼとの結合から遮断する。
【００１６】
一実施形態では、本願のモエシンモジュレーターは、モエシンの、その結合パートナー（例えば、構造タンパク質またはモエシン基質）との相互作用に干渉し、それによって、細胞骨格またはそのシグナル伝達経路におけるモエシンの構造的役割を混乱させる。
【００１７】
一態様では、本願のモエシンモジュレーターは、細胞傷害性薬剤などの毒素と連結される。これらの分子／物質は、放射線照射および／または化学療法薬などの付加薬剤／増強剤と組み合わせて処方または投与されてもよい。
【００１８】
本願はまた、モエシンの異常な活性化と関連している疾患または病的状態をモジュレートするのに有用な方法を提供する。したがって、一態様では、本願は、対象においてモエシン活性化をモジュレートする方法を提供し、前記方法は、対象に、Ｔｈｒ５５８のリン酸化を阻害する本願のモジュレーター分子を投与し、それによって、モエシン活性化がモジュレートされるステップを含む。
【００１９】
モエシンは、例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞遊走、細胞形態形成および細胞アポトーシスを含めた、多数の生物学的および生理学的機能にとって重要である複数の細胞構造およびシグナル伝達経路に関与している。したがって、別の態様では、本願は、モエシンに活性化される細胞成長（例えば、増殖および／または生存）を阻害する方法を提供し、前記方法は、細胞または組織を、本願のモエシンモジュレーターと接触させ、それによって、モエシン活性化と関連している細胞増殖が阻害されるステップを含む。さらに別の態様では、本願は、モエシンによって活性化される細胞増殖を阻害する方法を提供し、前記方法は、細胞または組織を、有効量の本願のモジュレーター分子と接触させ、それによって、モエシン活性化と関連している細胞増殖が阻害されるステップを含む。
【００２０】
一実施形態では、本願は、細胞または組織においてアポトーシスを誘導または促進する
方法を提供し、前記方法は、標的細胞または組織を、有効量の本願のモジュレーター分子と接触させ、それによって、細胞または組織のアポトーシスを誘導または促進するステップを含む。標的細胞または組織は、癌性細胞／組織、上皮細胞／組織または内皮細胞／組織であり得る。
【００２１】
一態様では、本願は、対象において異常なモエシン活性化と関連している病的状態を治療する方法を提供し；前記方法は、対象に、有効量の本願のモジュレーター分子を投与し、それによって、前記状態が治療されるステップを含む。
【００２２】
一態様では、本願は、モエシンの異常な活性化を有する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳類を治療的に治療する方法を提供し、前記方法は、前記哺乳類に、有効量の本願のモジュレーター分子を投与し、それによって、前記哺乳類を効果的に治療するステップを含む。
【００２３】
一態様では、本願は、モエシンの異常な活性化と関連している細胞増殖性障害を治療または予防する方法を提供し、前記方法は、このような治療を必要とする対象に、有効量の本願のモジュレーター分子を投与し、それによって、前記細胞増殖性障害を効果的に治療または予防するステップを含む。一実施形態では、前記増殖性障害は、癌である。さらに別の実施形態では、前記増殖性障害は、肺線維症、嚢胞性線維症、硬変、心内膜心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、クローン病、ケロイド、全身性硬化症または進行性塊状線維症などの臓器線維症である。
【００２４】
一実施形態では、本願の方法において標的とされる細胞は、癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭癌腫細胞（例えば、甲状腺の）、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨肉腫細胞、腎癌腫細胞、肝細胞癌腫細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌腫細胞、頭頸部扁平上皮癌腫細胞、黒色腫細胞および白血病細胞からなる群から選択されるものであり得る。一実施形態では、本願の方法において標的とされる細胞は、過剰増殖および／または過形成性細胞である。一実施形態では、本願の方法において標的とされる細胞は、異形成細胞である。さらに別の実施形態では、本願の方法において標的とされる細胞は、転移性細胞である。
【００２５】
本願の組成物は、追加の治療薬と組み合わせて使用してもよい。一実施形態では、本願の組成物は、炎症促進性サイトカインなどの１種または複数のサイトカインと組み合わせて使用してもよい。本願の組成物との組合せにおいて有用な炎症促進性サイトカインの例として、それだけには限らないが、ＴＮＦ（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、ＩＬ−１およびＩＬ−６が挙げられる。一実施形態では、本願の治療の方法は、標的とされる細胞および／または組織（例えば、癌細胞）が、放射線照射治療、化学療法薬またはその他の細胞傷害性薬剤に曝されるステップをさらに含む。
【００２６】
一態様では、本願は、本願の１種または複数のモジュレーター分子および担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、担体は、薬学的に許容される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】全長ヒトモエシンタンパク質のアミノ酸配列を示す図である（配列番号３）。
【図１Ｂ】全長ヒトモエシンタンパク質のｃＤＮＡ配列（配列番号４）を示す図であり、下線は、Ｃ末端テールドメインをコードする核酸配列を示す。
【図２Ａ】ｐＥＴ３２ａ（＋）の制限およびクローニングマップである。
【図２Ｂ】ｐＥＴ２８ａ（＋）の制限およびクローニングマップである。
【図３】ＴＮＦ−α（群１）、全長モエシンに対する抗体（群２）、モエシンタンパク質のＣ末端テールドメインに対する抗体（群３）、ＴＮＦ−αおよび全長モエシンに対する抗体（群４）、ＴＮＦ−αおよびモエシンタンパク質のＣ末端テールドメインに対する抗体（群５）およびＰＢＳ溶液（群６）を用いる治療後のＨＰＭＥＣ細胞の増殖速度を示すグラフである。
【図４Ａ】群１〜６を用いる治療後のＨＰＭＥＣ細胞の早期アポトーシスを示すグラフである。
【図４Ｂ】群１〜６を用いる治療後の後期アポトーシスおよび死滅ＨＰＭＥＣ細胞を示すグラフである。
【図５Ａ】３６時間インキュベートされたＨＰＭＥＣ対照細胞の電子顕微鏡写真（×６０００）である。
【図５Ｂ】ＴＮＦ−α単独を用いて３６時間処理されたＨＰＭＥＣ細胞の電子顕微鏡写真（×６０００）である。
【図５Ｃ】ＴＮＦ−αおよび全長モエシンに対する抗体を用いて３６時間処理されたＨＰＭＥＣ細胞の電子顕微鏡写真（×６０００）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本願の実施では、別段に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年および定期的更新）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）などの文献において十分に説明されている。本願において使用されるプライマー、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当技術分野で公知の標準技術を使用して作製できる。
【００２９】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４年）およびＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９２年）は、当業者に、本願において使用される用語の多くの一般指針を提供する。
【００３０】
定義
用語「モエシン」は、ＬａｎｋｅｓおよびＦｕｒｔｈｍａｙｒ（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：８２９７〜８３０１頁に記載されるように、ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎを表す。全長ヒトモエシンタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列（図１）を有する５７７個のアミノ酸のポリペプチドである。モエシンタンパク質は、以下に詳細に定義される、３つのドメイン：Ｎ末端ＦＥＲＭドメイン、ヘリックスドメインおよびＣ末端テールドメインからなる。それは、ＥＲＭ（エズリン−ラディキシン−モエシン）ファミリーに属する。３種のＥＲＭタンパク質は、細胞膜のすぐ下の細胞質において主に
発現され、高度の配列相同性を共有し、細胞膜とアクチン細胞骨格間を連結するタンパク質として作用する。さらに、ヒトモエシンタンパク質は、マウスおよびウシモエシンなどのその他の種に由来するモエシンと高度の配列相同性を共有する。Ｓａｔｏら（１９９２年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０３：１３１〜１４３頁。
【００３１】
用語「末端切断型モエシン断片」とは、全長野生型モエシンタンパク質よりも短いモエシンポリペプチドの一部を指す。特に、この用語は、モエシンの特別なドメイン（以下でさらに詳述される、Ｎ末端ＦＥＲＭドメイン、ヘリックスドメインまたはＣ末端テールドメイン）内のアミノ酸配列を有する、１０個のアミノ酸またはそれ以上のポリペプチドを包含する。ドメイン特異的抗モエシン自己抗体と結合できるこのようなモエシン断片は、本願において有用である。
【００３２】
ヒトモエシンタンパク質の「Ｎ末端ＦＥＲＭドメイン」とは、タンパク質のアミノ末端に構造的に近接し、タンパク質の細胞膜への局在化および接着分子との相互作用に機能的に関与する野生型ヒトモエシンタンパク質の球状部分を指す。ＦＥＲＭドメインは、バンド４．１タンパク質とのその相同性のために、ｂａｎｄ  ｆｏｕｒ−ｐｏｉｎｔ−ｏｎｅ，ｅｚｒｉｎ，ｒａｄｉｘｉｎ，ｍｏｅｓｉｎ相同性ドメインを表し、バンド４．１スーパーファミリーのメンバーを定義し、これは、赤血球バンド４．１、タリンおよびエズリン−ラディキシン−モエシン（ＥＲＭ）タンパク質ファミリーなどの細胞骨格タンパク質ならびにいくつかのチロシンキナーゼおよびホスファターゼおよび腫瘍抑制タンパク質マーリンを含む。具体的には、この用語は、成熟型のヒトモエシンタンパク質の最初の約２９７個のアミノ酸残基（例えば、アミノ酸残基１〜２９７）を指す。ある特定の文献では、同じドメインが、Ｎ−ＥＲＭ関連ドメイン（Ｎ−ＥＲＭＡＤ）としても知られており、これは本明細書における定義に含まれる。Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒら（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４、１６８３０〜７頁。
【００３３】
ヒトモエシンタンパク質の「Ｃ末端テールドメイン」とは、タンパク質のカルボキシ末端に構造的に近接し、アクチンフィラメントとの結合およびそれとの相互作用に機能的に関与している野生型ヒトモエシンタンパク質の一部を指す。モエシンのテールドメインは、正に帯電しており、伸びた、メアンダー（ｍｅａｎｄｅｒｉｎｇ）構造をとる。具体的には、この用語は、ヒトモエシンタンパク質の最後の約１０７個のアミノ酸残基（例えば、アミノ酸残基４７１〜５７７）を指す。ある特定の文献では、同じドメインが、Ｃ−ＥＲＭ関連ドメイン（Ｃ−ＥＲＭＡＤ）としても知られており、これは本明細書における定義に含まれる。Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒら（１９９５年）。Ｃ末端テールドメインの最後の３４個のアミノ酸残基は、ＥＲＭタンパク質の中で高度に保存されており、Ｆ−アクチンとの結合のための領域を形成する。Ｆ−アクチン結合領域内には、タンパク質の活性化の間にリン酸化されるトレオニン残基が存在する（野生型ヒトモエシン中のＴｈｒ５５８）。
【００３４】
ヒトモエシンタンパク質の「ヘリックスドメイン」とは、Ｎ末端ＦＥＲＭドメインとＣ末端テールドメインの間に存在する野生型ヒトモエシンの中央部分を指す。伸びたαヘリックス構造をとり、２つの末端ドメインの間のリンカーとして作用する。具体的には、この用語は、ヒトモエシンタンパク質のおよそアミノ酸残基２９８〜４７０を包含する領域を指す。
【００３５】
ペプチドまたはポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインし、必要に応じて、最大の配列同一性パーセントを達成するようギャップを導入した後に、保存的置換はいずれも配列同一性の一部として考慮せずに、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたは
Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して当技術分野の技術の範囲内の種々の方法で達成できる。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定できる。
【００３６】
「異常なモエシン活性化と関連している障害または病的状態」とは、対象におけるモエシンの異常な活性化によって引き起こされるか、または促進される障害または状態を指す。少なくとも部分的には、モエシンタンパク質のＣ末端テールドメイン内のＴｈｒ５５８のリン酸化によるモエシンの異常な活性化は、異常な上皮または内皮細胞に関与する疾患の過程および状態に関与している。異常なモエシン活性化と関連している例示的病的状態として、それだけには限らないが、腫瘍成長および転移、臓器および組織の線維症、肺動脈性肺高血圧症および炎症が挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「腫瘍」とは、悪性であろうと、良性であろうと、すべての腫瘍性細胞成長および増殖ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書において言及される場合相互に排他的ではない。
【００３８】
用語「癌」および「癌性」とは、通常、未制御の細胞成長／増殖を特徴とする哺乳類における生理学的条件を指すか、または説明する。癌の例として、それだけには限らないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫、肺の扁平上皮癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫および種々の種類の頭頸部癌が挙げられる。
【００３９】
本明細書において「自己免疫障害」または「自己免疫疾患」とは、個体自身の物質および組織に対して向けられた免疫応答から生じる疾患または障害である。自己免疫疾患または障害の例として、それだけには限らないが、乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含めた炎症性皮膚疾患などの炎症応答；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎など）と関連する応答；呼吸窮迫症候群（成人性呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹および喘息などのアレルギー状態ならびにＴ細胞の浸潤および慢性炎症応答に関与するその他の状態；アテローム性動脈硬化症；白血球接着欠乏症；関節リウマチ；全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）（それだけには限らないが、ループス腎炎、皮膚ループスを含む）；真性糖尿病（例えば、Ｉ型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および脈管炎において通常見られるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連している免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外漏出に関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（それだけには限らないが、クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）またはクームス陽性貧血を含む）；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｂｕｌｌｏｕｓ）；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発ニューロパチー；免疫血小板減少性紫斑病（ＹＩＰ）または自己免疫血小板減少症などが挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「治療」とは、治療されている個体または細胞の自然経過を変更しようとする、予防のためか、または臨床病理の間に実施できる臨床的介入を指す。治療の望ましい効果として、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的病理学的結果の低減、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解または緩和、予後の緩解または改善が挙げられる。一部の実施形態では、本願の抗体は、疾患または障害の発生を遅延するために使用される。
【００４１】
「有効量」とは、所望の治療結果または予防結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。
【００４２】
本願の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの、個体において所望の応答を誘発する能力などの因子に従って変わり得る。治療有効量とはまた、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの治療上有益な効果が、任意の毒性または有害な効果を上回るものである。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずしも必要ではないが、通常、疾患の前か、または疾患の早期ステージでは、対象において予防的用量が使用されるので、予防有効量は、治療有効量よりも少ないものとなる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」とは、薬剤投与と適合する、任意の成分（例えば、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤）を指す。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害または妨げる、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、
Ｐ32およびＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたはその他のインターカレート剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質および小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素（その断片および／または変異体を含む）ならびに以下に開示される種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含むものとする。その他の細胞傷害性薬剤は、以下に記載されている。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００４５】
「化学療法薬」は、癌の治療において有用な化合物である。化学療法薬の例として、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；エチレンイミンおよびアルトレタミンを含めたメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミン；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）および９−アミノ
カンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６頁（１９９４年）参照のこと）などの抗生物質；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体、；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどのアンチアドレナール；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン
；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミンを操作したナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法の略語）などの上記のうち２種以上の組合せならびにＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵおよびロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）と組み合わせて用いる治療レジメンの略語）が挙げられる。
【００４６】
癌の成長を促進し得るホルモンの効果を調節、低減、遮断または阻害するよう作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれ、全身（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）または全身（ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ）治療の形態であることが多い。それらは、それ自身ホルモンである場合もある。例として、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））を含めた抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））などのエストロゲン受容体アンタゴニスト；卵巣を抑制またはシャットダウンするよう機能する薬剤、例えば、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリンなどの黄体（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどのその他の抗アンドロゲン；ならびに副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ホルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））などが挙げられる。さらに、化学療法薬のこのような定義は、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な（ａｂｈｅｒａｎｔ）細胞増殖に関与しているシグナル伝達経路において遺伝子の発現を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ
（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ラパチニブジトシレート（ＧＷ５７２０１６としても知られるＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）などのＣＯＸ−２阻害剤；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。
【００４７】
用語「サイトカイン」は、別の細胞に細胞間メディエーターとして作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例として、リンホカイン、モノカインおよび伝統的なポリペプチドホルモンがある。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン：副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−βおよび−γなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書において使用される場合、用語サイトカインは、天然の供給源に由来するか、または組換え細胞培養物に由来するタンパク質および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。サイトカインのサブセットとして、「炎症促進性サイトカイン」とは、炎症反応を誘導または促進するサイトカインを指す。炎症促進性サイトカインの例として、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１およびＩＬ−６が挙げられる。
【００４８】
「単離」ポリペプチドは、同定され、その天然の環境の混入成分から分離および／または回収されたものである。その天然の環境の混入成分は、ポリペプチドの診断的または治療的使用に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定される、９５重量％超のポリペプチドに、または９９重量％超に、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルーまたは銀染色を使用する還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一性に精製される。単離ポリペプチドは、組換え細胞内の原位置にポリペプチドを含むが、これは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１種の混入成分が存在しないからである。しかし、通常、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００４９】
用語「抗体」は、広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長またはインタクトなモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および所望の生物活性を示す限り、抗体断片（下記参照）に及ぶ。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能性ある突然変異、例えば、微量で存在し得る天然に発生する突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、通常、標的と結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一標的結合性ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから特定のクローンを選択することであり得る。選択した標的結合性配列を、例えば、標的に対する親和性を改善するために、標的結合性配列をヒト化するために、細胞培養におけるその製造を改善するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその免疫原性を低減するために、多重特異性抗体を作製するなどのために、さらに変更してもよいということ、および変更された標的結合性配列を含む抗体も、本願のモノクローナル抗体であるということは理解されなければならない。通常、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加えて、通常、その他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。
【００５１】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体とは、それを、同一抗原と結合するその他の抗体と区別する、その抗体の生物学的特徴のうち１つまたは複数を有するものである。
【００５２】
注目する抗体によって結合される抗原上のエピトープと結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるものなどの日常的なクロスブロッキングアッセイを実施してもよい。
【００５３】
本願のポリペプチドに関して、用語「生物活性」および「生物学的に活性な」とは、分子の、特異的に結合し、細胞応答、例えば、増殖、遊走などを調節する能力を指す。細胞応答はまた、それだけには限らないが、遊走および／または増殖を含めた、受容体によって媒介されるものを含む。この文脈において、用語「モジュレートする」は、促進および阻害の両方を含む。
【００５４】
患者の応答性は、限定するものではないが、（１）減速および完全停止を含めた疾患進行の、ある程度までの阻害、（２）疾患のエピソードおよび／または症状の数の低減、（３）病変の大きさの低減、（４）隣接する末梢臓器および／または組織への疾患細胞浸潤の阻害（すなわち、低減、減速または完全停止）、（５）疾患拡大の阻害（すなわち、低減、減速または完全停止）、（６）障害と関連している１種または複数の症状の、ある程度までの軽減、（７）治療後に疾患がないことを提示する長さの増大、（８）疾患の病変の退縮または消失、例えば、無増悪生存期間をもたらすことがあるが、もたらさなければならないわけではない自己免疫応答の低減、（９）全生存期間の増大、（１０）より高い応答率および／または（１１）治療後の所与の時点での死亡率の低減を含めた患者への利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる。
【００５５】
用語「利益」は、広い意味で使用され、任意の望ましい効果を指す。
【００５６】
本願は、モエシン活性をモジュレートするための、また、上皮細胞の機能障害と関連し
ている障害を治療するための組成物および方法を提供する。当業者に公知の従来法を使用して、本願を実施できる。
【００５７】
モエシン活性のモジュレーター
モエシン活性のモジュレーターは、モエシンの１種または複数の生物活性を摸倣または増強するもの（アゴニスト）およびモエシンの効果を妨げるか、またはそれに干渉するもの（アンタゴニストまたは阻害剤）を含む。一態様では、本明細書に記載されたモエシンモジュレーターは、モエシン阻害剤である。モエシン活性を混乱させる任意の分子が、候補阻害剤であり得る。当業者に周知のスクリーニング技術によって、これらの分子は同定できる。モエシンを阻害する１つの様式は、休止形態のリン酸化を遮断することによって、または活性形態を脱リン酸化することによってその活性化に干渉することである。一実施形態では、このようなモエシンリン酸化の混乱は、Ｃ末端テールドメイン内のＴｈｒ５５８部位で達成される。「モエシンリン酸化阻害剤」は、モエシン上のリン酸化部位（複数可）を部分的または完全に遮断、阻害またはそれに干渉する任意の分子を含む。このような阻害剤の例として、それだけには限らないが：（１）小さい有機および無機化合物、（２）小さいペプチド、（３）抗体および誘導体、（４）モエシンまたはその他のＥＲＭファミリータンパク質と密接に関連しているペプチドおよび（５）核酸アプタマーが挙げられる。
【００５８】
１．小分子モジュレーター
小分子は、モエシン活性の有用なモジュレーターであり得る。小分子モジュレーターの例として、小さいペプチド、ペプチド様分子および合成非ペプチジル有機または無機化合物が挙げられる。一態様では、本願の小分子モジュレーターは、可溶性である。「小分子」とは、約５ｋＤ未満または約０．６ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質またはその他の有機もしくは無機分子であり得る。真菌、細菌または藻類抽出物などの化学的および／または生物学的混合物のライブラリーは、当技術分野で公知であり、任意のアッセイを用いてスクリーニングできる。分子ライブラリーを合成する方法の例は、記載されている（Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．３３：２０５９〜２０６１頁（１９９４年）；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．３３：２０６１〜２０６４頁（１９９４年）；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３〜５頁（１９９３年）；ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：６９０９〜１３頁（１９９３年）；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３〜５１頁（１９９４年）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８〜８５頁（１９９４年）。
【００５９】
２．ポリペプチド／抗体モジュレーター
一実施形態では、本明細書において提供されたモエシンモジュレーターは、ポリペプチド組成物であり得る。モエシン活性化を阻害するポリペプチドは、潜在的に有用な阻害剤である。一実施形態では、ポリペプチドモエシン阻害剤は、モエシンタンパク質のＣ末端テールドメインに特異的な抗モエシン抗体である。それらは、テールドメインのＴｈｒ５５８でリン酸化部位を遮断することによって、モエシンが活性化されるのを妨げ得る。別の実施形態では、ポリペプチドモエシン阻害剤は、Ｔｈｒ５５８リン酸化部位を含むＣ末端テールドメインの末端切断型、非機能性断片である。このような断片は、Ｔｈｒ５５８でのリン酸化について、内因性モエシン分子と競合し、それによって、それらが活性化されるのを妨げるか、または低減し得る。一態様では、ポリペプチドモエシン阻害剤は、Ｔｈｒ５５８部位の周囲の領域に由来する少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基を含む。例えば、ポリペプチドは、ＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ（配列番号２）の部分または完全配列を含み得る。
【００６０】
一実施形態では、ポリペプチドモジュレーターは、標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、モジュレーターは、組換えＤＮＡ技術によって製造される。モジュレーターは、組換え発現に代わって、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成してもよい。
【００６１】
ポリペプチドモエシンモジュレーターは、突然変異株または変異体タンパク質を含み、その残基のいずれも、モジュレーション活性を維持するペプチドを依然としてコードしながら、これらのペプチドの対応する残基から変化されてもよい。一実施形態では、参照ポリペプチドの変異体は、参照ポリペプチドの配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一般に、変異体は、参照ポリペプチドと実質的に同一か、またはそれより大きい結合親和性、例えば、技術分野で認められた結合アッセイ定量化単位／測定基準に基づいて、参照ポリペプチドの少なくとも０．７５×、０．８×、０．９×、１．０×、１．２５×または１．５×倍の結合親和性を示す。
【００６２】
モエシンの生物学的特性をモジュレートするヒトおよび非ヒトポリクローナルおよびモノクローナル抗体（非ヒトモノクローナル抗体のヒト化形態を含む）が、本願において企図される。これらは、抗体のアミノ酸配列変異体、グリコシル化変異体および断片を含む。抗体モジュレーターまたはその変異体は、当技術分野で公知の、本明細書において手短に記載された技術を使用して製造できる。例えば、抗体変異体は、異なる残基で置換された、抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基を有してもよい。抗体について、置換型突然変異誘発のための最も注目する部位は、一般に、超可変領域を含むが、フレームワーク領域（ＦＲ）変更も企図される。
【００６３】
抗体について、置換型変異体の１種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の超可変領域残基の１個または複数を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択された得られた変異体（複数可）は、それらがそれから作製された親抗体と比較して改善された生物学的特性を有する。このような置換型変異体を作製するための好都合な様式は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。手短には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位で、すべての可能性あるアミノ酸置換を作製する。このように作製された抗体を、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、繊維状ファージ粒子からディスプレイさせる。次いで、ファージによってディスプレイされた変異体を、本明細書において開示されるように、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、抗原結合に有意に貢献している超可変領域残基を同定してもよい。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが、抗体および抗原間の接触点を同定するために有益であり得る。このような接触残基および隣接する残基が、本明細書において詳述された技術による置換のための候補である。このような変異体が作製されると、変異体のパネルを、本明細書に記載されたようなスクリーニングに付し、１種または複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択してもよい。
【００６４】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法として、それだけには限らないが、天然供給源からの単離（天然に発生するアミノ酸配列変異体の場合には）または抗体の先に調製された変異体または非変異体版のオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発によってが挙げられる。
【００６５】
本願の抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能である追加の非タンパク質性
部分を含有するようさらに修飾してもよい。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの限定するものではない例として、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコールおよびそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分岐であっても非分岐であってもよい。抗体に付着しているポリマーの数は変わり得、２種以上のポリマーが付着している場合には、それらは、同一分子である場合も異なる分子である場合もある。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、それだけには限らないが、改善される抗体の特別な特性または機能、規定された条件下で療法において抗体誘導体が使用されるかどうかなどを含めた考慮に基づいて決定できる。
【００６６】
一実施形態では、モエシン阻害剤は、ハイスループット競合アッセイによってスクリーニングおよび同定され、ここで、候補化合物の、モエシンの結合物（例えば、抗モエシン抗体またはモエシンのリン酸化部位に作用するキナーゼ）との結合と競合する能力が測定される。細胞不含アッセイは、モエシンまたは末端切断型モエシン断片を、既知結合物化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成することと、アッセイ混合物を、試験化合物と接触させることと、試験化合物の、モエシンまたは結合物化合物と相互作用する能力を決定することとを含み、ここで、試験化合物の、モエシンまたは結合物化合物と相互作用する能力を決定することは、モエシン／結合物複合体の検出可能な特徴がモジュレートされるかどうかを決定することを含む。例えば、タンパク質のリン酸化の程度によって決定される、モエシンおよびプロテインキナーゼの結合性相互作用は、試験化合物が、モエシンおよびキナーゼ化合物間の相互作用をモジュレートできるかどうかを示し得る。複合体の量は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ（競合結合ＥＬＩＳＡを含む）、酵母ツーハイブリッドおよび近接（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、酵素−基質）アッセイによって評価できる。
【００６７】
ペプチドまたはポリペプチドの組換え製造
本願のポリペプチドは、容易に入手可能である技術および材料を使用して組換えによって製造され得る。本願のポリペプチドの組換え製造のためには、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のために複製可能ベクターへ挿入する。本願のポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来手順を使用して容易に単離され、配列決定される。例えば、タンパク質をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、ヒトモエシンタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、配列決定する。多数のベクターが利用可能である。ベクター構成要素は、一般に、それだけには限らないが、以下：シグナル配列、複製起点、１種または複数の選択遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうち１種または複数を含む。
【００６８】
本願のポリペプチドは、直接的だけでなく、通常、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列またはその他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換えによって製造され得る。通常選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。原核生物の宿主細胞に対しては、シ
グナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であり得る。酵母分泌のためには、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダーまたはＷＯ９０／１３６４６に記載されたシグナルであり得る。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【００６９】
このような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームで、本願のポリペプチドをコードするＤＮＡにライゲーションされる。発現およびクローニングベクターの両方とも、ベクターが、１種または複数の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが、宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点が、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は、酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点は、ただ初期プロモーターを含有するので、通常、使用され得る）。
【００７０】
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完するか、または（ｃ）複合培地から得られない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする、例えば、遺伝子は、バチルスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする。
【００７１】
選択スキームの一例では、薬物を利用して宿主細胞の増殖を停止する。異種遺伝子で成功裏に形質転換された細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を産生し、したがって、選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例では、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
【００７２】
哺乳類細胞のための適した選択マーカーの別の例として、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、通常、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものがある。
【００７３】
例えば、メトトレキサート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬を含有する培養培地において形質転換体のすべてを培養することによって、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞をまず同定する。野生型ＤＨＦＲが使用される場合には、適当な宿主細胞として、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株がある。
【００７４】
あるいは、本願のポリペプチド、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８などの選択マーカーの選択剤を含有する培地での細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号参照のこと。
【００７５】
酵母における使用に適した選択遺伝子として、酵母プラスミドＹｒｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子がある（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９年））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７）。酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１損傷が存在すると、トリプトファンの不在下で増殖させることによって形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
【００７６】
さらに、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換には、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターを使用してもよい。あるいは、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）について、組換えウシ（ｃａｌｆ）キモシンの大規模製造のための発現系が報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５頁（１９９０年）。クリベロマイセス属の工業用菌株による、成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８〜９７５頁（１９９１年）。
【００７７】
発現およびクローニングベクターは、普通、宿主生物によって認識され、本願のポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結されているプロモーターを含有する。原核生物の宿主とともに使用するのに適したプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、その他の公知の細菌プロモーターは適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、本願のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【００７８】
真核生物については、プロモーター配列は公知である。事実上すべての真核性遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列として、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）がある。ほとんどの真核性遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてが、真核細胞の発現ベクター中に適宜挿入されている。
【００７９】
酵母宿主とともに使用するための適したプロモーティング配列の例として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
【００８０】
増殖条件によって制御される転写という追加の利点を有する、誘導プロモーターであるその他の酵母プロモーターとして、アルコール脱水素酵素２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連している分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与している酵素のプロモーター領域がある。酵母発現において使用するための適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【００８１】
哺乳類宿主細胞においてベクターからの本願のポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび典型的にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、このようなプロモーターが、宿主細胞系と適合するという条件で制御される。
【００８２】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳類宿主においてＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下での、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列を、プロモーターとして使用してもよい。
【００８３】
高等真核生物による、本出願のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大されることが多い。今では、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）由来の多数のエンハンサー配列が、公知である。通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製起点の後側にある（ｂｐ１００〜２７０）ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンシングエレメントに関しては、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７〜１８頁（１９８２年）も参照のこと。エンハンサーは、ポリペプチドをコードする配列の５’または３’位置でベクター中にスプライシングされ得るが、通常、プロモーターから５’側に位置する。
【００８４】
真核細胞の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたはその他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、場合により、３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、本願のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用転写終結成分として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域がある。ＷＯ９４／１１０２６およびそれに開示される発現ベクターを参照のこと。
【００８５】
本明細書におけるベクターにおける本願のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞として、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞がある。この目的に適した原核生物として、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）および赤痢菌属（Ｓｈ
ｉｇｅｌｌａ）ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）など、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの腸内細菌科が挙げられる。一般に、大腸菌クローニング宿主として、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）があるが、大腸菌Ｂ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などのその他の株が適している。これらの例は、制限ではなく例示である。
【００８６】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核生物微生物が、本発明のポリペプチドをコードするベクターの適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母は、下等真核細胞宿主微生物の中で最もよく使用される。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；および糸状菌、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）などの、いくつかのその他の属、種および株が、一般に利用可能であり、本明細書において有用である。
【００８７】
本願のポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する場合もある。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株が公的に入手可能である。例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株およびこのようなウイルスが、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのための、本願に従う本明細書におけるウイルスとして使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用され得る。
【００８８】
しかし、脊椎動物細胞が最も注目されてきており、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となった。有用な哺乳類宿主細胞株の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；
ヒト胎児由来腎臓株（２９３または懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１頁（１９８０年）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【００８９】
本願のポリペプチドの製造のために、宿主細胞を、上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適当なように改変された従来の栄養培地中で培養する。
【００９０】
本願のポリペプチドを製造するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養できる。宿主細胞の培養には、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（普通、マイクロモル範囲の終濃度で存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源で補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助剤も、当業者に公知であろう適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【００９１】
ペプチドまたはポリペプチドの化学的合成
本願のペプチドはまた、化学的合成、例えば、Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．８５：２１４９〜２１５４頁（１９６３年）においてＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって記載された固相合成法、またはＢｏｄａｎｓｚｋｙらによる「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９７６年に記載された標準溶液合成法によっても製造され得る。これらの書籍は、参照により全文が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
ペプチドの固相合成法の一般的な手順は、最初に、ペプチドの保護されたＣ末端アミノ酸を樹脂に付着させることを含む。付着後、樹脂を濾過し、洗浄し、Ｃ末端アミノ酸のαアミノ基上の保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル）を除去する。この保護基の除去は、当然、アミノ酸と樹脂の間の結合を破壊することなく行われなくてはならない。次いで、得られた樹脂ペプチドに、最後から２番目のＣ末端保護されたアミノ酸をカップ
リングする。このカップリングは、第２のアミノ酸の遊離カルボキシ基と、樹脂に付着した第１のアミノ酸のアミノ基の間のアミド結合の形成によって起こる。ペプチドのすべてのアミノ酸が樹脂に付着するまで、連続するアミノ酸を用いてこの一連の事象を反復する。最後に、保護されたペプチドを、樹脂から切断し、保護基を除去して所望のペプチドを得る。ペプチドを樹脂から分離するために、また保護基を除去するために使用する切断技術は、樹脂および保護基の選択に応じて変わり、ペプチド合成の技術に精通している人には公知である。
【００９３】
上記の樹脂は、任意の適したポリマーであり得、第１の保護されたアミノ酸が共有結合によって堅く連結され得る官能基を含有しなくてはならない。セルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレートおよびポリスチレンなど、種々のポリマーが、この目的に適している。固相合成において使用できる適当な保護基として、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジル（ＢＺＬ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（ＡＯＣ）、トシル（ＴＯＳ）、ｏ−ブロモフェニルメトキシカルボニル（ＢｒＺ）、２，６−ジクロロベンジル（ＢＺＬＣｌ．ｓｕｂ．２）およびフェニルメトキシカルボニル（ＺまたはＣＢＺ）が挙げられる。さらなる保護基はまた、Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７３年に記載されている。この書籍は、参照により全文が本明細書に組み込まれる。
【００９４】
標準溶液合成法は、アミド結合形成の化学的または酵素的方法を使用する、アミノ酸またはペプチド断片の段階的またはブロックカップリングのいずれかによって実施できる。これらの溶液合成法は、当技術分野で周知である。
【００９５】
ポリペプチド精製
本願のポリペプチドまたはタンパク質は、対象から回収してもよい。組換え技術を使用する場合には、本願のポリペプチドは、細胞膜周辺腔において細胞内で製造されるか、または培地中に直接的に分泌され得る。本願のポリペプチドは、培養培地からか、または宿主細胞溶解物から回収してもよい。膜結合型の場合には、適した界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を使用してか、または酵素的切断によって膜から放出され得る。本願のポリペプチドの発現において使用される細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤などの種々の物理的または化学的手段によって破壊され得る。
【００９６】
ペプチドが化学的に合成される場合には、本願のペプチドは、培地中のその他の成分から所望のペプチドを分離できる任意の適した技術によって反応培地から回収され得る。固相合成のためには、適した切断溶液を使用して、樹脂から保護されたペプチドをまず切断する。切断溶液の選択は、樹脂およびそれに結合しているアミノ酸（ＦＭＯＣ法のためのトリフルオロ酢酸など）の特性に応じて変わる。切断は、普通、酸性条件下で実施される。切断が完了すると、次いで、解離性ペプチドが得られ、任意の適した技術（以下に記載される方法など）を使用してさらに精製される。
【００９７】
以下の手順は、適したタンパク質精製手順の例示である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿法；逆相ＨＰＬＣ；シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム、ＤＥＡＥ等）でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ−７５；ＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；およびエピトープタグが付いた形態の本願のポリペプチドと結合するための金属キレート化カラムを使用するゲル濾過によるもの。タンパク質精製の種々の方法を使用してもよく、このような方法
は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２（１９９０年）；Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２年）に記載されている。選択される精製ステップ（複数可）は、例えば、使用される製造プロセスおよび製造される本願の特定のポリペプチドの性質に応じて変わる。
【００９８】
治療的／予防的適用
本願のモエシンモジュレーターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞活性をモジュレートするために治療的に使用できる。一態様では、モエシン阻害剤を、モエシンが活性化されるのを遮断するために使用し、それによって、モエシンの異常な活性化と関連している障害を治療できる。
【００９９】
一態様では、本願は、モエシンの異常な活性化と関連している障害を有する対象において、異常な上皮または内皮細胞の増殖を阻害する方法を提供する。別の態様では、本願は、モエシンの異常な活性化と関連している障害を有する対象において、異常な上皮または内皮細胞のアポトーシスを誘導または促進する方法を提供する。
【０１００】
本願の組成物を、哺乳類を治療するために使用してもよいということが企図される。一実施形態では、例えば、前臨床データを得る目的で、組成物を非ヒト哺乳類に投与する。例示的な治療される非ヒト哺乳類として、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類および前臨床研究が実施されるその他の哺乳類が挙げられる。このような哺乳類は、組成物を用いて治療される疾患の確立された動物モデルであり得、または注目する組成物の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態の各々において、哺乳類において、用量増加研究を実施してもよい。
【０１０１】
さらに、または代替法では、組成物を使用して、組成物の投与から恩恵を受け得るヒト、例えば、疾患または障害を患っている患者を治療する。
【０１０２】
一実施形態では、本願は、異常なモエシン活性化と関連している増殖性障害の治療を包含する。異常な細胞増殖は、原発腫瘍成長および転移の両方に関与しているので、本願によって提供される治療は、原発部位での腫瘍の腫瘍性成長を阻害でき、ならびに第２の部位で腫瘍の転移を防げることができ、それによって、その他の治療法による腫瘍の攻撃を可能にする。本明細書において治療される癌の例として、それだけには限らないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例として、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫および肺の扁平上皮癌腫を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）の癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫および種々の種類の頭頸部癌ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連している異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連しているものなど）およびメイグス症候群が挙げられる。より詳しくは、本願の抗体による治療を受け入れられる癌として、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ
）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１０３】
医薬製剤
種々の物質または分子（ペプチドなどを含む）を、治療薬として使用してもよい。これらの物質または分子は、この生成物を、薬学的に許容される担体媒体との混和物に組み合わせる、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方できる。治療用製剤は、保存のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、これとして、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含めた抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前またはその後の、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０１０５】
本明細書における治療用組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。
【０１０６】
腫瘍などの種々の疾患を治療するために使用される場合に、本願のモジュレーターを、同一または同様の疾患に適したその他の治療薬と組み合わせてもよいということが企図される。癌を治療するために使用される場合には、本願のモジュレーターを、従来の癌療法、例えば、手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組合せと組み合わせて使用してもよい。
【０１０７】
一部のその他の態様では、本願のモエシンアンタゴニストとの組合せ腫瘍療法にとって有用なその他の治療薬として、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２としても知られている）
ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはＴＮＦなどの腫瘍成長に関与しているその他の因子のアンタゴニストが挙げられる。好ましくは、本願の抗ＮＲＰ１抗体を、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体などの１種または複数のチロシンキナーゼ受容体を標的とする小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＲＴＫＩ）と組み合わせて使用してもよい。多数の治療用小分子ＲＴＫＩが、当技術分野で公知であり、これとして、それだけには限らないが、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標））、ＺＤ６１２６（ＡＮＧ４５３）、ＺＤ１８３９、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、セマキサニブ（ＳＵ５４１６）、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ−７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６）、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、ＸＬ８８０およびＣＨＩＲ−２６５が挙げられる。
【０１０８】
本願のモエシンモジュレーターは、単独または第２の治療薬と組み合わせてのいずれかで、１種または複数の化学療法薬と組み合わせてさらに使用してもよい。本願の組み合わせた治療法では、種々の化学療法薬を使用してもよい。企図される化学療法薬の例示的な、限定するものではない一覧が、「定義」の下で本明細書において提供されている。
【０１０９】
投与経路は、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼球内、動脈内または病巣内経路による注射または注入、局所投与または持続放出系によってに一致する。
【０１１０】
本願の医薬組成物の投与量および所望の薬物濃度は、想定される具体的な使用に応じて変わり得る。適当な投与量または投与経路の決定は、通常の医師の技術の範囲内で周知である。動物実験によって、ヒト療法のために有効な用量を決定するための信頼できる指針が提供される。有効な用量の種間スケーリングは、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９年、４２〜９６頁中、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」によって定められた原理に従って実施できる。
【０１１１】
本願の物質または分子のｉｎ  ｖｉｖｏ投与が使用される場合には、正常な投与量は、投与経路に応じて、１日あたり、約１０ｎｇ／ｋｇ哺乳類の体重から最大１００ｍｇ／ｋｇ哺乳類の体重またはそれ以上、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日で変わり得る。具体的な投与量および送達方法についての指針は文献において提供されている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同５，２０６，３４４号；または同５，２２５，２１２号参照のこと。種々の製剤が、種々の治療化合物および種々の障害にとって有効となること、およびある臓器または組織を標的とする投与は、例えば、別の臓器または組織への送達とは異なる様式での送達を必要とし得るということが予測される。
【０１１２】
物質または分子の投与を必要とする任意の疾患または障害の治療に適した放出特徴を有する製剤での、物質または分子の持続放出投与が望まれる場合には、物質または分子のマイクロカプセル化が企図される。ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２およびＭＮ  ｒｇｐ１２０を用いて、持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化が成功裏に実施された。Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２：７９５〜７９９頁（１９９６年）；Ｙａｓｕｄａ、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．、２７：１２２１〜１２２３頁（１９９３年）；Ｈｏｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：７５５〜７５８頁（１９９０年）；Ｃｌｅｌａｎｄ、「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ編（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年）、４３９４６２頁；ＷＯ９７／０３６９２、ＷＯ９６／４００７２、ＷＯ９６／０７３９９；および米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１１３】
持続放出製剤は、その生体適合性および広範な生分解性特性のために、ポリ−乳酸−ｃｏグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを使用して開発できる。ＰＬＧＡの分解生成物、乳酸およびグリコール酸は、ヒト身体内で迅速に排除され得る。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成に応じて数ヶ月から数年に調整できる。Ｍ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９０年）、１〜４１頁中、Ｌｅｗｉｓ、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ」。
【０１１４】
組成物（例えば、医薬組成物）は、投与のための使用説明書と一緒に、キット、容器、パックまたはディスペンサー中に含めることができる。キットとして供給される場合には、組成物の異なる成分が、別個の容器中にパッケージングされ、使用の直前に混和され得る。成分をこのように別個にパッケージングすることによって、活性成分の機能を失うことなく長期間貯蔵することが可能となり得る。キットはまた、診断試験または組織適合試験などの特定の試験の遂行を促進する、別個の容器に入った試薬を含む場合もある。
【０１１５】
キット中に含まれる試薬は、種々の成分の寿命が保たれ、容器の材料によって吸着または変更されないようないかなる種類の容器に入れて供給されてもよい。例えば、密閉ガラスアンプルは、窒素などの中性の、非反応性ガスの下でパッケージングされた、凍結乾燥したモジュレーター物質／分子および／またはバッファーを含有し得る。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属または試薬を保持するのに通常使用される任意のその他の材料などの任意の適した材料からなり得る。適した容器のその他の例として、アンプルと同様の物質から作ることができる簡単なビンおよびアルミニウムまたは合金などのホイルで裏打ちされた内部からなり得る包みが挙げられる。その他の容器として、試験管、バイアル、フラスコ、ビン、シリンジなどが挙げられる。容器は、滅菌アクセスポートを有し得る、例えば、皮下注射針によって穿刺することが可能なストッパーを有するビン。その他の容器は、容易に除去可能であり、除去すると、成分が混合可能となる膜によって分けられた２つの区画を有する場合もある。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであり得る。
【０１１６】
キットはまた、説明材料とともに供給され得る。使用説明書は、紙またはその他の基板に印刷されている場合もあり、および／または、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、レーザーディスク（登録商標）、オーディオテープなどの電子読み取り可能な媒体として供給される場合もある。詳細な使用説明書が、キットに物理的に付属していない場合もあり、代わりに、ユーザーが、キットの製造業者または販売業者によって指定されたインターネットウェブサイトに案内される場合も、または電子メールとして供給される場合もある。
【０１１７】
本願の別の実施形態では、上記の障害の治療にとって有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適した容器として、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、種々の材料から形成され得る。容器は、状態を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性薬剤は、抗体である。容器上の、または容器に付属しているラベルは、組成物が、選択された状態を治療するために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の容器を含み得る。使用説明書とともに、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび添付文書を含め、商業上の観点およびユーザーの観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
【０１１８】
以下の実施例は、本願の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本願の実施において良好に機能するよう、本発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることが
できるということは、当業者によって理解されなければならない。しかし、当業者ならば、本開示内容を踏まえると、開示されている特定の実施形態において多数の変化をもたらすことができ、本願の趣旨および範囲から逸脱することなく、依然として類似のまたは同様の結果を得ることができるということを理解しなければならない。
【実施例】
【０１１９】
[実施例１]      
抗モエシン抗体の調製
モエシンのＣ末端テールドメインに対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ法を使用することによって調製した。配列番号１の配列を有するＣ末端ドメインを作製するために、ＰＣＲを使用して、上記のＣ末端テールドメインに対応するｃＤＮＡ断片を増幅した（図１に示される配列番号４参照のこと、ここでは、下線部分が、Ｃ末端テールドメインのｃＤＮＡ配列である）。
【０１２０】
ＰＣＲによって増幅されたモエシンＤＮＡ断片を、ｐＥＴ３２ａ（＋）およびｐＥＴ２８ａ（＋）から選択された発現ベクター中にクローニングした。次いで、構築されたベクターを使用して、培養および発現のために大腸菌宿主細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。ｐＥＴ３２ａ（＋）およびｐＥＴ２８ａ（＋）の制限およびクローニングマップは、それぞれ、図２（ａ）および２（ｂ）に示されている。Ｃ末端ドメインのための構築された発現系は、制限酵素消化を用いて検証し、それに続いて配列決定して、Ｃ末端ドメインの発現のための正しいリーディングフレームを確認した。
【０１２１】
十分に培養した後、標準タンパク質発現プロトコールに従って、発現されたＣ末端ドメインを有する宿主細胞を、Ｃ末端ドメインを収集および精製するために回収した。得られたタンパク質断片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてアッセイして、その同一性および純度を確認した。
【０１２２】
次いで、発現されたＣ末端ドメインを使用して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用することによるハイブリドーマ法に従って、モエシンのＣ末端テールドメインに対するモノクローナル抗体を作製した。
【０１２３】
ハイブリドーマ法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載され、これは、参照のためにその全文が本願に組み込まれる。典型的なハイブリドーマ法では、マウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）を抗原（例えば、Ｃ末端ドメイン）を用いて免疫処理し、次いで、免疫処理されたマウスから得た脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合する。融合細胞を、ハイブリドーマの成長を選択的に可能にする培地中に回収し、生存可能なハイブリドーマコロニーを成長させる。十分な時間の後、抗原（例えば、Ｃ末端ドメイン）を使用し、ＥＬＩＳＡ試験および免疫組織化学的アッセイによって上清をスクリーニングする。さらなるサブクローニングのために陽性細胞を選択する。選択されたクローンを、限界希釈法によってサブクローニングする。すべてのクローンが、ＥＬＩＳＡ陽性となるまでサブクローニングを実施する。次いで、陽性クローンを選択して、抗原に対するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマを得る。
【０１２４】
全長モエシンタンパク質に対する抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手したが、それも、Ｃ末端ドメインの代わりに全長モエシンタンパク質を使用することによって、上記のハイブリドーマ法に従って製造できる。
【０１２５】
[実施例２]
モエシン阻害剤の細胞増殖を阻害する能力の評価
この実験を使用して、モエシン阻害剤の、細胞増殖を阻害または低減する能力を評価する。
【０１２６】
ヒト肺微小血管内皮細胞株（ＨＰＭＥＣ）を使用して、細胞増殖アッセイを実施した。細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに、１０6個細胞／ｃｍ2でプレーティングし、以下に記載される種々の試験および対照試薬の存在下で室温で培養した。所定の期間培養した後、細胞を回収し、フローサイトメトリー分析のために標識した。試験群から得た平均ＯＤ570値を、細胞培養の開始時に試験群と同数の細胞を有する群から得た平均ＯＤ570値で除することによって、２時間、２４時間および３６時間での増殖速度を決定した。
【０１２７】
試験および対照群は以下のとおりである：
１）ＴＮＦ−α単独；
２）全長モエシンタンパク質に対する抗体（抗モエシン）；
３）Ｃ末端テールドメインのみに対する抗体（抗Ｍ３）；
４）ＴＮＦ−α＋抗モエシン；
５）ＴＮＦ−α＋抗Ｍ３；
６）ＰＢＳ溶液（陰性対照）
【０１２８】
培養後に得られた細胞および上清を、細胞形態学解析、ウエスタンブロットならびにフローサイトメトリーおよび免疫蛍光アッセイに付した。種々の薬剤、特に、抗Ｍ３抗体の効果を調べ、特性決定した。結果が図３に示されている。細胞の増殖速度は、培養後およそ２４時間で落ち始めた。陰性対照（群６）と比較すると、抗モエシンおよび抗Ｍ３を用いる処理は、細胞増殖速度を低下させ、ＴＮＦ−αと組み合わせて抗モエシンおよび抗Ｍ３を用いる処理は、細胞増殖速度をさらにより実質的に低下させた。ＴＮＦ−α単独を用いる処理は、細胞増殖速度を低下させたが、抗モエシンまたは抗Ｍ３との組合せほど大きくではなかった。この結果は、抗モエシンおよび抗Ｍ３は、細胞増殖を阻害し得ることを示す。
【０１２９】
[実施例３]      
モエシンの細胞間発現およびアポトーシスの分析
実施例１に記載したように抗モエシン抗体の存在下での細胞培養物を、アポトーシスアッセイならびに表面抗原アッセイに付して、抗体の、内皮細胞アポトーシスの促進およびモエシンの細胞間発現（タンパク質の活性形態を示す）に対する効果を評価した。
【０１３０】
アネキシンＶアッセイを使用してアポトーシスを研究した。回収した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、７０％エタノール、ＲＮＡ（２００ｍｇ／ｌ）およびＰＩ（２０ｍｇ／ｌ）を逐次加えた。次いで、生存可能細胞は、ＦＩＴＣおよびＰＩともに陰性であるが、早期アポトーシスにある細胞は、ＦＩＴＣ陽性であるが、ＰＩ陰性であり、後期アポトーシスにあるか、またはすでに死滅した細胞は、ＦＩＴＣおよびＰＩともに陽性であるので、細胞を、ＦＩＴＣおよびＰＩの二重染色のためにアネキシン−Ｖ  ＦＩＴＣ／ＰＩキットを用いて染色した。染色された細胞を、フローサイトメーターを使用して、さまざまな試験薬剤の存在下でアポトーシス細胞の量について分析する。試験群および対照群を用いて処理した後の、早期アポトーシスにある細胞のパーセンテージおよび後期アポトーシスにある細胞または死滅細胞のパーセンテージを決定し、結果が、図４（ａ）および図４（ｂ）にそれぞれ示されている。この結果は、抗モエシンを用いる処理は、早期アポトーシスにある細胞および後期アポトーシスにあるか、または死滅した細胞のパーセンテージをわずかに増大させることを示す。ＴＮＦ−αは、抗モエシンおよび抗Ｍ３のアポトーシス誘導効果を実質的に増強し得る。ＴＮＦ−α単独は、細胞アポトーシスを誘導し得るが、その効果は、抗モエシンまたは抗Ｍ３との組合せほど大きくはない。
【０１３１】
免疫蛍光アッセイを使用して、モエシンの細胞表面発現を検出した。ＨＰＭＥＣ細胞を、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いて処理し、その後、抗モエシン抗体を添加し、細胞を培養し、その後、蛍光標識された二次抗体を添加した。細胞を、細胞表面上でのモエシンの存在について蛍光顕微鏡下で研究した。抗モエシン抗体を含まない細胞培養物を、陰性対照として使用した。
【０１３２】
上記のアッセイの結果は、抗モエシン抗体を用いない場合には、細胞表面モエシンは検出できないということを示した。ウエスタンブロットは、上清においてもモエシンを全く検出しなかった。刺激因子ＴＮＦ−αは含まないが抗モエシン抗体の存在下では、細胞骨格において明らかな変化はなく、アポトーシスの有意な増大もなかった。しかし、ＴＮＦ−αを添加した後、アポトーシスおよび細胞表面モエシンの両方が、対照群と比較して増大した。
【０１３３】
[実施例４]
細胞の形態学的変化に対するモエシン阻害剤の影響の観察
細胞を、実施例１に記載されるような種々の試験薬剤の存在下で、形態学的変化について顕微鏡下で研究した。
【０１３４】
細胞骨格形態：
対照群６では、細胞骨格構造は、規定の細胞の端、規則的なパターンおよび正常な核の大きさを有し、正常と思われた。
【０１３５】
抗モエシン抗体のみが添加された群（抗モエシンを用いた群２および抗Ｍ３を用いた群３）では、細胞は、最初は正常と思われたが、部分的に混乱したＦ−アクチン構造および不規則な端が、３６時間インキュベーションした後にのみ見られた。核には、明らかな変化はなかった。
【０１３６】
群２と同様に、ＴＮＦ−αのみの群（群１）は、Ｆ−アクチン構造の部分的な混乱が観察された３６時間後までは構造に明らかな変化はなかった。核には、明らかな変化はなかった。
【０１３７】
しかし、ＴＮＦ−αおよび抗モエシン抗体の両方を用いて処理された群では、２４時間後に細胞骨格が崩壊し、Ｆ−アクチンが細胞質中に広がり、非極性アクチンフィラメントからなる繊維束を形成した。３６時間で、アポトーシスプロセスを示す核凝結が見られた。
【０１３８】
微絨毛形態
正常なＨＰＭＥＣは、図５（ａ）に示されるように、表面上に滑らかで、円柱の形状の、規則的なパターンの微絨毛を有する。ＴＮＦ−αを用いた場合（群１）、３６時間後に、これらの微絨毛は、図５（ｂ）に示されるように、小さくなり、あまり高密度ではなくなったように思われた。ＴＮＦ−αおよび抗モエシン抗体を用いた場合（群４および５）、３６時間後に、図５（ｃ）に示されるようにＨＰＭＥＣ表面上の微絨毛が有意に低減またはさらには完全に消失した。
【０１３９】
本発明者らの結果は、抗モエシン抗体は、モエシン阻害剤として、細胞構造の混乱、さらには細胞死を引き起こし得るということを示唆する。しかし、これらの効果は、ＴＮＦ−αなどの炎症因子を用いない場合には限定的である。しかし、ＴＮＦ−αの存在下では、細胞に対するこのような損傷効果は、有意に増強される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年8月7日(2015.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において異常なモエシン活性化と関連している障害または病的状態を治療するための組成物であって、モエシン阻害剤としてヒトモエシンのＣ末端テールドメインと結合する単離抗体を含み、前記障害または病的状態が呼吸器系または臓器の線維症と関連している組成物。