(57)【要約】【課題】免疫学的測定法で生じる非特異的反応を抑制する方法を提供することである。【解決手段】試料中の抗原又は抗体を測定する免疫学的測定法において、抗原と抗体が反応する際に、リジン、アルギニン又はヒスチジン等の塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩又は塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドもしくは蛋白質（例えば塩基性アミノ酸のポリマー、ヒストン又はプロタミン）を共存させることで、非特異的反応を抑制する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗原又は抗体を測定する免疫学的測定法において、抗原と抗体が反応する際に、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩又は塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドもしくは蛋白質を共存させることを特徴とする方法。
【請求項２】
塩基性アミノ酸がリジン、アルギニン又はヒスチジンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩基性アミノ酸塩がリジン塩酸塩、アルギニン塩酸塩又はヒスチジン塩酸塩である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドまたは蛋白質が、塩基性アミノ酸のポリマー、ヒストン又はプロタミンである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の抗体あるいは抗原を測定する免疫学的測定方法において、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩又は塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドもしくは蛋白質を共存させることを特徴とする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定法は、測定対象物の分析、測定、定量、検出などとして利用されており特に臨床検査薬として広く医療現場で使用されている。この免疫学的測定法は、抗原とその抗原に対する抗体との間の抗原抗体反応を利用するものであるが、その検知、検出を容易にするため様々な手法が開発されてきている。具体的に免疫学的測定法としてはラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、凝集反応免疫測定法などが開発されてきて、現在広く利用されている。
【０００３】
この抗原抗体反応にあずかる抗体あるいは抗原は、不溶性の担体に結合されたり、検出可能な方法で標識することが多い。例えば不溶性の担体としてアガロース、ニトロセルロース、デキストランなどの生体由来高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリアクリルアミドなどのアクリル樹脂、テフロン（登録商標）、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラス、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸マグネシウムなどの無機質材料などからなる微粒子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレン、ゲルなどがあげられる。不溶性担体に固定された抗原または抗体と、分析試料中の抗体又は抗原等とを特異的に結合反応せしめ、特異的に結合した分析対象物である抗体又は抗原を検知することがなされる。検出可能な方法としては、１２５Ｉ、３Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光物質、金コロイド、セレンコロイドなどの発光又は発色物質などで標識された抗原あるいは抗体が試薬として用いられている。
【０００４】
このような免疫学的測定法が、臨床検査薬として広く医療現場で使用されているが、Ｂ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスのなど感染の有無を確認するためのＨＢｓ抗原やＨＣＶ抗体の検出や、腫瘍マーカーによる癌の診断などにおいて、カットオフ値を基準にして判断する場合は、測定値が乖離値を示すことは医療現場において致命的な問題である。
【０００５】
このような乖離値は、免疫学的測定法に用いられる抗原あるいは抗体と測定サンプル中の成分間で起こる非特異的な反応によるものであり、従来、不溶性担体の表面や標識抗体の遊離結合部位をブロックするためのブロッキング剤を使用することが提案されているが、十分ではないため、非特異的反応に起因する乖離値を無くすことが強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先に述べたように免疫学的測定法は、医療現場では広く使われている反面、非特異的反応に起因する乖離値によって判断を誤ることもある。特にＨＣＶ抗体、ＨＢｓ抗体、ＴＰ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）抗体のような感染症抗体の検出に用いられるイムノアッセイでは天然抗原だけではなくリコンビナント抗原を用いられる例が多く、不溶性担体に固定された抗原と分析対象の抗体以外の抗体との非特異的に結合反応が起こることがある。過去には、非特異的な相互作用を最少にするために、不溶性担体の表面や標識抗体の遊離結合部位をブロックするためのブロッキング剤として、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のたんぱく質、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を用いたりする手法が使用されていた。しかしながら、依然、非特異的反応はイムノアッセイ技術における問題として残っている。本発明の目的は、イムノアッセイで生じる非特異的反応を抑制する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討した結果、試料中の抗体あるいは抗原を検出するための免疫測定において、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩または塩基性アミノ酸を多く含むペプチドあるいは蛋白質を添加することによって、非特異的反応を抑制しうることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち本発明は以下の通りである。
（１）試料中の抗原又は抗体を測定する免疫学的測定法において、抗原と抗体が反応する際に、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩又は塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドもしくは蛋白質を共存させることを特徴とする方法。
（２）塩基性アミノ酸がリジン、アルギニン又はヒスチジンである（１）に記載の方法。
（３）塩基性アミノ酸塩がリジン塩酸塩、アルギニン塩酸塩又はヒスチジン塩酸塩である（１）に記載の方法。
（４）塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドまたは蛋白質が、塩基性アミノ酸のポリマー、ヒストン又はプロタミンである（１）に記載の方法。
【０００９】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１０】
本発明において、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩又は塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドもしくは蛋白質（以下、非特異的反応抑制剤ともいう）は一般に市販で入手可能であり、単独または組み合わせて使用することができる。本発明に用いられる非特異的反応抑制剤の量は、免疫反応液中に好ましくは０．１から１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．５から５ｗ／ｖ％である。
【００１１】
塩基性アミノ酸としては特に限定はないが、好ましくはリジン、アルギニン又はヒスチジンである。また塩基性アミノ酸塩としては特に限定はなく、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩等が用いられるが、好ましくは塩酸塩である。塩基性アミノ酸の割合が１０％以上のペプチドまたは蛋白質とは、塩基性アミノ酸の含有量が高いペプチド又は蛋白質を意味し、例えば塩基性アミノ酸のポリマー、ヒストン又はプロタミン等があげられる。
【００１２】
本発明では、標識を用いることができる。標識としては、例えば酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープなどいずれでも効果がある。また、直接これらの物質を検出に用いる物質に標識せず、ビオチン−アビジン等を利用して間接的に標識してもよい。抗原に結合した標識物質を検出することは、例えば、公知の酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又は発光免疫測定法（ＬＩＡ）等により行うことができる。
【００１３】
本発明においては、不溶性担体を用いることができる。不溶性担体に関しては、よく知られているガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストランなどの物質からなるビーズ、チューブ、プレート、磁性微粒子など用いることができ、反応後にＢ／Ｆ分離可能な担体が好ましく、その材質などは問わない。また、不溶性担体と抗体（あるいはレセプター、結合蛋白質）との結合は、物理的結合あるいは化学的に中間体を介した結合等、Ｂ／Ｆ分離時に結合能が失われない方法が好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸塩および塩基性アミノ酸を多く含むペプチドあるいは塩基性アミノ酸を多く含む蛋白類を共存させるという簡便な操作で、いわゆるブロッキング剤を用いなくても免疫学的測定で生じる非特異的免疫反応を抑制することが可能となる。本発明に用いられる非特異的反応抑制剤は一般に市販で入手可能であり、また良く知られている材料であり、単独または組み合わせて使用することができる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
免疫測定装置としてＡＩＡ−１８００自動免疫測定装置（東ソー社製）を用い、１ステップ競合法によりＴＰ抗体の測定を行った。具体的には、まず３種類のＴＰ抗原（１５ｋＤａ，１７ｋＤａ，４７ｋＤａ）を固定化したフェライト含有エチレン酢酸ビニルコポリマービーズおよび一次反応液（１％ＢＳＡ２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７））を反応カップに分注して凍結乾燥し、試薬Ａを作製した。さらに同一条件で一次反応液に０．１、１．０、５．０、１０ｗ／ｖ％リジン塩酸塩、又は５．０ｗ／ｖ％アルギニン塩酸塩を添加した試薬Ｂから試薬Ｆを作製した。
【００１７】
測定は最初に試薬Ａ〜Ｆの反応カップに試験試料（血清）と凍結乾燥物の溶解液とを同時に添加し、３７℃にて攪拌しながら１０分間反応させた。その後、未反応物をＢ／Ｆ分離により除去し、アルカリ性フォスファターゼにて標識された抗ヒトイムノグロブリンマウスモノクローナル抗体（東ソー・エイアイエイ社製）を含む二次反応液（１％ＢＳＡを含む５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７））を分注し、３７℃にて攪拌しながら１０分間反応させた。その後、未反応物をＢ／Ｆ分離により除去し、４−メチルウンベリフェリルりん酸塩を含む基質溶液を添加した。ＴＰ抗体を介してＴＰ抗原に結合したアルカリ性フォスファターゼ標識抗ヒトイムノグロブリンマウスモノクローナル抗体よって生成される単位時間当たりの４メチルウンベリフェロンの生成（ｎＭ／秒）を蛍光測定した。本生成度はアルカリ性フォスファターゼ量に比例し、蛍光の強さによって試験試料中のＴＰ抗体の濃度を知ることができる。
【００１８】
検体中のＴＰ抗体濃度は、あらかじめＴＰ抗体標準品を用いて検量線を作成させた上で求めた。ＴＰ抗体の測定結果の判定は、１．０  ＣＯＩ（カットオフインデックス）以上を陽性（＋）、１．０  ＣＯＩ未満を陰性として判断した。
【００１９】
作製された試薬Ａ〜試薬Ｆを用いて３例のＴＰ抗体陰性検体と３例のＴＰ抗体陽性検体を測定した。ＴＰ抗体陰性検体は、梅毒の病歴がない供血者から採取したものである。
【００２０】
表１は、ＴＰ抗体陰性および陽性検体を測定した結果である。表１からわかるように、試薬Ａで測定すると１．０  ＣＯＩ以上の値を示していた偽陽性検体が、試薬Ｂで低くなり、試薬Ｃから試薬Ｅは１．０  ＣＯＩ未満の値を示すようになり、リジン濃度が５ｗ／ｖ％以上（試薬Ｄ，Ｅ）で０  ＣＯＩ付近に収束していた。１次反応液にリジン塩酸塩を添加していくことで陰性検体中の成分による非特異的反応が小さくなり偽陽性検体がなくなった。また試薬Ｆでも非特異的反応が低くなる傾向がみられた。同濃度（１ｗ／ｖ％）を添加している試薬Ｃほどは低下しなかったが、アルギニン塩酸塩を添加しても効果があった。
【００２１】
一方、ＴＰ抗体陽性検体では試薬Ａから試薬Ｆは同様の値を示しており、１次反応液に塩基性アミノ酸を添加しても陽性検体の反応性が低下することはなくＴＰ抗体を測定することができていた。
【００２２】
以上の試薬Ａから試薬Ｆによる結果から判断すると、塩基性アミノ酸がＴＰ抗体陰性検体の非特異的反応を回避していることは明らかである。特にリジン塩酸塩の効果が高いことがわかった。
【００２３】
【表１】
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実施例２
実施例１で作製された試薬Ａと試薬Ｄを用いて１３例のＴＰ抗体陰性検体と８例のＴＰ抗体陽性検体を測定した。ＴＰ抗体陰性検体は、梅毒の病歴がない供血者から採取したものである。
【００２４】
表２は、ＴＰ抗体陰性検体１３例を測定した結果である。表２からわかるように、試薬Ａで測定すると１．０  ＣＯＩ以上の値を示していた偽陽性検体が、試薬Ｄでは１．０  ＣＯＩ未満の値を示すようになり、全体的にばらついていた値が０  ＣＯＩ付近に収束していることがわかる。１次反応液にリジン塩酸塩を添加したことで、陰性検体中の成分による非特異的反応が非常に小さくなり偽陽性検体がなくなっている。
【００２５】
表３は、ＴＰ抗体陽性検体８例を測定した結果である。試薬Ａ、試薬Ｄどちらも同様の値を示しており、１次反応液にリジン塩酸塩を添加しても陽性検体の反応性が低下することはなくＴＰ抗体を測定することができていた。
【００２６】
以上の試薬Ａと試薬Ｄによる結果から判断すると、塩基性アミノ酸がＴＰ抗体陰性検体の非特異的反応を回避していることは明らかである。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
【表３】
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