(57)【要約】      （修正有）【課題】修復を必要とする骨のインビボ修復または増強のための、生体内吸収される移植可能な構造物、及び該構造物の製造方法の提供。【解決手段】絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含むミネラル化絹材料である、移植可能な構造物であり、該絹ポリマーが該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲で不溶性状態に形成され、該ハイドロキシアパタイト粒子を実質的に囲み、0.1〜約90重量%の該ハイドロキシアパタイトを含む構造物、及び該構造物の製造方法。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、製造物品であって、
該絹が、該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲で不溶性状態に形成される、製造物品。
【請求項２】
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、製造物品であって、
該絹が、該ハイドロキシアパタイト粒子の存在下で不溶性状態に形成される、製造物品。
【請求項３】
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、請求項1または2記載の製造物品。
【請求項４】
前記物品が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、請求項1、2、または3のいずれか一項記載の製造物品。
【請求項５】
0.1〜約90重量%のハイドロキシアパタイトを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の製造物品。
【請求項６】
生理活性物質をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の製造物品。
【請求項７】
生絹ファイバーをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の製造物品。
【請求項８】
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、移植可能な構造物であって、
該絹ポリマーが、該ハイドロキシアパタイト粒子を実質的に囲む、移植可能な構造物。
【請求項９】
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、請求項8記載の構造物。
【請求項１０】
前記構造物が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、請求項8または9記載の構造物。
【請求項１１】
移植後に生体内吸収される（bioresorbed）、請求項8、9、または10のいずれか一項記載の移植可能な構造物。
【請求項１３】
移植後に骨中に取り込まれる、請求項8〜11のいずれか一項記載の移植可能な構造物。
【請求項１４】
絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、および
該絹ポリマーが該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成されるように、不溶性状態を形成するように該絹ポリマーを誘導する工程
を含む、移植可能な構造物の製造のための方法。
【請求項１５】
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記移植可能な構造物が、0.1〜約90重量%のハイドロキシアパタイトを含む、請求項13または14記載の方法。
【請求項１７】
前記移植可能な構造物が、生理活性物質をさらに含む、請求項13、14、または15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記移植可能な構造物が、生絹ファイバーをさらに含む、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記移植可能な構造物が、該構造物が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記移植可能な構造物が、移植後に生体内吸収される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記移植可能な構造物が、移植後に骨中に取り込まれる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記移植可能な構造物の生産のためのキットであって、
(a)凍結乾燥絹ポリマー、
(b)ハイドロキシアパタイト粒子、および
(c)それらのための包装材料
を含む、キット。
【請求項２３】
HFIP溶媒をさらに含む、請求項21記載のキット。
【請求項２４】
絹ポリマーの不溶性状態への形成のための容器をさらに含む、請求項21または22記載のキット。
【請求項２５】
(a)ペースト組成物を形成するために、絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、
(b)骨損傷または欠損を有する個体において修復または補強を必要とする骨の領域に、該ペースト組成物を適用する工程;および
(c)適用した該ペースト組成物中の該絹ポリマーを不溶性状態に形成する工程
を含む、個体において骨を修復または強化するための方法であって、
不溶性状態の絹ポリマーを含む適用した該組成物が、骨組織による置換のための骨格を提供する、方法。
【請求項２６】
修復を必要とする骨のインビボ修復または増強の使用のための請求項1〜7のいずれか一項記載の物品。
【請求項２７】
修復を必要とする骨のインビボ修復または増強のための医薬の調製における請求項1〜7のいずれか一項記載の製造物品の使用。
【請求項２８】
修復を必要とする骨の修復または増強の使用のための請求項8〜13のいずれか一項記載の移植可能な構造物。
【請求項２９】
修復を必要とする骨をインビボで修復または増強するための医薬の調製における請求項1〜7のいずれか一項記載の移植可能な構造物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年2月7日に出願された米国特許仮出願第61/026,896号および2008年8月1日に出願された米国特許仮出願第61/085,569号の35U.S.C.§119(e)の下の恩典を主張し、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所(National Institute of Health)による助成金番号ED002520およびEB003210の下、政府の支援によって行われたものでる。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、絹フィブロインとハイドロキシアパタイトとの混合物に関する。本発明は、骨および歯の修復および置換にさらに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
組織の修復および再生の主要な目的は、欠損領域において、インビボで支持体として働き、かつ再生させる成長を促進する移植可能な構造物を生産するために、インビトロで生物学的な代替物を開発することである。
【０００５】
近年、ポリ(グリコール酸)、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、およびそれらのコポリマーであるポリ(L-ラクチック-コ-グリコール酸)(PLGA)などの生分解性ポリマーが、組織形成の研究において骨格材料として用いられてきている。(Sofia et al. Journal of Biomedical Materials research 2001, 54, 139-148(非特許文献1))。これらのポリマーの利点には、それらの生体適合性および分解性が包含される。しかしながら、PLGAは、加水分解の間に生じる酸分解産物による炎症を引き起こし得る(Sofia et al. Journal of Biomedical Materials Research 2001, 54, 139-148(非特許文献1))。相反する加水分解速度および組織応答プロフィールを引き起こす、ポリエステルに伴う加工の困難性もまた存在する。それゆえ、生体内吸収性（bioresorbable）および生体適合性であることと同時に、加水分解速度、構造、および機械的強度などのより制御可能な特徴を有する、ポリマー材料が必要とされている。生物学的ポリマー材料はしばしば、合成ポリマー材料により再生されることが不可能な性質の組み合わせを示す。(Perez-Rigueiro et al. Science, 1998; 70: 2439-2447(非特許文献2); Hutmacher D. Biomaterials 2000. 21, 2529-2543(非特許文献3))。骨組織は一例であり;骨組織再生用の骨格は、生分解性および生体適合性に加え、高い機械的強度および空隙を必要とする。
【０００６】
骨髄幹細胞(BMSC)が骨形成系列に沿って分化し、3次元骨様組織を形成できることがいくつかの研究で示されている(Holy et al. J. Biomed. Mater. Res.(2003)65A:447-453(非特許文献4); Karp et al., J. Craniofacial Surgery 14(3): 317-323(非特許文献5))。しかしながら、重要な限界がある。いくつかのリン酸カルシウム骨格は、限られた分解能を示す(Ohgushi et al. 1992. CRC Handbook of Bioactive Ceramics. T. Yamamuro, L. L. Hench, and J. Wilson, editors. Boca Raton, FL: CRC Press. 235-238(非特許文献6))か、または分解が急速すぎる(Petite et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18: 959-963(非特許文献7))。所望の機能を維持するよう機械的性質を調和させることにおける困難性もまた、問題を残す(Harris et al. J. Biomed. Mater. Res. 42: 396-402(非特許文献8))。
【０００７】
BMSCが、軟骨形成系列に沿って分化し、3次元軟骨様組織を、ポリ(ラクチック-コ-グリコール酸)またはポリ-L-乳酸などの生物材料基材上に形成できることもまた、研究により示されている(Caterson et al. 2001. J. Biomed. Mater. Res. 57: 394-403(非特許文献9); Martin et al. 2001. J. Biomed. Mater. Res. 55: 229-235(非特許文献10))。しかしながら、軟骨形成用のこれらの骨格の使用では、骨工学におけるそれらの使用で観察されるのと同じ制限が明らかである。
【０００８】
新規の生体適合性ポリマー、特に骨または軟骨などの機械的に丈夫な用途のための骨格の形成に適したポリマーの必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sofia et al. Journal of Biomedical Materials Research 2001, 54, 139-148
【非特許文献２】Perez-Rigueiro et al. Science, 1998; 70: 2439-2447
【非特許文献３】Hutmacher D. Biomaterials 2000. 21, 2529-2543
【非特許文献４】Holy et al. J. Biomed. Mater. Res.(2003)65A:447-453
【非特許文献５】Karp et al., J. Craniofacial Surgery 14(3): 317-323
【非特許文献６】Ohgushi et al. 1992. CRC Handbook of Bioactive Ceramics. T. Yamamuro, L. L. Hench, and J. Wilson, editors. Boca Raton, FL: CRC Press. 235-238
【非特許文献７】Petite et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18: 959-963
【非特許文献８】Harris et al. J. Biomed. Mater. Res. 42: 396-402
【非特許文献９】Caterson et al. 2001. J. Biomed. Mater. Res. 57: 394-403
【非特許文献１０】Martin et al. 2001. J. Biomed. Mater. Res. 55: 229-235
【発明の概要】
【００１０】
歯学および医学における新規の生体材料のための探索は、タンパク質ポリマーなどの天然材料まで拡張してきている。カイコガ(Bombyx mori)から加工されるようなカイコ絹は、修復材料から組織工学骨格にまで及ぶ、歯学および医学における適用のための候補である。
【００１１】
本明細書において記載されるものは、絹ポリマーとハイドロキシアパタイトとの混合物を含む方法および組成物である。本明細書において記載される方法を用い、絹ポリマーとハイドロキシアパタイトとの混合物を調製でき、さらに、所望の形に成形可能な混合物を提供できる。本明細書で記載される方法および組成物は、例えば、骨の治癒または歯の構築もしくは支持を促進するために移植され得る移植可能な構造物の形成を可能とする。
【００１２】
本明細書において記載される一つの局面において、本発明者らは、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む製造物品であって、絹がハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成されている製造物品を開発した。本明細書において記載されるこの局面およびすべての他の局面において、製造物品は、絹不溶性状態の形成前に絹ポリマーおよびハイドロキシアパタイト粒子を混合することにより形成できる。
【００１３】
本明細書において記載される、この局面およびすべての他の局面の一つの態様において、実質的に均一な混合物を形成するために、絹ポリマーおよびハイドロキシアパタイト粒子を一緒に混合する。
【００１４】
本明細書において記載される、この局面およびすべての他の局面の別の態様において、得られる物品が、それが内部で形成された容器の形を実質的に保持するように、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を、所望の形/大きさの容器内で固めることができる。
【００１５】
本明細書において記載される、この局面およびすべての他の局面の別の態様において、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物は、物品が0.1重量%から90重量%のハイドロキシアパタイト(およびすべての組成物が0.1重量%から90重量%のハイドロキシアパタイトの範囲内)を含むように、当業者の裁量により組成を変えることができる。
【００１６】
本明細書において記載される、この局面およびすべての他の局面の他の態様において、絹ポリマーとハイドロキシアパタイトとの混合物で生産される物品は、生理活性物質をさらに含む。代わりにまたは加えて、物品はさらに生絹ファイバーを含むことができる。
【００１７】
本明細書において開示される本発明の別の局面は、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む移植可能な構造物の製品であって、絹ポリマーがハイドロキシアパタイト粒子を実質的に囲む製品である。一つの態様において、移植可能な構造物は、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との実質的に均一な混合物から形成される。
【００１８】
本明細書において記載される、この局面およびすべての他の局面の別の態様において、得られる構造物が、それが内部で形成された容器の形を実質的に保持するように、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を、所望の形/大きさの容器内で固めることができる。
【００１９】
本明細書において記載される、この局面およびすべての他の局面の別の態様において、絹とハイドロキシアパタイトの構造物は、移植後に生体内吸収される（bioresorbed）か、または代わりに、移植後に骨中に取り込まれる、一時的支持体を提供する。
【００２０】
本明細書において記載される別の局面は、絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、および絹ポリマーがハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成されるように、不溶性状態を形成するように絹ポリマーを誘導する工程を含む、移植可能な構造物の製造のための方法である。
【００２１】
本明細書において、移植可能な構造物の生産のためのキットもまた開示され、該キットまたはシステムは、(a)凍結乾燥絹ポリマーまたは絹ポリマー、および(b)ハイドロキシアパタイト粒子、(c)それらのための包装材料を含む。一つの態様において、キットまたはシステムは溶媒、例えばHFIPをさらに含む。別の態様において、システムは絹ポリマーの不溶性状態への形成のための容器をさらに含む。
【００２２】
本明細書において、個体において骨を修復または強化するための方法もまた記載され、該方法は、(a)ペースト組成物を形成するために、絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混する工程、(b)骨損傷または欠損を有する個体中で修復または補強を必要とする骨の領域に、該ペースト組成物を適用する工程;および(c)適用した該ペースト組成物中の絹ポリマーを不溶性状態に形成する工程を含み;ここで、不溶性状態の絹ポリマーを含む適用した該組成物が、骨組織による置換のための骨格を提供する。
【００２３】
定義
本明細書で用いる「絹ポリマー」または「絹フィブロイン」という用語は、カイコフィブロインおよび昆虫またはクモ絹タンパク質を包含する(Lucas et al., Adv. Protein Chem 13: 107-242(1958))。好ましくは、フィブロインは溶解カイコ絹またはクモ絹を含有する溶液から得られる。概して、絹フィブロインの絹ポリマーは実質的にセリシンを除去するように処理されている。カイコ絹タンパク質は、例えばカイコガ(Bombyx mori)から得られ、クモ絹は、例えばネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)から得られる。あるいは、本発明における使用に適した絹タンパク質は、細菌、酵母、哺乳類細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物由来などの遺伝子操作された絹を含有する溶液から得ることができる。例えば、WO97/08315および米国特許第5,245,012号を参照のこと。本明細書で用いる「生絹」または「生絹ファイバー」という用語は、セリシンを除去するように処理されていない絹ファイバーを意味し、それゆえ、例えば、繭から直接得られた絹ファイバーを包含する。
【００２４】
本明細書において用いる「不溶性状態」という用語は、絹ポリマーに関して使用する場合、実質的に無定形の、主にβ-シート構造の形態またはその状態にあることを意味する。「不溶性状態に形成される」という用語は、絹モノマーの絹ポリマーへの重合を表すことを意図するものではない。むしろ、可溶性絹ポリマーの水不溶性状態への変換を表すことを意図する。本明細書で用いる絹ポリマーは、遠心分離によりペレット化できる場合、または37℃またはそれより低い温度で水中に浸漬によりまたは水ですすぐことにより溶解できない場合、「不溶性状態」にある。
【００２５】
本明細書において用いる「前記ハイドロキシアパタイト粒子の周囲」という用語は、絹の不溶性状態への固化または形成が同じ容器内でかつ実質的に一単位で起こるような、絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との実質的に均一な混合物の形成を意味する。それゆえ、「前記ハイドロキシアパタイト粒子の周囲」は、例えば、ハイドロキシアパタイト粒子の事前に形成された不溶性絹ポリマー上への二次的な沈着を排除する。「実質的に均一な」という用語は、絹ポリマーおよびハイドロキシアパタイト粒子が一緒に結合され、例えば、絹およびハイドロキシアパタイトが混合により十分に内部分散(interdisperse)されているペーストを形成することを意味する。
【００２６】
本明細書において用いる「生体内吸収された」または「生体内吸収（bioresorption）」という用語は、移植された構造物への内因性組織または細胞の浸潤を意味し、これは、移植された構造物の一つまたは複数の構成要素が新しい組織により置換される、移植可能な構造物および組織の組み込みを可能とする。
【００２７】
本明細書において用いる「含んでいる」または「含む」という用語は、本発明に必須な、組成物、方法、およびそれらの各構成要素を意味するように用いられ、さらに、必須であるか否かに関わらず、明記されていない要素の包含を排除しない。
【００２８】
本明細書において用いる「実質的に〜からなる」という用語は、組成物、方法、またはそれらの各構成要素の記載に包含されることができる他の要素の組み込みを説明し、これらは、本発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に作用しないものに限定される。
【００２９】
「からなる」という用語は、本明細書に記載する、本発明、組成物、方法、およびそれらの各構成要素を意味し、これらは、構成要素、組成物、または方法に必須な要素であると考えられないいずれの要素をも排除することが意図される。
[本発明1001]
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、製造物品であって、
該絹が、該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲で不溶性状態に形成される、製造物品。
[本発明1002]
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、製造物品であって、
該絹が、該ハイドロキシアパタイト粒子の存在下で不溶性状態に形成される、製造物品。
[本発明1003]
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、本発明1001または1002の製造物品。
[本発明1004]
前記物品が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、本発明1001、1002、または1003のいずれかの製造物品。
[本発明1005]
0.1〜約90重量%のハイドロキシアパタイトを含む、本発明1001〜1004のいずれかの製造物品。
[本発明1006]
生理活性物質をさらに含む、前記本発明のいずれかの製造物品。
[本発明1007]
生絹ファイバーをさらに含む、前記本発明のいずれかの製造物品。
[本発明1008]
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、移植可能な構造物であって、
該絹ポリマーが、該ハイドロキシアパタイト粒子を実質的に囲む、移植可能な構造物。
[本発明1009]
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、本発明1008の構造物。
[本発明1010]
前記構造物が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、本発明1008または1009の構造物。
[本発明1011]
移植後に生体内吸収される（bioresorbed）、本発明1008、1009、または1010のいずれかの移植可能な構造物。
[本発明1013]
移植後に骨中に取り込まれる、本発明1008〜1011のいずれかの移植可能な構造物。
[本発明1014]
絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、および
該絹ポリマーが該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成されるように、不溶性状態を形成するように該絹ポリマーを誘導する工程
を含む、移植可能な構造物の製造のための方法。
[本発明1015]
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記移植可能な構造物が、0.1〜約90重量%のハイドロキシアパタイトを含む、本発明1013または1014の方法。
[本発明1017]
前記移植可能な構造物が、生理活性物質をさらに含む、本発明1013、1014、または1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記移植可能な構造物が、生絹ファイバーをさらに含む、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記移植可能な構造物が、該構造物が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記移植可能な構造物が、移植後に生体内吸収される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記移植可能な構造物が、移植後に骨中に取り込まれる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
移植可能な構造物の生産のためのキットであって、
(a)凍結乾燥絹ポリマー、
(b)ハイドロキシアパタイト粒子、および
(c)それらのための包装材料
を含む、キット。
[本発明1023]
HFIP溶媒をさらに含む、本発明1021のキット。
[本発明1024]
絹ポリマーの不溶性状態への形成のための容器をさらに含む、本発明1021または1022のキット。
[本発明1025]
(a)ペースト組成物を形成するために、絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、
(b)骨損傷または欠損を有する個体において修復または補強を必要とする骨の領域に、該ペースト組成物を適用する工程;および
(c)適用した該ペースト組成物中の該絹ポリマーを不溶性状態に形成する工程
を含む、個体において骨を修復または強化するための方法であって、
不溶性状態の絹ポリマーを含む適用した該組成物が、骨組織による置換のための骨格を提供する、方法。
[本発明1026]
修復を必要とする骨のインビボ修復または増強の使用のための本発明1001〜1007のいずれかの物品。
[本発明1027]
修復を必要とする骨のインビボ修復または増強のための医薬の調製における本発明1001〜1007のいずれかの製造物品の使用。
[本発明1028]
修復を必要とする骨の修復または増強の使用のための本発明1008〜1013のいずれかの移植可能な構造物。
[本発明1029]
修復を必要とする骨をインビボで修復または増強するための医薬の調製における本発明1001〜1007のいずれかの移植可能な構造物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】セリシン除去の前と後の絹繭の例を示す。
【図２】本明細書において記載される絹調製方法のための透析技術を示す。図の左側は、透析カセット中の絹溶液を示し、図の右側は、低張溶液中の該カセットの透析を示す。
【図３】凍結乾燥後の凍結乾燥絹の代表例を示す。
【図４】絹溶液で満たし、続いて、HFIPを除去しかつ絹に固化または不溶性状態を形成させるために、絹溶液がメタノール中に浸かっている容器の例を示す。
【図５】絹ポリマーを生産するために本明細書において用いられる一つの態様の概略図、およびその方法を用いて作製された例示的な絹ブロックを示す写真である。
【図６】例示的な30%ハイドロキシアパタイト-絹混合物、および例示的な容器への混合物のパッキングを示す。
【図７】種々の形および大きさの絹ポリマー構造物のいくつかの態様の写真を示す。
【図８】(a)ブラケットの周囲で絹に風を当てる工程、(b)セリシンを除去する工程、(c)絹をスライスする工程、および(d)絹を乾燥させる工程を含む、絹ファイバーを生産するための例示的な方法を示す。
【図９】円柱形容器にて非溶解絹ファイバーの存在下で形成した例示的な絹ポリマーブロックを示す。
【図１０】いくつかの例示的な非ミネラル化およびミネラル化絹サンプルの圧縮率を示すグラフである。
【００３１】
表1は、非ミネラル化絹ポリマー、ミネラル化絹バイオポリマー、および市販の歯科用コンポジットレジン修復材の圧縮率の値を示す。
【００３２】
表2は、象牙質に結合したコンポジットおよびミネラル化絹ポリマーの剪断結合強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
絹ポリマーの単離
絹は、カイコ、すなわちカイコガ(Bombyx mori)により産生される、よく記載されている天然のファイバーであり、数千年の間、織物の糸の形態で伝統的に用いられている。この絹は、糸のコアを形成するフィブロインと呼ばれる繊維タンパク質(重鎖および軽鎖の両方)と、フィブロインファイバーを取り囲み、それらを共に接着するセリシンと呼ばれる糊様タンパク質とを含有する。フィブロインは、アミノ酸グリシン、アラニン、およびセリンを90%まで含有し、ファイバー中でβ-プリーツシートを形成する、極めて不溶性のタンパク質である(Asakura, et al., Encyclopedia of Agricultural Science, Arntzen, C. J., Ritter, E. M. Eds.; Academic Press: New York, NY, 1994; Vol. 4, pp1-11)。
【００３４】
絹は、印象的な機械的性質、生体適合性および生分解性のため、生体材料および組織工学のための材料選択の重要なセットを提供する(Altman, G. H., et al., Biomaterials 2003, 24, 401-416; Cappello, J., et al., J. Control. Release 1998, 53, 105-117; Foo, C. W. P., et al., Adv. Drug Deliver. Rev. 2002, 54, 1131-1143; Dinerman, A. A., et al., J. Control. Release 2002, 82, 277-287; Megeed, Z., at al., Adv. Drug Deliver. Rev. 2002, 54, 1075-1091; Petrini, P., et al., J. Master. Sci-Master. M. 2001, 12, 849-853; Altman, G. H., et al., Biomaterials 2002, 23, 4131-4141; Panilaitis. B., et al., Biomaterials 2003, 24, 3079-3085)。フィブロインなどの再処理された絹の独特な機械的性質およびその生体適合性により、絹ファイバーは生物工学材料および医薬用途における使用のために特に魅力的である。例えば、3次元多孔性絹骨格は、組織工学における使用について記載されている(Meinel et al., Ann. Biomed. Eng. 2004 Jan; 32(1): 112-22; Nazarov, R., et al., Biomacromolecules (2004), 5, 718-726)。さらに、再生された絹フィブロインフィルムは、酸素-および薬物-透過性膜、酵素固定化の支持体、および細胞培養の基材として研究されている(Minoura, N., et al., Polymer 1990, 31, 265-269; Chen, J., et al., Minoura, N., Tanioka, A. 1994, 35, 2853-2856; Tsukada, M., et al., Polym. Sci. Part B Polym. Physics 1994, 32, 961-968)。加えて、絹ハイドロゲルは、組織工学ならびに薬物送達において多くの用途が見出されている(Megeed et al., Pharm. Res. 2002 Jul; 19(7):954-9; Dinerman et al., J. Control. Release. 2002 Aug 21; 82(2-3):277-87)。
【００３５】
絹およびハイドロキシアパタイトを含む移植可能な構造物の調製のための方法および組成物が本明細書において記載される。これらの構造物において、絹ポリマーはハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成される。構造物は、骨または歯の修復を支持するため、または例えば、一つまたは複数の生理活性物質を移植部位に送達するための、インプラントとしての使用を見出す。本明細書において記載される本発明の実施のための方法、材料、および考慮することは、以下に記載される。濃縮される絹フィブロイン溶液は、当業者に公知の任意の方法により調製できる。
【００３６】
製造物品の製造のために容器に加える前に、Na2CO3中でカイコ繭を沸騰させ、次いで臭化リチウム(LiBr)中で可溶化し、凍結乾燥し、有機溶媒ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)中で再溶解することによりセリシン除去を使用する一つのアプローチが、実施例に記載される。
【００３７】
あるいは、有機溶媒の使用を避けることが有利であり得る。そのような溶媒は、処理した材料がインビトロまたはインビボで細胞に曝される場合に生体適合性の問題を引き起こし得る。さらに、例えば、成長因子または他の生理活性分子などの生理活性物質を移植される構造物中に包含させることが望まれる場合、物質の活性を保持するためにすべて水性のアプローチを使用することが有利であり得る。
【００３８】
有機溶媒はまた、フィブロイン材料の性質を変えることもできる。例えば、メタノールなどの有機溶媒中の絹フィブロインフィルムの浸漬は、水和したまたは膨張した構造物の脱水を引き起こし、その結果結晶化、およびしたがって水中での可溶性の消失をもたらす。さらに、組織工学骨格に関しては、有機溶媒の使用は、絹材料の分解性を少なくできる。
【００３９】
本明細書において記載されるようなミネラル化絹調製物を調製するために使用される絹を調製するためのすべて水性のアプローチは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、U.S.20070187862に記載される。
【００４０】
ミネラル
本明細書において記載される方法における使用のためのミネラルは、使用することが望まれる任意の生体適合性ミネラルを包含できる。好ましいミネラルは、その、骨との親和性に関してよく知られた特徴を有する、ハイドロキシアパタイトである。多様な大きさのハイドロキシアパタイト粒子を用い、移植可能な構造物を合成でき、これらはBerkely Advanced Biomaterials(Berkeley. CA)などの商業的な供給源から、ナノクリスタル、粉末、顆粒、およびブロックの状態で利用可能である。ハイドロキシアパタイト粒子の大きさは、続く絹不溶化に望まれる材料特性に応じて広く変わり得る。ハイドロキシアパタイトの粒子は、例えばナノ粒子であることができ、または、例えば500μmから最大ミリメートルの大きさまで、非常に大きくてもよい。用いられる粒子の大きさは、圧縮率、剪断結合強度、および空隙率などの製造物品の性質を変える。種々のハイドロキシアパタイト粒子の大きさの使用のための方法が、本明細書において考慮される。
【００４１】
絹ポリマーおよびハイドロキシアパタイト粒子の組み合わせ
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、物品または移植可能な構造物の生産に関連する方法が、本明細書において記載される。絹ポリマーを単離し、本明細書において上記したように処理する。絹ポリマーおよびハイドロキシアパタイト粒子を、実質的に均一な混合物、例えばペースト中に混合し、絹ポリマーを、ハイドロキシアパタイト粒子の存在下で、好ましくは、ハイドロキシアパタイト粒子を取り囲んで、不溶性状態に形成させる。均一な混合物の形成は、ハイドロキシアパタイト粒子の溶解を包含せず、むしろ、粒子は溶解した絹と混合され、ペースト様物質を生産する。生産される不溶性構造物は、移植可能な構造物として使用できる。
【００４２】
ハイドロキシアパタイト粒子の量は、0.1重量％のハイドロキシアパタイトから90重量%のハイドロキシアパタイトまで変わり得る。好ましくは、ハイドロキシアパタイト粒子は、少なくとも1重量%、少なくとも2重量%、少なくとも5重量%、少なくとも10重量%、少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、および90重量%を含めて最大少なくとも90重量%であるか、または、この範囲内のハイドロキシアパタイトの任意の割合である。例えば、ハイドロキシアパタイト粒子は、0.1%から90%、0.1%から80%、0.1%から70%、0.1%から60%、0.1%から50%、0.1%から40%、0.1%から30%、0.1%から20%、0.1%から10%、0.1%から5%、0.1%から1%、90%から80%、90%から70%、90%から60%、90%から50%、90%から40%、90%から30%、90%から20%、90%から10%、90%から5%、90%から2%、90%から1%、90%から0.1%、10%から50%、15%から45%、20%から40%、30%から70%、30%から60%、30%から50%、30%から40%、10%から30%、15%から30%、または20%から30%の範囲内にあり得る。
【００４３】
絹の不溶性状態への形成
一般に、再生された絹フィブロインは水に可溶性であり、β-シート構造として主に絹ポリマーを含む不溶性のアモルファス組成物を得るために、アルコールまたは他の適当な物質中に浸漬する必要がある(Sofia et al. Journal of Biomedical Materials Research 2001, 54, 139-148)。それゆえ、水溶液中に沈める前に、β-シート構造への相転移を誘導するように、絹構造物を、第一にアルコールなどのβ-シート構造誘導物質に浸す。β-シート構造誘導物質の種類は、異なる性質を有する構造を生じるように選択できる。例えば、メタノールおよびプロパノールを用いてβ-シート構造を誘発する場合、得られる構造はより強いが、しかしより砕けやすく、それゆえ骨再生に適当である。有機溶媒またはアルコールによらない不溶性化を包含する絹不溶性化の種々の方法が、本明細書において考慮され、本明細書において記載される物品または構造物に必要とされる特徴に基づいて適合させることができる。U.S.20070187862は、可溶性絹フィブロインからの不溶性絹構造物の調製のためのすべて水性のアプローチを記載している。
【００４４】
容器
本明細書において記載される絹ポリマーは、容器から絹が取り外せるという条件で、任意の容器内で不溶性状態に形成され得る。容器は、絹混合物がその中に注がれるかまたは詰められる任意の入れ物であり、これは、絹の不溶性状態への形成後に所望の構造物の形を有する空洞を含む。それゆえ、容器を取り外した時、絹-ハイドロキシアパタイト構造物は、容器の空洞の形を実質的に保持する。例えば、絹の不溶性状態への形成は、絹-ハイドロキシアパタイト混合物の縮みを伴い得るため、容器は所望の構造物の体積よりも大きい容積であり得る。さらに、固体化絹が容器の外側表面の形を保持するように、容器の周囲で絹混合物が不溶性状態に形成される容器もまた、本明細書において意図される。
【００４５】
容器は、例えば、プラスチック、ガラス、セラミック、または金属で構成できる。いくつかの態様において、生産される物品に構造上の破損なしに、絹ポリマーの取り外しを可能にする可塑性の容器を用いることが有用である。本明細書おいて記載される方法に用いられる容器は、当業者の裁量で広く変えることができる。さらに、容器の選択は、特定の必要性に合わせるように容易に変更できる。
【００４６】
本明細書において記載される移植可能な構造物は、択一的にまたは追加的に、ブロックまたは他の構造物から粉砕して、最終の移植可能な構造物を生産できることが理解されるべきである。このように、所望の形の容器内での形成を用いることができ、または、所与の形は、当業者により粉砕されるかまたは刻まれ、所望の形を生産することできる。
【００４７】
移植可能な構造物
概して、「移植可能な構造物」は、移植時に宿主生体において免疫応答を生じない、任意の構造物である。それゆえ、移植可能な構造物は、例えば、刺激原であるべきではなくもしくは刺激原を含むべきでなく、またはLPSなどを含むべきでない。さらに、いくつかの例において、移植可能な構造物は細胞浸潤、血管増殖、または生体内吸収もしくは組織への構造物の取り込みを阻害する他の性質を許容する、またはこれを妨げないことが好ましい。例えば、そのような例では、構造物が単純な固体3次元形態ではなく、細胞などが吸収プロセスの間にアクセスできるような、いくつかの空隙を含むかまたは発達させることが重要である(すなわち、生体内吸収の欠如が望まれない限り)。概して、移植可能な構造物は免疫応答(例えば、炎症または移植片の構成要素に対する抗体の産生)を起こさないまたは誘発しないことが好ましいが、いくつかの場合には、免疫応答を引き起こすこと(例えば、特定の抗原に対する抗体の産生)、または組織への取り込みを防ぐことが構造物にとって有利である。そのような局面もまた、本明細書において記載される方法内に意図される。
【００４８】
移植可能な構造物は、広く種々の使用に適用できるが、しかしながら、本明細書において記載する移植可能な構造物は骨または歯の構造の修復または支持のために移植されることが好ましい。移植可能な絹構造物は、例えば、歯、折れた骨、脆弱/弱い骨のための一時的な支持を提供するために、または、骨の破断、破損、石灰化の欠損などの治癒の促進のために用いることができる。本明細書において記載される構造物または製造物品を用い、生理活性物質を送達することもでき、組織の修復または支持のための一次的使用としてまたは二次的なものとして使用できる。このような態様において有用な生理活性物質は、本明細書において以下に記載される。
【００４９】
概して、組織再生成長期間の長さは、絹構造物で移植される特定の組織に依存する。成長期間は、新たな組織が所望の性質を獲得するまで、例えば、再生組織が、特定の厚さ、大きさ、強さ、タンパク様成分の組成、および/または特定の細胞濃度に達するまで続き得る。これらのパラメーターを評価するための方法は、当業者に公知である。移植可能な構造物は、組織の成長期間を超えない速度で再吸収するべきである。このように、構造物は、周囲の組織の十分な浸潤が起こり(当技術分野において公知の方法により検出されるように)、移植可能な構造物が、組織強度または構造(例えば、骨密度)にもはや必要ではなくなるまで、実質的に無傷で残るべきである。このような物質は、例えば所望の生物学的プロセスの推進を介して、または例えば移植後に構造物を浸出させることにより、インサイチューで予防的または治療的な利益を提供できる。
【００５０】
生理活性物質
一つの好ましい態様において、薬学的/治療的な作用物質または生物学的に活性な作用物質などの添加剤を絹-ハイドロキシアパタイト混合物中に組み込む。例えば、成長因子、調合薬、または生物学的成分を移植可能な構造物の形成の間に混合物中に組み込むことができる。
【００５１】
本明細書において記載される方法と組み合わせて用いることができる種々の異なる薬学的/治療的作用物質は、広範囲であり、限定するものではないが、小分子、タンパク質、抗体、ペプチド、および核酸を包含する。概して、本発明を介して投与できる生理活性物質には、限定ではないが、抗生物質および抗ウイルス物質などの抗感染症薬;化学療法剤(すなわち、抗ガン剤);抗拒絶反応剤;鎮痛剤および鎮痛剤の組み合わせ;抗炎症剤;ストロイドなどのホルモン;成長因子(骨形成タンパク質(すなわち、BMPの1〜7)、骨形成様タンパク質(すなわち、GFD-5、GFD-7、およびGFD-8)、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(すなわち、FGF 1〜9)、血小板由来成長因子(PDGF)、インシュリン様成長因子(IGF-IおよびIGF-II)、形質転換成長因子(すなわち、TGF-β-III)、血管内皮成長因子(VEGF));エンドスタチンなどの抗血管形成タンパク質、および他の天然由来のまたは遺伝的に操作されたタンパク質、ポリサッカライド、糖タンパク質、またはリポタンパク質が含まれる。例えば、骨成長に重要な成長因子は、参照により本明細書に組み入れられる、"The Cellular and Molecular Basis of Bone Formation and Repair" by Vicki Rosen and R. Scott Thies, published by R. G. Landes Companyに記載される。加えて、本明細書において記載される混合物を用い、薬理学的材料、ビタミン、鎮静剤、ステロイド、催眠剤、抗生物質、化学療法剤、プロスタグランジン、および放射性調合薬などの任意の種類の分子化合物を送達できる。本明細書において記載される絹ハイドロキシアパタイト構造物は、上記の材料および、限定するものではないが、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物、単糖、細胞、遺伝子、抗血栓剤、代謝拮抗剤、成長因子阻害剤、成長促進物質、抗凝血剤、抗有糸分裂剤、線維素溶解剤、抗炎症性ステロイド、およびモノクローナル抗体を包含する他の物の送達に適している。
【００５２】
製造物品それ自体が、いくつかの局面において、生理活性物質の送達のための担体として考えられるが、本明細書において記載される製造物品の生理活性物質/治療物質/調合薬は、薬学的に許容される担体と混合することにより、調剤できる。固体化絹/ハイドロキシアパタイト構造物を溶解しない、またはそうでなければこれに障害を与えない任意の薬学的な担体を用いることができる。生理活性物質または治療物質は、液体、微細に分けられた固体、または任意の他の適当な物理的な形態として絹-ハイドロキシアパタイト混合物に添加できる。あるいは、生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液中に事前に形成された絹-ハイドロキシアパタイト構造物を浸漬することにより、該構造物に本明細書において記載されるように添加できる。すなわち、前記作用物質は、絹-ハイドロキシアパタイト構造物が形成される時に必ずしも存在する必要は無い。
【００５３】
本明細書において記載される方法における使用のために適当な他の生物学的に活性な作用物質の例には、限定するものではないが、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、または例えば、細胞結合に作用することが知られる"RGD"インテグリン結合配列などの公知のインテグリン結合ドメインを含むペプチドもしくはそれらの変種(Schaffner PおよびDard 2003 Cell Mol. Life Sci. Jan; 60(1):119-32;Hercel U. et al. 2003 Biomaterials Nov; 24(24):4385-415)などの細胞結合メディエーター;生物学的に活性なリガンド;および細胞または組織の内部成長(ingrowth)の特定の変化を増強するかまたは除外する物質が包含される。このような添加剤は、例えば、移植される構造物に有益な特徴を与える細胞を包含するように構造物がインビトロで操作されている、組織工学用途において特に有用である。例えば、3次元絹-ハイドロキシアパタイト骨格マトリックスの細胞集合の工程は、好ましくは、マトリックスに配置するために用いられる培養細胞の増殖を促進するのに効果的な成長因子の存在下で行われる。増殖を促進する作用物質は、用いられる細胞の種類に依存する。例えば、線維芽細胞を用いる場合、本明細書における使用のための成長因子は、線維芽細胞成長因子(FGF)、もっとも好ましくは塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(ヒト組換えbFGF、UPSTATE Biotechnology, Inc.)である。増殖または分化を増強する添加物質の他の例は、限定するものではないが、骨形成タンパク質(BMP)などの骨誘導物質;サイトカイン、上皮細胞成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、インシュリン様成長因子(IGF-IおよびII)、TGF-αおよび同様なものなどの成長因子を含む。当然ながら、このような添加物質を、宿主細胞がインビボで移植された構造物に浸潤することおよび/または該構造物を置換することが促進される状況で用いることができる。
【００５４】
移植可能な構造物を用い、治療物質を細胞および組織に送達することができる。本明細書において記載される構造物中に、例えば薬学的作用物質、成長因子、および他の生物学的制御因子、酵素、またはおそらく細胞でさえも組み込むことができることは、長期間放出および安定性、ならびに活性および放出のより優れた制御のためのこれらの構成要素の安定性を提供する。
【００５５】
生理活性物質の安定性または活性を補助するために必要なまたは指示された他の試薬もまた、本明細書において記載するような生理活性物質とともに、ミネラル化絹構造物を作製するために用いる混合物中に包含できる。このように、必要な緩衝剤、塩、またはコファクターを必要に応じ加えることができる。
【００５６】
圧縮構造物および圧縮率試験
圧縮率試験は、当業者に公知であり、当業者により行うことができる。例えば、圧縮率試験は、10kNロードセルを用いるInstron(登録商標)3366テスターを用いて行うことができる。本明細書において記載されるように調製された構造物の試験に一般的に適用できるアプローチにおいて、試験の一日前に、サンプルを0.9% NaCl溶液中に浸漬する。試験パラメーターは、参照により本明細書に組み入れられる、ASTM Standard ASTM D695: Standard Test Method for Compressive Properties of Rigid Plastics(Volumes 03.01, 444-476(2006); および08.01, 78-85(2006)から部分的に修正する。1 mm/分のクロスヘッド伸張速度を負荷と共に用いることができ、置換を200サンプル/分のサンプリング速度で記録できる。カイコ絹材料に対する圧縮率は、例えば、2つの負荷境界の間の記録されたデータポイントに適合する最小二乗を適用するセグメント率法を用いる、BlueHill(登録商標)1.9 Materials Testing Softwareを用いて計算する。コンポジット材料に対する圧縮率は、100Nおよび300Nの負荷範囲、ならびに2500Nおよび4500N範囲にて記録される応力ひずみデータを用いて計算される。負荷のこれらの範囲は、各材料の負荷変形カーブの直線部分内にあると判断される。
【００５７】
剪断結合応力試験
剪断結合応力試験は、絹-ハイドロキシアパタイト構造物が特定の剪断下で象牙質に結合したままでいる強さの測定である。
【００５８】
第一に、試験および同様に調製された公知の剪断結合強度のコンポジットとの比較のために、絹-ハイドロキシアパタイト構造物を調製する。絹-ハイドロキシアパタイト構造物を調製するための一つの方法は、以下の通りである。一つの態様において、ヒトの歯を採取し、アクリル樹脂にセットする。歯をトリミングして平らな象牙質表面を露出させ、240グリットのサンドペーパーで湿式で研磨する。円柱状のミネラル化絹バイオポリマー構造物を試験に適当な寸法(例えば、直径約6.5mm、高さ約4〜6mm)で調製する。絹結合表面を9.5%フッ化水素酸でエッチングし、次いでレジンセメント(Variolink II, Ivoclar Vivadent)を用い、適当な結合圧レベル(例えば、約500g+/-100g)下で象牙質表面に接着する。コントロールとして、同様な寸法の結合したコンポジット-レジン円柱を調製し、絹-ハイドロキシアパタイト構造物との比較のために象牙質に結合できる。結合のために均一なコンポジット円柱を製作するため(直径約5.8mm、高さ約5mm)、コンポジット-レジン(4 Seasons, Ivoclar Vivadent)をプラスチィックストロー中に装填できる。レジンコンポジット円柱を、第5世代単一成分接着剤(Excite, Ivoclar Vivadent)を用い象牙質表面上に結合し、20秒間光重合させる。結合標本は37℃の水中で24時間保管できる。
【００５９】
剪断結合強度をクロスヘッドスピード0.5mm/分にてインストロン(Instron)4202を用いて得ることができる。次いで、得られた絹-ハイドロキシアパタイト構造物の強度を、公知の強度のコンポジットと、またはハイドロキシアパタイトを含まない絹構造物の強度と比較できる。
【００６０】
インビボ構造物形成
事前に形成した構造物を移植することに加え、構造物をペースト形態にて適用し、インビボで不溶性状態に硬化できることもまた、本明細書において意図される。この施与方法は、構造物の形および大きさを直接的に傷害の位置に調整するために特に有用であり、例えば、骨修復により容易に説明される。骨の部分は、疾患または傷害(すなわち、欠損部位)の領域に直接的に絹-ハイドロキシアパタイト混合物を適用し、次いで混合物を不溶性状態へ形成させることにより、効果的に置換されるかまたは増強できる。骨は、それ自体で修復を開始でき、移植された構造物は、時間の経過と共に分解して個人自身の骨により置換される。それゆえ、絹構造物を除去するためのさらなる処置は必要でない。この施与形態の一つの大きな利点は、移植片の形を修復されるべき部位にて場所中に形作ることができ、欠損部位の外側で設計し形成する必要が無いことである。
【００６１】
インビボでの構造物形成のための基本的な工程は、絹-ハイドロキシアパタイトを混合物に形成する工程、修復を必要とする部位に混合物を位置させる工程、次いで、修復部位にて混合物を不溶性状態に形成する(本明細書において「硬化する」ともいう)工程を含む。
【００６２】
修復部位を取り囲む組織に対する損傷を最小限にするために、すべて水性のアプローチを用いて絹ペーストを形成することが必須である。一つの態様において、ハイドロキシアパタイト粒子を含有する絹溶液(水中)を濃縮ゲルまたはスラリー中で調製する。この系を、欠損部位に注入するか、または、パテに似た堅さに成形して該欠損内に位置させることが可能である。適用および絹がβシート形成を介して安定化する時間の経過とともに、材料は硬くなる。βシートの形成は、注入またはパテの成形の間にかけられる剪断応力、創傷部位内の局所的脱水、またはこれらの二つの作用の組み合わせにより起こる。
【００６３】
絹-ハイドロキシアパタイトペーストの不溶性状態への硬化は、混合物を事前に加熱し、次いで体内に配置する前に冷却することによっても達成できる。加えて、グリセロールなどの生理学的な中性促進剤を用いることができる。一つの態様において、絹-ハイドロキシアパタイト混合物は欠損部位内に配置する前に超音波処理される。
【００６４】
上記の詳細な説明および以下の実施例は単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解される。当業者に明らかである、開示された態様に対する種々の変更および修正が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われてもよい。さらに、全ての特許、特許出願、および特定された刊行物は、例えば本発明との関連において使用され得るそのような刊行物において記載される方法論を説明しかつ開示する目的のために、明確に参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示のためのみに提供される。この点に関して、いかなるものも、先行発明の効力またはいかなる他の理由により、そのような開示に先行する資格を本発明者が与えられないことを承認するものと解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関する全ての記載または内容に関する表示は、本出願者に利用可能な情報に基づいており、かつこれらの文献の日付または内容の正確さに関するいかなる承認ともならない。本発明は、以下の番号がつけられた項のいずれか一つにおいて特定されるものでありうる。
【００６５】
１.絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む製造物品であって、
該絹が、該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲で不溶性状態に形成される、製造物品。
2.絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む製造物品であって、
該絹が、該ハイドロキシアパタイト粒子の存在下で不溶性状態に形成される、製造物品。
3.前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、項1または2記載の製造物品。
4.前記物品が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、項1、2、または3記載の製造物品。
5.0.1〜約90重量%のハイドロキシアパタイトを含む、項1〜4のいずれか一項記載の製造物品。
6.生理活性物質をさらに含む、前記項のいずれか一項記載の製造物品。
7.生絹ファイバーをさらに含む、前記項のいずれか一項記載の製造物品。
8.絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含む、移植可能な構造物であって、
該絹ポリマーが、該ハイドロキシアパタイト粒子を実質的に囲む、移植可能な構造物。
9.前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、項8記載の構造物。
10.前記構造物が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、項8または9記載の構造物。
11.移植後に生体内吸収される、項8、9、または10記載の移植可能な構造物。
12.移植後に骨中に取り込まれる、項8〜11のいずれか一項記載の移植可能な構造物。
13.絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、および
該絹ポリマーが該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成されるように、不溶性状態を形成するように該絹ポリマーを誘導する工程
を含む、移植可能な構造物の製造のための方法。
14.前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、項13記載の方法。
15.前記移植可能な構造物が、0.1〜約90重量%のハイドロキシアパタイトを含む、項13または14記載の方法。
16.前記移植可能な構造物が、生理活性物質をさらに含む、項13、14、または15記載の方法。
17.前記移植可能な構造物が、生絹ファイバーをさらに含む、項13〜16のいずれか一項記載の方法。
18.前記移植可能な構造物が、該構造物が内部で形成された容器の形を実質的に保持している、前記項のいずれか一項記載の方法。
19.前記移植可能な構造物が、移植後に生体内吸収される、前記項のいずれか一項記載の方法。
20.前記移植可能な構造物が、移植後に骨中に取り込まれる、前記項のいずれか一項記載の方法。
21.前記移植可能な構造物の生産のためのキットであって、
(a)凍結乾燥絹ポリマー、
(b)ハイドロキシアパタイト粒子、および
(c)それらのための包装材料
を含む、キット。
22.HFIP溶媒をさらに含む、項21記載のキット。
23.絹ポリマーの不溶性状態への形成のための容器をさらに含む、項21または22記載のキット。
24.(a)ペースト組成物を形成するために、絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と混合する工程、
(b)骨損傷または欠損を有する個体において修復または補強を必要とする骨の領域に、該ペースト組成物を適用する工程;および
(c)適用した該ペースト組成物中の該絹ポリマーを不溶性状態に形成する工程
を含む、個体において骨を修復または強化するための方法であって、
不溶性状態の絹ポリマーを含む適用した該組成物が、骨組織による置換のための骨格を提供する、方法。
【実施例】
【００６６】
実施例1:絹/ハイドロキシアパタイト物品および移植可能な構造物を作製するために使用される方法論の一つの態様
A.生絹の抽出およびすすぎ
乾燥繭を切り開き、カイコ組織を除去した。セリシン除去を促進するため、繭をいくつかの断片に細断し、5gのカイコ繭組織を、0.02M NaCO3溶液中、30〜45分間煮沸して、絹繭からセリシンを除去した。絹を沸騰している液体中にゆるく浸漬して、可能な限り多くの表面領域を曝した。絹を溶液から取り出し、しぼり、ビーカーの中の温かい蒸留水(5グラム当たり1L)の中で20分間、時々攪拌しながら浸した。この工程をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄の後、絹の水気を切り、しぼり、平らに広げて、フード下にて12〜18時間乾燥させた。図1に示すように、乾燥絹の量は、セリシンを含まない絹の元々の量の約70〜75%であった。
【００６７】
B: 臭化リチウム溶液中の溶解
次いで、20%重量/体積比の絹塊/LiBrである絹濃度で、絹を9.3MのLiBr溶液中に溶解した。絹を60℃チャンバー中で4時間溶解させた。
【００６８】
C: 絹溶液の透析
シリンジを用い、溶解絹溶液の12mLのアリクオットを12mLの透析カセット中に移した。絹溶液を含む各透析カセットを1Lの蒸留水に対して透析した。例えば、4個までのカセットを一つのプラスチィック性の5L容量バケットに包含させることができ、図2に示すように4Lの水を必要とする。蒸留水を1時間後、4時間後、およびその後、引き続く2日間の間12時間毎に、合計で6回交換した。
【００６９】
D: 遠心分離
絹溶液をシリンジを用いて透析カセットから集め、45mLのFalcon(商標)遠心チューブ中に移した。絹溶液を冷却し、次いで9,000RPMで30分間遠心分離して、元々の繭から残ったいずれの不純物/残骸も除去した(図3参照)。遠心分離を減速させ、20分間の間におだやかに止めた。絹溶液を新しいチューブ中に移し、冷却し、遠心分離を繰り返して、2回目を行った。
【００７０】
E: 凍結およびその後の絹の乾燥
精製した絹を含有する遠心チューブの上部を除去し、チューブを冷凍庫に一晩置いた。凍結絹を凍結乾燥して、純粋な凍結乾燥絹を生産した。この形態の絹は、乾燥環境中、室温にて数週間保存できる。
【００７１】
F: HFIP(ヘキサ-フルオロ-イソ-プロパノール)中の絹の溶解
凍結乾燥絹の重さを計り、絹の17%重量/体積の最終濃度とするのに必要な90%体積のHFIP中に溶解した。最終の10%のHFIPを加える前に約2日間、絹を溶解させた。残りのHFIPの添加に続けて、溶液を約4時間置き、溶液の適当な混合を得た。絹溶解プロセスを図5に示す。
【００７２】
G: 絹HFIP溶液の再重合カプセル中への注入およびHFIP除去
不溶性絹構造物の形成のために、シリンジを用いて絹溶液の別個の体積を(完全な溶解に続けて)カプセル中に移した。カプセルは厳重に密封するように選択されるが、しかし、最終的な絹ブロックが用いたカプセルの形態をとるように任意の形であった(図6参照)。
【００７３】
24時間後、メタノールを絹カプセルに加えて、HFIPの蒸発を促進させた。絹プラグは凝固の際、メタノールの存在下で有意に縮んだ。
【００７４】
H: ミネラル化カイコ絹ポリマー処理および説明
17%絹ポリマー製作プロセスのバリエーションとして、HFIP中に溶解後、無機ミネラル分を絹溶液に添加した。例えば、材料の機械的性質の改良のために、ミネラル負荷絹ポリマーのプロトタイプを製作した。使用した無機ミネラル分は、ハイドロキシアパタイト(HA=Ca10(PO4)6(OH)2))であった。
【００７５】
30%までのHAを含むミネラル負荷絹ポリマー材料を合成した。より高い割合を、それが望ましければ、例えば40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上まで調製できる。一度必要量のHA粉末(この例では、30質量%を得るのに必要な量)を絹-HFIP混合物中に添加した場合、得られる材料は図8に示すように生地様粘稠度を有した。ミネラル負荷絹材料の粘度は、純粋な絹溶液のものよりも、シリンジの使用で等分することが不可能なほど高かった。しかしながら、十分な圧では、ミネラル化絹溶液混合物は、不溶性絹-ハイドロキシアパタイト構造物の形成のために任意の外形および大きさの空洞内に注入することができた。ミネラル化絹材料のプロトタイプを作製するために、材料をプラスチィックピペットチップおよび円柱プラスチックカプセルなどのアイテム内に詰めた。材料が詰められる空洞の遠心端の開口部が小さいとよりよい結果となり、より少ない空隙で充填することが可能となることが見出された。
【００７６】
カプセル中に分散するかまたは不溶性絹-ハイドロキシアパタイト構造物を成形した後、本明細書において記載される非ミネラル化絹材料に行うのと同じ工程を用いて、ミネラル化絹材料を処理して完成させた。様々な形および大きさを有する絹ポリマー/ハイドロキシアパタイト構造物を図9に示す。
【００７７】
I. 組み込まれた生絹ファイバーを含むミネラル化カイコ絹ポリマー
加えられたハイドロキシアパタイトに加えて、絹ポリマー材料の他のバリエーションは、混合物中に非溶解絹ファイバーを加えて、絹ポリマーを構造的に強化する助けとすることである。これは、例えば、ファイバーを適用される圧縮力の方向に平行して整列させる場合、特に有利である。
【００７８】
セリシン除去工程により絹ファイバーを処理し、図10に示すように約3mmの長さの切片にスライスした。約2質量%の非溶解絹ファイバーを含むミネラル化絹ブロックのプロトタイプを作製し、図11に示す。絹ファイバーはいずれの特定の方向にも向いておらず、カプセル中に詰められている間に絹-ミネラル混合物中に挿入された。
【００７９】
J. 残存HFIP除去を促進するための完成したサンプルの真空ポンプ吸引（vacuumpumping）工程
絹ポリマーのすべての形態の完成したサンプルが、それらがフードから除去された後にHFIPの香りを有していることが観察された。さらなる処理工程を、約2日間真空チャンバー内(図12参照)で完成したサンプルに行った。少量の完成したサンプルを-25ATMにて真空ポンプ内に置いた。HFIPの香りはこの処置後に減少したが、完全には消失しなかった。残存溶媒により引き起こされる潜在的な問題を回避するための別のアプローチは、有機溶媒の使用を回避するすべて水性の方法を使用することである。
【００８０】
実施例2.絹/ハイドロキシアパタイト物品および構造物の機械的性質
30%のHAおよび非ミネラル化絹ポリマーのバッチを処理の間に円柱形状内に詰めて、2つの材料の圧縮率を決定した。
【００８１】
圧縮率試験は、表1に示すように、絹ポリマーにミネラル分を加えることの相対的な利点を示した。
【００８２】
別の研究として、レジンセメントを用いたミネラル化絹ベースバイオポリマーと天然の抜き取った歯の象牙質との間の剪断結合強度試験を行った(表2)。コントロールとして、象牙質に結合したのと同様な大きさの結合した歯科用コンポジット-レジンボタンの剪断結合強度試験もまた評価した。
【００８３】
（表１）一元配置分散分析(one-way ANOVA)により分析した、非ミネラル化絹バイオポリマー、ミネラル化絹バイオポリマー、および市販される歯科用コンポジットレジン修復材料の圧縮率試験(n=24、8/グループ)
2015205208.tif 000003
【００８４】
（表２）独立サンプルT検定(Independent Samples T-test)により分析した、象牙質に結合したコンポジットおよびミネラル化絹ポリマーの剪断結合強度試験(n=16)
2015205208.tif 000004
【図１】
2015205208.tif 000005
【図２】
2015205208.tif 000006
【図３】
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【図４】
2015205208.tif 000008
【図５】
2015205208.tif 000009
【図６】
2015205208.tif 000010
【図７】
2015205208.tif 000011
【図８】
2015205208.tif 000012
【図９】
2015205208.tif 000013
【図１０】
2015205208.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月31日(2015.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹ポリマーとハイドロキシアパタイト粒子との混合物を含み、内部で形成された容器の形を実質的に保持する、製造物品であって、
該絹ポリマーが、該容器中で該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲で不溶性状態に形成され、該不溶性状態の絹が主にβ-シート構造を含む、前記製造物品。
【請求項２】
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、請求項1記載の製造物品。
【請求項３】
ハイドロキシアパタイトの含量が、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上まで負荷される、請求項1記載の製造物品。
【請求項４】
不溶性状態への形成が、絹-ハイドロキシアパタイト混合物の縮みを伴う、請求項1記載の製造物品。
【請求項５】
容器の外側表面の形を保持する、請求項1記載の製造物品。
【請求項６】
さらに粉砕されるかまたは刻まれている、請求項1記載の製造物品。
【請求項７】
標準偏差19.16で平均圧縮率84.2 MPaを有する、請求項1記載の製造物品。
【請求項８】
標準偏差0.616で剪断結合強度1.318 MPaを有する、請求項1記載の製造物品。
【請求項９】
生理活性物質をさらに含む、請求項1記載の製造物品。
【請求項１０】
生絹ファイバーをさらに含む、請求項1記載の製造物品。
【請求項１１】
絹ポリマーの溶液をハイドロキシアパタイト粒子と容器中で混合する工程、および
該絹ポリマーが該ハイドロキシアパタイト粒子の周囲に不溶性状態に形成されるように、該容器中で不溶性状態を形成するように該絹ポリマーを誘導する工程
を含み、該不溶性状態の絹ポリマーが主にβ-シート構造を含む、物品の製造方法。
【請求項１２】
前記絹ポリマーおよび前記ハイドロキシアパタイト粒子が、実質的に均一な混合物である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記物品が0.1〜90重量％のハイドロキシアパタイトを含む、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
前記物品が生理活性物質をさらに含む、請求項11または12記載の方法。
【請求項１５】
前記物品が生絹ファイバーをさらに含む、請求項11または12記載の方法。
【請求項１６】
前記物品が、内部で形成された容器の形を実質的に保持する、請求項11または12記載の方法。
【請求項１７】
前記物品が移植後に生体内吸収される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記物品が移植可能な構造物である、請求項11または12記載の方法。
【請求項１９】
前記移植可能な構造物が対象に移植され、移植後に骨中に取り込まれる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
修復を必要とする骨のインビボ修復または増強のための医薬の調製における、請求項1〜10のいずれか一項記載の製造物品の使用。