(57)【要約】【課題】本発明は、高感度でエンドトキシンを測定できる、高純度リムルス試薬、エンドトキシン濃度測定キット、及びエンドトキシン濃度測定法を目的とする。【解決手段】本発明は、Ｃ因子を含み、Ｃ因子、Ｂ因子及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まない、発光合成基質法に用いるための高純度リムルス試薬である。該高純度リムルス試薬は、さらにＢ因子を含むことが好ましく、さらに前凝固酵素を含むことがより好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ因子を含み、Ｃ因子、Ｂ因子及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まない、発光合成基質法に用いるための高純度リムルス試薬。
【請求項２】
さらにＢ因子を含む、請求項１に記載の高純度リムルス試薬。
【請求項３】
さらに前凝固酵素を含む、請求項２に記載の高純度リムルス試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の高純度リムルス試薬と、エンドトキシンの結合により活性化された活性型Ｃ因子を介する反応により発光基質を遊離する発光合成基質を含有する基質試薬と、遊離する発光基質を発光させる発光酵素を含有する酵素試薬とを有するエンドトキシン濃度測定キット。
【請求項５】
被験試料に請求項１〜３のいずれか一項に記載の高純度リムルス試薬を添加するリムルス試薬添加工程、
エンドトキシンの結合により活性化された活性型Ｃ因子を介する反応により発光基質を遊離する発光合成基質を含有する基質試薬を添加する基質添加工程、
遊離する発光基質を発光させる発光酵素を含有する酵素試薬を添加する酵素添加工程、
発光強度を測定する測定工程を有する、エンドトキシン濃度測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高純度リムルス試薬、エンドトキシン濃度測定キット、及びエンドトキシン濃度測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「エンドトキシン（endotoxin：内毒素）」は、グラム陰性菌の外膜を構成する成分の一つであり、その活性の本体はＬＰＳ（lipopolysaccharide：リポ多糖）である。生体内におけるエンドトキシンの存在は、グラム陰性菌の表層に外膜の一部として存在する。また、一般的にはグラム陰性桿菌の死後、フリーのエンドトキシンとして血流中に遊離して存在している。
【０００３】
エンドトキシンが血液中に一定量以上存在する場合、当該エンドトキシンの刺激によって単球や顆粒球等で過剰の炎症性サイトカインが産生される。その結果、エンドトキシン血症と呼ばれる発熱、敗血症、敗血症性ショック、又は多臓器不全等の症状が惹起される。
そのため、血液中に直接投与する注射用医薬品等において、エンドトキシンをより高感度で測定することは、医薬品の投与によりこれらの症状が引き起こされることを防止するために重要である。また、診断において、血液中のエンドトキシンをより低濃度で正確に測定することは、患者の早期診断や治療経過観察をするために重要である。
【０００４】
エンドトキシン測定法としては、一般にリムルステストによる方法が知られている。
リムルステストは、カブトガニの血球抽出液中のエンドトキシンにより特異的に誘導されるカスケードを利用したものである。該カスケードは、具体的に以下の（１）〜（３）の３段階の反応を有する。
（１）エンドトキシンが、Ｃ因子と強固に結合して、Ｃ因子を活性型に変換する段階。
（２）次いで、活性型Ｃ因子が、Ｂ因子を活性型に変換する段階。
（３）次いで、活性型Ｂ因子が、前凝固酵素から凝固酵素を生成する段階。
各段階で生成する活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子及び凝固酵素は、それぞれ配列特異的なプロテアーゼ活性を有する。
【０００５】
リムルステストにおける検出系としては、ゲル化転倒法（ゲル化法）及び比濁時間分析法（比濁法）、発光合成基質法（発光法）、発色合成基質法（比色法）等が挙げられる。中でも、発光合成基質法（発光法）と発色合成基質法（比色法）は、プロテアーゼ活性がアミノ酸配列特異的であることを利用した、合成基質を用いる検出系として開発されてきている。
例えば、特許文献１には、検出系として発光合成基質法（発光法）を用いたリムルステストが開示されている。同文献の実施例では、合成基質として、ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリンが用いられている。また、該実施例には、検出されたエンドトキシンの最低濃度は、１０−４エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬであることが示されている。
また、特許文献２には、検出系として発色合成基質法（比色法）を用いたリムルステストが開示されている。同文献の実施例では、合成基質として、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡが用いられている。また、同文献には、検出されたエンドトキシンの最低濃度は、１０−１ＥＵ／ｍＬであることが示されている。また、同文献においては、カブトガニ血球抽出液由来の前凝固酵素を用いた場合と、組換え前凝固酵素を用いた場合とでは、同等の活性であることも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６３８４０号
【特許文献２】国際公開第２００８／００４６７４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、リムルステストにおいて、エンドトキシンの濃度をさらに高感度で測定できることが望まれている。
そこで、本発明は、高感度でエンドトキシンを測定できる、高純度リムルス試薬、エンドトキシン濃度測定キット、及びエンドトキシン濃度測定法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］Ｃ因子を含み、Ｃ因子、Ｂ因子及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まない、発光合成基質法に用いるための高純度リムルス試薬。
［２］さらにＢ因子を含む、［１］に記載の高純度リムルス試薬。
［３］さらに前凝固酵素を含む、［２］に記載の高純度リムルス試薬。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の高純度リムルス試薬と、エンドトキシンの結合により活性化された活性型Ｃ因子を介する反応により発光基質を遊離する発光合成基質を含有する基質試薬と、遊離する発光基質を発光させる発光酵素を含有する酵素試薬とを有するエンドトキシン濃度測定キット。
［５］被験試料に［１］〜［３］のいずれかに記載の高純度リムルス試薬を添加するリムルス試薬添加工程、エンドトキシンの結合により活性化された活性型Ｃ因子を介する反応により発光基質を遊離する発光合成基質を含有する基質試薬を添加する基質添加工程、遊離する発光基質を発光させる発光酵素を含有する酵素試薬を添加する酵素添加工程、発光強度を測定する測定工程を有する、エンドトキシン濃度測定法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の高純度リムルス試薬、エンドトキシン濃度測定キット、及びエンドトキシン濃度測定法によれば、エンドトキシン濃度を高感度で測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】高純度リムルス試薬を用いた場合のエンドトキシンの検出結果を示すグラフである。
【図２】従来のカブトガニ血球より調製したリムルス試薬を用いた場合のエンドトキシンの検出結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜高純度リムルス試薬＞
本発明の高純度リムルス試薬は、Ｃ因子を含み、Ｃ因子、Ｂ因子及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まない。該高純度リムルス試薬は、発光合成基質法（発光法）に用いられる。
また、高純度リムルス試薬は、さらにＢ因子を含むことが好ましく、さらに前凝固酵素を含むことがより好ましく、個別に精製して得たＣ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素を再構成したものであることが最も好ましい。
【００１２】
本明細書において「Ｃ因子、Ｂ因子及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まない」とは、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を実質的に含まないことを意味する。この「実質的に」含まないとは、本発明による効果を妨げない程度に、高度にＣ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素が精製されていることを意味する。
また、「高度に」精製されているとは、高純度リムルス試薬中の、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素の総含有量に対する、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質の含有量（以下、「夾雑物含有量」という。）が、５０質量％以下であることを意味する。夾雑物含有量が５０質量％以下であれば、本発明の効果、すなわちエンドトキシン濃度の検出感度の向上が充分に図られる。
該夾雑物含有量は、４０質量％以下であることが好ましく、２０質量％以下であることがより好ましく、１０質量％以下であることがさらに好ましく、５質量％以下であることが最も好ましい。夾雑物含有量が前記上限値以下であれば、エンドトキシン濃度の検出感度のさらなる向上が図られる。
本発明の高純度リムルス試薬は、乾燥粉末であってもよく、液体であってもよい。
【００１３】
［Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素］
本発明の高純度リムルス試薬におけるＣ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素は、カブトガニ血球抽出物等から高度に精製した天然タンパク質であってもよく、組換えタンパク質であってもよい。
カブトガニ血球抽出物等から高度に精製した天然タンパク質は、公知の精製方法により得た天然タンパク質でよい。例えば、Ｃ因子についてはEur. J. Biochem. 154, 511-521 (1986)、Ｂ因子についてはJ. Biochem. 99, 847-857 (1986)、前凝固酵素についてはJ. Biochem. 97, 1561-1574 (1985)に記載される精製方法により得た天然タンパク質等が挙げられる。
【００１４】
組換えタンパク質は、クローニングしたＣ因子、Ｂ因子、又は前凝固酵素をコードする遺伝子を、大腸菌、酵母等の微生物又は昆虫細胞や哺乳類細胞に導入し発現させたタンパク質を精製したものである。Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素をコードする遺伝子は、文献やデータベースにより公知である。したがって、例えば、Ｂ因子をコードする遺伝子はJ. Biol. Chem. 268, 21384-21388 (1993)、Ｃ因子をコードする遺伝子はJ. Biol. Chem. 266, 6554-6561 (1991)、前凝固酵素をコードする遺伝子は国際公開第２００８／００４６７４号に掲載される塩基配列情報等を参照して、ＰＣＲ法等により適宜増幅し、クローニングすることができる。また、遺伝子は、野生型であってもよく、野生型を適宜改変して得た変異型であってもよい。
【００１５】
変異型としては、公知のものがあればそれを用いればよく、新たに改変して得たものを用いてもよい。新たに改変する場合には、例えば、発現したＣ因子、Ｂ因子、又は前凝固酵素の活性型における酵素活性が野生型よりも高くなるように設計し得たもの等が好ましい。例えば、野生型のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列等が挙げられる。ここで、「１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、挿入、置換又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されていることが意図される。
また、野生型と変異型の相同性は、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００１６】
Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素は、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まないものとする点、精製をより容易に行える点、生物保護の点から、組換えタンパク質であることが好ましい。
【００１７】
（含有割合）
高純度リムルス試薬にＢ因子を含ませる場合、高純度リムルス試薬におけるＣ因子に対するＢ因子の含有割合（Ｂ因子／Ｃ因子）は、質量比で１０／１〜０．１／１が好ましく、２／１〜０．５／１がより好ましい。
高純度リムルス試薬に前凝固酵素を含ませる場合、高純度リムルス試薬におけるＣ因子に対する前凝固酵素の含有割合（前凝固酵素／Ｃ因子）は、質量比で１０／１〜０．１／１が好ましく、２／１〜０．５／１がより好ましい。
Ｂ因子／Ｃ因子及び前凝固酵素／Ｃ因子が前記範囲内であれば、リムリス反応が良好に進む。
【００１８】
（他の成分）
高純度リムルス試薬には、塩、ｐＨ調整剤等のカブトガニ血球抽出物に由来しない他の成分を適宜含ませてもよい。
【００１９】
［製造方法］
（タンパク質源）
Ｃ因子、Ｂ因子、前凝固酵素は、カブトガニ血球抽出物から天然タンパク質を得てもよく、組換えタンパク質を大腸菌、酵母等の微生物又は昆虫細胞や哺乳類細胞に発現させて得てもよい。大腸菌、酵母等の微生物又は昆虫細胞や哺乳類細胞に発現させる場合のベクターは、プラスミドベクターを用いてもよく、バキュロウイルス等のウイルスベクターを用いてもよい。発現は、一過性でもよく、安定発現でもよい。
Ｃ因子、Ｂ因子、前凝固酵素は、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する物質を含まないものとする点、精製をより容易に行える点、生物保護の点から、組換えタンパク質を大腸菌、酵母等の微生物、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等に発現させて得るのが好ましい。
【００２０】
（精製）
Ｃ因子、Ｂ因子、前凝固酵素の精製方法は、公知の精製方法であれば、特に限定されない。精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィを用いる方法等が挙げられる。
天然タンパク質を得るための精製方法としては、例えば、Eur. J. Biochem. 154, 511-521 (1986)、J. Biochem. 99, 847-857 (1986)、J. Biochem. 97, 1561-1574 (1985)に記載されるイオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過等を用いる方法が挙げられる。
【００２１】
アフィニティクロマトグラフィを用いる場合、タンパク質は天然タンパク質であってもよく、組換えタンパク質であってもよい。中でも、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）等の汎用のタグペプチドを利用したアフィニティクロマトグラフィを行うため、タンパク質源は組換えタンパク質が好ましい。
タグに特異的なアフィニティビーズとしては、例えば、ポリヒスチジンタグに対してはニッケル等の金属キレートアガロース（ＧＥヘルスケア社製の「Ni Sepharose excel」等）、ＦＬＡＧ（登録商標）タグに対しては抗ＦＬＡＧ（登録商標）モノクローナル抗体アガロース（シグマ社製の「M2 agarose」等）、ＧＳＴタグに対してはグルタチオンビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ社製の「Glutathione Magnetic Beads」等）等が挙げられる。
アフィニティビーズを用いるアフィニティクロマトグラフィは、バッチにより行ってもよく、アフィニティビーズを空のカラムに充填したカラムを用いて行ってもよい。スケールアップがしやすい点及び精製の安定性の点から、カラムを用いるのが好ましい。
【００２２】
上述した精製方法の中でも、効率的な精製が行える点から、アフィニティクロマトグラフィを用いる方法が好ましい。
また、精製は、１段階でも本発明の効果が充分得られるが、該効果をさらに良好にするため、精製の手間、コスト、時間等を考慮しつつ多段階で行ってもよい。
多段階とする場合には、同種の精製方法を繰返し行ってもよく（例えば、イオン交換クロマトグラフィを繰返し行う等）、異種の精製方法を組合せて行ってもよい。中でも、純度をさらに高めるため、異種の精製方法を組合せるのが好ましい。
【００２３】
［用途］
本発明の高純度リムルス試薬は、発光合成基質法（発光法）に用いられる。
発光合成基質法（発光法）は、エンドトキシンのＣ因子への結合により生成された、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子、又は凝固酵素の基質として、後述する発光合成基質を用いる検出系である。発光合成基質法（発光法）においては、まず、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子、又は凝固酵素のプロテアーゼ活性により発光合成基質が加水分解され、後述する発光基質が遊離する。次いで、この発光基質に後述する発光酵素を作用させることにより、該発光基質が発光する。発光の強度とエンドトキシンの濃度とが相関することから、発光強度を測定すればエンドトキシン濃度を算出できる。
【００２４】
＜エンドトキシン濃度測定キット＞
本発明のエンドトキシン濃度測定キットは、上述の高純度リムルス試薬と、基質試薬と、酵素試薬とを有する。
高純度リムルス試薬は、上述したとおりである。
［基質試薬］
基質試薬は、エンドトキシンの結合により活性化された活性型Ｃ因子を介する反応により発光基質を遊離する発光合成基質（以下、単に「発光合成基質」という。）を含有する。
基質試薬は、乾燥粉末であってもよく、液体であってもよい。
【００２５】
（発光合成基質）
発光合成基質は、発光基質にペプチドが結合したものである。
発光基質：
発光基質とは、発光酵素の基質であり、該発光酵素の作用により生物発光する物質である。発光基質としては、ルシフェリン等が挙げられる。中でも、アミノ基がペプチドのカルボキシル基とアミド結合を形成させることができるため、発光基質にペプチドを結合させやすいことから、アミノルシフェリンが好ましい。
発光基質の種類は、単独でもよく、２種以上の組合せであってもよい。
【００２６】
ペプチド：
ペプチドは、該ペプチドのＣ末端における発光基質とのアミド結合が、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子及び凝固酵素のいずれか１種のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列を有するものであればよい。発光基質とのアミド結合を切断できるものであれば、ペプチドのアミノ酸残基数及びアミノ酸配列は限定されないが、特異性、合成コスト、取扱い易さ等の観点からアミノ酸残基数は２個〜１０個が好ましい。
【００２７】
具体的には、凝固酵素の認識配列を有するペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号１）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号２）、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号３）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号４）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号５）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号６）、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号７）等が挙げられる。
【００２８】
活性型Ｃ因子の認識配列を有するペプチドとしては、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号８）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−（配列番号９）、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（配列番号１０）等が挙げられる。
【００２９】
活性型Ｂ因子の認識配列を有するペプチドとしては、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−（配列番号１１）、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号１２）等が挙げられる。
【００３０】
ペプチドのＮ 末端は、保護基で保護されていてもよい。保護基としては、通常この分野で用いられるものであれば限定されることなく用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ−スクシニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、ｐ−トルエンスルホニル基等が挙げられる。
ペプチドの種類は、単独でもよく、２種以上の組合せであってもよい。
【００３１】
（他の成分）
基質試薬には、塩、ｐＨ調整剤等の他の成分を適宜含ませてもよい。
【００３２】
（製造方法）
発光合成基質は、市販されているものであってもよく、合成したものであってもよい。
市販されているものとしては、例えば、プロメガ社から市販されている「Proteasome-GloTM Assay Systems」に付属の発光合成基質（ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン）が挙げられる。
合成する方法としては、例えば、特表２００５−５３０４８５号公報（国際公開第２００３／０６６６１１号）に記載の方法が挙げられる。
【００３３】
基質試薬中に遊離のアミノルシフェリンが含まれる場合は、これを予め除去しておくことが好ましい。発光合成基質から遊離のアミノルシフェリンを除去することにより、バックグラウンド発光を抑制することができる。遊離のアミノルシフェリンを除去する方法としては、例えば、トリシンの２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４の８ｍＭ、ＥＤＴＡの０．１３ｍＭを含む溶液（ｐＨ７．８）に溶解する発光合成基質に、補酵素Ａの０．８ｍＭ、ＡＴＰの１．５ｍＭ、ホタルルシフェラーゼの２５０μｇ／ｍＬ及びＤＴＴの９０ｍＭを含む溶液を加え、室温（２５℃）で１時間〜６時間インキュベートして、遊離のアミノルシフェリンを分解する方法が挙げられる。
【００３４】
［酵素試薬］
酵素試薬は、遊離する発光基質を発光させる発光酵素（以下、単に「発光酵素」という。）を含有する。
酵素試薬は、乾燥粉末であってもよく、液体であってもよい。発光酵素は溶液中で失活しやすいため、酵素試薬は乾燥粉末であることが好ましい。又は、酵素試薬は、発光酵素を含む乾燥粉末と発光酵素溶解用の溶媒とを分けて保存し、用時調製により溶液とされるのが好ましい。
（発光酵素）
発光酵素は、発光合成基質から遊離した発光基質の生物発光を触媒し、光を発生させるものであればよい。発光酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、イクオリン等が挙げられる。
発光酵素は、天然タンパク質であってもよく、組換えタンパク質であってもよい。また、発光酵素は、市販されているものであってもよく、精製したものであってもよい。
発光酵素の種類は、単独でもよく、２種以上の組合せであってもよい。
【００３５】
ルシフェラーゼ：
発光基質がルシフェリンである場合、発光酵素にはルシフェラーゼが好ましい。また、発光基質がアミノルシフェリンである場合は、発光酵素には甲虫由来のルシフェラーゼが好ましい。甲虫由来のルシフェラーゼとしては、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシ、鉄道虫等の甲虫由来のルシフェラーゼが好ましい。
【００３６】
ルシフェラーゼは、野生型であってもよく、変異型であってもよい。
野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列とこれをコードする遺伝子は公知であり、データベースを適宜参照して知ることができる。例えば、北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列は、アクセッション番号：Ｍ１５０７７としてデータベース（例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database（http://www.ebi.ac.uk/embl/））に登録されている。
【００３７】
野生型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列としては、例えば、野生型のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられる。ここで、「１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、挿入、置換又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されていることが意図される。
また、野生型と変異型の相同性は、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００３８】
変異型ルシフェラーゼの中でも、発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼを用いるが好ましい。超微量のエンドトキシンを高感度に測定できるからである。発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼとしては、例えば以下の変異型ルシフェラーゼを挙げることができる。
（ｉ）野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１３）において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（ｉｉ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ） がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（ｉｉｉ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ） がグリシン（Ｇｌｙ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（ｉｖ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がグリシン（Ｇｌｙ）に置換され、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（ｖ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がロイシン（Ｌｅｕ）に、５３０位のロイシン（Ｌｅｕ）がアルギニン（Ａｒｇ）に置換され、さらに、４７位のイソロイシン（Ｉｌｅ）がスレオニン（Ｔｈｒ） に、５０位のアスパラギン（Ａｓｎ）がセリン（Ｓｅｒ）に、５９位のメチオニン（Ｍｅｔ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に、２５２位のスレオニン（Ｔｈｒ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
【００３９】
上記（ｉ）〜（ｖ）の各変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度は、それぞれ北米ホタルルシフェラーゼ（野生型）の発光強度と比較して（ｉ）１８倍、（ｉｉ）１８倍、（ｉｉｉ）８倍、（ｉｖ）２０倍、（ｖ）２１倍に増大したことが確認されている（特開２００７−９７５７７号公報参照）。
【００４０】
（他の成分）
酵素試薬には、ＡＴＰ、塩、ｐＨ調整剤等の他の成分を適宜含ませてもよい。
例えば、発光合成基質としてルシフェリン、発光酵素としてルシフェラーゼを用いる発光反応においては、ＡＴＰ及び２価金属イオンが必要である。したがって、酵素試薬は、緩衝液中に、上述の発光合成基質及び発光酵素の他、予めＡＴＰ及び２価金属イオンを含んでいてもよく、用時調製により含ませる形態であってもよい。
【００４１】
（製造方法）
発光酵素は、市販されているものであってもよく、精製して得たものであってもよい。
市販されている発光酵素としては、例えば、ルシフェラーゼPhotinus pyralis（ホタル）由来（シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
精製して得る場合、例えば、野生型ホタルルシフェラーゼであれば、天然タンパク質であってもよく、組換えタンパク質であってもよい。また、変異型ホタルルシフェラーゼであれば、組換えタンパク質が用いられる。
以下、ホタルルシフェラーゼを精製して得る場合について説明する。
【００４２】
天然のホタルルシフェラーゼを精製して得る場合、ホタルルシフェラーゼは、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシ、鉄道虫等の甲虫から作製したタンパク質抽出液から、精製して得る。精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィを用いる方法等が挙げられる。
【００４３】
組換えタンパク質を精製して得る場合、まず、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、公知の方法により発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に導入して、組換えタンパク質を発現させる。次いで、該宿主細胞から作製したタンパク質抽出液から、組換えタンパク質を精製して得る。
【００４４】
組換えタンパク質の中でも、特に変異型ホタルルシフェラーゼを精製して得る場合には、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、野生型ホタルルシフェラーゼの遺伝子を改変して得ればよい。
遺伝子の改変は、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、有機合成等、当業者に周知の方法により行うことができる。なお、上記「発光酵素」の項の（ｉ）〜（ｖ）に記載の変異型ホタルルシフェラーゼは、特開２００７−９７５７７号公報の実施例を参照することにより作製することができる。
【００４５】
また、当業者は、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ヒメボタル、マドボタル、光コメツキムシ及び鉄道虫についても、公知のデータベースに登録されたこれらのルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の方法により変異型ルシフェラーゼを容易に取得することができる。さらに、上記（ｉ）〜（ｖ）に記載の北米ホタル由来の変異型ホタルルシフェラーゼの置換アミノ酸を参照すれば、他の甲虫由来のルシフェラーゼにおける同等の位置のアミノ酸を置換することにより、当業者は発光強度が増大した変異型ルシフェラーゼを容易に取得することができる。
【００４６】
＜エンドトキシン濃度測定法＞
本発明のエンドトキシン濃度測定法は、被験試料に上述の高純度リムルス試薬を添加するリムルス試薬添加工程、エンドトキシンの結合により活性化された活性型Ｃ因子を介する反応により発光基質を遊離する発光合成基質を含有する基質試薬を添加する基質添加工程、遊離する発光基質を発光させる発光酵素を含有する酵素試薬を添加する酵素添加工程、  発光強度を測定する測定工程を有する。
被験試料としては、注射剤、輸液、透析液等の医薬品；血液（血漿）、尿等の臨床試料；食品；上水、下水、河川水及び海洋水等の水；土壌及び大気；等が挙げられる。
【００４７】
以下、各工程の手順について説明する。
リムルス試薬添加工程においては、まず、被験試料に、高純度リムルス試薬を添加、混合する。次いで、２０〜４０℃で５〜２０分間静置する。
基質添加工程においては、リムルス試薬添加工程後の反応液に、発光合成基質を含有する基質試薬を添加、混合する。次いで、２０〜４０℃で２〜１０分間静置する。
酵素添加工程においては、基質添加工程後の反応液に、酵素試薬を添加、混合する。
測定工程においては、生物発光測定装置を用いて、酵素添加工程後の反応液の発光強度を測定する。生物発光測定装置は、市販されているものを用いることができる。生物発光測定装置としては、例えば、「ルミテスター（登録商標）Ｃ１０００」（キッコーマン社製）等が挙げられる。
なお、各試薬が乾燥粉末である場合は、予め溶液とすることなく、液体状の被験試料や反応液に添加することにより溶解してもよい。
【００４８】
リムルス試薬添加工程におけるＣ因子の濃度は、被験試料に高純度リムルス試薬を添加した後の濃度で１ｎｇ／μＬ〜１μｇ／μＬが好ましく、１０ｎｇ／μＬ〜１００ｎｇ／μＬがより好ましい。
リムルス試薬添加工程におけるＢ因子の濃度は、被験試料に高純度リムルス試薬を添加した後の濃度で１ｎｇ／μＬ〜１μｇ／μＬが好ましく、１０ｎｇ／μＬ〜１００ｎｇ／μＬがより好ましい。
リムルス試薬添加工程における前凝固酵素の濃度は、被験試料に高純度リムルス試薬を添加した後の濃度で１ｎｇ／μＬ〜１μｇ／μＬが好ましく、１０ｎｇ／μＬ〜１００ｎｇ／μＬがより好ましい。
Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素のそれぞれの濃度が前記下限値以上であれば、リムリス反応が良好に進み、一方、前記上限値以下であれば、材料コストが抑えられ、また、充分な溶解性が得られる。
【００４９】
基質添加工程における発光合成基質の濃度は、反応液に基質試薬を添加した後の濃度で０．１〜１００μＭが好ましく、１〜２０μＭがより好ましい。発光合成基質の濃度が前記下限値以上であれば、充分な検出感度が得られ、一方、前記上限値以下であれば、材料コストが抑えられる。
酵素添加工程におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度は後述するエンドトキシン濃度測定法の酵素添加工程において、基質遊離液にＡＴＰ試薬を加えた後の濃度で１０−７〜１０−３Ｍが好ましく、１０−６〜１０−４Ｍがより好ましい。ＡＴＰの濃度が前記下限値以上であれば、酵素反応においてＡＴＰが不足することを防げ、一方、前記上限値以下であれば、材料コストが抑えられ、また、過剰なＡＴＰによる酵素反応の阻害が防げる。
酵素添加工程における発光酵素の濃度は、後述するエンドトキシン濃度測定法の酵素添加工程において、基質遊離液に酵素試薬を加えた後の濃度で１ｎｇ／μＬ〜１０μｇ／μＬが好ましく、１０ｎｇ／μＬ〜１００ｎｇ／μＬがより好ましい。発光酵素の濃度が前記下限値以上であれば、充分な検出感度が得られ、一方、前記上限値以下であれば、材料コストが抑えられる。
【００５０】
＜他の態様＞
本発明のエンドトキシン濃度測定キットにおいて、高純度リムルス試薬と基質試薬とが混合試薬であってもよい。このような混合試薬を用いる場合、被験試料に該混合試薬を添加する１回の操作で、リムルス試薬添加工程と基質添加工程とを進行させられる。
【００５１】
以上に説明した高純度リムルス試薬、エンドトキシン濃度測定キット、及びエンドトキシン濃度測定法によれば、エンドトキシン濃度を高感度で測定できる。この作用効果は、高純度リムルス試薬に、検出系として発光合成基質法（発光法）を組合せたことによるものである。
発色合成基質法（比色法）を用いたリムルステストにおいては、カブトガニ血球抽出液由来の前凝固酵素を用いた場合と、組換え前凝固酵素を用いた場合とでは、同等の活性であることが知られている。
一方、後述する実施例に示すとおり、本発明の発光合成基質法（発光法）を用いたリムルステストにおいては、カブトガニ血球抽出液由来のリムルス試薬を用いた場合に比べて、組換えＣ因子、組換えＢ因子、組換え前凝固酵素を個別に精製して再構成した高純度リムルス試薬を用いた場合、エンドトキシン濃度の検出感度が改善された。
これらから、従前のリムルス試薬に発光合成基質法（発光法）を組合せた場合には、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素以外のカブトガニ血球抽出物に由来する何らかの物質（夾雑物）により、発光合成基質法（発光法）における何らかの阻害反応が生じていることが推察される。よって、本発明による作用効果は、この阻害反応を除去したことにより得られたものと推察される。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
＜製造例１＞
Ｃ因子、Ｂ因子、前凝固酵素をコードする遺伝子は、ミナミカブトガニ（Tachypleus gigas）の造血組織より調製したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを使用したＰＣＲ法により増幅させた。
【００５３】
【化１】
2015141088.tif 000002
【００５４】
なお、増幅させた遺伝子の塩基配列は、Ｃ因子をコードする遺伝子についてはアクセッション番号：ＡＦ４６７８０４、Ｂ因子をコードする遺伝子についてはアクセッション番号：Ｄ１４７０１、前凝固酵素をコードする遺伝子についてはアクセッション番号：Ｍ５８３６６として登録されている塩基配列のタンパク質コーディング領域を含んでいる。
【００５５】
増幅させた各遺伝子を昆虫細胞用発現ベクターｐｈｒ５１２Ｚに組換え、クローニングし、発現ベクターを得た。
なお、昆虫細胞用発現ベクターｐｈｒ５１２Ｚは、ｐＩＥｘ−５ベクター（ノバジェン社製）をベースとし、該ベクターのアンピシリンをコードする遺伝子を除去し、該遺伝子があった箇所に、ｐＩＥｘ−４ベクター（ノバジェン社製）由来のＩＥ１プロモーター下にｐＩＺＴベクター（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）由来のゼオシン抵抗性遺伝子を組換えたＤＮＡを挿入することで昆虫細胞がゼオシン抵抗性を示すようにデザインした、染色体組換え型の発現ベクターである。ここで、Ｃ因子をコードする遺伝子を組換えた発現ベクターを「Ｃ５１Ｚ」、Ｂ因子をコードする遺伝子を組換えた発現ベクターを「Ｂ５１Ｚ」、前凝固酵素をコードする遺伝子を組換えた発現ベクターを「ＣＥ５１Ｚ」と称することとした。
【００５６】
セルフェクチン（登録商標）ＩＩ（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）を用いたリポフェクチン法により、Ｃ５１Ｚ、Ｂ５１Ｚ、ＣＥ５１Ｚを昆虫細胞ｓｆ９株に導入し、遺伝子組換え細胞を得た。
昆虫細胞の培養には、ＳＦ ９００ ＩＩＩ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）に、ウシ胎児血清が１０体積％、ゼオシン（ライフテクノロジーズ・ジャパン社製）が６００ｐｐｍとなるように添加した培地を用いた。各遺伝子組換え細胞を３週間培養して、ゼオシン耐性細胞を得た。ここで、Ｃ因子を発現するゼオシン耐性細胞を「Ｃ５１Ｚ組換え細胞」、Ｂ因子を発現するゼオシン耐性細胞を「Ｂ５１Ｚ組換え細胞」、前凝固酵素を発現するゼオシン耐性細胞を「ＣＥ５１Ｚ組換え細胞」と称することとした。
【００５７】
Ｃ５１Ｚ、Ｂ５１Ｚ、ＣＥ５１Ｚ組換え細胞を２７℃で７日間培養した。Ni Sepharose excel（ＧＥヘルスケア社製）の１ｍＬを用いて、前記それぞれの組換え細胞の培養上清１００ｍＬから、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素を精製した。次いで、前記Ｃ因子、Ｂ因子、前凝固酵素を含む溶液の溶媒を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）用いて、トレハロースの１０質量％、酢酸マグネシウムの１ｍＭ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌの５０ｍＭを含む溶液（ｐＨ７．８）に置換した。その際、タンパク質濃度がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬになるように調整し、Ｃ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素を含む溶液を得た。
それぞれのタンパク質溶解液は、すぐに使用する場合にはそのまま使用し、使用まで１日以上ある場合には−２０℃で保存した。
【００５８】
＜製造例２＞
ルシフェラーゼは、特開２００７−９７５７７号公報に記載された方法により得た。具体的には、まず、ヒスチジンタグがＣ末端に付加された高輝度化変異北米ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ２８ａ（メルク社製）に組換えた。次いで、該ベクターを大腸菌に導入し、ヒスチジンタグがＣ末端に付加された高輝度化変異北米ホタルルシフェラーゼを発現させた。次いで、大腸菌を超音波処理し、該高輝度化変異北米ホタルルシフェラーゼを含む粗抽出液を作製した。次いで、Ni Sepharose excel（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該粗抽出液から該高輝度化変異型ホタルルシフェラーゼを精製した。
精製した高輝度化変異型ホタルルシフェラーゼを、ＡＴＰの１０−５ Ｍ、酢酸マグネシウムの１ｍＭ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌの５０ｍＭを含む溶液（ｐＨ８．０）に溶解し、２５０ｎｇ／μＬのルシフェラーゼ液を得た。
【００５９】
＜実施例１＞
製造例１で得たＣ因子、Ｂ因子、及び前凝固酵素の溶解液を等量ずつ混合して、高純度リムルス試薬を得た。
試料には、エンドトキシン（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来エンドトキシン）（生化学工業社製）をパイロジェンフリー水で希釈することにより、１０−６〜１０−１ＥＵ／ｍＬの範囲で６段階に調製したものを用いた。また、ブランクにはエンドトキシンを含まないパイロジェンフリー水を用いた。
発光合成基質は、ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−アミノルシフェリン（ＡＡＴバイオクエスト社製）を用いた。酢酸マグネシウムの１ｍＭ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌの５０ｍＭを含む溶液（ｐＨ８．０）に、該発光合成基質を７５μＭとなるように溶解し、これを基質溶液とした。
【００６０】
まず、反応試験管に高純度リムルス試薬を５０μＬずつ分注した。次いで、５０μＬの試料を該高純度リムルス試薬に加え、ボルテックスミキサーにより数秒間混合し、反応液を得た。反応液を３７℃の保温器にて１０分間静置した。
次いで、基質溶液の５０μＬを前記反応液に加え、反応液を３７℃の保温器にて５分間静置した。
次いで、反応液を生物発光測定専用試験管「ルミチューブ」（キッコーマン社製）に移し、５０μＬのルシフェラーゼ液を加えた。これを生物発光測定装置「ルミテスター（登録商標）Ｃ１０００」（キッコーマン社製）にセットして、発光強度を測定した。
図１に、エンドトキシン濃度を横軸とし、発光強度を縦軸として表した実施例１の結果のグラフを示す。
【００６１】
＜比較例１＞
高純度リムルス試薬の代わりに、従来のカブトガニ血球より調製したリムルス試薬（和光純薬社製のエンドトキシン測定キット（シングルテストワコー）のカブトガニ血球より調製したリムルス試薬）を用いた以外は、実施例１と同様にエンドトキシンの濃度を測定した。
図２に、比較例１の結果のグラフを示す。
【００６２】
図２に示すように、従来のカブトガニ血球より調製したリムルス試薬用いた場合には、エンドトキシン濃度が１０−４ＥＵ／ｍＬ以下で、発光強度の変化に乏しい。すなわち、ルシフェラーゼアッセイ系においては、従来のカブトガニ血球より調製したリムルス試薬用いた場合、エンドトキシンの検出限界が１０−４ＥＵ／ｍＬであることを意味する。
これに対し、図１に示すように、高純度リムルス試薬を用いた場合、エンドトキシン濃度が１０−６ＥＵ／ｍＬまで直線的に検出できた。
以上の結果から、ルシフェラーゼアッセイ系においては、高純度リムルス試薬を用いた場合、検出限界が１０−６ＥＵ／ｍＬよりも小さいことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、注射剤、輸液、透析液等の医薬品、血液（血漿）、尿等の臨床試料の他、食品や環境中のエンドトキシンの検出又は濃度測定に用いることができる。
【図１】
2015141088.tif 000003
【図２】
2015141088.tif 000004
【配列表】
2015141088000001.app