(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病の診断が可能なマーカーの測定法を提供する。【解決手段】赤血球含有試料に抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体を反応させることを特徴とする赤血球中のアミロイドβタンパク質凝集体の免疫学的測定法。抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体を含有する赤血球中のアミロイドβタンパク質凝集体の免疫学的測定試薬。抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体が、粒子径５０nm以上の非晶質のアミロイドβタンパク質凝集体に特異的に結合する抗体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球含有試料に抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体を反応させることを特徴とする赤血球中のアミロイドβタンパク質凝集体の免疫学的測定法。
【請求項２】
抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体が、粒子径５０nm以上の非晶質のアミロイドβタンパク質凝集体に特異的に結合する抗体である請求項１記載の免疫学的測定法。
【請求項３】
赤血球が、ヒト赤血球である請求項１又は２記載の免疫学的測定法。
【請求項４】
アルツハイマー病診断の目的で測定するものである請求項１〜３のいずれかに記載の免疫学的測定法。
【請求項５】
抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体を含有する赤血球中のアミロイドβタンパク質凝集体の免疫学的測定試薬。
【請求項６】
抗アミロイドβタンパク質凝集体抗体が、粒子径５０nm以上の非晶質のアミロイドβタンパク質凝集体に特異的に結合する抗体である請求項５記載の免疫学的測定試薬。
【請求項７】
赤血球が、ヒト赤血球である請求項５又は６記載の免疫学的測定試薬。
【請求項８】
アルツハイマー病診断薬である請求項５〜７のいずれかに記載の免疫学的測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球含有試料中のアミロイドβタンパク質凝集体の免疫学的測定法及び免疫測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の発症機構は未だ不明であり、根本的治療法も確立されていない。アルツハイマー病は、初期には認知機能障害や神経症状以外の局所神経症状を認めることは稀である。病気がかなり進行した後にＣＴやＭＲＩ等の画像検査で診断が可能であるものの、アルツハイマー病の根本的治療法がないため、進行を抑制する薬剤による治療しかない。
【０００３】
このため、アルツハイマー病を早期かつ簡易に発見する方法の開発が強く求められている。アルツハイマー病の主要な病理変化である老人斑の主要構成成分がアミロイドβタンパク（Ａβ）であることから、当該Ａβは、アルツハイマー病の発症と進展に深く関与していることから注目され広く研究されている。例えば、髄液中のＡβ４２の低下やタウタンパク質の増加を測定する手段が提案されている。しかし、髄液採取は負担が大きく、感染リスクを伴うため、健康診断で利用できる手段ではない。また、ＣＴ等による画像診断は簡便ではあるが、病気がある程度進行してからでないと確認できない。
【０００４】
最近、赤血球中にＡβが存在すること、及び赤血球中のＡβ1-42、Ａβ1-40が測定できることが報告された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kiko et al, PLOSone, 7, Nov. 2012, e49620
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、赤血球中のＡβ量は１０ng／mL程度と報告されており、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡの検出下限値は１００ng／mL程度であり、簡便な免疫学的測定法では赤血球中のＡβは測定できない。
従って、より簡便な手段によりアルツハイマー病の診断が可能なマーカーの測定法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、Ａβではなく、Ａβ凝集体に特異的な抗体を用いて体液試料中の量を測定してきたところ、赤血球中に高濃度のＡβ凝集体が存在することを初めて見出した。さらに検討を続けたところ、赤血球中のＡβ凝集体濃度はアルツハイマー病と相関することから、これを測定すれば簡易かつ早期にアルツハイマー病の診断が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は次の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕赤血球含有試料に抗Ａβ凝集体抗体を反応させることを特徴とする赤血球中のＡβ凝集体の免疫学的測定法。
〔２〕抗Ａβ凝集体抗体が、粒子径５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体に特異的に結合する抗体である〔１〕記載の免疫学的測定法。
〔３〕赤血球が、ヒト赤血球である〔１〕又は〔２〕記載の免疫学的測定法。
〔４〕アルツハイマー病診断の目的で測定するものである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の免疫学的測定法。
〔５〕抗Ａβ凝集体抗体を含有する赤血球中のＡβ凝集体の免疫学的測定試薬。
〔６〕抗Ａβ凝集体抗体が、粒子径５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体に特異的に結合する抗体である〔５〕記載の免疫学的測定試薬。
〔７〕赤血球が、ヒト赤血球である〔５〕又は〔６〕記載の免疫学的測定試薬。
〔８〕アルツハイマー病診断薬である〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫学的測定試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫学的測定法によれば、簡便な手段により、赤血球含有試料中のＡβが測定でき、早期にアルツハイマー病の診断が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】凝集体およびモノマーのＡＦＭ画像を示す図である。（Ａ）ナノ凝集体；直径５０nm程度の楕円形のナノ凝集体に混ざって直径２００nm以上の大きな凝集体が見られる。（Ｂ）マイクロ凝集体（ＬＯＡ）（Ｃ）繊維状Ａβ1-42（Ｄ）モノマー
【図２】各凝集体に対する各モノクローナル抗体の反応性を示す図である。
【図３】サイズ分画したナノ凝集体画分に対する各モノクローナル抗体の反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の赤血球中のＡβ凝集体の免疫学的測定法は、赤血球含有試料に抗Ａβ凝集体抗体を反応させることを特徴とする。
【００１３】
被測定検体は、赤血球含有試料であり、特にヒト赤血球含有試料が好ましい。赤血球含有試料としては、全血液、血液中の赤血球画分のいずれでもよいが、測定精度の点から赤血球画分がより好ましい。
【００１４】
測定に用いる抗Ａβ凝集体抗体としては、Ａβモノマーや繊維状Ａβと反応せず、Ａβ凝集体に特異的に結合する抗体が好ましく、さらに粒子径５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体に特異的に結合する抗体がより好ましい。このようなＡβ凝集体特異的な抗Ａβ凝集体抗体としては、本発明者らが先に報告した抗体（J. Biosci. Bioeng. 115, 216-220(2013）、Adv. Biosci. Biotechnol., 4, 63-66(2013)、特開２０１３−１５９５９６（粒子径２２０nm以上のＡβ凝集体に対する抗体）、及び粒子径５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体（ナノ凝集体ともいう）に対する反応性が高く、粒子径２２０nm以上のＡβ凝集体に対する反応性が相対的に低い抗体等が挙げられる。ここで、反応性が相対的に低いとは、ＥＬＩＳＡによる吸光度で１／２以下、好ましくは１／３以下であることをいう。
【００１５】
本発明に用いる抗Ａβ凝集体抗体は、前記の特性を有している限り、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、特異性の高いものが得られやすい点でモノクローナル抗体が好ましい。
【００１６】
本発明に用いる抗Ａβ凝集体ポリクローナル抗体は、粒子径５０nm以上のＡβ凝集体を抗原として哺乳動物を免疫し、その抗血清を採取し、特異性を確認すればよい。
【００１７】
本発明に用いる抗Ａβ凝集体モノクローナル抗体は、通常の細胞融合により得られるハイブリドーマを培養して作製することができる。ここでハイブリドーマは、粒子径５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体で免疫した哺乳動物の免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞から、５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体と結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。
【００１８】
ハイブリドーマを作製するための抗原としては、アミロイドβタンパクの凝集体の一つで水に溶解しやすい非晶質のＡβ凝集体、すなわち、粒子径５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体を用いる。
【００１９】
ハイブリドーマの作製に使用する動物としては、マウス、ウサギ等が挙げられるが、ハイブリドーマの作製のために最も広く使用されているマウスを用いるのが好ましい。マウスの免疫感作は、前記の５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体を、必要に応じてFreundのアジュバントと共にマウスに注射することにより行う。次に免疫されたマウスから脾細胞を採取し、マウスミエローマセルライン例えば、Ｐ３Ｕ１との細胞融合を常法に従って行う。
【００２０】
ＨＡＴ培地に増殖したハイブリドーマの培養上清を常用のサンドイッチ法により５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体と結合するモノクローナル抗体の存在について試験する。この検定においては、抗原として用いた５０nm以上の非晶質のＡβ凝集体、Ａβ1-42、Ａβ1-40、Ａβ16-20、Ａβ繊維状凝集体をサンドイッチ法の抗原として使用して、特異性を確認できる。
【００２１】
この中に、５０nm以上２２０nm未満の非晶質のＡβ凝集体と結合し、単量体Ａβ及び繊維状Ａβ凝集体と結合せず、マイクロ凝集体との反応性が相互的に低い、モノクローナル抗体を産生する９個のクローンが見出された。このうち、１クローンをＡｎｔｉ−ＬＦＩ  ７９−３と命名し、ＮＩＴＥ  Ｐ−１４８９として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物受託センターに寄託した。
【００２２】
本発明に用いるモノクローナル抗体を製造するには、例えば上記のハイブリドーマのいずれかを常用の培地中で培養し、培養上清から目的とするモノクローナル抗体を採取すればよい。あるいは、前記ハイブリドーマのいずれかをマウスの腹腔内に接種し、該マウスから腹水を採取し、そして該腹水から目的とするモノクローナル抗体を採取すればよい。培養上清又は腹水からのモノクローナル抗体の採取、すなわち単離・精製は、常法に従って行うことができる。例えば、硫酸アンモニウムにより塩析、５０nm以上のＡβ凝集体を固定した支持体を用いるアフィニティークロマトグラフィー等を組合せて用いることができる。
【００２３】
本発明に用いる抗体は、その目的に応じてキメラ抗体、ヒト化抗体とすることができる。さらに、蛍光、発光、放射性同位元素、金属コロイド等の標識体とすることもできる。
【００２４】
赤血球含有試料中のＡβ凝集体の測定は、抗Ａβ凝集体抗体を用いる免疫学的測定手段によって行なわれる。より具体的には、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、免疫比濁法、免疫沈降法、ＥＭＩＴ法、イムノクロマト法等が挙げられる。このうち、ＥＬＩＳＡについて説明すると、抗Ａβ凝集体抗体を、マイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の担体に結合させ、これを検体と接触させることにより、検体中のＡβ凝集体を担体上の抗Ａβ凝集体に結合させる。結合していない分画を洗浄した後、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗Ａβ凝集体抗体と接触させた後、標識を測定することにより、Ａβ凝集体を測定することができる。
【００２５】
抗Ａβ凝集体抗体を用いた免疫学的測定法によれば、正常ヒト赤血球５０％液中のＡβ凝集体濃度は５.０μｇ／mLであり、十分に検出可能濃度であることが判明した。
【００２６】
また、アルツハイマーモデルマウス（ｔｇ２５７６）の血液中のＡβ凝集体濃度は、正常動物の血液中のＡβ凝集体濃度よりも有意に低いことが判明し、血液中のＡβ凝集体濃度を測定すれば、早期にアルツハイマー病の診断が可能である。すなわち、被検赤血球含有試料中の赤血球含有試料中のＡβ凝集体濃度が、健常者由来の赤血球含有試料中のＡβ凝集体濃度に比べて低い場合には、その被検試料は、アルツハイマー病由来であると判定できる。
【００２７】
本発明の免疫学的測定法を実施するには、抗Ａβ凝集体抗体を含有する赤血球中のＡβ免疫学的測定試薬として用いるのが好ましい。当該免疫学的測定試薬には、抗Ａβ凝集体抗体、抗Ａβ凝集体抗体標識体、緩衝液、標準試薬、プロトコール（使用説明書）等が含まれる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
参考例１
［モノクローナル抗体の作成方法］
（１）抗原の作製
【００３０】
（ナノ凝集体）
Ａβ1-42（AnyGen Co.Ltd, Korea）を０．２２mMとなるように１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに溶解し、４℃で１６時間静置、３７℃で３時間静置したのち、減圧乾燥させた。この溶解と減圧乾燥の操作を２回繰り返し、水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体を作製した。この画分には様々な大きさの凝集体が含まれているため、０．２２μｍ、３００ｋＤａ（約５０nm）および、１００ｋＤａのフィルターでろ過することによりサイズ分画を行った。
【００３１】
（マイクロ凝集体）
リン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's  ＰＢＳ）中に０．２２mM  Ａβ1-42（AnyGen Co.Ltd, Korea）と繊維状凝集体の形成を抑制する２．２mM  Ａβ16-20（ＫＬＶＦＦ）を加え３７℃、３rpmで１６時間攪拌した。この溶液を０．２２μｍのフィルターでろ過した残渣をマイクロ凝集体（ＬＯＡ）とした。
【００３２】
（繊維状Ａβ凝集体）
マイクロ凝集体の作成においてＡβ16-20を加えずに調整した後３７℃１６時間静置して繊維状Ａβ凝集体を作製した。
【００３３】
（モノマー）
Ａβ1-42を５０μＭになるように１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに加え、超音波処理で懸濁後、３０℃で１６時間放置し完全に溶解させた。減圧乾燥により溶媒を除いたものをモノマーとして用いた。
【００３４】
上記により作製したナノ凝集体、マイクロ凝集体（ＬＯＡ）、繊維状Ａβ凝集体及び、モノマーの形状を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ、JSPM-5200,JEOEL）を用いて観察した。Ａβ1-42の各凝集体もしくはモノマーを１μｇ／mLに調整し、１０μｌを雲母片上に滴下し減圧乾燥させた。測定はＡＣモードで、共振周波数１９０kHzで行った。図１に、ＡＦＭの画像を示す。
【００３５】
（２）抗体の作製
上記により作製したナノ凝集体（０．１mg）を完全もしくは非完全フロイントアジュバントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、８週目、雌）に免疫した。免疫は、２週おきに３回行った。免疫したマウスの脾臓を摘出し、その細胞数の２割のマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を混合後、この混合細胞にＰＥＧ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）１mLを１分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。１分間攪拌後、無血清培地ＦＣＳ３mLを３分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。続けて無血清培地１０mLを３分間かけて攪拌しながらゆっくりと加えた。その後、５分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ2）を行い、遠心分離（１０００rpm、５min）により上清を捨てた。ＨＡＴ培地で希釈することで細胞を解して培養した。
【００３６】
この培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法によりナノ凝集体に反応する抗体を生産する細胞のスクリーニングを行った。陽性が得られた細胞を限界希釈しハイブリドーマの単一化を行った。
【００３７】
ＥＬＩＳＡ法はＮｕｎｃイムノプレートマキシソープ（Thermo scientific Inc.）を用いて４℃、１６時間インキュベートして各抗原を非共有結合で固定した。Dulbecco's  ＰＢＳに０．０５％  Tween２０を加えた溶液（ＰＢＳ−Ｔ）により洗浄を行った後、ブロッキングバッファー（イムノブロック、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）添加し、３７℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２次抗体としてＨＲＰを標識した抗マウスＩｇＧヤギ由来（Sigma-Aldrich）を加え、３７℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（Sigma-Aldrich）の説明に従って発色させ、４９２nmで測定した。
【００３８】
各濃度のナノ凝集体、繊維状Ａβ1-42、モノマーＡβ1-42及び、マイクロ凝集体を抗原として本発明抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った。
図２及び図３に、ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００３９】
図２に示す様に本発明のモノクローナル抗体はナノ凝集体画分に高い反応性を示した。弱いながらＬＯＡにも反応性が見られ、繊維状及びモノマーＡβ1-42とはほとんど反応せずナノ凝集体にのみ高い反応性を示した。一方、ＬＯＡに対する抗体３１−２（特許文献３）はナノ凝集体画分及びＬＯＡに同等の反応性が見られた。
得られたハイブリドーマ９個のうち、相対的にナノ凝集体画分に反応性が高く、繊維状およびモノマーに対する反応性が低い１個をＡｎｔｉ−ＬＦＩ  ７９−３と命名した。
【００４０】
図３に示す様に本発明のモノクローナル抗体はナノ凝集体画分の中で、２２０nmのフィルターを通過するが３００ｋＤａのフィルターを通過しない凝集体と最も良く反応する。この凝集体よりも大きな２２０nmのフィルターを通過しない凝集体とは若干反応するが、３００ｋＤａ以下の凝集体とはほとんど反応しない。
【００４１】
実施例１
Ａ．実験方法
（１）Ａβ1-42凝集体の作成
市販のＡβ1-42（ＡｎｙＧｅｎ，純度：９５．６％（ＨＰＬＣ，ＭＡＳＳ））１００μｇを１．５mLチューブに加え１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール２００μｌにより溶解し、０．５mg／mLのＡβ1-42凝集体溶液を作製した。この溶液を４℃、１６時間インキュベートし、さらに３７℃、３時間インキュベートした。その後、凍結乾燥を行い上記の操作を繰り返した。この溶液を超純水により１mg／mLに調整し、可溶性のＡβ1-42凝集体とした(Shimizu T. et al., J. Biosci. Bioeng., 115, 216-220(2013))。抗原濃度は２８０nmの波長で吸光度を測定し、吸光度１を１mg／mLとして計算した。
【００４２】
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＡβ1-42凝集体の検量線作成
線維状Ａβ1-42及びＡβ1-42モノマーと反応せずＡβ1-42凝集体のみを認識する９種類のモノクローナル抗体(Shimizu T. et al., J. Biosci. Bioeng., 115, 216-220(2013)及び、Shimizu T. et al., Adv. Biosci. Biotechnol., 4, 63-66 (2013))の中から異なる２つの抗体を捕獲抗体およびＨＲＰ標識検出抗体として使用してサンドイッチＥＬＩＳＡによりＡβ1-42凝集体の検出を行い、検出感度が最も高くなる組み合わせを選択した。抗Ａβ1-42凝集体モノクローナル抗体２μｇ／mLを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃイムノプレート  マキシソープ、Thermo Fisher Scientific Inc）の各ウェルに一次抗体として１００μｌ加え、３７℃で１時間放置した。その後、溶液を除去しダルベッコＰＢＳ（和光純薬）にＴｗｅｅｎ２０を０．０５ｖ／ｖ％加えたＰＢＳ−Ｔで洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとしてイムノブロックを２００μｌ添加し、３７℃で１時間放置した。溶液除去後ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、抗原としてＡβ1-42凝集体を１００μｌ加え、３７℃で１時間放置後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔにより洗浄した。検出抗体としてＨＲＰを標識した抗体を１００μｌ加え、３７℃で１時間放置し、溶液除去後ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。発色はｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＳＩＧＭＡ）で行い、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９２nmの吸光度を測定した。
【００４３】
（３）赤血球中Ａβ1-42凝集体の検出
ヒト赤血球（Lee BioSolutions, Inc）に等量の蒸留水を添加し振盪混和して溶血させた。この試料中のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質測定キット（Pierce）により測定し、Ａβ1-42凝集体濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
アルツハイマー病モデルマウスとしてＴｇ２５７６と呼ばれる遺伝子改変マウスが広く用いられている。Ｔｇ２５７６はＡβ1-42の前駆体タンパク質遺伝子に変異を導入しＡβ1-42を大量に生産するようにした組換えモデルマウスで、１２ヶ月の飼育でその脳に老人斑が形成される。Ｔｇ２５７６及び野生型の１７月齢オスマウスそれぞれ３匹ずつの尾から採血し、等量の蒸留水を加え振盪混和した試料に含まれるＡβ1-42凝集体濃度を測定した。
【００４４】
Ｂ．結果
抗原であるＡβ1-42凝集体1μｇ／mLを測定した時、最も高い吸光度となった抗体の組み合わせは７７−３および３７−１１をそれぞれ捕獲抗体および検出抗体とした時であった。以降はこの抗体の組み合わせによりサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。この時、抗原を添加しない陰性対照の吸光度の標準偏差の３．３倍を検出下限値とした時、検出下限値は０．０１μｍ／mLであった。
ヒト赤血球を等量の蒸留水で処理した試料中のＡβ1-42凝集体濃度は１．７μｇ／mLであり、検出下限値を考慮すると測定可能な値であった。この試料中のタンパク質濃度は２３mg／mLであり、赤血球中にはタンパク質１mgあたり２２６ng（５０pmol）のＡβ1-42凝集体が含まれることが分かった。
Ｔｇ２５７６及び野生型マウスの血液に含まれるタンパク質１mgあたりのＡβ1-42凝集体量は表１の様になった。それぞれ８匹ずつのマウス血液試料を調べたところ、Ｔｇ２５７６マウスのＡβ1-42量の平均は８．１ngである一方、野生型マウスのものは１０．１ngであり、モデルマウスが低い値となった。この結果はアルツハイマー病患者の髄液中のＡβ1-42濃度が健常人のものと比較して５割程度低いという結果と矛盾しない(東海林幹夫、Cognition and Dimentia, 8, 2790-275 (2009))。本方法による赤血球中のＡβ1-42凝集体濃度の測定はより簡便に測定できる方法である。
【００４５】
【表１】
2015141149.tif 000002
【図１】
2015141149.tif 000003
【図２】
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【図３】
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