(57)【要約】      （修正有）【課題】デング熱ウイルスが原因の疾患の予防及び／又は治療のための免疫原性組成物の提供。【解決手段】デング１型ウイルス抗原、デング２型ウイルス抗原、デング３型ウイルス抗原及びデング４型ウイルス抗原から選択される少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原、並びに、水中油型乳剤を含むアジュバント及び３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とＱＳ２１との組み合わせを含むアジュバントから選択されるアルミニウム不含アジュバントを含む、デング熱用免疫原性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原およびアルミニウム不含アジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原が、デング１型ウイルス抗原、デング２型ウイルス抗原、デング３型ウイルス抗原およびデング４型ウイルス抗原からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原がデング熱２型ウイルス抗原である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原が完全に死滅したウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが水中油型乳剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが、代謝可能油、トコールおよび乳化剤を含む水中油型乳剤キャリアを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記代謝可能油がスクアレンである、請求項５または６記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記トコロールがαトコフェロールである、請求項６または７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記乳剤が非イオン性界面活性剤乳化剤を含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエートである、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
スクアレンおよびαトコフェロールを１以下の比率で含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、
約２％〜約１０％のスクアレン、
約２％〜約１０％のαトコフェロール、
約０．３％〜約３％のポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエートを含む用量に処方されてなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが、
約１０ｍｇ〜約１２ｍｇのスクアレン、
約１０ｍｇ〜約１２ｍｇのαトコフェロール、
約４ｍｇ〜約６ｍｇのポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエート
を含む用量に処方されてなる、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントが、
１０．６８ｍｇのスクアレン、
１１．８６ｍｇのトコフェロール、
４．８５ｍｇのポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエート
を含む用量に処方されてなる、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記アジュバントが分割量で処方されてなる、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントが３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）およびＱＳ２１の組み合わせを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントが３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１をリポソーム製剤として含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントがさらにコレステロールを含む、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記アジュバントがさらに１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記アジュバントがコレステロール、ＤＯＰＣ、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記アジュバントが、
約０．１〜約０．５ｍｇのコレステロール、
約０．２５〜約２ｍｇのＤＯＰＣ、
約１０μｇ〜約１００μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、および
約１０μｇ〜約１００μｇのＱＳ２１
を含む用量で処方されてなる、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
コレステロールのＱＳ２１に対する比率が５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
コレステロールのＱＳ２１に対する比率が１：１（ｗ／ｗ）である、請求項１６〜２１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントが、
約０．２５ｍｇのコレステロール、
約１．０ｍｇのＤＯＰＣ、
約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、および
約５０μｇのＱＳ２１
を含む用量で処方されてなる、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記アジュバントがＱＳ２１およびコレステロールを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
デング熱ワクチンを製造する方法であって、
少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原を用意し、かつ、
少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原をアルミニウム不含アジュバントと共に処方すること
を含む、方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原が、ホルムアルデヒド、ベタプロピオラクトン（ＢＰＬ）、過酸化水素、紫外線照射およびγ線照射の群から選択される作用因子に生のウイルスを接触または露出させる１つまたは複数の工程により不活化されてなる完全に死滅したウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者のデング熱ウイルスによる疾患を予防、改善または治療する方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物をその患者に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
患者が５才未満である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
患者が１才未満である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワクチンが非経口で投与される、請求項２７または２９に記載の方法。
【請求項３２】
医薬として用いるための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年２月１７日出願の米国仮出願第６１／１５３０６０号の出願日遡及の特典を主張し、参照によりその開示を本明細書に包含する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱はヒトの急性ウイルス性疾患で、蚊を通じて伝染する。これは世界中の熱帯地方と亜熱帯地方の風土病であり、年間１００，０００，０００件の症例が発生していると推定されている。比較的希な症状であるが、デング出血熱（ＤＨＦ）とデング性ショック症候群（ＤＳＳ）は、小児の死亡の大きな原因である。現在、デング熱に対して防御するワクチンは存在せず、蚊ベクターを規制して疾患を予防する試みは概して有効ではないことがわかってきた。このように、デング熱ウイルスによって引き起こされる疾患を防御できる安全で効果的なワクチンの必要性は未だ残されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本開示は、デング熱ウイルスに対し免疫応答を誘発する組成物に関する。さらに具体的には、本開示はアジュバントを含む不活化デング熱ウイルスワクチンに関する。本明細書で開示の組成物は、アルミニウム不含アジュバント、例えば、Ｔｈ１免疫応答を促進可能なアルミニウム不含アジュバント、を含む。本開示には、これらの使用方法、例えば、薬剤の処方方法、デング熱ウイルスによる疾患の治療の予防方法も記載されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の詳細な説明
緒言
本発明は、安全で有効なデング熱ワクチンに対する要求を満たすワクチンに関する。精製不活化デング熱ウイルスワクチンは弱毒化生デング熱ウイルスに比べ大きな利点がある。
不活化ウイルスは感染力を持たず、そのため病原性に戻ることはなく、あるいは疾患の原因となることもあり得ないからである。弱毒化生デング熱ウイルスに比べ精製不活化デング熱ウイルスワクチンの１つの欠点は、高い力価のデング熱特異的中和抗体を誘導する能力が低く、防御免疫応答期間が比較的短い可能性があることである。これらの欠点は、適切なアジュバントを加えた精製不活化デング熱抗原の製剤により克服される。本明細書で開示されているように、アジュバントは、アルミニウム不含（ａｌｕｍ−ｆｒｅｅ）アジュバント（またはアジュバント系）で、高い力価のデング熱特異的中和抗体を効果的に誘発する。一実施形態では、アジュバントは主にＴｈ１応答またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の製造に特徴付けられる均衡したＴｈ１／Ｔｈ２応答を誘発する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】未処置Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの抗デング２型中和抗体価を示す棒グラフ。
【図２】未処置Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの抗デング２型中和抗体価を示す棒グラフ。
【図３】未処置Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの抗デング２型中和抗体価を示す棒グラフ。
【図４】末梢血細胞中の細胞内サイトカイン染色による細胞性免疫応答特性を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本明細書で開示された免疫原性組成物は、アルミニウム不含アジュバントと組み合わせて、少なくとも１つの（すなわち、１つまたは２つ以上の）不活化デング熱ウイルス抗原を含む。不活化デング熱ウイルス抗原は、デング１型ウイルス抗原、デング２型ウイルス抗原、デング３型ウイルス抗原およびデング４型ウイルス抗原から選択可能である。従って免疫原性組成物は、デング１型、デング２型、デング３型またはデング４型から選択された単一株由来の単一不活化デング熱ウイルス抗原を含む一価組成物であっても、またはこれらデング熱ウイルス株の２つ以上の不活化抗原を含む多価（例えば、二価、三価、四価）組成物であってもよい。１つの代表的実施形態では、免疫原性組成物はデング２型ウイルス抗原を含む。例えば、免疫原性組成物は不活化デング２型抗原を含む一価組成物であってもよい。あるいは、免疫原性組成物は二価、三価または四価の組成物であって、１つ、２つまたは３つの追加の不活化デング熱ウイルス抗原と組み合わせて不活化デング２型ウイルス抗原を含んでもよい。例えば、一実施形態では、組成物は四価の組成物であり、不活化デング１型ウイルス抗原、不活化デング２型ウイルス抗原、不活化デング３型ウイルス抗原および不活化デング４型ウイルス抗原を含む。
【０００７】
１つまたは複数の不活化デング熱ウイルス抗原がアルミニウムまたはアルミニウム塩不含アジュバント、すなわち、アルミニウム不含アジュバントまたはアジュバント系を加えて処方される。一実施形態では、アジュバントは水中油型乳剤を含む。例えば、水中油型乳剤には、代謝可能油を包含する油相を含んでもよく、また任意選択としてトコールのような追加の油相成分を含んでもよい。また、水中油型乳剤は、緩衝生理食塩水 （例えば、燐酸塩緩衝食塩水）のような水性成分も含む。さらに、水中油型乳剤は、通常、乳化剤を含む。一実施形態では、代謝可能油はスクアレンである。一実施形態では、トコールはαトコフェロールである。一実施形態では、乳化剤は非イオン性界面活性剤乳化剤（ポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエート、ＴＷＥＥＮ８０（商標）、等）である。
代表的実施形態では、水中油型乳剤はスクアレンとαトコフェロールを含み、その比率は１（ｗ／ｗ）以下である。
【０００８】
１つの具体的な例では、免疫原性組成物は、水中油型乳剤アジュバント系を含み、これは、約２％〜約１０％のスクアレン、約２％〜約１０％のαトコフェロール、および約０．３％〜約３％のポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエートを含む用量に処方されている。例えば、免疫原性組成物は、約１０ｍｇ〜約１２ｍｇのスクアレン、約１０ｍｇ〜約１２ｍｇのαトコフェロール、および約４ｍｇ〜約６ｍｇのポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエートを含む用量に処方されたアジュバント含んでもよい。１つの具体的な例では、アジュバントは一回（全）用量中に、１０．６８ｍｇのスクアレン、１１．８６ｍｇのトコフェロール、４．８５ｍｇのポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエートを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は前出の成分量の分割量（すなわち、前出の組成物の一回用量処方の分率、例えば、前出の成分量の半分、前出の成分量の１／４または１／３、１／６等の他の分率）で処方される。
【０００９】
特定の実施形態では、不活化デング熱ウイルス抗原は、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）および／またはＱＳ２１を含むアルミニウム不含アジュバント系を添加して処方される。一実施形態では、アジュバント系は、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む。例えば、一実施形態では、アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１をリポソーム製剤中に含む。任意選択として、アジュバント系はコレストロールを含んでもよい。一具体的実施形態では、アジュバントはＱＳ２１とコレステロールを含有する。任意選択として、アジュバント系は、１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含んでもよい。例えば、不活化デング熱ウイルス抗原に添加して処方される１つの具体的なアジュバント系としては、コレステロール、ＤＯＰＣ、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１がある。
【００１０】
１つの具体的な例では、免疫原性組成物は、約０．１〜約０．５ｍｇのコレステロール、約０．２５〜約２ｍｇのＤＯＰＣ、約１０μｇ〜約１００μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、および約１０μｇ〜約１００μｇのＱＳ２１を含む用量に処方されたアジュバントを含む。一実施形態では、アジュバント中のコレステロールとＱＳ２１の比は、５：１（ｗ／ｗ）である。例えば、アジュバント中のコレステロールとＱＳ２１の比は、およそまたは正確に１：１（ｗ／ｗ）であってもよい。１つの具体的処方では、約０．２５ｍｇのコレステロール、約１．０ｍｇのＤＯＰＣ、約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、および約５０μｇのＱＳ２１を含む一回用量に処方される。他の実施形態では、免疫原性組成物は前出の成分量の分割量（すなわち、前出の組成物の一回用量処方の分率、例えば、前出の成分（ＤＯＰＣ、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１）の量の半分、前出の成分の量の１／４または１／３、１／６等の他の分率）で処方される。
【００１１】
別の態様では、本開示はデング熱ワクチンを製造するための、次の工程を含む方法に関する。すなわち、少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原を提供する工程、および少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原にアルミニウム不含アジュバントを加えて処方する工程である。例えば、免疫原性組成物は、不活化または死滅させた病原性または弱毒化株から製造した全ウイルス抗原を用いて処方可能である。例えば、ホルムアルデヒド、ベタプロピオラクトン（ＢＰＬ）、もしくは過酸化水素、等の化学薬品を用いて、または紫外線照射を用いて、または２つ以上の不活化工程の組み合わせ（同じ種類であっても、異なるものであってもよく、例えば、ホルムアルデヒドとＢＰＬ、ホルムアルデヒドとＵＶ照射、ＢＰＬとＵＶ照射、過酸化水素とＵＶ照射等任意の組み合わせ）を使って、生の（病原性または弱毒化）ウイルスを死滅または不活化させ、複製不能にすることができる。任意選択として、不活化デング熱ウイルスは、抗原サブユニットの分割または追加精製のような追加処理に供してもよい。
【００１２】
別の態様では、本開示はデング熱ウイルスによる患者の疾患を予防、改善または治療する方法に関し、この方法は、アルミニウム不含アジュバント（本明細書記載のように）と組み合わせて少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を投与することを含む。一実施形態では、この方法は、免疫原性組成物を小児、例えば、５歳未満または１歳未満の小児、に投与することを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は１歳未満の未処置患者に投与される。他の実施形態では、免疫原性組成物は成人患者、例えば、約６０または６５才を越える高齢患者、に投与される。このような患者は以前にデング熱ウイルスに接触した可能性がある。通常、ワクチンは、非経口で、例えば、筋肉内に、投与される。別の態様では、本開示は、デング熱ウイルス感染および／またはデング熱ウイルス誘導疾患、例えば、出血熱（ＤＨＦ）やデング性ショック症候群（ＤＳＳ）の予防、改善または治療のため、医薬品に使用する目的でアルミニウム不含アジュバントと組み合わせて使用される、少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原を含む免疫原性組成物に関する。
【００１３】
用語
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするため、次に用語の説明を行う。追加の用語と説明は、本開示の中で提供される。
【００１４】
他に説明がなければ、本明細書で使われている全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に記載されている。
【００１５】
単数形用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に別義が示されていなければ、複数の指示対象を含む。同様に、文脈から明確に別義が示されていなければ、単語「または（ｏｒ）」は「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。用語「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」は２つ以上を意味する。さらに、核酸またはポリペプチドの塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために用意されている点は理解されるべきである。また、抗原等の物質の濃度やレベルに関して与えられている数値限定は近似値であることが意図されている。従って、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇと示されている場合は、その濃度は少なくとも約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）（または「約（ａｂｏｕｔ）」または「〜」）２００ｐｇであると理解されることが意図されている。
【００１６】
本明細書記載のものと類似または同等の方法と材料を本開示の実践または試験に使用するのは可能であるが、適切な方法と材料は以下に記載する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。従って、文脈から明確に別義が示されていなければ、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」およびその変化形、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は表明された化合物もしくは組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）もしくは工程、または化合物群もしくは工程群を包含するが、他の任意の化合物、組成物、工程、またはこれらの群を排除しないことを意味すると理解されるべきである。省略形「ｅ．ｇ．」はラテン語の「例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ）」からきたもので、本明細書では非限定的例を示すために使われる。従って、省略形「ｅ．ｇ．」は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【００１７】
免疫原性組成物はヒトの患者または実験動物（例えば、実験的設定の場合）への投与に適した、デング熱ウイルス等の病原体などに対して特異的免疫応答を誘発することが可能な物質の組成物である。免疫原性組成物それ自体は、１つまたは複数の抗原（例えば、全精製ウイルスまたはその抗原サブユニット、例えば、ポリペプチド）または抗原エピトープを含む。また、免疫原性組成物は、免疫応答を誘発または促進することができる１つまたは複数の追加の成分、例えば、賦形剤、キャリアおよび／またはアジュバント、を含むことも可能である。特定の例では、免疫原性組成物を投与して、病原体により誘導された症状または病状に対して患者を防御する免疫応答を誘発する。いくつかの例では、病原体が原因の症状または疾患は、患者を病原体（例えば、デング熱ウイルス）に曝した後、その病原体の複製を抑制することにより予防（または治療、例えば、減弱または改善）される。本開示中では、免疫原性組成物という用語は、デング熱に対する防御的または緩和的免疫応答を誘発する目的で患者または患者集団へ投与される組成物（すなわち、ワクチン組成物またはワクチン）を包含すると理解されるべきである。
【００１８】
用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（例えば、病原体または病原体を含む組成物に関して）は、組成物から望ましくない成分を除去するプロセスを指す。精製は相対的な用語で、望ましくない成分の全痕跡を組成物から除くことを要求するものではない。ワクチン製造に関連する精製には、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー精製法または親和沈殿法等のプロセスがある。従って、用語「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、絶対的純度を意味するのではなく、むしろ相対的な用語としての使用が意図されている。従って例えば、精製ウイルスの調製は、ウイルスがその発生環境、例えば、自然または人工環境下そのウイルスが複製された細胞または細胞集団中、にある場合よりもより濃縮されているプロセスである。
実質的に純粋なウイルスの調製は、所望のウイルスまたはウイルス成分が、調製物の全タンパク質の少なくとも５０％であるように精製することであってもよい。特定の実施形態では、実質的に純粋なウイルスは、調製物の全タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上を意味する。
【００１９】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」生物学的成分（例えば、ウイルス、核酸分子、タンパク質または細胞器官）は、その成分が発生した、または製造された細胞および／または生命体中の他の生物学的成分から実質的に分離または精製されている。「単離された」ウイルスおよびウイルス成分、例えば、タンパク質には、標準的精製法で精製されたウイルスおよびタンパク質が含まれる。また、この用語は、宿主細胞中で組換え発現により調製されたウイルスおよびウイルス成分（ウイルスタンパク質など）を含む。
【００２０】
「抗原」は、動物中で抗体の製造および／またはＴ細胞応答を促進することができる化合物、組成物または物質で、注入、吸収または他の方法で動物に導入された組成物を含む。用語「抗原」は、全ての関連する抗原エピトープを含む。用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を指す。「優性抗原エピトープ」または「優性エピトープ」は、機能的に重要な宿主免疫応答、例えば、抗体応答またはＴ細胞応答がなされるエピトープである。従って、病原体に対する防御免疫応答に関しては、優性抗原エピトープはこれらの抗原性部分であり、これが宿主免疫系により認識されると、病原体が原因の疾患に対して保護が提供される。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、適切なＭＨＣ分子に結合するとＴ細胞により特異的に結合（Ｔ細胞受容体経由）されるエピトープを指す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（または、Ｂ細胞受容体分子）に特異的に結合されるエピトープである。
【００２１】
本開示では、デング熱ウイルス抗原は、通常、完全に死滅したまたは不活化したウイルスである。デング熱ウイルスワクチンに関して、用語「不活化した（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）」は、抗原成分（例えば、ウイルス）がインビボまたはインビトロで複製不能であることを意味する。例えば、用語「不活化した」は、インビトロ等で複製され、次いで化学的または物理的手段を使ってもはや複製できないように死滅させられたウイルスを包含する。また、この用語は追加のプロセス（例えば、分割、分画等）により製造された抗原、および組換え法、例えば、細胞培養中の組換え法により製造された成分を含む。
【００２２】
「アジュバント」は、この薬剤が無い場合に比較して抗原特異的免疫応答の製造を促進する薬剤である。通常のアジュバントは、アルミニウム含有アジュバントを含み、これは無機質（または無機質塩、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウム ヒドロキシホスファート）の懸濁物を含み、この無機質の上に抗原が吸着される。
本開示では、アジュバントはａｌｕｍ（アルミニウム）不含アジュバントで、前述のようないずれのアルミニウム塩も存在しない状態で処方される。アルミニウム不含アジュバントは、油および水乳剤、例えば、油中水型、および水中油型（およびその改変型で複乳剤および可逆的乳剤を含む）乳剤、リポ糖類、リポ多糖類、免疫賦活性核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチド等）、リポソーム、トール様受容体アゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）、およびこれらの成分の種々の組み合わせを含む。
【００２３】
「免疫応答」は、免疫系細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、または単球、の刺激に対する応答である。免疫応答は、抗原特異的中和抗体のような特異的抗体を製造するＢ細胞応答であってもよい。また、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答のようなＴ細胞応答であってもよい。一部の例では、応答は特定の抗原に対し特異的（すなわち、「抗原特異的応答」）である。抗原が病原体由来である場合は、抗原特異的応答は「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」は病原体の有害な機能または活動を抑制し、病原体による感染を減らす、または病原体の感染による症状（死亡を含む）を軽減する免疫応答である。防御免疫応答は、例えば、ウイルス複製の抑制、またはプラーク減少アッセイもしくはＥＬＩＳＡ中和アッセイによるプラーク形成抑制により、またはインビボで病原体攻撃に対する抵抗性を測定することにより計測可能である
【００２４】
「Ｔｈ１」に偏った免疫応答は、ＩＬ−２とＩＦＮγを製造するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の存在、従ってＩＬ−２とＩＦＮγの分泌または存在により特徴付けられる免疫応答である。一方、「Ｔｈ２」に偏った免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を製造する圧倒的多数のＣＤ４＋ヘルパー細胞が特徴の免疫応答である。
【００２５】
「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、生きている多細胞性脊椎動物生命体である。本開示では、患者は、非ヒト動物、例えば、マウス、コトンラット、または非ヒト霊長類等の実験的対象であってもよい。あるいは、患者はヒトの患者であってもよい。
【００２６】
本明細書で開示の免疫原性組成物は、デング熱ウイルスの感染による疾患の予防、改善および／または治療に好適である。
【００２７】
本明細書で開示の免疫原性組成物は、１つまたは複数の精製不活化デング熱ウイルス抗原を含む。例えば、免疫原性組成物は、単一のデング熱ウイルス株を含んでも（すなわち一価組成物）、または２つ以上のデング熱ウイルス株を含んでも（すなわち、多価組成物）よい。通常、多価組成物は、異なる血清型から選択された株を含む。疾患の原因となる４つのデング熱ウイルスの血清型、すなわち、１型デング熱（ＤＥＮ−１）、２型デング熱（ＤＥＮ−２）、３型デング熱（ＤＥＮ−３）、４型デング熱（ＤＥＮ−４）、があり、交差反応性非中和抗体がより重症型のデング熱疾患の病因になるので、各血清型から１つずつが選択されて最終のワクチンに含有され、従って４つの血清型のいずれかによって引き起こされる疾患に対する保護が保証されている。従って、一実施形態では、免疫原性組成物は四価の組成物であり、デング熱ウイルスの４つの血清型のそれぞれから選択した株を含む。
【００２８】
抗原として使われるウイルスは、基本的にどのようなデング熱ウイルス株（または複数株）から選択してもよい。例えば、血清型に対する定まった（例えば、共通）配列、例えば、ＤＥＮ−１共通配列、ＤＥＮ−２共通配列、ＤＥＮ−３共通配列、またはＤＥＮ−４共通配列、への適合性に基づいて選ばれた各血清型を選択してもよい。このようなウイルスは、自然発生のものであっても合成のものであってもよい。あるいは、ウイルス株は、ワクチン投与が予定されている地域または集団で流行している株に関連して選択してもよい。別の選択肢としては、入手可能性または以前の経験に基づいて便宜上行われる各血清型の選択がある。例えば、代表的な株は、米国特許第6,254,873号に記載されており、本件は参照により本明細書に包含される。追加の適切な株は、例えば、米国特許第7,226,602号に開示されている。さらに追加の株は、例えば、VBRC viral genome database(http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/Flaviviridae/Dengue/Curated_genes),およびthe Dengue Virus Database (http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/Dengue/ProjectInfo.html)で見つけられる。
【００２９】
精製不活化デング熱ウイルスワクチンに関して、病原性または弱毒化株のいずれかを使用可能である。通常、病原体株は、宿主細胞中でより高い力価に繁殖し、商業スケールでの製造を促進する。しかし、病原性株は製造に関わる作業員の感染を防ぐため取り扱いに特別な注意が必要である。細胞培養中で製造させ、デング熱の蚊ベクター中で病原性減弱化および／または複製減少化を選択するように適応させた弱毒化株は取り扱い上の注意は少なくてよいが、製造は困難である。不活化デング熱ウイルスとアルミニウム不含アジュバントを含む免疫原性組成物に関連した、使用に適した代表的弱毒化株は、国際公開第WO 00/57907号および米国特許第6,638,514号ならびに国際公開第WO 00/58444号および米国特許第6,613,556号に記載されており、これらは参照により本明細書に包含される。従って、通常、選択株は、ヒトに使用される物質の製造に適した細胞（例えば、病原体が無いことを保障された細胞）中で複製可能な多くの株の中から選ばれる。例えば、株は、最高力価、例えば、少なくとも約５ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ以上、に細胞株中で成長するウイルスを特定するためにスクリーニンし、（ｉｉ）選択細胞株中で最高力価に成長するデング熱ウイルス株を選択し、そして（ｉｉｉ）さらに選択細胞株中で一回から数回の追加継代によりこれら選択株を高成長に適合させることが可能である。選択されたウイルス（例えば、デング熱ウイルスの４つの血清型から選択されたウイルス）は、さらに、付加的細胞培養継代または遺伝子操作によって高い力価に成長するよう適合させて、高力価のマスターおよび種子製造ロットを作ることができる。
【００３０】
デング熱ウイルスを繁殖させるための適切な細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、ベロ細胞、ＡＧＭＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ−１もしくはＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、胎仔アカゲザル肺（ＦＲｈＬ−２）細胞のような初代細胞株、ＢＳＣ−１細胞およびＭＲＣ−５細胞、またはヒト二倍体繊維芽細胞、ならびに鳥類の細胞、ニワトリもしくはアヒル胎仔誘導細胞株、例えば、ＡＧＥ１細胞、および初代ニワトリ胎仔繊維芽細胞、ならびにＣ６／３６のような蚊細胞株が含まれる。
選択細胞は血清または血清誘導蛋白質が無い条件で成長するように適合させ、無血清（および／または無タンパク質）成長条件下、高力価でデング熱ウイルス複製を維持することができるものが好ましい。
【００３１】
細胞培養でウイルスを繁殖させるため、選択したデング熱ウイルス株を宿主細胞（例えば、前に挙げた適切な細胞型の中から選択した宿主細胞）に感染させる。ウイルス吸着の後に、培養物には細胞成長を支援する培地が与えられる。培地は血清または血清誘導タンパク質、または他の動物誘導タンパク質を含まないことが好ましく、あるいは、製造中に血清添加培地を無血清培地で置き換えてもよい。多くの無血清培地の製剤が市販品として入手可能である。無血清条件下で維持される細胞中でウイルスを製造する方法の詳細については、例えば、US Patent Application No. 20060183224に記載されている。この文献は参照により本明細書に包含される。
【００３２】
宿主細胞は培養物中で所望のウイルス力価になるまで数日間維持される。任意選択として、細胞は連続灌流システム中で維持され、このシステムから数日間以上のコースにわたって、間欠的または連続的にウイルスを得てもよい。不連続培養条件下では、感染後３〜７日までに少なくとも約１０６〜１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価であることが望ましい。一部の宿主細胞では、力価は数日間高いままであり、ウイルスは収率を最大化するために多くの時点で回収できる。例えば、ウイルスは、感染後約３〜約１３日目から上澄み液を集め、細胞を再供給することにより、培養物から毎日採取可能である。任意選択で、追加処理に先立ち、上澄み液をプールしてもよい。他の宿主細胞では、ウイルスは高い力価に成長させることができるが、持続時間はより短い。このような場合、経験的に決めた手法によりピーク力価のところでウイルスを取り出すことができる。
【００３３】
例えば、ベロ細胞はフィシンを添加したＶＰＳＦＭ培地中で継代１４１代まで増幅可能である。１つの追加の継代を豚トリプシンの存在下実行可能である。細胞をバイオリアクター（４Ｌ）中に約０．７ｘ１０６細胞／ｍｌで播いて、マイクロキャリア（ｃｙｔｏｄｅｘ−１）上でＶＰＳＦＭ＋プルロニック０．１％中、灌流条件（例えば、一日目：０容積／日；１日目〜２日目：１容積／日；次の３日間：１．５容積／日）で、５日間培養可能である。次に約３ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞をデング熱ウイルスに感染（３５℃）させる（例えば、ＤＭＥＭ＋グルタミン４ｍＭ＋ＦＢＳ２％（培地容積を２Ｌに減らして）培地中で感染の多重度０．０１、３７℃で２時間の条件下）。次にバイオリアクタター中の培地の容量を４Ｌに調節する。３日後、大部分の培地（約３Ｌ）を除去しＤＭＥＭ培地＋グルタミン４ｍＭで置き換える。感染後７日でウイルスが採取可能となる。
【００３４】
ウイルスを回収するため、ウイルスを当技術分野で既知の通常の方法、例えば、低速遠心分離（例えば、１５００ｘｇで１０分間）、または孔径０．４５μｍのフィルタを通してろ過することにより、採取する。前記ウイルスを濃縮する方法は、当業者の通常の技術の範囲内にあり、例えば、限外濾過法（例えば、３００ｋＤ以下の孔径の膜を用いた）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００沈殿法がある。ウイルスの精製方法は、当業者には既知であり、連続または多段ショ糖勾配法による精製、サイズ排除、イオン交換、吸着もしくはアフィニティカラムを使ったカラムクロマトグラフィーによる精製、またはポリマー２相もしくは多相システムでの分配による精製、およびこれらの組み合わせを含む。ウイルス陽性画分のアッセイ法には、プラークアッセイ、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイ、および／または免疫測定のような抗原アッセイが含まれる。
【００３５】
例えば、デング熱ウイルスは培養上澄み液からポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法により濃縮可能である。感染細胞からの上澄み液を、遠心分離器（１，５００ｘｇ）で１０分間清澄化する。清澄化した上澄み液を６％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ）および０．５Ｍ ＮａＣｌに調整し、静かに攪拌しながら４℃で４５分間保持する。沈殿物を５，０００ｘｇ、５０分の遠心分離により集め、ＳＴＥ緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）に再懸濁する。次に、ウイルス懸濁液を遠心分離（４℃、１２，０００ｘｇ、１０分）により清澄化する。沈渣を廃棄し、さらに上澄み液を遠心分離（４℃、１７０，０００ｘｇ、８０分）にかけウイルス沈渣を作る。このウイルス沈渣を所望の濃度でＳＴＥ緩衝液に再懸濁する。
【００３６】
あるいは、または追加的に、デング熱ウイルスを細胞上澄み液から接線流限外濾過により濃縮可能である。感染細胞からの上澄み液を上述の低速の遠心分離により清澄化し、次に０．４５μｍＣＮフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過する。濾過した上澄み液を、低タンパク質結合１００ｋＤカットオフ膜（例えば、オメガ１００Ｋ スクリーンチャンネル、Ｆｉｌｔｒｏｎ、Ｉｎｃ．）を使って接線流限外濾過により濃縮する。毎分４００ｍｌの流量、毎分約１００ｍｌのろ過率および２０〜３０ｐｓｉの圧力の下、４℃で濃縮を行う。
【００３７】
さらなる精製は、ショ糖勾配超遠心分離を使って行うことができる。デング熱ウイルスは基本的には以前記載した方法（Srivastava et al. Arch. Virol. 96: 97-107, 1987）に少し修正を加えたショ糖勾配法で精製できる。１５ｍｌショ糖勾配は１“ｘ３．５”（４０ｍｌ）超遠心チューブ(Ｕｌｔｒａ−ｃｌｅａｒ（商標）,Beckman, Inc.)に燐酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ、ＣａおよびＭｇ不含、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＭＡ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中の次のショ糖溶液（ｗ／ｗ）を段階的に添加して作成できる：２ｍｌ ６０％、２ｍｌ ５５％、２ｍｌ ５０％、２ｍｌ ４５％、２ｍｌ ４０％、２ｍｌ ３５％、２ｍｌ ３０％および１ｍｌ １５％。室温で２〜４時間チューブを静置することでスムーズな勾配が形成される。２５ｍｌまでの濃縮ウイルスを各チューブに加える。次に超遠心分離を、例えば、ＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って、４℃、１７，０００ｒｐｍで１８時間、行う。遠心分離の後、１〜２ｍｌの画分をチューブの底部から集めことができる。画分を、総タンパク質量、ウイルスＨＡ、およびウイルス抗原の所望のアッセイに供することが可能である。正の勾配画分は、通常、プールされ、培地１９９（Ｍ１９９、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）またはＰＢＳを使って１０％以下のショ糖に希釈される。任意選択として、不活化の前に、ウイルスプールを０．２２μｍ低タンパク質結合フィルタ（ＧＶタイプ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過してもよい。
【００３８】
精製に続いて、回収ウイルスは、その抗原性および免疫原性を保持するが、感染力は破壊するように選択された手段により不活化される。１つの例では、ホルマリンまたはβ-プロプリオラクトン等の有効量の薬剤をウイルスに添加し、この混合物を不活化するまで不活化薬剤と共にインキュベートする。例えば、ホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）はＰＢＳで１：４０に希釈し、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで約７．４に調整する。次に０．２２μｍＣＮフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通してこの溶液を無菌化する。このホルマリン溶液を精製ウイルス（１：５０）に添加し最終ホルマリン濃度を０．０５％とする。不活化は、１５℃と２５℃の間で、４８時間〜１４日間（通常、１０日以下）で行われる。任意選択で、ウイルスを０．２２μｍＧＶタイプフィルタを通して濾過し、新しい容器に移してもよい。不活化の完了時点で、バルク培養物中の遊離ホルマリンを、例えば、等モル量の無菌の１０％ｗ／ｖ亜硫酸水素ナトリウムの添加により、中和する。
【００３９】
あるいは、不活化は、放射能源を使ってウイルスが不活化されるまで照射して達成できる。放射能源の１つの好ましい例には、ウイルスの感染力を不活化するのに十分で、しかも抗原性は基本的に損なわない線量で使用されるコバルト６０がある。有用な線量の例は、５．５〜７．０Ｍｒａｄの範囲の線量である。例えば、１．５ｍｌの無菌ポリプロピレンチューブ中の５０μｌウイルス分割量を凍結させ、所望の照射を行うに十分な時間、６０Ｃｏ源のガンマセル中でドライアイス上に置く。
【００４０】
あるいは、紫外線照射を用いてデング熱ウイルスを不活化することもできる。ウイルスを紫外線照射するための適切な商業ベースの装置は、当技術分野でよく知られ、装置は市販品として、例えば、Ｂａｙｅｒから入手可能で、上澄み液（またはウイルスを含む他の流体）を、約２５４ｎｍ光源を使いウイルスを不活化するのに十分な時間で、かつ、免疫原性を保持する条件で、ＵＶ−Ｃ光源に曝すことができる。
【００４１】
あるいは、デング熱ウイルスに対し過酸化水素を、US Patent Application No. 20070031451に記載のように使用して不活化可能である。本特許は参照により本明細書に包含される。
【００４２】
所望なら、２つ以上の不活性化工程を用いることも可能である。２つ以上の不活性化工程を用いる場合、かかる工程は同じであっても、異なっていてもよい。例えば、前出の不活化プロセス等、任意の適切な不活化プロセスの組み合わせを、ヒトの患者へ投与する免疫原性組成物処方のためにデング熱ウイルスを精製および不活化する際、用いることができる。
【００４３】
ウイルス調製の品質は当技術分野で既知の種々の方法でモニターできる。例えば、不活性化の前にプラーク滴定アッセイによりウイルスをモニターできる。ウイルスは製造に用いたものと同じまたは異なる宿主細胞上で増幅され、適切な細胞株、例えば、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞またはベロ細胞単層、に感染させるために使用される。また、ウイルスプラーク数を評価して回収ウイルスの感染力を評価できる（例えば、Sukhavachanaet al. WHO Bull. 35: 65-6, 1966参照）。回収抗原の量と品質を評価する別の方法は、ウイルス赤血球凝集（ＨＡ）および赤血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイによるものである。ウイルスＨＡおよびＨＩアッセイは以前に記載した方法で行うことができる（Clarke & Casals, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-73, 1958）。総タンパク質量は、基本的には、Bradfordによる記載（Anal. Biochem. 72: 248, 1976）のように、市販のキット（BioRad, Hercules, Calif.）および標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはγグロブリンを使って測定される。
【００４４】
あるいは、抗原は不活性化後、例えば、抗原スポットブロットアッセイにより検出および／または定量可能である。不活化ウイルス調製物中の抗原を検出および定量するため、ウイルス試料を連続的に希釈（通常は倍数希釈）してニトロセルロース紙上に点状に配置する。そのセルロース紙を風乾し、５％カゼインのＰＢＳ溶液でブロックして、特異的抗体または抗血清、次に酵素結合２次抗体と一緒にインキュベートする。また、ウイルスはウエスタンブロットによっても検出可能である。簡単に述べれば、抗原調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（１％ＳＤＳ、６６ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、１％グリセロールおよび０．７％ブロムフェノールブルーを含有）に２２℃で１０分間溶解し、１２．５％ポリアクリルアミドゲル（例えば、Feighny et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50(3): 322-8, 1994に記載のように）で電気泳動を行う。分解タンパク質を電気泳動によりナイロンまたはニトロセルロース膜上に移動する。次にタンパク質をコロイド状金で染色して検出し、ウイルス光源をウエスタンブロットプロセスの非同位体修飾を使って免疫学的に同定できる。
【００４５】
免疫原性組成物および方法
不活化デング熱ウイルスを適切なアルミニウム不含アジュバントと混合してヒトの患者の免疫化に適切な免疫原性組成物を製造し、高い力価のウイルス中和抗体を誘発し、免疫化したヒトをデング熱ウイルスが原因の疾患から防御する。通常、不活化デング熱ウイルスは薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤に入れて処方される。
【００４６】
薬学的に許容可能なキャリアおよび賦形剤はよく知られており、当業者が選択可能である。例えば、キャリアまたは賦形剤は、好ましくは、緩衝液を含む。また、任意選択として、キャリアまたは賦形剤は、溶解性と安定性を安定化する少なくとも１つの成分を含む。可溶化剤／安定化剤の例には、洗剤、例えば、ラウレルサルコシン、および／またはポリオキシエテチレンソルビタンモノオレエートが含まれる。あるいは、可溶化剤／安定化剤にはアルギニンおよびガラス形成ポリオール（ショ糖、トレハロース等）が含まれる。
多くの薬学的に許容可能なキャリアおよび／または薬学的に許容可能な賦形剤が当技術分野で既知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E.  W.  Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975) に記載されている。
【００４７】
従って、適切な賦形剤およびキャリアを当業者が選択でき、選択した投与経路で患者に送達するために適した製剤を製造することが可能となる。
【００４８】
限定されないが、適切な賦形剤には、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非洗剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋および他の二価の陽イオン関連塩、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、およびβ−メルカプトエタノールが挙げられる。また、その他に、洗剤（ポリオキシエテチレンソルビタンモノオレエート、トリトンＸ−００、ＮＰ−４０、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ナトリウムドデシルスルファート、セチルトリメチルアンモニウムブロミドを含む）を賦形剤として使ってももよい。
【００４９】
また、本明細書で開示されている免疫原性組成物はアジュバントを含む。デング熱に対する防御免疫応答を誘発する目的で患者へ投与するのに適した免疫原性組成物という観点からは、アジュバントはＴｈ１／Ｔｈ２バランス応答またはＴｈ１に偏った免疫応答を誘発するように選択されたアルミニウム不含アジュバントである。このような免疫応答はγ−ＩＦＮ製造により特徴付けられる。
【００５０】
通常、アジュバントは、この組成物が投与される患者または患者集団でＴｈ１／Ｔｈ２バランス応答またはＴｈ１に偏った免疫応答を促進するよう選択される。例えば、免疫原性組成物が、デング熱感染を受けやすい（またはそのリスクが高い）特定の年齢群の患者に投与する予定である場合、アジュバントはその患者または患者集団に対し安全でかつ有効であるように選択される。従って、新生児もしくは幼児（誕生から１歳のまでの患者等）または小児（例えば、誕生から５歳のまでの患者等）に投与する目的で不活化デング熱ウイルス抗原を含む免疫原性組成物を処方する場合、アジュバントは新生児および幼児および／または小児に対し安全でかつ有効であるように選択される。
【００５１】
さらに、通常、免疫原性組成物が投与されるルート経由で投与される場合、アジュバントはＴｈ１免疫応答を促進するよう選択される。例えば、免疫原性組成物が筋肉内投与用として処方されている場合、１つまたは複数の３Ｄ−ＭＰＬ、スクアレン（例えば、ＱＳ２１）、リポソーム、および／または油および水乳剤を含むアジュバントの選択が望ましい。
【００５２】
不活化デング熱抗原と組み合わせて使用するための１つの適切なアジュバントは、無毒性細菌性リポ多糖誘導体である。無毒性リピドＡ誘導体の適切な例は、モノホスホリルリピドＡ、またはさらに具体的には３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。３Ｄ−ＭＰＬはＭＰＬの名称でＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｎ．Ａ．から販売されており、文書中ではＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと呼ばれている。例えば、米国特許第4,436,727号、4,877,611号、4,866,034号および4,912,094号参照。３Ｄ−ＭＰＬはＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を伴って主にＣＤ４＋Ｔ細胞応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、GB2220211 Aで開示されている方法により製造可能である。化学的には、これは３、４、５、または６アシル化鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。本発明の組成物には、小粒子３Ｄ−ＭＰＬが使われる。
小粒子３Ｄ−ＭＰＬは０．２２μｍフィルタを通して除菌された程度の粒度を有する。この調製はWO94/21292に記載されている。
【００５３】
３Ｄ−ＭＰＬ等のリポ多糖類は免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜１００μｇを使用可能である。この３Ｄ−ＭＰＬは約５０μｇ、例えば、４０〜６０μｇ、適切には、４５〜５５μｇまたは４６〜５４μｇまたは４７〜５３μｇまたは４８〜５２μｇ、または４９〜５１μｇ、または５０μｇのレベルで使用可能である。別の実施形態では、幼児または小児への投与例として、免疫原性組成物の用量は、免疫原性組成物のヒト用量当たり約２５μｇレベルの３Ｄ−ＭＰＬの分割量を含む。この３Ｄ−ＭＰＬは約２５μｇのレベルで使用可能であり、例えば、２０〜３０μｇ、適切には、２１〜２９μｇまたは２２〜２８μｇまたは２３〜２７μｇまたは２４〜２６μｇ、または２５μｇ、で使用可能である。他の実施形態（例えば、非常に若い幼児への投与に適切な）では、免疫原性組成物のヒト用量はさらに低い量の約１０μｇレベル、例えば、５〜１５μｇ、適切には６〜１４μｇ、例えば、７〜１３μｇまたは８〜１２μｇまたは９〜１１μｇ、または１０μｇ、の３Ｄ−ＭＰＬ分割量を含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇレベル、例えば、１〜９μｇ、または２〜８μｇまたは適切には３〜７μｇまたは４〜６μｇ、または５μｇ、の３Ｄ−ＭＰＬを含む。
【００５４】
他の実施形態では、米国特許第6,005,099号および欧州特許番号第0 729 473 B1号に記載のように、リポ多糖類はβ（１−６）グルコサミン二糖類であってもよい。当業者なら、これらの参考文献の教示に基づいて３Ｄ−ＭＰＬ等の種々のリポ多糖類を容易に製造できるであろう。それでもなお、これらの文献は参照により本明細書に包含される。前述の免疫賦活剤（ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと類似構造を有する免疫賦活剤）のほかに、上記ＭＰＬの構造の一部分であるアシル化単糖および二糖誘導体もまたアジュバントとして適切である。他の実施形態では、アジュバントはリピドＡの合成誘導体で、その一部のものはＴＬＲ４アゴニストとして記載され、限定されないが、ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスファート）、(WO 95/14026); ＯＭ ２９４ ＤＰ（３Ｓ、９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１、１０−ジオール、１、１０−ビス（ジヒドロゲンオホスファート）(国際公開第WO 99/64301号およびWO 00/0462号);およびＯＭ １９７ ＭＰ−Ａｃ ＤＰ（３Ｓ−、９Ｒ）−３−Ｄ（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１、１０−ジオール、１−ジヒドロゲンオホスファート１０−（６−アミノヘキサノアート） (WO 01/46127)が挙げられる。
【００５５】
使用可能な他のＴＬＲ４リガンドには、アルキルグルコサミニドリン酸塩（ＡＧＰ）、例えば、WO 98/50399または米国特許第6,303,347号（ＡＧＰ合成プロセスも開示されている）に開示のものがあり、より適切なものとしては、ＲＣ５２７またはＲＣ５２９、または米国特許第6,764,840号に開示のＡＧＰの薬学的に許容可能な塩がある。ＡＧＰの一部はＴＬＲ４アゴニストであり、一部はＴＬＲ４アンタゴニストである。
【００５６】
ＴＬＲ４を通してシグナル伝達応答を起こすことが可能な他の適切なＴＬＲ４リガンド（Sabroe et al, JI 2003 p1630-5）には、例えば、グラム陰性菌由来のリポ多糖類とその誘導体、またはその断片、特に、ＬＰＳの非毒性誘導体（３Ｄ−ＭＰＬ等の）がある。
他の適切なＴＬＲアンタゴニストには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５または９０、サーファクタントタンパク質Ａ、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチドおよびｂ−デフェンシン−２、およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）がある。一実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＨＳＰ６０、７０または９０である。他の適切なＴＬＲ４リガンドは、WO 2003/011223およびWO 2003/099195に記載されており、例えば、WO2003/011223の４〜５ページまたはWO2003/099195の３〜４ページに開示の化合物Ｉ、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩおよび特にWO2003/011223でＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、およびＥＲ８０４７６４として開示されている化合物がある。例えば、１つの適切なＴＬＲ４リガンドはＥＲ８０４０５７である。
【００５７】
デング熱ウイルス抗原を含んだ免疫原性組成物に混合して使用可能な他のアジュバントには、例えば、本明細書記載の３Ｄ−ＭＰＬまたは別のアジュバントの代替品として、またはそれと組み合わせて使用できる、ＱＳ２１等のサポニンがある。
【００５８】
サポニンについては、Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)から学ぶことが出来る。サポニンはステロイドまたはトリテルペン配糖体で、植物および海生動物界に広く分布している。サポニンは水中でコロイド溶液を形成し振盪で発泡すること、およびコレステロールを沈殿させることで知られる。サポニンが細胞膜の近くにあると、膜中に気孔様構造を形成し膜を破裂させる。赤血球の溶血はこの現象の例であるが、これは特定のサポニンの特性であり、全てに当てはまる特性ではない。
【００５９】
サポニンは、全身投与のためのワクチンに入れるアジュバントとして知られる。それぞれのサポニンのアジュバントおよび溶血作用が当分野で広範囲に研究されてきた(Lacaille-Dubois and Wagner、上記参照)。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（南米の木であるキラジャ サポナリア モリナの樹皮由来）およびその画分がUS 5,057,540および“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55、およびEP 0 362 279 B1に記載されている。免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と名付けられたＱｕｉｌ Ａの画分を含む粒子状の構造は溶血性であり、ワクチンの製造に用いられてきた（Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739,および米国特許第6,846,489号）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は強力な全身性アジュバントといわれており、その製造方法は、米国特許第5,057,540号および欧州特許第0 362 279 B1号に開示されている。これらの特許は参照により本明細書に包含される。このサポニン、またはその画分は単独、または組み合わせて使用でき、また、任意選択としてＩＳＣＯＭＳとして処方してもよい。全身性の予防接種研究に使われてきた他のサポニンには、他の植物種、例えば、カスミソウおよびサポナリア属（Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992）由来のものが含まれる。
【００６０】
ＱＳ２１は、ＨＰＬＣ精製キラジャ サポナリア モリナの樹皮由来無毒画分である。ＱＳ２１製造方法は、米国特許第5,057,540号に開示されている。ＱＳ２１を含む非反応原性（non-reactogenic）アジュバント製剤は、WO 96/33739に記載されている。前述の参考文献は参照により本明細書に包含される。前記免疫学的に活性なＱＳ２１等のサポニンは、免疫原性組成物のヒト用量当たり１〜５０μｇの量を使用してもよい。免疫原性組成物のヒト用量当たり約１〜１００μｇのレベルで使用するのが好都合である。例えば、ＱＳ２１は、約５０μｇのレベル、例えば、４０〜６０μｇ、適切には４５〜５５μｇまたは４６〜５４μｇまたは４７〜５３μｇまたは４８〜５２μｇ、または４９〜５１μｇ、または５０μｇで使用できる。別の実施形態では、例えば、幼児または小児に対する投与向けに、免疫原性組成物用量は、２５μｇの分割量、例えば、２０〜３０μｇ、適切には２１〜２９μｇまたは２２〜２８μｇまたは２３〜２７μｇまたは２４〜２６μｇ、または２５μｇの分割量を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約１０μｇのレベル、例えば、５〜１５μｇ、適切には６〜１４μｇ、例えば、７〜１３μｇまたは８〜１２μｇまたは９〜１１μｇ、または１０μｇのＱＳ２１をふくむ。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇ、例えば、１〜９μｇ、または２〜８μｇまたは適切には３〜７μｇまたは４〜６μｇ、または５μｇのＱＳ２１を含む。ＱＳ２１およびされにコレステロールを含むこのような製剤（リポソーム製剤が適切）は、抗原と一緒に処方した場合、Ｔｈ１刺激を可能にするアジュバントであることが示されている。従って、例えば、不活化デング熱ウイルス抗原は、ＱＳ２１とコレステロールの組み合わせを含むアジュバントと共に免疫原性組成物中に包含されることが好ましい。任意選択として、このアジュバントは、１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホホコリン（ＤＯＰＣ）を含んでもよい。ＱＳ２１等のサポニンは、１つまたは複数の追加の免疫賦活剤（例えば、本明細書で議論されているような３Ｄ−ＭＰＬ、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、または他のＴＬＲアゴニスト、等）と一緒に処方することもできる。
【００６１】
前述した様な異なるアジュバントの組み合わせも不活化デング熱ウイルス抗原を含む組成物として使用可能である。例えば、すでに示したように、ＱＳ２１は３Ｄ−ＭＰＬと一緒に処方可能である。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は、通常は１：１０〜１０：１のオーダー、例えば、１：５〜５：１であり、また、実質的に１：１であることも多い。通常、この比率は２．５：１〜１：１の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲にある。任意選択として、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせに、コレステロールおよびＤＯＰＣのどちらか一方または両方を含めてもよい。このような組み合わせの処方と投与量、特に幼児や小児への投与に適する用量（分割量）に関するさらなる詳細については、WO2007068907およびUS 20080279926に記載されており、これらは参照により本明細書に包含される。組み合わせの処方をした場合は、かかる組み合わせは抗原特異的Ｔｈ１免疫応答を促進することができる。
【００６２】
一部の例では、アジュバント製剤は水中油型乳剤を含む。
【００６３】
水中油型乳剤の１つの例では、スクアレン等の代謝可能油やトコフェロール例えば、αトコフェロール等のトコール、、および、水性キャリア中のポリソルベート８０またはトウィーン８０等の界面活性剤を含み、追加の免疫促進薬を含まない。例えば、水性キャリアは燐酸塩緩衝食塩水であってもよい。この水中油型乳剤の１つの好ましい例は、本明細書中でＡＳ０３と命名されている。さらに、水中油型乳剤がソルビタントリオレアート（ＳＰＡＮ ８５（商標））および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含んでもよい。水中油型乳剤の別の例は、ＭＦ５９で、これはスクアレンベース乳剤系でＮｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから販売されている。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、抗原または抗原組成物および水中油型乳剤を含むアジュバント組成物を含むワクチン組成物が提供され、前記水中油型乳剤は０．２５〜１０ｍｇの代謝可能油（スクアレンが好適）、０．２５〜１１ｍｇのトコール（αトコフェロールのようなトコフェロールが好適）および０．１２５〜４ｍｇの乳化剤を含む。一部の例では、例えば、小児への投与用として、水中油型乳剤は標準成人用量の１／２、１／４、または１／８の分割量で添加される。不活化デング熱ウイルスワクチンと組み合わせた使用に適した水中油型乳剤の分割量のさらなる詳細については、WO 2008043774, USSN 12/445,090に記載されており、これは参照により本明細書に包含される。
【００６５】
水中油型乳剤を使った特定の製剤では、かかる乳剤は、追加の成分として、例えば、コレステロール、スクアレン、αトコフェロール、および／またはポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標））またはソルビタン トリオレアート等の洗剤を含んでもよい。代表的製剤では、かかる成分は、約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のαトコフェロールおよび０．３〜３％のポリオキシエテチレン ソルビタン モノオレエート(全て容量/容量) のように添加される。より安定な乳剤を得るためには、通常、スクアレン対αトコフェロールの比率は、１以下である。一部の例では、製剤は安定剤を含んでもよい。
【００６６】
任意選択として、油および水乳剤アジュバントは、１つまたは複数のさらなる免疫賦活剤を含む。一具体的実施形態では、アジュバント製剤は、水中油型乳剤等の乳剤の形に調製された３Ｄ−ＭＰＬを含む。一部の例では、WO 94/21292に開示されているように、乳剤は、粒径０．２μｍ未満の小粒度を有する。例えば、３Ｄ−ＭＰＬ粒子は０．２２ミクロン膜を通して細菌濾過されるのに十分な細粒にすることができる（欧州特許第0 689 454号に記載）。あるいは、３Ｄ−ＭＰＬはリポソーム製剤としても調整可能である。任意選択として、３Ｄ−ＭＰＬ（またはその誘導体）を含むアジュバントは、追加の免疫賦活剤成分を含んでもよい。
【００６７】
例えば、不活化デング熱ウイルス抗原を含む免疫原性組成物が幼児への投与用に処方される場合、アジュバントの投与量は、幼児患者に対し有効で克つ非反応原性であるように決定される。一般的に、幼児製剤中のアジュバントの投与量は、成人（例えば、６５才以上の成人）への投与用製剤に使われるよりも少ない。例えば、３Ｄ−ＭＰＬ粒子の量は、通常、用量として１μｇ〜２００μｇ、例えば、１０〜１００μｇ、または１０μｇ〜５０μｇの範囲である。幼児用量は通常この範囲の低い方の端にあり、例えば、約１μｇ〜約５０μｇ、例えば、約２μｇから、または約５μｇから、または約１０μｇから、約２５μｇまで、または約５０μｇまでの範囲である。通常、製剤中にＱＳ２１が使われる場合は、その範囲は同程度である（および上述の比率に従う）。成人と高齢者に対しては、通常の製剤は、幼児製剤に通常使われるよりも多くのアジュバント成分を含む。
【００６８】
免疫原性組成物は、通常、免疫防護量（またはその分割量）の抗原を含み、従来法の技術で調製可能である。ヒトの患者への投与を目的とした組成物を含め、免疫原性組成物の調製は、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61  Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995およびNew Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に一般的に記載されている。リポソームへの封入に関しては、例えば、by Fullerton, U.S. Patent 4,235,877に記載されている。タンパク質の高分子への接合については、例えば、Likhiteによる米国特許第4,372,945号およびArmorらによる米国特許第4,474,757号に開示されている。
【００６９】
通常、免疫原性組成物の各用量中の抗原の量は、通常の患者に対し大きな有害副作用の無い状態で免疫防御応答を誘導する量が選択される。ここでの免疫防御は、必ずしも感染に対し完全な防御を意味するものではなく、ウイルスに関連する症状や疾患、特に重症疾患に対する防御を意味する。抗原の量は用いられる免疫原に依存して変化してもよい。一般に、ヒト用量は、０．０５〜１００μｇの不活化ウイルス、例えば、約０．１μｇ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５μｇ）から約５０μｇまで、例えば、約０．５μｇ〜約３０μｇ、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、または約２５μｇの各不活化デング熱ウイルス株を含みうる。免疫原性組成物で利用される量は患者の集団（例えば、幼児）に基づき選択される。特定の組成物に対する至適量は患者における抗体力価や他の応答の観察を含む標準的調査により確認できる。初回接種に続いて、患者は適切な間隔（例えば、４週間）の後、追加免疫を受けることが出来る。
【００７０】
選択されたアジュバントに関わらず、最終製剤中の濃度は標的集団に対し安全で有効であるように計算されることに留意すべきである。例えば、ヒトのデング熱ウイルスに対して免疫応答を誘発する免疫原性組成物は、幼児（例えば、初回投与の年齢として、０〜６ヶ月等の誕生から１才までの幼児）に投与することが望ましい。デング熱に対して免疫応答を誘発する目的の免疫原性組成物はヒトの成人への投与も好ましい（例えば、単独または、例えば、「旅行者用」ワクチンに関連して、他の病原体の抗原と組み合わせた投与）。アジュバントの選択はこれらの異なる用途により異なる可能性があり、各状況に対する至適アジュバントと濃度は当業者により経験的に決定可能である。
【００７１】
患者のデング熱に対する免疫応答を誘発する方法もまた本開示の特徴である。この方法には、免疫学的に有効な量の、不活化デング熱ウイルス抗原とアルミニウム不含アジュバントを含む組成物をヒトの患者等の患者に投与することが含まれる。例えば、組成物はＴｈ１に偏った免疫応答を誘発するアジュバントを含む。この組成物は、デング熱特異的免疫応答を誘発するように処方されている。すなわち、この組成物はＴｈ１に偏った免疫応答向けに処方され、またこの応答を得てデング熱ウイルスの感染を減らすか、または防ぐ、および／またはデング熱ウイルスに感染後の病的反応を減らすか、または防ぐ。
【００７２】
通常、ワクチンは注射可能なように液体溶液または懸濁液として調製される。また、注射の前、液体への溶解用または懸濁用に適した固体形態としても調製される。組成物は種々の異なる経路で投与できるが、免疫原性組成物では、筋肉内、皮下または皮内経路投与での送達が最も一般的である。一般的に、ワクチンは、中和抗体の製造と保護に有効な用量を皮下、皮内、または筋肉内投与できる。ワクチンは投与製剤に適した方法で、予防上および／または治療上有効な量を投与する。投与量は通常用量で０．０５〜１００μｇの範囲の各不活化ウイルス株であるが、治療される患者、抗体を合成する患者の免疫系の能力、および所望の防御レベルに依存する。正確なワクチンの投与量は、開業医の判断に任せてよく、各患者に固有であってよい。
【００７３】
ワクチンは用量スケジュールを組んで投与可能で、また好ましくは反復投与スケジュールをつくり、予防接種の基本的コースでは１〜１０回投与し、その後免疫応答の持続または強化に必要な後続の時間間隔で別の用量を投与する。例えば、１〜４ヶ月で２番目の用量を、さらに必要なら数ヶ月または数年後に後続の用量を投与することもできる。また、投与計画の少なくとも一部は個人の要求に応じて決定され、また開業医の判断に依存している。適切な免疫スケジュールの例には、第一回目の用量、続いて７日〜６ヶ月の間に２回目の用量、および任意選択として、最初の免疫接種後１ヶ月〜２年の間の３回目の用量、または、防御免疫を付与するウイルス中和抗体価を誘発するのに十分な他のスケジュール、例えば、定着した小児科ワクチンスケジュールに相当するよう選択されたスケジュール、が挙げられる。１〜３接種を含む免疫の基本的コースの後に、不活化デング熱ウイルスワクチンによるデング熱に対する防御免疫の生成が十分に期待できる。これは防御免疫の良好レベル維持のため計画された間隔（例えば、２年ごと）の追加免疫により補強可能である。
【００７４】
実施例
実施例Ｉ−精製不活化デング熱ウイルス（１μｇおよび１０μｇ）とアルミニウム不含アジュバントを含む代表的免疫原性組成物の免疫原性
１５匹の未処置成熟雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス群に２種の用量のデング２型（Ｄｅｎ−２）株の精製不活化ウイルス（ＰＩＶ）を含む代表的ワクチン候補の筋肉内ワクチン接種を行った。ワクチンは合計５０μｌの容量で投与した。マウスはデング熱ＰＩＶ単独を含む製剤、またはＡｌｕｍ（水酸化アルミニウム）、水酸化アルミニウム上に吸着した３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（ＡＳ０４Ｄ）、水中油型乳剤（ＡＳ０３Ａ）、およびリポソーム製剤に入れた３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１（ＡＳ０１Ｂ）（下記表１の群参照）をアジュバントとして添加したデング熱ＰＩＶワクチンを含む製剤で免疫化した。ＡＳ０３ＡおよびＡＳ０１Ｂは、アルミニウム（ａｌｕｍ）不含アジュバントの非限定的な２つの例である。製剤用に使われたデング熱ＰＩＶ抗原は基本的に本明細書に記載された方法で、野生型Ｄｅｎ−２ウイルスの培養物を、０．１８５％のホルマリンで７日間、２２℃で不活化して得た精製バルクである。
【００７５】
本明細書の実施例全てについて、ＵＮＩＳＴＡＴを使って接種後のＣＤ４＋頻度と中和力価に関する統計分析を行った。分散分析に適用したプロトコルを簡単に記述すると、データの対数変換、各集団（群）に対しシャピロ−ウイルク検定を行い群の分布の正規性を検証、コクラン検定を行い異なる集団（群）間の分散の均一性を検証、選択されたデータに対し分散分析、一元配置分散分析における相互作用検定、および多重比較のためのテューキーＨＳＤ検定である。
【表１】
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【００７６】
液性免疫応答を最初の免疫後２１日目（Ｄａｙ ０に設定）と２回目の免疫後（Ｄａｙ ２１）、すなわち、免疫後２１日目と４２日目、に測定した。血清サンプルを抗デング熱中和アッセイを使って試験した。簡単に述べれば、デング熱ウイルスに対するマウス血清中和力価を測定するため、濾過して加熱不活性化した血清を固定量の単一特異性デング熱ウイルス（デング２型）と共にインキュベートした。次いで、血清とウイルスの混合物をベロ細胞単層（ＷＨＯセルバンクから入手）に添加し４日間インキュベートした。血清サンプルによるウイルス感染抑制をＥＬＩＳＡを使って測定し、９６ウエルマイクロプレートに接着したベロ細胞上の細胞結合型ウイルス抗原を検出した。得られた光学密度の読み値を自動処理によりエクセル表計算シートに取り込み、対数中間点線形回帰プログラムモデルを使ってウイルスの感染減少率パーセント（マイクロ中和試験５０パーセント減少率、またはＭＮ５０と呼ぶ）を算出した。ウイルスの中和力価（ＭＮ５０）は、血清が無いウイルス用量対照（ＴＶ）と比較して、アッセイの吸光度の読み取り値が５０％減少する血清希釈値の逆数として定義している。
【００７７】
中和抗体価はｄａｙ ２１の各群に対しプールした血清、およびｄａｙ ４２の各血清で測定した。結果を図１に示した。試験した両方の用量（１および１０μｇ総タンパク質量）に対し同じ免疫学的特性が観察された。中和抗体価は、１μｇまたは１０μｇデング熱ＰＩＶワクチンを２回投与後、一回量の組成物投与後の応答に比べて改善された。試験した２つの用量のデング熱ＰＩＶワクチンの中で、アジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンに比べ有意に低い中和抗体応答が、アジュバント無添加ワクチンで観察された（ｐ＜０．００００１）。１０μｇの総タンパク質用量に関し、ＡＳ０４Ｄアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンは、ａｌｕｍ単独アジュバント（ＡＳ２２Ａ）添加のデング熱ＰＩＶワクチンの応答に比べ、有意に高い中和抗体応答を誘導した（ｐ＝０．００２７）。１μｇの総タンパク質量では、これら２つのアジュバント間に差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。図１に示すように、ＡＳ０４ＤまたはＡＳ２２Ａを添加した組成物よりも、アルミニウム不含アジュバントを添加した組成物（ＡＳ０３Ａ（ｐ＜０．０１７３）またはＡＳ０１Ｂ（ｐ＜０．０００１））は、有意に高い中和抗体応答を誘導した。ＡＳ０３ＡおよびＡＳ０１Ｂアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンは、同等レベルの中和抗体価を誘導した（ｐ＞０．０５）。
【００７８】
デング熱ＰＩＶの１または１０μｇ総タンパク質用量で、アルミ含有アジュバント（例えば、ＡＳ２２ＡまたはＡＳ０４Ｄ）と組み合わせた同じ抗原により誘導される応答と比較して、アルミニウム不含アジュバント系（本明細書で示されたＡＳ０３ＡまたはＡＳ０１Ｂの例で示されるように）を含む組成物で免役したマウスにおいて、より高い中和抗体価が観察されたことをこれらの結果が示している。
【００７９】
実施例ＩＩ−異なるアジュバント希釈度に対する精製不活化デング熱ウイルス（１μｇおよび１０μｇ）とアルミニウム不含アジュバントを含む代表的免疫原性組成物の免疫原性
１５匹の未処置成熟雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス群に２種の用量の代表的デング熱ＰＩＶワクチンを合計５０μｌの容量で筋肉内投与した。マウスはデング熱ＰＩＶ単独を含む製剤、またはＡｌｕｍ（ＡＳ２２Ａ、水酸化アルミニウム）を含むアジュバント、または異なるアジュバント系の希釈物、例えば、ＡＳ０４Ｄの標準用量の１／２（ＡＳ０４Ｄ／２）、ＡＳ０３Ｂ（５、９３ｍｇのトコフェロールを含む水中油型乳剤ベースアジュバント系）、およびＡＳ０１Ｅ（ＡＳ０１Ｂの半分の用量）（表２に詳細記載）、を添加したデング熱ＰＩＶ抗原を含む製剤で免疫化した。製剤用に使われたＰＩＶは、野生型Ｄｅｎ−２ウイルスの培養物を、０．１８５％のホルマリンで７日間、２２℃で不活化して得た精製バルクである。
【表２】
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【００８０】
免疫に対する液性免疫応答を最初と２回目の免疫後２１日目（最初の免疫後２１日目と４２日目）に１５マウス／群について測定した。血清サンプルを前述の中和アッセイを使って試験した。
【００８１】
２１日目のプール血清での群当たりの中和抗体価、および４２日目のそれぞれの血清による群当たりの中和抗体価を図２に示す。同じ免疫学的特性が試験した両方の用量（１および１０μｇ総タンパク質量）で観察された。デング熱ＰＩＶ抗原の１μｇまたは１０μｇの一回投与のみの誘導応答に比べ、免疫原性組成物の２回投与後の方が、より高い中和抗体価が観察された。試験した２つの用量のデング熱ＰＩＶワクチンの中で、アジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンに比べ、アジュバント無添加ワクチンで、有意に低い中和抗体応答が観察された（ｐ＜０．００００１）。１μｇ総蛋白用量で、ＡＳ０４Ｄ／２のアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンは、ａｌｕｍ含有アジュバント単独添加デング熱ＰＩＶワクチンにより誘導された応答と同等の中和抗体応答を誘導した（ｐ＞０．０５）。試験した同じワクチン用量に関し、ＡＳ０３ＢまたはＡＳ０１Ｅのアジュバント添加デング熱ＰＩＶワクチンは、ＡＳ０４Ｄ（ＡＳ０３Ｂに対してｐ＜０．０２９およびＡＳ０１Ｅに対してｐ＜０．００００１）またはａｌｕｍ（ＡＳ０３Ｂに対してｐ＜０．００３５およびＡＳ０１Ｅに対してｐ＜０．００００１）のアジュバント添加ワクチンに比較して、有意に高い中和抗体価を誘導した。
【００８２】
結論として、１または１０μｇ総タンパク質用量のデング熱ＰＩＶ抗原で、アルミニウム含有アジュバント（ＡＳ２２ＡまたはＡＳ０４Ｄ／２）を添加した同じ抗原により誘導された応答に比べ、希釈したアルミニウム不含アジュバント系（ＡＳ０３ＢまたはＡＳ０１Ｅ）を添加した組成物で免役したマウスにおいて、より高い中和抗体価が観察された。
【００８３】
実施例ＩＩＩ−異なるアジュバント希釈度に対する精製不活化デング熱ウイルス（２μｇおよび２００ｎｇ）とアルミニウム不含アジュバントを含む代表的免疫原性組成物の免疫原性
２５匹の成熟雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス群に２種の用量の代表的デング熱ＰＩＶワクチン合計５０μｌの容量を筋肉内投与して免疫した。マウスに対しデング熱ＰＩＶ単独を含む製剤、またはＡｌｕｍ（ＡＳ２２Ａ、水酸化アルミニウム）を含むアジュバント、または異なるアジュバントの希釈物、例えば、ＡＳ０４Ｄ（ＡＳ０４Ｄ／２）、ＡＳ０３Ｂ（５、９３ｍｇのトコフェロールを含む水中油型乳剤ベースアジュバント系）、およびＡＳ０１Ｅ（ＡＳ０１Ｂの半分の用量）（表３に群の詳細記載）を添加したデング熱ＰＩＶ抗原を含む製剤で免疫した。製剤用に使われたＰＩＶは、野生型Ｄｅｎ−２ウイルスの培養物を、０．１８５％のホルマリンで７日間、２２℃で不活化して得た精製バルクである。
【表３】
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【００８４】
免疫原性組成物投与に対する液性免疫応答を最初と２回目の免疫後１４日目（それぞれ最初の免疫後１４日目と２８日目）に１５マウス／群について測定した。血清サンプルを前述の中和アッセイを使って評価した。
【００８５】
免疫後７日目に各群から１０匹のマウスが屠殺され、それぞれ２つの脾臓からなる５つのプールを使ってＩＣＳにより細胞性免疫応答を評価した。ＡＳ０４Ｄ／２、ＡＳ０３Ｂ、ＡＳ０１Ｅのアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチン２μｇで免疫したマウスとアジュバント無添加ワクチンまたはＡＳ２２Ａ（１〜５群）のアジュバント添加ワクチンの２００ｎｇで免疫したマウス、およびＰＢＳ（９群）を受けたマウスに対してのみＣＭＩを評価した。１５匹の他のマウスの血清を最初の免疫後の１４日目（ｄａｙ １４）および２回目の免疫後の１４日目（ｄａｙ ２８）に集めた。
【００８６】
最初の免疫後１４日目（ｄａｙ １４）のプールした血清による群当たりの中和抗体価および２８日目（ｄａｙ ２８）のそれぞれの血清による群当たりの中和抗体価を測定した。この結果を図３に示す。２μｇまたは２００ｎｇのデング熱ＰＩＶワクチン２回投与の場合、一回投与後の力価に比べ高い中和抗体価が観察された。アジュバント無添加製剤に比較し、アジュバント添加したデング熱ＰＩＶ製剤において有意に高い中和抗体応答が観察された（ｐ＜０．００８９）。２００ｎｇのデング熱ＰＩＶ用量について、ＡＳ２２ＡまたはＡＳ０４Ｄ／２を添加した同じ抗原製剤による誘発に比べ、ＡＳ０３ＢおよびＡＳ０１Ｅのアジュバントを添加した製剤で実質的に、より高い中和抗体応答を誘発した。
より低い２００ｎｇ総タンパク質用量で、ＡＳ２２ＡおよびＡＳ０４Ｄ／２のアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶは、同等の中和抗体応答を誘導した（ｐ＞０．０５）。より高い２μｇ総タンパク質用量で、ＡＳ０４Ｄ／２添加の製剤は、ＡＳ０３Ｂのアジュバントを添加したワクチンと同等の中和抗体価を誘導した（ｐ＞０．０５）。しかしながら、低い抗原用量（２００ｎｇ）では、ＡＳ０３Ｂを添加した製剤がＡＳ０４Ｄ／２添加よりも有意に高い中和抗体価を誘発した（ｐ＝０．００１２）。興味深いことに、ＡＳ０１Ｅのアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶが他の全ての群に比較して優位に高い中和抗体価を誘導した（ｐ＜０．００２８）。
【００８７】
前述の希釈アジュバントと組み合わせたデング熱ＰＩＶの２回の投与に続いて細胞性免疫応答も評価した。２回目の免疫の７日後（Ｄａｙ ２１）ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン応答をＩＣＳにより評価した（図４）。
【００８８】
アジュバント無添加デング熱ＰＩＶワクチンにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答が、他の全ての群に比べ低かった（ｐ＜０．００１）。ＡＳ０１Ｅのアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶで免疫したマウスは、他の全ての群に比較して最も高いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導した（ｐ＜０．００００１）。ＡＳ２２Ａ、ＡＳ０４Ｄ／２およびＡＳ０３Ｂのアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンで得られたＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、統計的に差が無かった（ｐ＞０．０５）。
【００８９】
結論として、水酸化アルミニウム（ＡＳ２２Ａ）のアジュバントを添加したデング熱ＰＩＶワクチンに比べ、より高い中和抗体価がａｌｕｍ（ＡＳ０３ＢまたはＡＳ０１Ｅ）を含まないアジュバント系を添加した当該ワクチンを免役したマウスで観察された。注目すべきは、ａｌｕｍ含有アジュバント、ＡＳ２２Ａを添加したデング熱ＰＩＶワクチンに比べ、ＡＳ０１Ｅのアジュバント添加した当該ワクチンでより高い中和抗体応答とＣＤ４＋Ｔ細胞応答が誘導されたことである。
【００９０】
要約すると、ａｌｕｍ含有アジュバント（ＡＳ２２Ａ、ＡＳ０４ＤまたはＡＳ０４Ｄ／２）で製剤したデング熱ＰＩＶで免疫したマウスに比べ、アルミニウム不含アジュバント系（例えば、アルミニウムを含まないＡＳ０１ＢまたはＡＳ０１Ｅ）で製剤したワクチンで免疫したマウスで、実質的により高い中和抗体応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答が誘発された。これらの結果は、ａｌｕｍ不含アジュバントで処方されたデング熱ＰＩＶワクチンの好ましい免疫特性を実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月21日(2015.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デング１型ウイルス抗原、デング２型ウイルス抗原、デング３型ウイルス抗原およびデング４型ウイルス抗原からなる群から選択される少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原、ならびに、水中油型乳剤を含むアジュバントおよび３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とＱＳ２１との組み合わせを含むアジュバントからなる群から選択されるアルミニウム不含アジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原がデング熱２型ウイルス抗原である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの不活化デング熱ウイルス抗原が完全に死滅したウイルスである、請求項１または請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントが水中油型乳剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、代謝可能油、トコールおよび乳化剤を含む水中油型乳剤キャリアを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記代謝可能油がスクアレンである、請求項４または５記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記トコールがαトコフェロールである、請求項５または６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記乳剤が非イオン性界面活性剤乳化剤を含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン ソルビタン モノオレエートである、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
スクアレンおよびαトコフェロールを１以下の比率で含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントが、
約２％〜約１０％のスクアレン、
約２％〜約１０％のαトコフェロール、
約０．３％〜約３％のポリオキシエチレン ソルビタン モノオレエート
を含む用量に処方されてなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、
約１０ｍｇ〜約１２ｍｇのスクアレン、
約１０ｍｇ〜約１２ｍｇのαトコフェロール、
約４ｍｇ〜約６ｍｇのポリオキシエチレン ソルビタン モノオレエート
を含む用量に処方されてなる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントが、
１０．６８ｍｇのスクアレン、
１１．８６ｍｇのトコフェロール、
４．８５ｍｇのポリオキシエチレン ソルビタン モノオレエート
を含む用量に処方されてなる、請求項１１または１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントが分割量で処方されてなる、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記アジュバントが３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）およびＱＳ２１の組み合わせを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントが３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１をリポソーム製剤として含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントがさらにコレステロールを含む、請求項１５または１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントがさらに１、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記アジュバントがコレステロール、ＤＯＰＣ、３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記アジュバントが、
約０．１〜約０．５ｍｇのコレステロール、
約０．２５〜約２ｍｇのＤＯＰＣ、
約１０μｇ〜約１００μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、および
約１０μｇ〜約１００μｇのＱＳ２１
を含む用量で処方されてなる、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
コレステロールのＱＳ２１に対する比率が５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
コレステロールのＱＳ２１に対する比率が１：１（ｗ／ｗ）である、請求項１５〜２０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記アジュバントが、
約０．２５ｍｇのコレステロール、
約１．０ｍｇのＤＯＰＣ、
約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、および
約５０μｇのＱＳ２１
を含む用量で処方されてなる、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
デング熱ワクチンを製造する方法であって、
少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原を用意し、かつ、
少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原をアルミニウム不含アジュバントと共に処方すること
を含む、方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの精製不活化デング熱ウイルス抗原が、ホルムアルデヒド、ベタプロピオラクトン（ＢＰＬ）、過酸化水素、紫外線照射およびγ線照射の群から選択される作用因子に生のウイルスを接触または露出させる１つまたは複数の工程により不活化されてなる完全に死滅したウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
医薬として用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【外国語明細書】
2015221803000001.pdf