(57)【要約】【課題】本発明は、生成する細胞集合体のサイズを制御して同一系内で培養できるとともに、培養後に特定のサイズを有するものを選択的に回収するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、第１の細胞培養室と第２の細胞培養室を有する細胞培養基材であって、第１の細胞培養室と第２の細胞培養室は、互いに隣接し、通孔を有する隔壁によって隔てられており、第１の細胞培養室の底部に、細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域の第１のパターンが形成され、第２の細胞培養室の底部に、細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域の第２のパターンが形成され、隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満であり、第１のパターンにおける細胞接着領域の面積が、第２のパターンにおける細胞接着領域の面積より小さい、または第１のパターン形状が、第２のパターン形状と異なる前記細胞培養基材に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の細胞培養室と第２の細胞培養室を有する細胞培養基材であって、
第１の細胞培養室と第２の細胞培養室は、互いに隣接し、通孔を有する隔壁によって隔てられており、
第１の細胞培養室の底部に、細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域の第１のパターンが形成され、
第２の細胞培養室の底部に、細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域の第２のパターンが形成され、
隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満であり、
第１のパターンにおける細胞接着領域の面積が、第２のパターンにおける細胞接着領域の面積より小さい、または第１のパターン形状が、第２のパターン形状と異なる、
前記細胞培養基材。
【請求項２】
隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さが１０μｍ以上である、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さが５０μｍ以下である、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
細胞接着領域が、刺激により細胞非接着性に変化する刺激応答性領域である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項５】
細胞接着領域が、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクルアミドの層を有する領域である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項６】
細胞を培養する方法であって、
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材を準備する工程、
細胞培養基材の細胞培養室の少なくとも１つに細胞を播種する工程、
各細胞培養室において細胞シートを形成する工程、
各細胞培養室において細胞シートを剥離する工程、および
各細胞培養室から細胞シートをそれぞれ回収する工程
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学研究、医学研究、臨床検査等、細胞培養を伴う技術分野に用いられる、細胞培養基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から細胞生物学の分野では細胞培養が不可欠である。近年、幹細胞研究や再生医療研究が盛んになるに伴い、ますます細胞培養の技術開発の重要性が高まっている。
【０００３】
細胞集合体として、細胞をシート状に培養し、トリプシンなどの酵素を使用せずに温度を低下させるだけで細胞をシート状に回収する「細胞シート工学」という技術が再生医療分野で注目されている。細胞シート工学によって得られる細胞シートは角膜や歯周組織などの再生医療で既に一定の治療効果も確認され欧州で既に臨床研究や治験が進められている。しかし、細胞シートを含め、サイズの異なる細胞集合体を同一系内で培養した場合の相互作用の効果については、検証が進んでいない。また、サイズの異なる細胞集合体を同一系内で培養した後に特定のサイズを有するものを選択的に回収する手段も知られていない。
【０００４】
特許文献１には、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子であるサイトカインを産出する物質と、細胞とをセルカルチャーインサートを用いて同一系内で培養することが記載されている。また、ＥＳ細胞においては、細胞集合体のサイズによって分化する細胞が異なることが報告されている（非特許文献１）。しかし、特許文献１の方法では、細胞集合体のサイズを制御して同一系内で培養すること、培養後に特定のサイズを有するものを選択的に回収することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２８４８１９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Stem Cell Research, Volume 2, Issue 2, March 2009, Pages 155-162
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生成する細胞集合体のサイズを制御して同一系内で培養できるとともに、培養後に特定のサイズを有するものを選択的に回収するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、２以上の細胞培養室を有する細胞培養基材を用い、それぞれの細胞培養室にサイズまたは形状の異なる細胞接着領域を形成し、通孔を有する隔壁で仕切り、単一の細胞や細胞分泌物は隔壁の通孔から細胞培養室間を行き来できるが、細胞接着領域上に形成され剥離した細胞集合体は隔壁の通孔を通過できないようにすることで、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１０】
（１）第１の細胞培養室と第２の細胞培養室を有する細胞培養基材であって、
第１の細胞培養室と第２の細胞培養室は、互いに隣接し、通孔を有する隔壁によって隔てられており、
第１の細胞培養室の底部に、細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域の第１のパターンが形成され、
第２の細胞培養室の底部に、細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域の第２のパターンが形成され、
隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満であり、
第１のパターンにおける細胞接着領域の面積が、第２のパターンにおける細胞接着領域の面積より小さい、または第１のパターン形状が、第２のパターン形状と異なる、
前記細胞培養基材。
（２）隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さが１０μｍ以上である、（１）に記載の細胞培養基材。
（３）隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さが５０μｍ以下である、（１）または（２）に記載の細胞培養基材。
（４）細胞接着領域が、刺激により細胞非接着性に変化する刺激応答性領域である、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養基材。
（５）細胞接着領域が、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクルアミドの層を有する領域である、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養基材。
（６）細胞を培養する方法であって、
（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養基材を準備する工程、
細胞培養基材の細胞培養室の少なくとも１つに細胞を播種する工程、
各細胞培養室において細胞シートを形成する工程、
各細胞培養室において細胞シートを剥離する工程、および
各細胞培養室から細胞シートをそれぞれ回収する工程
を含む前記方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、生成する細胞集合体のサイズを制御して同一系内で培養できるとともに、培養後に特定のサイズを有するものを選択的に回収することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態の上面図を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態の断面図を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一実施形態において、本発明の細胞培養基材は、例えば図１および図２に示すように、
第１の細胞培養室１と第２の細胞培養室２を有し、
第１の細胞培養室１と第２の細胞培養室２は、互いに隣接し、通孔３を有する隔壁４によって隔てられており、
第１の細胞培養室１の底部５に、細胞接着領域６とそれを囲む細胞非接着領域７の第１のパターンが形成され、
第２の細胞培養室２の底部５に、細胞接着領域６とそれを囲む細胞非接着領域７の第２のパターンが形成され、
隔壁４の通孔３の外縁によって画定される面の最大長さは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域６の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満であり、
第１のパターンにおける細胞接着領域の面積が、第２のパターンにおける細胞接着領域の面積より小さい、または第１のパターン形状が、第２のパターン形状と異なるという特徴を有する。
【００１４】
細胞培養基材は、第１および第２の細胞培養室に加えて、少なくとも第１および第２のパターンのいずれかとは細胞接着領域の面積および／または形状において異なるパターンをその底部に有する更なる細胞培養室を有していてもよい。
【００１５】
本発明では、互いに隣接した細胞培養室の底部において、面積および／または形状の異なる細胞接着領域を有するパターンを形成することにより、同一の細胞培養基材において、面積および／または形状の異なる細胞シートを容易に形成することができる。また、互いに隣接した細胞培養室が、所定の大きさの通孔を有する隔壁で隔てられており、剥離した細胞シートは細胞培養室間を行き来できないことから、隣接した細胞培養室で形成された細胞シートを同時に剥離したとしても、異なる細胞培養室の細胞シート同士が混ざることがなく、目的のサイズおよび／または形状を有する細胞シートを選択的に回収することができる。
【００１６】
第１のパターン形状が、第２のパターン形状と異なるとは、例えば、第１および第２のパターンの外縁によって画定される面の形状が互いに異なる場合、第１および第２のパターンの外縁によって画定される面の形状は同一であるが、内角の角度、または辺、長軸もしくは短軸方向の長さ等の寸法が互いに異なる場合、あるいは、第１および第２のパターンの外縁によって画定される辺の数または頂点の形状が異なる場合をさす。
【００１７】
一方、細胞から分泌されるサイトカインなどの成分は、隔壁を通過できることから、第１の細胞培養室で形成された細胞シートを、第２の細胞培養室で形成されたサイズの異なる細胞シートから分泌される成分に接触させることができ、その成分の影響の有無を試験することができる。例えば、ＥＳ細胞においては、細胞集合体のサイズによって分化する細胞が異なることが報告されていることから分泌成分も異なってくると考えられ、その影響の有無を試験することもできる。ひいては、特定の細胞シートを、それとは異なるサイズを有する細胞シートの分泌成分の影響下で培養するとともに、特定の細胞シートを選択的に回収する系を設計することができる。
【００１８】
第１および第２の細胞培養室の底部に形成される細胞接着領域は、細胞接着性を発現している領域である。そして、第１および第２の細胞培養室において、細胞接着領域は、細胞非接着領域に囲まれており、それぞれ第１および第２のパターンを形成している。細胞非接着領域は、細胞非接着性を発現している領域である。細胞接着性を発現しているとは、細胞が接着、伸展しやすく、細胞接着伸展率が高い状態、具体的には、細胞接着伸展率が６０％以上、好ましくは８０％以上である状態をいう。また、細胞非接着性を発現しているとは、細胞が接着、伸展しにくく、細胞接着伸展率が低い状態、具体的には、細胞接着伸展率が５％以下、好ましくは２％以下である状態をいう。
【００１９】
細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内でたとえば、ウシ血管内皮細胞を播種し、３７℃インキュベーター内(ＣＯ２濃度５％)に保管し、３時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））を表す。
【００２０】
細胞接着領域は、細胞非接着領域に囲まれて、一定の面積および／または形状を有する領域を形成する。好ましくは、各細胞培養室には、細胞非接着領域に囲まれた細胞接着領域が、複数存在する。換言すれば、各細胞培養室には、複数の隔離された細胞接着領域および各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域のパターンが形成される。同じ細胞培養室に複数隔離して形成される細胞接着領域のパターンは、同じ面積および形状を有することが好ましい。同じ細胞培養室内で形成される細胞シートは同時に回収されるため、同じサイズの細胞シートを選択的に回収できるからである。
【００２１】
一方、異なる細胞培養室に形成される細胞接着領域のパターンは、異なる面積および／または形状を有する。すなわち、第１のパターンにおける細胞接着領域の面積は、第２のパターンにおける細胞接着領域の面積より小さい。さらに／あるいは、第１のパターン形状は、第２のパターン形状と異なる。それにより、特定の細胞シートを、それとは異なるサイズおよび／または形状を有する細胞シートの分泌成分の影響下で培養することができる。
【００２２】
細胞非接着領域に囲まれた各細胞接着領域の面積は、特に制限されず、培養する細胞の種類に応じて適宜設定されるが、例えば、１０００μｍ２〜５００００００μｍ２、好ましくは２５００μｍ２〜１００００００μｍ２の範囲となるようパターン形成される。
【００２３】
各細胞接着領域の形状は特に制限されないが、四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等であることができる。四角形のものが好ましく、一辺が３０μｍ〜１０００μｍの範囲の四角形、特に正方形の形状が特に好ましい。また、半径が１５μｍ〜５００μｍの円形も好ましい。１つの細胞培養室において、複数存在する細胞接着領域は、同じ形状を有することが好ましいが、異なる形状が混在していてもよい。
【００２４】
各細胞接着領域は、細胞非接着領域に囲まれて互いに隔離されているが、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上互いに離れて配置される。すなわち、細胞接着領域間の最短距離が好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上となるように配置される。ここで、細胞接着領域間の最短距離とは、隣り合う細胞接着領域間の隙間の最小距離のことである。細胞接着領域間の最短距離が短いと、隣り合う細胞接着領域に接着した細胞同士が凝集してしまい機能が低下することがあるため好ましくない。
【００２５】
各細胞培養室の底部における細胞接着領域の割合は、通常５〜７０％、好ましくは１０〜５０％、より好ましくは２０〜４０％である。また、各細胞接着領域は、規則的に一定の間隔で、例えば格子状に配置されていることが好ましい。細胞接着領域が不均一だと、細胞が多い場所では培地中の栄養成分が足りなくなって細胞が死滅する可能性があるため好ましくない。
【００２６】
第１の細胞培養室と第２の細胞培養室を隔てる隔壁は通孔を有し、通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満である。第１と第２の細胞培養室を隔てる隔壁の通孔は、各細胞培養室の細胞接着領域に形成された細胞シートを剥離したものが、通過することができず、別の細胞培養室に移動しないような大きさを有する。したがって、別々の細胞培養室において剥離された細胞シートが互いに混ざり合うことがなく、選択的な回収が可能である。各細胞培養室における細胞接着領域の面積および／または形状を制御することにより、得られる細胞シートの面積および／または形状を制御すれば、特定の面積および／または形状を有する細胞シートを、各細胞培養室から選択的に回収することができる。
【００２７】
一方、隔壁の通孔は、細胞から分泌されるサイトカイン等のタンパク質成分を通過させることが可能な大きさを有することが好ましい。それにより、第１の細胞培養室で形成された細胞シートにより分泌された成分を、第２の細胞培養室で培養される細胞に作用させることが可能になる。逆も同様である。また、隔壁の通孔は、単一の細胞を通過させることが可能な大きさを有することが好ましい。複数の細胞培養室で同種の細胞を培養しようとする場合は、１つの細胞培養室に細胞を播種するだけで、別の細胞培養室にも細胞が分散するため、各細胞培養室にそれぞれ細胞を播種する必要がなくなり、作業を効率化することができる。
【００２８】
隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さとは、隔壁の通孔の外縁によって画定される面の重心を通過する該面と平行な直線における、該直線と該通孔の外縁との一方の交点から他方の交点までの長さのうち、最大のものをさす。通孔の外縁によって画定される面の形状は特に制限されないが、例えば、四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等とすることができる。通孔の外縁によって画定される面が円形である場合、該面の最大長さは円の直径をさす。隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満である。第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さとは、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の重心を通過する該面と平行な直線における、該直線と該細胞接着領域の外縁との一方の交点から他方の交点までの長さのうち、最小のものをさす。細胞接着領域の外縁によって画定される面の形状は特に制限されないが、例えば、四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等とすることができる。細胞接着領域の外縁によって画定される面が円形である場合、該面の最小長さは円の直径をさし、細胞接着領域の外縁によって画定される面が四角形である場合、該面の最小長さは短辺の長さをさす。細胞接着領域に形成された細胞シートは、剥離すると多少収縮するが、隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さが、第１のパターンおよび第２のパターンにおける細胞接着領域の外縁によって画定される面の最小長さの１／２未満であれば、細胞シートが隔壁の通孔を通過しないといえる。具体的には、隔壁の通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは３０μｍ以下である。
【００２９】
隔壁は、複数の通孔を有することが好ましく、例えば、ネットの形態であってもよい。複数の通孔を有することにより、タンパク質成分や単一細胞を別の細胞培養室に効率的に分散させることができる。タンパク質成分や単一細胞を通過させる観点から、通孔の外縁によって画定される面の最大長さは、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは１５μｍ以上である。
【００３０】
隔壁の材料は、培養液中に有害な溶出成分を放出しないものであれば特に制限されないが、成型しやすく穴を開けやすいものが好ましい。隔壁の厚みも特に制限されないが、薄い方が、細胞が隔壁の通孔に詰まるリスクが少なく好ましい。培養中に破れたり、成型部分が外れたりしない強度を有することが好ましい。
【００３１】
細胞接着領域とそれを囲む細胞非接着領域のパターンを有する細胞培養室に細胞を播種すると、細胞は細胞接着領域に接着し、一緒になって細胞シートを形成する。したがって、細胞シートは、細胞接着領域に接着している状態では、細胞接着領域とほぼ同じ面積と形状を有することになる。細胞シートは、細胞接着領域から剥離することにより回収することが可能になるが、通常、細胞シートは剥離により収縮する。収縮の割合は、培養する細胞により異なるが、例えば、細胞接着領域に接着している状態と比較して、面積が１５〜４０％になるまで収縮する場合がある。細胞シートは、典型的には細胞が単層で連結したシート状細胞培養物を指すが、これに限らず、複数層が積層された積層物でもよい。また、細胞接着領域の面積が小さく、形成される細胞集合体がシート状とはいえない場合であっても、本発明においては細胞が互いに連結している限り細胞シートに包含されるものとする。
【００３２】
細胞接着領域に接着した細胞シートを剥離する方法は、特に制限されず、当技術分野で公知の方法を使用できる。例えば、トリプシン等の酵素を用いる方法や、細胞接着領域を激応答性領域で形成する方法が挙げられる。剥離の際に、細胞シートへ与える損傷が少ないことから、細胞接着領域を激応答性領域とすることで、細胞を剥離することが好ましい。
【００３３】
刺激応答性領域は、刺激により細胞の接着性を変化させることにより培養する細胞の接着および剥離を行うことができるものである。刺激応答性領域は、好ましくは、特定の刺激により細胞の接着性が高い細胞接着性を発現している状態から、細胞の接着性が低い細胞非接着性を発現している状態に変化し得るものである。
【００３４】
刺激応答性領域に細胞を播種すると、細胞接着性を発現している際には細胞が刺激応答性領域に接着するが、細胞非接着性を発現している際には細胞の刺激応答性領域への接着が阻害されるため、接着していた細胞を剥離することができる。したがって、細胞接着性を発現している刺激応答性領域に細胞を播種して接着させ培養することにより細胞シートを形成し、特定の刺激により、刺激応答性領域を、細胞非接着性を発現している状態に変化させ、細胞シートを剥離回収することができる。播種した細胞は、細胞接着性を発現している刺激応答性領域に接着することから、刺激によって細胞を剥離した後に得られる細胞シートの形状は、刺激応答性領域のパターンの形状、すなわち平面形状を反映したもの、好ましくは略同一または略相似形となる。
【００３５】
刺激応答性領域は、刺激応答性材料の層をその表面に有する領域である。刺激応答性材料としては、刺激の有無により細胞の接着性が変化し、培養する細胞の接着および剥離を行うことができるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、温度、光、ｐＨ、電位および磁力によりそれぞれ細胞の接着性が変化する温度応答性材料、光応答性材料、ｐＨ応答性材料、電位応答性材料、および磁力応答性材料等を挙げることができる。本発明においては、なかでも、温度応答性材料であることが好ましい。
【００３６】
温度応答性材料は、温度変化により、細胞の接着性が変化するものであれば特に限定されるものではない。温度応答性材料の細胞接着性を発揮する温度領域が、１０℃〜４５℃の範囲内であることが好ましく、なかでも、３３℃〜４０℃の範囲内であることが好ましい。温度領域が上述の範囲内であることにより、細胞を安定的に培養することができるからである。温度応答性材料の細胞非接着性を発揮する温度領域が、１℃〜３６℃の範囲内であることが好ましく、なかでも、４℃〜３２℃の範囲内であることが好ましい。温度領域が上述の範囲内であることにより、細胞へのダメージの少ないものとすることができる。
【００３７】
温度応答性材料としては、具体的には、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、および、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等の温度応答性ポリマーを挙げることができ、なかでもＰＮＩＰＡＡｍ、ポリ−Ｎ−ｎ―プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドを好ましく用いることができ、特に、ＰＮＩＰＡＡｍを好ましく用いることができる。細胞接着性を有する温度領域および細胞非接着性を有する温度領域が上述の温度領域であり、ダメージの少ないものとすることができるからである。
【００３８】
温度応答性材料は１種類のみからなるものであってもよく、２種類以上含むものであってもよい。また、温度領域の調整をするため、温度応答性材料同士および／またはその他のポリマーと共重合したものを用いるものであってもよい。
【００３９】
光応答性材料としては、光照射の有無により細胞の接着性が変化するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、特開２００５−２１０９３６号公報に開示されるような、光触媒や、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギドおよびロイコ色素等の光応答成分を含むものを用いることができる。
【００４０】
電位応答性材料としては、電位の印加により、細胞の接着性が変化するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、特開２００８−２９５３８２号公報に開示されるような、電極と、ＲＧＤ配列を含むペプチド等の細胞接着性部分を有し、上記電極表面にチオレートを介して結合するアルカンチオール、システイン、アルカンジスルフィド等のスペーサ物質とを有するものを挙げることができる。
【００４１】
磁力応答性材料としては、磁力の付与・除去により細胞の接着性が変化するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、特開２００５−３１２３８６号公報に開示されるような、フェライト等の磁性粒子を正電荷リポソームに封入した磁性粒子封入正電荷リポソームを挙げることができる。
【００４２】
刺激応答性材料の層の膜厚としては、刺激応答性を発揮することができるものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内であることが好ましく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。また、刺激応答性材料の層の被覆量として、０．３〜６．０μｇ／ｃｍ２であることが好ましい。
【００４３】
刺激応答性材料の層の形成方法としては、特に限定されるものではない。具体的には、刺激応答性材料を含む組成物をスピンコート等の公知の塗布方法を用いて、細胞培養室の底部を構成する基材上に塗布する。基材上で刺激応答性領域のパターンを形成する方法としては、フォトリソグラフィー法によりパターニングする方法や、グラビア印刷やフレキソ印刷、スクリーン印刷、インクジェット法などの公知のパターン塗布法を用いてパターン状に塗布する方法を使用できる。貫通孔（スルーホール）を有するメタルマスク等を介して、パターン状に刺激応答性領域を電子線や紫外線処理することによって作製してもよい。刺激応答性材料が光触媒等の無機物のみからなるものである場合には、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。
【００４４】
細胞培養基材の形状は、互いに隣接する第１の細胞培養室と第２の細胞培養室、ならびに第１の細胞培養室と第２の細胞培養室を隔てる通孔を有する隔壁を有している限り特に限定されない。例えば、汎用の培養ディッシュのような底部と側壁を有する細胞培養容器に、通孔を有する隔壁を設置して、第１の細胞培養室と第２の細胞培養室を形成してもよい。通孔を有する隔壁をさらに設置することにより、さらなる細胞培養室を形成してもよい。隔壁の設置は、例えば、接着剤等を用いて接着することにより実施できる。その場合、細胞培養容器の底部が、各細胞培養室の底部を構成することになる。細胞培養室の底部、一実施形態においては細胞培養容器の底部を構成する基材は板状またはフィルム状とすることができる。細胞培養基材を構成する基材や隔壁等の各部材は、一体に形成されていてもよいし、別々に形成した後に組み合わせ、例えば接着剤等を用いて接着してもよい。
【００４５】
基材を構成する材料としては、金属、ガラス、セラミック、プラスチック、エラストマー等やこれらの複合材を用いることができるがこれらには限定されない。特に透明な材料が望ましい。細胞の顕微鏡観察を容易にするからである。金等の蒸着層も厚さ５０ｎｍ程度なら光透過性を有するので好適に用いることができる。プラスチックとしては、特に制限されないが、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等が挙げられる。
【００４６】
上記のような基材を構成する材料は、細胞非接着性であってもよく、その場合、その表面は細胞非接着領域となる。そのような基材上に細胞接着領域、好ましくは刺激応答性領域を形成すると、播種した細胞は、細胞非接着領域には接着せず細胞接着領域にのみ接着し、細胞接着領域のパターン形状と略同一または略相似形の細胞シートを形成することになる。そして、例えば、特定の刺激により刺激応答性領域を細胞非接着性に変化させることにより、形成された細胞シートを剥離して取得することができる。
【００４７】
培養する細胞の種類としては、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞を用いることができるが、接着性の細胞が好ましい。具体的には、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等を用いることができる。細胞は、一種類のみであってもよく、二種類以上用いるものであってもよい。細胞が由来する動物も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。
【００４８】
細胞培養基材に播種する細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。細胞を、通常の方法で予備培養して増殖させ、酵素処理することにより剥離および回収した上で播種することが好ましい。
【００４９】
本発明の細胞培養基材を用いた細胞培養法は、例えば、以下のように実施することができる。まず、細胞培養基材の細胞培養室の少なくとも１つに細胞を播種する。細胞培養室間を隔てる隔壁の通孔は、単一の細胞であれば通過させることができるため、細胞培養室の少なくとも１つに細胞を播種すれば、隔壁によって仕切られた別の細胞培養室にも細胞を分散させることができる。すべての細胞培養室にそれぞれ細胞を播種しても問題ない。細胞を播種した後、インキュベートすることにより、細胞を細胞接着領域に接着させ、各細胞培養室において面積または形状の異なる細胞シートを形成する。その際、細胞シートから分泌されるサイトカイン等のタンパク質を含む分泌成分は、隔壁の通孔を通過することができるため、特定の細胞培養室で形成された細胞シートから分泌された成分を、別の細胞培養室で培養される細胞に作用させることができる。また作用の有無を試験するために、本発明の細胞培養基材を用いることもできる。
【００５０】
続いて、細胞接着領域を刺激応答性領域で形成した場合は、温度等の刺激を付与することにより、細胞シートを剥離する。各細胞培養室において剥離された細胞シートは、隔壁の通孔を通過することができないため、別々の細胞培養室で形成された細胞シートが混ざり合うことはない。したがって、各細胞培養室から細胞シートをそれぞれ回収することにより、目的の細胞シートを選択的に回収することができる。
【符号の説明】
【００５１】
１：第１の細胞培養室
２：第２の細胞培養室
３：通孔
４：隔壁
５：細胞培養室の底部
６：細胞接着領域
７：細胞非接着領域
８：細胞シート
【図１】
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【図２】
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