(57)【要約】【課題】本発明は基板上にセレプターを整列化させ、斯かるレセプターに対して結合するリガンドを高感度に測定する事又は斯かるレセプターに結合するリガンドを高効率にスクリーニングすることを目的とする。【解決手段】基板、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子、及びＦｃ融合レセプターを備えるセンシング基板であって、基板が、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆され、更にＦｃ融合レセプターが、ＨＢｓＡｇタンパク質が有するＺＺタグを介して、ウイルス用粒子と結合してなるセンシング基板の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子、及びＦｃ融合レセプターを備えるセンシング基板であって、
基板が、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆され、更に
Ｆｃ融合レセプターが、ＨＢｓＡｇタンパク質が有するＺＺタグを介して、ウイルス用粒子と結合してなる、
センシング基板。
【請求項２】
ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる請求項１に記載のセンシング基板。
【請求項３】
ＦｃがヒトＩｇＧ由来である請求項１又は２に記載のセンシング基板。
【請求項４】
レセプターが、ＶＥＧＦレセプター、レクチンレセプター、プロラクチンレセプター、及びＴＮＦαレセプターからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜３の何れか１項に記載のセンシング基板。
【請求項５】
ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子が、ウイルス様粒子１モルにおけるＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質の含有量が１００〜１５０モルであるウイルス様粒子である、請求項１〜４の何れか１項に記載のセンシング基板。
【請求項６】
基板１ｃｍ２当たり０．１〜０．５ピコモルのウイルス様粒子で被覆されてなる、請求項１〜５の何れか１項に記載のセンシング基板。
【請求項７】
表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、エリプソメトリー法、蛍光偏光測定法、免疫電界効果トランジスター、レーザー比濁法、表面増強ラマン分光法、弾性表面波、及び共鳴超音波プロファイリングからなる群より選択される何れかの方法用である、請求項１〜６の何れか１項に記載のセンシング基板。
【請求項８】
ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子で被覆されてなる基板に、Ｆｃ融合レセプターを添加する工程を含む、センシング基板の製造方法。
【請求項９】
以下の工程を含むレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法；
（１）請求項１〜６の何れか１項に記載のセンシング基板に、該レセプターに対するリガンド候補物質を添加する工程、
（２）工程１によって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含むリガンドスクリーニング方法；
（Ａ）請求項１〜６の何れか１項に記載のセンシング基板に、該レセプターのリガンド候補物質を添加する工程、
（Ｂ）工程Ａによって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、エリプソメトリー法、蛍光偏光測定法、免疫電界効果トランジスター、レーザー比濁法、表面増強ラマン分光法、弾性表面波、及び共鳴超音波プロファイリングからなる群より選択される何れかの方法に供する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセンシング基板及びそれを用いたリガンドの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量物質の検出方法として、目的とする物質を直接もしくは基板上に固層化した抗体／抗原などを介して捕捉し、補足した目的物質の検出を、抗原抗体反応などを利用して蛍光や発色、発光などにより行う上記免疫学的方法、あるいは物質との結合を直接感知する表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、水晶発振子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、蛍光偏光測定法、免疫電界効果トランジスター、レーザー比濁法、表面増強ラマン分光法、弾性表面波、共鳴超音波プロファイリング等の原理に基づいたセンシング方法がある。
【０００３】
例えばＳＰＲ法に基づく方法は、金属（誘導体）界面に局在しながら界面に沿って伝搬する電磁波である表面プラズモンを利用し、物質が結合したときの金属表面での電荷密度波の変化を測定することで物質の結合力や量を測定する方法である。また、ＱＣＭは水晶発振子に設置した電極上に吸着した質量に比例して基本振動数が減少することを利用し、ピコグラムレベルで物質の結合量や結合と解離の速度が測定できる方法である
このようなセンシング方法では、目的とする物質を捕捉・認識可能な抗体やＦｃ融合タンパク質を基板上に整列化して結合させる手法が提唱されている（特許文献１〜４）。そして、これらの文献には、ウイルス様粒子として様々な自己組織化能を有するタンパク質を用いる技術、Ｆｃを認識するペプチドのアミノ酸配列等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−０９６６７７号公報
【特許文献２】特開２００８−１９１１４３号公報
【特許文献３】特開２００７−１２７６２６号公報
【特許文献４】特開２００７−１２１２７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術では、自己組織化能を有するタンパク質を含むウイルス様粒子をセンシング基板に適用し、抗体を整列化する技術が開発されているが、斯かるセンシング基板上にレセプターを整列化し、リガンドを定量又はリガンドスクリーニングを行う方法については何ら実証されていない。
【０００６】
また、センシング基板上でのリガンドーレセプターの結合反応に基づいた、リガンドの検出感度や、特定のレセプターに対するリガンド候補物質のスクリーニングがどの程度の精度で行うことができるかといった具体的な検討もなされていない。
【０００７】
このような背景技術に鑑みて、本発明は基板上にセレプターを整列化させ、斯かるレセプターに対して結合するリガンドを高感度に測定する事又は斯かるレセプターに結合するリガンドを高効率にスクリーニングすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、特定の自己組織化能を有するタンパク質とＦｃに対して結合能を有するペプチドを組み合わせて作製したウイルス様粒子によって基板を被覆し、更にＦｃ融合レセプターを適用することによって作製したセンシング基板のその基板上において、レセプターを整列化させ得ることを見出した。この様にして得られた基板、ウイルス様粒子及びＦｃ融合レセプターを備えるセンシング基板を用いる事によって、本来、レセプターを単独で用いた場合には得られなかった程度の高い感度又は広いダイナミックレンジをもってリガンドの測定ができることをも見出した。
【０００９】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様を広く包含するものである。
【００１０】
項１  基板、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子、及びＦｃ融合レセプターを備えるセンシング基板であって、基板がＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆され、更にＦｃ融合レセプターが、ＨＢｓＡｇタンパク質が有するＺＺタグを介してウイルス様粒子と結合してなる、センシング基板。
【００１１】
項２  ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる上記項１に記載のセンシング基板。
【００１２】
項３  ＦｃがヒトＩｇＧ由来である上記項１又は項２に記載のセンシング基板。
【００１３】
項４  レセプターが、ＶＥＧＦレセプター、レクチンレセプター、プロラクチンレセプター、及びＴＮＦαレセプターからなる群より選択される少なくとも１つである、上記項１〜項３の何れか１項に記載のセンシング基板。
【００１４】
項５  ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子が、ウイルス様粒子１モルにおけるＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質の含有量が１００〜１５０モルであるウイルス様粒子である、上記項１〜項４の何れか１項に記載のセンシング基板。
【００１５】
項６  基板１ｃｍ２当たり０．１〜０．５ピコモルのウイルス様粒子で被覆されてなる、上記項１〜項５の何れか１項に記載のセンシング基板。
【００１６】
項７  表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法、蛍光偏光測定法、免疫電界効果トランジスター、レーザー比濁法、表面増強ラマン分光法、弾性表面波、共鳴超音波プロファイリングからなる群より選択される何れかの方法用である、上記項１〜項６の何れか１項に記載のセンシング基板。
【００１７】
項８  ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆されてなる基板に、Ｆｃ融合レセプターを添加する工程を含む、センシング基板の製造方法。
【００１８】
項９  ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる上記項８に記載の製造方法。
【００１９】
項１０  ＦｃがヒトＩｇＧ由来である上記項８又は９に記載の製造方法。
【００２０】
項１１  レセプターが、ＶＥＧＦレセプター、レクチンレセプター、プロラクチンレセプター、及びＴＮＦαレセプターからなる群より選択される少なくとも１つである、上記項８〜項１０の何れか１項に記載の製造方法。
【００２１】
項１２  ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子が、ウイルス様粒子１モルにおけるＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質の含有量が１００〜１５０モルであるウイルス様粒子である、上記項８〜項１１の何れか１項に記載の製造方法。
【００２２】
項１３  ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆されてなる基板が、基板１ｃｍ２当たり０．１〜０．５ピコモルのウイルス様粒子で被覆されてなる、上記項８〜項１２の何れか１項に記載の製造方法。
【００２３】
項１４  以下の工程を含むレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法；
（１）上記項１〜６の何れか１項に記載のセンシング基板に、該レセプターに対するリガンド候補物質を添加する工程、
（２）工程１によって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程。
【００２４】
項１５  以下の工程を含むリガンドスクリーニング方法；
（Ａ）上記項１〜６の何れか１項に記載のセンシング基板に、該レセプターのリガンド候補物質を添加する工程、
（Ｂ）工程Ａによって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係るセンシング基板上には、レセプターを整列化させることができる。そして斯かるレセプターに対して結合し得るリガンドを高感度で又は広い範囲の濃度で検出することができる。
【００２６】
本発明に係るレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法によると、創薬、診断、研究分野におけるレセプターに対する標的分子の評価に有用であり、さらにウェットな環境下で測定し得る。
【００２７】
本発明に係るリガンドスクリーニング方法によると、高感度にレセプターアゴニスト、アンタゴニスト等のスクリーニングが達成し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係るセンシング基板の一態様を示す模式図。
【図２】実験例１のプロラクチンレセプターに対してプロラクチンを作用させた際のＱＣＭデータを示す図
【図３】各種リガンドのレセプターへの結合量を検討した実験結果を示す図。（Ａ）は、実験例１のプロラクチンレセプターに対してプロラクチンを作用させた際の結合量の変化を示すグラフ。（Ｂ）は、実験例２のＶＥＧＦレセプターに対してＶＥＧＦを作用させた際の結合量の変化を示すグラフ。（Ｃ）は、実験例３のレプチンレセプターに対してレプチンを作用させた際の結合量の変化を示すグラフ。（Ｄ）は、実験例４のＴＮＦαレセプターに対してＴＮＦαを作用させた際の結合量の変化を示すグラフ。（Ａ）〜（Ｄ）の全てにおいて、グラフの縦軸は各種リガンドの結合量（ｎｇ／ｃｍ２）を示し、グラフの横軸は各種リガンドの使用濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に本発明について詳細に説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。
【００３０】
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１２；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ５Ｅ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊｕｌｉａｎ  Ｌｅｗｉｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒａｆｆ；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １２／Ｅ（ＬＡＮＧＥ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ｂｙ  Ｂｅｒｔｒａｍ  Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｓｕｓａｎ  Ｍａｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｔｒｅｖｏｒ（Ｄｅｃ  １３，２０１１）等の文献を参照すればよい。
【００３１】
＜センシング基板＞
本発明に係るセンシング基板は、基板、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質、及びＦｃ融合レセプターを備える。
【００３２】
上記基板はＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆されており、更に上記Ｆｃ融合レセプターはＨＢｓＡｇタンパク質が有するＺＺタグを介してウイルス様粒子と結合している。
【００３３】
図１に本発明に係るセンシング基板の１つの態様の模式図を示す。模式図に示されるセンシング基板１は、基板２、ウイルス様粒子５、及びＦｃ融合レセプター６を備える。基板１は、ウイルス様粒子５によって被覆されている。またウイルス様粒子５は、ＺＺタグ３を有するＨＢｓＡｇタンパク質４を含む。更にＦｃ融合レセプター６は、ウイルス様粒子５に含まれるＨＢｓＡｇタンパク質４が有するＺＺタグ３を介してウイルス様粒子５に結合している。また、Ｆｃ融合レセプター６は、ウイルス様粒子５を介して基板２に結合していることになる。
【００３４】
本発明に係るセンシング基板にて用いる用語「被覆される」とは、例えば図１に示す模式図のように、基板全体が覆われる必要はなく、少なくとも基板１の一方の面がウイルス様粒子５によって部分的に覆われてもよい。
【００３５】
本発明に係るセンシング基板は、主として基板の片面に測定対象物質を滴下して用いるものであり、斯かる滴下面さえウイルス様粒子５によって覆われていればよい。
【００３６】
ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子による基板の被覆量は、特に限定はされないが、通常は基板１ｃｍ２当たり０．１〜０．５ピコモル程度とすればよい。より好ましくは０．２〜０．４ピコモル程度である。
【００３７】
本発明に係るセンシング基板において、Ｆｃ融合レセプターは基板上において整列化されていることが好ましい。整列化とは、例えば図１に示す本発明に係るセンシング基板の模式図では、Ｆｃ融合レセプター６の配向性が分子レベルで一様となっている状態を意味する。
【００３８】
特にレセプター８のレセプターに対するリガンド又はリガンド候補物質との結合部位が基板２から遠い方向に存在し、且つＦｃ融合レセプター６が、ウイルス様粒子５を介して基板２に結合している状態が好ましい整列化である。
【００３９】
このような整列化の状態は、公知の方法によって確認することができる。例えば、Ｉｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２（２０１０）  １４５５−１４６４に記載されたＡＦＭによる観察、Ｉｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２（２０１２）７９０に記載された高速ＡＦＭによる観察に等よって確認することができる。
【００４０】
ウイルス様粒子の形状は、特に限定はされないが、例えば球状、楕円球状、ラグビーボール状、略球状、フィラメント状等が挙げられる。また、これらの形状において、その内部は中空であっても液体で満たされていてもよく、カプシドのようにタンパク質で埋まっていても良い。
【００４１】
本発明に係るセンシング基板に備えられるウイルス様粒子は、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含む。ＨＢｓＡｇタンパク質がＺＺタグを有するとは、ＨＢｓＡｇタンパク質の末端領域にＺＺタグが付加された態様を示す。
【００４２】
ＨＢｓＡｇタンパク質とは、自己組織化能を有し、これと脂質二重膜を構成要素とすることで、上述のようなウイルス様粒子を形成する。
【００４３】
ＨＢｓＡｇタンパク質とは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原タンパク質であり、特に限定はされないが、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００４４】
ＺＺタグとは、後述するようなＦｃに特異的に結合する機能を有するポリペプチドである。具体的には、黄色ブドウ球菌等由来のプロテインＡが有するＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣドメインの配列の一部を含むＺドメインがタンデムに配置されたドメインである。
【００４５】
ＺＺタグのアミノ酸配列は特に限定はされないが、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列が挙げられる。
【００４６】
ＨＢｓＡｇタンパク質に対して付加されるＺＺタグの位置は、特に限定はされないが、ＨＢｓＡｇタンパク質が自己組織化することによって形成されたウイルス様粒子の外側の領域にあたる位置であればよい。例えばＨＢｓＡｇタンパク質が上述のような配列番号２に示すアミノ酸配列からなる場合、そのＮ末端側の領域にあたる位置にＺＺタグが付加されていればよい。
【００４７】
このようなＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質は、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
【００４８】
上述の具体的なアミノ酸配列は、ＨＢｓＡｇタンパク質であれば自己組織化能を、ＺＺタグであればＦｃドメインに対する結合能を、そしてＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質であれば自己組織化能に加えてＦｃドメインに対する結合能を減衰させない範囲に限って、変異導入されたアミノ酸配列であってもよい。具体的な変異導入数は、共に特に限定はされないが、通常は変異導入前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
【００４９】
なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等を包含する。具体的な変異導入については、公知の方法を採用することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。用語「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。
【００５０】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
なお、用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
【００５１】
ウイルス様粒子中のＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質の量は、特に限定はされないが、ウイルス様粒子１モルに対して通常は１００〜１５０モル程度のＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含んでいればよい。
【００５２】
上述のようなＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子は、公知の方法を用いて作製することができる。具体的には、特許文献１〜３に記載の方法を適宜改変して作成すればよい。
【００５３】
本発明に係るセンシング基板に備えられるＦｃ融合レセプターとは、Ｆｃが融合したレセプターである。Ｆｃ融合レセプターにおけるＦｃの融合位置は、レセプターのＣ末側の領域であってもＮ末側の領域であってもよいが、レセプターの他の生理活性分子との相互作用に寄与しないと考えられる領域にＦｃが融合していることが好ましい。Ｆｃの由来は特に限定はされないが、例えばヒトＩｇＧに由来するＦｃであることが好ましい。
【００５４】
ヒトＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のサブクラスが存在し、本発明においては特に限定はされないが、中でもＩｇＧ１が好ましい。
【００５５】
レセプターとは細胞膜又は細胞内小器官の膜に存在し、生体内において、サイトカイン、成長因子、表面抗原、レクチン、ホルモン、酵素、神経伝達物質、シグナル伝達関連物質、セカンドメッセンジャー、局所仲介物質、接触型シグナル分子等といった生理活性分子と特異的に結合し、斯かる結合によって細胞内にシグナル伝達が惹起されて細胞内にて生理的な変化をもたらすタンパク質分子、又は上記生理活性分子と結合し、細胞内小器官内で生理現象を惹起し得るタンパク質分子であれば特に限定はされない。
【００５６】
このようなレセプターとして、例えば七回膜貫通型レセプター、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）、セリン・スレオニンキナーゼ型レセプター、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、代謝型レセプター、グアニル酸シクラーゼレセプター、イオンチャネル型レセプター、核内レセプター小胞体膜レセプター、細胞表面レセプター、細胞内レセプター（核内レセプター）、ステロイドホルモンレセプター、甲状腺ホルモンレセプター、酵素共役型レセプター、嗅覚レセプター、プロテアーゼ活性化型レセプター（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３、ＰＡＲ−４等）、チロシンキナーゼ会合型レセプター、チロシンフォスファターゼレセプターが挙げられる。
【００５７】
より具体的には、ＴＧＦβレセプター（ＴＧＦＲ）、アクチビンレセプター（ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２等）、骨形成因子レセプター上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４等）、血小板由来増殖因子レセプター(ＰＤＧＦＲ)、神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ；ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ等）、インスリンレセプター、インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦＲ）、幹細胞因子レセプター、顆粒コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯＲ）、繊維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦＲ）、Ｆａｓ、各種ＣＤタンパク質、インターフェロンレセプター（ＩＦＮＲ）、各種インターロイキンレセプター、ニコチン性アセチルコリンレセプター、グリシンレセプター、グルタミン酸レセプター、グアニル酸シクラーゼレセプター、血管内皮細胞増殖因子レセプター（ＶＥＧＦレセプター）、レクチンレセプター、プロラクチンレセプター、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２等）、ＧＡＢＡレセプター、アンジオテンシンレセプター（ＡＴ１、ＡＴ２等）、アセチルコリンレセプター、アデノシンレセプター、アドレナリンレセプター、ドーパミンレセプター（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５等）、グルカゴンレセプター、ヒスタミンレセプター（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４等）、オピオイドレセプター（ＯＰ１、ＯＰ２、ＯＰ３、ＯＰ４等）、セクレチンレセプター、セロトニンレセプター（５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７等）、ソマトスタチンレセプター（ＳＳＴ1、ＳＳＴ２、ＳＳＴ３、ＳＳＴ４、ＳＳＴ５等）、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲα、ＴＲβ等）、レチノイドレセプター（ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ等）、ペルオキシソーム増殖剤応答性レセプター（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγ等）、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ等）、エストロゲンレセプター（ＥＲα、ＥＲβ）、鉱質コルチコイドレセプター、プロゲステロンレセプター、アンドロゲンレセプター、Ｇタンパク質共役型光レセプター（ロドプシン）、ネトリンレセプター、コルチゾールレセプター、エステラジオールレセプター、テストステロンレセプター、ノッチレセプター、チロキシンレセプター、メラノコルチンレセプター（ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５等）、バソプレシンレセプター（Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２等）、トロンビンレセプター、タキキニンレセプター（ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３等）、サブスタンスＰレセプター、一過性受容器電位（ＴＲＰ）レセプター、ブラジキニンレセプター、プロスタノイドレセプター、ＡＴＰレセプター、カンナビノイドレセプター、サイトカインレセプター、血小板膜糖タンパク質受容体（ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ等）、Ｔｏｌｌ様レセプター、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）レセプター、リアノジンレセプター、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンレセプター、オレキシンレセプター、サイトカインレセプター、エンドセリンレセプター、ニューロペプチドＹレセプター、血管作動性腸ペプチドレセプター（ＶＩＰ）、脳下垂体アデニル酸シクラー��活性化ポリペプチドレセプター（ＰＡＣＡＰ）等が挙げられる。
【００５８】
中でも、ＶＥＧＦレセプター、レクチンレセプター、プロラクチンレセプター、ＴＮＦαレセプター等が好ましい。
【００５９】
Ｆｃ融合レセプターは、例えば市場から入手することもできるが、組み換え遺伝子を宿主に導入することによって生化学的に作製して入手することも可能である。
【００６０】
本発明に係るセンシング基板は、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、エリプソメトリー法、蛍光偏光測定法、免疫電界効果トランジスター、レーザー比濁法、表面増強ラマン分光法、弾性表面波、共鳴超音波プロファイリング等の用途に好適に用いられる。
【００６１】
このような用途に好適に用いられる範囲において、本発明に係るセンシング基板に備えられる基板の材質は特に限定はされないが、例えば、金属、プラスチック、有機・無機高分子材料等が挙げられる。
【００６２】
より具体的には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、ＰＶＤＦ、セルロース、シリコン、マイカー、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ又はＴＰＸ（登録商標））、ポリスチレン（ＰＳｔ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリアクリルアミド、ポリイミド等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体又は複合体；石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類及びその複合体；金、白金、アルミナ、クロム、亜鉛、鉛、鉄、ステンレススチール、タンタル、銀、銅、ニッケル、コバルト、チタン等の金属及びその複合体や酸化物；セラミックス及びその複合体、天然ゴムやラテックスゴム等の複合体；アガロース、デキストラン、セルロース、キチン、キトサン等多糖類の複合体等が挙げられる。
【００６３】
また、基板の表面の全体又は片面が上述の材料のうちの１種又は数種を組み合わせてコーティングされていてもよい。例えば、ガラス基板を金属で被覆した組み合わせや樹脂基板の表面を金属でコーティングした基板等が挙げられる。
【００６４】
また、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等親水性ポリマーで表面をコーティング、グラフト等の処理に供して疎水化しても、ラジカル化されていてもよい。
【００６５】
本発明に係るセンシング基板上にはレセプターを整列化させて結合させることができる。これに基づいて、レセプターに対するリガンド候補物質の結合量を高感度又は広いダイナミックレンジで測定することができる。また、レセプターに対して結合するリガンド候補物質のスクリーニングを高感度に達成することができる。
【００６６】
＜センシング基板の製造方法＞
本発明に係るセンシング基板の製造方法は、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆されてなる基板に、Ｆｃ融合レセプターを添加する工程を含む。
【００６７】
基板、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子、及びＦｃ融合レセプターは、上記の本発明に係る＜センシング基板＞で詳述した通りとすることができる。
【００６８】
基板のウイルス様粒子による被覆量は、上記の本発明に係る＜センシング基板＞で詳述した被覆量と同様とすることができる。
【００６９】
基板へのＦｃ融合レセプターの添加量は、上記の本発明に係る＜センシング基板＞で詳述したウイルス様粒子の被覆量から、斯かるウイルス様粒子に含まれるＨＢｓＡｇタンパク質が有するＺＺタグのモル数を算出し、当該モル数以上の量となるように適宜調整すればよい。
【００７０】
なお、上述の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるＺＺタグを採用した場合、ＺＺタグ１モルあたり２モルのＦｃが結合することを考慮すればよい。
【００７１】
本発明に係るセンシング基板の製造方法において、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子によって被覆されてなる基板に、Ｆｃ融合レセプターを添加する前に、前記基板に対して予めブロッキング処理に供してもよい。
【００７２】
具体的には、スキムミルク、ＢＳＡ、ＦＢＳ等のブロッキング剤を用いた公知の方法によってブロッキング処理を行えばよい。
【００７３】
更に、本発明に係るセンシング基板の製造方法によると、得られたセンシング基板上にレセプターを整列化させることができる。整列化とは、上述の本発明に係る＜センシング基板＞にて詳述した通りとすることができる。
【００７４】
＜レセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法＞
本発明に係るレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法は、以下の工程１及び工程２を含む。
【００７５】
（１）上述の本発明に係るセンシング基板に、レセプターに対するリガンド候補物質を添加する工程１。
【００７６】
（２）工程１によって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程２。
【００７７】
工程１について
本発明に係るレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法における工程１は、上述の本発明に係るセンシング基板に、該レセプターに対して結合するリガンドを添加する工程である。
【００７８】
工程１におけるセンシング基板とは、上述の本発明に係る＜センシング基板＞と同様とすることができる。工程１におけるレセプターは、上述の本発明に係る＜センシング基板＞と同様にすることができる。
【００７９】
レセプターに対するリガンド候補物質とは特に限定はされないが、レセプターに対して特異的に結合するかどうかは問わず、結合する可能性ある生理活性物質であれば限定はされない。この様なリガンド候補物質はレセプターに対するリガンドに限らず、アゴニスト、アンタゴニスト等もリガンド候補物質に包含される。
【００８０】
例えば、Ｄ１〜Ｄ５等のドーパミンレセプターは、ドーパミンをリガンドするものであるが、オランザピン等の生理活性物質もドーパミンレセプターに結合する。すなわち、ドーパミンレセプターのリガンド候補物質は、ドーパミンに限定はされずオランザピン等といった生理活性物質も包含される。
【００８１】
レセプターに対するリガンド候補物質の添加量は、特に限定はされず、適宜調整すればよい。添加する際の環境も特に限定はされないが、続く工程２における各種方法に応じて適宜選択すればよい。
【００８２】
工程２について
本発明に係るレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法における工程２は、工程１によって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程である。
【００８３】
本発明に係るレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法において、具体的に結合定数を算出する方法は特に限定はされないが、例えば、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、エリプソメトリー法等を用いて従来用いられている方法、これらの方法に基づく機器に付属されたプログラムを用いた方法にて算出してもよいし、これらの機器によって得られたデータを公知の方法を用いて適宜解析して算出すればよい。
【００８４】
＜レセプターに対するリガンドスクリーニング方法＞
本発明に係るレセプターに対するリガンドスクリーニング方法は、以下の工程Ａ及び工程Ｂを含む。
【００８５】
（Ａ）上述の本発明に係るセンシング基板に、レセプターのリガンド候補物質を添加する工程。
【００８６】
（Ｂ）工程Ａによって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程。
【００８７】
工程Ａについて
本発明に係るレセプターに対するリガンドスクリーニング方法における工程Ａは、上述の本発明に係るセンシング基板に、該レセプターのリガンド候補物質を添加する工程である。
【００８８】
工程Ａにおけるセンシング基板とは、上記の本発明に係る＜センシング基板＞と同様とすることができる。工程Ａにおけるレセプターは、上述の本発明に係る＜センシング基板＞と同様にすることができる。
【００８９】
リガンド候補物質は、特に限定されることはなく、例えば、上述の＜本発明に係るレセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法＞にて詳述したリガンド候補物質とすればよい。このようなリガンド候補物質は、例えばコンビナトリアルケミストリー技術等に基づいて作成されたリガンドライブラリーに含まれるものを適宜用いればよく、市場からこのようなリガンドライブラリーを入手して用いてもよい。
【００９０】
レセプターのリガンド候補物質の添加量は、特に限定はされず、適宜調整すればよい。添加する際の環境も特に限定はされないが、続く工程２における各種方法に応じて適宜選択すればよい。
【００９１】
工程Ｂについて
本発明に係るリガンドスクリーニング方法における工程２は、工程Ｂによって得られたリガンド候補物質添加センシング基板を、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、及びエリプソメトリー法からなる群より選択される何れかの方法に供する工程である。
【００９２】
表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法、二面偏波式干渉法、エリプソメトリー法等を用いて、リガンドライブラリー中にレセプターに結合するリガンドが存在するかどうかを確認する方法は、例えば、上述した本発明に係る＜レセプターに対するリガンド候補物質の結合定数を測定する方法＞等に基づいて、一定の数値以上の結合定数を有するリガンド候補物質を選択し、これをレセプターに対して結合するリガンドであると決定すればよい。
【実施例】
【００９３】
以下に示す実験例に基づいて、本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明が以下に示す実験例に限定されないのは言うまでもない。
【００９４】
実験例１
測定機器として、水晶発振子マイクロバランス法を原理とするＴｗｉｎ−Ｑ（アズワン社）を用いた。装置の設定は−１Ｈｚ＝３０ｐｇ＝０．６ｎｇ／ｃｍ２であり、検出限界は−３．３Ｈｚ以下＝１００ｐｇ以下＝〜２ｎｇ／ｃｍ２以下とした。また、センシング基板として、ＡＴ−ｃｕｔ  ２７−ＭＨｚ（アズワン社；金電極の直径２．５ｍｍ：面積約４．９ｍｍ２）を用いた。
【００９５】
反応層のバッファーとしてＰＢＳを用い、２５℃にて測定を行った。また、撹拌筒の回転数を６００ｒｐｍに設定した。
【００９６】
〔比較例１〕
装置に設置したセンシング基板に１μｇのヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ｈｕｍａｎ  １３２ｋＤａ（ｄｉｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｐ９１２１−５０ＵＧ）を滴下した（図１Ａの（Ｉ）のイベント）。
【００９７】
測定周波数の変動が安定した後に、５％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社）を２０μＬ滴下した（１ｍｇに相当；図２Ａの（ＩＩ）のイベント）。
【００９８】
そして、測定周波数の変動が安定した後に、各種濃度に調製したヒト由来プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｈｕｍａｎ  ２４ｋＤａ（ｍｏｎｏｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｌ４０２１−５０ＵＧ）を滴下し、周波数の変動が±３Ｈｚ以内で１分間安定した際に結合量を判定した（図２Ａの（ＩＩＩ）のイベント）。
【００９９】
〔比較例２〕
装置に設置したセンシング基板に３μｇのプロテインＡ（４２ｋＤａ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ：Ｓｉｇｍａ社：＃Ｐ３８３８―１ＭＧ）を滴下した（図２（Ｂ）の（Ｉ）のイベント）。
【０１００】
測定周波数の変動が安定した後にＰＢＳでセンシング基板を洗浄し、次いで１ｍｇに相当する２０μＬの５％ブロックエースを滴下した（図２（Ｂ）の（ＩＩ）のイベント）。
【０１０１】
そして測定周波数の変動が安定した後に、１μｇのヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合プロラクチンを滴下した（図２（Ｂ）の（ＩＩＩ）のイベント）。
【０１０２】
次いで、測定周波数の変動が安定した後に、各種濃度に調製したヒト由来プロラクチンを滴下し、周波数の変動が±３Ｈｚ以内で１分間安定した際に結合量を判定した（図２（Ｂ）の（ＩＶ）のイベント）。
【０１０３】
〔実施例１〕
装置に設置したセンシング基板に３μｇのＺＺ−ＢＮＣを滴下した（図２（Ｃ）の（Ｉ）のイベント）。
【０１０４】
ＺＺ−ＢＮＣは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＺＺタグを有するＨＢｓＡｇタンパク質（４８ｋＤａ）を含むウイルス様粒子であって、ウイルス様粒子１モル当たり１２０モルのＨＢｓＡｇタンパク質を含むものである。この様なウイルス様粒子は、特許文献１〜３等に記載の方法を用いて作製した。
【０１０５】
測定周波数の変動が安定した後にＰＢＳでセンシング基板を洗浄し、次いで１ｍｇに相当する２０μＬの５％ブロックエースを滴下した（図１（Ｃ）の（ＩＩ）のイベント）。
【０１０６】
そして測定周波数の変動が安定した後に、１μｇのヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合プロラクチンを滴下した（図２（Ｃ）の（ＩＩＩ）のイベント）。
【０１０７】
次いで、測定周波数の変動が安定した後に、各種濃度に調製したヒト由来プロラクチンを滴下し、周波数の変動が±３Ｈｚ以内で１分間安定した際に結合量を判定した（図２（Ｃ）の（ＩＶ）のイベント）。
【０１０８】
結果を図３（Ａ）に示す。なお、グラフの縦軸はセンシング基板上に結合したプロラクチンの量（ｎｇ／ｃｍ２）を示し、横軸はセンシング基板に滴下したプロラクチンの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。また、グラフの丸印（●）は〔実施例１〕の結果、四角印（■）は〔比較例１〕の結果、そして三角印（▲）は〔比較例２〕の結果を示す。
【０１０９】
実験例２
上記実施例１におけるヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合プロラクチンに代えて、ヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合ＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２（Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ｈｕｍａｎ  ３２０ｋＤａ（ｄｉｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｖ６７５８−５０ＵＧ）を用い、ヒト由来プロラクチンに代えて、ヒト由来ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｈｕｍａｎ  ３８．２ｋＤａ（ｄｉｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｖ７２５９−１０ＵＧ）を用いて、上述の〔比較例１〕、〔比較例２〕、及び〔実施例１〕と同様の実験を行った。
【０１１０】
結果を図３（Ｂ）に示す。なお、グラフの縦軸はセンシング基板上に結合したＶＥＧＦの量（ｎｇ／ｃｍ２）を示し、横軸はセンシング基板に滴下したＶＥＧＦの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。また、グラフの丸印（●）は〔実施例１〕の結果、四角印（■）は〔比較例１〕の結果、そして三角印（▲）は〔比較例２〕の結果を示す。
【０１１１】
実験例３
上記実施例１におけるヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合プロラクチンに代えて、ヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合レプチンレセプター（Ｌｅｐｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ｈｕｍａｎ  １２１ｋＤａ（ｍｏｎｏｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｌ４７８７−１ＵＧ）を用い、ヒト由来プロラクチンに代えて、ヒト由来レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ  Ｈｕｍａｎ  １６ｋＤａ（ｍｏｎｏｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｌ４１４６−１ＭＧ）を用いて、上述の〔比較例１〕、〔比較例２〕、及び〔実施例１〕と同様の実験を行った。
【０１１２】
結果を図３（Ｃ）に示す。なお、グラフの縦軸はセンシング基板上に結合したレプチンの量（ｎｇ／ｃｍ２）を示し、横軸はセンシング基板に滴下したレプチンの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。また、グラフの丸印（●）は〔実施例１〕の結果、四角印（■）は〔比較例１〕の結果、そして三角印（▲）は〔比較例２〕の結果を示す。
【０１１３】
実験例４
上記実施例１におけるヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合プロラクチンに代えて、ヒトＩｇＧ由来Ｆｃ融合ＴＮＦαレセプター（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ（ＴＮＦｓＲＩＩ）／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ｈｕｍａｎ  １４０ｋＤａ（ｄｉｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：＃Ｔ７１８９−５０ＵＧ）を用い、ヒト由来プロラクチンに代えて、ヒト由来ＴＮＦα（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α  ｈｕｍａｎ  ５１ｋＤａ（ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ）；Ｓｉｇｍａ社：Ｈ８９１６−１０ＵＧ）を用いて、上述の〔比較例１〕、〔比較例２〕、及び〔実施例１〕と同様の実験を行った。
【０１１４】
結果を図３（Ｄ）に示す。なお、グラフの縦軸はセンシング基板上に結合したＴＮＦαの量（ｎｇ／ｃｍ２）を示し、横軸はセンシング基板に滴下したＴＮＦαの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。また、グラフの丸印（●）は〔実施例１〕の結果、四角印（■）は〔比較例１〕の結果、そして三角印（▲）は〔比較例２〕の結果を示す。
【０１１５】
考察
以下に、上記実験例１〜４の結果をまとめた表１〜４を示す。各種リガンドの結合量は、添加量の増大に対して検出量が一定となるその数値に基づいて算出し、検出限界値は、図３の（Ａ）〜（Ｄ）に示すグラフの点線で示される使用したＱＣＭ装置のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値（２ｎｇ／ｃｍ２）を基に算出した。
【０１１６】
【表１】
2015184269.tif 000002
【０１１７】
表１に示す結果から、実施例１は比較例１及び２よりも、それぞれ０．８倍及び４．２倍の量のプロラクチンレセプターを基板上に結合させることができ、プロラクチンレセプターのリガンドであるプロラクチンの結合量は、比較例１及び２よりもそれぞれ３．９倍及び４．５倍にも達することが明らかとなった。したがって、実施例１の方法は比較例１及び２の方法よりも著量のプロラクチンを測定することができることが明らかとなった。
【０１１８】
また、実施例１は、レセプターの結合量が比較例１よりも少ないにもかかわらず、リガンドであるプロラクチンの結合量が多いことが明らかとなった。このことから、実施例１の方法において、プロラクチンレセプターが、そのプロラクチンとの結合部位が立体障害を起こすことなく、プロラクチンと結合しやすい状態で基板上に整列化されていることが示唆される。
【０１１９】
そして、実施例１は、比較例２よりも４．６倍もの優れた検出限界値を示すこと明らかである。よって、実施例１の方法によると、試料中のプロラクチン量が著量であっても、ごく少量であってもプロラクチンを検出できるといった優れた効果を発揮することが示された。
【０１２０】
【表２】
2015184269.tif 000003
【０１２１】
表２に示す結果から、実施例１は比較例１及び２よりも、それぞれ０．５倍及び４２．３倍の量のＶＥＧＦレセプターを基板上に結合させることができ、ＶＥＧＦレセプターのリガンドであるＶＥＧＦの結合量は、比較例１及び２よりもそれぞれ４．１倍及び１７．９倍にも達することが明らかとなった。したがって、実施例１の方法は比較例１及び２の方法よりも著量のＶＥＧＦを測定することができることが明らかとなった。
【０１２２】
また、実施例１は、レセプターの結合量が比較例１よりも少ないにもかかわらず、リガンドであるＶＥＧＦの結合量が多いことが明らかとなった。このことから、実施例１の方法において、ＶＥＧＦレセプターが、そのＶＥＧＦとの結合部位が立体障害を起こすことなく、ＶＥＧＦと結合しやすい状態で基板上に整列化されていることが示唆される。
【０１２３】
そして、実施例１は、比較例１及び２よりもそれぞれ３５倍及び１７２倍もの優れた検出限界値を示すこと明らかである。よって、実施例１の方法によると、試料中のＶＥＧＦ量が著量であっても、ごく少量であってもＶＥＧＦを検出できるといった優れた効果を発揮することが示された。
【０１２４】
【表３】
2015184269.tif 000004
【０１２５】
表３に示す結果から、実施例１は比較例１及び２よりも、それぞれ０．３倍及び１．８倍の量のレプチンレセプターを基板上に結合させることができ、レプチンレセプターのリガンドであるレプチンの結合量は、比較例１及び２よりもそれぞれ２．５倍及び１．７倍であることが明らかとなった。したがって、実施例１の方法は比較例１及び２の方法よりも著量のレプチンを測定することができることが明らかとなった。
【０１２６】
また、実施例１は、レセプターの結合量が比較例１よりも少ないにもかかわらず、リガンドであるレプチンの結合量が多いことが明らかとなった。このことから、実施例１の方法において、レプチンレセプターが、そのレプチンとの結合部位が立体障害を起こすことなく、レプチンと結合しやすい状態で基板上に整列化されていることが示唆される。
【０１２７】
そして、実施例１は、比較例１及び２よりもそれぞれ３０．８倍及び２８．０倍もの優れた検出限界値を示すこと明らかである。よって、実施例１の方法によると、試料中のレプチン量が著量であっても、ごく少量であってもレプチンを検出できるといった優れた効果を発揮することが示された。
【０１２８】
【表４】
2015184269.tif 000005
【０１２９】
表３に示す結果から、実施例１は比較例１及び２よりも、それぞれ０．５倍及び５．４倍の量のＴＮＦαレセプターを基板上に結合させることができ、ＴＮＦαレセプターのリガンドであるＴＮＦαの結合量は、比較例１及び２よりもそれぞれ２．８倍及び３．０倍であることが明らかとなった。したがって、実施例１の方法は比較例１及び２の方法よりも著量のＴＮＦαを測定することができることが明らかとなった。
【０１３０】
また、実施例１は、レセプターの結合量が比較例１よりも少ないにもかかわらず、リガンドであるＴＮＦαの結合量が多いことが明らかとなった。このことから、実施例１の方法において、ＴＮＦαレセプターが、そのＴＮＦαとの結合部位が立体障害を起こすことなく、ＴＮＦαと結合しやすい状態で基板上に整列化されていることが示唆される。
【０１３１】
そして、実施例１は、比較例１及び２よりもそれぞれ２．７倍及び１．２倍もの優れた検出限界値を示すこと明らかである。よって、実施例１の方法によると、試料中のＴＮＦα量が著量であっても、ごく少量であってもＴＮＦαを検出できるといった優れた効果を発揮することが示された。
【図１】
2015184269.tif 000006
【図２】
2015184269.tif 000007
【図３】
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【配列表】
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