(57)【要約】      （修正有）【課題】過酸化水素定量等の酸化発色試薬に好適な高感度等の性質に加え、光安定性も優れた新化合物の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2015048345.tif 000014［Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、４−ジ置換アミノアリール基、Ｒ１とＲ２のアリール基はＳ又はＯを介して互いに結合してもよく、更にＲ１とＲ２のアリール基の少なくとも１ヶ所がスルホン酸基で置換されていてもよく、Ａはアダマンタニレン基、Ｘは式（Ｘ−１）等で示される官能基又は原子団］【選択図】図７
2015048345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表されることを特徴とする化合物又はその塩。
【化１】
2015048345.tif 000011
〔式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、４−ジ置換アミノアリール基を表し、Ｒ１とＲ２のアリール基は硫黄原子または酸素原子を介して互いに結合してもよく、さらにＲ１とＲ２のアリール基の少なくとも１ヶ所がスルホン酸基で置換されていてもよく、Ａはアダマンタニレン基を表し、また、Ｘは下記の式（Ｘ−１）から（Ｘ−３）のいずれかで表される官能基または原子団を表す。〕
【化２】
2015048345.tif 000012
【請求項２】
下記の式（Ｉ−１）で表されることを特徴とする請求項１に記載の化合物又はその塩。
【化３】
2015048345.tif 000013
〔式（Ｉ−１）中、Ａ及びＸは、前記の式（Ｉ）に関して定義したものと同じである。〕
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物又はその塩を含むことを特徴とする酸化発色試薬。
【請求項４】
ペルオキシダーゼが関与する酸化反応の測定に用いられることを特徴とする請求項３に記載の酸化発色試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素を定量すること等に用いることのできる新規な酸化発色性化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、酸化発色性化合物から成る試薬を用いてペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素を定量することが行われている。
このような酸化発色試薬としては、多くの化合物が案出されており、例えば、ｏ−トリジン（ジメチルベンジジン）、ｏ−フェニレンジアミン、テトラメチルベンジン及びこれらの類縁化合物が挙げられるが、フェノチアジン系構造を有する酸化発色性化合物は、分子吸光係数が高いので高感度の測定が可能であることが期待され注目されている。
【０００３】
特公昭６０−３３４７９号公報（特許文献１）には、フェノチアジン系構造を有する酸化発色性化合物の例が開示されているが、この化合物は水溶性に欠ける点において実用には適していなかった。その後、改良が続けられ、特開昭６３−２４６３５６号公報（特許文献２）には、現在ＤＡ−６７（和光純薬工業製）として市販されている酸化発色試薬を含む酸化発色性化合物が開示されている。
【０００４】
このＤＡ−６７は、下記の化学構造式（Ａ）で表され、高感度の酸化発色試薬として広く使用されているが、光安定性が悪いという問題を抱えている。
【０００５】
【化１】
2015048345.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭６０−３３４７９号公報
【特許文献２】特開昭６３−２４６３５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、過酸化水素の定量等のための酸化発色試薬として用いられるのに好適な高い感度を有する等の性質に加えて、光安定性においても優れた新しい化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、研究を重ねた結果、フェノチアジン系構造のような色素形成部位の窒素原子を介してカルボニル炭素が結合し、そのカルボニル炭素の隣にアダマンタニレン基を有している特定構造の化合物によって、上述の目的が達成されることを見出した。
【０００９】
かくして、本発明に従えば、下記の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が提供される。
【００１０】
【化２】
2015048345.tif 000004
【００１１】
式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、４−ジ置換アミノアリール基を表し、Ｒ１とＲ２のアリール基は硫黄原子または酸素原子を介して互いに結合してもよく、さらにＲ１とＲ２のアリール基の少なくとも１ヶ所がスルホン酸基で置換されていてもよく、Ａはアダマンタニレン基を表し、また、Ｘは下記の式（Ｘ−１）から（Ｘ−３）のいずれかで表される官能基または原子団を表す。
【００１２】
【化３】
2015048345.tif 000005
【００１３】
上記（Ｉ）式で表される本発明の化合物又はその塩のうち、特に好ましいのは、下記の式（Ｉ−１）で表される化合物又はその塩である。
【００１４】
【化４】
2015048345.tif 000006
【００１５】
式（Ｉ−１）中、Ａ及びＸは、前記の式（Ｉ）に関して定義したものと同じである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の化合物又はその塩は、酸化発色試薬として用いられるのに好適な新規物質である。
本発明の化合物又はその塩は、酸化発色試薬として用いられる場合、感度が高く夾雑物の影響が少ない等の特性に加えて、光安定性がきわめて優れているという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明化合物の例および比較化合物の化学構造式を示す。
【図２】本発明の化合物を合成する反応スキームを例示する。
【図３】本発明の化合物の過酸化水素添加によるスペクトル変化を例示する。
【図４】本発明の化合物を酸化発色試薬として用いた場合のｐＨの影響を比較化合物と対比して示すものである。
【図５】本発明の化合物が酸化発色試薬としてＨ２Ｏ２の定量に用いられることを既存試薬として対比して示すものである。
【図６】本発明の化合物が酸化発色試薬として用いられる場合の反応速度を既存試薬と対比して示すものである。
【図７】本発明の化合物が酸化発色試薬として用いられる場合の光安定性を既存試薬として対比して示すものである。
【図８】本発明の化合物が酸化発色試薬として用いられる場合の夾雑物の影響を既存試薬として対比して示すものである。
【図９】本発明の化合物の別の例が酸化発色試薬として用いられる場合の夾雑物の影響を既存試薬と対比して示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、式Ｒ１−ＮＨ−Ｒ２で示されるジアリール誘導体に、アダマンタンをジカルボニルジクロライドとして反応させることにより合成することができる。さらに、その後、必要に応じて、ＯＳｕ体（ｏ−スクシンイミジルエステル：活性エステル体）とし、目的の化合物に応じたアミン化合物を反応させる（後述の実施例参照）。
【００１９】
Ｒ１−ＮＨ−Ｒ２で示されるジアリール誘導体は、一般的には、既知の反応に従い、例えば、アニリン誘導体とフェニレンジアミン誘導体とを酸化重合して色素化合物を合成した後、これを還元することで得られるが、既存の色素として入手できる原料から容易に合成することもできる。
【００２０】
例えば、本発明に従う好ましい化合物である式（Ｉ−１）で表される化合物は、メチレンブルーとして知られている色素を水素化ホウ素ナトリウム等で還元することにより、対応するＲ１−ＮＨ−Ｒ２で示される化合物（フェノチアジン誘導体）を経由して合成することができる。
【００２１】
式（Ｉ）の本発明化合物において、Ｒ１及びＲ２で示される４−ジ置換アミノアリール基の４−ジ置換される置換基としては、一般に、炭素数１〜６の低級アルキル基又は低級アルコキシ基が挙げられ、好ましい例は、メチル基である。また、式（２）の本発明化合物において、Ｒ１及びＲ２で示される４−ジ置換アミノアリール基のアルール基としては、一般に、フェニル基またはナフチル基が挙げられ、好ましい例はフェニル基である。
【００２２】
かくして、式（Ｉ）の本発明化合物に属するものとして、次の構造式で表されるものを挙げることができる。
【００２３】
【化５】
2015048345.tif 000007
【００２４】
【化６】
2015048345.tif 000008
【００２５】
【化７】
2015048345.tif 000009
【００２６】
【化８】
2015048345.tif 000010
【００２７】
上記各式中、Ａはアダマンタニレン基を表し、また、Ｘは、既述のように式（Ｘ−１）、（Ｘ−２）及び（Ｘ−３）のいずれかで表される官能基または原子団を表す。
【００２８】
上記式の化合物のうち、原料の入手の点などから合成が容易であり、さらに、酸化発色試薬として用いられた場合に、感度が高いことに加えて光安定性が優れている等の理由から、特に好ましいのは式（Ｉ−１）で表される化合物である。
【００２９】
式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、塩の形態で存在し使用に供されることも多く、それらの塩も本発明の範囲に包含されるものとする。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などの金属塩、アンモニウム塩などの塩基付加塩、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸塩などを挙げることができるが、これらのうち、特に好ましいものとして一般に用いられるのはナトリウム塩である。
【００３０】
本発明の化合物は、酸化発色試薬として、ＤＡ−６７のような広く使用されているものと同程度の高い感度を有し夾雑物による影響が低い等の性質を保持しながら、光安定性が大幅に向上しているという特徴を有する。本発明の化合物がこのような特性を発揮する理由は、完全には解明されていないが、カルボニル炭素で色素形成部位と結合し、そのカルボニル炭素の隣が（アダマンタニレン基にある）四級炭素を有しているという独特の構造に因るものと推察される（後述の実施例参照）。
【００３１】
かくして、本発明化合物の酸化発色試薬としての特に好ましい用途として、ペルオキシダーゼが関与する酸化反応の測定が挙げられる。すなわち、被測定サンプル中に本発明の化合物を添加して発色させて吸収スペクトルを測定し、該スペクトルの吸光度から、過酸化水素の濃度を検知したり、あるいは、ペルオキシダーゼの活性を調べることができる。
【００３２】
さらに、本発明の化合物は、酸化性物質により酸化されて発色するので、この性質を利用する他の用途も可能である。例えば、本発明の化合物は、塩素により酸化されて発色するので、水中の残留塩素濃度の測定にも応用される。すなわち、被測定サンプル中に本発明の化合物を添加して発色させて吸収スペクトルを測定し、該スペクトルの吸光度から残留塩素濃度を検知することもできる。
【実施例】
【００３３】
本発明の特徴を更に具体的に説明するために、以下に実施例によって示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００３４】
実施例１：本発明化合物の合成
本発明に従う化合物として、図１に示す化合物Ａ，B、ＣおよびＤを合成した。
＜化合物Ａの合成＞
図２の（Ｉ）に示す反応スキームに従い、アダマンタンジカルボニルジクロライドを次のように合成した：１Ｌナスフラスコに、１，３−アンマンタンジカルボン酸５０ｇ（０．２２ｍｏｌ）、クロロホルム３００ｍｌに加え、マグネチックスターラーで撹拌溶解した。次いで、ＤＭＦを１ｍｌ滴下した。塩化チオニル３４ｍｌ（０．４７ｍｏｌ）を加え、７５℃で加熱還流した。溶け残りが無くなっているのを確認後、エバポレーターで減圧濃縮を行った。溶液が乾固し、白色の粉末を得た。真空ラインにつなぎ、一晩減圧下で保存した。
【００３５】
次に、図２の（II）に示す反応スキームに従い、目的の本発明化合物Ａを次のように合成した：３Ｌフラスコに、メチレンブルー１８１ｇ（４８４ｍｍｏｌ）を投入し、水６００ｍｌを加え加温溶解した。クロロホルムを１Ｌ加え、ＮａＢＨ４水溶液を滴下した。分液し、クロロホルム層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。クロロホルム溶液を反応容器へ移し、トリエチルアミンを６８．４ｍｌ（０．４９ｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを１ｇ加え、氷浴にセットした。スターラーで撹拌しながらアダマンタンジカルボニルジクロライドのクロロホルム溶液を少量ずつ滴下した。反応後、反応液を濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整後、カラムクロマトグラフで精製した。カラム精製後、淡青白色粉末８２．０ｇを得た。
同定データ：
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δｐｐｍ  １．３０−１．６２（１０Ｈ，ｍ，ａｄａｍａｎｔｉｎｅ  Ｈ），  １．８０（２Ｈ，ｓ，ａｄａｍａｎｔｉｎｅ  Ｈ），１．８９（２Ｈ，ｓ，ａｄａｍａｎｔｉｎｅ  Ｈ），２．８８（１２Ｈ，ｓ，−Ｎ−（ＣＨ３）２），６．６４−７．３３（６Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｈ）  ＭＳ：［Ｍ−Ｎａ＋２Ｈ］＋＝４９２
【００３６】
＜活性エステル体の合成＞
上記のように合成した本発明化合物Ａから、図２の（III）に示す反応スキームに従い、次のように活性エステル体を合成した：２００ｍｌナスフラスコに化合物Ａ９１８ｍｇ（２．１ｍｍｏｌ）、クロホルム５０ｍｌ加え、氷浴に浸けた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド７２２ｍｇ（６．２７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン３９ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド９７７μｌ（６．２７ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。反応液を濃縮し、カラム精製後、活性エステル体を１．２ｇ得た。
【００３７】
＜化合物Ｄの合成＞
図２の（IV）に示す反応スキームに従い、上記のようにして得た活性エステル体から本発明化合物Ｄを次のように合成した：５ｍｌバイアル瓶に活性エステル体１００ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ２ｍｌ、水１．５ｍｌ、タウリン２１ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）加え、一晩撹拌拌した。反応液を濃縮し、カラム精製後、化合物Ｄを５２．７ｍｇ得た。
【００３８】
＜化合物Ｂの合成＞
図２の（Ｖ）に示す反応スキームに従い、上記のようにして得た活性エステル体から本発明化合物Ｂを次のように合成した：５ｍｌバイアル瓶に活性エステル体１００ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ３ｍｌ、３，６，９，１２−テトラオキサトリデカン−１−アミン３５ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）加え、一晩撹拌した。反応液を濃縮し、カラム精製後、化合物Ｂを６９．４ｍｇ得た。
【００３９】
＜化合物Ｃの合成＞
図２の（VI）に示す反応スキームに従い、上記のようにして得た活性エステル体から本発明の化合物Ｃを次のように合成した：５ｍｌバイアル瓶に活性エステル体１００ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ３ｍｌ、３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサペンタコサン−１−アミン６５ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）加え、一晩撹拌した。反応液を濃縮し、カラム精製後、化合物Ｃを６９．９ｍｇ得た。
【００４０】
実施例２：発色試験
実施例１で合成した本発明化合物Ａについてペルオキシダーゼ存在下における過酸化水素による発色試験を行った。
【００４１】
＜過酸化水素添加によるスペクトル変化＞
本発明化合物Ａの濃度０．１ｍＭ、ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）濃度３．３Ｕ／ｍｌとし、過酸化水素濃度を変えて、３７℃で５分間インキュベーションした後、吸光スペクトルを測定した。
その結果を図３に示す。図に示されるように過酸化水素の濃度に応じて６５０ｎｍ付近に鋭敏な吸光スペクトルが認められた。なお、モル吸光係数は約１０万であり、ＤＡ−６７に匹敵するものであった。
【００４２】
＜ｐＨの影響試験＞
９６ウエルプレートのそれぞれのウエルに、バッファー５０μｌ、超純水５０μｌを加え、本発明化合物Ａまたは比較化合物ＡもしくはＢ（図１参照）６００μＭ＋ＰＯＤ４Ｕ／ｍｌ（５０μｌ）を加えた後、６０μＭ  Ｈ２Ｏ２を５０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベーションした後、吸光スペクトルを測定した。
その結果を図４に示す。図４に示されるように、本発明化合物Ａは、ｐＨの影響を受けることなく安定である。これに対して、比較化合物ＡおよびＢは、いずれもｐＨの影響を非常に受けやすいことが示された。
【００４３】
実施例３：既存試薬との比較試験
本発明の化合物の酸化発色試薬としての特性を既存の市販試薬（ＤＡ−６７：和光純薬工業株式会社製）と比較して調べた。
【００４４】
＜Ｈ２Ｏ２定量性＞
９６ウエルプレートの各ウエルにバッファー１００μｌを入れ、次に６０μＭのＨ２Ｏ２を１００μｌ添加し倍々希釈してＨ２Ｏ２の濃度を変化させた。これに酸化発色試薬（本発明化合物ＡまたはＤＡ−６７）０．２ｍＭ＋ＰＯＤ（４Ｕ／ｍｌ）溶液１００μｌを添加した。３８℃で５分間インキュベーションした後、６５０ｎｍにおける吸収スペクトルを測定した。なお、酸化発色試薬（０．２ｍＭ）＋ＰＯＤ（４Ｕ／ｍｌ）の調製は、本発明化合物Ａについては、１０ｍＭ水溶液１００μｌにＰＯＤを加えて水で５ｍｌとし、また、ＤＡ−６７については５ｍＭ水溶液２００μｌにＰＯＤを加えて水で５ｍｌとすることにより行った。
その結果を図５に示す。本発明化合物ＡはＤＡ−６７と同様の感度を示し、ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）存在下の過酸化水素の定量に供し得ることが理解される。
【００４５】
＜反応速度＞
ペルオキシダーゼ存在下におけるＨ２Ｏ２による酸化の反応速度を調べた。試験管に１０ｍＭの本発明化合物ＡまたはＤＡ−６７を３０μｌ入れ、これに１ｍＭのＨ２Ｏ２を３０μｌ添加した後、２．７ｍｌのバッファー＋ＰＯＤを加えて３７℃に保持して５分毎に６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果を図６に示す。本発明化合物ＡはＤＡ−６７と同程度を反応速度示すことが理解される。
【００４６】
＜溶液安定性＞
光照射下における溶液安定性を次のように試験した。本発明化合物ＡおよびＤＡ−６７のそれぞれを５０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）で０．２５ｍＭとなるように調製した。調製した各試薬を蛍光灯下に静置して、６５０ｎｍの吸光度の経時変化を追跡した。
結果を図７に示す。ＤＡ−６７溶液は時間経過とともに吸光度が急激に変化するのに対して、本発明化合物Ａの溶液は経時的に吸光度が変化することなく、光安定性が大幅に向上していることが示されている。
【００４７】
＜干渉チェック（夾雑物の影響チェック＞
夾雑物としてビリルビン−Ｆ（ＢＩＬ−Ｆ）、ビリルビン−Ｃ（ＢＩＬ−Ｃ）および溶血ヘモグロビン（Ｈｂ）を用いて、その干渉の程度をチェックした。各溶液の調製は次のように行った。
酸化発色試薬（本発明化合物またはＤＡ−６７）＋ＰＯＤ：酸化発色試薬を５０ｍＭＢｉｃｉｎｅ５００μｌで溶解し、酸化発色試薬濃度３ｍＭの溶液を作成した。その溶液にＰＯＤを加え、水で４．５ｍｌにした。干渉チェック溶液：１ボトル／２ｍｌ水に溶解し、１０倍希釈した。
Ｈ２Ｏ２／バッファー溶液：１ｍＭＨ２Ｏ２水溶液３００μｌ／５ｍバッファーとした。
【００４８】
９６ウエルプレートの各ウエルに干渉チェック溶液を入れ、これに酸化発色試薬＋ＰＯＤ溶液９０μｌを加え、さらに、Ｈ２Ｏ２／バッファー溶液１００μｌを添加した。３７℃で１０分間インキュベーションした後、６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
本発明化合物ＡとＤＡ−６７を比較した測定結果を図８に示す。また、本発明化合物Ｂ、本発明化合物Ｃ、および本発明化合物ＤとＤＡ−６７を比較した測定結果を図９に示す。本発明の化合物は、いずれも、ＤＡ−６７と比較して、夾雑物の影響は同程度または若干悪い程度であることが示されている。
【００５０】
以上の結果から、本発明の化合物は、既存試薬と比べて、ペルオキシダーゼ存在下におけるＨ２Ｏ２測定に関して同程度の感度及び反応速度を示し、夾雑物の影響もほぼ同等でありながら、光安定性が大幅に向上していることが理解された。
【図１】
2015048345.tif 000015
【図２】
2015048345.tif 000016
【図３】
2015048345.tif 000017
【図４】
2015048345.tif 000018
【図５】
2015048345.tif 000019
【図６】
2015048345.tif 000020
【図７】
2015048345.tif 000021
【図８】
2015048345.tif 000022
【図９】
2015048345.tif 000023