(57)【要約】【課題】毒性が強いクロロホルムを不要にしたアムホテリシンＢリポソームの製造方法を提供する。【解決手段】アムホテリシンＢを内包したリポソームの製造方法は、（１）リン脂質に低級アルコール及び非プロトン性極性溶媒を添加した後に酸性化液体を添加して調製したリン脂質溶液に、アムホテリシンＢに非プロトン性極性溶媒を添加して調製したアムホテリシンＢ溶液を添加し混合して、リン脂質−アムホテリシンＢ複合体を含有した複合体溶液を生成するステップと、（２）前記複合体溶液に、第２のリン脂質及びコレステロールに低級アルコールを添加して調製した第２のリン脂質溶液を添加した後に水和して、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液を生成するステップと、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アムホテリシンＢを内包したリポソームの製造方法であって、（１）リン脂質に低級アルコール及び非プロトン性極性溶媒を添加した後に酸性化液体を添加して調製したリン脂質溶液に、アムホテリシンＢに非プロトン性極性溶媒を添加して調製したアムホテリシンＢ溶液を添加し混合して、リン脂質−アムホテリシンＢ複合体を含有した複合体溶液を生成するステップと、（２）前記複合体溶液に、第２のリン脂質及びコレステロールに低級アルコールを添加して調製した第２のリン脂質溶液を添加した後に水和して、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液を生成するステップと、を備えるアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項２】
前記リン脂質溶液に含まれるリン脂質が、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩の群から選ばれた１種である、請求項１に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項３】
前記リン脂質溶液に含まれる低級アルコールが、エタノール、メタノール、２−プロパノールの群から選ばれた１種である、請求項１又は２に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項４】
前記リン脂質溶液に含まれる非プロトン性極性溶媒と前記アムホテリシンＢ溶液に含まれる非プロトン性極性溶媒が、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドの群から選ばれた１種である、請求項１〜３の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項５】
前記リン脂質溶液に含まれるリン脂質と前記酸性化液体含有の酸性物質とのモル比が、１．０：０．８〜１．０：１．２の範囲内である、請求項１〜４の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項６】
前記の粗リポソーム溶液を生成するステップは、前記複合体溶液に前記第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液のｐＨを調整するｐＨ調整処理を含む、請求項１〜５の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項７】
前記ｐＨ調整処理は、前記複合体溶液に前記第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液に酸性度中和液体を添加し、続いてｐＨ緩衝液を添加する処理である、請求項６に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項８】
前記第２のリン脂質溶液に含まれる第２のリン脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリンである、請求項１〜７の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項９】
前記第２のリン脂質溶液は、前記第２のリン脂質及び前記コレステロールの他に、α−トコフェロールを含んでいる、請求項１〜８の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項１０】
前記第２のリン脂質溶液に含まれる低級アルコールが、エタノール、メタノール、２−プロパノールの群から選ばれた１種である、請求項１〜９の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項１１】
前記粗リポソーム溶液に粒子径制御処理を施して、整粒化リポソームを含有した整粒化リポソーム溶液を生成するステップをさらに備える、請求項１〜１０の何れか１項に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【請求項１２】
前記整粒化リポソーム溶液に外液置換処理を施して、外液濃度が調整された外液置換リポソーム溶液を生成するステップをさらに備える、請求項１１に記載のアムホテリシンＢリポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アムホテリシンＢを内包したリポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アムホテリシンＢリポソームの製造方法として、クロロホルムを含有したリン脂質溶液にクロロホルムを含有したアムホテリシンＢ溶液を添加し混合して複合体を生成する手順を採用したものが知られている（例えば後記特許文献１を参照）。しかしながら、毒性が強いクロロホルムは人体に悪影響を与えるリスクが高いことから、前記手順を採用して製造されたアムホテリシンＢリポソームはその使用において厳格な管理及び注意を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第２９５８７７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、毒性が強いクロロホルムを不要にしたアムホテリシンＢリポソームの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するため、本発明は、アムホテリシンＢを内包したリポソームの製造方法であって、（１）リン脂質に低級アルコール及び非プロトン性極性溶媒を添加した後に酸性化液体を添加して調製したリン脂質溶液に、アムホテリシンＢに非プロトン性極性溶媒を添加して調製したアムホテリシンＢ溶液を添加し混合して、リン脂質−アムホテリシンＢ複合体を含有した複合体溶液を生成するステップと、（２）前記複合体溶液に、第２のリン脂質及びコレステロールに低級アルコールを添加して調製した第２のリン脂質溶液を添加した後に水和して、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液を生成するステップと、を備えている。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、毒性が強いクロロホルムを不要にしたアムホテリシンＢリポソームの製造方法を提供することができる。
【０００７】
本発明の前記目的及び他の目的と、各目的に応じた特徴と効果は、以下の説明と添付図面によって明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は複合体溶液の生成と粗リポソーム溶液の生成に関する説明図である。
【図２】図２は整粒化リポソーム溶液の生成に関する説明図である。
【図３】図３は外液置換リポソーム溶液の生成に関する説明図である。
【図４】図４は外液置換機の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
毒性が強いクロロホルムを不要にしたアムホテリシンＢリポソームの製造方法は、図１に示したように、原則として、（１）リン脂質に低級アルコール及び非プロトン性極性溶媒を添加した後に酸性化液体を添加して調製したリン脂質溶液に、アムホテリシンＢ（Ａｍｂ）に非プロトン性極性溶媒を添加して調製したアムホテリシンＢ溶液を添加し混合して、リン脂質−アムホテリシンＢ複合体を含有した複合体溶液を生成するステップと、（２）前記複合体溶液に、第２のリン脂質及びコレステロールに低級アルコールを添加して調製した第２のリン脂質溶液を添加した後に水和して、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液を生成するステップと、を備えている。
【００１０】
前記の複合体溶液を生成するステップにおいて、リン脂質溶液に含まれるリン脂質は、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩（ＤＳＰＧ−Ｎａ）の群から選ばれた１種であり、好ましくはＤＳＰＧ−Ｎａである。また、リン脂質溶液に含まれる低級アルコールは、エタノール、メタノール、２−プロパノールの群から選ばれた１種であり、好ましくはエタノールである。さらに、リン脂質溶液に含まれる非プロトン性極性溶媒とアムホテリシンＢ溶液に含まれる非プロトン性極性溶媒は、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の群から選ばれた１種であり、好ましくはＮＭＰである。さらに、リン脂質溶液を調製する際に添加される酸性化液体はプロトン供与体であれば良く、具体的には塩酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液、酢酸溶液等であって、これらの中でも塩酸溶液が適している。さらに、リン脂質溶液に含まれるリン脂質と酸性化液体含有の酸性物質とのモル比は、１：０．８〜１：１．２の範囲内であり、好ましくは１：０．９４である。
【００１１】
加えて、前記の複合体溶液を生成するステップにおける一連の処理温度は、アムホテリシンＢ溶液を調製する際の温度（常温（１５〜２５℃の範囲内））を除いて、４０〜８０℃の範囲内、好ましくは５０〜７５℃の範囲内、より好ましくは６０〜７０℃の範囲内であるが特に制限されない。また、各添加後の保持持間は１２０分以内、好ましくは６０分以内、より好ましくは３０分以内であるが特に制限されない。
【００１２】
一方、前記の粗リポソーム溶液を生成するステップは、粗リポソームをより安定に形成するために、複合体溶液に第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液のｐＨを調整するｐＨ調整処理、具体的には複合体溶液に第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液に酸性度中和液体を添加し、続いてｐＨ緩衝液を添加する処理（図１を参照）を含んでいることが好ましい。換言すれば、複合体溶液に第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液のｐＨが２〜９の範囲内であれば粗リポソームを形成できるが、前記ｐＨ調整処理を採用すれば、粗リポソーム溶液を生成するステップにおいて粗リポソームをより安定に形成することできる。
【００１３】
前記ｐＨ調整処理、具体的には複合体溶液に第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液に酸性度中和液体を添加し、続いてｐＨ緩衝液を添加する処理を採用する場合、酸性度中和液体は酸性度を中和できるものであれば良く、具体的には水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、水酸化カルシウム溶液等であって、これらの中でも水酸化ナトリウムが適している。また、ｐＨ緩衝液はリポソーム形成に使用される一般的な水溶液であれば良く、具体的にはスクロース−ヒスチジン溶液、スクロース−コハク酸溶液、ＨＥＰＥＳ溶液、硫酸アンモニウム溶液等であって、これらの中でもスクロース−ヒスチジン溶液が適している。このｐＨ緩衝液のｐＨは至適領域があるものの、粗リポソーム形成にあってはｐＨ２〜９を用いることが可能で、リポソーム構成成分であるリン脂質の安定性を考慮するとｐＨ６．５又はその付近が好ましい。
【００１４】
前記の粗リポソーム溶液を生成するステップにおいて、第２のリン脂質溶液に含まれる第２のリン脂質はリポソーム形成用リン脂質として通常使用されているものであれば良く、具体的にはホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等のグリセロリン脂質や、スフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（ＳＭ））等のスフィンゴリン脂質や、カルジオリピン等の天然又は合成のジホスファチジル系リン脂質及びこれらの誘導体や、これらを常法に従って水素添加したもの（例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等であって、これらの中でもＨＳＰＣが適している。また、第２のリン脂質溶液は、第２のリン脂質及びコレステロールの他に、α−トコフェロールを含んでいても良い。さらに、第２のリン脂質溶液に含まれる低級アルコールは、エタノール、メタノール、２−プロパノールの群から選ばれた１種であり、好ましくはエタノールである。
【００１５】
加えて、前記の粗リポソーム溶液を生成するステップにおける一連の処理温度は４０〜８０℃の範囲内、好ましくは５０〜７５℃の範囲内、より好ましくは６０〜７０℃の範囲内であるが特に制限されない。また、各添加後の保持持間は１２０分以内、好ましくは６０分以内、より好ましくは３０分以内であるが特に制限されない。
【００１６】
前記のアムホテリシンＢリポソームの製造方法は、前記の複合体溶液を生成するステップと前記の粗リポソーム溶液を生成するステップに続けて、図２に示した（３）粗リポソーム溶液に粒子径制御処理を施して、整粒化リポソームを含有した整粒化リポソーム溶液を生成するステップを備えていても良く、さらに続けて、図３に示した（４）整粒化リポソーム溶液に外液置換処理を施して、外液濃度が調整された外液置換リポソーム溶液を生成するステップを備えていても良い。以下、具体例等を挙げて詳述する。
【００１７】
［具体例１］
この具体例１は、先に述べた複合体溶液を生成するステップ及び粗リポソーム溶液を生成するステップ（図１を参照）に関するものである。
【００１８】
先ず、６５℃の温度下で、ＤＳＰＧ−Ｎａ７９．５ｍｇにエタノール１ｍｌ及びＮＭＰ１ｍｌを添加した後に２．５Ｍ塩酸溶液３７．５μｌを添加してＤＳＰＧ溶液を調製する。また、常温下（１５〜２５℃の範囲内）で、Ａｍｂ４７ｍｇにＮＭＰ１ｍｌを添加してＡｍｂ溶液を調製する。そして、６５℃の温度下で、２．５Ｍ塩酸溶液を添加して溶解した後のＤＳＰＧ溶液にＡｍｂ溶液を添加し混合して３０分保持する。これにより、ＤＳＰＧ−Ａｍｂ複合体を含有した複合体溶液が生成される。因みに、２．５Ｍ塩酸溶液は、塩酸２２ｍｌに水を加えて１００ｍｌとしたものである。
【００１９】
さらに、６５℃の温度下で、ＨＳＰＣ１９９．５ｍｇ及びコレステロール４９．４ｍｇにエタノール２ｍｌを添加してＨＳＰＣ溶液を調製する。そして、６５℃の温度下で、前記複合体溶液にＨＳＰＣ溶液を添加した後に２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液２２μｌを添加して１０分保持し、続いてｐＨ６．５スクロース−ヒスチジン溶液４０ｍｌを添加する。これにより、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液が生成される。因みに、２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液は、水酸化ナトリウム１０ｇに水を加えて１００ｍｌとしたものであり、一方、ｐＨ緩衝液であるｐＨ６．５スクロース−ヒスチジン溶液は、スクロース３００ｇとヒスチジン７．６８ｇに水を加えて３０００ｍｌとし、これに前記２．５Ｍ塩酸溶液を加えてｐＨを６．５としたものである。
【００２０】
前記具体例１によって粗リポソームが形成されていることを確認するため、前記粗リポソーム溶液を用いてＡｍｂ濃度の定量を行い、この定量値からＡｍｂ回収率（％）＝（Ａｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）／（４７／４５））×１００の式によりＡｍｂ回収率を算出した。算出されたＡｍｂ回収率は８６．３％であり、高率でＡｍｂが回収できていることが確認された。
【００２１】
ここで、前式中のＡｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法について説明する。先ず、前記粗リポソーム溶液１ｍｌをｐＨ６．５スクロース−ヒスチジン溶液で１０倍希釈し、この希釈溶液１ｍｌにアセトリニトル４ｍｌ及び１ｍＭ酢酸溶液１ｍｌを添加した後にメタノールを添加して１０ｍｌとして、測定用試料を調製する。また、Ａｍｂ１６ｍｇにＤＭＳＯ４ｍｌを添加して溶解した後、これにメタノールを添加して５０ｍｌとして、標準原液を調製する。さらに、標準原液をメタノールで希釈して、４０−１６０μｇ／ｍｌのＡｍｂ標準溶液を調製する。さらに、標準溶液１ｍｌにアセトリニトル４ｍｌ及び１ｍＭ酢酸溶液１ｍｌを添加した後にメタノールを添加して１０ｍｌとして、検量線用標準液を調製する。そして、前記測定用試料と検量線用標準液に対し、カラムがＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、カラム温度が４０℃、保持時間がほぼ１０分、測定波長が３８３ｎｍの条件下で、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にて測定を実施した。また、測定用試料中のＡｍｂ濃度は、希釈率を考慮した上で検量線式により算出した。因みに、１ｍＭ酢酸溶液は、ｐＨ４．０／１０ｍＭ酢酸溶液５ｍｌに水を加えて５０ｍｌとしたものであり、ここでのｐＨ４．０／１０ｍＭ酢酸溶液は、酢酸ナトリウム三水和物１．３６ｇに水を加えて１０００ｍｌとし、これに酢酸を加えてｐＨを４．０としたものである。
【００２２】
ところで、前記具体例１において複合体溶液を生成する際に添加した２．５Ｍ塩酸溶液はその量が多いほどＤＳＰＧの溶解度が増し、且つ、ＤＳＰＧ−Ａｍｂ複合体の形成に有利であると考えられるが、その一方で２．５Ｍ塩酸溶液の添加量が増すとＡｍｂの分解が促進される懸念もある。そこで、２．５Ｍ塩酸溶液の適正な添加量を検証するために、（ａ）ＤＳＰＧ−Ｎａを７９．４ｍｇとし、２．５Ｍ塩酸溶液を１５０μｌとし、ＨＳＰＣを２００．８ｍｇとし、コレステロールを５１．３ｍｇとし、２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を８８μｌとした他は前記具体例１と同じ手順で複合体溶液の生成及び粗リポソーム溶液の生成を行うと共に、（ｂ）ＤＳＰＧ−Ｎａを７９．８ｍｇとし、２．５Ｍ塩酸溶液を７５μｌとし、ＨＳＰＣを１９８．９ｍｇとし、コレステロールを４９．３ｍｇとし、２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を４４μｌとした他は前記具体例１と同じ手順で複合体溶液の生成及び粗リポソーム溶液の生成を行い、前記と同じ手順でＡｍｂ回収率（％）をそれぞれ算出した。
【００２３】
検証例（ａ）において算出されたＡｍｂ回収率は０％であり、検証例（ｂ）において算出されたＡｍｂ回収率は７．７％であり、何れも前記具体例１に比べてＡｍｂの回収率が著しく低下していることが確認された。前記具体例１においてＤＳＰＧ溶液に含まれるＤＳＰＧが１００μｍｏｌで塩酸が９３．７５μｍｏｌであり、検証例（ａ）においてＤＳＰＧ溶液に含まれるＤＳＰＧが１００μｍｏｌで塩酸が３７５μｍｏｌであり、検証例（ｂ）においてＤＳＰＧ溶液に含まれるＤＳＰＧが１００μｍｏｌで塩酸が１８７．５μｍｏｌであることを勘案すると、Ａｍｂ回収率（％）にはＤＳＰＧと塩酸とのモル比が深く関与していると言える。また、前記具体例１におけるＤＳＰＧと塩酸のモル比が１：０．９４であることを考慮すると、該モル比が１：０．８〜１：１．２の範囲内にあれば少なくとも８０％以上のＡｍｂ回収率が得られ、また、該モル比が１：０．９〜１：１の範囲内にあればより高いＡｍｂ回収率が得られると推測される。
【００２４】
［具体例２］
この具体例２は、先に述べた複合体溶液を生成するステップ及び粗リポソーム溶液を生成するステップ（図１を参照）に、先に述べた整粒化リポソーム溶液を生成するステップ（図２を参照）と外液置換リポソーム溶液を生成するステップ（図３を参照）を付加したものである。
【００２５】
先ず、６５℃の温度下で、ＤＳＰＧ−Ｎａ６４０．８ｍｇにエタノール４ｍｌ及びＮＭＰ４ｍｌを添加した後に２．５Ｍ塩酸溶液３００μｌを添加してＤＳＰＧ溶液を調製する。また、常温下（１５〜２５℃の範囲内）で、Ａｍｂ３６９．６ｍｇにＮＭＰ８ｍｌを添加してＡｍｂ溶液を調製する。そして、６５℃の温度下で、２．５Ｍ塩酸溶液を添加して溶解した後のＤＳＰＧ溶液にＡｍｂ溶液を添加し混合して１０分保持する。これにより、ＤＳＰＧ−Ａｍｂ複合体を含有した複合体溶液が生成される。
【００２６】
さらに、６５℃の温度下で、ＨＳＰＣ１５７０．４ｍｇ、コレステロール３８６．４ｍｇ及びα−トコフェロール４．７３ｍｇにエタノール１６ｍｌを添加してＨＳＰＣ溶液を調製する。そして、６５℃の温度下で、前記複合体溶液にＨＳＰＣ溶液を添加した後に２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液１７６μｌを添加して１０分保持し、続いてｐＨ６．５スクロース−ヒスチジン溶液３２０ｍｌを添加する。これにより、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液が生成される。
【００２７】
そして、前記粗リポソーム溶液に含まれている粗リポソームの粒子径を１１０ｎｍに調整するために、高圧乳化機（Ｅｍｕｌｓｉｌｅｘ  Ｃ５０、Ａｖｅｓｔｉｎ社製）を用いて、該粗リポソーム溶液に高圧乳化処理（粒子径制御処理）を施して、整粒化リポソームを含有した整粒化リポソーム溶液を生成する。具体的には、粗リポソーム溶液に付加する圧力を約９，０００ｐｓｉに設定し、粒子径がほぼ１１０ｎｍになるまでバッチ処理を繰り返すことによって粒子径制御を行う。
【００２８】
そして、前記整粒化リポソーム溶液の外液（溶媒）に含まれている未封入のＡｍｂや余剰のエタノール及びＮＭＰ等の不要分を除去するために、図４に示した外液置換機を用いて、該整粒化リポソーム溶液に外液置換処理を施して、外液濃度が調整された外液置換リポソーム溶液を生成する。図４に示した外液置換機は、前記整粒化リポソーム溶液を貯留する処理液容器と、処理液容器内の整粒化リポソーム溶液を限外濾過膜に送る管路及び処理液ポンプと、限外濾過膜から排出されなかった液分を処理液容器に戻す管路と、置換液を貯留する置換液容器と、置換液容器内の置換液を処理液容器内に送る管路及び置換液ポンプとを有している。限外濾過膜には分子分画量が３００，０００Ｄａのものを使用し、置換液にはｐＨ６．５スクロース−ヒスチジン溶液を使用した。
【００２９】
この外液置換機によれば、整粒化リポソーム溶液の外液（溶媒）に含まれている未封入のＡｍｂや余剰のエタノール及びＮＭＰ等の不要分を限外濾過膜から排出して非排出分を処理液容器に戻す一方、処理液容器内の液濃度が一定になるように排液速度と同じ速度で置換液容器内の置換液を処理液容器に送り込むことができる。具体的には、限外濾過膜からの排液量が処理液容器内に最初に投入した処理液（整粒化リポソーム溶液）の５倍相当量になるまで、両ポンプを動作させて外液置換を行う。
【００３０】
前記具体例２によって所期の粒子径制御が行われていることを確認するため、該具体例２に準じたバッチ処理を４回実施し、各バッチ処理毎で得られた整粒化リポソームの平均粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて測定した。各バッチ処理毎の測定結果はそれぞれ１０７．３ｎｍ、１１８．５ｎｍ、１０９．５ｎｍ、１０８．６ｎｍであり、何れも、目標粒子径である１１０ｎｍの粒子径を有することが確認された。
【００３１】
加えて、前記具体例２によって粒子径制御及び外液置換を行っても先に述べたＡｍｂ回収率（％）が低下していないことを確認するため、該具体例２に準じたバッチ処理を４回実施し、各バッチ処理毎で得られた外液置換リポソーム溶液を用いてＡｍｂ濃度の定量とＤＳＰＧ濃度の定量をそれぞれ行い、各々の定量値からＡｍｂ回収率（％）＝（（Ａｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）／ＤＳＰＧ濃度（ｍｇ／ｍｌ））／（３６９．６／６４０．８））×１００の式によりＡｍｂ回収率を算出した。各バッチ処理毎の算出結果はそれぞれ９０．３％、９５．３％、９９．９％、１０１．４％であり、何れも、９０％を超える高率でＡｍｂが回収できていることが確認された。因みに、前式中のＡｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法は先に述べた通りであり、ＤＳＰＧ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法は非特許文献であるＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２０１２，１８１８（１１），２８０１〜２８０７に記載されている方法に準じて行った。
【００３２】
また、前記具体例２によって所期の外液置換が行われていることを確認するため、該具体例２に準じたバッチ処理を５回実施し、各バッチ処理毎で得られた外液置換リポソーム溶液を用いてエタノール濃度及びＮＭＰ濃度を浸透圧から推定した。この浸透圧は、Ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＯＳＭＯＭＥＴＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３Ｄ３（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて測定した。ＮＭＰ濃度及びエタノール濃度と浸透圧は良好な直線関係を示すことが明らかになったことから、直線式を利用して、外液置換リポソーム溶液中に含まれるＮＭＰとエタノールの濃度をそれぞれ算出した。その結果、各バッチ処理毎のエタノール濃度及びＮＭＰ濃度はそれぞれ５２１ｐｐｍ及び４５２ｐｐｍ、６６３ｐｐｍ及び５７６ｐｐｍ、６１５ｐｐｍ及び５３５ｐｐｍ、９９４ｐｐｍ及び８６４ｐｐｍ、９４７ｐｐｍ及び８２２ｐｐｍであり、何れも、ＩＣＨガイドラインにおけるエタノール濃度限界値（５，０００ｐｐｍ）及びＮＭＰ濃度限界値（４，８４０ｐｐｍ）よりも格段低く、人体に対する安全性が十分に確保できていることが確認された。
【００３３】
［具体例３］
この具体例３は、前記具体例２に準じて製造されたアムホテリシンＢリポソームと既存のＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）との製剤学的同等性について検証したものである。尚、製剤学的同等性の指標は薬物／脂質比と粒子径とした。
【００３４】
先ず、６５℃の温度下で、ＤＳＰＧ−Ｎａ６４０．９ｍｇにエタノール４ｍｌ及びＮＭＰ４ｍｌを添加した後に２．５Ｍ塩酸溶液３００μｌを添加してＤＳＰＧ溶液を調製する。また、常温下（１５〜２５℃の範囲内）で、Ａｍｂ３６９．７６ｍｇにＮＭＰ８ｍｌを添加してＡｍｂ溶液を調製する。そして、６５℃の温度下で、２．５Ｍ塩酸溶液を添加して溶解した後のＤＳＰＧ溶液にＡｍｂ溶液を添加し混合して７分保持する。これにより、ＤＳＰＧ−Ａｍｂ複合体を含有した複合体溶液が生成される。
【００３５】
さらに、６５℃の温度下で、ＨＳＰＣ１５７１．６ｍｇ、コレステロール３８６．５ｍｇ及びα−トコフェロール５．０６ｍｇにエタノール１６ｍｌを添加してＨＳＰＣ溶液を調製する。そして、６５℃の温度下で、前記複合体溶液にＨＳＰＣ溶液を添加した後に２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液１７６μｌを添加して３分保持し、続いてｐＨ６．５スクロース−ヒスチジン溶液３２０ｍｌを添加する。これにより、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液が生成される。
【００３６】
そして、前記具体例２と同じ手順で粒子径制御と外液置換を行って、整粒化リポソームを含有した整粒化リポソーム溶液を生成し、続いて外液濃度が調整された外液置換リポソーム溶液を生成する。
【００３７】
一方、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）はその説明書の指示に従って注射用水に溶解後直ちに振とうし、添付の５μｍのフィルターでろ過して４ｍｇ／ｍｌとし、この溶液を５％ブドウ糖注射液で４倍希釈することで１ｍｇ／ｍｌとした。
【００３８】
前記具体例３によって製造されたアムホテリシンＢリポソームがＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）と製剤学的に同等であることを確認するため、各々の対してＡｍｂ定量と脂質定量（ＤＳＰＧ、ＨＳＰＣ及びコレステロールの定量）と粒子径測定を行った。そして、Ａｍｂの定量値と各脂質の定量値から、Ａｍｂ／ＤＳＰＧ＝Ａｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）／ＤＳＰＧ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の式と、Ａｍｂ／ＨＳＰＣ＝Ａｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）／ＨＳＰＣ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の式と、Ａｍｂ／コレステロール＝Ａｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）／コレステロール濃度（ｍｇ／ｍｌ）の式により、薬物／脂質比をそれぞれ算出した。因みに、粒子径測定方法と前式中のＡｍｂ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法は先に述べた通りであり、前式中のＤＳＰＧ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法とＨＳＰＣ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法とコレステロール濃度（ｍｇ／ｍｌ）の定量方法は非特許文献であるＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２０１２，１８１８（１１），２８０１〜２８０７に記載されている方法に準じて行った。
【００３９】
薬物／脂質比の算出結果によれば、前記具体例３によって製造されたアムホテリシンＢリポソームのＡｍｂ／ＤＳＰＧとＡｍｂ／ＨＳＰＣとＡｍｂ／コレステロールはそれぞれ０．５６と０．２３と０．８８であり、一方、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）のＡｍｂ／ＤＳＰＧとＡｍｂ／ＨＳＰＣとＡｍｂ／コレステロールはそれぞれ０．５６と０．２１と０．８５であり、このことから両者の薬物／脂質比が同等であることが確認された。また、粒子径の測定結果によれば、前記具体例３によって製造されたアムホテリシンＢリポソームの平均粒子径は１０９．０ｎｍであり、一方、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の粒子径は平均１０８．２ｎｍであり、このことから両者の粒子径も同等であることが確認された。
【００４０】
以上説明したように、（１）リン脂質に低級アルコール及び非プロトン性極性溶媒を添加した後に酸性化液体を添加して調製したリン脂質溶液に、アムホテリシンＢに非プロトン性極性溶媒を添加して調製したアムホテリシンＢ溶液を添加し混合して、リン脂質−アムホテリシンＢ複合体を含有した複合体溶液を生成するステップと、（２）前記複合体溶液に、第２のリン脂質及びコレステロールに低級アルコールを添加して調製した第２のリン脂質溶液を添加して、粗リポソームを含有した粗リポソーム溶液を生成するステップとを採用することにより、リン脂質溶液、アムホテリシンＢ溶液及び第２のリン脂質溶液の溶媒としてクロロホルムを使用しなくても粗リポソームを形成することができる。換言すれば、前記溶媒として毒性が強いクロロホルムを使用せずに粗リポソームを形成できるので、該クロロホルムを使用した場合に比べて人体に悪影響を与えるリスクを低く抑えたアムホテリシンＢリポソームを提供することができる。
【００４１】
加えて、複合体溶液を生成してから粗リポソーム溶液を生成するまでの過程において従前のようなクロロホルム除去ステップ、具体的にはスプレードライ等の乾燥ステップが不要となるため、製造プロセスを簡略化してコスト削減に貢献することができる。
【００４２】
また、複合体溶液を生成するステップにおいて、リン脂質溶液に含まれるリン脂質と酸性化液体含有の酸性物質とのモル比を、１：０．８〜１：１．２の範囲内とすることにより、複合体の形成に関してアムホテリシンＢを高率で、具体的には８０％以上で回収することができる。
【００４３】
さらに、粗リポソーム溶液を生成するステップにおいて、複合体溶液に第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液のｐＨを調整するｐＨ調整処理、具体的には複合体溶液に第２のリン脂質溶液を添加した後の溶液に酸性度中和液体を添加し、続いてｐＨ緩衝液を添加する処理を採用することにより、粗リポソーム溶液を生成するステップにおいて粗リポソームをより安定に形成することできる。
【００４４】
さらに、複合体溶液を生成するステップと粗リポソーム溶液を生成するステップに続けて、（３）粗リポソーム溶液に粒子径制御処理を施して、整粒化リポソームを含有した整粒化リポソーム溶液を生成するステップを採用することにより、所望の平均粒子径を有するアムホテリシンＢリポソームを提供することができる。
【００４５】
さらに、整粒化リポソーム溶液を生成するステップに続けて、（４）整粒化リポソーム溶液に外液置換処理を施して、外液濃度が調整された外液置換リポソーム溶液を生成するステップを採用することにより、整粒化リポソームの外液（溶媒）に含まれている未封入のアムホテリシンＢや余剰の低級アルコール及び非プロトン性極性溶媒等の不要分を除去すると共に外液濃度を調整して、人体に悪影響を与えるリスクをより一層低く抑えたアムホテリシンＢリポソームを提供することができる。
【００４６】
さらに、複合体溶液を生成するステップと粗リポソーム溶液を生成するステップに続けて、（３）粗リポソーム溶液に粒子径制御処理を施して、整粒化リポソームを含有した整粒化リポソーム溶液を生成するステップと、（４）整粒化リポソーム溶液に外液置換処理を施して、外液濃度が調整された外液置換リポソーム溶液を生成するステップを採用することにより、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）と製剤学的に同等なアムホテリシンＢリポソームを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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