(57)【要約】【課題】表皮細胞に作用して、コーニファイド・エンベロープタンパクの産生を促進するコーニファイド・エンベロープタンパクの産生促進剤を提供する。【解決手段】スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドを有効成分として含有するコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドを有効成分として含有するコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【請求項２】
スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドが、ヒト型セラミドである請求項１に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【請求項３】
スフィンゴイドが、フィトスフィンゴシンである請求項１又は請求項２に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【請求項４】
スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドを分散粒子中に含有する分散組成物である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【請求項５】
さらにオレイン酸を含む請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【請求項６】
コーニファイド・エンベロープタンパクが、インボルクリン及びトランスグルタミナーゼから選択される少なくとも１種のタンパクである請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、物理的、化学的、及び生物学的攻撃に対するバリア機能としての役割を担う、高度に複雑な組織である。これは、脱水からの保護及び体温の制御において重要な役割を果たす。このバリア機能は、表皮の最外層に位置する角質層によって構成される。
角質層の構造は、角質細胞の間を細胞間脂質が埋めている構造であることが知られており、細胞間脂質は、セラミド、コレステロール、及び脂肪酸を含み、高密度なラメラ構造を構築する。そして、年齢、健康、環境状態等の因子により脂質組成の変化が起こるとバリア機能の低下が懸念される。このため、バリア機能低下の抑制を目的として、細胞間脂質に含まれる成分を局所適用して、皮膚の性能が改善することが試みられている。
セラミドは、皮膚角質層に付与することでバリア機能を有することが知られており、例えば、セラミドとコレステロールと遊離脂肪酸を含有する皮膚処置組成物が提案されている（特許文献１）。
一方、表皮細胞の分化過程を促進することにより乾燥肌、しわ、肌荒れ、アトピー性皮膚炎の改善及び予防する目的とし、大豆抽出物、クロラッパタケ抽出物を含有する化粧料が提案されている。当該化粧料としては糖セラミドを含有する例は記載されるものの、表皮細胞の分化過程を促進する機能を有するのは、植物由来成分である大豆抽出物又はクロラッパタケ抽出物である（特許文献２、３）。
【０００３】
セラミドの機能として、肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）及びマウス線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）にて、セラミド（フィト型）で転写因子ＰＰＡＲ（ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体）が活性化させることが報告されているが、検討されたセラミドはいずれも、炭素数２の脂肪族基を有する合成セラミドである（非特許文献１）。
また、表皮細胞にＰＰＡＲ活性剤を適用すると細胞の分化が促進されることが記載されている（非特許文献２）。
【０００４】
表皮細胞のコーニファイド・エンベロープタンパクの形成が十分に行われない場合には、角質層の物理的強度が異常となる。例えば、過増殖を伴った荒れ肌、アトピー性皮膚炎等では、コーニファイド・エンベロープタンパクの形成不全が認められている（非特許文献３）。
従って、コーニファイド・エンベロープタンパク、例えば、インボルクリン及びトランスグルタミナーゼは、表皮細胞における角質層の物理的強度の維持、防御機能の維持と密接な関係があり、非常に重要なタンパクである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５０５８８６号公報
【特許文献２】特表２０１０−５２９９６０号公報
【特許文献３】特開２００５−０８９３８９公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｉｐｉｄｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ．  ２０１１  Ａｕｇ  ２４；１０：１５０．
【非特許文献２】Ｄｅｒｍａｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２０１１  Ａｐｒ；３（２）：１１３−８．
【非特許文献３】Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１  Ｆｅｂ；１０（１）：３５−４４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
セラミドは角質層の細胞間脂質成分として物理的なバリアを形成し、バリア機能を有することは知られている。他方、角質層の内部に位置する正常表皮細胞における特定のタンパク質の産生促進作用については未だ十分に解明されていない。セラミドについても、炭素数２、６、及び８の脂肪族基を有する合成セラミドについての検討がなされるものの、十分な知見を得るに至っていないのが現状である。
【０００８】
本発明の目的は、表皮細胞に作用して、コーニファイド・エンベロープタンパクの産生を促進する新規なコーニファイド・エンベロープタンパクの産生促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、詳細な検討をおこなった結果、炭素数９以上の脂肪酸とスフィンゴイドのエステル体であるセラミドが、角化細胞内のコーニファイド・エンベロープタンパクと呼ばれる裏打ちタンパクの産生を促進させることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］  スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドを有効成分として含有するコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
［２］  スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドがヒト型セラミドである［１］に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
［３］  スフィンゴイドがフィトスフィンゴシンである［１］又は［２］に記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
［４］  スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドを分散粒子中に含有する分散組成物である［１］〜［３］のいずれか１つに記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
［５］  さらにオレイン酸を含む［１］〜［４］のいずれか１つに記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
［６］  コーニファイド・エンベロープタンパクが、インボルクリン及びトランスグルタミナーゼから選択される少なくとも１種のタンパクである［１］〜［５］のいずれか１つに記載のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、表皮細胞に作用して、コーニファイド・エンベロープタンパクの産生を促進する、新規なコーニファイド・エンベロープタンパクの産生促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例４にかかる単層培養細胞におけるトランスグルタミナーゼタンパクの発現量を示したグラフである。
【図２】実施例５にかかる表皮モデルにおけるインボルクリンタンパクの発現量を示したグラフである。
【図３】実施例６にかかる表皮モデルにおけるトランスグルタミナーゼタンパクの発現量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤(以下、「タンパク産生促進剤」と称することがある）は、スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミド（以下、「特定セラミド」と称することがある）を有効成分として含有する。
本発明のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤が表皮細胞に作用して、コーニファイド・エンベロープタンパクの産生を促進することで、表皮細胞を賦活化し、乾燥肌、しわ、肌荒れの改善効果が期待される。
【００１４】
なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
＜スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミド＞
本発明のコーニファイド・エンベロープタンパクの産生促進剤が有効成分として含有するセラミドは、スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体である。
セラミドは、スフィンゴイドと脂肪酸とのエステルであり、特定セラミドを構成するスフィンゴイドとしては、ジヒドロスフィンゴシン、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、６−ジヒドロキシスフィンゴシン等が挙げられる。
特定セラミドを構成する炭素数９以上の脂肪酸としては、炭素数９〜３０の脂肪族基を有する脂肪酸が好ましく、炭素数１６〜２４の脂肪酸がより好ましい。
脂肪酸としては、直鎖脂肪族基を有する脂肪酸であってもよく、炭素鎖中に炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を含んだ不飽和脂肪酸であってもよく、α−ヒドロキシ脂肪酸であってもよく、直鎖状のω−ヒドロキシ飽和脂肪酸のω末端に、リノール酸、ステアリン酸等の直鎖状の脂肪酸がエステル結合した構造を有するω−ヒドロキシ脂肪酸であってもよい。
【００１６】
本発明に係る特定セラミドは、スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体である限り、特に制限はない。
特定セラミドとしては、人の表皮細胞に含まれるのと同様の構造、又は類似の構造を有するヒト型セラミドが好ましく、ヒト型セラミドとしては、フィトスフィンゴシンと脂肪酸とのエステルであるフィトセラミドがより好ましい。
本発明の作用は明確ではないが、以下のように推定される。スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドは、角質層に付与された場合、角質層の角質細胞間に存在する細胞間脂質に含まれるヒト型セラミド或いは共存する他の細胞間物質に対する親和性が良好であることで、他の構造を有するセラミドと比較して、角質層を通過しやすい。このため、表皮細胞におけるタンパク生産に寄与する部位への到達が容易であることが考えられる。さらに、特定セラミドが表皮細胞に到達した場合においても、生体への親和性に起因して、タンパク産生促進効果が効率よく得られると考えられる。
一方、スフィンゴイドとエステル体を形成する脂肪酸において、炭素数が９未満、例えば、炭素数２、６、及び８等の炭素鎖を有する脂肪酸では、スフィンゴイドとエステル体を形成してセラミドを得たとしても、得られたセラミドは、予想外なことに本発明の効果を奏し得ない。
【００１７】
特定セラミドは、天然型セラミドであっても、合成セラミドであってもよく、また、合成品、抽出品等の由来は問わない。本発明における特定セラミドとは、後述する天然型セラミド及びこれを基本骨格として有する化合物であって、スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドを包含し、天然型セラミド、合成セラミドを総称したものである。
なお、特定セラミドは、本発明の効果を損なわない範囲において、溶解性を付与するために分子内に炭素−炭素多重結合を有していてもよく、浸透性を向上させるために疎水基を導入したり等、置換基を有していてもよい。導入可能な置換基としては、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、ニトロ基、スルホニル基、リン酸基、水酸基、アシルオキシ基、アルコキシ基等が挙げられる。
以下、本発明における特定セラミドについて詳述する。
【００１８】
（天然型セラミド）
本発明において、天然型セラミドとは、ヒトの皮膚の角質層に存在するセラミドと同じ構造又は類似の構造を有するヒト型セラミドのことを意味する。
以下、本発明に用いうる天然型セラミドについて詳細に説明する。
【００１９】
本発明におけるセラミドとして好適に用いることのできる天然型セラミドとしては、Ceramide 1、Ceramide 4、Ceramide 9、Ceramide 2、Ceramide 3、Ceramide 3B、Ceramide 5、Ceramide 6、Ceramide 7、Ceramide 8、Ceramide 10等を挙げることができる。
【００２０】
また、溶解性を付与するために分子内に二重結合を導入することや、浸透性を付与するために疎水基を導入すること等、目的に応じて、上記特定セラミドに修飾を加えたものを用いることもできる。
【００２１】
これら天然型と称される一般的な構造を有するセラミドは、天然物（抽出物）、微生物発酵法で得られたセラミドであるが、合成物、動物由来のセラミドをさらに含んでもよい。
これらのセラミドは天然型（Ｄ（−）体）の光学活性体であることが好ましい。本発明に用いられる特定セラミドの相対立体配置は、天然型の立体配置であり、天然型の立体配置のセラミドとそれ以外の非天然型の立体配置のセラミドとの混合物でもよい。
なかでも、効果の観点から、天然型の光学活性体をより多く使用することが好ましい。
【００２２】
このような天然型セラミドは、市販品としても入手可能であり、例えば、Ceramide I、Ceramide III、Ceramide IIIＡ、Ceramide IIIＢ、Ceramide IIIＣ、Ceramide VI（以上、コスモファーム社製）、Ceramide TIC-001（高砂香料社製）、CERAMIDE II（Quest International社製）、DS-Ceramide VI、DS-CLA-Phytoceramide、Ｃ6-Phytoceramide、DS-ceramide Y3S（DOOSAN社製）、CERAMIDE２(セダーマ社製)、「セラミド３」〔商品名、エボニック社製〕、「セラミド６」〔商品名、エボニック社製〕等が挙げられる。
【００２３】
（合成セラミド）
セラミド類似体は、セラミドの構造を模倣して合成されたものである。このような合成セラミドの公知の化合物としては、例えば、下記構造式に示されるような合成セラミド（３−１）及び（３−２）を挙げることができる。
【００２４】
【化１】
2015221755.tif 000002
【００２５】
合成セラミドを適用する場合には、天然型セラミドや糖修飾セラミドの構造を模倣して合成され、セラミドを構成する脂肪酸の炭素数が９以上の合成セラミドであれば、本発明に使用することができ、天然型セラミドの構造を模倣して合成された合成セラミドであることが好ましい。合成セラミドは、市販品としても入手可能である。例えば、上記例示化合物（３−２）（セチルヒドロキシプロリンパルミタミド）は、symrise株式会社製「CeramideBio」（商品名）として入手可能である。
【００２６】
以下に、本発明においてコーニファイド・エンベロープタンパクの産生促進剤の有効成分として有用な特定セラミドを構成する脂肪酸の好ましい例を挙げるが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００２７】
【化２】
2015221755.tif 000003
【００２８】
上記脂肪酸とエステル体を形成し、特定セラミドとなりうるスフィンゴイドの例を挙げる。
【００２９】
【化３】
2015221755.tif 000004
【００３０】
特定セラミドとしては、ジヒドロスフィンゴシン［ＤＳ］と脂肪酸［Ｎ］とのエステル（以下、セラミド［ＮＤＳ］と称する）、ジヒドロスフィンゴシン［ＤＳ］とα−ヒドロキシ脂肪酸［Ａ］とのエステル（以下、セラミド［ＡＤＳ］と称する）、フィトスフィンゴシン［Ｐ］と脂肪酸［Ｎ］とのエステル（以下、セラミド［ＮＰ］と称する）、フィトスフィンゴシン［Ｐ］とα−ヒドロキシ脂肪酸［Ａ］とのエステル（以下、セラミド［ＡＰ］と称する）等が好ましく、なかでも、フィトセラミドに包含されるセラミド［ＮＰ］、セラミド［ＡＰ］等がより好ましい。
以下に、本発明に使用しうる代表的な特定セラミドとして、炭素数１８のスフィンゴシンと炭素数１８の直鎖脂肪酸とのエステルである化合物を挙げる。下記化合物においては、エステル結合部位を破線で示す。
【００３１】
【化４】
2015221755.tif 000005
【００３２】
本発明に好適に使用されるヒト型セラミドとしては、セラミド３、セラミド３Ｂ、セラミド６、セラミド１０等が挙げられる。代表的なセラミドとして、以下にセラミド３、及びセラミド３Ｂの構造を示す。
【００３３】
【化５】
2015221755.tif 000006
【００３４】
本発明のタンパク産生促進剤には、スフィンゴイドと炭素数９以上の脂肪酸とのエステル体であるセラミドから選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有していればよく、２種以上を含有していてもよい。特定セラミドは一般に融点が高く、結晶性が高いことから、２種以上併用することが、分散安定性、取り扱い性が向上する点で好ましい。
【００３５】
本発明のタンパク産生促進剤を作用させる表皮細胞は、特に断らない限り正常表皮細胞を指し、正常表皮細胞とは、癌化していない表皮細胞のことを指す。表皮細胞には、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、α樹状細胞、メルケル細胞が含まれる。
【００３６】
本発明のタンパク産生促進剤は、正常な表皮細胞に作用してコーニファイド・エンベロープタンパクの産生を促進させることができる。これにより、表皮細胞においてコーニファイド・エンベロープタンパクと呼ばれる裏打ちタンパクの産生が促進される。コーニファイド・エンベロープタンパクは裏打ちタンパクとも呼ばれ、コーニファイド・エンベロープタンパクが増加することで、細胞膜が良好な状態に維持され、細胞間脂質ラメラ構造の形成にも寄与する。
【００３７】
＜コーニファイド・エンベロープタンパク＞
角質層の構造の中で、バリア機能にとって重要な要素としては、角化細胞内のケラチン・フィラグリン溶解産物、コーニファイド・エンベロープタンパクと呼ばれる裏打ちタンパクの結合により厚くなった細胞膜、及び、角質層細胞間脂質層等が挙げられる。
本発明では、これらの種々の重要な要素の中でも、コーニファイド・エンベロープタンパクが、バリア機能に優れていることを見出した。コーニファイド・エンベロープタンパクとしては、インボルクリン及びトランスグルタミナーゼから選択される少なくとも１種のタンパクであることが好ましい。
【００３８】
（インボルクリン）
インボルクリンはコーニファイド・エンベロープにおいて最外層に位置する構成タンパク質である（Ｓｔｅｉｎｅｒｔ，ＰＭ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５  Ｊｕｌ  ２８；２７０（３０）：１７７０２−１１）。
インボルクリンは、ロリクリン等のその他のタンパク質とトランスグルタミナーゼ等の酵素によって架橋されるだけでなく、細胞間脂質であるセラミドと共有結合をし、細胞間脂質ラメラ構造の形成にも非常に重要であることが報告されている（Ｎｅｍｅｓ，  Ｚ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９９  Ｊｕｌ  ２０；９６（１５）：８４０２−７）。また、インボルクリンは表皮細胞の分化過程で特異的に細胞膜の近傍に、コーニファイド・エンベロープタンパク形成の前段階に産生され、表皮細胞分化マーカーと考えられている。
【００３９】
（トランスグルタミナーゼ）
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）は、カルシウム依存的にタンパク質のグルタミン酸残基とリジン残基との間にイソペプチド結合を形成する反応を触媒する。この生理的意義は、血液凝固、細胞死、形態形成、細胞外マトリクスの強化と幅広い。ＴＧａｓｅはヒトにおいてはこれまで９種のアイソザイムの存在が報告されているが、表皮細胞には主にＴＧａｓｅ１、ＴＧａｓｅ３が存在する。皮膚表皮の形成は、深層の未分化な前駆細胞が分化して、角化した表皮細胞として表層に押し出されることによって達成される。この分化に伴い、細胞内タンパク質がＴＧａｓｅにより共有結合的に架橋され、硬度化（角質化）が生じ、外部に対し強力なバリアとして機能する。表皮細胞のＴＧａｓｅは、未分化な段階では不活性な前駆体型で存在し、分化に伴い限定分解され、活性型に変化して活性を有する（人見  清隆  著『皮膚表皮におけるタンパク質架橋酵素（トランスグルタミナーゼ）の活性化機構の解析』）。
【００４０】
本発明のタンパク産生促進剤は、表皮細胞に付与することで、付与しない場合に比べて、表皮細胞におけるコーニファイド・エンベロープタンパクの産生量を増加させることができる。このため、本発明のタンパク産生促進剤により、表皮細胞の賦活化による皮膚ターンオーバーの改善、皮膚の乾燥防止、乾燥等によるしわの発生防止、肌荒れの改善等の効果が期待できる。
【００４１】
表皮細胞におけるコーニファイド・エンベロープタンパクの産生量の測定方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。具体的には、本発明のタンパク産生促進剤を付与した培養細胞又は市販の三次元表皮モデルからタンパク質を抽出し、分光光度法、免疫染色法等の分析に供する方法、核酸を抽出し、関連遺伝子をＰＣＲ法等の分析に供する方法等が挙げられる。
抽出と分析方法の一例を、単層培養系におけるタンパク産生量の測定法を挙げて説明する。測定条件の詳細は、実施例にて説明する。
【００４２】
正常ヒト包皮由来表皮角化細胞を、培地を用いて培養し、細胞を剥離して、アッセイ培地等にて再分散し、播種する。その後、１日培養した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した被検物質であるセラミド溶液等を１％添加した培地に置換し、さらに２日間培養する。ＰＢＳにて洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを加え、細胞を剥離し、回収する。回収した細胞を４℃にて一晩静置後、水浴中で３０分間超音波処理し、タンパク質を抽出する。遠心処理し、上清を回収して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｒａｐｉｄ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）にてタンパク量を定量する方法にてタンパクの産生量を測定することができる。
培養細胞として、例えば正常ヒト包皮由来表皮角化細胞（ライフテクノロジーズ社）、正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ社）等が挙げられる。
市販の三次元表皮モデルとしては、ＬａｂｏＣｙｔｅ  Ｅｐｉｍｏｄｅｌ（Ｊ−ＴＥＣ社）、ＥＰＩ−２００（クラボウ社）、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＴＯＹＯＢＯ社）等が挙げられる。
【００４３】
本発明のタンパク産生促進剤を表皮細胞に付与させるときに、タンパク産生促進剤に含有される特定セラミドの量は、正常表皮細胞のタンパク量１ｇ当たり０．０１ｍｇ〜１０００００ｍｇが好ましく、０．１ｍｇ〜１００００ｍｇがより好ましく、１ｍｇ〜１０００ｍｇがさらに好ましい。
【００４４】
本発明のタンパク産生促進剤を例えば、分散組成物の如き、特定セラミドを含有する組成物の形態で用いる場合、当該組成物における特定セラミドの含有量は、剤型によって異なる。
一般に、特定セラミドの含有量は、組成物の全質量に対して、好ましくは０．０００５質量％〜１０質量％であり、より好ましくは０．００１質量％〜５質量％であり、さらに好ましくは０．００５質量％〜１質量％である。
【００４５】
本発明のタンパク産生促進剤を使用する場合、タンパク産生促進剤の形態には特に制限はない。既述のセラミドの他、後述する他の成分（医薬や化粧品として許容可能な担体、又は必要に応じた他の任意成分）を含む組成物の形態としてもよい。
組成物の形態としては、オイル組成物、分散組成物、又は粉末組成物等が挙げられる。オイル組成物、分散組成物、及び粉末組成物は、公知の方法に従い調製することができる。
従来公知のセラミドの使用法では、角質層におけるバリア機能を付与すれば効果が得られるため、適用部位である角質層に付与しうるものであれば種々の剤型を選択することができた。一方、本発明のコーニファイド・エンベロープタンパク産生促進剤は、セラミドが角質層を通過して正常表皮細胞に効率よく作用することが好ましく、角質層を通過させ、表皮細胞まで到達させ、コーニファイド・エンベロープタンパクの産生促進機能を効率よく発現させるための態様とすることが好ましい。
表皮細胞に到達しやすい製剤の態様の一つとして、例えば、セラミドを分散組成物における分散粒子として含有する態様が挙げられる。このとき、分散粒子の粒子径を小さくすることが、皮膚に付与した際の浸透性の観点から好ましい。
また、本発明のタンパク産生促進剤の効果を損なわない範囲で、分散組成物に尿素等の経皮吸収剤を含有させる態様も適用することができる。
【００４６】
本発明のタンパク産生促進剤を含む組成物に含有される他の成分は、組成物の形態、目的等に応じて適宜選択することができる。他の成分の好適な例としては、例えば、機能性油性成分、乳化剤、その他の添加成分等が挙げられる。
【００４７】
＜分散組成物＞
本発明のタンパク産生促進剤の好ましい態様の一つである分散組成物について説明する。
本発明においては、特定セラミドの浸透性を向上させ、機能を十分に発揮させるための一つの態様として、以下に記載するような分散組成物が挙げられる。
【００４８】
分散組成物としては、特定セラミドを含有し、油相として水相中に分散する油相成分である分散粒子と、分散媒としての水相成分と、を含む態様が挙げられる。（以下、特定セラミドを含有する油相である分散粒子を、「特定セラミド含有粒子」と称することがある。）
特定セラミド含有粒子は、他の油性成分を含んでいてもよい。
以下、分散組成物が含み得る特定セラミド以外の成分について説明する。
【００４９】
（他の油性成分）
本発明のタンパク産生促進剤が分散組成物の形態をとる場合、水相中に、特定セラミド含有粒子（油相）を分散させて構成される。油相中には、特定セラミドとは異なる油性成分（以下、「他の油性成分」と称することがある。）及び溶媒から選択される少なくとも１種を含有させて、油性成分及び溶媒の少なくともいずれかの中に、特定セラミドを含む油滴様の分散粒子が存在する形態をとることができる。なお、分散粒子に特定セラミド以外の成分を含む形態をとる場合、本発明における特定セラミド含有粒子の平均粒径とは、特定セラミドを含む油相からなる分散粒子の平均粒径を意味する。
【００５０】
なお、本発明における「他の油性成分」とは、常温では、特定セラミドと分離しない油性成分を指し、「溶媒」とは特定セラミドを溶解できる溶媒のことをいい、例えばアルコール等が挙げられる。
【００５１】
併用可能な他の油性成分としては、以下に示す機能性油性成分等が挙げられる。
（機能性油性成分）
機能性油性成分としては、水性媒体に溶解せず、油性媒体に溶解する油溶性成分であれば、特に限定はなく、目的に応じた物性又は機能性を有するものを適宜選択して使用することができる。
他の油性成分としては、通常、紫外線吸収剤、抗炎症剤、保湿剤、毛髪保護剤、美白剤、抗シミ剤、細胞賦活剤、エモリエント剤、角質溶解剤、帯電防止剤、脂溶性ビタミン等として使用されているものが挙げられる。
使用可能な油性成分としての機能性油性成分は、より具体的には、カロチノイド、トコフェロール等の油溶性ビタミンを含むラジカル捕捉剤、またココナッツ油等の油脂が挙げられる。
ここで、機能性油性成分とは、生物体内に存在する場合に生体において所望の生理学的作用の発揮が期待され得る油性成分を意味する。
【００５２】
（水）
本発明のタンパク産生促進剤が分散組成物の形態をとる場合、連続相としての水相には水を含むことができる。特定セラミド含有分散粒子は分散相として、連続相としての水相中に存在する。
本発明において使用される水としては、純水、イオン交換水等の不純物が少ない水であることが好ましい。
【００５３】
水相には、水が含まれていればよいが、水溶性成分、水と混和しうる成分等、水以外の成分を含んでいてもよい。水相が含みうる水以外の成分は特に限定されるものではなく、例えば、分散組成物の製造において、連続相に通常添加され得る水溶性の公知の成分が挙げられる。
【００５４】
（分散剤、又は乳化剤）
分散組成物には、セラミド含有粒子の分散安定性を向上させるため、レシチン、脂肪酸、界面活性剤、高分子分散剤、塩等の公知の分散剤又は乳化剤を含有させることができる。
【００５５】
（その他の添加成分）
分散組成物には、既述の他の油性成分、水、及び分散剤等以外に、医薬品、機能性食品又は化粧品等の分野において通常用いられる添加成分を、目的に応じて適宜含有させることができる。他の添加成分は、その特性によって、油溶性又は水溶性の添加成分として、本発明のタンパク産生促進剤に含有させることができる。
【００５６】
その他の添加成分としては、例えば、グリセリン、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；グルコース、果糖、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ペクチン、カッパーカラギーナン、ローカストビーンガム、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアガム、キサンタンガム、カラヤガム、タマリンド種子多糖、アラビアガム、トラガカントガム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストリン等の単糖類又は多糖類；ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクトース、マルトトリイトール、キシリトール等の糖アルコール；塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機塩；カゼイン、アルブミン、メチル化コラーゲン、加水分解コラーゲン、水溶性コラーゲン、ゼラチン等の分子量５０００超のタンパク質；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン等のアミノ酸及びそれらの誘導体；カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、酸化エチレン・酸化プロピレンブロック共重合体等の合成高分子；ヒドロキシエチルセルロース・メチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体；等を挙げることができる。
既述のその他の添加成分は、その機能に基づいて、例えば機能性成分、賦形剤、粘度調整剤又はラジカル捕捉剤等として含んでもよい。
本発明のタンパク産生促進剤が分散組成物の形態をとる場合においては、例えば、種々の薬効成分、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、着色剤等、通常、その用途で使用される他の添加物を併用することができる。
【００５７】
＜分散組成物の製造方法＞
特定セラミド含有粒子の形成態様としては、特に限定されるものではないが、１）特定セラミド含有粒子（油相）を予め固体粒子として形成した後、分散媒（水相）に分散させる態様、２）特定セラミドを加熱して溶融状態とするか、或いは、適切な溶剤に溶解して液状とした後、水相に添加して分散させ、その後、常温に降温するか、或いは、溶剤を除去することで、特定セラミド含有粒子を系中で形成する態様、等が挙げられる。
特定セラミドは、単独で油相として分散粒子を形成してもよいが、分散安定性等の観点からは、特定セラミドを他の油性成分と相溶させるか、有機溶剤に溶解して油相を調製する方法が好ましい。
【００５８】
特定セラミド含有粒子を含む分散組成物は、水相中に分散された油相としての特定セラミド含有粒子を含む特定セラミド含有粒子の分散組成物であり、少なくとも特定セラミドを含む油相成分と、水相成分と、を常法により撹拌、混合することを含む製造方法により得ることができる。
【００５９】
油相を調製する際には、水溶性有機溶媒を好ましく用いることができる。水溶性有機溶媒としては、水に対する２５℃での溶解度が１０質量％以上の有機溶媒を指す。得られる分散組成物の安定性の観点から、油相の調製に用いる水溶性有機溶媒の水に対する溶解度は、３０質量％以上が好ましく、５０質量％以上がより好ましい。
【００６０】
水溶性有機溶媒は、単独で用いてもよく、複数の水溶性有機溶媒を併用してもよい。また、水と水溶性有機溶媒とを併用してもよい。水と併用する場合には、水溶性有機溶媒は、少なくとも５０容量％以上含まれていることが好ましく、７０容量％以上であることがより好ましい。
【００６１】
水溶性有機溶媒は、分散組成物の製造において、特定セラミドを含む分散組成物を調製する際に、油相成分を混合して油相を調製するために好ましく用いられ、水相との混合後には除去されることが好ましい。
【００６２】
水溶性有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチルエチルケトン、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル、酢酸メチル、アセト酢酸メチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール等及びそれらの混合物が挙げられる。
これらの中でも、エタノール、エタノールと水との混合溶媒、プロピレングリコール、アセトン等が好ましく、エタノール、エタノールと水との混合溶媒がより好ましい。
【００６３】
水相成分と特定セラミドを含有する油相成分とを混合して分散組成物を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の分散方法、乳化方法を適宜用いることができる。なお、分散粒子の粒子径をより小さくするという観点からは、１００ＭＰａ以上の剪断力を付加する高圧乳化法や、水相成分に油相成分を直接注入するジェット注入法等を用いてもよい。
特定セラミド含有粒子の粒子径をより小さくし、分散安定性、保存安定性をより向上させる観点から、油相成分及び水相成分を各々独立に、最も狭い部分の断面積が１μｍ２〜１ｍｍ２であるマイクロ流路にそれぞれ独立して通過させた後に組み合わせて混合するマイクロミキサーを用いた方法を用いることも好ましい。
このとき、水相の粘度は３０ｍＰａ・ｓ以下であることが、特定セラミド含有粒子の微粒子化の観点から好ましい。
【００６４】
分散組成物を調製する際における油相と水相との比率（質量）は、特に限定されるものではないが、油相／水相比率（質量％）として０．１／９９．９〜５０／５０が好ましく、０．５／９９．５〜３０／７０がより好ましく、１／９９〜２０／８０がさらに好ましい。
油相／水相比率を上記範囲とすることにより、有効成分を充分に含み、実用上充分な分散安定性が得られるため好ましい。
【００６５】
（特定セラミド含有粒子の粒径）
特定セラミド含有粒子の体積平均粒径は、特定セラミド含有粒子の安定性及び角質層への浸透性を向上するという観点から、好ましくは５００ｎｍ以下であり、より好ましくは２ｎｍ以上１５０ｎｍ以下であり、３ｎｍ以上１５０ｎｍ以下がさらに好ましく、５ｎｍ以上１２０ｎｍ以下がさらにより好ましく、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下が最も好ましい。
【００６６】
本発明における分散粒子の粒径は、市販の種々の粒度分布計等で計測可能であるが、粒径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を適用したものとする。
動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられる。
【００６７】
本発明における分散粒子の粒径は、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）を用いて測定した値であり、具体的には、以下のよう計測した値を採用する。
即ち、粒径の測定方法は、本発明に係る分散組成物から分取した試料に含まれる油性成分の濃度が１質量％になるように純水で希釈を行い、石英セルを用いて測定を行う。粒径は、試料屈折率として１．６００、分散媒屈折率として１．３３３（純水）、分散媒の粘度として純水の粘度を設定した時の体積平均径として求めることができる。
【００６８】
特定セラミドは結晶性が高いため、分散組成物として調製しても、希釈したり、機能性油分等の一般的な皮膚外用剤、化粧料の成分と混合した場合に、乳濁したり析出物を発生したりする場合がある。
本発明においては、特定セラミドの浸透性を向上させ、機能を十分に発揮させるための例として、以下に記載するような実施形態の分散組成物を適用することができる。
【００６９】
以下に詳述する分散組成物の実施形態を、分散組成物の「第１の態様」と称する。
分散組成物の第１の態様としては、（Ａ）特定セラミドを含有し、油相として水相中に分散する特定セラミド含有分散粒子と、（Ｂ）脂肪酸及び脂肪酸塩から選ばれる少なくとも一つの脂肪酸成分と、（Ｃ）ＩＯＢが２．２以上であり、且つ組成物中での全含有量が３質量％以上２０質量％以下である第一の多価アルコール、及び、ＩＯＢが２．０以下であり、且つ組成物中での全含有量が０又は３質量％以下である第二の多価アルコールを含む多価アルコール成分と、を含み、分散組成物の全量に対する界面活性剤の総含有量が０であるか、又は１質量％以下であり、特定セラミドの総含有量が脂肪酸成分の総含有量の３．０倍以上である分散組成物が挙げられる。
【００７０】
（Ｂ）脂肪酸成分が、ラウリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、γリノレン酸、αリノレン酸及びそれらの塩からなる群より選択された少なくとも１種であることが好ましく、分散安定性の観点から、オレイン酸であることが特に好ましい。
【００７１】
脂肪酸成分として脂肪酸塩を適用する場合、脂肪酸塩を構成する塩構造としては、ナトリウム、カリウム等の金属塩や、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸塩、トリエタノールアミン等のアルカノールアミン塩等が挙げられる。塩の種類は、用いられる脂肪酸の種類等により適宜選択されるが、溶解性及び分散性の観点からは、ナトリウム塩等の金属塩が好ましい。
【００７２】
本発明に係る分散組成物において、脂肪酸成分は、特定セラミドを良好に分散可能にする量で含有されていればよく、保存安定性及び浸透性の観点から、特定セラミドの組成物中の全質量は、脂肪酸成分の全質量の３．０倍以上であることが好ましく、３．０倍以上１００倍以下であることがより好ましく、４．０倍以上２０倍以下であることがさらに好ましい。上記範囲とすることで、過剰な脂肪酸の分離、析出を抑制することができ、脂肪酸成分の特定セラミド分散粒子への定着が充分となり、好ましい。
【００７３】
また、分散組成物における分散粒子のサイズを小さくし、組成物の透明性を向上させる観点からは、脂肪酸成分の含有量は、全組成物に対し、質量換算で０．００００１質量％以上３．０質量％以下であることが好ましく、０．００００５質量％以上２．０質量％以下であることがより好ましい。
【００７４】
（Ｃ）多価アルコール成分としては、ＩＯＢが２．２以上且つ組成物中での全含有量が３質量％以上２０質量％以下である第一の多価アルコールと、ＩＯＢが２．０以下且つ組成物中での全含有量が０又は３質量％以下である第二の多価アルコールとを含む。本発明では、このようにＩＯＢが異なる２種の多価アルコール成分のうち、ＩＯＢが高い第一の多価アルコールを、ＩＯＢの低い第二の多価アルコールによりも多量に含むので、特定セラミド含有分散粒子の凝集発生を効果的に抑制し、分散安定性を良好なものにする。
なお、本発明において「多価アルコール」とは化合物中に水酸基を２以上有し、２５℃で液体の物質を意味する。
【００７５】
ここで、ＩＯＢ（Inorganic Organic Balance）とは、有機概念図に基づき求められる無機性値及び有機性値の比を表わす値として周知であり、油性基剤の極性の度合いを表し、下記の式（Ｉ）で表される。［「有機化合物の予測と有機概念図」、藤田（化学の領域１１−１０）、１９５７年、ｐ．７１９〜７２５、「有機概念図による乳化処方設計」日本エマルジョン株式会社、矢口、１９８５年、ｐ．９８］に従って、具体的には、下記式（Ｉ）により求められる。
ＩＯＢ＝無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）      （Ｉ）
【００７６】
本発明では、第一の多価アルコールは、ＩＯＢが２．２以上のものである。分散粒子安定性の観点からＩＯＢが２．４以上のものが好ましく、２．８以上のものがより好ましく、３．２以上のものが最も好ましい。
ＩＯＢが２．２以上の第一の多価アルコールとしては、プロピレングリコール（ＩＯＢ＝３．３３）、グリセリン（ＩＯＢ＝５．００）、１，３−ブチレングリコール（ＩＯＢ＝２．５）、ジグリセリン（ＩＯＢ＝３．５）等、又はこれらの２つ以上の組み合わせを挙げることができる。なかでも、グリセリンが好ましい。
【００７７】
第二の多価アルコールは、ＩＯＢが２．０以下の化合物である。第二の多価アルコールとしては、粒子安定性の観点からＩＯＢが１．０以上２．０以下のものが好ましく、１．５以上、２．０以下であることが最も好ましい。
このような第二の多価アルコールとしては、イソプレングリコール（ＩＯＢ＝２．００）、ジプロピレングリコール（ＩＯＢ＝１．８３）、エトキシジグリコール（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）（ＩＯＢ＝１．６３）ペンチレングリコール（ＩＯＢ＝２．００）、ヘキシレングリコール（ＩＯＢ＝１．８２）等、又はこれらの２つ以上の組み合わせを挙げることができる。
【００７８】
第一の多価アルコールの分散組成物における含有量は、３質量％以上２０質量％以下である。第一の多価アルコールの含有量が３質量％以下では、第一の多価アルコールによる保湿効果が期待できない。また、第一の多価アルコールの含有量が２０質量％以上であると、粒子安定性が悪化し、透明感が低下するため好ましくない。第一の多価アルコールの含有量は、５．０質量％〜１５．０質量％であることがより好ましい。
【００７９】
第二の多価アルコールの分散組成物における含有量は、３質量％以下である。３質量％以下とすることにより、分散組成物の溶液安定性を損なうことがない。粒子安定性の観点から、第二の多価アルコールの含有量は、０．０質量％〜２．０質量％であることが好ましく、０．０質量％〜１．０質量％であることがより好ましく、０、即ち分散組成物中に含まれないことが特に好ましい。
また、溶液安定性の観点から、第二の多価アルコールの含有量は、第一の多価アルコールの全含有量の８０質量％以下であることが好ましく、５０質量％以下であることがさらに好ましく、０であることが特に好ましい。
【００８０】
また、第一の多価アルコールの分散組成物における含有量は、安定性と保湿性付与の観点より、特定セラミドの全質量の３倍〜１０００倍であることが好ましく、５倍〜１０００倍であることがより好ましく、１０倍〜１０００倍であることがさらに好ましい。
第一の多価アルコールとしては、グリセリン、及び１，３−ブチレングリコールから選ばれる少なくとも１種であり、分散組成物に含まれる特定セラミドを含む分散粒子の体積平均粒径が５００ｎｍ以下であることが好ましい態様である。
【００８１】
このような分散組成物は、少なくとも特定セラミドを含む油相成分と、水相成分と、を４０℃以下の温度で混合して、多価アルコール成分を水相成分として有する特定セラミド分散物を得ること、得られた特定セラミド分散物と、水性組成物とを混合することを含む製造方法により得ることができる。
【００８２】
第１の態様における分散組成物には、脂肪酸成分には包含されない界面活性剤を含有してもよい。
界面活性剤の含有量は０、又は分散組成物の全質量の１質量％以下である。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、非イオン性界面活性剤の分散組成物中の含有量は、特定セラミドの全質量に対して１０倍〜１００倍であってもよい。
非イオン性界面活性剤の例としては、グリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤は、分散組成物における油相成分として含有することができる。
分散組成物が非イオン性界面活性剤を含有する場合、非イオン性界面活性剤の含有量は、分散粒子の微細化の観点から分散組成物の全質量に対して１質量％以下であり、好ましくは０．５質量％以下であり、また０．３質量％以上であることが好ましい。
【００８３】
このような非イオン性界面活性剤のなかでも、乳化安定性の観点からポリグリセリン酸脂肪酸エステルが好ましく、特にＨＬＢが１０以上１６以下のポリグリセリン脂肪酸エステルがより好ましい。
ＨＬＢが１０以上１６以下のポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤は、油相／水相の界面張力を大きく下げることができ、その結果、油相として分散組成物中に含まれる特定セラミド含有粒子の粒径を細かくすることができる。
【００８４】
ここで、ＨＬＢは、通常、界面活性剤の分野で使用される親水性−疎水性のバランスで、通常用いる計算式、例えば川上式等が使用できる。本発明においては、下記の川上式を採用する。
ＨＬＢ＝７＋１１．７ｌｏｇ（Ｍｗ／ＭＯ）
ここで、Ｍｗは親水基の分子量、ＭＯは疎水基の分子量である。
【００８５】
また、カタログ等に記載されているＨＬＢの数値を使用してもよい。また、上記の式からも分かるように、ＨＬＢの加成性を利用して、任意のＨＬＢ値の界面活性剤を得ることができる。
【００８６】
分散組成物の第１の態様においても、既述のように、特定セラミド含有粒子を、水相に分散させて油相として構成することが好ましい。また、分散された油相中に特定セラミドに加え、他の油性成分及び溶媒から選択される少なくとも１種を含有させて、油性成分及び溶媒の少なくともいずれかの中に、特定セラミドを含む油滴様の分散粒子が存在する形態をとることができる。
【００８７】
分散組成物において用いうる「他の油性成分」、「溶媒」、及び「その他の添加成分」としては、既述の「他の油性成分」、「溶媒」、及び「その他の添加成分」を同様に例示することができる。
【００８８】
＜分散組成物の製造方法（第１の態様）＞
第１の態様における特定セラミド含有粒子の形成態様としては、１）特定セラミド含有粒子（油相）を予め固体粒子として形成した後、分散媒（水相）に分散させる態様の他、２）特定セラミドを加熱して溶融状態とするか、或いは、適切な溶剤に溶解して液状とした後、水相に添加して分散させ、その後、常温に降温するか、或いは、溶剤を除去することで、特定セラミド含有粒子を系中で形成する態様が挙げられる。また、特定セラミドは、単独で油相として調製してもよいが、他の油性成分と相溶させるか、有機溶剤に溶解して油相を調製することが好ましい。
【００８９】
第１の態様における特定セラミド含有粒子を含む分散組成物は、油相として水相中に分散された特定セラミド含有粒子と、油相成分又は水相成分である脂肪酸成分とを含む特定セラミドの分散組成物であり、少なくとも特定セラミドを含む油相成分と、水相成分と、を４０℃以下の温度で混合することを含む製造方法により得ることができる。
この方法によれば、４０℃以下の温度で油相成分と水相成分とを混合するので、油相成分が良好に溶解すると共に、経時安定性及び保存安定性に優れた特定セラミド分散物を得ることができる。
第１の態様における分散組成物では、特定セラミド含有分散粒子の体積平均粒子径が十分に小さいため、透明な分散組成物とすることができる。
【００９０】
油相を調製する際には、水溶性有機溶媒を好ましく用いることができる。本発明に使用しうる水溶性有機溶媒としては、既述の水溶性有機溶媒を同様に挙げることができ、好ましい態様も同様である。
【００９１】
水溶性有機溶媒は、単独で用いてもよく、複数の水溶性有機溶媒を併用してもよい。また、水と水溶性有機溶媒とを併用しもよい。水と併用する場合には、水溶性有機溶媒は、少なくとも５０容量％以上含まれていることが好ましく、７０容量％以上であることがより好ましい。
【００９２】
水溶性有機溶媒は、分散組成物の製造において、特定セラミドの分散組成物を調製する際に、油相成分を混合して油相を調製するために好ましく用いられ、水相との混合後には除去されることが好ましい。
【００９３】
特定セラミドを分散粒子とて含む分散組成物を調製する際、油相成分と水相成分との混合時の温度は４０℃以下である。混合時の４０℃以下の温度は、油相成分と水相成分とを混合する際に達成できればよいが、適用される混合（乳化）方法によって設定される領域を適宜変更することができる。マイクロミキサーを用いた方法では、少なくとも混合直前から分散直後までの領域における温度を４０℃以下とすればよい。
【００９４】
水相成分と油相成分との混合は、１００ＭＰａ以上の剪断力を付加する高圧乳化法や、水相成分に油相成分を直接注入するジェット注入法等、公知の方法を用いてもよい。
特定セラミド含有粒子の粒子径、分散安定性、保存安定性の観点から、油相成分及び水相成分を各々独立に、最も狭い部分の断面積が１μｍ２〜１ｍｍ２であるマイクロ流路にそれぞれ独立して通過させた後に組み合わせて混合するマイクロミキサーを用いた方法を用いることが好ましい。
このとき、水相の粘度は３０ｍＰａ・ｓ以下であることが、特定セラミド含有粒子の微粒子化の観点から好ましい。
【００９５】
特定セラミドを含有する分散組成物の製造方法としては、例えば、ａ）脂肪酸塩（存在する場合）を含む水性媒体（水等）を用いて水相を調製し、ｂ）少なくとも特定セラミドを含む油相成分を用いて油相を調製し、ｃ）前記油相と、前記水相とを、マイクロミキサーを用いて、後に詳述する方法にて混合して分散を行い、体積平均粒径が１ｎｍ以上１００ｎｍ以下の特定セラミド含有粒子（分散粒子）を含む特定セラミド分散物（エマルション）を得るステップが挙げられる。
【００９６】
前記分散物を調製する際における油相と水相との比率（質量）は、特に限定されるものではないが、既述の油相／水相比率（質量％）と同様、０．１／９９．９〜５０／５０が好ましく、０．５／９９．５〜３０／７０がより好ましく、１／９９〜２０／８０がさらに好ましい。
油相／水相比率を上記範囲とすることにより、有効成分である特定セラミドを充分に含み、実用上充分な分散安定性が得られるため好ましい。
【００９７】
（マイクロミキサー）
特定セラミドを分散粒子として含む分散組成物の製造においては、分散粒子の体積平均粒径をより小さく、例えば、１ｎｍ以上１００ｎｍの分散粒子として安定に形成するため、油相成分と、水相成分とを、各々独立に、最も狭い部分の断面積が１μｍ２以上１ｍｍ２以下であるマイクロ流路に通過させた後に組み合わせて混合する製造方法をとることが好ましい。
【００９８】
油相成分と水相成分との前記混合は、より微小な分散粒子を得るとの観点から、対向流衝突による混合であることが好ましい。
【００９９】
対向流衝突により混合させる最も適切な装置は、対向衝突型マイクロミキサーである。マイクロミキサーは、主に２つの異なる液を微小空間中で混合するもので、一方の液が特定セラミド等の機能性油性成分を含有する有機溶媒相であり、もう一方の液が水性溶液としての水相である。
マイクロ化学プロセスの一つである粒径が小さなエマルション調製にマイクロミキサーを適用した場合、比較的低エネルギーで発熱が少なく、通常の撹拌乳化分散方式や高圧ホモジナイザー乳化分散に比べて、粒径が揃っていて、保存安定性にも優れる良好なエマルション又はディスパージョンを得易い。熱劣化し易い天然成分を含む乳化に最適な方法である。
【０１００】
既述の第１の態様では、界面活性剤等の乳化剤に代えて脂肪酸成分を用いて特定セラミドを分散させる。このため、界面活性剤等の乳化剤を用いた場合よりも、特定セラミドの角質への浸透性を向上させることができ、ひいては、角質の下層にある表皮細胞への特定セラミドの到達性を向上させることができる。
【０１０１】
特定セラミドを含有する分散組成物の製造方法の別の態様として、以下に示す製造方法により得られた分散組成物が挙げられる。以下、本実施形態を第２の態様と称する。
【０１０２】
＜分散組成物の製造方法（第２の態様）＞
本実施形態における分散組成物の製造方法は、特定セラミドと、非イオン性界面活性剤と、特定セラミドの質量に対して１０倍量〜１２０００倍量の多価アルコールと、を含む混合物（以下、「分散処理前液」とも称する。）を１００℃以上に加熱した状態で分散処理し、粗分散液を得ること（以下、「粗分散液調製工程」とも称する。）と、粗分散液と水又は水を含む組成物（以下、「水等」とも称する。）と、を混合した後、高圧乳化処理すること（以下、適宜、「高圧乳化処理工程」と称する。）と、を含む製造方法であり、分散組成物の第２の態様の製造方法により得られた分散組成物も本発明に適用することができる。
【０１０３】
第２の態様に係る分散組成物の製造方法においては、予め特定セラミドと、非イオン性界面活性剤と、特定量の多価アルコールとを組み合わせた混合物を１００℃以上に加熱し、特定セラミドを溶融させた状態で分散処理した後、得られた粗分散液と水等とを混合し、高圧乳化処理をすることにより、微細で、かつ粒子の表面状態が肌に浸透しやすい状態の特定セラミド分散粒子を得ることができる。
この微細な特定セラミド分散粒子を含む分散組成物は、従来の方法で製造された同等の粒径の特定セラミド含有分散粒子を含む分散組成物に比して、顕著に優れた皮膚浸透性を示す。
【０１０４】
その理由については、明らかではないが、本発明者は、以下のように推測している。
一般に、特定セラミド含有分散粒子の肌への浸透性の観点から、特定セラミド含有分散粒子の粒径は小さいほど良いと考えられる。第２の態様に係る製造方法においては、予め特定セラミドと、非イオン性界面活性剤と、特定量の多価アルコールとを組み合わせて含む液を１００℃以上に加熱し、特定セラミドを溶融させた状態で分散処理した後、得られた粗分散液と水等とを混合し、高圧乳化処理することにより、微細で、かつ粒子の表面状態が角質に浸透しやすい状態の特定セラミド分散粒子が形成されるためではないかと考えられる。
【０１０５】
分散処理前液の調製に使用される多価アルコールは、グリセリン及びジオール化合物からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
多価アルコールの含有量は、特定セラミドの質量に対して１０倍量〜１２０００倍量であり、３０倍量〜１０００倍量であることが好ましく、５０倍量〜５００倍量であることがより好ましい。
【０１０６】
特定セラミドと、非イオン性界面活性剤と、多価アルコールとは、単に混合されていればよい。特定セラミドと、非イオン性界面活性剤と、多価アルコールとは一度に混合してもよく、或いはこれらの成分をいくつかに分けて混合してもよい。混合の方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、撹拌による混合が挙げられる。
分散処理前液は、必要に応じて、特定セラミド、非イオン性界面活性剤、及び多価アルコール以外の他の成分を含んでもよい。他の成分については、既述の第１の態様等において述べた通りであり、例えば、コレステロール等の成分が挙げられる。
【０１０７】
粗分散液調製工程では、特定セラミドを溶融させる観点から、分散処理前液を１００℃以上に加熱する。分散処理前液を加熱する温度は、好ましくは１００℃以上２００℃以下であり、より好ましくは１０５℃以上１４０℃以下である。分散処理前液を、１４０℃を超える温度で加熱すると、特定セラミドの種類、加熱条件等によっては酸化分解する場合がある。
【０１０８】
分散処理前液を分散処理し、粗分散液を得る手段としては、特に限定されるものではなく、一般的な撹拌装置を用いることができる。撹拌装置としては、例えば、マグネチックスターラー、家庭用ミキサー、パドルミキサー、インペラーミキサー、ホモミキサー、ディスパーミキサー、ウルトラミキサー等が挙げられる。
【０１０９】
分散処理の時間は、特に限定されるものではなく、撹拌装置の種類、混合物（分散処理前液）の組成等に応じて、適宜設定することができる。
【０１１０】
＜高圧乳化処理工程＞
高圧乳化処理工程は、粗分散液調製工程にて得られた粗分散液と水等とを混合した後、高圧乳化処理する工程である。
高圧乳化処理工程では、溶融された特定セラミドの粗分散液と水等とを混合し、高圧乳化処理することで、特定セラミド含有分散粒子を含む分散組成物を得る。
【０１１１】
水等と混合する際の粗分散液の温度は、突沸を防ぐ観点から、１００℃以下に設定することが好ましく、９０℃〜１００℃に設定することがより好ましい。
水等の温度は、特に限定されるものではないが、特定セラミド含有分散粒子の微細化の観点から、４０℃〜９０℃に設定することが好ましく、５０℃〜８０℃に設定することがより好ましい。
【０１１２】
粗分散液と水等とは一度に混合してもよく、或いは一方に他方を少しずつ添加しながら混合してもよく、特定セラミド分散粒子の微細化の観点から、撹拌している粗分散液中に水等を添加する方法が好ましい。混合の方法としては、例えば、撹拌による混合が挙げられる。
粗分散液と水等との混合比率は、特に限定されるものではないが、特定セラミド分散粒子の微細化の観点から、粗分散液／水等比率（質量基準）として、１／２０〜１０／１であることが好ましく、１／１０〜５／１であることがより好ましく、１／２〜２／１であることがさらに好ましい。
また、粗分散液と水等とは、特定セラミド分散粒子の微細化と経時安定性の観点から、本発明の製造方法で得られる特定セラミド分散組成物中における分散相と連続相との比率が、分散相／連続相比率（質量基準）として、１／１０００〜１／５となるように混合することが好ましく、１／１００〜１／１０となるように混合することがより好ましく、１／５０〜１／１０となるように混合することがさらに好ましい。
【０１１３】
本発明において「高圧乳化処理」とは、５０ＭＰａ以上の剪断力（処理圧力）を被分散物に付加する分散処理を意味する。特定セラミド分散粒子の微細化の観点から、被分散物に付加する剪断力は、１００ＭＰａ以上であることが好ましく、１８０ＭＰａ以上であることがより好ましく、２００ＭＰａ以上であることがさらに好ましい。上限値は、市販の装置では、温度上昇及び耐圧性の観点から３００ＭＰａ以下であることが好ましい。
【０１１４】
高圧乳化処理の手段としては、特に限定されるものではなく、一般的な高圧乳化装置を用いることができる。高圧乳化装置としては、アルティマイザーＨＪＰ−２５００５（（株）スギノマシン製）、マイクロフルイダイザー（マイクロフルイディスク社製）、ナノマイザー（吉田機械興業社製、ゴーリンタイプホモジナイザー（ＡＰＶ社製）、ラニエタイプホモジナイザー（ラニエ社製）、高圧ホモジナイザー（ニロ・ソアビ社製）、ホモゲナイザー（三和機械（株）製）、高圧ホモゲナイザー（イズミフードマシナリ（株）製）、超高圧ホモジナイザー（イカ社製）等の高圧ホモジナイザーが挙げられる。
【０１１５】
高圧乳化処理の際の温度は、特定セラミド分散粒子の微細化の観点から、２０℃〜８０℃に設定することが好ましく、４０℃〜７０℃に設定することがより好ましい。
【０１１６】
高圧乳化処理を行う回数は１回でもよいが、液全体の均一性を高めるためには、高圧乳化処理を２回以上行うことが好ましく、２回〜５回行うことがより好ましい。
【０１１７】
高圧乳化処理工程では、特定セラミド分散粒子の微細化の観点から、粗分散液と水等とを混合した後、高圧乳化処理する前に、超音波付与による分散処理を行うことが好ましい。超音波付与による分散処理には、一般的な超音波分散装置を用いることができる。
【０１１８】
超音波分散装置としては、超音波ホモジナイザーＵＳ−６００、ＵＳ−１２００Ｔ、ＲＵＳ−１２００Ｔ、ＭＵＳ−１２００Ｔ（以上、（株）日本精機製作所製）、超音波プロセッサーＵＩＰ２０００、ＵＩＰ−４０００、ＵＩＰ−８０００、ＵＩＰ−１６０００（以上、ヒールッシャー社製）等が挙げられる。これらの超音波分散装置は、２５ｋＨｚ以下、好ましくは１５ｋＨｚ〜２０ｋＨｚの周波数で使用することができる。
【０１１９】
＜その他の工程＞
以上例示した本発明に適用可能な分散組成物の製造方法においては、本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて、既述の分散処理以外の、その他の工程を含んでもよい。
その他の工程としては、例えば、殺菌工程等が挙げられる。
【０１２０】
本発明のタンパク産生促進剤は、有効成分として表皮細胞に作用して、コーニファイド・エンベロープタンパクの産生を促進することができる。
また、タンパク産生促進剤の好ましい態様である、特定セラミドを分散粒子中に含有する分散組成物とすることで、皮膚外用剤等の医薬品、化粧料等に好適に用いることができる。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」、「部」は質量基準である。
【０１２２】
〔実施例１〕
（ヒト型セラミド含有分散組成物Ａの調製）
下記組成１の各成分を混合し、約３０分撹拌し、ヒト型セラミド含有分散組成物Ａを調製した。
分散組成物Ａにおけるセラミド含有分散粒子の粒子径を既述の方法で測定したところ、体積平均粒子径は、数１００ｎｍ〜数１０μｍであった。
【０１２３】
（組成１）                                                  （含有量（％））
セラミド３Ｂ〔ヒト型セラミド〕                              ０．９％
セラミド６〔ヒト型セラミド〕                                １．１％
オレイン酸                                                  ０．４％
グリセリン                                                １．４３％
１，３−ブタンジオール                                    １．４３％
水酸化ナトリウム                                                適量
純水                                                            残量
【０１２４】
〔実施例２〕
（ヒト型ナノセラミドを分散粒子として含有する分散組成物（分散組成物Ｂ））
下記油相液１組成に記載の各成分を室温にて約３０分間撹拌して、油相液１を調製した。
水相液１は、純水に下記「水相液１組成」に記載の各成分を約３０℃に加温し、充分に撹拌溶解して調製した。
【０１２５】
＜油相液１組成＞
セラミド３Ｂ〔ヒト型セラミド〕                              ０．９部
セラミド６〔ヒト型セラミド〕                                １．１部
オレイン酸（融点：１４℃）                                  ０．２部
エタノール〔水溶性有機溶媒〕                              ９７．８部
【０１２６】
＜水相液１組成＞
純水                                                    ９７．１４部
グリセリン                                                １．４３部
１，３−ブタンジオール                                    １．４３部
水酸化ナトリウム                                              適量
【０１２７】
得られた油相液１（油相）と水相液１（水相）を、それぞれ１：７の比率（質量比）で、衝突型であるＫＭ型マイクロミキサー１００／１００を用いてミクロ混合して、３０℃のセラミド分散液１を得た。なお、マイクロミキサーの使用条件は、下記のとおりである。
【０１２８】
−マイクロチャンネル−
油相側マイクロチャンネル
断面形状／幅／深さ／長さ  ＝  矩形／７０μｍ／１００μｍ／１０ｍｍ
水相側マイクロチャンネル
断面形状／幅／深さ／長さ  ＝  矩形／４９０μｍ／１００μｍ／１０ｍｍ
−流量−
外環に水相を２１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量で導入し、内環に油相を３．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量で導入してミクロ混合した。
【０１２９】
（分散組成物Ｂの調製）
得られたセラミド分散液１を大川原製作所製の「エバポール（ＣＥＰ−ｌａｂ）」を使用し、エタノール濃度が０．１質量％以下になるまで繰り返し脱溶媒することで、セラミド濃度が２．０質量％になるように濃縮、調整し、ｐＨ＝７．５の、特定セラミドを含む分散粒子を含有する分散組成物Ｂを得た。ここで、セラミド濃度とは、分散組成物Ｂの全質量を基準とした特定セラミドの含有量である。
分散組成物Ｂにおけるセラミド含有分散粒子の粒子径を記述の方法で測定したところ、体積平均粒子径は、約２０ｎｍであった。
【０１３０】
なお、実施例１及び実施例２で使用した各成分の詳細は以下の通りである。
セラミド３Ｂ〔セラミドIIIＢ：商品名、ＥＶＯＮＩＫ社〕
セラミド６〔セラミドVI：商品名、ＥＶＯＮＩＫ社〕
オレイン酸（融点：１４℃）〔ルナック-ＯＶ：商品名、花王（株）〕
エタノール〔トレーサブル９９：商品名、日本アルコール販売（株）〕
グリセリン〔グリセリン：商品名、花王（株）〕
１，３−ブタンジオール〔ブタンジオール：商品名、（株）ダイセル〕
０．１モル水酸化ナトリウム〔１Ｎ  ＮａＯＨ：商品名、和光純薬工業（株）〕
【０１３１】
〔実施例３−１〕
（単層培養系：インボルクリンタンパク産生量の測定〕
正常ヒト包皮由来表皮角化細胞（ＨＫＤｎ）をＥｐｉｌｉｆｅ（０．０６ｍｍｏｌ  Ｃａ２＋、０．２ｕｇ／Ｌ  ＥＧＦ、２０ｍｇ／Ｌ  インスリン、１ｍｇ／Ｌ  ハイドロコーチゾン、４ｍｌ／Ｌ  ＢＰＥ、１００ｍｇ／Ｌ  ゲンタマイシン、１００ｕｇ／Ｌ  アンフォテリシン含有；クラボウ社製）培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で８０％コンフルになるまで培養した。
トリプシン処理により剥離したのち、アッセイ培地（ＤＭＥＭ・ＨＡＭ−Ｆ１２（３：１）、５％ウシ胎児血清；ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製）にて再分散し、２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種した。  ３７℃、５％ＣＯ２下で１日培養した後、ＤＭＳＯに溶解した被検物質（ヒト型セラミド：セラミド３Ｂとセラミド６との１：１（モル比）混合物）をセラミド濃度が５μｍｏｌとなる量で添加した培地に置換し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２日間培養した。リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）にて洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）含有０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加え、細胞を剥離、回収した。
【０１３２】
回収した細胞を４℃にて一晩静置後、水浴中で３０分間超音波処理し、タンパク質を抽出した。４℃、３０００ｘｇ、１５分間遠心処理し、上清を回収した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｒａｐｉｄ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）にてタンパク量を定量した。
回収したタンパク質抽出液を用い、抗ヒトインボルクリン抗体（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）にてウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの結果を画像解析ソフト（富士フイルム（株）：Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ）により数値化した。また、特定セラミドを添加しない標準試料におけるインボルクリンタンパクの生成量を同様に数値化した。表１の「タンパク産生促進効果」の欄には、特定セラミドを含有しない標準試料におけるタンパク産生量を１００としたときの、特定セラミドを含有した試料におけるタンパク産生量の増加率を記載した。
【０１３３】
また、タンパク産生量の増加率から、以下の基準にて促進効果を評価した。その結果を、表２の「判定」の欄に記載した。
（基準）
Ａ：産生量の増加率は５０％以上
Ｂ：産生量の増加率は２０％以上５０％未満
Ｃ：産生量の増加率は１０％以上２０％未満
Ｄ：産生量の増加率は１０％未満
【０１３４】
〔実施例３−２〜実施例３−３〕
セラミド３Ｂとセラミド６との１：１モル比の混合物を、ヒト型セラミドであるセラミド３及びセラミド３Ｂについて、それぞれセラミド濃度５μｍｏｌとなるように培地に添加した以外は、実施例３−１と同様にしてインボルクリンタンパクの生成量の増加率を算出した。また、増加率から、タンパク産生促進効果を評価した。結果を表１に示す。
【０１３５】
〔実施例３−４〕
セラミド３Ｂとセラミド６との１：１モル比の混合物を、ヒト型セラミドであるセラミド１０に代え、セラミド濃度１０μｍｏｌとなるように培地に添加した以外は、実施例３−１と同様にしてインボルクリンタンパクの生成量の増加率を算出した。また、増加率から、タンパク産生促進効果を評価した。結果を表１に示す。
【０１３６】
〔実施例３−５〕
セラミド３Ｂとセラミド６との１：１モル比の混合物を、実施例２で得た分散組成物（ヒト型セラミドであるセラミド３Ｂ及びセラミド６を質量比０．９：１．１で含有する体積平均粒子径約２０ｎｍのナノ粒子を含有）について、セラミド濃度０．６μｍｏｌとなるように培地に添加した以外は、実施例３−１と同様にしてインボルクリンタンパクの生成量の増加率を算出した。また、増加率から、タンパク産生促進効果を評価した。結果を表１に示す。
【０１３７】
【表１】
2015221755.tif 000007
【０１３８】
表１の結果より、単層培養細胞にてヒト型セラミドの適用により、インボルクリンタンパクの生成量が増加することが明らかになった。ヒト型セラミドの中でも、フィトセラミドであるセラミド３、３Ｂ、６は、いずれも、ジヒドロセラミドであるセラミド１０に比べて、低濃度でも良好なタンパク質産生促進効果を得られることがわかる。さらに、実施例３−１と実施例３−５との対比より、同種の特定セラミドを用いた場合においても、セラミド含有粒子の粒子径を小さくすることで、タンパク産生促進効果がより向上することがわかる。
【０１３９】
〔実施例４〕
（単層培養系：トランスグルタミナーゼタンパク産生量の測定）
実施例３において用いたＤＭＳＯに溶解した被検物質（ヒト型セラミド）において、１μｍｏｌ溶液（なお、図１においてμｍｏｌは「μＭ」と略して記載）、及び５μｍｏｌ溶液をそれぞれ１％添加した培地を用いた以外は実施例３と同様にして、タンパク質抽出液を回収した。
回収したタンパク質抽出液を用い、Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  １，  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｕｓｃｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．製）にてトランスグルタミナーゼタンパク量を測定した。結果を図１に示す。
図１の結果より、単層培養細胞にてヒト型セラミドの適用により、トランスグルタミナーゼタンパクの発現量が増加することが明らかになった。
【０１４０】
〔実施例５〕
（表皮モデル：インボルクリンタンパク産生量の測定）
３次元表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）は、付属のアッセイ培地で３７℃、５％ＣＯ２下にて１日間、前培養した。
１％ヒト型セラミド粗分散物（実施例１で得た分散組成物Ａ）、もしくは１％ヒト型セラミドナノ分散物（実施例２で得た分散組成物Ｂ）を角質層側から５０μｌ適用し、５％ＣＯ２下で３日間培養した。
培養した皮膚組織をＰＢＳ１００μｌにて２回洗浄した後、培養カップより剥離し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）含有０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加え、細胞を剥離・回収した。
回収した細胞を４℃にて一晩静置後、ビーズ式破砕機にて２分処理し、タンパク質を抽出した。４℃、３０００ｘｇ、１５分間遠心処理し、上清を回収した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｒａｐｉｄ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）にてタンパク量を定量した。
回収したタンパク質を用い、実施例３と同様の方法にてインボルクリンタンパク量を測定した。コントロール（水）を１００％としたときの相対値を図２に示す。
図２の結果より、表皮モデルにてヒト型セラミド分散物の適用により、インボルクリンタンパクの発現量が増加することが明らかになった。さらに、特定セラミド含有粒子の体積平均粒子径をナノ化することでその効果が向上することが明らかになった。
【０１４１】
〔実施例６〕
（表皮モデル：トランスグルタミナーゼタンパク産生量の測定）
実施例３で回収したタンパク質抽出液を用い、実施例４に記載の方法にてトランスグルタミナーゼタンパク量を測定した。コントロール（水）を１００％としたときの相対値を図３に示す。
図３の結果より、表皮モデルにてヒト型セラミド分散物の適用により、トランスグルタミナーゼタンパクの発現量が増加することが明らかになった。さらに、特定セラミド含有粒子の体積平均粒子径をナノ化することでその効果が向上することが明らかになった。
【０１４２】
〔実施例７〕
化粧水の調製
本発明のタンパク産生促進剤（実施例２で得た分散組成物Ｂ）を用いて、下記組成１を有する化粧水を、常法により調製した（全量１００質量％）。
〔組成１〕
（成分）                                            〔含有量：％〕
分散組成物Ｂ（実施例２で得た分散組成物Ｂ：以下同様）        ５．０
グリセリン                                                  ５．０
１，３−ブタンジオール                                      ６．５
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル          １．２
エタノール                                                  ３．０
カルボキシビニルポリマー                                    ０．２
クエン酸ナトリウム                                          １．０
コラーゲン                                                  １．０
パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．０５
Ｎ−アセチルヒドロキシプロリン                              １．０
精製水                                                      残量
【０１４３】
〔実施例８〕
化粧水の調製
下記組成２を有する化粧水を、常法により調製した（全量１００質量％）。
〔組成２〕                                              〔含有量（％）〕
分散組成物Ｂ                                                  １．０
グリチルレチン酸ジカリウム                                    １．０
ジプロピレングリコール                                        ４．０
ポリオキシエチレンメチルグルコシド                            １．０
１，３−ブチレングリコール                                    ４．０
ポリエチレングリコール                                        １．０
エタノール                                                    ２．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）                ０．２
フェノキシエタノール                                          ０．３
グリセリンモノ−２−エチルヘキシルエーテル                    ０．２
オリザノール                                                  ０．０１
ポリオキシエチレンフィトステロール
（ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−２０：日光ケミカルズ社製）        ０．０３
αリポ酸                                                      ０．５
シスチン                                                      ０．５
Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン                          １．０
水溶性コラーゲン                                              １．０
加水分解コラーゲン                                            １．０
海藻エキス（１）                                              １．０
アスタキサンチン含有乳化組成物（オキアミ抽出物）              ０．２
［以下に記載する方法で調製した組成物］
リコピン含有乳化組成物［以下に記載する方法で調製した組成物］  ０．１
リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウム                          １．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                        ０．２
クエン酸                                                      １．０
クエン酸ナトリウム                                            適量
水                                                            残量
【０１４４】
＜アスタキサンチン含有乳化組成物の調製＞
下記の成分を、７０℃で加熱しながら１時間溶解して、水相組成物Ａを得た。
・ショ糖ステアリン酸エステル（ＨＬＢ＝１６）                      ３３．０ｇ
・モノオレイン酸デカグリセリル（ＨＬＢ＝１２）                    ６７．０ｇ
・グリセリン                                                    ４５０．０ｇ
・純水                                                          ３００．０ｇ
【０１４５】
下記成分を、７０℃で加熱しながら１時間溶解して、油相組成物Ａを得た。
・オキアミ抽出物                                                  １５．０ｇ
・ミックストコフェロール（理研ビタミン製、理研Ｅオイル８００）    ３２．０ｇ
・中鎖脂肪酸グリセライド（花王製、ココナードＭＴ）                ９３．０ｇ
・レシチン（理研ビタミン製、レシオンＰ、大豆由来）                １０．０ｇ
【０１４６】
上記で得られた水相組成物Ａを７０℃に保ったままホモジナイザー（機種名：ＨＰ９３、（株）エスエムテー社製）で攪拌し（１００００ｒｐｍ）、水相組成物Ａへ油相組成物Ａを添加して予備乳化物を得た。
続いて、得られた予備乳化物を約４０℃まで冷却し、アルティマイザーＨＪＰ−２５００５（（株）スギノマシン社製）を用いて、２００ＭＰａの圧力で高圧乳化を行った。その後、平均孔径１μｍのミクロフィルターでろ過して、アスタキサンチン含有乳化組成物（アスタキサンチン含有率：０．３質量％）を調製した。
【０１４７】
得られたアスタキサンチン乳化組成物をミリＱ水にて１質量％に希釈し、粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、分散粒子の粒径を測定したところ、５８ｎｍであった。
【０１４８】
上記オキアミ抽出物を製品名：Ａｓｔａｘ−ＳＴ  （株）マリン大王社製や、製品名：ＡＳＴＯＴＳ−Ｓ  武田紙器（株）社製（ヘマトコッカス藻抽出物）に替えても同等の乳化組成物を得ることができる。
【０１４９】
＜リコピン含有乳化組成物の調製＞
〔油相組成物Ｂ〕
・トマトオレオレジン                                                １．１４ｇ
（サンブライト製、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ  １５％（リコピン１５質量％含有））
・レシチン（理研ビタミン製、レシオンＰ、大豆由来）                  １．０ｇ
・中鎖脂肪酸グリセライド（花王製、ココナードＭＴ）                  １２．８ｇ
【０１５０】
〔水相組成物Ｂ〕
・オレイン酸デカグリセリル−１０                                    ８．０ｇ
（ＨＬＢ＝１２．０、日光ケミカルズ製、Ｄｅｃａｇｌｙｎ  １−ＯＶ）
・ショ糖ステアリン酸エステル                                        ２．０ｇ
（三菱化学フーズ製、リョートーシュガーエステルＳ−１６７０）
・グリセリン                                                      ４５．０ｇ
・精製水                                                    １００ｇまでの残量
【０１５１】
水相組成物Ｂに用いる各成分を、上記の組成にしたがって容器に秤量し、７０℃の恒温槽にて攪拌しながら加熱混合し、よく混合されたことを確認し、７０℃で保持し、水相組成物Ｂを得た。
また、油相組成物Ｂに用いる各成分を、上記の組成にしたがって容器に秤量し、１５０℃のホットプレート上にて攪拌しながら５分間加熱混合し、よく混合されたことを確認し、油相組成物Ｂを得た。
得られた水相組成物Ｂを油相組成物Ｂに加えて攪拌混合し、超音波ホモジナイザーを用いて、所定の時間分散させて、粗分散液を得た。
その後、得られた粗分散物を更に超高圧乳化装置（アルティマイザー、（株）スギノマシン社製）を用い、２００ＭＰａの高圧乳化を行い、リコピン含有の組成物（リコピン含有率：０．１７質量％）を調製した。
【０１５２】
得られたリコピン含有乳化組成物をミリＱ水にて１質量％希釈し、粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、分散粒子の粒径を測定したところ、５２ｎｍであった。
上記の方法で調製されたアスタキサンチン含有乳化組成物、リコピン乳化組成物を適宜用いて、前記実施例８の化粧水を調製した。
【０１５３】
〔実施例９〕
クリームの調製
下記組成３を有するクリームを、常法により調製した（全量１００質量％）。
〔組成３〕                                              〔含有量（％）〕
分散組成物Ｂ                                                    １．０
アルブチン                                                      ２．０
グリチルレチン酸ジカリウム                                      １．０
リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウム                            ０．１
１，２−ペンタンジオール                                        ３．０
ジプロピレングリコール                                          ７．０
濃グリセリン                                                    ５．０
ポリエチレングリコール６０００［分子量：６０００］              １．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                          ０．５
トリメチルグリシン                                              ０．５
１，３−ブチレングリコール                                      ３．０
キサンタンガム                                                  ０．５
アクリル酸／メタアクリル酸アルキル共重合体                      ０．７
スクワラン                                                      ０．５
シア脂                                                          １．０
サラシミツロウ                                                  １．０
ベヘニルアルコール                                              １．０
モノステアリン酸グリセリル                                      ２．０
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル                    １．０
トコフェロール                                                  ０．５
アスタキサンチン                                                ０．２
水溶性コラーゲン                                                １．０
加水分解コラーゲン溶液（魚由来）                                １．０
Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン                            １．０
オリザノール                                                    ０．０１
ポリオキシエチレンフィトステロール
（ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−２０：日光ケミカルズ社製）          ０．０３
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）                  ０．２
ツボクサエキス                                                  ０．０１
レシチン                                                        ０．１
ショ糖脂肪酸エステル                                            ０．１
モノオレイン酸ポリグリセリル                                    ０．１
クエン酸                                                        ０．７
クエン酸ナトリウム                                              適量
フェノキシエタノール                                            ０．３
精製水                                                            残量
【０１５４】
〔実施例１０〕
ジェリー様美容液の調製
下記組成４を有するジェリー様美容液を、常法により調製した（全量１００質量％）。
〔組成４〕                                              〔含有量（％）〕
ヘマトコッカス藻抽出物                                            ０．１
アスタキサンチン含有乳化組成物（オキアミ抽出物）
［既述の方法で調製した組成物］                    ０．２
セラミド３、セラミド６混合物（モル比  １：１）                    １．０
分散組成物Ｂ                                                      １．０
加水分解コラーゲン                                                １．０
アセチルヒドロキシプロリン                                        １．０
エチルヘキシルグリセリン                                          ０．１
オレイン酸                                                        ０．５
１，３−ブチレングリコール                                        １．０
グリセリン                                                        ２．０
スクロース                                                        ０．１
オレイン酸ポリグリセリル−１０                                    ０．１
ステアリン酸ポリグリセリル−２                                    ０．１
フェノキシエタノール                                              ０．２
コラーゲン                                                        １．０
オリザノール                                                      ０．０１
ポリオキシエチレンフィトステロール
（ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−２０：日光ケミカルズ社製）            ０．０３
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）                    ０．２
ツボクサエキス                                                    ０．０１
レシチン                                                          ０．１
クエン酸                                                          １．０
クエン酸ナトリウム                                                適量
（ＰＥＧ−２４０／デシルテトラデセス−２０／ＨＤＩ）コポリマー    ０．３
ダマスクバラ花油                                                  微量
香料                                                              微量
精製水                                                            残量
【図１】
2015221755.tif 000008
【図２】
2015221755.tif 000009
【図３】
2015221755.tif 000010