(57)【要約】【課題】抗原と抗体との反応において、バックグラウンドを大きく上昇させること無く、反応の促進を図る方法を提供する。【解決手段】１〜５０ｍＭのアミノ酸（好ましくは酸性アミノ酸であるアスパラギン酸またはグルタミン酸）の共存下、試料中の抗原又は抗体と、不溶性担体に固定化した抗体又は抗原とを反応させる。また不溶性担体に固定化した抗体又は抗原、及びアミノ酸を含有する凍結乾燥された免疫測定試薬。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の共存下、試料中の抗原又は抗体と、不溶性担体に固定化した抗体又は抗原とを反応させることを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】
アミノ酸が酸性アミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸の濃度が１〜５０ｍＭである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
不溶性担体に固定化した抗体又は抗原、及びアミノ酸を含有することを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項６】
凍結乾燥されている請求項５に記載の免疫測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定方法及び免疫測定試薬に関するものである。更に詳細には、本発明は、試料中の抗原又は抗体と固定化した抗体又は抗原とを反応させる際に、アミノ酸を共存させることにより、バックグラウンドを大きく上昇させること無く、抗原と抗体との反応性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体物質を固定化した不溶性担体は、様々な生理活性物質を測定対象とする診断薬の材料として開発され、利用されている。中でも抗体を固定化した不溶性担体は、イムノアッセイ用の診断薬材料として極めて有用であり、広く一般に使用されている。
【０００３】
上記の不溶性担体に当たっては、測定対象を認識する抗体を固定化した不溶性担体を用いたイムノアッセイが開発され、一般的に利用されている。イムノアッセイでは、測定対象の定量のため、測定対象を検出する値（Ｓ）と測定対象が存在しない場合の値（Ｎ）との差が十分に離れている、即ちＳ／Ｎが大きい必要がある。
【０００４】
測定対象とそれに対する抗体との免疫反応時においては、反応の促進や値の正確性・再現性を高めるためにタンパク質や糖を含む緩衝液を共存させる方法があるが、より高感度に定量するためには上記成分のみでは十分ではなく、更なる改良の余地が残されていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明の目的は、抗原と抗体との反応時にアミノ酸を共存させることにより、バックグラウンドを大きく上昇させること無く、反応の促進を図る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者は鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）アミノ酸の共存下、試料中の抗原又は抗体と、不溶性担体に固定化した抗体又は抗原とを反応させることを特徴とする免疫測定方法。
（２）アミノ酸が酸性アミノ酸である、（１）に記載の方法。
（３）アミノ酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）アミノ酸の濃度が１〜５０ｍＭである、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）不溶性担体に固定化した抗体又は抗原、及びアミノ酸を含有することを特徴とする免疫測定試薬。
（６）凍結乾燥されている（５）に記載の免疫測定試薬。
【０００７】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【０００８】
本発明において、測定対象である試料中の抗原又は抗体としては特に限定はなく、例えば抗原としてはサイログロブリン、ＴＳＨ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９等があげられる。不溶性担体に固定化される抗体や抗原としては特に限定はなく、前述の抗原に対するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体が挙げられ、また抗原としてはＦＴ３などがあげられる。これらは、必ずしもヒトに由来するものである必要はなく、例えばラット、ブタ、イヌ、ウサギ由来であっても良い。また更に、生体組織由来の抽出精製物のほか、化学合成物、遺伝子組換え技術による製造物等のものであっても良い。
【０００９】
本発明においては、抗体又は抗原を不溶性担体に固定化して用いる。不溶性担体としては例えばガラス、樹脂、金属等のプレート、粒子、微粒子、磁性微粒子等が用いられる。中でも微粒子や磁性微粒子等において本発明の効果が著しい。抗体又は抗原を不溶性担体に固定化させる方法には特に限定はなく、例えば疎水的作用による吸着や、微粒表面の官能基を介した共有結合などがあげられる。
【００１０】
本発明において、不溶性担体に固定化された抗体又は抗原と、試料中の抗原又は抗体とを反応させる際に、アミノ酸を共存させることを特徴とする。このときのアミノ酸には特に限定はなく、酸性、中性、塩基性のいずれのアミノ酸でもよいが、酸性アミノ酸が好ましく、アスパラギン酸又はグルタミン酸がさらに好ましい。アミノ酸を共存させる濃度には特に限定はないが１〜５０ｍＭが好ましく、１０〜３０ｍＭがさらに好ましい。これらのアミノ酸は１種類を用いてもよいが、２種以上併用してもよい。２種以上用いる場合には、各アミノ酸の濃度が前述の範囲内にあることが好ましい。
【００１１】
本発明では、不溶性担体に固定化された抗体又は抗原と、試料中の抗原又は抗体とを反応させる際に、タンパク質又は糖を共存させてもよい。タンパク質としては特に限定はないが、例えば哺乳動物の正常血清タンパク質、アルブミン、コラーゲン、ゲリゼート、スキムミルク、乳酸発酵物、ゼラチンおよびその分解物などを用いることができ、その濃度には特に限定はないが、１〜５０％が好ましい。糖としては特に限定はないが、例えばＤ−マンニトール、シュークロース、ｍｙｏ−イノシトール、トレハロース、β−シクロデキストリン、グルコース、ラクトース、フルクトース、セルロース、ラフィノース、マルトース、ガラクトース、キシロース等を用いることができ、その濃度は特に限定はないが、例えば１〜１０％が好ましい。
【００１２】
それ以外に、目的に応じて保護剤（例えばウシ血清アルブミン等）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、ビタミンＥ等）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（例えばセルロース、ポロエチレングリコール等）、懸濁化剤（例えばポリビニルピロリドン等）、乳化剤（例えばアルキルスルホン酸等）、溶解補助剤（例えばグリセリン等）、緩衝剤（例えばりん酸塩、トリスヒドキシルアミン塩酸塩等）、等張化剤（例えばＤ−ソルビトール、塩化ナトリウム等）、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、界面活性剤（例えばトライトンＸ−１００、ツィーン２０等）等を共存させても良い。
【００１３】
本発明の免疫測定を行うにあたり、不溶性担体に固定化した抗体又は抗原、及びアミノ酸を含有する免疫測定試薬を用いて行ってもよい。この試薬は凍結乾燥されていてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、アミノ酸を共存させることにより、抗原と抗体の反応性が促進される、即ちイムノアッセイによって検出される値を向上させることが可能である。このときバックグラウンドは上昇させることがない又は少ないため、Ｓ／Ｎ比を大きくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１におけるアミノ酸添加の有無と測定値の関係を示す図である。
【図２】実施例１におけるアミノ酸添加の有無と測定値の関係を示す図である。
【実施例】
【００１６】
本発明の具体的な実施の態様を実施例により説明する。しかし本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお実施例においては、本発明が提供する免疫測定試薬を凍結乾燥物の形で酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用の試料として測定した例を示したが、本発明は放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又は発光免疫測定法（ＬＩＡ）等すべての方法に適用することが可能である。
【００１７】
実施例１  ＣＥＡの免疫測定
（１）固相の調製
固相となる磁性微粒子（ダイナビーズ：ダイナル社製）を０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度にした懸濁液に、抗ＣＥＡ抗体を０．２ｍｇ／ｍＬ濃度となるように加え、３７℃で３時間インキュベートして抗体を吸着させた。微粒子を洗浄後、１０％のＰＥＧを原料としたブロッキング溶液で３７℃、１７時間ブロッキングを行い、抗ＣＥＡ抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。更に（Ａ）を５％のウシ血清を含む溶液０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、表１に記載のアミノ酸を添加して固相懸濁液を作製し、これを凍結乾燥して固定化抗体試薬（Ｂ）を得た。
【００１８】
（２）検出用標識抗体
抗ＣＥＡ抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％のコラーゲンペプチドを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものを、凍結乾燥することで、標識抗体試薬（Ｃ）を作製した。
【００１９】
（３）標準溶液の調製
既知濃度のＣＥＡを、５％のコラーゲンペプチドを含む溶液０．０３ｍｏｌ／Ｌ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）で既定濃度（０ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ）となるように希釈し、ＣＥＡ測定用の標準溶液（Ｄ）及び（Ｄ’）とした。
【００２０】
（４）標準溶液の測定
化学発光酵素免疫反応による測定を行った。測定は、固定化抗体試薬（Ｂ）を、界面活性剤を含む純水と標準溶液（ＤもしくはＤ’）で溶解した後、３７℃で５分間免疫反応を実施した。その後Ｂ／Ｆ分離を行った。次に界面活性剤を含む純水で溶解した標識抗体試薬（Ｃ）を加えて３７℃３分間免疫反応を実施し、再びＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）、フルオレセイン、及び臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを加え、発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）を測定した。結果を表１、表２、図１、図２に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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これらの結果から明らかなように、アミノ酸を共存させることにより、抗原と抗体の反応性が促進され、検出値が大きく向上したが、バックグラウンドは上昇することはなく、結果としてＳ／Ｎ比が大きく向上した。この効果は酸性アミノ酸を用いた方が大きく、特にアスパラギン酸とグルタミン酸を併用した方が大きかった。
【図１】
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【図２】
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