(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬品や健康食品、畜産用や水産用の飼料添加物として、低コストで高い免疫賦活効果を示す組成物の提供。【解決手段】ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する構成糖として、少なくともN-アセチル-D-ガラクトサミン、N-アセチル-D-グルコサミン、L-フコース、D-アラビノース、D-マンノース、D-グルコース、及びD-ガラクトースからなる群から選択される１又は複数を含む多糖類、及び、該多糖類を含有する組成物、さらに該多糖類を有効成分とする免疫賦活剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する多糖類。
【請求項２】
前記ヒトデが、アカヒトデ科に属するヒトデである、請求項１に記載の多糖類。
【請求項３】
前記ヒトデが、オニヒトデである、請求項１又は請求項２に記載の多糖類。
【請求項４】
構成糖として、少なくともN-アセチル-D-ガラクトサミン、N-アセチル-D-グルコサミン、L-フコース、D-アラビノース、D-マンノース、D-グルコース、及びD-ガラクトースからなる群から選択される１又は複数を含む、請求項１〜請求項３いずれか一項に記載の多糖類。
【請求項５】
耐熱性を有する、請求項１〜請求項４いずれか一項に記載の多糖類。
【請求項６】
高温高圧耐性を有する、請求項１〜請求項５いずれか一項に記載の多糖類。
【請求項７】
平均分子量が約５．０×１０４〜約１．８×１０５である、請求項１〜請求項６いずれか一項に記載の多糖類。
【請求項８】
前記免疫賦活作用がToll-like Receptor 4を介したものである、請求項１〜請求項７いずれか一項に記載の多糖類。
【請求項９】
請求項１〜請求項８いずれか一項に記載の多糖類を含有する組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、ヒトデ乾燥粉末、ヒトデ粘液乾燥粉末、又はそれらのアルコール不溶性画分である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記多糖類を有効成分とし、請求項９又は請求項１０に記載の組成物を含有する免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する多糖類、該多糖類を含む組成物、及び該多糖類を有効成分とする免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、免疫賦活作用を有する多糖類が多数見出されている。免疫賦活作用を有する多糖に関する技術としては、例えば、酸性ムコ多糖（特許文献１参照）、リポ多糖及びβグルカン（特許文献２参照）、ガゴメ由来の粘性多糖類（特許文献３参照）、Ｌ−フコースおよびＤ−キシロースの他にＤ−グルクロン酸を主な構成成分とする硫酸化多糖であるアスコフィラン（特許文献４参照）、β−１，３−結合を有するマンナン（特許文献５参照）等が存在する。しかし、免疫賦活作用を有する多糖の多くは、菌類由来又は植物由来であり、動物由来のものは見出されていなかった。
【０００３】
棘皮動物に分類されるヒトデ（ヒトデ綱、及びクモヒトデ綱に属する種を含む。）は、食用には適さない一方で、漁業の邪魔となったり養殖貝やサンゴ等への食害が発生したりという問題があり、有効な活用法が求められてきた。例えば、ヒトデ抽出物を有効成分とする抗原虫組成物（特許文献６参照）、ヒトデ由来の新規トリプシン（特許文献７参照）、ヒトデの抽出物を含有する植物生育促進剤（特許文献８参照）、ヒトデ綱に属する生物からの抽出物に含有されるステロイド配糖体（特許文献９参照）等が挙げられる。
【０００４】
また、本願発明らは、サンゴへの食害が問題となっているオニヒトデ（Acanthaster planci）とマダイとを同じ水槽で飼育することで、マダイの病気が抑制されたことから、オニヒトデが分泌する粘液に動物の免疫を活性化させる成分が含まれていることを見出した（共同通信社、２００９年）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−０３１０８９号公報
【特許文献２】特開２０１２−０８２１５６号公報
【特許文献３】特開２００９−２２７６１８号公報
【特許文献４】特開２００８−１２０７０７号公報
【特許文献５】特開２００６−０６０２８８号公報
【特許文献６】特開２０１０−０３０９３６号公報
【特許文献７】特開２００６−２７１３３２号公報
【特許文献８】特開２００５−２４７６９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでの免疫賦活作用を有する多糖類は、医薬品や健康食品、畜産用や水産用の飼料添加物として応用されているが、十分な免疫賦活効果を示すものは少なかった。そこで、低コストで高い免疫賦活効果を示す組成物の開発が求められていた。また、ヒトデにはさまざまな有用物質が含まれていると考えられたが、免疫賦活作用を有する物質がどのような性状かは明らかになっておらず、有効に利用されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する多糖類である。より好ましい態様では、ヒトデは、アカヒトデ科に属するオニヒトデである。
【０００８】
本発明の別の多糖類は、構成糖として、少なくともN-アセチル-D-ガラクトサミン、N-アセチル-D-グルコサミン、L-フコース、D-アラビノース、D-マンノース、D-グルコース、及びD-ガラクトースからなる群から選択される１又は複数を含む。
【０００９】
また、本発明の別の多糖類は、耐熱性又は高温高圧耐性を有する。
【００１０】
さらに、本発明の別の多糖類の平均分子量は約５．０×１０４〜約１．８×１０５である。
【００１１】
また、本発明の別の多糖類の免疫賦活作用はToll-like Receptor 4を介したものである。
【００１２】
別の本発明は、ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する多糖類を含有する組成物である。本発明の組成物は、トデ乾燥粉末、ヒトデ粘液乾燥粉末、又はそれらのアルコール不溶性画分であり得る。
【００１３】
さらに別の本発明は、ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する多糖類を有効成分とした免疫賦活剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、ヒトデに由来する免疫賦活作用を有する多糖類、該多糖類を含む組成物、及び該多糖類を有効成分とする免疫賦活剤である。本発明を、ヒトや畜産動物、水産動物、愛玩動物等に投与することにより、高い免疫賦活作用が得られる。また、本発明は、ヒトデを利用した免疫賦活作用を有する健康食品や、免疫賦活作用を有する畜産用又は水産用の飼料原料として使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】オニヒトデ粘液の限界ろ過による分画の免疫賦活作用を示す図である。
【図２】オニヒトデ粘液の免疫賦活作用がプロテイナーゼＫ処理で変化しないことを示す図である。
【図３】オニヒトデ粘液から得られた濃縮画分（Ｃ）及び水抽出画分（Ｄ）の免疫賦活作用を示す図である。
【図４】オニヒトデ粘液を、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて分画したことを示す図である。
【図５】オニヒトデ粘液から得られた分子量の大きな分画を用いた陰イオン交換クロマトグラフィの結果を示す図である。
【図６】オニヒトデ由来の多糖類の分子量を、高速液体クロマトグラフィを用いて測定したことを示す図である。
【図７】オニヒトデ由来の多糖類の構成糖分析におけるトータルイオンクロマトグラムを示す図である。
【図８】抗TLR2抗体、又は抗TLR4抗体存在下における本発明の多糖類の免疫賦活作用を示す図である。
【図９】オニヒトデ由来の多糖類を含有する組成物によるマダイの飼育試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ヒトデ由来で且つ免疫賦活作用を有する多糖類と、多糖類を含む組成物、及び多糖類を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。
【００１７】
本発明の多糖類はヒトデ由来であり、より具体的にはヒトデが分泌する粘液由来である。発明者らは、オニヒトデ（Acanthaster planci）が分泌する粘液が免疫賦活作用を有する多糖類を含有していることを見出し、本発明に到達した。さらに、非常に広い範囲の種に属するヒトデが免疫賦活作用を有する多糖を含有していると考えられる。免疫賦活作用を有する多糖類を含有するヒトデであれば、本発明に利用することができる。
【００１８】
ヒトデは、動物界の中で棘皮動物門（Echinodermata）に属し、ヒトデ綱（Asteroidea）及びクモヒトデ綱 (Ophiuroidea)に分類される生物の総称である。ヒトデ綱は、ホウキボシ科、イトマキヒトデ科、オニヒトデ科、モミジガイ科、スナヒトデ科、タコヒトデ科、キヒトデ科、及びニチリンヒトデ科等に分類される。
【００１９】
ヒトデと呼ばれる生物種は、具体的には、アカヒトデ（Certonardoa semiregularis）、イトマキヒトデ（Asterinapectinifera）、オニヒトデ （Acanthaster planci）、トゲモミジガイ（Astropecpten polyacanthus）、スナヒトデ（ Luidiaquinaria）、ヤツデスナヒトデ （Luidia maculata）、タコヒトデ（ Plazaster borealis）、キヒトデ（ヒトデ・マヒトデ）（Asteriasamurensis）、ヤツデヒトデ （Coscinasterias acutispina）、フサトゲニチリンヒトデ（Crossaster papposus）、クモヒトデ（Ophioplocusjaponicus）等が挙げられる。
【００２０】
本発明におけるヒトデの種類は限定されず、免疫賦活作用を有する多糖類を含有するヒトデ、又は免疫賦活作用を有する多糖類を含有する粘液を分泌するヒトデであれば本発明に利用することができる。
【００２１】
本発明に利用されるヒトデは、オニヒトデ（Acanthaster planci）であることが好ましい。オニヒトデとは、オニヒトデ科に属する生物であり、サンゴを好んで食する。大発生した場合にはサンゴ礁が破壊されるため世界中で問題となっているが、駆除されたオニヒトデの有効利用法は確立されていなかった。本発明者らは、オニヒトデが分泌する粘液が強い免疫賦活作用を有することを見出し、本発明に到達した。
【００２２】
また、本発明の多糖類の平均分子量は限定されないが、好ましくは、約１．０×１０４〜約１．０×１０８であり、より好ましくは、約２．０×１０４〜約２．０×１０６であり、さらに好ましくは、約５．０×１０４〜約１．８×１０５である。
【００２３】
本発明の多糖類は、構成糖として、単糖及びその誘導体を含む。以下、本発明の多糖類に含まれ得る単糖及びその誘導体について詳細に説明する。
【００２４】
単糖は、中性糖とも呼ばれ、アルドースとケトースに分類され、含まれる炭素の数によって、三炭糖（トリオース）、四炭糖（テトロース）、五炭糖（ペントース）、六炭糖（ヘキソース）、七炭糖（ヘプトース）、八炭糖（オクツロース）等と呼ばれる。三炭糖の具体例として、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン等が挙げられる。四炭糖の具体例として、エリトロース、トレオース、エリトルロース等が挙げられる。五炭糖の具体例として、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アビオース、リブロース、キシルロース等が挙げられる。六炭糖の具体例として、アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等が挙げられる。七炭糖の具体例として、セドヘプツロース、コリオース等が挙げられる。
【００２５】
さらに、糖の誘導体としては、デオキシ糖、ウロン酸、アルドン酸、アルダル酸、アミノ糖等が挙げられる。デオキシ糖の具体例として、デオキシリボース、デオキシグルコース、キノボース、テベトース、ラムノース、ラムヌロース、フコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、シマロース、アベクオース、アスカリロース、コリトース、パラトース、チベロース等が挙げられる。また、ウロン酸の具体例として、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸、ガラクツロン酸、イズロン酸等が挙げられる。また、アルドン酸の具体例として、グロン酸、グルコン酸等が挙げられる。また、アルダル酸の具体例として、グルカル酸、ガラクタル酸、マンナル酸等が挙げられる。また、アミノ糖の具体例として、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸、アミノウロン酸、ムラミン酸等が挙げられる。ウロン酸、アルドン酸、又はアルダル酸を多く含む多糖類は酸性を示し、酸性多糖類と呼ばれる。
【００２６】
また、上記の単糖及びその誘導体は光学異性体を持つ場合がある。かかる場合、単糖及びその誘導体はＤ型、Ｌ型どちらの光学異性体でも構わない。
【００２７】
本発明の多糖類は、構成糖として、単糖（中性糖）、アミノ糖、ウロン酸、アルドン酸、アルダル酸、デオキシ糖を含み得る。より具体的には、本発明の多糖類は、N-アセチル-D-ガラクトサミン（D-GalNAc）、N-アセチル-D-グルコサミン（D-GlcNAc）、L-フコース（L-Fuc）、D-アラビノース（D-Ara）、D-マンノース（D-Man）、D-グルコース（D-Glu）、及びD-ガラクトース（D-Gal）からなる群から含まれる１又は複数を含むことが好ましい。
【００２８】
多糖類の構成糖の分析は、ガスマスクロマトグラフィ質量分析計を用いて行われる。ガスマスクロマトグラフィ質量分析計により得られたトータルイオンクロマトグラムのピーク面積と標準品とを比較して、構成糖の含有量及び含有率を算出することができる。具体的には、トリフルオロ酢酸（TFA）等により多糖類を加水分解し、誘導体化し、乾固させ、ガスクロマトグラフィ質量分析計（GC/MS）で分析することで、トータルイオンクロマトグラムを得ることができる。ここでの誘導体化は、アセチル化を施す方法や、ジエチルジチオアセタール化及びトリメチルシリル化を施す方法が公知となっている。
【００２９】
本発明の多糖類は、ガスマスクロマトグラフィ質量分析計を用いて得られたトータルイオンクロマトグラムにより解析される構成糖のモル比が、N-アセチル-D-ガラクトサミン（D-GalNAc）が約４０％〜約５０％、N-アセチル-D-グルコサミン（D-GlcNAc）が約５％〜約１５％、L-フコース（L-Fuc）が約１％〜約１０％、D-アラビノース（D-Ara）が約１％〜約１０％、D-マンノース（D-Man）が約５％〜約１５％、D-グルコース（D-Glu）が約１％〜約１０％、及びD-ガラクトース（D-Gal）が約３０％〜約４０％であることが好ましい。
【００３０】
また、本発明の多糖類は、耐熱性を有していることが好ましい。多糖類が耐熱性を有している場合には、多糖類が熱処理されても、その免疫賦活作用が保持される。熱処理の温度は限定されないが、例えば、８０℃〜３００℃であり、好ましくは９０℃〜２００℃であり、より好ましくは１００℃〜１５０℃である。また、熱処理の時間は限定されないが、１分間〜２時間であり、好ましくは、５分間〜３０分間である。本発明の多糖類は、少なくとも、１２０℃・２０分間の熱処理で免疫賦活作用が失われない。
【００３１】
また、本発明の多糖類は、高温高圧耐性を有していることが好ましい。多糖類が高温高圧耐性を有している場合には、多糖類が高温高圧処理されてもその免疫賦活作用は失われない。高温高圧処理とは、高温且つ高圧の処理をいう。高温高圧処理の圧力は限定されないが、例えば、０．１ＭＰａ〜１０００ＭＰａであり、好ましくは０．２Ｍｐａ〜１００Ｍｐａである。高温高圧処理の温度は限定されないが、例えば、８０℃〜３００℃であり、好ましくは９０℃〜２００℃であり、より好ましくは１００℃〜１５０℃である。
【００３２】
高温高圧処理はエクストルーダによる処理が含まれる。エクストルーダは混練押出機とも呼ばれ、食品や飼料の加工に用いられる。本発明の多糖類は、エクストルーダによる処理でも免疫賦活作用を失わないものであることが好ましい。エクストルーダは、１軸型又は多軸型のスクリュを備える。具体的には、本発明の多糖類を含有する組成物やその他の原料がエクストルーダ内でスクリュによって混練され、高温高圧処理を施されながら、ダイから押し出される。
【００３３】
また、本発明は、ヒトデ由来で免疫賦活作用を有する多糖類を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、免疫賦活作用を有する多糖を含有するヒトデ又は該ヒトデが分泌する粘液から製造される。本発明の組成物は、ヒトデ又は該ヒトデが分泌する粘液を原料とし、濃縮処理、熱処理、高温高圧処理、乾燥処理、粉砕処理等の処理を施して製造することができる。
【００３４】
本発明の組成物は、好ましくは、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液を乾燥処理及び粉砕処理して得られた乾燥粉末である。粉末であることがより好ましい。本発明の組成物を乾燥粉末とすることで、本発明の組成物を供与したヒト又は動物における多糖類の吸収が促進されると同時にその保存が容易となる。
【００３５】
また、別の本発明の組成物は、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液から免疫賦活作用を有する多糖類を抽出する処理を施して製造される。本発明の多糖類は水に可溶であるため、多糖類の抽出には水が溶媒として用いられる。抽出の温度、圧力は限定されず、加熱抽出や、減圧抽出・加圧抽出でも構わない。すなわち、本発明の組成物は、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液からの抽出物、好ましくは水抽出物である。該抽出物には免疫賦活作用を有する多糖類が含有される。
【００３６】
また、本発明の組成物に含まれる多糖類は、水に可溶であり、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ヘキサン等の極性の低い溶媒には不溶である。したがって、本発明の組成物は、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液に含まれる夾雑物を極性の低い溶媒を用いて除去して得られたものであることが好ましい。すなわち、本発明の組成物は、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液から調整された多糖類不溶性溶媒に対する不溶性固形物であり得る。
【００３７】
具体的には、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液の乾燥粉末を多糖類不溶性溶媒と混合し、遠心分離や吸引濾過等の手段によって多糖類不溶性溶媒を取り除くことによって不溶性固形物を得ることができる。多糖類不溶性溶媒とは、多糖類が不溶である溶媒をいい、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、それらの混合溶媒等、極性が低い溶媒が挙げられる。本工程は１回でも構わないが、複数回繰り返すことで、組成物中の多糖類の含有率を高めることができる。
【００３８】
多糖類不溶性溶媒としては、アルコール、又はアルコール水溶液が好ましく用いられる。アルコール水溶液は、約５０容量％以上、具体的には、約６０容量％以上、約７０容量％以上、約８０容量％以上、約９０容量％以上のものを用いることができる。すなわち、本発明の組成物は、ヒトデ又はヒトデが分泌する粘液の乾燥粉末から調整されたアルコール不溶性固形物であり得る。
【００３９】
本発明の組成物は、免疫賦活組成物として用いることができる。すなわち、上述の多糖を有効成分とする免疫賦活剤として、医薬品や健康食品、機能食品、動物用医薬品、飼料、飼料添加剤、飼料原料、水質改善剤として提供され、ヒトだけでなく、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等の畜産、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マダイ、ブリ、カンパチ、ハタ、フグ、マグロ、ウナギ、エビ、カニ等の水産養殖に利用することができる。
【００４０】
また、本発明は、該ヒトデから分泌される粘液に含まれる多糖類が飼育水中に存在することによって水生生物の免疫を賦活する飼育方法を包含する。本飼育方法においては、ヒトデと水生生物とを同一の水槽で飼育してもよく、ヒトデと水生生物とを別々の水槽で飼育して飼育水を共有してもよく、多糖類が含まれるヒトデの粘液を水生生物の飼育水に添加してもよい。水生生物とは、具体的にはマダイ、ブリ、カンパチ、ハタ、フグ、マグロ、ウナギ、エビ、カニ等の水産養殖種や、コイ、キンギョ、熱帯魚等の観賞魚等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
さらに、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４２】
１．オニヒトデに含まれる免疫賦活作用を有する物質の同定
オニヒトデ（Acanthaster planci）が含有し、免疫賦活作用を有する物質の同定を行った。海水中にオニヒトデが分泌した粘液を回収し、ロータリエバポレータを用いて減圧濃縮を行い、酢酸エチルを添加して水層（Ａ）及び酢酸エチル層（Ｂ）に分画した。
【００４３】
マウスマクロファージ細胞株（RAW264細胞）の培養液に水層（Ａ）及び酢酸エチル層（Ｂ）を添加し、産出される一酸化窒素量を測定した。活性化したマクロファージは、一酸化窒素を産出することが知られており、これを免疫賦活の指標として用いた。また、ポジティブコントロールとして、免疫賦活作用を有することが知られているリポ多糖（LPS）を用いた。水層（Ａ）に免疫賦活作用がみられ、酢酸エチル層（Ｂ）に免疫賦活作用がみられなかったことから、免疫賦活作用を有する物質は既知のサポニンではないことがわかった。
【００４４】
また、水層を、限外ろ過膜を用いて分子量３．０×１０３で分画し、免疫賦活作用を測定した。図１に示すように分子量３．０×１０３より大きい物質が含まれる分画でのみ免疫賦活作用が認められたため、免疫賦活作用を有する物質は分子量３．０×１０３より大きいであることがわかった。
【００４５】
さらに、水層（Ａ）をタンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫで処理した場合に、その免疫賦活作用が保持されるかどうかを調べた。図２に示すように、３７℃、及び５５℃の処理でタンパク質がプロテイナーゼＫ処理によりで分解されたことがSDS-PAGEで確認された。一方、マクロファージの一酸化窒素の産出量は変化しなかったため、免疫賦活作用を有する物質はタンパク質ではないことがわかった。
【００４６】
海水中にオニヒトデが分泌した粘液を回収し、ロータリエバポレータを用いて減圧濃縮を行い、濃縮画分（Ｃ）を得た。濃縮画分（Ｃ）に４倍量のメタノールを添加して撹拌し、遠心して沈殿物として得られたアルコール（メタノール）不溶性固形物に対して水抽出を行い、水抽出画分（Ｄ）を得、濃縮画分（Ｃ）及び水抽出画分（Ｄ）の免疫賦活作用を測定した。図３に示すように、濃縮画分（Ｃ）及び水抽出画分（Ｄ）で強い免疫賦活作用が認められたため、免疫賦活作用を有する物質はアルコール（メタノール）に不溶であり、多糖類であると考えられた。
【００４７】
水抽出画分（Ｄ）を、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて分画した。カラムにはSephacryl-S500カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図４に示すように、複数の免疫賦活作用を示す物質が含まれていると考えられた。
【００４８】
ゲルろ過クロマトグラフィによる画分のうち、分子量が大きい画分について、DEAE sepharose陰イオン交換カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて0Mから1Mの塩化ナトリウム水溶液で溶出を行った。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図５に示すように、0.2 Mの塩化ナトリウム水溶液溶出画分に強い免疫賦活作用を示した。陰イオン交換カラムに吸着し、0.2 M 塩化ナトリウム水溶液で溶出したため、免疫賦活作用を有する物質は酸性であることがわかった。
【００４９】
ゲル濾過クロマトグラフィで免疫賦活作用が認められた溶出画分を高速液体クロマトグラフィにかけ、分子量を測定した。カラムには分画範囲が５億から１万のShowdex（登録商標） SB-807 HQ（昭和電工株式会社製）を用いた。図６に示すように、免疫賦活作用を有する物質は、分子量約１．８１×１０５の多糖類であることがわかった。
【００５０】
さらに、精製された多糖類を2 Mのトリフルオロ酢酸（TFA）１００℃、１６時間の条件で加水分解し、加水分解で得られた単糖及びその誘導体をアセチル化し、さらに窒素を吹き付けて乾固して水に溶解させ、ヘキサンで抽出した。HP-5カラム（アジレントテクノロジー株式会社製）を用いてガスクロマトグラフィ質量分析計（GC/MS）を用いて上記の多糖の構成糖を分析したところ、図７に示されるパターンのトータルイオンクロマトグラム（TIC）が得られた。トータルイオンクロマトグラムのピークに対応する単糖及びその誘導体の面積比を算出し、さらに標準品を用いて単糖及びその誘導体の重量比と構成比（モル％）を算出した。構成比（モル％）を表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
以上の結果から、多糖類は、オニヒトデが分泌する粘液に含まれ、水に可溶であり、約80容量％のメタノール水溶液に不溶であり、酸性多糖類であり、さらに平均分子量が約１．８１×１０５であり、少なくとも、構成糖として、N-アセチル-D-ガラクトサミン、N-アセチル-D-グルコサミン、L-フコース、D-アラビノース、D-マンノース、D-グルコース、及びD-ガラクトースからなる群から含まれる１又は複数を含むことが明らかとなった。
【００５３】
２．本発明の多糖類による免疫賦活の作用機序の解析
本発明の多糖類の有する免疫賦活作用が、動物のマクロファージのどの受容体を介して起こるかを調べた。Toll-like Receptor 2に対する抗体（anti-mTLR2）、又はToll-like Receptor 4に対する抗体（anti-mTLR4）でマクロファージを処理し、ウリミバエ由来多糖、又はLPSを1ng/mLになるように添加し、一酸化窒素の産出量を測定した。結果を図８に示す。Toll-like Receptor 4に対する抗体で処理したマクロファージで一酸化窒素の産出量が有意に低下したため、本発明の多糖類による免疫賦活作用は、少なくともToll-like Receptor 4を介していることが示された。
【００５４】
３．本発明の多糖類を含む飼料によるマダイ飼育試験
本発明の多糖類を含有する組成物によりマダイの耐病性が向上するかどうかを調べた。本発明の組成物として海水中にオニヒトデが分泌した粘液を回収して得られた海水抽出液（実施例１）を得た。さらに、ロータリエバポレータを用いて減圧濃縮し、アルコールを添加して得られたアルコール不溶性の水抽出画分（実施例２）を得た。マダイは尾叉長約10cm、魚体重約25gの個体を、各12尾ずつ水槽に収容した。実施例１又は実施例２を含有する飼料を作製し、マダイに供与した。4週間飼育した後に、マダイの腹腔内にエドワジエラ症を引き起こすグラム陰性菌であるEdwardsiellatardaを５．０×１０５ cellを接種して強制感染させ、生存数を計測した。結果を図９に示す。本実施例の組成物を供与した群は、対照群に比べていずれも生存率が高かった。したがって、オニヒトデ由来の多糖類の有する免疫賦活作用により、マダイがEdwardsiella tardaに対する耐病性を獲得したと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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