(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸において一塩基置換する方法を提供する。【解決手段】イノシンと、光応答性修飾ヌクレオシドが導入された光応答性修飾核酸と、光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有しイノシンに対応する相補的な位置にシトシン（Ｃ）を有する標的核酸とを、ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉ：
【化１】
2015195736.tif 000010
（ただし、式Ｉ中、
Ｒ１は、水素を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表されるイノシンが、式ＩでＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式ＩＩ：
【化２】
2015195736.tif 000011
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ４は、水素を表し、
Ｒ５は、水酸基を表し、
Ｒ６は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの３’側に隣接した位置に、式ＩＩでＲ４に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン（Ｃ）を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程、
を含む、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する方法。
【請求項２】
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程、の後に、さらに、
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、２０℃〜４０℃の範囲の温度でインキュベーションして行われる、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、１時間〜１０日間の範囲でインキュベーションして行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、ｐＨ６．２〜７．８の範囲のｐＨでインキュベーションして行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、０．１秒〜３０秒の範囲で光照射して行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、３００ｎｍ〜３３０ｎｍの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、０．１秒〜３０秒の範囲で光照射して行われる、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程の後に、さらに、
光架橋が開裂した二重鎖を解離して、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換された標的核酸の鎖を得る工程、
を含む、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換された標的核酸を製造する方法。
【請求項１２】
次の式Ｉ：
【化３】
2015195736.tif 000012
（ただし、式Ｉ中、
Ｒ１は、水素を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表されるイノシンが、式ＩでＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式ＩＩ：
【化４】
2015195736.tif 000013
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ４は、水素を表し、
Ｒ５は、水酸基を表し、
Ｒ６は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの３’側に隣接した位置に、式ＩＩでＲ４に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸塩基変換剤。
【請求項１４】
請求項１２に記載の光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン（Ｃ）を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
を含む、光架橋を形成する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって、光架橋が形成された核酸を製造する方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸光架橋剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸中の塩基を変換する方法、及び核酸塩基変換剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学的の分野において、人為的な遺伝子の点突然変異（一塩基置換）、すなわち、意図した遺伝子の意図した位置で意図した一塩基置換を人為的に生じさせる技術は、長年の夢であり、永らく求められてきていた。
【０００３】
一方、核酸の光反応技術として、５−シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３−ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３７５３９３８号公報
【特許文献２】特許第３７５３９４２号公報
【特許文献３】特許第４８１４９０４号公報
【特許文献４】特許第４９４０３１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、核酸において一塩基置換する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、核酸の光反応技術を鋭意研究してきたところ、光応答性修飾核酸と標的となる核酸をハイブリダイゼーションして二重鎖を形成させた後に、光照射によって光架橋を形成させて、インキュベーションを行うことによって、標的核酸中に一塩基置換を高い効率で実現できること、この光架橋性修飾核酸の塩基配列中に導入した光応答性塩基の５’側に隣接させてイノシン（Ｉ）を導入すると、イノシン（Ｉ）に相補的な位置のシトシン（Ｃ）がウラシル（Ｕ）へと塩基変換できること、これが室温や３７℃の中性溶液という穏和な条件下で実現できること、を見いだして、本発明に到達した。
【０００７】
したがって、本発明は次の（１）以下にもある。
（１）
次の式Ｉ：
【化１】
2015195736.tif 000002
（ただし、式Ｉ中、
Ｒ１は、水素を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表されるイノシンが、式ＩでＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式ＩＩ：
【化２】
2015195736.tif 000003
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ４は、水素を表し、
Ｒ５は、水酸基を表し、
Ｒ６は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの３’側に隣接した位置に、式ＩＩでＲ４に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン（Ｃ）を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程、
を含む、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する方法。
（２）
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程、の後に、さらに、
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程、
を含む、（１）に記載の方法。
（３）
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、２０℃〜４０℃の範囲の温度でインキュベーションして行われる、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、１時間〜１０日間の範囲でインキュベーションして行われる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、ｐＨ６．２〜７．８の範囲のｐＨでインキュベーションして行われる、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、０．１秒〜３０秒の範囲で光照射して行われる、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、３００ｎｍ〜３３０ｎｍの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、（２）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、０．１秒〜３０秒の範囲で光照射して行われる、（２）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程の後に、さらに、
光架橋が開裂した二重鎖を解離して、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換された標的核酸の鎖を得る工程、
を含む、（２）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）
（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換された標的核酸を製造する方法。
【０００８】
さらに、本発明は、次の（２１）以下にもある。
（２１）
次の式Ｉ：
【化３】
2015195736.tif 000004
（ただし、式Ｉ中、
Ｒ１は、水素を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表されるイノシンが、式ＩでＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式ＩＩ：
【化４】
2015195736.tif 000005
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ４は、式ＩＩでＲ４に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ５は、水酸基を表し、
Ｒ６は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの３’側に隣接した位置に、式ＩＩでＲ４に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸。
（２２）
（２１）に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸塩基変換剤。
（２３）
（２１）に記載の光応答性修飾核酸の、核酸塩基変換のための使用。
（２４）
（２１）に記載の光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン（Ｃ）を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
を含む、光架橋を形成する方法。
（２５）
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、（２４）に記載の方法。
（２６）
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、０．１秒〜３０秒の範囲で光照射して行われる、（２４）〜（２５）のいずれかに記載の方法。
（２７）
（２４）〜（２６）のいずれかに記載の方法によって、光架橋が形成された核酸を製造する方法。
（２８）
（２１）に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸光架橋剤。
（２９）
（２１）に記載の光応答性修飾核酸の、核酸光架橋のための使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、核酸において、シトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）への一塩基置換を、高い効率で実現できる。この一塩基置換は、光反応を利用した特異的な置換であり、室温や３７℃の中性溶液という穏和な条件下でも実現できるので、核酸を損傷することなく、生理的な条件下で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は塩基変換方法のスキームを示す説明図である。
【図２】図２は塩基対形成の説明図である。
【図３】図３は光架橋反応の結果を示すチャート及びグラフである。
【図４】図４は塩基変換反応の結果を示すチャート及びグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施他の形態に限定されるものではない。
【００１２】
［塩基置換の方法］
本発明によれば、
式Ｉで表されるイノシンが、リン酸ジエステル結合して導入され、式ＩＩで表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの３’側に隣接した位置に、リン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン（Ｃ）を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程、
を含む方法によって、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換することができる。
【００１３】
好適な実施の態様において、光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換する工程、の後に、さらに、光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程、を行うことができる。
【００１４】
［標的核酸］
標的核酸は、一塩基変換の標的となる塩基を有する核酸である。標的となる塩基は、シトシン（Ｃ）であり、これがウラシル（Ｕ）へと一塩基変換される。すなわち、本発明の一塩基変換によれば、標的核酸の塩基配列中にリン酸ジエステル結合されたシチジンがウリジンへと変換され、あるいは、リン酸ジエステル結合されたデオキシシチジンがデオキシウリジンへと変換され、結果として特異的な一塩基置換が実現される。標的核酸の塩基長に特に制約はないが、例えば、６塩基長以上、７塩基長以上、８塩基長以上、９塩基長以上、とすることができ、例えば、１０００塩基長以下、１００塩基長以下、５０塩基長以下、２０塩基長以下、１６塩基長以下、１２塩基長以下、とすることができる。標的核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。
【００１５】
［光応答性修飾核酸］
光応答性修飾核酸は、一塩基置換の標的となる塩基を有する標的核酸と相補的な塩基配列を有し、ただし、標的核酸の塩基配列中で標的となるシトシンに対して相補的な位置には、式Ｉのイノシン（すなわち、イノシン又はデオキシイノシン）が導入されて位置しており、イノシンの３’側に隣接して、式ＩＩの光応答性修飾ヌクレオシドが導入されて位置している。なお、標的核酸の塩基配列中において、光応答性修飾ヌクレオシドに対して相補的な位置には、任意の塩基（ヌクレオシド）が位置することができ、例えば、グアニンが位置することができる。光応答性修飾核酸の塩基長に特に制約はないが、例えば、６塩基長以上、７塩基長以上、８塩基長以上、９塩基長以上、とすることができ、例えば、１０００塩基長以下、１００塩基長以下、５０塩基長以下、２０塩基長以下、１６塩基長以下、１２塩基長以下、とすることができる。光応答性修飾核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。
【００１６】
［イノシン］
光応答性修飾核酸の塩基配列中に導入されたイノシンは、次の式Ｉで表されるイノシンである：
【化５】
2015195736.tif 000006
【００１７】
式Ｉにおいて、Ｒ１は、水素を表し、Ｒ２は、水酸基を表し、Ｒ３は、水素又は水酸基を表す。
【００１８】
［光応答性修飾ヌクレオシド］
光応答性修飾核酸の塩基配列中に導入された光応答性修飾ヌクレオシドは、次の式ＩＩで表される光応答性修飾ヌクレオシドである：
【化６】
2015195736.tif 000007
【００１９】
式ＩＩにおいて、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素を表し、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素を表し、
Ｒ４は、水素を表し、
Ｒ５は、水酸基を表し、
Ｒ６は、水素又は水酸基を表す。
【００２０】
好適な実施の態様において、式ＩＩのＲ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２１】
好適な実施の態様において、式ＩＩのＲ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２２】
［二重鎖の形成］
光応答性修飾核酸と標的核酸は、上述のように、相補的な塩基配列を有しているので、公知の条件下で、ハイブリダイズさせて二重鎖を形成することができる。
【００２３】
［光架橋の形成］
光応答性修飾ヌクレオシドは、二重鎖を形成した後に、光照射によって光反応して、イノシンに対して相補的な位置に位置するシトシン（すなわち、塩基変換の標的となるシトシン）と、光架橋を形成する。光照射は、例えば、３４０ｎｍ〜３８０ｎｍの範囲、３６０ｎｍ〜３７０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば、３６６ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。好適な実施の態様において、単波長光、例えば３６６ｎｍの波長の単波長光を、使用することができる。光照射は、例えば、０．１秒〜３０秒、１秒〜２０秒、５秒〜１５秒の範囲の照射時間によって行うことができる。光照射は、例えば、０℃〜４０℃、０℃〜３０℃、０℃〜２０℃、０℃〜１０℃の範囲の温度で、例えば、氷冷下で、行うことができる。
【００２４】
本発明の光応答性修飾核酸は、イノシンを導入したことによって、必要となる光照射時間が短縮されている。したがって、本発明の光応答性修飾核酸は、光架橋剤としても、優れたものとなっており、本発明は、光架橋剤、光架橋を形成する方法、光架橋が形成された核酸を製造する方法にもある。
【００２５】
［二重鎖のインキュベーションによる塩基変換］
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションすると、標的核酸中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）へと塩基変換される。このインキュベーションは、９０℃といった高温に加熱する必要はなく、高濃度の化合物を投入する必要もなく、常温常圧で生理的な塩濃度とｐＨで、行うことができる。このために、操作は簡易であり、また核酸あるいは共存する生体分子を損傷する可能性は最小であり、インビトロ及びインビボの広い応用が期待される。
【００２６】
インキュベーションは、例えば、４℃〜４０℃、１０℃〜４０℃、２０℃〜４０℃、３０℃〜３８℃の範囲の温度で、行うことができる。インキュベーションは、例えば、中性条件下、例えば、ｐＨ６．２〜７．８の範囲のｐＨで、行うことができる。所望により、公知の緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、カコジル酸緩衝液、を使用してもよい。インキュベーションは、例えば、生理食塩水の塩濃度、例えば、５０〜１５０ｍＭ、８０〜１２０ｍＭの塩濃度としてもよく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、などの塩を使用して、行うことができる。インキュベーションは、例えば、１時間〜１０日間、６時間〜７日間、１２時間〜４日間、２４時間〜３日間の範囲で、行うことができる。好適な実施の態様において、シトシンからウラシルへの塩基変換の効率（変換率）は、例えば、１０％以上、１５％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、とすることができ、例えば、９０％以下、７０％以下、５０％以下とすることができる。塩基変換率は、インキュベーション時間とともに増大する傾向にあり、所望の変換率に応じて、インキュベーション時間を選択することができる。本発明によれば、このような穏和な条件下で、このような短時間のインキュベーション時間で、塩基変換できる。
【００２７】
［光架橋の開裂］
塩基変換された後の二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させることができる。開裂に使用される光照射は、例えば、３００ｎｍ〜３３０ｎｍ、３１０ｎｍ〜３２０ｎｍｍの範囲の波長を含む光、例えば３１２ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。好適な実施の態様において、単波長光、例えば３１２ｎｍの波長の単波長光を、使用することができる。開裂に使用される光照射は、例えば、１分〜６０分、５分〜３０分、１０分〜２０分の範囲の照射時間によって行うことができる。開裂の光照射は、例えば、０℃〜４０℃、１０℃〜４０℃、１５℃〜３５℃、２０℃〜３０℃の範囲の温度で、例えば、室温下で、行うことができる。
【００２８】
［二重鎖の解離］
光架橋が開裂した後の二重鎖は、核酸のアニーリングの条件として、公知の条件下とすることによって、単鎖へと解離することができる。すなわち、塩基変換された標的核酸は、光応答性修飾核酸と分離して、回収することができる。二重鎖の解離の条件下で、光架橋の開裂を行ってもよい。
【００２９】
［塩基変換された標的核酸］
本発明によれば標的核酸は、温度やｐＨなどを含めて、生理的な条件に近い穏和な条件下で、塩基変換される。そのために、核酸分子、あるいは他の生体分子に、与える損傷は最小のものとなるために、インビトロにとどまらず、インビボでの広い応用が期待されるものである。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［塩基変換方法のスキーム］
図１に、塩基変換方法のスキームをまとめて示す。図１の右側は、実施例による塩基変換方法の実験操作を示す流れ図である。イノシン（Ｉ）と隣接するCNVKを有する光応答性修飾核酸とイノシンと相補的な位置にあるシトシン（Ｃ）を有する標的核酸とで、二重鎖を形成させた（図１の右側の上から一段目）。これに対して３６６ｎｍの光照射をすると、わずか１０秒の照射で、ＣとCNVKの間に光架橋が形成され（図１の右側の上から二段目）、これを３７℃でインキュベーションするとＣがＵへと塩基変換した（図１の右側の上から三段目）。これに対して３１２ｎｍの光照射をすると、ＵとCNVKの間の光架橋が開裂して、塩基変換された標的核酸が得られた。
【００３２】
図１の左側は、比較例による実験操作を示す流れ図である。イノシン（Ｉ）の代わりにグアノシン（Ｇ）を有する光応答性修飾核酸と標的核酸とで、二重鎖を形成させた（図１の左側の上から一段目）。これに対して３６６ｎｍの光照射をすると、ＣとCNVKの間に光架橋が形成されたが（図１の左側の上から二段目）、実施例と同程度に光架橋が形成されるためには、少なくとも３０秒の光照射を要した。これを３７℃でインキュベーションしても、観察された時間内（３日間）では塩基変換は生じなかった。
【００３３】
なお、あえて、これを９０℃に加熱して、２日間インキュベーションすると部分的に塩基変換が生じた（図１の左側の上から三段目）。これに対して３１２ｎｍの光照射をすると、ＵとCNVKの間の光架橋が開裂して、塩基変換された標的核酸が得られた。
【００３４】
イノシン（Ｉ）とグアノシン（Ｇ）が、それぞれシトシン（Ｃ）とどのように塩基対を形成すると考えられているかを、図２に示す。
【００３５】
［光反応性修飾ヌクレオシドを含むオリゴＤＮＡの合成］
核酸塩基の塩基部分に代えてビニルカルバゾール骨格構造を備えて、デオキシリボース部分にはデオキシリボースを備えた、光反応性修飾ヌクレオシドとして、次式：
【化７】
2015195736.tif 000008
の３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド (CNVK)を合成した。この化合物から、次式：
【化８】
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の核酸合成試薬を合成した。これらの合成は、特許文献４（特許第４９４０３１１号）の実施例のスキーム１の手順に沿って行った。その後、一般的なシアノエチルホスホロアミダイト法に従い、ＤＮＡ自動合成機により、光反応性修飾ヌクレオシド（CNVＫ）を含むオリゴＤＮＡを合成した。オリゴＤＮＡの同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析により行った。
【００３６】
［光架橋反応］
２重鎖ＤＮＡ（１５μＭ）及びｄＵ（７５μＭ）を緩衝液（５０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解して、氷浴下、ＬＥＤ光源（３６６ｎｍ、１６００ｍＷ／ｃｍ2）を用いて光照射を行った。光照射後のサンプルをＵＰＬＣ（５０ｍＭギ酸アンモニウム／アセトニトリル、（アセトニトリル１％から１５％／１０分））により分析し、各ピークの比から光架橋効率を算出した。得られた結果を、図３に示す。
【００３７】
［塩基変換反応］
ＨＰＬＣにより生成した光架橋後２重鎖ＤＮＡ（５μＭ）を緩衝液（５０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、３７℃でインキュベートした。３１２ｎｍ光照射（トランスイルミネータ）による開裂（２５℃、１５分）を行った後、ＵＰＬＣ（５０ｍＭギ酸アンモニウム／アセトニトリル、（アセトニトリル１％から１０％／１５分）による分析を行い、各ピークの比から塩基変換効率を算出した。得られた結果を、図４に示す。
【００３８】
図３は、本発明による光架橋反応の加速実験を示すチャート及びグラフである。次の配列のオリゴＤＮＡ（ＯＤＮ）を使用して、実験を行った。
ＯＤＮ（ＩＫ）：  ５’−ＴＧＣＩ CNVＫＡＣＧ−３’
ＯＤＮ（Ｃ）：  ５’−ＡＣＧＴＧＣＧＣＡ−３’
ＯＤＮ（ＧＫ）：  ５’−ＴＧＣＧ CNVＫＡＣＧ−３’
図３の５’−ＴＧＣＸCNVＫＡＣＧ−３’のうち、ＸがＩとなったＯＤＮが上記ＯＤＮ（ＩＫ），ＸがＧとなったＯＤＮが上記ＯＤＮ（ＧＫ）である。ＯＤＮ（Ｃ）は、これらと二重らせんを形成可能な相補性のＯＤＮである。図３の左側のチャートは、ＯＤＮ（ＩＫ）、ＯＤＮ（ＧＫ）が、それぞれＯＤＮ（Ｃ）と光架橋された二重らせん（★印のピーク）を形成していくことを示している。図３の右側のグラフは、このチャートを、横軸を光照射時間（秒）、縦軸光架橋反応率（％）としてまとめたグラフである。ＯＤＮ（ＩＫ）とＯＤＮ（Ｃ）の光架橋形成は、ＯＤＮ（ＧＫ）とＯＤＮ（Ｃ）の光架橋形成と比較して、速やかに進行し、例えば、ＯＤＮ（ＧＫ）では光照射後約３０秒間を要した光架橋率（約９５％）に、ＯＤＮ（ＩＫ）では光照射後１０秒間で到達した。（すなわち、ＧをＩに変更することで光架橋反応が３倍に加速された。）
【００３９】
図４は、本発明による塩基変換反応の実験を示すチャート及びグラフである。使用したオリゴＤＮＡ（ＯＤＮ）の配列は、図３と同じである。ＯＤＮ（ＩＫ）を使用した場合には、３７℃で３日間までインキュベートしたところ、ＯＤＮ（Ｃ）は、ＣがＵに変換されてＯＤＮ（Ｕ）となっていった。図４の左側のチャートはこのＯＤＮ（Ｕ）の形成を示している。図４の右側のグラフは、このチャートを、横軸を反応時間（日）、縦軸をＣがＵに変換されてＯＤＮ（Ｕ）となった割合（Ｃ→Ｕ変換率％）としてまとめたグラフである。ＯＤＮ（ＩＫ）では、Ｕへの塩基変換が３７℃において時間とともに速やかに進行して３日後には約４０％に達しているが、ＯＤＮ（ＧＫ）では、この条件下（３７℃、３日間）ではＵへの塩基変換が観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、穏和な条件下で、人為的な遺伝子の点突然変異（一塩基置換）、すなわち、遺伝子において意図した一塩基置換を生じさせる技術を提供する。本発明は産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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