(57)【要約】【課題】ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物の提供。【解決手段】下記一般式（I）：2015193584.tif 000032［式中、Ｒ1は、−Ｈ、又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ2は、−ＯＨ、−ＮＨ2、又は−Ｎ（ＣＨ3）2であり、Ｒ3は、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、又は−ＣＲ4＝で、ここで、Ｒ4は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2であり、但し、１つ以上のＲ3は−Ｎ＝であり、ｎは０〜３の整数である］で表される複素環式化合物及びその塩。【選択図】図５
2015193584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）：
【化１】
2015193584.tif 000030
［式中、Ｒ1は、−Ｈ、又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ2は、−ＯＨ、−ＮＨ2、又は−Ｎ（ＣＨ3）2であり、Ｒ3は、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、又は−ＣＲ4＝で、ここで、Ｒ4は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2であり、但し、１つ以上のＲ3は−Ｎ＝であり、ｎは０〜３の整数である］で表される複素環式化合物。
【請求項２】
前記一般式（I）中のＲ1が−Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の複素環式化合物。
【請求項３】
前記一般式（I）中のＲ2が−Ｎ（ＣＨ3）2であることを特徴とする請求項１又は２に記載の複素環式化合物。
【請求項４】
下記化学式（II）、（III）又は（IV）：
【化２】
2015193584.tif 000031
で表されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の複素環式化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の複素環式化合物の塩。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の複素環式化合物又は請求項５に記載の塩を含む発光基質組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規複素環式化合物及びその塩、並びに、発光基質組成物に関し、特には、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な複素環式化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物発光系の中でも、ホタルの発光系は、発光効率に優れた系として知られている。該ホタルの発光系においては、発光基質であるホタルルシフェリンが、発光酵素のホタルルシフェラーゼと、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在下、励起状態のオキシルシフェリンに変換され、該オキシルシフェリンが基底状態へと失活する際に波長が約５６０ｎｍの黄緑色の蛍光が発せられる。
【０００３】
また、昨今、かかるホタルの発光系の発光基質の類似体として、多彩な発光波長を実現する化合物が合成されている。例えば、下記特許文献１には、ホタルルシフェリンのフェノール性水酸基を２級又は３級アミノ基で置換したルシフェリン誘導体が開示されている。また、下記特許文献２及び３には、ホタルルシフェリンと類似の分子構造を有するルシフェラーゼの発光基質が開示されている。
【０００４】
これらのホタルルシフェリン類似体の中でも、長波長の光を発する発光基質は、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有望であり、例えば、和光純薬工業株式会社から商品名「アカルミネ」として、長波長光を発するホタルルシフェリン類似体が市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−９１６９５号公報
【特許文献２】特開２００９−１８４９３２号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／０２７７７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記ホタル発光系の発光基質類似体は、多彩な発光波長を実現できるものの、水溶性が低く、特に、生体内深部の可視化に有用な長波長光を発する発光基質で顕著である。一般に、マウスやラット等の実験動物の生体内への投与においては、発光基質は１〜１５ｍｇ／ｍｌ程度の溶解度を有することが必要であるが、上記の長波長光を発する発光基質は、水への溶解度が約０．１ｍｇ／ｍｌであり、実用性に問題が有った。
【０００７】
これに対して、本発明者らは、特定の分子構造を有し、ホタル生物発光系における発光基質として機能する水に難溶性の発光基質を、ハロゲン化水素で塩化することで、ホタル生物発光系における発光能を保持しつつ、水溶性が大幅に向上することを見出している。
【０００８】
しかしながら、上記水に難溶性の発光基質のハロゲン化水素塩は、生体内への投与のために、ｐＨが中性付近の緩衝液に添加すると、水に難溶性の発光基質が析出してしまうという問題があった。また、上記水に難溶性の発光基質のハロゲン化水素塩をｐＨが約２の酸性溶液として、実験動物の生体内へ投与すると、生体内の細胞が適切に活動するためにｐＨが７．４前後で調節されている血液（細胞外液）のバランスが崩れる等の問題があり、実験動物への投与は可能であるが好ましくない。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の問題を解決し、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、特定の複素環を有する化合物が、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明によれば、下記一般式（I）：
【化１】
2015193584.tif 000003
［式中、Ｒ1は、−Ｈ、又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ2は、−ＯＨ、−ＮＨ2、又は−Ｎ（ＣＨ3）2であり、Ｒ3は、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、又は−ＣＲ4＝で、ここで、Ｒ4は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2であり、但し、１つ以上のＲ3は−Ｎ＝であり、ｎは０〜３の整数である］で表される複素環式化合物が提供され、該複素環式化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、また、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。
【００１２】
本発明の複素環式化合物の好適例においては、前記一般式（I）中のＲ1が−Ｈである。この場合、複素環式化合物の発光効率及びｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が更に良好である。
【００１３】
本発明の複素環式化合物の他の好適例においては、前記一般式（I）中のＲ2が−Ｎ（ＣＨ3）2である。この場合、複素環式化合物の発光効率が更に優れる。
【００１４】
本発明の複素環式化合物の中でも、下記化学式（II）、（III）又は（IV）：
【化２】
2015193584.tif 000004
で表される化合物が好ましく、上記化学式（III）又は（IV）で表わされる化合物が特に好ましい。上記化学式（II）、（III）又は（IV）で表される複素環式化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性、発光効率、生体内深部の可視化、入手容易性が特に優れ、また、上記化学式（III）で表わされる化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が非常に高い上、発光波長が長く、生体内深部の可視化に特に有用であり、また、上記化学式（IV）で表わされる化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が極めて高い。
【００１５】
また、本発明によれば、前記複素環式化合物の塩が提供され、該塩も、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。
【００１６】
また、本発明によれば、前記複素環式化合物又は塩を含む発光基質組成物が提供され、該発光基質組成物は、ｐＨが中性付近でも安定であり、発光酵素のホタルルシフェラーゼと共にホタル生物発光系を構成できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】天然ホタルルシフェリン、アカルミネ及びピリジン環含有発光基質（７）の発光経時変化を示す。
【図２】天然ホタルルシフェリン、アカルミネ及びピリジン環含有発光基質（１７）の発光経時変化を示す。
【図３】天然ホタルルシフェリン、アカルミネ及びピラジン環含有発光基質（２７）の発光経時変化を示す。
【図４】天然ホタルルシフェリン、アカルミネ及びピリジン環含有発光基質（７）の発光スペクトルを示す。
【図５】天然ホタルルシフェリン、アカルミネ及びピリジン環含有発光基質（１７）の発光スペクトルを示す。
【図６】天然ホタルルシフェリン、アカルミネ及びピラジン環含有発光基質（２７）の発光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明の複素環式化合物は、上記一般式（I）で表される。本発明の複素環式化合物は、ジヒドロチアゾール環に加えて、複素環をもう一つ有し、該複素環は、ベンゼン環よりも極性が高い。そのため、本発明の複素環式化合物は、水溶性が高く、また、ｐＨが中性付近（好ましくはｐＨが４〜１０、より好ましくはｐＨが６〜８）の緩衝液への溶解性に優れる。また、本発明の複素環式化合物は、分子構造がホタルルシフェリンと類似しているため、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。
【００２０】
＜一般式（I）で表される複素環式化合物＞
上記一般式（I）中、Ｒ1は、−Ｈ（水素）又は炭素数１〜３のアルキル基である。ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基が挙げられる。なお、Ｒ1としては、発光効率及びｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性の観点から、−Ｈが好ましい。
【００２１】
上記一般式（I）中、Ｒ2は、−ＯＨ（ヒドロキシ基）、−ＮＨ2（アミノ基）、又は−Ｎ（ＣＨ3）2（ジメチルアミノ基）である。なお、Ｒ2としては、発光効率の観点から、−Ｎ（ＣＨ3）2が好ましい。
【００２２】
また、上記一般式（I）中、Ｒ3は、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、又は−ＣＲ4＝で、ここで、Ｒ4は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2（アリル基）であり、但し、１つ以上のＲ3は−Ｎ＝である。なお、本発明においては、合成の容易性の観点から、４つのＲ3の内、１つが−Ｎ＝で、３つが−ＣＨ＝であることが好ましく、即ち、本発明の複素環式化合物は、ピリジン環を有することが好ましい。また、本発明においては、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性の観点から、４つのＲ3の内、２つが−Ｎ＝で、２つが−ＣＨ＝であることが好ましく、即ち、本発明の複素環式化合物は、ピラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環を有することも好ましく、ピラジン環を有することが更に好ましい。
【００２３】
上記一般式（I）中、ｎはビニレン単位（−ＣＨ＝ＣＨ−）の繰り返し数を示し、０〜３の整数である。ｎの数が大きい程、発光波長が長くなるため、生体内深部の可視化の観点から、ｎは２又は３であることが好ましく、入手容易性の観点から、ｎは２であることが好ましい。
【００２４】
上記一般式（I）で表される複素環式化合物は、特に限定されるものではないが、以下のようにして合成することができる。例えば、出発物質として２−アミノ−５−シアノピリジン、５−アミノ−２−シアノピリジン等のシアノピリジン誘導体を使用し、所望により、ヨードメタンと反応させて、ジメチルアミノ体を得、次いで、水素化ジイソブチルアミニウムと反応させて、アルデヒド体を生成させる。或いは、出発物質として２−アミノ−５−ブロモ−ピラジン等のブロモピラジン誘導体を使用し、所望により、ヨードメタンと反応させて、ジメチルアミノ体を得、次いで、ノルマルブチルリチウム等のアルキルリチウムと反応させた後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド化合物と反応させて、アルデヒド体を生成させる。次いで、該アルデヒド体を４−ホスホノクロトン酸トリエチルと反応させてエチルエステル体を得、次いで、該エチルエステル体を水酸化ナトリウム水溶液中でカルボキシル体に変換する。一方、Ｄ−システイン−Ｓ−トリチル化合物を塩化水素、１，４−ジオキサン溶液存在下、メタノール溶液中で反応させて、メチルエステル体を準備し、次いで、該メチルエステル体と前記カルボキシル体とを反応させて、アミド体を生成させる。次いで、該アミド体をトリフルオロ酢酸無水物、トリフルオロメタンスルホン酸無水物等の酸無水物によって環化させて複素環を生成させ、チアゾリン体を得る。次いで、所望により、チアゾリン体のメチルエステル部分を加水分解して、チアゾリン環を有するカルボキシル体を得る。また、出発物質を適宜変更したり、種々の置換基を導入したりする等して、或いは、他の合成経路を利用して、所望の複素環式化合物を得ることができる。
【００２５】
上述した一般式（I）で表される複素環式化合物の中でも、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性、発光効率、生体内深部の可視化、入手容易性の観点から、上記化学式（II）、（III）又は（IV）で表される複素環式化合物が好ましく、化学式（III）又は（IV）で表わされる化合物が特に好ましい。なお、上記化学式（III）で表わされる化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が非常に高い上、発光波長が長く、生体内深部の可視化に特に有用である。また、上記化学式（IV）で表わされる化合物は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が極めて高い。
【００２６】
＜一般式（I）で表される複素環式化合物の塩＞
上記一般式（I）で表される複素環式化合物は、塩とすることもできる。ここで、本発明の複素環式化合物の塩は、酸との付加塩でも、塩基との付加塩でもよい。例えば、本発明の複素環式化合物と酸との付加塩における酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸、亜リン酸、亜硝酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、パモ酸、ステアリン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、また、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、ケイ皮酸塩、パモ酸塩、ステアリン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンジスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、トリフルオロ酢酸塩等が挙げられる。一方、本発明の複素環式化合物と塩基との付加塩における塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等が挙げられ、また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
【００２７】
上記一般式（I）で表される複素環式化合物の塩も、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。上述のように、上記一般式（I）で表される複素環式化合物はｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れるため、上記一般式（I）で表される複素環式化合物の塩をｐＨが中性付近の緩衝液に溶解させても、上記一般式（I）で表される複素環式化合物の析出を抑制することができる。
【００２８】
＜発光基質組成物＞
本発明の発光基質組成物は、上述した一般式（I）で表される複素環式化合物又はその塩を含み、上述した一般式（I）で表される複素環式化合物又はその塩のみからなってもよい。本発明の発光基質組成物は、ｐＨが中性付近でも、上記一般式（I）で表される複素環式化合物の析出が抑制されているため、安定であり、また、発光酵素のホタルルシフェラーゼと共にホタル生物発光系を構成できる。
【００２９】
上述した本発明の複素環式化合物及びその塩は、発光甲虫ルシフェラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在する系に添加することによって、発光甲虫ルシフェラーゼにより酸化して発光する。なお、本発明の複素環式化合物及びその塩は、ＡＴＰ及びＭｇ2+と共に発光検出キット（発光基質組成物）として提供することもでき、また、該発光検出キットには、他の発光基質や適切なｐＨに調整した溶液を含めてもよい。
【００３０】
本発明の複素環式化合物及びその塩を発光系に応用する場合、好適な発光強度を得るためには、本発明の複素環式化合物及びその塩を１μＭ以上の濃度で使用することが好ましく、５μＭ以上の濃度で使用することが更に好ましい。即ち、本発明の発光基質組成物は、上述した一般式（I）で表される複素環式化合物又はその塩を１μＭ以上の濃度で含むことが好ましく、５μＭ以上の濃度で含むことが更に好ましい。また、本発明の発光基質組成物のｐＨ、並びに、発光系のｐＨは、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８であり、必要に応じて、ｐＨを安定化するために、リン酸カリウム、トリス塩酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を含んでもよい。
【００３１】
また、本発明の複素環式化合物及びその塩は、ホタル発光甲虫ルシフェラーゼ発光系において、種々の酸化酵素によって発光させることができる。ルシフェラーゼは、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）、鉄道虫（Railroad worm）等から単離されており、いずれも使用できる。また、使用可能な酸化酵素としては、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ等も挙げられる。
【００３２】
本発明の複素環式化合物及びその塩を発光基質とする生物発光は、発光系にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）、ピロリン酸又はマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）が存在すると、その発光が増強される。これらの化合物の発光増強効果は、発光系におけるＣｏＡ、ピロリン酸又はＭｇ2+の濃度がそれぞれ５μＭ以上において顕著であり、濃度の増加にしたがって発光が増強される。
【００３３】
ホタル生物発光系を測定／検出に使用するためには、酵素の失活を防止してプラトーな発光挙動を示すように、発光を安定化させることが好ましく、例えば、発光系にマグネシウムイオンを存在させることが好ましく、マグネシウムイオンとピロリン酸を共存させることが更に好ましい。なお、マグネシウムイオン単独の場合、発光安定化の観点から、発光系のマグネシウムイオン濃度は、０．５ｍＭ以上が好ましく、濃度の増加に従って発光の安定性が向上する。また、ピロリン酸マグネシウムを使用する場合、発光安定化の観点から、発光系のピロリン酸マグネシウム濃度は、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上が更に好ましい。なお、ピロリン酸とマグネシウムイオンとの割合は、当量比でなくてもよい。また、好適なマグネシウム塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸塩、酢酸マグネシウム等の有機酸塩が挙げられる。また、好適なピロリン酸塩として、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属のピロリン酸塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のピロリン酸塩、鉄のピロリン酸塩が挙げられる。
【００３４】
本発明の複素環式化合物及びその塩は、生物学的測定／検出における発光標識として利用でき、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、核酸等を標識するために使用できる。なお、本発明の複素環式化合物又はその塩をこれらの物質に結合させる方法は、当業者に周知であり、例えば、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基やアミノ基に対して本発明の複素環式化合物又はその塩を結合させることができる。
【００３５】
また、本発明の複素環式化合物及びその塩は、発光基質の発光によって発光甲虫ルシフェラーゼ活性を検出することを利用した測定／検出に利用することができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞又は動物に対して本発明の複素環式化合物又はその塩を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子又はタンパク質の発現などを測定／検出することができる。なお、波長の長い光は、光透過性が高く、組織透過性も高い。従って、本発明の複素環式化合物及びその塩の中でも、長波長の発光を有する複素環式化合物及びその塩は、生体内深部を可視化するための標識材料として有用である。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３７】
（１）機器分析及び測定装置
・1Ｈ核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ ＮＭＲ）
日本電子社製ＥＣＡ５００（５００ＭＨｚ）を使用して測定し、“1Ｈ ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：ケミカルシフト値（水素の数，多重度，スピン結合定数）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐｍで表記した。多重度は、ｓ（単一線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示し、幅広いシグナルについては、ｂｒと付記した。スピン結合定数（Ｊ）は、Ｈｚで記載した。
【００３８】
・13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（13Ｃ ＮＭＲ）
日本電子社製ＥＣＡ ５００（１２５ＭＨｚ）を使用して測定し、“13Ｃ ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：ケミカルシフト値（多重度）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐｍで表記した。多重度は、ｓ（単一線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示した。
【００３９】
・質量スペクトル（ＭＳ）：電子衝撃法（ＥＩ）
日本電子社製ＪＭＳ−６００Ｈ型質量分析計を用い、電子衝撃法（ＥＩ、イオン化エネルギー：７０ｅＶ）により測定した。“ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ  質量数（相対強度）”と記載した。
【００４０】
・質量スペクトル（ＭＳ）：エレクトロンスプレーイオン法（ＥＳＩ）
日本電子社製ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ型ＴＯＦ質量分析計ＡｃｃｕＴＯＦを用い、エレクトロンスプレーイオン化法（ＥＳＩ）により測定した。なお、装置の設定は、脱溶媒ガス２５０℃、オリフィス１温度８０℃、ニードル電圧２０００Ｖ、リングレンズ電圧１０Ｖ、オリフィス１電圧８５Ｖ、オリフィス２電圧５Ｖとした。サンプル送液は、インフュージョン法で行い、流速３０μｌ／ｍｉｎとした。“ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  質量数（Ｍ＋付加イオン）”と記載した。
【００４１】
（２）クロマトグラフィー
・分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．５７１５）厚さ０．２５ｍｍを使用した。ＴＬＣ上の化合物の検出はＵＶ照射（２５４ｎｍ又は３６５ｎｍ）及び発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。発色剤としてはｐ−アニスアルデヒド（９．３ｍｌ）と酢酸（３．８ｍｌ）をエタノール（３４０ｍｌ）に溶解し、濃硫酸（１２．５ｍｌ）を添加したものを使用した。
【００４２】
・分取用薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）
Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．５７４４）厚さ０．５ｍｍを用いるか、又はＥ．Ｍｅｒｃｋ社製の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル６０ＧＦ254（Ａｒｔ．７７３０）を２０ｃｍ×２０ｃｍのガラスプレート上に、厚さ１．７５ｍｍに調整したものを使用して行い、“［使用したガラスプレートの縦の長さ×横の長さ×厚さ×枚数；展開溶媒］”と記載した。
【００４３】
・高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
Ａｇｉｌｅｎｔ社製の１１００ｓｅｒｉｅｓを用いて測定した。
【００４４】
・シリカゲルカラムクロマトグラフィー
Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社製のシリカゲル６０Ｆ254（Ａｒｔ．７７３４）を使用して行い、“使用したシリカゲルの重さ、展開溶媒”と記載した。
【００４５】
（３）基本操作
・反応後の抽出溶液の乾燥は、飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加えることで行った。
【００４６】
・反応後の中和を樹脂で行ったものについては、オルガノ株式会社製陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ ＮＡ、又は陰イオン交換樹脂アンバーライトＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いた。
【００４７】
・溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下（２０〜３０ｍｍＨｇ）、ロータリーエバポレーターを用いて行った。痕跡量の溶媒の除去は、液体窒素浴で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ（約１ｍｍＨｇ）を用いて行った。
【００４８】
・溶媒の混合比はすべて体積比で表した。
【００４９】
（４）溶媒
・蒸留水
アドバンテック東洋株式会社製ＧＳ−２００型蒸留水製造装置を用いて蒸留、及びイオン交換処理したものを使用した。
【００５０】
・トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル
関東化学株式会社製の有機合成用脱水溶媒、又は特級溶媒を、モレキュラーシーブス（４Ａ）を用いて乾燥させて使用した。
【００５１】
・ＮＭＲ測定用溶媒
以下に示すものをそのまま用いた。
ＣＤＣｌ3：ＩＳＯＴＥＣ Ｉｎｃ.製 ９９．７ ＡＴＯＭ％Ｄ、０．０３％ ＴＭＳ
ＣＤ3ＯＤ：ＩＳＯＴＥＣ Ｉｎｃ.製 ９９．８ ＡＴＯＭ％Ｄ（〜０．７ ＡＴＯＭ％13Ｃ）、０．０５％ ＴＭＳ
【００５２】
＜ピリジン環含有発光基質の合成１＞
（２−ジメチルアミノ−５−シアノピリジン（１）の合成）
２−アミノ−５−シアノピリジン（０）（１，１８５ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（ＭｅＩ）（２．８３ｍｌ、４５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０ｍｌ）に溶解させた。この溶液を０℃にし、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（１,４３７ｍｇ、３５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を室温に昇温し、１２時間撹拌した。反応混合物に少量のメタノールを加え、過剰のヨードメタン、水素化ナトリウムを分解させた。続いて水（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル６２．９ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、２−ジメチルアミノ−５−シアノピリジン（１）（１，１２１ｍｇ、７．６２ｍｍｏｌ、７６．２％）が茶褐色粉末固体として得られた。
【化３】
2015193584.tif 000005
【００５３】
・２−ジメチルアミノ−５−シアノピリジン（１）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.15 (6 H, s), 6.48 (1 H, d, J = 9.1 Hz), 7.58 (1 H, dd, J = 9.1, 2.3 Hz), 8.41 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 38.0 (q) × 2, 95.3 (d), 105.2 (s), 119.1 (s), 139.4 (s), 152.8 (s), 159.7 (s)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 147 (M+・,97%),132 (100%), 118 (78%)
【００５４】
（５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）の合成）
５−シアノ−２−ジメチルアミノピリジン（１）（１,１２１ｍｇ、７．６２ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、１．０Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）−トルエン溶液（１２ｍｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。続いてこの混合溶液を室温に昇温させ、１時間撹拌した。その後この反応混合物に少量のアセトン、水を加え過剰の還元剤を分解させた。さらにこの混合溶液に飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液（５０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を加え、一晩攪拌した。その後、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル６０ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１→０：１）］にて精製すると、５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）（６９９．５ｍｇ、４．６７ｍｍｏｌ、６１．０％）が淡黄色粉末固体として得られた。
【化４】
2015193584.tif 000006
【００５５】
・５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 3.21 (6 H, s), 6.55 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 7.91 (1 H, dd, J = 9.2, 2.3 Hz), 8.55 (1 H, d, J = 2.3 Hz), 9.77 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ (125 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 38.3 (q) × 2, 105.8 (d), 121.8 (s), 136.1 (d), 154.7 (d), 161.5 (s), 189.3 (d)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 150 (M+・, 100%), 135 (74%), 121 (60%)
【００５６】
（エチルエステル体（３）の合成）
５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピリジン（２）（６００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、４−ホスホノクロトン酸トリエチル（１．５ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、水素化ナトリウム（ＮａＨ）（３４２ｍｇ、１４．３ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。この反応混合物に水（１０ｍｌ）を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し、この溶液を室温に昇温させた。続いて、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル６０．１ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（２：１）］にて精製すると、エチルエステル体（３）（４３３ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、４４．０％）が黄色粉末固体として得られた。
【化５】
2015193584.tif 000007
【００５７】
・エチルエステル体（３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 1.30 (3 H, t, J = 7.2 Hz), 3.12 (6 H, s), 4.21 (2 H, q, J = 7.2 Hz), 5.88 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.50 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.66 (1 H, dd, J = 10.9, 16.0 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 16.0 Hz), 7.42 (1 H, dd, J = 14.9, 10.9 Hz), 7.62 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 14.4 (q), 38.2 (q) × 2, 60.2 (t), 105.9 (d), 119.0 (d), 120.1 (s), 122.4 (d), 134.4 (d), 138.0 (d), 145.3 (d), 148.9 (d), 159.2 (s), 167.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 247.11
【００５８】
（カルボキシル体（４）の合成）
エチルエステル体（３）（３４０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）（１０ｍｌ）に溶解し、５．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５６０μｌ）を加え、その溶液を５時間加熱還流した。反応混合物に５．０Ｍ塩酸（５６０μｌ）を加え中和した後、ＴＨＦ（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。カルボキシル体（４）（２４０．２ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、７９．７％）が薄黄色固体として得られた。
【化６】
2015193584.tif 000008
【００５９】
・カルボキシル体（４）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.13 (6 H, s), 5.88 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.51 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.69 (1 H, dd, J = 11.4, 15.2 Hz), 6.83 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 7.50 (1 H, dd, J = 11.4, 15.2 Hz), 7.63 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.20 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125MHz, ＤＭＳＯ-Ｄ6）：δ 38.1(q) × 2, 106.6(d), 120.1(d), 122.9(s), 135.0(d), 138.0(d), 138.3(d), 145.6(d), 149.1(d), 159.3(s), 168.3(s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 219.08
【００６０】
（アミド体（５）の合成）
カルボキシル体（４）（１２６ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）とＳ−トリチル−Ｄ−システインメチルエステル（２６１ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５．０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２７８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１４１ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で１５時間撹拌した。反応混合物に水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５０ｇ；酢酸エチル−ヘキサン（１：１）］にて精製すると、アミド体（５）（２６４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、７９．０％）が黄色固体として得られた。
【化７】
2015193584.tif 000009
【００６１】
・アミド体（５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 2.69 (2 H, m), 3.13 (6 H, s), 3.70 (3 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.84 (1 H, d, J = 15.0 Hz), 6.50 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.64 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 6.76 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.18-7.38 (17 H, comp), 7.60 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.2 (t), 38.2 (q) × 2, 51.2 (q), 52.7 (d), 67.0 (s), 105.9 (d), 120.3 (s), 121.0 (d), 122.4 (d), 127.0 (d), 128.1 (d) × 2, 129.6 (d) × 2, 134.5 (d), 137.4 (d), 142.5 (d), 144.4 (s), 148.6 (d), 159.1 (s), 165.8 (s), 171.2 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [(M+H)+] m/z : 578.22
【００６２】
（チアゾリン体（６）の合成）
アミド体（５）（１６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にし、ジクロロメタン（５．０ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡＡ）（０．２ｍｌ、１．４４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。続いて室温に昇温させ、２４時間撹拌した。原料が消失したのを確認した後、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂を洗浄して濾別し、得られた洗液を減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×３枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］で精製すると、チアゾリン体（６）（１３．４ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、１５．０％）が黄色固体として得られた。
【化８】
2015193584.tif 000010
【００６３】
・チアゾリン体（６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.11 (6 H, s), 3.56 (2 H, m), 3.81 (3 H, s), 5.15 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.49 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 6.53 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.72 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.92 (1 H, dd, J = 9.8, 15.5 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 9.8, 14.9 Hz), 7.61 (1 H, dd, J = 2.3, 9.2 Hz), 8.16 (1 H, d, J = 2.3 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.6 (t), 38.2 (q) × 2, 52.8 (q), 77.9 (d), 106.0 (d), 120.2 (s), 123.1 (d), 123.3 (d), 134.1 (d), 136.3 (d), 143.3 (d), 148.8 (d), 159.0 (s), 170.2 (s), 171.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 318.08
【００６４】
（ピリジン環含有発光基質（７）の合成）
チアゾリン体（６）（１０．７ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５ｍｌ）に溶解し、５．０Ｍ塩酸（３００μｌ）を加え、その溶液を２４時間室温で撹拌した。反応混合物に重曹を加え中和した後、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。ピリジン環含有発光基質（７）［即ち、上記化学式（II）で表される化合物］（９．２ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、８８．２％）が粗生成物として得られた。
【化９】
2015193584.tif 000011
【００６５】
・発光基質（７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.29 (6 H, s), 3.76-3.68 (2 H, comp.), 5.25 (1 H, m), 6.69 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.10 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 9.8 Hz), 8.05 (1 H, s), 7.23 (1 H, m), 8.25 (1 H, d, J = 9.7 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤ3ＣＤ）：δ 35.5 (t), 37.2 (q) × 2, 80.8 (d), 106.5 (d), 120.7 (d), 123.3 (d), 123.6 (d), 134.4 (s), 135.3 (d), 142.5 (d), 147.7 (d), 158.9 (s), 169.5 (s), 176.9 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 304.10
【００６６】
＜ピリジン環含有発光基質の合成２＞
（２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）の合成）
５−アミノ−２−シアノピリジン（１０）（１，３０８ｍｇ、１１ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（ＣＨ3Ｉ）（２．０ｍｌ、３３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍｌ）に溶解させた。この溶液を０℃にし、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（１３０８ ｍｇ、３３ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を５０時間撹拌した。反応混合物に少量のメタノールを加え、過剰のヨードメタン、水素化ナトリウムを分解させた。続いて水（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５９．２ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］にて精製すると、２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）（１，３０３．８ｍｇ、８．８６ｍｍｏｌ、８０％）が茶褐色粉末固体として得られた。
【化１０】
2015193584.tif 000012
【００６７】
・２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.08 (6 H, s), 6.87 (1 H, dd, J = 9.2, 2.9 Hz), 7.48 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 8.12 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 39.8 (q) × 2, 116.5 (s), 119.0 (d), 119.1 (s), 129.1 (d), 135.3 (d), 147.2 (s)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 146 (M+・, 100%), 147 (81%)
【００６８】
（２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）の合成）
２−シアノ−５−ジメチルアミノピリジン（１１）（７２３．０ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、１．０Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）−トルエン溶液（７．５ｍｌ）をゆっくり加え、１５分間撹拌した。続いてこの混合溶液を室温に昇温させ、１時間撹拌した。その後この反応混合物に十分量のアセトン、水を加え過剰の還元剤を分解させた。さらにこの混合溶液に飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液（５０ｍｌ）、酢酸エチル（１０ｍｌ）を加え、一晩攪拌した。その後、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５６．９ｇ；クロロホルム−メタノール（１０：１）］にて精製すると、２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）（３６８．７ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、５０％）が淡黄色粉末固体として得られた。
【化１１】
2015193584.tif 000013
【００６９】
・２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 3.13 (6 H, s), 6.96 (1 H, dd, J = 8.6, 2.9 Hz), 7.86 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 2.9 Hz), 9.88 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ (125 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 39.7 (q) × 2, 116.5 (d), 123.4 (d), 133.9 (d), 141.5 (s), 148.2 (s), 191.5(s)
ＭＳ（ＥＩ） m/z 150 (M+・, 100%)
【００７０】
（エチルエステル体（１３）の合成）
２−アルデヒド−５−ジメチルアミノピリジン（１２）（３１．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、４−ホスホノクロトン酸トリエチル（８０μｌ、０．３６ｍｍｏｌ）を、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を０℃まで冷却し、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（２１．６ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３０分間撹拌した。この反応混合物に水（１０ｍｌ）を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し、この溶液を室温に昇温させた。続いて、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×２枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、エチルエステル体（１３）（３８．７ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ、７４％）が黄色粉末固体として得られた。
【化１２】
2015193584.tif 000014
【００７１】
・エチルエステル体（１３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 1.31 (3 H, t, J = 7.5 Hz), 3.03 (6 H, s), 4.21 (2 H, q, J = 6.8 Hz), 5.98 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.90 (1 H, dd, J = 8.6, 2.8 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 11.4, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 7.46 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 8.14 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 14.4 (q), 40.0 (q) × 2, 60.3 (t), 118.0 (d), 120.7 (d), 123.8 (d), 125.4 (d), 135.0 (d), 139.8 (d), 142.3 (s), 144.9 (s), 145.6 (d), 167.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 247.15
【００７２】
（カルボキシル体（１４）の合成）
エチルエステル体（１３）（５４．０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）（１０ｍｌ）に溶解し、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１３０μｌ）を加え、その溶液を２６時間加熱還流した。反応混合物に４Ｍ塩酸を加え中和した後、減圧濃縮した。カルボキシル体（１４）（２４０．２ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、７９．７％）が薄黄色個体として得られた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル１１．９ｇ；クロロホルム−メタノール（５：１）］にて精製すると、カルボキシル体（１４）（５０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１１５％）が淡緑色粉末固体として得られた。
【化１３】
2015193584.tif 000015
【００７３】
・カルボキシル体（１４）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.02 (6 H, s), 5.99 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.86 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.06 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 2.9, 8.6 Hz), 7.37 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.45 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.00 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 38.6 (q) × 2, 118.9 (d), 123.1 (d), 123.6 (d), 126.1 (d), 133.2 (d), 137.8 (d), 142.0 (s), 143.5 (s), 146.0 (d), 172.3 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 219.11
【００７４】
（アミド体（１５）の合成）
カルボキシル体（１４）（１０４．８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）とＳ−トリチル−Ｄ−システインメチルエステル（３８６．８ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（３００．６ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２９５．１ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物に水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５０．５ｇ；クロロホルム−メタノール（１０：１）］にて精製したのち、さらに、分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×４枚；クロロホルム−メタノール（１０：１）］にて精製すると、アミド体（１５）（２６４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、７９％）が黄色固体として得られた。
【化１４】
2015193584.tif 000016
【００７５】
・アミド体（１５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 2.70 (2 H, m), 3.02 (6 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.91 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 5.96 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 6.49 (1 H, m), 6.84 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.90 (1H, dd, J = 2.9 Hz, 8.6 Hz), 7.12 (1 H, dd, J = 11.5, 15.4 Hz), 7.25-7.39 (15 H, m), 8.14 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.1 (t), 40.1 (q) × 2, 51.2 (s), 52.8 (d), 67.1 (s), 118.1 (d), 122.6 (d), 123.8 (d), 125.5 (d), 127.0 (t) × 3, 128.1 (d) × 6, 129.6 (d) × 6, 135.0 (d), 139.1 (n), 142.2 (d), 144.4 (s) × 3, 145.5 (s) × 3, 149.4 (s), 165.7 (s), 171.1 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [(M+H)+] m/z : 578.22
【００７６】
（チアゾリン体（１６）の合成）
アミド体（１５）（１４５．１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にし、ジクロロメタン（１０．０ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ2Ｏ）（１０５μｌ、０．６２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、５０分間撹拌した。原料が消失したのを確認した後、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂を洗浄して濾別し、得られた洗液を減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×２枚；酢酸エチル］で精製すると、チアゾリン体（１６）（１５．６ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、２０％）が黄色油状物として得られた。
【化１５】
2015193584.tif 000017
【００７７】
・チアゾリン体（１６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.05 (6 H, s), 3.56 (2 H, m), 3.82 (3 H, s), 5.16 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.64 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.79 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.89 (1 H, dd, J = 2.9, 8.6 Hz), 6.95 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.20 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.12 (1 H, d, J = 2.9 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.6 (t), 40.0 (q) × 2, 52.9 (q), 78.0 (d), 118.1 (d), 123.7 (d), 125.1 (d), 126.3 (d), 135.0 (d), 138.1 (d), 142.6 (s), 142.9 (s), 145.5 (d), 170.2 (s), 171.5 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 318.12
【００７８】
（ピリジン環含有発光基質（１７）の合成）
チアゾリン体（１６）（１５．６ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（１ｍｌ）に溶解し、４Ｍ塩酸（１ｍｌ）を加え、その溶液を４０時間室温で撹拌した。反応混合物に重曹を加え中和した後、減圧濃縮した。ピリジン環含有発光基質（１７）［即ち、上記化学式（III）で表される化合物］（３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、２０％）が粗生成物として得られた。
【化１６】
2015193584.tif 000018
【００７９】
・ピリジン環含有発光基質（１７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.02 (6 H, s), 3.52 (2 H, m), 5.95 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.63 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.81 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.96 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.08 (1 H, dd, J = 10.9, 15.5 Hz), 7.11 (1 H, dd, J = 2.8, 8.9 Hz), 7.44 (1 H, d, J = 8.9), 7.99 (1 H, d, J = 2.8 Hz)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 35.5 (t), 38.7 (q) × 2, 80.9 (d), 118.9 (d), 122.9 (d), 125.1 (d), 126.6 (d), 133.3 (d), 136.9 (d), 141.8 (s), 142.2 (s), 146.0 (d), 169.2 (s), 176.8 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 304.09
【００８０】
＜ピラジン環含有発光基質の合成＞
（２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）の合成）
２−アミノ−５−ブロモ−ピラジン（２０）（１，１７０ｍｇ、６．７２ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（ＣＨ3Ｉ）（１．２ｍｌ、１９．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍｌ）に溶解させた。この溶液を０℃にし、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を５時間撹拌した。反応混合物に少量のメタノールを加え、過剰のヨードメタン、水素化ナトリウムを分解させた。続いて水（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル４８．５ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）（１，０９６ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ、８０％）が淡黄色粉末固体として得られた。
【化１７】
2015193584.tif 000019
【００８１】
・２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.08 (6 H, s), 7.74 (1 H, s), 8.10 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 37.9 (q) × 2, 124.7 (s), 129.2 (d), 143.8 (d), 154.0 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 201.96, 203.96
【００８２】
（５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）の合成）
２−ジメチルアミノ−５−ブロモ−ピラジン（２１）（１．３７ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下とした。この溶液を、アセトンバスを用いて−８０℃まで冷却し、１．５７Ｍノルマルブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）−ヘキサン溶液（１０．８ｍｌ）をゆっくり加え、１時間撹拌した。続いてこの混合溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２．０ｍｌ、２６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた後、室温に昇温させ１時間撹拌した。その後この反応混合物に水を加え１５分間撹拌し、酢酸エチル（２×２００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル４６．９ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）（９７５ｍｇ、６．５ｍｍｏｌ、９５％）が淡黄色粉末固体として得られた。
【化１８】
2015193584.tif 000020
【００８３】
・５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 3.23 (6 H, s), 8.05 (1 H, d, J = 1.2 Hz), 8.64 (1 H, d, J = 1.2 Hz), 9.86 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ (125 MHz, ＣＤＣｌ3)：δ 38.0 (q) × 2, 129.4 (d), 136.8 (s), 144.4 (d), 155.7 (s), 190.8 (d)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+Na]+ ; m/z 174.04
【００８４】
（エチルエステル体（２３）の合成）
５−アルデヒド−２−ジメチルアミノピラジン（２２）（４４．５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、４−ホスホノクロトン酸トリエチル（１５０μｌ、０．５８ｍｍｏｌ）を、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０ｍｌ）に溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）（２７．４ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、１５分間撹拌した。この反応混合物にエタノール（ＥｔＯＨ）（５ｍｌ）を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し、この溶液を室温に昇温させた。続いて、酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×１枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：１）］にて精製すると、エチルエステル体（２３）（４７．６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、６５％）が黄色粉末固体として得られた。
【化１９】
2015193584.tif 000021
【００８５】
・エチルエステル体（２３）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 1.31 (3 H, t, J = 7.4 Hz), 3.17 (6 H, s), 4.22 (2 H, q, J = 7.4 Hz), 5.99 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.83 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.14 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 7.45 (1 H, dd, J = 11.5, 15.5 Hz), 7.22 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 8.04 (1 H, s), 8.05 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 14.4 (q), 37.8 (q) × 2, 60.4 (t), 120.7 (s), 121.2 (d), 125.7 (d), 130.0 (d), 136.2 (s), 142.4 (d), 144.5 (d), 153.9 (s), 167.3 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 248.11
【００８６】
（カルボキシル体（２４）の合成）
エチルエステル体（２３）（４７．６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）（１０ｍｌ）に溶解し、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１２０μｌ）を加え、その溶液を４５分間加熱還流した。反応混合物に４Ｍ塩酸を加え中和した後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル１６．５ｇ；クロロホルム−メタノール（５：１）］にて精製すると、カルボキシル体（２４）（３６．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、８４％）が淡黄色粉末固体として得られた。
【化２０】
2015193584.tif 000022
【００８７】
・カルボキシル体（２４）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.15 (6 H, s), 5.97 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 6.87 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 11.5, 14.9 Hz), 7.39 (1 H, dd, J = 11.5, 14.9 Hz), 8.07 (1 H, s), 8.11 (1 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 36.6 (q) × 2, 121.7 (d), 125.5 (d), 129.8 (d), 135.8 (d), 136.8 (d), 142.0 (d), 144.5 (s), 153.3 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [M+H]+ ; m/z 220.07
【００８８】
（アミド体（２５）の合成）
カルボキシル体（２４）（７２０．０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）とＳ−トリチル−Ｄ−システインメチルエステル（３，６００ｍｇ、９．９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍｌ）に溶解した。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２，０３５ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１，２７０ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合物を室温で１７時間撹拌した。反応混合物に水（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［シリカゲル５６．０ｇ；ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］にて精製すると、アミド体（２５）（１，６２６ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ、８４％）が黄色固体として得られた。
【化２１】
2015193584.tif 000023
【００８９】
・アミド体（２５）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 2.66-2.75 (2 H, m), 3.17 (6 H, s), 3.72 (3 H, s), 4.73 (1 H, m), 5.93 (1 H, dd, J = 7.5, 14.9 Hz), 6.81 (1 H, d, J = 14.9 Hz), 7.13 (1 H, dd, J = 11.4, 14.9 Hz), 7.20-7.43 (16 H, m), 8.05 (2 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.1 (t), 37.8 (q) × 2, 51.2 (q), 52.7 (d), 67.1 (s), 123.0 (d), 125.7 (d), 127.0 (d) × 3, 128.1 (d) × 4, 129.6 (d) × 4, 135.7 (d), 137.4 (d), 141.8 (d), 142.3 (d), 144.4 (s) × 3, 153.9 (s), 165.6 (s), 171.1 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） [(M+Na)+] m/z : 601.13
【００９０】
（チアゾリン体（２６）の合成）
アミド体（２５）（１１４．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下にし、ジクロロメタン（１０．０ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ2Ｏ）（１００μｌ、０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、３５分間撹拌した。原料が消失したのを確認した後、陰イオン交換樹脂ＩＲＡ４００ ＯＨ ＡＧを用いて中和した。樹脂を洗浄して濾別し、得られた洗液を減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．７５ｍｍ×１枚；ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］で精製すると、チアゾリン体（２６）（２８．２ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、４４％）が黄色固体として得られた。
【化２２】
2015193584.tif 000024
【００９１】
・チアゾリン体（２６）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 3.16 (6 H, s), 3.53 (1 H, dd, J = 9.2, 11.5 Hz), 3.60 (1 H, dd, J = 9.2, 11.5 Hz), 3.82 (3 H, s), 5.17 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.65 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.77 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 6.96 (1 H, dd, J = 11.2, 14.9 Hz), 7.16 (1 H, dd, J = 11.2, 14.9 Hz), 8.03 (2 H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤＣｌ3）：δ 34.6 (t), 37.8 (q) × 2, 52.9 (q), 78.1 (d), 125.4 (d), 126.5 (d), 130.0 (d), 134.6 (d), 137.4 (d), 142.3 (s), 142.5 (d), 153.8 (s), 170.1 (s), 171.4 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 319.05
【００９２】
（ピラジン環含有発光基質（２７）の合成）
チアゾリン体（２６）（１１．２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をＨ2Ｏ（２ｍｌ）に溶解し、４Ｍ塩酸（１．５ｍｌ）を加え、その溶液を１９時間室温で撹拌した。反応混合物にアンモニア水を加え中和した後、減圧濃縮した。逆相カラムクロマトグラフィー（ＳｕｐｅｌｃｌｅａｎTM ＬＣ−１８ ＳＰＥ）で精製すると、ピラジン環含有発光基質（２７）（４．１ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、３７％）が茶色固体として得られた。
【化２３】
2015193584.tif 000025
【００９３】
・ピラジン環含有発光基質（２７）の同定結果
1Ｈ ＮＭＲ（500 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 3.15 (6 H, s), 3.52-3.62 (2 H, m), 5.04 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 6.60 (1 H, d, J = 15.4 Hz), 6.85 (1 H, d, J = 15.5 Hz), 7.02 (1 H, dd, J = 11.2, 15.5 Hz), 7.17 (1 H, dd, J = 11.2, 15.5 Hz), 8.08 (1 H, s), 8.11 (1H, s)
13Ｃ ＮＭＲ（125 MHz, ＣＤ3ＯＤ）：δ 35.1 (t), 36.6 (q) × 2, 79.1 (d), 124.5 (d), 126.3 (d), 129.8 (d), 133.8 (d), 134.5 (d), 137.1 (s), 141.8 (d), 142.2 (s), 153.9 (s)
ＭＳ（ＥＳＩ） m/z: [(M+H)+] 305.06
【００９４】
＜溶解度測定＞
上記のようにして得たピリジン環含有発光基質（７）、ピリジン環含有発光基質（１７）、ピラジン環含有発光基質（２７）又は下記化学式（ａ）：
【化２４】
2015193584.tif 000026
で表されるアカルミネ（黒金化成株式会社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．００２２）に、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳバッファー）を５０μｌ加え、よく振盪させた。続いて、不溶物を沈殿させるため、遠心分離を１３，０００ｒｐｍで、３分間行った後、上澄み液を採取した。得られた上澄み液（飽和溶液）を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量測定を行った。結果を表１に示す。
【００９５】
【表１】
2015193584.tif 000027
【００９６】
表１から、ピリジン環含有発光基質（７）は、アカルミネより、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が５．７倍高く、また、ピリジン環含有発光基質（１７）は、アカルミネより、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が９．７倍高く、また、ピラジン環含有発光基質（２７）は、アカルミネより、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性が１４倍高いことが分かる。
【００９７】
＜発光測定＞
上記のようにして得たピリジン環含有発光基質（７）又は（１７）、或いは、ピラジン環含有発光基質（２７）を用いて、発光経時変化及び発光強度、並びに、発光スペクトルの測定を行った。また、比較対照として、上記アカルミネ、並びに、下記化学式（ｂ）：
【化２５】
2015193584.tif 000028
で表される天然のホタルルシフェリン（和光純薬工業株式会社製）を用いて、発光経時変化及び発光強度、並びに、発光スペクトルの測定を行った。
【００９８】
・発光経時変化及び発光強度測定
ｐＨ８．０で０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ溶液）を２０μｌ、各発光基質の溶解液（発光基質濃度＝１００μＭ）を２０μｌ、発光基質を分解する酵素である０．０１ｍｇ／ｍｌのｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μｌ、０．２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを４０μｌ混合し、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−２２７０）で６０秒間発光経時変化の測定を行った。結果を図１、図２及び図３に示す。
また、同測定条件下、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−１８５０）で３００秒間積算し、発光強度測定を行った（Ｎ＝２）。なお、天然ホタルルシフェリンは５７０ｎｍ、アカルミネは６７５ｎｍ、ピリジン環含有発光基質（７）は６２５ｎｍ、ピリジン環含有発光基質（１７）は６７０ｎｍ、ピラジン環含有発光基質（２７）は６２５ｎｍの発光強度で比較した。天然ホタルルシフェリンの発光強度を１００とした相対発光強度の値を表２に示す。
【００９９】
【表２】
2015193584.tif 000029
【０１００】
図１、図２及び図３から、ピリジン環含有発光基質（７）及び（１７）、並びに、ピラジン環含有発光基質（２７）は、ホタル生物発光系における発光基質として機能することが分かる。また、図１、図２及び図３から分かるように、ピリジン環含有発光基質（７）及び（１７）、並びに、ピラジン環含有発光基質（２７）の発光経時変化は、アカルミネの発光経時変化とほぼ同じであった。
また、表２から、ピリジン環含有発光基質（７）及び（１７）、並びに、ピラジン環含有発光基質（２７）の発光強度は、天然のホタルルシフェリンに比べ約１割の発光強度であるものの、アカルミネとほぼ同じ発光強度であることが分かる。
【０１０１】
・発光スペクトル測定
ｐＨ８．０で０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ溶液）を２０μｌ、各発光基質の溶解液（発光基質濃度＝１００μＭ）を２０μｌ、発光基質を分解する酵素である０．０１ｍｇ／ｍｌのｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μｌ、０．２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを４０μｌ混合し、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ−１８５０）で１８０秒間発光スペクトルを測定した。結果を図４、図５及び図６に示す。
【０１０２】
図４及び図６から分かるように、ピリジン環含有発光基質（７）及びピラジン環含有発光基質（２７）の発光スペクトルにおける極大波長は６２５ｎｍであり、天然のホタルルシフェリンの極大波長５６０ｎｍに比べ、６５ｎｍ長波長であり、また、アカルミネの極大波長６７５ｎｍに比べ、５０ｎｍ短波長であった。
また、図５から分かるように、ピリジン環含有発光基質（１７）の発光スペクトルにおける極大波長は６７０ｎｍであり、天然のホタルルシフェリンの極大波長５６０ｎｍに比べ、１１０ｎｍ長波長であり、また、アカルミネの極大波長と同等であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明の複素環式化合物及びその塩は、ｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れ、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。
【図１】
2015193584.tif 000033
【図２】
2015193584.tif 000034
【図３】
2015193584.tif 000035
【図４】
2015193584.tif 000036
【図５】
2015193584.tif 000037
【図６】
2015193584.tif 000038