(57)【要約】【課題】有効なコラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤、セラミド合成促進剤を提供すること。【解決手段】本発明のコラーゲン（ヒアルロン酸、セラミド）の合成促進剤は松樹皮処理物を含有する。本発明のコラーゲン合成促進剤は、皮膚におけるＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１の発現を促進するものである。また、本発明のヒアルロン酸合成促進剤は、皮膚におけるヒアルロン酸合成酵素であるＨａｓ２又はＨａｓ３の遺伝子発現を増強させるものである。本発明のセラミド合成促進剤は、セラミドの合成酵素であるＳＰＴの遺伝子発現を増強させるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
松樹皮処理物を含有することを特徴とする、コラーゲン合成促進剤。
【請求項２】
松樹皮処理物を含有することを特徴とする、コラーゲン遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１又はＣＯＬ３Ａ１の発現促進剤。
【請求項３】
松樹皮処理物を含有することを特徴とする、ヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項４】
松樹皮処理物を含有することを特徴とする、ヒアルロン酸合成酵素であるＨａｓ２又はＨａｓ３の遺伝子発現促進剤。
【請求項５】
松樹皮処理物を含有することを特徴とする、セラミド合成促進剤。
【請求項６】
松樹皮処理物を含有することを特徴とする、セラミドの合成酵素であるＳＰＴの遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン、ヒアルロン酸及びセラミドの合成促進剤並びにこれらの成分の合成に関与する遺伝子の発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、生体たんぱく質の約３０％を占める生体骨格の主たる構造たんぱく質である。コラーゲンは、生体の支持組織として構造維持に重要な役割を果たしているほか、皮膚、血管、腱、骨、歯など体内の殆どの組織に存在して細胞を保護し、細胞間因子として細胞の結合など重要な生理的役割を果たしている。体内に存在するコラーゲンのうち、特に皮膚に存在するコラーゲンについては、これまで美容や皮膚疾患や皮膚傷害の治療との関連から多く研究されている。皮膚は表皮と、表皮の下部に存在する真皮より構成され、真皮は皮膚の中でも最も領域の広い部分である。その真皮の90%以上を細胞外マトリックスが占めるところ、コラーゲンはこの細胞外マトリックスを構成する主要成分である。皮膚に存在するコラーゲンとしてはＩ型コラーゲンやIII型コラーゲンが挙げられ、Ｉ型コラーゲンは、大人の真皮に存在する全コラーゲンの８０％を占めるといわれている。Ｉ型コラーゲンは、２つのα１鎖と１つのα２鎖からなり、骨や皮膚を形成し、弾力性をもたせる役割を有するといわれている。このα１鎖をコードする遺伝子として、ＣＯＬ１Ａ１が知られている。また、III型コラーゲンは、３本の同一のα１（III）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。III型コラーゲンは、比較的細い繊維で、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞などの足場を作っているほか、組織に柔軟性を与えるとされる。このα１（III）鎖をコードする遺伝子としてＣＯＬ３Ａ１が知られている。
【０００３】
ヒアルロン酸は、皮膚における表皮及び真皮、軟骨、関節液などに存在する高分子多糖類であり、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗、および細菌感染の防止など、多くの機能を有している。ヒアルロン酸は、コラーゲンと共に皮膚、特に真皮中の細胞外マトリックスに多量に存在し、水分を保持する能力が非常に高く、肌のみずみずしさ、ハリ、弾力性に深く関わっている。ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸合成酵素により生成される。哺乳類のヒアルロン酸合成酵素としては、Ｈａｓ１、Ｈａｓ２及びＨａｓ３が存在することが知られている。Ｈａｓ２はヒトの真皮における主要なヒアルロン酸合成酵素であり、保湿力の高い高分子ヒアルロン酸の合成に関与するといわれている。Ｈａｓ３はヒトの表皮における主要なヒアルロン酸合成酵素とされている。また、Ｈａｓ３は低分子ヒアルロン酸を合成するところ、この低分子ヒアルロン酸は免疫機構で機能していることが予想され、人工換気による肺障害等との関係が知られている。
【０００４】
セラミドは、表皮の中でも、最も外側に位置する角質層における角質間細胞脂質の主要成分であり、体内の水分の蒸発を抑える役割を担っている。具体的には、セラミドは、皮膚の最外層を覆う角層細胞間脂質の主成分として特異的に存在し、皮膚本来がもつ生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。角層の構造はレンガとモルタルに例えられ、約１５層ほどに積み重なった角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持し、一方、角質細胞間脂質は、約５０％のセラミドを主成分とし、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分が交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。セラミドは、表皮細胞の角化の過程において、セリンとパルミトイル−ＣｏＡを基に、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼをはじめとした酵素の働きにより生成される。
【０００５】
コラーゲン、ヒアルロン酸、セラミドについては、加齢や紫外線暴露、乾燥、酸化等の様々な原因により減少することが知られている。例えば皮膚中のＩ型コラーゲンが低減することは、皮膚や骨等の強度を低減させ、ＩＩＩ型コラーゲンが低減することは皮膚の水分を低減させる等といわれている。皮膚においてＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンが低減することは、皮膚のシワやタルミの原因となることが知られている。また、皮膚中のヒアルロン酸が減少することは、皮膚の乾燥、皮膚のハリの衰え、弾性の低下、皺の原因となるほか、関節の機能異常等に関係することが知られている。また、セラミドについても、角質層の間における脂質（つまり、角質間細胞脂質）としてセラミドの分泌が損なわれると皮膚が水分を保てなくなり、アトピー性皮膚炎など、水分不足に起因して様々な皮膚疾患を発症するといわれている。
【０００６】
また近年、高脂肪食の摂取により、皮膚のＩ型コラーゲンやヒアルロン酸の量がその構成遺伝子又は合成酵素の遺伝子発現量と共に低減することが報告されており（非特許文献１）、皮膚の萎縮や創傷治癒の遅れ、床ずれの悪化等との関係が指摘されている。
【０００７】
コラーゲン、ヒアルロン酸、セラミドの産生を促進する作用を有する組成物としてこれまでに様々なものが提案されている。例えばコラーゲン産生促進作用を有するものとして、特許文献１には、シスタチン及び／又はシスタチン分解物が記載されており、特許文献２には、ＴＧＦ−β及び／又はＴＧＦ−β分解物が記載されており、特許文献３には、リンゴンベリー(Vaccinium vitis-idaea)とアムラ(Phyllanthus emblica又はEmblica officinale)の植物体又はその抽出物が記載されており、特許文献４には、グリセロリン脂質が記載されている。またヒアルロン酸産生促進作用を有するものとして、特許文献５には、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が記載されており、特許文献６には、乳塩基性タンパク質画分及び／又は乳塩基性タンパク質画分分解物が記載されており、特許文献７には、卵殻膜が記載されている。また、セラミド産生促進作用を有するものとして、特許文献８には、スフィンゴイド類が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−０７７０１９号公報
【特許文献２】特開２０１２−１６７０２１号公報
【特許文献３】特開２０１３−０１４５６１号公報
【特許文献４】特開２０１３−０６０４７６号公報
【特許文献５】特開２０１３−１８０９８９号公報
【特許文献６】特開２０１３−２３４１２９号公報
【特許文献７】特開２０１４−０４０４０２号公報
【特許文献８】特開２０１２−０９２０３２号公報
【０００９】
【非特許文献１】Mol. Nutr. Food. Res. 2010, 54, S53-S61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、皮膚等におけるコラーゲンの合成の促進に有効な剤を提供することにある。また本発明の課題は、皮膚等におけるヒアルロン酸の合成の促進に有効な剤を提供することにある。また本発明の課題は、皮膚等におけるセラミドの合成促進に有効な剤を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、松樹皮処理物を含有することを特徴とする、コラーゲン合成促進剤を提供する。
本発明は、松樹皮処理物を含有することを特徴とする、コラーゲン遺伝子ＣＯＬ１Ａ１又はＣＯＬ３Ａ１の発現促進剤を提供する。
本発明は、松樹皮処理物を含有することを特徴とする、ヒアルロン酸合成促進剤を提供する。
本発明は、松樹皮処理物を含有することを特徴とする、ヒアルロン酸合成酵素であるＨａｓ２又はＨａｓ３の遺伝子発現促進剤を提供する。
本発明は、松樹皮処理物を含有することを特徴とする、セラミドの合成促進剤を提供する。
本発明は、松樹皮処理物を含有することを特徴とする、セラミド合成酵素であるＳＰＴの遺伝子発現促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、皮膚等におけるコラーゲンの合成の促進に有効な剤が提供される。本発明によれば皮膚等におけるヒアルロン酸の合成の促進に有効な剤が提供される。本発明によれば、皮膚等におけるセラミドの合成の促進に有効な剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例及び参考例におけるコラーゲン遺伝子ＣＯＬ１Ａ１発現量を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例及び参考例におけるコラーゲン遺伝子ＣＯＬ３Ａ１発現量を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例及び参考例におけるヒアルロン酸合成酵素Ｈａｓ２の遺伝子発現量を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例及び参考例におけるヒアルロン酸合成酵素Ｈａｓ３の遺伝子発現量を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例及び参考例におけるセラミド合成酵素ＳＰＴの遺伝子発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明をその好ましい実施形態に基づき説明する。本発明は松樹皮処理物を含有するコラーゲン合成促進剤、コラーゲン遺伝子の発現促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進剤、セラミドの合成促進剤及びセラミド合成酵素遺伝子の発現促進剤に関するものである。好ましくは、松樹皮処理物を有効成分として含有し、より好ましくは、松樹皮抽出物を有効成分として含有する。以下、これらの剤を総称して本発明の剤ともいう。以下の説明は、特に断らない限り、本発明の剤のいずれにも当てはまる。
【００１５】
本発明の剤に用いる松樹皮処理物の原料松としては、フランス海岸松（Ｐｉｎｕｓ Ｍａｒｔｉｍａ）、ニュージーランドマツ、フィンランドマツ、エキナタマツ、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、ストローブマツ、サトウマツ、リュウキュウマツ、スラッシュマツ、カリビアマツ、リギダマツ、テ−ダマツ、ダイオウショウ、タイワンアカマツ、バンクスマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダ等が挙げられる。中でも、フランス海岸松、ニュージーランドマツ、フィンランドマツの樹皮処理物が好ましく、特に、フランス海岸松が好ましい。
【００１６】
フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。このフランス海岸松の樹皮は、フラボノイド類であるプロアントシアニジン（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）を主要成分として含有する他に、有機酸ならびにその他の生理活性成分等を含有している。この主要成分であるプロアントシアニジンには、活性酸素を除去する強い抗酸化作用があることが知られている。
【００１７】
松樹皮処理物としては、松の樹皮を粉砕して得られる松樹皮粉砕物、水及び／又は有機溶媒で抽出して得られる松樹皮抽出物を挙げることができる。これらは単独、混合のいずれでも使用できる。中でも、上述するプロアントシアニジンやその他生理活性成分による使用時の効果の顕著性や品質の安定性の観点から松樹皮抽出物を用いることが好ましい。松樹皮抽出物を得るに当たり、水を用いる場合には温水、または熱水が用いられる。抽出に用いる有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ブタン、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエテン等の食品あるいは薬剤の製造に許容される有機溶媒が好ましく用いられる。これらの水、有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。特に、熱水、含水エタノール、含水プロピレングリコール等が好ましく用いられる。
【００１８】
松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法は特に制限はないが、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法等が用いられる。
【００１９】
超臨界流体抽出法とは、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）等が用いられるが、二酸化炭素が好ましく用いられる。
【００２０】
超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体を分離する分離工程とを行う。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。
【００２１】
また、エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、抽出流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類を２〜２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、この流体を用いて超臨界流体抽出を行うことによって、目的とする抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、効率的な松樹皮抽出物を得る方法である。
【００２２】
超臨界流体抽出法は、比較的低い温度で操作できるため、高温で変質・分解する物質にも適用できるという利点、抽出流体が残留しないという利点、溶媒の循環利用が可能であるため、脱溶媒工程等が省略でき、工程がシンプルになるという利点がある。
【００２３】
また、松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法は、上述の抽出法以外に、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法等の方法によって行ってもよい。
【００２４】
松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法は、複数の抽出方法を組み合わせてもよい。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成の松樹皮抽出物を得ることが可能となる。
【００２５】
松樹皮からの抽出物は、限外濾過、あるいは吸着性担体（ダイヤイオンＨＰ−２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−ＬＨ２０、キチン等）を用いたカラム法またはバッチ法などにより、精製を行うことが安全性の面から好ましい。また、必要に応じて、減圧濃縮、凍結乾燥などの方法により濃縮または乾燥して、液状、ペースト状、または粉末状（抽出物粉末）、細粒状、顆粒状としてもよい。松樹皮抽出物等の松樹皮処理物は、粉末状、細粒状、顆粒状であることが好ましい。
【００２６】
本発明に用いられる松樹皮処理物は、主な成分の一つとして、プロアントシアニジンを含有することが好ましい。プロアントシアニジンは、フラバン−３−オールおよび／またはフラバン−３，４−ジオールを構成単位とする重合度が２以上の縮重合体からなる化合物群をいう。プロアントシアニジンは、植物が作り出す強力な抗酸化物質であり、植物の葉、樹皮、果実の皮および種に集中的に含まれている。なお、このプロアントシアニジンは、ヒトの体内では生成することができない物質である。
【００２７】
松樹皮処理物に含有するプロアントシアニジンとしては、特に、重合度が低い縮重合体が多く含まれるプロアントシアニジンが好ましい。重合度の低い縮重合体としては、重合度が２〜３０の縮重合体（２〜３０量体）が好ましく、重合度が２〜１０の縮重合体（２〜１０量体）がより好ましく、重合度が２〜４の縮重合体（２〜４量体）がさらに好ましい。重合度が２〜４の縮重合体（２〜４量体）のプロアントシアニジンは、特に体内に吸収されやすい。本明細書では、重合度が２〜４の重合体を、オリゴメリック・プロアントシアニジン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ、以下「ＯＰＣ」と称する）という。
【００２８】
本発明に用いられる松樹皮処理物は、ＯＰＣを１０質量％以上、好ましくは１５質量％以上、より好ましくは２０質量％以上の割合で含有する抽出物であることが望ましい。
【００２９】
松樹皮は、プロアントシアニジンの中でもＯＰＣに富むため、プロアントシアニジンの原料として好ましく用いられる。しかし、松樹皮には、プロアントシアニジンだけでなく、プロアントシアニジン以外の成分も含まれている。例えば、松樹皮処理物が抽出物である場合、プロアントシアニジンを植物体より抽出する工程により、様々な有機酸やフラボノイドも抽出される。そのような有機酸やフラボノイドは、プロアントシアニジン以外の成分である。そのような有機酸やフラボノイドとしては、例えば、カフェー酸、フマル酸、キナ酸、没食子酸、バニリン酸、フェルラ酸、並びにカテキン類などが挙げられる。
【００３０】
松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法について、具体的に好ましい態様としては、以下の方法を挙げることができる。ただしこの方法に限定されるものではない。
【００３１】
フランス海岸松の樹皮１ｋｇを、塩化ナトリウムの飽和溶液３Ｌに入れ、１００℃にて３０分間抽出し、抽出液を得る（抽出工程）。その後、抽出液を濾過し、得られる不溶物を塩化ナトリウムの飽和溶液５００ｍＬで洗浄し、洗浄液を得る（洗浄工程）。この抽出液と洗浄液を合わせて、松樹皮の粗抽出液を得る。
【００３２】
次いで、この粗抽出液に酢酸エチル２５０ｍＬを添加して分液し、酢酸エチル層を回収する工程を５回行う。回収した酢酸エチル溶液を合わせて、無水硫酸ナトリウム２００ｇに直接添加して脱水する。その後、この酢酸エチル溶液を濾過し、濾液を元の５分の１の量になるまで減圧濃縮する。濃縮された酢酸エチル溶液を２Ｌのクロロホルムに注ぎ、攪拌して得られる沈殿物を濾過により回収する。この沈殿物を酢酸エチル１００ｍＬに溶解した後、再度１Ｌのクロロホルムに添加して沈殿させる操作を２回繰り返す洗浄工程を行う。この方法により、例えば、ＯＰＣを２０質量％以上含有する松樹皮抽出物を得ることができる。
【００３３】
本発明の剤は、上記に説明した松樹皮処理物を含有するものである。
【００３４】
本発明の剤においては、上記松樹皮処理物のみからなるものであってもよいが、松樹皮処理物以外に、他の素材を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば粉末状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、固形状、丸状、液状、飴状、ペースト状、クリーム状、ハードカプセルやソフトカプセルのようなカプセル状、カプレット状、タブレット状、ゲル状、ゼリー状、グミ状、ウエハース状、ビスケット状、クッキー状、チュアブル状、シロップ状、スティック状等の形態にして、これを飲食品や経口剤（医薬品や医薬部外品を含む）として利用することができる。
【００３５】
また、本発明の剤は、松樹皮処理物をティーバッグ状に分包し、お湯に成分を浸出させてから飲むものであってもよい。また、その服用形態としては、水、お湯、牛乳などに溶いて飲むようにしたり、飲食品等に添加して摂取したりしてもよい。
【００３６】
本発明の剤においては、上記成分以外に、他の素材として、例えば、ビタミン類、タンパク質、水溶性食物繊維、オリゴ糖、ミネラル類、ムコ多糖類、乳製品、豆乳製品、植物又は植物加工品、乳酸菌、納豆菌、酪酸菌、麹菌、酵母などの微生物を配合することができる。更に必要に応じて通常食品分野で用いられる、アスコルビン酸、トコフェロール、リボフラビン、β-カロテン、葉酸、ビオチンなどのビタミン類；カルシウム、マグネシウム、セレン、鉄などのミネラル類；タウリン、ニンニクなどに含まれる含硫化合物；ヘスペリジン、ケルセチンなどのフラバノイド類やフラボノイド類；難消化性デキストリン、アルギン酸、キチン、キトサン、グアーガムなどの食物繊維；大豆蛋白、コラーゲンなどのタンパク質；ペプチド；アミノ酸；乳脂肪、ラード、牛脂、魚油などの動物性油脂；大豆油、菜種油などの植物性油脂；オレンジ、レモン、グレープフルーツ、いちごなどの果実およびその果汁Ｆローヤルゼリー、プロポリス、はちみつ、還元麦芽糖、乳糖、糖アルコール、液糖；これら以外の賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などを挙げることができる。その他の成分の含有量は、本発明の剤の剤形や求められる効果のレベルや内容等に応じて適宜選択することができる。
【００３７】
本発明の剤は上述したように飲食品や経口剤（医薬品、医薬部外品を含む）として用いられていてもよい。例えば、本発明の剤を、松樹皮処理物に加えて脂質を含有させてここでいう飲食品等の形態として用いた場合、脂質の摂取に伴う皮膚のコラーゲン、ヒアルロン酸、セラミドの減少を、効果的に防止することが可能でありうるため好ましい。この場合、飲食品等の形態である本発明の剤において、脂質１００質量部に対し、松樹皮処理物が０．５質量部以上、特に１質量部以上であることが上記の観点から好ましい。
【００３８】
本発明の剤において、上記に説明した松樹皮処理物の含有量は、使用する松樹皮処理物の処理方法、剤の用途や剤形、摂取方法の違いや求められる効果のレベル等によっても異なるが、一般に、本発明の剤において、上記松樹皮処理物が０．００１質量％以上５０質量％以下であることが好ましく、０．００５質量％以上２０質量％以下であることが更に好ましい。
【００３９】
本発明において、松樹皮処理物の含有量に特に制限はない。好ましくは、成人１日あたりの摂取量が、松樹皮処理物として１〜５０００ｍｇ、より好ましくは２〜３０００ｍｇとなるように含有することが好ましい。
【００４０】
本発明の剤は、後述する実施例で示すように、これを経口摂取することにより、皮膚におけるＩ型コラーゲンの構成成分をコードする遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１及び／又はＩＩＩ型コラーゲンの構成成分をコードする遺伝子であるＣＯＬ３Ａ１の発現を促進することを通じて、コラーゲンの合成を促進するものである。このため、本発明の剤は、コラーゲン合成促進剤としてだけでなく、コラーゲン遺伝子発現促進剤、特に、Ｉ型コラーゲン遺伝子及び／又はＩＩＩ型コラーゲン遺伝子発現促進剤、具体的には、ＣＯＬ１Ａ１及び／又はＣＯＬ３Ａ１の発現促進剤としても用いることができる。このような本発明の剤は体内、特に皮膚や骨のコラーゲン減少に伴う様々な障害、疾患、疾病等の機能低下を予防又は改善することができる。例えば、皮膚のターンオーバーを促して皮膚のハリ及び弾力性を改善すると共に潤いを与え、皮膚のたるみ、かさつき、肌荒れ、シワ等の皮膚トラブルを予防又は改善する効果を奏しうる。
【００４１】
また、本発明の剤は、後述する実施例で示すように、これを経口摂取することにより、ヒアルロン酸合成酵素であるＨａｓ２及びＨａｓ３をそれぞれコードする遺伝子の発現を促進することを通じて、ヒアルロン酸の合成を促進するものである。このため、本発明の剤は、ヒアルロン酸合成促進剤としてだけでなく、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤、特に、具体的には、Ｈａｓ２遺伝子及び／又はＨａｓ３遺伝子の発現促進剤としても用いることができる。このようにヒアルロン酸合成酵素の遺伝子発現を通じてヒアルロン酸合成促進を図ることにより、本発明の剤は体内、特に皮膚のヒアルロン酸減少に伴う様々な障害、疾患、疾病等の機能低下を防止することができる。例えば、皮膚の保湿を促して皮膚のハリ及び弾力性を改善すると共に潤いを与え、皮膚の肌荒れ、シワ、かさつき等の皮膚トラブルを予防又は改善したり、関節障害、関節軟膏損傷等を予防又は改善する効果を奏しうる。特に本発明の剤は、真皮のヒアルロン酸を合成する主要酵素であり、ヒアルロン酸合成酵素の中でも比較的保湿性の高い高分子ヒアルロン酸を産出するといわれるＨａｓ２の発現を促進することで、高い美容効果を奏しうるものである。また、本発明の剤は、Ｈａｓ３の発現を促進することで、表皮のヒアルロン酸の合成を促進するほか、免疫機能を強化し得る。
【００４２】
また、本発明の剤は、後述する実施例で示すように、これを経口摂取することにより、セラミド合成酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）をコードする遺伝子の発現を促進することを通じて、セラミドの合成を促進するものである。このため、本発明のセラミド合成促進剤は、セラミド合成酵素遺伝子発現促進剤、特に、具体的には、ＳＰＴ遺伝子の発現促進剤としても用いることができる。このようにＳＰＴの遺伝子発現を通じてセラミド合成促進を図ることにより、本発明の剤は皮膚、特に表皮におけるセラミド減少に伴う様々な障害、疾患、疾病等の機能低下を防止することができる。例えば、皮膚の保湿を促して、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎、乾癬など、様々な皮膚症状の予防・改善を効果的に行えるようになることが期待される。
【００４３】
更に本発明の剤は、コラーゲン、ヒアルロン酸、セラミドの各成分の合成を促進することによる相乗効果により、有効な経口摂取用の皮膚改善剤、とりわけシワ又はタルミの防止又は改善剤、皮荒れの予防又は改善剤等に用いることができる。本発明の剤は、ヒト及びヒト以外の動物（哺乳類等）のいずれを対象にしてもよい。
【００４４】
更に、後述する実施例で示すように、本発明の剤は、高脂肪食摂取時においてＣＯＬ１Ａ１及び／又はＣＯＬ３Ａ１の発現促進することが可能であり、高脂肪食の摂取によるコラーゲンの量の低下を抑制することが可能である。ここでいう高脂肪食の例としては、脂質のエネルギー比率が２０％以上の飲食品を挙げることができる。したがって、本発明の剤は、高脂肪食によるコラーゲン量の低下の抑制剤としても用いることができる。
同様に、本発明の剤は、高脂肪食摂取時においてＨａｓ２遺伝子及び／又はＨａｓ３遺伝子の発現を促進することが可能であり、高脂肪食の摂取によるヒアルロン酸の量の低下を抑制することが可能である。したがって、本発明の剤は、高脂肪食によるヒアルロン酸の低下の抑制剤としても用いることができる。
更に、本発明の剤は、高脂肪食摂取により低下したセラミド量及びＳＰＴ遺伝子の発現量を防止することが可能である。したがって、本発明の剤は、高脂肪食によるセラミド量及びセラミド合成酵素遺伝子発現量の低下の抑制剤としても用いることができる。
このような本発明の剤は、特に、例えば高脂肪食下における皮膚の萎縮や創傷治癒の遅れ、床ずれの悪化等の治療等にも有効でありうる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。しかし本発明の範囲はかかる実施例に限定されない。以下、特に断らない場合「％」は質量％、「部」は質量部を表す。
【００４６】
〔参考例１〕
AIN-76Gに準拠した標準食を、参考例１のサンプル食とした。参考食１の脂質のエネルギー比率は１２％であった。
参考例１のサンプル食の組成を下記表１に示す。
【００４７】
【表１】
2015221759.tif 000002
【００４８】
〔参考例２〕
高脂肪食のモデルとして、参考例１のサンプル食において、ショ糖の量を５０．０部から３０．０部に減らし、また、コーン油５．０部の代わりにラード２５．０部を配合して、参考例２のサンプル食とした。参考食２の脂質のエネルギー比率は４６％であった。
【００４９】
〔実施例１〕
松樹皮処理物として、松樹皮抽出物（商品名「フラバンジェノール」（登録商標、株式会社東洋新薬製）を、参考例２のサンプル食１００部に対し５部添加し、混合して、実施例１のサンプル食とした。
【００５０】
参考例１及び２並びに実施例１のサンプルを以下の＜コラーゲン、ヒアルロン酸及びセラミドの合成促進試験＞に供した。
【００５１】
＜コラーゲン、ヒアルロン酸及びセラミドの合成促進試験＞
4週齢SD系雄性ラット１８匹を参考例１のサンプル食にて、1週間馴化飼育後、６匹ずつ、参考例１のサンプル食の摂取群、参考例２のサンプル食の摂取群、実施例１のサンプル食の摂取群の３群に分けて4週間飼育した。食餌は、午後4時から翌午前10時まで供与し、水は自由摂取とした。
4週間飼育した後、餌抜きし、ソムノペンチルで麻酔後、背部毛を剃った。背部の毛を沿った部分に瞬間接着剤を塗布したスライドグラスを付着させ、脂質を採取した。次に背部の皮膚を採取し、臀部付近の皮膚から直径18ｍｍの円盤状皮膚を4枚抜き取った。摂取した部分のうち、残りの皮膚からRNAを抽出し、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、Ｈａｓ２遺伝子、Ｈａｓ３遺伝子、およびＳＰＴ遺伝子のそれぞれの発現量（mRNA量）を以下の方法で測定した。また、円盤状の皮膚から以下の方法でコラーゲン量、ヒアルロン酸量およびセラミド量を測定した。
【００５２】
＜遺伝子発現量の測定＞
皮膚切片を液体窒素下で破砕後、SV Total RNA Isolation System  (Promega社)を用いてtotal RNAを抽出した。得られたＲＮＡについて濃度測定後、アガロース電気泳動にてRNAが分解されていないことを確認した。このtotal RNAをHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems社)を用いてcDNA化した後、下記のプライマー及びプローブを用い、real time PCR System (Applied Biosystems社)により、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、Ｈａｓ２遺伝子、Ｈａｓ３遺伝子及びＳＰＴ遺伝子のそれぞれの発現量を測定した。
それぞれの遺伝子の発現量は、β-actinを内部標準として算定した。
ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１の発現量の平均値及び標準誤差の結果を表２並びに図１及び図２に、Ｈａｓ２遺伝子及びＨａｓ３遺伝子の発現量の平均値及び標準誤差の結果を表３並びに図３及び図４に、ＳＰＴ遺伝子の発現量平均値及び標準誤差のを表４及び図５にそれぞれ示す。これらの表及び図において各遺伝子の発現量は、参考例１の摂取群における発現量を１とした場合の相対値として示した。得られた遺伝子発現量について、Kruskal-Wallis-H-testにて検定した後、Student-Newman  -Keuls testにて多重比較で確認することにより、有意差の検定を行った。図１〜図５における小文字のアルファベットが異なる場合、有意差があることを示す。
【００５３】
プライマー及びプローブの配列
ラットＣＯＬ１Ａ１（Genbank accession number:Z78279）
非特許文献１のTable2に記載のプライマー及びプローブを用いた。
ラットＣＯＬ３Ａ１
Forward primer: 5’-TTGGGATGCAACTACCTTGGT-3’/配列番号１
Reverse primer: 5’-TCCCCACTCCCACACACAT-3’/配列番号２
Probe: FAM-TGACATGGTTCTGGCTTCCAGACATCTCT-TAMRA/配列番号３の配列の５’末端を6-ＦＡＭで修飾し、３’末端をＴＡＭＲＡで修飾したもの
ラットＨａｓ2遺伝子（Genbank accession number:AF008201）
非特許文献１のTable2に記載のプライマー及びプローブを用いた。
ラットＨａｓ3遺伝子（Genbank accession number:AF543196）
非特許文献１のTable2に記載のプライマー及びプローブを用いた。
ラットSPT遺伝子
Forward primer: 5’-CAGTGCAGCCTGCTTTGCTA-3’/配列番号４
Reverse primer: 5’-GCCTTTCGAGGATTCTTTTGATC-3’/配列番号５
Probe: FAM-CCAGAAAGGACTACAGGCATCACGCAG-TAMRA/配列番号６の配列の５’末端を6-ＦＡＭで修飾し、３’末端をＴＡＭＲＡで修飾したもの
ラットβ−actin遺伝子（Genbank accession number:V01217）
非特許文献１のTable2に記載のプライマー及びプローブを用いた。
【００５４】
＜Ｉ型コラーゲン量の測定＞
円盤状の皮膚1枚の重量を測定した。その後、皮膚を解剖バサミで細断後、皮膚重量100mg当たり2.5mlの冷生理食塩水を添加し、ホモジナイズした。皮膚懸濁液を4℃にて20時間振盪後、遠心し、上清を得た。この上清中に含まれるトロポコラーゲンを測定対象であるコラーゲンとした。
コラーゲン量の測定は、ウエスタンブロッティング法を用いて行った。前記で得られた上清を、６％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけた。電気泳動後のたんぱく質を、ニトロセルロース膜に移し、一次抗体として抗ヒトI型コラーゲン抗体（Lockland社製）を用い、二次抗体として、HRP-抗rabbit抗体（GE社製）を用いてＩ型コラーゲン量を測定した。定量は、蛍光・発光画像解析装置LAS-3000（富士フィルム社製）を用いて行った。結果を表２に示す。同表においてＩ型コラーゲン量は、参考例１のＩ型コラーゲン量を１とした場合の相対値として示した。
【００５５】
＜ヒアルロン酸量の測定＞
円盤状の皮膚1枚の重量を測定後、アセトンで脱脂し、再度重量を測定した。皮膚を細断後、脱脂後皮膚重量100mg当たり5mlの50ｍM Tris/HCl緩衝液(pH7.8)を添加し、20分間煮沸した。得られた煮沸物に等量の2mg/mlアクチナーゼE溶液（科研製薬）を添加し、1週間40℃にて反応させた。反応停止は、冷トリクロロ酢酸水溶液を終濃度10％になるように添加させて行った。遠心後、上清を回収し、アミコンウルトラ30K（ミリポア社）にて1mlに濃縮した。この濃縮液500μlをヒアルロニダーゼ（生化学工業社製）にて18時間60℃にて処理後、マイクロコン30(ミリポア社)にて処理した。マイクロコンの透過液のウロン酸量を測定して、ヒアルロン酸量とした。ウロン酸の測定方法は“Bitter,T,.et al, A modeified uronic acid carbazole reaction. Anal Biochem. 1962, 4,330-334 ”に記載された方法で行った。結果を表３に示す。同表においてヒアルロン酸量は、参考例１のヒアルロン酸量を１とした場合の相対値として示した。
【００５６】
＜ セラミド量の測定＞
スライドグラスに瞬間接着剤を塗布して採取したラット背部角質層をヘキサン：エタノール（体積比95：5）溶液に浸し、超音波処理で脂質を抽出した。抽出液から窒素ガスにて溶媒を蒸発させ、角質層の脂質を得た。クロロホルムにて脂質濃度を一定にした後、シリカゲルプレート (メルク社、HPTLC Silica gel 60F）にスポッティングし、クロロホルム：メタノール：酢酸（体積比192：7：1）で展開した。展開後、硫酸銅・リン酸溶液（リン酸8gおよび硫酸銅（II）・五水和物15.63gを水に溶解し、100mlにした溶液）を噴霧し、乾燥後、150℃にて10分間加熱し、脂質を発色させた。セラミドのスポットを蛍光・発光画像解析装置LAS-3000（富士フィルム社製）にて数値化した。結果を表４に示す。同表においてセラミド量は、参考例１のセラミド量を１とした場合の相対値として示した。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
表２並びに図１及び図２の結果から、松樹皮処理物を含有していない参考例１及び参考例２は、皮膚におけるＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１の発現量が低いのに対し、松樹皮処理物を含有している実施例１では、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１の発現量が有意に高いことが判る。また表２から、高脂肪食を摂取した参考例２では、普通食を摂取した参考例１よりも皮膚のＩ型コラーゲン合成量が低減する傾向がみられるところ、実施例１では高脂肪食を摂取しているにも関わらず、普通食である参考例１と同程度に皮膚のＩ型コラーゲン量が高いことが判る。
【００６１】
表３並びに図３及び図４の結果から、松樹皮処理物を含有していない参考例１及び参考例２は、皮膚におけるＨａｓ２及びＨａｓ３遺伝子の発現量が低いのに対し、松樹皮処理物を含有している実施例１では、Ｈａｓ２及びＨａｓ３遺伝子の発現量が有意に高いことが判る。また表３から、高脂肪食を摂取した参考例２では、普通食を摂取した参考例１よりも皮膚のヒアルロン酸量が低減する傾向がみられるところ、実施例１では高脂肪食を摂取しているにも関わらず、普通食である参考例１以上にヒアルロン酸量が高いことが判る。
【００６２】
表４及び図５の結果から、松樹皮処理物を含有していない高脂肪食を摂取した参考例２は、皮膚におけるＳＰＴ遺伝子の発現量が低いのに対し、高脂肪食と共に松樹皮処理物を摂取した実施例１では、ＳＰＴ遺伝子の発現量が有意に高いことが判る。また表４から、高脂肪食を摂取した参考例２では、普通食を摂取した参考例１よりも表皮のセラミドが低減する傾向がみられるところ、実施例１では高脂肪食を摂取しているにも関わらず、普通食である参考例１以上に表皮のセラミド量が高いことが判る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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