(57)【要約】【課題】薬物を安定して内包し、長期に渡る徐放性を有する医薬組成物を提供すること。【解決手段】本発明の医薬組成物は、ヒアルロン酸を含む架橋ゲル（Ａ）と、キレート形成基を有するヒアルロン酸を含むナノゲル（Ｂ）と、薬物とを含む。この医薬組成物では、該薬物がナノゲル（Ｂ）に内包されており、該薬物を内包したナノゲル（Ｂ）が架橋ゲル（Ａ）に分散されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ヒアルロン酸を含む架橋ゲルと、
（Ｂ）キレート形成基を有するヒアルロン酸を含むナノゲルと、
薬物とを含む、医薬組成物であって、
該薬物がナノゲル（Ｂ）に内包されており、
該薬物を内包したナノゲル（Ｂ）が架橋ゲル（Ａ）に分散されている、医薬組成物。
【請求項２】
前記架橋ゲル（Ａ）が互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を２種以上含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ナノゲル（Ｂ）に含まれるヒアルロン酸が前記互いに架橋可能な置換基をさらに有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記キレート形成基が以下の置換基である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物：
【化１】
2015221765.tif 000036
（式中、Ｒ２およびＲ３は（ＣＨ２）ｒを表し、ｒは０〜２の整数である。Ｒ２およびＲ３は同一であってもよく、異なっていてもよい）。
【請求項５】
前記架橋可能な置換基がアルデヒド基とヒドラジド基との組合せ、アジド基とシクロオクチン基との組合せ、チオール基とマレイミド基との組合せ、ならびに、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基と水酸基との組み合わせからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記薬物が金属を含む薬物である、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記薬物が抗がん剤である、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
キレート形成基を有するヒアルロン酸と薬物とを用いて、薬物を内包するナノゲルを調製する工程と、
互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸に該薬物を内包するナノゲルを添加する工程と、
該薬物を内包するナノゲルを添加したヒアルロン酸と、薬物を内包するナノゲルを添加していない他の互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸とを接触させる工程とを含む、医薬組成物の調製方法。
【請求項９】
前記医薬組成物の調製がインサイチュで行われる、請求項８に記載の医薬組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、ヒアルロン酸を含む架橋ゲルと、該架橋ゲルに分散されたヒアルロン酸を含むナノゲルと、該ナノゲルに内包された薬物とを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、関節、ガラス体、皮膚等の生体内の細胞外マトリックスに広く存在することが知られている。ヒアルロン酸は、食品、化粧品等の分野だけではなく、関節機能改善薬や眼科手術補助剤として医療分野でも広く用いられている。近年、癒着防止材料、再生医療スキャフォールド、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）担体として適用可能なヒアルロン酸ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋ゲルが提案されている（特許文献１）。また、ヒアルロン酸のレセプターであるＣＤ４４の発現量が多くのガン細胞で高くなることが知られており、抗がん剤にヒアルロン酸を添加し、治療する方法が提案されている（特許文献２）。
【０００３】
シスプラチン（ＣＤＤＰ）等の白金系抗ガン剤は、ＤＮＡと結合し複製を阻害することが知られている。そのため、ＣＤＤＰを用いた様々なガン治療が行われている。例えば、持続温熱腹膜灌流装置を用いて、腹膜播種に対して高濃度でＣＤＤＰを送達する直接温熱療法が行われており、一定の効果をあげている。しかしながら、この場合、手術により部品を取り付ける必要があり、患者への負担が大きい。また、他の方法として、ゼラチンにＣＤＤＰを含ませたゲルシートを用いた治療が提案されている（非特許文献１）。この方法では、ＣＤＤＰを均一に患部に送達することができるものの、外科手術が必要となる。さらに、ヒアルロン酸とＣＤＤＰとのナノ粒子を用いたＤＤＳ（非特許文献２）や、ヒアルロン酸ベースのｉｎ  ｓｉｔｕ架橋ゲルを用いたＤＤＳ（非特許文献３）が提案されている。しかしながら、これらのＤＤＳでは内包されたＣＤＤＰが短時間で放出される。そのため、より安定して薬物を内包でき、長期的な徐放性に優れたＤＤＳが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１６５４６２号パンフレット
【特許文献２】特開２００９−４６４５０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕｎａｇａ  Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９２  （２００３）  ３０１−３１３
【非特許文献２】ＹＯＵＮＧ−ＩＬ  ＪＥＯＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,  ９７,  （２００８）
【非特許文献３】Ｓ．  Ｅｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｔ.Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．:Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  （２０１３）  １−３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、薬物を安定して内包し、長期に渡る徐放性を有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の医薬組成物は、ヒアルロン酸を含む架橋ゲル（Ａ）と、キレート形成基を有するヒアルロン酸を含むナノゲル（Ｂ）と、薬物とを含む。この医薬組成物では、該薬物がナノゲル（Ｂ）に内包されており、該薬物を内包したナノゲル（Ｂ）が架橋ゲル（Ａ）に分散されている。
１つの実施形態においては、上記架橋ゲル（Ａ）は互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を２種以上含む。
１つの実施形態においては、上記ナノゲル（Ｂ）に含まれるヒアルロン酸は上記互いに架橋可能な置換基をさらに有する。
１つの実施形態においては、上記キレート形成基は以下の置換基である：
【化１】
2015221765.tif 000002
（式中、Ｒ２およびＲ３は（ＣＨ２）ｒを表し、ｒは０〜２の整数である。Ｒ２およびＲ３は同一であってもよく、異なっていてもよい）。
１つの実施形態においては、上記架橋可能な置換基はアルデヒド基とヒドラジド基との組合せ、アジド基とシクロオクチン基との組合せ、チオール基とマレイミド基との組合せ、ならびに、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基と水酸基との組み合わせからなる群より選択される少なくとも１種である。
１つの実施形態においては、上記薬物は金属を含む薬物である。
１つの実施形態においては、上記薬物は抗がん剤である。
本発明の別の局面によれば、医薬組成物の調製方法が提供される。本発明の医薬組成物の調製方法、キレート形成基を有するヒアルロン酸と薬物とを用いて、薬物を内包するナノゲルを調製する工程と、互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸に該薬物を内包するナノゲルを添加する工程と、該薬物を内包するナノゲルを添加したヒアルロン酸と、薬物を内包するナノゲルを添加していない他の互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸とを接触させる工程とを含む。
１つの実施形態によれば、上記医薬組成物の調製はインサイチュで行われる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、薬物を安定して内包し、長期に渡る徐放性を有する医薬組成物が提供され得る。本発明の医薬組成物は、内包される薬物だけではなく、薬物を内包したナノゲル（Ｂ）をも放出し得る。薬物を内包するナノゲル（Ｂ）は、それ自体が徐放性を有する。そのため、さらに長期的な徐放性を有する医薬組成物を得ることができる。このような構成にすることにより、薬物を安定して内包し、長期に渡る徐放性を有する医薬組成物を提供することができる。さらに、本発明の医薬組成物は内包する薬物とナノゲル（Ｂ）に含まれるヒアルロン酸が有するキレート形成基との組み合せにより、薬物の放出速度を調整し得る。さらに、キレート形成基を有するヒアルロン酸が互いに架橋可能な置換基をさらに有することにより、ナノゲル（Ｂ）と架橋ゲル（Ａ）とが架橋し、より強固に薬物を保持することができる。そのため、本発明の医薬組成物は、内包する薬物を所望の量および時間で放出することができ、適切な治療効果を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】医薬組成物の調製に用いるダブルシリンジの写真である。
【図２】Ｍｅｔ−５Ａの細胞生存率を示すグラフである。
【図３】ＭＮＫ４５Ｐの細胞生存率を示すグラフである。
【図４】各サンプルのキレート曲線である。
【図５】医薬組成物１および２の徐放曲線を表すグラフである。
【図６】医薬組成物３および４の徐放曲線を表すグラフである。
【図７】架橋ゲル濃度を変更した医薬組成物の徐放曲線を表すグラフである。
【図８】医薬組成物１、２、Ｃ１、および、Ｃ２におけるＭＫＮ４５の細胞生存率を表すグラフである。
【図９】マウスの体重変化を表すグラフである。
【図１０】播種重量変化を表すグラフである。
【図１１】播種数変化を表すグラフである。
【図１２】血中尿素窒素含有量を表すグラフである。
【図１３】血中クレアチニン濃度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。
【００１１】
本発明の医薬組成物は、ヒアルロン酸を含む架橋ゲル（Ａ）と、キレート形成基を有するヒアルロン酸を含むナノゲル（Ｂ）と、薬物とを含む。本発明の医薬組成物では、薬物がナノゲル（Ｂ）に内包されており、該薬物を内包したナノゲル（Ｂ）は、架橋ゲル（Ａ）に分散・保持されている。本発明の医薬組成物は、内包される薬物だけではなく、薬物を内包したナノゲル（Ｂ）をも放出し得る。薬物を内包するナノゲル（Ｂ）は、それ自体が徐放性を有する。そのため、さらに長期的な徐放性を有する医薬組成物を得ることができる。このような構成にすることにより、薬物を安定して保持し、長期に渡る徐放性を有する医薬組成物を提供することができる。さらに、キレート形成基を有するヒアルロン酸が互いに架橋可能な置換基をさらに有することにより、ナノゲル（Ｂ）と架橋ゲル（Ａ）とが架橋し、より強固に薬物を保持することができる。そのため、本発明の医薬組成物は、内包する薬物を所望の量および時間で放出することができ、適切な治療効果を提供することができる。
【００１２】
本発明の医薬組成物における、架橋ゲル（Ａ）、ナノゲル（Ｂ）、薬物の配合割合は、所望の投与量、徐放速度等に応じて、選択することができる。例えば、医薬組成物における架橋ゲル（Ａ）の割合を調整することにより、医薬組成物に含まれるナノゲル（Ｂ）および薬物の保持時間を調整することができる。また、本発明の医薬組成物では、薬物だけではなく、徐放性を有するナノゲル（Ｂ）自体も放出される。そのため、ナノゲル（Ｂ）の割合を調整することでも薬物の保持時間を調整することができる。本発明の医薬組成物では、架橋ゲル（Ａ）およびナノゲル（Ｂ）の双方の割合を調整することにより、薬物の保持時間を調整することが可能であり、より徐放性が制御されたＤＤＳを提供することができる。
【００１３】
＜Ａ．架橋ゲル＞
本発明で用いる架橋ゲル（Ａ）は、ヒアルロン酸を含む。本明細書において、ヒアルロン酸を含む架橋ゲルとは、ヒアルロン酸分子同士が架橋されることにより、三次元的な網目構造が形成されたゲルをいう。ヒアルロン酸は生体適合性に優れるため、ＤＤＳの担体として好適に用いることができる。また、内包する薬物として抗ガン剤を用いる場合、ガン細胞を標的とした投与を好適に行うことができ得る。
【００１４】
架橋ゲル（Ａ）に含まれるヒアルロン酸の分子量は、例えば、１０，０００〜２，０００，０００であり、好ましくは２０，０００〜８００，０００である。
【００１５】
ヒアルロン酸の架橋は、任意の適切な方法により、行うことができる。１つの実施形態としては、架橋ゲル（Ａ）は、互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を２種以上含み、これらの置換基同士が架橋することが好ましい。架橋剤を用いることなく、置換基同士が架橋して架橋ゲルを形成することにより、後述するように、ｉｎ  ｓｉｔｕ（インサイチュ）で医薬組成物を調製することができる。そのため、本発明の医薬組成物の投与のために、開腹手術を行う必要がなく、例えば、内視鏡手術等の負担が少ない方法により投与することができる。
【００１６】
上記互いに架橋可能な置換基は、生体内の条件で架橋可能な置換基であることが好ましい。具体的には、ヒドラジド基とアルデヒド基との組合せ、アジド基とシクロオクチン基との組合せ、チオール基とマレイミド基との組合せ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基と水酸基との組合せ等が挙げられる。架橋ゲル（Ａ）は上記組合せのうち１組を有するヒアルロン酸のみを含んでいてもよく、異なる置換基の組合せを有するヒアルロン酸を２種以上含んでいてもよい。生体内の条件下で速やかに架橋ゲルが形成されることから、ヒドラジド基を有するヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＤＨ）と、アルデヒド基を有するヒアルロン酸（ＨＡ−ＣＨＯ）とを組み合わせて用いることが好ましい。ＨＡ−ＡＤＨとＨＡ−ＣＨＯを用いる場合、ヒドラジド基とアルデヒド基が生体内の条件下で下記式のように結合し、架橋ゲルが形成される。
【化２】
2015221765.tif 000003
【００１７】
上記置換基を有するヒアルロン酸の置換基による修飾率は、好ましくは４０％〜９０％であり、より好ましくは５０％〜８５％である。修飾率が上記範囲内であれば、所望の架橋密度を有する架橋ゲルを好適に形成することができる。
【００１８】
互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を２種以上含む場合、通常、互いに架橋する置換基の割合がモル比で１：１となるように調整される。ナノゲル（Ｂ）に含まれるヒアルロン酸として、キレート形成基と上記置換基とを有するヒアルロン酸とを用いる場合、ナノゲル（Ｂ）に含まれるヒアルロンの有する置換基を考慮して、割合を調整してもよい。
【００１９】
架橋ゲル（Ａ）の調製には、通常、ヒアルロン酸を任意の溶媒に溶解させたヒアルロン酸溶液が用いられる。このヒアルロン酸溶液の濃度を調整することにより、架橋ゲル（Ａ）の架橋密度を調整することができ、所望の徐放速度や体内での保持時間に調整することができる。ヒアルロン酸溶液の濃度は好ましくは０．５重量％〜５重量％である。ヒアルロン酸溶液の濃度が上記の範囲内であることにより、安定して薬物を輸送することができ、さらに、例えば、抗ガン剤を内包する場合、播種数の減少効果とともに、架橋ゲルによる腎毒性をも防止し得る。ヒアルロン酸溶液の溶媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。
【００２０】
架橋ゲル（Ａ）の別の実施形態としては、ヒアルロン酸を、例えば、ビスエポキシド類、ジビニルスルホン、ジヒドラジン、ジヒドラジド、または、ポリイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋することにより調製する方法が挙げられる。
【００２１】
また、ヒアルロン酸を含む架橋ゲルとして、市販の架橋ヒアルロン酸を用いてもよい。市販の架橋ヒアルロン酸としては、例えば、Ｅｘｔｒａｃｅｌ（登録商標）−Ｘ（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ製）、Ｃｏｒｇｅｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ．製）等が挙げられる。
【００２２】
＜Ｂ．ナノゲル＞
本発明で用いるナノゲル（Ｂ）は、キレート形成基を有するヒアルロン酸を含む。キレート形成基を有するヒアルロン酸を含むことにより、例えば、内包する薬物として金属を含む薬物を用いる場合、該薬物とヒアルロン酸に含まれるキレート形成基とがキレートを形成する。そのため、薬物がナノゲル（Ｂ）により安定して内包され得る。さらに、ヒアルロン酸が有するキレート形成基と薬物との結合はｐＨに依存して切断され得るので、本発明の医薬組成物はエンドソーム膜内で薬物を放出し得る。例えば、細胞外（ｐＨ７付近）ではキレート形成基と薬物との結合は維持されるのに対し、エンドソーム内（ｐＨ５〜６）ではその結合が切断される。そのため、本発明の医薬組成物は、標的まで安定して薬物を輸送することができる。上記ナノゲル（Ｂ）は、キレート形成基を有するヒアルロン酸を単独で含んでいてもよく、２種以上組み合わせて用いられていてもよい。２種以上のキレート形成基を有するヒアルロン酸を任意の割合で含むことにより、内包した薬物の徐放速度を調整することができる。
【００２３】
本発明で用いるキレート形成基を有するヒアルロン酸は、例えば、下記式（１）で表される。
【化３】
2015221765.tif 000004
【００２４】
式（１）において、Ｒ１はキレート形成基を表す。式（１）において、ｎはキレート基を有していないヒアルロン酸の繰り返し単位を表す。ｎは好ましくは２５〜５，０００であり、より好ましくは５０〜１，０００である。式（１）において、ｍはキレート基を有するヒアルロン酸の繰り返し単位を表す。ｍは好ましくは１〜３，２５０であり、より好ましくは２〜６５０である。キレート形成基を有するヒアルロン酸の配置は特に制限はなく、ブロック構造であっても、ランダム構造であってもよい。
【００２５】
上記キレート形成基Ｒ１としては、ナノゲルが内包する薬物に応じて、任意の適切な官能基とすることができる。キレート形成基としては、例えば、カルボキシル基、ジカルボン酸アミノ基、ジカルボン酸基等が挙げられる。薬物として、ＣＤＤＰを用いる場合、ＣＤＤＰの有する塩素原子と良好に配位することから、カルボキシル基を側鎖に有するヒアルロン酸を用いることが好ましい。
【００２６】
Ｒ１は好ましくは下記式で表される置換基である。下記式で表されるキレート形成基を有することにより、より安定して薬物を保持することができる。
【化４】
2015221765.tif 000005
（式中、Ｒ２およびＲ３は（ＣＨ２）ｒを表し、ｒは０〜２の整数である。Ｒ２およびＲ３は同一であってもよく、異なっていてもよい）。
【００２７】
Ｒ２およびＲ３は直鎖状であることが好ましく、これらが同一であることがさらに好ましい。ｒは０〜２であり、キレート形成基がメチレン基を有さない、または、上記範囲内のメチレン基を有する直鎖のジカルボン酸である場合、キレート形成基を有するヒアルロン酸は薬物と多員環構造（通常、５〜７員環構造）のキレートを形成し得る。そのため、より安定した状態で薬物を保持し得る。
【００２８】
例えば、薬物としてＣＤＤＰを内包させる場合、ＣＤＤＰとｒが０であるキレート形成基を有するヒアルロン酸とは、以下のような６員環構造を形成し得る。
【化５】
2015221765.tif 000006
【００２９】
また、ＣＤＤＰとｒが１であるキレート形成基を有するヒアルロン酸とは、以下のような８員環構造を形成し得る。
【化６】
2015221765.tif 000007
【００３０】
上記のように、キレート形成基の種類に応じて形成されるキレートが異なり、それにより医薬組成物から放出される形態が変わり得る。例えば、ｒが０であるキレート形成基はＣＤＤＰとより安定した配位構造である６員環構造を形成する。そのため、より安定して薬物を内包するナノゲル（Ｂ）となり、このナノゲル（Ｂ）自体が医薬組成物から放出され得る。一方、キレート形成基と単座配位した薬物は、ナノゲル（Ｂ）から解離しやすい。そのため、キレート形成基と単座配位した薬物は、本発明の医薬組成物から薬物として容易に放出され得る。
【００３１】
キレート形成基を有するヒアルロン酸のキレート形成基の修飾率は、好ましくは５ｍｏｌ／ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ／ｍｏｌ％であり、より好ましくは１０ｍｏｌ／ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ／ｍｏｌ％であり、さらに好ましくは２０ｍｏｌ／ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ／ｍｏｌ％である。キレート形成基の修飾率が上記の範囲内であれば、薬物の安定した内包性と適度な徐放性とを両立し得る。キレート形成基の修飾率は、１Ｈ−ＮＭＲを用いて測定することにより、算出することができる。
【００３２】
キレート形成基を有するヒアルロン酸の薬物担持率は、好ましくは２０ｍｏｌ／ｍｏｌ％〜１００ｍｏｌ／ｍｏｌ％であり、より好ましくは２５ｍｏｌ／ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ／ｍｏｌ％である。薬物担持率が上記の範囲内であれば、薬物を多量に内包できるキャリアとしてよく知られているミセルとほぼ同等の薬物を担持することができ、優れたキャリアとして機能し得る。
【００３３】
上記キレート形成基を有するヒアルロン酸は架橋可能な置換基をさらに有することが好ましい。キレート形成基を有するヒアルロン酸が架橋可能な置換基を有することにより、ナノゲル（Ｂ）に含まれるヒアルロン酸が、架橋ゲル（Ａ）を形成するヒアルロン酸とも架橋し、ナノゲル（Ｂ）をより安定して内包する医薬組成物が得られる。架橋可能な置換基としては、上記架橋ゲル（Ａ）の項で例示した置換基が挙げられる。好ましくは、架橋ゲル（Ａ）に含まれるヒアルロン酸が有する架橋可能な置換基と同じ置換基を有することが好ましい。架橋可能な置換基による修飾率は、キレート形成基によるキレートの形成を妨げない範囲であればよい。
【００３４】
ナノゲル（Ｂ）に薬物を内包させる方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。ナノゲル（Ｂ）に薬物を内包させる方法の詳細については、以下のＤ−１項に詳述する。
【００３５】
＜Ｃ．薬物＞
本発明の医薬組成物に用いられる薬物としては、医薬組成物の用途に応じて、任意の適切な薬物を用いることができる。上記の通り、本発明で用いるナノゲル（Ｂ）はキレート形成基を有するヒアルロン酸を含む。本発明の１つの実施形態においては、薬物として金属を含む薬物を用いることが好ましい。また、本発明で用いる架橋ゲル（Ａ）およびナノゲル（Ｂ）はヒアルロン酸を含み、ヒアルロン酸はガン細胞を標的とした投与に好適である。そのため、本発明の１つの実施形態としては、薬物として抗ガン剤を用いることが好ましい。
【００３６】
金属を含む薬物としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン等の白金錯体を含む抗ガン剤等が挙げられる。なかでも、金属を含む抗ガン剤である白金錯体を含む抗ガン剤は本発明の医薬組成物に含まれる薬物として、特に好適である。
【００３７】
＜Ｄ．医薬組成物の調製方法＞
本発明の医薬組成物の調製方法は、好ましくはキレート形成基を有するヒアルロン酸と薬物とを用いて、薬物を内包するナノゲルを調製する工程と、該薬物を内包させたナノゲルを架橋ゲルに分散させる工程とを含む。より好ましくは、本発明の医薬組成物の調製方法は、キレート形成基を有するヒアルロン酸と薬物とを用いて、薬物を内包するナノゲルを調製する工程と、互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸に該薬物を内包するナノゲルを添加する工程と、該薬物を内包するナノゲルを添加したヒアルロン酸と、薬物を内包するナノゲルを添加していない他の互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸とを接触させる工程とを含む。
【００３８】
Ｄ−１．薬物を内包するナノゲルの調製方法
薬物を内包するナノゲルを調製する方法としては、例えば、キレート形成基を有するヒアルロン酸と薬物とを混合して加熱する方法（加熱反応）、キレート形成基を有するヒアルロン酸と薬物とを撹拌する方法、硝酸銀法等が挙げられる。短時間で高い薬物担持率のナノゲルが得られることから加熱反応により内包させることが好ましい。
【００３９】
加熱反応により内包させる場合、加熱温度は好ましくは５０℃〜１２０℃であり、より好ましくは７０℃〜１００℃である。加熱方法としては、任意の適切な加熱手段を用いることができ、例えば、ヒートブロック、ウォーターバス、オイルバス、ホットプレート等が挙げられる。
【００４０】
キレート形成基を有するヒアルロン酸を調製する方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、ヒアルロン酸と水を混合してｐＨを７．０に調整した溶液に、脱水縮合剤を添加し、次いでｐＨを５．０に維持しながら、キレート形成基を提供し得る化合物を滴下し、透析する方法が挙げられる。
【００４１】
上記キレート形成基を提供し得る化合物としては、例えば、ジカルボン酸アミン等が挙げられる。具体的には、イミノ二酢酸、アミノマロン酸等が挙げられ、好ましくはイミノ二酢酸、アミノマロン酸である。また、ジカルボン酸アミンに代えて、例えばアミノマロン酸ジエチルとヒアルロン酸とを反応させた後、けん化することにより、キレート形成基の末端をカルボキシル基としてもよい。
【００４２】
上記脱水縮合剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド等が挙げられる。
【００４３】
架橋可能な置換基を有するキレート形成基を有するヒアルロン酸を調製する方法としては、得られたキレート形成基を有するヒアルロン酸のキレート形成基を有していない側鎖を、例えばアルデヒド化することにより、調製することができる。
【００４４】
Ｄ−２．薬物を内包させたナノゲルを分散させた架橋ゲルの調製方法
薬物を内包させたナノゲルを分散させた架橋ゲルは、上記Ｄ−１項の方法で得られたナノゲルを添加した後、例えば、上記Ａ項に記載の互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を架橋することにより調製することができる。薬物を内包させたナノゲルを分散させた架橋ゲルは、互いに架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を２種以上用いて、１つの架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸に上記薬物を内包するナノゲルを添加し、次いで、該薬物を内包するナノゲルを添加したヒアルロン酸と、薬物を内包するナノゲルを添加していない他の架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸とを接触させることにより、調製することが好ましい。このような方法を用いて、架橋ゲルを調製することにより、例えば、図１に示すダブルシリンジを用いて、インサイチュでの医薬組成物の調製が可能となる。
【００４５】
具体的には、架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸をそれぞれリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に添加し、一方の溶液に薬物を内包させたナノゲルを分散させた後、得られた溶液をダブルシリンジのそれぞれのシリンジに充填し、それらを同時に押し出し、静置することにより架橋ゲルを形成し得る。
【００４６】
ゲルの形成時間は、ヒアルロン酸溶液の濃度や、ヒアルロン酸の有する架橋可能な置換基の数等により、調整することができ、例えば、５秒間〜１時間であり、好ましくは３０秒〜１０分である。
【００４７】
薬物を内包するナノゲルを調製する際に、架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸を用いる場合、薬物を内包するナノゲルは、該ナノゲルに含まれるヒアルロン酸と同じ架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸に溶解させることが好ましい。このような構成であれば、架橋が防止され、シリンジからの押し出しが容易となる。
【００４８】
Ｅ．医薬組成物の用途
本発明の医薬組成物は、例えば、医薬組成物における架橋ゲル（Ａ）の割合を調整することにより、医薬組成物に含まれるナノゲル（Ｂ）および薬物の保持時間を調整することができる。また、本発明の医薬組成物では、薬物だけではなく、徐放性を有するナノゲル（Ｂ）自体も放出される。そのため、ナノゲル（Ｂ）の割合を調整することでも薬物の保持時間を調整することができる。本発明の医薬組成物では、架橋ゲル（Ａ）およびナノゲル（Ｂ）の双方の割合を調整することにより、薬物の保持時間を調整することが可能であり、より徐放性が制御されたＤＤＳを提供することができる。また、ヒアルロン酸はガン細胞を標的とした投与に好適であるため、抗ガン剤を用いたＤＤＳに好適に用いることができる。
【００４９】
例えば、腹膜播種のようなガンの治療においては、開腹手術等の外科手術を用いることが必要であり、患者への負担が大きい。本発明の医薬組成物はインサイチュでの調製が可能であり、内視鏡等を用いて、患者への負担をより軽減させた投与が可能である。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
Ｉ．ヒアルロン酸の合成
［合成例１］アルデヒド化ヒアルロン酸（架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸１）
１．アルデヒド化ヒアルロン酸の合成
３００ｍＬのナスフラスコにヒアルロン酸（キッコーマンバイオケミファ（株）製、製品名：ＦＣＨ-２００、分子量：１，８００，０００〜２，２００，０００）１．５ｇ（１等量）を入れ、ｍｉｌｌｉＱ水１５０ｍＬを加え溶解した。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬（株）製、商品名：１９７−２４０２）０．４ｇを添加し、アルミホイルで遮光し、２時間撹拌した。撹拌後、エチレングリコール（和光純薬（株）製、商品名：０５８−００９８６）２００μＬを添加し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ＝６０００〜８０００）を用いて、飽和塩化ナトリウム水溶液２Ｌで透析した。次いで、純粋で２日間透析し、その後３日間凍結乾燥し、アルデヒド化ヒアルロン酸を得た（収率：３０％）。合成例１の反応式は以下の通りである。
【００５２】
【化７】
2015221765.tif 000008
【００５３】
２．アルデヒド化率の測定
ＴＮＢＳアッセイにより、合成したヒアルロン酸のアルデヒド化率を測定した。カルバジン酸ｔ−ブチル（和光純薬（株）製、商品名：３２２−２９１７１）１．６ｍｇを１％トリクロロ酢酸（和光純薬（株）製、商品名：７６−０３−９）１ｍＬに溶解した。次いで、得られたアルデヒド化ヒアルロン酸２ｍｇを溶解し、２４時間振とうして室温で反応させ、アルデヒド化ヒアルロン酸溶液を得た。別途、ＴＮＢＳ（和光純薬（株）、商品名：２０９−１−４８３）２９．３２ｍｇを炭酸水素ナトリウム水溶液２５ｍＬに溶解し、４ｍＭ  ＴＮＢＳ溶液を得た。得られたＴＮＢＳ溶液２ｍＬを試験管に入れ、２００μＬのアルデヒド化ヒアルロン酸溶液を加え、２時間反応させた。ホルムアルデヒドを用いて検量線を作成し、検量線の式からアルデヒド化率を算出した。得られたアルデヒド化ヒアルロン酸のアルデヒド化率は８１．７％であった。
【００５４】
３．分子量の検討
３００ｍＬのナスフラスコにヒアルロン酸（キッコーマンバイオケミファ（株）製、製品名：ＦＣＨ-２００、分子量：１，８００，０００〜２，２００，０００）１．５ｇ（１等量）を添加し、ｍｉｌｌｉＱ水１５０ｍＬを加え溶解した。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬（株）製、商品名：１９７−２４０２）０．４ｇを添加し、アルミホイルで遮光しながら撹拌し、２、４、８、２４、４８時間後にサンプルを採取した。採取後のサンプルに、エチレングリコール（和光純薬（株）製、商品名：０５８−００９８６）２００μＬおよび塩化ナトリウム（和光純薬（株）製、商品名：１９１−０１６６５）を添加し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ＝６０００〜８０００）を用いて、飽和塩化ナトリウム水溶液２Ｌで透析した。次いで、純粋で２日間透析し、その後３日間凍結乾燥を行った。得られた各サンプル１．０ｍｇをリン酸緩衝液に溶解した後、０．４４μｍのフィルターでろ過し、１００μＬの溶液をＧＰＣにインジェクションし、デキストランの検量線から分子量を算出した。用いた装置および測定条件は以下の通りである。各サンプルの分子量を表１に示す。
［装置］
島津高速液体クロマトグラフ用送液ユニット  ＬＣ−１０ＡＤＶＰ  （株）島津製作所製
８３０−ＲＩ型インテリジェント示差屈折計  日本分光（株）社製
［測定条件］
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＧＭＰＷＸＬ  東ソー（株）社製
溶離液：０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ＝６．８）
サンプル濃度：１ｍｇ／ｍＬ
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検量線：デキストラン
【００５５】
【表１】
2015221765.tif 000009
【００５６】
［合成例２］ヒドラジド修飾ヒアルロン酸（架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸２）
１．ヒドラジド修飾ヒアルロン酸の合成
３００ｍＬナスフラスコにヒアルロン酸（キッコーマンバイオケミファ（株）製、製品名：ＦＣＨ-２００、分子量：１，８００，０００〜２，２００，０００）０．５ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、ｍｉｌｌｉＱ水１００ｍＬを加え、１晩撹拌した。さらに、アジポジヒドラジド（和光純薬（株）製、商品名：０１１−０６７９５）２．１８ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。次いで、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム水溶液（０．１Ｎ）を滴下し、反応溶液のｐＨを６．８に調整した。別途、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）５０６．７ｍｇ（３．７５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ：ｍｉｌｌｉＱ＝１：１の１０ｍＬ溶液に溶かした溶液を調製し、反応溶液に滴下した。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（東京化成工業（株）製、商品名：Ｈ０４６８）７１８．９ｍｇ（３．７５ｍｍｏｌ）をｍｉｌｌｉＱ水３ｍＬに溶解した溶液を反応溶液に滴下した後、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム水溶液（０．１Ｎ）で反応溶液のｐＨを５に調整し、１晩撹拌した。１晩撹拌後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ＝６０００〜８０００）を用いて、飽和塩化ナトリウム水溶液３Ｌで透析し、その後３日間凍結乾燥し、ヒドラジド修飾ヒアルロン酸を得た（収量：０．４９８２ｇ、収率：５０％）。合成例２の反応式は以下の通りである。
【００５７】
【化８】
2015221765.tif 000010
【００５８】
２．ヒドラジド化率の測定
得られたヒドラジド修飾ヒアルロン酸の修飾率を１Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した。得られたヒドラジド修飾ヒアルロン酸の修飾率は６２％であった。
【００５９】
［合成例３］イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸（キレート形成基を有するヒアルロン酸）
１．イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸の合成
２００ｍＬナスフラスコにヒアルロン酸（キッコーマンバイオケミファ（株）製、製品名：ＦＣＨ-２００、分子量：１，８００，０００〜２，２００，０００）０．２０ｇ（１等量）を添加し、ｍｉｌｌｉＱ水４０ｍＬを加えて２時間撹拌し、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）を用いて反応溶液のｐＨを７．０に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＤ）０．２８ｇ（３等量）をｍｉｌｌｉＱ水１．２ｍＬに溶解し、パスツールピペットを用いて反応溶液に添加した。別途、イミノ二酢酸０．３４ｇ（５等量）を水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）４ｍＬに溶解し、反応溶液に滴下し、イミノ二酢酸溶液を０．５ｍＬ滴下するごとにｐＨメーターを用いて反応溶液のｐＨを確認し、反応溶液のｐＨを５．０程度に調整した。滴下後、３０分ごとに反応溶液のｐＨを５．０程度に調整しながら、１晩撹拌した。１晩撹拌後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ＝６０００〜８０００）を用いて、純水３Ｌで２日間透析し、その後３日間凍結乾燥し、イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸を得た（収率：９５％）。合成例３の反応式は以下の通りである。
【００６０】
【化９】
2015221765.tif 000011
【００６１】
２．イミド二酢酸による修飾率の測定
得られたイミド二酢酸修飾ヒアルロン酸の修飾率を１Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した。イミノ二酢酸に含まれる４つのプロトンのピーク（２．８５ｐｐｍ）とヒアルロン酸のアセチル基のピーク（１．９７ｐｐｍ）との積分比から修飾率を算出した。得られたイミド二酢酸修飾ヒアルロン酸の修飾率は３６％であった。
【００６２】
［合成例４］アミノマロン酸修飾ヒアルロン酸（キレート形成基を有するヒアルロン酸２）
１．アミノマロン酸修飾ヒアルロン酸の合成
２００ｍＬナスフラスコにヒアルロン酸（キッコーマンバイオケミファ（株）製、製品名：ＦＣＨ-２００、分子量：１，８００，０００〜２，２００，０００）０．２０ｇ（１等量）を添加し、ｍｉｌｌｉＱ水４０ｍＬを加えて２時間撹拌し、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）を用いて反応溶液のｐＨを７．０に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＤ）０．２８ｇ（３等量）をｍｉｌｌｉＱ水１．２ｍＬに溶解し、パスツールピペットを用いて反応溶液に添加した。フラスコを遮光し、別途アミノマロン酸ジエチル（和光純薬（株）製、商品名：３５６−１２２２２）０．４５ｇ（５等量）をｍｉｌｌｉＱ水４ｍＬに溶解して、反応溶液に滴下し、アミノマロン酸ジエチル溶液を０．５ｍＬ滴下するごとにｐＨメーターを用いて反応溶液のｐＨを確認し、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）または塩酸（１Ｎ）を用いて、反応溶液のｐＨを５．０程度に調整した。滴下後、３０分ごとに反応溶液のｐＨを５．０程度に調整しながら、１晩撹拌した。次いで、反応溶液にアミノマロン酸の末端−ＣＯＯＣ２Ｈ５と等モルの水酸化ナトリウム（和光純薬（株）製、商品名：１９８−１３７６５）を添加して１晩撹拌し、けん化した。１晩撹拌後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ＝６０００〜８０００）を用いて、飽和塩化ナトリウム水溶液３Ｌで１日間、純水で２日間透析し、その後３日間凍結乾燥し、アミノマロン酸修飾ヒアルロン酸を得た（収率：９０％）。合成例４の反応式は以下の通りである。
【００６３】
【化１０】
2015221765.tif 000012
【００６４】
２．アミノマロン酸による修飾率の測定
得られたアミノマロン酸修飾ヒアルロン酸の修飾率を１Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した。アミノマロン酸に含まれるアミノ基のピーク（２．８５ｐｐｍ）とヒアルロン酸のアセチル基のピーク（１．９７ｐｐｍ）との積分比から修飾率を算出した。得られたアミノマロン酸修飾ヒアルロン酸の修飾率は３０％であった。
【００６５】
［合成例５］イミド二酢酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸（キレート形成基および架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸１）
１．イミド二酢酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸の合成
合成例３で得られたイミド二酢酸修飾ヒアルロン酸を用いた以外は合成例１と同様にして、イミド二酢酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸を得た。合成例５の反応式は以下の通りである。
【００６６】
【化１１】
2015221765.tif 000013
【００６７】
２．イミド二酢酸修飾率の測定
合成例３と同様に、１Ｈ−ＮＭＲを用いてイミド二酢酸修飾率を測定した。得られたイミド二酢酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸の修飾率は１１％であった。
【００６８】
［合成例６］アミノマロン酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸（キレート形成基および架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸２）
１．アミノマロン酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸の合成
合成例４で得られたアミノマロン酢酸修飾ヒアルロン酸を用いた以外は合成例１と同様にして、アミノマロン酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸を得た。合成例６の反応式は以下の通りである、
【００６９】
【化１２】
2015221765.tif 000014
【００７０】
２．アミノマロン酸修飾率の測定
合成例４と同様にして、１Ｈ−ＮＭＲを用いてアミノマロン酸修飾率を測定した。得られたアミノマロン酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸の修飾率は１４％であった。
【００７１】
＜ＭＴＴアッセイ＞
合成例１〜６で合成したヒアルロン酸を用いて、以下の方法により生体適合性評価を行った。評価にはヒト正常中皮細胞株ＭｅＴ-５Ａ細胞、および、マウス高度腹膜転移株ＭＫＮ４５Ｐを用いた。各細胞の培地の組成を表２に示す。
クリーンベンチ内で、各細胞を培養したシャーレ内の古い培地をアスピレーターで吸引して除去した後、ＰＢＳを約１０ｍＬ添加し、浮遊している細胞を洗浄し、ＰＢＳをアスピレーターで吸引した。次いで、シャーレにトリプシン入りＥＤＴＡを５ｍＬ添加し、約５分インキュベートし、細胞を剥離した。剥離した細胞を培地に懸濁させ、ファルコンチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。この際、懸濁液の一部を取り分け、細胞数をカウントした。遠心分離後、上澄み溶液をアスピレーターで吸引し、カウントした細胞数をもとに、細胞濃度が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう新しい培地を添加した。この溶液を、８連結マルチピペッターを用いて、９６穴マイクロプレートに５０μＬずつ加えた（このとき、各ｗｅｌｌに５０００個の細胞が存在する計算となる）。このマイクロプレートを２４時間インキュベートした。合成例１〜６で得られたヒアルロン酸、および、イミノ二酢酸、アミノマロン酸の濃度がそれぞれ０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬとなるように調整した培地溶液を調製し、この培地溶液１００μＬずつ添加し、２４時間インキュベートした。Ｄｙｅ  Ｓｏｌｕｉｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、商品名：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を各ｗｅｌｌに１５μＬずつ添加し、４時間インキュベートした。クリーンベンチから取出し、Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、商品名：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加し、振盪器で１晩振盪した。マイクロプレートリーダーを用いて各ｗｅｌｌの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールｗｅｌｌとサンプル添加ｗｅｌｌの吸光度の比から、各ｗｅｌｌの細胞生存率を算出した。Ｍｅｔ−５Ａの細胞生存率を示すグラフを図２に、ＭＮＫ４５Ｐの細胞生存率を示すグラフを図３にそれぞれ示す。
【００７２】
【表２】
2015221765.tif 000015
【００７３】
アルデヒド修飾ヒアルロン酸およびヒドラジド修飾ヒアルロン酸はいずれの濃度でも高い生体適合性を有していた。イミノ二酢酸およびアミノマロン酸は、ヒアルロン酸を修飾する形態とすることにより、生体適合性が向上した。濃度が高くなるのにしたがって細胞生存率が低下した。通常、医薬組成物の調製に用いられる濃度では細胞生存率は６０％以上であり、生体への影響は小さいと考えられた。
【００７４】
ＩＩ．ナノゲルの合成および評価
［合成例７］ＣＤＤＰ内包ナノゲル１の調製
ナスフラスコに合成例３で得られたイミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸１００ｍｇを添加し、ｍｉｌｌｉＱ水２０ｍＬを加え、撹拌した（Ａ液）。マイクロチューブにシスプラチン（ＣＤＤＰ、日本化薬（株）製）１５ｍｇおよびｍｉｌｌｉＱ水１ｍＬを添加し、ヒートブロックで９５℃に加熱しＣＤＤＰ溶液を得た（Ｂ液）。Ａ液を８００ｍＬ、Ｂ液を２００ｍＬそれぞれ採取し、ヒートブロック上で混合し、９５℃で１時間加熱した。次いで、氷浴で冷却し、透析膜（ＭＷＣＯ＝６，０００−８，０００）を用いて、１Ｌビーカー内で１時間透析を行った。透析後、溶液を凍結乾燥し、ＣＤＤＰ内包ゲル１を得た。
【００７５】
［合成例８］ＣＤＤＰ内包ナノゲル２の調製
イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸に代えて、合成例４で得られたアミノマロン酸修飾ヒアルロン酸を用いた以外は合成例７と同様にしてＣＤＤＰ内包ゲル２を得た。
【００７６】
［合成例９］ＣＤＤＰ内包ナノゲル３の調製
イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸に代えて、合成例５で得られたイミド二酢酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸を用いた以外は合成例７と同様にしてＣＤＤＰ内包ゲル３を得た。
【００７７】
［合成例１０］ＣＤＤＰ内包ナノゲル４の調製
イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸に代えて、合成例６で得られたアミノマロン酸修飾アルデヒド化ヒアルロン酸を用いた以外は合成例７と同様にしてＣＤＤＰ内包ゲル４を得た。
【００７８】
＜ＣＤＤＰ担持率評価＞
白金標準溶液１０００ｐｐｍをＰＢＳで希釈し、０、１０、５０、１００ｐｐｂの標準溶液を作製した。原子吸光光度計（Ｚ−２０００、日立偏光ゼーマン原子吸光光度計システム）で各標準溶液の白金濃度を測定し検量線を作成した。同様に、合成例７および８で調製したナノゲルを原子吸光光度計で測定し、検量線から白金濃度を算出した。結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2015221765.tif 000016
【００８０】
＜キレート安定定数評価＞
ＣＤＤＰを用いて、ナノゲルを形成するヒアルロン酸とＣＤＤＰとのキレート安定度数を算出した。実験はキレート滴定により、以下のように行った。水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。別途、窒素バブリングしたｍｉｌｌｉＱ水１０ｍＬにＣＤＤＰを溶解し、合成例７〜１０のナノゲルをポリマー濃度が０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるよう調整し、サンプル溶液を得た。同様に、ナノゲルに代えて、イミノ二酢酸、アミノマロン酸をそれぞれ濃度が０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるよう調整し、比較サンプル溶液を得た。得られた水酸化ナトリウム水溶液を自動滴定装置のビュレットに入れ、窒素雰囲気下でサンプル溶液に滴下した。各サンプルのキレート滴定曲線を図４に示す。得られたキレート滴定曲線から以下の方法によりキレート生成定数を算出した。各サンプルの値を表４に示す。
【００８１】
キレート生成定数の算出
ｐＨ滴定から各ｐＨにおけるＫａを決定した。
次に、以下のマスバランス、電化バランス、および、経験式を連立し、経験式のｎを算出した。
マスバランス
【数１】
2015221765.tif 000017
電化バランス
【数２】
2015221765.tif 000018
経験式
【数３】
2015221765.tif 000019
また、以下の３つの式から各ｐＨにおける［ＨＡ］および
【数４】
2015221765.tif 000020
の値を算出し、プロットした。
【数５】
2015221765.tif 000021
【数６】
2015221765.tif 000022
【数７】
2015221765.tif 000023
次いで、
【数８】
2015221765.tif 000024
に対応するｐ（［ＨＡ］／［Ｈ＋］）の値からｂ１およびＢ２の値を求めた。Ｂ２がキレート生成定数を表す。
【数９】
2015221765.tif 000025
【数１０】
2015221765.tif 000026
なお、それぞれの式は以下の平衡式の値である。
錯体生成平衡
【数１１】
2015221765.tif 000027
【数１２】
2015221765.tif 000028
【数１３】
2015221765.tif 000029
酸解離平衡
【数１４】
2015221765.tif 000030
全体
【数１５】
2015221765.tif 000031
錯体生成定数
【数１６】
2015221765.tif 000032
【００８２】
【表４】
2015221765.tif 000033
【００８３】
イミノ二酢酸とアミノマロン酸の配位定数（１段目：ｂ１、２段目：ｂ２）の比較から、アミノマロン酸のＰｔとのキレート形成能はイミノ二酢酸よりも高いことが分かった。一方、アミノマロン酸をキレート形成基とした合成例４のヒアルロン酸では、キレート生成定数の値が低下し、ヒアルロン酸によるキレート形成阻害の影響が示唆された。これとは逆に、イミノ二酢酸をキレート形成基とした合成例３のヒアルロン酸では、キレート生成定数の値が上昇し、ヒアルロン酸によりキレート生成能が向上した。
【００８４】
ＩＩＩ．医薬組成物
［実施例１］
合成例２で調製したヒドラジド修飾ヒアルロン酸２０ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解し、1晩振とうした。合成例１で調製したアルデヒド修飾ヒアルロン酸２０ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解し、０．０２重量％となるよう合成例７で調製したナノゲル１を溶解した。各ヒアルロン酸溶液を２ｍＬシリンジに充填した。直径１２ｍｍの孔をあけたシリコンモールドをガラス板にのせダブルシリンジ（図１）で溶液を注入しカバーガラスをかけた（ｎ＝４）。８時間静置し、医薬組成物１を調製した。
【００８５】
［実施例２］
合成例７で調製したナノゲルに代えて、合成例８で調製したナノゲルを用いた以外は実施例１と同様にして医薬組成物２を調製した。
【００８６】
［実施例３］
合成例７で調製したナノゲルに代えて、合成例９で調製したナノゲルを用いた以外は実施例１と同様にして医薬組成物３を調製した。
【００８７】
［実施例４］
合成例７で調製したナノゲルに代えて、合成例１０で調製したナノゲルを用いた以外は実施例１と同様にして医薬組成物４を調製した。
【００８８】
（比較例１）
修飾されていないヒアルロン酸を用いた以外は合成例７と同様にして、ＣＤＤＰ内包ナノゲルを調製した。得られたナノゲルを用いた以外は実施例１と同様にして医薬組成物Ｃ１を調製した。
【００８９】
（比較例２）
イミノ二酢酸で修飾したカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いて、ＣＤＤＰ内包ナノゲルを調製した。得られたナノゲルを用いた以外は実施例１と同様にして医薬組成物Ｃ２を調製した。
【００９０】
＜徐放性試験＞
ケースの重さを計量し、医薬組成物１〜４を入れ、メディアとしてＰＢＳを５ｍＬ加えた。次いで、ケースを３７℃のインキュベーター内で振とうし、各測定時間に５０μＬずつメディアをサンプリングし、同時にゲルの重量を測定した。７日後にメディアをすべて回収しヒアルロン酸分解酵素入りのＰＢＳ（１０ｕｎｉｔ/ｍＬ）を２ｍＬ添加し、ゲル内に残留した薬物を内包するナノゲル量を算出した。採取したサンプルを用いて、メディアに含まれる担体ポリマーの量を蛍光スペクトルを用いて測定した。またＣＤＤＰの量を原子吸光光度計(Ｚ−２０００、日立偏光ゼーマン原子吸光光度計システム)で測定した。医薬組成物１および２について得られた徐放曲線を図５に、医薬組成物３および４について得られた徐放曲線を図６にそれぞれ示す。
【００９１】
＜架橋ゲル濃度依存性試験＞
ヒドラジド修飾ヒアルロン酸およびアルデヒド修飾ヒアルロン酸の濃度が１重量％、２重量％、３重量％となるようＰＢＳ溶液にそれぞれ溶解した以外は実施例１と同様にして医薬組成物を調製し、上記の方法で徐放性試験を行った。徐放曲線を図７に示す。濃度が１重量％の場合、放出速度が最も早く、ゲルの膨潤度からナノゲルが即座に放出されていると考えられた。通常、濃度が高くなるにつれて、架橋密度が高くなり、放出速度が遅くなる。３重量％の場合、架橋可能な置換基を有するヒアルロン酸が均一に混合されず、架橋されていない部分からの放出が起こったと解される。
【００９２】
＜ＭＴＴアッセイ＞
医薬組成物１、２、Ｃ１およびＣ２を用いて、上記の方法でＭＫＮ４５細胞を用いたＭＴＴアッセイを行った。各医薬組成物での細胞生存率の結果を図８に示す。医薬組成物１、２およびＣ１は中皮腫細胞であるＭＫＮ４５細胞に選択的に取り込まれるため、ヒアルロン酸を含まないＣ２に比べて細胞毒性が高かった。
【００９３】
＜マウス投与試験＞
播種を形成したＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（メス、５週齢）を用いて投与試験を行った。投与条件を表５に示す。実験はコントロール群はＮ＝９、サンプル群はＮ＝７で行った。ＰＢＳおよびＣＤＤＰ／ＰＢＳは２７Ｇの針を用いて１０ｍＬのシリンジで投与した。ＣＤＤＰ内包架橋ゲルおよびキレート形成基を有するヒアルロン酸を用いた架橋ゲルはダブルシリンジ（図１）を用いて投与した。１重量％のポリマー溶液は２１Ｇの針を、２重量％のポリマー溶液は１８Ｇの針を用いた。投与の３週間後、マウスの体重を測定した後、開腹し、播種総重量および播種数を測定した。さらに、血液を採取して、クレアチニンおよび尿素窒素（ＢＵＮ）の量を測定した。マウスの体重変化を表すグラフを図９に、播種重量を示すグラフを図１０に、播種数を示すグラフを図１１に示す。また、播種のサイズと播種数とを表５に示す。また、血中のＢＵＮ量を図１２に、クレアチニン量を図１３にそれぞれ示す。
【表５】
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【００９４】
［評価］
マウスの体重を測定した結果、ＣＤＤＰ単独投与群では体重が顕著に減少した。また、架橋ゲル濃度を２重量％とした投与群では腹膜内にゲルが残留していることが確認された。腹膜内に残留したゲルは黄色であり、腎機能の低下による水やＮａの貯留による黄色の腹水を引き寄せたものと解され、２重量％の架橋ゲルではゲルに貯留した水分の保持が起こったと解された。一方、１重量％の架橋ゲルを用いた投与群ではゲルは腹膜内に残留していなかった。
【００９５】
腹膜播種重量は各サンプル群の間に有意差はなかった（図１０）。一方、播種数はキレート形成基を有するヒアルロン酸を用いたナノゲルに内包された薬物を用いたサンプル（架橋ゲル濃度：１重量％）群とコントロール群およびＰＢＳ＋ＣＤＤＰ投与群との間に有意差があった（図１１）。これらを播種のサイズごとに分類した結果を表６に示す。薬物を内包するナノゲルを架橋ゲルに分散することにより、特に１０ｍｍ以下の播種数を効果的に減少させることができた。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
架橋ゲルを投与すると腹腔内の腹水等の体液がゲルに引き寄せられ、脱水症状がでるおそれがある。血中のＢＵＮ量は過剰なタンパク質摂取や、脱水により上昇する。医薬組成物１−１（架橋ゲル１重量％）の投与群の血中ＢＵＮ量はコントロール群と有意差がなかった（図１２、図１３）。そのため。架橋ゲルによる脱水症状が抑えられていたと考えられた。また、腎機能が低下すると血中クレアチニン量が上昇する。しかしながら、どの投与群においてもクレアチニン量に有意差はなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の医薬組成物は、製薬、医療等の分野で好適に用いられ得る。特に、抗ガン剤を用いた治療に好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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