(57)【要約】      （修正有）【課題】ごく微量の試料を含む標準物質の安定供給を可能にすることのできる試料作製装置の提供。【解決手段】絶縁体でコートされ、貫通孔が設けられた導電性基板と、導電性基板を挟むように配置された電極対と、電極対に接続され、試料が貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定する電流検出装置を備える試料作製装置。イオン電流値の変化を測定することにより、貫通孔を通過した試料の分子数が測定される。これにより、分子数測定済みの試料が作製される。【選択図】図１
2015198652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子数測定済みの試料を作製するための試料作製装置であって、
前記試料作製装置は、
絶縁体でコートされ、貫通孔が設けられた導電性基板と、
前記導電性基板を挟むように配置された電極対と、
前記電極対に接続され、試料が前記貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定する電流検出装置と、
を備え、
前記イオン電流値の変化を測定することにより、前記貫通孔を通過した試料の分子数が測定されることを特徴とする試料作製装置。
【請求項２】
前記貫通孔を通過した試料を分取する分取装置を備える、請求項１に記載の試料作製装置。
【請求項３】
前記貫通孔の直径は、３ｎｍ〜１００ｎｍに設定される、請求項１または請求項２に記載の試料作製装置。
【請求項４】
前記試料は、核酸分子であり、前記核酸分子には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の試料作製装置。
【請求項５】
試料作製装置を用いて分子数測定済みの試料を作製する試料作製方法であって、
前記試料作製装置は、
絶縁体でコートされ、貫通孔が設けられた導電性基板と、
前記導電性基板を挟むように配置された電極対と、
前記電極対に接続され、試料が前記貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定する電流検出装置と、
を備え、
前記方法は、
試料が前記貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定し、
前記イオン電流値の変化を測定することにより、前記貫通孔を通過した試料の分子数を測定することを特徴とする方法。
【請求項６】
前記貫通孔を通過した試料を分取する、請求項５に記載の試料作製方法。
【請求項７】
前記貫通孔の直径は、３ｎｍ〜１００ｎｍに設定される、請求項５または請求項６に記載の試料作製方法。
【請求項８】
前記試料は、核酸分子であり、前記核酸分子には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる、請求項５ないし請求項７のいずれかに記載の試料作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子数測定済みの試料を作製するための試料作製装置および試料作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＭＯ検出を含む食品検査をはじめ、医療における診断においても遺伝子検査が広く利用されるようになってきている。食品検査でＧＭＯの検出を実施し、さらにはウィルスなどの検出を行うためには、特定の塩基配列を持つＤＮＡを選択的に検出することが遺伝子検査の基本的な技術であり、ＰＣＲ法のようなＤＮＡの増幅反応を応用した検出系が一般的に用いられている。
【０００３】
ＤＮＡの検出系が、遺伝子検査に用いることが妥当であるかどうかを判断するために必要な、最も基本的な情報が、その検出系を用いでどこまで少量のＤＮＡを検出できるのか、すなわち検出限界である。ＰＣＲでは、一般的には、わずか１分子のＤＮＡから検出可能であると考えられているが、これまで、既存のＰＣＲ装置において何分子のＤＮＡが検出可能であるのか、その性能が検証されることは一般的ではなかった。なぜならば、そのような性能評価のためには、分子数をあらかじめ計測し、含まれる分子の個数がわかっている標準サンプルが必要だからである。
【０００４】
現在、ＰＣＲ分析において性能評価等に用いられている標準ＤＮＡは、吸光度法等の様々な核酸定量手法に基づき、直接ＤＮＡの濃度を定量するか、あるいは試験室間共同定量試験によって認証値が規定されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kuribara , H., Shindo, Y., Matsuoka, T., Takubo, K., Futo, S., Aoki, N., Hirao, T., Akiyama, H., Goda, Y., Toyoda, M., Hino, A. Novel reference molecules for quantification of genetically modified maize and soybean. J. AOAC Int., 85, 1077-1089 (2002).
【非特許文献２】National Institute of Standards and Technology (NIST). Standard Reference Materials (SRM) Home. http://www.nist.gov/srm/
【非特許文献３】Kline, M.C., Duewer, D.L., Travis, J.C., Smith, M.V., Redman, J.W., Vallone, P.M., Decker, A.E., Butler, J.M. Production and certification of NIST Standard Reference Material 2372 Human DNA Quantitation Standard. Anal. Bioanal. Chem. 394, 1183-1192 (2009).
【非特許文献４】Baume, M., Garrelly, L., Facon, J.P., Bouton, S., Fraisse, P.O., Yardin, C., Reyrolle, M., Jarraud, S. The characterization and certification of a quantitative reference material for Legionella detection and quantification by qPCR. J. Appl. Microbiol. 114, 1725-1733 (2013).
【非特許文献５】European Commission. Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and measurements (IRMM). ERM application notes. http://irmm.jrc.ec.europa.eu/reference_materials_catalogue/user_support/Pages/index.aspx
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の手法では、標準物質としてＤＮＡの分子数に値付けを行うためには、少なくとも定量が可能な一定濃度以上のＤＮＡ溶液である必要があり、数分子という極低濃度のＤＮＡ溶液を標準物質として値付けし、安定的に供給することはできなかった。また、限界希釈法により、１分子の標準物質を作製できることは知られているが、限界希釈法では、ほとんどのサンプルにはＤＮＡが含まれず、わずかに確率的に１分子のＤＮＡが含まれる溶液ができるような条件で希釈し後から１分子のＤＮＡを含む溶液を選択するため、ほとんどの製品にＤＮＡが含まれないことが自明であり、量産には向かなかった。さらに、１分子以外の分子数を得ようとすれば、１分子のサンプルを複数混合する必要があり、多大な工数を必要とするという問題があった。
【０００７】
このような背景から、その後の試料の量産のための自動化等の施策に適した原理に基づく分子数の計測方法を利用した、分子数測定済み試料作製装置及び分子数測定済み試料の作製方法の開発が切望されていた。
【０００８】
試料の量産のための自動化等の施策に適した原理に基づく分子数の計測方法を利用した、分子数測定済み試料作製装置及び分子数測定済み試料の作製方法の開発においては、従来用いられていたような吸光度法等の様々な核酸定量手法に基づくＤＮＡの濃度定量方法、試験室間共同定量試験による認証値の規定は、分子数が少なすぎるため利用することはできない。また、限界希釈法は、手法の原理の問題による歩留まりの向上は望めず、量産には適していないという問題点があり、これら少ない分子数の計測方法および、数分子レベルの極低濃度の核酸溶液を作ることができ、なおかつ量産化に適した核酸試料の作製原理の開発が課題となっていた。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、従来の定量方法や限界希釈法では達成できなかった分子数測定済み試料の量産化に適した、分子数測定済み試料作製装置、および、その装置を用いた分子数測定済み試料の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の試料作製装置は、分子数測定済みの試料を作製するための試料作製装置であって、試料作製装置は、絶縁体でコートされ、貫通孔が設けられた導電性基板と、導電性基板を挟むように配置された電極対と、電極対に接続され、試料が貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定する電流検出装置と、を備え、イオン電流値の変化を測定することにより、貫通孔を通過した試料の分子数が測定される。
【００１１】
また、本発明の試料作製装置は、貫通孔を通過した試料を分取する分取装置を備えてもよい。
【００１２】
また、本発明の試料作製装置では、貫通孔の直径は、３ｎｍ〜１００ｎｍに設定されてもよい。
【００１３】
また、本発明の試料作製装置では、試料は、核酸分子であり、核酸分子には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれてもよい。
【００１４】
本発明の試料作製方法は、試料作製装置を用いて分子数測定済みの試料を作製する試料作製方法であって、試料作製装置は、絶縁体でコートされ、貫通孔が設けられた導電性基板と、導電性基板を挟むように配置された電極対と、電極対に接続され、試料が貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定する電流検出装置と、を備え、方法は、試料が貫通孔を通過するときのイオン電流値の変化を測定し、イオン電流値の変化を測定することにより、貫通孔を通過した試料の分子数を測定する。
【００１５】
また、本発明の試料作製方法では、貫通孔を通過した試料を分取してもよい。
【００１６】
また、本発明の試料作製方法では、貫通孔の直径は、３ｎｍ〜１００ｎｍに設定されてもよい。
【００１７】
また、本発明の試料作製方法では、試料は、核酸分子であり、核酸分子には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、イオン電流値の変化を測定することにより、貫通孔を通過した試料の分子数を直接的に測定する。従来のように間接的にＤＮＡの濃度を定量するのではなく、直接的に分子数を測定する手法を用いているため、これまでは不可能であった、ごく微量の試料（例えばＤＮＡ）を含む標準物質の安定供給が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施の形態における試料作製装置の構成を示す説明図
【図２】ＧＭ標準ＤＮＡの配列を示す図
【図３】本発明の実施例におけるイオン電流値の測定結果を示す図
【図４】本発明の実施例におけるリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す図
【図５】本発明の実施の形態におけるリアルタイムＰＣＲによる概算定量を示す図
【図６】本発明の実施例におけるＰＣＲ結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態の試料作製装置について、図面を用いて説明する。本実施の形態では、試料（ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸）の検出による食品検査や遺伝子検査（医療分野の診断等に利用される遺伝子検査）等に用いられる試料作製装置の場合を例示する。
【００２１】
本発明の実施の形態の試料作製装置の構成を、図面を参照して説明する。図１は、本実施の形態の試料作製装置の構成を示す説明図である。図１に示すように、試料作製装置１は、導電性基板２と電極対３と電流検出装置４と分取装置５を備えている。導電性基板２は、例えばシリコン基板であり、表面（上下両面）を絶縁体６（例えば窒化シリコン）でコートされている。また、導電性基板２の中央部には、貫通孔７が設けられている。貫通孔７の直径は、３ｎｍ〜１００ｎｍに設定されている。この貫通孔７は、ナノポアとも呼ばれる。電極対３は、導電性基板２を挟むように上下に配置されている。電極対３には、電源装置８が接続されており、電極対３に電圧を印加すると、供給した試料９が電気泳動により貫通孔７を通過する。なお、供給した試料９は、圧力により貫通孔７を通過するようにしてもよく、電気泳動と圧力を併用してもよい。貫通孔を通過した試料は、分取装置５に分取される。電極対３には、電流検出装置４が接続されている。電流検出装置４は、試料が貫通孔７を通過するときのイオン電流値の変化を測定する。試料作製装置１は、イオン電流値の測定結果を表示する表示装置１０（ディスプレイ）を備えてもよい。また、試料作製装置１は、イオン電流値の測定結果に応じて電極対３に印加する電圧をコントロールする制御装置１１を備えてもよい。電極対３に印加する電圧のコントロールは、作業者が手動で行ってもよい。
【００２２】
上述のように、本実施の形態では、分子数の測定に、ゲーティングナノポアデバイスを用いる。ゲーティングナノポアデバイスは、窒化シリコン基板に直径数〜数十ｎｍの貫通孔７（ナノポア）を形成し、一分子摘出および一分子識別を可能とする技術である。次々世代型高速シークエンサーをはじめ様々な分野への応用が期待されている。ナノポアデバイスは、上下にイオン電流計測用及び電気泳動用の電極対３が設置され、試料分子９が電気泳動によってナノポアを通過する際にイオン電流値が変化することを利用して検出する。イオン電流変化の回数がナノポアを通過した分子数に相当する。
【００２３】
本実施の形態では、このナノポアデバイスを用いて、１分子からごく少数のＤＮＡを含む核酸溶液試料を作製した。原理的には、電極間に電圧を印可し、電気泳動によってＤＮＡをナノポアへ引き寄せ、電流値をリアルタイムで計測し、特定の個数の電流変化が生じた時点で電圧を切ることによって、規定分子数の核酸が回収可能である。本実施の形態では、このような原理に基づき、ゲーティングナノポアデバイスを作製し、電気泳動を用いて核酸を回収し、その過程でイオン電流を計測することによって分子数を測定し、所望の個数の核酸分子が測定されたのを確認して、核酸試料を回収することにより、分子数測定済み試料作製装置を構成し、構成された装置を用いて分子数測定済み試料の作製を実現する。
【００２４】
本実施の形態で使用するゲーティングナノポアデバイスは、例えば、下記のように作製することができる。Ｓｉ3Ｎ4膜で表面が被覆されたＳｉウェハーを、フォトリソグラフィー、電子線リソグラフィー、ポアを作製する。このようなナノポア構造にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作製した流路を組み合わせることで、ゲーティングナノポアデバイスを作製することが可能である。
【００２５】
本実施の形態のゲーティングナノポアデバイスによるＤＮＡ の回収には、電気泳動を用いることができる。この電気泳動においては、例えば直径２０ｎｍのナノポア、Ａｕ電極であれば、５００ｍＶ前後の電圧を印加させることによりＤＮＡの電気泳動を実施することができる。また、このとき、公知のナノパーティクル計測器のように、圧力を単独または電気泳動と併用してもよい。
【００２６】
本実施の形態におけるイオン電流計測では、核酸を含む緩衝溶液を陰極側に注入し、陽極側には、核酸を含まないＴＥ緩衝液を注入し、１００ＭＨｚの条件で、定電圧化におけるイオン電流の変化を計測し、分子が通過したことによるイオン電流の変化を検出する。分子数が所望の数に達したところで電気泳動、もしくは圧力の付加を停止するが、この停止は手動でも可能であり、また、ソフトウェア等を用いて自動的に電圧を遮断することによって実現してもよい。このような方法により、ナノポアをＤＮＡが通過したことを示すイオン電流の低下が観察された段階で電気泳動のための電圧を切りあるいは圧力の付加を停止し、ナノポアデバイスの陽極側に充填されているＴＥ緩衝液をすべて回収することで、所望の分子数の核酸を含む緩衝液を回収することが可能である。
【００２７】
＜実施例＞
以下実施例により、詳しく本発明を説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本実施例では、分子数の測定に、厚さ５０ｎｍのＳｉ3Ｎ4膜で表面が被覆された、厚さ０．５ｍｍのＳｉウェハーを、フォトリソグラフィー、電子線リソグラフィー、プラズマクリーニング、さらに、ＳＥＭを用いたポア縮小、といった微細加工を行うことで構成した、直径約２０ｎｍのナノポアを用いた。このようなナノポア構造にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作製した流路を組み合わせたものをナノポアデバイスとしてＤＮＡ回収の実施に用いた。
【００２９】
本実施例に用いたＤＮＡは、我が国の遺伝子組換え（ＧＭ）検知に用いられている組換え配列および各種農作物特異的な内在性配列を中心にした配列（図２参照）を、プラスミドへ挿入して構築した。ＤＮＡ試料は下記のようにして調製した。大腸菌内で複製した後にプラスミドを抽出・精製した。対象となる配列を制限酵素、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、電気泳動によって分離・精製した。本標準ＤＮＡ（以下、ＧＭ標準ＤＮＡ）は７２９ｂｐからなり、ＤＮＡの５’側および３’側に、それぞれＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ処理による４塩基の５’末端突出構造を有する。ＧＭ標準ＤＮＡは、ダイズの内在性遺伝子Ｌｅｃｔｉｎ１を標的としたＬｅ１（１１８ｂｐ）、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを標的としたｐ３５Ｓ（１０１ｂｐ）、トウモロコシの内在性遺伝子Ｓｔａｒｃｈ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩｂを標的としたＳＳＩＩｂ（１１４ｂｐ）、Ｎｏｐａｌｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子のターミネーターを標的としたｔＮＯＳ（１５１ｂｐ）、イネ内在性遺伝子Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅを標的としたＳＰＳ（９２ｂｐ）、さらに、９＋８＋１３６＝１５３ｂｐの人工配列から構成されている。アガロースゲルからの回収はＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）により行い、回収されたＤＮＡ断片をフェノール処理・エタノール沈殿によって精製したものを実験に用いた。
【００３０】
本実施例のゲーティングナノポアデバイスによるＤＮＡ の回収は、電気泳動を用いて行った。実際には、直径約２０ｎｍのナノポアを用い、Ａｕ電極を用いて、５００ｍＶの電圧を２００秒間印加させＤＮＡの電気泳動を行った。
【００３１】
本実施例では、次にＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝溶液中に対象ＤＮＡが１０10分子／μＬが含まれる溶液を陰極側に注入し、陽極側には、ＤＮＡを含まない（ＣｏｌＥ１／ＴＥ溶液を含む）ＴＥ緩衝液を注入し、１００ＭＨｚの条件で、定電圧化におけるイオン電流の変化を計測した。測定には、通常のパッチクランプアンプを使用し、電流は一般的なオシロスコープを用いてモニタした。本実施例では、手動で電気泳動用の電圧を遮断したが、電圧の遮断には、電流変化を検出して電圧を遮断するためのソフトウェアを用いてもよい。ナノポアをＤＮＡが通過したことを示すイオン電流の低下が観察された段階で電圧を切り、ナノポアデバイスの陽極側に充填されているＴＥ緩衝液をすべて回収した。具体的には、電流計測後、ナノポアデバイスを計測機から取り外し、陽極側のＰＤＭＳ孔にイエローチップを差し込み、陽極側に充填されている全溶液をピペットを用いて慎重に回収した。回収した溶液は、１０倍量のキャリヤーＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ  ＣｏｌＥ１）を含むＴＥ溶液を加え、４℃で保存した。以後の説明ではこの溶液をナノポア回収ＤＮＡと呼ぶ。
【００３２】
ナノポア回収ＤＮＡに含まれる分子数の評価は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  （Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。ＰＣＲの標的には、Ｌｅ１およびｐ３５Ｓを用いた。プライマープローブの配列は、以下の通り、
Ｌｅ１用プライマー、Ｌｅ１ｎ０２−５’５’−ＧＣＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡ−３’およびＬｅ１ｎ０２−３’５’−ＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴ−３’、Ｌｅ１用プローブ、Ｌｅ１−Ｔａｑ  ５’ＦＡＭ−ＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−ＴＡＭＲＡ３’、
ｐ３５Ｓ用プライマー、Ｐ３５Ｓ  １−５’５’−ＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴ−３’およびＰ３５Ｓ  １−３’５’−ＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴ−３’、ｐ３５Ｓ用プローブ、Ｐ３５Ｓ−Ｔａｑ  ５’ＶＩＣ−ＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴ−ＴＡＭＲＡ３’。
【００３３】
Ｌｅ１を標的とした解析では９６ウェルプレートを用い、反応溶液は２５μＬ、ｐ３５Ｓを標的とした解析では３８４ウェルプレートを用い、反応溶液は１０μＬで行った。溶液の組成は、以下の通り
定量に供するＤＮＡ溶液
ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー０．５μＭ、
ＴａｑＭａｎプローブ０．２μＭ
反応溶液の半量のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＰＣＲ反応条件は、以下の通り
５０℃  ２分 →９５℃  １０分 →（９５℃  ３０秒 →５９℃  １分)  ×４５  サイクル
９６００ｅｍｕｌａｔｉｏｎモード
Ｌｅ１を用いた解析では、ＧＭダイズＭＯＮ８９７８８（ＲＲＳ２）定量用標準プラスミドｐＳＣＳ（２０，１２５，１５００，２００００，２５００００コピー／ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて作成した検量線をもとに定量した。Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅは、マニュアルモードに変更し、増幅曲線のＬｉｎｅａｒ  ｐｈａｓｅ中に設定するために、非特許文献１あるいは、独立行政法人 農林水産消費安全技術センターのＪＡＳ分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル」ＩＶ  定量的ＰＣＲ編の方法にしたがって決定した。
【００３４】
一方、ｐ３５Ｓは、Ｌｅ１で概算定量を行った解析済みＤＮＡ溶液を回収し、１０倍希釈したもののうち、２．５μＬを解析に供し、デジタルＰＣＲ解析を行った（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅは０．２）。増幅があったものをＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｗｅｌｌと判定した。
【００３５】
本実施例では、実施前に陰極側にＴＥ緩衝液のみを充填して測定および陽極側の溶液の回収を行った(Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）。続いて、本実施例では、１０10分子／μＬのＧＭ標準ＤＮＡを陰極側に充填し、一定時間泳動した後、陽極側の溶液を回収する操作を行った。回収溶液は約４μＬであった。回収ＤＮＡを安定化させるため、回収溶液に３５μＬの５ｎｇ／μＬ  ＣｏｌＥ１／ＴＥ用液を加え、全量４０μＬのナノポア回収ＤＮＡ溶液とした。
【００３６】
イオン電流の変化を詳細に解析した結果、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌでは電流値の変化は認められなかった。一方、ＧＭ標準ＤＮＡを陰極側に充填した場合には、ＤＮＡが通過していることを示す電流値の変化を示すピークが多数検出された（図３）。詳細な解析を行った結果、ピークの数は約４５０と見積もられた。
【００３７】
これらのナノポア回収ＤＮＡから２．５μＬを用いて、Ｌｅ１を標的にリアルタイムＰＣＲによって定性分析を行ったこところ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＣｏｎｔｒｏｌではＤＮＡ由来の増幅は認められず、ナノポア回収ＤＮＡから増幅が認められた（図４）。
【００３８】
次に、ナノポア回収ＤＮＡ中のＤＮＡの分子数を見積もるために、ＧＭダイズＭＯＮ８９７８８定量用標準プラスミドｐＳＣＳを用いて作成した検量線による、リアルタイムＰＣＲによる概算定量を行った（図５）。５回の繰り返し実験を行い、ナノポア回収ＤＮＡ溶液４０μＬ中０．２５μＬ分に含まれるＤＮＡ分子の絶対定量を行った（図６）。その結果、ナノポア回収ＤＮＡ０．２５μＬ中のＧＭ標準ＤＮＡは、平均で２．８１±１．０５分子／μＬとなった。したがって、元のナノポア回収ＤＮＡ中の全ＤＮＡ分子数は、約２．８１×４０／０．２５＝４５０分子と見積もられ、これは、イオン電流値変化のピーク数と一致していた。このように、イオン電流の変化によって分子数を計測することが可能であり、計測した数の分子を含む試料が得られることが示され、本発明の分子数測定済み試料作製装置及び分子数測定済み試料の作製方法を実施することができた。
【００３９】
このような構成を使えば同様の方法により１分子から所望の数の分子数までの分子数測定済み試料を作製することができる分子数測定済み試料作製装置を構成でき、さらに分子数測定済み試料を作成するための分子数測定済み試料の作製方法が実現可能である。
【００４０】
本実施の形態の試料作製装置によれば、従来のように間接的にＤＮＡの濃度を定量するのではなく、直接的にＤＮＡの分子数をカウントする手法を用いているので、これまでは不可能であった、ごく微量のＤＮＡを含む標準物質の安定供給が可能になると考えられる。このような、１分子標準物質が実用化されれば、市販されているＰＣＲ装置の能力評価が可能となる。また、ＰＣＲ検査においては、検知下限や定量下限の絶対的評価が可能となる。
【００４１】
以上、本発明の実施の形態を例示により説明したが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではなく、請求項に記載された範囲内において目的に応じて変更・変形することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上のように、本発明にかかる試料作製装置は、ごく微量の試料を含む標準物質の安定供給が可能になるという効果を有し、試料（ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸）の検出による食品検査や遺伝子検査（医療分野の診断等に利用される遺伝子検査）等に用いられ、有用である。
【符号の説明】
【００４３】
１  試料作製装置
２  導電性基板（シリコン基板）
３  電極対（電気泳動電極対）
４  電流検出装置
５  分取装置
６  絶縁体（窒化シリコン）
７  貫通孔（ナノポア）
８  電源装置
９  試料（ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸）
１０  表示装置（ディスプレイ）
１１  制御装置
【図２】
2015198652.tif 000003
【図４】
2015198652.tif 000004
【図５】
2015198652.tif 000005
【図６】
2015198652.tif 000006
【図１】
2015198652.tif 000007
【図３】
2015198652.tif 000008
【配列表】
2015198652000001.app