(57)【要約】【課題】ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のためのバイオマーカー、前記バイオマーカーの検出物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または検定用組成物、前記バイオマーカーの検出物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物、前記バイオマーカーを用いるｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証方法、前記バイオマーカーを用いるｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別方法、及び前記選別された適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む癌の予防及び／または治療方法が提供される。【解決手段】本発明のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のためのバイオマーカーは、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含む。【選択図】図２
2015129755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測用組成物。
【請求項２】
ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証用組成物。
【請求項３】
ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物。
【請求項４】
前記相互作用する物質は、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と結合する化合物、蛋白質、及び核酸からなる群より選択された１種以上である、請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、
ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、ＬＹ２８７５３５８、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、及びそれらの抗原結合断片、ならびに
クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、フォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＧＸ−５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＥＭＤ１２１４０６３、ゴルバチニブ（Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ）、ＩＮＣＢ２８０６０、ＭＫ−２４６１、チバンチニブ（ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ）、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ７９４８３３、ＢＭＳ７７７６０７、ＭＧＣＤ−２６５、ＡＭＧ−２０８、ＢＭＳ−７５４８０７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、及びこれらの薬学的に許容可能な塩
からなる群より選択された１種以上である、請求項１から４のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体およびその抗原結合断片は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含む、請求項５に記載の組成物；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１
配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８から１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２
配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６から１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、もしくは前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２
配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む連続する９から１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域及び前記軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位及び前記軽鎖可変部位の組み合わせ。
【請求項７】
患者から得られた生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測のための情報を提供する方法。
【請求項８】
患者から得られた生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法。
【請求項９】
患者から得られた生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別のための情報を提供する方法。
【請求項１０】
前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、
ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、ＬＹ２８７５３５８、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、及びそれらの抗原結合断片、ならびに
クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、フォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＧＸ−５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＥＭＤ１２１４０６３、ゴルバチニブ（Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ）、ＩＮＣＢ２８０６０、ＭＫ−２４６１、チバンチニブ（ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ）、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ７９４８３３、ＢＭＳ７７７６０７、ＭＧＣＤ−２６５、ＡＭＧ−２０８、ＢＭＳ−７５４８０７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、及びこれらの薬学的に許容可能な塩
からなる群より選択された１種以上である、請求項７から９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合するｃ−Ｍｅｔ抗体およびそれらの抗原結合断片は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含む、請求項１０に記載の方法；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１
配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８から１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２
配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６から１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、もしくは前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２
配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む連続する９から１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域及び前記軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位及び前記軽鎖可変部位の組み合わせ。
【請求項１２】
ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証用組成物。
【請求項１３】
前記相互作用する物質は、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と結合する化合物、蛋白質及び核酸からなる群より選択された１種以上である、請求項１２に記載のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証用組成物。
【請求項１４】
前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、
ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、ＬＹ２８７５３５８、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、及びそれらの抗原結合断片、ならびに
クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、フォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＧＸ−５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＥＭＤ１２１４０６３、ゴルバチニブ（Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ）、ＩＮＣＢ２８０６０、ＭＫ−２４６１、チバンチニブ（ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ）、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ７９４８３３、ＢＭＳ７７７６０７、ＭＧＣＤ−２６５、ＡＭＧ−２０８、ＢＭＳ−７５４８０７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、及びこれらの薬学的に許容可能な塩
からなる群より選択された１種以上である、請求項１２または１３に記載のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証用組成物。
【請求項１５】
前記ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合するｃ−Ｍｅｔ抗体およびそれらの抗原結合断片は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含む、請求項１４に記載のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証用組成物；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１
配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８から１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２
配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６から１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、もしくは前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２
配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む連続する９から１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域及び前記軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位及び前記軽鎖可変部位の組み合わせ。
【請求項１６】
患者から得られた生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法。
【請求項１７】
前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、ＬＹ２８７５３５８、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、及びそれらの抗原結合断片、ならびに
クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、フォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＳＧＸ−５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＥＭＤ１２１４０６３、ゴルバチニブ（Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ）、ＩＮＣＢ２８０６０、ＭＫ−２４６１、チバンチニブ（ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ）、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２、ＡＭＧ４５８、ＢＭＳ７９４８３３、ＢＭＳ７７７６０７、ＭＧＣＤ−２６５、ＡＭＧ−２０８、ＢＭＳ−７５４８０７、ＪＮＪ−３８８７７６０５、及びこれらの薬学的に許容可能な塩
からなる群より選択された１種以上である、請求項１６に記載のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法。
【請求項１８】
前記ｃ−Ｍｅｔ内の配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３を含む連続する５から１９個のアミノ酸を認識しまたは当該アミノ酸と結合するｃ−Ｍｅｔ抗体およびそれらの抗原結合断片は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含む、請求項１７に記載のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１
配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８から１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２
配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６から１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、もしくは前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；
配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２
配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む連続する９から１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域及び軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位及び軽鎖可変部位の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のためのバイオマーカー、前記バイオマーカーの検出物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または検定用組成物、前記バイオマーカーの検出物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物、前記バイオマーカーを用いるｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証方法、前記バイオマーカーを用いるｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別方法、及び前記選別された適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む癌の予防及び／または治療方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカー（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）とは、外部的な影響によって生命体内部で誘発された変化を把握することができる指標を意味し、癌、脳卒中、痴呆など各種病気を診断したり、特定治療剤の効能を予測したりモニタリングするための用途として研究が活発になっている。薬物開発と関連したバイオマーカーとしては、薬物の生体内作用有無を確認するための効能検証マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｒｋｅｒ；ＰＤマーカー）、生体内投与以前に薬物の反応性を予め予測して投与することができる効能予測マーカー（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ）などがある。このようなマーカー（ｍａｒｋｅｒ）の活用は薬物の臨床戦略を樹立することに役立つが、たとえば薬物の作用を通じて効能が予想される効能予測マーカーの場合には患者選別過程に活用してより効果的な薬物治療が可能にし、効能検証マーカーの場合には薬物が個別患者によく作用しているかモニタリングしてより効果的な治療戦略を樹立することができるようにする。また、効能予測マーカーがない場合でも、効能検証マーカーが存在すれば薬物治療において個別患者の薬物に対する反応がより初期にモニタリング可能であるため、薬物の効能が現れる群とそうでない群の早期選別を可能にして、結論的により効果的で成功的な薬物治療が可能にする。また、効果検証マーカーは投与濃度による薬物反応性程度をモニタリングして薬物の適正投与量算定の指標としても利用可能である。
【０００３】
一方、癌は現在まで主要死亡原因の一つである。医療技術の発達により癌の治療技術に目立つ変化が来ているが、５年生存率数値は過去２０年間で１０％程度の向上にとどまる。これは癌の急速な成長、転移などの特性によって適正時期の診断と治療が難しいためであると言える。適切なバイオマーカーを癌治療に導入することによって、癌の特性を把握し適切な治療剤を適期に使用できる機会を増大させ、癌治療の成功率を大きく高めることができる。たとえば、同一な肺癌患者でも肺癌分類別、遺伝子別、分泌する蛋白質別に特性が異なり、これによる適した治療剤も異なる。したがって特定治療剤を使用する化学療法において、前記治療剤に相応するバイオマーカーが存在すれば、試行錯誤を減らし成功確率をより高めることができる。このような趣旨で抗癌治療剤の効能予測または検定のためのバイオマーカーの探索が非常に重要であり、適したバイオマーカーが成功的に導出されれば、抗癌剤の効用と価値及びこれを使用する治療の成功率を大きく上昇させることができるはずである。
【０００４】
一方、ｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）の受容体であり、ＨＧＦはｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼの細胞外部位に結合して、多様な正常細胞と腫瘍細胞において分裂、運動、形態発生、血管形成を誘発するサイトカインの一種である。ｃ−Ｍｅｔは細胞表面に存在する代表的な受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）であって、それ自体が癌誘発遺伝子であり、時にはリガンドのＨＧＦと無関係に癌発生、癌転移、癌細胞移動、癌細胞の浸潤、血管新生などのような腫瘍と関連する様々な機序に関与する。このため、近年、ｃ−Ｍｅｔは抗癌治療のターゲットとして注目される蛋白質であり、ｃ−Ｍｅｔの作用を阻害する抗体などの標的治療剤の開発が行なわれている。
【０００５】
このように開発されたｃ−Ｍｅｔ標的治療剤を用いた治療の効能をより増進させ成功可能性を高めるために、前記治療剤の効能を予測または検証して前記治療剤の適用が適した患者を選別し治療剤投与後の反応性をモニタリングしてより効果的な治療戦略を樹立することに適用可能なバイオマーカーの開発が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証が可能な可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）マーカーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のためのバイオマーカーを提供する。
【０００８】
他の実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別のためのバイオマーカーを提供する。
【０００９】
他の実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証用組成物及びキットを提供する。
【００１０】
他の実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物及びキットを提供する。
【００１１】
他の実施形態は、生物試料内のＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の存在有無、水準、及び／または変異有無を測定する段階を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証方法を提供する。
【００１２】
他の実施形態は、生物試料内のＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の存在有無、水準、及び／または変異有無を測定する段階を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法を提供する。
【００１３】
他の実施形態は、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む癌の予防及び／または治療方法を提供する。
【００１４】
他の実施形態は、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含むｃ−Ｍｅｔ抑制方法を提供する。
【００１５】
ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を予め予測するか及び／または投与されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を検定するための用途が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証が可能な可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）マーカーを提供することによって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を用いる治療の効能をより増進させることができ、患者個々人に最適化したオーダーメイド型治療を可能にして治療効率をより高めることができるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による抗癌効果（腫瘍の大きさ変化）を示すグラフであって、１ａはＬｏｖｏ細胞移植マウスモデルでの腫瘍の大きさ変化を示す。
【図１ｂ】癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による抗癌効果（腫瘍の大きさ変化）を示すグラフであって、１ｂはＨＴ２９細胞移植マウスモデルでの腫瘍の大きさ変化を示す。
【図１ｃ】癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による抗癌効果（腫瘍の大きさ変化）を示すグラフであって、１ｃはＥＢＣ−１細胞移植マウスモデルでの腫瘍の大きさ変化を示す。
【図１ｄ】癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による抗癌効果（腫瘍の大きさ変化）を示すグラフであって、１ｄはＨｓ７４６Ｔ細胞移植マウスモデルでの腫瘍の大きさ変化をそれぞれ示す。
【図１ｅ】癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による抗癌効果（腫瘍の大きさ変化）を示すグラフであって、１ｅはＭＫＮ４５細胞移植マウスモデルでの腫瘍の大きさ変化を示す。
【図２】それぞれの癌細胞株移植マウスモデルでのＩＬ−８水準を示すグラフであって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性とＩＬ−８水準との関連性を示す。
【図３】癌細胞株移植マウスモデルで抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非反応群（Ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応群（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理有無及び処理量によるＩＬ−８水準変化を示すグラフである。
【図４】患者由来癌細胞移植マウスモデルのうちの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非処理群（ＰＢＳ投与群、ビヒクル）の血清試料内のＩＬ−８水準を示すグラフである。
【図５】患者由来癌細胞移植マウスモデルのうちの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非処理群（ＰＢＳ投与群、ビヒクル、ｂｌａｃｋ  ｂａｒ）と抗ｃ−Ｍｅｔ抗体投与群（Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２、ｇｒａｙ  ｂａｒ）の血清試料内のＩＬ−８水準を示すグラフであって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理有無によるＩＬ−８水準と抗癌効能との相関関係を示す。
【図６】癌細胞（ＥＢＣ−１）移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の容量別処理による腫瘍の大きさ変化を示すグラフである。
【図７】癌細胞（Ｈｓ７４６Ｔ）移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の容量別処理による腫瘍の大きさ変化を示すグラフである。
【図８】ＥＢＣ−１移植マウスモデル（図６）での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後のＩＬ−８水準を時間帯別に示す結果である。
【図９】Ｈｓ７４６Ｔ移植マウスモデル（図７）での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後のＩＬ−８水準を時間帯別に示すグラフである。
【図１０】Ｕ８７ＭＧ移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による腫瘍の大きさ変化を示すグラフである。
【図１１】Ｕ８７ＭＧ移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理有無による蛋白質発現の差を示すケミルミネッセンス（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いたタンパク質配列（ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙ）実験結果である。
【図１２】多様な癌細胞株移植マウスモデルの血清での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるｂＩＧ−Ｈ３水準変化を示すグラフである。
【図１３】患者由来癌細胞移植マウスモデルの血清での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるｂＩＧ−Ｈ３水準変化を示すグラフである。
【図１４】患者由来癌細胞移植マウスモデルから分離された癌組織での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるｂＩＧ−Ｈ３水準変化を示すグラフである。
【図１５】患者由来癌細胞移植マウスモデル（ＬＸＦＡ６２３）での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理有無による蛋白質発現の差を示すケミルミネッセンス（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いたタンパク質配列（ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙ）実験結果である。
【図１６】多様な癌細胞株移植マウスモデルの血清での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるＭＩＦ水準変化を示すグラフである。
【図１７】患者由来癌細胞移植マウスモデルの血清での抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるＭＩＦ水準変化を示すグラフである。
【図１８】患者由来癌細胞移植マウスモデルでのｃ−Ｍｅｔ発現程度を示すウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果である。
【図１９】患者由来癌細胞移植マウスモデルでのＫ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ突然変異存在有無による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による腫瘍の大きさ変化を示すグラフである。
【図２０】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応群のｃ−Ｍｅｔ阻害剤であるクリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）またはＰＨＡ６６５７５２に対する反応性を示すグラフである。
【図２１】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する非反応群のｃ−Ｍｅｔ阻害剤であるクリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）またはＰＨＡ６６５７５２に対する反応性を示すグラフである。
【図２２】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応群の培養上清にｃ−Ｍｅｔ阻害剤であるＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）またはＰＨＡ６６５７５２を処理した場合の相対的ＩＬ−８水準を示すグラフである。
【図２３】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する非反応群の培養上清にｃ−Ｍｅｔ阻害剤であるＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）またはＰＨＡ６６５７５２を処理した場合の相対的ＩＬ−８水準を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１９】
具体的には、本発明の一実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のためのバイオマーカーを提供する。
【００２０】
他の実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別のためのバイオマーカーを提供する。
【００２１】
他の実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証用組成物及びキットを提供する。
【００２２】
他の実施形態は、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物及びキットを提供する。
【００２３】
他の実施形態は、生物試料内のＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の存在有無、水準、及び／または変異有無を測定する段階を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のための情報を提供する方法を提供する。
【００２４】
他の実施形態は生物試料内のＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の存在有無、水準、及び／または変異有無を測定する段階を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法を提供する。
【００２５】
他の実施形態は、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む癌の予防及び／または治療方法を提供する。前記癌の予防及び／または治療方法は、前記投与段階以前に前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象を選別する段階を追加的に含むことができる。
【００２６】
他の実施形態は、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含むｃ−Ｍｅｔ抑制方法を提供する。前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法は、前記投与段階以前に前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象を選別する段階を追加的に含むことができる。
【００２７】
本明細書で、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤のｃ−Ｍｅｔ関連病気、例えば癌の予防、改善、軽減、または治療効果を意味するものであって、癌の場合、癌細胞または癌組織の減少、癌細胞または癌組織の死滅、癌転移と関連した癌細胞の移動及び／または浸透の抑制などの効果を意味する。
【００２８】
本発明で、特定蛋白質の発現水準は、前記蛋白質を定量するか前記蛋白質をコードする遺伝子、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを定量することによって測定でき、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異の場合は遺伝子水準で測定できる。
【００２９】
ＩＬ−８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８）はケモカインの一種であって、免疫反応の重要な媒介体として作用する。ＩＬ−８は、好中球走化性因子（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）とも知られており、好中球または他の顆粒性白血球の走化性を誘導してこれら細胞の炎症部位に移動させる役割と、炎症部位での食菌作用を誘導する役割を果たす。ＩＬ−８はまた、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進し、腫瘍細胞の増殖及び転移に寄与する因子とも知られている。本発明の一実施形態ではＩＬ−８の発現水準によってｃ−Ｍｅｔ阻害剤に対する反応性が変わり、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理有無または処理前後のＩＬ−８の発現水準差が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤に対する反応性の有無によって変わることを明らかにした（実施例１参照）。より具体的には、生物試料のＩＬ−８またはこれをコードする遺伝子の水準が高い場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者にｃ−Ｍｅｔ阻害剤、例えば抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を適用時、その効能がよく発揮されることを確認することができる。また、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、例えば抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が効能をよく発揮する場合（薬物反応群）、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤適用後のＩＬ−８またはこれをコードする遺伝子の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤適用前より減少することを確認することができる。
【００３０】
即ち、ＩＬ−８の発現水準を測定することによって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を予測してｃ−Ｍｅｔ阻害剤を適用するのに適した対象を選別することができる。または、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理の有無または処理前後によるＩＬ−８の発現水準変化を測定することによって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を検定（確認）またはモニタリングし、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の継続的な適用有無を決定したり、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与容量、投与間隔、投与回数などの治療戦略を樹立したりするのに有用に用いることができる。これに基づいて、ＩＬ−８のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証マーカーとしての有用性を最初に提案する。
【００３１】
前記ＩＬ−８は、マウス、ラットなどのげっ歯類、ヒト、サルなどの霊長類などを含む哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの脊椎動物に由来するものであってもよく、例えば、ＮＰ＿０００５７５．１、ＡＡＨ１３６１５．１、ＡＡＡ５９１５８．１、ＮＰ＿００１０２８１３７．１、ＡＡＡ８０１４１．２、およびＡＡＡ８６７１１．１からなる群より選択されたものであってもよい。ＩＬ−８をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）は、例えば、ＮＭ＿０００５８４．３、ＢＣ０１３６１５．１（４１〜３４０位）、ＮＣ＿０００００４、ＮＧ＿０２９８８９、ＮＣ＿０１８９１５．２、ＡＣ＿０００１３６、Ｍ２８１３０．１、ＮＭ＿００１０３２９６５．１、Ｓ７８５５５．１、およびＵ１９８４９．１からなる群より選択されたものであってもよい。
【００３２】
一実施形態は、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証のためのバイオマーカーを提供する。
【００３３】
他の実施形態は、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別のためのバイオマーカーを提供する。
【００３４】
他の実施形態は、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／または効能検証用組成物及びキットを提供する。
【００３５】
他の実施形態は、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含むｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物及びキットを提供する。
【００３６】
他の実施形態は、生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／もしくは効能検証方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／もしくは効能検証のための情報を提供する方法、またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測及び／もしくは効能検証のために、生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する方法を提供する。他の実施形態は、生物試料内のＩＬ−８及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法、またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のために生物試料内のＩＬ−８及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する方法を提供する。
【００３７】
一実施形態では、生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測のための情報を提供する方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法、またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法が提供される。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別方法において、生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が高い場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者では前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断（予測）するか、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者をｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象と判断することができる。したがって、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測または効能予測のための情報を提供する方法は、前記生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が高い場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者では、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断（予測）する段階を、前記測定する段階以後に追加的に含むことができる。また、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法は、前記生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が高い場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象と判断する段階を、前記測定する段階以後に追加的に含むことができる。
【００３８】
ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が高いというのは、例えば、適用しようとするｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮しない患者から分離された生物試料（比較基準試料）と比較して、ＩＬ−８蛋白質量及び／またはこれをコードする遺伝子（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の量が多い場合を意味するものであり得る。例えば、試験対象生物試料のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、適用しようとするｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮しない比較基準生物試料と比較して、重量基準で１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、または５倍以上である場合、例えば１．５から１００倍、２から１００倍、３から１００倍、４から１００倍、または５から１００倍である場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者では前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると予測するか、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象と判断することができる。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってもよい。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮しない生物試料は、例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が効能を示さないＬｏｖｏ細胞株（ＣＣＬ−２２９、ＡＴＣＣ）、ＨＴ−２９細胞株（ＨＴＢ−３８、ＡＴＣＣ）などであり得るが、これらに制限されるものではない。したがって、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測（もしくは効能予測のための情報を提供する方法）、またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法（もしくはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法）は、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の比較基準試料中の水準を測定する段階を追加的に含むことができ、その具体的な測定方法は、試験対象試料中のＩＬ−８及び／またはこれをコードする遺伝子水準の測定と同様な方法で遂行できる。
【００３９】
前記生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階は、（ｉ）生物試料にＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を処理（添加）して反応させる段階；ならびに（ｉｉ）前記得られた反応物を分析してＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を定量する段階を含むことができる。一実施形態では、前記段階（ｉ）以前に、生物試料を用意する段階を追加的に含むことができる。前記生物試料を用意する段階は、患者から生物試料を得る（分離する）段階または患者から分離された生物試料を入手する段階を含んでもよい。前記段階（ｉ）で、前記相互作用する物質は、ＩＬ−８検出に使用するためのものであって、ＩＬ−８に特異的に結合する全ての低分子化合物（例えば、蛍光体、染料（ｄｙｅ）など）、蛋白質（抗体、アプタマーなど）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。より具体的には、例えば、前記相互作用する物質は、ＩＬ−８に特異的に結合する化合物、抗体（細胞内染色用抗体（Ｈｕｍａｎ  ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＭＡｂ；  ＃ＩＣ２０８Ｐ；  Ｒ＆Ｄシステムズ社）など）、アプタマー、およびＩＬ−８をコードする遺伝子の一部または全部に結合するポリヌクレオチド（例えば、プライマー（例えば、ＩＬ−８遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いられるプライマーセット（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＯ：  ＢＣ０１３６１５．１；  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号１１３）およびＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１１４））など）、プローブ、アプタマーなど）、化合物、またはこれらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。前記相互作用する物質は、蛍光物質、発色物質などの通常の標識物質で標識されるか、または標識されないものであってもよい。前記段階（ｉ）は前記生物試料に前記相互作用する物質を処理（添加）して複合体を形成させる段階であってもよい。前記段階（ｉｉ）で、前記反応物は、段階（ｉ）で得られたＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上、ならびにこれらと相互作用する物質が相互作用（結合）して生成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であってもよく、前記定量する段階は、前記生成された複合体を定量するか、前記複合体に接合された標識物質を測定するか、または前記複合体を試料から分離した後、これからＩＬ−８またはこれをコードする遺伝子を再び分離したＩＬ−８またはこれをコードする遺伝子を定量する段階を含んでもよい。前記ＩＬ−８の定量段階は、蛋白質定量に使用される全ての通常の手段、例えば、免疫クロマトグラフィー、免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ、例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８／ＮＡＰ−１  （＃ＢＭＳ２０４／３，  ｅ��ｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）等）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；  例えば、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  ａｓｓａｙ（例えば、ＩＬ−８  ｆｌｅｘ  ｓｅｔ  （＃５５８２７７）、  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｋｉｔ  （＃５５１８１１）、以上、ＢＤバイオサイエンス社製）、細胞内染色（Ｉｎｔｒａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ、例えば、Ｈｕｍａｎ  ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＭＡｂ（＃ＩＣ２０８Ｐ；Ｒ＆Ｄシステムズ社）などのような抗体を使用）、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ（ルミネックス社）など）などによって遂行できるが、これらに制限されるわけではない。ＩＬ−８をコードする遺伝子の定量段階は、遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）定量に使用される全ての通常の手段、例えば、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等）、ｍＲＮＡマイクロアレイなどを用いて遂行できるが、これらに制限されるわけではない。
【００４０】
他の実施形態では、生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証（もしくは、確認もしくはモニタリング）方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証（もしくは、確認もしくはモニタリング）のための情報を提供する方法、またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証（もしくは、確認もしくはモニタリング）のために生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する方法が提供される。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法において、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理する前に測定した患者から得られた生物試料（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群生物試料）内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準と、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理した後に測定した患者から得られた生物試料（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群生物試料）内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準とを比較し、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理した後に患者から得られた生物試料（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群生物試料）内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理する前（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群）の水準より減少した場合、前記生物試料が由来する患者では前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断することができる。したがって、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法は、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群及び処理群の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を比較する段階及び／または前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群より減少した場合、前記生物試料が由来する患者で前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断する段階を、前記測定（比較）する段階以後に、追加的に含むことができる。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってもよい。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群や処理群とは、それぞれ同一の生物試料全体に対してｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理する前と処理した後の状態を意味するか、または、同一の生物試料を分量してｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理しない群（例えば、ビヒクルのみ処理）とｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理した群を意味し得る。本明細書で、別途の言及がない限り、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群とｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理前の生物試料、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群とｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理後の生物試料は、それぞれ互いに同一な意味として使用されるものであり得る。
【００４１】
ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準は、ＩＬ−８蛋白質及び／またはこれをコードする遺伝子（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を定量することによって測定できる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理後の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理前の水準の、約０から約８０重量％、約０から約７０重量％、約０から約６０重量％、約０から約５０重量％、約０から約４０重量％、約０から約３０重量％、約０から約２０重量％、または約０から約１０重量％である場合、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準より減少したと判断することができる。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理前の約０重量％というのは、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上が前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料から検出されないこと（存在しないこと）を意味する。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群（または処理前）と処理群（または処理後）の生物試料のＩＬ−８及び／またはこれをコードする遺伝子水準は、同一の患者から得られた生物試料で互いに同様な方法で測定されたものであってもよい。
【００４２】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証マーカーとしてＩＬ−８及び／またはこれをコードする遺伝子を使用する場合、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤投与後、比較的に短期間、例えば一週間以内、５日以内、３日以内、２日以内、または１日以内にＩＬ−８及び／またはこれをコードする遺伝子を定量し、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤投与前のＩＬ−８及び／またはこれをコードする遺伝子の定量値と比較して、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を確認することができる。したがって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療の初期段階にｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を確認することができるので、より効果的な治療戦略を樹立できるという利点がある。
【００４３】
一実施形態では、前記生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階は、（１）ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の処理前患者から得られた（分離された）生物試料中（または患者から得られた（分離された）生物試料の一部であるｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理生物学的試料中）の、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階；ならびに（２）前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理後の前記患者から得られた（分離された）生物試料中（または前記患者から得られた（分離された）生物試料の他の部分であるｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理生物学的試料中）の、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含んでもよい。前記段階（１）と段階（２）は、それぞれ（ｉ）前記生物試料にＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を処理（添加）して反応させる段階；ならびに（ｉｉ）前記得られた反応物を分析してＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を定量する段階を含むことができる。前記段階（ｉ）以前に、生物試料を用意する段階を追加的に含むことができる。前記生物試料を用意する段階は、患者から生物試料を得る（分離する）段階または患者から分離された生物試料を入手する段階を含んでもよい。前記段階（ｉ）で、前記相互作用する物質は、ＩＬ−８検出に用いるためのものであって、ＩＬ−８に特異的に結合する全ての低分子化合物、蛋白質（抗体、アプタマーなど）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記相互作用する物質は、ＩＬ−８に特異的に結合する化合物、抗体、アプタマー、またはＩＬ−８をコードする遺伝子の一部または全部に結合するポリヌクレオチド（例えば、プライマー、プローブ、アプタマーなど）、化合物、またはこれらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。前記相互作用する物質は、蛍光物質、発色物質などの標識物質で標識されるか若しくは標識されないものであってもよい。前記段階（ｉ）は、前記生物試料に前記相互作用する物質を処理（添加）して複合体を形成させる段階であってもよい。前記段階（ｉｉ）で、前記反応物は、段階（ｉ）で得られたＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上及びこれと相互作用する物質が相互作用（結合）して生成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であってもよく、前記定量する段階は、前記生成された複合体を定量するか、前記複合体に接合された標識物質を測定するか、または前記複合体を試料から分離した後、これからＩＬ−８またはこれをコードする遺伝子を再び分離したＩＬ−８またはこれをコードする遺伝子を定量する段階を含んでもよい。
【００４４】
前記効能検証方法は、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の継続的な使用可否の判断及び／または前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件（例えば、投与量、投与間隔、投与回数など）の決定に活用できる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準より減少した場合、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を継続して使用できると判断することができる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準の、約０から約８０重量％、約０から約７０重量％、約０から約６０重量％、約０から約５０重量％、約０から約４０重量％、約０から約３０重量％、約０から約２０重量％、または約０から約１０重量％である場合、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を継続して使用できると判断することができる。また、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内の、ＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準より減少した場合、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与条件を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件と判断することができる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のＩＬ−８及びこれをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準の、約０から約８０重量％、約０から約７０重量％、約０から約６０重量％、約０から約５０重量％、約０から約４０重量％、約０から約３０重量％、約０から約２０重量％、または約０から約１０重量％である場合、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与条件を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件と判断することができる。前記投与条件は、投与容量、投与間隔、投与回数などからなる群より選択された１種以上出合ってもよい。
【００４５】
他の実施形態は、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ抑制方法を提供する。
【００４６】
他の実施形態は、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象に、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む、癌の予防及び／または治療方法を提供する。
【００４７】
前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を選別する段階を、前記投与段階以前に追加的に含むことができ、その具体的方法及び段階は前述の通りである。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってもよい。
【００４８】
より具体的には、前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象を確認する段階；及び前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤の薬学的有効量を投与する段階、を含むことができる。
【００４９】
他の実施形態では、前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法は、
生物試料内のＩＬ−８及び／またはこれをコードする遺伝子の水準を測定してｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象を選別する段階；ならびに、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤の薬学的有効量を投与する段階、を含むことができる。
【００５０】
この時、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与条件、例えば、投与量、投与間隔、及び／または投与回数は、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証方法で判断されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件であってもよい。
【００５１】
スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などの抗癌剤は、ＩＬ−８水準が高い個体で抵抗性が誘発され、抗癌効果を発揮しない場合が多い。しかし、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、特に下記の特定抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＩＬ−８水準が高い個体にむしろ優れた抗癌効果を示すことができるので、より効果的な抗癌治療戦略を提示することができる。
【００５２】
ｂＩＧ−Ｈ３は、ＴＧＦＢＩ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ、形質転換成長因子β誘導性遺伝子蛋白質）とも呼ばれ、ＲＧＤモチーフを含む蛋白質であり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型コラーゲンに結合する。ＲＧＤモチーフは、ＥＣＭ（ｅｘｔａｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、細胞外基質）部分に多く分布する。ｂＩＧ−Ｈ３は、ａ３ｂ１インテグリンと結合して細胞接着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、細胞移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に関与する。ｂＩＧ−Ｈ３は可溶性蛋白質であり、腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）で癌転移、癌血管形成などに関与する。現在までｃ−Ｍｅｔ蛋白質とｂＩＧ−Ｈ３との関係が報告されたことがない。
【００５３】
ＭＩＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、マクロファージ遊走阻止因子）は、重要な免疫調節因子であり、炎症性サイトカインの一種類である。
【００５４】
本発明の一実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群と処理群、または処理前後のｂＩＧ−Ｈ３及び／もしくはＭＩＦの発現水準差が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤に対する反応性の有無によって変わることを明らかにした（実施例２及び実施例３参照）。より具体的には、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、例えば抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が効能をよく発揮する場合（薬物反応群）、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤適用後のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤適用前の水準よりも減少することを確認することができる。
【００５５】
即ち、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理有無または処理前後のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の発現水準を測定することによって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を検定（確認）またはモニタリングしてｃ−Ｍｅｔ阻害剤の継続的な適用有無を決定するか、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与容量、投与間隔、投与回数などの治療戦略を樹立することに有用に使用できる。これに基づいて、ｂＩＧ−Ｈ３及び／またはＭＩＦのｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証マーカーとしての有用性を最初に提案する。
【００５６】
前記ｂＩＧ−Ｈ３は、マウス、ラットなどのげっ歯類、ヒト、サルなどの霊長類などを含む哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの脊椎動物に由来するものであってもよく、例えば、ヒトｂＩＧ−Ｈ３（ＮＰ＿０００３４９．１、ＡＡＣ２４９４４．１、ＡＡＣ０８４４９．１、ＡＡＨ０００９７．１など）、マウスｂＩＧ−Ｈ３（ＮＰ＿０３３３９５．１、ＡＡＩ２９９０１．１、ＡＡＩ２９９０２．１など）、ラットｂＩＧ−Ｈ３（ＮＰ＿４４６２５４．１など）、およびセブラフィッシュｂＩＧ−Ｈ３（ＮＰ＿８７８２８２．１、など）からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。ｂＩＧ−Ｈ３をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）は、例えば、ＮＭ＿０００３５８．２、ＮＭ＿００９３６９．４、ＮＭ＿０５３８０２．１、およびＮＭ＿１８２８６２．１からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００５７】
前記ＭＩＦは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの脊椎動物に由来するものであってもよく、例えば、ヒトＭＩＦ（ＮＰ＿００２４０６．１など）、サルＭＩＦ（例えば、ＮＰ＿００１０２８０８７．１など）、ヒツジＭＩＦ（例えば、ＮＰ＿００１０７２１２３．１）など）、げっ歯類ＭＩＦ（例えば、マウスＭＩＦ（ＮＰ＿０３４９２８．１など）、ラットＭＩＦ（ＮＰ＿１１２３１３．１など）、ＮＰ＿００１２６６７５６．１、など）、ウシＭＩＦ（ＮＰ＿００１０２８７８０．１など）、ゼブラフィッシュＭＩＦ（ＮＰ＿００１０３６７８６．１など）、ブタＭＩＦ（ＮＰ＿００１０７０６８１．１など）、カエルＭＩＦ（ＮＰ＿００１０８３６５０．１、ＮＰ＿００１１０７１４７．１など）、および魚類ＭＩＦ（例えば、ＮＰ＿００１１１８０５３．１、ＮＰ＿００１１３５０１９．１、ＮＰ＿００１０２７８８９．１）からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。ＭＩＦをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）は、例えば、ＮＭ＿００２４１５．１、ＮＭ＿００１０３２９１５．１、ＮＭ＿００１０７８６５５．１、ＮＭ＿０１０７９８．２、ＮＭ＿０３１０５１．１、ＮＭ＿００１２７９８２７．１、ＮＭ＿００１０３３６０８．１、ＮＭ＿００１０４３３２１．１、ＮＭ＿００１０７７２１３．２、ＮＭ＿００１０９０１８１．１、ＮＭ＿００１１１３６７５．１、ＮＭ＿００１１２４５８１．１、ＮＭ＿００１１４１５４７．１、およびＮＭ＿００１０３２７１７．１からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００５８】
一実施形態は、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のためのバイオマーカーを提供する。
【００５９】
他の実施形態は、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証用組成物及びキットを提供する。
【００６０】
他の実施形態は、生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証（または確認またはモニタリング）方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証（もしくは、確認もしくはモニタリング）のための情報を提供する方法、またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証（もしくは、確認もしくはモニタリング）のために生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する方法を提供する。
【００６１】
例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法において、患者から得られた生物試料（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群生物試料）内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理する前に測定された水準と、患者から得られた生物試料（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群生物試料）内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理した後に測定された水準とを比較し、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理した後に測定された患者から得られた生物試料（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群生物試料）内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を処理する前（またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群）の水準より減少した場合、前記生物試料が由来する患者では前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断することができる。したがって、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証のための情報を提供する方法は、前記測定（比較）する段階以後に、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群と処理群、または処理前後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を比較する段階及び／または前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前より減少した場合、前記生物試料が由来する患者で前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断する段階を追加的に含むことができる。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってもよい。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群と処理群の定義は前述の通りである。
【００６２】
ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準は、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、蛋白質及び／またはこれらをコードする遺伝子（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を定量することによって測定することができる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準の、約０から約８０重量％、約０から約７０重量％、約０から約６０重量％、約０から約５０重量％、約０から約４０重量％、約０から約３０重量％、約０から約２０重量％、または約０から約１０重量％である場合、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準より減少したと判断することができる。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の約０重量％とは、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料から検出されないこと（存在しないこと）を意味する。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群と処理群、または処理前後の生物試料のＩＬ−８及び／もしくはこれらをコードする遺伝子水準は、同一の患者から得られた生物試料で互いに同様な方法で測定されたものであり得る。
【００６３】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証マーカーとしてｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及び／またはこれらをコードする遺伝子を使用する場合、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤投与後比較的短期間、例えば、一箇月以内、２週間以内、一週間以内、５日以内、３日以内、２日以内、または１日以内にｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及び／またはこれらをコードする遺伝子を定量し、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤投与前と比較し、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を確認することができる。したがって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療の初期段階にｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を確認することができるので、より効果的な治療戦略を樹立できるという利点がある。
【００６４】
一実施形態では、前記生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階は、（１）ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の処理前に患者から得られた（分離された）生物試料中（または、患者から得られた（分離された）生物試料の一部であるｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理試料中）のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階；ならびに（２）前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理後に前記患者から得られた（分離された）生物試料（または、患者から得られた（分離された）生物試料の他の部分であるｃ−Ｍｅｔ阻害剤が処理された試料中）のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準を測定する段階を含んでもよい。前記段階（１）と段階（２）は、それぞれ（ｉ）前記生物試料にｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を処理（添加）して反応させる段階；ならびに（ｉｉ）前記得られた反応物を分析してｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上を定量する段階を含むことができる。前記段階（ｉ）以前に、生物試料を用意する段階を追加的に含むことができる。前記生物試料を用意する段階は、患者から生物試料を得る（分離する）段階または患者から分離された生物試料を入手する段階を含んでもよい。前記段階（ｉ）で、前記相互作用する物質は、ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦの検出に使用するためのものであって、ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦに特異的に結合する全ての低分子化合物（例えば、蛍光体、染料（ｄｙｅ）など）、蛋白質（抗体、アプタマーなど）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦに特異的に結合する化合物、抗体、アプタマー、またはｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦをコードする遺伝子の一部または全部に結合するポリヌクレオチド（例えば、プライマー、プローブ、アプタマーなど）、化合物、またはこれらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。前記相互作用する物質は、蛍光物質、発色物質などの通常の標識物質で標識されるか、または標識されないものであってもよい。前記段階（ｉ）は、前記生物試料に前記相互作用する物質を処理（添加）して複合体を形成させる段階であってもよい。前記段階（ｉｉ）における前記反応物は、段階（ｉ）で得られたｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上及びこれらと相互作用する物質が相互作用（結合）して生成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であってもよく、前記定量する段階は、前記生成された複合体を定量するか、前記複合体に接合された標識物質を測定するか、または前記複合体を試料から分離した後、これからｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、またはこれらをコードする遺伝子を再び分離したｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、またはこれらをコードする遺伝子を定量する段階を含んでもよい。前記ｂＩＧ−Ｈ３およびＭＩＦの定量段階は、蛋白質定量に使用される全ての通常の手段、例えば、免疫クロマトグラフィー、免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；  例えば、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  ａｓｓａｙ、  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｋｉｔ、  ＢＤバイオサイエンス社製）、細胞内染色（Ｉｎｔｒａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ（ルミネックス社）などによって遂行できるが、これらに制限されるわけではない。ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦをコードする遺伝子の定量段階は、遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）定量に使用される全ての通常の手段、例えば、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等）、ｍＲＮＡマイクロアレイなどを用いて遂行できるが、これらに制限されるわけではない。
【００６５】
前記効能検証方法は、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の継続的な使用可否判断及び／または前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件（例えば、投与量、投与間隔、投与回数など）の決定に活用することができる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準より減少した場合、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を継続して使用できると判断することができる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準の約０から約８０重量％、約０から約７０重量％、約０から約６０重量％、約０から約５０重量％、約０から約４０重量％、約０から約３０重量％、約０から約２０重量％、または約０から約１０重量％である場合、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を継続して使用できると判断することができる。また、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準より減少した場合、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与条件を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件と判断することができる。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤処理群または処理後の生物試料内のｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、及びこれらをコードする遺伝子からなる群より選択された１種以上の水準が、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤無処理群または処理前の水準の、約０から約８０重量％、約０から約７０重量％、約０から約６０重量％、約０から約５０重量％、約０から約４０重量％、約０から約３０重量％、約０から約２０重量％、または約０から約１０重量％である場合のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与条件を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件と判断することができる。前記投与条件は、投与容量、投与間隔、投与回数などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００６６】
他の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤をｃ−Ｍｅｔの阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ抑制方法が提供される。他の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を癌の予防及び／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む、癌の予防及び／または治療方法が提供される。前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法において、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与は、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証方法で判断されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適切な投与条件、例えば、投与量、投与間隔、及び／または投与回数によって行なうことができる。
【００６７】
前記ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ及びこれらをコードする遺伝子の水準は、前記蛋白質または遺伝子と相互作用する物質を用いる通常の全ての蛋白質分析方法によって測定できる。前記ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ及びこれらをコードする遺伝子の水準は、前記蛋白質または遺伝子と相互作用する物質は、ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３、またはＭＩＦ蛋白質に特異的に結合する化合物、抗体、アプタマー、及びＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３、またはＭＩＦをコードする遺伝子の全部または一部に結合するポリヌクレオチド（例えば、プライマー、プローブ、アプタマーなど）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３、及びＭＩＦ蛋白質の水準は、前記ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３、またはＭＩＦ蛋白質に特異的に結合する化合物、抗体、アプタマーなどを用いる通常の酵素反応、蛍光、発光及び／または放射線検出を通じて測定することができ、具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイ、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；  例えば、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  ａｓｓａｙ（ＢＤバイオサイエンス社製）、細胞内染色（Ｉｎｔｒａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ））、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ（ルミネックス社）などからなる群より選択された方法によって測定することができるが、これに制限されるものではない。また、前記ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦをコードする遺伝子の水準は、通常の遺伝子分析方法を用いて測定することができ、例えば、前記遺伝子と混成化可能なプライマー、プローブ、またはアプタマーを使用する通常の遺伝子分析方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、マイクロアレイ法、などを用いて測定することができるが、これに制限されるものではない。一実施形態では、前記プライマーは、ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦをコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列において連続する５から２００００ｂｐ、または５から１０００ｂｐ、例えば、１０から１５００ｂｐ、１０から１０００ｂｐ、１０から５００ｂｐ、２０から２００ｂｐ、または５０から２００ｂｐの遺伝子断片を検出できるものであって、前記遺伝子断片の３’−末端及び５’−末端それぞれの連続する５から２００��ｂｐ、５から１５００ｂｐ、５から１０００ｂｐ、５から５００ｂｐ、５から１００ｂｐ、例えば、５から５０ｂｐ、５から３０ｂｐ、または１０から２５ｂｐ部位とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的な）塩基配列を有するプライマー対であってもよい。前記遺伝子とハイブリダイズ可能なプローブまたはアプタマーは、ＩＬ−８、ｂＩＧ−Ｈ３またはＭＩＦをコードする遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列において連続する５から１００ｂｐ、５から５０ｂｐ、５から３０ｂｐ、または５から２５ｂｐの遺伝子断片とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的）塩基配列を有するものであってもよい。前記‘ハイブリダイズ可能’であるとは、前記遺伝子部位の塩基配列と８０％以上、例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有することによって相補的結合が可能であるのを意味し得る。
【００６８】
一方、ＲＡＳ−ＲＡＦ経路は、代表的な細胞増殖シグナル経路であって、癌細胞の増殖に主要な経路である。このような理由で、ＲＡＳ−ＲＡＦ経路は抗癌剤開発の主要標的になってきた。したがって、ＲＡＳ−ＲＡＦ経路の変異はこれを標的とする薬物の効能に影響を与える重要な因子になり得る。しかし、現在までｃ−Ｍｅｔ蛋白質とＲＡＳ−ＲＡＦ変異との関係が報告されたことがない。
【００６９】
本発明の一実施形態では、ＲＡＳ及び／またはＲＡＦ変異の有無によってｃ−Ｍｅｔ阻害剤に対する反応性が変わることを確認した（実施例４参照）。より具体的には、生物試料のＲＡＳ及び／またはＲＡＦの変異が観察される場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者では、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、例えば抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を適用時、その効能が発揮されないことを確認することができる。
【００７０】
即ち、ＲＡＳ及び／またはＲＡＦの変異を検出することによって、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能を予測するか、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を適用するのに適した対象を選別することに有用に使用できる。これに基づいて、ＲＡＳ−ＲＡＦのｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測マーカーとしての有用性を最初に提案する。
【００７１】
ＲＡＳ蛋白質は、ＧＴＰａｓｅのスーパーファミリーに属する蛋白質であって、マウス、ラットなどのげっ歯類、ヒト、サルなどの霊長類などを含む哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの脊椎動物に由来するＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳなどより選択されたものであってもよい。例えば、ＫＲＡＳはヒトＫＲＡＳ（ＮＰ＿００４９７６．２、ＮＰ＿２０３５２４．１など）、マウスＫＲＡＳ（ＮＰ＿０６７２５９．４など）、ゼブラフィッシュＫＲＡＳ（ＮＰ＿００１００３７４４．１など）、カエルＫＲＡＳ（ＮＰ＿００１０９５２０９．１）、ウシＫＲＡＳ（ＮＰ＿００１１０３４７１．１）、ニワトリＫＲＡＳ（ＮＰ＿００１２４３０９１．１）、サルＫＲＡＳ（ＮＰ＿００１２４８４４１．１）、ＮＰ＿００１０２８１５３．１、ＮＰ＿１１３７０３．１、およびＮＰ＿００１００８０３４．１からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。ＫＲＡＳをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）は、例えばＮＭ＿００４９８５．４、ＮＭ＿０３３３６０．３、ＮＭ＿０２１２８４．６、ＮＭ＿００１００３７４４．１、ＮＭ＿００１１０１７３９．１、ＮＭ＿００１１１０００１．１、ＮＭ＿００１２５６１６２．１、ＮＭ＿００１２６１５１２．２、ＮＭ＿００１０３２９８１．２、ＮＭ＿０３１５１５．３、およびＮＭ＿００１００８０３３．１からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７２】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測と関連するＫＲＡＳの変異は、例えば、野生型ＫＲＡＳ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００４９８５）のコドン１２ＧＧＴ（ＮＰ＿００４９７６のアミノ酸配列の中、１２番目位置するＧｌｙに該当）及び／またはコドン１３ＧＧＣ（ＮＰ＿００４９７６のアミノ酸配列の中、１３番目位置するＧｌｙに該当）が下記の表１のように置換されたものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００７３】
【表１】
2015129755.tif 000003
【００７４】
この他にも、ＮＰ＿００４９７６のアミノ酸配列の中、１３番目に位置するアミノ酸であるＧｌｙ、２４番目に位置するアミノ酸であるＩｌｅ、５９番目に位置するアミノ酸であるＡｌａ、６１番目に位置するアミノ酸であるＧｌｎ、及び１４６番目に位置するアミノ酸であるＡｌａからなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたもの、および／またはＫＲＡＳをコードする遺伝子において上記のアミノ酸変異（置換）を誘導するように変異（置換）がされた核酸であってもよい。例えば、前記ＫＲＡＳの変異は、ＮＰ＿００４９７６のアミノ酸配列基準に、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ａ１４６Ｔ、Ａ５９Ｔ、Ｌ２３Ｒ、Ｇ１３Ｎ、Ｇ１３Ｄ、Ｉ２４Ｆ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１３Ｃ、及びＱ６１Ｋ、ならびにＫＲＡＳをコードする遺伝子において上記のアミノ酸変異（置換）を誘導するように変異（置換）がされた核酸からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸変異を含むことができる。
【００７５】
【化１】
2015129755.tif 000004
【００７６】
ＲＡＦは、マウス、ラットなどのげっ歯類、ヒト、サルなどの霊長類などを含む哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などの脊椎動物に由来するＢＲＡＦ、ｃ−ＲＡＦ、Ａ−ＲＡＦ、Ｖ−ＲＡＦ、ＫＳＲ１、ＫＳＲ２などからなる群より選択されたものであってもよい。例えば、ＢＲＡＦは、ヒトＢＲＡＦ（ＮＰ＿００４３２４．２など）、マウスＢＲＡＦ（ＮＰ＿６４７４５５．３など）、カエルＢＲＡＦ（ＮＰ＿００１０８３５２６．１など）、ゼブラフィッシュＢＲＡＦ（ＮＰ＿９９１３０７．２など）、ラットＢＲＡＦ（ＮＰ＿５７９８１７．１など）、およびニワトリＫＲＡＳ（ＮＰ＿９９０６３３．１など）からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。ＢＲＡＦをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）は、例えばＮＭ＿００４３３３．４、ＮＭ＿１３９２９４．５、ＮＭ＿００１０９００５７．１、ＮＭ＿２０５７４４．３、ＮＭ＿１３３２８３．１、およびＮＭ＿２０５３０２．１からなる群より選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７７】
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測と関連するＢＲＡＦの変異は、例えば、野生型ＢＲＡＦ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００４３２４）のアミノ酸配列（配列番号１１０）を基準に、５９６番目アミノ酸（Ｇ）、６００番目アミノ酸（Ｖ）、６０１番目アミノ酸（Ｋ）、４６９番目アミノ酸（Ｇ）、４６６番目アミノ酸（Ｇ）、５９６番目アミノ酸、５８１番目アミノ酸（Ｎ）、５９７番目アミノ酸（Ｌ）、４６４番目アミノ酸（Ｇ）などからなる群より選択された一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異であり得る。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測と関連するＢＲＡＦの変異は、次の変異のうちの一つ以上に該当するアミノ酸変異、ＢＲＡＦをコードする遺伝子において下記のアミノ酸変異（置換）を誘導するように変異（置換）がされた核酸；またはこれらの組み合わせであり得る：Ｇ５９６Ｒ（５９６番目アミノ酸ＧがＲに置換）、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｒ、Ｋ６０１Ｅ、Ｋ６０１Ｅ、Ｇ４６９Ａ、Ｖ６００Ｍ、Ｇ４６９Ａ、Ｖ６００Ｌ、Ｇ４６６Ｖ、Ｖ６００Ｄ、Ｇ４６９Ｖ、Ｄ５９４Ａ、Ｄ５９４Ｇ、Ｄ５９４Ｎ、Ｎ５８１Ｓ、Ｌ５９７Ｖ、Ｌ５９７Ｓ、Ｌ５９７Ｑ、Ｋ６０１Ｎ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６９Ｅなど。
【００７８】
【化２】
2015129755.tif 000005
【００７９】
一実施形態では、ＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異の検出物質を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測用組成物、またはキットが提供される。
【００８０】
他の実施形態では、ＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異の検出物質を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別用組成物、またはキットが提供される。
【００８１】
他の実施形態では、生物試料中のＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異有無を検出する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測のための情報を提供する方法、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法が提供される。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別方法において、生物試料中のＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異が検出されない場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者では、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断（予測）するか、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者をｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象と判断することができる。したがって、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測または効能予測のための情報を提供する方法は、前記生物試料内のＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異が検出されない場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者では前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮すると判断（予測）する段階を、前記測定（検出）する段階以後に追加的に含むことができる。また、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別方法またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象の選別のための情報を提供する方法は、前記生物試料内のＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異が検出されない場合、前記生物試料または前記生物試料が由来する患者を前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象と判断する段階を、前記測定（検出）する段階以後に追加的に含むことができる。
【００８２】
前記生物試料内のＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異有無を検出する段階は、（ｉ）ＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異を検出可能な物質で前記生物試料を処理（または、前記生物試料に添加）して反応させる段階；ならびに（ｉｉ）得られた反応物の存在の有無を検出し、ＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上の変異を検出する段階を含むことができる。前記段階（ｉ）以前に、生物試料を用意する段階を追加的に含むことができる。前記生物試料を用意する段階は、患者から生物試料を得る（分離する）段階または患者から分離された生物試料を入手する段階を含んでもよい。前記段階（ｉ）で、前記変異を検出可能な物質は、ＫＲＡＳ遺伝子及び／またはＢＲＡＦ遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列において変異部位を含む連続する５から２０００ｂｐ、５から１５００ｂｐ、５から１０００ｂｐ、５から５００ｂｐ、５から１００ｂｐ、５から５０ｂｐ、５から３０ｂｐ、または５から２５ｂｐの遺伝子断片と混成化可能な（例えば、相補的）塩基配列を含むプローブまたはアプタマー、ＫＲＡＳ遺伝子及び／またはＢＲＡＦ遺伝子（全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の塩基配列において変異部位を含む連続する５から２０００ｂｐ、５から１０００ｂｐ、例えば、１０から１５００ｂｐ、１０から１０００ｂｐ、１０から５００ｂｐ、２０から２００ｂｐ、または５０から２００ｂｐの遺伝子断片の３’末端及び５’末端の連続する５から１００ｂｐ、５から５０ｂｐ、５から３０ｂｐ、または５から２５ｂｐの部位にハイブリダイズ可能な（例えば、相補的な）塩基配列を有するプライマー対などからなる群より選択される１種以上であってもよく、これらは蛍光物質、発色物質などの標識物質で標識されるか、または標識されないものであってもよい。前記‘ハイブリダイズ可能’であるとは、前記遺伝子部位の塩基配列と８０％以上、例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有することによって相補的結合が可能であることを意味し得る。前記段階（ｉ）は、前記生物試料に前記変異を検出可能な物質を処理（添加）して複合体を形成させる段階であってもよい。
【００８３】
前記段階（ｉｉ）で、前記反応物は、段階（ｉ）で得られたＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子からなる群より選択された１種以上と、検出可能な物質とがハイブリダイズされて生成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であってもよく、前記変異を検出する段階は、前記生成された複合体の存在有無を検出するか、前記複合体に接合された標識物質を検出するか、または前記複合体を試料から分離した後、これからＫＲＡＳ遺伝子及び／もしくはＢＲＡＦ遺伝子、若しくはそれらの断片を分離して塩基配列を分析する段階を含んでもよい。
【００８４】
一方、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のようなｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療の特性上、適用される癌細胞のｃ−Ｍｅｔ発現量が一定水準以上であることが、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が効能を発揮できる前提になり得る。
【００８５】
したがって、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤効能予測、患者選別、または効能検定のための組成物及び／またはキットは、ＩＬ−８、ｂ−ＩＧ−Ｈ３、ＭＩＦ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ、及びこれらの遺伝子からなる群より選択された１種以上と、相互作用する物質とに加えて、ｃ−Ｍｅｔ及びｃ−Ｍｅｔ遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質を追加的に含むことができる。前記ｃ−Ｍｅｔ及びｃ−Ｍｅｔ遺伝子からなる群より選択された１種以上と相互作用する物質は、ｃ−Ｍｅｔ及び／またはｃ−Ｍｅｔ遺伝子と特異的に反応する（または特異的に結合する）低分子化合物、蛋白質、ペプチド、核酸（ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）、などからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ及び／またはｃ−Ｍｅｔ遺伝子と相互作用する物質は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する低分子化合物、抗体及びアプタマー、及びｃ−Ｍｅｔ遺伝子の全部または一部（例えば、約５から約１００ｂｐ、約５から５０ｂｐ、約５から約３０ｂｐ、または約５から約２５ｂｐ）に結合する核酸（例えば、プライマー、プローブ、アプタマーなど）からなる群より選択された１種以上であってもよく、これらは、選択的に、通常の標識、例えば蛍光物質、発色物質などで標識されたものであってもよい。
【００８６】
また、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測方法（もしくは効能予測に情報を提供する方法）またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別方法（もしくは対象選別に情報を提供する方法）は、患者から得られた生物試料のｃ−Ｍｅｔ蛋白質水準またはこれをコードする遺伝子（例えば、全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）の水準を測定する段階を追加的に含むことができる。その具体的な測定段階は、前述の通りである。例えば、通常のウエスタンブロッティング方法を用いる場合は、前記生物試料（例えば、癌細胞または癌組織）から得られた所定量（例えば、１０μｇ）の全体細胞蛋白質をＳＤＳ＿ＰＡＧＥゲルにロードし、メンブレンに転写する。その後、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とメンブレンとを反応させた後、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）反応を通じて一定時間（例えば、３０秒程度）暴露する。この際、バンド（ｂａｎｄ）が検出される場合は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療が効能を示すことができる前提要件が満たされたと判断することができる。他の実施形態では、癌組織を用いた組織切片（Ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ）（ＦＦＰＥ（Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ、ホルマリン固定パラフィン包埋組織）など）用いた免疫組織化学染色（ＩＨＣ、Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により判定した場合において、ｃ−Ｍｅｔ水準が＋２以上のとき、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療が効能を示すことができる前提要件が満たされたと言える。また他の実施形態では、マイクロアレイ（例えば、アフィメトリクスアレイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｒｒａｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ａｒｒａｙ；  プライマーセット“２０３５１０＿ａｔ”を使用）を使用し、製造者の説明書によってｍＲＮＡ水準を測定した結果、生物試料内ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡ水準が１２，０００以上、１３，０００以上または１４，０００以上である場合、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療が効能を示すことができる前提要件が満たされたと判断できる。このようなｃ−Ｍｅｔの高発現特性を有する癌細胞は、主に肺癌、乳癌、脳癌、胃癌、肝癌、腎癌などの癌細胞であり得るが、他の種類の癌細胞でも患者個々人の特性によってｃ−Ｍｅｔ発現量が高い場合もｃ−Ｍｅｔ阻害剤を用いる治療対象に含まれる。
【００８７】
他の実施形態で、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測方法（もしくは効能予測に情報を提供する方法）またはｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象選別方法（もしくは対象選別に情報を提供する方法）で使用された生物試料は、ｃ−Ｍｅｔ発現量が高い組織、細胞、または体液（血液、血清、小便、唾液など）であってもよい。例えば、アフィメトリクスアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ａｒｒａｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ａｒｒａｙ；  プライマーセット“２０３５１０＿ａｔ”を使用）を用いた測定結果、ｃ−Ｍｅｔ水準が１２，０００以上、１３，０００以上または１４，０００以上である組織、細胞、または体液（血液、血清、小便、唾液など）であってもよい。
【００８８】
他の実施形態では、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ抑制方法を提供する。
【００８９】
他の実施形態では、前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与する段階を含む、癌の予防及び／または治療方法を提供する。
【００９０】
前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体適用対象を選別する段階を、前記投与段階以前に追加的に含むことができ、その具体的方法及び段階は前述の通りである。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってもよい。
【００９１】
より具体的には、前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象を確認する段階；ならびに前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤の薬学的有効量を投与する段階を含むことができる。
【００９２】
他の実施形態では、前記ｃ−Ｍｅｔ抑制方法または癌の予防及び／または治療方法は、生物試料のＫＲＡＳ遺伝子及びＢＲＡＦ遺伝子の変異有無を検出してｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象を選別する段階；ならびに前記選別されたｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象にｃ−Ｍｅｔ阻害剤の薬学的有効量を投与する段階を含むことができる。
【００９３】
本明細書では、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の適用対象は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を使用する治療法を適用するのに適した患者を意味するものであって、全ての哺乳類、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類であってもよく、例えば、癌患者であってもよい。前記生物試料は、患者自身（例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などを含む哺乳類）、または前記患者から分離されるもしくは人工的に培養された細胞、組織、体液（例えば、血液、血清、小便、唾液など）などであってもよく、例えば、血液または血清であってもよい。
【００９４】
本明細書において、「ｃ−Ｍｅｔ阻害剤」という用語は、ｃ−Ｍｅｔの活性および／もしくは発現を阻害し、またはｃ−Ｍｅｔのリガンドを阻害することによりｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を遮断することができる薬剤を意味する。一実施形態では、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体およびその抗原結合断片；ならびにクリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ；ＰＦ−０２３４１０６６；３−（（Ｒ）−１−２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）−５−１−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ；ＸＬ−１８４；Ｎ−（４−（６，７−ジメトキシキノリン−４−イルオキシ）フェニル）−Ｎ−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド）、フォレチニブ（ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ；Ｎ−（３−フルオロ−４−（６−メトキシ−７−（３−モルホリノプロポキシ）キノリン−４−イルオキシ）フェニル）−Ｎ−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド）、ＰＨＡ−６６５７５２（（Ｒ，Ｚ）−５−（２，６−ジクロロベンジルスルホニル）−３−（（３，５−ジメチル−４−（２−（ピロリジン−１−イルメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン）インドリン−２−オン）、ＳＵ１１２７４（（Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（（３，５−ジメチル−４−（１−メチルピペラジン−４−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド）、ＳＧＸ−５２３（６−（６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イルチオ）キノリン）、ＰＦ−０４２１７９０３（２−（４−（３−（キノリン−６−イルメチル）−３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノール）、ＥＭＤ１２１４０６３（ベンゾニトリル、３−［１，６−ジヒドロ−１−［［３−［５−［（１−メチル−４−ピペリジニル）メトキシ］−２−ピリミジニル］フェニル］メチル］−６−オキソ−３−ピリダジニル］）、ゴルバチニブ（Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ；Ｎ−（２−フルオロ−４−（（２−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ピペリジン−１−カルボキシアミド）ピリジン−４−イル）オキシ）フェニル）−Ｎ−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド）、ＩＮＣＢ２８０６０（２−フルオロ−Ｎ−メチル−４−（７−（キノリン−６−イルメチル）イミダゾ［１，２−ｂ］［１，２，４］トリアジン−２−イル）ベンズアミド）、ＭＫ−２４６１（Ｎ−（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド）、チバンチニブ（ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ；ＡＲＱ１９７；（３Ｒ，４Ｒ）−３−（５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）ピロリジン−２，５−ジオン）、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２（６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］キノリン）、ＡＭＧ４５８（｛１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−［５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ）ピリジン−２−イル］−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド｝）、ＢＭＳ７９４８３３（Ｎ−（４−（（２−アミノ−３−クロロピリジン−４−イル）オキシ）−３−フルオロフェニル）−５−（４−フルオロフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド）、ＢＭＳ７７７６０７（Ｎ−［４−［（２−アミノ−３−クロロピリジン−４−イル）オキシ］−３−フルオロフェニル］−４−エトキシ−１−（４−フルオロフェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド）、ＭＧＣＤ−２６５（Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−７−イルオキシ）フェニルカルバモチオイル）−２−フェニルアセトアミド）、ＡＭＧ−２０８（７−メトキシ−４−［（６−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル）メトキシ］キノリン）、ＢＭＳ−７５４８０７（（２Ｓ）−１−［４−［（５−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−２−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−３−ピリジニル）−２−メチル−２−ピロリジンカルボキサミド）、ＪＮＪ−３８８７７６０５（６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］キノリン）、およびこれらの薬学的に許容可能な塩などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００９５】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔを抗原に認識及び／またはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する全ての抗体またはそれらの抗原結合断片であってもよい。前記抗原結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよい。例えば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して細胞内移動（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導する全ての抗体またはそれらの抗原結合断片であってもよい。前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔの特定部位、例えば、ＳＥＭＡドメイン内の特定部位をエピトープとして認識するものであってもよい。
【００９６】
本明細書では、別途の言及がない限り、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体としては、完全な形態の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（例えば、ＩｇＧ形態）だけでなく、前記抗体の抗原結合断片も使用される。
【００９７】
前記「ｃ−Ｍｅｔ蛋白質」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔ蛋白質は、全ての種に由来するものであってもよく、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６．２）、サルｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ＮＰ＿００１１６２１００）などのような霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７．２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５．１）などのようなげっ歯類由来のものなどであってもよい。前記蛋白質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００２４５．２に提供されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００２３６に提供されたポリペプチド配列によってコードされた蛋白質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、癌発生、癌転移、癌細胞移動、癌細胞浸潤、血管新生などの様々な機序に関与する。
【００９８】
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の受容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の三つの部分に区分され、細胞外部位は、α−サブユニットとβ−サブユニットとが二硫化ジスルフィド結合によって連結された形態であり、ＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（ｐｌｅｘｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ）及びＩＰＴドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｆｏｌｄ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ｐｌｅｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｏｍａｉｎ）を含む。ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を有するものであってもよく、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在するドメインであって、ＨＧＦが結合する部位に該当する。ＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）中の特定部位、つまり、ＳＥＭＡドメインの１０６番目から１２４番目までに該当する配列番号７１で示されるアミノ酸配列を有する領域は、ＳＥＭＡドメイン内のエピトープ中の第２番目と３番目のプロペラ領域間のループ（ｌｏｏｐ）領域に該当する。この領域は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープとして作用することができる。
【００９９】
用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一実施形態によれば、前記エピトープは、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の連続する５個以上のアミノ酸を含む部位、例えば、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の１０６番目から１２４番目までに該当する配列番号７１内に位置する連続する５個から１９個のアミノ酸を含むものであってもよい。例えば、前記エピトープは、配列番号７１のアミノ酸配列において配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含んで連続する５から１９個のアミノ酸からなるものであってもよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
【０１００】
前記配列番号７２のアミノ酸配列を有するエピトープは、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質のＳＥＭＡドメイン内の第２番目と３番目のプロペラ領域間のループ部位の中の最も外側に位置した部位に該当し、前記配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープは、一実施形態による抗体または抗原結合断片が最も特異的に結合する部位である。
【０１０１】
したがって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号配列番号７１のアミノ酸配列において、配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５から１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するものであってもよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープに、特異的に結合する抗体または抗原結合断片であってもよい。
【０１０２】
一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つを含むものであってもよい；
（ｉ）下記ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変部位；  配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、  配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８から１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、  及び配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６から１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３
（ｉｉ）下記ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、もしくは前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変部位；  配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、  配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、  及び配列番号９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む連続する９から１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｉｉ）前記重鎖相補性決定領域及び軽鎖相補性決定領域の組み合わせ
（ｉｖ）前記重鎖可変部位及び軽鎖可変部位の組み合わせ。
【０１０３】
前記配列番号４から配列番号９はそれぞれ、下記の一般式Ｉから一般式ＶＩで示されるアミノ酸配列である：
【０１０４】
【化３】
2015129755.tif 000006
【０１０５】
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は存在しないかＰｒｏまたはＳｅｒであり、Ｘａａ２はＧｌｕまたはＡｓｐである。前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３はＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５はＡｓｎまたはＴｈｒである。前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６はＳｅｒまたはＴｈｒである。前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８はＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９はＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０はＬｙｓまたはＡｓｎである。前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２はＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３はＳｅｒまたはＰｒｏである。前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４はＧｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６はＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【０１０６】
一実施形態では、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号８５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【０１０７】
前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号１０６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、及び配列番号８９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【０１０８】
一実施形態では、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号８５からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変部位；ならびに配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号１０６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、及び配列番号８９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変部位を含むものであってもよい。
【０１０９】
一実施形態によれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片において、前記重鎖可変部位は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変部位は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【０１１０】
他の実施形態では、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはそれらの抗原結合断片は、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ；ＭｅｔＭａｂ）、ＬＹ２８７５３５８（重鎖：配列番号１１１；  軽鎖：配列番号１１２）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ；ＡＭＧ１０２）、またはそれらの抗原結合断片などであってもよい。
【０１１１】
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて産生する動物由来抗体は、一般に、治療目的でヒトに投与時、免疫拒絶反応が起こることがある。このような免疫拒絶反応を抑制するために、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝子工学的方法を用いて、抗−アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因とされる動物由来抗体の不変部位をヒト抗体の不変部位に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて、抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、相変わらず動物由来アミノ酸が可変部位に存在していて、潜在的な抗−イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善するために開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変部位のうち、抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ部位をヒト抗体フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して製作される。
【０１１２】
ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なのは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れる最適化されたヒト抗体を選定することであり、このために、抗体データベースの活用、結晶構造の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化されたヒト抗体のフレームワークに動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体のフレームワークに位置しながら、抗原結合に影響を与えるアミノ酸が存在する場合があるので、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在することから、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須と言える。
【０１１３】
一実施形態によれば、前記抗体は、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト由来抗体であってもよい。前記抗体は、生体から分離されたものであってもよい。
【０１１４】
完全な抗体は、２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。抗体の不変部位（Ｆｃ）は、重鎖不変部位（ＣＨ）と、軽鎖不変部位（ＣＬ）とに分けられ、重鎖不変部位は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変部位は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【０１１５】
用語「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために、十分な可変部位配列を有するアミノ酸配列を含む可変部位ドメインＶＨ、３個の不変部位ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、ならびにヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖及びその断片を全て含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」は抗原に特異性を付与するための十分な可変部位配列を有するアミノ酸配列を含む可変部位ドメインＶＬ、及び不変部位ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て含む意味として解釈される。
【０１１６】
用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変部位（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列（相補性決定領域）を意味する。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、及びＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにおいて主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原及び抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応を行なうことを意味する。
【０１１７】
用語「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体構造に対するそれの断片で、抗原が結合可能な部分を含むポリペプチドの一部を意味する。一実施形態では、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変部位と、軽鎖の不変部位、及び重鎖の１番目の不変部位（ＣＨ１）を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。
【０１１８】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点からＦａｂと差がある。
【０１１９】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体片で、Ｆｖ断片を生成する組み換え技術は当業界に広く公知されている。
【０１２０】
二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを通じて重鎖の可変部位と単鎖の可変部位とが共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直接連結されていて、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造を成すことができる。前記ペプチドリンカーは、１から１００個または２から５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよく、その含まれているアミノ酸の種類は制限がない。
【０１２１】
前記抗原結合断片は、蛋白質加水分解酵素を用いて得られ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる）、遺伝子組み換え技術によって製作することができる。
【０１２２】
用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１及びＣＨ２領域の間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。
【０１２３】
非ヒト動物由来抗体がキメラ化（ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）過程を経ると、非ヒト動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジに置換されるが、非ヒト動物由来のＩｇＧ１ヒンジはヒトＩｇＧ１ヒンジに比べてその長さが短く、二つの重鎖の間の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）が３個から２個に減少し、ヒンジの硬直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が互いに相異なる効果を示す。したがって、ヒンジ領域の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）はヒト化抗体の抗原結合効率性を増加させることができる。前記ヒンジ領域のアミノ酸配列を変形させるためのアミノ酸の欠失、付加または置換方法は当業者によく知られている。
【０１２４】
ここで、本発明の一実施形態では、抗原結合効率性を増進させるために、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片は一つ以上のアミノ酸が欠失、付加または置換されてアミノ酸配列が改変されたヒンジ領域を含むものであってもよい。例えば、前記抗体は、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、または配列番号１０４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域、または配列番号１０５のアミノ酸配列を有するヒンジ領域（非変形ヒトヒンジ領域）を含むものであってもよい。より具体的には、前記ヒンジ領域は、配列番号１００または配列番号１０１のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【０１２５】
一実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０のハイブリドーマ細胞から産生される、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質の細胞外部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であってもよい（大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号公報参照；前記文献は本明細書に参照として含まれる）。前記の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、大韓民国公開特許第２０１１−００４７６９８号公報に定義された抗体を全て含むことができる。
【０１２６】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の前記定義されたＣＤＲ部位または軽鎖可変部位と重鎖可変部位を除いた部位、例えば、軽鎖不変部位と重鎖不変部位は、全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、またはＩｇＭなど）に由来したものであってもよい。
【０１２７】
一実施形態によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列、配列番号６４のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列、配列番号６６のアミノ酸配列（このうち、１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、及び配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに配列番号６８のアミノ酸配列（このうち、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、配列番号７０のアミノ酸配列（このうち、１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）、配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列、及び配列番号１０８のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものであってもよい。
【０１２８】
例えば、前記抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号７０または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体；ならびに配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体からなる群より選択されたものであってもよい。
【０１２９】
一方、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて３６番（ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う、配列番号６８内の６２番目のアミノ酸の位置）のヒスチジン（Ｈｉｓ）がチロシン（Ｔｙｒ）に置換された形態のポリペプチドである。前記置換によって、一実施形態による抗体の産生量が増加され得る。また、前記配列番号１０８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号６８のアミノ酸配列中の１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除いた２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいてｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによる２７ｅ位置（ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う、配列番号１０８内の３２番目の位置；ＣＤＲ−Ｌ１の内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換されたもので、前記置換によって、一実施形態による抗体の活性（例えば、ｃ−Ｍｅｔに対する結合親和性、ｃ−Ｍｅｔの分解活性、及びＡｋｔのリン酸化抑制活性など）がより増進できる。
【０１３０】
一実施形態においては、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体であってもよい。
【０１３１】
前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、薬学的に許容可能な担体と共に適用（投与）できる。前記薬学的に許容可能な担体は、薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、前記成分以外に、医薬組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
【０１３２】
前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、または直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、蛋白質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与されてもよい。
【０１３３】
本明細書において、「薬学的有効量」は、薬物が薬学的に有意な効果を奏する量を意味する。１回投与のためのｃ−Ｍｅｔ阻害剤の薬学的有効量は、製剤化方法、投与方式、患者の年令、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方できる。例えば、１回投与のための前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の薬学的有効量は、０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ、または０．０２から１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに制限されるものではない。前記１回投与のための薬学的有効量は、単位用量の形態で一つの製剤に製剤化されるか、適切に分量して製剤化されるか、多用量容器内に入れて製造されてもよい。
【０１３４】
本発明で、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、癌の予防及び／または治療に使用できる。前記癌は、ｃ−Ｍｅｔの過発現及び／または（異常な）活性化に関連するものであってもよく、固形癌または血液癌であってもよい。例えば、前記癌は、これに制限されないが、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記癌はｃ−Ｍｅｔ阻害剤（例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体）抵抗性癌であってもよい。前記癌は原発性癌または転移性癌であってもよい。
【０１３５】
前記癌の予防及び／または治療効果は、癌細胞の成長を抑制する効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制して、これによる癌の悪化を抑制する効果を含む。また、原発性癌だけでなく、転移性癌に対する効果を含む。
【実施例】
【０１３６】
以下、本発明を実施例及び試験例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び試験例は、本発明を例示するためのもので、本発明を制限すると解釈されてはならない。
【０１３７】
（参考例１：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の作製）
１．１．ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体‘ＡｂＦ４６’の産生
１．１．１．マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のマウスに、１匹当り１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と、同量の完全フロイントアジュバントを混合して、４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射した。２週後に、前記と同様の方法で、前記抗原として使用されたヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質を、前記注射した量の半分である５０μｇを、同量の不完全フロイントアジュバントと混合して、マウスの腹腔内に注射した。１週後、最後のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）が行われ、３日後に、前記マウスの尾から採血して血清を得た。その後、血液を１／１０００倍にＰＢＳで希釈して、下記のＥＬＩＳＡ法でｃ−Ｍｅｔを認知する抗体の力価が増加することを確認した。前記結果で抗体の量が十分に得られるマウスを選別し、下記の細胞融合過程を行った。
【０１３８】
１．１．２．細胞融合及びハイブリドーマの製造
細胞融合実験３日前に、５０μｇのヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質と等量のＰＢＳとの混合物を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射して免疫した。免疫化されたマウスを麻酔した後、体の左側に位置した脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで粉砕して細胞を分離し、培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合して、脾臓細胞懸濁液を調製した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。前記得られた脾臓細胞１×１０８個と、骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０８個とを混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、培養培地（ＤＭＥＭ）に入っている４５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍｌ）によって３７℃で１分間処理した後、培養培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを添加した。以後、培養培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌを１０分間かけて添加し、３７℃のウォーターバスで５分間放置した。その後、培養培地（ＤＭＥＭ）にて５０ｍｌに合わせて、再び遠心分離した。細胞沈殿物を選択培地（ＨＡＴ培地）で１〜２×１０５／ｍｌ程度に再懸濁させ、９６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに０．１ｍｌずつ分注した後、３７℃の二酸化炭素培養器で培養して、ハイブリドーマ細胞群を作製した。
【０１３９】
１．１．３．ｃ−Ｍｅｔ蛋白質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別
前記参考例１．１．２で製造されたハイブリドーマ細胞群のうち、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質にのみ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質とヒトのＦｃ蛋白質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法によってスクリーニングした。
【０１４０】
マイクロタイタープレートに、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合蛋白質を、１ウェル当りそれぞれ５０μｌ（２μｇ／ｍｌ）ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応しない抗原は洗浄して除去した。ｃ−ＭｅｔでないＦｃに結合される抗体を選別して除外させるために、ヒトのＦｃ蛋白質を、前記と同様の方法でプレート表面に付着させた。
【０１４１】
前記参考例１．１．２で得られたハイブリドーマ細胞の培養液を、前記用意されたそれぞれのウェルに５０μｌずつ加えて１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液−ツイン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄し、反応しない培養液を除去した。これに、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を加えて、１時間、室温で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。その次に、ペルオキシダーゼの基質溶液（ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応の程度は、ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定して確認した。
【０１４２】
前記のような反応程度の確認によって、ヒトのＦｃには結合せず、ヒトのｃ−Ｍｅｔ蛋白質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を繰り返し選別した。繰り返し選別によって得られたハイブリドーマ細胞株を制限稀釈して、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、２００９年１０月６日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である、大韓民国、ソウル、鍾路区、蓮建洞所在の韓国細胞株研究財団に寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０が付与された（韓国公開特許第２０１１−００４７６９８号公報参照）。
【０１４３】
１．１．４．モノクローナル抗体の産生及び精製
前記参考例１．１．３で得られたハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を産生精製した。
【０１４４】
まず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれている培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍｌで培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳで２回以上洗浄し、ＦＢＳが除去された状態で、前記細胞沈殿物を培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍｌに再懸濁させた後、３日間、３７℃の二酸化炭素培養器で培養した。
【０１４５】
以後、遠心分離して、抗体を産生する細胞を除去し、抗体の分泌した培養液を分離して、４℃に保管するか、直ちに集めて、抗体の分離精製に使用した。親和性カラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＵＳＡ）を装着したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記用意された培養液５０ｍｌ〜３００ｍｌから抗体を純粋精製した。その後、蛋白質凝集用フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてＰＢＳで上層液を置換し、精製された抗体を保管し、後の実施例に使用した。
【０１４６】
１．２．ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６の作製
一般に、マウス抗体は、治療目的でヒトに注入された時、免疫拒絶反応（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す可能性が高いため、これを解決するために、前記参考例１．１．で作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原の結合に関連する可変部位（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を除いた不変部位（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を、ヒトＩｇＧ１抗体の配列に置換するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６を作製した。
【０１４７】
重鎖に該当するヌクレオチド配列は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）で、軽鎖に該当するヌクレオチド配列は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ’（配列番号３９）から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。以後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３９）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることにより、キメラ抗体の発現のため重鎖を含むベクター及び軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。
【０１４８】
前記構築されたベクターはそれぞれ、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行なわれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて回収された。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現１日前に細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。すなわち、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した。その後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。
【０１４９】
以後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１５０】
前記培養された細胞を遠心分離し、上清をそれぞれ１００ｍｌ取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（溶出バッファー）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１００４）で溶出させた。得られた溶出物をＰＢＳにバッファー交換し、最終的にキメラ抗体ＡｂＦ４６（以下、ｃｈＡｂＦ４６と名づける）を精製した。
【０１５１】
１．３．キメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６からヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の作製
１．３．１．重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｈｅａｖｙ及びＨ３−ｈｅａｖｙ２種のデザインのために、まず、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、前記参考例１．２で精製されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖腺（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ酸レベルで８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をＫａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、３０番（Ｓ→Ｔ）、４８番（Ｖ→Ｌ）、７３番（Ｄ→Ｎ）、７８番（Ｔ→Ｌ）のアミノ酸は、元々、マウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列に逆変異させた。以後、Ｈ１は、追加的に８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）のアミノ酸に突然変異を与え、最終的にＨ１−ｈｅａｖｙ（配列番号４０）とＨ３−ｈｅａｖｙ（配列番号４１）を構築した。
【０１５２】
Ｈ４−ｈｅａｖｙのデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調べた結果、ＡｂＦ４６抗体のマウスのフレームワーク配列と配列が非常に類似すると同時に、従来の最も安定的と知られているＶＨ３サブタイプを用いて、Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を導入した。これにより、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）を構築した。
【０１５３】
１．３．２．軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｌｉｇｈｔ（配列番号４３）及びＨ２−ｌｉｇｈｔ（配列番号４４）の２種のデザインのために、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルで７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、Ｈ１−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆変異させ、Ｈ２−ｌｉｇｈｔは、４９番のアミノ酸（Ｙ→Ｉ）１個のみを逆変異させて構築した。
【０１５４】
Ｈ３−ｌｉｇｈｔ（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した結果のうち、前記ＶＫ４−１のほか、ＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０は、アミノ酸レベルで６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をＫａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この時、Ｈ３−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆変異させて構築した。
【０１５５】
Ｈ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調べた結果、従来の最も安定的と知られているＶｋ１サブタイプを用いて、Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を導入した。この時、Ｈ４−ｌｉｇｈｔは、３６番（Ｙ→Ｈ）、４６番（Ｌ→Ｍ）、４９番（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を追加的に逆変異させて構築した。
【０１５６】
以後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−ｈｅａｖｙ；配列番号４７、Ｈ３−ｈｅａｖｙ；配列番号４８、Ｈ４−ｈｅａｖｙ；配列番号４９）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記軽鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｈ１−ｌｉｇｈｔ；配列番号５０、Ｈ２−ｌｉｇｈｔ；配列番号５１、Ｈ３−ｌｉｇｈｔ；配列番号５２、Ｈ４−ｌｉｇｈｔ；配列番号５３）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１５７】
前記構築されたベクターはそれぞれ、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行なわれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて回収された。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現１日前の細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を行いった。すなわち、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。
【０１５８】
前記培養された細胞を遠心分離し、上清各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（溶出バッファー）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳにバッファー交換し、最終的にヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と名づける）を精製した。一方、後の実施例で使用したヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重鎖、軽鎖の組み合わせは、Ｈ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）及びＨ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）である。
【０１５９】
１．４．ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変部位及び軽鎖可変部位を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを作製するための遺伝子をデザインした。それぞれの重鎖可変部位及び軽鎖可変部位を‘ＶＨ−リンカー−ＶＬ’の形態となるようにし、前記リンカーは‘ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ’（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド（配列番号５５）をバイオニア社に依頼して合成し、これを発現させるためのベクターを配列番号５６に示した。
【０１６０】
以後、前記ベクターから発現した結果物を分析し、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力を示すことを確認した。
【０１６１】
１．５．親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリー遺伝子の作製
１．５．１．標的ＣＤＲの選定及びプライマーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のために６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、前記作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から‘Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ’によって定義した。それぞれのＣＤＲは下記の表１の通りである。
【０１６２】
【表２】
2015129755.tif 000007
【０１６３】
抗体ＣＤＲのランダム配列導入のために、次のようにプライマーを作製した。従来のランダム配列導入方式は、突然変異を与えようとする部位に同一の割合の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が導入されるようにＮコドンが用いられる。本実施例では、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダム塩基を導入するために、各ＣＤＲのアミノ酸をコードする３個の野生型ヌクレオチド中の１番目及び２番目のヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ導入する方式を採った。また、３番目のヌクレオチドは、同一に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）が導入されるようにプライマーをデザインした。
【０１６４】
１．５．２．ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリーの作製及びｃ−Ｍｅｔに対する結合力の確認
ＣＤＲのランダム配列の導入による抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記参考例１．５．１のような方法で作製されたプライマーを用いて行った。鋳型としてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、２個のＰＣＲ切片を作製し、これを重複拡張重合酵素連鎖反応（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）方法により、所望のＣＤＲのみそれぞれ突然変異したｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を確保して作製された６つのＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。
【０１６５】
このように作製されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔに対する結合力を確認し、それぞれのライブラリーは、野生型に比べてｃ−Ｍｅｔに対する結合力が大部分低下する傾向を示したが、一部でｃ−Ｍｅｔに対する結合力が維持される突然変異を確認した。
【０１６６】
１．６．作製されたライブラリーから親和性の改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔに対するライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。確保された遺伝子配列はそれぞれ下記の表３の通りであり、これをＩｇＧ形態に変換した。下記のクローンのうち、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から産生された４種の抗体を選別して後続の実験を行った。
【０１６７】
【表３】
2015129755.tif 000008
【０１６８】
１．７．選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ’（配列番号３８）の構造を有するように設計された。ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖の場合、親和性の成熟の際に抗体のアミノ酸が変更されなかったので、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま使用した。但し、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒンジでないＵ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）に置換した。軽鎖は‘ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ’の構造を有するように遺伝子が設計された。親和性の成熟後に選別された、前記４種の抗体の軽鎖可変部位を含んでコードするポリヌクレオチド（配列番号５８から配列番号６１）をバイオニア社に依頼して合成した。その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に該当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ切片（Ｌ３−１由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５８、Ｌ３−２由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号５９、Ｌ３−３由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６０、Ｌ３−５由来のＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ切片：配列番号６１）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１０１Ｓ）とＸｈｏＩ（ＮＥＢ社、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いて、クローニングすることにより、親和性の成熟した抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１６９】
前記構築されたベクターはそれぞれ、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行なわれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて回収された。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現１日前の細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を行った。すなわち、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意し、ＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。
【０１７０】
前記培養された細胞を遠心分離して上清各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（溶出バッファー）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳにバッファー交換し、最終的に親和性の成熟した４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｌ３−１由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２（Ｌ３−２由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３（Ｌ３−３由来）、及びｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５（Ｌ３−５由来）と名づける）を精製した。
【０１７１】
１．８．不変部位及び／またはヒンジ領域の置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の製造
前記参考例１．７で選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和性が最も高く、Ａｋｔのリン酸化及びｃ−Ｍｅｔの分解の程度が最も低いと測定されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１を対象に、ヒンジ領域または不変部位及びヒンジ領域の置換された抗体を作製した。
【０１７２】
ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ及びヒトのＩｇＧ１不変部位からなる重鎖、ならびにｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位及びヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）不変部位からなる軽鎖、からなる抗体を、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）と名づけた。ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ及びヒトのＩｇＧ１不変部位からなる重鎖、ならびにｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位及びヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖、からなる抗体を、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  ｈｉｎｇｅ）と名づけた。ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ及びヒトのＩｇＧ２不変部位からなる重鎖、ならびにｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位及びヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖、からなる抗体を、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ）と名づけた。また、一方、前記３種の抗体は、産生量増大のために、ヒトのカッパ不変部位からなる軽鎖の３６番のヒスチジン（Ｈｉｓ）を全てチロシン（Ｔｙｒ）に置換した。
【０１７３】
前記３種の抗体を作製するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ及びヒトのＩｇＧ１不変部位からなるポリペプチド（配列番号６２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ及びヒトのＩｇＧ１不変部位からなるポリペプチド（配列番号６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変部位、ヒトのＩｇＧ２ヒンジ及びヒトのＩｇＧ２不変部位からなるポリペプチド（配列番号６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番のヒスチジンがチロシンに置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変部位及びヒトのカッパ不変部位からなるポリペプチド（配列番号６８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）をバイオニア社に依頼して合成した。以後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１７４】
前記構築されたベクターはそれぞれ、一過性発現はＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行なわれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  ｎｏ．１２６６２）を用いて回収された。使用された細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養された。一過性発現１日前の細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で用意した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時、一過性発現を行なった。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入を行った。すなわち、１５ｍｌのチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の割合でＤＮＡを用意してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）２ｍｌと混合し（Ａ）、他の１５ｍｌのチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（Ｂ）した後、（Ａ）と（Ｂ）とを混合して１５分間インキュベートした後、１日前に用意した細胞に混合液を徐々に入れ混ぜた。形質導入完了後、３７℃、湿度８０％、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器で５日間培養した。
【０１７５】
前記培養された細胞を遠心分離して上清各１００ｍｌを取って、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（溶出バッファー）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳにバッファー交換し、最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  ｈｉｎｇｅ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ））を精製した。このうち、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を代表してｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ）を選択して下記の実施例に使用し、便宜上、前記抗体をＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２と名づけた。
【０１７６】
（実施例１：ＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測及び効能検証）
１．１．癌細胞株移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測及び効能検証試験
１．１．１．癌細胞株移植マウスモデルの製作
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測及び効能検証試験に使用するために、多様な癌細胞株（Ｌｏｖｏ細胞株、ＨＴ−２９細胞株、ＥＢＣ−１細胞株、ＭＫＮ４５細胞株、またはＨｓ７４６Ｔ細胞株）を移植した異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）マウスモデルを製作した。
【０１７７】
具体的には、ヒト大腸癌細胞株であるＨＴ２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８、「ＨＴ−２９」とも称する。）とＬｏｖｏ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２９）細胞をＢＡＬＢ／Ｃヌード（ｎｕｄｅ）マウス（４〜５週齢、ｍａｌｅ；Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に各５×１０６細胞ずつ皮下に（ｓ．ｃ）注入して異種移植マウスモデルを製作した。この時、マウスはグループ当り１５匹ずつを使用した。また、ヒト胃癌細胞株であるＨｓ７４６Ｔ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３５）細胞及びＭＫＮ４５（ＡＴＣＣ  ＲＣＢ１００１）細胞とヒト非小細胞性肺癌細胞株であるＥＢＣ−１（ＡＴＣＣ  ＪＣＲＢ０８２０）細胞を用いて前記と同様な方法で異種移植マウスモデルを製作した。
【０１７８】
前記のように、Ｌｏｖｏ移植マウスモデル、ＨＴ−２９移植マウスモデル、ＥＢＣ−１移植マウスモデル、Ｈｓ７４６Ｔ移植マウスモデル、及びＭＫＮ４５移植マウスモデルを製作して下記の試験に使用した。
【０１７９】
１．１．２．癌細胞株移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測
前記参考例１で製作された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を前記実施例１．１．１で製作されたＬｏｖｏ移植マウスモデル、ＨＴ−２９移植マウスモデル、ＥＢＣ−１移植マウスモデル、Ｈｓ７４６Ｔ移植マウスモデル及びＭＫＮ４５移植マウスモデルに投与した後、腫瘍の大きさを測定して、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ；抗体の抗癌効果有り）と非反応群（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ；抗体の抗癌効果無し）を確認した。
【０１８０】
具体的には、前記実施例１．１．１で製作したマウスモデルで、細胞株移植以後７〜１０日以後からグループ別に抗ｃ−Ｍｅｔ抗体投与を始めた。それぞれの投与は７日間隔で４週間静脈注射し、腫瘍の大きさは一週間に二回ずつ確認して記録した。投与グループは対照群であるＰＢＳ投与群と抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理グループに分け、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体はＨＴ２９とＬｏｖｏ細胞株モデルはグループ別に０．２、１、５、１０ｍｇ／ｋｇで処理し、ＥＢＣ−１、ＭＫＮ４５、およびＨｓ７４６Ｔ細胞株モデルはグループ別に０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０、１０．０ｍｇ／ｋｇで処理した。前記得られた結果を図１ａから図１ｅに示した（１ａ：Ｌｏｖｏ、１ｂ：ＨＴ２９、１ｃ：ＥＢＣ−１、１ｄ：Ｈｓ７４６Ｔ、１ｅ：ＭＫＮ４５）。図１ａから図１ｅには代表的に対照群であるＰＢＳ投与群と抗ｃ−Ｍｅｔ抗体投与群のうちの代表的な投与群（ＨＴ２９とＬｏｖｏモデル及びＭＫＮ４５モデルはそれぞれ抗体５ｍｇ／ｋｇ投与、ＥＢＣ−１とＨｓ７４６Ｔモデルはそれぞれ抗体３ｍｇ／ｋｇ投与）のみを示し、矢印で表示された部分は抗体処理時期または安楽死時期である。図１ａから図１ｅで確認されるように、Ｌｏｖｏ移植マウスモデルとＨＴ−２９移植マウスモデルではＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２が抗癌効果をほとんど示さない反面、ＥＢＣ−１移植マウスモデル、Ｈｓ７４６Ｔ移植マウスモデルおよびＭＫＮ４５移植マウスモデルでは明確な抗癌効果を示すことが分かる。したがって、Ｌｏｖｏ移植マウスモデルおよびＨＴ−２９移植マウスモデルはＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群に分類し、ＥＢＣ−１移植マウスモデル、Ｈｓ７４６Ｔ移植マウスモデルおよびＭＫＮ４５移植マウスモデルはＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群に分類することができる。
【０１８１】
Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群と非反応群の血清内ＩＬ−８水準の差を確認するために、Ｌｏｖｏ移植マウスモデル、ＨＴ−２９移植マウスモデル、ＥＢＣ−１移植マウスモデル、及びＨｓ７４６Ｔ移植マウスモデルからＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２投与が行われない対照群マウス（ＰＢＳ投与群；１００μＬの量で７日間隔で４週間投与）の血清内ＩＬ−８水準を測定してＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性との関連性を試験した。マウスモデルの全血を、ＢＤ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴＴＭ  ｔｕｂｅに回収した。全血の回収後、穏やかにチューブを５分間反転させて攪拌した後、３０分間室温（約２５℃）で凝血させた。その後、１５００ｘｇで１０分間、冷却した遠心分離機により遠心分離することにより凝血塊を除去した。遠心上清を新しいチューブに移すことにより、血清サンプルを得た。
【０１８２】
各モデルの対照群マウス血清は、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｋｉｔ（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて実験を行った。すなわち、製造業者のガイドライン（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）に従って、マウス血清を１／４（ｖ／ｖ）でアッセイダイリューエントバッファー（Ａｓｓａｙ  ｄｉｌｕｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した後、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）抗ヒトＩＬ−８抗体がコーティングされているビーズ（ｂｅａｄｓ）（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｋｉｔ、＃５５１８１１、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に常温で１時間３０分間反応させた。反応が終わった後、試料に前記ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｋｉｔに含まれている洗浄バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬを添加した後、遠心分離し上清を除去した。残った試料を前記キットに含まれているストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＰＥと１時間３０分間追加的に反応させた後、洗浄バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬ添加後に遠心分離（２００ｇ、５ｍｉｎ）した後、上清を除去して未反応試料を除去した。その後、洗浄バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）２００μＬを添加しフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて分析した。分析が終わったデータは、ＦＣＡＰ  ａｒｒａｙ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて血清内ＩＬ−８濃度を計算し、希釈係数（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）をかけて血清内ＩＬ−８数値を定量化した。
【０１８３】
前記得られた結果を図２に示した。図２で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群は全てＩＬ−８水準が５００ｐｇ／ｍＬ以上である反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群は全てＩＬ−８水準が約５０−１５０ｐｇ／ｍｌ程度であって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群のＩＬ−８水準が非反応群と比較して少なくとも３倍以上であった。したがって、ＩＬ−８水準が高い癌細胞の場合、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２が効果をよく発揮すると予測できる。
【０１８４】
１．１．３．癌細胞株移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるＩＬ−８水準変化を測定して前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性との関連性を試験した。
【０１８５】
具体的には、前記実施例１．１．２の動物実験の結果として得られた血清試料のうち、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非投与群（ＰＢＳ投与群；対照群）試料と、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体投与群のうちの代表的な低濃度と高濃度処理群一つずつを比較するために、ＨＴ２９とＬｏｖｏモデル（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非反応群）では０．２ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＥＢＣ−１とＨｓ７４６Ｔモデル（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応群）では１ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇ投与群の血清試料を使用して抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理による抗癌効能程度とＩＬ−８水準の変化との相関関係を調べた。血清試料内のＩＬ−８水準の分析は前記１．１．２に説明された方法を参照して行った。
【０１８６】
前記得られた結果を図３に示した。図３で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＩＬ−８発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時（ビヒクル処理；ＰＢＳ投与群）と比較して有意な差がないか、またはむしろ増加した。その反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＩＬ−８発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時と比較して顕著に減少するか、またはほとんど発現しなかった。これはＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を処理した患者のＩＬ−８発現水準を測定することによって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性、即ち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能をモニタリングすることができることを意味する。
【０１８７】
１．２．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測及び効能検証試験
１．２．１．患者由来癌細胞移植マウスモデル製作
ＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証によって実際患者に適用時、信頼できる効能予測及び効能検定が可能か試験するために、患者由来癌細胞（肺癌細胞）が移植された異種移植マウスモデルを製作した。
【０１８８】
具体的には、本実験は専門業者であるＯｎｃｏｔｅｓｔ社（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｂｒｕｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼して行なった。患者由来肺癌細胞（非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ））であるＬＸＦＡ２９７、５２６、６２３、９８３、１０４１、そして１６４７細胞を培養し、ＮＭＲＩヌード（ｎｕｄｅ）マウス（４〜６週齢、雌；Ｈａｒｌａｎ）の皮下に（ｓ．ｃ）注入して異種移植マウスモデルを製作した。この時、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ  ＳＯＰ「Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」に従った方法を用いた。マウスはグループ当り１０匹ずつを使用した。腫瘍移植後、グループ毎の平均的な腫瘍の大きさについての測定偏差を減らすため、製作したマウスモデルをランダムに分け、その後、薬物投与を行なった。患者由来胃癌細胞であるＧＸＦ２１４およびＧＸＦ２５１、ならびに患者由来腎臓癌細胞であるＲＸＦ４８８、ＲＸＦ１１１４およびＲＸＦ１２２０を用いて、同様の試験を行った。
【０１８９】
前記製作された患者由来癌細胞移植マウスモデルの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性を試験するために、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理による抗癌効果を試験した。
【０１９０】
具体的には、抗体処理による抗癌効果をモニタリングするために、周期的にマウスに移植した腫瘍の大きさを測定した。下記の表は試験終了時期にそれぞれの抗体処理グループ（５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）の腫瘍大きさを、ビヒクル処理グループ（対照群；ＰＢＳ投与群）の腫瘍大きさで割った抗癌効能程度（腫瘍抑制程度（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）＝１００−（実験群の腫瘍大きさ／対照群の腫瘍大きさ×１００））を求めて下記の表４及び表５に示した。
【０１９１】
Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時に３０％以上腫瘍の大きさが減った場合、統計的有意性が示され、この場合にｅｆｆｉｃａｃｙ（効能）があると判断し、このような場合をｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（反応群）に区分した。一方、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時の腫瘍の大きさの減少が３０％未満の場合は、効能がない（ｎｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）と判断し、非反応群に区分した。
【０１９２】
【表４】
2015129755.tif 000009
【０１９３】
【表５】
2015129755.tif 000010
【０１９４】
上記表４及び表５で確認されるように、製作された患者由来癌細胞移植マウスモデルのうちの肺癌細胞移植モデルであるＬＸＦＡ５２６、ＬＸＦＡ６２３、ＬＸＦＡ１６４７と腎臓癌細胞移植モデルであるＲＸＦ１１１４がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応を示し（反応群）、残りのモデルは反応を示さなかった（非反応群）。
【０１９５】
１．２．２．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測
Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群と非反応群の血清内ＩＬ−８水準の差を確認するために、前記実施例１．２．１．で製作された移植マウスモデルからＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２投与前に採取された血清内のＩＬ−８水準を測定してＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性との関連性を試験した。
【０１９６】
具体的には、前記患者由来癌細胞移植マウスモデルから獲得したそれぞれの血清試料を試験群別に整理した。肺癌モデル６種、胃癌モデル２種、腎臓癌モデル３種の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非処理群である対照群（ＰＢＳ投与群）の血清試料内ＩＬ−８水準を測定した。ＩＬ−８水準の測定方法は前記１．１．２に記述された方法と同一である。
【０１９７】
前記得られた結果を図４に示した。図４で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群は全てＩＬ−８水準が約７５０ｐｇ／ｍＬ以上である反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群は全てＩＬ−８水準が約５００ｐｇ／ｍＬ未満であった。反応群の血清ＩＬ−８水準は、非反応群のそれと比較して少なくとも１．５倍以上であることが観察された。したがって、患者由来癌細胞移植マウスモデルでも、ＩＬ−８水準が高い癌細胞の場合、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２が効果をよく発揮すると予測できる。
【０１９８】
１．２．３．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
患者由来癌細胞移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるＩＬ−８水準変化を測定して、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性との関連性を試験した。
【０１９９】
具体的には、前記患者由来癌細胞移植マウスモデルから獲得したそれぞれの血清試料を試験群別に整理して、肺癌モデル６種、胃癌モデル２種、腎臓癌モデル３種の対照群（ＰＢＳ投与群）と抗ｃ−Ｍｅｔ抗体投与群（５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）の血清試料内ＩＬ−８水準を測定し、抗体処理有無によるＩＬ−８水準と抗癌効能との相関関係を測定した。ＩＬ−８水準の測定方法は前記１．１．２に記述された方法と同一である。
【０２００】
前記得られた結果を図５に示した。図５で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＩＬ−８発現水準が、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時（ビヒクル（ＰＢＳ）処理）と比較して有意な差がないか、またはむしろ増加した。その反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＩＬ−８発現水準が、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時と比較して顕著に減少するか、またはほとんど発現しなかった。これは、患者由来癌細胞移植モデルでもＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性とＩＬ−８発現水準変化と関連性があることを示している。すなわち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を処理した患者のＩＬ−８発現水準を測定することによって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性、即ち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能をモニタリングすることができることを意味する。
【０２０１】
１．３．抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後時間別ＩＬ−８水準変化測定
１．３．１．癌細胞株移植マウスモデル製作及びこれに対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗癌活性試験
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証マーカーとしてのＩＬ−８の反応性が腫瘍大きさの変化といかなる相関関係があるか確認するために、従来の抗癌効能を示した癌細胞株（ＥＢＣ−１細胞株、Ｈｓ７４６Ｔ細胞株）を移植した異種移植マウスモデルを製作した。
【０２０２】
本実験は、実施例１．１と異なり、腫瘍大きさの変化がほとんどない状態での反応性を調べるよう設定された。腫瘍移植以後に腫瘍の大きさを１０００ｍｍ３程度に増殖させた後、抗体を濃度別に処理し、様々な時間帯別にグループ当り３匹ずつのマウスの血清と腫瘍組織を採取した。同時に、腫瘍の大きさも一定時間ごとに確認して抗癌効能も確認した。
【０２０３】
具体的には、ヒト胃癌細胞株であるＨｓ７４６Ｔ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３５）細胞とヒト非小細胞性肺癌細胞株であるＥＢＣ−１（ＡＴＣＣ  ＪＣＲＢ０８２０）細胞を移植した異種移植マウスモデルが使用された。培養したそれぞれの細胞をそれぞれ１５０匹のＢａｌｂ．ｃヌード（ｎｕｄｅ）マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に５×１０６細胞ずつ皮下に（ｓ．ｃ）注入した。使用されたマウスは全て５〜６週の間の週齢の雄で、全てＳＰＦｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（条件）で飼育された。全て一定の所定のサイズまで腫瘍を増殖させるために、細胞が移植されたマウスは、移植から１６〜２０日間の期間が経過した以後にのみ、薬物（抗体）を処置した。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ３程度に育った以後、グループ当り３０匹ずつランダムに、ＰＢＳ処理グループ（Ｇｒｏｕｐ１）、ならびに抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理グループ（Ｇｒｏｕｐ２、３、及び４）に群分けした。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理グループも、抗体投与濃度によって、１ｍｇ／ｋｇ処理群（Ｇｒｏｕｐ２）、３ｍｇ／ｋｇ処理群（Ｇｒｏｕｐ３）、及び１０ｍｇ／ｋｇ処理群（Ｇｒｏｕｐ４）に分けた。それぞれの実験群に対する抗体及びビヒクル投与は、最初投与日から一週間以後にもう一度投与する方法で総２回行なわれた。この時、それぞれの試料採取は、第１回目の投与以後１時間、１日（２４時間）、２日（４８時間）、３日（７２時間）、７日（１６８時間）目に行なわれた。第２回目の投与以後１時間（１６９時間）、１日（１９２時間）、２日（２１６時間）、３日（２４０時間）、７日（３３６時間）目にも、試料採取がそれぞれ行われた。試料は、各時間帯別に３匹ずつのマウスを屠殺して血清と組織を採取した。さらに、それぞれの試料採取時に各マウスの腫瘍大きさを測定して抗体の抗癌効能程度も共に観察した（ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｖｉｖａｒｉｕｍ）。
【０２０４】
前記得られた抗癌効能結果を図６（ＥＢＣ−１移植モデル）及び図７（Ｈｓ７４６Ｔ移植モデル）に示した。
【０２０５】
図６及び図７で確認されるように、ＥＢＣ−１細胞株とＨｓ７４６Ｔ細胞株の担癌動物（ｔｕｍｏｒ  ｂｅａｒｉｎｇ  ａｎｉｍａｌ）を用いた実験でも抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗癌効能が確認され、前記抗癌効能は濃度依存性を示したことが分かる。
【０２０６】
１．３．２癌細胞株移植マウスモデルでのＩＬ−８を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
前記実施例１．３．１で得られたＥＢＣ−１移植マウスモデル及びＨｓ７４６Ｔ移植マウスモデルから採取した試料を用いて以下の実験を行なった。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能によるＩＬ−８の反応性が腫瘍大きさによったものかを調べるためにＥＢＣ−１移植マウスモデルまたはＨｓ７４６Ｔ移植マウスモデルの血清試料で抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理後時間帯別ＩＬ−８水準を測定して分析した。
【０２０７】
より具体的には、前記それぞれの抗体処理群当り３匹ずつから各時間帯別（図８参照）に採取した血清１００ｕＬずつを混合して試料を用意した後、前記１．１．２で使用した同一な実験方法で血清内ＩＬ−８水準を確認して定量化した。
【０２０８】
前記得られた結果を図８と図９に整理した。図中、「ｂｅｆｏｒｅ  ｄｏｓｉｎｇ（投与前）」と「１  ｄａｙ（第１日目）」の間の「１」は、「１時間」を意味する。
【０２０９】
図８と図９で確認できるように、ＩＬ−８水準は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理時に濃度依存的に減少する傾向を示しているだけでなく、高濃度処理群である１０ｍｇ／ｋｇでは処理後１時間にすでに減少したのを確認することができた。これは、ＩＬ−８の血清での減少が単純に腫瘍の大きさのみを反映する指標でなく、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の生体内反応性を反映する初期検証マーカーとして活用可能であることを示す。また、図６及び７で確認できるように、対照群（ＰＢＳ投与群）で腫瘍の大きさが持続的に増加するのに反し、図８及び９のＩＬ−８水準は増加しないことから分かるように、単純な腫瘍サイズの増減による変化ではないことを確認することができる。
【０２１０】
１．４．抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外のｃ−Ｍｅｔの効能検証
ＩＬ−８水準変化が抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外のｃ−Ｍｅｔを標的とする薬物に対する反応性モニタリングにも有用に適用されるか確認した。
【０２１１】
具体的には、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２）に効能を示した代表的な細胞株であるＥＢＣ−１（ヒト肺癌細胞株；ＡＴＣＣ  ．ＪＣＲＢ０８２０）とＨｓ７４６Ｔ（ヒト胃癌細胞株；ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３５）を、そして効能を示さなかった代表的な細胞株としてＬｏｖｏ（ヒト大腸癌細胞株；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２９）及びＨＴ２９（ヒト大腸癌細胞株；ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）を選択して培養した。このように選択した４種の細胞株を同一な細胞数（１×１０４細胞／ｗｅｌｌ）で９６ウェルプレートに接種した後、（１０％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）を含有したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）にて３７℃で２４時間培養した（５％ＣＯ２条件で培養）。培養した細胞に代表的なｃ−Ｍｅｔ阻害剤として知られているクリゾチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社）および、ＰＨＡ６６５７５２（（Ｒ、Ｚ）−５−（２，６−ジクロロベンジルスルホニル）−３−（（３，５−ジメチル−４−（２−（ピロリジン−１−イルメチル）ピロリジン−１−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン）インドリン−２−オン）、ならびに対照群としてコントロールＩｇＧ（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＩｇＧ（ｃａｔ＃００９−０００−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）およびＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２抗体（リファレンス）でそれぞれ処理した。前記薬物（または抗体）は、１０００ｎＭから０．０１ｎＭまで１０倍階段希釈法（１０−ｆｏｌｄ  ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）で希釈して処理し、薬物処理後、７２時間後に各処理群の細胞培養液でＩＬ−８水準をＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  ｍｅｔｈｏｄで分析を行なった（ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  ｋｉｔを使用；実施例１．１．２参照）。さらに、この時、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の抗癌効能を確認するために細胞増殖程度をＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイ（プロメガ社製）を用いて分析を行なった。
【０２１２】
前記得られた細胞増殖程度（７２時間目のＣＴＧアッセイ結果）を図２０（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応群）及び図２１（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非反応群）に示した。図２０に示されているように、各ｃ−Ｍｅｔ阻害剤（クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）とＰＨＡ６６５７５２）に対する細胞反応性は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２）と同様に観察された。すなわち、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）またはＰＨＡ６６５７５２にて処理すると、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２）反応群であるＥＢＣ−１及びＨｓ７４６Ｔ細胞株において、阻害剤濃度１０ｎＭ以上で増殖が抑制されるのに対し、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の増殖抑制効能が観察されなかった非反応群Ｌｏｖｏ及びＨＴ２９細胞株では、前記ｃ−Ｍｅｔ阻害剤に対する反応性も観察されなかった（図２１参照）。
【０２１３】
さらに、この時、各薬物に対する反応性が観察され始めた濃度である１０ｎＭ濃度において、各処理群の培養液中のＩＬ−８水準を分析（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）  ｍｅｔｈｏｄ；ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  ｋｉｔを使用；実施例１．１．２参照）した結果を図２２及び２３に示した（培地（ｍｅｄｉｕｍ）のＩＬ−８水準を１００％としてこれに対する相対的比率で換算して示す）。図２２及び２３の結果に示されているように、細胞増殖抑制反応を示したＥＢＣ−１及びＨｓ７４６Ｔ細胞株（反応群）ではＩＬ−８水準が有意な程度に減少する反面、非反応群であるＬｏｖｏ及びＨＴ−２９細胞株では有意な程度のＩＬ−８水準の減少傾向が観察されなかった。
【０２１４】
このような結果は、細胞のｃ−Ｍｅｔ発現を抑制させた時に観察されるＩＬ−８水準の減少は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体だけでなく、他のｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能検証指標として用いることができることを示すと言える。
【０２１５】
（実施例２：ｂＩＧ−Ｈ３を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能検証）
２．１．抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能検証マーカーとしてのｂＩＧ−Ｈ３選択
１１９個の可溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を検出することができるａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｒｒａｙ  ｋｉｔ  ｎｏｎ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐａｎｅｌ，  ｃａｔ＃  ＡＲＹ０１２、Ｒ＆Ｄシステムズ社；  代替的には、ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｒｒａｙ  ｋｉｔ（例えば、＃ＡＲＹ００５、Ｒ＆Ｄシステムズ社が使用され得る）を用いて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が抗癌効能を示す癌細胞において抗ｃ−Ｍｅｔ抗体未処理群と処理群とで発現の差を示す蛋白質を、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証マーカーとして選定した。
【０２１６】
先ず、Ｕ８７ＭＧ細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）により前記実施例１．１．１．の方法で製作されたマウスモデルを用いて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理（０．２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）による腫瘍大きさ変化を測定して図１０に示した。図１０で確認されるように、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２は、Ｕ８７ＭＧ移植マウスモデルで容量依存的に抗癌効能を示すのを確認することができる。
【０２１７】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応性が確認されたＵ８７ＭＧ細胞株において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体未処理群と処理群とで、蛋白質の発現の差を調査した。
【０２１８】
このために、Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）を使用して前記実施例１．１．１．の方法で製作されたマウスから採取した血清を、ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ｃａｔ＃  ＡＲＹ０１２）と共にインキュベートし、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性を確認した。前記メンブレンに提供されたバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）と捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と共に、メンブレンとマウスの血清２００μｌとを４℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）インキュベートした。その後、ケミルミネッセンス（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）方法でメンブレンを現像した。Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの量で、細胞株移植以後７〜１０日以後から７日間隔で４週間静脈注射して投与した。
【０２１９】
得られた結果を図１１に示した。メンブレンの角部と中間のドット（ｄｏｔ）はポジティブコントロールドット（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｏｔ）であり、ボックスで表示したドットが有意な変化を示したドットであってｂＩＧ−Ｈ３を示す。図１１に示したように、対照群（ＰＢＳ処理群、ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時にｂＩＧ−Ｈ３蛋白質の水準が顕著に減少したのを確認することができる。これは、ｂＩＧ−Ｈ３が抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証マーカーとして使用できることを示唆する。
【０２２０】
２．２．癌細胞株移植マウスモデルでのｂＩＧ−Ｈ３を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
２．２．１．癌細胞株移植マウスモデル製作
前記実施例１．１．１を参照して、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証試験に使用するために、多様な癌細胞株（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非反応癌細胞株：Ｌｏｖｏ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２９）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）、ＰＣ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４３５）、ＢｘＰＣ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）、ＭＤＡＭＢ２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）；抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応癌細胞株：Ｈｓ７４６Ｔ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３５）、ＭＫＮ４５（ＡＴＣＣ  ＲＣＢ１００１）、ＥＢＣ−１（ＡＴＣＣ  ＪＣＲＢ０８２０）、Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）、ＭＨＣＣ９７Ｈ（ＡＴＣＣ  ＮＢ１００−１２２）をそれぞれ移植した異種移植マウスモデルを製作した。
【０２２１】
前記製作された癌細胞株移植マウスモデルのうち、Ｈｓ７４６Ｔ移植マウスモデル、ＭＫＮ４５移植マウスモデル、及びＥＢＣ−１移植マウスモデルが抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に反応性を示すのが前記実施例１．１．２．で確認されている。
【０２２２】
２．２．２．癌細胞株移植マウスモデルでのｂＩＧ−Ｈ３を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
前記実施例２．２．１で製作された癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるｂＩＧ−Ｈ３水準変化を測定して、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性との関連性を試験した。
【０２２３】
具体的には、各癌細胞移植マウスの血清をプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）した後、前記実施例１．１．２に記載された方法を参照して、ビヒクル（ＰＢＳ）投与群（コントロール）とＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理群の、それぞれプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）された血清内のｂＩＧ−Ｈ３水準をｂＩＧ−Ｈ３  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて定量分析した。より具体的には、ＢＤ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴＴＭ  ｔｕｂｅにマウスモデルの全血を回収した。全血の回収後、穏やかにチューブを５分間反転させて攪拌した後、３０分間室温（２５℃）で凝血させた。その後、１０００ｘｇで１５分間、遠心分離することにより、血清を得た。各ＥＬＩＳＡアッセイについては、ＭＩＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ＤＭＦ００Ｂ）およびＩＧ−Ｈ３（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ＤＹ２９３５）  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを使用し、製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔には、１００μｌのアッセイ希釈剤ＲＤ１−５３を各ウェルに加えた。コートされたプレートに５０μｌ／ウェルの量で血清サンプルを加え、室温（約２５℃）で２時間インキュベートした。洗浄工程後、２００μｌの抗体接合体を各ウェルに加えて２時間インキュベートし、基質溶液を添加後さらに３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用い、波長４５０ｎｍを計測した。
【０２２４】
前記得られた結果を図１２に示した。図１２で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のｂＩＧ−Ｈ３発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時（ビヒクル処理）と比較して有意な差がないか、またはむしろ増加した。その反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のｂＩＧ−Ｈ３発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時と比較して顕著に減少するか、またはほとんど発現しなかった。これは、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を処理した患者のｂＩＧ−Ｈ３発現水準を測定することによって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性、即ち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能をモニタリングすることができることを意味する。
【０２２５】
２．３．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのｂＩＧ−Ｈ３を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
２．３．１．患者由来癌細胞移植マウスモデル製作
前記実施例１．２．１を参照して、患者由来肺癌細胞移植マウスモデルＬＸＦＡ２９７、ＬＸＦＡ５２６、ＬＸＦＡ６２３、ＬＸＦＡ９８３、ＬＸＦＡ１０４１、及びＬＸＦＡ１６４７を製作し、前記表４で確認されるように、このうちのＬＸＦＡ５２６、ＬＸＦＡ６２３、及びＬＸＦＡ１６４７は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応群である。
【０２２６】
２．３．２．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのｂＩＧ−Ｈ３を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
患者由来癌細胞移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるｂＩＧ−Ｈ３水準変化を測定して、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性との関連性を試験した。
【０２２７】
具体的には、実施例２．２．２と同一な実験方法（実施例１．１．２に記載された方法参照）で、各群当りマウスの血清をプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）した後、ビヒクル（ＰＢＳ）投与群（コントロール）とＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理群のプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）された血清内のｂＩＧ−Ｈ３水準をｂＩＧ−Ｈ３  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて定量分析した。
【０２２８】
得られた結果を図１３に示した。図１３で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のｂＩＧ−Ｈ３発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時（ビヒクル（ＰＢＳ）処理）と比較して有意な差がないか、またはむしろ増加した。その反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のｂＩＧ−Ｈ３発現がほとんど観察されなかった。これは、患者由来癌細胞移植モデルでもＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性とｂＩＧ−Ｈ３発現水準変化と関連性があることを示すこと。従って、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を処理した患者のｂＩＧ−Ｈ３発現水準を測定することによって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性、即ち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能をモニタリングすることができることを意味する。
【０２２９】
前記Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理群と非処理群動物モデルから分離された癌組織を粉砕し、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ社）５００μｌで溶解させた後、遠心分離してｃｅｌｌ  ｓｏｕｐ（細胞溶解物）を回収して定量した。全体細胞蛋白質が１μｇとなる量の細胞溶解物内を、ｂＩＧ−Ｈ３キャプチャ用抗体がプリコート（ｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇ）されたｂＩＧ−Ｈ３  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）のプレートに積層した。前記キット内に含まれているＨＲＰがｃｏｎｊｕｇａｔｅ（接合）されたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（検出抗体）を使用し、Ｏ．Ｄ４５０で値を測定した。
【０２３０】
前記結果を図１４に示した。図１４に示されているように、細胞溶解物においても、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応群のうちの抗体処理群の全体細胞蛋白質１μｇ当たりに含まれているｂＩＧ−Ｈ３の量が、抗体無処理群と比較して顕著に減少することを確認することができる。
【０２３１】
（実施例３：ＭＩＦを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能検証）
３．１．抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能検証マーカーとしてのＭＩＦ選択
３６個のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を検出できるａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｒ＆Ｄシステムズ社  ＡＲＹ００５）を使用して、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による抗癌効能が確認されたＬＸＦＡ６２３マウスモデル（実施例１．２．１及び表４参照）を用いて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体未処理群と処理群とで発現の差を示す蛋白質を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証マーカーとして選定した。
【０２３２】
より具体的には、ＬＸＦＡ６２３動物モデルにおいて、抗体無処理群（ＰＢＳ投与群；対照群マウス）またはＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２抗体５ｍｇ／ｋｇにより処理されたマウスから採取されたそれぞれ２００μｌの血清を、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）と共に一晩インキュベートした。その後、キット中のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｘを用いてケミルミネッセンス（ｃｈｅｍｉ−ｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ）で発現するドットを測定した。前記試験はａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｒ＆Ｄシステムズ社  ＡＲＹ００５）を用いて行なった。
【０２３３】
前記得られた結果を図１５に示した。図１５に示されているように、対照群（ＰＢＳ投与群、ＣＯＮＴＲＯＬ）と比較して、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時にＭＩＦ蛋白質の水準が顕著に減少したことを確認することができる。これは、ＭＩＦが抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証マーカーとして使用できることを示唆する。
【０２３４】
３．２．癌細胞株移植マウスモデルでのＭＩＦを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
前記実施例２．２．１を参照して、多様な癌細胞株（抗ｃ−Ｍｅｔ抗体非反応癌細胞株：Ｌｏｖｏ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２２９）、ＨＴ−２９（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＴＢ−３８）、ＰＣ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１４３５）、ＢｘＰＣ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６８７）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＴＢ−２６）；抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応癌細胞株：Ｈｓ７４６Ｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＴＢ−１３５）、ＭＫＮ４５（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＲＣＢ１００１）、ＥＢＣ−１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＪＣＲＢ０８２０）、Ｕ８７ＭＧ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＨＴＢ−１４）、ＭＨＣＣ９７Ｈ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＢ１００−１２２）を移植した異種移植マウスモデルを製作して本試験に使用した。
【０２３５】
前記製作された癌細胞株移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるＭＩＦ水準変化を測定して、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性との関連性を試験した。
【０２３６】
具体的には、実施例１．１．２の方法を参照して、各異種移植の抗体未処理群（ＰＢＳ投与群；コントロール）とＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理群の血清を、それぞれプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）した後、ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社  ＤＭＦ００Ｂ）を用いて前記血清内のＭＩＦ水準を定量した。実験方法は提供されたマニュアルに従った。
【０２３７】
得られた結果を図１６に示した。図１６で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＭＩＦ発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時（ＰＢＳ処理）と比較して有意な差がないか、またはむしろ増加した。その反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＭＩＦ発現水準が、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時と比較して顕著に減少するか、またはほとんど発現しなかった。これは、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を処理した患者のＭＩＦ発現水準を測定することによって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性、即ち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能をモニタリングすることができることを意味する。
【０２３８】
３．３．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのｂＩＧ−Ｈ３を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能検証
前記実施例１．２．１を参照して、患者由来肺癌細胞移植マウスモデルＬＸＦＡ２９７、ＬＸＦＡ５２６、ＬＸＦＡ６２３、ＬＸＦＡ９８３、ＬＸＦＡ１０４１、及びＬＸＦＡ１６４７を製作し、前記表４で確認されるように、このうちのＬＸＦＡ５２６、ＬＸＦＡ６２３、及びＬＸＦＡ１６４７は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体反応群である。
【０２３９】
前記用意された患者由来癌細胞移植マウスモデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体処理によるＭＩＦ水準変化を測定して、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性との関連性を試験した。
【０２４０】
具体的には、前記実施例３．２で記述した方法を参照して、ＭＩＦ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社  ＤＭＦ００Ｂ）を用いてＭＩＦ水準を定量した。
【０２４１】
得られた結果を図１７に示した。図１７で確認されるように、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する非反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＭＩＦ発現水準がＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２無処理時（ビヒクル処理）と比較して有意な差がないか、またはむしろ増加した。その反面、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応群では、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理時のＭＩＦ発現が顕著に減少するか、または観察されなかった。これは、患者由来癌細胞移植モデルでも、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性とＭＩＦ発現水準変化とに関連性があることを示す。従って、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を処理した患者のＭＩＦ発現水準を測定することによって、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性、即ち、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２の効能をモニタリングすることができることを意味する。
【０２４２】
（実施例４：ＲＡＳ−ＲＡＦ突然変異を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能予測）
４．１．患者由来癌細胞移植マウスモデルでのＲＡＳ−ＲＡＦ突然変異を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測試験
４．１．１．患者由来癌細胞移植マウスモデル製作
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測に使用するために、患者由来癌細胞を移植した異種移植マウスモデルを製作した。
【０２４３】
具体的には、雌のＮＭＲＩヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒまたはＨａｒｌａｎより入手、４〜６週齢）に癌患者から抽出した癌組織（ＬＸＦＡ／ＬＸＦＬ：Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ、肺癌；ＧＸＦ／ＧＸＡ：Ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、胃癌；ＲＸＦ：Ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ、腎臓癌；ＧＸＡ：ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、胃癌；ＬＸＦＬ：ｌｕｎｇ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、肺大細胞癌；ＯＶＸＦ：ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ、卵巣癌；ＰＡＸＦ：ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、すい臓癌；ＣＸＦ：ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ、大腸癌）を皮下に（Ｓ．Ｃ）移植した。腫瘍が８０から２００ｍｍ３ほどに成長した段階で、ランダムに群当り１０匹ずつに群分けした。ＰＢＳを静脈注射した群を対照群とし、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２を５ｍｇ／ｋｇの容量で注射した群を抗体投与群とした。抗体投与時期は、群分け後、０、７、１４、２１、２８、及び３５日目とした。腫瘍大きさが２０００ｍｍ３となった時点で、マウスを屠殺して、以下の実験に使用した。
【０２４４】
４．１．２．患者由来癌細胞移植マウスモデルのｃ−Ｍｅｔ発現量測定
前記製作された患者由来癌細胞移植マウスモデルでのｃ−Ｍｅｔ発現水準をウエスタンブロッティング方法で測定した。
【０２４５】
具体的には、前記マウスモデルから分離された腫瘍組織を粉砕し、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ社）５００μｌで溶解させた後、遠心分離して細胞溶解物を得た。全体細胞内蛋白質１０μｇに相当する量の細胞溶解物をロードし（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、メンブレン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ社；抗体含む）に３０秒間暴露させた。
【０２４６】
得られた結果を図１８に示した。図１８中、ｃ−Ｍｅｔバンドが観察されるモデルはＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対して反応群と言える。但し、ＬＸＦＡ２２０１はバンドが観察されるが、ＲＡＦ変異を伴うので、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２に対する反応性がない。
【０２４７】
４．１．３．患者由来癌細胞移植マウスモデルのＲＡＳ−ＲＡＦ突然変異存在有無及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性測定
前記製作された患者由来癌細胞移植マウスモデルでのＫ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ突然変異の有無、ならびに抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性を調査した。
【０２４８】
具体的には、癌細胞から抽出したＤＮＡをＳｅｑｕｅｎｏｍＴＭシステム（シーケノム社）用いて、前記システムに提供されたプライマーを用いてＰＣＲ後、野生型（ＷＩＬＤ）と変異型（ＭＵＴＡＮＴ）とを区分した。変異が現れた部位は、Ｋ−ＲＡＳの場合、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｇ１２Ｃであり、Ｂ−ＲＡＦの場合、Ｇ５９６Ｒ、Ｄ５９４Ａで主に見つけられた。
【０２４９】
本試験は実施例１．２．１．過程を参照して行なった。
【０２５０】
前記得られた結果を図１９（ＬＸＦＡ２２０１及びＬＸＦＡ２１５８モデルでの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体効能の有無；残りのマウスモデルでの効能は表４及び表５参照）及び表６（各マウスモデルでのＫ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ変異の有無）に示した。なお、ｃ−Ｍｅｔ水準は、アフィメトリクスアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ａｒｒａｙ；  プライマーセット“２０３５１０＿ａｔ”を使用）を使用し、製造者の説明書によって各モデルの腫瘍組織におけるｃ−Ｍｅｔ  ｍＲＮＡ水準を測定した。
【０２５１】
【表６】
2015129755.tif 000011
【０２５２】
表６で確認されるように、Ｋ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦのうちの一つ以上で変異が存在する場合、ｃ−Ｍｅｔ発現量が十分に多いとしても（例えば、ＬＸＦＡ２２０１参照）、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が効能を発揮しないことが分かる。これは、Ｋ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦでの変異の有無を確認することによって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測が可能であるのを示す。
【０２５３】
４．２．癌細胞株でのＲＡＳ−ＲＡＦ突然変異を用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の効能予測試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
４．２．１．癌細胞株の用意
ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＨＴＢ−１１４）、ＮＣＩ−Ｈ１９９３（ＣＲＬ−５９０９）、ＮＣＩ−Ｈ１３７３（ＣＲＬ−５８６６）、Ａ５４９（ＣＣＬ−１８５）、ＨＣＣ８２７（ＣＲＬ−２８６８）、及びＥＢＣ−１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＪＣＲＢ０８２０）細胞株をそれぞれ１×１０４ｃｅｌｌ／ウェルの量で用意し、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２抗体（１μｇ／ｍｌ）と７２時間反応させた後、細胞増殖程度を測定して抗体無処理群（対照群）と比較した。
【０２５４】
４．２．２．癌細胞株移植マウスモデルのＲＡＳ−ＲＡＦ突然変異の存在の有無及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性測定
前記用意された癌細胞株でのＫ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ突然変異の存在の有無及び抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に対する反応性を調査した。
【０２５５】
具体的には、前記用意された癌細胞から抽出したＤＮＡを、ＳｅｑｕｅｎｏｍＴＭシステム（シーケノム社）を用いて、前記システムに提供されたプライマーでＰＣＲ後、野生型と変異型とに区分した。変異が現れた部位は、Ｋ−ＲＡＳの場合、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、およびＧ１２Ｓであり、Ｂ−ＲＡＦの場合、Ｇ５９６Ｒ、Ｄ５９４Ａで主に見つけられた。
【０２５６】
得られた結果を表７に示した。
【０２５７】
【表７】
2015129755.tif 000012
【０２５８】
表７に示されているように、癌細胞株でも、Ｋ−ＲＡＳとＢ−ＲＡＦが全て野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）である場合にのみ、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が効能を発揮することを確認することができる。
【０２５９】
（実施例５：各マーカーの使用による予測正確度試験）
５．１．抗体効能試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）
患者由来腫瘍組織（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ＬＳＣＬＣ、非小細胞肺癌）が皮下に（ｓ．ｃ）移植されたマウス異種移植モデル１４種を、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ社（ドイツ）に依頼して作製した。
【０２６０】
前記１４種の患者由来腫瘍移植マウスモデルに、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２とＰＢＳ（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ；対照群））を投与し腫瘍組織の大きさを測定して前記抗体に対する反応性有無を測定した。
【０２６１】
前記患者由来腫瘍移植マウスモデルの腫瘍大きさが１００ｍｍ３以上に成長した時点から、Ｌ３−１Ｙ／ＩｇＧ２（コントロールの場合、ＰＢＳバッファー）を５ｍｇ／ｋｇの量で１週に１回静脈投与（ｉ．ｖ）して、計６週間実験を行い、腫瘍大きさが２０００ｍｍ３以上になった時点で実験を中断した。
【０２６２】
腫瘍大きさ（ｍｍ３）は長径×短径×短径×１／２の式を用いて体積として計算した。効能群の判別は、ＡＮＯＶＡ分析を通じてｐ値が０．０５以下の仮説のみを棄却して行った。即ち、薬を投与した群で、投与しない群に比べて腫瘍の大きさの分布が変わらなかったという仮説をＡＮＯＶＡにより試験して、ｐ値が０．０５以下の群は効能群、超過する群を非効能群と判別した。
【０２６３】
前記得られた選別されたサンプルのＬ３−１Ｙ／ＩｇＧ２処理に対する反応性の有無の解析結果を表８に示した：
【０２６４】
【表８】
2015129755.tif 000013
【０２６５】
５．２．抗体効能予測正確度試験
上記１４個の患者由来腫瘍移植マウスモデルに対して以下の７つのテストを実施した。７つのテストそれぞれの予測正確度、予測感度、及び予測特異度を下記のように計算した：
【０２６６】
【数１】
2015129755.tif 000014
【０２６７】
また、７つのテストの結果を表９に示した。表９で記載された表示の定義は以下の通りである：
ＴＰ（ｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：抗体効能試験と該当テストで全て陽性（効能有り）と判断
ＴＮ（ｔｒｕｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）：抗体効能試験と該当テストで全て陰性（効能無し）と判断
ＦＰ（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：抗体効能試験では陰性であるが、該当テストでは陽性と判断
ＦＮ（ｆａｌｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）：抗体効能試験では陽性であるが、該当テストでは陰性と判断。
【０２６８】
５．２．１．ｃ−Ｍｅｔ  ＩＨＣ：Ｖｅｎｔａｎａ（対照例）
前記５．１の実験を終えたマウスの腫瘍組織を摘出して、一部はＦＦＰＥ（Ｆｏｒｍａｌｉｎ  Ｆｉｘｅｄ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｅｍｂｅｄｄｅｄ、ホルマリン固定パラフィン包埋）ブロックを製作した。前記用意されたＦＦＰＥブロックはＶｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、免疫組織化学）（ｓｐ４４（Ｖｅｎｔａｎａ社、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ７９０−４４３０）を使用、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社のｍｅｔｍａｂが臨床ｐｈａｓｅＩＩＩに用いた実験法；ＵＳ２０１３０８９５４１  Ａ１参照）を用いて製造業者で提供する標準プロトコル（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に従って表面発現（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ｃ−ＭＥＴを測定するのに使用した。
【０２６９】
前記Ｖｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法によるＩＨＣスコア（ｓｃｏｒｅ）が２〜３であれば、効能群と判断することができる。
【０２７０】
５．２．２．改変ｃ−Ｍｅｔ  ＩＨＣ（改変Ｖｅｎｔａｎａ）
Ｖｅｎｔａｎａ抗体（ｓｐ４４）を５／６倍に希釈して使用したことを除いて、前記５．２．１のＶｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法と同一な試験を行った。前記改変Ｖｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法によるＩＨＣスコアが２〜３であれば、効能群と判断することができる。
【０２７１】
５．２．３．ＩＬ−８を用いた効能予測
前記実施例１．１．２の試験方法によって各モデルのＰＢＳ処理群（対照群）の血清内ＩＬ−８水準を定量化した。血清内ＩＬ−８水準が５００ｐｇ／ｍｌ以上である場合を陽性、５００ｐｇ／ｍｌ未満である場合を陰性と判断した。
【０２７２】
５．２．４．組み合わせＩ
前記実施例５．２．２（改変Ｖｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法による効能予測）、及び５．２．３（ＩＬ−８を用いた効能予測）で得られた結果を組み合わせて抗体効能を予測した。具体的には、実施例５．２．２の改変Ｖｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法によるＩＨＣスコアが２〜３であり、実施例５．２．３の血清内ＩＬ−８水準が５００ｐｇ／ｍｌ以上である場合を陽性と判断し、その以外の場合を陰性と判断した。
【０２７３】
前記実施例５．２．１、５．２．２、５．２．３、及び５．２．４で得られた結果を下記の表９に示した。
【０２７４】
【表９】
2015129755.tif 000015
【０２７５】
５．２．５．ＲＡＳ−ＲＡＦ突然変異存在有無による効能予測
実施例４．１．３の方法によって前記１４個の患者由来腫瘍移植マウスモデルに対してＫ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ突然変異存在有無を調査して、Ｋ−ＲＡＳとＢ−ＲＡＦが全て野生型である場合を陽性、Ｋ−ＲＡＳとＢ−ＲＡＦのうちの一つ以上で突然変異が存在する場合を陰性と判断した。
【０２７６】
５．２．６．組み合わせＩＩ
前記実施例５．２．３（ＩＬ−８を用いた効能予測）ならびに５．２．５（Ｋ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ突然変異の存在の有無による効能予測）を組み合わせて、抗体効能を予測した。具体的には、実施例５．２．３の血清内ＩＬ−８水準が５００ｐｇ／ｍｌ以上であり、Ｋ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦが全て野生型である場合を陽性と判断し、その以外の場合は陰性と判断した。
【０２７７】
５．２．７．組み合わせＩＩＩ
前記実施例５．２．２（改変Ｖｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法による効能予測）、５．２．３（ＩＬ−８を用いた効能予測）ならびに５．２．５（Ｋ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦ突然変異の存在の有無による効能予測）を組み合わせて抗体効能を予測した。具体的には、実施例５．２．２の変形されたＶｅｎｔａｎａ  ＭＥＴ  ＩＨＣ方法によるＩＨＣスコアが２〜３であり、実施例５．２．３の血清内ＩＬ−８水準が５００ｐｇ／ｍｌ以上であり、Ｋ−ＲＡＳ及びＢ−ＲＡＦが全て野生型である場合を陽性と判断し、その以外の場合は陰性と判断した。
【０２７８】
前記実施例５．２．５、５．２．６及び５．２．７で得られた結果を下記の表１０に示した：
【０２７９】
【表１０】
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【０２８０】
前記表９及び表１０で確認されるように、改変ｃ−ＭＥＴ  ＩＨＣ方法、ＩＬ−８マーカー及びＫＲＡＳ−ＢＲＡＦ変異マーカーをそれぞれ単独で用いる場合、予測正確度（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｃｃｕｒａｃｙ）がそれぞれ６４．２９％、７１．４３％及び７１．４３％であって、全て対照群（２８．５７％）と比較して高い予測正確度を示した。改変ｃ−Ｍｅｔ  ＩＨＣ、ＩＬ−８マーカー及びＫＲＡＳ−ＢＲＡＦ変異マーカーのうちの２つ以上を組み合わせた場合、より高い予測正確度を示し、特に、前記の三つの条件を全て用いる場合、１００％の予測正確度を示した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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