(57)【要約】【課題】フォトニック結晶の反射面の寸法精度を向上させる。【解決手段】標的物質捕捉装置２１は、凹部又は凸部が周期的に形成された表面を有する標的物質捕捉構造体２５と、前記表面の少なくとも一部に成膜されて反射面２９を形成する金属膜２６と、を含み、前記標的物質捕捉構造体２５は前記金属膜２６側の少なくとも一部が光硬化樹脂である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹部又は凸部が周期的に形成された表面を有する標的物質捕捉構造体と、
前記表面の少なくとも一部に成膜されて反射面を形成する金属膜と、を含み、
前記標的物質捕捉構造体は前記金属膜側の少なくとも一部が光硬化樹脂である、
標的物質捕捉装置。
【請求項２】
前記光硬化樹脂が、フッ素を含有する紫外線硬化樹脂である、請求項１に記載の標的物質捕捉装置。
【請求項３】
前記紫外線硬化樹脂が、フッ素を含有する開環メタセシス重合ナノインプリント材料である、請求項２に記載の標的物質捕捉装置。
【請求項４】
標的物質が生体物質である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の標的物質捕捉装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の標的物質捕捉装置を備えた検出装置。
【請求項６】
前記標的物質捕捉構造体と前記金属膜とを備えるフォトニック結晶基板を有し、
前記フォトニック結晶基板からの反射光の波長の変化で標的物質の存在及び前記標的物質の濃度の少なくとも一方を検出するバイオセンサーである、請求項５に記載の検出装置。
【請求項７】
所定のパターンを有する金型をシート状の光硬化性樹脂に押圧し、
前記光硬化性樹脂に光を照射し、
硬化後の光硬化樹脂から前記金型を離型して、凹部又は凸部が周期的に形成された一面を有する標的物質捕捉構造体を得て、
前記一面の少なくとも一部に金属膜を成膜する、
標的物質捕捉装置の製造方法。
【請求項８】
前記光硬化性樹脂が、フッ素を含有する紫外線硬化性樹脂であり、前記光が紫外線である、請求項７に記載の標的物質捕捉装置の製造方法。
【請求項９】
前記紫外線硬化性樹脂が、フッ素を含有する開環メタセシス重合ナノインプリント材料である、請求項８に記載の標的物質捕捉装置の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質捕捉装置、標的物質捕捉装置の製造方法及び標的物質捕捉装置を備えた検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、細胞などの標的物質を検出したり濃度を測定したりする手段として、フォトニック結晶を用いたバイオセンサーが知られている（例えば、非特許文献１）。非特許文献１に記載されているバイオセンサーは、金薄膜が形成されたフォトニック結晶基板に光を照射し、フォトニック結晶基板で反射された反射光の波長のピークの変化を測定することにより、標的物質を検出したり、標的物質の濃度を計測したりしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「Investigation  of  Plasmon  resonances  in  metal  films  with  nanohole  arrays  for  biosensing  applications」：Takumi  Sannomiya,  Olivier  Scholder,  Konstantins  Jefimovs,  Christian  Hafner,  and  Andreas  B.  Dahlin,  Received  10th  December  2010,  Revised  1th  February  2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
微細構造であるフォトニック結晶基板を作製することは容易ではなく、僅かな欠陥が反射光の波長スペクトルに大きな影響を及ぼす可能性がある。精度の高いフォトニック結晶の反射面を形成するには、ナノスケールの凹凸パターンを被成形材料に転写するナノインプリント技術が有用である。
【０００５】
ナノインプリント技術には熱ナノインプリント技術と光ナノインプリント技術とがある。熱ナノインプリント技術は、被成形材料をガラス転移点以上に加熱しナノスケールの凹凸パターンを転写する方法である。熱ナノインプリント技術は、ガラス転移点以上に加熱することが必要となるので被成形材料が熱収縮する可能性及び加熱冷却の時間が高速プロセス実現の妨げとなる可能性がある。光ナノインプリント技術は、被成形材料に光硬化樹脂を使用し、凹凸パターンを有するナノモールド（金型）を光硬化樹脂に押圧した状態で、光（例えば紫外線）を光硬化樹脂に照射して硬化させることにより、ナノスケールの凹凸パターンを転写する方法である。
【０００６】
光ナノインプリント技術は、低温低圧で微細パターンを被成型材料に転写することが可能であるので、加熱冷却の時間が不要となり高速プロセスの実現が可能となる。本発明者らの検討によれば、光ナノインプリント技術によれば、熱ナノインプリント技術の４分の１程度の時間でセンサを作製することができる。また光ナノインプリント技術においては、ガラス転移点以上に加熱する必要がないため、被成型材料が熱収縮する可能性を低減できる。
【０００７】
光硬化樹脂（硬化後）又は光硬化性樹脂（硬化前）として知られているアクリル系ポリマー又はエポキシ系ポリマーは、未硬化樹脂がモールドに残ってしまった場合、アッシング又は強アルカリ溶媒によって未硬化樹脂を除去することが必要となり、モールドが損傷する原因となる。モールドの損傷を避けるためには、オリジナルのモールドの複製であるレプリカモールドを作製する必要があり、余計な工程や費用が発生する。また、アクリル系ポリマー又はエポキシ系ポリマーの場合、光硬化の際に２０％程度の体積収縮を生じる。
【０００８】
本発明は、フォトニック結晶の反射面の寸法精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、凹部又は凸部が周期的に形成された表面を有する標的物質捕捉構造体と、前記表面の少なくとも一部に成膜されて反射面を形成する金属膜と、を含み、前記標的物質捕捉構造体は前記金属膜側の少なくとも一部が光硬化樹脂である標的物質捕捉装置である。
【００１０】
本発明は、光硬化により標的物質捕捉構造体を成形するので、ガラス転移点以上に加熱する必要がない。その結果、加熱冷却に伴う時間が不要となり工程時間を短縮できる。また熱収縮に伴う成形不良を軽減できる。
【００１１】
前記光硬化樹脂は、フッ素を含有する紫外線硬化樹脂であることが好ましい。前記紫外線硬化樹脂は、フッ素を含有する開環メタセシス重合（ＦＲＯＭＰ）ナノインプリント材料であることが好ましい。
【００１２】
フッ素を含有する開環メタセシス重合ナノインプリント材料を使用することによって、成形後の離型性を向上させることができ、モールド内に未硬化樹脂が残留した場合も有機溶剤によって簡便に除去することができるので、モールドの損傷発生を軽減することができる。
【００１３】
標的物質は生体物質であることが好ましい。
【００１４】
本発明は、前述した標的物質捕捉装置を備える検出装置である。
【００１５】
前記検出装置は、前記標的物質捕捉構造体と前記金属膜とを備えるフォトニック結晶基板を有し、前記フォトニック結晶基板からの反射光の波長の変化で標的物質の存在及び/又は濃度を検出するバイオセンサーであることが好ましい。
【００１６】
本発明は、所定のパターンを有する金型をシート状の光硬化性樹脂に押圧し、前記光硬化性樹脂に光を照射し、硬化後の光硬化樹脂から前記金型を離型して、凹部又は凸部が周期的に形成された表面を有する標的物質捕捉構造体を得て、前記表面の少なくとも一部に金属膜を成膜する標的物質捕捉装置の製造方法である。
【００１７】
本発明は、光硬化により標的物質捕捉構造体を成形するので、ガラス転移点以上に加熱する必要がない。その結果、加熱冷却に伴う時間が不要となり工程時間を短縮できる。また熱収縮に伴う成形不良を軽減できる。
【００１８】
前記光硬化性樹脂は、フッ素を含有する紫外線硬化性樹脂であり、前記光が紫外線であることが好ましい。前記紫外線硬化性樹脂は、フッ素を含有する開環メタセシス重合（ＦＲＯＭＰ）ナノインプリント材料であることが好ましい。
【００１９】
フッ素を含有する開環メタセシス重合ナノインプリント材料を使用することによって、成形後の離型性を向上させることができ、モールド内に未硬化樹脂が残留した場合も有機溶剤によって簡便に除去することができるので、モールドの損傷発生を軽減することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、フォトニック結晶の反射面の寸法精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、標的物質検出装置を示す図である。
【図２】図２は、標的物質捕捉装置の斜視図である。
【図３】図３は、標的物質捕捉装置の平面図である。
【図４】図４は、図３におけるＡ−Ａ断面を示す図である。
【図５】図５は、標的物質捕捉装置の凹部の壁面の部分拡大図である。
【図６】図６は、標的物質捕捉装置の他の凹部の壁面の部分拡大図である。
【図７−１】図７−１は、本実施形態に係る標的物質捕捉装置の製造方法の一例を説明する図である。
【図７−２】図７−２は、本実施形態に係る標的物質捕捉装置の製造方法の一例を説明する図である。
【図７−３】図７−３は、本実施形態に係る標的物質捕捉装置の製造方法の一例を説明する図である。
【図８】図８は、本実施形態に係る標的物質捕捉装置の製造方法の一例を説明する図である。
【図９−１】図９−１は、光ナノインプリントで使用する金型を示す図である。
【図９−２】図９−２は、光ナノインプリントで金型により樹脂に転写されたパターンを示す図である。
【図１０】図１０は、光硬化樹脂に転写された凹凸の各寸法を説明するための模式図である。
【図１１−１】図１１−１は、光ナノインプリントにより作製したフォトニック結晶のＡＦＭ測定結果を示す図である。
【図１１−２】図１１−２は、熱ナノインプリントにより作製したフォトニック結晶のＡＦＭ測定結果を示す図である。
【図１２−１】図１２−１は、本実施形態の変形例に係る標的物質捕捉装置の製造方法を示す図である。
【図１２−２】図１２−２は、本実施形態の変形例に係る標的物質捕捉装置の製造方法を示す図である。
【図１２−３】図１２−３は、本実施形態の変形例に係る標的物質捕捉装置の製造方法を示す図である。
【図１３】図１３は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図１４】図１４は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図１５】図１５は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図１６】図１６は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図１７】図１７は、フォトニック結晶バイオセンサーを説明する図である。
【図１８】図１８は、フォトニック結晶バイオセンサーを説明する図である。
【図１９】図１９は、フォトニック結晶バイオセンサーを説明する図である。
【図２０】図２０は、フォトニック結晶バイオセンサー固定手段を説明する図である。
【図２１】図２１は、フォトニック結晶バイオセンサー固定手段を説明する図である。
【図２２】図２２は、フォトニック結晶バイオセンサーの別の形態を説明する図である。
【図２３】図２３は、標的物質検出装置の光検出部がフォトニック結晶バイオセンサーに光を照射する例を示す図である。
【図２４】図２４は、標的物質検出装置の光検出部が有する測定プローブの構造を示す図である。
【図２５】図２５は、標的物質検出装置の光検出部の評価条件を示す図である。
【図２６】図２６は、標的物質検出方法のフローチャートである。
【図２７】図２７は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図２８】図２８は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図２９】図２９は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図３０】図３０は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【図３１】図３１は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、標的物質検出装置を実施するための形態（以下、実施形態という）を図面に基づいて説明する。なお、以下の実施形態により本発明が限定されるものではない。また、以下の実施形態における構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のもの、いわゆる均等の範囲のものが含まれる。さらに、以下の実施形態で開示した構成要素は適宜組み合わせることが可能である。
【００２３】
［実施形態１］
＜標的物質検出装置＞
実施形態１に係る標的物質捕捉装置を備えた標的物質検出装置について説明する。図１は、標的物質検出装置を示す図である。標的物質検出装置１０は、本実施形態に係るフォトニック結晶バイオセンサー１１（標的物質捕捉装置２１）と、光検出部１２と、処理部１３とを含む。
【００２４】
［フォトニック結晶バイオセンサー］
まず、フォトニック結晶バイオセンサー１１について説明する。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、標的物質捕捉装置２１と、上部プレート２２と、下部プレート２３とを含む。上部プレート２２は、開口部２４が設けられている。本実施形態においては、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、上部プレート２２と下部プレート２３とにより標的物質捕捉装置２１を挟む構造である。なお、本実施形態においては、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、上部プレート２２及び下部プレート２３を含んで形成されているが、これに限定されるものではなく、標的物質捕捉装置２１のみで形成されていてもよい。
【００２５】
（標的物質捕捉装置）
図２は、標的物質捕捉装置２１の斜視図である。図３は、標的物質捕捉装置２１の平面図である。図４は、図３におけるＡ−Ａ断面を示す図であり、フォトニック結晶の本体として標的物質捕捉構造体２５の表面２７と直交する平面で標的物質捕捉構造体２５を切ったときの断面を示す。後述する図５、図６も同様である。なお、図２〜図６は、模式的に示した図であるため、標的物質捕捉装置２１を構成する成分の厚さ及び大きさ等は実際とは異なる。本実施形態及び後述する他の実施形態においても同様である。図２〜図４に示すように、標的物質捕捉装置２１は、標的物質捕捉構造体２５及び金属膜２６を含んでいる。標的物質捕捉装置２１は、標的物質捕捉構造体２５の表面２７に円柱状の凹部（以下、適宜凹部という）２８Ａが周期的に形成されている。この表面２７を金属膜２６で被覆して反射面２９を形成している。反射面２９は、金属膜２６の表面である。反射面２９は、金属膜２６の標的物質捕捉構造体２５の表面２７側とは反対側で、金属膜２６に照射された光を反射する。
【００２６】
まず、標的物質捕捉構造体２５について説明する。フォトニック結晶は、表面に所定深さの凹部又は所定高さの凸部が周期的に形成された反射面を有し、前記反射面に特定波長の光（平行光）を照射すると、その反射光が得られる構造体である。表面に凹部又は凸部が周期的に形成された反射面に光を照射すると、特定波長の反射光が得られる構造体は、一般にフォトニック結晶と呼ばれる。
【００２７】
フォトニック結晶とは、サブ波長間隔の格子構造を有する構造体である。そして、それはフォトニック結晶の表面（反射面）に広領域波長の光を照射すると、フォトニック結晶の表面状態に依存した特定の波長帯の光を、反射又は透過するものである。フォトニック結晶の表面状態は、例えばフォトニック結晶の形状及び材質に依存する。この反射光又は透過光の変化を読み取ることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量化することができる。フォトニック結晶の表面状態の変化としては、表面への物質の吸着及び構造変化などが挙げられる。表面に金属薄膜が形成されたフォトニック結晶も、光が照射されると、光の反射率又は光の透過率に極値（極大値又は極小値）が現れる。この反射率又は透過率の極値は、金属の種類、金属の膜厚、フォトニック結晶の表面形状に依存するものである。この光の反射率又は光の透過率を読み取ることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量化することができる。金属薄膜については後述する。フォトニック結晶の表面状態の変化を反射光又は透過光の変化から定量化するには、次の方法を用いることができる。例えば、極値（極大値又は極小値）での反射率又は透過率の変化量、あるいは反射率又は透過率が極値となる波長のシフト量を求めるなどである。なお、反射率又は透過率の極値が複数ある場合には、任意の極値に着目する。そして、着目した極値について変化量を求めること、又は着目した極値となる波長のシフト量を求めることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量することができる。
【００２８】
図２〜図４に示すように、標的物質捕捉構造体２５は、表面２７に凹部２８Ａが周期的に形成された反射面２９を有している。この反射面２９に光を照射すると、標的物質捕捉構造体２５の形状と材質に依存した特定波長の光が反射される。
【００２９】
本実施形態において、凹部２８Ａは、三角形の格子状に配置されている。また、凹部２８Ａの直径Ｄ１は、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。また、凹部２８Ａの中心間の距離Ｃ１は、１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、２００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である。また、凹部２８Ａの深さをＨ１としたとき、凹部２８Ａのアスペクト比（Ｈ１／Ｄ１）は、０．１以上１０以下であることが好ましく、より好ましくは、０．５以上５．０以下である。なお、凹部２８Ａの寸法は、上記のものに限定されず、凹部２８Ａは、四角形の格子、六角形の格子などでもよい。凹部２８Ａは、三角形、四角形、六角形が組み合わされて格子状になっていてもよい。
【００３０】
標的物質捕捉構造体２５の形状及び寸法は、図２〜図４に示した形状に限定されることはない。例えば、標的物質捕捉構造体２５の形状は、矩形又は多角形の格子状のパターンが表面に形成されたもの、又は平行線状パターンや波型形状パターンなどが表面に形成されたもの（詳しくは周期的にパターンなどが形成されたもの）、又はこれらのパターンの組合せであってもよい。
【００３１】
標的物質捕捉構造体２５は、少なくとも金属膜２６側の少なくとも一部が光硬化樹脂である。標的物質捕捉構造体２５の全ての材料は、光硬化樹脂であってもよい。樹脂を用いて標的物質捕捉構造体２５を作製するに当たり、樹脂の温度をこの樹脂のガラス転移点以上とする必要がない。そのため、樹脂を冷却して固化させるときの容積変化が少なくなるので、寸法精度の低下が抑制される。
【００３２】
光硬化樹脂としては、紫外線の照射により硬化する紫外線硬化樹脂が好ましく、特に、構造中にフッ素を含有する開環メタセシス重合（ＦＲＯＭＰ：Fluorinated  Ring-opening  Metathesis  Polymerization）型紫外線硬化樹脂が好ましい。具体的には、三井化学社製のＦＲＯＭＰナノインプリント材料（商品名）を使用できる。光硬化樹脂がフッ素を含有していることによって離型性が改善され、モールドに未硬化樹脂が残留することを軽減できる。また、フッ素を含有する光硬化樹脂は離型性が高いため、モールドに離型剤を塗布することなく使用できる。
【００３３】
標的物質捕捉構造体２５は、材料基板の表面に微細な加工を施すことにより作製される。加工方法としては、光ナノインプリントが好ましい。
【００３４】
次に、金属膜２６について説明する。本実施形態において、図４に示すように、標的物質捕捉構造体２５は、表面２７が金属膜２６で被覆されている。金属膜２６は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）又はアルミニウム（Ａｌ）のうちのいずれか１種類以上を用いて形成されることが好ましい。本実施形態において、金属膜２６はＡｕで形成されている。Ａｕは、安定性に優れるため、反射面２９として好ましい。金属膜２６に銀（Ａｇ）又はアルミニウム（Ａｌ）のうちのいずれか１種類以上を用いる場合、金で表面を被覆することが好ましい。このようにすることで、金の使用量を低減して標的物質捕捉構造体２５の製造コストを抑制することができる。
【００３５】
金属膜２６の膜厚が小さいと、標的物質捕捉構造体２５への入射光の一部は金属膜２６を透過することがある。その結果、反射光から得られる情報量の低下、回折光又は標的物質捕捉構造体２５の裏面からの反射光など、標的物質捕捉構造体２５からの反射光には不要な情報が多く含まれる可能性がある。金属膜２６の膜厚を適度に大きくすることにより、標的物質捕捉構造体２５からの反射光に含まれる不要な情報を低減して、標的物質の検出精度及び濃度の計測精度を向上させることができる。また、金属膜２６の膜厚が適度に小さいと、標的物質捕捉構造体２５の表面２７に詳細なパターン形状を作製することが容易であるので好ましい。例えば、パターンの角がシャープになって、パターンの寸法を確保することが容易となる。このような観点から、本実施形態において、金属膜２６の膜厚は、好ましくは３０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、より好ましくは１５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは２００ｎｍ以上４００ｎｍ以下である。波長に対する反射率の変化は、金属膜２６の膜厚が２００ｎｍを超えるとほぼ同様になるためである。
【００３６】
金属膜２６は、スパッタリング又は蒸着装置などによって標的物質捕捉構造体２５の表面２７に形成することができる。金属膜２６の最表面は、Ａｕとすることが好ましい。金属膜２６にＡｇ、Ｐｔ、Ａｌを用いた場合、それぞれの極値における反射光の波長は、Ａｕを金属膜２６として用いた場合に対して１．５倍となる。このように、Ａｇ、Ｐｔ、Ａｌは、Ａｕよりも１．５倍の感度を有する。Ａｇは酸化されやすいので、標的物質捕捉構造体２５の表面２７にＡｇを形成した後、酸化されにくいＡｕ又はＳｉＯ２などの酸化物薄膜を形成することが好ましい。この場合、２００ｎｍの厚さを有するＡｇの膜の表面に、５ｎｍの厚さを有するＡｕの膜を形成することができる。２００ｎｍの厚さを有するＡｇの膜の表面に５ｎｍの厚さを有するＡｕの膜を形成した場合、２００ｎｍの厚さを有するＡｕの膜に比べて、感度が１．５倍になる。また、５ｎｍのＡｕの膜の有無で、感度の変化は見られなかった。ＡｌもＡｇと同様に酸化されやすいので、標的物質捕捉構造体２５の表面２７にＡｌの膜を形成した後、酸化されにくいＡｕ又はＳｉＯ２などの酸化物薄膜を形成することが好ましい。抗体などで修飾するために、Ｐｔも、Ａｕ又はＳｉＯ２などの酸化物薄膜を形成することが好ましい。
【００３７】
標的物質捕捉構造体２５の表面２７は、3-triethoxysilylpropylamine（ＡＰＴＥＳ）などを用いて改質されることが好ましい。標的物質捕捉構造体２５の表面２７に、Ａｕ又はＡｇの金属膜２６を形成させた場合には、ＡＰＴＥＳではなく、一端にチオール基を有し、他端にアミノ基やカルボキシル基などの官能基を有する炭素鎖を用いて標的物質捕捉構造体２５の表面２７を改質することが好ましい。Ａｕ又はＡｇ以外の金属膜２６を標的物質捕捉構造体２５の表面２７に形成させた場合は、一端に官能基を有するシラン系カップリング剤、例えばＡＰＴＥＳを使用して、標的物質捕捉構造体２５の表面２７を改質することが好ましい。
【００３８】
標的物質捕捉装置２１は、標的物質捕捉構造体２５の表面２７を金属膜２６で被覆し反射面２９を形成したものであるため、標的物質捕捉構造体２５の凹部２８Ａに対応して反射面２９に標的物質捕捉装置２１の凹部２８Ｂが周期的に形成されている。凹部２８Ｂは、凹部２８Ａと同様に、隣接する凹部同士を線で結んだ場合に上から見て複数の隣接し合う三角形の格子を形成する位置に配置されている。また、凹部２８Ｂの直径Ｄ２は、金属膜２６の厚さにもよるが、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。また、凹部２８Ｂの中心間の距離Ｃ２は、凹部２８Ａの中心間の距離Ｃ１と同様、１００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、２００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である。また、凹部２８Ｂの深さをＨ２としたとき、凹部２８Ｂのアスペクト比（Ｈ２／Ｄ２）は、０．１以上１０以下であることが好ましく、より好ましくは、０．５以上５．０以下である。なお、凹部２８Ｂの寸法は、前述したものに限定されない。
【００３９】
凹部２８Ｂは、凹部２８Ｂの壁面２８ａが凹部２８Ｂの底面２８ｂに所定の角度を有して形成されている。図５は、凹部２８Ｂの壁面２８ａの部分拡大図である。図６は、標的物質捕捉装置の他の凹部の壁面の部分拡大図である。図５では、説明の便宜上、標的物質捕捉構造体２５の表面２７に設けられる金属膜２６は省略する。図５に示すように、凹部２８Ｂの壁面２８ａは、凹部２８Ｂの平坦となる底面２８ｂに所定の角度を有している。凹部２８Ｂの底面２８ｂの重心を通る断面において、凹部２８Ｂの壁面２８ａと底面２８ｂとの境界を第１境界部３１とする。表面２７と凹部２８Ｂの壁面２８ａとの境界を第２境界部３２とする。底面２８ｂに対して垂直方向に第１境界部３１を通る直線と、底面２８ｂに対して水平方向に第２境界部３２を通る直線との交点を交点Ａとする。第１境界部３１と第２境界部３２とを直線で結ぶ距離をＬ１とする。第１境界部３１と交点Ａとを直線で結ぶ距離をＬ２とする。第２境界部３２と交点Ａとを直線で結ぶ距離をＬ３とする。Ｌ１とＬ２とが成す角度をθとする。このとき、凹部２８Ｂは、下記式（１）、（２）を満たすようにＬ１とＬ２とが成す角度θが形成されている。
ｔａｎθ＝Ｌ３／Ｌ２  ・・・（１）
０≦ｔａｎθ≦１．０  ・・・（２）
【００４０】
凹状の穴（ホール）が周期的に配列して設けられた構造を有する金属の表面に光を照射したとき、反射光の波長スペクトルにピークが観察される。反射光の波長に対する反射率が最大となる波長（ピーク波長）は、一般的に下記式（ｉ）で求めることができる。式（ｉ）中、λpeakは、ピーク波長であり、a0は、ホールの周期であり、ｉ、ｊは、回折次数であり、εmは、金属の誘電率であり、εdは、環境の誘電率である。
【００４１】
【数１】
2015232525.tif 000003
【００４２】
上記式（ｉ）によれば、凹部２８Ｂが配置される周期を与えられればピーク波長が求まる。ピーク波長のスペクトルを観察する場合、ピーク波長のスペクトルの幅が小さい方が容易にピーク波長の位置を特定することができる。よって、凹部２８Ｂの配置される周期が明確に与えられることで、ピーク波長のスペクトルの幅は小さくなり、ピーク波長の位置が特定し易くなる。
【００４３】
標的物質捕捉装置２１は、凹部２８Ｂが反射面２９に周期的に形成された周期構造を有するものである。凹部２８Ｂの壁面２８ａが、上記式（１）、（２）を満たすように反射面２９に形成されることにより、反射光の波長スペクトルの形状は幅が狭くなり、反射光のピーク波長を容易に特定することができる。これにより、標的物質を精度よく検出することができる。この結果、フォトニック結晶バイオセンサー１１のセンサ感度を高めることができる。なお、反射光の波長スペクトルの形状の幅は、半値幅などである。
【００４４】
また、凹部２８Ｂは、下記式（２）’を満たすように形成されていることが好ましい。凹部２８Ｂの壁面２８ａが、上記式（１）、下記式（２）’を満たすように形成されることにより、反射光の波長スペクトルの形状はさらに幅が狭くなり、反射光のピーク波長をさらに容易に特定することができる。この結果、標的物質をさらに精度よく検出することができる。
０≦ｔａｎθ≦０．７・・・（２）’
【００４５】
式（２）及び（２）’から、θは０度以上となる。θ＝０度である場合、標的物質捕捉装置２１の表面２７と凹部２８Ｂの壁面２８ａとの接続部分Ｋが略９０度になる。接続部分Ｋが略９０度になると、標的物質捕捉装置２１の形状の制御、特に凹部２８Ｂの形状の制御が難しくなる。すなわち、凹部２８Ｂの所期の形状を得ることが難しくなる。ｔａｎθ＞０、すなわちθを０よりも大きくすることにより、特に凹部２８Ｂの所期の形状を得やすくなるので好ましい。例えば、標的物質捕捉構造体２５を射出成形型又はインプリント等で作る場合は、抜き勾配も確保できるため、好ましい。また、標的物質捕捉装置２１は、比較的圧力の高い水で洗浄されるが、接続部分Ｋの角度が略９０度になると、角が取れやすくなる。その結果、凹部２８Ｂは所期の形状を有さなくなる可能性がある。ｔａｎθ＞０、すなわちθを０よりも大きくすることにより、接続部分Ｋの角が取れる可能性を低減できるので、凹部２８Ｂは、洗浄後においても所期の形状を有するようになるので好ましい。さらに、ｔａｎθ＞０、すなわちθを０よりも大きくすることにより、凹部２８Ｂ内に水が入りやすくなるので、標的物質を確実に凹部２８Ｂに捕捉することができる。
【００４６】
（フォトニック結晶の作製方法）
次に、光ナノインプリントにより標的物質捕捉装置２１を作製する工程の一例を説明する。図７−１、図７−２、図７−３及び図８は、本実施形態に係る標的物質捕捉装置の製造方法の一例を説明する図である。図７−１に示すステップＳ１０１において、まず、光硬化性樹脂１０２を樹脂シート１０１上に積層したシート状樹脂１００を準備する。光ナノインプリントでは、ナノメートルレベルの微細構造、又はナノメートルレベルの周期構造のパターンを有する金型１０３が用いられる。図７−２に示すステップＳ１０２において、金型１０３を樹脂シート１０１上の光硬化性樹脂１０２に押し付けて、所定圧力で押圧しながら、所定時間紫外線ＵＶを照射する。次に、図７−３に示すステップＳ１０３において、所定時間照射後、硬化した光硬化樹脂１０２’から金型１０３を離型し、微細構造及び周期構造が転写されたフォトニック結晶１００’を得る。硬化した光硬化樹脂１０２’は、図１〜図６におけるフォトニック結晶の本体である標的物質捕捉構造体２５に相当する。
【００４７】
標的物質捕捉構造体２５を作製した後、図８に示すステップＳ１０４のように、金型１０３と接していた表面に、スパッタリング又は蒸着装置などによって金属膜２６を形成して、標的物質捕捉装置２１が完成する。
【００４８】
図９−１は、光ナノインプリントで使用する金型を示す図である。図９−２は、光ナノインプリントで金型により樹脂に転写されたパターンを示す図である。金型１０３は外形１０ｍｍ角、厚さ０．６ｎｍ程度の矩形シリコン（Ｓｉ）基板であり、矩形の中心部付近に５ｍｍ角のドットパタン形成領域１０５を有している。このドットパタン形成領域１０５には、高さ２００ｎｍの円柱状の突起１０６が所定間隔で設けられている。この突起１０６が光硬化樹脂１０２’に転写されて凹部２８Ａとなる。
【００４９】
図１０は、光硬化樹脂に転写された凹凸の各寸法を説明するための模式図である。図１０において、ａは凹凸が繰り返される周期、ｂは凹部の底の径、ｃは凹部の入り口の径、ｄは凹部の深さ（あるいは凸部の高さ）を示す。使用した金型の凹凸周期は５９９ｎｍ以上６０１ｎｍ以下であった。
【００５０】
図１０に示す各寸法について、光ナノインプリントで作製したフォトニック結晶と、熱ナノインプリントで作製したフォトニック結晶とを比較した結果を表１に示す。各寸法は同一試験片において複数個所を測定して求めた平均値である。
【表１】
2015232525.tif 000004
【００５１】
表１に示すように、光ナノインプリントで作製したフォトニック結晶は、熱ナノインプリントで作製したフォトニック結晶に比べて、凹部深さｄがより深くなっていた。格子間隔を示す凹凸周期ａも、金型により近い値となっていた。
【００５２】
図１１−１は、光ナノインプリントで作製したフォトニック結晶との、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Atomic  Force  Microscope）の測定結果である。図１１−２は、熱ナノインプリントで作製したフォトニック結晶の、原子間力顕微鏡の測定結果である。この結果からも、格子間隔を示す凹凸周期ａが金型により近いものとなっていることが分かる。また、光ナノインプリントによるフォトニック結晶においては、図１０に示す各寸法のバラツキは殆ど確認されなかった。
【００５３】
図１１−１及び図１１−２に示す測定チャートにおける長さｌと、ピーク高さまでの距離ｍとから次式によってピーク比を求めることができる。
ピーク比＝（ｌ−ｍ）／ｌ
ピーク比が大きいほど凹部深さが深いことが分かる。
【００５４】
（変形例）
図１２−１、図１２−２及び図１２−３は、本実施形態の変形例に係る標的物質捕捉装置の製造方法を示す図である。前述した標的物質捕捉装置の製造方法では、樹脂シート１０１上に光硬化性樹脂１０２を積層したシート状樹脂１００を準備したが、本変形例では、シート状樹脂１００を準備せず、ローラ又はスキージ１０４等を用いて、光硬化性樹脂１０２を金型１０３内に直接塗布する点が異なる。図１２−１に示すステップＳ２０１において、金型１０３上に光硬化性樹脂１０２を直接塗布し、ローラ１０４で均一にならす。図１２-２に示すステップＳ２０２において、光源から紫外光を光硬化性樹脂１０２に照射して硬化させる。図１２−３に示すステップＳ２０３において、金型１０３から離型することにより、金型１０３のパターンが転写された光硬化樹脂１０２’が得られる。ここではローラを例として説明したが、スキージを使用してもよい。
【００５５】
（標的物質捕捉物質）
次に、標的物質を捕捉する標的物質捕捉物質について説明する。標的物質とは、標的物質検出装置１０が検出する対象物であって、タンパク質などの高分子、オリゴマー、低分子のいずれであってもよい。標的物質は、単分子に限定されず、複数の分子からなる複合体であってもよい。標的物質として、例えば、大気中の汚染物質、水中の有害物質、人体内のバイオマーカー（Biomarker）などが挙げられる。中でも、コルチゾールなどが好ましい。コルチゾールは、分子量３６２ｇ／ｍｏｌの低分子物質である。コルチゾールは、人間がストレスを感じると唾液中のコルチゾール濃度が増加するため、人間が感じているストレスの度合いを評価する物質として注目されている。コルチゾールを標的物質としてその濃度を測定すれば、例えば、人間の唾液中に含まれるコルチゾールの濃度を測定することで、ストレスの度合いを評価することができる。ストレスの度合いを評価すれば、被測定者が鬱病などの精神疾患につながるレベルのストレス状態にあるか否かを判断することができる。
【００５６】
標的物質捕捉物質とは、標的物質と結合し、標的物質を捕捉する物質である。ここで、結合するとは、化学的に結合する場合の他、例えば物理吸着、ファンデルワールス力による結合のように、化学的結合によらない結合であってもよい。好ましくは、標的物質捕捉物質は、標的物質と特異的に反応して標的物質を捕捉するものであり、標的物質を抗原とした抗体であることが好ましい。特異的に反応するとは、選択的に標的物質と可逆的又は不可逆的な結合をして複合体を形成することを意味し、化学反応に限定されない。また、特異的に反応する物質が標的物質以外に存在していても構わない。試料中に標的物質の他に標的物質捕捉物質と反応する物質があっても、その親和性が標的物質と比較して非常に小さい場合は、標的物質を定量することができる。標的物質捕捉物質は、標的物質を抗原とした抗体、人工的に作製した抗体、アデニン、チミン、グアニン又はシトシンなどのＤＮＡを構成する物質から構成される分子、ペプチドなどを用いることができる。標的物質がコルチゾールである場合は、標的物質捕捉物質は、コルチゾール抗体であることが好ましい。
【００５７】
標的物質捕捉物質を作製するには公知の方法を採用することができる。例えば、抗体は、血清法、ハイブリドーマ法又はファージディスプレイ法によって作製できる。ＤＮＡを構成する物質から構成される分子は、例えばＳＥＬＥＸ法（Systematic  Evolution  of  Ligands  by  Exponential  Enrichment:試験管内人工進化法）により作製できる。ペプチドは、例えばファージディスプレイ法により作製できる。標的物質捕捉物質は、何らかの酵素・同位体により標識されている必要はない。しかし、酵素・同位体によって標識されていてもよい。
【００５８】
本実施形態において、標的物質捕捉物質は、図４に示す標的物質捕捉装置２１の反射面２９に固定される。標的物質捕捉物質を標的物質捕捉装置２１の反射面２９に固定する手段として、共有結合、化学吸着、物理吸着などの化学的結合、物理的結合方法が挙げられる。これらの手段を、標的物質捕捉物質の性質に応じて適宜選択することができる。例えば、固定する手段として吸着を選択した場合、吸着の操作は以下のようなものである。例えば、標的物質を含んだ溶液を、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に滴下し、標的物質捕捉装置２１を、所定の時間、室温で、又は必要に応じて冷却・加温して、標的物質捕捉物質を反射面２９に吸着させる。
【００５９】
フォトニック結晶バイオセンサー１１は、特定の抗原（例えばコルチゾール）とのみ結合する抗体（例えばコルチゾール抗体）を標的物質捕捉装置２１の反射面２９の表面に予め吸着（固定）させておく。これにより、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、特定の抗原を検出することができる。これは、標的物質捕捉構造体２５の光学的特性と、標的物質捕捉構造体２５の表面又は表面近傍で起こる各種の生体・化学反応、例えば特定の抗原は特定の抗体とのみ反応するという抗原抗体反応とを利用するものである。
【００６０】
フォトニック結晶バイオセンサー１１は、標的物質捕捉物質である抗体が固定された反射面２９に、ブロッキング剤（保護物質）が固定されたものであってもよい。ブロッキング剤は、標的物質がフォトニック結晶バイオセンサー１１に接触させられる前に固定される。標的物質捕捉構造体２５の反射面２９の表面は、一般的に超疎水性である。このため、疎水性相互作用によって標的物質捕捉物質である抗体以外の不純物が、反射面２９に吸着してしまうおそれがある。さらに、標的物質捕捉構造体２５の光学特性は表面状態に大きく影響されるので、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９には、不純物が吸着されていないことが好ましい。標的物質捕捉構造体２５の反射面２９にブロッキング剤が固定されることで、反射光の検出精度を向上させることができる。
【００６１】
したがって、標的物質捕捉物質である抗体が標的物質捕捉構造体２５の反射面２９に吸着（固定）された部分以外の箇所には、不純物などが固定されないように、いわゆるブロッキング剤を予め固定させておくことが好ましい。ブロッキング剤を予め吸着させておくには、ブロッキング剤を、標的物質捕捉構造体２５の表面に接触させる。ブロッキング剤として、スキムミルクやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを使用することができる。
【００６２】
次に、フォトニック結晶バイオセンサー１１が標的物質である抗原及びその濃度を検出する基本的な原理を説明する。図１３〜図１６は、フォトニック結晶バイオセンサー１１の原理を説明する図である。一般的に、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、標的物質捕捉構造体２５の光学的特性と、標的物質捕捉構造体２５の表面又は表面近傍で起こる各種生体・化学反応、例えば、特定の抗原は特定の抗体とのみ反応するという抗原抗体反応とを利用して、微量のタンパク質又は低分子物質を検出するものである。そして、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に特定波長の光を照射したときの表面プラズモン共鳴現象及び局在表面プラズモン共鳴現象の少なくとも一方による反射光の波長の極値がシフトする現象を利用する。
【００６３】
図１３に示すように、標的物質捕捉装置２１の反射面２９には、抗体（標的物質捕捉物質）３４が吸着により固定されている。
【００６４】
次に、図１４に示すように、反射面２９の抗体３４が吸着した部分以外の箇所、すなわち、抗体３４が吸着した部分以外の反射面２９に、ブロッキング剤（保護物質）３５を予め吸着させる。これにより、反射面２９の抗体３４が吸着した部分以外の箇所に不純物などが吸着しないようにする。
【００６５】
次に、図１５に示すように、抗体３４とブロッキング剤３５とが吸着されているフォトニック結晶バイオセンサー１１に抗原（標的物質）３６を接触させ、抗原抗体反応を行う。抗体３４に抗原３６が捕捉された複合体３７が、反射面２９に固定される。
【００６６】
次に、図１に示す光検出部１２は、図１６に示すように、抗原３６が標的物質捕捉構造体２５の反射面２９に捕捉されている状態で特定波長の光（入射光）ＬＩを平行光で標的物質捕捉装置２１の反射面２９に照射する。そして、図１に示す光検出部１２は、反射面２９で反射された反射光ＬＲを検出し、反射光ＬＲの極値の波長を求める。そして、図１に示す処理部１３は、反射光ＬＲの強度の極値における波長及び強度の極値における波長のシフト量を求めて、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に捕捉された抗原３６の有無を検出したり、抗原３６の濃度を求めたりする。
【００６７】
フォトニック結晶バイオセンサー１１は、前述した原理に基づき、抗体３４及び抗原３６の組合せの種類を変えることにより、検出対象の物質であるタンパク質などの各種生体物質又は低分子量物質の種類を変えることができる。
【００６８】
フォトニック結晶バイオセンサー１１では、反射面２９に固定された抗体３４に抗原３６が捕捉されることにより、反射面２９の状態が変化し、反射光ＬＲに変化が生じる。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、光学的な物理量を出力する。この物理量は、標的物質捕捉装置２１の反射面２９における表面状態の変化に相関し、反射面２９に固定された抗体３４に抗原３６が捕捉されて形成される複合体３７の量と相関する。光学的な物理量は、例えば、反射光ＬＲの強度が極値となる波長のシフト量、光の反射率の変化量、光の反射率が極値となる波長のシフト量、反射光ＬＲの強度、反射光ＬＲの強度の極値の変化量などである。本実施形態では、反射光ＬＲの強度又は光の反射率が極値となる波長のシフト量を用いる。
【００６９】
光学的な物理量を出力させるには、例えば次のようにする。標的物質捕捉装置２１の反射面２９に対して垂直に光を入射し、反射光ＬＲを検出する。標的物質捕捉装置２１の反射面２９の垂線に対して角度をつけて光を入射し、反射光ＬＲを検出することもできる。反射光ＬＲを検出することにより、図１に示す標的物質検出装置１０をコンパクトにすることができる。垂直に入射され、垂直に反射された光を検出する場合には、二股の光ファイバーを用いて光を入射し、反射光ＬＲを検出することが好ましい。この構造については後述する。
【００７０】
（フォトニック結晶バイオセンサーの作製方法）
図１７、図１８及び図１９は、フォトニック結晶バイオセンサー１１の説明図である。図１７、図１８及び図１９を用いて、図１に示すフォトニック結晶バイオセンサー１１の作製方法の一例について説明する。図１７に示すように、標的物質捕捉装置２１を下部プレート２３に設置した後、図１８に示すように、上部プレート２２を下部プレート２３の上に設置して、標的物質捕捉装置２１を、下部プレート２３と上部プレート２２とにより挟むことにより、フォトニック結晶バイオセンサー１１が作製される。開口部２４の下部プレート２３側における端部は、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９により閉塞される。このような構造により、上部プレート２２は、開口部２４側の内壁と反射面２９とで囲まれて形成される、一定容積の液滴保持部３８を有する。開口部２４側の内壁とは、上部プレート２２と開口部２４との境界面である、上部プレート２２の内壁をいう。
【００７１】
図１９は、液滴保持部３８に所定の溶液を滴下した状態を示す。この場合、液滴保持部３８が液滴保持機能を発揮するため、開口部２４から溶液が流出するのを抑制する。また、溶液の量としては、液滴保持部３８に広がる程度の量があれば、標的物質を検出し、かつ測定することが可能となる。
【００７２】
開口部２４の形状は、円柱形に限らず、開口部２４の内部に液滴を保持することができれば、他の形状としてもよい。また、開口部２４を円柱状とした場合、その直径などは、抗体３４及び抗原３６の組合せの種類、必要な測定精度又は反射光の検出器の光学系に合わせて様々な直径とすることができる。開口部２４の直径は、上述した抗体３４に抗原３６を吸着させる際の操作、取扱いの利便性などを考慮し、０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、２ｍｍ以上６ｍｍ以下である。
【００７３】
上部プレート２２及び下部プレート２３の材質などは、特に限定されない。ただし、上部プレート２２及び下部プレート２３の表面の清浄度などを考慮すると、ステンレス鋼、ポリシクロオレフィン系樹脂、シリカなどを用いて形成されることが好ましい。
【００７４】
次に、フォトニック結晶バイオセンサー１１の別の形態について説明する。上部プレート２２は、疎水性の材料で形成されてもよい。特に、唾液などのいわゆる親水性の溶液の検出及び測定では、上部プレート２２が疎水性の材料で形成されていれば、液滴保持部３８に的確に溶液を集めることができる。また、脂質などのいわゆる親油性の溶液の検出及び測定では、上部プレート２２が疎水性の材料で形成されていれば、液滴保持部３８に的確に溶液を集めることができる。
【００７５】
さらに、上部プレート２２は、撥水性若しくは撥油性又は撥水撥油性のある材料で形成されてもよい。すなわち、疎水性、親油性、親水性、撥水性、撥油性を発揮する表面処理又はコーティングを溶液の性質に合わせて上部プレート２２に施してもよい。このようにすることで、液滴保持部３８に的確に溶液を集めることができる。
【００７６】
フォトニック結晶バイオセンサー１１は、フォトニック結晶バイオセンサー１１の下部に、図１に示す光検出部１２に対してフォトニック結晶バイオセンサー１１の位置を定めて、フォトニック結晶バイオセンサー１１を固定するための固定材（標的物質捕捉部固定手段、フォトニック結晶バイオセンサー固定手段）を装着することが好ましい。固定材としては、マグネットシート、両面テープ、接着剤などが使用できる。また、フォトニック結晶バイオセンサー１１を固定するために、固定材ではなく、固定機構として真空チャック又は静電チャックを用いてもよい。フォトニック結晶バイオセンサー１１を固定しておくことにより、検出・測定時の振動などによる測定位置のずれを減少することが可能となる。その結果、より正確な検出及び測定が実現できる。
【００７７】
図２０及び図２１は、フォトニック結晶バイオセンサー固定手段を説明する図である。図２０は、マグネットシート３９の取付け前の状態を示し、図２１は、マグネットシート３９の取付け後の状態を示す。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、フォトニック結晶バイオセンサー１１の下部側にマグネットシート３９が取り付けられている。マグネットシート３９は、フォトニック結晶バイオセンサー固定手段として機能する。
【００７８】
フォトニック結晶バイオセンサー１１は、光ナノインプリントなどにより均一に作製されている。標的物質検出装置１０がより正確に反射光を検出できるようにするため、フォトニック結晶バイオセンサー１１に照射される光の入射部位及び反射部位が正確に位置決めされることが好ましい。
【００７９】
すなわち、フォトニック結晶バイオセンサー１１と後で説明する測定プローブとの測定時の位置関係は、抗原抗体反応の前後で同一であることが好ましく、同一の部分を測定することが好ましい。したがって、測定プローブとフォトニック結晶バイオセンサー１１の反射面２９との距離は、抗原抗体反応の前後で同一であることが好ましく、５０μｍ以上５００μｍ以下に固定することが好ましい。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、上部プレート２２を含むことで、上部プレート２２がスペーサとして機能し、測定プローブとフォトニック結晶バイオセンサー１１の反射面２９との距離を一定にすることができる。
【００８０】
フォトニック結晶バイオセンサー１１に、反射面２９における特定の位置を表示する、位置決め用のマーカーによってマークを付けるようにしてもよい。マーカーは、フォトリソグラフィー、スパッタリング、蒸着、これらを利用したリフトオフプロセス、インクなどによる印刷又はインプリントによるパターン形成などによって付けることができる。マーカーは、その位置を読み取ることができればフォトニック結晶バイオセンサー１１の表面（反射面２９側）又は裏面（反射面２９の反対側）のどちらに付けてもよい。また、標的物質捕捉構造体２５の測定部分を外して標的物質捕捉構造体２５自体にマーカーを付けてもよい。さらに、マーカーを上部プレート２２、下部プレート２３に付けてもよい。
【００８１】
次に、フォトニック結晶バイオセンサー１１のさらに別の形態について説明する。図２２は、フォトニック結晶バイオセンサー１１の別の形態を説明する図である。図２２に示すように、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、開口部２４を塞ぐ部材を含む。開口部２４を塞ぐ部材は、孔付カバー４１とシート４２とを含む。孔付カバー４１は、開口部４３を有する板状部材であり、孔付カバー４１は、フォトニック結晶バイオセンサー１１の表面（反射面２９側）に設けられる。シート４２は、孔付カバー４１のフォトニック結晶バイオセンサー１１とは反対側（光の入射側）に設けられる。シート４２は、被覆部材として機能する。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、孔付カバー４１とシート４２とにより開口部２４、４３が塞がれる。
【００８２】
孔付カバー４１の開口部４３側の内壁と、開口部２４側の内壁と、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９とで囲まれた空間が、一定容積の液滴保持部４４となる。開口部４３側の内壁とは、孔付カバー４１と開口部４３との境界面である、孔付カバー４１の内壁をいう。開口部４３は、液滴保持部４４に標的物質が配置された後、シート４２により覆われる。これにより、液滴保持部４４はシート４２により塞がれる。
【００８３】
フォトニック結晶バイオセンサー１１は、孔付カバー４１及びシート４２を備えることで、フォトニック結晶バイオセンサー１１の開口部２４に滴下された溶液の蒸発を抑制することができる。このため、抗原抗体反応時の蒸発などによる溶液の濃度が変化するのを抑制することができる。また、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、孔付カバー４１及びシート４２を備えることで、外部から溶液へ異物が混入することを抑制することができる。
【００８４】
さらに、液滴保持部４４に溶液を充填することにより、溶液を充填した状態で反射光をより正確に測定することも可能である。この場合、シート４２は透明な材料であることが好ましく、より好ましくは、反射光の強度の極値における波長の光の吸収が少ないものが好ましい。例えば、シート４２の材料は、可視光線領域から紫外線領域の反射光で測定する場合は石英（シリカ）などが好ましい。
【００８５】
［光検出部］
次に、図１に示す光検出部１２について説明する。図１に示す光検出部１２は、光源５１と、測定プローブ５２と、光検出装置５３と、第１光ファイバー５４と、第２光ファイバー５５と、コリメートレンズ５６とを含む。光源５１と測定プローブ５２とは、第１光ファイバー５４により光学的に接続されている。測定プローブ５２と光検出装置５３とは、第２光ファイバー５５により光学的に接続されている。必要に応じて、光源５１及び光検出装置５３などに接続され、光源５１の制御及び光検出装置５３からの信号を処理する制御装置を設けてもよい。
【００８６】
図２３は、光検出部１２がフォトニック結晶バイオセンサー１１に光を照射する例を示す図である。図１に示す第１光ファイバー５４は、図１に示す光源５１からの光を測定プローブ５２に導き、測定プローブ５２からフォトニック結晶バイオセンサー１１が有する標的物質捕捉装置２１の反射面２９へ照射する。コリメートレンズ５６は、第１光ファイバー５４から出射し、測定プローブ５２から照射された光を平行光にしてから、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９へ入射光ＬＩとして照射する。第２光ファイバー５５は、標的物質捕捉装置２１の反射面２９で反射した光を反射光ＬＲとして受光し、図１に示す光検出装置５３へ導く。コリメートレンズ５６の種類は特に限定されないが、例えば、ナノストラクチャーを持つ反射防止フィルムを用いることができる。光検出装置５３は、例えば、フォトトランジスタ又はＣＣＤ（Charge  Coupled  Device）などの受光素子を備えた、光を検出するための装置である。
【００８７】
図２４は、図１に示す光検出部１２が有する測定プローブ５２の構造を示す図である。測定プローブ５２は、第１光ファイバー５４と第２光ファイバー５５とが接合される。そして、測定プローブ５２は、第１光ファイバー５４の光の出射面６１と、第２光ファイバー５５の反射光ＬＲの入射面６２とが同一の面（入出射面）６３上に配置される。このように、測定プローブ５２は、第１光ファイバー５４と第２光ファイバー５５とが、第１光ファイバー５４の出射側（出射面６１側）と第２光ファイバー５５の入射側（入射面６２側）とで一体となっている。そして、測定プローブ５２は、第１光ファイバー５４と第２光ファイバー５５とを用いて光を入射し、反射光ＬＲを検出する。
【００８８】
測定プローブ５２は、このような構造としているため、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９に照射する入射光ＬＩと、反射面２９からの反射光ＬＲとをほぼ同一の位置から出射し、入射させることができる。測定プローブ５２を上述したような構造にするとともに、コリメートレンズ５６を用いて測定プローブ５２からの光を平行光にすることで、光検出部１２は、反射面２９に平行光の入射光ＬＩを垂直に入射することができる。それとともに、反射面２９から垂直に反射した反射光ＬＲを受光することができる。このようにすることで、測定プローブ５２は、反射光強度の低下を最小限に抑えることができるとともに、主として反射光ＬＲの０次光成分を検出することができる。これにより、処理部１３は、標的物質捕捉装置２１の反射面２９の正確な情報を得ることができるため、標的物質の検出精度及び濃度の計測精度が向上する。なお、反射光ＬＲを検出する手法は、前述したような測定プローブ５２に限定されない。例えば、コリメートレンズ５６と反射面２９との間にハーフミラーを配置し、ハーフミラーによって反射光ＬＲを分離して第２光ファイバー５５から光検出装置５３に導いてもよい。
【００８９】
次に、光検出部１２の評価条件を説明する。図２５は、本実施形態に係る標的物質検出装置１０の光検出部１２の評価条件を示す図である。図２５に示すように、光検出部１２は、測定プローブ５２の入出射面６３と標的物質捕捉装置２１の反射面２９との間にコリメートレンズ５６を配置する。コリメートレンズ５６と反射面２９との距離（計測距離）をｈ、コリメートレンズ５６から出射した平行光の反射面２９における直径をｄ１、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９が露出する開口部２４の直径をｄ２とする。本評価では、ｈを１５ｍｍ又は４０ｍｍとし、ｄ１を３．５ｍｍ、ｄ２を５ｍｍとした。反射面２９に照射される光の光軸ＺＬ及び反射面２９で反射された反射光の光軸ＺＬは、いずれも反射面２９に対して直交している。測定プローブ５２の直径は２００μｍである。照射する光は白色光を用いた。反射率は、標準物質（アルミニウム板）の反射光強度に対する比率である。
【００９０】
［処理部］
次に、図１に示す処理部１３について説明する。処理部１３は、光検出部１２が検出した反射光の極値の波長を求める。処理部１３は、それとともに、求めた極値の波長のシフト（波長シフト量）に基づいて、少なくとも標的物質（例えば、図１５、図１６などに示す抗原３６）の有無を検出する。処理部１３は、例えば、マイクロコンピュータである。波長シフト量と標的物質捕捉装置２１の反射面２９に捕捉された標的物質の濃度とは相関がある。このため、処理部１３は、波長シフト量から反射面２９に捕捉された標的物質の濃度を求めることができる。
【００９１】
（標的物質を検出する方法）
次に、図１に示す標的物質検出装置１０を用いて標的物質を検出する方法（標的物質検出方法）を説明する。この例においては、標的物質捕捉装置２１の反射面２９にコルチゾール抗体を吸着させて、唾液中のコルチゾールを検出対象の標的物質として、検出・測定する場合を説明する。標的物質捕捉構造体２５としては、光ナノインプリントにより所定の微細構造を表面に形成したＦＲＯＭＰナノインプリント材料（商品名、三井化学社製）のシートを所定の大きさに切断したものを用いている。
【００９２】
図２６は、本実施形態に係る標的物質検出方法の一例を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１１では、コルチゾール抗体溶液（コルチゾール抗体濃度１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）を標的物質捕捉装置２１の反射面２９に滴下する。そして、所定の時間又は必要であれば、フォトニック結晶バイオセンサー１１を所定の温度で所定の時間静置し、コルチゾール抗体を標的物質捕捉装置２１の反射面２９に吸着させる。
【００９３】
次に、ステップＳ１２では、リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Phosphate  buffered  saline）を標的物質捕捉装置２１の反射面２９に滴下する。その後、遠心力などにより除去するリンス処理を複数回行う。
【００９４】
次に、ステップＳ１３では、ブロッキング剤３５としてスキムミルクを標的物質捕捉構造体２５の反射面２９に滴下し、フォトニック結晶バイオセンサー１１を所定の時間又は必要であれば所定の温度で所定の時間静置し、スキムミルクを標的物質捕捉装置２１の反射面２９におけるコルチゾール抗体の非吸着部に吸着させる。
【００９５】
その後、ステップＳ１４では、リンス処理（ステップＳ１２）と同様に、リン酸緩衝液によりリンス処理を複数回行う。上述した操作により、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に所定の処理がなされ、フォトニック結晶バイオセンサー１１が形成される。
【００９６】
次に、ステップＳ１５では、光検出部１２は、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９に光を照射したときの反射面２９からの反射光ＬＲを検出し、処理部１３は、反射光ＬＲを計測する。処理部１３は、例えば、反射光ＬＲの反射光強度のスペクトルを計測する。反射面２９に照射する光（入射光ＬＩ）の波長は、例えば３００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下である。
【００９７】
次に、ステップＳ１６では、まず、コルチゾールを含む溶液としての唾液の準備をする。唾液のサンプリング及び不純物の除去などの前処理は、例えば、市販の唾液採取キットを用いて行う。唾液の準備は、フォトニック結晶バイオセンサー１１に唾液を滴下する前であればいつ行ってもよい。例えば、フォトニック結晶バイオセンサー１１を形成する前に行ってもよく、フォトニック結晶バイオセンサー１１を形成するのと並行して行ってもよく、反射光強度を計測した後に行ってもよい。サンプリング及び前処理の終了した唾液１０μＬ〜５０μＬをフォトニック結晶バイオセンサー１１に滴下する。
【００９８】
次に、ステップＳ１７では、フォトニック結晶バイオセンサー１１を、所定の時間、また必要であれば所定の温度で所定の時間、静置して抗原抗体反応を行う。
【００９９】
その後、ステップＳ１８では、リンス処理（ステップＳ１４）と同様に、リン酸緩衝液によりリンス処理を複数回行う。
【０１００】
次に、ステップＳ１９では、標的物質検出装置１０を用いて、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に光を照射する。このときに照射する光は、ステップＳ１５で反射面２９に照射した光と同一である。そして、標的物質検出装置１０は、反射面２９からの反射光ＬＲ、例えば、反射光強度のスペクトルを計測する。
【０１０１】
フォトニック結晶バイオセンサー１１の反射光強度の極値における波長は、反射面２９又は反射面２９の近傍での抗原抗体反応などにより影響を受けて変化する。このため、反応前後の反射光強度の極値における波長の差、すなわち波長シフト量から、唾液中のコルチゾールを検出できる。また、波長シフト量から唾液中のコルチゾールの濃度を求めることができる。
【０１０２】
ステップＳ２０では、処理部１３は、ステップＳ１９で計測した反射光強度（又は反射率）の極値（極小値）における波長のシフト（波長シフト量）を求める。波長シフト量は、例えば、反射面２９に標的物質が捕捉された後における波長λ２と、反射面２９に標的物質が捕捉されていないときにおける反射光強度（又は反射率）の極値（最小値）に対応する波長λ１との差分λ２−λ１である。
【０１０３】
ステップＳ２１で、処理部１３は、例えば、所定量以上の波長シフト量がある場合、唾液中にコルチゾールが存在すると判定する。また、処理部１３は、波長シフト量に基づき、例えば、波長シフト量とコルチゾールの濃度との関係式を用いてコルチゾールの濃度を決定する。このとき、前記関係式は予め求めておき、処理部１３の記憶部に保存しておく。
【０１０４】
上述した例では、標的物質が捕捉されていない状態の反射面２９における反射光強度の極値の波長を用いて波長シフト量を求めたが、これに限定されるものではない。また、ステップＳ１５、ステップＳ１９において、極値が複数ある場合には、着目する極値を適宜選定する。そして、選定された極値について、波長λ１及び波長λ２を求める。
【０１０５】
このように、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、反射面２９に凹部２８Ｂを周期的に複数設けた標的物質捕捉装置２１を含む。凹部２８Ｂは、凹部２８Ｂの壁面２８ａが凹部２８Ｂの底面２８ｂに対して所定の角度を有するように標的物質捕捉装置２１の反射面２９に形成されている。これにより、凹部２８Ｂの周期が明確になり、反射光ＬＲの波長のスペクトルの形状の幅（例えば、半値幅）が小さくなるため、ピーク波長を容易に特定することができる。したがって、標的物質検出装置１０は、少なくとも溶液中から標的物質（この例では、コルチゾール）を精度よく検出することができる。
【０１０６】
また、標的物質検出装置１０は、平行光でフォトニック結晶バイオセンサー１１の反射面２９に対して垂直に光（入射光ＬＩ）を照射し、反射面２９で垂直に反射した反射光ＬＲを受光して、標的物質（例えば、コルチゾール）を検出したり、標的物質の濃度を求めたりする。そして、標的物質捕捉装置２１は、凹部２８Ｂの壁面２８ａが凹部２８Ｂの底面２８ｂに対して所定の角度を有するように反射面２９に形成されているため、反射光ＬＲのピーク波長の特定を容易に行うことができる。このため、標的物質の検出精度及び濃度の計測精度をさらに向上させることができる。また、コルチゾール抗体溶液、唾液、リンス液などの使用量を大幅に低減することができる。
【０１０７】
なお、本実施形態では、標的物質捕捉装置２１は、反射面２９に抗体３４を固定しているが、これに限定されるものではなく、標的物質捕捉装置２１は、反射面２９に抗体３４を固定しないで用いてもよい。
【０１０８】
［実施形態２］
図１に示す標的物質検出装置１０を用いて標的物質を検出する他の方法について説明する。本実施形態に係る標的物質捕捉装置２１は、反射面２９に固定するものを抗原（標的物質）３６とし、この抗原３６に抗体３４を吸着させることに変更したこと以外は実施形態１と同様であるため、重複した説明は省略する。
【０１０９】
図２７〜図３１は、フォトニック結晶バイオセンサーの原理を説明する図である。抗体３４と、抗原３６との特異的反応として、本実施形態では、抗原３６としてコルチゾールと、抗体３４として抗コルチゾール抗体とを用いて説明する。
【０１１０】
まず、図２７に示すように、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に抗原３６を固定する手段として、抗体３４を反射面２９に固定する手段と同様に行うことができる。抗原３６を反射面２９に固定する手段としては、例えば、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法が挙げられる。これらの手段は、抗原３６の性質に応じて適宜選択することができる。
【０１１１】
標的物質捕捉装置２１に固定される抗原３６の量は、一定量である。これにより、標的物質捕捉装置２１に固定される抗原３６に抗体３４が吸着して複合体６５（図２９及び図３０参照）が形成された場合に、形成された複合体６５の量と相関する物理量を、フォトニック結晶バイオセンサー１１が出力できる。固定される抗原３６の一定量は、適宜変更してもよく、例えば、試料Ｓに含まれる抗原３６の量の範囲によって最適な量に設定することができる。
【０１１２】
その後、図２８に示すように、ブロッキング剤３５を反射面２９の抗原３６の付着していない箇所に固定させる。
【０１１３】
次に、標的物質捕捉構造体２５の反射面２９に、例えば３００ｎｍ以上９００ｎｍ以下の光（入射光）ＬＩを平行光で、かつ光軸が反射面２９と直交するように照射する。このときの反射光ＬＲの強度又は反射率が極値（この例では極小値）となる波長をλ１とする。
【０１１４】
次に、図２９に示すように、抗原３６と抗体３４との複合体６５と、抗体３４とを含む混合物Ｍを準備する。混合物Ｍは、抗原３６を含む試料Ｓと既知量の抗体３４を含む溶液Ｇとを混合することで得られる。複合体６５は、抗原３６を含む試料Ｓと既知量の抗体３４を含む溶液Ｇとを混合することで、抗体３４と抗原３６とが反応して得られる。抗体３４は、抗体３４の既知量を試料Ｓに含まれる抗原３６の結合する部位の量よりも多くすることにより、混合物Ｍ中に抗原３６と反応せずに残ったものである。混合物Ｍを、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に接触させる。これにより、図３０に示すように、反射面２９に固定された抗原３６と抗体３４とで複合体６５を反射面２９に形成させる。その後、図３１に示すように、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に、例えば３００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下の光（入射光）ＬＩを平行光で、かつ光軸が反射面２９と直交するように照射する。このときの、反射光ＬＲの反射光強度又は反射率が極値（この例では極小値）となる波長をλ２とする。
【０１１５】
光の反射率が極値となる波長の波長シフト量は、λ２−λ１である。標的物質捕捉装置２１の反射面２９における表面状態の変化に応じて、波長シフト量は変化する。この波長シフト量に基づいて、抗原３６の検出及び定量を行う。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、光学的な物理量を出力する。この物理量は、反射面２９における表面状態の変化に相関し、反射面２９に固定された抗原３６と抗体３４とで形成される複合体６５の量と相関する。
【０１１６】
本実施形態は、標的物質捕捉装置２１に抗原３６であるコルチゾールを固定させて、抗体３４である抗コルチゾール抗体を反応させている。上記実施形態１のように、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に抗体３４を固定させた後、抗体３４に抗原３６を反応させる場合と比較して、本実施形態のように、標的物質捕捉装置２１の反射面２９にコルチゾールを固定させた後、コルチゾールに抗コルチゾール抗体を反応させる場合の方が、標的物質捕捉装置２１の表面状態の変化が大きくなり、フォトニック結晶バイオセンサー１１の感度が向上する。また、本実施形態では、凹部２８Ｂは、凹部２８Ｂの壁面２８ａが凹部２８Ｂの底面２８ｂに対して所定の角度を有するように標的物質捕捉装置２１の反射面２９に形成されているため、ピーク波長を容易に特定することができる。このため、本実施形態によれば、フォトニック結晶バイオセンサー１１の感度をさらに高くすることができる。
【０１１７】
次に、抗原３６の濃度の測定方法を説明する。試料Ｓに含まれる抗原３６の結合する部位の量をＸ、混合物Ｍ中の抗体３４の既知量をＣとする。このとき、ＸとＣとの関係は、ＸをＣよりも少なくする（Ｘ＜Ｃ）。混合物Ｍ中において、抗原３６と抗体３４とが抗原抗体反応して、複合体６５が形成される。ＸはＣよりも少ない（Ｘ＜Ｃ）ので、混合物Ｍ中の抗体３４の量は、Ｃ−Ｘとなる。そして、混合物Ｍを、一定量の抗原３６が固定された反射面２９に接触させると、混合物Ｍ中の抗体３４が反射面２９の抗原３６と抗原抗体反応して、複合体６５が形成される。反射面２９に固定されている抗原３６の量は、混合物Ｍ中の抗体３４の量Ｃ−Ｘ以上である。
【０１１８】
混合物Ｍ中のすべての抗体３４が反射面２９の抗原３６と抗原抗体反応すると、複合体６５の量はＣ−Ｘになる。混合物Ｍを反射面２９に接触させる前後において計測した波長λ１、λ２から求めた波長シフト量Δλは、反射面２９に固定された複合体６５の量に相当する。したがって、Δλ＝ｋ×（Ｃ−Ｘ）となる。ｋは、波長シフト量Δλを複合体６５の量に変換するための定数である。反射面２９に固定された複合体６５の量と波長シフト量Δλとの関係は、予め求めておく。上記関係式から、抗原３６の量Ｘは、Ｃ−Δλ／ｋで求めることができる。抗原３６の濃度は、抗原３６の量Ｘに基づいて求めることができる。
【０１１９】
また、本実施形態では、フォトニック結晶バイオセンサー１１は、例えば、複合体６５と特異的に反応する二次抗体を、複合体結合物質として、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に固定された複合体６５と反応させるようにしてもよい。二次抗体は、複合体６５よりも過剰な量を、標的物質捕捉装置２１の反射面２９に接触させる。そして、全ての複合体６５に二次抗体を付加させて第二複合体とする。このようにすることで、標的物質捕捉装置２１の表面状態の変化がさらに大きくなる。この結果、フォトニック結晶バイオセンサー１１の感度がさらに上昇する。二次抗体は、そのまま使用することもできるし、他の物質を付加して使用してもよい。二次抗体が大きいほど標的物質捕捉装置２１の表面状態の変化が大きくなるため、二次抗体に他の物質を付加した後、複合体６５と反応させることで、フォトニック結晶バイオセンサー１１の感度がさらに大きくなる。
【０１２０】
反射面２９に、第二複合体を形成させる場合は、第二複合体を形成させた後の反射面２９に光を照射する。その結果得られる反射光強度又は反射率が極値（この例では極小値）となる波長をλ２とする。極値が複数ある場合には、着目する極値を適宜選定する。選定された任意の極値について、波長λ１及び波長λ２を求める。フォトニック結晶バイオセンサー１１は、光学的な物理量を出力する。この物理量は、反射面２９における表面状態の変化に相関し、反射面２９に固定された第２複合体の量と相関する。これにより、第２複合体を検出及び定量する。第２複合体の量は、複合体６５の量と同一であるから、複合体６５を定量することができる。
【０１２１】
上述した標的物質捕捉装置は、標的物質捕捉構造体２５を、凹部の代わりに表面に凸部が周期的に形成された反射面を備えるフォトニック結晶にしてもよい。
【０１２２】
以上説明したように、本発明によれば、光硬化樹脂を使用する光ナノインプリント技術によりフォトニック結晶を形成することによって、フォトニック結晶の反射面の寸法精度を向上させることができる。したがって、このようなフォトニック結晶を用いた検出装置において、標的物質を精度よく検出することができる。また本発明は、離型性に優れた材料を光ナノインプリント技術に用いることによって、未硬化樹脂のモールド内残留を軽減するとともに、万が一残留してしまった場合であっても、有機溶剤等で簡便に除去しうる。さらに本発明によれば、光硬化の際の体積収縮率を軽減させることができる。
【符号の説明】
【０１２３】
１０  標的物質検出装置
１１  フォトニック結晶バイオセンサー
１２  光検出部
１３  処理部
２１  標的物質捕捉装置
２２  上部プレート
２３  下部プレート
２４、４３  開口部
２５  標的物質捕捉構造体
２６  金属膜
２７  表面
２８Ａ、２８Ｂ  円柱状の凹部（凹部）
２８ａ  壁面
２８ｂ  底面
２９  反射面
３１  第１境界部
３２  第２境界部
３４  抗体（標的物質捕捉物質）
３５  ブロッキング剤（保護物質）
３６  抗原（標的物質）
３７、６５  複合体
３８、４４  液滴保持部
３９  マグネットシート
４１  孔付カバー
４２  シート
５１  光源
５２  測定プローブ
５３  光検出装置
５４  第１光ファイバー
５５  第２光ファイバー
５６  コリメートレンズ
６１  出射面
６２  入射面
６３  同一の面（入出射面）
８２、９３  最深部
Ａ  交点
Ｍ  混合物
ＬＩ  入射光
ＬＲ  反射光
【図１】
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【図２】
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【図３】
2015232525.tif 000007
【図４】
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【図５】
2015232525.tif 000009
【図６】
2015232525.tif 000010
【図７−１】
2015232525.tif 000011
【図７−２】
2015232525.tif 000012
【図７−３】
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【図８】
2015232525.tif 000014
【図９−１】
2015232525.tif 000015
【図９−２】
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【図１０】
2015232525.tif 000017
【図１２−１】
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【図１２−２】
2015232525.tif 000019
【図１２−３】
2015232525.tif 000020
【図１３】
2015232525.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
2015232525.tif 000023
【図１６】
2015232525.tif 000024
【図１７】
2015232525.tif 000025
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2015232525.tif 000028
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図１１−１】
2015232525.tif 000040
【図１１−２】
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