(57)【要約】【課題】薬剤獲得耐性及び薬剤自然耐性の機構の解明のために、さらには、薬剤獲得耐性及び薬剤自然耐性を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニングに使用するために、EML4-ALK遺伝子を発現する細胞株、さらには薬剤獲得耐性能及び薬剤自然耐性能を有するEML4-ALK遺伝子を発現する細胞株の提供。【解決手段】以下の工程より得られるA925L由来癌細胞株が生着かつ増殖できること、さらには薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有することを確認して、本発明を完成した。（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈から投与する工程；（２）該哺乳類の胸水から癌細胞を取得する工程；及び（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程より得られる生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株：
（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程；
（２）該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程；及び
（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
【請求項２】
前記（１）〜（３）の工程を複数回繰り返すことを特徴とする請求項１に記載のA925L由来癌細胞株。
【請求項３】
以下の工程より得られる生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株：
（１）請求項１又は２に記載のA925L由来の癌細胞株を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程；
（２）前記哺乳類に薬剤を投与する工程；
（３）前記投与により薬剤耐性を示した該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程；及び
（４）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
【請求項４】
薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する請求項１〜３のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株。
【請求項５】
前記薬剤は、クリゾチニブである請求項３又は４に記載のA925L由来癌細胞株。
【請求項６】
前記薬剤は、クリゾチニブ及び／又はCH5424802である請求項３〜５のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株。
【請求項７】
寄託番号がNITE P-01839であるA925L由来癌細胞株。
【請求項８】
寄託番号がNITE P-01840であるA925L由来癌細胞株。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株を担持する非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
以下の工程を含む薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニング方法：
（１）候補化合物を、請求項１〜８のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株又は請求項９に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程；及び
（２）該細胞株又は腫瘍の増殖を指標として、該候補化合物が薬剤耐性を有する癌に対する抗癌剤になるかどうかを判定する工程。
【請求項１１】
前記指標は、ALKリン酸化阻害である請求項１０に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
（肺癌）
日本では、毎年約6万人以上が肺癌で死亡しており、その中で非小細胞肺癌（NSCLC）は、約75％以上であると言われている。このような肺癌患者の治療方法として、一般的に上皮成長因子受容体（EGFR）のチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）の投与がある。
さらに、NSCLC患者の約3-5％が、EML4-ALKという変異遺伝子を持つことが知られている。
【０００３】
（EML4-ALK遺伝子）
EML4-ALK遺伝子は、肺がん細胞内において２番染色体内の逆位が生じ、EML4遺伝子とALK遺伝子が融合して生成される。また、EML4-ALK融合遺伝子は、癌細胞の増殖に関与していることが報告されている。
【０００４】
（クリゾチニブ）
クリゾチニブ（PF-02341066）は、未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）を阻害する化合物として知られており、日本では2012年3月30日にALK融合遺伝子陽性の切除不能な進行・再発の非小細胞肺癌の治療剤として承認を受けている（参照：非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、クリゾチニブは、EML4-ALK遺伝子のALK融合遺伝子を有する非小細胞肺がん（ALK陽性NSCLC）に対して高い有効性を示すが、1年ほどで耐性が生じることが問題となっている（参照：特許文献１）。
【０００６】
特許文献１では、「クリゾチニブ耐性であるEML4-ALK＋非小細胞性肺がんを処置するための化合物」を開示している。
特許文献２では、「EML4-ALK遺伝子を導入した癌細胞」を開示している。
しかしながら、これらの特許文献では、「生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株、さらには薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有するA925L由来癌細胞株」を開示又は示唆をしていない。
【０００７】
以上により、薬剤（特に、クリゾチニブ耐性）の機構の解明並びに薬剤（クリゾチニブ）耐性を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニング方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】http://www.pfizer.co.jp/pfizer/company/press/2012/2012_03_30.html
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１４−５０４６４６
【特許文献２】国際公報ＷＯ２０１１−１０２５０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
薬剤獲得耐性及び薬剤耐性の機構の解明のために、さらには、薬剤獲得耐性及び薬剤自然耐性を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニングに使用するために、EML4-ALK遺伝子を発現する細胞株、さらには薬剤獲得耐性能及び薬剤自然耐性能を有するEML4-ALK遺伝子を発現する細胞株の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、以下の工程より得られるA925L由来癌細胞株が生着かつ増殖できること、さらには薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有することを確認して、本発明を完成した。
（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈から投与する工程；
（２）該哺乳類の胸水から癌細胞を取得する工程；及び
（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．以下の工程より得られる生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株：
（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程；
（２）該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程；及び
（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
２．前記（１）〜（３）の工程を複数回繰り返すことを特徴とする前項１に記載のA925L由来癌細胞株。
３．以下の工程より得られる生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株：
（１）前項１又は２に記載のA925L由来の癌細胞株を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程；
（２）前記哺乳類に薬剤を投与する工程；
（３）前記投与により薬剤耐性を示した該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程；及び
（４）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
４．薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する前項１〜３のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株。
５．前記薬剤は、クリゾチニブである前項３又は４に記載のA925L由来癌細胞株。
６．前記薬剤は、クリゾチニブ及び／又はCH5424802である前項３〜５のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株。
７．寄託番号がNITE P-01839であるA925L由来癌細胞株。
８．寄託番号がNITE P-01840であるA925L由来癌細胞株。
９．前項１〜８のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株を担持する非ヒト哺乳動物。
１０．以下の工程を含む薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニング方法：
（１）候補化合物を、前項１〜８のいずれか１に記載のA925L由来癌細胞株又は前項９に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程；及び
（２）該細胞株又は腫瘍の増殖を指標として、該候補化合物が薬剤耐性を有する癌に対する抗癌剤になるかどうかを判定する工程。
１１．前記指標は、ALKリン酸化阻害である前項１０に記載の抗癌剤のスクリーニング方法。」
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、生着かつ増殖でき、さらには薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有するA925L由来癌細胞株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の生体内に生着・増殖できる癌細胞株の選択。
【図２】実施例２のA925LPE3の抗癌剤感受性の確認。
【図３】実施例３のA925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の抗癌剤感受性の確認。
【図４】実施例４のA925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物に抗癌剤を投与した時の腫瘍の画像解析。
【図５】実施例５のA925L由来癌細胞株が哺乳動物の脛骨に生着・増殖して、さらに、抗癌剤に感受性があるかどうかの確認。
【図６】実施例６のA925L由来癌細胞株が哺乳動物の脳に生着・増殖して、さらに、抗癌剤に感受性があるかどうかの確認。
【図７】実施例７の薬剤耐性の高いA925L由来癌細胞株の樹立。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、「（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程、（２）該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程；及び（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程より得られる生着かつ増殖できるA925L由来癌細胞株」並びに「A925L由来癌細胞株を用いた抗癌剤のスクリーニング方法」である。以下に詳細に説明する。
【００１６】
（A925L細胞）
本発明の「A925L細胞」は、EML4-ALK  variant 5を含む癌細胞であれば、特に由来は限定されない。
例えば、独立行政法人  製品評価技術基盤機構(NITE)  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター等から入手可能である。
【００１７】
（A925L由来癌細胞株）
本発明の「A925L由来癌細胞株」は、下記で説明する樹立方法から得られた細胞株及びその変異株を意味する。さらに、A925L由来癌細胞株は、哺乳類に移植した場合には、生着及び増殖能を有し、さらには薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する。
薬剤獲得耐性能とは、A925L由来癌細胞が薬剤で処理される（より詳しくは、数か月持続的に薬剤に暴露される）ことにより、該薬剤存在下でも増殖できるようになる能力を意味する。
薬剤自然耐性能とは、A925L由来癌細胞が薬剤で処理された場合（より詳しくは、数日間薬剤に暴露された場合）一部の細胞が死滅せず生存する能力を意味する。
本発明の「変異株」は、A925L由来癌細胞株の特性（癌細胞の特性、生着能、増殖能並びに薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能）を維持しており、かつ人工変異（例、薬剤処理）又は自然変異を得た細胞株を対象とする。
【００１８】
（A925L由来癌細胞株の特性）
本発明の「A925L由来癌細胞株」は、癌細胞（特に、肺癌細胞）の特性を維持しながら、哺乳類に移植した場合には、生着かつ増殖することができる。特に、哺乳類の脳、胸腔、骨（脛骨）等に生着かつ増殖できる。
なお、A925L細胞と同様に、EML4-ALK変異を持つH3122細胞（EML4-ALK  variant 1）及びH2228細胞（EML4-ALK  variant 3）では、下記で説明する樹立方法と同様の方法で得られたH3122由来癌細胞株及びH2228細胞癌細胞株は、生着かつ増殖することができなかった。
よって、本発明の「A925L由来癌細胞株」は、EML4-ALK遺伝子変異を持つ癌細胞の中では特有の性質を有する。
【００１９】
（寄託番号NITE P-01839のA925L由来癌細胞株）
本発明の寄託番号NITE P-01839のA925L由来癌細胞株は、下記で説明するA925L由来癌細胞株の樹立方法に限定されず、哺乳類に移植した場合には、生着及び増殖能を有し、さらには薬剤獲得耐性能（クリゾチニブの獲得耐性能）を有する。
【００２０】
（寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株）
本発明の寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株は、下記で説明するA925L由来癌細胞株の樹立方法に限定されず、哺乳類に移植した場合には、生着及び増殖能を有し、さらには薬剤自然耐性能（クリゾチニブの耐性、CH5424802の耐性）を有する。
【００２１】
（A925L由来癌細胞株の製造方法）
本発明のA925L由来癌細胞株（特に、寄託番号NITE P-01839のA925L由来癌細胞株）の製造方法は、下記の工程（１）〜（３）を含む製造方法により得ることができるが、特に限定されない。また、参考として、Chest. 2002 Jul;122(1):282-8に記載のA925L由来癌細胞株の製造方法を参照することができる。
【００２２】
（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程。
（２）該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程。
（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
さらに、前記（１）〜（３）の工程を複数回、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上繰り返すことが好ましい。
【００２３】
本発明のA925L由来癌細胞株（特に、寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株）の製造方法は、下記の工程（１）〜（７）を含む方法により得ることができるが、特に限定されない。
【００２４】
（１）A925L細胞を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程。
（２）該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程。
（３）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
（４）該A925L由来の癌細胞株を、ヒトを除く哺乳類に静脈投与、皮下移植、胸腔内移植、脳内移植、骨内移植又は腹腔内移植する工程。
（５）前記哺乳類に薬剤を投与する工程。
（６）前記投与により薬剤耐性を示した該哺乳類の胸水又は腹水から癌細胞を取得する工程。
（７）該癌細胞をin vitroで培養して、A925L由来癌細胞株を樹立する工程。
なお、上記好ましい薬剤は、クリゾチニブである。
【００２５】
（クリゾチニブ）
クリゾチニブは、c−Met／HGFR及びALKを含めたプロテインチロシンキナーゼを標的とする癌治療剤であって、ＰＦ−０２３４１０６６とも呼ばれる。
本発明の「クリゾチニブ」は、（Ｒ）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）−５−（１−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン及びそれの医薬的に許容できる塩類を含む。
また、クリゾチニブは、市販されており容易に入手可能である。
【００２６】
（CH5424802）
CH5424802（AF802）は、キナーゼ活性を選択的に阻害することにより、腫瘍細胞の増殖を阻害しアポトーシスを誘導することで、抗腫瘍効果を有することが知られている（参照：下記の化学式）。
また、CH5424802は、市販されており容易に入手可能である。
【００２７】
【化１】
2015228860.tif 000002
【００２８】
（薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニング方法）
本発明の「薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニング方法」は、以下の工程を含むが、特に限定されない。
（１）候補化合物を、A925L由来癌細胞株又は該細胞株を担持した非ヒト哺乳動物に投与する工程。
（２）該細胞株又は腫瘍の増殖を指標として、該候補化合物が薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する癌に対する抗癌剤になるかどうかを判定する工程。
【００２９】
本発明で用いる「候補化合物」としては任意の物質を使用することができる。候補化合物の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。また、候補化合物は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。候補化合物は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明の「増殖の指標」とは、候補化合物非存在下での増殖と比較した、細胞の数、腫瘍の面積、増殖を示すマーカー（例えば、特定のタンパク質の活性、リン酸化タンパク質の量、ALKリン酸化阻害程度）である。該指標を測定することにより、候補化合物が薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有する癌に対する抗癌活性を有するかどうかを判定することができる。
また、薬剤耐性の薬剤としては、好ましくは、クリゾチニブ、CH5424802等を例示することができるが、特に限定されない。
【００３０】
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例は金沢大学動物実験指針に基づいて行った。
【実施例１】
【００３１】
（生体内に生着・増殖できる癌細胞株の選択）
本実施例では、生体内に生着・増殖できる癌細胞株、特に肺癌細胞株を樹立することを目的とする。様々な細胞株をSCIDマウスで培養（in vivo培養）して、癌細胞を該マウスから取得し、in vitro培養し、さらに該癌細胞をマウスに移植して、生着・増殖能を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３２】
（生体内に生着・増殖できる癌細胞株の選択方法及び結果）
A925L ｛1x106/15uL、独立行政法人  製品評価技術基盤機構(NITE)  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センターから入手可能｝を、8匹のSCIDマウスの胸腔内に接種した。接種後の21日目には2/8のマウスに胸水が形成された（参照：図１Ａ）。得られた胸水中の癌細胞をin vitroで培養したのち、さらにSCIDマウスに静注した。このサイクルを3回繰り返し、高胸水形成能を有する細胞株（以後、"A925LPE3"と称する場合があり、寄託番号NITE P-01839のA925L由来癌細胞株）を得た（参照：図１Ｃ）。A925LPE3(1x106/15uL)をSCIDマウスの胸腔内に接種すると、21日目には8/8のマウスにがん性胸水が形成された（参照：図１Ｂ）。 
加えて、A925LPE3は、親株であるA925Lと同様に、variant 5を有することを確認した。
なお、EML4-ALK変異を持つH3122細胞（EML4-ALK  variant 1）及びH2228細胞（EML4-ALK  variant 3）は、生着できなかった。
加えて、EGFR変異株（PC-9、HCC827、H1975、HCC2279、H1650、PC-3）は、生着できなかった。
以上により、本実施例の結果により、A925L由来癌細胞株は、他の癌細胞株とは異なり、生着かつ増殖することができる。
【実施例２】
【００３３】
（A925L由来癌細胞株の抗癌剤感受性の確認）
実施例１で得られたA925LPE3の抗癌剤感受性を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３４】
（A925L由来癌細胞株の抗癌剤の感受性の確認方法）
A925L｛2000個/well  （96穴平底プレート）｝、A925LPE3｛2000個/well  （96穴平底プレート）｝、H3122｛2000個/well  （96穴平底プレート）｝、H2228｛2000個/well  （96穴平底プレート）｝及びPC9｛2000個/well  （96穴平底プレート）｝に、図２Ａ、２Ｂに記載の各濃度のクリゾチニブ又はCH5424802を添加して、細胞の成長度を確認した。
さらに、クリゾチニブ（1μM）又はCH5424802（1μM）を添加したA925L並びにクリゾチニブ（1μM）又はCH5424802（1μM）を添加したA925LPE3の遺伝子発現を解析した。
【００３５】
（A925L由来癌細胞株の抗癌剤の感受性の確認結果）
A925L及びA925LPE3は、クリゾチニブ及びCH5424802の両方に同等の感受性を示した（参照：図２Ａ、Ｂ、Ｄ）。さらに、A925L及びA925LPE3は、クリゾチニブ及びCH5424802に高感受性のH3122及び低感受性のH2228と比較し、中程度の感受性を示した（参照：図２Ａ、Ｂ、Ｄ）。
加えて、A925L及びA925LPE3は、クリゾチニブ及びCH5424802処理により、ALKリン酸化が抑制され、下流のSTAT3、AKT、ERKのリン酸化がいずれも著明に抑制された（参照：図２Ｃ）。
以上により、A925LPE3は、抗癌剤濃度依存的に感受性を示すので、抗癌剤の作用機構の解明及び抗癌剤のスクリーニングに使用することができる。
【実施例３】
【００３６】
（A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の抗癌剤感受性の確認）
A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の抗癌剤感受性を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３７】
（A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の抗癌剤感受性の確認方法）
A925L PE3 (1x106)をSCIDマウスの皮下に移植し、200mm3の腫瘍体積になった時点で、クリゾチニブ又はCH5424802を連日経口投与し、腫瘍径を継時的に測定した。
さらに、該マウスに生着・増殖したA925L PE3の ALK遺伝子及びp-ALK遺伝子発現量を測定した。
【００３８】
（A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の抗癌剤感受性の確認結果）
25mg/kgクリゾチニブ投与したマウスの腫瘍増大は遅延したが、腫瘍縮小は得られなかった（参照：図３Ａ）。50mg/kgクリゾチニブ投与したマウスでは、腫瘍縮小効果が得られたが腫瘍は残存した（参照：図３Ａ）。 
25mg/kg CH5424802投与したマウスでは、顕著に腫瘍縮小効果が得られ、7日目には腫瘍はほぼ消失した（参照：図３Ａ）。 
抗癌剤を投与されたマウスのA925L PE3では、クリゾチニブ投与によりALKリン酸化は著明に抑制され、CH5424802投与では完全に阻害された（参照：図３Ｂ）。これにより、クリゾチニブ及びCH5424802は、ALKリン酸化阻害の程度に応じて、腫瘍細胞の増殖を抑制した。
これにより、A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物（ヒトを除く）は、抗癌剤濃度依存的に腫瘍縮小を示すので、抗癌剤の作用機構の解明及び抗癌剤のスクリーニングに使用することができる。
さらに、A925L PE3のALKリン酸化阻害を「増殖の指標」として、抗癌剤のスクリーニングに使用することができる。
【実施例４】
【００３９】
（A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の画像解析）
A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物に抗癌剤を投与した時の腫瘍の画像解析を行った。詳細は、以下の通りである。
【００４０】
（A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の画像解析方法）
最初に、A925L PE3にEGFR/Luc を導入したA925L PE3（Luc）を作成した。さらに、基質（Luciferin）をA925L PE3（Luc）に添加することにより、A925L PE3（Luc）がルシフェラーゼにより発光することを確認した。
次に、1x106 A925L PE3（Luc）をSCIDマウス胸腔に移植し、12日目から25mg/kgクリゾチニブ又は25mg/kg CH5424802による連日経口投与を行った。 
【００４１】
（A925L由来癌細胞株を生着・増殖させた哺乳動物の画像解析の結果）
コントロール群（抗癌剤未添加）は、継時的に発光が増強（腫瘍が増大）して、28日目で死亡した（参照：図４Ａ、Ｂ）。
クリゾチニブ投与群は、投与開始から発光が低下し（腫瘍が縮小し）、28日目にはほぼ発光が消失した。しかし、28日目以後は、クリゾチニブ投与継続にかかわらず発光が増強し（腫瘍が増大し）、70日目には死亡した（参照：図４Ａ、Ｂ）。 
CH5424802投与群は、投与開始から継時的に発光が低下し（腫瘍が縮小し）、120日で投与を中断しても160日時点での発光はほとんどない状態が維持された。 
これにより、クリゾチニブ投与の量を調整して投与することにより、A925L由来癌細胞株は、薬剤獲得耐性能、特にクリゾチニブ獲得耐性能を有することを確認した。
以上により、A925L由来癌細胞株及び該細胞株を担持した哺乳物（ヒトを除く）は、クリゾチニブ獲得耐性の解明及び薬剤耐性（特に、クリゾチニブ）を有する癌に対する抗癌剤のスクリーニングに使用することができる。
【実施例５】
【００４２】
（A925L由来癌細胞株が脛骨に生着・増殖できるかの確認及び抗癌剤感受性の確認）
A925L由来癌細胞株が、哺乳動物の脛骨に生着・増殖して、さらに、抗癌剤に感受性があるかどうかの確認をした。詳細は、以下の通りである。
【００４３】
（A925L由来癌細胞株の脛骨に生着・増殖できるかの確認及び抗癌剤感受性の確認方法）
実施例４と同様に、1x106 A925L PE3（Luc）をSCIDマウスの脛骨に移植し、10日目から25mg/kgクリゾチニブ又は25mg/kg CH5424802による連日経口投与を行った。 
【００４４】
（A925L由来癌細胞株が脛骨に生着・増殖できるかの確認及び抗癌剤感受性の確認結果）
A925L由来癌細胞株であるA925L PE3は、脛骨に生着・増殖できた。さらに、クリゾチニブ投与では、28日目（投与開始18日目）から発光が上昇した（腫瘍が増大した、参照：図５Ａ、Ｂ）。CH5424802投与では、発光の低下（腫瘍の縮小）が見られた（参照：図５Ａ、Ｂ）。
以上により、A925L由来癌細胞株は、脛骨に生着・増殖でき、さらには、抗癌剤感受性だけでなく獲得耐性を示した。
【実施例６】
【００４５】
（A925L由来癌細胞株が脳に生着・増殖できるかの確認及び抗癌剤感受性の確認）
A925L由来癌細胞株が、哺乳動物の脳に生着・増殖して、さらに、抗癌剤に感受性があるかどうかの確認をした。詳細は、以下の通りである。
【００４６】
（A925L由来癌細胞株の脛骨に生着・増殖できるかの確認及び抗癌剤感受性の確認方法）
実施例４と同様に、1x106 A925L PE3（Luc）をSCIDマウスの脳に移植し、10日目から25mg/kgクリゾチニブ又は25mg/kg CH5424802による連日経口投与を行った。 
【００４７】
（A925L由来癌細胞株が脳に生着・増殖できるかの確認及び抗癌剤感受性の確認結果）
A925L由来癌細胞株であるA925L PE3は、脳に生着・増殖できた。さらに、クリゾチニブ投与では、一旦、発光の減少（腫瘍の縮小）が見られたが、26日目（投与開始16日目）から発光が上昇した（腫瘍が増大した、参照：図６Ａ、Ｂ）。CH5424802投与では、発光の低下（腫瘍の縮小）が見られた（参照：図６Ａ）。
以上により、A925L由来癌細胞株は、脳に生着・増殖でき、さらには、抗癌剤感受性だけでなく獲得耐性を示した。
【実施例７】
【００４８】
（寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株の樹立及び特性評価）
より薬剤耐性の高いA925L由来癌細胞株を樹立するために、A925L PE3から新たなA925L由来癌細胞株を樹立した。詳細は以下の通りである。
【００４９】
（寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株の樹立方法）
実施例４のクリゾチニブ投与中に腫瘍増殖が再発したマウスの胸水から癌細胞株を取得して、A925LCR3（寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株）を樹立した。
さらに、実施例２と同様に、A925LCR3及びA925L PE3の抗癌剤の感受性を確認した。
【００５０】
（寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株の特性評価）
A925LCR3は、親株であるA925L PE3と比較し、クリゾチニブ耐性だけでなく、CH5424802に対しても耐性を獲得したことを確認した（参照：図７Ａ、Ｂ、Ｃ）。
以上により、A925LCR3は、クリゾチニブ耐性だけでなくCH5424802耐性も有する。
【００５１】
（総論）
本実施例により、２つのA925L由来癌細胞株を樹立した。
寄託番号NITE P-01839のA925L由来癌細胞株は、哺乳類の脳、胸腔、骨（脛骨）等に生着かつ増殖でき、さらには、クリゾチニブの獲得耐性能を有する。
寄託番号NITE P-01840のA925L由来癌細胞株は、哺乳類の脳、胸腔、骨（脛骨）等に生着かつ増殖でき、さらには、クリゾチニブの耐性及びCH5424802耐性（薬剤自然耐性能）を有する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
生着かつ増殖でき、さらには薬剤獲得耐性能及び／又は薬剤自然耐性能を有するA925L由来癌細胞株を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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