(57)【要約】【課題】醸造設備の省力化、小型化、簡素化に対応するため、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くすることを特徴としたしょうゆ様調味料の製造法、また、麹菌の影響を受けない新たなしょうゆ様調味料を提供することを目的とする。【解決手段】プロテアーゼ、アミラーゼ等の加水分解酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母であって、蛋白質原料、澱粉質原料等の存在下で、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くすることを特徴としたしょうゆ様調味料の製造に用いるための形質転換耐塩性酵母を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼをコードする遺伝子、またはプロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母であって、蛋白質原料の存在下または蛋白質原料および澱粉質原料の存在下で、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、製麹工程を省略または使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料の製造に用いるための、形質転換耐塩性酵母。
【請求項２】
カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼまたはセルラーゼをコードする遺伝子から選択される１または２以上の遺伝子を導入した、請求項１に記載の形質転換耐塩性酵母。
【請求項３】
食塩濃度を４％以上２０％以下にした培地中で、食塩濃度依存的に加水分解酵素の分泌能が向上する、請求項１または２に記載の形質転換耐塩性酵母。
【請求項４】
加水分解酵素をコードする遺伝子の分泌シグナルを麹菌アルカリプロテアーゼ由来の分泌シグナルに改変することで、改変前と比較してより効率的な加水分解酵素の分泌発現が可能である、請求項１から３いずれか一項に記載の形質転換耐塩性酵母。
【請求項５】
加水分解酵素をコードする遺伝子にＧＰＩアンカー配列を有する配列を連結した改変遺伝子を導入することで、改変前と比較してより多くの加水分解酵素を細胞表層に局在させた、請求項１から４いずれか一項に記載の形質転換耐塩性酵母。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の形質転換耐塩性酵母を用いて、蛋白質原料の存在下または蛋白質原料および澱粉質原料の存在下で、４％から２０％の濃度になるように食塩を添加して、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、製麹工程を省略または使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の形質転換耐塩性酵母、またはプロテアーゼ、アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼもしくはセルラーゼ等の麹菌由来の加水分解酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母から選択される複数の形質転換耐塩性酵母を組み合わせて、蛋白質原料の存在下または蛋白質原料および澱粉質原料の存在下で、４％から２０％の濃度になるように食塩を添加して、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、製麹工程を省略または使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌機能を有する耐塩性酵母、該耐塩性酵母を用いて、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させ、しょうゆの醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料およびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、醸造業において醸造設備の省力化、小型化、簡素化が望まれている。特に、多大な設備投資を必要とする製麹工程を要しない醸造食品の製造が望まれている。
しょうゆを例にすると、原料として蛋白質原料と澱粉質原料が用いられ、該蛋白質原料としては主として脱脂大豆または大豆が、また、澱粉質原料としては主として小麦が用いられる。脱脂大豆は蒸煮され、割砕した小麦と別途用意した種麹を加えて混合し、製麹装置を備えた製麹室に入れ、温度を調節しながら、３〜４日間製麹し、その後、麹を麹室から出す。この出麹を仕込みタンクに入れ、次いで、食塩を清水に溶かし、適当な濃度に調製した塩水を混合して、諸味を調製する。
上記製麹工程を省略することができれば、新たな製麹装置や製麹室の設置に必要な設備投資を行うことなく、また、麹の品質管理を行うことなく、仕込みタンクのみでしょうゆの製造を行うことが可能となる。製麹工程が省略されるため、麹菌による発酵の影響を受けない新たな醸造食品の開発も可能となる。製麹工程を省略しないまでも、使用する麹量を減少させることができれば、製麹工程に用いられる新たな製麹装置や製麹室の設置に必要な設備投資が抑えられる。また、仕込みタンクでのしょうゆの醸造期間が短くできれば、仕込みタンクの設置数を減らすことも可能となる。
【０００３】
上記しょうゆの製造法において、製麹工程を省略してしょうゆ様調味料の製造を目指す場合、麹菌由来のプロテアーゼ、アミラーゼ等の加水分解酵素の供給がないため、別途、プロテアーゼ、アミラーゼ等の加水分解酵素の供給が必要となる。しょうゆ醸造において、プロテアーゼ生産能が低下すると、蛋白質の分解、アミノ酸化が進みにくくなるため、しょうゆの旨味が減少する。アミラーゼ生産能が低下すると、糖源の分解が進みにくくなるため、酵母の利用できるグルコースが減少し、酵母による適正なアルコール発酵が起こりにくくなる。また、糖のしょうゆ様調味料の味への寄与が少なくなるため、風味として物足りない調味料になる。
ペクチナーゼやセルラーゼ等の加水分解酵素が減少すると、原料の細胞壁の分解が進まないために諸味の圧搾性に悪影響を及ぼし、生産性の低下につながる。
よって、プロテアーゼ、アミラーゼ等の加水分解酵素が強化されるなど麹菌機能を備え、防黴のための高塩濃度環境下でも生育することができる耐塩性酵母が必要とされる。
【０００４】
麹菌由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡを含み、アルカリプロテアーゼ生産能を有するサッカロマイセス属に属する微生物、アルカリプロテアーゼ生産能を有するチゴサッカロマイセス属に属する微生物（チゴサッカロマイセス・ルキシー  Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）を培養し、培養物よりアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
しかし、生産された上記アルカリプロテアーゼをしょうゆ醸造やその他の調味料生産において利用することは試みられていない。また、アルカリプロテアーゼ生産能を有する耐塩性酵母だけでは、蛋白質原料のみしか分解することができず、通常の発酵では澱粉質原料からアミラーゼによって分解されて供給されるはずの糖の供給が行われず、麹菌機能を備えた耐塩性酵母ということができず、製麹工程を省略することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０２−１６７０８６号公報
【特許文献２】特開平０２−２１１８６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、醸造設備の省力化、小型化、簡素化に対応するため、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料の製造法、また、麹菌の影響を受けない新たなしょうゆ様調味料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母、および該耐塩性酵母を用いて、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料の製造法を提供することにより、醸造設備の省力化、小型化、簡素化を可能にし、また、麹菌の影響がない新たなしょうゆ様調味料を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）  プロテアーゼをコードする遺伝子、またはプロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母であって、蛋白質原料の存在下または蛋白質原料および澱粉質原料の存在下で、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、製麹工程を省略または使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料の製造に用いるための、形質転換耐塩性酵母。
（２）  カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼまたはセルラーゼをコードする遺伝子から選択される１または２以上の遺伝子を導入した、上記（１）に記載の形質転換耐塩性酵母。
（３）  食塩濃度を４％以上２０％以下にした培地中で、食塩濃度依存的に加水分解酵素の分泌能が向上する、上記（１）または（２）に記載の形質転換耐塩性酵母。
（４）  加水分解酵素をコードする遺伝子の分泌シグナルを麹菌アルカリプロテアーゼ由来の分泌シグナルに改変することで、改変前と比較してより効率的な加水分解酵素の分泌発現が可能である、上記（１）から（３）いずれか一つに記載の形質転換耐塩性酵母。
（５）  加水分解酵素をコードする遺伝子にＧＰＩアンカー配列を有する配列を連結した改変遺伝子を導入することで、改変前と比較してより多くの加水分解酵素を細胞表層に局在させた、上記（１）から（４）いずれか一つに記載の形質転換耐塩性酵母。
（６）  上記（１）から（５）のいずれか一つの形質転換耐塩性酵母を用いて、蛋白質原料の存在下または蛋白質原料および澱粉質原料の存在下で、４％から２０％の濃度になるように食塩を添加して、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、製麹工程を省略または使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料。
（７）  上記（１）から（５）のいずれか一つに記載の形質転換耐塩性酵母、またはプロテアーゼ、アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼもしくはセルラーゼ等の麹菌由来の加水分解酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母から選択される複数の形質転換耐塩性酵母を組み合わせて、蛋白質原料の存在下または蛋白質原料および澱粉質原料の存在下で、４％から２０％の濃度になるように食塩を添加して、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、製麹工程を省略または使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料の製造方法。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母を用いて、または該耐塩性酵母と耐塩性乳酸菌を用いて、発酵、熟成させることにより、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させる、しょうゆの醸造期間を短くすることを特徴としたしょうゆ様調味料を提供する。
【００１０】
＜耐塩性酵母＞
本発明における耐塩性酵母としては、公知にしょうゆ醸造に用いられているチゴサッカロマイセス・ルキシー、チゴサッカロマイセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｌｉ）、カンディダ・エテケリシー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、カンディダ・バーサティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）等の耐塩性酵母が好ましい。
【００１１】
＜麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母＞
本発明の麹菌機能を兼ね備えた形質転換耐塩性酵母は、耐塩性酵母を宿主とし、例えば、麹菌由来のプロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、カルボキシペプチダーゼ遺伝子、グルタミナーゼ遺伝子、ペクチナーゼ遺伝子またはセルラーゼ遺伝子等の加水分解酵素遺伝子をそれぞれ単独または複数並列に導入することにより得られる。
上記加水分解酵素遺伝子のＤＮＡを適当なプロモーターおよびターミネーターに連結し、それを耐塩性酵母に組換えにて挿入する。使用するプロモーターには、例えば、ＴＤＨ１遺伝子のプロモーターが利用できる。構成的プロモーターを使用することにより強制発現株を作製することができ、この強制発現株によって制御対象のタンパク質を強制的に発現させることができる。
分泌シグナルは、上記加水分解酵素遺伝子の分泌シグナル領域をそのまま用いてもよいが、耐塩性酵母で作動可能な麹菌由来の分泌シグナル領域を連結し、加水分解酵素がより分泌可能な分泌シグナル領域を選抜して用いてもよい。分泌シグナル領域の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて行うことができ、例えば、麹菌アルカリプロテアーゼ遺伝子の分泌シグナル領域を加水分解酵素遺伝子に連結した改変遺伝子を導入することで、改変前と比較して加水分解酵素をより効率的に分泌させることができる。
【００１２】
また、上記加水分解酵素遺伝子のＤＮＡを適当なＧＰＩアンカー配列を有するＤＮＡと連結した改変遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母では、改変前と比較してより多くの加水分解酵素を耐塩性酵母の細胞表層に局在させることができる。
ＧＰＩアンカー配列は、インターネットサイトのＰｒｅｄ  ＧＰＩ（ｈｔｔｐ：／／ｇｐｃｒ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／ｐｒｅｄｇｐｉ／ｄａｔａｓｅｔ．ｈｔｍ）を参考にして、ＧＰＩアンカー型酵素遺伝子を検索することで得ることができる。
ＧＰＩアンカー型酵素遺伝子には、例えば、ＧＡＳ１、ＳＥＤ１などが利用でき、上記加水分解酵素遺伝子とＧＡＳ１またはＳＥＤ１を連結した改変遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母では、改変前と比較してより多くの加水分解酵素を耐塩性酵母の細胞表層に局在させることができる。
【００１３】
プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、カルボキシペプチダーゼ遺伝子、グルタミナーゼ遺伝子、ペクチナーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子等の加水分解酵素遺伝子は、アスペルギルス属に属する麹菌の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の遺伝子をクローニングすることにより得られる。
遺伝子のクローニング方法としては、例えば、麹菌より染色体ＤＮＡを抽出し、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）等のゲノム配列を参考として設計したプライマーを用いて染色体ＤＮＡよりＰＣＲにより目的のＤＮＡ断片を得る方法が挙げられる。
麹菌としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ４２３９）が挙げられる。
【００１４】
ベクターへのクローニングには、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)等の市販のキットあるいは、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ  ＳＫ＋（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等の市販のプラスミドベクターＤＮＡ、λＥＭＢＬ３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等の市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。
【００１５】
得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を形質転換または形質導入して、それぞれ形質転換体または形質導入体を得る。形質転換は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９７９年，第６８巻，ｐ３２６−３３１）により行なうことができる。
【００１６】
組換え体ＤＮＡは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、カルボキシペプチダーゼ遺伝子、グルタミナーゼ遺伝子、ペクチナーゼ遺伝子またはセルラーゼ遺伝子等の加水分解酵素遺伝子を適当な酵母用のベクターに挿入することにより得られる。
酵母用のベクターとしては、耐塩性酵母で利用可能なものであればよく、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。例えば、酵母発現ベクターＹＥｐ−ＦＬＡＧ−１（ＳＩＧＭＡ社製）、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）、ｐＹＥＸ−ＢＸ、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＹＥＸ−４Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等が使用できる。
耐塩性酵母の形質転換体を選択するマーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ５、ＡＤＥ１のような栄養要求性を相補する遺伝子や、Ｇ４１８など薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
【００１７】
＜麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母による発酵＞
プロテアーゼをコードする遺伝子、またはプロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母により、大豆等の蛋白質原料の存在下および小麦等の澱粉質原料の存在下で、醸造中に耐塩性酵母が生産する加水分解酵素を作用させ原料分解を進行させることで、使用する麹量を減少させ、醸造期間を短くしたしょうゆ様調味料を製造することができる。
プロテアーゼをコードする遺伝子、またはプロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子を複数並列に導入した１種類の形質転換耐塩性酵母を発酵に用いてもよいし、プロテアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母、またはプロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母の２種類を併存させて発酵させてもよい。
プロテアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母のみで、大豆等の蛋白質原料の存在下、発酵させる場合には、蛋白質原料のみしか分解することができず、澱粉質原料からアミラーゼによって分解されて供給されるはずの糖の供給が行われないため、糖を別途培地に補う必要がある。
カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ等の加水分解酵素をコードする遺伝子をさらにプロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子と複数並列に導入した１種類の形質転換耐塩性酵母を、発酵に用いてもよいし、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ等の加水分解酵素をコードする遺伝子を導入した別の形質転換耐塩性酵母を、上記プロテアーゼをコードする遺伝子およびアミラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母と複数種類併存させて発酵させてもよい。
【００１８】
麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母による発酵時の食塩濃度は、加水分解酵素の分泌能を培地中の食塩濃度依存的に向上させることができる４．０〜２０．０％（ｗ／ｖ）が好ましく、６．０〜１６．０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。諸味においては、食塩濃度が４．０％（ｗ／ｖ）未満では防黴性を高める目的としては好ましくない。反対に２０．０％（ｗ／ｖ）を超えると耐塩性酵母による発酵が阻害されるため好ましくない。
食品製造に使用可能な任意のｐＨ調整剤でｐＨ調整することにより、耐塩性酵母による発酵を促進させ、よりしょうゆの味、香りに近づけることができる。調整後のｐＨは、３．０〜７．０が好ましく、ｐＨ４．０〜６．５がより好ましい。ｐＨが低すぎると、酸味が強くなり、また、発酵が阻害されることがある。逆に高すぎると、しょうゆ様調味料としての味・香りの品質が低下する。
ｐＨ調整剤は、食品製造に使用可能なものであれば限定されず、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムの他、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸等を用いることができる。呈味の観点から、水酸化ナトリウムまたは乳酸の使用が特に好ましい。
ｐＨを調整し、食塩を添加し、耐塩性酵母を添加する前に、防黴性を高める観点から、加熱殺菌を行ってもよい。好ましくは７０〜９０℃で１〜６０分間、または１００〜１４０℃で５〜３０秒間加熱し、その後冷却する。
発酵温度は、耐塩性酵母による発酵を効率よく行わせる観点から１５〜４５℃において発酵を行うことが好ましく、特に２０〜３５℃の温度で耐塩性酵母による発酵を行うことが好ましい。
【００１９】
耐塩性酵母添加後は、耐塩性酵母の増殖を旺盛にするため、一定期間諸味を好気条件下で発酵させることが好ましい。好気条件下に保つためには、諸味に酸素または空気を通気し、プロペラ攪拌機を使用する等の方法が好ましい。
【００２０】
耐塩性酵母の増殖は、寒天培養法により菌数を計数する他、諸味中のエタノール量を、ガスクロマトグラフ法を用いて測定することで確認することができる。
エタノールが０．５〜２．５％（ｖ／ｖ）となった際に好気条件下での耐塩性酵母による発酵を終えることが好ましい。好気条件下での耐塩性酵母による発酵を終えた諸味は、さらに静置し、耐塩性酵母による発酵を継続し、エタノールや各種の香気成分を生成させてもよい。その後、香りが劣化しにくい１０〜３０℃の温度において熟成を行うこともできる。
【００２１】
本発明の麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母による発酵期間は、１〜８週間程度が好ましく、２〜６週間が特に好ましい。熟成を行う場合は、発酵期間終了後、１〜１６週間程度熟成させるのが好ましく、約３〜１０週間が特に好ましい。発酵・熟成の終了は、一般成分、香気成分、色度等を考慮して決定することができる。
【００２２】
プロテアーゼ、アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ等の等の麹菌由来の加水分解酵素を効率的に分泌させる、またはこれらを細胞表層に局在させた耐塩性酵母を静置、遠心分離、ろ過等により濃縮することで、より高濃度の加水分解酵素を得ることができる。また、細胞表層に麹菌由来の加水分解酵素を局在させた場合、該耐塩性酵母を回収し、繰り返し培養に用いることもできる。
【００２３】
＜乳酸発酵＞
さらに、本発明の麹菌機能を兼ね備えた耐塩性酵母による発酵諸味は、耐塩性乳酸菌を添加し、１５〜４５℃の温度にて乳酸発酵を行うこともできる。この場合、特に、２０〜３５℃の温度で乳酸発酵を行うことが好ましい。
本発明における乳酸発酵に用いられる耐塩性乳酸菌としては、公知にしょうゆ醸造に用いられているテトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）等の耐塩性乳酸菌の他、漬物等の発酵食品に見出されるペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）が好ましく、しょうゆの風味を持たせる観点からは、特にテトラジェノコッカス・ハロフィラスが好ましい。耐塩性乳酸菌を添加し、乳酸発酵を行う場合の諸味は、通常ｐＨ５．０〜７．０が好ましく、乳酸発酵完了後の諸味は、ｐＨ４．０〜６．０が好ましい。
【００２４】
本明細書における「しょうゆ様調味料」とは、日本農林規格に定める「しょうゆ」と同様の用途で用いられる液体調味料をいう。しょうゆと同様の用途で用いられれば、しょうゆ麹原料（例えば、大豆や小麦）が、しょうゆ様調味料製造のための原料に使用されていなくてもよく、その他、耐塩性酵母の生育に必要な原料が含まれていてもよい。しょうゆ様調味料には、果汁、エキス類、ペースト類、だし類、調味料、酒類、発酵調味料、酸味料、香料等が混合されていてもよい。また、本明細書で記載する「しょうゆ」は、日本農林規格のしょうゆと同一の概念である。
【００２５】
発酵、熟成を終えて得られたしょうゆ様調味料は、清澄化を行ってもよい。清澄化方法は、制限なく従来公知の膜処理、珪藻土ろ過、遠心分離、凝集法、沈降法などを用いることができる。
【００２６】
しょうゆ様調味料は、一般成分分析、香気成分分析を行い、成分を調整することができる。この際ｐＨや塩分、エタノール濃度、グルタミン酸濃度、有機酸濃度、香気成分濃度を適宜調整してもよい。呈味と防黴性の観点から、好ましくはｐＨが３．５〜５．５、塩分が４．０〜２０．０％（ｗ／ｖ）、エタノールが０．５〜８．０％（ｖ／ｖ）、乳酸が０．０２〜３．０％（ｗ／ｖ）となるように調整することが好ましい。
【００２７】
しょうゆ様調味料は、色度も適宜調整することができる。色度は、ＪＡＳ規格により、こいくちしょうゆの場合、しょうゆの標準色１８番（ＪＩＳＺ８７２９の物体色の表示方法によるＬ＊（明度指数）＝３０．０、ａ＊＝４６．１、ｂ＊＝５１．６とする。）未満であることとされており、うすくちしょうゆの場合は、しょうゆの標準色２２番（ＪＩＳＺ８７２９の物体色の表示方法によるＬ＊（明度指数）＝３６．７、ａ＊＝４５．６、ｂ＊＝６２．９とする。）以上であることとされている。
発酵・熟成の温度や期間、殺菌を行う場合には、殺菌時の温度や時間を調整することや、しょうゆ様調味料を希釈する、公知の活性炭処理により脱色する、カラメル、酵母エキスを添加する等して色度を調整してもよい。
こいくちしょうゆ様のしょうゆ様調味料として提供する場合は、しょうゆの標準色１８番未満が好ましく、うすくちしょうゆ様のしょうゆ様調味料として提供する場合は、しょうゆの標準色２２番以上が好ましい。色度の測定には、しょうゆ標準色度計などを用いることができる。
【００２８】
成分を調整したしょうゆ様調味料は、殺菌または除菌を行ってもよい。殺菌の場合は、火入れと呼ばれる加熱殺菌工程を経る。火入れは、公知のしょうゆ製成過程で行なわれている加熱条件を用いればよい。好ましくは７０〜９０℃で１〜６０分間、または１００〜１３０℃で５〜３０秒間加熱し、その後冷却する。加熱によって澱が生じることがあるため、数日間静置した後、澱から上清を分離してしょうゆ様調味料が得られる。また、除菌の場合は、非加熱で公知のＭＦ膜によるろ過、除菌等を行い、ろ過物をしょうゆ様調味料として得る。
【００２９】
このように発酵・熟成させて得られたしょうゆ様調味料は、しょうゆに見出される様々な香気成分が発酵により増加し、風味のバランスに優れ、しょうゆの味と香りが感じられるしょうゆ様調味料となる。これらの成分が生成されているかは、定法に従ってガスクロマトグラフ法により定量することで確認することができる。発酵・熟成は、これら各成分の濃度が上述の濃度範囲に達したことを確認した後、終了することができる。発酵、熟成終了の決定に際しては、上記各成分以外にも、耐塩性酵母、耐塩性乳酸菌による発酵、熟成中のメイラード反応によって生じる成分を考慮することができる。
【００３０】
本発明のしょうゆ様調味料は、日本農林規格の「しょうゆ」と同様の使い方ができ、また任意の飲食品に配合することができる。例えば、つゆ、たれ、和風だし、洋風だし、中華だし、ドレッシング、スープ、ケチャップ、トマトソース、ウスターソース、その他ソース等の調味料に添加して用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母における、アルカリプロテアーゼ活性の確認（実施例３）。
【図２】アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母による、しょうゆ原料の分解（実施例４）。
【図３】カルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換耐塩性酵母による、食塩濃度依存的なカルボキシペプチダーゼの分泌の変化（実施例６）。
【図４】分泌シグナルを改変したカルボキシペプチダーゼの形質転換耐塩性酵母における分泌（実施例７）。
【図５】細胞表層提示用に改変したカルボキシペプチダーゼの形質転換耐塩性酵母における局在（実施例８）。
【図６】細胞表層提示用に改変したカルボキシペプチダーゼの形質転換耐塩性酵母における濃縮（実施例８）。
【実施例】
【００３２】
〔実施例１〕
チゴサッカロマイセス・ルキシーの形質転換体を選択するマーカー遺伝子として、ＵＲＡ５を栄養要求性マーカー遺伝子として用いた。ＵＲＡ５遺伝子は、チゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ１８７６）より取得した。
【００３３】
先ず、チゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株を２ｍＬのＹＰＤ(イーストエクストラクト  １％、グルコース  ２％、ペプトン  ２％)培地を含む試験管に一白金耳植菌後、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で２日間振とう培養を行い、８，０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離により菌体を集菌後、３００μＬのＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁し、スパチュラ２杯程度のガラスビーズ（安井器械社製）を添加した後、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて２，５００ｒｐｍ×６０秒の振とう、および３０秒の冷却を８回繰り返すことにより細胞を破砕した後、１２５μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１６，０００ｇ×３分間の遠心分離後、上清のエタノール沈殿を行い、５０μＬの滅菌水に溶解することでチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の染色体ＤＮＡを得た。
【００３４】
この染色体ＤＮＡ配列を鋳型として、配列番号１、２（表１）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによりＵＲＡ５遺伝子を得た。ＰＣＲ反応にはＫＯＤ―ＰＬＵＳ―ＮＥＯ(東洋紡社製)を用い、メーカーの推奨するプロトコル通りに増幅反応を行った。得られたＰＣＲ産物と、ｐＡＵＲ１２３  ＤＮＡを鋳型として配列番号３、４（表１）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲで増幅したベクター領域を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてメーカーの推奨するプロトコル通りに操作を行い、ＰＣＲ産物の連結反応を行った。得られた反応液で大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、終濃度５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地（０．５％  イーストエクストラクト、１％  トリプトン、０．５％  塩化ナトリウム、２％  寒天）での生育能を指標に形質転換体を得た。
【００３５】
制限酵素処理後のアガロースゲル電気泳動パターン、およびＵＲＡ５遺伝子配列領域のシークエンス解析より、選抜した形質転換体の中から目的通りの改変ベクターが構築されているものを選抜した。終濃度５０μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した２ｍＬのＬＢ液体培地を含む試験管に選抜した形質転換体を植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍの条件で１２時間培養した。この培養液より、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）  ＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてメーカーの推奨するプロトコル通りにベクターを抽出し、これをチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の形質転換に用いるベクターとした。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
〔実施例２〕
・アルカリプロテアーゼ遺伝子配列の取得
アルカリプロテアーゼ遺伝子のドナーとして用いられるアスペルギルス・ソーヤとしては、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ４２３９）を用いた。
アスペルギルス・ソーヤ  ＮＢＲＣ４２３９株の分生子約１０，０００，０００個を５．０ｇの小麦フスマ(フスマ：水＝５：４)に植え、３０℃にて２０時間培養した。培養終了後、約３００から４００ｍｇの菌体を液体窒素により急速に凍結したのち、冷却しておいた乳鉢と乳棒で破砕した。この破砕菌体１００ｍｇを８００μＬのＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)にて室温で５分間処理し、クロロフォルム処理およびアルコール沈殿を経てＴｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。この検体を、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社製）の存在下でＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅのＤＮａｓｅ  Ｉ(タカラバイオ社製)にてメーカーの推奨するプロトコル通りに処理することにより、混入しているゲノムＤＮＡを出来うる限り分解した。
【００３８】
さらに、ＤＮａｓｅＩ処理したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮｅａｓｙカラムにて精製し、精製Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。精製Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、タカラバイオ社製のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴａｓｅを用い、メーカーの推奨するプロトコル通りに逆転写反応を行った。反応終了後、反応液を７０℃で１５分間処理することにより逆転写酵素を失活させｃＤＮＡを得た。
得られたｃＤＮＡ溶液を鋳型として、配列番号５、６（表１）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによりアルカリプロテアーゼ遺伝子の増幅を行った。
【００３９】
〔実施例３〕
・アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入したチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の作製
上述の通り作製したチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の形質転換に用いるベクターＤＮＡを鋳型として配列番号２、７（表１）のプライマーを用いたＰＣＲによりベクター領域を、チゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号８、９（表１）のプライマーを用いたＰＣＲによりＴＤＨ１プロモーター領域を、チゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１０、１１（表１）のプライマーを用いたＰＣＲによりＴＤＨ１ターミネーター領域を、それぞれ得た。
【００４０】
これらと取得されたアルカリプロテアーゼ遺伝子のＰＣＲ産物を混合し、上記と同様の手法でそれぞれのＤＮＡ断片の連結反応を行い、目的とするアルカリプロテアーゼ発現ベクターを得た。構築されたアルカリプロテアーゼ遺伝子を含むベクターでチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６（ウラシル要求性）株を形質転換し、ＳＤ最小培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、２％ グルコース、０．１９２％ Ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｅｄｉｕｍ）での生育能を指標に形質転換体を選抜した。
【００４１】
なお、チゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６（ウラシル要求性）株の形質転換は、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４：１０９２−１０９４  （２０１０）や、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，５５：４８１−４８４  （２００３）に記載のエレクトロポレーション法により行った。
得られた形質転換体を培地（ＹＰＤ培地に食塩濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるように調製したものを試験管に２ｍＬずつ分注したもの）に植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で４日間培養し、得られた培養液を上記と同様の手法でマルチビーズショッカーにより菌体を破砕した後、５００μＬをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に供し、１度滅菌水で洗浄後、１００μＬとなるように水を添加した後、溶出した。得られた５倍酵素濃縮液のアルカリプロテアーゼ活性を測定した。ＹＰＤ培地に１０％となるように食塩を添加しているのは、実施例６において食塩濃度が高い場合において、加水分解酵素の分泌が増大されることを見出したためである。
【００４２】
アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入した形質転換体におけるアルカリプロテアーゼの活性測定は、以下のように行った。
ミルクカゼインを終濃度が２％となるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。この２％ミルクカゼイン溶液１００μＬに、９０μＬの水、および上記の通り作製した５倍酵素濃縮液１０μＬを加えてボルテックスミキサーにより混合した。３０℃にて２０分間インキュベートした。反応終了後、２００μＬの４００ｍＭ  トリクロロ酢酸を加えて混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。この酸変性溶液を、１５，０００ｒｐｍ×１０分間の遠心分離を行い、上清５０μＬを得た。ここに２５０μＬの４００ｍＭ炭酸ナトリウムと５０μＬのＦＯＬＩＮ  ＆  ＣＩＯＣＡＬＴＵＥＵ´Ｓ  ＰＨＥＮＯＬ  ＲＥＡＧＥＮＴ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製)の水５倍希釈液を加え、３０℃で３０分間インキュベートした後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することでアルカリプロテアーゼ活性を求めた。
【００４３】
その結果、アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入した形質転換体では、アルカリプロテアーゼ活性を確認することができた（図１）。なお、コントロールは、アルカリプロテアーゼを含まないベクターで形質転換したチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株を用いて同様の活性測定を行ったものを指す。
【００４４】
〔実施例４〕
・しょうゆ原料の分解
５００ｍＬのプラスチックボトル（アズワン社製）に大豆ミール３０．７ｇ、割砕小麦３３．７ｇとなるようにしょうゆ原料を入れ、そこに１３８ｍＬのＹＰＤ培地に食塩濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるように調製したものを添加した。ここに、アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入した形質転換体を３０℃、１８０ｒｐｍで２日間振とう培養した前培養液２ｍＬを植菌し、３０℃で１日に１度通気・撹拌しながら２週間の静置培養を行った。
得られた培養液１ｇをエッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ×１０分間の遠心分離を行い、上清１００μＬを得た。得られた上清をメーカーの推奨するプロトコル通りにデュマサーム（ゲルハルトジャパン社製）に供することで、可溶化した窒素濃度を測定した。
【００４５】
その結果、アルカリプロテアーゼ遺伝子を導入した形質転換体では、しょうゆ原料分解能を向上させることができることを確認した（図２）。なお、コントロールは、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含まないベクターで形質転換したチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株を同様の手法で管理したものを指す。酵母無しとは、しょうゆ原料をＹＰＤ（＋１０％食塩）培地で懸濁したところにチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株を添加せずに同様の手法で管理したものを指す。
【００４６】
〔実施例５〕
・カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入したチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の作製
上記で作製したアルカリプロテアーゼ発現ベクターを鋳型として配列番号９、１０（表１）のプライマーを用いて発現ベクターのアルカリプロテアーゼ遺伝子領域を除いたものを、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のｃＤＮＡ溶液を鋳型として、配列番号１２、１３（表１）のプライマーを用いてカルボキシペプチダーゼ遺伝子領域を、それぞれＰＣＲにより増幅した。
これらを上記と同様の手法でそれぞれのＤＮＡ断片の連結反応を行い、目的とするカルボキシペプチダーゼ発現ベクターを得た。これでチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６（ウラシル要求性）株を形質転換した。なお、形質転換体の選抜は、上記と同様の手法により行った。
【００４７】
〔実施例６〕
ＹＰＤ培地に食塩濃度が０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％（ｗ／ｖ）となるように調製したものを、それぞれ試験管に２ｍＬずつ分注した。ここに、カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を３０℃、１８０ｒｐｍで２日間振とう培養した前培養液４０μＬを植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で４日間振とう培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離に供することで、培養上清を分離した。培養上清のカルボキシペプチダーゼ活性を酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定キット（キッコーマンバイオケミファ社製）により、メーカーの推奨するプロトコル通りに測定した。
【００４８】
その結果、培地中の食塩濃度依存的に、カルボキシペプチダーゼの分泌能を向上させることができることを確認した（図３）。
【００４９】
〔実施例７〕
上記で作製したカルボキシペプチダーゼ発現ベクターを鋳型として配列番号９、１４（表１）のプライマーを用いて発現ベクターのカルボキシペプチダーゼ遺伝子の分泌シグナル領域を除いたものを、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１５、１６（表１）のプライマーを用いてアルカリプロテアーゼ遺伝子の分泌シグナル領域を、それぞれＰＣＲにより増幅した。これらを上記と同様の手法でそれぞれのＤＮＡの断片の連結反応を行い、目的とする改変カルボキシペプチダーゼ発現ベクターを得た。なお、分泌シグナル領域の予測は、ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて行った。
【００５０】
作製した改変カルボキシペプチダーゼ発現ベクターでチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６（ウラシル要求性）株を形質転換した。なお、形質転換体の選抜は、上記と同様の手法により行った。ＹＰＤ培地に食塩濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるように調製したものを、それぞれ試験管に２ｍＬずつ分注した。ここに、改変カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を同培地中で３０℃、１８０ｒｐｍで２日間振とう培養した前培養液４０μＬを植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で４日間振とう培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離に供することで、培養上清を分離した。上記と同様の手法で培養上清のカルボキシペプチダーゼ活性を測定した。
【００５１】
その結果、改変カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体では、カルボキシペプチダーゼの分泌能を向上させることができることを確認した（図４）。なお、コントロールは、分泌シグナル改変前のカルボキシペプチダーゼ発現ベクターで形質転換したチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株を同様の手法で管理したものを指す。
【００５２】
〔実施例８〕
上記で作製したカルボキシペプチダーゼ発現ベクターを鋳型として配列番号１０、１７（表１）のプライマーを用いて発現ベクターのカルボキシペプチダーゼ遺伝子の終始コドンを除いたものを、チゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１８、１９（表１）のプライマーを用いてＧＰＩアンカー型酵素遺伝子ＧＡＳ１の終始コドンを含む３’末端側１５０塩基を、それぞれＰＣＲにより増幅した。
これらを上記と同様の手法でそれぞれのＤＮＡの断片の連結反応を行い、目的とする改変カルボキシペプチダーゼ発現ベクターを得た。なお、ＧＰＩアンカー型酵素遺伝子の予測はＰｒｅｄ  ＧＰＩ（ｈｔｔｐ：／／ｇｐｃｒ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／ｐｒｅｄｇｐｉ／ｄａｔａｓｅｔ．ｈｔｍ）を用いて行った。
【００５３】
作製した改変カルボキシペプチダーゼ発現ベクターでチゴサッカロマイセス・ルキシーＮＢＲＣ１８７６（ウラシル要求性）株を形質転換した。形質転換体の選抜は、上記と同様の手法により行った。ＹＰＤ培地に食塩濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるように調製したものを、１５０ｍＬ容フラスコに３０ｍＬ分注した。ここに、改変カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を同培地中で３０℃、１８０ｒｐｍで２日間振とう培養した前培養液６００μＬを植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で４日間振とう培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離に供することで、培養上清を分離した。集菌したペレットを１度滅菌水で洗浄した後、回収した培養液と等量の滅菌水で再懸濁した。
【００５４】
得られた培養上清、および菌懸濁液、それぞれのカルボキシペプチダーゼ活性を上記と同様の手法により測定した。なお、コントロールは、細胞表層提示用の改変を行う前のカルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を同様の手法で管理したものを指す。
【００５５】
その結果、改変カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体では、改変前と比較してより多くのカルボキシペプチダーゼ活性を細胞表層に局在させることができることを確認した（図５）。
【００５６】
ＹＰＤ培地に食塩濃度が１０％（ｗ／ｖ）となるように調製したものを、１５０ｍＬ容フラスコに３０ｍＬ分注した。ここに、改変カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を同培地中で３０℃、１８０ｒｐｍで２日間振とう培養した前培養液６００μＬを植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で４日間振とう培養を行った。得られた培養液を８，０００ｒｐｍ×３分間の遠心分離に供し、上清を取り除くことにより最終的に３ｍＬに調製し、菌体を２０倍に濃縮した培養液を作製した。この菌体ペレットをボルテックスにより十分に均一に懸濁させた後、懸濁液のカルボキシペプチダーゼ活性を上記と同様の手法により測定した。
【００５７】
その結果、改変カルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体（改変ｃｐｄ）では、改変前と比較してより効率的にカルボキシペプチダーゼを濃縮することができることを確認した（図６）。なお、コントロールは、細胞表層提示用の改変を行う前のカルボキシペプチダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を同様の手法で管理したものを指す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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