(57)【要約】【課題】  培養が困難な土壌微生物などが産生する抗生物質の探索を可能にする、抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  微生物が生息する環境試料に、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した後、環境試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡに含まれる抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡをメタトランスクリプトーム解析によって選抜する工程を含む。本発明によれば、培養が困難な微生物の他、これまでに知られていない微生物が産生する抗生物質の探索も可能である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が生息する環境試料に、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した後、環境試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡに含まれる抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡをメタトランスクリプトーム解析によって選抜する工程を含む抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】
抗生物質産生関連遺伝子がポリケタイド合成酵素（ｐｋｓ）遺伝子である請求項１記載の方法。
【請求項３】
環境試料が土壌であって、対象とする微生物が土壌微生物である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質が糖類である請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
糖類がキチンである請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法によってスクリーニングされた抗生物質産生関連遺伝子を用いた遺伝子工学的手法による抗生物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌などの土壌微生物に代表される環境中の微生物が二次代謝産物として産生する抗生物質が、人類の健康や福祉に多大な貢献を果たしていることは周知の通りであるが、これまでその探索は、例えば土壌微生物の場合、微生物の生息場所である土壌を分離源として希釈平板法によって出現したコロニーを選択し、純粋培養を行った後、得られた分離株の抗生物質の産生性を調べる方法によって行われてきた（例えば非特許文献１）。しかしながら、こうした方法は、作業が煩雑で困難な上、効率が悪いことに加え、近年では、長年にわたる探索努力の結果から、新たに見出される抗生物質が既に知られている物質であるといったことが多い。また、土壌中には極めて多種多様の微生物が生息しているが、そのうち培養が可能な微生物はせいぜい１％程度といわれており、残りの約９９％は培養が困難な微生物である（例えば非特許文献２）。従って、培養が困難な土壌微生物については、上記のようなこれまでの方法ではその抗生物質の産生性を調べることができないことから、探索が手つかずの状態にある。よって、培養が困難な土壌微生物が新規な抗生物質を産生しているとしても（その可能性は大いに期待される）、これまでの方法では探索することができない以上、探索するための新たな方法が必要となるが、そうした方法は今だ存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】堀田国元ら、「バイオサイエンスと放線菌」、日本放線菌学会編、医学出版センター、１９９４年
【非特許文献２】Ｔｏｒｓｖｉｋ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５６：７８２−７８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、培養が困難な土壌微生物などが産生する抗生物質の探索を可能にする、抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の点に鑑みてなされた本発明の抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法は、請求項１記載の通り、微生物が生息する環境試料に、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した後、環境試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡに含まれる抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡをメタトランスクリプトーム解析によって選抜する工程を含む。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、抗生物質産生関連遺伝子がポリケタイド合成酵素（ｐｋｓ）遺伝子である。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、環境試料が土壌であって、対象とする微生物が土壌微生物である。
また、請求項４記載の方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法において、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質が糖類である。
また、請求項５記載の方法は、請求項４記載の方法において、糖類がキチンである。
また、本発明の抗生物質の生産方法は、請求項６記載の通り、請求項１乃至５のいずれかに記載の抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法によってスクリーニングされた抗生物質産生関連遺伝子を用いた遺伝子工学的手法による。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、培養が困難な土壌微生物などが産生する抗生物質の探索を可能にする、抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例におけるキチンの添加によって土壌中に生息する微生物による発現が活性化された抗生物質産生関連遺伝子（ｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子）の断片の存在を示す電気泳動の結果である。
【図２】同、存在が確認された２５の遺伝子断片の１〜６０ｂｐの配列を解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法は、微生物が生息する環境試料に、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した後、環境試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡに含まれる抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡをメタトランスクリプトーム解析によって選抜する工程を含む。
【０００９】
微生物による抗生物質の産生は、生息の場や栄養源を他の微生物と奪い合うため、他の微生物の増殖や機能を阻害することを目的とするものであり、微生物は抗生物質を常に産生しているのではなく、餌や他の微生物の存在を感知して産生する（Ｎａｚａｒｉ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７９（２）：７０７−７１３）。本発明の抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法は、微生物がこうして二次代謝産物として抗生物質を産生するメカニズムを利用したものであり、微生物が生息する環境試料に、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した後、発現が活性化された抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡを環境試料から直接抽出し、メタトランスクリプトーム解析によってそのｍＲＮＡを選抜する。こうして、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した環境試料中に生息する微生物による発現が活性化されていることが判明した抗生物質産生関連遺伝子が、新規な抗生物質の産生に関与しているかもしれないと予想されるような場合、得られた配列情報に基づいてその抗生物質の産生に関与していると考えられる遺伝子の全長を環境試料のＤＮＡ（メタゲノム）から取得し、機能を確認することで、その遺伝子を発現している微生物を培養することなく、その微生物が産生する抗生物質の新規性や有用性などについて知ることができる。土壌などの環境試料から抽出したＲＮＡを解析するためのメタトランスクリプトーム解析は、集団中に存在する生物が解析時に何をしているのかを明らかにするためのものとして有用であることは、当業者に周知の通りである（必要であれば例えばＷａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９６：７９３−８０２を参照のこと）。なお、本発明において、「産生の活性化」と「発現の活性化」の意味するところは、産生や発現がない状態からある状態に変化する場合や、産生量や発現量が増加する場合などである。
【００１０】
本発明において、抗生物質は、抗菌剤として作用する物質のみならず、抗真菌剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などとして作用する物質も含み、その化学構造としては、β−ラクタム系、アミノグリコシド系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ペプチド系、核酸系、ポリエン系などが挙げられる。
【００１１】
本発明において、標的とする抗生物質産生関連遺伝子としては、これまでに多くの配列情報が蓄積されて公開されている、様々な抗生物質の分子骨格の基本となるポリケタイドを合成する酵素の遺伝子として知られているポリケタイド合成酵素（ｐｋｓ）遺伝子の他、非リボソームペプチド合成酵素遺伝子、ペニシリン結合タンパク質遺伝子などが挙げられる。こうした抗生物質産生関連遺伝子の配列情報は、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋなどの遺伝子バンクから入手することができる。
【００１２】
本発明において、環境試料としては土壌が挙げられ、対象とする微生物としては土壌微生物が挙げられるが、環境試料は水であってもよく、対象とする微生物は水中微生物であってもよい。なお、こうした環境試料中に生息する抗生物質を産生する微生物としては、ストレプトマイシンなどを産生するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に代表される放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の他、ペニシリンなどを産生するアオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属真菌に代表される真菌（Ｒｅｇｎｕｍ  Ｆｕｎｇｉ）などが知られているが、本発明によれば、これまでに知られていない微生物が産生する抗生物質の探索も可能である。
【００１３】
本発明において、微生物が生息する環境試料に添加する、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質としては、他の生物の遺骸やバイオマスとして存在するキチンやセルロースなどの高分子多糖の他、スクロースに例示される二糖、グルコースに例示される単糖などの糖類が挙げられる（Ｎａｚａｒｉ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７９（２）：７０７−７１３）。糖類は微生物の餌となって微生物による抗生物質の産生を活性化させる。微生物による抗生物質の産生を活性化させるその他の物質としては、微生物の代謝系に取り込まれるアミノ酸やタンパク質、あらゆる生物にとって必須である核酸、場合によれば、微生物に対して抗生物質の産生を活性化させる刺激を与える他の微生物が産生する抗生物質などが考えられる。微生物が生息する環境試料に対する微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質の添加量は、例えば１ｇや１ｍＬの環境試料に対して１μｇ〜１ｇであってよい。
【００１４】
微生物が生息する環境試料に、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加し、よく混ぜ込んだり溶解してから、微生物の活動に適した１０〜４５℃に保温し、例えば１分間〜１２０時間が経過した後、環境試料からＲＮＡを抽出する。環境試料からのＲＮＡの抽出は、市販のＲＮＡ抽出キットを用いた自体公知の方法であってよい（必要であれば例えばＮａｚａｒｉ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，７７：６２３−６３５を参照のこと）。こうして環境試料から抽出されたＲＮＡに含まれる抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡのメタトランスクリプトーム解析による選抜は、例えば次のようにして行えばよい。
【００１５】
まず、環境試料から抽出されたＲＮＡには、全てのＲＮＡの９０％以上を占めるリボソームＲＮＡや抗生物質の産生に関連しない遺伝子由来のｍＲＮＡなども多量に含まれているので、抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡを濃縮してもよい。この操作は、例えば、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加していない環境試料から抽出されるＲＮＡを、市販のｃＤＮＡサブトラクションキットを用いたサブトラクション法によって除去することで行うことができる（必要であれば例えばＤｉａｔｃｈｅｎｋｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：６０２５−６０３０を参照のこと）。
【００１６】
環境試料から抽出されたＲＮＡのサンプルから、あるいは、濃縮された抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡを含むサンプルから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを鋳型にして、抗生物質産生関連遺伝子の既知の配列情報に基づいた縮重ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ）を行い、例えばその遺伝子の保存性が高い領域の断片を増幅する。こうして増幅された遺伝子断片を、個別にキャピラリーＤＮＡシーケンサーなどによって解析したり、高性能ＤＮＡシーケンサーによって網羅的に解析したりすることで（高性能ＤＮＡシーケンサーによる網羅的解析については必要であれば例えばＲｏｅｓｃｈ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＩＳＭＥ  Ｊ，１：２８３−２９０を参照のこと）、抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡを選抜する。なお、環境試料から抽出されたＲＮＡのサンプルから、あるいは、濃縮された抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡを含むサンプルから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡをそのまま網羅的に解析することで、抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡを選抜してもよい。
【００１７】
本発明の抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法により、既知の抗生物質産生関連遺伝子とある程度似通っているが異なる（例えば相同性が６０〜８０％）と予想される抗生物質産生関連遺伝子由来のｍＲＮＡの存在を確認することができたような場合、その抗生物質産生関連遺伝子は、新規な抗生物質の産生に関与する遺伝子の候補とすることができる。こうした場合、その抗生物質の産生に関与していると考えられる遺伝子の全長を環境試料のＤＮＡ（メタゲノム）から取得する。その具体的な方法としては、微生物による抗生物質の産生を活性化させる物質を添加した環境試料から抽出したＤＮＡ（メタゲノム）を、大腸菌を宿主とするプラスミドベクターなどにクローニングすることで得たメタゲノムバンクに、その候補遺伝子由来のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡをハイブリダイズすることにより、目的とするクローンを選抜することで取得する方法や、その候補遺伝子の配列情報を利用したメタゲノムウォーキング（必要であれば例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８３：３８９−３９６を参照のこと）を行うことで取得する方法などが挙げられる。取得されたその遺伝子を、例えばその遺伝子を有する微生物が生息する環境と同じ環境に生息する微生物を宿主とする発現ベクターにクローニングすることで、その遺伝子が産生に関与する抗生物質を遺伝子工学的手法によって生産することができる（必要であれば例えばＧｏｍｅｚ−Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ  Ｊ．Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４：２０７−２１５を参照のこと）。こうして生産された抗生物質の構造や活性を調べることで、その抗生物質の新規性や有用性などを明らかにすることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１９】
実施例１：キチンの添加によって土壌中で活性化される抗生物質産生関連遺伝子（ｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子）のスクリーニング
Ｌｉｎｇａｐｐａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９６２）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，５２：３１７−３２３に記載の方法に従って市販のパウダーキチン（ナカライテクノス社）から調製したコロイダルキチンを、環境試料としての愛媛県の畑地土壌に０．２重量％の割合で添加し、よく混ぜ込んでから３０℃に保温した。実験開始から４８時間後と７２時間後に、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて土壌からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡをＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−４００  ＨＲ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて混在するＤＮＡをＤＮａｓｅ消化して除去し、最後にＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて濃縮した。このサンプルからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことでｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを鋳型にして、ＥＸｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いた縮重ＰＣＲを行うことにより、抗生物質の分子骨格の基本となるポリケタイドを合成する酵素の遺伝子として知られているＩＩ型ポリケタイド合成酵素（ｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ）遺伝子の断片を増幅した。なお、縮重ＰＣＲは、フォワードプライマーとして配列番号１に示すＧＧＩＴＧＣＡＣＳＴＣＩＧＧＩＭＴＳＧＡＣ（５’末端がｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子の開始コドンから数えて５４０番目に位置する配列に相当）、リバースプライマーとして配列番号２に示すＣＣＧＡＴＳＧＣＩＣＣＳＡＧＩＧＡＧＴＧ（同、１１００番目に位置する配列に相当）を、縮重プライマーとして用いて行った。結果を図１に示す。図１には、コロイダルキチンを土壌に添加しないこと以外は上記と同様の方法でｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子の断片を増幅した結果をあわせて示す。図１から明らかなように、コロイダルキチンを土壌に添加した場合にのみ、約５００ｂｐのｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子の断片の存在が確認できたことから、土壌中に生息する微生物によるｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子の発現は、土壌にコロイダルキチンを添加することで活性化されることがわかった。
【００２０】
実験開始から４８時間後に土壌から抽出したＲＮＡから上記の方法で増幅したｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子の断片を、Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて大腸菌にクローニングした後、得られた遺伝子断片の配列決定を、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ）によって行い、ｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子の既知の配列と比較した。２５の遺伝子断片の１〜６０ｂｐの配列を解析した結果を図２に示す。図２から明らかなように、コロイダルキチンを土壌に添加することで、土壌中に生息する微生物による発現が活性化されたｔｙｐｅＩＩ  ｐｋｓ遺伝子には、様々な配列を有するものがあり、これまでに知られていない配列を有するものも含まれている（図中のＰＫＳ−５とＰＫＳ−２４）ことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、培養が困難な土壌微生物などが産生する抗生物質の探索を可能にする、抗生物質産生関連遺伝子のスクリーニング方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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