(57)【要約】      （修正有）【課題】移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に、移植材料に伸展・生着させることが可能な移植材料の製造方法の提供。【解決手段】２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸等から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する播種工程と、播種した細胞を培養する培養工程により製造された細胞構造体を、移植用基材に付着させる付着工程を備える、移植材料の製造方法。該移植用基材は、多孔質であるか又は、人工血管であることが好ましい。【選択図】図２２
2015058298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用基材に下記製造方法により製造された細胞構造体を付着させる付着工程を備えることを特徴とする、移植材料の製造方法；
＜記＞
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、
前記細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、
細胞を、１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する播種工程と、
前記播種した細胞を培養する培養工程と
を備える、細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記移植用基材は、多孔質であることを特徴とする、請求項１に記載の移植材料の製造方法。
【請求項３】
前記移植用基材は、人工血管であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の移植材料の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする、移植材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に、移植材料に伸展・生着させることが可能な移植材料の製造方法、及び該方法により製造された移植材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
移植治療において用いられる、人工血管、人工皮膚、人工気管等の移植材料には、移植部位の周辺組織の細胞が伸展・浸潤・生着しやすいこと、生体の異物反応が生じにくいこと等の諸特性が求められ、移植材料に関しては今日までに多様な研究がなされてきた。
【０００３】
例えば、人工血管について言えば、特許文献１には、生体内に特殊なアクリル製の部材を埋入し、この部材に対する生体の異物反応により部材の周辺にコラーゲン製の管状の組織体を形成させて、この管状の組織体を脱細胞処理することによって、コラーゲン製の人工血管を製造することが開示されている。また、特許文献２には、筒状に成形された非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体を含む人工血管を製造することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２６１２６０号公報
【特許文献２】特開２００７−０８９７３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
移植後の移植材料には、移植部位の周辺組織の細胞が伸展し、やがて生着する。このとき、細胞分裂を多くの回数繰り返すには、比較的長い時間がかかる。そのため、従来の移植材料では、移植部位の周辺組織の細胞が移植材料の端部から移植材料の全体に伸展・生着するまでに、比較的長い時間を要し（例えば、人工血管の場合には約３〜約６月）、移植部位が治癒するまでに比較的長い時間を要していた。
また、細胞分裂の回数には限界が存在し（例えば、血管の場合には血管内皮細胞に関して約６０回程度）、移植材料の端部から細胞が伸展・生着することができる範囲にも限界が存在する（例えば、血管の場合には人工血管の端部から約２ｃｍ程度）。そのため、従来の移植材料では、移植部位の周辺組織の細胞を移植材料の狭い範囲にしか伸展・生着させることができず、移植部位のサイズを比較的小さくしなければならなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に、移植材料に伸展・生着させることが可能な移植材料を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の移植材料の製造方法は、移植用基材に下記製造方法により製造された細胞構造体を付着させることを特徴とする；＜記＞２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、前記細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する播種工程と、前記播種した細胞を培養する培養工程とを備える、細胞構造体の製造方法。
本発明の移植材料の製造方法では、前記移植用基材は、多孔質であることが好ましい。また、本発明の移植材料の製造方法では、前記移植用基材は、人工血管とすることができる。
本発明の移植材料は、上記本発明の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする。
【０００８】
なお、上記細胞密度は、生きた細胞の細胞密度とする。
またなお、本願明細書中に用いられる細胞密度の単位「個／ｍｍ２」と、一般的な細胞密度の単位「個／ｍＬ」との対応関係は、各種細胞培養器（例えば、３５ｍｍ径〜１５０ｍｍ径のディッシュ、６ウェル〜９６ウェルのプレート、Ｔ２５〜Ｔ１６０のフラスコ等）の培養面の面積及びその適切な培地量を考慮すれば、当業者に明確に理解される。例えば、上記「１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度」とは、当業者に周知の２４ウェル細胞培養プレートを細胞培養器として用いた場合には、「２０×１０４個／ｍＬ以上の細胞密度」に相当する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の移植材料の製造方法によれば、移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に、移植材料に伸展・生着させることが可能な移植材料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞構造体の製造方法に従って培養された、ペレット状の構造を有するラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。
【図２】血管内皮細胞から無数の繊維芽細胞様の細胞が拡散した様子を捉えた写真である。
【図３】（ａ）は、細胞培養用組成物及び細胞培養器を用いて培養された、ペレット状の構造を有するラット皮下脂肪由来の間質細胞の細胞構造体がバイオチューブに接着した様子を実体顕微鏡で観察したときの写真であり、（ｂ）は、細胞構造体が接着したバイオチューブを（ａ）中のＸ−Ｘ’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。
【図４】細胞構造体の製造方法に従って培養された、管腔状（チューブ状）の構造を有するラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。
【図５】細胞構造体の製造方法に従って、様々な細胞密度で培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡及び肉眼で観察したときの写真である。
【図６】細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養用組成物を用いて、細胞構造体の製造方法に従って培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。
【図７】細胞培養用組成物中の重合体の含有量を変化させて調製した、細胞培養器を用いて、細胞構造体の製造方法に従って培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。
【図８】アニオン性物質を含まない組成物で被覆した細胞培養器を用いて培養された、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。
【図９】（ａ）、（ｂ）細胞構造体の製造方法に従って培養された細胞の構造と、培養条件との相関を示す図である。
【図１０】細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養用組成物及び細胞培養器を用いて培養された、ラット皮下脂肪由来の間質細胞を位相差顕微鏡で観察したときの写真である。
【図１１】曇点以上の温度で凝集させた重合体／トリス混合物を２５℃の条件にしたときの光透過率（濁度）の経時変化を示す図である。
【図１２】細胞培養用組成物中の重合体に対するトリスの割合を変化させて調製した、細胞培養用組成物について、異なる温度で１Ｈ  ＮＭＲ測定した結果について示す図である。
【図１３】細胞培養用組成物中の重合体に対するトリスの割合を変化させて調製した、細胞培養用組成物の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果について示す図である。
【図１４】細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養器の表面（固体表面）のゼータ電位を測定した結果について示す図である。
【図１５】細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養器の表面に沈殿させる前の微粒子のゼータ電位を測定した結果について示す図である。
【図１６】（ａ）は、細胞培養プレートの表面を、ダイナミックタッピングモードで測定した画像を示す図であり、（ｂ）は、細胞培養プレートの表面を、位相モードで測定した画像を示す図である。
【図１７】細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養器の表面を、蛍光顕微鏡により観察したときの写真である（蛍光はアニオン性物質として用いた蛍光標識したＤＮＡに由来する）。
【図１８】細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比を変化させて調製した、細胞培養器の表面を、水中ＡＦＭにより観察したときの写真である。
【図１９】左上及び左下は、ＧＦＰノックインラット皮下脂肪由来の間質細胞のペレット状の細胞構造体を載せたバイオチューブを、それぞれ×５、×１２．５の倍率で観察したときの写真であり、右上及び右下は、細胞構造体を形成していないＧＦＰノックインラット皮下脂肪由来の間質細胞を加えたバイオチューブを、それぞれ×５、×１２．５の倍率で観察したときの写真である。
【図２０】（ａ）は、図１９左上及び左下に示すバイオチューブをＹ１−Ｙ１’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真であり、（ｂ）は、図１９右上及び右下に示すバイオチューブをＹ２−Ｙ２’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。
【図２１】（ａ）、（ｂ）は、図１９左上及び左下に示すバイオチューブを３７℃で１４日間培養した後に、Ｙ１−Ｙ１’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。
【図２２】（ａ）は、野生型のルイスラットにおいて、腹部大動脈にバイオチューブを移植して、バイオチューブの両端部付近及び中央部付近の外表面にペレット状の細胞構造体を載せたときの様子を観察したときの写真であり、（ｂ）は、上記移植３週間後に、バイオチューブの様子を観察したときの写真である。
【図２３】（ａ）は、移植３週間後に採取したバイオチューブを、観察のために切断した部位、及び移植時にペレット状の細胞構造体を載せた部位と共に、模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すバイオチューブをＺ１−Ｚ１’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真（写真中、宿主の血管部分はエラスチンによる自家蛍光で緑色に光っており、バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが緑色に光っている）である。
【図２４】（ａ）は、移植３週間後に採取したバイオチューブを、観察のために切断した部位、及び移植時にペレット状の細胞構造体を載せた部位と共に、模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すバイオチューブをＺ２−Ｚ２’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真（写真中、宿主の血管部分はエラスチンによる自家蛍光で緑色に光っており、バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが緑色に光っている）であり、（ｃ）は、（ｂ）に示すバイオチューブのうち、特に、ペレット状の細胞構造体を載せた部分を拡大して示す写真である。
【図２５】（ａ）は、移植３週間後に採取したバイオチューブを、観察のために切断した部位、及び移植時にペレット状の細胞構造体を載せた部位と共に、模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示すバイオチューブをＺ３−Ｚ３’に沿って切断したときの断面を蛍光顕微鏡で観察したときの写真（写真中、バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが層状に緑色に光っている）であり、（ｃ）は、（ｂ）に示すバイオチューブのうち、特に、ペレット状の細胞構造体を載せた部分を拡大して示す写真である。（ｄ）は、（ｃ）に示す部分を、ＤＡＰＩ染色して蛍光顕微鏡で観察したときの写真（写真中、バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが層状に緑色に光っており、それらの細胞のＤＡＰＩ染色された細胞核が斑点状に青色に光っている）である。
【図２６】（ａ）は、移植３週間後に採取したバイオチューブの外観を観察したときの写真であり（左及び右は、腹部大動脈の端部、吻合部、バイオチューブの端部、及び腸管の一部を示し、中央は、バイオチューブの中央部、及び腸管の一部を示す）、（ｂ）は、（ａ）中央に示すバイオチューブの中央部、及び腸管の一部を拡大して示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照して、本発明の移植材料の製造方法、及び本発明の移植材料の実施形態について詳細に例示説明する。
【００１２】
（細胞構造体の製造方法）
初めに、本発明の移植材料の製造方法の前提となり得る、細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体について記載する。
【００１３】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡの重合体）は、温度応答性高分子として公知であり、その下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature、以下、「曇点」ともいう。）は３２℃程度である。そのため、ＤＭＡＥＭＡの重合体を含む細胞培養用組成物を被覆してなる細胞培養器を用いた場合には、例えば、室温（約２５℃）のクリーンベンチ内で細胞培養の操作を行う際に、被覆したポリマー層が再溶解して流失してしまうという問題があった。
なお、本願明細書中では、組成物の「曇点」とは、必ずしも厳密な意味で、「所定の温度未満では溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、その温度」を指すものではなく、「不溶化して沈殿した組成物を所定の温度未満の条件下で溶解する際に、溶解に要する時間が１０分以上である、その温度」をも指す。
【００１４】
まず、発明者らは、室温（２５℃）程度の曇点を有する細胞培養用組成物を調製することに成功した。この細胞培養用組成物は、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。
また、発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記細胞培養用組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。
【００１５】
そして、発明者らは、この細胞培養器を用いて、一般的な細胞インキュベーター中で（３７℃で）、血管内皮細胞、脂肪幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、線維芽細胞等の細胞を培養したところ、細胞は互いに集まって、ペレット状（準組織状）や管腔状（チューブ状）の細胞構造体を形成した。ここで、細胞構造体の形状は、細胞培養器に播種される細胞の密度に依存する傾向があることを見出した。
【００１６】
本発明の移植材料の製造方法において用いられる細胞構造体の製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合して細胞培養用組成物を調製する調製工程と、細胞培養用組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する播種工程と、播種した細胞を培養する培養工程とを備えることを特徴とする。
以下、一例の細胞構造体の製造方法が備える各工程の詳細を記載する。
【００１７】
（調製工程）
一例の細胞構造体の製造方法では、まず、細胞培養用組成物を調製する（調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。
【００１８】
（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【００１９】
この細胞培養用組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【００２０】
ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【００２１】
また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【００２２】
上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加などにより、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【００２３】
上記（３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピンなどの人工核酸などが挙げられる。
【００２４】
また、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【００２５】
（３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【００２６】
なお、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【００２７】
一例の細胞構造体の製造方法では、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした細胞培養用組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。
【００２８】
上記割合の細胞培養用組成物を用いた細胞構造体の製造方法によれば、培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【００２９】
また、上記割合は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００３０】
上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【００３１】
一例の細胞構造体の製造方法では、細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。
【００３２】
Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。
【００３３】
上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。
【００３４】
（準備工程）
次いで、調製した細胞培養用組成物を細胞培養器の培養面に被覆して、被覆細胞培養器を準備する（準備工程）。
【００３５】
この被覆細胞培養器によれば、細胞を培養した場合に、例えば、室温のクリーンベンチ内で操作する際においても、上記組成物はある程度の時間、具体的には５分〜４０分間、固化したままであるため、上記組成物、ひいては培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができる。
【００３６】
上記被覆細胞培養器では、培養工程で、上記組成物に含まれるＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の疎水性側鎖と、トリスのアミノ基とが、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えるものと推定される。
また、上記組成物に含まれるアニオン性物質は、培養工程で、上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にするものと推定される。
なお、上記被覆細胞培養器は、培養面に上記（１）及び上記（２）のみからなる組成物を被覆してなる被覆細胞培養器と比較して、細胞毒性、細胞傷害性が抑制され、細胞培養に適した表面状態を有していると推定される。
【００３７】
ここで、上記被覆細胞培養器では、該細胞培養器の培養面が単位面積当たりに有する、細胞培養用組成物中に含まれる（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体の量が、５〜２００ｎｇ／ｍｍ２であることが好ましい。
【００３８】
上記（１）の単位面積当たりの量を、５〜２００ｎｇ／ｍｍ２とすれば、細胞構造体を形成しやすくするという上記細胞培養用組成物の効果が得られやすい。
【００３９】
上記と同様の理由及びコスト上の理由により、上記重合体の単位面積当たりの量は、５〜５０ｎｇ／ｍｍ２であることが更に好ましい。
【００４０】
ここで、上記被覆細胞培養器は、例えば、曇点以下の温度まで冷却した細胞培養用組成物の水溶液を、被覆細胞培養器のウェルの底面に流延させて、その後、３７℃のインキュベーター中で静置して、上記組成物を被覆するために使用した不要な水（上澄液）を除去して、その後、上記組成物を固化させることにより調製することができる。
上澄液の除去を、アスピレーターを用いて行うことが好ましい。これにより、培地の希釈を避け、且つ、上澄液中の微量の成分の影響を除くことができる。
【００４１】
（播種工程）
そして、準備した被覆細胞培養器に、細胞を、１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する（播種工程）。
この工程は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
【００４２】
上記細胞密度に関して、例えば、２００ｍｍ２の培養面の面積及び１ｍＬの培地容量を有する２４ウェルプレートに、播種する場合に、１．０×１０３個／ｍｍ２以上の細胞密度で播種を行うためには、２０×１０４個／ｍＬ以上の細胞密度を有する細胞浮遊液を用いる必要がある。
【００４３】
一例の細胞構造体の製造方法は、軟骨細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の間葉系細胞に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。
【００４４】
上記細胞密度で細胞を播種すれば、詳細なメカニズムは不明であるが、下記の培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。この細胞構造体は、そのペレット状の構造内に生存している細胞を有する。
【００４５】
また、上記細胞密度は、培養中の細胞同士の接触による増殖停止などの、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、５．０×１０３個／ｍｍ２以下とすることが好ましい。
【００４６】
そして、上記細胞密度は、１．５×１０３個／ｍｍ２〜３．０×１０３個／ｍｍ２とすることが更に好ましい。上記細胞密度を上記範囲とすれば、下記の培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００４７】
（培養工程）
最後に、播種された細胞を培養する（培養工程）。
この工程は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。
【００４８】
また、培養時間、使用される培地等の培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。
【００４９】
一例の細胞構造体の製造方法によれば、軟骨細胞などが分化したときに見られるペレット状の構造と同様な構造を有する、ペレット状の細胞構造体を細胞培養器内に再現することを可能にし、分化した細胞中で発現しているＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質等の情報を得ることができる。具体的には、細胞内におけるタンパク質間の相互作用や、細胞の生理活性物質に対する応答性の解析などが可能になる。そのため、一例の細胞構造体の製造方法は、医薬品の研究や分子生物学の基礎研究のための有用なツールを提供することができる。
【００５０】
（細胞構造体）
本発明の移植材料の製造方法において用いられる一例の細胞構造体は、上記一例の細胞構造体の製造方法により製造することができる。
【００５１】
なお、上記細胞構造体の製造方法では、調整工程において、（２）のトリスを用いずに細胞培養用組成物を調製することも可能である。この場合にも、上記細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造された細胞構造体による効果を得ることができる。
【００５２】
（移植材料の製造方法、移植材料）
次いで、本発明の移植材料の製造方法、及び該方法により製造された移植材料について記載する。
発明者らは、ペレット状の細胞構造体の製造方法、及び該方法により製造されたペレット状の細胞構造体に関する前述の発見に加えて、ペレット状の細胞構造体は、生体内の所定の部位におく、又は生体内の所定の部位の環境に似た環境中におくことによって、その部位の組織に適合した細胞（その部位におけるあるべき型の細胞）に分化する機能を有することを見出した。本発明の移植材料の製造方法は、これらの発見に基づくものである。
【００５３】
本発明の移植材料の製造方法は、移植用基材に前述の細胞構造体の製造方法により製造されたペレット状の細胞構造体を付着させる付着工程を備えることを特徴とし、また、本発明の移植材料は、本発明の移植材料の製造方法により製造されたことを特徴とする。
【００５４】
本発明の移植材料の製造方法により製造された本発明の移植材料によれば、移植材料に対して所望の位置に、移植部位の周辺組織に適合した細胞に分化する機能を有するペレット状の細胞構造体を与えることができる（すなわち、移植材料内に細胞ソースを提供することができる）。そのため、移植部位の周辺組織の細胞を、移植材料の広い範囲に伸展・生着させることができ、移植部位のサイズを比較的大きくすることが可能となる。
【００５５】
また、本発明の移植材料の製造方法により製造された本発明の移植材料によれば、移植材料に対して所望の量で、移植部位の周辺組織に適合した細胞に分化する機能を有するペレット状の細胞構造体を付着させることができる。そのため、移植部位の周辺組織の細胞を、移植材料に短期間で伸展・生着させることができ、移植部位を早期に治癒することが可能となる。
【００５６】
移植材料が生体内に移植された際、移植材料内には毛細血管等の組織はおろか細胞さえも存在せず、免疫系が存在しないため、移植材料内における菌の繁殖（ポケット感染）が生じることがある。
本発明の移植材料の製造方法により製造された本発明の移植材料によれば、ペレット状の細胞構造体が、短期間で広範囲に、移植用基材の表面に伸展・生着するため、移植材料に免疫系を及ぼしやすくなる。そのため、上記の移植材料内における菌の繁殖を抑制することができる。
【００５７】
移植材料が生体内に移植された際、移植材料に対する異物反応によりコラーゲンを主成分とするカプセルが形成し、形成したカプセルは後に石灰化してしまうことがある。
本発明の移植材料の製造方法により製造された本発明の移植材料によれば、ペレット状の細胞構造体が、短期間で広範囲に、移植用基材の表面に伸展・生着するため、移植された移植材料が生体に異物と認識されにくくなる。そのため、上記コラーゲンを主成分とするカプセルの形成量を低減することができ、カプセルの石灰化を抑制することができる。
【００５８】
例えば、コラーゲンからなる移植材料（例えば、コラーゲン製の人工血管）を用いれば、コラーゲンは生体適合性を有するために、移植された移植材料が生体に異物と認識されにくくなる。そのため、移植材料のカプセル化に関する問題はある程度解決される。しかしながら、本発明の移植材料の製造方法により製造された本発明の移植材料は、コラーゲンからなる移植材料と比較してもなお、カプセルの形成量の低減、及びカプセルの石灰化の抑制の効果を有する。
【００５９】
また、例えば、多孔質材料からなる移植材料（例えば、多孔質の人工血管）を用いれば、周辺組織の細胞が移植材料に伸展・生着しやすくなる。そのため、細胞が移植材料に伸展・生着する時間及び範囲に関する問題や、移植材料内における菌の繁殖に関する問題はある程度解決される可能性がある。しかしながら、本発明の移植材料の製造方法により製造された本発明の移植材料は、多孔質材料からなる移植材料と比較してもなお、移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に移植材料に伸展・生着させる効果、及び、特に、移植材料の周辺におけるカプセル形成により免疫担当細胞の接近が妨げられることに起因する移植材料内における菌の繁殖を抑制する効果を有する。
【００６０】
（付着工程）
以下、本発明の移植材料の製造方法が備える付着工程の詳細を記載する。
用いられる細胞としては、特に、侵襲性の低い手法による採取を可能にする観点から、脂肪幹細胞が好ましい。なお、脂肪幹細胞は、皮下の脂肪組織を脂肪吸引することによって、採取することができ、採取部位としては、例えば、ヒトの腹部、イヌの胸部等が挙げられる。
移植用基材にペレット状の細胞構造体を付着させる手法としては、例えば、細胞構造体をピンセット等で掴んで移植用基材に載せること、細胞構造体を含む培地を移植用基材に加えること、血管造影用やステントデリバリー用のカテーテルに搭載して、経皮・経管的に、血管造影（アンギオ）による視認又は内視鏡による視認下で、移植用基材に載せること等が挙げられるが、特に限定されない。
【００６１】
ペレット状の細胞構造体は移植用基材の少なくとも一部に付着させればよく、ペレット状の細胞構造体を付着させる移植用基材の位置は、移植用基材の中央部や端部、移植時に吻合部となり得る部分とすることができ、特に限定されない。ペレット状の細胞構造体は、移植用基材上で伸展・浸潤・生着することができるため、適切な環境での培養により移植用基材の全体に亘って細胞を行き渡らせることができる。
付着させる作業は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でもインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも行うことができる。インビトロの場合、細胞培養器において移植部位の環境に似た環境を作り出し、その環境において上記作業を行うことが可能であり、インビボの場合、移植手術中に移植部位において行うことが可能である。
【００６２】
移植用基材としては、例えば、人工血管、人工皮膚、人工気管、人工軟骨、人工歯根、人工骨、多孔性の組織補填材等が挙げられる。
【００６３】
移植用基材の特性としては、多孔質であることが好ましい。
移植用基材を多孔質なものとすれば、細胞が移植用基材の内部に浸潤することが可能になるため、移植用基材のどの部位にペレット状の細胞構造体を付着させても、移植用基材の広い範囲に細胞を伸展・生着させることが容易になる（例えば、人工血管の場合、その一部にペレット状の細胞構造体を付着させるだけで、人工血管の内表面、内部、及び外表面に細胞を行き渡らせることが可能となる）。そのため、前述の、移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に、移植用基材に伸展・生着させるという本発明の移植材料の製造方法の効果を高めることができる。
【００６４】
移植用基材としては、合成材料（化学繊維、高分子材料等）、生体材料、ハイブリッド材料等が挙げられ、一般的には、高分子材料が用いられる。
移植用基材に用いられる高分子材料としては、あらゆる医用高分子材料（一般医用高分子材料、治療用高分子材料）が挙げられ、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、シリコーン、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリ糖酸、ポリヒドロキシアルコン酸、キトサン、ゼラチン等が挙げられ、特に、多孔性を備えさせる観点からは、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、ナイロン、ポリウレタン、ポリエステルが好ましく、特に、生体内で分解させる（生分解性を備えさせる）観点からは、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリ糖酸、ポリヒドロキシアルコン酸、キトサン、ゼラチンが好ましい。
【００６５】
前述の通り、移植用基材としては、人工血管を用いることができる。
この場合、移植用基材の材質としては、多孔性及び生体適合性の観点から、コラーゲンが好ましい。また、この場合、ペレット状の細胞構造体を付着させる作業は、ＥＧＦＰ（血管内皮細胞増殖因子）等を含む培養液等を用いて、インビトロで行うことが可能であり、血管近傍においてインビボで行うことも可能である。
特に、人工血管が生体内に移植された際、人工血管の内部に十分な量の血管内皮細胞が伸展・生着するまでの間、細胞が存在しない又は乏しい領域に、人工血管に繋がれた血管からパンヌス（擬内膜）と呼ばれる組織が伸びてくることが知られている。パンヌスは血流等により細分化され細片となり、この細片が血管を詰まらせる（閉塞させる）可能性を高める。
移植用基材として人工血管を用いれば、移植した人工血管の周辺に存在する血管内皮細胞を、短期間で広範囲に、人工血管に伸展・生着させることができるため、上記のパンヌスが伸展し得る領域を小さくすることができる。そのため、上記のパンヌスの伸展に起因する血管閉塞の可能性を低減し、人工血管を開存させ続けることが可能になる。
【００６６】
なお、ペレット状の細胞構造体の製造方法の各工程の詳細については前述の通りである。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６８】
（試験Ａ）
（試験Ａ１）細胞構造体の製造
（試験Ａ１ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
（Ａ１ａ−１）温度応答性ポリマーの合成
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート７．０ｇを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２１時間紫外線照射することにより、上記反応物を、溶媒を用いることなく（すなわち、ニート条件下で）、重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び、１５時間後に固化して、重合体が、反応生成物として得られた。この反応生成物を、クロロホルムに溶解させ、その後、ｎ−ヘキサンを用いて再沈殿させた。クロロホルム／ｎ−ヘキサンを用いた上記再沈殿を、計６回繰り返すことにより、反応生成物を精製した。
精製した重合体をエバポレーションすることにより、その中に残留する溶媒を除去した。その後、重合体を１５０ｍＬのベンゼンに溶解させ、ＰＴＦＥ製の０．４５μｍフィルター（ポール社製、型番：Ｅｋｉｃｒｏｄｉｓｋ  ２５ＣＲ）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、カチオン性の温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量４．３ｇ、転化率：６１．４％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝９７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝４．１）と決定した。
また、このポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ２Ｏ）中で測定した。結果は下記の通りである。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, 2H, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, 2H, -O-CH2-)
【００６９】
（Ａ１ａ−２）ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の調製
以下、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの無菌水を用いた。
（Ａ１ａ−１）で合成した温度応答性ポリマーを水溶液を調製し、この水溶液を４℃まで冷却することにより、この溶液を液体状態とし、冷却下で２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）（和光純薬製、Ｔｒｉｓ９９９）の顆粒を加えて、速やかに溶解させ、０．２μｍ混合セルロース膜フィルターでろ過し、ポリマー／トリス混合物の水溶液（最終濃度は、ポリマー：１００μｇ／ｍＬ、トリス：１００μｇ／ｍＬ）を得た。
一方、アニオン性物質として、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ＤＮＡ）（プロメガ社製、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、型番：Ｅ１７４１）を用い、このＤＮＡを無菌水に溶解させた（最終濃度：３３μｇ／ｍＬ）。このＤＮＡ溶液３００μLに、上記ポリマー／トリス混合物の水溶液４００μＬを少しずつ滴下して混合した。
そして、この混合物を水１，３００μＬで希釈して、溶液の全量が約２，０００μＬとなるように調整し、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物、すなわち、本発明の移植材料の製造方法において用いられる一例の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物の水溶液（最終濃度、ポリマー：２０μｇ／ｍＬ、トリス：２０μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ：５μｇ／ｍＬ）を得た。
この細胞培養用組成物のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）は、８．０であった。
【００７０】
（Ａ１ａ−３）ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の曇点の測定
（Ａ１ａ−２）で調製したポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の水溶液の、６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜４０℃の間で、低温側から高温側に向かって測定した。
その結果、２０℃〜２８℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、２９℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３０℃付近から吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３０℃の曇点を有することを確認した。
また、冷蔵庫中で冷却して透明な水溶液に戻した、（Ａ１ａ−３）で調整した混合物水溶液を３７℃まで昇温させると、混合物水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、２４時間〜４８時間の間、固化した状態のままであったが、その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。これにより、室温付近における固相から液相への相転移の速度が小さくなっていることが確認された。
上記（Ａ１ａ−２）における、温度応答性ポリマー単体の曇点の測定では、温度変化（昇温及び降温速度は共に１℃／分）に対して良好な応答性で、相転移が生じたことを考慮すると、応答性の遅延が顕著であった。
【００７１】
（試験Ａ１ｂ）細胞培養器に対する細胞培養組成物の被覆（被覆工程）
（Ａ１ａ−２）で調整した細胞培養用組成物の水溶液を４℃まで冷却することにより、この溶液を液体状態とし、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、マイクロプレート、型番：３８１５−０２４、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ２）の各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ、室温下で加えて、素早く穴の底面の全面に流延させた。そして、この細胞培養皿を、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で６時間インキュベートした。
こうして、培養面であるウェルに細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。
【００７２】
（試験Ａ１ｃ、Ａ１ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
室温条件下において、試験Ａ１ｂで準備した２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、
ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９６５、ＦＣＳ：インビトロジェン社製、ロット番号：８５２５４６）中に浮遊させ、細胞密度を１５×１０２個／ｍｍ２（３０×１０４個／ｍＬ）に調整した、培養液を１ｍＬずつ加えた。播種初期の状態の顕微鏡写真の撮影も含めてこの操作には、５分〜１０分を要した。そして、この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で培養した（試験例Ａ１）。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、培養５日目に、培養皿の端部から全ての細胞が一度に剥離して、まるでシートが丸まりながら収縮して行くような動作で、細胞が互いに一箇所に凝集する現象が生じた。上記現象は、肉眼で十分に視認可能であった。互いに集まった細胞は、立体的なペレット状の構造を形成した（図１）。この構造を、位相差顕微鏡で更に詳細に観察すると、これらの細胞が、あたかも何らかの組織を形成するかのように自発的に集合していることを示した（試験例Ａ１）。
【００７３】
得られたペレット状の構造体を、コーティング処理が施されていない通常の２４ウェル細胞培養プレートに移して、更に培養を続けたところ、ペレット状の構造体から無数の繊維芽細胞様の細胞が、ブリードするように放射状に拡散して、培養皿の全面に広がって接着した。これにより、肉眼で視認できるほどの大きさの細胞塊では、通常、内部の細胞がネクローシスを生じ、死滅してしまうこととは対照的に、ペレット状の構造体中の細胞は、生存していることが確認された（図２）。
【００７４】
（比較試験Ａ１）
（比較試験Ａ１ａ、Ａ１ｂ）細胞培養用組成物及び細胞培養器の調製
試験Ａ１ａと同様に、細胞培養用組成物を調製し、試験１ｂと同様に、細胞培養器を調製した。
【００７５】
（比較試験Ａ１ｃ、Ａ１ｄ）細胞の培養
比較試験Ａ１ｂで準備した２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を、上記完全培地中に浮遊させ、細胞密度を５．０×１０２個／ｍｍ２（１０×１０４個／ｍＬ）に調整した、培養液を１ｍＬずつ加えた。そして、この細胞を細胞培養インキュベーター中で培養した（比較試験例Ａ１）。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じて、プレート表面の露出が確認されるようになった。
５日目に、上記露出する領域は、肉眼で確認できるようになり、一方、互いに集まった細胞は、二次元平面で見て網目状の構造を形成した。この網目状の構造を、更に詳細に観察したところ、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成していることが確認され、これらの細胞が、あたかも血管を形成するかのように自発的に集合していることを示した（図４）。
【００７６】
（試験Ａ２）細胞密度の検討
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ２ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
アニオン性物質として、ＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５（ＤＮＡ）を用いた。また、重合体に対するトリスの割合を０．１とした。
トリスの含有量のみを変えることにより、重合体に対するトリスの割合を０．１とした、ポリマー／トリス混合物の水溶液を、試験Ａ１ａの（Ａ１ａ−２）と同様に、調製した。
この細胞培養用組成物のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）を８．４とした。
【００７７】
（試験Ａ２ｃ、Ａ２ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
接着性のラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた。そして、細胞密度を、３．８×１０２個／ｍｍ２（７．５×１０４個／ｍＬ）、７．５×１０２個／ｍｍ２（１５×１０４個／ｍＬ）、１５×１０２個／ｍｍ２（３０×１０４個／ｍＬ）とした（それぞれ、試験例Ａ２、試験例Ａ３、試験例Ａ４）。
上記以外は、試験Ａ１ｃ、Ａ１ｄと同様に、細胞培養を行った。図５に、位相差顕微鏡で観察した図を示す。
７０時間後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、５日目に、試験例Ａ２及び試験例Ａ３では、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じ、その細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成した（図５）。一方、試験例Ａ４では、細胞の集合体が凝集してペレット状の構造を形成した（図５）。図５から、試験例Ａ２の管腔状の構造の方が、試験例Ａ３の管腔状の構造よりも均質性が高く、また、試験例Ａ４では、一部の細胞層が完全に剥離してペレット構造体を形成しつつあることが分かる。
【００７８】
（試験Ａ３）アニオン性物質の割合の検討（Ｃ／Ａ比の検討）
下記に示す条件以外は、試験例１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ３ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
アニオン性物質の含有量のみを変えることにより、細胞培養用組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）を、０．５、２、４、８、１６として、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物を、試験Ａ１ａの（Ａ１ａ−２）と同様に、調製した（それぞれ、試験例Ａ５、試験例Ａ６、試験例Ａ７、試験例Ａ８、試験例Ａ９）。
【００７９】
（試験Ａ３ｃ、Ａ３ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
接着性のラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた以外は、試験Ａ１ｂと同様に、細胞培養を行った。ここで、細胞密度は、７．５×１０２個／ｍｍ２（１５×１０４個／ｍＬ）とした。図６に、位相差顕微鏡で観察した図を示す。
５日目に、試験例Ａ８では、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成していることが確認された（図６）。一方、試験例Ａ５及び試験例Ａ６では、接着した細胞が、通常の培養をした場合に観察されるような良好な接着伸展性を示し（図６）、試験例Ａ７では、一部の細胞がプレート上を移動し、細胞が互いに集まる現象が生じて、多くの小さな凝集体が形成され（図６）、試験例Ａ９では、ほとんどの細胞が死滅した（図６）。
【００８０】
（試験Ａ４）細胞培養用組成物の水溶液中に含まれるポリマーの含有量の検討
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ４ａ）細胞培養用組成物の調製（調整工程）
トリスの含有量のみを変えることにより、重合体に対するトリスの割合を０．１とした、ポリマー／トリス混合物の水溶液を、試験Ａ１ａの（Ａ１ａ−２）と同様に、調製した。
この細胞培養用組成物のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）を８．４とした。
【００８１】
（試験Ａ４ｂ）細胞培養器の準備（準備工程）
ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加える細胞培養用組成物の水溶液中に含まれる温度応答性ポリマーの含有量を１．０、２．０、４．０、８．０μｇとして、試験Ａ１ｂと同様に、細胞培養器に対して細胞培養組成物を被覆した（ウェルが単位面積当たりに有する温度応答性ポリマーの量は、それぞれ、５、１０、２０、４０ｎｇ／ｍｍ２）。そして、培養面に細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた（それぞれ、試験例Ａ１０、試験例Ａ１１、試験例Ａ１２、試験例Ａ１３）。
【００８２】
（試験Ａ４ｃ、Ａ４ｄ）細胞の培養（播種工程、培養工程）
接着性のラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた。そして、細胞密度を３．８×１０２個／ｍｍ２（７．５×１０４個／ｍＬ）とした。
上記以外は、試験Ａ１ｄと同様に、細胞培養を行った。図７に、位相差顕微鏡で観察した図を示す。
５日目に、試験例Ａ１１では、細胞の集合体は、ペレット状の構造を形成した（図７）。一方、試験例Ａ１０では、接着した細胞が、通常の培養をした場合に観察されるような良好な接着伸展性を示し（図７）、試験例Ａ１２及び試験例Ａ１３では、細胞の集合体は、管腔状（チューブ状）の構造を形成した（図７）。
【００８３】
（試験Ａ５）アニオン性物質の検討：ヘパリンを用いた場合
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
（試験Ａ５ａ）細胞培養用組成物及び細胞培養器の調製
アニオン性物質としてヘパリンを用いた。ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物は、３０〜３２℃の曇点を有することが確認でき、また、３７℃まで昇温させて固化させた上記混合物を室温（２５℃）で維持したところ、数分〜２４時間の間、固化した状態のままであったが、その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化することが確認できた。
そして、培養面に上記混合物を被覆してなる細胞培養器が得られた。この細胞培養器は、高い細胞親和性を有し、また、抗血栓性を示した。
発明者らは、上記試験Ａ５に係る細胞培養用組成物について、非特許文献“Nakayama, Y., Yamaoka, S., Nemoto, Y., Alexey, B., Uchida, K., Thermoresponsive Heparin Bioconjugate as Novel Aqueous Anti throrombogenic Coating Material, Bioconjugate Chem., 2011, 22, 193-199.”に報告した。
【００８４】
（比較試験Ａ２）非被覆の細胞培養器
下記に示す条件以外は、試験１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
未処理の、又はフィブロネクチンを被覆した、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、試験Ａ１ｃと同様に、細胞播種を行い、この細胞を細胞培養インキュベーター中で培養した。
３日後に、細胞はコンフルエントの状態となった。更に培養を続けたところ、大部分の細胞は増殖を止めたものの、ごく一部の細胞は、培養面に接着した細胞の上に重なるように増殖した。そして、ネクローシス、融合、剥離浮遊等を生じる細胞が増加して、多くの細胞が死滅した（この細胞死は、死細胞から放出された分解酵素やＨＳＰ（ヒートショックプロテイン）の影響であると推測される）（下記の図８に示す結果と同様の結果が得られた）。実施例Ａ１ｂのように、プレート表面の露出や、細胞の管腔状（チューブ状）やペレット状の構造は、確認されなかった。
【００８５】
（比較試験Ａ３）アニオン性物質を含まない組成物で被覆した細胞培養器
下記に示す条件以外は、試験Ａ１と同様とした。詳細な条件は表１に示す。
アニオン性物質を含まない、（Ａ１ａ−２）で調製したポリマー／トリス混合物の水溶液を用いて、試験Ａ１ｂと同様に、細胞培養器の培養面に細胞培養用組成物を被覆した。そして、細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。
【００８６】
ラット皮下脂肪由来の血管内皮細胞（初代培養細胞）を用いた。そして、細胞密度を７．５×１０２個／ｍｍ２（１５×１０４個／ｍＬ）とした。
上記以外は、試験Ａ１ｄと同様に、細胞培養を行った。培養初期（培養６時間後）に、ほとんどの細胞は接着しておらず、培養２日目には、ほとんどの細胞がネクローシスしていることが確認された（図８）。
【００８７】
（試験Ａ１０）細胞構造体の製造
（試験Ａ１０ａ）細胞培養用組成物の調製
（Ａ１０ａ−２）ポリマー／アニオン性物質混合物の調製
アニオン性物質として、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡＮａ）を用いた。ポリアクリル酸（数平均分子量Ｍｎ＝４．０×１０６ｇ／ｍｏＬ）を秤量し、これに分子中のカルボキシル基と化学量論的に等モル数の水酸化ナトリウムを混合し、更に水を加えて水溶液とした。この水溶液を７２時間攪拌した後に凍結乾燥させることにより粉末を得て、この粉末を以下の実験に用いた。この粉末の調整方法は当業者に周知である。２０μＬのポリマーの水溶液（８５μｇ／ｍＬ）、３０μＬのポリアクリル酸ナトリウム水溶液（３３μｇ／ｍＬ）、及び生理食塩水を調整した。試験Ａ１と同様に、これらを混合し、Ｃ／Ａ比を０．５、１、２、４、６とした混合物を、異なるポリマー及びポリアクリル酸ナトリウム量について、調整した。そして、この混合物をそれぞれの条件において適量の生理食塩水で希釈して、溶液の全量が２００μＬとなるように調整し、ポリマー／アニオン性物質混合物、すなわち細胞培養用組成物の水溶液を得た。詳細な条件は表１に示す。
【００８８】
（Ａ１０ｂ）細胞培養器に対する細胞培養用組成物の被覆（被覆工程）
（Ａ１０ａ−２）で調整した細胞培養用組成物の水溶液を用いて、（Ａ１ａ−７）と同様に、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ２）の各ウェルを被覆した。
こうして、培養面であるウェルに細胞培養用組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。
【００８９】
（試験Ａ１０ｃ−１、１０ｄ−１）細胞の培養（播種工程、培養工程）
ラット皮下脂肪由来の間質細胞（初代培養細胞）を用いて、細胞密度を１０×１０４個／ｍＬ（細胞密度：５．０×１０２個／ｍｍ２）とした以外は、（試験Ａ１ｃ）、（試験Ａ１ｄ）と同様に、細胞培養を行った（試験例Ａ１４〜Ａ２８）。
６日後に、細胞を観察した。Ｃ／Ａ比を０．５とした試験例Ａ１４では細胞に変化は見られず、Ｃ／Ａ比を１、２とした試験例Ａ１５、Ａ１６では、細胞の集合体は多数の小さな凝集体を形成し、Ｃ／Ａ比を４とした試験例Ａ１７では、細胞の集合体は管腔状（チューブ状）の構造を形成し、Ｃ／Ａ比を６とした試験例Ａ１８では、ほとんどの細胞が死滅した（図１０、上段）。また、Ｃ／Ａ比を０．５とした試験例Ａ１９では細胞に変化は見られず、Ｃ／Ａ比を１とした試験例Ａ２０では、細胞の集合体は多数の小さな凝集体を形成し、Ｃ／Ａ比を２とした試験例Ａ２１では、細胞の集合体は管腔状（チューブ状）の構造を形成し、Ｃ／Ａ比を４、６とした試験例Ａ２２、Ａ２３では、ほとんどの細胞が死滅した（図１０、中段）。更に、Ｃ／Ａ比を０．５とした試験例Ａ２４では細胞に変化は見られず、Ｃ／Ａ比を１とした試験例Ａ２５では、細胞の集合体は多数の小さな凝集体を形成し、Ｃ／Ａ比を２、４、６とした試験例Ａ２６、Ａ２７、Ａ２８では、ほとんどの細胞が死滅した（図１０、下段）。
【００９０】
（試験Ａ１０ｃ−２、１０ｄ−２）細胞の培養（播種工程、培養工程）
ラット皮下脂肪由来の間質細胞（初代培養細胞）、及びＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ  ２５（ＤＮＡ）を用いて、細胞密度を１０．０×１０４個／ｍＬ（細胞密度：５．０×１０２個／ｍｍ２）とした以外は、（試験Ａ１ｃ）と同様に、細胞培養を行った（試験例Ａ２９）。詳細な条件は表１に示す。１日後に、（試験Ａ１ｃ）と同様に、ペレット状の細胞構造体（直径約１ｍｍ）が形成した。
１００ｍｍ径の細胞培養皿に１０ｍＬの培地を入れ、ここにバイオチューブを沈めた。上記（試験Ａ１ｃ）で得たペレット状の細胞構造体をピンセットで掴み、これをバイオチューブ上に載せたところ、５分後に細胞構造体はバイオチューブに接着して剥がれなくなった（図３（ａ）参照）。そのまま３７℃で７日間インキュベートすると、ペレット状の細胞構造体は、その体積を減少させて、バイオチューブとの境界が実体顕微鏡を用いた観察では区別できなくなった。このバイオチューブを蛍光顕微鏡を用いて、バイオチューブのＸ−Ｘ’に沿ってクロスセクション観察したところ、ＧＦＰ陽性の細胞がバイオチューブ中へ浸潤して生着していることが分かった。（図３（ｂ）。上記現象は、ペレット状の細胞構造体からブリードした細胞が速やかに接着したものと考えられる。
これらの結果から、ペレット状の細胞構造体を、（１）培養細胞の層に載せることによって簡単に異種細胞の共培養を行える可能性、（２）生体組織と接触させることによって、細胞構造体を形成する細胞を組織に向かって浸潤させて接着させる可能性、（３）生体組織の欠損部位へ載せたり被覆したりすることによって、欠損部位に細胞を補填できる可能性が示された。
【００９１】
なお、本実施例で用いたバイオチューブ（人工血管とも言う）は、コラーゲンを主成分とするものであり、特開平２００４−２６１２６０号公報、の実施例に記載される方法で作成されたものであるが、単にコラーゲンフィルムを巻いて作成したチューブを用いた場合にも同様の現象が生じる。
【００９２】
上記試験例Ａ及び比較試験例Ａの結果を表１に示す。また、一例の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物及び細胞培養器を用いて培養された細胞の構造と、培養条件との相関を図９に示す。
【００９３】
【表１−１】
2015058298.tif 000003
【表１−２】
2015058298.tif 000004
【００９４】
（試験Ｂ）ポリマー／トリス混合物の解析
（試験Ｂ１）ポリマー／トリス混合物の曇点の測定
ポリマーの最終濃度を０．１％、重合体に対するトリスの割合を０、０．５、１、２、４、８として、（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−３）と同様に、ポリマー／トリス混合物の水溶液を調整した（それぞれ、試験例Ｂ１、試験例Ｂ２、試験例Ｂ３、試験例Ｂ４、試験例Ｂ５、試験例Ｂ６）。
【００９５】
（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−３）で調製したポリマー／トリス混合物の水溶液の、６００ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜３７℃の間で測定した。
具体的には、上記の各水溶液２ｍＬを、１０ｍｍ×１０ｍｍの角型石英セル（厚さ１ｍｍ）にそれぞれ加えた。そして、初期温度２０℃から１℃ずつ昇温させながら、各温度における吸光度を測定した。ここで、各温度における吸光度は、ポリマーの温度応答性の影響を受けないように、その温度を３０分間維持した後の吸光度を測定することによって決定した。
その結果、トリスを含まない場合（試験例Ｂ１）には、ポリマーの曇点は、３２℃であり、ポリマー／トリス混合物（試験例Ｂ２〜試験例Ｂ６）の曇点は、３１．０℃〜３０．５℃に低下した。
【００９６】
また、上記ポリマー／トリス混合物の水溶液の温度応答性について解析を行った。具体的には、上記各ポリマー／トリス混合物の水溶液を３７℃で３０分間静置して白濁させ、その後すぐに２５℃で維持し、水溶液の透過率が１００％（対照は水）となるまでに要する時間を測定した。
図１１に結果を示す。ポリマーに対するトリスの割合が増加するほど、固相から液相への相転移の速度が小さくなっていることが確認された。
【００９７】
（試験Ｂ２）ポリマー／トリス混合物の１Ｈ  ＮＭＲによる解析
ポリマーの最終濃度を４．１ｍｇ／ｍＬ、重合体に対するトリスの割合を１、２、４、８として、（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−２）に記載した方法に準拠してポリマー／トリス混合物の重水（Ｄ２Ｏ）溶液を調製した（それぞれ、試験例Ｂ７、試験例Ｂ８、試験例Ｂ９、試験例Ｂ１０）。
このポリマー／トリス混合物の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、４℃、２５℃、３７℃の条件で測定した。詳細な条件は表２に示す。
【００９８】
図１２に結果を示す。ポリマーの１Ｈ  ＮＭＲシグナルの積分値とはポリマー側鎖の−Ｎ（ＣＨ３）２基のプロトンの積分値を指し、トリスの積分値とは−Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３基のプロトンの積分値を指す。４℃では、ポリマーに対するトリスの重量比（相対比）と、ポリマーに対するトリスの１Ｈ  ＮＭＲシグナルの積分値の比とが、ほぼ理論値通りの値を示した。２５℃では、ポリマーに対するトリスの重量比（相対比）が増大するにつれて、ポリマーに対するトリスの１Ｈ  ＮＭＲシグナルの積分値の比が急激に増大した。３７℃では、ポリマー側鎖のプロトンのピークは検出されなかった。これらの結果から、ポリマー／トリス混合物は２５℃付近を超えると、疎水凝集により凝集塊を形成し、これにより温度応答性に凝集するポリマーが磁場環境から遮蔽されること、またその一方で、水溶性のポリマー／トリス混合物では、いかなる温度においてもトリスはポリマーと比較して溶媒中に存在している割合が多いことがわかった（無論、トリス分子の一部はポリマーとの水素結合によりポリマーと共に凝集塊の内部に取り込まれていると考えられる）。
【００９９】
（試験Ｂ３）ポリマー／トリス混合物の示差走査熱量計による解析
ポリマーの最終濃度を４．１ｍｇ／ｍＬ、重合体に対するトリスの割合を０、０．５、１、２、４、８として、（試験Ａ）の（試験Ａ１ａ）（Ａ１ａ−２）と同様に、ポリマー／トリス混合物の水溶液を調整した（それぞれ、試験例Ｂ１１、試験例Ｂ１２、試験例Ｂ１３、試験例Ｂ１４、試験例Ｂ１５、試験例Ｂ１６）。
以下に記載する温度制御は熱分析装置のプログラムを使用して行なった。ポリマー／トリス混合物の水溶液を４０℃まで加熱して３分間維持し、密閉式測定セル内で沈殿を生じさせた後、この混合物を瞬時に２５℃まで冷却し、そのまま２５℃で維持した。そして、この混合物を、示差走査熱量計（島津製作所製、型番：ＤＳＣ６０）を用いて、微分示差走査熱量測定（ｄＤＳＣ）に供した。詳細な条件は表２に示す。
【０１００】
図１３に結果を示す。ポリマー／トリス混合物は２５℃付近で溶解し、この際に吸熱が生じるところ、ポリマーに対するトリスの重量比が増大するにつれて、２５℃に冷却してから吸熱が生じるまでの時間が長くなることがわかった。
【０１０１】
そして、（試験Ｂ１）〜（試験Ｂ３）の結果から、温度応答性を有するポリマーにトリスを加えることによって、ポリマーを含む組成物の温度応答性に変化が生じることが明らかとなった。より詳細には、トリスを加えることによって、一度３７℃で培養皿の底面にポリマーを含む組成物を、凝集、沈殿させて塗布することによって調製した細胞培養器に対して、室温（約２５℃）で（例えば、クリーンベンチ内で）細胞播種の操作を行う際に、細胞培養器に被覆したポリマー層がその温度応答性により再溶解して流失してしまうことを防ぐことができる。
【０１０２】
上記試験例Ｂの結果を表２に示す。
【０１０３】
【表２−１】
2015058298.tif 000005
【表２−２】
2015058298.tif 000006
【表２−３】
2015058298.tif 000007
【０１０４】
（試験Ｃ）細胞培養器表面のゼータ電位の測定
（試験Ｃ１）細胞培養器表面全体のゼータ電位の測定
（試験Ｃ１−１）細胞培養器に対する細胞培養用組成物の被覆
ポリスチレン製の細胞培養プレート（ｎｕｎｃ社、Ｎｕｎｃｌｏｎ（登録商標）  Δ  Ｓｕｒｆａｃｅ、１００ｍ径）を、３５ｍｍ×１４ｍｍ×１ｍｍのサイズの小片に裁断した。なお、上記細胞培養プレートは、アンモニア及び酸素を含む混合ガス中でプラズマ放電を行うことによって調製され、この処理により、アンモニア由来のアミノ基（−ＮＨ２）及び酸素由来のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が導入されたものである。
ここで、（試験Ａ）の（試験Ａ３）と同様に、Ｃ／Ａ比を０．５、２、４、８、１６として、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物を調製し、そして、（試験Ａ）の（試験Ａ１）（Ａ１ａ−７）と同様に、各ポリマー／トリス混合物を、上記裁断された細胞培養プレートに対して被覆した（それぞれ、試験例Ｃ１、試験例Ｃ２、試験例Ｃ３、試験例Ｃ４、試験例Ｃ５）。
具体的には、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の水溶液を、上記小片の細胞接着面の全表面に流延させ、この細胞培養プレートの小片を別の細胞培養プレート内に置き蓋をした。
加湿用水の存在下で乾燥を防ぎながら細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で６時間インキュベートを行い、その後、加湿用水の使用をやめると同時に細胞培養プレートの蓋を外すことによりインキュベーター内は乾燥条件にして、２４時間インキュベートを行った。その結果、約２１時間後には、混合物を流延させた面の水分は、ほとんど蒸発していた。走査型電子顕微鏡による観察により、ポリマー／トリス混合物の水溶液を流延した小片のほぼ全面に、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物による被覆層が均質に形成されていることがわかった。
【０１０５】
（試験Ｃ１−２）ゼータ電位の測定１
（試験Ｃ１−２ａ）Ｃ／Ａ比との関係について
上記被覆された小片の被覆表面のゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。
具体的には、石英セルの下面に小片の試料を密着させ、セル内部にモニター粒子懸濁液を注入した。ここで、標準のモニター粒子として、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ〜＋５ｍＶ）を用いた。また、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。そして、ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式を用いて算出した。
非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位は−６８ｍＶであり、一般的な熱可塑性樹脂の固体表面のゼータ電位として当業者に周知の値であった（比較試験例Ｃ１）。
一方、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、正の値を示し、また、Ｃ／Ａ比依存的に増加することがわかった。具体的には、Ｃ／Ａ比＝０．５の試験例Ｃ１では、−２８ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝２の試験例Ｃ３では、０．５ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝４の試験例Ｃ３では、１９ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝８の試験例Ｃ４では、２０ｍＶ、Ｃ／Ａ比＝１６の試験例Ｃ５では、２２ｍＶであった。
この結果を（試験Ａ）の（試験Ａ３）の結果と比較することによって、細胞培養器の表面のゼータ電位が細胞の分化に影響を及ぼす可能性が示唆された。
なお、当業者に周知の通り、現在の技術では、固体表面のゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものであり、また、試料の調製工程においても、コーティング操作自体にバラツキが存在するものであるため、上記ゼータ電位の測定値はある程度の誤差を有し得る。図１４に結果を示す。細胞培養器表面全体のゼータ電位は、Ｃ／Ａ比が増大するにつれて飽和する傾向が見られた。
（試験Ｃ１−２ｂ）ｐＨとの関係について
（試験Ｃ１−２ａ）と同様に、上記被覆された小片の被覆表面のゼータ電位を測定した。
モニター粒子懸濁液の溶媒をｐＨ＝５の条件下で用いた。まず、非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位を測定したところ、−４０ｍＶであった（比較試験例Ｃ２）。これは、酸性条件とすることにより、培養プレート表面に導入されたカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）のプロトンの解離が抑制されると共に、アミノ基（−ＮＨ２）のプロトン化が促進されて、陽電荷が増加した結果であると推測される。一方、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、正の値を示し、また、Ｃ／Ａ比依存的に増加することがわかった。具体的には、Ｃ／Ａ比＝２の試験例Ｃ６では、３６ｍＶであった。試験例Ｃ２の結果（ｐＨ＝７、０．５ｍＶ）と比較すると、電位が大きく高まった。
この結果は、ポリマーが有する三級アミノ基のプロトン化が促進されて、陽電荷が増加した結果であると推測される。なお、ｐＨ＝５、Ｃ／Ａ比＝２の条件における３６ｍＶというゼータ電位は、ｐＨ＝７、Ｃ／Ａ比＝１６の条件における（試験例Ｃ５）２２ｍＶというゼータ電位と比較して高い。
なお、モニター粒子懸濁液の溶媒をｐＨ＝９の条件下で用いたところ、非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位は−７１ｍＶであり（比較試験例Ｃ３）、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、Ｃ／Ａ比＝２の試験例Ｃ１０では、−１２ｍＶとなり、負の値に転じた。
これらの結果より、細胞の分化に影響を及ぼす可能性がある、細胞培養器の表面のゼータ電位は、細胞培養用組成物のｐＨによっても調製することが可能であることが示された。
【０１０６】
（試験Ｃ１−３）ゼータ電位の測定２
標準のモニター粒子として、ＦＣＳ（ウシ胎児血清、インビトロジェン社製、オーストラリア産、ロット番号８５２５４６）溶液中のタンパク粒子を用いた以外は、（試験Ｃ２）と同様にゼータ電位を測定した。
なお、ＦＣＳは当業者に周知の通り混合物であるため、ＦＣＳ溶液にレーザー光を照射した際に中性域で一番強い光散乱のピークが観察された（ほとんどの場合単一ピークとして観察される）粒子をモニター粒子とした。
１０％ＦＣＳ水溶液中で測定した上記標準のモニター粒子のゼータ電位は、約−２０ｍＶであった。
非被覆の細胞培養プレートの表面のゼータ電位は−１９ｍＶであり（比較試験例Ｃ４）、一方、ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物により被覆された細胞培養プレートの表面のゼータ電位は、いずれのＣ／Ａ比においても約−１４ｍＶであった（試験例Ｃ１１〜Ｃ１４）。
非被覆の細胞培養プレートの場合には、その表面のゼータ電位は、ＦＣＳのモニター粒子のゼータ電位とほぼ同程度であることから、プレート表面にＦＣＳに含まれるタンパク質成分が吸着していることが示唆された。一方、細胞培養用組成物で被覆した細胞培養プレートの場合には、その表面のゼータ電位は、ＦＣＳのモニター粒子のゼータ電位と比較して、絶対値が小さい値であることから、ＦＣＳに含まれるタンパク質成分のプレート表面への吸着の阻害、又は一部のタンパク質成分のプレート表面への選択的吸着が生じていることが示唆された。
【０１０７】
（試験Ｃ２）細胞培養器表面の微粒子のゼータ電位の測定
上記（Ａ１ａ−２）ポリマー／トリス／アニオン性物質混合物の調製の記載に準拠してポリマー／アニオン性物質混合物、すなわち、一例の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物の水溶液を調製した。
アニオン性物質として、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ＤＮＡ）（プロメガ社製、型番：Ｅ１７４１）を当業者に周知の方法で脱塩し、ＤＮａｓｅフリー水にＤＮＡを溶解させた（最終濃度：３３μｇ／ｍＬ）。
ポリマーの水溶液は最終濃度１００μｇ／ｍＬに調整し、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬを前記ＤＮＡ溶液３００μLに少しずつ滴下して混合した。そして、この混合物を水で希釈して、いずれの溶液も全量が約２，０００μＬとなるように調整し、ポリマー／アニオン性物質混合物、すなわち、一例の細胞構造体の製造方法に用いる細胞培養用組成物の水溶液を得た（それぞれ、試験例Ｃ１５、試験例Ｃ１６、試験例Ｃ１７、試験例Ｃ１８、試験例Ｃ１９）。ＣＡ比としては、それぞれ１、２、４、８、１６となる。調製した溶液をゼータ電位計（シスメックス社、ゼーターサイザーナノ）を使用して溶液中でブラウン運動している微粒子のゼータ電位を測定した。
【０１０８】
図１５に結果を示す。細胞培養器表面に凝集して沈殿する前の微粒子についても、そのゼータ電位は、Ｃ／Ａ比が増大するにつれて飽和する傾向が見られた。この結果は、細胞培養器表面全体のゼータ電位の測定結果と相関を有していた。
【０１０９】
上記試験例Ｃ及び比較試験例Ｃの結果を表３に示す。
【０１１０】
【表３】
2015058298.tif 000008
【０１１１】
（試験Ｄ）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による表面構造解析
（試験Ｄ−１）原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による表面構造解析
図１６（ａ）に、非被覆又は細胞培養用組成物で被覆した細胞培養プレートの表面を、接触タッピングモードで測定した画像を示す。この結果から、プレートの表面のナノスケールでの凹凸が、Ｃ／Ａ比により変化する様子が確認された（試験例Ｄ１、試験例Ｄ２、試験例Ｄ３、試験例Ｄ４）。
図１６（ｂ）に、非被覆又は細胞培養用組成物で被覆した細胞培養プレートの表面を、位相モードで画像化したものを示す。この結果から、プレートの表面の粘弾性的又は吸着的性質も、プレート表面のナノスケールでの凹凸と同様に、Ｃ／Ａ比により変化する様子が確認された（試験例Ｄ１、試験例Ｄ２、試験例Ｄ３、試験例Ｄ４）。
【０１１２】
（試験Ｄ−２）蛍光顕微鏡による表面観察
アニオン性物質として、Ｃｙ３で蛍光標識した２．７ｋｂのＤＮＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、型番：ＭＩＲ７９０４）を用いた。（Ａ０ａ）と同様に、Ｃ／Ａ比を２、４、８、１６（それぞれ、試験例Ｄ５、試験例Ｄ６、試験例Ｄ７、試験例Ｄ８）としたポリマー／アニオン性物質混合物を調整した。そして、（Ａ１ｂ）と同様に、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ２）の各ウェルを被覆した。プレートを３７℃で６時間インキュベーションした後、各ウェルを蛍光顕微鏡（ニコン社製、商品名：ＴＥ２０００−Ｕ）を用いて観察した（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５７０ｎｍ）。詳細な条件は表４に示す。
図１７に、観察結果を示す。Ｃ／Ａ比を２とした試験例Ｄ５から、Ｃ／Ａ比を１６とした試験例Ｄ８に向かって、蛍光強度が低くなる傾向が見られた。この結果は、Ｃ／Ａ比が大きい場合にはＣｙ３標識ＤＮＡがポリマーに被覆されるため、レーザー光がポリマーに遮断されたことを示唆している。
【０１１３】
（試験Ｄ−３）水中ＡＦＭによる表面観察
アニオン性物質として、ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（ＤＮＡ）（プロメガ社製、型番：Ｅ１７４１）を当業者に周知の方法で脱塩し、ＤＮａｓｅフリー水へ溶解して用いた。（Ａ１ａ−５）と同様に、Ｃ／Ａ比を２、４、８、１６（それぞれ、試験例Ｄ９、試験例Ｄ１０、試験例Ｄ１１、試験例Ｄ１２）としたポリマー／アニオン性物質混合物を調整した。そして、（Ａ１ａ−７）と同様に、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ２）の各ウェルを被覆した。プレートを３７℃で３時間インキュベーションした後、各ウェルを原子間力顕微鏡（島津製作所社製、ＳＰＭ−９７００）を用いて観察した（共振周波数７５ｋＨｚ〜１４５ｋＨｚ、バネ定数０．１Ｎ／ｍ、窒化ケイ素）。詳細な条件は表４に示す。
図１８に、観察結果を示す。図１８上段は、ダイナミックタッピングモードによる画像を示し、図１８下段は、位相モードでの画像を示す。Ｃ／Ａ比を２とした試験例Ｄ９から、Ｃ／Ａ比を１６とした試験例Ｄ１２に向かって、微粒子の数（密度）が増大する傾向が見られた。微粒子は直径５０ｎｍ〜５００ｎｍであった。この結果から、ポリマー／アニオン性物質混合物は、被覆時に流延してフィルムになることなく、培養皿の底面に微粒子として沈殿して堆積していること、これによりウェルにポリスチレンが露出する領域が存在することが確認された。
【０１１４】
上記試験例Ｄ及び比較試験例Ｄの結果を表４に示す。
【０１１５】
【表４】
2015058298.tif 000009
【０１１６】
（試験Ｅ）移植材料の製造方法
（試験Ｅ１）インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における生体移植材料の製造
前述の（試験Ａ１０）に記載の細胞構造体の製造方法に従って、ペレット状の細胞構造体を製造した。
具体的には、細胞としてラット皮下脂肪由来の間質細胞（初代培養細胞）を、アニオン性物質としてＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ  ２５（ＤＮＡ）を用いて、細胞密度を１６．０×１０４個／ｍＬ（細胞密度：８．０×１０２個／ｍｍ２）とした以外は、（試験Ａ１０ｃ−２）と同様に、細胞培養を行った（試験例Ｅ１）。詳細な条件は表５に示す。１日後に、（試験Ａ１０ｃ−２）と同様に、ペレット状の細胞構造体（直径約２００〜約８００ｎｍ）が形成した。
なお、ここで、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、及び各種増殖因子等を含む血管新生誘導用ゲル（マトリゲル（登録商標））を準備し、細胞培養皿をこの血管新生誘導用ゲルで被覆し、一方のペレット状の細胞構造体については、被覆した細胞培養皿で適量の培地を用いて更に１〜７日間培養した。もう一方のペレット状の細胞構造体については、特に被覆処理を施していないポリスチレン製の細胞培養皿で適量の培地を用いて更に１〜７日間培養した。いずれの細胞培養皿で培養した場合にも、前述の細胞培養用組成物で被覆した細胞培養皿で培養した場合と異なり、ペレット状の細胞構造体はバラバラになり、細胞構造体を構成していた細胞は細胞培養皿に単層を形成した。
【０１１７】
【表５】
2015058298.tif 000010
【０１１８】
なお、ペレット状の細胞構造体のサイズは、用いる細胞培養皿の培養面の面積により制御した。培養面の面積が０．３２ｃｍ２の場合、５．０×１０４〜１．０×１０５個程度の細胞数を有する細胞構造体を、培養面の面積が２．０ｃｍ２の場合、２．５×１０５〜５．０×１０５個程度の細胞数を有する細胞構造体を、培養面の面積が９．６ｃｍ２の場合、１．０×１０６〜２．５×１０６個程度の細胞数を有する細胞構造体を製造することができた（図示せず）。
【０１１９】
２つのポリスチレン製の６ウェル細胞培養プレートのそれぞれに適量の培地を入れ、ここに、コラーゲンを主成分とするバイオチューブ（例えば、特開２００４−２６１２６０号公報の実施例に記載の方法参照）を沈めた。
一方のプレートについては、ＧＦＰノックインラット皮下脂肪由来の間質細胞を用いて製造したＧＦＰ陽性のペレット状の細胞構造体（細胞数：１．０×１０６個）をピンセットで掴み、これをバイオチューブ上に載せた（試験例Ｅ１）。なお、本（試験Ｅ）で製造したペレット状の細胞構造体がＧＦＰ陽性であるのは、細胞培養皿に被覆された細胞培養用組成物に含まれるＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ  ２５が細胞内に導入された後に発現しているためである。もう一方のプレートについては、細胞構造体を形成していないＧＦＰノックインラット皮下脂肪由来の間質細胞（細胞数：１．０×１０６個）をバイオチューブ上に加えた（比較試験例Ｅ１）。
２つのプレートを３７℃で２日間インキュベートした後の様子を図１９に示す（左上及び左下は、ペレット状の細胞構造体を載せたバイオチューブを図示の倍率（×５、×１２．５）で観察した写真、右上及び右下は、細胞構造体を形成していない細胞を加えたバイオチューブを図示の倍率（×５、×１２．５）で観察した写真）。試験例Ｅ１では、細胞構造体はバイオチューブ上に接着して剥がれなくなった。比較試験例Ｅ１では、細胞はバイオチューブ上に接着しなかった。２つのバイオチューブを蛍光顕微鏡を用いて、バイオチューブのＹ１−Ｙ１’及びＹ２−Ｙ２’（図１９に示す）に沿ってクロスセクション観察した様子を図２０に示す。
特に、試験例Ｅ１のプレートを３７℃で１４日間インキュベートした後の様子を図２１（ａ）、（ｂ）に示す。ペレット状の細胞構造体は、バイオチューブの外表面に沿ってその延在方向に伸展する（図２１（ａ）、図中、太矢印にて示す）と共に、バイオチューブの径方向外側から径方向内側に向かって多孔質であるバイオチューブの内部を通過して、バイオチューブの内部に浸潤し、バイオチューブの内表面に伸展することがわかった（図２１（ｂ）、図中、太矢印にて示す）。
【０１２０】
（試験Ｅ２）インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における生体移植材料の製造
（試験Ｅ１）と同様に、ペレット状の細胞構造体を製造・培養して、ラット皮下脂肪由来の間質細胞からなるＧＦＰ陽性のペレット状の細胞構造体（３．０×１０５個）を調整した。また、野生型のルイスラット（Ｌｅｗｉｓ  Ｒａｔ）（オス、３８０ｇ）を準備した。１．５ｍｍ口径、約１５ｍｍ長のシリコーン製ロッドピンをラットの皮下に約３０日間埋入した。このチューブを取り出し、アルガトロバン（抗凝固剤）のメタノール溶液に浸漬し、約３０分間風乾した。
ラットの腹部を切開した。そして、腹部大動脈の一部を切除し、該大動脈をバイオチューブを介して吻合した。血流を再開させると、バイオチューブ内部で血栓が生じることなく、また、吻合部から血液が漏れることなく、バイオチューブが拍動しながら血液を流すことが確認された。ペレット状の細胞構造体を、ピンセットを用いて、バイオチューブの両端部付近及び中央部付近の外表面に、それぞれ１つずつ（計３個）載せたところ、数分後に細胞構造体はバイオチューブに接着して剥がれなくなった（図２２（ａ）参照）。その後、切開した腹部を縫合して、常法に従って移植手術を完了させた。
３週間後に、ラットの腹部を再び切開した。図２２（ｂ）に示すように、細胞凝集体を載せたバイオチューブ部分にはコラーゲンを主成分とするカプセルは形成されていなかった（図中、太矢印にて示す）が、細胞凝集体を載せなかったバイオチューブ部分はカプセルで覆われていた（図中、細矢印にて示す）。
【０１２１】
（蛍光顕微鏡観察）
移植手術後３週間のバイオチューブを採取し、このバイオチューブに伸展、浸潤、生着した細胞が発現するＧＦＰについて、蛍光顕微鏡を用いてバイオチューブを観察した。また、バイオチューブの外表面に生着した細胞、及びバイオチューブの内表面に生着した細胞等について、その細胞形態を観察した。図２３（ａ）、図２４（ａ）、図２５（ａ）に、採取したバイオチューブを、観察のために切断した部位、及びペレット状の細胞構造体を載せた部位と共に、模式的に示す。
図２３（ｂ）に、腹部大動脈とバイオチューブとの境界部付近において、血管／バイオチューブの側壁付近を削ぐように（Ｚ１−Ｚ１’に沿って）、クロスセクション観察したときの写真を示す（図中、左側が血管側、右側がバイオチューブ側）。図２３（ｂ）中、宿主の血管部分はエラスチンによる自家蛍光で緑色に光っており、蛍光を有さず暗視野となるべき（コラーゲンを主成分とする）バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが緑色に光っている。
図２４（ｂ）に、腹部大動脈の端部からバイオチューブの中央部付近まで、血管／バイオチューブの真ん中付近を、ほぼ延在方向になぞるように（Ｚ２−Ｚ２’に沿って）、クロスセクション観察したときの写真を示す（図中、左側が血管側、右側がバイオチューブ側）。図２４（ｂ）中、宿主の血管部分はエラスチンによる自家蛍光で緑色に光っており、蛍光を有さず暗視野となるべき（コラーゲンを主成分とする）バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが緑色に光っている。図２４（ｃ）に、図２４（ｂ）に示すバイオチューブのうち、特に、ペレット状の細胞構造体を載せた部分（側壁の一部）を拡大して示す。
図２５（ｂ）に、バイオチューブの中央部付近を、延在方向にほぼ垂直な向きに（Ｚ３−Ｚ３’に沿って）、クロスセクション観察したときの写真を示す。図２５（ｂ）中、バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが層状に緑色に光っている。図２５（ｃ）に、図２４（ｂ）に示すバイオチューブのうち、特に、ペレット状の細胞構造体を載せた部分（側壁の一部）を拡大して示す（図中、上側がバイオチューブ内表面側、下側がバイオチューブ外表面側）。図２５（ｄ）に、図２５（ｃ）に示す部分を、更に、細胞核についてＤＡＰＩ染色して蛍光顕微鏡で観察したときの写真を示す。図２５（ｄ）中、バイオチューブ部分はその内表面に生着、その内部に浸潤したペレット状の細胞構造体由来の細胞が発現するＧＦＰが層状に緑色に光っており、それらの細胞のＤＡＰＩ染色された細胞核が斑点状に青色に光っている。
【０１２２】
（免疫染色）
移植手術後３週間のバイオチューブを採取し、このバイオチューブに伸展、浸潤、生着した細胞が発現するＣＤ３１について、一次抗体として抗ラットＣＤ３１、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ−ＰＥを用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて、染色後のバイオチューブを観察した。なお、血管内皮細胞はＣＤ３１を発現するため染色されるが、他の細胞（例えば、平滑筋細胞、繊維芽細胞等）はＣＤ３１を発現しないため染色されない。
【０１２３】
蛍光顕微鏡観察の結果（図２３〜図２５）から、バイオチューブの外表面に載せたペレット状の細胞構造体は、バイオチューブの外表面に沿ってその延在方向に伸展し、バイオチューブの外表面に生着することがわかった。また、バイオチューブの径方向外側から径方向内側に向かって多孔質であるバイオチューブ内部に浸潤して、バイオチューブ内部や内表面にも伸展し、生着することがわかった。バイオチューブ内表面に生着したペレット状の細胞構造体由来の細胞については、免疫染色の結果（図示せず）からＣＤ３１陽性であること、蛍光顕微鏡観察において観察された細胞形態から血管内皮細胞の形状を有することが示されたため、血管内皮細胞に分化したことが確認された。また、バイオチューブ外表面に生着したペレット状の細胞構造体由来の細胞については、免疫染色の結果（図示せず）から、ＣＤ３１陰性であること、蛍光顕微鏡観察において観察された細胞形態から平滑筋細胞の形状を有することが示されたため、平滑筋細胞に分化したことが確認された。なお、平滑筋細胞よりも更にバイオチューブ外方にある細胞は、繊維芽細胞に分化したことが示唆された。
【０１２４】
（外観観察）
移植手術後３週間のバイオチューブを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液に２４時間浸漬した後、バイオチューブの外観を観察した。
図２６（ａ）に、採取したバイオチューブの外観の写真を示す。図２６（ａ）中、左及び右に示す写真は、腹部大動脈の端部、吻合部、バイオチューブの端部、及び腸管の一部を示し、中央に示す写真は、バイオチューブの中央部、及び腸管の一部を示す。図２６（ｂ）に、図２６（ａ）中央に示す写真を拡大して示す。
【０１２５】
外観観察の結果から、吻合部の予後は良好であること（図２６（ａ））、バイオチューブの内表面は血管の内腔面と同様のものとなっていること（図２６（ｂ））が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明の移植材料の製造方法によれば、移植部位の周辺組織の細胞を、短期間で広範囲に、移植用基材に伸展・生着させることが可能な移植材料を製造することができる。そして、本発明の移植材料によれば、移植部位のサイズを比較的大きくすること、及び移植部位を早期に治癒することが可能となる。また、本発明の移植材料によれば、移植材料内における菌の繁殖を抑制することができる。更に、本発明の移植材料によれば、移植材料に対するカプセルの形成量を低減することができ、カプセルの石灰化を抑制することができる。
【図９】
2015058298.tif 000011
【図１１】
2015058298.tif 000012
【図１２】
2015058298.tif 000013
【図１３】
2015058298.tif 000014
【図１４】
2015058298.tif 000015
【図１５】
2015058298.tif 000016
【図１】
2015058298.tif 000017
【図２】
2015058298.tif 000018
【図３】
2015058298.tif 000019
【図４】
2015058298.tif 000020
【図５】
2015058298.tif 000021
【図６】
2015058298.tif 000022
【図７】
2015058298.tif 000023
【図８】
2015058298.tif 000024
【図１０】
2015058298.tif 000025
【図１６】
2015058298.tif 000026
【図１７】
2015058298.tif 000027
【図１８】
2015058298.tif 000028
【図１９】
2015058298.tif 000029
【図２０】
2015058298.tif 000030
【図２１】
2015058298.tif 000031
【図２２】
2015058298.tif 000032
【図２３】
2015058298.tif 000033
【図２４】
2015058298.tif 000034
【図２５】
2015058298.tif 000035
【図２６】
2015058298.tif 000036