(57)【要約】【課題】  体内時計の不調による生活リズムの乱れを改善し、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食その他、体内時計の不調に起因する症状又は疾患を、経口摂取により、予防、治療、又は改善（緩和）するための手段を提供すること。【解決手段】  ミオイノシトール、ピニトール、acnegia、柴胡、抑肝散、補中液気湯、温経湯、加味帰脾湯、エルゴチオネイン、及びTAHEEBOからなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含む、経口摂取可能な体内時計調節剤及びこれを含む体内時計の不調に起因した症状又は疾患を改善するための組成物、並びに、体内時計の振幅上昇を指標とした経口摂取可能な体内時計調節剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオイノシトール、ピニトール、acnegia、柴胡、抑肝散、補中液気湯、温経湯、加味帰脾湯、エルゴチオネイン、及びTAHEEBOからなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含む、経口摂取可能な体内時計調節剤。
【請求項２】
時計遺伝子発現調節作用を有する、請求項１記載の体内時計調節剤。
【請求項３】
請求項１記載の体内時計調節剤を含む、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を予防、治療、又は改善するための経口摂取可能な組成物。
【請求項４】
時計遺伝子の発現を調節することにより、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を予防、治療、又は改善する、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記症状又は疾患が、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食、代謝、及び精神活動からなる群から選ばれるいずれかの生理活動の障害、又は肥満、うつ病、心筋梗塞、脳梗塞、及び癌からなる群から選ばれるいずれかの疾患である、請求項３又は４記載の組成物。
【請求項６】
睡眠改善用組成物である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
飲食品又は医薬組成物である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
被験物質による体内時計リズムの振幅上昇を指標として、体内時計調節剤をスクリーニングする方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項８記載の方法：
被験物質を添加した低栄養培地と添加しない低栄養培地でショウジョウバエを飼育し、その体内時計に関連した行動リズムの振幅を計測する工程、及び
被験物質の添加により前記行動リズムの振幅が上昇した場合に、当該被験物質を体内時計調節剤として選択する工程。
【請求項１０】
体内時計に関連した行動リズムがCPリズム又は歩行活動リズムである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
さらに、前記被験物質を添加した低栄養培地と添加しない低栄養培地でショウジョウバエを飼育し、その不動時間を比較する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、培養細胞を用いて、前記被験物質による体内時計の周期長に対する影響を測定する工程を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口摂取により体内時計の周期長もしくは振幅、又は睡眠時間の調整作用を有する物質を含む体内時計調節剤、及び前記体内時計調節剤を含む、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を予防、治療又は改善するための組成物に関する。また本発明は、体内時計の振幅上昇を指標とした経口摂取可能な体内時計調節剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球の環境は１日や１年の周期で変動する。地球上で生きる多くの生物はこの変動を能動的に利用するために体内に自律振動する時計「体内時計」を持っている。体内時計の乱れは、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食その他の生理活動に障害をもたらす。そのため、体内時計を調節し、上記障害を予防又は治療するための物質や方法の探索が行われている（特許文献１〜７）。
【０００３】
キイロショウジョウバエ（Drosophila Melanogaster）は、概日時計など様々な機構や遺伝子においてヒトやほ乳類などとの共通性が見られ、古くからモデル動物として広く研究に用いられてきた。発生に関わるホメオボックスや体内時計遺伝子等の生物学的に重要な知見はショウジョウバエの研究によってしばしばもたらされてきた。また、ショウジョウバエはヒトやほ乳類と共通の生理行動を示し、睡眠についても、ほ乳類と共通の睡眠遺伝子を多数保有することが報告されている。
【０００４】
体内時計の分子メカニズム、特に１日周期の時計（概日時計）もショウジョウバエで先駆的に研究されてきた。現在考えられている体内時計の分子メカニズムは、特定のタンパク質の量が1日の周期で変動するというものである。具体的にはCLOCK, CYCLEがPERIOD, TIMELESSの転写を亢進し、PERIOD, TIMELESSがCLOCK, CYCLEの転写活性を抑制するというネガティブフィードバックが１日の周期で起きているというものである。
【０００５】
ショウジョウバエの概日時計は繁殖行動と密接な関係がある。交尾の成功頻度は時計遺伝子のPERIOD, TIMELESSによってコントロールされている。また、雌雄1匹ずつセットで小さいケースの中に入れて観察すると、お互い１匹でいた時とは異なった、しかし１日の周期を持った行動をとる。これは、雄が雌に対して行う求愛行動と密接な関係にある。
【０００６】
この求愛行動リズム（Close Proximity Rhythm: CPリズム）は、１日周期で夕方頃に休息期を示し、早朝を中心に高いピークを示すことや、栄養価の低い培地条件で測定するとCPリズムの振幅が減少することが明らかになっている。また、発明者らは、CPリズムに必要なニューロンを同定している（非特許文献１）。上記は雄の求愛行動（追いかけ行動）を見たものだが、発明者らは雌の求愛行動も約1日の概日リズムを示し、この行動には体内時計遺伝子が必要であることを見出している（非特許文献２）。しかしながら、CPリズムの詳細な機構やリズムの振幅を上昇させる物質成分は明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１３６９６７号
【特許文献２】特開２００８−２４７８２９号
【特許文献３】特開２００９−８４１９２号
【特許文献４】特開２０１０−７７０８１号
【特許文献５】特開２０１３−１３３２９５号
【特許文献６】特開２０１３−１８１００５号
【特許文献７】特開２０１３−１８４９２１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sakai, T., Ishida, N.: Circadian rhythms of female mating activity governed by clock genes in Drosophila . Proc Natl Acad Sci USA 98: 9221-9225, 2001
【非特許文献２】Hamasaka Y, Suzuki T, Ishida N.: Evening circadian oscillator as the primary determinant of rhythmic motivation for Drosophila courtship behavior. Genes Cells 15: 1240-1248, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、体内時計の不調による生活リズムの乱れを改善し、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食その他、体内時計の不調に起因する症状又は疾患を予防、治療、又は改善するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、発明者らは、ショウジョウバエを用いて、その求愛行動リズム（CPリズム）に影響を与える物質の探索を目的として、種々の実験を行った。
【００１１】
まず、発明者らは、栄養価の低い培地では、CPリズムの振幅が大幅に減少することに注目し、この振幅を回復させる物質のスクリーニングを行った。機能性成分を多く含むアイスプラント抽出粉末含有培地と低栄養培地（0.5％ glucose含有培地）を比較すると、前者ではCPリズムの振幅が上昇するが、後者ではCPリズムの振幅が大幅に減少することが確認された。一方、時計遺伝子perの変異系統(per0)を用いて、同様の実験を行うと、低栄養培地ではCP値が減少し、アイスプラント抽出粉末含有培地ではCP値が上昇するが、どちらの培地においてもper0のCPリズムの振幅は消失することが確認された。このことから、ショウジョウバエのCPリズムには時計遺伝子が必要であることが示唆された。
【００１２】
次に、ミオイノシトール、ピニトール、acnegia、柴胡、抑肝散、補中益気湯、温経湯、加味帰脾湯、エルゴチオネイン、TAHEEBOを培地に添加し、体内時計の周期長又は振幅、あるいは睡眠時間の変化を解析した。その結果、これらの物質をそれぞれ、単独又は組み合わせて摂取することにより、体内時計の周期長又は振幅、あるいは睡眠時間を調整し、個々人の状況に合わせた体内時計の調節が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は以下の[１]〜[１２]に関する。
[１] ミオイノシトール、ピニトール、acnegia、柴胡、抑肝散、補中液気湯、温経湯、加味帰脾湯、エルゴチオネイン、及びTAHEEBOからなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含む、経口摂取可能な体内時計調節剤；
[２] 時計遺伝子発現調節作用を有する、[１]記載の体内時計調節剤；
[３] [１]記載の体内時計調節剤を含む、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を予防、治療、又は改善するための経口摂取可能な組成物；
[４] 時計遺伝子の発現を調節することにより、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を予防、治療、又は改善する、[３]記載の組成物；
[５] 前記症状又は疾患が、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食、代謝、及び精神活動からなる群から選ばれるいずれかの生理活動の障害、又は肥満、うつ病、心筋梗塞、脳梗塞、及び癌からなる群から選ばれるいずれかの疾患である、請求項３又は４記載の組成物；
[６] 睡眠改善用組成物である、[５]記載の組成物；
[７] 飲食品又は医薬組成物である、[６]記載の組成物；
[８] 被験物質による体内時計リズムの振幅上昇を指標として、体内時計調節剤をスクリーニングする方法。
[９] 以下の工程を含む、[８]記載の方法：
被験物質を添加した低栄養培地と添加しない低栄養培地でショウジョウバエを飼育し、その体内時計に関連した行動リズムの振幅を計測する工程、及び
被験物質の添加により前記行動リズムの振幅が上昇した場合に、当該被験物質を体内時計調節剤として選択する工程；
[１０] 体内時計に関連した行動リズムがCPリズム又は歩行活動リズムである、[９]記載の方法；
[１１]さらに、前記被験物質を添加した低栄養培地と添加しない低栄養培地でショウジョウバエを飼育し、その不動時間を測定する工程を含む、[９]〜[１０]のいずれか１項に記載の方法；
[１２]さらに、培養細胞を用いて、前記被験物質による体内時計の周期長に対する影響を測定する工程を含む、[８]〜[１１]のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の体内時計調節剤は、単独又は組み合わせて摂取することにより、体内時計の周期長又は振幅、あるいは睡眠時間を調整し、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食その他、体内時計の不調に起因するさまざまな症状又は疾患を予防、治療、又は改善することができる。
【００１４】
本発明の体内調節剤の主成分（有効成分）である、ミオイノシトール、ピニトール、acnegia、柴胡、抑肝散、補中益気湯、温経湯、加味帰脾湯、エルゴチオネイン、TAHEEBOは、いずれも（機能性）食品あるいは医薬品の成分として経口摂取されているものであり、その安全性も確立されている。それゆえ、本発明の体内時計調節剤は、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を緩和するための飲食品又は医薬品の主成分（有効成分）として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ショウジョウバエの求愛行動の工程を示す。
【図２】標準的な餌培地における野生型ショウジョウバエのCPリズム（左）と低栄養の餌培地における野生型ショウジョウバエのCPリズム（右）を示す。黒のバーはDの時間帯を、白のバーはLの時間帯を表している。
【図３】低栄養の餌培地における野生型のCPリズム（左）と低栄養餌に0.5%アイスプラント粉末を加えた培地における野生型のCPリズム（右）を示す。
【図４】低栄養の餌培地における時計遺伝子変異型のCPリズム（左）と低栄養餌に0.5%アイスプラント粉末を加えた培地における時計遺伝子変異型のCPリズム（右）を示す。
【図５】低栄養の餌培地におけるCPリズム（左上）と低栄養餌にそれぞれ0.001%成分A、0.01%成分A、0.1%成分Aを加えた培地における野生型のCPリズム（順に右上、左下、右下）を示す。
【図６】低栄養の餌培地におけるCPリズム（左上）と低栄養餌中それぞれ0.001%成分B、0.01%成分B、0.1%成分Bを加えた培地における野生型のCPリズム（順に右上、左下、右下）を示す。
【図７】哺乳類培養細胞（NIH3T3細胞）を用いたリアルタイムルシフェラーゼアッセイの結果（体内時計の周期長）を示す。Ａ：コントロールを１としたときの各被験物質添加時の周期長の平均値を示す。Ｂ：ピニトールとミグリトールについて、添加量を変化させたときの周期長の変化を示す。
【図８】ショウジョウバエを用いた歩行活動リズム測定の結果（体内時計の振幅）を示す。Ａ：コントロールに対する各被験物質添加時のCP値の振幅を示す。Ｂ：TAHEEBOについて、添加量を変化させたときの振幅の変化を示す。
【図９】ショウジョウバエを用いた睡眠計測結果を示す。コントロール（何も添加しない場合）に対する各被験物質添加時の睡眠時間の値を示す。ピニトール、柴胡、温経湯、加味帰脾湯、acnegiaで睡眠量の増加がみられた。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．体内時計調節剤
１．１  主成分（有効成分）
本発明の体内時計調節剤は、ミオイノシトール、ピニトール、acnegia、柴胡、抑肝散、補中液気湯、温経湯、加味帰脾湯、エルゴチオネイン、及びTAHEEBOからなる群より選ばれるいずれか１又は２以上を含む。これらの成分は、いずれも食品中に含まれる機能性成分、医薬品あるいはその有効成分として公知のものである。以下に、各成分の構造（構成）と公知の作用について記載する。
【００１７】
（１）ミオイノシトール
イノシトールはシクロヘキサンの各炭素上の水素原子がひとつずつヒドロキシ基に置き換わった構造（1,2,3,4,5,6-シクロヘキサンヘキサオール）を持つ、糖アルコールの一種で、甘味を有し、ビタミンＢ８とも呼ばれる。イノシトールには、ヒドロキシ基の位置により９種類の異性体が存在し、最も一般的なものはミオイノシトール（（1,2,3,5/4,6-イノシトール）である。
イノシトールは生体成分として広く存在し、穀物の糠や豆、果物や肉や魚と広く含有される。イノシトールは、脂肪肝や高脂血症の治療、生活習慣病の改善、セロトニン異常に起因するうつ病、パニック障害、及び強迫性障害における不安感の軽減に有効であるとの報告がある。
【００１８】
（２）ピニトール
ピニトールはイノシトールの一種で、マメ科の植物に存在する天然の物質である。ピニトールは植物性インスリン様物質とも呼ばれ、インスリン抵抗性を高め、血糖低下作用を有し、糖尿病や糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜症の改善、肝機能の向上に効果があるとの報告がある。ピニトールを多く含有する植物としては、大豆、ルイボス、アイスプラントなどが知られている。
【００１９】
（３）acnegia
acnegiaは、桂皮、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍薬、ヨクイニンを含む漢方製剤である。下腹部痛、肩こり、にきび、月経不順に効果があることが報告されている。
【００２０】
（４）柴胡
ミシマサイコ又はその同属植物の根で、生薬として古くから使用され、解熱作用、消炎作用、鎮痛作用、鎮静作用、抗菌作用、抗ウイルス作用等を有することが報告されている。
【００２１】
（５）抑肝散
白朮、茯苓、川ｎ、釣藤鈎、当帰、柴胡、及び甘草を含む漢方製剤。情緒不安、不眠、夜泣き、自律神経失調症の治療等に使用される。最近では、進行したアルツハイマー型認知症で起こる妄想や、徘徊、暴力などの抑制にも効能があることが報告されている。
【００２２】
（６）補中液気湯
人参、白朮、黄耆、当帰、柴胡、陳皮、大棗、生姜、甘草、及び升麻を含む漢方製剤。虚弱体質、胃腸障害、疲労倦怠、病後の衰弱、食欲不振、寝汗、痔などの治療に使用される。
【００２３】
（７）温経湯
麦門冬、半夏、当帰、甘草、桂皮、芍薬、川きゅう、人参、牡丹皮、呉茱萸、生姜、及び阿膠を含む漢方製剤。月経不順、月経困難、帯下、更年期障害、不眠、神経症、湿疹、足腰の冷え、しもやけなどの治療に使用される。
【００２４】
（８）加味帰脾湯
人参、蒼朮または白朮、茯苓、甘草、生姜、大棗、酸棗仁、竜眼、遠志、当帰、黄耆、木香、柴胡、及び梔子を含む漢方製剤。貧血や不眠、神経症などの治療に使用される。
【００２５】
（９）エルゴチオネイン
エルゴチオネインとは、麦角から発見されたアミノ酸の一種で、キノコなどの菌類や一部の細菌のみが合成できる。抗酸化作用が強く、DNAの損傷や過酸化脂質の生成防止効果、肌の光老化抑制効果が報告されている。また、最近では、活性酸素による神経細胞損傷を緩和、脳神経を保護することで、アルツハイマー病の予防効果が期待されている。
【００２６】
（１０）TAHEEBO
TAHEEBO（タヒボ）はアマゾン流域に生育するタブベイア・アベラネダエという植物の内部樹皮の抽出物をいう。TAHEEBOにはキノンという色素成分が含まれ、その1つであるNFD（ナフトランディオン）は、抗がん効果を有することが報告されている。TAHEEBOは、免疫を強化し、活性酸素を除去するため、老化予防効果があること、発痛誘発物質ブラジキニンの生成を抑制し、抗炎症、鎮痛効果が認められとの報告がある。
【００２７】
１．２  作用・効果
本発明の体内時計調節剤は、体内時計の周期長又は振幅、あるいは睡眠時間を調整し、体内時計の不調に起因したさまざまな症状又は疾患、たとえば、睡眠、体温、血圧、ホルモン分泌、摂食、代謝、精神活動等の生理活動の障害、又は肥満、うつ病、心筋梗塞、脳梗塞、及び癌等の疾患を予防、治療、又は改善（緩和）することができる。
【００２８】
「体内時計の周期長」とは、体内時計の１周期（睡眠・覚醒の概日リズム）の長さで、正常人では約２４．３時間である。実験的には、「体内時計の周期長」は、培養細胞を用いた系であれば、指標とする時計遺伝子の発現リズムの周期により、ショウジョウバエを用いた系であれば、歩行活動やCPリズムの周期長を体内時計の周期として評価することができる。
【００２９】
「体内時計の振幅」とは、体内時計の指標となる因子（値）の振れ幅である。実験的には、「体内時計の振幅」は、時計遺伝子の発現量を指標とする場合には、その１周期における発現量の幅であり、CP値を指標とする場合には、その１周期におけるCP値の幅を意味する。体内時計の振幅は老化とともに減衰することが知られている。
【００３０】
「睡眠時間」は、哺乳動物であれば、行動や、脳波、眼球運動、筋電図により計測することができる。近年ショウジョウバエにおいても、ヒトや哺乳動物と同様の睡眠用行動を示し（Hendricks, J.C., 2000, Shaw, P.J., 2000）、共通の睡眠遺伝子を有することがわかってきている（Crocker, A., 2010）。たとえば、睡眠様行動時においてショウジョウバエは姿勢が低くなり、また、覚醒時に比べて刺激に対する応答が低下することなどが知られている。また、夜間に睡眠阻害を行った場合、日中における急激な睡眠量の上昇が観察されるなど、ほ乳類の睡眠と共通性を多く示す。そこで、最近では、ショウジョウバエの行動をDAMシステムで自動計測し、一定以上不動の時間を「睡眠」と定義することで、実験的に「睡眠時間」を評価することが行われている。
【００３１】
本発明の体内時計調節剤は、時計遺伝子の発現調節を介して、その機能を発揮すると考えられる。時計遺伝子とは、概日リズム（体内時計）を調節する機能を有する遺伝子であって、Per1 (period1)、Per2 (period2)、Per3(period3)、Bmal1、Bmal2、Cry1、Cry2、Clock、Ror、Rev-erb、E4BP4、GSK3β等、現在多数の遺伝子が知られている。後述する実施例では、Per2の発現を解析するレポーター系を記載したが、同様にして、他の時計遺伝子の発現もリアルタイムで簡便に解析できる。
【００３２】
１．３  製剤処方
本発明の体内時計調節剤は、上記主成分のほか、生理学的に許容される担体や添加物を含むことができる。そのような担体や添加物としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００３３】
本発明の体内時計調節剤の投与量、投与回数は、対象の症状、年齢、体重、投与形態、併用される薬剤の投与量、投与回数等に応じて、適宜調整される。
【００３４】
本発明の体内時計調節剤の投与経路は特に限定されず、経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経鼻、経皮、直腸内、膣内投与のいずれも可能であるが、経口投与が好ましい。
【００３５】
本発明の体内時計調節剤は、上記投与経路に適した形態に製剤化でき、例えば顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤等の形態に製剤化できる。
【００３６】
主成分のうち、ミオイノシトール、ピニトール、エルゴチオネインはそのままの形態で用いられるほか、本発明の目的を損なわない範囲において、その薬理学上許容される塩、溶媒和物、水和物であってもよく、包摂体、エステル、エーテル、プロドラッグ等に誘導体化されてもよい。
【００３７】
本発明の体内時計調節剤の効果は、後述する実施例に記載した培養細胞系やショウジョウバエを用いた試験系のほか、体内時計の不調に呈するマウスやラット等の動物モデルを用いて評価することもできる。そのような試験系は、前掲特許公報（たとえば、特開２００９−８４１９２号、特開２０１３−１８１００５号等）に記載されている。
【００３８】
２．睡眠改善用組成物
本発明の体内時計調節剤は、特に体内時計の不調に起因した睡眠障害を改善するための組成物として利用できる。
【００３９】
ここで、体内時計の不調に起因した睡眠障害とは、概日リズム睡眠障害とも呼ばれ、外因性のものとしては、いわゆる時差ぼけ、交代勤務性睡眠障害が挙げられ、内因性のものとしては、睡眠相が望ましい時間帯から遅れて固定し、前進させることが困難な状態となる睡眠相後退症候群、睡眠相が望ましい時間帯から慢性的に前進しており、後退させることが困難な状態となる睡眠相前進症候群、通常の環境で生活しているにも関わらず入眠・覚醒の時刻が次第に遅れ、24時間より長い周期で推移する状態となる非24時間睡眠覚醒症候群、睡眠や覚醒の出現が不規則に起こり、一日に複数回睡眠する不規則型睡眠・覚醒パターン等が挙げられる。
【００４０】
３．飲食品・医薬組成物
本発明の体内時計調節剤をそのまま用いてもよいし、これを機能性成分として配合した飲食品又は有効成分として配合した医薬組成物であってもよい。本発明の体内時計調節剤は、治療効果のみならず、予防的効果もあるため、食品（機能性食品含む）、医薬部外品、一般用（OTC）の医薬組成物、及び医療用の医薬組成物に広く利用できる。
【００４１】
４．体内時計調節剤のスクリーニング方法
本発明は、被験物質による体内時計リズムの振幅上昇を指標として、体内時計調節剤をスクリーニングする方法も提供する。
【００４２】
体内時計リズムの振幅上昇の評価は、例えば、被験物質を添加した低栄養培地と添加しない低栄養培地でショウジョウバエを飼育し、各々そのCP（近接行動）リズム又は歩行活動リズム等の体内時計に関連した行動リズムの振幅を計測し、低栄養条件下で減少した行動リズムの振幅が、被験物質の添加により回復（上昇）した場合に、当該被験物質を体内時計調節剤として選択することができる。
【００４３】
上記方法は、さらに、体内時計の周期長や睡眠時間に対する前記被験物質の影響と合わせて、体内調節剤としての効果を総合評価することで、より正確なスクリーニングが可能となる。
【００４４】
たとえば、睡眠時間に対する影響については、被験物質を添加した低栄養培地と添加しない低栄養培地でショウジョウバエを飼育し、その不動時間を睡眠時間として計測し、前記被験物質がさらに睡眠時間を延長させる効果を有する場合に、当該被験物質は体内時計調節剤として有用と評価することができる。なお、睡眠時間（不動時間）は、Drosophila Activity Monitoring（DAM）システムを用いて、ショウジョウバエの行動を自動計測することで容易に測定することができる（Hendricks, J.C., 2000, Shaw , P.J., 2000、Crocker, A., 2010）。
【００４５】
また、体内時計の周期長に対する影響については、培養細胞を用いて容易に計測することができる。すなわち、前述した時計遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を導入し、時計遺伝子の発現をリアルタイムでチェックできるアッセイ系を作製し、被験物質の添加・非添加（存在・非存在下）における時計遺伝子の発現を解析することで、体内時計の周期長を評価することができる。前記被験物質がさらに体内時計の周期長を正常化させる効果を有する場合に、当該被験物質は体内時計調節剤として有用と評価することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：低栄養餌培地におけるCPリズム
実験方法
ショウジョウバエにおいて、雄が雌に対して行う求愛行動は複雑な工程を経る（図１）。しかしながら、求愛行動中は一貫して雄は雌に非常に接近した位置にいる。したがって、雄と雌の位置を特定し、互いの位置が非常に接近している場合（5mm以内）、それは雄が雌に求愛行動している最中であるとみなす。
【００４８】
6ウェルプレートの各ウェルに標準的な餌培地あるいは低栄養の餌培地（下記）を入れ、1つのウェルに野生型Oregon-Rの雌雄1匹ずつ入れた。これを25℃のインキュベータに入れ、LD環境を整え（Lの時間は通常ライトオン、レッドライトオン、Dの時間帯は通常ライトオフ、レッドライトオン）、CCDカメラを用いて10秒に1度静止画を撮影した。撮影した画像を解析し、1時間毎の、雄が雌に対して求愛行動をしている時間の割合を算出し、グラフ化してCPリズムを可視化した。図２に結果を示す。
【００４９】
標準的な餌培地：
5% [w/v] グルコース、8% [w/v] コーンミール、5% [w/v] ドライイースト、0.64% [w/v] 寒天、0.17% [v/v] プロピオン酸、0.17% [v/v] パラオキシ安息香酸ブチル
低栄養の餌培地：
5% [w/v] グルコース、1.5% [w/v] 寒天、0.17% [v/v] パラオキシ安息香酸ブチル
【００５０】
図２に示されるとおり、栄養価の低い培地ではCPリズムの振幅が減少した。
行動のリズムを観測する実験では、通常最初はLD（12時間明期；12時間暗期）条件で観測し、その後DD（常暗）条件にして観測する。これにより、外部環境として1日の周期が与えられているLDの状態から、外部環境からは1日の周期が分からないDDの状態へ移行してもリズムは維持される。よって、DDの状態でもリズムが維持されれば、その行動のリズムは概日時計によって支配されていることを示唆する。
【００５１】
実施例２：アイスプラント添加餌培地におけるCPリズム（野生型）
低栄養の餌ではCPリズムの振幅が減少することから、高栄養の餌でCPリズムの振幅が上昇することが予測された。そこで、低栄養の餌培地にアイスプラント抽出粉末（日本アドバンストアグリ社製）を添加し、CPリズムの変化を調べた。なお、アイスプラントには、カロテンや数種類のビタミンのほか、他の野菜にはない機能性成分が多く含まれており、それらの成分がメタボリックシンドロームや生活習慣病の予防に役立つことが知られている。
【００５２】
参考例１に記載した低栄養の餌培地および低栄養餌中0.5%アイスプラント粉末を加えた培地における野生型Oregon-RのCPリズムを計測し、結果を図５に示した。
【００５３】
図５に示されるとおり、低栄養の餌培地に対し、低栄養餌中0.5%アイスプラント粉末を加えた培地では、野生型ショウジョウバエのCPリズムの振幅は濃度に伴い上昇することが確認された。また、この結果から、アイスプラント中の機能性成分は、雄の雌に対する求愛行動を活性化させることが示唆された。
【００５４】
実施例３：アイスプラント添加餌培地におけるCPリズム（変異型）
ショウジョウバエの求愛行動は、繁殖行動や概日時計と密接な関係があり、交尾の成功頻度は時計遺伝子のPERIOD, TIMELESSによってコントロールされている。このことから、低栄養培地条件下の野生型ショウジョウバエに対し、0.5%アイスプラント添加培地条件下の野生型ショウジョウバエでは時計遺伝子periodが活性化され、PERIODタンパク質の増加が予測される。そこで、時計遺伝子periodの変異系統(per0)を用いて、アイスプラント中の機能性成分がper0系統の求愛行動に及ぼす影響について調べた。結果を図４に示す。
【００５５】
図４に示されるとおり、低栄養の餌培地に対し、低栄養餌中0.5%アイスプラント粉末を加えた培地では、変異型ショウジョウバエの求愛活動がアリズミックのまま活性化された。
【００５６】
この結果より、ハエのCPリズムには体内時計遺伝子が必要であると考えられる。また、低栄養餌中0.5%アイスプラント粉末を加えた培地における野生型のCPリズム（図３）と、同様の培地条件下で計測した変異型CPリズム（図４）の比較より、アイスプラント中の機能性成分は時計遺伝子periodを活性化させないことが確認された。よって、アイスプラント中の機能性成分は時計遺伝子の経路とは別の経路に作用すると考えられた。
【００５７】
実施例４：アイスプラント構成成分添加餌培地におけるCPリズム（野生型）
アイスプラント中の成分のうち、ショウジョウバエの求愛行動を活性化させる具体的な成分物質を特定するため、アイスプラント中に含まれる成分分析の結果（筑波大学 根岸紀 様より提供）を元に、アイスプラント中に含まれる主な機能性成分であるミオイノシトールとピニトールがショウジョウバエのCPリズムに影響を及ぼすかを調べた。
【００５８】
低栄養の餌培地および低栄養餌中にそれぞれ0.1%、0.01%、0.001%ずつミオイノシトールを加えた3つの培地における野生型Oregon-RのCPリズムを図５に示した。
【００５９】
低栄養の餌培地および低栄養餌中にそれぞれ0.1%、0.01%、0.001%ずつピニトールを加えた3つの培地における野生型Oregon-RのCPリズムを図６に示した。
【００６０】
以上の結果から、低栄養餌中それぞれ0.001%、0.01%、0.1%のミオイノシトールを加えた培地における野生型のCPリズムは、コントロールの低栄養培地におけるCPリズムと比べて、CPリズムの振幅を有意に上昇させた。この結果より、アイスプラント成分によるCPリズム振幅上昇には、少なくともアイスプラント中のミオイノシトールが必要であると考えられた。
【００６１】
実施例５：哺乳類培養細胞を用いたリアルタイムルシフェラーゼアッセイ（体内時計周期長に対する影響）
実験方法：
既報（Kawasaki et al., PLoS One. 2013;8(3):e58221；Oike et al., Biochem Biophys Res Commun. 2011 Jul 8;410(3):654-8）に従い、哺乳類培養細胞を用いたリアルタイムルシフェラーゼアッセイを行った。すなわち、Per2プロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したベクターをNIH3T3細胞に導入し、LUCレポーター系を構築した。細胞は、10％FCSとペニシリン−ストレプトマイシン加えたDMEM培地中37℃CO2雰囲気下で培養後、50％ウマ血清で2時間刺激して時計遺伝子の発現リズムを同調させ、0.1mMルシフェリンと各被験物質0.1％を加えた培地で培養し、Photon Detection UNIT LM-2400(浜松フォトニクス)を用いて発光を計測した。なお、発光は1分おきに10分間積算して測定した。結果を図７に示す。
【００６２】
結果：
図７に示されるように、コントロールに比較して、ピニトール、ミオイノシトール、温経湯、抑肝散は体内時計周期長を短縮させるのに対し、柴胡、補中益気湯は延長させ、加味帰脾湯はほとんど変化させなかった（図７Ａ）。
また、ピニトール、ミオイノシトールについては添加量を変えて測定を行ったところ、添加量に依存して周期長は短縮した（図７Ｂ）。一方、コントロールであるLiClは周期長を延長させた。
【００６３】
実施例６：ショウジョウバエを用いた歩行活動リズム測定（体内時計振幅に対する影響）
実験方法：
実施例３と同様に、低栄養餌培地に各種被験物質を0.1％添加した食餌成分培地を調製した。
１ウェル毎に作成した食餌成分培地に、ショウジョウバエの雄雌を1匹ずつ入れ、雄が雌を追いかける行動のリズム（近接行動リズム：Close Proximity Rhythm）をCCDカメラで自動計測することでショウジョウバエの歩行行動リズムを測定した。結果を図８Ａに示す。
【００６４】
結果：
図８に示されるように、コントロールに比較して、ピニトール、ミオイノシトール、は体内時計振幅を増加させるのに対し、柴胡、加味帰脾湯、温経湯、acnegiaは短縮させた（図８Ａ）。
また、TAHEEBOについては添加量を変えて求愛行動測定を行ったところ、添加量に依存して振幅が増加した（図８Ｂ）。
【００６５】
実施例７：ショウジョウバエを用いた睡眠計測（睡眠時間に対する影響）
実験方法：
実施例３と同様に、低栄養餌培地に各種被験物質を0.1％添加した食餌成分培地を調製した。
ショウジョウバエ（野生型:Cantous S）は、明暗サイクル12: 12の条件下で1週間飼育して概日リズムを整え、その後は恒常暗下で測定を行った。既報（Hendricks, J.C., 2000, Shaw , P.J., 2000、Crocker, A., 2010））を参考に、Drosophila Activity Monitoring（DAM）システムを用いて、ショウジョウバエの行動を自動計測し、不動時間を測定して睡眠時間を求めた。結果を図９に示す。
【００６６】
結果：
図９に示されるように、コントロールに比較して、ピニトール、柴胡、加味帰脾湯、温経湯、acnegiaは睡眠時間を増大させるのに対し、エルゴチオネインとミオイノシトールは短縮させた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の体内時計調節剤は、単独又は組み合わせて摂取することにより、体内時計の周期長又は振幅、あるいは睡眠時間を調整できる。よって、体内時計の不調に起因した症状又は疾患を改善するための飲食品又は医薬品として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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