(57)【要約】【課題】蛍光を効率よく検出する。【解決手段】核酸増幅チップ１は、２本鎖核酸の増幅のための複数のウェル３が形成された基板２を備え、ウェルは、当該ウェルの上方から当該ウェル内の前記２本鎖核酸に励起光を照射して生成される蛍光を当該ウェルの上方に進行させるものであり、ウェルの深さｂを当該ウェルの径ａで割ったアスペクト比は０．５より大きく設定される。【選択図】図１
2015186453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖核酸の増幅のための複数のウェルが形成された基板を備え、
前記ウェルは、当該ウェルの上方から当該ウェル内の前記２本鎖核酸に励起光を照射して生成される蛍光を当該ウェルの上方に進行させるものであり、
前記ウェルの深さｂを当該ウェルの径ａで割ったアスペクト比は０．５より大きく設定される核酸増幅チップ。
【請求項２】
前記ウェルの内壁面の表面粗さＲａは、５μｍ以下である請求項１に記載の核酸増幅チップ。
【請求項３】
前記ウェルの内壁面に入射される前記蛍光に対する反射率は５０％以上である請求項１または２に記載の核酸増幅チップ。
【請求項４】
前記基板は、ポリプロピレンをベース材料として、前記ポリプロピレンよりも反射率の高い有機物材料を含有させたものである請求項３に記載の核酸増幅チップ。
【請求項５】
前記ウェルの内壁面は曲面である請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
【請求項６】
前記ウェルの深さ方向の断面形状は、楕円をその短軸に平行な線で切断した当該楕円の半分以下の曲線または放物線である請求項５に記載の核酸増幅チップ。
【請求項７】
前記ウェルには、検体と、この検体に含まれる２本鎖核酸を抽出する試薬と、特定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマと、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた蛍光を生じさせる試薬と、前記２本鎖核酸の転写を促す酵素と、が収納される請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本鎖核酸を増幅させる核酸増幅チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大な数の遺伝子配列の中から特定の遺伝子配列を選択的に増幅させる技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法と呼ばれる技術が知られている。ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させた後、特定の１本鎖ＤＮＡの特定の部位にのみ結合するプライマを用いて、特定の２本鎖ＤＮＡのみを増幅させる技術である。増幅させた特定の２本鎖ＤＮＡに蛍光分子を結合させると、２本鎖ＤＮＡの増幅数が多いほど蛍光量が増加するため、この蛍光量を測定することで、増幅した２本鎖ＤＮＡを有する病原体等を特定することができる。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅に要する時間が２時間ほどと短く、増幅のプロセスも簡易であるため、全自動の卓上用のＰＣＲ測定装置で２本鎖ＤＮＡの増幅と特定とを行うことができる。従来のＰＣＲ測定装置では、例えばチューブの中に、検体、複数の試薬、酵素およびプライマなどを収納して、蛍光の光量を測定していた。ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させる際には高い温度に設定し、また１本鎖ＤＮＡにプライマを結合させた後は冷却する必要があり、温度を迅速に変化させることが測定時間の短縮化のためにも重要となる。
【０００４】
このような背景から、マイクロ流路やマイクロウェルを有する核酸増幅チップを用いて、使用する試薬の量を減らす工夫がなされている（特許文献１〜６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−５１６２８１号公報
【特許文献２】特開２００４−９７２００号公報
【特許文献３】特開２００９−６０８５９号公報
【特許文献４】特開２００７−１８９９６２号公報
【特許文献５】特開２００６−３４５７９８号公報
【特許文献６】特開平５−３１７０３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、マイクロ流路では、試薬が予め決められた流路を通過するため、増幅の状態を調整することはできない。また、流路は通常一つしかないため、プライマごとに別個のチップを設けなければならず、手間がかかってしまう。
【０００７】
また、マイクロ流路とマイクロウェルの共通の問題として、試薬の使用量がごくわずかであるため、核酸増幅させた２本鎖ＤＮＡに照射される励起光によって発光する蛍光の光量もあまり強くない。よって、蛍光をできるだけ効率よく検出できるようにするのが望まれる。上述した特許文献１〜６には、蛍光を効率よく検出するための工夫や技術については何ら開示されていない。
【０００８】
本発明は、上述した課題を解決するためになされたものであり、その目的は、核酸増幅させた２本鎖ＤＮＡに照射される励起光によって発光する蛍光を効率よく検出可能な核酸増幅チップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様では、２本鎖核酸の増幅のための複数のウェルが形成された基板を備え、
前記ウェルは、当該ウェルの上方から当該ウェル内の前記２本鎖核酸に励起光を照射して生成される蛍光を当該ウェルの上方に進行させるものであり、
前記ウェルの深さｂを当該ウェルの径ａで割ったアスペクト比は０．５より大きく設定される核酸増幅チップが提供される。
【００１０】
前記ウェルの内壁面の表面粗さＲａは、５μｍ以下であってもよい。
【００１１】
前記ウェルの内壁面に入射される蛍光に対する反射率は５０％以上であってもよい。
【００１２】
前記基板は、ポリプロピレンをベース材料として、前記ポリプロピレンよりも反射率の高い有機物材料を含有させたものであってもよい。
【００１３】
前記ウェルの内壁面は曲面であってもよい。
【００１４】
前記ウェルの深さ方向の断面形状は、楕円をその短軸に平行な線で切断した当該楕円の半分以下の曲線または放物線であってもよい。
【００１５】
前記ウェルには、検体と、この検体に含まれる２本鎖核酸を抽出する試薬と、特定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマと、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた蛍光を生じさせる試薬と、前記２本鎖核酸の転写を促す酵素と、が収納されていてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、核酸増幅させた２本鎖ＤＮＡに照射される励起光によって発光する蛍光を効率よく検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸増幅チップ１の上面図。
【図２】図１のＡ−Ａ線断面図。
【図３】（ａ）ウェル３のアスペクト比が小さい例、（ｂ）はウェル３のアスペクト比が大きい例を示す図。
【図４】（ａ）〜（ｃ）はウェル３の表面粗さＲａを説明する図。
【図５】（ａ）は３種類の材料１〜３についての反射率を示すグラフ、（ｂ）は３種類の材料１〜３についての透過率を示すグラフ。
【図６】図５（ａ）と図５（ｂ）のグラフの特性をまとめた図。
【図７】ウェル３の断面形状を放物線または楕円の例を示す図。
【図８】（ａ）は２本鎖核酸に結合した蛍光物質から斜め上方に進行する蛍光の光路軌跡を示し、（ｂ）は２本鎖核酸に結合した蛍光物質から斜め下方に進行する蛍光の光路軌跡を示す図。
【図９】（ａ）はウェル３の開口側が平坦面である例、（ｂ）はウェル３の底面が平坦面である例を示す図。
【図１０】本実施形態による核酸増幅チップ１を用いたＰＣＲ法の処理手順の一例を示すフローチャート。
【図１１】相補的に結合した２本鎖ＤＮＡを示す図。
【図１２】相補的に結合した２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに分離されることを示す図 。
【図１３】１本鎖ＤＮＡにプライマが結合した様子を示す図。
【図１４】２つの２本鎖ＤＮＡが生成された様子を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本件明細書に添付する図面においては、図示と理解のしやすさの便宜上、縮尺および縦横の寸法比等を、実物のそれらから適宜変更したり、誇張してある。
【００１９】
図１は本発明の一実施形態に係る核酸増幅チップ１の上面図、図２は図１のＡ−Ａ線断面図である。本実施形態に係る核酸増幅チップ１は、例えばＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡの核酸増幅を行うものであり、図１に示すように、基板２の一主面に沿って離隔して配置される複数のウェル３を備えている。図１では、一主面に４つのウェル３を設ける例を示しているが、ウェル３の数には特に制限はない。
【００２０】
核酸増幅チップ１は、例えば矩形状の基板２を用いて構成されており、基板２の一辺は１０〜１５ｍｍ程度で、その厚さは０．５〜３．０ｍｍ程度である。また、ウェル３の開口径は１〜２ｍｍ程度、ウェル３の深さは１．０〜２．０ｍｍ程度である。なお、核酸増幅チップ１の縦横サイズと厚さ、およびウェル３の開口径と深さには特に制限はない。ただし、本実施形態では、一つのウェル３内に収納可能な試薬の量をできるだけ少なくすることを念頭に置いており、例えば、ウェル３内に収納される試薬の総量を０．５〜３．０μリットル程度に抑えることを想定している。
【００２１】
後述するように、核酸増幅チップ１は、ウェル３内の温度を短時間で５０℃以上上下させる必要があるため、基板２の材料として、熱伝導性に優れていることと、例えば０〜１００℃程度の温度範囲での耐熱性が求められる。
【００２２】
本実施形態による核酸増幅チップ１が増幅する対象となる核酸とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、その他のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどである。以下では、ＤＮＡを増幅する例について説明する。
【００２３】
本実施形態では、核酸増幅チップ１の上方から各ウェル３に向けて、所定の波長の励起光を照射し、この励起光が各ウェル３内で増幅した２本鎖核酸に結合している蛍光物質に当たったときに発光される蛍光を、核酸増幅チップ１の上方に置かれた検出器で検出する。検出器は、蛍光の光量を検出することで、２本鎖核酸の増幅度合いを把握できる。本実施形態の特徴の一つは、検出器でできるだけ多くの蛍光が検出できるように、核酸増幅チップ１で生じた蛍光を上方に進行させることが可能なウェル３を設けたことである。
【００２４】
（ウェル３のアスペクト比）
本実施形態によるウェル３は、図２に示すように、その深さｂをウェル３の径ａで割ったアスペクト比ｂ／ａを０．５より大きく設定している。このようなアスペクト比ｂ／ａを設定する理由は、ウェル３の深さが浅いほど、ウェル３内で生じた蛍光の発光方向が分散しやすくなるためである。励起光は、ウェル３の底面の法線方向すなわちウェル３の上方から入射されるが、２本鎖核酸に結合した蛍光物質に励起光が当たったことにより発光される蛍光は、必ずしもウェル３の上方に向かって進むとは限らない。ウェル３のアスペクト比ｂ／ａが小さいと、図３（ａ）に示すように、ウェル３の深さ方向よりも底面方向に分散配置される２本鎖核酸の割合が相対的に増え、結果として、ウェル３の底面の法線方向に対して斜めに進行する蛍光の割合が増えてしまう。すなわち、ウェル３のアスペクト比ｂ／ａが小さいほど、種々の方向に分散する蛍光の割合が増えてしまい、核酸増幅チップ１の上方に配置される検出器で検出される蛍光も少なくなる。
【００２５】
これに対して、図３（ｂ）に示すように、ウェル３のアスペクト比ｂ／ａを大きくすると、ウェル３の底面方向よりも深さ方向に分散配置される２本鎖核酸の割合が相対的に増えることから、ウェル３の底面の法線方向に進行する蛍光の割合も増大する。よって、ウェル３のアスペクト比が高いほど、蛍光はより上方に進行しやすくなる。
【００２６】
本発明者の検討結果によると、ウェル３内に収納される試薬の総量を０．５〜３．０μリットルとしたときに、検出器にて蛍光の光量を正しく検出可能なアスペクト比ｂ／ａは０．５より大きい場合であり、より望ましくは１．０より大きい場合であることがわかった。
【００２７】
このように、ウェル３のアスペクト比ｂ／ａを０．５より大きく、より望ましくは１．０より大きくすることで、蛍光の光量の検出精度を向上できる。
【００２８】
なお、ウェル３の径ａとは、ウェル３の開口部が円形の場合は直径、楕円形の場合は例えば長軸の長さ、四角形の場合は例えば対角線の長さである。また、ウェル３の深さｂは、ウェル３の開口部をなす開口面から鉛直方向に最深部までの長さである。
【００２９】
（ウェル３の表面粗さＲａ）
２本鎖核酸に結合した蛍光物質に励起光が当たったときに発光される蛍光の中には、ウェル３の底面の法線方向から斜めに進行するものも存在することから、ウェル３のアスペクト比ｂ／ａを０．５より大きくすると、蛍光がウェル３の側面に当たる可能性もありうる。この場合、図４（ａ）に示すように、当たった蛍光をウェル３の上方に反射させるのが望ましい。また、蛍光の一部は、ウェル３の底面の方向に進行して底面に当たるが、底面に当たった蛍光も上方に反射させるのが望ましい。ウェル３の側面や底面が図４（ｂ）のように平坦であれば、側面や底面に当たった蛍光は入射方向に応じた方向に正反射するが、側面や底面が図４（ｃ）のように粗面化されていれば、側面や底面に当たった蛍光は種々の方向に散乱してしまう。このため、ウェル３の側面や底面が粗面化されている場合には、ウェル３の上方に進行する蛍光の強度が弱くなってしまう。
【００３０】
よって、ウェル３の側面および底面からなる内壁面に当たった蛍光を、上方に反射させやすくするには、内壁面の平滑度を向上させて、表面粗さＲａをできるだけ低く抑えるのが望ましい。
【００３１】
ウェル３は微小サイズであるため、核酸増幅チップ１の製造後に、各ウェル３の内壁面の表面粗さＲａを小さくする加工処理を行うのは容易ではない。よって、核酸増幅チップ１を製造する際に表面粗さＲａを小さくしてウェル３を形成するのが望ましい。例えば、ウェル３を備えた核酸増幅チップ１を射出成形により一体成形する場合は、射出成形用の金型のウェル３部分の表面をできるだけ平坦にして、この金型を用いて作製される核酸増幅チップ１内の各ウェル３の内壁面の表面粗さＲａを所定値以下にするのが望ましい。所定値とは例えば５μｍである。本発明者が検討したところ、ウェル３の側面および底面の表面粗さＲａが５μｍ以下であれば、蛍光が当たったときの散乱を抑制でき、上方に反射される蛍光の割合を増やすことができて、検出器で正しく蛍光の光量を検出できることがわかった。
【００３２】
なお、表面粗さＲａの測定には、例えば白色干渉計（Ｚｙｇｏ社製）を用いることができる。
【００３３】
（ウェル３の表面反射率）
核酸増幅チップ１の材料により、入射される蛍光に対する反射率と透過率が異なるため、ウェル３の内壁面の平滑度を上げるだけでは、必ずしも蛍光を効率よく上方に反射させることができない場合がありうる。したがって、ウェル３の内壁面の反射性能をより向上させるには、核酸増幅チップ１の材料を反射性能に優れたものにするのが望ましい。
【００３４】
図５（ａ）は３種類の材料１〜３についての反射率を示すグラフである。このグラフの横軸は光の波長、縦軸は反射率である。蛍光の波長は５００ｎｍ程度の中心波長を持つため、横軸の波長範囲は４００〜６００ｎｍとしている。
【００３５】
材料１はＰＰ（ポリプロピレン）である。材料２はＰＰにワックスを添加させたものである。材料３はＰＰにワックスと酸化マグネシウム（ＭｇＯ）を添加させたものである。ワックスはＰＰよりも反射率が高い有機物であり、具体的な材料としては、例えば樹脂改質用シリコーンDow Corning Toray BY27シリーズ（東レ社製）である。酸化マグネシウムは白色の固体であり、酸化マグネシウムを添加することで、核酸増幅チップ１の白色度が増し、反射性能が向上する。材料２におけるワックスの添加割合は、例えば３％程度であり、材料３における酸化マグネシウムの添加割合は、例えば５０％程度である。
【００３６】
図５（ａ）からわかるように、蛍光の波長範囲を含む４００〜６００ｎｍの光に対しては、材料１よりも材料２の方が反射率が高く、材料２よりも材料３の方が反射率が高くなる。
【００３７】
図５（ｂ）は上述した材料１〜３についての透過率を示すグラフである。このグラフの横軸は光の波長、縦軸は透過率である。図５（ｂ）からわかるように、蛍光の波長範囲を含む４００〜６００ｎｍの光に対しては、材料１よりも材料２の方が透過率が低く、材料２よりも材料３の方が透過率が低くなる。
【００３８】
なお、図５（ａ）の反射率と図５（ｂ）の透過率の測定は、紫外可視分光光度計UV2550/2450（株式会社島津製作所製）を用いて行った。
【００３９】
図６は図５（ａ）と図５（ｂ）のグラフの特性をまとめた図である。図示のように、蛍光の波長範囲を含む４００〜６００ｎｍの光に対しては、材料１の反射率は１０〜１５％、材料１の透過率は８０〜８５％、材料２の反射率は５０〜６０％、材料２の透過率は４７〜５０％、材料３の反射率は９０〜９７％、材料３の透過率は７〜１２％である。
【００４０】
反射率が５０％未満では、ウェル３内で増幅された２本鎖核酸の数にもよるが、検出器で正しく蛍光の光量を検出できないおそれがある。よって、図６の結果から判断すると、ＰＰにワックスやＭｇＯを添加すると、反射率が高くなる場合もあるため、核酸増幅チップ１の材料としては、ＰＰにワックスを添加したり、さらにＭｇＯを添加してもよい。
【００４１】
図５では、基板２の材料としてＰＰを用いる例を説明したが、ＰＰ以外に、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＥ（ポリエチレン）、ポリエステルなどを用いてもよい。また、添加材として、上述した酸化マグネシウムを用いれば、反射率だけでなく、熱伝導性を向上させることもできる。また、熱伝導性を向上させる目的で、酸化マグネシウム以外の材料を添加してもよい。
【００４２】
（ウェル３の形状）
図２では、ウェル３の側面が底面に対して略鉛直方向に延びている例を示したが、側面に当たった蛍光を上方に反射させるには、ウェル３の側面および底面は曲面の方が望ましい。ここで、曲面とは、ウェル３の底面の中央部を通過する全方向の断面形状がいずれも曲線であることを意味し、曲面の具体的な断面形状としては、放物線や楕円の一部曲線などである。楕円の一部曲線とは、楕円をその短軸に平行な線で切断した当該楕円の半分以下の曲線である。
【００４３】
ウェル３の断面形状を放物線または楕円の一部曲線にすると、図７に示すように、ウェル３の開口部に近いほど、断面の接線の傾き角度が小さくなる。すなわち、ウェル３の開口部に近いほど、ウェル３の底面の法線方向と接線との為す角度はより小さくなる。図７では、ウェル３の開口部側の為す角度をθ１、ウェル３の底面側の為す角度をθ２としており、θ２＞θ１である。よって、開口部に近い側の側面に当たった光の反射角度も小さくなり、法線方向に近い角度方向すなわち上方に蛍光が進行していく。
【００４４】
図８はウェル３の断面形状が楕円の一部曲線である場合の断面図であり、図８（ａ）は２本鎖核酸に結合した蛍光物質から斜め上方に進行する蛍光の光路軌跡を示し、図８（ｂ）は２本鎖核酸に結合した蛍光物質から斜め下方に進行する蛍光の光路軌跡を示す図である。
【００４５】
図８（ａ）の場合、斜め上方に進行する蛍光は、例えばウェル３の左側曲面に当たり、上方に反射される。一方、図８（ｂ）の場合、斜め下方に進行する蛍光は、例えばウェル３の左側曲面で反射された後、右側曲面でさらに反射されて、上方に進行する。蛍光の光路は、図８（ａ）や図８（ｂ）に限られないが、ウェル３の断面形状を曲線にすることで、ウェル３内の２本鎖核酸に結合した蛍光物質に励起光が当たったことにより生じる蛍光の多くは、ウェル３の上方に進行する。よって、ウェル３の断面形状を曲線にすることで、検出器で検出される蛍光の割合を増やすことができる。
【００４６】
なお、ウェル３の側面および底面の全体が曲面である必要はない。例えば、図９（ａ）のように、ウェル３の開口部側は平坦面であってもよい。あるいは図９（ｂ）のように、ウェル３の底面の少なくとも一部は平坦面であってもよい。すなわち、蛍光が当たる可能性の高い側面部分の少なくとも一部を曲面にするのが望ましい。本発明者の検討によれば、ウェル３の側面および底面の総面積に対して、約６７％以上を曲面にすれば、蛍光を効率的に上方に進行させることができる。約６７％以上とした根拠は下記の通りである。ウェル３の側面を曲面にすれば、図８に示したように蛍光がウェル３の上方に進行しやすくなる。アスペクト比ｂ／ａ≧０．５で、かつウェル３の底面が平坦面であるとすると、ウェル３の側面および底面の総面積に対する曲面の割合は６７％以上となる。
【００４７】
上述したように、ウェル３内で生じた蛍光をウェル３の上方に進行させる方策として、１）アスペクト比ｂ／ａ＞０．５、２）ウェル３の側面および底面の表面粗さＲａ＜５μｍ、３）ウェル３の側面および底面の反射率≧５０％、４）ウェル３の形状が曲面、の４つが考えられる。このうち、１）は必須条件であり、残りの２）〜４）は必ずしも必須条件ではなく、適宜、１）の条件と組み合わせて実施すれば、より上方に進行する蛍光の割合を増やすことができる。
【００４８】
図１０は本実施形態による核酸増幅チップ１を用いたＰＣＲ法による遺伝子解析の処理手順の一例を示すフローチャートである。図１０のフローチャートは、不図示のＰＣＲ測定装置にて行われる。
【００４９】
ＰＣＲ測定装置に、核酸増幅チップ１をセットするにあたって、遺伝子解析を行う対象である検体とＤＮＡ抽出用の試薬とを所定の容器に入れて混合し、その一部を核酸増幅チップ１の各ウェル３内に注入する（ステップＳ１）。なお、各ウェル３内には、それぞれ別個のプライマが予め収納されているものとする。プライマは、特定の１本鎖ＤＮＡの特定の部位に結合する性質を持っている。よって、例えば、核酸増幅チップ１に４個のウェル３があり、各ウェル３に別種類のプライマをそれぞれ収納しておけば、検体に４種類のプライマに対応する１本鎖ＤＮＡのいずれかが含まれているか否かを検出できることになる。なお、場合によっては、２つ以上のウェル３内に、同一のプライマを入れておいてもよい。
【００５０】
この他、ウェル３内には、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を発生させるための蛍光物質を含んだＰＣＲ反応用の試薬や、二本鎖ＤＮＡの転写を促す酵素であるポリメラーゼも収納される。このように、ウェル３には、検体と、ＤＮＡ抽出用の試薬と、プライマと、ＰＣＲ反応用の試薬および酵素とが少なくとも収納される。なお、ＤＮＡ抽出用の試薬で抽出されるＤＮＡは、図１１に示すように、相補的に結合した２本鎖ＤＮＡ１１である。
【００５１】
次に、ウェル３内の温度を上げることで、図１２に示すように、検体中の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離させる（ステップＳ２）。このときの温度は９０℃以上に設定される。２本鎖ＤＮＡが分離されることで、２つの１本鎖ＤＮＡ１２が生成されることになる。
【００５２】
次に、温度を４０〜６５℃程度に下げて、図１３に示すように、分離した１本鎖ＤＮＡの特定の部位にプライマ１３を結合させる（ステップＳ３）。
【００５３】
その後、温度を７０℃程度にまで上げて、図１４に示すように、プライマ１３部分の２本鎖ＤＮＡを伸長させる（ステップＳ４）。これら２つの１本鎖ＤＮＡのそれぞれが２本鎖ＤＮＡ１１になるため、元の２本鎖ＤＮＡ１１が２倍に増えたことになる。ステップＳ４の処理が終了すると、ステップＳ２の処理に戻って、所定回数に達するまでステップＳ２〜Ｓ４の処理が繰り返される。
【００５４】
このように、図１０のステップＳ１〜Ｓ４の処理を行うたびに、２本鎖ＤＮＡを２倍に増やすことができる。ＰＣＲ法では、ステップＳ１〜Ｓ４の処理を３０回程度繰り返して、２本鎖ＤＮＡの数を増幅する。一つのウェル３内で増幅する２本鎖ＤＮＡは、そこに収納されているプライマに依存する１種類だけであるため、それぞれ異なるプライマを入れた複数のウェル３では、それぞれ異なる２本鎖ＤＮＡを増やすことができる。よって、例えば、検体の中に、ある特定の病原体が含まれているか否かを検査する際には、この特定の病原体に対応した１本鎖ＤＮＡに結合するプライマをいずれかのウェル３の中に入れておけば、このウェル３内の２本鎖ＤＮＡの数が増えるかどうかで、検体に特定の病原体が含まれているか否かを検出できる。
【００５５】
ＰＣＲ測定装置では、核酸増幅チップ１内の各ウェル３に対して励起光を照射して、２本鎖核酸に結合した蛍光物質が発する蛍光の光量すなわち強度を測定する。２本鎖ＤＮＡの数が多いほど、蛍光の光量は増大するため、蛍光の光量により、各ウェル３内で２本鎖ＤＮＡが増幅したか否かを判別することができる。ＰＣＲ測定装置では、各ウェル３に入れたプライマの種類を把握しているため、蛍光の光量が多かったウェル３内のプライマの種類により、検体に含まれる特定の病原体等の遺伝子配列を特定することができる。
【００５６】
図１０では、ＰＣＲ法による遺伝子増幅の処理手順を説明したが、本実施形態は、ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅手法にも適用可能である。より具体的には、本実施形態は、ＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法などに幅広く適用可能である。
【００５７】
これらの方法はいずれも、結果として、２本鎖ＤＮＡを増幅するため、２本鎖ＤＮＡに結合する蛍光物質を含んだ試薬をウェル３の中に入れておくことで、ＰＣＲ法と同様に、特定の遺伝子配列が増幅したか否かを判別できる。
【００５８】
上述した実施形態では、２本鎖ＤＮＡを増幅する例を説明したが、本実施形態は、ＤＮＡではなく、ＲＮＡを増幅する場合にも適用可能である。すなわち、本実施形態による核酸増幅チップ１は、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる２本鎖核酸を増幅する場合に適用可能である。
【００５９】
このように、本実施形態では、ウェル３のアスペクト比を０．５より大きくするため、ウェル３内で増幅した２本鎖核酸に結合した蛍光物質に励起光が当たって発光した蛍光を、効率よくウェル３の上方に進行させることができ、検出器で検出される蛍光の割合を増やすことができる。よって、検出器では、蛍光の光量を精度よく検出できる。また、ウェル３の内壁面の平滑度を向上させることで、内壁面に当たった蛍光を上方に反射させやすくすることができる。さらに、核酸増幅チップ１の材料として反射性能に優れた材料を用いることで、ウェル３の内壁面での反射率を高くすることができ、より多くの蛍光を上方に進行させることができる。また、ウェル３の内壁面を曲面とすることで、内壁面に当たった蛍光をより多く上方に進行させることができる。
【００６０】
本発明の態様は、上述した個々の実施形態に限定されるものではなく、当業者が想到しうる種々の変形も含むものであり、本発明の効果も上述した内容に限定されない。すなわち、特許請求の範囲に規定された内容およびその均等物から導き出される本発明の概念的な思想と趣旨を逸脱しない範囲で種々の追加、変更および部分的削除が可能である。
【符号の説明】
【００６１】
１  核酸増幅チップ、２  基板、３  ウェル、１１  ２本鎖ＤＮＡ、１２  １本鎖ＤＮＡ、１３  プライマ
【図１】
2015186453.tif 000003
【図２】
2015186453.tif 000004
【図３】
2015186453.tif 000005
【図４】
2015186453.tif 000006
【図５】
2015186453.tif 000007
【図６】
2015186453.tif 000008
【図７】
2015186453.tif 000009
【図８】
2015186453.tif 000010
【図９】
2015186453.tif 000011
【図１０】
2015186453.tif 000012
【図１１】
2015186453.tif 000013
【図１２】
2015186453.tif 000014
【図１３】
2015186453.tif 000015
【図１４】
2015186453.tif 000016