(57)【要約】【課題】細胞内にｃＡＭＰ結合型タンパク質を発現させることなく、細胞内のｃＡＭＰを検出する方法を提供する。【解決手段】  ｃＡＭＰ検出方法は、ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞１と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示するリポソーム２であって、内部にｃＡＭＰ検出試薬を有するリポソーム２とを準備する工程と、（ｂ）細胞１とリポソーム２との間に、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路４を形成させる工程と、（ｃ）細胞１によって産生されたｃＡＭＰは連絡通路４を通してリポソーム２に移動し、リポソーム２の中でｃＡＭＰがｃＡＭＰ検出試薬と結合し、ｃＡＭＰ検出試薬３がｃＡＭＰ結合状態試薬６に変化する工程と、（ｄ）ｃＡＭＰ検出試薬３からｃＡＭＰ結合状態試薬６への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程とを包含する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、
（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示するリポソームであって、内部にｃＡＭＰ検出試薬を有するリポソームとを準備する工程と、
（ｂ）前記細胞と前記リポソームとの間に、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路を形成させる工程と、
（ｃ）前記細胞によって産生されたｃＡＭＰは前記連絡通路を通して前記リポソームに移動し、前記リポソームの中でｃＡＭＰが前記ｃＡＭＰ検出試薬と結合し、前記ｃＡＭＰ検出試薬がｃＡＭＰ結合状態試薬に変化する工程と、
（ｄ）前記ｃＡＭＰ検出試薬から前記ｃＡＭＰ結合状態試薬への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程と
を包含するｃＡＭＰ検出方法。
【請求項２】
前記ｃＡＭＰ検出試薬としてnano-Lantern(cAMP)を用い、
前記工程（ｄ）と同時またはそれよりも前の工程において、前記細胞および前記リポソームの外液にnano-Lantern(cAMP)の基質を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【請求項３】
前記リポソームはコネキシン分子を提示し、前記リポソームの作成方法として、バキュロウィルス−リポソーム融合法を用いる、請求項１に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【請求項４】
ラットβ１アドレナリン受容体に対するイソプロテレノール刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする、請求項２または３に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【請求項５】
マウス嗅覚受容体Olfr168に対する２−ペンタノン刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする、請求項２または３に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、細胞内のｃＡＭＰを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰは、細胞刺激に応答して、細胞内シグナル伝達分子により新たに細胞内で産生されるシグナル分子（セカンドメッセンジャー）の１つである。
【０００３】
非特許文献１は、細胞内にｃＡＭＰ結合型発光タンパク質を発現させ、細胞内ｃＡＭＰを検出する方法を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Fan, F. et al., Novel Genetically Encoded Biosensors Using Firefly Luciferase. ACS Chem. Biol., 3, 346, (2008)
【非特許文献２】Saito K, et al., Luminescent protein for high-speed single-cell and whole-body imaging, Nature Communications, 3, 1262, (2012)
【非特許文献３】Imre Berger et al., Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes, 22, 1583, (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願の、限定的ではない例示的なある実施形態は、細胞内にｃＡＭＰ結合型タンパク質を発現させたり、細胞外から細胞内にｃＡＭＰ検出試薬を注入したりすることなく、細胞内のｃＡＭＰを検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による一態様は、ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示するリポソームであって、内部にｃＡＭＰ検出試薬を有するリポソームとを準備する工程と、（ｂ）前記細胞と前記リポソームとの間に、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路を形成させる工程と、（ｃ）前記細胞によって産生されたｃＡＭＰは前記連絡通路を通して前記リポソームに移動し、前記リポソームの中でｃＡＭＰが前記ｃＡＭＰ検出試薬と結合し、前記ｃＡＭＰ検出試薬がｃＡＭＰ結合状態試薬に変化する工程と、（ｄ）前記ｃＡＭＰ検出試薬から前記ｃＡＭＰ結合状態試薬への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程とを包含するｃＡＭＰ検出方法を含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一態様にかかるｃＡＭＰの検出方法によれば、細胞内にｃＡＭＰ結合型発光タンパク質を発現させることなく、低侵襲に細胞内ｃＡＭＰを検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）および（ｂ）は、例示的な実施形態によるｃＡＭＰの検出方法を説明する概念図であり、（ｂ）は、（ａ）の破線Ｐ１で示す部分の拡大図である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、実施例１、２におけるリポソームの準備方法を説明するための模式的な工程断面図である。
【図３】（ａ）は、実施例１、２における細胞−リポソーム間連絡通路の作成方法を説明するための模式的な断面図であり、（ｂ）は、（ａ）の一部Ｐ２の拡大断面図である。
【図４】（ａ）は、実施例１、２における細胞−リポソーム間連絡通路の作成方法を説明するための模式的な断面図であり、（ｂ）および（ｃ）は、（ａ）の一部Ｐ３の拡大断面図である。
【図５】（ａ）は、実施例１、２における細胞およびリポソームの観察装置の模式図であり、（ｂ）は、（ａ）の観察装置に設置された容器内の細胞およびリポソームを示す拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一態様の概要は以下のとおりである。
【００１０】
本発明の一態様であるｃＡＭＰ検出方法は、ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示するリポソームであって、内部にｃＡＭＰ検出試薬を有するリポソームとを準備する工程と、（ｂ）前記細胞と前記リポソームとの間に、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路を形成させる工程と、（ｃ）前記細胞によって産生されたｃＡＭＰは前記連絡通路を通して前記リポソームに移動し、前記リポソームの中でｃＡＭＰが前記ｃＡＭＰ検出試薬と結合し、前記ｃＡＭＰ検出試薬がｃＡＭＰ結合状態試薬に変化する工程と、（ｄ）前記ｃＡＭＰ検出試薬から前記ｃＡＭＰ結合状態試薬への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程とを包含する。
【００１１】
前記ｃＡＭＰ検出試薬として、例えば、nano-Lantern(cAMP)を用い、前記工程（ｄ）と同時またはそれよりも前の工程において、前記細胞および前記リポソームの外液にnano-Lantern(cAMP)の基質を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００１２】
前記リポソームは、例えば、コネキシン分子を提示し、前記リポソームの作成方法として、バキュロウィルス−リポソーム融合法を用いてもよい。
【００１３】
上記ｃＡＭＰ検出方法は、例えば、ラットβ１アドレナリン受容体に対するイソプロテレノール刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする。
【００１４】
上記ｃＡＭＰ検出方法は、例えば、マウス嗅覚受容体Olfr168に対する２−ペンタノン刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする。
【００１５】
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の例示的な実施形態によるｃＡＭＰの検出方法を説明する概念図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）の破線ｐ１で示す部分の拡大図である。
【００１６】
まず、図１（ａ）および（ｂ）に示すように、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞１と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示するリポソーム２とを準備する（工程（ａ））。リポソーム２は、内部にｃＡＭＰ検出試薬３を有している。
【００１７】
次いで、細胞１とリポソーム２との間に、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路４を形成する（工程（ｂ））。
【００１８】
細胞１によってｃＡＭＰ５が産生されると、産生されたｃＡＭＰ５は、連絡通路４を通って、細胞１と接するリポソーム２に移動し、リポソーム２の内部でｃＡＭＰ検出試薬３と結合する。ｃＡＭＰ検出試薬３は、ｃＡＭＰ５との結合により、ｃＡＭＰ結合状態試薬６に変化する（工程（ｃ））。細胞１内のｃＡＭＰ５の産生は、例えば、ラットβ１アドレナリン受容体に対するisoproterenol刺激、あるいは、マウス嗅覚受容体Olfr168に対する2-pentanone刺激によって惹起される。
【００１９】
工程（ｃ）におけるｃＡＭＰ検出試薬３からｃＡＭＰ結合状態試薬６への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する（工程（ｄ））。これにより、細胞１内におけるｃＡＭＰ５の産生を検知したり、細胞１内で産生されたｃＡＭＰ５を定量することが可能になる。
【００２０】
ｃＡＭＰ検出試薬３として、例えば、nano-Lantern(cAMP)を用いてもよい。「nano-Lantern(cAMP)」は、化学発光タンパク質と蛍光タンパク質をハイブリッド化して得られる超高輝度化学発光タンパク質（Nano-lantern）を、ｃＡＭＰの検出用に改変した発光プローブであり、例えば非特許文献２に開示されている。nano-Lantern(cAMP)は、例えば、大腸菌株JM109(DE3)をNano-lantern cAMPの発現ベクター（非特許文献１で開示）によって形質転換して培養し（例えば２３℃）、培養中に大腸菌内部で生産されたNano-lantern cAMPタンパク質をNi-NTAアガロースを用いて精製することによって調整される。nano-Lantern(cAMP)を用いる場合には、例えば、工程（ｄ）と同時かそれよりも前の工程において、細胞１とリポソーム２とを含む外液にnano-Lantern(cAMP)の基質を投与する工程を含み得る。
【００２１】
nano-Lantern(cAMP)はｃＡＭＰと結合することにより、ｃＡＭＰとの結合前よりも発光強度の高い状態（ｃＡＭＰ結合状態試薬６）になる。従って、工程（ｄ）において、「検出試薬の性質の変化」として、例えば、発光強度の増加率を検出してもよい。なお、「検出試薬の性質の変化」は、発光強度の増加に限定されず、使用するｃＡＭＰ検出試薬に応じた性質の変化を検出することができる。
【００２２】
コネキシンを提示するリポソーム２の作成方法として、例えば、バキュロウィルス−リポソーム融合法を用いてもよい。
【００２３】
本実施形態におけるｃＡＭＰの検出方法は、細胞１内のｃＡＭＰを検知、定量またはその両方を行う方法を広く含む。例えば、ラットβ１アドレナリン受容体に対するisoproterenol刺激によって惹起された細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を検出対象としてもよい。あるいは、マウス嗅覚受容体Olfr168に対する2-pentanone刺激によって惹起された細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を検出対象としてもよい。
【００２４】
以下、図面を参照しながら、本発明による実施例の検出方法を説明する。
【００２５】
＜実施例１＞
（工程（ａ））
まず、β１アドレナリン受容体、Ｇαタンパク質、およびコネキシン４３を発現する細胞１が用意された。細胞１は、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リポフェクション法によって、β１アドレナリン受容体遺伝子（配列表の配列番号１）発現プラスミド、Gαタンパク質遺伝子（配列表の配列番号２）発現プラスミド、およびコネキシン４３遺伝子（配列表の配列番号３）発現プラスミドを導入し、表１に示した組成を有する培地中で、37℃の温度で、５％二酸化炭素雰囲気下で４８時間静置することによって準備された。
【００２６】
【表１】
2015186463.tif 000003
【００２７】
次に、nano-Lantern(cAMP)（非特許文献２）を取り込んだ状態のリポソーム２を作成した。
【００２８】
図２（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、内部にnano-Lantern(cAMP)を有するリポソーム２を作成する方法の一例を示す工程断面図である。
【００２９】
具体的には、まず、図２（ａ）に示すように、表面を大気プラズマ洗浄したカバーガラス１０に、低融点アガロース１%水溶液１１をのせ、６０℃に加温して水分を完全に飛ばした。次いで、図２（ｂ）に示すように、アガロースコートしたカバーガラス１０のアガロース面に、5μｌ（マイクロリットル）の精製nano-Lantern(cAMP)水溶液１２を７８ｎＭ（ナノモラー）（＝７８×１０-9ｍｏｌ／Ｌ）を塗りつけ、水分がなくなるまで、遮光下、室温で乾燥させた。その後、図２（ｃ）に示すように、乾燥させたnano-Lantern(cAMP)１２上に、メタノールに溶かした脂質・グルコース混合メタノール溶液１３（ＤＯＰＣ：０．７ｍｇ／ｍｌ、ＤＯＰＧ：０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｇｌｕｃｏｓｅ：０．２２５ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ塗りつけ、メタノールが完全に乾燥するまで、遮光下、室温で乾燥させた。このようにして得られたスライドガラスに、図２（ｄ）に示すように、表２に示される組成を有する緩衝液Ａ（ｐＨ７．４）１４を滴下した。１５分後、蛍光顕微鏡で観察すると、リポソーム（Giant Unilamellar Vesicle）２の生成が確認された。
【００３０】
【表２】
2015186463.tif 000004
【００３１】
（工程（ｂ））
続いて、リポソーム２と細胞１との間に連絡通路４を形成した。
【００３２】
図３（ａ）および図４（ａ）は、それぞれ、連絡通路４の形成方法の一例を示す工程断面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）の一部ｐ２の拡大図、図４（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ、図４（ａ）の一部ｐ３の拡大図である。
【００３３】
まず、コネキシン４３を提示するバキュロウィルスが、一般的な組み替えバキュロウィルス作成法（非特許文献３）によって準備された。
【００３４】
次いで、図３（ａ）に示すように、上記の細胞１とバキュロウィルス２０とを同一容器２１内に配置した。これにより、細胞１表面に提示されたコネキシン４３と、バキュロウィルス２０に提示されたコネキシン４３との複合体が形成された。容器２１を、表３に示される緩衝液Ｂ（ｐＨ７．４）２２によって満たした。このとき、図３（ｂ）に示すように、細胞１とバキュロウィルス２０との間に、連絡通路４が形成された。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
この後、図４（ａ）および（ｂ）に示すように、細胞１およびバキュロウィルス２０を含む容器２１内に、図２に示す方法で得られたリポソーム２を配置した。これにより、図４（ｃ）に示すように、バキュロウィルス２０とリポソーム２とが融合し、リポソーム２と細胞１との間に連絡通路４が形成された構造が得られた。容器２１は、底面がガラスで作られているので、倒立顕微鏡観察に用いることができる。したがって、倒立顕微鏡によって、細胞１およびリポソーム２の状態を観察することが可能である。
【００３７】
（工程（ｃ））
図４（ｃ）に示す構造によって、細胞１内のｃＡＭＰは連絡通路４を通して、リポソーム２に拡散する。こうすることで、リポソーム２内のｃＡＭＰ濃度は細胞内ｃＡＭＰ濃度を反映する。本実施例では、細胞１の外液に、β１アドレナリン受容体の活性化剤であるイソプロテレノール（isoproterenol）を添加し、細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を惹起した。これにより、リポソーム２内のｃＡＭＰ濃度も上昇した。
【００３８】
リポソーム２内に流入したｃＡＭＰ５は、リポソーム２に内包されたnano-Lantern(cAMP)と結合し、nano-Lantern(cAMP)の発光強度を変化させる。nano-Lantern(cAMP)の発光に必要なセレンテラジンは、細胞１およびリポソーム２の外液から、リポソーム膜を透過して供給される。先述のとおり、リポソーム２内のｃＡＭＰ濃度は細胞１内ｃＡＭＰの濃度上昇を反映するため、nano-Lantern(cAMP)の発光強度変化は、細胞１内のcAMP濃度変化を反映する。本実施例では、リポソーム２内のｃＡＭＰ濃度の上昇により、nano-Lantern(cAMP)の発光強度が増加した。
【００３９】
（工程（ｄ））
nano-Lantern(cAMP)の発光強度の増加率を測定することにより、細胞１内のｃＡＭＰ濃度変化を検出した。
【００４０】
図５（ａ）は、本工程で使用した観察装置の模式図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）の観察装置に設置された容器２１内の細胞およびリポソームを示す拡大図である。本実施例では、観察装置として、ＣＣＤカメラつき倒立顕微鏡３１を用いた。
【００４１】
図５（ａ）および（ｂ）に示すように、ＣＣＤカメラつき倒立顕微鏡３１に容器２１を設置し、細胞１に接触したリポソーム２の発光を捕らえ、輝度の時間変化を記録した。迷光の影響を避けるため、倒立顕微鏡３１は、十分に外光を遮った暗室下におかれる必要がある。輝度の記録をしつつ、細胞外液にβ１アドレナリン受容体のアゴニストであるイソプロテレノールを終濃度30μM（マイクロモラー）で添加したところ（上記工程（ｃ））、細胞１に接触したリポソーム２の発光が上昇し、細胞１内のｃＡＭＰ濃度上昇を捕らえた。
【００４２】
表４に実施例１で得られたリポソーム２の発光強度の増加率を示す。発光強度増加率は下記の式によって算出される。
発光強度増加率＝（アゴニスト添加後の最大発光強度）／（アゴニスト添加直前の発光強度）−１
【００４３】
＜比較例１＞
比較例１は、実施例１の工程（ｄ）に下記の変更を加えて実施された。その他の工程は、実施例１と同様とした。
【００４４】
工程（ｄ）において、細胞１に接触していないリポソーム２の発光を捕らえ、輝度の時間変化を記録した。表４に比較例１で得られたリポソーム２の発光強度の増加率を示す。
【００４５】
＜実施例２＞
実施例２は、実施例１の工程（ａ）および工程（ｄ）に、下記の変更を加えて実施された。その他の工程は、実施例１と同様とした。
【００４６】
実施例２の工程（ａ）においては、細胞１として、マウス嗅覚受容体Olfr168、Gαタンパク質、受容体輸送タンパク質（RTP1S）、およびコネキシン４３を発現する細胞が用意された。
【００４７】
細胞１は、HEK293T細胞に、リポフェクション法によって、マウス嗅覚受容体Olfr168遺伝子（配列表の配列番号４）発現プラスミド、Gαタンパク質遺伝子発現プラスミド、受容体輸送タンパク質（RTP1S）遺伝子（配列表の配列番号５）発現プラスミド、およびコネキシン４３遺伝子を導入し、37℃の温度で、５％二酸化炭素雰囲気下で48時間静置することによって準備された。
【００４８】
実施例２の工程（ｄ）においては、細胞外液に加える受容体アゴニストとして、マウス嗅覚受容体Olfr168のアゴニストである２−ペンタノン（2-pentanone）が終濃度3mM（ミリモラー）で添加された。
【００４９】
表５に実施例２で得られたリポソーム２の発光強度増加率を示す。
【００５０】
＜比較例２＞
比較例２は、実施例２の工程（ｄ）に下記の変更を加えて実施された。その他の工程は、実施例２と同様とした。
【００５１】
比較例２の工程（ｄ）において、細胞１に接触していないリポソーム２の発光を捕らえ、輝度の時間変化を記録した。
【００５２】
表５に比較例２で得られたリポソーム２の発光強度の増加率を示す。
【００５３】
【表４】
2015186463.tif 000006
【００５４】
【表５】
2015186463.tif 000007
【００５５】
表４および表５に示す結果から分かるように、細胞１と接していないリポソーム２内では、細胞１内でｃＡＭＰが産生されてもnano-Lantern(cAMP)の発光強度は変化しなかった（比較例１、２）。これに対し、細胞１と連絡通路４を介して接するリポソーム２内では、細胞１内でｃＡＭＰが産生されると、nano-Lantern(cAMP)の発光強度が高くなった（実施例１、２）。従って、nano-Lantern(cAMP)の発光強度の増加率を測定することにより、細胞内ｃＡＭＰの濃度変化を検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の一態様にかかるｃＡＭＰの検出方法は、細胞内にｃＡＭＰ結合性タンパク質を発現させることなく、細胞内ｃＡＭＰの濃度変化を検出することができるので、薬剤スクリーニング、細胞生理学研究、細胞分化評価などに有用である。また、細胞内の低分子を、低侵襲にリポソーム内に抽出する方法を含んでいるため、メタボロジーへの展開も期待される。
【符号の説明】
【００５７】
１        細胞
２        リポソーム
３        ｃＡＭＰ検出試薬
４        連絡通路
６        ｃＡＭＰ結合状態試薬
１０      カバーガラス
２０      バキュロウィルス
２１      容器
３１      倒立顕微鏡
【図１】
2015186463.tif 000008
【図２】
2015186463.tif 000009
【図３】
2015186463.tif 000010
【図４】
2015186463.tif 000011
【図５】
2015186463.tif 000012
【配列表】
2015186463000001.app