(57)【要約】【課題】微生物の増殖速度の低下を抑制しつつ、副生物の生成を低減させ、２，３−ブタンジオールを効率よくかつ安全に製造するための微生物を提供する。【解決手段】２，３−ブタンジオール生産能を有し、ａ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性、ｂ）アセテートキナーゼ活性およびホスホトランスアセチラーゼ活性のいずれか一方または両方、並びにｃ）ＣｏＡトランスフェラーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，３−ブタンジオール生産能を有し、次のａ）、ｂ）、およびｃ）の活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物。
ａ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性
ｂ）アセテートキナーゼ活性およびホスホトランスアセチラーゼ活性のいずれか一方または両方
ｃ）ＣｏＡトランスフェラーゼ活性
【請求項２】
ピルベートオキシダーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ピルベートカルボキシラーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された、請求項１または請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
さらに、アセトラクテートシンターゼ活性、アセトラクテートデカルボキシラーゼ活性、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、およびジアセチルレダクターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
さらに、キシロースイソメラーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
さらに、キシルロキナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
前記微生物が、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物またはその処理物を水性媒体中で有機原料に作用させることを特徴とする２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項９】
前記有機原料が、グルコース、スクロース、およびキシロースからなる群より選ばれる１種類以上を含むものである、請求項８に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載の方法により２，３−ブタンジオールを製造する工程、および前記工程で得られた２，３−ブタンジオールを原料として１，３−ブタジエンへの変換工程を含む、１，３−ブタジエンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２，３−ブタンジオール生産能を有する新規な微生物およびそれを用いた２，３−ブタンジオールの製造方法に関するものである。また、該製造方法で得られた２，３−ブタンジオールを原料とする１，３−ブタジエンンの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
２，３−ブタンジオールは炭素数４の直鎖炭化水素であり、２、３位にそれぞれヒドロキシル基が結合し、（Ｒ，Ｒ），（Ｓ，Ｓ），（ｍｅｓｏ）体の３種の光学異性体が存在する。２，３−ブタンジオールは、脱水反応により合成ゴムの原料として有用な１，３−ブタジエンや、溶媒として用いられるメチルエチルケトンなどの原料となるほか、それ自身も印刷用インク、芳香剤、可塑剤、食品、医薬品、柔軟剤などの用途での利用が期待されている。
加えて、現在、石油資源の枯渇、環境への影響などの要因から、微生物を用いた発酵生産に注目が集まっている。２，３−ブタンジオールを天然に発酵生産する微生物として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓなどが知られている（例えば非特許文献１）。
【０００３】
２，３−ブタンジオールを天然に発酵生産する検討の歴史は古く、またその生産性も比較的高い。例えば前述のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、蓄積量１５０ｇ／Ｌ、生産性４．２１ｇ／Ｌ／ｈの成績が報告されている（非特許文献２）。その一方で、これらの微生物は、肺炎、腸炎などの原因菌でありＢＳＬ２に指定され、産業利用上、大規模に培養することには適していない欠点がある。
【０００４】
そのため、安全に培養が可能なＧＲＡＳないしＢＳＬ１に分類される、２，３−ブタンジオール大量生産菌の探索または、菌株の改変による毒性の除去が試みられている。加えて一般的に用いられる大腸菌などを遺伝子組換え技術により２，３−ブタンジオールを生産させる試みが行われてきた。しかしながら、いずれの技術においても、天然菌に匹敵する生産性を示す安全な微生物は得られていない。
【０００５】
また、２，３−ブタンジオールの製造に用いる微生物については、遺伝子組換え技術による２，３−ブタンジオール生産経路に関わる遺伝子の増強や、副生成物の生産経路に関わる遺伝子の破壊を行って、生産性を向上させる手法も有用な技術となり得る。
例えば非特許文献３には、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを用いることにより、乳酸の副生を抑制し、２，３−ブタンジオールの生産性が向上することが示されている。
【０００６】
また、特許文献１には、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子、ホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アセテートキナーゼ遺伝子、およびピルベートオキシダーゼ遺伝子を破壊したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いることにより、乳酸と酢酸の副生を抑制し、２，３−ブタンジオールの生産性を向上することが示されている。
さらに、非特許文献４には、ピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子を破壊したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いることにより、エタノールの副生を抑制し、２，３−ブタンジオールの生産性を向上することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１３／０７６１４４号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．，２０１１，Ｍａｙ−Ｊｕｎ  ２９（３），ｐ３５１−６４
【非特許文献２】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，Ｆｅｂ  ８２（１），ｐ４９−５７
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，２０１２，Ｊｕｌ  １０９（７），ｐ１６１０−２１
【非特許文献４】Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１３，Ｏｃｔ  １４６，ｐ２７４−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献３に記載の方法は、乳酸の副生が減少するものの、エタノール、ギ酸、酢酸、コハク酸などが依然として副生しており、２，３−ブタンジオールの生産について改善の余地があった。
また、特許文献１に記載の方法は、乳酸、酢酸の副生を減少させる遺伝子改変を行い、２，３−ブタンジオールを生産しているものの、その蓄積量は最大でも０．２５７ｇ／Ｌと低い成績であり、さらなる副生物の低減や２，３−ブタンジオールの生産について改善の余地があった。
さらに、非特許文献４に記載の方法は、ピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子の破壊によって、増殖速度が低下するという問題があった。そのため、増殖が回復した変異株を取得しているが、この手法は多大な労力を要するため、合理的な微生物の改変が望まれていた。
本発明の課題は、微生物の増殖速度の低下を抑制しつつ、副生物の生成を低減させ、２，３−ブタンジオールを効率よくかつ安全に製造する微生物、並びに該微生物を用いた２，３−ブタンジオールおよび１，３−ブタジエンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、２，３−ブタンジオールの製造に用いる微生物においてラクテートデヒドロゲナーゼ活性、アセテートキナーゼ活性およびホスホトランスアセチラーゼ活性のいずれか一方または両方、並びにＣｏＡトランスフェラーゼ活性を低減することにより、微生物の増殖速度の低下を抑制しつつ、乳酸や酢酸などの副生を低減して２，３−ブタンジオールの生産性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、上記課題は以下の構成により達成される。
［１］２，３−ブタンジオール生産能を有し、次のａ）、ｂ）、およびｃ）の活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物。
ａ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性
ｂ）アセテートキナーゼ活性およびホスホトランスアセチラーゼ活性のいずれか一方または両方
ｃ）ＣｏＡトランスフェラーゼ活性
［２］ピルベートオキシダーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された、［１］に記載の微生物。
［３］ピルベートカルボキシラーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された、［１］または［２］に記載の微生物。
［４］さらに、アセトラクテートシンターゼ活性、アセトラクテートデカルボキシラーゼ活性、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、およびジアセチルレダクターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［１］〜［３］のいずれかに記載の微生物。
［５］さらに、キシロースイソメラーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［１］〜［４］のいずれかに記載の微生物。
［６］さらに、キシルロキナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［１］〜［５］のいずれかに記載の微生物。
［７］前記微生物が、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［１］〜［６］のいずれかに記載の微生物。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の微生物またはその処理物を水性媒体中で有機原料に作用させる２，３−ブタンジオールの製造方法。
［９］前記有機原料が、グルコース、スクロース、およびキシロースからなる群より選ばれる１種類以上を含むものである、［８］に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
［１０］［８］または［９］に記載の方法により２，３−ブタンジオールを製造する工程、および前記工程で得られた２，３−ブタンジオールを原料として１，３−ブタジエンへの変換工程を含む、１，３−ブタジエンの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、増殖速度の低下を伴うことなく、副生物の生成を低減して２，３−ブタンジオールの生産性が向上した微生物を提供することができる。
このような本発明の微生物を用いることにより、２，３−ブタンジオールを効率よくかつ安全に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】２，３-ブタンジオール生成およびその副生物生成に関する代謝経路を示す図である。
【図２】ｐＣ３．１４Ｆ−ＡｌｓＳＤの構築手順を示す図である。
【図３】ｐＴＺ４Ｆ−ＢｄｈＡの構築手順を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜本発明の微生物＞
本発明の微生物は、２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物であり、かつ、次のａ）、ｂ）、およびｃ）の活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物である。
ａ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性
ｂ）アセテートキナーゼ活性およびホスホトランスアセチラーゼ活性のいずれか一方または両方
ｃ）ＣｏＡトランスフェラーゼ活性
【００１５】
本発明において、「２，３−ブタンジオール生産能」とは、微生物を培地中で培養したときに、該微生物が該培地中に２，３−ブタンジオールを生成蓄積することができることをいう。
２，３−ブタンジオールは炭素数４の直鎖炭化水素であり、２、３位にそれぞれヒドロキシル基が結合し、（Ｒ，Ｒ），（Ｓ，Ｓ），（ｍｅｓｏ）体の３種の光学異性体が存在する。本発明において、微生物が生産する２，３−ブタンジオールはこれらのうちいずれの異性体であってもよい。
【００１６】
ここで、２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物は、本来的に２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物であってもよいし、育種により２，３−ブタンジオール生産能を付与したものでもよい。
育種により２，３−ブタンジオール生産能を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、２，３−ブタンジオールの生合成経路における酵素遺伝子の発現強化など、公知の方法を採用することができる。例えば、後述するようなアセトラクテートシンターゼ活性、アセトラクテートデカルボキシラーゼ活性、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、ジアセチルレダクターゼ活性を付与または増強するような改変などが挙げられる。
【００１７】
本発明で用いる微生物は、２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物であれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選択される微生物であることが好ましい。
その中でも、コリネ型細菌、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。
【００１８】
上記コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌である。
【００１９】
本発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ  Ｗ，  Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｗ，  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ＫＨ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９１，  Ｖｏｌ．４１，  ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、およびその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株およびＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株とする。
【００２０】
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００２１】
本発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なアナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００２２】
本発明で使用可能なアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なマンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００２３】
本発明で使用可能なバスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Ｂａｓｆｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌としては、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｙｉｓ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、ザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）等が挙げられる。
【００２４】
本発明で使用可能な糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等が挙げられる。このうち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）等が挙げられる。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属では、リゾパス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられる。
【００２５】
本発明で使用可能な酵母菌としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００２６】
上記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）等が挙げられる。
上記シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。
上記カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。
上記ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）としては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）等が挙げられる。
【００２７】
上記クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等が挙げられる。
上記ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等が挙げられる。
上記チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）等が挙げられる。
【００２８】
上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００２９】
本発明の微生物は、上述したように２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物に、後述の通り、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性、アセテートキナーゼ活性およびホスホトランスアセチラーゼ活性のいずれか一方または両方、並びにＣｏＡトランスフェラーゼ活性が低減するように改変することによって得ることができる。
【００３０】
本発明において、「ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨとも呼ぶ）活性」とは、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２７）をいう。「ＬＤＨ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＬＤＨ活性が低下していることをいう。ＬＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＬＤＨ活性は完全に消失していてもよい。ＬＤＨ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫａｎａｒｅｋらの方法（Ｋａｎａｒｅｋ  Ｌ，  Ｈｉｌｌ  ＲＬ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９６４，  Ｖｏｌ．２３９，  ｐ４２０２−４２０６）によりＬＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００３１】
ＬＤＨ活性が低減するように改変された株は、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＬＤＨ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、染色体上のｌｄｈ遺伝子を破壊したり、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによっても達成される。具体的には、染色体上のプロモーター配列を含むｌｄｈ遺伝子の領域において、その一部または全てを欠失させること、塩基配列を挿入して分断すること、変異を導入すること、より微弱なプロモーターへ置換することなどが挙げられる。なお、これらＬＤＨ活性を低減する方法を複数組み合わせてもよい。
ＬＤＨ活性が低減するように改変された株の作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈaｆｅｒ  Ａ，  Ｔａｕｃｈ  Ａ，  Ｊaｇｅｒ  Ｗ，  Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ，  Ｐｕｈｌｅｒ  Ａ，  Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｖｏｌ．１４５（１），  ｐ６９−７３）等が挙げられる。
【００３２】
以下、コリネ型細菌においてｌｄｈ遺伝子を破壊する方法について説明する。ｌｄｈ遺伝子の取得は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＣ＿００６９５８の配列中にｃｇ３２１９で登録されているコリネバクテリウム・グルタミカムのｌｄｈ遺伝子配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングできる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｓａｉｔｏ  Ｈ，  Ｍｉｕｒａ  Ｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，  １９６３，  Ｖｏｌ．７２，  ｐ６１９−６２９、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３３】
上記のようにして調製したｌｄｈ遺伝子またはその一部を遺伝子破壊に使用することができる。ただし、遺伝子破壊に用いる遺伝子は破壊対象の細菌の染色体ＤＮＡ上のｌｄｈ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性（同一性）を有していればよいため、コリネ型細菌のｌｄｈ遺伝子と相同性を有する相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ（ｌｄｈ遺伝子配列の相補鎖）であれば、相同組換えは起こり得る。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３４】
上記のような遺伝子を使用し、例えば、ｌｄｈ遺伝子の部分配列を欠失し、正常ＬＤＨタンパク質を産生しないように改変した欠失型ｌｄｈ遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のｌｄｈ遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第６３０３３８３号明細書、または特開平０５−００７４９１号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことができ、コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドとしては、エシェリヒア・コリで複製能力を持つプラスミドが好ましく、例えば、ｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ社製）、ｐＨＳＧ３９９（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００３５】
本発明において、「アセテートキナーゼ（以下、ＡＣＫとも呼ぶ）活性」とは、アセチルリン酸とＡＤＰから酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．２．１）をいう。「ＡＣＫ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＡＣＫ活性が低下していることをいう。ＡＣＫ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＡＣＫ活性は完全に消失していてもよい。ＡＣＫ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＲａｍｐｏｎｉらの方法（Ｒａｍｐｏｎｉ  Ｇ，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９７５，  Ｖｏｌ．４２，  ｐ４０９−４２６）によりＡＣＫ活性を測定することによって確認することができる。
【００３６】
本発明において、「ホスホトランスアセチラーゼ（以下、ＰＴＡとも呼ぶ）活性」とは、アセチルＣｏＡにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．３．１．８）をいう。「ＰＴＡ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＰＴＡ活性が低下していることをいう。ＰＴＡ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＰＴＡ活性は完全に消失していてもよい。ＰＴＡ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫｌｏｔｚｓｃｈらの方法（Ｋｌｏｔｚｓｃｈ  ＨＲ，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９６９，  Ｖｏｌ．１２，  ｐ３８１−３８６）によりＰＴＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００３７】
ＡＣＫ活性が低減するように改変された株、ＰＴＡ活性が低減するように改変された株は、上述のＬＤＨ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。ＡＣＫ活性とＰＴＡ活性はいずれか一方を低減させてもよいが、酢酸の副生を効率よく低減させるためには、両方の活性を低下させることがより好ましい。
なお、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｆｅｂ  １４５（Ｐｔ２），ｐ５０３−５１３に記載されているように、両酵素はｐｔａ−ａｃｋオペロンにコードされているため、ｐｔａ遺伝子を破壊した場合は、ＰＴＡおよびＡＣＫの両酵素の活性を低下させることができる。
【００３８】
本発明において、「ＣｏＡトランスフェラーゼ（以下、ＣＴＦとも呼ぶ）活性」とは、アセチルＣｏＡのＣｏＡを他の物質に転移して酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．８．３．１８）をいう。「ＣＴＦ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＣＴＦ活性が低下していることをいう。ＣＴＦ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＣＴＦ活性は完全に消失していてもよい。ＣＴＦ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＶｅｉｔらの方法（Ｖｅｉｔ  Ａ，  Ｒｉｔｔｍａｎｎ  Ｄ，  Ｇｅｏｒｇｉ  Ｔ，  Ｙｏｕｎ  ＪＷ，  Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ＢＪ,  Ｗｅｎｄｉｓｃｈ  ＶＦ，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００９，  Ｖｏｌ．１４０（１−２），  ｐ７５−８３）によりＣＴＦ活性を測定することによって確認することができる。
【００３９】
ＣＴＦ活性が低減するように改変された株は、上述のＬＤＨ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
また、ＬＤＨ活性、ＡＣＫ活性およびＰＴＡ活性のいずれか一方または両方、並びにＣＴＦ活性を低減するような改変について、その順番は問わない。
【００４０】
２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物において、ＬＤＨ活性を低減するような改変を行うと、乳酸の副生を低減できるものの、その微生物の増殖速度が低下してしまうという問題が明らかとなった。そこで、その改変に加えて、アセチルＣｏＡから酢酸を生成する代謝経路に関与するＡＣＫ活性およびＰＴＡ活性のいずれか一方または両方、並びにＣＴＦ活性を低減するような改変を行うと、酢酸の副生を低減できるだけでなく、微生物の増殖速度の低下も大きく抑制でき、ＬＤＨ活性を低減した際の問題を解決することができた。
【００４１】
２，３−ブタンジオール、および乳酸の生合成経路はＮＡＤＨ等の還元力を消費する経路である。一方で、ピルビン酸からアセチルＣｏＡを経由して酢酸を生合成する経路は、逆に、ＮＡＤＨ等の還元力を供給する経路である。これは、ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体（以下、ＰＤＨｃとも呼ぶ）によってピルビン酸がアセチルＣｏＡに変換される際にＮＡＤＨ等を生じるためである。
２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物において、ＬＤＨ活性を低減するような改変を行うと、乳酸の副生が低減され、酢酸の副生が増加する傾向が見られる。つまり、還元力を消費する経路のフラックスが減少するだけでなく、還元力を供給する経路のフラックスが増加することになる。その結果、ＬＤＨ活性を低減するような改変のみを行った株では、細胞内の酸化還元バランスが大きく変化し、微生物の増殖速度が低下したと考えられる。
２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物において、ＬＤＨ活性を低減するような改変に加えて、ＡＣＫ活性およびＰＴＡ活性のいずれか一方または両方、並びにＣＴＦ活性を低減するような改変を行うと、乳酸だけでなく酢酸の副生も低減し、２，３−ブタンジオールの生産が増加する。つまり、ＬＤＨ活性を低減するような改変のみの場合と比べて、還元力を供給する経路のフラックスが減少し、還元力を消費する経路のフラックスが増加することになる。その結果、細胞内の酸化還元バランスが改善し、微生物の増殖速度の低下を大きく抑制できたと考えられる。
【００４２】
本発明の微生物は、上述の改変に加えて、ピルベートオキシダーゼ活性を低減するように改変することが好ましい。「ピルベートオキシダーゼ（以下、ＰｏｘＢとも呼ぶ）活性」とは、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．２．５．１）をいう。「ＰｏｘＢ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＰｏｘＢ活性が低下していることをいう。ＰｏｘＢ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＰｏｘＢ活性は完全に消失していてもよい。ＰｏｘＢ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＣｈａｎｇらの方法（Ｃｈａｎｇ  ＹＹ，  Ｃｒｏｎａｎ  ＪＥ  ＪＲ，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８２，  Ｖｏｌ．１５１，  ｐ１２７９−１２８９）によりＰｏｘＢ活性を測定することによって確認することができる。
【００４３】
ＰｏｘＢ活性が低減するように改変された株は、上述のＬＤＨ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
ＬＤＨ活性、ＡＣＫ活性およびＰＴＡ活性のいずれか一方または両方、並びにＣＴＦ活性を低減するような改変に加えて、ＰｏｘＢ活性を低減するような改変を行うことで、さらに酢酸の副生を低減でき、２，３−ブタンジオールの生産性をより向上することができる。
【００４４】
本発明の微生物は、上述の改変に加えて、ピルベートカルボキシラーゼ活性を低減するように改変してもよい。「ピルベートカルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性」とは、ピルビン酸をカルボキシル化してオキサロ酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：６．４．１．１）をいう。「ＰＣ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＰＣ活性が低下していることをいう。ＰＣ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＰＣ活性は完全に消失していてもよい。ＰＣ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＦｉｓｈｅｒらの方法（Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＨ，  Ｍａｇａｓａｎｉｋ  Ｂ，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８４，  Ｖｏｌ．１５８（１），  ｐ５５−６２）によりＰＣ活性を測定することによって確認することができる。
【００４５】
ＰＣ活性が低減するように改変された株は、上述のＬＤＨ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
ＬＤＨ活性、ＡＣＫ活性およびＰＴＡ活性のいずれか一方または両方、並びにＣＴＦ活性を低減するような改変に加えて、ＰＣ活性を低減するような改変を行うことで、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等の副生を低減でき、さらに２，３-ブタンジオールの生産性を向上することができる。
【００４６】
本発明の微生物は、本来的に２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物または育種により２，３−ブタンジオール生産能を付与したものでもよい。
育種により２，３−ブタンジオール生産能を付与する具体的な改変例としては、アセトラクテートシンターゼ活性、アセトラクテートデカルボキシラーゼ活性、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、およびジアセチルレダクターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素活性を付与または増強するような改変などが挙げられる。
【００４７】
ここで、「アセトラクテートシンターゼ（以下、ＡＬＳとも呼ぶ）活性」とは、ピルビン酸からアセト乳酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．２．１．６）をいう。「ＡＬＳ活性が増強する」とは、ＡＬＳ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＡＬＳ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＡＬＳ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＳｔｏｒｍｅｒらの方法（Ｓｔｏｒｍｅｒ  ＦＣ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９６８，  Ｖｏｌ．２４３（１３），  ｐ３７３５−３７３９）により、ＡＬＳ活性を測定することによって確認することができる。
【００４８】
ＡＬＳ活性を増強する方法としては、例えば、親株を変異剤によって処理する方法、ＡＬＳをコードするａｌｓＳ遺伝子のコピー数を高める方法、ａｌｓＳ遺伝子やａｌｓＳ遺伝子のプロモーターを改変する方法などが挙げられる。さらに、これらＡＬＳ活性を増強する方法を複数組み合わせてもよい。
【００４９】
以下、ＡＬＳ活性が付与または増強するように改変された株の具体的な作製方法について説明する。ＡＬＳ活性が増強された株は、親株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＡＬＳ活性が上昇した株を選択することによって得ることができる。
また、ＡＬＳ活性が付与または増強された株は、ａｌｓＳ遺伝子を用いて改変することによっても得ることができる。具体的には、ａｌｓＳ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、ａｌｓＳ遺伝子を含むベクターで形質転換すること、または相同組換え法等の手法によって染色体上に該遺伝子を導入し、染色体上で多コピー化させることなどによって達成できる。
【００５０】
さらに、ＡＬＳ活性が増強された株は、染色体上またはプラスミドベクター上のａｌｓＳ遺伝子に変異を導入することによって、ａｌｓＳ遺伝子がコードするタンパク質１分子当たりのＡＬＳ活性を増加させることによっても達成できる。
また、ａｌｓＳ遺伝子の発現が増強された株は、染色体上またはプラスミドベクター上でａｌｓＳ遺伝子のプロモーターへ変異を導入すること、より強力なプロモーターへ置換することなどでａｌｓＳ遺伝子を高発現化させることによっても達成できる。
【００５１】
ＡＬＳ活性の付与または増強に用いるａｌｓＳ遺伝子としては、ＡＬＳ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、バチルス・サブチリス以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のａｌｓＳ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｌｓＳ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＡＬＳ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＡＬＳ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のａｌｓＳ遺伝子を用いてもよい。
【００５２】
上記のようにして単離されたＡＬＳをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能なように挿入することにより、ＡＬＳ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＡＬＳ活性が付与または増強するように改変された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＡＬＳをコードするＤＮＡを発現可能なように組み込むことによってもＡＬＳ活性が付与または増強するように改変された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００５３】
染色体上またはプラスミド上にａｌｓＳ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ａｌｓＳ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００５４】
以下、コリネ型細菌においてａｌｓＳ遺伝子を導入する方法について説明する。コリネ型細菌を使用する場合、ａｌｓＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でａｌｓＳ遺伝子の発現が可能な組換えプラスミドを得ることができる。該組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株を形質転換することにより、ａｌｓＳ遺伝子が導入されたコリネ型細菌が得られる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｖｅｒｔeｓ  ＡＡ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｋｕｒｕｓｕ  Ｙ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ，  Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．１４４（３），  ｐ１８１−１８５）等によって行うことができる。
【００５５】
コリネ型細菌に遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開２００６−３２０２０８号公報に記載のプラスミドｐＴＺ４；国際公開ＷＯ２００５−０２１７７０号パンフレットに記載のプラスミドｐＣ３．１４；特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報および米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、およびｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、およびｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、およびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００５６】
上記プラスミドベクターにおいて、ａｌｓＳ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであってもよく、用いるａｌｓＳ遺伝子自身のプロモーターであってもよい。プロモーターを適宜選択することによっても、ａｌｓＳ遺伝子の発現量の調節が可能である。コリネ型細菌において機能するプロモーターの具体例としては、ＴＺ４プロモーター、ｆｂａプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターなどが挙げられる。
【００５７】
また、２，３−ブタンジオール生産能の付与においては、アセトラクテートデカルボキシラーゼ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「アセトラクテートデカルボキシラーゼ（以下、ＡＬＤＣとも呼ぶ）活性」とは、アセト乳酸からアセトインを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：４．１．１．５）をいう。「ＡＬＤＣ活性が増強する」とは、ＡＬＤＣ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＡＬＤＣ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＡＬＤＣ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＬｏｋｅｎらの方法（Ｌｏｋｅｎ  ＪＰ，  Ｓｔｏｒｍｅｒ  ＦＣ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９７０，  Ｖｏｌ．１４（１），  ｐ１３３−１３７）により、ＡＬＤＣ活性を測定することによって確認することができる。
【００５８】
ＡＬＤＣ活性が付与または増強するように改変された株は、上述のＡＬＳ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＡＬＤＣ活性の付与または増強に用いるａｌｓＤ遺伝子としては、ＡＬＤＣ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、バチルス・サブチリス以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のａｌｓＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｌｓＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＡＬＤＣ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＡＬＤＣ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のａｌｓＤ遺伝子を用いてもよい。
【００５９】
ＡＬＳ活性およびＡＬＤＣ活性を付与または増強する場合、導入するａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
【００６０】
さらに、２，３−ブタンジオール生産能の付与においては、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（以下、ＢＤＨとも呼ぶ）活性」とは、アセトインを還元して２，３−ブタンジオールを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．−，１．１．１．４，１．１．１．７６）をいう。「ＢＤＨ活性が増強する」とは、ＢＤＨ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＢＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＢＤＨ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＵｉらの方法（Ｕｉ  Ｓ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｈ，  Ｍｕｒａｋｉ  Ｈ，  Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９８３，  Ｖｏｌ．６１（５），  ｐ４６７−４７１）により、ＢＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００６１】
ＢＤＨ活性が付与または増強するように改変された株は、上述のＡＬＳ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＢＤＨ活性の付与または増強に用いるｂｄｈＡ遺伝子としては、ＢＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、バチルス・サブチリス以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｂｄｈＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｂｄｈＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＢＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＢＤＨ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｂｄｈＡ遺伝子を用いてもよい。
【００６２】
さらに、２，３−ブタンジオール生産能の付与においては、ジアセチルレダクターゼ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「ジアセチルレダクターゼ活性（以下、ＤＲとも呼ぶ）」とは、ジアセチルを還元してアセトインを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．３０３，１．１．１．３０４）をいう。「ＤＲ活性が増強する」とは、ＤＲ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＤＲ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＤＲ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＵｉらの方法（Ｕｉ  Ｓ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｈ，  Ｍｕｒａｋｉ  Ｈ，  Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９８３，  Ｖｏｌ．６１（５），  ｐ４６７−４７１）により、ＤＲ活性を測定することによって確認することができる。
【００６３】
ピルビン酸から生成されたアセト乳酸は、酸素存在下で自発的に脱炭酸され、酵素活性を必要とすることなく、ジアセチルが生成する。このように生成したジアセチルをジアセチルレダクターゼによって還元し、アセトインへ変換する。このアセトインがさらに２，３−ブタンジオールへ変換されることで２，３−ブタンジオールの生産性向上に寄与することができる。
【００６４】
ＤＲ活性が付与または増強するように改変された株は、上述のＡＬＳ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＤＲ活性の付与または増強に用いるｂｄｈＡ遺伝子としては、ＤＲ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、バチルス・サブチリス以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｂｄｈＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｂｄｈＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＤＲ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＤＲ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｂｄｈＡ遺伝子を用いてもよい。
【００６５】
なお、このｂｄｈＡ遺伝子がコードする酵素のように、ＢＤＨ活性を有する酵素は、ＤＲ活性も有する場合が多い。このような遺伝子を用いると、ＢＤＨ活性とＤＲ活性を同時に付与または増強することができる。
【００６６】
２，３−ブタンジオールの生産性を向上させるためには、ピルビン酸から２，３−ブタンジオールを生合成する代謝経路のうち律速となる反応を触媒する酵素活性を付与または増強すればよく、アセトラクテートシンターゼ活性、アセトラクテートデカルボキシラーゼ活性、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、およびジアセチルレダクターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性を付与または増強するような改変を行うことによって達成できる。２，３−ブタンジオールの生産性をより向上させるためには、好ましくは、２種類以上、さらに好ましくは、３種類以上、特に好ましくは、４種類全ての活性を増強するような改変を行うことが望ましい。
【００６７】
本発明で用いる微生物は、本来的にキシロース資化能を有する微生物であってもよいし、育種によりキシロース資化能を付与したものでもよい。
育種によりキシロース資化能を付与する具体的な改変例としては、キシロースイソメラーゼ活性、キシルロキナーゼ活性を増強するような改変などが挙げられる。
【００６８】
ここで、「キシロースイソメラーゼ（以下、ＸｙｌＡとも呼ぶ）活性」とは、キシロースを異性化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．５）をいう。「ＸｙｌＡ活性が増強する」とは、ＸｙｌＡ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＸｙｌＡ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＸｙｌＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＧａｏらの方法（Ｇａｏ  Ｑ，  Ｚｈａｎｇ  Ｍ，  ＭｃＭｉｌｌａｎ  ＪＤ，  Ｋｏｍｐａｌａ  ＤＳ，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．９８（１００），  ｐ３４１−５５）により、ＸｙｌＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００６９】
ＸｙｌＡ活性が付与または増強するように改変された株は、上述のＡＬＳ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸｙｌＡ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＡ遺伝子としては、ＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、大腸菌以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＸｙｌＡ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｘｙｌＡ遺伝子を用いてもよい。
【００７０】
また、キシロース資化能の付与においては、キシルロキナーゼ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「キシルロキナーゼ（以下、ＸｙｌＢとも呼ぶ）活性」とは、キシルロースをリン酸化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１７）をいう。「ＸｙｌＢ活性が増強する」とは、ＸｙｌＢ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＸｙｌＢ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＸｙｌＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＥｌｉａｓｓｏｎらの方法（Ｅｌｉａｓｓｏｎ  Ａ，  Ｂｏｌｅｓ  Ｅ，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｏｔｅｎｓｔｅｒｂｅｒｇ  Ｍ，  Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ  ＪＭ，  Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｉ，  Ｊｕｈｎｋｅ  Ｈ，  Ｈａｈｎ−Ｈａｔｅｎｇｅｒｄａｌ  Ｂ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０００，  Ｖｏｌ．５３，  ｐ３７６−８２）により、ＸｙｌＢ活性を測定することによって確認することができる。
【００７１】
ＸｙｌＢ活性が付与または増強するように改変された株は、上述のＡＬＳ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸｙｌＢ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＢ遺伝子としては、ＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＸｙｌＢ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｘｙｌＢ遺伝子を用いてもよい。
【００７２】
ＸｙｌＡ活性およびＸｙｌＢ活性を付与または増強する場合、導入するｘｙｌＡ遺伝子とｘｙｌＢ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
【００７３】
なお、本発明の微生物は、上述のような、さらに副生物を低減するための改変（ＰｏｘＢ活性、ＰＣ活性の低減など）、２，３−ブタンジオール生産能を付与または増強するための改変（ＡＬＳ活性、ＡＬＤＣ活性、ＢＤＨ活性、ＤＲ活性の増強など）、キシロース資化能を付与するための改変（ＸｙｌＡ活性、ＸｙｌＢ活性の増強など）のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００７４】
＜２，３−ブタンジオールの製造方法＞
本発明の製造方法は、本発明の微生物またはその処理物を水性媒体中で、有機原料に作用させることにより、２，３−ブタンジオールを生産させる工程（以下、「発酵工程」という）を含む。
【００７５】
本発明の製造方法では、本発明の微生物の菌体の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
また、本発明の製造方法は、前記発酵工程の後に、生産された２，３−ブタンジオールを回収する工程（以下、「回収工程」という）を有することが好ましい。
【００７６】
本発明の製造方法に本発明の微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いてもよいが、発酵工程に先立ち、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。即ち、後述する種培養や本培養を行なうことで、本発明の微生物を予め増殖させた後に、発酵工程を行なうことができる。
なお、後述する種培養や本培養と、後述する発酵工程は、区別することなく、同時に行なうこともできる。また、種培養または本培養した微生物を反応液中で増殖させながら、有機原料と反応させることによって２，３−ブタンジオールを生産させることもできる。
【００７７】
（種培養）
種培養は、本培養に供する本発明の微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本発明の微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物等が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
【００７８】
種培養においては、必要に応じて、前記培地に炭素源を添加してもよい。種培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、またはアラビノースが好ましく、特にグルコース、スクロースまたはキシロースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００７９】
種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、２，３−ブタンジオールの生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【００８０】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【００８１】
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【００８２】
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
【００８３】
（本培養）
本培養は、後述する２，３−ブタンジオール生産反応に供する本発明の微生物の菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。
【００８４】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００８５】
また、本培養においては、前記培地に炭素源を添加することが好ましい。本培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、またはアラビノースが好ましく、特にグルコース、スクロースまたはキシロースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００８６】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００８７】
前記炭素源の使用濃度は特に限定されないが、微生物の増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．５〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記炭素源の減少にあわせ、炭素源を追加で添加してもよい。
【００８８】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【００８９】
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【００９０】
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【００９１】
また、本培養においては、より２，３−ブタンジオールの製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
【００９２】
本培養後の菌体は、後述する２，３−ブタンジオール生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
【００９３】
（発酵工程）
発酵工程では、上述の２，３−ブタンジオール生産能を有する微生物またはその処理物を水性媒体中で、有機原料に作用させることにより、２，３−ブタンジオールを生産させる。この発酵工程で起こる反応を、以下、「２，３−ブタンジオール生産反応」という。
【００９４】
ここで、水性媒体とは、発酵工程における２，３−ブタンジオール生産反応を行う水溶液のことであり、後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。当該水性媒体中で、本発明の微生物またはその処理物と有機原料とを反応させることにより２，３−ブタンジオール生産反応を行うことができる。本明細書において、水性媒体とは、反応容器に含まれる液体全てを意味する。
【００９５】
水性媒体としては、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、反応液は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本発明の微生物が資化して２，３−ブタンジオールを生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００９６】
本発明で用いる有機原料としては、本発明の微生物が資化して２，３−ブタンジオールを生産し得るものであれば特に限定されず、いわゆる一般的な糖質を用いることができる。
具体的には、グリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；、セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハノース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等が挙げられる。
【００９７】
上述した糖質の中でも、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖質が好ましく、これらの中でも、ヘキソース、ペントース、およびこれらを構成成分とする二糖類からなる群から選ばれる少なくとも一種がより好ましい。
ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。ペントースとしてはキシロース、アラビノースが好ましく、キシロースがより好ましい。ヘキソースおよびペントースを構成成分とする二糖類としては、スクロースが好ましい。グルコース、キシロース、スクロースは、自然界、植物の主な構成成分となっているため、原料の入手が容易なためである。
なお、本発明で用いる有機原料には、１種類の糖が単独で含有されていてもよいし、２種類以上の糖が含有されていてもよい。
【００９８】
本発明で用いる有機原料は、前記糖質を含んでいれば特に制限されないが、例えば、１種類以上の前記糖質を水に溶解して水溶液としたもの、１種類以上の前記糖質を構成成分として含む植物体またはその一部を糖質まで分解したもの、１種類以上の前記糖質を構成成分として含む植物体またはその一部から糖質を抽出したもの等を用いることができる。具体的には、後述するようなリグノセルロース分解原料、スクロース含有原料、デンプン分解原料等が挙げられる。
【００９９】
本発明で用いる有機原料は、必要に応じて水等で希釈して糖質の濃度を下げて用いてもよいし、濃縮して糖質の濃度を高めて用いてもよい。
本発明における有機原料中に含まれる糖質の濃度としては、有機原料の由来や、含有する糖質の種類等によって大きく変動するため、特に限定されないが、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性を考慮して、通常０．１質量％以上、好ましくは２質量％以上であり、また、通常８０質量％以下、好ましくは７０質量％以下である。ただし、糖質を２種類以上含む場合は、その合計の濃度を示す。
【０１００】
好ましい有機原料として、リグノセルロース分解原料が挙げられる。
リグノセルロースとは、構造性多糖のセルロース、ヘミセルロース、及び芳香族化合物の重合体のリグニンから構成される有機物である。リグノセルロースは、通常、食用にはできず、通常であれば廃棄、焼却処理をされるものが多いため、安定して供給でき、資源を有効利用できる点で好ましい。
リグノセルロース分解原料としては、バガス、コーンストーバー、麦わら、稲わら、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ササ、ススキ等の草本系バイオマスや、廃木材、オガ粉、樹皮、古紙等の木質系バイオマス等を好適に用いることができる。中でも、バガス、コーンストーバー、麦わらが好ましい。
【０１０１】
上述のリグノセルロース分解原料から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、リグノセルロースに対して必要に応じて前処理を施した後、酵素、酸、亜臨界水、超臨界水等による加水分解、または熱分解を行う方法等が挙げられる。
【０１０２】
また、好ましい有機原料として、スクロース含有原料が挙げられる。
また、スクロースは、細胞中にスクロースを蓄積できる植物に含まれ、以下、このような植物のことを「スクロースを含む植物」という。スクロースを含む植物としては、サトウキビ、テンサイ、サトウカエデ、オウギヤシ、ソルガム等の砂糖の原料として使用されるもの等が挙げられ、中でも、サトウキビ、テンサイが好ましい。
【０１０３】
スクロースを含む植物から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、当該植物を粉砕した後に圧搾または浸出を行なう方法等が挙げられる。本発明においては、このようにして得られたスクロースを含む植物の搾汁（例えば、サトウキビの場合はケーンジュース）、粗糖、廃糖蜜等も有機原料として用いることができる。
【０１０４】
また、好ましい有機原料として、デンプン分解原料が挙げられる。
また、デンプンは、細胞中にデンプンを蓄積できる植物に含まれ、以下、このような植物のことを「デンプンを含む植物」という。デンプンを含む植物としては、キャッサバ、トウモロコシ、馬鈴薯、小麦、甘藷、サゴヤシ、米、クズ、カタクリ、緑豆、ワラビ、オオウバユリ等が挙げられ、中でも、キャッサバ、トウモロコシ、馬鈴薯、小麦が好ましい。
【０１０５】
デンプンを含む植物から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、当該植物から抽出したデンプンを加水分解する方法等が挙げられる。
【０１０６】
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、２，３−ブタンジオールの生成を阻害しない範囲で可能な限り高くすると生産性の点で有利であり、好ましい。水性媒体中に含まれる有機原料の濃度は、そこに含まれる糖質の濃度で、水性媒体に対して、通常５％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、一方、通常３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下である。また、２，３−ブタンジオールの生産反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせて、有機原料の追加で添加してもよい。
【０１０７】
２，３−ブタンジオール生産反応中の水性媒体のｐＨは、用いる本発明の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、反応液のｐＨを、通常５．０以上、好ましくは５．５以上、より好ましくは６．０以上、さらに好ましくは６．５以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが好ましい。
【０１０８】
水性媒体のｐＨは、２，３−ブタンジオール生産反応中に生産される副生物が酸性物質である場合には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。２，３−ブタンジオール生産反応中に生産される副生物が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。
【０１０９】
２，３−ブタンジオール生産反応に用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体重量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
【０１１０】
２，３−ブタンジオール生産反応の時間は、特に限定はないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。
【０１１１】
２，３−ブタンジオール生産反応の温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常２℃〜２０℃、好ましくは７℃〜１５℃高い温度で行うことが好ましい。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３０℃以上、好ましくは３５℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。有機化合物生産反応の間、常に３０℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【０１１２】
２，３−ブタンジオール生産反応は、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよいが、通気、攪拌を行なうことが好ましい。具体的には、酸素移動速度として、通常０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上であり、一方、通常２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下、好ましくは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下である。
【０１１３】
本発明の２，３−ブタンジオールの製造方法は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。
【０１１４】
（回収工程）
本発明は、上記の２，３−ブタンジオール生産反応により２，３−ブタンジオールが生成し、反応液中に蓄積させることができる。蓄積させた２，３−ブタンジオールは、常法に従って、水性媒体より回収する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去し、ナノ濾過膜処理後に蒸留することによって、高純度の２，３−ブタンジオールを回収することができる。
得られた２，３−ブタンジオールは、医薬品や化粧品の中間体原料、印刷用インク、芳香剤、可塑剤、柔軟剤、殺虫剤などの原料として用いることができる。
【０１１５】
＜１，３−ブタジエンの製造方法＞
本発明においては、上述した方法により２，３−ブタンジオールを製造した後に、得られた２，３−ブタンジオールを原料として、常法に従って、１，３−ブタジエンを製造することができる。具体的には、例えば、アセチル化した後に酢酸を脱離する方法などが挙げられる。
１，３−ブタジエンは合成ゴムやＡＢＳ樹脂などの主原料となるほか、ヘキサメチレンジアミンやアジピン酸、１，４−ブタンジオール等といった多種類の化合物を合成可能な出発物質であり、石油由来の既存合成樹脂をバイオマス由来に置き換えられる可能性があるため、その製造技術が注目されている。
【実施例】
【０１１６】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０１１７】
［作製例１］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ遺伝子）、アセテートキナーゼ遺伝子（ａｃｋ遺伝子）、およびＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆ遺伝子）の破壊、さらに、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０１１８】
＜ＰＴＡ−ＡＣＫ破壊株の作製＞
ＰＴＡ−ＡＣＫ破壊株作製の供試菌株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株（ＬＤＨ破壊株：ＷＯ２００５−０２１７７０）を用いた。該菌株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＴＡＣＫ１（特開２００８−０６７６２９）を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９） により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ 、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、および寒天  １５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＴＡＣＫ１がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｐｔａ−ａｃｋ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１１９】
次に、上記相同組み換え株を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｐｔａ−ａｃｋ遺伝子がｐＴＡＣＫ１に由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号１および２）を用いて分析すると、野生型では１，６４５ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では１，０８６ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨと命名した。
【０１２０】
＜ＣＴＦ破壊株の作製＞
ＣＴＦ破壊株作製の供試菌株は、上記にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＡＣＨ２２（特開２００８−０６７６２９）を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９） により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株の形質転換および２回相同組換え体の選抜は、上記ＰＴＡ−ＡＣＫ破壊株の作製と同様の方法で行い、数十個のショ糖非感受性コロニーを得た。これらのうちｃｔｆ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの判定は、ｃｔｆ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号３および４）を用いて分析することによって行うことができ、野生型では１，２２８ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では１，００３ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨと命名した。
【０１２１】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
（Ａ）Ｆｂａプロモーターを用いた発現ベクターの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のＦｂａプロモーターを利用したコリネ型細菌においてタンパク質発現が可能なプラスミドベクターは、ｐＴＺ４ベクター（特開２００６−３２０２０８）及びｐＣ３．１４ベクター（ＷＯ２００５−０２１７７０）にフルクトース１，６−ビスホスフェイトアルドラーゼのプロモーター配列の領域を増幅したＤＮＡ断片を挿入することで作製した。Ｆｂａプロモーター配列は、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子上流の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に遺伝子合成サービス（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）で合成した（配列番号５）。
これを鋳型として、合成したプライマー（配列番号６および７）を用いたＰＣＲにてＦｂａプロモーター領域を増幅した。反応液組成：鋳型ＤＮＡ５μＬ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）０．３μＬ、５倍濃度添付バッファー１０μＬ、１００μＭ各々プライマー０．３μＬ、添付ｄＮＴＰｓ４μＬを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用い、９４℃で１５秒、５４℃で３０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを５回繰り返し、続けて９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを２５回繰り返した。さらにサイクルの前に９４℃での保温は３分、最終サイクル後に７２℃での保温３分をそれぞれ加えた。
得られたＦｂａプロモーター領域のＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製後、制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ、または制限酵素ＫｐｎＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約０．２ｋｂのＤＮＡ断片は、それぞれ０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、ＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キット（ＧＬサイエンス社）を用いてゲルから回収した。
【０１２２】
これらのＤＮＡ断片を、コリネ型細菌発現ベクターｐＣ３．１４を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで、コリネ型細菌発現ベクターｐＴＺ４をＫｐｎＩ及びＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を用いて連結した。得られた各プラスミドＤＮＡで大腸菌ＨＴＳ０８株（タカラバイオ社）を形質転換し、前者は２５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、後者は５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（前者は２５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、後者は５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）で液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて各プラスミドＤＮＡを精製した。得られた各プラスミドＤＮＡは、プライマー（前者は配列番号８および９、後者は配列番号９および１０）を用いて、Ｆｂａプロモーター配列の導入を確認し、これらをそれぞれｐＣ３．１４Ｆ、ｐＴＺ４Ｆと命名した。
【０１２３】
（Ｂ）ＡｌｓＳＤ増強用プラスミドの構築
枯草菌（バチルス・サブチリスＡＴＣＣ６０５１株）株由来ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子はオペロンを構成しており（以下、ａｌｓＳＤとも呼ぶ）、この構造のまま両遺伝子のクローニングを行った。
枯草菌（バチルス・サブチリスＡＴＣＣ６０５１株）をＬＢ培地［Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  １０ｇ／Ｌ］２ｍＬにて、対数増殖期後期まで培養し、インビトロジェン社  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ｇＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｋｉｔのプロトコールに従い、ゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡは滅菌水にて１０００倍に希釈してＰＣＲの鋳型に利用した。
枯草菌（バチルス・サブチリスＡＴＣＣ６０５１株）株由来ａｌｓＳＤ遺伝子断片の取得は上記で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に全塩基配列が報告されているゲノム配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ００９１２６．３）、および該遺伝子の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０４４７０．１）を基に設計したプライマー（配列番号１１および１２）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ５μＬ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）０．３μＬ、５倍濃度添付バッファー１０μＬ、１００μＭ各々プライマー０．３μＬ、添付ｄＮＴＰｓ４μＬを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用い、９４℃で１５秒、５４℃で３０秒、７２℃で２分からなるサイクルを５回繰り返し、続けて９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分のサイクルを２５回繰り返した。さらにサイクルの前に９４℃での保温は３分、最終サイクル後に７２℃での保温３分をそれぞれ加えた。
得られたａｌｓＳＤ遺伝子配列のＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約２．５ｋｂのＤＮＡ断片は０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、ＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キット（ＧＬサイエンス社）を用いてゲルから回収した。
【０１２４】
このＤＮＡ断片を、上記（Ａ）にて構築したｐＣ３．１４Ｆを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＨＴＳ０８株（タカラバイオ社）を形質転換し、２５μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含む）で液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断することにより約２．５ｋｂの挿入断片が認められたことを確認し、これをｐＣ３．１４Ｆ−ＡｌｓＳＤと命名した。（図２に構築手順を示す。）
【０１２５】
（Ｃ）ＢｄｈＡ増強用プラスミドの構築
枯草菌（バチルス・サブチリスＡＴＣＣ６０５１株）株由来ｂｄｈＡ遺伝子断片の取得は上記で調製した枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型とし、既に全塩基配列が報告されているゲノム配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ００９１２６．３）、該遺伝子の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＢ１２４４３．１）を基に設計したプライマー（配列番号１３および１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ５μＬ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）０．３μＬ、５倍濃度添付バッファー１０μＬ、１００μＭ各々プライマー０．３μＬ、添付ｄＮＴＰｓ４μＬを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用い、９４℃で１５秒、５４℃で３０秒、７２℃で１分からなるサイクルを５回繰り返し、続けて９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２５回繰り返した。さらにサイクルの前に９４℃での保温は３分、最終サイクル後に７２℃での保温３分をそれぞれ加えた。
得られたｂｄｈＡ遺伝子配列のＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約１．１ｋｂのＤＮＡ断片は０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、ＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キット（ＧＬサイエンス社）を用いてゲルから回収した。
【０１２６】
このＤＮＡ断片を、上記（Ａ）にて構築したｐＴＺ４Ｆを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＨＴＳ０８株（タカラバイオ社）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）で液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断することにより約１．１ｋｂの挿入断片が認められたことを確認し、これをｐＴＺ４Ｆ−ＢｄｈＡと命名した。（図３に構築手順を示す。）
【０１２７】
（Ｄ）ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株の作製
ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、上記にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換に用いるため、上記（Ｂ）にて構築したｐＣ３．１４Ｆ−ＡｌｓＳＤおよび上記（Ｃ）にて構築したｐＴＺ４Ｆ−ＢｄｈＡをそれぞれ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９） により大腸菌ＪＭ１１０株を形質転換し、脱メチル化されたプラスミドＤＮＡを調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ 、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、および寒天  １５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＣ３．１４Ｆ−ＡｌｓＳＤおよびｐＴＺ４Ｆ−ＢｄｈＡの双方がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で保持されており、この菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（以下、ＭＢＤ０４とも呼ぶ）と命名した。
【０１２８】
［作製例２］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ遺伝子）、アセテートキナーゼ遺伝子（ａｃｋ遺伝子）、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆ遺伝子）、およびピルベートオキシダーゼ遺伝子（ｐｏｘＢ遺伝子）の破壊、さらに、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０１２９】
＜ＰｏｘＢ破壊株の作製＞
ＰｏｘＢ破壊株作製の供試菌株は、作製例１にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＯＸＢ１１（特開２００８−０６７６２９）を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９） により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株の形質転換および２回相同組換え体の選抜は、上記ＰＴＡ−ＡＣＫ破壊株の作製と同様の方法で行い、数十個のショ糖非感受性コロニーを得た。これらのうちｐｏｘＢ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの判定は、ｐｏｘＢ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号１５および１６）を用いて分析することによって行うことができ、野生型では１，５１８ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では９８１ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨと命名した。
【０１３０】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、上記にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換は作製例１のＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株の作製と同様の方法で行い、作製した菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（以下、ＭＢＤ０５とも呼ぶ）と命名した。
【０１３１】
［作製例３］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ遺伝子）、アセテートキナーゼ遺伝子（ａｃｋ遺伝子）、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｔｆ遺伝子）、ピルベートオキシダーゼ遺伝子（ｐｏｘＢ遺伝子）、およびピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｃ遺伝子）の破壊、さらに、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＣ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０１３２】
＜ＰＣ破壊株の作製＞
（Ｅ）ＰＣ破壊用プラスミドの構築
ゲノム上のｐｃ遺伝子プロモーターを置換するためのプラスミドｐＭＪＰＣ１７．２（ＷＯ２０１２−１２８２３１）を制限酵素ＢａｍＨIおよびＢｇｌIIで切断することにより約０．４ｋｂからなるＰＣのコーディング領域のアミノ末端側の配列を切り出した。残った約５．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて回収した。回収したＤＮＡ断片の末端をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて環状化させ、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎIにより切断した結果、約２．０ｋｂのアミノ末端側の欠損を示す断片が確認され、これをｐＫＢ−ＰＣ１と命名した。
【０１３３】
（Ｆ）ＰＣ増強株の作製
ＰＣ破壊株作製の供試菌株は、作製例１にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、上記（Ｅ）にて構築したｐＫＢ−ＰＣ１を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９） により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株の形質転換および２回相同組換え体の選抜は、上記ＰＴＡ−ＡＣＫ破壊株の作製と同様の方法で行い、数十個のショ糖非感受性コロニーを得た。これらのうちｐｃ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの判定は、ｐｃ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号１７および１８）を用いて分析することによって行うことができ、野生型では１，２９７ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では１，２０３ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＣ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨと命名した。
【０１３４】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、上記にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＣ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換は作製例１のＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株の作製と同様の方法で行い、作製した菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＣ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（以下、ＭＢＤ０６とも呼ぶ）と命名した。
【０１３５】
［作製例４］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ株を作製した。
【０１３６】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、常法（Ｗｏｌｆ  Ｈｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６（３），ｐ１１６５−７０、Ｋｕｒｕｓｕ  Ｙｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９０，５４（２），ｐ４４３−７）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を用いた。該菌株の形質転換は作製例１のＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株の作製と同様の方法で行い、作製した菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ（以下、ＭＢＤ０１とも呼ぶ）と命名した。
【０１３７】
［作製例５］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）の破壊、さらに、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０１３８】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株（ＬＤＨ破壊株：ＷＯ２００５−０２１７７０）を用いた。該菌株の形質転換は作製例１のＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株の作製と同様の方法で行い、作製した菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＬＤＨ（以下、ＭＢＤ０２とも呼ぶ）と命名した。
【０１３９】
［作製例６］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ遺伝子）、およびアセテートキナーゼ遺伝子（ａｃｋ遺伝子）の破壊、さらに、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子（ａｌｓＤ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｄｈＡ遺伝子）の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０１４０】
＜ＡＬＳ、ＡＬＤＣ、ＢＤＨ増強株の作製＞
ＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株作製の供試菌株は、作製例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ株を用いた。該菌株の形質転換は実施例１のＡｌｓＳＤ、ＢｄｈＡ増強株の作製と同様の方法で行い、作製した菌株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（以下、ＭＢＤ０３とも呼ぶ）と命名した。
【０１４１】
［実施例１］
＜ＭＢＤ０４株の増殖評価＞
作製例１にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０４）株の増殖評価を行うため、以下の通り種培養を行って菌体を調製し、その後、本培養としてフラスコ培養を実施した。
【０１４２】
（Ａ）種培養
種培養を行うため、ＣＧＸＩＩ培地（硫酸アンモニウム ２０ｇ／Ｌ、尿素 ５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ  ４２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物  ０．２５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン・５水和物  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・７水和物  １ｍｇ／Ｌ、硫酸銅  ０．２ｍｇ／Ｌ、塩化ニッケル・６水和物  ０．０２ｍｇ／Ｌ、ビオチン  ０．２ｍｇ／Ｌ、グルコース  ４０ｇ／Ｌ、プロトカテク酸  ３０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）２ｍＬを１５ｍＬ容の試験用培養チューブに入れ、無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン水溶液および２５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン水溶液を２μＬずつ添加し、ＭＢＤ０４株を接種して一昼夜、３２℃にて振とう培養した。
【０１４３】
（Ｂ）本培養
本培養を行うため、ＣＧＸＩＩ培地（上記と同様にカナマイシン及びストレプトマイシンを含む）５０ｍｌを２００ｍｌのノーマルフラスコに入れ、ＯＤ660の吸光度が０．１となるように得られた種培養液を添加、３０℃にて振とう培養した。培養開始２４時間後に８０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を２．５ｍｌ添加した。また、培養開始後４８時間及び６９時間の段階で、サンプリングを行い、ＯＤ660の吸光度を測定した。
その結果、培養開始４８時間後のＯＤ660の値は１３．１、培養開始６９時間後のＯＤ660の値は１４．７であった。
【０１４４】
［実施例２］
＜ＭＢＤ０５株の増殖評価＞
作製例２にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０５）株を使用したこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、培養開始４８時間後のＯＤ660の値は１３．９、培養開始６９時間後のＯＤ660の値は１４．２であった。
【０１４５】
［実施例３］
＜ＭＢＤ０６株の増殖評価＞
作製例３にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＣ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０６）株を使用したこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、培養開始４８時間後のＯＤ660の値は１４．７、培養開始６９時間後のＯＤ660の値は１６．４であった。
【０１４６】
［比較例１］
＜ＭＢＤ０１株の増殖評価＞
作製例４にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ（ＭＢＤ０１）株を使用したこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、培養開始４８時間後のＯＤ660の値は１７．１、培養開始６９時間後のＯＤ660の値は１６．１であった。
【０１４７】
［比較例２］
＜ＭＢＤ０２株の増殖評価＞
作製例５にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０２）株を使用したこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、培養開始４８時間後のＯＤ660の値は９．３４、培養開始６９時間後のＯＤ660の値は９．５０であった。
【０１４８】
［比較例３］
＜ＭＢＤ０３株の増殖評価＞
作製例６にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０３）株を使用したこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、培養開始４８時間後のＯＤ660の値は１０．６、培養開始６９時間後のＯＤ660の値は１１．０であった。
【０１４９】
実施例１〜３、比較例１〜３の結果として、培養開始４８時間後および６９時間後のＯＤ660の値を表１にまとめた。
【０１５０】
【表１】
2015228804.tif 000002
【０１５１】
表１より、２，３−ブタンジオール生産菌株であるＭＢＤ０１株に対してｌｄｈ遺伝子を破壊したＭＢＤ０２株は、ＭＢＤ０１株に比べて増殖速度が大きく低下し、培養６９時間後の到達ＯＤ660で比較して５９％程度となることがわかった。また、ＭＢＤ０２株に対してさらにｐｔａ−ａｃｋ遺伝子を破壊したＭＢＤ０３株は、ＭＢＤ０２株よりもやや増殖速度が回復するものの、培養６９時間後の到達ＯＤ660で比較して約１６％向上するにとどまった。
一方、ＭＢＤ０３株に対してさらにｃｔｆ遺伝子を破壊したＭＢＤ０４株は、ＭＢＤ０２株に比べて増殖速度が大幅に回復し、培養６９時間後の到達ＯＤ660で比較して約５５％向上した。ＭＢＤ０４株に対してさらにｐｏｘＢ遺伝子を破壊したＭＢＤ０５株は、ＭＢＤ０４株と同等の増殖速度であった。ＭＢＤ０５株に対してさらにｐｃ遺伝子を破壊したＭＢＤ０６株は、ＭＢＤ０４株よりもさらに増殖速度が回復し、培養６９時間後の到達ＯＤ660で比較してＭＢＤ０２株に対して約７３％向上、ＭＢＤ０１株と同等にまで回復した。
以上より、２，３−ブタンジオール生産菌株において、ｌｄｈ遺伝子を破壊すると増殖が悪化するものの、ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子およびｃｔｆ遺伝子を破壊することで大幅に増殖速度が回復、さらにｐｃ遺伝子を破壊すると元の菌株と同等にまで回復するということが明らかになった。これらの遺伝子改変は副生物の低減だけでなく、２，３−ブタンジオール生産菌株の増殖能を維持する上でも重要となる。
【０１５２】
［実施例４］
＜ＭＢＤ０５株の２，３−ブタンジオール生産評価＞
作製例２にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０５）株の２，３−ブタンジオール生産評価を行うため、以下の通り種培養を行って菌体を調製し、その後、本培養と同時に２，３−ブタンジオール生産反応を実施した。
【０１５３】
（Ｇ）種培養
種培養を行うため、ＣＧＸＩＩ培地（硫酸アンモニウム ２０ｇ／Ｌ、尿素 ５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ  ４２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物  ０．２５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄・７水和物  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン・５水和物  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・７水和物  １ｍｇ／Ｌ、硫酸銅  ０．２ｍｇ／Ｌ、塩化ニッケル・６水和物  ０．０２ｍｇ／Ｌ、ビオチン  ０．２ｍｇ／Ｌ、グルコース  ４０ｇ／Ｌ、プロトカテク酸  ３０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）２ｍＬを１５ｍＬ容の試験用培養チューブに入れ、無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン水溶液および２５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン水溶液を２μＬずつ添加し、ＭＢＤ０５株を接種して一昼夜、３２℃にて振とう培養した。
【０１５４】
（Ｈ）２，３−ブタンジオール生産反応
本培養と同時に２，３−ブタンジオール生産反応を行うため、ＣＧＸＩＩ培地（上記と同様にカナマイシン及びストレプトマイシンを含む）５０ｍｌを２００ｍｌのノーマルフラスコに入れ、ＯＤ660の吸光度が０．２となるように上記（Ｇ）で得られた種培養液を添加、３０℃にて振とう培養した。培養開始２４時間後、および４２時間後に８０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を２．５ｍｌ添加した。また、培養開始４０時間後及び６４時間後の段階で、サンプリングを行い、遠心分離後に培養上清を回収、蒸留水で１０倍に希釈して液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーによる分析を行った。
それぞれの分析条件は以下の通りである。乳酸、酢酸、コハク酸は液体クロマトグラフィー分析により定量し、アセトイン、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールはガスクロマトグラフィー分析により定量した。
【０１５５】
（液体クロマトグラフィー分析条件）
ポンプ：日立ハイテクノロジーズ社製  Ｌ−２１３０
カラムオーブン：日立ハイテクノロジーズ社製  Ｌ−２３５０
ＵＶ検出器：日立ハイテクノロジーズ社製  Ｌ−２４００
ＲＩ検出器：日立ハイテクノロジーズ社製  Ｌ−２４９０
カラム：信和化工社製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ＩＤ×３００ｍｍＬ
温度：６０℃
溶離液：０．１１質量％過塩素酸溶液  １．０ｍＬ／分
検出方法：ＵＶ（２１０ｎｍ），ＲＩ
注入量：１０μＬ
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
装置：島津製作所製  ＧＣ１７Ａ
カラム：ＤＢ−１７（０．２５ｍｍφ×３０ｍ  膜厚０．２５μｍ）
ｃａｒｒｉｅｒ：Ｈｅ  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
スプリット比：１／５０
注入口温度：２６０℃
検出器温度：２８０℃
カラム温度：５０℃→２８０℃  １０℃／ｍｉｎ
検出器：ＦＩＤ
注入量：１μＬ
【０１５６】
その結果、反応開始４０時間後の乳酸は０．４１ｇ／Ｌ、酢酸は１．２１ｇ／Ｌ、コハク酸は４．６７ｇ／Ｌ、アセトインは２．１０ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは１．６９ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは９．０８ｇ／Ｌ、反応開始６４時間後の乳酸は０．７５ｇ／Ｌ、酢酸は１．２７ｇ／Ｌ、コハク酸は１．５５ｇ／Ｌ、アセトインは３．８７ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは３．３３ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは１２．４ｇ／Ｌであった。
【０１５７】
［実施例５］
＜ＭＢＤ０６株の２，３−ブタンジオール生産評価＞
作製例３にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＰＣ／ΔＰｏｘＢ／ΔＣＴＦ／ΔＰＴＡ−ＡＣＫ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０６）株を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、反応開始４０時間後の乳酸は０．２２ｇ／Ｌ、酢酸は１．１６ｇ／Ｌ、コハク酸は４．２９ｇ／Ｌ、アセトインは１．１１ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは１．４９ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは１１．０ｇ／Ｌ、反応開始６４時間後の乳酸は０．５８ｇ／Ｌ、酢酸は１．２４ｇ／Ｌ、コハク酸は１．２４ｇ／Ｌ、アセトインは２．８２ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは２．７９ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは１３．４ｇ／Ｌであった。
【０１５８】
［比較例４］
＜ＭＢＤ０１株の２，３−ブタンジオール生産評価＞
作製例４にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ（ＭＢＤ０１）株を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、反応開始４０時間後の乳酸は１１．４ｇ／Ｌ、酢酸は１．０２ｇ／Ｌ、コハク酸は１．３２ｇ／Ｌ、アセトインは２．８２ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは１．０２ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは９．８７ｇ／Ｌ、反応開始６４時間後の乳酸は１１．６ｇ／Ｌ、酢酸は１．０３ｇ／Ｌ、コハク酸は０．０４ｇ／Ｌ、アセトインは４．１６ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは１．１１ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは１０．２ｇ／Ｌであった。
【０１５９】
［比較例５］
＜ＭＢＤ０２株の２，３−ブタンジオール生産評価＞
作製例５にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＢｄｈＡ／ＡｌｓＳＤ／ΔＬＤＨ（ＭＢＤ０２）株を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。その結果、反応開始４０時間後の乳酸は０．１２ｇ／Ｌ、酢酸は５．１８ｇ／Ｌ、コハク酸は１．９０ｇ／Ｌ、アセトインは０．６０ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは０．５３ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは４．３２ｇ／Ｌ、反応開始６４時間後の乳酸は０．３６ｇ／Ｌ、酢酸は５．２２ｇ／Ｌ、コハク酸は０．１５ｇ／Ｌ、アセトインは１．１５ｇ／Ｌ、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオールは０．９５ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオールは４．８６ｇ／Ｌであった。
【０１６０】
実施例４、５、比較例４、および５の結果として、培養開始４０時間後および６４時間後の乳酸、酢酸、コハク酸、アセトイン、（Ｍｅｓｏ）−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）または（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール合計値を表２にまとめた。
【０１６１】
【表２】
2015228804.tif 000003
【０１６２】
表２より、２，３−ブタンジオール生産菌株であるＭＢＤ０１株に対してｌｄｈ遺伝子を破壊したＭＢＤ０２株は、ＭＢＤ０１株と比べて乳酸の副生が大幅に低減するものの、２，３−ブタンジオール（（Ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）の生産性も低下し、反応６４時間後の蓄積濃度で比較して５１％程度となってしまうことがわかった。これは、ｌｄｈ遺伝子を破壊したことによって、増殖速度が低下し、菌体量が不足していることが影響していると考えられる。また、ＭＢＤ０２株は、ＭＢＤ０１株と比較して酢酸、コハク酸の副生が増加した。
一方、ＭＢＤ０２株に対してさらにｐｔａ−ａｃｋ遺伝子、ｃｔｆ遺伝子、およびｐｏｘＢ遺伝子を破壊したＭＢＤ０５株は、ＭＢＤ０２株と比べて酢酸の副生が大幅に低減し、反応６４時間後の蓄積濃度で比較して約７６％の低減化を達成した。また、２，３−ブタンジオール（（Ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）の生産性も大きく向上し、反応６４時間後の蓄積濃度で比較してＭＢＤ０１株に対して約３９％向上した。ただし、ＭＢＤ０２株よりもさらにコハク酸の副生が増加した。
ＭＢＤ０５株に対してさらにｐｃ遺伝子を破壊したＭＢＤ０６株は、ＭＢＤ０５株と比べてコハク酸の副生が低減し、反応６４時間後の蓄積濃度で比較して約２０％の低減化を達成した。また、２，３−ブタンジオール（（Ｍｅｓｏ）、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）の合計）の生産性もさらに向上し、反応６４時間後の蓄積濃度で比較してＭＢＤ０１株に対して約４３％向上した。
以上より、２，３−ブタンジオール生産菌株において、ｌｄｈ遺伝子、ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子、ｃｔｆ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｐｃ遺伝子を破壊することによって、乳酸、酢酸、およびコハク酸の副生を低減することができ、２，３−ブタンジオールの生産性を向上できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明によれば、発酵の進行とともに微生物の増殖速度の著しい低下を伴うことなく、副生物の生成を低減して２，３−ブタンジオールの生産性が向上した微生物を提供することができる。
このような本発明の微生物を用いることにより、２，３−ブタンジオールを効率よくかつ安全に製造することができる。したがって、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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