(57)【要約】【課題】  従来の一分子型（分子内型）センサーと比較して、被検物質結合部の配列の長さや被検物質が被検物質結合部に結合して生じる構造変化の影響を受けることなく、かつ極めて感度を向上させた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーを提供する。【解決手段】  蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ蛍光物質および蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する。【選択図】  図１３
2015232558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ前記蛍光物質および前記蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する前記ＦＲＥＴ分子センサー。
【請求項２】
蛍光物質が蛍光タンパク質またはタンパク質蛍光標識物質である、請求項１に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【請求項３】
被検物質結合部がイノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）受容体のリガンド結合部であり、蛍光競合物質が９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（Ｆ−ＡＤＡ）または（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｆ−ＬＬ）である、請求項１または請求項２に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【請求項４】
被検物質結合部が抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分であって、蛍光競合物質が前記抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質である、請求項１または請求項２に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【請求項５】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有して担体に固定化された蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ前記蛍光物質および前記蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する担体固定化被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサー。
【請求項６】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーまたは請求項５の担体固定化被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーと対象とを接触させる工程と、
励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程と
を有する、蛍光の強度を指標として対象中の被検物質を測定する方法。
【請求項７】
９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（Ｆ−ＡＤＡ）または（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｆ−ＬＬ）の、請求項１または請求項２に記載のＦＲＥＴ分子センサーにおける蛍光競合物質としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサー、すなわち、被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーに関し、特に、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ蛍光物質および蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬分野、医療分野、あるいは食品分野などのポストゲノム関連技術分野において、被検物質を定量するためのタンパク質分子センサーの開発が盛んに行われている。そのようなタンパク質分子センサーとして、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用した分子センサーも多数開発されている。ＦＲＥＴとは、蛍光エネルギー供与体であるドナーチャネル（ドナー分子あるいはドナー蛍光分子）および蛍光エネルギー受容体であるアクセプターチャネル（アクセプター分子あるいはアクセプター蛍光分子）という２つの蛍光物質が近接した位置に存在する場合において、ドナーチャネルを光励起することによりそのエネルギーがアクセプターチャネルへ無輻射的に移動し、アクセプターチャネルが発光する非放射的なエネルギー移動現象をいう。
【０００３】
ＦＲＥＴを利用した分子センサーとして、従来、ドナーチャネルおよびアクセプターチャネルが立体的に分離されている二分子型（分子間型）の分子センサーとドナーチャネルおよびアクセプターチャネルが立体的に一体化されている一分子型（分子内型）の分子センサーに大別される（特許文献１）。二分子型（分子間型）センサーは主に分子間相互作用を検出するものであり、一分子型（分子内型）センサーは主に分子の構造変化（ＦＲＥＴに影響を及ぼすような構造変化）を検出するものである。一分子型（分子内型）センサーの場合、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの量が原則として同じになることから、アクセプター蛍光タンパク質検出チャネルへの漏れ込みやアクセプター蛍光タンパク質のＦＲＥＴによらない直接励起などの二分子型（分子間型）センサーにおける問題点が改善され、ＦＲＥＴの効率の増減は、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの蛍光量比をとるだけで十分評価することができるものであることから、現在のＦＲＥＴを利用した分子センサーの多くは一分子型（分子内型）センサーとなっている。
【０００４】
従来のＦＲＥＴを利用した分子センサーとしては、例えば、ドナーチャネル、複数のアクセプターチャネル、およびドナーチャネルとアクセプターチャネルとの間に連結され構造変化領域とを有する分子センサー（特許文献２）や、ドナーチャネルが結合している化合物、アクセプターチャネルが結合している化合物、ならびにドナーチャネルおよびアクセプターチャネルのいずれも結合していない化合物を共重合させた分子センサー（特許文献３）、ドナー蛍光タンパク質と、アクセプター蛍光分子と、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光分子との間に接続され、特異的生体分子認識領域とを含む分子センサー（特許文献４）を挙げることができる。また、本発明者らは、以前、ＦＲＥＴを利用した一分子型（分子内型）センサーである細胞内イノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）測定用分子センサーについて特許出願を行い、特許取得している（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４３４７７号パンフレット
【特許文献２】特開２０１０−２３３４９１号公報
【特許文献３】特開２０１１−２０１９４３号公報
【特許文献４】特開２０１４−０５５７７７号公報
【特許文献５】特許第４８０３９７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の二分子型（分子間型）センサーはもちろんのこと、一分子型（分子内型）センサーであっても、ドナーチャネルとアクセプターチャネルとの間に存在する被検物質結合部が長鎖の配列を有する場合や、被検物質が被検物質結合部に結合して生じる構造変化の程度や態様などによっては、アクセプター蛍光タンパク質検出チャネルへ漏れ込み、アクセプター蛍光タンパク質のＦＲＥＴによらない直接励起、あるいはＦＲＥＴに影響を及ぼさないような構造変化の感知不能などの問題が発生してしまい、結果としてセンサーの役割を果たし得ないものも存在していた。
【０００７】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、従来の一分子型（分子内型）センサーと比較して、被検物質結合部の配列の長さや被検物質が被検物質結合部に結合して生じる構造変化の影響を受けることなく、かつ極めて感度を向上させた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質、詳述すれば、ドナーチャネルまたはアクセプターチャネルのいずれか一方である蛍光物質および被検物質結合部を有し、かつ前記蛍光物質がドナーチャネルの場合はアクセプターチャネルを有さず前記蛍光物質がアクセプターチャネルの場合はドナーチャネルを有さない蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質であって蛍光被検物質センサーがドナーチャネルを有する場合はアクセプターチャネルであり、蛍光被検物質センサーがアクセプターチャネルを有する場合はドナーチャネルである前記蛍光競合物質とを備えたＦＲＥＴ分子センサーとすることで、センサーの態様は二分子型（分子間型）に包含され得るものの、蛍光競合物質が被検物質結合部に結合した際、被検物質結合部の配列の長さや被検物質が被検物質結合部に結合して生じる構造変化の影響を受けることなくドナーチャネルとアクセプターチャネルとが近接でき、その結果、従来の一分子型（分子内型）センサーと比較して、センサーとしての感度が極めて向上することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００９】
（１）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ前記蛍光物質および前記蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する前記ＦＲＥＴ分子センサー。
【００１０】
（２）蛍光被検物質センサーが、前記蛍光物質がドナーチャネルの場合はアクセプターチャネルを有さず前記蛍光物質がアクセプターチャネルの場合はドナーチャネルを有さない前記蛍光被検物質センサーであり、ならびに蛍光競合物質が、蛍光被検物質センサーがドナーチャネルを有する場合はアクセプターチャネルであり蛍光被検物質センサーがアクセプターチャネルを有する場合はドナーチャネルである前記蛍光競合物質である、（１）に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【００１１】
（３）蛍光被検物質センサーが、ドナーチャネルである蛍光物質および被検物質結合部を有する前記蛍光被検物質センサーであり、ならびに蛍光競合物質がアクセプターチャネルである前記蛍光競合物質である、（１）または（２）に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【００１２】
（４）蛍光物質が蛍光タンパク質またはタンパク質蛍光標識物質である、（１）から（３）のいずれか一項に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【００１３】
（５）被検物質結合部がイノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）受容体のリガンド結合部であり、蛍光競合物質が９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（Ｆ−ＡＤＡ）または（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｆ−ＬＬ）である、（１）から（４）のいずれか一項に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【００１４】
（６）被検物質結合部が抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分であって、蛍光競合物質が前記抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質である、（１）から（４）のいずれか一項に記載のＦＲＥＴ分子センサー。
【００１５】
（７）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して被検物質を測定するＦＲＥＴ分子センサーであって、蛍光物質および被検物質結合部を有して担体に固定化された蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ前記蛍光物質および前記蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する担体固定化被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサー。
【００１６】
（８）（１）から（６）のいずれか一項に記載の被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーまたは（７）の担体固定化被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーと対象とを接触させる工程と、励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程とを有する、蛍光の強度を指標として対象中の被検物質を測定する方法。
【００１７】
（９）９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（Ｆ−ＡＤＡ）または（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｆ−ＬＬ）の、（１）または（２）に記載のＦＲＥＴ分子センサーにおける蛍光競合物質としての使用。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーによれば、被検物質結合部の配列の長さや被検物質が被検物質結合部に結合して生じる構造変化の影響を受けることなく、被検物質を精度高く定量することができ、従って微量の被検物質についても定量することができ、従来のＦＲＥＴを利用した分子センサーを用いた定量法と比較して極めて感度を向上させた定量法を確立させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】化合物１を出発物質とした化合物２〜７の作成フローを示す図である。
【図２】ＦＩＴＣからの化合物１２の作成フローを示す図である。
【図３】化合物７と化合物１２とからのＦ−ＡＤＡ（化合物１３）の作成フローおよび化合物１１と化合物１２とからのＦ−ＬＬ（化合物１４）の作成フローを示す図である。
【図４】化合物２を出発物質とした化合物８〜１１の作成フローを示す図である。
【図５】細胞内ストア内のＣａ２＋濃度変化を解析することによりＩＰ３、Ｆ−ＡＤＡおよびＦ−ＬＬのＩＰ３受容体を介するＣａ２＋放出の効力を算定した図である。図中、縦軸は算定したＣａ２＋放出の効力を示し、横軸はＩＰ３、Ｆ−ＡＤＡまたはＦ−ＬＬの濃度を示す。
【図６】蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）の構成を示す図である。図中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｌ１」および「Ｌ２」はいずれもリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを示す。
【図７】蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡと蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳの特異性を解析した図である。図中、ＡａおよびＡｂの画像は３０ｎＭのＦ−ＡＤＡを作用させる前の時点（Ｂの矢印１の時点）の蛍光像を示す図であり、ＡｃとＡｄの画像は３０ｎＭのＦ−ＡＤＡを作用させた後の時点（Ｂの矢印３の時点）の蛍光像を示す図であり、Ｂは蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡの添加による蛍光変化を示す図であり、Ｃは細胞を含む領域の蛍光からＢＧ領域の蛍光を引いた場合の蛍光変化を示す図である。ＢおよびＣの縦軸は蛍光強度を示し、横軸は経過時間を示す。また、Ｄは蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍを示す図であり、Ｄの縦軸は蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値を示し、横軸は経過時間を示す。
【図８】蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＮ（ＬｖＮ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）およびＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）の構成を示す図である。図中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＭＰ」は小胞体局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｃｅｒｕｌｅａｎ」は青色蛍光タンパク質Ｃｅｒｕｌｅａｎを示し、「Ｌ１」、「Ｌ１Ｈ１」、「Ｌ２」および「Ｌ２−６」はいずれもリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ１（１−６０４）」はラット１型ＩＰ３受容体アミノ酸配列のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）」はラット２型ＩＰ３受容体アミノ酸配列のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示し、「ＩＰ３Ｒ３（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｋ５０７Ａ」はラット３型ＩＰ３受容体アミノ酸配列のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の５０７番のリシン（Ｋ）をアラニン（Ａ）へ変異させたペプチドを示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを示す。
【図９】ＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）遺伝子の作成手順を示す図である。図中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合配列を示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰの配列を示し、「ＬＢＤ」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを示し、「Ｖｅｎｕｓ（ｍ）」は無発色タンパク質Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔを示す。
【図１０】蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）の構成を示す図である。図中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｌ１」および「Ｌ２」はリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示し、「Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔ」は無発色タンパク質Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔを示す。
【図１１】Ｆ−ＡＤＡを作用させた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＮ（ＬｖＮ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）およびＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）の、４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比を示す図である。図中、縦軸は蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値を示し、横軸は経過時間を示す。また、図中の「１０」および「３０」の値ならびに横棒は、それぞれ、作用させたＦ−ＡＤＡの濃度（ｎＭ）、およびＦ−ＡＤＡが作用した時間帯を示す。
【図１２】ＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子の作成手順を示す図である。図中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合配列を示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰの配列を示し、「ＬＢＤ」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを示す。
【図１３】蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）の構成を示す図である。図中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｌ１」はリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示す。
【図１４】Ｆ−ＡＤＡを作用させた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）の蛍光強度（上段）ならびに４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比（下段）を示す図である。図中、縦軸は蛍光強度（上段）または蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値（下段）を示し、横軸は経過時間（上段および下段）を示す。また、図Ａ中の「３０」および「１００」の値、ならびに横棒は、作用させたＦ−ＡＤＡの濃度（ｎＭ）およびＦ−ＡＤＡが作用した時間帯を示す。
【図１５】Ｆ−ＬＬを作用させた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）の蛍光強度（上段）ならびに４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比（下段）を示す図である。図中、縦軸は蛍光強度（上段）または蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値（下段）を示し、横軸は経過時間（上段および下段）を示す。また、図Ａ中の「３０」および「１００」の値、ならびに横棒は、作用させたＦ−ＬＬの濃度（ｎＭ）およびＦ−ＬＬが作用した時間帯を示す。
【図１６】Ｆ−ＡＤＡを作用させた後にＩＰ３を作用させた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）の蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍを示す図である。図中、縦軸は蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値を示し、横軸は経過時間を示す。また、図中の「３０」および「１００」の値、ならびに横棒は、作用させたＦ−ＡＤＡの濃度（ｎＭ）およびＦ−ＡＤＡが作用した時間帯を示し、「１０」の値、ならびに横棒は、作用させたＩＰ３の濃度（μＭ）およびＩＰ３が作用した時間帯を示す。
【図１７】Ｆ−ＬＬを作用させた後にＩＰ３を加えた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）の蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍを示す図である。図中、縦軸は蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値を示し、横軸は経過時間を示す。また、図中の「１００」の値、ならびに横棒は、作用させたＦ−ＬＬの濃度（ｎＭ）およびＦ−ＬＬが作用した時間帯を示し、「０．１」、「１」および「１０」の値、ならびに横棒は、作用させたＩＰ３の濃度（μＭ）およびＩＰ３が作用した時間帯を示す。
【図１８】ｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子の作成手順を示す図である。図中、「ＥＲＴ」は小胞体結合配列を示し、「ＨｉｓＴａｇ」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなる精製用のタグペプチドを示し、「Ｃｅｒｕｌｅａｎ」は青色蛍光タンパク質Ｃｅｒｕｌｅａｎを示し、「ＬＢＤ」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰの配列を示す。
【図１９】蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）の構成を示す図である。図中、「６Ｈ」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなる精製用のタグペプチドを示し、「Ｃｅｒｕｌｅａｎ」は青色蛍光タンパク質Ｃｅｒｕｌｅａｎを示し、「Ｌ１Ｈ１」はリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示す。
【図２０】蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）結合ビーズの蛍光像を示す図（Ａ）、および蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）結合ビーズにそれぞれ１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭまたは３００ｎＭのＦ−ＬＬ、Ｆ−ＡＤＡまたはＦＩＴＣを作用させた場合のそれぞれの蛍光変化率を示す図（Ｂ、ＣおよびＤ）である。図Ｂ、ＣおよびＤ中、縦軸は蛍光変化率を示し、横軸は濃度（ｎＭ）を示す。
【図２１】Ｆ−ＬＬを作用させた後にＩＰ３を作用させた場合の、担体固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）の蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍ（Ａ）および蛍光変化率（Ｂ）を示す図である。図中、縦軸は蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値を示し、横軸は経過時間を示す。また、図中の「１００」の値、ならびに横棒は、作用させたＦ−ＬＬの濃度（ｎＭ）およびＦ−ＬＬが作用した時間帯を示し、「０．１」、「１」および「１０」の値、ならびに横棒は、作用させたＩＰ３の濃度（μＭ）およびＩＰ３が作用した時間帯を示す。
【図２２】ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ遺伝子、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ遺伝子、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ遺伝子の作成手順を示す図である。図中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合遺伝子配列を示し、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧタグの遺伝子配列を示し、「ＬＴ」および「ＬＴ」はＬｕｍｉｏＴａｇの遺伝子配列を示し、「Ｅ１」はＳｃａＩ切断サイトを示し、「Ｅ２」はＥｃｏ４７ＩＩＩ切断サイトを示し、「１−８２−Ｅ１−ＬＴ−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−ＬＴ−Ｅ２−１４１−６０４」、「１−８２−Ｅ１−ＬＴ−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」、「１−８２−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−ＬＴ−Ｅ２−１４１−６０４」および「１−８２−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質の遺伝子配列を示し、「Ｈｘ６」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示す。
【図２３】Ｆ−ＡＤＡを作用させた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓの蛍光強度（上段）ならびに４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比（下段）を示す図である。図中、縦軸は蛍光強度（上段）または蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値（下段）を示し、横軸は経過時間（上段および下段）を示す。また、上段図中の白抜きの横棒はＤＡＣＭが作用した時間帯を示し、黒に塗りつぶした横棒はＦ−ＡＤＡが作用した時間帯を示す。
【図２４】ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７遺伝子、ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３遺伝子およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９遺伝子の作成手順を示す図である。図中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合遺伝子配列を示し、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧタグの遺伝子配列を示し、「Ｅ１」はＳｃａＩ切断サイトを示し、「Ｅ２」はＥｃｏ４７ＩＩＩ切断サイトを示し、「１−８２−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質の遺伝子配列を示し、「Ｈｘ６」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示し、「ｃｐＳＥＣＦＰ１５７」、「ｃｐＳＥＣＦＰ１７３」および「ｃｐＳＥＣＦＰ２２９」はそれぞれＥＣＦＰの円順列置換体である蛍光タンパク質ｃｐＳＥＣＦＰ１５７、ｃｐＳＥＣＦＰ１７３、およびｃｐＳＥＣＦＰ２２９の遺伝子配列を示し、「１−８２−ｃｐＳＥＣＦＰ１５７−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」、「１−８２−ｃｐＳＥＣＦＰ１７３−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」、および「１−８２−ｃｐＳＥＣＦＰ２２９−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」はそれぞれＥＣＦＰの円順列置換体である蛍光タンパク質ｃｐＳＥＣＦＰ１５７、ｃｐＳＥＣＦＰ１７３、およびｃｐＳＥＣＦＰ２２９をＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質へ挿入した遺伝子配列を示す。
【図２５】Ｆ−ＡＤＡを作用させた場合の、蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７、ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９の蛍光強度（上段）ならびに４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比（下段）を示す図である。図中、縦軸は蛍光強度（上段）または蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値（下段）を示し、横軸は経過時間（上段および下段）を示す。また、上段図中の黒に塗りつぶした横棒はＦ−ＡＤＡが作用した時間帯を示す。
【図２６】蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８および被検物質ＣＴ２−１８を作用させた場合の、リン酸緩衝液で洗浄したアガロースビーズ結合蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーの４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比（Ａ）および洗浄しないアガロースビーズ結合蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーの４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比（Ｂ）を示す図である。図中、縦軸は蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍの値を示し、横軸は蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８および被検物質ＣＴ２−１８の濃度を示す。
【図２７】ＤＡＣＭでラベルされた抗ｃ−Ｍｙｃ抗体固相化Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧビーズとＦＩＴＣでラベルされたｃ−Ｍｙｃペプチドとを備えたＦＲＥＴ分子センサーの４２５ｎｍの励起による４８０ｎｍと５３５ｎｍの蛍光比と、これにラベルされていないｃ−Ｍｙｃを共存させたときの蛍光比の変化を示す。
【図２８】ＤＡＣＭでラベルされた抗ＤＹＫ抗体固相化Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧビーズとＦＩＴＣでラベルされたＤＹＫペプチドとを備えたＦＲＥＴ分子センサーの４２５ｎｍの励起による４８０ｎｍと５３５ｎｍの蛍光比と、これにラベルされていないＤＹＫペプチドを共存させたときの蛍光比の変化を示す。
【図２９】ＤＡＣＭでラベルされた抗ＩＰ３受容体抗体固相化Ｎｉ−ＮＴＡ錯体化Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧビーズとＦＩＴＣでラベルされたＨｉｓタグ付ペプチド（ＤＹＫペプチド）とを備えたＦＲＥＴ分子センサーの４２５ｎｍの励起による４８０ｎｍと５３５ｎｍの蛍光比と、これにラベルされていないＤＹＫペプチドを共存させたときの蛍光比の変化を示す。
【図３０】ＤＡＣＭでラベルされたＰｒｏｔｅｉｎ  ＧビーズとＦＩＴＣでラベルされた抗体とを備えたＦＲＥＴ分子センサーの４２５ｎｍの励起による４８０ｎｍと５３５ｎｍの蛍光比と、これにラベルされていない抗体を共存させたときの蛍光比の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーについて詳細に説明する。本発明に係る被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーは、蛍光物質および被検物質結合部を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して前記被検物質結合部と結合ないし解離する蛍光競合物質を備え、かつ蛍光物質および蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用する分子センサーである。
【００２１】
本発明に係る被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーは、蛍光被検物質センサーおよび蛍光競合物質という二分子型（分子間型）の分子センサーであって、かつ、蛍光被検物質センサーに含まれる蛍光物質および蛍光競合物質のいずれか一方がドナーチャネル（ドナー分子）であり、他方がアクセプターチャネル（アクセプター分子）であってもよい。すなわちその場合、蛍光物質がドナーチャネルの場合、蛍光被検物質センサーはアクセプターチャネルを有さず、かつ蛍光競合物質はアクセプターチャネルであり、蛍光物質がアクセプターチャネルの場合、蛍光被検物質センサーはドナーチャネルを有さず、かつ蛍光競合物質はドナーチャネルである。なお、本実施例においては、蛍光物質がドナーチャネルであって、蛍光被検物質センサーはアクセプターチャネルを有さず、かつ蛍光競合物質はアクセプターチャネルである事例を示しているが、本発明はこれに限定されない。
【００２２】
本発明における蛍光被検物質センサーが有する「蛍光物質」は、ＦＲＥＴにおけるドナーチャネル（ドナー分子）またはアクセプターチャネル（アクセプター分子）となり得る蛍光物質であれば特に限定されず、そのような蛍光物質としては、例えば、蛍光タンパク質やタンパク質蛍光標識物質を挙げることができる。そのような蛍光タンパク質としては、例えば、ＣＦＰ、ＹＥＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質を挙げることができ、これら蛍光タンパク質の変異体などを利用してもよい。そのような変異体としては、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰおよびこれらの円順列置換体（円順列変異体）などを挙げることができる。
【００２３】
また、「タンパク質蛍光標識物質」としては低分子蛍光物質を挙げることができ、例えば、ドナーチャネル（ドナー分子）としての低分子蛍光物質である１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、ＩＡＡＮＳ、ＭＩＡＮＳなどのナフタレン誘導体；ピレンマレイミド、ピレンヨードアセタミドなどのピレン誘導体；ＣＰＭ、ＤＣＩＡ、ＤＡＣＩＡ、ＤＡＣＭ、ＭＤＣＣ、ＩＤＣＣなどのクマリン誘導体；フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインマレイミド、５−ヨードアセタミドフルオレセイン、５−ブロモメチルフルオレセイン、オレゴングリーン４８８マレイミド、オレゴングリーン４８８ヨードアセタミドなどのフロレセイン誘導体；アレクサ４８８マレイミド、アレクサ５３２マレイミド、アレクサ５４６マレイミド、アレクサ５６８マレイミド、アレクサ５９４マレイミド、アレクサ５５５マレイミドなどのアレクサ誘導体；ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３ブロモメチル、ＢＯＤＩＰＹ４９９／５０８マレイミド、ＢＯＤＩＰＹ５０７／５４５ヨードアセタミド、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ヨードアセタミドなどのＢＯＤＩＰＹ誘導体；テトラメチルローダミンマレイミド、テトラメチルローダミンヨードアセタミド、ローダミンレッドマレイミドなどのローダミン誘導体；テキサスレッドマレイミド、テキサスレッドヨードアセタミドなどのテキサスレッド誘導体；などを挙げることができ、アクセプターチャネル（アクセプター分子）としての低分子蛍光物質であるフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインマレイミド、５−ヨードアセタミドフルオレセイン、５−ブロモメチルフルオレセイン、オレゴングリーン４８８マレイミド、オレゴングリーン４８８ヨードアセタミドなどのフロレセイン誘導体；アレクサ４８８マレイミド、アレクサ５３２マレイミド、アレクサ５４６マレイミド、アレクサ５６８マレイミド、アレクサ５９４マレイミド、アレクサ５５５マレイミド、アレクサ６３３マレイミド、アレクサ６４７マレイミド、アレクサ６６０マレイミド、アレクサ６８０マレイミドなどのアレクサ誘導体；ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３ブロモメチル、ＢＯＤＩＰＹ４９９／５０８マレイミド、ＢＯＤＩＰＹ５０７／５４５ヨードアセタミド、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ヨードアセタミド、ＢＯＤＩＰＹ５７７／６１８マレイミド、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０マレイミドなどのＢＯＤＩＰＹ誘導体；テトラメチルローダミンマレイミド、テトラメチルローダミンヨードアセタミド、ローダミンレッドマレイミドなどのローダミン誘導体；テキサスレッドマレイミド、テキサスレッドヨードアセタミドなどのテキサスレッド誘導体；などを挙げることができる。
【００２４】
本発明における蛍光被検物質センサーが有する「被検物質結合部」とは、被験物質との間で特異的な結合を形成することができる物質又はその一部をいい、例えば、被検物質がイノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）の場合はＩＰ３受容体又はそのリガンド結合部、被検物質がアセチルコリンであればアセチルコリン受容体又はそのリガンド結合部、被検物質が抗原であれば、その抗原に対する抗体又はそのパラトープ含有ポリペプチド部分、ヒスチジンタグ配列に対する金属−ＮＴＡ錯体、イムノグロブリンに対するプロテインＡ、Ｇ及びＬ、アビジンに対するビオシン、酵素反応の基質に対する酵素（例えばグルタチオンに対するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などをそれぞれ挙げることができる。
【００２５】
ＩＰ３受容体のリガンド結合部としては、例えば、ラット、マウス、ウシ、ウサギ、ニワトリ、ヒト、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、ヒトデ、線虫などの広範な生物種のものを用いてもよい。例えば、ラットのＩＰ３受容体アイソタイプ１のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号１）、ラットのＩＰ３受容体アイソタイプ２のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号２）、ラットのＩＰ３受容体アイソタイプ３のアミノ酸配列のうち第２２５〜５７９番目（配列番号３）、マウスのＩＰ３受容体アイソタイプ１のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号４）、マウスのＩＰ３受容体アイソタイプ２のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号５）、マウスのＩＰ３受容体アイソタイプ３のアミノ酸配列のうち第２２５〜５７９番目（配列番号６）、ウシのＩＰ３受容体アイソタイプ１のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号７）、ウシのＩＰ３受容体アイソタイプ２のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号８）、ウシのＩＰ３受容体アイソタイプ３のアミノ酸配列のうち第２２５〜５７９番目（配列番号９）、ウサギのＩＰ３受容体アイソタイプ１のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号１０）、ウサギのＩＰ３受容体アイソタイプ２のアミノ酸配列のうち第２７０〜６２５番目（配列番号１１）、ウサギのＩＰ３受容体アイソタイプ３のアミノ酸配列のうち第３７８〜７３９番目（配列番号１２）、ニワトリのＩＰ３受容体アイソタイプ１のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号１３）、ニワトリのＩＰ３受容体アイソタイプ２のアミノ酸配列のうち第２３６〜５９１番目（配列番号１４）、ニワトリのＩＰ３受容体アイソタイプ３のアミノ酸配列のうち第２２５〜５７９番目（配列番号１５）、ヒトのＩＰ３受容体アイソタイプ１のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号１６）、ヒトのＩＰ３受容体アイソタイプ２のアミノ酸配列のうち第２２４〜５７９番目（配列番号１７）、ヒトのＩＰ３受容体アイソタイプ３のアミノ酸配列のうち第２２５〜５７９番目（配列番号１８）を用いることができる。
【００２６】
また、本発明における「被検物質結合部」には、上述したＩＰ３受容体又はそのリガンド結合部そのものの他、それらのホモログ、人為的改変体または保存的変異を有するタンパク質も包含される。本明細書において、当該ホモログ、人為的改変体、または保存的変異を有するタンパク質を、保存的バリアントという。保存的バリアントとしては、１もしくは数個から数十個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加などを含む配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２７】
「１もしくは数個から数十個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、よりさらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。
【００２８】
保存的置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、およびＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換を挙げることができる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位などには、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
【００２９】
さらに、上記のような保存的変異を有するタンパク質は、アミノ酸配列全体に対して、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。なお、本明細書において、「相同性」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指すことがある。
【００３０】
「抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分」とは、被検物質である抗原（免疫原）のエピトープと結合する抗体の抗原結合部分すなわちパラトープを含むポリペプチド部分をいい、例えば、抗体そのものの他、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）などを挙げることができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分はそれぞれ、当技術分野で公知の方法によって実質的に完全形の抗体分子をパパインおよびペプシンでタンパク質分解反応させることによって作製できる。Ｆａｂ’抗体分子部分も当技術分野で公知であり、２つのＨ鎖部分を連結しているジスルフィド結合をメルカプトエタノールで還元し、次いで得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化することによってＦ（ａｂ’）２部分から作製される。また、抗原に対し免疫原性の存否は問われず、抗原にはハプテンが含まれる。さらに、抗体が、ある特定の抗原に対し「結合する」とは、当該特定抗原に対して結合性があることが明らかであればよい。当該特定抗原に対し「結合する」とは、他の抗原と全く結合しない場合も含むが、他の抗原と結合するとともに当該特定抗原に対し結合する場合も含む。
【００３１】
また、本発明において、抗体は任意の種々の方法によって調製することができる。例えば、被検物資である抗原性フラグメントを動物に投与してポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導する方法の他、動物（好ましくは、マウス）を被検物質により免疫した後、脾臓細胞を抽出し、適切なミエローマ細胞株と融合させることによりハイブリドーマを作製してモノクローナル抗体（またはその被検物質結合性フラグメント）を調製する方法などを挙げることができる。
【００３２】
ヒスチジン残基は、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛などの金属イオンとキレート結合して錯体を形成することが知られており、これらの金属イオンを利用することで、ヒスチジンタグなどのヒスチジン残基を含有する被験物質を検出することができる。これらの金属イオンは、例えば、蛍光被検物質センサーのアミノ基にＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｙｌ−ＮＴＡを反応させ、次いで当該金属イオンを含む溶液を加えることで、ＮＴＡとの錯体として蛍光被検物質センサーに導入することができる。
【００３３】
プロテインＡ及びＧはイムノグロブリン、特にＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合することが知られており、これを被験物質結合部として用いることで、ＩｇＧ又はそのＦｃフラグメントを被験物質として検出することができる。また、プロテインＬはイムノグロブリンのκ軽鎖と特異的に結合することが知られており、これを被験物質結合部として用いることで、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど、又はそれらのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２若しくはｓｃＦｖフラグメントを被験物質として検出することができる。
【００３４】
蛍光物質である蛍光タンパク質と被検物質結合部は、直接結合して配列していても、リンカーを介して結合して配列されていてもよい。そのようなリンカーとしては特に限定されず、当技術分野において用いられているペプチド配列、通常２〜２０アミノ酸程度の長さのペプチド配列を用いることができる。
【００３５】
タンパク質蛍光標識物質を蛍光物質とするときは、蛍光被検物質センサーのアミノ酸残基との間における非ペプチド結合によって蛍光被検物質センサーに導入してもよい。例えば蛍光被検物質センサーがシステイン残基を含んでいる場合には、マレイミド基を有するタンパク質蛍光標識物質とシステイン残基とを反応させることによって、タンパク質蛍光標識物質を蛍光被検物質センサーに導入することができる。このようにしてタンパク質蛍光標識物質が導入された蛍光被験物質センサーは、後に説明する「蛍光競合物質」との結合によってＦＲＥＴが生じ、ＦＲＥＴ分子センサーとして機能する。なお、タンパク質蛍光標識物質の導入は、被験物質結合部のリガンドに対する結合能を妨げない限り、任意のアミノ酸残基に対して行ってもよい。
【００３６】
蛍光被検物質センサーは、必要に応じて局在化シグナルを有してもよい。蛍光被検物質センサーにおける局在化シグナルの結合位置はＮ末端またはＣ末端のいずれでもよく、局在化部位としては、細胞膜、ミトコンドリア、細胞骨格、核、小胞体などを挙げることができる。さらに、蛍光被検物質センサーはタグを有していてもよい。そのようなタグとしては例えば、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧ−ｔａｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなる精製用のタグペプチド（ヒスチジンタグ、Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）−ｔａｇ、ＨＡ（へマグルチニンペプチド）−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇなどを挙げることができる。
【００３７】
蛍光被検物質センサーは適当な担体に固定化されていてもよい。蛍光被験物質センサーを担体に固定する方法としては、前記タグを介して固定する方法の他に、例えば、分子センサーに結合性を持つ分子（抗体、プロテインＡ、プロテインＧ）を固定化した担体を用いる方法の他、分子センサーをビオチン化してアビジンあるいはストレプトアビジンなどを固定化した担体に結合させる方法、蛍光被検物質センサーの官能基（ＮＨ２基、ＣＯＯＨ基、フェノール基など）に反応性をもつＮＨ２基、ＣＯＯＨ基、エポキシ基、ＯＨ基を固定化した担体に結合させる方法などを挙げることができる。
【００３８】
本発明における蛍光被検物質センサーを固定化する担体としては、例えば、スチレン系重合性モノマー、アクリル系重合性モノマー、メタクリル系重合性モノマーおよびビニル系重合性モノマーなどの重合性モノマーが重合されてなる有機高分子化合物；磁性微粒子；金属酸化物；金属；半導体化合物；アガロース；セファロース；木板；ガラス板；シリコン基板；植物繊維、動物繊維、鉱物繊維および食物繊維などの天然繊維；合成繊維、半合成繊維、再生繊維、ガラス繊維、炭素繊維および人造鉱物繊維などの化学繊維；などを挙げることができる。
【００３９】
本発明において、「蛍光競合物質」とは、ＦＲＥＴにおけるドナーチャネル（ドナー分子）またはアクセプターチャネル（アクセプター分子）となり得る蛍光物質そのもの、あるいはそのような蛍光物質で修飾された、被検物質と競合して被検物質結合部と結合ないし解離する物質であって、例えば受容体に対するリガンドそれ自体又はそのアナログに相当する物質、又は被験物質結合部に対する特異的な結合能を有する物質などを意味する。例えば、被験物質結合部がＩＰ３受容体であるときは蛍光物質で修飾されたＩＰ３、９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（Ｆ−ＡＤＡ）、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｆ−ＬＬ）などを蛍光競合物質として用いることができる。Ｆ−ＡＤＡの構造を下記式（Ｉ）に、Ｆ−ＬＬの構造を下記式（ＩＩ）に、それぞれ示す。
【００４０】
【化１】
2015232558.tif 000003
【００４１】
【化２】
2015232558.tif 000004
【００４２】
被験物質結合部に対する競合物質を蛍光物質で標識する方法は、当業者に広く知られた方法で行うことができる。例えば競合物質がタンパク質であるときは、先に例示したタンパク質蛍光標識物質を、それぞれについて知られた方法でタンパク質に導入すればよい。競合物質が低分子化合物であれば、被験物質結合部との特異的な結合能を妨げない範囲で、有機合成化学的手法によって蛍光物質で修飾すればよい。
【００４３】
なお、本発明において、「結合」は「作用」、「相互作用」、「特異的な相互作用」、「選択的な相互作用」「反応」、「認識」と交換可能に用いられる場合がある。
【００４４】
本発明においては、ＦＲＥＴ分子センサーを細胞内で用いることもできる。蛍光被検物質センサーまたは蛍光競合物質を細胞内に導入するには、公知のいかなる方法を用いてもよく、蛍光被検物質センサーまたは蛍光競合物質を直接細胞に導入する方法の他、例えば、蛍光タンパク質と被験物質結合部との融合タンパク質である蛍光被検物質センサーをコードするＤＮＡを細胞に導入して発現させた後に蛍光競合物質を導入してもよい。このような蛍光被検物質センサーをコードするＤＮＡを細胞に導入して発現させる方法としては、例えば、かかる蛍光被検物質センサーをコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込むことにより、各種細胞や動物や植物を形質転換することができる。その場合のベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、アグロバクテリウムなどを挙げることができる。ベクターを細胞に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎによる遺伝子導入などの方法を用いることができる。
【００４５】
融合タンパク質の細胞内発現の方法としては、例えば、融合タンパク質遺伝子が染色体ＤＮＡに組込まれた遺伝子を動物または植物へ導入してトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を作出する方法を挙げることができる。トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の作出は公知の方法により行うこともでき、その作出において、融合遺伝子は染色体ＤＮＡの任意の部位に挿入されてもよい。このようなトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物と蛍光競合物質とを用いれば、ｉｎ  ｖｉｖｏの系で被検物質の定量が可能であり、被検物質やその受容体の機能の解明、治療や診断法の確立、薬剤のスクリーニングなどに利用することができる。また、これらのトランスジェニック動物やトランスジェニック植物から得られた細胞は薬剤のスクリーニングなどにも利用することができ、蛍光競合物質と併せて被検物質測定キットや被検物質測定機器を作成することもできる。
【００４６】
次に、本発明における蛍光の強度を指標として対象中の被検物質を測定する方法は、下記の（Ｉ）、（ＩＩ）の工程を有している。
（Ｉ）被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーまたは担体固定化被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーと対象とを接触させる工程（対象接触工程）、
（ＩＩ）励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程（照射測定工程）。
【００４７】
対象接触工程（Ｉ）とは、蛍光競合物質が結合した蛍光被検物質センサーと被検物質を含むまたは被検物質を含むであろうと推測される対象（対象物）とを接触させる工程、または蛍光競合物質が結合していない蛍光被検物質センサーと被検物質を含むまたは被検物質を含むであろうと推測される対象（対象物）とを接触させた後に蛍光競合物質を導入する工程のいずれかである。
【００４８】
照射測定工程（ＩＩ）において、励起光を照射するとは、所望の光源を用いて、ドナーチャネルの励起極大波長又はその近傍の波長を含む範囲の光を照射することをいい、光源としては、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源の他、レーザーなどの単色光を用いてもよい。レーザー光源としては、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）の他、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、アルゴンイオンレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｌａｓｅｒ）（４３０ｎｍ）などを用いることができ、二光子励起法の場合は８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いることができる。
【００４９】
また、蛍光を測定するとは、ドナーチャネル及び／又はアクセプターチャネルの蛍光極大波長又はその近傍の波長を含む範囲、例えば２００〜８００ｎｍ、好ましくは３００〜７００ｎｍ、より好ましくは４００〜６００ｎｍ、さらにより好ましくは４６０〜５５０ｎｍの範囲における、ＦＲＥＴによるそれらの蛍光強度の変化を測定することをいう。
【００５０】
対象中の被験物質の定量は、既知濃度の被験物質を用いて予め検量線を作成しておくことで算出することができ、典型的には以下の手順で算出することができる。最初に被験物質が存在しない条件下で蛍光被検物質センサーと蛍光競合物質とを接触させてＦＲＥＴを生じさせた後、これらのドナーチャネル及び／又はアクセプターチャネルが有する蛍光極大波長又はその近傍の波長範囲における蛍光強度を測定する。次いで、既知濃度の被験物質をこの系に添加し、蛍光競合物質と被験物質との間で蛍光被験物質センサーに対する結合の競合を起こした状態で、蛍光強度を測定する。被験物質の濃度を変化させて同様の測定を行い、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの蛍光強度の比と被験物質濃度とをプロットすることで検量線を作成する。その後、対象を用いて上記の対象接触工程（Ｉ）および蛍光照射工程（ＩＩ）を行い、得られた蛍光強度比から対象中の被験物質量を算出する。
【００５１】
本発明の測定方法の好ましい態様の一つは、蛍光顕微鏡用のガラスプレート等の適当な支持体上で、担体に固定化された蛍光被験物質センサー及び蛍光競合物質を備えたＦＲＥＴ分子センサーと対象とを接触させる工程、及び蛍光顕微鏡を用いて励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程を含む。また本発明の測定方法の好ましい別の態様は、蛍光測定が可能な素材からなるマイクロ流路又はこれを載せたマイクロチップ内で、担体に固定化された蛍光被験物質センサー及び蛍光競合物質を備えたＦＲＥＴ分子センサーと対象とを接触させる工程、及び励起光を照射して生じた蛍光を測定する工程を含む。いずれの場合も、ＦＲＥＴが生じる反応場を担体表面に凝縮すること、および短い光路を介してＦＲＥＴにより生じる蛍光を測定することにより、検出感度を高めることができる。
【００５２】
以下、本発明に係る被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーについて、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞ＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合する蛍光競合物質の作成
被験物質結合部としてイノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）受容体のリガンド結合部と、これに結合する蛍光競合物質を作成した。
（１）Ｆ−ＡＤＡの作成
９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（Ｆ−ＡＤＡ）を下記の手順に従って作成した。
【００５４】
［１−１］９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−ｅｔｈｙｎｙｌ−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅの作成
先ず、５’ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｐｈｏｓｔｉｎ誘導体合成の前駆体（化合物１、α−ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｔｒｉｆｌａｔｅ；Ｔ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：１４５５−１４５８，２００６）を出発物質として、９−［５−Ｄｅｏｘｙ−５−ｅｔｈｙｎｙｌ−（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−β−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ］ａｄｅｎｉｎｅ（化合物７）を作成した。
【００５５】
ジイソプロピルアミン（１．８８ｍＬ，１３．４ｍｍｏｌ）とＨＭＰＡ（２．３３ｍＬ，１３．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かし、−７８℃にて１．６６Ｍのｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液（５．０３ｍＬ，１３．４ｍｍｏｌ）を加えた。０℃まで昇温させて３０分間撹拌し、再び−７８℃にてトリメチルシリルアセチレン（１．８５ｍＬ，１３．４ｍｍｏｌ）を加えた後、化合物１（２．９８ｇ，３．８３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を加えてさらに１時間撹拌した。続いて、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて酢酸エチルで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液と分液し、続いて水と分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。ろ過後、ろ液を減圧下にて溶媒留去し、残渣をメタノール（１５０ｍＬ）に溶解した後、炭酸カリウム（６３２ｍｇ，４．６０ｍｍｏｌ）を加えて３時間撹拌した。反応液の溶媒を減圧下にて濃縮後、ジエチルエーテルを用いて希釈し、水と分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。ろ過後、減圧下にて溶媒留去して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）により精製して、無色非結晶性固体の化合物２（２．３５ｇ，３．５８ｍｍｏｌ，９４％）を得た。
【００５６】
続いて、化合物２（１．００ｇ，１．５３ｍｍｏｌ）の８０％トリフルオロ酢酸水溶液（５０ｍＬ）を３０分間撹拌した後、反応液の溶媒を減圧下にて留去し、トルエンを用いて残渣を共沸した。残渣をアセトニトリル（３３ｍＬ）に溶かし、ジメチルアミノピリジン（２．２４ｇ，１８．３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．５６ｍＬ，１８．３ｍｍｏｌ）およびイソ酪酸無水物（２．０３ｍＬ，１２．２ｍｍｏｌ）を加えて２時間撹拌した。反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加えて分液後、有機層を水で洗浄し、続いて飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して濾過した後、ろ液の溶媒を減圧下にて留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）により精製して、無色非結晶性固体の化合物３（１．０８ｇ，１．３８ｍｍｏｌ，２ｓｔｅｐｓ  ９０％）を得た。
【００５７】
続いて、Ｎ６−ベンゾイルアデニン（１．４４ｇ，６．３９ｍｍｏｌ）をＨＭＤＳ／ピリジン（２／１）の混合溶液（５０ｍＬ）に懸濁して、反応液が透明になるまで加熱しつつ還流した。反応液の溶媒を留去した後、トルエンを用いて共沸し、残渣に化合物３（１．０２ｇ，１．２８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）を加えた。生じた混合溶液に、氷冷下、四塩化スズ（１．８１ｍＬ，７．６８ｍｍｏｌ）を滴下した後、同温度で１時間、さらに室温で２時間撹拌した。反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加えて分液後、有機層を水で洗浄し、続いて飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥、濾過後、ろ液を減圧下にて溶媒留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４：１）により精製して、白色非結晶性固体の化合物４（９０６ｍｇ，０．９７１ｍｍｏｌ，７６％）を得た。
【００５８】
続いて、化合物４（１００ｍｇ，０．１０７ｍｍｏｌ）のメタノール（２ｍＬ）溶液に２８％ナトリウムメトキサイド（２１．０μＬ，０．１０７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液をＷＫ２１２（Ｈ＋）カラムを用いて精製して、白色非結晶性固体の化合物５（６４．９ｍｇ，０．１１３ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００５９】
続いて、化合物５（５０．２ｍｇ，０．０８１１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（４ｍＬ）溶液にイミダゾリウムトリフレート（５８．５ｍｇ，０．２６６ｍｍｏｌ）およびジベンジルジイソプロピルホスホアミダイト（８０．２μＬ，０．３６５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。少量の水を加えた後、−７８℃にてｍＣＰＢＡ（６２．９ｍｇ，０．３６５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて分液後、有機層を重曹水で洗浄し、続いて水で洗浄し、さらに食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下にて溶媒留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝９９：１）により精製して、白色非結晶性固体の化合物６（１０４ｍｇ，０．０７４５ｍｍｏｌ，９２％）を得た。
【００６０】
続いて、化合物６（６４．２ｍｇ，０．０４５８ｍｍｏｌ）をトルエンで３回共沸後、ジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解し、−７８℃にて１Ｍのトリブロモボランジクロロメタン溶液（４２４，μＬ，０．４２４ｍｍｏｌ）を加えた。同温度で１０時間撹拌し、２８％アンモニア水溶液を加えた後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をＡＧ  ｒｅｓｉｎカラム（水→１５０ｍＭのＴＦＡ水溶液）により精製して、白色定形状結晶の化合物７（２５ｍｇ，０．０３６９ｍｍｏｌ，８１％）を得た。化合物１を出発物質とした化合物２〜７の作成フローを図１に示し、化合物７のＮＭＲスペクトルデータを下記に示す。
【００６１】
化合物７のＮＭＲスペクトルデータ
ｍ．ｐ．１５８−１５９℃；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ  ４００ＭＨｚ）δ８．４７，８．３８（ｅａｃｈ  ｓ，  ｅａｃｈ  １Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−８），６．３３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝４．９８Ｈｚ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝４．９８Ｈｚ，４．５３Ｈｚ），５．２４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’’，Ｊ＝３．６２Ｈｚ），４．７０（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４’，Ｊ＝４．９８Ｈｚ），４．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝９．０６Ｈｚ），４．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’’），４．１３（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４’’，Ｊ＝９．５１Ｈｚ），３．８４−３．７３（ｍ，４Ｈ，Ｈ−６’’ａ，６’’ｂ，２’’，５’’），２．７８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，５’ｂ），２．４１（ｓ，１Ｈ，ａｌｋｙｎｅ）；１３ＣＮＭＲ（Ｄ２Ｏ  １００ＭＨｚ）δ１５０．４９，１４８．９６，１４５．０２，１４３．８６，１１９．４４，９８．３３，８８．２５（Ｊ＝２．４０Ｈｚ），８８．０２，８０．２４，７８．６３（Ｊ＝８．４０Ｈｚ），７５．８０（Ｊ＝３．６０Ｈｚ），７５．３６，７３．４８，７２．８７，７２．００，７０．９４，６０．６５，４７．２５；３１Ｐ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ  １６２ＭＨｚ）δ０．８１，０．５４，０．００；ＥＳＩ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ６７６（Ｍ＋Ｈ）＋；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１８Ｈ２５Ｎ５Ｏ１７Ｐ３  ６７６．０１１７６，ｆｏｕｎｄ  ６７６．０１１２６（Ｍ＋Ｈ）＋，ＨＰＬＣ  ｐｕｒｉｔｙ：ＲＴ  ７．９８２，９８．１１％
【００６２】
［１−２］Ｎ−（３−ａｚｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−（３’，６’−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ［ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］ｘａｎｔｈｅｎ］−５−ｙｌ）−ｔｈｉｏｕｒｅａの作成
次に、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）からＮ−（３−ａｚｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−（３’，６’−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ［ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］ｘａｎｔｈｅｎ］−５−ｙｌ）−ｔｈｉｏｕｒｅａ（化合物１２）を作成した。
【００６３】
ＦＩＴＣ（２０．２ｍｇ，０．０５１４ｍｍｏｌ）を飽和重曹水（２ｍＬ）に溶解して、３−アジドプロピルアミン（３０．８ｍｇ，０．３０８ｍｍｏｌ）を加えて３時間撹拌し、減圧下にて溶媒を留去した後、Ｃ１８逆層クロマトグラフィー（溶出溶媒；アセトニトリル：水＝１：３，１：２，１：１）により精製して、赤色定形状結晶の化合物１２（２４．２ｍｇ，０．０４９１ｍｍｏｌ，９６％）を得た。ＦＩＴＣからの化合物１２の作成フローを図２に示し、ＮＭＲスペクトルデータを下記に示す。
【００６４】
化合物１２のＮＭＲスペクトルデータ
ｍ．ｐ．１８５−１８６℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ７．９８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１２，Ｊ＝１．８１Ｈｚ），７．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１０，Ｊ＝１．８１Ｈｚ，６．３４Ｈｚ），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−９，Ｊ＝８．１６Ｈｚ），７．１０（ｄ，２Ｈ，Ｈ−４，５，Ｊ＝９．０６Ｈｚ），６．６２−６．５９（ｍ，Ｈ−１，２，７，８，４Ｈ），３．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．３４Ｈｚ，６．８０Ｈｚ），３．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，６．３４Ｈｚ），１．９２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ  １２５ＭＨｚ）δ１８２．２６，１７９．５９，１７３．６７，１５９．５８，１５８．４７，１４１．５４，１４１．１９，１３２．５６，１３１．２１，１３０．８３，１２５．４９，１２５．０８，１２２．９６，１１４．３９，１０４．１８，４３．０２，３８．２３，２９．３４，２８．００；ＥＳＩ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  ４８８（Ｍ＋Ｈ）＋；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ４８８．１０３４１  Ｃ２４Ｈ１８Ｏ５Ｎ５Ｓ，ｆｏｕｎｄ  ４８８．１０４２９（Ｍ＋Ｈ）＋，ＨＰＬＣ  ｐｕｒｉｔｙ：ＲＴ  １５．１２７，９９．０５３％
【００６５】
［１−３］Ｆ−ＡＤＡの作成
次に、本実施例１（１）［１−１］において作成した化合物７と本実施例１（１）［１−２］において作成した化合物１２からＦ−ＡＤＡ（化合物１３）を作成した。
【００６６】
化合物７（７．００ｍｇ，０．０１０３ｍｍｏｌ）のリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ，ｐＨ＝７．０，７００μＬ）溶液に化合物１２（７．０７ｍｇ，０．０１４５ｍｍｏｌ）、硫酸銅（１．６５ｍｇ，０．０１０３ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（８．１９ｍｇ，０．０４１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した後、反応液をＣ１８逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；アセトニトリル：水＝１：３，１：２，１：１）により精製して、黄色定形状結晶のＦ−ＡＤＡ（化合物１３；１０．１ｍｇ，０．００８５０ｍｍｏｌ，８３％）を得た。Ｆ−ＡＤＡの構造を下記式（Ｉ）に、化合物７と化合物１２とからのＦ−ＡＤＡ（化合物１３）の作成フローを図３に、ＮＭＲスペクトルデータを下記に、それぞれ示す。
【００６７】
【化３】
2015232558.tif 000005
【００６８】
Ｆ−ＡＤＡ（化合物１３）のＮＭＲスペクトルデータ
ｍ．ｐ．２９４−２９５℃（ｄｅｃ．）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３  ４００ＭＨｚ）δ７．９４，７．８９（ｅａｃｈ  ｓ，ｅａｃｈ  １Ｈ，Ｈ−２，８），７．４８（ｓ，１Ｈ，ｔｒｉａｚｏｌｅ），７．３５（ｓ，１Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−１２），７．２７（ｓ，１Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−１０），７．１２（ｍ，３Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−９，４，５），６．４５（ｍ，４Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−１，２，７，８），６．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．１５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１’’，２’），４．４９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’’），４．４０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．１９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’’，ｔｒｉａｚｏｌｅ−ＣＨ２），３．９３（ｍ，４Ｈ，Ｈ−４’，６’’ａ，６’’Ｂ，２’’），３．８７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’’，３．３５，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ），３．０５（ｍ，ＣＨ２ＮＨ），１．９０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）；３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３  ２０２ＭＨｚ）δ５．２３，４．６７，４．４２；ＥＳＩ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  １１６５（Ｍ＋Ｈ）＋；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４２Ｈ４５Ｏ２２Ｎ１０  １６５．１５６５２，ｆｏｕｎｄ  １１６５．１５３８５（Ｍ＋Ｈ）＋，ＨＰＬＣ  ｐｕｒｉｔｙ：ＲＴ  １１．４８０，９２．１５０％
【００６９】
（２）Ｆ−ＬＬの作成
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−［Ｎ−［［１−［５−［［３’，６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏｓｐｉｒｏ（ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ）−５−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｔｈｉｏｘｏｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｆ−ＬＬ）を下記の手順に従って作成した。
【００７０】
［２−１］（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−ｅｔｈｙｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅの作成
先ず、本実施例１（１）［１−１］における反応中間体である化合物２（５−Ｄｅｏｘｙ−５−ｅｔｈｙｎｙｌ−３−Ｏ−［２，６−ｄｉ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−３，４−Ｏ−（２，３−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔａｎ−２，３−ｄｉｙｌ）−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−１，２−Ｏ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ）を出発物質として、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−２−ｅｔｈｙｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−３，４−ｄｉ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（化合物１１）を作成した。
【００７１】
化合物２（５０．０ｍｇ，０．０７６１ｍｍｏｌ）を９０％トリフルオロ酢酸水溶液（５ｍＬ）に溶かし、室温で５分間撹拌した後、反応液を減圧下にて濃縮し、残渣を水（ｘ３）およびエタノールで共沸した。残渣をピリジン（２ｍＬ）に溶かして無水酢酸（４２２μＬ，４．５１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した後、溶媒を減圧下にて留去した。残渣を酢酸エチルと飽和重曹水（１０ｍＬｘ２）で分液後、有機層を水（１０ｍＬ）、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥して濾過した後、ろ液を減圧下にて濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１）により精製して、白色非結晶性固体の化合物８（４４．１ｍｇ，０．０６７４ｍｍｏｌ，２  ｓｔｅｐｓ  ８７％）を得た。
【００７２】
続いて、０℃にて化合物８（２０．０ｍｇ，２８．２μｍｏｌ）とトリエチルシラン（１３．０μＬ，５６．３μｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５００μＬ）にＴＭＳＯＴｆ（１０．２μＬ，５６．６μｍｏｌ）を滴下し、同温下にて２０分間撹拌した後、室温に昇温させて３０分間撹拌した。飽和重曹水とクロロホルムを加えて分液後、有機層を水（４ｍＬ）で洗浄し、続いて飽和食塩水（４ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥して濾過した後、ろ液を減圧下にて留去し、白色固体を得た。この固体をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＭｅ（２８％  ｉｎ  ＭｅＯＨ，３０μＬ）を加えた後、室温で１２時間撹拌した。ＷＫ２１２（Ｈ＋）カラムで精製して、白色非結晶性固体の化合物９（８ｍｇ，０．０１７１ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００７３】
続いて、本実施例１（１）［１−１］における反応中間体である化合物６を作成した手法に従い、化合物９（２２．２ｍｇ，４０．２μｍｏｌ）、１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌ（２５．３ｍｇ，３６０μｍｏｌ）、Ｄｉｂｅｎｚｙｌ  ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ（５８．４ｍｇ，２４０μｍｏｌ）およびｍＣＰＢＡ（４１．１ｍｇ，２４０μｍｏｌ）を用いて、白色非結晶性固体の化合物１０（４７．３ｍｇ，３７．５μｍｏｌ，９２％）を得た。
【００７４】
続いて、化合物１０（３６．０ｍｇ，０．０２８１ｍｍｏｌ）をトルエン共沸（ｘ３）した後、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、−７８℃にて１Ｍのトリブロモボランジクロロメタン溶液（４５０μＬ，０．４５１ｍｍｏｌ）を加え、同温度下７時間撹拌した。少量のエタノールを加えた後、減圧下にて溶媒を留去した。水を溶出溶媒としてＣ１８逆相カラムにより残渣を精製して、白色定形状結晶の化合物１１（１３．１ｍｇ，０．０２４１ｍｍｏｌ，８６％）を得た。化合物２を出発物質とした化合物８〜１１の作成フローを図４に示し、化合物１１のＮＭＲスペクトルデータを下記に示す。
【００７５】
化合物１１のＮＭＲスペクトルデータ
ｍ．ｐ．１４３−１４４℃；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２０，５００ＭＨｚ）δ５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝３．４３Ｈｚ），４．７６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），４．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝８．５９Ｈｚ，９．１６Ｈｚ），４．２１（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３，Ｊ＝５．７３Ｈｚ），４．０５−３．９１（ｍ，４Ｈ，Ｈ−６’ａ，６’ｂ，１ａ，１ｂ），３．７１−３．６３（ｍ，４Ｈ，Ｈ−４，４’，５’，２’），２．６０−２．４６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ，５ｂ），２．３０（ｓ，１Ｈ，ａｌｋｙｎｅ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ９７．５９，８０．６５，７８．４９，７７．４４（Ｊ＝６．００Ｈｚ），７３．３８，７２．５９，７２．３０，７１．９６，７１．９３（Ｊ＝４．８０），７１．０５，７０．９９（Ｊ＝２．４０），６０．６３，２２．２９；３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，２０２ＭＨｚ）δ０．７０，０．４８，０．１３；ＥＳＩ−ＬＲＭ  ｍ／ｚ  ５４３（Ｍ＋Ｈ）＋；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ２２Ｏ１７Ｐ３  ５４３．００７５３，ｆｏｕｎｄ  ５４３．００８４６（Ｍ＋Ｈ）＋
【００７６】
［２−２］Ｆ−ＬＬの作成
次に、本実施例１（１）本実施例１（２）［２−１］において作成した化合物１１と［１−２］において作成した化合物１２からＦ−ＬＬ（化合物１４）を作成した。
【００７７】
アルゴン雰囲気下、化合物１１（１３．５ｍｇ，０．０２４２ｍｍｏｌ）と化合物１２（１６．０ｍｇ，０．０３３１ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（０．８ｍＬ）とリン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ，ｐＨ＝７．０，０．２ｍＬ）の混合溶液に溶かした後、硫酸銅（１９．２ｍｇ，０．１２１ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（９５．１ｍｇ，０．４８２ｍｍｏｌ）の水溶液（５００μＬ）を加え室温で５時間撹拌した。反応液をＣ１８逆相カラムクロマトグラフィー［溶出溶媒：アセトニトリル／トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ７．０）］により精製後、キレックス１００カラム（Ｋ＋型、溶出溶媒：水）を通して、黄色定形状結晶のＦ−ＬＬ（化合物１４；５．０２ｍｇ，０．００４９１ｍｍｏｌ，単離収率２０％）を得た。Ｆ−ＬＬの構造を下記式（ＩＩ）に、化合物１１と化合物１２とからのＦ−ＬＬ（化合物１４）の作成フローを図３に、ＮＭＲスペクトルデータを下記に、それぞれ示す。
【００７８】
【化４】
2015232558.tif 000006
【００７９】
Ｆ−ＬＬ（化合物１４）のＮＭＲスペクトルデータ
ｍ．ｐ．２９８−２９９℃（ｄｅｃ．）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ７．８０（ｍ，１Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−１２），７．５２（ｓ，１Ｈ，ｔｒｉａｚｏｌｅ），７．４２（ｍ，１Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−１０），７．１２（ｍ，３Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−９，４，５），６，４７（ｍ，４Ｈ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｈ−１，２，７，８），５．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１’），４．５３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），４．３８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４，ｔｒｉａｚｏｌｅ−ＣＨ２），４．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’），４．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．９２（１Ｈ，Ｈ−３），３．８０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−１ａ，１ｂ，４’），３．７０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．６２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），３．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ，５ｂ），３．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６’ａ，６’ｂ），３．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ），２．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，２０２ＭＨｚ）δ５．１５，４．５１，４．３２；ＥＳＩ−ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ  １０３２（Ｍ＋Ｈ）＋；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３７Ｈ４１Ｏ２２Ｎ５Ｐ３  １０３２．１１７６７，ｆｏｕｎｄ  １０３２．１１７９５（Ｍ＋Ｈ）＋，ＨＰＬＣ  ｐｕｒｉｔｙ：ＲＴ  １０．６８０，９０．６７９％
【００８０】
（３）細胞内Ｃａ２＋貯蔵部位からのＣａ２＋放出試験
本実施例１（１）で得られたＦ−ＡＤＡおよび同（２）で得られたＦ−ＬＬがＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合する蛍光競合物質になり得るかどうかの確認試験を行うべく、先ずは細胞内Ｃａ２＋貯蔵部位（Ｃａ２＋ストア）からＣａ２＋が放出されるか否かの確認試験を行った。ＩＰ３はＣａ２＋シグナルを誘導する細胞内メッセンジャーであり、ＩＰ３がＣａ２＋チャネルであるＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合すると、ＩＰ３受容体が活性化して小胞体等の細胞内Ｃａ２＋貯蔵部位（Ｃａ２＋ストア）から細胞質にＣａ２＋が放出される。この原理を利用した確認試験を行った。
【００８１】
［３−１］細胞内にｍａｇ−ｆｕｒａ−２を取り込ませたサポニン穿孔ＣＯＳ−７細胞の作成
容量が約１００μＬの実験チャンバーの中においてＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ  ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ）を培養し、細胞を含む実験チャンバー内において１０μＭのｍａｇ−ｆｕｒａ−２を含むＨａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ液を３０分間作用させることにより細胞の細胞内小器官内にｍａｇ−ｆｕｒａ−２を取り込ませ、１００μｇ／ｍＬのサポニンを含む細胞内溶液様緩衝液（ＩＣＭ；１２４ｍＭ  ＫＣｌ，２５ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，３３０μＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．３）に細胞を約３分間暴露することによりチャンバー内の細胞をサポニンで穿孔してサポニン穿孔細胞を得た後、チャンバー内を１ｍＭ  ＡＴＰと１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＩＣＭに置換した。
【００８２】
［３−２］蛍光イメージング法による小胞体内Ｃａ２＋ストア内のＣａ２＋濃度変化の解析
本実施例１（３）［３−１］で得られたサポニン穿孔細胞に対し、様々な濃度のＩＰ３、Ｆ−ＡＤＡおよびＦ−ＬＬを作用させ、蛍光イメージング法により小胞体内Ｃａ２＋ストア内のＣａ２＋濃度の変化を解析した。蛍光イメージング法は、蛍光倒立顕微鏡ＴＥ２０００（ニコンインステック社）と、ＥＭ−ＣＣＤカメラＣ９１００−１３、高速波長切り替え装置Ｕ７７７３、Ｗ−Ｖｉｅｗ光学系および画像解析ソフトウェアＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳから構成されるイメージングシステム（浜松ホトニクス社）を用いて行った。具体的には、様々な濃度のＩＰ３、Ｆ−ＡＤＡおよびＦ−ＬＬを作用させたサポニン穿孔細胞を蛍光倒立顕微鏡ＴＥ２０００（ニコンインステック社）にセットして３４５ｎｍまたは３８０ｎｍの光を照射し、蛍光フィルターを用いて５３５±１２．５の蛍光を抽出した。得られた蛍光をＥＭ−ＣＣＤカメラで同時記録して、画像解析ソフトウェアを用いて蛍光比を算出し、蛍光比の変化から、細胞内ストア内のＣａ２＋濃度変化を解析することにより、ＩＰ３、Ｆ−ＡＤＡおよびＦ−ＬＬのＩＰ３受容体を介するＣａ２＋放出の効力を算定した。その結果を図５に示す。
【００８３】
図５に示すように、ＩＰ３、Ｆ−ＡＤＡおよびＦ−ＬＬのいずれも、Ｃａ２＋放出による濃度依存的な蛍光変化が確認され、そのＥＣ５０値はＩＰ３の３３４ｎＭに対して、Ｆ−ＡＤＡは２．４ｎＭ、Ｆ−ＬＬは１５８ｎＭであった。このことから、Ｆ−ＡＤＡおよびＦ−ＬＬによっても、ＩＰ３と同様にＩＰ３受容体を介して細胞内Ｃａ２＋ストアからＣａ２＋が放出させることができることが明らかとなった。
【００８４】
（４）蛍光競合物質と蛍光ＩＰ３センサーとの特異性の解析
次に、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ発現細胞に対するＦ−ＡＤＡの特異性を、次の手順に従って解析した。
【００８５】
［４−１］蛍光ＩＰ３センサー発現細胞の作成
既報（Ｔａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：８９１０−８９１７，２００９）に掲載されているＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現プラスミドを細胞内に導入して、既存の蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）が発現した細胞を作成した。具体的には、容量が約１００μＬの実験チャンバーの中においてＣＯＳ−７細胞（ＲＩＫＥＮ  ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ）を培養し、リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて細胞にＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）の遺伝子（配列番号１９）を導入することにより、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）が発現した細胞を得た。図６に蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）の構成を示す。図６中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｌ１」および「Ｌ２」はリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のリガンド結合部に親和性を高めるアミノ酸変異Ｒ４４０Ｑを入れたペプチド、すなわちラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質ＥＹＦＰのミュータントであってＥＹＦＰ配列の４６番のフェニルアラニン（Ｆ）をロイシン（Ｌ）へ、６４番のフェニルアラニン（Ｆ）をロイシン（Ｌ）へ、１５３番のメチオニン（Ｍ）をトレオニン（Ｔ）へ、１６３番のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）へ、１７５番のセリン（Ｓ）をグリシン（Ｇ）へ、それぞれ変異させた黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（Ｔ．Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１）：８７−９０，２００２）を示す。
【００８６】
［４−２］蛍光ＩＰ３センサー発現サポニン穿孔細胞の作成
細胞の細胞内小器官内にｍａｇ−ｆｕｒａ−２を取り込ませることを除く他は、本実施例１（３）［３−１］と同様の手法に基づいて、同（４）［４−１］で得られた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）が発現した細胞から蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現サポニン穿孔細胞を得た。
【００８７】
［４−３］蛍光イメージング法による解析
得られた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現サポニン穿孔細胞にＦ−ＡＤＡを反応させ、本実施例１（３）［３−２］のイメージングシステム（浜松ホトニクス社）を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を蛍光イメージング法にて解析した。具体的には、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現サポニン穿孔細胞に対しＦ−ＡＤＡを作用させた後、蛍光倒立顕微鏡ＴＥ２０００（ニコンインステック社）にセットして４３５ｎｍの光を照射し、試料からの蛍光をＷ−Ｖｉｅｗ光学系４８５ｎｍのダイクロイックミラーを用いて２光路に分離した後、それぞれの光路に取り付けた蛍光フィルターを用いて４８０±１５ｎｍおよび５３５±１２．５ｎｍの蛍光を抽出した。それぞれの蛍光をＥＭ−ＣＣＤカメラで同時記録して、画像解析ソフトウェアを用いて４８０ｎｍの蛍光と５３５ｎｍの蛍光の蛍光比を算出した。
【００８８】
蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現サポニン穿孔細胞を、蛍光競合物質（Ｆ−ＡＤＡ  ３０ｎＭ）を含むＩＣＭと置換すると、当該細胞のみならずバックグラウンドの蛍光のわずかな上昇が認められたことから、当該細胞の蛍光強度からバックグラウンド蛍光を減算することによって、蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡと蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳの特異性を解析した。その結果を図７に示す。
【００８９】
図７中、ＡａおよびＡｂの画像は３０ｎＭのＦ−ＡＤＡを作用させる前の時点（Ｂの矢印１の時点）の蛍光像を示す図であり、ＡｃとＡｄの画像は３０ｎＭのＦ−ＡＤＡを作用させた後の時点（Ｂの矢印１の時点）の蛍光像を示す図であり、Ｂは蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡの添加による蛍光変化を示す図である。また、Ｃは蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡと蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳとの反応による蛍光成分を抽出するための、細胞を含む領域の蛍光からＢＧ領域の蛍光を引いた場合の蛍光変化を示す図であり、Ｄはその蛍光比４８０ｎｍ／５３５ｎｍを示す図である。図７に示すように、蛍光ＩＰ３センサー発現細胞を含む領域と含まない領域（ＢＧ）の蛍光変化を比較したところ、蛍光ＩＰ３センサー発現細胞を含む領域では、Ｆ−ＡＤＡを添加した時点（矢印２）でＣＦＰ蛍光を主に含む４８０ｎｍの蛍光が低下し、Ｖｅｎｕｓと蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡの蛍光を含む５３５ｎｍの蛍光が上昇したことが認められ、細胞を含まないＢＧ領域では、Ｆ−ＡＤＡの蛍光である５３５ｎｍの蛍光のみがわずかに上昇したことが認められた。これらのことから、蛍光競合物質と蛍光ＩＰ３センサーとの反応によって、蛍光比（４８０ｎｍ／５３５ｎｍ）が低下することが明らかとなり、作成した蛍光競合物質は蛍光ＩＰ３センサーの特異性を有すること、すなわちＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合してＣＦＰとＦＲＥＴを引き起こすことが明らかとなった。
【００９０】
＜実施例２＞蛍光ＩＰ３センサーにおける蛍光タンパク質の検討
従来の蛍光ＩＰ３センサーは、蛍光物質としてＣＦＰ（ＥＣＦＰ）およびＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）の２つの蛍光タンパク質を有しているが、実施例１（４）の結果より、ＩＰ３受容体のリガンド結合部、蛍光物質として１つの蛍光タンパク質を備えていれば、Ｆ−ＡＤＡまたはＦ−ＬＬといった蛍光競合物質とともに蛍光ＩＰ３センサーとして十分機能するのではないかとの知見が得られたことから、これを確認する試験を行った。
【００９１】
（１）既存の各種蛍光ＩＰ３センサー発現細胞の作成
実施例１（４）［４−１］と同様の手法に基づいて、既報（Ｔａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：８９１０−８９１７，２００９）に掲載されている既存の蛍光ＩＰ３センサーであるＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）（配列番号２０）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）（配列番号２１）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）（配列番号２２）、ＬＩＢＲＡｖＮ（ＬｖＮ）（配列番号２３）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）（配列番号１９）およびＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）（配列番号２４）の各プラスミドをそれぞれの細胞内に導入して、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＮ（ＬｖＮ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）およびＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社に依頼して合成したＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）が発現した細胞をそれぞれ作成した。それぞれの蛍光ＩＰ３センサーの構成を図８に示す。図８中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＭＰ」は小胞体局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｃｅｒｕｌｅａｎ」は青色蛍光タンパク質Ｃｅｒｕｌｅａｎを示し、「Ｌ１」、「Ｌ１Ｈ１」、「Ｌ２」および「Ｌ２−６」はいずれもリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ１（１−６０４）」はラット１型ＩＰ３受容体アミノ酸配列のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）」はラット２型ＩＰ３受容体アミノ酸配列のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示し、「ＩＰ３Ｒ３（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｋ５０７Ａ」はラット３型ＩＰ３受容体アミノ酸配列のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の５０７番のリシン（Ｋ）をアラニン（Ａ）へ変異させたことを示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを示す。
【００９２】
（２）黄色蛍光タンパク質が発光しない蛍光ＩＰ３センサー発現細胞の作成
［２−１］黄色蛍光タンパク質が発光しない蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）遺伝子の作成
次に、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）のＶｅｎｕｓを蛍光発色させないように変異させた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）を下記の手順に従って作成した。
【００９３】
先ず、Ｖｅｎｕｓ発現プラスミドをテンプレートとし、ＱｕｉｋＣａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）、ならびに次のＰＣＲプライマー、Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔＦＰ（フォワードプライマー）およびＶｅｎｕｓ  ｍｕｔＲＰ（リバースプライマー）を用いて、黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの発色団のアミノ酸を変異させた無発色タンパク質Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔ（Ｖｅｎｕｓ配列の６５番のグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）へ、６６番のチロシン（Ｙ）をアスパラギン（Ｎ）へ、６７番のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）へ、それぞれ変異させたｍｕｔａｎｔ）発現プラスミドを作成した。
Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔＦＰ：ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＴＴＣ（配列番号２５）
Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔＲＰ：ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ（配列番号２６）
【００９４】
次に、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）遺伝子の黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ遺伝子と、作成した無蛍光発色タンパク質Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔ遺伝子とを入れ替えた。具体的には、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩにより切断し、Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔ発現プラスミドをＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現プラスミドに挿入することによってＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）遺伝子（配列番号２７）を作成した。ＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）遺伝子の作成手順を図９に示す。図９中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合遺伝子配列を示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰの遺伝子配列を示し、「ＬＢＤ」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の遺伝子配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの遺伝子配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ（ｍ）」は無発色タンパク質Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔの遺伝子配列を示す。
【００９５】
［２−２］蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）発現細胞の作成
次に、実施例１（４）［４−１］と同様の手法に基づいて、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）発現プラスミドを細胞内に導入して、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）が発現した細胞を作成した。蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）の構成を図１０に示す。図１０中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｌ１」および「Ｌ２」はリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示し、「Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔ」は無発色タンパク質Ｖｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔを示す。
【００９６】
（３）蛍光ＩＰ３センサー発現サポニン穿孔細胞の作成および蛍光イメージング法による解析
続いて、実施例１（４）［４−２］と同様の手法に基づいて、本実施例２（１）および（２）で得られた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＮ（ＬｖＮ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）およびＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）が発現した細胞からそれぞれの蛍光ＩＰ３センサー発現サポニン穿孔細胞を得て、終濃度が１０ｎＭまたは３０ｎＭとなるようにＦ−ＡＤＡを作用させた他は、実施例１（４）［４−３］と同様の手法に基づいて、それぞれの蛍光ＩＰ３センサー発現サポニン穿孔細胞における４８０ｎｍの蛍光と５３５ｎｍの蛍光の蛍光比を算出した。その結果を図１１に示す。
【００９７】
図１１に示すように、１型〜３型ＩＰ３受容体のリガンド結合部を含む蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）およびＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）とＦ−ＡＤＡとの反応では、いずれも４８０ｎｍの蛍光が低下するとともに５３５ｎｍの蛍光が上昇し、その結果、いずれも４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光比は低下した。２型ＩＰ３受容体のリガンド結合部に親和性を高めるアミノ酸変異（Ｒ４４０Ｑ）を入れたＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）においても同様の蛍光比の低下が認められた。さらにＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）の細胞膜局在配列を小胞体局在配列に置換したＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）や蛍光タンパク質のアミノ酸置換によって蛍光を発しないＶｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔを用いたＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）でも同様の蛍光比の変化が認められた。一方、３型ＩＰ３受容体のリガンド結合部においてＩＰ３が結合するために必須なアミノ酸の１つを変異（Ｋ５０７Ａ）させたＬＩＢＲＡｖＮ（ＬｖＮ）では蛍光変化が全く起こらなかった。
【００９８】
これらのことから、これらの蛍光変化は蛍光ＩＰ３センサーと蛍光競合物質の特異的反応によって起こることが明らかになった。発明者らによるこれまでの研究では、ＬＩＢＲＡｖＩ（ＬｖＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩ（ＬｖＩＩ）、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）およびＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）とＩＰ３との結合は、４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光比を上昇させることが明らかにされている（Ｔａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：８９１０−８９１７，２００９）。発明者らは、これらの蛍光変化が、ＩＰ３の結合によってＩＰ３受容体のリガンド結合部の立体構造が変化し、ＩＰ３受容体のリガンド結合部のＮ末端とＣ末端に連結したＣＦＰ（ＥＣＦＰ）とＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）の間におけるＦＲＥＴの効率の低下によるものであると考えている。これに対し、本実施例２における蛍光ＩＰ３センサーと蛍光競合物質との反応では蛍光比が低下したことから、全く異なる原理が働いていることが明らかになった。すなわち、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）のＦＲＥＴアクセプターであるＶｅｎｕｓを無蛍光無発色のＶｅｎｕｓ  ｍｕｔａｎｔに置換したＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｍ（ＬｖＩＩＳＶｍ）を用いても、蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡとの反応によって大きな蛍光変化が観察されたことから、蛍光ＩＰ３センサーと蛍光競合物質の反応にはＹＦＰの蛍光が必要ではないことが示された。
【００９９】
＜実施例３＞１つの蛍光タンパク質を備えた蛍光ＩＰ３センサーの検討
次に、１つの蛍光タンパク質を備えた蛍光ＩＰ３センサーについて、次の手順に従って検討した。
【０１００】
（１）１つの蛍光タンパク質を備えた蛍光ＩＰ３センサーの作成
蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）遺伝子からＶｅｎｕｓ遺伝子を除去した蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）発現ベクターを作成した。具体的には、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現プラスミドおよびＥＣＦＰ−Ｃ１発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社；配列番号２８）を制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩにより切断し、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）発現プラスミドから精製したＥＣＦＰとラット２型ＩＰ３受容体のリガンド結合部遺伝子を含むＤＮＡ断片をＥＣＦＰ−Ｃ１発現プラスミドのＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ切断サイトに挿入することによりＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子（配列番号２９）を作成した。ＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子の作成手順を図１２に示す。図１２中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合遺伝子配列を示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰの遺伝子配列を示し、「ＬＢＤ」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の遺伝子配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの遺伝子配列を示す。
【０１０１】
（２）蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）発現細胞の作成
次に、実施例１（４）［４−１］と同様の手法に基づいて、ＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）発現プラスミドを細胞内に導入して、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）が発現した細胞を作成した。蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）の構成を図１３に示す。図１３中、「Ｐ」は細胞膜局在シグナルを示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰを示し、「Ｌ１」はリンカーを示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示す。
【０１０２】
（３）蛍光ＩＰ３センサー発現サポニン穿孔細胞の作成および蛍光イメージング法による解析
続いて、実施例１（４）［４−２］と同様の手法に基づいて、本実施例３（２）で得られた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）が発現した細胞から蛍光ＩＰ３センサー発現サポニン穿孔細胞を得て、終濃度が３０ｎＭまたは１００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡまたはＦ−ＬＬを作用させた他は、実施例１（４）［４−３］と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡまたはＦ−ＬＬを作用させた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）発現サポニン穿孔細胞における４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比を算出した。その結果を図１４および図１５に示す。
【０１０３】
図１４に示すように、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）が発現したサポニン穿孔細胞に１００ｎＭのＦ−ＡＤＡを作用させることにより、４８０ｎｍ蛍光が約２０％低下するとともに５３５ｎｍ蛍光が７０％上昇（１．７倍に上昇）し（図１４Ａ）、その結果、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が約５０％低下した（図１４Ｂ）。また、図１５に示すように、Ｆ−ＬＬでも同様の蛍光比の変化が認められ（図１５Ａ）、１００ｎＭのＦ−ＬＬによる４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が約２０％低下した（図１５Ｂ）。蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）とＩＰ３との反応による蛍光比の変化は約１５％である（Ｔａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：８９１０−８９１７，２００９）のに対し、蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）とＦ−ＡＤＡとの反応による蛍光比の変化は約１５０％（１．５倍）であった（図１４Ｂ）。これらのことから、一種類の蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）およびＩＰ３受容体のリガンド結合部を有する蛍光ＩＰ３センサー、ならびに蛍光競合物質を備えた、蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）および蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用するＩＰ３測定ＦＲＥＴ分子センサーを構築できることが示された。
【０１０４】
＜実施例４＞蛍光競合物質が被検物質ＩＰ３と競合してＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合ないし解離するか否かの検討
蛍光競合物質が被検物質ＩＰ３と競合してＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合ないし解離するか否かを確認する試験を、下記の手順に従って行った。
【０１０５】
実施例３（３）で作成した蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）が発現したサポニン穿孔細胞に、終濃度が３０ｎＭもしくは１００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡを作用させた後に１０μＭのＩＰ３を作用させ、または、終濃度が１００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＬＬを作用させた後に終濃度が０．１μＭ、１μＭないし１０μＭとなるように段階的にＩＰ３を作用させた他は、実施例１（４）［４−３］と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡおよびＩＰ３、ならびにＦ−ＬＬおよびＩＰ３を作用させた蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ＬｖＩＩＳＶｄ）発現サポニン穿孔細胞における４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光比を算出した。その結果を図１６および図１７に示す。
【０１０６】
図１６に示すように、親和性がＩＰ３の約１５０倍である蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡを作用させると、Ｆ−ＡＤＡが結合して４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が下降した。その後、実験チャンバー内を洗浄したが、Ｆ−ＡＤＡの解離が極めて遅いため、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比の変化はごくわずかであった。続いて、ＩＰ３を添加することによりＦ−ＡＤＡの解離が促進され、その結果、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比は急速に上昇した。一方、図１７に示すように、親和性が低い蛍光競合物質Ｆ−ＬＬを作用させた場合において、Ｆ−ＬＬの存在下でＩＰ３を添加することによってＦ−ＬＬおよびＩＰ３の競合が起こり、ＩＰ３の濃度に依存して４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比は上昇した。これらの結果から、蛍光競合物質が被検物質ＩＰ３と競合してＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合ないし解離することが示された。
【０１０７】
＜実施例５＞担体固定化ＩＰ３測定ＦＲＥＴ分子センサーの検討
実施例３において、一種類の蛍光タンパク質およびＩＰ３受容体のリガンド結合部を有する蛍光ＩＰ３センサー、ならびに蛍光競合物質を備えた、蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）および蛍光競合物質が引き起こすＦＲＥＴを利用するＩＰ３測定ＦＲＥＴ分子センサーを構築できることが示された。そこで、当該蛍光ＩＰ３センサーを担体に固定化し、これと蛍光競合物質との組み合わせにより、担体に固定化したＩＰ３を測定したＦＲＥＴ分子センサーを構築できるか否かを検討した。
【０１０８】
（１）担体固定化蛍光ＩＰ３センサーの作成
［１−１］蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子の作成
先ず、実施例２（１）のＭＰ−ＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＭＰ−ＬｖＩＩＳ）（図８）発現プラスミド（配列番号２４）を制限酵素ＳａｃＩにより切断し、小胞体局在ドメインＭＰを除去した後に再結合させて、細胞質型蛍光ＩＰ３センサーであるｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ｃｙＬｖＩＩＳ）発現プラスミド（配列番号３０）を作成した。続いて、作成したｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ｃｙＬｖＩＩＳ）発現プラスミドを制限酵素ＳｍａＩとＨｉｎｃＩＩにより切断、再結合させてＶｅｎｕｓ遺伝子を除去することにより、１つの蛍光タンパク質を備えた細胞質型蛍光ＩＰ３センサーであるｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子（配列番号３１）を作成した。ｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）遺伝子の作成手順を図１８に示す。図１８中、「ＥＲＴ」は小胞体結合遺伝子配列を示し、「ＨｉｓＴａｇ」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示し、「Ｃｅｒｕｌｅａｎ」は青色蛍光タンパク質Ｃｅｒｕｌｅａｎの遺伝子配列を示し、「ＬＢＤ」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の遺伝子配列を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの遺伝子配列を示し、「ＥＣＦＰ」は青色蛍光タンパク質ＥＣＦＰの遺伝子配列を示す。
【０１０９】
［１−２］ビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）の作成
次に、実施例１（４）［４−１］と同様の手法に基づいて、ｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）発現プラスミドを細胞内に導入して、蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）が発現した細胞を作成した。蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）の構成を図１９に示す。図１９中、「６Ｈ」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなる精製用のタグペプチドを示し、「Ｃｅｒｕｌｅａｎ」は青色蛍光タンパク質Ｃｅｒｕｌｅａｎを示し、「Ｌ１Ｈ１」はリンカー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＥＡＡＡＲＳＲ）；配列番号３２）を示し、「ＩＰ３Ｒ２（１−６０４）ｗｉｔｈ  Ｒ４４０Ｑ」はラット２型ＩＰ３受容体のリガンド結合部に親和性を高めるアミノ酸変異Ｒ４４０Ｑを入れたペプチド、すなわちラット２型ＩＰ３受容体のＮ末端から１〜６０４番のアミノ酸配列からなるペプチドであってその配列の４４０番のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）へ変異させたペプチドを示す。
【０１１０】
続いて、実施例１（４）［４−２］と同様の手法に基づいて、得られた蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）が発現した細胞をサポニンで穿孔し、その上清にＴａｌｏｎビーズ（タカラバイオ社）を加えて２時間インキュベートすることによりビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）を作成した。さらに、セルタックを塗布した実験チャンバーにこのビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）を接着させ、蛍光倒立顕微鏡ＴＥ２０００（ニコンインステック社）およびＥＭ−ＣＣＤカメラＣ９１００−１３を用いて蛍光像を撮影した後、終濃度が１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭまたは３００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡ、蛍光競合物質Ｆ−ＬＬまたはＦＩＴＣを作用させ、実施例１（３）［３−２］のイメージングシステム（浜松ホトニクス社）を用いて蛍光変化率を算出した。その結果を図２０に示す。
【０１１１】
図２０に示すように、Ｆ−ＬＬまたはＦ−ＡＤＡを作用させた場合、濃度依存的な蛍光比の変化が認められ、Ｆ−ＬＬおよびＦ−ＡＤＡによる最大蛍光変化率はそれぞれ６０％（１．６倍）と７５％（１．７５倍）であった（図２０ＡおよびＢ）。これらに対し、ＩＰ３受容体と結合しないＦＩＴＣを加えても蛍光変化率は０に近い値であった（図２０Ｄ）。これらのことから、担体固定化蛍光ＩＰ３センサーであるビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）は、蛍光競合物質との特異的な結合によって４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が変化することが明らかになった。さらにこの定量的解析によって、従来の蛍光ＩＰ３センサーＬＩＢＲＡｖＩＩＳ（ＬｖＩＩＳ）およびＩＰ３による４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比の変化の約１０倍という大きな反応が起こることが明らかになった。
【０１１２】
（２）蛍光競合物質が被検物質ＩＰ３と競合して担体固定化蛍光ＩＰ３センサーのＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合ないし解離するか否かの検討
蛍光競合物質が被検物質ＩＰ３と競合して担体固定化蛍光ＩＰ３センサーのＩＰ３受容体のリガンド結合部と結合ないし解離するか否かを確認する試験を、下記の手順に従って行った。
本実施例５（１）で作成した担体固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）に、終濃度が１００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＬＬを作用させた後に終濃度が０．１μＭ、１μＭないし１０μＭとなるように段階的にＩＰ３を作用させた他は、実施例１（４）［４−３］と同様の手法に基づいて、Ｆ−ＬＬおよびＩＰ３を作用させた担体固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）における４８０ｎｍの蛍光と５３５ｎｍの蛍光の蛍光比および蛍光変化率を算出した。その結果を図２１に示す。
【０１１３】
図２１に示すように、ビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）に１００ｎＭのＦ−ＬＬを作用させると４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が低下し、その後ＩＰ３を加えるとＦ−ＬＬおよびＩＰ３の競合によってビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）およびＦ−ＬＬの結合が阻害され、ＩＰ３濃度に依存して４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が上昇した（図２１Ａ）。すなわち、Ｆ−ＬＬおよびＩＰ３を含む試料をビーズ固定化蛍光ＩＰ３センサーｃｙＬＩＢＲＡｖＩＩＳＶｄ（ｃｙＬｖＩＩＳＶｄ）に作用させた場合に、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比の上昇率からＩＰ３濃度を測定できることが示された。競合するリガンドの結合はそれぞれの濃度に依存することから、Ｆ−ＬＬ濃度を低下させることによってより低濃度のＩＰ３測定が可能になると考えられ、３０ｎＭのＦ−ＬＬおよび１００ｎＭのＦ−ＬＬをそれぞれ作用させ、さらにＩＰ３を作用させることにより比較したところ、その通りに、すなわち低濃度のＦ−ＬＬを作用させ、さらにＩＰ３を作用させることによりＩＰ３による蛍光変化率は大きくなった（図２１Ｂ）。これらの結果から、担体固定化蛍光ＩＰ３センサーおよび蛍光競合物質を有する担体固定化ＩＰ３測定ＦＲＥＴ分子センサーによれば、精度の高いＩＰ３測定が可能になることが示された。
【０１１４】
＜実施例６＞ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸配列改変の検討および蛍光ＩＰ３センサーにおける蛍光物質の検討
ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸配列に１〜十数個のアミノ酸が付加、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質がＩＰ３受容体のリガンド結合部として機能するか否か、および蛍光ＩＰ３センサーにおいて、蛍光タンパク質の代わりに有機蛍光化合物を蛍光物質として用いることができるか否かを同時に検討した。
【０１１５】
（１）ＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質発現遺伝子の作成
蛍光タンパク質の代わりにシステイン結合性蛍光有機化合物であるＮ−［４−メチル−７−（ジメチルアミノ）クマリン−３−イル］マレインイミド（ＤＡＣＭ）を用いることを目的として、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の上流に位置するアミノ酸８２番と８３番との間にＬｕｍｉｏＴａｇ（ＬＴ、ＣＣＰＧＣＣ、配列番号３３）を挿入したＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、ラット１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の上流に位置するアミノ酸１４０番と１４１番との間にＬｕｍｉｏＴａｇを挿入したＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、および当該挿入したＬｕｍｉｏＴａｇを除去したＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓを、以下の手順に従ってそれぞれ作成した。
【０１１６】
［１−１］Ｌｈｂ−ｍａ遺伝子の作成
先ず、膜結合ドメイン、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグおよびＬｕｍｉｏＴａｇを含む１２個のアミノ酸からなるペプチド鎖をマウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部に付加または挿入したＬｈｂ−ｍａ（配列番号３４）を作成した。具体的には、膜結合ドメイン、ＦＬＡＧタグおよびヒスチジンタグを付加し、かつＬｕｍｉｏＴａｇをマウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の上流に位置するアミノ酸８２番と８３番との間、およびアミノ酸１４０番と１４１番との間に挿入した遺伝子配列を有するＬｈｂ−１プラスミド（配列番号３５）をＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社に依頼して合成し、得られたＬｈｂ−１プラスミドおよび実施例２（１）のＬＩＢＲＡｖＩＩＩ（ＬｖＩＩＩ）プラスミド（配列番号２２）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩにより切断した後、Ｌｈｂ−１遺伝子を含むＤＮＡ断片をＬＩＢＲＡｖのベクターに挿入することによりＬｈｂ−ｍａ遺伝子を作成した。
【０１１７】
［１−２］ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）遺伝子の作成
本実施例６（１）［１−１］で得られたＬｈｂ−ｍａ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＮｒｕ１により切断した後、再結合することにより、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部上流のＬｕｍｉｏＴａｇを除去した。これによって、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸８２番と８３番との間、およびアミノ酸１４０番と１４１番との間にＬｕｍｉｏＴａｇを含むＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）遺伝子が得られた。
【０１１８】
［１−３］ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ遺伝子、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ遺伝子、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ遺伝子の作成
本実施例６（１）［１−２］で得られたＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）遺伝子を制限酵素ＳｃａＩで切断した後、再結合することにより、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸８２番と８３番との間のＬｕｍｉｏＴａｇを除去した。これによって、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸１４０番と１４１番との間にＬｕｍｉｏＴａｇを含むＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ遺伝子（配列番号３６）が得られた。
【０１１９】
次に、本実施例６（１）［１−２］で得られたＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）遺伝子を制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩで切断した後、再結合することにより、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸１４０番と１４１番との間のＬｕｍｉｏＴａｇを除去した。これによって、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸８２番と８３番との間にＬｕｍｉｏＴａｇを含むＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ（配列番号３７）遺伝子が得られた。
【０１２０】
続いて、得られたＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ遺伝子を制限酵素ＳｃａＩで切断した後、再結合することにより、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸８２番と８３番との間のＬｕｍｉｏＴａｇを除去した。これによって、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部にＬｕｍｉｏＴａｇを含まないＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ遺伝子（配列番号３８）が得られた。ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ遺伝子、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ遺伝子、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ遺伝子の作成手順を図２２に示す。図２２中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合遺伝子配列を示し、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧタグの遺伝子配列を示し、「ＬＴ」および「ＬＴ」はＬｕｍｉｏＴａｇの遺伝子配列を示し、「Ｅ１」はＳｃａＩ切断サイトを示し、「Ｅ２」はＥｃｏ４７ＩＩＩ切断サイトを示し、「１−８２−Ｅ１−ＬＴ−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−ＬＴ−Ｅ２−１４１−６０４」、「１−８２−Ｅ１−ＬＴ−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」、「１−８２−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−ＬＴ−Ｅ２−１４１−６０４」および「１−８２−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質の遺伝子配列を示し、「Ｈｘ６」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示す。
【０１２１】
（２）蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ発現サポニン穿孔細胞の作成および蛍光イメージング法による解析
続いて、実施例１（４）［４−１］と同様の手法に基づき、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓのそれぞれの発現プラスミドを細胞内に導入することによりＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓがそれぞれ発現した細胞を作成した後、実施例１（４）［４−２］と同様の手法に基づき、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓがそれぞれ発現した細胞からそれぞれのサポニン穿孔細胞を得た。得られたそれぞれのサポニン穿孔細胞に対し、システイン結合性蛍光有機化合物であるＮ−［４−メチル−７−（ジメチルアミノ）クマリン−３−イル］マレインイミド（ＤＡＣＭ）２μＭにて処理を２分間行い、ＤＡＣＭが結合した蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓを細胞膜上に発現させた。これら蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ発現サポニン穿孔細胞に対し、終濃度が１００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡを作用させた他は、実施例１（４）［４−３］と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡを作用させた蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｓ、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ、およびＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ発現サポニン穿孔細胞における４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光強度、ならびに４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比を算出した。その結果を図２３に示す。
【０１２２】
図２３に示すように、ＤＡＣＭから蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡへのＦＲＥＴによって、４８０ｎｍの蛍光が３〜５倍に増加し、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が大きく低下した。このことから、ＩＰ３受容体のリガンド結合部のアミノ酸配列に１〜数十個のアミノ酸が付加、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質がＩＰ３受容体のリガンド結合部として機能し、かつ蛍光ＩＰ３センサーにおいて、蛍光タンパク質の代わりに有機蛍光化合物を蛍光物質として用いることができることが示された。
【０１２３】
ＤＡＣＭはシステインに結合することによって蛍光物質に変化する化合物であり、また、ＬｕｍｉｏＴａｇは４個のシステイン残基を含むペプチドであることから、ＤＡＣＭはＬｕｍｉｏＴａｇに結合し得る。しかし、ＬｕｍｉｏＴａｇを除去したＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓにおいても反応が見られたことから、Ｆ−ＡＤＡとのＦＲＥＴに関与するＤＡＣＭは、挿入したＬｕｍｉｏＴａｇを除くＩＰ３受容体のリガンド結合部中のシステインに結合したことが示された。また、ＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓには、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の２５３番，２９２番，３２６番，３９４番，５３０番，５５３番および５５６番に該当する、計７個のシステイン残基が存在する（Ｂｏｓａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：６９６−７００，２００２）ことが知られていることから、これらに有機蛍光化合物を結合させても蛍光ＩＰ３センサーとしての機能が失われないことが示された。
【０１２４】
さらに、ＩＰ３受容体では、そのＮ末端側７００個程度のアミノ酸によってリガンド結合部が構成されている。例えば、Ｎ末端の７３４個のアミノ酸と比較して、そのＮ末端側の１〜３１番，１〜６２番，１〜１４６番，１〜１６２番，１〜１８３番，１〜１９９番，１〜２１５番のアミノ酸を除去した場合のＩＰ３結合能は大きく低下するが消失はしない。さらに１〜２２０番，１〜２２３番，１〜２２５番のアミノ酸を除去すると結合能が回復するが、１〜２２８番，１〜２３８番，１〜２６１番，１〜２８３番，１〜３０７番のアミノ酸を除去すると結合能が消失する。また、５７９〜６４９番のアミノ酸を除去しても結合能は変化しないが、５６８〜６４９番のアミノ酸を除去すると結合能は消失する。さらに、２２４〜５７９番のペプチド鎖のＩＰ３結合親和性は１〜７３４番のペプチド鎖のＩＰ３結合親和性と比較して約１０倍であることが知られており（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８２７７−１８２８４，１９９６）、アミノ酸２２４〜５７９番がリガンド結合部として必須であり、ｃｏｒｅドメインと呼ばれている。また、２４１番のアルギニン（２４１Ｒ）、２４９番のリシン（２４９Ｋ）、２６５番のアルギニン（２６５Ｒ）、２６９番のアルギニン（２６９Ｒ）、５０４番のアルギニン（５０４Ｒ）、５０６番のアルギニン（５０６Ｒ）、５０８番のリシン（５０８Ｋ）、５１１番のアルギニン（５１１Ｒ）、５６８番のアルギニン（５６８Ｒ）、および５６９番のリシン（５６９Ｋ）の１０個のアミノ酸が必須であり、これらを変異させることによってＩＰ３結合能が消失することが知られている（Ｂｏｓａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：６９６−７００，２００２；およびＹｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８２７７−１８２８４，１９９６）。
【０１２５】
一方、それ以外のアミノ酸は置換が可能であり、これまでに、１００番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ１００Ｑ）、１０１番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ１０１Ｑ）、２３５番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ２３５Ｑ）、２５７番のアルギニンをグルタミンへ、２５８番のリシンをグルタミンへ、および２５９番のリシンをグルタミンへ置換（Ｒ２５７Ｑ／Ｋ２５８Ｑ／Ｋ２５９Ｑ）、２９３番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ２９３Ｑ）、３０４番のアルギニンをグルタミンへ、および３０６番のリシンをグルタミンへ置換（Ｒ３０４Ｑ／Ｋ３０６Ｑ）、３５０番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ３５０Ｑ）、３７６番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ３７６Ｑ）、４１２番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ４１２Ｑ）、４２４番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ４２４Ｑ）、４２７番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ４２７Ｑ）、４５９番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ４５９Ｑ）、４７０番および４７１番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ４７０Ｑ／Ｒ４７１Ｑ）、５０１番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ５０１Ｑ）、５３７番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ５３７Ｑ）、５４５番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ５４５Ｑ）、５５４番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ５５４Ｑ）、５６１番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ５６１Ｑ）、５７６番のリシンをグルタミンへ置換（Ｋ５７６Ｑ）、６０３番のアルギニンをグルタミンへ、および６０４番のリシンをグルタミンへ置換（Ｒ６０３Ｑ／Ｋ６０４Ｑ）、６２３番のアルギニンをグルタミンへ、および６２４番のリシンをグルタミンへ置換（Ｒ６２３Ｑ／Ｋ６２４Ｑ）、６２６番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ６２６Ｑ）、６２９番のアルギニンをグルタミンへ置換（Ｒ６２９Ｑ）することによってはＩＰ３結合の活性は大きく変化しないことが知られている（Ｂｏｓａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１７：１９３−２０３，２００５）。
【０１２６】
さらにＮ末端の６０４個のアミノ酸で構成されるＩＰ３受容体のリガンド結合部において調べた場合、３０番のロイシンをリシンへ置換（Ｌ３０Ｋ）、３２番のロイシンをリシンへ置換（Ｌ３２Ｋ）、３３番のバリンをリシンへ置換（Ｖ３３Ｋ）、３４番のアスパラギン酸をリシンへ置換（Ｄ３４Ｋ）、３６番のアルギニンをグルタミン酸へ置換（Ｒ３６Ｅ）、５４番のアルギニンをグルタミン酸へ置換（Ｒ５４Ｅ）、１２７番のリシンをグルタミン酸へ置換（Ｋ１２７Ｅ）、５４番のアルギニンをグルタミン酸へ、および１２７番のリシンをグルタミン酸へ置換（Ｒ５４Ｅ／Ｋ１２７Ｅ）、ならびに６７〜１０８番の除去することによってＩＰ３結合親和性が上昇し、Ｋｄ値が３０〜９０％低下するのに対し、３５番のアスパラギン酸をリシンへ置換（Ｄ３５Ｋ）、５１番のリシンをグルタミン酸へ置換（Ｋ５１Ｅ）、５２番のリシンをグルタミン酸へ置換（Ｋ５２Ｅ）、９７番のアスパラギン酸をリシンへ置換（Ｄ９７Ｋ）、９９番のグルタミン酸をリシンへ置換（Ｅ９９Ｋ）、１０４番のグルタミン酸をリシンへ置換（Ｅ１０４Ｋ）、１０６番のグルタミン酸をリシンへ置換（Ｅ１０６Ｋ）、９７番のアスパラギン酸および９９番のグルタミン酸をいずれもリシンへ置換（Ｄ９７Ａ／Ｅ９９Ａ）、１０４番および１０６番のグルタミン酸をリシンへ置換（Ｅ１０４Ｋ／Ｅ１０６Ｋ）することによっては、ＩＰ３結合親和性は５０〜８０％に低下する。
【０１２７】
以上のように、２４１番のアルギニン（２４１Ｒ）、２４９番のリシン（２４９Ｋ）、２６５番のアルギニン（２６５Ｒ）、２６９番のアルギニン（２６９Ｒ）、５０４番のアルギニン（５０４Ｒ）、５０６番のアルギニン（５０６Ｒ）、５０８番のリシン（５０８Ｋ）、５１１番のアルギニン（５１１Ｒ）、５６８番のアルギニン（５６８Ｒ）、および５６９番のリシン（５６９Ｋ）の１０個の必須アミノ酸以外については、アミノ酸の除去や置換を行ってもＩＰ３受容体のリガンド結合部の機能が損なわれないといえる。さらに、マウス１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の４４１番のアルギニンをグルタミンへ置換すること（Ｒ４４１Ｑ）は、ＩＰ３結合親和性を大きく高めるが、同じ置換（Ｒ４４１Ｑ）をマウス２型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の４４１番で行っても、同様の親和性の上昇が起こることから（Ｔａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：８９１０−８９１７，２００９）、ＩＰ３受容体のサブタイプや動物種にかかわらず、１０個の必須アミノ酸以外は変異が可能であると考えられる。
【０１２８】
＜実施例７＞ＩＰ３受容体のリガンド結合部にＥＣＦＰの円順列置換体を挿入した蛍光ＩＰ３センサーの検討
実施例６の結果から、ＩＰ３受容体のリガンド結合部の内部にペプチド鎖を挿入しても、ＩＰ３受容体のリガンド結合部の機能は損なわれなかったことから、ＩＰ３受容体のリガンド結合部の内部に蛍光タンパク質であるＥＣＦＰの円順列置換体を挿入した蛍光ＩＰ３センサーについて検討するとともに、蛍光競合物質との組み合わせにより担体固定化ＩＰ３測定ＦＲＥＴ分子センサーの構築可能か否かについて検討した。
【０１２９】
（１）蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７、ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９の作成
実施例６（１）［１−３］で作成したＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓのリガンド結合部のアミノ酸８２番と８３番との間に、ＥＣＦＰの円順列置換体である蛍光タンパク質ｃｐＳＥＣＦＰ１５７、ｃｐＳＥＣＦＰ１７３、およびｃｐＳＥＣＦＰ２２９（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０１：１０５５４−１０５５９，２００４）を挿入した。具体的には、ｃｐＳＥＣＦＰ１５７、ｃｐＳＥＣＦＰ１７３、およびｃｐＳＥＣＦＰ２２９を発現するベクター（配列番号３９〜４１）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｃａ１（ＳｎａＩ）で切断して各蛍光タンパク質遺伝子を精製した。精製した各蛍光タンパク質遺伝子を、ＳｃａＩで切断したＯＰ１−ｍａ（ＥＮ）−Ｅ−Ｓ発現プラスミドに挿入して、蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９発現プラスミド（配列番号４２〜４４）を作成した。ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７遺伝子，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３遺伝子およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９遺伝子の作成手順を図２４に示す。図２４中、「→」はベクター遺伝子の一部を示し、「ＭＴ」は膜結合遺伝子配列を示し、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧタグの遺伝子配列を示し、「Ｅ１」はＳｃａＩ切断サイトを示し、「Ｅ２」はＥｃｏ４７ＩＩＩ切断サイトを示し、「１−８２−Ｅ１−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」はＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質の遺伝子配列を示し、「Ｈｘ６」は６個の連続するヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）残基からなるタグペプチドの遺伝子配列を示し、「ｃｐＳＥＣＦＰ１５７」、「ｃｐＳＥＣＦＰ１７３」および「ｃｐＳＥＣＦＰ２２９」はそれぞれＥＣＦＰの円順列置換体である蛍光タンパク質ｃｐＳＥＣＦＰ１５７、ｃｐＳＥＣＦＰ１７３、およびｃｐＳＥＣＦＰ２２９の遺伝子配列を示し、「１−８２−ｃｐＳＥＣＦＰ１５７−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」、「１−８２−ｃｐＳＥＣＦＰ１７３−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」、および「１−８２−ｃｐＳＥＣＦＰ２２９−８３−１４０−Ｅ２−１４１−６０４」はそれぞれＥＣＦＰの円順列置換体である蛍光タンパク質ｃｐＳＥＣＦＰ１５７、ｃｐＳＥＣＦＰ１７３、およびｃｐＳＥＣＦＰ２２９をＩＰ３受容体のリガンド結合部の改変タンパク質へ挿入した遺伝子配列を示す。
【０１３０】
（２）蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９発現サポニン穿孔細胞の作成および蛍光イメージング法による解析
続いて、実施例１（４）［４−１］と同様の手法に基づき、蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７、蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、および蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９のそれぞれの発現プラスミドを細胞内に導入することにより蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９がそれぞれ発現した細胞を作成した後、実施例１（４）［４−２］と同様の手法に基づき、蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９がそれぞれ発現した細胞からそれぞれのサポニン穿孔細胞を得た。終濃度が１００ｎＭとなるように蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡを作用させた他は、実施例１（４）［４−３］と同様の手法に基づいて、それぞれ蛍光競合物質Ｆ−ＡＤＡを作用させた蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９発現サポニン穿孔細胞における４８０ｎｍの蛍光および５３５ｎｍの蛍光の蛍光強度、ならびに４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比を算出した。その結果を図２５に示す。
【０１３１】
図２５に示すように、これら蛍光ＩＰ３センサーＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１５７，ＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ１７３、およびＯＰ１Ｓ−ｃｐＣ２２９が機能することが確認された。このことから、蛍光タンパク質をＩＰ３受容体のリガンド結合部の内部に挿入することが可能であることが示された。なお、ラット１型ＩＰ３受容体のリガンド結合部の場合は、ループを形成しているＮ末端側の１〜１３番，２３〜２４番，３０〜３６番，４０〜５１番，６１〜６６番，７６〜８６番，１０９〜１１９番，１２６〜１２９番，１４０〜１４６番，１５３〜１５６番，１６０番，１６６〜１８０番，１８７〜１９２番，２００〜２０６番，２１２〜２１６番，２２５番，２２９〜２３８番，２４５〜２４８番，２５７〜２５９番，２６６〜２７７番，２８１番，２８７〜３０１番，３０８〜３１２番，３１９〜３５２番，３５９〜３６３番，３６６番，３７３〜３８６番，３９３〜３９６番，４０６〜４１４番，４２２〜４３０番，４３５〜４３６番，４６３〜４６６番，４８５〜５０３番，５１３〜５１４番，５２４〜５５１番，５６４〜５６７番，５７３〜５７９番のアミノ酸において、蛍光タンパク質を挿入できることが示唆される（Ｂｏｓａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：６９６−７００，２００２；Ｂｏｓａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１７：１９３−２０３，２００５；およびＴａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０９０４−３０９０８，１９９６）。
【０１３２】
＜実施例８＞蛍光物質および抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して対象とする抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質を備えた被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーの構築、および競合的蛍光抗原アッセイ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｓｓａｙ：ＣＦＡＡ）の構築
蛍光物質および抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して対象とする抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質を備えた被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーを構築して、競合的蛍光抗原アッセイ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｓｓａｙ：ＣＦＡＡ）の構築を試みた。
【０１３３】
（１）ＦＩＴＣによりＣＴ２−１８を蛍光修飾して得られる蛍光ペプチドＦ−ＣＴ２−１８の作成
ヒトＩＰ３受容体のパラログであるヒト２型ＩＰ３受容体（ヒトＩＰ３Ｒ２）のＣ末端、２６８５〜３００１番の１８アミノ酸ＣＧＦＬＧＳＮＴＰＨＶＮＨＨＭＰＰＨで構成されるペプチドであるＣＴ２−１８（配列番号４５）をＦＩＴＣにより蛍光修飾して得られる蛍光ペプチド（Ｆ−ＣＴ２−１８）は、ＣＴ２−１８と競合し、かつＣＴ２−１８を抗原として作成した抗体（ＡＢｓＩＩ）のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合する蛍光競合物質である。抗体の作成に使用した抗原ペプチドＣＴ２−１８およびＣＴ２−１８のＮ末端にＦＩＴＣによりラベルした蛍光ペプチドＦ−ＣＴ２−１８を、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．のＤｒ．ＣａｂｉｎＪｏｈｎ，ＭＤ（ＵＳＡ）に依頼することにより合成した。
【０１３４】
（２）蛍光物質でラベルした抗体ＡＢｓＩＩ結合アガロースビーズの作成
既報（Ｔａｎｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２７４８８−２７４９３，２０００）に記載されているＣＴ２−１８を抗原として作成した抗体ＡＢｓＩＩに対し、２００μＭのＤＡＣＭを３０分間作用させることにより、蛍光物質ＤＡＣＭでラベルしたＡＢｓＩＩを有する蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーを作成した。具体的には、約１０μｇのＡＢｓＩＩおよび０．０５％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０００μＬに１０μＭのＤＡＣＭを加え、４℃で２時間静置した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアガロースビーズを加え、さらに４℃で２時間静置することによりアガロースビーズに蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーを結合させた後、リン酸緩衝液で洗浄した。蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーを結合させたアガロースビーズを１００μＬのリン酸緩衝液に分散し、ＡからＤのチューブに２０μＬずつ分注した。Ａのチューブにはリン酸緩衝液を、Ｂのチューブには１μＭの蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８を、Ｃのチューブには１μＭの蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８および１μＭの被検物質ＣＴ２−１８を、Ｄのチューブには１μＭの蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８および１０μＭの被検物質ＣＴ２−１８を、それぞれ１００μＬ加え、２時間静置した。
【０１３５】
（３）蛍光イメージング法による解析
これらのアガロースビーズ結合蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーおよび蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８の作用による蛍光を、実施例１（３）［３−２］のイメージングシステム（浜松ホトニクス社）を用いて測定して、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比を算出した。その結果を図２６に示す。図２６Ａはアガロースビーズ結合蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーをリン酸緩衝液で洗浄後に蛍光測定を行った結果であり、図２６Ｂはアガロースビーズ結合蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーを洗浄せずに蛍光測定を行った結果である。
【０１３６】
図２６Ａに示すように、蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーにおけるＤＡＣＭおよび蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８のＦＲＥＴにより、４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比が８５％低下した。このＦＲＥＴによる蛍光変化はＣＴ２−１８の濃度に依存して回復し、蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８の１０倍量に該当する被検物質ＣＴ２−１８の添加により蛍光比が５倍に増大した。また、図２６Ｂに示すように、アガロースビーズ結合蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーを洗浄せずに同様の蛍光測定を行った場合、溶液中の蛍光の影響を受けるため、蛍光ＡＢｓＩＩ−ＣＴ２−１８センサーにおけるＤＡＣＭおよび蛍光競合物質Ｆ−ＣＴ２−１８の蛍光変化は若干小さくなるものの、被検物質ＣＴ２−１８の添加による４８０ｎｍ／５３５ｎｍ蛍光比の回復を十分に確認することができた。
【０１３７】
以上の結果から、蛍光物質および抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分を有する蛍光被検物質センサー、ならびに被検物質と競合して対象とする抗体のパラトープ含有ポリペプチド部分と特異的に結合ないし解離しかつ蛍光修飾された物質を備えた被検物質測定ＦＲＥＴ分子センサーを構築して、競合的蛍光抗原アッセイ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｓｓａｙ：ＣＦＡＡ）を構築することができることが示された。
【０１３８】
＜実施例９＞蛍光物質でラベルしたニコチン性アセチルコリン受容体およびＦＩＴＣによりラベルしたニコチン性アセチルコリンの組み合わせからなるＦＲＥＴ分子センサーの検討
細胞膜表面のニコチン性アセチルコリン受容体を蛍光物質でラベルし、ＦＩＴＣによりラベルしたニコチン性アセチルコリンである蛍光競合物質を用いることにより、生体内のアセチルコリン濃度を測定することができる。
【０１３９】
＜実施例１０＞抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いた固相化ＦＲＥＴ分子センサー
（１）蛍光被験物質センサーの作製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＳ社製  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｇａｌｏｓｅ）溶液１００μＬに、抗ｃＭｙｃモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍＬ）２５μＬを加え、４℃で２時間インキュベートして、ビーズに抗体を結合させた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で抗体ビーズを洗浄後、４００μＬの抗体ビーズ溶液に対して８μＬの１０ｍＭ  ＤＡＣＭを加えて４℃で３０分間インキュベートした（最終濃度２００μＭ）。その後、５０μＭのシステインを加えて反応を停止して、ＤＡＣＭでラベルされた抗ｃ−Ｍｙｃ抗体がビーズに固相化された蛍光被験物質センサーを作製した。
【０１４０】
（２）ＦＩＴＣでラベルされたｃ−Ｍｙｃペプチドの作製
２ｍＭのｃ−Ｍｙｃペプチド（アミノ酸配列：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号４６）溶液１００μＬ（２４０μｇ）にＦＩＴＣラベル試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ）５μＬを加え、４℃、１０分間のインキュベーションによりペプチドをＦＩＴＣラベルした。その後、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を５μＬ（５００μｇ）加え、２０分間のインキュベーションによって、余剰のラベル試薬をＢＳＡと反応させた。その後、限外濾過によって分子量＜５０Ｋｄの蛍光ペプチド（ＦＩＴＣ−ｃＭｙｃ）を回収することで、蛍光競合物質を作製した。
【０１４１】
（３）非固相化蛍光被験物質センサーの作製
２５μｇの抗ｃＭｙｃモノクローナル抗体を含むＰＢＳ  ４００μＬに対して８μＬの１０ｍＭ  ＤＡＣＭを加えて４℃で３０分間インキュベートした。その後、５０μＭのシステインで反応を停止して、限外濾過によって分子量＜５０Ｋｄの画分を除去し、ＤＡＣＭでラベルされた抗ｃ−Ｍｙｃ抗体である蛍光被験物質センサーを作製した。
【０１４２】
（４）蛍光イメージング法による解析
０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳに（１）及び（３）で作製した蛍光被験物質センサーをそれぞれ加え、（２）で作製した蛍光競合物質２０μＭを、または蛍光競合物質２０μＭと被験物質（ＦＩＴＣでラベルされていないｃ−Ｍｙｃペプチド）４００μＭとを加え、２時間反応させた。それぞれの反応溶液５μＬをカバーガラスに滴下し、×２０の対物レンズを装着した蛍光イメージング・システム（実施例１、（４）、［４−３］参照）を用いて、４２５ｎｍの励起による、４８０ｎｍと５３５ｎｍの蛍光イメージを記録し、その蛍光比（４８０ｎｍ／５３５ｎｍ）を測定した。その結果を図２７に示す。左のグラフが固相化された蛍光被験物質センサーを用いたときの、右のグラフが固相化されていない蛍光被験物質センサーを用いたときの蛍光比である。
【０１４３】
図２７に示すように、ＤＡＣＭからＦＩＴＣへのＦＲＥＴによる４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光比は、被験物質の存在により上昇した。特に、固相化された蛍光被験物質センサーを備えるＦＲＥＴ分子センサーの方が明確に上昇する、すなわち感度が優れることが確認された。
【０１４４】
＜実施例１１＞抗ＤＹＫ抗体を用いたＦＲＥＴ分子センサー
（１）蛍光被験物質センサーの作製
実施例１０の（１）と同様にして、ＤＡＣＭでラベルされた抗ＤＹＫ抗体がビーズに固相化された蛍光被験物質センサーを作製した。
【０１４５】
（２）ＦＩＴＣでラベルされたＤＹＫペプチドの作製
Ｕｎｉｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社に依頼して、ＦＩＴＣでラベルされたＤＹＫペプチド（アミノ酸配列：ＧＤＹＫＤＤＤＤＫＣＣＰＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＨＨＨＨＨＨ、配列番号４７、ＦＴ１と表す）を蛍光競合物質として作製した。また被験物質として蛍光ラベルされていないＤＹＫペプチド（ＦＴ２）を作製した。
【０１４６】
（３）蛍光イメージング法による解析
実施例１０の（４）と同様にして、ＤＡＣＭでラベルされた抗ＤＹＫ抗体がビーズに固相化された蛍光被験物質センサーと蛍光競合物質であるＦＴ１  ０．４μＭ、またはＦＴ１  ０．４μＭと被験物質４．０μＭとを反応させ、蛍光イメージング・システムを用いて蛍光比（４８０ｎｍ／５３５ｎｍ）を測定した。その結果を図２８に示す。
【０１４７】
図２８に示すように、ＤＡＣＭからＦＩＴＣへのＦＲＥＴによる４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光比は、被験物質の存在により上昇した。
【０１４８】
実施例１０及び実施例１１の結果から、特異抗体を被験物質結合部とする固相化された蛍光被験物質センサーおよび蛍光競合物質を備えたＦＲＥＴ分子センサーは、その抗体の特異的抗原の検出に利用することができることが確認された。
【０１４９】
＜実施例１２＞ヒスチジンタグ付タンパク質検出用ＦＲＥＴ分子センサー
（１）蛍光被験物質センサーの作製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＳ社製  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｇａｌｏｓｅ）溶液１００μＬに、抗タイプ２  ＩＰ３受容体抗体（ＡＢｓＩＩ）を加え４℃で２時間インキュベートし、抗体ビーズを作成した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で抗体ビーズを洗浄後、４００μＬの抗体ビーズ溶液に対して８μＬの１０ｍＭ  ＤＡＣＭを加えて（最終濃度２００μＭ）４℃で３０分間インキュベートした。その後、５０μＭのシステインで反応を停止させた。さらに、８μＬの１０ｍＭのＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｙｌ−ＮＴＡ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）（最終濃度２００μＭ）を加えて４℃で３０分間インキュベートした。その後、５０μＭのシステインで反応を停止させ、さらに１０ｍＭのＮｉＣｌ２を加えて３０分間インキュベーションすることで、ＤＡＣＭで標識され、Ｎｉ−ＮＴＡ錯体を有する蛍光被験物質センサーを作製した。
【０１５０】
（２）蛍光イメージング法による解析
実施例１０の（４）と同様にして、０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳに（１）で作製した蛍光被験物質センサーを加え、実施例１１の（２）で作製したＦＴ１  １００μＭ、又はＦＴ１  １００μＭと被験物質（ＦＴ１と競合するペプチド）であるＦＴ２  １００μＭとを反応させ、蛍光イメージング・システム（対物レンズの倍率は×１０）を用いて蛍光比（４８０ｎｍ／５３５ｎｍ）を測定した。その結果を図２９に示す。
【０１５１】
図２９に示すように、ＤＡＣＭからＦＩＴＣへのＦＲＥＴによる４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光比は、被験物質であるＦＴ２の存在により上昇した。ＦＴ１及びＦＴ２は、いずれもヒスチジンタグを有するペプチドであってＮｉ−ＮＴＡ錯体と結合する一方、ＡＢｓＩＩとは結合しない。このことから、上記の蛍光比の上昇は、ＦＴ１及びＦＴ２と蛍光被験物質センサーに含まれるＮｉ−ＮＴＡ錯体との結合によるものであり、このことはかかる蛍光被験物質センサー及びヒスチジンタグを有するペプチドである蛍光競合物質を備えたＦＲＥＴ分子センサーが、ヒスチジンタグを有するペプチドの検出、定量さらには分離精製にも利用可能であることを意味する。
【０１５２】
＜実施例１３＞抗体分子検出用ＦＲＥＴ分子センサー
（１）ＤＡＣＭでラベルされたビーズの作製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＳ社製  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｇａｌｏｓｅ）溶液４００μＬに対して８μＬの１０ｍＭ  ＤＡＣＭを加えて（最終濃度２００μＭ）４℃で３０分間インキュベートした。その後、５０μＭのシステインを加えて反応を停止して、ＤＡＣＭでラベルされたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズ（ＤＡＣＭ−ＰＧ）を蛍光被験物質センサーとして作製した。
【０１５３】
（２）ＦＩＴＣでラベルされた抗タイプ２  ＩＰ３受容体抗体（ＡＢｓＩＩ）の作製
１００μｇの抗タイプ２  ＩＰ３受容体抗体（ＡＢｓＩＩ）を含むＰＢＳ溶液にＦＩＴＣラベル試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ）５μＬを加え、４℃、１０分間のインキュベーションによりＡＢｓＩＩをＦＩＴＣラベルした。その後、限外濾過によって分子量＜５０Ｋｄの画分を除去し、ＦＩＴＣでラベルされたＡＢｓＩＩ（ＦＩＴＣ−ＡＢｓＩＩ）を回収することで、蛍光競合物質を作製した。
（３）蛍光イメージング法による解析
０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳに（１）で作製した蛍光被験物質センサーを加え、（２）で作製した蛍光競合物質０．１μｇ／ｍＬを、または蛍光競合物質０．１μｇ／ｍＬと被験物質（ＦＩＴＣでラベルされていないＡＢｓＩＩ）０．１μｇ／ｍＬまたは１．０μｇ／ｍＬとを加え、２時間反応させた。それぞれの反応溶液５μＬをカバーガラスに滴下し、×１０の対物レンズを装着した蛍光イメージング・システム（実施例１、（４）、［４−３］参照）を用いて、４２５ｎｍの励起による、４８０ｎｍと５３５ｎｍの蛍光イメージを記録し、その蛍光比（４８０ｎｍ／５３５ｎｍ）を測定した。その結果を図３０に示す。
【０１５４】
図３０に示すように、ＤＡＣＭからＦＩＴＣへのＦＲＥＴによる４８０ｎｍ／５３５ｎｍの蛍光比は、被験物質の量に依存して上昇した。このことから、ＤＡＣＭでラベルされた抗体結合用ビーズである蛍光被験物質センサーおよび蛍光ラベルされた任意の抗体である蛍光競合物質を備えたＦＲＥＴ分子センサーは、被験試料中の抗体分子の検出を検出に利用可能であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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