(57)【要約】 【課題】油脂を原料としてクエン酸を生産することができる微生物を提供すること、およびその微生物を用いたフマル酸の製造方法を提供すること。【解決手段】  フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株を用いることにより、高効率でフマル酸を生産することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株。
【請求項２】
リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１６８９）である、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
油脂を原料としてフマル酸生産能を有する、請求項１または２記載の菌株。
【請求項４】
油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株。
【請求項５】
フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株を、油脂を炭素源として培養する工程を含む、フマル酸の製造方法。
【請求項６】
リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１６８９）である、請求項５記載の分解方法。
【請求項７】
油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
培養工程に用いる培養液に三価の鉄イオンを添加する、請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
フマル酸の生産量が培養液１Ｌあたり８ｇ以上である、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フマル酸生産能を有する微生物、および該微生物を用いるフマル酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フマル酸はジカルボン酸の一種であり、不飽和ポリエステル樹脂や可塑剤製造において、重合反応やエステル化の出発物質としての需要が高い。フマル酸は現在主に化学合成で生産されているが、化石燃料の埋蔵量には限りがある。また、原油高とそれにともなうブタンやベンゼンの高騰が、今後のフマル酸生産のコスト高につながると予測されている。そこで、持続可能な社会を構築するためにも、フマル酸をバイオマスから製造する技術が求められている。
【０００３】
微生物を用いたフマル酸の発酵生産では、カビを用いて、グルコースから生産する方法が広く知られている。フマル酸生産菌としては、Rhizopus、Mucor、Cunninghamella、Cicinella等が知られているが、Rhizopus属菌が最も生産性の高い菌株として利用されている（非特許文献１）（特許文献１，２）。
【０００４】
近年、栽培の技術革新により、世界の植物油の生産量が増加している。天然油脂の生産増により、油脂系バイオマスを持続可能な資源としてとらえ、微生物の発酵原料として用いる研究が行われている（非特許文献２）。TabuchiらはCandida lipolytica No.228株での生産試験を行った結果、大豆油、魚油、あまに油から30〜50%のクエン酸生産に成功した（非特許文献３）。また、Ikenoらは変異処理により取得したCandida lipolytica 281を用いてパーム油から振とう培養で102g/lのクエン酸生産に成功した（非特許文献４）。しかし、油脂からの有機酸生産菌はクエン酸生産に関するものしかなく、油脂からのフマル酸発酵についてはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２３０２３２号公報
【特許文献２】特開２００５−２１１０４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Carol A. Roa Engel, Adrie J. J. Straathof, Tiemen W. Zijlmans, Walter M. van Gulik, and Luuk A. M. van der Wielen. (2008)  Fumaric acid production by fermentation.  Appl Microbiol Biotechnol. 78(3): 379-389.
【非特許文献２】KOH Jeong-Sam and Yasuji MINODA.  Microbial Utilization of Natural Oil and Fats.
【非特許文献３】田渕武士,田中優行,阿部又三,(1969)日本農芸化学会, 43, 154
【非特許文献４】Y. Ikeno, M. Masuda, K. Tanno, I. Oomori, N. Takahashi, Citric acid production from various raw materials by yeast.  J. Ferment. Technol., 53, 752 (1975)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
油脂系バイオマスからフマル酸を発酵生産することができれば、安価なバイオマス原料から合成樹脂等の工業製品を持続的に安定供給することができる。さらに、石油の消費を抑えることで限りある資源の有効利用に貢献することも可能となる。
【０００８】
しかし、油脂からの有機酸生産菌はクエン酸生産に関するものしかなく、油脂からのフマル酸発酵についてはこれまで知られていない。
【０００９】
そこで本発明は、油脂を原料としてクエン酸を生産することができる微生物を提供することを目的とする。
【００１０】
課題を解決するための手段
この問題を解決するため、自然界より、油脂を原料としてクエン酸を生産することができる微生物を取得することを目的として探索を行った。
【００１１】
鋭意検討した結果、高効率でフマル酸を生産することができる菌株を見出し、さらに油脂を原料としてフマル酸を生産することを見出し、本発明を完成した。  
【００１２】
即ち、本発明はこれに限定される訳ではないが以下の発明を包含する。
［１］フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株。
［２］リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１６８９）株である、［１］記載の菌株。
［３］油脂を原料としてフマル酸生産能を有する、［１］または［２］記載の菌株。
［４］油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の菌株。
［５］フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株を、油脂を炭素源として培養する工程を含む、フマル酸の製造方法。
［６］リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１６８９）である、［５］記載の分解方法。
［７］油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、［５］または［６］記載の方法。
［８］培養工程に用いる培養液に三価の鉄イオンを添加する、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］フマル酸の生産量が培養液１Ｌあたり８ｇ以上である、［５］〜［８］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、油脂系バイオマスからフマル酸を発酵生産することができ、安価なバイオマス原料から合成樹脂等の工業製品を持続的に安定供給することができる。さらに、石油の消費を抑えることで限りある資源の有効利用に貢献することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、アポロンＤＢ−ＦＵを用いてＢＬＡＳＴ検索によるＴＭ−９３株のＩＴＳ５．８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の相同性検索を行った結果を示す。
【図２】図２は、ＢＬＡＳＴ検索によるＴＭ−９３株のＩＴＳ５．８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の相同性検索結果を示す。
【図３】図３は、ＩＴＳ５．８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を利用したＴＭ−９３株の分子系統樹である。
【図４】図４は、ＣＮ比の検討結果を示す。
【図５】図５は、培養温度の検討結果を示す。
【図６】図６は、金属イオン添加試験結果を示す。
【図７】図７は、各種油脂からのフマル酸生産試験結果を示す。
【図８】図８は、フマル酸生産培養での経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
フマル酸生産菌
本発明は、フマル酸生産菌に関し、具体的にはフマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはその変異株である。  
【００１６】
リゾプスオリーゼに属し、フマル酸生産能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。
【００１７】
本発明の微生物は、フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼであればよい。具体的には、代表例として、平成２５年８月１２日付けで、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センターに受領されたリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１６８９）が挙げられる。リゾプスオリーゼの菌学的性質は、例えばザ・マイコ−タ（The Mycota）第７巻（２００６年）に記載されている。
【００１８】
更に本発明の微生物は、フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼであれば、野生株、変異株のいずれでも良い。
【００１９】
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００２０】
以下に、フマル酸生産菌のスクリーニングの一例を示す。油脂を炭素源とした培地を用いてスクリーニングすることもできるが、ここでは一次スクリーニングでは炭素源としてグルコースを用いた培地を用い、得られた候補株を油脂を炭素源として用いた培地で選別する方法を記載する。各地より採取した土壌を生理食塩水で適宜希釈し、炭素源としてグルコースを含む栄養培地に懸濁し、一次スクリーニング用平板培地に適量を塗布する。３０℃で７日程培養を行い、有機酸の生成に伴う炭酸カルシウムの溶解によって生じるクリアゾーンが形成されたコロニーを識別する。次いで、滅菌した爪楊枝を用いて、コロニー周辺のクリアゾーンの部分をすくい取り、セルロース薄層に塗り、クエン酸以外の有機酸の産生能を有するかを分析する。一次スクリーニングで得られた菌株を、油脂を含む培地を分注したマイクロタイタープレートに植菌し、３０℃にて７日間振とう培養を行う。培養終了後、タイタープレートを遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析してフマル酸産生能を評価する。フマル酸の産生が認められた菌株であって、リゾプスオリーゼと同定されたものを本発明の菌株とすることができる。
フマル酸の生産
本発明はフマル酸の生産方法に関し、本発明方法ではフマル酸は培養液中に生産される。培養液に生産されたフマル酸は、当業者に周知の方法にて分離精製することができる。
【００２１】
リゾプスオリーゼに属する微生物の培養に用いる培地としては、リゾプスオリーゼに属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）およびＮＢ培地が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００２２】
しかし、本発明では、油脂を炭素源として用いることができる。油脂とは、脂肪酸とグリセリンのエステルで、通常はトリグリセリドの形態のものである。一般に常温で液体のものを脂肪油といい、固体のものを脂肪というが、本明細書においては、そのいずれであってもよい。本発明における原料として用いることができる油脂には特に制限はなく、例示としてはサラダ油、コーン油、大豆油、キャノーラ油、ゴマ油、サフラワー油、椰子油、オリーブオイル、ピーナッツオイル、アーモンドオイル、魚油、カカオバター、ピーナッツバター、バター、マーガリンが挙げられる。
【００２３】
培養液中の油脂の濃度は、用いる菌株によって適宜設定することができるが、５〜５０％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０％である。培養液中の炭素源濃度と窒素源濃度の比（ＣＮ比）は、５００：１〜１００：１が好ましく、さらに好ましくは４００：１〜２００：１である。培養温度は、菌株によって適宜設定することができるが、２５℃〜３５℃の範囲が好ましい。
【００２４】
培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。本発明の方法では、培養中にフマル酸が生産されることから培養液のｐＨが低下する。そのため、ｐＨの低下を抑制する目的で炭酸カルシウムを含んだ培養液にて培養することが好ましい。また、炭酸カルシウムは培養中に添加してもよい。
【００２５】
本発明において、上記微生物に対し、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばフマル酸の生産がみられる。好ましくは回転振盪培養がよく、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲が好ましい。
【００２６】
フマル酸の生産は、培養上清をＨＰＬＣ分析することにより確認することができる。
【実施例】
【００２７】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
＜実施例１  微生物のスクリーニング＞
フマル酸生産菌の探索
環境中に存在する有機酸生産菌の中でも、特に多く存在するのがクエン酸生産菌である。そこで、油脂を炭素源としたフマル酸生産菌を取得するにあたって、２段階の選抜法を用いた。はじめに、グルコースを炭素源として有機酸生産菌を単離し、薄層クロマトグラフィーを用いてクエン酸以外の有機酸を生産する菌株を選抜した。次いで炭素源を油脂に変更し、フマル酸の生産試験を行った。
一次スクリーニング
表１に示した培地を１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌し、ここにクロラムフェニコールを１００ｍｇ／ｌとなるように添加した。さらに、１８０℃で４時間乾熱滅菌した炭酸カルシウムの粉末を１６．７ｇ／ｌとなるように培地に添加し、寒天平板培地（寒天濃度１．５％）を作成した。
【００２８】
【表１】
2015039347.tif 000002
【００２９】
スクリーニング源として、つくば市内を中心に採取した土壌約０．１ｇを１ｍｌ生理食塩水に懸濁し、一次スクリーニング用平板培地に１００μｌ塗布した。３０℃で７日程間培養を行い、有機酸の生成に伴う炭酸カルシウムの溶解によって生じるクリアゾーンが形成されたコロニーを識別した。次いで、滅菌した爪楊枝を用いて、コロニー周辺のクリアゾーンの部分をすくい取り、セルロース薄層に塗りつけ、分析を行った。展開液には酢酸エチル：９０％ギ酸：蒸留水＝３５：５：６（ｖ／ｖ）を用い、発色剤としてｐＨ指示薬であるブロモフェノールブルーを用い、スポットを観察し、クエン酸以外の有機酸を生産する菌を取得した。
二次スクリーニング
一次スクリーニングで得られた菌株（約２，５００種）を、表２の培地２ｍｌを分注した２４穴マイクロタイタープレートに植菌し、３０℃、１，０００ｒｐｍ、７日間培養した。振とう培養機として、Deep Well Maximizer(TAITEC)を使用した。培養終了後、タイタープレートを遠心分離し、上清１ｍｌをＨＰＬＣで分析した。分析条件を表３に示した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
【表３】
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【００３２】
その結果、４株において約１％のフマル酸生産が確認された。このうち最も生産性のよいＴＭ−９３株を最優良株として選出した。
フマル生産菌の同定
ＴＭ−９３株の同定は、以下の方法で行った。なお、同定試験は株式会社テクノスルガ・ラボに委託した。
形態観察
培地にはポテトデキストロース（ＰＤＡ）寒天培地「ダイゴ」（日本製薬）を使用し、２５℃で７日間培養した。光学顕微鏡ＢＸ５１（オリンパス）および実体顕微鏡ＳＺＨ１０（オリンパス）を使用し、簡易形態観察を行なった。その結果、白色〜黒色、羊毛状のコロニーの形成が認められた。栄養菌糸から直立した胞子嚢柄は高さ１〜１．５ｍｍであり、先端部には黒〜黒褐色、球形の胞子嚢の形成が認められた。また、胞子嚢柄の基部には仮根が形成される様子が観察された。
ＩＴＳ５．８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析
本菌株より抽出したＤＮＡを用い、ＩＴＳ５およびＩＴＳ４（Tj White, T. Bruns, S. Lee, J. Taylo.(1990).Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In:PCR protocols,a guide to methods and applications, 315-322.AcademicPress,New York）をプライマーに使用し、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ)を用いてＩＴＳ５．８Ｓ  ｒＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲからシークエンス反応にはBigDye Terminator v3.1 Kit(Applied Biosystems, USA)を使用し、シークエンス解析にはABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer System (Applied Bio-systems, USA)を使用した。決定したＤＮＡ配列に対し、アポロンＤＢ−ＦＵ６．０（テクノスルガ・ラボ）および国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)を用いて相同性検索を行なった。
【００３３】
決定された塩基配列を表４に示した。この配列に基づき、アポロンＤＢ−ＦＵを用いて相同性検索を行ったところ、図１に示す結果が得られた。また、国際塩基配列データベースに対する相同性検索を行ったところ、図２に示す結果が得られた。アポロンＤＢ−ＦＵおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹を図３に示した。
【００３４】
【表４】
2015039347.tif 000005
【００３５】
アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、ＴＭ−９３株はリゾプスオリーゼの複数の塩基配列と９９．０〜１００％の相同性を、アミロマイセスルキシ（Amylomyces rouxii）の複数の塩基配列と９９．３〜９９．８％の相同性を示した。また、作成した系統樹においてはリゾプスオリーゼおよびアミロマイセスルキシと同一の系統枝を形成した。
【００３６】
しかし、現在、アミロマイセスルキシはリゾプスオリーゼが分子系統学的に差がないこと、自然界からは検出されず、発酵食品のスターターの中など限られた環境のみから分離されていることから、リゾプスオリーゼから自然変異を起こしたものであると考えられている。 （小田 有二, 曾根 輝雄,(2005),乳酸生産能に基づくリゾプスオリーゼの再分類,バイオサイエンスとインダストリー 63:17-20）。本菌株は自然界から分離され、形態観察の結果、アミロマイセスルキシではなくリゾプスオリーゼに類似した特徴が観察されたことから、リゾプスオリーゼであると同定した。
【００３７】
同菌株は、平成２５年８月１２日付けで、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センターに受領され、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１６８９が付与された。
＜実施例２  フマル酸生産試験＞  
実施例１にて分離したＴＭ−９３株による油脂からのフマル酸生産試験を行った。
ＣＮ比の検討
二次スクリーニングに使用した培地（表２）のオリーブ油濃度を調整することで最適なＣＮ比を検討した。凍結保存したＴＭ−９３株をＭａｌｔ平板培地上にて３０℃、３日間培養した。生理食塩水１ｍｌに一白金耳の菌体を加え、激しく撹拌し菌懸濁液を作成した。培養液３０ｍｌに菌懸濁液５００μｌを加え３００ｍｌ容三角フラスコで振とう培養した（２００ｒｐｍ、３０℃、７日間）。培養中炭酸カルシウムを適宜加え培地ｐＨを調整した。培養終了後、培養液１ｍｌを１．５  ｍｌ容チューブに移し、上清中のフマル酸をＨＰＬＣで定量した。
【００３８】
図４に示すように、窒素源０．１％に対してオリーブ油３０％の時、フマル酸生産量が最大となった。この時のＣＮ比は３００：１であった。
温度条件の検討
オリーブ油濃度を３０％とし、温度条件を２５℃、３０℃、３５℃、４０℃に設定して同様に実験を行なった。  結果を図５に示す。フマル酸の生産は３０℃で最大となった。
金属イオンの添加培養
金属イオンの影響を検討した。各金属塩について１０ｇ／ｌ溶液を作成し、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ溶液は０．２μｍ酢酸セルロースフィルター(ADVANTEC DISMIC-13cp)を用いて濾過滅菌、それ以外の金属塩溶液はオートクレーブ滅菌した。２４穴培養プレートにオリーブ油濃度１５％、塩化アンモニウム濃度０．０５％に調整した二次スクリーニング培地（表２）を２ｍｌ分注した。金属塩溶液２０μｌを添加し、３０℃で３日間振とう培養した。培養後、同様にＨＰＬＣ分析に供した。その結果を図６に示す。フマル酸生産はコバルト塩によって著しく阻害された。一方、三価の鉄イオンを添加した系で生産が増加し、生産性が約２倍に向上した。
各種油脂を用いた生産試験
バイオマスとして有望な各種油脂からのフマル酸生産試験を行った。培養液３０ｍｌに菌懸濁液５００μｌを加え３００ｍｌ容三角フラスコで振とう培養した（２００ｒｐｍ、３０℃、７日間）。培養中炭酸カルシウムを適宜加え培地ｐＨを調整した。培養終了後、ＨＰＬＣにてフマル酸を定量した。なお実験は各２連で行った。
【００３９】
結果を図７に示す。今回の実験では、ＴＭ−９３株はオリーブ油以外にも多様な油脂からのフマル酸生産を行うことが確認された。  
最適培養条件における生産の経時変化
凍結保存したＴＭ−９３株をＭａｌｔ平板培地上にて３０℃、３日間培養した。生理食塩水１ｍｌに一白金耳の菌体を加え、激しく撹拌し菌懸濁液を作成した。二次スクリーニングに使用した培地（表２）のうち、オリーブ油を１５％、塩化アンモニウムを０．０５％に変更し、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを添加した。作成した培養液３０ｍｌに菌懸濁液５００μｌを加え３００ｍｌ容三角フラスコで振とう培養した（２００ｒｐｍ、３０℃、７日間）。培養中、炭酸カルシウムを適宜加え培地ｐＨを調整した。培養終了後、ＨＰＬＣにてフマル酸生産量を定量した。
【００４０】
図８に結果を示す。フマル酸生産量は培養７日目において１４．８ｇ／ｌとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、油脂系バイオマスからフマル酸を発酵生産することができ、安価なバイオマス原料から合成樹脂等の工業製品を持続的に安定供給することができる。さらに、石油の消費を抑えることで限りある資源の有効利用に貢献することも可能である。
【図１】
2015039347.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2015039347000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月26日(2013.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株。
【請求項２】
リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８９）である、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
油脂を原料としてフマル酸生産能を有する、請求項１または２記載の菌株。
【請求項４】
油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株。
【請求項５】
フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株を、油脂を炭素源として培養する工程を含む、フマル酸の製造方法。
【請求項６】
リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８９）である、請求項５記載の分解方法。
【請求項７】
油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
培養工程に用いる培養液に三価の鉄イオンを添加する、請求項５〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
フマル酸の生産量が培養液１Ｌあたり８ｇ以上である、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
即ち、本発明はこれに限定される訳ではないが以下の発明を包含する。
［１］フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株。
［２］リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８９）株である、［１］記載の菌株。
［３］油脂を原料としてフマル酸生産能を有する、［１］または［２］記載の菌株。
［４］油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の菌株。
［５］フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼに属する菌株、またはフマル酸生産能を有するその変異株を、油脂を炭素源として培養する工程を含む、フマル酸の製造方法。
［６］リゾプスオリーゼに属する菌株がリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８９）である、［５］記載の分解方法。
［７］油脂がラード、大豆油、ヒマシ油、パーム油、およびオリーブ油からなる群から選択されるものである、［５］または［６］記載の方法。
［８］培養工程に用いる培養液に三価の鉄イオンを添加する、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］フマル酸の生産量が培養液１Ｌあたり８ｇ以上である、［５］〜［８］のいずれかに記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の微生物は、フマル酸生産能を有するリゾプスオリーゼであればよい。具体的には、代表例として、平成２５年８月１２日付けで、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センターに受領され、同８月１２日付けで受託されたリゾプスオリーゼＴＭ−９３（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８９）が挙げられる。リゾプスオリーゼの菌学的性質は、例えばザ・マイコ−タ（The Mycota）第７巻（２００６年）に記載されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
同菌株は、平成２５年８月１２日付けで、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センターに受領され、同８月１２日付けにて受託された受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８９が付与された。
＜実施例２  フマル酸生産試験＞  
実施例１にて分離したＴＭ−９３株による油脂からのフマル酸生産試験を行った。
ＣＮ比の検討
二次スクリーニングに使用した培地（表２）のオリーブ油濃度を調整することで最適なＣＮ比を検討した。凍結保存したＴＭ−９３株をＭａｌｔ平板培地上にて３０℃、３日間培養した。生理食塩水１ｍｌに一白金耳の菌体を加え、激しく撹拌し菌懸濁液を作成した。培養液３０ｍｌに菌懸濁液５００μｌを加え３００ｍｌ容三角フラスコで振とう培養した（２００ｒｐｍ、３０℃、７日間）。培養中炭酸カルシウムを適宜加え培地ｐＨを調整した。培養終了後、培養液１ｍｌを１．５  ｍｌ容チューブに移し、上清中のフマル酸をＨＰＬＣで定量した。