(57)【要約】【課題】本発明は、マンデロニトリルなどのα−シアノヒドリン化合物の酸化反応を酸化してベンゾイルシアニドなどを生成する反応を触媒する新規マンデロニトリル酸化酵素、および当該酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素と当該マンデロニトリル酸化酵素をコードする遺伝子は、それぞれ、特定のアミノ酸配列と塩基配列を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするマンデロニトリル酸化酵素。
（１）  配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）  配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、マンデロニトリルを酸化する活性を有するアミノ酸配列；
（３）  配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つ、マンデロニトリルを酸化する活性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出される分子質量のバンドが６７±３．４ｋＤａに表れる請求項１に記載のマンデロニトリル酸化酵素。
【請求項３】
下記の（４）〜（６）のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするマンデロニトリル酸化酵素遺伝子。
（４）  配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列；
（５）  配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該配列にコードされたタンパク質がマンデロニトリルを酸化する活性を有する塩基配列；
（６）  配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つ、当該配列にコードされたタンパク質がマンデロニトリルを酸化する活性を有する塩基配列
【請求項４】
請求項３に記載のマンデロニトリル酸化酵素遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンデロニトリルなどのα−シアノヒドリン化合物を酸化してベンゾイルシアニドなどを生成する反応を触媒する新規マンデロニトリル酸化酵素、および当該酵素をコードする遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ヤスデは、外敵から身を守るために防御物質を放出する。ヤスデの中でもオビヤスデ目（Ｐｏｌｙｄｅｓｍｉｄａ）の一部のヤスデは、シアン化水素やマンデロニトリルを防御物質として産生する。
【０００３】
ヤスデにおけるシアン化水素の発生機構の一つとして、マンデロニトリルとその酸化物であるベンゾイルシアニドのショッテン−バウマン反応によりマンデロニトリルベンゾエートと共にシアン化水素を生成する経路がある。
【０００４】
【化１】
2015167478.tif 000002
【０００５】
しかし、ヤスデの分泌腺からは主成分としてマンデロニトリルしか検出されておらず、ベンゾイルシアニドの由来は不明である。また、マンデロニトリルからベンゾイルシアニドへの酸化を触媒する酵素の存在も知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、ヤスデにおけるベンゾイルシアニドの生成過程は知られていない。おそらく分泌されたマンデロニトリルが酸化されてベンゾイルシアニドが生じると推測されるが、詳細は不明であり、この反応に関与する酵素の存在も知られていない。
【０００７】
そこで本発明は、マンデロニトリルなどのα−シアノヒドリン化合物を酸化してベンゾイルシアニドなどを生成する反応を触媒する新規マンデロニトリル酸化酵素、および当該酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、防御などのためにシアン化水素を含むガスを放出するヤンバルトサカヤスデから、マンデロニトリルの酸化活性を有する酵素を見出して、本発明を完成した。
【０００９】
本発明を以下に示す。
【００１０】
［１］  下記の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするマンデロニトリル酸化酵素。
（１）  配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）  配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、マンデロニトリルを酸化する活性を有するアミノ酸配列；
（３）  配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つ、マンデロニトリルを酸化する活性を有するアミノ酸配列
【００１１】
［２］  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出される分子質量のバンドが６７±３．４ｋＤａに表れる上記［１］に記載のマンデロニトリル酸化酵素。
【００１２】
［３］  下記の（４）〜（６）のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするマンデロニトリル酸化酵素遺伝子。
（４）  配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列；
（５）  配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該配列にコードされたタンパク質がマンデロニトリルを酸化する活性を有する塩基配列；
（６）  配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つ、当該配列にコードされたタンパク質がマンデロニトリルを酸化する活性を有する塩基配列
【００１３】
［４］  上記［３］に記載のマンデロニトリル酸化酵素遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【００１４】
［５］  上記［４］に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のマンデロニトリル酸化酵素は、マンデロニトリルなどのα−シアノヒドリン化合物の酸化反応を触媒する全く新しい酵素である。よって、本発明のマンデロニトリル酸化酵素は、様々な化合物に変換することができ、合成中間体などとして有用なニトリル化合物の製造に利用できるものとして有用である。
【００１６】
また、本発明のマンデロニトリル酸化酵素は、α−シアノヒドリン化合物を酸化するに当たり、当該α−シアノヒドリン化合物と等モルの過酸化水素を生成する。よって、過酸化水素の生成量を測定することにより、α−シアノヒドリン化合物の量や濃度の測定も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素の分子質量を、分子量マーカーを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示すゲルの写真である。
【図２】図２は、本発明のマンデロニトリル酸化酵素をＨＰＬＣで分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、先ず、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素について説明する。
【００１９】
＜マンデロニトリル酸化酵素＞
本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素は、上記（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有するものである。
【００２０】
上記マンデロニトリル酸化酵素において、「配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列」は、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）由来の天然型マンデロニトリル酸化酵素のアミノ酸配列である。ヤンバルトサカヤスデは、特に沖縄県や鹿児島県で周期的に異常発生し、列車を止めるなどする一方で、駆除しようとするとシアン化水素を含むガスを放出して健康被害を及ぼすなど問題になっている。本発明者らは、ヤンバルトサカヤスデがマンデロニトリルを有し且つシアン化水素を産生することに注目し、シアン化水素の生成機構として、マンデロニトリルを酸化する酵素が存在し、マンデロニトリルの酸化により生成したベンゾイルシアニドがマンデロニトリルと反応してマンデロニトリルベンゾエートとシアン化水素が生成するとの機構を推定して実験を進めたところ、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素の単離精製に成功したものである。また、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素は、異常発生する一方で駆除方法が確立していないヤンバルトサカヤスデより単離精製できることから、本発明は、ヤンバルトサカヤスデの処理方法としても価値が高い。
【００２１】
その他、ヤンバルトサカヤスデと同じくオビヤスデ目（Ｐｏｌｙｄｅｓｍｉｄａ）に分類されるヤスデのうち、タンバアカヤスデ（Ｎｅｄｙｏｐｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ）、ミドリババヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｎｏｍｉｎｅａ）、エパネルコデウス属（Ｅｐａｎｅｒｃｈｏｄｕｓ  ｓｐ．）、エパネルコデウス  フルヴス（Ｅｐａｎｅｒｃｈｏｄｕｓ  ｆｕｌｖｕｓ  Ｈａｇａ）、キシャヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｌａｍｉｎａｔｅ  ａｒｍｉｇｅｒａ）も、ベンゾイルシアニドを産生し、ショッテン−バウマン反応によりマンデトニトリルベンゾエートとシアン化水素を生成する経路を有する（Ｋａｗａｈａｒａら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．，３７，ｐｐ．２３２−２３８（２０１１））。よって、これらヤスデも本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素を産生し、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素はこれらヤスデからも精製できると考えられる。
【００２２】
本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、シグナルペプチド、ヒスチジンタグ、固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。
【００２３】
本発明の上記アミノ酸配列（２）において、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質がマンデロニトリルを酸化する活性を有する限り特に限定されるものではない。前記「１から数個」の範囲は、例えば１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、１個程度であることができる。
【００２４】
本発明の上記アミノ酸配列（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、当該アミノ酸配列の相同性を有する酵素がマンデロニトリルを酸化する活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の相同性は７０％以上であれば特に限定されないが、８０％以上、９０％以上または９５％以上が好ましく、より好ましくは９６％以上または９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上、９９％以上または９９．５％以上であり、特に好ましくは９９．８％以上である。本発明において「配列の相同性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が特定の相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
【００２５】
上記アミノ酸配列（２）および（３）において、「マンデロニトリルを酸化する活性を有する」とは、後記の反応条件において、少なくとも、マンデロニトリルを酸化してベンゾイルシアニドを生成する活性を有することをいう。
【００２６】
上記アミノ酸配列（１）を有するマンデロニトリル酸化酵素の分子質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、図１のとおり、６７ｋＤａ付近にバンドが認められた。図１に示す結果より、上記アミノ酸配列（１）を有するマンデロニトリル酸化酵素の分子質量は６７±３．４ｋＤａの範囲に含まれると考えられる。
【００２７】
上記アミノ酸配列（１）を有するマンデロニトリル酸化酵素は、補酵素としてＮＡＤ+やＮＡＤＰ+を必要とせず、非共有結合型ＦＡＤを保持している。また、酸化反応において基質であるα−シアノヒドリン化合物と等モルの過酸化水素を生成する。また、本発明者らの実験的知見によれば、上記アミノ酸配列（１）を有するマンデロニトリル酸化酵素の至適ｐＨは６〜７であるが、ｐＨが高いほどマンデロニトリルなどは分解し易くなるので、反応はｐＨ５前後、より具体的にはｐＨ４．５以上、５．５以下で行うことが好ましい。また、至適温度は２０℃であることから、１５℃以上、２５℃以下程度で反応を行うことが好ましい。
【００２８】
以上の上記アミノ酸配列（１）を有するマンデロニトリル酸化酵素の特定は、上記アミノ酸配列（２）または（３）を有するマンデロニトリル酸化酵素にも当てはまると考えられる。
【００２９】
＜遺伝子とベクター＞
本発明に係る遺伝子は、上記マンデロニトリル酸化酵素をコードするものである。なお、本発明に係る遺伝子を規定する文言の定義などは、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素を規定する文言の定義などを準用するものとする。
【００３０】
上記遺伝子（４）は、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）から単離精製された天然型マンデロニトリル酸化酵素をコードする遺伝子である。よって、上記遺伝子（４）も、ヤンバルトサカヤスデのｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより得てもよい。
【００３１】
本発明に係る遺伝子の塩基配列（５）および（６）は、上記マンデロニトリル酸化酵素（２）または（３）のアミノ酸配列をコードするものとしてデザインすることができる。
【００３２】
本発明の核酸は、例えば、配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するマンデロニトリル酸化酵素遺伝子ＤＮＡもしくはその相補配列、またはこれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用することが可能である。
【００３３】
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００ｍＭ以上、２０００ｍＭ以下、温度が４０℃以上、７５℃以下、好ましくは塩濃度が６００ｍＭ以上、９００ｍＭ以下、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のマンデロニトリル酸化酵素をコードする核酸を得るための条件を設定することができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を参照することができる。ハイブリダイズする核酸としては、例えば、配列番号３または配列番号４の塩基配列に対して７０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含む核酸またはその部分断片が挙げられる。当該配列相同性としては、８０％以上、９０％以上または９５％以上が好ましく、より好ましくは９６％以上または９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上、９９％以上または９９．５％以上であり、特に好ましくは９９．８％以上である。
【００３５】
本発明において、マンデロニトリル酸化酵素遺伝子の調製を行う方法は特に制限されず、通常は、公知の方法で行うことができる。例えば、ヤンバルトサカヤスデのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより調製してもよいし、また、天然型マンデロニトリル酸化酵素遺伝子を基に、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法や、遺伝子ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。
【００３６】
これらの部位特異的変異誘発法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，ｐｐ．４８８−９２（１９８５）、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，ｐｐ．３５０−６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８５，ｐｐ．２７６３−６（１９８８）等に記載されている。近年では、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法を基にした部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００３７】
また、目的とする変異導入箇所が、対象遺伝子配列において消化・連結が容易な制限酵素部位の近隣に存在する場合、目的変異を導入したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてＰＣＲを行うことで、目的変異が導入された遺伝子ＤＮＡ断片を容易に得ることができる。さらには、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）で伸長させて合成遺伝子として得ることもできる。
【００３８】
また、ハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてランダムに変異を導入する方法などのランダムな変異導入法によっても、天然型マンデロニトリル酸化酵素遺伝子から所望の変異型マンデロニトリル酸化酵素遺伝子を得ることができる。
【００３９】
上記の方法によって得た本発明のマンデロニトリル酸化酵素遺伝子を宿主で発現させるために、遺伝子の上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することができる。或いは、当該マンデロニトリル酸化酵素遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該変異遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該マンデロニトリル酸化酵素遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用する。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、マンデロニトリル酸化酵素遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。即ち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、天然型マンデロニトリル酸化酵素遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。
【００４０】
プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。
【００４１】
ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特段限定されるものではなく、例えばρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター等が挙げられる。
【００４２】
また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列をマンデロニトリル酸化酵素遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法などにより付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列などが挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作製して利用してもよい。
【００４３】
一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４４】
本発明において使用されるベクターは、上記のマンデロニトリル酸化酵素遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＴｒｃ９９Ａ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ、日本）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＥＴ−１２（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）、ｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）などを用いることができる。また、必要に応じてこれらベクターを改変したものも用いることができる。また、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーターを有する発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡまたはｐＫＫ２３３−２などを用いることもできる。
【００４５】
上記のマンデロニトリル酸化酵素遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
＜形質転換体＞
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換または形質導入することで、形質転換体を作製することができる。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のマンデロニトリル酸化酵素を発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌；酵母（Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）やカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌；動物細胞；昆虫細胞；植物細胞などが挙げられる。
【００４８】
＜マンデロニトリル酸化酵素の製造方法＞
本発明のマンデロニトリル酸化酵素は、ヤンバルトサカヤスデから製造することができる。例えば、ヤンバルトサカヤスデを液体窒素中磨り潰した破砕物を緩衝液に懸濁し、固形分を遠心分離にて取り除き、得られた上清を粗酵素液とすることができる。本酵素をさらに精製するために、得られた粗酵素液を硫酸アンモニウムを用いて塩析または分画し、沈殿物を取得することができる。得られた沈殿物から本酵素を精製するために、各種クロマトグラフィを用いることができる。具体的には、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ等を組み合わせることができる。なお、本発明のマンデロニトリル酸化酵素は部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明には精製品と部分精製品の両方が含まれるものとする。
【００４９】
その他、本発明のマンデロニトリル酸化酵素は、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から精製することにより製造することもできる。
【００５０】
本発明において「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的のマンデロニトリル酸化酵素は、上記培養物中に蓄積される。
【００５２】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。また、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５３】
培養中、ベクターおよび目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。即ち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加してもよく、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中に、必要に応じてアンピシリンを培地に添加してもよい。
【００５４】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【００５５】
形質転換体の培養条件は、目的のマンデロニトリル酸化酵素の生産性および宿主の生育が妨げられない条件であれば特段限定されるものではないが、通常、培養温度は１０℃以上、４５℃以下、好ましくは１０℃以上、４０℃以下、さらに好ましくは１５℃以上、４０℃以下、さらにより好ましくは２０℃以上、３７℃以下で行い、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。培養時間は５時間以上、１２０時間以下程度とすることができ、好ましくは５時間以上、１００時間以下、さらに好ましくは１０時間以上、１００時間以下、さらにより好ましくは１５時間以上、８０時間以下程度行う。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、大腸菌であれば６以上、９以下に調整する。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
【００５６】
培養のための培地の初発ｐＨは７以上、９以下に調整するのが適当である。また、培養は、５℃以上、４０℃以下、好ましくは１０℃以上、３７℃以下で５時間以上、１００時間以下行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施するのが好ましい。
【００５７】
本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素は、上記培養物から精製されるが、その精製度合いは特に制限されない。例えば、上記培養物をホモジェナイズし、濾過や遠心分離などにより不溶物を除去した溶液をそのまま用いてもよいし、さらに、カラムクロマトグラフィなどにより精製して、粗酵素液や酵素液を得てもよい。
【００５８】
＜酵素反応＞
本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素の活性は、例えば、以下の反応により測定することができる。即ち、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）中に適量の酵素と終濃度で１０ｍＭのマンデロニトリルを加え、１分間反応を行う。反応生成物をヘキサンで抽出し、ＨＰＬＣにて生成したベンゾイルシアニドを測定する。或いは、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素の作用により、反応したマンデロニトリルと同モルの過酸化水素が生成するため、生成した過酸化水素を、例えば、反応液中にペルオキシダーゼと、４−アミノアンチピリンおよびＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンとの組合せなどの発色試薬を共存させ、吸光度により測定してもよい。なお、測定に用いるマンデロニトリル酸化酵素の量は、その精製度などに応じて、予備実験などで適宜決定すればよい。
【００５９】
本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素は、マンデロニトリルのみを基質をするものではなく、式（Ｉ）で表されるような、α−シアノヒドリン化合物であってそのシアノ基に対する第２位炭素−第３位炭素間にパイ電子系が存在する化合物に対しても活性を示す。具体的には、α−シアノヒドリン化合物（Ｉ）を酸化してカルボニルシアニド化合物（ＩＩ）と過酸化水素を生成する以下の反応を触媒する。
【００６０】
【化２】
2015167478.tif 000003
【００６１】
［式中、Ｒ1は、置換基αを有していてもよいＣ6-12アリール基、−ＣＨ＝ＣＨＲ2、または、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨＲ3を示し；Ｒ2は、置換基βを有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；Ｒ3は、置換基βを有していてもよいＣ1-6アルキル基を示し；上記置換基αは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子からなる群より選択される１以上の置換基を示し；上記置換基βは、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子からなる群より選択される１以上の置換基を示す］
【００６２】
本発明において「Ｃ6-12アリール基」とは、炭素数が６以上、１２以下の一価芳香族炭化水素基をいう。例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、インデニル、ビフェニル等であり、好ましくはフェニルまたはナフチルである。
【００６３】
「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等である。アリール基上の置換基として好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。Ｒ2として好ましくはＣ2-5アルキル基であり、より好ましくはＣ3-4アルキル基であり、最も好ましくはｎ−プロピルである。Ｒ3として好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基である。
【００６４】
「Ｃ1-6アルコキシ基」とは、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基をいう。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ等であり、好ましくはＣ1-4アルコキシ基であり、より好ましくはＣ1-2アルコキシ基である。
【００６５】
「ハロゲン原子」としては、フルオロ原子、クロロ原子、ブロモ原子、およびヨード原子を例示することができ、クロロ原子またはブロモ原子が好ましい。
【００６６】
上記反応の条件は、上記のマンデロニトリル酸化酵素の活性測定方法の条件と同様とすることができる。但し、α−シアノヒドリン化合物（Ｉ）とカルボニルシアニド化合物（ＩＩ）の縮合化合物であるシアノヒドリルカルボネート化合物（ＩＩＩ）が必要である場合には、反応液のｐＨを７．０以上、１２．０以下、より好ましくは７．５以上、８．５以下に調整しておくことが好ましい。
【００６７】
【化３】
2015167478.tif 000004
【００６８】
反応後は、通常の後処理をしてもよい。例えば、目的化合物がカルボニルシアニド化合物（ＩＩ）である場合には、ｐＨに留意して分解を抑制しつつ精製する。また、目的化合物がシアノヒドリルカルボネート化合物（ＩＩＩ）である場合には、通常の抽出や精製を行えばよい。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００７０】
実施例１：  マンデロニトリル酸化酵素の分離精製
ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）を、鹿児島県にて捕獲した。捕獲したヤスデは、使用するまで−８０℃で保管した。
【００７１】
冷凍保存されていた上記ヤンバルトサカヤスデを、液体窒素中、乳鉢と乳棒を使って磨り潰した。得られた粉砕物を４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、３時間撹拌した。得られた懸濁液を遠心分離し、上清を粗酵素液とした。当該粗酵素液に硫酸アンモニウムをその濃度が３０％飽和となるまで徐々に添加した後、低温で３０分間撹拌した。次いで、４℃、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムをその濃度が５５％飽和となるまで徐々に添加した後、低温で３０分間撹拌した。当該分散液を、４℃、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、得られた沈殿を４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、同緩衝液で透析した。
【００７２】
得られた粗酵素液を、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ樹脂（ＴＯＳＯＨ社製，「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ」）を充填したカラムに添加した。目的酵素は当該ＤＥＡＥ樹脂に吸着されないため、透過液を回収した。得られた画分に硫酸アンモニウムをその濃度が３０％飽和になるまで添加した。当該溶液を、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０，３０％飽和硫酸アンモニウムを含む）で平衡化した疎水性樹脂（ＴＯＳＯＨ社製，「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ」）を含むカラムに添加し、吸着させた。当該カラムを４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０，３０％飽和硫酸アンモニウムを含む）で洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度を３０％飽和から０％まで直線的に低下させた同緩衝液を流すことで、目的酵素を溶出させた。酵素活性を有する画分を回収し、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。
【００７３】
得られた活性画分中の緩衝液を遠心用フィルターデバイス（ミリポア社製，「Ａｍｉｃｏｎ」）を用いた限外濾過により２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）に交換した後、１０ｍＬに濃縮した。得られた濃縮液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）で平衡化した陰イオン交換樹脂カラム（ＧＥヘルスケア社製，「Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム」）に加え、活性成分を吸着させ、カラムを同緩衝液で洗浄した。吸着されたタンパク質を、同緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇させることで溶出させた。活性画分を回収し、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で透析した。得られた活性画分に１５０ｍＭになるように塩化ナトリウムを添加し、遠心用フィルターデバイス（ミリポア社製，「Ａｍｉｃｏｎ」）を用いた限外濾過により約２００μＬに濃縮した。得られた濃縮液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したゲル濾過用カラム（ナカライテスク社製，「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｄｉｏｌ−３００−ＩＩ」）に添加し、同緩衝液を０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度で流すことによりタンパク質を溶出させた。回収した活性画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和になるように添加し、４０％飽和硫酸アンモニウムと１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した疎水クロマトグラフ用カラム（ナカライテスク社製，「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＨＩＣ」）に添加して活性成分を吸着させた。吸着されたタンパク質を、同緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に低下させることにより溶出させた。二つの活性画分を回収し、それぞれ４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で透析した。以下、得られた活性化区分を「酵素１」と「酵素２」という。これら酵素を下記条件のＨＰＬＣで分析した。
【００７４】
ＨＰＬＣ条件
カラム：  ＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：  Ａ）０．１％ＴＦＡ、Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル
グラジエント：２５％Ｂ（２分）、２５→５０％Ｂ（２５分）
流速：  １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：  ３０℃
検出：  ２１５ｎｍ
【００７５】
結果を図２に示す。図２のとおり、酵素１にはリテンションタイム１７分と１９分の２種類のタンパク質が含まれていた。酵素２はリテンションタイム１９分のタンパク質のみであった。
【００７６】
なお、上記において、酵素活性は以下のとおり測定した。先ず、マンデロニトリルを１Ｍになるようアセトニトリルに溶解した。５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）に、酵素溶液をそのまま或いは必要に応じて希釈して１μＬ、および１Ｍマンデロニトリル溶液を５μＬ加えて合計５００μＬとし、室温で１分間反応させた。反応後、ヘキサン５００μＬで反応生成物を抽出し、下記条件のＨＰＬＣにて生成したベンゾイルシアニドおよび共存するマンデロニトリルベンゾエートを測定した。
【００７７】
ＨＰＬＣ条件
カラム：  ＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：  ６０％アセトニトリル（０．０４％リン酸含む）
流速：  １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：  ３０℃
検出：  ２７３ｎｍ（ベンゾイルシアニド）
２３２ｎｍ（マンデロニトリルベンゾエート）
【００７８】
なお、本発明では、マンデロニトリル酸化酵素活性１Ｕを、マンデロニトリルからベンゾイルシアニドを１分間に１μｍｏｌ生成する酵素量と定義する。
【００７９】
実施例２：  至適ｐＨの検討
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素２を、様々なｐＨに設定した緩衝液中で反応させて至適ｐＨを求めた。その結果、本酵素はｐＨ６〜７で高い活性を示した。しかし、ｐＨの上昇に伴って基質であるマンデロニトリルの自然分解が顕著になるため、反応溶液のｐＨは５前後が適すると判断した。
【００８０】
実施例３：  至適温度および熱安定性の検討
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素２を様々な温度に設定した緩衝液中で反応させ、至適温度を求めた。その結果、本酵素の至適温度は約２０℃であることが判明した。
【００８１】
また、本酵素を２５〜７０℃で１５分間加熱処理した後、酵素活性を測定して熱安定性を調べた。その結果、本酵素は５０℃までは８０％以上の活性を維持し、６０℃でも４５％の活性を示すという熱安定性を有していた。
【００８２】
実施例４：  基質特異性の検討
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素２の様々な化合物に対する酸化酵素活性を確認した。被検化合物としては、２−プロパノール、ベンジルアルコール、１−フェニルエタノール、２−アミノ−１−フェニルエタノール、マンデル酸、マンデル酸メチルを用いた。反応後、ヘキサンで抽出した生成物をＧＣ−ＭＳで分析した。
【００８３】
また、被検化合物として置換ベンズアルデヒドシアノヒドリン、置換フェニルアセトアルデヒドシアノヒドリン、アルカナールおよびアルケナールシアノヒドリンについても同様に実験を行った。但しこの場合には、被検化合物を、ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１、１０：１または５：１の混合液、或いは、酢酸エチルまたはベンゼンに１０ｍＭになるよう溶解し、酵素溶液１μＬと５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）１００μＬの混合溶液に被検化合物溶液を添加し、二相系で１５分間反応させた。反応後、被検化合物を溶解した溶媒と同じ溶媒１ｍＬで抽出し、生成物をＧＣ−ＭＳで分析した。
【００８４】
なお、本実施例では、生成物の標品が入手困難であり生成物の定量が困難であるため、酵素反応による生成物の有無で活性の有無を評価した。活性が認められた化合物の化学構造を以下に示す。
【００８５】
【化４】
2015167478.tif 000005
【００８６】
上記結果のとおり、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素は、α−シアノヒドリン化合物であってそのシアノ基に対する第２位炭素−第３位炭素間にパイ電子系が存在する化合物に対して活性を示した。
【００８７】
実施例５：  過酸化水素の発生の確認
本発明酵素を用いたマンデロニトリル酸化反応における活性酸素の発生について検討した。上記実施例１の酵素反応条件において、１０ｍＭマンデロニトリル、適量のマンデロニトリル酸化酵素２、１ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン、および１Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液を用い、反応液量を１ｍＬとして反応を行い、生成した過酸化水素とペルオキシダーゼの作用により生成する色素の発色を、５５５ｎｍの吸光度により経時的に測定した。その結果、反応時間の経過とともに５５５ｎｍの吸光度が上昇し、過酸化水素の発生が認められた。
【００８８】
実施例６：  補因子の検討
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素２の溶液に最終濃度が１％になるよう過塩素酸を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。１６，０００×ｇで１０分遠心し、沈殿物を取り除いた。回収した上清をＨＰＬＣで分析した。その結果、リテンションタイム５．６分に標品と一致するＦＡＤを検出した。よって、本発明に係るマンデロニトリル酸化酵素は、補因子としてＦＡＤを有することが明らかとなった。
【００８９】
ＨＰＬＣ条件
カラム：  ＣＯＳＭＯＳＩＬ  Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：  １０％アセトニトリル（０．０９％リン酸含む）
流速：  １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：  ３０℃
検出：ＰＤＡ  ２００−５００ｎｍ
【００９０】
実施例７：  マンデロニトリル酸化酵素の部分アミノ酸配列の決定
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素をリジルエンドプロテアーゼでゲル内消化後、生じたペプチド断片をＨＰＬＣにて分離し、プロテインシークエンシングシステムにて内部アミノ酸配列を決定した（外部委託）。マンデロニトリル酸化酵素１の部分アミノ酸配列を配列番号５に、マンデロニトリル酸化酵素２の部分アミノ酸配列を配列番号６〜８に示す。
ＴＰＬＡＶＶＤＮＲＬＲＶ（配列番号５）
ＥＶＩＬＳＡＧＡＬＮ（配列番号６）
ＶＬＬＬＥＡＧＧ（配列番号７）
ＳＲＧＹＩＧＬＲＳ（配列番号８）
【００９１】
実施例８：  マンデロニトリル酸化酵素遺伝子のクローニング
（１）  マンデロニトリル酸化酵素１の遺伝子のクローニング
ヤンバルトサカヤスデの体節側方突起から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、全ＲＮＡを精製した。得られた全ＲＮＡから、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌｏａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）、およびＧｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。
【００９２】
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素１のｃＤＮＡのクローニングを、以下のように進めた。上記実施例７で得られた配列番号５のアミノ酸配列情報に基づいて、ｉｎ−ｈｏｕｓｅトランスクリプトームデータベースからマンデロニトリル酸化酵素１をコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列情報を取得し、それをもとに下記の遺伝子配列特異的プライマーを作製した。
ChuaMOX1-1：  5'-CATTGATACGATGGTTCGAGGCGTACACG-3'（配列番号９）
ChuaMOX1-2：  5'-CGGTTGTCAACCACAGCTAATGGAGTCTTG-3'（配列番号１０）
【００９３】
上記プライマーを用い、また、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼとしては、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ，ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社）を使用し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）に挿入し、塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報から、さらに下記の遺伝子配列特異的プライマーを作製した。なお、下記のプライマーにおいて、「Ｐ−５’」は、５’末端がリン酸化されていることを示す。
ChuaMOX1-3：  5'-GGTTCGCATCCAGGGAATGTGGCATTGTGC-3'（配列番号１１）
ChuaMOX1-4：  5'-CCCTTACACAGCGATGCTTATTGGGAATG-3'（配列番号１２）
P-ChuaMOX1-5：  P-5'-GTACAAGAGCTG-3'（配列番号１３）
ChuaMOX1-6：  5'-CAATGGACACACTCAAACAGGTGTACAACG-3'（配列番号１４）
ChuaMOX1-7：  5'-CCATTGATGGCATACTTAACTCCAATAGCG-3'（配列番号１５）
【００９４】
上記プライマーを用い、上記と同様にしてｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。ＰＣＲによるエラーを防ぐため、２１個の独立したクローンを用いた。全長のｃＤＮＡ配列（配列番号３）は、塩基配列解析ソフトであるＡＴＧＣとＧｅｎｅｔｙｘ  Ｖｅｒ．１２（Ｇｅｎｅｔｙｘ社）を用いて決定した。
【００９５】
決定された塩基配列より推定アミノ酸配列を求め、推定分子質量６２８１８Ｄａのマンデロニトリル酸化酵素１（配列番号１）を同定した。
【００９６】
（２）  マンデロニトリル酸化酵素２の遺伝子のクローニング
上記実施例１で精製したマンデロニトリル酸化酵素２のｃＤＮＡのクローニングについては、以下のように進めた。上記実施例７で得られた配列番号６〜８のアミノ酸配列情報に基づいて、マンデロニトリル酸化酵素２をコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列情報を取得し、それをもとに下記の遺伝子配列特異的プライマーを作製した。
ChuaMOx2-1：  5'-GATGCTAATGTGCGTGGTCGTCAGGGG-3'（配列番号１６）
ChuaMOx2-2：  5'-GAAATTTGGTCGAGTGTGAACAATGGGCCAC-3'（配列番号１７）
【００９７】
酵素１の場合と同様にして、ＰＣＲによるエラーを防ぐために１１個の独立したクローンを用い、酵素２の全ｃＤＮＡ配列（配列番号４）を決定した。
【００９８】
決定された塩基配列より推定アミノ酸配列を求め、推定分子質量６４６９５Ｄａのマンデロニトリル酸化酵素２（配列番号２）を同定した。
【図２】
2015167478.tif 000006
【図１】
2015167478.tif 000007
【配列表】
2015167478000001.app