(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内にｃＡＭＰ結合型タンパク質を発現させることなく、細胞内のｃＡＭＰを検出する方法の提供。【解決手段】ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞１と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示する平面脂質膜２と、マイクロチャンバーとを準備し、平面脂質膜２は、マイクロチャンバー３の開口部を覆う様に配置されており、マイクロチャンバー３内にｃＡＭＰ検出試薬４を具備しており、細胞１は平面脂質膜２と接し、細胞１とマイクロチャンバー３との間には、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路５が形成されている、（ｂ）細胞によって産生されたｃＡＭＰ６が連絡通路５を通して、マイクロチャンバー３に移動し、マイクロチャンバーの中でｃＡＭＰ６がｃＡＭＰ検出試薬４と結合し手生ずる検出試薬７の性質の変化を検出する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、
（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示する平面脂質膜と、マイクロチャンバーとを準備する工程であって、前記平面脂質膜は、前記マイクロチャンバーの開口部を覆う様に配置されており、前記マイクロチャンバー内にｃＡＭＰ検出試薬を具備しており、前記細胞は前記平面脂質膜と接し、前記細胞と前記マイクロチャンバーとの間には、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路が形成されている、工程と、
（ｂ）前記細胞によって産生されたｃＡＭＰが前記連絡通路を通して、前記マイクロチャンバーに移動し、前記マイクロチャンバーの中でｃＡＭＰが前記ｃＡＭＰ検出試薬と結合し、前記ｃＡＭＰ検出試薬がｃＡＭＰ結合状態試薬に変化する工程と、
（ｃ）前記ｃＡＭＰ検出試薬から前記ｃＡＭＰ結合状態試薬への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程と
を包含するｃＡＭＰ検出方法。
【請求項２】
前記ｃＡＭＰ検出試薬としてnano-Lantern(cAMP)を用いる、請求項１に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【請求項３】
前記平面脂質膜はコネキシン分子を提示し、前記平面脂質膜の作成方法として、バキュロウィルス−脂質膜融合法を用いる、請求項１に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【請求項４】
ラットβ１アドレナリン受容体に対するイソプロテレノール刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする、請求項２または３に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【請求項５】
マウス嗅覚受容体Olfr168に対する２−ペンタノン刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする、請求項２または３に記載のｃＡＭＰ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、細胞内のｃＡＭＰを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰは、細胞刺激に応答して、細胞内シグナル伝達分子により新たに細胞内で産生されるシグナル分子（セカンドメッセンジャー）の１つである。
【０００３】
非特許文献１は、細胞内にｃＡＭＰ結合型発光タンパク質を発現させ、細胞内ｃＡＭＰを検出する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−９８７１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fan, F. et al., Novel Genetically Encoded Biosensors Using Firefly Luciferase. ACS Chem. Biol., 3, 346, (2008)
【非特許文献２】Saito K, et al., Luminescent protein for high-speed single-cell and whole-body imaging, Nature Communications, 3, 1262, (2012)
【非特許文献３】Imre Berger et al., Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes, 22, 1583, (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願の、限定的ではない例示的なある実施形態は、細胞内にｃＡＭＰ結合型タンパク質を発現させたり、細胞外から細胞内にｃＡＭＰ検出試薬を注入したりすることなく、細胞内のｃＡＭＰを検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示する平面脂質膜と、マイクロチャンバーとを準備する工程であって、前記平面脂質膜は、前記マイクロチャンバーの開口部を覆う様に配置されており、前記マイクロチャンバー内にｃＡＭＰ検出試薬を具備しており、前記細胞は前記平面脂質膜と接し、前記細胞と前記マイクロチャンバーとの間には、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路が形成されている、工程と、（ｂ）前記細胞によって産生されたｃＡＭＰが前記連絡通路を通して、前記マイクロチャンバーに移動し、前記マイクロチャンバーの中でｃＡＭＰが前記ｃＡＭＰ検出試薬と結合し、前記ｃＡＭＰ検出試薬がｃＡＭＰ結合状態試薬７に変化する工程と、（ｃ）前記ｃＡＭＰ検出試薬から前記ｃＡＭＰ結合状態試薬への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程とを包含するｃＡＭＰ検出方法を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様にかかるｃＡＭＰの検出方法によれば、細胞内にｃＡＭＰ結合型発光タンパク質を発現させることなく、低侵襲に細胞内ｃＡＭＰを検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）および（ｂ）は、例示的な実施形態によるｃＡＭＰの検出方法を説明する概念図であり、（ｂ）は、（ａ）の破線Ｐ１で示す部分の拡大図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実施例１、２における平面脂質膜の準備方法を説明するための模式的な工程断面図であり、（ｄ）は（ｃ）の破線Ｐ２で示す部分の拡大図である。
【図３】（ａ）は、実施例１、２における細胞−マイクロチャンバー間連絡通路の作成方法を説明するための模式的な断面図であり、（ｂ）は、（ａ）の一部Ｐ３の拡大断面図である。
【図４】（ａ）は、実施例１、２における細胞−マイクロチャンバー間連絡通路の作成方法を説明するための模式的な断面図であり、（ｂ）および（ｃ）は、（ａ）の一部Ｐ４の拡大断面図である。
【図５】（ａ）は、実施例１、２における細胞およびマイクロチャンバーの観察装置の模式図であり、（ｂ）は、（ａ）の観察装置に設置された容器内の細胞およびマイクロチャンバーを示す拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一態様の概要は以下のとおりである。
【００１１】
本発明の一態様であるｃＡＭＰ検出方法は、ｃＡＭＰを検知または定量する方法であって、（ａ）コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示する平面脂質膜と、マイクロチャンバーとを準備する工程であって、前記平面脂質膜は、前記マイクロチャンバーの開口部を覆う様に配置されており、前記マイクロチャンバー内にｃＡＭＰ検出試薬を具備しており、前記細胞は前記平面脂質膜と接し、前記細胞と前記マイクロチャンバーとの間には、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路が形成されている、工程と、（ｂ）前記細胞によって産生されたｃＡＭＰが前記連絡通路を通して、前記マイクロチャンバーに移動し、前記マイクロチャンバーの中でｃＡＭＰが前記ｃＡＭＰ検出試薬と結合し、前記ｃＡＭＰ検出試薬がｃＡＭＰ結合状態試薬に変化する工程と、（ｃ）前記ｃＡＭＰ検出試薬から前記ｃＡＭＰ結合状態試薬への変化にともなう、検出試薬の性質の変化を検出する工程とを包含する。
【００１２】
前記ｃＡＭＰ検出試薬として、例えば、nano-Lantern(cAMP)を用いる。
【００１３】
前記平面脂質膜は、例えばコネキシン分子を提示し、前記平面脂質膜の作成方法として、バキュロウィルス−脂質膜融合法を用いてもよい。
【００１４】
上記ｃＡＭＰ検出方法は、例えば、ラットβ１アドレナリン受容体に対するイソプロテレノール刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする。
【００１５】
上記ｃＡＭＰ検出方法は、例えば、マウス嗅覚受容体Olfr168に対する２−ペンタノン刺激によって惹起された前記細胞内のｃＡＭＰ濃度上昇を検出対象とする。
【００１６】
図１（ａ）および（ｂ）は、本発明の例示的な実施形態によるｃＡＭＰの検出方法を説明する概念図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）の破線Ｐ１で示す部分の拡大図である。
【００１７】
まず、図１（ａ）および（ｂ）に示すように、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を発現する細胞１と、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を提示する平面脂質膜２と、マイクロチャンバー３とを準備する（工程（ａ））。平面脂質膜２は、マイクロチャンバー３の開口部を覆う様に配置されている。マイクロチャンバー３内は、ｃＡＭＰ検出試薬４を含む液で満たされている。
【００１８】
細胞１は、マイクロチャンバー３の外側に配置され、マイクロチャンバー３の上面に位置する平面脂質膜２と接している。細胞１とマイクロチャンバー３との間には、コネキシン分子もしくはイネキシン分子を介した連絡通路５が形成されている。
【００１９】
細胞１によってｃＡＭＰ６が産生されると、産生されたｃＡＭＰ６は、連絡通路５を通って、細胞１と接するマイクロチャンバー３に移動し、マイクロチャンバー３の内部でｃＡＭＰ検出試薬４と結合する。ｃＡＭＰ検出試薬４は、ｃＡＭＰ６との結合により、ｃＡＭＰ結合状態試薬７に変化する（工程（ｂ））。細胞１内のｃＡＭＰ６の産生は、例えば、ラットβ１アドレナリン受容体に対するisoproterenol刺激、あるいは、マウス嗅覚受容体Olfr168に対する2-pentanone刺激によって惹起される。
【００２０】
次に、工程（ｂ）におけるｃＡＭＰ検出試薬４からｃＡＭＰ結合状態試薬７への変化にともなった検出試薬の性質の変化を検出する（工程（ｃ））。これにより、細胞１内におけるｃＡＭＰ６の産生を検知したり、細胞１内で産生されたｃＡＭＰ６を定量することが可能になる。
【００２１】
ｃＡＭＰ検出試薬４として、例えば、nano-Lantern(cAMP)を用いてもよい。「nano-Lantern(cAMP)」は、化学発光タンパク質と蛍光タンパク質をハイブリッド化して得られる超高輝度化学発光タンパク質（Nano-lantern）を、ｃＡＭＰの検出用に改変した発光プローブであり、例えば非特許文献２に開示されている。nano-Lantern(cAMP)は、例えば、大腸菌株JM109(DE3)をNano-lantern cAMPの発現ベクター（非特許文献１で開示）によって形質転換して培養し（例えば２３℃）、培養中に大腸菌内部で生産されたNano-lantern cAMPタンパク質をNi-NTAアガロースを用いて精製することによって調整される。
【００２２】
nano-Lantern(cAMP)はｃＡＭＰと結合することにより、ｃＡＭＰとの結合前よりも発光強度の高い状態（ｃＡＭＰ結合状態試薬７）になる。従って、工程（ｃ）において、「検出試薬の性質の変化」として、例えば、発光強度の増加率を検出してもよい。なお、「検出試薬の性質の変化」は、発光強度の増加に限定されず、使用するｃＡＭＰ検出試薬に応じた性質の変化を検出することができる。
【００２３】
コネキシンを提示する平面脂質膜２の作成方法として、例えば、バキュロウィルス−脂質膜融合法を用いてもよい。
【００２４】
本実施形態におけるｃＡＭＰの検出方法は、細胞１内のｃＡＭＰを検知、定量またはその両方を行う方法を広く含む。例えば、ラットβ１アドレナリン受容体に対するisoproterenol刺激によって惹起された細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を検出対象としてもよい。あるいは、マウス嗅覚受容体Olfr168に対する2-pentanone刺激によって惹起された細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を検出対象としてもよい。
【００２５】
以下、図面を参照しながら、本発明による検出方法の実施例を説明する。
【００２６】
＜実施例１＞
（工程（ａ））
まず、β１アドレナリン受容体、Ｇαタンパク質、およびコネキシン４３を発現する細胞１が用意された。細胞１は、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リポフェクション法によって、β１アドレナリン受容体遺伝子（配列表の配列番号１）発現プラスミド、Gαタンパク質遺伝子（配列表の配列番号２）発現プラスミド、およびコネキシン４３遺伝子（配列表の配列番号３）発現プラスミドを導入し、表１に示した組成を有する培地中で、37℃の温度で、５％二酸化炭素雰囲気下で４８時間静置することによって準備された。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
次に、マイクロチャンバー３内にｃＡＭＰ検出試薬４を封入した状態で、マイクロチャンバー３の開口部を覆うように平面脂質膜２を作成した。
【００２９】
図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、マイクロチャンバー内に平面脂質膜２を作成する方法の一例を示す工程断面図である。図２（ｄ）は、図２（ｃ）におけるマイクロチャンバー３の上部Ｐ２の拡大図である。
【００３０】
具体的には、まず、図２（ａ）に示すように、ガラス１０の上に、PDMSステンシル１１を接着させることで複数のマイクロチャンバー３を形成した。マイクロチャンバー３の表面を大気プラズマで洗浄した後、ｃＡＭＰ検出試薬４を０．８ｎＭ（ナノモラー）含有する緩衝液Ａ（ｐＨ７．４)１２でマイクロチャンバー３を満たした。ここでは、ｃＡＭＰ検出試薬としてnano-Lantern(cAMP)を用いた。また、緩衝液Ａ１２として、表２に示される組成を有する緩衝液を用いた。次いで、図２（ｂ）に示すように、マイクロチャンバー３の外にあふれた緩衝液Ａ１２を脂質のヘキサデカン溶液１３（ＤＯＰＣ：０．７ｍｇ／ｍｌ、ＤＯＰＧ：０．３ｍｇ／ｍｌ）に置換した。その後、図２（ｃ）に示すように、脂質のヘキサデカン溶液１３中に、表３に示す組成を有する緩衝液Bの液滴１４を配置した。これにより、図２（ｄ）に示すように、液滴１４とマイクロチャンバー３の上部とが接するところに平面脂質膜２が形成された。これは、特許文献１に開示された接触法による脂質膜形成の応用である。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
続いて、マイクロチャンバー３と細胞１との間に連絡通路５を形成した。
【００３４】
図３（ａ）および図４（ａ）は、それぞれ、連絡通路５の形成方法の一例を示す工程断面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）の一部Ｐ３の拡大図、図４（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ、図４（ａ）の一部Ｐ４の拡大図である。
【００３５】
まず、コネキシン４３を提示するバキュロウィルス２０が一般的な組み替えバキュロウィルス作成法（非特許文献３）によって準備された。
【００３６】
次いで、図３（ａ）に示すように、細胞１とバキュロウィルス２０とを同一容器内、緩衝液Ｂ中で静置することで、細胞１表面に提示されたコネキシン４３と、バキュロウィルス２０に提示されたコネキシン４３との複合体を形成した。このとき、図３（ｂ）に示すように、細胞１とバキュロウィルス２０との間に、連絡通路５が形成された。
【００３７】
図４（ａ）に示すように、得られた複合体を緩衝液Ｂの液滴１４に加える。これにより、図４（ｂ）に示すように、バキュロウィルス２０と平面脂質膜２とが融合し、図４（ｃ）に示すように、マイクロチャンバー３と細胞１との間に連絡通路５が形成された構造が得られた。
【００３８】
マイクロチャンバー３は、底面がガラス１０であるため、倒立顕微鏡観察に用いることができる。したがって、倒立顕微鏡によって、細胞、平面脂質膜およびマイクロチャンバーの状態を観察することが可能である。
【００３９】
（工程（ｂ））
図４（ｃ）に示す構造によって、細胞１内のｃＡＭＰは連絡通路５を通して、マイクロチャンバー３に拡散する。こうすることで、マイクロチャンバー内ｃＡＭＰ濃度は細胞内ｃＡＭＰ濃度を反映する。本実施例では、液滴１４に、β１アドレナリン受容体の活性化剤であるイソプロテレノール（isoproterenol）を添加し、細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を惹起した。これにより、マイクロチャンバー３内のｃＡＭＰ濃度も上昇した。液滴１４への試薬添加は、後述するようにキャピラリーを介して行われた。
【００４０】
マイクロチャンバー内に流入したｃＡＭＰは、マイクロチャンバー３に内包されたnano-Lantern(cAMP)と結合し、nano-Lantern(cAMP)の発光強度を変化させる。nano-Lantern(cAMP)の発光に必要な基質であるセレンテラジンは、液滴１４から、平面脂質膜を透過して供給される。先述のとおり、リポソーム内のｃＡＭＰ濃度は細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇を反映するため、nano-Lantern(cAMP)の発光強度変化は、細胞内のｃＡＭＰ濃度変化を反映する。本実施例では、マイクロチャンバー３内のｃＡＭＰ濃度の上昇により、nano-Lantern(cAMP)の発光強度が増加した。
【００４１】
（工程（ｃ））
次いで、nano-Lantern(cAMP)の発光強度の増加率を測定することにより、細胞１内のｃＡＭＰ濃度変化を検出した。
【００４２】
図５（ａ）は、本工程で使用した観察装置の模式図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）の観察装置に設置された容器２１内の細胞およびリポソームを示す拡大図である。本実施例では、観察装置として、ＣＣＤカメラつき倒立顕微鏡３１を用いた。
【００４３】
図５（ａ）および（ｂ）に示すように、ＣＣＤカメラつき倒立顕微鏡３１に、マイクロチャンバー３を備えた容器２１を設置し、細胞１が接触したマイクロチャンバー３ａ内の発光を捕らえ、輝度の時間変化を記録した。容器２１内の液滴１４への試薬添加は、キャピラリー３０を介して行われた。迷光の影響を避けるため、倒立顕微鏡は、十分に外光を遮った暗室下におかれる必要がある。輝度の記録をしつつ、細胞外液（液滴１４）にβ１アドレナリン受容体のアゴニストであるイソプロテレノールを終濃度30μM（マイクロモラー）で添加したところ（上記工程（ｂ））、アゴニストの添加により、細胞１に接触したマイクロチャンバー３ａの発光が上昇し、細胞１内のｃＡＭＰ濃度上昇を捕らえた。
【００４４】
表４に実施例１で得られたマイクロチャンバー３ａ内の発光強度の増加率を示す。発光強度増加率は下記の式によって算出される。
発光強度増加率＝（アゴニスト添加後の最大発光強度）/（アゴニスト添加直前の発光強度）−1
【００４５】
＜比較例１＞
比較例１は、実施例１の工程（ｃ）に下記の変更を加えて実施された。その他の工程は、実施例１と同様とした。
【００４６】
工程（ｃ）において細胞１に接触していないマイクロチャンバー３ｂの発光を捕らえ、輝度の時間変化を記録した。 表４に比較例１で得られたマイクロチャンバー３ｂの発光強度の増加率を示す。
【００４７】
＜実施例２＞
実施例２は、実施例１の工程（ａ）および工程（ｃ）に、下記の変更を加えて実施された。その他の工程は、実施例１と同様とした。
【００４８】
実施例２の工程（ａ）においては、細胞１として、マウス嗅覚受容体Olfr168、Gαタンパク質、受容体輸送タンパク質（RTP1S）、およびコネキシン４３を発現する細胞が用意された。
【００４９】
細胞１は、HEK293T細胞に、リポフェクション法によって、マウス嗅覚受容体Olfr168遺伝子（配列表の配列番号４）発現プラスミド、Gαタンパク質遺伝子発現プラスミド、受容体輸送タンパク質（RTP1S）遺伝子（配列表の配列番号５）発現プラスミド、およびコネキシン４３遺伝子を導入し、37℃の温度で、５％二酸化炭素雰囲気下で48時間静置することによって準備された。
【００５０】
実施例２の工程（ｃ）においては、液滴１４に加える受容体アゴニストとして、マウス嗅覚受容体Olfr168のアゴニストである２−ペンタノンが終濃度3mM（ミリモラー）で添加された。
【００５１】
表５に実施例２で得られたマイクロチャンバー３ａ内の発光強度増加率を示す。
【００５２】
＜比較例２＞
比較例２は、実施例２の工程（ｃ）に下記の変更を加えて実施された。その他の工程は、実施例２と同様とした。
【００５３】
比較例２の工程（ｃ）において、細胞１に接触していないマイクロチャンバー３ｂ内の発光を捕らえ、輝度の時間変化を記録した。
【００５４】
表５に比較例２で得られたマイクロチャンバー３ｂ内の発光強度の増加率を示す。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
【表５】
2015186464.tif 000007
【００５７】
表４および表５に示す結果から分かるように、細胞１と接していないマイクロチャンバー３ｂ内では、細胞１内でｃＡＭＰが産生されてもnano-Lantern(cAMP)の発光強度は変化しなかった（比較例１、２）。これに対し、細胞１と連絡通路５を介して接するマイクロチャンバー３ａ内では、細胞１内でｃＡＭＰが産生されると、nano-Lantern(cAMP)の発光強度が高くなった（実施例１、２）。従って、nano-Lantern(cAMP)の発光強度の増加率を測定することにより、細胞内ｃＡＭＰの濃度変化を検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明一態様にかかるｃＡＭＰ検出方法は、細胞内にｃＡＭＰ結合性タンパク質を発現させることなく、細胞内ｃＡＭＰの濃度変化を検出することができるので、薬剤スクリーニング、細胞生理学研究、細胞分化評価などに有用である。また、細胞内の低分子を、低侵襲にマイクロチャンバー内に抽出する方法を含んでいるため、メタボロジーへの展開も期待される。
【符号の説明】
【００５９】
１        細胞
２        平面脂質膜
３        マイクロチャンバー
４        ｃＡＭＰ検出試薬
５        連絡通路
７        ｃＡＭＰ結合状態試薬
１０      ガラス
１４      液滴
２０      バキュロウィルス
２１      容器
３１      倒立顕微鏡
【図１】
2015186464.tif 000008
【図２】
2015186464.tif 000009
【図３】
2015186464.tif 000010
【図４】
2015186464.tif 000011
【図５】
2015186464.tif 000012
【配列表】
2015186464000001.app