(57)【要約】【課題】培養設備が簡便であり、且つ、コンタミネーションの懸念が少ない、微生物の効率的な培養方法（特に、液体培地による液体培養法）等を提供する。【解決手段】発酵槽において液体培地で微生物（但し、偏性嫌気性微生物を除く）を培養する際に、培養中は発酵槽中の培養液をダイヤフラムポンプにより循環させ、その循環中にマイクロバブル発生装置により通気することで、高い生存率及び活性を保持した微生物（例えば酵母、乳酸菌など）を簡便且つ効率的に培養する（増殖させる）ことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵槽において液体培地で微生物（但し、偏性嫌気性微生物を除く）を培養する方法であって、培養中は発酵槽中の培養液をダイヤフラムポンプにより循環させ、その循環中にマイクロバブル発生装置により培養液に通気することを特徴とする、微生物の液体培養法。
【請求項２】
酵母又は乳酸菌の培養を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母の培養を行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母の培養を行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
マイクロバブル発生装置による通気量を１分間当たり培養液量の１００分の１〜１０分の１の量とすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
循環液量を１分間当たり培養液量の１〜５倍量とすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の液体培養法に関する。詳細には、簡便な装置を用いて、コンタミネーション等の懸念なく効率的に微生物を培養し、増殖させるための液体培養法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の工業的生産（大量培養）においては、高効率性と汚染（コンタミネーション）の低リスク性が求められる。このうち、高効率性を達成するためには、例えば好気性菌であれば、安定した十分な酸素供給が重要なファクターであり、そのためには培養液の十分な攪拌が必要である。通性嫌気性菌の場合でも、酸素供給の必要性はないが、培養液の攪拌は増殖環境の均一化という点で重要である。
【０００３】
このため、微生物の大量培養を行う場合、通常、攪拌設備が備わった発酵槽（発酵タンク）を用いる。しかし、大きな発酵槽ほど、攪拌設備の外界との遮断性が低くなる傾向にあり、例えば、攪拌シャフトなどはコンタミネーションの原因となりやすい。なお、小スケールの培養でしばしば用いられるマグネットスターラーによる攪拌は、大量培養に適した方法ではない。
【０００４】
また、好気性菌等の培養での酸素供給については、高効率性達成のためには攪拌だけでなく培養液への通気が必要とされており、通常は１分間に培養液の液量と同量程度の通気量が求められる。ここで、攪拌設備に頼らないで培養液への通気及び攪拌を行う方法として、エアー攪拌（通気による攪拌）が知られているが、これは大量培養においては攪拌が不十分になりやすく、また酸素供給も十分でない場合があるため、培養効率に影響が出る可能性がある。さらに、通気配管にポンプを直結して培養液を循環・攪拌する方法も考えられるが、これはポンプのメカニカルシール等からの汚染（コンタミネーション）の懸念があり、通常は採用されてこなかった。
【０００５】
なお、これ以外にも微生物の効率的な培養を行い且つコンタミネーションのリスクを低減した培養装置等の提案はいくつかなされているが（例えば特許文献１）、特殊な装置を用意する必要性がある場合が多く、簡便な方法とは言えない。
【０００６】
このような背景技術の中で、簡便な（汎用品で設計可能な）装置を用いて、コンタミネーション等の懸念なく効率的に微生物を培養し、増殖させる方法等の開発が、各種業界（例えば醸造業界、発酵食品製造業界等）などから引き続き望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１６１１３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、培養設備が簡便であり、且つ、コンタミネーションの懸念が少ない、微生物の効率的な培養方法、特に、液体培地による液体培養法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、発酵槽において液体培地で好気性微生物や通性嫌気性微生物を培養するにあたり、培養中は発酵槽中の培養液をダイヤフラムポンプにより循環させ、その循環中の培養液にマイクロバブル発生装置により通気することで、高い生存率及び活性を保持した微生物（例えば酵母、乳酸菌など）を簡便且つ効率的に培養する（増殖させる）ことができることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）発酵槽において液体培地で微生物（但し、偏性嫌気性微生物を除く）を培養する方法であって、培養中は発酵槽中の培養液をダイヤフラムポンプ（あるいは、これと同様の構造を有するポンプ）により循環させ、その循環中に（例えば、循環配管において）マイクロバブル発生装置により培養液に通気（空気導入又は酸素導入）することを特徴とする、微生物の液体培養法。
（２）酵母又は乳酸菌の培養を行うことを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母の培養を行うことを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母の培養を行うことを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）マイクロバブル発生装置による通気量を１分間当たり培養液量の１００分の１〜１０分の１の量（例えば、培養液量が２．５Ｌの場合０．０２５〜０．２５Ｌ／ｍｉｎ程度）とすることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）循環液量を１分間当たり培養液量の１〜５倍量（例えば、培養液量が２．５Ｌの場合２．５〜１２．５Ｌ／ｍｉｎ程度）とすることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、攪拌設備のない発酵槽、ダイアフラムポンプ、マイクロバブル発生ノズルなどの簡便な装置により、非常に少ない通気量で培養液中の溶存酸素濃度を安定的に高められ、好気性微生物や通性嫌気性微生物（酵母、乳酸菌など）を高効率で大量に培養することができる。そして、本発明に係る培養法では、外界との遮断性を著しく高めることが可能であるため、コンタミネーションの懸念が極めて少ないのも特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る微生物の液体培養法の装置模式図を示す。図中の番号１が発酵槽、番号２がダイヤフラムポンプ、番号３がマイクロバブル発生装置、番号４が循環配管を表す。また、循環配管中の矢印は培養液の通液方向を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明においては、発酵槽（発酵タンク）により微生物の液体培養を行う。使用する発酵槽は攪拌設備を備えている必要はなく、特に、攪拌シャフトなどの外界との遮断性に影響を与える設備がないものを用いるのが好ましい。発酵槽の容量については、特段の限定はなく、小容量（１リットル程度）から大容量（数百リットル程度）までのものを幅広く使うことができる。
【００１４】
そして、この発酵槽とダイアフラムポンプを循環配管により接続して、発酵槽内の培養液をこのポンプにより循環させながら微生物を培養する。循環液量としては、１分間当たり培養液量（総培養液量）の１〜５倍量程度が好ましく、例えば培養液が５Ｌである場合には、５〜２５Ｌ／ｍｉｎ程度である。なお、本発明においては、このような培養液の循環を行うことにより、これ以外の培養液の物理的攪拌を全く行わないのが特徴である。
【００１５】
ダイアフラムポンプについては、市販品等を適宜使用でき、特段の制限はない。なお、ダイアフラムポンプは、通液部分が構造上外界と遮断されており、コンタミネーションの懸念が極めて低いことが特徴である。また、流量及び液圧も十分あり、大容量（例えば数百リットル程度）の発酵槽においても十分適応可能である。この他、このような構造を有するポンプとしては、メカニカルシールの無いマグネットポンプ（例えば三和ハイドロテック株式会社製品など）等がある。
【００１６】
さらに、この循環中（例えば循環配管の途中）にマイクロバブル発生装置を組み込み、循環中の培養液にマイクロバブル通気（空気又は酸素の導入）を行う。マイクロバブル発生装置へはコンプレッサー等を用いて空気又は酸素を供給し、この際、供給する空気又は酸素は、０．１〜０．５μｍ程度のフィルターを通して除菌を行うのが好ましい。そして、培養液への通気量は、空気導入を例とすれば、１分間当たり培養液量（総培養液量）の５０分の１〜１０分の１の量とするのが好ましく、例えば培養液が５Ｌである場合には、０．１〜０．５Ｌ／ｍｉｎ程度である。酸素導入の場合には、１分間当たり培養液量（総培養液量）の１００分の１〜２０分の１の量としても良い。
【００１７】
マイクロバブル発生装置についても、市販品等を適宜使用でき、特段の制限はないが、ループ流式マイクロバブル発生ノズル（例えばＯＫエンジニアリング有限会社製品など）を用いるのが好ましい。そして、マイクロバブル発生装置の組み込みは、循環中の培養液に安定的に通気できるところであれば場所、順序等の限定はないが、ダイアフラムポンプから発酵槽への戻し配管に組み込むのが最も好適である。
【００１８】
微生物の培養条件は、微生物培養の一般的な液体培地（例えば、酵母であればＹＰＤ培地など）を用い、至適培養温度（例えば、酵母であれば３０〜３５℃程度）付近で一定時間（例えば２４〜４８時間程度）培養を行う。なお、本発明において酵母を培養する場合、上記培養条件以外の実施態様を完全に除外するものではないが、この培養条件の範囲内で実施するのがより好適である。
【００１９】
本発明の培養対象となる微生物は、好気性微生物及び通性嫌気性微生物であり、酸素存在下で増殖できない偏性嫌気性微生物は除外される。例えば、好気性微生物としては酵母など、通性嫌気性微生物としては乳酸菌などが例示され、醸造食品、発酵食品に多く用いられているサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母を対象とするのが好適である。このサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母としては、清酒酵母、焼酎酵母、パン酵母などが例示される。なお、味噌・醤油などの製造に関わる耐塩性酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属など）などの他の属の酵母が対象として除外されるものではない。また、通性嫌気性微生物は、酸素の存在下で増殖しやすい種を対象とするのが好ましい。
【００２０】
このような本発明に係る微生物の液体培養法は、一般的な通気及び攪拌設備での攪拌を行う通常法（従来法）よりはるかに少ない通気量で培養液中の溶存酸素濃度を高められ、対象微生物の効率的な培養が達成でき、また、外界との遮断性を低くするような設備がなく且つポンプ等の全てが密閉系であることからコンタミネーションの懸念が極めて少なく、しかも、培養設備の構造が極めて簡単（簡素）であるためコストメリットも高い。なお、本発明に係る培養方法に用いる装置の一例を、模式図として図１に示した。
【００２１】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例１】
【００２２】
（醸造用酵母の培養試験）
本発明に係る液体培養法と従来法の醸造用酵母培養効率等を比較確認するため、以下の試験を実施した。
【００２３】
好気性菌である醸造用酵母（きょうかい７０１号）を以下の２つの方法で培養した。まず、本発明に係る方法は、攪拌設備のない発酵槽（容量５Ｌ）に２．５Ｌの滅菌液体培地（ＹＰＤ培地）を加え、別に上記酵母を同じ培地で前培養した培養液を投入し、これを循環配管を通じてダイアフラムポンプ（Ｘｙｌｅｍ株式会社製品；ＦＬＯＪＥＴ  Ｄｉａｐｈｒａｇｍ  Ｐｕｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ４４０５−１４３）で循環させた。そして、ダイアフラムポンプから発酵槽へ戻す循環配管の途中にマイクロバブル発生装置（ＯＫエンジニアリング有限会社製品）を備え付け、このエアー吸入部には０．５μｍフィルターを付けて除菌をしながらマイクロバブル通気を行った。なお、循環液量は７Ｌ／ｍｉｎ、通気量は０．１Ｌ／ｍｉｎとした。
【００２４】
一方、本発明の対照となる従来法（対照法）は、攪拌設備（攪拌シャフト）を備えた発酵槽（容量５Ｌ）に２．５Ｌの滅菌液体培地（ＹＰＤ培地）を加え、別に上記酵母を同じ培地で前培養した培養液を投入した。そして、コンプレッサーを用いて０．５μｍフィルターを通して発酵槽に直接通気を行った。なお、攪拌シャフトの回転数は２５０ｒｐｍ、通気量は２．５Ｌ／ｍｉｎ（１ＶＶＭ）とした。
そして、これらを４８時間培養し、２４時間後、４８時間後における酵母数（個／ｍｌ）及び生菌率を測定した。
【００２５】
この結果を下記表１に示した。下記表１の結果からわかる通り、本発明に係る方法は、対照法の約１０分の１の通気量で且つ攪拌設備での培養液攪拌を行わなくとも、対照法と同等の培養効率で酵母を培養、増殖できることが明らかとなった。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００２８】
本発明は、培養設備が簡便であり、且つ、コンタミネーションの懸念が少ない、微生物の効率的な培養方法（特に、液体培地による液体培養法）等を提供することを目的とする。
【００２９】
そして、発酵槽において液体培地で微生物（但し、偏性嫌気性微生物を除く）を培養する際に、培養中は発酵槽中の培養液をダイヤフラムポンプにより循環させ、その循環中にマイクロバブル発生装置により通気することで、高い生存率及び活性を保持した微生物（例えば酵母、乳酸菌など）を簡便且つ効率的に培養する（増殖させる）ことができる。
【図１】
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