(57)【要約】      （修正有）【課題】多能性幹細胞を分化させる方法を提供する。【解決手段】多能性幹細胞をアクチビンＡを５０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を０．２５〜２％体積／体積（ｖ／ｖ）で含む培地中で培養し、胚体内胚葉細胞を産生し、これを特定の胚層への分化を制御及び方向づけすることで、例えば、治療及び薬物スクリーニングにおいて有用である肝細胞様細胞及び膵細胞様細胞を産生する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類の多能性幹細胞（ｐＰＳＣ）から胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を産生する方法であって、アクチビンＡ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地中でｐＰＳＣを培養し、それによってＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される遺伝子を発現するＤＥ細胞を産生する段階を含んでなる方法。
【請求項２】
前記アクチビンＡが５０〜１５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培地中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アクチビンＡが１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＰＳＣが変化する濃度の前記ＤＭＳＯの存在下で培養される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＭＳＯが０．２５〜２％体積／体積の範囲内の濃度で培地中に存在する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＤＭＳＯが０．２５〜０．７５％体積／体積の範囲内の濃度で培地中に存在する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＤＭＳＯが０．５〜０．６％体積／体積の範囲内の濃度で培地中に存在する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ｐＰＳＣが最初は高濃度のＤＭＳＯの存在下で培養され、次いで低濃度のＤＭＳＯの存在下で培養される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
培地がさらに、ＦＧＦ２、Ｗｎｔ３ａ、ＳＦＲＰ５及びＬＹ２９４００２からなる群から選択される１種以上の増殖因子又はモジュレーターを含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ｐＰＳＣが培地中で３〜５日間培養される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ｐＰＳＣが培地中で４日間培養される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ｐＰＳＣが、ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞及び間葉幹細胞からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
さらに、ＤＭＳＯを含む培地中でＤＥ細胞を分化させ、それによって肝細胞様細胞又は膵細胞様細胞を産生する段階を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ＤＭＳＯ並びにＢＭＰ２、ＦＧＦ４及びＢＭＰ４からなる群から選択される増殖因子又はモジュレーターを含む培地中で前記ＤＥ細胞を培養し、それによってＡＬＢを発現する肝細胞様細胞を産生する段階を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４記載の方法によって産生される肝細胞様細胞。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法によって産生される膵細胞様細胞。
【請求項１７】
肝細胞に対する効果に関して試験化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１５記載の肝細胞様細胞を試験化合物に接触させる段階、及び前記試験化合物の不存在下で前記肝細胞様細胞の形態、表現型、生理機能、遺伝子発現又は生存可能性の変化を測定する段階を含んでなる方法。
【請求項１８】
膵細胞様細胞に対する効果に関して試験化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１６記載の膵細胞様細胞を試験化合物に接触させる段階、及び前記試験化合物の不存在下で前記膵細胞様細胞の形態、表現型、生理機能、遺伝子発現又は生存可能性の変化を測定する段階を含んでなる方法。
【請求項１９】
霊長類の多能性幹細胞（ｐＰＳＣ）から中胚葉細胞を産生する方法であって、アクチビンＡ及びＤＭＳＯを含む培地中でｐＰＳＣを培養し、それによってＮＣＡＭ／ＣＤ５６、ＫＤＲ、ＰＤＧＲＦ−α、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６及びＣＤ１６６からなる群から選択される遺伝子を発現する中胚葉細胞を産生する段階を含んでなる方法。
【請求項２０】
霊長類の多能性幹細胞（ｐＰＳＣ）から外胚葉細胞を産生する方法であって、アクチビンＡ及びＤＭＳＯを含む培地中でｐＰＳＣを培養し、それによってＭＡＰ２、ＰＡＸ６及びＮＥＵＲＯＤ１からなる群から選択される遺伝子を発現する外胚葉細胞を産生する段階を含んでなる方法。
【請求項２１】
薬物又は毒性スクリーニングにおける請求項１５記載の肝細胞様細胞の使用。
【請求項２２】
薬物又は毒性スクリーニングにおける請求項１６記載の膵細胞様細胞の使用。
【請求項２３】
治療における請求項１５記載の肝細胞様細胞又は請求項１６記載の膵細胞様細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞生物学の分野に関し、特に多能性幹細胞を分化させる方法に関する。本発明の方法は、多能性幹細胞から特定の胚層への分化を制御及び方向づけすることで、例えば、治療及び薬物スクリーニングにおいて有用である肝細胞様細胞及び膵細胞様細胞を産生するために使用できる。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のような多能性幹細胞は、中胚葉、外胚葉及び内胚葉胚層の誘導体である全ての細胞タイプに対する起源を提供する能力を有する。
【０００３】
多能性幹細胞から肝細胞様細胞へのインビトロ分化は、潜在的に、薬物開発、薬物誘発毒性の検出及び再生医学における研究及び治療用途の可能性を有する無限の数の細胞を生成することができる（Ｌｅｍａｉｇｒｅ，Ｆ．Ｐ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００９．１３７（１），６２−７９）。しかし、特定の細胞タイプへの分化過程はしばしば非効率的であり、再現性に欠ける。多くの場合、早期アイデンティティ（例えば、胚体内胚葉（definitive endoderm））を獲得する細胞の能力は、たとえ必要な増殖因子及び／又は小分子をステージ特異的なやり方で添加した場合でも、さらに特定の細胞タイプに成功裡に移行し得る細胞を導くことはない（Ｏｃｈｉｙａ，Ｔ．，  Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ  Ａ．Ｂａｎａｓ．，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．２０１０．７９（２），６５−７３）。
【０００４】
胚体内胚葉（ＤＥ）は約１５日間のヒト胚形成で形成され、それは肝臓を含む各種の臓器を生み出すので、その効率的なインビトロ分化は非常に重要である。ｈＥＳＣを低濃度の血清の存在下で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡに暴露すると多数の細胞にＤＥアイデンティティを獲得させるという重要な発見（Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５．２３（１２），１５３４−４１）は。ＤＥへの分化のさらなる改善に道を開いた。アクチビンＡは、インビボでのＤＥ発生に際して極めて重要なＮｏｄａｌシグナリングを模倣するために使用された。分化を改善するための試みにおいて非常に多くの因子がＤＥ特異化培地に添加されてきたが（例えば、酪酸ナトリウム、Ｂ２７（Ｈａｙ，Ｄ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００８．２６（４），８９４−９０２；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００８．１０（３），３３１−９）、アルブミン画分Ｖ（Ｃａｉ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００７．４５（５），１２２９−３９）、ＦＧＦ４及びＢＭＰ２（Ｈａｎｎａｎ，Ｎ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，２０１３．８（２），４３０−７）、Ｗｎｔ３ａ及びＨＧＦ（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，２０１０．１９（７），９６１−７８））、主分化剤としての１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの使用は十分に確立されている。
【０００５】
これらの研究にもかかわらず、多能性転写因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現を効果的にダウンレギュレートさせるのは依然として難しいままであり（Ｈａｙ，Ｄ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００８．２６（４）：８９４−９０２；Ｓｙｎｎｅｒｇｒｅｎ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，２０１０．１９（７），９６１−７８；Ｔｏｕｂｏｕｌ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１０．５１（５），１７５４−６５）、これは分化因子に対するｈＥＳＣの応答がある程度妨げられている可能性を示唆している。したがって、ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ及び他の霊長類多能性幹細胞（ｐＰＳＣ）から内胚葉、中胚葉又は外胚葉系統の細胞への分化過程を方向づけるための簡単でコスト効果的かつ効率的な方法に対するニーズが今なお存在している。特に、多能性ヒト幹細胞から胚体内胚葉への分化を最適化するための簡単で頑強な方法に対するニーズが存在している。
【０００６】
本発明はこれらの問題と取り組み、（例えば、薬物開発及び毒性学試験のための）インビトロスクリーニング及び治療において有用な内胚葉、中胚葉及び外胚葉系統の細胞を産生するための方法を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ｐＰＳＣから内胚葉、中胚葉又は外胚葉系統の細胞への分化を方向づけるために使用できる方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、霊長類の多能性幹細胞から胚体内胚葉への分化を方向づけるための方法を提供する。
【０００８】
本発明の第１の態様に従えば、ｐＰＳＣから胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を産生する方法であって、アクチビンＡ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地中でｐＰＳＣを培養し、それによってＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される遺伝子を発現するＤＥ細胞を産生する段階を含んでなる方法が提供される。
【０００９】
本方法の利点は、さらに内胚葉系統の他の細胞タイプ（例えば、肝細胞又は膵細胞）に分化させ得るＤＥ細胞が高い収量で産生されることである。
【００１０】
一実施形態では、アクチビンＡは５０〜１５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で培地中に存在する。
【００１１】
別の実施形態では、アクチビンＡは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する。
【００１２】
さらに別の実施形態では、ｐＰＳＣは変化する濃度のＤＭＳＯの存在下で培養される。
【００１３】
一実施形態では、ＤＭＳＯは０．２５〜２％体積／体積（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で培地中に存在する。好ましくは、ＤＭＳＯは０．２５〜０．７５％ｖ／ｖの範囲内の濃度で培地中に存在する。さらに好ましくは、ＤＭＳＯは０．５〜０．６％ｖ／ｖの範囲内の濃度で培地中に存在する。
【００１４】
別の実施形態では、ｐＰＳＣは最初は高濃度のＤＭＳＯの存在下で培養され、次いで低濃度のＤＭＳＯの存在下で培養される。
【００１５】
さらに別の実施形態では、培地はさらに、ＦＧＦ２、Ｗｎｔ３ａ、ＳＦＲＰ５及びＬＹ２９４００２からなる群から選択される１種以上の増殖因子又はモジュレーターを含む。
【００１６】
一実施形態では、ｐＰＳＣは培地中で３〜５日間培養される。好ましくは、ｐＰＳＣは培地中で４日間培養される。
【００１７】
別の実施形態では、ｐＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞及び間葉幹細胞からなる群から選択される。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明の第１の態様の方法はさらに、ＤＭＳＯを含む培地中でＤＥ細胞を分化させ、それによって肝細胞様細胞又は膵細胞様細胞を産生する段階を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、ＤＭＳＯ並びにＢＭＰ２、ＦＧＦ４及びＢＭＰ４からなる群から選択される増殖因子又はモジュレーターを含む培地中で前記ＤＥ細胞を培養し、それによってＡＬＢを発現する肝細胞様細胞を産生する段階を含む。
【００２０】
本発明の第２の態様に従えば、本明細書中で前記に記載された方法によって産生される肝細胞様細胞が提供される。
【００２１】
本発明の第３の態様に従えば、本明細書中で前記に記載された方法によって産生される膵細胞様細胞が提供される。
【００２２】
本発明の第４の態様に従えば、肝細胞に対する効果に関して試験化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書中に記載された肝細胞様細胞を試験化合物に接触させる段階、及び試験化合物の不存在下で肝細胞様細胞の形態、表現型、生理機能、遺伝子発現又は生存可能性の変化を測定する段階を含んでなる方法が提供される。
【００２３】
本発明の第５の態様に従えば、膵細胞様細胞に対する効果に関して試験化合物をスクリーニングする方法であって、本明細書中に記載された膵細胞様細胞を試験化合物に接触させる段階、及び試験化合物の不存在下で膵細胞様細胞の形態、表現型、生理機能、遺伝子発現又は生存可能性の変化を測定する段階を含んでなる方法が提供される。
【００２４】
本発明の第６の態様に従えば、ｐＰＳＣから中胚葉細胞を産生する方法であって、アクチビンＡ及びＤＭＳＯを含む培地中でｐＰＳＣを培養し、それによってＮＣＡＭ／ＣＤ５６、ＫＤＲ、ＰＤＧＲＦ−α、ＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６及びＣＤ１６６からなる群から選択される遺伝子を発現する中胚葉細胞を産生する段階を含んでなる方法が提供される。好ましい実施形態では、中胚葉細胞は心筋細胞である。
【００２５】
本発明の第７の態様に従えば、ｐＰＳＣから外胚葉細胞を産生する方法であって、アクチビンＡ及びＤＭＳＯを含む培地中でｐＰＳＣを培養し、それによってＭＡＰ２、ＰＡＸ６及びＮＥＵＲＯＤ１からなる群から選択される遺伝子を発現する外胚葉細胞を産生する段階を含んでなる方法が提供される。好ましい実施形態では、外胚葉細胞はニューロンである。
【００２６】
本発明の第８の態様に従えば、薬物又は毒性スクリーニングにおける本明細書中で前記に記載された肝細胞様細胞の使用が提供される。
【００２７】
本発明の第９の態様に従えば、薬物又は毒性スクリーニングにおける本明細書中で前記に記載された膵細胞様細胞の使用が提供される。
【００２８】
本発明の第１０の態様に従えば、治療における本明細書中で前記に記載された肝細胞様細胞又は膵細胞様細胞の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＤＥ分化の４日目における分化マーカーのフローサイトメトリー分析を示している。
【図２】図２は、ＤＥ分化の４日目における分化マーカーのｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ＆Ｂ）及びフローサイトメトリー（Ｃ）分析を示している。
【図３】図３は、ＤＥ分化の４日目における分化マーカーの免疫蛍光分析を示している。
【図４】図４は、ＤＥ及び肝細胞プロジェニター分化の４日目及び１２日目における分化マーカーの免疫蛍光分析を示している。（Ａ）ステージ１及びステージ２分化操作の模式図。（Ｂ）分化マーカーの免疫蛍光染色。
【図５】図５は、分化マーカーに関するｑＲＴ−ＰＣＲデータの相関分析を示している。
【図６】図６は、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析による本発明方法と先行技術方法との比較を示している。
【図７】図７は、免疫蛍光による本発明方法と先行技術方法との比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書で用いる「霊長類の多能性幹細胞」（ｐＰＳＣ）という用語は、適切な条件下で３つの胚層（即ち、内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全ての誘導体である様々な細胞タイプの子孫を産生し得る特性、又は組織培養において３つの胚層の全ての同定可能な細胞を形成する能力を有する霊長類由来の細胞をいう。多能性幹細胞の定義には、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８．２８２，１１４５−４７）によって記載されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ，２００７．１３１，８６１−８７２）によって記載された、分化した細胞の再プログラミングによって産生される人工多能性幹細胞、及びＲｅｖａｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７，９（３），４３２−４４９）によって記載された、受精なしに産生された胚から誘導される単為生殖性ヒト胚性幹細胞（ｐｈＥＳＣ）によって例示される様々なタイプの胚細胞が含まれる。
【００３１】
最近、Ｋｉｌｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，２００６．４４４，４８１−４８５）は、胚を破壊することなく単一の割球からｈＥＳＣを単離するための単一割球生検法を記載した。さらに、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００８．２（２），ｐ．１１３−７）は、胚の破壊なしに、ｈＥＳＣ共培養なしの１つを含む５つのｈＥＳＣ株の誘導を実証した。割球は着床前遺伝診断と同様な技法を用いて取り出し、かかる操作は親胚の以後の胚盤胞発達を妨げないように思われた。
【００３２】
疑念を回避するため、胚組織、胎児組織、成人組織（例えば、ｉＰＳＣ）又は他の源から誘導されるか否かにかかわらず、完全に多能性である（３つの胚層の全ての誘導体である子孫を産生し得る）霊長類由来の任意の細胞がｐＰＳＣの定義に含まれる。
【００３３】
未分化ｈＥＳＣの培養
Ｈ１ヒトＥＳ細胞株をＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（マディソン、米国ウィスコンシン州）から入手し、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）被覆容器（被覆時約０．３ｍｇ／ｍｌ）上で増殖させ、ｍＴｅＳＲ中で培養した（いずれもＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ社から入手）。Ｈ７ヒトＥＳ細胞株をマトリゲル被覆容器上で増殖させ、８０ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び０．５ｍｇ／ｍｌのＴＧＦＢＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ１０  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社）中においてフィーダーフリーかつ血清フリーの状態で維持した。約８０％コンフルエントになった時点で細胞を継代するため、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼで５分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手）でトリプシン処理した。ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中の１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ社）を用いてトリプシン処理を停止した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＹＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）を用いて全細胞数及び生細胞数を決定した。コラゲナーゼIVを用いて、継代すべきフラスコ中のコロニーの境界を分離した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地中にこすり落とし、新しいマトリゲル被覆容器上に０．５〜０．６×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で継代した。培地は毎日交換した。
【００３４】
ｈＥＳＣの分化
胚体内胚葉の形成：ｈＥＳＣを適切な培養フラスコ又はプレート上に０．６×１０5細胞／ｃｍ2で継代し、２日間培養した。胚体内胚葉分化を開始させるためには、ｈＥＳＣをＰＢＳで１回洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）及び０．２５〜２％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）を補充したＲＭＰＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で培養した。最初の２４時間後にＦＢＳ（０．２％）を添加し、培地を毎日交換しながら細胞を４日間培養した。
【００３５】
肝細胞特異化：ｈＥＳＣから誘導された胚体内胚葉細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手）、Ｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）、３０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ４、０．５％ＤＭＳＯを補充したＫＯ−ＤＭＥＭ培地及び２％ＫＯＳＲ中でＢＭＰ４と共に５日間培養した。次いで、肝芽細胞様細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、新しいマトリゲル被覆容器上に０．４×１０5細胞／ｃｍ2で播種し、同じ培地中で次の３日間培養した。ただし、ＢＭＰ４を１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦで置換した。次に、細胞をｐＰＳＣで洗浄し、２％ＦＢＳ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２μｇ／ｍｌインスリン（Ｒｏｃｈｅ社）、２μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳｉｇｍａIV）、１０-7Ｍデキサメタゾン（ＳｉｇｍａIV）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補充したＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で、培地を毎日交換しながら６日間培養した。次いで、
２％ＦＢＳ、２μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２μｇ／ｍｌインスリン、１０-7Ｍデキサメタゾン及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭを補充したＬ−１５培地（フェノールレッドフリー、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で、培地を毎日交換しながら細胞を１０日間培養した。
【００３６】
ＨｅｐＧ２の培養
肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞株（ＡＴＴＣ）を、ポリ−Ｄ−リシン被覆容器上において、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で０．４×１０5細胞／ｃｍ2の密度で２日間培養した後に使用した。
【００３７】
免疫蛍光分析
ステージ特異的マーカーを検出するため、９６ウェルプレート（透明な底部を有するｕＣｌｅａｒ黒色プレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ社）中で細胞を増殖させ分化させた。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、４％パラホルムアルデヒド（ＵＳＢ社）中において室温で１５分間固定し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、パーム／洗浄緩衝液（ＢＤ社）中の１％ＢＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び０．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）中においてＲＴで３０分間ブロックした。続いて、細胞をパーム／洗浄緩衝液で希釈した一次ウサギ抗ＯＣＴ４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）及びマウス抗ＳＯＸ１７抗体（Ａｂｃａｍ社）によってＲＴで２時間又は４℃で一晩染色した。続いて、細胞をパーム／洗浄緩衝で数回洗浄し、パーム／洗浄緩衝で１：４００に希釈したヤギ抗マウスＦＩＴＣ及びニワトリ抗ウサギＣｙ５（分子プローブ）と共に暗所において４℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで数回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共に室温で１５分間インキュベートした。続いてＰＢＳで洗浄した後、９６ウェルプレートをＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で画像化した。
【００３８】
フローサイトメトリー分析
６ウェルプレート中で培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｐｗｂｌｏｇｉｅｓ社）で処理して単一細胞懸濁液を得た。５分間のインキュベーション後、１０％ＦＢＳを含む培地を添加することでトリプシンを不活性化した。細胞を計数し、３００ｇで５分間遠心し、ＰＢＳで２回洗浄し、続いて２％パラホルムアルデヒド（ＵＳＢ社）中で固定した。室温で１５分間遠心した後、
細胞をＰＢＳ及びパーム／洗浄緩衝液（ＰＷＢ）（ＢＤ社）で洗浄し、続いて０．１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）及び二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の種からの１０％血清を補充したパーム／洗浄緩衝液中に４×１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、次いで５０μＬのアリコート（２×１０5細胞）を個別の５ｍｌポリスチレン丸底ＦＡＣＳアッセイチューブに移した。ＯＣＴ４及びＳＯＸ１７による細胞の二重染色のためには、細胞をパーム／洗浄緩衝液中において最初にマウス抗ＯＣＴ４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社）で染色し、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳで２回洗浄し、パーム／洗浄緩衝液中においてヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）及びヤギ抗ＳＯＸ１７−ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共にインキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、試料を３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％ＦＢＳ中に３００μＬ／チューブの最終体積で再懸濁した。ＯＣＴ４及びＳＯＸ１７に関する独立の染色を同様にして実施した。細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトフローメーター上で分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００３９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  ＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて全細胞ＲＮＡの単離を実施し、各試料中のＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計上で測定した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ＲＥＶＥＲＳＥ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて１μｇの抽出全ＲＮＡを逆転写した。非標識ＰＣＲプライマー及びＦＡＭ系プローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｐｗｂｌｏｇｉｅｓ社によるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）をＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に用いて、ＴａｑＭａｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＣＰを実施した。濃縮ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×）を水及びｃＤＮＡと合わせた。Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘの最終濃度は、水で希釈した適当な濃度のプライマー／ＦＡＭプローブを添加する異なるで達成した。７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で反応を実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲサイクリング条件は、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１０分間及び６０℃で１分間の４５サイクルであった。各試料は、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用しながら三重に試験した。結果の分析は、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ用のＳＤＳソフトウェアにおいて実施した。ＧＡＰＤＨ及びＢ−Ａｃｔｉｎハウスキーピング遺伝子に対して相対定量化を計算し、各試料からの反復試験に関して標準偏差（ｎ＝３）を報告した。
【００４０】
結果
フローサイトメトリーによるＯＣＴ４及びＳＯＸ１７発現の分析（図１）は、アクチビンＡ含有培地に０．５％及び１％ＤＭＳＯを添加すれば、アクチビンＡのみで処理した対照細胞に比べてＯＣＴ４発現細胞の減少及びＳＯＸ１７発現細胞の増加が生じることを示している。Ｎｏｄａｌシグナリングは脊椎動物の生体内における胚体内胚葉の特異化にとって非常に重要であり、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの使用はこのシグナリング経路をインビトロで再現してＤＥへの分化を刺激するための当技術分野の標準技術である。増殖因子ＦＧＦ２及びＷｎｔ３ａは、アクチビンＡと共に使用した場合、ＤＥ分化を助けることが報告されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（１２），１５３４−４１；Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６．２４（１１），１３９２−４０１）。アクチビンＡにＦＧＦ２又はＷｎｔ３ａを補充することは、アクチビンＡ及びＤＭＳＯに比べて劣ったＤＥへの分化を生じることがわかった（図１）。
【００４１】
ｑＲＴ−ＰＣＲ及びさらにフローサイトメトリー分析（図２）は、アクチビンＡの作用を増強するために使用したした場合、ＤＭＳＯがＤＥ形成を促進する作用を有することを確認した。ｑＲＴ−ＰＣＲ（図２Ａ＆Ｂ）は、ＤＭＳＯの増加する濃度がＯＣＴ４発現の有意な用量依存性減少並びにＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４及びＣＸＣＲ４のアップレギュレーションを生じる異なるを示し、ＯＣＴ４のダウンレギュレーションはフローサイトメトリー分析によって確認された（Ｃ）。
【００４２】
アクチビンＡで推進されるＤＥへの分化のＤＭＳＯ増強の、免疫蛍光イメージングによるさらなる分析（図３）は、ＤＭＳＯの増加する濃度（Ａ＋Ｘ％ＤＭＳＯ）が０％から２％ＤＭＳＯまでＯＣＴ４発現のダウンレギュレーションを生じることを確認した。ＳＯＸ１７染色は０．６％ＤＭＳＯで最大であった。これらのデータは、ＤＭＳＯに関して０．５〜０．６％の最適濃度を表いている。
【００４３】
予備的ＤＥ特異化ステージ１でのアクチビンＡ＋ＤＭＳＯによる細胞の処理は、肝細胞表現型へのさらなる細胞分化のために不可欠であることが判明した（図４）。アクチビンＡ及びＤＭＳＯによる細胞の処理は、４日目においてＯＣＴ４の有意なダウンレギュレーション及びＳｏｘ１７のアップレギュレーションを生じた（図４Ｂ；Ａ）が、後者はこの初期特異化段階の不存在下では認められなかった（図４Ｂ；Ｂ）。初期アクチビンＡ＋ＤＭＳＯステージ１の特異化段階を含めればまた、アクチビンＡ及びＤＭＳＯでプライムさない細胞（図４Ｂ；Ｆ）に比べ、肝細胞様細胞への分化の１２日目において細胞のＡＦＰ発現をアップレギュレートした（図４Ｂ；Ｃ）。
【００４４】
マーカー遺伝子発現の相関分析（図５）は、ＤＥから肝細胞様細胞への分化の全期間にわたってＤＭＳＯがもたらす分化の増強を確証した。分化の４日目におけるＯＣＴ４ダウンレギュレーション及びＳＯＸ１７アップレギュレーションの直線的相関は、様々な濃度のＤＭＳＯ（Ｘ％ＤＭＳＯ）の存在下で観察された（図５Ａ）。良好な相関（図５Ｂ）はまた、４日目（胚体内胚葉）における増加したＳＯＸ１７発現及び２８日目（肝細胞様細胞）におけるＡＬＢ発現とＤＭＳＯの増加する濃度（Ｘ％ＤＭＳＯ）との間でも観察された。最後に良好な相関は、４日目（胚体内胚葉）において減少したＯＣＴ４発現及び２８日目（肝細胞様細胞）において増加したＡＬＢ発現とＤＭＳＯの増加する濃度（Ｘ％ＤＭＳＯ）との間でも記録された（図５Ｃ）。
【００４５】
本発明の方法と確立された先行技術方法との比較（図６）は、ＤＥ分化におけるアクチビンＡの活性を増強するためのＤＭＳＯの使用に由来する有意な改善を示した。（図６Ａ）ｈＥＳＣ及びＨｅｐＧ２対照細胞並びにＨａｙ  ｅｔ  ａｌの方法を用いて５日目にＤＥに分化させたｈＥＳＣ（Ｈａｙ  Ｄ５）及び本発明のＤＭＳＯ法を用いて４日目にＤＥに分化させたｈＥＳＣ（ＫＣＧＥ  Ｄ４）における遺伝子多能性及び分化遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現プロファイリング。（Ｂ）ｈＥＳＣ及びＨｅｐＧ２対照細胞並びにＨａｙ  ｅｔ  ａｌの方法を用いて５日目にＤＥに分化させたｈＥＳＣ（Ｈａｙ  Ｄ５）及び本発明のＤＭＳＯ法を用いて４日目にＤＥに分化させたｈＥＳＣ（ＫＣＧＥ  Ｄ４）における個別遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲデータ。これらのデータは、標準的な先行技術であるＨａｙ  ｅｔ  ａｌのプロトコルと本発明のＫＣＧＥ方法との間の統計的に有意な（**ｐ＜０．０５及び***ｐ＜０．０１）差を示している。
【００４６】
本発明の方法によってもたらされる改善は、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌの先行技術方法及び本発明のＫＣＧＥ方法によって産生されたＤＥ細胞におけるＳＯＸ１７及びＯＣＴ４発現の免疫蛍光分析（図７）によって確証された。本発明の方法は、先行技術方法に比べてＯＣＴ４発現の大幅な減少増加したＳＯＸ１７発現を生じた。
【００４７】
全体としてこれらのデータは、ｈＥＳＣからＤＥへ、続いてさらなる分化子孫への分化を促進するアクチビンＡの作用をＤＭＳＯが増強することを確証している。ＤＭＳＯは０．２５〜２％の濃度範囲にわたって活性であることが示され、遺伝子発現並びに細胞の形態及び生存可能性に基づく最も有益な効果は０．２５〜０．７５％ＤＭＳＯの濃度範囲で観察され、最大の利益は０．５〜０．６％ＤＭＳＯで観察された。
【００４８】
細胞培養及び分化におけるＤＭＳＯの作用機構はまだ未知のままであるが、この小分子は部分的にヒストンデアセチラーゼ阻害剤として機能し得ることで（Ｍａｒｋｓ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｒ．Ｂｒｅｓｌｏｗ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７．２５（１），８４−９０）、ヒストンデアセチラーゼの活性を抑制し、ひいてはクロマチンをあまりコンパクト化されない状態に維持し、それによって転写のためにより利用しやすくするものと仮定されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２００２．１（４），２８７−９９）。いかなる特定の仮説にも限定されることはないが、胚体内胚葉分化において、アクチビンＡ系培地に特定濃度範囲内のＤＭＳＯを添加することは、ＤＥプライミング遺伝子の発現のための利用可能性を高め、それによってこの胚層の形成を統制する転写機構に積極的な影響を及ぼことがあり得る。
【００４９】
本発明では、胚体内胚葉分化に際してアクチビンＡ系培地に０．５〜０．６％の小分子ＤＭＳＯを添加すると、多能性遺伝子の迅速なダウンレギュレーションが起こり、この効果の結果としてＤＭＳＯは胚体内胚葉形成を統制するアクチビンＡの能力を有意に増強した。このプロトコルと、ＤＥ特異化に際してヒストンデアセチラーゼ阻害剤酪酸Ｎａを使用するＨａｙ  ｅｔ  ａｌのプロトコル（Ｈａｙ，Ｄ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８．２６（４），８９４−９０２）との並行分化は、多能性転写因子ＯＣＴ４を効果的にダウンレギュレートするという点においてＤＭＳＯにより達成される有意な効果をさらに確証した。
【００５０】
ＤＥ分化ステージ中にこの小分子を含めることのさらなる意外な特徴は、有意にアップレギュレートされたアルブミンレベルによって示されるように、肝細胞特異化の下流ステージにおいて観察された。これは、細胞分化の開始直後における多能性遺伝子の短期ダウンレギュレーションが、マルチステージ分化過程を通じて細胞が分化シグナルに効率よく長期間応答するためには非常に重要であることを実証している。
【００５１】
以上、本発明の好ましい例示的な実施形態を記載してきたが、当業者には、限定ではなく例示のみを目的として記載された実施形態以外のやり方でも本発明を実施できることが容易に理解されよう。本発明は以下に示す特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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