(57)【要約】      （修正有）【課題】ヤマノイモ植物に感染した場合に、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有する新たな弱毒性ヤマノイモモザイクウイルスや、かかる弱毒性ヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物の提供。【解決手段】（ａ）特定の塩基配列からなるＲＮＡを有する弱毒性ヤマノイモモザイクウイルス；（ｂ）特定の塩基配列と少なくとも９３％以上の同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡを有し、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有する弱毒性ヤマノイモモザイクウイルス；の（ａ）又は（ｂ）に記載の弱毒性ヤマノイモモザイクウイルス。前記弱毒性ヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマイモ又はムカゴ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のヤマノイモモザイクウイルス。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するヤマノイモモザイクウイルス；
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９３％以上の同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡを有し、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有するヤマノイモモザイクウイルス；
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶ−ＴＫ−２、又は配列番号２に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶ−ＴＫ−７である請求項１記載のヤマノイモモザイクウイルス。
【請求項３】
請求項１又は２記載のヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物。
【請求項４】
ヤマノイモ属植物が自然薯であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のヤマノイモ属植物。
【請求項５】
請求項３又は４記載のヤマノイモ属植物を栽培して得られたイモ。
【請求項６】
請求項３又は４記載のヤマノイモ属植物を栽培して得られたムカゴ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤマノイモモザイクウイルスや、ヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヤマノイモ属植物は、日本で食用として広く栽培されており、主に、日本原産種である自然薯、中国大陸原産種であるナガイモ、熱帯アジア原産種であるダイショの三種に分類される。かかるヤマノイモ属植物は、主に種イモから栽培されるため、ウイルスを保毒した種イモを用いて栽培すると、ウイルスを保毒したヤマノイモ属植物が生育してしまう。現在日本で栽培されているヤマノイモ属植物のほとんどが、ポティウイルス科ポティウイルス属に属するヤマノイモモザイクウイルス（Japanese yam mosaic virus:ＪＹＭＶ）に感染していることが知られている。ヤマノイモモザイクウイルスに感染すると葉に黄色小斑点が生じ、黄変部は次第にえそ症状となり、早枯を生じやすくなるため、無病徴株と比べて収量が大きく低下する。
【０００３】
菌類病や細菌病に対する薬剤が開発されているなかで、ウイルス病に対しては実用的な薬剤の開発が進んでいない。したがって、ヤマノイモ属植物におけるヤマノイモモザイクウイルス病対策としては、無病種子・苗の利用や、アブラムシ等の媒介昆虫の防除が行われてきた。
【０００４】
無病種子・苗の利用としては、ヤマノイモモザイクウイルスフリーの種イモ若しくは苗を利用する方法が用いられるが、生育過程で早期にヤマノイモモザイクウイルスに感染してしまうという問題があった。また、アブラムシ等の媒介昆虫の防除としては、農薬を使用する方法や、周辺の雑草を除去する方法が用いられていた。しかしながら、農薬を使用する方法においては、イモが奇形し易いという問題や、農薬の使用に対する消費者の抵抗感が生じるという問題があり、周辺の雑草を除去する方法においては、遠方から飛来する媒介昆虫によるヤマノイモモザイクウイルス伝播を完全に防ぐことは難しいという問題があった。
【０００５】
近年、ウイルス病に対する有効な防除手段として、植物があるウイルスに感染した場合に、かかる植物は感染したウイルスと同系統の他のウイルスに感染しにくくなる「干渉効果」という現象を利用し、弱毒性ウイルスをウイルスワクチンとして予め植物に接種して強毒性ウイルスによる感染を防ぐという方法が注目されてきた。その結果、トマト系統に対するウイルスＬ11Ａ２３７（非特許文献１参照）や、マスクメロンに感染するキュウリ緑斑モザイクウイルス（非特許文献２参照）等が弱毒性ウイルスとして実用化されてきた。
【０００６】
ヤマノイモ属植物においても、ヤマノイモモザイクウイルスＹＭＯ６を有しており、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対する抵抗性を有しているヤマノイモ属植物(特許文献１参照)や、ヤマノイモモザイクウイルスＪＹＭＶ−Ｍに感染しているヤマノイモモザイクウイルス抵抗性作物(特許文献２参照)が提案されているが、系統が異なる強毒ウイルスに対しては高い干渉効果が望めず、実用化に適したより優良なヤマノイモモザイクウイルスの作出が熱望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１７２２０５号公報
【特許文献２】特開２０００−３００２７０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】大島信行ら、新弱毒ウイルスL11A237、日植病報、44：504-508(1978)
【非特許文献２】亀谷満朗、弱毒ウイルス利用によるウイルス病の防除、農業および園芸、64:159-164(1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ヤマノイモ植物に感染した場合に、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有する新たなヤマノイモモザイクウイルスや、かかるヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、まずは病徴が軽く、かつヤマノイモモザイクウイルスに感染しているヤマノイモ属植物をいくつか選別した。選別したヤマノイモ属植物を、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物の１ｍ近傍で栽培しても病徴は軽く、かつイモやムカゴの収量がウイルスフリー株の収量と同等又はそれ以上となることを見いだした。さらに、かかるヤマノイモ属植物に感染しているウイルスの外被タンパク質領域の塩基配列を決定し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、［１］（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するヤマノイモモザイクウイルス；（ｂ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９３％以上の同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡを有し、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有するヤマノイモモザイクウイルス；の（ａ）又は（ｂ）に記載のヤマノイモモザイクウイルスや、［２］配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶ−ＴＫ−２、又は配列番号２に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶ−ＴＫ−７である上記［１］記載のヤマノイモモザイクウイルスに関する。
【００１２】
また、本発明は、［３］上記［１］又は［２］記載のヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物や、［４］ヤマノイモ属植物が自然薯であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のヤマノイモ属植物に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、［５］上記［３］又は［４］記載のヤマノイモ属植物を栽培して得られたイモや、［６］上記［３］又は［４］記載のヤマノイモ属植物を栽培して得られたムカゴに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のヤマノイモモザイクウイルスをヤマノイモ属植物に感染させることで、ヤマノイモ属植物に強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対する抵抗性を付与することが可能となる。また、本発明のヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物を栽培することで、イモやムカゴの収量を向上させることや農薬の使用を軽減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】弱毒候補株のＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。矢印はヤマノイモモザイクウイルスに特有のバンドである２４１ｂｐの位置を示す。
【図２】電気泳動の結果に基づき各株のヤマノイモモザイクウイルス感染の有無をまとめた結果を示す図である。
【図３】汁液接種による弱毒性の確認試験における接種源と接種植物との組み合わせを示す図である。
【図４】汁液接種を行った植物の病徴観察結果を示す図である。
【図５】屋外漆塚農場における圃場試験の栽培方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のヤマノイモモザイクウイルスとしては、（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するヤマノイモモザイクウイルス；（ｂ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９３％以上の同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡを有し、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有するヤマノイモモザイクウイルス；の（ａ）又は（ｂ）に記載のヤマノイモモザイクウイルスであれば特に制限されず、かかるヤマノイモモザイクウイルスは弱毒性を有するとともに、ヤマノイモ属植物に感染することで、感染したヤマノイモ属植物に強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対する抵抗性を与えることが可能となる。
【００１７】
本発明において、弱毒性とは、ウイルスが植物に感染した場合に、植物においてモザイク症状、萎縮、壊死、黄化、葉脈の糖化等の病徴がほとんど示されず、生育や収量に影響がほとんどないウイルスの性質をいう。一方、強毒性とは、ウイルスが植物に感染した場合に、植物においてモザイク症状、萎縮、壊死、黄化、葉脈の糖化等の病徴を示し、植物の生育や収量に影響があるウイルスの性質をいう。また、本発明において、弱毒性ウイルスが感染した植物を弱毒株、強毒性ウイルスが感染した植物を強毒株という。
【００１８】
本発明において、ヤマノイモモザイクウイルス（Japanese yam mosaic virus:以下、ＪＹＭＶともいう）とは、ポティウイルス科ポティウイルス属に属し、長さ６８０〜７８０ｎｍのひも状のＲＮＡウイルスをいう。国内で栽培されているヤマノイモ植物に感染しているウイルスのほとんどは、ＪＹＭＶである。
【００１９】
本発明において、配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するヤマノイモモザイクウイルスとしては、ゲノムＲＮＡ中に配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有しているヤマノイモモザイクウイルスであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶ−ＴＫ−２（以下、単に「ＪＹＭＶ−ＴＫ−２」ともいう。）を挙げることができる。
【００２０】
また、配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９３％以上の同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡを有し、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有するヤマノイモモザイクウイルスとしては、ゲノムＲＮＡ中に配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＲＮＡを有し、ヤマノイモ植物に感染した場合に、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して干渉作用を有するヤマノイモモザイクウイルスであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号２に示される塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶ−ＴＫ−７（以下、単に「ＪＹＭＶ−ＴＫ−７」ともいう。）を挙げることができる。
【００２１】
前記干渉作用とは、植物があるウイルスに感染した場合に、かかる植物は、感染したウイルスと同系統の他のウイルスに感染しにくくなるという現象を意味する。
【００２２】
ＪＹＭＶ−ＴＫ−２やＪＹＭＶ−ＴＫ−７は植物ウイルスであることから、特許庁長官の指定する寄託機関において受託ができない微生物に該当する。そのため、出願人自らが国立大学法人宇都宮大学に保管し、一定条件下で譲渡可能としている。なお、配列番号１に示される塩基配列と配列番号２に示される塩基配列とは９９．６％の同一性を有する。
【００２３】
本発明において、ヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物としては、上記本発明のヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物であれば特に制限されないが、ＪＹＭＶ−ＴＫ−２又はＪＹＭＶ−ＴＫ−７に感染したヤマノイモ属植物を好適に例示することができる。かかるヤマノイモ植物は、ヤマノイモマイルドモザイクウイルスや、ヤマノイモえそモザイクウイルス等のヤマノイモ属に感染する他のウイルスと重複感染してもよい。
【００２４】
ヤマノイモモザイクウイルスに感染したヤマノイモ属植物は、カーボランダムでヤマノイモ属植物を傷つけ、ヤマノイモモザイクウイルス感染葉の汁液をこすりつけて感染させる汁液接種法や、ヤマノイモモザイクウイルスに感染した種イモ若しくはムカゴを栽培する方法や、アブラムシ等の植物ウイルス媒介昆虫にヤマノイモモザイクウイルスを含む液を吸汁させて、かかる媒介昆虫によって接種する媒介昆虫法により得ることができる。汁液接種法や、媒介昆虫法によって接種する場合には、接種するヤマノイモ属植物としてウイルスフリーのヤマノイモ属植物を用いることが好ましい。
【００２５】
ヤマノイモ植物としては、自然薯（Dioscorea japonica）や、ナガイモ群、ツクネイモ群、イチョウイモ群からなるナガイモ（Dioscorea opposita）や、ダイショ（Dioscorea alata）等を例示することができ、自然薯を好適に例示することができる。
【００２６】
本発明のイモ（担根体）としては、上記本発明のヤマノイモ植物を栽培して得られたイモであれば特に制限されないが、本発明のヤマノイモモザイクウイルスに感染した自然薯を栽培して得られたイモであることが好ましい。イモはヤマノイモ属植物の一般的な栽培方法によって得ることができるほか、例えば次の文献（特開２００９−２９６９２７号公報）に記載の方法により得ることができ、かかる文献の方法を用いれば、地表でイモを栽培することができることから、栽培労力を低減することが可能となる。
【００２７】
本発明のムカゴとしては、上記本発明のヤマノイモ植物を栽培して得られたムカゴであれば特に制限されないが、本発明のヤマノイモモザイクウイルスに感染した自然薯を栽培して得られたムカゴであることが好ましい。ムカゴはヤマノイモ属植物の一般的な栽培方法によって得ることができるほか、例えば次の文献（特開２０１２−１６１３１１号公報）に記載の方法により得ることができ、かかる文献の方法を用いれば、空中でムカゴを大きく栽培すること、ムカゴの形が円柱状になることから扱いを容易にすること、食用のムカゴとして高収量で収穫することが可能となる。
【実施例１】
【００２８】
［弱毒候補株の選抜］
（栽培した株及びｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出）
平成２４年６月２９日に、カクヤス商販株式会社の漆塚農場（栃木県那須郡那須町漆塚）で栽培している自然薯の株であるＴＫ１（１）〜（３）、ＴＫ２（１）〜（３）、ＴＫ３（１）〜（３）、ＴＫ４（１）〜（３）、ＴＫ５（１）〜（３）、ＴＫ６（１）〜（４）、ＴＫ７（１）、ＴＫ８（１）〜（４）、市販のウイルスフリー株(ＶＦ株)であるＶＦ１〜８の合計３２株から葉を採取して凍結保存した。凍結保存した葉０．１ｇから、simple-direct-tube (SDT)方法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出を行った。ＳＤＴ方法は、ウイルスの検出をより簡便、安価、迅速に行えるように、Kajihara Hらの文献(Kajihara et al., J. Gen. Plant Pathol. 75:72-75(2009))を参考に考案した方法で、感染葉の摩砕にはＰＢＳＴではなく０．０５Ｍ炭酸バッファー（pH9.6）を使用し、汁液の静置時間を室温で１５分から３７℃で２時間に変更し、ＤＥＰＣ水３０μlに溶出後、８０℃で５分間処理し氷上に２分間静置する処理を追加している。なお、ＴＫ１（１）〜（３）、ＴＫ２（１）〜（３）、ＴＫ３（１）〜（３）、ＴＫ４（１）〜（３）、ＴＫ５（１）〜（３）、ＴＫ６（１）〜（４）、ＴＫ７（１）、ＴＫ８（１）〜（４）は、それぞれ上記農場で平成２３年に栽培した自然薯の株であるＴＫ１、ＴＫ２、ＴＫ３、ＴＫ４、ＴＫ５、ＴＫ６、ＴＫ７、ＴＫ８から得た１又は複数の種イモから生育した株であり、例えば、ＴＫ１（１）〜（３）はＴＫ１から得た３つの種イモからそれぞれ生育した株を表す。
【００２９】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
次に、PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit (タカラバイオ社製)を用いて抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＪＹＭＶに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲでＪＹＭＶの感染の有無を調べた。ＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマーとしては、次の文献(Kajihara et al., J. Gen. Plant Pathol. 75:72-75(2009))を基に設計した配列番号３に示すフォワードプライマー（125F）と配列番号４に示すリバースプライマー（12345R）を用い、ＢＩＯＴＡＱ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＬＩＮＥ社製）を用いてそのプロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、ＪＹＭＶ特有のバンド（２４１ｂｐ）を観察することでＪＹＭＶの感染の有無を判断した。
【００３０】
（結果）
図１（ａ）に、各レーン（１〜８）左から順にＴＫ１（１）、ＴＫ２（１）、ＴＫ３（１）、ＴＫ４（１）、ＴＫ５（１）、ＴＫ６（１）、ＴＫ７（１）、ＴＫ８（１）のサンプルの泳動パターン結果を示し、図１（ｂ）に、各レーン（１〜１０）左から順にＶＦ１〜１０のサンプルの泳動パターン結果を示す。図には示していないが、ＴＫ１（２）、（３）の泳動パターンはＴＫ１（１）と同様であり、ＴＫ２（２）、（３）の泳動パターンはＴＫ２（１）と同様であり、ＴＫ３（２）、（３）の泳動パターンはＴＫ３（１）と同様であり、ＴＫ４（２）、（３）の泳動パターンはＴＫ４（１）と同様であり、ＴＫ５（２）、（３）の泳動パターンはＴＫ５（１）と同様であり、ＴＫ６（２）〜（４）の泳動パターンはＴＫ６（１）と同様であり、ＴＫ８（２）〜（４）の泳動パターンはＴＫ８（１）と同様であった。また、電気泳動の結果に基づき各株のＪＹＭＶの感染の有無をまとめた結果を図２に示す。
【００３１】
ＪＹＭＶ特有のバンド（２４１ｂｐ）が最も濃かったＴＫ３（１）〜（３）、ＴＫ５（１）〜（３）、ＶＦ８は、葉のモザイク症状や萎縮が顕著であったことから、強毒性ＪＹＭＶが感染した強毒株と判断した。一方、ＴＫ１（１）〜（３）、２（１）〜（３）、４（１）〜（３）、７（１）、８（１）〜（４）はＪＹＭＶ特有のバンドが観察され、かつ病徴も軽かったことから、弱毒性ＪＹＭＶが感染した弱毒候補株と判断した。また、ＴＫ６（１）〜（４）とＶＦ１、２ではＪＹＭＶ特有のバンドが観察されず、病徴も見られなかったことから、ＪＹＭＶが感染していない健全株であると判断した。ＶＦ３〜１０に関して、ウイルスフリー株であるにも関わらずウイルスが検出されたのは、種イモがウイルスを保持していた、もしくは圃場内でアブラムシを介して感染した可能性が考えられた。
【実施例２】
【００３２】
［汁液接種による弱毒性の確認］
（汁液接種）
平成２４年７月１２日に、弱毒候補株に感染したＪＹＭＶの弱毒性の確認を目的として、カーボランダムを用いて汁液接種を行った。弱毒候補株ＴＫ１、２、４、７、８の種イモから生育した株の葉を接種源、健全株ＴＫ６の種イモから生育した３株(ＴＫ６（１）、（２）、（４）)とＶＦ２の種イモから生育した２株（ＶＦ２−（１）、ＶＦ２−（２））：ウイルスフリー確認済み）を接種植物として試験を行った。また、対照として、強毒株ＴＫ３の種イモから生育した株の葉を接種源、健全株ＴＫ６（３）を接種植物とする組み合わせや、接種なしの健全株ＴＫ６を用意した。接種源と接種植物の組み合わせは図３のとおりである。
【００３３】
汁液接種は以下の方法で行った。まず接種植物の葉４〜５枚に印をつけた後、カーボランダムを適量ふりかけ、乳鉢でリン酸バッファー(37.5mM pH7.0)と合わせてすりつぶした接種源の葉の汁液を脱脂綿に染み込ませて、傷が付きすぎないよう葉に優しくなすりこんだ。
【００３４】
（病徴の観察結果）
平成２４年１０月１８日に、各植物の病徴を観察した。観察結果を図４に示す。弱毒候補株であるＴＫ１、２、４、７、８を接種した植物はモザイク症状や萎縮がほとんどみられず、特にＴＫ２、７を接種した植物は病徴がみられなかった。一方、強毒株ＴＫ３を接種した植物は、徐々に株が萎縮し、１０月１８日の時点でほとんどの葉が枯死した。接種源である強毒株ＴＫ３そのものも１０月１８日の時点で完全に枯死していた。
【００３５】
また、RNeasy Mini Kit (QIAGEN社製)を用いて弱毒候補株又は強毒株を接種した植物からそれぞれｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出後、実施例１と同様の方法でｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ産物の電気泳動によりＪＹＭＶ検出を行った。その結果、弱毒候補株又は強毒株を接種したすべての植物から明瞭なＪＹＭＶ特異的バンド（２４１ｂｐ）が観察された。
【００３６】
上記のように、弱毒候補株を接種した植物においては病徴が軽く、かつＪＹＭＶが検出されたことから、弱毒候補株ＴＫ１、２、４、７、８に感染したＪＹＭＶの弱毒性は十分であると考えられた。
【実施例３】
【００３７】
［ＪＹＭＶの外被タンパク質領域の塩基配列の決定］
実施例２において、ＴＫ２、７を接種した植物は特に病徴が軽かったことから、ＴＫ２、７に感染したＪＹＭＶの外被タンパク質（ＣＰ）領域の塩基配列を調べた。
【００３８】
（塩基配列の決定）
実施例１と同様にＴＫ２、７からｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成を行った後、次の文献（藤ら、ヤマノイモモザイクウイルス弱毒系統の選抜とその強毒系統に対する干渉効果、日植病報、65：494-497（2000）、特開２０１０−１７２２０５号公報）を基に設計した配列番号５に示すフォワードプライマー（JYMV-CP-F）と配列番号６に示すリバースプライマー（JYMV-CPC1）のプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＪＹＭＶのＣＰ領域を増幅した。次に、増幅されたＤＮＡ断片を回収し、クローニング後にシークエンス解析を行った。シークエンス反応はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社製)を用い、そのプロトコルに従って行い、ＧＥＮＥＹＸ（登録商標）Ｖｅｒ．１０（ゼネティックス社製）によって解析した。
【００３９】
ＴＫ２から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに基づいて解析した塩基配列を配列番号７に、ＴＫ７から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに基づいて解析した塩基配列を配列番号８に示す。配列番号７に示す塩基配列と８に示す塩基配列とは８７０塩基中８６７塩基が同一であり、９９．６％の同一性を有していた。また、ＪＹＭＶはＲＮＡウイルスであることから、ＴＫ２には配列番号７に示す塩基配列において、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換された配列番号１に示す塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶが感染しており、ＴＫ７には配列番号８に示す塩基配列において、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換された配列番号２に示す塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶが感染していることが明らかとなった。ＴＫ２に感染している、配列番号１に示す塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶを「ＪＹＭＶ−ＴＫ−２」と命名し、ＴＫ７に感染している、配列番号２に示す塩基配列からなるＲＮＡを有するＪＹＭＶを「ＪＹＭＶ−ＴＫ−７」と命名した。
【００４０】
なお、実施例２におけるＴＫ２又は７を接種した植物からもｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、上記と同様の方法でＣＰ領域の塩基配列を調べたところ、ＪＹＭＶ−ＴＫ−２又はＪＹＭＶ−ＴＫ−７のＣＰ領域の塩基配列とそれぞれ同様であり、接種源と接種植物で同一のウイルスが感染していることが確認された。
【実施例４】
【００４１】
［他のＪＹＭＶの塩基配列との比較］
ＪＹＭＶ−ＴＫ−２又はＪＹＭＶ−ＴＫ−７のＣＰ領域の塩基配列を、これまでに知られている他の弱毒性ＪＹＭＶであるＭｉｌｄ株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＤＤ２７４８０４）及びＹＭＯ６株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＦＷ４２０５０５）のＣＰ領域の塩基配列と比較した。塩基配列の比較はＧＥＮＥＹＸ  Ｖｅｒ．１０を用いた。その結果、ＪＹＭＶ−ＴＫ−２又はＪＹＭＶ−ＴＫ−７のＣＰ領域の塩基配列は、Ｍｉｌｄ株のＣＰ領域の塩基配列と８７％、ＹＭＯ６株のＣＰ領域の塩基配列と９１％の同一性しか有しておらず、ＪＹＭＶ−ＴＫ−２又はＪＹＭＶ−ＴＫ−７は弱毒性ＪＹＭＶであるＭｉｌｄ株やＹＭＯ６株とは異なる新たな系統のＪＹＭＶであることが明らかとなった。
【実施例５】
【００４２】
［圃場試験−１］
カクヤス商販株式会社の屋外漆塚農場にて、図５に示すように、１つの区画において中心に強毒株であるＴＫ３を、その１ｍ周辺に弱毒株であるＴＫ２、ＴＫ７、ウイルスフリー株であるＴＫ６を植え付けて６ヶ月栽培した。同様の区画を合計５区画設置した。なお、強毒株の１ｍ周辺にヤマノイモ属植物を栽培することにより、かかるヤマノイモ属植物はアブラムシ等の媒介昆虫によって、強毒株に感染している強毒性のＪＹＭＶに感染しやすくなる。
【００４３】
６ヶ月栽培後、いずれの区画においても、中心のＴＫ３は枯れたが、ＴＫ２、ＴＫ７はほとんど病徴を示すことなく生育した。また、ＴＫ６はＴＫ２やＴＫ７と比べて早く枯れ、生育も悪くなる株もあった。したがって、ＪＹＭＶ−ＴＫ−２、ＪＹＭＶ−ＴＫ−７は強毒性ＪＹＭＶに対して干渉作用を有し、かかるＪＹＭＶ−ＴＫ−２、ＪＹＭＶ−ＴＫ−７に感染したヤマノイモ植物であるＴＫ２、ＴＫ７は強毒性ＪＹＭＶに対して抵抗性を有することが明らかとなった。
【実施例６】
【００４４】
［圃場試験−２］
カクヤス商販株式会社の室内漆塚農場にて、ＴＫ２、ＴＫ７、ＴＫ６をそれぞれ１０株ほど植え付けて６ヶ月栽培し、イモの重量、ムカゴ付き等の生育状況を調べた。結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2015167516.tif 000002
【００４６】
ＴＫ２、ＴＫ７はウイルスフリーのＴＫ６と比較してイモ重量、ムカゴ付き、ウイルス影響目視（葉のモザイク症状、委縮）、イモ病徴、葉の色の濃さ、紅葉の早さのいずれの項目においても同等若しくは優れており、実用化に適した優良な弱毒株であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によると、強毒性ヤマノイモモザイクウイルスに対して抵抗性を有するヤマノイモ植物を提供することができ、ヤマノイモ栽培分野において産業上の有用性は高い。
【図１】
2015167516.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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