(57)【要約】【課題】グリセロールからエタノールを合成する能力に優れ、ギ酸耐性を有する新規な微生物変異株を提供する。【解決課題】クレブシエラ・バリコラ（Klebsiella variicola）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有し、培地中のギ酸濃度が４〜５．５重量％で生育する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ・バリコラ（Klebsiella variicola）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有し、培地中のギ酸濃度が４〜５．５重量％で生育する微生物変異株。
【請求項２】
受託番号FERM P-22039又は受託番号FERM P-22203で特定されるクレブシエラ・バリコラの変異株であることを特徴とする請求項１記載の微生物変異株。
【請求項３】
受領番号NITE AP-01688であることを特徴とする請求項１記載の微生物変異株。
【請求項４】
グリセロールを含む廃水に請求項１〜３いずれか１項記載の微生物変異株を接触させる工程と、
上記微生物変異株を接触させた後、生成されたエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
【請求項５】
上記微生物変異株を接触させた後、生成された水素を回収する工程を更に含むことを特徴する請求項４記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記廃水は、バイオディーゼル燃料を生産した後の残査を含有する廃水であることを特徴とする請求項４記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
グリセロールを含む廃水に請求項１〜３いずれか１項記載の微生物変異株を接触させる発酵槽を備える廃水処理装置。
【請求項８】
上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることを特徴とする請求項７記載の廃水処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば廃水に含まれるグリセロールからエタノールを生成することができる微生物から得られた微生物変異株に関し、さらに当該微生物変異株を用いたエタノールの製造方法及び廃水処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼル燃料とは、主に植物の含有油脂を原料としたディーゼルエンジン用の燃料であり、現在使用されている軽油の代替え燃料となりうる。特に、バイオディーゼル燃料は、カーボンニュートラルなエネルギー源として注目されている。バイオディーゼル燃料を精製するには、先ず、パーム油等の油脂にメタノールと触媒（酸触媒あるいはアルカリ触媒）を加えてエステル交換反応を起こし、これに酸あるいはアルカリを加えて中和させたうえで、グリセロールを残査成分として脂肪酸メチルエステルと分離する。分離した脂肪酸メチルエステルから触媒成分を取り除き、さらに蒸留することでメタノールを除去し、脂肪酸メチルエステルを主成分とするバイオディーゼル燃料を精製することができる。
【０００３】
以上のように、バイオディーゼル燃料を精製する工程において、残査成分として必ずグリセロールが得られるのであるが、この残査成分については特に有用な用途もなく通常は廃棄されている。残査成分として得られたグリセロールを活用する例としては、特許文献１（特開２００６−１８０７８２号公報）に開示されるように、エンテロバクター属細菌を利用してグリセロールから水素とエタノールとを製造するものが挙げられる。
【０００４】
より具体的に特許文献１には、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）を多孔質担体に固定しておき、これを用いてグリセロールから水素とエタノールを発酵生産するといった技術が開示されている。ただし、特許文献１には、バイオディーゼル燃料を精製する過程で生ずるグリセロールを含む廃液を原料とする場合、エンテロバクター・アエロゲネスをそのまま使用したのでは発酵効率が著しく低いことが述べられている。
【０００５】
そして、本発明者らは、グリセロールからエタノールを合成する能力に優れた新規な微生物を単離同定するに至った（特許文献２）。特許文献２には、グリセロールからエタノールを生成する能力を有するクレブシエラ・バリコラ（Klebsiella variicola）が開示されている。特許文献２に開示された新規微生物は、クレブシエラ・バリコラ（Klebsiella variicola）TB-83株として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構に承継）に寄託されている。また、特許文献２には、このTB-83株に対して変異原処理を施し、エタノール耐性が向上した変異株を取得したことが開示されている。この変異株は、TB-83Dと命名され、同様に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１８０７８２号公報
【特許文献２】特開２０１２−１３９２１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、特許文献２に開示されたTB-83株及びTB-83D株については、グリセロール代謝に伴って生成するギ酸に対して耐性が劣るといった問題があった。すなわち、TB-83株及びTB-83D株を利用してグリセロールからエタノールを合成する系では、生成したギ酸によって菌の生育が劣り、十分なグリセロール代謝、優れたエタノール合成を達成することが困難であった。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、ギ酸耐性に優れた微生物変異体を提供することを目的とし、更に、当該微生物変異体を用いたエタノールの製造方法及び廃水処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため、本発明者等は、既知のクレブシエラ・バリコラTB-83D株を用いてギ酸耐性に優れた変異株を探索し、その結果、ギ酸耐性に優れるとともにエタノール合成能にも優れた変異株を作出することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明に係る微生物変異株は、クレブシエラ・バリコラ（Klebsiella variicola）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有し、培地中のギ酸濃度が４〜５．５重量％で生育する微生物変異株である。
【００１０】
特に本発明に係る微生物変異株は、受託番号FERM P-22039（上記TB-83株）又は受託番号FERM P-22203（TB-83D株）で特定されるクレブシエラ・バリコラの変異株であることが好ましい。
【００１１】
本発明者らが作出した微生物変異株は、TB-83Hと命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に２０１３年８月１２日に受領番号NITE AP-01688として寄託した。
【００１２】
一方、本発明に係るエタノールの製造方法は、上述した本発明に係る微生物変異株を使用してグリセロールからエタノールを生産する方法である。すなわち、本発明に係るエタノールの製造方法は、グリセロールを含む廃液を用いるシステムに適用することができる。グリセロールを含む廃液としては、バイオディーゼル燃料を精製する過程で残査成分として産生されるグリセロール廃液を挙げることができる。また、本発明に係るエタノールの製造方法においては、エタノールとともに水素ガスを回収することができる。言い換えると、上述した本発明に係る微生物変異株を利用してグリセロールから水素を製造する方法も提供することができる。
【００１３】
また、本発明に係る廃水処理装置は、グリセロールを含む廃水に上述した本発明に係る微生物変異株を接触させる発酵槽を備えるものである。本発明に係る廃水処理装置において、グリセロールを含む廃水としては、バイオディーゼル燃料を精製する過程で得られる廃水を使用することができる。また、本発明に係る廃水処理装置は、上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、廃水等に含まれるグリセロールを用いてエタノールといった有用な物質を得ることができ、ギ酸耐性に優れた新規な微生物変異株を提供することができる。特に、本発明に係る微生物変異株は、エタノール生産能に優れ、且つ、ギ酸耐性に優れるため、例えばバイオディーゼル燃料の精製過程で生ずる廃液に含まれるグリセロールからエタノールの製造するシステムに適用することができる。
【００１５】
また、本発明によれば、微生物変異株により廃水等に含まれるグリセロールを用いてエタノールを製造するといった発酵槽を有する廃液処理装置を提供することができる。本発明に係る廃水処理装置によれば、例えばバイオディーゼル燃料の精製過程で生ずるグリセロール含有廃液を原料として有用なエタノールや水素といった物質を効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１で作出したギ酸耐性変異株及びTB-83D株を、各種濃度のギ酸含有培地にて培養した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物変異株は、クレブシエラ・バリコラ（Klebsiella variicola）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有し、培地中のギ酸濃度が４〜５．５重量％で生育する微生物変異株である。すなわち、本発明に係る微生物変異株は、ギ酸耐性に優れるといった特徴がある。本発明に係る微生物変異株は、４〜５．５重量％といった濃度のギ酸存在下でもグリセロールからエタノールを生成する能力を有することから、
グリセロールからエタノールを合成する系でギ酸が生成したとしても、十分なグリセロール代謝、優れたエタノール合成を維持することができる。
【００１８】
特に本発明に係る微生物変異株は、受託番号FERM P-22039（上記TB-83株）又は受託番号FERM P-22203（TB-83D株）で特定されるクレブシエラ・バリコラの変異株から作出することができる。これら受託番号FERM P-22039（上記TB-83株）又は受託番号FERM P-22203（TB-83D株）で特定されるクレブシエラ・バリコラの変異株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NITE-IPOD）より分譲を受けることができる。
【００１９】
具体的には、TB-83株又はTB-83D株に対して変異原処理を施し、突然変異が導入することで本発明に係る微生物変異株を作出することができる。ここで、変異原処理とは、対象の微生物に対して突然変異を誘発する処理であれば特に限定されず、例えば、X線、放射線及び紫外線等の電磁波を照射する処理、ニトロソグアニジン、ニトロソアミン、ブロモデオキシウリジン、N-エチル-N-ニトロソウレア、エタンスルホン酸メチル、ベンゾピレン、臭化エチジウム等の化合物を接触させる処理、ウイルスやトランスポゾン等を利用して核酸を導入する処理等を挙げることができる。
【００２０】
また、この寄託された微生物のうちTB-83D株に対して変異原処理を施し、ギ酸耐性が向上し、且つエタノール合成能が向上した微生物変異株を取得することができる。TB-83D株を親株としてギ酸耐性が向上し、且つエタノール合成能が向上した微生物変異株をTB-83Hと命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に２０１３年８月１２日に受領番号NITE AP-01688として寄託した。本発明に係る微生物には、ギ酸耐性が向上したTB-83H株も包含される。
【００２１】
また、本発明に係る微生物変異株は、親株に比較してギ酸耐性が向上し、エタノール合成能に優れるといった特徴以外は、親株の特徴を備える。特に、親株としてTB-83D株を使用した場合、本発明に係る微生物変異株はTB-83D株の特徴を備えている。TB-83D株は、特開２０１２−１３９２１６号公報に開示されるように、グリセロールからエタノールを生成する能力を有し、且つ、エタノール耐性を有するTB-83株に対して変異原処理を施し、ストレプトマイシン耐性が付与され、且つエタノール耐性が向上した変異株である。よって、親株としてTB-83D株を使用した場合、本発明に係る微生物変異株はストレプトマイシン耐性を有し、また7重量%といった高濃度のエタノール存在下で生育することができる。
【００２２】
但し、本発明に係る微生物変異株は、寄託した微生物変異株TB-83H株に限定されるものではない。本発明に係る微生物変異株は、寄託された微生物以外にも、例えば、TB-83株或いはTB-83D株に対して変異原処理を施すことで作出することができる。具体的な手法としては、先ず、TB-83株或いはTB-83D株に対して紫外線照射処理を行った後、４〜５．５重量％のギ酸を含むグリセロール含有培地で生育可能な株を本発明に係る微生物変異株として同定することができる。
【００２３】
さらに、本発明に係る微生物変異株は、寄託された微生物変異株TB-83H株に対して、さらに変異原処理を施し、突然変異が導入された変異株も含まれる。通常、変異原処理により変異株を作製する場合、親株とは異なる表現型を付与することを目的とする場合が多い。よって、寄託された微生物（親株）から作製された変異株は、この目的に添って親株と異なる表現型を有していることが好ましいが、有意に異なる表現型を有してない変異株であっても良い。なお、変異原処理によって、親株に薬剤耐性を付与した変異株や、親株と比較して優れたアルコール耐性を有する変異株を作製することができる。
【００２４】
本発明に係る微生物変異株を用いることで、グリセロールを利用したエタノールの製造方法を構築することができる。すなわち、上記微生物を利用することによって、グリセロールを含有する溶液を用いたエタノールの製造システムを構築することができる。グリセロールを含む溶液とは、特に限定されるものではないが、例えば、バイオディーゼル燃料の製造過程に生ずる廃液を挙げることができる。バイオディーゼル燃料を製造する際には、先ず、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステル及びグリセロールを生成する。そして、生成したグリセロールを分離することで、メチルエステルを主成分とするバイオディーゼル燃料を製造することができる。
【００２５】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法等を用いて行なうことができる。
【００２６】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂又はその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。
【００２７】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。
【００２８】
かかるバイオディーゼル燃料を分離した後の廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。なお、廃液には、原料として使用した油脂に含まれる成分によって異なるが、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。また、バイオディーゼル燃料を分離した後の廃液は、エタノールの製造方法にそのまま使用しても良いし、適宜、水等の溶媒を添加して所望のグリセロール濃度にしてから使用しても良い。さらに、バイオディーゼル燃料を分離した後の廃液には、他の物質を添加することもできる。
【００２９】
また、本発明に係る微生物変異株を用いてグリセロールからエタノールを製造する際には、溶液中に含まれるグリセロール濃度は、特に限定されないが、10〜200(g/l)とすることができ、特に10〜100(g/l)とすることが好ましく、20〜50(g/l)とすることがより好ましい。なお、本発明に係る微生物変異株を培養する際には、上述したグリセロールの他に、炭素源となる物資、窒素源となる物質を含有する培地を適宜選択して使用することができる。また、酵母抽出液やカゼインなどのタンパク質の酵素分解物といった一般に微生物用培地に用いられている培地組成物を使用しても良い。
【００３０】
さらに、本発明に係る微生物変異株を用いてグリセロールからエタノールを製造する際には、上記微生物変異株の培養時間としては、特に限定されないが、3〜7（日）とすることができ、特に4〜5（日）とすることが好ましい。培養温度としては、特に限定されないが、20〜35（℃）とすることができ、特に25〜30（℃）とすることが好ましい。
【００３１】
一方、上述した微生物変異株によれば、グリセロールからエタノールを生成する際に併せて水素が生成される。よって、上述した微生物変異株を用いることによって、水素の製造方法及び水素製造システムを構築することもできる。
【００３２】
ところで、本発明の製造方法に使用する培養装置は、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。培養方式としては、回分培養、連続培養、フィード培養のいずれの培養方式であってもよい。培養装置としては、図示しないが、上述した微生物変異株によりグリセロールからエタノールを生成するための発酵槽を備えていればその他の構成は特に限定されない。例えば、培養装置には、エタノールを回収するための回収装置や、水素を回収するための水素回収装置を備えていても良い。
【００３３】
特に、本発明に係る微生物変異株は、ギ酸耐性を有するため、グリセロールからエタノールを生成する過程で生成したギ酸により生育阻害を受けたり、グリセロール代謝能が低下したりするといった不都合を回避することができる。具体的に、本発明に係る微生物変異株は、培養液に含まれるグリセロールを消費してエタノールを生合成し始めてから、培養液に含まれるギ酸濃度が４〜５．５重量％を超えるまで生育を継続することができる。
【００３４】
また、本発明に係る微生物変異株をTB-83株やTB-83D株を親株として作出した場合には、親株が有していたアルコール耐性を維持している。よって、本発明に係る微生物変異株をは、グリセロールから生成したエタノールにより生育阻害を受けたり、グリセロール代謝能が低下したりするといった不都合を回避することができる。具体的に、本発明に係る新規微生物は、培養液に含まれるグリセロールを消費してエタノールを生合成し始めてから、培養液に含まれるエタノール濃度が５重量％、好ましくは２％を超えるまで生育を継続することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
〔実施例１〕
本実施例では、受託番号FERM P-22203（TB-83D株）で特定されるクレブシエラ・バリコラを入手し、TB-83D株を親株としてギ酸耐性に優れる変異株の取得を試みた。まず、親株であるTB-83D株のギ酸耐性を調べるために、各ギ酸濃度(3%、4%及び5%)のLB寒天培地上で生育を調べたところ、TB-83D株はギ酸濃度3%まで生育することが明らかとなった。
【００３７】
次に、UV照射による変異導入を繰り返し行った結果、一回目のスクリーニングで768株の変異株が得られた。次に、TB-83D株のギ酸耐性試験と同様に、各ギ酸濃度(3%、4%及び5%)の寒天培地上に、得られた768株をレプリカしてその生育を調べたところ、ギ酸濃度5%で生育した菌株を152株獲得し、その中でも比較的生育の良い27株を選抜することができた。
【００３８】
そして、これら27株を、1mlの2% グリセロール基本培地を分注した24穴マルチプレートを用いて25℃で4日間静置培養を行った。培養液を遠心し、その上清について4-アミノアンチピリンを用いたエタノール簡易測定を行ったところ、5株（3B12、3F12、4A6、4A9及び5C11）がTB-83D株よりも高い吸光度値を示した。この結果から、3B12、3F12、4A6、4A9及び5C11の5株をギ酸耐性を有する微生物変異株とした。継代培養における復帰変異の検討を含め、これら5株を各ギ酸濃度の寒天培地上で生育を調べたところ、5%ギ酸含有寒天培地上でも良好な生育を示した（図１）。一方、親株であるTB-83D株は生育しなかった(図１)。
【００３９】
なお、図１においてAはギ酸濃度が3%であり、Bはギ酸濃度が4%であり、Cはギ酸濃度が5%であり、Dはギ酸濃度が5.5%である。また、図１において、「１」はTB-83D株であり、「２」は3B12であり、「３」は3F12であり、「４」は4A6であり、「５」は4A9であり、「６」は5C11である。
【００４０】
〔実施例２〕
実施例１で取得したギ酸耐性株について、エタノール生産試験を行った。実験にはミニジャーファーメンターを用いた。
【００４１】
先ず、実施例１で取得した5株（3B12、3F12、4A6、4A9及び5C11）のギ酸耐性株及びTB-83D株を２％グリセロール含有基本培地（pH9）2mLにそれぞれ植菌し、30℃、120rpmで3日間前々培養した。次に、1%グリセロール含有基本培地25mLに培養液1mLを植菌し、25℃で3日間静置により前培養した。その後、基本培地（下記、表１参照）の酵母エキスとカザミノ酸を5倍量にした5%グリセロール含有基本培地500mLに前培養液全量を加え、スターラーで緩やかに撹拌しつつ25℃で培養した。また、pHコントローラーとペリスタポンプを用いて6N NaOH溶液を滴下し、pHを8に維持した。経時的に培養液約lmLを採取し、生育量OD580の測定と上清のHPLC分析を行った。また、培養3日目と10日目に50%グリセロール溶液をそれぞれ50mL及び20mL補充した。
【００４２】
【表１】
2015039348.tif 000002
【００４３】
培養開始から3日目及び7日目に培地に含まれるエタノールを定量した結果を表２に示した。
【００４４】
【表２】
2015039348.tif 000003
【００４５】
表２に示すように、実施例で作出した５つのギ酸耐性株のうち4A6株は、親株であるTB-83D株と比較して高いエタノール生産量を示した。親株に対してギ酸耐性が付与され、且つエタノール生産能が向上した変異株4A6を、TB-83H株と命名した。すなわち、本実施例により、ギ酸耐性を有し、グリセロールからのエタノール生産能に優れた微生物変異株を作出できることが示された。
【図１】
2015039348.tif 000004