(57)【要約】【課題】  ＰＰＡＲを活性化させる新規な成分を提供すること。【解決手段】  本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるヒドロキシエイコサペンタエン酸を有効成分とするものであり、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪燃焼の促進、肥満の抑制、脂肪肝の抑制、糖尿病の予防や改善、インスリン抵抗性の予防や改善、持久力の向上といった効果をもたらし、よって、現代社会における生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）などに対して有効である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるヒドロキシエイコサペンタエン酸もしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とするＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項２】
ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの少なくとも１つである請求項１記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項３】
オキアミからの抽出操作によって水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるヒドロキシエイコサペンタエン酸を単離取得することによるＰＰＡＲ活性化剤の調製方法。
【請求項４】
抽出操作を水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行う請求項３記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲ活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）は、核内受容体型の転写調節因子として機能するタンパク質である。ＰＰＡＲには、ペルオキシソームの増殖を通して血中トリグリセリド濃度の低下を導く作用を有するα型、脂肪組織に分布して脂肪細胞分化などに関与する他、インスリン抵抗性改善の標的分子であるγ型、骨格筋のエネルギー消費が増大することにより末梢組織中の脂肪蓄積を抑制する作用を有するδ型（β型）の３種類のサブタイプが知られている。従って、ＰＰＡＲの活性化は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪燃焼の促進、肥満の抑制、脂肪肝の抑制、糖尿病の予防や改善、インスリン抵抗性の予防や改善、持久力の向上といった効果をもたらし、よって、現代社会における生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）などに対して有効であることから、例えばＰＰＡＲαを活性化させる薬剤としてフィブラート系薬剤が既に上市されている。しかしながら、より優れたＰＰＡＲを活性化させる成分の探索が今なお精力的に行われている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−６３５５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、ＰＰＡＲを活性化させる新規な成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、これまで海洋生物であるオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａｃｅａ）に含まれる成分が有する薬理作用について研究を行ってきており、その成果として、オキアミの水溶性抽出物が脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用や体重増加抑制作用を有することを見出している（特開２０１２−１５３６４６号公報）。そこで本発明者らは、オキアミに含まれる成分について更に詳細に検討したところ、オキアミから単離取得した特定のヒドロキシエイコサペンタエン酸（ＨＥＰＥ）がＰＰＡＲの優れた活性化作用を有することを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、請求項１記載の通り、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥもしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする。
また、請求項２記載のＰＰＡＲ活性化剤は、請求項１記載のＰＰＡＲ活性化剤において、ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの少なくとも１つである。
また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤の調製方法は、請求項３記載の通り、オキアミからの抽出操作によって水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥを単離取得することによる。
また、請求項４記載の調製方法は、請求項３記載の調製方法において、抽出操作を水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行う。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥを有効成分とする新規なＰＰＡＲ活性化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１における、オキアミから単離取得した、５−ＨＥＰＥ、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１２−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥのそれぞれのＰＰＡＲ活性化作用の評価結果を示すグラフである。
【図２】同、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥのそれぞれのＰＰＡＲ活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図３】同、各種のＨＥＰＥのそれぞれの低濃度でのＰＰＡＲ活性化作用の評価結果を示すグラフである。
【図４】参考例１における、ＨＰＬＣによるオキアミからの各種のＨＥＰＥの単離取得の結果を示すチャートである。
【図５】同、リサイクルＨＰＬＣの結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明によって提供されるＰＰＡＲ活性化剤の有効成分である水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥとしては、例えば下記の化学構造を有する８−ＨＥＰＥ（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の他、９−ＨＥＰＥ（９−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，７Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−ＨＥＰＥ（１１−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１２Ｅ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１２−ＨＥＰＥ（１２−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１０Ｅ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）などが挙げられる。水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥは、不斉炭素を有するので光学異性体が存在し、また、複数の二重結合を有するので種々のシス−トランス異性体が存在するが、本発明はそのいずれをも権利範囲に包含するものである。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
本発明において水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥは、天然物から単離取得されたものであってもよいし、有機合成化学的手法によって合成されたものやエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を人工的に酸化させたもの（このものは例えばＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社より市販されている）であってもよい。本発明者らの検討によれば、オキアミからの抽出操作により、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥ、とりわけ、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１２−ＨＥＰＥを単離取得することができる。原料として用いるオキアミは特に限定されるものではなく、三陸地方でイサダと呼ばれて食用に供されるツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ）の他、ナンキョクオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ  ｓｕｐｅｒｂａ）などであってもよい。オキアミは生のものを用いてもよいし、凍結したものを用いてもよい。また、オキアミの乾物や塩蔵物を用いてもよい。抽出操作は例えばアルコール（メタノールやエタノールやイソプロパノールなど）やアセトンやアセトニトリルなどの水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行うことができる。単離取得された化合物の精製度を高めるために、イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー、活性炭やアルミナやシリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを用いた分離操作の他、結晶化操作、減圧濃縮操作、凍結乾燥操作などの各種操作を単独または適宜組み合わせて行ってもよい。
【００１２】
水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥはアルキルエステルの形態であってもよい。アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステル、ヘキシルエステルなどの炭素数が１〜６の低級アルキルエステルが挙げられる。
【００１３】
水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥが塩の形態をとる場合、その薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなどとの無機塩、低級アルキルアミン、低級アルコールアミンなどとの有機塩、リジン、アルギニン、オルニチンなどとの塩基性アミノ酸塩の他、アンモニウム塩などが挙げられる。
【００１４】
水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥを医薬品としてヒトや動物に対して投与する場合の投与方法は、経口的な投与方法であってもよいし、非経口的な投与方法であってもよい。非経口的な投与方法としては、例えば、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与などが挙げられ、この場合、ＨＥＰＥは、これらの投与方法に適した形態に自体公知の方法で製剤化されて投与される。製剤形態としては、例えば、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収テープ、点眼剤、点鼻剤などが挙げられる。注射剤を調製する場合、適宜、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して注射剤とする。経口投与製剤としては、例えば、錠剤（糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングしたものを含む）、丸剤、トローチ剤、液剤、これらの製剤学的に許容され得る徐放化製剤などが挙げられる。液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤（ドライシロップを含む）、エリキシル剤などを含む。例えば、錠剤は、公知の製剤学的製造法に準じ、薬学的に許容され得る担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤などとともに調製することができる。この場合、担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などを用いることができる。結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどを用いることができる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどを用いることができる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴールなどを用いることができる。着色剤としては、医薬品に添加することが許容されているものを用いることができる。錠剤や顆粒剤は、必要に応じ、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体などで被膜してもよいし、２層以上の層で被膜してもよい。さらにエチルセルロースやゼラチンなどを用いてカプセル化してもよい。
【００１５】
水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの少なくとも１つの優れた活性化作用を有するので、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪燃焼の促進、肥満の抑制、脂肪肝の抑制、糖尿病の予防や改善、インスリン抵抗性の予防や改善、持久力の向上といった効果をもたらし、よって、現代社会における生活習慣病や内臓脂肪症候群などに対して有効である。その投与量は、投与対象者の年齢や体重、症状の程度、健康状態などの条件によって適宜設定すればよいが、標準的には、成人１日当たり約１０ｍｇ〜約１０ｇを、経口的または非経口的に１日１回〜数回にて投与すればよい。
【００１６】
また、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥは、種々の形態の食品（サプリメントを含む）に、ＰＰＡＲの活性化作用を発揮するに足る有効量を添加して食してもよい（体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１００ｍｇの摂取が標準的である）。
【００１７】
また、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥは、ＰＰＡＲの活性化作用を有する研究試薬として利用することもできる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１９】
実施例１：各種のＨＥＰＥのＰＰＡＲ活性化作用の評価
（実験方法）
ＰＰＡＲリガンド活性の測定をＰｒｏｍｅｇａ社の核内受容体解析用ルシフェラーザレポーターシステムを用いて行うことによって評価した。具体的には、ｐＦＮ２６Ａ（ＢＩＮＤ）ｈＲｌｕｃ−ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  Ｖｅｃｔｏｒの制限酵素サイト（Ｓｇｆ１、Ｐｍｅ１）に、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれのリガンド結合ドメインの塩基配列（α：２０１−４６８位のアミノ酸、γ：２３８−５０６位のアミノ酸、δ：１７１−４４１位のアミノ酸に対応）をクローニングし、酵母由来ＧＡＬ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインとＰＰＡＲリガンド結合ドメインの融合タンパク質の発現ベクター（以下ＧＡＬ４−ＰＰＡＲ発現ベクターと記載する）を作製した。次に、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＧＡＬ４−ＰＰＡＲ発現ベクターとｐＧＬ４．３５を１：１の割合で遺伝子導入した。遺伝子導入から３６〜４０時間後に、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と抗生物質−抗真菌剤溶液（シグマ−アルドリッチ社）を含むＤＭＥＭ培地にＨＥＰＥを各種の濃度で添加した培地に交換し、その２４時間後にＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞溶解液を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定はＰｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
【００２０】
（実験結果その１）
後述する方法でオキアミから単離取得した、５−ＨＥＰＥ（５−ｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１２−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥ（１８−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１６Ｅ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を、それぞれ１２８μＭの濃度で添加した培地（被験物質はメタノールに溶解して添加）で細胞を培養した際の、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれの活性化作用を図１に示す（コントロールとして被験物質を添加する際に用いたメタノールと同容量のメタノールのみを添加した培地で細胞を培養した際のルシフェラーゼ活性を１とした相対値）。また、図１には、ＥＰＡ（ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社、以下同じ）とそのエチルエステル（ＥＰＡ−Ｅｔ）（ＷＡＫＯ社）の作用をあわせて示す。図１から明らかなように、８−ＨＥＰＥと９−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの全ての優れた活性化作用を有していた。１２−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲδの活性化作用を有していた。５−ＨＥＰＥと１８−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのいずれの活性化作用も有していないか、有していてもごく僅かであった。
【００２１】
（実験結果その２）
後述する方法でオキアミから単離取得した、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１８−ＨＥＰＥを、それぞれ各種の濃度で添加した培地（被験物質はメタノールに溶解して添加）で細胞を培養した際の、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれの活性化作用を図２に示す（コントロールとして被験物質を添加する際に用いたメタノールと同容量のメタノールのみを添加した培地で細胞を培養した際のルシフェラーゼ活性を１とした相対値）。また、図２には、ＥＰＡの作用をあわせて示す。図２から明らかなように、８−ＨＥＰＥと９−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの全ての優れた活性化作用を濃度依存的に有していたが、１８−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのいずれの活性化作用も有していないか、有していてもごく僅かであった。
【００２２】
（実験結果その３）
ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社より購入した、５−ＨＥＰＥ、８−ＨＥＰＥ、９−ＨＥＰＥ、１１−ＨＥＰＥ（１１−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１２Ｅ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１２−ＨＥＰＥ、１５−ＨＥＰＥ（１５−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ，１７Ｚ−ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１８−ＨＥＰＥを、それぞれ５μＭの濃度で添加した培地（被験物質はエタノールに溶解して添加）で細胞を培養した際の、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδのそれぞれの活性化作用を図３に示す（コントロールとして被験物質を添加する際に用いたエタノールと同容量のエタノールのみを添加した培地で細胞を培養した際のルシフェラーゼ活性を１とした相対値）。また、図３には、パルミチン酸（ＰＡ）（ＷＡＫＯ社）、アラキドン酸（ＡＡ）（ＷＡＫＯ社）、ＥＰＡ、各種のヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）（ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社）の作用をあわせて示す。図３から明らかなように、１１−ＨＥＰＥは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδの全ての優れた活性化作用を低濃度で有していた。
【００２３】
以上の実験結果より、ＰＰＡＲの優れた活性化作用を有するＨＥＰＥは、水酸基の結合位置が８位〜１２位という炭素鎖の中央寄りのＨＥＰＥであり、水酸基の結合位置が５位、１５位、１８位といった炭素鎖の末端寄りのＨＥＰＥは、ＰＰＡＲの活性化作用を有さないか、有していてもごく僅かであることがわかった。
【００２４】
製剤例１：カプセル剤
９−ＨＥＰＥ２００ｍｇ、精製大豆油８０ｍｇ、ミツロウ１５ｍｇ、ビタミンＥ５ｍｇを４０℃に加温しながら十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒の内容量が３００ｍｇのゼラチン被覆カプセル剤を製造した。
【００２５】
参考例１：オキアミからのＨＥＰＥの単離取得
（メタノール抽出）
三陸地方で漁獲されたイサダ（ツノナシオキアミ）を１００℃の温風で約１時間乾燥させた後、粉砕した。得られた粉末に１０倍量（ｗ／ｖ）のメタノールを加えて２時間以上抽出した後、ペーパーフィルタで濾過してメタノール抽出液を得た。
【００２６】
（ＨＰ−２０による分画）
メタノール抽出液２００ｍＬに対して３０ｇの合成樹脂吸着剤ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社）を用いて行った。具体的には、まず、３０ｇのＨＰ−２０をクロマト管に充填し、１００％メタノール２００ｍＬで洗浄した後、３０％メタノール水溶液２００ｍＬで平衡化した。次に、メタノール抽出液２００ｍＬを蒸留水８００ｍＬで希釈してからアプライし、３０％メタノール水溶液２００ｍＬで洗浄した後、８０％メタノール水溶液２００ｍＬで溶出させてＨＰ−２０溶出液２００ｍＬを得た。
【００２７】
（ＩｎｅｒｔＳｅｐ  Ｃ１８による分画）
ＨＰ−２０溶出液２００ｍＬあたり１本（１０ｇ）のカラムを用いて行った。具体的には、まず、カラムを１００％メタノール＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで洗浄した後、３０％メタノール水溶液＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで平衡化した。次に、ＨＰ−２０溶出液２００ｍＬを蒸留水６００ｍＬで希釈してからアプライし、３０％メタノール水溶液＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで洗浄した後、１００％メタノール＋０．１％酢酸溶液４０ｍＬで溶出させ、得られた溶出液をエバポレーションして黄色の油状物を得た。
【００２８】
（ＨＰＬＣによる精製）
黄色の油状物を１００ｍｇ／ｍＬでメタノールに溶解した後、以下の条件で行った。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ−Ｃ１８（ＧＬサイエンス社）φ２０．０ｍｍ×２５０ｍｍ（５μｍ）
サンプル：１０ｍｇ／ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬストックを蒸留水で１０倍に希釈し濾過）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：１ｍＬ（１０ｍｇ）
移動層：１５ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ：蒸留水＋０．２％ギ酸溶液、Ｂ：ＡｃＮ、（Ａ：Ｂ）４５：５５→４５ｍｉｎ、４５：５５ｔｏ１０：９０→２０ｍｉｎ、１０：９０→１０ｍｉｎ、４５：５５→１０ｍｉｎ
検出器：ＵＶ２３５ｎｍ
カラムオーブン：４０℃
結果を図４に示す。図４に示した５つのピークのうち、１、２、５のピークの成分を単離取得し、３と４のピークの成分をリサイクルＨＰＬＣで精製した。
【００２９】
（リサイクルＨＰＬＣによる精製）
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ−Ｃ１８（ＧＬサイエンス社）φ２０．０ｍｍ×２５０ｍｍ（５μｍ）
サンプル：１ｍｇ／ｍＬ（１０％メタノール水溶液）（３と４のピークの成分のフラクションをエバポレーションしたものをメタノールに溶解することで調製した１０ｍｇ／ｍＬストックを蒸留水で１０倍に希釈）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：５００μＬ（５００μｇ）
移動層：６０％ＡｃＮ＋０．１％ギ酸溶液（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）１５ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ２３５ｎｍ
カラムオーブン：４０℃
リサイクル：１９ｍｉｎ  ＯＮ，７１ｍｉｎ  ＯＦＦ
分取：８５−９４ｍｉｎシグナル２５０以上で分取
結果：図５
【００３０】
以上の工程によってイサダから単離取得した５つの成分の物理化学的特性を、ＣｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社より購入した各種のＨＥＰＥ（標準物質）の物理化学的特性と照合した結果、５つの成分が、５−ＨＥＰＥ（イサダの乾燥粉末からの収率：０．００３％、以下同じ）、８−ＨＥＰＥ（収率：０．００６％）、９−ＨＥＰＥ（収率：０．００２％）、１２−ＨＥＰＥ（収率：０．００３％）、１８−ＨＥＰＥ（収率：０．００８％）であることがわかった。５つの成分の同定結果を表１に示す。また、標準物質の保持時間を表２に示す。
【００３１】
【表１】
2015140323.tif 000004
【００３２】
【表２】
2015140323.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、水酸基の結合位置が８位〜１２位のいずれかであるＨＥＰＥを有効成分とする新規なＰＰＡＲ活性化剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2015140323.tif 000006
【図２】
2015140323.tif 000007
【図３】
2015140323.tif 000008
【図４】
2015140323.tif 000009
【図５】
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