(57)【要約】      （修正有）【課題】糖化残渣又はリグニン吸着性の低いキシラナーゼの提供。【解決手段】変異キシラナーゼ触媒ドメインの製造方法であって、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、特定の配列で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、特定の配列の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、特定の配列の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、特定の配列の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、特定の配列の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換することを含む、方法及びその方法により変異させた変異キシラナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異キシラナーゼ触媒ドメインの製造方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【請求項２】
変異キシラナーゼの製造方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼにおいて、
該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
該触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【請求項３】
キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着性の低減方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【請求項４】
キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼにおいて、
該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
該触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【請求項５】
前記置換後の触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１〜５０位で示されるアミノ酸配列に相当する領域が、配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列が配列番号４で示されるアミノ酸配列又はそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列、又はそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインが製造される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
変異キシラナーゼ触媒ドメインであって、Ｎ末端から順に、
（ａ）配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ならびに
（ｄ）配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
からなる、変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【請求項９】
Ｃ末端に、（ｅ）配列番号４の１８８〜１９８位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項８記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【請求項１０】
前記（ｃ）が、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項８又は９記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【請求項１１】
配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列、又はそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ触媒ドメインと糖質結合モジュールとを含む変異キシラナーゼ。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は請求項１２記載の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターを宿主に導入する形質転換体の製造方法。
【請求項１６】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は請求項１２記載の変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤。
【請求項１７】
セルラーゼをさらに含む、請求項１６記載のバイオマス糖化剤。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異キシラナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源である。その中でもセルロース系バイオマスが注目を浴びている。セルロースを分解することで糖を製造し、得られた糖から化学変換や微生物を用いた発酵技術により石油資源の代替物やバイオ燃料などの有用資源を製造する技術の開発が、世界中で行われている。
【０００３】
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを主成分として構成される。このようなバイオマスは、セルロースを分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを分解するヘミセルラーゼなどが相乗的に作用することにより、複雑な形式で分解されることが知られている。セルロース系バイオマスの有効活用にあたっては、セルロースやヘミセルロースを高効率に分解可能な糖化酵素の開発が必要となる。
【０００４】
セルロース系バイオマスの糖化には、セルラーゼを主成分とする糖化酵素カクテルが従来から使用されている。近年、セルラーゼを主成分とする糖化酵素カクテルに対して、キシラナーゼやアラビノフラノシダーゼなどのヘミセルラーゼを添加することによって、糖化率が向上することが報告され、セルロース系バイオマス糖化におけるヘミセルラーゼの重要性が示唆された(特許文献１）。
【０００５】
セルロース系バイオマスの糖化においては、糖化酵素が基質であるセルロースやヘミセルロースに吸着し、それらを分解することによって糖が生産される。こうした糖の生産に関わるセルロースやヘミセルロース基質への該酵素の吸着は、生産的吸着と呼ばれる。対照的に、糖化酵素により分解されない成分、例えばリグニン、灰分、その他成分などへの該酵素の吸着は、非特異的吸着と呼ばれる。酵素の糖化効率は、酵素の比活性、耐熱性、非特異的吸着などの因子に左右されると考えられており、糖化酵素の開発にあたっては、これらの因子が着目される。
【０００６】
セルロース系バイオマスを糖化酵素で糖化した後の残渣成分は、リグニンが主成分である。しかし、セルロース系バイオマス中のリグニンに糖化酵素が吸着することにより、糖化効率が低下することが知られている。セルロース系バイオマス糖化において、糖化酵素のリグニンへの非特異的吸着性は好ましくない性質である。これまでに、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）IIにおいて、負電荷のアミノ酸への置換、正電荷のアミノ酸の除去等の改変により、非セルロース素材への非特異的吸着が低減したことが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１１−５１５０８９号公報
【特許文献２】特表２０１１−５２３８５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
グリコシドヒドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ）１１に属するキシラナーゼ（以下、ＧＨ１１キシラナーゼということがある）は、セルロース系バイオマスの糖化に利用可能なヘミセルラーゼである。しかし、ＧＨ１１キシラナーゼは、糖化残渣やリグニンへの吸着性が高いものが多く、バイオマス糖化に用いた場合、非特異的吸着による糖化率低下をもたらすという欠点がある。ＧＨ１１キシラナーゼにおける糖化残渣やリグニンの吸着部位は未だ不明であり、酵素改変による吸着性低減の試みは従来行われていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＧＨ１１キシラナーゼの中で、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌由来キシラナーゼが糖化残渣又はリグニンへの吸着性が低いことを見出した。また本発明者らは、ＧＨ１１キシラナーゼにおける糖化残渣又はリグニンの吸着に関わる部位を特定した。さらに本発明者らは、ＧＨ１１キシラナーゼの糖化残渣又はリグニンの吸着に関わる部位を、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌由来キシラナーゼの対応部位に置き換えた変異（組換え）キシラナーゼが、糖化残渣又はリグニンの吸着性が低減することを見出した。
【００１０】
したがって、一態様において本発明は、変異キシラナーゼ触媒ドメインの製造方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法を提供する。
【００１１】
別の一態様において、本発明は、変異キシラナーゼの製造方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼにおいて、
該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
該触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の一態様において、本発明は、キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着性の低減方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法を提供する。
【００１３】
別の一態様において、本発明は、キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼにおいて、
該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
該触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、変異キシラナーゼ触媒ドメインであって、Ｎ末端から順に、
（ａ）配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ならびに
（ｄ）配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
からなる、変異キシラナーゼ触媒ドメインを提供する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼ触媒ドメインと糖質結合モジュールとを含む変異キシラナーゼを提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は上記変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、上記ベクターを宿主に導入する形質転換体の製造方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、上記変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は上記変異キシラナーゼを含むバイオマス糖化剤を提供する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、上記バイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、糖化残渣やリグニンへの吸着性が低減した変異キシラナーゼ触媒ドメインを提供する。該触媒ドメインを含む変異キシラナーゼを使用することにより、従来のキシラナーゼと比較して、リグニンを含むバイオマスをより効率的に糖化することができ、またより効率的かつ安価にバイオマスから糖を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着率。
【図２】キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着率。
【図３】キシラナーゼ含有酵素組成物によるリグニン存在下でのキシランからの生成糖量。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（１．定義）
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２４】
本明細書において、アミノ酸配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２５】
本明細書において、「グリコシドヒドロラーゼファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ）１１」（又はＧＨ１１ということがある）とは、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ−ＡＣＴＩＶＥ  ＥＮＺＹＭＥ  ＣＡＺＹ−Ｈｏｍｅ（［ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／］）にて分類されるファミリーの第１１族を意味する。本明細書において、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼ（又はＧＨ１１キシラナーゼ）とは、アミノ酸２００個程度のタンパク質でβジェリーロール構造を有し、エンド− β−１，４−キシラナーゼ活性又はエンド− β−１，３−キシラナーゼ活性を有するヘミセルラーゼファミリーである（バイオマス分解酵素研究の最前線−セルラーゼ・へミセルラーゼを中心として−近藤昭彦、天野良彦、田丸浩  株式会社シーエムシー出版）。
【００２６】
本明細書において、「キシラナーゼ」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を有する酵素をいう。より詳細には、「キシラナーゼ触媒ドメイン（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ；ＣＤ）」、又はリンカーを介して結合されたＣＤと「糖質結合モジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ）」からなる酵素をいう。
【００２７】
本明細書において、「キシラナーゼ活性」とは、キシラン中のキシロースβ−１，４−グリコシド結合を加水分解する活性をいう。タンパク質のキシラナーゼ活性は、キシランを基質として当該タンパク質と反応させ、キシラン分解産物の生成量を測定することによって決定することができる。例えば、タンパク質のキシラナーゼ活性は、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて、キシランから生成した糖の還元末端を定量化することによって測定することができる。より詳細には、可溶キシラン、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び対象タンパク質を混合し、５０℃で反応させた後、ＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム、ジニトロサリチル酸、酒石酸ナトリウムカリウムを含む溶液）を添加して９９．９℃で反応させ、次いで反応液の波長５４０ｎｍでの吸光度を測定する。測定値を、キシロースを用いて作成した検量線により標準化することにより、生成糖の還元末端を定量化することができる。ＤＮＳ法によるキシラナーゼ活性測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【００２８】
本明細書において、「キシラナーゼ触媒ドメイン」又は単に「触媒ドメイン」（いずれもＣＤということがある）とは、キシラナーゼに含まれる、キシラナーゼ活性を保有するドメインをいう。天然に存在するＣＤの例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラニモナス・セルロシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）（ＤＳＭ１５８９４）由来のドメイン、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）ＹＸ由来のドメイン、及びそれらのドメインの領域に相当する他のＧＨ１１キシラナーゼのキシラナーゼ活性を保有する領域、が挙げられる。
【００２９】
本明細書において、「糖質結合モジュール（ＣＢＭ）」とは、ＣＤにリンカーを介して共有結合されている、キシラナーゼの触媒反応の基質（例えば、キシラン）と結合するドメインをいう。天然に存在するＣＢＭの例としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるキシラニモナス・セルロシリティカ（ＤＳＭ１５８９４）由来のモジュール、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるサーモビフィダ・フスカＸＹ由来のモジュール、及びそれらのモジュールの領域に相当する他のＧＨ１１キシラナーゼの基質結合性領域、が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系及び／又はリグノセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物又は粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎若しくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類、藻類などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００３１】
本明細書において、「糖化残渣」とは、バイオマス中のセルロース、ヘミセルロースを糖化酵素で糖化した後の残存固形分をいう。キシラナーゼの「糖化残渣吸着性」の高さは、例えば、糖化残渣とキシラナーゼとを反応させて、該糖化残渣にキシラナーゼを吸着させた後、反応液の上清に残存するキシラナーゼ活性を測定し、該糖化残渣と反応させなかった場合のキシラナーゼ活性に対する相対活性を求めることによって算出することができる。例えば、糖化残渣吸着率は以下の式で表すことができる。
糖化残渣吸着率（％）＝１００−相対比活性（％）
相対比活性（％）＝（糖化残渣との反応後の酵素試料のキシラナーゼ活性／糖化残渣と未反応の酵素試料のキシラナーゼ活性）×１００
上記相対比活性がより低いキシラナーゼほど、より高い糖化残渣吸着性を有する。糖化残渣としては、例えば、リグニン、又は公知のセルラーゼ若しくはセルラーゼ製剤（例えば、ノボザイムズ社製Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２）を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣を用いることができる。糖化残渣とキシラナーゼとの反応には、例えば、５０℃で１時間の処理を採用することができる。キシラナーゼの糖化残渣吸着性の測定のための具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【００３２】
（２．変異キシラナーゼの製造方法）
一実施形態において、本発明の変異キシラナーゼは、ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメイン中の糖化残渣吸着に関わる領域を、キシラニモナス・セルロシリティカ由来キシラナーゼ触媒ドメインの対応する領域で置換することによって製造された、組換えキシラナーゼである。本発明者らによる鋭意研究の結果、ＧＨ１１キシラナーゼにおける糖化残渣吸着に関わる領域は、その触媒ドメイン中の特定の領域、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるサーモビフィダ・フスカ由来キシラナーゼ触媒ドメインにおいては、該アミノ酸配列の１１４位〜１６７位までの領域であることが明らかにされた。また、当該領域を、糖化残渣吸着性の低いキシラニモナス・セルロシリティカ由来キシラナーゼ触媒ドメインの相当する領域、すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１８位〜１７２位領域で置換することにより、酵素の糖化残渣吸着性が低減されることが明らかにされた。さらに、当該領域を部分的に置換した場合でも、同様の糖化残渣吸着性低減効果が得られることも明らかにされた。したがって、ＧＨ１１キシラナーゼにおいて糖化残渣吸着性に関与する領域は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の１１４位〜１６７位領域（又は配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１８位〜１７２位領域）に相当する領域であり、この領域の一部又は全部をキシラニモナス・セルロシリティカ由来キシラナーゼ触媒ドメインの相当する領域（すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１８位〜１７２位領域の対応する一部又は全部）で置換することにより、糖化残渣吸着性が改善された変異キシラナーゼを得ることができる。
【００３３】
したがって、一態様において、本発明は、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片、又は該断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する断片により、ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、該配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部に相当する領域を置換することを含む、変異キシラナーゼ触媒ドメインの製造方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ＧＨ１１キシラナーゼにおいて、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片、又は該断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する断片により、該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、該配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部に相当する領域を置換することを含む、変異キシラナーゼの製造方法を提供する。
【００３４】
上記変異キシラナーゼ又はその触媒ドメインは、変異前のキシラナーゼ又はその触媒ドメインと比べて、糖化残渣吸着性が低減されている。
したがって、なお別の態様において、本発明は、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片、又は該断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する断片により、ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、該配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部に相当する領域を置換することを含む、キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着性の低減方法を提供する。
なお別の態様において、本発明は、ＧＨ１１キシラナーゼにおいて、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片、又は該断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する断片により、該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、該配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部に相当する領域を置換することを含む、キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法を提供する。
【００３５】
上記本発明の方法の一実施形態において、上記配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片としては、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列からなる断片、及び配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の部分配列であって、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、又は５４アミノ酸残基長の断片が挙げられる。好ましくは、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列からなる断片、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列からなる断片、配列番号２の１３５〜１４０位で示されるアミノ酸配列からなる断片、配列番号２の１３３〜１６３位で示されるアミノ酸配列からなる断片、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列からなる断片、及び配列番号２の１５０〜１６５位で示されるアミノ酸配列からなる断片、が挙げられる。
【００３６】
上記本発明の方法の好ましい実施形態において、上記配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する断片の例としては、上記に列挙した配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を含む断片と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する断片；配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を含む断片と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有する断片；配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を含む断片と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有する断片；配列番号２の１３３〜１６３位で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有する断片；配列番号２の１５０〜１６５位で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上の配列同一性を有する断片、などが挙げられる。
【００３７】
好ましくは、上述した配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する断片は、キシラナーゼ活性及び配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインと同等の糖化残渣吸着率を有するポリペプチドにおける、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１８〜１７２位領域に相当する領域から得られた断片であり得る。ここで、同等の糖化残渣吸着率とは、後述の参考例４〜６に従って測定された１５ｍｇ／ｍＬ糖化残渣の吸着率が２０％以下、好ましくは１０％以下であること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣の吸着率に対して１５０％未満、好ましくは１２０％未満であることをいう。
【００３８】
上記本発明の方法において、本発明の変異キシラナーゼの親キシラナーゼとなる、変異前のＧＨ１１キシラナーゼ（以下、親ＧＨ１１キシラナーゼとも称する）としては、キシラニモナス属由来キシラナーゼ、サーモビフィダ属由来キシラナーゼ、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来キシラナーゼ、バチルス属由来キシラナーゼ、アスペルギルス属由来キシラナーゼ、クロストリジウム属由来キシラナーゼ、セルロモナス属由来キシラナーゼなどが挙げられる。好ましくは、上記方法において、親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％未満であり、より好ましくは８５％以下、さらに好ましくは８０％以下である。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインは、キシラニモナス・セルロシリティカ（ＤＳＭ１５８９４）由来キシラナーゼの触媒ドメインである。
【００３９】
上記本発明の方法においては、好ましくは、さらに親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１〜５０位に相当する領域を、配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる断片で置換する。好ましくは、上記配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる断片とは、キシラナーゼ触媒ドメインのポリペプチドにおける、配列番号４で示されるアミノ酸配列の１〜４６位領域に相当する領域から得られた断片であり得る。
【００４０】
上記本発明の方法のまた別の実施形態においては、親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのＣ末端には、配列番号４の１８８〜１９８位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる断片が配置される。例えば、該断片で、上述した配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなる断片やそれらに相当する断片で置換した領域のＣ末端側領域を置換するか、又は該断片を該置換した領域のＣ末端側に付加する。
【００４１】
したがって、上記本発明の方法の好ましい実施形態においては、変異前の親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、例えば、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼの触媒ドメインとしては、サーモビフィダ・フスカＸＹ由来キシラナーゼの触媒ドメインが挙げられる。
【００４２】
好ましくは、上記本発明の方法における変異前の親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置（言い換えれば、配列番号２で示されるアミノ酸配列の８９位に相当する位置及び／又は１７９位に相当する位置）に、それぞれグルタミン酸残基を有し得る。これらの位置に存在するグルタミン酸残基は、キシラナーゼ活性に関与すると考えられている（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，２００６，６２：７８４−７９２）。
【００４３】
（３．変異キシラナーゼ）
以上のように親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインを変異させることにより、糖化残渣吸着性が低減した変異キシラナーゼ触媒ドメインを製造することができる。
【００４４】
本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインは、ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部に相当する領域が、該配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列の一部又は全部からなるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。かつ本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインは、キシラナーゼ活性を有し、変異前の親ＧＨ１１キシラナーゼと比べて糖化残渣への吸着性が低減されている。
【００４５】
さらに、本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列においては、配列番号２の１〜５０位に相当する領域が、配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００４６】
したがって、好ましい一実施形態において、本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインは、Ｎ末端から順に、以下のアミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）以下：
（ｃ１）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは
（ｃ２）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは
（ｃ３）配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
ならびに
（ｄ）配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４７】
好ましい実施形態において、上記（ａ）は、配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列、又はそれと９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、より好ましい実施形態において、上記（ａ）は、配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列である。
【００４８】
好ましい実施形態において、上記（ｂ）は、配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列、又はそれと６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、より好ましい実施形態において、上記（ｂ）は、配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列である。好ましくは、上記（ｂ）において、配列番号４で示されるアミノ酸配列の８５位に相当する位置にはグルタミン酸残基を有し得る。
【００４９】
好ましい実施形態において、上記（ｃ１）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列と、好ましくは９２％以上、より好ましくは９６％以上の同一性を有し、さらに好ましくは配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列である。また、上記（ｃ１）における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列と、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００５０】
好ましい実施形態において、上記（ｃ２）における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列と、好ましくは９３％以上、より好ましくは９６％以上の同一性を有し、さらに好ましくは配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列である。また、上記（ｃ２）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列と、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００５１】
また好ましい実施形態において、上記（ｃ３）における配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列と、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、なお好ましくは配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列である。
【００５２】
好ましい実施形態において、上記（ｄ）は、配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列、又はそれと６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、より好ましい実施形態において、上記（ｄ）は、配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列である。好ましくは、上記（ｄ）において、配列番号４で示されるアミノ酸配列の１７４位に相当する位置にはグルタミン酸残基を有し得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、上記（ａ）は配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、上記（ｂ）は配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、かつ上記（ｄ）は配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。より好ましい実施形態において、上記（ａ）は配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列であり、上記（ｂ）は配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列であり、かつ上記（ｄ）は配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列である。
【００５４】
一実施形態において、上記（ａ）〜（ｄ）からなる本発明の変異キシラナーゼの触媒ドメインは、そのＣ末端に、さらに（ｅ）配列番号４の１８８〜１９８位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。
【００５５】
別の好ましい一実施形態において、本発明の変異キシラナーゼの触媒ドメインは、配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも９０％、例えば９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上、なおより好ましくは９８％以上、なおさらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００５６】
本発明はまた、上記本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインを含む変異キシラナーゼを提供する。本発明の変異キシラナーゼは、上記本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインと、糖質結合モジュールとを含み、キシラナーゼ活性を有し、かつ本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインを含まないキシラナーゼと比べて糖化残渣への吸着性が低減されている、キシラナーゼである。
【００５７】
本発明の変異キシラナーゼ又はその触媒ドメインは、後述の参考例４〜６に従って、ノボザイムズ社製セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣を糖化残渣とし、該糖化残渣１５ｍｇ／ｍＬと本発明の変異キシラナーゼ又はその触媒ドメインとを、５０℃で１時間反応させて糖化残渣吸着率を算出した場合に、糖化残渣吸着率が、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、さらにより好ましくは４０％以下、なお好ましくは３０％以下、さらになお好ましくは２０％以下である。あるいは、本発明の変異キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着率は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着率に対して、１５０％未満、好ましくは１２０％未満である。
【００５８】
（４．ベクター及び形質転換体）
本発明の変異キシラナーゼは、例えば、上記本発明の変異キシラナーゼ又はその触媒ドメイン（以下、本発明のＣＤともいう）をコードする遺伝子を導入された形質転換体により生産することができる。より詳細には、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤは、当該変異キシラナーゼ又はＣＤをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、当該形質転換体を培養することによって生産することができる。すなわち、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有する本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤをコードする遺伝子が発現して、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤが生産される。生産された変異キシラナーゼ又はＣＤを該培養物から単離又は精製することにより、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤを取得することができる。
【００５９】
したがって、本発明はさらに、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の変異キシラナーゼ若しくはＣＤをコードするポリヌクレオチド、又はそれらを含むベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。さらに本発明は、該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。さらに本発明は、当該形質転換体を培養することを含む、変異キシラナーゼ又はその触媒ドメインの製造方法を提供する。
【００６０】
本発明のＣＤをコードするポリヌクレオチドは、当該ＣＤのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。例えば、本発明のＣＤをコードするポリヌクレオチドは、下記手順にて調製することができる：親ＧＨ１１キシラナーゼの触媒ドメイン、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドを調製する。一方で、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上同一なアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメイン（以下、Ｘｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎということがある）をコードするポリヌクレオチドを調製する。次いで、両ポリヌクレオチドを定法に従って切断及び連結することにより、Ｘｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎをコードするポリヌクレオチド中の所定の領域で、親ＧＨ１１キシラナーゼ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド中の相当する領域を置換すれば、本発明のＣＤをコードするポリヌクレオチドを調製することができる。ポリヌクレオチドの切断及び連結には、公知の試薬又はキット（例えば、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；タカラバイオ）を用いることができる。
【００６１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）は、キシラニモナス・セルロシリティカ（ＤＳＭ１５８９４）などから単離することができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）は、サーモビフィダ・フスカＸＹなどから単離することができる。当該菌からのポリヌクレオチドの単離は、当該分野で用いられる任意の方法を用いて行うことができる。例えば、当該菌の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１又は３の配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的核酸を選択的に増幅し、増幅した核酸を精製することで、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、上記手順で単離した配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって作製することができる。例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに上記公知の方法で突然変異導入し、得られたポリヌクレオチドを発現させてタンパク質を得た後、当該タンパク質のキシラナーゼ活性及び糖化残渣吸着率を調べ、所望のキシラナーゼ活性及び糖化残渣吸着性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することによって得ることができる。好ましくは、後述の参考例４〜６に従って測定された１５ｍｇ／ｍＬ糖化残渣の吸着率が２０％以下、より好ましくは１０％以下であるか、あるいは糖化残渣吸着率が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインに対して１５０％未満、好ましくは１２０％未満であり、かつキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択するとよい。
【００６３】
本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、そのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。あるいは、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、上記本発明のＣＤをコードするポリヌクレオチドを、糖質結合モジュールをコードするポリヌクレオチドと連結することによって調製することができる。糖質結合モジュールをコードするポリヌクレオチドは、キシラナーゼを有する公知の微生物、例えば、キシラニモナス・セルロシリティカ（ＤＳＭ１５８９４）、サーモビフィダ・フスカＸＹなどから単離することができる。あるいは、触媒ドメイン及び糖質結合モジュールを含むＧＨ１１キシラナーゼの遺伝子をクローニングし、当該遺伝子上の触媒ドメインコード領域の一部を、Ｘｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎをコードするポリヌクレオチドの所定の領域で置換することによって、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドを調製することができる。
【００６４】
本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤをコードするポリヌクレオチドを導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（いずれもタカラバイオ株式会社製）などを好適に用いることができる。
【００６５】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、上記本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子、（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、本発明のベクターを導入する宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養をコードする遺伝子を含むベクターを用いてもよい。
【００６６】
キシラナーゼやその触媒ドメインをコードする配列と上記制御配列やマーカー遺伝子配列との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）などの方法によって行うことができる。プラスミドベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。
【００６７】
上記制御配列の例としては、Ｓ２３７ｅｇｌプロモーター及びシグナル配列（Ｂｉｏｓｃｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，６４（１１）：２２８１−２２８９）、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。あるいは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、βキシロシダーゼなどの糖化酵素を発現するプロモーターを使用してもよい。あるいは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの代謝経路の酵素のプロモーターを使用してもよい。
【００６８】
上記ベクターを導入する形質転換体の宿主としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、バチルス属細菌、例えば、枯草菌又はその変異株（例えば、特開２００６−１７４７０７号公報に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸなど）が好ましい。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられ、このうち、酵素生産性の観点からはトリコデルマ属が好ましい。
【００６９】
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
【００７０】
斯くして得られた、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、当該ベクター上の遺伝子が発現して、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。生成された本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤは、該培養物から通常の方法により単離又は精製することができる。このとき、当該ベクター上で本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤの遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成された該キシラナーゼ又はＣＤは菌体外に分泌されるため、より容易に回収され得る。回収された該キシラナーゼ又はＣＤは、さらに公知の手段で精製されてもよい。
【００７１】
（５．バイオマス糖化方法又は糖の製造方法）
上記本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤは、従来公知のキシラナーゼやキシラナーゼ製剤と比較して、糖化残渣の吸着率が低く、バイオマスを糖化する活性が向上している。したがって、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤは、バイオマスの糖化のため、又はバイオマスからの糖の製造のために好適に使用することができる。
したがって、本発明はさらに、上記本発明の変異キシラナーゼ又はその触媒ドメインを有効成分とするバイオマス糖化剤を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ若しくはその触媒ドメイン、又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマス糖化方法を提供する。
さらに本発明は、上記本発明の変異キシラナーゼ若しくはその触媒ドメイン、又は上記本発明のバイオマス糖化剤を用いるバイオマスからの糖の製造方法を提供する。
【００７２】
本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤを有効成分とするバイオマス糖化剤は、好ましくはバイオマス糖化用の酵素組成物（以下、本発明の酵素組成物ということもある）である。本発明の酵素組成物は、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤを含み、また糖化効率の向上の観点から、好ましくはさらにセルラーゼを含む。ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。本発明の酵素組成物に使用されるセルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。本発明の酵素組成物において、これらのセルラーゼは、単独で使用されても２種以上の組合せで使用されてもよい。糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。
【００７３】
本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤと併用され得るセルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＴＭＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、及びウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤの含有量は、糖化効率向上の観点から、該ＣＤの量に換算して、好ましくは０．５〜７０質量％、より好ましくは１〜５０質量％さらに好ましくは２〜４０質量％、さらにより好ましくは２〜３０質量％である。
【００７５】
本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１０〜９９質量％、より好ましくは３０〜９５質量％、さらに好ましくは５０〜９５質量％である。また、当該本発明のバイオマス糖化剤の総タンパク質量中における、本発明の変異キシラナーゼ又はその触媒ドメイン以外のヘミセルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１〜３０質量％、より好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．５〜２０質量％である。
【００７６】
本発明の酵素組成物における、本発明の変異キシラナーゼ又はＣＤと上記セルラーゼとのタンパク質量比は、糖化効率向上の観点から、[ＣＤ／セルラーゼ]の質量比として、好ましくは０．０１〜１００、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．０５〜１、よりさらに好ましくは０．０５〜０．５である。
【００７７】
本発明によるバイオマスからの糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明の変異キシラナーゼ、本発明のＣＤ、又は上記本発明の酵素組成物で糖化する工程を含む。本発明の糖の製造方法では、糖化残渣吸着性の低い本発明の変異キシラナーゼやＣＤを用いることによって、キシラナーゼの非特異的吸着が低減することによりキシラン糖化率が向上する。さらに本発明の糖の製造方法では、セルロース糖化効率も向上する。このセルロース糖化効率向上の理由は明らかではないが、本発明の変異キシラナーゼやＣＤを用いることにより、バイオマス中のヘミセルロースが効率的に分解されて、糖化酵素がセルロースに接触しやすい状態となり、全体として糖化効率が向上するためであると推測される。
【００７８】
本発明のバイオマス糖化剤が適用される、又は本発明の糖の製造方法で用いられるバイオマスとしては、（１．定義）の章で前述したとおりである。入手容易性、原料コスト、及び糖化効率向上の観点からは、当該バイオマスとしては、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉又は果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。当該バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また当該バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００７９】
本発明のバイオマス糖化方法、及び糖の製造方法は、バイオマスの粉砕効率向上、及び糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、バイオマスを本発明の変異キシラナーゼ、ＣＤ又は酵素組成物で糖化する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。
【００８０】
上記前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理及び水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行うことがより好ましい。
【００８１】
上記アルカリ処理とは、バイオマスを、後述する塩基性化合物と反応させることをいう。当該アルカリ処理の方法としては、バイオマスを、後述する塩基性化合物を含むアルカリ溶液に浸漬する方法（以下、「浸漬処理」ということがある）や、バイオマスと塩基性化合物とを混合して、後述する粉砕処理にかける方法（以下、「アルカリ混合粉砕処理」ということがある）などが挙げられる。
【００８２】
上記粉砕処理とは、バイオマスを機械的に粉砕して小粒子化することをいう。バイオマスを小粒子化することにより、糖化効率がより向上する。また、当該粉砕処理により、バイオマスに含まれるセルロースの結晶構造が破壊されると、糖化効率がなお向上する。当該粉砕処理は公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、バイオマスを小粒子化することができる装置であればよい。当該粉砕処理は、上述した塩基性化合物によるアルカリ処理と組み合わせてもよい。当該粉砕処理は、アルカリ処理の前又は後に行ってもよく、あるいは、粉砕処理と並行してアルカリ処理、例えば上述したアルカリ混合粉砕処理を行ってもよい。アルカリ混合粉砕処理では、例えば、アルカリ溶液に浸漬したバイオマスを粉砕処理にかけてもよく（湿式粉砕）、又は固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけてもよいが（乾式粉砕）、このうち、乾式粉砕が好ましい。
【００８３】
上記水熱処理とは、バイオマスを、水分の存在下で加熱処理することをいう。当該水熱処理は、公知の反応装置を用いて行うことができ、用いられる反応装置に特に制限はない。好ましくは、当該水熱処理では、バイオマスの粗粉砕物を、水に分散した水スラリーの状態とし、これを加熱処理する。水スラリー中のバイオマスの含有量は、スラリーの流動性向上の観点から、好ましくは１〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは８〜３００ｇ／Ｌである。
【００８４】
本発明のバイオマス糖化方法、及び糖の製造方法は、バイオマス、好ましくは上記前処理されたバイオマスを、本発明の変異キシラナーゼ、ＣＤ又は酵素組成物で糖化する工程（本明細書において「糖化処理」ということがある）を含む。
【００８５】
上記糖化処理の条件は、本発明の変異キシラナーゼやＣＤ、及び併用するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定することができる。
【００８６】
上記糖化処理においては、バイオマスを含む懸濁液に、本発明の変異キシラナーゼやＣＤ、又は酵素組成物を添加することが好ましい。懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５〜２０質量％、より好ましくは３〜１５質量％、さらに好ましくは５〜１０質量％である。
【００８７】
上記懸濁液に対する本発明の変異キシラナーゼやＣＤ、又は酵素組成物の使用量は、上記前処理条件、ならびに併用する酵素の種類及び性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、該ＣＤの量に換算して、好ましくは０．０４〜６００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは０．１〜５０質量％である。
【００８８】
上記糖化処理の反応ｐＨとしては、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５〜７である。
【００８９】
上記糖化処理の反応温度は、糖化効率の向上、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは２５〜８５℃、さらに好ましくは３０〜８０℃、さらにより好ましくは４０〜７５℃、なお好ましくは４５〜６５℃、なおより好ましくは５０〜６５℃、さらになお好ましくは５０〜６０℃である。当該糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類若しくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）、及び生産コスト低減の観点から、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜４日間、さらに好ましくは１〜３日間である。
【００９０】
上述した本発明の別の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。
【００９１】
＜１＞変異キシラナーゼ触媒ドメインの製造方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【００９２】
＜２＞変異キシラナーゼの製造方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼにおいて、
該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
該触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【００９３】
＜３＞キシラナーゼ触媒ドメインの糖化残渣吸着性の低減方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）において、
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【００９４】
＜４＞キシラナーゼの糖化残渣吸着性の低減方法であって、以下：
グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼにおいて、
該キシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（ただし、該触媒ドメインのアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は９０％未満である）における配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換するか、あるいは、
該触媒ドメインのアミノ酸配列における配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域を、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列で置換する
ことを含む、方法。
【００９５】
＜５＞アルカリ混合粉砕バガスのセルラーゼ糖化処理後に生じた糖化残渣に対する吸着率が、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、さらにより好ましくは４０％以下、なお好ましくは３０％以下、さらになお好ましくは２０％以下である、＜３＞又は＜４＞記載の方法。
【００９６】
＜６＞好ましくは、上記配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、以下：
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列、又は
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
であり、かつ
好ましくは、上記配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、以下：
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列、又は
配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９３％以上、より好ましくは９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の方法。
【００９７】
＜７＞好ましくは、上記グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域が、以下のアミノ酸配列で置換される、＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法：
配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列、又は
配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００９８】
＜８＞好ましくは、上記グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインが以下である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法：
（１ａ）キシラニモナス属由来キシラナーゼ、サーモビフィダ属由来キシラナーゼ、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来キシラナーゼ、バチルス属由来キシラナーゼ、アスペルギルス属由来キシラナーゼ、クロストリジウム属由来キシラナーゼ、セルロモナス属由来キシラナーゼの触媒ドメインであるか；
（１ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性が８５％以下、好ましくは８０％以下であるか；又は
（１ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９８％、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００９９】
＜９＞好ましくは、上記グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインが、配列番号４の８５位に相当する位置及び／又は１７４位に相当する位置にグルタミン酸残基を有する、＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法。
【０１００】
＜１０＞好ましくは、上記グリコシドヒドロラーゼファミリー１１に属するキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列における、配列番号２の１〜５０位で示されるアミノ酸配列に相当する領域が、以下のアミノ酸配列で置換される、＜１＞〜＜９＞のいずれか１に記載の方法：
配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列、又は
配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１０１】
＜１１＞好ましくは、上記置換後の触媒ドメインのアミノ酸配列における、配列番号２の１〜５０位で示されるアミノ酸配列に相当する領域が、以下のアミノ酸配列からなる、＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の方法：
配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列、又は
配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１０２】
＜１２＞好ましくは、配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列に相当する領域のＣ末端に、以下のアミノ酸配列からなる断片を付加する、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の方法：
配列番号４の１８８〜１９８位で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１０３】
＜１３＞好ましくは、以下のアミノ酸配列からなるキシラナーゼ触媒ドメインが製造される、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の方法：
配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列、又は
配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上、なおより好ましくは９８％以上、なおさらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１０４】
＜１４＞変異キシラナーゼ触媒ドメインであって、Ｎ末端から順に、
（ａ）配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ならびに
（ｄ）配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列、
からなる、変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【０１０５】
＜１５＞好ましくは、上記（ａ）〜（ｄ）が以下である＜１４＞記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン：
（ａ）：配列番号４の１〜４６位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）：配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、なおより好ましくは配列番号４の４７〜１１３位で示されるアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列；
（ｃ）は以下の（ｃ１）〜（ｃ３）のいずれかである：
（ｃ１）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは
（ｃ２）配列番号２の１１８〜１４３位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２の１４４〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、好ましくは９３％以上、より好ましくは９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは
（ｃ３）配配列番号２の１１８〜１７２位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）：配列番号４の１６８〜１８７位で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１０６】
＜１６＞好ましくは、Ｃ末端に、（ｅ）配列番号４の１８８〜１９８位で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、＜１４＞又は＜１５＞記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【０１０７】
＜１７＞好ましくは、上記（ｃ）が（ｃ３）である、＜１５＞又は＜１６＞記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【０１０８】
＜１８＞配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列、又はそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異キシラナーゼ触媒ドメイン。
【０１０９】
＜１９＞好ましくは以下のアミノ酸配列からなる、＜１８＞記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン：
配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列；又は
配列番号７、８、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９６％以上、なお好ましくは９７．５％以上、なおより好ましくは９８％以上、なおさらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１１０】
＜２０＞上記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の変異キシラナーゼ触媒ドメインと糖質結合モジュールとを含む変異キシラナーゼ。
【０１１１】
＜２１＞上記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は＜２０＞記載の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【０１１２】
＜２２＞上記＜２１＞記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１１３】
＜２３＞上記＜２２＞記載のベクターを宿主に導入する形質転換体の製造方法。
【０１１４】
＜２４＞上記＜２１＞記載のポリヌクレオチド又は上記＜２２＞記載のベクターを含む形質転換体。
【０１１５】
＜２５＞上記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は＜２０＞記載の変異キシラナーゼを含む、バイオマス糖化剤。
【０１１６】
＜２６＞好ましくはセルラーゼをさらに含む、＜２５＞記載のバイオマス糖化剤。
【０１１７】
＜２７＞上記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は＜２０＞記載の変異キシラナーゼを用いるバイオマス糖化方法。
【０１１８】
＜２８＞好ましくはさらにセルラーゼを用いる、＜２７＞記載の方法。
【０１１９】
＜２９＞上記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン又は＜２０＞記載の変異キシラナーゼのバイオマス糖化のための使用。
【０１２０】
＜３０＞好ましくはセルラーゼと併用される、＜２９＞記載の使用。
【０１２１】
＜３１＞上記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の変異キシラナーゼ触媒ドメイン、上記＜２０＞記載の変異キシラナーゼ、又は上記＜２５＞又は＜２６＞記載のバイオマス糖化剤を用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
【実施例】
【０１２２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【０１２３】
＜参考例１  ＰＣＲ反応＞
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）又はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマーとアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを１０μＬ添加して、反応液総量を２０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５５〜６０℃で１０秒間及び７２℃で１０〜９０秒間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１０秒）の３段階の温度変化を３０回繰り返すことにより行った。
【０１２４】
＜参考例２  タンパク質濃度測定  （Ｌｏｗｒｙ法）＞
タンパク質の定量にはＬｏｗｒｙ法を用いた。酵素溶液は適切な濃度にイオン交換水で希釈した後、ＤＣプロテインアッセイ（バイオラッド）を用いて定量した。Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ  １ｍＬに対してＲｅａｇｅｎｔ  Ｓを２０μＬの割合で混合し、タンパク質５μＬ対してこの混合液を２５μＬ添加した。さらにＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ（発色液）を２００μＬ添加し、１５分間室温で静置した。マイクロプレートリーダー（Ｖｅｒｓａ  ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で７５０ｎｍの吸光度を測定し、ＢＳＡの検量線からタンパク質の濃度を定量した。
【０１２５】
＜参考例３  キシラナーゼ活性の測定＞
キシラナーゼ活性の測定は３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて、生成糖の還元末端を定量化した。終濃度可溶キシラン１％（ｗ／ｖ）（２％（ｗ／ｖ）ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１分間煮沸し、室温に静置後、遠心分離により得られた上清を可溶キシランとした）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、酵素１０μＬを混合し、５０℃で１０分間反応させた。反応終了後、１００μＬのＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム（和光純薬工業）１．６％（ｗ／ｖ）、ジニトロサリチル酸（和光純薬工業）０．５％（ｗ／ｖ）、酒石酸ナトリウムカリウム（和光純薬工業）３０．０％（ｗ／ｖ））を添加し、９９．９℃で１０分間反応させた。マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイスジャパン）で波長５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、生成糖の還元末端を定量化した。検量線にはキシロースを用いた。
【０１２６】
＜参考例４  バイオマスの調製＞
（１）バガス調製
バガス（サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量７．０質量％）を減圧乾燥機ＶＯ−３２０（アドバンテック東洋）中に入れ、窒素流通下の条件で２時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量２．０質量％の乾燥バガスを得た。
（２）混合粉砕処理
得られた乾燥バガス１００ｇと粒径０．７ｍｍの粒状の水酸化ナトリウム「トーソーパール」（東ソー社製）８．８ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）を、バッチ式振動ミルＭＢ−１（中央化工機：容器全容積３．５Ｌ、媒体としてφ３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、断面形状が円形のＳＵＳ３０４製ロッドを１３本使用、ロッド充填率５７％）に投入し、２時間粉砕処理することでバガス粉砕物（平均粒子径約１６．６μｍ）を得た。
【０１２７】
＜参考例５  糖化残渣＞
参考例４で調製したアルカリ混合粉砕バガス５％（ｗ／ｖ）、セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社）５ｍｇ／ｇ−バイオマス、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン塩酸塩（ｗａｋｏ）、０．６μｇ／ｍＬエリスロマイシン（ｗａｋｏ）を含む１０ｍＬの液を、２５ｍＬの自立型遠沈管中で５０℃、１５０ｒｐｍ（タイテック：ＢＲ−４０Ｆ）にて２４時間反応させ、バガスを糖化させた。反応終了後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ×１０分）により上清を除去し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で２回洗浄し、固形分を回収した。得られた糖化残渣を（以下、ＣＴｅｃ２糖化残渣という）を、以下のキシラナーゼ吸着性解析に用いた。
【０１２８】
＜参考例６  糖化残渣に対する吸着性解析＞
基質（糖化残渣）としてＣＴｅｃ２糖化残渣を用い、キシラナーゼの吸着挙動を解析した。所定濃度の基質（糖化残渣懸濁液を分注し、遠心分離により含水状態の固形分のみとした。糖化残渣の質量は検量線より算出した。）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、キシラナーゼ５０〜２００μｇ／ｍＬを含む０．５〜１ｍＬの反応液を２ｍＬのエッペンドルフチューブ又は９６穴ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＩＥＮＴＩＦＩＣ）で、５０℃、１５０ｒｐｍにて１時間振盪した。反応終了後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、キシラナーゼ活性を前述のＤＮＳ法で測定した。下記式で示すように、基質濃度０ｍｇ／ｍＬの場合の活性を１００とし、基質と反応させた反応液の上清のキシラナーゼ相対比活性を算出した。得られた活性値を１００から減算することでキシラナーゼの糖化残渣吸着率を算出した。
糖化残渣吸着率（％）＝１００−相対比活性（％）
相対比活性（％）＝（糖化残渣を添加した反応液上清のキシラナーゼ活性／糖化残渣未添加の反応液上清のキシラナーゼ活性）×１００
【０１２９】
＜参考例７  生成糖分析＞
キシランの糖化反応後の上清中の還元糖量分析では、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース量をＨＰＬＣで定量した。ＨＰＬＣには、Ｄｉｏｎｅｘ社のＤＸ５００クロマトグラフィーシステム、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）、ＥＤ４０パルスドアンペロメトリー検出器を使用し、溶離液には、Ａ：１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、Ｂ：１Ｍ酢酸ナトリウム／１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液、Ｃ：超純水を使用した。
【０１３０】
＜実施例１  変異キシラナーゼの調製＞
（１）キシラナーゼ遺伝子含有ベクターの作製
キシラニモナス・セルロシリティカ  ＤＳＭ１５８９４株（Ｘｃｅｌ）、及びサーモビフィダ・フスカ  ＹＸ株（Ｔｆｕ）を、それぞれＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ培地（３．０％Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ、２．０％Ａｇａｒ）に植菌し、２８℃にて１日間培養した。培養で得られた菌体から、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＭｉｃｒｏｂｉａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
【０１３１】
得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマーＸｃｅｌ−Ｘｙｎ  Ｆ（配列番号１８）とリバースプライマーＸｃｅｌ−Ｘｙｎ  Ｒ（配列番号１９）を用いて、Ｘｃｅｌキシラナーゼ（Ｘｃｅｌ−Ｘｙｎ）遺伝子領域（配列番号１５）の約１．０ｋｂｐ断片（Ａ）を増幅した。同様に、Ｔｆｕキシラナーゼ（Ｔｆｕ−Ｘｙｎ）遺伝子領域（配列番号１６）の約１．０ｋｂｐ断片（Ｂ）を含むベクターを作製した。プライマーにはフォワードプライマーＴｆｕ−Ｘｙｎ  Ｆ（配列番号２０）とリバースプライマーＴｆｕ−Ｘｙｎ  Ｒ（配列番号２１）を用いた。
【０１３２】
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のＢａｍＨＩ制限酵素切断点に、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７アルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号１７）をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマーｐＨＹ−Ｓ２３７  Ｆ（配列番号２２）とリバースプライマーｐＨＹ−Ｓ２３７  Ｒ（配列番号２３）を用いてＳ２３７アルカリセルラーゼ構造遺伝子を除く領域の約５．６ｋｂｐ断片（Ｃ）を増幅した。増幅した遺伝子断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。
【０１３３】
精製されたＤＮＡ断片（Ａ）又は（Ｂ）１μＬとＤＮＡ断片（Ｃ）１μＬ、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）に含まれる５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｅｍｉ×２μＬ、ＤＮａｓｅフリーの水６μＬを混合し、５０℃で１５分反応させ、キシラナーゼ遺伝子の断片をベクターにクローニングした。その後、反応液２μＬを用いて、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。形質転換体の再生培地には、５０ｐｐｍアンピシリンナトリウム（和光純薬工業）、２．０％アガー（和光純薬工業）を含むＬＢ寒天培地を用いた。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体は同様のＬＢ寒天培地を用いて培養後（３７℃、１日間）、得られた菌体からプラスミドをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて回収、精製した。
【０１３４】
（２）キシラナーゼ触媒ドメイン遺伝子の調製
キシラナーゼ触媒ドメイン（ＣＤ）をコードする遺伝子の発現ベクターを作製するために、上述のＸｃｅｌ−Ｘｙｎ遺伝子、又はＴｆｕ−Ｘｙｎ遺伝子が挿入された組み換えプラスミドを鋳型とし、表１に示したフォワードプライマーＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎ  Ｆ（配列番号２４）とリバースプライマーＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎ  Ｒ（配列番号２５）、又はフォワードプライマーＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ  Ｆ（配列番号２６）とリバースプライマーＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ  Ｒ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにて、Ｘｃｅｌ−Ｘｙｎ又はＴｆｕ−ＸｙｎのＣＤをコードする遺伝子を含む約５．６〜６．０ｋｂｐ断片を増幅した。プライマーの作製はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）のマニュアルに従った。遺伝子断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。精製したＰＣＲ断片２μＬを用いてコンピテンとセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。
以下において、Ｘｃｅｌ由来キシラナーゼＣＤをＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎということがある。またＴｆｕ由来キシラナーゼ触媒ＣＤをＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎということがある。
【０１３５】
【表１】
2015167552.tif 000002
【０１３６】
（３）変異キシラナーゼ遺伝子の調製
Ｘｃｅｌ−ＣＤ−ＸｙｎとＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎとのキメラキシラナーゼを作製した。上述のＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎをコードする遺伝子の導入されたプラスミド及びＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎをコードする遺伝子の導入されたプラスミドを鋳型に、表２〜３記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、各触媒ドメインの部分断片をコードするＤＮＡを増幅した。上記（２）と同様の方法で、各部分断片をコードするＤＮＡを所定の順序でプラスミドベクター上に連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の形質転換、形質転換株の選抜、及びプラスミドの精製を行った。
【０１３７】
【表２】
2015167552.tif 000003
【０１３８】
【表３】
2015167552.tif 000004
【０１３９】
（４）変異キシラナーゼ生産
精製したプラスミドの宿主菌への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）に従って行った。宿主には、枯草菌１６８株から９つの菌体外プロテアーゼ、溶菌酵素を欠損させ、タンパク質のフォールディング効率を向上させたΔＤｐｒ９ｌｙｔ↑ｐｒｓＡ株、１６８株から９つの菌体外プロテアーゼ、菌体外セルラーゼを欠損させ、タンパク質のフォールディング効率を向上させた８７４・Ｄｐｒ７・ｅｇｌＳ↑ｐｒｓＡ株を使用した。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有ＤＭ３再生寒天培地（バクトカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、コハク酸二ナトリウム六水和物（和光純薬工業）４．０５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二カリウム（和光純薬工業）０．３５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム（和光純薬工業）０．１５％（ｗ／ｖ）、グルコース（和光純薬工業）０．１％（ｗ／ｖ）、塩化マグネシウム（和光純薬工業）２０ｍＭ、牛血清アルブミン（和光純薬工業）０．０１％（ｗ／ｖ）、トリパンブルー０．００５％（ｗ／ｖ）（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ）、テトラサイクリン塩酸塩（和光純薬工業）０．００５％（ｗ／ｖ）、カルボキシメチルセルロース１．０％（ｗ／ｖ）、寒天１．０％（ｗ／ｖ））を用いた。
【０１４０】
ＤＭ３再生寒天培地上に生育した形質転換体をＬＢ（１５μｇ／ｍＬテトラサイクリン・大試験管）５ｍＬに植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで１６時間振盪培養した。培養液６００μＬを２×Ｌ  Ｍａｌ培地３０ｍＬ（バクトトリプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１．０％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン五水和物（和光純薬工業）７５ｐｐｍ、マルトース一水和物（和光純薬工業）７．５％（ｗ／ｖ）、テトラサイクリン塩酸塩１５ｐｐｍ）に接種し、３０℃、１２０ｒｐｍにて２〜３日間振盪培養（ＰＲＥＣｉ：ＰＲＸＹｇ−９８−Ｒ型）した。得られた培養液は遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分）により上清を回収した。得られた上清はＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ（登録商標）１０ＤＧ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）により脱塩、バッファー置換した。置換用のバッファーには５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーを用いた。
【０１４１】
得られたキメラキシラナーゼＣＤの構造を表４に示す。
【０１４２】
【表４】
2015167552.tif 000005
【０１４３】
＜実施例２  変異キシラナーゼの糖化残渣吸着性＞
参考例６の条件にて、実施例１で調製した各変異キシラナーゼＣＤについて、ＣＴｅｃ２糖化残渣に対する吸着率を解析した。ＣＴｅｃ２糖化残渣濃度は１５又は５８ｍｇ／ｍＬとした。結果を図１に示す。（ｃ１）〜（ｃ２）領域にＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎの配列を有する本発明の変異キシラナーゼＣＤ（ＴＴＸＸＸ、ＴＸＸＸＸ）は、Ｔｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎと比較して、糖化残渣吸着率が低減していた。これらの結果から、配列番号４で示されるＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎのアミノ酸配列の１１４〜１６７位領域に相当する領域がキシラナーゼの糖化残渣吸着に関与していること、当該領域をＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎ由来の配列と置き換えることによって、キシラナーゼの糖化残渣吸着を低減できることが示された。
【０１４４】
＜実施例３  変異キシラナーゼの糖化残渣吸着性＞
配列の異なる（ｃ１）〜（ｃ２）領域を有する変異キシラナーゼＣＤについて、実施例２と同じ条件で糖化残渣吸着率を解析した。結果を図２に示す。（ｃ１）及び（ｃ２）領域のいずれかにＸｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎの配列を有するキシラナーゼＣＤ（ＸＸＴＸＴ、ＸＸＴＸＸ、ＸＸＸＴＴ、ＸＸＸＸＴ）は、（ｃ１）〜（ｃ２）領域にＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎの配列を有するもの（ＸＸＴＴＴ、ＸＸＴＴＸ）と比較して、糖化残渣吸着率が低減していた。
【０１４５】
＜実施例４  リグニン存在下でのキシランの糖化＞
（１）可溶キシランの調製
２％（ｗ／ｖ）ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１分間煮沸し、室温に静置後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）により得られた上清を可溶キシランとした。
【０１４６】
（２）糖の製造
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、可溶キシラン１％（ｗ／ｖ）、リグニン０〜２ｍｇ／ｍＬ、セルラーゼ１ｍｇ／ｇ−バイオマス、キシラナーゼ１ｍｇ／ｇ−バイオマス、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン塩酸塩（ｗａｋｏ）、０．６μｇ／ｍＬエリスロマイシン（ｗａｋｏ）を含む１ｍＬの液を２ｍＬのエッペンドルフチューブ中で５０℃、１５０ｒｐｍ（タイテック：ＢＲ−４０Ｆ）にて反応させ、キシランの糖化を行った。上記キシラナーゼとしては、実施例１で調製した変異キシラナーゼＣＤ（ＴＴＸＸＸ、ＴＸＸＸＸ、ＸＸＴＴＴ）、Ｘｃｅｌ−ＣＤ−Ｘｙｎ（配列番号２）又はＴｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎ（配列番号４）を用いた。上記セルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤（セルクラスト（登録商標）；ノボザイムズ社）を用いた。
【０１４７】
反応終了後、反応液を１１０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離することで上清を回収した。上清中の還元糖量は、参考例７に記載した手法で定量した。結果を図３に示す。リグニン存在下におけるキシランからの生成糖量は、本発明の変異キシラナーゼＣＤを含む酵素組成物を使用した場合、Ｔｆｕ−ＣＤ−Ｘｙｎを含む酵素組成物と比較して最大３．５倍に増加した。このことから、本発明の変異キシラナーゼはリグニン等の糖化残渣を含むバイオマスの糖化に適していることが示された。
【図１】
2015167552.tif 000006
【図２】
2015167552.tif 000007
【図３】
2015167552.tif 000008
【配列表】
2015167552000001.app