(57)【要約】      （修正有）【課題】植物由来のヒドロキシニトリルリアーゼより安定性が高く、その遺伝子を用いて異種発現も可能な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼおよび当該ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとその変異体、及び、それらの遺伝子を含むベクターにより形質転換された形質転換体を培養した培養物から得る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（１）  配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高いアミノ酸配列；
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高いアミノ酸配列。
【請求項２】
上記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有するサブユニットの二量体である請求項１に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項３】
キャンベルリニアス属（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ）由来のものである請求項１または２に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項４】
ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）由来のものである請求項３に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項５】
下記（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
（４）  配列番号２に示される塩基配列；
（５）  上記（４）に規定される塩基配列において、１または数個の塩基が欠損、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ当該塩基配列によりコードされた（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号２に示される塩基配列によりコードされた天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い塩基配列；
（６）  上記（４）に規定される塩基配列に対して少なくとも３０％の相同性を有する塩基配列であり、且つ当該塩基配列によりコードされた（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号２に示される塩基配列によりコードされた天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い塩基配列。
【請求項６】
配列番号１に示される塩基配列を有する請求項５に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
【請求項７】
請求項５または６に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造するための方法であって、
請求項８に記載の形質転換体を培養して培養物を得る工程、および、
上記培養物から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製する工程
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来のヒドロキシニトリルリアーゼより安定性に優れ、その遺伝子を用いて異種発現も可能である（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、当該ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および当該ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物をシアノヒドリン（α−ヒドロキシニトリル）に変換する反応を触媒する酵素である。シアノヒドリンは、α−ヒドロキシ酸、α−ヒドロキシケトン、β−アミノアルコールなど様々な化合物に変換できることから、医薬分野や化学品分野などにおける中間体として重要である。従って、ヒドロキシニトリルリアーゼを大量に生産する方法の開発が望まれている。
【０００３】
ヒドロキシニトリルリアーゼは、（Ｓ）選択性および（Ｒ）選択性の２つのグループに分けられる。その中で（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、酸性条件下においてケトンまたはアルデヒドとシアン化合物から（Ｒ）−シアノヒドリンを生成する反応を触媒する。この反応の代表例として、ベンズアルデヒドとシアン化合物である青酸から、（Ｒ）−マンデロニトリルを生成する反応がある。また、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、安価な基質から医薬および化成品中間体として利用価値の高い光学活性体を生産することのできる生体触媒としても使用されており、多くの分野において極めて有用である。
【０００４】
光学活性シアノヒドリンの工業的生産にヒドロキシニトリルリアーゼを利用するために、菌体あたりまたはタンパク質あたりの活性が高く立体選択性の高いヒドロキシニトリルリアーゼを大量に生産する方法の開発が望まれている。
【０００５】
ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアン配糖体を有する植物においてのみ存在することが知られている。例えば、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとしてアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）などのバラ科植物由来のものなどが知られている。また、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとして、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）などのイネ科植物由来のものや、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、バリオスペルマム（Ｂａｌｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）などのトウダイグサ科植物由来のものが知られている。しかし、これらの植物体からは微量のヒドロキシニトリルリアーゼしか抽出することができなかった。
【０００６】
そこで、ヒドロキシニトリルリアーゼを大量に得るために、遺伝子工学的な方法でヒドロキシニトリルリアーゼを得る試みがなされてきた（特許文献１〜９）。しかしながら、形質転換体を用いて異種タンパク質を発現させる場合には、同種タンパク質についての研究によって得た発現量や生化学的活性などの結果をそのままあてはめることができない場合がある。即ち、形質転換体を用いて異種タンパク質を発現させる場合には、形質転換体の挙動や発現量、目的タンパク質の生化学的活性などを予め予測することは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平１１−５０８７７５号公報
【特許文献２】特開２０００−１８９１５９号公報
【特許文献３】特開２０００−１８９１６０号公報
【特許文献４】特開２０００−２４５４８６号公報
【特許文献５】特開２００２−３３０７９１号公報
【特許文献６】国際公開第０１／４８１７８号パンフレット
【特許文献７】特開２００４−１９４５５０号公報
【特許文献８】特開２００４−１９４５５１号公報
【特許文献９】特開２０００−１２５８８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、ヒドロキシニトリルリアーゼは産業上非常に重要な酵素となり得るものであるので、工業的な利用のためにも安定供給が求められる。しかし、シアン配糖体を有する植物で見出されているヒドロキシニトリルリアーゼを植物体から精製する場合、わずかしか得られない。その一方で、ヒドロキシニトリルリアーゼは異種発現が難しいという問題があった。また、ヒドロキシニトリルリアーゼで光学活性化合物を生産する際には、酵素を過酷な条件にさらす必要があるので、安定性の高い酵素が望まれている。
【０００９】
そこで本発明は、植物由来のヒドロキシニトリルリアーゼより安定性が高く、その遺伝子を用いて異種発現も可能な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、当該ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子、および当該ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定地域で周期的に大量発生するヤンバルトサカヤスデが産生する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが極めて安定性に優れることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
［１］  下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（１）  配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高いアミノ酸配列；
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列であり、且つ当該アミノ酸配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高いアミノ酸配列。
【００１２】
［２］  上記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有するサブユニットの二量体である上記［１］に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【００１３】
［３］  キャンベルリニアス属（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ）由来のものである上記［１］または［２］に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【００１４】
［４］  ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）由来のものである上記［３］に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【００１５】
［５］  下記（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
（４）  配列番号２に示される塩基配列；
（５）  上記（４）に規定される塩基配列において、１または数個の塩基が欠損、置換および／または付加された塩基配列であり、且つ当該塩基配列によりコードされた（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号２に示される塩基配列によりコードされた天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い塩基配列；
（６）  上記（４）に規定される塩基配列に対して少なくとも３０％の相同性を有する塩基配列であり、且つ当該塩基配列によりコードされた（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号２に示される塩基配列によりコードされた天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い塩基配列。
【００１６】
［６］  配列番号１に示される塩基配列を有する上記［５］に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子。
【００１７】
［７］  上記［５］または［６］に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【００１８】
［８］  上記［７］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【００１９】
［９］  （Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造するための方法であって、
上記［８］に記載の形質転換体を培養して培養物を得る工程、および、
上記培養物から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製する工程
を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼはヤンバルトサカヤスデ個体中に含まれるが、その量は少ないといえる。しかし、ヤンバルトサカヤスデは周期的に局地で大量発生するため、酵素精製の出発材料として比較的大量かつ容易に得ることができる。即ち、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの精製の困難さは、出発原料であるヤンバルトサカヤスデの量により克服することができる。また、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは安定性に優れており、例えば、合成中間体として重要なシアノヒドリンの製造に適用することができる。よって本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明酵素を単離したヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）の写真である。（Ａ）は捕獲した際の比較的大型のヤンバルトサカヤスデの写真であり、（Ｂ）は比較的小型のヤンバルトサカヤスデの拡大写真である。
【図２】図２は、ヤンバルトサカヤスデから精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示すゲルの写真である。（Ａ）は分子量マーカーを用いて分子質量を求めるためのゲルの写真であり、（Ｂ）は糖鎖の有無を確認するために染色したゲルの写真である。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、ヤンバルトサカヤスデから精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの紫外・可視・近赤外スペクトル、赤外スペクトル、または円偏光二色性スペクトルの測定結果である。
【図４】図４は、ヤンバルトサカヤスデから精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのｃＤＮＡ、推定アミノ酸配列およびプライマーのアニーリングサイトを示す。
【図５】図５（Ａ）と（Ｂ）は、それぞれ、ヤンバルトサカヤスデから精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの反応ｐＨと比活性または残存活性との関係を示すグラフである。
【図６】図６（Ａ）と（Ｂ）は、それぞれ、ヤンバルトサカヤスデから精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの反応温度と比活性または残存活性との関係を示すグラフである。
【図７】図７（Ａ）と（Ｂ）は、それぞれ、ヤンバルトサカヤスデから精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと組換え型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの反応ｐＨまたは反応温度と残存活性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、先ず、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼについて説明する。
【００２３】
＜（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ＞
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記（１）〜（３）の何れかのものである。
上記（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼにおいて、「配列番号３に示すアミノ酸配列」は、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）由来の天然型ヒドロキシニトリルリアーゼのアミノ酸配列である。ヤンバルトサカヤスデは、特に鹿児島県で周期的に異常発生し列車を止めるなどする一方で、駆除しようとするとシアン化水素を含むガスを放出して健康被害を及ぼすなど問題になっている。本発明者らは、ヤンバルトサカヤスデがシアン化水素を産生することに注目し、ヒドロキシニトリルリアーゼを有するのではと考えて実験を進めたところ、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの単離精製に成功したものである。また、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、異常発生する一方で駆除方法が確立していないヤンバルトサカヤスデから単離精製できることから、本発明は、ヤンバルトサカヤスデの処理方法としても価値が高い。
【００２４】
その他、ヤンバルトサカヤスデと同じくオビヤスデ目（Ｐｏｌｙｄｅｓｍｉｄａ）に分類されるタンバアカヤスデ（Ｎｅｄｙｏｐｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ）、ミドリババヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｎｏｍｉｎｅａ）、エパネルコデウス属（Ｅｐａｎｅｒｃｈｏｄｕｓ  ｓｐ．）、エパネルコデウス  フルヴス（Ｅｐａｎｅｒｃｈｏｄｕｓ  ｆｕｌｖｕｓ  Ｈａｇａ）、キシャヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｌａｍｉｎａｔｅ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヤケヤスデ（Ｏｘｉｄｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、オオギヤスデ属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｒｙｐｈａ  ｓｐ．）、ヤマトオビヤスデ（Ｅｐａｎｅｒｃｈｏｄｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃａｓ Ｃａｒｌ）、アマビコヤスデ（Ｒｉｕｋｉａｒｉａ  ｓｅｍｉｃｉｒｃｕｌａｒｉｓ  ｓｅｍｉｃｉｒｃｕｌａｒｉｓ）、ヤマトアカヤスデ（Ｎｅｄｙｏｐｕｓ  ｐａｔｒｉｏｔｉｃｕｓ  ｐａｔｒｉｏｔｉｃｕｓ）も、シアン化水素やマンデロニトリルなどを防御物質として産生する（Ｋｕｗａｂａｒａら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．，３７，ｐｐ．２３２−２３８（２０１１））。また、本発明者らによる予備実験により、ミドリババヤスデとアマビコヤスデの摩砕物は、ベンズアルデヒドからマンデロニトリルを合成する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を、それぞれ４．２３Ｕ／ｍｇおよび６．３５Ｕ／ｍｇ有することが確認されている。よって、上記ヤスデも本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを産生し、本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼはこれらヤスデからも精製できると考えられる。
【００２５】
本発明において「ヒドロキシニトリルリアーゼ活性」とは、シアン化合物とケトン化合物またはアルデヒド化合物からシアノヒドリンを生成する反応を触媒する活性（以下、「合成活性」と呼ぶ）と、その逆反応を触媒する活性（以下、「分解活性」と呼ぶ）のいずれをも意味する。本発明においては、例えば、合成活性は、ベンズアルデヒドからの（Ｒ）−マンデロニトリルの生成量を測定することにより算出することができる。マンデロニトリルの生成量は、例えばＨＰＬＣで定量することができる。また、分解活性は、基質であるマンデロニトリルからのベンズアルデヒドの生成量を測定することにより算出することができる。ベンズアルデヒドの生成量は、例えば、クエン酸ナトリウム緩衝液に、ヒドロキシニトリルリアーゼとラセミ体マンデロニトリルを添加したときの波長２８０ｎｍにおける吸光値の増加を計測することで定量することができる。
【００２６】
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、特に広いｐＨ範囲や温度範囲において活性を維持するという高い安定性を有する。
【００２７】
本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。また、特定のアミノ酸配列を有していれば、糖鎖を有していてもよいものとする。
【００２８】
本発明の上記アミノ酸配列（２）において、「１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、上記アミノ酸配列（１）を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを有する天然型ヒドロキシニトリルリアーゼと同等またはより優れるヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する限り特に限定されるものではない。前記「１から数個」の範囲は、例えば１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、１個程度であることができる。
【００２９】
本発明の上記アミノ酸配列（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、当該アミノ酸配列の相同性を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと同等またはより高いヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の相同性は３０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上であり、より好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上または９５％以上であり、さらに好ましくは９６％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上であり、特に好ましくは９９．８％以上である。本発明において「配列の相同性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が特定の相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
【００３０】
なお、Ｂｌａｓｔｐを用いた本発明者らによる検索によれば、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと相同性のある既知タンパク質は見付かっていない。具体的には、Ｂｌａｓｔｐ検索で見出されたタンパク質は５種類のみであり、その中で、ＢＡＤ３０８３２  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｇｒｏｕｐ］に対して最も高い相同性が示されている。但し、その相同性値は４４％に過ぎない。しかも、この相同性値は２９アミノ酸残基からなる部分配列と比較した結果であり、当該タンパク質全体のアミノ酸配列を比較した場合、相同性値ははるかに小さな値になるはずである。即ち、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、これまでの既知タンパク質とは全く相同性を有さない新規なものであるといえる。
【００３１】
上記アミノ酸配列（２）および（３）において、「（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して維持されているか或いは高い」とは、対象となるタンパク質のヒドロキシニトリルリアーゼ活性が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと比較して相対的に同等か或いは高いことをいう。具体的には、比較すべき２以上の酵素について同一条件で上記の合成反応または分解反応を行い、生成物量を比較し、上記アミノ酸配列（２）および（３）を有する酵素の活性が上記天然型酵素に比べて高ければよい。
【００３２】
＜遺伝子とベクター＞
本発明に係る遺伝子は、上記（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするものである。
上記遺伝子（４）は、ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）から単離精製された天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子である。よって、上記遺伝子（４）も、ヤンバルトサカヤスデから調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより得てもよい。
【００３３】
本発明に係る遺伝子の塩基配列（５）および（６）は、上記（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（２）または（３）のアミノ酸配列をコードするものとしてデザインすることができる。
【００３４】
本発明の遺伝子は、例えば、配列番号１または配列番号２の塩基配列を有する（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子ＤＮＡもしくはその相補配列、またはこれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。また、公知の方法による遺伝子合成により、配列番号１または配列番号２の塩基配列を持つＤＮＡを合成しても良い。
【００３５】
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００ｍＭ以上、２０００ｍＭ以下、温度が４０℃以上、７５℃以下、好ましくは塩濃度が６００ｍＭ以上、９００ｍＭ以下、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする核酸を得るための条件を設定することができる。
【００３６】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等を参照することができる。ハイブリダイズする核酸としては、例えば、配列番号１または配列番号２の塩基配列に対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸またはその部分断片が挙げられる。
【００３７】
本発明において、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の調製を行う方法は特に制限されず、通常は、公知の方法で行うことができる。例えば、天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を基に、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法や、遺伝子ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。
【００３８】
これらの部位特異的変異誘発法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，ｐｐ．４８８−９２（１９８５）、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，ｐｐ．３５０−６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８５，ｐｐ．２７６３−６（１９８８）等に記載されている。近年では、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法を基にした部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ（株）社製）等を用いて行うことができる。
【００３９】
また、目的とする変異導入箇所が、対象遺伝子配列において消化・連結が容易な制限酵素部位の近隣に存在する場合、目的変異を導入したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてＰＣＲを行うことで、目的変異が導入された遺伝子ＤＮＡ断片を容易に得ることができる。さらには、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）で伸長させて合成遺伝子として得ることもできる。
【００４０】
また、ヒドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてランダムに変異を導入する方法などのランダムな変異導入法によっても、天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子から所望の変異型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を得ることができる。
【００４１】
上記の方法によって得た本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を宿主で発現させるために、遺伝子の上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することができる。或いは、当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該変異遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用する。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。即ち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、天然型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。
【００４２】
プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。
【００４３】
ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特段限定されるものではなく、例えばρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター等が挙げられる。
【００４４】
また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法などにより付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列などが挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作製して利用してもよい。
【００４５】
一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４６】
本発明において使用されるベクターは、上記の変異遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＴｒｃ９９Ａ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社、日本）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＥＴ−１２（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）、ｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）などを用いることができる。また、必要に応じてこれらベクターを改変したものも用いることができる。また、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーターを有する発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡまたはｐＫＫ２３３−２などを用いることもできる。
【００４７】
上記の改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
＜形質転換体＞
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換または形質導入することで、形質転換体を作製することができる。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌；ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞；Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）細胞などの昆虫細胞；植物細胞などが挙げられる。
【００５０】
＜（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法＞
本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から精製することにより製造することができる。
【００５１】
本発明において「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記培養物中に蓄積される。
【００５３】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。また、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５４】
培養中、ベクターおよび目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。即ち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加してもよく、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中に、必要に応じてアンピシリンを培地に添加してもよい。
【００５５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＬＡＡ等を培地に添加することができる。
【００５６】
形質転換体の培養条件は、目的の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの生産性および宿主の生育が妨げられない条件であれば特段限定されるものではないが、通常、培養温度は１０℃以上、４５℃以下、好ましくは１０℃以上、４０℃以下、さらに好ましくは１５℃以上、４０℃以下、さらにより好ましくは２０℃以上、３７℃以下で行い、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。培養時間は５時間以上、１２０時間以下程度とすることができ、好ましくは５時間以上、１００時間以下、さらに好ましくは１０時間以上、１００時間以下、さらにより好ましくは１５時間以上、８０時間以下程度行う。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、大腸菌であれば６以上、９以下に調整する。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
【００５７】
培養のための培地の初発ｐＨは７以上、９以下に調整するのが適当である。また、培養は、５℃以上、４０℃以下、好ましくは１０℃以上、３７℃以下で５時間以上、１００時間以下行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施するのが好ましい。
【００５８】
本発明に係る（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、上記培養物から精製されるが、その精製度合いは特に制限されない。例えば、上記培養物をホモジェナイズし、濾過や遠心分離などにより不溶物を除去した溶液をそのまま用いてもよいし、さらに、カラムクロマトグラフィなどにより精製して、粗酵素液や酵素液を得てもよい。
【００５９】
＜酵素反応＞
（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナー存在下でアルデヒドやケトンをシアノヒドリンに変換する合成反応を触媒し、また、その逆反応であるシアノヒドリンの分解反応を触媒する酵素である。
【００６０】
本発明では、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性の測定方法として、例えば、シアン化カリウム存在下でベンズアルデヒドを基質とし、マンデロニトリルの生成量をＨＰＬＣにて測定する方法を挙げることができる。或いは、ラセミ体マンデロニトリルを基質とし、その分解を吸光度計にて吸収波長２８０ｎｍを測定することで検出する方法も挙げられる。溶媒としては、シアノヒドリンの安定性などから中性より酸性とするため、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いることが好ましい。合成反応はｐＨ４．０以上、４．２以下程度、分解反応はｐＨ５以上、５．５以下程度で行うことが好ましい。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６２】
実施例１：  天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの取得
（１）  （Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの精製
ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）を、鹿児島県にて、その異常発生が認められた２０１０年１１月、２０１１年１１月および２０１２年８月に捕獲した。捕獲したヤスデは、ドライアイスを入れた容器中で冷却し、使用するまで−８０℃で保管した。図１は、生きているヤンバルトサカヤスデの写真である。
【００６３】
冷凍保存されていた上記ヤンバルトサカヤスデ（合計２ｋｇ）を、液体窒素中、乳鉢と乳棒を使って磨り潰した。得られた微粒子を、氷冷しつつ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３時間以上撹拌することによって懸濁した。得られた懸濁液を多層に重ねた綿ガーゼに注意深く通すことで、固形物を除去した。得られた溶液をサケ精液から得られた硫酸プロタミン（ナカライテスク社製）で３０分間処理した後、４℃、２８５００×ｇで３０分間遠心分離した。得られた上清から、以下に示す条件により酵素を精製した。なお、以下の操作は、０〜４℃で行った。
【００６４】
先ず硫安分画を行い、次いでカラムクロマトグラフィにより、上記上清から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを精製した。カラムクロマトグラフィでは、ＤＥＡＥ樹脂（ＴＯＳＯＨ社製，「ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）−６５０Ｍ」）、疎水性樹脂（ＴＯＳＯＨ社製，「Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）」−６５０Ｍ）、陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製，「Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ」）、強陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製，「ＭｏｎｏＱＴＭ  ５／５０  ＧＬ」）、およびゲルろ過クロマトグラフィカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製，「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５」および「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ」）を用いた。また、精製工程毎に、以下に示す条件で酵素活性を測定した。以下、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを「Ｒ−ＣｈＨＮＬ」と略記する。
【００６５】
（２）  酵素活性の測定
ヒドロキシニトリルリアーゼの酵素活性は、ベンズアルデヒドを基質とし、以下のとおりにして測定した。即ち、４００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２，７６０μＬ）に、基質としてベンズアルデヒドの１．２５Ｍ  ＤＭＳＯ溶液（４０μＬ）、適量の酵素液（最大１００μＬ）を混合した。次に１Ｍ  ＫＣＮ（１００μＬ）を加えて合成反応を開始し、２２℃で５分間反応させた。反応後、反応液１００μＬを回収し、ｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝８５：１５の混合液を加えて激しく撹拌し、４℃、１６０００ｇで３分間遠心分離した。有機層（５００μＬ）を回収した。
得られた有機層（５μＬ）を、下記条件のＨＰＬＣで分析した。
カラム：  キラルＯＪ−Ｈカラム（Ｄａｉｃｅｌ社製）
溶離液：  ｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝８５：１５
流速：  １ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度：  ３０℃
検出：  ２５４ｎｍ
保持時間：  ベンズアルデヒド  −  ５．５分
（Ｒ）−マンデロニトリル  −  １２分
（Ｓ）−マンデロニトリル  −  １４分
【００６６】
また、基質であるベンズアルデヒドの消費は、２８０ｎｍの吸光度測定によりモニターした。表１に、精製工程毎の酵素データを示す。
【００６７】
【表１】
2015167477.tif 000002
【００６８】
また、ラセミ体マンデロニトリルからベンズアルデヒドへの分解反応の活性は、以下のように測定した。２ｍＭのラセミ体マンデロニトリルを含む１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０−５．５）に酵素溶液を添加し、緩やかに撹拌し、２２℃で１〜２分間反応させ、ベンズアルデヒドの生成量を２８０ｎｍの吸光度で測定した。ベンズアルデヒドの分子吸光係数としては、ε280＝１．４ｍＭ-1ｃｍ-1を適用した。精製酵素のシアノヒドリン合成方向への活性は、シアノヒドリン分解方向の活性より２．６倍高かった。
【００６９】
実施例２：  天然型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの構造の分析
（１）  分子質量と４次構造の分析
上記実施例１で精製されたＲ−ＣｈＨＮＬの単量体サブユニットのサイズを、分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分子量と４次構造は、ＧＥヘルスケア社製のＳｕｐｅｒｄｅｘ  １０／３００ＧＬを用いたゲルろ過クロマトグラフィにより求めた。詳細は、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３，  ｐｐ．１００−１１０（２０１１）（以下、当該文献を「Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１１）と略記する）を参照した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）中、１は、上から９７．４ｋＤａ、６６．２ｋＤａ、４５ｋＤａ、３１ｋＤａ、２１．５ｋＤａおよび１４．４ｋＤａの分子量マーカーのレーンであり、２は精製Ｒ−ＣｈＨＮＬのレーンである。
【００７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとゲルろ過の結果から、Ｒ−ＣｈＨＮＬの分子質量は４７．３ｋＤａであり、分子質量２４．８ｋＤａのサブユニットのホモダイマーであることが明らかになった。
【００７１】
（２）  糖鎖の有無
糖鎖の有無は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて確認した。詳しくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、グリコプロテインに含まれるｃｉｓ−ジオールを過ヨウ素酸によりアルデヒドに酸化し、生成したアルデヒド基をシッフ塩基に変換して赤紫色に発色させ、糖鎖の有無を確認した。かかる反応でＲ−ＣｈＨＮＬの糖鎖の有無を確認した結果を、代表的なグリコプロテインである西洋ワサビペルオキシダーゼの結果と共に図２（Ｂ）に示す。図２（Ｂ）中、１はＲ−ＣｈＨＮＬのレーンであり、２は西洋ワサビペルオキシダーゼのレーンである。
【００７２】
（３）  分光分析
Ｒ−ＣｈＨＮＬを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、紫外可視近赤外分光光度計（島津製作所社製，「ＵＶ２６００」）で２１０〜６００ｎｍの範囲で測定することにより、補欠分子族を検出した。また、Ｒ−ＣｈＨＮＬを、室温、ｐＨ７．０で、分光計（Ｊａｓｃｏ社製，「７２０  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）により１７０〜３００ｎｍの範囲で分析した。さらに、赤外分光光度計（Ｗａｌｔｈａｍ社製，「Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＩＲ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００」）を用い、精製酵素の二次構造を推定した。Ｒ−ＣｈＨＮＬの紫外・可視・近赤外スペクトル、赤外スペクトル、および円偏光二色性スペクトルを測定した。それぞれの結果を図３（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【００７３】
紫外・可視・近赤外スペクトルの測定結果（図３（Ａ））によれば、Ｒ−ＣｈＨＮＬは補酵素ＦＡＤを含まない。また、赤外スペクトルの測定結果（図３（Ｂ））によれば、１６４５／ｃｍのピークから、Ｒ−ＣｈＨＮＬはβ−リッチなタンパク質であることが分かる。さらに、円偏光二色性スペクトルの測定結果（図３（Ｃ））によれば、２２２ｎｍの円二色性から、Ｒ−ＣｈＨＮＬはα−リッチではないことが明らかとなった。
【００７４】
実施例３：  組換え型（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造
（１）  Ｒ−ＣｈＨＮＬをコードするｃＤＮＡのクローニング：
ヤンバルトサカヤスデを氷温麻酔し、ピンセットを用いてその体節側方突起を集めた。取得された組織をｔｏｔａｌ  ＲＮＡ分離用試薬（インビトロゲン社製，「ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ」）に添加し、ディスポーザブルホモジナイザー（Ｎｉｐｐｉ社製，「ＢｉｏＭａｓｈｅｒ  ＩＩ」）を使ってホモジェナイズした。指示書に基づいてＲＮＡを抽出した。５’／３’−ＲＡＣＥのためのｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔとＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを使って合成し、ＲＮａｓｅ  Ｈ（タカラバイオ社製）で処理した。
【００７５】
（２）  プライマーの設計
ｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法（ＡＰＲＯライフサイエンス研究所）を用いて若しくは用いずに、エドマン分解法により精製したＲ−ＣｈＨＮＬのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列に基づいて、以下の縮重プライマーを設計した。
【００７６】
PKAAINPIQEf：  5'-CC(A/C/G/T)AA(A/G)GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/T/C)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/T/C)CA(A/G)GA-3'（配列番号４）
APTALDIKf1：  5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)TT(A/G)GA(C/T)AT(A/C/T)AA-3'（配列番号５）
APTALDIKf2：  5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)CT(A/C/G/T)GA(C/T)AT(A/C/T)AA-3'（配列番号６）
APTALDIKr1：  5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(C/T)AA(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)GC-3'（配列番号７）
APTALDIKr2：  5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(A/C/G/T)AG(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)GC-3'（配列番号８）
AAINPIQEf：  5'-GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'（配列番号９）
ATINPIQEf：  5'-GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'（配列番号１０）
LAINPIQEf1：  5'-TT(A/G)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'（配列番号１１）
LAINPIQEf2：  5'-CT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'（配列番号１２）
LTINPIQEf1：  5'-TT(A/G)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'（配列番号１３）
LTINPIQEf2：  5'-CT(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3'（配列番号１４）
AAINPIQEr：  5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GC-3'（配列番号１５）
ATINPIQEr：  5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GC-3'（配列番号１６）
LAINPIQEr1：  5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(C/T)AA-3'（配列番号１７）
LAINPIQEr2：  5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AG-3'（配列番号１８）
LTINPIQEr1：  5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(C/T)AA-3'（配列番号１９）
LTINPIQEr2：  5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)AG-3'（配列番号２０）
NCPETHGCFAFf：  5'-AA(C/T)TG(C/T)CC(A/C/G/T)GA(A/G)AC(A/C/G/T)CA(C/T)GG(A/C/G/T)TG(C/T)TT(C/T)GC(A/C/G/T)TT-3'（配列番号２１）
NCPETHGCFAFr：  5'-AA(A/C/G/T)GC(A/G)AA(A/G)CA(A/C/G/T)CC(A/G)TG(A/C/G/T)GT(C/T)TC(A/C/G/T)GG(A/G)CA(A/G)TT-3'（配列番号２２）
【００７７】
なお、配列の前の記号は、縮重プライマーを設計するもとになったアミノ酸配列と、最後のｆとｒはｃＤＮＡ塩基配列に対応するプライマーアニーリングの方向を示す。
【００７８】
（３）  ＰＣＲ
上記縮重プライマーとポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，「Ｄｒｅａｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」，および，Ｃｌｏｎｔｅｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，「Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ」）を用い、ＰＣＲを行った。反応は、９４℃で３分間の後、（ｉ）９４℃で１分間、（ｉｉ）４０℃で１分間、（ｉｉｉ）７２℃で１分間の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルを７０回繰返して行った。次いで、ゲル（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，「Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ」）を使ってＰＣＲ産物を精製し、ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）」）のＥｃｏ  ＲＶ認識部位にライゲーションした。ＤＮＡ配列を、遺伝子解析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，「３５００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を使って決定した。得られた配列をアッセンブルし、シーケンスアセンブリソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ社製，「ＡＴＧＣ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｙｘ」）を使って解析した。
得られたＤＮＡ配列に基づいて、以下の遺伝子特異的プライマーを設計した。
【００７９】
R-ChHNL-1：5'-CTGACTGAAACCTTCGAATGCACCACTCG-3'（配列番号２３）
R-ChHNL-2：5'-GGCATAATGAATCTTGTCGCCGTTTGGAAC-3'（配列番号２４）
R-ChHNL-3：5'-TTTGGTAGTGGACCAGCGAGCAGGTTGCAC-3'（配列番号２５）
R-ChHNL-4：5'-ATAATCCCTTTAAAGTTCAGGTGCAATTAG-3'（配列番号２６）
R-ChHNL-5：5'-ATACCAACACATCAAACTTACCAAGCTTAG-3'（配列番号２７）
R-ChHNL-6：5'-ATTATGGCTTACGATTTCGTCGGTGGTCC-3'（配列番号２８）
【００８０】
上記プライマーとＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製，「ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ」）を使い、ＰＣＲを行った。鋳型としては、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで作製した上記のｃＤＮＡを用いた。反応は、９４℃で２分間の後、（ｉ）９８℃で１０秒間および（ｉｉ）６８℃で１分間のサイクルを３５回繰返して行った。ＰＣＲ産物は、ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）」）にライゲーションし、配列を決定した。その他のプロトコールは、上記と同様にした。全長ｃＤＮＡ配列は、エラーを避けるため、１８の独立したクローンを用いて決定した。
【００８１】
得られたｃＤＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を図４に示す。図４中、アスタリスクは終止コドンを示し、シグナルペプチドはイタリック体で記載しており、矢印はプライマーのアニーリングサイトを示し、アミノ酸残基の下線は決定されたアミノ酸配列を示す。以上のとおり、ヤンバルトサカヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（Ｒ−ＣｈＨＮＬ）をコードするｃＤＮＡをクローニングした。推定アミノ酸配列は、Ｂｌａｓｔｐ  ｓｅａｒｃｈでのいかなるタンパク質とも相同性を示さなかった。
【００８２】
（４）  酵母系発現ベクターの構築
遺伝子特異的プライマーであるＣｈＨＮＬ−４およびＣｈＨＮＬ−５と、ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，「ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」）を用い、ｃＤＮＡ全長を増幅した。ＰＣＲは、９５℃で２分間の後、（ｉ）９５℃で２０秒間、（ｉｉ）４０℃で２０秒間、（ｉｉｉ）７２℃で１分間のサイクルを３０回繰返し、最後に７２℃で３分間反応させた。反応液を制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製，「Ｄｐｎ  Ｉ」）で、３７℃で１時間処理した。ＤＮＡ断片をゲルで精製し、ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製，「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）」）にライゲーションし、上記と同様に配列を決定した。
【００８３】
成熟ＣｈＨＮＬをコードするｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）へ挿入するために、以下の制限酵素認識サイトを含むプライマーを設計した。
【００８４】
XhoIkex2-mChuaHNL：5'-GCGCTCGAGAAAAGACTGACTTGTGATCAACTTCCC-3'（配列番号２９）
ChuaHNLstop-XbaI：5'-CGCTCTAGATTAGTAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTC-3'（配列番号３０）
【００８５】
上記プライマーを用いて上記と同様にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ複製物をベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製，「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）」）にライゲーションして塩基配列を確認した後、挿入配列をプラスミドベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，「ｐＰＩＣＺαＡ」）の制限酵素認識部位にライゲーションした。
【００８６】
（５）  形質転換体の作製と組換え型Ｒ−ＣｈＨＮＬの精製
作製されたプラスミドベクターを、制限酵素ＳａｃＩを用いて３７℃で３〜４時間消化した。陽性の酵母クローンを得るため、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と、ＧＳ１１５系統のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を使用した。Ｐｉｃｈｉａコンピテント細胞の調製法は、Ｊｏａｎ  Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８，ｐｐ．４４−４８（２００５）の方法に従った。形質転換体をヒスチジン添加最少グリセロール培地で培養した後、タンパク質の発現を誘導するために、さらにヒスチジン添加最少メタノール（０．５％）培地４Ｌ中、３０℃で４日間培養した。
【００８７】
培地をタンジェントフォロー・フィルトレーションシステムで濃縮し、陰イオン交換樹脂カラム（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）−６５０Ｍ，カラム体積：２５ｍＬ）に添加した。非吸着画分を疎水性相互作用クロマトグラフィ（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）−６５０Ｍ）で分離し、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ  １０／３００ＧＬでＲ−ＣｈＨＮＬを精製した。
【００８８】
実施例４：  Ｒ−ＣｈＨＮＬの基質
Ｒ−ＣｈＮＨＬの基質を、シアノヒドリン合成反応によりスクリーニングした。Ｒ−ＣｈＮＨＬの基質を決定するために、酵素試料として強陰イオン交換カラム画分（２５μＬ，表１）を２．５Ｕ用い、ブランクとしては、酵素試料の代わりに再蒸留水を用いた。３００μｍｏｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）、酵素試料、５０ｍＭのカルボニル化合物および１００ｍＭのＫＣＮを混合し（総量：１ｍＬ）、２５℃で５分間反応させた。結果は、検出波長を２５４ｎｍとするＯＪ−Ｈキラルカラムを用いたＨＰＬＣでモニターし、反応生成物を検出することにより活性の有無を決定した。
【００８９】
但し、ベンズアルデヒド以外の芳香族被検化合物は、５０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液（４μＬ）として反応させた。被検化合物４−ブロモベンズアルデヒドのための抽出溶媒は、ｎ−へキサン：２−プロパノール＝１９：１の混合溶媒を用いた。被検化合物が水に溶解しない場合には、３０℃、１０００〜１５００ｒｐｍで撹拌した。また、脂肪族の被検化合物の場合、反応時間を２時間とした。反応後、反応液４００μＬにジイソプロピルエーテル６００μＬを加え、激しく撹拌し、１６０００ｇで５分間遠心分離した。上清４００μＬに、無水酢酸２０μＬ、ピリジン１０μＬ、４−ジメチルアミノピリジン２〜３ｍｇを加え、３７℃で一晩反応させた。引き続き、シアノヒドリン化合物と４−ジメチルアミノピリジンの気化のため、６０℃で２〜４時間反応させた。さらに水１００μＬとエチルアセテート４００μＬを加え、遠心後、上清１５０μＬを試料とした（Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，６，ｐｐ．２８３−２８６（１９９５）を参照）。生成化合物の検出には、Ｓｕｐｅｌｃｏ  β−Ｄｅｘ  ３２５カラムを接続したガスクロマトグラフィ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製「ＧＣ−２０１４」）を用い、キャリアガスとしてはヘリウムを使用した。活性が認められた化合物を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2015167477.tif 000003
【００９１】
表２に示す結果のとおり、Ｒ−ＣｈＮＨＬは、一般的な天然ＮＨＬが基質とするベンズアルデヒドのみならず、様々なカルボニル化合物を基質とすることが明らかとなった。
【００９２】
実施例５：  Ｒ−ＣｈＨＮＬの動力学的分析
基質として様々なアルデヒド化合物またはマンデロニトリルのラセミ体を用い、上記と同様の条件で酵素反応を行った。但し、基質としてベンズアルデヒドを用いた場合には、反応条件をｐＨ５．２で且つ２２℃、またはｐＨ５．８で且つ３５℃とした。基質として様々な濃度のベンズアルデヒドを使い、酵素活性測定はそれぞれ３回行い、その平均値を算出して基質飽和曲線を作成し、Ｖmax、Ｋmおよびｋcatの値を求めるためＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットした。結果を表３に示す。なお、表３中の「Ｓ．Ａ．」は比活性であり、相対比活性は、基質としてベンズアルデヒドを用いてｐＨ５．２，２２℃で反応させた場合に対する比活性である。また、基質としてマンデロニトリルラセミ体を用いた場合は分解反応になるので、比活性は算出できない。
【００９３】
【表３】
2015167477.tif 000004
【００９４】
表３に示す結果のとおり、Ｒ−ＣｈＮＨＬは、これまで知られているＨＮＬに比べても、補酵素としてＦＡＤを利用しないにもかかわらず最も高いｋcat／Ｋm値を示した。
【００９５】
実施例６：  Ｒ−ＣｈＨＮＬの温度およびｐＨに対する安定性
上記実施例１で得た天然型Ｒ−ＣｈＨＮＬまたは上記実施例３で得た組換え型Ｒ−ＣｈＨＮＬについて、最終濃度４００ｍＭのクエン酸塩緩衝液と基質としてベンズアルデヒドを用い、上記と同様の酵素反応条件により温度とｐＨに対する安定性を試験した。温度による安定性は、ｐＨ７．０の反応液中、０〜７０℃の温度範囲で１時間反応させることにより測定した。また、反応温度を２０℃に設定し、ｐＨを３〜１１に変更して同様に反応を行った。この際、ｐＨ３〜８ではクエン酸−リン酸緩衝液を用い、ｐＨ８〜１１ではグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた。酵素活性は、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１１）に記載の方法に従って測定した。天然型Ｒ−ＣｈＨＮＬの反応ｐＨと比活性および残存活性との関係をそれぞれ図５（Ａ）と図５（Ｂ）に示し、反応温度と比活性および残存活性との関係をそれぞれ図６（Ａ）と図６（Ｂ）に示す。また、両Ｒ−ＣｈＨＮＬの反応温度および反応ｐＨと残存活性との関係をそれぞれ図７（Ａ）と図７（Ｂ）に示す。
【００９６】
図５のとおり、天然由来Ｒ−ＣｈＨＮＬはｐＨ５．８で最大活性を示し、ｐＨ４でも最大活性値の約１０％の活性を示す。この至適ｐＨは、他の植物由来ＨＮＬの至適ｐＨである５．１より高い。また、図５（Ｂ）のとおり、天然由来Ｒ−ＣｈＨＮＬは広いｐＨ範囲において安定性を示すことが分かる。
【００９７】
また、図５のとおり、天然由来Ｒ−ＣｈＨＮＬは、０〜７０℃という広い温度範囲で活性を示し、３５℃が至適温度であり、６０℃以下で高い活性を示すことが明らかとなった。なお、既知の植物由来ＨＮＬの中で最も安定なのは、アーモンド由来のＨＮＬであり、６０℃で１時間保持しても安定であると記載されている（Ｗｏｋｅｒ，Ｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２８，ｐｐ．５８４−５９０（１９９４）；Ｊａｎｓｅｎ，Ｉ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５，ｐｐ．９０−９９（１９９２））。しかし、最も安定なアーモンド由来のＨＮＬでも、７５℃では３０分間で完全に失活する。それに対して本発明に係るＲ−ＣｈＨＮＬの活性は、図５のとおり６０℃では１時間超の保持でも維持されることが予想され、７５℃で１時間保持しても２０％の活性が維持されている。このように本発明に係るＲ−ＣｈＨＮＬは、既知のＨＮＬに比べて安定性が高いといえる。
【００９８】
さらに、図６のとおり、組換え型Ｒ−ＣｈＨＮＬは、天然由来Ｒ−ＣｈＨＮＬほどｐＨや温度に対して安定ではないものの、一般的な酵素に比べれば十分に高い安定性を有することが示された。
【００９９】
実施例６：  Ｒ−ＣｈＨＮＬの活性阻害剤の検討
Ｒ−ＣｈＨＮＬについて、活性阻害剤につき実験した。上記と同様の酵素反応条件において、実施例１で得た天然由来Ｒ−ＣｈＨＮＬを用い、１ｍＭまたは０．１ｍＭの濃度の被検化合物を反応液に加え、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０℃で６０分間反応を行った。残存活性を３回測定した。その平均値を表４に示す。
【０１００】
【表４】
2015167477.tif 000005
【０１０１】
表４に示す結果のとおり、試験した被検化合物のうち、阻害活性を示すものはわずかしかなかった。例えばスルフヒドリル試薬であるヨード酢酸とヨードアセトアミドは、１０ｍＭまで濃度を上げた場合にＲ−ＣｈＨＮＬの活性を阻害した。同じ傾向は、有名なセリンプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦでも認められた。チオシアン酸アンモニウムは、トウダイグサ科植物であるパラキノゴムおよびバリオスペルマムに由来するＳ−ＨＮＬを強く阻害するが、本発明に係るＲ−ＣｈＨＮＬは阻害しなかった。金属の中では、水銀イオンと銀イオンが３０〜４０％の阻害活性を示したのみであった。以上の結果のとおり、本発明に係るＲ−ＣｈＨＮＬは、従来酵素に対する様々な活性阻害剤の存在下でも安定した活性を示すことが明らかとなった。
【図１】
2015167477.tif 000006
【図２】
2015167477.tif 000007
【図３】
2015167477.tif 000008
【図４】
2015167477.tif 000009
【図５】
2015167477.tif 000010
【図６】
2015167477.tif 000011
【図７】
2015167477.tif 000012
【配列表】
2015167477000001.app