(57)【要約】【課題】複数の細菌を同時一斉に検出・定量する手法を提供すること。【解決手段】同一の反応条件のPCRで増幅可能な少なくとも５種の細菌遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーとプローブを試料から抽出したDNAと混合して、前記反応条件でPCRを行い、細菌遺伝子を検出及び/又は定量することを特徴とする、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量する方法。配列番号１〜３６のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量するためのキット。【選択図】図４
2015039320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一の反応条件のPCRで増幅可能な少なくとも５種の細菌遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーとプローブを試料から抽出したDNAと混合して、前記反応条件でPCRを行い、細菌遺伝子を検出及び/又は定量することを特徴とする、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量する方法。
【請求項２】
配列番号１〜３４のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてPCRを行い、非病原性大腸菌、病原性大腸菌、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、レジオネラ、ウェルシュ菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ菌及びコレラ菌からなる群より選択される少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量する請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記(1)〜(17)のプライマーペアからなる群より選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いてPCRを行う請求項２記載の方法。
(1) 配列番号１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ftsZ）
(2) 配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：uidA）
(3)配列番号５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：eaeA）
(4)配列番号７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：stx1）
(5)配列番号９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１０のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：stx2）
(6)配列番号１１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ipaH 7.8）
(7)配列番号１３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ipaH all）
(8)配列番号１５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：virA）
(9)配列番号１７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：invA）
(10)配列番号１９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２０６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ttrC）
(11)配列番号２１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：cadF）
(12)配列番号２３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ciaB）
(13)配列番号２５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：cpe）
(14)配列番号２７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：plc）
(15)配列番号２９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３０のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：mip）
(16)配列番号３１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：iap）
(17)配列番号３３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：hlyA）
【請求項４】
目的試料に濃度既知の内部標準となる細菌を添加して、DNA抽出とPCRを行い、内部標準細菌の検出と定量を行うことで、添加した内部標準細菌の回収率を判断する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
内部標準細菌として、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株を用い、NH8B_3641を標的とするPCRを行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
配列番号３５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペアを用いて、NH8B_3641を標的とするPCRを行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
同一条件で増幅可能な細菌遺伝子を標的とするPCRを行う前に、前記PCRに用いる全種類のプライマーペアを混合してPCRを行うことにより、DNAの前増幅を行う請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的遺伝子を組み込んだプラスミドを直鎖状にし、濃度を測定した後に段階希釈したもので検量線を予め作成しておき、この検量線を用いて、目的試料中の細菌の量又は濃度を求める請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
配列番号１〜３６のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数細菌の同時検出及び／又は定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
迅速に病原体を検出・定量することは、適切な治療、感染症の拡大防止、および感染リスクの評価において極めて重要である。しかしながら、複数種の病原体が存在するため、従来法による検出・定量技術では、それらを同時一斉に検出することは困難であった。 
定量的PCR法は、PCR反応生成物の量をモニタリングすることでターゲット遺伝子の存在量を定量する手法であり、Sybr Green法とTaqManプローブ法に大別される。TaqManプローブを用いた定量的PCR法は、検出感度および特異性が高いため、微量に存在する遺伝子を定量する場合に適している。病原因子遺伝子配列に対して特異的なPCRプライマーおよびTaqManプローブを用いることで、対象となる病原体を個別に定量検出する方法は多く報告されている（例えば、Malorny et al. 2004（非特許文献１））。2〜4種類の病原体であれば、異なる波長を持つ蛍光色素を用いたマルチプレックス定量的PCR法によって同時定量することも可能（LaGier et al. 2004（非特許文献２））だが、それ以上の種類の病原体を同時に定量検出する方法は未だ存在しない。
【０００３】
一方で、複数病原体を検出・定量しようという試みとして16S rRNA遺伝子を大量に解析するアプローチが注目を集めている。マイクロアレイ技術に基づくPhyloChipやパイロシーケンス法に基づく方法（Ye and Zhang 2011（非特許文献３））などが知られている。しかしながら、16S rRNA遺伝子を対象とした解析では、病原性大腸菌のように16S rRNA遺伝子では非病原性大腸菌と区別できないものを検出することはできない。
【０００４】
また近年は、半導体に用いられていた集積回路の設計技術をバイオ分野に応用しようという試みが盛んである。そのひとつに、化学・生化学実験を一枚のチップ上で行える微細化実験室ともいえる技術があり、それらは総称して実験室チップ（Lab-on-a-chip; LOC）と呼ばれている。2011年にLOCを用いた複数種病原体検出キットVereFoodborneがVeredus Laboratorie社（本社シンガポール）から発表されたが、このキットには定量性がないため、リスク評価・管理へ応用するには難がある。また、Biotrove OpenArrayシステム（Applied Biosystems社、米国カリフォルニア州）を用いたSybr Green法による定量的PCRによって複数種病原体を検出・定量する手法が報告されている（Stedtfeld et al. 2008（非特許文献４））が、検出感度が十分ではないため普及するには至っていない。
【０００５】
2007年にはLOC上でTaqManプローブ法による定量的PCRを行う装置BioMarkがFluidigm社（本社米国カリフォルニア州）から販売された。これまでのところヒト細胞における遺伝子発現解析や遺伝子の変異検出など、主にマイクロアレイ解析の代替品として使われてきた（Spurgeon et al. 2008（非特許文献５））が、BioMark装置を用いて複数種の病原体微生物の定量検出に応用した事例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Malorny B, Paccassoni E, Fach P, Bunge C, Martin A, Helmuth R. 2004. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Appl. Environ. Microbiol. 70: 7046-7052.
【非特許文献２】LaGier MJ, Joseph LA, Passaretti TV, Musser KA, and Cirino NM. 2004. A real-time multiplexed PCR assay for rapid detection and differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Mol. Cell. Probes 18:275-282.
【非特許文献３】Ye L, Zhang T. 2011. Pathogenic bacteria in sewage treatment plants as revealed by 454 pyrosequencing. Environ Sci. Technol. 45:7173-7179.
【非特許文献４】Stedtfeld RD, Baushke SW, Tourlousse DM, Miller SM, Stedtfeld TM, Gulari E, Tiedje JM, Hashsham SA. 2008. Development and experimental validation of a predictive threshold cycle equation for quantification of virulence and marker genes by high-throughput nanoliter-volume PCR on the OpenArray platform. Appl. Environ. Microbiol. 74:3831-3838.
【非特許文献５】Spurgeon SL, Jones RC, Ramakrishnan R. 2008. High throughput gene expression measurement with real time PCR in a microfluidic dynamic array. PLOS One 3:e1662.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、複数の細菌を同時一斉に検出・定量する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、同一条件で反応可能な、18 個の遺伝子を対象としたTaqMan probe 法によるqPCR アッセイを設計した。このほか、すでに確立されている2 つのTaqMan qPCR アッセイを合わせて、合計で20 個のアッセイを本研究で用いた。これにより、食中毒および水系感染症の代表的な病原細菌9 種（病原性大腸菌、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、レジオネラ、ウェルシュ菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ菌、コレラ菌）、一般大腸菌1 種、プロセスコントロールNH8B 株を対象とするTaqMan qPCR アッセイを構築することができた。
【０００９】
定量のため、ターゲット遺伝子を組み込んだプラスミドを直鎖状にし、PicoGreen 比色法で濃度測定後に段階希釈したものを検量線として用いた。従来法によるqPCR (以下、C-qPCR)はABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)を用いて、マイクロ流体工学装置によるqPCR (以下、MF-qPCR；図１)はBioMark (Fluidigm)を用いて行った。
【００１０】
MF-qPCR の前に、DNA の前増幅(Specific Target Amplification; 以下、STA)反応を行った。これは、上記20 個のアッセイに用いるプライマーペアを混合して行う14 サイクルのマルチプレックスPCR である。STA 反応がqPCR の定量性能に影響を与えるかどうか慎重に検討した。また、11 種35 株の微生物純粋培養株から抽出したゲノムDNA を用いてC-qPCR およびMF-qPCR を行い、アッセイの特異性を検証した。
【００１１】
ヒト糞便に、病原体9 株とプロセスコントロール株を単独または混合して接種しDNA を抽出した。また、湖沼水に大腸菌O157:H7 およびプロセスコントロール株を各濃度101〜107 cells/L となるように接種し、加圧濾過を行なった。濾過後の膜から菌懸濁液を回収しDNA を抽出した。糞便および環境水から得られたDNA に対してC-qPCR およびMF-qPCR を行った。
【００１２】
本研究において、特異的かつ高感度なTaqMan qPCR アッセイを20 個開発することができた。アッセイは高い増幅効率(90〜110%)と広い増幅レンジ(2〜2×106 copies/μL)を持っていた（図２）。STA 反応を行った検量線ほうが小さいCq 値（図２のy 軸）をとったことから、検出感度が高まっていることがわかった。また、検量線の傾きはSTA 反応の有無によらず同様であったことから、増幅効率に大きな差はないと判断した。さらに、STA 反応の有無によらず増幅レンジに大きな差がなかった。以上のことから、STA 反応はqPCR の定量性能に影響を与えないと判断した。
【００１３】
純粋株を用いた特異性検証の結果、Listeria monocytogenes serovar 4c JCM7679 からはターゲット遺伝子（iap、hlyA）が増幅されなかったが、それ以外の株からはそれぞれのターゲット遺伝子が検出された（図３）。したがって、本研究で開発したTaqMan qPCR アッセイは特異的であると判断した。
【００１４】
糞便や環境水試料に病原体を接種した場合、接種菌株のみを特異的に検出することができた（図４、図５）。夾雑細菌が多数存在する糞便のようなサンプルからも特定の病原体を特異的に検出によることができた。その際の検出感度はそれぞれ500〜5×104 cells/g 糞便および100 cells/L 水であった。菌体を段階希釈して接種した場合は、菌体量に応じて定量値が減少していった（図６）。したがって、MF-qPCR による定量は環境試料に対しても適応可能と考えられる。本発明は、これらの知見により、完成されたものである。
【００１５】
本発明の要旨は、以下の通りである。
１．同一の反応条件のPCRで増幅可能な少なくとも５種の細菌遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーとプローブを試料から抽出したDNAと混合して、前記反応条件でPCRを行い、細菌遺伝子を検出及び/又は定量することを特徴とする、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量する方法。
２．配列番号１〜３４のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてPCRを行い、非病原性大腸菌、病原性大腸菌、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、レジオネラ、ウェルシュ菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ菌及びコレラ菌からなる群より選択される少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量する１記載の方法。
３．下記(1)〜(17)のプライマーペアからなる群より選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いてPCRを行う２記載の方法。
(1) 配列番号１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ftsZ）
(2) 配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：uidA）
(3)配列番号５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：eaeA）
(4)配列番号７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：stx1）
(5)配列番号９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１０のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：stx2）
(6)配列番号１１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ipaH 7.8）
(7)配列番号１３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ipaH all）
(8)配列番号１５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：virA）
(9)配列番号１７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：invA）
(10)配列番号１９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２０６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ttrC）
(11)配列番号２１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：cadF）
(12)配列番号２３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ciaB）
(13)配列番号２５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：cpe）
(14)配列番号２７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：plc）
(15)配列番号２９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３０のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：mip）
(16)配列番号３１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：iap）
(17)配列番号３３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：hlyA）
４．目的試料に濃度既知の内部標準となる細菌を添加して、DNA抽出とPCRを行い、内部標準細菌の検出と定量を行うことで、添加した内部標準細菌の回収率を判断する１〜３のいずれかに記載の方法。
５．内部標準細菌として、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株を用い、NH8B_3641を標的とするPCRを行う４記載の方法。
６．配列番号３５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペアを用いて、NH8B_3641を標的とするPCRを行う５記載の方法。
７．同一条件で増幅可能な細菌遺伝子を標的とするPCRを行う前に、前記PCRに用いる全種類のプライマーペアを混合してマルチプレックスPCRを行うことにより、DNAの前増幅を行う１〜６のいずれかに記載の方法。
８．標的遺伝子を組み込んだプラスミドを直鎖状にし、濃度を測定した後に段階希釈したもので検量線を予め作成しておき、この検量線を用いて、目的試料中の細菌の量又は濃度を求める１〜７のいずれかに記載の方法。
９．配列番号１〜３６のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量するためのキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、複数細菌を同時一斉に検出及び／又は定量できるようになった。本発明の方法は、病原体特定のための迅速な診断ツールとして、および正確なリスク評価手法として応用可能であると期待される。また、糞便指標菌（大腸菌）の定量に用いることにより、飲料水や食品等の安全性評価手法として利用可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マイクロ流体工学装置による定量的PCR（MF-qPCR）法の原理。実際のMF-qPCR では、1 回のランで最大96 サンプル、96 ターゲットのqPCR（合計で9,216 反応/run）を行うことができる。
【図２】20 種類のTaqMan qPCR アッセイによる検量線。STA 反応後に作成した検量線（●）とSTA 反応なしで作成した検量線（○）をそれぞれのアッセイについて図示した．また、検量線の数式とr2 値を示した。
【図３】20 種類のTaqMan qPCR アッセイの特異性検証。病原体の純粋株からDNA を抽出し、TaqMan qPCR に供した。C-qPCR およびMF-qPCR では同じ結果が得られた。
【図４】糞便試料への適用。ヒト糞便に濃度既知の病原体を接種し、DNA 抽出後にMF-qPCR に供した。MF-qPCR による定量値はグレースケールで示した（色が明るいほうが定量値は大きい）。サンプル名のMix E6〜Mix E2 とは、10 種類の病原体（腸管出血性大腸菌（EHEC）O157、サルモネラ、カンピロバクター、ウェルシュ菌、レジオネラ、リステリア、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、およびプロセスコントロールNH8B 株）をすべて混合し、濃度106〜102 に希釈して接種したものである。
【図５】環境水試料への適用。湖沼水に腸管出血性大腸菌（EHEC）O157 とプロセスコントロールNH8B株を混合し，濃度107〜101 に希釈して接種した。MF-qPCR による定量値はグレースケールで示した（色が明るいほうが定量値は大きい）。
【図６】接種菌体量とMFq-PCR による定量値の関係。環境水試料に接種した病原体濃度をx 軸に、MF-qPCR による定量値をy 軸にとり、回帰直線をひいた。4 つの回帰直線は、eaeA（◇）、stx1（□）、stx2（△）、およびNH8B_3641（●）をターゲットとした定量結果に基づくものである。
【図７】qPCRプライマーを設計するために用いたヌクレオチド配列のアライメント。標的遺伝子の多様性をカバーするように配列を選択した。プライマーとプローブのアニーリングサイトを整列させたヌクレオチド配列上部に示す。
【図８】qPCRプライマーを設計するために用いたヌクレオチド配列のアライメント。
【図９】qPCRプライマーを設計するために用いたヌクレオチド配列のアライメント。
【図１０】qPCRプライマーを設計するために用いたヌクレオチド配列のアライメント。
【図１１】qPCRプライマーを設計するために用いたヌクレオチド配列のアライメント。
【図１２】qPCRプライマーを設計するために用いたヌクレオチド配列のアライメント。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、同一の反応条件のPCRで増幅可能な少なくとも５種の細菌遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーとプローブを試料から抽出したDNAと混合して、前記反応条件でPCRを行い、細菌遺伝子を検出及び/又は定量することを特徴とする、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量する方法を提供する。
【００２０】
PCRで標的とする遺伝子は、検出及び/又は定量の対象とする細菌に存在する遺伝子であって、同時に検出及び/又は定量する他の細菌の遺伝子を増幅するためのPCRの反応条件と同一の反応条件のPCRで増幅可能なものであればよい。標的遺伝子は、標的細菌に特異的に存在する遺伝子（例えば、サルモネラに特異的に存在するinvA）が望ましいが、普遍的に存在する遺伝子であっても標的細菌に特異的プライマーを設計できれば構わない。例えば、ftsZは大腸菌やサルモネラなどに共通して存在するが、配列多様性が高いため大腸菌に特異的なプライマーを設計できる。PCRの増幅産物の長さは、60〜150ヌクレオチド長であるとよく、プライマーの長さは、18〜27ヌクレオチド長であるとよく、プローブの長さは、8〜30ヌクレオチド長であるとよいが、これらに限定されるわけではない。PCRの反応条件としては、95℃で5〜30秒（DNA鎖の熱変性）、60℃で30〜60秒（プライマーのアニーリングおよびDNA伸張反応）を30〜40サイクルとするとよいが、これに限定されるわけではない。
【００２１】
試料としては、糞便、環境水、水道水、飲料水、上水、下水などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２２】
本発明の方法において、配列番号１〜３４のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてPCRを行い、非病原性大腸菌、病原性大腸菌、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、レジオネラ、ウェルシュ菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ菌及びコレラ菌からなる群より選択される少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量することができる。例えば、下記(1)〜(17)のプライマーペアからなる群より選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いてPCRを行うとよい。
(1) 配列番号１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ftsZ）
(2) 配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：uidA）
(3)配列番号５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：eaeA）
(4)配列番号７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：stx1）
(5)配列番号９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１０のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：stx2）
(6)配列番号１１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ipaH 7.8）
(7)配列番号１３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ipaH all）
(8)配列番号１５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：virA）
(9)配列番号１７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号１８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：invA）
(10)配列番号１９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２０６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ttrC）
(11)配列番号２１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：cadF）
(12)配列番号２３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：ciaB）
(13)配列番号２５のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２６のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：cpe）
(14)配列番号２７のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号２８のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：plc）
(15)配列番号２９のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３０のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：mip）
(16)配列番号３１のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３２のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：iap）
(17)配列番号３３のヌクレオチド配列からなるプライマーと配列番号３４のヌクレオチド配列からなるプライマーのペア（標的遺伝子：hlyA）
本発明の方法において、目的試料に濃度既知の内部標準となる細菌を添加して、DNA抽出とPCRを行い、内部標準細菌の検出と定量を行うことで、添加した内部標準細菌の回収率を判断することができる。後述の実施例では、内部標準細菌として、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株を用い、NH8B_3641を標的とするPCRを行った。PCRには、配列番号３５のヌクレオチド配列からなるプライマー（IAC_23F）と配列番号３６のヌクレオチド配列からなるプライマー（IAC_92R）のペアを用いた。図５および図６で示した実験では、環境水試料に既知濃度のPseudogulbenkiania sp. NH8B株と既知濃度の大腸菌O157:H7 Sakai株を同時に接種し、DNA抽出後に同時検出法で定量した。Pseudogulbenkiania sp. NH8B株はNH8B_3641を対象としたqPCR、大腸菌O157:H7 Sakai株はeaeA、stx1、stx2遺伝子を対象としたqPCRによって定量した。その結果、回収率はPseudogulbenkiania sp. NH8B株と大腸菌O157:H7 Sakai株でほぼ同じであった。このことより、大腸菌O157:H7を定量する際の内部標準（実施例では、プロセスコントロール）として、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株は適していると言える。さらに、大腸菌O157:H7とその他の腸管病原細菌は細胞構造が似ている（すなわち、DNA抽出効率がほぼ同じと考えられる）ので、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株は腸管病原細菌一般（サルモネラやカンピロバクターなど）の定量の際にも内部標準として使えると考えられる。NH8B_3641には、突然変異が入っており、類似の遺伝子と比較して極端に短い配列になっている。NH8B_3641と全く同じ配列の遺伝子は、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株以外には存在しないと考えられ、実際にデータベースで配列の検索を行ったところ、他の細菌にはヒットしなかった。したがって、NH8B_3641を対象とすることで、接種したPseudogulbenkiania sp. NH8B株のみを特異的に検出・定量することができると考えられる。内部標準として望ましい条件は以下の通りである。
(1) 目的試料（環境水、食品など）に存在しない。
(2) 対象微生物（例えば、病原細菌、糞便指標菌（大腸菌）など）の検出・定量に影響しない。
(3) 病原性を有さない。
(4) 培養が簡単で、試料への接種も容易に行える。
【００２３】
Pseudogulbenkiania sp. NH8B株は上記すべてを満たす。
【００２４】
本発明の方法において、同一条件で増幅可能な細菌遺伝子を標的とするPCRを行う前に、前記PCRに用いる全種類のプライマーペアを混合してPCRを行うことにより、DNAの前増幅を行うとよい。MF-qPCRでは10 nlのチャンバー内でqPCRを行う。qPCRマスターミックス等による希釈を考慮すると、目的遺伝子をMF-qPCRで検出及び定量するためには最低でも222コピー/μlのDNA試料が必要になる。環境試料中の病原微生物の濃度は低いことが多いので、この濃度を満たさない場合が想定される。STA反応と呼ばれる前増幅処理を行うと、目的遺伝子を特異的に増幅できるため、この問題が解決可能になる。STA反応は10〜14サイクルのマルチプレックスPCRである。STA反応のサイクル数を多くしすぎると定量性能に影響を与えうるが、14サイクルによるSTA反応は、その後のqPCRの定量性能に影響を与えない（実施例１参照）。14サイクルによるSTA反応により、試料中の目的遺伝子は約1,000〜15,000倍に増幅される。
【００２５】
定量的PCRには、Sybr Green法とTaqManプローブ法の２種類の方法がある。Sybr Green法は、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）を用いるので、標的遺伝子毎にプローブを用意する必要がなく、コストが安く、反応系の構築も容易であるが、検出感度と特異性は高くない。これに対して、TaqManプローブを用いる方法は、標的遺伝子毎に異なる蛍光標識プローブを用いるので、コストは高いが、検出感度と特異性が高くなる。本発明においては、TaqManプローブ法でPCRの定量を行うことが好ましい。TaqManプローブは、鋳型DNAに特異的にハイブリダイズするものであればよく、市販品として入手可能である。後述の実施例では、表２に記載の市販品（UPLプローブ：Roche）を用いた。また、UPLプローブがハイブリダイズする箇所を図７〜１２に示す。
【００２６】
本発明の方法において、標的遺伝子を組み込んだプラスミドを直鎖状にし、濃度を測定した後に段階希釈したもので検量線を予め作成しておき、この検量線を用いて、目的試料中の細菌の量又は濃度を求めるとよい。後述の実施例では、定量のため，ターゲット遺伝子を組み込んだプラスミド（ターゲット遺伝子１つにつき、１つのプラスミドに組み込んだ）を直鎖状にし，PicoGreen 比色法で濃度測定後に、プラスミド溶液をすべて混ぜて段階希釈し、検量線溶液とした。
【００２７】
本発明の方法をマイクロアレイやLOC上で実施することにより、短時間に大量の試料を分析することができる。
【００２８】
本発明の方法により、病原性細菌、糞便汚染指標菌などを同時検出及び／又は定量することができる。
【００２９】
また、本発明は、配列番号１〜３６のいずれかのヌクレオチド配列からなるプライマーを含む、少なくとも５種の細菌を同時検出及び/又は定量するためのキットを提供する。
【００３０】
本発明のキットには、さらに、内部標準となる菌体、内部標準となる菌体を培養するための培地及び抗生物質、内部標準となる菌体から抽出したDNA、DNA抽出試薬、蛍光標識プローブ、検量線作成のための材料（例えば、PCR産物をクローニングするためのベクター（例、プラスミド）及び宿主、プラスミド単離試薬、プラスミドを直鎖状にするための酵素、ゲル抽出試薬、DNA濃度測定試薬など）、バッファー、検量線、取扱い説明書、測定値から細菌量を換算するソフトウエア、などを含めてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
１-１．  実施例１では、表２に示す対象遺伝子を組み込んだプラスミドを混合して通常のPCR 装置で検出及び定量した例を示す。試薬の調整はコンタミネーション（外部からのDNAの混入）を防止するため、HEPA/UV PCRワークステーション（UVP）内で行った。
１-２．  表２に示すそれぞれの対象遺伝子について、フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてPCRを行った。PCR反応液は表３のように調整し、PCR反応は以下のプログラムで行った：95℃（10分）、30サイクル（95℃（30秒）、60℃（30秒）、72℃（30秒））。PCR反応の鋳型には、表１において太字で示した菌株を用いた。
１-３．  PCR産物をpCR 2.1-TOPO vector (Invitrogen)に組み込み、大腸菌DH5αにエレクトロポレーション法で導入した。この操作はpCR 2.1-TOPO vectorの製品マニュアルに従った。導入したプラスミドを大腸菌DH5α内で増幅し、GeneJET Plasmid Mini Kit (Fermentas)を用いて抽出した。抽出したプラスミドをBam HI（Takara Bio）で切断し、直鎖状にした後、FastGene Gel/PCR Extraction Kitを用いて精製した。
１-４．  精製後の直鎖状プラスミドの濃度は、PicoGreen dsDNA quantification reagent（Molecular Probes）を用いて定量し、108コピー/μlとなるよう希釈した。それぞれの対象遺伝子についてプラスミドを作成するので、20種類のプラスミド溶液（濃度は108コピー/μl）が作成される。
１-５．  20種類のプラスミド溶液を2 μlずつとり、60 μlのPCRグレード水（Ambion）と混合した。この操作により、各プラスミドの濃度2×106コピー/μlの混合液が作成される。これを2E6スタンダードと呼ぶ。2E6スタンダードを段階的に希釈し、各プラスミドの濃度が2×105コピー/μl、2×104コピー/μl、2×103コピー/μl、2×102コピー/μl、20コピー/μlおよび2コピー/μlの混合液を作成した。それぞれ2E5スタンダード、2E4スタンダード、2E3スタンダード、2E2スタンダード、2E1スタンダードおよび2E0スタンダードと呼ぶ。
１-６．  表２に示すそれぞれの対象遺伝子について、フォワードプライマーとリバースプライマーの濃度がそれぞれ20 μMとなるように混合した（表４参照）。これをプライマーペアミックスと呼ぶ。以上の操作により、20種のプライマーペアミックスが作成される。
１-７．  STA反応を行うため、20種のプライマーペアミックスを等量で混合し、各プライマー濃度が0.2 μMとなるように調整した（表５参照）。これをSTAプライマー混合液と呼ぶ。
１-８．  STA反応はSTAプライマー混合液を用いた14サイクルのマルチプレックスPCRである。STA反応液は、表６のように容量10 μlで調整し、ABI 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて反応を行った。STA反応は、以下のプログラムで行った：95℃（10分）、14サイクル（95℃（15秒）、60℃（4分））。
１-９．  通常のqPCR反応（C-qPCR）は、表７のように容量20 μlで調整し、ABI 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて行った。鋳型DNAとして、STA反応前の2E0〜2E6スタンダードおよびSTA反応後の2E0〜2E6スタンダードをTEバッファ（10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 8.0）で60倍希釈したものを用いた。
１-１０．C-qPCR反応は、以下のプログラムで行った：95℃（10分）、40サイクル（95℃（10秒）、60℃（1分））。各サイクルにおいて、60℃で蛍光強度（FAMおよびROX）の読み取りを行った。FAMはTaqManプローブが分解されることによって生じる蛍光であるため、PCR産物が増幅されるにつれて蛍光強度は増加する。ROXはqPCRマスターミックスに含まれているリファレンス色素であり、FAM蛍光強度の補正に用いた。
１-１１．蛍光強度の閾値に達したときのサイクル数（Threshold cycle; Ct）を、ABI Prism 7000 SDS Software（Applied Biosystems）を用いて求めた。Ct値をx軸に、鋳型DNAに含まれるDNAコピー数（STA反応を行った場合はSTA反応前のDNAコピー数）をy軸にプロットし、回帰直線を引くことによって検量線を作成した。それぞれの遺伝子に対してSTA反応前の2E0〜2E6スタンダードおよびSTA反応後の2E0〜2E6スタンダードを60倍希釈したものから得られた2本の検量線を図３に示す。qPCRの増幅効率（E）は、検量線の傾き（S）と次式から求め、パーセント（％）で示した。
E = 10(-1/S)-1
１-１２．それぞれのqPCRアッセイは高い増幅効率(90〜110%)と広い増幅レンジ(2〜2×106 copies/μL)を持っていた（図２）。検量線の傾きはSTA 反応の有無によらず同様であり、STA 反応の有無によらず増幅レンジに大きな差がなかったことから、STA 反応はqPCR の定量性能に影響を与えないと判断した。
１-１３．STA 反応を行った検量線ほうが小さいCt 値（図２のy 軸）をとったことから、検出感度が高まっていることがわかった。Ct値の差は4〜8であったので、STA反応後の希釈（60倍希釈）を考慮すると、鋳型DNAの量は960〜15,360倍（ほぼ210〜214倍）に増えている計算になる。STA反応は14サイクルのマルチプレックスPCRなので、理論的には遺伝子コピー数は214倍に増えるはずである。以上より、増幅倍率は対象遺伝子によって異なるが、STA反応は低濃度のDNAコピー数を増幅するのに適していると判断できる。
【００３２】
〔実施例２〕
２-１．  実施例２では、表１に示す菌株をC-qPCR法およびMF-qPCR法により同時検出した例を示す。試薬の調整はコンタミネーション（外部からのDNAの混入）を防止するため、HEPA/UV PCRワークステーション（UVP）内で行った。
２-２．  表１に示す菌株からDNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)を用いてDNAを抽出した。
２-３．  実施例１で作成した2E1〜2E6スタンダードを定量のための検量線試料として用いた。
２-４．  C-qPCRは実施例１と同様の定量操作（１-９〜１-１１）を行った。
２-５．  これ以降はMF-qPCRの操作を示す。２-２および２-３で示したDNA試料を用いて、実施例１（１-６〜１-８）と同様にSTA反応を行った。STA反応産物はTEバッファで6倍に希釈した。
２-６．  6倍希釈したSTA反応産物を用いてサンプルプレミックス（表８）を作成した。
２-７．  表２に示すそれぞれの対象遺伝子について、10Xアッセイ（表９）を作成した。プローブは表２に示すUPLプローブ（Roche）もしくはFAMおよびMGB/NFQで修飾された配列番号４１または配列番号４２（表３）に示すプローブを用いた。
２-８．  Dynamic Array 48.48チップ（Fluidigm）の個別包装を開封し、Control line fluid（Fluidigm）をチップの所定の箇所に注いだのち、IFC Controller MX (Fluidigm)に挿入した。Prime (113x)プログラムにより、Dynamic Array 48.48チップの初期化を行った。
２-９．  初期化後のDynamic Array 48.48チップに２-６で作成したサンプルプレミックスおよび２-７で作成した10Xアッセイをそれぞれ5 μlずつ所定のウェルに注入した。Dynamic Array 48.48チップをIFC Controller MXに挿入し、Load Mix (113x)プログラムにより、反応液を微細流路およびチャンバーへの注入し混合した。
２-１０．Load Mix (113x)終了後、Dynamic Array 48.48チップをBioMark HD Reader (Fluidigm)に挿入し、qPCR反応を開始した。反応プログラムは以下のとおりである：50℃（2分）、95℃（10分）、40サイクル（95℃（15秒）、70℃（5秒）、60℃（1分））。各サイクルにおいて、60℃で蛍光強度（FAMおよびROX）の読み取りを行った。FAMはTaqManプローブが分解されることによって生じる蛍光であるため、PCR産物が増幅されるにつれて蛍光強度は増加する。ROXはqPCRマスターミックスに含まれているリファレンス色素であり、FAM蛍光強度の補正に用いた。
２-１１．蛍光強度の閾値に達したときのサイクル数（Threshold cycle; Ct）を、Real-Time PCR Analysis software version 3.0.2（Fluidigm）を用いて求めた。検量線試料について、Ct値をx軸に、STA反応前のDNAコピー数をy軸にプロットし、回帰直線を引くことによって検量線を作成した。検量線を用いて、濃度未知試料のDNAコピー数を求めた。
２-１２．純粋株を用いた特異性検証の結果、対象遺伝子を保有する病原細菌9 種（病原性大腸菌、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、レジオネラ、ウェルシュ菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ菌、コレラ菌）、一般大腸菌1 種、プロセスコントロールNH8B 株を特異的に検出することができた（図３）。C-qPCR法とMF-qPCR法からは同一の結果を得ることができた。
２-１３．病原性大腸菌にはeaeAを保有する腸管病原性大腸菌（Enteropathogenic E. coli; EPEC）、stx1またはstx2を保有する志賀毒素生産性大腸菌（Shiga-toxin producing E. coli; STEC）、eaeAおよびstx1またはstx2を保有する腸管出血性大腸菌（Enterohemorrhagic E. coli; EHEC）などが存在するが、本手法によりそれらを識別することができた。
２-１４．赤痢菌は系統分類学的には大腸菌の一種と考えられているので、大腸菌を対象とした遺伝子（ftsZおよびuidA）が検出されることは間違いではない。
２-１５．リステリア4c血清型JCM7679株 についてはターゲット遺伝子（iap、hlyA）が増幅されなかったが、それ以外のリステリア株からはそれぞれのターゲット遺伝子が検出された。ヒト患者から単離されるリステリアのほとんどは血清型1/2a、1/2b、および4bであり4c血清型の単離例は希であるため、リステリア4c血清型JCM7679株が本手法で検出されなかったことは、診断目的および公衆衛生目的の使用として大きな影響はないと予想される。
【００３３】
〔実施例３〕
３-１．  実施例３では、健常者のヒト糞便に大腸菌O157株、赤痢菌、サルモネラ、カンピロバクター、ウェルシュ菌、レジオネラ、リステリア、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、およびプロセスコントロールNH8B 株を接種し、MF-qPCR法により同時検出した例を示す。試薬の調整はコンタミネーション（外部からのDNAの混入）を防止するため、HEPA/UV PCRワークステーション（UVP）内で行った。
３-２．  6人の健常者から糞便を採取し、大腸菌O157 Sakai株、赤痢菌RIMD 0509763株、サルモネラJCM 1652株、カンピロバクタージェジュニJCM 2013株、ウェルシュ菌 JCM 1290株、レジオネラJCM 7571株、リステリアJCM 7671株、コレラ菌RIMD 2203246株、腸炎ビブリオ菌RIMD  2210633株、およびプロセスコントロールPsuedogulbenkiania sp. NH8B 株を単独あるいは全種混合して接種した。単独接種の場合は107 cells/200 mg糞便、混合接種の場合は102〜106 cells/200 mg糞便となるように接種菌体濃度を調整した。
３-３．  QIAamp DNA Stool minikit (QIAGEN)を用いて３-２で調整した糞便試料からDNAを抽出した。
３-４．  実施例１で作成した2E1〜2E6スタンダードを定量のための検量線試料として用いた。
３-５．  ３-３および３-４で示したDNA試料を用いて、実施例１（１-６〜１-８）と同様にSTA反応を行った。STA反応産物はTEバッファで6倍に希釈した。
３-６．  実施例２（２-６〜２-７）と同様にサンプルプレミックスおよび10Xアッセイを作成した。
３-７．  Dynamic Array 96.96チップ（Fluidigm）の個別包装を開封し、Control line fluid（Fluidigm）をチップの所定の箇所に注いだのち、IFC Controller HX (Fluidigm)に挿入した。Prime (136x)プログラムにより、Dynamic Array 96.96チップの初期化を行った。
３-８．  初期化後のDynamic Array 96.96チップに３-６で作成したサンプルプレミックスおよび10Xアッセイをそれぞれ5 μlずつ所定のウェルに注入した。Dynamic Array 96.96チップをIFC Controller HXに挿入し、Load Mix (136x)プログラムにより、反応液を微細流路およびチャンバーへの注入し混合した。
３-９．  Load Mix (136x)終了後、Dynamic Array 96.96チップをBioMark HD Reader (Fluidigm)に挿入し、qPCR反応を開始した。反応プログラムは実施例２（２-１０）と同様である。
３-１０．実施例２（２-１１）と同様に、得られたqPCR結果を解析し、濃度未知試料のDNAコピー数を求めた。
３-１１．定量結果を図４に示す。MF-qPCR による定量値はグレースケールで示した（色が明るいほうが定量値は大きい）。サンプル名のMix E6〜Mix E2 とは、10 種類の細菌株ををすべて混合し、濃度106〜102 に希釈して接種したものである。
３-１２．ヒト糞便に接種した病原細菌を特異的に検出することができた。ただし、大腸菌はヒト腸内の常在細菌であるためであるため、大腸菌非接種のヒト糞便試料からも大腸菌を対象とする遺伝子（ftsZ及びuidA）が検出されている（図４）。
３-１３．細菌を段階希釈して接種したヒト糞便試料からは、接種濃度に応じて検出される遺伝子コピー数も減少したことから、MF-qPCRは目的細菌の検出だけでなく定量も可能であると考えられる。以上より、ヒト糞便のように夾雑細菌が多数存在する環境試料からも、目的細菌を特異的に検出及び定量することが可能であると示された。
【００３４】
〔実施例４〕
４-１．  実施例４では、湖沼水に大腸菌O157株およびプロセスコントロールNH8B 株を混合接種し、MF-qPCR法により同時検出及び定量した例を示す。試薬の調整はコンタミネーション（外部からのDNAの混入）を防止するため、HEPA/UV PCRワークステーション（UVP）内で行った。
４-２．  北海道大学構内の大野池の水を40リットル採取した。採取日（2012年11月9日）の水質は以下のとおりである：10℃、pH 5.7、電気伝導度 11.5 S/m、懸濁物質 9.0 mg/l、全窒素 0.273 mg/l、全リン 0.364 mg/l。
４-３．  環境水5リットルに対して、大腸菌O157 Sakai株およびPseudogulbenkiania sp. NH8B株を、それぞれの濃度が101〜107 cells/lとなるように接種した。
４-４．  環境水を加圧濾過することにより、菌体を孔径0.20 μmのポリエーテルスルホン膜（Millipore）上に捕集した。捕集後の膜をカッターナイフで四等分し50 ml容の遠心管に入れ、25 mlの0.1%ゼラチン入りPBS（pH 7.2）中で激しく振盪することによって、膜から菌体を分離した。その後10,000×gで15分遠心して菌体をペレット状にした。
４-５．  PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories）を用いて、菌体ペレットからDNAを抽出した。
４-６．  実施例１で作成した2E1〜2E6スタンダードを定量のための検量線試料として用いた。
４-７．  ４-５および４-６で示したDNA試料を用いて、実施例１（１-６〜１-８）と同様にSTA反応を行った。STA反応産物はTEバッファで6倍に希釈した。
４-８．  実施例３（３-６〜３-１０）と同様にMF-qPCRによる目的細菌の同時検出及び定量を行った。
４-９．  定量結果を図５に示す。MF-qPCR による定量値はグレースケールで示した（色が明るいほうが定量値は大きい）。サンプル名のMix E6〜Mix E2 とは、10 種類の細菌株ををすべて混合し、濃度106〜102 に希釈して接種したものである。実施例３と同様に、接種菌株のみを特異的に検出することができた。
４-１０．大野池にはカモが多数飛来するため、この池の水はカモ由来の糞便によって汚染されている可能性がある。したがって、大腸菌低濃度接種試料及び大腸菌非接種の環境水試料からも大腸菌を対象とする遺伝子（ftsZ及びuidA）が検出されているのは、カモ腸内の常在細菌である大腸菌に由来するものであると考えられる。
４-１１．実施例３と同様に細菌を段階希釈して接種した環境水試料からは、接種濃度に応じて検出される遺伝子コピー数も減少したことから、MF-qPCRは目的細菌の検出だけでなく定量も可能であると考えられる。この関係をより明確に表したものが図６である。大腸菌O157 Sakai株の定量値（eaeA、stx1、stx2）およびPseudogulbenkiania sp. NH8B株の定量値（NH8B_3641）は、接種菌体濃度と傾き1の正の相関を示した（r2>0.97）ことから、MF-qPCRによる定量値は環境水中に存在する細菌数を反映していると判断できる。
４-１２．また、MF-qPCRによって得られた定量値（cells/l）と接種菌体量（cells/l）を比較して求めた菌体の回収率は、大腸菌O157 Sakai株とPseudogulbenkiania sp. NH8B株でそれぞれ27.4 ± 5.0％および22.6 ± 3.1％と似たような値となった。このことより、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株は大腸菌O157を定量する際の内部標準（プロセスコントロール）に適していると言える。すなわち、既知濃度のPseudogulbenkiania sp. NH8B株を環境試料に接種し、DNA抽出及びMF-qPCRによる定量を行うことによってNH8B株の回収率を得る。大腸菌O157の回収率はNH8B株の回収率と同様であることから、MF-qPCRの定量値とNH8Bの回収率から、環境試料中の大腸菌O157濃度を求めることができる。回収率を考慮することによって、DNA抽出におけるDNAの損失やqPCR時の反応阻害を補正することができるため、より正確な濃度の計算が可能になる。
４-１３．大腸菌O157:H7とその他の腸管病原細菌は細胞構造が似ている（すなわち、DNA抽出効率がほぼ同じと考えられる）ので、Pseudogulbenkiania sp. NH8B株は腸管病原細菌一般（サルモネラやカンピロバクターなど）の定量の際にも内部標準として使えると考えられる。
本実施例で用いた菌株を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2015039320.tif 000003
【００３６】
本実施例で用いたqPCRプライマーとプローブを表２に示す。なお、Vibrio choleraeのctxA遺伝子を標的とするプライマーとしては、forward primer (5′-TTTGTTAGGCACGATGATGGAT-3′)（配列番号３７） 及びreverse primer (5′-ACCAGACAATATAGTTTGACCCACTAAG-3′)（配列番号３８）を用いた（84 base pair amplicon within the ctxA gene）。プローブとしては、ctxA 遺伝子内の配列、5’-TGTTTCCACCTCAATTAGTTTGAGAAGTGCCC-3’（配列番号４１）の5′末端をFAMで標識し、3′末端をNon-fluorescence Quencher (NFQ) およびMinor Grove Binder（MGB）で標識したものを用いた。また、Vibrio parahaemolyticusのtdh遺伝子を標的とするプライマーとしては、forward primer: 5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′（配列番号３９）及びreverse primer: 5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′（配列番号４０）を用いた（75 base pair amplicon）。プローブとしては、5′-TGT CCC TTT TCC TGC CCC CGG-3′（配列番号４２）の5′末端をFAMで標識し、3′末端をNon-fluorescence Quencher (NFQ) およびMinor Grove Binder（MGB）で標識したものを用いた。
【００３７】
【表２】
2015039320.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法は、病原体特定のための迅速な診断ツールとして、および正確なリスク評価手法として応用可能であると期待される。また、糞便指標菌（大腸菌）の定量に用いることにより、飲料水や食品等の安全性評価手法として利用可能であると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号と配列を以下の表にまとめる。
【００４０】
【表３】
2015039320.tif 000005
【００４１】
【表４】
2015039320.tif 000006
【００４２】
【表５】
2015039320.tif 000007
【００４３】
【表６】
2015039320.tif 000008
【００４４】
【表７】
2015039320.tif 000009
【００４５】
【表８】
2015039320.tif 000010
【００４６】
【表９】
2015039320.tif 000011
【図６】
2015039320.tif 000012
【図１】
2015039320.tif 000013
【図２】
2015039320.tif 000014
【図３】
2015039320.tif 000015
【図４】
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【図５】
2015039320.tif 000017
【図７】
2015039320.tif 000018
【図８】
2015039320.tif 000019
【図９】
2015039320.tif 000020
【図１０】
2015039320.tif 000021
【図１１】
2015039320.tif 000022
【図１２】
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【配列表】
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