(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、直接人体の皮膚で分析可能であり、皮膚に浸透した成分の量と分布を評価できる分析方法を提供する。【解決手段】皮膚に浸透した皮膚外用剤の成分を分析する方法であって、皮膚外用剤を皮膚に塗布する工程と、皮膚外用剤が塗布された該皮膚の領域から粘着テープを用いて複数層の角質を剥離する工程と、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析法）を用いて、該角質が付着した粘着テープから生成したイオンを質量分析する工程とを有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に浸透した皮膚外用剤の成分を分析する方法であって、
皮膚外用剤を皮膚に塗布する工程と、
皮膚外用剤が塗布された該皮膚の領域から粘着テープを用いて複数層の角質を剥離する工程と、
ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて、該角質が付着した粘着テープから生成したイオンを質量分析する工程とを有することを特徴とする分析方法。
【請求項２】
角質が付着した粘着テープから生成したイオンが、皮膚に塗布した皮膚外用剤の成分、角質細胞及びテープから選ばれた１種類以上のイオンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
角質が付着した粘着テープから生成したイオンの分布を平面上にマッピングする工程を含む請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚に浸透した成分の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚外用剤を開発する上で、成分の経皮吸収性を評価する技術は、外用剤の薬理効果や安全性を確認するために必要である。皮膚は、表皮の角質層において角質細胞と細胞間脂質によるモルタル様の構造体を形成し、外部環境からの異物の侵入を防いでいる。したがって、物質の経皮吸収性の評価には、バリア機能を有する角質層における物質の透過速度と透過経路を正確に測定することが重要である。
【０００３】
従来、経皮吸収性を評価する場合、フランツセルを用いた経皮吸収モデルを使用する方法、ラジオアイソトープを用いた方法が用いられてきたが、いずれも間接的な方法であったり、動物を対象とする方法であるため、人体の経皮吸収性を正確に評価するためには問題があった。また、人体で試験を行う方法としては、テープストリップ法により剥離した角層中の化合物の濃度をＨＰＬＣや質量分析装置を用いて定量する方法が知られている（特許文献１及び２）。しかしながら、テープストリップ法により剥離した角層から化合物を溶媒抽出したり、加熱分解する必要があり、迅速に定量できない問題があった。さらに、これらの方法では、角質層中に浸透した成分の量はわかるが、角質層中の成分の分布はわからないため、成分の経皮吸収経路を評価するには不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２４３６３６
【特許文献２】特開２０１３−１５５１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、直接人体の皮膚で分析可能であり、皮膚に浸透した成分の量と分布を評価できる分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、この課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、皮膚から粘着テープにより採取した試料における浸透した成分に由来するイオンの量と分布をＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて測定することにより、皮膚に塗布した成分の経皮吸収性を分析できることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、皮膚に浸透した皮膚外用剤の成分を分析する方法であって、皮膚外用剤を皮膚に塗布する工程と、皮膚外用剤が塗布された該皮膚の領域から粘着テープを用いて複数層の角質を剥離する工程と、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて、該角質が付着した粘着テープから生成したイオンを質量分析する工程とを有する。
【０００８】
本発明の分析方法は、皮膚に浸透した皮膚外用剤の成分を分析する方法であって、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて、角質が付着した粘着テープに含まれる皮膚外用剤の成分、角質細胞、及びテープから生成したイオンを質量分析する工程を有する。
【０００９】
本発明の分析方法は、皮膚に浸透した皮膚外用剤の成分を分析する方法であって、皮膚外用剤の成分、角質細胞、及びテープから生成したイオンの分布を平面上にマッピングする工程を有する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、直接人体の皮膚で分析可能であり、皮膚に浸透した成分の量と分布を評価できる分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】リン酸アスコルビルマグネシウムを含まない製剤を塗布した皮膚の角質１層目を剥離したテープにおけるＴＯＦ−ＳＩＭＳマッピング画像を表す。
【図２】リン酸アスコルビルマグネシウム１％水溶液を塗布した皮膚の角質４層目を剥離したテープにおけるＴＯＦ−ＳＩＭＳマッピング画像を表す。
【図３】リン酸アスコルビルマグネシウム１％水溶液を塗布した皮膚の角質２〜７層目を剥離したテープにおけるリン酸アスコルビルマグネシウムの相対イオン強度ＩＡ／ＩＳの変化を示した図である。
【図４】トコフェリルリン酸ナトリウムを含まない製剤を塗布した皮膚の角質３層目を剥離したテープにおけるＴＯＦ−ＳＩＭＳマッピング画像を表す。
【図５】トコフェリルリン酸ナトリウム０．５％水溶液を塗布した皮膚の角質３層目を剥離したテープにおけるＴＯＦ−ＳＩＭＳマッピング画像を表す。
【図６】トコフェリルリン酸ナトリウム０．５％水溶液を塗布した皮膚の角質２〜７層目を剥離したテープにおけるトコフェリルリン酸ナトリウムの相対イオン強度ＩＡ／ＩＳの変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の分析方法は、皮膚に浸透した皮膚外用剤の成分を分析する方法であって、皮膚外用剤を皮膚に塗布する工程と、皮膚外用剤が塗布された該皮膚の領域から粘着テープを用いて複数層の角質を剥離する工程と、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いて、該角質が付着した粘着テープから生成したイオンを質量分析する工程を有する。
【００１３】
本発明における皮膚外用剤は、特に限定されないが、クリーム、ローション、ゲル剤、軟膏、ペースト剤、スプレー剤、貼付剤等皮膚に適用されるものが挙げられる。皮膚外用剤には、浸透性を評価するための成分が含まれる。皮膚への塗布方法は、特に限定されず、塗布面積、塗布量や塗布時間、塗布回数を自由に選択できる。
【００１４】
浸透性を評価する成分は、無機物、有機物いずれでもよい。浸透性を評価する成分の皮膚外用剤に含まれる濃度や数は、特に限定されない。ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより得られるスペクトル結果より、評価する成分に特異的な指標イオンを有することが好ましい。浸透性を評価する成分に特異的な指標イオンを選択することで、同時に複数の成分の浸透性を評価することができる。
【００１５】
本発明における粘着テープは、特に限定されないが、メンディングテープ、セロハンテープ、ビニールテープ、クラフトテープ、サージカルテープ、布粘着テープ、アルミテープ、カーボンテープなどが挙げられる。好ましくは、メンディングテープが、可塑剤や高分子樹脂由来の夾雑ピークが少ないので、良い。粘着テープの大きさは特に限定されないが、１ｃｍ×１ｃｍの正方形又は直径１ｃｍの円形が好ましい。粘着テープによる角質の剥離は、粘着テープを採取皮膚部位に張り、一定の圧力を加えた後、粘着テープを剥がして行う。同一部位からの採取回数を増やすことで、複数層の角質を剥離することができ、皮膚の深さ方向の変化を分析することができる。採取回数は特に限定されないが、２回以上が好ましく、２０回以上では角質層がなくなり、痛みを伴うため、避けた方がよい。
【００１６】
本発明におけるＴＯＦ−ＳＩＭＳは、飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）である。ＴＯＦ−ＳＩＭＳは、固体表面に一次イオンを照射することによって放出された二次イオンを、飛行時間型の質量分析器を用いて分析し、得られるスペクトルより試料表面の構造解析を行う手法である。固体表面上の分子や原子の分布を観察し、分布状況を可視化することができる。飛行時間型であることから、多種多様なイオンを同時に分析することが可能である。またイオンはポジティブ、ネガティブ共に検出することが可能であり、評価する成分に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳの測定方法は、特に限定されず、最適な分析ができるように適宜調整することができる。使用する一次イオンは、セシウム、金、ガリウム、マンガン、ビスマス、アルゴン、酸素が挙げられ、好ましくは金である。一次イオンの加速電圧、ビーム径、パルス幅は分析の用途に応じて適宜調整することが可能であり、好ましくは加速電圧１５ｋＶ〜２５ｋＶ、ビーム径１００ｎｍ〜１μｍ、パルス幅１ｎｓ〜２０ｎｓである。
【００１８】
本発明における試料の前処理はほとんど必要なく、そのままＴＯＦ−ＳＩＭＳ解析に供することができる。また、時間をおいて測定する場合は、試料を冷凍して保管すれば、保管中の試料中の成分の分解や飛散、移動などを防ぐことができる。特に試料表面の汚染を防ぐためには、よく洗浄したガラス器具あるいはアルミ箔を用いて保管することが望ましい。
【００１９】
本発明の角質が付着した粘着テープから生成したイオンを質量分析する工程では、角質を剥離した粘着テープから生成した皮膚外用剤の成分、角質細胞、及びテープの指標イオンの強度を測定することができる。角質を剥離した粘着テープから生成した皮膚外用剤の成分の指標イオン強度から、テープに付着した成分の場所と面積を評価できる。角質を剥離した粘着テープから生成した角質細胞の指標イオン強度から、テープに付着した角質細胞の場所と面積を評価できる。角質を剥離した粘着テープから生成したテープの指標イオン強度から、角質細胞が付着していないテープの場所と面積を評価できる。皮膚外用剤の成分、角質細胞、及びテープの指標イオンの強度いずれも単独又は組み合わせて解析に用いることができる。好ましくは、角質を剥離した粘着テープにおける一定面積当たりの成分の指標イオン強度の総和を用いると、粘着テープを使用した角質層における浸透した成分の量が算出できるので、良い。さらに好ましくは、角質細胞の指標イオン強度に対する成分の指標イオン強度の比率を算出することで、皮膚より剥離された角質細胞あたりに存在する成分の量が算出できるので、良い。
【００２０】
角質を剥離した複数の粘着テープにおける成分の指標イオン強度を比較することにより、浸透した成分の量を比較することができる。同一部位からの採取回数を増やして、角質を剥離した粘着テープにおける成分の指標イオン強度を測定することにより、浸透した成分の皮膚の深さ方向の変化を分析することができる。
【００２１】
本発明の分析方法は、皮膚外用剤の成分、角質細胞、及びテープから生成したイオンの分布を平面上にマッピングする工程を有する。マッピングに使用するイオンは、皮膚外用剤の成分、角質細胞、及びテープから生成したイオンから選択できる。好ましくは、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより得られたスペクトル結果より、皮膚外用剤の成分、角質細胞及びテープそれぞれに特異的な指標イオンを選択すると良い。指標イオンの質量数、電荷及び数は特に限定されない。測定する視野の大きさは特に限定されないが、５０μｍ四方〜１ｍｍ四方が好ましく、２００μｍ四方〜４００μｍ四方がより好ましい。画像の画素数は自由に設定することができるが、１２８ｐｉｘｅｌ四方〜１０２４ｐｉｘｅｌ四方が好ましい。測定時間は数分〜数時間の範囲で可能であり、各指標イオンの検出状況を確認しながら適宜調整することができる。
【００２２】
マッピングは、皮膚外用剤の成分、角質細胞及びテープそれぞれの指標イオンが検出された場所にマーカーを印字することにより行う。マーカーの大きさ、種類、色及び数は特に限定されず、検出感度に合わせて適宜選択できる。マーカーの大きさが小さいほど、解像度が高くなり、好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１  リン酸アスコルビルマグネシウムの浸透性評価  
（試料の塗布及び角質細胞の剥離）
被験者の前腕内側部２．５ｃｍ×３．５ｃｍに１％リン酸アスコルビルマグネシウムを含む水溶液２ｍＬを含浸させたコットンを貼付し、５分間静置した。コットンを取り除いた後、新しいコットンで皮膚表面に残った試料を取り除き、５分間静置した。その後、塗布部位よりメンディングテープ（住友３Ｍ）を用いて、連続７回テープストリップをして、角質細胞を剥離し、得られたテープを標本とした。コントロールは、隣接部位にリン酸アスコルビルマグネシウムを含まない製剤を用いて同じ実験を行った。
【００２５】
（角質細胞の分析）
７層分の角質細胞を剥離した７枚の粘着テープを標本とし、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより分析を行った。検出条件を以下に示す。
（１）装置：ＴＲＩＦＴ−ＩＩＩ（アルバックファイ社製）
（２）測定条件：
高分解能イメージングモード
１次イオン  １９７Ａｕ１＋  ：２２ｋＶ（ｃｕｒｒｅｎｔ：１．２ｎＡ、Ｐｕｌｓｅ  ｗｉｄｔｈ  １１ｎｓ）
検出：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：３００×３００μｍ２、２５６×２５６ｐｉｘｅｌ、２０分積算
【００２６】
粘着テープの指標イオンをｍ／ｚ＝７、角質細胞の指標イオンをｍ／ｚ＝３６８、リン酸アスコルビルマグネシウムの指標イオンをｍ／ｚ＝２４とし、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより検出された場所をそれぞれマッピングした。また、各粘着テープの測定視野におけるリン酸アスコルビルマグネシウムの指標イオン強度の総和（ＩＡ）と角質細胞の指標イオン強度の総和（ＩＳ）を算出し、リン酸アスコルビルマグネシウムの相対イオン強度ＩＡ／ＩＳを算出した。
【００２７】
結果を図１〜３に示す。図１は、コントロールの３層目の角質を剥離したテープのマッピング画像を示す。粘着テープの領域を灰色、角質細胞部分を白色、リン酸アスコルビルマグネシウム指標イオンは黒色の点で示した。この結果から、粘着テープと角質細胞が存在する部分が明確に分離されていることがわかる。リン酸アスコルビルマグネシウム指標イオンはベースラインノイズとしては検出されているが、少量しか存在せず、かつテープおよび角質細胞の両領域から同程度に検出されていることがわかる。図２は、リン酸アスコルビルマグネシウム１％水溶液を塗布し３層目の角質を剥離したテープのマッピング画像を示す。粘着テープの領域を灰色、角質細胞部分を白色、リン酸アスコルビルマグネシウム指標イオンは黒色の点で示した。リン酸アスコルビルマグネシウムと粘着テープ、角質細胞が存在する部分が明確に分離されている。このようにマッピングすることで、皮膚に浸透したリン酸アスコルビルマグネシウムの場所を明確に示すことができる。図３は、リン酸アスコルビルマグネシウム１％水溶液を塗布した２〜７層目までの角質を剥離したテープのリン酸アスコルビルマグネシウムの相対イオン強度ＩＡ／ＩＳの変化を示した図である。図３から、リン酸アスコルビルマグネシウムの皮膚浸透量の角質の深さ方向の変化を見ることができる。
【００２８】
実施例２  トコフェリルリン酸ナトリウムの浸透性評価  
（試料の塗布及び角質細胞の剥離）
被験者の前腕内側部２．５ｃｍ×３．５ｃｍに０．５％トコフェリルリン酸ナトリウムを含む水溶液２ｍＬを含浸させたコットンを貼付し、５分間静置した。コットンを取り除いた後、新しいコットンで皮膚表面に残った試料を取り除き、６０分間静置した。その後、塗布部位よりメンディングテープ（住友３Ｍ）を用いて、連続７回テープストリップをして、角質細胞を剥離し、得られたテープを標本とした。コントロールは、隣接部位にトコフェリルリン酸ナトリウムを含まない製剤を用いて同じ実験を行った。
【００２９】
（角質細胞の分析）
７層分の角質細胞を剥離した７枚の粘着テープを標本とし、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより分析を行った。検出条件を以下に示す。
（１）装置：ＴＲＩＦＴ−ＩＩＩ（アルバックファイ社製）
（２）測定条件：
高分解能イメージングモード
１次イオン  １９７Ａｕ１＋  ：２２ｋＶ（ｃｕｒｒｅｎｔ：１．２ｎＡ、Ｐｕｌｓｅ  ｗｉｄｔｈ  １１ｎｓ）
検出：Ｎｅｇａｔｉｖｅ
測定範囲：３００×３００μｍ２、２５６×２５６ｐｉｘｅｌ、２０分積算
【００３０】
粘着テープの指標イオンをｍ／ｚ＝３２５、角質細胞の指標イオンをｍ／ｚ＝３６７、トコフェリルリン酸ナトリウムの指標イオンをｍ／ｚ＝７９とし、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより検出された場所をそれぞれマッピングした。また、各粘着テープの測定視野におけるトコフェリルリン酸ナトリウムの指標イオン強度の総和（ＩＡ）と角質細胞の指標イオン強度の総和（ＩＳ）を算出し、トコフェリルリン酸ナトリウムの相対イオン強度ＩＡ／ＩＳを算出した。
【００３１】
結果を図４〜６に示す。図４は、コントロールの３層目の角質を剥離したテープのマッピング画像を示す。粘着テープを灰色、角質細胞部分を白色、トコフェリルリン酸ナトリウム指標イオンは黒色の点で示した。この結果から、粘着テープと角質細胞が存在する部分が明確に分離されていることがわかる。トコフェリルリン酸ナトリウム指標イオンはベースラインノイズとしてテープ・角質を問わずに均等に検出され、その量も少ないことがわかる。図５は、トコフェリルリン酸ナトリウム０．５％水溶液を塗布した３層目の角質を剥離したテープのマッピング画像を示す。粘着テープを灰色、角質細胞部分を白色、トコフェリルリン酸ナトリウム指標イオンは黒色の点で示した。トコフェリルリン酸ナトリウムと粘着テープ、角質細胞が存在する部分が明確に分離されている。このようにマッピングすることで、皮膚に浸透したトコフェリルリン酸ナトリウムの場所を明確に示すことができる。図６は、トコフェリルリン酸ナトリウム０．５％水溶液を塗布した２〜７層目までの角質を剥離したテープのトコフェリルリン酸ナトリウムの相対イオン強度ＩＡ／ＩＳの変化を示した図である。図６から、トコフェリルリン酸ナトリウムの浸透量の角質の深さ方向の変化を見ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、直接人体の皮膚で分析可能であり、皮膚に浸透した成分の量と分布を評価できる分析方法を提供することができる。
【図３】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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