(57)【要約】【課題】細胞シートを積層させた細胞構造体を従来よりも容易に製造することができる細胞培養容器、細胞培養装置および細胞構造体の製造方法を提供する。【解決手段】細胞および培養液Ｍを収容する容器１を備えた細胞培養容器１０である。容器１は、個々に温度調節が可能な複数の調温部２を備える。複数の調温部２は、細胞を接着させると共に温度変化によって細胞を剥離させる温度応答性ポリマーＰが配置された細胞保持領域４を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞および培養液を収容する容器を備えた細胞培養容器であって、
前記容器は、個々に温度調節が可能な複数の調温部を備え、
前記調温部は、細胞を接着させると共に温度変化によって前記細胞を剥離させる温度応答性ポリマーが配置された細胞保持領域を有することを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
前記容器は、前記細胞の接着を防止する表面処理が施された表面処理部を有し、
前記表面処理部は、前記複数の調温部の前記細胞保持領域を区画するように設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記複数の調温部は、それぞれ熱媒体を流通させる流路を備えることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記調温部は、前記容器の底壁に設けられ、
前記底壁には、個々の前記調温部を区画する隔壁が立設され、
前記隔壁の高さは、前記容器の外周壁の高さよりも低いことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
個々の前記調温部は、断熱材によって区画されていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記容器は、可視光を透過させる透明性を有し、
前記複数の調温部は、一列に配置されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養容器と、
前記細胞培養容器を支持する支持台と、
個々の前記調温部の温度を調節する温度調節機構と、
を備えることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養容器を用い、
前記複数の調温部の前記細胞保持領域で前記細胞を含む細胞シートを形成し、
選択した前記調温部の温度を変化させることによって該選択した前記調温部の前記細胞保持領域から前記細胞シートを剥離させることを特徴とする細胞構造体の製造方法。
【請求項９】
選択した前記調温部の前記細胞保持領域から剥離させた前記細胞シートを他の前記調温部の前記細胞保持領域に保持された前記細胞シートに積層させて細胞積層体を形成し、
前記細胞保持領域に前記細胞積層体を保持した前記調温部の温度を変化させることで該細胞積層体を該細胞保持領域から剥離させることを特徴とする請求項８に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項１０】
前記調温部の前記細胞保持領域から剥離させた前記細胞積層体を他の前記調温部の細胞保持領域に保持された前記細胞シートに積層させることで前記細胞積層体における前記細胞シートの積層数を増加させることを特徴とする請求項９に記載の細胞構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器、細胞培養装置および細胞構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野では、細胞をシート状に培養した細胞シートが用いられている。例えば、細胞シートを単体で移植に用いる場合には、同環境で作製した他の細胞シートを検査に用いることがある。また、複数の細胞シートを用いて腎臓や肝臓などの組織を作製する場合がある。これらの組織は、複雑な３次元構造を有し、多種の細胞が組織化されているため、細胞を培養するだけで組織化することは困難である。そのため、細胞を２次元的に増殖させて得られた細胞シートを重ね合わせ、３次元構造体を製造する方法が用いられている（例えば、下記特許文献１を参照）。
【０００３】
特許文献１は、温度応答性高分子が被覆されたＡ領域と、細胞親和性が低い高分子が被覆されているＢ領域の２領域を有する細胞培養支持体を開示している。特許文献１では、細胞培養支持体上で前眼部関連細胞を培養し、必要により培養細胞層を重層化させている。その後、培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、培養した３次元構造体等を高分子膜に密着させ、そのまま高分子膜と共に剥離している。これにより、細胞、細胞間のデスモソーム構造、および細胞、基材間の基底膜様蛋白質が保持された状態で回収される構造欠陥の少ない前眼部関連細胞シートまたは３次元構造体を提供している。
【０００４】
また、同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質による表面がパターン状に表れている器材に、それぞれの表面に対し同時に電子線を照射し温度応答性ポリマーをグラフト化して温度応答性細胞培養器材を得る方法が知られている（例えば、下記特許文献２を参照）。特許文献２では、簡便な方法で（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着増殖した細胞を剥離させられる表面、と（２）細胞を全く付着させない表面を有する温度応答性細胞培養器材を得ることができる、とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１３１２７５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４４４１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述の細胞培養支持体または細胞培養器材によって細胞シートを作製するには、通常、細胞を培養する培地を収容する容器内に細胞を接着させる接着性領域を設けるが、１つの容器内に１つの接着性領域を形成する方法と、１つの容器内に複数の接着性領域を形成する方法がある。
【０００７】
前者の場合、細胞シートを積層させた細胞構造体を得るためには、個々の容器内で形成した個々の細胞シートを取り出して積層させる必要がある。この場合、個々の容器毎に培地交換が必要になるだけでなく、検査用の細胞シートを得るための余分な容器が必要になるなど、操作が煩雑になる虞がある。後者の場合、１つの容器内の複数の接着性領域から複数の細胞シートが同時に剥離し、それらが意図せず互いに重なり合うなど、細胞シートを積層させる作業に支障を来す虞がある。
【０００８】
例えば、前記特許文献１に記載の細胞培養支持体では、支持体上で培養細胞層を重層化させ、その後、培養した３次元構造体等を高分子膜に密着させ、そのまま高分子膜と共に剥離している。そのため、支持体上で重層化しない細胞種に関しては、個々の容器内で形成した個々の細胞シートを取り出して積層させる必要があり、操作が煩雑になる虞がある。
【０００９】
また、前記特許文献２に記載の細胞培養器材では、１つの器材内に細胞が付着、増殖する表面を有する複数の部分を設け、培養温度を変えることで、その部分に付着、増殖した細胞を剥離させている。この場合、１つの器材内で複数の細胞シートが同時に剥離し、細胞シートを積層させる作業に支障を来す虞がある。
【００１０】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、細胞シートを積層させた細胞構造体を従来よりも容易に製造することができる細胞培養容器、細胞培養装置および細胞構造体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成すべく、本発明の細胞培養容器は、細胞および培養液を収容する容器を備えた細胞培養容器であって、前記容器は、個々に温度調節が可能な複数の調温部を備え、前記複数の調温部は、細胞を接着させると共に温度変化によって前記細胞を剥離させる温度応答性ポリマーが配置された細胞保持領域を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の細胞培養装置は、前記細胞培養容器を支持する支持台と、個々の前記調温部の温度を調節する温度調節機構と、を備えることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の細胞構造体の製造方法は、前記細胞培養容器を用い、前記複数の調温部の前記温度応答性ポリマー上で細胞シートを形成し、選択した前記調温部の温度を変化させることによって該選択した前記調温部の前記温度応答性ポリマーから前記細胞シートを剥離させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞培養容器によれば、１つの容器内の複数の調温部の細胞保持領域で細胞を増殖させて複数の細胞シートを均一な条件で一括して製造した後、選択した調温部の温度を変化させることで、当該調温部の細胞保持領域に配置された温度応答性ポリマーから細胞シートを選択的に剥離させることができる。したがって、細胞本来の機能を損なうことなく、細胞シートを積層させた細胞構造体を従来よりも容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施形態１に係る細胞培養容器の概略構成を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図。
【図２】実施形態１に係る細胞培養装置の概略構成を示すブロック図。
【図３】実施形態１に係る細胞構造体の製造方法の一例を説明する工程図。
【図４】実施形態１に係る細胞構造体の製造方法の別の例を説明する工程図。
【図５】実施形態２に係る細胞培養容器の概略構成を示す断面図。
【図６】実施形態３に係る細胞培養容器の概略構成を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図。
【図７】実施形態４に係る細胞培養容器の概略構成を示す平面図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明の細胞培養容器、細胞培養装置および細胞構造体の製造方法の実施の形態を詳細に説明する。
【００１７】
［実施形態１］
図１は、本発明の実施形態１に係る細胞培養容器１０の概略構成を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【００１８】
（細胞培養容器）
細胞培養容器１０は、細胞を培養するための培養液Ｍを収容する容器１を備えている。容器１は、好ましくは、平面視で一方向に延びる形状に形成される。本実施形態の容器１は、平面視で長方形の形状に形成されている。容器１は、外周壁１ａと底壁１ｂとを有し、上部が開放されている。
【００１９】
容器１の材料としては、例えば、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料などを用いることができる。なお、容器１は、例えばガラスや透明な樹脂材料等、可視光を透過させる透明性を有する材料によって構成することが好ましい。
【００２０】
容器１に収容する培養液Ｍとしては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。
【００２１】
容器１内の培養液Ｍで培養する細胞は、接着性細胞であれば特に限定されず、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞などの骨細胞などが挙げられる。
【００２２】
容器１は、個々に温度調節が可能な複数の調温部２を備えている。本実施形態では、複数の調温部２は、容器１の底壁１ｂに設けられ、容器１の長手方向に沿って一列に配置されている。調温部２は、それぞれ熱媒体を流通させる流路３を備えている。
【００２３】
流路３は、容器１の短手方向に沿って設けられ、容器１の短手方向の中央部において幅が拡張された拡大部３ａを有している。各流路３の拡大部３ａは、平面視で個々の調温部２に重なる位置に形成されている。すなわち、本実施形態では、容器１の底壁１ｂに設けられた流路３の拡大部３ａと平面視で重なる部分が調温部２とされている。
【００２４】
調温部２は、それぞれ細胞を接着させると共に温度変化によって細胞を剥離させる温度応答性ポリマーＰが配置された細胞保持領域４を有している。温度応答性ポリマーＰは、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性に変化する。
【００２５】
細胞接着性とは、細胞が接着しやすいことをいう。細胞接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりやすいか否かで決定される。細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
【００２６】
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。
【００２７】
温度応答性ポリマーＰとしては、細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞積層体の回収時の温度下において親水性を示すものである。具体的には、温度応答性ポリマーＰの下限臨界溶解温度Ｔは、０〜８０℃であることが好ましく、０〜５０℃であることがより好ましい。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的には、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。
【００２８】
温度応答性ポリマーＰを容器１にパターニングして細胞保持領域４に配置する方法としては、例えば、電子線（ＥＢ）照射、熱重合、光重合等を採用することができる。
【００２９】
温度応答性ポリマーＰが配置された細胞保持領域４は、平面視で円形に形成されている。また、細胞保持領域４の大きさは、平面視で全体が調温部２に重なる大きさとされている。なお、細胞保持領域４の形状は、円形に限定されず、温度応答性ポリマーＰ上で形成する細胞シートＣＳ（図３参照）の形状に応じて適宜変更することができる。
【００３０】
細胞保持領域４の形状は、例えば、矩形、多角形、楕円形、または長円形等の島状の形状に形成することができる。また、細胞保持領域４の形状は、例えば、直線状、曲線状、または帯状に形成することも可能である。この場合、容器１の底壁１ｂを長手方向または短手方向に横断するように細胞保持領域４を形成してもよい。細胞保持領域４の大きさおよび形状を変更する場合には、それに応じて調温部２および流路３の拡大部３ａの大きさおよび形状を変更することが好ましい。すなわち、調温部２および流路３の拡大部３ａは、細胞保持領域４と同等の大きさおよび形状にすることができる。
【００３１】
容器１は、細胞保持領域４が形成されていない部分に、細胞の接着を防止する表面処理が施された表面処理部５を有している。表面処理部５は、複数の細胞保持領域４を区画するように設けられている。表面処理部５は、表面処理によって容器１の表面に細胞非接着性が付与された部分である。
【００３２】
表面処理部５には、細胞非接着性の処理、例えば、容器１の表面を親水性面とする親水化処理が施されている。ここで、親水性面とは、例えば、水接触角が７０°以下である面のことをいう。親水性面の水接触角は、好ましくは６０°以下、より好ましくは５０°以下、さらに好ましくは４５°以下であり、好ましくは１０°以上である。水接触角が上記範囲であれば、十分な親水性を有しているといえる。なお、水接触角は、２３℃の水において測定される水接触角をさす。
【００３３】
親水化処理は、特に限定されず、例えば、プラズマ処理、コーティング処理、ＵＶ照射処理、ＥＢ照射処理、表面への親水性ポリマー等のグラフト重合処理等によって行うことができる。プラズマ処理としては、例えば、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、キセノン（Ｘｅ）等の希ガス、窒素（Ｎ２）、酸素（Ｏ２）、フッ化炭素ガス等の不活性ガスを用いたプラズマ処理が挙げられる。なお、表面処理部５は、強疎水性ポリマーの固定化技術を用いた表面処理を行うこともできる。また、表面処理部５のパターニング方法としては、例えば、マスクを使用したリソグラフィを用いることができる。
【００３４】
（細胞培養装置）
図２は、本実施形態の細胞培養装置１００の概略構成を示すブロック図である。
【００３５】
細胞培養装置１００は、前述の細胞培養容器１０を支持する支持台１１０と、細胞培養容器１０の個々の調温部２の温度を調節する温度調節機構１２０と、を備えている。支持台１１０は、細胞培養容器１０を載置して支持固定することができるステージ状に構成されている。
【００３６】
温度調節機構１２０は、熱媒体として水を用い、冷水を供給および回収する冷水供給部１３０、冷水供給管１３１および冷水回収管１３２と、温水を供給および回収する温水供給部１４０、温水供給管１４１および温水回収管１４２とを備えている。冷水供給管１３１および温水供給管１４１と細胞培養容器１０の流路３の入口は三方弁Ｖ１を介して接続されている。同様に、細胞培養容器１０の流路３の出口と冷水回収管１３２および温水回収管１４２は三方弁Ｖ２を介して接続されている。
【００３７】
細胞培養容器１０の個々の調温部２の流路３の入口に設けられた三方弁Ｖ１は、流路３の入口と、冷水供給管１３１および温水供給管１４１との接続を切り替えるように、個々に制御または操作される。また、流路３の出口に設けられた三方弁Ｖ２は、流路３の入口が冷水供給管１３１に接続されている場合に流路３の出口を冷水回収管１３２に接続し、流路３の入口が温水供給管１４１に接続されている場合に流路３の出口を温水回収管１４２に接続するように、個々に制御または操作される。
【００３８】
以上の構成に基づき、本実施形態の細胞培養装置１００は、温度調節機構１２０の温水供給部１４０から温水供給管１４１を介して細胞培養容器１０の個々の調温部２の流路３に温水を供給し、調温部２の温度を調節することで、調温部２の細胞保持領域４に配置された温度応答性ポリマーＰの温度を所定の温度に調節することができる。また、個々の調温部２の流路３の入口および出口に設けられた三方弁Ｖ１，Ｖ２を制御または操作することによって、各流路３に供給されていた温水を、流路３毎に温度調節機構１２０の冷水供給部１３０から冷水供給管１３１を介して供給される冷水に切り替えることができる。これにより、調温部２を個々に冷却し、調温部２の細胞保持領域４に配置された温度応答性ポリマーＰの温度を所定の温度に冷却することができる。
【００３９】
（細胞構造体の製造方法）
図３は、前述の細胞培養容器１０および細胞培養装置１００を用いた細胞構造体ＣＳＴの製造方法の一例を説明する工程図である。
【００４０】
細胞培養容器１０および細胞培養装置１００を用いて細胞構造体ＣＳＴを製造するには、まず、図３（ａ）に示すように、細胞を懸濁させた培養液Ｍを細胞培養容器１０の容器１に収容する。そして、複数の調温部２の細胞保持領域４の温度応答性ポリマーＰに細胞を接着させてシート状に培養することで、細胞保持領域４に細胞シートＣＳを形成する。このとき、細胞培養容器１０の各流路３には、温水供給部１４０から、例えば約３７℃の温水ＨＷを供給する。
【００４１】
細胞保持領域４の温度応答性ポリマーＰ上に細胞シートＣＳが形成されたら、例えば、前述の三方弁Ｖ１，Ｖ２を制御または操作することによって、図３（ｂ）に示すように、選択した調温部２の流路３に供給する温水ＨＷを、冷水供給部１３０から供給する、例えば、約２０℃の冷水ＣＷに切り替える。これにより、当該選択した調温部２の温度を変化させ、細胞保持領域４の温度応答性ポリマーＰの温度を所定の温度に冷却し、温度応答性ポリマーＰから細胞シートＣＳを剥離させる。
【００４２】
剥離させた細胞シートＣＳは、例えば、容器１から取り出して、例えば、図３（ｅ）に示すような、細胞シートＣＳを支持する支持体２０上に配置する。このとき、細胞培養容器１０が備える容器１内の複数の調温部２の中から選択した調温部２の細胞保持領域４のみから細胞シートＣＳが剥離し、その他の調温部２の細胞保持領域４には細胞シートＣＳが保持された状態になっている。したがって、容器１内で複数の細胞シートＣＳが意図せず重なることが防止され、細胞シートＣＳを回収する操作が容易になる。
【００４３】
最初の細胞シートＣＳを回収した後、図３（ｃ）に示すように、選択した他の調温部２の流路３に供給する温水ＨＷを、冷水供給部１３０から供給する冷水ＣＷに切り替え、当該調温部２の細胞保持領域４の温度応答性ポリマーＰから細胞シートＣＳを剥離させる。そして、当該選択した他の調温部２の温度応答性ポリマーＰから剥離させた細胞シートＣＳを容器１から取り出して、支持体２０に配置した最初の細胞シートＣＳに積層させる。このときも、容器１内の複数の調温部２の中から選択した調温部２の細胞保持領域４のみから細胞シートＣＳを選択的に剥離させることで、細胞シートＣＳを回収する操作が容易になる。
【００４４】
さらに、図３（ｄ）に示すように、この操作をさらに他の選択された調温部２で順次繰り返すことで、必要な枚数の細胞シートＣＳを容器１から取り出して支持体２０上で積層させる。このときも、容器１内の複数の調温部２の中から選択した調温部２の細胞保持領域４のみから細胞シートＣＳを剥離させることで、細胞シートＣＳを回収する操作が容易になる。以上により、図３（ｅ）に示すように、複数の細胞シートＣＳが積層された細胞構造体ＣＳＴを得ることができる。
【００４５】
図４は、前述の細胞培養容器１０および細胞培養装置１００を用いた細胞構造体ＣＳＴの製造方法の別の例を示す工程図である。
【００４６】
図４に示す例では、細胞培養容器１０の容器１から細胞シートＣＳを取り出すことなく容器１内で積層させて細胞構造体ＣＳＴを製造する点で、図３に示す例と異なっている。本例のその他の点は、図３に示す例と同一であるので、説明を適宜省略する。
【００４７】
図４（ａ）に示すように、細胞培養容器１０の各流路３に温水ＨＷを供給した状態で複数の調温部２の細胞保持領域４おいて細胞シートを形成した後、図４（ｂ）に示すように、選択した調温部２の流路３に供給する温水ＨＷを冷水ＣＷに切り替えて細胞シートＣＳを剥離させる。そして、当該選択した調温部２の細胞保持領域４から剥離させた細胞シートＣＳを、他の調温部２の細胞保持領域４に保持された細胞シートＣＳに積層させて細胞構造体ＣＳＴを形成する。
【００４８】
このとき、細胞培養容器１０が備える容器１内の複数の調温部２の中から選択した調温部２の細胞保持領域４のみから細胞シートＣＳが剥離し、その他の調温部２の細胞保持領域４には細胞シートＣＳが保持された状態になっている。したがって、容器１内で複数の細胞シートＣＳが意図せず重なることが防止され、細胞シートＣＳを積層させる操作が容易になる。
【００４９】
次に、図４（ｃ）に示すように、細胞保持領域４に細胞構造体ＣＳＴを保持した調温部２の流路３に供給する温水ＨＷを冷水ＣＷに切り替えて当該調温部２の温度を変化させることで、細胞構造体ＣＳＴを細胞保持領域４から剥離させる。さらに、当該調温部２の細胞保持領域４から剥離させた細胞構造体ＣＳＴを、他の調温部２の細胞保持領域４に保持された細胞シートＣＳに積層させることで、細胞構造体ＣＳＴにおける細胞シートＣＳの積層数を増加させる。このときも、容器１内の複数の調温部２の中から選択した調温部２の細胞保持領域４のみから細胞構造体ＣＳＴを選択的に剥離させることで、細胞構造体ＣＳＴを細胞シートＣＳに積層する操作が容易になる。
【００５０】
次に、図４（ｄ）に示すように、細胞保持領域４に細胞構造体ＣＳＴを保持した調温部２の流路３に供給する温水ＨＷを冷水ＣＷに切り替えて当該調温部２の温度を変化させることで、細胞構造体ＣＳＴを細胞保持領域４から剥離させる。この操作を繰り返すことで、所望の枚数の細胞シートＣＳを積層させた細胞構造体ＣＳＴを容易に得ることができる。
【００５１】
なお、容器１内で複数の細胞シートＣＳを積層させる操作および細胞構造体ＣＳＴを細胞シートＣＳに積層させる操作は、容器１内の培養液Ｍを排出してから行い、細胞シートＣＳの積層後に、再度、容器１内に培養液Ｍを導入するようにしてもよい。これにより、細胞シートＣＳおよび細胞構造体ＣＳＴを積層させる操作を容易にすることができる。
【００５２】
以上のように、本実施形態の細胞培養容器１０は、個々に温度調節が可能な複数の調温部２を備えている。そして、調温部２は、細胞を接着させると共に温度変化によって細胞を剥離させる温度応答性ポリマーＰが配置された細胞保持領域４を有している。そのため、１つの容器１内の複数の調温部２の細胞保持領域４で細胞を増殖させ、複数の細胞シートＣＳを均一な条件で一括して製造することができる。これにより、移植に用いる細胞シートＣＳと検査用の細胞シートＣＳとを、同一環境で培養することができる。また、複数の細胞保持領域４の培地交換を一括して行うことができるだけでなく、検査用の細胞シートＣＳを得るための余分な容器が不要になり、細胞シートＣＳを含む細胞構造体ＣＳＴの製造を容易にすることができる。
【００５３】
また、細胞を死滅させることのない、例えば約２０℃から３７℃の温度範囲で、選択した調温部２の温度を変化させることで、当該調温部２の細胞保持領域４に配置された温度応答性ポリマーＰから細胞シートＣＳを選択的に剥離させることができる。また、細胞シートＣＳを選択的に剥離させることで、前述のように細胞シートＣＳを回収および積層する操作が容易になる。したがって、細胞本来の機能を損なうことなく、細胞シートＣＳおよび細胞シートＣＳを積層させた細胞構造体ＣＳＴを従来よりも容易に製造することができる。
【００５４】
また、容器１は、細胞の接着を防止する表面処理が施された表面処理部５を有している。そして、表面処理部５は、複数の調温部２の細胞保持領域４を区画するように設けられている。そのため、細胞保持領域４の周囲に細胞が接着せず、複数の細胞保持領域４の間に細胞シートＣＳが連続的に形成されることが防止される。したがって複数の調温部２の細胞保持領域４で、それぞれ細胞シートＣＳを形成して、複数の細胞シートＣＳを一括して製造することができる。また、表面処理部５によって区画することで、細胞保持領域４の形状および大きさを自由に設定することができ、所望の形状および大きさの細胞シートＣＳを得ることができる。
【００５５】
また、複数の調温部２は、それぞれ熱媒体である水を流通させる流路３を備えている。これにより、流路３に流通させる水の温度を調節することで、個々の調温部２の温度を調節することができる。また、調温部２にヒータやペルティエ素子などの冷熱源を設ける場合と比較して、細胞培養容器１０および細胞培養装置１００の構成を簡略化することができる。また、可視光を透過させる透明な材料によって流路３を含む容器１を構成することで、細胞培養容器１０を顕微鏡観察に用いる際に観察の妨げとなることを防止できる。
【００５６】
このように、容器１が可視光を透過させる透明性を有することで、細胞培養容器１０をそのまま顕微鏡観察に用いることができ、検査等における利便性を向上させることができる。また、複数の調温部２が一列に配置されているので、各調温部２の細胞保持領域４に形成された細胞シートＣＳの観察、検査およびその他の処理を、調温部２の配列方向に平行な一方向に沿って連続して行うことができ、これらの処理の効率を向上させることができる。
【００５７】
また、本実施形態の細胞培養装置１００は、前述の細胞培養容器１０と、細胞培養容器１０を支持する支持台１１０と、細胞培養容器１０の個々の調温部２の温度を調節する温度調節機構１２０と、を備えている。したがって、前述のように、細胞培養容器１０を用い、細胞本来の機能を損なうことなく、細胞シートＣＳを積層させた細胞構造体ＣＳＴを従来よりも容易に製造することができる。
【００５８】
以上説明したように、本実施形態の細胞培養容器１０、細胞培養装置１００および細胞構造体ＣＳＴの製造方法によれば、細胞本来の機能を損なうことなく、細胞シートＣＳを積層させた細胞構造体ＣＳＴを従来よりも容易に製造することができる。
【００５９】
［実施形態２］
図５（ａ）から（ｃ）は、本発明の実施形態２に係る細胞培養容器１０Ａの概略構成を示す断面図である。
【００６０】
本実施形態の細胞培養容器１０Ａは、容器１の底壁１ｂに、個々の調温部２を区画する隔壁６が立設されている点で、前述の実施形態１の細胞培養容器１０と異なっている。本実施形態の細胞培養容器１０Ａのその他の点は、実施形態１の細胞培養容器１０と同一であるので、同一の部分には同一の符号を付して説明は省略する。
【００６１】
容器１の底壁１ｂに立設されて個々の調温部２を区画する隔壁６の高さは、容器１の外周壁１ａの高さよりも低くされている。そのため、図５（ａ）に示すように、培養液Ｍの水位が隔壁６の高さよりも高い状態においては、培養液Ｍは個々の調温部２間を移動して均一化され、個々の調温部２の細胞保持領域４に保持された細胞シートＣＳの培養を均一な条件で行うことができる。
【００６２】
また、選択した調温部２の細胞保持領域４の細胞シートＣＳを剥離させる際には、図５（ｂ）に示すように、培養液Ｍの水位を隔壁６の高さよりも低くすることで、個々の調温部２間での培養液Ｍの移動が防止され、隣接する調温部２間の培養液Ｍの移動に伴う熱の移動を防止することができる。これにより、選択した調温部２に隣接する他の調温部２の細胞保持領域４が、選択した調温部２の温度変化に起因する熱の影響を受けることが抑制され、誤って細胞シートＣＳが剥離することを防止できる。
【００６３】
なお、図５（ｃ）に示すように、選択した調温部２の細胞保持領域４の細胞シートＣＳを剥離させる際に、補助隔壁６ａを増設して隔壁６の高さを培養液Ｍの水位よりも高くすることで、図５（ｂ）に示す例と同様の効果を得ることができる。この場合、培養液Ｍを容器１から排出する工程を省略することができる。
【００６４】
［実施形態３］
図６は、本発明の実施形態３に係る細胞培養容器１０Ｂの概略構成を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【００６５】
本実施形態の細胞培養容器１０Ｂは、個々の調温部２が断熱材７によって区画されている点で、前述の実施形態１の細胞培養容器１０と異なっている。本実施形態の細胞培養容器１０Ｂのその他の点は、実施形態１の細胞培養容器１０と同一であるので、同一の部分には同一の符号を付して説明は省略する。
【００６６】
細胞培養容器１０Ｂは、個々の調温部２を区画する断熱材７を有している。断熱材７の材料は、その熱伝導率が容器１を構成する材料の熱伝導率よりも低い材料であれば特に限定されない。断熱材７は、平面視で容器１の短手方向の一方の外周壁１ａから他方の外周壁１ａまで底壁１ｂの幅方向に連続的に設けられ、断面視で容器１の底面である底壁１ｂの下面から容器１の内底面である底壁１ｂの上面まで底壁１ｂの厚さ方向に連続的に設けられている。これにより、選択した調温部２に隣接する他の調温部２の細胞保持領域４が、当該選択した調温部２の温度変化に起因する熱の影響を受けることが抑制される。
【００６７】
なお、断熱材７の配置は、調温部２間の熱の移動を抑制することができる配置であれば特に限定されず、個々の調温部２の間に部分的に設けられていてもよい。また、個々の調温部２を囲むように断熱材７を配置してもよい。
【００６８】
［実施形態４］
図７は、本発明の実施形態４に係る細胞培養容器１０Ｃの概略構成を示す平面図である。
【００６９】
本実施形態の細胞培養容器１０Ｃは、調温部２が多行多列に形成されている点で、前述の実施形態１の細胞培養容器１０と異なっている。本実施形態の細胞培養容器１０Ｃのその他の点は、実施形態１の細胞培養容器１０と同一であるので、同一の部分には同一の符号を付して説明は省略する。
【００７０】
細胞培養容器１０Ｃは、調温部２が多行多列に形成され、各調温部２に流路３が形成されている。したがって、本実施形態の細胞培養容器１０Ｃによれば、実施形態１の細胞培養容器１０と同様の効果が得られるだけでなく、より多くの細胞シートＣＳを一括して製造することが可能になる。
【００７１】
以上、図面を用いて本発明の実施の形態を詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における設計変更等があっても、それらは本発明に含まれるものである。
【００７２】
例えば、前述の実施の形態では、調温部が底壁に設けられている構成について説明したが、調温部は底壁に限定されず、外周壁や隔壁に設けてもよい。
【００７３】
また、前述の実施の形態では、調温部が熱媒体を流通させる流路を備えることによって個々に温度調節が可能に構成されている例について説明した。しかし、調温部の構成は、個々に温度調節が可能な構成であれば、熱媒体を流通させる流路を備える構成に限定されない。例えば、調温部に、ヒータやペルティエ素子などの冷熱源を設けることによって個々に温度調節が可能な構成としてもよい。また、調温部の温度を測定する温度センサを用いることで、個々の調温部の温度制御をより正確に行うことも可能である。
【００７４】
また、前述の実施の形態では、細胞培養容器が備える容器に流路が形成されている例について説明したが、容器は流路を備えていなくてもよい。例えば、容器と流路を形成する流路形部材とを別の部材とし、細胞培養容器の使用時に調温部の位置に流路が形成されるように容器の外側に流路形成部材を取り付けるようにしてもよい。
【００７５】
また、前述の実施の形態では、温度応答性ポリマーが配置された細胞保持領域を平面視で円形に形成し、調温部の形状および大きさを細胞保持領域の形状に対応する形状でかつ細胞保持領域の全体と重なる大きさとしたが、調温部の形状および大きさは特に限定されない。調温部の面積は、細胞保持領域に配置された温度応答性ポリマーの温度を調節可能であれば、細胞保持領域の面積よりも小さくてもよい。
【符号の説明】
【００７６】
１…容器、１ａ…外周壁、１ｂ…底壁、２…調温部、３…流路、４…細胞保持領域、５…表面処理部、６…隔壁、７…断熱材、１０…細胞培養容器、１００…細胞培養装置、１１０…支持台、１２０…温度調節機構、ＣＳ…細胞シート、ＣＳＴ…細胞構造体、ＣＷ…冷水（熱媒体）、ＨＷ…温水（熱媒体）、Ｍ…培養液、Ｐ…温度応答性ポリマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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