(57)【要約】【課題】多剤耐性緑膿菌（MDRP）等の細菌感染症の治療及び予防に有効な新規医薬又は除菌薬を提供すること。【解決手段】パツリンを含有してなる、緑膿菌のMexY又はMexYと高い相同性を有する細菌の排出ポンプの阻害剤；パツリンと、該排出ポンプの基質となり得る抗菌薬とを組み合わせてなる、該排出ポンプを有する細菌に対する抗菌剤；多剤耐性緑膿菌に感染した患者から分離した該緑膿菌株に、パツリン及び緑膿菌のMexY排出ポンプの基質となり得る抗菌薬をそれぞれ単独で、並びに併用して接触させ、それぞれを単独で接触させた場合に対して、併用して接触させた場合に、相乗的に生育が阻止された菌株を、MexY排出ポンプの機能亢進による多剤耐性機構を有する菌株であると判定することを特徴とする、病原緑膿菌株の多剤耐性機構の同定方法等が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パツリンを含有してなる、細菌の排出ポンプ阻害剤であって、該排出ポンプが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とするものである、阻害剤。
【請求項２】
細菌がグラム陰性細菌である、請求項１記載の阻害剤。
【請求項３】
排出ポンプが緑膿菌のMexY排出ポンプである、請求項１記載の阻害剤。
【請求項４】
パツリンと、細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬とを組み合わせてなる、該細菌に対する抗菌剤であって、該排出ポンプが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とするものである、抗菌剤。
【請求項５】
細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬が、キノロン、アミノ配糖体、クメルマイシン、クロラムフェニコール、リポペプチド、グリシルサイクリン、ケトライド、マクロライド、オキサゾリジノン、ホスホマイシン、ストレプトグラミン及びテトラサイクリンからなる群より選択される１種以上である、請求項４記載の抗菌剤。
【請求項６】
細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬がアミノ配糖体である、請求項４記載の抗菌剤。
【請求項７】
アミノ配糖体がアミカシンである、請求項６記載の抗菌剤。
【請求項８】
細菌感染症の治療もしくは予防、又は細菌の除菌用である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の抗菌剤。
【請求項９】
細菌が多剤耐性緑膿菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１０】
細菌に汚染されている、又はそのおそれのある対象物を、パツリン及び該細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬に接触させることを特徴とする、該対象物からの該細菌の除菌方法であって、該排出ポンプが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とするものである、方法。
【請求項１１】
多剤耐性緑膿菌に感染した患者から分離した該緑膿菌株に、パツリン及び緑膿菌のMexY排出ポンプの基質となり得る抗菌薬をそれぞれ単独で、並びに併用して接触させ、それぞれを単独で接触させた場合に対して、併用して接触させた場合に、相乗的に生育が阻止された菌株を、MexY排出ポンプの機能亢進による多剤耐性機構を有する菌株であると判定することを特徴とする、病原緑膿菌株の多剤耐性機構の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の薬剤排出ポンプの阻害薬及びその用途に関する。より詳細には、本発明は、パツリンを含有してなる、緑膿菌のMexY、又はMexYと高い相同性を有しアミノ配糖体系抗菌薬を排出基質とする細菌のRND型排出ポンプの阻害剤、並びに、パツリンと、当該排出ポンプにより排出される抗菌薬とを組み合わせてなる、緑膿菌等の細菌（特に、多剤耐性緑膿菌）の感染予防・治療剤及び除菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）はグルコース非発酵グラム陰性桿菌であり、ヒトの皮膚、呼吸器、消化管等に常在する。健常人に対しては病原性を示すことはほとんどないが、免疫力の低下した病人や高齢者などの易感染宿主に対しては、難治性の感染症を引き起こす。
多剤耐性緑膿菌（Multi-Drug Resistant Pseudomonas aeruginosa; MDRP）は、緑膿菌に対し強い抗菌活性が期待できるカルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬及びアミノ配糖体系抗菌薬の3系統の抗菌薬すべてに耐性を獲得した菌株をいう。現在、MDRPの分離率は、国内では1〜数%と推定されており、いったん感染症が発症した場合、有効な抗菌薬がほとんどないため、治療は難しく、死亡する例も少なくない。
【０００３】
緑膿菌は内因性の耐性機構に、他の耐性菌からのプラスミド伝達などによる獲得耐性機構が組み合わさって高度耐性・多剤耐性となる。内因性とは、染色体上に元来保有する遺伝子に基づく耐性機構を指し、特定抗菌薬の継続使用によりそれらの遺伝子あるいはその発現調節機構が変異するなどして耐性を獲得することをいう。内因性の耐性機構には、β-lactam薬分解酵素の過剰産生、透過孔形成外膜蛋白の発現量低下による薬剤透過性の低下、抗菌薬の標的蛋白質の変異による親和性の低下、薬剤排出ポンプの機能亢進等がある。中でも、排出ポンプは、多種の抗菌薬を排出することから、多剤耐性に大きく関わっていることが知られている。
緑膿菌の排出ポンプで最も重要なのは、RND（Resistance-Nodulation-cell Division）型と呼ばれる、3種の蛋白質（内膜に存在し、基質認識と輸送を担うRND排出蛋白質（RND）、外膜チャネル蛋白質（OEP）、両者を結合するペリプラズム蛋白質（MFP））からなるマルチコンポーネントの排出ポンプである。緑膿菌のゲノムには少なくとも12種のRND型排出ポンプオペロンが存在する。これらのうち、野生株で構成的に発現しているのはmexAB-oprMオペロン（mexAがMFP、mexBがRND、oprMがOEPコンポーネントをそれぞれコードする）が主であるが、いずれのオペロンにも発現制御遺伝子があり、基質などにより発現が誘導される可能性があり、耐性変異株では制御遺伝子の変異により発現抑制が解除され排出ポンプの産生量が恒常的に上昇している場合もある。MexXY-OprM (非特許文献１)（mexXYオペロンは固有のOEP遺伝子を持たず、OprMをOEPコンポーネントとする。）は、大半のMDRPにおいて発現量が上昇しており、多剤耐性の一因として重要であることが明らかとなった。
【０００４】
薬剤排出ポンプの機能亢進により多剤耐性を獲得した緑膿菌に対しては、当該排出ポンプを阻害して、菌体内の抗菌薬濃度を高めることができれば、耐性となった抗菌薬に対する感受性を回復することができ、MDRP感染症の治療及び予防に有効である。
現在までに、緑膿菌の排出ポンプ阻害薬はいくつか報告されているが（例えば、特許文献１〜３参照）、いずれもMexBを標的とするものであり、MexYを阻害する薬剤についての報告は皆無である。各排出ポンプの基質特異性は甘く、多種多様な化合物を認識するもののRND蛋白質に応じて基質特異性に違いがあり、アズトレオナムはMexBに特異的であるのに対し、アミノ配糖体系抗菌薬はMexYに特異的であることが知られている（キノロン系、マクロライド系、クロラムフェニコール系、およびテトラサイクリン系抗菌薬はMexB、MexYのいずれによっても排出される; 非特許文献１〜３）。従って、フルオロキノロン系抗菌薬などの排出を十分に阻害するためには、MexB阻害薬に加えてMexY阻害薬も必要になってくることから、排出阻害薬との併用剤は3剤併用となり、実用的でない。アミノ配糖体系抗菌薬は、複数のポンプにより排出されない数少ない抗菌薬の一種であり、MexYを阻害する薬剤は、アミノ配糖体系薬の併用薬として期待できる。
【０００５】
パツリン（Patulin）は、ペニシリウム属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ビソクラミス属（Byssochlamys）、ペシロマイセス属（Paecilomyces）に属する種々の微生物が産生するマイコトキシンであり、リンゴのカビ毒として知られている。多くの動物種に対して急性毒性を示し、ラット及びマウスにおける経口でのLD50は29-55mg/kgであり、米国食品医薬品局（FDA）は果汁飲料等への含有量を50μg/Lに規制している（非特許文献４）。我が国でも食品衛生法に基づき、同等の規格基準が設けられている。また、亜急性毒性としては、胃腸の異常、拒食、体重減少などが報告されているが、サルへの5〜500μg/kg/日投与では毒性は認められていない（非特許文献４）。
パツリンは多くの細菌や一部の真菌に対して広い抗菌活性を示し（例えば、非特許文献５参照）、以前は風邪に対する臨床試験が行われたこともあるが（非特許文献６）、上述のように高用量では毒性を示す場合があるため、医薬としては永らく顧みられていないのが現状である。また、Bordetella bronchisepticaに対する抗菌活性に関して、リファンピシンやボトロマイシンとの併用による相乗効果が報告されているが（非特許文献７）、機序として転写又は翻訳阻害が示唆されるのみで、排出ポンプや緑膿菌に対する作用については何ら知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2002/087589号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2005/113579号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2005/089738号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Masuda, N. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 44(12): 3322-3327 (2000)
【非特許文献２】Morita, Y. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 47: 27-32 (2001)
【非特許文献３】Li, X.-Z. and Nikaido, H., Drugs, 69(12): 1555-1623 (2009)
【非特許文献４】Puel, O. et al., Toxins, 2: 613-631 (2010)
【非特許文献５】Wallen, L.L. et al., J. Antibiot., 33(7): 767-769 (1980)
【非特許文献６】Chalmers, I. and Clarke, M., Int. J. Epidemiol., 33(2): 253-260 (2004)
【非特許文献７】Dulaney, E.L. and Jacobsen, C.A., J. Antibiot., 40(8): 1211-1212 (1987)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、緑膿菌、中でもMDRP感染症の治療及び予防に有効な新規医薬又は除菌薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、アミノ配糖体系抗菌薬であるアミカシンがMexYに特異的な排出基質であることに着目し、MexXY-OprM排出ポンプを阻害し得る物質を鋭意探索した結果、自体MDRPに対して弱い抗菌活性を有するパツリンが、抗菌作用を示さない濃度のアミカシン存在下で、複数のMDRP株の生育を著しく阻止することを見出した。この生育阻止効果がMexY排出ポンプ阻害に基づくものであることを検証すべく、ディスク拡散法を用いて、パツリン含浸ディスクを中心にして4方向に等間隔で、アミカシン（MexY特異的排出基質；膜透過性良好）、アズトレオナム（MexB特異的排出基質；膜透過性良好）、エリスロマイシン（MexBよりもMexYの基質になり易い；膜透過性やや不良）又はバンコマイシン（膜難透過性）を含浸させたディスクを配置し、阻止円の形成を観察したところ、パツリンはアミカシンと顕著な相乗効果を示した他、エリスロマイシンと若干の併用効果を示したが、アズトレオナム及びバンコマイシンとは併用効果を示さなかった。このことから、パツリンは、MexB阻害や膜透過性亢進ではなく、MexY排出ポンプを阻害することで、該排出ポンプの特異的基質であるアミカシンの排出を阻害し、それによって菌体内のアミカシン濃度を抗菌活性を発揮するに十分な程度まで高めることで、MDRPをアミカシン感受性に変化させたものと考えられた。緑膿菌以外のグラム陰性細菌の中にも、MexYと高い相同性を有し、アミノ配糖体系抗菌薬を排出基質とするRND型排出ポンプを有する細菌が知られている。従って、パツリンはこれらの排出ポンプも阻害し、アミノ配糖体系抗菌薬等との併用により、当該細菌に対しても相乗的な抗菌効果を発揮し得ることが強く示唆された。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下のものを提供する。
〔１〕パツリンを含有してなる、細菌の排出ポンプ阻害剤であって、該排出ポンプが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とするものである、阻害剤。
〔２〕細菌がグラム陰性細菌である、上記〔１〕記載の阻害剤。
〔３〕排出ポンプが緑膿菌のMexY排出ポンプである、上記〔１〕記載の阻害剤。
〔４〕パツリンと、細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬とを組み合わせてなる、該細菌に対する抗菌剤であって、該排出ポンプが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とするものである、抗菌剤。
〔５〕細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬が、キノロン、アミノ配糖体、クメルマイシン、クロラムフェニコール、リポペプチド、グリシルサイクリン、ケトライド、マクロライド、オキサゾリジノン、ホスホマイシン、ストレプトグラミン及びテトラサイクリンからなる群より選択される１種以上である、上記〔４〕記載の抗菌剤。
〔６〕細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬がアミノ配糖体である、上記〔４〕記載の抗菌剤。
〔７〕アミノ配糖体がアミカシンである、上記〔６〕記載の抗菌剤。
〔８〕細菌感染症の治療もしくは予防、又は細菌の除菌用である、前記〔４〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗菌剤。
〔９〕細菌が多剤耐性緑膿菌である、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の剤。
〔１０〕細菌に汚染されている、又はそのおそれのある対象物を、パツリン及び該細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬に接触させることを特徴とする、該対象物からの該細菌の除菌方法であって、該排出ポンプが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80%以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とするものである、方法。
〔１１〕多剤耐性緑膿菌に感染した患者から分離した該緑膿菌株に、パツリン及び緑膿菌のMexY排出ポンプの基質となり得る抗菌薬をそれぞれ単独で、並びに併用して接触させ、それぞれを単独で接触させた場合に対して、併用して接触させた場合に、相乗的に生育が阻止された菌株を、MexY排出ポンプの機能亢進による多剤耐性機構を有する菌株であると判定することを特徴とする、病原緑膿菌株の多剤耐性機構の同定方法。
【発明の効果】
【００１１】
パツリンは、緑膿菌のMexY排出ポンプやMexYと高い相同性を有する他の細菌由来の排出ポンプを特異的に阻害することができるので、これらの排出ポンプにより排出され得る抗菌薬と組み合わせて用いることにより、緑膿菌等の細菌、特にMDRPに対して顕著な抗菌作用を示す。例えば、アミカシンやトブラシン等の既存のアミノ配糖体系抗菌薬は、MDRPに対しては無効もしくは高用量でしか使用できなかったが、パツリンとの併用により、これらの既存薬が低用量で使用可能となる。既に耐性菌が存在する抗菌薬を使用することで、現在有効とされているポリミキシンBやコリスチンに対する耐性菌の出現を阻止することにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】（Ａ）パツリン（2.5-20μg）及び種々の抗菌薬（50μg）の単独の抗菌活性、並びに（Ｂ）アミカシン（96μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性を示す図である。ディスク内の数字は阻止円径（mm）を示す。P: パツリン、AMK: アミカシン。
【図１−２】多剤耐性緑膿菌MDRP No. 74株に対する、（Ｃ）エリスロマイシン（64μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性、並びに（Ｄ）クロラムフェニコール（128μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性を示す図である。ディスク内の数字は阻止円径（mm）を示す。P: パツリン、EM: エリスロマイシン、CP: クロラムフェニコール。
【図１−３】多剤耐性緑膿菌MDRP No. 74株に対する、（Ｅ）テトラサイクリン（64μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性を示す図である。ディスク内の数字は阻止円径（mm）を示す。P: パツリン、TC: テトラサイクリン。
【図２−１】多剤耐性緑膿菌MDRP No. 50株に対する、（Ａ）パツリン（2.5-20μg）及び種々の抗菌薬（50μg）の単独の抗菌活性、並びに（Ｂ）アミカシン（48μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性を示す図である。ディスク内の数字は阻止円径（mm）を示す。P: パツリン、AMK: アミカシン。
【図２−２】多剤耐性緑膿菌MDRP No. 50株に対する、（Ｃ）エリスロマイシン（64μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性、並びに（Ｄ）クロラムフェニコール（128μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性を示す図である。ディスク内の数字は阻止円径（mm）を示す。P: パツリン、EM: エリスロマイシン、CP: クロラムフェニコール。
【図２−３】多剤耐性緑膿菌MDRP No. 50株に対する、（Ｅ）テトラサイクリン（64μg/mL）とパツリン（2.5-20μg）又は種々の抗菌薬（50μg）との併用による抗菌活性を示す図である。ディスク内の数字は阻止円径（mm）を示す。P: パツリン、TC: テトラサイクリン。
【図３】パツリンとアミカシンの併用効果が、パツリンによるMexXY-OprM排出ポンプ阻害によるものであることを示す図である。Sample: パツリン生産菌株PSTF0045の培養抽出液（20μL）、AMK: アミカシン（50μg）、AZT: アズトレオナム（50μg）、EM: エリスロマイシン（50μg）、VCM: バンコマイシン（50μg）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、パツリンを含有してなる、細菌の排出ポンプ阻害剤（以下、本発明の阻害剤ともいう）を提供する。
本発明の阻害剤が阻害し得る「細菌の排出ポンプ（以下、本発明の排出ポンプともいう）」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるPseudomonas aeruginosa PAO1株由来のMexY蛋白質と、80%以上の類似性を有する蛋白質からなり、アミノ配糖体系抗菌薬を基質とする、RND型排出ポンプである。MexXY-OprM排出ポンプシステムは、緑膿菌のマルチコンポーネント型排出ポンプシステムのうち、基質認識及び輸送本体としての機能を担うRNDコンポーネントとしてMexYを、RNDコンポーネントと外膜チャネルであるOEPコンポーネントとを結合するペリプラズム蛋白質であるMFPコンポーネントとしてMexXを含む排出ポンプである。OEPコンポーネントは適宜選択され得るが、通常、産生量の多いOprMがOEPコンポーネントとなる場合が多い。また、排出ポンプの「基質」とは、MexY等のRNDコンポーネントにより認識され、該排出ポンプから菌体外に排出され得る物質を意味する。
【００１４】
アミノ酸配列の「類似性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて、配列番号１で表されるアミノ酸配列と他のアミノ酸配列とをアラインさせた場合の、類似アミノ酸残基（positive: 同一アミノ酸の場合の他、SerとThr、SerとAla、SerとAsn、AsnとAsp、AsnとHis、AspとGlu、GluとGln、GluとLys、GlnとArg、GlnとLys、HisとTyr、ArgとLys、MetとIle、MetとLeu、MetとVal、IleとLeu、IleとVal、LeuとVal、PheとTyr、PheとTrp、TyrとTrpのマッチング）の割合（％）として、計算することができる。
【００１５】
配列番号１で表されるPseudomonas aeruginosa PAO1株由来のMexY蛋白質のアミノ酸配列は、NCBIデータベースにAccession No. NP_250708として登録されている。MexY蛋白質は、各緑膿菌株間で高度に保存されており、ほとんどの株がBLAST解析で99%の類似性及び同一性を示す。また、緑膿菌以外にもMexYに対応する薬剤排出ポンプを発現する細菌が存在する。例えば、緑膿菌と同様、非発酵グラム陰性の病原菌として知られるAchromobacter sp.（例: A. xylosoxidans、A. baumannii）や種々のBurkholderia sp.（例: B. pseudomallei、B. cepacia complex）は、緑膿菌のMexYと約80%以上の類似性と約70%の同一性を有する薬剤排出ポンプ（例: A. xylosoxidansのAxyY（Accession No. EGP45231; 74%同一性、86%類似性）、A. baumanniiのAdeB、B. pseudomallei（Accession No. YP_006274748; 70%同一性、83%類似性）及びB. cepacia complexのAmrB等）を有しており、これらの排出ポンプは、いずれもアミノ配糖体系抗菌薬に対する耐性機構の1つであることが知られている。従って、緑膿菌のMexYのみならず、MexYと高い相同性（即ち、80%以上のアミノ酸類似性及び／又は70%以上のアミノ酸同一性）を有し、且つMexYと同様の抗菌薬に対する基質特異性（特に、アミノ配糖体を排出基質とすること）を有する、他の細菌が有する薬剤排出ポンプも、本発明の排出ポンプに包含される。
【００１６】
本発明で用いられるパツリン（Patulin）は、ペニシリウム属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ビソクラミス属（Byssochlamys）、ペシロマイセス属（Paecilomyces）に属する種々の微生物が産生するマイコトキシンであり、下記の構造式で示される化合物（IUPAC名: 4-ヒドロキシ-4H-フロ[3,2-c]ピラン-2(6H)-オン）である。
【００１７】
【化１】
2015113290.tif 000002
【００１８】
パツリンを産生する具体的な微生物としては、例えば、ペニシリウム属に属するP. carneum, P. clavigerum, P. concentricum, P. coprobium, P. dipodomyicola, P. expansum, P. glandicola, P. gladioli, P. griseofulvum, P. marinum, P. paneum, P. sclerotigenum, P. vulpinum、アスペルギルス属に属するAspergillus clavatus, A. giganteus, A. longivesica、ビソクラミス属に属するByssochlamys. nivea、ペシロマイセス属に属するPaecilomyces saturatus等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのうち、リンゴのカビ毒の主たる病原菌であるP. expansumはリンゴ果実から容易に分離することができる。パツリンは、例えば、上記パツリン生産菌を適当な培養液（例: YES培養液（2% 酵母エキス、15% ショ糖）等）中、25℃で培養し、得られた培養上清を濃縮した後、クロロホルム、次いで酢酸エチルで抽出し、抽出液を合せてHarwigらの方法（Can. Inst. Food Sci. Technol. J., 6: 22-25 (1973)）により単離・結晶化することにより、製造することができる。また、パツリンは、アラビノースを保護ケトンに変換した後、Wittig縮合反応を行い、さらに酸触媒環化反応及び脱水反応を行うことで、化学的に合成することもできる。あるいは、市販のパツリン（例: Sigma-Aldrich社、製品番号P1639）を購入して用いてもよい。
本明細書においては、パツリンは、上記構造式で示される化合物に加えて、その類縁体をも包含する意味で用いられ得る。ここで類縁体としては、本発明の排出ポンプを特異的に阻害し得る限り特に制限はなく、例えば、エステル類（例: 酢酸エステル、安息香酸エステル）などが挙げられるが、動物体内で代謝された後に上記阻害活性を示すプロドラッグ型の化合物もこの中に含まれ得る。あるいは、パツリン生合成における前駆物質（例: アスクラジオール、ネオパツリン）もパツリン類縁体に含まれる。これらの前駆物質は、例えば、パツリン産生菌染色体上のパツリン生合成系酵素遺伝子クラスターに存在する、所望の前駆物質をパツリンもしくは他の前駆物質に変換する反応を触媒する酵素遺伝子を、常法により欠損させ、該欠損株を培養して得られる培養上清からHPLC等周知の技術により精製することができる。
【００１９】
パツリンは、緑膿菌、特にMDRPに対して、自体弱いながらも抗菌活性を有しているが（最小発育阻止濃度MIC=128 μg/mL）、単独で抗菌作用を示さない濃度でも、MexY排出ポンプを阻害することで、同じく単独で抗菌作用を示さない濃度で添加されたMexY排出基質であるアミノ配糖体系抗菌薬のMexY介在性排出を抑制し、該抗菌薬の菌体内濃度を抗菌作用が発揮されるのに十分な程度に維持することができる。
結果として、単独ではともに抗菌作用を示さない濃度であっても、パツリンとアミノ配糖体系抗菌薬を併用すると、現在国内では未認可のMDRPに対して単独で抗菌効果を示す唯一の薬剤であるコリスチンの代わりに、MDRPに対して抗菌効果が期待できる。
従って、パツリンは、MexY等の本発明の排出ポンプにより排出される抗菌薬に対して耐性を獲得した細菌、好ましくは緑膿菌を含むグラム陰性病原菌、特にMDRPに感染した患者に投与することにより、本発明の排出ポンプの特異的な阻害を介して、該細菌を該抗菌薬に対して（高）感受性にし（脱耐性化し）、低用量の既存薬投与により細菌感染症を治療することを可能にする。即ち、パツリンは本発明の排出ポンプの排出基質である抗菌薬に対する感受性増強もしくは付与薬（脱耐性化薬）として有用である。
【００２０】
パツリンは、そのまま、あるいは自体公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体とともに混合した医薬組成物、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、口腔内崩壊錠、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤、貼布剤等の製剤として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に投与することができる。
【００２１】
本発明の阻害剤中のパツリンの含有量は、特に限定されず、製剤全体の約0.01〜100重量%である。
該阻害剤の投与量及び投与回数は特に限定されず、微生物感染症の種類や重篤度、基礎疾患の有無、患者の年齢、体重などの条件などに応じて、適宜の投与量及び投与回数を選択することが可能である。例えば、MDRP感染症患者に対し、抗菌薬に対する感受性増強もしくは付与剤として経口的に投与する場合、成人に対して、パツリンとして約0.005〜約5mg/kg/日、好ましくは約0.01〜約0.5ng/kg/日を、1日1回または2〜3回に分けて投与することができる。
【００２２】
本発明の阻害剤の製造に用いられ得る薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、水溶性高分子、塩基性無機塩；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等があげられる。また、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、発泡剤、香料等の添加物を用いることもできる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、D-マンニトール、でんぷん、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、酸化チタン等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク、ステアリン酸等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム末、ゼラチン、プルラン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
崩壊剤としては、（1）クロスポビドン、（2）クロスカルメロースナトリウム（FMC-旭化成）、カルメロースカルシウム（五徳薬品）等スーパー崩壊剤と称される崩壊剤、（3）カルボキシメチルスターチナトリウム（例、松谷化学（株）製）、（4）低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（例、信越化学（株）製）、（5）コーンスターチ等が挙げられる。該「クロスポビドン」としては、ポリビニルポリピロリドン（PVPP）、1-ビニル-2-ピロリジノンホモポリマーと称されているものも含め、1-エテニル-2-ピロリジノンホモポリマーという化学名を有し架橋されている重合物のいずれであってもよく、具体例としては、コリドンCL（BASF社製）、ポリプラスドンXL（ISP社製）、ポリプラスドンXL-10（ISP社製）、ポリプラスドンINF-10（ISP社製）等である。
水溶性高分子としては、例えば、エタノール可溶性水溶性高分子〔例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（以下、HPCと記載することがある）等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン等〕、エタノール不溶性水溶性高分子〔例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（以下、HPMCと記載することがある）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、グアーガム等〕等が挙げられる。
塩基性無機塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩が挙げられる。好ましくはマグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩である。さらに好ましくはマグネシウムの塩基性無機塩である。該ナトリウムの塩基性無機塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等が挙げられる。該カリウムの塩基性無機塩としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。該マグネシウムの塩基性無機塩としては、例えば、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト〔Mg6Al2(OH)16・CO3・4H2O〕および水酸化アルミナ・マグネシウム、好ましくは、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム等が挙げられる。該カルシウムの塩基性無機塩としては、例えば、沈降炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α-トコフェロール等が挙げられる。
着色剤としては、例えば、食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号等の食用色素；食用レーキ色素、ベンガラ等が挙げられる。
甘味剤としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン二カリウム、アスパルテーム、ステビア、ソーマチン等が挙げられる。
酸味剤としては、例えば、クエン酸（無水クエン酸）、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
発泡剤としては、例えば、重曹等が挙げられる。
香料としては、合成物および天然物のいずれでもよく、例えば、レモン、ライム、オレンジ、メントール、ストロベリー等が挙げられる。
【００２３】
パツリンは、自体公知の方法に従い、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤等の上記担体を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。腸溶性製剤とする場合、腸溶層と薬剤含有層との間に両層の分離を目的として、自体公知の方法により中間層を設けることもできる。
【００２４】
パツリンを例えば口腔内崩壊錠とする場合、例えば、結晶セルロースおよび乳糖を含有する核を、パツリンおよび必要により塩基性無機塩で被覆し、さらに水溶性高分子含有被覆層で被覆して組成物を得、得られた組成物をポリエチレングリコール含有腸溶性被覆層で被覆し、次にクエン酸トリエチル含有腸溶性被覆層で被覆し、さらにポリエチレングリコール含有腸溶性被覆層で被覆し、最後にマンニトールで被覆して細粒を得、得られた細粒と添加剤とを混合し、成形する方法によって製造することができる。
【００２５】
上記の腸溶性被覆層としては、例えば、セルロースアセテートフタレート(CAP)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、メタアクリル酸共重合体〔例えば、オイドラギット（Eudragit） L30D-55（商品名；レーム社製）、コリコートMAE30DP（商品名；BASF社製）、ポリキッドPA30（商品名；三洋化成社製）等〕、カルボキシメチルエチルセルロース、セラック等の水系腸溶性高分子基剤；メタアクリル酸共重合体〔例えば、オイドラギットNE30D（商品名）、オイドラギットRL30D（商品名）、オイドラギットRS30D（商品名）等〕等の徐放性基剤；水溶性高分子；クエン酸トリエチル、ポリエチレングリコール、アセチル化モノグリセリド、トリアセチン、ヒマシ油等の可塑剤等の一種または二種以上混合したもの等からなる層が挙げられる。
【００２６】
上記の添加剤としては、例えば、水溶性糖アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、還元澱粉糖化物、キシリトール、還元パラチノース、エリスリトール等）、結晶セルロース（例えば、セオラスKG 801、アビセルPH 101、アビセルPH 102、アビセルPH 301、アビセルPH 302、アビセルRC-591（結晶セルロース・カルメロースナトリウム）等）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、LH-22、LH-32、LH-23、LH-33（信越化学（株））およびこれらの混合物等）等が挙げられ、さらに結合剤、酸味料、発泡剤、甘味剤、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、賦形剤、崩壊剤等も用いられる。
【００２７】
上述の通り、パツリンは、本発明の排出ポンプの排出基質である抗菌薬に耐性な細菌の、該抗菌薬に対する感受性増強もしくは付与薬（脱耐性化薬）として機能する。従って、本発明はまた、パツリンと、細菌の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬とを組み合わせてなる、該細菌に対する抗菌剤（以下、本発明の併用剤ともいう）を提供する。本発明の併用剤は、上記した本発明の排出ポンプを発現する細菌であれば、いかなる菌株に対しても使用可能であるが、該排出ポンプの機能亢進（例えば緑膿菌の場合、mexX-mexYオペロンの制御遺伝子の変異や、生育ストレスに適応したMexY排出ポンプの発現上昇を含む）により多剤耐性を獲得した緑膿菌に対して、特に有用である。
【００２８】
「本発明の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬」としては、本発明の排出ポンプによって菌体外に排出される抗菌薬であれば、該排出ポンプに特異的な基質であっても、非特異的な基質であってもよい。好ましくは、他の薬剤排出ポンプ（例えば緑膿菌の場合、MexAB-OprM、MexCD-OprJ等）よりも本発明の排出ポンプに対する選択性が高い抗菌薬であり、より好ましくは本発明の排出ポンプに特異的な抗菌薬である。本発明の排出ポンプに特異的な抗菌薬としては、例えば、アミノ配糖体系抗菌薬（例: アミカシン(AMK)、トブラマイシン(TOB)、ストレプトマイシン(SM)、ネオマイシン(NM)、カナマイシン(KM)、ゲンタマイシン(GM)等）などが挙げられる。また、排出ポンプ非特異的な抗菌薬としては、例えば、キノロン系抗菌薬（例: シプロフロキサシン(CPFX)、レボフロキサシン(LVFX)、ナリジキシン酸(NA)、ピロミジン酸(PA)、ピペミジン酸(PPA)、シノキサシン(CNX)、ノルフロキサシン(NFLX)、オフロキサシン(OFLX)、エノキサシン(ENX)、トスフロキサシン(TFLX)、スパルフロキサシン(SPFX)等）、マクロライド系抗菌薬（例: エリスロマイシン(EM)、オレアンドマイシン(OM)、スピラマイシン(SPM)、クラリスロマイシン(CAM)等）、テトラサイクリン系抗菌薬（例: テトラサイクリン(TC)、クロルテトラサイクリン(CTC)、オキシテトラサイクリン(OTC)、ミノサイクリン(MINO)等）、リンコマイシン(LCM)、クロラムフェノコール(CP)、カルベニシリン(CBPC)及びスルベニシリン(SBPC)を除くほとんどのペニシリン系抗菌薬（例: ペニシリンG(PCG)、クロキサシリン(MCIPC)、ナフシリン(NFPC)、アモキシリン(AMPC)、ピペラシリン(PIPC)、アンピシリン(ABPC)等）、セフスロジン(CFS)及びセフタジジム(CAZ)を除くほとんどのセフェム系抗菌薬（例: セファマンドール(CMD)、セフロキシム(CXM)、セフォペラゾン(CPZ)、セフォタキシム(CTX)、セフチジキシム(CZX)、セフトリアゾン(CTRX)、セフピロム(CPR)、セフェピム(CFPM)、セフォゾプラン(CZOP)、セフォセリス(CFSL)、セフォキシチン(CFX)等）、イミペネム(IPM)などを除くカルバペネム系抗菌薬（例: メロペネム(MEPM)、ドリペネム(DRPM)等）、ホスホマイシン(FOM)、サルファ剤(例: トリメプリム(TMP)、スルファメトキサザール(SMX)等)、リファンピシン(RFP)などが挙げられる。
一方、本発明の排出ポンプにより排出されない抗菌薬としては、緑膿菌のMexBに特異的な一部のβ-ラクタム系抗菌薬（例: カルベニシリン(CBPC)、スルベニシリン(SBPC)、セフタジジム(CAZ)、モキサラクタム(LMOX)、アズトレオナム(AZT)等）、並びにノボビオシン(NV)、セフスロジン(CFS)、フロモキセフ(FMOS)が挙げられる。
緑膿菌に対して元来強い抗菌活性を有する抗菌薬として、カルバペネム系抗菌薬、フルオロキノロン系抗菌薬及びアミノ配糖体系抗菌薬が挙げられるのが、MexY排出ポンプ特異的なアミカシン等のアミノ配糖体系抗菌薬が、パツリンとの併用抗菌薬として、特に好ましく例示される。
【００２９】
本発明の排出ポンプの基質となり得る抗菌薬は、パツリンと、自体公知の方法に従って混合し、ひとつの医薬組成物（例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等）中に製剤化すなわち合剤にして併用してもよく、それぞれを別々に製剤化し、同一対象に対して同時にまたは時間差をおいて投与してもよい。抗菌薬の投与量は、投与対象、投与ルート、症状等によっても異なるし、また、抗菌薬の排出ポンプ選択性の程度によっても異なるが、使用する抗菌薬に対して感受性の細菌が起炎菌となる感染症において、通常使用される投与量で使用することができる。
【００３０】
本発明の併用剤は、本発明の排出ポンプを有する細菌、好ましくは緑膿菌等のグラム陰性病原菌、特にMDRPの感染症（例: 肺炎などの呼吸器感染症、肝・胆道系感染症、創傷感染症、腎盂腎炎・複雑性尿路感染症、扁桃炎、細菌性中耳炎・副鼻腔炎、皮膚・軟部組織感染症、敗血症、心内膜炎、腹膜炎、胸膜炎、髄核炎、骨髄炎等）患者の治療用として用いられるほか、当該細菌の院内感染が発生した病院に入院中の無症候患者に対して感染・発症予防用に投与することもできるし（人工呼吸器管理中の患者等では接触感染も起こり得るので、接触感染予防として医療従事者にも投与され得る）、院内感染が発生した施設内の設備、器具等（例えば、水道の蛇口、シンク、製氷機、加湿器、ネブライザー、内視鏡、人工呼吸器等の湿潤環境にある設備・器具、汚染された消毒液など）の除菌用に、また、院内感染予防のために施設内の設備、器具等の汚染防止用として、例えば、液剤、噴霧剤、抗菌シートなどの形態で、汚染された、又はそのおそれのある部位に適用され得る。
【００３１】
本発明はまた、MDRPに感染した患者から分離した該緑膿菌株に、パツリン及び緑膿菌のMexY排出ポンプの基質となり得る抗菌薬（好ましくは、アミノ配糖体系抗菌薬等のMexY特異的な抗菌薬）をそれぞれ単独で、並びに併用して接触させ、それぞれを単独で接触させた場合に対して、併用して接触させた場合に、相乗的に生育が阻止された菌株を、MexY排出ポンプの機能亢進による多剤耐性機構を有する菌株であると判定することを特徴とする、病原緑膿菌株の多剤耐性機構の同定方法を提供する。
MDRP感染症患者からの病原菌の分離は、患者から採取した喀痰、膿、尿、便、血液、腹水、胸水、髄膜等を、例えばNAC寒天培地（ニッスイ）等にプレーティングして、黄緑がかった蛍光物質を産生するコロニーの形成を指標にして行うことができるが、当該技術分野で周知の他の方法を用いてもよい。緑膿菌のコロニーをピックアップして液体培養して検体培養液を調製する。
抗菌活性の試験は、例えばディスク拡散法、微量液体希釈法、あるいはそれらの組み合わせにより行うことができる。例えば、薬剤を含まない固形培地と、パツリンもしくはMexY排出ポンプにより排出される抗菌薬のいずれか一方を含む固形培地とに、被検体である臨床分離菌を播種し、前者には、円形濾紙にパツリン又は該抗菌薬を含浸させたディスクをおき、後者には、固形培地に含まれない方の薬剤を含浸させたディスクをおいて、適当な時間インキュベートし、各ディスクの周りに生じる発育阻止円の径を測定・比較して、後者のプレートで相乗的に阻止円径が拡大した場合に、被検体がMexY排出ポンプの機能亢進による多剤耐性機構を有している、従って、パツリンとMexY排出ポンプにより排出される抗菌薬とを組み合わせた治療プロトコルが有効であると、予測することができる。この際、固形培地中に含有させる薬剤濃度、ディスクに含浸させる薬剤量は、予め微量液体希釈法により決定されたMIC値に基づいて適宜選択することができる。
あるいは、後述の実施例２に示される方法を用いれば、より厳密かつ多角的に、臨床分離菌の多剤耐性機構を分析することができる。
【００３２】
本発明はまた、上記病原緑膿菌株の多剤耐性機構の同定のためのキットを提供する。当該キットは、パツリン、MexY排出ポンプの基質となり得る抗菌薬（好ましくは、アミノ配糖体系抗菌薬等のMexY特異的な抗菌薬）を少なくとも含み、さらに緑膿菌の培養に適した培地成分、ディスク拡散法に用いる円形濾紙、併用による抗菌活性の評価のためのMDRP感染症の治療用抗菌薬（ポリミキシンB(PL-B)、コリスチン(CL)、AZT/AMK併用など）を含んでもよい。あるいは、より厳密かつ多角的に多剤耐性機構を分析するためのキットにおいては、上記構成に加えて、MexBに特異的な抗菌薬（例: AZT等）、MexY/MexB非特異的抗菌薬(例: EM)、膜透過性低下により耐性となる抗菌薬（例: VCM）等をさらに含んでもよい。
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１  MDRPに対するパツリン及びMexY排出基質の併用効果
（１）パツリン及びアミカシンの併用効果
MDRPとして、緑膿菌の標準株Pseudomonas aeruginosa PAO1（アミカシンのMIC=1.25μg/mL）と比較して、mexB遺伝子及びmexY遺伝子の発現が亢進し、且つ外膜透過孔蛋白質をコードするoprD遺伝子の発現が低下した臨床分離株、MDRP No. 74（アミカシンのMIC=256μg/mL）及びMDRP No. 50（アミカシンのMIC=128μg/mL）を用いた（株式会社ビー・エム・エルより供与）。抗生物質無添加、又はMICの3/8濃度のアミカシン（MDRP No. 74: 96μg/mL; MDRP No. 50: 48μg/mL）を添加したミューラーヒントン固形培地（AppliChem社製）にMDRP No. 74又はMDRP No. 50を播種し、各プレートに、パツリン（P; 2.5, 5, 10, 20μg）又は種々の抗菌薬50μgを含浸させたディスクをおき、37℃で18時間培養し、各ディスクの周りに形成された発育阻止円径を測定した。その結果、パツリンはいずれのMDRP株に対しても20μgで弱い抗菌活性を示した（図１−１Ａ及び図２−１Ａ）。アミカシン添加プレートでは、パツリンは用量依存的にMDRPの発育を阻止した。抗生物質無添加プレートでは全く発育を阻止しなかった2.5〜10μgでも、ポリミキシンB(PL-B)50μgと同等もしくはそれ以上にMDRPの発育を阻止した（図１−１Ｂ及び図２−１Ｂ）。
以上より、パツリンとアミカシンとを併用することにより、MDRPに対して相乗的な抗菌効果が得られることが明らかとなった。
【００３５】
（２）パツリン及びエリスロマイシンの併用効果
MDRPとして、MDRP No. 74（エリスロマイシンのMIC=512μg/mL）及びMDRP No. 50（エリスロマイシンのMIC=256μg/mL）を用いた。64μg/mLのエリスロマイシン（MDRP No. 74: MICの1/8濃度、MDRP No. 50: MICの1/4濃度）を添加したミューラーヒントン固形培地（AppliChem社製）にMDRP No. 74又はMDRP No. 50を播種し、各プレートに、パツリン（P; 2.5, 5, 10, 20μg）又は種々の抗菌薬50μgを含浸させたディスクをおき、37℃で18時間培養し、各ディスクの周りに形成された発育阻止円径を測定した。その結果、エリスロマイシン添加プレートでは、パツリンは用量依存的にMDRPの発育を阻止した。抗生物質無添加プレート（図１−１Ａおよび図２−１Ａ）では全く発育を阻止しなかった5〜10μgでも、MDRPの発育を阻止した（図１−２Ｃ及び図２−２Ｃ）。
以上より、パツリンとエリスロマイシンとを併用することにより、MDRPに対する抗菌活性が増強されることが明らかとなった。
【００３６】
（３）パツリン及びクロラムフェニコールの併用効果
MDRPとして、MDRP No. 74（クロラムフェニコールのMIC=256μg/mL）及びMDRP No. 50（クロラムフェニコールのMIC=256μg/mL）を用いた。又はMICの1/2濃度のクロラムフェニコール128μg/mLを添加したミューラーヒントン固形培地（AppliChem社製）にMDRP No. 74又はMDRP No. 50を播種し、各プレートに、パツリン（P; 2.5, 5, 10, 20μg）又は種々の抗菌薬50μgを含浸させたディスクをおき、37℃で18時間培養し、各ディスクの周りに形成された発育阻止円径を測定した。その結果、クロラムフェニコール添加プレートでは、パツリンは用量依存的にMDRPの発育を阻止した。抗生物質無添加プレート（図１−１Ａおよび図２−１Ａ）では全く発育を阻止しなかった10μgでも、MDRPの発育を阻止した（図１−２Ｄ及び図２−２Ｄ）。
以上より、パツリンとクロラムフェニコールとを併用することにより、MDRPに対する抗菌活性が増強されることが明らかとなった。
【００３７】
（４）パツリン及びテトラサイクリンの併用効果
MDRPとして、MDRP No. 74（テトラサイクリンのMIC=128μg/mL）及びMDRP No. 50（テトラサイクリンのMIC=128μg/mL）を用いた。MICの1/2濃度のテトラサイクリン64μg/mLを添加したミューラーヒントン固形培地（AppliChem社製）にMDRP No. 74又はMDRP No. 50を播種し、各プレートに、パツリン（P; 2.5, 5, 10, 20μg）又は種々の抗菌薬50μgを含浸させたディスクをおき、37℃で18時間培養し、各ディスクの周りに形成された発育阻止円径を測定した。その結果、テトラサイクリン添加プレートでは、パツリンは用量依存的にMDRPの発育を阻止した。抗生物質無添加プレート（図１−１Ａおよび図２−１Ａ）では全く発育を阻止しなかった10μgでも、MDRPの発育を阻止した（図１−３Ｅ及び図２−３Ｅ）。
以上より、パツリンとテトラサイクリンとを併用することにより、MDRPに対する抗菌活性が増強されることが明らかとなった。
【００３８】
実施例２  パツリン・アミカシン併用効果のメカニズム確認
実施例１で観察されたMDRPの増殖に及ぼすパツリンとアミカシンとの併用効果のメカニズムを解明するために、ディスク拡散法を用いて、パツリン（パツリン産生菌PSTF0045の培養抽出液20μL）を含浸させたディスクを中心にして、4方向に等間隔で、アミカシン（AMK; MexY特異的排出基質で膜透過性良）、アズトレオナム（AZT; MexB特異的排出基質で膜透過性良）、エリスロマイシン（EM; MexB及びMexYの両方の基質となり得るが、MexBよりもMexYに選択性が高い。膜透過性はやや不良）又はバンコマイシン（VCM; 膜難透過性）50μgを含浸させたディスクを配置して培養を行い、阻止円の形成を観察した。その結果、AZTはディスクの中心から同心円状に阻止円を形成したのに対し、AMKでは、発育が阻害された領域がパツリン含浸ディスクに近い側に偏っていた（図３）。MexBよりもMexYに選択性が高いEMでも、阻止円は若干パツリン含浸ディスク側に傾いたが、パツリンとの併用効果は顕著ではなかった（図３）。膜難透過性のVCMでは阻止円は形成されず、併用効果は認められなかった（図３）。膜透過性の悪いVCMやEMとの併用効果がないか、弱いことから、パツリンとのアミカシンとの併用効果は、パツリンによる膜透過性亢進によるものではないと考えられた。
以上の結果を総合すると、MDRPに対する抗菌活性におけるパツリンとアミカシンとの併用効果は、パツリンのMexY排出ポンプ阻害作用により、アミカシンの菌体外への排出が抑制され、アミカシンンの菌体内濃度が抗菌効果を発揮するのに十分な程度に維持されたことによると結論された。従って、パツリンは、アミカシンだけでなく、MexY排出ポンプにより排出され得る任意の抗菌薬に対して、併用による抗菌活性増強効果を奏するものと考えられた。
【００３９】
実施例３  緑膿菌及びMDRPに対するパツリンとアミカシンとの併用効果
試験菌として、緑膿菌標準株Pseudomonas aeruginosa PAO1（ATCC 15962）、多剤耐性緑膿菌株MDRP NCGM2.S1（Antimicrob. Agents Chemother., 49 (2005) 3734-3742）、PAO1由来のmexAB mexCD-oprJ mexEF-oprN欠損株YM34（FEMS Microbiol. Lett., 202 (2001) 139-143）を用いた。パツリンの濃度は各試験菌に対するMIC以下の濃度（0〜64 μg/ml）とし、パツリン存在下でのアミカシンのMICを試験した。MDRP NCGM2.S1株に対しアミカシン単独でのMICは64 μg/mlであったが、パツリン（64 μg/ml）存在下では16 μg/mlに低下した。PAO1株に対しアミカシン単独でのMICは2 μg/mlであったが、パツリン（8 μg/ml）存在下では0.5 μg/mlに低下した。YM34株に対しても、アミカシン単独でのMIC 4 μg/mlがパツリン（2 μg/ml）存在下で1 μg/mlに低下していた。即ち、いずれの緑膿菌に対してもパツリンがアミカシンの抗菌作用を増強させていた（表１）。
【００４０】
【表１】
2015113290.tif 000003
【００４１】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
【００４２】
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、パツリンを主成分とする、緑膿菌のMexY又はそれと高い相同性を有する他の細菌の排出ポンプ（本発明の排出ポンプ）の阻害剤、パツリンと、本発明の排出ポンプにより排出される抗菌薬との併用による、該排出ポンプを有する細菌、好ましくは緑膿菌等のグラム陰性病原菌、特にMDRPの感染症の治療・予防剤、当該菌の除菌剤が提供される。パツリンはヒトへの毒性があるため、これまで医薬用途が顧みられてこなかったが、少なくとも、院内感染の感染源となり得る病院内の設備や器具等の除菌には、直ぐにでも本技術を実用化可能である。また、ヒトへの副作用のない十分に低用量の条件でも、併用薬の抗菌活性が発揮されるので、MDRP感染症に対する治療薬（医薬）としても有望である。
【図１−１】
2015113290.tif 000004
【図１−２】
2015113290.tif 000005
【図１−３】
2015113290.tif 000006
【図２−１】
2015113290.tif 000007
【図２−２】
2015113290.tif 000008
【図２−３】
2015113290.tif 000009
【図３】
2015113290.tif 000010
【配列表】
2015113290000001.app