(57)【要約】【課題】迅速かつ網羅的に行うことができ、精度の高い真菌の鑑別方法、前記真菌の鑑別方法の対照として用いることができる真菌鑑別用アレイ、及び前記真菌の鑑別方法に用いることができる真菌鑑別用キットの提供。【解決手段】被検試料、及び対照について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により遺伝子を検出する遺伝子検出工程と、前記被検試料、及び前記対照で検出された遺伝子を比較し、前記被検試料における真菌を鑑別する鑑別工程とを含み、前記対照が、特定の真菌を含むアレイである真菌の鑑別方法などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料、及び対照について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により遺伝子を検出する遺伝子検出工程と、
前記被検試料、及び前記対照で検出された遺伝子を比較し、前記被検試料における真菌を鑑別する鑑別工程とを含み、
前記対照が、以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むアレイであることを特徴とする真菌の鑑別方法。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
【請求項２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いるプローブが、ＰＮＡプローブ及びＤＮＡプローブのいずれかである請求項１に記載の真菌の鑑別方法。
【請求項３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いるプローブが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属に属する菌を標的としたプローブ、及び真菌を標的としたプローブの少なくともいずれかを含む請求項１から２のいずれかに記載の真菌の鑑別方法。
【請求項４】
アレイが、少なくとも以下に記載の真菌を含む請求項１から３のいずれかに記載の真菌の鑑別方法。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
【請求項５】
アレイが、少なくとも以下に記載の真菌を含む請求項１から３のいずれかに記載の真菌の鑑別方法。
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
【請求項６】
被検試料が、病理組織、及び細胞診断材料のいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の真菌の鑑別方法。
【請求項７】
以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むことを特徴とする真菌鑑別用アレイ。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
【請求項８】
少なくとも以下に記載の真菌を含む請求項７に記載の真菌鑑別用アレイ。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
【請求項９】
少なくとも以下に記載の真菌を含む請求項７に記載の真菌鑑別用アレイ。
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
【請求項１０】
ブロック状である請求項７から９のいずれかに記載の真菌鑑別用アレイ。
【請求項１１】
固相支持体上に固定したものである請求項７から１０のいずれかに記載の真菌鑑別用アレイ。
【請求項１２】
請求項７から１１のいずれかに記載の真菌鑑別用アレイと、プローブとを含むことを特徴とする真菌鑑別用キット。
【請求項１３】
プローブが、ＰＮＡプローブ及びＤＮＡプローブのいずれかである請求項１２に記載の真菌鑑別用キット。
【請求項１４】
プローブが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属に属する菌を標的としたプローブ、及び真菌を標的としたプローブの少なくともいずれかを含む請求項１２から１３のいずれかに記載の真菌鑑別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌の鑑別方法、真菌鑑別用アレイ、及び真菌鑑別用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高度医療の発展に伴い、深在性（内臓）真菌症の発生頻度は、経年的に増加傾向にある。中でも、アスペルギルス症の増加が著しい。また、接合菌症も懸念されている。
抗真菌薬の感受性は、おおむね分子系統学的分類による分類群と一致していることから、起因菌の同定は、真菌症の確定診断と同時に適切な真菌化学療法を施行する観点から重要となっている。
しかしながら、確定診断には、真菌学的検査が必須であるが、培養検査の陽性率が低く、かつ、培養には時間がかかるという問題がある。また、確定診断後に治療を開始した場合の治療成功率は低いため、実際の臨床では、深在性真菌症の疑いとして経験的な判断で抗真菌薬の投薬が行われているが、起因菌が多種に渡るという特徴を有する疾患であることから、第一選択薬では全菌種に有効でないため必ずしも高い効果が得られないという問題がある。そのため、第一選択薬が有効でなかった場合には、速やかに薬を変更する必要があり、迅速かつ網羅的な診断技術の開発が求められている。
【０００３】
これまでに、ＰＣＲ法による深在性真菌症起因菌の検出法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。前記ＰＣＲ法は、感度及び特異性に優れるものの、コンタミネーションによる偽陽性や、強固な細胞壁を有する真菌からのＤＮＡの抽出の困難さなどの問題がある。そのため、信頼性が認知され、広く普及する診断法の確立には至っていない。
【０００４】
更に、病理組織内では必ずしも典型的な菌形態を示すとは限らず、菌形態のみで菌種を特定することは困難であるという問題もある。特に、新興病原真菌と呼ばれるもののうち、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属やＰｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ属等の糸状菌は、各種抗真菌薬に対する感受性が異なるにも関わらず、組織内における形態学的類似性からＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属との鑑別が事実上不可能であるという問題がある。また、酵母であるものの糸状菌様の形態をとるＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属と、Ｃａｎｄｉｄａ属とを形態学的に鑑別することも困難であるという問題がある。
また、病理組織からＰＣＲ法により真菌を検出しようとすると、ホルマリン固定などによりＤＮＡの断片化が亢進し、遺伝子の増幅ができず、偽陰性となってしまうことがあるという問題もある。
【０００５】
したがって、迅速かつ網羅的に行うことができ、精度の高い診断技術の開発が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−５４５６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、迅速かつ網羅的に行うことができ、精度の高い真菌の鑑別方法、前記真菌の鑑別方法の対照として用いることができる真菌鑑別用アレイ、及び前記真菌の鑑別方法に用いることができる真菌鑑別用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、
＜１＞  被検試料、及び対照について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により遺伝子を検出する遺伝子検出工程と、
前記被検試料、及び前記対照で検出された遺伝子を比較し、前記被検試料における真菌を鑑別する鑑別工程とを含み、
前記対照が、以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むアレイであることを特徴とする真菌の鑑別方法である。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
＜２＞  以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むことを特徴とする真菌鑑別用アレイである。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
＜３＞  前記＜２＞に記載の真菌鑑別用アレイと、プローブとを含むことを特徴とする真菌鑑別用キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、迅速かつ網羅的に行うことができ、精度の高い真菌の鑑別方法、前記真菌の鑑別方法の対照として用いることができる真菌鑑別用アレイ、及び前記真菌の鑑別方法に用いることができる真菌鑑別用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、製造例１−１で作製したアレイブロックにおける３０種の各真菌の配置を説明する図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、製造例１−２で作製したアレイブロックにおける９種の各真菌の配置を説明する図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、製造例１−２で作製したアレイブロックである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、製造例１−２で作製したアレイブロックを薄切切片とし、スライドガラスに添付した状態を示す図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、製造例１−３で作製したアレイブロックにおける６種の各真菌の配置を説明する図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例１−１のシグナルを検出した結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例１−２のシグナルを検出した結果を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、試験例１−３のシグナルを検出した結果を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、試験例１−４のシグナルを検出した結果を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、試験例１−５のシグナルを検出した結果を示す図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、試験例１−６のシグナルを検出した結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例２−１の被検試料１をＰＡＳ染色した結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例２−１の被検試料１について、プローブとして「（Ｆ）ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、試験例２−１の被検試料１について、プローブとして「（Ｅ）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、試験例２−１の被検試料１について、プローブとして「（Ｃ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例２−２の被検試料２をＰＡＳ染色した結果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例２−２の被検試料２について、プローブとして「（Ｆ）ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、試験例２−２の被検試料２について、プローブとして「（Ｅ）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、試験例２−２の被検試料２について、プローブとして「（Ｃ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例２−３の被検試料３をＰＡＳ染色した結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例２−３の被検試料３について、プローブとして「（Ｆ）ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、試験例２−３の被検試料３について、プローブとして「（Ｅ）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、試験例２−３の被検試料３について、プローブとして「（Ｃ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、シグナルを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（真菌の鑑別方法、真菌鑑別用アレイ）
本発明の真菌の鑑別方法は、遺伝子検出工程と、鑑別工程とを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の真菌鑑別用アレイは、本発明の真菌の鑑別方法の対照として好適に用いることができる。
以下、本発明の真菌の鑑別方法の説明と併せて本発明の真菌鑑別用アレイを説明する。
【００１２】
＜遺伝子検出工程＞
前記遺伝子検出工程は、被検試料、及び対照について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により遺伝子を検出する工程である。
【００１３】
−被検試料−
前記被検試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、病理組織、及び細胞診断材料のいずれかが好ましい。
前記病理組織の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（以下、「ホルマリン固定パラフィン」と称することがある）態様が好ましい。前記病理組織の採取部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ホルマリン固定パラフィンは、保存性に優れる点で、有利である。
【００１４】
前記細胞診断材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、喀痰、尿などが挙げられる。前記細胞診断材料は、非侵襲的に採取できる点で、有利である。
【００１５】
−対照（真菌鑑別用アレイ）−
前記対照は、以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むアレイである。前記アレイとしては、本発明の真菌鑑別用アレイを好適に用いることができる。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
【００１６】
−−真菌−−
前記アレイにおける真菌としては、前記（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含む限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属やＰｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ属など、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属と組織標本上にて鑑別が困難な真菌を鑑別することができ、また、酵母でありながら、糸状菌様の形態を示すＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属やＣａｎｄｉｄａ属と形態学的に類似する酵母菌を鑑別することでき、診断における有用性が高い点で、前記（１）、（３）、（４）、（６）、（９）、及び（１５）に記載の真菌を含む態様、前記（２）、（３）、（４）、（６）、（８）、（９）、（１５）、（１６）、及び（２４）に記載の真菌を含む態様が好ましく、前記（２）、（３）、（４）、（６）、（８）、（９）、（１５）、（１６）、及び（２４）に記載の真菌を含む態様がより好ましい。
【００１７】
前記（１）から（３０）に記載の真菌の株としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下に記載の株が好ましい。
前記（１）から（３０）に記載の真菌の株は、例えば、ＮＢＲＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ＮＩＴＥ）、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、帝京大学医真菌研究センター、独立行政法人  理化学研究所、ＣＢＳ（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）などから入手可能である。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２１株（ＮＢＲＣより入手可能）
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＮＢＲＣ  ３３０２３株（ＮＢＲＣより入手可能）
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２６株（ＮＢＲＣより入手可能）
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２２株（ＮＢＲＣより入手可能）
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＮＢＲＣ  ６３４４株（ＮＢＲＣより入手可能）
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ  ＮＢＲＣ  ５２３２株（ＮＢＲＣより入手可能）
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ  ７１５２株（ＮＢＲＣより入手可能）
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ  ＮＢＲＣ  ８０７８株（ＮＢＲＣより入手可能）
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ  ５７８０株（ＮＢＲＣより入手可能）
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４４株（ＮＢＲＣより入手可能）
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ  ＮＢＲＣ  ４４４６株（ＮＢＲＣより入手可能）
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ  ＮＢＲＣ  ５７６３株（ＮＢＲＣより入手可能）
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ  ４５５４株（ＮＢＲＣより入手可能）
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ  ＮＢＲＣ  １００２２２株（ＮＢＲＣより入手可能）
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１株（ＡＴＣＣより入手可能）
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ  ＣＢＳ２４７９Ｔ株（ＣＢＳより入手可能）
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ  ＴＩＭＭ０３１０株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ  ＴＩＭＭ１０６４株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ＴＩＭＭ０２６０株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ  ＴＩＭＭ０３０２株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ  ＴＩＭＭ０２６９株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ  ＴＩＭＭ１６６８株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ  ＴＩＭＭ０２９２株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＴＩＭＭ０３１３株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＴＩＭＭ０３５４株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ  ＴＩＭＭ２９３７株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ  ＪＣＭ３５８５株（独立行政法人  理化学研究所より入手可能）
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ  ＩＦＯ０８０８株（独立行政法人  理化学研究所より入手可能）
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＩＭＭ０９２５株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ  ＴＩＭＭ３３７６株（帝京大学医真菌研究センターより入手可能）
【００１８】
−−真菌鑑別用アレイの製造方法−−
前記真菌鑑別用アレイの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のようにして製造することが好ましい。
【００１９】
−−−真菌ブロックの製造−−−
まず、前記真菌を各真菌の培養に適した条件で培養する。前記培養に適した条件としては、特に制限はなく、公知の条件を適宜選択することができる。
次いで、前記真菌をホルマリン固定する。前記ホルマリン固定の方法としては、特に制限はなく、例えば、前記培養物を１０体積％のホルマリン溶液で１２時間〜２４時間処理した後、遠心によりホルマリン固定された真菌を回収する方法が挙げられる。
次いで、前記ホルマリン固定した真菌を、溶解させたアミロペクチン含有アガロース溶液に注入し、室温で固定させる。その後、パラフィン包埋し、真菌ブロックを製造することができる。
前記アミロペクチン含有アガロースにおけるアミロペクチンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２体積％が好ましい。
前記パラフィン包埋の方法としては、特に制限はなく、通常の病理組織の標本作製と同様に行うことができる。
【００２０】
−−−アレイの製造−−−
前記真菌ブロックを用いてアレイを製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下のようにして製造することができる。
４０℃の湯煎に前記真菌ブロックを入れて５分間加温した後、室温で３０秒程度冷却してから、ティッシュ・アレイヤー装置（東屋医科器械社、型番：ＫＩＮ−２）を用いて２ｍｍ径の円柱を作製する。指定のティッシュブロック２ｍｍ径（４８穴）を包埋皿（包埋リング用  ４号）（サクラファインテックジャパン社）に載せ、セロハンテープで周りを固定し、包埋センター（ティシュー・テック社、型番：ディスペンシング・コンソールＩＶ）のホットプレート部分で包埋皿にパラフィンを１／５くらいまで流し込み、ティッシュブロック２ｍｍ径の穴に、作製した２ｍｍ径の各円柱を薄切面が下になるよう差し込み、押し出し棒で上部から押し込む。更に、コールドスポットにて上部より再度、押し込み、薄切面が平面になるようにする。冷却板に載せた後、パラフィンが固体化し、白色になったところで、各ブロックをパラフィン融点より５℃高く設定した６４℃の孵卵器で４５分間前後加温し、パラフィンと臓器を馴染ませ、−２０℃の冷凍庫で１５分間冷却し、包埋皿を外し、ティッシュ・アレイブロックを作製することができる。
【００２１】
前記アレイの形状、構造、大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブロック状、切片状などが挙げられる。
前記アレイは、固相支持体上に固定されたものであってもよい。前記固相支持体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スライドガラスなどが挙げられる。前記固相支持体上に固定されたアレイの態様としては、例えば、前記ブロック状のアレイの薄切切片をスライドガラス上に固定した態様などが挙げられる。前記薄切切片の厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１μｍ〜５μｍなどが挙げられる。
【００２２】
−ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法−
前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法の方法としては、特に制限はなく、公知の方法により行うことができ、例えば、前処理（後述する「前処理工程」参照）した同一のスライドガラス上の前記被検試料、及び対照の薄切切片に前記プローブを含むハイブリダイゼーション液を添加し、処理する方法が挙げられる。
前記ハイブリダイゼーションの温度としては、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｔｍ値マイナス２５℃程度が好ましい。
前記ハイブリダイゼーションの具体例としては、例えば、前記プローブを含むハイブリダイゼーション液を添加し、９４℃で５分間変性させた後、ＤＮＡプローブの場合は、５０℃で一晩処理する方法、ＰＮＡプローブの場合は５６℃で９０分間処理する方法、などが挙げられる。
前記ハイブリダイゼーション後は、非特異的にハイブリダイズしたプローブを除去するために洗浄処理を行うことが好ましい。前記洗浄処理としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００２３】
−−プローブ−−
前記プローブの種類としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡプローブ、ペプチド核酸プローブ（以下、「ＰＮＡプローブ」と称することがある）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ＰＮＡプローブが、特異性と迅速性に優れている点で、有利である。
なお、前記ＰＮＡプローブは、Ｎ−グリシンを骨格としてそれらが酸アミド結合（ペプチド結合）でオリゴマーを形成している通常の核酸のアナログである。
【００２４】
前記プローブとしては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属に属する菌を標的としたプローブ、及び真菌を標的としたプローブの少なくともいずれかを含むことが、抗真菌剤の選択を目的とした菌の鑑別により適する点で、好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記プローブは、菌種内の保存性が高く、コピー数が多い遺伝子を標的とすることも好ましい。
【００２５】
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌を標的としたプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかが好ましい。前記（Ａ）であると、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌と、Ｍｕｃｏｒ属の菌及びＦｕｓａｒｉｕｍ属の菌とを高い精度で鑑別することができ、前記（Ｂ）であると、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓを特異的に検出でき、同じＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属でありながら、ポリエンマクロライド系抗真菌剤に抵抗性を示すことが知られているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓは検出されない点で、有利である。
【００２６】
（Ａ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＬＰ）を標的としたＤＮＡプローブ（配列番号：１及び２のいずれかで表される５８３塩基からなるＤＮＡプローブ）
前記（Ａ）のプローブは、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、ＰＣＲ法にて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＡＬＰ遺伝子領域を増幅することにより得ることができる。
＜フォワードプライマー＞
５’−ＧＣＣＴＡＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：３）
＜リバースプライマー＞
５’−ＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号：４）
前記（Ａ）のプローブは、１個若しくは数個の塩基が、置換、欠失、付加、及び挿入の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるものであってもよい。また、前記（Ａ）のプローブは、配列番号１及び２のいずれかで表されるプローブの両者を使用してもよいし、どちらか一方を単独で使用してもよい。
【００２７】
（Ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）を標的としたＤＮＡプローブ（配列番号：５及び６のいずれかで表される２５４塩基からなるＤＮＡプローブ）
前記（Ｂ）のプローブは、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、ＰＣＲ法にて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のＬＴＲの遺伝子領域を増幅することにより得ることができる。
＜フォワードプライマー＞
５’−ＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：７）
＜リバースプライマー＞
５’−ＧＧＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号：８）
前記（Ｂ）のプローブは、１個若しくは数個の塩基が、置換、欠失、付加、及び挿入の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるものであってもよい。また、前記（Ｂ）のプローブは、配列番号５及び６のいずれかで表されるプローブの両者を使用してもよいし、どちらか一方を単独で使用してもよい。
【００２８】
前記Ｃａｎｄｉｄａ属に属する菌を標的としたプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の（Ｃ）が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを特異的に検出でき、形態学的に区別することが困難であるＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属との鑑別が可能な点で、好ましい。
（Ｃ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ
Ｎ末端−ｔａｃｔｔｇｔｇｃｇｃｔａｔｃｇｇｔ−Ｃ末端（配列番号：９）
前記（Ｃ）のプローブは、１個若しくは数個の塩基が、置換、欠失、付加、及び挿入の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるものであってもよい。
【００２９】
前記Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌を標的としたプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の（Ｄ）が、組織標本上にてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属と鑑別が困難なＦｕｓａｒｉｕｍ属を特異的に検出可能な点で、好ましい。
（Ｄ）Ｆｕｓａｒｉｕｍ属の２８Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ
Ｎ末端−ｇａｔｇａｔｃａａｃｃａａｇｃｃｃａ−Ｃ末端（配列番号：１０）
前記（Ｄ）のプローブは、１個若しくは数個の塩基が、置換、欠失、付加、及び挿入の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるものであってもよい。
【００３０】
前記Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属に属する菌を標的としたプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の（Ｅ）が、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉを特異的に検出でき、形態学的に区別することが困難であるＣａｎｄｉｄａ属との鑑別が可能な点で、好ましい。
（Ｅ）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ
Ｎ末端−ｃｇｇａｃａａｔｃｇａａｇａｃ−Ｃ末端（配列番号：１１）
前記（Ｅ）のプローブは、１個若しくは数個の塩基が、置換、欠失、付加、及び挿入の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるものであってもよい。
【００３１】
前記真菌を標的としたプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の（Ｆ）が、あらゆる真菌に共通な領域を標的としたプローブであり、標本中の核酸の保存性の評価が可能な点で、好ましい。
（Ｆ）  多くの病原真菌の２８Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ（以下、「ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ＰＮＡプローブ」と称することがある）
Ｎ末端−ｔａｃｔｔｇｔｇｃｇｃｔａｔｃｇｇｔ−Ｃ末端（配列番号：１２）
前記（Ｆ）のプローブは、１個若しくは数個の塩基が、置換、欠失、付加、及び挿入の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるものであってもよい。
【００３２】
前記プローブの標識としては、特に制限はなく、公知の標識を適宜選択することができ、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
前記標識の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＰＮＡプローブでは、Ｎ末端にリンカーを介して配置させることができる。
前記リンカーとしては、特に制限はなく、公知のリンカーを適宜選択することができ、例えば、アミノエトキシエトキシアセテート（ＡＥＥＡ）などが挙げられる。前記リンカーの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＰＮＡプローブは、例えば、化学合成により製造することができる。
【００３３】
前記ＤＮＡプローブを標識する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法により、前記ＤＮＡプローブとする領域を増幅する際に、前記標識で標識された塩基を取り込ませることにより、標識されたＤＮＡプローブを製造することができる。
【００３４】
−遺伝子の検出−
前記遺伝子の検出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができ、例えば、蛍光顕微鏡により前記標識又は前記標識に対する蛍光標識二次抗体の蛍光シグナルを検出することにより、遺伝子を検出することができる。
前記蛍光標識二次抗体の蛍光シグナルと検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記標識としてＦＩＴＣを用いる場合には、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ロッシュダイアグノスティクス社製）とペルオキシダーゼ標識ポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社製）による酵素抗体法を施し、ニッケル・コバルトＤＡＢ法により、遺伝子を検出することができる。
【００３５】
＜鑑別工程＞
前記鑑別工程は、前記被検試料、及び前記対照で検出された遺伝子を比較し、前記被検試料における真菌を鑑別する工程である。
【００３６】
−鑑別−
前記鑑別は、前記被検試料、及び前記対照で検出された遺伝子を比較することにより行うことができる。即ち、前記被検試料で遺伝子が検出された場合において、前記対照の中で同様に遺伝子が検出された真菌を確認することにより、前記被検試料における真菌を鑑別することができる。
【００３７】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前処理工程などが挙げられる。
前記前処理工程は、前記被検試料、及び前記対照について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う前に処理する工程をいう。前記前処理としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脱パラフィン処理、再水和処理、標的核酸を露出させる処理などが挙げられる。
前記脱パラフィン処理、及び前記再水和処理の方法としては、特に制限はなく、公知のホルマリン固定パラフィン切片について行う方法と同様に行うことができる。
前記標的核酸を露出させる処理の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液に前記被検試料、及び前記対照を入れ、９８℃のウォーターバスで２０分間処理する方法、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（株式会社ニッポンジーン製）を１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１０分間処理する方法などが挙げられる。前記標的核酸を露出させる処理の方法は、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよいが、２種を併用することが好ましい。
【００３８】
（真菌鑑別用キット）
本発明の真菌鑑別用キットは、本発明の真菌鑑別用アレイと、プローブとを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の構成を含む。
【００３９】
−真菌鑑別用アレイ−
前記真菌鑑別用アレイは、上述の真菌の鑑別方法に記載した真菌鑑別用アレイを用いることができる。
【００４０】
−プローブ−
前記プローブとしては、上述の真菌の鑑別方法に記載したプローブと同様のプローブを用いることができる。
【００４１】
−その他の構成−
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション液、２×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋなどが挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下に試験例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例等に何ら限定されるものではない。
【００４３】
（製造例１−１：真菌鑑別用アレイ−１の製造）
菌株として、以下の３０種を用いた。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２１株（ＮＢＲＣより入手）
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＮＢＲＣ  ３３０２３株（ＮＢＲＣより入手）
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２６株（ＮＢＲＣより入手）
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２２株（ＮＢＲＣより入手）
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＮＢＲＣ  ６３４４株（ＮＢＲＣより入手）
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ  ＮＢＲＣ  ５２３２株（ＮＢＲＣより入手）
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＮＢＲＣ  ７１５２株（ＮＢＲＣより入手）
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ  ＮＢＲＣ  ８０７８株（ＮＢＲＣより入手）
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ  ５７８０株（ＮＢＲＣより入手）
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ  ＮＢＲＣ  ９７４４株（ＮＢＲＣより入手）
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ  ＮＢＲＣ  ４４４６株（ＮＢＲＣより入手）
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ  ＮＢＲＣ  ５７６３株（ＮＢＲＣより入手）
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ  ４５５４株（ＮＢＲＣより入手）
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ  ＮＢＲＣ  １００２２２株（ＮＢＲＣより入手）
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１株（ＡＴＣＣより入手）
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ  ＣＢＳ２４７９Ｔ株（ＣＢＳより入手）
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ  ＴＩＭＭ０３１０株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ  ＴＩＭＭ１０６４株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ＴＩＭＭ０２６０株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ  ＴＩＭＭ０３０２株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ  ＴＩＭＭ０２６９株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ  ＴＩＭＭ１６６８株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ  ＴＩＭＭ０２９２株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＴＩＭＭ０３１３株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＴＩＭＭ０３５４株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ  ＴＩＭＭ２９３７株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ  ＪＣＭ３５８５株（独立行政法人  理化学研究所より入手）
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ  ＩＦＯ０８０８株（独立行政法人  理化学研究所より入手）
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＩＭＭ０９２５株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ  ＴＩＭＭ３３７６株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
【００４４】
＜真菌ブロックの製造＞
−真菌の培養−
（Ｉ）  上記３０種の菌株のうち、かび（糸状菌）は、培地として、ポテトデキストロースブロス（シグマ−アルドリッチ社製）を用い、２５℃で４８時間から７２時間培養した。
（ＩＩ）  上記３０種の菌株のうち、Ｃａｎｄｉｄａ属以外の酵母は、培地としてＹＭＰＤブロス（０．３質量％イーストエクストラクト、０．３質量％モルトエクストラクト、０．５質量％ペプトン、１．０質量％グルコース；ベクトンディッキンソン社製）を用い、２５℃で一晩培養した。
（ＩＩＩ）  上記３０種の菌株のうち、Ｃａｎｄｉｄａ属の菌は、培地として１０体積％のＦＣＳ（シグマ−アルドリッチ社製）を含有する１９９培地（日水製薬株式会社製）を用い、３７℃で一晩培養した。
【００４５】
−ホルマリン固定−
培養した真菌株を５０ｍＬのコニカルチューブ（商品名：ファルコン）に入れ、１０％ホルマリン溶液にて１２時間〜２４時間固定を行った。その後、糸状菌は、１，５００ｒｐｍで１５分間、酵母菌は、１，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行い、アスピレーターを用いてホルマリン溶液の除去を行った。次いで、生理食塩水（大塚製薬株式会社製）を適量添加し、転倒混和後、同条件にて遠心分離を行った。生理食塩水の操作は３回行い、最後に生理食塩水を入れ、４℃又は−２０℃で保存した。
【００４６】
−パラフィン包埋ブロックの作製−
アミロペクチン（白玉粉、株式会社幸田商店Ｋ３）  ０．８ｇを採取し、薬さじで粉末状にし、超純水（メルク株式会社  超純水装置）８０ｍＬを添加、混合させた後、煮沸した。アガロース（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（ＴＭ）Ａｇａｒｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））  ０．８ｇを採取し、前記煮沸したアミロペクチン溶液の白濁した上清４０ｍＬを加え、電子レンジで３回〜５回程度煮沸させた。これを６０℃になるまで冷却した。
ホルマリン浮遊液とした真菌株を生理食塩水で洗浄後、４℃に保存した真菌株を遠心分離し、上清を捨てた（遠心条件：糸状菌は、１，５００ｒｐｍで１５分間、酵母菌は、１，０００ｒｐｍで１５分間）。糸状菌は薬さじ３杯、酵母菌は滅菌スポイトで０．５ｍＬを採取し、シリコン製容器に入れ、アミロペクチン含有アガロース溶液  ２ｍＬを加え、薬さじで混ぜた後に固形化した。
上記で作製した各ブロックを５％〜１０％ホルマリン溶液に１２時間〜２４時間固定し、ディスペンシング・コンソールＩＶ（ティッシュー・テック社）にて脱水及び透徹を行い、各ブロックの包埋を行った。
【００４７】
＜アレイブロックの製造＞
４０℃の湯煎に各真菌株のパラフィン包埋ブロックを入れて５分間加温した後、室温で３０秒程度冷却してから、ティッシュ・アレイヤー装置（東屋医科器械社、型番：ＫＩＮ−２、特許番号：３８７７２１３）を用いて２ｍｍ径の円柱を作製した。指定のティッシュブロック２ｍｍ径（４８穴）を包埋皿（包埋リング用  ４号）（サクラファインテックジャパン社）に載せ、セロハンテープで周りを固定し、包埋センター（ティシュー・テック社、型番：ディスペンシング・コンソールＩＶ）のホットプレート部分で包埋皿にパラフィンを１／５くらいまで流し込み、ティッシュブロック２ｍｍ径の穴に、作製した２ｍｍ径の各円柱を薄切面が下になるよう差し込み、押し出し棒で上部から押し込んだ。更に、コールドスポットにて上部より再度、押し込み、薄切面が平面になるようにした。冷却板にのせた後、パラフィンが固体化し、白色になったところで、各ブロックをパラフィン融点より５℃高く設定した６４℃の孵卵器で４５分間前後加温し、パラフィンと臓器を馴染ませ、−２０℃の冷凍庫で１５分間冷却し、包埋皿を外し、ティッシュ・アレイブロックを作製した。
図１Ａに前記アレイブロックにおける各真菌の配置を示す。図１Ａ中、１から３０は、前記（１）から（３０）の真菌にそれぞれ対応する。
【００４８】
（製造例１−２：真菌鑑別用アレイ−２の製造）
製造例１−１において、菌株を以下の９種に代えた以外は、製造例１−１と同様にして、ティッシュ・アレイブロックを作製した。
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＮＢＲＣ  ３３０２３株（ＮＢＲＣより入手）
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２６株（ＮＢＲＣより入手）
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２２株（ＮＢＲＣより入手）
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ  ＮＢＲＣ  ５２３２株（ＮＢＲＣより入手）
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ  ＮＢＲＣ  ８０７８株（ＮＢＲＣより入手）
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ  ５７８０株（ＮＢＲＣより入手）
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１株（ＡＴＣＣより入手）
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ  ＣＢＳ２４７９Ｔ株（ＣＢＳより入手）
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＴＩＭＭ０３１３株（帝京大学医真菌研究センターより入手）
【００４９】
図１Ｂに前記アレイブロックにおける各真菌の配置を示す。図１Ｂ中、２〜４、６、８、９、１５、１６、及び２４は、前記（２）〜（４）、（６）、（８）、（９）、（１５）、（１６）、及び（２４）の真菌にそれぞれ対応する。また、図１Ｃに前記アレイブロックを示し、図１Ｄに前記アレイブロックを薄切切片とし、スライドガラスに添付した状態を示す。
【００５０】
（製造例１−３：真菌鑑別用アレイ−３の製造）
製造例１−１において、菌株を以下の６種に代えた以外は、製造例１−１と同様にして、ティッシュ・アレイブロックを作製した。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２１株（ＮＢＲＣより入手）
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２６株（ＮＢＲＣより入手）
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＮＢＲＣ  ３３０２２株（ＮＢＲＣより入手）
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ  ＮＢＲＣ  ５２３２株（ＮＢＲＣより入手）
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ  ５７８０株（ＮＢＲＣより入手）
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１株（ＡＴＣＣより入手）
【００５１】
図１Ｅに前記アレイブロックにおける各真菌の配置を示す。図１Ｅ中、１、３、４、６、９、及び１５は、前記（１）、（３）、（４）、（６）、（９）、及び（１５）の真菌にそれぞれ対応する。
【００５２】
（製造例２−１：ＤＮＡプローブ（Ａ）の製造）
（Ａ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＬＰ）を標的としたプローブ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＡＬＰを標的としたプローブとして、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識された５８３ｂｐ（配列番号：１及び２）のＤＮＡプローブ（以下、「ＤＮＡプローブ（Ａ）」と称することがある）を以下のようにして調製した。
前記ＤＮＡプローブ（Ａ）は、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、ＰＣＲ法にて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＡＬＰ遺伝子領域を増幅する際に、ＦＩＴＣ標識塩基を取り込むことにより、調製した。
＜フォワードプライマー＞
５’−ＧＣＣＴＡＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：３）
＜リバースプライマー＞
５’−ＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号：４）
【００５３】
（製造例２−２：ＤＮＡプローブ（Ｂ）の製造）
（Ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）を標的としたプローブ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のＬＴＲを標的としたプローブとして、ＦＩＴＣで標識された２５４ｂｐ（配列番号：５及び６）のＤＮＡプローブ（以下、「ＤＮＡプローブ（Ｂ）」と称することがある）を以下のようにして調製した。
前記ＤＮＡプローブ（Ｂ）は、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、ＰＣＲ法にて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のＬＴＲの遺伝子領域を増幅する際に、ＦＩＴＣ標識塩基を取り込むことにより、調製した。
＜フォワードプライマー＞
５’−ＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：７）
＜リバースプライマー＞
５’−ＧＧＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号：８）
【００５４】
（製造例３−１〜３−４：ＰＮＡプローブ（Ｃ）〜（Ｆ）の製造）
ＰＮＡプローブとして、以下の４種を用意した（株式会社ファスマック製）。なお、いずれのプローブも、Ｎ末端側にリンカーである２つのアミノエトキシエトキシアセテート（ＡＥＥＡ）を介して標識であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が結合している。
【００５５】
＜製造例３−１：ＰＮＡプローブ（Ｃ）＞
（Ｃ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ
Ｎ末端−ｔａｃｔｔｇｔｇｃｇｃｔａｔｃｇｇｔ−Ｃ末端（配列番号：９）
なお、前記ＰＮＡプローブ（Ｃ）は、「Ｏｌｉｖｅｉｒａ  Ｋ，  Ｈａａｓｅ  Ｇ，  Ｋｕｒｔｚｍａｎ  Ｃ，  Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＪＪ，  Ｓｔｅｎｄｅｒ  Ｈ．  ２００１．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９：４１３８−４１４１．」に記載されている。
【００５６】
＜製造例３−２：ＰＮＡプローブ（Ｄ）＞
（Ｄ）Ｆｕｓａｒｉｕｍ属の２８Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ
Ｎ末端−ｇａｔｇａｔｃａａｃｃａａｇｃｃｃａ−Ｃ末端（配列番号：１０）
【００５７】
＜製造例３−３：ＰＮＡプローブ（Ｅ）＞
（Ｅ）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ
Ｎ末端−ｃｇｇａｃａａｔｃｇａａｇａｃ−Ｃ末端（配列番号：１１）
【００５８】
＜製造例３−４：ＰＮＡプローブ（Ｆ）＞
（Ｆ）多くの病原真菌の２８Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ（「ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ＰＮＡプローブ」と称することがある）
Ｎ末端−ｔａｃｔｔｇｔｇｃｇｃｔａｔｃｇｇｔ−Ｃ末端（配列番号：１２）
【００５９】
（試験例１−１）
前記製造例１−１で作製した真菌鑑別用アレイ−１と、前記製造例２−１で作製したＤＮＡプローブ（Ａ）とを用い、以下のようにしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、真菌の検出を行った。
【００６０】
＜前処理＞
前記製造例１−１で作製したアレイブロックを薄切切片とした（厚み３μｍ）。前記薄切切片をスライドガラスに載せ、常法により脱パラフィン、及び再水和を行った。次いで、薄切切片における標的核酸を露出させるために、前記薄切切片を１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液に入れ、９８℃のウォーターバスで２０分間処理した。その後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（株式会社ニッポンジーン製）を１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１０分間処理した。
【００６１】
＜ハイブリダイゼーション及び遺伝子の検出＞
前記前処理した薄切切片に、１０％の前記ＤＮＡプローブ（Ａ）を含むハイブリダイゼーション液（株式会社ニッポンジーン製）を２０μＬ添加し、９４℃で５分間変性させた（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）後、５０℃で一晩処理し、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）で、１５分間、２回洗浄して余剰なプローブを除去した。前記洗浄の際の温度は、５０℃とした。
洗浄後、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にて、ＦＩＴＣの蛍光シグナルを検出した。
【００６２】
ＦＩＴＣのシグナルを検出した結果を図２Ａに示す（アレイにおける各菌の配置は図１Ａ参照）。図２Ａの結果から明らかなように、前記「（Ａ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＬＰ）を標的としたプローブ」を用いることにより、おおむねＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の検出が可能であった。なお、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉでシグナルを認めたが、そのシグナル強度は弱く部分的で、判別が可能であると考えられた。一方、形態学的に類似し、薬剤感受性が異なる糸状菌であるＭｕｃｏｒ属やＦｕｓａｒｉｕｍ属は検出されなかった。したがって、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌と、Ｍｕｃｏｒ属の菌及びＦｕｓａｒｉｕｍ属の菌とを高い精度で鑑別できることが示された。
【００６３】
（試験例１−２）
試験例１−１において、前記真菌鑑別用アレイ−１を前記真菌鑑別用アレイ−３に代え、前記ＤＮＡプローブ（Ａ）を前記ＤＮＡプローブ（Ｂ）に代え、遺伝子の検出において、以下のＤＡＢ発色を更に行った以外は、試験例１−１と同様にしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、真菌の検出を行った。
＜ＤＡＢ発色＞
ハイブリダイゼーション及び洗浄を行った後、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ロッシュダイアグノスティクス社製）とペルオキシダーゼ標識ポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社製）による酵素抗体法を施し、ニッケル・コバルトＤＡＢ法で黒紫色に発色させ、遺伝子の検出を行った。
【００６４】
ＤＡＢのシグナルを検出した結果を図２Ｂに示す（アレイにおける各菌の配置は図１Ｅ参照）。図２Ｂの結果から明らかなように、前記「（Ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）を標的としたプローブ」を用いることにより、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓを特異的に検出できることが示された。前記「（Ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのレトロトランスポゾンのＡｆｕｔ−１のｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）を標的としたプローブ」では、同じＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属でありながら、ポリエンマクロライド系抗真菌剤に抵抗性を示すことが知られているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓは検出されないため、有用性が高いと考えられる。
【００６５】
（試験例１−３）
試験例１−１において、前記真菌鑑別用アレイ−１を前記真菌鑑別用アレイ−２に代え、前記ＤＮＡプローブ（Ａ）を前記ＰＮＡプローブ（Ｃ）に代え、＜ハイブリダイゼーション及び遺伝子の検出＞を以下のように行った以外は、試験例１−１と同様にしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、真菌の検出を行った。
【００６６】
＜ハイブリダイゼーション及び遺伝子の検出＞
前記前処理した薄切切片に、前記ＰＮＡプローブ（Ｃ）を１μｇ／ｍＬ含むハイブリダイゼーション液（株式会社ニッポンジーン製）を２０μＬ添加し、９４℃で５分間変性させた（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）後、５６℃で９０分間処理した。ハイブリダイゼーション後、２×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）で、１５分間、２回洗浄して余剰なプローブを除去した。前記洗浄の際の温度は、５６℃とした。
洗浄後、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ロッシュダイアグノスティクス社製）とペルオキシダーゼ標識ポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社製）による酵素抗体法を施し、ニッケル・コバルトＤＡＢ法で黒紫色に発色させ、遺伝子の検出を行った。
【００６７】
ＤＡＢのシグナルを検出した結果を図２Ｃに示す（アレイにおける各菌の配置は図１Ｂ参照）。図２Ｃの結果から明らかなように、前記「（Ｃ）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いることにより、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属と組織標本上鑑別困難で、抗真菌剤の感受性が異なるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを特異的に検出できることが示された。
【００６８】
（試験例１−４）
試験例１−３において、前記真菌鑑別用アレイ−２を前記真菌鑑別用アレイ−１に代え、前記ＰＮＡプローブ（Ｃ）を前記ＰＮＡプローブ（Ｄ）に代えた以外は試験例１−３と同様にしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、真菌の検出を行った。
【００６９】
ＤＡＢのシグナルを検出した結果を図２Ｄに示す（アレイにおける各菌の配置は図１Ａ参照）。図２Ｄの結果から明らかなように、前記「（Ｄ）Ｆｕｓａｒｉｕｍ属の２８Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いることにより、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属を特異的に検出できることが示された。なお、他の一部の菌でシグナルを認めたが、そのシグナル強度は弱く部分的で、判別が可能であると考えられた。
【００７０】
（試験例１−５）
試験例１−３において、前記ＰＮＡプローブ（Ｃ）を前記ＰＮＡプローブ（Ｅ）に代えた以外は試験例１−３と同様にしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、真菌の検出を行った。
【００７１】
ＤＡＢのシグナルを検出した結果を図２Ｅに示す（アレイにおける各菌の配置は図１Ｂ参照）。図２Ｅの結果から明らかなように、前記「（Ｅ）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属の２６Ｓ  ｒＲＮＡを標的としたＰＮＡプローブ」を用いることにより、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓと組織標本上鑑別困難で、抗真菌剤の感受性が異なるＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉを特異的に検出できることが示された。
【００７２】
（試験例１−６）
試験例１−３において、前記ＰＮＡプローブ（Ｃ）を前記ＰＮＡプローブ（Ｆ）に代えた以外は試験例１−３と同様にしてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行い、真菌の検出を行った。
【００７３】
ＤＡＢのシグナルを検出した結果を図２Ｆに示す（アレイにおける各菌の配置は図１Ｂ参照）。図２Ｆの結果から明らかなように、前記あらゆる真菌に共通な領域を標的としたプローブであり、標本中の核酸の保存性の評価が可能な「（Ｆ）  ｐａｎｆｕｎｇａｌ  ＰＮＡプローブ」を用いることにより、多くの真菌を検出できることが示された。
【００７４】
（試験例２−１）
被検試料として、カンジダ症として登録された症例のホルマリン固定パラフィン（以下、「被検試料１」と称することがある）を用い、対照として、前記製造例１−１で得られたアレイを用い、以下のようにして真菌の鑑別を行った。
【００７５】
＜前処理＞
前記被検試料１のホルマリン固定パラフィン、及び前記製造例１−１で作製したアレイブロックを薄切切片とした（厚み３μｍ）。前記両薄切切片を同一のスライドガラスに横並びに載せ、常法により脱パラフィン、及び再水和を行った。次いで、薄切切片における標的核酸を露出させるために、前記薄切切片を１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液に入れ、９８℃のウォーターバスで２０分間処理した。その後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（株式会社ニッポンジーン製）を１０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１０分間処理した。
【００７６】
＜ハイブリダイゼーション及び遺伝子の検出＞
前記前処理した薄切切片に、ＰＮＡプローブを１μｇ／ｍＬ含むハイブリダイゼーション液（株式会社ニッポンジーン製）を２０μＬ添加し、９４℃で５分間変性させた（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）後、５６℃で９０分間処理した。ハイブリダイゼーション後、２×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）で、１５分間、２回洗浄して余剰なプローブを除去した。前記洗浄の際の温度は、５６℃とした。
洗浄後、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体（ロッシュダイアグノスティクス社製）とペルオキシダーゼ標識ポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社製）による酵素抗体法を施し、ニッケル・コバルトＤＡＢ法で黒紫色に発色させ、遺伝子の検出を行った。
【００７７】
前記ＰＮＡプローブとしては、前記製造例３−１、３−３、及び３−４で製造したＰＮＡプローブ（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）を使用した。
【００７８】
前記被検試料１のＤＡＢのシグナルを検出した結果を図３Ｂから３Ｄに示す。図３Ｂは、プローブとして前記プローブ（Ｆ）を用いた場合の結果を示し、図３Ｃは、プローブとして前記プローブ（Ｅ）を用いた場合の結果を示し、図３Ｄは、プローブとして前記プローブ（Ｃ）を用いた場合の結果を示す。なお、図３Ａは、前記被検試料１を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色した図である。
図３Ｂから３Ｄの結果から明らかなように、前記被検試料１は、カンジダ症ではなく、トリコスポロン症と判断された。
【００７９】
（試験例２−２）
被検試料として、カンジダ症として登録された症例（前記試験例２−１とは別の症例）のホルマリン固定パラフィン（以下、「被検試料２」と称することがある）を用いた以外は、前記試験例２−１と同様にして、真菌を鑑別した。
【００８０】
前記被検試料２のＤＡＢのシグナルを検出した結果を図４Ｂから４Ｄに示す。図４Ｂは、プローブとして前記プローブ（Ｆ）を用いた場合の結果を示し、図４Ｃは、プローブとして前記プローブ（Ｅ）を用いた場合の結果を示し、図４Ｄは、プローブとして前記プローブ（Ｃ）を用いた場合の結果を示す。なお、図４Ａは、前記被検試料２を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色した図である。
図４Ｂから４Ｄの結果から明らかなように、前記被検試料２は、カンジダ症ではなく、トリコスポロン症と判断された。
【００８１】
（試験例２−３）
被検試料として、カンジダ症として登録された症例（前記試験例２−１及び２−２とは別の症例）のホルマリン固定パラフィン（以下、「被検試料３」と称することがある）を用いた以外は、前記試験例２−１と同様にして、真菌を鑑別した。
【００８２】
前記被検試料３のＤＡＢのシグナルを検出した結果を図５Ｂから５Ｄに示す。図５Ｂは、プローブとして前記プローブ（Ｆ）を用いた場合の結果を示し、図５Ｃは、プローブとして前記プローブ（Ｅ）を用いた場合の結果を示し、図５Ｄは、プローブとして前記プローブ（Ｃ）を用いた場合の結果を示す。なお、図５Ａは、前記被検試料３を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色した図である。
図５Ｂから５Ｄの結果から明らかなように、前記被検試料３は、カンジダ症であると判断された。
【００８３】
前記試験例２−１から２−３の結果から明らかなように、本発明の真菌鑑別用アレイを対照として用いることにより、形態学的に鑑別が困難である菌についても高い精度で鑑別できることが示された。
【００８４】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  被検試料、及び対照について、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により遺伝子を検出する遺伝子検出工程と、
前記被検試料、及び前記対照で検出された遺伝子を比較し、前記被検試料における真菌を鑑別する鑑別工程とを含み、
前記対照が、以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むアレイであることを特徴とする真菌の鑑別方法である。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
＜２＞  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いるプローブが、ＰＮＡプローブ及びＤＮＡプローブのいずれかである前記＜１＞に記載の真菌の鑑別方法である。
＜３＞  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いるプローブが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属に属する菌を標的としたプローブ、及び真菌を標的としたプローブの少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の真菌の鑑別方法である。
＜４＞  アレイが、少なくとも以下に記載の真菌を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の真菌の鑑別方法である。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
＜５＞  アレイが、少なくとも以下に記載の真菌を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の真菌の鑑別方法である。
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
＜６＞  被検試料が、病理組織、及び細胞診断材料のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の真菌の鑑別方法である。
＜７＞  以下の（１）から（３０）に記載の真菌から選択される少なくとも６種を含むことを特徴とする真菌鑑別用アレイである。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（５）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（７）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１０）Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
（１１）Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ｖａｒ． ｅｌｅｇａｎｓ
（１２）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ
（１３）Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｓｐ． ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ
（１４）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（１７）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｖａｒ． ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ
（１８）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ
（１９）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ
（２０）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ
（２１）Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ
（２２）Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ
（２３）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
（２５）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
（２６）Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ
（２７）Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ
（２８）Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ
（２９）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（３０）Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
＜８＞  少なくとも以下に記載の真菌を含む前記＜７＞に記載の真菌鑑別用アレイである。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ｖａｒ． ｆｌａｖｕｓ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
＜９＞  少なくとも以下に記載の真菌を含む前記＜７＞に記載の真菌鑑別用アレイである。
（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ
（４）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｖａｒ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
（６）Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ
（８）Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
（１５）Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
（１６）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ
（２４）Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
＜１０＞  ブロック状である前記＜７＞から＜９＞のいずれかに記載の真菌鑑別用アレイである。
＜１１＞  固相支持体上に固定したものである前記＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載の真菌鑑別用アレイである。
＜１２＞  前記＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載の真菌鑑別用アレイと、プローブとを含むことを特徴とする真菌鑑別用キットである。
＜１３＞  プローブが、ＰＮＡプローブ及びＤＮＡプローブのいずれかである前記＜１２＞に記載の真菌鑑別用キットである。
＜１４＞  プローブが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する菌を標的としたプローブ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属に属する菌を標的としたプローブ、及び真菌を標的としたプローブの少なくともいずれかを含む前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の真菌鑑別用キットである。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の真菌鑑別用アレイ、及び真菌鑑別用キットは、本発明の真菌の鑑別方法に好適に利用可能である。
本発明の真菌の鑑別方法は、迅速かつ網羅的に行うことができ、精度が高いので、真菌症の病理診断における分子生物学的解析法に基づいた補助診断法として好適に用いることができ、また、ホルマリン固定された病理組織における真菌を鑑別することもできるので、発生動向調査にも好適に利用可能である。
【図１Ａ】
2015198646.tif 000002
【図１Ｂ】
2015198646.tif 000003
【図１Ｃ】
2015198646.tif 000004
【図１Ｄ】
2015198646.tif 000005
【図１Ｅ】
2015198646.tif 000006
【図２Ａ】
2015198646.tif 000007
【図２Ｂ】
2015198646.tif 000008
【図２Ｃ】
2015198646.tif 000009
【図２Ｄ】
2015198646.tif 000010
【図２Ｅ】
2015198646.tif 000011
【図２Ｆ】
2015198646.tif 000012
【図３Ａ】
2015198646.tif 000013
【図３Ｂ】
2015198646.tif 000014
【図３Ｃ】
2015198646.tif 000015
【図３Ｄ】
2015198646.tif 000016
【図４Ａ】
2015198646.tif 000017
【図４Ｂ】
2015198646.tif 000018
【図４Ｃ】
2015198646.tif 000019
【図４Ｄ】
2015198646.tif 000020
【図５Ａ】
2015198646.tif 000021
【図５Ｂ】
2015198646.tif 000022
【図５Ｃ】
2015198646.tif 000023
【図５Ｄ】
2015198646.tif 000024
【配列表】
2015198646000001.app