(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロチャンバーに細胞を収容するのに要する時間を短縮できる細胞配列チップの提供。【解決手段】細胞配列チップ１００は、液体が流れる流路と、流路の底面に配置されている複数の凹部と、流路の天面に配置されている１または２以上の凸部１３３と、を有する。前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に沿った、前記凹部の中心を通る前記流路の断面において、前記凸部の上流側側面の下端１３４は、前記流路での液体の流れ方向において、当該凹部の上流側開口縁から開口径の半分の長さ上流側に位置する点と、前記凹部の下流側開口縁から開口径の半分の長さ下流側に位置する点との間に配置されていることが好ましい。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体が流れる流路と、
前記流路の底面に配置されている複数の凹部と、
前記流路の天面に配置されている１または２以上の凸部と、
を有する、細胞配列チップ。
【請求項２】
前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に沿った、前記凹部の中心を通る前記流路の断面において、前記凸部の上流側側面の下端は、前記流路での液体の流れ方向において、当該凹部の上流側開口縁から開口径の半分の長さ上流側に位置する点と、前記凹部の下流側開口縁から開口径の半分の長さ下流側に位置する点との間に配置されている、請求項１に記載の細胞配列チップ。
【請求項３】
前記断面において、前記凸部の上流側側面の下端は、前記流路での液体の流れ方向において、当該凹部の上流側開口縁と前記凹部の下流側開口縁との間に配置されている、請求項２に記載の細胞配列チップ。
【請求項４】
前記凸部は、前記凹部上における前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に対して直交する方向に延在する凸条である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞配列チップ。
【請求項５】
前記凹部の底面は、細胞接着性を有し、
前記凹部の開口径は、２０μｍ以上かつ５００μｍ以下であり、
前記凹部の深さは、１０μｍ以上かつ２５０μｍ以下である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞配列チップ。
【請求項６】
前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に沿った前記流路の断面において、前記凸部の下端は、前記凹部の深さ方向において前記凹部の開口縁よりも前記流路の天面側に配置されており、
前記流路の天面の前記凸部が配置されていない領域と、前記流路の底面の前記凹部が配置されていない領域との間隔は、２０μｍ以上かつ１０００μｍ以下である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞配列チップ。
【請求項７】
液体が流れる流路と、前記流路の底面に配置されている複数の凹部と、前記流路の天面に配置されている１または２以上の凸部と、を有する、細胞配列チップを準備する工程と、
細胞を含有する液体を前記流路内に導入し、前記凹部内に前記細胞を回収する工程と、
を含む、細胞配列方法。
【請求項８】
前記液体の導入は、間欠的に行われる、請求項７に記載の細胞配列方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞配列チップおよび前記細胞配列チップを用いた細胞の配列方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、各種幹細胞など（以下「希少細胞」ともいう）は、病態に応じて血液中に存在する。たとえば、血液中を循環する癌細胞であるＣＴＣを検出することは、癌転移の早期発見の観点から非常に有用である。しかし、希少細胞は血液中に極めて稀にしか存在せず、検出することは極めて難しい。
【０００３】
そこで近年、様々な希少細胞の検出方法が提案されている。たとえば、希少細胞の検出方法として、検体（例えば血液）に由来する細胞懸濁液を、複数の凹部（以下「マイクロチャンバー」ともいう）を有する細胞配列チップに提供し、マイクロチャンバーに細胞を収容した後、全細胞を分析する方法が提案されている。
【０００４】
たとえば、特許文献１には、細胞を収容するためのマイクロチャンバーを有するマイクロアレイチップを用いた、細胞の検出方法が記載されている。特許文献１に記載の細胞の検出方法では、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液をマイクロアレイチップに提供し、マイクロチャンバーに細胞を収容している。
【０００５】
一方、特許文献２には、マイクロチャンバーと、さらに細胞懸濁液を導入するための流路を有する細胞組織体マイクロデバイスを用いた、細胞組織体の形成方法が記載されている。特許文献２に記載の細胞組織体の形成方法では、ポンプ機構により流路に細胞懸濁液を導入し、マイクロチャンバーに細胞を収容している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０２７００３号
【特許文献２】特開２００６−１２２０１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１および特許文献２に記載されているように、マイクロチャンバーに細胞を収容する場合、細胞の自重を利用して細胞を沈降させるのが一般的である。したがって、マイクロチャンバーへの細胞の移動は律速となり、マイクロチャンバーに細胞を収容するのに要する時間を短縮することができない。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、マイクロチャンバーに細胞を収容するのに要する時間を短縮できる細胞配列チップを提供することを目的とする。また、本発明は、この細胞配列チップを用いた細胞の配列方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、底面に複数の凹部（マイクロチャンバー）が形成されている流路において、流路を流れる液体を凹部に向かって流すための凸部を天面に形成することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の細胞配列チップに関する。
【００１１】
［１］液体が流れる流路と、前記流路の底面に配置されている複数の凹部と、前記流路の天面に配置されている１または２以上の凸部と、を有する、細胞配列チップ。
［２］前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に沿った、前記凹部の中心を通る前記流路の断面において、前記凸部の上流側側面の下端は、前記流路での液体の流れ方向において、当該凹部の上流側開口縁から開口径の半分の長さ上流側に位置する点と、前記凹部の下流側開口縁から開口径の半分の長さ下流側に位置する点との間に配置されている、［１］に記載の細胞配列チップ。
［３］前記断面において、前記凸部の上流側側面の下端は、前記流路での液体の流れ方向において、当該凹部の上流側開口縁と前記凹部の下流側開口縁との間に配置されている、［２］に記載の細胞配列チップ。
［４］前記凸部は、前記凹部上における前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に対して直交する方向に延在する凸条である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の細胞配列チップ。
［５］前記凹部の底面は、細胞接着性を有し、前記凹部の開口径は、２０μｍ以上かつ５００μｍ以下であり、前記凹部の深さは、１０μｍ以上かつ２５０μｍ以下である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞配列チップ。
［６］前記流路での液体の流れ方向および前記凹部の深さ方向に沿った前記流路の断面において、前記凸部の下端は、前記凹部の深さ方向において前記凹部の開口縁よりも前記流路の天面側に配置されており、前記流路の天面の前記凸部が配置されていない領域と、前記流路の底面の前記凹部が配置されていない領域との間隔は、２０μｍ以上かつ１０００μｍ以下である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の細胞配列チップ。
【００１２】
また、本発明は、以下の細胞の配列方法に関する。
【００１３】
［７］液体が流れる流路と、前記流路の底面に配置されている複数の凹部と、前記流路の天面に配置されている１または２以上の凸部と、を有する、細胞配列チップを準備する工程と、細胞を含有する液体を前記流路内に導入し、前記凹部内に前記細胞を回収する工程と、を含む、細胞配列方法。
［８］前記液体の導入は、間欠的に行われる、［７］に記載の細胞配列方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、マイクロチャンバーに細胞を収容するのに要する時間を短縮できる細胞配列チップを提供することができる。したがって、本発明によれば、例えば細胞配列チップを用いた希少細胞の検出に要する時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、実施の形態に係る細胞配列チップの平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。
【図２】図２Ａは、マイクロチャンバーチップの平面図であり、図２Ｂは、枠体の平面図であり、図２Ｃは、天板の底面図である。
【図３】図３Ａは、実施の形態に係る細胞配列チップの部分拡大断面図であり、図３Ｂは、凸部を有さない従来の細胞配列チップの部分拡大断面図である。
【図４】図４は、実施の形態の変形例に係る天板の底面図である。
【図５】図５は、流体シミュレーションの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１７】
［細胞配列チップ］
図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞配列チップ１００を示す図である。図１Ａは、細胞配列チップ１００の平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、細胞配列チップ１００は、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を有する。
【００１８】
図２Ａは、マイクロチャンバーチップ１１０の平面図であり、図２Ｂは、枠体１２０の平面図であり、図２Ｃは、天板１３０の底面図である。図１Ｂに示されるように、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０をこの順で積層することで、液体が流れる流路１２１が形成される。つまり流路１２１とは、後述する導入口１３１などから液体が導入された場合に液体が流れる空間をいう。
【００１９】
（マイクロチャンバーチップ）
図１Ｂおよび図２Ａに示されるように、マイクロチャンバーチップ１１０は、基板１１１と、基板１１１の一方の面に形成された複数のマイクロチャンバー１１２（凹部）とを有する。図１Ｂに示されるように、基板１１１のマイクロチャンバー１１２が形成されている面は、液体（例えば細胞懸濁液や洗浄液、染色液など）が流れる流路１２１の底面となる。各マイクロチャンバー１１２は、流路１２１に対して開口している。マイクロチャンバー１１２の数および配置は、特に限定されない。本実施の形態では、図２Ａに示されるように、マイクロチャンバー１１２は、流路１２１の中央部にマトリックス状に配置されている。
【００２０】
基板１１１（マイクロチャンバーチップ１１０）の素材は、特に限定されない。基板１１１の素材は、マイクロチャンバー１１２内に収容される細胞の種類に応じて適宜選択されうる。たとえば、マイクロチャンバー１１２内に収容される細胞に好適な細胞接着性を付与するように荷電状態や親水性、疎水性などを考慮して、基板１１１の素材を選択すればよい。ここで、「細胞接着性」とは、基板１１１に対する細胞の接着力が大きくなるような基板１１１表面の性質を意味する。「細胞の接着力」とは、平面に付着している複数の細胞に対して、前記平面と略平行方向に力を加えたときに、半数（５０％）の細胞が前記平面から剥離する力の値（単位：Ｎ）を意味する。たとえば、底面（平面）上に複数の細胞が付着している流路１２１に液体を流した場合、細胞に加えられる力Ｆは以下の式（１）で算出される。
Ｆ＝３πμＶｄ    …（１）
ここで、Ｆは細胞に加えられる力（Ｎ）、μは液体の粘性係数（Ｎ／ｍ２・ｓ）、Ｖは液体の流速（ｍ／ｓ）、ｄは細胞の直径（ｍ）である。具体的には、細胞の接着力Ｆは、０.０１ｎＮ超であることが好ましく、０.１ｎＮ以上であることがより好ましい。
【００２１】
また、基板１１１は、表面処理されていてもよい。表面処理の方法の例には、プラズマ処理、コロナ放電処理、ブロッキング剤によるブロッキング処理、親水性ポリマーやタンパク質、脂質などによるコーティング処理が含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。基板１１１の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマーなどの樹脂が含まれる。本実施の形態では、基板１１１は、疎水性の樹脂（例えば、ポリスチレンやポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなど）からなり、マイクロチャンバー１１２の底面は、疎水性である。基板１１１の厚みは、必要な強度を確保できれば特に限定されず、マイクロチャンバー１１２の深さなどに応じて適宜設定されうる。
【００２２】
マイクロチャンバー１１２の形状は、１個または２個以上の細胞を収容することができれば特に限定されない。マイクロチャンバー１１２の形状の例には、円柱、多角柱、逆円錐台、逆多角錐台が含まれる。また、マイクロチャンバー１１２の大きさは、特に限定されず、マイクロチャンバー１１２に収容される細胞の種類や収容される細胞の数などに応じて適宜設定されうる。通常は、マイクロチャンバー１１２の大きさは、マイクロチャンバー１１２の底面に１０〜１５個程度の細胞が付着できる大きさであることが好ましい。たとえば、マイクロチャンバー１１２の開口径は、２０〜５００μｍの範囲内であり、マイクロチャンバー１１２の深さは、１０〜２５０μｍの範囲内である。
【００２３】
基板１１１にマイクロチャンバー１１２を形成する方法は、特に限定されない。基板１１１にマイクロチャンバー１１２を形成する方法の例には、金型成形法やリソグラフィ法、収束イオンビーム（ＦＩＢ）を用いる方法などが含まれる。また、マイクロチャンバー１１２が形成されたフィルムを基板１１１に貼り付けてもよいし、マイクロチャンバー１１２が既に形成された市販の基板１１１（マイクロチャンバーチップ１１０）を購入してもよい。
【００２４】
マイクロチャンバー１１２内に収容される細胞の種類は、特に限定されない。マイクロチャンバー１１２内に収容される細胞の例には、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞などが含まれる。
【００２５】
（枠体）
図１Ｂおよび図２Ｂに示されるように、枠体１２０は、マイクロチャンバーチップ１１０と天板１３０との間に配置されている、貫通孔１２２を有する薄板である。貫通孔１２２の形状は、マイクロチャンバー１１２上に細胞懸濁液を流すことが可能であれば、特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。また、枠体１２０の厚みは、流路１２１の天面の凸部１３３が配置されていない領域と、流路１２１の底面のマイクロチャンバー１１２が配置されていない領域との間隔（流路の深さ）に相当する。枠体１２０の厚みは、特に限定されず、所望の流路の高さ（深さ）に応じて適宜設定される。たとえば、枠体１２０の厚みは、２０〜１０００μｍの範囲内である。枠体１２０の厚みを２０〜１０００μｍの範囲内とすることで、流路１２１内においてマイクロチャンバー１１２外の面に付着した細胞を、流路１２１内を流れる液体の力で容易に剥離させることが可能となる。また、流路１２１内の細胞による目詰まりの発生を防止しつつ、流路１２１内の細胞懸濁液中の細胞がマイクロチャンバー１１２内に沈降するまでの時間を短縮することもできる。
【００２６】
枠体１２０の素材は、特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体１２０の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体１２０は、両面に粘着性を有するシリコンシート（両面シール）などであってもよい。枠体１２０として両面シールを使用することで、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を容易に固定することができる。
【００２７】
枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、流路１２１の側面となる。そのため、枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、細胞配列チップ１００の使用時には細胞懸濁液と接触する。したがって、枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、必要に応じて表面処理されていてもよい。表面処理の例には、プラズマ処理、コロナ放電処理、親水性ポリマーやタンパク質、脂質などによるコーティング処理が含まれる。たとえば、枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、細胞の非特異的結合を防止するためのブロッキング処理が施されてもよい。ブロッキング剤の例には、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ウシ血清アルブミンを含む）、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物；リン脂質、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。なお、枠体１２０は、マイクロチャンバーチップ１１０または天板１３０と一体化されていてもよい。
【００２８】
（天板）
図１Ｂおよび図２Ｃに示されるように、天板１３０は、枠体１２０の上に配置されている、第１の貫通孔１３１、第２の貫通孔１３２、および一方の面に１または２以上の凸部１３３を有する薄板である。天板１３０の凸部１３３が配置されている面は、液体が流れる流路１２１の天面となる。また、第１貫通孔１３１は、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を積層したとき、液体を流路１２１に導入するための導入口１３１となる。第２貫通孔１３２は、流路１２１内から液体を排出するための排出口１３２となる。通常、導入口１３１は、流路１２１の一端に連通する。また排出口１３２は、流路１２１の他端に連通する。導入口１３１および排出口１３２の形状は、特に限定されない。また、天板１３０の厚みも、必要な強度を確保できれば特に限定されない。
【００２９】
凸部１３３は、後述するように、流路１２１を流れる液体の進行方向を変え、マイクロチャンバー１１２内への細胞の移動を促進する。本実施の形態では、天板１３０は、マイクロチャンバーチップ１１０のマイクロチャンバー１１２と同数の凸部１３３を有する。各凸部１３３は、各マイクロチャンバー１１２に対応する位置に配置されている。
【００３０】
マイクロチャンバー１１２上における液体の進行方向の成分は、液体の流れ方向、マイクロチャンバー１１２の深さ方向、ならびに液体の流れ方向およびマイクロチャンバー１１２の深さ方向に対して直交する方向（以下「流路１２１の幅方向」ともいう）からなる。ここで、「液体の流れ方向」とは、天板１３０を平面視したときに、マイクロチャンバー１１２上において液体が流れる方向をいう。また、液体の流れ方向、マイクロチャンバー１１２の深さ方向、および流路１２１の幅方向は互いに直交する。
【００３１】
凸部１３３の形状は、液体の進行方向を変え、マイクロチャンバー１１２内への細胞の移動を促進することができれば特に限定されない。凸部１３３の形状の例には、三角柱や四角柱などの多角柱；三角錐や四角錐などの多角錐などが含まれる。
【００３２】
流路１２１の幅方向での凸部１３３の長さは、液体の進行方向を変え、マイクロチャンバー１１２内への細胞の移動を促進することができれば特に限定されず、マイクロチャンバー１１２の開口径、凸部１３３の位置などにより適宜設定されうる。
【００３３】
液体の流れ方向での凸部１３３の長さは、凸部１３３が液体の流圧に対して必要な強度を確保できれば特に限定されず、液体の流れ方向における凸部１３３間の間隔などに応じて適宜設定されうる。
【００３４】
凸部１３３の高さも液体の進行方向を変え、マイクロチャンバー１１２内への細胞の移動を促進することができれば特に限定されず、枠体１２０の厚みや凸部１３３の形状、位置などにより適宜設定されうる。凸部１３３の下端は、マイクロチャンバー１１２の開口縁よりもマイクロチャンバー１１２の底面側に配置されてもよい。しかしながら、マイクロチャンバー１１２内の細胞がマイクロチャンバー１１２外に移動することを抑制する観点からは、凸部１３３の下端は、マイクロチャンバー１１２の開口縁よりも流路１２１の天面側に配置されていることが好ましい。
【００３５】
凸部１３３の位置は、液体の進行方向を変え、マイクロチャンバー１１２内への細胞の移動を促進することができれば、特に限定されない。細胞の配列を促進する観点からは、凸部１３３は、マイクロチャンバー１１２の近傍に配置されることが好ましい。
【００３６】
図３Ａは、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００の部分拡大断面図であり、図３Ｂは、凸部１３３を有しない従来の細胞配列チップ１００’の部分拡大断面図である。図３Ａおよび図３Ｂは、液体の流れ方向およびマイクロチャンバー１１２の深さ方向に沿った断面図である。図中の左側が上流であり、右側が下流である。
【００３７】
図３Ａに示されるように、マイクロチャンバー１１２の、液体の流れ方向の開口径をＲとする。液体の流れ方向およびマイクロチャンバー１１２の深さ方向に沿った、マイクロチャンバー１１２の中心を通る流路１２１の断面において、凸部１３３の上流側側面の下端１３４は、流路１２１での液体の流れ方向において、マイクロチャンバー１１２の上流側開口縁から開口径の半分の長さ（Ｒ／２）上流側に位置する点と、マイクロチャンバー１１２の下流側開口縁から開口径の半分の長さ（Ｒ／２）下流側に位置する点との間（図３Ａでの破線Ａおよび破線Ｂの間）に配置されることが好ましい。また、前記断面において、凸部１３３の上流側側面の下端１３４は、流路１２１での液体の流れ方向において、マイクロチャンバー１１２の上流側開口縁とマイクロチャンバー１１２の下流側開口縁との間に配置されていることがより好ましい。ここで、「マイクロチャンバー１１２の中心」とは、マイクロチャンバー１１２の開口面の重心を意味する。
【００３８】
図３Ａに示されるように、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００では、凸部１３３が液体の進行方向を変える。それにより、液体の進行方向の成分のうちマイクロチャンバー１１２の深さ方向の成分が増大し、液体に含まれる細胞１０のマイクロチャンバー１１２への移動速度が増大する。さらに、凸部１３３がマイクロチャンバー１１２の近傍に配置されている場合、液体の進行方向は、凸部１３３が配置されたマイクロチャンバー１１２の近傍で変えられるため、マイクロチャンバー１１２が配置されている領域に沈降する細胞１０の割合が増加する。その結果として、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００は、マイクロチャンバー１１２内への細胞１０の収容に要する時間を短縮することができる。
【００３９】
一方、図３Ｂに示されるように、凸部１３３を有しない従来の細胞配列チップ１００’では、細胞１０は自重のみによってマイクロチャンバー１１２へ移動しなければならない。そのため、細胞１０のマイクロチャンバー１１２への移動速度は遅い。そのため、凸部１３３を有しない細胞配列チップ１００’では、マイクロチャンバー１１２内への細胞１０の収容に長時間を要する。
【００４０】
天板１３０に凸部１３３を形成する方法は、特に限定されない。凸部１３３を形成する方法の例には、金型成形加工やリソグラフィ、エッチング、収束イオンビーム（ＦＩＢ）などが含まれる。また、凸部１３３が形成されたフィルムを平板に貼り付けてもよい。
【００４１】
天板１３０の素材は、特に限定されないが、蛍光顕微鏡などを用いて外部から流路１２１内を観察する観点からは、光透過性を有する素材であることが好ましい。天板１３０の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体１２０と同様に、天板１３０の流路１２１の天面となる面（凸部１３３が配置されている面）も表面処理（例えばブロッキング処理）されていてもよい。
【００４２】
以上の構成により、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００を製造することができる。たとえば、細胞配列チップ１００は、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０をこの順番で積層し、互いに固定することで製造されうる。これらを固定する方法は、特に限定されないが、観察やメンテナンスの観点から互いに取り外し可能に固定されることが好ましい。固定方法の例には、係合による固定、螺子を用いた固定、粘着剤を用いた固定が含まれる。
【００４３】
［細胞の配列方法］
次に、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００の使用方法（本実施の形態に係る細胞の配列方法）について説明する。
【００４４】
まず、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００を準備する。
【００４５】
次に、細胞配列チップ１００のマイクロチャンバー１１２内に、細胞１０を回収する。具体的には、細胞を含有する液体（細胞懸濁液）を導入口１３１から流路１２１内に導入して、流路１２１内を細胞懸濁液で満たす。次いで、細胞配列チップ１００を一定時間（例えば１〜１５分間）静置する。これにより、細胞懸濁液に含まれる細胞１０の一部をマイクロチャンバー１１２内に沈降させることができる。しかし、残部の細胞１０はマイクロチャンバー１１２外に沈降してしまう。そのため、マイクロチャンバー１１２外に沈降している細胞１０をマイクロチャンバー１１２内に回収するために、間欠送液を行うことが好ましい。間欠送液を行うことにより、マイクロチャンバー１１２外の細胞１０に間欠的に移動力を付与し、細胞１０をマイクロチャンバー１１２内に回収することができる。
【００４６】
間欠送液は、マイクロチャンバー１１２外の細胞１０を送液方向に移動させるためのワンショット送液工程と、移動した細胞１０を沈降させるための静置工程とを含む。送液を行う装置が、所定の送液圧を所定の時間、流路１２１内に発生させて、マイクロチャンバー１１２外の細胞１０を送液方向に移動させるように送液をすると、「ワンショット送液」となる。一方、この装置が、送液圧を発生させないと「静置」となる。ワンショット送液工程の開始から静置工程の終了までを１サイクルとすると、マイクロチャンバー１１２外の細胞１０は、例えば１サイクルで送液方向に５０μｍ程度移動する。マイクロチャンバー１１２外の細胞１０がマイクロチャンバー１１２の直上に移動した場合は、その細胞１０はマイクロチャンバー１１２内に沈降する。マイクロチャンバー１１２外の細胞１０をマイクロチャンバー１１２内に回収する観点からは、間欠送液のサイクル数は、２回以上が好ましく、１０回以上がより好ましい。
【００４７】
なお、間欠送液では、導入口１３１からだけでなく、排出口１３２から送液を行ってもよい。たとえば、導入口１３１から間欠送液を１サイクルまたは２サイクル以上を行った後、排出口１３２から間欠送液を１サイクルまたは２サイクル以上を行ってもよい。導入口１３１および排出口１３２から交互に間欠送液を行うことで、マイクロチャンバー１１２内に細胞１０をより効率的に回収することができる。
【００４８】
ワンショット送液における送液量は、流路１２１の大きさなどに応じて適宜設定される。たとえば、ワンショット送液における送液量は、流路１２１内の細胞懸濁液の体積の１／１００〜１／２程度が好ましい。また、流路１２１内の流速が１ｍｍ／秒以下となるように、単位時間あたりの送液量を調整することが好ましい。静置時間は、特に限定されないが、例えば１〜３０秒間である。
【００４９】
前述のとおり、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００では、凸部１３３を有しない細胞配列チップ１００’と比べて、マイクロチャンバー１１２内へ細胞１０の移動速度が速い。そのため、本実施の形態に係る細胞配列チップ１００では、凸部１３３を有しない細胞配列チップ１００’と比較して静置時間を短くすることができる。
【００５０】
以上のように、本実施の形態の細胞配列チップ１００を使用することで、流路１２１内に細胞懸濁液を導入した際に、マイクロチャンバー１１２内へ細胞１０を効率的に移動させることができる。このため、本実施の形態の細胞配列チップ１００を使用することで、マイクロチャンバー１１２内に細胞１０を収容するのに要する時間を短縮できる。
【００５１】
なお、上記実施の形態では、マイクロチャンバーチップ１１０の複数のマイクロチャンバー１１２と、天板１３０の複数の凸部１３３とがそれぞれ対応する細胞配列チップ１００について説明した。しかしながら、マイクロチャンバー１１２と凸部１３３とは同数でなくてもよい。たとえば、図４に示されるように、細胞配列チップ１００は、マイクロチャンバー１１２よりも少数の、流路１２１の幅方向に延在する凸部１３３（凸条）を有していてもよい。この場合、凸部１３３（凸条）の流路１２１の幅方向の長さは、マイクロチャンバー１１２の流路１２１の幅方向の長さよりも長く、各凸部１３３（凸条）は、複数のマイクロチャンバー１１２に対応する。このようにすることで、流路１２１の幅方向に隣接する凸部１３３の間を通って流れる液体が無くなり、マイクロチャンバー１１２に向かって流れる液体を増加させることができる。なお、本明細書において「凸条」とは、一方向に延びる細長い凸部を意味する。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。
【００５３】
［実施例１］
１．細胞配列チップの作製
金型成形加工により、ポリスチレンからなる、スライドガラスと同じ大きさのマイクロチャンバーチップを作製した。マイクロチャンバーチップの上面の中央の領域（長手方向５０ｍｍ，短手方向２０ｍｍ）に、マイクロチャンバー（開口径１００μｍ，底面径８０μｍ，深さ５０μｍ）をピッチ３００μｍで１００００孔形成した。
【００５４】
金型成形加工により、アクリル樹脂からなる、２つの貫通孔（導入口および排出口）を有する天板（長手方向１００ｍｍ，短手方向５０ｍｍ）を作製した。天板の下面の中央の領域（長手方向５０ｍｍ，短手方向２０ｍｍ）に、凸部（長手方向５０μｍ，短手方向５０μｍ，高さ５０μｍ）をピッチ３００μｍで１００００個形成した。
【００５５】
マイクロチャンバーチップの上面上に、枠体として貫通孔を有する両面シール（厚み１００μｍ）を積層した。さらに、枠体の上に天板を積層して、細胞配列チップＡを作製した。細胞配列チップＡでは、マイクロチャンバーチップの上面（流路の底面）に形成された各マイクロチャンバーと、天板の下面（流路の天面）に形成された各凸部とが対向している。細胞配列チップＡを平面視した場合、各凸部の上流側側面の下端が、対応するマイクロチャンバーの開口部の中心と重なるように、各凸部は配置されている。
【００５６】
また、比較例として、凸部を有する天板を用いる代わりに、凸部を有しない天板（平板状のアクリル樹脂基板）を用いて、細胞配列チップＡと同様の手順により細胞配列チップＢを作製した。
【００５７】
２．細胞配列チップへの細胞の配列
以下の手順により、細胞配列チップＡ（実施例）および細胞配列チップＢ（比較例）に細胞懸濁液を導入し、マイクロチャンバー内に収容された細胞の割合を測定した。
【００５８】
細胞配列チップの導入口および排出口に、それぞれチューブコネクタを介して送液チューブを接続した。一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、３０％エタノール水溶液中に配置した。また、一端が排出口に接続された送液チューブの他端をシリンジポンプに接続した。この状態で、シリンジポンプを用いて１５ｍＬ／分の速度でエタノール水溶液を吸引して、流路内全面（マイクロチャンバーの底面および側面を含む）を濡らした。次いで、一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に移動させた。この状態で、シリンジポンプを用いて１５ｍＬ／分の速度でリン酸緩衝液を吸引して、流路内を洗浄した。一端が導入口に接続された送液チューブの他端を、１００μＬ中に２×１０５個の白血球細胞を含む細胞懸濁液中に配置した。また、一端が排出口に接続された送液チューブの他端をシリンジポンプに接続した。この状態で、シリンジポンプを用いて０．０００５〜１０ｍＬ／分の間の所定の速度で１００μＬの細胞懸濁液を吸引して、流路内を細胞懸濁液で満たした。５分間静置した後、光学顕微鏡を用いて、マイクロチャンバー内に収容された細胞数を計測し、各流速におけるマイクロチャンバー内への細胞の回収率を算出した。実験結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
2015198592.tif 000003
【００６０】
表１に示されるように、実施例に係る細胞配列チップＡでは、今回実施したすべての流速において比較例に係る細胞配列チップＢよりも高い割合で細胞を回収することができた。特に、流速が０．０１ｍＬ／分の場合、比較例に係る細胞配列チップＢでは３０％の細胞しか回収できなかったのに対し、実施例に係る細胞配列チップＡでは８０％もの細胞を回収することができた。
【００６１】
以上の結果から、流路の天面に１または２以上の凸部を有する細胞配列チップは、マイクロチャンバーに細胞を収容するのに要する時間を短縮できることがわかる。
【００６２】
［実施例２］
凸部の位置がそれぞれ異なる複数の細胞配列チップについて、流体解析ソフトウェア（ＦＬＯＷ−３Ｄ バージョン１０；フローサイエンス社）を用いて、マイクロチャンバー近傍における液体の流れのシミュレーションを行った。マイクロチャンバーの開口部径を１００μｍ、マイクロチャンバーの深さを５０μｍ、凸部の長手方向の長さを１００μｍ、凸部の高さを５０μｍと設定した。細胞配列チップを平面視した場合の液体の流れ方向における凸部の上流側側面の下端の位置を変数について、以下の５つの条件（変数）を設定した。
条件１：凸部がない場合（以下「凸なし」という）
条件２：対応するマイクロチャンバーの開口部の中心と重なる場合（以下「凸５０」という）
条件３：対応するマイクロチャンバーの上流側開口縁と重なる場合（以下「凸１００」という）
条件４：対応するマイクロチャンバーの上流側開口縁からさらに２５μｍ上流側に位置する場合（以下「凸１２５」という）
条件５：対応するマイクロチャンバーの上流側開口縁からさらに５０μｍ上流側に位置する場合（以下「凸１５０」という）
【００６３】
評価指標としては、基板表面（マイクロチャンバー外の領域を基準とする）から天板方向２２μｍ（一般的な細胞の直径に相当）の位置における、液体の流れ方向の液体の流速に対するマイクロチャンバーの深さ方向の液体の流速の比を採用した。本指標は、数値が大きいほど、細胞がマイクロチャンバーの深さ方向へ移動しやすいことを示唆する。
【００６４】
シミュレーションの結果を図５に示す。図５のグラフにおいて、横軸（ｒ）は、マイクロチャンバーの開口部の中心を０とした場合に、液体の流れ方向における凸部の上流側側面の下端の位置（μｍ）を示す。ｒが−５０〜５０（μｍ）である位置に、マイクロチャンバーが開口している。一方、縦軸（Ｃ）は、前述の評価指標（流速の比）である。
【００６５】
図５に示されるように、流路の天面に凸部がない場合（凸なし）に比べて、流路の天面に凸部がある場合（凸５０、凸１００、凸１２５および凸１５０）では、マイクロチャンバー近傍において、深さ方向の液体の流速が増大しており、マイクロチャンバー内に細胞が移動しやすいことがわかる。特に、凸部の上流側側面の下端がマイクロチャンバー上に位置する場合（凸５０および凸１００）、深さ方向の液体の流速が顕著に増大することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明に係る細胞配列チップは、例えば疾患の迅速な検査などに有用である。
【符号の説明】
【００６７】
１０  細胞
１００，１００’  細胞配列チップ
１１０  マイクロチャンバーチップ
１１１  基板
１１２  マイクロチャンバー（凹部）
１２０  枠体
１２１  流路
１２２  貫通孔
１３０  天板
１３１  導入口
１３２  排出口
１３３  凸部
１３４  凸部の上流側側面の下端
【図１】
2015198592.tif 000004
【図２】
2015198592.tif 000005
【図３】
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【図４】
2015198592.tif 000007
【図５】
2015198592.tif 000008