(57)【要約】【課題】従来手法では、核酸増幅反応曲線のプラトー値やCt値から増幅の有無を判定することができたとしても、正常な核酸増幅反応曲線か否かを判定できない。【解決手段】本発明は、測定対象とする試料について、２次元グラフの第１の軸を核酸増幅産物についての測定値、第２の軸を核酸増幅反応の進捗を示す値とする核酸増幅反応曲線を取得する測定部と、正常な核酸増幅反応曲線と測定した核酸増幅反応曲線を比較する比較部と、比較結果に基づいて、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常か否か判定する判定部とを有する核酸増幅分析装置を提供する。【選択図】図６Ａ
2015225032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象とする試料について、２次元グラフの第１の軸を核酸増幅産物についての測定値、第２の軸を核酸増幅反応の進捗を示す値とする核酸増幅反応曲線を取得する測定部と、
正常な核酸増幅反応曲線と測定した核酸増幅反応曲線を比較する比較部と、
比較結果に基づいて、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常か否か判定する判定部と
を有する核酸増幅分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記比較部は、正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾き又はプラトー値と、測定した核酸増幅反応曲線の変曲点での傾き又はプラトー値を比較する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸増幅分析装置において、
前記核酸増幅反応曲線の不連続な測定値に対してシグモイド関数を適用する第１の処理、シグモイド関数へ準ニュートン法を用いた近似処理を繰り返し適用する第２の処理、シグモイド関数のパラメータを決定する第３の処理を実行して、前記核酸増幅反応曲線の近似式を算出する演算機能部
を更に有する核酸増幅分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸増幅分析装置において、
前記演算機能部は、
算出された前記近似式に従い算出された増幅産物に基づく測定値に対し、閾値に達する核酸増幅反応の進捗を示す値を算出する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸増幅分析装置において、
前記演算機能部は、
算出された前記近似式を前記核酸増幅反応曲線にフィッティング可能な場合、前記近似式を１階微分した関数に、前記近似式を２階微分して算出した変曲点の値を代入して、前記変曲点における前記近似式の傾きを算出する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項６】
請求項３に記載の核酸増幅分析装置において、
前記演算機能部は、
前記核酸増幅反応曲線が算出された前記近似式にフィッティング不可の場合、前記核酸増幅反応曲線のプラトー値を算出する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記正常な核酸増幅反応曲線の前記変曲点と当該変曲点における前記傾き、又は、前記プラトー値を試薬容器の情報記憶手段から読み取る読み取り部
を更に有することを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きと、前記測定した核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きを表示画面上に対比的に表示する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記正常な核酸増幅反応曲線のプラトー値と、前記測定した核酸増幅反応曲線のプラトー値を表示画面上に対比的に表示する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記判定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合、想定される不具合内容及び／又は増幅不良を報知する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記判定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合、再キャリブレーション条件設定画面を通じて事前に設定された条件に従い、再キャリブレーションを実行させる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再キャリブレーション条件が、正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きと測定した核酸増幅反応曲線の変曲点での傾きとの比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再キャリブレーション条件が、正常な核酸増幅反応曲線のプラトー値と測定した核酸増幅反応曲線のプラトー値との比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記判定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合、再検査条件設定画面を通じて事前に設定された再検査条件に従い、再検査を実行させる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再検査条件が、正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きと測定した核酸増幅反応曲線の変曲点での傾きとの比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再検査条件が、正常な核酸増幅反応曲線のプラトー値と測定した核酸増幅反応曲線のプラトー値との比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸増幅分析装置において、
前記測定部は、
それぞれ独立に温度制御可能な複数の温調ブロックと、
反応液を収容する複数の反応容器がそれぞれの前記温調ブロックで温度制御される保持具と
を更に有することを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸増幅分析装置において、
前記測定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合の不具合内容に前記温調ブロックの異常が含まれたとき、異常が疑われる温調ブロックで温度制御される前記保持具の使用を禁止する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸増幅分析装置において、
再キャリブレーション条件設定画面を通じ、ユーザは、異常が疑われる温調ブロックの使用を禁止するか否かを事前に選択できる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸増幅分析装置において、
再検査条件設定画面を通じ、ユーザは、異常が疑われる温調ブロックの使用を禁止するか否かを事前に選択できる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる核酸の増幅反応をモニタリングする核酸増幅分析装置に関する。
【技術背景】
【０００２】
遺伝子検査の分野では、微量の標的遺伝子を増幅して検出する核酸増幅技術が利用されている。遺伝子検査の最も一般的な例にPCR(Polymerase Chain Reaction)法がある。PCR
法は、標的とする核酸を含む反応液に対して温度変化（温度サイクル）を繰り返し、特定の塩基配列を選択的に増幅させる方法である。一般的なPCR法は、(1)熱変性、(2)アニー
リング、(3)伸長の3ステップを1サイクルとし、各ステップを試薬指定の温度で制御する
ことにより、鋳型となるDNAを2倍に増幅させる。サイクルを繰り返すことで、鋳型となるDNAが指数関数的に増幅することができる。
【０００３】
PCR法の増幅反応をリアルタイムに検出し、標的核酸を定量または定性分析する方法と
して、リアルタイムPCRがある。従来のリアルタイムPCR装置は、複数の反応液に対して、同時に同じ温度サイクルを開始して鋳型となるDNAを増幅する。
【０００４】
リアルタイムPCR法では、PCRを行う際に蛍光色素が付加されたプローブなどを使用し、蛍光強度を測定することによりDNAの増幅産物を検出する。蛍光強度の検出は、基本的に
、一定時間毎に行う。このため、X軸にサイクル数、Y軸に蛍光強度をプロットすると、不連続な散布図が得られる。
【０００５】
リアルタイムPCR法における増幅の判定は、蛍光強度が所定の閾値に達したサイクル（Threshold Cycle Value: Ct値）を算出することにより行う。定量検査においては、既知濃度の標準液（キャリブレータ）についてCt値を算出し、Ct値と核酸濃度との関係を示す検量線を作成する。そして、未知濃度サンプルについてCt値を求め、作成した検量線からサンプル中の核酸濃度を算出する。リアルタイムPCR法において、サイクル数(X軸)と蛍光強度(Y軸)間の不連続なプロットからCt値を求める解析法として、ダブルシグモイド曲線に
近似させる方法が提案されている（特許文献1）。
【０００６】
核酸増幅分析装置は、検査品質の判定に、ポジティブコントロールやネガティブコントロール、インターナルコントロールを用いる。ポジティブコントロールやネガティブコントロール、インターナルコントロールの検査結果が不良である場合、核酸増幅分析装置は、同時に測定した標的核酸試料の検査結果も不良であると判定する。なお、増幅の判定法には、プラトー検出やCt値検出がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２６７７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、(1)反応液に核酸増幅反応を阻害する物質が含まれていた時、(2)試薬の消費期限が切れていた時、(3)温調ブロック異常に伴う温度サイクル不良等の装置トラブルな
どがあった時、核酸増幅反応曲線の変化量は、正常な反応と比べ小さくなる。このような異常な核酸増幅反応曲線であっても、特許文献1に記載のダブルシグモイド式に近似する
ことができればCt値を求めることができる。ただし、求められたCt値は正確でない可能性が残る。また、従来手法では、核酸増幅反応曲線のプラトー値やCt値から増幅の有無を判定することができたとしても、正常な核酸増幅反応曲線か否かを判定することはできなかった。
【０００９】
そこで、本発明は、遺伝子検査等に利用される核酸増幅分析装置に、測定した核酸増幅反応の良否を判定する機能を設け、Ct値などの核酸増幅反応の進捗を示す値の測定結果の信頼性を向上させる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、例えば特許請求の範囲に記載の構成を採用する。本明細書は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例を挙げるならば、「測定対象とする試料について、２次元グラフの第１の軸を核酸増幅産物についての測定値、第２の軸を核酸増幅反応の進捗を示す値とする核酸増幅反応曲線を取得する測定部と、正常な核酸増幅反応曲線と測定した核酸増幅反応曲線を比較する比較部と、比較結果に基づいて、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常か否か判定する判定部とを有する核酸増幅分析装置」を特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、キャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロール等の核酸を含む試料について、核酸増幅反応が正常か否かを検出でき、Ct値等の核酸増幅反応の進捗を示す値の測定結果の信頼性を向上させることができる。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】核酸増幅分析装置の構成例を示す図。
【図２】核酸増幅反応曲線が正常か否かの判定に使用するフローチャート。
【図３】正常な核酸増幅反応曲線と異常な増幅曲線の例を示す図。
【図４】正常な核酸増幅反応曲線と異常な増幅曲線を２階微分して得られる曲線の例を示す図。
【図５】正常な核酸増幅反応曲線と異常な増幅曲線を１階微分して得られる曲線の例を示す図。
【図６Ａ】判定結果画面の例を示す図（近似できる場合）。
【図６Ｂ】判定結果画面の例を示す図（近似できる場合）。
【図６Ｃ】判定結果画面の例を示す図（近似できない場合）。
【図６Ｄ】判定結果画面の例を示す図（近似できない場合）。
【図７】自動再キャリブレーションの条件設定画面の例を示す図。
【図８】核酸増幅部を説明する図。
【図９】自動再検の条件設定画面の例を示す図。
【図１０】異常原因の通知画面例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明の実施態様は
、後述する形態例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
【００１４】
［装置構成］
図１に、核酸増幅分析装置１００の概略構成を示す。サンプル容器１０１には、核酸を含む検体が収容される。サンプル容器ラック１０２には、複数のサンプル容器１０１が収容される。試薬容器１０３には、検体に加える試薬が収納される。試薬容器ラック１０４には、複数の試薬容器１０３が収容される。反応容器１０５は、検体と試薬の混合に使用される。反応容器ラック１０６には、複数の反応容器１０５が収容される。反応液調整部１０７は、サンプル容器１０１から吸引した検体と試薬容器１０３から吸引した試薬を反応容器１０５に吐出して混合し、反応液を調整する。密閉ユニット１０８は、反応容器１０５の密閉に使用される。攪拌ユニット１０９は、密閉された反応容器１０５に収納された反応液の攪拌に使用される。
【００１５】
核酸増幅分析装置１００には、ロボットアームX軸１１０と、ロボットアームY軸１１１を有する。ロボットアームX軸１１０は、核酸増幅分析装置１００のX方向に沿って配置される。ロボットアームY軸１１１は、ロボットアームX軸１１０上に、Y軸方向に沿って配
置される。ロボットアームY軸１１１は、ロボットアームX軸１１０の駆動によりX軸方向
に移動される。ロボットアームY軸１１１上には、ロボットアームY軸の駆動によりY軸方
向に移動されるグリッパユニット１１２が配置される。グリッパユニット１１２は、反応容器１０５を掴み、装置内の各部に搬送する。また、ロボットアームY軸１１１上には、
ロボットアームY軸の駆動によりY軸方向へ移動することができる分注ユニット１１３が配置される。分注ユニット１１３は、サンプル容器１０１に収納された検体や試薬容器１０３に収納された試薬を吸引し、反応液調整部１０７に架設された反応容器１０５に吐出する。
【００１６】
チップラック１１５は、分注ユニット１１３を用いて検体や試薬を吸引・吐出する時に使用されるチップ１１４を複数収容する。核酸増幅部１１６は、反応容器１０５に収納された反応液中の核酸の増幅に使用される。検出器１１７は、増幅過程の蛍光強度の検出に使用される。廃棄ボックス１１８は、使用済みのチップ１１４や使用済みの反応容器１０５の廃棄に使用する。入力部１１９は、キーボードやマウス等である。入力部１１９は、試薬ボトルに張り付けられたバーコード等から基準値（後述する変曲点や変曲点の傾き）の情報の入力にも用いられる。基準値がバーコードに記述されている場合、入力部１１９にはバーコードリーダーを使用する。表示部１２０は、液晶モニタ等である。制御部１２１は、装置全体の動作を制御するコンピュータである。本実施例で提案する異常な核酸増幅反応曲線の検出処理も制御部１２１が実行する。
【００１７】
［検出処理動作の概要］
図２に、異常な核酸増幅反応曲線の検出処理手順の概要を示す。制御部１２１は、まずキャリブレータやポジティブコントロール等を含む試料をPCR測定し、核酸増幅反応曲線
を取得する（ステップ２０１）。次に、制御部１２１は、測定により得た核酸増幅反応曲線をシグモイド式に近似する処理を行い、近似（フィッティング）の可否を判定する（ステップ２０２）。制御部１２１は、近似可の場合にはステップ２０３に進み、近似不可の場合にはステップ２０９に進む。
【００１８】
ステップ２０３においては、制御部１２１は、近似した核酸増幅反応曲線（近似式）の変曲点（例えば上へ凸から下へ凸へと変化する点）を求めるため、近似された核酸増幅反応曲線（近似式）を数学的に２階微分する。次に、制御部１２１は、２階微分式が０（ゼロ）となる変数の値を求める（ステップ２０４）。ここでの変数は、核酸増幅反応の進捗を示す値である。算出法には、２分法やニュートン法等があるが、本実施例では後述の通り、２分法を簡潔化した方法を採用する。次に、制御部１２１は、変曲点における傾きを算出するため、近似された核酸増幅反応曲線（近似式）を数学的に１階微分する（ステップ２０５）。続いて、制御部１２１は、１階微分式の変数値にステップ２０４で求めた変曲点を代入し、変曲点での傾きを算出する（ステップ２０６）。ここでの変数も、核酸増幅反応の進捗を示す値である。
【００１９】
この後、制御部１２１は、判定条件（後述する式（12））に従い、近似された核酸増幅反応曲線（近似式）が正常か否かを判定する（ステップ２０７）。正常であると判定された場合、制御部１２１は、ステップ２１０に移行して一連の判定処理を終了する。一方、異常であると判定された場合、制御部１２１は、ステップ２０８に移行する。ステップ２０８で、制御部１２１は、想定される不具合を例えば液晶モニタに表示し、その後、ステップ２１０に移行して一連の判定処理を終了する。
【００２０】
なお、ステップ２０２からステップ２０９に移行した場合、制御部１２１は、判定条件（後述する式（14））に従い、測定された核酸増幅反応曲線が正常か否かを判定する。正常であると判定された場合、制御部１２１は、ステップ２１０に移行して一連の判定処理を終了する。一方、異常であると判定された場合、制御部１２１は、ステップ２０８に移行する。ステップ２０８では、前述したように、制御部１２１は、想定される不具合を液晶モニタに表示し、その後、ステップ２１０に移行して一連の判定処理を終了する。
【００２１】
以下の説明でも、引き続き、核酸増幅方法としてPCR法を適用する場合について説明す
る。もっとも、核酸増幅法は、PCR法に限定されない。例えばLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法などの恒温核酸増幅方法も適用することができる。
【００２２】
PCR法等の温度サイクルを含む核酸増幅法においては、増幅産物に基づく規定の測定値
を閾値として用いるときに、当該閾値に測定値が達するサイクル数をCt値と定義する。恒温核酸増幅法では、増幅産物に基づく規定の測定値を閾値として用いるときに、当該閾値に測定値が達する反応時間をCt値に対応する概念として定義する。従って、本明細書においては、「核酸増幅反応の進捗を示す値」を、増幅産物の一定量を閾値として用いるときに、当該閾値に測定値が達するサイクル数または反応時間を意味する。
【００２３】
ところで、核酸増幅法における増幅産物を検出する方法は任意であり、例えば従来公知の検出原理を利用することができる。増幅した核酸の検出には、いわゆる蛍光検出法を利用することができる。また、反応液の濁度変化、散乱光強度変化に基づいて増幅した核酸を検出しても良い。ここでの蛍光検出法には、インターカレータを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレータ法は、一般的にSYBR Green1と核酸増幅
反応によって合成された二本鎖DNAを結合させ、励起光の照射により生じる蛍光強度を測
定することにより、増幅産物の生成量に基づく蛍光量をモニタする方法である。一方、蛍光標識プローブ法の一例として、5’末端を蛍光物質で、3’末端をクエンチャー物質で修飾したTaqManプローブと核酸増幅反応によって合成された二本鎖DNAを結合させ、励起光
の照射により生じる蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量に基づく蛍光量をモニタする方法がある。
【００２４】
［理想的な（基準となる）核酸増幅反応曲線の作成］
以上のように、如何なる核酸増幅法であっても、所定の間隔で核酸増幅産物から発せられる蛍光量や濁度変化、散乱光量等を検出することにより、X軸を増幅反応の進捗を示す
値（サイクル数又は反応時間）、Y軸を増幅産物の検出値（蛍光強度、濁度変化、散乱強
度等）とする核酸増幅反応曲線を作成することができる。
【００２５】
本実施例の場合、ステップ２０２の近似（フィッティング）処理において、核酸増幅反応曲線を、５つのパラメータを持つシグモイド式(1)に近似させる。
2015225032.tif 000003
【００２６】
以下に示す表１に、各パラメータの意味を示す。
2015225032.tif 000004
【００２７】
ステップ２０１で測定された核酸増幅反応曲線の式(1)への近似は、準ニュートン法に
より行い、式(1)から得られる計算値F(Xi)と実測値Yi（i：サイクル数又は反応時間）と
の差の二乗和Zｉ2（式(2)）が所定値以下になるまで非線形最小二乗法（準ニュートン）
処理を繰り返し、上記パラメータの最適値を決定する。
2015225032.tif 000005
【００２８】
ここで、準ニュートン法について簡単に説明する。準ニュートン法は、以下のステップI〜IIIで構成される。
【００２９】
ステップＩ：
行列J（5行i列）を、次の式(3)により定義する。ｉは増幅反応の進捗を示す値（サイクル数又は反応時間）である。(δZ/δB)1，(δZ/δa)1，(δZ/δb)1，(δZ/δc)1，(δZ/δK)1は、Zｉにi＝1を代入し、変数Ｂ, ａ, ｂ, ｃ ,Ｋで偏微分する意味である。
2015225032.tif 000006
【００３０】
ステップII：
残差Zｉを次の式(4)で表現する。
2015225032.tif 000007
ここで、ΔＢ，Δａ，Δｂ，Δｃ，ΔＫは、次の式(5)で与えられ、Ｂ，ａ，ｂ，ｃ，Ｋ
は期待値、Ｂ’，ａ’，ｂ’，ｃ’，Ｋ’は設定値である。
2015225032.tif 000008
【００３１】
ステップIII：
式(4)を変形し、ΔＢ，Δａ，Δｂ，Δｃ，ΔＫを計算する。
2015225032.tif 000009
ここで、Jｔは行列Jの配置行列であり、(Jｔ *J)-1は(Jｔ *J)の逆行列である。制御部１２１は、以上のステップIIとステップIIIを、式(2)の残差二乗和Zi2が設定値以下にな
るまで反復する。
【００３２】
本実施例では、核酸増幅反応曲線の近似式を式(1)で表すが、従来公知のダブルシグモ
イド式を利用することも可能である。
【００３３】
図３に、使用した検査項目試薬で核酸増幅反応させる場合に望まれる理想的な核酸増幅反応曲線３０１を示す。なお、核酸増幅反応曲線３０１は、式(1)に近似した後のグラフ
であり、各パラメータの値は表２の通りである。
【００３４】
2015225032.tif 000010
【００３５】
本実施例では、表２のパラメータにより決まる核酸増幅反応曲線３０１を、使用した検査項目試薬におけるポジティブコントロールの正常な増幅曲線と見なす。そして、式(1)
を２階微分(式(7))して核酸増幅反応曲線３０１の変曲点を求める。式(7)中の変数Ｂ，Ｋ，ａ，ｂ，ｃは表２に従う。
2015225032.tif 000011
【００３６】
図４に、核酸増幅反応曲線３０１を式(7)により２階微分した後のグラフ４０１を示す
。２分法より、F’’(26)＞0, F’’(27)＜0である。このため、F’’(X) ＝ 0となるXは、26 ＜ X ＜27の範囲にある。よって、本実施例では、F’’(26) ≒ 0とし、X=26を変曲点とする。本実施例とは別に、ニュートン近似を適用し、F’’(X) ≒ 0を算出すること
も可能である。
【００３７】
次に、制御部１２１は、式(1)を１階微分（式(8)）し、核酸増幅反応曲線３０１の各X
値に対する傾きを求める。式(8)中の変数Ｂ，Ｋ，ａ，ｂ，ｃは表２に従う。
2015225032.tif 000012
【００３８】
式(8)のXに先に求めた変曲点X ＝ 26を代入すると、F’(26) ＝ 0.048となる。制御部
１２１は、この値を、正常な核酸増幅反応曲線３０１の変曲点における傾きとする。図５に、式(8)により表される核酸増幅反応曲線３０１を１階微分したグラフ５０１を示す。
【００３９】
さらに、制御部１２１は、この傾き0.048を測定に使用した検査項目試薬に対するポジ
ティブコントロール核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きの基準値(S)とし、他の試薬
情報と共に試薬ボトルに貼り付けられるバーコードに登録する。なお、登録先はバーコードに限らず、試薬ボトルに張り付けられるＩＣタグ等のメモリに登録しても良い。因みに、傾きの基準値は、同じメーカの同一検査項目の試薬でも、試薬ロット（Lot）により変
わる可能性がある。このバーコード等に判定式の基準値が登録されているので、いずれの核酸増幅分析装置においても、測定された核酸増幅反応曲線が正常か否かの判定を行うことが可能となる。
【００４０】
さらに、キャリブレータやインターナルコントロールなど他の核酸試料においても、ポジティブコントロールの核酸増幅反応曲線と同様、キャリブレータやインターナルコントロールなど他の核酸試料について、理想となる核酸増幅反応曲線３０１の変曲点における傾きの基準値(S)も試薬バーコードに登録することができる。
【００４１】
さらに、制御部１２１は、ポジティブコントロールについて、使用した検査項目の試薬に対し、正常な核酸増幅反応曲線３０１のプラトー値３０２を式(9)より算出する。算出
されたプラトー値３０２は、基準とする核酸増幅反応曲線のプラトー値(P)として試薬バ
ーコード等に登録することができる。本実施例では、次の式(9)からプラトー値(P) ＝ 1.0とした。
【００４２】
2015225032.tif 000013
ただし、F(Xi-1)は（i-1）サイクルにおける検出値の近似値であり、F(Xi)はiサイクルにおける検出値の近似値であり、ｉはPCRの最終サイクルである。
【００４３】
キャリブレータやインターナルコントロールなど他の核酸試料についても理想となる核酸増幅反応曲線のプラトー値３０２がある。キャリブレータやインターナルコントロールなど他の核酸試料についても、基準とする核酸増幅反応曲線のプラトー値(P)を試薬バー
コードに登録することができる。
【００４４】
［測定時の処理動作］
次に、対象試料について測定された核酸増幅反応曲線が異常か否かを検出する動作について説明する。前述したように、図２に示すフローチャートには、(1)試薬バーコードに
登録されたキャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロールなどの核酸試料に対する核酸増幅反応曲線の変曲点での傾きの基準値(S)を利用する処理と、(2)試薬バーコードに登録されたキャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロールなどの核酸試料に対する核酸増幅反応曲線のプラトー値の基準値(P)を利用す
る処理の２パターンが用意されている。その理由は、ユーザがキャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロールを含む患者検体を測定した場合に、核酸増幅反応曲線が式(1)に近似できる場合と、増幅産物に基づく検出値が低い又は核酸増幅反応
曲線のベースライン３０５のバラつき等により近似不可となる場合とがあるためである。
【００４５】
図３に、ポジティブコントロールについて異常な核酸増幅反応曲線３０３の例を示す。
(1)反応液に増幅反応を阻害する物質が含まれていた、(2)試薬の消費期限が切れていた、(3)温調ブロック異常に伴う温度サイクル不良等の装置トラブルなどがあった時、核酸増
幅反応曲線３０３の変化量は、正常（理想的）な核酸増幅反応曲線３０１と比べて強度が小さくなる。図３に示す異常な核酸増幅反応曲線３０３は、測定された核酸増幅反応曲線を式(1)に近似した後のグラフであり、各パラメータの値は表３の通りである。
【００４６】
2015225032.tif 000014
【００４７】
ステップ２０１におけるポジティブコントロールの測定後、制御部１２１は、ステップ２０２においてポジティブコントロールの核酸増幅反応曲線は、前述の式(1)に基づき、
次の式(10)に近似される。
【００４８】
2015225032.tif 000015
なお、式(10)では、近似式を与える各パラメータの値に、表３に示した値を代入している。この式(10)が、核酸増幅反応曲線３０３（Ft(X)とする）である。
【００４９】
次に、制御部１２１は、式(10)を式(7)に従い２階微分(Ft’’(X)とする)した後（ステップ２０３）、測定ポジティブコントロール増幅曲線の変曲点を求める（ステップ２０４）。図４に、式(10)により表される核酸増幅反応曲線３０３を２階微分した後のグラフ４０２を示す。ステップ２０４において、Ft’’(X) ≒ 0となるX = 26を、核酸増幅反応曲線３０３の変曲点とする。
【００５０】
次に、制御部１２１は、式(10)を式(8)に従い１階微分し(Ft’(X)とする)（ステップ２０５）、測定ポジティブコントロール増幅曲線の変曲点における傾きを求める（ステップ２０６）。図５に、式(10)により表される核酸増幅反応曲線３０３を１階微分したグラフ５０２を示す。式(11)のXに先に求めた変曲点X = 26を代入すると、傾きは、Ft’(26) ＝ 0.029となる。
【００５１】
2015225032.tif 000016
【００５２】
次に、制御部１２１は、ステップ２０７において使用した試薬バーコードに登録されたポジティブコントロール核酸増幅反応曲線の傾きの基準値(S)（本実施例の場合は、F’(26) ＝ 0.029）を利用し、式(10)に近似された核酸増幅反応曲線３０３が正常か否かを式(12)で判定する。
【００５３】
2015225032.tif 000017
ただし、S’は判定対象増幅曲線の変曲点での傾き、Sは基準増幅曲線の変曲点での傾きである。
【００５４】
ここで、式(12)に、S = 0.048、S’ = 0.029を代入すると、判定式Dsの値は、以下により計算される。
2015225032.tif 000018
【００５５】
仮にDs ＜ 0.7の時を異常であるとすると、制御部１２１は、核酸増幅反応曲線３０３
を異常と判定してステップ２０８に進み、想定される不具合の内容をモニタに表示する。
なお、想定される不具合の内容は、過去の測定結果よりデータベース化されているものとする。一方、Ds ≧ 0.7であれば、制御部１２１は、測定により得られた核酸増幅反応曲
線を正常であると判定し、アラームを表示させることなく判定処理を終了する（ステップ２１０）。
【００５６】
一方、ステップ２０２において、増幅産物に基づく検出値が低い又は核酸増幅反応曲線のベースライン３０５のバラつき等により、測定により得られた核酸増幅反応曲線を式(1)に近似できなかった場合、制御部１２１は、使用した試薬バーコードに登録されたポジ
ティブコントロール核酸増幅反応曲線のプラトー値(P)とP = 1.0（式(9)より）とを利用
し、得られた核酸増幅反応曲線が正常か否かを次の式(14)を用いて判定する（ステップ２０９）。
【００５７】
2015225032.tif 000019
ただし、P’は、判定対象増幅曲線のプラトー値であり、Pは基準増幅曲線のプラトー値である。
【００５８】
仮に測定したポジティブコントロールの核酸増幅反応曲線３０３が式(1)へ近似できな
かった場合、核酸増幅反応曲線３０３のプラトー値(P’)３０４は、P’ = 0.6となる。ここで、Pは式(9)より、P’は式(15)より導かれる。
【００５９】
2015225032.tif 000020
ただし、Y(Xi-1)は(i-1)サイクルでの検出値（実測値）であり、Y(Xi)はiサイクルでの検出値（実測値）であり、ｉはPCRの最終サイクルである。
【００６０】
ここで、式(14)にP = 1.0、P’= 0.6を代入すると、判定式Dpの値は、以下により計算
される。
2015225032.tif 000021
【００６１】
仮にDp ＜ 0.7の時を異常であるとすると、制御部１２１は、核酸増幅反応曲線３０３
を異常と判定してステップ２０８に進み、想定される不具合の内容をモニタに表示する。
やはり、想定される不具合の内容は、過去の測定結果よりデータベース化されているものとする。一方、Dp ≧ 0.7の場合、制御部１２１は、測定により得られた核酸増幅反応曲
線を正常であると判定し、アラームを表示させることなく判定処理を終了する（ステップ２１０）。ただし、近似エラーのアラームは、別途モニタに表示される。
【００６２】
本実施例では、ポジティブコントロールの核酸増幅反応曲線について、核酸増幅反応曲線が正常か否かを判定する方法を説明しているが、キャリブレータやインターナルコントロールを含む核酸試料を測定した場合も、同様に処理される。
【００６３】
なお、測定した核酸試料の核酸増幅反応曲線が正常と判定された場合、制御部１２１は、増幅産物に基づく測定値に対し、閾値(Threshold Line)に達する核酸増幅反応の進捗を示す値を算出する。異常と判定された核酸増幅反応曲線の場合、制御部１２１は、進捗値を算出するが、同時に増幅不良のアラームを付与する。
【００６４】
［判定結果の表示例］
図６Ａに、ステップ２０７における判定結果の表示画面例を示す。当該画面には、基準となる核酸増幅反応曲線と測定試料の増幅曲線に関する一次微分曲線６０１（式(8)参照
）と、変曲点における傾き比（S’/S）と変曲点の結果６０２とが表示される。同画面に
は、一次微分曲線６０１についてX軸スクロール６０４が用意される。X軸スクロール６０４を軸方向に沿って移動すると、制御部１２１は、指定のX軸位置（本実施例ではサイク
ル数）に対する基準核酸増幅反応曲線又は測定試料の核酸増幅反応曲線における傾き６０３も画面内に表示される。
【００６５】
図６Ｂに、ステップ２０７における判定結果の別の表示画面例を示す。当該画面には、基準となる核酸増幅反応曲線と、測定試料の核酸増幅反応曲線と、過去に測定した同一項目の一次微分曲線とを重ね合わせたグラフ６０５が表示される。また、同画面には、各増幅曲線の変曲点と、当該変曲点における傾きの結果６０６も表示される。図６Ｂでは、グラフ６０５に、３試料の一次微分曲線が表示されているが、PCの処理能力の範囲内でユーザが重ね合わせたい数（核酸試料の数）を選択できるようにしても良い。
【００６６】
図６Ｃに、ステップ２０９における判定結果の表示画面例を示す。当該画面には、基準となる核酸増幅反応曲線と測定試料の核酸増幅反応曲線をそれぞれ示すグラフ６０７と、プラトー値の比（P’/P）及びプラトー値の結果６０８とが表示される。
【００６７】
図６Ｄに、ステップ２０９における判定結果の別の表示画面例を示す。当該画面には、基準となる核酸増幅反応曲線と、測定試料の核酸増幅反応曲線と、過去に測定した同一項目の核酸増幅反応曲線を重ね合わせたグラフ６０９が表示される。また、同画面には、各増幅曲線に対応するプラトー値の結果６１０も表示される。本実施例では、グラフ６０９に、３試料の核酸増幅反応曲線が表示されているが、PCの処理能力の範囲内でユーザが重ね合わせたい数（核酸試料の数）を選択できるようにしても良い。
【００６８】
［再キャリブレーション条件設定画面］
制御部１２１には、キャリブレータの核酸増幅反応曲線が異常であると判定された場合に、自動的に再キャリブレーションを実行する機能が搭載されている。ここで、再キャリブレーションとは、核酸試料が収納されたサンプル容器１０１や試薬容器１０３をユーザが新たに架設することなく（すなわち、最初に載置したサンプル容器１０１や試薬容器１０３を使用し）、再度実行されるキャリブレーションのことである。
【００６９】
図７に、自動再キャリブレーション条件設定画面の表示例を示す。図７中の傾き比（S
’/S）は式(12)で算出される値であり、プラトー比（P’/P）は式(14)で算出される値で
ある。測定結果に基づいて計算された傾き比（S’/S）やプラトー比（P’/P）がユーザの設定した値より小さく、かつ「再キャリブレーションをする」ボタンにチェックが入っている場合、制御部１２１は、異常と判定された濃度が得られたキャリブレータについてのみ再測定を自動実行する機能を有する。
【００７０】
ここでは、再キャリブレーション機能に関連する核酸増幅分析装置１００の構造部分について、図を用いて簡単に説明する。図８に、核酸増幅分析装置１００における核酸増幅部１１６と検出部１１７の詳細構成を示す。核酸増幅部１１６は、カローセル８０２上に、独立して温度制御可能な温調ブロック８０３を複数有している。反応液を収容する複数の反応容器１０５に対応する温調ブロックには、温度制御される保持具８０４が設けられている。なお、カローセル８２０は中心軸８０５を軸中心に回転する。
【００７１】
前述のステップ２０８において発生した不具合の内容に、温調ブロック８０３の異常が含まれる場合、核酸増幅分析装置１００（制御部１２１）は、異常が疑われる温調ブロック８０３の使用を中止する（マスクする）機能を有している。図７中の「温調異常ブロックをマスク」ボタンが、この温調ブロックのマスク機能の実行の有無を設定するボタンである。当該ボタンにチェックが入っている場合、制御部１２１は、異常が疑われる温調ブロック８０３を使用せず（マスクし）、別の温調ブロック８０３を用いて再キャリブレーションを実行する。
【００７２】
制御部１２１は、ポジティブコントロールの核酸増幅反応曲線が異常と判定された場合も、自動的にポジティブコントロールを再検する機能を搭載する。図９に、自動再検条件設定画面の表示例を示す。図９中の条件設定法は、再キャリブレーション機能の場合と同様である。ここで、再検とは、核酸試料が収納されたサンプル容器１０１や試薬容器１０３をユーザが新たに架設することなく（すなわち、最初に載置したサンプル容器１０１や試薬容器１０３を使用し）、同一の核酸試料について同一項目の再測定を実行することである。
【００７３】
前述のステップ２０９において核酸増幅反応曲線が異常と判定された場合も、制御部１２１は、インターナルコントロールを自動的に再検することができる。条件設定画面の表示項目は、図７と同様である。ただし、「自動再キャリブレーションする」ボタンに代えて、「自動再検」するボタンが用いられる。さらに、自動再検機能は、上記ポジティブコントロールやインターナルコントロールを含む検体以外の核酸試料にも適用可能である。
【００７４】
［効果］
前述の通り、核酸増幅分析装置１００によれば、キャリブレータ、ポジティブコントロール、インターナルコントロール等の核酸を含む試料について、核酸増幅反応が正常か否かを検出することが可能となり、Ct値といった核酸増幅反応の進捗を示す値の測定結果の信頼性を向上させることができる。
【００７５】
また、核酸増幅分析装置１００によれば、核酸増幅反応曲線が異常と判定された場合に想定される不具合の内容をモニタに表示することができ（図１０）、ユーザに適切な処理を推奨することができる。さらに、キャリブレータの核酸増幅反応曲線が異常と判定された場合、自動で再キャリブレーションを実行する機能を持たせることで、ユーザの負担を軽減することができる。
【００７６】
さらに、ポジティブコントロールや濃度未知試料（検体）と同時に測定されるインターナルコントロール、その他の核酸を含む試料の核酸増幅反応曲線が異常と判定された場合、自動で再検を実行する機能を持たせることで、ユーザの負担軽減を図ることができる。
【００７７】
［他の実施例］
本発明は、上述した実施例の構成に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでい
る。例えば上述した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために、一部の実施例について詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要は無い。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成に他の構成を追加し、又は、各実施例の一部構成を他の構成で置換し、又は各実施例の一部構成を削除することも可能である。
【００７８】
また、上述した各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例
えば集積回路その他のハードウェアとして実現しても良い。また、上記の各構成、機能等は、それぞれの機能を実現するプログラムをプロセッサが解釈して実行することにより実現しても良い。すなわち、各構成等をソフトウェアにより実現しても良い。この場合、各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリやハードディスク、SSD（Solid State Drive）等の記憶装置、ICカード、SDカード、DVD等の記憶媒体に格納
することができる。
【００７９】
また、制御線や情報線は、説明上必要と考えられるものを示すものであり、製品上必
要な全ての制御線や情報線を表すものでない。実際にはほとんど全ての構成が相互に接続されていると考えて良い。
【符号の説明】
【００８０】
100…核酸増幅分析装置
101…サンプル容器
102…サンプル容器ラック
103…試薬容器
104…試薬容器ラック
105…反応容器
106…反応容器ラック
107…反応液調整部
108…密閉ユニット
109…攪拌ユニット
110…ロボットアームX軸
111…ロボットアームY軸
112…グリッパユニット
113…分注ユニット
114…チップ
115…チップラック
116…核酸増幅部
117…検出器
118…廃棄ボックス
119…入力部
120…表示部
121…制御部
802…カローセル
803…温調ブロック
804…保持具
805…中心軸
【図１】
2015225032.tif 000022
【図２】
2015225032.tif 000023
【図３】
2015225032.tif 000024
【図４】
2015225032.tif 000025
【図５】
2015225032.tif 000026
【図６Ａ】
2015225032.tif 000027
【図６Ｂ】
2015225032.tif 000028
【図６Ｃ】
2015225032.tif 000029
【図６Ｄ】
2015225032.tif 000030
【図７】
2015225032.tif 000031
【図８】
2015225032.tif 000032
【図９】
2015225032.tif 000033
【図１０】
2015225032.tif 000034