(57)【要約】【課題】本発明は、サンプルの入手や測定が容易な癌の検出方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、被検体から得られた試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の検出方法であって、試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から得られた試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の検出方法であって、試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す、方法。
【請求項２】
癌が、膵臓癌または大腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌の存在を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、予後不良の癌の存在を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
試料が被検体から得られた細胞外液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出手段を含んでなる、癌の診断薬または診断キット。
【請求項７】
癌が、膵臓癌または大腸癌である、請求項５に記載の診断薬または診断キット。
【請求項８】
癌が、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌である、請求項６または７に記載の診断薬または診断キット。
【請求項９】
癌が、予後不良の癌である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の診断薬または診断キット。
【請求項１０】
検出手段がＥＲＯ１−Ｌαタンパク質に対する抗体である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の診断薬または診断キット。
【請求項１１】
ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる、癌治療用医薬組成物。
【請求項１２】
癌が、膵臓癌または大腸癌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤が、ＥＲＯ１−Ｌαに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を指標にした癌の検出方法に関する。本発明はまた、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出手段を含んでなる癌の診断薬および診断キットに関する。本発明はさらに、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる癌治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、予後不良な癌として知られ、極めて治療が困難な癌の一つである。特徴的な症状や自覚症状が現れにくく、多くは進行が進んでから発見されることが多い。従って、早期に発見するための手法の開発が望まれる。また、膵臓癌は、外科的切除により治療が試みられるが手術は侵襲性が高い。従って、外科的手術の代替法の確立が望まれる。
【０００３】
また、大腸癌は、便潜血検査などにより早期発見が可能であり、早期発見により手術により根治ができる可能性の高い癌である。手術後に再発した場合も、早期発見と早期の切除により根治が期待できる場合がある。しかし、発見が遅れ、切除困難な転移が起こった場合には、抗癌剤治療または放射線治療などが試みられる。しかし、これらの治療は必ずしも有効でない場合があり、治療法の選択やその有効性の評価が極めて重要である。従って、最適な治療法を選択する際の指標の確立が望まれる。
【０００４】
ところで、Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1 Like α（ＥＲＯ１−Ｌα）タンパク質が、特に低酸素環境下で誘導されるタンパク質として見出されている（非特許文献１）。ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、ジスルフィド結合の形成を触媒することが知られ、従ってタンパク質のフォールディングに不可欠な役割を果たしている（非特許文献２）。しかしながら、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質と、癌、特に膵臓癌との具体的関係は不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dalit May et. al, Oncogene (2005) 24: 1011-1020
【非特許文献２】Yanyan Chu et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2009) 389: 645-650
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、サンプルの入手や測定が容易な癌の検出方法、診断薬および診断キットを提供することを目的とする。本発明はさらに、副作用が低減された癌の治療のための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が癌細胞特異的に発現していること、特に膵臓癌および大腸癌で高発現していることを見出した。本発明者らはまた、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が高発現している癌患者では、外科的手術後の予後が不良であることを見出した。本発明者らはさらに、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が高発現している癌細胞において、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子をノックダウンすると癌の形成が抑制されることを見出した。本発明者らはさらにまた、細胞内タンパク質として知られるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が、意外にも細胞外に分泌されていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
【０００８】
すなわち、本発明では、以下の発明が提供される。
（１）被検体から得られた試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の検出方法であって、試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す、方法。
（２）癌が、膵臓癌または大腸癌である、上記（１）に記載の方法。
（３）試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌の存在を示す、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、予後不良の癌の存在を示す、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）試料が被検体から得られた細胞外液である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出手段を含んでなる、癌の診断薬または診断キット。
（７）癌が、膵臓癌または大腸癌である、上記（５）に記載の診断薬または診断キット。
（８）癌が、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌である、上記（６）または（７）に記載の診断薬または診断キット。
（９）癌が、予後不良の癌である、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の診断薬または診断キット。
（１０）検出手段がＥＲＯ１−Ｌαタンパク質に対する抗体である、上記（６）〜（９）のいずれかに記載の診断薬または診断キット。
（１１）ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる、癌治療用医薬組成物。
（１２）癌が、膵臓癌または大腸癌である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤が、ＥＲＯ１−Ｌαに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
【０００９】
本発明の癌の検出方法は、血液や体液などの細胞外液をサンプルとして用いることができるので、サンプルの入手容易性および測定容易性の観点で有利である。本発明の癌の検出方法はまた、癌の治療方法の有効性に関する示唆が得られる点で有利である。本発明の医薬組成物の有効成分が標的とするＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、癌細胞でのみ高発現を示すため、本発明の医薬組成物は、副作用低減の観点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、正常なヒト組織から作製された市販のｃＤＮＡライブラリを用いてＥＲＯ１−Ｌαおよびβの発現をＰＣＲにより確認した結果を示す図である。
【図２】図２は、癌細胞株から抽出して得られたｍＲＮＡを用いてＥＲＯ１−Ｌαおよびβの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した結果を示す図である。
【図３】図３は、癌患者の膵臓組織の切片におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を示す免疫組織化学染色像である。
【図４】図４は、各種組織切片におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を示す免疫組織化学染色像である。図４Ａは、正常な膵臓組織、図４Ｂは、正常な小腸組織、図４Ｃは、正常な直腸組織および直腸癌の組織の組織切片におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を示す。
【図５】図５は、各組織におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を、ウェスタンブロット法により確認した結果を示す図である。
【図６】図６は、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現のｓｈＲＮＡによるノックダウンの結果を示すウェスタンブロットの結果である。
【図７】図７は、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現が低下したがん細胞が、ヌードマウスの体内では癌を形成できなくなることを示す図である。
【図８】図８は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質のノックダウンクローンにおける、ＭＨＣクラスＩ分子の発現量の低下を示す図である。
【図９】図９は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質のノックダウンクローンにおける、特異的細胞傷害性Ｔ細胞への応答の低下を示す図である。
【図１０】図１０は、癌患者におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量の分布を示す図である。
【図１１】図１１は、癌患者におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量と癌の再発リスクとの関係を示す図である。
【図１２】図１２は、ＥＲＯ１−Ｌαの発現が高い癌患者と低い癌患者の生存曲線を示す図である。
【図１３】図１３は、ｍｙｃタグＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を強制発現させた大腸癌細胞ＳＷ４８０細胞が、培養上清にＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を分泌することを示す図である。図１３では、培養上清をｍｙｃ抗体で免疫沈降して得られたＥＲＯ１−Ｌαタンパク質をウェスタンブロット法により検出している。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
後記実施例で示されるように、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は正常組織では発現せず癌特異的に発現する。従って、本発明の検出方法では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が被検体の試料で検出された場合には、被検体に癌が存在する可能性が高いと判定することができる。すなわち、本発明の検出方法は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在を指標として、被検体に癌が存在するか否かを判定する方法である。
【００１２】
このように本発明の検出方法では被検体に癌が存在すると判定することができるが、被験体が癌患者であるか否かは医師等の判断により決定される。従って、本発明の検出方法は、癌の診断を補助する方法として用いることができる。すなわち、本発明によれば、被検体から得られた試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の診断のためのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出方法であって、試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す方法が提供される。本発明の検出方法による結果に基づいて診断を行う際には、医師等は、例えば、癌マーカーを測定する方法および生検による方法などの当業者に周知の検査方法および／または診断方法を用いることができる。さらに、本発明の検出方法では癌細胞を検出することができる。すなわち、本発明によれば、被検体から得られた試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することを含んでなる、癌細胞の検出方法であって、試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在が、被検体中の癌細胞の存在を示す、癌細胞の検出方法が提供される。
【００１３】
後記実施例で示されるように、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は細胞内にて発現するタンパク質であり癌組織内にて検出されるが、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌からはＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が細胞外に分泌される。従って、本発明の検出方法では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を被検体から得られた細胞外液で検出することができる。すなわち、本発明では、検出対象となる試料は、癌組織または癌であると疑われる組織としてもよく、また、被検体から得られた細胞外液としてもよい。
【００１４】
本明細書では、細胞外液とは、血液、リンパ液および組織液などの体液を意味し、体腔内にたまった体腔液も細胞外液に含まれる。本発明では、血液の代わりに、血清または血漿などの血液の液体成分を用いてもよい。従って、「血液」には血清や血漿などの血液の液体成分も含まれる。
【００１５】
本発明の検出方法の指標となるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、細胞内タンパク質であり、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を酸化する。ＰＤＩは酸化により活性化し、標的タンパク質にジスルフィド結合を形成させ、これにより、タンパク質のフォールディングおよび品質管理に関与するとされている（非特許文献２）。ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質のアミノ酸配列およびＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の塩基配列は周知であり、例えば、ヒトＥＲＯ１−Ｌα（ｈＥＲＯ１−Ｌα）の塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に示される通りである。
【００１６】
後記実施例に示される通り、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、特に大腸癌（直腸癌および結腸癌）および膵臓癌で高い発現を示す。そして、大腸癌（直腸癌および結腸癌）および膵臓癌などのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を高発現する癌からはＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が分泌される。従って、本発明の検出方法の検出対象となる癌は、特に限定されないが、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌、より好ましくはＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を高発現する癌、例えば、大腸癌および膵臓癌などの固形癌である。
【００１７】
ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、細胞外に分泌されて細胞外液中に混入するが、体内を循環中に細胞外液中で代謝または分解されることがある。従って、本発明の検出方法では、細胞外液中でＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出する際には、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の代謝物および／または分解物（例えば、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の断片）を細胞から分泌されたＥＲＯ１−Ｌαタンパク質として検出してもよい。
【００１８】
本発明の検出方法の対象となる被検体は、哺乳類動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。被検体は、必ずしも癌が疑われる被検体である必要はないが、例えば、癌が疑われる被検体（例えば、ヒト）とすることが好ましく、膵臓癌または大腸癌であることが疑われる被検体（例えば、ヒト）とすることがより好ましい。本発明の検出方法では、予後不良な癌の存在が示され、また、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現および／または機能を阻害する治療法に対して感受性を有する癌の存在が示されるので、被検体は癌と診断された被検体（例えば、癌患者）であってもよい。癌であると疑われる被検体または癌と診断された被検体を対象とする場合には、測定する試料は、細胞外液としてもよいし、癌であると疑われる組織または癌組織としてもよい。
【００１９】
後記実施例に示されるように、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌を有する患者は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現しない癌を有する患者に比べて、治療後の予後が不良であった。具体的には、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌を有すると、外科的治療後の患者における再発までの期間が短くなる、または、再発率が高まるなど、癌の再発のリスクが高まる。従って、本発明の検出方法では、被検体の試料中でＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が検出された場合には、予後不良の癌が存在することが示される。例えば、本発明の検出方法を癌と診断された被検体に実施する場合に、被検体の試料中でＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が検出されたときは、癌が予後不良の癌であることが示される。
【００２０】
また、後記実施例に示されるように、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量が高い癌を有する患者は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量が低い癌を有する患者に比べて、治療後の予後が不良であった。具体的には、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量が高い癌を有すると、外科的治療後の患者における再発までの期間が短くなる、または、再発率が高まるなど、癌の再発のリスクが高まる。従って、本発明の検出方法では、被検体の試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量が、健常者または予後が良好であった患者の試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量よりも増加している場合には、予後不良の癌が存在することが示される。
【００２１】
また、後記実施例に示されるように、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌において、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を抑制すると、癌の発達が阻害された。本発明の検出方法によれば、被検体の試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌の存在を示す。そして、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌は、上述の通り、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制などのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療法に感受性を有する。従って、本発明の検出方法では、被検体の試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が検出された場合には、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌が存在することが示される。本発明の検出方法を癌と診断された被検体に実施する場合に、被検体の試料中でＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が検出されたときは、癌が、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌であることが示される。
【００２２】
なお、本明細書では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療は、特に限定されないが、例えば、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を抑制すること、または、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の活性を阻害することなど、癌細胞内でＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の働きを抑えることにより行う治療を意味する。
【００２３】
このように、本発明によれば、被検体の試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することにより、被検体が癌を有しているか否か、癌治療の予後が良好であるか否か、癌がＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有するか否かを判定することができる。
【００２４】
被検体の試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出できる限り限定されるものではないが、例えば、簡便性、感度および特異性の観点から、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質に対する抗体（抗ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質抗体）を用いて行うことが好ましい。抗体を用いたタンパク質の検出法としては、特に限定されないが、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）などの当業者に周知の方法が挙げられ、ＥＬＩＳＡは診断薬にも利用されている。また、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、抗原特異性の高さの観点からはモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２５】
本発明によれば、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出手段を含んでなる、癌の診断薬および診断キットが提供される。本発明の診断薬および診断キットは本発明の検出方法に関する記載に従って実施することができる。すなわち、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出手段はＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出できる適切な材料（ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の検出剤）である限り限定されるものではないが、上記のように抗ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質抗体を用いることができる。
【００２６】
前述のように、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は細胞外液中に分泌される。従って、本発明の診断キットは、細胞外液（例えば、血液）検査用の診断キットとしてもよく、その場合、診断薬の他に細胞外液（例えば、血液）採取のための器具および／または容器を含んでいてもよい。本発明の細胞外液検査用の診断キットでＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が検出された場合には、癌、特に膵臓癌または大腸癌を疑うことができ、癌が予後不良であると疑うことができ、および／または、癌がＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する可能性が高いと判断することができる。
【００２７】
癌が既に同定されている場合には、本発明の診断薬または診断キットは、診断の正確性を高める観点で、患者から採取した癌組織を診断するための診断薬または診断キットとすることが好ましい。このとき、正常組織と比較して癌組織でのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現がより高いことが示された場合には、癌が予後不良であると疑うことができ、および／または、癌がＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する可能性が高いと判断することができる。
【００２８】
従って、本発明の診断薬または診断キットは、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現および／または機能を阻害する薬剤や治療方法の有効性を予測するための、コンパニオン診断薬または診断キットとして用いることもできる。
【００２９】
本発明の診断薬および診断キットの診断対象となる癌は、特に限定されないが、癌、好ましくは、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌、より好ましくは、膵臓癌および大腸癌などのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を高発現する固形癌である。
【００３０】
本発明の検出方法は、本発明の診断薬または診断キットを用いて行ってもよい。すなわち、本発明によれば、本発明の診断薬または診断キットを用いて、被検体から得られた試料中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することを含んでなる、本発明の検出方法が提供される。
【００３１】
後記実施例によれば、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌においてＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を抑制した場合には、癌はほとんど増殖しなくなった。従って、本発明によれば、癌、好ましくは、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌、より好ましくは、膵臓癌および大腸癌などのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を高発現する癌の治療に用いるための、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００３２】
ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現抑制剤としては、特に限定されないが、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子を標的としたｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００３３】
ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）、特に限定されないが、２０〜３０ｂｐ、好ましくは、２１〜２３ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。このような二本鎖ＲＮＡは、当業者であれば、周知の方法を用いて、ＥＲＯ１−Ｌαの遺伝子配列を元に設計し製造することができる。本発明では、特に限定されないが、例えば、ｓｉＲＮＡとして、配列番号１３および１４の塩基配列を有する核酸をアニールして得られるｓｉＲＮＡを用いることができる。また、本発明では、配列番号１３および１４の塩基配列として、３’末端に２つのＴを有する核酸を用いたが、この２つのＴは、そのうちの一つまたは両方をＵに代えて用いてもよい。
【００３４】
ｓｈＲＮＡとは、生体内でＤｉｃｅｒにより分解を受けてｓｉＲＮＡを生成することができるＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、二本鎖のステムとヘアピンループを含むステムループ構造を有する。このヘアピンループ部分の配列は特に限定されないが、５〜１２塩基の配列とすることができる（Kawasaki H. et. al., Nucleic Acid Res. (2003) 31: 700-707、Paddison P. J. et. al., Genes and Dev. (2002) 16: 948-958、Lee N. S., Nat. Biotech. (2002) 20: 500-505およびSui G., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2002) 99: 5515-5520）。このようなｓｈＲＮＡは、当業者に周知の方法によりＥＲＯ１−Ｌαの遺伝子配列を元に設計し製造することができる。本発明では、特に限定されないが、例えば、ｓｈＲＮＡとして、実施例で用いた配列番号１１または１２のｓｈＲＮＡを用いることができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、賦形剤、補助剤および／または添加剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物はまた、１以上の他の抗癌剤をさらに含んでいてもよい。
【００３６】
本発明によればまた、治療上有効量のＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現抑制剤を、それを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）、例えば、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌を有する哺乳類（例えば、ヒト）に投与することを含んでなる、癌の治療法が提供される。
【００３７】
本発明の癌の治療法は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌を有する哺乳類（例えば、ヒト）に対してＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現または機能を阻害することにより行われ得る。従って、本発明の癌の治療法は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する哺乳類（例えば、ヒト）を、本発明の検出方法に基づいて同定した後に行うことが好ましい。従って、本発明の癌の治療法は、哺乳類（例えば、ヒト）の試料中にＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が存在するか否かを決定すること、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在を指標として癌を診断すること、および治療上の有効量のＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現抑制剤を該哺乳類に投与することを含んでなる、癌の治療法とすることができる。
【実施例】
【００３８】
実施例１：ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現の組織特異性
本実施例では、様々なヒト組織におけるＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現を確認した。
【００３９】
ヒトの各組織のｃＤＮＡとしては、ＢＤバイオサイエンシズ社から購入したmultiple tissue cDNA panelsのｃＤＮＡを用い、ＰＣＲ法により正常組織におけるＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現を確認した。
【００４０】
ＰＣＲは、ＥＲＯ１−Ｌαの検出用プライマーとしては、５’−ＧＣＣＣＧＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＴ−３’（配列番号：５）および５’−ＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号：６）を用い、ＥＲＯ１−Ｌβの検出用プライマーとしては、５’−ＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＡ−３’（配列番号：７）および５’−ＡＴＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号：８）を用い、インターナルコントロールとしてのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）の検出用プライマーとしては、５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ−３’（配列番号：９）および５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号：１０）を用いた。
【００４１】
ＰＣＲ反応では、１μＬのｃＤＮＡ、各５０ｐｍｏｌのプライマーおよびＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を含むＰＣＲ反応液５０μＬを用い、９２℃で２分加熱した後に、９２℃１分、６２℃１分および７２℃１分のサイクルを３０サイクル行った。
【００４２】
ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動の後にエチジウムブロマイド染色を行い、ＵＶ光により検出した。また、ＰＣＲ産物の塩基配列は、ＡＢＩ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＰＲＩＳＭ  ３１０およびＡｍｐｌｉＣｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて決定した。
【００４３】
その結果、ＥＲＯ１−Ｌβは、リンパ球、肝臓、脾臓、膵臓および精巣などの正常組織にて発現が認められたが、ＥＲＯ１−Ｌαは、正常組織での発現はほとんど認められなかった（図１）。
【００４４】
次に、ＥＲＯ１−Ｌαの癌細胞株における発現を確認した。
【００４５】
ヒト膵臓癌細胞株である、Ｐａｎｃ１、ＨＰＡＦ２、ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３は、ＡＴＣＣ社から購入した。その他、ヒト白血病細胞株Ｔ２Ａ２４（ＡＴＣＣ社から購入）、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ社から購入）、ヒト肺腺癌細胞株ＬＨＫ２（札幌医科大学で樹立された肺癌細胞株）、ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１５（ＡＴＣＣ社から購入）、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ社から購入）、ヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ１（ＡＴＣＣ社から購入）、ヒト乳癌細胞株ＨＭＣ１（ＡＴＣＣ社から購入）およびヒト腎臓癌細胞株ＳＭＫＴＲ（札幌医科大学で樹立された腎臓癌細胞株）を用いて、各種癌細胞株でのＥＲＯ１−Ｌαの発現を確認した。
【００４６】
これらの細胞からＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩおよびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて製造者マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、正常組織における条件と同一の条件で行った。
【００４７】
その結果、ＥＲＯ１−Ｌαは、ＨＣＴ１５細胞、ＳＷ４８０細胞、Ｃａｋｉ１細胞、ＨＰＡＦ２細胞、ＨＰＡＣ細胞、およびＢｘＰＣ３細胞において比較的高い発現が認められた（図２）。
【００４８】
このように、ＥＲＯ１−Ｌαは、正常組織では発現がほとんど認められなかったが、癌細胞株では発現が認められた。
【００４９】
実施例２：癌組織におけるＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現
本実施例では、癌組織におけるＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現を組織切片の免疫染色により確認した。
【００５０】
ヒトの癌患者の各種組織におけるＥＲＯ１−Ｌαの発現を調べた。組織としては、乳癌組織検体、胃癌組織検体、結腸直腸癌組織および膵臓癌組織を対象とした。組織は、１０％ホルマリンにより固定し、パラフィン包埋してから、ミクロトームを用いて２０μｍ厚の組織切片とした。その後、組織切片に対して、脱パラフィン処理および１２１℃１０分間のオートクレーブ処理を行った。さらに、抗ＥＲＯ１−Ｌα抗体（Ａｂｎｏｖａ社製、製品番号：Ｈ０００３０００１−Ｍ０１）、二次抗体としてペルオキシダーゼコンジュゲート羊抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社製、製品番号：Ｋ４０００）およびＤＡＢ (ＤＡＫＯ社製、製品番号Ｋ３４６８)を用いて常法に従って免疫組織化学染色を行った。その後、光学顕微鏡を用いて染色した各種組織切片を観察した。
【００５１】
観察の際、各組織のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量は４段階で評価した。４段階評価は以下の指標に基づいて行った。すなわち、図３ＡのようにＥＲＯ１−Ｌαがほとんど発現しないものは（−）とし、図３Ｂのようにわずかに発現が認められるものを（＋）とし、図３Ｃのように部分的に高い発現が認められるものを（＋＋）とし、図３Ｄのように全体的に高い発現が認められるものを（＋＋＋）とした。
【００５２】
各癌組織でのＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を上記指標に基づいて評価し、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現レベルと癌の種類との関係を調べたところ、結果は表１に示される通りであった。
【００５３】
【表１】
2015232441.tif 000002
【００５４】
表１に示されるように、ＥＲＯ１−Ｌαは、直腸結腸癌および膵臓癌において高い発現を示し、特に、膵臓癌では検体のうち約８６％が（＋＋）または（＋＋＋）の高発現を示した。一方で、乳癌や胃癌では（−）または（＋）の発現レベルに留まるものが大半を占めた。このことから、ＥＲＯ１−Ｌαの発現は、膵臓癌および直腸結腸癌（大腸癌）に特徴的であることが明らかとなった。
【００５５】
実施例３：正常な膵臓組織におけるＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現
本実施例では、正常な膵臓組織におけるＥＲＯ１−Ｌαの発現を免疫組織化学染色法とウェスタンブロット法により確認した。
【００５６】
正常なヒト膵臓、小腸および大腸、並びに大腸癌組織の正常な部分を対象とし、これらの組織切片におけるＥＲＯ１−Ｌαの発現解析は、実施例２に記載の免疫組織化学染色法により確認した。
【００５７】
その結果、正常なヒト膵臓および小腸では、ＥＲＯ１−Ｌαの発現は認められなかった（図４ＡおよびＢ）。また、正常な大腸でもＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現は認められなかったが、大腸癌の組織では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の高い発現が認められた（図４Ｃ）。
【００５８】
次に、ヒト膵臓、胃および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現をウェスタンブロット法により確認した。正の対照としては、ｍｙｃタグを付したＥＲＯ１−Ｌα（配列番号：３および４）を発現する２９３Ｔ細胞を用いた。この細胞株は、８０％コンフルエントの２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社から購入）にヒトＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の５’末端にｍｙｃ遺伝子をインフレームで連結した遺伝子を挿入した発現ベクター（ピューロマイシン耐性遺伝子を発現する）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用いて製造者マニュアルに従ってトランスフェクションし、４８時間後に２μｇ／ｍＬ  ピューロマイシン（シグマアルドリッチ社製）を添加して安定クローンとして樹立した株である。なお、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ社から購入）は、ヒト急性骨髄性白血病細胞として知られる細胞株であり、ＫＧ−１／Ｈ−２Ｋｂ細胞は、本発明者らがＫＧ−１細胞にマウスのＭＨＣクラスＩ分子であるＨ−２Ｋｂ遺伝子を導入して樹立した細胞株である。
【００５９】
各組織を氷冷したＰＢＳで洗浄し、次いで、細胞を溶解させるために、細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロッシュ社製））中で、氷上でインキュベートした。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃の条件で溶解したサンプルは２０分間遠心分離を行った。得られた全細胞抽出液は、常法に従ってＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ社製）に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳を含むＰＢＳ）で室温で１時間ブロッキングし、その後、ウサギ抗ＥＲＯ１−Ｌαモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）またはマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体ＡＣ−１５（シグマアルドリッチ社製）を用いて６０分間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜は、洗浄バッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ−ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を用いて２時間インキュベートした。最後に、シグナルをｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて製造者マニュアルに従って検出した。
【００６０】
すると、膵臓、胃およびＰＢＭＣのいずれにおいても、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現は認められなかった（図５）。一方、正の対照として用いたｍｙｃタグを有するＥＲＯ１−Ｌαを発現する２９３Ｔ細胞では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の高い発現が認められた（図５）。
【００６１】
このように、組織切片における免疫組織化学染色法によっても、組織から抽出した全タンパク質を用いたウェスタンブロット法によっても、正常な組織ではＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を確認することはできなかった。
【００６２】
実施例１および２の結果を総合すると、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、ヒト癌患者の組織（特に膵臓および直腸結腸）において高い発現を示したが、正常な組織（特に膵臓、胃、小腸を含む多くの組織）においてはほとんど発現していないことが明らかとなった。
【００６３】
実施例４：ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子のノックダウンと腫瘍形成の関係
実施例１〜３により、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、癌組織（特に膵臓や直腸結腸）でのみ高い発現を示し、癌でない正常組織での発現は認められなかった。本実施例では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が癌治療の標的となり得るかを調べるため、癌モデルマウスを用いてＥＲＯ１−Ｌα遺伝子のノックダウン実験を行った。
【００６４】
まず、配列番号１１または１２の塩基配列を有するＥＲＯ１−Ｌα遺伝子ノックダウン用のｓｈＲＮＡを転写するＤＮＡをＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱベクター（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位に挿入した。具体的には、配列番号１１または１２の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡの５’末端にｇａｔｃｃｇからなるＢａｍＨＩの制限酵素切断部位を連結し、３’末端にｔｔｔｔｔｔｃｔａｇａからなるターミネータおよびＥｃｏＲＩの制限酵素切断部位を連結して得られた一本鎖ＤＮＡと、これに相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡとを１００℃で２０分加熱し、その後、室温に戻しながらアニールして得たＤＮＡをＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱベクター（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位に挿入した。これらのｓｈＲＮＡ発現ベクターは、８０％コンフルエントにしたＰａｎｃ１細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用いて製造者マニュアルに従ってトランスフェクションし、４８時間後に２μｇ／ｍＬ  ピューロマイシン（シグマアルドリッチ社製）を添加して、安定クローンを樹立した。得られたＥＲＯ１−Ｌαノックダウンクローン３種（ｓｈ１−３、ｓｈ３−４およびｓｈ３−６）のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現をウェスタンブロット法により確認した。ｓｈ１−３は、配列番号１１の塩基配列を組み込んだｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いてＥＲＯ１−Ｌα遺伝子をノックダウンしたクローンであり、ｓｈ３−４およびｓｈ３−６は、配列番号１２の塩基配列を組み込んだｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いてＥＲＯ１−Ｌα遺伝子をノックダウンしたクローンであった。なお、ウェスタンブロット法は、実施例３に記載の方法に従って行った。
【００６５】
その結果、いずれのクローンにおいても、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現が大きく抑制されていることが分かった（図６）。
【００６６】
得られたＥＲＯ１−Ｌαノックダウンクローン３種のうち、ｓｈ１−３またはｓｈ３−４を導入した２種、ｐａｎｃ１細胞、スクランブルｓｈＲＮＡを発現するｐａｎｃ１細胞をそれぞれ１×１０６細胞ヌードマウスの腹腔内に注射してその後の腫瘍形成を調べた。実験は、１群あたり５匹のマウスを用いて行った。
【００６７】
その結果、ｐａｎｃ１細胞またはコントロールｓｈＲＮＡのクローンを注射したマウスは、腫瘍を形成したが、ＥＲＯ１−Ｌαノックダウンクローンであるｓｈ１−３およびｓｈ３−４は、腫瘍形成能がほとんど認められなかった（図７）。
【００６８】
また、配列番号１３および配列番号１４の塩基配列を有するＲＮＡをアニールして得られるｓｉＲＮＡを用いて、大腸癌細胞株ＳＷ４８０でＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現をノックダウンする実験を行った。その結果、このｓｉＲＮＡを用いた場合でも、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現のノックダウンが確認できた（データ省略）。なお、このｓｉＲＮＡの３’末端のオーバーハングは、ＴＴをＵＵに変えてもノックダウンの効果に差は無いことが知られている。また、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現をノックダウンした大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞において、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩ分子の量を、Ｗ６／３２−ＦＩＴＣ抗体を用いたフローサイトメーターを用いて調べた。すると、ＭＨＣクラスＩ分子の発現量は４０％低下した（図８）。さらに、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現のノックダウンとＴ細胞応答との関係を調べるために、ｓｉＲＮＡを導入した上記ＳＷ４８０細胞と細胞傷害性Ｔ細胞（cep55 specific CTL）とを２４時間共培養し、細胞傷害性Ｔ細胞からのインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）の産生量をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。すると、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現をノックダウンした細胞では特異的細胞傷害性Ｔ細胞の応答が低下した（図９）。このように、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現をノックダウンした細胞で、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面での発現が低下したことから、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現が低下すると癌免疫機能が低下する可能性が示唆されたが、この結果に反して、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の発現のノックダウンクローン（ｓｈ１−１、ｓｈ３−４およびｓｈ３−６）では腫瘍形成能が抑えられたことは驚きであった。
【００６９】
これらの結果から、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現は、腫瘍形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。
【００７０】
実施例５：大腸癌患者における予後とＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現
実施例４で、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現が腫瘍形成に重要な役割を果たしていることが示された。そこで、本実施例では、実際の直腸結腸癌患者におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現と予後の関連について調べた。
【００７１】
２００５年〜２００８年の間に札幌医科大学で手術を行った８５人の直腸結腸癌患者におけるＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を免疫組織化学染色法により確認した。まず、本実施例では、評価対象の組織は、各癌患者から得た直腸結腸癌の組織とした。組織は、１０％ホルマリンにより固定し、パラフィン包埋してから、ミクロトームを用いて２０μｍ厚の組織切片を作製した。脱パラフィン処理を行い、１２１℃で１０分間オートクレーブ処理を行ってから、抗ＥＲＯ１−Ｌα抗体（Ａｂｎｏｖａ社製、製品番号：Ｈ０００３０００１−Ｍ０１）および二次抗体としてペルオキシダーゼコンジュゲート羊抗マウス抗体（ＤＡＫＯ社製、製品番号：Ｋ４０００）およびＤＡＢ（ＤＡＫＯ社製、製品番号Ｋ３４６８）を用いて常法に従って免疫組織化学染色を行った。その後、光学顕微鏡を用いて染色した各種組織切片を観察した。
【００７２】
観察の際、各組織のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量は４段階で評価した。すなわち、ＥＲＯ１−Ｌαがほとんど発現しないものはスコア０、わずかに発現が認められるものはスコア１、部分的に高い発現が認められるものはスコア２、全体的に高い発現が認められるものはスコア３と評価した（図１０）。
【００７３】
次に、患者が直腸結腸癌を再発するまでの期間を各患者に調べ、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現と関連付けた。すると、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を過剰発現する患者群（スコア３）では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現が低い患者群（スコア０〜２）と比較して、再発までの期間が有意に短かった（図１１）。具体的には、表２に示されるように、再発までの期間は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を過剰発現する患者群（スコア３）では平均２．３５年であり、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現が低い患者群（スコア０〜２）の期間の約８割であった。また、無再発生存率（ｒｅｌａｐｓｅ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を過剰発現する患者群（スコア３）では、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現が低い患者群（スコア０〜２）に対して６７．８６％に低下していた。
【００７４】
この結果から、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量と大腸癌の再発率および再発までの期間は関連し、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現量を調べることにより大腸癌の再発率および再発までの期間を評価することが可能であることが示された。
【００７５】
【表２】
2015232441.tif 000003
【００７６】
さらに、再発しなかった例と再発した例とで各スコアの占める割合を調べると、再発しなかった７１例中スコア３の症例は１９例（７１例中２６．８％）であったのに対して、再発した１４例中ではスコア３の症例は９例（１４例中６４．３％）であった。このことから、ＥＲＯ１−Ｌαの発現量が高いほど、再発リスクが高まることが示唆された（表３および４）。
【００７７】
【表３】
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【表４】
2015232441.tif 000005
【００７８】
さらに、実施例２の表１に示される膵臓癌患者５１名に関して、カプランマイヤー曲線を作成した。すると、表１で（−）または（＋）に分類された低発現の群（７名）では、（＋＋）または（＋＋＋）に分類された高発現の群（４４名）に比べ、生存日数が長くなる傾向が見られた（図１２）。生存中央値を比較すると、低発現群では１５１７日であり、高発現群は５２７日であり、高発現群と低発現群の生存中央値の差は統計的に有意であった（Ｐ＝０．００１９）。
【００７９】
このことから、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質が発現する癌を有する患者では、予後が不良であることが示唆された。
【００８０】
実施例６：ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の細胞外への分泌
さらに、本発明者らは、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、細胞外に分泌されることを発見した。
【００８１】
まず、ｍｙｃタグを付したＥＲＯ１−Ｌα遺伝子を導入したｐＩＲＥＳ-ｐｕｒｏ発現ベクターを調製した。得られた発現ベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用いて製造者マニュアルに従って大腸癌細胞株ＳＷ４８０細胞にトランスフェクションし、４８時間後に、細胞の培養上清を回収した。次に、得られた培養上清中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降し、その後、ウェスタンブロット法によりＥＲＯ１−Ｌα遺伝子の存在を確認した。正の対照として、ＥＲＯ１−Ｌα遺伝子を導入したＳＷ４８０細胞およびＥＲＯ１−Ｌα遺伝子を発現する２９３Ｔを用い、これらの細胞溶解物は実施例３に記載の方法を用いて得た。
【００８２】
その結果、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降した細胞の培養上清中に、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の６２ｋＤａのバンドを認めた（図１３）。
【００８３】
このことから、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質は、細胞外に分泌されることが明らかとなった。
【００８４】
生体内では細胞外に分泌されたタンパク質は組織液と一緒になってリンパ液に流入し、最終的には血液に流入する。従って、被検体から得られた細胞外液中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在を調べることにより、細胞外に分泌されたＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を検出することができる。
【００８５】
正常組織ではＥＲＯ１−Ｌαタンパク質はほとんど産生されず、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を細胞外に分泌するのは、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する組織、すなわち、癌（例えば、膵臓癌または大腸癌）である。従って、被検体から得られた細胞外液中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在を調べることにより、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌の存在を推定できる。
【００８６】
ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌は、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の発現を抑制することで、増殖が困難となる。癌患者の細胞外液中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在を確認することにより、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質を発現する癌の存在、および、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の阻害剤などが抗癌剤としての有効性を評価し得る。この結果は、血清中のＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の存在を調べることにより、ＥＲＯ１−Ｌαタンパク質の阻害剤などの抗癌剤としての有効性が評価可能であることを示すものである。
【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
2015232441.tif 000018
【配列表】
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