(57)【要約】【課題】            夾雑物であるフミン酸はトラップしたまま、ウイルスのみを特異的に回収し精製することができる精製ウイルス液の製造方法、及び該ウイルス精製を行えるウイルス精製部材を提供することを課題とする。【解決手段】        ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する、精製ウイルス液の製造方法であって、上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、製造方法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する、精製ウイルス液の製造方法であって、
上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
前記サンプル液と接触させた前記基材を、ｐＨ１０〜１２の回収液に接触させる工程をさらに有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記基材が中空糸膜である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記官能基Ａがアミノ基である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記サンプル液のｐＨが３．０〜９．０である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程と、
ｐＨ１０〜１２である回収液を基材と接触させる工程と、
基材と接触後の回収液を回収して得られる精製ウイルス液をウイルス検出工程にかける工程とを有し、
前記官能基Ａが、単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス検出方法。
【請求項７】
共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材を有し、前記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス精製部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製ウイルス液の製造方法、ウイルス検出方法及びウイルス精製部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全志向が高まる近年、河川水や海水といった環境水、水道水や井戸水等の生活用水、土壌や食品等、我々を取り巻く環境に対する安全性の担保が非常に重要視されている。特に環境水や生活水が各種ウイルスによって汚染されると、近隣住民へと爆発的に感染し、甚大な健康被害を生じる恐れがあり、とくに開発途上地域における生活用水のウイルス汚染は大きな問題となっている。
【０００３】
これらを鑑み、環境中のウイルス汚染を恒常的に監視することは、人々の安全安心を維持していく上で非常に重要であり、そのためには簡便で正確にウイルス量を評価する方法を確立することが急務である。
【０００４】
しかし、様々な環境、特に環境水中のウイルス量はごく少量であるため、検出することが非常に難しいということが課題となっている。そこで、ウイルスを濃縮回収したうえで、ウイルスを検出する方法が試みられてきた。
【０００５】
例えば、ウイルス検出に用いる試料を、超遠心やポリエチレングリコール法などによって濃縮する方法などが知られている。
【０００６】
また、特許文献１においては、表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じてウイルスを捕捉し、ウイルスの濃度を評価する方法が報告されており、その際には、必要に応じて限外ろ過膜で２次濃縮を行う場合もある。
【０００７】
上記のような方法でウイルスを濃縮回収し、得られたウイルス液を、各種方法で検出、同定を行う。一般的によく行われるのが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等に代表される核酸増幅検査（ＮＡＴ）法である。ＮＡＴ法は、ウイルスに含まれる核酸を人工的に増幅して高感度に検出する方法であり、ウイルスに特異なプライマーによって検出を行う場合や、遺伝子を増幅させた後にハイブリダイゼーション等で同定を行う。
【０００８】
しかし、上記のようなウイルス濃縮方法では、環境中に存在するＮＡＴ法を阻害する物質であるフミン酸も同時に回収してしまうという問題があった。
【０００９】
フミン酸とは、環境中に存在する腐植物質の一種であり、植物残差や微生物、プランクトンの遺骸が微生物による分解を受け、その分解生成物から化学的、生物的に合成された高分子有機酸の混合物である。腐植物質はフミン質とも呼ばれ、アルカリ溶液に可溶だが、酸性溶液では沈殿を形成するフミン酸、どのｐＨでも可溶なフルボ酸、及びアルカリに不溶なヒューミン（またはフムス質）が存在する。フミン質は、動植物由来物質であることから、土壌・海水・河川湖沼水や排水・廃棄物等、環境中のあらゆる場所に存在する。フミン質は、動植物由来であることから不定形の高分子物質であるが、芳香環族を多数有する三次元網目状構造をもつものが多い。その中でもフミン酸は、水酸基やカルボキシル基と言った酸性基を一つ以上有するポリフェノール型カルボン酸であることが多く、その構造から金属類のキレート性を有し、工業的にはキレート剤として用いられる。
【００１０】
一方、ウイルスの回収及び同定を行う際にＮＡＴ法を用いる場合、このフミン酸が阻害物質として働くという問題点があった。フミン酸は上記のように様々な環境中に存在することから、環境中から得たサンプル中へのフミン酸のコンタミネーションは避けられず、環境中からウイルスを濃縮したとしてもフミン酸まで回収してしまうと、ＮＡＴ法での検出が行えなくなり、ウイルスが存在しているのにもかかわらず不検出と判断されてしまう為、環境安全に対する脅威となっている。
【００１１】
上記問題を解決する為に、特許文献２においては、特定の細孔を持つシリカゲルにフミン酸等の夾雑物を吸着させることによる、ウイルス検出率の向上方法が報告されている。しかし、細孔の大きさに依存した非特異的な吸着であるため、定量的測定には不十分であるといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４４５５４号
【特許文献２】特開２０１１−１５５９１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、夾雑物であるフミン酸はトラップしたまま、ウイルスのみを特異的に回収し精製することができる精製ウイルス液の製造方法、及び該ウイルス精製を行えるウイルス精製部材を提供することを課題とする。また、該精製ウイルス液の製造方法によって得られる精製ウイルス液を用いたウイルス検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは鋭意検討の結果、所定の基材を適用することにより上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、上記課題は、以下の手段により達成される。
【００１６】
（１）ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する、精製ウイルス液の製造方法であって、上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、製造方法；
（２）前記サンプル液と接触させた前記基材を、ｐＨ１０〜１２の回収液に接触させる工程をさらに有する、（１）に記載の製造方法；
（３）前記基材が中空糸膜である、（１）または（２）に記載の製造方法；
（４）前記官能基Ａがアミノ基である、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法；
（５）前記サンプル液のｐＨが３．０〜９．０である、（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法；
（６）ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程と、ｐＨ１０〜１２である回収液を基材と接触させる工程と、基材と接触後の回収液を回収して得られる精製ウイルス液をウイルス検出工程にかける工程とを有し、前記官能基Ａが、単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス検出方法；
（７）共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材を有し、前記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス精製部材。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の精製ウイルス液の製造方法は、夾雑物であるフミン酸を濃縮することなく、ウイルスのみを特異的に回収し濃縮することができることから、ウイルス検出方法に対し感度よく定量的なウイルス含有試験液を提供することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する精製ウイルス液の製造方法であって、上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする。
【００１９】
本発明の官能基Ａを有する基材は、サンプル液中のウイルス及びフミン酸を吸着することができる。この時、官能基Ａの共役酸のｐＫａが８．０〜９．９であり、なおかつ単一の官能基である時、回収液を基材に接触させると、フミン酸を吸着したままウイルスのみを溶出できることから、フミン酸が除去された精製ウイルス液（すなわち、フミン酸は濃縮されることなく、またはほとんどなく、ウイルスのみを特異的に濃縮したウイルス液）を得ることができる。得られた精製ウイルス液はフミン酸が選択的に除去されているため、その後のウイルス検出工程を精度よく定量的に実施することができる。
【００２０】
〔ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液〕
本発明におけるウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液とは、ウイルス及びフミン酸が含まれる水媒体の液体である。ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液は、ウイルスを含有すると思われるサンプルを水に混濁すればよく、ウイルスを含有するサンプルとは、河川水・湖沼水・海水・雨水といった環境水、井戸水・水道水・ボトルドウォーターといった飲料水や下水・排水・プール水・農業用水・工業用水・冷媒水といった産業用水に代表される生活用水；食品、土壌、動植物、血液等の体液など、様々なものをサンプルとして用いることができる。
【００２１】
ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液は、ウイルスを含有するサンプルを水に混濁することによって得られ、例えば環境水や生活用水のような液体サンプルであれば滅菌水で希釈すればよく、固形サンプルであれば滅菌水で混濁した上清や、固形サンプル表面を滅菌水で洗浄した洗浄液等もサンプル液として用いることができる。
【００２２】
本形態に適用可能なウイルスとしては、特に制限されず、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス等が挙げられる。
【００２３】
前記２本鎖ＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス、ポドウイルス等が挙げられる。
【００２４】
前記１本鎖ＤＮＡウイルスとしては、パルボウイルス等が挙げられる。
【００２５】
前記２本鎖ＲＮＡウイルスとしては、ロタウイルス、レオウイルス等が挙げられる。
【００２６】
前記１本鎖ＲＮＡウイルスとしては、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ノロウイルス、ネコカリシウイルス等のｍＲＮＡとして作用する１本鎖ＲＮＡウイルス；麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス等のｍＲＮＡの相補鎖として作用する１本鎖ＲＮＡウイルスが挙げられる。
【００２７】
前記１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス、泡沫状ウイルス等が挙げられる。
【００２８】
前記２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス等が挙げられる。
【００２９】
これらのうち、本形態に適用されうるウイルスは、水中に存在し、ヒトに感染しうるアデノウイルス、ポリオーマウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ノロウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ロタウイルス、アイチウイルス、パレコウイルス、レオウイルスであることが好ましく、ノロウイルス、ＨＡＶ、ＨＥＶ、エンテロウイルス、ロタウイルスであることがより好ましい。
【００３０】
上述のウイルスは単独で適用しても、２種以上が混合されて適用されてもよい。
【００３１】
また、本形態のサンプル液に含有されうるフミン酸としては、特に制限されず、公知のもの、例えば、自然界に存在しうるフミン酸、自然界のフミン酸と化学構造の少なくとも一部が異なるフミン酸誘導体等が挙げられる。これらのフミン酸はサンプル液中に単独で含まれていても、２種以上が混合して含まれていてもよい。
【００３２】
フミン酸は、上述のように複雑な構造を有しているが、吸光度の測定によりフミン酸の検出、評価を行うことができる。
【００３３】
サンプル液のｐＨは、３．０〜９．０であることが好ましく、８．０〜９．９であることがより好ましい。サンプル液のｐＨが上記範囲にあると、ウイルス及びフミン酸の電荷バランスが好適になることから好ましい。ｐＨは公知慣用の方法で調整すればよく、各種酸塩基で調整してもよいし、無機塩のバッファーで調整してもかまわない。また、サンプルが、所望のｐＨである場合は、無調整でそのままサンプル液とすることができる。
【００３４】
〔ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程〕
本形態に係る精製ウイルス液の製造方法は、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材と接触させる工程を有する。この際、前記官能基Ａは単一の官能基である。
【００３５】
本発明の共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａを表面に有する基材とは、官能基Ａを表面に有する基材であればよい。官能基Ａを表面に有するとは、基材自体が官能基を有していてもよいし、基材表面に官能基Ａを有する化合物を固定化してもよいし、官能基Ａを有する化合物を基材表面に塗布することでも得ることができる。
【００３６】
基材の材質は特に限定は無いが、好ましくは疎水性の材料であり、具体的にはオレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、スルホン系樹脂、ポリイミド系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂、セルロース混紡エステルが挙げられる。
【００３７】
オレフィン系樹脂としては、例えば、ポリエチレン（例えば、低密度ポリエチレン、直鎖状低密度ポリエチレン、超低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレンなど）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリブチレン、ポリブタジエンの他、エチレン−プロピレン共重合体（ランダム共重合体）等のエチレン及び／又はプロピレンと他のα−オレフィンとの共重合体（特にランダム共重合体）などが挙げられる。
【００３８】
スチレン系樹脂としては、スチレンの単一重合体のほか、ハイインパクトポリスチレン（ＨＩＰＳ）、メチルメタクリレート・ブタジエン・スチレン共重合体、スチレン・無水マレイン酸共重合体、スチレン・アクリロニトリル共重合体などが挙げられる。
【００３９】
アクリル系樹脂としては、（メタ）アクリル系単量体（（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸Ｃ１−１８アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリロニトリルなど）の単独又は共重合体、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸メチルなどのポリ（メタ）アクリル酸エステル、メタクリル酸メチル−（メタ）アクリル酸共重合体、メタクリル酸メチル−アクリル酸エステル−（メタ）アクリル酸共重合体、メタクリル酸メチル−（メタ）アクリル酸エステル共重合体、（メタ）アクリル酸エステル−スチレン共重合体（ＭＳ樹脂など）などが挙げられる。
【００４０】
スルホン系樹脂としては、ポリスルホン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリアリールスルホン樹脂などが例示できる。
【００４１】
ポリイミド系樹脂としては、ポリエーテルイミド系樹脂、ポリアミドイミド系樹脂、ポリベンズイミダゾール系樹脂などが挙げられる。
【００４２】
ウレタン系樹脂としては、例えば、ジイソシアネート類（ヘキサメチレンジイソシアネートなどの脂肪族ジイソシアネート類、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどの脂環族ジイソシアネート類、トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタン−４，４′−ジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシアネートなどの芳香族ジイソシアネート類又はその水添ジイソシアネート類、キシリレンジイソシアネートなどの芳香脂肪族ジイソシアネート類又はその水添ジイソシアネート類など）と、ポリオール類（例えば、ポリエステルポリオール、ポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリエーテルポリオール、ポリカーボネートポリオールなど）と、必要により鎖伸長剤との反応により得られるポリウレタン系樹脂などが挙げられる。
【００４３】
エステル系樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート等の芳香族ポリエステル、さらに塗料用樹脂等で使用されるジオールとジカルボン酸との縮合により得られるポリエステルなどが挙げられる。
【００４４】
エーテル系樹脂としては、ポリ（チオ）エーテル系樹脂が挙げられ、ポリオキシアルキレン系樹脂（安定化されたポリオキシメチレングリコール又はホモ又はコポリアセタール系樹脂、ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシテトラメチレングリコールなどのポリオキシＣ１−４アルキレンジオール）、ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリフェニレンエーテルケトン系樹脂、ポリスルフィド系樹脂（ポリフェニレンスルフィド又はその共重合体などのポリチオエーテル系樹脂）、ポリエーテルケトン系樹脂（ポリエーテルエーテルケトン系樹脂を含む）などが挙げられる。
【００４５】
〔官能基Ａ〕
本発明における官能基Ａとは、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９、好ましくは８．５〜９．９、より好ましくは９．０〜９．５であり、かつ基材表面に存在するとき、官能基Ａは単一の官能基である。
【００４６】
この際、「官能基Ａが単一の官能基である」とは、基材の表面に存在する官能基Ａ（ｐＫａが８．０〜９．９である官能基）が、単一のものからなることを意味する。この際、官能基Ａは、基材に直接存在していても、他の要素（例えば、介在する基）を介して存在していてもよい。
【００４７】
よって、複数種の官能基Ａが存在するポリエチレンイミン等については、官能基Ａが単一の官能基であるとはいえない。
【００４８】
官能基Ａが単一であるか否かは、官能基Ａを含む基材を酸で滴定した際に得られる滴定曲線の変曲点数を計測することで判別することができる。
【００４９】
なお、本明細書において、「官能基Ａの共役酸のｐＫａ」の値は、官能基Ａを含む基材を酸で滴定した際の滴定値から、ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式により算出された計算値を採用するものとする。すなわち、当該「官能基Ａの共役酸のｐＫａ」は基材に導入された形態で算出されたものであるため、例えば官能基Ａが「−ＣＨ２ＮＨ２」である場合には、これに相当するアミンである「ＣＨ３ＮＨ２」の共役酸のｐＫａの値とは異なる場合がある。
【００５０】
また、基材が介在する基を有する場合において、「官能基Ａ」は、ｐＫａが８．０〜９．９であり、かつ、当該ｐＫａを満たす最小の基を意味するものとする。例えば、基材の表面に存在する基が「−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」である場合、官能基Ａとしては、「−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「−ＣＨ２ＯＨ」「−ＯＨ」の５種の基が考えられる。これらのうち、「−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「−ＣＨ２ＯＨ」「−ＯＨ」の共役酸のｐＫａは８．０未満であることから、これらの基は官能基Ａではない。一方、「−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」および「−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」はｐＫａが８．０〜９．９の範囲内にあることから官能基Ａとなりうる。このうちの最小の基は「−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」であることから、当該「−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」が官能基Ａとなる（よって、「−ＣＨ２−」は介在基である）。
【００５１】
官能基Ａの具体例としては、特に制限されないが、アミノ基が挙げられる。アミノ基としては、１−ヒドロキシ−２−アミノエチル基等の１級アミノ基；１−ヒドロキシ−２−（Ｎ−メチルアミノ）エチル基等の２級アミノ基；１−ヒドロキシ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエトキシカルボニル基等の３級アミノ基等が挙げられる。
【００５２】
なお、本明細書において、「共役酸」とは、下式におけるＡＨ＋のことを指す。
Ａ  ＋  Ｈ＋      →      ＡＨ＋
【００５３】
官能基Ａを表面に有する基材と、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液とを接触させると、官能基Ａにウイルスとフミン酸が吸着する。これは、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基Ａがプラスを帯び、ウイルス及びフミン酸がマイナスを帯びていることから、電気的な結合が生じているものと思われる。
【００５４】
上記基材の表面に官能基Ａを導入するには、様々な方法がある。例えば、アミノ基を有する化合物を基材表面に塗布してもよい。この際、用いられうるアミノ基を有する化合物としては、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基含有シランカップリング剤や、アミノ基を有する公知各種の樹脂が挙げられる。また、基材表面に官能基Ａを有する化合物を結合させてもよく、例えば基材表面に有するエポキシ基を介してアンモニアやジエチルアミンを反応させる方法などもある。またジメチルアミノエチルメタクリレートや、ジエチルアミノエチルメタクリレートといったアミノ基含有モノマーを塗布後グラフト重合させることにより、基材表面に官能基を導入する方法などもある。
【００５５】
〔回収液〕
前記サンプル液と接触させた基材は、例えば、ｐＨ１０〜１２の回収液を接触させることで、精製ウイルス液を得ることができる。すなわち、一実施形態において、本発明に係る精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液と接触させた前記基材を、ｐＨ１０〜１２の回収液に接触させる工程をさらに有する。ｐＨ１０〜１２の回収液と接触させると場がアルカリ側になるため、官能基Ａの電荷が中性となり、ウイルスと官能基Ａ間の電気的な結合が解除され、ウイルスが脱離されるからと考えられる。この際、フミン酸は基材から脱離しないため、精製されたウイルス液を得ることができる。これは、フミン酸の疎水的な構造が基材と相互作用して吸着されているからではないかと考えられる。
【００５６】
なお、共役酸のｐＫａが８．０〜９．９である官能基が複数存在する（官能基Ａが単一ではない）場合、例えばポリエチレンイミンを固定化した基材のような場合、回収液と接触させてウイルスを脱離させる際、フミン酸までもが溶出しやすくなり、精製ウイルス液にフミン酸が混入しうる。この理由は定かではないが、複数の官能基がウイルスと結合する事により、回収液と接触させてもウイルスが脱離しにくくなり、より高いアルカリ性の回収液と接触させなければウイルスを脱離させる事ができなくなる結果、フミン酸も同時に脱離・溶出してしまう為と考えられる。
【００５７】
〔基材〕
本発明の基材の形状は特に限定は無く、多孔質膜状、中空糸状、平膜状、ビーズ状、が挙げられるが、サンプル液との接触効率の点から中空糸状であることが好ましく、多孔質膜からなる中空糸状が特に好ましい。
【００５８】
本発明の基材とサンプル液を接触させる場合、様々な方法を用いることができる。バッチ式の場合、基材とサンプル液をビーカーや試験管、マイクロチューブやチップ等に入れ、撹拌することで接触させることができる。撹拌する場合、撹拌翼や撹拌子を使用してもよいし、振動式ミキサー等で撹拌してもよい。
【００５９】
フロー式の場合、基材をカラムやチューブに詰めた上、サンプル液を通液してもよいし、担体に基材を固定したうえで通液してもよい。
【００６０】
〔精製ウイルス液の回収工程〕
上記回収液をサンプル液と接触させた基材と接触させると、回収液にウイルスが溶出するため、ウイルスが溶出した回収液を回収することで、精製ウイルス液を得ることができる。精製ウイルス液を回収するには、基材と回収液とを分離すればよい。分離の方法は公知慣用の方法を用いればよく、濾過、デカンテーション、遠心分離等の方法を用いることができるし、注射器等を用いて液のみを採取してもよい。
【００６１】
〔ウイルス検出工程〕
得られた精製ウイルス液は、ウイルス検出工程に供することができる。
【００６２】
ウイルス検出工程とは、ウイルスを検出、及び同定する工程である。ウイルス検出方法としては、古くは単離培養からの形態的同定法が用いられていたが、現在はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等に代表される核酸増幅検査（ＮＡＴ）法が用いられる。ＮＡＴ法は、培養方法が確立していないウイルスを検出できるうえ、培養日数が不要なため短期間での検出が可能と言う利点がある。
【００６３】
回収工程で得られる精製ウイルス液中で、ウイルス濃度が低い場合、公知慣用の方法でウイルスを濃縮してもよく、具体的には陽電荷膜法や陰電荷膜法、ポリエチレングリコール沈殿法、セルロース凝集法、限外ろ過法などが挙げられる。本発明で得られる精製ウイルス液は、ＮＡＴ法を阻害するフミン酸が除去、またはほとんど分離されているため、感度よく検出することが可能である。
【００６４】
精製ウイルス液をＮＡＴ法に供する場合、ウイルスから核酸を抽出する前処理を行うことが好ましい。ウイルス核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の抽出は、特に限定されるものではなく、フェノール・クロロホルム抽出法、界面活性剤やプロテアーゼを併用した抽出法等が用いられる。また、ウイルス核酸精製に関しても、液相抽出法、エタノール沈殿法やスピンカラム法等により行うことができる。
【００６５】
抽出された核酸は、ＮＡＴ法により検査を行うが、ＮＡＴ法はウイルス等の微量の遺伝子を人工的に増幅して高感度に検出する方法の総称であり、ＰＣＲ法の他、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法、鎖置換反応（ＬＡＭＰ）法、等温遺伝子増幅（ＩＣＡＮ）法、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法等が挙げられる。
【００６６】
例えばＰＣＲ法の場合、ウイルスに特異的なプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅が認められればウイルスが存在することが判明する。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例の記載に制限されるものではない。また、実施例において特段の記載がない場合、部及び％は質量基準である。
【００６８】
（参考例１）基材の調製例
密度０．９６８ｇ／ｃｍ３、メルトインデックス５．５の高密度ポリエチレン（三井石油化学工業株式会社製ＨＩＺＥＸ  ２２００Ｊ）を吐出口径１６ｍｍ、円環スリット幅が２．５ｍｍ、吐出断面積が１．０６ｃｍ２の中空糸賦型用紡糸口金を用い、紡糸温度１６０℃で紡糸し、紡糸ドラフト１８９０でボビンに巻き取った。得られた未延伸中空糸の寸法は内径が３２４μｍ、膜厚が４８μｍであった。
【００６９】
この未延伸中空糸を１１５℃で２４時間、定長で熱処理した。つづいて室温で７５００％／ｍｉｎの変形速度で１．８倍延伸した後、１００℃の加熱炉中で変形速度が２２０％／ｍｉｎとなるように総延伸倍率が３．８倍になるまで熱延伸を行った、さらに１２５℃の加熱炉で総延伸倍率が２．３倍になるまで連続的に熱収縮を行い、延伸糸を得た。得られた多孔性中空糸膜の内径は２９４μｍ、膜厚は４０μｍであった。
【００７０】
（実施例１）
１）エチレン−ビニルアルコール共重合体（日本合成化学製品、エチレン含量４４モル％、重量平均分子量９００００）２．５ｗｔ％エタノール／水混合溶液（５０℃）に参考例１で得られた中空糸を１００秒間浸漬し、５０℃のエタノール飽和蒸気下で８０秒保温した後、さらに８０秒かけて溶剤を乾燥させて親水化処理を行った。このようにして得られた中空糸（約１３ｃｍ、約１５０本：樹脂固定化量１９．５ｍｇ）を、アセトン２０ｍＬ、エピクロロヒドリン１６ｍＬ、４０％ＮａＯＨ水溶液４ｍＬを入れた試験管中に浸漬した。超音波をかけながら、３０〜４０℃で５時間反応させ、反応終了後、アセトンと水で洗浄し、真空乾燥し、エポキシ基が導入された中空糸を得た。
【００７１】
上記で作製したエポキシ基が導入された中空糸を、２０％エタノールアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ８．９）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０４０μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
【００７２】
２）該アミノ基固定化中空糸（６ｃｍ×１２本）を用いて、少量サンプル用モジュール（内径３ｍｍ、外径５ｍｍ、有効長５ｃｍ、外表面積５ｃｍ２）を作製した。
【００７３】
３）精製水にＱβファージ（ＮＢＲＣ２００１２）及びフミン酸（ナカライテスク株式会社）をそれぞれ終濃度１×１０８ＰＦＵ／ｍＬ、１０ｐｐｍとなるよう加えてファージ・フミン酸混合液（ｐＨ：７．０）を調製した。
【００７４】
上記のファージ・フミン酸液１ｍＬを、注射器を用いてモジュールに通液し、ろ液を非吸着画分として回収した。次いで１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  １ｍＬを回収液（ｐＨ：１１）として、注射器を用いてモジュールに通液し、ろ液を溶出画分として回収した。
【００７５】
それぞれの画分において、フミン酸を２６０ｎｍの吸光度測定にて定量した。また、それぞれの画分から、ＱＩＡＧＥＮ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎキット（株式会社キアゲン）を用いてファージＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にてＲＮＡ量を定量した。測定に用いたプライマー及びプローブの配列は文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４９（２００８），ｐ１２３−１２８）に従って作製し、測定はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ライフテクノロジースジャパン株式会社）を使用した。
【００７６】
ファージ及びフミン酸の濃度を測定した結果、基材への接触処理前(以降これを未処理とする)のファージ・フミン酸混合液に対し、非吸着画分中に含まれるファージ及びフミン酸量はそれぞれ８％、４％であった。よって、モジュール中の基材に対する吸着率は、それぞれファージが９２％，フミン酸が９６％であることが分かった。
【００７７】
また、ファージ・フミン酸混合液を通液後、回収液にて溶出操作を行ったところ、未処理のファージ・フミン酸混合液に対し、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ６４％，４６％であった。
【００７８】
上記で得られたフミン酸の回収率に対するファージの回収率（フミン酸の回収率／ファージの回収率）を回収率比として算出したところ、０．７２であった。なお、回収率比は、その値が小さいほどフミン酸を分離することができたことを意味する。
【００７９】
（実施例２）
１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、２８％アンモニア水に浸漬し、２０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ  ９．５）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０２２μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
【００８０】
２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  １ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ９５％，１００％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ６９％，３２％であった。よって、回収率比は０．４６である。
【００８１】
（実施例３）
１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、２０％ジエチルアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ  ９．９）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０２５μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
【００８２】
２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  １ｍＬ（ｐＨ：１２）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ９６％，１００％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ６３％，４６％であった。よって、回収率比は０．７３である。
【００８３】
（比較例１）
１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、５％ポリアリルアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ１０．６）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０１５μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
【００８４】
２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  １ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分のファージ，フミン酸量はそれぞれ０％である事から、ファージ及びフミン酸の吸着率はそれぞれ１００％，１００％と算出された。また、ファージ・フミン酸混合液を通液後、回収液にて溶出操作を行ったところ、未処理のファージ・フミン酸混合液に対し、溶出画分におけるファージ，フミン酸はほとんど回収されず、回収率はそれぞれ０％であった。このため、回収率比は算出できなかった。
【００８５】
（比較例２）
１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、５％ポリεリジン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ  ７．６）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０４２μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
【００８６】
２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  １ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ１００％，８７％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ７１％，６５％であった。よって、回収比率は０．９２である。
【００８７】
（比較例３）
１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、５％ポリエチレンイミン（和光純薬製品、平均分子量６００）の水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ  ８．８；平均値）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０２１μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
【００８８】
２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  １ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ１００％，９７％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ７０％，６８％であった。よって、回収比率は０．９７である。
【００８９】
実施例１〜３および比較例１〜３で得られた結果を下記表１に示す。
【００９０】
【表１】
2015167536.tif 000002
【００９１】
表１の結果からも明らかなように、実施例１〜３では回収率比が特に小さく、選択的にファージを分離することができ、得られた液は、ウイルスのみを好適に濃縮した精製ウイルス液であるといえる。
【００９２】
一方、比較例１〜３では、回収率比が１に近い値となっており、得られた回収液には、ウイルスとともにフミン酸も混合していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の精製ウイルス液の製造方法は、ウイルス検査方法に対し好適に使用可能である。