(57)【要約】【課題】リグノセルロース原料への酵素（セルラーゼ）の吸着を抑制する方法を提供する。【解決手段】リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して５〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加し、前記原料懸濁液を１８０〜２３０℃で加熱処理（化学的処理）する。前記化学的処理を施した原料懸濁液を酵素により糖化処理を行う。化学的処理の前に機械的処理、化学的処理の後に磨砕処理を行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して５〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加し、前記原料懸濁液を１８０〜２３０℃で加熱処理する化学的処理工程、前記化学的処理を施した原料懸濁液を酵素により糖化処理を行う糖化工程を有することを特徴とするリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【請求項２】
前記糖化処理が糖類を発酵基質とする発酵用微生物を用いて糖化処理と発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理であることを特徴とする請求項１に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【請求項３】
前記化学的処理の前に機械的処理を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【請求項４】
前記化学的処理の後に磨砕処理を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化に適した処理を施したリグノセルロースを含有するバイオマスをセルロース分解酵素やヘミセルロース分解酵素からなる酵素群により糖化処理する反応を含むリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法において、使用する酵素群を反応液から高回収率で回収して長期間にわたって循環利用することを可能とするリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化に適した処理を施したリグノセルロース原料から糖を製造する技術は、この糖を微生物の発酵基質として用いることによりガソリンの代替燃料となるアルコールや、プラスチック原料となるコハク酸や乳酸などの化成品原料を製造することができることから、循環型社会の形成に有益な技術である。
植物系バイオマス中の多糖類から発酵基質となる単糖や小糖類を製造する方法は２つに大別できる。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。
【０００３】
酸糖化法は酵素糖化法に比べて技術的に完成されているが、リグノセルロース系バイオマスを原料とする方法の場合は、澱粉や廃糖蜜などを原料とする方法に比べて糖収率が低いことに加えて、処理工程から排出される廃酸の処理設備や、酸による腐食に耐え得る大型の設備が必要となること等が製品コストの増大原因となっていて実用化の大きな障壁となっている。
【０００４】
一方、酵素糖化法は、近年酵素の価格が下がってきていることと技術の進歩から、後処理まで含めた全体のコストで酸糖化法のコストに近づいてきてはいるが、酵素糖化法の全体コストに占める割合が高い酵素の価格は依然として高いことから、酵素糖化法の実用化のためには酵素にかかる費用の一層の低減が重要である。
【０００５】
酵素糖化法のコストを下げる技術としては、セルロース繊維への酵素のアクセスを容易にする前処理の方法の開発や、結晶性セルロースを効率よく糖化する方法の開発、更には酵素の効率的な回収、再利用方法の開発などが考えられる。
【０００６】
リグニンを除去していないリグノセルロース材料は、リグニンを除去したリグノセルロース材料と比べて酵素によって分解されにくく、糖化されずに樹脂、金属などの不純物と一緒に糖化液中に残渣として残る。一般に、この残渣はスクリーン、遠心分離等により分離し廃棄される。この残渣には酵素糖化法におけるコストの中で大きな比重を占めている酵素が多量に吸着されているため、反応液から分離した残渣をそのまま廃棄してしまうと高価な酵素も廃棄されてしまうという問題があった。
【０００７】
上記のような残渣中の酵素の回収手段として、残渣の洗浄が考えられる。しかし、酵素は、その分子内に有しているセルロースに特異的に吸着するセルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）等によりセルロースと強固に結合しているため、単なる水洗浄ではセルロースに吸着した酵素を十分に回収することは困難であった。
そこで、酵素の回収率の改善を目的として界面活性剤を添加して処理する方法（特許文献１参照）などが提案されている。しかし、界面活性剤処理法でも、酵素の回収率が十分であるとはいえず、また、薬品添加による酵素の失活や、処理工程付加に伴うコストアップ及び後の発酵段階における微生物への悪影響などが懸念されることなどから実用的ではない。
【０００８】
糖液からの酵素の回収法としては、限外濾過を用いた方法（特許文献２参照）、糖液に再度セルロースを添加して酵素を吸着回収する方法（特許文献３参照）などが提案されている。しかし、限外濾過法は微少な不純物がろ過膜につまり十分な処理速度及び酵素回収率が得られない問題があるし、セルロース添加による回収法では十分な酵素回収が困難であった。
【０００９】
吸着した酵素を剥離させる工程を経ずに、酵素が吸着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用する方法が提案されている（特許文献４）。この方法では、残渣の蓄積は避けられないので反応効率が低下することが懸念される。また、ＣＢＨ（セロビオハイドラーゼ）等、ＣＢＤを有する酵素に関してはリグノセルロース残渣を次回分で再処理することで酵素の循環利用が可能であるが、ベータ−グルコシダーゼ等は上清中に遊離している場合もあるので、添加したセルラーゼの全てを循環利用することは困難である。
【００１０】
酵素のコストを低減する方法として、酵素を循環利用する方法が報告されている。Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｄ．らの方法（非特許文献１）によると、酵素を大量（濾紙分解活性で基質１ｇに対して８０−１６０単位）に添加して古紙原料を酵素加水分解する主反応槽に、酵素加水分解液中の未反応古紙面から高剪断力で生成グルコースやセロビオース成分を除いて常に新しいセルロース繊維表面を露出させる高速遠心ポンプによる磨砕装置と、磨砕装置からの処理液から未反応原料と加水分解液を分離して未反応原料のみを主反応槽に循環する膜分離装置と、膜分離装置からの加水分解液から酵素と生成グルコース及びセロビオースを分離して酵素のみを主反応槽に循環する限外濾過装置とを有する循環ラインを設けた連続システムを想定してコストを予測している。このシステムにより、糖化率は２５時間で１００％であり、酵素の残存率は２４時間で９５％以上であるとされている。また、酵素が残渣に吸着されて失われること、残渣の酵素の吸着機能はｐＨを５〜７に高めることで低下可能な場合があること、温度を５℃に下げることで低減できるという報告もあることが記載されている。
【００１１】
酵素を回収再利用する方法として、蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を５％の濃度で糖化槽に加え、２万単位のセルラーゼを添加して、限外濾過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、８日間で２ｋｇのシラカンバ材から単糖類を６３０ｇ得ている方法も報告されており、この方法で酵素の使用量を２０％節約できたとされている（非特許文献２）。
【００１２】
リグノセルロース系原料への酵素の吸着を抑制する方法として、リグノセルロース系原料に水溶性塩類を添加する方法（特許文献５）、リグノセルロース系原料に炭酸カルシウムを添加する方法（特許文献６）が報告されている。しかし、酵素糖化法において酵素コストの低減を図るためには、さらに効率的にリグノセルロース系原料への酵素吸着を抑制する方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開昭６３-８７９９４号公報
【特許文献２】特開昭６１-２３４７９０号公報
【特許文献３】特開昭５５-１４４８８５号公報
【特許文献４】特開２０１０-９８９５１号公報
【特許文献５】特許４９４７２２３
【特許文献６】特開２０１２-１００６１７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｔｈｒｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｂiｏｃｈｅｍ．Ｂiｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５／４６，ｐｐ．６４１−６５３（１９９４）
【非特許文献２】Ｉｓｈiｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂiｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂiｏｅｎｇ．，３７，９４８−９５４（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、リグノセルロース系原料を酵素（セルラーゼ）で糖化処理する方法において、リグノセルロース原料への酵素の吸着を抑制する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して５〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加し、前記原料懸濁液を１８０〜２３０℃で加熱処理することにより、リグノセルロース原料への酵素（セルラーゼ）の吸着が抑制され、酵素を工程内において循環させて再利用できることを見出し、下記発明を完成した。
【００１７】
（１）リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して５〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加し、前記原料懸濁液を１８０〜２３０℃で加熱処理する化学的処理工程、前記化学的処理を施した原料懸濁液を酵素により糖化処理を行う糖化工程を有することを特徴とするリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【００１８】
（２）前記糖化処理が糖類を発酵基質とする発酵用微生物を用いて糖化処理と発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理であることを特徴とする（１）項に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【００１９】
（３）前記化学的処理の前に機械的処理を行うことを特徴とする（１）項又は（２）項に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【００２０】
（４）前記化学的処理の後に磨砕処理を行うことを特徴とする（１）項〜（３）項のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、リグノセルロース系原料の未反応分や反応残渣等への糖化酵素の吸着が抑えられて、酵素処理懸濁液からの糖化酵素の分離・回収が容易となる結果、酵素損失が極めて少ない経済性の高い連続的なリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００２３】
＜リグノセルロース系原料＞  
本発明の方法で原料として使用するリグノセルロース系原料としては、木質系として、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、木本性植物の切株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられ、草本系としてケナフ、稲藁、麦わら、コーンコブ、バガス等の農産廃棄物、油用作物やゴム等の工芸作物の残渣及び廃棄物（例えば、ＥＦＢ： Ｅｍｐｔｙ  Ｆｒｕｉｔ  Ｂｕｎｃｈ）、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等が挙げられる。
また、バイオマスとしては、木材由来の紙、古紙、パルプ、パルプスラッジ、スラッジ、下水汚泥等、食品廃棄物、等を原料として利用することができる。これらのバイオマスは、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであっても用いることができる。
【００２４】
前記木質系のリグノセルロース系原料としては、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属植物、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属植物、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属植物、ポプラ属植物、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属植物等が利用できるが、ユーカリ属植物、アカシア属、ヤナギ属植物が原料として大量に採取し易いため好ましい。特に、ユーカリ属植物としては、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐｅｌｉｔａ、          アカシア属としては、Ａｃａｃｉａ  ｍａｎｇｉｕｍ、Ａｃａｃｉａ  ａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｉｍｉｓ、アカシアハイブリッド（Ａｃａｃｉａ  ｍａｎｇｉｕｍとＡｃａｃｉａ  ａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｉｍｉｓの交雑種）、ヤナギ属植物としては、Ｓａｌｉｘ  ｓｃｈｗｅｒｉｎｉｉを用いるのが好ましい。
木本性植物由来のリグノセルロース系原料の中では、林地残材（樹皮、枝葉を含む）、樹皮を用いるのが好ましい。例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属又はアカシア（Ａｃａｃｉａ）属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。
【００２５】
＜機械的処理＞
本発明では、前記リグノセルロース原料に機械的処理を施すことができる。機械的処理としては、切断、裁断、破砕、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、リグノセルロースを次工程の化学的処理工程で糖化され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、切出し装置、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー、ボールミル等を用いることができる。
【００２６】
前記機械的処理の前工程又は後工程として、不純物（石、ゴミ、金属、プラステック等のリグノセルロース以外の不純物）を除去するための洗浄などによる不純物除去工程を導入することもできる。
原料を洗浄する方法としては、例えば、原料に水を噴射して原料に混合されている不純物を除く方法、あるいは、原料を水中に浸漬し不純物を沈降させて取り除く方法等が挙げられる。また、メタルトラップ等の装置を用いて、不純物を原料から分離する方法が挙げられる。
原料に不純物が含まれていると、リファイナーのディスク（プレート）等の機械的処理で用いる装置の部品を破損させる可能性があるし、配管が詰まる等の製造工程内でトラブルを起こす等の問題が発生するため、不純物除去工程を導入することが望ましい。
【００２７】
＜化学的処理＞
前記、機械的処理を施したリグノセルロース原料を次に化学的処理する。化学的処理としては、リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して５〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加した水溶液を加熱処理する。
【００２８】
ｐＨ調整剤として用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられるが、これらの薬品に限定されない。
【００２９】
加熱処理温度は、１８０〜２３０℃が好ましく、１８０〜２００℃がさらに好ましい。また、加熱処理時間は、１０〜３００分で行うことができるが、１０〜１８０分が好ましい。
【００３０】
本発明では、リグノセルロース原料に前記の添加量で亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤（アルカリ）を添加して加熱処理することにより、リグノセルロース原料に含まれる大部分のリグニンが除去されるが、リグノセルロース原料中に残存するリグニンはスルホン化される。スルホン化されたリグニンが電荷を帯びることにより酵素と反発し合い原料への酵素の吸着が抑制される。
【００３１】
（磨砕処理）
本発明では、前記化学的処理により得られたリグノセルロース原料（原料懸濁液）を磨砕処理装置で磨砕することが好ましい。磨砕処理装置としては、レファイナー、ボールミル等が挙げられる。レファイナーを用いる場合は、レファイナーのディスク（プレート）のクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲で磨砕することが好ましく、０．１〜１．０ｍｍの範囲がさらに好ましい。使用するレファイナーとしては、シングルディスクレファイナー、ダブルディスクレファイナー等を使用することができ相対するディスクのクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲に設定できるレファイナーであれば特に制限なく使用することができる。ディスクのクリアランスが２．０ｍｍを超えると糖化または併行糖化発酵で得られる糖収率が低下するため好ましくない。一方、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより小さいとレファイナーで磨砕処理した後の加水分解物（固形分）の収率が低下し、また、レファイナーの運転に要する電気消費量が増大するため好ましくない。
レファイナーのディスク（プレート）の材質、ディスクの型、ディスク面の刃の型、ディスク面に対する刃の方向等のディスクの形状については効果が得られる材質、形状であれば、特に制限なく使用することができる。
【００３２】
前記の磨砕処理が施されているリグノセルロース系原料を固液分離装置により脱水しても良い。固液分離装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。
【００３３】
前記の化学的処理後の原料を糖化または併行糖化発酵を行う前に殺菌処理を行うことが好ましい。リグノセルロース系バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。
殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なｐＨに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化及び／又は糖化発酵工程に適したｐＨに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化発酵工程に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やｐＨを調整してから原料を送り出すことで、好適ｐＨ、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。
【００３４】
前記の化学的処理が施されたリグノセルロース原料が、糖化工程または併行糖化発酵工程へ供給される。
【００３５】
＜糖化工程＞
化学的処理が施されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、糖化工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素（セルラーゼ、ヘミセルラーゼ）により糖化（セルロース→グルコース、ヘミセルロース→グルコース、キシロース）される。
【００３６】
＜併行糖化発酵工程＞
化学的処理が施されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、さらに酵母等の微生物と混合されて併行糖化発酵工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素により糖化され、生成された糖が微生物によりエタノールに発酵される。
【００３７】
糖化工程又は併行糖化発酵工程で用いるリグノセルロース系原料の懸濁濃度は、１〜３０質量％であることが好ましい。１質量％未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、３０質量％を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。
【００３８】
併行糖化発酵で使用するセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベーターグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素である。
各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いれば良い。
【００３９】
市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤がある。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
原料固形分１００質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は、０．５〜１００質量部が好ましく、１〜５０質量部が特に好ましい。
【００４０】
糖化工程または併行糖化発酵工程でのｐＨは３．５〜１０．０の範囲に維持することが好ましく、４．０〜７．５の範囲に維持することがより好ましい。
【００４１】
糖化工程または併行糖化発酵工程の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、２５〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がさらに好ましい。反応は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は１０〜２４０時間、さらに好ましくは１５〜１６０時間である。連続式の場合も、平均滞留時間が、１０〜１５０時間、さらに好ましくは１５〜１００時間である。
【００４２】
＜発酵工程＞
糖化工程と発酵工程を別の反応槽で行う場合は、前記糖化工程後の処理液は、発酵工程へ移送し発酵微生物を用いて発酵を行う。
【００４３】
発酵工程あるいは併行糖化発酵工程で用いられる発酵微生物としては、サッカロマイセス・セラビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ）、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓsａｔｃｈｅｎｋｉa  ｏｒｉｅｎｔaｌｉｓ）等の酵母やザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）等の細菌、等が挙げられる。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物（酵母、細菌等）を用いることもできる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物を特に制限なく用いることができる。
【００４４】
また、微生物は固定化しておいてもよい。微生物を固定化しておくと、次工程に微生物を液と共に送り出して再回収するという工程を省くことができるか、少なくとも回収工程にかかる負担を軽減することができるし、微生物をロスするリスクを軽減することもできる。また、微生物を固定化するほどでのメリットはないが、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。
【００４５】
糖化工程または併行糖化発酵工程から排出された培養液は、固液分離工程へ移送され、液体分（濾液）と固形分（残渣）に分離することができる。固液分離を行う装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。固液分離で用いるメッシュサイズは、１．２５〜６００メッシュが好ましく、６０〜６００メッシュがさらに好ましい。
回収された固形分（残渣）は糖化工程または併行糖化発酵工程へ移送し糖化発酵の原料として用いることもできる。
固液分離工程で分離された液体分（濾液）は蒸留工程へ移送される。
【００４６】
＜エタノール蒸留工程＞
併行糖化発酵工程、又は発酵工程から排出された培養液は、蒸留工程で減圧蒸留装置等のエタノール分離装置により発酵生成物（エタノール等）を蒸留分離することができる。減圧下では低い温度で発酵生成物を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
蒸留温度は２５〜６０℃が好ましい。２５℃未満であると、生成物の蒸留に時間がかかって生産性が低下する。また、６０℃より高いと、酵素が熱変性して失活してしまい、新たに追加する酵素量が増加するため経済性が悪くなる。
蒸留後の蒸留残渣留分中に残る発酵生成物濃度は０．１質量％以下であることが好ましい。このような濃度にすることによって、後段の固液分離工程において固形物とともに排出される発酵生成物量を低減することができ、収率を向上させることができる。
【００４７】
蒸留後の発酵生成物（エタノール等）を分離した後の蒸留残液は、固液分離装置により残渣と液体分に分離することができる。分離された残渣には、酵素、リグニン、発酵微生物が含まれている。残渣に吸着している酵素を遊離させて回収し、再利用することもできる。リグニンは、燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。発酵微生物（酵母など）を残渣から分離して、糖化又は併行糖化発酵工程で再利用することもできる。
【実施例】
【００４８】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。
【００４９】
［実験例１]
［前処理］
チップ状のEｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｌｕｓ（ユーカリ）の林地残材（樹皮７０％、枝葉３０％）を２０ｍｍの丸孔スクリーンを取り付けた一軸破砕機（西邦機工社製、ＳＣ−１５）で破砕し原料として用いた。
［化学的処理］
上記原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム２００ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加後、水を添加し水溶液の容量を８Ｌに調製した。前記原料懸濁液を混合後、２３０℃、１０分間で加熱処理した。加熱処理後の原料懸濁液をレファイナー（熊谷理器工業製、ＫＲＫ高濃度ディスクレファイナー）でディスク（プレート：図１参照）のクリアランスを１．０ｍｍに設定し磨砕した。次に６０メッシュ（２５０ｕm）のスクリーンを用いて磨砕処理後の原料源濁液を固液分離（脱水）することにより溶液の電気伝導度が３０ｕＳ／ｃｍになるまで水で洗浄した。固液分離後の固形分を原料として下記の方法で酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験を実施した。結果を表１に示す。
【００５０】
［酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験］
基質原料を最終濃度５質量％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を最終濃度１質量％、硫酸アンモニウムを最終濃度０．５質量％、となるように調製した水溶液にセルラーゼ１０ｍｌ（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。３０℃、１２０ｒｐｍの攪拌下で糖化反応を行い、２４時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
【００５１】
酵素回収で最も重要とされるベータ−グルコシダーゼの活性を指標にして回収率を算出した。活性測定は以下に示す方法で行った。結果を表１に示す。
（ベータ−グルコシダーゼ活性）
ベータ−グルコシダーゼ活性の測定は、１．２５ｍＭ ４−Ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｒｉｆｅｒｙｌ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含む１２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１６ｕｌに、酵素液４ｕｌ加え、３７℃、１０分間反応を行った後、５００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１００ｕｌを添加して反応を停止させ、３５０ｎｍの励起光での４６０ｎｍの蛍光強度を測定することで行った。酵素回収率は以下の計算式から求めた。 
酵素回収率（％）＝（上清の酵素活性／添加した酵素活性）ｘ  １００
【００５２】
［実験例２]
実験例１（［化学的処理］）において、２３０℃で６０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５３】
［実験例３]
実験例１（［化学的処理］）において、２３０℃で１８０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５４】
［実験例４]
実験例１（［化学的処理］）において、２００℃で１０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５５】
［実験例５]
実験例１（［化学的処理］）において、２００℃で６０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５６】
［実験例６]
実験例１（［化学的処理］）において、２００℃で１８０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５７】
［実験例７]
実験例１（［化学的処理］）において、１８０℃で１０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５８】
［実験例８]
実験例１（［化学的処理］）において、１８０℃で６０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５９】
［実験例９]
実験例１（［化学的処理］）において、１８０℃で１８０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６０】
［実験例１０]
実験例１（［化学的処理］）において、１７０℃で１０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６１】
［実験例１１]
実験例１（［化学的処理］）において、１７０℃で６０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６２】
［実験例１２]
実験例１（［化学的処理］）において、１７０℃で１８０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６３】
［実験例１３]
実験例１（［化学的処理］）において、１６０℃で１０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６４】
［実験例１４]
実験例１（［化学的処理］）において、１６０℃で６０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６５】
［実験例１５]
実験例１（［化学的処理］）において、１６０℃で１８０分間の加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例１と同様の方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６６】
表１
2015167530.tif 000002
【００６７】
表１に示すように、１８０〜２３０℃で１０〜１８０分間の加熱処理を行った試験（実験例１〜９）では、１７０℃で１０〜１８０分間又は１６０℃で１０〜１８０分間の加熱処理を行った試験（実験例１０〜１５）と比較し、ベータ―グルコシダーゼの回収率が高かった。
以上の結果から、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム２００ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加し、１８０〜２３０℃で１０〜１８０分間の加熱処理を行うことによりリグノセルロース系原料へのベータ―グルコシダーゼ（セルラーゼ）の吸着が抑制されることが判明した。
【００６８】
［実験例１６]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５０ｇ及び水酸化ナトリウム１ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００６９】
［実験例１７]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム３００ｇ及び水酸化ナトリウム１ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７０】
［実験例１８]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５００ｇ及び水酸化ナトリウム１ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７１】
［実験例１９]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５０ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７２】
［実験例２０]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム３００ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７３】
［実験例２１]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５００ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７４】
［実験例２２]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５０ｇ及び水酸化ナトリウム３０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７５】
［実験例２３]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム３００ｇ及び水酸化ナトリウム３０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７６】
［実験例２４]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５００ｇ及び水酸化ナトリウム３０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７７】
［実験例２５]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５０ｇ及び水酸化ナトリウム５０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７８】
［実験例２６]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム３００ｇ及び水酸化ナトリウム５０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００７９】
［実験例２７]
実験例２（［化学的処理］）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５００ｇ及び水酸化ナトリウム５０ｇを添加し、実験例２と同様の方法で加熱処理を行った。それ以外の操作は全て実験例２と同様の方法で実施した。結果を表２に示す。
【００８０】
表２
2015167530.tif 000003
【００８１】
表２に示すように、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム５０〜５００ｇ及び水酸化ナトリウム１０〜５０ｇを添加し、１８０℃で６０分間の加熱処理を行った試験（実験例１６〜２７）においてもベータ―グルコシダーゼを高い回収率で回収できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明により、リグノセルロース系原料への糖化酵素の吸着が抑制されて、酵素糖化処理液からの酵素の分離が容易となる。酵素糖化処理工程内における糖化酵素の循環率が長期にわたって高い水準に維持されるため、リグノセルロース原料の酵素糖化処理による糖類やエタノール等を工業的に生産することが可能となる。