(57)【要約】【課題】エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができる新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼ阻害剤及びエラスターゼの水解活性阻害剤、並びに前記ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡの提供。【解決手段】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであるポリペプチドなどである。（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有する請求項１から２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドを含有することを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドを含有し、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害することを特徴とするエラスターゼの水解活性阻害剤。
【請求項６】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスターゼに対する阻害活性を有する新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼ阻害剤及びエラスターゼの水解活性阻害剤、並びに前記ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺アスペルギルス症は、深在性真菌症の中でも最も頻度が高く、中でも慢性型であるアスペルギローマと慢性壊死性肺アスペルギルス症が多数を占めている。これらの疾病において、日和見感染性Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓが産生するエラスターゼが病原因子となっていることが明らかになっている。例えば、これらのエラスターゼは健康なモルモットの肺に強い出血性肺炎を誘起し、マウス肺胞マクロファージの活性を抑制する。
【０００３】
そこで肺アスペルギルス症患者に対し、抗真菌剤に加え、エラスターゼ阻害剤であるウリナスタチンを併用することにより、喀血・血痰などの臨床症状が早期に改善することが明らかになっている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ウリナスチンのエラスターゼ阻害活性には限度があり、高濃度でも５０％阻害程度であったため、より微量で有効な新規エラスターゼインヒビターの探索が行われている。
【０００４】
これまでに、本発明者らによって、日和見感染性Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．より、新規エラスターゼインヒビターが見出され、その諸性質が明らかにされている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓやＡ． ｆｌａｖｕｓは、病原性を有し、Ｐ２レベルに属すため、それに即した設備を要し、また大量に培養する際、所轄官庁への届出と判断が必要になるという問題がある。また、仮にこれらの菌株の漏出により、何らかのトラブルが起きた場合、大きな問題になりかねないという問題もある。また、エラスターゼインヒビターには、保存性、熱殺菌、薬剤の調製の点で熱安定性が求められ、また、生体での使用の点でｐＨ安定性が求められるが、未だ十分に満足し得るエラスターゼインヒビターは提供されていない。
【０００５】
また、先に述べた日和見感染性Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．のエラスターゼは、エラスチンを分解する以外にも、ヒトフィブリノーゲンやＩ型コラーゲン（以下、「コラーゲンｔｙｐｅＩ」と称することもある）を水解する活性も有している。前記ヒトフィブリノーゲンが水解されると、組織からの出血の際、止血しないという問題があり、前記Ｉ型コラーゲンが水解されると、コラーゲンは人体構成タンパク質であるため、人体組織が崩壊しやすくなるという問題がある。そのため、該エラスターゼの水解活性をも阻害することができるエラスターゼインヒビターも必要とされている。
【０００６】
したがって、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができるエラスターゼインヒビターの速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｙｃｏｌ．  ２００６，  ４７，  １７１−１７８
【非特許文献２】Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８．  ５７，  ８０３−８０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができる新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼ阻害剤及びエラスターゼの水解活性阻害剤、並びに前記ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＧＬＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）として米国ＦＤＡより、その安全性が認定されており、実際に清酒、醤油、味噌などの醸造に用いられ、塩麹などとして食されている他、食品用酵素剤の給源として利用されるなど、極めて安全性の高い微生物である麹菌Ａ． ｏｒｙｚａｅが、エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドを産生すること、及び前記ポリペプチドの配列を確認したところ、その配列はＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ及びＡ． ｆｌａｖｕｓには存在しておらず、前記ポリペプチドが新規なエラスターゼインヒビターであることを知見した。更に、前記ポリペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼのみならず、ヒト好中球エラスターゼに対しても阻害活性を有することも知見した。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリペプチドである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜２＞  前記＜１＞に記載のポリペプチドを含有することを特徴とするエラスターゼ阻害剤である。
＜３＞  前記＜１＞に記載のポリペプチドを含有し、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害することを特徴とするエラスターゼの水解活性阻害剤である。
＜４＞  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができる新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼ阻害剤及びエラスターゼの水解活性阻害剤、並びに前記ポリペプチドをコードする新規ＤＮＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより製造例１で得られたエラスターゼインヒビターの分子質量を測定した結果を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例５−１のＳＤＳスラブ電気泳動の結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例５−２のＳＤＳスラブ電気泳動の結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例６−１のＳＤＳスラブ電気泳動の結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例６−２のＳＤＳスラブ電気泳動の結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例７−１のエラスチン含有平板培地におけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの培養結果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例７−２のエラスチン含有平板培地におけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの培養結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１４】
前記「数個のアミノ酸」の数個とは、前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１個〜９個が挙げられる。
また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される位置としては、前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１５】
なお、本発明の前記エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドは、前記（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、前記（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列同一性を有するものであってもよい。前記配列同一性としては、前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【００１６】
前記アミノ酸配列の同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、及びＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３）により決定することができる。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌらによって開発されている（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，  １９９０)。これらは、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で利用することができる。
前記アミノ酸配列の同一性を分析するＢＬＡＳＴプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
＜エラスターゼに対する阻害活性の確認＞
前記ポリペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有することを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例４に示すように、発色性合成基質を含む基質溶液と、エラスターゼと前記ポリペプチドとを含む酵素溶液とを反応させた後、吸光度を測定することにより確認することができる。
【００１８】
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼとして、Ｊａｐ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３６：２３５−２４３  １９９５の記載に基づいて精製したエラスターゼを用いる場合の基質としては、例えば、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）（株式会社ペプチド研究所製）を用いることができる。
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼとして、Ｊａｐ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３８：５３−５９  １９９７の記載に基づいて精製したエラスターゼを用いる場合の基質としては、例えば、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（株式会社ペプチド研究所）を用いることができる。
前記ヒト好中球エラスターゼとして、シグマ社製のエラスターゼを用いる場合の基質としては、例えば、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｐＮＡ（株式会社ペプチド研究所）を用いることができる。
【００１９】
前記酵素溶液と、前記基質溶液との反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３７℃で３０分間などが挙げられる。
【００２０】
＜分子量＞
前記配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳで測定した分子質量は、６，３００．５４である。また、図１のマススペクトルのパターンに示されるように単一の成分である。
なお、前記ポリペプチドが、配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである場合には、分子質量が６，３００．５４ではないことがあるが、本発明の効果を損なわない限り、分子質量が６，３００．５４でなくてもよい。
【００２１】
＜由来＞
前記ポリペプチドの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、糸状菌、酵母、細菌などが挙げられる。これらの中でも、安全性の点で、麹菌が好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅがより好ましい。
【００２２】
＜水解活性阻害作用＞
前記ポリペプチドは、前記エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有することが好ましい。
【００２３】
−水解活性阻害作用の確認−
前記ポリペプチドが、前記エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有することを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例５−１〜６−２に示すようにして確認することができる。
具体的には、前記エラスターゼが有するヒトフィブリノーゲンの水解活性を阻害する作用を確認する場合には、例えば、ヒト血清フィブリノーゲン（シグマ社製）を含む基質溶液に、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼのみ、又はＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼと前記ポリペプチドとを混和した混合液を加え、３７℃で反応させ、経時的に採取したサンプルを、ポリアクリルアミドを支持体としたＳＤＳスラブ電気泳動を行い、両者の結果を比較することにより、ヒトフィブリノーゲンの水解活性を阻害する作用を有するか否かを確認することができる。
また、前記エラスターゼが有するＩ型コラーゲンの水解活性を阻害する作用を確認する場合には、例えば、コラーゲンｔｙｐｅＩ（和光純薬工業株式会社製）を含む基質溶液に、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼのみ、又はＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼと前記ポリペプチドとを混和した混合液を加え、３７℃で反応させ、経時的に採取したサンプルを、ポリアクリルアミドを支持体としたＳＤＳスラブ電気泳動を行い、両者の結果を比較することにより、Ｉ型コラーゲンの水解活性を阻害する作用を有するか否かを確認することができる。
【００２４】
前記ポリペプチドは、後述する試験例２に示すように、３７℃、５０℃、６０℃、８０℃、又は１００℃で１０分間の加熱を行った後でも前記エラスターゼに対する阻害活性がほぼ１００％残っており、熱に対して強固な安定性を有している。
【００２５】
前記ポリペプチドは、後述する試験例３に示すように、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、又はｐＨ９の溶液で処理した後でも前記エラスターゼに対する阻害活性がほぼ１００％残っており、人体のｐＨ域、即ちｐＨ６〜９の範囲において安定である。
【００２６】
＜用途＞
本発明のポリペプチドは、病原因子である日和見感染性ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓであるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来のエラスターゼのみならず、ヒト好中球エラスターゼに対しても優れた阻害活性を有するので、肺アスペルギルス症のみならず、人体内エラスターゼの亢進により発生する諸疾患に対しても有効であると考えられる。また、前記ポリペプチドは、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用をも有する。したがって、後述する本発明のエラスターゼ阻害剤、エラスターゼの水解活性阻害剤、医薬組成物、化粧料組成物に好適に利用可能である。
【００２７】
＜ポリペプチドの製造方法＞
前記ポリペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の工程を含む方法が好ましい。
【００２８】
＜＜培養工程＞＞
前記培養工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、麹菌、及び後述する形質転換体の少なくともいずれかを培養する工程が好ましい。
【００２９】
前記麹菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安全性の点で、Ａ． ｏｒｙｚａｅが好ましい。
前記Ａ． ｏｒｙｚａｅの具体例としては、清酒醸造用麹菌Ａ． ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株が挙げられる。
【００３０】
前記培養は、前記麹菌、及び後述する形質転換体の少なくともいずれか（以下、「生産菌」と称することがある）を培地中に接種し、前記ポリペプチドの生産に良好な条件で培養することによって行われる。
【００３１】
前記培地としては、特に制限はなく、用いる生産菌に応じて適宜選択することができる。前記生産菌として麹菌を用いる場合には、例えば、１質量％のＹＣＢ（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ）と、１質量％のＣａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄとを含む液体培地を用いることができる。
【００３２】
前記ポリペプチドの生産のための種母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体培地、平板培地、斜面培地、半斜面培地などの培地上で前記生産菌を培養した生育物などを使用することができる。
【００３３】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、振とう培養、タンク培養などが挙げられる。
前記培養の温度としては、前記生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記ポリペプチドを生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
前記培養液のｐＨとしては、前記生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記ポリペプチドを生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができる。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、前記ポリペプチドの蓄積に合わせて適宜選択することができる。
【００３４】
＜＜採取工程＞＞
前記採取工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記培養工程で得られた培養物から本発明のポリペプチドを採取する工程が好ましい。
【００３５】
前記培養物としては、前記培養工程で得られ、前記ポリペプチドを含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、液体培養後の培養上清、菌体、固体培養後の固体培地、及びこれらの混合物などが挙げられる。
なお、前記培養物として、前記菌体を用いる場合は、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ポリペプチドを菌体から抽出し、これを分離及び／又は精製に供してもよい。
【００３６】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができ、例えば、溶媒抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、クロマトグラフ法などが挙げられる。これらの方法を単独又は適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離及び／又は精製された前記ポリペプチドを採取することができる。
例えば、培養上清をろ過した培養ろ液を、ＤＥ−５２−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５カラム、逆相ＨＰＬＣの順に処理することにより、前記ポリペプチドを採取することができる。
【００３７】
なお、前記採取工程における前記ポリペプチドの精製の程度としては、特に制限はなく、粗精製物であってもよいし、粗精製物を更に精製したものであってもよい。
【００３８】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、洗浄工程、精製工程などが挙げられる。
前記洗浄工程は、前記培養工程で得られた培養物、又は前記採取工程で得られた前記ポリペプチドを洗浄する工程である。前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。
前記精製工程は、前記採取工程で得られた前記ポリペプチドを精製する工程である。前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができ、例えば、前記採取工程に記載した方法と同様の方法が挙げられる。
【００３９】
（ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００４０】
前記「数個のアミノ酸」の数個とは、上述のポリペプチドで記載したものと同様である。
【００４１】
前記ストリンジェントな条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ナトリウム濃度が２５ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、２５ｍＭ〜３００ｍＭがより好ましく、温度が４２℃〜６８℃が好ましく、４２℃〜６５℃がより好ましい。例えば、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ  ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、温度４２℃が挙げられる。
【００４２】
なお、本発明の前記エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、前記（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、前記（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、前記（ｃ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ、又は、（ｄ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡと配列同一性を有するものであってもよい。前記塩基配列の同一性としては、ポリペプチドが前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記塩基配列の同一性は、上述したアミノ酸配列の同一性と同様にして決定することができる。
【００４３】
前記ＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション技術を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる方法、前記ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により変異を導入する方法などが挙げられる。
なお、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。一方、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合もある。本発明のＤＮＡには、このような人工的に調製されたＤＮＡ、又は天然の変異ＤＮＡが含まれる。
【００４４】
前記ＤＮＡの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどが挙げられる。これらの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
【００４５】
なお、上記のような塩基配列の配列同一性や、コードするタンパク質のアミノ酸配列の配列同一性を示すようなＤＮＡは、上述のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群や公共データベースの中から、例えば、前述のＢＬＡＳＴプログラムを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００４６】
このようにして得られたＤＮＡが前記エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードしていることは、例えば、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養し、得られたタンパク質について、上述したように前記エラスターゼに対する阻害活性を測定することにより確認することができる。
【００４７】
（組換えベクター）
前記組換えベクターは、本発明のＤＮＡを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の構成を含む。
【００４８】
前記ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。
【００４９】
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マーカー遺伝子、制御配列、精製用配列などが挙げられる。
【００５０】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のＤＮＡや、必要に応じて更にその他のＤＮＡを連結若しくは挿入することにより得ることができる。
ベクターに上記ＤＮＡを連結若しくは挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。
【００５１】
（形質転換体）
前記形質転換体は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
前記形質転換体は、前記組換えベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。
【００５２】
前記宿主としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、麹菌、酵母、大腸菌、バチルス属に属する細菌、シュードモナス属に属する細菌、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらの中でも、麹菌であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅが好ましい。
【００５３】
前記組換えベクターを宿主中に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記組換えベクターが宿主に導入されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
【００５４】
前記形質転換体は、上述したように本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。
【００５５】
（エラスターゼ阻害剤）
本発明のエラスターゼ阻害剤は、本発明のポリペプチドを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記エラスターゼ阻害剤は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対す阻害活性を有する。
【００５６】
前記エラスターゼ阻害剤における前記ポリペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記エラスターゼ阻害剤は、前記ポリペプチドそのものであってもよい。
【００５７】
−その他の成分−
前記エラスターゼ阻害剤における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記エラスターゼ阻害剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
−−添加剤又は補助剤−−
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５９】
前記エラスターゼ阻害剤は、前記ポリペプチドを含むため、前記エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れるので、医薬組成物、化粧料組成物などとして、好適に利用可能である。
なお、前記エラスターゼ阻害剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。また、前記エラスターゼ阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬組成物中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００６０】
（エラスターゼの水解活性阻害剤）
本発明のエラスターゼの水解活性阻害剤は、本発明のポリペプチドを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記エラスターゼの水解活性阻害剤は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する。
【００６１】
前記エラスターゼの水解活性阻害剤における前記ポリペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記エラスターゼの水解活性阻害剤は、前記ポリペプチドそのものであってもよい。
【００６２】
−その他の成分−
前記エラスターゼの水解活性阻害剤における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記エラスターゼ阻害剤で記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記エラスターゼの水解活性阻害剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６３】
前記エラスターゼの水解活性阻害剤は、前記ポリペプチドを含むため、前記エラスターゼが有する水解活性を阻害することができ、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れるので、医薬組成物、化粧料組成物などとして、好適に利用可能である。
なお、前記エラスターゼの水解活性阻害剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。また、前記エラスターゼの水解活性阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬組成物中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００６４】
（医薬組成物）
前記医薬組成物は、本発明のエラスターゼ阻害剤、及びエラスターゼの水解活性阻害剤の少なくともいずれかを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記医薬組成物における前記エラスターゼ阻害剤、及びエラスターゼの水解活性阻害剤の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記医薬組成物は、前記エラスターゼ阻害剤そのものであってもよいし、前記エラスターゼの水解活性阻害剤そのものであってもよいし、前記エラスターゼ阻害剤及び前記エラスターゼの水解活性阻害剤からなるものであってもよい。
【００６５】
−その他の成分−
前記医薬組成物における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記エラスターゼ阻害剤で記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記医薬組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６６】
前記医薬組成物は、前記ポリペプチドを含むため、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができるので、肺アスペルギルス症などの病原性Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓが産生するエラスターゼが病原因子となる疾患や、ヒト好中球エラスターゼの亢進により発症する皮膚トラブルなどの諸疾患などに対する医薬組成物として、好適に利用可能である。
なお、前記医薬組成物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。また、前記医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００６７】
＜剤形＞
前記エラスターゼ阻害剤、エラスターゼの水解活性阻害剤、又は医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の前記エラスターゼ阻害剤、エラスターゼの水解活性阻害剤、又は医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
【００６８】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００６９】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００７０】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００７１】
＜投与＞
前記エラスターゼ阻害剤、エラスターゼの水解活性阻害剤、又は医薬組成物の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬組成物や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いることができる。
【００７２】
（化粧料組成物）
前記化粧料組成物は、本発明のエラスターゼ阻害剤、及びエラスターゼの水解活性阻害剤の少なくともいずれかを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記化粧料組成物における前記エラスターゼ阻害剤、及びエラスターゼの水解活性阻害剤の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記化粧料組成物は、前記エラスターゼ阻害剤そのものであってもよいし、前記エラスターゼの水解活性阻害剤そのものであってもよいし、前記エラスターゼ阻害剤及び前記エラスターゼの水解活性阻害剤からなるものであってもよい。
【００７３】
−その他の成分−
前記化粧料組成物における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基材又は担体、添加剤、その他の活性成分などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記化粧料組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
−−基材又は担体−−
前記基材又は担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭化水素、脂肪酸、トリ脂肪酸グリセリド、高級アルコール、シリコーン油、グリコールアセタート、グリコールエステル、グリコールジニトラート、セルロース誘導体、エステル類、多糖類、低級アルコール、グリコールエーテル、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７５】
−−添加剤−−
前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、増粘剤、保存剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、安定化剤、刺激軽減剤、防腐剤、着色剤、分散剤、香料、パール光沢付与剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７６】
−−その他の活性成分−−
前記その他の活性成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗酸化成分、老化防止成分、抗炎症成分、美白成分、角質柔軟成分、細胞賦活化成分、ビタミン類、血行促進成分、保湿成分、ＤＮＡの損傷の予防及び／又は修復作用を有する成分、紫外線吸収成分、紫外線散乱成分、洗浄成分、抗菌成分、収斂成分などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７７】
前記化粧料組成物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、パウダー剤、パップ剤、不織布等のシートに薬液を含浸させたシート剤、及びリップスティックのようなスティック剤などが挙げられる。
【００７８】
前記化粧料組成物の用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基礎化粧料、洗浄用化粧料、メークアップ化粧料、入浴剤などが挙げられる。
前記基礎化粧料の具体例としては、化粧水、乳液、クリーム、美容液、日焼け止め用化粧料、パック、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリームなどが挙げられる。
前記洗浄用化粧料の具体例としては、洗顔料、メイク落とし、ボディーシャンプー、シャンプー、リンスなどが挙げられる。
前記メークアップ化粧料の具体例としては、ファンデーション、化粧下地、リップクリーム、口紅、チークカラーなどが挙げられる。
【００７９】
前記化粧料組成物は、常法に従い製造することができる。
【００８０】
前記化粧料組成物は、前記ポリペプチドを含むため、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びｐＨに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができるので、ヒト好中球エラスターゼの亢進により発症する皮膚トラブルなどを緩和する化粧料組成物として、好適に利用可能である。
【実施例】
【００８１】
以下、製造例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。
【００８２】
（製造例１：エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチド）
Ａ． ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株（独立行政法人酒類総合研究所より入手）をＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｉｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ、Ｄｉｆｃｏ社製）斜面培地で３０℃、５日間培養した後、１質量％のＹＣＢ（Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ、Ｄｉｆｃｏ社製）と、１質量％のＣａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（和光純薬工業株式会社製）とを含む液体培地１００ｍＬに３白金耳接種し、３７℃で２週間静置培養した。
培養４日目に培養液を採取し、Ｄｉｓｍｉｃ−２５ＣＳフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）でろ過し、滅菌したろ液を精製に用いた。
前記培養ろ液を、０．０１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて、４℃で一晩透析した後、ＤＥ−５２−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）にアプライした。次に、０．０１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で素通り画分を溶出させた後、塩濃度を０．０１Ｍから０．５Ｍまで上昇させて、流速１３．５ｍＬ／時間で溶出させ、３ｍＬずつ分画した。
【００８３】
＜各画分のエラスターゼに対する阻害活性の確認＞
前記分画した各画分のエラスターゼに対する阻害活性（以下、「エラスターゼ阻害活性」と称することがある）を以下のようにして調べた。
Ｊａｐ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３６：２３５−２４３  １９９５の記載に基づいて精製したＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のエラスターゼと、前記各画分の粗酵素液の等量混合液０．１ｍＬとを３７℃で１５分間反応させた後、この混合液に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を０．９ｍＬ、基質液（５０ｍＭ  Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ（株式会社ペプチド研究所）を２０μＬ加えた。これを３７℃で３０分間反応させた後、１０％  トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液１ｍＬを加えて反応を止めた。この反応液に０．１％  亜硫酸ナトリウム溶液、０．５％  スルファミン酸アンモニウム溶液、及び０．１％  Ｎ−ナフチルエチレンジアミン溶液を０．２ｍＬずつ、ボルテックスでよく攪拌しながら、この順番で加え、１０分間後、５５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、前記エラスターゼインヒビターを加えない場合をブランクとして同様にして測定した。
前記測定の結果から、以下の式（１）より、エラスターゼ阻害活性を求めた。
エラスターゼ阻害活性（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／Ａ｝×１００  ・・・  式（１）
Ａ：エラスターゼインヒビターを加えなかった場合の吸光度
Ｂ：エラスターゼを加えた場合の吸光度
【００８４】
前記エラスターゼ阻害活性の確認によりエラスターゼ阻害活性が確認された画分を集め、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて、４℃で一晩透析した。これを凍結濃縮した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）にアプライし、０．０１Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を用い、流速７．２ｍＬ／時間で溶出させ、３ｍＬずつ分画した。
【００８５】
前記分画した各画分について、前記エラスターゼ阻害活性の確認と同様にしてエラスターゼ阻害活性を確認したところ、フラクション番号９５〜１４５が５０％以上のエラスターゼ阻害活性を有していた。これらのフラクションの中で、比較的強いエラスターゼ阻害活性を有し、多くのタンパク質と分離できたフラクション番号９５〜１３９を集め、逆相ＨＰＬＣに注入した。なお、前記逆相ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
−逆相ＨＰＬＣの条件−
・  装置  ：  ＭＯＤＥＬ３０２（ギルソン社製）
・  カラム  ：  Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｐａｃｋｅｄ  Ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ−ＨＧ−５
・  溶出液  ：  溶液Ａ・・・０．１％  ＴＦＡ含有水、溶液Ｂ・・・０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリル
・  溶出条件  ：  溶液Ｂ  ０体積％→５０体積％／２５分間
・  流量  ：  １．０ｍＬ／分間
・  検出  ：  ２１５ｎｍ（紫外部）
【００８６】
前記逆相ＨＰＬＣにおいて、１５．５分付近の単一ピークを集め、前記エラスターゼ阻害活性の確認と同様にしてエラスターゼ阻害活性を測定した結果、９０％以上の阻害活性が認められたため、前記１５．５分付近の単一ピークがエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチド（以下、「エラスターゼインヒビター」、若しくは「ＡＯＥＩ」と称することがある）であると推定し、以下の諸性質を調べた。
【００８７】
（試験例１：エラスターゼインヒビターの分子質量）
前記エラスターゼインヒビターを含む画分を凍結乾燥し、前処理としてサンプルを０．１体積％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ  ａｓｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）水溶液５０μＬで溶解した後、マトリックス（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）と混和した。
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分子質量の測定を行った結果、前記エラスターゼインヒビターの分子質量は６，３００．５４であることが分かった（図１参照）。
【００８８】
（試験例２：エラスターゼインヒビターの熱安定性）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）にて４℃で、一晩透析し、約６０ｎｇ／ｍＬに調製した。これを５００μＬのナイクロチューブに加え、３７℃、５０℃、６０℃、８０℃、又は１００℃で１０分間のヒートブロックによる加熱を行った後、前記製造例１に記載のエラスターゼ阻害活性の確認と同様にしてエラスターゼ阻害活性を測定した。その結果、１００℃で加熱した場合であっても、エラスターゼ阻害活性がほぼ１００％残っており、前記エラスターゼインヒビターが、熱に対し強固な安定性を有することが分かった。
【００８９】
（試験例３：エラスターゼインヒビターのｐＨ安定性）
ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、又はｐＨ９の溶液を、ｐＨ６は０．１Ｍ  酢酸緩衝液を用い、ｐＨ７〜９は０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて調整した。
前記各ｐＨ緩衝液と、前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビター（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）溶液；約６０ｎｇ/ｍＬ）との等量混合溶液を４℃で一晩放置した後、これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で、２時間透析した。
前記透析処理液のエラスターゼ阻害活性を、前記製造例１に記載のエラスターゼ阻害活性の確認と同様にして測定した結果、少なくともｐＨ６〜９では阻害活性がほぼ１００％残存しており、この範囲のｐＨ（人体のｐＨ域に相当）では安定であることが分かった。
【００９０】
（試験例４：エラスターゼインヒビターの特異性）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターの各種エラスターゼに対する阻害活性を以下のようにして調べた。
−基質溶液の調製−
表１に記載の基質を５０ｍＭになるようにＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｙｌ  ｓｕｌｈｏｘｉｄｅ）で溶解し、これを基質溶液とした。
−酵素溶液の調製−
表１に記載のエラスターゼ（６００ｎｇ／ｍＬ）と、前記エラスターゼインヒビター（約６０ｎｇ／ｍＬ）との等量混合液０．１ｍＬを３７℃で１５分間反応させた後、前記混合液に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．９ｍＬを加え、これを酵素溶液とした。
なお、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼは、Ｊａｐ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３６：２３５−２４３  １９９５の記載に基づいて精製したエラスターゼであり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼは、Ｊａｐ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３８：５３−５９  １９９７の記載に基づいて精製したエラスターゼである。
【００９１】
−阻害活性測定−
前記酵素溶液に２０μＬの前記基質溶液を加え、３７℃で３０分間反応させた後、１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を１ｍＬ加えて反応を停止させた。前記反応を停止させた溶液に、０．１％亜硫酸ナトリウム溶液と、０．５％スルファミン酸アンモニウム溶液とをこの順番に加え、溶液をボルテックス等で十分混和した後、０．１％  Ｎ−ナフチルエチレンジアミン溶液を加えた後、約１０分間後の５５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、前記エラスターゼインヒビターを加えない場合をブランクとして同様にして測定した。
前記測定の結果から、以下の前記式（１）より、エラスターゼ阻害活性を求めた。結果を表１に示す。
【００９２】
【表１】
2015039317.tif 000002
表１中、「Ｓｕｃ」は「Ｓｕｃｃｉｎｙｌ」を表し、「ｐＮＡ」は「ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ」を表す。
【００９３】
前記表１の結果から、前記エラスターゼインヒビターは、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のエラスターゼ、及びＡ． ｆｌａｖｕｓ由来のエラスターゼに対しては強い阻害活性を示した。また、ヒト好中球（Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）エラスターゼに対しても阻害活性を示した。一方、ブタ膵臓（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ）エラスターゼに対しては阻害活性を示さなかった。
【００９４】
（試験例５−１：エラスターゼの水解活性を阻害する作用−１−１）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターが、エラスターゼの水解活性を阻害するか否かを、ＯｕｙａｎｇとＴｅｎｇの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．４２：２９８−３０８，１９７４）に準拠し、以下のようにして試験した。
ヒト血清フィブリノーゲン（シグマ社製）を０．１質量％になるよう生理食塩水に溶解したものを基質溶液とした。
前記基質溶液１ｍＬに、試験例４と同様にして調製したＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼを１００μＬ加え、３７℃で反応させ、経時的（０分間、５分間、１５分間、３０分間、６０分間、１２０分間、１８０分間）に５０μＬずつ取り、等量の反応停止液（４％  ＳＤＳ、４％  メルカプトエタノール、及び１０ｍＭ  尿素を含有する１０ｍＭ  リン酸緩衝液）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。
これらをサンプルとして、１２％ポリアクリルアミドを支持体としたＳＤＳスラブ電気泳動を行った。結果を図２Ａに示す。
【００９５】
（試験例５−２：エラスターゼの水解活性を阻害する作用−１−２）
前記試験例５−１において、エラスターゼ１００μＬを基質溶液に加えていた点を、以下のようにして調製した、エラスターゼと、エラスターゼインヒビターとの混合液の１００μＬを基質溶液に加えた以外は、試験例５−１と同様にして試験した。結果を図２Ｂに示す。
−混合液の調製−
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビター１００μＬ（約６０ｎｇ／ｍＬ）と、試験例４と同様にして調製したＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ１００μＬ（６００ｎｇ／ｍＬ）とを混和し、３７℃で１５分間インキュベートし、エラスターゼと、エラスターゼインヒビターとの混合液とした。
【００９６】
図２Ａ及び図２Ｂでは、左から順に、マーカー（Ｓｔｄ．）、０分間（０）、５分間（５）、１５分間（１５）、３０分間（３０）、６０分間（６０）、１２０分間（１２０）、１８０分間（１８０）の結果を示す。
図２Ａ及び図２Ｂの結果から、エラスターゼは時間の経過とともにヒト血清フィブリノーゲンを水解したが、エラスターゼインヒビターの存在下ではその水解は阻害された。
【００９７】
（試験例６−１：エラスターゼの水解活性を阻害する作用−２−１）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターが、エラスターゼの水解活性を阻害するか否かを、以下のようにして試験した。
コラーゲンｔｙｐｅＩ（和光純薬工業株式会社製）を生理食塩水に溶解し、３ｍｇ／ｍＬとしたものを基質溶液とした。
前記基質溶液９００μＬに、試験例４と同様にして調製したＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼを１００μＬ加え、３７℃で反応させ、経時的（０分間、５分間、１５分間、３０分間、６０分間、１２０分間、１８０分間）に１００μＬずつ取り、６０℃で２０分間加温して反応を停止させた。
これらに、４％  ＳＤＳ、及び３％  メルカプトエタノールを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２）を１００μＬ加え、１０％のポリアクリルアミドを支持体としたＳＤＳスラブ電気泳動を行った。結果を図３Ａに示す。
【００９８】
（試験例６−２：エラスターゼの水解活性を阻害する作用−２−２）
前記試験例６−１において、エラスターゼ１００μＬを基質溶液に加えていた点を、以下のようにして調製した、エラスターゼ（６００ｎｇ／ｍＬ）と、エラスターゼインヒビター（約６０ｎｇ／ｍＬ）との混合液の１００μＬを基質溶液に加えた以外は、試験例６−１と同様にして試験した。結果を図３Ｂに示す。
−混合液の調製−
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターと、試験例４と同様にして調製したＡ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼとを等量混和し、３７℃で１５分間インキュベートし、エラスターゼと、エラスターゼインヒビターとの混合液とした。
【００９９】
図３Ａ及び図３Ｂでは、左から順に、マーカー（Ｓｔｄ．）、０分間（０）、５分間（５）、１５分間（１５）、３０分間（３０）、６０分間（６０）、１２０分間（１２０）、１８０分間（１８０）の結果を示す。
図３Ａ及び図３Ｂの結果から、エラスターゼは時間の経過とともにコラーゲンｔｙｐｅＩを水解したが、エラスターゼインヒビターの存在下ではその水解は阻害された。
【０１００】
（試験例７−１：エラスターゼによるエラスチンの水解活性を阻害する作用−１）
エラスチン（シグマ社製）を含有した培地（エラスチン  １質量％、ペプトン  １質量％、グルコース  ２質量％，酵母エキス  ０．５質量％、ｐＨ７．２）において、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（独立行政法人国立病院機構  東名古屋病院より入手）を穿刺培養し、３７℃で１０日間培養した結果、培地中に含まれるエラスチンが分解された（図４Ａ参照）。
【０１０１】
（試験例７−２：エラスターゼによるエラスチンの水解活性を阻害する作用−２）
前記試験例７−２において、培地に前記製造例１で得られたエラスチンインヒビターを約３ｎｇ含有させた以外は、試験例７−１と同様にして試験した結果、エラスチンの水解が阻害された（図４Ｂ参照）。
【０１０２】
（試験例８：エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターのアミノ酸配列を、Ｍｏｄｅｌ  ４９１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ／Ｍｏｄｅｌ  ６１１  ＰＴＨ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。その結果、ネイティブのエラスターゼインヒビターのアミノ酸配列は、Ｎ末端より４９残基まで決定された。
前記配列について、独立行政法人酒類総合研究所の麹菌ＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｎｒｉｂｆ２１．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ＥＳＴ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）にて確認したところ、機能未知のポリペプチドであるＡｏＥＳＴ２６０８に該当した。前記配列は、Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、及びＡ． ｆｌａｖｕｓにはなく、新規なエラスターゼインヒビターと考えられた。前記エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列は、ｃＤＮＡから決定されたポリペプチドのアミノ酸配列を一部補い、配列番号：１に示した。
【０１０３】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリペプチドである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜２＞  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来である前記＜１＞に記載のポリペプチドである。
＜３＞  エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のポリペプチドである。
＜４＞  前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドを含有することを特徴とするエラスターゼ阻害剤である。
＜５＞  前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドを含有し、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、及びＩ型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害することを特徴とするエラスターゼの水解活性阻害剤である。
＜６＞  前記＜４＞に記載のエラスターゼ阻害剤、及び前記＜５＞に記載のエラスターゼの水解活性阻害剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬組成物である。
＜７＞  前記＜４＞に記載のエラスターゼ阻害剤、及び前記＜５＞に記載のエラスターゼの水解活性阻害剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする化粧料組成物である。
＜８＞  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来エラスターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：２で示される塩基配列を含むＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
＜９＞  前記＜８＞に記載のＤＮＡを含有することを特徴とする組換えベクターである。
＜１０＞  前記＜９＞に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、
麹菌、及び前記＜１０＞に記載の形質転換体の少なくともいずれかを培養する工程と、
前記培養物から前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドを採取する工程とを含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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