(57)【要約】【課題】本発明は、転写制御因子ｍａｎＲ及びｘｌｎＲを同時に強制発現させた麹菌を用いることで、多糖類の分解方法、延いては諸味粘度を低下させ圧搾性をより向上させた醤油の製造法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ｍａｎＲ遺伝子又はその相同遺伝子及びｘｌｎＲ遺伝子又はその相同遺伝子を強制発現させた形質転換体用いて多糖類を分解する方法を提供する。【選択図】図１５
2015167475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類を分解する方法であって、
下記の遺伝子(a)及び(b)を強制発現させた形質転換体を用いることを特徴とする方法：
(a) 下記(a-1)〜(a-5)のいずれかの遺伝子：
(a-1) 配列番号１記載の塩基配列から成る遺伝子、
(a-2) 配列番号３記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(a-3) 配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(a-4) 配列番号３記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(a-5) 配列番号３記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、並びに
(b) 下記(b-1)〜(b-5)のいずれかの遺伝子：
(b-1) 配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子、
(b-2) 配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(b-3) 配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(b-4) 配列番号４記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(b-5) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子。
【請求項２】
前記遺伝子(a)がトランスレーションエロンゲーションファクターのプロモーターの支配下、そして、前記遺伝子(b)がアルカリプロテアーゼのプロモーターの支配下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主が糸状菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記糸状菌がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖類が醤油原料由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に従い、醤油原料由来の多糖類を分解する工程を含む、醤油の製造方法。
【請求項７】
以下の遺伝子を含む組換えベクター。
(a) 下記(a-1)〜(a-5)のいずれかの遺伝子：
(a-1) 配列番号１記載の塩基配列から成る遺伝子、
(a-2) 配列番号３記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(a-3) 配列番号１記載の塩基配列から成る遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(a-4) 配列番号３記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(a-5) 配列番号３記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、並びに
(b) 下記(b-1)〜(b-5)のいずれかの遺伝子：
(b-1) 配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子、
(b-2) 配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(b-3) 配列番号２記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(b-4) 配列番号４記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(b-5) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写制御因子ｍａｎＲ及びｘｌｎＲを二重強制発現させた醤油麹菌を用いる多糖類の分解方法、延いては当該方法を用いた醤油の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）及び麹菌アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）は、古くから日本の食品製造に用いられてきた醸造微生物であり、ともに産業上非常に重要な糸状菌である (例えば、非特許文献１参照)。
【０００３】
醤油醸造において麹カビの生産する数多くの酵素は、原料分解という重要な役割を担っている。なかでも糖質加水分解酵素は、原料由来のセルロース、ヘミセルロース及びペクチン類などの多糖成分を分解することで、醤油醸造における諸味粘度を低下させ、圧搾を容易にする働きをしていると考えられる。
【０００４】
糖質分解酵素のうち、カルボキシメチルセルロース糖化酵素（ＣＭＣａｓｅ）や、ペクチン液化酵素（ペクチナーゼ）、ペクチンリアーゼ、及びβ−グルカナーゼなどの麹菌酵素は、醤油醸造における諸味粘度の低下とろ過性の向上、及び醤油諸味の圧搾性の向上に重要な働きをすることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
ＣＭＣａｓｅに関しては、大豆細胞壁のキシログルカン分解に関与し、これが圧搾性の向上につながっていると考えられている(例えば、非特許文献２参照)。
【０００６】
上記のように、醤油醸造における糖質分解酵素群の働きは、諸味粘度の低下と圧搾性の向上に大きな影響を及ぼす要因である。そのため、醤油醸造時に麹菌の生産する糖質加水分解酵素群の働きが弱かった場合には、諸味粘度が増加することにより圧搾性の低下が生じ、諸味より回収できる液汁の量が減少するという問題が発生する。
【０００７】
この問題を防ぐする手段としては、ＣＭＣａｓｅなどのセルラーゼや、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼをコードしている遺伝子を強制発現することにより、糖質分解酵素の生産量を増強した麹菌を醤油醸造に用いることが考えられる。しかし、複数の糖質分解酵素遺伝子を同時に強制発現し麹菌酵素の増強を行っていくことには限界がある。特に、二種類の転送制御因子が必ずしも相加効果を発揮するとは限らず、ましてや、相乗効果を生じさせることは当業者でも予測できない。
【０００８】
また、原料由来の多糖類については、その構造が複雑であるがゆえ、効率的な分解には複数の性質の異なる酵素群が協調して作用する必要がある。例えば、ヘミセルロースの1つである４−Ｏ−メチルグルクロノアラビノキシランを効率的に分解するためには、キシランの主鎖を分解するエンドキシラナーゼやβ−キシロシダーゼだけでなく、側鎖分解酵素であるα−L-アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ等、複数の酵素の働きが必要である(例えば、非特許文献３参照)。
【０００９】
そのため、糖質分解酵素の制御因子の遺伝子を強制発現させることで、目的とする糖質分解酵素群の生産を包括的に増大させるという方法が、原料由来の多糖類の分解を促進するのに有効であると考えられる。
【００１０】
これまでに麹菌アスペルギルス・オリゼーでは、キシラン加水分解酵素遺伝子群及びセルロース加水分解酵素群の正の転写制御因子であるＸｌｎＲが発見されている（例えば、非特許文献４、非特許文献５及び特許文献１参照）。
【００１１】
また、本菌株では、近年、マンナン加水分解酵素遺伝子群及びセルロース加水分解酵素遺伝子群の正の転写制御因子であるＭａｎＲ（例えば、非特許文献６、非特許文献７及び特許文献２参照）が見出されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】麹学  第５版  村上英也 編著
【非特許文献２】醤油の科学と技術、栃倉辰六郎編集
【非特許文献３】Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｐ．  Ｃｏｕｇｈｌａｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｈａｚｌｅｗｏｏｄ
【非特許文献４】Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ．; ３５、１５７−１６９（２００２）
【非特許文献５】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２８、２７９−２８２（２００２）
【非特許文献６】Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ．; ４９、９８７−９９５（２０１２）
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．；７７、４２６−４２９（２０１３）
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００１−０９５５８１号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１０１１２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、転写制御因子ｍａｎＲ及びｘｌｎＲを同時に強制発現させた麹菌を用いることで、麹中の糖質分解酵素の活性を増大させ、多糖類の分解を増強し、延いては諸味粘度を低下させた醤油の製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従来、転写制御因子ｍａｎＲ及びｘｌｎＲを同時に強制発現させた場合にセルラーゼ及びヘミセルラーゼ生産への影響が相加的もしくは相乗的に表れるかは、醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤに限らず、麹菌であるアスペルギルス・オリゼー、黒かびであるアスペルギルス・ニガーなどの他のアスペルギルス属糸状菌でも調べられた例は無い。
【００１６】
このような状況下において、本発明者等は、菌類においてアスペルギルス・ソーヤ由来の転写制御因子ｍａｎＲ遺伝子およびおよびｘｌｎＲを強制発現させることで多糖類の分解が増強されることを見出し、さらに本強制発現株を醤油醸造に用いることで、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本願は以下の発明を提供する：
第１の発明は、ｍａｎＲ遺伝子又はその相同遺伝子及びｘｌｎＲ遺伝子又はその相同遺伝子を強制発現させた形質転換体用いて多糖類を分解する方法に関する。より具体的には、下記の遺伝子(a)（ｍａｎＲ遺伝子又はその相同遺伝子）及び遺伝子(b)（ｘｌｎＲ遺伝子又はその相同遺伝子）が強制発現される。
(a) 下記(a-1)〜(a-5)のいずれかの遺伝子：
(a-1) 配列番号１記載の塩基配列から成る遺伝子、
(a-2) 配列番号３記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(a-3) 配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(a-4) 配列番号３記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(a-5) 配列番号３記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、並びに
(b) 下記(b-1)〜(b-5)のいずれかの遺伝子：
(b-1) 配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子、
(b-2) 配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
(b-3) 配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子と９０％以上の同一性を有する塩基配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、
(b-4) 配列番号４記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子、あるいは
(b-5) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成る、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする遺伝子。
【００１８】
上記遺伝子は、それぞれ適切な強制発現用プロモーター制御下になるように連結したベクターに配置される。例えば、遺伝子(a)はトランスレーションエロンゲーションファクターのプロモーターの支配下、そして、遺伝子(b)はアルカリプロテアーゼのプロモーターの支配下に置かれるのが好ましい。このようなベクターを作製したのち、これを、宿主に導入することで所望の形質転換体（ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株）が作製される。宿主の例として糸状菌、好ましくはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）が挙げられるが、これらの限定されることを意図していない。分解される多糖類は大豆および小麦等の醤油原料由来の多糖類であってもよい。
【００１９】
第２の発明は、上記多糖類の分解方法を用いた醤油の製造法に関する。
【００２０】
第３の発明は、上記遺伝子(a)及び(b)を含む組換えベクターに関する。
【００２１】
第４の発明は、上記組換えベクターを含む形質転換体に関する
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、醤油原料中の多糖類の分解が促進され、延いては諸味粘度を低下させた醤油製造法を提供することができる。その結果、諸味からの自然だれによる液汁回収量が増加する。また、諸味粘度が低下していることから、本製法で作製した諸味は圧搾性が向上していることが期待される。尚、２つの転写制御因子遺伝子ｍａｎＲ及びｘｌｎＲを二重強制発現させた菌類が、多糖類の分解増強や、醤油醸造において諸味粘度低下や圧搾性の向上のなどの有用な性質を示すかどうかについては、本出願より前の時点には全く知見が無い状態であった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】アスペルギルス・ソーヤ ＫＰ―ｄｅｌ株作製過程
【図２】アスペルギルス・ソーヤＫＰ―ｄｅｌ株からのａｄｅＡ 遺伝子除去方法
【図３Ａ】ＤＮＡシーケンス解析による ａｄｅＡ 遺伝子欠失領域の確認
【図３Ｂ】ＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ株の栄養要求性の確認結果
【図４】アスペルギルス・ソーヤ ＫＰ―ｄｅｌ株の ｐｙｒＧ 復元確認結果
【図５】ｘｌｎＲ遺伝子強制発現用カセットの構造と宿主への組込み位置
【図６】ｘｌｎＲ―ＯＥ  (ΔｐｙｒＧ)株のＰＣＲによる確認結果
【図７】ｍａｎＲ遺伝子強制発現用カセットの構造と宿主への組込み位置
【図８】ｍａｎＲ-ｘｌｎＲ-ＯＥ株のＰＣＲによる確認結果
【図９】ｍａｎＲ 単独強制発現株のＰＣＲによる確認結果
【図１０】ＰＣＲによる ｘｌｎＲ−ＯＥ  （ΔｐｙｒＧ) 株の ｐｙｒＧ 遺伝子復元確認結果
【図１１】アスペルギルス・ソーヤでのｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現によるマンナン加水分解酵素群生産への影響
【図１２】アスペルギルス・ソーヤでのｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現によるキシラン加水分解酵素群生産への影響
【図１３】アスペルギルス・ソーヤでのｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現によるセルロース加水分解酵素群生産への影響
【図１４】ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現株を用いた醤油原料短期間分解試験における麹及び諸味の状態
【図１５】ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現株を用いた醤油原料短期間分解試験における諸味粘度測定結果
【図１６】ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現株を用いた醤油原料短期間分解試験における自然だれによる回収液汁量測定結果
【図１７】アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株系統でのｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現株 （ＭＸＯＥ―Ｎ２株）の作製
【図１８】ＭＸＯＥ―Ｎ２ 株を用いた醤油原料短期間分解試験結果
【図１９】ＭＸＯＥ―Ｎ２株を用いた醤油小規模醸造試験における諸味の状態
【図２０】ＭＸＯＥ―Ｎ２株を用いた醤油小規模醸造試験における諸味粘度測定結果
【図２１】ＭＸＯＥ―Ｎ２株を用いた醤油小規模醸造試験における自然だれによる回収液汁量測定結果
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明にて利用するｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株は、配列番号１（ｍａｎＲ遺伝子）及び配列番号２（ｘｌｎＲ遺伝子）を単離後、適当なプロモーターに連結したベクターを作製した後、これを宿主とする醤油麹菌等の糸状菌に導入することで得ることができる。このようにして得られた形質転換体を用いて、多糖類の分解、延いては醤油醸造を行うことで、本発明を実施することが可能である。
【００２５】
配列番号１の塩基配列から成るｍａｎＲ遺伝子及び配列番号２の塩基配列から成るｘｌｎＲ遺伝子に代えて、糖質加水分解酵素の転写制御因子をコードする、それらの相同遺伝子を利用してもよい。相同遺伝子は、例えば、各遺伝子と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有することが好ましい。各遺伝子をコードするタンパク質についても、その相同タンパク質が糖質加水分解酵素の転写制御因子である限り、当該タンパク質をコードする遺伝子を利用することができる。本明細書で使用する場合、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列又はアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全塩基又は全アミノ酸残基に対する、同一塩基又はアミノ酸残基の割合（％）を意味する。好ましくは、当該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。
【００２６】
本発明のｍａｎＲ-ｘｌｎＲ二重強制発現株の作製は、本明細書の開示内容に基づき当業者であれば容易に実施することができる。例えば、アスペルギルス・ソーヤ、さらに具体的には、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部、寄託番号ＩＤ：ＮＢＲＣ４２３９）が挙げられる。
【００２７】
ｍａｎＲ-ｘｌｎＲ二重強制発現株で産生が増強される糖質加水分解酵素の例として、セルロース、ヘミセルロース及びペクチン類などの多糖成分を分解する酵素が挙げられる。本発明の二重強制発現株は特に、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの産生を増強させることができるため、セルロース及びヘミセルロースの分解に好適に使用することができる。
【００２８】
形質転換体の作製方法
本発明の組換えベクターは、ｍａｎＲ遺伝子及びｘｌｎＲ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で該2種転写制御因子を強制発現であればどのようなものでも用いることができ、例えば、染色体組み込み型に限らず、糸状菌において保持可能な自立複製型プラスミドなどのベクターを用いることもできる。
【００２９】
宿主染色体上に強制発現用ベクターを導入する場合、ベクターに搭載されている遺伝子が正しく強制発現される状態であるならば、その導入様式は限定されない。例えば、染色体にベクターを組み込ませる場合には、目的とする染色体上の領域に対応する配列を組み込もうとするベクターの両端に付加し、相同組換えを利用し組み込ませても良い。また、外来ＤＮＡの宿主染色体上への非相同組換えによる取り込みを利用し、ベクターを宿主染色体上にランダムに組み込んでも良い。
【００３０】
ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。
【００３１】
マーカー遺伝子としては、例えば、ａｄｅＡ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ｓＣ、のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、ピリチアミンやオーレオバシジンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
【００３２】
対象転写制御因子の強制発現に用いるプロモーターとしては、例えば、アルカリプロテアーゼプロモーター(ａｌｐプロモーター)、トランスレーションエロンゲーションファクタープロモーター（ｔｅｆ１プロモーター）、α―アミラーゼプロモーター等が挙げられる。
【００３３】
本発明の形質転換体は、宿主を、組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、多糖類の分解に適した菌類であれば特に限定はされず、例えば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー等の醤油醸造に用いることができる糸状菌類が挙げられる。
【００３４】
形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。糸状菌を用いる場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：９９−１０４，１９８９に記載の方法が利用できる。
【００３５】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
・醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤのｍａｎＲ遺伝子及びｘｌｎＲ遺伝子の推定
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株については、そのドラフトゲノム解析の結果が２０１１年に公開されており(ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１８,  １６５−１７６、２０１１)、本菌のスキャッフォールドの塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＥＮＡ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＦ０９３５５７からＤＦ０９３５８５として登録・公開されている。
【００３７】
本ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列中に、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株にて公開されているｘｌｎＲ遺伝子（ＤＯＧＡＮ遺伝子番号：ＡＯ０９００１２０００２６７、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｃ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／）及びｍａｎＲ遺伝子(ＤＤＢＪ／ＥＮＡ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号:ＡＢ７０１７６４)に相当する遺伝子が存在するか、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５、３３８９？４０２、１９９７）を利用して検索を行った。
【００３８】
その結果、アスペルギルス・ソーヤのゲノムＤＮＡ上には、配列番号１に示すアスペルギルス・ソーヤｍａｎＲ遺伝子（スキャッフォールド１１番、ＤＤＢＪアクセッション番号ＤＦ０９３５６３．１：５９１１７７―５８８６９１）及び、配列番号２に示すアスペルギルス・ソーヤｘｌｎＲ遺伝子（スキャッフォールド４８番、ＤＤＢＪアクセッション番号ＤＦ０９３５７７．１：２１１１４８９−２１１４５２０）が存在していることを確認できた。
【００３９】
また、アスペルギルス・オリゼーにおけるそれぞれの転写制御因子遺伝子のエクソン−イントロン構造を基に、アスペルギルス・ソーヤにおけるｍａｎＲ及びｘｌｎＲ遺伝子のエクソン−イントロン構造の予測を行った。そのデータを基に各遺伝子がコードしているアミノ酸の配列を、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウエアー・バージョン１１（株式会社ジェネティクス製）を用いて推定した。
【００４０】
その結果、配列番号１のｍａｎＲ遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列を、配列番号２のｘｌｎＲ遺伝子は配列番号４に示すアミノ酸配列をそれぞれコードしていることが予想された。なお、アスペルギルス・ソーヤのＭａｎＲ（配列番号３）とアスペルギルス・オリゼーのＭａｎＲ（ＡＢ７０１７６４）の同一性は、９８％であり、８個のアミノ酸の相違が見られた（７６３／７７１）。また、アスペルギルス・ソーヤのＸｌｎＲ（配列番号４）と、アスペルギルス・オリゼーのＸｌｎＲ（ＡＯ０９００１２０００２６７）の同一性は、９７％であり、２７個のアミノ酸の相違が見られた（９２２／９４９）。このことから、ＭａｎＲ及びＸｌｎＲに関しては、アスペルギルス・ソーヤとアスペルギルス・オリゼーで異なった配列のものを有していると考えられる。
【実施例２】
【００４１】
・醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤにおけるｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株の作製
配列番号１番及び配列番号２番に示す遺伝子を、醤油麹菌にて同時に強制発現させた場合に、本菌のセルラーゼ・ヘミセルラーゼ生産能を増強させる効果があるか検証した。
【００４２】
・強制発現株の作製時に使用した培地
アスペルギルス・ソーヤの液体培養用培地としては、デキストリン−ペプトン培地（ポリペプトン  １％、デキストリン  ２％、リン酸二水素カリウム ０．５％、硝酸ナトリウム ０．１％、硫酸マグネシウム  ０.０５％、カザミノ酸  ０．１％、ｐＨ  ６．０）を使用した。
【００４３】
また、本菌を培養する際の最少寒天培地には、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（３．０％  ｇｌｕｃｏｓｅ，０．０５％  ＫＣｌ，０．２  ％  ＮａＮＯ3，０．１％  ＫＨ2ＰＯ4，０．０５％  ＭｇＳＯ4，０．００１％  ＦｅＳＯ4，ｐＨ  ６．０）を用いた。
【００４４】
また、本菌の分生子を形成させる際には、マルツ寒天培地（麦芽エキス８％、硫酸銅  ０．０００２％、四ほう酸ナトリウム０．００００４％、リン酸第二鉄０．０００８７％、硫酸マンガン０．０００９５％、 モリブデン酸ナトリウム  ０．０００８％、硫酸亜鉛  ０．０００８％、寒天１．５％、ｐＨ６．０）を用いた。
【００４５】
栄養要求性株培養する場合には、ウリジン要求性株では終濃度１５ｍＭのウリジンを、アデニン要求性株では終濃度０．０１％のアデニンを使用する培地に添加した。
【００４６】
・醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤの菌体からのゲノムＤＮＡの調製方法
ベクター作製時のＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲの鋳型ＤＮＡなどに使用する麹菌アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡは、下記の手順にて抽出・精製を行った。糸状菌菌体又は分生子を、１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った４０ｍｌのデキストリン−ペプトン培地に植え、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間培養した。培養終了後、ろ過により菌体を回収し、ペーパータオルで挟み、水分を除いた後、液体窒素を用いて急速に凍結させた。
【００４７】
次に、液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に凍結した菌体を入れ、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。この粉砕から、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出したのち、ＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  のＲＮａｓｅ（ニッポンジーン社製）にて検体を処理し、混入していたＲＮＡを分解し以降の実験に用いた。
【００４８】
・醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤの分生子からのゲノムＤＮＡの調製
菌体をマルツ寒天培地にて３０℃、７日間培養し分生子を形成させた。この分生子を、プレート１枚あたり５ｍＬの滅菌済み０．０１％  Ｔｗｅｅｎ溶液に懸濁後して回収した。得られた分生子懸濁液５００  μＬを遠心分離後、沈殿を８００μＬのＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製） に再懸濁したのち、これを直径０．５ｍｍのガラスビーズ（５００μＬ分）を入れたスクリューキャップ付き２．０ｍＬに移し、ビーズショッカー（安井機器社製）により破砕した。破砕液を６５０μＬ分取後、３００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて混合したのち、１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を６５０μＬ分取した。ここに６５０μＬのフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール（ニッポンジーン社製）を加えた後、ボルテックスミキサーにより激しく混合し、１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。水層を６００μＬ分取し、２−ｐｒｏｐａｎｏｌ沈殿により濃縮後、沈殿を５０μＬのＴＥバッファーにより溶解し、これをゲノムＤＮＡとした。
【００４９】
・本実施例２にて用いた宿主株作製とその作製経緯
実施例２に記載するｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株は、アスペルギルス・ソーヤ  ＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ株（ΔｐｙｒＧ，ΔａｄｅＡ、Δｋｕ７０）（アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株誘導体）を宿主として作製した。
【００５０】
なお、アスペルギルス・ソーヤ  ＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ株は、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株（ΔｐｙｒＧ、Δｋｕ７０）（ＮＢＲＣ４２３９株誘導体）（キッコーマン株式会社  真中純子氏より供与）を親株として作製した株である。
【００５１】
アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株（ΔｐｙｒＧ、Δｋｕ７０）は、次の手順を経て得られた株である（図１）。
【００５２】
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を、過塩素酸を含む培地上で培養することにより、ｎｉａＤ遺伝子に自然変異が導入され不活性化された株（アスペルギルス・ソーヤΔｎｉａＤ株）を取得した。このΔｎｉａＤ株のｐｙｒＧ遺伝子座に、変異の導入されていないｎｉａＤ遺伝子を導入することにより、アスペルギルス・ソーヤΔｐｙｒＧ、ｎｉａＤ＋株を作製した。
【００５３】
このΔｐｙｒＧ、ｎｉａＤ＋株のｋｕ７０遺伝子を、ｐｙｒＧ遺伝子により破壊したのち、ｐｙｒＧ遺伝子の除去を行い、Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株であるアスペルギルス・ソーヤＰ６−１−１２株を得た。
【００５４】
次に、このＰ６−１−１２株のｐｙｒＧ遺伝子座に導入されているｎｉａＤ遺伝子を除去しΔｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ、ΔｎｉａＤ株であるＮＤ−ｄｅｌ株を取得した。ＮＤ−ｄｅｌ株に存在する変異型ｎｉａＤ遺伝子を、変異が導入されていないｎｉａＤ遺伝子に置き換え、ｎｉａＤ遺伝子が野生型に復帰した状態の株であるアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株）を得た。
【００５５】
アスペルギルス・ソーヤ  ＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ株（ΔｐｙｒＧ，ΔａｄｅＡ、Δｋｕ７０）は、以下に示す工程を経て作製した株である（図２）。
アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株に、ｐｙｒＧをループアウトにより除去可能な状態で、ａｄｅＡ遺伝子座に導入した。ａｄｅＡ除去用ベクターはＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて調製した。
【００５６】
ＰＣＲ用酵素には、ＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏを、鋳型にはアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来のゲノム（１反応あたり２０ｎｇ）を使用し、全量４０μＬにて反応を実施した。また、使用したプライマーの配列は、表１〜４に示した通りである。１ｓｔ  ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃、２分間の加熱ののち、９８℃ １０秒間、６０℃１０秒間、６８℃ ５分間を３５サイクルとした。
【００５７】
【表１】
2015167475.tif 000003
【００５８】
【表２】
2015167475.tif 000004
【００５９】
【表３】
2015167475.tif 000005
【００６０】
【表４】
2015167475.tif 000006
【００６１】
得られたＰＣＲ産物全量を電気泳動後、ＱＩＡＧＥＮ社のゲル抽出キットを用い精製した。この精製ＤＮＡフラグメントを各２０μＬずつ混合し、そのうち１６μＬをＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ用の鋳型として使用した。Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ実施時のプライマーセットとしては、配列番号５と配列番号１２を使用した。ＰＣＲ用酵素は、１ｓｔ  ＰＣＲと同様にＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏを使用し、全量３２０μＬで反応を行った。Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃、２分間の加熱ののち、９８℃１０秒間、６８℃１０分間を３５サイクルとした。増幅したａｄｅＡ破壊用ベクターを、２−プロパノール沈殿により濃縮し、１０μＬのＴＥバッファーに溶解した。これをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いてアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株に導入した。
【００６２】
なお、本形質転換では、ベクターにｐｙｒＧマーカーがついているため、得られる株は、ｐｙｒＧ＋株となるが、ａｄｅＡが破壊された状態となるため、選択培地には終濃度で０．０１％になるようアデニンを添加した１．２Ｍソルビトール入りのＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いた。得られた形質転換体を、アデニンを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地にて２回植え継いだのちマルツ寒天培地に植え、分生子を形成させた。この分生子を、プレート１枚あたり５ｍＬの滅菌済み０．０１％  Ｔｗｅｅｎ溶液に懸濁後して回収し、ゲノムＤＮＡを抽出・精製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号１２をオリゴヌクレオチドプライマーとして使用したＰＣＲを行い、目的とする領域にベクターが導入されているかを確認した。なお、ネガティブコントロールには、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株を使用した。
【００６３】
その結果、正しくベクターが導入されていた株が４株得られていた。また、これら４株はいずれもアデニン要求性を示す株であった。本形質転換体をアスペルギルス・ソーヤＫＡ−ｄｅｌ（Δｋｕ７０、ΔａｄｅＡ、ｐｙｒＧ＋）と名づけた。
【００６４】
アスペルギルス・ソーヤＫＡ−ｄｅｌをマルツ寒天培地に植え、３０℃で７日間培養したのち、分生子を回収した。この分生子を滅菌済み０．０１％Ｔｗｅｅｎ溶液にて、２．５×１０5／ｍＬになるように希釈した。この希釈液２００μＬを終濃度１．５ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）と１５ｍＭウリジン及び０．０１％アデニンを含む、ツアペックＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地にスプレッダーによりまき、３０℃で４日間した。得られた５−ＦＯＡ耐性株を再度マルツ寒天培地で培養後、分生子よりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドプライマー（いずれも欠失領域の外側に設計したプライマー）を用いたＰＣＲを行うことにより、ｐｙｒＧ遺伝子の脱落を含むループアウト型組み換えが生じているかを確認した。その結果、複数の株において、目的とする組換え体が得られていることがわかった（図３Ａ）。
【００６５】
その中の１株であるＳ２−５Ｒ株について、ゲノムの欠失領域とその周辺領域のＤＮＡ配列の解析をおこなった（図３Ａ）。その結果、本株では当初設計していた通りの組換えが生じていることが確認できた。また、本株の栄養要求性を調べたところアデニン、ウリジン二重栄養要求性株であることが確認された（図３Ｂ）。
【００６６】
この株を、アスペルギルス・ソーヤＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ、ΔａｄｅＡ株）と名づけ、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株作製用の宿主として用いることとした。
【００６７】
【表５】
2015167475.tif 000007
【００６８】
また、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株のｐｙｒＧ遺伝子を野生型と同じものに回復させた株についても作製した。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６に示したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ｐｙｒＧ遺伝子全長を含む６．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを導入しｐｙｒＧ遺伝子を復元した株を作製した。本株のｐｙｒＧ遺伝子の復元をＰＣＲにより確認した結果を図４に示した。
【００６９】
なお、確認時のＰＣＲ用のプライマーには配列番号１５及び配列番号１６を使用した。電気泳動の結果、ｐｙｒＧ遺伝子が復元された宿主株が複数取得できていることが確認された。この形質転換体をアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０株とし、ｍａｎＲ及びｘｌｎＲ強制発現の効果の確認のを行う際のネガティブコントロールとして使用した。
【表６】
2015167475.tif 000008
【００７０】
・ｘｌｎＲ強制発現カセット導入株の作製
ｘｌｎＲ強制発現用ベクターの概要を図５に記した。
今回強制発現させるターゲット遺伝子は転写制御因子であるため、ベクターのコピー数の増加を実施すると、菌体に負荷がかかりすぎ、悪影響を生じることが懸念される。そのため、もともとあったｘｌｎＲのプロモーターをより強力なアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーターに置換し、固体培養時にのみｘｌｎＲが高発現されるようにした。
【００７１】
ｘｌｎＲ強制発現用ベクターはＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて調製した。ＰＣＲ用酵素にはＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏを、鋳型にはアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来のゲノム（１反応あたり２０ｎｇ）を使用し、全量４０ μＬにて反応を実施した。
【００７２】
また、使用したプライマーの配列は、表７〜１０に示した通りである。１ｓｔ  ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃ ２分間の加熱ののち、９８℃ １０秒間、６０℃１０秒間、６８℃ ５分間を３５サイクルとした。
【００７３】
【表７】
2015167475.tif 000009
【００７４】
【表８】
2015167475.tif 000010
【００７５】
【表９】
2015167475.tif 000011
【００７６】
【表１０】
2015167475.tif 000012
【００７７】
得られたＰＣＲ産物全量を電気泳動後、ＱＩＡＧＥＮ社のゲル抽出キットを用い精製した。この精製ＤＮＡフラグメントを各２０ μＬずつ混合し、そのうち１６ μＬをＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ用の鋳型として使用した。Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ実施時のプライマーセットとしては、配列番号１７と配列番号２４を使用した。ＰＣＲ用酵素は、１ｓｔ  ＰＣＲと同様にＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏを使用し、全量４０μＬで反応を行った。Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃ ２分間の加熱ののち、９８℃１０秒間、６８℃１０分間を３５サイクルとした。
【００７８】
Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、強制発現用ベクターは微量にしか得られなかった。そこで、増幅したＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物をゲル抽出により精製後これを鋳型とし、表１１に示したプライマーを使用しｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを実施した。
【００７９】
その結果、対象とする強制発現用ベクターを良好に増幅することができた(反応条件は、反応液量を３２０μＬに増やした以外は、Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲと同じである)。
【００８０】
【表１１】
2015167475.tif 000013
【００８１】
増幅したｘｌｎＲ強制発現用ベクターを、２−プロパノール沈殿により濃縮し、１０μＬのＴＥバッファーに溶解した。これをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いてアスペルギルス・ソーヤＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ株に導入した。なお、本形質転換では、ベクターにａｄｅＡマーカーがついているため、得られる株はａｄｅＡ＋株となるが、ｐｙｒＧについては破壊されたままとなるため、選択培地には終濃度で１５ｍＭになるようウリジンを添加した１．２Ｍソルビトール入りのＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いた。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５と配列番号２６に記したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲを行い、目的とする領域にベクターが導入されているかを確認した。なお、ネガティブコントロールには、宿主であるアスペルギルス・ソーヤＫＰＡ−ｄｅｌ−Ｓ２−５Ｒ株を使用した。ＰＣＲによる形質転換体の確認結果を図６に記した。得られた形質転換体にはベクターが正しく導入されており核も純化された状態であった。この形質転換体をアスペルギルス・ソーヤｘｌｎＲ−ＯＥΔｐｙｒＧ株とした。
【００８２】
・ｘｌｎＲ強制発現株へのｍａｎＲ強制発現用カセットの導入
次に、ｘｌｎＲ−ＯＥΔｐｙｒＧ株を宿主とし、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株を作製した。ｍａｎＲ強制発現用ベクターの構造を図７に記した。ｍａｎＲについてもｘｌｎＲと同様に転写制御因子遺伝子であるため、コピー数の増加を伴う強制発現を行った場合、菌体に悪影響があることが懸念された。そのため、ｍａｎＲ遺伝子のもともとのプロモーターを、トランスレーションエロンゲーションファクターのプロモーターであるプロモーターに置換する方法での遺伝子強制発現を行った。
【００８３】
ｍａｎＲ強制発現用ベクターはｘｌｎＲ強制発現用ベクターと同様に、Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて調製した。ｍａｎＲ強制発現用ベクターの作製に用いたＰＣＲ用プライマーは表１２〜１５に示した通りであり、それ以外の反応条件についてはｘｌｎＲ強制発現用ベクターの構築と同じである。
【００８４】
【表１２】
2015167475.tif 000014
【００８５】
【表１３】
2015167475.tif 000015
【００８６】
【表１４】
2015167475.tif 000016
【００８７】
【表１５】
2015167475.tif 000017
【００８８】
得られたＰＣＲ産物を精製後、２０ μLずつ等量で混合し、そのうち１６μLをＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ用の鋳型として使用した。Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ実施時のプライマーセットとしては、配列番号２７と配列番号３４を使用した。ＰＣＲ用の酵素にはＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏを使用し、全量３２０μLで反応を行った。Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃ ２分間の加熱ののち、９８℃ １０秒間 ６８℃１０分間を３５サイクルとした。
【００８９】
得られたＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、目的とするＰＣＲ産物が良好に得られていた。そこで、これをアルコール沈殿により濃縮したのち、ｘｌｎＲ−ＯＥΔｐｙｒＧ株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ、 ａｄｅＡ＋株)  に導入した。ｍａｎＲ強制発現用ベクターにｐｙｒＧマーカーが搭載されているため、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株は栄養要求性の無い株となる。得られた形質転換体については、アスペルギルス・ソーヤｘｌｎＲ−ＯＥΔｐｙｒＧ株と同様、ＰＣＲ法にて確認した。プライマーとしては、配列番号２７と配列番号３４を用いた。また、得られたｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株については、表１１に記載した配列番号２５と配列番号２６を使用し、ＰＣＲによりｘｌｎＲ強制発現カセットが正しく維持されているかについても確認を行った。
【００９０】
形質転換体の確認の結果を図８に記した。なおネガティブコントロールにはアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を使用した。取得された複数の形質転換体において、ｍａｎＲの強制発現用ベクターカセット及びｘｌｎＲ強制発現ベクターカセットが正しく導入され、核も純化されている状態であることが確認されたできた。この形質転換体をアスペルギルス・ソーヤｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株とした。
【００９１】
・ｍａｎＲを単独で強制発現させたアスペルギルス・ソーヤの作製
ｍａｎＲ単独強制発現株については、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株のゲノムを鋳型とし、ｍａｎＲ強制発現用カセットをＰＣＲにより増幅し、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ）株へ導入することで作製した。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーには、配列番号２７及び配列番号３４を使用し、ＰＣＲ用酵素にはＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏを使用した。
【００９２】
形質転換体の確認を図９に示した。ネガティブコントロールには、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株を使用した。核純化されかつ栄養要求性の無いｍａｎＲ単独強制発現株を複数株得ることができた。このｍａｎＲ単独強制発現株をアスペルギルス・ソーヤｍａｎＲ−ＯＥ株とした。
【００９３】
・栄養要求性の無いｘｌｎＲ単独強制発現株の作製
ｘｌｎＲ−ＯＥΔｐｙｒＧ株は栄養要求性があるため、この株をｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株の比較対照として用いることは適切でないと思われる。そこでｘｌｎＲ―ＯＥΔｐｙｒＧ株のｐｙｒＧ遺伝子を復元させた株を作製した。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６に示したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５及び配列番号１６）を用いたＰＣＲを行い、ｐｙｒＧ遺伝子全長を含む６．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲの温度サイクルの条件は、９４℃ ２分間の加熱ののち、９８℃ １０秒間 ６８℃９分間を３５サイクルとした。得られたＤＮＡフラグメントを２−プロパノール沈殿により濃縮したのち、ｘｌｎＲ―ＯＥΔｐｙｒＧ株に導入し、１．２Ｍソルビトールを含む最少培地で選抜することで形質転換体を得た。本形質転換体をｘｌｎＲ―ＯＥΔｐｙｒＧ株作製時と同様の方法にて確認した。
【００９４】
形質転換体の確認を図１０に示した。ネガティブコントロールには、ｘｌｎＲ―ＯＥΔｐｙｒＧを使用した。核純化されかつ栄養要求性の無いｘｌｎＲ単独強制発現株を複数株得ることができた。このｘｌｎＲ単独強制発現株をアスペルギルス・ソーヤｘｌｎＲ―ＯＥ株とした。
【００９５】
・転写制御因子遺伝子強制発現株の各種糖質分解酵素酵素活性の測定
実施例２において作製した形質転換体において、目的とする転写制御因子が正しく強制発現され、各種糖質分解酵素の生産量の増加が生じているかを検証した。
【００９６】
（１）醤油麹作製と菌体外酵素抽出液の調製
各形質転換体をマルツ寒天培地に接種し、３０℃にて７日間培養し分生子を形成させた。この分生子を、滅菌済み０．０１％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用いて回収し、滅菌済み７０μｍメッシュのセルストレーナー（ＢＤファルコン社製）に通して混入してきた菌糸を除去したのち、血球計算盤を用いて各懸濁液中の分生子数をカウントした。この計測値をもとに各懸濁液の分生子数が５．０ｘ１０7／ｍＬになるよう０．０１％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用いて希釈した。７ｇの原料（脱脂大豆：小麦：水＝１：１：１．３）を１５０ｍＬ容三角フラスコに入れ、オートクレーブにより滅菌した。これに上記希釈済み分生子を２００μＬずつ接種し、３０℃で４０時間培養した。培養が終了した１５０ｍＬ容三角フラスコに、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を２０ｍＬ加えてゴム栓をし、１００回激しく撹拌した。これを４℃にて一晩静置し、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＮｏ．５Ｃのろ紙にてろ過し、ろ液を酵素活性測定に使用した。
【００９７】
（２）各種加水分解酵素活性測定手順
β―マンナナーゼ活性測定
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に２％になるようアゾ−カロブガラクトマンナン（メガザイム）を溶解させた基質溶液１５０μＬに、７５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）及び、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液により適宜希釈した粗酵素溶液７５μＬを加え、４０℃にて３０分間インキュベートした。ここに８００μＬの１００％エタノールを加え１０分間静置後、１，５００ｘｇで１５分間遠心分離したのち、上清のＯＤ５９０ｎｍを測定することによりマンナナーゼ活性を測定した。なおブランクとしては、酵素溶液より前に反応停止用の１００％エタノールを添加したものを使用した。また、各検体のＯＤ５９０ｎｍからブランクのＯＤ５９０ｎｍを差し引いたものをΔＯＤ５９０ｎｍとし、コントロール（ＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０）におけるΔＯＤ５９０ｎｍの平均値を１倍とし、各検体の相対活性を求めた。
【００９８】
キシラナーゼ活性測定
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に０．２５％となるようにＲＢＢキシランを溶解させた基質溶液２５０μＬに、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）により希釈した粗酵素溶液５０μＬを添加し、４０℃にて２０分間インキュベートした。ここに、１，０００μＬの１００％エタノールを添加し、１０分間室温にて静置したのち、１５，０００ｘｇにて１０分間遠心分離を行った。この遠心分離後の上清のＯＤ５９５ｎｍを測定することで、キシラナーゼ活性を求めた。なおブランクとしては、酵素溶液より前に反応停止用の１００％エタノールを添加したものを使用した。また、各検体のＯＤ５９５  ｎｍからブランクのＯＤ５９５ｎｍを差し引いたものをΔＯＤ５９５ｎｍとし、コントロール（ＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０）におけるΔＯＤ５９５ｎｍ平均値を１倍とし、各検体の相対活性を求めた。
【００９９】
エンドグルカナーゼ活性測定（ＣＭＣａｓｅ活性）
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に２．０％となるようにアゾ−カルボキシメチルセルロース（メガザイム社製）を溶解させた基質液１５０μＬに、緩衝液により５倍希釈した粗酵素溶液を１５０μＬ添加し、４０℃にて２０分間インキュベートした。反応液に反応停止液（２％酢酸ナトリウム−０．２％酢酸亜鉛溶液ｐＨ５．０と９９．５％エタノールを１：４で混合したもの）を８００μＬ加えたのち、１，５００ｘｇにて１０分間遠心分離を行った。この上清のＯＤ５９０ｎｍを測定することによりエンドグルカナーゼ活性を測定した。なおブランクとしては、酵素溶液より前に反応停止液を添加したものを使用した。また、各検体のＯＤ５９０ｎｍからブランクのＯＤ５９０ｎｍを差し引いたものをΔＯＤ５９０ｎｍとし、コントロール（ＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０）におけるΔＯＤ５９０ｎｍ平均値を１倍とし、各検体の相対活性を求めた。
【０１００】
セロビオハイドロラーゼ活性測定  （Ａｖｉｃｅｌａｓｅ）
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に６．０％となるようにアゾ−アビセル（メガザイム社製）を均一に分散させた基質液３００μＬに、粗酵素溶液原液を３００μＬ添加し、４０℃にて２４時間、１８０ｒｐｍにて振盪しながらインキュベートした。反応液を９５℃１５分間処理し反応停止後、１，５００ｘｇにて１０分間遠心分離した。この遠心分離後の上清のＯＤ５９０ｎｍを測定することで、セロビオハイドロラーゼ活性を求めた。なおブランクとしては、酵素溶液を添加後直ちに９５℃、１５分間処理したものを使用した。また、各検体のＯＤ５９０ｎｍからブランクのＯＤ５９０ｎｍを差し引いたものをΔＯＤ５９０ｎｍとし、コントロール（ＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０）におけるΔＯＤ５９０ｎｍ平均値を１倍とし、各検体の相対活性を求めた。
【０１０１】
ｐ−ニトロフェニル  （ｐＮＰ）  誘導体基質を用いた活性測定法
（α−ガラクトシダーゼ、及び  β−キシロシダーゼ）
１．２５ｍＭになるように５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した合成基質溶液（各糖質のｐ−ニトロフェニル−誘導体）４００μＬに、緩衝液により適宜希釈した菌体外酵素液を１００μＬ加え、４０℃で１５分間インキュベートした。ここに、５００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加えることで反応を停止したのち、加水分解反応により遊離したｐ−ニトロフェノールの吸収極大である４０５ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ）を測定することで、各種加水分解酵素活性を測定した。また、１．２５  ｍＭ合成基質溶液に０．５Ｍ炭酸ナトリウムを先に添加したのち、希釈済み酵素溶液を加えた系列をブランクとした。酵素反応を行った系列のＯＤ４０５ｎｍ値からブランクのＯＤ４０５を引いた値をΔＯＤ４０５ｎｍとし、コントロール（ＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０）におけるΔＯＤ４０５ｎｍの平均値を１倍として、各検体の相対活性を求めた。
【０１０２】
（３）菌体外酵素活性測定結果
各検体のβ−マンノシダーゼ及びα−ガラクトシダーゼの活性測定結果を図１１に示した。ｍａｎＲ−ＯＥ株では、β−マンナナーゼ及びα−ガラクトシダーゼ活性がコントロール株（ＮＢＲＣ４２３９Δｋｕ７０）と比較し、顕著に上昇していた。これは、ＭａｎＲが醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤでもマンナン加水分解酵素群の正の制御因子として機能していることを示すも結果であった。これは、以前アスペルギルス・オリゼーにおいて観測されていたのと同様の現象である（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ．; ４９、９８７−９９５、２０１２）。また、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株では、β−マンナナーゼについては顕著に増大する傾向が見られ、α−ガラクトシダーゼについても上昇する傾向が見られた。
【０１０３】
ＸｌｎＲにより制御される酵素であるキシラナーゼ及びβ−キシロシダーゼの活性測定を図１２に示した。
【０１０４】
ｘｌｎＲ−ＯＥ株では、キシラナーゼ及びβ−キシロシダーゼ活性の上昇が確認された。ＸｌｎＲについても、アスペルギルス・ソーヤにおいてでも、アスペルギルス・オリゼーのＸｌｎＲと同様に（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｂｉｏｌ．; ３５、１５７−１６９、２００２）、キシラン加水分解酵素群の正の転写制御因子として機能していることがわかった。また、ｍａｎＲ単独強制発現株では、キシラナーゼ活性が若干上昇する傾向が見られ、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株ではｘｌｎＲ−ＯＥ株よりもより高いキシラナーゼ活性を示した。これは、アスペルギルス・ソーヤでは一部のキシラナーゼ遺伝子が、ＭａｎＲによって制御されていることを示唆するものである。また、β−キシロシダーゼ活性については、ｍａｎＲ単独強制発現株では活性の上昇がみられなかった。
【０１０５】
しかし、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株では、ｘｌｎＲ単独強制発現株よりも高い活性が確認された。ＭａｎＲは、単独ではβ−キシロシダーゼの生産を制御することができないが、ＸｌｎＲと共存している状態ではβ−キシロシダーゼを正に制御する可能性が考えられる。本実施例では、ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ−ＯＥ株において、β―マンナナーゼ活性及びキシラナーゼ活性の顕著な上昇が確認されたことから、本形質転換体中ではｍａｎＲ及びｘｌｎＲが正しく強制発現されていると判断した。
【０１０６】
過去のアスペルギルス・オリゼーにおける解析事例では、ＭａｎＲ及びＸｌｎＲはいずれもセルラーゼ遺伝子の発現を制御することが公知となっている（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．；７７、４２６−４２９、２０１３；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２８、２７９−２８２、２００２）。そのため、ｍａｎＲとｘｌｎＲを二重強制発現させたアスペルギルス・ソーヤは高いセルラーゼ生産能を有していることが期待される。ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥのセルラーゼ生産性を評価した（図１３）。
【０１０７】
エンドグルカナーゼ活性については、ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ−ＯＥ株が最も高い活性を示し、コントロール株の５倍以上の活性を有していた。また、セロビオハイドロラーゼ活性については基質であるアビセルが結晶性セルロースであるために、分解がしにくいため活性としてはエンドグルカナーゼよりも弱いものであったが、ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ−ＯＥ株で最も高い活性が見られた。
【０１０８】
以上の通り、アスペルギルス・ソーヤにおけるｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現は、本菌のセルラーゼ生産量を顕著に増加させることが確認できた。これは、本二重強制発現株は、植物由来の多糖類分解に有用であることを示すものである。また、本実施例では、強制発現株の宿主としてアスペルギルス・ソーヤを用いたが、本実施例のデータから考えると２種転写制御因子、ＭａｎＲ及びＸｌｎＲのそれぞれの機能は醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤと麹菌アスペルギルス・オリゼーの間で保存されていると考えられる。
【０１０９】
このことから、これら２菌株ではセルラーゼ及びヘミセルラーゼの生産制御システムについても高度に保存されることが予想される。したがって、ｍａｎＲ及びｘｌｎＲを強制発現させる宿主に、アスペルギルス・オリゼーを用いたとしても、アスペルギルス・ソーヤを宿主とした場合と同様の効果が得られると考えられる。
【実施例３】
【０１１０】
・ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重発現株を用いた醤油原料短期間分解試験
実施例２にて示したとおり、アスペルギルス・ソーヤにおけるｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重強制発現では、本菌のセルラーゼ・ヘミセラーゼの生産能が大幅に向上していることが確認された。そこで、本菌を用いた醤油原料の短期間分解試験を行い、本菌株が醤油製造における原料由来の多糖成分の分解促進に有効であるか検討を行った。
【０１１１】
（１）ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重発現の醤油原料短期間分解試験における諸味粘度への影響
脱脂大豆、小麦及び水を１：１：１．３の割合で混合したのち、１５ｇ秤量し、１５０ｍＬ容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、２．７  ｘ  １０7個のｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株、ｍａｎＲ−ＯＥ株、ｘｌｎＲ−ＯＥ株又はＮＢＲＣ４２３９  Δｋｕ７０株（ネガティブコントロール）の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた（盛込み）。これを３０℃で培養し盛込みから４６時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は３反復で行った。
【０１１２】
出麹サンプルを滅菌した薬匙を用いてよくほぐしたのち、ここにオートクレーブにより滅菌処理を行った２８％食塩水を１５ｍＬ加えよく混ぜて諸味としたのち、品包装用ラップフィルムと輪ゴムを用いて蓋をした。これを３０℃、１８０  ｒｐｍにて振盪しながら３６時間分解を行った。分解反応終了後、サンプルを２５  ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、回転粘度計（ＴＯＫＩＭＥＣ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＢＬＩＩ）により諸味粘度を測定した。
【０１１３】
各検体を用いて作製した醤油麹の出麹時の状態を図１４Ａに示した。いずれの検体も麹菌の菌糸が表面まで生えているのが確認できる状態であり、本試験の条件では大きな生育阻害等は発生していなかった。また、各遺伝子発現株では醤油麹菌の分生子形成が遅れる傾向があり、ｍａｎＲ−ＯＥ株及びｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株ではその傾向が顕著であった。また、短期間分解試験終了時の各検体の諸味の状態を図１４Ｂに示した。
【０１１４】
各転写制御因子強制発現株では、コントロールと比較し諸味の液汁部分が多くなり、諸味の粘度が低下する傾向が見られた。ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ−ＯＥ株も諸味では、その傾向が最も顕著であった。
【０１１５】
各検体の諸味の粘度測定結果を図１５に示した。
【０１１６】
ｍａｎＲ−ＯＥ株及びｘｌｎＲ−ＯＥ株では、コントロールと３連の平均値で比較した場合、若干粘度が低下していることが確認された。しかし、これら２系列では強制発現の効果が顕著に現れるサンプルと効果がほとんど見られないサンプルが混在している状態であった。一方、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株では、コントロールと比較して顕著に諸味の粘度が低下し、実験反復間での差も単独強制発現株と比較して小さくなる傾向が見られた。
【０１１７】
以上のことから、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株を用いた場合、醤油原料由来の多糖成分の分解が安定的に促進され、諸味の粘度を低下させることが可能であると考えられる。
【０１１８】
（２）ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ二重発現の醤油原料短期間分解試験における自然だれによる液汁回収量への影響
脱脂大豆、小麦及び水を１：１：１．３の割合で混合したのち、１５ｇ秤量し、１５０ｍＬ容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、２．７  ｘ  １０7個のｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥ株、ｍａｎＲ−ＯＥ株、ｘｌｎＲ−ＯＥ株又はＮＢＲＣ４２３９  Δｋｕ７０株（ネガティブコントロール）の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた（盛込み）。これを３０℃で培養し盛込みから４６時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は３反復で行った。
【０１１９】
出麹サンプルを滅菌した薬匙を用いてよくほぐしたのち、ここにオートクレーブにより滅菌処理を行った２８％食塩水を１５ｍＬ加えよく混ぜて諸味としたのち、食品包装用ラップフィルムと輪ゴムを用いて蓋をした。これを３０℃、１８０  ｒｐｍにて振盪しながら４８時間分解を行った。この諸味を、漏斗にセットした１１０ｍｍ径のワットマンＮｏ．１のろ紙上に約２４ｇ分取し、その量を天秤にて測定した。そしてろ過により得られた液汁を、あらかじめ重量を測定しておいた１５ｍＬ容ポリプロピレンチューブにより回収し、その全体重量を経時的に測定することで、諸味から自然だれにより回収される液汁（原料分解液）の量を計測した。そしてこの回収される液汁の重量をろ紙上にアプライした諸味重量（g）で割ることで、諸味１ｇあたりから得られる液汁量を求めた。
【０１２０】
原料短期間分解試験にて自然だれにて回収される液汁の量の経時変化を測定した結果を図１６Ａに示した。なお、本グラフは３連の液量測定値の平均をそれぞれプロットした図である。ｍａｎＲ―ＯＥ株及びｘｌｎＲ―ＯＥ株では、回収される液汁の量がコントロール株よりも多なった。また、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ−ＯＥでは、ｍａｎＲ−ＯＥ株及びｘｌｎＲ−ＯＥ株よりもさらに多い液汁が回収された。
【０１２１】
このことから、ｍａｎＲとｘｌｎＲの二重強制発現は、醤油原料の短期間分解において自然だれにより回収される液汁の量に対して、効果があることが確認された。また、回収液汁量が増加しない状態となった、ろ過開始から４時間後における回収液重量を図１６Ｂに示した。この結果によると、諸味粘度と同様に、ｍａｎＲ−ＯＥ株及びｘｌｎＲ−ＯＥ株では、転写制御因子強制発現の効果が顕著に出る検体と、あまり効果の無い検体の両者が観測されるが、ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ−ＯＥ株では、安定的に回収液重量が増加していた。
【０１２２】
本実施例のデータは、高濃度の塩が存在する状況にて、醤油の原料である脱脂大豆及び小麦の分解を直接的に調べたものであり、これにより有効性が確認されたということは、実際の醤油製造工程においても有効である可能性が高いと考えられる。また、本データからすると、食塩存在下で植物由来の材料を短期間で分解し、醤油様調味液を製造する場合にも、ｍａｎＲ―ｘｌｎＲ―ＯＥ株は有用であると考えられる。
【実施例４】
【０１２３】
・アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株系統でのｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現の効果の検証
実施例２から３までに示したデータは、いずれもアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の誘導体にて取得したデータである。アスペルギルス属状菌の場合、同じ属種であっても系列の異なる株で遺伝子強制発現を行っ場合に効果が現れないこともありうる。
そこで、ＮＢＲＣ４２３９株とは異なる系列のである、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株の系統を宿主とした場合でも、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現の効果があるか検証を行った。
【０１２４】
醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤＤＫｕＡＰ−１株（ΔＫｕ７０、ΔａｄｅＡ、ΔｐｙｒＧ株；アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株を親株とする変異株）を宿主とし、ｘｌｎＲ単独強制発現株であるＸＲＯＥ−Ｎ２株及びｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株であるＭＸＯＥ−Ｎ２株を作製した。また、ｍａｎＲ単独強制発現株であるＭＸＯＥ−Ｎ２株については、醤油麹菌アスペルギルス・ソーヤＤＫｕＰ−１株（ΔＫｕ７０、ΔｐｙｒＧ株；アスペルギルス・ソーヤＤｋｕＡＰ−１株のアデニン要求性が無い株）を宿主とし作製した。
【０１２５】
これら形質転換体については、実施例２に記載したアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株系統での、各種強制発現株の作製と同じ手順にて作製を行った。なお、本実施例４にて使用した形質転換体はいずれも、ベクターが正しく導入されかつ核が純化された状態であることを確認したものである（図１７）。
【０１２６】
また、コントロールとしては、宿主株であるアスペルギルス・ソーヤＤＫｕＡＰ−１株のａｄｅＡとｐｙｒＧが破壊されていない株である、アスペルギルス・ソーヤＤＫｕ株（Δｋｕ７０）を利用した。
【０１２７】
・ＭＸＯＥ−Ｎ２株を用いた醤油原料短期間分解試験
上記形質転換体が、醤油原料の分解に有効であるか、短期間分解試験を実施し評価した。脱脂大豆、小麦及び水を１：１：１．３の割合で混合したのち、１５ｇ秤量し、１５０ｍＬ容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、２．７  ｘ  １０7個のＸＲＯＥ−Ｎ２株、ＭＲＯＥ−Ｎ２株、ＭＸＯＥ−Ｎ２株又はアスペルギルス・ソーヤＤｋｕ株（コントロール）の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた（盛込み）。これを３０℃で培養し盛込みから４３時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は３反復で行った。
【０１２８】
出麹サンプルを滅菌した薬匙を用いてよくほぐしたのち、ここにオートクレーブにより滅菌処理を行った２８％食塩水を１５ｍＬ加えよく混ぜて諸味としたのち、食品包装用ラップフィルムと輪ゴムを用いて蓋をした。これを３０℃、１８０ｒｐｍにて振盪しながら６４時間分解を行った。
【０１２９】
・諸味粘度測定
分解反応終了後、サンプルを２５  ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、回転粘度計（ＴＯＫＩＭＥＣ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＢＬＩＩ）  により粘度を測定した。
【０１３０】
・自然だれによる液汁量測定
短期間分解反応終了後の諸味を、漏斗にセットした１１０ｍｍ径のワットマンＮｏ．１のろ紙上に約２５ｇ分取し、その量を天秤にて測定した。ろ過により得られた液汁を、あらかじめ重量を測定しておいた１５ｍＬ容ポリプロピレンチューブにより回収し、その全体重量を経時適に測定することで、諸味から自然だれにより回収される液汁（原料分解液）の量を計測した。この回収される液汁の重量をろ紙上にアプライした諸味重量（g）で割ることで、諸味１ｇあたりから得られる液汁量を求めた。
【０１３１】
・原料短期間分解試験の結果
図１８Ａは、諸味粘度を測定した結果である。ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株であるＭＸＯＥ−Ｎ２株では諸味粘度が他の検体と比較して顕著に低下していた。
【０１３２】
図１８Ｂには短期間分解試験の諸味をろ過して得られる液汁量の経時変化を示したものである。
【０１３３】
なお、グラフは３連で行った分解試験の平均値をプロットしたものである。ＭＸＯＥ−Ｎ２株用いた時の諸味をろ過したときが、最も多い量の液汁を回収することができた。
【０１３４】
以上データから、ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現の効果は、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の系列を宿主とした時にだけに限定されるものでなはく、他のアスペルギルス・ソーヤを宿主として利用した場合にも表れるものであると考えられる。
【実施例５】
【０１３５】
・ＭＸＯＥ−Ｎ２株を用いた醤油小規模試醸造試験
ｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株であるＭＸＯＥ−Ｎ２株を用いて醤油を試醸した際に、諸味粘度の低下と自然だれによる液汁の回収量の増加が見られるか確認を行った。
【０１３６】
・製麹
脱脂大豆と小麦及び水を１：１：１．３の比率で混合した醤油原料５５ｇをフェルンバッハフラスコに入れ、オートクレーブにより滅菌し室温まで冷却した。ここに、４．０  ｘ  １０7／ｍＬに希釈したＸＲＯＥ−Ｎ２株、ＭＲＯＥ−Ｎ２株、ＭＸＯＥ−Ｎ２株及びコントロール株（Ｄｋｕ株）の分生子を２．５  ｍＬずつ接種しよく混合した（盛込み）。これを３０℃で１８時間インキュベート後一手入れを行ってほぐしたのち、３０℃でさらに６時間インキュベートし二手入れを行って再度ほぐした。二手入れ後、温度を２５℃に下げたのち１９時間培養し、盛込みから４３時間経過した時点で出麹とした。
【０１３７】
・仕込み・乳酸発酵・酵母発酵
出麹サンプル４０ｇを滅菌済みの１００ｍＬプラスチックボトルに移し、ここに３５ｍＬの３０％食塩水(ｗ／ｖ)を加えて混合し諸味とした。これに、純粋培養した醤油乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィルス及び醤油酵母ジゴサッカロミセス・ルキシーを添加し、１５℃から３０℃にて９０日間発酵させた。
【０１３８】
発酵試験期間中、最も早くに諸味の粘性が低下した系列はＭＸＯＥ−Ｎ２株の系列であった。９０日間発酵を行った諸味の状態を図１９に示した。
【０１３９】
各遺伝子強制発現株ではコントロールと比較して液汁部分が多くなる傾向がみられ、ＭＸＯＥ−Ｎ２株ではその傾向が最も顕著であった。
【０１４０】
・諸味粘度の測定
９０日間発酵の諸味を２５ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、２５℃にて１時間保温した。この保温済みの諸味の粘度を、回転粘度計（ＴＯＫＩＭＥＣ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＢＬＩＩ）により測定した。
【０１４１】
諸味粘度の測定結果を、図２０に示した。
【０１４２】
なお、本表は３連で行った仕込みサンプルの平均測定値と標準偏差を示したものである。粘度の平均から見ると、各遺伝子強制発現株ではコントロールと比較して諸味粘度が低下する傾向が見られた。なかでもＸＲＯＥ−Ｎ２株とＭＸＯＥ−Ｎ２株では、顕著に諸味粘度が低下する傾向が見られ、最も諸味粘度が低くなったのは二重強制発現株であるＭＸＯＥ−Ｎ２株の系列であった。
【０１４３】
一方、ＭＲＯＥ−Ｎ２株の系列では、系列間での諸味粘度のばらつきが大きい状態であった。以上のことから、ｍａｎＲとｘｌｎＲの二重強制発現は、実際の醤油仕込み条件においても、諸味粘度の低下に効果があることが判った。
【０１４４】
・自然だれによる液汁量測定
発酵試験が終了した醤油諸味を、漏斗にセットした１１０ｍｍ径のワットマンＮｏ．１のろ紙上に約２４ｇ分取し、その量を天秤にて測定した。ろ過により得られた液汁を、あらかじめ重量を測定しておいた１５ｍＬ容ポリプロピレンチューブにより回収し、その全体重量を経時的に測定することで、諸味から自然だれにより回収される液汁（原料分解液）の量を計測した。この回収される液汁の重量をろ紙上にアプライした諸味重量（g）で割ることで、諸味１ｇあたりから得られる液汁量を求めた。
【０１４５】
醤油諸味より自然だれにて回収される液汁の量の経時変化を測定した結果を図２１Ａに示し、ろ過開始から６時間が経過し液量に変化が見られくなった時点の各検体の回収液汁量を図２１Ｂに示した。なお本試験は、３連にて行った発酵試験の検体についてそれぞれ自然だれを測定し、そのデータを集計したものである。その結果、ＸＲＯＥ−Ｎ２株とＭＸ−ＯＥ株では回収される液汁量がコントロールと比較して顕著に増大した。また、ＸＲＯＥ−Ｎ２株では多いものではＭＸＯＥ−Ｎ２株と同レベルの液が回収されるが、少ないものではコントロール株と変わらないレベルのものまで、仕込みロットごとのばらつきが大きくなる傾向が見られた。一方、ＭＸＯＥ−Ｎ２株では仕込みロットごとの差が少なく、安定的に回収液汁量が増加していた。
【０１４６】
このように、ｍａｎＲとｘｌｎＲをアスペルギルス・ソーヤにて二重強制発現させると、乳酸発酵・酵母発酵を行った場合でも、安定的に諸味粘度の低下と自然だれによる回収液汁量の増加が引き起こされることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明のｍａｎＲ−ｘｌｎＲ二重強制発現株を用いた多糖類の分解方法は、ｍａｎＲ及びｘｌｎＲの単独強制発現株を用いた場合と比較しても、多糖類の分解を著しく促進する。特に、このような多糖類の分解方法を醤油の製造方法に適用した場合、諸味粘度が低下し自然だれによる液汁の回収量が増加することが確認された。以上の実施例にて示した結果は、本発明に係る多糖類の分解方法、そして醤油の製造方法が従来の株を用いた方法よりも優れた方法であり、産業上の利用可能性が高いことを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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