(57)【要約】      （修正有）【課題】アワビの効率的生産のための、アワビの成長促進方法であって、アワビｖａｓａ遺伝子マーカー、およびアワビｖａｓａタンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子の提供。【解決手段】新規アワビｖａｓａ遺伝子マーカー、アワビｖａｓａ遺伝子およびタンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子、アワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法並びにアワビの生殖細胞系列の発達抑制方法。また、不稔化アワビの製造方法、加えて、生殖細胞系列検出マーカーとしてのアワビｖａｓａ遺伝子の検出手段。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から選択されるポリヌクレオチドからなる、アワビｖａｓａ遺伝子マーカー：
（ａ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個の塩基の付加がなされた塩基配列からなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
アワビｖａｓａタンパク質の発現をＲＮＡ干渉により抑制しうるＲＮＡ分子であって、該ＲＮＡ分子を構成する塩基配列が、請求項１に記載のポリヌクレオチドおよびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列の相補配列からなるＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含んでなるものである、ＲＮＡ分子。
【請求項３】
ＲＮＡ分子を構成する塩基配列が、配列番号３または４に記載の塩基配列およびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含んでなるものである、請求項２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡである、請求項２または３に記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子を含んでなる、アワビｖａｓａ遺伝子発現抑制剤。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子を、アワビの未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する工程を含んでなる、未受精卵、受精卵または生殖巣の細胞におけるアワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子を、アワビの生殖巣に導入する工程を含んでなる、アワビの生殖細胞系列の発達抑制方法。
【請求項８】
（ａ）ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施した未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、
（ｂ）卵巣にｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施し、該卵巣から摘出または産卵誘発により得た未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、および
（ｃ）受精卵にｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施して、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理受精卵を得る工程のいずれかの工程を含んでなる、不稔化アワビの製造方法。
【請求項９】
ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を請求項２〜４のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子により行う、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ｖａｓａ遺伝子検出用プライマーまたはプローブ。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、アワビｖａｓａ遺伝子マーカーに関し、また、アワビｖａｓａタンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子およびこれを用いたアワビｖａｓａタンパク質の発現抑制方法並びにアワビの生殖細胞系列の発達抑制方法に関する。さらに、本発明は、不稔化アワビの製造方法、加えて、生殖細胞系列検出マーカーに関する。
【０００２】
背景技術
アワビはミミガイ科ハリオティス属（Haliotis）の大型巻貝の総称であり、世界中に約７０種類存在する。日本国内では、クロアワビ（Haliotis discus discus）、エゾアワビ（Haliotis discus hannai）、マダカアワビ（Haliotis madaka）およびメガイアワビ（Haliotis gigantea）の４種が経済的価値の高い漁業上重要なアワビとして種苗生産および養殖の対象となっている。また、オーストラリアでは、ミミガイ（Haliotis asinina）が新たな養殖対象として期待されている。しかし、アワビ、特にエゾアワビは、成長が遅く出荷までにかかる期間が長い。そのため、アワビを効率的に生産するためにアワビの成長を促進する方法が数多く検討されている。
【０００３】
成長を促進する方法としては、例えば、上記４種のアワビの中でも成長が速いメガイアワビと、エゾアワビとを掛け合わせたハイブリッド（雑種）の作出が検討されている（非特許文献１参照）。しかしながら、ハイブリッドは繁殖時期が変化することが多く、従ってハイブリッド種苗を人工種苗として放流すると生態系全体での増殖効率の低下などを引き起こす可能性もある。
【０００４】
別の方法としては、エゾアワビでは、性成熟による成長停滞や消耗を防いで成長を促進するために、三倍体のエゾアワビの作出が行われている。しかしながら、三倍体のエゾアワビは、その後の生存率が通常（二倍体）のアワビに比べて低い（非特許文献２参照）。また、三倍体のアワビは、通常のアワビ同様に配偶子形成が起こり、特に雄では受精可能な正常な精子が形成され、生殖期には通常のアワビ同様に成長率の低下が見られることが確認されている。
【０００５】
近年では、ＲＮＡ干渉技法による生殖細胞系列の発達抑制方法が知られている。特許文献１では、アコヤガイのｐｏｖ遺伝子を標的とするＲＮＡ干渉を利用した生殖細胞系列の発達が抑制されたアコヤガイの製造方法が報告されている。また、非特許文献３では、マガキの生殖細胞を囲む体細胞で発現するＴＧＦβを標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いた生殖腺内の生殖細胞の発達抑制方法が報告されている。しかしながら、アワビ類が属する原始腹足類では、生殖細胞の起源や生殖腺形成機構は未だ明らかになっておらず、生殖細胞の発達抑制を目的としたＲＮＡ干渉を行うための標的とすべき遺伝子は確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２１９４９７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】原素之，動物遺伝育種研究, 2008, 36, 105-115
【非特許文献２】林崎孝志，月刊養殖， 1989, 84-87
【非特許文献３】Arnaud Huvet et. al., Mar Biotechnol (2012) 14:402-410
【発明の概要】
【０００８】
このように、アワビを効率的に生産できるアワビの成長促進方法はこれまで報告されていなかった。
【０００９】
本発明者らは今般、エゾアワビのｃＤＮＡから、ｖａｓａタンパク質をコードする遺伝子マーカーを同定し、生殖細胞系列を検出できるマーカーを開発した。また、アワビｖａｓａ遺伝子のＲＮＡと、その相補的な配列のＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡをエゾアワビの卵巣に接種したところ、生殖巣およびその後得られた未受精卵において高効率でｖａｓａ遺伝子の発現を抑制できることを見出した。さらに、この二本鎖ＲＮＡはエゾアワビだけでなく、クロアワビおよびメガイアワビといった他のアワビ類においても高効率でｖａｓａ遺伝子の発現を抑制できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、新規アワビｖａｓａ遺伝子マーカー、アワビｖａｓａ遺伝子およびタンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子、アワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法並びにアワビの生殖細胞系列の発達抑制方法を提供することをその目的とする。本発明はまた、不稔化アワビの製造方法、加えて、生殖細胞系列検出マーカーとしてのアワビｖａｓａ遺伝子の検出手段を提供することもその目的とする。
【００１１】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）下記から選択されるポリヌクレオチドからなる、アワビｖａｓａ遺伝子マーカー：
（ａ）配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個の塩基の付加がなされた塩基配列からなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）アワビｖａｓａタンパク質の発現をＲＮＡ干渉により抑制しうるＲＮＡ分子であって、該ＲＮＡ分子を構成する塩基配列が、上記（１）に記載のポリヌクレオチドおよびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列の相補配列からなるＲＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含んでなるものである、ＲＮＡ分子。
（３）ＲＮＡ分子を構成する塩基配列が、配列番号３または４に記載の塩基配列およびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含んでなるものである、上記（２）に記載のＲＮＡ分子。
（４）ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡである、上記（２）または（３）に記載のＲＮＡ分子。
（５）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡ分子を含んでなる、アワビｖａｓａ遺伝子発現抑制剤。
（６）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡ分子を、アワビの未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する工程を含んでなる、未受精卵、受精卵または生殖巣の細胞におけるアワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法。
（７）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡ分子を、アワビの生殖巣に導入する工程を含んでなる、アワビの生殖細胞系列の発達抑制方法。
（８）下記：
（ａ）ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施した未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、
（ｂ）卵巣にｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施し、該卵巣から摘出または産卵誘発により得た未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、および
（ｃ）受精卵にｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施して、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理受精卵を得る工程のいずれかの工程を含んでなる、不稔化アワビの製造方法。
（９）ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡ分子により行う、上記（８）に記載の製造方法。
（１０）上記（１）に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ｖａｓａ遺伝子検出用プライマーまたはプローブ。
【００１２】
本発明のＲＮＡ分子を用いることにより、アワビｖａｓａ遺伝子およびタンパク質の発現を抑制でき、それによりアワビの生殖細胞系列の発達を抑制できる。また、本発明のＲＮＡ分子を用いて未受精卵、受精卵または卵巣においてアワビｖａｓａ遺伝子の発現を抑制することで、不稔化アワビを製造することができる。不稔化アワビでは性成熟による成長停滞や消耗を防ぐことができるため、通常のアワビよりも成長を促進することができる。さらに、本発明のアワビｖａｓａ遺伝子マーカーを生殖細胞系列検出マーカーとして用いれば、遺伝子レベルで生殖細胞系列の存在を確認でき、従来肉眼でしか確認できなかった生殖細胞系列を、生殖巣が未成熟の段階、少なくとも５ｍｍ程度の稚貝段階から検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、エゾアワビの成体各組織でのＲＴ−ＰＣＲによるｖａｓａ遺伝子の発現パターンを示す写真である。Ｈｄｈｖａｓａ：awabi-vasa-RNAi1プライマーセットの結果。Ｈｄｈａｃｔｉｎ：awabi-actinプライマーセットの結果。Ｇｉ：鰓、Ｈｅ：心臓、Ｍａ：外套膜、Ｍｕ：貝殻筋、Ｏｖ：生殖巣（卵巣）、Ｔｅ：生殖巣（精巣）、ｕＦｅ：未受精卵、ＲＴ（−）：逆転写酵素なし、ＤＷ：蒸留水のみ。
【図２】図２は、エゾアワビの成体組織（Ａ：成熟卵巣、Ｂ成熟精巣）でのアワビｖａｓａ遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現部位を示す組織切片in situハイブリダイゼーションの結果を表す写真である。下段の写真は、上段の写真の四角領域の拡大図である。図中、赤矢じりは、隣接切片における同一細胞を示す。ＨＥ：ヘマトキシリンエオシン染色。Ａ：ｏｇ：卵原細胞、ｏｃ１〜５：卵母細胞ステージ１〜５、ｔｒ：膠原繊維束、ｊｃ：ゼリー層。Ｂ：ｓｇ：精原細胞、ｓｃ：精母細胞、ｓｚ：精子、ｔｒ：膠原繊維束、下段の写真の挿入図：精原細胞と精母細胞の拡大図。
【図３】図３は、各アワビのｖａｓａ遺伝子の比較表（縮重プライマーセット１の増幅断片）である。
【図４】図４は、各アワビのｖａｓａ遺伝子の比較表（縮重プライマーセット２の増幅断片）である。
【図５】図５は、各アワビのｖａｓａ遺伝子に対応するアミノ酸配列の比較表（縮重プライマーセット１の増幅断片）である。
【図６】図６は、各アワビのｖａｓａ遺伝子に対応するアミノ酸配列の比較表（縮重プライマーセット２の増幅断片）である。
【図７】図７は、エゾアワビの未受精卵からベリジャー幼生までの初期発生段階でのリアルタイムＰＣＲによるアワビｖａｓａ遺伝子発現量比を示す。未受精卵での発現量を１として各発生段階での発現レベルを算出した。
【図８】図８は、エゾアワビ未受精卵、ベリジャー幼生（受精後３日目）、初期稚貝（受精後６０日目）でのアワビｖａｓａ遺伝子の発現部位を示すin situハイブリダイゼーションの結果を表す写真である。図中、矢印はｖａｓａ遺伝子発現細胞を示し、赤矢じりは、隣接切片における同一細胞を示す。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明によれば、アワビｖａｓａ遺伝子に特異的なポリヌクレオチドからなるマーカーが提供される。ｖａｓａ遺伝子は、未受精卵、受精卵および生殖巣（卵巣および精巣）で特異的に発現し、アワビの生殖細胞（卵および精子）系列の発生（分化）、発達に関与する遺伝子である。従って、本発明のマーカーは、アワビの生殖細胞系列検出マーカーとして用いることができる。また、従来、肉眼での生殖巣の有無の確認以外方法がなかったアワビの不稔化状態を、本発明によれば遺伝子レベルで判断できるため、肉眼で不稔化が確認できないサイズのアワビであっても不稔化を判別することができる。すなわち、本発明のアワビｖａｓａ遺伝子マーカーは、アワビの不稔化を確認するためのマーカーとしても用いることができる。
【００１５】
本発明において「アワビ」は、ミミガイ科ハリオティス属に属するものを意味し、例えば、クロアワビ（Haliotis discus discus）、エゾアワビ（Haliotis discus hannai）、マダカアワビ（Haliotis madaka）、メガイアワビ（Haliotis gigantea）、トコブシ（Haliotis diversicolor）、フクトコブシ（Haliotis diversicolor diversicolor Reeve）、ミミガイ（Haliotis asinina）アカアワビ（Haliotis rubra）、ウスヒラアワビ（Haliotis laevigata）、セイヨウトコブシ（Haliotis tuberculata）、ヘリトリアワビ（Haliotis iris）、サザナミトコブシ（Haliotis australis）、ミダノアワビ（Haliotis midae）、アカネアワビ（Haliotis rufescens）、マアナゴ（Haliotis ovina）、イボアナゴ（Sanhaliotis varia）、チリメンアナゴ（Haliotis crebrisculpta）が挙げられる。これらの中でも、アワビは、好ましくは、日本国内で漁業上重要とされているクロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビおよびメガイアワビの４種、オーストラリアで新たな養殖対象として期待されているミミガイであり、より好ましくは、日本国内の各所で種苗生産および養殖されているクロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビおよびメガイアワビである。エゾアワビはクロアワビの北方亜種であるといわれている。しかし、これらの４種は遺伝的には差があることが確認されており（非特許文献１参照）、かつ、生殖時期が異なること（エゾアワビは８〜１０月、クロアワビとメガイアワビは１０〜１２月、マダカアワビは１１月〜１月）や、配偶子が成熟に至るまでの時間（有効積算温度での時間）が異なるため成熟サイズも異なることが知られている。
【００１６】
本発明のアワビｖａｓａ遺伝子マーカーは、クロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビ、メガイアワビの４種に共通の配列をターゲットとしているため、これら全部または一部の雑種に対しても検出マーカーとして用いることができる。
【００１７】
本発明のアワビｖａｓａ遺伝子マーカーは、配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに加えて、アワビｖａｓａ遺伝子を特異的に検出可能な下記（ｂ）および（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドをも含むものである：
（ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、１または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個の塩基の付加がなされた塩基配列からなるポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号３または４に記載の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１８】
前記（ｂ）において、「１または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個の塩基の付加がなされた」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の１〜複数個の数の塩基の置換等により改変がなされたことを意味する。塩基の改変の個数は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個である。
【００１９】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドの改変は、図３または図４においてエゾアワビ、クロアワビ、マダカアワビ、メガイアワビのｃＤＮＡ配列を比較した際の相違数が大きい部位で行われるものが好ましい。このような部位としては、４種のアワビにおいて１以上の種で、好ましくは２以上の種で塩基が相違する部位が挙げられ、このような部位としては、例えば、配列番号３では７０３番目、配列番号４では１７１、１８３または３００番目の塩基が挙げられる。
【００２０】
前記（ｃ）のポリヌクレオチドは配列番号３または４に記載の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列からなるものである。この配列同一性は、好ましくは少なくとも８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは８９％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００２１】
上記配列同一性は、公知の手法によって決定されるものであり、かかる手法としては、例えば、Karlin and AltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873-5877(1993))等が挙げられる。また、このアルゴリズムに基づく、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸを用いることもできる。
【００２２】
前記（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチドは、配列番号３または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと実質的に同等のもの、すなわち、アワビｖａｓａ遺伝子マーカーとして機能しうるものである。すなわち、前記（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチドはアワビｖａｓａ遺伝子（アンチセンス鎖）にストリンジェントな条件でハイブリダイズするものから選択することができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ヌクレオチド以外のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドと標的ヌクレオチドとの二本鎖の融解温度（℃）および溶液の塩濃度等に依存して決定できる。標的配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等）。
【００２３】
ハイブリダイゼーション法は、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、アワビｖａｓａ遺伝子およびｖａｓａ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現をＲＮＡ干渉により抑制しうるＲＮＡ分子が提供される。本発明のＲＮＡ分子を構成する塩基配列が、標的ＲＮＡ、すなわち本発明のｖａｓａ遺伝子およびその一部の塩基配列並びにその塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列の相補配列からなるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることにより、アワビのｖａｓａ遺伝子の発現を顕著に抑制することができる。本発明のＲＮＡ分子としては、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが挙げられ、好ましくは、取り扱いの容易性等の点から二本鎖ＲＮＡである。
【００２５】
「ＲＮＡ干渉」とはＲＮＡｉとも呼ばれ、ＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が引き金となり、そのアンチセンス鎖と相補的な配列を持つｍＲＮＡが切断される機構である。本発明においてＲＮＡ干渉は、転写後の遺伝子発現の抑制として知られる転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）でもよく、遺伝子からｍＲＮＡへの転写そのものを抑制する転写時サイレンシングでもよい。転写後遺伝子サイレンシングは、外から細胞内に導入されたｄｓＲＮＡによって、配列特異的に標的ｍＲＮＡが分解され、結果として標的遺伝子の発現が抑制されるという現象である。具体的には、二本鎖ＲＮＡが細胞内に導入されると、まず、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ等のリボヌクレアーゼにより分解され、ｓｉＲＮＡを生成する。そして、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体を形成することで一本鎖となる。このＲＩＳＣ複合体が標的ＲＮＡを認識して、一本鎖がｍＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの切断や分解を行う。転写時サイレンシングは、遺伝子のプロモーター領域でＤＮＡのメチル化の誘発を介した遺伝子発現抑制システムである。
【００２６】
「二本鎖ＲＮＡ分子」とは、二本の一本鎖ＲＮＡ分子が、全体にわたって、または部分的にハイブリダイズして得られるＲＮＡ分子を意味する。それぞれの一本鎖ＲＮＡを構成するヌクレオチドの数は互いに異なっていてもよい。また、二本鎖ＲＮＡを構成する一方または両方のヌクレオチド鎖は、一本鎖の部分（オーバーハング）を含んでいてもよい。
【００２７】
「相補的」とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、およびシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。
【００２８】
「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のＲＮＡ分子が、ｖａｓａ遺伝子およびその転写産物にハイブリダイズするが、ｖａｓａ遺伝子およびその転写産物以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。本発明のＲＮＡ分子は、前記標的配列に対応する配列を含むものとされるが、前記標的配列に完全に相補的な配列を有する必要はなく、その標的配列に特異的にハイブリダイズしうる限り、相補的でないヌクレオチドを含んでいてもよい。しかしながら、本発明のＲＮＡ分子は、好ましくは前記標的配列に相補的な配列を含んでなるものとされる。
【００２９】
本発明のＲＮＡ分子の配列は、例えば、本発明のアワビｖａｓａ遺伝子（アンチセンス鎖）に対して完全に同一でもよいし、部分的に同一であってもよい。好ましくは、配列番号３または４に記載の塩基配列またはその部分配列である。前記アンチセンス鎖の配列は、例えば、標的ＲＮＡの相補配列に対する同一性（標的ＲＮＡの配列に対する相補性）が、例えば、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００３０】
本発明によるＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡである場合、該二本鎖ＲＮＡ分子を構成するアンチセンス鎖は、センス鎖のヌクレオチドと対合した二本鎖部分の３’末端側に突出部分（オーバーハング）を有していてもよい。この突出部分のヌクレオチド配列は、ｖａｓａ遺伝子に関連する配列または関連しない配列のどちらであってもよく、その長さも特に制限されないが、好ましくは２ヌクレオチド長の配列、より好ましくは２つのウラシル残基（ＵＵ）とされる。センス鎖もまた、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合した二本鎖部分の３’末端側に同様の突出部分を有するものとしてもよい。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれば、前記センス鎖は、その３’末端において突出部分を含まないものとされる。
【００３１】
本発明による二本鎖ＲＮＡ分子における二本鎖部分は、上記標的配列に対応する配列を含んでなるものであればよい。従って、この二本鎖部分は、さらに別の配列を含むことができ、例えば、ｖａｓａ遺伝子ｍＲＮＡにおいて上記標的配列の周辺に位置する配列に対応するヌクレオチド残基を含むことができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれば、前記二本鎖部分は、上記標的配列に対応する配列からなるもの、すなわち、上記標的配列に対応する配列のみを含むものとされる。
【００３２】
前記二本鎖ＲＮＡ分子の長さは、特に制限されないが、例えば、５００〜３０００塩基であり、好ましくは５００〜７００塩基であり、より好ましくは５００〜７００塩基である。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、本発明のＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡを含んでなるアワビｖａｓａ遺伝子発現抑制剤が提供される。本発明のｖａｓａ遺伝子発現抑制剤の対象となるアワビは、好ましくは、クロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビ、メガイアワビ、ミミガイまたはこれらの一部もしくは全部の雑種から選択されるいずれか一種であり、より好ましくは、他のアワビに比べて成長が遅い点で、クロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビ、メガイアワビ、またはこれらの一部もしくは全部の雑種から選択されるいずれか一種、さらに好ましくは、クロアワビ、エゾアワビ、またはこれらの雑種から選択されるいずれか一種、特に好ましくは最も成長が遅い点で、エゾアワビである。
【００３４】
本発明のｖａｓａ遺伝子発現抑制剤は溶媒に懸濁した形態で使用することができる。使用できる溶媒としては、ｖａｓａ遺伝子発現抑制剤の対象への導入方法により適宜調整できるが、例えば、水、海水、塩水、緩衝液が挙げられる。塩水のＮａＣｌ濃度は、特に制限されないが、例えば、約３０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは約３０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記緩衝液は、例えば、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｈｅｐｅｓ等を含んでいてもよい。前記緩衝液の種類は、特に制限されない。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、本発明のＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡを、アワビの未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する工程を含んでなる、未受精卵、受精卵または生殖巣の細胞におけるアワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法が提供される。本発明のｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法の対象となるアワビは、好ましくはクロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビ、メガイアワビ、ミミガイまたはこれらの一部もしくは全部の雑種から選択されるいずれか一種であり、より好ましくは、成長が他のアワビに比べて遅い点で、クロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビ、メガイアワビ、またはこれらの一部もしくは全部の雑種から選択されるいずれか一種であり、さらに好ましくは、クロアワビ、エゾアワビ、またはこれらの雑種から選択されるいずれか一種、特に好ましくは最も成長が遅い点で、エゾアワビである。
【００３６】
本発明において、未受精卵は、卵巣からステージ５の卵母細胞を物理的に摘出したものであってもよく、あるいは自然排卵または通常の人工種苗生産方法で用いられる誘発採卵により得られたものでもよい。ステージ５の卵母細胞は、その大きさを顕微鏡観察することにより判別することができる。本発明に用いる卵巣から摘出された未受精卵は、好ましくは、卵径が２００μｍ〜２５０μｍであり、かつ、卵の形がいびつでない球形のものである。受精卵は、例えば、卵分割した受精卵（例えば、胚）であってもよく、より好ましくは、８細胞期までの受精卵、特に好ましくは未分裂の受精卵（例えば受精後１時間）である。生殖巣は、卵巣または精巣をいう。
【００３７】
本発明においてＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡを、未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する際には、ＲＮＡ分子それ自体を導入してもよいし、これらを発現する発現を導入してもよい。前記発現ベクターとしては、前記ＲＮＡ分子を発現できればよく、その種類は特に制限されず、例えば、ウイルス系ベクターや非ウイルス系ベクターが挙げられる。
【００３８】
本発明において、ＲＮＡ分子をアワビの未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する工程は、未受精卵または受精卵をＲＮＡ分子と接触させることにより、あるいは、生殖巣にＲＮＡ分子を注入または接触することにより行うことができる。ＲＮＡ分子をアワビの未受精卵、受精卵または卵巣に導入する工程を実施することによりｖａｓａ遺伝子の発現が抑制された未受精卵または受精卵を得ることができることから、上記工程を以下、「ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理」ということがある。
【００３９】
本発明において、未受精卵または受精卵へのＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡの接触方法としては、未受精卵または受精卵の取り込み能によりＲＮＡ分子が取り込まれる限り特に制限されないが、例えば、ＲＮＡ分子の溶液への未受精卵または受精卵の浸漬する形態が挙げられる。浸漬時間は適宜調整することができ、好ましくは１０分〜１２時間、より好ましくは３０分〜１０時間、さらに好ましくは１〜６時間である。
【００４０】
本発明において、生殖巣へのＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡの注入方法は、数カ所に分けて注射接種する形態が好ましい。また、生殖巣へのＲＮＡ分子の接触方法は、生殖巣に存在する生殖細胞系列の取り込み能によりＲＮＡ分子が取り込まれる限り特に制限されないが、二本鎖ＲＮＡ分子の溶液へアワビをそのまま浸漬する形態が好ましい。浸漬時間は適宜調整することができる。
【００４１】
導入するＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡの濃度は、ｖａｓａ遺伝子およびｖａｓａ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現抑制効果が得られれば特に制限されないが、導入する個体（サイズにより異なるが、例えば軟体重量８〜１５０ｇ）に対し、好ましくは、少なくとも１μｇ／１００μｌ〜１０００μｇ／１００μｌ、より好ましくは５０μ／１００μｌ〜５００μｇ／１００μｌ、さらに好ましくは７０μ／１００μｌ〜７００μｇ／１００μｌ、特に好ましくは１００μ／１００μｌである。注入量は、導入する個体サイズにより適宜調整できるが、１００〜４００μが好ましい。
【００４２】
ｖａｓａ遺伝子の発現抑制効果は、本発明の生殖細胞系列検出マーカーを用いて例えば後述する実施例２および３に記載のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにより確認した際に、通常の個体と比較してｖａｓａ遺伝子の発現量が少ない場合に、ｖａｓａ遺伝子の発現が抑制していると判断できる。
【００４３】
本発明のアワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法によれば、アワビの生殖巣においてｖａｓａ遺伝子の発現を抑制することができ、生殖巣に存在する生殖細胞系列の発達を抑制することができる。すなわち、本発明の別の態様によれば、本発明のＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡを、アワビの生殖巣に導入する工程を含んでなる、アワビの生殖細胞系列の発達抑制方法が提供される。ここで、生殖細胞系列の発達抑制とは、導入した個体の生殖巣内で、結果的に、成熟生殖細胞の形成が抑制されることを意味する。成熟生殖細胞の形成の抑制は、例えば、生殖細胞系列の発達において、卵原細胞や精原細胞の分裂、一次生殖母細胞への成長および分化、前記一次生殖母細胞の減数第一分裂、二次生殖母細胞からの減数第二分裂等のいずれの工程が抑制されることによって実現されてもよい。生殖細胞系列の発達が抑制されることで、性成熟による成長停滞や消耗を防いで成長を促進することができる。「生殖細胞系列」とは、生殖細胞（卵または精子）、始原生殖細胞、雌性配偶子、雄性配偶子を意味する。
【００４４】
また、本発明の別の態様によれば、本発明のＲＮＡ分子、特に二本鎖ＲＮＡを、アワビの生殖巣に導入する工程を含んでなる、生殖細胞系列の発達が抑制されたアワビの製造方法が提供される。本発明のＲＮＡ分子をアワビの生殖巣に導入した後、該アワビは通常のアワビの種苗生産方法と同様の方法で養殖等することができる。本発明の製造方法で製造された生殖細胞系列の発達が抑制されたアワビでは、性成熟による成長停滞や消耗を防ぐことができ、従って通常のアワビよりも成長を促進することができる。また、本発明の製造方法で製造された生殖細胞系列の発達が抑制されたアワビでは、生殖細胞が形成されないまたは量が少ないため、あるアワビ種が生息する海域に異なる種のアワビ種苗を放流する場合の交雑による雑種繁殖を防ぐことが可能となる。
【００４５】
生殖細胞系列の発達抑制のために導入するＲＮＡ分子は、導入した生殖巣の中で長期的に生産される点でＲＮＡ分子を発現する発現ベクターの形態が好ましい。
【００４６】
本発明のアワビｖａｓａ遺伝子の発現抑制方法によれば、アワビの未受精卵、受精卵または生殖巣においてｖａｓａ遺伝子の発現を抑制することができ、ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理が施された未受精卵および受精卵を用いて種苗生産を行うと不稔化形質を有する不稔化アワビを作出することができる。すなわち、本発明の別の態様によれば、不稔化アワビの製造方法が提供される。
【００４７】
本発明の不稔化アワビの製造方法は、通常のアワビの種苗生産方法においてアワビの未受精卵、受精卵または親貝の卵巣においてｖａｓａ遺伝子の発現を抑制することを特徴とするものである。すなわち、本発明の不稔化アワビの製造方法は、以下のいずれかの工程を含んでなるものである：
（ａ）ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施した未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、
（ｂ）卵巣にｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施し、該卵巣から摘出または産卵誘発により得た未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、および
（ｃ）受精卵にｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理を施して、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理受精卵を得る工程。
【００４８】
工程（ｃ）の受精卵は、工程（ａ）または（ｂ）で得られた受精卵であってもよいし、本発明の処理が施されていない受精卵であってもよい。
【００４９】
本発明において、不稔化アワビとは、例えば、受精卵、幼生、稚貝のいずれであってもよい。不稔化とは、生殖細胞（卵または精子）が形成されないあるいは、通常の個体よりも著しく生殖巣の成長が低いことをいう。不稔化個体かどうかの確認は、成体となったアワビの生殖巣を形態観察により確認するか、あるいは本発明の生殖細胞系列検出マーカーを用いて例えば後述する実施例３に記載のin situハイブリダイゼーション法により確認することができる。
【００５０】
本発明の不稔化アワビの製造方法は、アワビの未受精卵、受精卵または卵巣においてｖａｓａ遺伝子の発現を抑制すること以外は通常のアワビの種苗生産方法と同様の方法で実施することができる。すなわち、前記工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で得られた受精卵を自然海水で飼育することで稚貝を得ることができる。稚貝から成体を得るための技術は確立されており、例えば、稚貝を種苗放流することや、閉鎖系施設で養殖することにより行われる。種苗放流した資源は、出荷サイズに到達すれば、成体を収穫することができる。出荷サイズは、アワビの種類や出荷地域（都道府県）により異なるが、通常エゾアワビでは７〜９ｃｍ以上、クロアワビでは１２ｃｍ以上、メガイアワビでは１０〜１２ｃｍ以上、マダカアワビでは１０〜１２ｃｍ以上とされている。
【００５１】
本発明の製造方法により製造された不稔化アワビでは、発生初期での生殖細胞への分化が抑制されるため、生殖細胞を全く持たないまたは生殖巣の成長が著しく低いアワビとなり、従って性成熟による成長停滞や消耗を防ぐことができる。従って、本発明による不稔化アワビは通常のアワビよりも成長を促進することができる。また、本発明の不稔化アワビの製造方法では、通常の生育期間（エゾアワビでは３〜５年齢、クロアワビでは３〜４年齢、メガイアワビでは３〜４年齢、マダカアワビでは３〜４年齢）でよりサイズの大きい個体を収穫することができるとともに、通常の生育期間よりも短い期間で所望のサイズの成体を収穫することができる。
【００５２】
本発明の製造方法により製造された不稔化アワビは、ｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理が施されたアワビの未受精卵または受精卵あるいはｖａｓａ遺伝子の発現抑制処理が施された生殖巣から得られた未受精卵を用いて繁殖させてなるものであり、アワビの染色体において遺伝子組換え等の人為的な遺伝子操作は行われていない。すなわち、本発明の製造方法により製造された不稔化アワビは、遺伝子組換え技術により作出された変異体ではないことから、消費者に安心感を与える水産資源である点で有利である。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、アワビの生殖細胞系列検出マーカーとしてのプライマーおよびプローブが提供される。
【００５４】
本発明によるプライマーは、本発明によるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、本発明のｖａｓａ遺伝子の全部または一部を、核酸増幅法により増幅することができる。従って、本発明によるプライマーは、生殖細胞系列検出マーカーとして用いることができる。また、本発明によるプライマーは、肉眼で不稔化が確認できないサイズのアワビの不稔化を判別するためマーカーとして用いることができる。
【００５５】
肉眼で不稔化が確認できないサイズのアワビとは、アワビの種類、個体差により異なるが、一般的には、サイズが３ｃｍ以下であって、１年齢以下のアワビが挙げられる。ここで、アワビのサイズは、殻長（殻の長辺）を測定することにより求められる。
【００５６】
本発明によるプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等からなるものを意味するが、好ましくは、ＤＮＡからなるものである。
【００５７】
本発明によるプライマーは、本発明のｖａｓａ遺伝子の全部または一部を核酸増幅法により増幅することができればよい。例えば、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２１個の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。本発明によるプライマーはまた、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の連続する１０〜３０個、１２〜３０個、１５〜３０個、２０〜３０個、または２１〜３０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。
【００５８】
本発明によるプライマーの長さは、少なくとも１０塩基であることができ、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも２０塩基、さらに好ましくは、少なくとも２１塩基である。本発明によるプライマーはまた、１２〜３０塩基、２０〜３０塩基、または２１〜３０塩基である。
【００５９】
本発明によるプライマーは、二種以上の本発明によるプライマーを組み合わせてなるプライマーセットとしても使用することができる。
【００６０】
本発明によるプライマーセットとしては、好ましくは、配列番号２２のポリヌクレオチドと配列番号２３のポリヌクレオチド、配列番号２４のポリヌクレオチドと配列番号２５のポリヌクレオチド、配列番号２６のポリヌクレオチドと配列番号２７のポリヌクレオチドに記載されるものである。
【００６１】
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法（Saiki,R.K.,Bugawan,T.L.,et al.(1986)Nature,324,163-166) 、ＮＡＳＢＡ法（Comptom,J.(1991)Nature,650,91-92）、ＴＭＡ法（Kacian,D.L.,and Fultz,T.J.(1995)US.Patent 5,399,491）、ＳＤＡ法（Walker,G.T.,Little,M.C.,et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Orita,M.,Iwahara,H.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2776-2770 ）等の公知の核酸増幅法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
【００６２】
本発明によるプライマーは、本明細書に開示した塩基配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、常法に従って実施できる。
【００６３】
本発明によるプローブは、本発明によるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、ｖａｓａ遺伝子の発現を検出することができる。従って、本発明によるプローブは、生殖細胞系列検出マーカーとして用いることができる。また、本発明によるプローブは、肉眼で不稔化が確認できないサイズのアワビの不稔化を判別するためマーカーとして用いることができる。
【００６４】
本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等からなるものを意味するが、好ましくは、ＤＮＡからなるものである。
【００６５】
本発明によるプローブとしては、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列にハイブリダイズすることができるものが挙げられる。
【００６６】
本発明によるプローブの長さは、少なくとも１０塩基である。本発明によるプローブの長さは、そのプローブの用途により適宜調整することができ、組織in situハイブリダイゼーション法に用いる場合は、好ましくは１００〜５００塩基である。本発明による組織in situハイブリダイゼーション法に用いるプローブとしては、好ましくは、配列番号２１のポリヌクレオチドに記載されるものである。
【００６７】
本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、in situハイブリダイゼーション等の公知の方法において、常法に従ってプローブとして使用することができる。
【００６８】
本発明によるプローブは、本明細書に開示した塩基配列に基づき、化学合成できる。プローブの調製は周知であり、常法に従って実施できる。
【００６９】
また、本発明のもう一つの態様によれば、本発明の生殖細胞系列検出マーカーを用いた、アワビの不稔化判別方法が提供される。
【実施例】
【００７０】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００７１】
実施例１：アワビｖａｓａ遺伝子の同定
（１）各種アワビのｃＤＮＡの合成
エゾアワビ（岩手県より入手）の卵巣、クロアワビ（千葉県より入手）の未受精卵、マダカアワビ（千葉県より入手）の未受精卵、およびメガイアワビ（千葉県より入手）の卵巣から、ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られたそれぞれの全ＲＮＡ５μｇから、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩＩ(Invitrogen社製)を用いてｃＤＮＡを合成し、各種アワビのｃＤＮＡとした。
【００７２】
（２）アワビｖａｓａの塩基配列の決定
ミミガイ（H. asinina）、アズマニシキガイ（Chlamys farreri）およびマガキ（Crassostrea gigas）の軟体動物種における既知のｖａｓａ遺伝子の塩基配列を比較し、相同性が高くｖａｓａタンパク質をコードする遺伝子が保存されていると期待される領域を選択し、下記表１に記載のとおり２セットの縮重プライマーを設計した。
【００７３】
【表１】
2015186454.tif 000002
【００７４】
設計した２セットの縮重プライマーを用いて上記（１）で得られたエゾアワビｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、エゾアワビのｖａｓａ遺伝子に由来すると予想されるＤＮＡ断片を増幅し、２種類の断片（プライマーセット１の断片：ｖａｓａＲＮＡｉ１（７４８ｂｐ）およびプライマーセット２の断片：ｖａｓａＲＮＡｉ２（５７２ｂｐ））を得た。クロアワビ、マダカアワビおよびメガイアワビのｃＤＮＡも同様にＰＣＲ反応を行いＰＣＲ増幅産物を得た。得られたそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＦａｓｔＧｅｎｅゲル／ＰＣＲ抽出キット(ニッポンジーン社製)で精製し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ＴＡベクター(Invitrogen社製)にクローニングした。目的のインサート遺伝子を持つプラスミドＤＮＡをＦａｓｔＧｅｎｅプラスミドミニキット(ニッポンジーン社製)により精製した。オペロン社にて、これらプラスミドＤＮＡについてシークエンス解析し、各種アワビのｖａｓａ遺伝子の塩基配列を決定した。決定された塩基配列は図３及び４（配列番号３、７、１１、１５及び配列番号４、８、１２、１６）に記載される通りである。また、決定された塩基配列（ｃＤＮＡ配列）から推定されるｖａｓａ遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は図５及び図６（配列番号１、５、９、１３及び配列番号２、６、１０、１４）に記載される通りである。
【００７５】
（３）エゾアワビでのｖａｓａ遺伝子の発現部位の確認
得られたエゾアワビｖａｓａ遺伝子（ｖａｓａＲＮＡｉ１（配列番号３）の塩基配列に基づいて、エゾアワビ成体各組織［４年齢（推定）］（生殖巣（卵巣または精巣）、鰓、心臓、外套膜、貝殻筋）および未受精卵での発現を下記表２のプライマーおよび条件でExTaq (TAKARA社製)を用いてＲＴ−ＰＣＲにより解析した。結果を図１に示す。
【００７６】
【表２】
2015186454.tif 000003
【００７７】
さらに、エゾアワビの成体［４年齢］から取り出した成熟卵巣および成熟精巣でのｖａｓａ遺伝子の発現パターンを組織切片in situハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法により確認した。具体的には、試料を、ブアン固定液中にて４℃で一晩固定後、７０％エタノール／ＤＥＰＣ−ＤＷでの洗浄を２回繰り返した。その後、使用時まで４℃で保存した。エタノールシリーズ・キシレンを通した後、パラフィンブロック内に包埋した。厚さ５μｍで連続隣接切片を作成し、へマトキシリン・エオシン染色と組織切片in situハイブリダイゼーションを行った。
【００７８】
組織切片はキシレン・エタノールシリーズを用いて脱パラフィンした後、ＰＢＳＴにて加水処理し、４％パラホルムアルデヒドによる後固定、１％過酸化水素による内在性アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の失活、プロテアーゼＫ(Wako社製)によるタンパク質分解、そしてアセチル化を行った。ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、５０ｎｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、５０ｎｇ／ｍｌヘパリン、０．０２％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸）中にて６５℃で１時間静置した後、下記表３に記載のプローブ：ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＲＮＡプローブを１ｎｇ／μｌの濃度になるように加えたハイブリダイゼーション緩衝液中で６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＲＮＡプローブは、ＲＮＡポリメラーゼ（Roche社製）を用いて、ＤＩＧ標識プローブの標準方法に従って調製した。
【００７９】
【表３】
2015186454.tif 000004
【００８０】
十分な洗浄を行った後、ＲＮａｓｅＡ(Invitrogen社製)により非特異的に結合しているプローブを除去した。ブロッキング溶液（３％ Ｂｌｏｃｋｉｎ ｒｅａｇｅｎｔ／ＰＢＳＴ(Sigma社製)）によりマスキングを施し、ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体溶液（Roche社製、ブロッキング溶液にて１：１０００希釈）を滴下した。４℃で一晩静置し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色基質を用いて可視化した。エタノールシリーズ・キシレンを通し、エンテランを用いてスライドガラスの封入を行った。顕微観察を行い、画像をデジタル記録した。結果を図２に示す。
【００８１】
図１に示されるように、得られたエゾアワビｖａｓａ遺伝子は、卵巣、精巣および未受精卵では強く発現していることが確認された。また図２に示されるように、得られたエゾアワビｖａｓａ遺伝子に基づいて設計されたアンチセンスプローブは、卵巣、精巣および未受精卵では強く発現していることが確認され、特に卵原細胞と初期の卵母細胞での強い発現が確認された。またｖａｓａ遺伝子は精子では発現していないことが確認された。すなわち、得られたｖａｓａ遺伝子は、生殖細胞系列に特異的に発現していることが確認された。また、未受精卵での発現が検出され、アワビ類でも母性ＲＮＡとして機能していることが示唆された。
【００８２】
（４）各種アワビのｖａｓａ遺伝子の比較
上記（２）で得られた各種アワビのｖａｓａ遺伝子配列およびアミノ酸配列を比較した。結果をｖａｓａ遺伝子配列について図３および４、アミノ酸配列について図５および６に示す。またエゾアワビのｖａｓａ遺伝子を示すｖａｓａＲＮＡｉ１（配列番号３、７４８ｂｐ）およびｖａｓａＲＮＡｉ２（配列番号４、５７２ｂｐ）と、他のアワビ種のｖａｓａ遺伝子の配列、および既知のミミガイのｖａｓａ遺伝子の塩基配列との相違数を下記表４および５に示す。さらにエゾアワビのｖａｓａ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示すｖａｓａＲＮＡｉ１（配列番号１）およびｖａｓａＲＮＡｉ２（配列番号２）と、他のアワビ種のｖａｓａアミノ酸配列、および既知のミミガイのｖａｓａアミノ酸塩基配列との相違数を下記表６および７に示す。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００８３】
実施例２：不稔化アワビの作出
（１）アワビのｖａｓａ遺伝子発現阻害剤（Ａｂａｌｏｎｅ ｖａｓａ  ｄｓＲＮＡ）の合成
上記実施例１（２）で得られたエゾアワビｖａｓａＲＮＡｉ１遺伝子を有するプラスミド（ｖａｓａＲＮＡｉ１プラスミド）を鋳型に用いてＰＣＲ反応を行い、直鎖型プラスミドＤＮＡを作成した。得られた直鎖型プラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ(Invitrogen社製)を用いて一本鎖センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを合成した。合成したセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を等量混合し、１００℃で１分間熱処理した。その後、室温で１０時間静置し二本鎖ＲＮＡのアニーリングを行った。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はアガロースゲル電気泳動により確認後、使用時まで−８０℃で保存した。
【表８】
2015186454.tif 000009
【００８４】
（２）ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理
各種アワビ（エゾアワビ（４年齢）、クロアワビ（１または４年齢）、メガイアワビ（５年齢））は、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理前、海水（１５〜２２℃）で飼育した。上記実施例２（１）で調製した二本鎖ＲＮＡ溶液に注射用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ）を加え所望の濃度になるように調整した。
【００８５】
得られた溶液をツベルクリン用硬質注射筒と２６Ｇ注射針を用いてアワビ成体の生殖巣（卵巣または精巣）内に接種した。接種量は１００μｌであり、２、３カ所に分けて接種を行った。接種後、適宜、卵巣からステージ５の卵母細胞（未受精卵）を摘出するか、あるいは通常のアワビの人工種苗生産方法に従って産卵誘発と人工受精とを行った。具体的には、産卵誘発は、空気中で３０分間干出刺激をした後、８００ｍＷｈ／Ｌ紫外線照射海水(約２０℃)内で３〜５時間ほど放卵・放精するまで放置した(浮永久、菊池省吾（１９８２）水産学シリーズ、41、64-79；浮永久、平成２年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース魚育成シリーズＮｏ．６、１０２頁（１９９０）)。また、人工受精は、得られた未受精卵を、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理を行っていない未処理の各種アワビから同様にして得られた精子と交配し、受精卵を得ることで行った。
【００８６】
得られた未受精卵（卵巣への二本鎖ＲＮＡ接種後約１時間〜３日）を試料として、リアルタイムＰＣＲによりｖａｓａ遺伝子の発現量を確認した。また、卵巣からの卵摘出後または産卵誘発後の成体生殖巣（卵巣または精巣）（二本鎖ＲＮＡ接種後１２時間〜７日）も、そのまま各アワビ種から回収し試料とした。また試料対照区としてアワビの外套膜も試料とした。さらに、対象区としてｖａｓａ遺伝子発現抑制処理を行っていない未処理個体または注射用緩衝液のみを接種した個体からも同様に未受精卵、卵巣または精巣を回収し試料とした。
【００８７】
エゾアワビについては、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理を行っていない通常のアワビの卵巣から摘出した卵（未受精卵）を、３０分、１時間、２時間、上記所望の濃度になるように調整した二本鎖ＲＮＡ溶液を含む溶液に侵漬して得た不稔化処理済未受精卵を得て、試料としてリアルタイムＰＣＲによりｖａｓａ遺伝子の発現量を確認した。
【００８８】
（３）ｖａｓａ遺伝子の発現量の確認
得られたそれぞれの試料は、実施例１（１）同様にＩＳＯＧＥＮを用いて全ＲＮＡを抽出した。未受精卵は５０個を１プールとし、卵巣、精巣は５０mｇを原料として抽出した。外套膜は５０mｇを原料として抽出した。
【００８９】
それぞれの全ＲＮＡ ５００ｎｇを鋳型として、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット(Bio-rad社製)に従いｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ(Bio-rad社製)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。具体的には、下記表９に記載のプライマーおよび条件で、ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）にて行った。プライマーはｖａｓａに対して３セット、ａｃｔｉｎに対して２セット作成した。
【００９０】
【表９】
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【００９１】
ハウスキーピング遺伝子であるアクチン遺伝子により補正を行いΔΔCt法の改法であるＰｆａｆｆｌ法で各種試料でのｖａｓａ遺伝子の発現量の比較を行った。結果を表１０に示す。結果中のプライマーセットは、一番きれいな検量線を示したプライマーセットを示す。なお、阻害率（％）は、二本鎖ＲＮＡを接種した個体でのｖａｓａ遺伝子発現量の対照区と比較した割合を示す。
【００９２】
【表１０】
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【００９３】
結果に示されるように、各種アワビにおいて、二本鎖ＲＮＡ接種後の卵巣、精巣および摘出または産卵誘発により得られた未受精卵において、ｖａｓａ遺伝子発現が抑制されていることが確認された。
（４）不稔化アワビ稚貝の作出
上記（３）のクロアワビの個体Ｎｏ．４〜７の未受精卵に、ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理を行っていない通常の種苗生産方法により得られた各種精子を交配し、人工受精を行い、不稔化処理を行ったエゾアワビおよびクロアワビの受精卵（ｖａｓａ遺伝子発現抑制処理済み）を得た。受精卵を発生させ、５ｍｍ程度の稚貝を得た。
【００９４】
実施例３：不稔化個体判別方法の確立
通常のエゾアワビを従来の人工種苗生産方法に従って、産卵誘発と人工受精を行い、未受精卵（０時間）、受精卵（受精後１時間）、８細胞期（受精後６時間）、桑実胚（受精後９時間）、トロコフォア幼生（受精後１５時間）、ベリンジャー幼生（受精後２４時間）などの未受精卵から幼生までの初期発生過程でのｖａｓａ遺伝子発現量の変化を、下記表１１のプライマーおよび条件で、リアルタイムＰＣＲにより定量的に調べた。結果を図７に示す。
【００９５】
【表１１】
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【００９６】
また、エゾアワビの未受精卵、ベリジャー幼生、５ｍｍ程度稚貝（受精後2ヶ月齢）での組織切片in situハイブリダイゼーションをおこなった。具体的には、試料をダビッドソン固定液／０．１％Ｔｗｅｅｎ中にて４℃で一晩固定後、１００％エタノールでの洗浄を４回繰り返した。その後、７０％エタノール／ＤＥＰＣ−ＤＷに置換し、使用時まで−２０℃で保存した。エタノールシリーズ・キシレンを通した後、パラフィンブロック内に包埋した。厚さ５μｍで連続隣接切片を作成した。へマトキシリン・エオシン染色と組織切片in situハイブリダイゼーションは、上記実施例１（３）に記載の方法に従って行った。結果を図８に示す。
【００９７】
図７および図８に示されるように、また、未受精卵からベリジャー幼生の期間では、発現量が低下するが、初期稚貝以降では生殖細胞系列検出マーカーとして使用できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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