(57)【要約】【課題】カプリル酸を高生産するサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質を提供することを目的とする。【解決手段】サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２８０位がイソロイシンからフェニルアラニンに変異したアミノ酸配列を有するＦＡＳ２タンパク質、または、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２７９位がフェニルアラニンからチロシンに変異したアミノ酸配列を有するＦＡＳ２タンパク質。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプリル酸を高生産するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質であって、前記ＦＡＳ２タンパク質をコードするアミノ酸配列が、以下の（ａ），（ｂ）いずれかに示されるアミノ酸配列であることを特徴とするＦＡＳ２タンパク質。
（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２８０位がイソロイシンからフェニルアラニンに変異したアミノ酸配列。
（ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２７９位がフェニルアラニンからチロシンに変異したアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載のＦＡＳ２タンパク質において、前記１２８０位がイソロイシンからフェニルアラニンに変異したアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異した配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異した配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であり、前記１２７９位がフェニルアラニンからチロシンに変異したアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異した配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異した配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であることを特徴とするＦＡＳ２タンパク質。
【請求項３】
カプリル酸を高生産するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子であって、前記ＦＡＳ２遺伝子をコードする塩基配列が、以下の（ａ），（ｂ）いずれかに示される塩基配列であることを特徴とするＦＡＳ２遺伝子。
（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列における３８３８位がＡからＴに変異した塩基配列。
（ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列における３８３６位がＴからＡに変異した塩基配列。
【請求項４】
請求項３記載のＦＡＳ２遺伝子において、前記３８３８位がＡからＴに変異した塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列における３８３８位のＡがＴに変異した配列番号５に示される塩基配列、又は配列番号４に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列における３８３８位のＡがＴに変異した配列番号５に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列であり、前記３８３６位がＴからＡに変異した塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列における３８３６位のＴがＡに変異した配列番号６に示される塩基配列、又は配列番号４に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列における３８３６位のＴがＡに変異した配列番号６に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列であることを特徴とするＦＡＳ２遺伝子。
【請求項５】
請求項３，４いずれか１項に記載のＦＡＳ２遺伝子において、前記ＦＡＳ２遺伝子は、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子であることを特徴とするＦＡＳ２遺伝子。
【請求項６】
カプリル酸を高生産するカプリル酸高生産性酵母であって、請求項３〜５いずれか１項に記載のＦＡＳ２遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母であることを特徴とするカプリル酸高生産性酵母。
【請求項７】
遊離脂肪酸を高生産する遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法であって、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母を選択培地で培養して、前記ＦＡＳ２遺伝子が存在する染色体上の該ＦＡＳ２遺伝子よりもセントロメア側に存在するアルギナーゼ遺伝子を自然変異により劣性ホモ接合型に変異せしめることを特徴とする遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法。
【請求項８】
請求項７記載の遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法において、前記遊離脂肪酸は、カプリル酸であることを特徴とする遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法。
【請求項９】
請求項７，８いずれか１項に記載の遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法において、前記選択培地は、カナバニン、アルギニン、オルニチンを含む選択培地であることを特徴とする遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法。
【請求項１０】
カプリル酸高生産性酵母を用いて製造した飲食品であって、請求項６記載のカプリル酸高生産性酵母を用いて製造したものであることを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カプリル酸を高生産する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質及びこのＦＡＳ２タンパク質をコードするＦＡＳ２遺伝子に関するものであり、更に、このＦＡＳ２遺伝子を有し、カプリル酸を高生産することができるカプリル酸高生産性酵母、更に、遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法及び前記カプリル酸高生産性酵母を用いて製造された飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
清酒製造において、酵母が生成する香気成分は、香り高い吟醸香を作り出すなど清酒の品質を決定するうえで重要なものとなっている。
【０００３】
この清酒の吟醸香を作り出す香気成分としては、例えば、リンゴ様の香気を発するカプロン酸エチルや果実様の香気を発するカプリル酸エチル等があり、これらの生成量を増加させることによって市場価値の高い清酒の製造が可能になる。
【０００４】
この香気成分であるカプロン酸エチルやカプリル酸エチルの前駆体であるカプロン酸やカプリル酸は、主に発行中の酵母によって生成されるものであるが、一般的には、酒類や食品の製造に用いられる酵母の脂肪酸合成酵素は、これらの生成能が低いため、従来、これらカプロン酸（カプロン酸エチル）やカプリル酸（カプリル酸エチル）を多量に生産する脂肪酸合成酵素に関する研究・開発（例えば特許文献１〜１０）が行われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１８１０７号公報
【特許文献２】特開２０１２−１４７６８０号公報
【特許文献３】特開２０１２−１６３０１号公報
【特許文献４】特開２０１１−１８２７４５号公報
【特許文献５】特開２００８−２２８５８８号公報
【特許文献６】特開２００８−５４５６０号公報
【特許文献７】特開２００２−２５３２１１号公報
【特許文献８】特開２００２−２７９８９号公報
【特許文献９】特開平０９−２９９０７５号公報
【特許文献１０】特開平０８−２３９５４号公報
【特許文献１１】特開平０７−７９７６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記に挙げた特許文献に示されるように、従来はカプロン酸の生産性向上を主としたものが多く、カプリル酸の生産性向上に関するものは非常に少なかった。従って、清酒製造においては、カプロン酸エチルを主とした吟醸香の清酒が多くなり、酒質の画一化が懸念されている。
【０００７】
また、上記特許文献の中にはカプロン酸の生産性向上と共にカプリル酸の生産性も向上するものが提案されているが、カプリル酸の生産量よりもカプロン酸が生産量の方が多く、そのため、カプロン酸エチル特有のリンゴ様の香りが支配的となってしまい、カプリル酸エチルの香りを生かした吟醸香を得ることはできず、上述した問題を解決することはできなかった。
【０００８】
本発明者らは、上述のような現状に鑑み、カプリル酸を主体とする脂肪酸生成を可能とする脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質を見出すべく鋭意研究を行った結果、遂に、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母を用いて、カプロン酸の生産量に比してカプリル酸の生産量が高く、しかも、その生産量は従来の酵母が生産するカプリル酸の生産量に比して極めて高い、従来にないカプリル酸の生産性に優れた脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質を得ることに成功した。
【０００９】
本発明は、カプリル酸を高生産するサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１１】
カプリル酸を高生産するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質であって、前記ＦＡＳ２タンパク質をコードするアミノ酸配列が、以下の（ａ），（ｂ）いずれかに示されるアミノ酸配列であることを特徴とするＦＡＳ２タンパク質に係るものである。                
（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２８０位がイソロイシンからフェニルアラニンに変異したアミノ酸配列。                                
（ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２７９位がフェニルアラニンからチロシンに変異したアミノ酸配列。
【００１２】
また、請求項１記載のＦＡＳ２タンパク質において、前記１２８０位がイソロイシンからフェニルアラニンに変異したアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異した配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異した配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であり、前記１２７９位がフェニルアラニンからチロシンに変異したアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異した配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異した配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であることを特徴とするＦＡＳ２タンパク質に係るものである。
【００１３】
また、カプリル酸を高生産するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子であって、前記ＦＡＳ２遺伝子をコードする塩基配列が、以下の（ａ），（ｂ）いずれかに示される塩基配列であることを特徴とするＦＡＳ２遺伝子に係るものである。                                      
（ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列における３８３８位がＡからＴに変異した塩基配列。                                                                            
（ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列における３８３６位がＴからＡに変異した塩基配列。
【００１４】
また、請求項３記載のＦＡＳ２遺伝子において、前記３８３８位がＡからＴに変異した塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列における３８３８位のＡがＴに変異した配列番号５に示される塩基配列、又は配列番号４に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列における３８３８位のＡがＴに変異した配列番号５に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列であり、前記３８３６位がＴからＡに変異した塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列における３８３６位のＴがＡに変異した配列番号６に示される塩基配列、又は配列番号４に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列における３８３６位のＴがＡに変異した配列番号６に示される塩基配列に対して９０％以上の一致度を有する塩基配列であることを特徴とするＦＡＳ２遺伝子に係るものである。
【００１５】
また、請求項３，４いずれか１項に記載のＦＡＳ２遺伝子において、前記ＦＡＳ２遺伝子は、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子であることを特徴とするＦＡＳ２遺伝子に係るものである。
【００１６】
また、カプリル酸を高生産するカプリル酸高生産性酵母であって、請求項３〜５いずれか１項に記載のＦＡＳ２遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母であることを特徴とするカプリル酸高生産性酵母に係るものである。
【００１７】
また、遊離脂肪酸を高生産する遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法であって、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母を選択培地で培養して、前記ＦＡＳ２遺伝子が存在する染色体上の該ＦＡＳ２遺伝子よりもセントロメア側に存在するアルギナーゼ遺伝子を自然変異により劣性ホモ接合型に変異せしめることを特徴とする遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法に係るものである。
【００１８】
また、請求項７記載の遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法において、前記遊離脂肪酸は、カプリル酸であることを特徴とする遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法に係るものである。
【００１９】
また、請求項７，８いずれか１項に記載の遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法において、前記選択培地は、カナバニン、アルギニン、オルニチンを含む選択培地であることを特徴とする遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法に係るものである。
【００２０】
また、カプリル酸高生産性酵母を用いて製造した飲食品であって、請求項６記載のカプリル酸高生産性酵母を用いて製造したものであることを特徴とする飲食品に係るものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は上述のように構成したから、カプロン酸の生産量に比してカプリル酸の生産量が高く、しかも、その生産量は従来の酵母が生産するカプリル酸の生産量に比して極めて高い、従来にないカプリル酸の生産性に優れたＦＡＳ２タンパク質となる。
【００２２】
従って、例えば本発明のＦＡＳ２タンパク質によって構成される脂肪酸合成酵素を備えた酵母を飲食品製造に用いることによって、抗微生物作用（Desbois, A. P., and Smith, V. J.: Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied microbiology and biotechnology, Vol.85, 1629-1642, 2010）や抗ウイルス作用（Isaacs, C. E., Litov, R. E., & Thormar, H.: Antimicrobial activity of lipids added to human milk, infant formula, and bovine milk. The Journal of nutritional biochemistry, Vol.6, 362-366, 1995）を有するカプリル酸を多量に含み、機能性を有する飲食品を提供することができるようになり、特に清酒製造に用いた場合は、これまでにないカプリル酸エチル特有の果実様の吟醸香を特徴とする新たな清酒造りが可能となり、懸念されている酒質の画一化を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１に係るＧ９株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析図である。
【図２】実施例１に係るＧ９ＯＡ株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析図である。
【図３】実施例１に係るＧ９ＯＡａｒｇ−２株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析図である。
【図４】実施例２に係るＧ９ａｒｇ株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析図である。
【図５】実施例２に係るＧ９ａｒｇＭＦ株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
好適と考える本発明の実施形態を、本発明の作用を示して簡単に説明する。
【００２５】
本発明のＦＡＳ２タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質であって、以下の（ａ），（ｂ）いずれかに示されるアミノ酸配列を有する。                                                      
（ａ）サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２８０位がイソロイシン（Ｉｌｅ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に変異したアミノ酸配列。                                        
（ｂ）サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質のアミノ酸配列における１２７９位がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からチロシン（Ｔｙｒ）に変異したアミノ酸配列。
【００２６】
具体的には、前記（ａ）に示されるアミノ酸配列とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異した配列番号２に示されるアミノ酸配列である。尚、本発明においては、前記（ａ）に示されるアミノ酸配列として、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異した配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列も含まれる。
【００２７】
また、前記（ｂ）に示されるアミノ酸配列とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異した配列番号３に示されるアミノ酸配列である。尚、本発明においては、前記（ｂ）に示されるアミノ酸配列として、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異した配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の一致度を有するアミノ酸配列も含まれる。
【００２８】
本発明は、上述した特定のアミノ酸の変異により、変異していないアミノ酸配列（例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列）を有するＦＡＳ２タンパク質により構成される脂肪酸合成酵素よりも、多量の脂肪酸を生産すると共に、生産する脂肪酸組成において、カプロン酸よりもカプリル酸の生産量が多く、カプリル酸を主成分とする脂肪酸組成を生産する脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質となる。
【００２９】
尚、本発明におけるサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母は、日本醸造協会のきょうかい７号酵母、きょうかい９号酵母、きょうかい１０号酵母、高エステル生成酵母きょうかい１７０１号、高エステル生成酵母きょうかい１８０１号、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母（Ｇ９株及びこのＧ９株の変異株など）の清酒酵母、日本醸造協会ブドウ酒１号酵母、同ブドウ酒３号酵母、同ブドウ酒４号酵母などのブドウ酒酵母、ビール酵母、パン酵母などサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母であれば特に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
本発明の具体的な実施例１について説明する。
【００３１】
本実施例は、遊離脂肪酸、特にカプリル酸を高生産するカプリル酸高生産性酵母に関するものであり、具体的には、カプロン酸よりもカプリル酸の生産性が高く、且つ、当該酵母の野生株が生産するカプリル酸の生産量に比べて極めて多量（約１０倍以上）のカプリル酸を生産するカプリル酸高生産性酵母である。
【００３２】
尚、上記遊離脂肪酸とは、サッカロマイセス・セレビシエが生成する脂肪酸であり、具体的には中鎖脂肪酸である、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）及び長鎖脂肪酸である、ラウリン酸（ドデカン酸）、ミリスチン酸（テトラデカン酸）、パルチミン酸（ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、オレイン酸（cis-９-オクタデセン酸）、リノール酸（cis，cis-９，１２-オクタデカジエン酸）、リノレン酸（cis，cis，cis-９，１２，１５-オクタデカトリエン酸）などである。
【００３３】
本実施例のカプリル酸高生産性酵母について詳述すると、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母であり、また、この酵母において発現する脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
この配列番号２に示されるアミノ酸配列は、きょうかい７号などの清酒酵母において変異が生じていないサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質が有する配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異したものである。
【００３５】
更に説明すると、この配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＦＡＳ２遺伝子は、配列番号５に示される塩基配列を有する。
【００３６】
この配列番号５に示される塩基配列は、野生株等の変異が生じていないサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子が有する配列番号４に示される塩基配列における３８３８位のＡがＴに変異したものである。
【００３７】
また、上述した配列番号５に示される塩基配列を有するＦＡＳ２遺伝子をホモ接合型で有する酵母は、このＦＡＳ２遺伝子をヘテロ接合型で有する酵母に比べ、カプリル酸の生産性が著しく向上する。
【００３８】
即ち、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、配列番号５に示される塩基配列を有するホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有することを特徴とする。
【００３９】
以下、上述した本実施例のカプリル酸高生産性酵母の取得方法について詳述する。
【００４０】
本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母を用い、この酵母の変異により取得した。
【００４１】
具体的には、本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母として、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母Ｇ９株（Sato, K., Kaneoke, M., Aoki, T., Nabekura, Y. and Watanabe, K.: A new medium for distinguishing between sake yeast and wild yeast. J. Brew. Soc. Jpn., 100, 209-213, 2005、以下、Ｇ９株と称す。）を用いた。尚、用いる酵母については、上記Ｇ９株に限らず、例えば日本醸造協会のきょうかい７号酵母、きょうかい９号酵母、きょうかい１０号酵母、高エステル生成酵母きょうかい１７０１号、高エステル生成酵母きょうかい１８０１号等の他の清酒酵母、日本醸造協会ブドウ酒１号酵母、同ブドウ酒３号酵母、同ブドウ酒４号酵母などのブドウ酒酵母、ビール酵母、パン酵母などでも良い。
【００４２】
手順としては、先ず、市川らの方法（特許第２６３２６５４号）を用いて、遊離脂肪酸（特にカプリル酸）の生産性が高い遊離脂肪酸高生産性酵母を取得した。
【００４３】
具体的には、Ｇ９株を、ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍＬに植菌し、３０℃で３日間、静置培養した後、変異処理をせずに直接セルレニン平板ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、０．５μｇ／ｍＬセルレニン（シグマ社製）、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーの中で比較的大きなコロニーを釣菌し、ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬工業社製）を用いたスクリーニング法（栗林ら：特開２０１２−２３１７５１号）を用いて、Ｇ９株から遊離脂肪酸（特にカプリル酸）の生産性が高い酵母を一株選抜・分離し、この単離した遊離脂肪酸高生産性酵母をＧ９ＯＡ株として取得した。
【００４４】
次いで、このＧ９ＯＡ株を用いてアルギナーゼ欠損株を取得した。
【００４５】
本実施例において、アルギナーゼ欠損株の取得は、公知の方法である北本らの方法（特公平６−９７９９３号）を用いた。
【００４６】
具体的には、上記の方法により取得したＧ９ＯＡ株を、ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍＬに植菌し、３０℃で３日間、静置培養した後、変異処理をせずに直接ＣＡＯ平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、２０ｐｐｍカナバニン、１ｍＭアルギニン塩酸塩、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーの中で比較的大きなコロニーを釣菌し、アルギニン平板培地に生育できず、オルニチン平板培地に生育できるものをアルギナーゼ欠損株として選抜し、この選抜したアルギナーゼ欠損株を、再度ＣＡＯ平板培地を用いてシングルコロニー単離を行い、この単離したアルギナーゼ欠損株をＧ９ＯＡａｒｇ株として取得した。尚、本実施例においては、上記方法によりＧ９ＯＡａｒｇ株を１０株取得でき、この１０株のＧ９ＯＡａｒｇ株をＧ９ＯＡａｒｇ−１〜Ｇ９ＯＡａｒｇ−１０とした。
【００４７】
次いで、このＧ９ＯＡａｒｇ−１〜Ｇ９ＯＡａｒｇ−１０のアルギナーゼ欠損株１０株の中から、Ｇ９ＯＡ株よりも遊離脂肪酸の生産性がさらに向上した、遊離脂肪酸高生産性アルギナーゼ欠損株を取得することにより、本実施例のカプリル酸高生産性酵母を取得した。
【００４８】
具体的には、Ｇ９ＯＡ株及びＧ９ＯＡａｒｇ−１〜Ｇ９ＯＡａｒｇ−１０の各酵母株を夫々ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍＬに植菌し、２８℃で２日間、静置培養を行い、この培養後のＹＰＤ液体培地中の遊離脂肪酸濃度をＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬工業社製）を用いて、各遊離脂肪酸濃度を比較した。尚、本実施例における遊離脂肪酸濃度の前記遊離脂肪酸濃度の分析は、前記キット（ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬工業社製））に付属しているマニュアルに従った。
【００４９】
各酵母株を培養したＹＰＤ液体培地中の遊離脂肪酸濃度の比較結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2015228849.tif 000003
【００５１】
この表１に示すように、Ｇ９ＯＡａｒｇ−２株がＧ９ＯＡ株よりも遊離脂肪酸濃度が高かったことから、このＧ９ＯＡａｒｇ−２株をＧ９ＯＡ株よりも遊離脂肪酸の生産性が更に向上した遊離脂肪酸高生産性アルギナーゼ欠損株、即ちカプリル酸高生産性酵母として取得した。
【００５２】
この取得したＧ９ＯＡａｒｇ−２株がカプリル酸高生産性酵母であることを確認するため、本実施例では、Ｇ９株、Ｇ９ＯＡ株、Ｇ９ＯＡａｒｇ−２株の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析と遊離脂肪酸組成の分析を行った。
【００５３】
先ず、ＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析について詳述する。
【００５４】
ＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析においては、先ず、Ｇ９株、Ｇ９ＯＡ株、Ｇ９ＯＡａｒｇ−２株の各酵母をＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍＬに植菌し、３０℃で２日間、静置培養した後、培養液を遠心分離して得られた菌体から、Ｇｅｎとるくん酵母用（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。尚、抽出したゲノムＤＮＡは、３ｎｇ／μｌの濃度になるようにＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl, 1mM EDAT, pH8.0, ニッポンジーン社製）に溶解し、−２０℃で保存した。
【００５５】
次いで、この抽出したゲノムＤＮＡの塩基配列解析を行った。
【００５６】
本実施例では、常法により、ＰＣＲ法を用いて、ＦＡＳ２遺伝子変異部位の増幅を行い、Applied Biosystems 3730xl ジェネティックアナライザ（Applied Biosystems社製）によって塩基配列を決定した。
【００５７】
上記塩基配列解析の結果、Ｇ９株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列は、配列番号４に示される野生型（３８３８位がＡのホモ型）の塩基配列であった（アミノ酸配列においては、配列番号１に示される１２８０位がイソロイシンであるアミノ酸配列であった。）。
【００５８】
また、Ｇ９ＯＡ株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列は、配列番号５に示される３８３８位のＡがＴに変異した塩基配列であった（アミノ酸配列においては、配列番号２に示される１２８０位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異したアミノ酸配列であった。）。
【００５９】
また、このＧ９ＯＡ株のＦＡＳ２遺伝子は、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子であった。
【００６０】
また、Ｇ９ＯＡａｒｇ−２株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列は、上記Ｇ９ＯＡ株同様、配列番号５に示される３８３８位のＡがＴに変異した塩基配列（アミノ酸配列も同様）であったが、このＧ９ＯＡａｒｇ−２株のＦＡＳ２遺伝子は、接合型がヘテロ接合型ではなく、ホモ接合型であった。尚、図１〜３は、上記のＧ９株に対するＧ９ＯＡ株、Ｇ９ＯＡａｒｇ−２株の変異部位の詳細及び接合型を模式的に示したものである。
【００６１】
次いで、遊離脂肪酸組成の分析について詳述する。
【００６２】
遊離脂肪酸組成の分析は、Ｇ９株、Ｇ９ＯＡ株、Ｇ９ＯＡａｒｇ−２株の各酵母株を麹汁培地３００ｍＬ（ボーメ度：6.0、pH 5.5）に植菌し、３０℃で７日間の静置培養を行い、各酵母の培養後の麹汁培地５０ｍＬを０．４５μｍのメンブレンフィルター（アドバンテック東洋社製、DISMIC-25cs Cat. No.25CS04AN）で酵母菌体を除去し、Kuribayashiらの方法（Kuribayashi, T., K., kaneoke, M., Hirata, D. and Watanabe, K.: Analysis of free fatty acids in sake by an enzymatic method and its application for estimating ethyl caproate and selecting yeast with high productivity of the ester. Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 391-394, 2012）によって、酵母培養液中の遊離脂肪酸をヘプタン／ジエチルエーテル抽出し、さらにInertSep NH2 FFカラム（ＧＬサイエンス社製）による固相抽出・精製の後、InertCap FFAP (ＧＬサイエンス社製、１５ｍ×内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ)を装備したガスクロマトグラフＧＣ-１４Ａ（島津製作所社製）を用いて、遊離脂肪酸組成を分析した。
【００６３】
上記方法を用いて各酵母の培養液中の遊離脂肪酸組成を分析した結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】
2015228849.tif 000004
【００６５】
この表２からも分かるように、塩基配列が野生型のＧ９株は、カプロン酸０．９ｍｇ／Ｌ、カプリル酸０．５ｍｇ／Ｌと、各遊離脂肪酸の生成量が低く、また、カプロン酸の生産量に比べてカプリル酸の生産量が低かった。
【００６６】
これに対して、遊離脂肪酸高生産性酵母であるＧ９ＯＡ株は、カプロン酸１．７ｍｇ／Ｌ、カプリル酸２．１ｍｇ／Ｌと、Ｇ９株に比べて遊離脂肪酸の生産量が高く、更に、カプロン酸の生産量に比べてカプリル酸の生産量が高くなっており、詳細には、Ｇ９株に対して、カプロン酸の生産量が約２倍、カプリル酸の生産量が約４倍であった。
【００６７】
更に、カプリル酸高生産性酵母であるＧ９ＯＡａｒｇ−２株においては、カプロン酸２．６ｍｇ／Ｌ、カプリル酸１１．４ｍｇ／Ｌと、更に各遊離脂肪酸の生産量が高くなると共に、カプロン酸の生産量に比べてカプリル酸の生産量が格段に高くなっており、詳細には、Ｇ９株に対して、カプロン酸の生産量が約３培、カプリル酸の生産量にいたっては約２２倍であった。尚、上述したいずれの酵母株も、他の遊離脂肪酸の生成量は定量限界以下であった。
【００６８】
以上より、本実施例のカプリル酸高生産性酵母のＧ９ＯＡａｒｇ−２株は、カプロン酸の生産量に比してカプリル酸の生産量が高く、しかも、その生産量は従来（野生型）の酵母が生産するカプリル酸の生産量に比して極めて高いカプリル酸高生産性酵母であることが確認できた。
【００６９】
このように、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、上述したヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子（野生型からの変異がヘテロ接合型で生じた変異型ＦＡＳ２遺伝子）を有するサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母であるＧ９ＯＡ株を、カナバニン、アルギニン、オルニチンを含む選択培地で培養して、前記ＦＡＳ２遺伝子が存在する染色体上の該ＦＡＳ２遺伝子よりもセントロメア側に存在するアルギナーゼ遺伝子を自然変異により劣性ホモ接合型に変異せしめる本実施例のカプリル酸高生産性酵母の取得方法によって取得することができ、また、本実施例で得られたカプリル酸高生産性酵母は、カプロン酸の生産量に比べてカプリル酸の生産量が飛躍的に高くなると共に、親株に比べて２０倍以上ものカプリル酸を生産する従来にない画期的なカプリル酸高生産性酵母となる。
【００７０】
従って、抗微生物作用や抗ウイルス作用を有するカプリル酸を豊富に含む飲食品の製造が可能となり、飲食品の保存性や飲食品の機能性の向上が図られることにより、優れた飲食品を提供できることとなる。
【００７１】
また、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、アルギナーゼ欠損酵母であるから、尿素を生成しない尿素非生産性酵母となり、酒類製品中の発ガン性物質であるカルバミン酸エチルの生成が抑制されるので、従来の酒類に比べて安全性の高い清酒等の、酵母を用いた飲食品を製造することができることとなる。
【００７２】
尚、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、上述した自然変異によるカプリル酸高生産性酵母の取得方法以外に、例えば遺伝子組み換え技術によって所定の遺伝子を組み換えることで、本実施例のＦＡＳ２タンパク質により構成される脂肪酸合成酵素を備えたカプリル酸高生産性酵母を造成することが可能である。
【００７３】
具体的には、この遺伝子組み換え技術を用いた変異の導入は常法に従い行うことができ、例えば、Methods in Enzymology, Vol.194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(1991 by Academic Press, Inc., p.281-301)や酵母遺伝子実験マニュアル（丸善株式会社、平成１４年１２月１０日発行）の記載に従い行なうことができる。
【００７４】
より具体的には、Aritomiらの方法（Aritomi K. et al., Bioscience. Biotechnology. Biochem., Vol.68, p.206-214, 2004）やpAUR135 DNAを使用したＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性酵母形質転換システム（タカラバイオ(株)）によって、上述の変異を有するＦＡＳ２遺伝子を、酵母に導入し、カプリル酸高生産性酵母を取得することができる。
【００７５】
また、酵母の形質転換方法としては、酢酸リチウム法(Ito H. et al., J. Bacteriol., Vol.153, p.163-168, 1983)、スフェロプラスト法やエレクトロポレーション法などの一般的な各種方法を採用でき、更に、S. cerevisiae Direct Transformation Kit Wako（和光純薬工業(株) ）やDS Yeast Transformation kit（Dualsystems Biotech 社）のような形質転換キットも使用できる。
【００７６】
また、ＰＣＲ産物を利用した形質転換法（例えば、バイオ実験イラストレイテッド第７巻使おう酵母できるTwo Hybrid (秀潤社、2003年10月30日発行)の"２章形質転換の理論と実験法, 5.遺伝子の破壊, 5-1PCRを用いた遺伝子の破壊（置換）法, 5-2置換の確認", p.70-74）やManivasakamらの方法（Manivasakam P. et al., Nucleic Acids Res., Vol.23, p.2799-2800, 1995）を用いることもできる。
【００７７】
以上のように変異処理した酵母の変異状態の確認は、常法である化学分解法（Maxam & Gilbert法）及びチェーンターミネータ法（Sangerジデオキシ法）などによって、この酵母のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析を行って、確認することができる。
【００７８】
また、本実施例では、上述したカプリル酸高生産性酵母の取得方法におけるヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する酵母から、ホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する酵母を容易に取得できることの検証も行ったので、以下に詳細を説明する。尚、この検証においては、前述したカプリル酸高生産性酵母の取得に用いたＧ９株を使用した。
【００７９】
検証手順としては、先ず、市川らの方法（特許第２６３２６５４号）を用いて、カプロン酸エチルの生産性が高いカプロン酸エチル高生産性酵母を取得した。
【００８０】
具体的には、Ｇ９株を、ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍＬに植菌し、３０℃で３日間、静置培養した後、変異処理をせずに直接セルレニン平板ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、０．５μｇ／ｍＬセルレニン（シグマ社製）、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーの中で比較的大きなコロニーを釣菌し、ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬工業社製）を用いたスクリーニング法（栗林ら：特開２０１２−２３１７５１号）を用いて、Ｇ９株からカプロン酸エチルの生産性が高いカプロン酸エチル高生産性酵母を一株選抜・分離し、このＧ９株より単離したカプロン酸エチル高生産性酵母をＧ９ＣＲ株として取得した。
【００８１】
次いで、このＧ９ＣＲ株を用いてアルギナーゼ欠損株を取得した。
【００８２】
このアルギナーゼ欠損株の取得については、本実施例のカプリル酸高生産性酵母の取得方法における、アルギナーゼ欠損株を取得した際の方法と同様の方法を用いて取得した。
【００８３】
本実施例では、上記Ｇ９ＣＲ株から２５株のアルギナーゼ欠損株を取得することができ、この取得したアルギナーゼ欠損株をＧ９ＣＲａｒｇ株とした。
【００８４】
次いで、この取得したアルギナーゼ欠損株の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析を行った。尚、比較の為、Ｇ９株及びＧ９ＣＲ株も一緒に行った。
【００８５】
この塩基配列解析の結果、Ｇ９株の塩基配列は、配列番号１に示される野生型の塩基配列であった。
【００８６】
また、Ｇ９ＣＲ株の塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列における３７４８位のＧがＡに変異した、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有することを確認した。
【００８７】
また、表３に示すように、Ｇ９ＣＲａｒｇ株の塩基配列は、取得した２５株中、１１株が配列番号１に示される塩基配列における３７４８位のＧがＡに変異したホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有し、１１株が野生型へ復帰したもの、即ち、Ｇ９株同様、塩基配列における３７４８位がＧのホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有することを確認した。
【００８８】
また、残りの３株は、配列番号１に示される塩基配列における３７４８位のＧがＡに変異したヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有していた。
【００８９】
【表３】
2015228849.tif 000005
【００９０】
このように、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する酵母を、ＣＡＯ平板培地を用いてアルギナーゼ欠損株（尿素非生産性変異株）を取得することにより、簡便且つ容易にホモ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する酵母を取得することが確認できた。
【実施例２】
【００９１】
本発明の具体的な実施例２について説明する。
【００９２】
本実施例は、実施例１同様のカプリル酸を高生産するカプリル酸高生産性酵母に関するものである。
【００９３】
本実施例のカプリル酸高生産性酵母について詳述すると、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する酵母であり、また、この酵母において発現する脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
【００９４】
この配列番号３に示されるアミノ酸配列は、野生株等の変異が生じていないサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母の脂肪酸合成酵素を構成するＦＡＳ２タンパク質が有する配列番号１に示されるアミノ酸配列における１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異したものである。
【００９５】
更に説明すると、この配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＦＡＳ２遺伝子は、配列番号６に示される塩基配列を有する。
【００９６】
この配列番号６に示される塩基配列は、野生株等の変異が生じていないサッカロマイセス・セレビシエに属する酵母のＦＡＳ２遺伝子が有する配列番号４に示される塩基配列における３８３６位のＴがＡに変異したものであり、具体的には、本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、配列番号６に示される塩基配列を有するヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子を有する。
【００９７】
以下、上述した本実施例のカプリル酸高生産性酵母の取得方法について詳述する。
【００９８】
本実施例のカプリル酸高生産性酵母は、市川らの方法（特許第２６３２６５４号）を用いて取得した。
【００９９】
具体的には、親株として、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母Ｇ９ａｒｇ株（Kuribayashi, T., Tamura, H., Sato, K., Nabekura, Y., Aoki, T., Anzawa, Y., Katsumata, K., Ohdaira, S., Yamashita, S., Kume, K., kaneoke, M., Watanabe, K. and Hirata, D.: Isolation of a non-urea-producing sake yeast strain carrying a discriminable molecular marker. Biosci. Biotechnol. Biochem., 77, 2505-2509, 2013、以下、Ｇ９ａｒｇ株と称す。）を用いた。
【０１００】
より具体的には、上記Ｇ９ａｒｇ株を、ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍＬに植菌し、３０℃で３日間、静置培養した後、変異処理をせずに直接セルレニン平板ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、０．５μｇ／ｍＬセルレニン（シグマ社製）、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーの中で比較的大きなコロニーを釣菌し、ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬工業社製）を用いたスクリーニング法（栗林ら：特開２０１２−２３１７５１号）を用いて、Ｇ９ａｒｇ株から中鎖脂肪酸（特にカプリル酸）の生産性が高い酵母を一株選抜・分離し、この単離した酵母をカプリル酸高生産性酵母としてのＧ９ａｒｇＭＦ株として取得した。
【０１０１】
この取得したＧ９ａｒｇＭＦ株がカプリル酸高生産性酵母であることを確認するため、このＧ９ａｒｇＭＦ株の脂肪酸合成酵素のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析と遊離脂肪酸組成の分析を行った。
【０１０２】
先ず、ＦＡＳ２遺伝子の塩基配列解析について詳述する。
【０１０３】
塩基配列解析の結果、Ｇ９ａｒｇＭＦ株のＦＡＳ２遺伝子の塩基配列は、配列番号６に示される３８３６位のＴがＡに変異した塩基配列であった（アミノ酸配列においては、配列番号３に示される１２７９位のフェニルアラニンがチロシンに変異したアミノ酸配列であった。）。
【０１０４】
また、このＧ９ａｒｇＭＦ株のＦＡＳ２遺伝子は、ヘテロ接合型のＦＡＳ２遺伝子であった。尚、Ｇ９ａｒｇ株に対するＧ９ａｒｇＭＦ株の変異部位について、図４，５に詳細を示す。
【０１０５】
次いで、遊離脂肪酸組成の分析について詳述する。
【０１０６】
本実施例の遊離脂肪酸組成の分析は、実施例１における遊離脂肪酸組成の分析と同様の方法で行った。
【０１０７】
各酵母の培養液中の遊離脂肪酸組成を分析した結果を表４に示す。尚、表４中の比較対象のＧ９株は、実施例１のデータを引用した。
【０１０８】
【表４】
2015228849.tif 000006
【０１０９】
この表４からも分かるように、本実施例のカプリル酸高生産性酵母であるＧ９ａｒｇＭＦ株は、カプロン酸４．９ｍｇ／Ｌ、カプリル酸５．３ｍｇ／Ｌと、各遊離脂肪酸の生産量が野生型のＧ９株よりも高くなると共に、カプロン酸の生産量に比べてカプリル酸の生産量が高くなっており、詳細には、Ｇ９株に対して、カプロン酸の生産量が約５培、カプリル酸の生産量にいたっては約１０倍であった。尚、上述したいずれの酵母株も、他の遊離脂肪酸の生成量は定量限界以下であった。
【０１１０】
以上より、本実施例のカプリル酸高生産性酵母のＧ９ａｒｇＭＦ株は、カプロン酸の生産量に比してカプリル酸の生産量が高く、しかも、その生産量は従来の酵母（野生型の酵母）が生産するカプリル酸の生産量に比して極めて高いカプリル酸高生産性酵母であることが確認できた。
【０１１１】
尚、本発明は、本実施例１，２に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。
【図１】
2015228849.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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