(57)【要約】【課題】単一細胞を単一の状態で培養し、そのクローン細胞を得ることができる細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置を提供すること。【解決手段】内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路の前記コーティング層上に単一細胞を単一に播種する播種工程と、前記播種工程で単一細胞が単一に播種された前記マイクロ流路内に培養液を循環させる循環工程と、を有する細胞培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路の前記コーティング層上に単一細胞を単一に播種する播種工程と、
前記播種工程で単一細胞が単一に播種された前記マイクロ流路内に培養液を循環させる循環工程と、
を有する細胞培養方法。
【請求項２】
前記播種工程において、播種された単一細胞が、ラミニンを含む培地で継代培養されたものである請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記継代培養の回数が２回以上である請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記培養液が、馴化培養液である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記循環工程において、前記播種工程で単一細胞が単一に播種された前記マイクロ流路内を、前記培養液で満たした状態で維持した後、前記培養液の循環を開始する請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記ラミニンが、ヒトラミニンである請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記マイクロ流路内に、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造を有する請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
単一細胞を播種する内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路を含む細胞培養部材。
【請求項９】
前記マイクロ流路内に、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造を有する請求項８に記載の細胞培養部材。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載の細胞培養部材と、
前記細胞培養部材の前記マイクロ流路内に培養液を循環させる循環装置と、
を備える細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一細胞に由来する同一の遺伝情報を有する細胞集団（以下、「クローン細胞」と称する場合がある。）を得るためには、単一細胞を、他の細胞の接触等が阻害された単一に播種した状態で培養することが必要となる。このようなクローン細胞を得る方法は、多能性細胞を産業的に利用する場合において特に求められると予測される。
クローン細胞を得るための細胞培養方法として、例えば、特許文献１には、単一分散された細胞を培養液の層流条件が調整されたマイクロ流路内で培養する方法が開示されている。
また、特許文献２には、単一分散されたヒト多能性幹細胞を、単一細胞の状態で、且つ分化多能性を保持したまま培養する細胞培養方法であって、適用する培養基材の細胞外基質のコーティングが、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントである発明が開示されている。
【０００３】
一方、特許文献３には、多能性幹細胞の分化多能性を維持しつつ、ウイルス混入等の潜在的な危険性を回避することを目的として、ラミニン５を含み、且つ支持細胞又は血清を含まない培地中で培養する培養方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第１３／０５８４０３号公報
【特許文献２】国際公開第１１／０４３４０５号公報
【特許文献３】国際公開第０９／１２３３４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、特許文献１、２では、培養によって、クローン細胞が得られていることが記載されている。
上記特許文献１の技術は、培地を層流条件で送液することにより、単一分散培養によるクローン化が可能であるという知見に基づくものである。
一方、上記特許文献２の技術は、底面積が小さいｗｅｌｌに単一分散した細胞を１×１０３個〜５×１０４個も播種していることから、播種後に細胞同士の接着が起こり、２以上の細胞となった状態のもののみが増殖している可能性がある。
【０００６】
なお、単一細胞の培養方法として、細胞間の接着を切断することによるアポトーシスを阻害するアポトーシス阻害剤（Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）という薬剤を用いた方法も考えられるが、薬剤等の添加は細胞品質への悪影響が懸念されるため、好ましくない。
【０００７】
本発明は、単一細胞を単一の状態で培養し、そのクローン細胞を得ることができる細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］  内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路の前記コーティング層上に単一細胞を単一に播種する播種工程と、前記播種工程で単一細胞が単一に播種された前記マイクロ流路内に培養液を循環させる循環工程と、を有する細胞培養方法。
【０００９】
［２］  前記播種工程において、播種された単一細胞が、ラミニンを含む培地で継代培養されたものである［１］に記載の細胞培養方法。
【００１０】
［３］  前記継代培養の回数が２回以上である［２］に記載の細胞培養方法。
【００１１】
［４］  前記培養液が、馴化培養液である［１］〜［３］のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
【００１２】
［５］  前記循環工程において、前記播種工程で単一細胞が単一に播種された前記マイクロ流路内を、前記培養液で満たした状態で維持した後、前記培養液の循環を開始する［１］〜［４］のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
【００１３】
［６］  前記ラミニンが、ヒトラミニンである［１］〜［５］のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
【００１４】
［７］  前記マイクロ流路内に、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造を有する［１］〜［６］のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
【００１５】
［８］  単一細胞を播種する内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路を含む細胞培養部材。
【００１６】
［９］  前記マイクロ流路内に、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造を有する［８］に記載の細胞培養部材。
【００１７】
［１０］  ［８］又は［９］に記載の細胞培養部材と、前記細胞培養部材の前記マイクロ流路内に培養液を循環させる循環装置と、を備える細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、単一細胞を単一の状態で培養し、そのクローン細胞を得ることができる細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の細胞培養装置の全体構成の一例を示す平面図である。
【図２】本発明の細胞培養部材の一例を示す分解斜面図である。
【図３】本発明の細胞培養部材の一例を示す断面図である。
【図４】本発明のその他の細胞培養部材の一例を示す断面図である。
【図５】本発明のその他の細胞培養部材の一例を示す断面図である。
【図６】本発明の細胞培養方法の一例により培養した細胞を、位相差顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
【図７Ａ】マイクロ流路内での培養から１４日目のＴＩＧ１−ｉＰＳＣを観察した結果を示す図である。
【図７Ｂ】図７ＡのＴＩＧ１−ｉＰＳＣを取出してマトリゲルをコートしたプレート上で馴化培養を行ったＴＩＧ１−ｉＰＳＣを観察した結果を示す図である。
【図７Ｃ】図７ＢのＴＩＧ１−ｉＰＳＣを取出して、さらに１回目の継代培養を行ったＴＩＧ１−ｉＰＳＣを観察した結果を示す図である。
【図８】本発明の細胞培養方法の一例により培養した細胞が多能性を維持していることを、免疫染色法により確認にした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[細胞培養方法]
本発明の１つの態様は、単一細胞を播種する内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路の前記コーティング層上に単一細胞を単一に播種する播種工程と、前記播種工程で単一細胞が単一に播種された前記マイクロ流路内に培養液を循環させる循環工程と、を有する細胞培養方法である。
本発明の細胞培養方法によれば、播種工程と循環工程とを経ることにより、単一細胞を単一の状態で培養し、そのクローン細胞を得ることができる。
以下、各工程について述べる。
【００２１】
（播種工程）
播種工程においては、内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路のコーティング層上に、単一細胞を単一に播種する。
ここで、「単一細胞」とは、他の細胞と接触していない細胞であり、具体的には、カドヘリン等の細胞外マトリックスを介して２個以上の細胞が接合されていない、単離された細胞を示す。
また、「単一の状態に単一細胞を播種する」または「単一細胞を単一に播種する」とは、単一細胞を、他の細胞と接触しておらず、且つ他の細胞と接触し難い状態で播種することを示す。
【００２２】
単一の状態に単一細胞を播種する方法としては、例えば、コーティング層を有するマイクロ流路（以下、単に「マイクロ流路」と称する場合がある。）に、単一細胞を分散した単一細胞分散液を注入して流す方法が挙げられる。
【００２３】
具体的には、（１）単一細胞の濃度が薄い単一細胞分散液を、マイクロ流路に注入する方法、（２）単一細胞の濃度が薄い単一細胞分散液を、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造を有するマイクロ流路内に注入する方法、が挙げられる。
隔離構造の詳細については、細胞培養部材の項において説明する。
【００２４】
単一の状態に播種する単一細胞同士の間隔は、単一の状態に播種する観点から、１ｍｍ以上の間隔であることが好ましく、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下の間隔であることがより好ましい。
【００２５】
単一細胞分散液は、単一細胞と、溶媒と、その他の添加剤と、を含む。
溶媒としては、例えば、培養液が挙げられる。但し、培養液は、後述する循環工程において循環させる培養液と同じものが好ましい。
【００２６】
単一細胞分散液中の細胞の濃度は、単一の状態に単一細胞を播種する観点から、薄い方が好ましい。
具体的には、単一細胞分散液中の細胞の濃度は、例えば、２．５×１０２細胞／ｍｌ以上１．０×１０４細胞／ｍｌ以下が好ましく、５．０×１０２細胞／ｍｌ以上５．０×１０３細胞／ｍｌ以下がより好ましく、５．０×１０２細胞／ｍｌが特に好ましい。
播種する単一細胞同士の間隔は、単一細胞分散液の細胞濃度により調整できる。
【００２７】
単一細胞分散液の調製方法、つまり、単一細胞を得る方法としては、例えば、カドヘリン等により接合している２個以上の細胞群から１個の細胞を単離する方法として公知の方法が挙げられ、例えば、力学的な方法、薬剤を用いて得る方法が挙げられる。
薬剤としては、プロテアーゼ活性を有する酵素又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する試薬が挙げられ、試薬として具体的には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標、Ｂｉｏｎｅｅｒ社製）、及びＡｃｃｕｍａｘ（登録商標、Ｂｉｏｎｅｅｒ社製）が挙げられるが、これらに限定されない。
なお、本発明の細胞培養方法で培養する細胞については後述する。
【００２８】
単一細胞を単一に播種するコーティング層には、ラミニンが含まれている。
ラミニンは、基底膜の主要構成成分である公知の糖タンパク質であり、ラミニンとして同定されているものであれば用いることができる。また、ラミニンは、必ずしも精製されている必要はなく、ラミニンを主要構成成分として含有する基底膜抽出物等を用いてもよい。
また、ラミニンは、例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来等のいずれを用いてもよいが、これらの中でもヒト由来のヒトラミニンが好ましい。
ヒトラミニンとしては、ヒトラミニン５２１、ヒトラミニン５１１、ヒトラミニン５２２、ヒトラミニン５２３が挙げられ、これらの中でもヒトラミニン５２１、ヒトラミニン５１１が好ましく、ヒトラミニン５２１が特に好ましい。
コーティング層の詳細については、後述する。
【００２９】
単一状態に播種する単一細胞は、ラミニンを含む培地で継代培養されたものから得られる細胞であることが好ましい。
つまり、単一状態に播種する単一細胞は、ラミニンを含む培地で培養された細胞群に対して、上述の単一細胞分散液を調製する方法により分離された単一細胞であることが好ましい。
ラミニンとしては、例えば、単一細胞を単一に播種するコーティング層に含まれるラミニンと同じ種類のラミニンが挙げられる。
なお、継代培養用の培地に含まれるラミニンと、マイクロ流路のコーティング層のラミニンとは、同じ種類であることが好ましい。
【００３０】
継代培養に用いるラミニンを含む培地としては、例えば、少なくとも表面にラミニン分子が存在する固相上の培地が挙げられ、具体的には例えば、ラミニンをコートしたプレートが挙げられる。ラミニンをコートしたプレートは、動物細胞培養用のプレートとして市販されているので、本発明の方法においてはこれらの市販のラミニンコートプレートを好ましく用いることができる。
【００３１】
ラミニンを含む培地での継代培養の回数は、多い程好ましいが、２回以上であることが特に好ましい。
つまり、単一状態に播種する単一細胞は、ラミニンを含む培地で少なくとも２回以上連続して継代培養された細胞群に対して、上述の単一細胞分散液を調製する方法により分離された単一細胞であることが好ましい。
【００３２】
本発明の細胞培養方法で培養する細胞は、主に多能性細胞であるが、これに限らず、他の細胞であってもよい。
ここで、本発明において使用される「多能性細胞」は、複数の種類の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。例えば、多能性細胞は、（Ａ）胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、（Ｂ）精子幹細胞（ＧＳ細胞）、（Ｃ）胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、（Ｄ）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞、および（Ｆ）培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｍｕｓｅ細胞）を含むが、これらに限定されない。多能性細胞は、種々の生物に由来するものであってよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳類動物由来の多能性細胞であり、より好ましくは、マウス由来の多能性細胞や霊長類由来の多能性細胞である。特に好ましくは、ヒト由来の多能性細胞である。
以下、（Ａ）〜（Ｆ）の細胞について説明する。
【００３３】
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され  （Ｍ．Ｊ．  Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．  Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された  （Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；  Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６），  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，  ５５：２５４−２５９；  Ｊ．Ａ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓ．  Ｍａｒｓｈａｌｌ  （１９９８），  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ３８：１３３−１６５）。
【００３４】
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  （ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＵＳＰ５，８４３，７８０；  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９２：７８４４−７８４８；  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２８２：１１４５−１１４７；  Ｈ．  Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３４５：９２６−９３２；  Ｍ．  Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３：９５５４−９５５９；  Ｈ．  Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１），  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．，  ２２２：２７３−２７９；Ｈ．  Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９：１５８０−１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４４４：４８１−４８５などに記載されている。
【００３５】
ＥＳ細胞作製のための培養液として、例えば０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、２０％  ＫＳＲ（Ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｒａｓ）および４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ−１２培養液を使用し、３７℃、２％  ＣＯ２／９８％  空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｏ．  Ｆｕｍｉｔａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６：２１５−２２４）。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２０％  ＫＳＲを含有するＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）中の０．２５％  トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
【００３６】
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６：４４３−４５２）。
【００３７】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２およびＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００３８】
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．  Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６９：６１２−６１６；  Ｋ．  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｃｅｌｌ，  １１９：１００１−１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  （ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
【００３９】
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ．  Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  Ｃｅｌｌ，  ７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．  Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５９：５５０−５５１）。
【００４０】
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｙａｍａｎａｋａ  （２００６）  Ｃｅｌｌ，  １２６：６６３−６７６；  Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｃｅｌｌ，  １３１：８６１−８７２；  Ｊ．  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８：１９１７−１９２０；  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｍ．ら，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：１０１−１０６  （２００８）；国際公開ＷＯ  ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ  ２０１０／１１１４０９、ＷＯ  ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６：  ７９５−７９７、Ｓｈｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ２：  ５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８��，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３，  ５６８−５７４、Ｚｈａｏ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ  Ａ，  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３，  １３２−１３５、Ｆｅｎｇ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．  Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ  ＪＢ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ  ＪＫ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ６：１６７−７４、Ｈａｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４６３：１０９６−１００、ＭａｌｉＰ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
【００４１】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸  （ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ  １２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１  （ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４  等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｇｏｎｉｓｔ  （例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ  Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
【００４２】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，  １２６，  ｐｐ．６６３−６７６，  ２００６；  Ｃｅｌｌ，  １３１，  ｐｐ．８６１−８７２，  ２００７；  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８，  ｐｐ．１９１７−１９２０，  ２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２，  ９４５−９４９，  ２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＷＯ  ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２：９４９−９５３，  ２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
【００４３】
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ  （ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ  Ｌ，  （２０１０）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ７：６１８−６３０）。
【００４４】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］などが含まれる。
【００４５】
培養法の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００４６】
あるいは、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）またはマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
【００４７】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０６：１５７２０−１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ５：２３７−２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
【００４８】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
【００４９】
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００５０】
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
【００５１】
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔ  ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している  （Ｔ．  Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９２：７４０−７４３；  Ｓ．  Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ７２：９３２−９３６；  Ｊ．  Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），  Ｎａｔｕｒｅ，  ４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ  ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＥＳ）細胞である。ｎｔ  ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．  Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），  ４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
【００５２】
（Ｆ）  培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ−３およびＣＤ１０５が陽性である。
【００５３】
（循環工程）
循環工程においては、上述の播種工程で単一細胞が単一に播種されたマイクロ流路内に、培養液を循環させる。
【００５４】
循環させる培養液の流速は、細胞に栄養を供給しつつ、老廃物を除去することの観点から、例えば、２５０ｎｌ／分以上４００００ｎｌ／分以下が好ましく、５００ｎｌ／分以上１００００ｎｌ／分以下がより好ましく、５０００ｎｌ／分が特に好ましい。
【００５５】
循環させる培養液の種類は、培養する細胞に応じて選択することができる。例えば、ＥＳ細胞を培養するための培養液としては、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン酸、２０％のＫＳＲ（Ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｒａｓ）、及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を補充したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ−１２培養液が使用される。また、ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、１０％以上１５％以下のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＤＭＥ培養液が用いられる。また、市販の培養液（マウスＥＳ細胞培養用培養液、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液）、無血清培地などが含まれる。
【００５６】
なお、単一細胞を単一状態で培養する方法として、細胞間の接着を切断することによるアポトーシスを阻害するアポトーシス阻害剤（Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）という薬剤を培養液に添加する方法が考えられるが、薬剤等の添加は細胞品質への悪影響が懸念されるため、好ましくない。
しかし、本発明の細胞培養方法によれば、アポトーシス阻害剤を適用せずに、単一状態に播種された単一細胞を培養することができる。
【００５７】
循環させる培養液は、馴化培養液であることが好ましい。馴化培養液は、フィーダー細胞の培養上清を含む馴化培養液であってもよいが、例えば、本発明の方法により培養される単一細胞を継代培養していたときに馴化された培養液、該単一細胞と同じ種類の細胞を培養することにより馴化された培養液、が好ましい。
循環させる培養液として馴化培養液を用いることにより、細胞が分泌した物質（例えば、増殖に必要な物質）が、分泌した細胞以外の細胞に作用する現象（パラクライン）が生じ易くなるため、単一の状態に播種された単一細胞が増殖し易くなると考えられる。
【００５８】
循環工程は、播種工程で単一細胞が単一に播種されたマイクロ流路内を培養液で満たした状態で維持した後、培養液の循環を開始することが好ましい。
この工程を有することにより、単一に播種された単一細胞の周辺に培養液が留まる結果、細胞が分泌した物質（例えば、増殖に必要な物質）が、分泌した細胞自身に作用する現象（オートクライン）が生じ易くなり、単一の状態に播種された単一細胞が増殖し易くなると考えられる。
【００５９】
培養液で満たした状態の時間は、オートクラインの影響を得る観点から、例えば、８時間以上が好ましく、８時間以上２４時間以内がより好ましい。
【００６０】
本発明の細胞培養方法は、上述のように、細胞の培養に適した温度で行うことが好ましい。例えば、細胞がヒト由来の細胞である場合、人の体温に近い温度で細胞の培養を行えるよう、培養液の温度を３６℃以上３８℃以下に維持することが好ましい。さらに、本発明の細胞培養方法は、４％以上６％以下のＣＯ２雰囲気下で行うことが好ましい。
さらに、維持培養のために、低酸素状態の状況下に設置してもよい。ここで、低酸素状態とは、酸素分圧が、１％以上１０％以下の状態であり、好ましくは、５％である。
【００６１】
[細胞培養装置]
本発明の細胞培養装置の一例である細胞培養装置１０は、図１に示すように、例えば、後述する細胞培養部材１２と、細胞培養部材１２のマイクロ流路内に培養液を循環させる循環装置と、を備える。
上述した本発明の細胞培養方法は、例えば、図１に示す細胞培養装置１０を適用することにより実現する。
以下、本発明の細胞培養装置について、図１を用いて詳細に説明する。
【００６２】
（循環装置）
循環装置は、例えば、リザーバ（貯蔵部）１４、循環ポンプ（送液手段）１６、圧力均一化機構（圧力均一化手段）１８、エアトラップ（気泡除去手段）２０、加圧機構（加圧手段）２２を備えており、各部にはチューブ２４Ａ〜２４Ｆが接続されて循環流路２６を構成している。なお、循環装置は、細胞培養部材１２に形成された６つのチャネルのうち、２つのチャネルを用いて培養を行うように、循環ポンプ１６、圧力均一化機構１８、エアトラップ２０、及び加圧機構２２が２つずつ設けられているが、これに限らず、使用するチャネルの数に応じて、さらに多くの循環流路２６を設けてもよい。また、１つの循環ポンプ１６に複数のチューブ２４を接続してもよい。
【００６３】
リザーバ１４は、図１の下側に設けられており、リザーバ１４の中には、培養液が貯蔵される。また、本実施形態では、１つのリザーバ１４に対して２つの循環ポンプ１６が接続されているが、これに限らず、それぞれの循環ポンプ１６に対して独立してリザーバ１４を設けてもよい。
【００６４】
リザーバ１４には、チューブ２４Ａを介して送液手段としての循環ポンプ１６が接続されている。循環ポンプ１６としては、様々な送液ポンプを利用することができるが、低流量で小型のポンプが好ましい。本実施形態では、一例として、ペリスタルティック方式のチュービングポンプが挙げられるが、これに限らず、他のポンプを用いてもよい。
【００６５】
循環ポンプ１６は、リザーバ１４からチューブ２４Ａを通じて培養液を吸い上げ、チューブ２４Ｂへ送液する。これにより、チューブ２４Ｂが接続された圧力均一化機構１８内の培養液が押し出され、チューブ２４Ｃを通じてエアトラップ２０へ送液される。これと同様にして、培養液は、チューブ２４Ｄを通じて細胞培養部材１２へ送液され、さらにチューブ２４Ｅ及び加圧機構２２を通じてリザーバ１４へ送液される。このようにして、培養液は層流として細胞培養部材１２のマイクロ流路３２Ｂ内を循環する。なお、ここでいう層流とは、流体の流線が壁面と平行であることを意味し、乱流ではない流れ場を意味する。好ましくは、層流は、壁に近づくほど流速は小さくなり、一定以上壁面から離れることで流速が均一となる流れ場である。
【００６６】
なお、循環装置は、少なくとも循環ポンプ（送液手段）１６と接続用のチューブを備えていればよく、リザーバ（貯蔵部）１４、圧力均一化機構（圧力均一化手段）１８、エアトラップ（気泡除去手段）２０、及び加圧機構（加圧手段）２２は、備えていなくてもよい。
【００６７】
（細胞培養部材）
細胞培養部材１２は、単一細胞を播種する内壁にラミニンを含むコーティング層を有するマイクロ流路を含む。
以下、具体的に説明する。
上述した本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養部材を適用することが好ましい。
本発明の細胞培養部材１２の一例を、図２〜図５を用いて説明する。但し、本発明の細胞培養部材１２は、図２〜図５に示すものに限られない。
【００６８】
細胞培養部材１２は、図２に示すように、例えば、樹脂板（樹脂プレート）３０、第１のポリメチルシロキサン（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））板３２、第２のポリメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）板３３、及びガラス板３４を備えており、これらをこの順番に重ねて形成されている。また、ガラス板３４の下方に下クランプ３８を配置した状態で、樹脂板３０の上方から上クランプ３６を当てて、上クランプ３６と下クランプ３８とで、樹脂板３０、第１のＰＤＭＳ板３２、第２のＰＤＭＳ板３３、及びガラス板３４を挟み込んでいる。この状態で、上クランプ３６の形成されたボルト孔３６Ａと下クランプ３８に形成されたボルト孔３８Ａにボルト４０を挿通して互いを締結し、細胞培養部材１２が形成されている。下クランプ３８は、培養中の細胞を観察するための穴がある。
【００６９】
樹脂板３０には、第１のＰＤＭＳ板３２に重ね合せたときにスリット３２Ｂ（以下、「マイクロ流路３２Ｂ」と称する場合がある）の一端に重なる位置に第１の孔３０Ａが６つ形成され、さらに、マイクロ流路３２Ｂの他端に重なる位置に第２の孔３０Ｂが６つ形成されている。第１の孔３０Ａ及び第２の孔３０Ｂがこのような位置であることにより、マイクロ流路３２Ｂ内を循環する培養液は、例えば、チューブ２４Ｄを通って第１の孔３０Ａから流入し、マイクロ流路３２Ｂ内を流れた後、チューブ２４Ｅを通って第２の孔３０Ｂから流出する。
【００７０】
第１のＰＤＭＳ板３２には、例えば、マイクロ流路を形成するためのスリット３２Ｂが独立して６つ形成されている。なお、スリット３２Ｂの数は、６つに限られない。
スリット３２Ｂの幅は、例えば、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましく、０．２ｍｍ以上０．５ｍｍ以下がより好ましい。また、スリット３２Ｂの深さは、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましく、０．２ｍｍ以上０．５ｍｍ以下が特に好ましい。スリット３２Ｂの長さは、０．５ｃｍ以上１０ｃｍ以下が好ましく、１ｃｍ以上２ｃｍ以下がより好ましい。
【００７１】
第２のＰＤＭＳ板３３には、第１のＰＤＭＳ板３２に重ね合せたときに第１のＰＤＭＳ板３２のマイクロ流路３２Ｂに沿う位置に孔（隔離孔３３Ａ）が５つ独立して形成されている。そのため、隔離孔３３Ａは、図３に示すように、マイクロ流路３２Ｂに対してポケット状の窪みを形成することとなるので、マイクロ流路３２Ｂは、ポケット状の窪みを有する流路となる。
つまり、図２、図３の細胞培養部材１２は、マイクロ流路３２Ｂ内に、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造として、ポケット状の窪みを有する。なお、隔離孔３３Ａの数は、５つに限られない。
単一細胞は、隔離孔３３Ａが形成する窪みの内部に播種することにより、他の細胞から隔離された単一の状態で培養し易くなる。
【００７２】
隔離孔３３Ａは、内径０．１ｍｍ以上２ｍｍ以下が好ましく、０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下がより好ましく、０．５ｍｍ以上１ｍｍ以下が特に好ましい。
また、隔離孔３３Ａの深さは、０．５ｍｍ以上２ｍｍ以下が好ましく、０．５ｍｍ以上１ｍｍ以下がより好ましい。
隔離孔３３Ａ同士の中心間距離は、０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好ましく、０．２ｍｍ以上１０ｍｍ以下がより好ましい。
【００７３】
なお、第１のＰＤＭＳ板３２及び第２のＰＤＭＳ板３３は、他の材質の部材にスリット３２Ｂ又は隔離孔３３Ａを形成したものであってもよい。他の材質としては、例えば、プラスチック、シリコン樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリスチレン、又はガラスが挙げられる。
【００７４】
ガラス板３４は、図３に示すように、隔離孔３３Ａにより露出される領域にラミニンを含むコーティング層３４Ａを有する。
ガラス板３４の材質は、第１のＰＤＭＳ板３２及び第２のＰＤＭＳ板３３と比較して、コーティング層を形成し易い材質が好ましい。
【００７５】
マイクロ流路３２Ｂは、樹脂板３０、第１のＰＤＭＳ板３２、第２のＰＤＭＳ板３３、及びガラス板３４を、この順に積層することにより形成される流路である。
つまり、マイクロ流路３２Ｂは、第１のＰＤＭＳ板３２及び第２のＰＤＭＳ板３３の表面で構成された主流路に、ガラス板３４を底面とした隔離孔３３Ａで構成された窪み（孔）を有する。
マイクロ流路３２Ｂは、ラミニンを含むコーティング層３４Ａを有する。具体的には、例えば、主に、マイクロ流路３２Ｂの内壁のうち、隔離孔３３Ａにより露出された、底面となるガラス板３４は、ラミニンを含むコーティング層３４Ａにより選択的に被覆されている。
ラミニンを含むコーティング層は、ガラス板３４の表面を処理して親水性特性を付与することにより、選択的に被覆し易くなる。すなわち、底面となるガラス板３４の表面に親水性特性を付与した後に、マイクロ流路３２Ｂ内にラミニンを含むコーティング層形成用溶液を注入することを含む方法により、コーティング層を、隔離孔３３Ａにより露出された、底面となるガラス板３４に形成してもよい。
【００７６】
コーティング層３４Ａには、培養に影響しない範囲で、ラミニン以外に例えば、マトリゲル、フィブロネクチン、ポリＬリジンが含まれていてもよい。
【００７７】
コーティング層３４Ａの形成方法としては、例えば、上述の構成で細胞培養部材１２を組立て、マイクロ流路３２Ｂを形成後、ラミニンを含むコーティング層形成溶液を、第１の孔３０Ａ又は第２の孔３０Ｂからマイクロ流路内に注入して、ガラス板３４上に塗布する方法が挙げられる。なお、コーティング層３４Ａは、ガラス板３４の表面を酸素プラズマ等で処理して親水性特性を得ることにより、さらに選択的にガラス板３４上に形成することができる。
【００７８】
ラミニンを含むコーティング層形成溶液は、具体的には例えば、以下のようにして調製する。
ＰＢＳまたは培地でラミニンなどのコーティング剤を希釈して調製する。
【００７９】
本発明の細胞培養部材１２は、単一細胞を単一に播種する観点から、図３に示すように、マイクロ流路３２Ｂ内に、単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造を有することが好ましい。
隔離構造は、図３に示す構造に限られず、その他の隔離構造としては、例えば、マイクロ流路３２Ｂ中に一対の隔壁３３Ｂを有する構造（図４参照）、ラミニンを含むコーティング層３４Ａを平坦面に部分的に設けた構造（以下、マイクロ流路３２Ｂに部分的に設けたコーティング層を、「部分コーティング層３４Ｂ」と称する場合がある。図５参照）とする構造、が挙げられる。
【００８０】
図４に示すマイクロ流路３２Ｂ中に隔壁を有する構造は、隔壁３３Ｂが複数設けられているため、隔壁３３Ｂの間で単一細胞を他の細胞から隔離して単一で播種し、該単一細胞を培養することができる。つまり、隔壁３３Ｂは単一細胞を他の細胞から隔離する隔離構造として機能する。
【００８１】
図５に示すラミニンを含むコーティング層を部分的に設ける構造は、ガラス板３４上の平坦面に、ラミニンを含む部分コーティング層３４Ｂを設けている。部分コーティング層３４Ｂを個別に複数設けることにより、部分コーティング層３４Ｂ上の単一細胞を、他の細胞から隔離することができる。
【００８２】
細胞培養部材１２としては、単一細胞を単一に播種する観点から、隔離構造を有する細胞培養部材が好ましい。隔離構造としては、単一に播種した単一細胞の培養を促す観点から、上述の、マイクロ流路３２Ｂに隔離孔３３Ａを有する構造（図３に示す構造）、マイクロ流路３２Ｂに隔壁３３Ｂを有する構造（図４に示す構造）、が好ましい。
隔離構造が、マイクロ流路３２Ｂに隔離孔３３Ａを有する構造、又は、マイクロ流路３２Ｂに隔壁３３Ｂを有する構造の場合、単一に播種された単一細胞の周辺の空間が狭まり、且つ、単一細胞の周辺に新たな培養液が流入し難くなるので、細胞が分泌した物質（例えば、増殖に必要な物質）が、分泌した単一細胞自身に作用する現象（オートクライン）が生じ易くなり、細胞が増殖し易くなると考えられる。
【００８３】
本発明の細胞培養装置１０は、インキュベーター１０２（恒温器）に格納することが好ましい。例えば、細胞がヒト由来の細胞である場合、人の体温に近い温度で細胞の培養を行えるよう、培養液の温度を３６℃以上３８℃以下に維持することが好ましい。
インキュベーター１０２は、細胞の培養に適した温度に維持できるものが好ましい。また、インキュベーター１０２としてＣＯ２インキュベーター１０２を用いて、４％以上６％以下のＣＯ２雰囲気下で行うことが好ましい。
さらに、維持培養のために、低酸素状態の状況下に設置してもよい。ここで、低酸素状態とは、酸素分圧が、１％以上１０％以下の状態であり、好ましくは、５％である。
【００８４】
なお、本発明の細胞培養部材は、単一分散状態の多能性細胞を単一の状態で培養した後、スクリーニングの対象となる候補薬剤を添加した培地をさらに流し、多能性細胞の変化を観察することで、候補薬剤の効果を検査するキットとして用いることができる。
ここで、多能性細胞の変化とは、例えば、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、脊索中胚葉、沿軸中胚葉、中間中胚葉細胞、側板中胚葉、神経細胞、グリア細胞、造血細胞、肝細胞、膵β細胞、腎前駆細胞、内皮細胞、周皮細胞、上皮細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞など特定の細胞への変化が挙げられる。また、候補薬剤は、各細胞への分化誘導剤として選択することができる。
なお、本発明の細胞培養部材を用いた場合、マイクロ流路内で培養するため、候補薬剤の量を少量にすることができる。
【実施例】
【００８５】
[試験例１]
（単一細胞分散液１）
−ｉＰＳ細胞の調製−
ＪＣＲＢ細胞バンクにより提供されたヒト胎児肺線維芽細胞（ＴＩＧ１）を用いて、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣをレトロウイルスにより導入し、ｈｉＰＳＣｓ株を誘導した。マトリゲル被覆ディッシュ上、ＭＥＦ（マウス胚性繊維芽細胞）馴化ｈＥＳ培地（２０％ノックアウト血清置換（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で、ＴＩＧ１−ｉＰＳＣを培養した。
【００８６】
−細胞の分散−
このマトリゲルを含む培地で継代培養されたＴＩＧ１−ｉＰＳＣを、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）／０．０４％ＥＤＴＡにより解離させて回収し、２回の洗浄後、５．０×１０２細胞／ｍｌとなるように５００μｌの新鮮な培養液（ＭＥＦコンディションドメディウム、ｍＴｅＳＲ１（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｎｎｅｉｌｌｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｒ  １））中に懸濁し、単一細胞分散液１を得た。
【００８７】
（細胞培養部材）
−各部材の準備−
・樹脂板３０
樹脂板３０は、ポリカーボネート（ＰＣ）で作製した。樹脂板３０には、内径１ｍｍの第１の孔３０Ａ及び第２の孔３０Ｂを設けた。
【００８８】
・第１のＰＤＭＳ板３２
まず、ＳＵ８リソグラフィ法により作製された、マイクロ流路となる６つのスリット（幅０．５ｍｍ、長さ２０ｍｍ、深さ０．５ｍｍ）を形成させる鋳型へ熱硬化性のＰＤＭＳ（Ｓｌｉｐｏｔ１８４、Ｔｏｒａｙ−ＤａｗＣｏｒｎｉｎｇ、Ｊａｐａｎ）を０．５ｍｍの厚さになるように注ぎ、８０℃で４時間、乾燥器中で硬化させた。その後、硬化したＰＤＭＳを鋳型から取り出して６つの流路が形成された第１のＰＤＭＳ板３２を得た。
【００８９】
・第２のＰＤＭＳ板３３
第２のＰＤＭＳ板３３は、第１のＰＤＭＳ板３２のマイクロ流路となる６つのスリットのかわりに、内径１ｍｍ、深さ０．５ｍｍの隔離孔３３Ａを作製した以外は、第１のＰＤＭＳ板３２と同様にして作製した。
第２のＰＤＭＳ板３３の隔離孔３３Ａは、第１のＰＤＭＳ板３２のマイクロ流路となる溝の長手方向に沿って、スリット１つにつき５個設けた。孔の中心と、この孔に隣接する孔の中心までの距離は、２．５ｍｍとなるようにした。
なお、第２のＰＤＭＳ板３３に設けられた隔離孔３３Ａは、合計で３０個であった。
【００９０】
・ガラス板３４
ガラス板３４は、ＳＵ８（ＳＵ−８  ２０１０、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製）を塗布してＳＵ８層を設けたガラス板とした。ＳＵ８層は、ガラス板へＳＵ８を塗布後、紫外線を照射し硬化させ作製した。ガラス板には、第１及び第２のＰＤＭＳ層と接合する際のＸＹ軸を合わせるための十字印をＳＵ８リトグラフィにより付した。次いで、ＳＵ８層の表面を酸素プラズマで処理することで、親水性特性を付加した。
【００９１】
−細胞培養部材の組立て−
図２に示す細胞培養部材１２を、以下の方法で得た。
樹脂板３０、マイクロ流路を形成するスリット状の溝を有する第１のＰＤＭＳ板３２、隔離構造（上記（１）のマイクロ流路中に隔離孔３３Ａを有する構造）を形成する第２のＰＤＭＳ板３３、及びコーティング層を有するガラス板３４を、上から順番に重ねて積層体を形成した。そして、上記積層体のガラス板の下方に下クランプを配置した状態で、樹脂プレートの上方から上クランプを当てて、上クランプと下クランプとで、樹脂板３０、第１のＰＤＭＳ板３２、第２のＰＤＭＳ板３３、及びガラス板３４を挟み込んだ。
この状態で、上クランプの形成されたボルト孔と下クランプに形成されたボルト孔にボルトを挿通して互いを締結し、コーティング層未形成の細胞培養部材１２を作製した。
【００９２】
−コーティング層の形成−
まず、ヒトラミニン５２１を含むコーティング層形成用溶液を、以下のようにして作製した。
ＰＢＳでヒトラミニン５２１を希釈して終濃度 20 μg/mLとなるよう調製した。
次に、上記コーティング層形成用溶液を、上記で得た細胞培養部材１２の第１の孔３０Ａ（注入口）から注入し、マイクロ流路３２Ｂ内の、隔離孔３３Ａにより露出したガラス板３４上を被覆するようにヒトラミニン５２１を含むコーティング層を形成した。
位相差顕微鏡で確認したところ、コーティング層が、マイクロ流路３２Ｂ内の隔離孔３３Ａにより露出した領域、つまりガラス板３４上に形成されていた。
【００９３】
（単一細胞の培養）
−播種工程−
ヒトラミニン５２１を含むコーティング層が形成された細胞培養部材の第１の孔３０Ａ（注入口）から、上記単一細胞分散液１を、シリンジを用いて注入し、単一細胞を単一に播種した。単一細胞分散液１は、第１のＰＤＭＳ板３２の溝と、第２のＰＤＭＳ板３３に設けられた孔とを満たす量を注入した。
マイクロ流路内に播種された単一細胞は、１６５個であった。
注入後、単一細胞が第２のＰＤＭＳ板３３に設けられた隔離孔３３Ａに１個ずつ入っていることを、位相差顕微鏡を用いて確認した。
その後、単一細胞が単一に播種された細胞培養部材を、温度が３７℃に維持されたＣＯ２インキュベーター１０２内に、２４時間静置した。
【００９４】
−循環工程−
静置した上記細胞培養部材を、図１に示す、細胞培養装置１０に配置した。
連結用のチューブには、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）管ＴＵＦ−１００シリーズＡＷＧ−３０（Ｃｈｕｋｏｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ社製）を使用した。
リザーバ１４には、単一細胞分散液１の培養液と同じ種類の培養液であって、ＴＩＧ１−ｉＰＳＣを培養して馴化した馴化培養液を入れた。
【００９５】
細胞培養装置を用いて、馴化培養液を流速５０００ｎｌ／分で循環させた。細胞培養装置は、温度が３７℃に維持されたＣＯ２インキュベーター１０２内に設置した。
【００９６】
（評価）
−培養の確認−
培養の確認を、上記の細胞培養装置を用いて単一に播種した単一細胞を、位相差顕微鏡を用いて観察することにより行った。観察は、循環を開始する直前（０日目）、培養から２日目、培養から６日目、培養から８日目、培養から１３日目、の計５回行った。細胞数は、０日目で１個、２日目で１個、６日目で８個、８日目で２８個、１３日目で８５個であった。観察の結果を図６に示す。
観察した結果、５０細胞以上まで増殖した単一細胞は、２例であった（表１中の５０細胞以上の増殖例（Ｂ））。また、表１中の、播種された単一細胞数（Ａ）、及び５０細胞以上の増殖例（Ｂ）から、平均増殖率（Ｂ／Ａ）を求めた。結果を表１に示す。
【００９７】
−多能性の確認−
マイクロ流路内での培養１４日目のＴＩＧ１−ｉＰＳＣ（図７Ａ参照）のコロニーからＴＩＧ１−ｉＰＳＣを取り、マトリゲルをコートしたプレート上で通常の培養を行い（図７Ｂ参照）、１回目の継代培養を行ったＴＩＧ１−ｉＰＳＣ（図７Ｃ参照）を回収して、多能性が維持されているか、確認した。
多能性は、免疫染色法により確認した。各方法とその結果を、以下に示す。
【００９８】
・免疫染色法
回収した細胞（ＴＩＧ１−ｉＰＳＣ）を４％  ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、室温（２５℃）で１０分間固定し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で洗浄後、４℃でブロッキング溶液（ＰＢＳＴ中、３％  ＢＳＡおよび２％  スキムミルク（ＤＩＦＣＯ，ＵＳＡ））中で一晩プレ処理した。次いで、一次抗体；抗ＯＣＴ４（１：５０，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＵＳＡ）、抗ＳＯＸ２（１：５００，  Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）または抗ＮＡＮＯＧ（１:２００，  Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）と免疫反応させた後に、蛍光二次抗体（１：５００，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。
さらに、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて核を対比染色し、ＳｌｏｗＦａｄｅ  ｌｉｇｈｔ褪色防止キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて光褪色を防止した後、ＩＸ７０倒立顕微鏡を用いて蛍光画像を得た。
【００９９】
上述の方法で免疫染色を行ったところ、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの多能性マーカータンパク質の発現が確認された（図８参照）。また、ＤＡＰＩ染色の結果、核が確認された。
【０１００】
上記の結果より、本実施例の培養方法は、単一に播種された単一細胞（ＴＩＧ１−ｉＰＳＣ）の多能性を維持したまま培養できることが明らかとなった。
【０１０１】
なお、参考例として、マイクロ流路内ではなくシャーレ内で培養したＴＩＧ１−ｉＰＳ及びフィーダー細胞（ＭＥＦ、株式会社リプロセル）についても、上記と同様に免疫染色法を行った（図８参照）。
その結果、シャーレ内で培養したＴＩＧ１−ｉＰＳについても、試験例１のマイクロ流路内での培養１４日目のＴＩＧ１−ｉＰＳと同様に、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの多能性マーカータンパク質の発現が確認された。また、ＤＡＰＩ染色の結果、核が確認された。
フィーダー細胞については、ＤＡＰＩ染色の結果、核は確認されたが、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの多能性マーカータンパク質の発現は確認されなかった。
【０１０２】
[試験例２]
調製したＴＩＧ１−ｉＰＳＣを、マトリゲル被覆を用いてマトリゲルを含む培地で培養するのではなく、ヒトラミニン５２１被覆を用いて、ヒトラミニン５２１を含む培地で培養を１回行った以外は、試験例１と同様にしてＴＩＧ１−ｉＰＳＣを得た。
この培養により得られたＴＩＧ１−ｉＰＳＣを、単一細胞分散液１と同様に処理して細胞群を解離し、単一細胞分散液２を得た。単一細胞分散液２の細胞濃度は、５×１０２細胞／ｍｌであった。
この単一細胞分散液２を、試験例１と同様の細胞培養部材に注入して播種し、試験例１と同様に培養した。
なお、単一細胞分散液２を注入後、単一細胞が第２のＰＤＭＳ板３３に設けられた孔に１個ずつ入っていることを、位相差顕微鏡を用いて確認した。
また、試験例２においてマイクロ流路内に播種された単一細胞は、２６２個であった。
【０１０３】
（評価）
試験例１と同様にして、培養された単一細胞の観察を、位相差顕微鏡を用いて行ったところ、５０細胞以上まで増殖した単一細胞は、１０例であった。また、表１中の、播種された単一細胞数（Ａ）、及び５０細胞以上の増殖例（Ｂ）から、平均増殖率（Ｂ／Ａ）を求めた。結果を表１に示す。
【０１０４】
[比較試験例１]
コーティング層形成溶液として、ヒトラミニン５２１ではなくマトリゲルを含むコーティング層形成溶液を用いたこと以外は、試験例１で用いた細胞培養部材と同様にして細胞培養部材を作製した。
マトリゲルを含むコーティング層形成溶液は、以下のようにして作製した。
マトリゲルを培養液にて５０倍に希釈して、マトリゲルコ―ティング溶液を作製した。
その後、試験例１と同様にして、上記細胞培養部材に単一細胞分散液１を注入して播種し、試験例１と同様に培養した。
なお、単一細胞分散液１を注入後、単一細胞が第２のＰＤＭＳ板３３に設けられた孔に１個ずつ入っていることを、位相差顕微鏡を用いて確認した。
また、比較試験例１においてマイクロ流路内に播種された単一細胞は、７８３個であった。
【０１０５】
（評価）
試験例１と同様にして、培養された単一細胞の観察を、位相差顕微鏡を用いて行ったところ、５０細胞以上まで増殖した単一細胞は、０例であった。また、表１中の、播種された単一細胞数（Ａ）、及び５０細胞以上の増殖例（Ｂ）から、平均増殖率（Ｂ／Ａ）を求めた。結果を表１に示す。
【０１０６】
【表１】
2015186474.tif 000002
【０１０７】
上記の結果、本実施例の細胞培養方法、細胞培養部材、及び細胞培養装置により、単一に播種した単一細胞を培養し、多能性を維持したまま、そのクローン細胞を得ることができることが明らかである。
また、単一細胞分散液用の細胞の継代培養用培地には、マイクロ流路のコーティング層と同様に、ヒトラミニン５２１が含まれている方がよいことが明らかとなった。
【符号の説明】
【０１０８】
１０            細胞培養装置
１２            細胞培養部材
１４            リザーバ（貯蔵部）
１６            循環ポンプ（送液手段）
１８            圧力均一化機構（圧力均一化手段）
２０            エアトラップ（気泡除去手段）
２２            加圧機構（加圧手段）
２４Ａ〜２４Ｆ  チューブ（循環流路）
２６            循環流路
３０            樹脂プレート
３０Ａ          第１の孔
３０Ｂ          第２の孔
３２            第１のＰＤＭＳ層
３２Ｂ          スリット（マイクロ流路）
３３            第２のＰＤＭＳ層
３３Ａ          隔離孔
３３Ｂ          隔壁
３４            ガラス板
３４Ａ          コーティング層
３４Ｂ          部分コーティング層
３６            上クランプ
３６Ａ          ボルト孔
３８            下クランプ
３８Ａ          ボルト孔
４０            ボルト
１０２          インキュベーター（恒温器）
【図１】
2015186474.tif 000003
【図２】
2015186474.tif 000004
【図３】
2015186474.tif 000005
【図４】
2015186474.tif 000006
【図５】
2015186474.tif 000007
【図６】
2015186474.tif 000008
【図７Ａ】
2015186474.tif 000009
【図７Ｂ】
2015186474.tif 000010
【図７Ｃ】
2015186474.tif 000011
【図８】
2015186474.tif 000012