(57)【要約】【課題】標的タンパク質の量を特異的に低減する技術を提供すること。【解決手段】本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。前記タンパク質領域は、Ｔｐｐ１領域であってもよい。前記タンパク質領域と、前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び／又はスペーサー配列が介在していてもよい。【選択図】図２
2015167527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、
Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、
を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記タンパク質領域は、Ｔｐｐ１領域である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記タンパク質領域と、前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び／又はスペーサー配列が介在する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を複数含む請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞又は非ヒト動物である形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌等の疾患は、先天的、又は外的環境等によって後天的に導入された遺伝子の変異によって生成される変異型タンパク質が主要な病因である。癌等の疾患の治療において、変異型タンパク質の発現を人工的に抑制する技術が着目されている。
【０００３】
変異型タンパク質等の標的タンパク質の発現を人工的に抑制する技術としては、転写段階で遺伝子の発現を抑制するアンチジーン法、翻訳段階でタンパク質の発現を抑制するアンチセンス法等が挙げられる（非特許文献１及び２）。これらの技術はいずれも、細胞外からオリゴヌクレオチドを添加し、標的タンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡに対して該オリゴヌクレオチドを結合させることで、オリゴヌクレオチドの結合部位よりも下流の遺伝子の転写及び翻訳を阻害し、標的タンパク質の発現を抑制する技術である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  Ｊ．  “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０１１）  ７６４，  １−１５
【非特許文献２】Ｍａｌｉｋ，  Ｒ．，  Ｒｏｙ，  Ｉ．  “Ｍａｋｉｎｇ  ｓｅｎｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１１）  ６（５），  ５０７−５２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の技術においては、標的遺伝子中の適切な標的配列を選択しなければ標的タンパク質の発現を抑制できないという問題、細胞外から添加したオリゴヌクレオチドが、核酸分解酵素等で分解されて標的配列に到達できないという問題、変異型タンパク質のみならず正常タンパク質の発現も同時に抑制してしまい得るという問題等があった。
【０００６】
本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、標的タンパク質の量を特異的に低減する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、標的タンパク質に特異的に結合するタンパク質に、シャペロン介在性オートファジー作用に関与する特定の分子シャペロンの結合モチーフを付加させた融合タンパク質によれば、該融合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合し、該標的タンパク質をリソソーム内で分解することができるので、標的タンパク質の量を特異的に低減できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。
【０００８】
（１）  標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、
Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、
を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【０００９】
（２）  前記タンパク質領域は、Ｔｐｐ１領域である、（１）に記載のポリペプチド。
【００１０】
（３）  前記タンパク質領域と、前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び／又はスペーサー配列が介在する（１）又は（２）に記載のポリペプチド。
【００１１】
（４）  前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を複数含む（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
【００１２】
（５）  （１）から（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【００１３】
（６）  （５）に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【００１４】
（７）  （６）に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞又は非ヒト動物である形質転換体。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、標的タンパク質の量を特異的に低減する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例において調製したプラスミドに挿入した遺伝子の構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、ｍＴｐｐ１の分解効率の検討結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において認められたｍＴｐｐ１の分解が、シャペロン介在性オートファジー作用によるものであるかについての検討結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００１８】
＜本発明のポリペプチド＞
本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。本発明は、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、熱ショック関連タンパク質Ｈｓｃ７０との結合を介した、シャペロン介在性オートファジー作用を利用して、タンパク質領域に結合した標的タンパク質をリソソームまで運搬し、該標的タンパクをプロテアーゼによって分解することで標的タンパク質の量を低減する技術である。
【００１９】
［Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列］
「Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列」とは、分子シャペロンである熱ショック関連タンパク質Ｈｓｃ７０に対するＫＦＥＲＱ様配列（「Ｈｓｃ７０結合モチーフ（Ｈｓｃ７０ｂｍ）」とも呼ばれる。）を含む配列である。以下、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を含む領域を「Ｈｓｃ７０ｂｍ領域」という。
【００２０】
Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列としては、特に限定されないが、配列番号１４（動物種：ヒト）、配列番号１５（動物種：ヒト）で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列の由来する動物種は特に限定されず、“Ｐｒｏｃ．  Ａｍ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｏｃ．  （２０１０）  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ．２９−３９”や、“Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  （２００７）  ３，  ２９５−２９９”等の文献において定義される結合モチーフを使用できる。
【００２１】
本発明においては、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列も使用できる。
【００２２】
Ｈｓｃ７０ｂｍ領域は、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列からなる領域であってもよいが、スペーサー配列等を含んでいてもよい。Ｈｓｃ７０ｂｍ領域には、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列が単数又は複数含まれていてもよい。Ｈｓｃ７０ｂｍ領域に、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列が複数含まれている場合、該アミノ酸配列は、タンデムに結合されていてもよいし、スペーサー配列を介して離れていてもよい。該スペーサー配列の長さは、１０〜２０アミノ酸であってもよい。
【００２３】
Ｈｓｃ７０ｂｍ領域におけるＨｓｃ７０に結合するアミノ酸配列の配置は特に限定されないが、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域に、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列が複数含まれている場合、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、Ｈｓｃ７０とが結合しやすいという点から、該アミノ酸配列を、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域の両末端に配置することが好ましい。
【００２４】
Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を介してＨｓｃ７０に特異的に結合し、次いで、該タンパク質とＨｓｃ７０との複合体は、細胞内におけるタンパク質分解の場であるリソソームまで運搬される。該複合体は、リソソームまで運搬された後、リソソームシャペロンＬｙｓ−Ｈｓｃ７３の働きにより、リソソーム関連膜タンパク質Ｔｙｐｅ−２ａ  ＬＡＭＰ−２ａを通過して、リソソーム内に取り込まれ、リソソーム内部のプロテアーゼにより分解される。このような、Ｈｓｃ７０に対する結合を介したタンパク質の分解作用を、「シャペロン介在性オートファジー作用」という。
【００２５】
本発明者らは、Ｈｓｃ７０ｂｍとＨｓｃ７０との特異的な結合に基づく、シャペロン介在性オートファジー作用を利用した標的タンパク質の分解に着目し、本発明に想到した。すなわち、任意の標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域にＨｓｃ７０ｂｍ領域が付加された融合タンパク質（つまり、本発明におけるポリペプチド）を細胞内で発現させると、該融合タンパク質は、タンパク質領域を介して標的タンパク質に結合する。次いで、又は標的タンパク質と融合タンパク質との結合と同時に、標的タンパク質に結合した融合タンパク質は、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域を介して、細胞内のＨｓｃ７０に結合し、リソソームまで運搬され、上記のシャペロン介在性オートファジー作用によって、融合タンパク質とともに標的タンパク質が分解される。シャペロン介在性オートファジー作用によって分解される標的タンパク質は、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域が付加されたタンパク質領域に特異的に結合するものに限られるので、本発明によれば、標的タンパク質の量を特異的に低減できる。
【００２６】
本発明のポリペプチドには、単数又は複数のＨｓｃ７０ｂｍ領域が含まれていてもよい。本発明のポリペプチドに複数のＨｓｃ７０ｂｍ領域が含まれていると、本発明のポリペプチドを、より特異的にＨｓｃ７０に結合させやすくなる。複数のＨｓｃ７０ｂｍ領域は、タンデムに結合されていてもよいし、タンパク質領域やその他の配列を介して離れていてもよい。
【００２７】
本発明のポリペプチドと、標的タンパク質とを、より特異的に結合させるために、本発明のポリペプチドには、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域とともに、ＳＵＭＯ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ（ＳＩＭ）と呼ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよい。「ＳＩＭ」とは、翻訳後修飾の１種であるＳＵＭＯ化を受けたタンパク質に結合する小さなタンパク質である「ＳＵＭＯ」に特異的に結合する配列である。本発明のポリペプチドにＳＩＭが含まれていると、ＳＵＭＯ化を受けたタンパク質のみを特異的にリソソームに運搬できる。
【００２８】
例えば、大腸癌の病因は、Ｗｎｔシグナル経路において蓄積したβ−カテニンが転写因子であるＴ−ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ−４（ＴＣＦ４）と結合して形成された複合体が、標的遺伝子の上流配列に結合し、標的遺伝子の転写を活性化することによって生じる腺腫形成であることが知られている。ＳＵＭＯ  Ｅ３リガーゼであるＲａｎＢＰ２は、ＴＣＦ４とともに複合体を形成することでＴＣＦ４をＳＵＭＯ化し、ＴＣＦ４とβ−カテニンとの結合親和性を増加させる。そのため、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域とともに、ＳＩＭを含む本発明のポリペプチドによれば、ＳＵＭＯ化修飾を受けたＴＣＦ４のみを特異的にリソソームに運搬して分解することができるので、ＴＣＦ４及びβ−カテニンの複合体の核への移行量が抑制され、その結果、標的遺伝子の転写が抑制され、大腸癌細胞の成長を阻害できることが期待される。
【００２９】
本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質の量が特異的に低減されたかどうかは、標的タンパク質の量や、タンパク質領域の量を公知の免疫染色等によって検出することで特定できる。標的タンパク質や、タンパク質領域の分解物が認められた場合、標的タンパク質の量が特異的に低減されたものと判断できる。
【００３０】
［タンパク質領域］
本発明におけるタンパク質領域は、任意の標的タンパク質に結合するアミノ酸配列を含むものであれば特に限定されない。このようなタンパク質領域として、具体的には、Ｔｐｐ１領域（例えば、配列番号９で表されるアミノ酸配列、又は配列番号９と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、抗体、酵素、レクチン、受容体、シグナル伝達タンパク質、基本転写因子、ヒストン、複数のタンパク質が集合して形成されるタンパク質複合体（リボソーム、プロテアソーム、基本転写因子、ヒストン、クロマチン・リモデリング複合体等）を構成するタンパク質等が挙げられる。
【００３１】
Ｔｐｐ１領域は、Ｔｐｐ１の全長配列であってもよいが、部分配列であってもよい。例えば、ヒトＴｐｐ１（全長５４４アミノ酸）については、８７−２５１アミノ酸領域を含む部分配列であれば、標的タンパク質であるテロメラーゼに結合できる。同様に、マウスＴｐｐ１（全長４１６アミノ酸）については、１−１６３アミノ酸領域を含む部分配列であれば、標的タンパク質であるテロメラーゼに結合できる。ヒトＴｐｐ１の８７−２５１アミノ酸領域のうち、Ｅ１６８、Ｅ１６９、Ｅ１７１、Ｒ１８０、Ｌ１８３、Ｌ２１２、Ｅ２１５がテロメラーゼとの結合に特に重要である。
【００３２】
上記のタンパク質領域の例示のうち、Ｔｐｐ１領域とは、テロメア伸長酵素であるテロメラーゼに特異的に結合するタンパク質である。つまり、タンパク質領域がＴｐｐ１領域である場合、「標的タンパク質」はテロメラーゼである。癌細胞においては、テロメラーゼが発現することによって、正常細胞においては細胞分裂の度に短縮していくテロメアを伸長させ、細胞が永続的に分裂することが知られる。そのため、本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質であるテロメラーゼを分解することで、癌等を治療できることが期待される。
【００３３】
タンパク質領域が抗体である場合、「標的タンパク質」は、該抗体に対する抗原タンパク質である。
【００３４】
タンパク質領域が酵素である場合、「標的タンパク質」は、該酵素の基質タンパク質である。
【００３５】
タンパク質領域がレクチンである場合、「標的タンパク質」は、該レクチンに対応する糖タンパク質である。
【００３６】
タンパク質領域が受容体である場合、「標的タンパク質」は、該受容体に対応するホルモン（ペプチド、タンパク質、糖タンパク質等）、シグナル伝達タンパク質である。
【００３７】
タンパク質領域がシグナル伝達タンパク質である場合、「標的タンパク質」は、該タンパク質に関連するシグナル伝達タンパク質である。
【００３８】
タンパク質領域が基本転写因子である場合、「標的タンパク質」は、該因子に対応するＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写制御因子である。
【００３９】
タンパク質領域がヒストンである場合、「標的タンパク質」は、該ヒストンに関連するヒストン関連タンパク質（ヒストン修飾酵素、ヒストン脱修飾酵素、ヒストン結合タンパク質、ヒストンシャペロン）である。
【００４０】
タンパク質領域が、タンパク質複合体を構成するタンパク質である場合、「標的タンパク質」は、該複合体を構成する他のタンパク質である。
【００４１】
タンパク質領域のアミノ酸配列は、いずれの動物種に由来するものであってもよい。動物種としては、マウス、ヒト、ラット、モルモット等が挙げられる。
【００４２】
タンパク質領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域の位置関係は特に限定されないが、タンパク質領域のＣ末端側にＨｓｃ７０ｂｍ領域のＮ末端が配置されていてもよいし、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域のＣ末端側にタンパク質領域のＮ末端が配置されていてもよい。
【００４３】
［その他の領域］
タンパク質領域と、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域との間（タンパク質領域とＨｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間）には、リンカー配列及び／又はスペーサー配列等のアミノ酸配列の小断片が介在していてもよい。このような配列の種類や長さを調整することにより、本発明のポリペプチドを、より効率的にＨｓｃ７０や標的タンパク質に結合させることができる。
【００４４】
リンカー配列としては、制限酵素部位を有するもの、蛍光タンパク質を発現するもの等が挙げられる。リンカー配列の長さは、１０〜２００アミノ酸であってもよい。
【００４５】
スペーサー配列は、特に限定されないが、５〜３０アミノ酸のものであってもよい。スペーサー配列が１０〜２０アミノ酸であると、本発明のポリペプチドを、より効率的にＨｓｃ７０や標的タンパク質に結合させることができる傾向にある。
【００４６】
本発明のポリペプチドの任意の部位には、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ等の公知のタグペプチドが付加されていてもよい。これらのタグを付加することにより、本発明のポリペプチドの発現の検出等を容易に行うことができる。
【００４７】
＜本発明のポリペプチドの製造方法＞
本発明のポリペプチドは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸をベクターに組み込み、該ベクターを細胞（ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞等）、大腸菌等に導入することによって、ポリペプチドとして大量に発現させることができる。
【００４８】
＜核酸＞
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、アミノ酸配列情報からプライマーを作成し、ＰＣＲ等によってクローニングしたタンパク質領域をコードする核酸や、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域をコードする核酸を、ライゲーション反応等によってつなげることにより本発明のポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
【００４９】
本願明細書で使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれる。
【００５０】
＜組み換えベクター＞
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組み換えベクターは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、任意のプラスミドを、任意の制限酵素で切断し、その切断部位に、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を結合させることによって作製できる。
【００５１】
本願明細書で使用される用語「組み換えベクター」は、組み換えＤＮＡ実験等において異種ＤＮＡの運搬に使用されるＤＮＡを指す。本発明の組み換えベクターとしては、例えば、本発明のポリペプチドを発現するＤＮＡ断片、任意の制限酵素認識部位、任意の複製開始点等を有するクローニングベクターや、本発明のポリペプチドを発現するＤＮＡ断片、転写開始点等を有する発現ベクター等が挙げられる。
【００５２】
＜形質転換体＞
上記の組み換えベクターを含む形質転換体は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。本願明細書で使用される用語「形質転換体」は、単離された細胞又は非ヒト動物である。細胞としては特に限定されず、任意の細胞株（例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞等）を使用できる。また、非ヒト動物としては特に限定されず、大腸菌、哺乳類（マウス、ラット等）、モデル動物等を使用できる。
【００５３】
本発明の形質転換体は、例えば、単離された細胞に、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス等によって組み換えベクターを導入することによって、単離された細胞の形質転換体が得られる。また、非ヒト動物の受精卵前核中へＤＮＡ顕微注入、ＥＳ細胞への相同組み換え、組み換えウイルスによる感染等を行うことによって非ヒト動物の形質転換体が得られる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５５】
＜プラスミドの構築＞
下記の方法にしたがい、プラスミドを作製した。使用したプライマーの塩基配列を、表１に示す。
【００５６】
【表１】
2015167527.tif 000003
【００５７】
プラスミドの調製に使用したマウスのＴｐｐ１（以下、「ｍＴｐｐ１」という。）の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2015167527.tif 000004
【００５９】
プラスミドの調製に使用したＨｓｃ７０ｂｍ領域の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表３に示す。
【００６０】
【表３】
2015167527.tif 000005
【００６１】
［ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ−ｍＴｐｐ１プラスミドの構築］
ｍＴｐｐ１（マウスＴｐｐ１の１−４１６アミノ酸領域）をコードするＤＮＡ断片をｐＧＡＤＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングしたプラスミドを鋳型として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び、表１に示した２種のプライマー（ＭＰＴＯＰ１ＢＡＳＥＦ、ＭＰＴＯＰ１２４８ＢＡＳＥＦ）を用いて、（９５℃で１分間）×１サイクル、（９５℃で２０秒間熱変性、５５℃で３０秒間アニーリング、６５℃で６分間伸長）×３０サイクル、（６５℃で５分間）×１サイクルでＰＣＲにより増幅した。こうして、５’末端にＥｃｏＲＩ及びＫｏｚａｋ配列、３’末端にＮｏｔＩを含むｍＴｐｐ１（１−４１６）遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。
【００６２】
得られた反応溶液をＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄに導入し、複数のクローンを得た。該クローン（ｐＧＡＤＴ７−ｍＴｐｐ１（１−４１６））及びｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、このベクターは発現ベクターに相当する。）をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ−ｍＴｐｐ１プラスミドを得た。
【００６３】
［Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドの構築］
表１に示したオリゴヌクレオチド（Ｈｓｃ７０ｂｍＦ２、Ｈｓｃ７０ｂｍＲ２）を等量ずつ混合し、９０℃で５分間静置した後、一晩徐冷しＨｓｃ７０ｂｍを２個含むオリゴヌクレオチドを作製した。ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ−ｍＴｐｐ１プラスミドをＮｓｐＶとＸｈｏＩで切断した。得られたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドを得た。Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図１（Ａ）に示す。図１（Ａ）中、「５ａａ」、「６ａａ」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「５ａａ」の配列はＡＡＡＲＧ（配列番号１６）であり、「６ａａ」の配列はＡＧＡＡＡＰ（配列番号１７）である。
【００６４】
［Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドの構築］
Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドを鋳型として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｌｅｎｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、表１に示したプライマー（ｍＴｐｐＨＡｔａｇＨｓｃ７０ｂｍＦ）を用いて、（９５℃で２分間）×１サイクル、（９５℃で２０秒間熱変性、５５℃で３０秒間アニーリング、６５℃で４分間伸長）×３０サイクル、（９５℃で２分間）×１サイクルでＰＣＲにより増幅した。こうして、ｍＴｐｐ１とＨｓｃ７０ｂｍの間にＨＡ  ｔａｇ配列を含む遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。得られた反応溶液をＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドを得た。Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）中、「１２ａａ」、「６ａａ」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「１２ａａ」の配列はＡＡＡＲＧＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１８）であり、「６ａａ」の配列はＡＧＡＡＡＰである。
【００６５】
［Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドの構築］
表１に示したオリゴヌクレオチド（Ｈｓｃ７０ｂｍＦ３、Ｈｓｃ７０ｂｍＲ３）を等量ずつ混合し、９０℃、５分間静置した後、一晩徐冷しＨｓｃ７０ｂｍを４個含むオリゴヌクレオチドを作製した。ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ−ｍＴｐｐ１プラスミドをＮｓｐＶとＸｈｏＩで切断した。得られたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを得た。Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドに挿入された遺伝子の構造を図１（Ｃ）に示す。図１（Ｃ）中、「５ａａ」、「６ａａ」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「５ａａ」の配列はＡＡＡＲＧであり、「６ａａ」の配列はＡＧＡＡＡＰである。
【００６６】
＜細胞培養及びトランスフェクション＞
下記の方法で、上記で調製した各プラスミドを、２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞）にトランスフェクションした。
【００６７】
［細胞培養用培地の調製］
２９３Ｔ細胞の継代に使用した細胞培養用培地の組成は下記のとおりである。
【００６８】
【表４】
2015167527.tif 000006
【００６９】
［トランスフェクション用培地の調製］
トランスフェクションにおいて使用したトランスフェクション用培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ（１×）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）である。
【００７０】
［細胞の調製方法］
液体窒素中に保存された２９３Ｔ細胞を常温の水浴中で５分間静置し、解凍した。細胞培養用培地９ｍｌと細胞液１ｍｌとを混合し、４℃、３０００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを作製した。該ペレットに細胞培養用培地１０ｍｌを加え懸濁した後、１００ｍｍ×２０ｍｍ細胞用ディッシュに播種し５．０％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【００７１】
［トランスフェクション］
上記で調製された８０〜９０％コンフルエントの細胞を、ＰＢＳバッファー  １０ｍｌで２回洗い、０．２５％−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク）１ｍｌを加え、３７℃、５分間保温後に細胞培養用培地１０ｍｌを加えて細胞を剥がした。得られた細胞を、血球計算板を用いて４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、６ウェルプレートに播種し、５．０％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養後、細胞をＰＢＳバッファーで２回洗い、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を各ウェルに１．５ｍｌ加えた。次いで、各ウェルあたり、各プラスミド  ８．０μｇ（トランスフェクション用培地２５０μｌ中で混合させたもの）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ２０μｌ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）の混合物（室温で２０分間静置したもの）を添加し、５．０％ＣＯ２、３７℃で４時間培養した。
【００７２】
＜細胞からのタンパク質抽出＞
細胞をＰＢＳバッファーで２回洗い、Ｍ−ＰＥＲ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）２００μｌ／ｗｅｌｌ（後述するオートファジー阻害剤を添加する場合は、５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加えて、ピペッティングにより細胞を破砕した。破砕物をチューブに入れ、小型回転培養機にて５分間反応させた後、４℃、１４０００ｇ、１０分間遠心分離し、ペレット以外の上清を抽出されたタンパク質として回収した。
【００７３】
＜タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動＞
各タンパク質をサンプルバッファー中に溶かし、トリシン系緩衝液（陽極バッファー、又は陰極バッファー）中で、室温、定電流下（３０ｍＡ）で泳動した。
【００７４】
各バッファー及びゲルの組成は下記のとおりである。
【００７５】
【表５】
2015167527.tif 000007
【００７６】
＜ウエスタンブロット及び免疫染色＞
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のタンパク質を、ウエスタンブロット及び免疫染色によって検出した。
【００７７】
［ウエスタンブロット（セミドライ式）］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲル上のタンパク質を、室温、定電流下（１．３ｍＡ／ｃｍ２）で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ一時間転写した。転写の際には、ブロッティングバッファーＡ乃至Ｃを使用した。転写後のメンブレンは１×ＰＢＳで洗浄し、ブロッキングバッファーに一晩浸した。ブロッキングされたメンブレンは、一次抗体溶液（一次抗体  ５μｌ、０．１％  ＳＤＳ、０．１％  カゼイン／１×ＰＢＳ）５ｍｌで一時間免疫染色した後、０．１％  ＰＢＳＴで洗浄した。さらに遮光条件下で、二次抗体溶液（二次抗体  ５μｌ、０．１％  ＳＤＳ、０．１％  カゼイン／１×ＰＢＳ）５ｍｌで一時間免疫染色した後、０．１％  ＰＢＳＴ、１×ＰＢＳで洗浄した。タンパク質の検出は、Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて７００ｎｍ又は８００ｎｍで行った。
【００７８】
各バッファーの組成は下記のとおりである。
【００７９】
【表６】
2015167527.tif 000008
【００８０】
１次抗体及び２次抗体は下記のものを使用した。
【００８１】
【表７】
2015167527.tif 000009
【００８２】
＜実施例１：ｍＴｐｐ１の分解効率の検討＞
ｍＴｐｐ１領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域を含む融合タンパク質が発現した場合、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域と分子シャペロンであるＨｓｃ７０とが結合し、シャペロン介在性オートファジーの作用により、該結合体がリソソームまで運搬される。その結果、該結合体はリソソーム内のプロテアーゼによって分解される。したがって、シャペロン介在性オートファジーが生じたかどうかは、ｍＴｐｐ１の分解物を検出することによって確認できる。そこで、本実施例においては、シャペロン介在性オートファジーが生じるかどうかを検討するために、下記の方法にしたがい、上記で調製した各プラスミドを使用して発現させたｍＴｐｐ１の分解物を検出し、その分解効率を算出した。
【００８３】
トランスフェクションから４時間後に、培地を（１）細胞培養用培地のみ、（２）細胞培養用培地及び５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、（３）細胞培養用培地及び１５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ及び１００μＭ  クロロキンのいずれかに交換した。ＮＨ４Ｃｌ及びクロロキンは、いずれもシャペロン介在性オートファジー阻害剤である。
【００８４】
トランスフェクションから２４時間後にＭ−ＰＥＲ  ２００μｌを用いて、上記の方法によって抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング後、免疫染色でタンパク質を検出した。その結果を図２（Ｂ）に示す。なお、内部標準としてβ−アクチンを使用した。
【００８５】
図２（Ｂ）において、最も左端のレーンは、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ  −ｍＴｐｐ１プラスミドを使用して発現させたｍＴｐｐ１（つまり、Ｈｓｃ７０ｂｍを含まないタンパク質）を使用した結果である。
図２（Ｂ）において、最も右端のレーンは、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣベクター（発現ベクター）を使用して発現させたタンパク質（つまり、ｍＴｐｐ１及びＨｓｃ７０ｂｍを含まないタンパク質）を使用した結果である。
図２（Ｂ）において、左側の１乃至３レーンは、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドを使用し、かつ、上記（１）乃至（３）のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図２（Ｂ）において、真ん中の１乃至３レーンは、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドを使用し、かつ、上記（１）乃至（３）のいずれかの培地を使用した結果を示す。
図２（Ｂ）において、右側の１乃至３レーンは、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを使用し、かつ、上記（１）乃至（３）のいずれかの培地を使用した結果を示す。
【００８６】
ｍＴｐｐ１の分解効率は、図２（Ｂ）の各レーンにおける「Ｔｐｐ１分解産物」のバンド強度の合計値を、バンド強度の合計値で割ることによって求めた。その結果を図２（Ａ）に示す。
【００８７】
図２（Ａ）及び（Ｂ）の各レーン１に示されるとおり、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミド、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミド及びＴｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドのいずれのプラスミドを使用しても、ｍＴｐｐ１の分解効率は高かった（それぞれ、２３．５％、３０．５％、３３．０％）。他方、オートファジー阻害剤の存在下で細胞培養して得られたタンパク質を示す図２（Ａ）及び（Ｂ）の各レーン２及び３においては、ｍＴｐｐ１の分解効率が低かったことから、これらのレーンにおいては、オートファジーが阻害され、ｍＴｐｐ１の分解が生じなかったことがわかる。つまり、図２（Ａ）及び（Ｂ）の各レーン１において認められたｍＴｐｐ１の分解は、シャペロン介在性オートファジーによるものであることがわかる。
【００８８】
また、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドを使用した結果と、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドを使用した結果とを比較すると、ｍＴｐｐ１とＨｓｃ７０ｂｍの間のスペーサー配列が長い後者のプラスミドの方が高い分解効率を示した。
【００８９】
Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（−）ＨＡプラスミドを使用した結果と、Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを使用した結果とを比較すると、付加されたＨｓｃ７０ｂｍの数が２個多い後者のプラスミドの方が高い分解効率を示した。
【００９０】
＜実施例２：シャペロン介在性オートファジー作用に関する検討＞
実施例１で認められたオートファジーが、シャペロン介在性オートファジーによるものかどうかを確認するため、シャペロン介在性オートファジー以外の経路のオートファジー阻害剤の存在下で実施例１同様の試験を行った。
【００９１】
具体的には、トランスフェクションから４時間後に、培地を（１）細胞培養用培地のみ、（２）細胞培養用培地及び１０ｍＭ又は５０ｍＭの３−ＭＡ、（３）細胞培養用培地及び５μＭ又は５０μＭのＭＧ１３２のいずれかに交換した。３−ＭＡ（３−メチルアデニン）は、マクロオートファジー阻害剤である。ＭＧ１３２は、ユビキチン・プロテアソーム分解系阻害剤である。
【００９２】
トランスフェクションから２４時間後にＭ−ＰＥＲ  ２００μｌを用いて、上記の方法によって回収したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング後、免疫染色でタンパク質を検出した。その結果に基づき、実施例１同様にＴｐｐ１の分解効率を算出した結果を図３に示す。なお、図３において、「Ｔｐｐ１」は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ−ｍＴｐｐ１プラスミドを使用して発現させたｍＴｐｐ１（つまり、Ｈｓｃ７０ｂｍを含まないタンパク質）を使用した結果である。「Ｔｐｐ１−Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡ」、「（＋）ＮＨ４Ｃｌ」、「（＋）ＮＨ４Ｃｌ，クロロキン」は、それぞれ、図２（Ａ）の真ん中の１乃至３レーンと同一の結果である。
【００９３】
図３に示されるとおり、シャペロン介在性オートファジー機構以外のタンパク質分解に対する阻害剤（３−ＭＡ、及びＭＧ１３２）を添加した場合には、シャペロン介在性オートファジー阻害剤（ＮＨ４Ｃｌ、及びクロロキン）を添加した時と比較して、ｍＴｐｐ１の分解効率が低下しなかった。つまり、実施例１で認められたｍＴｐｐ１の分解は、主にシャペロン介在性オートファジー作用によって生じたものであることがわかる。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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