(57)【要約】      （修正有）【課題】さまざまな酵母株の塩基配列情報の違いから、酵母株を、味噌・醤油醸造業上重要な特徴の異なる株群（グループ）に区分けする方法の提供。【解決手段】Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分に相当する塩基配列部分の有無を指標に、味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品などから分離される酵母株群を、［１］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株と［２］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株とに区分けする酵母株の判別法、及び判別法を用いる味噌・醤油（製品）及びその仕掛品の検査法。【選択図】図１１０
2015228833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分の有無を指標に、味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）などから分離される酵母株群を、［１］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株と［２］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株とに区分けする酵母株の判別法、及び本法を用いる事を特徴とする味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などの検査法。
【請求項２】
請求項１の、酵母株における、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分の有無を調べるために、同塩基配列部分ないしはその上流及び下流にある、蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ））上の部分塩基配列を参考にして設計した合成ヌクレオチドを用いて同塩基配列部分を増幅させるＰＣＲ法を用いる事を特徴とする、請求項１及び請求項５の判別法。
【請求項３】
Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）を含む、３７４４２９番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３９）」に相当する塩基配列部分か、あるいは「３７４４２９番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３９）から、プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）を除いた塩基配列部分、すなわち３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３８）に相当する塩基配列部分」に相当する塩基配列部分かのいずれかの有無を指標に、味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）などから分離される酵母株群を、［１］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株と［２］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株とに区分けする酵母株の判別法、及び本法を用いる事を特徴とする味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などの検査法。
【請求項４】
請求項３の、酵母株における、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）を含む、３７４４２９番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３９）」に相当する塩基配列部分か、あるいは「３７４４２９番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３９）から、プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）を除いた塩基配列部分、すなわち３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３８）」に相当する塩基配列部分かのいずれかの有無を調べるために、同塩基配列部分ないしはその上流及び下流にある、蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ））上の部分塩基配列を参考にして設計した合成ヌクレオチドを用いて同塩基配列部分を増幅させるＰＣＲ法を用いる事を特徴とする、請求項３及び請求項５の判別法。
【請求項５】
Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分及び、「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）を含む、３７４４２９番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３９）」に相当する塩基配列部分または「３７４４２９番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３９）から、プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）を除いた塩基配列部分、すなわち３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３８）」に相当する塩基配列部分の有無を指標に、味噌・醤油及び醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）などから分離される酵母株群を、［１］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株と［２］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株とを区分けする酵母株の判別法、及び本法を用いる事と特徴とする味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などの検査法。
【請求項６】
上記の請求項１、請求項３、請求項５によって区分けされる、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの塩基配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの塩基配列部分（＝配列番号３８）」に相当する塩基配列部分を持ち、かつ／または「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの塩基配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分を持つ酵母株群を、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）」に相当する塩基配列部分の有無を指標に、［１］−２．味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）などといった環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、いわゆる味噌・醤油主発酵酵母株と［１］−１．それ以外のＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株、すなわち味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）などといった環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）」以外の環境から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能が低いために、味噌・醤油醸造に利用する事が難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とに区分けする酵母株の判別法、及び本法を用いる事を特徴とする味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などの検査法。
【請求項７】
上記の請求項１、請求項３、請求項５によって区分けされる、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３８）」に相当する塩基配列部分を持ち、かつ／または「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分を持つ酵母株群の中から、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）」に相当する塩基配列部分の有無を指標に、味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）などといった環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、すなわち味噌・醤油醸造用の種酵母株（または実用株）として利用できる味噌・醤油主発酵酵母株を選択する方法、及び本法を用いて取得した種酵母株を用いる事を特徴とする味噌・醤油の醸造方法。
【請求項８】
上記の請求項１、請求項３、請求項５、請求項６によって区分けされる、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの塩基配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３８）」に相当する塩基配列部分を持ち、かつ／または「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分を持つが、かつＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）」に相当する塩基配列部分は持っていない酵母株群を、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上の３７４４９８番目の塩基に相当する塩基がシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ（Ｃ））であるか、あるいはチミン（Ｔｙｍｉｎｅ（Ｔ））であるかを指標に、［１］−２−２．（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）中で皮膜を形成し、それらの品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株と［１］−２−１．（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く）味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、しかも皮膜を形成する能力を持たない事から、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株とに区分けする酵母株の判別法、及び本法を用いる事を特徴とする味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などの検査法。
【請求項９】
上記の請求項１、請求項３、請求項５、請求項６によって区分けされる、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「３７４４２９番目の塩基から３７４５１２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３６）と３７６２６４番目の塩基から３７６６７２番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３８）」に相当する塩基配列部分を持ち、かつ／または「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分を含む、１１３２４５４番目の塩基から１１３３７８８番目の塩基までの配列部分（＝配列番号４１）」に相当する塩基配列部分を持つが、かつＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上にある「プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い３７４５１３番目の塩基から３７６２６３番目の塩基までの配列部分（＝配列番号３７）」に相当する塩基配列部分は持っていない酵母株群の中から、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上の３７４４９８番目の塩基に相当する塩基がシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ（Ｃ））であるか、あるいはチミン（Ｔｙｍｉｎｅ（Ｔ））であるかを指標に、「味噌・醤油（製品）及びその醸造工程中の仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、しかも皮膜を形成する能力を持たない事から、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」、すなわち味噌・醤油醸造用の種酵母株（または実用株）として相応しい株を選択する方法、及び本法を用いて取得した種酵母株を用いる事を特徴とする味噌・醤油の醸造方法。
【請求項１０】
請求項４のＰＣＲ法で調製した増幅産物を制限酵素ＭａｅIIIで処理する事によって生じる分解断片のパターン、すなわち分解断片の本数と各断片の鎖長を調べる事を特徴とする、請求項８及び請求項９の判別法（ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母が持つ染色体上の特定の塩基配列部分の特徴を利用した［Ａ］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉの判別（または区分け）法と、特に［Ｂ］現行の分類上はＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉという１属１種に包括されており、区分けされていない、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）由来の、高濃度の食塩（＝塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））を含む味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それらの諸味中でのエタノール生産性能（または発酵能）が高いＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株の判別（または区分け）法と、さらに［Ｃ］醤油中で皮膜を形成する能力を有する、すなわち醤油産膜性Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ株の判別（または区分け）法、及びこれらの方法を利用した味噌・醤油製造工程の工程管理、及び製品（味噌・醤油）、仕掛品である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油などの品質管理に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油（しょうゆ）は、日本料理において欠かす事ができない、代表的な調味料である。醤油の起源（ルーツ）は、少なくとも紀元前７００〜８００年頃か、あるいはそれ以前から既に中国にあったとされる「醤（ひしお）」ではないかとされ、同じく日本料理においてよく用いられる５つの調味料「さしすせそ（さとう（砂糖）・しお（塩）・す（酢）・せうゆ（＝しょうゆ）・みそ）」のうちの１つ、味噌（みそ）の起源も、同じくこの醤や「（し、和名：クキ）」ではないかと言われている。これらが、中国大陸から、ないしは朝鮮半島経由で日本に伝えられ、その後の時代の流れの中で、日本風に、また地域ごとにも改変が加えられて、現在の醤油や味噌の形になったものと見られている（キッコーマン株式会社：キッコーマン株式会社八十年史、ｐ９−１４（序：しょうゆ小史）  （２０００）、久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ１３２−１４０及びｐ１９１−１９２  日本醤油協会  （２０１２））。
【０００３】
そのため、現在、日本国内には、地域ごとでの改変によって生まれた数種類の醤油がある。現在、国内で醸造されている醤油としては、「濃口醤油（こいくち（しょうゆ））」、「淡口醤油（うすくち（しょうゆ））」、「溜醤油（たまり（しょうゆ））」、「再仕込（み）醤油（さいしこみ（しょうゆ））」、「白醤油（しろ（しょうゆ））」があり、これらの醤油の品質は日本農林規格（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＪＡＳ））で規格化されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｆｆ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ／ｊａｓ／ｊａｓ＿ｋｉｋａｋｕ／ｐｄｆ／ｋｉｋａｋｕ＿ｓｙｏｕｙｕ＿ｈ２１０８３１．ｐｄｆ（農林水産省ホームページ「しょうゆの日本農林規格（ＰＤＦ：３５１ＫＢ）」））。このうち、現在の国内での醤油製造量のうちの８０％以上を占めるのが「濃口醤油」であり、さらにその８割は（同じく日本農林規格（ＪＡＳ）で定められている３種類の製法、すなわち「本醸造」、「混合醸造」、「混合」のうちの）「本醸造」方式で製造されている（横塚保（著）：日本の醤油  その源流と近代工業化の研究、ｐ２１、ライフリサーチプレス  （２００４）、北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性、ｐ１１−１８（石川雄章（著））、シーエムシー出版  （２００６）、一島英治（著）：［ものと人間の文化史１３８］麹（こうじ）、ｐ１３８、法政大学出版局  （２００７）、久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ１１−１４、ｐ３１−３６及びｐ１７８−１７９、日本醤油協会  （２０１２））。
【０００４】
本醸造の濃口醤油は、大豆（脱脂加工大豆を含む）、小麦、食塩などを原料に、「麹菌（または麹カビ）」と呼ばれるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリゼ）、ないしはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ（アスペルギルス・ソーヤ）が生産する酵素の作用と、耐塩性の醤油乳酸菌（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ（＝旧：Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ（テトラジェノコッカス（＝旧：ぺディオコッカス）・ハロフィラス）、以下、Ｔ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓと略す）や醤油酵母による発酵とを利用して製造する発酵調味料であり、それゆえに醤油醸造において、仕込み工程及びそれ以降の製造工程での醤油酵母や醤油乳酸菌などの微生物管理は高い品質の醤油を製造するための重要な要素の１つである。
【０００５】
醤油の仕込み工程は、その醤油諸味の成分変化と微生物の挙動の特徴から、大きく４つの過程に分ける事ができる。すなわち、仕込み直後からの［１］麹菌由来の酵素の作用による小麦澱粉や大豆蛋白質の分解過程と、その後に続く［２］醤油乳酸菌（Ｔ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）による乳酸発酵過程、［３］醤油酵母によるアルコール発酵過程、そして［４］熟成（または後熟）過程の４つである。
【０００６】
醤油の醸造に関わる酵母、すなわち醤油酵母としては、仕込み工程における過程［３］、すなわち醤油酵母によるアルコール発酵過程を中心に、醤油諸味のエタノール発酵と香気形成に関与する「醤油主発酵（または醗酵）酵母」であるＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ（＝チゴサッカロミセス（またはチゴサッカロマイセス）・ルーキシー。以下、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと略す）や、醤油諸味の香気形成に関わる「熟成酵母（または後熟酵母）」であるＣａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ（＝キャンディダ（またはカンジダ）・バーサティルス。以下、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓと略す）が挙げられる。醤油諸味中からは、これらの酵母の他に、Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ（＝キャンディダ（またはカンジダ）・エッチェルシー。以下、Ｃ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉと略す）などもよく分離される。醤油諸味から分離されるこれらの醤油酵母は、一般的な酵母などよりも遥かに強い食塩（＝塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））耐性能（注：以下、耐塩性能と略す）を持っている。
【０００７】
これらの酵母（＝醤油酵母）の他に、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓやＣ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ以外のＣａｎｄｉｄａ属酵母、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属酵母（＝デバリオミセス（またはデバリオマイセス）属酵母）やＨａｎｓｅｎｕｌａ属酵母（＝ハンセヌラ属酵母）、Ｐｉｃｈｉａ属酵母（＝ピキア属酵母）などが醤油諸味から分離される事もあるが、これらの酵母はいずれも耐塩性能が弱く、醤油諸味中ではほとんど増殖できない。そのため、これらの酵母については、あくまで醤油諸味に混入した汚染酵母と見做し、「醤油酵母」や、あるいは「熟成酵母（または後熟酵母）」とは呼ばないのが一般的である。醤油諸味中の酵母（菌）叢（フローラ）の大部分がこうした醤油酵母のみによって構成されている事は、寒天培地などを用いる一般的な培養法による菌叢（フローラ）解析結果からだけでなく、たとえば田中らのグループによる、ヤマサ醤油株式会社の銚子工場での、２００４〜２００６年の醤油諸味を対象とした、培養「非」依存的な酵母（菌）叢（フローラ）解析手法である「ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））法」での解析結果からも確認されている（田中泰史、渡部潤、茂木喜信：醤研、３８（６）、３４７−３５６  （２０１２）、Ｙ．Ｔａｎａｋａ，Ｊ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．Ｍｏｇｉ：Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１（１），１００−１０６  （２０１２））。
【０００８】
濃口醤油や、その醸造工程での仕掛品である醤油諸味や生揚げ醤油などは、１６％前後ないしはそれ以上の、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含んでいるために、そうした環境で生育できるのは上記のような特定の微生物だけである。昔の醤油の仕込み工程では、木桶などの「開放型」の仕込み容器を用い、現在は一部の醤油メーカーが行なっているような人為的な微生物（＝種菌や種酵母）の添加（または接種）も行なわれず（栃倉辰六郎（編著）：増補  醤油の科学と技術、ｐ１４２（門脇清（著））、日本醸造協会  （１９９４））、しかも仕込み期間も数ヶ月から、長い場合には１〜２年にも及ぶものであったにも関わらず、それでも腐敗したりせずに醤油をきちんと醸造できていたのは、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む醤油諸味中では、醤油酵母と総称される、こうした特定の微生物しか生育できないからである。そのため、『（ｐ１２５）工場にゆけば空樽の上で居眠りしていても醤油はできる』と揶揄する者もいるほどに、つまりは『（ｐ１２０）掘立小屋にもろみを置いて何もしないでおくものだ』というのが、昔の醤油の醸造方法であったという（横塚保（著）：日本の醤油  その源流と近代工業化の研究、ライフリサーチプレス  （２００４））。
【０００９】
また、製品（＝醤油。ただし減塩醤油などを除く）も、同様に高濃度の食塩（ＮａＣｌ）（やさらにはエタノール、有機酸など）を含んでいるため、（後記する通り、醤油メーカーでは冷蔵保存する事を推奨してはいるものの）開栓後も常温保管されるのが一般的で、醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の混入による皮膜形成（後記）を除けば、腐敗する事はほとんどない。たとえば、三瀬勝利・井上富士男（編）の「食品中の微生物検査法解説書（講談社サイエンティフィク  （１９９６））」中の、醤油中の微生物検査法に関する章、すなわち「５．１９  調味料類―しょう油、つゆなど（ｐ２８６−２９０（木島卓・今井廣敬（著）））」の「Ａ.微生物規格基準」の項にも、『（ｐ２８８）食品衛生上問題となる微生物は生育せず、微生物規格はない。また指導基準もない。耐塩性微生物が主な汚染対象菌である。』とあり、それゆえに「５．１９．３  検査法」の「Ｃ．検査項目と手順」にも、『（ｐ２９０）食品衛生微生物は、成分上から生育せず、また殺菌、密封を行っているため、必ずしも検査の必要は認められない。』と記されている。醤油自体に殺菌力があり（山本泰、森谷悌治、辻原輝明：醤研、４（３）、１０１−１０４  （１９７８）、増田進、工藤由紀子、熊谷進：醤研、２４（５）、２７５−２８１（１９９８））、この醤油の持つ殺菌力は古くから醤油漬などの保存食品にも利用されてきた（大森邦英：醤研、１（４）、２０８−２１２  （１９７５））。
【００１０】
醤油と較べると食塩（ＮａＣｌ）濃度は５〜１３％程度とやや低いものの、原材料や製法が似ている味噌（後記）の場合にも、大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリー。以下、Ｅ．ｃｏｌｉと略す））（腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ））  Ｏ１５７：Ｈ７を含む）や腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ属）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカス・アウレウス））、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（サルモネラ・エンテリティダス）など）などを人為的に接種したとしても、食塩（ＮａＣｌ）などによる水分活性（Ａｗ＝０．６８〜０．８２）やｐＨの低さ（ｐＨ≒５）、アルコールなどの作用により、醤油の場合と同様に、日数経過に伴って死滅してしまう事が報告されており（窪田譲、伊藤公雄、望月務：醸協、７６（１２）、８２１−８２６  （１９８１）、伊藤公雄、今井学、石神実、武田茂、安平仁美：味噌の科学と技術、３１（３）、１０２−１０６  （１９８３）、中央味噌研究所資料：味噌の科学と技術、４５（７）、２７４−２８２  （１９９７）、伊藤公雄、武田茂、桜井令子、北村靖則、原山文徳：味噌の科学と技術、４７（７）、２４３−２４６  （１９９９））、実際に全国６５の工場で製造された計１０１点の市販の味噌（注：市販味噌の各種成分値（範囲）は、水分３７．５〜５９．７％、食塩５．１〜１４．３％、全糖３．９〜３６．１％、ｐＨ＝４．６１〜５．２２）を調べた調査（伊藤公雄、窪田譲、今井学、望月務：味噌の科学と技術、２６４、３２−３３  （１９７４））や食塩４％の米味噌を調べた調査（松本伊左尾、今井誠一：醸協、７３（１）、５６−５８  （１９７８））でも、大腸菌群や腸炎ビブリオなどは検出されなかったという（三瀬勝利・井上富士男（編）：食品中の微生物検査法解説書、ｐ２７９−２８６（好井久雄（著））、講談社サイエンティフィク  （１９９６））。
【００１１】
上記した通り、醤油も味噌もその起源（ルーツ）は同じだと考えられ、それゆえに「普通味噌」の中でも、米味噌（注：ただし米甘味噌を除く）や麦味噌などの、仕込み工程（特に発酵・熟成工程）における味噌の中の（味噌）酵母の種類や挙動は、醤油の仕込み工程における醤油諸味中の（醤油）酵母の種類や挙動と非常によく似ており、米味噌や麦味噌の製品や仕掛品からも、醤油諸味などの場合と同様に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉやＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｅｔｉｃｈｅｌｌｓｉｉなどの酵母が分離される（野白喜久雄・小崎道雄・好井久雄・小泉武夫（編）：改訂  醸造学、ｐ１５１−１８１（好井久雄（著））及びｐ１８２−２０２（伊藤寛（著））、講談社サイエンティフィク  （１９９３）、藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ１６２−１６９（好井久雄（著））、幸書房  （２００１）、北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性、ｐ１１−１８（石川雄章（著））、シーエムシー出版  （２００６））。それゆえに、これらの酵母は、「味噌・醤油酵母」と呼ばれる事もある（注：「普通味噌」は、用いる原料の違いに基づき、米味噌、麦味噌、豆味噌及びこれらを混ぜ合わせた調合味噌に大別されるが、この米味噌の中に区分けされている「米甘味噌」は、きわめて短期間で造る、いわゆる酵素分解型の味噌であり、ゆえに仕込み工程での味噌酵母の増殖とそれに伴うアルコール発酵はほとんどない。また、米や麦を使わずに、大豆と食塩のみで製造する「豆味噌」（石田卓：醸協、６４（９）、７９９−８０４  （１９６９））は、原料として米や麦を加える米味噌や麦味噌、江戸時代頃から大豆と小麦とを等量ないしはそれに近い比率で使用するようになったとされる日本の醤油諸味（キッコーマン株式会社：キッコーマン株式会社八十年史、ｐ９−１４（序：しょうゆ小史）  （２０００））などに較べて、味噌・醤油主発酵酵母の発酵源となる糖分が少ないために、仕込み工程での味噌主発酵酵母の増殖とそれに伴うアルコール発酵はほとんどない（山里一英・宇田川俊一・児玉徹・森地敏樹（編）：微生物の分離法、ｐ２８６−２９２（好井久雄（著））、Ｒ＆Ｄプランニング  （１９８６）、藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ１６２−１６９（好井久雄（著））、幸書房  （２００１）、伊藤明徳：味噌の科学と技術、５１（３）、７９  （２００３））。中国の伝統的な醤油も、大豆と少量の小麦ないしは小麦粉とでつくるために、やはり諸味中の糖分が日本の醤油諸味と較べると少なく、醤油酵母による発酵はほとんどなく、ゆえに製品中のアルコール濃度は０〜０．８％程度と、非常に低い（栃倉辰六郎（編著）：増補  醤油の科学と技術、ｐ５０８−５１２（林和也（著））、日本醸造協会  （１９９４）、吉沢淑・石川雄章・蓼沼誠・長澤道太郎・永見憲三（編）：醸造・発酵食品の事典、ｐ４０２−４３０（林和也・森修三（著））、朝倉書店  （２００２）、関根一男：キッコーマン情報、１３７（２００３−１）、６−９  （２００３）））。
【００１２】
味噌・醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉは、分類上は、以前はＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｏｊａ（チゴサッカロミセス（またはチゴサッカロマイセス）・ソーヤ）やＺ．ｍａｊｏｒ（マヨ（ー）ル）など、また一時期は清酒、焼酎・泡盛などの醸造やパン生地の発酵に関わる清酒酵母・焼酎酵母（泡盛酵母を含む）・パン酵母などのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（＝サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・セレヴィジエ。以下、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと略す）と同じＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（＝サッカロミセス属）に分類され、それゆえにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ（＝サッカロミセス・ルーキシー。以下、Ｓ．ｒｏｕｘｉｉと略す）との学名で呼ばれていた事もあったが（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９７０）、吉田忠：北海道大学農学部邦文紀要、８（４）、２８９−３４７  （１９７３））、現在では有性的生活環の違いなどから、同じサッカロミセス科（またはサッカロミケス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ））の中の別属であるＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（チゴサッカロミセス属）の株として取り扱われている。
【００１３】
味噌や醤油の製造工程における仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）や製品（である味噌・醤油）などから分離されるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株は、エタノール耐性能についてはＳ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅよりも弱いものの、２０〜２２％の食塩（ＮａＣｌ）存在下でも生育できるという、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅよりも遥かに強い耐塩性能を有しているため、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む味噌・醤油諸味中で増殖し、エタノール発酵を行なう事ができる（久寿米木一裕：醸協、９６（１）、３３−４２  （２００１））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、上記した通り、清酒や焼酎・泡盛などの醸造やパン生地の発酵などの醸造・発酵食品産業分野で幅広く利用されているものの、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉよりも耐塩性能が遥かに弱いために、これを使って一般的な味噌・醤油諸味をエタノール発酵させる事はできない。味噌では、ワイン酵母のＯＣ−２株や清酒酵母のきょうかい７号（Ｋ７）を用いた醸造例（ケース）の報告もあるにはあるが、たとえばきょうかい７号（Ｋ７）の耐塩性能は７〜８％前後までと弱く（清酒酵母研究会（編）：清酒酵母の研究  ―８０年代の研究―、ｐ１０１−１１０（吉田清（著））、清酒酵母研究会  （１９９２））、それゆえに「こうした実施例」は一般的な味噌よりも仕込み時の食塩（ＮａＣｌ）濃度を３〜４％と低くした、いわゆる「低塩味噌」に関するものに過ぎない（久寿米一裕、工藤真豪：醸協、９８（１）、１１−１８  （２００３））。味噌・醤油諸味中での醤油主発酵酵母（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の挙動こそが、味噌・醤油諸味、そしてそれらを製品化させた味噌・醤油中のエタノール濃度を決定づける。
【００１４】
さらに、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉは、このアルコール発酵過程において、イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）や２−フェニルエタノール（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ）、メチオノール（ｍｅｔｈｉｏｎｏｌ、正式には３−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）、カラメル様の甘い香りを呈する４−ヒドロキシ−２（または５）−エチル−５（または２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２（ｏｒ  ５）−ｅｔｈｙｌ−５（ｏｒ  ２）−ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｆｕｒａｎｏｎｅ（ＨＥＭＦ））（Ｎ．Ｎｕｎｏｍｕｒａ，Ｍ．Ｓａｓａｋｉ  Ｙ．Ａｓａｏ  ａｎｄ  Ｔ．Ｙｏｋｏｔｓｕｋａ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０（３），４９１−４９５  （１９７６））などの、醤油特有の香気成分の生成にも関与する（林田安生、西村賢了、Ｊ．コリンスローター：醸協、９３（９）、７３０−７３８  （１９９８）、Ｅ．Ｓｕｇａｗａｒａ＆Ｙ．Ｓａｋｕｒａｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（４），７４９−７５２  （１９９９））。
【００１５】
醤油諸味からよく分離される醤油酵母としては、上記したように、他に、Ｃａｎｄｉｄａ属に分類されるＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓやＣ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉが挙げられる。
【００１６】
Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓは、醤油麹中のフェルラ酸（ｆｅｌｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）やｐ−クマル酸（ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）などの桂皮酸類を脱炭酸し、還元して４−エチルグアヤコール（４−ｅｔｈｙｌ  ｇｕａｉａｃｏｌ（４−ＥＧ））や４−エチルフェノール（４−ｅｔｈｙｌ  ｐｈｅｎｏｌ（４−ＥＰ））などの揮発性フェノール類を生成する能力を持っており、この４−ＥＧなどは醤油に「重厚感」を与える特徴香を構成する揮発性成分の１つとして知られている（横塚保、逆井利夫、浅尾保夫：農化、４１（９）、４２８−４３３  （１９６７）、横塚保、逆井利夫、浅尾保夫：農化、４１（９）、４３４−４４１  （１９６７）、横塚保、逆井利夫、浅尾保夫：農化、４１（９）、４４２−４４７  （１９６７））。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉは、この生成能力を持っていない（横塚保、逆井利夫、浅尾保夫：農化、４１（９）、４３４−４４１  （１９６７）、末澤保彦：農化、６９（１２）、１５８７−１５９６（１９９５））。
【００１７】
ただし、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓが生成するこうした揮発性成分が醤油の香気成分としてどの程度「重要」なのかという評価は、あくまで個人差を伴う嗜好性に基づくものであるがゆえに、意見が分かれるところでもある。４−ＥＧの刺激閾値は非常に低く、ｐｐｍ濃度でも認知され（横塚保、逆井利夫、浅尾保夫：農化、４１（９）、４４２―４４７  （１９６７））、醤油ではわずか０．１ｐｐｍの濃度差が嗜好性を左右する（横塚保（著）：日本の醤油  その源流と近代工業化の研究、ｐ１５３、ライフリサーチプレス  （２００４））。化学合成４−ＥＧの添加による嗜好性評価試験では、最適値は０．８ｐｐｍ．（で、同時にメチオノールとの成分和が４．５ｐｐｍ前後となる状態）とされ（森修三、布村伸武、佐々木正興：日本農芸化学会大会（宮城学院女子大学（仙台））講演要旨集、昭和５８年度、ｐ２３６（講演番号２Ｏ−７）、１９８３−０３−３０  （１９８３）、森修三、佐々木正興、布村伸武：醸協、８１（１０）、７０１−７０６  （１９８６）、佐々木正興、森修三：醸協、８６（１２）、９１３−９２２  （１９９１））、また市販の醤油の官能評価試験で上位１０位に入選した醤油中の４−ＥＧ濃度は０．５〜１ｐｐｍ、最大でもせいぜい２ｐｐｍ程度であったとの報告もあり（横塚保、浅尾保夫、逆井利夫：農化、４１（９）、４４２−４４７  （１９６７））、Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ（＝Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）株と一緒に、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ株やＣ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ株も添加して醸造した（醤油）製品のほうが市場での嗜好性が高いと評する者もいる一方で（横塚保（著）：日本の醤油  その源流と近代工業化の研究、ｐ７４、ライフリサーチプレス  （２００４））、４−ＥＧがこの濃度水準を超えて過剰になると、薬品臭くなり、逆に官能的に嫌われたり、製品としての醤油の価値を損ねさせてしまう事があるのも事実である（栃倉辰六郎（編著）：増補  醤油の科学と技術、ｐ１４６（門脇清（著））、日本醸造協会  （１９９４）、久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ９６−９８、日本醤油協会  （２０１２））。
【００１８】
Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓが醤油諸味に及ぼす影響として知られているのは、現時点ではこの４−ＥＧや４−ＥＰの生成に関するものだけである。さらに、Ｃ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉに至っては、このような能力さえ持っておらず（奥沢洋平、板倉徹、江口卯三夫：醤研、８（１）、２１−２７  （１９８２）、末澤保彦：農化、６９（１２）、１５８７−１５９６（１９９５））、それゆえに仕込み工程での醤油諸味に果たす役割自体が不明である。そのため、仕込み工程での醤油諸味の発酵・熟成への関与が明確な醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉとこの４−ＥＧなどの生成に関わるＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、あるいは醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉのみを「醤油酵母」と呼ぶべきだと主張する専門家もいる（森治彦：醸協、９６（７）、４７５−４８２  （２００１）、森治彦：醸協、９６（８）、５３５−５４１  （２００１））。
【００１９】
いずれにせよ、上記した、分類学的にはわずか２属２種ないしは３種程度の醤油酵母が仕込み工程の醤油諸味中で増殖して、エタノールや香気成分を生産する事で、醤油の特徴的な味や香りがつくりあげられると言っても過言ではなく、さらに（醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉと熟成酵母（または後熟酵母）であるＣａｄｉｄａ属酵母とをひとまとめにして「醤油酵母」と呼ぶ事が多いものの）醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉが醤油の品質に及ぼす影響は、熟成酵母（または後熟酵母）であるＣａｎｄｉｄａ属酵母が及ぼす影響に較べると、「遥かに」大きい。味噌における発酵の主体もＺ．ｒｏｕｘｉｉであり、長熟発酵型の味噌の場合には、これに熟成酵母（または後熟酵母）であるＣａｎｄｉｄａ属酵母などが加わってくる（山里一英・宇田川俊一・児玉徹・森地敏樹（編）：微生物の分離法、ｐ２８６−２９２（好井久雄（著））、Ｒ＆Ｄプランニング  （１９８６））。
【００２０】
そのため、［Ａ］味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）中の味噌・醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のみに注目し、このＺ．ｒｏｕｘｉｉ株と、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母など、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株とを判別（または区分け）する事は、味噌・醤油醸造工程及び製品などの品質管理上きわめて重要な事であり、これらを判別（または区分け）する方法は産業上有用である。
【００２１】
Ｚ．ｒｏｕｘｉｉが分離されるのは、味噌・醤油の製造工程における仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）や製品（である味噌・醤油）だけではない。「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外にも、たとえばしば漬や千枚漬、たくあん漬、ぬかみそ漬、味噌漬、奈良漬、福神漬などの漬物、フナやハゼなどの甘露煮、ソース、ごまだれ、ドレッシングなどの調味料、蜂蜜、糖蜜やシロップ、さらには鶯餅（うぐいすもち）、最中（もなか）、ぜんざい、ババロア、モンブラン、エクレア、シュークリーム、パウンドケーキ、ショートケーキといった和洋菓子など、高濃度の糖質を含む、浸透圧の高い食品などからも、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉは分離される。ただし、このような「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外でのＺ．ｒｏｕｘｉｉの分離例の大半は、あくまで食品に混入した「汚染酵母」としての事例（ケース）である（内藤茂三：醤研、３３（５）、３４９−３６２  （２００７）、内藤茂三：食衛誌、４９（１）、Ｊ１−８  （２００８））。
【００２２】
味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された株と、たとえば蜂蜜や和洋菓子など、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の「分離源」から分離された株とは、現行の分類では、区別される事なく、ともにＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている。そもそも、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株（ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＢＣＲＣ２１５０６株＝ＤＢＶＰＧ６１８７株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＭＵＣＬ３０２５４株＝ＮＢＲＣ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）も、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）からではなく、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪（かもろみ））（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｂｌａｃｋ−ｇｒａｐｅ  ｍｕｓｔ）から分離された株である。
【００２３】
このＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）は、「高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された株であるために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株に較べると、耐塩性能が明らかに弱い。Ｐｒｉｂｙｌｏｖａらのグループは、この黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）と味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）との特徴（＝表現形質）を比較してみたところ、味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）はグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の資化性能を有するが、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）はグリセロール資化性能をほとんど持っておらず、ＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む培地で培養した場合に細胞内のグリセロール量が上昇するが、ＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）では上昇せず、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）や塩化リチウム（ＬｉＣｌ）に対する耐性能もＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）のほうがＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）よりもはるかに強かったと報告している（Ｌ．Ｐｒｉｂｙｌｏｖａ，Ｊ．ｄｅ  Ｍｏｎｔｉｇｎｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ：Ｙｅａｓｔ，２４（３），１７１−１８０  （２００７））。これは、このＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）に限った話ではない。一般的に、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の耐塩性能は、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のそれに較べると弱い（内藤茂三：醤研、３３（５）、３４９−３６２  （２００７））。
【００２４】
酵母分類・同定の聖書とされる”Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ”の初版（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−Ｖａｎ  Ｒｉｊ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９５２））や、また”Ｙｅａｓｔｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”の初版（Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｗ．Ｐａｙｎｅ，Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ（ｅｄｓ．），Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８３））では、そもそもＺ．ｒｏｕｘｉｉの分類キーに（５０％、あるいは６０％のＤ−グルコース（またはぶどう糖（ｇｌｕｃｏｓｅ））存在下での生育といった、耐糖性能に関する項目は加えられていたものの）１０％、あるいは１６％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下での生育といった耐塩性能に関する項目が加えられていなかった。こうした耐塩性能に関する項目が分類キーに加えられたのは随分後になってからの事であり、たとえば”Ｙｅａｓｔｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”の場合には、３版（Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｗ．Ｐａｙｎｅ，Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ（ｅｄｓ．），Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００））から、耐塩性能に関する２項目が分類キーに追加されたものの、（同書ｐ７９８の）うち［Ｏ６］１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下での生育については「可（＋）」としながら、［Ｏ７］１６％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下での生育については「可または不可（＋，−）」と記されているのは、既にＺ．ｒｏｕｘｉｉに区分けされ、しかも基準株でもあるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）自体が「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された株であり、その耐塩性能も弱かったためであ（ろうと思われ）る。つまり、現在の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群は、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む環境への適応能力が高い「耐塩性酵母（Ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔ  ｙｅａｓｔ（ｓ））」ではなく、高濃度の「糖質や食塩（ＮａＣｌ）」を含む環境への適応能力が高い「耐浸透圧性酵母（Ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｙｅａｓｔ（ｓ））」なのであり、それゆえにその株群の中には「耐塩性能の強い株と弱い株とが混在している」のである。
【００２５】
醤油醸造設備技術の発達に伴い、近年では仕込み用の、屋外型の大型発酵タンクを利用する事例（ケース）が大手の醤油メーカーを中心に増えてきているが、このような設備で安定した品質の醤油を醸造するためには、仕込み後約１ヶ月、醤油諸味のｐＨが５．０〜５．３ぐらいの状態での、醤油酵母（＝種酵母）の人為的な接種（または添加）作業が必要不可欠となる（栃倉辰六郎（編著）：増補  醤油の科学と技術、ｐ１４２−１４６（門脇清（著））、日本醸造協会  （１９９４））。そのためには、接種用種酵母に相応しい酵母株を取得する必要があるが、味噌・醤油醸造に利用する味噌・醤油酵母の実用株は、専ら味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された株群の中から選び出される。これは、味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の耐塩性能が、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のそれよりも強いために、これらの株のほうが高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む味噌・醤油諸味中で旺盛に増殖し、エタノール発酵を行なってくれるからである。
【００２６】
古い事例（ケース）としては、たとえば矢内らのグループが醤油諸味のエタノール発酵を増強させるための試験で用いた添加用種酵母株も醤油諸味からの分離株であったというらしい（矢内次郎、瀧田啓三、雨宮清司：調味科学、３（４）、１８−２２  （１９５５））。こうした傾向は最近でもまったく変わってはおらず、たとえば三輪らのグループが再仕込醤油用の優良な種酵母株を分離するのに用いた分離源も島根県の醤油工場９社の再仕込醤油諸味（三輪昭生、伊藤寛、姫野国夫、新国佐幸：醤研、１５（３）、８６−９２  （１９８９））、安藤らのグループが（醤油諸味を低温管理して）淡い色の醤油をつくるために選択した低温発酵性酵母（安藤義則、亀澤浩幸、下野かおり、日高修、狩行勲：低温発酵性酵母（特許５１４５５０８）のｋ８株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３０１）を含む）を分離するのに用いた分離源も鹿児島県内の味噌・醤油工場から収集した味噌・醤油諸味や生揚げ醤油であり（安藤義則、狩行勲、亀澤浩幸、下野かおり、高峯和則、日高修：鹿児島県工業技術センター、２０、５−９  （２００６））、またたとえば秋田県味噌醤油工業協同組合が配布している「秋田香酵母ゆらら（登録商標）」や、仙台味噌用酵母「まろい」（高橋清：醸協、９２（４）、２４１−２５０  （１９９７））などの実用味噌酵母株も、味噌から分離された株である(渡辺隆幸：醸協、９３（１）、２２−２７  （１９９８））。
【００２７】
このような「醸造食品の製造に利用するための有用微生物を同じ分離源、すなわちその醸造食品ないしはその仕掛品から分離する」というやりかたは、珍しい事ではなく、味噌や醤油に限らず、清酒や焼酎、ワイン（または葡萄（ぶどう）酒）など、醸造・発酵食品全般で見られるものである。
【００２８】
Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母群の場合と同様に、現行の分類でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類される酵母群の中にも、「清酒酵母」や「焼酎酵母（泡盛酵母を含む）」と呼ばれる、日本酒（または清酒）や焼酎（泡盛を含む）の醸造に利用するのに便利な特徴（＝表現形質）を持つ株群、「ワイン酵母」と呼ばれる、ワインの醸造に利用するのに便利な特徴（＝表現形質）を持つ株群、「ビール酵母」、厳密には発酵中に細胞が麦汁の表面に浮かび上がってくるという特徴を示す事から「上面発酵ビール酵母（ｔｏｐ−ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ  ｙｅａｓｔｓ）」と呼ばれる、いわゆる「エール（Ａｌｅ）」や「スタウト（Ｓｔｏｕｔ）」、「アルト（Ａｌｔ）」、「ヴァイツェン（またはバイツェン（Ｗｅｉｚｅｎ））」、「トラピスト（Ｔｒａｐｐｉｓｔ）」などの上面発酵ビール醸造（独立行政法人酒類総合研究所（著）：うまい酒の科学  ―造り方から楽しみ方まで、酒好きなら読まずにいられない、ソフトバンク  クリエイティブ  （２００７））に利用するのに便利な特徴（＝表現形質）を持つ株群、「パン酵母」と呼ばれる、パン生地の発酵に利用するのに便利な特徴（＝表現形質）を持つ株群、あるいはこのような発酵・醸造食品産業に利用するのには不向きだが、研究目的でよく用いられる株群（注：以下、実験室酵母、または実験室酵母株群と呼ぶ）などが混在している。
【００２９】
たとえば、清酒酵母は発見当初は「文字通り」、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｋｅ  Ｙａｂｅ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・サケ・ヤベ。以下、Ｓ．ｓａｋｅと略す）、泡盛酵母もＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ＩＮＵＩ（サッカロミセス・アワモリ・イヌイ）、またビール酵母については、イギリスの醸造場から単離された上面発酵ビール酵母はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、（ビールの）発酵が進むと発酵タンク（の中の麦汁）の底に細胞が沈むという特徴を示す「下面発酵ビール酵母（ｂｏｔｔｏｍ−ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ  ｙｅａｓｔｓ）」のほうは分離されたデンマークの「カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）醸造場」に因んで、いわば「Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ醸造場（または地方）のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母株」という意味の（語尾に−ｅｎｓｉｓを付してラテン語化した）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  Ｈａｎｓｅｎ  ｖａｒ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（＝サッカロミセス・カールスバーゲンシス・ハンセン・バリエタス・カールスバーゲンシス。以下、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓと略す）、さらにワイン酵母に至っては、その分離源や株ごとの微妙な特徴（＝表現形質）の違いに応じてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｅｎｓｉｓ（サッカロミセス・キャペンシス（またはカペンシス））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ（サッカロミセス・チェバリエリー）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ（サッカロミセス・イタリカス）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ（＝サッカロミセス・バヤヌス。以下、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓと略す）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｕｓ（サッカロミセス・ヘテロジニカス）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ（サッカロミセス・ウバルム）などと命名されたが（飯塚廣・後藤昭二（著）：酵母の分類同定法、ｐ１２２−１２３、東京大学出版会  （１９６９）、清酒酵母研究会（編）：清酒酵母の研究  ―８０年代の研究―、ｐ３０−４４（工藤哲三・西谷尚道（著））及びｐ４４−５５（後藤昭二（著））、ｐ１０１−１１０（吉田清（著））、清酒酵母研究会  （１９９２））、現行の分類ではこれらの種の大半がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという１属１種に区分けされている。
【００３０】
なお、上記のワイン酵母のうち、Ｓ．ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｕｓやＳ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ（サッカロミセス・グロボウサス）は、現在は（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではなく）Ｓ．ｂａｙａｎｕｓに区分けされている。また、下面発酵ビール酵母についても、一時はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ（サッカロミセス・ウバラム）（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９７０））や、あるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類すべきとの意見も出されたものの（Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｍｅｙｅｎ  ｅｘ  Ｒｅｓｓ．，ｐｐ３７９−３９５  Ｉｎ：Ｎ．Ｊ．Ｋ．Ｋｒｅｇｅｒ  ｖａｎ  Ｒｉｊ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（３ｒｄ  ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９８４））、その後の染色体長多型（または電気泳動的核型）の比較（Ｇ．Ｐ．Ｃａｓｅｙ，Ｗ．Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｈ．Ｒａｎｋ：Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，９４（４），２３９−２４３  （１９８８）、Ｙ．Ｔａｋａｔａ，Ｊ．Ｗａｔａｒｉ，Ｎ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｍａｄａ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，４７，１０９−１１３  （１９８９）、Ｍ．Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇｏｔｏ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１（３），２３９−２４７  （１９９５））、染色体ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合（またはＤＮＡ−ＤＮＡ分子交雑（ＤＮＡ−ＤＮＡ  ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））試験（Ａ．Ｖ．Ｍａｒｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３５（４），５０８−５１１  （１９８５）、Ａ．Ｖ．Ｍａｒｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ａ．Ｍａｒｔｉｎｉ：Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｗｅｎｈｏｅｋ，５３（２），７７−８４  （１９８７））やマイクロプレート−ハイブリダイゼーション法（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）でのＤＮＡ類似性調査などの結果から（Ｍ．ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｅ．Ｓｏｍａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇｏｔｏ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０（２），８３−９３  （１９９４））、さらにはたとえばホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ＭＥＴ２）（Ｊ．Ｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｋｉｅｌｌａｎｄ−Ｂｒａｎｄｔ：Ｇｅｎｅ，１４０（１），３３−４０  （１９９４））やアルコールアセチルトランスフェラーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＡＴａｓｅ））遺伝子（ＡＴＦ１）（Ｔ．Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．Ｂｏｇａｋｉ，Ｙ．Ｔａｍａｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈａｍａｃｈｉ：Ｙｅａｓｔ，１２（６），５９３−５９８  （１９９６））、エンドヌクレアー��（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）遺伝子（ＨＯ）（Ｙ．Ｔａｍａｉ，Ｋ．Ｔａｎａｋａ，Ｎ．Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｋ．Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ：Ｙｅａｓｔ，１６（１４），１３３５−１３４３  （２０００））、分枝鎖アミノ酸パーミアーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｅｍｉａｓｅ）遺伝子（ＢＡＰ２）（Ｙ．Ｋｏｄａｍａ，Ｆ．Ｏｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ａｓｈｉｋａｒｉ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７（８），３４５５−３４６２  （２００１））など、個別の遺伝子を調べた結果からも、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが持つ遺伝子と相同、あるいは類似性が高い）遺伝子（Ｓｃ型遺伝子）だけでなく、（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが持つ遺伝子との類似性は８０％前後とやや低く）Ｓ．ｂａｙａｎｕｓないしはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ（＝サッカロミセス・パストリアヌス。以下、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓと略す）が持つ遺伝子と相同、あるいは類似性が高い事からこれらの酵母に由来するものと見られる遺伝子（非Ｓｃ型遺伝子（またはＮｏｎ−Ｓｃ型遺伝子））も持っている事が判明したため、それゆえに現在は（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではなく）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ．ｂａｙａｎｕｓ（ないしはその近縁種）との交雑によって生まれた（不安定な）種間雑種（が、さらに乗換え（ｃｒｏｓｓ（ｉｎｇ）  ｏｖｅｒ）や消失（ｇｅｎｅ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ／ｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｌｏｓｓ）などによる染色体の再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）（Ｓ．Ｃａｓａｒｅｇｏｌａ，Ｈ．−Ｖ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｇ．Ｌａｐａｔｈｉｔｉｓ，Ａ．Ｋｏｔｙｋ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ：Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍ．Ｅｖｏｌｕｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１（４），１６０７−１６１８  （２００１））を起こした異種（高次）倍数体株（ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ）だとされ（Ｙ．Ｔａｍａｉ，Ｔ．Ｍｏｍｍａ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ：Ｙｅａｓｔ，１４（１０），９２３−９３３  （１９９８）、Ｙ．Ｔａｍａｉ，Ｋ．Ｔａｎａｋａ，Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈａｒａｓｈｉｍａ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５５（３），３３３−３４０  （２００１）、Ｙ．Ｋｏｄａｍａ，Ｆ．Ｏｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ａｓｈｉｋａｒｉ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７（８），３４５５−３４６２  （２００１））、現行の分類ではＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓとして取り扱われている（清酒酵母・麹研究会（編）：清酒酵母の研究  ―９０年代の研究―、ｐ１５８−１６１（尾形智夫（著））、清酒酵母・麹研究会  （２００３）、大隅良典・下田親（編）：酵母のすべて  ―系統・細胞から分子まで―、ｐ９７−１０２（児玉由紀子（著））、シュプリンガー・ジャパン  （２００７）（注：現在は丸善出版から再出版されている）、久保田寛、中尾嘉宏：醸協、１０５（１）、８−１５  （２０１０））。２００９年には、ラガービール酵母（ｔｈｅ  Ｌａｇｅｒ  ｂｒｅｗｉｎｇ  ｙｅａｓｔ（ｓ）（注：下面発酵ビール酵母を用いるビール醸造では、���母発酵後の麦汁をさらに低温下で貯蔵熟成させ、製品として仕上げるために、こうした製法でつくるビールは「貯蔵」を意味するドイツ語の「ラガー」を付けて「ラガービール（Ｌａｇｅｒ  ｂｅｅｒ）」と呼び、こうした醸造に用いる下面発酵ビール酵母を「ラガービール酵母」と呼ぶ（中尾嘉宏：化学と生物、４３（９）、５５９−５６１  （２００５）））であるＷｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ（バイヘンステファン）３４／７０株の全ゲノム配列（２５Ｍｂ）が解読され、その結果からも上記の「両種の種間雑種である」との説が正しい事が確認された（Ｙ．Ｎａｋａｏ，Ｔ．Ｋａｎａｍｏｒｉ，Ｔ．Ｉｔｏｈ，Ｙ．Ｋｏｄａｍａ，Ｓ．Ｒａｉｎｉｅｒｉ，Ｎ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｎａｇａ，Ｍ．Ｈａｔｔｏｒｉ  ａｎｄ  Ｔ．Ａｓｈｉｋａｒｉ：ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，１６（２），１１５−１２９  （２００９））。
【００３１】
醸造・発酵食品の製造工程におけるその仕掛品という環境は、低温ないしは零下（または冷凍）で、嫌気的で、時には乾燥にも晒され、しかも環境中の栄養成分は偏っており、さらには高濃度の糖質（による高浸透圧）やアルコールなどを含む場合もある、非常に過酷なストレス環境である。それゆえに、このような環境で働く事が求められるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、すなわち実用株（または種酵母株）には、このような環境ストレスに対する適応能力が求められる（Ｂ．Ｒ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｐ．Ｒ．Ｌｅｃｌａｉｒｅ，Ｃ．Ｄ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋ．Ａ．Ｓｍａｒｔ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３１（５），５３５−５６９  （２００７）、島純、安藤聡、中村敏英：日食工誌、５７（６）、２２５−２３１  （２０１０））。
【００３２】
しかも、醸造・発酵食品産業分野で利用されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに求められる特徴（＝表現形質）は、その醸造・発酵食品ごとに大きく異なる。たとえば、清酒醸造の場合には、酵母による発酵は１５℃以下という低温条件の醪（もろみ）の中で行なわれ、しかも２０％近いアルコールを生産させる必要があるため、清酒酵母には少なくとも低温条件下でも旺盛に生育できる能力や、他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株には見られない、高濃度のエタノールを生産する能力が求められる（藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ１５５−１６１（矢野俊博（著））、幸書房  （２００１））。ビールは、麦芽（や副原料）を糖化して製造した麦汁を酵母発酵させたものであり、その麦汁中の主要な糖はマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）やマルトトリオース（ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）である事から、ビール酵母には他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株よりも高い、これらの糖の同化（または資化）性能／発酵性能が求められる。また、ワインを醸造する場合には、細菌や野生酵母の増殖を抑制するために、搾った葡萄果醪（＝粗果汁）に亜硫酸（注：厳密には「ピロ亜硫酸カリウム」、通称：メタカリ）を添加するのが一般的であり、それゆえにワイン酵母には低温条件下で生育してエタノールを生産する能力の他に、さらにワインの醸造工程で混入してくる細菌や野生酵母よりも高い亜硫酸耐性能も要求される（大隅良典・下田親（編）：酵母のすべて  ―系統・細胞から分子まで―、ｐ３１１−３１５（下飯仁（著））、シュプリンガー・ジャパン  （２００７）（注：現在は丸善出版から再出版されている）、下飯仁：食品工業、５０（７）、５６−６１  （２００７）、加藤拓、下飯仁：醸協、１０５（８）、５００−５０６  （２０１０））。パン生地の原料は、小麦粉と食塩（ＮａＣｌ）、ショ糖（スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、またはサッカロース（ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ））などであるが、特に菓子パン用の生地の場合には、小麦粉当たり２０〜４０％ものショ糖が加えられるため、このような高濃度の糖質を含むパン生地の中でも旺盛な発酵を行なうパン酵母には、強い耐糖性能が求められる。さらに、最近のパン製造では、種酵母として「乾燥酵母（ドライイースト）」を用い、また製造途中のパン生地を−２０℃程度で冷凍保存したりする事もあるため、強い乾燥耐性能や冷凍耐性能なども求められる（島純：食品と技術、４４７（２００８−０９）、１１−１８  （２００８））。
【００３３】
そのため、現行の分類でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されているすべての酵母株が、清酒醸造やワイン醸造、ビール醸造、あるいはパン生地の発酵に利用できる訳ではない。たとえば、ビール酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株や実験室酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株で（低温条件下の醪の中で高濃度のエタノールを生産させて）清酒を醸造したり、焼酎酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株でパン生地を発酵させてパンをつくったりする事は難しい。竹田らのグループは、さまざまな酵母を用いた清酒醪の発酵性試験の結果について報告しているが、２０％以上のエタノールを生産したのは清酒酵母と焼酎酵母だけであり、ビール酵母やワイン酵母にはこのような高濃度のエタノール生産性能がなく、清酒醸造に不向きだったという（竹田正久、中里厚実、塚原寅次：発酵工学、６０（３）、１３７−１４４  （１９８２）、竹田正久、中里厚実、塚原寅次：発酵工学、６１（４）、２０１−２０５  （１９８３））。実験室酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の、清酒醪中でのエタノール生産性能はせいぜい１０％強に過ぎないという（渡辺大輔：化学と生物、５０（１０）、７２３−７２９  （２０１２））。また、向井らは、ビール酵母だけでなく、清酒酵母やワイン酵母なども用いた小規模の麦汁（マッシュ（ｍａｓｈ））発酵性試験を行なってみたところ、いずれの酵母でもビールを醸造する事は可能だったが、清酒酵母やワイン酵母ではビール酵母に較べて（マルトース同化（または資化）性能／発酵性能が弱いために）主発酵の期間が長くなり、真正発酵度も高くはならず（しかも清酒酵母の場合にはエステル香が、またワイン酵母の場合には酸味とフェノール臭が強くなり）、効率的かつ安定的にビールを製造するうえでは問題が生じる可能性があると報告している（向井伸彦、岡田明彦、鈴木昭紀、高橋利郎：醸協、９３（１２）、９６７−９７５  （１９９８））。
【００３４】
つまり、現行の分類ではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという１属１種の中に分類されている酵母株群の中で、清酒醸造で求められる、さらには清酒醸造に望ましい特徴（=表現形質）を持ったＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株だけが「清酒酵母」と呼ばれ、またワイン醸造で求められる、さらにはワイン醸造に望ましい特徴（＝表現形質）を持ったＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株だけが「ワイン酵母」と呼ばれ、ビール醸造で求められる、さらにはビール醸造に望ましい特徴（＝表現形質）を持ったＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株だけが「ビール酵母」と呼ばれているのである（Ｒ．Ｙ．スタニエ（Ｓｔａｎｉｅｒ）・Ｅ．Ａ．エーデルバーグ（Ａｄｅｌｂｅｒｇ）・Ｊ．Ｌ．イングラム（Ｉｎｇｒａｈａｍ）（共著）／高橋甫・斎藤日向・手塚泰彦・水島昭二・山口英世（訳）：微生物学（下）（原書第４版）（ＴＨＥ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＷＯＲＬＤ；４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ｐ４７３−４７８、培風館  （１９７８））。ただ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという同属同種内に区分けされる株群における、株ごとのそうした特徴（＝表現形質）の違いは、上記した通り、非常に大きく、それゆえに、たとえば清酒酵母（旧：Ｓ．ｓａｋｅ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに再分類する際にも、その余りにも異なる特徴（＝表現形質）を根拠に、独立した種とすべきではないかとの意見も出たという（竹田正久、塚原寅次：醗工、５３（３）、１０３−１１１  （１９７５））。
【００３５】
まず、１９９６年に、ヨーロッパを中心に、アメリカやカナダ、日本などをも含む１００以上の研究室が参加する巨大プロジェクトの形で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の全ゲノム配列（注：１６本の染色体から構成される約１３．４Ｍｂ）が解読されて（Ａ．Ｇｏｆｆｅａｕ，Ｂ．Ｇ．Ｂａｒｒｅｌ，Ｈ．Ｂｕｓｓｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄｕｊｏｎ，Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｆ．Ｇａｌｉｂｅｒｔ，Ｊ．Ｄ．Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，Ｃ．Ｊａｃｑ，Ｍ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｌｏｕｉｓ，Ｈ．Ｗ．Ｍｅｗｅｓ，Ｙ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｐ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｈ．Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇ．Ｏｌｉｖｅｒ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４（５２８７），５４６−５６７  （１９９６））、ゲノム上の遺伝子の塩基配列やこれらの遺伝子の染色体上の配置などの情報が公開され（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｅｔａｂａｓｅ（ＳＤＧ）は、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／を参照）、その後も次々とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類される株のゲノム解読が進んだ事で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの分子生物学的な研究が急速に進展したが、最近のこうした研究の成果によると、同じＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されているこれらの酵母株のゲノムは非常によく類似しており、その違いは塩基数で数％程度でしかないとされる。
【００３６】
たとえば、日本では、独立行政法人酒類総合研究所、財団法人日本醸造協会、１０の大学、６つの公的試験研究機関、９社の酒造メーカーから構成される産官学共同のゲノム解析コンソーシアムと独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＮＩＴＥ））の共同研究により、現行の分類ではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている、清酒酵母である「きょうかい７号（ａ  ｓａｋｅ  ｙｅａｓｔ  ｓｔｒａｉｎ  Ｋｙｏｋａｉ  ｎｏ．７（Ｋ７））」の全ゲノム配列が解読され、その情報は公開されているが（Ｓａｋｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＹＧＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｎｒｉｂｆ１．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ＳＹＧＤ／））、第５染色体と第１４染色体の一部に逆位があり、複数の染色体の末端付近や、また（酵母の）トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  （ｏｆ）  ｙｅａｓｔ（Ｔｙ））の分布などにも違いが認められたものの、それらの点を除けば、上記のＳ２８８Ｃ株のゲノム情報とほぼ対応していて、塩基配列レベルでの一致度は９６．２％、多くの遺伝子が９９％以上、ほとんどの遺伝子が９８％以上という高い類似性を示しているという（下飯仁、藤田信之：化学と生物、４５（８）、５３９−５４３  （２００７）、下飯仁、赤尾健、渡辺大輔：生物工学、８９（９）、５３２−５３５  （２０１１）、Ｔ．Ａｋａｏ，Ｉ．Ｙａｓｈｉｒｏ，Ａ．Ｈｏｓｏｙａｍａ，Ｈ．Ｋｉｔａｇａｋｉ，Ｈ．Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｄ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｒ．Ａｋａｄａ，Ｙ．Ａｎｄｏ，Ｓ．Ｈａｒａｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．Ｋａｊｉｗａｒａ，Ｋ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｎ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．Ｋｕｈａｒａ，Ｔ．Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ，Ｈ．Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｎａｋａｏ，Ａ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｍ．Ｎａｍｉｓｅ，Ｔ．Ｏｂａ，Ｔ．Ｏｇａｔａ，Ａ．Ｏｈｔａ，Ｍ．Ｓａｔｏ，Ｓ．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｙ．Ｔａｋａｔｓｕｍｅ，Ｓ．Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｈ．Ｔｓｕｂｏｉ，Ａ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．Ｙｏｄａ，Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，１８（６），４２３−４３４  （２０１１）、北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性II、ｐ１２９−１３９（下飯仁（著））、シーエスシー出版  （２０１１））。
【００３７】
つまり、清酒・焼酎の醸造に用いる清酒酵母・焼酎酵母（泡盛酵母を含む）やワイン醸造に用いるワイン酵母も、さまざまな研究に用いられる実験室酵母も、これらの酵母はすべて、現行の分類では同じＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという１属１種に分類されており、しかも各々の酵母株群のゲノムも非常によく似てはいるものの、それぞれの酵母群が持つ特徴（＝表現形質）はそのゲノム上のほんのわずかの塩基の違いに基づいて大きく異なっており、しかもそのそれぞれの特徴（＝表現形質）の一部は「醸造特性」として、その酵母株を醸造産業で利用した際の製品の出来栄え（または品質）や生産性（または生産効率）に大きな影響を及ぼすものである。
【００３８】
たとえば、現行の分類ではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている清酒酵母株は、現行の分類では同じくＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている実験室酵母株などと較べると、低温条件下での生育能が強く、清酒醪中で２０％近く、ないしはそれ以上という、高濃度のエタノールを生産する能力、すなわち醸造特性を持っており、その高いエタノール生産性能については、古くから精力的に研究されてきた。そして、そうした研究を通して、エタノール生産性能のより高い株を取得するためのさまざまな方法も開発された。
【００３９】
たとえば、クロトリマゾール（ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ）は、エルゴステロールの生合成を阻害したり、あるいは細胞膜の不飽和脂肪酸に結合して、膜構造を破壊したりする事で、真菌（酵母を含む）の生育を阻害するイミダゾール系抗真菌剤だが（Ｈ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１２（１），１６−２５  （１９７７）、Ｈ．Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｏｓｓｃｈｅａ，Ｇ．Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎｓａ，Ｗ．Ｃｏｏｌｓａ，Ｗ．Ｆ．Ｊ．Ｌａｕｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌ．Ｌｅ  Ｊｅｕｎｅ：Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２１（１），５９−７８  （１９７８））、このクロトリマゾールに対する耐性能を獲得した変異株（ＣＴＺ２３９株）は、醪期間全体を通して高い発酵性能を示す事が見出されており（清酒酵母・麹研究会（編）：清酒酵母の研究  ―９０年代の研究―、ｐ８６−９０（渡辺睦（著））、清酒酵母・麹研究会  （２００３））、このクロトリマゾール耐性能を指標に「高いエタノール生産性能を持つ株」を取得する方法は特許出願もされている（広畑修二、渡辺睦、山下伸雄：アルコール耐性の高い酵母の育種方法とその酵母菌株およびそれを用いた清酒の製造方法、特開平６−２０５６６７）。また、トリコセシン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｎ）（Ｈ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｓ．Ｂ．Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｋｉｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ：Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５（５），６２９−６３０  （１９９９）、福田央、木崎康造、高橋康次郎：高アルコール生産酵母の育種、特許３０６９６７９）やアニソマイシン（ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ）（福田央、荒巻功：発酵速度を増大させた酵母の育種、特許３０６９６８９）、オリゴマイシン（ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）（福田央、木崎康造：高濃度アルコール含有もろみを製造する酵母の育種法、特許３０２６２００）に対する耐性能を獲得した変異株を用いて醸造した清酒のアルコール濃度も高くなる事が報告されている。
【００４０】
グルコース類縁体（アナログ（ａｎａｌｏｇ（ｕｅ）））である２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（２−ＤＧ））に対する耐性能を獲得した変異株は、カタボライト抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）が解除されていて、糖の取り込み機能が亢進し、エタノール発酵速度が速い、あるいはエタノール生産性能が高い事が見出され（Ｇ．Ｇ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉ．Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０ｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ，２４３−２５０  （１９８５）、Ｒ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ，Ｉ．Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｓｔｅｗａｒｔ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，４４，１６１−１６６  （１９８６）、Ｓ．Ｎｏｖａｋ，Ｔ．Ｄ'Ａｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｓｔｅｗａｒｔ：Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７（１），３５−３９  （１９９１））、さまざまな醸造用酵母株の２−デオキシグルコース耐性株が作出された（森屋和仁：醸協、８４（６）、３８９−３９１  （１９８９）、Ｋ．Ｍｏｒｉｙａ，Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ，Ｓ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔａｄｅｎｕｍａ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７（５），３２１−３２３  （１９８９））。
【００４１】
たとえば、水野らのグループも、ビール酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＣＹＣ１２４５株から２−デオキシグルコース耐性変異株（２ＤＧＲ１９株）を作出してみたところ、親株（ＮＣＹＣ１２４５株）よりもエタノール生産性能が高く（かつ酢酸生産性は低く）、小規模のビール醸造試験では、親株よりも（酢酸濃度は半分で、かつ）エタノール濃度が１．１％高いビールができたと報告している。この耐性変異株である２ＤＧＲ１９株では、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＤＨ））をコードしている４つの遺伝子（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４）のうち、ＡＤＨ４の転写レベルが親株よりも高く、それゆえにアルコールデヒドロゲナーゼ活性も高くなっていたという（Ａ．Ｍｉｚｕｎｏ，Ｈ．Ｔａｂｅｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｉｗａｈｕｔｉ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０１（１），３１−３７  （２００６））。ただ、４つの遺伝子（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４）にコードされているアルコールデヒドロゲナーゼのうち、清酒醪や麦汁中でのエタノール生産性能を左右する鍵となる酵素は、ＡＤＨ１から構成的に生産されるアルコールデヒドロゲナーゼのはずである。また、清酒酵母であるきょうかい７号（Ｋ７）と実験室酵母Ｘ２１８０−１Ａ株を用いた清酒の小仕込み試験（総米４００ｇ、三段仕込み）を行なってみたところ、本試験でもやはりＸ２１８０−１Ａ株のエタノール生産性能はきょうかい７号（Ｋ７）よりも低かったものの、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性は、エタノール生産性能とは逆に、きょうかい７号（Ｋ７）のほうが低かったとの報告もある。清酒醪の中で比較的長期間に渡ってエタノールを生産し続けて、２０％以上という高いエタノール濃度をつくり出すためには、高いエタノール生産速度は不必要、あるいはむしろ邪魔なのかも知れない（清酒酵母・麹研究会（編）：清酒酵母の研究  ―９０年代の研究―、ｐ６７−７１（大淵和彦（著））、清酒酵母・麹研究会  （２００３））。
【００４２】
また、清酒酵母による、こうした清酒醪中での高いエタノール生産性には、たとえば自らが生産した高濃度のエタノールを含む生育環境中でも（死滅せずに）生存し続ける能力を持っているという特徴も、重要な要素の１つとして関係しているものと考えられる。それゆえに、清酒酵母からのさらなるエタノール耐性変異株の作出に関する研究も古くから精力的に行なわれ、同様にイソアミルアルコール（及びエタノールを含む環境）（秋田修、渡辺隆幸、蓮尾徹夫、小幡孝之、原昌道：発酵工学、６８（２）、９５−１００  （１９９０））やＫ１キラートキシン（朝田朝子、内村博文、今村武司：生物工学、７８（３）、７７−８１  （２０００））、窒素飢餓（伊野本真彦、山田修、五味勝也、飯村穣：醸協、９３（３）、２２４−２３０  （１９９８））に対する耐性能などを指標にしてエタノール耐性能が高い株を取得する方法も開発された。たとえば、公益財団法人日本醸造協会から頒布されているきょうかい１１号（Ｋ１１）も、きょうかい７号（Ｋ７）から作出されたアルコール耐性変異株である。
【００４３】
エタノールによる酵母の細胞障害は、濃度依存的で、細胞膜など（の生体膜）の透過性が高まり、細胞質が酸性化する事で生じるとされる（島純、安藤聡、中村敏英：日食工誌、５７（６）、２２５−２３１  （２０１０））。そのため、酵母のエタノール耐性能には、たとえば細胞膜成分のうちの、特に細胞膜の流動性に影響を及ぼす膜脂質中の不飽和脂肪酸（特にオレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））（Ｈ．Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈａｒａ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８１（５），４０６−４１１  （１９９６）、Ｔ．Ｍ．Ｓｗａｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｗａｔｓｏｎ：Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５（６），４７２−４７９  （１９９９））やステロール（Ｔ．Ｄ’ａｍｏｒｅ，Ｃ．Ｊ．Ｐａｎｃｈａｌ，Ｉ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇ．Ｇ．Ｓｔｅｗａｒｔ：Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９（４），２８７−３０４  （１９８９）、Ｈ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ−Ｃａｐｒｉｏｇｌｉｏ，Ｗ．Ｍ．Ｃａｓｅｙ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｐａｒｋｓ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６（９），２８５３−２８５７  （１９９０）、Ｈ．Ａｌｅｘａｎｄｒｅ，Ｉ．Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２４（１），１７−２２  （１９９４）、Ｃ．Ｎｏｖｏｔｎｙ  ＆  Ｆ．Ｋａｒｓｔ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６（５），５３９−５４２  （１９９４））、リン脂質（たとえば、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）（Ｐ．Ｍｉｓｈｒａ  ＆  Ｒ．Ｐｒａｓａｄ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３４（１２），３２０５−３２１１  （１９８８））やホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）（Ｋ．Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｈ．Ｏｂａｔａ，Ｈ．Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈａｒａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９８（２），１０７−１１３  （２００４））など）、細胞内の浸透圧調節に関与するトレハロース（Ｊ．Ｊ．Ｃ．Ｍａｎｓｕｒｅ，Ａ．Ｄ．Ｐａｎｅｋ，Ｌ．Ｍ．Ｃｒｏｗｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｃｒｏｗｅ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ，１１９１（２），３０９−３１６  （１９９４））やグリセロールなどの合成能が関係しているものと見られ、特に酵母株のエタノール耐性能に及ぼす細胞膜成分の影響に関する研究については古くから精力的に進められてきた。
【００４４】
たとえば、酵母の細胞膜に含まれるエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）は、細胞膜の流動性に影響を及ぼし、エタノールに対する抵抗性を付与する成分として知られている。酵母株をエタノール存在下で培養すると、（生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験では、ステロール合成の鍵となる酵素である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡリダクターゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ（ＨＭＧ）  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の活性がエタノールによって減少する事が見出されており）細胞膜のステロール含量は減少するものの、ステロール中に占めるエルゴステロール量は増加する事が知られており（Ｈ．Ｍ.Ｗａｌｋｅｒ−Ｃａｐｒｉｏｇｌｉｏ，Ｗ．Ｍ．Ｃａｓｅｙ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｐａｒｋｓ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６（９），２８５３−２８５７  （１９９０））、たとえば清酒酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＹ−３２株の、エルゴステロールの合成に関わる酵素群のうちの１つであるＳ−アデノシルメチオニン：△２４−ステロール−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：ｄｅｌｔａ  ２４−ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードしている遺伝子（ＥＲＧ６）の欠損株は、親株（＝ＳＹ−３２株）に較べて細胞内のエルゴステロール量が少なく、エタノール感受性を示す事が報告されている（Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．Ｉｅｆｕｊｉ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．Ｓｏｇａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｓａｔｏｈ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（２），２２９−２３６  （２０００））。現行の分類でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている清酒酵母のきょうかい７号(Ｋ７）やきょうかい９号（Ｋ９）では、実験室酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０株（ないしはＸ２１８０−１Ａ株）に較べて、この「エルゴステロールの合成及び輸送に関与する酵素・蛋白質群」をコードしている遺伝子群（ＥＲＧ１３、ＨＭＧ１、ＥＲＧ２０、ＥＲＧ２４、ＥＲＧ２６、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、ＥＲＧ５、ＥＲＧ２８）の発現量が高く、それゆえにエルゴステロール量も高い事が見出されている（Ｍ．Ｓｈｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．Ｍｉｔｓｕｅｄａ，Ｍ．Ａｇｏ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ，Ｋ．Ｉｗａｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｉｅｆｕｊｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.，６９（１２），２３８１−２３８８  （２００５））。きょうかい７号（Ｋ７）では脂肪酸の不飽和化反応を触媒する△９  脂肪酸デサチュラーゼ（△９  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードしている遺伝子（ＯＬＥ１）も高発現しているとの報告もある（Ｔ．Ｙａｍａｄａ，Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｔｏ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９９（５），５１２−５１６  （２００５））。実験室酵母であるＸ２１８０株では、エルゴステロール合成系遺伝子群（ＨＭＧ１など）の発現に影響を及ぼす転写因子をコードしている遺伝子（ＨＡＰ１）の３’−末端付近に「（酵母の）トランスポゾン１（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｙｅａｓｔ  １（Ｔｙ１））」が入り込んでいるために、この遺伝子からつく���れる転写因子（Ｈａｐ１）の活性が低下しているという（Ｋ．Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．Ｇｕ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９８（３），１５９−１６６  （２００４））。ただし、この実験室酵母のＨＡＰ１をきょうかい７号（Ｋ７）のＨＡＰ１で置き換えると、細胞内のエルゴステロール量はきょうかい７号（Ｋ７）並みにまで回復する（ため、両株におけるこのＨａｐ１活性の違いが両株におけるエルゴステロール合成・輸送系遺伝子の発現量の違いを生み出している原因だと見られる）ものの、それでもエタノール耐性能までは改善されず、それゆえに酵母株のエタノール耐性能には（こうした遺伝子も含む）複数の遺伝子が関与しているものと見られている（下飯仁：食品工業、５０（７）、５６−６１  （２００７））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのエタノール耐性能には、少なくとも２５６個以上の遺伝子が関与しているとの報告もある（Ｓ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｉ．Ｔａｋｅｏ，Ｋ．Ｋｕｍｅ，Ｍ．Ｋａｎａｉ，Ａ．Ｓｈｉｔａｍｕｋａｉ，Ｍ．Ｍｉｚｕｎｕｍａ，Ｔ．Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ，Ｈ．Ｉｅｆｕｊｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｈｉｒａｔａ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（４），９６８−９７２  （２００４））。上記した通り、エルゴステロールの生合成を阻害する作用を持つイミダゾール系抗真菌剤であるクロトリマゾールに対する耐性能を獲得した、きょうかい１００１号（Ｋ１００１）の耐性変異株（＝ＣＴＺ２３９株）は、親株（Ｋ１００１）よりも高いエタノール発酵性能を示し、しかもＡＢＣ（ＡＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポーターの発現が亢進しているために（細胞内のＡＴＰレベルが低く（渡辺睦：生物工学、８０（２）、５７−６３  （２００２））、多剤耐性も示したものの、なぜかエタノールに対する耐性能については（親株（Ｋ１００１）と同程度で）向上していなかったという（広畑修二、渡辺睦、西村顕、近藤恭一：生物工学、７２（４）、２８３−２８９  （１９９４））。
【００４５】
酵母の細胞内のトレハロースについては、細胞の乾燥耐性能、あるいは冷凍耐性能との関係から調べた報告が多いものの（Ａ．Ｈｉｎｏ，Ｋ．Ｍｉｈａｒａ，Ｋ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｔａｋａｎｏ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６（５），１３８６−１３９１  （１９９０）、Ｊ．Ｓｈｉｍａ，Ａ．Ｈｉｎｏ，Ｃ．Ｙａｍａｄａ−Ｉｙｏ，Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｒ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｔａｋａｎｏ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５（７），２８４１−２８４６  （１９９９））、エタノール耐性能にも影響を及ぼすものと見られており、たとえば細胞内のトレハロース含量の異なる数種類の酵母株の１０％エタノール存在下での生存能力を調べてみたところ、トレハロース含量の多い株ほど生存能力が高かったとのＭａｎｓｕｒｅの報告（Ｊ．Ｊ．Ｃ．Ｍａｎｓｕｒｅ，Ａ．Ｄ．Ｐａｎｅｋ，Ｌ．Ｍ．Ｃｒｏｗｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｃｒｏｗｅ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１１９１（２），３０９−３１６  （１９９４））や細胞内のトレハロースの加水分解に関与する酵素の１つである酸性トレハラーゼ（ａｃｉｄ  ｔｒｅｈａｌａｓｅ）をコードしているＡＴＨ１の破壊株は、野生株よりも細胞内のトレハロース含量が高く、１８％エタノール存在下での生存能力も高く、（清酒醪のように）２０〜３５％のグルコースを含む高浸透圧培地中でのエタノール生産性能も高かったとのＫｉｍの報告などがある（Ｊ．Ｋｉｍ，Ｐ．Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ｔ．Ｈａｒｄｉｎｇ，Ａ．Ｈｅｆｎｅｒ−Ｇｒａｖｉｎｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｋｌｉｏｎｓｋｙ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２（５），１５６３−１５６９  （１９９６））。上記の、熱ショック蛋白質Ｈｓｐ１２ｐにも、細胞膜に局在して、細胞膜を保護する働きがあるとされ、Ｈｓｐ１２をコードしている遺伝子（ＨＳＰ１２）の破壊株を作出してみたところ、エタノールに対する感受性が増し、１０％以上のエタノール存在下での死滅率が劇的に高かったとの報告もある（Ｋ．Ｓａｌｅｓ，Ｗ．Ｂｒａｎｄｔ，Ｅ．Ｒｕｍｂａｋ  ａｎｄ  Ｇ．Ｌｉｎｄｓｅｙ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１４６３（２），２６７−２７８  （２０００））。きょうかい７０１号（Ｋ７０１）から作出したエタノール耐性株を調べてみたところ、やはりストレス関連遺伝子群やトレハロース合成に関与するＴＰＳ１、ＴＰＳ１などの遺伝子を高発現しており、細胞内に高濃度のグリセロールやトレハロースを蓄積していたという報告もある（Ｙ．Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｎｉｔｔａ，Ｈ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｔ．Ｉｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｔｏ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０（３），３１３−３２０  （２０００））。
【００４６】
酵母の細胞壁の組成及び構造も、細胞膜と同様に、その生育環境に応じて変化する事が知られており、エタノール耐性能にも関与するものと見られている。たとえば、Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌらによる、ワイン酵母のエタノール発酵過程におけるトランスクリプトーム解析の結果では、細胞内での細胞壁合成系の遺伝子（ＦＫＳ１、ＧＳＣ２、ＳＳＤ１、ＭＰＴ５など）の転写量が発酵の進行に伴って増加した事が報告されている（Ｔ．Ｒｏｓｓｉｇｎｏｌ，Ｌ．Ｄｕｌａｕ，Ａ．Ｊｕｌｉｅｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｂｌｏｎｄｉｏｎ：Ｙｅａｓｔ，２０（１６）,１３６９−１３８５  （２００３））。上記の、きょうかい７号（Ｋ７）から作出されたアルコール耐性変異株であるきょうかい１１号（Ｋ１１）は、（アルコールに対する耐性能だけでなく）Ｋ１キラートキシンや細胞壁溶解酵素ザイモリエイス（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）（登録商標）に対する耐性能も示す事から、細胞壁の構造が変化している可能性が指摘されている（原昌道、佐々木雅晴、小幡孝之、野白喜久雄：醸協、７１（４）、３０１−３０４  （１９７６））。
【００４７】
酵母細胞は、高濃度のエタノールや高浸透圧、熱ショックなどのストレスに晒されると、転写因子であるＭｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐを介する形で、そのプロモーター領域にこれらの転写因子の結合モチーフ（ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＲＥ））を持つ遺伝子群（ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ）の発現が促される事が見出されている（北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性、ｐ３７−４６（井沢真吾・井上善晴（著））、シーエムシー出版  （２００６））。たとえば、ワイン酵母のエタノール発酵過程では、発酵の進行（＝エタノール濃度の上昇）に伴ってこうした遺伝子群の転写量が増加する事が見出されており（Ｃ．Ｒｉｏｕ，Ｊ．−Ｍ．Ｎｉｃａｕｄ，Ｐ．Ｂａｒｒｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ：Ｙｅａｓｔ，１３（１０），９０３−９１５  （１９９７）、Ｓ．Ｐｕｉｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｐｅｒｅｚ−Ｏｒｔｉｎ：Ｙｅａｓｔ，１６（２），１３９−１４８  （２０００））、また清酒酵母から作出されたエタノール耐性変異株の中には、こうした遺伝子群の構成的な転写量の上昇が認められ、細胞内のトレハロースやグリセロールの濃度や、カタラーゼ活性などが高い状態にある株がいる事も報告されている（Ｙ．Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｎｉｔｔａ，Ｈ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｔ．Ｉｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｔｏ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０（３），３１３−３２０  （２０００））。きょうかい７０１号（Ｋ７０１）から作出された、高いエタノール耐性能を持つために醪末期でもエタノール発酵が衰えないＫ１キラートキシン耐性変異株であるＳＲ４−３株（新田朝子、内山博文、今村武司：生物工学、７８（３）、７７−８１  （２０００））を詳細に調べた結果によると、たとえばヒートショック蛋白質Ｈｓｐ１２ｐをコードしているＨＳＰ１２（Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｖａｒｅｌａ，Ｕ．Ｍ．Ｐｒａｅｋｅｌｔ，Ｐ．Ａ．Ｍｅａｃｏｃｋ，Ｒ．Ｊ．Ｐｌａｎｔａ  ａｎｄ  Ｗ．Ｈ．Ｍａｇｅｒ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５（１），６２３２−６２４５  （１９９５））やカタラーゼ（（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）ｃａｔａｌａｓｅ）をコードしているＣＴＴ１（Ｗ．Ｓｐｅｖａｋ，Ｆ．Ｆｅｓｓｌ，Ｊ．Ｒｙｔｋａ，Ａ．Ｔｒａｃｚｙｋ，Ｍ．Ｓｋｏｎｅｃｚｎｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ｒｕｉｓ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３（９），１５４５−１５５１  （１９８３）、Ｔ．Ｂｅｌａｚｚｉ，Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗｉｅｓｅｒ，Ｍ．Ｓｃｈａｎｚ，Ｇ．Ａｄａｍ，Ａ．Ｈａｒｔｉｇ  ａｎｄ  Ｈ．Ｒｕｉｓ：ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０（３），５８５−５９２  （１９９１）、Ｒ．Ｗｉｅｓｅｒ，Ｇ．Ａｄａｍ，Ａ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍａｒｃｈｌｅｒ，Ｈ．Ｒｕｉｓ，Ｚ．ｋｒａｗｉｅｃ  ａｎｄ  Ｔ．Ｂｉｌｉｎｓｋｉ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（１９)，１２４０６−１２４１１  （１９９１））、グルセロール合成に関与するグリセロール  ３−燐酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードしているＧＰＤ（Ｋ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｒ．Ａｎｓｅｌｌ，Ｐ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌ．��ｄｌｅｒ：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０（５），１１０１−１１１１  （１９９３））やトレハロース合成に関与するトレハロース−６−燐酸シンターゼ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＰＳ）をコードしているＴＰＳ１やＴＰＳ２（Ａ．Ｖａｎ  Ｌａｅｒｅ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６３（３），２０１−２０９  （１９８９））、培養後期に発現する細胞壁蛋白質をコードしているＳＰＩ１（Ｓ．Ｐｕｉｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｐｅｒｅｚ−Ｏｒｉｔｉｎ：Ｙｅａｓｔ，１６（２），１３９−１４８  （２０００））など、生育環境からのストレスに応じて発現が誘導されるはずの遺伝子群が、ストレスのない生育環境下でも発現しており、しかもストレスをかけてやるとさらに発現量が増える事、そのために細胞内のトレハロースやグリセロールの濃度、カタラーゼ活性も高く、アルコールに対する耐性能だけでなく、他のさまざまなストレスにも耐性を示したという（清酒酵母・麹研究会（編）：清酒酵母の研究  ―９０年代の研究―、ｐ９０−９５（小川義明（著））、清酒酵母・麹研究会  （２００３））。きょうかい７号（Ｋ７）のエタノール耐性変異株であるきょうかい１１号（Ｋ１１）でも、その親株であるきょうかい７号（Ｋ７）では生育環境中のエタノール濃度の上昇によるストレス（＝エタノールストレス）などに応じて、転写因子であるＭｓｎ２ｐ及びＭｓｎ４ｐを介する形で発現が誘導されるＨＳＰ１２など、プロモーター領域にこれらの転写因子の結合モチーフ（ＳＴＲＥ）を持つ遺伝子群が、ストレスのない生育環境下でも高発現しているという（Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｔａｍｕｒａ，Ｊ．Ｐ．Ｍａｇｂａｎｕａ，Ｋ．Ｔａｋａｏ，Ｋ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｔ．Ａｋａｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０４（３），１６３−１７０  （２００７））。また、ＭＳＮ２を高発現する清酒酵母を作出してみたところ、やはり親株よりエタノール耐性能が高く、清酒醪中でのエタノール生産性能も高かったという報告もある（Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｄ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．Ａｋａｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０７（５），５１６−５１８  （２００９））。ただし、このようなイソアミルアルコール（及びエタノールを含む環境）やＫ１キラートキシンなどに対する耐性株の多くは、清酒醸造に用いた場合に、清酒醪中のエタノール濃度が高くなる醪末期も酵母が死滅しにくく、発酵が続くという特徴を示す反面、醪初期から中期にかけての発酵はやや緩慢な（＝遅い）傾向を示すという。
【００４８】
細胞内の「液胞（ｖａｃｕｏｌｅ）」は、「空っぽ」を意味するラテン語「ｖａｃｕｕｓ」に由来するその名が示す通り、発見当初は重要な役割を果たしてはいないものと過小評価されていた細胞（内）小器官（オルガネラ（ｏｒｇａｎｅｒａ））だが、その後の研究を通して、（能動的に細胞質の溶質を蓄積して、液胞内部の浸透圧を上昇させる事で、細胞内の水分を流入させて膨らむ事で）細胞の構造的強度に関わる（細胞内）空間充填剤として、また代謝産物の貯蔵・毒性物質の隔離や生体高分子の分解などの重要な役割も担っている事が判明している（黒岩常祥・三角修己・高野博嘉・伊藤竜一・松永幸大（著）：細胞、ｐ９１−９３（高野博嘉・伊藤竜一（著））、朝倉書店  （２００８））。
【００４９】
酵母の液胞も、通常の環境下での生育には必須ではないものの、たとえば低浸透圧条件下で培養すると肥大化する一方、高浸透圧条件下で培養すると小さく断片化して数が増える（Ｐ．Ｇ．Ｍｅａｄｅｎ，Ｎ．Ａｒｎｅｂｏｒｇ，Ｌ．Ｕ．Ｇｕｌｄｆｅｌｄｔ，Ｈ．Ｓｉｅｇｕｍｆｅｌｄｔ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊａｋｏｂｓｅｎ：Ｙｅａｓｔ，１５（１２），１２１１−１２２２  （１９９９），Ｃ．Ｊ．Ｂｏｎａｎｇｅｌｉｎｏ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｕ，Ｊ．Ｅ．Ｄｕｅｘ，Ｍ．ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ａ．Ｅ．Ｗｕｒｍｓｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｇａｒｙ，Ｓ．Ｄ．Ｅｍｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｓ．Ｗｅｉｓｍａｎ：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５６（６），１０１５−１０２８  （２００２））といった具合に、生育環境に応じて形態変化する事が知られている（Ｓ．Ｃ．Ｌｉ＆Ｐ．Ｍ．Ｋａｎｅ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７９３（４），６５０−６６３  （２００９））。現行の分類ではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されているワイン酵母のＥＣ１１１８株やＯＣ２株、清酒酵母であるきょうかい９号（Ｋ９）やきょうかい１０号（Ｋ１０）も、高濃度の糖質を含む（高浸透圧）合成培地で培養した場合には、その細胞内の液胞が小さく断片化して数が増える事は確認されているが、ただしこれらの酵母株を用いて清酒を仕込んだ場合には、ワイン酵母であるＥＣ１１１８株及びＯＣ２株では、清酒醪という高浸透圧環境での増殖に伴って、その細胞内の液胞が小型化・断片化して数が増えるものの、清酒酵母であるきょうかい９号（Ｋ９）及びきょうかい１０号（Ｋ１０）では、液胞の小型化・断片化が非常に起こりにくい事も見出されている（Ｓ．Ｉｚａｗａ，Ｋ．Ｉｋｅｄａ，Ｔ．Ｍｉｋｉ，Ｙ．Ｗａｋａｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｉｎｏｕｅ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８（１），２７７−２８２  （２０１０））。一般的な高等植物細胞では、液胞が、いわば「空間充填剤」として細胞体積の３０％から最大では９０％を占め、（能動的に細胞質の溶質を蓄積して、液胞内部の浸透圧を上昇させる事で）細胞内の水分を流入させる事で膨圧を生み出し（＝膨らみ）、細胞構造の維持に寄与している（黒岩常祥・三角修己・高野博嘉・伊藤竜一・松永幸大（著）：細胞、ｐ９１−９３（高野博嘉・伊藤竜一（著））、朝倉書店  （２００８））のと同様に、酵母細胞においても、液胞が浸透圧調節と細胞構造の維持に関わっている可能性があり、実際に、液胞形成能を欠くｓｌｐ（ｓｍａｌｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐｏｏｌ）１変異株（Ｙ．Ｗａｄａ，Ｋ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｋａｎｂｅ，Ｋ．Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ａｎｒａｋｕ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０（５），２２１４−２２２３  （１９９０））（注：このｓｌｐ１は、ｖｐｓ（ｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ）３３（Ｄ．Ｊ．Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｐ．Ｋ．Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄ．Ｅｍｒ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５４（３），２６６−２９２  （１９９０））である）を作出してみたところ、（清酒醪などのような）高濃度のエタノールや糖を含む高浸透圧環境下では（親株に較べて）生育が弱くなったり、生育できなくなったとの報告もある。また、細胞外（＝生育環境）から物質を���り込みにくくなる醪末期には、液胞で貯蔵しておいたアミノ酸や燐酸イオン（ＰＯ４３−）などを供給する事で、細胞の生存性に影響を及ぼしている可能性は考えられる（清酒酵母研究会（編）：清酒酵母の研究  ―８０年代の研究―、ｐ１５５−１６３（北本勝ひこ（著））、清酒酵母研究会  （１９９２））。
【００５０】
ただ、清酒醪中でエタノール発酵を行なっている最中の清酒酵母の細胞は、そもそも生育環境ストレスに対する耐性能が著しく低い状態にあるとの報告もある。渡辺らのグループは、きょうかい６号（Ｋ６）や７号（Ｋ７）、９号（Ｋ９）、１０号（Ｋ１０）などの清酒酵母では、生育環境中のエタノール濃度の上昇によるストレス（＝エタノールストレス）などに対する応答反応に関わる転写因子（Ｍｓｎ４ｐ）をコードしている遺伝子（ＭＳＮ４）上にある、他のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株には見られない（＝清酒酵母特異的な）、開始コドンの位置のずれ（Ｔ２Ｃ）やＣ末端側の１１７アミノ酸配列の欠失を引き起こす一塩基多型（Ｃ１５４０Ｔ）や、またこのＭｓｎ４ｐや、これと相同な機能を持つ転写因子（Ｍｓｎ２ｐ）などの（情報伝達系の）上流で働くＰＡＳキナーゼ（＝プロテインキナーゼ）の遺伝子（ＲＩＭ１５）上にある、清酒酵母特異的なフレームシフト型変異（５０５５ｉｎｓＡ）などのために、Ｍｓｎ４ｐやＭｓｎ２ｐを介した（プロモーター領域にこれらの転写因子の結合モチーフ（ＳＴＲＥ）を持つ遺伝子群の発現を伴う）ストレス応答反応系がうまく働かず、また「細胞壁が薄いがゆえにストレス感受的な対数増殖期細胞」から「細胞壁が厚くなるがゆえにストレス耐性能も高まった状態の休止期（Ｇ０期）細胞」への移行もうまく進まない状態になっており、それゆえに自らの発酵による生育環境中のエタノール濃度の上昇も気にせずに、自滅するまで増殖し続けて（清酒酵母でしか見られないほどの）過度のエタノールを生産してしまうのではないかと見ている（Ｄ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．Ｗｕ，Ｃ．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｔ．Ａｋａｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７（３），９３４−９４１  （２０１１）、渡辺大輔：バイオサイエンスとインダストリー、６９（４）、３１１−３１３  （２０１１）、下飯仁、赤尾健、渡辺大輔：生物工学、８９（９）、５３２−５３５  （２０１１）、Ｄ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．Ａｒａｋｉ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｎ．Ｍａｅｙａ，Ｔ．Ａｋａｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７８（１１），４００８−４０１６  （２０１２）、渡辺大輔：化学と生物、５０（１０）、７２３−７２９  （２０１２））。
【００５１】
また、きょうかい７号（Ｋ７）を含む清酒酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ただし泡なし酵母を除く）の第１５染色体の末端付近には、同じくＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類される実験室酵母株などにはない、（実験室酵母株が持つＹＯＬ１５５ｃとＹＪＲ１５１ｃとの融合によって生じた遺伝子ではないかと見られている）細胞表層蛋白質の一種をコードしている高泡形成遺伝子であるＡＷＡ１（Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｏｋｕｄａ，Ｒ．Ａｔｔｈｉ，Ｋ．Ｉｗａｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｔｏ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８（４），２０１８−２０２５  （２００２）、清酒酵母・麹研究会（編）：清酒酵母の研究  ―９０年代の研究―、ｐ７１−７５（下飯仁（著））、清酒酵母・麹研究会  （２００３）、Ｋ．Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｔａｇａｋｉ，Ｋ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｋ．Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：Ｊ.Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９７（１），１４−１８  （２００４））、また第２染色体や第８染色体、第９染色体、第１２染色体上のいずれも末端付近にはビオチンの生合成に関与する蛋白質をコードしている遺伝子であるＢＩＯ６があり（Ｈ．Ｗｕ，Ｋ．Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｏｍｏｉ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１（１１），６８４５−６８５５  （２００５））、それゆえにきょうかい７号（Ｋ７）は、同じＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている上面発酵ビール酵母株やワイン酵母株などでは見られない、（発酵による生じた二酸化炭素（ＣＯ２）の泡に酵母細胞がくっつくために泡が消えにくく、発酵タンクからあふれ出してしまうという「高泡」をつくる）「高泡形成能」や「ビオチン非要求性」などの特徴（＝表現形質）を示す（下飯仁、藤田信之：化学と生物、４５（８）、５３９−５４３  （２００７）、大隅良典・下田親（編）：酵母のすべて  ―系統・細胞から分子まで―、ｐ３１１−３１５（下飯仁（著））、シュプリンガー・ジャパン  （２００７）（注：現在は丸善出版から再出版されている））。
【００５２】
同じＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている酵母でありながら、清酒酵母と、それ以外の酵母株とでは、細胞表層にも違いがあるものと見られている。たとえば、上記の、清酒酵母特異的な遺伝子であるＡＷＡ１がコードしているのも、細胞表層局在性蛋白質である。そのため、清酒酵母であるきょうかい７号（Ｋ７）や焼酎酵母であるＳＨ−４号（＝現在の「きょうかい酵母（焼酎用）」のきょうかい２号）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタラム）やＬ．ｌｅｉｃｈｍａｎｉｉ（ラクトバチルス・ライヒマニ（＝ライヒマン菌））などの乳酸菌との間で凝集性を示すが、その変異株である泡なし清酒酵母、同じくＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されているビール酵母やワイン酵母、パン酵母などは凝集性を示さず、逆にきょうかい７号（Ｋ７）やＳＨ−４号（＝きょうかい２号（焼酎用））はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）とは凝集性を示さないが、他の酵母株は凝集性を示す。清酒・焼酎酵母と他の酵母とでは細胞表層の荷電も異なっているという(百瀬洋夫、三宅正太郎、外池良三：醸協、６４（８）、７４９−７５０  （１９６９））。上記のエタノール耐性株の中にも、細胞壁の構造が変化した株が見出されており、表層構造もエタノール耐性能に影響を及ぼすようである。
【００５３】
このように、こうした酵母株ごとの生理的な特徴（＝表現形質）は、それぞれの酵母株が持つ、わずかな（遺伝子などを含む）遺伝情報の違いに起因するものであり、このような遺伝情報の違いに裏打ちされた特徴（＝表現形質）のうち、さまざまな発酵・醸造食品を製造するうえで重要なもの、すなわち「醸造特性」だけに限って評価した結果として各株に与えられる名称が、「清酒酵母」や「ワイン酵母」、「上面発酵ビール酵母」などの実用的な分類名なのである。清酒酵母を例に挙げて上記した通り、さまざまな醸造・発酵食品の製造に用いられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の（特徴（＝表現形質）のうちの）醸造特性の多くは、複数の遺伝子によって支配されている場合が多いようであり、ゆえに現時点でも不明な点が多いものの（加藤拓、下飯仁：バイオサイエンスとインダストリー、６７（６）、２６３−２６７  （２００９））、それゆえにこれらの酵母株は、現行の分類では１属１種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに一括化されていて、株群ごとに区別されていなくても、さまざまな産業分野では、それぞれ醸造・発酵食品などの名前を冠せた呼び名を使って、きちんと区別して取り扱っているのである（大塚謙一（著）：ワイン博士の本、地球社  （１９７３））。
【００５４】
こうした株ごとの醸造特性の違いは、その生態学的な分布にも影響を及ぼしている事が少なくない。地球上には、エネルギーとしての光、栄養源としての有機物や無機物、さらには酸素（Ｏ２）や二酸化炭素（ＣＯ２）の濃度、水素イオン濃度（ｐＨ）、温度、浸透圧（＝糖や塩などの濃度）などの組み合わせによる無数の環境があるが、それぞれの環境には、その環境が持つ条件（＝エネルギー源や栄養源など）にうまく適応した生物種が生息している（石田昭夫・永田進一・大島朗伸・新谷良雄・佐々木秀明（著）：細菌の栄養科学  ―環境適応の戦略―、共立出版  （２００６））。それゆえに、清酒醪という環境中には清酒醪という環境が持つ条件にうまく適応した（酵母株を含む）微生物が、ワイン醸造前の葡萄果醪（＝粗果汁）という環境中には葡萄果醪（＝粗果汁）という環境が持つ条件にうまく適応した（酵母株を含む）微生物が生息している。たとえば、ワイン酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、上面発酵ビール酵母であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株よりも、発酵前の葡萄果醪（＝粗果汁）という環境への適応能力が高い。特に、通常のワイン（またはぶどう酒）醸造の場合には、上記した通り、搾った葡萄果醪（＝粗果汁）に、野生酵母の増殖を抑制するために亜硫酸（注：厳密には「ピロ亜硫酸カリウム」、通称：メタカリ）を添加するため、強い亜硫酸耐性能を持つワイン酵母のみが旺盛に増殖し、酵母（菌）叢（フローラ）を形成する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている実験室酵母株では第１６染色体上にある細胞膜局在性の亜硫酸排出ポンプの遺伝子（ＳＳＵ１）が、同じくＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されているワイン酵母株（の遺伝子ＳＳＵ−Ｒ（Ｎ．Ｇｏｔｏ−Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ，Ｋ．Ｓｈｉｋｉ，Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｉｗａｔａ，Ｙ．Ｙａｍａｎｅ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈａｒａ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８６（５），４２７−４３３  （１９９８）、後藤奈美：醸協、９４（４）、２６２−２６８  （１９９９）））では第８染色体上に転座し、そのプロモーター領域も変化しているために、発現性が強まっており、この事が亜硫酸耐性能の強さに結び付いているとされる（大隅良典・下田親（編）：酵母のすべて  ―系統・細胞から分子まで―、ｐ３１１−３１５（下飯仁（著））、シュプリンガー・ジャパン  （２００７）（注：現在は丸善出版から再出版されている）、下飯仁：食品工業、５０（７）、５６−６１  （２００７）、加藤拓、下飯仁：醸協、１０５（８）、５００−５０６  （２０１０））。そのため、葡萄果醪（＝粗果汁）中の酵母（菌）叢（フローラ）からは、ワイン酵母と呼ぶに相応しい特徴（＝表現形質）を持ったＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株が高頻度に分離される。
【００５５】
そのため、特に昔は、たとえば清酒醸造に用いるための実用株、すなわち清酒酵母株は清酒醪から、また焼酎醸造に用いる実用株、すなわち焼酎酵母株は焼酎醪から分離される事が多かった。公益財団法人日本醸造協会から頒布されている「きょうかい酵母（登録商標）（清酒用）」は、多くの蔵元で実際に使用されている清酒酵母の実用株であるが、１９０６年に灘の酒蔵「桜正宗」の酒母から分離された「きょうかい１号（Ｋ１）」を筆頭に、きょうかい１〜７号（Ｋ１〜Ｋ７）、９号（Ｋ９）、１０号（Ｋ１０）、１２号（Ｋ１２）はいずれも清酒や清酒醪などから分離された株であり、また８号（Ｋ８（＝６号の変異株））や１１号（Ｋ１１（＝７号（Ｋ７）から分離されたエタノール耐性（変異）株））、１３号（Ｋ１３（＝９号と１０号との交配株））、泡なし酵母の６０１号（Ｋ６０１（＝６号の変異株））や７０１号（Ｋ７０１（＝７号の変異株））Ｋ．Ｏｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ａｋｉｙａｍａ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３５（７），１０２４−１０３２  （１９７１））、９０１号（Ｋ９０１（＝９号の変異株））、１００１号（Ｋ１００１（＝１０号の変異株））などもこれらの株からの派生株である（清酒酵母研究会（編）：改訂  清酒酵母の研究、ｐ２７（笠原秀夫（著））及びｐ２１９−２３１（大内弘造（著））、清酒酵母研究会  （１９８０）、日本醸造協会：吟醸と吟醸酵母、日本醸造協会  （１９８８）、清酒酵母研究会（編）：清酒酵母の研究  ―８０年代の研究―、ｐ１０１−１１０（吉田清（著））、清酒酵母研究会  （１９９２））。同様に、この日本醸造協会から頒布されている焼酎酵母（泡盛酵母を含む）の「きょうかい２号（＝ＳＨ−４号）」も球磨地方の米焼酎醪から分離された株であり（菅間誠之助：醸協、６７（８）、６７２−６７７  （１９７２））、「鹿児島工試酵母」も泡盛醪から、「宮崎酵母」も甘藷醪から分離された株である（清酒酵母研究会（編）：清酒酵母の研究  ―８０年代の研究―、ｐ３０−４４（工藤哲三・西谷尚道（著））、清酒酵母研究会  （１９９２））。ワイン酵母の「きょうかい１号」も葡萄（の実）・果醪・貯蔵樽・壜詰め葡萄酒など、ワイン醸造ラインから分離された約１５０株の中から選び出された１株である（坂口謹一郎、森貞信、鎭目淑夫：農化、１３（８）、７１３−７３５  （１９３７））。さまざまな醸造・発酵食品に利用するための、酵母などの有用微生物を同じ分離源（＝醸造・発酵食品）から分離するのは、微生物がその分離源、すなわち醸造・発酵食品ないしはその仕掛品という「環境」で生息する中で、その環境により適した特徴（＝表現形質）へと「わずかずつ」進化（あるいは退化）し、時には(たとえば上記の清酒酵母のエタノール高生産性能や高泡形成能のような）他の分離源から分離された同属同種の微生物には見られないような特徴（＝表現形質）や醸造特性をも獲得したりしている、あるいはその可能性が高いという事を考慮したうえでの事である。
【００５６】
上記した通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されるさまざまな酵母に関する（生化学的及び分子生物学的な）研究が進み、研究成果の蓄積の進んだ最近では、それぞれの醸造・発酵食品の製造に利用する実用酵母株として必要な、あるいは望ましい特徴（＝表現形質）、すなわち「醸造特性」というものも、かなり分かってきてはいる環境にあるため、（これまでの醸造・発酵食品からの分離株を用いて製造した場合とは、たとえば香気成分や有機酸の組成が異なるなど、「毛色」の異なる、特徴的な醸造・発酵食品を製造しようとの意図からも）たとえば花や果実、樹皮などの植物（柏木亨：醸協、９７（１）、２−６  （２００２）、小室友香里、穂坂賢、中田久保：醸協、９９（１０）、７４３−７４９  （２００４）、松田義弘、工藤普平、小関敏彦、上木厚子、上木勝司：醸協、１００（３）、１９９−２０８  （２００５）、小室友香里、清水大介、加藤陽子、穂坂賢、田中久保：醸協、１００（６）、４５４−４６０  （２００５）、岩口伸一、鈴木孝仁、松澤一幸、清水浩美、大橋正孝、都築正男、藤野千代：生物工学、８７（７）、３５６−３５７  （２００９））、土壌（高峰和則、大山修一、吉崎由美子、玉置尚徳、鮫島吉廣：醸協、１０５（８）、５４６−５５５  （２０１０）、田村雅彦、三雲大、石栗秀：ＪＡＴＡＦＦジャーナル、１（３）、４５−４８  （２０１３））や海水、海藻、海産小動物など（小玉健太郎：醸協、９４（１１）、８７９−８８３  （１９９９）、柳田藤寿、小玉健太郎：醸協、９７（２）、１５０−１６１  （２００２）、谷村健、濱田明美、鬼束楠里、野崎直樹、甲斐孝憲、小川喜八郎：醸協、１００（１）、５６−６４  （２００５））といった、醸造・発酵食品とはほとんど関係のない分離源からＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅないしはその近縁種（または同胞種（ｓｉｂｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ））をも含めた株群（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ（サッカロミセス・センス・ストリクト））を分離し、分離した酵母株群の中から、それぞれの醸造・発酵食品製造用の実用株として必要な、あるいは望ましい特徴（＝表現形質）、すなわち醸造特性を持つ株のみを選び出して、このような選択株を用いて清酒や焼酎、ビール、ワイン、パンなどを製造し、製品を販売する事例（ケース）も増えてきてはいる。ただし、このような選択株は、たとえば清酒醪からの分離株（＝清酒酵母）に較べると、やはりエタノール生産性能が弱い事も多いようで、それゆえにこのような選択株を使って醸造された清酒には、低アルコールタイプのものが多く（大橋正孝：なら技術だより、１４４（２００９．２．）、２−３  （２００９））、そうした面から評価すると、一般的な清酒酵母と遜色のない醸造特性を持った株であるとは言い難いかも知れない。
【００５７】
味噌・醤油のうち、特に醤油醸造に利用できるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、いわゆる「醤油主発酵酵母」は、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のみであり、たとえば蜂蜜や花など、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株は、上記した通り、こうした「味噌・醤油由来株」に較べると耐塩性能が明らかに弱いために、醤油醸造の仕込み工程での、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む醤油諸味のエタノール発酵に利用する事はできないし、それゆえにそのような株を用いて、「製品」としての醤油を醸造したとの報告もない。
【００５８】
実際に、さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株を用いた醤油諸味液汁発酵試験を実施して、確認してみた。
【００５９】
試験１．さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の醤油諸味液汁（のエタノール）発酵試験：
【００６０】
同試験に用いた供試株は、菌株保存研究機関（＝独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）のＮＢＲＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＩＴＥ）及び公益財団法人野田産業科学研究所（Ｎｏｄａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＩＳＬ）））で保存されているＺ．ｒｏｕｘｉｉ株（２０１０年７月時点）の中から、さらにその株の分離源に関する記録がきちんと公表されている株のみを選び出した。すなわち、［１］味噌から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株）、ＮＩＳＬ３７６３株（＝ＡＴＣＣ４２９８１株＝ＩＡＭ１２８７９株）の３株、［２］味噌から分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）、［３］醤油や醤油諸味などから分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＢＲＣ０５０５株、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株）、ＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株）の４株、［４］醤油や醤油諸味などから分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）の３株、［５］「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆（オランダ））、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜（カナダ））、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花（日本）））、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ（日本）））、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン（西ドイツ）））、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン（フランス）））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜（カナダ）））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰（ノルウェー）））、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）（イタリア）））の９株、すべて合わせると５群、計２０株である（注：括弧内には、各株の、別の菌株保存研究機関での株名と分離源（と国名）を記した）。
【００６１】
酵母株のエタノール生産性能を評価するための発酵試験を行なう場合には、試験用の液体培地（＝本試験の場合には醤油諸味液汁）に添加する酵母株の培養液、いわゆる「種培養液」の調製に注意を払う必要がある。種培養液中の酵母株の生育活性が低いと、これを試験用の液体培地に接種した際に、増殖が遅延したり、発酵の進行が遅れたりする事があるからである。たとえば、伊藤寛・菊池修平（編著）の「中国の豆類発酵食品（幸書房  （２００３））」中のｐ７４、「第３章  中国の発酵食品の微生物」の「（２）耐塩性酵母の培養条件」の項を見ると、『（ｐ７４）醤油、醤やトウチーに含まれる耐塩性酵母は高濃度食塩の中で生育するための前述のビタミンなどを必要とするが、これらは大豆が分解したトウチーや醤油に含まれ、これらの諸味の成分を加えると増殖が良くなる。例えば、種培養や分離培地に５〜７％のトウチーや１０〜１２％の生醤油（火入れや保存料を添加してないもの）を加えると増殖が良くなる。３０℃でＺ．ｒｏｕｘｉｉは２〜３日で、Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母は５〜７日で増殖し、コロニーが検出される。（中略）醤や醤油の仕込みに添加する種菌は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉでは液体培地に前培養し、種水として加える。Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母は醤や醤油諸味に前培養して加えるのが最も良い。』と記されており、ゆえに本試験での前培養用及び種培養液調製用の液体培地としては、下記の、生揚げ醤油（を清澄化処理したもの）を容積比（Ｖ／Ｖ）で１５％加えた生醤油液体培地を用いた。
【００６２】
生醤油液体培地の培地組成：
７％（Ｗ／Ｖ）グルコース、８．５％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生揚げ醤油（＝脱脂加工大豆、大豆、小麦、食塩を原料とする、発酵・熟成後の濃口醤油諸味の圧搾後液汁を清澄化処理したもの。火入れ処理前（＝非加熱）、成分無調整）、ｐＨ＝５．２〜５．３（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。
【００６３】
生醤油液体培地の調製法：
まず、７ｇグルコース、８．５ｇ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を蒸留水に溶かす。これに１５ｍｌ濃口生揚げ醤油を加え、よく攪拌した後、１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝５．２〜５．３に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。試験管に２ｍｌずつ分注し、試験管の口を綿栓で塞ぎ、これを高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ（ａｕｔｏｃｌａｖｅ））で１２１℃、１５分間殺菌する。
【００６４】
１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天の培地組成：
２％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．５％（Ｗ／Ｖ）酵母エキスＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（べクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＢＤ））製、製品コード：Ｎｏ．２１２７５０）、０．５％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０５％（Ｗ／Ｖ）硫酸マグネシウム、１０％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、２．４％（Ｗ／Ｖ）寒天（和光純薬工業株式会社製、製品コード：Ｎｏ．０１０−１５８１５））、ｐＨ＝５．０〜５．３（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。
【００６５】
１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天の調製法：
まず、２ｇグルコース、０．５ｇ酵母エキス、０．５ｇ燐酸二水素カリウム、０．０５ｇ硫酸マグネシウム、１０ｇ塩化ナトリウム、２．４ｇ寒天を蒸留水に溶かし、これに１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝５．０〜５．３に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。これを高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した後、熱いうちに、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、殺菌済みシャーレに（シャーレ１枚につき約１０ｍｌずつ）流し込み、冷やして固める。
【００６６】
生醤油寒天（７％ＮａＣｌ）の培地組成：
７％（Ｗ／Ｖ）グルコース、４．５１％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生揚げ醤油（＝脱脂加工大豆、大豆、小麦、食塩を原料とする、発酵・熟成後の濃口醤油諸味の圧搾後液汁を清澄化処理したもの。火入れ処理前（＝非加熱）、成分無調整）、２．４％（Ｗ／Ｖ）寒天（和光純薬工業株式会社製、製品コード：Ｎｏ．０１０−１５８１５）、ｐＨ＝５．２〜５．３（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。
【００６７】
生醤油寒天（７％ＮａＣｌ）の調製法：
まず、７ｇグルコース、４．５１ｇ塩化ナトリウム、１５ｍｌ濃口生揚げ醤油、２．４ｇ寒天を蒸留水に溶かし、これに１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝５．２〜５．３に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。これを高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した後、熱いうちに、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、殺菌済みシャーレに（シャーレ１枚につき約１０ｍｌずつ）流し込み、冷やして固める。
【００６８】
上記した通り、現在の日本国内での醤油製造量のうちの８０％以上を占めるのが「濃口醤油」であり、その８割は「本醸造方式」で製造されている事（横塚保（著）：日本の醤油  その源流と近代工業化の研究、ｐ２１、ライフリサーチプレス  （２００４）、北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性、ｐ１１−１８（石川雄章（著））、シーエムシー出版  （２００６）、一島英治（著）：［ものと人間の文化史１３８］麹（こうじ）、ｐ１３８、法政大学出版局  （２００７）、久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ１１−１４及びｐ１７８−１７９、日本醤油協会  （２０１２））から、同試験用の液体培地としては本醸造方式で製造された濃口醤油用の醤油諸味液汁を用いた。
【００６９】
濃口醤油諸味液汁の調製法：
醤油メーカーの工場で製造された濃口醤油の仕掛品、すなわち濃口醤油の仕込み工程における、仕込み後３０〜４０日前後の濃口醤油諸味（注：諸味のｐＨ＝５．２〜５．６）を、市販のガーゼに包んだ状態にして搾り、得られた搾汁をさらにガラス製ロートとＡＤＶＡＮＴＥＣグループ製の濾紙「ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ（ＱＵＡＬＩＴＡＴＩＶＥ）  Ｎｏ．２」を用いて濾過処理する。得られた濾液中の食塩分（ＮａＣｌ）、全窒素分（Ｔｏｔａｌ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔ．Ｎ．））、還元糖分（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｓｕｇａｒ（Ｒ．Ｓ．））の濃度分析については、財団法人日本醤油技術センターに委託した。また、同濾液中のエタノール濃度については、ガスクロマトグラフィー法で測定した（注：分析法の詳細については後記する。なお、本法で検出可能なエタノール濃度は０．１％（Ｖ／Ｖ）以上である）。得られた濾液中の食塩分（ＮａＣｌ）は１７．８％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は１．６８％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）は１０．１％（Ｗ／Ｖ）、エタノール濃度は０．１％（Ｖ／Ｖ）未満（＝検出限界未満）であり、発酵試験に用いるのに適当な液汁であると判断した。この得られた液汁に、和光純薬工業株式会社製のＬ−乳酸（製品コード：１２９−０２６６６）を加えて（注：ただし、乳酸の添加量は濾液容量の０．５％（Ｖ／Ｖ）未満にとどめ）、液汁のｐＨを５．２〜５．３に調整した上で、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、ワットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ）株式会社製「シリンジ・フィルター  ２５ｍｍＧＤ／Ｘ  Ｓｔｅｒｉｌｅ（製品コード：６９００−２５０４）」を用いる濾過除菌処理を施して無菌化し、この濾液を殺菌済みの試験管１本につき５ｍｌずつ分注して、試験管の口を綿栓で塞いだ（＝封じた）。
【００７０】
種培養液の調製：
供試株を上記の生醤油液体培地２ｍｌ（入りの試験管）に接種し、３０℃、２日間（厳密には約３０時間）、１４０ｒｐｍ．振とう培養し、この培養液２ｍｌのうちの０．４ｍｌを新しい生醤油液体培地２ｍｌに接種し、これを３０℃、１８時間、１４０ｒｐｍ．振とう培養する。これを以下、「種培養液」と呼ぶ。
【００７１】
種培養液１ｍｌ当たりの酵母数の計数：
上記の手順で調製した種培養液の、１ｍｌ当たりの酵母数は、以下の手順で計数した。まず、種培養液をよく攪拌したうえで、クリーンベンチなどの無菌条件下で、うち１ｍｌを採り、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分殺菌した、９ｍｌの１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液入りの試験管」に加え、ヤマト科学株式会社製タッチミキサＭＴ−３１（注：回転数は２８００〜３３００ｒｐｍ．程度）を使ってよく攪拌する。攪拌後の試験管から、すなわち種培養液の１０倍希釈液０．１ｍｌを採り、殺菌済みのスパーテルなどを使って、これを上記の１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天の表面に塗抹する。また、攪拌後の試験管から、同希釈液１ｍｌを採り、これを新しい１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液入りの試験管に加え、上記のタッチミキサを使ってよく攪拌する。攪拌後の試験管から、すなわち種培養液の１００倍希釈液０．１ｍｌを採り、新しい１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天の表面に塗抹する。種培養液の希釈倍率が1億倍（＝１００００００００倍＝１０８倍）に至るまで、この作業を繰り返す。希釈液を塗抹した寒天はいずれも、３０℃に設定した恒温器（または培養器）内に３〜７日間置き、寒天上に形成された菌集落（コロニー）の数を計数する。ただし、上記の供試株２０株のうち、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））だけは、他の１９株に較べると、耐塩性能が弱いものと見られ、１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天上では菌集落（コロニー）をまったく形成しなかったため、種培養液中の酵母数の計数には、この１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天の代わりに、生醤油寒天（７％ＮａＣｌ）を用いた。図１．は、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の種培養液の、上記手順で調製した希釈液を、さまざまな塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度の寒天培地に塗抹し、これを３０℃条件下で６〜９日間培養した際の菌集落（コロニー）の形成の様子を撮影したものである。この図１．の結果から、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の種培養液１ｍｌ中の酵母数を計数するのに用いる寒天の組成は、（１）ＹＤ寒天よりも（２）生醤油寒天の方が、そして寒天中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度は７％が適当であろうと判断し、「生醤油寒天（７％ＮａＣｌ）」を用いる事に決めた。
【００７２】
醤油諸味液汁発酵試験の手順：
上記の醤油諸味液汁５ｍｌ（入りの試験管）に、供試株の種培養液（を液汁の２％（Ｖ／Ｖ）に相当する）０．１ｍｌを接種し（注：一部の株については（６％（Ｖ／Ｖ）に相当する）０．３ｍｌ接種した試験区も設けた。詳細については後記する）、試験管の口を綿栓で塞いだ。供試株１株に対して、種培養液を０．１ｍｌ接種した試験管（試験区）２本と、０．３ｍｌ接種した試験管（試験区）２本の、計４本を準備し、うち試験管１〜２本（０．１ｍｌ接種の試験区のみ、あるいは０．１ｍｌ接種の試験区と０．３ｍｌ接種の試験区）を３０℃の振とう培養条件（１４０ｒｐｍ．）下で６日間、もう１〜２本（０．１ｍｌ接種の試験区のみ、あるいは０．１ｍｌ接種の試験区と０．３ｍｌ接種の試験区）は３０℃の静置培養条件下で１２日間培養した。培養終了後の醤油諸味液汁は、ワットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ）株式会社製「シリンジ・フィルター  ２５ｍｍＧＤ／Ｘ  Ｓｔｅｒｉｌｅ（製品コード：６９００−２５０４）」を用いて、液汁中の供試株（の細胞）を除去したうえで、ガスクロマトグラフィー法で、液汁中のエタノール濃度を測定した。
【００７３】
醤油中のエタノール濃度の測定に用いた機器は、［機器本体］横川アナリティカルシステムズ株式会社製「ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＤ  ＨＰ６８９０ｓｅｒｉｅｓ  ＧＣ  ｓｙｓｔｅｍ」、［カラム］ジーエルサイエンス株式会社製「ＨＰ６８９０  Ｇｌａｓｓ  Ｉ．Ｄ．２Φ×  ４ＦＴ（製品コード：３００３−５９２０４）」、［カラム充填剤］Ｗａｔｅｒｓ株式会社製「Ｐｏｒａｐａｋ  ＴｙｐｅＱ  Ｍｅｓｈ５０−８０（製品コード：１００２−１１３０５）」である。濃度測定時の内部標準液として、イソプロパノール水溶液を用いた。本法で検出可能なエタノール濃度は、０．１％（Ｖ／Ｖ）以上である。
【００７４】
図３．は、さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株（２０株）を、仕込み後３０〜４０日の醤油諸味液汁に接種し、３０℃条件下で、６日間振とう培養（１４０ｒｐｍ．）、あるいは１２日間静置培養した際のエタノール生産量（濃度）を調べた結果をまとめたものである（注：これら２０株を、図３．で用いた醤油諸味液汁とは異なる製造ロットの液汁に接種し、静置培養した際のエタノール生産量（濃度）を調べた結果をまとめたものとして、図９７．の（１）も示す）。「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のエタノール生産量は、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株に較べると明らかに低く、特に静置培養条件下ではほとんど（＝上記のガスクロマトグラフィー法で検出可能な０．１％（Ｖ／Ｖ）以上の）エタノールを生産しなかった。特に、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））やＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））は、醤油諸味液汁中での増殖自体が悪く、振とう培養条件及び静置培養条件の両条件下でほとんど（＝上記のガスクロマトグラフィー法で検出可能な０．１％（Ｖ／Ｖ）以上の）エタノールを生産しなかった。たとえば、
【００７５】
図２．は、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）と、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の、醤油諸味液汁中での増殖の様子を撮影した写真だが、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪））の増殖は、振とう培養条件下、静置培養条件下の両方において、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））よりも明らかに弱い。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））やＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））のように、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の一部の株は、そもそも生醤油液体培地中での増殖さえも弱く、種培養液中の酵母数が１０８ＣＦＵ／ｍｌに達しない場合もあったため、このような株については、醤油諸味液汁５ｍｌへの種培養液の接種量を通常（＝０．１ｍｌ）の３倍、すなわち０．３ｍｌに増量した試験区も設け、同様にエタノール生産性能を調べてみたが、やはりほとんど（＝上記のガスクロマトグラフィー法で検出可能な０．１％（Ｖ／Ｖ）以上の）エタノールを生産しなかった。
【００７６】
このように、醤油醸造の仕込み工程における醤油諸味のエタノール発酵に利用できるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、いわゆる「醤油主発酵酵母株」は、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌諸味・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のみに限られ、たとえば蜂蜜や花など、いわゆる「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株は、こうした株に較べると耐塩性が弱いために、醤油醸造の仕込み工程における醤油諸味のエタノール発酵に利用する事はできない。たとえば、戸井田らのグループも、蜂蜜から分離したＺ．ｒｏｕｘｉｉ  Ａ２株(蟻川幸彦、小松良寿、戸井田仁一、近藤君夫：長野県工技セ食品部報、３３（９）、４７−４８  （２００５））を用いて、醤油諸味よりも食塩（ＮａＣｌ）濃度が低い、信州味噌タイプ（食塩（ＮａＣｌ）濃度１１〜１３％程度、対水食塩濃度２０〜２２％）の味噌の仕込み試験を試みてはみたものの、Ａ２株の耐塩性能が味噌醸造用実用株であるＮｏ．６株に較べると弱く、そのまま味噌の醸造に利用するのは難しいとの結論を出している（戸井田仁一、蟻川幸彦：長野県工技センター研報、２、Ｆ１０−Ｆ１３  （２００７））。
【００７７】
本発明者（＝馬渕）は、２００１年に、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群の中から、醤油醸造、すなわち１６％前後ないしはそれ以上という高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む醤油諸味の効率的なエタノール発酵に利用できる、「特に高いエタノール生産性能」を持つ酵母株だけを選び出す方法を考案している（馬渕清人：エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地、同酵母株の分離法及び同酵母株を用いる含塩醗酵食品の製造法、特許３９３８４８８）。これは、「現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株は、ある濃度以上の硫酸銅や塩化リチウム、塩化マンガンなどを含む（ただし塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）はほとんど含まない）培地中では生育が阻害されるが、この培地中のグルコース濃度を高めてやると生育できるようになる事、しかも「生育可能」になるのに必要な最小グルコース濃度は酵母株ごとに異なる事から、これを指標にしてＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群をいくつかの株群に区分けできるという本発明者（＝馬渕）の別の発明（馬渕清人：醤油酵母の分離識別法、特許３９０４１８７）」を利用して、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株をいくつかの株群に区分けしてみたところ、特定の株群にのみ、醤油諸味液汁中でのエタノール生産性能が「特に高い」Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株が集まる事を発見した、その「発見」に基づいたものである。たとえば、この特許の「実施例６」の「（表７）実験室株のエタノール生産性と本発明培地での生育」を見ると、Ｍｎ培地及びＣｕ培地の両方で生育可能な株群に区分けされたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株はいずれも、他の２群に区分けされたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株よりも（特に振とう培養条件下において）明らかに高いエタノール生産性能を示しているが、これらの酵母株の分離源はいずれも味噌・醤油ないしはその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）である。
【００７８】
そもそも、現行の分類では同じＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株であっても、醤油及びその仕掛品である醤油諸味や生揚げ醤油などという環境への適応能力は、株ごとに大きく異なっている。現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群の中には、たとえば醤油中に接種した際に、すぐに死滅してしまう株と、死滅せずに醤油中で生存し続ける株とがいる。そこで、実際に、さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の醤油中での生存能力についても調べてみた。
【００７９】
試験２．供試株の醤油中での生存性試験：
【００８０】
同試験に用いた供試株は、菌株保存研究機関で保存されているＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の中から、さらにその株の分離源に関する記録がきちんと公表されている株のみを選び出した。すなわち、上記の試験１．の計２０株である。種培養液の調製及び種培養液１ｍｌ当たりの酵母数の計数も、上記の試験１．の手順の通りに行なった。
【００８１】
上記した通り、現在の日本国内での醤油製造量のうちの８０％以上を占めるのが濃口醤油であり、その８割は「本醸造」方式で製造されている事（横塚保（著）：日本の醤油  その源流と近代工業化の研究、ｐ２１、ライフリサーチプレス  （２００４））、北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性、ｐ１１−１８（石川雄章（著））、シーエムシー出版  （２００６）、一島英治（著）：［ものと人間の文化史１３８］麹（こうじ）、ｐ１３８、法政大学出版局  （２００７））から、同試験には、市販の濃口醤油（本醸造）の中から、さらに製品ラベルの「原材料名」欄に、原材料として記されているのが「大豆（遺伝子組換えでない）」、「脱脂加工大豆（遺伝子組換えでない）」、「小麦」、「食塩」、「アルコール」のみであり、それ以外の原材料、たとえば保存料（安息香酸ナトリウムやパラオキシ安息香酸エステル類）などの食品添加物に関する記述がないものを選択して用いた。すなわち、市販の濃口醤油I、II、III及びIVの４試料と、この醤油メーカーから入手した濃口生揚げ醤油（＝脱脂加工大豆、大豆、小麦、食塩を原料とする、発酵・熟成後の濃口醤油諸味の圧搾後液汁を清澄化処理したもの。火入れ処理前（＝非加熱）、成分無調整）の１試料、計５試料を用いた。上記の濃口醤油及び濃口生揚げ醤油中の食塩分（ＮａＣｌ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）、食塩分（ＮａＣｌ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）及びｐＨ値の測定は、財団法人日本醤油研究所（編）の「しょうゆ試験法（日本醤油研究所  （１９８５））」のｐ２−６（１−１−２  全窒素分）、ｐ６−７（１−１−３  食塩分）、ｐ１２−１４（１−１−６  直接還元糖分）、ｐ１９（１−３−２  ｐＨ）に記されている通りに行なった。また、エタノール濃度の測定は、上記のガスクロマトグラフィー法で行なった。濃口醤油Iの食塩分（ＮａＣｌ）は１６．１７％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は１．５９８％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）は２．２１％（Ｗ／Ｖ）、エタノール濃度は２．７６％（Ｖ／Ｖ）でｐＨ＝４．７２、濃口醤油IIの食塩分（ＮａＣｌ）は１６．２０％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は１．５９４％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）は２．７３％（Ｗ／Ｖ）、エタノール濃度は２．９９％（Ｖ／Ｖ）でｐＨ＝４．８６、濃口醤油IIIの食塩分（ＮａＣｌ）は１６．２０％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は１．６００％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）は２．８８％（Ｗ／Ｖ）、エタノール濃度は２．８８％（Ｖ／Ｖ）でｐＨ＝４．９１、濃口醤油IVの食塩分（ＮａＣｌ）は１６．２１％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は１．５９４％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）は２．６８％（Ｗ／Ｖ）、エタノール濃度は２．９３％（Ｖ／Ｖ）でｐＨ＝４．７３、また濃口生揚げ醤油の食塩分（ＮａＣｌ）は１６．６％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は１．７７３％（Ｗ／Ｖ）、エタノール濃度は３．２３％（Ｖ／Ｖ）でｐＨ＝４．９６（注：還元糖分（Ｒ．Ｓ．）の濃度測定は未実施）であった。これらの成分値は、一般的な濃口醤油（製品）及び濃口生揚げ醤油などと較べても、特にかけ離れた数値ではなかったため、以下の生存性試験に用いるのに適当な試料（＝濃口醤油及び濃口生揚げ醤��）であると判断した。
【００８２】
濃口醤油及び濃口生揚げ醤油の除菌処理：
試験に用いる濃口醤油及び濃口生揚げ醤油は、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、ワットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ）株式会社製「シリンジ・フィルター  ２５ｍｍＧＤ／Ｘ  Ｓｔｅｒｉｌｅ（製品コード：６９００−２５０４）」を用いる除菌濾過処理を施して無菌化し、この濾液を殺菌済みの試験管１本につき５ｍｌずつ分注する。
【００８３】
生存性試験の手順：
上記の、除菌処理済みの濃口醤油５ｍｌ（入りの試験管）及び濃口生揚げ醤油５ｍｌ（入りの試験管）に供試株の種培養液（を醤油の２％に相当する）０．１ｍｌを接種し、試験管の口をシリコン栓で塞いだ。これを３０℃に設定した恒温器（または培養器）内に置き、３０日間保存（または静置培養）した。保存（または静置培養）終了後の醤油、すなわち試験区のうち、醤油の液面に白〜淡い褐色の、乾燥して粉をふいたような性状の「皮膜（ｆｉｌｍ、またはｐｅｌｌｉｃｌｅ）」が形成されたもの（後記）を除き、それ以外の試験区については、醤油１ｍｌ中の生存酵母数を計数した。醤油１ｍｌ中の生存酵母数の計数は、上記の試験１．の「種培養液１ｍｌ当たりの酵母数の計数」手順と同様の方法で行なった。なお、本法で検出可能な酵母数は１０ＣＦＵ／ｍｌ以上である。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
表１．は、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株１１株と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株９株を濃口醤油や濃口生揚げ醤油に接種して、３０℃条件下で３０日間保存（または静置培養）した後の、醤油１ｍｌ中の生存数を調べた結果をまとめたものである。濃口醤油I（注：種培養液接種後の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度（推定値）は１６．０７％）及びIIの試験区（注：種培養液接種後の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度（推定値）は１６．１０％）では、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株１１株のうち、醤油中で皮膜を形成したＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）の４株を除く７株の場合には、生存率０．１％以上と、高い生存性を示したのに対して、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株９株のうち、ビターオレンジシロップボンボン（ｂｏｎｂｏｎ  ｏｆ  ｂｉｔｔｅｒ−ｏｒａｎｇｅ  ｓｙｒｕｐ）から分離されたＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株）、塩漬豆（ｓａｌｔｅｄ  ｂｅａｎｓ）から分離されたＮＢＲＣ１７３０株とクリーミーケーキ（ｃｒｅａｍｙ  ｃａｋｅ）から分離されたＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株）の３株を除く６株の場合には、すべて死滅してしまったのか、生存細胞が検出されなかった（＝本法で検出可能な酵母数（１０ＣＦＵ／ｍｌ）未満）。
【００８６】
たとえば、図４．は、上記の手順通りに、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源、すなわち黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）を接種した濃口醤油II５ｍｌを、３０℃条件下で３０日間保管（または静置培養）したうえで、うち０．１ｍｌをそのまま１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天上に塗抹し、３０℃条件下で４日間培養した後の、同寒天の様子を撮影した写真である。味噌から分離されたＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）は、接種後３０日を経ても、濃口醤油II中で生存し続けたために、このＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）を接種した濃口醤油IIを塗抹した寒天上には、たくさんの菌集落（コロニー）（注：濃口醤油１ｍｌ当たり換算で４．４×１０５ＣＦＵ）が出現したのに対して、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源、すなわち黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合には、接種してから３０日の間に濃口醤油II中で死滅してしまったものと見られ、このＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）を接種した濃口醤油IIを塗抹した寒天上には、写真の通り、菌集落（コロニー）が出現しなかった。
【００８７】
濃口生揚げ醤油中での生存細胞数は、一部の例外的な株での場合を除き、濃口醤油中での生存細胞数に較べると低かったが、これは濃口生揚げ醤油中の食塩分（ＮａＣｌ）や全窒素分（Ｔ．Ｎ．）、エタノール濃度が、濃口醤油に較べて高い事が関係しているものと見られる。上記の例外的な３株のうちの１株、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））と、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の一部については、こうした濃口生揚げ醤油の試験区では生存細胞が検出されなかった（＝本法で検出可能な酵母数（１０ＣＦＵ／ｍｌ）未満）のに対して、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株）や醤油から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株）などと、塩漬豆（ｓａｌｔｅｄ  ｂｅａｎｓ）から分離されたＮＢＲＣ１７３０株だけは、こうした濃口生揚げ醤油の試験区でも高い生存性を示した。
【００８８】
上記の試験結果から、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の中には、濃口醤油やその仕掛品である濃口生揚げ醤油中で高い生存能力を示す株が多く、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の中には、濃口醤油やその仕掛品である濃口生揚げ醤油中で高い生存能力を示す株が非常に少ない事が判明した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを例に上記した通り、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株も、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含むその環境（＝分離源）に「より」適応できるように、また一方、たとえば蜂蜜や花などから分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のほうは、蜂蜜や花という環境（＝分離源）で生息する事を通して、それぞれの環境（＝分離源）に「より」適応できるような特徴（＝表現形質）を身につけたのであろう。「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のうち、ＮＢＲＣ１７３０株だけが例外的に、濃口醤油や濃口生揚げ醤油中で高い生存能力を示したのは、同株が「塩漬豆（オランダ）」という、（大豆と食塩（ＮａＣｌ）とを用いて製造するという）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）に比較的似た環境（＝分離源）から分離された株であったからではないかと見られる。
【００８９】
このような濃口醤油や生揚げ醤油中での生存能力が高い（＝濃口醤油や生揚げ醤油という環境への適応能力が高い）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株は、醤油醸造の仕込み工程では、上記の試験１．の結果が示す通り、醤油主発酵酵母株として醤油諸味のエタノール発酵に関わる能力を持つという有益性を示す反面、醤油や生揚げ醤油を原材料とするつゆ類などの製造工程では、問題を引き起こす事もある。たとえば、上記の試験２．で、醤油中で高い生存能力を示した、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌諸味・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された株が、ストレートつゆ類の原材料として用いる予定の醤油や生揚げ醤油などに残存している場合、あるいは混入してしまった場合、つゆの調合工程（での希釈）で食塩（ＮａＣｌ）濃度が低下するのに伴い、（調合後直ちに殺菌処理を行なわないと）時間経過とともにこうした株が増殖し始め、製品を腐敗させてしまうという事故を引き起こす事がある。たとえば、濃口醤油に接種した場合に、醤油中で死滅せず、接種後の日数の経過に伴って増殖さえしたＳ．ｒｏｕｘｉｉ（＝現：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）  Ｎｏ．２株に関する報告もある（高草仁、四方日出男、大森邦英、西山輝、森口繁弘：醤研、１（４）、１９０−１９４  （１９７５））。
【００９０】
つまり、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株と、たとえば蜂蜜や花といった、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とでは、耐塩性能という「（味噌・醤油醸造上重要な）醸造特性（＝表現形質）」が大きく異なっているために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株は味噌や醤油の醸造に利用できる「味噌・醤油主発酵酵母株」である一方、醤油（製品）などの環境にも適応して生存してしまうため、つゆ類などの製造工程で問題を引き起こす有害酵母株にも化ける危険性があるのに対して、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株は味噌や醤油の醸造に利用するのは難しく、また醤油（製品）などへの残存による問題もほとんど引き起こさない。そのため、［Ｂ］「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高い事から、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、かつ醤油諸味のエタノール発酵に関わる能力を持つ事から、味噌・醤油醸造に利用できるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株（＝味噌・醤油主発酵酵母株）」と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低い事から、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味のエタノール発酵に関わる能力も持っておらず、それゆえに味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」とを区分けする事も、味噌・醤油醸造及び製品などの開発・品質管理上きわめて重要な事であり、これらを区分けする判別法も産業上有用である。
【００９１】
最近、このような「耐塩性能の強い株と弱い株とが同じＺ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種に分類されている現行の分類自体が、本当に適切なのであろうか」という疑問を口にする研究者達が増えてきている。Ｋｕｒｔｚｍａｎの報告によれば、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）と、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＩＳＬ３３６９株）との、染色体ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合（または分子交雑、ハイブリッド形成、ハイブリダイゼーション）試験から導き出されたＤＮＡ相同値（ＤＮＡ  ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）は８８〜８９％と、（数々の経験の積み重ねから築き上げられた）同種の指標とされる７０％（Ｌ．Ｇ．Ｗａｙｎｅ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｃｏｌｗｅｌｌ，Ｐ．Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｍｏｎｔ，Ｏ．Ｋａｎｄｌｅｒ，Ｍ．Ｉ．Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ，Ｌ．Ｈ．Ｍｏｏｒｅ，Ｗ．Ｅ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｍ．Ｐ．Ｓｔａｒｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｔｒｕｐｅｒ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３７（４），４６３−４６４  （１９８７））を一応は超えている（Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ：Ｙｅａｓｔ，６（３），２１３−２１９  （１９９０））。しかしながら、Ｄｕａｒｔｅらは、アイソザイムパターン解析（ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ｐａｔｔｅｒｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいたクラスター解析結果から、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種に分類される酵母株群の中には、［１］黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＰＹＣＣ５２７６株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＮＩＳＬ３４６１株）を含む株群の他に、たとえば［２］味噌から分離されたこのＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＩＳＬ３３６９株（味噌））や、ＰＹＣＣ３６９３株（誉（白）味噌（ｈｏｍａｒｅ  ｗｈｉｔｅ  ｍｉｓｏ））のような、別の株群が混在している可能性を指摘している（Ｆ．Ｌ．Ｄｕａｒｔｅ，Ｃ．Ｐａｉｓ，Ｉ．Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｍａｒｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｌｅａｏ：Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７（４），４３６−４４２  （２００４））。上記のＰｒｉｂｙｌｏｖａらによれば、この黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）と味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）とでは、（耐塩性能などの特徴（＝表現形質）が異なる事は上記した通りだが）そもそも細胞の大きさや形も異なっており、染色体の数は黒葡萄濃縮粗���汁（＝果醪）から分離されたＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）が７本であったのに対して、味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）は８本で、ゲノムサイズもより大きいという（Ｌ．Ｐｒｉｂｙｌｏｖａ，Ｊ．ｄｅ  Ｍｏｎｔｉｇｎｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ：Ｙｅａｓｔ，２４（３），１７１−１８０  （２００７））。
【００９２】
最近よく用いられる酵母の遺伝学的な分類法として、たとえばリボソームの構成分子の１つであるリボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（ｒＲＮＡ））の遺伝子の、その部分的な塩基配列を指標とする方法がある。酵母の場合には、ｒＲＮＡは（それぞれの分子の沈降係数（Ｓｖｅｄｂｅｒｇ（Ｓ）値）に基づいて命名された）ラージサブユニット（ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＬＳＵ））の構成要素である２６ＳｒＲＮＡ（２６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ））、スモールサブユニット（ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＳＳＵ））の構成要素である１８ＳｒＲＮＡ（１８Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ））、５．８ＳｒＲＮＡなどから構成されており、これらｒＲＮＡの遺伝子（注：ｒＲＮＡ遺伝子そのものの塩基配列を解読せず、これを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲ法などで調製した増幅産物の塩基配列を解読した場合には、この増幅産物を以前は”ｒＤＮＡ”と表記する事があった。つまり、この”ｒＤＮＡ”はｒＲＮＡ遺伝子という意味とほぼ同義である。『（ｐ６１−６２）しかしながら、”ｒＤＮＡ”はゲノム中に存在し、分子そのものが単体で存在するわけではないため、最近の主要な科学雑誌では、”ｒＤＮＡ”という表記は使用せず、ｒＲＮＡ遺伝子と直接呼ぶ方向で調整が進められている。（中村和憲・関口勇地（著）：微生物相解析技術  ―目に見えない微生物を遺伝子で解析する―、米田出版  （２００９））』。ただ、本明細書では、”ｒＤＮＡ”という表記を使っている文献も引用している事から、以下、ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）と併記する事にする）を含む塩基配列部分のうち、転写領域（上の、特に遺伝子）は進化速度（＝単位期間当たりの塩基置換の回数）が遅いために種内での変異が小さく、特に２６ＳｒＲＮＡの遺伝子（２６ＳｒＲＮＡ遺伝子）上のＤ１／Ｄ２領域（またはＤ１／Ｄ２ドメイン）を含む部分配列（約６００ｂｐ）が同種内の株では９９％以上の類似性を示す一方（Ｓ．Ｗ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ：Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４（２），１２４−１２９  （１９９１）、Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｒｏｂｎｅｔｔ：Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，７３（４），３３１−３７１  （１９９８））、「１８ＳｒＲＮＡ遺伝子と５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子との間」や「５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子と２６ＳｒＲＮＡ遺伝子との間」にある内部転写スペーサー（領域）（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ（ｒｅｇｉｏｎ））、すなわちＩＴＳ１やＩＴＳ２などは挿入や欠失、点変異などによって変化に富んでおり、（そもそもＩＴＳ１の塩基配列とＩＴＳ２の塩基配列とでも違いがあり、近縁種間の分子系統解析などで使用するのにはＩＴＳ１の配列情報の方がよりよいとされるが（Ｙ．Ｏｄａ，Ｍ．Ｙａｂｕｋｉ，Ｋ．Ｔｏｎｏｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｕｋｕｎａｇａ：Ｙｅａｓｔ，１３（１３），１２４３−１２５０  （１９９７）、Ｒ．Ｍｏｎｔｒｏｃｈｅｒ，Ｍ．−Ｃ．Ｖｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ｂｒｉｏｌａｙ，Ｃ．Ｇａｕｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍａｒｍｅｉｓｓｅ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４８（１），２９５−３０３  （１９９８）、Ｇ．Ｉ．Ｎａｕｍｏｖ，Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｅ．Ｓ．Ｎａｕｍｏｖａ，Ｅ．Ｊ．Ｌｏｕｉｓ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０（６），１９３１−１９４２  （２０００）））同種株内の「変種」以上では９９％以上の類似性を示すとされる（Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６（１），１８９−１９４  （１９９６）、Ｔ．Ｓｕｇｉｔａ，Ａ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｓｈｉｎｏｄａ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７（６），１９８５−１９９３  （１９９９））。
【００９３】
これらの知見のうち、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の、Ｄ１／Ｄ２領域を含む部分配列は、酵母分類・同定の聖書である”Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ”でも、１９９８年改訂の４版（Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（４ｔｈ  ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９９８））から分類基準として採用され、それゆえにこれを指標とする判別法は現在では「酵母の簡易同定法」とも呼ばれ、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの）酵母株の（属種）同定を必要とするさまざまな場面でごく当たり前に用いられるようになっている（後藤慶一：モダンメディア、５５（９）、２３７−２４２  （２００９）、後藤慶一：日食微誌（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２７（２）、５６−６２  （２０１０））。
【００９４】
また、スペーサー領域を指標とする判別法についても、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど、現行の分類では同属同種に分類されている醸造用酵母株の（特に産業用途別）区分けに利用しようとする試みが、比較的古くから研究されてきた。たとえば、Ｍｏｌｉｎａらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓに分類されている酵母株の、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子と５ＳｒＲＮＡの遺伝子（５ＳｒＲＮＡ遺伝子）との間のスペーサー領域（ＩＴＳ）の塩基配列は、同種内でもバラエティーに富んでいて、これを指標として用いる事で株群をさらに区分けできる可能性があると報告しており（Ｆ．Ｉ．Ｍｏｌｉｎａ，Ｓ．−Ｃ．Ｊｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．Ｈｕｆｆｍａｎ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１０８（３），２５９−２６３  （１９９３））、ＫａｗａｈａｒａらはＩＴＳ１上の４箇所（＝ポジションＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）とＩＴＳ２上の２箇所（＝ポジションＥ及びＦ）との、計６箇所の塩基の違い（＝多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ））を指標にすれば、醸造用酵母株を、［１］清酒酵母（＝きょうかい酵母のＫ６、Ｋ７、Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１４、Ｋ１５など）・焼酎酵母（＝Ｓ２株など）株群（とパン酵母１株を含む）、［２］ワイン酵母株群（＝ＯＣ２株など）、［３］ビール酵母・ウィスキー酵母株群（とパン酵母７株を含む）の計３群に区分けできると報告している（Ｍ．Ｋａｗａｈａｔａ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｉｅｆｕｊｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１（７），１６１６−１６２０  （２００７））。また、山岸及び尾形も、このスペーサー領域の塩基配列全長ないしは一部を指標に、下面発酵ビール酵母をさらに株群に区分けするための方法を考案しており（山岸裕美、尾形智夫：新規オリゴヌクレオチドとそれを用いた酵母分類法、特許３７９５２５９）、上記のＫａｗａｈａｒａらも、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓに分類されるビール酵母数株についても、スペーサー領域を使えば、（産業上の用途は同じだが）さらに３群に区分けできる事を報告している（Ｍ．Ｋａｗａｈａｔａ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｉｅｆｕｊｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１（７），１６１６−１６２０  （２００７））。
【００９５】
しかしながら、こうした方法をＺ．ｒｏｕｘｉｉに適用した場合にも、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種に分類されている酵母株群の中に、少なくとも２群以上の酵母株群が混在している可能性が見えてくる。たとえば、Ｓｕｅｚａｗａらのグループは、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」を含むさまざまな分離源から分離された計４２株を対象に調べてみた結果、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の部分的な塩基配列を指標にした場合には２群、すなわち［１］黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）やクリーミーケーキから分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）、蜂蜜から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０６８６株（＝ＮＩＳＬ３４５６株）などが含まれる「Ｔｙｐｅ１」群と、［２］花から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）や、醤油諸味から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株などが含まれる「Ｔｙｐｅ２」群とに区分けでき、しかも両者間の同配列部分の相違性は、本来ならば別種だと判定される「１％」の壁を超える２．６％であった事、さらにＩＴＳを指標にした場合にはＴｙｐｅI〜ＴｙｐｅVIIの７群に区分けでき、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）などが含まれる「ＴｙｐｅI」群と、味噌から分離されたＩＦＯ０５２５株（＝ＮＩＳＬ３４５２株）や花から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）が含まれる「ＴｙｐｅVI」群との相違性は１２％にも及び、両方の指標を利用した場合には９群（＝Ｔｙｐｅ１−I、Ｔｙｐｅ１−II、Ｔｙｐｅ１−III、Ｔｙｐｅ１−Ｖ、Ｔｙｐｅ１−VII、Ｔｙｐｅ２−I、Ｔｙｐｅ２−IV、Ｔｙｐｅ２−VI、Ｔｙｐｅ２−VII）にまで区分けできる事を見出した（Ｙ．Ｓｕｅｚａｗａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｏｒｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（９），２４５２−２４５５  （２００８））。
【００９６】
Ｊａｍｅｓらのグループがさまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株９株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域を調べてみた結果でも、味噌から分離されたＮＣＹＣ１６８２株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）やソフトドリンク工場（ｓｏｆｔ  ｄｒｉｎｋｓ  ｆａｃｔｏｒｙ）から分離されたＮＣＹＣ３０４２株などの同領域の部分配列は、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＮＣＹＣ５６８株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）などのそれとは一致しなかったと報告しており、しかも（上記の下面発酵ビール酵母（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ．ｂａｙａｎｕｓとの種間雑種であるがゆえに、「両親」から受け継いだ、２種類のホモセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＭＥＴ２）やアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＴＦ１）、エンドヌクレアーゼ遺伝子（ＨＯ）、分枝鎖アミノ酸パーミアーゼ遺伝子（ＢＡＰ２）を持っているように）これらの株は耐塩性に関わるＮａ＋／Ｈ＋−アンチポーター（Ｎａ＋／Ｈ＋−ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）をコードしている遺伝子（ＳＯＤ２）やアデニン合成に関わる酵素であるホスホリボシル−アミノイミダゾール  カルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードしている遺伝子（ＡＤＥ２）（Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ，Ｖ．Ｂｒａｕｎ  ａｎｄ  Ｊ．−Ｌ．Ｓｏｕｃｉｅｔ：Ｙｅａｓｔ，１５（１３），１３９９−１４０２  （１９９９））、ヒスチジン合成に関わる酵素イミダゾールグリセロール燐酸デヒドラターゼ（ｉｍｉｄａｚｏｌｅｇｌｙｃｅｒｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードしている遺伝子（ＨＩＳ３）（Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ，Ｖ．Ｂｒａｕｎ  ａｎｄ  Ｊ．−Ｌ．Ｓｏｕｃｉｅｔ：Ｙｅａｓｔ，１６（７），５８１−５８７  （２０００））などを２つずつ持っていて、しかも２つずつある各遺伝子のうちの片方の塩基配列はＮＣＹＣ５６８株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）などが持つＳＯＤ２（またはＺ（ｒ）ＳＯＤ２）やＡＤＥ２、ＨＩＳ３の塩基配列との類似性が非常に高いのに対して、もう片方の遺伝子の塩基配列はＮＣＹＣ５６８株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）などが持つＳＯＤ２（またはＺ（ｒ）ＳＯＤ２）やＡＤＥ２、ＨＩＳ３の塩基配列との類似性が低く、各遺伝子はそれぞれ、起源が異なる微生物に由来するものである可能性が高い事から、Ｊａｍｅｓらは、これらの株がＮＣＹＣ５６８株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）と他のＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母との交雑によって生まれた株（（ｎａｔｕｒａｌ）���ｙｂｒｉｄ）ではないかと推察している（Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂｏｎｄ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，５（８），７４７−７５５  （２００５））。黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＡＴＣＣ２６２３株（＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）は、耐塩性に関わるＭＡＰキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）  ｋｉｎａｓｅ）をコードしている遺伝子（ＨＯＧ）、グリセロールの代謝に関わるグリセロール−３−燐酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＰＤ））やグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＣＹ））をコードしている遺伝子（ＧＰＤやＧＣＹ）も、それぞれ１つずつしか持っていないが（ＳＯＤ（ＺｒＳＯＤ２、またはＺＳＯＤ２）及びＨＯＧ（ＺｒＨＯＧ１）については、Ｏ．Ｋｉｎｃｌｏｖａ，Ｓ．Ｐｏｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ：Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８（２），１５１−１５８  （２００１）。ＧＰＤ（ＺｒＧＰＤ１）及びＧＣＹ（ＺｒＧＣＹ１）については、Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｙ．Ｔａｍａｉ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，４（４−５），５０５−５１０  （２００４））、味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）はこれらの遺伝子も２つずつ持っているという（注：２つのＳＯＤ（ＺＳＯＤ２及びＺＳＯＤ２２）については、Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．Ｍｉｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｔａｍａｉ：Ｙｅａｓｔ，１１（９），８２９−８３８  （１９９５）、Ｔ．Ｉｗａｋｉ，Ｙ．Ｈｉｇａｓｈｉｄａ，Ｈ．Ｔｓｕｊｉ，Ｙ．Ｔａｍａｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ：Ｙｅａｓｔ，１４（１３）１１６７−１１７４  （１９９８）。２つのＨＯＧ（ＺｒＨＯＧ１及びＺｒＨＯＧ２）については、Ｔ．Ｉｗａｋｉ，Ｙ．Ｔａｍａｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５（１），２４１−２４８  （１９９９）。２つのＧＰＤ（ＺｒＧＰＤ１及びＺｒＧＰＤ２）及び２つのＧＣＹ（ＺｒＧＣＹ１及びＺｒＧＣＹ２）については、Ｔ．Ｉｗａｋｉ，Ｓ．Ｋｕｒｏｎｏ，Ｙ．Ｙｏｋｏｓｅ，Ｋ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｙ．Ｔａｍａｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ：Ｙｅａｓｔ，１８（８），７３７−７４４  （２００１））。
【００９７】
Ｇｏｒｄｏｎらのグループも、味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）の持つ遺伝子群を調べてみたところ、ＨＯＧ１やＳＯＤ２などの遺伝子はもちろん、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）やスペーサー領域も２種類、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であ（り、上記のＳｕｅｚａｗａらが「Ｔｙｐｅ１」と仮称した株群に含まれ）るＣＢＳ７３２株のそれと一致する塩基配列と、上記のＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）のそれと一致する塩基配列との両方を持っている事を見出し、それゆえにこうした発見を踏まえて、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母群の中には、［１］黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）などから構成される株群（注：以下、（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（群）と記す）と、上記の［２］ソフトドリンク工場から分離されたＮＣＹＣ３０４２株（＝ＣＢＳ９９５１株）などから構成される株群（注：Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ（＝チゴサッカロミセス・シュードルーキシー）と仮称されている事から、以下、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ（群）と記す。ただし、「ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ」なる種名自体は、現行の分類で正式に認められたものではない。Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ（群）に属する株に関する報告は、上記のＪａｍｅｓらによるＮＣＹＣ３０４２株（＝ＣＢＳ９９５１株（ソフトドリンク工場））（Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂｏｎｄ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，５（８），７４７−７５５  （２００５））ぐらいしかなく、現時点では表現形質に関する報告自体もない。このＮＣＹＣ３０４２株（＝ＣＢＳ９９５１株）は、オランダの菌株保存研究機関「ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  菌類多様性センター（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｃｅｎｔｒｅ）では、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．として、またイギリスの菌株保存研究機関である「ナショナル・コレクション・オブ・イースト・カルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＹＣ））」のホームページ上に公開されている「（菌）株情報」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｙｃ．ｃｏ．ｕｋ／ｙｅａｓｔ−ｎｃｙｃ−３０４２．ｈｔｍｌ）には、（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉではなく）Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ（チゴサッカロミセス・ハイブリッド・ストレイン）として登録されており、同株の「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（＝情報）」欄には、『ＮＣＹＣ３０４２  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｂｅ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ  ａｒｉｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｒｏｓｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  ａｎ  ｕｎｋｎｏｗｎ  Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｒａｉｎ．（注：［和訳］ＮＣＹＣ３０４２株は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌｌｉｓ（＝チゴサッカロミセス・メリス。以下、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓと略す）と他の、未知のＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母との交雑によって生まれた（異種間）交雑株だと見られる）』と記されている（２０１３年８月３０日調査時点））と、［３］この味噌から分離されたＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株）のような、上記の［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（群）と［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ（群）との（自然）交雑によって生まれたのではないかと見られる株群（注：以下、［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ（群）と略す）とが混在しているのではないかと見ており（Ｊ．Ｌ．Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｈ．Ｗｏｌｆｅ：Ｙｅａｓｔ，２５（６），４４９−４５６  （２００８））、さらに最近、研究者達の間では、（下面発酵ビール酵母（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ．ｂａｙａｎｕｓとの間での種間交雑とその後の染色体の再編成（＝乗換えや消失など）を経て生まれた異種高次倍数体であるという上記の事例（ケース）と同じく）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のほとんどないしはすべてが、この３群のうちの［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ（群）に区分けすべき株に相当するのではないかとも言われ始めている（注：［３］Ｚｙｇｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる（現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている）株群が、耐塩性能の弱い［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと、少なくとも味噌や醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）からは分離されたとの報告がない［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉとの交雑によって生まれたものだと仮定した場合、［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる株群の耐塩性能がこれらの親株よりも極端に強いという事は、不可解にも思えるかも知れない。ただ、近縁種どうしの交雑によって生まれた異質倍数体が多い植物の場合、このような亜種間交雑ないしは種間交雑によって生まれたばかりの異質倍数体（群）では、その個体（または株）ごとに、両方の親株からそれぞれ受け継いだゲノムの再編成（Ｌ．Ｈ．Ｒｉｅｓｅｂｅｒｇ，Ｂ．Ｓｉｎｅｒｖｏ，Ｃ．Ｒ．Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｕｎｇｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ａｒｉａｓ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２６２），７４１−７４５  （１９９６）、Ｈ．Ｓｈａｋｅｄ，Ｋ．Ｋａｓｈｋｕｓｈ，Ｈ．Ｏｚｋａｎ，Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａ．Ｌｅｖｙ：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１３（８），１７４９−１７５９  （２００１））や転移因子（トランスポゾンなど）の活性化（Ｂ．Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｅｎｄｅｌ：Ｇｅｎｏｍｅ，４３（５），８７４−８８０  （２０００）、Ｘ．Ｓｈａｎ，Ｚ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｄｏｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｌｏｎｇ，Ｆ．Ｈａｎ，Ｙ．Ｄｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｉｕ：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，２２（４），９７６−９９０  （２００５））、ＤＮＡメチル化の変化（Ａ．Ｓａｌｍｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ａｉｎｏｕｃｈｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｅｄｅｌ：Ｍｏｌ．Ｅｃｏｌ．，１４（４），１１６３−１１７５  （２００５））などを起こしながら、（あたかも両方の親株から受け継いだ遺伝子群のさまざまな組み合わせを試すかのように）遺伝子群の発現パターンもきわめてランダムに変化させる事が知られており（Ｊ．Ｃ．Ｐｉｒｅｓ，Ｊ．Ｚｈａｏ，Ｍ．Ｅ．Ｓｃｈｒａｎｚ，Ｅ．Ｊ．Ｌｅｏｎ，Ｐ．Ａ．Ｑｕｉｊａｄａ，Ｌ．Ｎ．Ｌｕｋｅｎｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃ．Ｏｓｂｏｒｎ：Ｂｉｏｌ．Ｊ．Ｌｉｎｎ．Ｓｏｃ．，８２（４），６７５−６８８  （２００４）、Ｋ．Ｌ．Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｅｎｄｅｌ：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，２１（１０），５３９−５４３  （２００５）、Ｋ．Ｌ．Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｅｎｄｅｌ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７１（４），２１３９−２１４２  （２００５）、Ｒ．Ｔ．Ｇａｅｔａ，Ｊ．Ｃ．Ｐｉｒｅｓ，Ｆ．Ｉｎｉｇｕｅｚ−Ｌｕｙ，Ｅ．Ｌｅｏｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｃ．Ｏｓｂｏｒｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９（１１），３４０３−３４１７  （２００７））、そのような過程を経て安定化した個体（または株）群の表現形質は個体（または株）ごとにバラエティーに富んでおり、なかには（同質倍数体株にも見られる倍数体強勢（ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ  ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ）としての）各種器官の巨大化や、異種ゲノム間の雑種強勢（ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ、またはｈｙｂｒｉｄ  ｖｉｇｏｒ）としての生育能の向上などの特徴を示すだけでなく（渡辺好郎（監修）／福井希一・辻本壽（共著）：改訂版  育種における細胞遺伝学、養賢堂  （２０１０））、さらに親株よりも環境に対する適応能力が高い（または強い環境耐性能を示す）個体（または株）や、親株とは異なる形質を持つ個体（または株）も混じっていて、（そもそも同質倍数体であっても、親株とまったく同じ生息地を持つ事は稀だが）こうした個体（または株）はその能力を武器に、親株とは異なる、より過酷な環境にも進出して定着する（＝生息地とする）事があるのだ（Ｌ．Ｈ．Ｒｉｅｓｅｂｅｒｇ，Ｏ．Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｄ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｚ．Ｌａｉ，Ｋ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｔ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｊ．Ｌ．Ｄｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｚｂａｃｈ，Ｌ．Ａ．Ｄｏｎｏｖａｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｌｅｘｅｒ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１（５６３７），１２１１−１２１６  （２００３）、Ｍ．Ｈ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，５９（７），１４２５−１４３６  （２００５）、Ｒ．Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｉｎａｔｓｕｇｉ，Ｊ．Ｌｉｈｏｖａ，Ｈ．Ｉｗａｎａｇａ，Ｈ．Ｋｕｄｏｈ，Ｋａｒｏｌ  Ｍａｒｈｏｌｄ，Ｏ．Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ，Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｖ．Ｖ．Ｙａｋｕｂｏｖ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋ．Ｓｈｉｍｉｚｕ：Ｍｏｌ．Ｅｃｏｌ．，１８（１９），４０２４−４０４８  （２００９））という（日本生態学会（森長真一・工藤洋）（編）：［シリーズ  現代の生態学７］エコゲノミクス  ―遺伝子からみた適応―、ｐ２４６−２６２（清水（稲継）理恵・清水健太郎（著））、共立出版  （２０１２））。
【００９８】
ちなみに、このソフトドリンク工場から分離されたＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ３０４２株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５６０塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ（ｂｐ））（（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ／ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＡＪ５５５４０６．１、（ＮＣＢＩ−）ＧＩ：４６０９４７５６）は、図５．の上段の配列（＝配列番号２）（注：図中では「配列２」と示す。以下の配列番号２以外の配列番号についても同様）の通りで、これは上記のＳｕｅｚａｗａらのグループが「Ｔｙｐｅ２」と仮称している株群の持つ塩基配列と完全に一致（＝１００％相同）しており、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５８１ｂｐ）（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６）、すなわちＳｕｅｚａｗａらのグループが「Ｔｙｐｅ１」と仮称している株群の持つ塩基配列（＝図５．の下段の塩基配列（＝配列番号１））とは、図５．中の塩基配列のうち、矢印で示した(1)〜(14)の計１４箇所（＝１４塩基）で異なっている（注：上下段の塩基配列、すなわちＴｙｐｅ１の塩基配列（＝配列番号１）とＴｙｐｅ２の塩基配列（＝配列番号２）との類似性は９７．５％である。尚、(1)等の括弧付きの数字で表した箇所は、図においては対応する丸付き数字により表されている）。
【００９９】
田中らのグループも、味噌・醤油諸味などから分離された味噌・醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉの中には、複数の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）を持つ株がいるようだと見ており（田中泰史、渡部潤、茂木喜信：醤研、３８（６）、３４７−３５６  （２０１２））、こうした複数の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）を持つ味噌・醤油主発酵酵母株に対しては、その「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）を含む、複数のＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）を持つ（という特徴は、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉを含む、複数の酵母株の交雑によって生まれた株である可能性が高い）」という遺伝情報を根拠に、（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉではなく）Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．と呼ぶべきだと見る研究者も増えてきている。
【０１００】
こうした最近の知見を基づき、一部の菌株保存研究機関でも保有しているＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の種名の見直しを始めたようである。たとえば、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）のＮＢＲＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＩＴＥ）では、２０１２年に、上記の試験１．で用いた供試株２０株のうちの、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）から分離されたＮＢＲＣ０５０５株、ＮＢＲＣ０５０６株（＝ＩＦＯ０５０６株＝ＮＩＳＬ３４０２株）、ＮＢＲＣ０５２１株（＝ＩＦＯ０５２１株＝ＮＩＳＬ３４５０株）、ＮＢＲＣ０５２５株（＝ＩＦＯ０５２５株＝ＮＩＳＬ３４５２株）、ＮＢＲＣ０８４５株（＝ＩＦＯ０８４５株＝ＮＩＳＬ３４５９株）、ＮＢＲＣ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の６株と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花（日本）））との計７株について、ホームページ上に公開している登録（＝属種）名を、「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ」から「Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．」に変更した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｃ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）。ただし、これら７株のうち、たとえば味噌から分離されたＮＢＲＣ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）は、他の多くの菌株保存研究機関でも保存されていて、たとえばオランダの菌株保存研究機関「ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  菌類多様性センター（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｃｅｎｔｒｅ）では（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ではなく）いまだにＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ４８３７株（＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）として（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ／ＢｉｏｌｏＭＩＣＳ．ａｓｐｘ？Ｌｉｎｋ＝Ｔ＆ＴａｂｌｅＫｅｙ＝１４６８２６１６０００００００６７＆Ｒｅｃ＝１０７９６２＆Ｆｉｅｌｄｓ＝Ａｌｌ（２０１３年８月３０日調査時点））、またイギリスの菌株保存研究機関「ナショナル・コレクション・オブ・イースト・カルチャーズ（ＮＣＹＣ）」でも、（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ではなく）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ１６８２株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）として登録されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｙｃ．ｃｏ．ｕｋ／ｙｅａｓｔ−ｎｃｙｃ−１６８２．ｈｔｍｌ（２０１３年８月３０日調査時点））。
【０１０１】
Ｃａｎｄｉｄａ属酵母やＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ属酵母、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属酵母（トリコスポロン属酵母）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母などの中には、液体（液体培地を含む）中で静置培養した際に、その液面に浮かび上がって細胞どうしが凝集し、白〜淡い褐色の、乾燥して粉をふいたような性状の「皮膜（ｆｉｌｍ、またはｐｅｌｌｉｃｌｅ）」を形成する株もおり、このような株群を「産膜（性）酵母（ｆｉｌｍ（−ｆｏｒｍｉｎｇ）  ｙｅａｓｔ（ｓ））」と総称する（好井久雄、金子安之、山口和夫（共著）：＜改訂増補版＞食品微生物学、ｐ２９−３０、技報堂出版  （１９７６））。このような産膜酵母は、液体ないしは固液混合型の食品に混入した際に、その食品中の各種成分を栄養源に増殖し、その食品の液面ないしは表面に皮膜を形成する事がある。
【０１０２】
産膜酵母が液体（培地など）の液面に浮かび上がって、皮膜を形成するのは、その細胞の表層の疎水性が高いためだとされ、産膜酵母（赤ワインから分離されたＳ．ｂａｙａｎｕｓ  ＦＹ−３株など）を接種する液体培地にトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）やツイ―ン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）などの非イオン系界面活性剤を加えると、皮膜を形成しなくなる（Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（６），１２１５−１２２２  （１９８０））。産膜酵母の細胞表層の疎水性も、その細胞表面に含まれる脂肪酸量によって影響を受ける事が知られている。産膜酵母の中には、［１］たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属産膜酵母やＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属産膜酵母などのように、グルコースを炭素源とする液体培地で培養した際には（グルコースをほぼ消費し尽くすまで）なかなか皮膜を形成しないが、エタノールを炭素源とする液体培地で培養した際には、エタノールを好気的に資化する事で、細胞表面の脂肪酸量が増えて、細胞表層の疎水性が高まるために（Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（６），１２２３−１２２９  （１９８０））、液体培地の液面に浮かび上がり、皮膜を形成するようになる産膜酵母株群と、［２］Ｃａｎｄｉｄａ属産膜酵母やＰｉｃｈｉａ属産膜酵母などのように、そもそも細胞表面の脂肪酸量が多いために、常に表層の疎水性が高く、液体培地の組成（または炭素源）に関係なく皮膜を形成する産膜酵母株群とがおり（清酒酵母研究会（編）：改訂  清酒酵母の研究、ｐ６６６−６７６（飯村穣・原昌道・大塚謙一（著））、清酒酵母研究会  （１９８０））、前者を「仮性産膜酵母（ｐｓｅｕｄｏ  ｆｉｌｍ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｙｅａｓｔｓ）」、後者を「真性産膜酵母（ｔｒｕｅ  ｆｉｌｍ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｙｅａｓｔｓ）」と呼び分ける事もある（後藤昭二：醗工、３７（９）、３８４−３９０  （１９５９））。
【０１０３】
醸造・発酵食品への産膜酵母の利用例としては、たとえばシェリー（またはシェリー酒（ｓｈｅｒｒｙ））の「フィノ（Ｆｉｎｏ）」が挙げられる。「フィノ」を醸造する場合には、まず破砕除梗（＝梗（または小枝）を取り除いた）後の葡萄果醪（＝粗果汁（ｇｒａｐｅ  ｍｕｓｔ））に、［１］通常のワイン醸造の場合には野生酵母の増殖を抑制するために添加する亜硫酸（注：厳密にはピロ亜硫酸カリウム、通称；メタカリ）を敢えて添加せずに、代わりに少量の石膏を添加して葡萄果醪（＝粗果汁）の酸度を上げるだけにとどめ、さらに発酵終了後のワインを樽詰め貯蔵（または熟成）する際に、［２］ワインを敢えて樽いっぱい（＝満タン）には詰めず、わざと樽内に３／４から１／６程度の空隙を残す事で、その貯蔵（または熟成）中に産膜酵母（＝フロール（または花、産膜性）・シェリー酵母（＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を増殖させて、ワインの液面全体に「フロ（ー）ル（または花（ｆｌｏｒ））」と呼ばれる白い皮膜（ｆｉｌｍ）を形成させ、貯蔵（または熟成）中のワインが空気に触れない状態にして、酸化による色調の濃色化を防ぎながら、独特の風味（＝産膜酵母が生産するアセトアルデヒド（ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）やエステル類（ｅｓｔｅｒｓ）、（アルデヒドと高級アルコールやフェノール類の縮合によって生じる）アセタール（ａｃｅｔａｌ）などの香気成分から構成されるシェリー香）をつけるのである。そのため、この樽詰め貯蔵（または熟成）での産膜酵母による風味づけの工程は、「花咲かせ工程（ｆｌｏｒｐｒｏｃｅｓｓ）」とも呼ばれる（横塚勇：醸協、６０（２）、１４１−１４５  （１９６５）、大塚謙一（著）：ワイン博士の本、ｐ１５３−１５７、地球社  （１９７３）、相田浩・高橋甫・上田清基・栃倉辰六郎・上田誠之助（著）：新版  応用微生物学II、ｐ１９３（栃倉辰六郎（著））、朝倉書店  （１９８１）、野白喜久雄・吉澤淑・鎌田耕造・水沼武二・蓼沼誠（編）：醸造の事典、ｐ２８５−２８６（戸塚昭（著））、朝倉書店  （１９８８）、吉澤淑・石川雄章・蓼沼誠・長澤道太郎・永見憲三（編）：醸造・発酵食品の事典、ｐ２７９−２８０（銭林裕（著））、朝倉書店  （２００２）、明比淑子：醸協、１０６（９）、５９７−６０５  （２０１１））。
【０１０４】
ただし、この「フィノ」のような、醸造食品への産膜酵母の利用例はどちらかといえば稀な事例（ケース）であり、この「フィノ」の醸造法自体が「型破り」であるとも言える。一般的には、食品中に産膜酵母が混入して増殖すると、食品の液面ないしは表面に白っぽい皮膜を形成する事で、食品の「見ため」を悪くするとともに、さらには混入してから皮膜を形成するまでの増殖過程で、食品中の糖質やアルコールなどの各種成分を消費したり、また食品としての嗜好性に悪い影響を及ぼす呈味成分や香気成分（＝アルデヒドや酸など）を生成したりする事を通じて、仕掛品や製品の品質の劣化を引き起こす。そのため、さまざまな食品メーカーでは、こうした産膜酵母が製造工程の仕掛品や製品中に混入しないように、そして仕掛品や製品中で皮膜が形成されないように対処する事のほうが圧倒的に多い。たとえば、静置発酵法で醸造している醸造酢の場合には、そのもろみ中で産膜酵母が増殖すると、酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ（アセトバクター  パストリアヌス））の増殖が抑制され、酢酸発酵自体が阻害されてしまう事がある（鵜木隆文、瀬戸口眞治、亀澤浩幸、下野かおり：鹿児島県工業技術センター研究報告、１８、７−１３  （２００４）、松永一彦、瀬戸口眞治、下野かおり、亀澤浩幸、西元研了、鵜木隆文：鹿児島県工業技術センター研究報告、２１、１１−１４  （２００７））。ワイン醸造の場合にも、上記の「フィノ」を除けば、貯蔵（または熟成）中のワインへの産膜酵母の混入による皮膜（フロール）の形成は、ワインにシェリー香を付けてしまうために禁物であり、貯蔵（または熟成）中のワインにおける産膜酵母の増殖に伴う皮膜形成は「（ワイン）産膜病」とも呼ばれ、忌み嫌われる。そのため、［１］破砕除梗後の葡萄果醪（＝粗果汁）に亜硫酸を添加する事で、発酵工程以降における野生の産膜酵母などの増殖を抑制し、さらに［２］貯蔵（または熟成）中のワインの中で産膜酵母が増殖しないように、ワインを樽や発酵タンクいっぱい、つまり「満タン」に詰めて、空隙をつくらないようにするのが一般的である（伊藤武・森地敏樹（編）：食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―、ｐ１９４−２００（後藤奈美（著））、サイエンスフォーラム  （２００４））。
【０１０５】
「産膜酵母」というのは、上記した通り、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｉｃｈｉａ属など、皮膜を形成する」という特徴（＝表現形質）を持った複数の属にまたがるさまざまな酵母群に対して付けられた「総称」に過ぎず、産膜酵母の微生物学的な特徴（＝表現形質）はその属・種・株ごとにさまざまであり、それゆえに食品ごとに皮膜形成の原因となる産膜酵母の種類は異なる。たとえば、上記した醸造酢の場合、鹿児島県で醸造している米黒酢やサトウキビ酢のもろみからは、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ（ピキア・アノマーラ（＝現：Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ）。以下、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（＝現：Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）と略す）やＰｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ（＝ピキア・メンブラニファシエンス。以下、Ｐ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓと略す）、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（イサタケンキア（またはイサチェンキア）・オリエンタリス（＝現：Ｐｉｃｈｉａ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ（ピキア・クドリアヴゼビー）））（松永一彦、瀬戸口眞治、下野かおり、亀澤浩幸、西元研了、鵜木隆文：鹿児島県工業技術センター研究報告、２１、１１−１４  （２００７））、糠漬けなどの漬物類の場合にもＰ．ａｎｏｍａｌａ（＝現：Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）やＰ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ（デバリオミセス（またはデバリオマイセス）・ハンゼニー。以下、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉと略す）などの産膜酵母が分離されたとの報告がある。
【０１０６】
恩田らのグループは、梅漬の塩蔵中の菌叢（フローラ）を解析してみたところ、塩蔵初期は専らＫｌｏｅｃｋｅｒａ  ａｐｉｃｕｌａｔａ（＝クロエ（ッ）ケラ・アピキュラータ。以下、Ｋ．ａｐｉｃｕｌａｔａと略す）で占められていたが、目視で皮膜の形成が観察される３週目以降になると（Ｋ．ａｐｉｃｕｌａｔａは検出されなくなって）代わりにＰ．ａｎｏｍａｌａ（＝現：Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）やＣａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ（キャンディダ（またはカンジダ）・ギリエルモンディ（またはギリエルモンジィ））が増え、それに伴ってｐＨが上昇し、３ヶ月も経ると今度はＤ．ｈａｎｓｅｎｉｉなどが増えてくるといった具合に、塩蔵中の日数経過に伴って検出される産膜酵母の種類も変わっていったと報告している。
【０１０７】
ビールの場合には、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（＝現：Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）やＰ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｙｃｏｄｅｒｍａ（キャンディダ（またはカンジダ）・マイコデルマ）（好井久雄、金子安之、山口和夫（共著）：＜改訂増補版＞食品微生物学、ｐ１６４、技報堂出版  （１９７６）、Ｊ．−Ｐ．Ｄｕｆｏｕｒ，Ｋ．Ｖｅｒｓｔｒｅｐｅｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄｅｒｄｅｌｉｎｃｋｘ：Ｂｒｅｗｉｎｇ  ｙｅａｓｔｓ．，ｐｐ３４７−３８８  Ｉｎ：Ｔ．Ｂｏｅｋｈｏｕｔ  ａｎｄ  Ｖ．Ｒｏｂｅｒｔ（ｅｄ．）：Ｙｅａｓｔ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ，Ｂ．Ｂｅｈｒ‘ｓ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  （２００３））、また発酵後期にはエタノール耐性能の強い産膜性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母（＝Ｓ．ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・オビホルミス）やＳ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・ファーメンティー）などによる汚染例などの報告がある（山里一英・宇田川俊一・児玉徹・森地敏樹（編）：微生物の分離法、ｐ２９２−２９４（後藤昭二（著））、Ｒ＆Ｄプランニング  （１９８６）、藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ１５５−１６１（矢野俊博（著））、幸書房  （２００１））。
【０１０８】
ワインの場合には、発酵初期の葡萄果醪（＝粗果汁）では、エタノール濃度が低い事もあって、エタノール耐性能の弱い、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母やＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属酵母などの産膜酵母による汚染例が多いが、発酵が進んだ葡萄果醪（＝粗果汁）では亜硫酸耐性能が強く、かつエタノール耐性能も強い産膜性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母（注：たとえば、上記の、赤ワインから分離されたＳ．ｂａｙａｎｕｓ（Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｏｔｓｕｋａ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（６），１２１５−１２２２  （１９８０））などによる汚染例が多くなる（飯村穣、大塚謙一、原昌道：醗工、５８（６）、４４９−４５２  （１９８０）、清酒酵母研究会（編）：改訂  清酒酵母の研究、ｐ６６６−６７６（飯村穣・原昌道・大塚謙一（著））、清酒酵母研究会  （１９８０）、藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ１５５−１６１（矢野俊博（著））、幸書房  （２００１）、伊藤武・森地敏樹（編）：食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―、ｐ１９４−２００（後藤奈美（著））、サイエンスフォーラム  （２００４））。
【０１０９】
上記の、シェリー酒の液面に皮膜（フロール）を形成して特有の香気を付与する有益な産膜酵母（＝フロール(または産膜性)・シェリー酒酵母）は、以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｅｔｉｃｕｓ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・ベティクス）（Ｊ．Ｍａｒｃｉｌｌａ  Ａｒｒａｚｏｌａ，Ｇ．Ａｌａｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅ．Ｆｅｄｕｃｈｙ：Ａｎａｌｅｓ  ｃｅｎｔｒｏ  ｉｎｖｅｓｔ．ｖｉｎｉｃｏｌａｓ，１，１−２３０  （１９３６））ないしはＳ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−Ｖａｎ  Ｒｉｊ：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９５２）、Ｊ．Ｇ．Ｂ．Ｃａｓｔｏｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｅ．Ａｒｃｈｅｒ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５（１），５６−６０  （１９５７））、Ｓ．ｃｈｅｒｅｓｉｅｎｓｉｓ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・チェレシエンシス）、Ｓ．ｍｏｎｔｕｌｉｅｎｓｉｓ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・モントリエンシス）などと呼ばれていたが（Ｒ．Ｙ．スタニエ（Ｓｔａｎｉｅｒ）・Ｅ．Ａ．エーデルバーグ（Ａｄｅｌｂｅｒｇ）・Ｊ．Ｌ．イングラム（Ｉｎｇｒａｈａｍ）（共著）／高橋甫・斎藤日向・手塚泰彦・水島昭二・山口英世（訳）：微生物学（下）（原書第４版）（ＴＨＥ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＷＯＲＬＤ；４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ｐ４７５、培風館  （１９７８）、相田浩・高橋甫・上田清基・栃倉辰六郎・上田誠之助（著）：新版  応用微生物学II、ｐ１９３（栃倉辰六郎（著））、朝倉書店  （１９８１））、上記した通り、現在はこれらもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１属１種に再分類されている。つまり、現行の分類でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという１属１種の中に分類されている株群の中には、上記した、皮膜を形成する能力を持っておらず、かつ清酒や焼酎の醸造に利用できる「清酒酵母」や「焼酎酵母」などの有用株や、そうした利用に不向きな株（実験室酵母株）に加え、さらには食品に有害な産膜性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｆｌｏｒ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｆｌｏｒ  ｙｅａｓｔ（Ｂ．Ｅｓｔｅｖｅ−Ｚａｒｚｏｓｏ，Ｍ．Ｊ．Ｐｅｒｉｓ−Ｔｏｒａｎ，Ｅ．Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｉｑｕｅｚ，Ｆ．Ｕｒｕｂｕｒｕ  ａｎｄ  Ａ．Ｑｕｅｒｏｌ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７（５），２０５６−２０６１  （２００１）））なども混在しているのである。
【０１１０】
醤油（減塩醤油を除く）中で皮膜を形成する原因酵母は、１属１種しかいない。醤油に混入して皮膜を形成する産膜酵母（注：以下、醤油産膜性酵母、あるいは醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと呼ぶ）も、上記のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合と同様、現在は有用な醤油主発酵酵母（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）と同じＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている。図６．は、溜醤油諸味から分離された醤油産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）を、上記の試験２．で用いた市販の濃口醤油II（注：成分組成は、食塩分（ＮａＣｌ）１６．２０％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）１．５９４％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）２．７３％（Ｗ／Ｖ）、エタノール２．９９％（Ｖ／Ｖ）、ｐＨ＝４．８６）に接種し、３０℃条件下で静置培養した際の様子（濃口醤油の液面）を経時的に撮影した写真を並べたものである。図６．の上段の写真群のうち、向かって左端の写真（接種後２日）を起点に、順に右に向かって、さらに下段の写真群に移って、左端の写真（接種後１０日）から順に右へと見ていくと、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））接種後の濃口醤油の液面の変化を追跡する事ができるが、ちょうど接種後６〜７日辺り（＝図６．中の、上段の写真群のうちの、左端から２枚目及び３枚目（一部拡大）の写真）から、濃口醤油の液面と試験管のガラス壁との接触面にまず白い粉状のＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の細胞が付着し始め、日数を経るに従ってその粉状の細胞が増えて液面全体に拡がり、湯葉状の皮膜となり、次第に分厚くなっていく様子が見てとれる。皮膜の成長は、接種後２０日ぐらい（＝図６．中の、下段の写真群のうちの、左端から４枚目の写真）までは続く。
【０１１１】
醤油やその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）は、食塩（ＮａＣｌ）濃度が１６％前後ないしはそれ以上と、非常に高いために、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の産膜酵母、すなわち上記した、他の食品では皮膜を形成するＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属酵母やＨａｎｓｅｎｕｌａ属酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ属酵母などは増殖できず、ゆえに醤油中での皮膜形成の原因微生物にはならない（というか、なれない）。そのため、醤油に皮膜形成が認められた場合、もしその醤油中の食塩（ＮａＣｌ）濃度が１５％以上なのであれば、その原因微生物はＺ．ｒｏｕｘｉｉだと判断して、まず問題はないとされる（伊藤武・森地敏樹（編）：食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―、ｐ１８７−１９３（半谷吉識（著））、サイエンスフォーラム  （２００４））。つまり、醤油産膜性酵母は現行の分類でのＺ．ｒｏｕｘｉｉの１属１種に含まれる株群のみである（注：ただし、醤油よりも食塩（ＮａＣｌ）濃度が低い味噌の場合には、このＺ．ｒｏｕｘｉｉの他、Ｐ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（＝現：Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）なども皮膜形成の原因微生物となる事がある（好井久雄、金子安之、山口和夫（共著）：＜改訂増補版＞食品微生物学、ｐ１７９、技報堂出版  （１９７６）））。
【０１１２】
たとえば、図７．は、味噌から分離された産膜性酵母であるＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株と溜醤油諸味から分離された醤油産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）を、（１）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が１０．９９％の生醤油液体培地と、（２）１６．２０％の濃口醤油IIとに接種し（注：供試株２株の種培養液接種前の濃口醤油IIの食塩分（ＮａＣｌ）は１６．２０％（Ｗ／Ｖ）であり、この濃口醤油５ｍｌに１０．９９％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む供試株の種培養液を、濃口醤油容量比で２％（Ｖ／Ｖ）、すなわち０．１ｍｌ接種した後の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度（推定値）は１６．１０％である）、３０℃で、前者、すなわち生醤油液体培地の試験区は１０日間、後者、すなわち濃口醤油の試験区は３０日間静置培養した際の様子（濃口醤油の液面）を撮影した写真であるが（注：試験手順については、下記の試験５．を参照）、これを見ると、溜醤油諸味から分離された醤油産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）は生醤油液体培地と濃口醤油の両方で皮膜を形成しているのに対して、味噌から分離された産膜性酵母であるＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株のほうは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が低い生醤油液体培地中では皮膜を形成する、すなわち皮膜を形成する能力（＝産膜性能）自体は持っているものの、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が１６％ないしはそれ以上と高い濃口醤油中では皮膜を形成しない、すなわち（耐塩性能が弱いために）醤油産膜性能は持っていない、つまり「産膜性／醤油「非」産膜性酵母株」である事が分かる。
【０１１３】
醤油産膜性酵母（または醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）は、醤油やその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）に混入して増殖すると、醤油の液面や醤油諸味の表面に、たとえば図６．の通り、「黴（かび）」のようにも見える、白っぽく、乾燥して粉をふいたような性状の皮膜を形成するため、以前は「白黴（しろかび、または醤油白黴（しょうゆしろかび））」や「白膜」などと呼ばれていた（富田実、山本澄人：醸協、９２（１２）、８５３−８５９  （１９９７））。醤油産膜性酵母（または醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）も、かつては（醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉがＺ．ｓｏｊａやＺ．ｍａｊｏｒと呼ばれていたのに対して）Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｓｕｓ（チゴサッカロマイセス（またはチゴサッカロミセス）・サルサス）やＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（ジャポニカス）、またＺ．ｒｏｕｘｉｉがＳ．ｒｏｕｘｉｉと呼ばれていた１９７０年頃には、Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ  ｖａｒ．ｈａｌｏｍｅｍｂｒａｎｉｓ（サッカロミセス（またはサッカロマイセス）・ルーキシー・バリエタス・ハロメンブラニス）と呼ばれ、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（注：当時はまだＳ．ｒｏｕｘｉｉである）の「変種」として区別されていたが（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９７０）、吉田忠：北海道大学農学部邦文紀要、８（４）、２８９−３４７  （１９７３））、１９８４年以降は両者ともにＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されるようになった（Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ  Ｒｉｊ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（３ｒｄ  ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９８４）、Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（４ｔｈ  ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９９８））。
【０１１４】
そのため、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種に分類される株群の中にも、上記したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合と同様に、［１］皮膜を形成する能力を持っておらず、上記の試験２．で示した通り、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、上記の試験１．で示した通り、味噌・醤油などの醸造に利用できる、有用な味噌・醤油主発酵酵母株（または醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）や、［２］たとえば黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）やビターオレンジシロップボンボンから分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株）などのように、上記の試験１．で示した通り、醤油諸味液汁中でのエタノール生産性能が低く、あるいはなく、上記の試験２．で示した通り、そもそも味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力自体が低いために（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）の中で皮膜を形成する能力も持っておらず）、味噌・醤油などの醸造に利用するのに不向きな株に加え、さらには［３］味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）の中で皮膜を形成する能力を持つ「味噌・醤油産膜性酵母株（または醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）も混在しているのである。
【０１１５】
図８．は、味噌から分離された醤油「非」産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）と、溜醤油諸味から分離された醤油産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）を濃口醤油諸味の圧搾後生液汁、すなわち濃口生揚げ醤油（注：成分組成は、食塩分（ＮａＣｌ）１６．６０％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）１．７７３％（Ｗ／Ｖ）、エタノール３．２３％（Ｖ／Ｖ）、ｐＨ＝４．９６）に接種し、３０℃で３０日間静置培養した際の様子（濃口生揚げ醤油の液面）を撮影した写真である（注：試験手順については下記の試験５．を参照）。両株ともに、現行の分類上は同属同種、すなわち同じＺ．ｒｏｕｘｉｉ株でありながら、醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）であるＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））は濃口生揚げ醤油の液面に皮膜を形成する一方、醤油「非」産膜性酵母（＝醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）であるＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））は濃口生揚げ醤油の液面に皮膜を形成せず、つまり静置培養条件下での両者の性状は大きく異なる。
【０１１６】
上記した通り、産膜酵母には「仮性産膜酵母」と「真性産膜酵母」とがあるが、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株は「仮性産膜酵母」に区分けされる。醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株は、液体培地中で静置培養した際には液面に皮膜を形成するものの、振とう培養条件下では皮膜を形成しない。図９．は、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））を、約１１％の食塩（ＮａＣｌ）を含む生醤油液体培地に接種して、３０℃条件下で３日間培養した際の様子（液体培地の液面）を撮影したものだが（注：試験手順は下記の試験５．を参照）、静置培養条件下では図９．中の、向かって「右側（の試験管）」の通り、皮膜を形成し（始め）ているのに対して、振とう培養条件下では、向かって「左側（の試験管）」の通り、皮膜を形成していない。そのため、振とう培養条件下では、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのかを、目視で判別（または区分け）する事はできない。
【０１１７】
醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）による皮膜の形成は、醤油中でなくても起こる。たとえば、図１０．は、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））を０〜１６％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃条件下で１０日間培養した際の様子（液体培地の液面）を撮影した写真だが（注：試験手順については下記の試験５．を参照）、このように微生物の培養に広く用いられるＹＰＤ液体培地中でも皮膜を形成する。
【０１１８】
富田（Ｔｏｍｉｔａ）らによる、醤油諸味から分離された産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｆ５１株に関する研究報告によれば、Ｆ５１株は高張液中でないと皮膜を形成しない、たとえば３％以上の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＹＭ培地（注：培地組成は、２％グルコース、０．５％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％マルツエキス）中では皮膜を形成するものの、０〜１％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＹＭ培地中では皮膜を形成せず、また１０％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＹＭ培地であっても、０．１％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を加えてやると、皮膜を形成しなくなるとの事だが（Ｍ．Ｔｏｍｉｔａ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（１），５１−５５  （１９９７）、富田実、山本澄人：醸協、９２（１２）、８５３−８５９  （１９９７））、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））を、０〜１８％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＹＰＤ液体培地（ｐＨ＝５．０）３ｍｌに接種し、３０℃条件下で２日間振とう培養（１４０ｒｐｍ．）して種培養液を調製し、この種培養液０．１ｍｌを同じ液体培地５ｍｌに（＝容量比２％）接種して、３０℃条件下で静置培養してみたところ、図１０．及び図１１．の（１）の通り、０〜１０％の食塩（ＮａＣｌ）を含むＹＰＤ液体培地では接種後２日、１６％の食塩（ＮａＣｌ）を含むＹＰＤ液体培地でも接種後３日で皮膜を形成した事から、少なくともこのＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）による皮膜の形成には、生育環境（＝培地）中の食塩（ＮａＣｌ）はあまり重要ではないのかも知れない。
【０１１９】
図１１．の（２）は、上記のＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））に、同じく醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株（醤油））、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株（溜醤油諸味））を加えた計４株を、上記の富田（Ｔｏｍｉｔａ）らが試験で用いたＹＭ液体培地に接種した際の様子（液体培地の液面）を撮影した写真である。ＹＭ液体培地は、ＹＰＤ液体培地よりも溶質量が少な（く、ゆえに比重が小さ）いために、供試株の細胞が液面に浮かびにくいものと見られ、供試株４株いずれの試験区でも、形成される皮膜がより薄くなり、うちＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））について、ＹＭ液体培地の液面に細胞が浮かび上がり始めた時点で成長が止まり、皮膜が形成されるまでには至らなかったものの、それでもＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））を接種したＹＭ液体培地では、上記のＹＰＤ液体培地の場合と同様、皮膜が形成された事から、株ごとによる違いも大きいようである（注：試験手順については、下記の試験５．を参照。なお、ＹＰＤ液体培地の組成は、下記の試験５．に記す通り、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース、１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス（Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、べクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー（ＢＤ）製（製品コード：Ｎｏ．２１２７５０））、２％（Ｗ／Ｖ）ポリペプトン（日本製薬株式会社製（製品コード：Ｎｏ．３９４−００１１５））、ｐＨ＝５．２〜５．３（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。ＹＰＤ液体培地の調製に用いたＢＤ製の酵母エキスに含まれるナトリウム（Ｎａ）は０．１％（日本べクトン・ディッキンソン株式会社・ＢＤバイオサイエンス・アドバンスト  バイオプロセシングからの私信）、また日本製薬株式会社製のポリペプトンに含まれる灰分は約６％（直接灰化法による）、ナトリウム（Ｎａ）はポリペプトン１００ｇ当たり２１５０ｍｇ（注：原子吸光光度法による測定値）であるとされ（日本製薬株式会社・ライフテック部からの私信）、これらの培養基からの持ち込みの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は合算しても０．０５％未満に過ぎない）。
【０１２０】
ワインやシェリーから分離された産膜性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の産膜性能に関しては、分子生物学的な研究も進んでいて、たとえばヒートショック蛋白質Ｈｓｐ１２ｐをコードしているＨＳＰ１２（Ｓ．Ｚａｒａ，Ｇ．Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｆａｒｒｉｓ，Ｍ．Ｂｕｄｒｏｎｉ  ａｎｄ  Ａ．Ｂａｋａｌｉｎｓｋｙ：Ｙｅａｓｔ，１９（３），２６９−２７６  （２００２））や細胞表層の疎水性に影響を及ぼす表層蛋白質Ｆｌｏ１１ｐをコードしているＦＬＯ１１などの遺伝子が産膜性能の発現に必須である事が確認されている（Ｍ．Ｉｓｈｉｇａｍｉ，Ｙ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．Ｈａｙａｋａｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０（３），６６０−６６６  （２００６）、戸田康裕、中川洋史、飯村穣：日本農芸化学会大会（福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡））講演要旨集、平成２１年度、ｐ２５６（講演番号３Ｐ０７１８Ｂ）、２００９−０３−２９  （２００９）、Ｙ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｙ．Ｔｏｄａ，Ｈ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｍ．Ｈａｙａｋａｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１１（１），７−９  （２０１１））。
【０１２１】
渡部らのグループは、こうしたワインやシェリーの産膜性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株における知見を参考に、醤油諸味中に形成された皮膜から分離した産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｚ３株の皮膜形成に関わる遺伝子を調べ、「（公開されているＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の全ゲノム情報から相同性検索によって探し出した、ＦＬＯ１１様蛋白質をコードしているものと思われる３つの遺伝子（ＦＬＯ１１Ａ、ＦＬＯ１１Ｂ、ＦＬＯ１１Ｃ）は、皮膜形成には必須ではない事を確認したものの、それとは異なる）新規」のＦＬＯ１１様蛋白質をコードしているものと見られるＦＬＯ１１Ｄを見出した事を報告している（渡部潤、上原健二、茂木喜信：醤研、３８（６）、３７０（第７５回  研究発表会講演要旨集（平成２４年度成田大会））  （２０１２）、Ｊ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｕｅｈａｒａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｏｇｉ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９５（２），３９３−４０５  （２０１３））。
【０１２２】
味噌・醤油醸造においても、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を積極的に利用するという事例（ケース）はほとんどなく、逆に味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）への混入及び増殖は品質の劣化を招く事から（三瀬勝利・井上富士男（編）：食品中の微生物検査法解説書、ｐ２８８（木島卓・今井廣敬（著））、講談社サイエンティフィク  （１９９６））、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉは「食品汚染菌」、要するに「悪玉菌」と評されている。醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉも、他の産膜酵母同様、醤油・生揚げ醤油などの液面や味噌・醤油諸味の表面にこのような白っぽい皮膜や白黴（のようなもの）を形成する事で、［１］味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の「見ため」を悪くするとともに、さらには混入してから皮膜・白黴（のようなもの）を形成するまでの増殖過程で、［２］味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中のアルコールなどを消費したり、また味噌・醤油としての嗜好性に悪い影響を及ぼす呈味成分やベンズアルデヒドなどの揮発性成分を生成したりする事を通して（今原廣次、中浜敏雄：醗工、４６（１１）、８７６−８８４  （１９６８））、味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質の劣化を引き起こす。
【０１２３】
醤油中に含まれる全窒素分（Ｔｏｔａｌ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔ．Ｎ．））（大原秀孝：調味科学、６（１）、６−１２  （１９５８））、アルコールや食塩（ＮａＣｌ）（花岡嘉夫：醗工、４２（９）、５５３−５６４  （１９６４））、酢酸（山下清志：醤研、１０（１）、１６−２０  （１９８４））、ベンゼン酸エチルエステル（横塚保：農化、２５（８）、４４６−４５０  （１９５１））やフェノール性物質（横塚保：農化、２７（５）、２７６−２８０  （１９５３）、横塚保：農化、２８（２）、１１４−１１８  （１９５４））などには、醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）による皮膜形成を抑制する効果がある。ただし、醤油（製品）やその仕掛品(である醤油諸味、生揚げ醤油など）における醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の混入と増殖によるこうした品質の劣化を防ぐには、これらの成分だけでは不十分な場合も少なくない。特に、近年、醤油メーカーでは、（食塩（ＮａＣｌ）の摂り過ぎが高血圧や心臓病、脳卒中などの発症の原因になるとの指摘を受けて）醤油（製品）中の食塩（ＮａＣｌ）濃度を敢えて減らそうとする、いわゆる「低塩化」の傾向が強い。その最たるものが、「減塩醤油」の製造・販売である。濃口醤油中の食塩（ＮａＣｌ）濃度は、昔は１８〜１９％だったらしいのだが（注：たとえば１９６４年当時の「本醸造濃口醤油（特級）」の食塩分（ＮａＣｌ）の濃度はだいたい１８．２０％ぐらい）、最近では１６％前後まで減ってきている（久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ８０−８１及びｐ２０５−２０６、日本醤油協会  （２０１２））。
【０１２４】
【表２】
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【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
表２．〜４．は、後記する醤油産膜性試験（＝試験５．）で用いた「７社の醤油メーカーが製造した市販の濃口醤油計２１試料」の各種成分組成を分析した結果であるが、これら７社の濃口醤油の食塩分（ＮａＣｌ）の濃度も１５．６２〜１６．４５％（Ｗ／Ｖ）であった。宮城らのグループが過去３０年の千葉県の醤油鑑評会に出品された醤油の成分分析値を統計解析した結果でも、食塩分（ＮａＣｌ）の濃度は３０年の間に０．７〜０．９％（Ｗ／Ｖ）も減少しているという（宮城淳、岡千寿、宮崎浩子、飯嶋直人、大垣佳寛、佐川巌、藤枝正之、福井潤一、作原直、五月女實：醤研、３７（３）、１８３−１９２  （２０１１））。
【０１２８】
そのため、醤油やその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）に皮膜が生じないようにするための研究及び技術開発も、古くから、盛んに行なわれてきた。醤油やその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）に対して施される「醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）対策」としては、さまざまなものがある。
【０１２９】
たとえば、［１］醤油の仕込み工程では、定期的に、あるいは醤油諸味の表面に皮膜らしき白っぽい構造物が目視で確認され始めた場合には、皮膜の形成やその成長を抑制するために醤油諸味を（通気）攪拌するのが一般的である。また、醤油諸味の表面に紫外線を照射したり、エタノールを噴霧する事で、醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の増殖を抑制する方法の有効性が検討されたりしている。［２］圧搾工程で醤油諸味から搾り出された生揚げ醤油には、「火香（ひが）」と呼ばれる特徴香を付与するためと、生醤油中の（醤油産膜性酵母を含む）微生物を殺菌するために、「火入れ（ひいれ）」と呼ばれる加熱処理が施される。当然、食品の種類や成分組成によって大きく異なるものの、酵母の栄養細胞や胞子ならば、一般的に６０℃、１０〜１５分間程度の加熱処理で殺菌できる（好井久雄、金子安之、山口和夫（共著）：＜改訂増補版＞食品微生物学、ｐ１１４、技報堂出版  （１９７６））。醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）は、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉなどの醤油酵母と較べても耐熱性が弱いようだとの報告もあり（高草仁、四方日出男、大森邦英、西山輝、森口繁弘：醤研、１（４）、１９０−１９４  （１９７５））、実際のプレート熱交換器を使った醤油の火入れ処理の場合には、６０℃、数秒の加熱と急冷で十分に殺菌できるという（花岡嘉夫：醸協、６７（５）、４１０−４１５  （１９７２））。さらに、火入れ後の醤油自体、フェノール性物質が「加熱処理によって生じた分」だけ増加しているため、醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の増殖を抑制する効果が生醤油の場合よりも強くなっている（横塚保：農化、２８（２）、１１４−１１８  （１９５４））。（火入れ処理を行なわずに）生醤油のまま保存ないしは製品化する場合の醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の増殖に伴う品質劣化の防止法としては、精密濾過膜（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ（ＭＦ））などを用いた濾過除菌処理（小山田陽、掘江三郎、水谷和秋、伊藤隆、平田淳、増尾光昭、佐藤正美、大野英作、松田康：なま醤油製造方法、特開平５−４９４４２）や高圧処理装置を用いた高圧殺菌処理（野口誠、小谷幸敏、秋田幸一：鳥取県食品加工研究所研究報告、３４、８２−８６  （１９９８）、野口誠：醸協、９５（１）、４６−５２  （２０００））などの他、たとえば純度の高い窒素ガスなどの、不活性ガスと接触させる方法なども考案されている（野田誠、野田義治：醤油の保存方法、特開２００４−３５０６０２）。
【０１３０】
さらに、［３］開栓後の製品（＝醤油）に醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が混入した場合の品質劣化を防ぐために、成分調整（または規格調整）の過程で、醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）の生育を抑制する効果を持つ「アルコール」を添加するのが一般的であり、またメーカーや製品によってはＪＡＳ規格で使用が認められている安息香酸ナトリウムやパラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピルなどの合成保存料（４種類のうちの３種類以下）を添加する場合もある（栃倉辰六郎（編著）：増補  醤油の科学と技術、ｐ３２７−３３８（杉森恒武・塚田陽二（著））、日本醸造協会  （１９９４）、藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ１６２−１６９（好井久雄（著））、幸書房  （２００１）、久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ７８−７９、日本醤油協会  （２０１２））。上記の宮城らが過去３０年の千葉県の醤油鑑評会に出品された醤油（製品）の成分分析値を統計解析した結果によると、醤油（製品）中のエタノール濃度は３０年の間に０．９〜１．５％（Ｗ／Ｖ）も増加し、平均２．６１±０．４３％（Ｗ／Ｖ）にもなっているという（宮城淳、岡千寿、宮崎浩子、飯嶋直人、大垣佳寛、佐川巌、藤枝正之、福井潤一、作原直、五月女實：醤研、３７（３）、１８３−１９２  （２０１１））。この醤油（製品）中のエタノール濃度の増加は、仕込み工程における酵母発酵管理技術の向上による影響もあるだろうが、醤油主発酵酵母（＝Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）は、上記の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである清酒酵母などと較べると、エタノール耐性能が弱い事もあって、醤油諸味のような、１６％ないしはそれ以上の食塩（ＮａＣｌ）存在下でのエタノール生産量はせいぜい３％レベルに過ぎず（久寿米一裕：醸協、９６（１）、３３−４２  （２００１））、ゆえに３％半ばから４％前後のエタノールを含む市販の醤油（製品）は、アルコールを添加して製造されているものであると見て、ほぼ間違いない。アルコールや上記の合成保存料を添加した場合には、醤油（製品）の原材料（アルコールや保存料）として表示する義務が発生するが、水村が平成２２年（第３８回）、平成２３年（第３９回）、平成２４年（第４０回）の全国醤油品評会に出品された濃口醤油約１７０種類（＝第３８回は１７０種類、第３９回は１７３種類、第４０回は１７２種類）のラベルを調べた結果によると、第３８回は１７０種類のうちの１３３種類、第３９回は１７３種類のうちの１３８種類、第４０回は１７２種類のうちの１４０種類のラベルに「アルコール」の表示があったものの、一方合成保存料の表示があったのは第３８回は１６種類、第３９回は１２種類、第４０回も１３種類に過ぎなかったという（水村津与志：醤研、３７（２）、１１５−１２３  （２０１１）、水村津与志：醤研、３８（３）、１５９−１６６  （２０１２）、水村津与志：醤研、３９（２）、７５−８２  （２０１３））。
【０１３１】
この他にも、芥子（からし）油及びその製剤を添加する方法（小林正造：芥子油類の醤油防黴に関する研究、大阪市立工業研究所報告（第七回）  昭和六年度  （１９３１））や、サラダ油などの食用油を滴下して醤油の液面に油膜（または油層）を形成させる方法（諌山薫：容器内の醤油の表面に生ずるカビを防止する方法、特開昭４７−０１４３９２）、酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸もしくはその塩類を重量比で３：２：２：２の割合で混合した複合有機酸を添加する方法（小倉元成：複合有機酸によるしょう油の防黴法、特許１１８３９９７）、乳酸エチル、コハク酸エチル、マロン酸エチル、マレイン酸エチル、クエン酸エチルのうちの少なくとも１種類以上（野田文雄、茂木恵太郎、萩原昭雄、神戸千幸、岩浅孝：醤油又は味噌の防バイ方法、特許１０５９００２）か、これにさらにエタノールも添加する方法（野田文雄、茂木恵太郎、萩原昭雄、岩浅孝：醤油又は味噌の防バイ方法、特許１０５９００３）、ギボウシ属（またはホスタ属（Ｈｏｓｔａ））の植物の搾汁液やその抽出液などを添加する方法（円谷悦造、山中正昭、柴田邦彦、川村吉也、正井博司：醤油または醤油を原料とする調味料の製造方法、特許１０５１２８７）、ショ糖脂肪酸エステルを添加する方法などが考案されている（今井正武、佐々木克実：発酵食品の表面に生ずる皮膜の生成を抑制する方法、特開昭６０−１４９３７１）。マメ科に属する小形低木の「ミソナオシ（またはウジクサ、ウジコロシ（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｃａｕｄａｔｕｍ（デスモディウム・コーダタム）））」の葉や茎は、「白黴（しろかび）が生え、蛆（うじ）がわいたりして、悪くなった味噌」に加えてやると、その和名「味噌直し」の通り、「味が直る」とされ、その昔、一部の地方の家庭では味噌の変敗防止法として用いられた事もあったそうだが、富田らは、このミソナオシの葉に含まれるグリセロ糖脂質に、産膜性酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｆ５１株の皮膜形成を抑制する効果がある事を見出している（富田実、山本澄人：醸協、９２（１２）、８５３―８５９  （１９９７））。また、醤油メーカー（や関連団体）は、開栓後の醤油（製品）に醤油産膜性酵母（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が混入して増殖しないようにと、消費者（ユーザー）に対して、開栓後の醤油は冷蔵庫で保管するようにし（松田俊文：キッコーマン技術情報、１６１（２００９―春号）、６−７  （２００９）、久保田芳郎・宗像伸子・舘博（監修）：しょうゆの不思議（改訂版）、ｐ６９、日本醤油協会  （２０１２）））、なるべく早く使い切るようにする、あるいはそもそも早期に使い切れる「小」容量の醤油（製品）を選ぶように勧めている場合が少なくない。
【０１３２】
上記したように、近年では、仕込みタンクなどの醸造設備の大型化に伴い、醤油諸味のエタノール発酵の適正管理を目的とした醤油主発酵酵母の人為的な接種（または添加）を行なう醤油メーカーも増えてきており（食品産業新聞、２０１３年１０月２１日（月曜日）（第４０８２号）、４−６）、さまざまな味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離・選択した種酵母（＝醤油主発酵酵母株）を用いるようになってきているが、このような醸造に積極的に利用するための種酵母を選択する場合には、醤油産膜性酵母株を除外するための試験、いわゆる「（醤油）産膜性試験」を実施し、醤油中で皮膜を形成しない醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を選び出すのが一般的である。たとえば、上記の、矢内らのグループが醤油諸味のエタノール発酵を増強させる試験で用いた添加用種酵母株の選択に関する報告中にも、選択した酵母株が「産膜性を示さない事を確認した」との記述があるし（矢内次郎、瀧田啓三、雨宮清司：調味科学、３（４）、１８−２２  （１９５５））、また秋田県味噌醤油工業協同組合の「秋田香酵母ゆらら」も、秋田県の品評会などに出品された味噌など９１点から分離された１０９２株の味噌酵母株の中から選び出されたものだが、この株の選択に関する報告（渡辺隆幸：醸協、９３（１）、２２−２７  （１９９８））中にも、やはり産膜性試験を実施した旨の記述がある。
【０１３３】
このように、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種の中には、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成しない醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株や、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成して、それらの品質を低下させてしまう醤油産膜性酵母株（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）が混在しており、それゆえに［Ｃ］味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高いＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群、すなわち味噌・醤油主発酵酵母を、さらに味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株（群）と、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株（群）とに判別（または区分け）する事は、味噌・醤油醸造及び製品などの品質管理上きわめて重要な事であり、これらを判別（または区分け）するための方法も産業上有用である。
【０１３４】
つまり、味噌・醤油などの醸造産業の立場から見ると、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種に分類される酵母群の中には、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、しかも皮膜形成能は持っていないために、味噌・醤油醸造に利用できるという意味では有益（な味噌・醤油主発酵酵母）だが、製品である味噌・醤油中でも生存し続け、味噌・醤油を原材料として利用するつゆ類などの製造場面において問題を引き起こしてしまう事もある醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」や、「（同じく）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多いが、味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）中で皮膜を形成して、その品質の劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能が低いために、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」が混在しているという事になる。そのため、味噌・醤油の醸造産業では、これらの酵母株群をひとまとめにＺ．ｒｏｕｘｉｉとして取り扱う現行の分類法よりも、さらに上記のような詳細な区分けが重要となる。つまり、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母群を上記３群に区分け（または判別）する事は、味噌・醤油醸造及び製品などの品質管理上きわめて重要な事であり、これらを判別（または区分け）するための方法は産業上有用である。本発明は、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母群を、きわめて簡便かつ迅速に判別し、さらにこれら３群に区分けする方法である。このような方法は、これまではまったくなかったものである。
【０１３５】
一般的に、微生物を判別（または区分け）する方法としては、形態学的及び生理学的性質・細胞成分を指標とする方法、免疫学的な方法、遺伝学的（または分子生物学的）な方法などがある。
【０１３６】
味噌・醤油やその仕掛品、すなわち仕込み工程における味噌・醤油諸味や製成工程における生揚げ醤油などの酵母（菌）叢（フローラ）の中から［Ａ］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を判別、あるいは選択的に検出するための、形態学的及び生理学的性質を指標とする方法としては、菌集落（コロニー）の形態観察（＝大きさ、色調、表面及び周縁の特徴などの観察）、栄養細胞の顕微鏡観察、炭素化合物（糖類を含む炭水化物）や窒素化合物（硝酸塩など）の同化性能（または資化性能）、糖類の発酵性能（＝炭酸ガスの発生の有無）、ビタミンなどの要求性（能）、温度耐性能、薬剤（シクロヘキシミド）や酢酸などに対する耐性能、抗浸透圧性能（＝耐糖性能（５０％、または６０％（Ｗ／Ｗ）グルコース存在下での生育能力）や耐塩性能）などを指標とする、いわゆる「同定法」の他に、菌集落（コロニー）の形状及び大きさだけを指標とする方法（三瀬勝利・井上富士男（編）：食品中の微生物検査法解説書、ｐ２８４（好井久雄（著））、講談社サイエンティフィク  （１９９６））、１８％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下でのマルトース資化性能の有無（Ｈ．Ｏｎｉｓｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５（５），３４１−３４９  （１９６１）、茂木恵太郎、茂木孝也：農化、４２（８）、４６６−４７０  （１９６８）、茂木恵太郎、茂木孝也：調味科学、１８（２）、３０−３４  （１９７１）、今井誠一、松本伊左尾：醸協、７０（６）、４１３−４１５  （１９７５））や生育ｐＨ域の違いを指標とする方法（松本伊左尾、今井誠一：日食工誌、２０（１１）、５１３−５１８  （１９７３））、清酒酵母の識別法（古川敏郎、秋山裕一：農化、３７（７）、３９８−４０２  （１９６３）、秋山裕一：醸協、５８（１２）、１１５５−１１５８  （１９６３））を真似た、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウム  クロライド（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ））還元能の有無を指標とする方法（季沢守、辛宝圭、季錫健・朴允仲：調味科学、１８（２）、５８−６５  （１９７１）、茂木恵太郎、逆井利夫：醤研、３（２）、６１−６３  （１９７７））、亜鉛（Ｚｎ）やリチウム（Ｌｉ）に対する感受性能を指標とする方法（馬場林留、泉保廣、茂田井宏、花岡嘉夫：農化、５１（５）、２６１−２６７  （１９７７）、微生物生態研究会（編）：微生物の生態７  ―技術論をめぐって＜識別＞、ｐ１３−２９（馬場林留（著））、学会出版センター  （１９８０））や、これにｐＨに対する生育特性、酸性ホスファターゼ（ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＣＰ））活性などの指標を加えた方法（森治彦、鳥海博次：醗工、６３（１）、４７−５３  （１９８５））、ο−バニリン（奥沢洋平、板倉徹、江口卯三夫：醤研、６（４）、１３８−１４０  （１９８０））やバナジン酸に対する耐性能を指標とする方法（末澤保彦、鈴木基文、森治彦：醸協、１０３（１０）、７８６−７８９  （２００８））などがある。
【０１３７】
同定法（注：詳細は、たとえば飯塚廣・後藤昭二（著）の「酵母の分類同定法（東京大学出版会  （１９６９））」や三瀬勝利・井上富士男（編）の「食品中の微生物検査法解説書（講談社サイエンティフィク  （１９９６））」のｐ１２０−１２３（諸角聖（著））の「３．９．４  酵母の観察と同定」などを参照）でのＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の判別は、精度は高いものの、検査項目が非常に多いために（森治彦：醸協、８０（８）、５１９−５２９  （１９８５））、手間がかかる。真菌の中でも、たとえば糸状菌（またはカビ）や一部の酵母の場合には、目視観察によって得られる集落の性状（形態及び色調）や顕微鏡観察によって得られる有性胞子（ｓｅｘｕａｌ  ｓｐｏｒｅ）・無性胞子（ａｓｅｘｕａｌ  ｓｐｏｒｅ、または分生子（ｃｏｎｉｄｉｕｍ））の形成様式や形態の情報が分類や同定の決め手となる事が多いのに対して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母やＺ．ｒｏｕｘｉｉを含むＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母などの場合には、形態的な特徴に乏しく（それゆえに分類や同定の指標として使えず）、未同定の酵母株の同定では、さまざまな生理生化学的な性状などを詳細に調べる作業が必要となる（矢口貴志：モダンメディア、５５（８）、２０５−２１６  （２００９）、矢口貴志：日食微誌（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２７（２）、４７−５５  （２０１０））。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の判別（または同定）のために必要な炭素源の資化性検査などについては、たとえばシスメックス・ビオメリュー株式会社（ＳＹＳＭＥＸ  ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）製の酵母様真菌同定用キット「ＩＤ３２Ｃアピ（ＩＤ３２Ｃ）（Ｃｏｄｅ．３２２０７）」を利用すれば、手間をかなり軽減化させる事ができるものの、検査の大半は培養法であるために、即日で判別（または同定）する事はできず、結果を得るまでに日数を要する。たとえば伊藤寛・菊池修平（編著）の「中国の豆類発酵食品（幸書房  （２００３））」のｐ７３の「表３．１０  新しいＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の分類キー」などにも記されている通り、「１６％食塩（ＮａＣｌ）培地での生育可／不可」という特徴（＝表現形質）は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉとその近縁種であるＺ．ｍｅｌｌｉｓとを判別（または区分け）するための鍵（キー）だとされるが、上記のＳｕｅｚａｗａらのグループによれば、両種の株を判別（または区分け）するための鍵（キー）としては不十分であり、両種の株を判別（または区分け）するためには、上記の、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）やＩＴＳ領域などの塩基配列部分を指標とする遺伝学的（または分子生物学的）な判別法（または簡易同定法）を用いる必要があるという（Ｙ．Ｓｕｅｚａｗａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｏｒｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（９），２４５２−２４５５  （２００８））。
【０１３８】
味噌や、特に醤油のメーカーなどでは、（特に醤油及びその仕掛品である醤油諸味の場合には、上記した通り、その中に含まれる酵母（菌）叢（フローラ）の大半がＺ．ｒｏｕｘｉｉと耐塩性のＣａｎｄｉｄａ属酵母に限られる事から）古くは、菌集落（コロニー）の形状や色調だけを指標に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株とＣａｎｄｉｄａ属酵母とを目視で判別（または区分け）する方法が用いられていた事もあった。これは、たとえば上記の試験１．で用いた１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天などの、一般的な寒天培地上で培養した場合に、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母株の生育がＺ．ｒｏｕｘｉｉ株よりも遅いために、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母株などが形成する菌集落（コロニー）のサイズがＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の菌集落（コロニー）よりも小さく、ゆえにその大きさ（や色調）を指標に、目視で両者を判別（または区分け）するというものである。たとえば、伊藤寛・菊池修平（編著）の「中国の豆類発酵食品（幸書房  （２００３））」中のｐ７４、すなわち「第３章  中国の発酵食品の微生物」の「（２）耐塩性酵母の培養条件」の項にも、『（ｐ７４）醤油、醤やトウチーに含まれる耐塩性酵母は高濃度食塩の中で生育するための前述のビタミンなどを必要とするが、これらは大豆が分解したトウチーや醤油に含まれ、これらの諸味の成分を加えると増殖が良くなる。例えば、種培養や分離培地に５〜７％のトウチーや１０〜１２％の生醤油（火入れや保存料を添加してないもの）を加えると増殖が良くなる。３０℃でＺ．ｒｏｕｘｉｉは２〜３日で、Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母は５〜７日で増殖し、コロニーが検出される。普通の酵母より培養期間が長く、Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母はコロニーが小さく滑らかである。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉではよく増殖した大きなコロニーは粗面でしわ状になり、Ｃａｎｄｉｄａ属の酵母と判別しやすい。（後略）』と記されている。
【０１３９】
たとえば、図３８．は、「下記の試験３．において、埼玉県内の醤油メーカーで醸造された市販の生醤油Ｅ（生揚げ）から分離し、かつ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法の結果から、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株であ（り、さらに下記の試験４．のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法（下記）の結果から、このＺ．ｒｏｕｘｉｉの中の、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株であ）ると判別されたＮｏ．７−１−６６株」と、「下記の試験３．において、同じ生醤油Ｅから分離し、かつ同じ簡易同定法の結果から、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓだと判明したＮｏ．７−３−４２株」とを、１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天（ｐＨ＝５．２）上で、３０℃、２日培養した際に生じた菌集落（コロニー）の様子を撮影したものである（注：試験３．及び試験４．の詳細については後記する）。このように、接種後の培養時間を厳密に決めておけば、菌集落（コロニー）の大きさ（サイズ）を指標に、目視でもある程度判別（または区分け）する事はできる。しかしながら、同属同種の酵母株であっても、同寒天上での生育速度は、株ごとに異なっていて、しかも培養時間がより長くなると、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母の菌集落（コロニー）もより大きく成長し、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の菌集落（コロニー）と見分けがつかない大きさ（サイズ）になってしまう。
【０１４０】
さらに、醤油よりも食塩（ＮａＣｌ）濃度の低い味噌の酵母（菌）叢（フローラ）には、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株やＣａｎｄｉｄａ属酵母株以外に、Ｐｉｃｈｉａ属酵母株なども含まれるため、菌集落（コロニー）の大きさ（サイズ）や色調だけを指標にして酵母株を目視で判別（または区分け）する事は、ほぼ不可能となる。たとえば、三瀬勝利・井上富士男（編）の「食品中の微生物検査法解説書（講談社サイエンティフィク  （１９９６））」中のｐ２８４（好井久雄（著））、すなわち「５  食品別微生物の検査法」の「５．１８  調味料類―みそ」の「５．１８．２  検査法」のうちの「Ｆ．耐塩性酵母」の項には、生醤油寒天培地上に形成された菌集落（コロニー）の『（ｐ２８４）計数に当たって、産膜酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓａなど）は集落の形状から除外する。Ｃａｎｄｉｄａ群の集落は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに比べてやや小型ではあるが、集落の大きさによる判別は困難である。』と記されている。
【０１４１】
また、上記した、それ以外の判別（または区分け）法についても（たとえば１８％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下でのマルトース資化性能の有無や生育ｐＨ域の違い、２，３，５−トリフェニル−テトラゾリウム  クロライド（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ））還元能の有無、亜鉛（Ｚｎ）やリチウム（Ｌｉ）に対する感受性能を指標とする方法の特徴や実際の手順などについては、たとえば山里一英・宇田川俊一・児玉徹・森地敏樹（編）の「微生物の分離法（Ｒ＆Ｄプランニング  （１９８６））」のｐ２８７−２８９（好井久雄（著））及びｐ３１４−３１５（伊藤寛及びティカ・カルキィ（著））などにも記されているが）、いずれも培養法であるために、即日では判別（または区分け）できず、また方法によっては判別（または区分け）精度自体が悪い。たとえば、醤油酵母の糖（マルトース）の資化性は、培地中の食塩（ＮａＣｌ）濃度や培養温度次第で変化し、そもそも株ごとでも異なっている（今井誠一、松本伊左尾：醸協、７０（６）、４１３−４１５  （１９７５））。また、ＴＴＣ法などは作業が煩雑であり、判別（または区分け）も容易ではない（微生物生態研究会（編）：微生物の生態７  ―技術論をめぐって＜識別＞、ｐ１３−２９（馬場林留（著））、学会出版センター  （１９８０））。
【０１４２】
酵母株を判別、あるいは選択的に検出するために利用できる細胞成分としては、たとえば菌体糖（の組成（Ｊ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｍ．Ｆｕｋａｇａｗａ，Ｓ．−Ｗ．Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｍａｇａｔａ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３１（６），５１９−５５０  （１９８５）））や、あるいは細胞壁のマンナンやグルカン（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｇｏｒｉｎ：Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，３５（１），３６１−３７８  （１９６９）、Ｊ．Ｋｏｃｏｕｒｅｋ  ａｎｄ  Ｃ．Ｅ．Ｂａｌｌｏｕ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１００（３），１１７５−１１８１  （１９６９）、Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｇｏｒｉｎ：Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，３６（１），１３５−１４１  （１９７０）、Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｇｏｒｉｎ：Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，３６（１），５０９−５２４  （１９７０））、菌体脂肪酸（の組成（Ｃ．Ｗ．Ｍｏｓｓ，Ｔ．Ｓｈｉｎｏｄａ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｓａｍｕｅｌｓ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，１６（６），１０７３−１０７９  （１９８２）、Ｂ．Ｃ．Ｖｉｌｊｏｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｆ．Ｋｏｃｋ，Ｈ．Ｂ．Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｌａｔｅｇａｎ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３３（４），１０１９−１０２２  （１９８７）））や（ユビ）キノンのイソプレノイド側鎖（の長さ（＝イソプレン単位数）や、さらに一部の酵母の場合にはイソプレノイド側鎖の二重結合の水素飽和度とその水素飽和の位置（Ｙ．Ｙａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｋｏｎｄｏ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（１），５９−７７  （１９７３）、Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｙ．Ｋａｎｅｍａｔｓｕ，Ｍ．Ｏｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｎｄｏ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７（３），６２１−６２８  （１９７３）、Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｏｋａｄａ，Ｏ．Ｕｅｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｎｄｏ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（３），１８９−２０８  （１９７３）、Ｙ．Ｙａｍａｄａ，Ｍ．Ａｒｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｎｄｏ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（５），３５３−３５８  （１９７３）））、上記のアイソザイムなどを含む酵素群や、それらも含めた蛋白質群（のゲル電気泳動パターン（＝バンド、すなわち蛋白質や酵素の数とそれぞれの移動度）（Ｍ．Ｙａｍａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｍａｇａｔａ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３１（３），３６１−３８１  （１９８１）、Ｍ．Ｔ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｙａｍａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｐｏｏｔ：Ｙｅａｓｔ，６（４），２９９−３１０  （１９９０）、Ｍ．Ｙａｍａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｍａｇａｔａ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８（２），１１９−１３８  （１９８２）、Ｍ．Ｙａｍａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｍａｇａｔａ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９（５），３６５−３７８  （１９８３）、Ｔ．Ｎａｋａｓｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ��．，３１（１），７１−８６  （１９８５）））、核酸におけるグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ（Ｇ））とシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ（Ｃ））のモル百分率、いわゆる「ＧＣ含量（またはＧ＋Ｃ含量（ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｓ  ｐｅｒｃｅｎｔ（Ｇ＋Ｃｍｏｌ％）））」（Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎａｋａｓｅ：Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，４１（１），８１−８８  （１９７５））などがある（森治彦：醸協、８０（８）、５１９−５２９  （１９８５）、鈴木健一朗・平石明・横田明（編）：微生物の分類・同定実験法  ―分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）、シュプリンガー・フェアラーク東京  （２００１）（注：現在は丸善出版から再出版されている）、杉山純多（編）：［バイオディバーシティ・シリーズ４］菌類・細菌・ウイルスの多様性と系統、ｐ１１１−１２０（西田洋巳・杉山純多（著））、裳華房  （２００５）、工藤俊章・大熊盛也（監修）：難培養微生物の利用技術、ｐ４５−５６（平石明（著））、シーエムシー出版  （２０１０）、矢口貴志：モダンメディア、５５（８）、２０５−２１６  （２００９）、矢口貴志：日食微誌（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２７（２）、４７−５５  （２０１０））。こうした細胞成分を指標にしてＺ．ｒｏｕｘｉｉを判別（または区分け）、あるいは選択的に検出する方法としては、たとえば茂木らのグループによる、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（１８：２））やリグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｓｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（２４：０））などの脂肪酸組成の違いを指標とする方法が報告されている（茂木恵太郎、内田金治、茂木孝也：農化、４６（１２）、６５７−６６３  （１９７２））。
【０１４３】
１９５２年にＬｏｄｄｅｒ及びＫｒｅｇｅｒ−Ｖａｎ  Ｒｉｊによって編まれた酵母分類学の聖書”Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ”（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒｅｇｅｒ−Ｖａｎ  Ｒｉｊ：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９５２））及び１９７０年改訂の２版（Ｊ．Ｌｏｄｄｅｒ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌ．，Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９７０））に記されている酵母株の分類基準は、上記した形態や生理・生化学的性状だけで構成されたものに過ぎなかったが、１９８４年改訂の３版（Ｎ．Ｊ．Ｋ．Ｋｒｅｇｅｒ  ｖａｎ  Ｒｉｊ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（３ｒｄ  ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９８４））からは、これに菌体糖組成、（ユビ）キノンタイプ、ＧＣ含量（またはＧ＋Ｃ含量）や染色体ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合（または分子交雑、ハイブリッド形成、ハイブリダイゼーション）試験結果も分類に生かす、化学（系統）分類学（ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ、またはｃｈｅｍｏｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ）的な考え方が加えられ（１９９８年改訂の４版（Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．）：Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ（４ｔｈ  ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９９８））からは、さらに１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や、上記の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列などの分子生物学的な特徴も、分類基準として追加されるようになっ）た（杉山純多（編）：［バイオディバーシティ・シリーズ４］菌類・細菌・ウイルスの多様性と系統、ｐ２２２−２２７（杉山純多（著））、裳華房  （２００５））。
【０１４４】
しかしながら、こうした酵母株ごとでの細胞成分の違いは、あくまでも他の指標を用いた際の識別（または区分け）結果を補強する手がかりとして使えるに過ぎず、これらの手がかり（単独）だけでＺ．ｒｏｕｘｉｉを判別（または区分け）する事はできない（杉山純多（編）：［バイオディバーシティ・シリーズ４］菌類・細菌・ウイルスの多様性と系統、ｐ１１１−１２０（西田洋巳・杉山純多（著））、裳華房  （２００５））。たとえば、酵母株２株の核酸組成の違い、すなわちＧＣ含量（またはＧ＋Ｃ含量）の違いが、融点（Ｔｍ）法で分析した結果が１．５〜２．０ｍｏｌ％Ｇ＋Ｃ超、また酵素分解物の高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ））による定量法を用いた場合には１．０ｍｏｌ％Ｇ＋Ｃ超であれば、両株のＤＮＡに大きな共通塩基配列部分は存在せず、それゆえに両株は別種である可能性が高いものと見做されるが、ただし両株が同じＧＣ含量（またはＧ＋Ｃ含量）を示したとしても、その結果だけを理由に、両株が同種だと判別（または区分け）する事はできない（森治彦：醸協、８０（８）、５１９−５２９  （１９８５））。また、アイソザイム（＝同じ反応を触媒する複数の酵素群）のゲル電気泳動パターン（またはバンドパターン）についても、たとえば酵母株２株の場合に生じたバンドパターンが同じ、すなわちバンド（＝アイソザイム）の数とそれぞれの移動度が同じであったとしても、両株の持つそれぞれの酵素（の分子量やアミノ酸配列など）が同一であるという保証はまったくない（杉山純多（編）：［バイオディバーシティ・シリーズ４］菌類・細菌・ウイルスの多様性と系統、ｐ１１１−１２０（西田洋巳・杉山純多（著））、裳華房  （２００５））。そもそも、酵母細胞の糖や脂肪酸の組成などは、その酵母株の培養条件（または生育環境）によっても大きく異なる事が知られている。さらに、上記の茂木らのグループによる脂肪酸組成の違いを指標とする判別（または区分け）法は、作業自体が煩雑であり、しかも熟練を要する。
【０１４５】
味噌・醤油やその仕掛品、すなわち仕込み工程における味噌・醤油諸味や製成工程における生揚げ醤油などの酵母（菌）叢（フローラ）の中からＺ．ｒｏｕｘｉｉ株を判別（または区分け）、あるいは選択的に検出するための免疫学的な方法としては、たとえば茂木及び逆井による「スライド凝集法」の報告がある。茂木及び逆井は、Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ（＝現在のＺ．ｒｏｕｘｉｉ）とＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属酵母（＝現在のＣａｎｄｉｄａ属酵母）とをスライド凝集法で判別（または区分け）できる事を報告しているが（茂木恵太郎、逆井利夫：農化、４８（１１）、６１３−６１７  （１９７４））、この方法もやはり作業が煩雑であり、熟練を要する。
【０１４６】
ただ、最近では、質量分析計（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＭＳ））を用いて、微生物が持つ（主に分子量５０００〜１５０００程度の）蛋白質群をまとめて一気に分析する事で得られるマススペクトルパターン（＝蛋白質群のパターン）を指標に、微生物を判別（または区分け）する方法の研究開発も進められており、臨床検査の現場に、（特に病原性）微生物同定法として導入されたりもしているようである。細胞が壊れやすい「細菌」での試験例（ケース）が多いものの（Ｓ．Ｑ．ｖａｎ  Ｖｅｅｎ，Ｅ．Ｃ．Ｊ．Ｃｌａａｓ  ａｎｄ  Ｅｄ  Ｊ．Ｋｕｉｊｐｅｒ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８（３），９００−９０７  （２０１０））、酵母についても、たとえばＭａｒｋｌｅｉｎらの報告などがある。酵母の場合にも、その種類ごとに細胞内の蛋白質群のパターンが異なっているため、これらの蛋白質群をまとめて一気に分析する事で得られるマススペクトルのパターンも酵母の種類ごとで異なっており（松山由美子：食品と開発、４６（１１）、１４−１５（２０１１）、松山由美子：ジャパンフードサイエンス、５１（１）、５７−６２  （２０１２））、たとえばＭａｒｋｌｅｉｎらのグループは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて、血液や脳脊髄液などの臨床サンプルから分離したＣａｎｄｉｄａ属酵母、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属酵母（クリプトコッカス属酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属酵母、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属酵母（ゲオトリクム属酵母）、Ｐｉｃｈｉａ属酵母、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ属酵母（ブラストシゾミセス属酵母、またはブラストシゾマイセス属酵母）など、計２６７株を非常に高い精度で同定（または判別）できたと報告している（Ｇ．Ｍａｒｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｊｏｓｔｅｎ，Ｕ．Ｋｌａｎｋｅ，Ｅ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈｏｒｒｅ，Ｔ．Ｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｗｅｎｚｅｌ，Ｍ．Ｋｏｓｔｒｚｅｗａ，Ｇ．Ｂｉｅｒｂａｕｍ，Ａ．Ｈｏｅｒａｕｆ  ａｎｄ  Ｈ．−Ｇ．Ｓａｈｌ：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７（９），２９１２−２９１７  （２００９））。前処理はほとんど不要で、しかも供試株の細胞を機器に載せてから蛋白質群パターン検出と相同性解析までの作業も自動化でき、さらに同定（または判別）結果を得るまでせいぜい５分程度ときわめて短時間で、そのうえランニングコストも安いが（川崎浩子：生物工学、９０（９）、５９２  （２０１２））、そもそも本法で用いている質量分析計（ＭＳ）自体が、他の分析機器類に較べて非常に高価であり、ゆえに本法はまだまだ一般的であるとは言えない。また、本発明で取り上げているＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の同定（または判別）に関する実施報告はない。
【０１４７】
さまざまな酵母の全ゲノム配列が解読され、そして解読結果が公開される、いわゆる「ポストゲノム時代」に突入した最近では、酵母株が持つ塩基配列など、遺伝情報を指標とする判別（または区分け）法（や、その結果に基づいた現行の分類法自体の見直し）の研究開発が非常に盛んに行なわれており、たとえば上記の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする「簡易同定法」のように、なかには公定法として認められている手法もある。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉにおける遺伝情報を指標とする同定法ないしは判別法に関する報告は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどで研究開発された方法を模倣したもの（ケース）が多いが、これも世界で初めて全ゲノム配列が解読された酵母株が、上記した通り、１９９６年のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株であり（Ａ．Ｇｏｆｆｅａｕ，Ｂ．Ｇ．Ｂａｒｒｅｌ，Ｈ．Ｂｕｓｓｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄｕｊｏｎ，Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｆ．Ｇａｌｉｂｅｒｔ，Ｊ．Ｄ．Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，Ｃ．Ｊａｃｑ，Ｍ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｌｏｕｉｓ，Ｈ．Ｗ．Ｍｅｗｅｓ，Ｙ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｐ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｈ．Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇ．Ｏｌｉｖｅｒ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４（５２８７），５４６−５６７  （１９９６））、その後の研究を通して蓄積された遺伝学的な情報量が圧倒的に多いためである。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の全ゲノム配列が解読され、その配列情報が公開されたのは２００９年、しかもこの際に解読用の供試株として用いられたのは、（味噌・醤油及びその仕掛品である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油などではなく）黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）であり（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９（１０），１６９６−１７０９  （２００９））、現時点（２０１４年３月３１日時点）でも全ゲノム配列が解読され、かつその情報が公開されているのはこのＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）だけである。ただし、上記した通り、味噌・醤油主発酵酵母であるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株や醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株など、さまざまなＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分的な塩基配列や、あるいは上記のＳＯＤ（＝ＺｒＳＯＤ２及びＺｒＳＯＤ２２）やＨＯＧ（＝ＺｒＨＯＧ１及びＺｒＨＯＧ２）、ＧＰＤ（＝ＺｒＧＰＤ１及びＺｒＧＰＤ２）やＧＣＹ（＝ＺｒＧＣＹ１及びＺｒＧＣＹ２）、細胞内のナトリウムイオン（Ｎａ＋）の排出に関与する酵素であるＮａ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｎａ＋−ＡＴＰａｓｅ）をコードしているＺＥＮＡ１（Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．Ｉｗａｋｉ，Ｙ．Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ａ．Ｉｃｈｉｍｉｙａ，Ｙ．Ｎａｇａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｔａｍａｉ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８８（２），１３６−１４２  （１９９９））、細胞外の浸透圧の変化に応じ���細胞内のグリセロール濃度を調節するグリセロール・チャネル蛋白質（またはグリセロール取り込み／排出促進蛋白質（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ））をコードしているＺｒＦＰＳ１（Ｘ．−Ｍ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｋａｙｉｎｇｏ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｐｒｉｏｒ：Ｙｅａｓｔ，２２（７），５７１−５８１  （２００５））などの、主に耐塩性能に関わる遺伝子や、また遺伝子工学的な研究において遺伝子組換え用マーカーとして利用される事が多いＡＤＥ２（Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ，Ｖ．Ｂｒａｕｎ  ａｎｄ  Ｊ．−Ｌ．Ｓｏｕｃｉｅｔ：Ｙｅａｓｔ，１５（１３），１３９９−１４０２  （１９９９））やＨＩＳ３（Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ，Ｖ．Ｂｒａｕｎ  ａｎｄ  Ｊ．−Ｌ．Ｓｏｕｃｉｅｔ：Ｙｅａｓｔ，１６（７），５８１−５８７  （２０００））、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（β−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ）をコードしているＬＥＵ２などの遺伝子の塩基配列は解読され、その配列情報は公開されている（Ｈ．Ｓｙｃｈｒｏｖａ：Ｙｅａｓｔ，１８（１０），９８９−９９４  （２００１））。
【０１４８】
酵母などの真核生物の場合には、細胞（内）小器官（オルガネラ）にもＤＮＡがあり、たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、環状のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ））の塩基配列（約８０ｋｂ）も解読され、その配列情報が公開されている（Ｆ．Ｆｏｕｒｙ，Ｔ．Ｒｏｇａｎｔｉ，Ｎ．Ｌｅｃｒｅｎｉｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｐｕｒｎｅｌｌｅ：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４０（３），３２５−３３１  （１９９８））。さらに、たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３６４Ｄ５株が持つ環状プラスミドの２μｍＤＮＡ（または２−μｍＤＮＡ、２μＤＮＡ、２μ  ｃｉｒｃｌｅ、２μｍ）（Ｊ．Ｈ．Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｂ．Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｐ．Ｓａｎｇｈａｖｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５６（３７７９），１２３４−１２３７  （１９６７））やＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（クリベロミセス（またはクリベロマイセス、クルイベロミセス、クルイベロマイセス）・ラクティス）  ＩＦＯ１２６７株が持っている線状プラスミドのｐＧＫｌ１（またはｐＧＫＬ１（８．９ｋｂ））やｐＧＫｌ２（またはｐＧＫＬ２（１３．４ｋｂ））（Ｎ．Ｇｕｎｇｅ，Ａ．Ｔａｍａｒｕ，Ｆ．Ｏｚａｗａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４５（１），３８２−３９０  （１９８１））などのように、一部の酵母株はその細胞内にプラスミドを持っており（飯野徹雄・深沢俊夫・由良隆（編）：組換えＤＮＡ実験技術  その現状と展望、ｐ１４−２５（大嶋泰治（著））、学会出版センター  （１９８４）、平野正（編）：酵母のバイオテクノロジー  基礎と応用、ｐ２５−３７（菱沼文男・菊池洋・徳永正雄・平井啓子・和田直美・北田邦雄（著））、学会出版センター  （１９８８））、こうしたプラスミドの塩基配列については、上記のゲノム情報などよりもずっと以前に解読され、そしてその配列情報は公開されている。
【０１４９】
たとえば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａ３６４Ｄ５株が持つ２μｍは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの実験室酵母株の多くが持つプラスミドで、この「２μｍ」という名称は、電子顕微鏡観察で判明したプラスミドの長さに因んで付けられたものである（Ｃ．Ｐ．Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｂｏｒｓｔ  ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｊ．ｖａｎ  Ｂｒｕｇｇｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０９（１），１−１５  （１９７０））。２μｍの細胞内でのコピー数は１倍体細胞当たり５０〜１００コピー程度と高く、プラスミドを有する株（＝ｃｉｒ＋株）と持っていない株（＝ｃｉｒ０株）とを交雑させると、その子孫がすべてプラスミドを持つ株（＝ｃｉｒ＋株）になるという、典型的な非メンデル遺伝様式を示す（Ｄ．Ｍ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８６（１），７３−８４  （１９７７））。このプラスミドの全塩基配列も解読され（Ｊ．Ｌ．Ｈａｒｔｌｅｙ  ＆  Ｊ．Ｅ．Ｄｏｎｅｌｓｏｎ：Ｎａｔｕｒｅ，２８６（５７７６），８６０−８６４  （１９８０））、その配列情報は公開されている（Ｊ０１３４７．１、ＧＩ：１７２１９０）。
【０１５０】
このプラスミドの鎖長（または全塩基数）は６３１８ｂｐで、そのプラスミド上には、図１２．の（１）の模式図の通り、プラスミドの分子内組換え（後記）に関係する蛋白質をコードしている遺伝子であるＦＬＰ、プラスミド上のＳＴＢ領域（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ、またはＲＥＰ３）とともに細胞内でのプラスミドの安定性やコピー数増加に関係する蛋白質をコードしている遺伝子であるＲＥＰ１やＲＥＰ２などが（Ｍ．Ｊａｙａｒａｍ，Ｙ．−Ｙ．Ｌｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ：Ｃｅｌｌ，３４（１），９５−１０４  （１９８３））、また５９９ｂｐの相同な塩基配列で構成される１対の逆向きの反復配列（インバーテッド・リピート（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｒｔ（ＩＲ）））がある。酵母の細胞内では、プラスミドｐＳＲ１は、このインバーテッド・リピート（ＩＲ）内の塩基配列部分どうしで高頻度に分子内組換えを起こすために構造（ｆｏｒｍ）が変化し（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ，Ｖ．Ｒ．Ｇｕａｒａｓｃｉｏ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊａｙａｒａｍ：Ｃｅｌｌ，２９（１），２２７−２３４  （１９８２））、結果的には「Ａ型（Ａ−ｆｏｒｍ）」及び「Ｂ型（Ｂ−ｆｏｒｍ）」（＝図１２．の（１）の模式図）と名付けられた、２種類の構造のプラスミドが１：１の比率で混じり合った状態で存在している（Ｃ．Ｐ．Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｂｏｒｓｔ  ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｊ．ｖａｎ  Ｂｒｕｇｇｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０９（１），１−１５  （１９７０））。たとえば、さまざまな醸造用酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ）を対象に、２μｍの有無を調べた結果によると、調べたパン酵母やビール酵母の大半が２μｍを持っていたのに対して、清酒、泡盛、焼酎など、日本の酒類の醸造に利用される酵母株のほとんどは２μｍを持っていなかったという、中里らの興味深い報告もあるものの（中里厚実、安光得、門倉利守、竹田正久：東京農大農学集報（Ｊｏｕｒ．Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．，Ｔｏｋｙｏ  Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ａｇｒｉｃ．））、４７（３）、２２６−２３０  （２００２））、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが２μｍを持っているその生理学的な意義さえ、そもそもあまりよく分かってはいない（飯野徹雄・深沢俊夫・由良隆（編）：組換えＤＮＡ実験技術  その現状と展望、ｐ４５１−４６２（菊池淑子（著））、学会出版センター  （１９８４）））。
【０１５１】
Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの場合にも、たとえばマジパン（ｍａｒｚｉｐａｎ）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｇ４１１８株（＝ＮＢＲＣ１０６７１株）からはプラスミドｐＳＲ１（６５２１ｂｐ）、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）からはプラスミドｐＳＲ２（Ａ．Ｔｏｈ−ｅ，Ｓ．Ｔａｄａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｏｓｈｉｍａ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５１（３），１３８０−１３９０  （１９８２））、またオランダの塩漬豆（ｓａｌｔｅｄ  ｂｅａｎｓ）から分離された  Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１７３０株（＝旧名：Ｓ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（サッカロミセス（またはサッカロマイウス）・ビスポラス）  ＩＦＯ１７３０株）からはプラスミドｐＳＢ３（６６１５ｂｐ）及びプラスミドｐＳＢ４（約６．０ｋｂ）が、またＺ．ｂａｉｌｉｉ（チゴサッカロミセス（またはチゴサッカロマイセス）・ベイリー（またはバイリー））では、高粱酒の諸味（ｋａｏｌｉａｎｇｃｈｉｕ−ｍｏｒｏｍｉ）から分離されたＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＩＦＯ０４６８株やウスターソースから分離されたＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＩＦＯ０４８８株、赤ワイン（ｓｏｕｒ  ｒｅｄ  ｗｉｎｅ）から分離されたＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＩＦＯ１１３７株、土（ｓｏｉｌ）から分離されたＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＩＦＯ１８０１株（＝ＮＢＲＣ１８０１株）からはプラスミドｐＳＢ１（約６．０ｋｂ）が、また同じくＩＦＯ１８０１株（＝ＮＢＲＣ１８０１株）、ＩＦＯ０４６８株やＩＦＯ１０４７株からはプラスミドｐＳＢ２（５４１５ｂｐ）が発見されており（Ａ．Ｔｏｈ−ｅ，Ｈ．Ａｒａｋｉ，Ｉ．Ｕｔａｔｓｕ  ａｎｄ  Ｙ．Ｏｓｈｉｍａ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０（１０），２５２７−２５３４（１９８４））、うちプラスミドｐＳＲ１（Ｈ．Ａｒａｋｉ，Ｈ．Ｔａｔｓｕｍｉ，Ａ．Ｊｅａｒｎｐｉｐａｔｋｕｌ，Ｔ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｋ．Ｕｓｈｉｏ，Ｔ．Ｍｕｔａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｏｓｈｉｍａ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８２（２），１９１−２０３  （１９８５））、プラスミドｐＳＢ３（Ａ．Ｔｏｈ−ｅ  ＆  Ｉ．Ｕｔａｔｓｕ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３（１２），４２６７−４２８３  （１９８５））及びプラスミドｐＳＢ２の、計３種類のプラスミドについては、全塩基配列が解読され（Ｉ．Ｕｔａｔｓｕ，Ｓ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ａ．Ｔｏｈ−ｅ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（１２），５５３７−５５４５  （１９８７））、それらの配列情報が公開されている（注：Ｂ−ｆｏｒｍのプラスミドｐＳＲ１（６２５１ｂｐ）の塩基配列情報はＸ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８、プラスミドｐＳＢ３（６６１５ｂｐ）の塩基配列情報はＸ０２６０８．１、ＧＩ：５２５３、プラスミドｐＳＢ２（５４１５ｂｐ）の塩基配列情報はＭ１８２７４．１、ＧＩ：１７３３３４）。
【０１５２】
２μｍと似ている事から「２μｍＤＮＡ類似プラスミド」と総称されるこれらのプラスミドのうち、特にプラスミドｐＳＲ１（＝図１２．の（２）の模式図）については、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μｍとの比較研究もなされた結果、同プラスミド上には、上記の２μｍと同様、３つの蛋白質をコードしているものと見られる３つの遺伝子、すなわち２μｍ上のＲＥＰ１に相当する、すなわちプラスミドの安定性に関わる分子量４６０００の蛋白質をコードしているものと見られるＰ遺伝子（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  Ｐ）、２μｍ上のＲＥＰ２に相当する、すなわちプラスミドのコピー数制御に関わる分子量２６０００の蛋白質をコードしているものと見られるＳ遺伝子（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  Ｓ）、２μｍ上のＦＬＰに相当する、すなわち分子内組換えに関わる分子量５６０００の蛋白質をコードしているものと見られるＲ遺伝子（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  Ｒ）が載っている事、またこれも２μｍと同様、相同な一対のインバーテッド・リピート（ＩＲ）も持っており、酵母の細胞内ではこのインバーテッド・リピート（ＩＲ）内の塩基配列部分どうしで分子内組換えを起こして構造（ｆｏｒｍ）変化する事などが判っている（永井進（編）：酵母の細胞工学と育種、ｐ９７−１１４（荒木弘之・東江昭夫・歌津幾代・辰巳宏樹・Ａｍｏｒｎｒａｔ  Ｊｅａｒｎｐｉｐａｔｋｕｌ・牛尾公平・大嶋泰治（著））、学会出版センター  （１９８６））。
【０１５３】
味噌・醤油やその仕掛品、すなわち仕込み工程における味噌・醤油諸味の酵母（菌）叢（フローラ）の中から［Ａ］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を判別、あるいは選択的に検出するための遺伝学的な方法としては、上記の、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標として利用する、いわゆる「簡易同定法」があるが、ただし本法をＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の分類に適用した場合には、上記したＳｕｅｚａｗａらの報告（Ｙ．Ｓｕｅｚａｗａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｏｒｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（９），２４５２−２４５５  （２００８））の通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群の中には、少なくとも２種類以上の種（しゅ）が混在しているという結果が出てしまう。
【０１５４】
実際に、市販の生（＝加熱処理を施していない）の米味噌や麦味噌、（除菌処理もしていない）生醤油から耐塩性酵母株を分離し、これらの株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を調べてみた。
【０１５５】
試験３．市販の生味噌・生醤油からの耐塩性酵母株の分離と、分離した株の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列の塩基配列解読（シークエンシング）／簡易同定試験：
【０１５６】
本試験において、耐塩性酵母株を分離するための分離源として用いた生味噌・生醤油は、インターネット上で販売されている市販製品群の中から選び出した。生味噌については、上記した通り、「普通味噌」のうちの（「豆味噌」及び「合わせ味噌（＝調合味噌）」を除き）、「米味噌（ただし米甘味噌を除く）」ないしは「麦味噌」に分類される、加熱殺菌処理を施していない味噌とし、さらに製品のラベルやインターネット上の製品紹介・説明欄の「原材料（または原材料名）」の記載が、「大豆」、「米」、あるいは「麦」ないしは「はだか麦」、及び「食塩」のみで、それ以外の原材料、たとえば酒精・酒粕、保存料（ソルビン酸）や酸化防止剤、漂白剤、甘味料などの食品添加物に関する記載はなく、かつ「味噌（製品）の食塩（ＮａＣｌ）濃度が低い、いわゆる減塩タイプではない」製品を選択し、以下の試験に用いた。すなわち、青森県内の味噌メーカーで製造された米味噌Ａ、富山県内の味噌メーカーで製造された米味噌Ｂ（越中味噌）、岡山県内の味噌メーカーで製造された米味噌Ｃ（赤味噌）及び、同メーカーで製造された麦味噌Ｄの計４試料である。また、生醤油については、製品ラベルの「原材料名」欄に、原材料として記されているのが「有機大豆（国内産）」、「有機小麦（国内産）」、「食塩」だけであり、それ以外の原材料、たとえば保存料（安息香酸ナトリウム）など、食品添加物に関する記載はなく、かつ（圧搾後の生揚げ醤油に一般的に施される）火入れ処理や精密濾過処理なども施されていない製品を選択し、以下の試験に用いた。すなわち、埼玉県内の醤油メーカーで製造された生醤油Ｅ（生揚げ）の１試料である（注：市販の生醤油は、濾過除菌処理した無菌の製品が多い。そこで、埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）中に醤油産膜性酵母株（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）が混入している事を確認する試験を予め行なった。すなわち、壜詰め状態の埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）をクリーンベンチ内（＝無菌条件下）で開栓し、うち５ｍｌを殺菌済み「空」試験管に移し替え、その口をシリコン栓で塞いだ上で、３０℃条件下で３０日間放置してみた。結果は、図１４．の（１）の写真の通り、醤油の液面に皮膜が形成され、同生醤油Ｅ（生揚げ）が無菌ではなく、少なくとも産膜性酵母株（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）が生息している事は確認できた）。
【０１５７】
味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天の培地組成：
５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、８．３％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１０％（Ｖ／Ｖ）濃口生揚げ醤油（＝脱脂加工大豆、大豆、小麦、食塩を原料とする、発酵・熟成後の濃口醤油諸味の圧搾後液汁を清澄化処理したもの。火入れ処理前（＝非加熱）、成分無調整）、２．４％（Ｗ／Ｖ）寒天（和光純薬工業（株）製、製品コード：Ｎｏ．０１０−１５８１５）、ｐＨ＝５．２〜５．３（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。同試験に用いた味噌・醤油酵母分離用生醤油寒天は、全国味噌技術会が発行した「みそ技術ハンドブック  付  基準みそ分析法（１９９５）」のｐ６２に記されている同培地の組成のうち、寒天の濃度を同書記載の１．７〜２．０％（Ｗ／Ｖ）から２．４％（Ｗ／Ｖ）に変更したものである。寒天の濃度を高く変更した理由は、同寒天上に試料溶液を塗抹しやすくするためである。同寒天中の寒天濃度を１．７〜２．０％（Ｗ／Ｖ）にすると、寒天が軟らかくなり、寒天上に殺菌したスパーテルなどを用いて液体試料を塗抹しようとした場合に、寒天に亀裂が入ったり、ひび割れたりしてしまう事がある。同寒天中の寒天濃度を２．４％（Ｗ／Ｖ）にしたのは、こうした事態を避けるためである。
【０１５８】
味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天の調製法：
５ｇグルコース、８．３ｇ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１０ｍｌ濃口生揚げ醤油、２．４ｇ寒天を蒸留水に溶かし、これに１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝５．２〜５．３に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。これを高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した後、熱いうちに、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、殺菌済みシャーレに（シャーレ１枚につき約１０ｍｌずつ）流し込み、冷やして固める。
【０１５９】
生味噌・生醤油からの耐塩性酵母株の分離：
生味噌・生醤油からの耐塩性酵母株の分離は、以下の手順で行なった。まず、クリーンベンチなどの無菌条件下で、生味噌５ｇ、あるいは生醤油５ｍｌを採り、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した、４５ｍｌの１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液入りの三角フラスコ」に入れ、ヤマト科学株式会社製タッチミキサＭＴ−３１（注：回転数は２８００〜３３００ｒｐｍ．程度）などを使ってよく攪拌する。攪拌後の「三角フラスコ中の溶液」、すなわち「生味噌・生醤油の１０倍希釈液」のうち、０．１ｍｌを採り、殺菌済みのスパーテルなどを使って、これを上記の味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天の表面に塗抹する。また、攪拌後の「三角フラスコ中の溶液（＝生味噌・生醤油の１０倍希釈液）」のうち、１ｍｌを採り、これを殺菌済みの１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液９ｍｌ入りの試験管に入れ、タッチミキサなどを使ってよく攪拌する。攪拌後の試験管中から、溶液（＝種培養液の１００倍希釈液）０．１ｍｌを採り、新しい１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天の表面に塗抹する。生味噌・生醤油の希釈倍率が１００万倍（＝１００００００倍＝１０６倍）に至るまで、この作業を繰り返す。希釈液を塗抹した寒天は、３０℃に設定した恒温器（または培養器）内に３〜７日間置き、寒天上に形成された菌集落（コロニー）の数を計数する。寒天上に形成された菌集落（コロニー）は、クリーンベンチなどの無菌条件下で、殺菌済みの爪楊枝や白金線などを使って、新しい味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天上に植え継ぎ、３０℃に設定した恒温器（または培養器）内に３〜７日間置いて培養した後（の様子を撮影したのが、図１３．及び図１４．の写真）、これらの菌集落（コロニー）の中から、４〜８個の菌集落（コロニー）を選び出し、新しい味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天上に２〜３回植え継ぐ事で（注：培養条件は３０℃、３〜５日）、シングルコロニー化した。
【０１６０】
生味噌・生醤油中の耐塩性酵母数を、上記の手順で計数した結果、青森県産米味噌Ａ中の耐塩性酵母数は３．０×１０２ＣＦＵ／ｇ、富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）は５．１×１０６ＣＦＵ／ｇ、岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）は６．０×１０３ＣＦＵ／ｇ、岡山県産麦味噌Ｄは２．０×１０３ＣＦＵ／ｇ、埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）は１．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌであった。図１３．の（１）は青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母株群、図１３．の（２）は富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した耐塩性酵母株群、図１３．の（３）は岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）から分離した耐塩性酵母株群、図１３．の（４）は岡山県産麦味噌Ｄから分離した耐塩性酵母株群、図１４．の（２）は埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母株群の、味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天上での生育の様子を撮影した写真である。
【０１６１】
この、図１３．の（１）の青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母株群の中から、Ｎｏ．１−１−１株、Ｎｏ．１−１−４株、Ｎｏ．１−１−５株、Ｎｏ．１−１−６株、Ｎｏ．１−２−８株、Ｎｏ．１−２−１３株、Ｎｏ．１−２−１４株、Ｎｏ．１−２−１９株の８株、図１３．の（２）の富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した耐塩性酵母株群の中からは、Ｎｏ．５−１−１株、Ｎｏ．５−１−７株、Ｎｏ．５−１−１０株、Ｎｏ．５−１−１６株、Ｎｏ．５−２−２株、Ｎｏ．５−２−９株、Ｎｏ．５−２−１２株、Ｎｏ．５−２−１７株の８株、図１３．の（３）の岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）から分離した耐塩性酵母株群の中からは、Ｎｏ．６−１−１−２株、Ｎｏ．６−１−１−５株、Ｎｏ．６−１−２−２５株、Ｎｏ．６−１−２−５０株の４株、図１３．の（４）の岡山県産麦味噌Ｄから分離した耐塩性酵母株群の中からはＮｏ．６−４−１−１０株、Ｎｏ．６−４−１−２０株、Ｎｏ．６−４−２−７株、Ｎｏ．６−４−２−１４株の４株、また図１４．の（２）の埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母株群の中からはＮｏ．７−１−２３株、Ｎｏ．７−１−６６株、Ｎｏ．７−１−８３株、Ｎｏ．７−１−８９株、Ｎｏ．７−２−１株、Ｎｏ．７−２−２株、Ｎｏ．７−２−６株、Ｎｏ．Ｎｏ．７−３−４２株の８株の、計３２株を選び出し、上記の手順でシングルコロニー化した。
【０１６２】
ＹＰＤ液体培地の培地組成：
２％（Ｗ／Ｖ）グルコース、１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス（Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、べクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー（ＢＤ）製、製品コード：Ｎｏ．２１２７５０）、２％（Ｗ／Ｖ）ポリペプトン（日本製薬株式会社製、製品コード：Ｎｏ．３９４−００１１５）、ｐＨ＝４．８〜５．２（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。
【０１６３】
ＹＰＤ液体培地の調製法：
２ｇグルコース、１ｇ酵母エキス、２ｇポリペプトンを蒸留水に溶かし、１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝４．８〜５．２に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。この液体培地２ｍｌずつを試験管に分注し、試験管の口を綿栓で塞いだ状態で、高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）を使い、１２１℃、１５分間殺菌し、殺菌後は冷却する。
【０１６４】
分離株の培養：
クリーンベンチなどの無菌条件下で、分離株を上記のＹＰＤ液体培地２ｍｌに接種し、３０℃、２日間（＝約３０時間）、１４０ｒｐｍ．振とう培養し、この培養液２ｍｌのうちの０．４ｍｌを新しいＹＰＤ液体培地２ｍｌに接種し、これを３０℃、１８時間、１４０ｒｐｍ．振とう培養した。
【０１６５】
上記の培養液２ｍｌを、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、３０分間殺菌した、２ｍｌ容量のマイクロチューブ」に流し込み、株式会社トミー精工製遠心分離器ＭＲＸ−１５２を用いて、４℃条件下で、３０００ｒｐｍ×２分間遠心分離処理し、遠心処理後に上清（＝液体培地）を丁寧に除去し、沈殿（＝分離株の細胞）を得た。
【０１６６】
分離株の細胞からの核酸成分の調製（または抽出）には、（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法を用いた。
【０１６７】
ビーズ破砕／フェノール処理法の手順：
（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法の手順は、京都大学・大学院・農学研究科・応用生命科学専攻・分子細胞科学講座・エネルギー変換細胞学分野（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＬＭＭ））のホームページ「微生物実験プロトコール集（仮設）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｋａｉｓ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌ（２０１３年８月２０日時点））に公開されていた手法『酵母からのゲノム抽出』を、若干改変したものである。すなわち、手順は、以下の通りである。
【０１６８】
まず、上記の沈殿（＝供試株の細胞）の入ったマイクロチューブに、沈殿とほぼ同（湿）重量のシグマ・アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｉｎｃ．）製ガラスビーズ（Ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓ，ａｃｉｄ−ｗａｓｈｅｄ（製品コード：Ｇ８７７２−１００Ｇ）、４２５〜６００μｍサイズのビーズ）と、０．２ｍｌの「Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（注：同溶液の組成は、２％トリトンＸ−１００、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ），ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２Ｈ２Ｏ）））、ｐＨ＝８．０）」とを加え、ヤマト科学株式会社製タッチミキサＭＴ−３１（注：回転数は２８００〜３３００ｒｐｍ．程度）を使って、３０秒間よく攪拌する。攪拌後の溶液に、株式会社ニッポンジーン製のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、遺伝子工学研究用、製品コード：Ｎｏ．３１１−９０１５１）０．２ｍｌを加えて、マイクロチューブを優しく反転させながら攪拌した後、さらにキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）株式会社製細胞破砕装置「Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ」を使って、５分間激しく攪拌する（注：ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（１／Ｓ）＝３０．０に設定）。攪拌終了後の溶液に、トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ（ＴＥ）溶液（ｐＨ＝７．５）０．４ｍｌと、上記のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール０．２ｍｌを加え、再度マイクロチューブを優しく反転させながら攪拌した後、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０分間遠心分離処理を行うと、上層（＝水溶液層）と下層（＝溶剤層）との２層に分離するので、その上層を（下層が混入しないように）丁寧に新しいマイクロチューブに移し、これに再びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール０．５ｍｌを加え、再度マイクロチューブを優しく反転させながら攪拌した後、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０分間遠心分離処理を行い、再び上層を（下層が混入しないように）丁寧に新しいマイクロチューブに移す。これに、クロロホルム０．５ｍｌを加え、やはりマイクロチューブを優しく反転させながらよく攪拌した後、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０分間遠心分離処理を行うと、やはり上層（＝水溶液層）と下層（＝クロロホルム層）との２層に分離するので、その上層を（下層が混入しないように）丁寧に新しいマイクロチューブに移し、これに溶液量の０．６倍〜等量のイソプロパノールを加え、マイクロチューブを優しく反転させながらよく攪拌した後、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０分間遠心分離処理を行なうと、生味噌・生醤油からの分離株の核酸成分がマイクロチューブの底に沈殿する。遠心分離処理後、チューブ内の上清を丁寧に除去したうえで、あらかじめ冷凍庫内（−２０℃）で冷やしておいた７０％エタノール水溶液１ｍｌを加え、マイクロチューブを優しく反転させながらよく攪拌した後、上��の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０分間遠心分離処理を行い、再び上清（＝エタノール水溶液）を丁寧に除去したうえで、このチューブを室温条件下で放置し、乾燥させる。乾燥処理後のチューブに、適当量のトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）溶液を流し込み、チューブの底に沈殿している分離株の核酸成分をＴＥ溶液に溶解させ、これを「分離株の核酸成分」として、以下の試験に用いた。
【０１６９】
上記の手順で調製（または抽出）した分離株の核酸成分（溶液）の濃度（及びその純度）は、２６０ｎｍの紫外線の吸光度を指標として利用する測定法で測定した（注：同法の原理は、たとえば田村隆明・村松正實（著）の「基礎分子生物学（第３版）（東京化学同人  （２００７））」のｐ１５１−１５２などに記されている）。実際に用いた機器は、ナカ・インスツルメンツ株式会社（Ｎａｋａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＣＯ．，Ｌｔｄ．）製分光光度計「Ｇｅｎｅ  ＳｐｅｃIII（７Ａ０−００３０）」（注：プログラム「Ｎｏ．７Ａ００５７１−０２」を搭載）であり、本機器で２３０〜３２０ｎｍの範囲の吸光度を測定し、機器に搭載されているプログラムを使って核酸成分（溶液）の濃度（及びその純度）を算出した。
【０１７０】
分離株が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を増幅するためのＰＣＲ法は、以下の手順で行なった。なお、同手順は、たとえばＴ．Ｂｏｅｋｈｏｕｔ＆Ｖ．Ｒｏｂｅｒｔ（Ｅｄ．）「Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ，Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．，Ｂ．Ｂｅｈｒ’ｓ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  （２００３）」中のｐ８５−８８「３．６．５  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｏｄｓ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄ１／Ｄ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ＳｒＤＮＡ，１８ＳｒＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）」などにも記されている。
【０１７１】
分離株が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を増幅するためのＰＣＲ法では、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）及びＮＬ−４（＝配列番号４）を用いた。用いたプライマーの塩基配列は、下記の通りである。
プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）：
（Ｆｏｒｗａｒｄ、２４塩基、分子量（ＭＷ）＝７４６８、Ｔｍ＝６１．７）
５’−ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ−３’
プライマーＮＬ−４（＝配列番号４）：
（Ｒｅｖｅｒｓｅ、１９塩基、ＭＷ＝５８６０、Ｔｍ＝６０．３）
５’−ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧ−３’
ＰＣＲ法で用いたこれらのプライマーの化学合成は、株式会社日本バイオサービスに委託した（ＤＮＡ合成：スモールスケール品）。
【０１７２】
ＰＣＲ反応には、［１］東洋紡株式会社製のキット「ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−（製品コード：Ｎｏ．ＫＯＤ−２０１）」ないしは［２］タカラバイオ株式会社製キット「ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（製品コード：ＲＲ００１Ａ）」を用いた。
【０１７３】
ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法の手順：
ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法には、東洋紡株式会社製のキット「ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−（製品コード：Ｎｏ．ＫＯＤ−２０１）」を用いた（注：以下、これをＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法と呼ぶ）。ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ反応液の調製は、ほぼ同キット付属の説明書中の「○一般的なＰＣＲ反応液量（ｔｏｔａｌ  ５０μｌ）」を参考に、たとえばＰＣＲ反応液２５μｌ分であれば、すなわち同キット付属の緩衝液（１０×ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  ｂｕｆｆｅｒ）２．５μｌ、同キット付属の核酸溶液（ｄＮＴＰ）２．５μｌ、同キット付属の２５ｍＭ硫酸マグネシウム溶液１μｌ、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−（＝１Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼ溶液）０．５μｌ、鋳型ＤＮＡとして用いる、分離株から調製（または抽出）した核酸成分（濃度は５００〜１０００μｇ／ｍｌ）０．５μｌ、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度）０．２５〜１．０μｌ、プライマーＮＬ−４（＝配列番号４）溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度）０．２５〜１．０μｌに、さらに「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水」を加えて、全量を２５μｌにする。つまり、ＰＣＲ反応液中のプライマーと、鋳型ＤＮＡとして用いる分離株由来の核酸成分の濃度を、同キット付属の説明書に記載されている濃度よりも高めに設定している。ＰＣＲ反応用のマイクロチューブ１本当たりの反応液量は２５μｌとした。
【０１７４】
Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の手順：
Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法には、タカラバイオ株式会社製キット「ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（製品コード：ＲＲ００１Ａ）」を用いた（注：以下、これをＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法と呼ぶ）。Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ反応液の調製は、ほぼ同キット付属の説明書中「○一般的なＰＣＲ反応液量（ｔｏｔａｌ  ５０μｌ）」を参考に、たとえばＰＣＲ反応液２５μｌ分であれば、すなわち同キット付属の緩衝液（１０×Ｂｕｆｆｅｒ）２．５μｌ、同キット付属の核酸溶液（ｄＮＴＰ）２μｌ、キット付属のＥｘ  Ｔａｑ（＝５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼ溶液）０．１２５μｌ、鋳型ＤＮＡとして用いる、分離株から調製（または抽出）した核酸成分（濃度は５００〜１０００μｇ／ｍｌ）０．５μｌ、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度）０．２５〜１．０μｌ、プライマーＮＬ−４（＝配列番号４）溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度）０．２５〜１．０μｌに、さらに「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水」を加えて、全量を２５μｌにする。つまり、ＰＣＲ反応液中のプライマーと、鋳型ＤＮＡとして用いる分離株由来の核酸成分の濃度を、同キット付属の説明書に記載されている濃度よりも高めに設定している。ＰＣＲ反応チューブ内での反応溶液量（＝マイクロチューブ１本当たりの反応溶液量）は２５μｌとした。
【０１７５】
ＰＣＲサイクラーは、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製の「ＭｙＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー」を用いた。ＰＣＲ法によるＤＮＡ合成反応は、［１］鋳型ＤＮＡの熱変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、［２］アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、［３］ＤＮＡポリメラーゼ反応の、３つの過程から構成される。ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法、Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法ともに、［１］鋳型ＤＮＡの熱変性温度は９４．０℃、［２］アニーリング温度は５２．０℃とし、ただし［３］ＤＮＡポリメラーゼ反応の温度はＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法では６８．０℃、またＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では７２．０℃とした。［１］〜［３］の反応の繰り返し回数は３６回とした。すなわち、実際のＰＣＲ反応条件は、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法は図１５．の（１）、Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法については図１５．の（３）の通りである（注：（１）ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法の［増幅条件］及び（３）Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の［増幅条件］での実施例、すなわち生じた増幅産物を、下記のアガロースゲル電気泳動法でアガロースゲル上に展開（後記）した際の様子を撮影した写真を、それぞれ、各［増幅条件］の下、すなわちＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法の実施例は図１５．の（２）、Ｅｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の実施例は図１５．の（４）に示した）。
【０１７６】
アガロースゲル電気泳動法の手順：
ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法やＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法による増幅産物の生成の有無及びその産物の鎖長の確認には、アガロースゲル電気泳動法を用いた。実際に用いた電気泳動装置は、株式会社アドバンス（ＡＤＶＡＮＣＥ）製サブマリン−タイプ電気泳動システム「Ｍｕｐｉｄ−２ｐｌｕｓ」である。ゲル電気泳動法の場合、用いるゲルのアガロース濃度を変えると、ＤＮＡ断片の分画能力（＝きれいに分画できるＤＮＡ断片の鎖長の大きさ）も変わる。０．７〜１．０％のアガロースゲルを用いるのが一般的だが、本試験３．で生じる増幅産物の鎖長は５００〜６００ｂｐ程度と小さいため、たとえば村松正實（編）の「［新臨床医のための分子医学シリーズ］よくわかる遺伝子工学  ―ベーシックな技術から臨床応用まで―（羊土社  （２０００））」のｐ２７（三嶋行雄（著））の「表１  アガロースゲルの濃度と分画に適したＤＮＡの大きさ」なども参考にして、１．５％アガロースゲルを用いた。
【０１７７】
１．５％アガロースゲルの調製：
電気泳動用のゲルは、１．５ｇのタカラバイオ株式会社製アガロースＬ０３「ＴａＫａＲａ」（製品コード：５００３）にＴＡＥ緩衝液（注：ＴＡＥ緩衝液は、５０×ＴＡＥ緩衝液（は、トリス（Ｔｒｉｓ）２４２ｇ、酢酸（Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）５７．１ｍｌ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２Ｈ２Ｏ））を蒸留水に溶かし、さらに蒸留水を加えて全量を１Ｌとした水溶液）を５０倍希釈したものである）を加えて、全量を１００ｍｌとし、これを市販の電子レンジで加熱して、アガロースをよく溶かしたうえで、上記の同電気泳動システム付属のゲルメーカーセット（注：成形型であるゲルメーカースタンド−Ｌ及びゲルトレイ−Ｓ、ゲルトレイ−Ｌ。ただし、コームについては、同セットの付属品ではなく、株式会社アドバンスの別売製品である「ミニゲル電気泳動システム≪ミューピッド≫コームセット（コーム２５）」を使用した）に流し込んで室温下で冷やして固めたもの（注：ゲルサイズは、ゲルトレイ−Ｓが５２ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｌ）、ゲルトレイ−Ｌが１０７ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｌ））を用いた。以下、これを１．５％アガロースゲルと呼ぶ。
【０１７８】
１．５％アガロースゲル電気泳動用マーカーの調製：
ゲル電気泳動時の分子量マーカーとしては、ニューイングランド・バイオラボ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ．）製「１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（製品コード：Ｎ３２３１Ｓ、濃度５００μｇ／ｍｌ×容量１００μｌ）」１本に対して、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水３００μｌ」と、１００μｌのタカラバイオ株式会社製１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（注：上記の制限酵素ＡｐａIの付属品）とを加えて、全量を５００μｌとし（注：マーカーの濃度は０．１μｇ／μｌとなる)、これを１レーン（＝アガロースゲル上の窪み（ウェル）１つ）当たり３．０μｌずつ流し込む（または載せる）形で用いた。以下、これを１．５％アガロースゲル電気泳動用マーカーと呼ぶ。
【０１７９】
ＰＣＲ反応後溶液の前処理及びゲル電気泳動処理：
上記のＰＣＲ反応後溶液などの試料は、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水３μｌ」及び上記の１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ１．５μｌと混合したうえで、これを「ＴＡＥ緩衝液を充たした上記のシステム（＝電気泳動層）」内に置いた１．５％アガロースゲル上の窪み（ウェル）に流し込み（または載せ）、３０分〜１時間程通電した。
【０１８０】
ゲルの染色法及び観察方法：
ゲル電気泳動終了後、アガロースゲルを電気泳動層内から取り出し、「Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．製の核酸染色剤「ＧｅｌＲｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ，１０，０００×ｉｎ  Ｗａｔｅｒ（製品コード：４１００３）」に蒸留水を加えて調製した５０００〜１００００倍希釈溶液２００〜３００ｍｌ」に漬け込み、室温下で３０〜１時間程度放置した（＝染色処理）。染色処理の済んだアガロースゲルを、アトー株式会社製ゲルイメージング「ＡＥ−６９３２ＧＸプリントグラフ」内の所定の位置に置いてＵＶ照射（波長：３１２ｎｍ）し、アガロースゲル（上の増幅産物）を観察し、写真を撮影した。ゲル上の増幅産物の鎖長は、上記の分子量マーカーに含まれる断片群との目視での相対的な移動度（＝ゲル上の位置）比較によって推定した。
【０１８１】
図１６．の（１）は青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．１−１−１株、Ｎｏ．１−１−４株、Ｎｏ．１−１−５株、Ｎｏ．１−１−６株、Ｎｏ．１−２−８株、Ｎｏ．１−２−１３株、Ｎｏ．１−２−１４株、Ｎｏ．１−２−１９株、図１６．の（２）は富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．５−１−１株、Ｎｏ．５−１−７株、Ｎｏ．５−１−１０株、Ｎｏ．５−１−１６株、Ｎｏ．５−２−２株、Ｎｏ．５−２−９株、Ｎｏ．５−２−１２株、Ｎｏ．５−２−１７株、図１６．の（３）は岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）及び麦味噌Ｄから分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．６−１−１−２株、Ｎｏ．６−１−１−５株、Ｎｏ．６−１−２−２５株、Ｎｏ．６−１−２−５０株、Ｎｏ．６−４−１−１０株、Ｎｏ．６−４−１−２０株、Ｎｏ．６−４−２−７株、Ｎｏ．６−４−２−１４株、図１６．の（４）は埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．７−１−２３株、Ｎｏ．７−１−６６株、Ｎｏ．７−１−８３株、Ｎｏ．７−１−８９株、Ｎｏ．７−２−１株、Ｎｏ．７−２−２株、Ｎｏ．７−２−６株、Ｎｏ．Ｎｏ．７−３−４２株の８株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとするＰＣＲ法で生じた増幅産物をゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【０１８２】
それぞれのゲルごとに、鎖長比較用に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物も同時に載せたが、図１６．の（４）の埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母株８株のうちの１株であるＮｏ．７−３−４２株を除く３１株の場合に生じた増幅産物は、目視ではこのＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物と同じ鎖長に見えた。
【０１８３】
なお、公開されているＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の全ゲノム情報によると、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）を用いたＰＣＲ法で増幅されるであろう、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）塩基配列部分は、染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上の３箇所、すなわち［１］８２１４６９番目のグアニン（Ｇ）から８２２０９２番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（６２４ｂｐ）と、［２］８３１３３７番目のグアニン（Ｇ）から８３１９６０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（６２４ｂｐ）、［３］８３８０４６番目のグアニン（Ｇ）から８３８６６９番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（６２４ｂｐ）であり、これら３箇所の塩基配列は完全に同一（＝１００％相同）である。
【０１８４】
得られた増幅産物の粗精製及び塩基配列解読（シークエンシング、またはシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））は、以下の手順で行なった。
【０１８５】
ＰＣＲ産物の調製：
増幅産物の粗精製は、以下の手順で行なった。まず、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法ないしはＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で調製した増幅産物を含むＰＣＲ反応液１５〜２０μｌを、１．５〜２．０ｍｌサイズの殺菌済みマイクロチューブに入れ換えたうえで、ＰＣＲ反応液の容量の、少なくとも２倍量以上の冷エタノールを加え、マイクロチューブを優しく反転させながらよく攪拌してから、−８０℃下で最低２時間以上置いた（＝エタノール沈殿）後、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０〜３０分間遠心分離処理を行い、上清（＝冷エタノール溶液）を丁寧に除去したうえで、このチューブを室温条件下で放置し、乾燥させる（＝乾燥処理）。本手順では、エタノール沈殿処理で一般的に用いられる、たとえば株式会社ニッポンジーン製の３Ｍ酢酸ナトリウム（３Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ（製品コード：３１６−９００８１））などは使わず、また冷エタノール量もたとえばＰＣＲ反応液の容量の３〜５倍といった、一般的な使用量である２倍よりも多めに用いると、ＰＣＲ反応液中のプライマーなどが沈殿物に混入しにくくなり、以下の塩基配列解読（シークエンシング）がスムーズに行なえる。乾燥処理後のチューブに、適当量（＝２０〜３０μｌ）のＴＥ溶液を流し込み、チューブの底に沈殿している分離株の核酸成分をＴＥ溶液に溶解させ、これを「ＰＣＲ産物」とした。
【０１８６】
ＰＣＲ法で生じた増幅産物から上記の手順で調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）には、上記のプライマーＮＬ−１（＝配列番号３）及びＮＬ−４（＝配列番号４）に加え、さらに解読用プライマーＮＬ−５（＝配列番号５）及びＮＬ−６（＝配列番号６）も用いた。用いた解読用プライマーＮＬ−５（＝配列番号５）及び解読用ＮＬ−６（＝配列番号６）の塩基配列は、下記の通りである。
解読用プライマーＮＬ−５（＝配列番号５）：
（２２塩基、ＭＷ＝６７１２、Ｔｍ＝６０．９）
５’−ＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣＡＴＡＣＣＴＣＡＧ−３’
解読用プライマーＮＬ−６（＝配列番号６）：
（２２塩基、ＭＷ＝６８０９、Ｔｍ＝６１．１）
５’−ＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＡＧＡＧ−３’
これらのプライマーの化学合成も、株式会社日本バイオサービスに委託した（ＤＮＡ合成：スモールスケール品）。
【０１８７】
ＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）は、株式会社バイオマトリックス研究所に委託した（注：ＤＮＡシーケンス受託解析のＡタイプ）。
【０１８８】
ＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）結果の、既知の塩基配列情報との照合（＝相同性検索）などの解析処理には、米国（立）バイオテクノロジー情報センター（または米国（立）生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）上に公開されている相同性検索プログラム「ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）のうちの、データベース上の既知の塩基配列情報の中から「問い合わせ（クエリー（ｑｕｅｒｙ））配列」との類似性が高いものだけを選択するための、つまり「塩基対塩基」用プログラムである「ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｌａｓｔ（Ｓｅａｔｃｈ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕｅｒｙ）」を用いた。ただし、上記のＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）結果のうち、「プライマーＮＬ−１（＝配列番号３（２４塩基））とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４（１９塩基））に相当する塩基配列部分を除いた残りの塩基配列部分（＝両プライマー間配列）」のみを、この相同性検索（ＢＬＡＳＴ）処理用の塩基配列データとして用いた。
【０１８９】
上記３２株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物のうち、１１株、すなわち青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母株であるＮｏ．１−１−４株、Ｎｏ．１−１−５株、Ｎｏ．１−１−６株、富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した耐塩性酵母株であるＮｏ．５−１−７株、岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）から分離した耐塩性酵母株であるＮｏ．６−１−１−２株及びＮｏ．６−１−１−５株、埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母株であるＮｏ．７−１−２３株、Ｎｏ．７−１−６６株、Ｎｏ．７−１−８３株、Ｎｏ．７−１−８９株、Ｎｏ．７−３−４２株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、上記の手順で容易に解読でき、うち８株、すなわちＮｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．７−１−２３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−６６株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８９株（生醤油Ｅ（埼玉））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）部分及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）部分を除いた塩基配列部分（５８１ｂｐ）はいずれも、［１］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））と完全に一致（＝１００％相同）しており（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、ゆえにこれら８株は現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉの、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称している２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ））を持つ株群に区分けされる株であると同定できた。
【０１９０】
１例として、この８株のうちの１株であるＮｏ．１−１−６株(米味噌Ａ（青森））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）を用いて解読（シークエンシング）した際の、実際のシークエンサーで読み取られた蛍光強度の波形図と変換（ベースコール）された塩基配列（図１７．）（注：変換（ベースコール）された塩基は、波形の真上に記されている。図中の「Ａ」はアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、「Ｔ」はチミン（Ｔｙｍｉｎｅ）、「Ｇ」はグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、「Ｃ」はシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）を、また「Ｎ」は２種類以上の塩基の波形が重なっていたり、あるいは蛍光強度が弱く、波形から塩基への変換（ベースコール）ができなかった部位、いわゆる「解読不能」を示している）と、（この解読結果を含む）すべての塩基配列解読（シークエンシング）結果をつなぎ合わせて作成した「Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物」の塩基配列のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）やプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）の配列の一部を含む塩基配列部分（＝配列番号７、図１８．）とを示す。図１７．及び図１８．（＝配列番号７）中の矢印(1)〜(6)及び矢印(8)〜(14)で示した「波形」部分（図１７．）と塩基への変換（ベースコール）処理後の塩基配列（＝配列番号７、図１８．）上の各塩基は、ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（果醪）））や、クリーミーケーキから分離されたＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）、蜂蜜から分離されたＩＦＯ０６８６株（＝ＮＩＳＬ３４５６株）などの株群が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）と、ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ２と仮称した、すなわち花から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）や醤油諸味から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株など、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）などの株群が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）との「塩基の一致しない部分（＝位置）」に相当し、これは図５．中の矢印に付けた番号とも一致しているが、図１７．の波形図では、いずれの矢印付きの部分（＝位置）も（単一の塩基を示す）単一の波形で構成されており、つまりきれいに塩基配列解読（シークエンシング）できている事が分かる。
【０１９１】
また、Ｎｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））及びＮｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））の２株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）部分及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）部分を除いた塩基配列部分（５８０ｂｐ）は両方ともに、［２］味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））や、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））とも完全に一致（＝１００％相同）しており（注：これらの相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、ゆえにこれら２株も現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉの、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称している２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ））を持つ株であると同定できた（注：なお、上記したＮＢＲＣでは、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））とほぼ一致（＝９９％以上相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）を持っておらず、この部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）との類似性が９９％に満たない、ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）のみを持つ株については、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと見做さず、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．に区分けしているようであり、そのルールに従うならば、Ｎｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））及びＮｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））もＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．に区分けすべき株となる）。
【０１９２】
１例として、この２株のうちの１株であるＮｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）やプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）の塩基配列の一部を含む塩基配列部分（＝配列番号８、図１９．）を示す。図１９．中の矢印(1)〜(5)、(7)及び矢印(9)〜(14)で示した「塩基」は、ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））や、クリーミーケーキから分離されたＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）や、蜂蜜から分離されたＩＦＯ０６８６株（＝ＮＩＳＬ３４５６株）などが持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）と、ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ２と仮称した、すなわち花から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）や醤油諸味から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株など、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）との「塩基配列の一致しない部分（＝位置）」に相当し、これは図５．中の矢印に付けた番号の位置と一致している。
【０１９３】
また、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））などの場合とは異なる鎖長の増幅産物が生じたＮｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））の場合の、その増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の、うちプライマーＮＬ−１（＝配列番号３）やプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）の配列の一部を含む塩基配列部分は、図２０．（＝配列番号９）の通りで、うちプライマーＮＬ−１（＝配列番号３）部分及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）部分を除いた塩基配列部分（５２１ｂｐ）は、たとえば味噌（ｍｉｓｏ  ｐａｓｔｅ）から分離されたＣａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｍｉｓｏ８３株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ１９６２１１．１、ＧＩ：８８７５９１７７（５２１ｂｐ）（Ｙ．Ｓｕｅｚａｗａ，Ｉ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｉｎｏｕｅ，Ｎ．Ｇｏｈｄａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０（２），３４８−３５４  （２００６）））など、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列と完全に一致（＝１００％相同）しており（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、ゆえにこのＮｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））はＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓであると同定できた。
【０１９４】
しかしながら、分離株３２株の中から、上記の、これら１１株を除いた残りの２１株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）されたＰＣＲ産物については、上記の手順による、すなわちプライマーＮＬ−１（＝配列番号３）及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）、さらにはプライマーＮＬ−５（＝配列番号５）やプライマーＮＬ−６（＝配列番号６）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）処理でも、その塩基配列すべてを確定する事ができなかった。
【０１９５】
１例として、この「解読し切れなかった２１株」のうちの１株であるＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の場合のＰＣＲ産物の、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）の際の、シークエンサーで読み取られた蛍光強度の波形図と変換（ベースコール）された塩基配列を添付した（図２１．）（注：変換（ベースコール）された塩基は、波形の真上に記されている）。図中の「Ａ」はアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、「Ｔ」はチミン（Ｔｙｍｉｎｅ）、「Ｇ」はグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、「Ｃ」はシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）を示しており、「Ｎ」は２種類以上の塩基の波形が重なっていたり、あるいは蛍光強度が弱く、波形から塩基への変換（＝ベースコール）ができなかった部位、いわゆる「解読不能」を示している。図２１．中の矢印(1)〜(10)で示した「波形」部分は、［１］ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））やクリーミーケーキから分離されたＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）、蜂蜜から分離されたＩＦＯ０６８６株（＝ＮＩＳＬ３４５６株）などの株群が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）（＝配列番号１）と、［２］ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ２と仮称した、すなわち花から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）や醤油諸味から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株など、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域の一部を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）（＝配列番号２）との「塩基の一致しない部分（＝位置）」に相当し、それゆえにこれは図５．中の矢印に付けた番号とも一致している。その事を踏まえた上で図２１．を見てみると、このＰＣＲ産物の塩基配列がきちんと解読できないのは、図２１．中の矢印(1)〜(10)で示した、［１］ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））やクリーミーケーキから分離されたＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）、蜂蜜から分離されたＩＦＯ０６８６株（＝ＮＩＳＬ３４５６株）などの株群が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）（＝配列番号１）と、［２］ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ２と仮称した、すなわち花から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）や醤油諸味から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株など、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）（＝配列番号２）との「塩基の一致しない部分（＝位置）」に複数（２種類）の塩基の存在を示す複数（２種類）の波形が生じているためである事に気づく。つまり、この結果は、このＰＣＲ産物の中に、［１］ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（果醪）））や、クリーミーケーキから分離されたＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）、蜂蜜から分離されたＩＦＯ０６８６株（＝ＮＩＳＬ３４５６株）などの株群が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）（＝配列番号１）と完全に一致する（＝１００％相同な）、あるいは類似性がきわめて高い塩基配列のＰＣＲ産物と、［２］ＳｕｅｚａｗａらのグループがＴｙｐｅ２と仮称した、すなわち花から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）や醤油諸味から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株など、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域の一部を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）（＝配列番号２）と完全に一致する（＝１００％相同な）、あるいは類似性が高い塩基配列のＰＣＲ産物とが混在している可能性を暗示するものである。
【０１９６】
なお、この「（恐らくは複数の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列の混在によるものと見られる）２種類の塩基の混在による塩基配列の部分的な解読不能」の原因が、これら２１株のシングルコロニー化処理の不全によるものでない事は、再度シングルコロニー処理した２１株を用いた再試験でも、この「解読不能」の状態が改善されなかった事から確認済みである（データ省略）。
【０１９７】
細胞内での蛋白質・ペプチド合成の役割を担う細胞（内）小器官（オルガネラ）であるリボソームは、細胞内に多数存在し、しかもｒＲＮＡはリボソームの質量の大部分を占める主要な構成成分であるために、細胞内では多量のｒＲＮＡの合成と供給とが必要となる。実際に、酵母などの真核生物の場合や、また原核生物の場合でも、細胞内での転写産物、すなわち全ＲＮＡ量の約８０〜９０％をｒＲＮＡが占めている（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ（著）／菊池韶彦・榊佳之・水野猛・伊庭英夫・紅順子（訳）：エッセンシャル  遺伝子（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＧＥＮＥ（２００６））、東京化学同人、ｐ８５  （２００７））。そのため、ｒＲＮＡの遺伝子（ｒＤＮＡ）は、（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））を含む）多くの生物種では、ゲノム上に多コピーで保存されており（相同組換えによる部分配列の欠失やコピー数の低下を防ぐ独自のシステムも持っており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｌａｂｓ／ＣｙｔｏＧｅｎ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｆｉｇ１．ｈｔｍｌ（国立遺伝学研究所・小林研究室）））、このような進化的起源が同一のコピー遺伝子群（多重遺伝子族）は１つの遺伝子ファミリーとして協調進化（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）する（＝コピー遺伝子のうちのどれかに変異が入ると、それが組み換えによって他のコピー遺伝子にも伝搬し、やがてコピー遺伝子群全部に同じ変異が入るために、遺伝子群が組となって進化していく）ために、原則的にそれらの塩基配列はすべて同じになるとされるものの（久米田裕子：日食微誌（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２５（２）、６６−６９  （２００８）））、なかには塩基配列の異なる（＝相同ではない）、複数のｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）を持つ微生物がいる事も知られている（Ｒ．Ｕ．Ｏｎｙｅｎｗｏｋｅ，Ｙ．−Ｊ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ，Ｂ．Ｋ．Ａｈｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗｉｅｇｅｌ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６（６），１３９１−１３９５  （２００６）、Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｈ．−Ｌ．Ｃｕｉ，Ｐ．−Ｊ．Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｓ．−Ｊ．Ｌｉｕ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７（１），１０３−１０６  （２００７））。
【０１９８】
このような複数のｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）を持つ微生物の、そ（れら）のｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）（を鋳型とするＰＣＲ法で調製した増幅産物）の塩基配列をそのまま上記の方法で解読しようとすると、当然の事ながら、その塩基配列解読（シークエンシング）結果には「複数の塩基の検出」を示す蛍光強度の波形が出現するために「解読不能（Ｎ）」となる塩基部分が混じる事になる。そのような場合には、複数の増幅産物を、（１）クローンライブラリ（ー）（ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）法（下記）などを使って区分けし、各々の増幅産物の塩基配列を解読する場合と、また（２）その解読結果の、「複数の塩基の検出」を示す蛍光強度の波形が生じた（ために「解読不能」とされた）塩基部分については、これらの波形から目視で複数の塩基を読み取り、それに相当する２〜３種類の混合塩基の略号を「手入力（修正）」して塩基配列を完成させる場合とがある。そのため、米国（立）バイオテクノロジー情報センター（または米国（立）生物工学情報センター（ＮＣＢＩ））の「ＧｅｎＢａｎｋ」、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ））の「ＥＮＡ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ）」、日本の国立遺伝学研究所の「ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）」が協力して構築している国際塩基配列データベース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（ＩＮＳＤ）には、「Ａ（アデニン）」、「Ｃ（シトシン）」、「Ｇ（グアニン）」、「Ｔ（チミン）」の計４種類の塩基（略号）の他に、さらに「Ｋ（グアニン、またはチミン）」、「Ｓ（グアニン、またはシトシン）」、「Ｍ（アデニン、またはシトシン）」、「Ｒ（アデニン、またはグアニン）」、「Ｗ（アデニン、またはチミン）」、「Ｙ（シトシン、またはチミン）」、「Ｄ（アデニン、またはグアニン、またはチミン）」、「Ｈ（アデニン、またはシトシン、またはチミン）」などの２〜３種類の混合塩基の略号も使った様式の塩基配列情報も登録されている。
【０１９９】
そこで、たとえば、上記の「Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）の際の、シークエンサーで読み取られた蛍光強度の波形図と変換（ベースコール）された塩基配列（図２１．）」中の、矢印(1)〜(10)で示した「２種類の塩基の検出」を示す蛍光強度の波形が出現した（ために「解読不能（Ｎ）」となっている）塩基部分については、これらの波形から目視で２種類の塩基を読み取り、（たとえば図２１．中の矢印(1)及び(2)の位置にはアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の波形が出ているので（Ｎを）「Ｒ」に、矢印(3)の位置にはシトシン（Ｃ）とチミン（Ｔ）の波形が出ているので（Ｎを）「Ｙ」に、矢印(4)の位置にはアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の波形が出ているので（Ｎを）「Ｗ」にといった具合に）それに相当する（上記の）２〜３種類の混合塩基の略号を「手入力（修正）」して塩基配列を完成させ、この「修正後配列」を「問い合わせ（クエリー）配列」とする相同性検索を行なってみたところ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ）ＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６１株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５５４ｂｐ）（ＦＲ６９０８６２．１、ＧＩ：３０７０７５８７４）との類似性がきわめて高い（＝相違が１％未満）との結果を得る事ができた。
【０２００】
同様に、２１株の塩基配列解読（シークエンシング）結果の「手入力修正」した塩基配列を問い合わせ（クエリー）配列とする相同性検索を行なってみたところ、Ｎｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−１６株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−４−１−１０（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−２−１株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−２株（生醤油Ｅ（埼玉））などの「手入力修正」した塩基配列は、このＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６１株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分配列（ＦＲ６９０８６２．１、ＧＩ：３０７０７５８７４）と、またＮｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））やＮｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．７−２−６株（生醤油Ｅ（埼玉））などの「手入力修正」した塩基配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ）ＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６６株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分配列（５５４ｂｐ）（ＦＲ６９０８６１．２、ＧＩ：３０７６１１８９５）（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））との類似性がきわめて高い（＝相違が１％未満）との結果を得る事ができた。
【０２０１】
そこで、このような２１株の「解読し切れなかったＰＣＲ産物」については、（１）クローンライブラリー法と呼ばれる以下の手順（中村和憲・関口勇地（著）：微生物相解析技術  ―目に見えない微生物を遺伝子で解析する―、米田出版  （２００９）、日本生態学会（大園享司・鏡味麻衣子）（編）：［シリーズ  現代の生態学１１］微生物の生態学、共立出版  （２０１１））に従って、すなわちＰＣＲ産物をいったんプラスミドに連結して、これを大腸菌株の細胞内に導入し（＝形質転換処理）、得られた形質転換株（クローン（ｃｌｏｎｅ））をシングルコロニー化処理（する事で、「プラスミドに連結した状態のＰＣＲ産物」を精製）したうえで、その細胞内から再びプラスミドを回収し、この回収したプラスミド上のＰＣＲ産物部分の塩基配列を解読してみた。
【０２０２】
塩基配列解読（シークエンシング）用のＰＣＲ産物は、上記のＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で調製したものを、またこれを連結させるプラスミドとしては、タカラバイオ株式会社製のプラスミド「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）（製品コード：Ｎｏ．３２７１）」を用いた。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、末端核酸付加酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ））としての活性も持つため、上記のＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で調製した増幅産物の３’−末端にはアデニン（ｄＡ）が付いている（工藤俊章・大熊盛也（監修）：難培養微生物の利用技術、ｐ３３−４４（本郷裕一（著））、シーエムシー出版  （２０１０）、野島博（著）：遺伝子工学  ―基礎から応用まで―、東京化学同人  （２０１３））。「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）（製品コード：Ｎｏ．３２７１）」は、ＴＡクローニング（ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ）用のプラスミドである。
【０２０３】
ＰＣＲ産物の、プラスミド「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）」上のＴ−クローニングサイトへの連結には、タカラバイオ株式会社製のキット「ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（製品コード：６０２３）」を用いた。連結（ライゲーション）反応時の「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）」、ＰＣＲ産物、殺菌済み蒸留水、「ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞」の溶液量及び、「連結（ライゲーション）」作業手順は、製品「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）」付属の説明書中の「○使用例」の通りである。
【０２０４】
ＰＣＲ産物を連結したＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）を導入する宿主としては、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）製の大腸菌株（の細胞）「ＳＵＲＥ２  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（製品コード：２００１５２）」を用いた。同大腸菌株へのプラスミドの導入（＝形質転換処理）手順は、同大腸菌株に添付されている説明書中の「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」に記されている通りである。
【０２０５】
Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天の培地組成：
２．５％（Ｗ／Ｖ）ルリア基礎培地（粉末）（ＬＵＲＩＡ  ＢＲＯＴＨ  ＢＡＳＥ（ＭＩＬＬＥＲ’Ｓ  ＬＢ  ＢＲＯＴＨ  ＢＡＳＥ（インビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、製品コード：１２７９５−０２７）））、０．０１％（Ｗ／Ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−Ｇａｌ）（和光純薬工業株式会社製、製品コード：０２９−０７８５３））、０．０３％（Ｗ／Ｖ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ），ｄｉｏｘａｎｅ  ｆｒｅｅ（ナカライテスク株式会社製、製品コード：１９７４２−８１））、０．０００００１％（Ｗ／Ｖ）アンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社製、製品コード：０１２−２３３０３）、２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（和光純薬工業株式会社製、製品コード：０１０−１５８１５）、ｐＨ＝６．８〜７．２（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。
【０２０６】
Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天の調製法：
２．５ｇのルリア基礎培地（粉末）、２．０ｇ寒天を蒸留水に溶かし、これに１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝６．８〜７．２に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を７５ｍｌにする。これを溶液Ａ（７５ｍｌ）とする。次に、０．１３６ｇの燐酸二水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＫＨ２ＰＯ４））を蒸留水に溶かして全量を１００ｍｌとした、すなわち１０ｍＭ燐酸二水素カリウム水溶液と、０．１７４ｇの燐酸水素二カリウム（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｋ２ＨＰＯ４））を蒸留水に溶かして全量を１００ｍｌとした、すなわち１０ｍＭ燐酸水素二カリウム水溶液との両者を、その混合液のｐＨをｐＨ計で測定しながら混合して、１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６．８〜７．２）を調製し、この緩衝液２０ｍｌに０．０１ｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を加え、「懸濁液」を調製する（注：Ｘ−Ｇａｌは水には溶けない）。これを溶液Ｂ（２０ｍｌ）とする。また、０．０３ｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を４ｍｌの蒸留水に溶かし、これを溶液Ｃとする。さらに１０ｍｇのアンピシリンナトリウムを１ｍｌの蒸留水に溶かし、これを溶液Ｄとする。溶液Ａ及び溶液Ｂは、高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌し、また溶液Ｃ及び溶液Ｄは、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、ワットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ）株式会社製「シリンジ・フィルター  ２５ｍｍＧＤ／Ｘ  Ｓｔｅｒｉｌｅ（製品コード：６９００−２５０４）」を用いる除菌濾過処理を施して無菌化する。高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で殺菌した後の溶液Ａ及び溶液Ｂを、熱いうちに、クリーンベンチ内などの無菌条件下で混合し、これにさらに溶液Ｃを加え、よく混合する。この溶液Ａ／溶液Ｂ／溶液Ｃの混合液９．９ｍｌを、冷えて固まらないうちに、あらかじめ溶液Ｄ０．１ｍｌを流し込んでおいた殺菌済みシャーレに流し込んで、シャーレを揺さぶりながら、両溶液をよく混合したうえで、室温下で冷やして固める。
【０２０７】
形質転換処理直後の大腸菌株を含む溶液を、上記のＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上に、殺菌済みのスパーテルなどを使って塗抹し、これを３７℃に設定した培養器（または恒温器）内に置いて、２〜３日間静置培養する。培養終了後の同寒天上に生じた菌集落（コロニー）のうち、「極端に」青い菌集落（コロニー）は除き（注：詳細については後記する）、残りの菌集落（コロニー）の中から５０〜６０コロニーを無作為に選択し、これらを殺菌済みの白金線や爪楊枝などを使って、新しいＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上に植え継ぎ、これを２〜３回繰り返して、シングルコロニー化処理し（て、形質転換株（クローン）を得）た。
【０２０８】
アンピシリンナトリウム加ＬＢ液体培地の培地組成：
２．５％（Ｗ／Ｖ）ルリア基礎培地（粉末）（ＬＵＲＩＡ  ＢＲＯＴＨ  ＢＡＳＥ（ＭＩＬＬＥＲ’Ｓ  ＬＢ  ＢＲＯＴＨ  ＢＡＳＥ（インビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製、製品コード：１２７９５−０２７）））、０．０００００１％（Ｗ／Ｖ）アンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社製、製品コード：０１２−２３３０３）、ｐＨ無調整。
【０２０９】
アンピシリンナトリウム加ＬＢ液体培地の調製法：
２．５ｇのルリア基礎培地（粉末）を蒸留水に溶かし、全量を９９ｍｌにする。これを溶液Ａとする。溶液Ａは、１．９８ｍｌずつ試験管に分注し、試験管の口を綿栓で塞いだ状態で、高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した後、室温下で冷やした。次に、１０ｍｇのアンピシリンナトリウムを１ｍｌの蒸留水に溶かし、これを溶液Ｂとする。溶液Ｂは、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、ワットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ）株式会社製「シリンジ・フィルター  ２５ｍｍＧＤ／Ｘ  Ｓｔｅｒｉｌｅ（製品コード：６９００−２５０４）」を用いる除菌濾過処理を施して無菌化し、これを試験管１本（当たり２ｍｌの溶液Ａ）に対して２０μｌ（＝０．０２ｍｌ）加えた。
【０２１０】
シングルコロニー化処理済みの形質転換株（クローン）の培養と集菌：
シングルコロニー化処理済みの形質転換株（クローン）は、上記のアンピシリンナトリウム加ＬＢ液体培地に接種し、３７℃、１８時間振とう培養（１４０ｒｐｍ．）した。培養終了後の培養液２ｍｌを、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、３０分間殺菌した、１．５〜２ｍｌ容量のマイクロチューブ」に流し込み、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を用いて、４℃条件下で、３０００ｒｐｍ、１〜２分間遠心分離処理し、遠心処理後に上清（＝液体培地）を丁寧に除去し、沈殿物（＝形質転換株（クローン）の細胞）を得た。
【０２１１】
形質転換株（クローン）からのプラスミドの回収：
得られた沈殿物（＝形質転換株（クローン）の細胞）からのプラスミドの回収には、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）株式会社製のキット「ＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（製品コード：２７４０５）」を用いた。作業手順は、同キット付属の「ＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」中のｐ１４−１５「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」に記されている通りである。
【０２１２】
アガロースゲル電気泳動法の手順：
形質転換株（クローン）の細胞内から回収したプラスミドの有無及びその鎖長の確認には、アガロースゲル電気泳動法を用いた。電気泳動装置は、上記の通りである。ゲルは、一般的によく用いられる０．７％アガロースゲルを用いた。
【０２１３】
０．７％アガロースゲルの調製法：
電気泳動用のゲルは、０．７ｇのタカラバイオ株式会社製「アガロースＬ０３「ＴａＫａＲａ」（製品コード：５００３）」にＴＡＥ緩衝液を加えて、全量を１００ｍｌとし、これを市販の電子レンジで加熱して、アガロースをよく溶かしたうえで、上記の同電気泳動システム付属のゲルメーカーセット（注：成形型であるゲルメーカースタンド−Ｌ及びゲルトレイ−Ｓ、ゲルトレイ−Ｌ。ただし、コームについては、同セットの付属品ではなく、株式会社アドバンスの別売製品である「ミニゲル電気泳動システム≪ミューピッド≫コームセット（コーム２５）」を使用した）に流し込んで、室温下で冷やして固めたものを用いた（注：ゲルサイズは、ゲルトレイ−Ｓが５２ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｌ）、ゲルトレイ−Ｌが１０７ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｌ））。
【０２１４】
０．７％アガロースゲル電気泳動用マーカーの調製：
また、ゲル電気泳動時の分子量マーカーとしては、ニューイングランド・バイオラボ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ．）製「１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（製品コード：Ｎ３２３２Ｓ、濃度５００μｇ／ｍｌ×容量２００μｌ）」を用いた。１本に対して、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した、２００μｌの蒸留水」及び１００μｌのタカラバイオ株式会社製１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（注：制限酵素ＡｐａI（下記）の付属品）を加えて、全量を５００μｌとし（注：マーカーの濃度は０．２μｇ／μｌとなる)、これを１レーン（＝アガロースゲル上の窪み（ウェル）１つ）当たり１．５μｌずつ載せる（または注ぎ込む）形で用いた。
【０２１５】
ゲル電気泳動法に関する、その他（＝サンプルの前処理、ゲル電気泳動処理、ゲルの染色法及び観察法）の手順は上記の通りである。
【０２１６】
１例として、青森県産米味噌Ａから分離したＮｏ．１−１−１株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物を連結させたＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）の導入処理で得られた、アンピシリン耐性を示す形質転換株（クローン）群５３株（＝ｅ−１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））〜ｅ−５３株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２）））のうちの１０株などの、Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上での生育の様子を撮影した写真（図２２．の（１））と、それらの形質転換株（クローン）から上記の手順で回収したプラスミドのゲル電気泳動写真を示す（図２２．の（２））。Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）は、大腸菌の形質転換株（クローン）作出の際に非常によく用いられるプラスミドｐＵＣ１９をベースに作製されたものと見られ、挿入断片の連結部位の違い、すなわちプラスミドｐＵＣ１９におけるマルチクローニングサイトがＴ−クローニングサイトにかわっている点を除けば、それ以外の塩基配列部分はプラスミドｐＵＣ１９と完全に同じである。そのため、Ｔ−クローニングサイトに「Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を増幅するためのＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物」を連結したプラスミドＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）を大腸菌ＳＵＲＥ２株の細胞内に導入した場合に得られる形質転換株（クローン）も、プラスミドｐＵＣ１９を用いた場合と同様、β−ガラクトシダーゼ陰性を示すアンピシリン耐性株となるはずであり、それゆえにＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上に出現する白色の菌集落（コロニー）のみを選択（＝青／白選択、またはブルー／ホワイト選択）し、その細胞内からプラスミドを回収し、同プラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっているＰＣＲ産物の塩基配列を解読するという手順を採るのが正しいはずである（田村隆明・村松正實（著）：基礎分子生物学（第３版）、ｐ１７１−１７２、東京化学同人  （２００７））。
【０２１７】
しかしながら、今回の試験の前に予め行なった予備試験の際に、Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で比較的青っぽい菌集落（コロニー）を形成した形質転換株（クローン）の細胞内からも、高い頻度でＰＣＲ産物の連結したプラスミドが見出される事を確認していた。
【０２１８】
１例として、図２２．の（１）及び（２）を示す。図２２．の（１）の写真中の形質転換株（クローン）「(1)β-ガラクトシダーゼ陽性株（ｐＵＣ１９）」は、プラスミドｐＵＣ１９の導入処理で得られたβ-ガラクトシダーゼ陽性を示すアンピシリン耐性株であり、それゆえにＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で培養すると、β-ガラクトシダーゼ陽性を示す青い菌集落（コロニー）を形成する。また、形質転換株（クローン）(2)〜(11)は、上記の手順通りに、Ｔ−クローニングサイトに「Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を増幅するためのＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物」を連結したプラスミドＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）を大腸菌の細胞内に導入した場合に得られた形質転換株（クローン）群のうちの１０株であるが、これらの形質転換株（クローン）のうち、「(2)β−ガラクトシダーゼ陽性株（ｐＭＤ１９’）」は、Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で培養した際に（β−ガラクトシダーゼ陽性を示す）青い菌集落（コロニー）を形成する株であり、同株の細胞内から回収したプラスミドの鎖長は、図２２．の（２）のゲル写真の通り、プラスミドｐＵＣ１９の導入処理で得られたβ-ガラクトシダーゼ陽性／アンピシリン耐性を示す形質転換株（クローン）「(1)β-ガラクトシダーゼ陽性株（ｐＵＣ１９’）」の細胞内から回収したプラスミド（ｐＵＣ１９）の鎖長とほぼ同じで、恐らくはＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）がセルフライゲーション化したもの（ｐＭＤ１９’）と見られる。これら、β−ガラクトシダーゼ陽性の形質転換株（クローン）(1)及び形質転換株（クローン）(2)が青い菌集落（コロニー）を形成するＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で培養した際に（β-ガラクトシダーゼ陰性を示す）白い菌集落（コロニー）を形成した形質転換株（クローン）７株、すなわち(3)ｅ−８株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１））、(4)ｅ−９株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−２））、(5)ｅ−１７株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３）、(6)ｅ−２３株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））、(7)ｅ−２４株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−４））、(10)ｅ−１株（１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））、(11)ｅ−１１株（１−１−１（Ｔｙｐｅ２−３））の細胞内から回収したプラスミドの鎖長は、上記の形質転換株（クローン）「(2)β−ガラクトシダーゼ陽性株（ｐＭＤ１９’）」の細胞内から回収したプラスミド（ｐＭＤ１９’）よりも明らかに大きく、それゆえに「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）上のＴ−クローニングサイトにＰＣＲ産物が連結したもの」だと判別できた。
【０２１９】
ただし、これら、β−ガラクトシダーゼ陽性の形質転換株（クローン）(1)及び形質転換株（クローン）(2)が青い菌集落（コロニー）を形成するＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で培養した際に、β-ガラクトシダーゼ擬陽性（または疑陽性）を示す、すなわち図２２．の（１）の写真のような、β−ガラクトシダーゼ陽性の形質転換株（クローン）よりも少し淡い色調の、「青っぽい菌集落（コロニー）」を形成した形質転換株（クローン）２株、すなわち(8)ｅ−６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））及び(9)ｅ−１２株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））の細胞内から回収したプラスミドの鎖長も、図２２．の（２）のゲル写真の通り、上記の形質転換株（クローン）「(2)β−ガラクトシダーゼ陽性株（ｐＭＤ１９’）」の細胞内から回収したプラスミド（ｐＭＤ１９’）よりも明らかに大きく、しかもＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で培養した際に（β-ガラクトシダーゼ陰性を示す）白い菌集落（コロニー）を形成した形質転換株（クローン）７株、すなわち(3)ｅ−８株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１））、(4)ｅ−９株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−２））、(5)ｅ−１７株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３）、(6)ｅ−２３株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））、(7)ｅ−２４株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−４））、(10)ｅ−１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））、(11)ｅ−１１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−３））の細胞内から回収したプラスミドと、目視では同じ鎖長に見え、つまり同プラスミド上のＴ−クローニングサイトにもＰＣＲ産物が連結されている事が判明した。そこで、本試験では、上記の形質転換処理で得られる、たとえば上記の８株のような、「白い菌集落（コロニー）を形成した形質転換株（クローン）」だけでなく、さらにこのような「Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上で培養した際にβ-ガラクトシダーゼ擬陽性（または疑陽性）を示す、青っぽい菌集落（コロニー）を形成した形質転換株（クローン）」も試験対象と見做し、すべてシングルコロニー化処理したうえで、それらの株の細胞内からプラスミドを回収した。
【０２２０】
上記の手順で選択した形質転換株（クローン）の細胞内から回収したこれらのプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっているのはＰＣＲ産物であり、その塩基配列解読（シークエンシング）には上記のプライマーＮＬ−１（＝配列番号３）やプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）、さらにはプライマーＮＬ−５（＝配列番号５）やプライマーＮＬ−６（＝配列番号６）を用いた。この塩基配列解読（シークエンシング）も、株式会社バイオマトリックス研究所に委託した（注：ＤＮＡシーケンス受託解析のＡタイプ）。
【０２２１】
塩基配列解読（シークエンシング）結果の解析処理、すなわち既知の塩基配列情報との照合などは、上記の手順通りに行なった。
【０２２２】
図２３．〜２９．（＝配列番号１０〜１６）は、図２２．の（１）の形質転換株（クローン）のうちの９株、すなわち(3)ｅ−８株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１））、(4)ｅ−９株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−２））、(5)ｅ−１７株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））及び(6)ｅ−２３株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））、(7)ｅ−２４株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−４））、(8)ｅ−６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））及び(9)ｅ−１２株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））、(10)ｅ−１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））、(11)ｅ−１１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−３））の細胞内から回収したプラスミド（のゲル電気泳動写真は図２２．の（２））の、また図３０．（＝配列番号１７）は同様に上記の手順で作出した形質転換株（クローン）ｅ−３６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−４））の細胞内から回収したプラスミド（注：ゲル写真は省略）の、Ｔ−クローニングサイトに連結されているＰＣＲ産物の、上記手順による塩基配列解読（シークエンシング）結果をまとめたものである。図２３．〜３０．（＝配列番号１０〜１７）の塩基配列中の先頭３塩基「アデニン−チミン−チミン（ＡＴＴ）」と末尾３塩基「アデニン−アデニン−チミン（ＡＴＴ）」は、プラスミド「Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）」上のＴ−クローニングサイト上の部分配列であり、それらに隣接している「矢印付きの塩基配列部分」はＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で用いたプライマーＮＬ−１（＝配列番号３（２４塩基））及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４（１９塩基））を示している。
【０２２３】
これらの形質転換株（クローン）から得られたプラスミド上の、Ｔ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列は、図２３．〜３０．に記した計８種類で、うち形質転換株（クローン）(3)ｅ−８株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１））の細胞内から回収したプラスミドｅ−８（Ｎｏ．１−１−１）上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１０、図２３．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８１ｂｐ）は、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））と完全に一致（＝１００％相同）しており（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、かつＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））とは２．４〜２．５％異なっていた。
【０２２４】
また、形質転換株（クローン）(8)ｅ−６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））及び形質転換株（クローン）(9)ｅ−１２株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））の細胞内から回収したプラスミドｅ−６（Ｎｏ．１−１−１）及びプラスミドｅ−１２（Ｎｏ．１−１−１）上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１４、図２７．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８０ｂｐ）はいずれも、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）しており（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、かつＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））とは２．４％異なっていた。
【０２２５】
上記の結果から、このＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））は、少なくとも、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列と完全に一致（＝１００％相同）する塩基配列と、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した、すなわちＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域の一部を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）する塩基配列との両方を持っている事が判明した。
【０２２６】
さらに、形質転換株（クローン）(4)ｅ−９株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−２））の細胞内から回収したプラスミドｅ−９（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−２））上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１１、図２４．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８１ｂｐ）は、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））とは、［１］図２４．（＝配列番号１１）中の矢印(1)が指す塩基の位置、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上の８２１９７２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［２］図２４．（＝配列番号１１）中の矢印(2)が指す塩基の位置、すなわち８２１８７５番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［３］図２４．（＝配列番号１１）中の矢印(3)が指す塩基の位置、すなわち８２１８７０番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている、［４］図２４．（＝配列番号１１）中の矢印(4)が指す塩基の位置、すなわち８２１８３３番目のチミン（Ｔ）がアデニン（Ａ）になっている、［５］図２４．（＝配列番号１１）中の矢印(14)が指す塩基の位置、すなわち８２１５６１番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっているという計５塩基の相違点を除けば、残り５７６塩基については一致していた（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。この塩基配列を、以下、Ｔｙｐｅ１−２と呼ぶ。
【０２２７】
形質転換株（クローン）(5)ｅ−１７株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））及び形質転換株（クローン）(6)ｅ−２３株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））の細胞内から回収したプラスミドｅ−１７（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））及びプラスミドｅ−２３（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１２、図２５．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８１ｂｐ）はいずれも、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））とは、［１］図２５．（＝配列番号１２）中の矢印(1)が指す塩基の位置、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上の８２１９７２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［２］図２５．（＝配列番号１２）中の矢印(2)が指す塩基の位置、すなわち８２１８７５番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［３］図２５．（＝配列番号１２）中の矢印(3)が指す塩基の位置、すなわち８２１８７０番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている、［４］図２５．（＝配列番号１２）中の矢印(4)が指す塩基の位置、すなわち８２１８３３番目のチミン（Ｔ）がアデニン（Ａ）になっているという計４塩基の相違点を除けば、残り５７７塩基については一致していた（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。この塩基配列を、以下、Ｔｙｐｅ１−３と呼ぶ。
【０２２８】
形質転換株（クローン）(7)ｅ−２４株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−４））の細胞内から回収したプラスミドｅ−２４（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−４））上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１３、図２６．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８１ｂｐ）は、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））とは、［１］図２６．（＝配列番号１３）中の矢印(1)が指す塩基の位置、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上の８２１９７２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［２］図２６．（＝配列番号１３）中の矢印（ａ）が指す塩基の位置、すなわち８２１８９２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［３］図２６．（＝配列番号１３）中の矢印（ｂ）が指す塩基の位置、すなわち８２１８１４番目のアデニン（Ａ）がない（または欠けている（・））という計３塩基の相違点を除けば、残り５７８塩基については一致していた（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。この塩基配列を、以下、Ｔｙｐｅ１−４と呼ぶ。
【０２２９】
また、形質転換株（クローン）(10)ｅ−１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））の細胞内から回収したプラスミドｅ−１（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１５、図２８．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８０ｂｐ）は、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域の一部を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））とは、［１］図２８．（＝配列番号１５）中の矢印(1)が指す塩基の位置、すなわちＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域の一部を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））上の８９番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている、［２］図２８．（＝配列番号１５）中の矢印(2)が指す塩基の位置、すなわち１８６番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている、［３］図２８．（＝配列番号１５）中の矢印(3)が指す塩基の位置、すなわち１９１番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）になっている、［４］図２８．（＝配列番号１５）中の矢印(4)が指す塩基の位置、すなわち２２８番目のアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）になっているという計４塩基の相違点を除けば、残り５７６塩基については一致していた（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。この塩基配列を、以下、Ｔｙｐｅ２−２と呼ぶ。
【０２３０】
形質転換株（クローン）(11)ｅ−１１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−３））の細胞内から回収したプラスミドｅ−１１（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−３））上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１６、図２９．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８０ｂｐ）は、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））とは、［１］図２９．（＝配列番号１６）中の矢印(5)が指す塩基の位置、すなわちＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））上の４５０番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）になっているという１塩基の相違点を除けば、残り５７９塩基については一致していた（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。この塩基配列を、以下、Ｔｙｐｅ２−３と呼ぶ。
【０２３１】
形質転換株（クローン）ｅ−３６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−４））の細胞内から回収したプラスミドｅ−３６（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−４））上のＴ−クローニングサイトに連結していたＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１７、図３０．）のうち、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間にある部分配列（５８０ｂｐ）も、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した株群が持つ塩基配列、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））とは、［１］図３０．（＝配列番号１７）中の矢印(1)が指す塩基の位置、すなわちＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））上の８９番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている、［２］図３０．（＝配列番号１７）中の矢印（ｃ）が指す塩基の位置、すなわち１８７番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）になっているという計２塩基の相違点を除けば、残り５７８塩基については一致していた（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。この塩基配列を、以下、Ｔｙｐｅ２−４と呼ぶ。
【０２３２】
図３１．は、得られた計８種類の塩基配列、すなわち上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））と完全に一致（＝１００％相同）していた塩基配列（Ｔｙｐｅ１）及びその塩基配列との類似性がきわめて高い塩基配列、すなわちＴｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３及びＴｙｐｅ１−４、またＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）していた塩基配列（Ｔｙｐｅ２）及びその塩基配列との類似性がきわめて高い塩基配列、すなわちＴｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３及びＴｙｐｅ２−４を模式図化したものである。
【０２３３】
Ｔｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ１−３は、Ｔｙｐｅ１、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））との類似性に基づいて、Ｔｙｐｅ１も含めてすべて「灰色」の棒として模式図化し、Ｔｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ１−４上にある「塩基違い（＝Ｔｙｐｅ１の塩基配列と一致しない塩基）」の部分は白い、あるいは黒い三角形の印を付けて示した。また、Ｔｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４は、Ｔｙｐｅ２、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））との類似性に基づいて、Ｔｙｐｅ２も含めてすべて「白い」棒として模式図化し、Ｔｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４上にある「塩基違い（＝Ｔｙｐｅ２の塩基配列と一致しない塩基）」の部分は灰色、または黒い三角形の印を付けて示した。
【０２３４】
Ｔｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ１−４上にある「Ｔｙｐｅ１と一致しない塩基」の部分のうちの、Ｔｙｐｅ１−４上にある［２］８２１８９２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［３］８２１８１４番目のアデニン（Ａ）がない（または欠けている（・））という２箇所（注：図３１．中の黒い三角形の印を付けた塩基）を除いた残りの箇所は、実はＴｙｐｅ１、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））とＴｙｐｅ２、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））との「塩基違い（＝一致しない塩基）」の部分に相当し、しかもＴｙｐｅ２の株群が持つ塩基配列上の「同位置の塩基」と一致している事を見出した。
【０２３５】
そのため、これらの塩基配列、すなわちＴｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ１−４は、塩基配列全長ではＴｙｐｅ１の株群が持つ塩基配列との類似性のほうが高いと評価されるものの、その塩基配列の中の一部のみを抽出して、これを「問い合わせ（クエリー）配列」とする相同性検索を行なってみると、Ｔｙｐｅ２の株群が持つ塩基配列と完全に一致（＝１００％相同）する、あるいは（Ｔｙｐｅ１よりも）Ｔｙｐｅ２の塩基配列との類似性のほうが高いとの結果を得る事ができる。
【０２３６】
たとえば、Ｔｙｐｅ１−３を例に挙げて説明すると、図２５．のＴｙｐｅ１−３の塩基配列（＝配列番号１２）の「プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）の３’−末端のグアニン（Ｇ）の右隣の塩基、すなわちアデニン（Ａ）を起点に、そのアデニン（Ａ）から、上記の「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＮＣＢＩ−ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））と一致しない計４塩基」のうちの１塩基、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上の［４］８２１８３３番目のアデニン（Ａ）の左隣の塩基、すなわち８２１８３２番目のグアニン（Ｇ）までの部分配列（２３７ｂｐ）」を抽出して、これを「問い合わせ（クエリー）配列」とする相同性検索を行なってみると、この部分配列はＴｙｐｅ２、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）しているとの結果を得る事ができる（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）は、ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株（味噌））、ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株（溜醤油諸味））の場合は８ｅ−１２０、ＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場）の場合は２ｅ−１１５）。それゆえに、これらの塩基配列、すなわちＴｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ１−４は、図３２．中の模式図でも示した通り、Ｔｙｐｅ１とＴｙｐｅ２とのキメラ配列（ないしはモザイク配列）だ���見る事ができる。
【０２３７】
また、Ｔｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４の「塩基違い（＝Ｔｙｐｅ２と一致しない塩基）」の部分のうちの、Ｔｙｐｅ２−４で見つかった［２］１８７番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）になっているという１箇所（注：図３１．中の黒い三角形の印を付けた塩基）を除いた残りの箇所も、実はＴｙｐｅ１、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））とＴｙｐｅ２、すなわち味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））との「塩基違い（＝一致しない塩基）」の部分に相当し、しかもＴｙｐｅ１の株群が持つ塩基配列上の「同位置の塩基」と一致している事を見出した。そのため、これらの塩基配列、すなわちＴｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４は、塩基配列全長ではＴｙｐｅ２の株群が持つ塩基配列との類似性のほうが高いと評価されるものの、その塩基配列の中の一部のみを抽出して、これを「問い合わせ（クエリー）配列」とする相同性検索を行なってみると、Ｔｙｐｅ１の株群が持つ塩基配列と完全に一致（＝１００％相同）する、あるいは（Ｔｙｐｅ２よりも）Ｔｙｐｅ１の株群が持つ塩基配列との類似性のほうが高いとの結果を得る事ができる。
【０２３８】
たとえば、Ｔｙｐｅ２−２を例に挙げて説明すると、図２８．のＴｙｐｅ２−２の塩基配列（＝配列番号１５）の「プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）の３’−末端のグアニン（Ｇ）の右隣の塩基、すなわちアデニン（Ａ）を起点に、そのアデニン（Ａ）から、上記の「味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００（５８０ｂｐ））や溜醤油諸味から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０８４５株（＝ＮＩＳＬ３４５９株）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０５．１、ＧＩ：２０８６０９１９５（５８０ｂｐ））、さらにはＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と一致しない計４塩基」のうちの１塩基、すなわちＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））上の［４］２２８番目のチミン（Ｔ）の左隣の塩基、すなわち２２９番目のグアニン（Ｇ）までの部分配列（２３７ｂｐ）」を抽出して、これを「問い合わせ（クエリー）配列」とする相同性検索を行なってみると、この部分配列はＴｙｐｅ１、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））や醤油醸造工程から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４９４株（＝ＮＩＳＬ３４４５株）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２７９１．１、ＧＩ：２０８６０９１８１（５８１ｂｐ））と完全に一致（＝１００％相同）しているとの結果を得る事ができる（注：これらの相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝８ｅ−１２０）。それゆえに、これらの塩基配列、すなわちＴｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４も、図３２．中の模式図で示した通り、Ｔｙｐｅ１とＴｙｐｅ２とのキメラ配列（ないしはモザイク配列）だと見る事ができる。
【０２３９】
図３１．で示したＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の場合のＰＣＲ産物の塩基配列上の、三角印で示した「塩基違い（＝一致しない塩基）」の部分を、上記の「キメラ配列（ないしはモザイク配列）化」現象によるものと仮定した場合の模式図が、図３２．である。図３１．では三角印で示した「塩基違い（＝一致しない塩基）」の部分の大半が「キメラ配列（ないしはモザイク配列）化」現象で説明可能であり、Ｔｙｐｅ１でもＴｙｐｅ２でも見出されない塩基は、Ｔｙｐｅ１−４で見つかった、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上の［ａ］８２１８９２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている、［ｂ］８２１８１４番目のアデニン（Ａ）がない（または欠けている（・））、またＴｙｐｅ２−４で見つかった、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされるＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））上の［ｃ］１８７番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）になっているという計３塩基に過ぎなかった。
【０２４０】
ただ、ＰＣＲ法及びクローンライブラリー法によって見出されたこれらのキメラ配列（ないしはモザイク配列）については、（１）Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の染色体上に実際にある塩基配列部分だという可能性と、（２）（Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の染色体上にはなく）２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列の塩基配列解読（シークエンシング）のために行なった上記の手順（＝ＰＣＲ法やクローンライブラリー法）の際に生じた人工産物（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）である可能性との両方が考えられる。
【０２４１】
上記の手順での塩基配列の解読結果から、Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））は、少なくとも、上記のＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））と完全に一致（＝１００％相同）するタイプの（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）と、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した、ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）を持っている事は判明している。そして、染色体上にこのような類似性の高い塩基配列部分が複数存在する場合には、それらの塩基配列部分どうしで組み換えを起こす事がある。そのため、両者の部分配列、すなわちＴｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）から成るキメラ配列（ないしはモザイク配列）も、細胞内でのＴｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）との組み換えによって生じたものである可能性が考えられる。
【０２４２】
Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））と同様に「ＰＣＲ産物をそのまま解読する事ができない」耐塩性酵母株、すなわちＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））などについても、上記の手順でＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）を行なってみたところ、やはりＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の場合と同様に、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））と完全に一致（＝１００％相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）と、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した、ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）と同時に、この両者、すなわちＴｙｐｅ１の部分配列とＴｙｐｅ２の部分配列とから成るキメラ配列（ないしはモザイク配列）が見出された。
【０２４３】
このＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））などの場合に生じたＰＣＲ産物（群）の塩基配列解読（シークエンシング）の結果から、株ごとに見出されるキメラ配列（ないしはモザイク配列）の種類と数は異なっている事も判明した（データ省略）。Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の場合のＰＣＲ産物から見つかった「Ｄ１／Ｄ２領域（またはＤ１／Ｄ２ドメイン）を含む部分配列」は、上記した通り、Ｔｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）と、さらに（それらの組み換えによって生じたのかも知れない）両者、すなわちＴｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）の部分配列とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）の部分配列とから成るキメラ配列（ないしはモザイク配列）であるＴｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ１−４、Ｔｙｐｅ２−２、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４の計８種類であったが、たとえば同じ分離源から分離されたＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））の場合のＰＣＲ産物から見つかったのは、Ｔｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）と、（それらの組み換えによって生じたのかも知れない）両者、すなわちＴｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）の部分配列とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）の部分配列とから成るキメラ配列（ないしはモザイク配列）であるＴｙｐｅ１−２、Ｔｙｐｅ１−３、Ｔｙｐｅ２−２と、（Ｔｙｐｅ１−４、Ｔｙｐｅ２−３、Ｔｙｐｅ２−４は見出されなかった代わりに）さらにＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））の場合には見られなかった新たな６種類の部分配列（Ｔｙｐｅ１−５、Ｔｙｐｅ１−６、Ｔｙｐｅ１−７、Ｔｙｐｅ１−８、Ｔｙｐｅ１−９、Ｔｙｐｅ２−５）を加えた計１１種類であり、このＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））において見つかった６種類の部分配列も、Ｔｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）との、（組み換えによって生じたのかも知れない）両者、すなわちＴｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）の部分配列とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）の部分配列とから成るキメラ配列（ないしはモザイク配列）の形をとっている事が判明している（データ省略）。
【０２４４】
上記した通り、下面発酵ビール酵母であるＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ（旧：Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）も、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ．ｂａｙａｎｕｓ（ないしはその近縁種）との種間交雑によって生まれた異種倍数体株であり、さまざまなＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ株の染色体を調べたところ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のものと見られる（Ｓｃ型）染色体と（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではなく）Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ（ないしはその近縁種）由来のものと見られる（非Ｓｃ型（またはＮｏｎ−Ｓｃ型））染色体との間で、多数の乗換えを起こしていて、それゆえに一部の染色体は両者が組み合わさったモザイク状を呈しているのだが、こうしたモザイク型染色体における乗換えの位置（や、そもそも染色体の数自体）は株ごとに異なっていたとの報告がある（Ｓ．Ｒａｉｎｉｅｒｉ，Ｙ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ，Ｋ．Ｍｉｋａｔａ，Ｙ．ｎａｋａｏ  ａｎｄ  Ｔ．Ａｓｈｉｋａｒｉ:Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２（６），３９６８−３９７４  （２００６））。ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）については、上記した通り、多くの生物種がゲノム上に多コピーで持つ代わりに、相同組換えによる部分配列の欠失やコピー数の低下を防ぐ独自のシステムを備えてはいるものの、組換え（による一時的なコピー数の低下）自体は起こる可能性がある（ために、コピー数を元通りに直すためのシステムも備えている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｌａｂｓ／ＣｙｔｏＧｅｎ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｆｉｇ１．ｈｔｍｌ（国立遺伝学研究所・小林研究室）））。
【０２４５】
ただ、さまざまなラガービール酵母（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列を調べてみた結果でも、（１）上記のＷｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ  ３４／７０株や、ＩＦＯ１００１１株（＝ＮＢＲＣ１００１１株）、ＲＨ６１３６株（ＡＪ５０８５９３．１、ＧＩ：３２１２７５３０）のように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが持っている２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列（Ｓｃ  ｔｙｐｅ）と同一の（＝１００％相同な）部分配列を持つ株群や（２）ＩＦＯ６１３株（＝ＮＢＲＣ１１０２４株）やＩＦＯ１１６７株（＝ＮＢＲＣ１１０２３株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１２６９３株）、ＮＲＲＬ  Ｙ−１５２５株（＝ＮＢＲＣ１０６１０株）のように、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓが持っている２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列（Ｓｂ  ｔｙｐｅ）と同一の（＝１００％相同な）部分配列を持つ株群、さらには（３）たとえばＩＦＯ１９６２株のように、その両方の部分配列（Ｓｃ  ｔｙｐｅ及びＳｂ  ｔｙｐｅ）を持つ株も見つかったとの報告はあるものの（Ｈ．−Ｍ．Ｄａｎｉｅｌ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｅｙｅｒ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８６（１−２），６１−７８  （２００３）、Ｃ．Ｐ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｒｏｂｎｅｔｔ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，３（４），４１７−４３２  （２００３）、Ｍ．Ｋａｗａｈａｔａ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｉｅｆｕｊｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１（７），１６１６−１６２０  （２００７））、両方の部分配列が混じり合ったキメラ配列（ないしはモザイク配列）は見出されてはいないようである。
【０２４６】
一方、ＰＣＲ法及びクローンライブラリー法によって見出されたこれらのキメラ配列は、（２）その２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列の塩基配列解読（シークエンシング）のために行なった上記の手順（＝ＰＣＲ法やクローンライブラリー法）の際に生じた人工産物である可能性も考えられる。
【０２４７】
今回、Ｔｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）とから成るキメラ配列が見出されたのは、いずれも「Ｔｙｐｅ１の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）」と「Ｔｙｐｅ２の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）」とを持つ２１株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物である。つまり、これら２１株の場合のＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、これらの酵母株から調製（または抽出）した核酸成分中に含まれる複数の鋳型ＤＮＡ部分、すなわち「Ｔｙｐｅ１の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）」と「Ｔｙｐｅ２の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）」との両方を増幅させている事になる。しかも、これらの鋳型ＤＮＡ部分の塩基配列は、非常に類似性が高い（ｒＲＮＡ遺伝子である）。
【０２４８】
このような、塩基配列の類似性がきわめて高い、複数の鋳型ＤＮＡ部分を増幅するためのＰＣＲ法を行なった場合には、ＰＣＲ反応溶液中でＴｙｐｅ１の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）とがヘテロ２本鎖ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ）を形成しやすく、これをクローンライブラリー法でクローン化した場合には、大腸菌が持つＭｕｔＨＬＳによる塩基配列修復システム（ＭｕｔＨＬＳ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ）（注：システムの詳細は、たとえば田村隆明・村松正實（著）の「基礎分子生物学（第３版）（東京化学同人  （２００７））」のｐ１２４−１２６を参照）によって（１本鎖のＴｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）と１本鎖のＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）との結合によって生じた）ヘテロ２本鎖ＤＮＡ上のミスマッチ塩基（または不対合塩基）部分が修復されるために、結果的にはちょうど（Ｔｙｐｅ１（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）の）２種類の塩基配列が所々に混ざり合った、モザイク状のホモ２本鎖ＤＮＡが作り出されてしまう可能性がある（Ｊ．Ｒ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｍａｒｃｅｌｉｎｏ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆ．Ｐｏｌｚ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０（９），２０８３−２０８８  （２００２））。
【０２４９】
また、調製（または抽出）した核酸成分中に断片化されたＤＮＡ（特に鋳型ＤＮＡ）が含まれていたり、またＰＣＲ法における伸長反応時間が短い場合、増幅反応の繰り返し回数が多過ぎる場合（Ｔ．Ｋａｎａｇａｗａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９６（４），３１７−３２３  （２００３））、あるいはテンプレートスイッチング（鋳型（鎖）乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ））によっても、２種類の配列が成るキメラ配列が作り出されてしまう事も報告されている（中村和憲・関口勇地（著）：微生物相解析技術  ―目に見えない微生物を遺伝子で解析する―、米田出版  （２００９））。
【０２５０】
前者、すなわち大腸菌の塩基配列修復システムによるキメラ配列（ないしはモザイク配列）の形成については、クローンライブラリー法で用いる宿主（大腸菌株）として、（本試験で用いたＳＵＲＥ２株は、親株と較べるとミスマッチ塩基部分の修復機能も低下しているとされるものの（ＳＵＲＥ２  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓの販売元であるアジレント・テクノロジー株式会社からの私信）、そもそも塩基配列修復システムに変異を導入した株ではなく）たとえばタカラバイオ株式会社製の、塩基配列修復システム欠損株（の細胞）である「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８  ｍｕｔＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（製品コード：９０５４）を用いる事により抑制する事ができ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８  ｍｕｔＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓの販売元であるタカラバイオ株式会社からの私信）、また後者の場合のキメラ配列の形成についても、ＰＣＲ反応条件を精査して、より適正化させる事により抑える事はできる。
【０２５１】
こうしたキメラ配列（ないしはモザイク配列）の形成は、たとえば１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を指標とする、微生物叢（フローラ）の直接的な（＝培養を伴わない）解析研究の場面では、古くから認識されていた現象ではあるものの（Ａ．Ｒ．Ｓｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ａ．Ｎｉｒｕｌａ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒｏｔｈ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７（１１），４４０９  （１９８９）、Ｗ．Ｌｉｅｓａｃｋ，Ｈ．Ｗｅｙｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ：Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．，２１（１），１９１−１９８  （１９９１）、Ｅ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｔ．Ｂｉｅｎｖｅｎｕ，Ｆ．Ｄｅｓｃｌａｕｘ  Ａｒｒａｍｏｎｄ，Ｋ．Ｂｅｌｄｊｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｂｅｌｄｊｏｒｄ：ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３（２），１２２−１２４  （１９９３）、Ｅ．Ｄ．Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．Ｂａｔｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｗａｒｄ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０（２），７４６−７４８  （１９９４）、Ｇ．Ｒｕａｎｏ，Ａ．Ｓ．Ｄｅｉｎａｒｄ，Ｓ．Ｔｉｓｈｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋ．Ｋｉｄｄ：ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３（４），２２５−２３１  （１９９４）、Ｍ．Ｊ．Ｆｅｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｗａｒｄ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（４），１３７５−１３８１  （１９９７））、その塩基配列が自然物なのか人工産物なのかの判別が時には（特に系統的に非常に近い複数種由来の塩基配列がキメラ配列化したような場合など）難しい場合もあり、公式の塩基配列データベースにも、こうした人工的なキメラ配列（ないしはモザイク配列）が多数登録されているという（Ｐ．Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｓｔ  ａｎｄ  Ｔ．Ｈｕｂｅｒ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３（１），２８９−２９３  （２００３））。
【０２５２】
なお、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、その複製反応時に増幅ミスを起こす事が知られてはいるものの、そうした増幅ミス（の頻度）は微生物の塩基配列の相同性を指標とする分類には影響を及ぼさない程度のものに過ぎず、上記の、人工的なキメラ配列のほうが分類上の問題となりやすいとの、Ａｃｉｎａｓらの報告がある（Ｓ．Ｇ．Ａｃｉｎａｓ，Ｒ．Ｓａｒｍａ−Ｒｕｐａｖｔａｒｍ，Ｖ．Ｋｌｅｐａｃ−Ｃｅｒａｊ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐｏｌｚ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１（１２），８９６６−８９６９  （２００５））。製品・キット化されているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの多くは、遺伝子操作によって増幅ミスの発生頻度が改善（＝低減化）されており（野島博（著）：遺伝子工学  ―基礎から応用まで―、東京化学同人  （２０１３））、その頻度はきわめて低い。今回のＰＣＲ産物の調製に用いたＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法での増幅ミスによる「塩基違い（＝鋳型ＤＮＡと一致しない塩基）」の発生頻度もわずか０．０３％程度に過ぎないといい（Ｅｘ  Ｔａｑの販売元であるタカラバイオ株式会社からの私信）、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３（２４塩基））及びプライマーＮＬ−４（＝配列番号４（１９塩基））を用いたＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で調製したＰＣＲ産物（６２３〜６２４ｂｐ）に見出された、上記の１〜５塩基の違いがこうした増幅ミスによるものだと仮定した場合には、その増幅ミスの発生頻度は上記の０．０３％を遥かに超える（１〜５／６２３〜６２４＝）０．１６〜０．８０％となる事から、見出されたこれらの塩基すべてがＰＣＲ反応中の増幅ミスによるものだとは考えづらい。
【０２５３】
生味噌及び生醤油から分離したＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））やＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））などの場合に生じたＰＣＲ産物の、クローンライブラリー法を用いての塩基配列解読（シークエンシング）によって見出された、Ｔｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）から成るキメラ配列（ないしはモザイク配列）群のすべて、あるいは一部が（１）これら株の染色体上に実際にある塩基配列部分なのか、あるいは（２）（これらの株の染色体上にはなく）２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列の塩基配列解読（シークエンシング）のために行なった上記の手順（＝ＰＣＲ法やクローンライブラリー法）の際に生じた人工産物なのかは、そもそもキメラ配列のもととなった両方の配列（＝Ｔｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）とＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ））自体がこれらの株の細胞内から同時に見出されている事もあって、よく分からない。
【０２５４】
ただ、いずれにせよ、こうしたＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））やＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））などの株群も、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１と仮称した、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）上にある、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＢ３０２８０６．１、ＧＩ：２０８６０９１９６（５８１ｂｐ）（＝配列番号１））と完全に一致（＝１００％相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）を持つ事から、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株であると、またＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と仮称した、ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）する（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）も持つ事から（ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが提唱しているＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群も、現行の分類上はＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている事から）現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株であると簡易同定できる。
【０２５５】
また、これらの株は、ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが提唱している区分けに従うとすれば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であり、彼らも［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに分類すべきとしているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））と、彼らがＺ．ｒｏｕｘｉｉとは同属「別種」の［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の、両方の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を持っている事から、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株とＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ株との交雑株、つまり［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとしているＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（注：種名は「なし」）だともいえる。
【０２５６】
ただ、この２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上のＤ１／Ｄ２領域の鎖長と塩基配列とを指標として用いる微生物の（属種）簡易同定法は、あくまで供試株の持つＤ１／Ｄ２領域が１種類だけであるという前提条件の下でのみ、利用すべきであり、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている株群のように、株によってＴｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）ないしはＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）という、２種類の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を持つ場合がある酵母株に対しては利用すべきではない。さらに、味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離したＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合には、たとえば上記のＮｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））やＮｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））などのように、（Ｔｙｐｅ１の部分配列（Ｚｒ  ｔｙｐｅ）ないしはＴｙｐｅ２の部分配列（Ｚｐ  ｔｙｐｅ）のいずれかしか持っていないために）上記の手順に従って２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列のＰＣＲ産物を調製し、その塩基配列を直接解読するだけという、比較的容易な方法で、現行の分類上のＺ．ｒｏｕｘｉｉだと簡易同定できる株だけでなく、たとえば上記のＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））などのように、（複数の生物種に由来するものと見られる）複数の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（のＤ１／Ｄ２領域を含む部分配列）を持つ（がゆえに（現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されているものの）ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらがＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとしている）株もおり、これらの株では、その塩基配列を直接解読する事ができず、その塩基配列解読（シークエンシング）のためには（前処理としての）上記の形質転換処理や形質転換株（クローン）の選択（クローンライブラリー法）、形質転換株（クローン）からプラスミドの回収という、非常に煩雑で多大な労力とコストを要する作業が必要で、しかもＰＣＲ法条件やクローンライブラリー法で使用する宿主（大腸菌株）の選択にも注意が必要であり、しかもＸ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンナトリウム加ＬＢ寒天上での形質転換株（クローン）の選択（＝擬陽性（または疑陽性）の色調を呈する形質転換株（クローン）を試験の対象として選択するか否かという判断）には熟練を要する場合がある。
【０２５７】
そもそも、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと同属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）の、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｐａｅ（チゴサッカロミセス・サパエ）の基準株であるＡＢＴ３０１株（バルサミコ酢（イタリア））が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（６２３ｂｐ）（ＡＪ９６６３４２．３、ＧＩ：３８４０８０４６０、またはＡＭ９４７６８２．１、ＧＩ：１７０６５０３２１）の塩基配列は、（Ｚ．ｓａｐａｅではないとされる）Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ３０４２株が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５６０ｂｐ）（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６）と同一（＝１００％相同）だとの報告があり（Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｔ．Ｃ．Ｄａｋａｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（Ｐｔ  １），３６４−３７１  （２０１３））、さらにはたとえばＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株（味噌））が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５８０ｂｐ）（ＡＢ３０２８１０．１、ＧＩ：２０８６０９２００）などとも同一（＝１００％相同）であり、つまり２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上のＤ１／Ｄ２領域の鎖長と塩基配列とを指標として用いる判別法（＝簡易同定法）ではＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属内の数種、すなわちＺ．ｓａｐａｅやＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多い、Ｚｙｇｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる（現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている）株群に含まれる一部（の株群）を区分けする事はできない。
【０２５８】
［Ｂ］同属同種内の酵母株を、その産業上用途に応じて区分け（または判別）する事もきわめて重要であり、その方法は当然産業上有用であるため、手法の研究と開発が盛んに行なわれている。Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの場合には、上記した通り、［Ｂ］現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群を、「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高いＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」と、「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低く、それゆえに「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」とを区分け（または判別）する事も、味噌・醤油醸造及び製品などの製造・品質管理上きわめて重要な事であり、これらを区分け（または判別）する方法も産業上有用である。
【０２５９】
しかしながら、「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能が高いＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」と、「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低く、それゆえに「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」とを区分け（または判別）するための形態学的及び生理学的性質・細胞成分検査法については、ほとんど報告がなく、また一部の報告についても同種内株の判別（または区分け）方法として実用化できる水準にまでは整備されていない。
【０２６０】
たとえば、森らのグループは、味噌・醤油諸味などから分離された耐塩性のＺ．ｒｏｕｘｉｉ株が、グルコースとフラクトース（＝果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ））を１：１の比率で含む環境で培養した場合にも、他の多くの酵母と同様に、何よりもまずグルコースを炭素源として消費するのに対して、蜂蜜やマジパン、ショートケーキなどから分離された耐糖性のＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合には、（グルコースよりも先に）フラクトースから先に消費するという特徴、すなわち「好フラクトース資化性（ｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｙ）」を示す事を報告している（森治彦、瀬能幸雄、島津善美：日本醗酵工学会大会（千里阪急ホテル、大阪大学工学部（大阪））講演要旨集、昭和６２年度、ｐ６７（講演番号２５７）、１９８７−１１−０２  （１９８７）、森治彦：醸協、９６（７）、４７５−４８２  （２００１））。このような好フラクトース資化性は、耐糖性のＺ．ｒｏｕｘｉｉ株に特異的なものではなく、同様に高濃度の糖質を含む環境から分離されたＳ．ｂａｉｌｉｉ（＝現在のＺ．ｂａｉｌｉｉ）などの酵母でも報告されており（Ｗ．Ｅｍｍｅｒｉｃｈ＆Ｆ．Ｒａｄｌｅｒ：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９（１１），３３１１−３３１８  （１９８３））、非常に興味深いが、もしこのような糖の「優先的」資化性能の違いを指標にして、「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に利用できるＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」と、「味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とを区分け（または判別）しようとするならば、培養前後の培地中のグルコース濃度とフラクトース濃度の変化を分析するという煩雑な成分分析作業が必要となる。
【０２６１】
上記した通り、本発明者（＝馬渕）は、２００１年に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群をいくつかの株群に区分けする方法（馬渕清人：醤油酵母の分離識別法、特許３９０４１８７）と、本法を利用して、醤油諸味のエタノール発酵に寄与できる「特に高い」能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のみを選択する方法を考案しており（馬渕清人：エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地、同酵母株の分離法及び同酵母株を用いる含塩醗酵食品の製造法、特許３９３８４８８）、後者の方法を用いれば、（醤油及びその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）の中での生存能力が高く、醤油諸味中でのエタノール生産性能が高いＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の中に含まれる）「特に高い」エタノール生産性能を持ち、それゆえに実際の醤油醸造への利用に向いているＺ．ｒｏｕｘｉｉ株のみをきわめて容易かつ迅速に選択・取得する事はできる。ただし、本法では、本発明で求めている、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群を、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高いＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群」と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低く、それゆえに「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群」との２群に、正確に区分け（または判別）する事は、本法ではできない。
【０２６２】
また、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母株群の同属同種内での区分けに関する免疫学的な試みも、ほとんどなされてはいない。
【０２６３】
上記した通り、１９９６年のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の全ゲノム配列解読完了（Ａ．Ｇｏｆｆｅａｕ，Ｂ．Ｇ．Ｂａｒｒｅｌ，Ｈ．Ｂｕｓｓｅｙ，Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄｕｊｏｎ，Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｆ．Ｇａｌｉｂｅｒｔ，Ｊ．Ｄ．Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，Ｃ．Ｊａｃｑ，Ｍ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｌｏｕｉｓ，Ｈ．Ｗ．Ｍｅｗｅｓ，Ｙ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｐ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｈ．Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇ．Ｏｌｉｖｅｒ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４（５２８７），５４６−５６７  （１９９６））をきっかけに、さまざまな醸造用酵母のゲノム解読から得られた遺伝情報どうしの比較を通して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株群を区分けしようとする研究が盛んに行なわれるようになった。
【０２６４】
同属同種の酵母株を区分け（または判別）するための指標として利用できる遺伝情報としては、上記したＩＴＳなどのスペーサー領域の他に、特定の株群のみが持っている遺伝子や、「遺伝的多型（または遺伝子多型（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ））」と総称される、（１）塩基配列上に見受けられる特定の位置の塩基の、株群ごとでの違い、すなわち一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ））や、（２）数塩基（＝マイクロサテライト（反復）配列（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｒｅｐｅａｔ））から数十塩基の塩基配列（＝ミニサテライト（反復）配列（ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｒｅｐｅａｔ））を単位とする繰り返し配列（＝可変回縦列反復配列（ｖａｒｉｏｕｓ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ（ＶＮＴＲ））の繰り返し回数の、株群ごとでの違い、（３）塩基配列の挿入や欠落、あるいは（４）遺伝子などのコピー数変化（＝コピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＣＮＰ））などがある（田村隆明・村松正實（著）：基礎分子生物学（第３版）、ｐ２１７−２１８、東京化学同人  （２００７）、川喜田正夫（著）：遺伝子（普及版）、ｐ１７２−１７４、朝倉書店  （２００８）、菅野純夫（監修）／水島−菅野純子・服部成介（著）：よくわかるゲノム医学  ―ヒトゲノムの基本からテーラーメード医療まで、ｐ２８−４４、羊土社  （２０１１））。
【０２６５】
そして、このような遺伝情報を指標とする株群の区分け（または判別）方法として、古くは、株ごとの染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）自体の、パルスフィールド・ゲル電気泳動法（ｐｕｌｓｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ））での泳動パターン（Ｄ．Ｃ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ：Ｃｅｌｌ，３７（１），６７−７５  （１９８４））の違い、すなわち［１］染色体長多型（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、または電気泳動的核型（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ））（Ｐ．Ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，Ｆ．Ｃ．Ｍ．Ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，Ｒ．Ｍｅｉｊｅｒｓ，Ｈ．Ｙ．Ｓｔｅｅｎｓｍａ  ａｎｄ  Ｗ．Ａ．Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ：Ｙｅａｓｔ，２（３），１９３−２０４  （１９８６）、Ｊ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｋ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３６（４），５６９−５７２  （１９８６）、Ｇ．Ｐ．Ｃａｓｅｙ，Ｗ．Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｈ．Ｒａｎｋ：Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，９４（４），２３９−２４３  （１９８８）、Ｙ．Ｔａｋａｔａ，Ｊ．Ｗａｔａｒｉ，Ｎ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｍａｄａ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，４７，１０９−１１３  （１９８９））を指標とする手法が検討された事もあり（見方洪三郎：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．，１２（２），９９−１０３  （１９９６））、たとえば後藤らによる、染色体長多型（または電気泳動的核型）を指標とする、きょうかい１０号（Ｋ１０）及びその派生株の判別（または区分け）（後藤邦康、蓮尾徹夫、小幡孝之、原昌道：醸協、８５（３）、１８５−１８９  （１９９０））や、また山本らによるワイン酵母の株レベルでの判別（または区分け）に関する報告などがあるが（山本奈美、山本信城、雨宮秀仁、横森洋一、清水健一、戸塚昭：醸協、８５（８）、５７３−５７５  （１９９０）、Ｎ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．Ａｍｅｍｉｙａ，Ｙ．Ｙｏｋｏｍｏｒｉ，Ｋ．Ｓｈｉｍｉｚｕ  ａｎｄ  Ａ．Ｔｏｔｓｕｋａ：Ａｍ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ，４２（４），３５８−３６３  （１９９１））、このような染色体長多型（または電気泳動的核型）での酵母株の区分け（または判別）には限界があった。
【０２６６】
また、上記の、染色体ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合（または分子交雑、ハイブリッド形成、ハイブリダイゼーション）試験も、酵母株の区分け（または判別）の際によく用いられる方法の１つであり、ＤＮＡ相同値が７０〜８０％以上の場合には同種だと見做されるものの（Ｌ．Ｇ．Ｗａｙｎｅ，Ｄ．Ｊ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｃｏｌｗｅｌｌ，Ｐ．Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｍｏｎｔ，Ｏ．Ｋａｎｄｌｅｒ，Ｍ．Ｉ．Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ，Ｌ．Ｈ．Ｍｏｏｒｅ，Ｗ．Ｅ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｍ．Ｐ．Ｓｔａｒｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｔｒｕｐｅｒ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３７（４），４６３−４６４  （１９８７））、７０％未満の場合でも別種だとの判断はできず、他の指標での区分け（または判別）結果も参考にする必要があるとされる（杉山純多（編）：［バイオディバーシティ・シリーズ４］菌類・細菌・ウイルスの多様性と系統、ｐ１１１−１２０（西田洋巳・杉山純多（著））、裳華房  （２００５））。
【０２６７】
ただ、その後、たとえば供試株のＤＮＡ上の特定領域だけを解析するためのサザンブロットハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法や［２］ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ））法・ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法など（牛久保宏：ウイルス、５４（１）、１０７−１１２  （２００４））、さまざまな遺伝子工学的手法が開発されるに伴って、こうした手法を利用した、酵母株が持つゲノム上の特定の塩基配列部分だけを指標とした判別（または区分け）方法も次々と開発された。たとえば、上記の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する手法としては、たとえばアニーリング時の特異性（＝塩基配列選択性）が低い１０〜１５塩基程度の短いランダムプライマーをわざと用いるＰＣＲ法で生じた増幅産物の泳動パターン（＝増幅産物の数と鎖長）を指標に、多型を検出する［３］ランダム増幅多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＤＮＡ（ＲＡＰＤ））解析法（Ｊ．Ｇ．Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｒ．Ｋｕｂｅｌｉｋ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ，Ｊ．Ａ．Ｒａｆａｌｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｖ．Ｔｉｎｇｅｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（２２），６５３１−６５３５  （１９９０））、制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）処理で生じた供試株のＤＮＡ断片群の中から、適当なプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーション法で検出した断片群のパターン（＝断片の数と鎖長）を指標とする［４］ＤＮＡフィンガープリント（ＤＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）法、制限（酵素切）断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ））解析法や、特定の塩基配列部分のみをＰＣＲ法で増幅して得られる増幅産物を制限酵素処理した際に生じる断片の泳動パターンを指標に、多型を検出する［５］ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析法（またはＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）解析法）（加藤隆一・鎌滝哲也（編）：薬物代謝学（第２版）  ―医療薬学・毒性学の基礎として―、ｐ１５０−１５１（有吉範高（著））、東京化学同人  （２０００）、日本生態学会（森長真一・工藤洋）（編）：［シリーズ  現代の生態学７］エコゲノミクス  ―遺伝子からみた適応―、ｐ１１−３５（井鷺裕司（著））、共立出版  （２０１２））、あらかじめ制限酵素処理した断片化ＤＮＡを鋳型に、アダプターと、そのアダプター配列も参考にして設計したプライマーとを使って、特定の塩基配列部分のみを選択的にＰＣＲ法で増幅した際に生じる増幅産物の泳動パターンを指標に、多型を検出する［６］増幅（ＤＮＡ）断片長多型（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＡＦＬＰ））解析法（Ｐ．Ｖｏｓ，Ｒ．Ｈｏｇｅｒｓ，Ｍ．Ｂｌｅｅｋｅｒ，Ｍ．Ｒｅｉｊａｎｓ，Ｔ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｌｅｅ，Ｍ．Ｈｏｒｎｅｓ，Ａ．Ｆｒｉｔｅｒｓ，Ｊ．Ｐｏｔ，Ｊ．Ｐａｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｋｕｉｐｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｚａｂｅａｕ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．,２３（２１），４４０７−４４１４  （１９９５））、そうした増幅産物などをホルムアミド溶液中で加熱してから急冷した際に生じる一本鎖ＤＮＡの高次構造の違いを指標に、多型を検出する［７］一本鎖（ＤＮＡ）高次構造多型（（ＰＣＲ−）Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＳＣＰ））法（Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．Ｉｗａｔａ，Ｈ．Ｔｓｕｊｉ：Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，９９，４５４−４６１  （１９９７）、Ｋ．Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｒ．Ｙａｂｅ，Ｍ．Ｕｃｈｉｋａｗａ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５３（３），１９０−１９９  （２００１）、中村貴子：筑波大学技術報告、２８、３９−４４  （２００８）、吹屋貞子、數田行雄：山口県環境保健センター所報、５３、４９−５１  （２０１０））、一塩基多型を３’−末端側に配置したプライマーを用いるＰＣＲ法での増幅産物の有無を指標に、多型を検出する［８］対立遺伝子特異的増幅（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＳＡ）、または対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＡＳ）  ＰＣＲ）、あるいはＭｕｔａｔｉｏｎ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＡＳＡ））法（加藤隆一・鎌滝哲也（編）：薬物代謝学（第２版）  ―医療薬学・毒性学の基礎として―、ｐ１５２（有吉範高（著））、東京化学同人  （２０００））や［９］一塩基多型を３’−末端側に配置した標識化オリゴヌクレオチドを使って多型を検出する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＡＳＯ）法、［１０］マルチプレックス一塩基伸長反応法（橋谷田真樹、那谷雅之、舟山眞人：ＤＮＡ多型、９、２４９−２５３  （２００１））などが、また株ごとに見受けられる繰り返し配列（＝可変回縦列反復配列（ＶＮＴＲ））の繰り返し回数の違いを検出する手法としては、［１１］単純反復配列多型（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ(ＳＳＲＰ)）解析法などが考案・開発された。最近では、［１２］直接的な塩基配列解読（ダイレクトシークエンシング（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）やプライマー伸長（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法）も容易に行なえるようになり、また［１３］マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）やＤＮＡチップが多型検出用に利用できる環境も整い、これらの手法を用いた酵母株の区分けも比較的簡単に行えるようになった（加藤隆一・鎌滝哲也（編）：薬物代謝学（第２版）  ―医療薬学・毒性学の基礎として―、ｐ１４８−１５５（有吉範高（著））、東京化学同人  （２０００）、藤井建夫（編）：［食品微生物II―制御編］食品の保全と微生物、ｐ２４２−２５１（木村凡（著））、幸書房  （２００１）、村松正実（監修）／林崎良英・岡崎康司・近藤伸二（編）：［現代化学  増刊４０］解読されたゲノム情報をどう活かすか、ｐ７７−９５（相沢克則・伊藤昌可・柴田一浩・外丸靖浩（著））、東京化学同人  （２００１）、川喜田正夫（著）：遺伝子（普及版）、ｐ１７２−１７４、朝倉書店  （２００８）、西方敬人・川上純司・藤井敏司・長濱宏治（著）：［細胞工学別冊］ゼロからはじめるバイオ実験マスターコース  (1)実験の基本と原理、学研メディカル秀潤社  （２０１２）、野島博（著）：遺伝子工学  ―基礎から応用まで―、東京化学同人  （２０１３））。
【０２６８】
上記のＰＣＲ法を用いた事例（ケース）としては、たとえばＲｙｕらのリボソーマル蛋白質Ｌ２（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ２（ＲＰＬ２））をコードしている遺伝子座での染色体転座を指標としたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳ．ｂａｙａｎｕｓなどの簡易判別法に関する報告（Ｓ．−Ｌ．Ｒｙｕ，Ｋ．Ｍｉｋａｔａ，Ｙ．Ｍｕｒｏｏｋａ，Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８６（３），２４９−２５２  （１９９８）、金子嘉信：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．，１５（１），１−７  （１９９９））、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析法については、たとえばＡｎｄｒｉｇｈｅｔｔｏらによる、乳製品から分離されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む、さまざまな酵母群の種判別に関する報告（Ｃ．Ａｎｄｒｉｇｈｅｔｔｏ，Ｅ．Ｐｓｏｍａｓ，Ｎ．Ｔｚａｎｅｔａｋｉｓ，Ｇ．Ｓｕｚｚｉ  ａｎｄ  Ａ．Ｌｏｍｂａｒｄｉ：Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０（１），５−９  （２０００））やＬａｉｄｌａｗらのｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）の一部を指標とするビール酵母などのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母の種同定に関する報告（Ｌ．Ｌａｉｄｌａｗ，Ｔ．Ａ．Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，Ｌ．Ｓａｖａｒｄ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５４(２)，９７−１０２  （１９９６））、またＤＮＡフィンガープリント法や制限（酵素切）断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析法については、たとえばＭａｓｎｅｕｆらの、ＭＥＴ２領域の制限（酵素切）断片長多型（ＲＦＬＰ）による（Ｉ．Ｍａｓｎｅｕｆ，Ｍ．Ａｉｇｌｅ  ａｎｄ  Ｄ．Ｄｕｂｏｕｒｄｉｅｕ：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３８（２−３），２３９−２４４  （１９９６））、あるいはＡｎｔｕｎｏｖｉｃｓらによる、電気泳動的核型解析との併用によるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母の種同定（Ｚ．Ａｎｔｕｎｏｖｉｃｓ，Ｌ．Ｉｒｉｎｙｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｐｉｃｚｋｉ：Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９８（４），９７１−９７９  （２００５））、ＬａｖａｌｌｉＥＥらやＭｏｌｚａｈｎら、あるいはＶｅｚｉｎｈｅｔらによる、上記の染色体長多型（または電気泳動的核型）との併用による醸造酵母の株レベルでの判別（または区分け）法（Ｆ．Ｖｅｚｉｎｈｅｔ，Ｂ．Ｂｌｏｎｄｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．−Ｎ．Ｈａｌｌｅｔ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２（５），５６８−５７１  （１９９０）、Ｆ．ＬａｖａｌｌｉＥＥ，Ｙ．Ｓａｌｖａｓ，Ｓ．Ｌａｍｙ，Ｄ．Ｙ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．Ｄｅｇｒｅ  ａｎｄ  Ｌ．Ｄｕｌａｕ：Ａｍ.Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．，４５（１），８６−９１  （１９９５）、Ｓ．Ｗ．Ｍｏｌｚａｈｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．Ｑｕａｉｎ：Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，１０１（２），７５−７８  （１９９５））、ＶｅｒｓａｖａｕｄらやＣｏｎｓｔａｎｔｉらによる、（現行の分類でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されている）さまざまなワイン酵母が持つミトコンドリアＤＮＡなどの解析による、生物地理学的な分布調査（Ａ．Ｖｅｒｓａｖａｕｄ，Ｐ．Ｃｏｕｒｃｏｕｘ，Ｃ．Ｒｏｕｌｌａｎｄ，Ｌ．Ｄｕｌ��ｕ  ａｎｄ  Ｊ．Ｎ．Ｈａｌｌｅｔ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１０），３５２１−３５２９  （１９９５））や醸造期間中の酵母（菌）叢（フローラ）解析の報告などがある（Ｍ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉ，Ｍ．Ｐｏｂｌｅｔ，Ｌ．Ａｒｏｌａ，Ａ．Ｍａｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｇｕｉｌｌａｍｏｎ：Ａｍ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．，４８（３），３３９−３４４  （１９９７））。上記した山岸及び尾形の、ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のスペーサー領域の塩基配列を指標とする下面発酵ビール酵母の分類法（山岸裕美、尾形智夫：新規オリゴヌクレオチドとそれを用いた酵母分類法、特許３７９５２５９）や、さらに細胞の凝集性に関わるＦＬＯ１遺伝子などをも指標として用いる酵母の同定方法（山岸裕美、大蔦由紀、尾形智夫：酵母を同定する方法、特開平１１−５６３６６）でも、ＰＣＲ法で調製したスペーサー領域などの増幅産物の塩基配列上の特徴を簡便かつ迅速に検査するための手段として、ＰＣＲ−（ＭｓｐI／ＳｃｒＦI−）ＲＦＬＰ法が利用されている。
【０２６９】
増幅ＤＮＡ断片長多型（ＡＦＬＰ）解析法は、このようなランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析法や制限（酵素切）断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法よりも増幅産物パターンの再現性や多型の検出感度が高いとされ（Ｊ．−Ｊ．Ｌｉｎ，Ｊ．Ｋｕｏ，Ｊ．Ｍａ，Ｊ．Ａ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｈ．Ｓ．Ｂｅａｒｄ，Ｍ．Ｈ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｗ．Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙ，Ｇ．Ｎ．Ｕｄｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，１４（２），１５６−１６９  （１９９６）、Ｊ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．Ｆｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｍａｃａｕｌａｙ，Ｂ．Ｇ．Ｈａｔｚ，Ａ．Ｊａｈｏｏｒ，Ｗ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ｒ．Ｗａｕｇｈ：Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９５（４），７１４−７２２  （１９９７）、Ｃ．Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．Ｃａｓｔａｇｌｉｏｎｅ，Ｍ．Ｏ．Ｗｉｎｆｉｅｌｄ，Ｆ．Ｓａｌａ，Ｃ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｅｌ，Ｇ．Ｂｒｅｄｅｍｅｉｊｅｒ，Ｂ．Ｖｏｓｍａｎ，Ｍ．Ｍａｔｔｈｅｓ，Ａ．Ｄａｌｙ，Ｒ．Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．Ｂｅｔｔｉｎｉ，Ｍ．Ｂｕｉａｔｔｉ，Ｅ．Ｍａｅｓｔｒｉ，Ａ．Ｍａｌｃｅｖｓｃｈｉ，Ｎ．Ｍａｒｍｉｒｏｌｉ，Ｒ．Ａｅｒｔ，Ｇ．Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ，Ｊ．Ｒｕｅｄａ，Ｒ．Ｌｉｎａｃｅｒｏ，Ａ．Ｖａｚｑｕｅｚ  ａｎｄ  Ａ．Ｋａｒｐ：Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，３１（５），３８１−３９０  （１９９７））、たとえばＤｅ  Ｂａｒｒｏｓ  Ｌｏｐｅｓらによる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む、さまざまな酵母群の種判別に関する報告がある（Ｍ．Ｄｅ  Ｂａｒｒｏｓ  Ｌｏｐｅｓ，Ｓ．Ｒａｉｎｉｅｒｉ，Ｐ．Ａ．Ｈｅｎｓｃｈｋｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４９（２），９１５−９２４  （１９９９））。
【０２７０】
Ａｚｕｍｉ及び後藤（Ｇｏｔｏ−Ｙａｍａｍｏｔｏ）は、増幅ＤＮＡ断片長多型（ＡＦＬＰ）解析法を行ない、その断片の共有率から非加重平均法で樹形図を作成したみたところ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（＝Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）がそれぞれ独立したクラスターを形成し、かつその条件下で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株が［１］清酒酵母・焼酎酵母群（とウィスキー酵母１株を含む）、［２］パン酵母・ワイン酵母・上面発酵ビール酵母群（とウィスキー酵母２株を含む）、［３］実験室酵母群の３つのクラスターに分かれる事を見出し、ゆえにこれらの株群が別個に進化した系統であると推論しており（Ｍ．Ａｚｕｍｉ＆Ｎ．Ｇｏｔｏ−Ｙａｍａｍｏｔｏ：Ｙｅａｓｔ  １８（１２）、１１４５−１１５４  （２００１）、清酒酵母・麹研究会（編）：清酒酵母の研究  ―９０年代の研究―、ｐ６３−６７（後藤奈美（著））、清酒酵母・麹研究会  （２００３）、後藤奈美：醸協、１０３（６）、４１８−４２５  （２００８））、Ｌｉｔｉらのグループも、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株が持つ塩基置換（ＳＮＰ）を指標にして系統樹を作成してみたところ、やはり清酒酵母群やワイン酵母群、実験室酵母群が別々のクラスターを形成した事を報告している（Ｇ．Ｌｉｔｉ，Ｄ．Ｍ．Ｃａｎｔｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｍｏｓｅｓ，Ｊ．Ｗａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｐａｒｔｓ，Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｒ．Ｐ．Ｄａｖｅｙ，Ｉ．Ｎ．Ｒｏｖｅｒｔｓ，Ａ．Ｂｕｒｔ，Ｖ．Ｋｏｕｆｏｐａｎｏｕ，Ｉ．Ｊ．Ｔｓａｉ，Ｃ．Ｍ．Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｄ．Ｂｅｎｓａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．Ｔ．Ｏ’Ｋｅｌｌｙ，Ａ．ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ｄ．Ｂ．Ｈ．Ｂａｒｔｏｎ，Ｅ．Ｂａｉｌｅｓ，Ａ．Ｎ．Ｎ．Ｂａ，Ｍ．Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ａ．Ｑｕａｉｌ，Ｉ．ＧｏｏｄＨｅａｄ，Ｓ．Ｓｉｍｓ，Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｂｌｏｍｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ＆Ｅ．Ｊ．Ｌｏｕｉｓ：Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３６）、３３７−３４１  （２００９））。
【０２７１】
特に清酒酵母群の場合には、上記した通り、清酒酵母群特異的な細胞壁蛋白質をコードしているＡＷＡ１を持っているため、たとえばこのＡＷＡ１を標的とするＰＣＲ法（下飯仁、宮下晃一、清水正史：清酒酵母の菌株同定法、特許３８３４６４９）や増幅ＤＮＡ断片長多型（ＡＦＬＰ）解析法を使えば、（一部の例外株を除く）清酒酵母群を判別する事ができる（Ｍ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｈ．Ｋｉｔａｇａｋｉ，Ｋ．Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｎｏｉ：Ｊ.Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１００（６），６７８−６８０  （２００５））。
【０２７２】
増幅ＤＮＡ断片長多型（ＡＦＬＰ）解析法は、栽培植物の種ないしは品種の判別（または区分け）や類縁関係の推定などにもよく用いられる方法であり（Ｍ．Ｈｉｌｌ，Ｈ．Ｗｉｔｓｅｎｂｏｅｒ，Ｍ．Ｚａｂｅａｕ，Ｐ．Ｖｏｓ，Ｒ．Ｋｅｓｓｅｌｉ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ：Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９３（８），１２０２−１２１０  （１９９６））、Ｒ．Ｐ．Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｗ．ＭｃＮｉｃｏｌ，Ｅ．Ｂａｉｒｄ，Ａ．Ｂｏｏｔｈ，Ｐ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｂ．Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｐｏｗｅｌｌ：Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，３（５），３５９−３６９  （１９９７）、Ｌ．Ｈａｒｔｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｅｅｆｅｌｄｅｒ：Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９６（１），１１２−１１６  （１９９８））、たとえば上記の後藤（山本）は、従来のランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析法や制限（酵素切）断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法、単純反復配列多型（ＳＳＲＰ)解析法などでは判別（または区分け）が困難であった、ワイン用の葡萄であるピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ  ｎｏｉｒ）種とピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ  ｂｌａｎｃ）種の判別（または区分け）も、この増幅ＤＮＡ断片長多型（ＡＦＬＰ）解析法を使えば、容易に行なえると報告している（後藤（山本）奈美：日本ブドウ・ワイン学会誌（Ｊ．ＡＳＥＶ  Ｊｐｎ．）、９（２）、８３−８８  （１９９８））。また、久保は、清酒酵母のアミノ酸生合成系の調節遺伝子（ＧＣＮ４）上の一塩基多型（ＳＮＰ）を指標にして、清酒酵母群（きょうかい７号（Ｋ７）、きょうかい９号（Ｋ９）、きょうかい１０号（Ｋ１０）、きょうかい１４号（Ｋ１４）などを含む）とその他の酵母群（ワイン酵母、焼酎酵母、ビール酵母、パン酵母、実験室酵母などを含む）とを区分けするＰＣＲ方法を考案している（久保義人：福井県農業試験場研究報告、４７、３８−４３  （２０１０））。
【０２７３】
単純反復配列多型（ＳＳＲＰ）解析法についても、たとえばＧａｌｌｅｇｏらのグループが、マイクロサテライト反復配列がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の区分けの指標として利用できる事を報告しており（Ｆ．Ｊ．Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｍ．Ａ．Ｐｅｒｅｚ，Ｉ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｄａｌｇｏ：Ａｍ．Ｊ．Ｅｎｏｌ．Ｖｉｔｉｃ．，４９（３），３５０−３５１  （１９９８））、これを醸造用酵母の判別（または区分け）に利用した事例（ケース）としては、たとえば福田らによる、ワイン酵母群や焼酎酵母群、清酒酵母群を判別（または区分け）するための、酵母の細胞壁蛋白質をコードしている遺伝子（ＡＧＡ１、ＤＡＮ４、ＨＳＰ１５０、ＳＥＤ１）などに含まれているミニサテライト反復配列を指標とするＰＣＲ法（福田央、周延、三上重明：醸協、１０１（５）、３５７−３６４  （２００６）、福田央、周延、三上重明：醸協、１０１（８）、６０１−６１３  （２００６））や、ＦＬＯ５や、第８染色体のテロメア近傍の右腕上の塩基配列（ＹＨＲ２１３Ｗ）などを参考にして設計したプライマーを用いるＰＣＲ法の報告などがある（福田央、周延、三上重明：醸協、１０２（２）、１３９−１４５  （２００７）、福田央、三上重明：ＹＨＲ２１３Ｗ又はＹＡＲ０６２Ｗ遺伝子を利用した醸造用酵母の判別法、特許５１５８６６９）。
【０２７４】
こうした繰り返し配列（の、特にミニサテライト反復配列）の繰り返し回数の多型は、法医学分野での（ヒトの）親子鑑定や個人識別の際の指標としても使われている（木南凌、内藤笑美子：蛋白質核酸酵素、３７（４）、７６４−７７１  （１９９２））。
【０２７５】
このようなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのさまざまな知見は、他の酵母株の分類にも応用されているが、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、味噌・醤油醸造に寄与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」、いわゆる味噌・醤油主発酵酵母株と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低く、それゆえに「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」とを区分け（または判別）するために、これらの分子生物学的な方法が利用されたとの報告もほとんどない。
【０２７６】
上記した通り、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの遺伝学的な研究を通して、最近では、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母株群の中には、複数の酵母株群が混在している可能性が指摘されている。現時点では、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上のＤ１／Ｄ２領域やＩＴＳなどのスペーサー領域、さらにはさまざまな遺伝子（ＣＤＳ）の塩基配列の比較研究などを通じて、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群の中には、少なくとも２〜３種類以上の酵母株群が混在しているものと見られているが、こうした指標を用いた判別法（や簡易同定法）で、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、味噌・醤油醸造に寄与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」とを区分け（または判別）する事はできない。
【０２７７】
上記した通り、たとえばＳｕｅｚａｗａらは、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母株群の中には、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の違いを指標にすれば、彼らがＴｙｐｅ１と仮称した塩基配列（を含む２６ＳｒＲＮＡ遺伝子）を持つ株群と、彼らがＴｙｐｅ２と仮称した塩基配列（を含む２６ＳｒＲＮＡ遺伝子）を持つ株群との２群が混在している事を報告しているが（Ｙ．Ｓｕｅｚａｗａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｏｒｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（９），２４５２−２４５５  （２００８））、同報告中のこの２群、すなわちＴｙｐｅ１の塩基配列（を含む２６ＳｒＲＮＡ遺伝子）を持つ株群とＴｙｐｅ２の塩基配列（を含む２６ＳｒＲＮＡ遺伝子）を持つ株群とに区分けした結果、すなわち同報告のｐ２４５３の『Ｔａｂｌｅ  １．  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ａｎｄ  Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｂｙ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ２６Ｓ  ｒＤＮＡ  ａｎｄ  ＩＴＳ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ』を詳しく見てみると、２群のうちの一方、すなわち黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｂｌａｃｋ−ｇｒａｐｅ  ｍｕｓｔ（Ｉｔａｌｙ））から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１１３０株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）やクリーミーケーキ（Ｃｒｅａｍｙ  ｃａｋｅ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）、蜂蜜（Ｈｏｎｅｙ（Ｃａｎａｄａ））から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０６８６株などが含まれるＴｙｐｅ１群には醤油諸味（Ｓｏｙ  ｓａｕｃｅ  ｍａｓｈ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＫＦ−４株やＺＲ１株も含まれているし、もう一方の株群、すなわち醤油諸味（Ｓｏｙ  ｓａｕｃｅ  ｍａｓｈ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＺＲ１４株やＴＳＹ−５株などが含まれるＴｙｐｅ２群の方にも、花（Ｆｌｏｗｅｒ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）が含まれている。つまり、Ｔｙｐｅ１群にも、Ｔｙｐｅ２群にも味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株と「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とが混在しており、ゆえにこの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列の違いを指標とする区分け法だけでは、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株と「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とを判別（または区分け）できない事が分かる。
【０２７８】
ちなみに、Ｓｕｅｚａｗａらは、同報告において、さらにＩＴＳも指標として利用した場合には、さらに９群（＝Ｔｙｐｅ１−I、Ｔｙｐｅ１−II、Ｔｙｐｅ１−III、Ｔｙｐｅ１−Ｖ、Ｔｙｐｅ１−VII、Ｔｙｐｅ２−I、Ｔｙｐｅ２−IV、Ｔｙｐｅ２−VI、Ｔｙｐｅ２−VII）に細分化できると記しているが、この区分け法を用いても、一部の株群（Ｔｙｐｅ）の中には味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株と「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とが混在しており（注：たとえば、ＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ１−Iと名付けた株群の中には、醤油諸味（Ｓｏｙ  ｓａｕｃｅ  ｍａｓｈ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＺＲ１株とクリーミーケーキ（Ｃｒｅａｍｙ  ｃａｋｅ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＩＦＯ１９１４株（＝ＮＢＲＣ１９１４株）とが、またＴｙｐｅ２―VIと名付けた株群の中にも、たとえば味噌諸味（Ｍｉｓｏ  ｐａｓｔｅ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＩＦＯ０５２５株（＝ＮＩＳＬ３４５２株）や醤油諸味（Ｓｈｏｙｕ−ｍｏｒｏｍｉ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＩＦＯ０５２１株（＝ＮＩＳＬ３４５０株）と、花（Ｆｌｏｗｅｒ（Ｊａｐａｎ））から分離されたＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株）が混在しており）、やはり味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株と、「味噌・醤油及びその仕掛品である（味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株とを判別（または区分け）できない事が見てとれる。
【０２７９】
Ｓｕｊａｙａらのグループは、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｍ２株のＩＴＳの鎖長とその制限酵素（ＨａｅIII及びＨｈａI）処理で生じる分解断片長の泳動パターン（が他の味噌酵母などとは異なっている事）を指標としたＭ２株の判別法を開発し、本法を用いて味噌（ｍｉｓｏ）中でのＭ２株の挙動を調べているが（Ｉ．Ｓｕｊａｙａ，Ｙ．Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．Ｔａｎａｋａ，Ｔ．Ｙａｍａｋｉ，Ｔ．Ｉｋｅｄａ，Ｎ．Ｋｉｋｕｓｈｉｍａ，Ｈ．Ｙａｔａ，Ａ．Ｙｏｋｏｔａ，Ｋ．Ａｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｆ．Ｔｏｍｉｔａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９６（５），４３８−４４７  （２００３））、この事は即ちＳｕｅｚａｗａらも上記の報告（Ｙ．Ｓｕｅｚａｗａ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｏｒｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（９），２４５２−２４５５  （２００８））中で示している通り、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株であっても、そのＩＴＳの塩基配列は株ごとに異なっていて、（まだ見出されていないパターンも含めて）いくつものパターンがあるものと見られる。
【０２８０】
同報告中のｐ４４１に載せられた『ＦＩＧ．１．ＩＴＳ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ（Ａ），ａｎｄ  ＨｈａI（Ｂ）  ａｎｄ  ＨａｅIII（Ｃ）  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．』を見てみると、味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の断片長のパターンは１種類ではなく、たとえば味噌から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株であっても、株特有のパターンを示したＭ２株のパターン（＝同ＦＩＧ．１．の電気泳動写真のレーン１９．）、ＩＦＯ１８７６株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株＝ＮＩＳＬ３３６９株（味噌））のパターン（＝同ＦＩＧ．１．の電気泳動写真のレーン１．）、ＩＦＯ０５２５株（＝ＮＩＳＬ３４５２株（味噌））のパターン（＝同ＦＩＧ．１．の電気泳動写真のレーン３．）など、「いくつか」のパターンがある事が分かる。上記のＳｕｅｚａｗａらも、計４２株のＺ．ｒｏｕｘｉｉ株を調べ、６種類のＩＴＳを見出しているが、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群の持つＩＴＳパターンが果たして全部で何種類あるのか、現時点ではまったく分かっておらず、その点が明確にならない限り、このＩＴＳが、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、味噌・醤油醸造に寄与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」と「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」との区分け（または判別）に利用できるのか否かさえ分からない。
【０２８１】
上記した通り、Ｇｏｒｄｏｎらは、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群の中には、［１］黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）のような（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群、［２］ソフトドリンク工場（イギリス）から分離されたＮＣＹＣ３０４２株のようなＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群、そして［３］ＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株＝ＮＩＳＬ３７６３株（味噌））のような（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多いとされる）、上記［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉとの交雑によって誕生したものと見られるＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群の、計３群が混在していると見ており（Ｊ．Ｌ．Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｈ．Ｗｏｌｆｅ：Ｙｅａｓｔ，２５（６），４４９−４５６  （２００８））、Ｈａｒｒｉｓｏｎらは、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群を、さらにこのＧｏｒｄｏｎらが提唱している計３群に区分けするための、株群特異的なプライマーを用いるＰＣＲ法を考案している（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））。
【０２８２】
このＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法は、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））がその染色体Ｆ（１５５４２８８ｂｐ）（ＣＵ９２８１７８．１、ＧＩ：２３８９４０１０３）上に持つイミダゾールグリセロール燐酸デヒドラダーゼ遺伝子（ＨＩＳ３）上の塩基配列を参考にして設計されたプライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ（＝配列番号１８（２２塩基、ＭＷ＝６９２１、Ｔｍ＝５９．９））：
５’−ＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴ−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ（＝配列番号１９（２２塩基、ＭＷ＝６７０８、Ｔｍ＝５９．７））：
５’−ＴＧＣＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡ−３’
（注：以下、上記のプライマーＦｏｒｗａｒｄ（＝配列番号１８）をプライマーＺＲ−１、プライマーＲｅｖｅｒｓｅ（＝配列番号１９）をプライマーＺＲ−２と記す）を用いるＰＣＲ法と、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべきとされるＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））が持つ２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５６０ｂｐ）（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６）と同一の（＝１００％相同な）（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（６２３ｂｐ）（ＡＪ９６６３４２．３、ＧＩ：３８４０８０４６０）を持つ、Ｚ．ｓａｐａｅの基準株であるＡＢＴ３０１株（バルサミコ酢（イタリア））（Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｔ．Ｃ．Ｄａｋａｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（Ｐｔ  １），３６４−３７１  （２０１３））の、ＮＣＹＣ３０４２株が持つイミダゾールグリセロール燐酸デヒドラダーゼ遺伝子（ＨＩＳ３）の部分配列（３６２ｂｐ）（ＡＪ６３４５９４．１、ＧＩ：６１９９９９２１（Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂｏｎｄ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，５（８），７４７−７５５  （２００５）））と、その塩基配列が同一（＝１００％相同）な遺伝子（ＨＩＳ３）の部分配列（４９５ｂｐ）（ＡＭ２７９７０７．１、ＧＩ：１０９６２７４０２、Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｓ．Ｃａｓｓａｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｙｅａｓｔ，２４（５），４０３−４１７  （２００７））を参考にして設計されたプライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ（＝配列番号２０（２０塩基、ＭＷ＝６９２１、Ｔｍ＝５９．９））：
５’−ＧＴＡＡＣＧＧＴＧＴＡＧＣＣＡＣＡＣＡＧ−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ（＝配列番号２１（２０塩基、ＭＷ＝６７０８、Ｔｍ＝５９．７））：
５’−ＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣ−３’
（注：以下、上記のプライマーＦｏｒｗａｒｄ（＝配列番号２０）をプライマーＺＰ−１、プライマーＲｅｖｅｒｓｅ（＝配列番号２１）をプライマーＺＰ−２と記す）を用いるＰＣＲ法との両方を実施し、前者のＰＣＲ法では（［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の）増幅産物が生じるものの、後者のＰＣＲ法では（［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の）増幅産物が生じない供試株を［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべき株だと、また後者のＰＣＲ法では（［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の）増幅産物が生じるものの、前者のＰＣＲ法では（［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の）増幅産物が生じない供試株を［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべき株だと判別し、さらに前者と後者の両方のＰＣＲ法で増幅産物が生じる供試株については［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株だと判別（または区分け）する方法である。
【０２８３】
上記した通り、最近では、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株は、この［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株に相当するものだとの推論も出されており、もしこの推論が正しいとすれば、このＨａｒｒｉｓｏｎらの方法は、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が高いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、味噌・醤油醸造に寄与する能力を持つ（現行の分類上の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株（または味噌・醤油主発酵酵母株）」、つまり［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しい（現行の分類上の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」、つまり［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株や［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ株に区分けすべき株とに区分けできる、味噌・醤油醸造産業上有用な方法だという事になり、大変興味深い。
【０２８４】
そこで、上記の試験３．で生味噌・生醤油から分離した３２株を、このＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法を用いて区分けしてみた。
【０２８５】
試験４．市販の生味噌・生醤油から分離した耐塩性酵母３２株（上記）の、ＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法による判別試験：
【０２８６】
供試株は、上記の試験３．で、生味噌・生醤油から分離した計３２株である。
【０２８７】
供試株の培養、核酸成分の調製（法である（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法）は、上記の試験３．の手順の通りである。
【０２８８】
［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるためのＰＣＲ法では、上記の、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）とプライマーＺＲ−２（＝配列番号１９）、また［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるためのＰＣＲ法では、上記の、プライマーＺＰ−１（＝配列番号２０）とプライマーＺＰ−２（＝配列番号２１）を用いた。用いたプライマーの塩基配列は、上記の通りである。ＰＣＲ法で用いたこれらのプライマーの化学合成は、株式会社日本バイオサービスに委託した（ＤＮＡ合成：スモールスケール品）。
【０２８９】
ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の手順：
ＰＣＲ反応には、タカラバイオ株式会社製キット「ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（製品コード：ＲＲ００２Ａ）」を用いた（注：以下、これをＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法と呼ぶ）。ＰＣＲ反応液の調製は、ほぼ同キット付属の説明書中「○一般的なＰＣＲ反応液量（ｔｏｔａｌ  ５０μｌ）」を参考にした。たとえば、上記の２種類のＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法のうちの１つである「［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）とプライマーＺＲ−２（＝配列番号１９）を使用）」の場合のＰＣＲ反応液２５μｌ分であれば、すなわち同キット付属の緩衝液（１０×Ｂｕｆｆｅｒ）２．５μｌ、同キット付属の硫酸マグネシウム溶液２．５μｌ、同キット付属の核酸溶液（ｄＮＴＰ）４μｌ、キット付属のＬＡ  Ｔａｑ（＝５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼ溶液）０．２５μｌ、鋳型ＤＮＡとして用いる、供試株から調製（または抽出）した核酸成分（濃度は５００〜１０００μｇ／ｍｌ）０．５〜０．７５μｌ、一方のプライマー（＝１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度のプライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）溶液）０．２５〜１．０μｌ、もう一方のプライマー（＝１０ｐｍｏｌ／μｌ濃度のプライマーＺＲ−２（＝配列番号１９）溶液）０．２５〜１．０μｌに、さらに「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水」を加えて、全量を２５μｌにした。つまり、ＰＣＲ反応液中のプライマーと、鋳型ＤＮＡとして用いる核酸成分の濃度を、同キット付属の説明書に記載されている濃度よりも高めに設定している。ＰＣＲ反応用マイクロチューブ１本当たりの反応液量は２５μｌとした。必ずＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）を使用しなければならないわけではなく、たとえば上記の試験３．で用いた同社製のキット「ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（製品コード：ＲＲ００１Ａ）」や東洋紡株式会社製のキット「ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−（製品コード：ＫＯＤ−２０１）」などを用いてもよい。以下に説明するＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ反応についても、特別な注釈がない場合には、これらのＰＣＲ反応液組成／量条件で行なっている。
【０２９０】
用いたＰＣＲサイクラーは、上記の試験３．の通りである。ＰＣＲ法によるＤＮＡ合成反応は、［１］鋳型ＤＮＡの熱変性、［２］アニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼ反応の、３つの過程から構成される。このＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、［１］鋳型ＤＮＡの熱変性温度は９４．０℃、［２］アニーリング温度は６０．０℃（３０秒間）、［３］ＤＮＡポリメラーゼ反応の温度は７２．０℃（３０秒間）とした。［１］〜［３］の反応の繰り返し回数は３５回とした。すなわち、実際のＰＣＲ反応条件は、図３３．〜３６．中の、向かって右側の枠内の［増幅条件］に記した通りである。
【０２９１】
ゲル電気泳動法の手順も、上記の試験３．の通りである。ゲル及び電気泳動用マーカーも、試験３．に記した１．５％アガロースゲル及び１．５％アガロースゲル電気泳動用マーカーを用いた。ＰＣＲ反応後溶液の前処理及びゲル電気泳動処理、ゲルの染色法及び観察方法の手順も、試験３．に記した通りである。
【０２９２】
図３３．は青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．１−１−１株、Ｎｏ．１−１−４株、Ｎｏ．１−１−５株、Ｎｏ．１−１−６株、Ｎｏ．１−２−８株、Ｎｏ．１−２−１３株、Ｎｏ．１−２−１４株、Ｎｏ．１−２−１９株、図３４．は富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．５−１−１株、Ｎｏ．５−１−７株、Ｎｏ．５−１−１０株、Ｎｏ．５−１−１６株、Ｎｏ．５−２−２株、Ｎｏ．５−２−９株、Ｎｏ．５−２−１２株、Ｎｏ．５−２−１７株、図３５．は岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）及び麦味噌Ｄから分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−２−２５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−２−５０株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−１０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−７株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−１４株（麦味噌Ｄ（岡山））、図３６．は埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母株８株、すなわちＮｏ．７−１−２３株、Ｎｏ．７−１−６６株、Ｎｏ．７−１−８３株、Ｎｏ．７−１−８９株、Ｎｏ．７−２−１株、Ｎｏ．７−２−２株、Ｎｏ．７−２−６株、Ｎｏ．Ｎｏ．７−３−４２株の８株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）及びＺＲ−２（＝配列番号１９）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果を示したのが各図の上段（１）の写真）と、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＰ−１（＝配列番号２０）及びＺＰ−２（＝配列番号２１）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果を示したのが各図の下段（２）の写真）で生じた増幅産物をゲル電気泳動した結果を示すゲル写真となっている。それぞれのゲルごとに、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物を、鎖長比較用として、同時に載せたが、このＮＩＳＬ３４６１株はＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に分類すべきとしている株であるため、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）及びＺＲ−２（＝配列番号１９）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の上段（１）の写真）では増幅産物が生じるものの、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＰ−１（＝配列番号２０）及びＺＰ−２（＝配列番号２１）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の下段（２）の写真）では増幅産物が生じない。この条件下において、各図のゲル写真が示す通り、上記の生味噌・生醤油から分離した計３２株のうち、「上記の試験３．の、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ��領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法でＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓだと同定されたＮｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））」を除く３１株の場合には、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）及びＺＲ−２（＝配列番号１９）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の上段（１）の写真）と、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＰ−１（＝配列番号２０）及びＺＰ−２（＝配列番号２１）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の下段（２）の写真）との両方で増幅産物が生じ、しかも［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３遺伝子の有無を調べるための、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）及びＺＲ−２（＝配列番号１９）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の上段（１）の写真）で生じた増幅産物の鎖長は、鎖長比較用の、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））での増幅産物と、目視上は同じであった。
【０２９３】
この結果から、これら３１株は、（現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類され、さらに）ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとしている株だと判明した。
【０２９４】
なお、これら３１株のうちの、たとえばＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））やＮｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））などの２１株については、上記した通り、通常の（２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする）簡易同定法では同定し切れず、「手入力修正した塩基配列」を問い合わせ（クエリー）配列とした相同性検索により、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ）ＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６１株（ＦＲ６９０８６２．１、ＧＩ：３０７０７５８７４）やＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ）ＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６６株（ＦＲ６９０８６１．２、ＧＩ：３０７６１１８９５）などの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（５５４ｂｐ）との類似性が（相違は１％未満と）きわめて高い事も見出したが、このＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６１株やＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６６株は、ＨａｒｒｉｓｏｎらがこのＰＣＲ法に関する報告（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））の中で供試株として用い、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）及びＺＲ−２（＝配列番号１９）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法と、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＰ−１（＝配列番号２０）及びＺＰ−２（＝配列番号２１）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法との両方で増幅産物が生じた事から、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株だと判別した株である。つまり、生味噌・生醤油から分離した、これら３1株はすべて、（１）２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法の結果と、（２）ＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法の結果から、［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとしているＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６１株やＵｎｉＬ（ｅｖｅｒ）２６６株と同じ株群に区分けすべき株である事が判明した。
【０２９５】
また、「上記の試験３．の、２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法でＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓだと同定されたＮｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））」の場合にも、図３６．の通り、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＲ−１（＝配列番号１８）及びＺＲ−２（＝配列番号１９）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の上段（１）の写真）と、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉタイプのＨＩＳ３の有無を調べるための、プライマーＺＰ−１（＝配列番号２０）及びＺＰ−２（＝配列番号２１）を用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（の結果が各図の下段（２）の写真）との両方で増幅産物が生じず、ゆえに「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母」だと正しく判別（または区分け）できた。
【０２９６】
このように、上記の試験３．で生味噌・生醤油から分離した計３２株について、ＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法を用いる事により、上記の試験３．の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法を用いた場合よりも遥かに迅速かつ容易に、うちＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））を除く３１株が、（現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される）ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきだとしている株だと、またＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））についても、「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母だ」と区分け（または判別）できた。
【０２９７】
ただし、このＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法を使って、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などから分離した酵母株を同定する場合には、供試株１株につき、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に特異的なプライマーを用いてのＰＣＲ法と、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に特異的なプライマーを用いてのＰＣＲ法の両方、つまり供試株１株当たり２種類のＰＣＲ法を実施し、その両方で、予測通りの鎖長を持つ増幅産物が生じるか、あるいは生じないかを確認する必要がある。
【０２９８】
上記した通り、［Ｃ］「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、味噌・醤油醸造に寄与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群」を、さらに（皮膜形成能を持たず、それゆえに）味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と、（皮膜形成能を有し）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質劣化を引き起こす味噌・醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株とに区分けする事も、味噌・醤油醸造における仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）及び製品などの品質管理上きわめて重要な事であり、これらを判別（または区分け）する方法も産業上有用である。
【０２９９】
現時点で、両者を判別（または区分け）するための形態学的及び生理学的性質・細胞成分検査法としては、実際に供試株を醤油に接種して、静置培養し、皮膜が形成されるか否かを調べる方法、いわゆる「醤油産膜性試験」と、その他には寒天培地上の菌集落（コロニー）の形態や色調を指標に目視で判別（または区分け）する方法、また遺伝学的な検査としてはＲＡＰＤ法などの報告がある。
【０３００】
酵母の産膜性能の有無を調べる方法、すなわち「産膜性試験」の手順は、たとえば飯塚廣及び後藤昭二（著）の「酵母の分類同定法（東京大学出版会  （１９６９））」中のｐ３０−３１に詳しく記されている。すなわち、培地は試験管や三角フラスコに入れた『（i）麦芽汁（ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）またはＹＭ（ｐｅｐｔｏｎｅ・ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ・ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｍｅｄｉｕｍ：０．５％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、０．３％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス、０．３％（Ｗ／Ｖ）マルツエキス、１．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース）、あるいは培地（ii）（０．１％酵母エキス（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、０．２％グルコース、０．０５％硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、０．１％燐酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、０．０７％硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、０．０１％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１％塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、ｐＨ＝３．４）』や、場合によっては『（iii）清酒、醤油、ブドウ汁、ブドウ酒など』を用い、この培地に『（ｐ３０−３１）（前略）酵母１白耳接種、１５〜２０℃で４〜７日間、ときには３週間まで培養し皮膜の形成状況を観察する。（中略）Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属などでは前記（i）、（ii）両培地に皮膜を形成するが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ系）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ属などの一部の種類では、培地（ii）のみに産膜し、仮性産膜性酵母とも呼ばれる。』とある。
【０３０１】
上記した通り、濃口醤油は１６％前後ないしはそれ以上の食塩（ＮａＣｌ）を含んでいるため、醤油中で皮膜を形成できるのは、こうした高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む環境への適応性が高い、すなわち高い耐塩性能を有する産膜性酵母株（＝醤油産膜性酵母株）のみであり、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種に分類されている株群に含まれる株ぐらいしかいない。しかしながら、培地（ｉ）や（ii）は、高濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでいないために、この培地（i）ないしは（ii）を使う方法は、あくまで供試株（＝酵母）が液体培地中で皮膜を形成する能力を持っているか否かを調べるための方法に過ぎず、この方法で産膜酵母であると判別された供試株群の中には、たとえば（図７．のＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株のような）Ｐｉｃｈｉａ属酵母などのような、醤油中では皮膜を形成する事ができない株、すなわち産膜性／醤油「非」産膜性株も含まれている。そのため、供試株が醤油中で皮膜を形成するか否かを調べるためには、培地として、（iii）のうちの「醤油」を用いる必要がある。
【０３０２】
この「供試株が醤油中で皮膜を形成するか否かの試験」、すなわち「醤油産膜性試験」の実施手順は、たとえば伊藤武・森地敏樹（編）の「食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―（サイエンスフォーラム  （２００４））」中の「第７章  高塩分食品・アルコール飲料で問題となる微生物」の「第１節  醤油（ｐ１８７―１９３（半谷吉識（著）））」の項にも記されている。すなわち、『（ｐ１８８）（前略）方法としては、あらかじめ殺菌した試験管に０．４５μｍのメンブランフィルターで除菌した被検醤油を５ｍｌ入れ、それに分離した酵母を終濃度１０４個／ｍｌ程度になるように接種し、２５℃で静置培養する。培養期間は目的に応じて変更すればよいが、一般に２〜３週間程度を目安とする。醤油に産膜酵母が生育した場合は、目視ですぐ分かる。はじめはスポット状に白い菌の塊が表面に見られるようになり、それが次第に大きくなり、最終的には醤油の表面全体を覆うまでになる。（後略）』。つまり、同方法で醤油産膜性酵母であるか否かを判別するには、２〜３週間もの日数を要するという事である。もちろん、供試株の接種菌数を増やせば、醤油に接種してから皮膜が形成され始めるまでの日数をある程度は短縮し、つまり判別（または区分け）結果を得るまでに要する日数を短くする事はできる。
【０３０３】
試験５．供試株の醤油産膜性試験：
上記の試験１．や試験２．で用いた供試株２０株について、醤油中での産膜性能、すなわち醤油産膜性能の有無を調べる「醤油産膜性試験」を行なってみた。
【０３０４】
本試験、すなわち供試株の産膜性試験で用いた液体培地は、ＹＭ液体培地、ＹＰＤ液体培地、生醤油液体培地、濃口醤油及び濃口生揚げ醤油、また同試験で用いた寒天培地は、１０％塩化ナトリウム加ＹＤ寒天及び生醤油寒天である。
【０３０５】
ＹＭ液体培地の培地組成：
１％（Ｗ／Ｖ）グルコース、２．１％（Ｗ／Ｖ）ＹＭブロス（ＹＥＡＳＴ  ＭＯＬＤ  ＢＲＯＴＨ（ＢＤ製、製品コード：２７１１２０））、ｐＨ＝５．０（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。
【０３０６】
ＹＭ液体培地の調製法：
１ｇグルコース、２．１ｇのＹＭブロスを蒸留水に溶かし、１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝５．０に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。この液体培地５ｍｌずつを試験管に分注し、産膜性試験用の試験管の口はシリコ栓で、また産膜性試験用に用いる種培養液調製用の試験管の口は綿栓で塞いだ状態で、高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌する。
【０３０７】
ＹＰＤ液体培地の培地組成及び調製法は上記の試験３．中の手順の通りである。ただし、上記の図１０．で用いた０．２〜１６．０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＰＤ液体培地は、このＹＰＤ液体培地に、０．２〜１６％（Ｗ／Ｖ）分の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えた後にｐＨ調整したものである。なお、この液体培地５ｍｌを入れた試験管のうち、産膜性試験用の試験管の口はシリコ栓で、また産膜性試験用に用いる種培養液調製用の試験管の口は綿栓で塞いだ。
【０３０８】
生醤油液体培地の培地組成及び調製法は上記の試験１．中の手順の通りである。なお、この液体培地を入れた試験管のうち、産膜性試験用の試験管の口はシリコン栓で、また産膜性試験用に用いる種培養液調製用の試験管の口は綿栓で塞いだ。
【０３０９】
醤油産膜性試験に用いる濃口醤油は、上記の試験２．中にも記した通り、市販（醤油）製品のうち、製品ラベルの「原材料名」欄に原材料として記されているのが「大豆（遺伝子組換えでない）」、「脱脂加工大豆（遺伝子組換えでない）」、「小麦」、「食塩」、「アルコール」のみであり、それ以外の原材料、たとえば保存料（安息香酸ナトリウムやパラオキシ安息香酸エステル類）などの食品添加物に関する記述がないもの、すなわち群馬県や千葉県、香川県などにある醤油メーカー７社（Ａ〜Ｇ）の市販の濃口醤油各３本ずつ、計２１試料を用いた。濃口醤油２１試料の成分値は、表２〜４．の通りである。
【０３１０】
また、濃口生揚げ醤油については、上記の７社のうちの１社から入手した濃口生揚げ醤油（＝脱脂加工大豆、大豆、小麦、食塩を原料とする、発酵・熟成後の濃口醤油諸味の圧搾後液汁を清澄化処理したもの。火入れ処理前（＝非加熱）、成分無調整）を用いた。
【０３１１】
濃口醤油の調製法、濃口生揚げ醤油の培地組成及び調製法は上記の試験２．中の手順の通りである。この液体培地５ｍｌを入れた試験管（は、醤油産膜性試験用としてのみ使用したため、試験管）の口はすべてシリコン栓で塞いだ。
【０３１２】
１０％塩化ナトリウム加ＹＤ寒天の培地組成及び調製法は上記の試験１．中の手順の通りである。
【０３１３】
生醤油寒天の培地組成：
７％（Ｗ／Ｖ）グルコース、７．５１％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生揚げ醤油（＝脱脂加工大豆、大豆、小麦、食塩を原料とする、発酵・熟成後の濃口醤油諸味の圧搾後液汁を清澄化処理したもの。火入れ処理前（＝非加熱）、成分無調整）、２．４％（Ｗ／Ｖ）寒天（和光純薬工業（株）製、製品コード：Ｎｏ．０１０−１５８１５）、ｐＨ＝５．２〜５．３（１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）でｐＨ調整）。（注：上記の試験３．で用いた「味噌・醤油酵母株分離用生醤油寒天」の培地組成とは、若干異なっている）
【０３１４】
生醤油寒天の調製法：
７ｇグルコース、７．５１ｇ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１５ｍｌ濃口生揚げ醤油、２．４ｇ寒天を蒸留水に溶かし、これに１Ｎ塩酸（ないしは１Ｎ水酸化ナトリウム）を加えてｐＨ＝５．２〜５．３に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにする。これを高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した後、熱いうちに、クリーンベンチ内などの無菌条件下で、殺菌済みシャーレに（シャーレ１枚につき約１０ｍｌずつ）流し込み、冷やして固める。
【０３１５】
産膜性試験用に用いる種培養液の調製：
上記のＹＭ液体培地での産膜性試験に用いる種培養液は、綿栓で口を塞いだ試験管に入れたＹＭ液体培地、上記のＹＰＤ液体培地での産膜性試験に用いる種培養液は、綿栓で口を塞いだ試験管に入れたＹＰＤ液体培地、上記の生醤油液体培地、濃口醤油、濃口生揚げ醤油での産膜性試験に用いる種培養液は、綿栓で口を塞いだ試験管に入れた生醤油液体培地で、それぞれ３０℃、１８時間振とう（１４０ｒｐｍ．）培養したものを用いた。
【０３１６】
醤油産膜性能の有無の判定：
試験用の液体培地５ｍｌ（入りの試験管）に、供試株の種培養液（を液体培地の２％（Ｖ／Ｖ）に相当する）０．１ｍｌ、または（液体培地の２０％（Ｖ／Ｖ）に相当する）１．０ｍｌを接種し、その口をシリコン栓で塞いだうえで、３０℃に設定した培養器（または恒温器）内で静置培養した。試験に用いた液体培地は、ＹＭ液体培地やＹＰＤ液体培地、生醤油液体培地、濃口醤油や濃口生揚げ醤油であり、供試株をＹＭ液体培地、ＹＰＤ液体培地、生醤油液体培地に接種した場合には最大１０日間、また濃口醤油及び濃口生揚げ醤油の場合には３０日（だが、一部の株についてのみ最大４５日）間培養した。ただし、ＹＭ液体培地、ＹＰＤ液体培地、生醤油液体培地を用いた産膜性試験の結果は、供試株の特徴、すなわち産膜性能の有無を調べるための調査に過ぎない。供試株の醤油中での皮膜形成能（＝醤油産膜性能）の有無は、あくまで濃口醤油を用いた「醤油産膜性試験」での結果に基づいて判定した。
【０３１７】
上記の試験２．の「供試株の醤油中での生存性試験」では、濃口醤油５ｍｌに対して、供試株の種培養液を（濃口醤油容量の２％（Ｖ／Ｖ）に相当する）０．１ｍｌ接種した後に、３０℃に設定した培養器（または恒温器）内で３０日間静置培養したために、培養終了時、すなわち３０日後の時点で（うち醤油産膜性能を持たない株を接種した濃口醤油（試験区）では、醤油の液面には目視で確認できるような変化は生じないものの）醤油産膜性能を持つ株を接種した濃口醤油（試験区）では、醤油の液面に、目視ではっきりと確認できる、白〜淡い褐色の、乾燥して粉をふいたような性状の皮膜が形成された。この醤油の液面に形成された皮膜は、上記した通り、醤油産膜性酵母株の細胞の凝集体であり、たとえばヤマト科学株式会社製タッチミキサＭＴ−３１（注：回転数は２８００〜３３００ｒｐｍ．程度）を使ってよく攪拌してもなかなか崩れず、ゆえに皮膜が形成された濃口醤油などから、酵母の細胞がきれいに分散した状態の、均質な溶液を調製する事はできなかった。上記の試験２．の「供試株の醤油中での生存性試験」において、培養終了後の醤油の液面に皮膜が形成された試験区を同試験（＝生存性試験）の「対象外」としたのは、均質な溶液を調製（して生存酵母数を測定する事が）できなかったためである。この試験５．では、供試株１株につき、その種培養液を濃口醤油容量（５ｍｌ）の２％（Ｖ／Ｖ）に相当する０．１ｍｌ接種した試験区と、２０％（Ｖ／Ｖ）に相当する１．０ｍｌ接種した試験区との、計２種類の試験区をつくり、ともに３０℃に設定した培養器（または恒温器）内に置いて、３０日間静置培養した後の醤油の液面での皮膜の形成の有無を目視で確認し、両試験区のうちの少なくともどちらか一方で皮膜が形成された場合に、供試株が醤油産膜性株だと判別し、両試験区ともに皮膜が形成されなかった場合には、醤油「非」産膜性株だと判別した。なお、たとえば醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜（カナダ）））の種培養液を生醤油液体培地に接種した場合（＝図３７．の（１）の写真）や、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる醤油「非」産膜性のＮｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））の種培養液を濃口醤油に接種した場合（＝図３７．の（２）の写真）のように、供試株によっては、生醤油液体培地や濃口醤油などの液面と試験管との接触面ないしはやや上方の管壁に細胞の塊（＝管壁付着物）が付着する事もあったが、これは「皮膜」ではなく、ゆえにこのような「管壁付着物」が形成されるものの、「皮膜」が形成されなかった場合には、供試株は醤油「非」産膜性株であると判別（または区分け）した。
【０３１８】
【表５】
2015228833.tif 000007
【０３１９】
表５．は、さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株２０株の醤油産膜性能の有無を調べた結果をまとめたものである。濃口醤油中で皮膜を形成した、すなわち醤油産膜性株はいずれも味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された４株、すなわちＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株（溜醤油諸味））、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株（醤油））であり、それ以外の１６株の種培養液を接種した醤油には、皮膜が形成されなかった。
【０３２０】
図６．は、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株だと判別された株のうちの１株である、溜醤油諸味から分離されたＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）を市販の濃口醤油II（注：醤油の各種成分濃度は以下の通り。食塩分（ＮａＣｌ）１６．２０％（Ｗ／Ｖ）、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）１．５９４％（Ｗ／Ｖ）、還元糖分（Ｒ．Ｓ．）２．７３％（Ｗ／Ｖ）、エタノール２．９９％（Ｖ／Ｖ）、ｐＨ＝４．８６）に、接種後の細胞の濃度（＝終濃度）が上記の方法の１００倍、すなわち１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように接種して（＝改変法）、３０℃で静置培養した場合の、培養経過に伴う皮膜形成の様子を試験管の側面から撮影したものである。この改変法を用いた場合でも、皮膜の形成が始まるのは接種後（６〜）７日であり、つまりこの株が醤油産膜性酵母であるとの判別結果を得るのに、最低でも（６〜）７日の日数を必要とする。
【０３２１】
【表６】
2015228833.tif 000008
【０３２２】
接種してから皮膜が形成されるまでに要する日数は、供試株の種類や試験に用いる醤油などの成分組成によっても大きく異なる。たとえば、表６．は、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉであるＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））及びＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株（醤油））を含む計５株を、（１）生醤油液体培地及び（２）市販の濃口醤油計７種類（＝濃口醤油Ａ１、濃口醤油Ｂ１、濃口醤油Ｃ１、濃口醤油Ｄ１、濃口醤油Ｅ１、濃口醤油Ｆ１、濃口醤油Ｇ１）に終濃度が１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように接種して、３０℃で３０日間静置培養した場合の皮膜の有無（液面の写真）と、接種してから皮膜が形成され始める、すなわち図６．の接種後（６〜）７日の写真のような「醤油の表面に粉、試験管壁に白い付着物が発生した」状態に達するまでに要した日数（が写真下の括弧内の数値）を示したものである。
【０３２３】
表６．中の写真が示す通り、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉであるＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））及びＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株（醤油））は、生醤油液体培地及び濃口醤油７種類（Ａ１〜Ｇ１）のすべて（の試験区）で皮膜を形成したが、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））はすべての試験区で皮膜を形成しなかった。また、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））とＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌）は、（１）塩化ナトリウム濃度が１０．９９％の生醤油液体培地に接種した際には皮膜を形成したものの、（２）食塩分（ＮａＣｌ）が１５．６２％（Ｗ／Ｖ）（濃口醤油Ｇ１）〜１６．２４％（Ｗ／Ｖ）（濃口醤油Ｂ１）と高い濃口醤油７試料すべてにおいて皮膜を形成しなかった。つまり、これら２株は、（液体培地の条件次第では）皮膜を形成する、いわゆる産膜性能自体は持っているものの、（２）食塩（ＮａＣｌ）濃度の高い濃口醤油中では皮膜を形成する能力、すなわち醤油産膜性能は持っていない、すなわち「産膜性／醤油「非」産膜性酵母株」である事が判明した。
【０３２４】
同じ醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株でも、濃口醤油中での増殖速度が株によって異なるため、接種してから皮膜が形成され始めるまでに要する日数も異なる。たとえば、表６．の（２）の濃口醤油Ｃ１の場合、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））は接種後６日で皮膜を形成し始めたのに対して、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）は接種後１２日、また濃口醤油Ｅ１の場合だと、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））は接種後７〜８日で皮膜を形成し始めたのに対して、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）は接種後１３日、濃口醤油Ｇ１の場合だと、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））は接種後１５〜１６日で皮膜を形成し始めたのに対して、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）は２２〜２３日と、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））とＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）とでは皮膜を形成し始めるまでの所要日数が異なる、つまりＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）のほうがより長かった。
【０３２５】
【表７】
2015228833.tif 000009
【０３２６】
また、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））を接種してから皮膜が形成され始めるまでに要する日数は、７社の市販の濃口醤油７種類（＝濃口醤油Ａ１〜Ｇ１）を用いた試験結果（表６．の（２））や７社２1種類の濃口醤油を用いた試験結果（表７．（注：皮膜形成の様子を撮影した写真は省略)）に示した通り、早いもの（＝濃口醤油Ａ２）では接種後５〜６日、遅いもの（＝濃口醤油Ｇ１）では１５〜１６日と、濃口醤油の種類、たとえば醤油メーカーや製品ロットの違いによっても大きく異なる。上記した通り、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉによる皮膜形成を抑制する醤油中の成分としては、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）、アルコールや食塩（ＮａＣｌ）などがあるが、本試験で用いた市販の濃口醤油中のこれらの成分値が、表２．〜４．の通り、醤油メーカーの醤油（製品）ごとに異なっているために、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を接種してから皮膜が形成され始めるまでの所要日数もメーカーの醤油（製品）ごとに異なってくるようである。
【０３２７】
たとえば、表２．〜４．に示した市販の濃口醤油計２１種類の各種成分値（％）をよく見てみると、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））を接種してから皮膜が形成され始めるまでに１４〜１６日もかかったＧ社の濃口醤油Ｇ１〜Ｇ３は、接種してから皮膜が形成され始めるまでに５〜６日しかかからなかったＡ社の濃口醤油Ａ１〜Ａ３に較べると、食塩分（ＮａＣｌ）や全窒素分（Ｔ．Ｎ．）は幾分低めだが、エタノール濃度はＡ社の濃口醤油が２．６２％（Ｖ／Ｖ）（濃口醤油Ａ２）〜２．９８％（Ｖ／Ｖ）（濃口醤油Ａ１）であるのに対して、Ｇ社の濃口醤油は３．６１％（Ｖ／Ｖ）（濃口醤油Ｇ２）〜３．９１％（Ｖ／Ｖ）（濃口醤油Ｇ１）と、１％（Ｖ／Ｖ）近くも高く、恐らくはこの事がこの皮膜形成に至るまでの所要日数の差の原因となったものと思われる。
【０３２８】
さらに、表２．〜４．に示した市販の濃口醤油計２１種類の各種成分値（％）を見れば分かる通り、同じメーカーの醤油（製品）であっても、成分値はその製品（ロット）ごとにも多少異なるため、同じメーカーの濃口醤油にＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））やＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）を接種して３０℃で静置培養した場合であっても、接種してから皮膜が形成され始めるまでに要する日数は製品（ロット）ごとで若干異なってくる。
【０３２９】
表７．に示した通り、たとえばＡ社の濃口醤油Ａ１〜Ａ３にＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）を接種してから皮膜が形成され始めるまでに要する所要日数は、エタノール濃度が低めの濃口醤油Ａ２（２．６２％（Ｖ／Ｖ））や濃口醤油Ａ３（２．６９％（Ｖ／Ｖ））では６〜８日だが、エタノール濃度が高めの濃口醤油Ａ１（２．９８％（Ｖ／Ｖ））では８〜９日と少し長くなり、また上記した、他社に較べるとエタノール濃度が高めのＧ社の濃口醤油の場合には、濃口醤油Ｇ１では接種後１５〜１６日で皮膜が形成され始めたものの、濃口醤油Ｇ２や濃口醤油Ｇ３では、接種後４５日まで培養期間を延長しても、結局皮膜を形成しなかった。この事はすなわち、もしＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）の醤油産膜性試験を、Ｇ社の濃口醤油だけを用いて行なった場合には、他のメーカーの醤油中では皮膜を形成する醤油産膜性株である同株を「醤油産膜性酵母株（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）ではない」と誤って判別（または区分け）する危険性がある事を示している。
【０３３０】
つまり、醤油中で皮膜を形成する醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるか否かを判別する上で重要な、醤油産膜性試験における「皮膜形成に至るまでの所要日数」は、醤油の種類や供試株の種類によっても大きく異なるため、用いる醤油自体を注意深く選ばないと（あるいは注意深く選べるだけの力量を持つ熟練者が試験を行なわないと）、判別（または区分け）を誤る危険性もある。
【０３３１】
醤油産膜性酵母株（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）を市販の濃口醤油に接種してから皮膜が形成され始めるまでに５日以上もの日数を要するのは、市販の濃口醤油が通常１６％前後ないしはそれ以上の食塩（ＮａＣｌ）、３％前後ないしはそれ以上のエタノール、１．５％以上の全窒素分（Ｔ．Ｎ．）などの「皮膜形成を抑制する成分」を含んでいて、それらの成分によって醤油産膜性酵母株（＝醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株）の活動が抑制されるためである。市販の濃口醤油の代わりに、濃口醤油よりも食塩（ＮａＣｌ）やエタノール、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）の濃度の低い液体培地を用いて、産膜性試験を行なえば、供試株が産膜性酵母であるか否かの判別をより迅速に行える。
【０３３２】
表６．の（１）は、市販の濃口醤油よりも食塩（ＮａＣｌ）やエタノール、全窒素分（Ｔ．Ｎ．）の濃度の低い生醤油液体培地に、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））やＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）を含む計５株を、終濃度が１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように接種して、３０℃で１０日間静置培養した場合の皮膜の有無（液面の写真）と、接種してから皮膜が形成され始めるまでに要した日数（が括弧内の数値）を示したものである。表６．の（１）の通り、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））とＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）は、接種してから２日という、上記の濃口醤油を用いた場合よりも遥かに早い日数で皮膜を形成し始めた。
【０３３３】
ただし、この生醤油培地を用いた産膜性試験では、市販の醤油濃口醤油７種類、すなわち濃口醤油Ａ１〜Ｇ１に接種した際には皮膜を形成しなかったＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））やＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌）も皮膜を形成してしまう。つまり、この生醤油培地を用いた産膜性試験では、より迅速に結果を得る事はできるものの、それは供試株が液体培地中で皮膜を形成する能力を有しているか否か、すなわち「産膜性能」の有無を調べているに過ぎず、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株のみを持つ、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む醤油中での皮膜形成能、すなわち醤油産膜性能を調べてはおらず、ゆえにこの方法では醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を判別（または区分け）できない。
【０３３４】
醤油中で皮膜を形成しない醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株は、寒天培地上で培養した際に、クリーム色の、表面がすべすべした菌集落（コロニー）を形成する事が多いのに対して、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の方は、寒天培地上で培養した際に、白っぽく、粉をふいたような菌集落（コロニー）を形成する事が多いため、両者を適当な寒天培地上で培養して、その菌集落（コロニー）の色調や形状を指標に、目視で判別（または区分け）する方法が以前は用いられていた。
【０３３５】
たとえば、味噌や醤油の仕込み工程において、味噌・醤油諸味中の味噌・醤油酵母の菌数を計測する際には、上記の試験３．の手順のように、味噌・醤油諸味を１０〜１５％塩化ナトリウム水溶液で適宜希釈したうえで、生醤油寒天に塗抹し、これを２５〜３０℃で２〜７日培養し、同寒天上に出現した菌集落（コロニー）を計測する方法が用いられるが、その際に同寒天上に出現した菌集落（コロニー）の色調や形状を指標に、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株とを目視で判別（または区分け）していた事もあったようである（好井久雄・金子安之・山口和夫（著）：＜改訂増補版＞  食品微生物学、ｐ４５７−４５９、技報堂出版  （１９７６））。
【０３３６】
図３９．及び図４０．、図４１．は、溜醤油諸味から分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）及び味噌から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）、花から分離された産膜性／醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株）、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株である、「非」産膜性のＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）、醤油諸味から分離された「非」産膜性のＣａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ  ＮＩＳＬ３７２０株（＝ＩＦＯ１００３７株）、味噌から分離された産膜性／醤油「非」産膜性酵母株であるＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株などを生醤油寒天（ｐＨ＝５．３）（図３９．及び図４０．）と１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天上（注：写真（図４１．）は、菌集落（コロニー）の色調が見やすいように、青紙上に（寒天培地の）シャーレを置いて撮影したものである）で培養した際の菌集落（コロニー）の様子を撮影した写真である。
【０３３７】
確かに、どちらの寒天上においても、濃口醤油に接種した際に皮膜を形成する醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の菌集落（コロニー）の色調は、そもそも皮膜形成能を持たない「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））（図３９．〜４１．）やＮＩＳＬ３４６８株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の菌集落（コロニー）の色調（図４０．及び図４１．）と較べると、白っぽく粉をふいたような感じで、この違いは目視でも識別できる（注：なお、生醤油液体培地に接種した際には皮膜を形成するものの、濃口醤油中では皮膜を形成しない産膜性／醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））は、図１．でも示した通り、耐塩性能が弱く、１０％の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む生醤油寒天（ｐＨ＝５．３）（図４０．）や１０％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ寒天上（図４１．）では生育できず、菌集落（コロニー）を形成しない）。
【０３３８】
ただし、こうした酵母数計数用の寒天培地の食塩（ＮａＣｌ）濃度は醤油よりも低いために、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の産膜性／醤油「非」産膜性酵母株も生育可能で、たとえば味噌から分離された産膜性／醤油「非」産膜性酵母株であるＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株も、生醤油寒天上では産膜性酵母株特有の白っぽい色調の菌集落（コロニー）を形成する。Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａは、味噌や（特に仕込み初期の）醤油諸味などからも分離される酵母株であり、図４０．及び図４１．中の（１）生醤油液体培地中で皮膜を形成している写真が示す通り、産膜性能は持つものの、耐塩性能が弱いために、図４０．及び図４１．中の（２）濃口醤油に接種した場合の写真が示す通り、１６％前後ないしはそれ以上の食塩（ＮａＣｌ）を含む醤油（製品）やその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）の中では生育できず、特に醤油（製品）中では皮膜を形成しない、つまり醤油産膜性酵母株ではない、すなわち醤油「非」産膜性の産膜性酵母株である。つまり、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離した酵母株群を、こうした寒天上に出現した菌集落（コロニー）の（白っぽい）色調や形状を指標にして、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と、このような産膜性／醤油「非」産膜性酵母株とに目視で判別（または区分け）するのは非常に難しい。
【０３３９】
上記した茂木らのグループは、（現行の分類でのＺ．ｒｏｕｘｉｉに相当する）Ｓ．ｒｏｕｘｉｉと（現行の分類でのＣａｎｄｉｄａ属酵母に相当する）Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属酵母との免疫学的手法（スライド凝集法）を用いた判別法を検討した過程において、（現行の分類での、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに相当する）『（ｐ６１６）（前略）醤油の白カビの原因となるＳａｃｃｈ．ｒｏｕｘｉｉ  ｖａｒ．ｈａｌｏｍｅｍｂｒａｎｉｓと推定され（る株は）、血清学的に（現行の分類での、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに相当する）非産膜性のＳ．ｒｏｕｘｉｉとやや差異が認められた（後略）』と報告しており（茂木恵太郎、逆井利夫：農化、４８（１１）、６１３−６１７  （１９７４））、非常に興味深いものの、これを指標に両者を判別（または区分け）できる方法としてまではつくり上げてはいない。また、上記した通り、こうした免疫学的な方法は作業が煩雑であり、熟練を要する。
【０３４０】
味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と、「悪玉菌」と評される味噌・醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株とを判別（または区分け）するためのＲＡＰＤ法の実施手順も、同じく伊藤武・森地敏樹（編）の「食品のストレス環境と微生物―その挙動・制御と検出―（サイエンスフォーラム  （２００４））」中の「第７章  高塩分食品・アルコール飲料で問題となる微生物」の「第１節  醤油（ｐ１８７−１９３（半谷吉識（著）））」のｐ１８８−１８９「１．３  遺伝子を用いた検査方法」の項で簡単に触れられている。手順は以下の通りである。まず、ゲノムＤＮＡ抽出法や、たとえばタカラバイオ株式会社の「Ｇｅｎとるくん（登録商標）（酵母用）」などのキットなどを使って、供試株と、「比較用の酵母」、つまりこの場合であれば、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株や醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株などのゲノムＤＮＡをそれぞれ調製（または抽出）して、これらを鋳型とする、アマシャム・バイオサイエンス株式会社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製のキット「Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＡＰＤ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂｅａｄｓ」を用いたＰＣＲ反応を実施し、供試株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応で生じた増幅産物のパターン（またはバンドパターン）、すなわち増幅産物の数とそれぞれの鎖長を、比較用の酵母から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応で生じた増幅産物のパターンと比較して、供試株を「供試株と同じパターンを示した比較用の酵母株」と同一株ないしはそれに近い株だと判別する。
【０３４１】
しかしながら、本手法についてのこれ以上の詳細な実施手順は公表されておらず、詳細は不明である。本手法では、（同書「食品のストレス環境と微生物」中のｐ１８９の「図−３  ＲＡＰＤ法による産膜酵母の識別（注：非産膜酵母１株及び産膜酵母２株の場合の増幅産物をゲル電気泳動法で処理した際のゲル写真）」を見たところ）鎖長の異なる複数の増幅産物が生じるため、そのバンドパターンの比較作業が煩雑であり、時には判別にも熟練を要する。
【０３４２】
そもそも、上記した通り、ＲＡＰＤ法自体が、緩い条件設定でＰＣＲ反応を行なう方法であるために、バンドパターンの再現性そのものが低いという弱点もある。同書「食品のストレス環境と微生物」では、この点の改善に「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ−ｓｉｔｅ化（配列タグ部位化（ＳＴＳ化））」が有効だと記されているが、この方法はあらかじめ『（ｐ１８９（半谷吉識（著）））（前略）ＲＡＰＤ法で得られた識別マーカーとなるバンドの配列を決定し、そのバンドだけが増幅できるようなプライマーおよびＰＣＲ条件を設定（後略）』しておいたうえで、ＲＡＰＤ法（による判別）を行なうというものであり（伊藤武・森地敏樹（編）：食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―、サイエンスフォーラム  （２００４））、この事前の最適化（準備）作業は非常に煩雑である。また、本手法で得られるバンドパターンは酵母株ごとに異なっているため、数多くの比較用の酵母株とそのバンドパターンに関するデータとをあらかじめ収集しておく必要がある。ただ、供試株の判別（または区分け法）作業前に、すべての酵母株のバンドパターンを網羅的に収集しておく事は、理論上不可能であろう。つまり、得られた供試株のバンドパターンが「手持ちの比較用の酵母株のバンドパターン群の中の醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株のバンドパターン」と同一であれば、供試株がその比較用の醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と同一株であるか、あるいはそれにきわめて近い醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であると判別（または区分け）できるが、得られた供試株のバンドパターンが「手持ちのバンドパターン」群の中にない場合には、その供試株が「醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか」という判別（または区分け）ができないのはもちろん、その供試株がそもそも「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉであるか否か」さえ判別（または同定）できない。
【０３４３】
上記した通り、渡部らは、ワインやシェリーから分離された産膜性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株での知見（Ｍ．Ｉｓｈｉｇａｍｉ，Ｙ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．Ｈａｙａｋａｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０（３），６６０−６６６  （２００６）、戸田康裕、中川洋史、飯村穣：日本農芸化学会大会（福岡国際会議場・マリンメッセ福岡（福岡））講演要旨集、平成２１年度、ｐ２５６（講演番号３Ｐ０７１８Ｂ）、２００９−０３−２９  （２００９）、Ｙ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｙ．Ｔｏｄａ，Ｈ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｍ．Ｈａｙａｋａｗａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｉｉｍｕｒａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１１（１），７−９  （２０１１））を参考にして、醤油諸味中に形成された皮膜から分離した産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｚ３株の皮膜形成に関わる遺伝子を調べ、「（上記の、公開されているＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の全ゲノム情報の中から見出した、ＦＬＯ１１様蛋白質をコードしているものと思われる３つの遺伝子、すなわちＦＬＯ１１Ａ、ＦＬＯ１１Ｂ、ＦＬＯ１１Ｃは、皮膜形成には関係しない事を確認したが、それとは異なる）新規」のＦＬＯ１１様蛋白質をコードしているものと見られるＦＬＯ１１Ｄ遺伝子を見出した事を報告しているが（渡部潤、上原健二、茂木喜信：醤研、３８（６）、３７０（第７５回  研究発表会講演要旨集（平成２４年度成田大会））  （２０１２）、Ｊ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｕｅｈａｒａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｏｇｉ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９５（２），３９３−４０５  （２０１３））、このＦＬＯ１１Ｄが醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を識別（または区分け）するための指標として利用できるか否かについての（複数の醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を供試株とした）検証を行なったとの報告は、現時点ではまだない。
【０３４４】
このように、現時点では、［Ｃ］「（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く）皮膜形成能を持たず、それゆえに味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」と、「（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高いが）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」とを精度よく判別（または区分け）する方法もない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０３４５】
本発明は、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などから分離した酵母群を、まず［Ａ］［１］現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群と［２］それ以外の酵母株群（Ｃａｎｄｉｄａ属酵母など）とに区分けし、さらにそのうちの［１］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群については、［Ｂ及びＣ］［１］−２−１．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、しかも皮膜形成能は持っていないがゆえに、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群、［１］−２−２．（同じく）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多いものの、こうした環境中で皮膜を形成する能力を持ち、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質劣化を引き起こす事から、「悪玉菌」と評される醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群、［１］−１．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の３群に区分けするための、簡便な遺伝学的な方法を提供する事を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０３４６】
本発明は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株が染色体Ｃ上に持つ、トリプトファン転移（または運搬）ＲＮＡ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ（ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）））遺伝子と見られる塩基配列部分と、その下流に位置する未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ））との間にある塩基配列部分や、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）と、その下流に位置する未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）との間にある（３７４４９８番目の塩基を含む）塩基配列部分、ないしはこれらの配列部分を含む塩基配列部分を増幅するためのＰＣＲ法などで生じる増幅産物の有無、及びその鎖長、プラスミドｐＳＲ１上の部分塩基配列との類似性が高い塩基配列部分の有無や塩基配列の特徴、特にＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基多型（ＳＮＰ）を指標として用いる、酵母株の判別（または区分け）法である。
【発明の効果】
【０３４７】
本発明、すなわち「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｇ４１１８株（＝ＮＢＲＣ１０６７１株（マジパン））から見つけられたプラスミドｐＳＲ１」の塩基配列上の部分配列との類似性が高い、染色体上の領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＰＣＲ法及び、同法で生じた増幅産物（から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物）の塩基配列解読（シークエンシング）法ないしはＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法によって生じる「分解（または制限）断片の本数」及び「それぞれの断片の鎖長」のパターン（＝バンドパターン）を指標として用いる事により、図１０９．及び図１１０．に記した通り、たとえば味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された、表現形質及び属種不明の味噌・醤油酵母群について、［Ａ］各株がまず［１］現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株なのか、あるいはたとえばＣａｎｄｉｄａ属酵母株やＰｉｃｈｉａ属酵母株などの、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株以外の株なのかを、さらに［１］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに分類された株群については、図１１０．に記した通り、［Ｂ］各株が［１］−１．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、（味噌・）醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは［１］−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、いわゆる「味噌・醤油主発酵酵母株」なのかを、そして［１］−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群、いわゆる味噌・醤油主発酵酵母株群に区分けされた株については、［Ｃ］各株が［１］−２−１．（味噌・）醤油諸味中でのエタノール生産性能が高く、しかも醤油中で皮膜を形成する能力を持たない事から、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは［１］−２−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成する能力を持ち、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成し、その品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのかを、迅速かつ簡便に判別できる事が判明した。
【図面の簡単な説明】
【０３４８】
【図１】塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）加ＹＤ／生醤油寒天上でのＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（花（日本））の生育  ―生育に及ぼす塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度の影響―
【図２】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株とＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株の、醤油諸味液汁中での増殖とエタノール生産性
【図３】さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の、醤油諸味液汁中でのエタノール生産性
【図４】濃口醤油II中でのＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の生存性  ―接種後３０日（３０℃）での醤油０．１ｍｌ中の生存酵母数―
【図５】Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ３０４２株（上段の配列（＝配列番号２））とＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株のＤ１／Ｄ２領域（下段の配列（＝配列番号１））の違い
【図６】濃口醤油II中での醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の皮膜形成
【図７】Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌）とＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の皮膜形成
【図８】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の中には、濃口醤油で皮膜を形成する醤油産膜性株と形成しない醤油「非」産膜性株とがいる
【図９】生醤油液体培地での、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の皮膜形成
【図１０】ＹＰＤ液体培地中での醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の皮膜形成
【図１１】ＹＰＤ液体培地、ＹＭ液体培地中での醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の皮膜形成
【図１２】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプラスミド（２μｍＤＮＡ）とＺ．ｒｏｕｘｉｉのプラスミド（ｐＳＲ１）
【図１３】生味噌（＝米味噌Ａ〜Ｃ、麦味噌Ｄ）から分離した耐塩性酵母
【図１４】埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母
【図１５】耐塩性酵母のＤ１／Ｄ２領域を増幅するためのＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法及びＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法
【図１６】米味噌Ａ〜Ｃ、麦味噌Ｄ、生醤油Ｅから分離した耐塩性酵母３２株の、Ｄ１／Ｄ２領域を指標とする同定  ―ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−ＰＣＲ法、またはＥｘ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物―
【図１７】青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−６株のＰＣＲ産物の、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）を用いた塩基配列解読の波形図
【図１８】青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−６株のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号７）  ―プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間の塩基配列（５８１ｂｐ）を含む―
【図１９】岡山県産米味噌Ｃから分離した耐塩性酵母Ｎｏ．６−１−１−２株のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号８）  ―プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間の塩基配列（５８０ｂｐ）を含む―
【図２０】埼玉県産生醤油Ｅから分離した耐塩性酵母Ｎｏ．７−３−４２株のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号９）  ―プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）とプライマーＮＬ−４（＝配列番号４）との間の塩基配列（５２１ｂｐ）を含む―
【図２１】青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株のＰＣＲ産物の、プライマーＮＬ−１（＝配列番号３）を用いた塩基配列解読の波形図
【図２２】青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株のＰＣＲ産物を連結したプラスミドを導入した形質転換株（アンピシリン耐性株）と、それらの株から回収したプラスミド
【図２３】形質転換株(3)ｅ−８株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１０（Ｔｙｐｅ１））
【図２４】形質転換株(4)ｅ−９株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−２））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１１（Ｔｙｐｅ１−２））
【図２５】形質転換株(5)ｅ−１７株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））及び(6)ｅ−２３株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ１−３））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１２（Ｔｙｐｅ１−３））
【図２６】形質転換株(7)ｅ−２４株（Ｎｏ．１−１−１(Ｔｙｐｅ１−４)）から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１３（Ｔｙｐｅ１−４））
【図２７】形質転換株(8)ｅ−６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））及び(9)ｅ−１２株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１４（Ｔｙｐｅ２））
【図２８】形質転換株(10)ｅ−１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−２））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１５（Ｔｙｐｅ２−２））
【図２９】形質転換株(11)ｅ−１１株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−３））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１６（Ｔｙｐｅ２−３））
【図３０】形質転換株ｅ−３６株（Ｎｏ．１−１−１（Ｔｙｐｅ２−４））から回収したプラスミド上のＴ−クローニングサイトにつながっていた耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（＝配列番号１７（Ｔｙｐｅ２−４））
【図３１】耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（８種類）
【図３２】耐塩性酵母Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物の塩基配列（８種類）  ―Ｔｙｐｅ１とＴｙｐｅ２、そのキメラ配列ないしはモザイク配列―
【図３３】青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母８株の、Ｈａｒｒｉｓｏｎらの方法による同定
【図３４】富山県産米味噌Ｂから分離した耐塩性酵母８株の、Ｈａｒｒｉｓｏｎらの方法による同定
【図３５】岡山県産米味噌Ｃ及び麦味噌Ｄから分離した耐塩性酵母８株の、Ｈａｒｒｉｓｏｎらの方法による同定
【図３６】埼玉県産生醤油Ｅから分離した耐塩性酵母８株の、Ｈａｒｒｉｏｓｎらの方法による同定
【図３７】醤油産膜性試験時に観察された「管壁付着物」
【図３８】１０％塩化ナトリウム加ＹＤ寒天上に形成されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株及びＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ株の菌集落（＝コロニー）
【図３９】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）と醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）  ―生醤油寒天上で形成される菌集落（＝コロニー）の形状―
【図４０】さまざまな耐塩性酵母の産膜性と、生醤油寒天上で形成される菌集落（＝コロニー）の形状
【図４１】さまざまな耐塩性酵母の産膜性と、１０％ＮａＣｌ加ＹＤ寒天上で形成される菌集落（＝コロニー）の形状
【図４２】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上にある、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（１）及び領域（２）（模式図）
【図４３】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（１）を含む部分配列（＝配列番号３５（２７６０ｂｐ））（一部）
【図４４】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（１）を含む部分配列（＝配列番号３５（２７６０ｂｐ））（一部）
【図４５】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（１）を含む部分配列（＝配列番号３５（２７６０ｂｐ））（一部）
【図４６】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（１）を含む部分配列（＝配列番号３５（２７６０ｂｐ））（一部）
【図４７】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（２）を含む部分配列（＝配列番号４０（２２３５ｂｐ））（一部）
【図４８】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（２）を含む部分配列（＝配列番号４０（２２３５ｂｐ））（一部）
【図４９】Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ上の、プラスミドｐＳＲ１との類似性が高い領域（２）を含む部分配列（＝配列番号４０（２２３５ｂｐ））（一部）
【図５０】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法
【図５１】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―核酸成分調製法の違いによる影響―
【図５２】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―味噌・醤油からの分離株の場合(1)―
【図５３】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―味噌・醤油からの分離株の場合(2)―
【図５４】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―味噌・醤油からの分離株の場合(3)―
【図５５】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―味噌・醤油以外からの分離株の場合(1)―
【図５６】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―味噌・醤油以外からの分離株の場合(2)―
【図５７】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―味噌・醤油以外からの分離株の場合(3)―
【図５８】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株の場合(1)―
【図５９】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株の場合(2)―
【図６０】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株の場合(3)―
【図６１】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法で調製した核酸成分を用いた場合(1)―
【図６２】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法で調製した核酸成分を用いた場合(2)―
【図６３】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株の場合(4)―
【図６４】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株の場合(5)―
【図６５】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―青森県産米味噌Ａからの分離株の場合―
【図６６】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―青森県産米味噌Ａからの分離株の場合―
【図６７】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―富山県産米味噌Ｂからの分離株の場合―
【図６８】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―富山県産米味噌Ｂからの分離株の場合―
【図６９】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―岡山県産米味噌Ｃからの分離株の場合―
【図７０】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―岡山県産麦味噌Ｄからの分離株の場合―
【図７１】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―埼玉県産生醤油Ｅからの分離株の場合―
【図７２】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―埼玉県産生醤油Ｅからの分離株の場合―
【図７３】醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４２）の一部）
【図７４】醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４２）の一部）
【図７５】醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４３）の一部）
【図７６】醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４３）の一部）
【図７７】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４４）の一部）
【図７８】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４４）の一部）
【図７９】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ）  Ｎｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４５）の一部）
【図８０】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ）  Ｎｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４５）の一部）
【図８１】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ）  Ｎｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４６）の一部）
【図８２】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ）  Ｎｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））のＰＣＲ産物（領域（２））の塩基配列（一部）（＝ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４６）の一部）
【図８３】領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じたＰＣＲ産物の塩基配列（模式図）
【図８４】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１９１４株（クリーミーケーキ）のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４７）の一部）
【図８５】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１９１４株（クリーミーケーキ）のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４７）の一部）
【図８６】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１９１４株（クリーミーケーキ）のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４７）の一部）
【図８７】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４８）の一部）
【図８８】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４８）の一部）
【図８９】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４８）の一部）
【図９０】醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号４９））
【図９１】醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号５０））
【図９２】醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ）  Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））のＰＣＲ産物（領域（１））の塩基配列（一部）（＝ＭＳＳ４と「未知の蛋白質」遺伝子との間の塩基配列部分（＝配列番号５１））
【図９３】領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じたＰＣＲ産物の塩基配列（模式図）
【図９４】領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法  ―ＮＢＲＣ１８１２株（花）の場合―
【図９５】領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で用いたプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の設計のもととなったＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子と見られる塩基配列（一部（＝配列番号５２））と、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株及びＥＣ１１１８株の同塩基配列部分（一部（＝配列番号５３〜５５））
【図９６】領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で用いたプライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の設計のもととなったＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株の「未知の蛋白質」をコードしている遺伝子と見られる塩基配列（一部（＝配列番号５６））と、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株の同塩基配列部分（一部（＝配列番号５７））
【図９７】さまざまな分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の、静置培養条件下における醤油諸味液汁中でのエタノール生産性
【図９８】青森県産米味噌Ａから分離した耐塩性酵母８株の産膜性
【図９９】富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した耐塩性酵母８株の産膜性
【図１００】岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）、麦味噌Ｄから分離した耐塩性酵母８株の産膜性
【図１０１】埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した耐塩性酵母８株の産膜性
【図１０２】領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法のＰＣＲ産物の塩基配列解読時の蛍光強度の波形（一部）  ―青森県産米味噌Ａから分離したＺ．ｒｏｕｘｉｉ株（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｉｎ）の場合―
【図１０３】領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じたＰＣＲ産物上に存在するＭａｅIII認識／切断配列の位置
【図１０４】ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法  ―醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合―
【図１０５】ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法  ―醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合―
【図１０６】ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法  ―分離源の異なる３株の場合―
【図１０７】ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法  ―味噌・醤油以外の分離源から分離された醤油「非」産膜性株の場合―
【図１０８】ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法  ―米味噌Ａ（青森）及びＢ（富山）から分離した醤油産膜性／醤油「非」産膜性株の場合―
【図１０９】発明した方法(2)を用いた、味噌・醤油及び仕掛品中の耐塩性酵母群の区分け（＝グルーピング）
【図１１０】発明した方法(1)を用いた、味噌・醤油及び仕掛品中の耐塩性酵母群の区分け（＝グルーピング）
【発明を実施するための形態】
【０３４９】
上記の、２００９年初夏に公開された、イタリアの黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離された、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の全ゲノム情報を詳細に調べてみたところ、その染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９（１４６４０９３ｂｐ））上には、「マジパンから分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｇ４１１８株（＝ＮＢＲＣ１０６７１株）の細胞内から見つかったプラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８（６２５１ｂｐ））上の「（２μｍ上のＲＥＰ１遺伝子に相当するものと見られる）Ｐ遺伝子（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  Ｐ）及びインバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部から構成される部分配列」、すなわち図１２．中の（２）のプラスミドｐＳＲ１（６２５１ｂｐ）のうちの「破線で囲んだ部分」との類似性が高い塩基配列部分」が少なくとも２箇所ある事（図４２．）を見出した。以下、このプラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性が高い塩基配列部分（＝ｐＳＲ１類似配列）２箇所を、それぞれ「領域（１）」、「領域（２）」と呼ぶ事にする。
【０３５０】
塩基配列どうしの類似性の評価には、上記の、米国（立）バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）上に公開されている相同性検索プログラム「ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）のうちの、データベース上の既知の塩基配列情報の中から「問い合わせ（クエリー（ｑｕｅｒｙ））配列」との類似性が高いものだけを選択するための、つまり「塩基対塩基」用プログラムである「ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｌａｓｔ（Ｓｅａｔｃｈ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕｅｒｙ）」を用いた。
【０３５１】
２箇所のｐＳＲ１類似配列のうちの１つ、「領域（１）」は、図４３．〜４６.（＝実際の塩基配列（＝配列番号３５））及び図４２．（＝模式図）の上段の図の通り、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、「３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）」である。
【０３５２】
図４３．〜４６．は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」上の３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）（図４３．）から、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」上の３７６８３５番目のチミン（Ｔ）（図４６．）までの、すなわち領域（１）を含む塩基配列部分（＝配列番号３５（２７６０ｂｐ））を「４分割」表記したものである。図４３．〜４６. （＝配列番号３５）中の塩基配列のうち、「実線及び丸破線様式の下線付きの塩基配列部分」は、プラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性が非常に高い塩基配列部分を、また「実線様式の下線付きの塩基配列部分」は「遺伝子」と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）を示している。
【０３５３】
この領域（１）のうちの、「３７４５２８番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７３６ｂｐ）」を、プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上の「Ｐ遺伝子及びインバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部から構成される部分配列」と比較しながら見てみると、図４２．の上段の模式図にも記した通り、プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上にある「インバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部、すなわち６０２番目のチミン（Ｔ）から７８８番目のグアニン（Ｇ）までの部分配列（１８７ｂｐ）」との類似性が高い３７４５２８番目のチミン（Ｔ）から３７４７１５番目のグアニン（Ｇ）までの部分配列（１８８ｂｐ）と、「Ｐ遺伝子及びインバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部、すなわち９８２番目のチミン（Ｔ）から２５３０番目のチミン（Ｔ）までの部分配列（１５４９ｂｐ）」との塩基配列の類似性が高い３７４７１６番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの部分配列（１５４８ｂｐ）との２つの部分配列から構成されていて、この２つの部分配列の間には「プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上の、７８９番目のチミン（Ｔ）から９８１番目のチミン（Ｔ）までの部分配列（１９３ｂｐ）」に相当する部分配列がない（または欠けている）事が分かる。
【０３５４】
領域（１）（１７５１ｂｐ）の塩基配列のうちの、この「図４３．中の３７４７１６番目のチミン（Ｔ）から、図４５．中の３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの部分配列（１５４８ｂｐ）」の、プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上にある「Ｐ遺伝子（の全長）及びインバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部、すなわち９８２番目のチミン（Ｔ）から２５３０番目のチミン（Ｔ）までの部分配列（１５４９ｂｐ）」との塩基配列の類似性は９８．５％（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、また「図４３．中の３７４５２８番目のチミン（Ｔ）から３７４７１５番目のグアニン（Ｇ）までの部分配列（１８８ｂｐ）」の、プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上にある「インバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部、すなわち６０２番目のチミン（Ｔ）から７８８番目のグアニン（Ｇ）までの部分配列（１８７ｂｐ）」との塩基配列の類似性も９６．３％（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝２ｅ−８０）と、非常に高い。
【０３５５】
「領域（１）」と定義した塩基配列部分は、厳密には、図４３．〜４５．中の「実線及び丸破線様式の下線付きの塩基配列部分」が示す、プラスミドｐＳＲ１上の「Ｐ遺伝子（の全長）及びインバーテッド・リピート（ＩＲ）の一部から構成される部分配列」との類似性が非常に高い２つの部分配列（１５４８ｂｐと１８８ｂｐ）から構成される、すなわち上記の「ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４５２８番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７３６ｂｐ）」に、さらに図４３.中の３７４５１５番目のチミン（Ｔ）から３７４５２３番目のチミン（Ｔ）までの、プラスミドｐＳＲ１上の「インバーテッド・リピート（ＩＲ）の部分配列」との類似性が非常に高い塩基配列（９ｂｐ）」と、その上流にある「３７４５１３番目のチミン−３７４５１４番目のシトシン（ＴＣ）（２ｂｐ）」をも加えた塩基配列部分（１１ｂｐ）と、さらにはその２つの塩基配列の間に入り込む形となっている、プラスミドｐＳＲ１の塩基配列との類似性が低い４ｂｐの塩基配列部分も加えた、すなわち図４２．の上段の模式図が示す通り、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４５１３番目のチミン（Ｔ）（図４３.）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）（図４５.）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）に相当する。
【０３５６】
ちなみに、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの、すなわち図４３．〜４６．の塩基配列部分（＝配列番号３５（２７６０ｂｐ））を含む配列部分上に、制限酵素ＡｐａIの認識／切断配列
５’−Ｇ  ＧＧＣＣ↓Ｃ−３’ 
（３’−Ｃ↑ＣＣＧＧ  Ｇ−５’ 
は存在しない（注：矢印（↑↓）は、ＡｐａI処理による切断部位を示している）。
【０３５７】
２箇所のｐＳＲ１類似配列のうちのもう１つ、すなわち「領域（２）」は、図４７.〜４９．（＝実際の塩基配列（＝配列番号４０））及び図４２．（＝模式図）の下段の図の通り、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）」及び「１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）」に当たる「トリプトファン転移（または運搬）ＲＮＡ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ（ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）））遺伝子と見られる塩基配列部分」と、１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」との間に位置する、１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）（図４７．）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）（図４９．）までの塩基配列部分（１３３５ｂｐ）である。
【０３５８】
図４７．〜４９．は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）」と「１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）」に当たる「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」上の１１３２０４４番目のアデニン（Ａ）（図４７．）から、１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」上の１１３４２７８番目のグアニン（Ｇ）（図４９．）までの、すなわち領域（２）を含む塩基配列部分（＝配列番号４０（２２３５ｂｐ））を「３分割」表記したものである。図４７．〜４９. （＝配列番号４０）中の塩基配列のうち、「実線及び丸破線様式の下線付きの塩基配列部分」は、プラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性が非常に高い塩基配列部分を、また「実線様式の下線付きの塩基配列部分」はその塩基配列部分上の、「遺伝子」と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）を示している。
【０３５９】
この領域（２）も、厳密には、図４７．〜４９．（＝配列番号４０）中の「実線及び丸破線様式の下線付きの塩基配列部分」が示す通り、プラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性が高い、図４７．中の（ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の）１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）から図４８．中の１１３３０２５番目のアデニン（Ａ）までの５７２ｂｐの塩基配列部分（注：この塩基配列部分を、以下、「領域（２）−（ａ）」と記す）、図４８．中の１１３３０４７番目のシトシン（Ｃ）から図４８．中の１１３３４６８番目のグアニン（Ｇ）までの４２２ｂｐの塩基配列部分（注：この塩基配列部分を、以下、「領域（２）−（ｂ）」と記す）、図４９．中の１１３３７５２番目のグアニン（Ｇ）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）までの３７ｂｐの塩基配列部分（注：この塩基配列部分を、以下、「領域（２）−（ｃ）」と記す）の、３つのｐＳＲ１類似配列と、その「領域（２）−（ａ）」と「領域（２）−（ｂ）」との間と、「領域（２）−（ｂ）」と「領域（２）−（ｃ）」との間に入り込んだ、プラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性が低い２つの塩基配列部分とから構成されている。
【０３６０】
領域（２）−（ａ）、すなわち「図４７．中の１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）から図４８．中の１１３３０２５番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（５７２ｂｐ）」は、「プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上にあるＰ遺伝子の２２１４番目のシトシン（Ｃ）から１６１１番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（６０４ｂｐ）」との類似性が７８．６％（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝２ｅ−１４３）、領域（２）−（ｂ）、すなわち「図４８．中の１１３３０４７番目のシトシン（Ｃ）から１１３３４６８番目のグアニン（Ｇ）までの４２２ｂｐの塩基配列部分」は、「プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上にあるＰ遺伝子の１４９５番目のシトシン（Ｃ）から１０７３番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（４２３ｂｐ）」との類似性が８２．７％（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝５ｅ−１１７）、また領域（２）−（ｃ）、すなわち「図４９.中の１１３３７５２番目のグアニン（Ｇ）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３７ｂｐ）」は、「プラスミドｐＳＲ１（Ｘ０２３９８．１、ＧＩ：５２５８）上のインバーテッド・リピート（ＩＲ）の５２１番目のグアニン（Ｇ）から５５７番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３７ｂｐ）」との類似性が８６．５％（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝１．６）と、「上記の領域（１）の、プラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性」と較べると低めではあるものの、それでもプラスミドｐＳＲ１上の部分配列との類似性が認められる。
【０３６１】
ちなみに、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの、すなわち図４７．〜４９．の塩基配列部分（＝配列番号４０（２２３５ｂｐ））を含む配列部分上に、制限酵素ＡｐａIの認識／切断配列
５’−Ｇ  ＧＧＣＣ↓Ｃ−３’ 
（３’−Ｃ↑ＣＣＧＧ  Ｇ−５’ 
は存在しない（注：矢印（↑↓）は、ＡｐａI処理による切断部位を示している）。
【０３６２】
そこで、このＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））以外の、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉ株に分類されている酵母株にも、この領域（１）及び領域（２）があるのか、あるいはないのかを、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の領域（１）及び（２）の上流及び下流にある遺伝子（ＣＤＳ）上の塩基配列を参考にして設計したプライマーを用いるＰＣＲ法を行なう事で調べてみた。
【０３６３】
試験６．さまざまなＺ．ｒｏｕｘｉｉ株における領域（１）及び領域（２）の有無の調査：
【０３６４】
試験に用いた供試株は、菌株保存研究機関で保存されているＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の中から、その株の分離源に関する記録がきちんと公表されている株のみを選び出した。すなわち、上記の試験１．、試験２．、試験５．で用いた、［１］味噌から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株）、ＮＩＳＬ３７６３株（＝ＡＴＣＣ４２９８１株＝ＩＡＭ１２８７９株）の計３株、［２］味噌から分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）、［３］醤油や醤油諸味などから分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＢＲＣ０５０５株、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株）、ＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株）の計４株、［４］醤油や醤油諸味などから分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）の計３株、［５］「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆（オランダ））、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜（カナダ））、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花（日本）））、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ（日本）））、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン（西ドイツ）））、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン（フランス）））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜（カナダ）））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰（ノルウェー）））、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）（イタリア）））の計９株、すべて合わせると５群、計２０株である。
【０３６５】
供試株の培養と、その細胞からの核酸成分の調製（または抽出）には、上記の試験３．で用いた方法、すなわち（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法と、さらに（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法と（ｃ）ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ法も加えた、計３種類の方法のうちのいずれかを用いた。
【０３６６】
（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法の手順：
「ＩＳＯＰＬＡＮＴ」は、株式会社ニッポンジーン製のＤＮＡ抽出キット（製品コード：Ｎｏ．３１０−０２７３３、２０回分）である。上記の試験３．の「ビーズ破砕／フェノール処理法の手順」における供試株の細胞（＝マイクロチューブに入った状態の沈殿）から、同キットを使って調製（または抽出）したものを「核酸成分」として、以下の実験に用いた。調製手順は、キットに添付されている「ＩＳＯＰＬＡＮＴマニュアル（第８版）」のｐ４の「Ｖプロトコール」に記されている通りである（注：手順には一切改変を加えなかった）。
【０３６７】
（ｃ）ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ法の手順：
「ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ」も、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のキット（Ｐ／Ｎ  ４３１８９３０）である。上記の試験３．の「ビーズ破砕／フェノール処理法の手順」における供試株の細胞（＝マイクロチューブに入った状態の沈殿）から、同キットを使って調製（または抽出）したものを「核酸成分」として、以下の実験に用いた。調製手順は、キットに添付されている「Ｑｕｉｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃａｒｄ」に記されている通りである（注：手順には一切改変を加えなかった）。
【０３６８】
核酸成分の制限酵素処理：
供試株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ法を行なう場合、核酸成分を予め（増幅する塩基配列部分上に認識／切断配列がない）制限酵素で処理して（断片化して）おくと、ＰＣＲ法における増幅効率が向上する事が知られている（村松正實（編）：［新臨床医のための分子医学シリーズ］よくわかる遺伝子工学  ―ベーシックな技術から臨床応用まで―、ｐ２４−３６（三嶋行雄（著））、羊土社  （２０００））。上記した通り、少なくともＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合には、本試験で増幅しようとしている（プライマーの結着配列部分を含む）両塩基配列部分、すなわち図４３．〜４６．の塩基配列部分（＝配列番号３５）及び図４７．〜４９．の塩基配列部分（＝配列番号４０）上には制限酵素ＡｐａIの認識／切断配列（５’−Ｇ  ＧＧＣＣ↓Ｃ−３’及び３’−Ｃ↑ＣＣＧＧ  Ｇ−５’から構成される６塩基対）がない事が分かっており、ゆえに供試株から調製（または抽出）した核酸成分を予め制限酵素ＡｐａIで処理しておけば、ＰＣＲ法での増幅効率が向上する事が予想される。そこで、本試験での一部、すなわち上記の計３種類の核酸成分調製法のうちの、（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製（または抽出）した核酸成分の「一部」については、予め制限酵素ＡｐａIで処理したうえで、ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとして用いた。制限酵素ＡｐａIによる前処理は、１．５ｍｌサイズの殺菌済みマイクロチューブ内で行なった。マイクロチューブに移した核酸成分１μｇに対して、タカラバイオ株式会社製の制限酵素ＡｐａI（製品コード：Ｎｏ．１００５Ａ）２Ｕ（＝０．１４μｌ）、同製品付属の緩衝液（１０×Ｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）１μｌを加え、これにさらに「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水」を加えて全量を１０μｌにする。この溶液を、３７℃に設定した反応器（または恒温器）などを使って（注：本試験では、旭テクノグラス株式会社製卓上小型恒温培養器ＮＩＢ−１１を使用）、３７℃に保温しながら、一夜置く（＝酵素反応処理）。核酸成分の前処理に用いる制限酵素は、ＡｐａIに限られるものではなく、増幅しようとする塩基配列（プライマーの結着配列部分を含む）上に認識／切断配列がない制限酵素であれば何でもよい。
【０３６９】
用いたプライマーとその調製：
供試株の領域（１）の有無を調べるためのＰＣＲ法では、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）と、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）を用いた。用いたプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」の、その部分配列（＝図４３．中の破線形式の下線付き塩基配列部分）を参考にして設計したもの、またプライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分」の、その部分配列（＝図４６．中の破線形式の下線付き塩基配列部分）を参考にして設計したもので、それぞれの塩基配列は下記の通りである。
プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）：
（Ｆｏｒｗａｒｄ、３０塩基、ＭＷ＝９２６８、Ｔｍ＝６４．５）
５’−ＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’
プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）：
（Ｒｅｖｅｒｓｅ、３０塩基、ＭＷ＝９２２８、Ｔｍ＝６４．８）
５’−ＡＴＧＴＡＴＣＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＧ−３’
ちなみに、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）から、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する、３７６８３５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（図４３．〜４６．（＝配列番号３５））の長さ（＝塩基数）は、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）では、図４２．の上段の模式図にも記した通り、２７６０ｂｐである。
【０３７０】
また、供試株の領域（２）の有無を調べるためのＰＣＲ法では、プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）とプライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）を用いた。用いたプライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）に当たる「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」の、その部分配列（＝図４７．中の破線形式の下線付き塩基配列部分）を参考にして設計したもの、またプライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」の、その部分配列（＝図４９．中の破線形式の下線付き塩基配列部分）を参考に設計したもので、それぞれの塩基配列は下記の通りである。
プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）：
（Ｆｏｒｗａｒｄ、３１塩基、ＭＷ＝９４８９、Ｔｍ＝６５．３）
５’−ＡＣＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＣＡＣ−３’
プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）：
（Ｒｅｖｅｒｓｅ、３１塩基、ＭＷ＝９４６３、Ｔｍ＝６４．４）
５’−ＣＡＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＧＴＣ−３’
ちなみに、プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の１１３２０４４番目のアデニン（Ａ）から、プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する、１１３４２７８番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（図４７．〜４９．（＝配列番号４０））の長さ（＝塩基数）は、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）では、図４２．の下段の模式図にも記した通り、２２３５ｂｐである。
【０３７１】
上記のＰＣＲ法で用いたこれらのプライマーの化学合成は、株式会社日本バイオサービスに委託した（ＤＮＡ合成：スモールスケール品）。
【０３７２】
ＰＣＲ反応は、ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で行なった。反応液の調製は、上記の試験４．の手順の通りである。もちろん、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）を使用しなければならないわけではなく、たとえば上記の同社製キット「ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（製品コード：ＲＲ００１Ａ）」や東洋紡株式会社製のキット「ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−（製品コード：ＫＯＤ−２０１）」などを用いてもよい。
【０３７３】
ＰＣＲサイクラーは、上記の「ＭｙＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー」を用いた。［１］鋳型ＤＮＡの熱変性温度は（９４〜）９５℃とし、また［３］ＤＮＡポリメラーゼ反応の温度は７２℃とした。［２］アニーリング反応は、通常ならば５５〜６０℃の範囲内の、さらに用いる２種類のプライマーの融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｍ））のうちの低いほうの温度（ないしはそれより５℃程度低めの温度）で行なうのが一般的とされるが（西方敬人・川上純司・藤井敏司・長濱宏治（著）：［細胞工学別冊］ゼロからはじめるバイオ実験マスターコース  (1)実験の基本と原理、学研メディカル秀潤社  （２０１２））、本試験では、データ収集の目的から、この５５〜６０℃の範囲を超える、５３．５℃、５６．７℃、６１．０℃、６４．４℃の計４種類の温度条件を用いた。［１］〜［３］の反応の繰り返し回数は３０回とした。すなわち、実際のＰＣＲ反応条件は、図５１．中の、向かって右側の枠内の［増幅条件］の通りである。
【０３７４】
アガロースゲル電気泳動法の手順：
ＰＣＲ法による増幅産物の有無及び（増幅産物が生じた場合の）その増幅産物の鎖長の確認には、アガロースゲル電気泳動法を用いた。電気泳動装置は、上記のサブマリン−タイプ電気泳動システム「Ｍｕｐｉｄ−２ｐｌｕｓ」、電気泳動用のゲルは上記の０．７％アガロースゲル、またゲル電気泳動用マーカーは上記の「１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ」を用いた。上記のＰＣＲ反応後の溶液２５μｌのうち、１．５〜３μｌに、上記の１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ１．５μｌを加えたうえで、これを「ＴＡＥ緩衝液を充たした上記のシステム（＝電気泳動層）」内に置いた１．５％アガロースゲル上の窪み（ウェル）に流し込み、３０分〜１時間程通電した（＝ゲル電気泳動法）。泳動処理後のゲルを、上記の試験３．中の手順通りに染色処理したうえで、ゲルイメージング「ＡＥ−６９３２ＧＸプリントグラフ」を使って、ＵＶ照射（波長：３１２ｎｍ）下でゲル（上の増幅産物）を観察し、増幅産物の有無、本数とそれぞれの鎖長を目視で確認し、写真も撮影した。ゲル上の増幅産物の鎖長は、上記の分子量マーカーに含まれる断片群との目視での相対的な移動度（＝ゲル上の位置）比較によって推定した。
【０３７５】
図５０．〜５７．は、上記の供試株２０株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとするＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で、各株における領域（１）及び領域（２）の有無を調べた結果を示すゲル電気泳動写真である。なお、図５０．〜５７．のすべては、上下２段の写真で構成されており、うち上段は「領域（１）の有無を調べるための、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）とプライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）とを用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法」で生じた増幅産物をゲル電気泳動した結果を示すゲル写真、うち下段は「領域（２）の有無を調べるための、プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）とプライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）とを用いたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法」で生じた増幅産物をゲル電気泳動した結果を示すゲル写真となっている。
【０３７６】
図５０．は、（写真の上下段とも、向かって左側から順に）味噌から分離されたＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）、醤油醸造工程から分離されたＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）、痰から分離されたＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株）の計４株の場合のＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の結果を示すゲル写真である。本試験では、（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製（または抽出）した各株の核酸成分をあらかじめＡｐａI処理したうえで、ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとして使用した。
【０３７７】
まず、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、図５０．の下段の写真が示す通り、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物は単一で、その鎖長は２ｋｂ強と、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）から算出される、プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する１１３２０４４番目のアデニン（Ａ）（図４７．）と、プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する１１３４２７８番目のグアニン（Ｇ）（図４９．）との間の塩基数（２２３５ｂｐ）と合致しており、他の３株で生じた増幅産物も単一で、目視ではこのＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物と同じ鎖長に見える。
【０３７８】
しかしながら、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、図５０．の上段の写真が示す通り、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物の鎖長は３ｋｂ弱と、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）から算出される、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）（図４３．）と、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する３７６８３５番目のチミン（Ｔ）（図４６．）との間の塩基数（２７６０ｂｐ）と合致しており、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））の場合に生じた単一の増幅産物も、目視ではこのＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物と同じ鎖長に見えるのだが、ただし味噌から分離されたＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）や醤油醸造工程から分離されたＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）の場合に生じた増幅産物は単一だが、その鎖長は、目視でもはっきりと見分けられる程に、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）やＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））の場合に生じた増幅産物よりも短く、１ｋｂ前後しかない。
【０３７９】
上記した通り、ＰＣＲ反応における［２］アニーリング反応温度としては、５３．５℃、５６．７℃、６１．０℃、６４．４℃の４条件を設定したが、株ごとに生じた増幅産物の（本数と）鎖長は、領域（１）及び（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で、４条件ともに（目視では）同じに見えた。つまり、この領域（１）及び（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、通常よりもより広範なアニーリング温度条件下においても、安定した結果を得る事ができる。
【０３８０】
図５１．は、この図５０．の供試株４株のうちの２株、すなわち味噌から分離されたＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）と黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）について、上記した計３種類の核酸成分調製（または抽出）法、すなわち（写真の上下段とも、向かって左側から順に）（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法、（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法、（ｃ）ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ法で調製（または抽出）した核酸成分を、うち（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製（または抽出）した核酸成分については予めＡｐａI処理したうえで、また（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法及び（ｃ）ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ法で調製（または抽出）した核酸成分については、ＡｐａI処理せずに、そのままの状態で、鋳型ＤＮＡとして用いた場合のＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の結果を示すゲル写真である。
【０３８１】
領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、図５１．の（２）、すなわち下段のゲル写真３枚が示す通り、両株ともに、（ａ）（ｂ）（ｃ）のいずれの方法で調製（または粗精製）した核酸成分を用いた場合でも、２ｋｂ強の、同じ鎖長の増幅産物が生じ、また領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法でも、図５１．の（１）、すなわち上段のゲル写真３枚示す通り、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物の鎖長は、（ａ）（ｂ）（ｃ）のいずれの方法で調製（または粗精製）した核酸成分を用いた場合でも３ｋｂ弱、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）の場合に生じた増幅産物の鎖長も、（ａ）（ｂ）（ｃ）のいずれの方法で調製（または粗精製）した核酸成分を用いた場合でも１ｋｂ前後と、少なくとも目視では図５０．の場合と同じで、しかも両株で生じた増幅産物の鎖長は、目視で簡単に見分けられる程に、明らかに異なっていた。つまり、上記の図５０．の結果で見出された、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた、供試株ごとでの増幅産物の鎖長の違いは、供試株からの核酸成分の調製（または抽出）法や制限酵素処理の有無などに関係なく、安定的に観察されるものである事が判明した。
【０３８２】
図５２．〜５４．は、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株９株、すなわちＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株）、ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）、ＮＢＲＣ０５０５株、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株）、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株）、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）の場合の、領域（１）及び（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の結果を示したものである。ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で鋳型ＤＮＡとして用いた供試株の核酸成分は、（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製（または抽出）したものを、予めＡｐａI処理したうえで用いた。それぞれのゲルごとに、鎖長比較用に、アニーリング反応温度を６１．０℃としたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法での、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））及びＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物を同時に載せたが、これら９株の場合の、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物も図５２．〜５４．の（２）、すなわち下段の写真の通り、単一で、その鎖長は、鎖長比較用の２株の場合に生じた増幅産物の鎖長と、少なくとも目視では同じに見える一方、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物は図５２．〜５４．の（１）、すなわち上段の写真の通り、単一で、その鎖長は、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物よりも短く、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物とは、少なくとも目視では同じ鎖長に見える。つまり、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された９株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった際に生じる増幅産物のパターン（＝バンドパターン）、すなわち本数及び各断片の鎖長は、同じく味噌・醤油及びその仕掛品（に当たる醤油醸造工程）から分離されたＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）やＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）の場合に生じるバンドパターンとは同じだが、黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）や痰といった、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）やＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株）の場合に生じるバンドパターンとは異なっている、より具体的には増幅産物の鎖長が異なっている事が分かる。
【０３８３】
図５５．〜５７．は、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株８株、すなわちＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合の、領域（１）及び（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の結果を示すゲル写真である。ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で鋳型ＤＮＡとして用いた供試株の核酸成分は（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製（または抽出）したものを、予めＡｐａI処理したうえで用いた。それぞれのゲルごとに、鎖長比較用に、アニーリング反応温度を６１．０℃としたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法での、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））及びＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物を同時に載せた。８株のうち、まずＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合には、図５７．の（１）及び（２）、すなわち上下段のゲル写真２枚の通り、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で、（アニーリング温度の如何を問わず）増幅産物が生じなかった（注：この増幅産物が生じなかった原因については、後に追加データを示して考察する）。このＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））を除いた７株の場合の、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物は、図５５．〜５７．の（２）、すなわち下段のゲル写真の通り、単一で、その鎖長は鎖長比較用の２株の場合に生じた増幅産物と、少なくとも目視では同じ鎖長に見える一方、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物は、図５５．〜５７．の（１）、すなわち上段のゲル写真の通り、単一だが、その鎖長は、うちＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合を除く６株では、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物よりも長く、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物とは、少なくとも目視では同じ鎖長に見える。つまり、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された８株のうち、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））及びＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株）を除く６株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった際に生じる増幅産物のパターン（＝バンドパターン）、すなわち本数と各断片の鎖長は、同じく黒葡萄濃縮��果汁（＝果醪）や痰といった、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）やＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株）の場合に生じるバンドパターンとは同じだが、味噌・醤油及びその仕掛品（に当たる醤油醸造工程）から分離されたＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）やＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）の場合に生じるバンドパターンとは異なっている、より具体的には増幅産物の鎖長が異なっている事が分かる。また、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合には、図５７．の（１）、すなわち上段の写真の通り、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物も単一ではあったが、その鎖長は、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物の鎖長よりも短く、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物とは、少なくとも目視では同じ鎖長に見える（注：このＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合に生じた増幅産物の鎖長が、他の「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた増幅産物の鎖長と異なっていた原因についても、後に考察する）。
【０３８４】
このように、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合に、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている株の場合には、（ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合を除き）２ｋｂ強の（単一の）増幅産物が生じる事、また、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合には、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合は、（ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））とＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合を除き）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））も含め、３ｋｂ弱の増幅産物が生じるのに対して、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合には、それよりも短い１ｋｂ前後の増幅産物が生じ、しかも両者の増幅産物の鎖長の違いは上記の０．７％アガロースゲル電気泳動法を用いれば目視で簡単に見分ける事ができるため、現行の分類では同じ属種であるＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている株群を、［１］−１．「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された、（試験１．及び試験２．で示した通り）醤油及びその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）という高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む環境への適応能力が低く、醤油諸味液汁中でのエタノール生産性能も低いために、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群と、［１］−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された、（試験１．及び２．で示した通り）醤油及びその仕掛品（である醤油諸味や生揚げ醤油など）という高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む環境への適応能力が高く、醤油諸味液汁中でのエタノール生産性能も高いために、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群との２群に容易に、かつ迅速に区分けできる事が判明した。
【０３８５】
次に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株にも、この領域（１）及び領域（２）があるのか否かを、同様に上記の、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で調べてみた。
【０３８６】
試験７．Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株における領域（１）及び領域（２）の有無の調査：
【０３８７】
本試験に用いる供試株としては、菌株保存研究機関（＝独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）のＮＢＲＣや公益財団法人野田産業科学研究所（ＮＩＳＬ））で保存されている酵母株群の中から、（１）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉとの近縁性なども考慮して選び出した。たとえば、Ｊａｍｅｓらのグループが行なった、ＩＴＳ１を指標としたＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母の系統分類の結果によると、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと近縁な関係にあるのはＺ．ｂａｉｌｉｉやＺ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ（チゴサッカロミセス（またはチゴサッカロマイセス）・ビスポラス）、またＩＴＳ２を指標とした系統分類の結果では、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと近縁な関係にあるのはＺ．ｍｅｌｌｉｓだとされる事から（Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６（１），１８９−１９４  （１９９６））、現行の分類でこうした属種に分類されている酵母株も供試株として選択した。すなわち、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＢＲＣ１８０１株（＝ＩＦＯ１８０１株（土（日本）））、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＢＲＣ１０６６７株（腐敗したトマトケチャップ（日本））、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＩＳＬ３４４０株（＝ＮＢＲＣ０４９３株＝旧：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４７６株（日本酒粕））、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓの基準株であるＮＢＲＣ１１３１株（分離源不明）、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓの基準株であるＮＢＲＣ１６１５株（蜂蜜（アメリカ））に、さらにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３３９８株（＝ＡＴＣＣ４１２６株（分離源不明））とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３７５０株（＝ＩＡＭ４９１９株（廃糖蜜））も加えた７株である。また、本試験に用いる供試株としては、菌株保存研究機関で保存されている酵母株群の中から、分離源に関する記録が公表されていて、（２）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などから分離された株であるものも選び出した。たとえば、耐塩性を有するＣ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ  ＮＩＳＬ３７２０株（＝ＩＦＯ１００３７株（醤油諸味（日本）））とその基準株であるＮＩＳＬ３７１９株（＝ＩＦＯ１５９２株（発酵キュウリ漬（アメリカ）））、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ＮＩＳＬ３７２２株（＝ＩＦＯ１００３８株（醤油諸味（日本）））、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ  ｖａｒ．ｆａｍａｔａ（キャンディダ（またはカンジダ）・ファマタ・バリエタス・ファマタ）  ＮＢＲＣ０８５６株（溜醤油諸味（日本））、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ（クルゼイ）  ＮＢＲＣ０２０１株（誉味噌（日本））、Ｃ．ｈａｌｏｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ（ハロニトラトフィラ）  ＮＢＲＣ１９０６株（醤油諸味）、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（トロピカリス）  ＮＢＲＣ０１９９株（桜味噌（日本））、産膜性／醤油「非」産膜性のＰ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌（日本））の８株である。上記の、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属やＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に分類されている酵母株７株と合わせると、計１５株である。
【０３８８】
まず、図５８．〜６０．は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの近縁種であるＺ．ｍｅｌｌｉｓ  ＮＢＲＣ１６１５株（蜂蜜）、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと同属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）のＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＢＲＣ１８０１株（＝ＩＦＯ１８０１株（土））、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＢＲＣ１０６６７株（腐敗したトマトケチャップ）、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＩＳＬ３４４０株（＝ＮＢＲＣ０４９３株＝旧：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４７６株（日本酒粕））やＺ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ  ＮＢＲＣ１１３１株（分離源不明）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３３９８株（＝ＡＴＣＣ４１２６株（分離源不明））及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３７５０株（＝ＩＡＭ４９１９株（廃糖蜜））の計８株についての、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の結果を示すゲル写真である。ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で鋳型ＤＮＡとして用いた供試株の核酸成分は（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製したものを、予めＡｐａI処理したうえで用いた。それぞれのゲルごとに、鎖長比較用に、アニーリング反応温度を６１．０℃としたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法での、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））及びＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物を同時に載せたが、これら８株の場合には、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方において、増幅産物自体が生じなかった。
【０３８９】
上記の図５７．〜６０．のゲル写真で示した、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で増幅産物が生じなかったＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＢＲＣ１８０１株（＝ＩＦＯ１８０１株（土））やＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＢＲＣ１０６６７株（腐敗したトマトケチャップ）、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＮＩＳＬ３４４０株（＝ＮＢＲＣ０４９３株＝旧：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４７６株（日本酒粕））、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ  ＮＢＲＣ１１３１株（分離源不明）、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ  ＮＢＲＣ１６１５株（蜂蜜（アメリカ））、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３３９８株（＝ＡＴＣＣ４１２６株（分離源不明））、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３７５０株（＝ＩＡＭ４９１９株（廃糖蜜））の計８株については、（（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製（または抽出）した核酸成分の代わりに）、（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法で調製（または抽出）した核酸成分を、ＡｐａI処理せずに、そのまま鋳型ＤＮＡとして用いるＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法も試してみたが、８株すべてにおいて、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方において、増幅産物自体が生じなかった。１例として、この８株のうちの４株、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ  ＮＢＲＣ１６１５株（蜂蜜）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３３９８株（＝ＡＴＣＣ４１２６株（分離源不明））、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＩＳＬ３７５０株（＝ＩＡＭ４９１９株（廃糖蜜））の場合の結果（＝図６１．及び図６２．のゲル写真）を示す。この結果から、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった際に、これら８株の場合に増幅産物が生じないという現象には再現性があり、かつ供試株からの核酸成分の調製（または抽出）法や制限酵素処理の有無などに関係なく、安定的に観察されるものである事が判明した。
【０３９０】
図６３．及び図６４．は、Ｃ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ  ＮＩＳＬ３７１９株（＝ＩＦＯ１５９２株（発酵キュウリ漬））、Ｃ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ  ＮＩＳＬ３７２０株（＝ＩＦＯ１００３７株（醤油諸味））、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ＮＩＳＬ３７２２株（＝ＩＦＯ１００３８株（醤油諸味））、Ｃ．ｆａｍａｔａ  ｖａｒ．ｆａｍａｔａ  ＮＢＲＣ０８５６株（溜醤油諸味）、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ  ＮＢＲＣ０２０１株（誉味噌）、Ｃ．ｈａｌｏｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ  ＮＢＲＣ１９０６株（醤油諸味）、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＮＢＲＣ０１９９株（桜味噌）、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌）の計８株についての、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の結果を示すゲル写真である。ＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で鋳型ＤＮＡとして用いた供試株の核酸成分は（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製したものを、予めＡｐａI処理したうえで用いた。それぞれのゲルごとに、鎖長比較用に、アニーリング反応温度を６１．０℃としたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法での、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））及びＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物を同時に載せたが、これら８株の場合にも、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方において、増幅産物自体が生じなかった。領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で増幅産物が生じなかったこれら８株については、（（ａ）ビーズ破砕／フェノール処理法で調製した核酸成分の代わりに）、（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法で調製した核酸成分を、ＡｐａI処理せずに、そのまま鋳型ＤＮＡとして用いるＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法も試してみたが、８株すべてにおいて、そして両方のＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、増幅産物自体が生じなかった（注：データは省略する）。この結果から、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった際に、これら８株の場合に増幅産物が生じなかったという現象には再現性があり、かつ供試株からの核酸成分の調製（または抽出）法や制限酵素処理の有無などに関係なく、安定的に観察されるものである事が判明した。
【０３９１】
このように、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合に、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母株の場合には（ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合を除き）２ｋｂ強の増幅産物が生じるのに対して、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株の場合には、たとえその株がＺ．ｂａｉｌｉｉやＺ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓといった、同属の近縁株であったとしても、またたとえその株が、たとえばＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ＮＩＳＬ３７２２株（＝ＩＦＯ１００３８株（醤油諸味（日本）））、Ｃ．ｆａｍａｔａ  ｖａｒ．ｆａｍａｔａ  ＮＢＲＣ０８５６株（溜醤油諸味（日本））、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ  ＮＢＲＣ０２０１株（誉味噌（日本））、Ｃ．ｈａｌｏｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ  ＮＢＲＣ１９０６株（醤油諸味）、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＮＢＲＣ０１９９株（桜味噌（日本））、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌（日本））などのように、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された株であったとしても、増幅産物が生じず、しかもその増幅産物の有無は上記の０．７％アガロースゲル電気泳動法を用いれば目視で簡単に確認できる、つまりこの領域（２）の有無を指標に、たとえば味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された（未同定の）酵母株群を、［１］現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群と、たとえばＣａｎｄｉｄａ属酵母株やＰｉｃｈｉａ属酵母などのような、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株群との２群に容易に、かつ迅速に区分けできる事が判明した。
【０３９２】
また、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合にも、［１］−１．現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母株で、かつ「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された株の場合には（ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））及びＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合を除き）３ｋｂ弱、また［１］−２．現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている酵母株で、かつ味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）から分離された株の場合には１ｋｂ前後の増幅産物が生じるのに対して、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株の場合には、たとえその株がＺ．ｂａｉｌｉｉやＺ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓといった、同属の近縁株であったとしても、またたとえその株が、たとえばＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ＮＩＳＬ３７２２株（＝ＩＦＯ１００３８株（醤油諸味（日本）））、Ｃ．ｆａｍａｔａ  ｖａｒ．ｆａｍａｔａ  ＮＢＲＣ０８５６株（溜醤油諸味（日本））、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ  ＮＢＲＣ０２０１株（誉味噌（日本））、Ｃ．ｈａｌｏｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ  ＮＢＲＣ１９０６株（醤油諸味）、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＮＢＲＣ０１９９株（桜味噌（日本））、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ  ＮＢＲＣ０９９１株（味噌（日本））などのように、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された株であったとしても、増幅産物が生じず、しかもその増幅産物の有無は上記の０．７％アガロースゲル電気泳動法を用いれば目視で簡単に確認できる、つまりこの領域（１）の有無を指標に、たとえば味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された（未同定の）酵母株群を、［１］現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群と、たとえばＣａｎｄｉｄａ属酵母株やＰｉｃｈｉａ属酵母などのような、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母株群との２群に容易に、かつ迅速に区分けでき、さらに［１］現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群については、その増幅産物の鎖長を指標に、［１］−１．「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された、（試験１．及び試験２．で示した通り）醤油という高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む環境への適応能力が低く、醤油諸味（液汁）中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群と、［１］−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油）から分離された、（試験１．及び２．で示した通り）醤油という高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む環境への適応能力が高く、醤油諸味（液汁）中でのエタノール生産性能も高い事から、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群との２群に容易に、かつ迅速に区分けできる事が判明した。
【０３９３】
そこで、上記の試験６．のＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物について、それらの塩基配列を解読してみた。
【０３９４】
試験８．さまざまなＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物の塩基配列解読（シークエンシング）：
【０３９５】
上記の試験６．における、各株の、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物のうち、６４．４℃のアニーリング温度条件下で生じた増幅産物から、上記の試験３．の手順で、ＰＣＲ産物を調製（または粗精製）した。
【０３９６】
増幅産物の塩基配列解読（シークエンシング）は、以下の手順で行なった。キャピラリーシークエンサーを用いての、１回の塩基配列解読（シークエンシング）で読み取れる塩基配列の鎖長は、せいぜい８００ｂｐ前後が限界とされる（藤博幸（編）：はじめてのバイオインフォマティクス、ｐ７９−９６（平川英樹（著））、講談社サイエンティフィク  （２００６））。領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物の鎖長はすべて２ｋｂ強なので、１回の塩基配列解読（シークエンシング）で、その全長を解読する事はできない。そこで、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の解読には、解読用プライマーＣ１１３２１５９（＝配列番号２６）、解読用プライマーＣ１１３３４４８Ｒ（＝配列番号２７）、解読用プライマーＣ１１３４１２３Ｒ（＝配列番号２８）の、計３種類の解読用プライマーを用いた。この解読用プライマーＣ１１３２１５９（＝配列番号２６）は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）に当たる「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」の、その部分配列（＝図４７．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考にして設計したもの、解読用プライマーＣ１１３４１２３Ｒ（＝配列番号２８）は１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」よりもやや上流の配列部分（＝図４９．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考に設計したもの、また解読用プライマーＣ１１３３４４８Ｒ（＝配列番号２７）も、１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）に当たる「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」と、１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」との間に位置する、１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分の、その部分配列（＝図４８．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考に設計したものであり、これらの解読用プライマーの塩基配列は、下記の通りである。
解読用プライマーＣ１１３２１５９（＝配列番号２６）：
（２１塩基、ＭＷ＝６４５８、Ｔｍ＝６０．２）
５’−ＴＧＴＴＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧ−３’
解読用プライマーＣ１１３３４４８Ｒ（＝配列番号２７）：
（２１塩基、ＭＷ＝６３４２、Ｔｍ＝６０．８）
５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣ−３’
解読用プライマーＣ１１３４１２３Ｒ（＝配列番号２８）：
（２１塩基、ＭＷ＝６５０４、Ｔｍ＝６１．３）
５’−ＡＧＡＧＴＣＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＧＴＴＡＧ−３’
この解読用プライマーＣ１１３２１５９（＝配列番号２６）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）では、領域（２）−（ａ）の上流領域を起点に、その下流にある領域（２）−（ａ）の全長と、さらに領域（２）−（ｂ）の一部を、また解読用プライマーＣ１１３３４４８Ｒ（＝配列番号２７）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）では、領域（２）−（ｂ）上の塩基配列部分を起点に、その上流にある領域（２）−（ａ）の一部を、さらに解読用プライマーＣ１１３４１２３Ｒ（＝配列番号２８）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）では、領域（２）−（ｃ）の下流領域を起点に、その上流にある領域（２）−（ｃ）の全長と、領域（２）−（ｂ）の一部を解読する事ができる（注：プライマー名の末尾の「Ｒ」は、下流側から上流側へ向けて逆手方向に解読するプライマーである事を示している）。
【０３９７】
領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列の解読の際に用いる解読用プライマーは、これらの塩基配列に限定されるものではない。上記の３種類の解読用プライマーのうち、たとえば解読用プライマーＣ１１３４１２３Ｒ（＝配列番号２８）の代わりに、解読用プライマーＣ１１３３１１２（＝配列番号２９）を用いたとしても、解読用プライマーＣ１１３４１２３Ｒ（＝配列番号２８）を用いた際の塩基配列解読（シークエンシング）と同様、正確に塩基配列を解読する事ができる。用いた解読用プライマーＣ１１３３１１２（＝配列番号２９）の塩基配列は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３３０４７番目のシトシン（Ｃ）から１１３３４６８番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（４２２ｂｐ）に当たる「領域（２）−（ｂ）」の、その部分配列（＝図４８．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考にして設計したもので、その塩基配列は下記の通りである。
解読用プライマーＣ１１３３１１２（＝配列番号２８）：
（２２塩基、ＭＷ＝６７６９、Ｔｍ＝６１．５）
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣ−３’
ＰＣＲ法で用いたこれらのプライマーの化学合成は、株式会社日本バイオサービスに委託した（ＤＮＡ合成：スモールスケール品）。
【０３９８】
一方、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では、上記した通り、供試株の種類、より正確には供試株の「分離源」とその「醸造特性」の違いによって、鎖長の異なる２種類の増幅産物、すなわち［１］−１．Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））を含む、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた３ｋｂ弱の増幅産物と、［１］−２．ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））を含む、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた１ｋｂ前後の増幅産物とが生じたため、前者の増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の解読に必要な必要な解読プライマーの本数及び種類は、後者の増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の解読に必要な解読用プライマーの本数及び種類とは異なる。後者の増幅産物、すなわち［１］−２．ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））を含む、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた１ｋｂ前後の増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）には、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（２２８ｂｐ）」の、その部分配列（＝図４６．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考にして設計した解読用プライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）を用いた。用いた解読用プライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）の塩基配列は、下記の通りである。
解読用プライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）：
（２２塩基、ＭＷ＝６８３１、Ｔｍ＝６１．３）
５’−ＧＴＴＧＡＴＡＧＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧ−３’
【０３９９】
この［１］−２．ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））を含む、味噌や醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた１ｋｂ前後の増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列の解読の際に用いる解読用プライマーは、この塩基配列に限定されるものではない。この解読用プライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）の代わりに、たとえば解読用プライマーＣ３７４１２３（＝配列番号３１）を用いても、きれいに解読する事ができる（注：詳しいデータは省略する）。用いた解読用プライマーＣ３７４１２３（＝配列番号３１）は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」の、その部分配列（＝図４３．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考にして設計したもので、その塩基配列は下記の通りである。
解読用プライマーＣ３７４１２３（＝配列番号３１）：
（２２塩基、ＭＷ＝６６８８、Ｔｍ＝６１．４）
５’−ＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＣＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＣ−３’
【０４００】
一方、前者の増幅産物、すなわち［１］−１．Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））を含む、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の鎖長は３ｋｂ弱と、前者、すなわち［１］−２．ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））を含む、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた増幅産物（１ｋｂ前後）から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物よりも大きく（＝鎖長が長く）、ゆえに上記の解読用プライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）ないしは解読用プライマーＣ３７４１２３（＝配列番号３１）を用いた塩基配列解読（シークエンシング）１回だけでは、ＰＣＲ産物の全塩基配列を解読し切れない。そこで、こうした増幅産物の塩基配列解読（シークエンシング）には、上記の解読用プライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）及び解読用プライマーＣ３７４１２３（＝配列番号３１）と、さらに領域（１）上の部分配列（＝図４４．中の破線形式の矢印付き塩基配列部分）を参考にして設計した解読用プライマーＣ３７５２９７（＝配列番号３２）及び解読用プライマーＣ３７５４６４Ｒ（＝配列番号３３）も加えた、計４種類の解読用プライマーを用いた。新たに用いた解読用プライマーＣ３７５２９７（＝配列番号３２）及び解読用プライマーＣ３７５４６４Ｒ（＝配列番号３３）の塩基配列は、下記の通りである。
解読用プライマーＣ３７５２９７（＝配列番号３２）：
（２１塩基、ＭＷ＝６３６５、Ｔｍ＝５９．７）
５’−ＡＧＴＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣ−３’
解読用プライマーＣ３７５４６４Ｒ（＝配列番号３３）：
（２１塩基、ＭＷ＝６４３２、Ｔｍ＝５９．９）
５’−ＣＣＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴＴＡＧＧＡＣＡＡＣ−３’
【０４０１】
なお、［１］−１．Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））を含む、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の場合に生じた３ｋｂ弱の鎖長のＰＣＲ産物の塩基配列の解読の際に用いる解読用プライマーは、これらの塩基配列に限定されるものではない。上記４種類の解読用プライマーのうち、たとえば解読用プライマーＣ３７５２９７（＝配列番号３２）の代わりに、領域（１）上の部分配列（＝図４４．中の破線形式の下線付き塩基配列部分）を参考にして設計した解読用プライマーＣ３７５２６９（＝配列番号３４）を用いたとしても、解読用プライマーＣ３７５２９７（＝配列番号３２）を用いた際の解読と同様、正確に塩基配列を解読する事ができる（注：詳しいデータは省略する）。用いた解読用プライマーＣ３７５２６９（＝配列番号３４）の塩基配列は、下記の通りである。
解読用プライマーＣ３７５２６９（＝配列番号３４）：
（２２塩基、ＭＷ＝６８００、Ｔｍ＝６１．２）
５’−ＴＧＡＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＧ−３’
ＰＣＲ法で用いたこれらのプライマーの化学合成は、株式会社日本バイオサービスに委託した（ＤＮＡ合成：スモールスケール品）。
【０４０２】
ＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）は、株式会社バイオマトリックス研究所に委託した（注：ＤＮＡシーケンス受託解析のＡタイプ）。
【０４０３】
塩基配列解読（シークエンシング）結果の、既知の塩基配列情報との照合（＝相同性検索）などの解析処理には、米国（立）バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）上に公開されている相同性検索プログラム「ＢＬＡＳＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）のうちの、データベース上の既知の塩基配列情報の中から「問い合わせ（クエリー（ｑｕｅｒｙ））配列」との類似性が高いものだけを選択するための、つまり「塩基対塩基」用プログラムである「ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｌａｓｔ（Ｓｅａｔｃｈ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕｅｒｙ）」を用いた。
【０４０４】
上記の試験６．で示した通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株２０株の、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、うちＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））を除いた１９株の場合に生じた増幅産物の鎖長はいずれも２ｋｂ強と、目視上は同じ鎖長に見え、しかも公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）から算出される、プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する１１３２０４４番目のアデニン（Ａ）（図４７．）と、プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する１１３４２７８番目のグアニン（Ｇ）（図４９．）との間の塩基数（２２３５ｂｐ）と合致しているように見えた。そこで、これらの増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を解読し、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同領域の塩基配列と比較してみた。
【０４０５】
図７３．〜７８．は、上記の試験６．での、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株の、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から上記の手順で調製（または精製）したＰＣＲ産物の塩基配列の解読結果の一部、つまり公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３２３９４番目のシトシン（Ｃ）から１１３３８４３番目のシトシン（Ｃ）までの、すなわち領域（２）を含む塩基配列部分（１４５０ｂｐ）に相当する配列部分（＝配列番号４２〜４４）を示したものであり、また図８３．はこれらＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）結果を、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（１４５０ｂｐ）との比較で模式図化したものである。図８３．中の三角形の印は、それぞれの株のＰＣＲ産物の解読結果の、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分と一致しない塩基の位置を示している。
【０４０６】
これらのＰＣＲ産物の塩基配列を解読した結果、まず［１］ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分のそれと完全に一致（＝１００％相同）している事、そして［２］１９株ともに鎖長（＝塩基数）は同じ（１４５０ｂｐ）で、［３］うち８株、すなわちＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株（醤油））、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株（溜醤油諸味））、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図７３．及び図７４．（＝配列番号４２）、模式図は図８３．の（１））も、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（１４５０ｂｐ）のそれと完全に一致（＝１００％相同）している事、また［４］うち３株、すなわちＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図７５．及び図７６．（＝配列番号４３）、模式図（後記）は図８３．の（２））はいずれも、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（１４５０ｂｐ）とは、「１１３２８００番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている」、「１１３３０４９番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）になっている」、「１１３３５６４番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」、「１１３３６８３番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている」という計４塩基の違いを除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事、［５］うち７株、すなわちＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株（醤油醸造工程））、ＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株（味噌））、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株（醤油関連））、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株（醤油諸味））、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株（味噌））、ＮＢＲＣ０５０５株（醤油関連）、ＮＩＳＬ���３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図７７．及び図７８．（＝配列番号４４）、模式図（後記）は図８３．の（３））はいずれも、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（１４５０ｂｐ）とは、「１１３３０６０番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている」という１塩基の違いを除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事が判明した。
【０４０７】
上記の試験６．で示した通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された９株のうち、唯一増幅産物が生じなかったＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））と、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））を除いた７株、すなわちＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた増幅産物の鎖長はいずれも３ｋｂ弱と、目視上は同じ鎖長に見え、しかも公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）から算出される、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）（図４３．）と、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する３７６８３５番目のチミン（Ｔ）（図４６．）との間の塩基数（２７６０ｂｐ）とも合致しているように見えた。そこで、これらの増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を解読し、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同領域の塩基配列と比較してみた。
【０４０８】
図８４．〜９１．は、上記の試験６．での、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から上記の手順で調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列の解読結果の一部、つまり公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」の、その３７４４２６番目のチミン（Ｔ）から、「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」の、その３７６６７５番目のグアニン（Ｇ）までの、すなわち領域（１）を含む塩基配列部分（２２５０ｂｐ）に相当する配列部分（＝配列番号４７〜５０）を示したものであり、また図９３．は、これらＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）結果を、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（２２５０ｂｐ）との比較で模式図化したものである。図９３．中の三角形の印は、それぞれの株のＰＣＲ産物の解読結果の、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（２２５０ｂｐ）と一致しない塩基の位置を示している。
【０４０９】
これらのＰＣＲ産物の塩基配列を解読した結果、まず［１］ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝塩基配列は省略、模式図は図９３．の（１）−１．）は、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（２２５０ｂｐ）のそれと完全に一致（＝１００％相同）している事、そして［２］うち２株、すなわちＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））及びＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図８４．〜８６．（＝配列番号４７）、模式図は図９３．の（１）−２．）は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７６３３２番目のチミン（Ｔ）と３７６３３３番目のチミン（Ｔ）との間に、「シトシン−チミン−チミン（ＣＴＴ）」の３塩基の繰り返しで構成された、「シトシン−チミン−チミン−シトシン−チミン−チミン−シトシン−チミン−チミン（ＣＴＴＣＴＴＣＴＴ）」の９塩基（＝図８６．中の枠囲いにした塩基配列部分）が余分にある事を除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事、また［３］うち４株、すなわちＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図８７．〜８９．（＝配列番号４８）、模式図は図９３．の（１）−３．）は、上記［２］の２株で見つかった「３７６３３２番目のチミン（Ｔ）−３７６３３３番目のチミン（Ｔ）間の余分な９塩基（＝図８９．中の枠囲いにした塩基配列部分）」に加え、さらに領域（１）上の「３７５５６３番目のグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）になっている」という違いも見つかったものの、この２箇所の違いを除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事が判明した。つまり、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された９株のうちの７株は、ｐＳＲ１類似配列のうちの１つである領域（１）、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの���基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）を持っている事が判明した。上記した通り、供試株のうちの６株、すなわちＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物は、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物よりも鎖長が９塩基分長かったり、また一致しない塩基部分もあるが、こうした塩基や鎖長（＝塩基数）の違いは上記のゲル電気泳動法での目視検査だけでは見分けられない。
【０４１０】
一方、上記の試験６．で示した通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された１１株、すなわち醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）やＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株）、ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株）、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株）、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株）、ＮＢＲＣ０５０５株、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）やＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）の場合に生じた増幅産物の鎖長はいずれも１ｋｂ前後と、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）から算出される、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）（図４３．）と、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する３７６８３５番目のチミン（Ｔ）（図４６．）との間の塩基数（２７６０ｂｐ）や、さらには「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された７株、すなわちＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた増幅産物の鎖長（３ｋｂ弱）よりも短かった。
【０４１１】
そこで、これらの増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を解読し、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（２２５０ｂｐ）と比較してみたところ、［４］醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））（＝図９０．（＝配列番号４９）、模式図は図９３．の（２））や醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））（＝図９１．（＝配列番号５０）、模式図は図９３．の（３）−１．）を含む１１株では、ｐＳＲ１類似配列のうちの１つである領域（１）、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）がない（または欠けている）事が判明した。そのため、これら１１株では、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間の塩基配列部分の塩基数は、わずか４９３ｂｐしかない。上記の試験６．の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された１１株の場合に生じた増幅産物の鎖長が１ｋｂ前後と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株（のうち、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株）及びＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株）を除いた７株）の場合に生じた増幅産物の鎖長（３ｋｂ弱）よりも短かったのは、そのためだと判明した。
【０４１２】
さらに、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された１１株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）結果を詳細に調べてみると、［５］醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））（＝図９０．（＝配列番号４９）、模式図は図９３．の（２））や醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））（＝図９１．（＝配列番号５０）、模式図は図９３．の（３）−１．）を含む１１株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列では、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分（２２５０ｂｐ）と合致しない計４箇所（＝計４塩基）、すなわち「３７４４５９番目のアデニン（Ａ）がない（または欠けている（・））」、「３７６２９２番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」、「３７６３０６番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている」、「３７６３７７番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」という塩基違いが見つかった。さらに、［６］１１株のうち、上記の試験５．の醤油産膜性試験において、濃口醤油（及び濃口生揚げ醤油）中で皮膜を形成した、つまり醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株である４株、すなわちＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）、ＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図９１．（＝配列番号５０）、模式図は図９３．の（３）−１．）では、さらに「ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」という塩基違いが見つかった。この「ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」という塩基違いは、上記の試験５．の醤油産膜性試験において、濃口醤油（及び濃口生揚げ醤油）中で皮膜を形成しなかった、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の７株、すなわちＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株（醤油醸造工程））、ＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株（味噌））、ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株（醤油関連））、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株（醤油諸味））、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株（味噌））、ＮＢＲＣ０５０５株（醤油関連）の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物はもちろん、上記の「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された（醤油「非」産膜性の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の７株、すなわちＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列にも見られないものであり、つまり「醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株特異的な塩基違い」である事が判明した。
【０４１３】
なお、上記の試験６．で記した通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株の、領域（１）及び（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉの９株のうち、図５７．や図６１．でも示した通り（＝図９４．の（１）及び（２）に再度示す）、「唯一」増幅産物が生じなかったＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））については、上記の試験４．、すなわちＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））で、この株が持つイミダゾールグリセロール燐酸デヒドラダーゼ遺伝子（ＨＩＳ３）の数と種類とを調べてみた。
【０４１４】
図９４．の（３）及び（４）は、その結果を示すゲル写真である。比較用の供試株としては、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法では増幅産物が生じるが、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法では増幅産物が生じず、ゆえにＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に分類すべきとしているＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））と、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法とＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法との両方で増幅産物が生じ、ゆえに［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））とを用いた。ＰＣＲ法で鋳型ＤＮＡとして用いた核酸成分は、３株ともに、上記の（ｂ）ＩＳＯＰＬＡＮＴ法で調製した。
【０４１５】
図９４．の（４）のゲル写真が示す通り、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合には、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法ではＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物と、目視では同じ鎖長に見える増幅産物が生じたものの、図９４．の（３）のゲル写真が示す通り、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法では増幅産物自体が生じず、ゆえに（この株を保存しているＮＢＲＣでも、発明者が同株を分譲された際（２０１０年７月時点）にはＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類していたものの、現在はＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．に区分けし直しており）ＧｏｒｄｏｎやＨａｒｒｉｓｏｎらが［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしている株である（可能性が高い）事が判明した。ＩＦＯ１８１２株（＝ＮＢＲＣ１８１２株（花））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列は、上記した通り、Ｓｕｅｚａｗａらによって既に解読されているが（ＡＢ３０２８０７．１、ＧＩ：２０８６０９１９７）、その鎖長は５８０ｂｐで、いわゆるＳｕｅｚａｗａらがＴｙｐｅ２と称している、ＧｏｒｄｏｎらやＨａｒｒｉｓｏｎらが［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとしているＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（ＡＪ５５５４０６．１、ＧＩ：４６０９４７５６（５６０ｂｐ）（＝配列番号２））と完全に一致（＝１００％相同）している事も、この推察を支持するものである。
【０４１６】
上記した通り、試験１．の醤油諸味液汁（のエタノール）発酵試験、試験２．の生存試験や試験５．の醤油産膜性試験などの際に、このＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花（日本）））だけは、他のＺ．ｒｏｕｘｉｉ株に較べると耐塩性能が極端に弱い事も確認している。試験１．、試験２．、試験５．で用いた供試株２０株の種培養液１ｍｌ当たりの酵母数（ＣＦＵ／ｍｌ）の計数には、食塩（ＮａＣｌ）濃度が約１０％と、種培養液とほぼ同じ食塩（ＮａＣｌ）濃度の生醤油寒天を用いる塗抹培養法を用いたが、供試株２０株の中で唯一、このＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花（日本）））だけが、図１．で示した通り、同寒天上では菌集落（コロニー）を形成せず、種培養液１ｍｌ当たりの酵母数（ＣＦＵ／ｍｌ）の計数用に、食塩（ＮａＣｌ）濃度を７％程度にまで減らした「生醤油寒天（７％ＮａＣｌ）」を用いざるを得なかった。
【０４１７】
仮に、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で増幅しようとした、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）（図４３．）と、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する３７６８３５番目のチミン（Ｔ）（図４６．）との間の塩基配列部分（注：この場合には、同塩基配列上の領域（１）の有無は考慮しない）や、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で増幅しようとした、同じく染色体Ｃ上の、プライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）の５’−末端のアデニン（Ａ）に相当する１１３２０４４番目のアデニン（Ａ）（図４７．）と、プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）の５’−末端のシトシン（Ｃ）に相当する１１３４２７８番目のグアニン（Ｇ）（図４９．）との間の塩基配列部分が［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に由来する塩基配列部分だと仮定した場合、「ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））だけが、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で増幅産物が生じなかった」という事実は、論理的に納得のゆく話でもある。もし仮りに、これらの塩基配列部分が［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に由来する塩基配列部分であるとすれば、これらの塩基配列部分を持つのは［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる株群と、その（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる株とＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる株との交雑によって生まれた株だとさ（れ、（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群由来の遺伝子情報も受け継いでいるものと見ら）れる［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる株群だけであり、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））のような、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる株群は同塩基配列部分を持っていないはずだからである。
【０４１８】
このように、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合に、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で増幅産物が生じなかった理由としては、この株が、供試株として選んだ計２０株の中で唯一［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる株であったためとも考えられる。
【０４１９】
ただし、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべきとされる株に関する報告は、上記した通り、ＪａｍｅｓらによるＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））（Ｓ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｊ．Ｂｏｎｄ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，５（８），７４７−７５５  （２００５））ぐらいしかなく、現時点ではその表現形質に関する報告もない。
【０４２０】
たとえば、上記の、バルサミコ酢（イタリア）から分離されたＺ．ｓａｐａｅ  ＡＢＴ３０１株や、Ｚ．ｓａｐａｅ  ＡＢＴ６０１株は、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））と同一（＝１００％相同）の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を持つ事から、当初はＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉだと見做され（Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｓ．Ｌａｎｄｉ，Ｌ．Ｄｅ  Ｖｅｒｏ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０１（１），６３−７１  （２００６））、それゆえにＧｅｎＢａｎｋ、ＥＮＡ、ＤＤＢＪが協力して構築している国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）にもＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ株の塩基配列情報として登録されたが（注：Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＡＢＴ３０１株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（６２３ｂｐ）の情報はＡＪ９６６３４２．３（ＧＩ：３８４０８０４６０）、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＡＢＴ６０１株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列（６２３ｂｐ）の情報はＡＪ９６６５１７．３（ＧＩ：３８８４８９４９２））、その後の研究結果から判明した生理・生化学的、あるいは分子生物学的な特徴がＺ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪））やＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））のそれとは明らかに異なる事（Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｓ．Ｃａｓｓａｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｙｅａｓｔ，２４（５），４０３−４１７  （２００７）、Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｓ．Ｃａｓｓａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ａ．Ｃｒｏｃｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，４５（１２），１５８２−１５９０  （２００８）、Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｔ．Ｃ．Ｄａｋａｌ，Ｍ．Ａ．Ｃｒｏｃｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１３（３），２４５−２５８  （２０１３））を理由に、結果的にはこれらの株を区分けするための（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＣＹＣ３０４２株とは別種の）Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｐａｅ  ｓｐ．ｎｏｖ．（チゴサッカロミセス・サパエ・スピーシーズ・ノバ）という新種が設けられ、うちＡＢＴ３０１株（バルサミコ酢（イタリア））は基準株に指定された（Ｌ．Ｓｏｌｉｅｒｉ，Ｔ．Ｃ．Ｄａｋａｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｕｄｉｃｉ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（Ｐｔ  １），３６４−３７１  （２０１３））。国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）にＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ株のものとして登録されている２６ＳｒＲＮＡ遺伝子の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列情報としては、他にＡＴＣＣ４２９８１株（＝ＩＡＭ１２８７９株（味噌））の部分配列（＝ｃｌｏｎｅ１（ＡＭ９４７６８１．１、ＧＩ：１７０６５０３２０（６２４ｂｐ））及びｃｌｏｎｅ２（ＡＭ９４７６８０．１、ＧＩ：１７０６５０３１９（６２２ｂｐ）））やＯＵＴ７１３６株（醤油諸味）の部分配列（ＨＥ６６４０９４．１、ＧＩ：３８０４９６９５８（５７０ｂｐ））もあるが（２０��４年２月２８日調査時点）、いずれも味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された株であり、少なくとも主要な菌株保存研究機関ではＺ．ｒｏｕｘｉｉとして取り扱われている。つまり、Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉに区分けすべき株は、現時点ではＮＣＹＣ３０４２株（ソフトドリンク工場（イギリス））以外にない。
【０４２１】
そして、［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべき株なのか否かを調べる方法も、上記のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））ぐらいしかない。
【０４２２】
それゆえに、ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））を［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべき株だと現時点で断定する事は難しく、ゆえにＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の場合に、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で増幅産物が生じなかった理由としては、単に今回発見した法則性に合致しない「例外的な株」であった可能性も考えられる。ただ、本発明は、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類され、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高い株群」の迅速かつ容易な判別法に関するものであり、ゆえに「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群の一部に、このＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））のような、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で増幅産物が生じない例外株がいたとしても、特に問題にはならない。現時点で、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）からＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉが分離されたとの報告はないからである。
【０４２３】
また、上記の試験６．で示した通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株２０株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された９株のうち、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合に生じた増幅産物の鎖長は、（上記のＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））を除いた）他の７株の場合に生じた増幅産物（３ｋｂ弱）よりも短く、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））を含む、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された１１株の場合に生じた増幅産物（１ｋｂ前後）と、少なくとも目視では同じ鎖長に見えた。そこで、このＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を解読し、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分と比較してみたところ、［１］ｐＳＲ１類似配列のうちの１つである領域（１）、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）がなく（または欠けており）、［２］「３７４４５９番目のアデニン（Ａ）がない（または欠けている（・））」、「３７６２９２番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」、「３７６３０６番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている」、「３７６３７７番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）になっている」という計４箇所（＝計４塩基）の塩基違いが見つかった（注：ちなみに、３７４４９８番目の塩基はチミン（Ｔ）である）。つまり、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、たとえばＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）など、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の７株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列と完全に一致（＝１００％相同）していた。上記の試験６．の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合に生じた増幅産物の鎖長が１ｋｂ前後と、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された（ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））及びこのＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））を除いた）７株の場合��生じた増幅産物の鎖長（３ｋｂ弱）より短く、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた増幅産物と、目視上同じ鎖長に見えたのは、そのためである。
【０４２４】
そこで、このＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））についても、上記のＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））と同様に、上記の試験４．、すなわちＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））で、この株が持つイミダゾールグリセロール燐酸デヒドラダーゼ遺伝子（ＨＩＳ３）の数と種類とを調べてみたところ（注：データは省略する）、（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法とＺ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法との両方で、ともに単一の、しかも醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物と、目視上同じ鎖長の増幅産物が生じ、ゆえに（ＮＢＲＣを含む菌株保存研究機関では、この株を現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類しているものの）ＧｏｒｄｏｎやＨａｒｒｉｓｏｎらが［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとしている株である（可能性が高い）事が判明した。つまり、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））の場合に生じた増幅産物が味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた増幅産物とまったく同一のものであった理由としては、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））が、［１］（生粋の）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ群から派生したと見られる［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株であるためとも考えられる。
【０４２５】
ただし、上記のＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））と同様、このＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））も、本試験で発見した法則性に合致しない「例外的な株」であるという可能性も捨てきれない。というのも、現時点で、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株が分離されたとの報告がないためである。なお、このＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））は、上記した通り、その細胞内からプラスミドｐＳＲ１が発見された、「非常に珍しい」株としても知られている。いずれにせよ、本発明は、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類され、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高い株群」の迅速かつ容易な判別法に関するものであり、ゆえに「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株の一部に、このＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））のような、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の両方で増幅産物が生じない例外株がいたとしても、特に問題にはならない。
【０４２６】
上記した通り、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株、すなわちＺ．ｂａｉｌｉｉやＺ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａやＣａｎｄｉｄａ属酵母などでは、増幅産物自体が生じなかった。供試株の、領域（１）の有無を調べるためのＰＣＲ法で用いたプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）を設計する際に参考にした、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２３４３ｂｐ）にコードされているものと見られるホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）は、（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ特異的な酵素ではなく）さまざまな生物種に普遍的に分布している酵素であり、たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（シゾサッカロミセス・ポンベ）、メタノール資化酵母のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピチア・パストリス）、焼酎や泡盛などの製造に用いられる黒麹菌（または黒麹カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（アスペルギルス・ニガー）））や、合成樹脂・繊維や印刷用インキなどの原料として用いられるイタコン酸（ｉｔａｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの生産にも利用される糸状菌Ａｓｐ．ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（ニューロスポラ・クラッサ））、さらには植物のシロイズナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ））、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ホモ・サピエンス））、動物実験で使われるハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ムス・ムスキュラス（またはムスクルス）））やドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラッツス・ノルベギクス））など、さまざまな生物種が持つ同酵素の遺伝子の塩基配列が解読され、その情報が公開されている。特に、Ｓ２８８Ｃ株やＥＣ１１１８株など、一部のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株については、上記した通り、全ゲノム情報が公開されている事から、Ｓ２８８Ｃ株やＥＣ１１１８株などの「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））」やその下流領域の塩基配列情報と、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」やその下流の塩基配列部分との類似性を調べる事ができる。
【０４２７】
ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））は、たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の場合には、染色体IV（ＢＫ００６９３８．２、ＧＩ：３２９１３８８６４）上の、８６８２２４番目のアデニン（Ａ）から８７０５６３番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２３４０ｂｐ）に、またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＣ１１１８株の場合にも、同じく染色体IV（ＦＮ３９３０６３．１、ＧＩ：２５９１４５０４１）上の、７５０６４３番目のアデニン（Ａ）から７５２９８２番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２３４０ｂｐ）にあり、その鎖長はいずれも２３４０ｂｐと、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上にある、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））よりもやや短い。
【０４２８】
このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の染色体IV（ＢＫ００６９３８．２、ＧＩ：３２９１３８８６４）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４０ｂｐ）））とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＣ１１１８株の染色体IV（ＦＮ３９３０６３．１、ＧＩ：２５９１４５０４１）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４０ｂｐ）））との、塩基配列の類似性は９９．５％と非常に高い一方（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）、すなわち３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２３４３ｂｐ）との類似性の高い塩基配列部分は、うち（同酵素のＮ末端寄りのアミノ酸配列部分をコードしている塩基配列部分を除いた）１２８３ｂｐ分に過ぎず、その類似性も７２．６％程度に過ぎない（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。
【０４２９】
また、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと同属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）の、Ｚ．ｂａｉｌｉｉの基準株であるＣＬＩＢ２１３株のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）、すなわち１２１４１９４番目のアデニン（Ａ）から１２１６４３４番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２２４１ｂｐ）を含む塩基配列情報（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）も公開されているが、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）、すなわち３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２３４３ｂｐ）との類似性の高い塩基配列部分は、うち（同酵素のＮ末端寄りのアミノ酸配列部分をコードしている塩基配列部分を除いた）１２１５０７９番目のシトシン（Ｃ）から１２１６４３４番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（１３５６ｂｐ）だけで、しかもその類似性も７３．６％程度に過ぎない（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。
【０４３０】
「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）上にある、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２（３０塩基））の設計の際に参考とした塩基配列部分、すなわち３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）から３７４１０５番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（３０ｂｐ）」（＝図９５．の（２）（＝配列番号５２））に相当する、Ｓ２８８Ｃ株やＥＣ１１１８株のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ）））上の同塩基配列部分を、上記のＢＬＡＳＴを用いた相同性検索で探してみたところ、図９５．の（４）の通り、Ｓ２８８Ｃ株の場合には、染色体IV（ＢＫ００６９３８．２、ＧＩ：３２９１３８８６４）上の８７０２０５番目のシトシン（Ｃ）から８７０２２２番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（＝配列番号５４（１８ｂｐ））、またＥＣ１１１８株の場合には、染色体IV（ＦＮ３９３０６３．１、ＧＩ：２５９１４５０４１）上の７５２６２４番目のシトシン（Ｃ）から７５２６４１番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（＝配列番号５５（１８ｂｐ））がそれに相当するとの結果を得る事ができるが、ただしそれらの塩基配列部分の鎖長はＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の塩基配列部分（３０ｂｐ）よりも短く、塩基配列の類似性もきわめて低く、特にプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）上の３’−末端寄りに相当する塩基配列部分の類似性が（うち１１塩基が欠けていて）きわめて低い事が分かる。
【０４３１】
上記した通り、同じＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに分類されているＳ２８８Ｃ株と、（Ｓ２８８Ｃ株とはまったく異なる特徴（＝表現形質）を示す）清酒酵母であるきょうかい７号（Ｋ７）の持つ遺伝子のほとんどが９８％以上という高い類似性を示す事（下飯仁、藤田信之：化学と生物、４５（８）、５３９−５４３  （２００７）、下飯仁、赤尾健、渡辺大輔：生物工学、８９（９）、５３２−５３５  （２０１１）、Ｔ．Ａｋａｏ，Ｉ．Ｙａｓｈｉｒｏ，Ａ．Ｈｏｓｏｙａｍａ，Ｈ．Ｋｉｔａｇａｋｉ，Ｈ．Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｄ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｒ．Ａｋａｄａ，Ｙ．Ａｎｄｏ，Ｓ．Ｈａｒａｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．Ｋａｊｉｗａｒａ，Ｋ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｎ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．Ｋｕｈａｒａ，Ｔ．Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ，Ｈ．Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｎａｋａｏ，Ａ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｍ．Ｎａｍｉｓｅ，Ｔ．Ｏｂａ，Ｔ．Ｏｇａｔａ，Ａ．Ｏｈｔａ，Ｍ．Ｓａｔｏ，Ｓ．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｙ．Ｔａｋａｔｓｕｍｅ，Ｓ．Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｈ．Ｔｓｕｂｏｉ，Ａ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．Ｙｏｄａ，Ｔ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ：ＤＮＡ  Ｒｅｓ．，１８（６），４２３−４３４  （２０１１）、北本勝ひこ（監修）：発酵・醸造食品の最新技術と機能性II、ｐ１２９−１３９（下飯仁（著））、シーエスシー出版  （２０１１））、そしてこのＳ２８８Ｃ株とＥＣ１１１８株のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ）））どうしの類似性も９９．５％ときわめて高い事から、（上記の試験７．で用いたＡＴＣＣ４１２６株（分離源不明）やＩＡＭ４９１９株（廃糖蜜）を含む）これらの株と同属同種（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株群のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））は、これらの株のそれと同一（＝１００％相同）か、きわめて類似性が高く、それゆえに「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）上にある、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の設計の際に参考とした塩基配列部分、すなわち３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）から３７４１０５番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（３０ｂｐ）」との類似性は低いものであろうと予想される。
【０４３２】
また、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）上にある、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の設計の際に参考とした塩基配列部分、すなわち「３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）から３７４１０５番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（３０ｂｐ）」（＝図９５．の（２）（＝配列番号５２））に相当する、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２４１ｂｐ））上の同塩基配列部分についても、上記のＢＬＡＳＴを用いた相同性検索で探してみたところ、図９５．の（３）の通り、１２１６０８５番目のシトシン（Ｃ）から１２１６１１１番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（＝配列番号５３（２７ｂｐ））がそれに相当するとの結果を得る事ができるが、その塩基配列部分（＝配列番号５３）の鎖長も、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の塩基配列部分（＝配列番号５２（３０ｂｐ））よりもやや短く、やはりプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）上の３’−末端寄りに相当する塩基配列部分の類似性が（うち４塩基分が欠けていて）低い。
【０４３３】
そして、（上記の試験７．で用いたＮＢＲＣ１８０１株（＝ＩＦＯ１８０１株（土（日本）））やＮＢＲＣ１０６６７株（腐敗したトマトケチャップ（日本））、ＮＩＳＬ３４４０株（＝ＮＢＲＣ０４９３株＝旧：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４７６株（日本酒粕））を含む）このＣＬＩＢ２１３株と同属同種（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）の株群のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））も、このＣＬＩＢ２１３株のそれと同一（＝１００％相同）か、きわめて類似性が高く、それゆえに「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）上にある、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の設計の際に参考とした塩基配列部分、すなわち３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）から３７４１０５番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（＝配列番号５２（３０ｂｐ））」との類似性は低いものである可能性が高い。
【０４３４】
ゆえに、上記の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株や、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと同属のＺ．ｂａｉｌｉｉ株などの場合にも増幅産物が生じなかった原因としては、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）を参考にして設計したプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の塩基配列（３０塩基）と、これらの株のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））上の、相当する塩基配列部分（＝鋳型ＤＮＡ）との類似性が低く、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）がＰＣＲ法でのアニーリング反応時にこれらの株の同塩基配列部分（＝鋳型ＤＮＡ）にうまく結着できなかったためではないかと考えられる。
【０４３５】
上記のＢＬＡＳＴ処理で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の染色体IV（ＢＫ００６９３８．２、ＧＩ：３２９１３８８６４）上やＥＣ１１１８株の染色体IV（ＦＮ３９３０６３．１、ＧＩ：２５９１４５０４１）上にあるホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ）））やＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）が持つホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２４１ｂｐ））と、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４０ｂｐ））との類似性を詳細に調べてみたところ、この（ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の）３７４０７６番目のシトシン（Ｃ）から３７４１０５番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（＝配列番号５２（３０塩基））以外にも、きわめて類似性の低い塩基配列部分が何箇所もある事が判明した。そのため、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なう場合に、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の代わりに、こうしたＢＬＡＳＴ処理で見出される「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ−それ以外（＝Ｚ．ｂａｉｌｉｉやＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）の酵母株間で類似性の低い、別の塩基配列部分」を参考にして（特に類似性の低い塩基配列部分が３’−末端側に来るように）設計した、最低１８塩基以上、好ましくは２４塩基以上、より好ましくは２７〜３３塩基のプライマーを用いても、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）を用いた場合と同様の結果、すなわち「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとするＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では増幅産物が生じるものの、このようなＺ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株では、増幅産物自体が生じない」という結果を得る事ができる（データ省略）。
【０４３６】
ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））の下流に位置する「（順番的に）「次」の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の場合には、染色体IV（ＢＫ００６９３８．２、ＧＩ：３２９１３８８６４）上の８７１０７４番目のアデニン（Ａ）から８７１３０１番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（２２８ｂｐ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＣ１１１８株の場合には、同じく染色体IV（ＦＮ３９３０６３．１、ＧＩ：２５９１４５０４１）上の７５３４５５番目のシトシン（Ｃ）から７５３８６８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（４１４ｂｐ）、またＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株の場合（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）には、１２１７０２９番目のアデニン（Ａ）から１２１７２１４番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（１８６ｂｐ）に相当する。これらの塩基配列部分（ＣＤＳ）のうち、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））の下流に位置する「（順番的に）「次」の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」、すなわち３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との類似性が高いのは、同属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）のＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株の塩基配列部分（１８６ｂｐ）だけで、しかもその類似性も８０％未満に過ぎない（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０）。
【０４３７】
「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」上にある、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３（３０塩基））の設計の際に参考とした塩基配列部分、すなわち３７６８０６番目のシトシン（Ｃ）から３７６８３５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３０ｂｐ）」（＝図９６．の（２）（＝配列番号５６））に相当する、ＣＬＩＢ２１３株（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）の「１２１７０２９番目のアデニン（Ａ）から１２１７２１４番目のアデニン（Ａ）までの、未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（１８６ｂｐ））」上の同塩基配列部分を、上記のＢＬＡＳＴを用いた相同性検索で探してみたところ、図９６．の（３）の通り、１２１７１３２番目のシトシン（Ｃ）から１２１７１６１番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（＝配列番号５７（３０ｂｐ））がそれに相当するとの結果を得る事ができるが、上記のプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）の場合と同様、特にプライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）上の３’−末端寄りに相当する塩基配列部分の類似性が低い。上記の試験７．で用いた、ＣＬＩＢ２１３株と同属同種（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）のＮＢＲＣ１８０１株（＝ＩＦＯ１８０１株（土（日本）））やＮＢＲＣ１０６６７株（腐敗したトマトケチャップ（日本））、ＮＩＳＬ３４４０株（＝ＮＢＲＣ０４９３株＝旧：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ０４７６株（日本酒粕））などのホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）の下流の塩基配列部分も、このＣＬＩＢ２１３株のそれと同一（＝１００％相同）か、きわめて類似性の高いものだとすれば、上記の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株や、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉと同属のＺ．ｂａｉｌｉｉ株などの場合にも増幅産物が生じなかった原因としては、（上記の原因の他に）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）の下流に位置する「（順番的に）「次」の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」を参考にして設計したプライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の塩基配列（３０塩基）と、これらの株のホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）の下流に位置する「（順番的に）「次」の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」上の、相当する塩基配列部分（＝鋳型ＤＮＡ）との類似性が低く、プライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）がＰＣＲ法のアニーリング反応時にこれらの株の同塩基配列部分（＝鋳型ＤＮＡ）にうまく結着できなかった事が関係している可能性も考えられる。
【０４３８】
上記のＢＬＡＳＴ処理で、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）が持つ、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））の下流に位置する「（順番的に）「次」の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）と、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ））の下流に位置する「（順番的に）「次」の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）との類似性を詳細に調べてみたところ、この（ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の）３７６８０６番目のシトシン（Ｃ）から３７６８３５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（＝配列番号５６（３０塩基））以外にも、きわめて類似性の低い塩基配列部分が何箇所もある事が判明した。そのため、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なう場合に、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）の代わりに、こうしたＢＬＡＳＴ処理で見出される「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ−それ以外（＝Ｚ．ｂａｉｌｉｉなど）の酵母株間で類似性の低い、別の塩基配列部分」を参考にして（特に類似性の低い塩基配列部分が３’−末端側に来るように）設計した、最低１８塩基以上、好ましくは２４塩基以上、より好ましくは２７〜３３塩基のプライマーを用いても、プライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）を用いた場合と同様の結果、すなわち「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとするＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では増幅産物が生じるものの、このようなＺ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株では、増幅産物自体が生じない」という結果を得る事ができる（データ省略）。
【０４３９】
さらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の染色体IV（ＢＫ００６９３８．２、ＧＩ：３２９１３８８６４）上の、「ホスファチジルイノノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４０ｂｐ）））」と「その下流に位置する、（順番的に「次」の）蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」との間、すなわち８７０５６４番目のグアニン（Ｇ）から８７１０７３番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（５１０ｂｐ）や、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＣ１１１８株の染色体IV（ＦＮ３９３０６３．１、ＧＩ：２５９１４５０４１）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）（と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４０ｂｐ）））」と「その下流に位置する、（順番的に「次」の）蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」との間、すなわち７５２９８３番目のグアニン（Ｇ）から７５３４５４番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分（４７２ｂｐ）、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株（ＨＧ３１６４５４．１、ＧＩ：５２３４２０９４６）が持つホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２４１ｂｐ））と「その下流に位置する、（順番的に「次」の）蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」との間、すなわち１２１６４３５番目のチミン（Ｔ）から１２１７０２８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（５９４ｂｐ）を調べてみたが、その塩基配列部分上には、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上にある「領域（１）」のような、ｐＳＲ１類似配列は存在せず、（このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の両遺伝子（ＣＤＳ）間配列部分と、同じくＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるＥＣ１１１８株の両遺伝子（ＣＤＳ）間配列部分との類似性は９９％弱ときわめて高いものの（注：この相同性検索結果の偶然性の期待値（ｅ−ｖａｌｕｅ）＝０．０））Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、領域（１）を含む塩基配列部分（＝両遺伝子（ＣＤＳ）間配列部分）、すなわち図４３．中の３７４４２９番目のアデニン（Ａ）から図４５．中の３７６６７２番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（２２４４ｂｐ）や、あるいは領域（１）を持たないＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））の同塩基配列部分（＝両遺伝子（ＣＤＳ）間配列部分（４９３ｂｐ）（＝図９０．（＝配列番号４９）））、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｎ���ＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の同塩基配列部分（＝両遺伝子（ＣＤＳ）間配列部分（４９３ｂｐ）（＝図９１．（＝配列番号５０）））などとの類似性も認められない。
【０４４０】
つまり、このＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」の下流領域の遺伝子（ＣＤＳ）の配置や、この「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」と「その下流領域の遺伝子（ＣＤＳ）」との間の塩基配列部分は、同種内ではよく保存されている一方、属種間では大きく異なっているようであり、それゆえにこうした塩基配列部分の鎖長やその塩基配列を指標に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種の株群とＺ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母群とが見分けられる。
【０４４１】
上記の通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株２０株のうち、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（花）を除いた１９株から調製（または粗抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において生じた増幅産物（から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物）の塩基配列解読（シークエンシング）の結果から、このうちの７株、すなわち「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（果醪）））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（クリーミーケーキ）が持つ領域（１）、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）（２３４３ｂｐ））」と「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）（＝配列番号３７）に相当する塩基配列部分のパターンは、図９３．にもまとめた通り、わずか２種類に過ぎず、しかも両者の違いはわずか１塩基でしかなく、つまり塩基配列どうしの類似性は９９．９％以上と、配列自体が種内で非常によく保存されていた。また、１９株が持つ領域（１）の近傍、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）（２３４３ｂｐ））」と「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、領域（１）を除いた配列部分、つまり３７４４２９番目のアデニン（Ａ）から３７４５１２番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（８４ｂｐ）（＝配列番号３６）に相当する塩基配列部分と、３７６２６４番目のチミン（Ｔ）から３７６６７２番目のグアニン���Ｇ）までの塩基配列部分（４０９ｂｐ）（＝配列番号３８）に相当する塩基配列部分の塩基配列パターンも、図９３．にもまとめた通り、４種類（から、後記の、市販の生味噌・生醤油から分離した３１株の場合を加えたとしても５種類）に過ぎず、しかもこれらの塩基の違いは９塩基以下に過ぎず、つまり塩基配列どうしの類似性は９８．２％以上と、こちらも配列自体が種内でよく保存されていた。
【０４４２】
そのため、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）を含む、さまざまな分離源から分離した、表現形質及び属種が不明な酵母株について、その細胞から調製（または粗抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を実施した際に、３ｋｂ弱の増幅産物が生じ、かつその増幅産物から上記の手順で調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を調べた際に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）（２３４３ｂｐ））」と「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）（＝配列番号３７）と少なくとも８０％以上、好ましくは９８％以上の類似性を示す塩基配列部分が見出されれば、その塩基配列部分を領域（１）と見做し、そしてその供試株を「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、（味噌・）醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」だと、また１ｋｂ前後の増幅産物が生じ、かつその増幅産物から上記の手順で調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を調べた際に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）（２３４３ｂｐ））」と「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）（＝配列番号３７）と９８％以上、好ましくは８０％以上の類似性を示す塩基配列部分が存在せず、しかもＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ホスファチジルイノシトール���４−燐酸  ５−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩＰ５Ｋ））をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）（２３４３ｂｐ））」と「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、領域（１）を除いた配列部分、つまり３７４４２９番目のアデニン（Ａ）から３７４５１２番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（８４ｂｐ）（＝配列番号３６）及び３７６２６４番目のチミン（Ｔ）から３７６６７２番目のグアニン（Ｇ）までの塩基配列部分（４０９ｂｐ）（＝配列番号３８）との類似性が少なくとも８０％以上、好ましくは９８％以上あれば、その供試株を「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」だと容易に区分けする事ができる。
【０４４３】
上記した通り、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合にも、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株、すなわちＺ．ｂａｉｌｉｉやＺ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａやＣａｎｄｉｄａ属酵母などでは、増幅産物自体が生じなかった。供試株の、領域（２）の有無を調べるためのＰＣＲ法で用いたプライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）を設計する際に参考にした、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）にあるトリプトファン転移（または運搬）ＲＮＡ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ（ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）））も、蛋白質合成工場であるリボソームにトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｔｒｐ））を輸送する役割を担っている、生物に必須の機能性核酸成分であり、多くの生物種のｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子を含む塩基配列部分が解読され、その塩基配列情報が公開されているため、（Ｓ２８８Ｃ株やＥＣ１１１８株など、一部のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を含む）さまざまな生物種のｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子やその下流の塩基配列部分との類似性も調べる事ができる。
【０４４４】
Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）のｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分は、この染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）だけでなく、染色体Ｅ（ＣＵ９２８１８１．１、ＧＩ：２３８９４２５３１）や染色体Ｇ（ＣＵ９２８１７９．１、ＧＩ：２３８９４０９１０）、染色体Ｄ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３９３３４）上にもあり、それらの塩基配列はたとえば同属のＺ．ｂａｉｌｉｉ  ＣＬＩＢ２１３株が持つｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分（ＨＧ３１６４５７．１、ＧＩ：５２３４２２９７１）とは完全に一致（＝１００％相同）、またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株やＥＣ１１１８株などが持つｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分ともほぼ同じ（＝９７．３％の類似性）であるため（注：データは省略する）、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の際に用いたプライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）はＰＣＲ法のアニーリング反応時に（条件さえきちんと整えてやれば）これらの塩基配列部分（＝鋳型ＤＮＡ）にうまく結着できるものと予想される。
【０４４５】
しかしながら、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法の際に用いたプライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）を設計する際に参考にした、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」を「問い合わせ（クエリー）配列」とする相同性検索を行なってみても、少なくとも現時点で公開されている塩基配列情報の中にはヒットするもの（＝塩基配列の類似性が高いもの）が見当たらない（注：データは省略する）。上記の通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株やＥＣ１１１８株を初め、多くの生物種の全ゲノム配列の解読が終了し、公開されているものの、そうした塩基配列情報の中にもこの「未知の蛋白質をコードしているものと見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」との類似性の高いものは見当たらない。つまり、この、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている株群が持つ、ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分の下流にある「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」自体が、他の生物種には見られない特徴的（あるいはＺ．ｒｏｕｘｉｉ特異的）なものなのかも知れない。
【０４４６】
つまり、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株群の場合に増幅産物が生じなかった理由としては、これらの生物種の染色体（＝鋳型ＤＮＡ）上に、このＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群が持つ「未知の蛋白質をコードしているものと見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」に相当する塩基配列部分、あるいは類似性の高い塩基配列部分がないために、ＰＣＲ法のアニーリング反応時にプライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）が結着できなかった事が関係しているものと考えられる。
【０４４７】
このＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分の下流に「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」があるという塩基配列上の特徴は、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群の一部（注：Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（花）を除く）にしか見られない特徴的（または特異的）なものと見られるため、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なう場合に、プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）の代わりに、「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」上の別の塩基配列部分を参考にして設計した、最低１８塩基以上、好ましくは２４塩基以上、より好ましくは２７〜３３塩基のプライマーを用いても、プライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）を用いた場合と同様の結果、すなわち「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとするＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法では増幅産物が生じるものの、このようなＺ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株では、増幅産物自体が生じない」という結果を得る事ができる（データ省略）。
【０４４８】
このＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」の下流領域の遺伝子（ＣＤＳ）の配置や、この「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」と「その下流領域の遺伝子（ＣＤＳ）」との間の塩基配列部分も、同種内ではよく保存されている一方、属種間では大きく異なっているようであり、それゆえにこうした塩基配列部分の鎖長やその塩基配列を指標に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉという１属１種の株群とＺ．ｒｏｕｘｉｉ以外の酵母群とが見分けられるものと見られる。
【０４４９】
上記の通り、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている供試株２０株のうち、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（花）を除いた１９株から調製（または粗抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において生じた増幅産物（から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物）の塩基配列解読（シークエンシング）の結果から、これらの供試株が持つ領域（２）、すなわちＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」と「その下流領域の遺伝子（ＣＤＳ）」との間の、１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１３３５ｂｐ）（＝配列番号４１）に相当する塩基配列部分の塩基配列のパターンも、図８３．にもまとめた通り、わずか３種類（から、後記の、市販の生味噌・生醤油から分離した３１株を加えたとしても５種類）に過ぎず、しかもその違いもわずか４塩基以下にとどまっており、つまり塩基配列どうしの類似性は９９．７％以上と、配列自体が種内で非常によく保存されていた。
【０４５０】
そのため、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）を含む、さまざまな分離源から分離した、表現形質及び属種が不明な酵母株について、その細胞から調製（または粗抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を実施した際に、２ｋｂ強の増幅産物が生じ、かつその増幅産物から上記の手順で調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列を調べた際に、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」と「その下流領域の遺伝子（ＣＤＳ）」との間の、１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１３３５ｂｐ）（＝配列番号４１）と少なくとも８０％以上、好ましくは９８％以上の類似性を示す塩基配列部分が見出されれば、その塩基配列部分を領域（２）と見做し、そしてその供試株を現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株だと容易に区分けする事ができる。
【０４５１】
上記の試験６．〜８．の結果に基づき、以下の法則性を見出した。
【０４５２】
［Ａ］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目の（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）に当たる「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」と、１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」との間に存在するｐＳＲ１類似配列である「領域（２）」、すなわち１１３２４５４番目のシトシン（Ｃ）から１１３３７８８番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１３３５ｂｐ）は、（たとえば［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべき株である可能性が高いＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））など、一部の株を除く）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株のみが持っている「特徴的な塩基配列部分」である。特に、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群では、供試株すべてが領域（２）を持っており、しかもその塩基配列はよく「保存」されていた（注：ただし、その塩基配列はすべての株において同一（＝１００％相同）なのではなく、株ごとで若干異なってはいる）。また、（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））と）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株は、領域（２）を持っておらず、さらにその領域（２）の上流、あるいは下流にある遺伝子などの塩基配列部分（ＣＤＳ）も、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉのそれらとは異なっているようであった。
【０４５３】
そのため、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された（属種不明の）酵母株について、その株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡに、たとえば上記のプライマーＣ１１３２０４４（＝配列番号２４）のような、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、１１３１９８０番目のチミン（Ｔ）から１１３２０１５番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）と１１３２０４５番目のシトシン（Ｃ）から１１３２０８０番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（３６ｂｐ）に当たる「ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ（ＣＣＡ）遺伝子と見られる塩基配列部分」を参考にして設計したプライマーと、たとえば上記のプライマーＣ１１３４２７８（＝配列番号２５）のような、同染色体Ｃ上の、１１３４２３８番目のアデニン（Ａ）から１１３４４４７番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２１０ｂｐ））」を参考にして設計したプライマーとを用いるＰＣＲ法を行なった際に、もし「２ｋｂ強の増幅産物」が生じれば、その酵母株を「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株である」と、また増幅産物が生じなかった場合には、その酵母株を「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の（＝異種の）株である」と判別（または区分け）できる。この判別（または区分け）法は、上記の、従来の判別（または区分け）法に較べて、非常に簡便であり、非常に迅速に判別結果を得る事ができる。
【０４５４】
［Ｂ］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に存在するｐＳＲ１類似配列である「領域（１）」、すなわち３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）は、（たとえば［２］Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ群に区分けすべき株である可能性が高いＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））や［３］Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべき株である可能性が高いＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））など、一部の株を除く）「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株にのみ認められる「特徴的な塩基配列」である。味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株は、現行の分類では同じＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されているものの、「領域（１）を除く塩基配列部分」のみしか持っておらず、ただしその塩基配列は非常によく「保存」されていた（注：ただし、その塩基配列はすべての株において同一（＝１００％相同）なのではなく、株ごとで若干異なってはいる）。また、（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ  ＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））と）Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株は、領域（１）を持っておらず、さらに「領域（１）を除く塩基配列部分」やその上流、あるいは下流にある遺伝子などの塩基配列部分も、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉのそれらとは異なっているようであった。
【０４５５】
そのため、試験６．及び試験７．で示した通り、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された（属種不明の）酵母株について、その株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡに、たとえば上記のプライマーＣ３７４０７６（＝配列番号２２）のような、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」を参考にして設計したプライマーと、たとえば上記のプライマーＣ３７６８３５（＝配列番号２３）のように、同染色体Ｃ上の、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」を参考にして設計したプライマーとを用いるＰＣＲ法を行なった際に、もし「１ｋｂ前後の増幅産物」が生じれば、その酵母株を「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が高く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も高いＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、いわゆる味噌・醤油主発酵酵母株だ」と、また「３ｋｂ弱の増幅産物」が生じた場合には、その酵母株を「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が低く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株だ」と、そして増幅産物が生じなかった場合には、その酵母株を「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の（＝異種の）株だ」と判別（または区分け）できる。この判別（または区分け）法は、上記した、従来の判別（または区分け）法に較べて、非常に簡便であり、非常に迅速に判別結果を得る事ができる。
【０４５６】
さらに、［Ｃ］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する「３７４４９８番目の塩基」が、醤油中で皮膜を形成する能力を持つ醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にはシトシン（Ｃ）、また醤油中で皮膜を形成する能力を持たない醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合には、その株の分離源に関係なくチミン（Ｔ）になっていた。つまり、３７４４９８番目の塩基の違いは、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の「醤油中での皮膜形成能」という産業上重要な特徴（＝表現形質）、すなわち醸造特性と相関している。
【０４５７】
そのため、上記［Ｂ］で調製した増幅産物の鎖長とその塩基配列を調べ、もし「１ｋｂ前後の増幅産物で、しかもその増幅産物上の、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基がシトシン（Ｃ）」であれば、その酵母株が「（味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が高く）味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成して、その品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株だ」と、また「１ｋｂ前後の増幅産物で、しかもその増幅産物上の、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基がチミン（Ｔ）」である場合には、その酵母株を「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が高く（醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く）味噌・醤油及び仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）中で皮膜を形成しない事から、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株だ」と、そして「３ｋｂ前後の増幅産物で、しかもその増幅産物上の、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基がチミン（Ｔ）」である場合には、その酵母株を「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境に対する適応能力が低く（それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成する能力も持っていないが、醤油諸味中でのエタノール生産性能も低く）、それゆえに味噌・醤油醸造に利用するのが難しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株だ」と判別（または区分け）できる。この判別（または区分け）法は、上記した、従来の判別（または区分け）法に較べて、非常に簡便であり、あるいは非常に迅速に判別結果を得る事ができる。
【０４５８】
この「現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉという同属同種内に分類されている酵母株群の中の株ごとに、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基が異なる」という現象は、上記した通り、試験１．で用いた供試株２０株のうちの、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基がチミン（Ｔ）である醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の１５株（７５％）と、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基がシトシン（Ｃ）である醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の４株（２０％）との２群において観察されたものであり、最も高頻度に見出された塩基、すなわちチミン（Ｔ）のその出現頻度は９５％未満と低く、またこれに対立する塩基、すなわちシトシン（Ｃ）の出現頻度も１％以上と高く、ゆえにこの塩基違いは「一塩基多型（ＳＮＰ）」だと見られる（日本生態学会（森長真一・工藤洋）（編）：［シリーズ  現代の生態学７］エコゲノミクス  ―遺伝子からみた適応―、ｐ１１−３５（井鷺裕司（著））、共立出版  （２０１２））。
【０４５９】
日本の特許庁の「遺伝子関連発明の審査の運用に関する事例集」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｐｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｔｅｔｕｚｕｋｉ／ｔ＿ｔｏｋｋｙｏ／ｓｈｉｎｓａ／ｐｄｆ／ｊｉｒｅｉ．ｐｄｆ）中の、ヒトの一塩基多型（ＳＮＰ）を例とする「事例８  ＳＮＰ」（ｐ１０−１１）の記述によれば、一塩基多型（ＳＮＰ）の発見自体については複数のヒトの塩基配列を解読して比較すれば容易になせる成果であるために、進歩性が認められず、ゆえに特許性もないものと判断すべきだが、発見したその一塩基多型（ＳＮＰ）が特定の診断などの用途に利用できる事が実験的に証明されれば、進歩性が認められるとされる（村松正実（監修）／林崎良英・岡崎康司・近藤伸二（編）：［現代化学  増刊４０］解読されたゲノム情報をどう活かすか、ｐ１１４−１１８（隅蔵康一（著））、東京化学同人  （２００１））。上記のＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群における「３７４４９８番目の位置の一塩基多型（ＳＮＰ）」は、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の濃口醤油中での皮膜形成能の有無という、味噌・醤油産業上重要な特徴（＝表現形質）、すなわち「醸造特性」を見極めるという特定の用途に利用できる、つまり味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質管理に悪影響を及ぼす醤油産膜性酵母株の判別（または区分け）という産業上重要な用途に利用できるという点で進歩性があり、実施可能要件も充たしている。
【０４６０】
なお、上記［Ｃ］の増幅産物における、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）については、上記の試験８．のような解読用プライマーを用いる塩基配列解読（シークエンシング）法で調べる事ができるが、塩基配列解読（シークエンシング）法を用いずに調べる事もできる。
【０４６１】
醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた増幅産物では、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目に相当する位置の塩基がシトシン（Ｃ）であるため、この３７４４９８番目のシトシン（Ｃ）を含む３７４４９４番目の塩基から３７４４９８番目の塩基までの５塩基（対）が制限酵素ＭａｅIIIの認識／切断配列である「グアニン−チミン−アデニン−アデニン−シトシン
５’−↓ＧＴＡＡＣ  −３’ 
（３’−  ＣＡＴＴＧ↑−５’ 
」となっている（注：制限酵素ＭａｅIIIの認識／切断配列は、厳密には、上記の塩基配列パターンを含むグアニン−チミン−塩基−アデニン−シトシン
５’−↓ＧＴＮＡＣ  −３’ 
（３’−  ＣＡＮＴＧ↑−５’
である。塩基「Ｎ」は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）のいずれでもよい。矢印（↓↑）は、ＭａｅIII処理による切断部位を示している）のに対して、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合には、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目に相当する位置の塩基がチミン（Ｔ）であるため、この３７４４９８番目のチミン（Ｔ）を含む３７４４９４番目の塩基から３７４４９８番目の塩基までの５塩基（対）が「グアニン−チミン−アデニン−アデニン−チミン
５’−  ＧＴＡＡＴ  −３’ 
（３’−  ＣＡＴＴＡ  −５’
」となっており、これは制限酵素ＭａｅIIIの認識／切断配列（＝
５’−↓ＧＴＮＡＣ  −３’及び３’−  ＣＡＮＴＧ↑−５’から構成される５塩基対）ではない。
【０４６２】
図１０３．は、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の増幅産物や、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の増幅産物を模式図化したものである。味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた（領域（１）がない）増幅産物上には、図１０３．の（２）が示す通り、３箇所のＭａｅIIIの認識／切断配列（＝５’−↓ＧＴＮＡＣ  −３’及び３’−  ＣＡＮＴＧ↑−５’から構成される５塩基対）があるが、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた（領域（１）がない）増幅産物上には、図１０３．の（３）が示す通り、さらに（ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目に相当する位置の塩基がシトシン（Ｃ）になっているために）この３７４４９４番目のグアニン（Ｇ）から３７４４９８番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列部分（＝５’−↓ＧＴＡＡＣ  −３’及び３’−  ＣＡＴＴＧ↑−５’から構成される５塩基対）も加えた計４箇所のＭａｅIII認識／切断配列（＝５’−↓ＧＴＮＡＣ  −３’及び３’−  ＣＡＮＴＧ↑−５’構成される５塩基対）がある。
【０４６３】
そのため、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた増幅産物をＭａｅIIIで処理した場合には、図１０３．の（２）が示す通り、５１７ｂｐ、３３３ｂｐ、８７ｂｐ、７２ｂｐの、計４本の分解（または制限）断片（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）が生じるのに対して、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じた増幅産物をＭａｅIIIで処理した場合には、図１０３．の（３）が示す通り、（上記の５１７ｂｐの分解（または制限）断片上にある、ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目に相当する位置のシトシン（Ｃ）を含むＭａｅIII認識／切断配列部位での切断によって生じる）４１８ｂｐと９９ｂｐ、３３３ｂｐ、８７ｂｐ、７２ｂｐの、計５本の分解（または制限）断片が生じる事になる。つまり、供試株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物をＭａｅIII処理した際に生じる分解（または制限）断片の本数と、それぞれの断片の鎖長を指標にすれば、（上記の塩基配列解読（シークエンシング）法を用いずとも）供試株が醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのかを判別（または区分け）できる。
【０４６４】
実際に、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物をＭａｅIII処理した際に生じる分解（または制限）断片の本数とそれぞれの断片の鎖長を指標にして、供試株が醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのかを判別（または区分け）できるか否かの試験を実施した。
【０４６５】
試験９．さまざまなＺ．ｒｏｕｘｉｉ株から調製（または抽出）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする「領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法」で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物への、ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法の適用による一塩基多型（ＳＮＰ）の識別と、これを指標とする醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株との判別（または区分け）：
【０４６６】
上記の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物のうち、６４．４℃のアニーリング温度条件下で生じた増幅産物（と、一部の試験（図１０４．の（ａ））については、６１．０℃のアニーリング温度条件下で生じた増幅産物も）から、上記の手順で、「ＰＣＲ産物」を調製（または粗精製）した。
【０４６７】
ＰＣＲ産物のＭａｅIII処理：
制限酵素ＭａｅIIIは、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）製のもの（製品コード：１０  ８２２  ２３０  ００１）を用いた。調製（または粗精製）したＰＣＲ産物のＭａｅIII処理は、「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、３０分間殺菌した、１．５ｍｌサイズのマイクロチューブ」内で行なった。マイクロチューブに移したＰＣＲ産物１μｇ（を含む溶液）に対して、ＭａｅIII１Ｕ（＝０．５μｌ）（ないしは一部の試験（図１０６．の（ｂ））では５Ｕ（＝２．５μｌ））、同製品付属の緩衝液（２×Ｂｕｆｆｅｒ）１２．５μｌを加え、これにさらに「高圧蒸気滅菌釜（オートクレーブ）で１２１℃、１５分間殺菌した蒸留水」を加えて全量を２５μｌにする。この２５μｌの溶液入りのマイクロチューブを、５５℃に設定した反応器（または恒温器）を使って（注：本試験では、旭テクノグラス株式会社製卓上小型恒温培養器ＮＩＢ−１１を使用）、５５℃に保温しながら、一夜置く（＝酵素反応させる）。この溶液に、株式会社ニッポンジーン製の３Ｍ酢酸ナトリウム（３Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ（製品コード：３１６−９００８１））１〜２μｌを加え、よく混合したうえで、少なくとも溶液の容量の２倍以上（＝５２〜５４μｌ以上）の冷エタノールを加え、マイクロチューブを優しく反転させながらよく攪拌した後、−８０℃下で最低２時間以上置き（＝エタノール沈殿）、上記の遠心分離器ＭＲＸ−１５２を使って、１２０００ｒｐｍ．×１０〜３０分間遠心分離処理（４℃下）を行い、上清（＝冷エタノール溶液）を丁寧に除去したうえで、このチューブを室温条件下で放置し、乾燥させる（＝乾燥処理）。乾燥処理後のチューブに、適当量（＝５μｌ程度）のトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）溶液を流し込み、チューブの底の沈殿物をＴＥ溶液に溶解させ、これを「ＭａｅIII処理物」とした。
【０４６８】
アガロースゲル電気泳動法の手順：
ＭａｅIII処理物に含まれる分解（または制限）断片の本数及び各断片の鎖長の確認には、アガロースゲル電気泳動法を用いた。電気泳動装置は、上記のサブマリン−タイプ電気泳動システム「Ｍｕｐｉｄ−２ｐｌｕｓ」、電気泳動用のゲルは上記の１．５％アガロースゲル、またゲル電気泳動用マーカーは上記の「１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ」を用いた。上記の「ＭａｅIII処理物」に、上記の１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ１．５μｌを加えたうえで、これを「ＴＡＥ緩衝液を充たした上記のシステム（＝電気泳動層）」内に置いた１．５％アガロースゲル上の窪み（ウェル）に流し込み、３０分〜１時間程通電した（＝ゲル電気泳動法）。泳動処理後のゲルを、上記の試験３．中の手順通りに染色処理したうえで、ゲルイメージング「ＡＥ−６９３２ＧＸプリントグラフ」を使って、ＵＶ照射下でゲル（上の増幅産物）を観察し、ＭａｅIII処理によって断片化した分解（または制限）断片の本数とそれぞれの断片の鎖長とを目視で確認した。ゲル上の増幅産物の鎖長は、上記の分子量マーカーに含まれる断片群との目視での相対的な移動度（＝ゲル上の位置）比較によって推定した。
【０４６９】
図１０４．及び図１０５．は、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の４株、すなわちＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））、ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株（溜醤油諸味））、ＮＩＳＬ３３５９（＝Ａ３１株（醤油））と、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の６株、すなわちＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株（味噌））、ＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株（醤油醸造工程））、ＮＢＲＣ０５０５株（醤油関連）、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株（醤油関連））、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株（醤油諸味））、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株（味噌））の、試験６．における領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法（アニーリング温度：６１．０℃ないしは６４．４℃）で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物（＝図１０４．の（１）及び図１０５．の（１））を、上記の手順でＭａｅIII処理したうえで、そのＭａｅIII処理物をゲル電気泳動処理した結果を示すゲル写真（＝図１０４．の（２）及び図１０５．の（２））である。
【０４７０】
図１０４．及び図１０５．のゲル写真が示す通り、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合でも、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合でも、目視で確認できる分解（または制限）断片の本数は３本である。ＰＣＲ産物のＭａｅIII処理で生じる断片群のうち、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の両方の場合に生じる、鎖長が８７ｂｐの断片と７２ｂｐの断片と、さらに醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にのみ生じる９９ｂｐの断片は１．５％アガロースゲル電気泳動法では分離し切れず、同ゲル上では１本のバンドに見える。ただし、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株と醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株との両方の場合に生じる３３３ｂｐの断片と、（ＣＢＳ７３２株の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目に相当する位置の一塩基多型（ＳＮＰ）が断片の鎖長にそのまま反映される）醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にのみ生じる５１７ｂｐの断片や醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にのみ生じる４１８ｂｐの断片は、目視で明確に確認できる（＝見分けられる）。
【０４７１】
この結果から、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行い、（いちいち増幅産物の塩基配列を解読せずとも）生じた増幅産物を粗精製したうえでＭａｅIII処理し、この分解（または制限）断片群をゲル電気泳動法でゲル上に展開して、その断片群の中に醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にのみ生じる５１７ｂｐの断片があるか、あるいは醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にのみ生じる４１８ｂｐの断片があるかを、目視で確認するだけで、その供試株が醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのかを判別（または区分け）できる事が判明した。
【０４７２】
上記した通り、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法において、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離された９株のうち、唯一増幅産物が生じなかったＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））と、ＮＢＲＣ１０６７１株（＝Ｇ４１１８株（マジパン））を除く７株、すなわちＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた増幅産物の鎖長はいずれも３ｋｂ弱と、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された１１株、すなわち醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４４５株（＝ＩＦＯ０４９４株）やＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株）、ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株）、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＩＦＯ０５０６株）、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＩＦＯ０５２１株）、ＮＩＳＬ３４５５株（＝ＩＦＯ０５３３株）、ＮＢＲＣ０５０５株、あるいは醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であるＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株）やＮＩＳＬ３３５９株（＝Ａ３１株）、ＮＩＳＬ３４５９株（＝ＩＦＯ０８４５株）、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株）の場合に生じた増幅産物（１ｋｂ前後）よりも明らかに大きいため、この領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法によって生じる増幅産物を（塩基配列解読（シークエンシング）したり、あるいはＭａｅIII処理したりせずとも）ゲル電気泳動法で調べた際に、その増幅産物の鎖長（３ｋｂ弱）を目視で確認するだけで、その株が「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」だと判別（または区分け）できるのだが、これら７株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物を、同様の手順でＭａｅIII処理した「ＭａｅIII処理物」をゲル電気泳動処理した場合の結果からでも、同様に「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」だと判別（または区分���）する事ができる。
【０４７３】
１例として、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合の結果を示すゲル写真（＝図１０６．の（２））と、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合の結果を示すゲル写真（＝図１０７．）とを示す。公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の染色体Ｃの塩基配列情報（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）によれば、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物をＭａｅIII処理した場合に生じる分解（または制限）断片の本数と、それぞれの断片の鎖長は、図１０３．の（１）の模式図が示す通り、（向かって左側から順に）５８３ｂｐ、６５ｂｐ、１５１ｂｐ、１４ｂｐ、２２ｂｐ、４５ｂｐ、６４６ｂｐ、２１４ｂｐ、５２８ｂｐ、３３３ｂｐ、８７ｂｐ、７２ｂｐの断片の計１２本であり、うち３本、すなわち３３３ｂｐ、８７ｂｐ、７２ｂｐの断片は、上記の、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株や醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株のＰＣＲ産物をＭａｅIII処理した場合にも生じるものである。実際に、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物（＝図１０６．の（１））を（ａ）１Ｕないしは（ｂ）５ＵのＭａｅIIIで処理した場合のゲル写真（＝図１０６．の（２））を見ると、目視で観察できる分解（または制限）断片の本数は７本である。ＭａｅIII処理で生じる計１２本の断片のうち、その鎖長が６５ｂｐ、１４ｂｐ、２２ｂｐ、４５ｂｐ、８７ｂｐ、７２ｂｐの、計６本の断片が１．５％アガロースゲルでは分離し切れず、ゲル上では１本のバンドに見える。ただし、これら６本の断片を除いた（鎖長順に）６４６ｂｐ、５８３ｂｐ、５２８ｂｐ、３３３ｂｐ、２１４ｂｐと１５１ｂｐの断片はそれぞれ、きれいに分離されており、上記の、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株や醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合に生じる「分解（または制限）断片の本数」及び「それぞれの断片の鎖長」から構成されるパターン（＝バンドパターン）とは明らかに異なっており、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株の場合にのみ生じる特徴的な「４１８ｂｐの断片」が生じて���ない事も目視ではっきりと確認できる。
【０４７４】
また、図１０７．のゲル写真が示す通り、ＮＩＳＬ３４４３株（＝ＩＦＯ０４８７株（ビターオレンジシロップボンボン））、ＮＩＳＬ３４５６株（＝ＩＦＯ０６８６株（蜂蜜））、ＮＩＳＬ３４５８株（＝ＩＦＯ０７４０株（痰））、ＮＢＲＣ１７３０株（塩漬豆）、ＮＢＲＣ１７３３株（発酵した蜂蜜）、ＮＢＲＣ１９１４株（＝ＩＦＯ１９１４株（クリーミーケーキ））の場合に生じた分解（または制限）断片のバンドパターンは、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株）の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物をＭａｅIII処理した場合の分解断片（または制限断片）のバンドパターンとまったく同じであった。
【０４７５】
これらの結果から、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物をＭａｅIII処理した際に生じる４１８ｂｐの断片は、「醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株特有」のものであり、それゆえに（いちいちＰＣＲ産物の塩基配列を解読せずとも）ＭａｅIII処理で生じる分解（または制限）断片の本数とそれぞれの断片の鎖長のパターン（＝バンドパターン）を指標にして、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される供試株群を、［１］−１．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群、［１］−２−１．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油諸味中でのエタノール生産性能も高く、しかも味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成する能力は持っていない事から、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群、［１］−２−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多いが、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成する能力を持ち、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群の３群に区分け（または判別）できる事が判明した。
【０４７６】
ＰＣＲ法で調製した増幅産物上の遺伝的多型（または遺伝子多型）を検出する方法としては、上記した通り、シークエンサーを用いる塩基配列解読（シークエンシング）法の他に、ＲＡＰＤ法や（ＰＣＲ−）ＲＦＬＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＣＰ法などがあるが、本法はこのうちの（ＰＣＲ−）ＲＦＬＰ法に相当する事から、以下、ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法と呼ぶ事にする。このＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法による判別（または区分け）法は、上記した、従来の判別（または区分け）法はもちろん、上記の試験８．の塩基配列解読（シークエンシング）法と較べても、さらに非常に簡便であり、さらに非常に迅速に区分け（または判別）結果を得る事ができる。
【０４７７】
そこで、上記の試験結果から考案した本発明、すなわち「新手法」が実際に使用できるか否かの試験をさらに実施してみた。
【０４７８】
試験１０．市販の生味噌・生醤油から分離した耐塩性酵母株への発明（＝新手法）の適用例１．（＝実施例１．）：
【０４７９】
供試株としては、上記の、青森県産米味噌Ａから分離した、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる８株、すなわちＮｏ．１−１−１株、Ｎｏ．１−１−４株、Ｎｏ．１−１−５株、Ｎｏ．１−１−６株、Ｎｏ．１−２−８株、Ｎｏ．１−２−１３株、Ｎｏ．１−２−１４株、Ｎｏ．１−２−１９株、富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる８株、すなわちＮｏ．５−１−１株、Ｎｏ．５−１−７株、Ｎｏ．５−１−１０株、Ｎｏ．５−１−１６株、Ｎｏ．５−２−２株、Ｎｏ．５−２−９株、Ｎｏ．５−２−１２株、Ｎｏ．５−２−１７株、岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）から分離した、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる４株、すなわちＮｏ．６−１−１−２株、Ｎｏ．６−１−１−５株、Ｎｏ．６−１−２−２５株、Ｎｏ．６−１−２−５０株、岡山県産麦味噌Ｄから分離した、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる４株、すなわちＮｏ．６−４−１−１０株、Ｎｏ．６−４−１−２０株、Ｎｏ．６−４−２−７株、Ｎｏ．６−４−２−１４株、埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる７株、すなわちＮｏ．７−１−２３株、Ｎｏ．７−１−６６株、Ｎｏ．７−１−８３株、Ｎｏ．７−１−８９株、Ｎｏ．７−２−１株、Ｎｏ．７−２−２株、Ｎｏ．７−２−６株と、同じ生醤油Ｅから分離した、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓに分類される１株、すなわちＮｏ．７−３−４２株の、計３２株を用いた。
【０４８０】
なお、これら生味噌・生醤油から分離した分離株計３２株については、上記の試験１．及び試験２．の手順通りに、濃口醤油諸味液汁発酵能（＝エタノール生産性能）（＝図９７．の（２））と醤油中での生存能力、さらに試験５．の手順通りに、醤油中での皮膜形成能、すなわち醤油産膜性能の有無を調べた（＝図９８．〜１０１．及び表８．〜９．）。
【０４８１】
【表８】
2015228833.tif 000010
【０４８２】
【表９】
2015228833.tif 000011
【０４８３】
図９８．は青森県産米味噌Ａから分離した８株、図９９．は富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した８株、図１００．は岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）及び麦味噌Ｄから分離した計８株、図１０１．は埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した８株の醤油産膜性試験の結果、すなわち生醤油液体培地及び濃口醤油中での皮膜形成の様子を撮影した写真である。
【０４８４】
この試験結果から、Ｎｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−１株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１６株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−１０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−１−２３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−６６株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８９株（生醤油Ｅ（埼玉））の１６株は醤油「非」産膜性株、またＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−２−２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−１−２−２５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−２−５０株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−７株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−１４株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−２−１株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−２株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−６株（生醤油Ｅ（埼玉））の１５株は醤油産膜性株である事が判明した。なお、埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離したＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株も、醤油産膜性能を持ち合わせてはおらず、醤油「非」産膜性株である事が判明した。
【０４８５】
また、図９７．の（２）は、この生味噌・生醤油から分離した分離株計３２株のうち、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））を除く、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる３１株について、上記の試験１．の手順通りに、静置培養条件下での、濃口醤油諸味液汁中でのエタノール生産性能を調べた結果を、また表８．及び表９．は濃口醤油中での（皮膜形成能力と）生存能力を調べた結果をまとめたものである。図９７．の（２）で用いた濃口醤油諸味液汁については、上記の試験２．の際に用いた濃口醤油諸味液汁とは異なる製造ロットの液汁を用いたため、予め、上記の試験１．で用いた供試株２０株の、静置培養条件下でのエタノール生産性能を調べ、上記の試験１．で得られた結果と同じ結果が得られる事（＝図９７．の（１））を確認したうえで、本試験に用いた。
【０４８６】
生醤油・生味噌から分離した３１株のうち、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株（で、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる株）である１６株、すなわちＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−１株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１６株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−１０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−１−２３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−６６株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８９株（生醤油Ｅ（埼玉））はいずれも、濃口醤油中で高い生存能力を示し（＝表８．及び９．）、かつ濃口醤油諸味液汁中でも、たとえばＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））やＮＩＳＬ３７６３株（＝ＩＡＭ１２８７９株（味噌））などの、上記の試験１．の、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株７株（＝図９７．の（１）中の黒い棒グラフ）と同程度ないしはそれ以上のエタノール生産性能を示した（＝図９７．の（２）中の黒い棒グラフ）。つまり、これら１６株の、醤油及びその仕掛品（である醤油諸味液汁や生揚げ醤油）という環境への適応能力の高さは、上記の試験１．で用いた、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離されたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群が示した特徴（＝表現形質）と合致していた。
【０４８７】
一方、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株（であり、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる株）である１５株、すなわちＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−２−２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−１−２−２５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−２−５０株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−７株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−１４株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−２−１株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−２株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−６株（生醤油Ｅ（埼玉））は、上記の図９８．〜１０１．で示した通り、濃口醤油中で皮膜を形成したため、濃口醤油中での生存能力を調べる事はできなかった（＝表８．及び表９．）。
【０４８８】
また、これら１５株を醤油諸味液汁中で静置培養した後の、その液汁中のエタノール濃度（Ｖ／Ｖ）を測定してみたところ、上記の試験１．の、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株４株の場合（＝図９７．の（１）中の白い棒グラフ）よりも明らかに低く、上記のガスクロマトグラフィー法で測定した場合の検出限界以下に相当する０．１％（Ｖ／Ｖ）未満であった（＝図９７．の（２）中の白い棒グラフ）。これは、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株が「仮性」産膜性酵母株である事、そして生味噌・生醤油から分離した「ばかり」の、これら１５株は、上記の試験１．で用いた供試株（のうちの醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株４株）のように「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）などの分離源から分離された後に、長期間に渡って菌株保存研究機関で冷蔵あるいは冷凍保存されていた、いわゆる保存株」よりも、さまざまな液体培地中での増殖が明らかに早く、ゆえに（たとえば市販の濃口醤油中での皮膜形成も、Ｎｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））やＮｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））のほうが、ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））よりも早かった（表７．）ように）醤油諸味液汁に接種してから皮膜を形成し始めるまでに要した日数も短かった事が関係しているものと思われる。仮性産膜性酵母株は、醤油諸味液汁中で培養すると、まず液汁中のグルコースを消費してエタノールを生産しながら増殖し、液汁中のグルコース濃度が低下してくると、今度はエタノールを（好気的）資化して増殖する（に伴い、細胞表層が変化して疎水性が高まり、液面で凝集して皮膜を形成する）。生味噌・生醤油から分離した醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株（であり、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされる株）である１５株の増殖は「保存株４株」よりも明らかに早かったために、液汁中のグルコース濃度の低下(とエタノール濃度の上昇)に伴う液汁中エタノールの好気的資化への代謝変換と細胞表層の変化に伴う皮膜形成も早くなった（ために、液汁中のエタノールも速やかに消費され、０．１％（Ｖ／Ｖ）未満にまで低下した）ものと見られる。
【０４８９】
これら、生味噌・生醤油から分離した３２株から、上記したビーズ破砕／フェノール処理法で核酸成分を調製（または抽出）し、これを鋳型ＤＮＡとする、領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ法でのアニーリング反応時の温度としては、上記の試験と同様に、５３．５℃、５６．７℃、６１．０℃、６４．４℃の計４種類の温度条件を用いた。ゲル電気泳動法では、０．７％アガロースゲルを用い、それぞれのゲルごとに、鎖長比較用に、アニーリング反応温度を６１．０℃としたＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で、ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））やＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物を同時にスポットした。
【０４９０】
図６５．及び図６６．は青森県産米味噌Ａから分離した８株、図６７．及び図６８．は富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した８株、図６９．は岡山県産米味噌Ｃ（赤味噌）から分離した４株、図７０．は岡山県産麦味噌Ｄから分離した４株、図７１．及び図７２．は埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離した８株の結果を示すゲル写真である。市販の生味噌・生醤油から分離したこれら３２株について、それぞれの株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なってみたところ、うちＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））を除く３１株、すなわち現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる株の場合には、各図の（２）、すなわち下段のゲル写真の通り、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））やＺ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物（２ｋｂ強）と、目視上同じ鎖長に見える増幅産物が生じ、またＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））の場合には、図７２．の（２）、すなわち下段のゲル写真の通り、（ＰＣＲ反応におけるアニーリング温度の如何を問わず）増幅産物自体が生じなかった。
【０４９１】
ちなみに、これら３１株の場合に生じた増幅産物については、上記の手順でＰＣＲ産物を調製（または粗精製）し、その塩基配列を解読してみた結果、［１］うち４株、すなわち醤油産膜性のＮｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．７−２−１株（生醤油Ｅ（埼玉））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、公開されているＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分と完全に一致（＝１００％相同）している事、そして［２］うち２株、すなわち醤油「非」産膜性のＮｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））及びＮｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図７９．及び図８０．（＝配列番号４５））は、図８３．の（４）の模式図の通り、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分とは、「１１３３０６０番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている」、「１１３３６５３番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）になっている」という計２塩基の違いを除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事、［３］うち２株、すなわち醤油「非」産膜性のＮｏ．６−４−１−１０株（麦味噌Ｄ（岡山））及びＮｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図８１．及び図８２．（＝配列番号４６））は、図８３．の（５）の模式図の通り、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分とは、「１１３２６９４番目のグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）になっている」、「１１３３０６０番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている」という計２塩基の違いを除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事、［４］残る２３株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、図８３．の（３）の模式図で示した醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列と完全に同じ（＝１００％相同）で、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の同塩基配列部分とは、「１１３３０６０番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）になっている」というわずか１塩基の違いを除けば、それ以外の部分の塩基配列は完全に一致している事が判明した。
【０４９２】
これら、市販の生味噌・生醤油から分離した３２株についての、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合の結果は、本発明で用いている法則性に合致するものであった。つまり、市販の生味噌・生醤油から分離した供試株３２株のうち、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる３１株も、その塩基配列上に１〜２塩基の違いはあるものの、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群（のうち、一部の例外株を除いた株群）のみが持っているものと推察した「領域（２）」を持っていた。また、埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離したＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株の場合には、この株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なってみたものの、増幅産物自体が生じなかった。つまり、これらの株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（２）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なう事により、うち３１株については、２ｋｂ強の鎖長の増幅産物が生じた事を根拠に、（上記の試験３．、すなわち２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法や試験４．のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法を用いずとも）これらの株が［１］現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株だと、またＮｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））については、増幅産物自体が生じなかった事を根拠に、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株だと判別（または区分け）でき（図１０９．）、この判別結果は上記の試験３．、すなわち２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法や試験４．のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法の結果による判別（または区分け）結果と一致していた。
【０４９３】
また、市販の生味噌・生醤油から分離したこれら３２株について、それぞれの株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なってみたところ、うちＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））を除く３１株、すなわち現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる株の場合には、図６５．〜７２．の（１）、すなわち上段のゲル写真の通り、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６１株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＣＢＳ７３２株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株（黒葡萄濃縮粗果汁（＝果醪）））の場合に生じた増幅産物（３ｋｂ弱）よりも鎖長が短く、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４５２株（＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））の場合に生じた増幅産物（１ｋｂ前後）と、目視上同じ鎖長に見える増幅産物が生じ、またＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））の場合には、図７２．の（１）、すなわち上段のゲル写真の通り、増幅産物自体が生じなかった。
【０４９４】
これら３１株の場合に生じた増幅産物については、上記の手順でＰＣＲ産物を調製（または粗精製）し、その塩基配列を解読してみた結果、［１］３１株の場合に生じたＰＣＲ産物のすべてにおいて、ｐＳＲ１類似配列のうちの１つである領域（１）、すなわちＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の、３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間に位置する、３７４５１３番目のチミン（Ｔ）から３７６２６３番目のチミン（Ｔ）までの塩基配列部分（１７５１ｂｐ）がなく（または欠けており）、そして［２］うち醤油「非」産膜性の１６株、すなわちＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−１株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１６株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−１−１−２株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−１−５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−１０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−１−２０株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−１−２３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−６６株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８３株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−１−８９株（生醤油Ｅ（埼玉））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、図９３．の（２）の模式図で示した醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列と完全に一致（＝１００％相同）、また［３］うち醤油産膜性の１５株のうちの１４株、すなわちＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−２−２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．６−１−２−２５株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−１−２−５０株（米味噌Ｃ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−７株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．６−４−２−１４株（麦味噌Ｄ（岡山））、Ｎｏ．７−２−１株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−２株（生醤油Ｅ（埼玉））、Ｎｏ．７−２−６株（生醤���Ｅ（埼玉））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列は、図９３．の（３）−１．の模式図で示した醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  ＮＩＳＬ３４６０株（＝ＩＦＯ０８４６株（溜醤油諸味））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列と完全に一致（＝１００％相同）しており、また［４］残る１株、すなわち醤油産膜性のＮｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の塩基配列（＝図９２．（＝配列番号５１））も、図９３．の（３）−２．の模式図でも示した通り、上記［３］で示した塩基配列に、さらに「３７４４７０番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）になっている」という１塩基の違いが加わったもの（＝図９３．の（３）−１．の模式図）に過ぎなかった。つまり、上記の手順で調製（または粗精製）した、これらのＰＣＲ産物における、ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する塩基が、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であ（り、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされ）る１６株の場合に生じたＰＣＲ産物ではチミン（Ｔ）、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であ（り、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとされ）る１５株の場合に生じたＰＣＲ産物ではシトシン（Ｃ）である事が判明した。
【０４９５】
１例として、青森県産米味噌Ａから分離した計８株の、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法で生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の、「ＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上の３７４４９８番目の塩基に相当する位置の塩基を含む一部配列」をシークエンサーで読み取った際の蛍光強度の波形（図）を示す（図１０２．）。
【０４９６】
この図１０２．における「向かって左側の４つの波形」、すなわち醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であ（り、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎに区分けすべきとされ）るＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））の４株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の解読時の波形（図）では、矢印が示している「３７４４９８番目の塩基に相当する塩基」の位置に生じているのは、単一の塩基による波形で、しかも（ＰＣＲ産物の塩基配列を、下流の「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」上から上流の「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」上に向けて解読するプライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）を用いて解読したために）その塩基は（チミン（Ｔ）と相補的な塩基対（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）をなす）アデニン（Ａ）である事、また図１０２．における「向かって右側の４つの波形」、すなわち醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株であ（り、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎに区分けすべきとされ）るＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））の４株の場合に生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物の解読時の波形（図）では、矢印が示している「３７４４９８番目の塩基に相当する塩基」の位置に生じているのは、単一の塩基による波形で、しかも（ＰＣＲ産物の塩基配列を、下流の「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」上から上流の「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ）」上に向けて解読するプライマーＣ３７６７９７Ｒ（＝配列番号３０）を用いて解読したために）その塩基は（シトシン（Ｃ）と相補的な塩基対をなす）グアニン（Ｇ）である事が明確に見てとれる。
【０４９７】
これら、市販の生味噌・生醤油から分離した３２株についての、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なった場合の結果も、本発明で用いている法則性に合致するものであった。つまり、市販の生味噌・生醤油から分離した供試株３２株のうち、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる３１株では、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉの基準株であるＣＢＳ７３２株（＝ＡＴＣＣ２６２３株＝ＩＦＯ１１３０株＝ＮＣＹＣ５６８株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２２９株＝ＰＹＣＣ５２７６株＝ＮＩＳＬ３４６１株）の染色体Ｃ（ＣＵ９２８１７５．１、ＧＩ：２３８９３８５５９）上、の３７２０８６番目のアデニン（Ａ）から３７４４２８番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「ホスファチジルイノシトール−４−燐酸  ５−キナーゼ（ＰＩＰ５Ｋ）をコードしている遺伝子（ＭＳＳ４）と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２３４３ｂｐ））」と、３７６６７３番目のアデニン（Ａ）から３７６９００番目のアデニン（Ａ）までの塩基配列部分に当たる「未知の蛋白質をコードしている遺伝子と見られる塩基配列部分（ＣＤＳ（２２８ｂｐ））」との間の塩基配列部分に相当する塩基配列部分上に、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された、現行の分類でＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株群（のうち、一部の例外株を除いた株群）と同様に、領域（１）がなく（または欠けており）、また埼玉県産生醤油Ｅ（生揚げ）から分離したＣ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  Ｎｏ．７−３−４２株の場合には、この株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なってみたものの、増幅産物自体が生じなかった。それゆえに、これらの株から調製（または粗精製）した核酸成分を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を行なう事により、うち３１株については、１ｋｂ前後の鎖長の増幅産物が生じた事を根拠に、（上記の試験３．、すなわち２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法や試験４．のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法を用いずとも）これらの株が［１］−２．「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株」であり、さらに、うち１６株についてはその増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物上の３７４４９８番目の塩基がチミン（Ｔ）である事を根拠に、（上記の試験５．の醤油産膜性試験を行なわずとも）［１］−２−１．醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株だと、またうち１５株についてはその増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物上の３７４４９８番目の塩基がシトシン（Ｃ）である事を根拠に、（上記の試験５．の醤油産膜性試験を行なわずとも）［１］−２−２．醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株だ��、またＮｏ．７−３−４２株（生醤油Ｅ（埼玉））については、増幅産物自体が生じなかった事を根拠に、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ以外の株だと判別（または区分け）でき（図１１０．）、この判別結果は上記の試験３．、すなわち２６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の（Ｄ１／Ｄ２領域を含む）部分配列を指標とする簡易同定法、試験４．のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法や試験５．の醤油産膜性試験の結果による判別（または区分け）結果と一致していた。
【０４９８】
本特許中で用いた供試株すべての分離源、醤油醸造特性（＝表現形質）と遺伝学的特性を、表１０．にまとめた。
【０４９９】
【表１０】
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【０５００】
試験１１．市販の米味噌・麦味噌・生醤油から分離した耐塩性酵母株への発明（＝新手法）の適用例２．（＝実施例２．（ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法））：
【０５０１】
上記の、青森県産米味噌Ａ及び富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類さ（れ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｂｒｉｄ（またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ｓｔｒａｉｎ群に区分けすべきとさ）れる醤油「非」産膜性の８株、すなわちＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−１株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１６株（米味噌Ｂ（富山））と醤油産膜性の８株、すなわちＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−２−２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））との計１６株を供試株とし、各株から上記のビーズ破砕／フェノール処理法で調製した核酸成分（のＡｐａI処理後分解（または制限）断片群）を鋳型ＤＮＡとする、領域（１）の有無を調べるためのＬＡ  Ｔａｑ−ＰＣＲ法を実施し、生じた増幅産物から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物を、上記の手順通りに、ＭａｅIII処理し、これをゲル電気泳動処理し、ゲル上に展開された分解（または制限）断片の数と各断片の鎖長のパターン（＝バンドパターン）を観察してみた。
【０５０２】
図１０８．の（１）、すなわち上段の写真は、青森県産米味噌Ａから分離した醤油「非」産膜性のＮｏ．１−１−１株、Ｎｏ．１−１−４株、Ｎｏ．１−１−５株、Ｎｏ．１−１−６株及び醤油産膜性のＮｏ．１−２−８株、Ｎｏ．１−２−１３株、Ｎｏ．１−２−１４株、Ｎｏ．１−２−１９株の場合の結果を示すゲル写真、また図１０８．の（２）、すなわち下段の写真は富山県産米味噌Ｂ（越中味噌）から分離した醤油「非」産膜性のＮｏ．５−１−１株、Ｎｏ．５−１−７株、Ｎｏ．５−１−１０株、Ｎｏ．５−１−１６株及び醤油産膜性のＮｏ．５−２−２株、Ｎｏ．５−２−９株、Ｎｏ．５−２−１２株、Ｎｏ．５−２−１７株の場合の結果を示すゲル写真である。図１０８．の（１）（＝上段の写真）及び（２）（＝下段の写真）ともに、醤油「非」産膜性の８株、すなわちＮｏ．１−１−１株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−５株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−１−６株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−１−１株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−７株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１０株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−１−１６株（米味噌Ｂ（富山））の場合には、醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株特有の５１７ｂｐの分解（または制限）断片が生じ、また醤油産膜性の８株、すなわちＮｏ．１−２−８株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１３株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１４株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．１−２−１９株（米味噌Ａ（青森））、Ｎｏ．５−２−２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−９株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１２株（米味噌Ｂ（富山））、Ｎｏ．５−２−１７株（米味噌Ｂ（富山））の場合には、醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株特有の４１８ｂｐの断片が生じているのが、目視で明確に確認できた。それゆえに、（ＰＣＲ産物の塩基配列解読（シークエンシング）を行なわずとも）このＰＣＲ産物のＭａｅIII処理（＝ＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法）によって生じる分解（または制限）断片群の本数と各断片の鎖長のパターン（＝バンドパターン）を指標に、より具体的にはＭａｅIII処理による５１７ｂｐの断片の出現を指標に、うち８株を「醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」だと、またＭａｅIII処理による４１８ｂｐの断片の出現を指標に、うち８株を「醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株」だと判別（または区分け）する事ができ、この判別結果は上記の試験５．、すなわち醤油産膜性試験での結果による判別（または区分け）結果と一致していた。
【産業上の利用可能性】
【０５０３】
本発明、すなわち「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ  Ｇ４１１８株（＝ＮＢＲＣ１０６７１株（マジパン））から見つけられたプラスミドｐＳＲ１」の塩基配列上の部分配列との類似性が高い、染色体上の領域（１）及び領域（２）の有無を調べるためのＰＣＲ法及び、同法で生じた増幅産物（から調製（または粗精製）したＰＣＲ産物）の塩基配列解読（シークエンシング）法ないしはＰＣＲ−ＭａｅIII−ＲＦＬＰ法によって生じる「分解（または制限）断片の本数」及び「それぞれの断片の鎖長」のパターン（＝バンドパターン）を指標として用いる事により、図１０９．及び図１１０．に記した通り、たとえば味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された、表現形質及び属種不明の味噌・醤油酵母群について、［Ａ］各株がまず［１］現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される株なのか、あるいはたとえばＣａｎｄｉｄａ属酵母株やＰｉｃｈｉａ属酵母株などの、［２］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株以外の株なのかを、さらに［１］Ｚ．ｒｏｕｘｉｉに分類された株群については、図１１０．に記した通り、［Ｂ］各株が［１］−１．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が低いために、「味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）」以外の分離源から分離される事が多く、（味噌・）醤油諸味中でのエタノール生産性能も低い事から、味噌・醤油醸造に利用するのが難しいＺ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは［１］−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高いために、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株、いわゆる「味噌・醤油主発酵酵母株」なのかを、そして［１］−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、それゆえに味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離される事が多く、味噌・醤油醸造に関与する能力を持つＺ．ｒｏｕｘｉｉ株群、いわゆる味噌・醤油主発酵酵母株群に区分けされた株については、［Ｃ］各株が［１］−２−１．（味噌・）醤油諸味中でのエタノール生産性能が高く、しかも醤油中で皮膜を形成する能力を持たない事から、味噌・醤油醸造に利用するに相応しい醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのか、あるいは［１］−２−２．味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成する能力を持ち、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の中で皮膜を形成し、その品質劣化を引き起こす醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株なのかを、迅速かつ簡便に判別できる事が判明した。
【０５０４】
なお、上記した通り、一部の菌株保存研究機関では、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類されている「保存株」の一部について、その（属）種名（及び学名）の見直しを行なっているようであり、たとえば本発明で供試株として用いたＺ．ｒｏｕｘｉｉ株２０株のうち、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から分離された醤油「非」産膜性株であるＮＩＳＬ３３６９株（＝ＣＢＳ４８３７株＝ＮＢＲＣ１８７６株＝ＩＦＯ１８７６株＝ＮＣＹＣ１６８２株＝ＮＲＲＬ  Ｙ−２５４７株（味噌））、ＮＢＲＣ０５０５株（醤油関連）、ＮＩＳＬ３４０２株（＝ＮＢＲＣ０５０６株＝ＩＦＯ０５０６株（醤油関連））、ＮＩＳＬ３４５０株（＝ＮＢＲＣ０５２１株＝ＩＦＯ０５２１株（醤油諸味））と醤油産膜性株であるＮＩＳＬ３４５２株（＝ＮＢＲＣ０５２５株＝ＩＦＯ０５２５株（味噌））及びＮＩＳＬ３４５９株（＝ＮＢＲＣ０８４５株＝ＩＦＯ０８４５株）、花から分離されたＮＢＲＣ１８１２株（＝ＩＦＯ１８１２株（花））の計８株については、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）のＮＢＲＣが、ホームページ上の登録（属種）名を、従来の「Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ」から「Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．」に変更している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｃ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）。上記した通り、現行の分類法自体に問題がある事は以前から指摘されていた事であり、ＧｏｒｄｏｎやＨａｒｒｉｓｏｎらによってこうした問題を解消するための新しい分類基準及びその手法が考案された事などから、こうした保存株の（属）種名（及び学名）の見直しは、今後もさまざまな菌株保存研究機関で行なわれる可能性が高いものと予想される。
【０５０５】
ただし、このような見直しの結果として、本発明で用いた供試株の一部ないしは全部の（属）種名（及び学名）がたとえ変更になったとしても、本発明の方法の「効果」自体には何らの影響もない。それは、本発明で酵母株の区分け（または判別）の基準としているのが、（属）種名（及び学名）というよりも、あくまで味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力、より具体的には生存能力やエタノール生産性能、あるいは醤油産膜性能といった、それぞれの株が持つ、味噌・醤油醸造と密接に関係する特徴（＝表現形質）、すなわち「醸造特性」であり、各株の醸造特性は上記の試験で示した通り（で、これらの特徴は（属）種名（及び学名）が変更されたとしても、その影響を受けないため）だからである。
【０５０６】
そのため、本発明の方法は、味噌・醤油醸造などの産業分野で利用できる。たとえば、本発明の方法を用いれば、図１０９．や図１１０．に記した通り、さまざまな味噌・醤油やその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）から、醤油「非」産膜性の味噌・醤油主発酵酵母（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）株群を簡便かつ迅速に取得でき、これらの株を味噌・醤油諸味のエタノール発酵用の実用株（または種酵母）として用いる事により、味噌・醤油諸味のエタノール発酵の適正化／効率化を図る事ができる。上記した通り、本発明者（＝馬渕）は、２００１年に、現行の分類ではＺ．ｒｏｕｘｉｉに分類される酵母株群の中から、醤油醸造、すなわち１６％前後ないしはそれ以上という、高濃度の食塩（ＮａＣｌ）を含む醤油諸味のエタノール発酵に寄与できる、特に高い能力を持つ酵母株のみを選択する方法を考案している（馬渕清人：エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地、同酵母株の分離法及び同酵母株を用いる含塩醗酵食品の製造法、特許３９３８４８８）。そのため、まず本発明の方法を用いて、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、かつ醤油諸味（液汁）中でのエタノール生産性能も高く、醤油中で皮膜を形成しない醤油「非」産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株群を選び出したうえで、さらに同方法（特許３９３８４８８）を使えば、上記の、非常に煩雑な同定試験や、試験３．の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を指標とする簡易同定法、あるいは試験４．のＨａｒｒｉｓｏｎらのＰＣＲ法（Ｅ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．Ｍｕｉｒ，Ｍ．Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｗｈｅａｌｓ：ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．，１１（４），３５６−３６５  （２０１１））、試験５．の醤油産膜性試験や試験１．の醤油諸味液汁（のエタノール）発酵試験などを一切行なわずに、簡便かつ迅速、効率的に実用株（または種酵母株）を得る事ができる。本発明の方法で取得した実用株（または種酵母株）はいずれも、味噌・醤油及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）という環境への適応能力が高く、かつ味噌・醤油諸味（液汁）中でのエタノール生産性能も高いという、共通した特徴（＝表現形質）、すなわち醸造特性を持っているものの、その他の「醸造特性」、たとえば低温条件下でのエタノール生産性能や、上記した醤油の特徴香といわれるＨＥＭＦや高級アルコール類などの生産性能などについては、当然株ごとに大きく異なっている。本発明の方法を使えば、さまざまな「醸造特性」を持つ、いわば「味噌・醤油醸造用種酵母株ライブラリー（またはコレクション）」も容易に構築でき、さまざまな味噌・醤油（製品）を開発・製造する際に種酵母株を使い分ける事も可能になる。
【０５０７】
本発明の方法を使えば、味噌・醤油などの仕込み工程や製成工程などでの仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の酵母（菌）叢（フローラ）も簡便かつ迅速に解析できるため、仕込み工程での味噌・醤油諸味の発酵管理の適正化／効率化を図り、（また（仕掛品や製品である）味噌の表面や、仕掛品である生揚げ醤油や（醤油）製品の液面に皮膜が形成していなくても（または形成される前に）、それらに混入している醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株をきわめて簡便に検出できるので）製成工程以降の工程での仕掛品（である味噌や生揚げ醤油など）の品質管理を徹底させる事も可能となる。たとえば、上記の手順で取得した実用株（または種酵母株）を味噌・醤油諸味に添加した際の、味噌・醤油諸味中での同株の挙動、すなわち添加後の増殖の様子や酵母（菌）叢（フローラ）中の占有率なども、本発明の方法や、さらには上記の、本発明者（＝馬渕）が考案した、酵母株群をいくつかの株群に区分けするための方法（馬渕清人：醤油酵母の分離識別法、特許３９０４１８７）なども併用すれば、詳しく調べる事ができる。また、本発明の方法を使えば、味噌・醤油（製品）中から検出された酵母の同定・判別試験を迅速・高精度化させる事もでき、味噌・醤油（製品）の品質管理を効率化させる事も可能となる。
【０５０８】
たとえば、清酒（製品及び貯蔵中の仕掛品）は１５％以上のエタノールを含んでいるために、（醤油の場合と同様に）大半の微生物はたとえ混入したとしても清酒中では増殖できないものの、「火落菌（ひおちきん）」と呼ばれるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉ（ラクトバチルス・ホモヒオチ）やＬ．ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ（フルクティボランス）などの限られた乳酸菌だけは清酒中で増殖して、濁り（＝清酒の白濁化）や酸敗（＝酢酸やグリコール酸などの有機酸、ヒスタミン、ジアセチルやアセトインなどの生成による酸味と酸臭（＝火落香）の形成）を引き起こす事が知られている（好井久雄、金子安之、山口和夫（共著）：＜改訂増補版＞食品微生物学、ｐ１５９−１６２及びｐ４５４−４５７、技報堂出版  （１９７６）、伊藤武・森地敏樹（編）：食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―、ｐ１９４−２００（後藤奈美（著））、サイエンスフォーラム  （２００４））。そのため、製品中に混入した火落菌を迅速に検出する技術は清酒醸造業上非常に有用であり、このような火落菌を検出するためのＳ．Ｉ．培地（注：現在は日本醸造協会から頒布されているＳＩ培地）を用いる培養法がまず考案され（菅間誠之助、井口琢郎：醸協、６５（８）、７２０−７２５  （１９７０））、より迅速に結果を得るための工夫が加えられ、さらに迅速かつ高精度に検出するための、抗火落菌モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法（Ｊ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．Ｍｉｎａｍｉ（Ｉｗａｔａ），Ｋ．Ｄｏｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈａｍａｃｈｉ：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（１１），２０３９−２０４３  （１９９５））や１６ＳｒＲＮＡ遺伝子−２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域を指標とするＰＣＲ法（Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．Ｓｈｉｍａｄａ，Ｈ．Ｍｕｋａｉ，Ｋ．Ａｓａｄａ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ．Ｆｕｊｉｎｏ  ａｎｄ  Ｔ．Ｓａｔｏ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０（２），６３７−６４０  （１９９４））、そしてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計を用いる火落菌の同定法（孫麗偉、寺本華奈江、島村政基、佐藤浩昭、田尾博明：分析化学、５６（１２）、１０７１−１０７９  （２００７））などが次々と開発され、このようにして開発された迅速検出法の一部については特許出願・特許化もされ（培養法における検出の迅速化技術については、真崎秀彦、林亮：火落菌の培養方法、特開平５−１０３６９５、鄭正權：火落菌の測定方法、特許３４５３１６８（２０１４年３月３１日現時点では権利消滅）、高橋秀臣：火落菌数の測定法、特開平１１−３４６７５９、兜森忠道、古木吉孝、南原智之：火落菌の検出法、特開２００２−１８６４９８。また、免疫学的検出法で用いる抗体の作製に関する特許出願としては、土肥健児、浜地正昭、本馬健光、布川弥太郎：火落菌に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、特開平５−８４０７０。分子生物学的な検出法については、中川朋子、向井博之、嶌田雅光、富士野公也、加藤郁之進：ラクトバチルス属細菌の検出方法、特許２９３５７９１（２０１４年３月��１日現時点では権利消滅）、嶌田雅光、富士野公也、加藤郁之進：ラクトバチルス属細菌の検出方法、特許３１０７９０４（２０１４年３月３１日現時点では権利消滅））、実際の醸造現場で利用されている。
【０５０９】
また、ビール（製品及び貯蔵中の仕掛品）も、エタノール（約５％）を含み、ｐＨが３．８〜４．７と比較的低めで、しかも栄養分は（発酵性糖類の濃度が０．３％以下と）枯渇し、溶存酸素量も少なく（０．１ｐｐｍ．程度）、さらに抗菌性を示す「ホップ」が原料として用いられる事もあって、こうしたビールの中で増殖して濁り（＝ビールの白濁化）や（ジアセチルなどの生成による）不快臭を生じさせる微生物も、ホップ耐性能に関わるｈｏｒＡ遺伝子（Ｍ．Ｓａｍｉ，Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｈｉｒｏｎｏ，Ｈ．Ｋａｄｏｋｕｒａ，Ｋ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｙｏｄａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｙａｍａｓａｋｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８４（１），１−６  （１９９７））も持つＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（ブレビス）やＬ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ（リンドネリ）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｍｎｏｓｕｓ（ペディオコッカス・ダムノサス）などの（グラム陽性の）乳酸菌株や、またＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ（ペクチネイタス・セレビシフィラス）やＰ．ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ（フリシンゲンシス）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（メガスフェラ・セレヴィシエ）などのグラム陰性の偏性嫌気性菌株などに限られる（三瀬勝利・井上富士男（編）：食品中の微生物検査法解説書、ｐ２６８−２７２（宮本豊（著））、講談社サイエンティフィク  （１９９６）、宮本豊：醸協、９６（７）、４５５−４６５  （２００１）、Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｗ．Ｎ．Ｋｏｎｉｎｇｓ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２−３），１０５−１２４  （２００３））。
【０５１０】
それゆえに、製品中に混入したこれらの細菌を迅速に検出する技術はビール醸造業上非常に有用であり、このような細菌を効率的に検出するためのさまざまな培地と培養法がまず編み出され（Ａ．Ｎａｋａｇａｗａ：Ｂｕｌｌ．Ｂｒｅｗ．Ｓｃｉ．，２４，１−１０  （１９７８）、Ｗ．Ｂａｃｋ：Ｂｒａｕｗｅｌｔ，１２０，１５６２−１５６９  （１９８０）、Ｓ．Ｙ．Ｌｅｅ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．，５２，１１５−１１９  （１９９４））、さらにより迅速かつ高精度に検出するための免疫学的な手法（Ｓ．Ｌ．Ｇａｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｗｈｉｔｉｎｇ：Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５１，１５８−１６３  （１９９３）、Ｔ．Ｙａｓｕｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｙｏｄａ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８４（１），３５−４０  （１９９７）、Ｔ．Ｙａｓｕｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｙｏｄａ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（１１），４５２８−４５３３  （１９９７））や、ｒＲＮＡ遺伝子やｈｏｒＡ遺伝子などを指標とする分子生物学的な手法が次々と開発され（Ｙ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｈ．Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．Ｋａｎｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｓｈｉｎｏ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５０，６４−６７  （１９９２）、Ｌ．Ｊ．ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５１，６３−６６  （１９９３）、Ｙ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｙ．Ｋａｎｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｓｈｉｎｏ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５１，４０−４１  （１９９３）、Ｙ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｙ．Ｋａｎｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｓｈｉｎｏ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５２，９５−９９  （１９９４）、Ｒ．Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５４（２），７８−８４  （１９９６）、Ｔ．Ａ．Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，Ｒ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｌ．Ｓａｖａｒｄ，Ｉ．Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５４（２），９１−９６  （１９９６）、Ｔ．Ｙａｓｕｉ，Ｈ．Ｔａｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｔ．Ｏｋａｍｏｔｏ：Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３（２），１５７−１６３  （１９９７）、Ｍ．Ｓａｍｉ，Ｈ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｈ．Ｋａｄｏｋｕｒａ，Ｋ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｙｏｄａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｙａｍａｓａｋｉ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５５（４），１３７−１４０  （１９９７）、Ｒ．Ｓａｔｏｋａｒｉ，Ｒ．Ｊｕｖｏｎｅｎ，Ａ．ｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ａ．Ｈａｉｋａｒａ：Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔ．，６０（１２），１５７１−１５７３  （１９９７）、Ｒ．Ｓａｔｏｋａｒｉ，Ｒ．Ｊｕｖｏｎｅｎ，Ｋ．Ｍａｌｌｉｓｏｎ，Ａ．ｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ａ．Ｈａｉｋａｒａ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５（２），１１９−１２７  （１９９８）、Ｒ．Ｊｕｖｏｎｅｎ，Ｒ．Ｓａｔｏｋａｒｉ，Ｋ．Ｍａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｈａｉｋａｒａ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５７（３），９９−１０３  （１９９９）、Ｙ．Ｍｏｔｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｏｇａｔａ：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，５８（１），４−７  （２０００）、Ｓ．Ａｓａｎｏ，Ｋ．Ｉｉｊｉｍａ，Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．Ｏｇａｔａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｋｉｔａｇａｗａ：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０８（２），１２４−１２９  （２００９））、それらの多くは特許化もされ（免疫学的な検出方法としては、佐藤敦、大竹康之、森俊夫、宮本豊：乳酸菌に対するモノクローナル抗体およびこれを用いた乳酸菌の検出法、特許２６０９９８２（２０１４年３月３１日現時点では権利消滅）、宮本豊、深田美奈子、西中直子：乳酸菌に特異的なモノクローナル抗体およびこれを用いた乳酸菌の検出法、特開平６−３１１８９５、中北保一：免疫学的手法によるメガスフェラ属微生物の検出法、特開平８−３１９２９７、横山昌人、田中美佐、伊藤美恵、田口博：乳酸菌検出用抗体及びそれを用いた乳酸菌検出方法、特許３６１４９９７（２０１４年３月３１日現時点では権利消滅）、土屋陽一：ビール有害乳酸菌検出用抗体とその診断的用途、特許３６１４７７９。また、分子生物学的な検出方法としては、土屋陽一、狩野幸信：乳酸菌の簡易同定法、特開平６−１１３８８８、土屋陽一、狩野幸信：乳酸菌の高感度検出法、特開平６−１４１８９９、船橋亙：乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該当菌の検出方法、特開平１０−２１０９８０、坂本幹太：ペクチネータス属菌の検出、ＷＯ９７／２００７１、坂本幹太：微生物検出用オリゴヌクレオチド及び微生物検出方法、特開平１０−３２３１９０、佐見学：乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた判定法、特開平１１−１８７８０、本山靖朗、尾形智夫、坂井和久：細菌検出のための遺伝子及びそれを用いた検出法、ＷＯ００／０９６８３、安原貴臣：ペクチネータス属の細菌検出用核酸プローブおよびビール混濁原因菌の検出方法、特開２００１−１４５４９２、安原貴臣：ペクチネータス属菌の特異的ならびに定量的検出方法、特開２００１−２１８５９８、飯島和丸、本山靖朗：細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法、特開２００１−２３１５６４、土屋陽一：乳酸菌検出方法、特開２００１−２９６３００、本山靖朗、安原貴臣、高橋恭子：ペクチネータス属菌検出のための核酸プローブ、およびその細菌に由来する核酸の検出方法、特開２００２−１７３５６、安原貴臣：メガスフェラ・セレビジエ検出のための核酸プローブ、およびビール混濁の原因となる細菌物質の検出方法、特開２００２−３４５７１、安原貴臣、高橋恭子、本山靖朗：ラクトバチルス属菌及びぺディオコッカス属菌検出のための塩基配列、およびそれらの菌の検出方法、特開２００２−３４５７８、本山靖朗、安原貴臣、高橋恭子：メガスフィラ・セレビジエ検出のための核酸プローブ、およびビールの混濁細菌の検出方法、特開２００２−１２５６７７、飯島和丸、本山靖朗：細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法、特開２００３−３８１８１、バイムフォール・クラウディア、スナイドル・イリ：ビールに対し有害な細菌の特異的迅速検出方法、特表２００４−５２９６６２、坂本幹太：ペクチネータス属菌の検出、特開２００４−１２１２５９、土屋陽一、小川雅裕、中北保���：酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法、ＷＯ２００５／０９３０５９、鈴木康司：ビール有害菌の検出方法、特開２００５−６５５６、中北保一、土屋陽一：偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法、特開２００５−２２９８３８、中北保一、土屋陽一：乳酸菌の検出・識別方法、特開２００５−２２９８３９）、製品（ビール）の品質管理の場面に取り入れられ、大きな効果を上げているようである（伊藤武・森地敏樹（編）：食品のストレス環境と微生物  ―その挙動・制御と検出―、ｐ１９４−２００（後藤奈美（著））、サイエンスフォーラム  （２００４）、工藤俊章・大熊盛也（監修）：難培養微生物の利用技術、ｐ２５５−２６５  （北垣浩志・北本勝ひこ（著））  シーエムシー出版  （２０１０））。
【０５１１】
本発明の方法の中には、このような清酒やビールに害を及ぼす特定の微生物の検出法の、いわば「味噌・醤油」版と言える要素、すなわち味噌・醤油に混入した際に皮膜を形成して見た目を「見ため」を悪くするとともに、さらには混入してから皮膜を形成するまでの増殖過程で、食品中の糖質やアルコールなどの各種成分を消費したり、また食品としての嗜好性に悪い影響を及ぼす呈味成分や香気成分（＝アルデヒドや酸など）を生成したりする事を通じて、仕掛品や製品の品質の劣化を引き起こす味噌・醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を迅速かつ簡便に検出する方法も含まれている。つまり、本発明の方法を使えば、味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）に混在している味噌・醤油産膜性Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ株を迅速かつ簡便に検出する事ができ、味噌・醤油（製品）及びその仕掛品（である味噌・醤油諸味や生揚げ醤油など）の品質管理を効率化させる事も可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５９】
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【図７４】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１１０】
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【配列表】
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