(57)【要約】【課題】本発明は、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を、抗がん剤の投与前に予測する方法を提供することを課題とする。【解決手段】抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取された骨肉腫細胞を含む生体試料から抽出したRNA中のmiRNA-100及びmiRNA-125bから選択される少なくとも１つの発現量を示す値を取得し、取得した発現量を示す値に基づいて、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を予測することにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取された骨肉腫細胞を含む生体試料からRNAを抽出する工程と、
抽出されたRNA中のmiRNA-100及びmiRNA-125bから選択される少なくとも１つの発現量を示す値を取得する工程と、
取得した発現量を示す値に基づいて、前記骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を予測する工程と
を含む、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測方法。
【請求項２】
生体試料が、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取された細胞、組織又は血液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予測工程において、発現量を示す値と所定の閾値とを比較し、比較の結果に基づいて、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を予測する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
予測工程において、発現量を示す値が所定の閾値以上である場合に骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性が低いと予測し、発現量を示す値が所定の閾値未満である場合に骨肉種細胞における抗がん剤の奏功性が高いと予測する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予測工程において、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、白金製剤、抗がん性植物アルカロイド及びアルキル化剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の奏功性を予測する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
代謝拮抗剤が、メトトレキサート、テガフール、カルモフール、5-フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン及びエノシタビンから選択される少なくとも１つである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗がん性抗生物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクラルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ及びマイトマイシンＣから選択される少なくとも１つである請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
白金製剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン及びネダプラチンから選択される少なくとも１つである請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗がん性植物アルカロイドが、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ノギテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチンから選択される少なくとも１つである請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アルキル化剤が、イフォスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ニムスチン、テモゾロマイド及びダカルバジンから選択される少なくとも１つである請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を、抗がん剤の投与前に予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨肉腫は、原発性悪性骨腫瘍の一種であり、腫瘍細胞間に骨や類骨基質を形成する。発生部位としては、大腿骨や脛骨の膝関節近位部が最も多く、次いで上腕骨の肩関節近位部に多く見られる。骨肉腫の確定診断は、骨肉腫の発生が疑われる部位から採取した組織の病理検査により行われる。その結果、骨肉腫と診断された場合は、一般的に、摘出手術前に腫瘍を縮小させて摘出部位を最小限にするために、抗がん剤による術前化学療法が約半年にわたり行われる。抗がん剤が奏功性を示した患者のうち約８割は完全寛解するが、抗がん剤が奏功性を示さなかった患者ではその約８割が５年以内に死亡するといわれている。術前化学療法において抗がん剤が効かなかった場合、手術により腫瘍を直ちに摘出することが有効である。
【０００３】
抗がん剤が骨肉腫に奏功性を示す場合は、術前化学療法の後に摘出手術を行うべきであるが、抗がん剤が骨肉腫に奏功性を示さない場合は、結果として無用な化学療法を行うこととなり、さらに化学療法の間に病状が進行することさえあり得る。もし、術前化学療法を行う前に抗がん剤が骨肉腫に対して奏功性を示すか否かを予測することができれば、術前化学療法における過剰な投薬を避けたり、早期に腫瘍の摘出手術をする判断を下したりすることが可能となる。このように、適切な治療方針をあらかじめ設定するために、骨肉腫に対する抗がん剤の奏功性の予測を可能にする手法の開発が望まれている。
【０００４】
本発明者らは、これまでに、骨肉腫における抗がん剤の奏功性を予測するために、ペロキシレドキシン２と呼ばれるタンパク質分子をバイオマーカーとして利用することを見出している(特許文献１参照)。また、近年では、microRNA(以下、「miRNA」ともいう)が、がんの発症、予後予測及び抗がん剤の耐性に関与していることが報告されている。例えば、非特許文献１〜１０には、種々のがん細胞におけるmiRNA-100及びmiR-125bの発現量の変化と、薬剤耐性との関連が開示されている(非特許文献１〜１０参照)。
【０００５】
しかし、非特許文献１〜１０には、骨肉腫におけるmiRNA-100及びmiRNA-125bの発現量と、発現量を調べた後に投与された抗がん剤に対する反応性との関連は開示されていない。さらに、これらの文献では、抗がん剤の投与により該抗がん剤への耐性を獲得した細胞株(獲得耐性株)におけるmiRNA-100及びmiRNA-125bの発現量を確認している。すなわち、これらの文献は、すでに抗がん剤に抵抗性となった細胞におけるmiRNA-100及びmiRNA-125bの発現量の変化を開示しているに過ぎず、抗がん剤を投与されていない細胞におけるmiRNA-100及びmiRNA-125bの発現量と、該細胞の抗がん剤への反応性との関係については全く開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−６３５２４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Feng Bら, MiR-100 resensitizes docetaxel-resistant human lung adenocarcinoma cells (SPC-A1) to docetaxel by targeting Plk1, Cancer Lett., 2012;317:184-91.
【非特許文献２】Dai Yら, MicroRNA expression profiles of head and neck squamous cell carcinoma with docetaxel-induced multidrug resistance, Head Neck., 2011;33:786-91.
【非特許文献３】Schotte Dら, MicroRNA characterize genetic diversity and drug resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia, Haematologica. 2011;96:703-11.
【非特許文献４】Hatano Yら, miR-125b develops chemoresistance in Ewing sarcoma/primitive neuroectodermal tumor, Cancer Cell Int. 2013;13:21.
【非特許文献５】Cui EHら, Serum microRNA 125b as a diagnostic or prognostic biomarker for advanced NSCLC patients receiving cisplatin-based chemotherapy, Acta Pharmacol Sin. 2013;34:309-13.
【非特許文献６】Wang Hら, Circulating MiR-125b as a marker predicting chemoresistance in breast cancer, PLoS One. 2012;7:e34210.
【非特許文献７】Zhang Hら, Upregulation of microRNA-125b contributes to leukemogenesis and increases drug resistance in pediatric acute promyelocytic leukemia, Mol Cancer. 2011;10:108.
【非特許文献８】Shi Lら, MicroRNA-125b-2 confers human glioblastoma stem cells resistance to temozolomide through the mitochondrial pathway of apoptosis, Int J Oncol. 2012;40:119-29.
【非特許文献９】Kong Fら, miR-125b confers resistance of ovarian cancer cells to cisplatin by targeting pro-apoptotic Bcl-2 antagonist killer 1, Technolog Med Sci. 2011;31:543-9.
【非特許文献１０】Zhou Mら, MicroRNA-125b confers the resistance of breast cancer cells to paclitaxel through suppression of pro-apoptotic Bcl-2 antagonist killer 1 (Bak1) expression, J Biol Chem. 2010;285:21496-507.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、本発明者らは、抗がん剤の奏功性の予測を可能にするバイオマーカーを見出している。しかし、そのようなマーカーは他に見出されておらず、より正確な予測を可能にするために新規マーカーのさらなる探索が望まれている。よって、本発明は、そのような新規マーカーを用いて、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を、抗がん剤の投与前に予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取された骨肉腫細胞において、その後に投与された抗がん剤に対して抵抗性を示した骨肉腫細胞の方が、感受性を示した骨肉腫細胞に比べて、miRNA-100及びmiRNA-125bの発現量が有意に高いことを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
よって、本発明は、
抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取された骨肉腫細胞を含む生体試料からRNAを抽出する工程と、
抽出されたRNA中のmiRNA-100及びmiRNA-125bから選択される少なくとも１つの発現量を示す値を取得する工程と、
取得した発現量を示す値に基づいて、上記骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を予測する工程と
を含む、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を、抗がん剤を投与する前に予測することを可能にする。よって、本発明は、術前化学療法を行う前に、骨肉腫患者への適切な治療方針を設定することを補助することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】術前化学療法が奏功した患者群及び術前化学療法が奏功しなかった患者群におけるmiRNA-100の発現量の分布を示すグラフである。
【図１Ｂ】術前化学療法が奏功した患者群及び術前化学療法が奏功しなかった患者群におけるmiRNA-125bの発現量の分布を示すグラフである。
【図２Ａ】術前化学療法が奏功した患者群及び術前化学療法が奏功しなかった患者群におけるmiRNA-100の発現量の分布を示すグラフである。
【図２Ｂ】術前化学療法が奏功した患者群及び術前化学療法が奏功しなかった患者群におけるmiRNA-125bの発現量の分布を示すグラフである。
【図３Ａ】miRNA-100の発現量に基づいて、骨肉腫患者における術前化学療法の奏功性を予測したときのROC曲線である。
【図３Ｂ】miRNA-125bの発現量に基づいて、骨肉腫患者における術前化学療法の奏功性を予測したときのROC曲線である。
【図４】骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。
【図５】図４の判定装置の機能構成を示すブロック図である。
【図６】図４に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図７】図４に示された判定装置を用いた、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
【図８】ウェスタンブロッティングにより解析したアポトーシス促進因子BAK1の発現量を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本実施形態の骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測方法(以下、単に「方法」ともいう)において、骨肉腫細胞は、細胞の形態、増殖速度、悪性度などは特に限定されない。なお、骨肉腫の種類には、骨内通常型骨肉腫及び亜型骨肉腫があり、亜型骨肉腫としては、骨内高分化型骨肉腫、円形細胞骨肉腫、傍骨性骨肉腫、骨膜性骨肉腫及び表在性低分化骨肉腫が知られている。本実施形態の方法は、抗がん剤を投与されていない限り、いずれの骨肉腫由来の細胞にも用いられるが、特に骨内通常型骨肉腫由来の細胞に好適である。
【００１４】
本実施形態の方法では、まず、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞を含む生体試料からRNAを抽出する工程が行われる。後述の参考例２に示されるように、抗がん剤の投与は、骨肉腫細胞におけるmiRNA-125bの発現量に影響を及ぼすおそれがあるので、生体試料は、抗がん剤が投与される前の患者に由来することが望ましい。ここで、該生体試料は、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞を含む限り特に限定されないが、好ましくは、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した臨床検体である。そのような骨肉腫患者としては、骨肉腫と診断された後、抗がん剤による治療をまだ開始していない患者が望ましい。なお、骨肉腫患者がいずれの抗がん剤も投与されていない限り、該患者の年齢、性別、骨肉腫の種類、発生部位及び病期(ステージ)などは特に限定されない。
【００１５】
抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した臨床検体としては、例えば、手術や生検により骨肉腫の発生部位から採取した細胞及び組織、並びに血液、血清、血漿及びリンパ液などが挙げられる。それらの中でも、細胞、組織及び血液が好ましい。また、上記患者から採取した骨肉腫の細胞又は組織を培養して得られた培養物を、生体試料として用いてもよい。さらに、上記患者の骨肉腫組織のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を、生体試料として用いることもできる。
【００１６】
生体試料からのRNAの抽出は、当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、生体試料と、チオシアン酸グアニジン及び界面活性剤を含む可溶化液とを混合し、得られた混合液に物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を施して、生体試料に含まれるRNAを該混合液中に遊離させることによって、トータルRNAを抽出することができる。好ましくは、さらに、混合液に酢酸ナトリウムなどを添加して液を酸性にし、ここにフェノール及びクロロホルムを添加して撹拌し、これを遠心分離することで、RNAを含む水層を回収する。そして、該水層からアルコール沈殿法などにより回収及び精製したRNAを、後述の測定工程に用いることがより好ましい。なお、上記の可溶化液として、ISOGEN II(株式会社ニッポンジーン)などの市販のRNA抽出用試薬を用いてもよい。また、生体試料からのRNAの抽出及び精製には、miRNeasy kit(QIAGEN社)やHigh Pure miRNA Isolation Kit(Roche社)などのmiRNA含有トータルRNAを抽出するための市販の試薬キットを用いてもよい。
【００１７】
次いで、本実施形態の方法では、生体試料から抽出されたRNA中のmiRNA-100及びmiRNA-125bから選択される少なくとも１つの発現量を示す値を取得する工程が行われる。本実施形態において、発現量を示す値は、上記の各miRNAの発現量の測定値自体であってもよいし、又は該測定値に基づいて算出された値であってもよい。
【００１８】
当該技術において、miRNA-100及びmiRNA-125bはそれぞれmiR-100及びmiR-125bとも表記される。また、miRNA-100及びmiRNA-125bの塩基配列自体は公知であり、例えばNCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)や、miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)などの公知のデータベースから知ることができる。本明細書では、miRNA-100及びmiRNA-125bの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２で示す。
【００１９】
本実施形態では、miRNA-100及びmiRNA-125bの発現量を示す値として、それらのmiRNA自体の量を測定してもよいし、その量を反映する物質の量を測定してもよい。ここで、miRNAの量を反映する物質としては、miRNAを逆転写して得られるcDNA、及び該cDNAをIVT増幅して得られるcRNAが挙げられる。トータルRNAに含まれるmiRNAはきわめて微量であるので、miRNAから得られるcDNA又はcRNAの量を、miRNAの発現量として測定することが好ましい。なお、miRNA由来のcDNAは、該miRNAの配列に相補的な配列を有する特異的プライマーを用いて合成してもよいし、該miRNAを含むトータルRNAを3'ポリアデニル化して、オリゴdTプライマーを用いて合成してもよい。また、miRNA由来のcDNAの合成は、TaqMan(登録商標) MicroRNA RT Kit(Applied Biosystems社)やMir-X(登録商標) miRNA First-Strand Synthesis Kit(タカラバイオ株式会社)などの市販の試薬キットを用いて行うこともできる。
【００２０】
本実施形態において、上記のmiRNAの発現量を測定する方法は特に限定されず、当該技術において公知の測定方法から選択することができる。そのような測定方法としては、プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法、核酸増幅法を利用した測定法及び質量分析法を利用した測定法が挙げられる。プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法としては、例えばマイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクションアッセイなどが挙げられる。核酸増幅法を利用した測定法としては、例えば定量的逆転写PCR(qRT-PCR)法、定量的逆転写LAMP(qRT-LAMP)法、次世代シーケンス解析(高速シーケンス解析)法などが挙げられる。また、TaqMan(登録商標)プローブを用いるqRT-PCR法も挙げられる。これらの中でも、qRT-PCR法が特に好ましい。
【００２１】
上記のmiRNAの発現量の測定は、TaqMan(登録商標) MicroRNA Assayなどの、miRNA-100及びmiRNA-125bの各miRNAを逆転写するためのプライマー及び得られたcDNAを増幅するための特異的プライマーセットを含む市販のmiRNA定量用試薬キットを用いて行ってもよい。
【００２２】
上記の各miRNAの発現量を測定するためのマイクロアレイは、該miRNA又はこれに由来するcDNA若しくはcRNA(以下、これらを「標的核酸分子」ともいう)と特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを適切な基板上に固定したチップであれば特に限定されない。なお、プローブは各miRNAの塩基配列に基づいて適宜設計できるが、各miRNAの全長配列からなることが好ましい。このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製することができる。また、上記の標的核酸分子と特異的にハイブリダイズできるプローブが搭載されている限り、市販のマイクロアレイを用いてもよい。
【００２３】
本明細書において、「特異的にハイブリダイズできる」とは、プローブがストリンジェントな条件下で標的核酸分子にハイブリダイズできることを意味する。また、「ストリンジェントな条件」とは、上記の標的核酸分子に、該標的核酸分子以外の核酸分子よりも検出可能に大きい程度(例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える)でハイブリダイズできる条件をいう。なお、ストリンジェントな条件は、通常、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHでの特定の配列の熱的融点(thermal melting point：Tm)よりも、約５℃低くなるように選択される。このTmは、規定されたイオン強度、pH及び核酸組成の下で標的核酸分子の塩基配列と相補的なプローブの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。このような条件は、当該技術において公知のポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション法に用いられる条件であればよい。具体的には、pH 7.0〜9.0で塩濃度が約1.5 M Naイオンより低い、より具体的には、約0.01〜1.0 M Naイオン濃度(又は他の塩)であり、少なくとも約30℃の条件が挙げられる。例えば、マイクロアレイ法におけるストリンジェントな条件は、37℃で50%ホルムアミド、１M NaCl、１% SDS中でのハイブリダイゼーション、及び60〜65℃での0.1×SSC中での洗浄を含む。
【００２４】
マイクロアレイにより発現量を測定する場合、上記の標的核酸分子は、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。標的核酸分子を標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。本実施形態においては、生体試料から抽出したmiRNAを標識してもよいし、該miRNAに由来するcDNA又はcRNAを標識してもよい。標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。蛍光物質としては、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Fluor(商標)などが挙げられる。なお、miRNA、cDNA及びcRNAをこれらの標識物質で標識する方法は当該技術において公知である。
【００２５】
マイクロアレイによる測定では、miRNAの発現量を示す値は、標的核酸分子とマイクロアレイのプローブとのハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度(例えば、蛍光強度、発光強度、電流量変化など)として得られる。また、miRNAの発現量を示す値は、該シグナル強度及び検量線から取得されるmiRNAの定量値であってもよい。なお、シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。
【００２６】
核酸増幅法に用いるプライマーは、上記の標的核酸分子に特異的にハイブリダイズして増幅可能なプライマーであれば特に限定されない。なお、PCR法におけるストリンジェントな条件としては、例えば、pH 7.0〜9.0、0.01〜0.1 MのTris HCl、0.05〜0.15 Mのカリウムイオン濃度(又は他の塩)、少なくとも約55℃の条件が挙げられる。そのようなプライマーは上記の各miRNAの塩基配列に基づいて適宜設計できる。また、プライマーは、核酸増幅法の種類に応じて設計されることが好ましい。なお、プライマーは当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
【００２７】
上記のプライマーは、当該技術において公知の標識物質で標識されていてもよい。プライマーの標識は、放射活性元素又は非放射活性分子を用いて行うことができる。放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3H及び125Iが挙げられる。非放射活性物質としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、及び化学発光性、生物発光性、蛍光又はリン光性の試薬のような発光性試薬が挙げられる。
【００２８】
核酸増幅法による測定では、miRNAの発現量を示す値は、例えば、増幅後の反応液の光学的測定値(蛍光強度、濁度、吸光度など)、該光学的測定値が所定の基準値に達したときのサイクル数(又は時間)、該光学的測定値の変化量が所定の基準値に達したときのサイクル数(又は時間)、該光学的測定値(又はサイクル数)及び検量線から取得されるmiRNAの定量値などとして得られる。なお、所定の基準値は、発現量を示す値の種類に応じて適宜設定することができるが、例えば、発現量を示す値がサイクル数である場合、所定の基準値として、核酸増幅反応が対数増殖を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。なお、内部標準となる低分子RNAについても発現量を測定し、得られた値でmiRNA-100及びmiRNA-125bの測定値を標準化してもよい。
【００２９】
本実施形態の方法では、上記のようにして取得した発現量を示す値に基づいて、生体試料に含まれる、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞における抗がん剤の奏功性を予測する工程が行われる。
【００３０】
本実施形態においては、上記の生体試料に含まれる、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者について、抗がん剤を後に投与したときに高い奏功性を示すのか、それとも低い奏功性を示すのかを予測する。ここで、抗がん剤の奏功性の高低の定義について一例を挙げると、抗がん剤の奏功性が高いと予測される場合は、該骨肉腫細胞に抗がん剤を投与した後、Huvos grading systemにより評価される細胞の生存率が10％未満であると予測されることを意味する。反対に、抗がん剤の奏功性が低いと予測される場合は、該骨肉腫細胞に抗がん剤を投与した後、Huvos grading systemにより評価される細胞の生存率が10％以上であると予測されることを意味する。
【００３１】
なお、本実施形態においては、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測とは、該骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞の抗がん剤に対する反応性の予測と解釈することができる。すなわち、抗がん剤の奏功性が高いと予測された場合は、骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞が抗がん剤に感受性であると予測することを意味する。反対に、抗がん剤の奏功性が低いと予測された場合は、骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞が抗がん剤に抵抗性であると予測することを意味する。
【００３２】
本実施形態においては、予測工程では、取得した発現量を示す値と、所定の閾値とを比較し、その比較の結果に基づいて骨肉腫患者の抗がん剤の奏功性を予測することが好ましい。具体的には、比較の結果、発現量を示す値が所定の閾値以上である場合に、骨肉腫患者の抗がん剤の奏功性が低いと予測する。反対に、発現量を示す値が所定の閾値未満である場合に骨肉種細胞における抗がん剤の奏功性が高いと予測する。
【００３３】
上記の所定の閾値は特に限定されず、例えば、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者について、抗がん剤に対する反応性のデータを蓄積することにより、経験的に設定することができる。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、抗がん剤を投与されていない複数の骨肉腫患者から生体試料を採取する。生体試料を採取した骨肉腫患者に抗がん剤治療を行った後、骨肉腫患者の腫瘍組織を摘出する。摘出した腫瘍組織を病理学的に調べ、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を確認する。そして、生体試料を、抗がん剤が奏功性を示した骨肉腫患者の試料と、抗がん剤が奏功性を示さなかった骨肉腫患者の試料とに分類し、それぞれの試料についてmiRNA-100及びmiRNA-125bの発現量を示す値を取得する。そして、取得した値から、抗がん剤が奏功性を示した骨肉腫患者の試料と、抗がん剤が奏功性を示さなかった骨肉腫患者の試料とを区別可能な値を求め、その値を所定の閾値として設定する。
【００３４】
本実施形態では、予測工程において、骨肉腫の治療に用いられる抗がん剤の奏功性を予測することが好ましい。そのような抗がん剤は、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド、白金製剤及びアルキル化剤から選択される。代謝拮抗剤としては、メトトレキサート、テガフール、カルモフール、5-フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン及びエノシタビンなどが挙げられる。抗がん性抗生物質としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクラルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ及びマイトマイシンＣなどが挙げられる。抗がん性植物アルカロイドとしては、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ノギテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンクリスチン及びビンブラスチンなどが挙げられる。白金製剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン及びネダプラチンなどが挙げられる。アルキル化剤としては、イフォスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ニムスチン、テモゾロマイド及びダカルバジンがなど挙げられる。
【００３５】
上記の抗がん剤の中でも、本実施形態の方法は、メトトレキサート、ドキソルビシン、シスプラチン及びイフォスファミドから選択される少なくとも１つの抗がん剤の奏功性の予測に好適である。特に本実施形態の方法は、メトトレキサート、ドキソルビシン及びシスプラチンから選択される少なくとも１つの抗がん剤の奏功性の予測により好適である。なお、メトトレキサート、ドキソルビシン及びシスプラチンの３種の抗がん剤は、骨肉腫の術前化学療法において一般的に用いられる組み合わせである。
【００３６】
本発明の実施形態には、骨肉腫患者の抗がん剤の奏功性の予測に関する情報の提供に適するシステムも含まれる。そのようなシステムは、例えば、次のとおりである。
【００３７】
プロセッサおよび該プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
該メモリには、下記のステップ：
抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞を含む生体試料由来のRNA中のmiRNA-100及びmiRNA-125bから選択される少なくとも１つの発現量を示す値を取得するステップと、
取得した発現量を示す値に基づいて、上記の骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するステップと
を該コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
抗がん剤の奏功性の予測に関する情報の提供に適するシステム。
【００３８】
また、本発明の実施形態には、抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。そのようなコンピュータプログラム製品は、例えば、次のとおりである。
【００３９】
コンピュータに読み取り可能な媒体を備え、
該媒体には、下記のステップ：
抗がん剤を投与されていない骨肉腫患者から採取した骨肉腫細胞を含む生体試料由来のRNA中のmiRNA-100及びmiRNA-125bから選択される少なくとも１つの発現量を示す値を取得するステップと、
取得した発現量を示す値に基づいて、上記の骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するステップと
を該コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品。
【００４０】
以下に、本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態はこの実施形態のみに限定されるものではない。図４は、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。図４に示された判定装置１は、測定装置２と、該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３とを含んでいる。
【００４１】
本実施形態においては、測定装置２は、リアルタイムPCR装置である。この測定装置２は、miRNA-100及び／又はmiRNA-125bの発現量を示す値を取得する。生体試料から調製したRNAとqRT-PCRに必要な試薬とを含む測定試料を測定装置２にセットすると、測定装置２は、該測定用試料中のmiRNA-100及び／又はmiRNA-125bの増幅産物に由来する光学的測定値を取得し、得られた値をコンピュータシステム３に送信する。
【００４２】
なお、miRNA-100及び／又はmiRNA-125bの発現量を示す値をマイクロアレイ法により解析する場合、測定装置２は、マイクロアレイスキャナーである。この場合、生体試料に由来する標的核酸分子と接触させたマイクロアレイを測定装置２にセットすると、測定装置２は、マイクロアレイ上のプローブと標的核酸分子との特異的なハイブリダイゼーションに基づくシグナルを検出する。そして、測定装置２は、プローブからのシグナル強度データを取得し、得られたデータをコンピュータシステム３に送信する。
【００４３】
コンピュータシステム３は、コンピュータ本体３ａと、入力デバイス３ｂと、検体情報、判定結果などを表示する表示部３ｃとを含む。コンピュータシステム３は、測定装置２から発現量を示す値を受信する。そして、コンピュータシステム３のプロセッサは、発現量を示す値に基づいて、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するプログラムを実行する。
【００４４】
図５は、図４に示された判定装置の機能構成を示すブロック図である。図５に示されるように、コンピュータシステム３は、取得部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。取得部３０１は、測定装置２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。なお、算出部３０３と判定部３０４とは、制御部３０６を構成している。
【００４５】
取得部３０１は、測定装置２から送信された情報を取得する。記憶部３０２は、所定の閾値、及び光学的測定値から発現量を示す値を算出するための式を記憶する。算出部３０３は、取得部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、miRNA-100及び／又はmiRNA-125bの発現量を示す値を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出された発現量を示す値が、記憶部３０２に記憶された所定の閾値よりも低いか否かを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報(例えば、該骨肉腫患者における抗がん剤の予測される奏功性の高低)として出力する。
【００４６】
図６は、図４に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。図６に示されるように、コンピュータ本体３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３２と、ハードディスク３３と、入出力インターフェイス３４と、読出装置３５と、通信インターフェイス３６と、画像出力インターフェイス３７とを備えている。ＣＰＵ３０、ＲＯＭ３１、ＲＡＭ３２、ハードディスク３３、入出力インターフェイス３４、読出装置３５、通信インターフェイス３６および画像出力インターフェイス３７は、バス３８によってデータ通信可能に接続されている。
【００４７】
ＣＰＵ３０は、ＲＯＭ３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、上述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するための判定装置としての端末として機能する。
【００４８】
ＲＯＭ３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１には、ＣＰＵ３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
【００４９】
ＲＡＭ３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３２は、ＲＯＭ３１およびハードディスク３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０の作業領域として利用される。
【００５０】
ハードディスク３３は、ＣＰＵ３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報を提供するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００５１】
読出装置３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３５は、可搬型記録媒体４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００５２】
入出力インターフェイス３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３４には、キーボード、マウスなどの入力デバイス３ｂが接続されている。操作者は、当該入力デバイス３ｂを使用することにより、コンピュータ本体３ａにデータを入力することが可能である。
【００５３】
通信インターフェイス３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータシステム３は、通信インターフェイス３６により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。通信インターフェイス３６は、測定装置２に接続されている。ＣＰＵ３０は、通信インターフェイス３６を介して、測定装置２との間で指示信号及びデータの送受信を行う。
【００５４】
画像出力インターフェイス３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３ｃに接続されている。これにより、表示部３ｃは、ＣＰＵ３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００５５】
次に、判定装置１による、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報の提供の処理手順を説明する。図７は、図４に示された判定装置を用いた、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報の提供のフローチャートである。ここでは、測定装置２から送信された光学的測定値からmiRNA-100及び／又はmiRNA-125bの発現量を示す値を取得し、得られた発現量を示す値を用いて予測を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００５６】
まず、ステップＳ１−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２からの光学的測定値を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得した光学的測定値から、記憶部３０２に記憶された、発現量を示す値を算出するための式にしたがって、miRNA-100及び／又はmiRNA-125bの発現量を示す値を算出する。
【００５７】
その後、ステップＳ１−３において、判定部３０４は、算出部３０３で算出された発現量を示す値が、記憶部３０２に記憶された所定の閾値よりも低いか否かの判定を行う。ここで、発現量を示す値が所定の閾値よりも低いとき、処理はステップＳ１−４に進行し、判定部３０４は、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性が高いと予測されることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。反対に、発現量を示す値が所定の閾値よりも低くないとき(すなわち、発現量を示す値が所定の閾値以上であるとき)、処理はステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性が低いと予測されることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００５８】
そして、ステップＳ１−６において、出力部３０５は、判定結果を、骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測に関する情報として出力し、表示部３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、抗がん剤による治療を開始する前に、骨肉腫患者の治療方針の設定を補助する情報を医師などに提供することができる。
【００５９】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１：  新規バイオマーカーの同定
(１)生体試料の調製
８名の骨肉腫患者に術前化学療法を行った後、これらの患者をHuvos Grading Systemにより、術前化学療法が奏功した患者群(Case Nos.１〜４の４名)と、術前化学療法が奏功しなかった患者群(Case Nos.５〜８の４名)とに分類した(表１参照)。術前化学療法に用いた抗がん剤は、メトトレキサート、ドキソルビシン及びシスプラチンであった。実施例１では、術前化学療法の開始前に上記の８名の骨肉腫患者から切開生検によりあらかじめ採取していた組織の冷凍サンプルを、生体試料として用いた。なお、術前化学療法が奏功した患者群はHuvos分類１又は２に該当し、手術時に得た検体の病理検査による術前化学療法後の骨肉腫細胞の生存率は10％未満であった。また、術前化学療法が奏功しなかった患者群はHuvos分類３又は４に該当し、手術時に得た検体の病理検査による術前化学療法後の骨肉腫細胞の生存率は10％以上であった。
【００６１】
【表１】
2015198643.tif 000002
【００６２】
(２)RNAの抽出
上記の各組織の冷凍サンプルを、マルチビーズショッカー(登録商標)(安井器械株式会社製)を用いて、液体窒素での冷却下に粉砕して粉体を得た。得られた粉体から、miRNeasy Mini kit(QIAGEN社)を用いてmiRNAを含むトータルRNAを抽出した。
【００６３】
(３)マイクロアレイによる解析
上記の各組織の冷凍サンプルから抽出したRNA(100 ng)を、Agilent miRNA Labeling Kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて処理して、該RNA中のmiRNAの3'末端に、蛍光標識されたシトシン残基を付加した。標識したRNAをHuman miRNAマイクロアレイ Rel.12.0(アジレント・テクノロジー株式会社)に添加し、該アレイに添付のプロトコールに従ってハイブリダイゼーションを行った。その後、Microarray Scanner System G20505C (Agilent Technologies社)を用いて、蛍光シグナル強度を測定した。
【００６４】
(４)定量的RT-PCRによる解析
上記の各組織の冷凍サンプルから抽出したRNA(10 ng)を、TaqMan(登録商標) MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems社)及び上記６種のmiRNAのそれぞれに対応するTaqMan(登録商標) MicroRNA Assay(Applied Biosystems社)のシリーズを用いて処理して、該RNA中のmiRNAからcDNAを合成してqRT-PCRを行った。qRT-PCRは、7300 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて行った。なお、上記のキットには、miRNA-100及びmiRNA-125bを含む上記６種のmiRNAのそれぞれについて、逆転写及びリアルタイムPCRに必要な特異的プライマーとTaqMan(登録商標)プローブが含まれている。qRT-PCRの具体的な操作手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。各miRNAの発現量は、低分子RNAであるRNU6B(Applied Biosystems社)転写産物の発現量によって標準化した。
【００６５】
(５)解析結果
マイクロアレイ解析の結果、術前化学療法が奏功した患者群と、術前化学療法が奏功しなかった患者群との間で発現量に有意差が認められたmiRNAとして、miRNA-100及びmiRNA-125bを含む６種のmiRNAを同定した。そして、qRT-PCRによる解析により、同定した６種のmiRNAのうちmiRNA-100及びmiRNA-125bの発現量が、術前化学療法が奏功した患者群よりも、術前化学療法が奏功しなかった患者群において有意に高いことが確認された(図１Ａ及びＢ参照)。これらのqRT-PCRの結果は、マイクロアレイ解析の結果と一致する。
【００６６】
実施例２：  新規バイオマーカーの発現の検証
(１)生体試料の調製
実施例１の患者とは異なる20名の骨肉腫患者に術前化学療法を行った後、これらの患者をHuvos Grading Systemにより、術前化学療法が奏功した患者群(Case Nos.１〜11の11名)と、術前化学療法が奏功しなかった患者群(Case Nos. 12〜20の９名)とに分類した(表２参照)。術前化学療法に用いた抗がん剤は、メトトレキサート、ドキソルビシン及びシスプラチンであった。実施例２では、術前化学療法の開始前に上記の20名の骨肉腫患者から生検によりあらかじめ採取していた組織のFFPEサンプルを、生体試料として用いた。なお、術前化学療法が奏功した患者群はHuvos分類１又は２に該当し、手術時に得た検体の病理検査による術前化学療法後の骨肉腫細胞の生存率は10％未満であった。また、術前化学療法が奏功しなかった患者群は、一部を除き、Huvos分類３又は４に該当し、手術時に得た検体の病理検査による術前化学療法後の骨肉腫細胞の生存率は10％以上であった。術前化学療法が奏功しなかった患者群の一部は、CT及びMRIを用いた画像診断により骨肉腫細胞の生存の程度を判定した。
【００６７】
【表２】
2015198643.tif 000003
【００６８】
(２)RNAの抽出
上記の各組織のFFPEサンプルを切断して、厚さ10μmの切片を得た。複数枚の切片を1.5 mLチューブに入れ、miRNeasy FFPE kit(QIAGEN社)を用いてmiRNAを含むトータルRNAを抽出した。
【００６９】
(３)定量的RT-PCR
上記の各組織のFFPEサンプルから抽出したRNA(10 ng)を、TaqMan(登録商標) MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan(登録商標) MicroRNA Assay has-miR100及びTaqMan(登録商標) MicroRNA Assay has-miR125b(いずれもApplied Biosystems社)を用いて処理して、該RNA中のmiRNAからcDNAを合成してqRT-PCRを行った。qRT-PCRは、7300 Real Time PCR System(Applied Biosystems社製)を用いて行った。なお、上記のキットには、miRNA-100及びmiRNA-125bのそれぞれについて、逆転写及びリアルタイムPCRに必要な特異的プライマーとTaqMan(登録商標)プローブが含まれている。qRT-PCRの具体的な操作手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。miRNA-100及びmiRNA-125bの発現量は、低分子RNAであるRNU6B(Applied Biosystems社)転写産物の発現量によって標準化した。
【００７０】
(４)解析結果
実施例１とは異なる患者においても、miRNA-100及びmiRNA-125bの発現量は、術前化学療法が奏功した患者群よりも、術前化学療法が奏功しなかった患者群において有意に高いことが確認された(図２Ａ及びＢ参照)。これらのqRT-PCRの結果に基づいて、上記の骨肉腫患者における術前化学療法の奏功性を予測したときのROC曲線を、図３Ａ及びＢに示す。これらの結果より、miRNA-100及びmiRNA-125bの発現量に基づいて、抗がん剤による治療の開始前に骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性を高い精度で予測できることがわかる。
【００７１】
参考例１：  miRNA-100及びmiRNA-125bの機能解析
miRNA-100及びmiRNA-125bのそれぞれを種々の骨肉腫細胞株に導入して、抗がん剤に対する感受性が変化するか否かを検討した。
(１)試料の調製
ヒト骨肉腫細胞株として、MNNG/HOS、MG63及び143Bを用いた。これらの細胞を96ウェルプレートに、１ウェル当たり３×103 cellsとなるように播いた。24時間後に培地を交換し、各細胞にmiRNA-100(配列番号１)、miRNA-125b(配列番号２)及びネガティブ・コントロール(ナンセンス配列のRNA)(microRNA control, Non-target RNA (S10CM0600; コスモ・バイオ株式会社))のそれぞれを、DharmaFECT transfection reagents(Thermo Scientific社)を用いて導入した。RNA導入の24時間後に培地を交換した。なお、具体的な操作手順は、用いた遺伝子導入試薬に添付のプロトコールに従った。
【００７２】
(２)感受性試験
各種のRNAを導入したMNNG/HOS、MG63及び143Bの各細胞に、メトトレキサート(MTX)、ドキソルビシン(DOX)及びシスプラチン(CDDP)のそれぞれを下記の条件で投与し、一定時間インキュベートした。その後、各細胞の生存率を、Cell Counting Kit-8(株式会社同仁化学研究所)を用いて測定した。なお、具体的な操作手順は、用いたキットに添付のプロトコールに従った。
メトトレキサート(MTX) ：０〜32μMの終濃度で投与し、72時間インキュベートした。
ドキソルビシン(DOX)   ：０〜1.3μMの濃度で投与し、48時間インキュベートした。
シスプラチン(CDDP)    ：０〜32μMの終濃度で投与し、48時間インキュベートした。
【００７３】
(３)結果
細胞生存率の測定結果から、各抗がん剤について50％細胞増殖阻害濃度(IC50)を求めた。結果を表３に示す。
【００７４】
【表３】
2015198643.tif 000004
【００７５】
表３より、ネガティブ・コントロールを導入した骨肉腫細胞に対して、miRNA-100及びmiRNA-125bのそれぞれを導入した細胞では、３種の抗がん剤のいずれに対してもIC50が上昇していた。これらの結果から、miRNA-100及びmiRNA-125bは、骨肉腫細胞に抗がん剤に対する抵抗性を付与することが示唆された。
【００７６】
参考例２：  アポトーシス促進因子の発現量に基づく、miRNA-125bの発現への抗がん剤の影響の検討
BAK1はアポトーシス促進因子であり、その発現は、miRNA-125bの発現量の増加により抑制されることが知られている。参考例２では、骨肉腫細胞におけるBAK1の発現量を指標として、miRNA-125bの発現への抗がん剤の影響を検討した。
(１)試料の調製
ヒト骨肉腫細胞株として、MNNG/HOSを用いた。この細胞を96ウェルプレートに、１ウェル当り３×103 cellsとなるように播いた。24時間後に培地を交換し、細胞にmiRNA-125b(配列番号２)及びネガティブ・コントロール(ナンセンス配列のRNA)(microRNA control, Non-target RNA(S10CM0600; コスモ・バイオ株式会社))のそれぞれを、DharmaFECT transfection reagents(Thermo Scientific社)を用いて導入した。RNA導入の24時間後に培地を交換した。なお、具体的な操作手順は、用いた遺伝子導入試薬に添付のプロトコールに従った。
【００７７】
(２)MNNG/HOS細胞におけるBAK1の発現量の確認
(i)細胞からのタンパク質の抽出
上記(１)で各種のRNAを導入したMNNG/HOS細胞に、ドキソルビシン(DOX)を０μM又は64μMの終濃度で投与し、48時間インキュベートした。その後、回収した細胞に尿素溶解バッファーを添加し、氷上で30分間インキュベートして細胞を溶解させた。溶解させた細胞を15,000 rpm、30分間、４℃で遠心分離を行い、上清を回収した。上清中のタンパク質濃度をBradford assay (Bio-Rad社)を用いて定量した。
【００７８】
(ii)ウェスタンブロッティングによるBAK1タンパクの検出
上清中のタンパク質を、SDS/ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離した後、ニトロセルロース膜(Bio-Rad社)に転写した。その後、Tween 20含有トリス緩衝生理食塩水(TBS-T)で調製した５％脱脂粉乳溶液(以下、「ブロッキングバッファー」ともいう)を用いて、膜のブロッキングを１時間行った。ブロッキング後、膜を、一次抗体(Anti-BAK1 polyclonal antibody (MBL社))をブロッキングバッファーで1:250の比率で希釈した溶液下、４℃にて一晩インキュベーションした。続いて、膜をTBS-Tでよく洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体(GE社)をブロッキングバッファーで1:2000の比率で希釈した溶液下にインキュベーションした。膜をTBS-Tで洗浄後、ECL-Primeキット(GE社)を用いて抗原抗体複合体を検出した。結果を図８に示す。
【００７９】
図８に示されるように、DOXを投与していない場合では、ネガティブ・コントロール導入株(NC)とmiRNA-125b導入株との間において、BAK1の発現量に明確な差異が見られた。一方、DOXを投与した場合では、NCとmiRNA-125b導入株との間において、BAK1の発現量に差異はほとんど見られなかった。参考例２の結果と、BAK1の発現がmiRNA-125bの発現量の増加により抑制されるという知見とから鑑みて、DOXの投与は、骨肉腫細胞におけるmiRNA-125bの発現量に影響を及ぼす可能性があると考えられる。したがって、DOXなどの抗がん剤の投与によるmiRNA-125bの発現量への影響を避けるため、miRNA-125bの発現量の測定は、患者に抗がん剤を投与する前に行うことが好ましいことが示唆された。
【符号の説明】
【００８０】
１    判定装置
２    測定装置
３    コンピュータシステム
３ａ  コンピュータ本体
３ｂ  入力デバイス
３ｃ  表示部
【図１Ａ】
2015198643.tif 000005
【図１Ｂ】
2015198643.tif 000006
【図２Ａ】
2015198643.tif 000007
【図２Ｂ】
2015198643.tif 000008
【図３Ａ】
2015198643.tif 000009
【図３Ｂ】
2015198643.tif 000010
【図４】
2015198643.tif 000011
【図５】
2015198643.tif 000012
【図６】
2015198643.tif 000013
【図７】
2015198643.tif 000014
【図８】
2015198643.tif 000015
【配列表】
2015198643000001.app