(57)【要約】【課題】ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査、治療薬の選択を行う方法、及びキットを提供する。また、新たな治療薬開発のためのツールの提供を行う。【解決手段】  ＪＡＫ１遺伝子の６５２番目のアミノ酸変異を検出することにより、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査、また、ＪＡＫ阻害剤の適用についての判断を行うことができる。さらに、該変異を発現する細胞を用いて化合物のスクリーニングを行い、新たな治療薬の開発に役立てることも可能となる。【選択図】図１
2015228825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法であって、
ＪＡＫ１遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、
前記ＤＮＡ配列の解析結果から得られるアミノ酸配列の６５２番目のアミノ酸が、野生型であるチロシンから、アスパラギン、ヒスチジン、又はアスパラギン酸へ変異していることを指標として、
ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
請求項１記載のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法であって、
さらに、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及び／又はＴＹＫ２遺伝子のＤＮＡ配列を解析することを特徴とする検査方法。
【請求項３】
請求項２に記載のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法であって、
配列番号１、２のプライマーを用いてＪＡＫ１遺伝子のＤＮＡ配列を、
配列番号３、４のプライマーを用いてＪＡＫ３遺伝子のＤＮＡ配列を解析することを特徴とする検査方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法であって、
前記ＤＮＡ配列の変異を定性的及び／又は定量的に解析することによって、
病勢の判定、治療効果の予測、治療効果の判定及び／又は予後予測の判定を行うことを特徴とする検査方法。
【請求項５】
ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫のがん罹患者がＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法であって、
ＪＡＫ１遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、
前記ＤＮＡ配列の解析結果から得られるアミノ酸配列の６５２番目のアミノ酸が、野生型であるチロシンから、アスパラギン、ヒスチジン、又はアスパラギン酸への変異であることを指標として、
ＪＡＫ阻害剤の適用を判断することを特徴とするＪＡＫ阻害剤の適用対象者識別方法。
【請求項６】
請求項５記載のＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫のがん罹患者がＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法であって、
さらに、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及び／又はＴＹＫ２遺伝子のＤＮＡ配列を解析することを特徴とするＪＡＫ阻害剤の適用対象者識別方法。
【請求項７】
請求項６記載のＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫のがん罹患者がＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法であって、
配列番号１、２のプライマーを用いてＪＡＫ１のＤＮＡ配列を
配列番号３、４のプライマーを用いてＪＡＫ３のＤＮＡ配列を解析することを特徴とするＪＡＫ阻害剤の適用対象者識別方法。
【請求項８】
ＪＡＫ阻害剤を探索する方法であって、
ＪＡＫ１遺伝子の変異によって、ＪＡＫ１タンパク質の６５２番目のアミノ酸が、野生型のチロシンからアスパラギン、ヒスチジンへ変異している細胞を用いて化合物をスクリーニングすることを特徴とするＪＡＫ阻害剤の探索方法。
【請求項９】
ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査キットであって、
配列番号１、２のプライマー、及び配列番号３、４のプライマーを含むことを特徴とする検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがんの検査、及び治療方法の選択、さらに新たな治療薬のスクリーニングに関する。特に、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫（extranodal NK/T-cell lymphoma、ＥＮＫＴＬ、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫ともいう。）の検査方法や検査キット、及び治療方法の選択に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは遺伝子の病気であり、突然変異が蓄積することにより生じることが明らかにされている。がん治療を行うにあたっても、がん組織に生じている遺伝子変異と、患者個人の遺伝子情報を明らかにすることにより、事前に抗がん剤治療の効果や、その副作用を予測することができる。それにより、無駄な治療、強い副作用を伴う治療を避けることができる。
【０００３】
ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫は、主として鼻腔に局所浸潤性、破壊性の病変を生じる悪性リンパ腫として知られており、エプスタイン・バー・ウイルス(Epstein-Barr Virus, ＥＢＶ)感染が発症に関与することが示唆されている。ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫は、アジア、メキシコ、南米で比較的多く見られるとはいうものの、悪性リンパ腫の中では稀であり、日本ではリンパ腫の数％に過ぎない。
【０００４】
ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の腫瘍細胞の遺伝子発現を解析した結果、ＨＡＣＥ１、ＰＲＤＭ１、ＦＯＸＯ３等のがん抑制遺伝子の発現の減少が報告されている。また、ＡＫＴ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、ＮＯＴＣＨ-１、ＮＦ−κＢ等、種々のシグナル伝達系の活性化が報告されている。特に、上記シグナル伝達系のうち、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の初期においてＳＴＡＴ３の活性化が生じていることも報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
症例が少ないことや、検体の採取が困難なこともあり、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の遺伝子変異に関する報告は少ないが、２つのグループの研究によれば、解析した腫瘍のうち多くの腫瘍で、Janus kinase（以下ＪＡＫという。）ファミリーに属するＪＡＫ３の恒常的なリン酸化、及びＪＡＫ３のpseudokinase domainに突然変異が生じていることが報告されている（非特許文献１、２、特許文献１）。これらの結果から、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の発症には、ＪＡＫ３遺伝子の突然変異が重要であることが示唆されている。
【０００６】
ＪＡＫファミリーに属する分子としては、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２がある。これらＪＡＫファミリータンパク質は、細胞膜に存在する受容体の細胞内ドメインに会合しており、受容体のチロシン残基のリン酸化やＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を行い、ＳＴＡＴタンパク質の転写活性化作用の制御を担っている。
【０００７】
上記のいわゆるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路のシグナル伝達系は、サイトカイン受容体からのシグナルを伝達する経路であるため、その制御異常は、血液腫瘍や、免疫系の異常等を引き起こすことが知られている。
【０００８】
また、ＪＡＫファミリー遺伝子は、正常造血で重要な役割を果たしていることから、種々の変異が血液腫瘍において報告されている。上述のように、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫においても、ＪＡＫ３の遺伝子変異が報告され発がんの原因であることが示唆されている。しかしながら、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫では、ＪＡＫファミリーの他の遺伝子や、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３の遺伝子のいわゆるhot spotと呼ばれる遺伝子変異の多い領域以外についての解析は十分に行われていない。
【０００９】
また、日本のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の症例においては、ＪＡＫ３の変異はまれにしか存在しないことが報告されている（非特許文献３）。したがって、ＪＡＫファミリーの他の遺伝子や他の箇所に変異が存在する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７７８１４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bouchekioua, A. et al., Leukemia, 2014年、Vol.28(2), pp.338-348
【非特許文献２】Koo G. C. et al., Cancer Discovery, 2012年、Vol.2(7), pp.591-597
【非特許文献３】Kimura, H., et al., Leukemia & Lymphoma, 2014年、Vol.55(4)、pp.962-963
【非特許文献４】Metzker M.L., Nat. Rev. Genet. 2010年、Vol.11(1)、pp.31-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫に新しく見つかったＪＡＫ１の遺伝子変異に基づき、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の診断、予後予測、治療薬の選択、治療薬のスクリーニング等に用い得る方法や、キットを提供するものである。
【００１３】
本発明者は、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の患者の腫瘍部のＪＡＫファミリー遺伝子全長の解析を行い、ＪＡＫ１遺伝子に突然変異が生じていることを見出した。ＪＡＫ１遺伝子のみの突然変異によるがん発症に関する報告は今までにはなく、さらに、今回見つかったＪＡＫ１遺伝子の突然変異は既知の遺伝子変異とは異なる新たな遺伝子変異である。
【００１４】
具体的には、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫のうち、ＪＡＫファミリー、特にＪＡＫ1遺伝子の変異を検出することにより、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査、治療法の選択を行うものである。すでに、ＪＡＫ１を分子標的とする治療薬としてルキソリチニブ、トファシチニブが知られている。したがって、ＪＡＫ１の遺伝子変異を捉えることにより、ルキソリチニブ、トファシチニブ等のＪＡＫ阻害剤による治療の対象とすることができる。
【００１５】
また、治療後においても、遺伝子解析による微小残存病変の検出を行い、治療効果の判定、すなわち予後予測を行うことも可能となる。
【００１６】
また、本発明者らにより見出された遺伝子変異を強制的に発現させた細胞や、遺伝子変異を含む細胞株を樹立することにより、ＪＡＫ１を標的とする分子治療薬、診断薬の開発を行うこともできる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法は、ＪＡＫ１遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、前記ＤＮＡ配列の解析結果から得られるアミノ酸配列の６５２番目のアミノ酸が、野生型であるチロシンから、アスパラギン、ヒスチジン、又はアスパラギン酸へ変異していることを指標として、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査することを特徴とする。
【００１８】
本発明者らは、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫に、ＪＡＫ１遺伝子の変異により、６５２番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）がアスパラギン（Ｎ）、あるいはヒスチジン（Ｈ）に変異する、Ｙ６５２Ｎ、Ｙ６５２Ｈの変異が存在することを見出した。
【００１９】
これまでにＪＡＫ１遺伝子の変異Ｙ６５２Ｄは、ＪＡＫ３の変異とともに検出されており、ＪＡＫ１の変異はＪＡＫ３の変異を伴わなければ発がんに結びつかないものであると考えられていた。しかしながら、本発明者らは、ＪＡＫ１遺伝子の変異単独でも発がんを誘発する症例が存在することを見出し、本発明を完成するにいたった。ＪＡＫ１の６５２番目のアミノ酸の変異を検出することによりＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の診断を行い得ることは本発明者らが初めて見出したことである。
【００２０】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法は、さらに、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及び／又はＴＹＫ２遺伝子のＤＮＡ配列を解析することを特徴とする。
【００２１】
ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫はＪＡＫファミリー遺伝子の変異に起因しているものが多いことが示唆されている。特に、ＪＡＫ３に遺伝子変異が生じていることが報告されている。したがって、ＪＡＫ１以外のＪＡＫファミリーの遺伝子変異を検出することにより、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の診断に役立てることができる。
【００２２】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法であって、配列番号１、２のプライマーを用いてＪＡＫ１遺伝子のＤＮＡ配列を、配列番号３、４のプライマーを用いてＪＡＫ３遺伝子のＤＮＡ配列を解析することを特徴とする。
【００２３】
上記配列番号のプライマーを用いることにより、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３遺伝子に変異が生じている場合には検出することが可能である。
【００２４】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫を検査する方法は、前記ＤＮＡ配列の変異を定性的及び／又は定量的に解析することによって、病勢の判定、治療効果の予測、治療効果の判定及び／又は予後予測の判定を行うことを特徴とする。
【００２５】
発がんの原因となっているＤＮＡ配列を検出し、解析することによって、がんであることを判定するだけではなく、病期、治療効果、予後予測等、様々なことについて判定が可能となる。
【００２６】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫のがん罹患者がＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法であって、ＪＡＫ１遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、前記ＤＮＡ配列の解析結果から得られるアミノ酸配列の６５２番目のアミノ酸が、野生型であるチロシンから、アスパラギン、ヒスチジン、又はアスパラギン酸への変異であることを指標として、ＪＡＫ阻害剤の適用を判断することを特徴とする。
【００２７】
上記遺伝子変異を検出することにより、ＪＡＫ１タンパク質の阻害剤であるルキソリチニブ等の治療薬の効果を期待することができる。遺伝子検査を行い、ＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを判断してから治療を開始することにより、無駄な治療を行わずにすむことから、患者の身体的負担を軽減することができる。
【００２８】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫のがん罹患者がＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法であって、さらに、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及び／又はＴＹＫ２遺伝子のＤＮＡ配列を解析することを特徴とする。
【００２９】
ＪＡＫファミリーを標的とした医薬品としてすでに承認されているものとしてはルキソリチニブ、トファシチニブがあるが、各ＪＡＫファミリータンパクに対する阻害のプロファイルに違いがある。
【００３０】
ルキソリチニブは、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２に対する選択性が高く、トファシチニブは、ＪＡＫ３に対する選択性が高い治療薬である。したがって、ＪＡＫファミリーのどの分子を標的とすべきかを見極めて、治療方法を選択することは患者にとって有用である。
【００３１】
本発明のＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫のがん罹患者がＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法であって、配列番号１、２のプライマーを用いてＪＡＫ１のＤＮＡ配列を、配列番号３、４のプライマーを用いてＪＡＫ３のＤＮＡ配列を解析することを特徴とする。
【００３２】
ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫はＪＡＫ１、ＪＡＫ３の突然変異が原因である場合には、上記配列番号のプライマーによって突然変異を検出し、適切な阻害剤による治療を行うことができる。
【００３３】
本発明のＪＡＫ阻害剤を探索する方法は、ＪＡＫ１遺伝子の変異によって、ＪＡＫ１タンパク質の６５２番目のアミノ酸が、野生型のチロシンからアスパラギン、ヒスチジンへ変異している細胞を用いて化合物をスクリーニングすることを特徴とする。
【００３４】
新たに見つかったＪＡＫ１遺伝子変異を有する細胞を用いて、化合物をスクリーニングすることにより、ＪＡＫファミリータンパク質に対する新たな阻害剤を開発することが可能となる。
【００３５】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査キットは、配列番号１、２のプライマー、及び配列番号３、４のプライマーを含むことを特徴とする。
【００３６】
配列番号１、２のプライマーによって、ＪＡＫ１遺伝子の変異を、配列番号３、４のプライマーによって、ＪＡＫ３遺伝子の変異を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＪＡＫ１のドメイン構造及び変異を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明のＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査方法、ＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かを識別するための方法、治療効果の判定方法、治療後の予後予測の方法は、ＪＡＫファミリーのＤＮＡ配列を確認することができるのであれば、どのような方法を用いてもよい。ここではSanger法シーケンシング、次世代シーケンサーを用いて、ＤＮＡ配列の解析を行っているが、質量分析、パイロシーケンシング等、公知のシーケンシング方法を用いることができる。
【００３９】
解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（非特許文献４参照）。次世代シーケンサーとしては、Illumina社のMiSeq/HiSeq、Life Technogies社のＳＯＬｉＤシステム、Roche社の４５４シーケンスシステム（GS FLX+/GS Junior）等が例示できる。シーケンシングにおいては、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、ＪＡＫ１ファミリー遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Roche社のRoche NimbleGen、Agilent Technologies社のSure Select等が例示できる。
【００４０】
また、本発明ではＪＡＫファミリーの特定の一塩基置換を検出することができる方法、例えばＰＣＲ法、スマートアンプ法、アリル特異的ＰＣＲ、一塩基伸長法等を用いて行うことも可能である。
【００４１】
さらに、一塩基置換によって生じるタンパク質変異を検出する抗体を作成し、抗体によってタンパク質を検出することによっても行うことができる。
【００４２】
本発明の検査方法における、被験者から得られる試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、被験者患部からの摘出検体、生検試料等を用いることができる。
【００４３】
検出感度を考慮すると、被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料がさらに好ましい。被検部位は、原発巣に限られず、例えば、転移巣又はその疑いのある臓器を含むことができる。
【００４４】
また、侵襲性の低さの観点からは、血液を試料として用いることが好ましい。血液を試料として用いる場合には、血中の細胞に含まれるＤＮＡのみならず、血中遊離ＤＮＡを解析対象として用いることもできる。
【００４５】
本発明により、ＮＫ/Ｔリンパ腫患者において、ＪＡＫファミリーのどの遺伝子に変異が生じているかを確認して、当該患者のＮＫ/Ｔリンパ腫の治療に適切なＪＡＫ阻害剤を選択し、投与することが可能となる。
【００４６】
ＪＡＫ阻害剤としては、ＪＡＫ１/ＪＡＫ２に、より選択性が高い阻害剤であるルキソリチニブ、ＪＡＫ３に、より選択性が高い阻害剤であるトファシチニブが知られている。本発明の方法によって、患者の遺伝子変異を解析した後に、その変異に合わせて、効果的なＪＡＫ阻害剤を治療薬として選択することは、患者にとっては無駄な治療を行わず、有効な治療のみを行うこととなり、患者の身体的負担を軽減することになる。
【００４７】
ＪＡＫファミリーを標的とした、ＮＫ/Ｔリンパ腫の化学療法の標準的なレジメンはないが、他の疾患で用いられているＪＡＫ阻害剤の用法・用量等に準じて、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３に選択性の高い薬剤を用いたＮＫ/Ｔリンパ腫の治療を行うことが可能である。具体的には、ＪＡＫ１遺伝子、ＪＡＫ３遺伝子に変異が見つかった場合には夫々以下の治療を行い、その治療効果に応じて用法・用量等を適宜変更すればよい。
【００４８】
≪ＪＡＫ１遺伝子に変異が見つかった場合≫
１．ルキソリチニブ
（in vitroヒト酵素活性阻害におけるＩＣ５０  ＪＡＫ１：３．３ｎＭ、ＪＡＫ２：２．８ｎＭ、ＪＡＫ３：４２８ｎＭ、Ｔｙｋ２：１９ｎＭ）
骨髄線維症（ＥＭＡ承認時）における用法、用量。  １回５、１０、１５、２０、２５ｍｇ、１日２回から開始。経口投与。効果が不十分な場合は、５ｍｇずつ増量する。
２．トファシチニブ
（in vitroヒト酵素活性阻害におけるＩＣ５０  ＪＡＫ１：３．２ｎＭ、ＪＡＫ２：４．１ｎＭ、ＪＡＫ３：１．６ｎＭ、Ｔｙｋ２：３４ｎＭ）
関節リウマチ（本邦承認時）における用法、用量。  １回５ｍｇ、１日２回（又は１回）経口投与。ただし、Ｐｈａｓｅ２では、３、５、１０、１５ｍｇ  ＢＩＤで、効果があることが報告されている。
【００４９】
≪ＪＡＫ３遺伝子に変異が見つかった場合≫
１．トファシチニブ
（in vitroヒト酵素活性阻害におけるＩＣ５０  ＪＡＫ１：３．２ｎＭ、ＪＡＫ２：４．１ｎＭ、ＪＡＫ３：１．６ｎＭ、Ｔｙｋ２：３４ｎＭ）
関節リウマチ（本邦承認時）における用法、用量。  １回５ｍｇ、１日２回（又は１回）経口投与。ただし、Ｐｈａｓｅ２では、３、５、１０、１５ｍｇ  ＢＩＤで、効果があることが報告されている。
【００５０】
また、ＪＡＫ１阻害剤として開発され、臨床への応用が期待されている低分子化合物を用いることも可能である。低分子化合物の具体例としては、GLPG-0634（N-[5-[4-[(6-Cyano-3-pyridinyl)methoxy]phenyl][1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl] cyclopropanecarboxamide、AbbVie 社/Galapagos NV社））、GSK-2586184（GLPG0778, GlaxoSmithKline/Galapagos社）、Momelotinib （CYT387, N-(cyanomethyl)-4-(2-(4-morpholinophenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide、Gilead Sciences 社）、Baricitinib (LY3009104, INCB028050、2-[1-ethylsulfonyl-3-[4-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)pyrazol-1-yl]azetidin-3-yl]acetonitrile 、Eli Lilly & Co; Incyte社)、Peficitinib（ASP015K,  1H-Pyrrolo(2,3-b)pyridine-5-carboxamide, 4-((5-hydroxytricyclo(3.3.1.13,7)dec-2-yl)amino)-, stereoisomer、Astellas Pharma社; Janssen Biotech社）、AZD1480（(S)-5-chloro-N2-(1-(5-fluoropyrimidin-2-yl)ethyl)-N4-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)pyrimidine-2,4-diamine 、AstraZeneca社）、ZM 39923 HCl, （3-(N-Benzyl-N-isopropyl)amino-1-(naphthalen-2-yl)propan-1-one hydrochloride、Sigma Aldrich社）、INCB-47986（Incyte社）、INCB-039110（Incyte社）、INCB-016562（Incyte社）、PF-04965842（Pfizer社）、PF-06263276（Pfizer社）及び、これらの薬学的に許容される塩等を挙げることができる。
【００５１】
上記低分子化合物のうち、今後、本発明に係るＪＡＫ阻害剤の適用対象者であるか否かの判断に基づいて用いるＪＡＫ１阻害剤としては、ＪＡＫ１に対する阻害作用の特異性が高いという観点から、GLPG-0634、GSK-2586184、Baricitinib、Momelotinib、AZD1480が好ましく、GLPG-0634、GSK-2586184が特に好ましい。
【００５２】
本発明の検査方法は、病勢判定（ステージ判定等）、治療効果予測、治療効果判定及び／又は予後予測の方法として用いることができる。前記方法は、治療の開始前及び開始後（治療中及び治療終了後）を含むいずれの段階にも用いることができ、各段階において、診断及び治療を行うに際しての有益な情報を得ることができる。
【００５３】
例えば、治療開始前に対象患者より得たサンプルを検査し、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の発症原因と考えられるＪＡＫファミリー遺伝子のＤＮＡ変異の有無を定性的に、あるいは、変異の存在量を定量的に解析することにより、患者のステージ（病期）判定、治療効果の予測、及び／又は、予後予測を行うことができる。
【００５４】
例えば、変異が検出されること、又は、変異量が多いことを指標として、ステージ（病期）が進行しているという判定（病勢判定）、治療効果が低いことの予測（治療効果予測）、治療を行った場合の予後が悪いことの判定（予後予測）を行うことができる。
【００５５】
より具体的には、例えば、原発巣が鼻部である場合、骨髄試料中に変異を検出することにより、ステージ（病期）が進行していることを判定することができる。なお、予後予測には、治療を行った場合の予後予測と、治療を行わなかった場合の予後予測を、それぞれ行うことも含まれうる。したがって、これらの判定、予測は、例えば、放射線療法、化学療法等の適切な治療法の選択、治療施行の是非の判断基準とすることができる。
【００５６】
また、例えば、治療開始後に対象患者から得たサンプルを検査し、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の発症原因と考えられるＪＡＫファミリー遺伝子のＤＮＡ変異の有無を定性的に、あるいは、変異の残存量を定量的に解析することによって、行っている治療の治療効果判定や、患者の予後予測を行うことができる。
【００５７】
例えば、変異が検出されないこと、又は、変異量が少ないことを指標として、治療の奏功、及び／又は、予後が良いことを予測することができる。より具体的には、本発明に係る方法により、残存病変（微小残存病変）の有無、程度等を確認することができ、治療効果判定、予後予測を行うことができる。
【００５８】
また、ここでは、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫の検査や、治療薬の選択を中心に説明しているが、ＪＡＫファミリーのタンパク質、特に、ＪＡＫ１の変異を有するその他のがん等の疾患についても、同様に検査、治療薬の選択方法として応用することが可能である。
【００５９】
また、本発明によって、ＪＡＫ１の変異によって生じるＪＡＫ−ＳＴＡＴ系のシグナル伝達系の新たな阻害剤の開発を行うこともできる。ＪＡＫファミリーのタンパク質は、pseudokinase domainに変異が生じることによって、恒常的な活性化が生じる。本発明者らにより見出されたＪＡＫ１の６５２番目のアミノ酸も、pseudokinase domainに位置する（図１参照）。したがって、６５２番目のアミノ酸がチロシンから、アスパラギン、ヒスチジンに変異している細胞は、ＪＡＫ１が恒常的に活性化しているものと考えられる。
【００６０】
ＪＡＫタンパク質の阻害剤をスクリーニングする場合には、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫から、Ｙ６５２Ｎ、又はＹ６５２Ｈの変異が生じている細胞株を樹立したり、Ｙ６５２Ｎ、又はＹ６５２Ｈに変異しているＪＡＫ１を強制的に発現した培養細胞を作成し、これに化合物を接触させ、その増殖能、アポトーシス等を解析することにより、ＪＡＫ１の阻害剤のスクリーニング、開発することができる。
【００６１】
新たな阻害剤や治療薬の開発は、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫だけではなく、ＪＡＫファミリーが関与しているその他のがんや免疫疾患等、様々な疾患の治療に役立つことは言うまでもない。
【００６２】
ＪＡＫファミリーが関与している疾患としては、がん全般、特に、リンパ系腫瘍及び骨髄系腫瘍を含む、血液腫瘍全般が挙げられる。リンパ系腫瘍としては、例えば、成熟Ｂ細胞腫瘍、成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞腫瘍が挙げられる。その中でも、成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞腫瘍、特には、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫−鼻型が好適に挙げられる。
【００６３】
また、骨髄系腫瘍としては、例えば、骨髄増殖性腫瘍、骨髄異型性症候群等が挙げられる。その中でも、慢性骨髄性白血病、真正赤血球増加症（真正多血症）が好適に挙げられる。
【００６４】
さらに、ＪＡＫファミリーが関与している他の疾患として、自己免疫疾患／炎症性疾患が挙げられる。例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症等が挙げられる。
【実施例】
【００６５】
以下、ＪＡＫ１ファミリーのＤＮＡの解析方法等を、症例解析をもとに説明する。本解析には，２００１年７月から２０１２年１０月までに，がん研有明病院（癌研究会附属病院を含む）にて生検診断されたＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫２６例を用いた。２６例のうち１８例を用い、すでに報告されているＪＡＫ１、ＪＡＫ３遺伝子の変異であるＪＡＫ１：Ｙ６５２Ｄ，ＪＡＫ３：Ａ５７２Ｖ、ＪＡＫ３：Ａ５７３Ｖについて配列番号１〜４のプライマーを用い（ＪＡＫ１：配列番号１（フォワードプライマー）及び２（リバースプライマー）、ＪＡＫ３：配列番号３（フォワードプライマー）及び４（リバースプライマー））、Sanger法シーケンシングによる検索を行った。
【００６６】
続いて、２６例のうち１４例について，次世代シーケンサー（ＭｉＳｅｑ、イルミナ株式会社製）によって、ＪＡＫファミリー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）遺伝子全長のキャプチャーシークエンス解析を行った。
【００６７】
カスタムプローブ(SureSelect)を作製しＪＡＫファミリー遺伝子のエンリッチメントを行い、quality controlのあとＢＷＡ、samtools、ＧＡＴＫなどを用いたin-house pipeline softwareを用いて解析した。
【００６８】
さらに、次世代シーケンサーを用いて検出された変異について、Sanger法による確認も行った。検出された変異については、同一患者由来の正常骨髄由来のＤＮＡを用いて体細胞突然変異であるかの確認を行った。
【００６９】
結果を以下に示す。解析を行った１８例のうち、ＪＡＫファミリー遺伝子に変異が生じていたのは２症例、３箇所である。ＪＡＫ１、ＪＡＫ３に配列５〜７で示す３つの体細胞突然変異が同定された。他の症例ではＪＡＫファミリーに変異は認められなかった。
【００７０】
ＪＡＫ１で検出された変異は、コーディング領域（ＣＤＳ）のＤＮＡ配列１９５４番目のＴがＣ（配列番号５、症例番号ＳＲＬ３６０（図１、Sample ID 360））、あるいはＡに変わったもの（配列番号７、症例番号ＳＲＬ１５２０（図１、Sample ID 1520））であり、ＪＡＫ１タンパク質６５２番目のアミノ酸を、チロシンからそれぞれヒスチジン（Ｙ６５２Ｈ）、アスパラギン（Ｙ６５２Ｎ）に変化させるものである。これらの変異は、今までに報告されたものとは異なる新規の体細胞変異である。
【００７１】
また、これまでに見つかっているＪＡＫ１の変異は、全てＪＡＫ３の変異と重複して生じているものであり、ＪＡＫ３の変異ががん発症と密接に関連していると考えられてきた（非特許文献２）。しかしながら、今回ＪＡＫ１の変異単独でＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫が発症している例（症例番号ＳＲＬ１５２０）が見つかったことから、ＪＡＫ１単独の変異によっても、ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫が発症することが示された。
【００７２】
さらに、１症例（症例番号ＳＲＬ３６０）でＪＡＫ３の５７３番目のアミノ酸をアラニン（Ａ）からバリン（Ｖ）に変異させる、コーディング領域（ＣＤＳ）のＤＮＡ配列１７１８番目の塩基がＣからＴに変わっているものも検出された（配列番号６）。当該変異はこれまでにも報告されていたものであるが、日本人患者では、今まで見つかっておらず、遺伝的背景の違いを示すものとされていたものである。
【００７３】
なお、各遺伝子のｃＤＮＡリファレンス配列として、ＪＡＫ１はENST00000342505、ＪＡＫ３はENST0000053444を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、ＪＡＫ１はENSP00000343204、ＪＡＫ３はENSP0000436421を用いた。
【００７４】
以上、今回ＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫において検出されたＪＡＫ１の２つの変異、Ｙ６５２Ｎ、Ｙ６５２Ｈ、及びすでに報告されていたＹ６５２Ｄの変異を検出することによって、ＪＡＫ１の変異に起因するＮＫ/Ｔ細胞リンパ腫であるか否かを判断することが可能となる。
【００７５】
それにより、ＪＡＫ１阻害剤を使用するか否か、治療薬の選択にも用いることができる。また、今回検出されたＪＡＫ３の変異Ａ５７３Ｖや、すでに報告されているＡ５７２Ｖの検出を併せて行うことにより、治療薬の選択をより細かく行うことができる。
【図１】
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【配列表】
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