(57)【要約】      （修正有）【課題】安定で安価なAChEおよびその生産菌を提供する。【解決手段】Burkholderia属に属し、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）産生能を有する微生物。更に該微生物の生産するＡＣｈＥを用いて阻害候補物質のKi値を算出することを特徴とする、ＡＣｈＥ阻害剤のスクリーニング方法。該ＡＣｈＥが、受託番号FERM P-01684で特定される微生物により産生されるＡＣｈＥであるスクリーニング方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Burkholderia 属に属し、アセチルコリンエステラーゼ産生能を有する微生物。
【請求項２】
受託番号FERM P-01684で特定される、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
Burkholderia 属に属し、アセチルコリンエステラーゼを生産する生産菌。
【請求項４】
受託番号FERM P-01684で特定される、請求項３に記載の生産菌。
【請求項５】
Burkholderia 属に属する微生物が産生するアセチルコリンエステラーゼを用いて阻害候補物質のKi値を算出することを特徴とする、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
アセチルコリンエステラーゼが、受託番号FERM P-01684で特定される微生物により産生されるアセチルコリンエステラーゼである、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルコリンエステラーゼを産生する微生物およびその生産菌に関する。また、本発明は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、有機リン系およびカルバメート系の農薬や殺虫剤により阻害を受け、この阻害の強さを指標に食品や環境中の危険物質の検出に応用されている。しかし現在主に使用されているヒトやラット由来のAChEは、不安定で失活しやすく高価である上に、失活と阻害の判別が難しいという欠点を有するため、安定で安価な酵素が求められている。またAChE阻害剤は、AChE阻害に伴い神経伝達物質であるアセチルコリン(ACh)を増加させ、脳において認知機能の低下を遅延させる効果を持つことから、アルツハイマー病の治療薬として使われている。しかし現在承認されているドネペジルやガランタミンなどの治療薬は病状の進行を遅らせるのみであり、副作用も大きく、強い阻害活性と同時に、副作用の少ない新規リード化合物の探索に利用できる安定なAChEが必要とされている。
【０００３】
特許文献１は、シュードモナス・エルギノーザ由来のAChEを開示するが、この酵素は安定性に改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2011-160730
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安定で安価なAChEを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、微生物に酵素源を求め、より安定で安価なAChEを生産できる微生物のスクリーニングを行った。その結果、茨城県霞ヶ浦の土壌より、37°C培養で強い増殖を示し、無色ハロ形成によってAChE活性を有する可能性のある菌株Para-1株などを単離した。これらの菌は16S rRNA遺伝子配列によりBurkholderia 属細菌と示唆され、Ellman法等の方法を用いて、強いAChE活性を保持することを明らかにした。
【０００７】
本発明は、以下の微生物、AChE生産菌およびAChE阻害剤のスクリーニング方法を提供するものである。
項１．  Burkholderia 属に属し、アセチルコリンエステラーゼ産生能を有する微生物。
項２．  受託番号FERM P-01684で特定される、項１に記載の微生物。
項３．  Burkholderia 属に属し、アセチルコリンエステラーゼを生産する生産菌。
項４．  受託番号FERM P-01684で特定される、項３に記載の生産菌。
項５．  Burkholderia 属に属する微生物が産生するアセチルコリンエステラーゼを用いて阻害候補物質のKi値を算出することを特徴とする、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
項６．  アセチルコリンエステラーゼが、受託番号FERM P-01684で特定される微生物により産生されるアセチルコリンエステラーゼである、項５に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、Burkholderia 属細菌が生産する安定で安価なAChEを得ることができ、これを用いてAChE阻害剤をスクリーニングすることができる。また、Ellman法等を用いてAChE活性を測定することによって、簡便かつ迅速に危険な有機リン系農薬の検出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】61-2-2株のハロ形成の結果を示す。
【図２】カルバリル(NAC)又はプロポクサー(PHC)を用いたLineweaver-Burk plot37°Cで部分精製サンプルと各阻害剤を5 minインキュベートし、その後ATCを添加して活性を測定した。両逆数プロットを作成し、交点の位置から阻害形式を決定した。阻害定数は、非競合阻害の場合Ki = kcatapp [I]/(kcat-kcatapp)より算出した([I]: 阻害剤の濃度、kcat: 阻害剤なしの時の回転数、kcatapp: 阻害剤ありの時の回転数)。
【図３】メタミドホスを用いたLineweaver-Burk plot
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、AChEを生産する微生物は、Burkholderia 属に属する微生物である。特に好ましい微生物は、Burkhorderia 属細菌Para-1株であり、この株は独立行政法人  製品評価技術基盤機構(NITE)バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センターに2013年8月7日に受託番号FERM P-01684として寄託している。
【００１１】
本発明の微生物が産生するAChEを用いて、AChE阻害剤をスクリーニングすることができる。阻害剤のスクリーニングは公知の方法に従い行うことができ、例えば本発明の微生物が産生するAChEと阻害剤候補物質を緩衝液と共に容器に加え、4-PDS、ATCを加えて吸光度変化を測定することにより実施することができる。
【００１２】
以下、AChEを産生する微生物の取得する方法を用いて、本発明をより詳細に説明する。
【００１３】
AChEを生産する微生物を探索するため、本発明者は、茨城県の大洗水族館、JA茨城かすみコンポストセンター、霞ヶ浦で得た計92サンプルを用いた。これらのサンプルを5 mlのACh培地 (0.5% ACh、0.1% KH2PO4、0.07% yeast extract、0.05% MgSO4、0.025% (NH4)2SO4、pH 4.0) で37°C静置培養と60°C振盪培養に分け、48時間間隔でそれぞれ5回、6回継代し、増殖を目安に37°C 培養から22サンプル、60°C培養から12サンプルを選抜した。
【００１４】
1% gellan gumを含むACh固体培地上で、AChが赤紫色に発色するAugustinsson法を用い、コロニーが持つ酵素活性でAChが分解されることにより生じる無色のハロを指標に有望株 (37°C 培養から3サンプル計12株、60°C培養から 1サンプル計3株) を選抜した。ただし有望株の37℃培養と60℃培養のサンプルに重複はなく、全て霞ヶ浦由来であった。
【００１５】
選抜した有望株について、ACh培地で本培養15時間行い、培養上清と細胞抽出液を調製し、アセチルチオコリン(ATC)を基質としたEllman法によるAChE活性測定を、培養温度に対応する反応温度で行った。その結果37°C培養の7株の細胞抽出液に有意なAChE活性がみられた。37°C培養の残り5株はカビ様で、サンプル調製が困難であったため測定が行えず、60°C培養の3株は活性がみられなかった。活性が見出された7株については別途薄層クロマトグラフィーで、細胞抽出液中のAChEによってAChからコリンに分解されていることを確認した。
【００１６】
次にこれらの7株について16S rRNAの遺伝子配列を決定し、得られた約1.4 kbpの配列を基にBLAST検索を行ったところ、全てBurkholderia 属細菌であることが示された。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００１８】
本明細書で使用する略称を以下に示す。
D.W.   脱イオン蒸留水
ACh    アセチルコリン
Ch     コリン
YE     yeast extract
ATC    アセチルチオコリン
4-PDS  4,4’-Dithiodipyridine
BSA    ウシ血清アルブミン
TEMED  N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン
CFE    無細胞抽出液
AS     硫酸アンモニウム
KPB    リン酸カリウムバッファー
【００１９】
1  試薬
使用した試薬は特に記さない限り、ナカライテスク株式会社から購入した。
1)培地用試薬
アセチルコリン、yeast extract、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4
2)Augustinsson試薬
アセチルコリン、ヒドロキシルアミン塩酸塩、塩化鉄(III)、水酸化ナトリウム
3)Ellman法試薬
アセチルチオコリン、4,4’-Dithiodipyridine[以上、和光純薬工業株式会社]、
4)電気泳動用試薬
アガロース LO3 「TAKARA」[タカラバイオ株式会社]、トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン(Tris)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、酢酸
5)染色用試薬
エチジウムブロマイド (EtBr)
6)ゲノムDNA調製用試薬
NaCl、Tris-HCl、EDTA、lysozyme、Proteinase K、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、フェノール、クロロホルム、RNase、氷冷エタノール、
7)PCR用試薬
KOD Fx DNA Polymerase、PCR buffer for KOD Fx、dNTPs [以上、東洋紡績株式会社]
8)シーケンス用キット
ABI PRISMTM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction kit、ABI PRISMTM BigDye Terminator Ver.3.1 Cycle Sequencing kit [以上、Applied Biosystems]
9)DNA実験キット・試薬
GENECLEAN II Kit [フナコシ株式会社]、QIAquick PCR Purification Kit [QIAGEN]、エタノール
【００２０】
2  機器
1)振盪培養器
Taitec personal H-10 [タイテック株式会社]
MT-622S [いわしや生物化学株式会社]
2)恒温装置
Thermo minder H-100 [タイテック株式会社]
3)オートクレーブ
SS-320、 BS-325、BLS-325 [以上、トミー精工]
4)遠心機
微量高速冷却遠心機 (MX-30)、卓上遠心機(HF-120)、高速遠心機 (RX-200) [以上、トミー精工]
5)クリーンベンチ
Hitachi Clean Bench PCV [日立工機株式会社]
6)電気泳動装置
Mupid-2X [タカラバイオ株式会社]
7)pHメーター
pH METER M-8E、pH METER F-51 [以上、株式会社堀場製作所]
8)天秤
Sartorius 電子分析天秤 1801 MP8、Sartorius 電子上皿天秤 L310 [以上、カールツァイス株式会社]
ポータブル天びんTE153S [ザルトリウス・メカトロニクスジャパン株式会社]
9)バイブレーター
VORTEX-GENIE TM-2 [エムエス機器株式会社]
10)マグネチックスターラー
HOT STIRRER S-700H [株式会社井内盛栄堂]
11)オートピペット
Pipetman P2、P20、P200、P1000 [以上、Gilson]
12)UVイルミネーター
DIGITAL IMAGE STOCKER DS-100 [東洋紡績株式会社]
島津ディジタルダブルビーム分光光度計  UV-210A [島津製作所]
13)シーケンサー
ABI PRISM 310 Genetic Analyzer [Perkin Elmer Applied Biosystems]
Genome Analyzer IIx (GA IIx) [北海道システムサイエンス株式会社]
14)サーマルサイクラ−
サーマルサイクラ− (PC-818A) [株式会社アステック]
15) 乾熱滅菌装置
DK-810 [ヤマト科学]
16)コンピューター、ソフトウェア
GENETYX-MAC Version 10 [ソフトウェア開発株式会社]
velvet_1.0.12 [http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/]
BLAST [http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]
【００２１】
3  バッファーおよび溶液
1)DNA実験用
特記しない限り特級試薬を用い、溶液は蒸留水（D.W.）とした。
【００２２】
【表１】
2015039318.tif 000002
【００２３】
【表２】
2015039318.tif 000003
【００２４】
4  培地
特記しない限り特級試薬を用いた。pH調整は、HCl溶液で行った。固体培地の場合は以下の組成に加え、1% gellan gumを加えて固化した。
【００２５】
【表３】
2015039318.tif 000004
【００２６】
5  オリゴヌクレオチドプライマー
16S rRNA配列の確認のためのPCRに用いたプライマーの配列を以下に示した。合成は北海道システムサイエンス株式会社に依頼した。
【００２７】
【表４】
2015039318.tif 000005
【００２８】
実験方法
1  滅菌処理
培地、試薬、チップ、マイクロチューブ、遠心管等は、121°C、1.2 kgf/cm2で20 minオートクレーブした。
【００２９】
2  アセチルコリン(ACh)安定性測定
50 mlのACh液体培地を、121°C、1.2 kgf/cm2で20 minオートクレーブし、その後37°C、60°Cの恒温槽にそれぞれ1〜5日入れておいた。1〜5日後の培地を10 μl 取り、50 mMリン酸バッファーで１mlとし100倍希釈した。その後2 mlのアルカリヒドロキシルアミン溶液を加え、1分間静置した。1 mlのHClを反応停止剤として、1 mlの塩化鉄 (III) 溶液を発色試薬として加え、540 nmの吸光度を測定し、ACh量を算出した(Scheme 1)。
【００３０】
【化１】
2015039318.tif 000006
【００３１】
3  スクリーニング
茨城県にサンプリングに行き、大洗水族館40サンプル、JA茨城かすみコンポストセンターで13サンプル、霞ヶ浦で39サンプル採取し、表５に示した。5 mlのACh液体培地で37°C静置培養(1%植菌、48時間間隔で継代)を5回行い、強い増殖を示すサンプルを選抜した。次に選抜したサンプルの培養液を0.85% (w/v) NaClで200倍、4万倍、800万倍に希釈し、ACh固体培地に100 μl塗布後、37°Cで48時間培養を行った。その後AChと反応して赤紫色を発色するAugustinsson試薬(Sceme 1)をまき、無色ハロの形成を確認した。同様に60°C振盪培養(1%植菌、48時間間隔で継代)を6回行い、サンプルを選抜し、無色のハロ形成を確認した。
【００３２】
【表５】
2015039318.tif 000007
【００３３】
4  酵素サンプル調製
前培養として5 ml ACh液体培地を含む試験管で37°C、24時間振盪培養し、その後本培養として1%植菌を行い37°C、15時間振盪培養した。遠心分離 (1,500 g、10min、4°C) して得られた上清を培養上清とし、生じた沈殿を1 mlの0.85% (w/v) NaClに懸濁し、遠心分離 (17,800 g、5 min、4°C) し上清を廃棄した。さらに沈殿を50 mMリン酸バッファー(pH7.0) に懸濁し、超音波破砕 (5 min) を行った。遠心分離 (17,800 g、5 min、4°C) し、その上清を細胞抽出液とした。
【００３４】
5  Ellman法
ディジタルダブルビーム分光光度計にキュベットを2つセットし、ブランク用キュベットにはD.W.を1 ml入れた。試料用のキュベットに50 mMリン酸バッファー (pH7.0) 、0.1 mM 4-PDS、3 mM ATChをTotal 990 μl (細胞抽出液測定時) あるいは900 μl (培養上清測定時) となるように順次加え、混合液が36.5°Cとなった時点で酵素サンプル (細胞抽出液10 μlあるいは培養上清100 μl) を加えてTotal 1 mlとした後マドラーで混合し、3分間吸光度の増加を測定した(Scheme 2)。
【００３５】
【化２】
2015039318.tif 000008
【００３６】
6  16S rRNA全塩基配列決定
6-1  ゲノムDNA調製
ゲノムDNAを抽出するため、Burkholderia.sp株を5 ml ACh液体培地で本培養7時間37°C振盪培養し、遠心分離 (1,500 g、10 min、4°C) で菌体を回収した。上清を捨て、1 mlの0.85% (w/v) NaClに懸濁し、遠心分離 (17,800 g、5 min、4°C) し上清を捨てた。さらに0.35 mg lysozymeを溶解した350 μl Lysis buffer (20% (w/v) sucrose、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH8.0) で懸濁し、1.25 mg lysozymeを加えて20分間氷冷した。100 μg Proteinase K、10% SDSを50 μl加え、37°Cで30分間インキュベートした。等体積のフェノール/クロロホルム (1:1) を加えて穏やかに攪拌し、遠心分離 (17,800 g、5 min、4°C)して上清を回収した。この操作は2回繰り返し、その後上清を回収した。
【００３７】
6-2  アガロースゲル電気泳動
アガロース濃度は0.8%とした。泳動は100 Vで行った。アガロースはTAEバッファーに溶解させ、泳動バッファーにTAEバッファーを用いた。
【００３８】
6-3  PCR
以下の条件でPCR反応を行い、QIA quick PCR Purification Kitを用いてPCR増幅産物を精製した。
【００３９】
PCR反応系                                            反応サイクル
D.W.            50                                  95°C       10 sec
×2 buffer       25                                  55°C       30 sec    ×30
dNTPs          10                                  68°C       1 min
primer        各 1.5 
template        10 
KOD Fx          0.5            
total volume     50 μl
※アニーリング温度、伸長反応時間は必要に応じて変更した。
【００４０】
6-4  DNAシークエンス
この操作はABI PRISMTMBigDye Terminator Yer.3 Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems Division) の説明書に従って行った。
【００４１】
Reaction Mixture                                      反応サイクル
96℃       30 sec
Pre-mix             1 μl                             50℃       15 sec    ×30
buffer               1.5μl                           60℃        2 min
primer              5 pmol
template      200-500 ng           
total volume (D.W.)  10 μl
【００４２】
10 μlのD.W.を入れた1.5 ml tubeに溶液を移した。続いて64 μl 96% EtOH、16 μl D.W.を加え、2 sec voltexし、15分間静置した。遠心分離 (17,800 g、20 min) して上清を除去し、250 μl 70% EtOHを125 μlずつ壁を洗いながら加え、軽く攪拌した。もう一度同じ条件で遠心分離し、上清除去後、ドライアップした。20 μlのT.S.R.を加え2 sec voltexした後、95℃で2分間加熱して氷冷し、sequence tubeへと溶液を移してABI 310 Analyzerへかけた。GENETYX-Macを用いて配列の確認を行った。
【００４３】
7  顕微鏡観察
5 mlのACh液体培地で37°C 24時間振盪培養したものから培養液1 μlをとり、プレパラートを作製した。400倍で菌を確認し、潤滑油を塗布後1000倍で顕微鏡観察を行い、写真撮影した。
【００４４】
8  増殖曲線とAChE活性
5 mlのACh液体培地で0〜24時間37°Cで振盪培養を行い、OD610を測定した。サンプル調製後、Ellman法によるAChE活性測定を行い、OD610との関係性を調べた。
【００４５】
実施例１
1  スクリーニング
1-1  サンプル選抜
表５に示した計150サンプルについてそれぞれ37°C (静置、48時間間隔で5回継代)、60°C (振とう、48時間間隔で6回継代) で培養を行い、特に強い増殖を指標に37°Cにおいて22サンプル、60°Cで12サンプル選抜した。
【００４６】
選抜した37°C、60°C培養サンプルは全て霞ヶ浦由来であった。
【００４７】
1-2  Augustinsson法によるハロ形成確認
37°C培養22サンプル、60°C培養12サンプルを、それぞれ1% gellam gumを含んだACh固体培地に植菌し、それぞれに対応した温度で48時間培養後Augustinsson法を用いて、コロニー周辺に1 mm程度の無色ハロを確認することにより有望株 (37°C 培養から3サンプル計12株、60°C培養から1サンプル3株) を選抜した。ただしこれら有望株の37℃培養と60℃培養のサンプルに重複はなかった。
【００４８】
しかしFig. 1 (a), (b) で見られるように、Augustinsson法で固体培地が均一に染まらず、無色ハロと染色のムラの判別が難しかった。その原因として、試薬を添加したとき接触した部分から優先的に染まったので、試薬の固体培地に対する浸透力が高かった可能性があげられる。
【００４９】
表６の結果からこれらの株は無色のハロを形成することから細胞外酵素としてAChEを生産していると推測された。
【００５０】
【表６】
2015039318.tif 000009
【００５１】
明確に無色のハロを形成しているものは○、ハロ形成か染色の度合いか判らないものを△とした。
【００５２】
ACh存在下で赤紫色に発色するAugustinsson法を用い、37°Cで48時間菌を培養したACh固体培地上で無色のハロ形成を確認した。
【００５３】
1-3  Ellman法によるAChE活性測定
37°C培養12株 (表6) について、培養上清と細胞抽出液にサンプル調製を行い、AChE活性測定を試みた。そのうち5株 (83-1-2を除く83-1-1から83-2-3) はカビ様の形態をもち、液体培養後のサンプル調製が困難であったため、7株のみ活性測定を行った。
【００５４】
37°CでAChE活性測定を行った7株について、全てにAChE活性が見られた (表7)。ただし活性を1分間1 ml-cultureあたりの吸光度変化 (△A324) とした。その中で61-2-2がもっとも活性が高く、次いで72-2-1、83-1-2の順に活性が高かった。また培養上清と細胞抽出液の活性を比較すると、細胞抽出液の活性が培養上清より102~103倍程度高かった (表7)。
【００５５】
この結果と無色なハロがコロニー周辺1mm程度で小さかったこと、Arthrobacter ilicisや、後述でBurkhorderia属と示唆されたこれらの7株と近縁属であるPseudomonas aerginosaがAChEを細胞内酵素として生産していることから、この選抜した株が生産する酵素は主に細胞内に存在すると推測された。
【００５６】
基質なし、あるいは4-PDSなしの条件下で活性測定を行ったところ、吸光度変化が生じず、酵素反応により吸光度変化が生じていることが示唆された。
【００５７】
【表７】
2015039318.tif 000010
【００５８】
培養上清は酵素量100μl、細胞抽出液は酵素量10 μlで測定。3 mM ATC、0.1 mM 4-PDS、チャートスピード3.0 cm/min、反応時間3分間で測定を行った。
【００５９】
以降の実験では61-2-2株を中心に、実験を行った。
【００６０】
1-5  16S rRNA分析による微生物の推定
最も強いAChE活性がみられた61-2-2株について、16S rRNA用プライマー (Eubacc27または1492R) を用いて、PCR productを得た。各々のPCR product についてDNAシーケンスによって、約1.4 kbpの遺伝子配列を決定し、BLAST検索を行ったところBurkholderia cepacia、Burkholderia vietnamiensis、Burkholderia multivoransの3種と近縁であった。さらに、これら3種の基準株と61-2-2株との配列相同性を評価したところ、Burkholderia vietnamiensisに最も近縁であるBurkholderia属細菌と推定された(表8)。
【００６１】
【表８】
2015039318.tif 000011
【００６２】
61-2-2株の16S rRNA遺伝子配列とB.cepacia ATCC 25416Tの配列1313 bp, B.vietnamiensis JCM 10562Tの配列1313 bp, B.multivorans ATCC 17616Tの1479 bp基準株の配列との相同性をそれぞれ算出した。
【００６３】
1-6 顕微鏡観察
顕微鏡観察の結果、AChE活性のあった37°C培養7株は運動性がある桿菌であることが分かった。また縦0.2 ~ 2.0 μm横0.3 ~ 0.8 μm程度で、特徴はBurkhorderia vietnamiensisの特徴と一致した(MONIQUE GILLIS, et al. (1995) Int. J. Syst. Bacteriol. Apr. : 274-289)。
【００６４】
実施例２
1 無細胞抽出液（CFE）調製
前培養として基本培地(pH 7)を含む試験管で37°C、24 h振盪培養し、その後本培養としてBurkhorderia 属細菌Para-1株（61-2-2株）1%植菌を行い37°Cで振盪培養した。スモールスケールでの本培養の場合、遠心分離（1,500 g、10 min、4°C）で生じた沈殿を1 mlの0.85% (w/v) NaClに懸濁し、遠心分離（17,800 g、5 min、4°C）し上清を除去した。さらに沈殿を50 mMリン酸カリウムバッファー（pH 7.0）に懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離（17,800 g、5 min、4°C）し、その上清をCFEとした。
【００６５】
フラスコ培養での本培養の場合、遠心分離（5,800 g、10 min、4°C）して沈殿を0.85% (w/v) NaClで懸濁して再び遠心分離（5,800 g、10 min、4°C）し、上清を除いた。得られた沈殿を50 mM リン酸カリウムバッファー（pH 7.0）で懸濁し、超音波破砕した後、上清を遠心分離（10,000 g、10 min、4°C）で回収した。
【００６６】
2 AChE活性の測定（Ellman法）
AChE活性の測定は、実験方法5に従って行った。
【００６７】
有機リン系（メタミドホス）・カルバメート系阻害剤（カルバリル、プロポクサー）を用いた阻害試験の場合は、試料用のキュベットに50 mMリン酸カリウムバッファー (pH 7.0)、酵素サンプル、阻害剤溶液を加え、37°Cで5 minインキュベートした(各阻害剤はDMSOに溶解し、反応液内のDMSO濃度は2% (v/v)である)。5分後、0.04 mM 4-PDS、ATCを加えて3分間吸光度の変化を測定した。0 mM阻害剤の場合は2% DMSOを酵素サンプルとインキュベートした。種々の阻害剤濃度でLineweaver-Burk plotを作成し、阻害形式及びKi値を算出した。
【００６８】
3 有機リン系及びカルバメート系阻害剤の阻害試験
Burkhorderia 属細菌Para-1株（61-2-2株）の無細胞抽出液をSephacryl S-300カラムにより精製したAChEサンプルを用いて、有機リン系農薬のメタミドホス、カルバメート系試薬のカルバリルとプロポクサーで阻害実験を行い、Ki値を求めた。結果を以下および図２，３に示す。
メタミドホス Ki = 0.063 mM
カルバリル Ki = 0.51 mM
プロポクサー Ki = 0.31 mM
【００６９】
これらのKi値から、この濃度までの阻害剤に対して、阻害性を調べることで濃度測定の範囲として期待されることが判った。
【００７０】
結論
本発明者はAChE生産菌のスクリーニングを行い、茨城県霞ヶ浦の土壌より、37°C培養で強い増殖を示し、無色ハロ形成によってAChE活性を有する可能性のある菌株Para-1株を単離した。この菌は16S rRNA遺伝子配列によりBurkholderia 属細菌と示唆され、Ellman法等の複数の方法を用いて、強いAChE活性を保持することを結論づけた。Burkholderia 属細菌が生産するAChE阻害活性を測定することによって、簡便かつ迅速に危険な有機リン系農薬の検出が可能になり、新規毒性指標として応用が考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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