(57)【要約】【課題】本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。【選択図】図１１
2015167506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
糖鎖が付加された、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
請求項５または６に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項５または６に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項９】
請求項５または６に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の従来の例としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、血糖センサ用酵素として古くから利用されているが、その理由は、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有しているからである。
【０００３】
グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいて、グルコースの測定は、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることによってなされる。しかし、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため、溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用酵素として用いられている。
【０００５】
これらは、溶存酸素の影響を受けない点で有利である。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であり測定が煩雑であるといった欠点がある。また、ＰＱＱＧＤＨは基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の信頼性に乏しいという欠点がある。
【０００６】
このような欠点が解消された酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。ＦＡＤＧＤＨは、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているという利点を有している。
【０００７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のＦＡＤＧＤＨについては、例えば、特許文献１（国際公開第２００４／０５８９５８号）、特許文献２（国際公開第２００６／１０１２３９号）、特許文献３（特開２００８−１７８３８０号公報）、特許文献４（特開２００８−１５４５７３号公報）、特許文献５（特開２００８−１５４５７４号公報）、特許文献６（特開２０１０−１９３９１３号公報）、特許文献７（国際公開第２００８／００１９０３号）、特許文献８（特開２０１１−５５８３６号公報）、特許文献９（特開２０１１−２１７７５５号公報）に開示されている。
【０００８】
酵素等を含むグルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合があり、グルコースセンサ用試薬等の保管時の環境温度が高温になる場合も考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は熱安定性が高いことが望ましい。
【０００９】
上述のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、野生株から培養・精製して得られたものである場合は、ある程度の熱安定性を有している。しかし、大量生産に最も適している遺伝子組換え大腸菌での発現によって製造されたＦＡＤＧＤＨは、野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨと比べて、熱安定性が大きく劣ることが分かっている（特許文献１０：国際公開第２００９／１１９７２８号）。なお、このように熱安定性が低下するのは、遺伝子組換え大腸菌によって生産された酵素には、表面に糖鎖が付加されていないためであると考えられている。
【００１０】
このような遺伝子組換え大腸菌での発現によって製造されたＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、例えば、遺伝子レベルでアミノ酸配列を改変する方法が検討されている（特許文献１０）。ここでは、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えＦＡＤＧＤＨを発現させた場合に、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性（５０℃で１５分間加熱処理した場合のＧＤＨ活性の安定性）を有するＦＡＤＧＤＨが得られることを開示している。しかし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを部分的に改変したものであるため、野生株のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨよりも、さらに熱安定性に優れ、より過酷な条件でも失活し難い特性を有するＦＡＤＧＤＨを得ることは容易でないと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８９５８号
【特許文献２】国際公開第２００６／１０１２３９号
【特許文献３】特開２００８−１７８３８０号公報
【特許文献４】特開２００８−１５４５７３号公報
【特許文献５】特開２００８−１５４５７４号公報
【特許文献６】特開２０１０−１９３９１３号公報
【特許文献７】国際公開第２００８／００１９０３号
【特許文献８】特開２０１１−５５８３６号公報
【特許文献９】特開２０１１−２１７７５５号公報
【特許文献１０】国際公開第２００９／１１９７２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
【００１４】
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質にも関する。
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
なお、このタンパク質もＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来であることが好ましい。
【００１５】
また、上記のタンパク質は、糖鎖付加されたタンパク質であることが好ましい。
また、本発明は、上記のタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
【００１６】
また、本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子にも関する。
【００１７】
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
また、本発明は、上記の遺伝子を含む組換えベクターにも関する。
また、本発明は、上記の遺伝子を含む形質転換体にも関する。
【００１９】
また、本発明は、上記の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法にも関する。
【００２０】
また、本発明は、上記の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法にも関する。
【００２１】
また、本発明は、上記のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬にも関する。
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたグルコースセンサにも関する。
【００２２】
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法にも関する。
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたバイオ燃料電池にも関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明においては、好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質（酵素）を見出したことにより、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することができる。また、このようなグルコース測定用酵素を用いることにより、グルコース濃度測定試薬やグルコースセンサ作製時や輸送時の酵素の熱失活が低減され、該酵素の使用量低減や測定精度の向上が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１でのＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）の縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２】Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図３】図２に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図４】Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図５】図４に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図６】Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列、および、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列の各々から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
【図７】実施例４において、実施例２（大腸菌発現）のＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図８】実施例４において、実施例３（酵母発現）のＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図９】実施例５において、実施例２（大腸菌発現）のＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１０】実施例５において、実施例３（酵母発現）のＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１１】実施例６の「温度安定性」評価におけるＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）の残活性率を示すグラフである。
【図１２】Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓについての「温度安定性」評価における残活性率を示すグラフである 。
【図１３】実施例６の「温度依存性」評価におけるＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）の相対活性を示すグラフである。
【図１４】実施例６の「ｐＨ安定性」評価におけるＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）の残活性率を示すグラフである。
【図１５】実施例６の「ｐＨ依存性」評価におけるＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）の相対活性を示すグラフである。
【図１６】実施例６の「固定化酵素電極での応答性」評価におけるＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）についての電流値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（実施形態１）
本実施形態の発明は、好熱性糸状菌であるＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）由来のタンパク質であって、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質（酵素）である。
【００２６】
これまで、好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質は知られておらず、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上する方策としての、好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質の探索も行われていなかった。また、好熱性糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を探索するのは、ＦＡＤＧＤＨの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。
【００２７】
本発明者らは、好熱性糸状菌のゲノムＤＮＡを独自の手法で調べることにより、いくつかの好熱性糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生していることを見出した。すなわち、ＦＡＤＧＤＨを産生することが知られている常温性糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、好熱性糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、そのＰＣＲ産物を分析することにより、好熱性糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。
【００２８】
常温性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、ＹＤＹＩＶＶＧＧＧＴＳＧＬ、ＱＶＬＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴＩＮＧＭＡＹＴＲＡＥＤＶＱＩＤ、ＲＳＮＦＨＰＶＧＴＡＡＭＭ、または、ＮＶＲＶＶＤＡＳＶＬＰＦＱＶＣＧＨＬＶＳＴＬＹＡＶＡＥＲＡである。
【００２９】
縮重ＰＣＲ用のプライマーは、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーを用いることが好ましい。
【００３０】
このような好ましいプライマーのうち、センスプライマーの塩基配列としては、
（Ａ）  ５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＫＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’（配列番号５）、
（Ｂ）  ５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号６）、
（Ｃ）  ５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号７）
が挙げられる。
【００３１】
アンチセンスプライマーの塩基配列としては、
（Ｄ）  ５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’（配列番号８）、
（Ｅ）  ５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’（配列番号９）
が挙げられる。
【００３２】
本発明のタンパク質（酵素）は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。ただし、本発明のＦＡＤＧＤＨ活性を有する組換えタンパク質は、意外にも、表面に糖鎖が付加されている場合（例えば、組換え酵母や好熱性糸状菌の野生株が産生したＦＡＤＧＤＨ）だけでなく、表面に糖鎖が付加されていない場合（例えば、組換え大腸菌によりＦＡＤＧＤＨを製造した場合）でも、従来と比べれば比較的優れた熱安定性を有する傾向を有している。このため、実用的に問題のない熱安定性を有するものが得られる限り、組換え大腸菌により糖鎖が付加されていない組換えＦＡＤＧＤＨを製造してもよく、この場合、製造効率の面では非常に有利であり、大幅な製造コストの削減が可能である。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のＦＡＤＧＤＨ活性を測定し、その熱処理前のＦＡＤＧＤＨ活性値に対する比率を求めることにより判断される。ＦＡＤＧＤＨ活性は、種々公知の方法で測定することができる。
【００３３】
（実施形態２）
本実施形態の発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質である。
【００３４】
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００３５】
配列番号１は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。配列番号２は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓは好熱性糸状菌である。
【００３６】
シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、一旦は合成されるが、最終的にはその役割を終えたのち切除される。
【００３７】
なお、本実施形態のタンパク質も、好熱性糸状菌由来のタンパク質であることが好ましい。
【００３８】
（実施形態３）
本実施形態の発明は、上記実施形態１または２のタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【００３９】
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４０】
配列番号３は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列および終止コドンも含んでいる。配列番号４は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列および終止コドンも含んでいる。
【００４１】
「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエキソンとし、そのエキソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。
【００４２】
また、本実施形態の遺伝子には、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
【００４３】
ここで、ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、ハイブリダイズの条件としては、「０．０２％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中で４０〜７０℃」の条件が挙げられる。なお、ストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。ハイブリダイズ後の洗浄条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温（２５℃）」の条件が挙げられる。ストリンジェントな条件では、配列番号３または４に示す塩基配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることが好ましい。
【００４４】
本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１または２のタンパク質をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。
【００４５】
（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態３の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態３の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。
【００４６】
（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態３の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、大腸菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、好ましくは大腸菌、酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物である。生産効率の点からは大腸菌を用いることが好ましい。大腸菌としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００などが使用できる。また、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅが使用できる。
【００４７】
本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態４の組換えベクターで形質転換された大腸菌または酵母が挙げられる。
【００４８】
（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態３の遺伝子を用いた好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態５の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。
【００４９】
好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態３の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主に導入される。宿主については、上記実施形態５で説明した宿主と同様である。なお、大腸菌でＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を生産する場合、上記遺伝子のＮ末端にあるシグナルペプチドを残したままでは十分な生産能が得られないことがあるため、シグナルペプチド（ゲノム情報からシグナルペプチドと推定されるアミノ酸配列）を削除した上記遺伝子を大腸菌に導入することが好ましい。
【００５０】
宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績）を用いても良い。宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。
【００５１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００５２】
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５３】
培地温度は菌が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌の場合、好ましくは２０〜４２℃程度であり、酵母の場合、好ましくは２０〜３５℃程度である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６〜７２時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度である。
【００５４】
培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが菌体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５５】
このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤或やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。
【００５６】
好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態３の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によって好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。
【００５７】
（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１または２のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。
【００５８】
グルコース濃度測定試薬は、実施形態６の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。
【００５９】
グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。
【００６０】
固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。
【００６１】
（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１または２のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００６２】
恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００６３】
（実施形態９）
本実施形態の発明は、実施形態１または２のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６５】
（実施例１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入した好熱性糸状菌であるＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）〔Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＮＢＲＣ６７６６）〕およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）〔Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＮＢＲＣ９７４８）〕を、ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または麦芽エキス培地（２％麦芽エキス、２％グルコース、０．１％ペプトン）を用いて好気的に培養した。培養後の好熱性糸状菌からＷｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６６】
既報のアスペルギルス属糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目して、本発明者らが独自に設計した後述のプライマーを用いて、好熱性糸状菌（Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なった。
【００６７】
縮重ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’）、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’）
のいずれかを用いた。
【００６８】
アンチセンスプライマーとしては、
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’）、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’）のいずれかを用いた。
【００６９】
なお、上記プライマーＡ〜Ｅは配列中にミックス塩基（Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ）を含んでいるが、プライマーＡ〜Ｅの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。
【００７０】
上記の好熱性糸状菌から得たゲノムＤＮＡを鋳型として、上記３種のセンスプライマーと２種のアンチセンスプライマーとの組み合わせによる６通りの縮重ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１．２％アガロースゲル）に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりＰＣＲ産物の存在を確認した。
【００７１】
その結果、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）の２種の好熱性糸状菌のゲノムを鋳型として得られたＰＣＲ産物について、約１．８ｋｂのＤＮＡバンドが検出された（図１（ａ）および（ｂ）の＊印）。なお、図１において、レーンＭはマーカー（Ｇｅｎｅ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｗｉｄｅ  １（０．１−２０ｋｂ）：Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）であり、レーン１はプライマーＡとＤの組合せを用いた場合、レーン２はプライマーＡとＥの組合せを用いた場合、レーン３はプライマーＢとＤの組合せを用いた場合、レーン４はプライマーＢとＥの組合せを用いた場合、レーン５はプライマーＣとＤの組合せを用いた場合、レーン６はプライマーＣとＥの組合せを用いた場合を示している。
【００７２】
縮重ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した後に、大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）にサブクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）のゲノムにＦＡＤＧＤＨ遺伝子が存在することが示唆された。
【００７３】
なお、上記プライマーＡ〜Ｅ以外のいくつかのプライマーを用いた場合は、アスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅は確認できなかった。
【００７４】
（実施例２）
本実施例では、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８））由来ＦＡＤＧＤＨを大腸菌を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【００７５】
（１）Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓからのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０  Ｘ  ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて検出した。
【００７６】
その結果、ＳａｃIのレーンから約４．０ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約４．０ｋＢのＳａｃＩ断片が、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。
【００７７】
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と、終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。
【００７８】
ＳａｃＩで切断したＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約４．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（宝酒造）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの鋳型とした。Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー６７６６_９７４８ＧＳＰ２（５’−ＧＧＡＴＴＧＴＡＣＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣ−３’）、および、プライマー６７６６_９７４８ＧＳＰ３（５’−ＴＧＡＡＣＧＣＧＡＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＴＴＣＣ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行なった結果、約３．０ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。
【００７９】
このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功したことが分かった。
【００８０】
次に、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー６７６６_９７４８ＧＳＰ７（５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＴＡＣＧＧＡＡＧＣＴ−３’）と６７６６_９７４８ＧＳＰ８（５’−ＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＴＧ−３’）を用いてＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。
【００８１】
その結果、単一の約２．６ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることが分かった。
【００８２】
（２）Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図２に示す。また、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図４に示す。
【００８３】
スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、これらの塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、４つのエキソン（エキソン１；３５５ｂｐ、エキソン２；６１９ｂｐ、エキソン３；６２０ｂｐ、エキソン４；２１５ｂｐ）から構成される１８０９ｂｐのＯＲＦ（６０３アミノ酸をコード）を含んでいた(図２の下線部および図３参照）。また、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、４つのエキソン（エキソン１；３５５ｂｐ、エキソン２；６１９ｂｐ、エキソン３；６２０ｂｐ、エキソン４；２１５ｂｐ）から構成される１８０９ｂｐのＯＲＦ（６０３アミノ酸をコード）を含んでいた(図４の下線部および図５参照）。
【００８４】
図６に、このようにして特定されたＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来のＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。なお、図６では、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来の遺伝子から類推されるアミノ酸配列（上段）と、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来の遺伝子から類推されるアミノ酸配列（下段）とを併記している。
【００８５】
図６に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１６番目のアラニン（Ａｌａ１６）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図６に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨを大腸菌および酵母で発現させる際には、このシグナルペプチドを含まないＤＮＡ配列で発現ベクターを構築した。
【００８６】
さらに、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８））由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（図６）を、他の好熱性糸状菌（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来ＦＡＤＧＤＨと比較した。表１に、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と他の糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨとのアミノ酸配列の相同性を示す。
【００８７】
【表１】
2015167506.tif 000003
【００８８】
表１に示すように、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と他の好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨとのアミノ酸配列の相同性は５７．０〜６６．１％であった。このことから、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来でない他の好熱性糸状菌は、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのような極めて高い耐熱性（実施例６参照）は有していないことから、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の相同性を有するタンパク質であれば、高い耐熱性を有する可能性が高いと考えられる。
【００８９】
（３）Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ〔Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）〕由来のＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより合成した。
【００９０】
まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６７６６_９７４８Ｅ１Ｓ（５’−ＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＣＡＧＴ−３’）と６７６６_９７４８Ｅ１Ａ（５’−ＧＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＧ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６７６６_９７４８Ｅ２Ｓ（５’−ＧＡＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧＣＴＣＧＣＧＣＧＧＡ−３’）と６７６６_９７４８Ｅ２Ａ（５’−ＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６７６６_９７４８Ｅ３Ｓ（５−ＡＡＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＴＣ−３）と６７６６_９７４８Ｅ３Ａ（５’−ＧＡＧＣＧＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣ−３）を用いた。エキソン４のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６７６６_９７４８Ｅ４Ｓ（５’−ＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴ−３’）と６７６６_９７４８Ｅ４Ａ（５’−ＡＧＧＴＴＡＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’）を用いた。なお、これらのプライマーは、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）に共通である。
【００９１】
増幅したエキソン１とエキソン２をＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、また同時にエキソン３とエキソン４もＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結した。Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ  により合成した両ＤＮＡ断片を再度Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。
【００９２】
次に、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、発現型プラスミド作製用プライマー６７６６_９７４８Ｅｓｃ１（５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴ−３’）および６７６６_９７４８Ｅｓｃ２（５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。
【００９３】
増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを作製した。
【００９４】
（４）Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の大腸菌における発現と組換え酵素の精製
Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ〔Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）〕由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。発現型プラスミドを保有するＢＬＲ（ＤＥ３）をＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）で一晩培養した（前培養）。本培養用ＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に前培養液を１％植菌し、４時間ほど３７℃で好気的に培養した。その後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１％となるように添加し、２５℃で約２０時間培養を続けた。
【００９５】
培養後の大腸菌を集菌し、ＰＢＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．５ｍＭ  リン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４）に懸濁することにより菌体を洗浄した。遠心分離により、再度集菌した菌体をＰＢＳ緩衝液に懸濁した。ＰＢＳ緩衝液に懸濁した菌体は超音波により破砕した。超音波破砕後の破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間、４℃）することにより上清（全菌体画分）と沈殿（未破砕菌体）に分離した。全菌体画分をさらに遠心分離（１２０００ｇ、２０分間、４℃）し、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。可溶性画分をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径０．７ｃｍ、高さ１．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。
【００９６】
溶出画分を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（直径０．７ｃｍ、高さ２．５ｃｍ）に供した。カラムを２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で洗浄した後に、吸着したタンパク質を１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。
【００９７】
（実施例３）
本実施例では、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【００９８】
まず、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ〔Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）およびＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）〕由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー６７６６_９７４８Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴ−３’）および６７６６_９７４８Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。
【００９９】
Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。
【０１００】
培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行なった。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。
【０１０１】
（実施例４）
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
実施例２および３で得られた計４種のＦＡＤＧＤＨ精製標品〔大腸菌で発現し、精製されたＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液、および、酵母で発現し、精製されたＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液〕中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ；  サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。得られた濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行なった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ  １０−２０％」（アトー）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  （１０−２５０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。
【０１０３】
また、実施例３のＦＡＤＧＤＨ精製標品については、別途、染色液として、ＰＡＳ(Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｃｈｉｆｆ  ｓｔａｉｎ)染色液「Ｐｉｅｒｃｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いる以外は、同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ＰＡＳ染色液は、糖を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。
【０１０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７（実施例２の精製標品）および図８（実施例３の精製標品）に示す。なお、図８の左側がＣＢＢベースの染色液を用いた場合、図の右側がＰＡＳ染色液を用いた場合の結果である。図７および図８（左側）に示されるように、大腸菌で発現したＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、酵母で発現したＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの両者共に、電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことが分かった。また、図８（右側）に示されるように、実施例３の精製標品は、いずれも糖鎖付加されたタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）であることが分かった。
【０１０５】
（実施例５）
＜吸収スペクトル計測＞
実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品を実施例４での濃度測定値に基づいて希釈し、２ｍｇ／ｍＬの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。該ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルを、ＵＶ／可視分光光度計ＤＵ−８００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）用いて計測した。また、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液にグルコースを終濃度１５０ｍＭとなるように添加した溶液、および、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液に還元剤である亜二チオン酸ナトリウム粉末を添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図９（実施例２の精製標品）および図１０（実施例３の精製標品）に示す。
【０１０６】
図９および１０に示されるように、ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、典型的なＦＡＤ由来のピークが観察された（図９および１０の「ＦＡＤＧＤＨ」）。一方、グルコース添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、ＦＡＤに由来するピーク（３５０〜５００ｎｍの吸収ピーク）が消失した（図９および１０の「ＦＡＤＧＤＨ＋グルコース」）。亜二チオン酸ナトリウム添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでも、ＦＡＤに由来するピークは消失した（図９および１０の「ＦＡＤＧＤＨ＋亜二チオン酸ナトリウム」）。
【０１０７】
これらの結果から、大腸菌および酵母にて発現し、精製されたＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは、両者共に補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、大腸菌および酵素によって生産された本発明の好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというＦＡＤＧＤＨの利点を有している。
【０１０８】
（実施例６）
本実施例では、実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（温度安定性、温度依存性、ｐＨ安定性、ｐＨ依存性、固定化酵素電極での応答性）に関する評価試験を行った。なお、本実施例における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。
【０１０９】
［酵素活性測定原理］
Ｄ−グルコース  ＋  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ  ＋  ＦＡＤＧＤＨ
→  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋  ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＰＩＰ
→  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ  ＋  ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。
【０１１０】
［酵素活性の定義］
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。
【０１１１】
具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤTEST、ΔＯＤBLANK）から以下の式により求められる。
【０１１２】
ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤTEST−ΔＯＤBLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）
なお、式中の各定数は、
３．１  ：  ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３  ：  ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．１  ：  ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。
【０１１３】
［活性測定方法］
（１）  キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）                １．５ｍＬ
１Ｍ  グルコース溶液                                            ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ  2,6-Dichlorophenolondophenol（ＤＣＰＩＰ）        ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ  1-Methoxy-5-methylphenazium  methylsulfate（1-mPMS）  ０．０２１ｍＬ
１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００                                  ０．０６ｍＬ
Ｈ２Ｏ                                                  ０．３９９ｍＬ
（２）  ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３）  ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤTEST）を算出する。
（４）  対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤBLANK）を算出する。
【０１１４】
＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が７Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて４０℃〜７０℃の範囲の数種の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求めた。結果を図１１に示す。なお、ＥＣは大腸菌で発現したもの、ＰＰは酵母で発現したものを示す。
【０１１５】
図１１に示されるように、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは、大腸菌発現であるか酵母発現であるか（糖鎖付加の有無）に関わらず、６５℃以下では極めて高い安定性を示し、７０℃でも高い活性を保持していた。このような極めて高い温度安定性は、他の好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨと比べても明らかに顕著なものである。
【０１１６】
比較のために、他の好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの一例として、同じＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属であるＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨ(大腸菌発現および酵母発現)についての同様の温度安定性試験の結果を図１２に示す。図１２に示されるように、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨは、大腸菌発現のものでは５０℃で活性が低下し、また酵母発現のものでは６０℃で活性が低下した。なお、図１２の試験結果は、本発明者らが既に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０７４１９９の図２２（明細書の段落［０１５０］、［０１５１］）と同じデータに基づくものである。
【０１１７】
＜温度依存性＞
ここでは、酵素活性の温度依存性の評価を行った。まず、上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．０５〜０．２Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、４℃〜７０℃の範囲で酵素活性を測定し、３７℃での活性を１００（％）としたときの相対活性を求めた。結果を図１３に示す。
【０１１８】
図１３に示されるように、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは、大腸菌発現であるか酵母発現であるか（糖鎖付加の有無）に関わらず、高温域で活性が上昇し、示適温度は７０℃以上であった。このような高温での極めて高い活性は、他の好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨと比べても明らかに顕著なものである。
【０１１９】
＜ｐＨ安定性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ安定性の評価を行った。まず、実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品の各々について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて各精製標品を水で希釈することで、酵素活性が１４Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。
【０１２０】
これらのＦＡＤＧＤＨ溶液に対して、所定のｐＨに調整された０．１ＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ広域緩衝液を等量混合し、ｐＨを２．０〜１１．０の範囲で変化させた複数の酵素溶液を調製し、各酵素溶液の調製直後の酵素活性を測定した。次に、各試料溶液を２５℃で２０時間インキュベートした後に酵素活性を測定して、インキュベート前の酵素活性に対するインキュベート後の酵素活性の割合（残活性率）を求めた。結果を図１４に示す。
【０１２１】
図１４に示すように、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、大腸菌発現であるか酵母発現であるか（糖鎖付加の有無）に関わらず、ｐＨ３．０以上の広い範囲で安定であった。
【０１２２】
＜ｐＨ依存性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ依存性の評価を行った。上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．２Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。ｐＨを４．０〜９．０の範囲で変化させた複数の酵素活性測定溶液を調製し、それぞれのｐＨ条件における酵素活性を測定した。最も活性が高かったｐＨ条件における酵素活性を１００（％）とし、他の各ｐＨ条件における酵素活性の比率を相対活性として求めた。結果を図１５に示す。
【０１２３】
図１５に示すように、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６）由来ＦＡＤＧＤＨは大腸菌発現ではｐＨ６．０、酵母発現ではｐＨ６．０〜７．０が至適ｐＨであり、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（９７４８）由来ＦＡＤＧＤＨは、大腸菌発現であるか酵母発現であるか（糖鎖付加の有無）に関わらず、ｐＨ５．０が至適ｐＨであった。Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨはｐＨ４．０〜９．０の広範囲で７０％以上の相対活性を保っていることが示された。
【０１２４】
＜固定化酵素電極での応答性＞
白金電極表面に、実施例２および３で得られたＴｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（６７６６および９７４８）由来のＦＡＤＧＤＨ精製標品を東洋合成工業(株)社製のＵＶ架橋性高分子であるＢｉｏｓｕｒｆｉｎｅ−ＡＷＰ−ＭＲＨと混合したものを塗布し、自然乾燥ののちにＵＶを照射して固定化酵素電極（計２種）を作製した。この固定化酵素電極を用いて、水溶液中のグルコース濃度に対する応答性を評価した。
【０１２５】
ｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファーを溶媒とし、０．２Ｍのフェリシアン化カリウムを含む溶液とさらに０．５Ｍのグルコースを含むグルコース・フェリシアン化カリウム溶液を調整した。固定化酵素電極と対極・参照電極として９ｍｍ２の白金電極をフェリシアン化カリウム溶液に浸して０．３Ｖの電圧を印加し、目的の濃度までグルコース溶液を滴下しながら固定化酵素電極と対極との間に生じる電流値を測定し、滴下グルコース濃度に応じて生じる電流値変化をグルコース濃度に対してプロットした。そのプロットに対し、０〜３００ｍＭの範囲において、最小二乗法により回帰直線を引いた。結果を図１６に示す。ＥＣは大腸菌で発現した実施例２の精製標品、ＰＰは酵母で発現した実施例３の精製標品を示す。
【０１２６】
図１６において、それぞれＲ２（決定係数：相関係数Ｒの二乗）は０．９９６、０．９９２であり、ほぼ１であることから、非常に直線性が高いことが示された。したがって、大腸菌での発現か酵母での発現かにかかわらず、Ｔｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓＴ由来ＦＡＤＧＤＨを用いて、精度よく、さらに広い濃度域でグルコース濃度を定量できることが示唆される。
【図２】
2015167506.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
2015167506.tif 000018
【図８】
2015167506.tif 000019
【配列表】
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