(57)【要約】      （修正有）【課題】間質細胞から幹細胞を製造方法を提供する。【解決手段】培養器を回転及び/又は振動させながら、間質細胞（間葉系間質細胞）を培養する工程を含む幹細胞の製造方法であって、間質細胞の培養工程後、得られた幹細胞を分化誘導培地において培養する工程を含む、分化した細胞の製造方法。分化した細胞が肝細胞、脂肪細胞、骨細胞及び神経細胞から成る群より選択される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養器を回転及び/又は振動させながら、該培養器中の間質細胞を培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
【請求項２】
間質細胞が間葉系間質細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
間葉系間質細胞が脂肪組織由来間質細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法によって製造された幹細胞。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法における間質細胞の培養工程後、得られた幹細胞を分化誘導培地において培養する工程を含む、分化した細胞の製造方法。
【請求項６】
分化した細胞が肝細胞、脂肪細胞、骨細胞及び神経細胞から成る群より選択される、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、間質細胞からの幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の分野において、iPS細胞を始めとした幹細胞の研究が進められている。当該研究の中で、脂肪組織由来細胞等の細胞へストレスを与えることで、幹細胞を製造する方法が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１は、低酸素培養によるストレスを使用して、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含む、脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法を開示する。また、特許文献１は、得られた脂肪組織由来体性幹細胞が脂肪組織、骨組織又は神経細胞への分化能を有したことを開示する。
【０００４】
特許文献２は、無血清培地を用いた培養によるストレスを使用して、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞を、血清を含まない培地において培養することを含む、間葉系幹細胞の初代培養方法を開示する。
【０００５】
しかしながら、物理的ストレスにより、脂肪組織由来細胞等の細胞から簡便に且つ大量に幹細胞を製造する方法は従来において知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2014-30423号公報
【特許文献２】特開2012-157263号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述の実情に鑑み、物理的ストレスにより、脂肪組織由来細胞等の細胞から簡便に且つ大量に幹細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、元来、接着して増殖する脂肪組織由来間質細胞等の間質細胞を、接着できないように当該間質細胞を含有する培養器(培地)を回転(ローテーション)させるというストレス下で培養することで、幹細胞を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。
【０００９】
（１）培養器を回転及び/又は振動させながら、該培養器中の間質細胞を培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
（２）間質細胞が間葉系間質細胞である、（１）記載の方法。
（３）間葉系間質細胞が脂肪組織由来間質細胞である、（２）記載の方法。
（４）（１）〜（３）のいずれか１記載の方法によって製造された幹細胞。
（５）（１）〜（３）のいずれか１記載の方法における間質細胞の培養工程後、得られた幹細胞を分化誘導培地において培養する工程を含む、分化した細胞の製造方法。
（６）分化した細胞が肝細胞、脂肪細胞、骨細胞及び神経細胞から成る群より選択される、（５）記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る幹細胞の製造方法によれば、物理的ストレスにより幹細胞を簡便に且つ大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】顕微鏡でチェックし、且つ評価されたrota-ADSCのコロニーサイズ及び分散度を示すグラフである。コロニーをプレート上に配置すると、コロニーサイズをimageJでより確かに確認できた。
【図２】回転懸濁の48時間後(接着前、2日目)のrota-ADSC(P9→P10)を示す写真である。
【図３】培養皿への接着後24時間(3日目)のrota-ADSC(P10)を示す写真である。
【図４】rota-ADSCのコロニーサイズ分布の決定方法を示す図である。ADSC(P10)を175000細胞/mLの濃度で、且つ最終容量17mLで使用した。48時間後、rota-ADSCの画像を撮り、同じ大きさと焦点で血球計算器の画像を撮り、重なり合わせた。得られた画像を、ImageJのスケール(0.365 pixel/μm)の設定に使用した。
【図５】ImageJ(http://imagej.nih.gov/ij/)を、図４に示す画像の処理及び解析に使用し、各コロニーの数及び表面積を決定した図である。各コロニーに割り当てられた数は、生データにおける数である。
【図６】rota-ADSCのコロニーサイズ分布及び累積容量を示すグラフである。グラフ1は、rota-ADSCコロニーのサイズ分布を示す。各カラムは、直径の範囲に対するコロニーの計数(左y軸)を示す。右y軸(グラフ1)は、特定の直径範囲(x軸)における全てのコロニー容量の合計により得られる総容量を示す。総容量に使用される直径の値は、imageJによって得られた生の値ではなく、計数で乗じた「bin center」(グラフプロットから先に得られた)により得られた値である。グラフ1におけるx軸は、双方のy軸に共通である。rota-ADSCの誘導後、細胞の大多数は、50〜200μmの範囲の直径を有するコロニーに存在した。各コロニーの細胞数は確実ではなく、またコロニーの密度は判らず、コロニーサイズに依存する。単一の細胞により占有される容量は一定である(1細胞/524μm3)と推定することで、コロニー当たりの得られた細胞数を予測することができた(グラフ2)。
【図７】培養皿上へのプレーティング後のGFP-rota-ADSC(P9)の微速度撮影画像である。
【図８】rota-ADSCとADSCにおける各遺伝子の発現に関するqRT-PCR結果を示すグラフである。Nanog、Sox2、Gata6、Klf4、Eras、Esg1及びRex1の陽性発現を、rota-ADSC コロニー(P9及びP16)の双方においてqRT-PCRにより確認した。ナイーブADSC(P8)においては、KLF4、Par4及びc-Mycのみが発現されていた。rota-ADSC集団において、能力は、確かに増加しており(Eras、Esg1及びRex1のアップレギュレーション)、自己複製能が維持されていた。データは、新しい(P7〜10)又は古い(P15〜17)継代ADSCにおいて、rota-ADSCコロニーへの誘導について差異がないことを潜在的に示す。古いADSCと若いADSCの双方は、同様のパターンを示すと考えられる。
【図９】rota-ADSCとナイーブADSCにおける細胞骨格成分を示すグラフである。ビンキュリン発現の低下は、細胞結合の低下及び細胞移動の調節の変化を強調した(Critchley, D.R., Cytoskeletal proteins talin and vinculin in integrin-mediated adhesion. Biochemical Society Transactions, 2004. 32: p. 831-836)。一方、プロフィリン1の中程度の増加は、細胞質アクチンフィラメントの消失を促進し、可能性としてはこれらフィラメントの結果として起こる蓄積は細胞外縁に位置し、厚い細胞皮質辺縁を形成し得る(Roy, P. and K. Jacobson, Overexpression of profilin reduces the migration of invasive breast cancer cells. Cell Motility and the Cytoskeleton, 2004. 57(2): p. 84-95)。CDH1はダウンレギュレートされ、全般的なβ-カテニン発現及びフィブロネクチン発現のわずかな増加が認識された。
【図１０】rota-ADSCとナイーブADSCにおける表面マーカーの発現を示すグラフである。陽性細胞の割合を、デブリと死細胞の排除後に解析した(7-AADを使用した)。非特異的染色を最小限にするために、FcRブロッキング試薬を抗体の染色前に使用した。
【図１１】25種の生物学的プロセスに関与する包括的な全ての主要な遺伝子を示すグラフである。x軸は、単一の遺伝子による特定のプロセスでの存在数を示す。
【図１２】ADSCクラスターからアルブミンを陽性発現する細胞への分化(試験1)を示す図である。
【図１３】rota-ADSCの肝細胞への分化(試験2)を示す図である。実施例２に示す分化方法は、グラフ及び写真に示す結果を示し、アルブミンの発現は15日目で存在し、Hnf1bの発現は、分化した肝細胞においてrota-ADSCクラスター形成後より10倍増加した。
【図１４】ナイーブADSCから肝細胞様細胞への分化試験(対照)を示すグラフである。ナイーブADSCから肝細胞様細胞への分化は起こらなかった。アルブミンもafpも決して発現しなかった。
【図１５】rota-ADSCからの脂肪細胞分化を示す図である。分化した細胞において、Pparg及びTfap2aが開始rota-ADSC細胞又はナイーブADSCよりも20〜30倍高く発現していた。当該結果は、画像に見られる脂肪細胞への分化形態を確認するものであった。
【図１６】図１５を補足する、rota-ADSCの脂肪細胞への分化を示す写真である。
【図１７】rota-ADSCとナイーブADSCからの骨細胞分化を示す図である。骨細胞分化に関して、調査された2つの集団の分化能において相違がなかった。チェックされた遺伝子全てが、アップレギュレートされた。
【図１８】rota-ADSCからの神経分化を示す図である。運動ニューロン前駆体及び運動ニューロンと同様に、ニューロゲニン-2が2ステップ分化後に発現された。Gfap発現は、通常アストロサイトにおいて見出されるグリア線維酸性タンパク質の形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る幹細胞の製造方法は、元来、接着して増殖する間質細胞を接着できないように、非接着培養ストレス下、すなわち、培養器(培地)を回転及び/又は振動させながら、該培養器中の間質細胞を培養することにより、幹細胞を製造する方法である。本発明に係る幹細胞の製造方法によれば、培養器を回転及び/又は振動させるという物理的ストレス下で、間質細胞からアノイキス耐性を有する細胞を選択し、且つ細胞-細胞相互作用を介した細胞クラスタリングを誘導することで、間質細胞由来の幹細胞を得ることができる。
【００１３】
ここで、間質細胞としては、例えば脂肪組織由来間質細胞、骨髄、臍帯の間質細胞の他、あらゆる組織に存在する間葉系間質細胞が挙げられる。また、間質細胞は、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ等の哺乳動物に由来するものであってよい。
【００１４】
本発明に係る幹細胞の製造方法においては、培養器を回転及び/又は振動させながら、該培養器中の培地において間質細胞を培養する。培養器として、例えばファルコンチューブ等の容器を使用することができる。また、培地は、通常、間質細胞の培養に使用するものであってよく、脂肪組織由来間質細胞の場合には、例えば100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン、250 ng/mlのアンフォテリシンB、2 mmol/LのL-Alanyl-L-Glutamine及び2〜20％(好ましくは、2〜10％)の血清(例えば、FBS)を含有する培地(例えば、DMEM/F12培地)が挙げられる。また、培養における間質細胞の濃度としては、例えば1×104〜1×106細胞/ml、好ましくは1.5×105〜2.0×105細胞/mlが挙げられる。
【００１５】
回転処理は、例えばMiltenyi Biotec MX001 Macsmix Tube Rotator等のローテーターを用いて、間質細胞が培養器に接着しないように例えば回転速度4〜12rpm、好ましくは8〜12rpmで培養器を回転させる。また、回転処理(培養)時間は、コロニーが大きな構造へと凝集しない時間であればよく、例えば12〜72時間、好ましくは36〜60時間とする。
【００１６】
一方、振動処理は、例えば振盪培養器にて、50〜220 rpmの設定で上述の回転処理と同様の時間行う。
【００１７】
回転/振動処理(培養)後、細胞を遠心分離等により単離し、再度培地に播種し、接着した細胞(又は細胞コロニー)を、幹細胞として得ることができる。
【００１８】
得られた幹細胞が自己複製能と分化能を有するか否かの評価は、例えば未分化細胞マーカー(例えばNanog、Sox2、Gata6、Klf4、Eras、Esg1、Rex1等)の発現を指標に行うことができる。
【００１９】
このようにして得られた幹細胞は、分化誘導培地で培養することで、3つの胚葉系統(内胚葉、中胚葉、外胚葉)の細胞に分化させることができる。分化した細胞としては、例えば肝細胞、脂肪細胞、骨細胞、神経細胞等が挙げられる。
【００２０】
幹細胞から肝細胞への分化誘導培地としては、例えば2〜6％FBS、2 mMのグルタミン、100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン、250 ng/mlのアンフォテリシンB、250 nMのデキサメタゾン(Dex)、CC-4182 HCM SingleQuots Kit(Lonza)(当該キットは、アスコルビン酸、BSA-FAF、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒト上皮成長因子(rhEGF)及びGA-1000を含有する；製造業者の説明書に準じた用量を使用)及び100〜300 ng/ml(好ましくは200 ng/ml)の肝細胞増殖因子(HGF)を含有する培地(例えばDMEM培地)が挙げられる。また、培養は、ラミニンコーティングプレートで行うことが好ましい。培養時間としては、例えば13〜18日間が挙げられる。
【００２１】
幹細胞から肝細胞への分化は、肝細胞マーカー(例えばアルブミン)の発現を指標として評価することができる。
【００２２】
幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地としては、例えば10％FBS、100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン硫酸塩、2 mMのグルタミン、100xのadipogenic supplement(ハイドロコルチゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシンを含有する)を含有する培地(例えばα-MEM培地)が挙げられる。培養時間としては、例えば6〜9日間が挙げられる。
【００２３】
幹細胞から脂肪細胞への分化は、例えば脂肪細胞マーカー(例えばPparg、Tfap2a)の発現を指標として評価することができる。
【００２４】
幹細胞から骨細胞への分化誘導培地としては、例えば10％FBS、100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン硫酸塩、2 mMのグルタミン、及び20xのmOsteogenic supplement(ascorbate-phosphate、β-glycerolphosphate、組換BMP-2を含有する)を含有する培地(例えばαMEM培地)が挙げられる。また、培養は、ラミニンコーティングプレートで行うことが好ましい。培養時間としては、例えば17〜23日間が挙げられる。
【００２５】
幹細胞から骨細胞への分化は、例えば骨細胞マーカー(例えばAlpl、Runx2、Bglap、Col1a1)の発現を指標として評価することができる。
【００２６】
幹細胞から神経細胞への分化は、2段階の培養ステップで行うことができる。第1培養ステップにおける分化誘導培地としては、例えば50xのB-27 supplement(cat#17504044、Life Technologies社)、100 microgram/mlのカナマイシン、2 mMのグルタミン(Gln)、30 ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)及び30 ng/mlのEGFを含有する培地(例えばNeurobasal medium)が挙げられる。第1培養ステップの培養時間としては、例えば7〜9日間が挙げられる。
【００２７】
次いで、第1培養ステップ後、培地を交換して、第2培養ステップを行う。第2培養ステップにおける分化誘導培地としては、例えば2％FBS、25 ng/mlのbFGF及び25 ng/mlの脳由来神経栄養因子(BDNF)を含有する培地(例えばα-MEM培地)が挙げられる。また、第2培養ステップの培養は、ラミニンコーティングプレートで行うことが好ましい。第2培養ステップの培養時間としては、例えば9〜12日間が挙げられる。
【００２８】
幹細胞から神経細胞への分化は、例えば神経細胞マーカー(例えばNeurog2、Gfap)の発現を指標として評価することができる。
【００２９】
以上のように、本発明に係る幹細胞の製造方法によれば、再生医療等の分野で有用な幹細胞を製造することができる。
【００３０】
例えば、肝炎(アルコール性/非アルコール性)、脂肪肝、肝硬変及び肝癌等の肝疾患は、生活習慣の変化から日本で急増している疾患である。肝疾患の悪性化において、温存措置は効果がなく肝移植を行わなければならない。しかしながら、移植においては、ドナー数が少なく、また拒絶反応が問題となる。
【００３１】
本発明に係る幹細胞の製造方法により製造された幹細胞は肝細胞に分化することができる。従って、本発明に係る幹細胞の製造方法に準じて、患者由来の間質細胞から幹細胞を製造し、さらに得られた幹細胞から肝細胞を分化させることにより、上述のように必要とされる肝移植に使用するための肝細胞を提供することができる。
【００３２】
また、本発明に係る幹細胞の製造方法に準じて、ウシの間質細胞から幹細胞を製造し、さらに得られた幹細胞から肝細胞を分化させることにより、食用の肝臓(レバー)を提供することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
なお、以下の実施例及び参照する図面において、「ナイーブADSC」は幹細胞への誘導前の脂肪組織由来間質細胞(Adipose-derived stromal cell)であり、且つ「rota-ADSC」は幹細胞への誘導後の脂肪組織由来間質細胞(幹細胞)である。
【００３５】
また、ペニシリンとストレプトマイシン(硫酸塩)とを併せて「P/S」と称し、ペニシリンとストレプトマイシン(硫酸塩)とアンフォテリシンBとを併せて「A/A(antibiotic-antimycotic)」と称する場合がある。
【００３６】
〔実施例１〕ナイーブADSCからのrota-ADSCクラスター誘導及びその特性評価
1. 材料及び方法
1-1. マウス脂肪組織由来間質細胞(ADSC)の抽出
マウスADSCを、屠殺したマウス(C57BL/6JCrj又はBL/6-GFP雄マウス)の鼠径部の脂肪から回収した。
【００３７】
リンパ節を取り出し、該組織をPBS(3mlバイアル中1ml)中に置き、ハサミで均一に切断した。PBS中の脂肪を、50mLファルコンチューブ中に置き、5mLのPBSを加え、1600rpmで5分間遠心分離に供した。この洗浄ステップを1回以上繰り返した。
【００３８】
遠心分離後、浮遊物およびペレットの吸引を避けながら中間洗浄PBSを除去した。次いで、5mlの0.15％w/vコラゲナーゼI溶液を添加し、懸濁液をMiltenyi Biotec MX001 Macsmix Tube Rotator中に置いた。回転(ローテーション)を、37℃及び5％CO2における最大速度12rpmの条件に設定し、20分間行った。回転中、ファルコンキャップをパラフィンフィルムで密閉した。
【００３９】
回転後、10mLの培地(DMEM-F12)を懸濁液に添加し、コラゲナーゼ処理を停止させ、酵素反応を抑制した。懸濁液を、1800rpmで15分間遠心分離に供した。
【００４０】
遠心分離後、上清及び脂肪滴の浮遊層を除去し、ペレットを10mLの培地に再懸濁した。当該懸濁液を、100μmセルストレーナーで濾し、1800rpmで6分間遠心分離に供した。当該遠心分離後、上清を除去し、ペレットを4.5mLの新しい培地に懸濁し、得られた細胞を1枚の6cm培養皿に播種した。
【００４１】
細胞をトリプシン処理により剥し、数回継代した。このようにして、幹細胞(rota-ADSC)への誘導に使用するADSCを7〜10回継代した。使用した培地は、FBS(20％)、A/A(5mL)及びグルタミン(5mL)を含有するDMEM/F12(500mL)であった。
【００４２】
1-2. rota-ADSC誘導プロトコール
マウスrota-ADSC細胞を、第1-1節で得られたナイーブADSCを処理することで産生した。rota-ADSCコロニーは、ADSCの継代回数(通常は、7〜9回継代した細胞を使用)に関係なく一定して得られた。具体的に、ナイーブADSCからrota-ADSCへの誘導は以下のプロトコルに従って行われた。
【００４３】
(1) ADSCをトリプシン/EDTA(0.05％w/v)で剥し、培地を添加することでトリプシンを中和した。次いで、細胞の総数を算出した。
(2) 1600rpmで5分間遠心分離し、上清を吸引した。
(3) ペレットをDMEM/F12/ペニシリン(100 units/ml)/ストレプトマイシン(100 microgram/ml)/アンフォテリシンB(250 ng/ml)/グルタミン(Gln)(2 mM)/FBS 20％に再懸濁し、1×105〜3×105細胞/mlの細胞濃度にした。最終容量は3〜25mlの範囲であった。なお、6ml未満の最終容量を使用する場合には、回転懸濁の間に非常に大きな細胞塊を形成するリスクが高かった(図１)。また、これら3つの制約を改変することで、コロニーのサイズ及びサイズ分散度を調節することができた。
(4) 細胞を含有するファルコンチューブを3層のパラフィルムで密閉し、且つ最後に丈夫なイエローテープの層で密閉した。また、エタノールを使用して、各段階で、ファルコンチューブ及びパラフィルムを滅菌消毒した。このように、当該ファルコンチューブの上部を、回転の際における漏出及び汚染を避けるために滅菌消毒した。
(5) ファルコンチューブを、Miltenyi Biotec MX001 Macsmix Tube Rotatorに配置し、回転を、最大速度：約12rpmで36〜66時間行った(図１)。
(6) 処理の最小時間は36時間とすることで、コロニー形成に再編成しなかった全ての単一細胞についてアポトーシスを誘導した。最大時間は66時間であり、この時間を超えると、コロニーはより大きな構造となり凝集する傾向にあり、コロニーの内部コアの細胞(特に、より大きなコロニーの細胞)は、低酸素及び低栄養摂取に起因して死滅し始めた。
(7) ファルコンチューブを1600rpmで5分間遠心分離に供し、上部のパラフィルム/イエローテープを外し、上清を吸引した。
(8) ペレットをDMEM/F12/A/A/Gln/FBS 20％に再懸濁し、細胞/コロニーを、回転処理前のナイーブADSCにより占有される表面積の1/6に相当する表面積のプレートに播種した。
(9) 生存細胞/コロニーは、8時間以内にプレートに接着した。懸濁中の残りの細胞は、培地交換の際に廃棄した。
(10) 得られたrota-ADSCの特性評価に関する情報を、図２〜９に示す。
【００４４】
2. 結果及び考察
回転/懸濁方法は、マウスADSCにストレスを与え、アノイキス耐性を有する細胞を選択し、且つ細胞-細胞相互作用を介した細胞クラスタリングを誘導するために見出された。rota-ADSCコロニーを、懸濁/振動系を用いて得た。得られたコロニーの直径は調節することができ、45μm〜180μmの範囲であった。懸濁/振動の48時間後、コロニーに再編成されていないADSCの多くがアポトーシスに直面し、約50〜80％の初期細胞数の細胞が操作中に死滅した。
【００４５】
Nanog、Sox2、Gata6、Klf4、Eras、Esg1及びRex1の陽性発現を、若い継代rota-ADSCコロニー及び多くの継代を経たrota-ADSCコロニー(それぞれ継代9回(P9)及びP16)の双方においてqRT-PCRにより確認した。ナイーブADSC(P8)においては、KLF4、Par4及びc-Mycのみが発現されていた。rota-ADSC集団において、能力は、確かに増加しており(Eras、Esg1及びRex1のアップレギュレーション)、自己複製能が維持されていた。図８に示すデータは、新しい(P7〜10)又は古い(P15〜17)継代ADSCにおいて、rota-ADSCコロニーへの誘導について差異がないことを潜在的に示す。古いADSCと若いADSCの双方は、同様のパターンを示すと考えられる(図８)。
【００４６】
懸濁/振動系の処理は、ADSC集団において、能力が高く、且つ凝集能が増強されていると考えられる細胞を選択した。
【００４７】
rota-ADSCの表面マーカーをチェックし、ナイーブADSCのものと比較すると、以下の点で最も有意な差異がみられた(図１０):
(1) ↑CD44−細胞-細胞相互作用、細胞接着及び移動に関与する細胞表面糖タンパク質；コロニーにおけるコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンの産生のため、CD44の増加は妥当である。CD44遺伝子転写は、部分的にはβ-カテニン及びWntシグナリングにより活性化される。
(2) ↓CD49b−細胞外マトリクスに対する接着挙動をモニタリングするためにチェックされた。
(3) ↓CD73−細胞複製の低下。
(4) ↓CD34−増殖のダウンレギュレーション及び未分化状態不全。
(5) ↓Notch-1−アポトーシスは、(分化を停止させる可能性がある)Notch-1ダウンレギュレーションを誘導する可能性がある。
(6) ↓CD95−アポトーシス関連受容体を発現していた細胞の死滅に起因する可能性がある低下。
【００４８】
回転の期間、増殖は停止した。幾つかの表面マーカーのダウンレギュレーションは、アポトーシスに直面した一部のADSCに起因した。
【００４９】
＜rota-ADSC対ナイーブADSCにおけるアップレギュレートされた経路＞
アップレギュレートされた遺伝子のマイクロアレイ遺伝子発現を検討し、ナイーブADSCとrota-ADSCとの間の差異を強調した。
【００５０】
合計1513種の遺伝子をマイクロアレイによりスクリーニングし、体系的に分析することで、生物学的意義を抽出した。
【００５１】
rota-ADSCにおいては、MAP、JNK及びp38 MAPキナーゼ経路がアップレギュレートされた。JNK及びp38 MAPキナーゼ経路は、血清又は反応性酸素種により誘導される。ERK5、PI3K-Aktシグナリング及びTGF-βシグナリング経路がまた活性化された。このことは、細胞増殖、炎症及びアポトーシス/抗アポトーシス調節アラートの増加を意味し、またJak-STATシグナリング経路の活性化によっても確認された。
【００５２】
リソソームグリコシダーゼが、rota-ADSCにおいて過剰産生された。アクチン細胞骨格の調節は、膜リモデリング及び輸送、仮足拡張、粒子内面化、ファゴソーム閉塞、及び最終的なファゴソーム-リソソーム融合、FcyR介在性ファゴサイトーシスに匹敵する経路を促進する。タンパク質の細胞内分解は、rota-ADSCにおいてユビキチン依存性プロセスからオートファジー-リソソーム経路にスイッチすると考えられる。
【００５３】
サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用が、特にヘマトポエチンファミリーに関してアップレギュレートされた。さらに、炎症性サイトカインは、toll様受容体シグナリング経路(TLR2、MD-2及びIFNAR2受容体)を介して産生され、且つ可能性としてはペプチドグリカン、リポタンパク質又はリポポリサッカリドにより誘導された。
【００５４】
rota-ADSCにおいては、局所接着が細胞外マトリクス(ECM)による細胞相互作用により影響された。このECMは、クラスター化した細胞自体により産生されるコラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、分泌型ホスホタンパク質-1により形成され、インテグリンがまた過剰産生された。運動性は、基質の喪失により妨げられ、アクチン細胞骨格の分解が直接的な結果であり、反対に、細胞骨格はナイーブADSCにおいて維持された。ECM-受容体相互作用と共にサイトカイン-サイトカイン受容体相互作用がWntシグナリング経路を促進し、且つJNKシグナリングを活性化した。結果は、顕著な細胞生存及び増殖であった。加えて、ホスファチジルイノシトールシグナリングは、部分的にアクチンポリマー化を妨げた。
【００５５】
細胞骨格は、ストレス操作の間に変化した。ナイーブADSCにおいては、接着結合、デスモソーム、ナクチン及びストレスファイバーが存在し、一方、rota-ADSCにおいて発現された遺伝子は、糸状仮足及び膜状仮足の形成並びにその他の全てのタイプの結合のダウンレギュレーションを強調した。
【００５６】
rota-ADSCにおいては、ゴナドトロピンの遺伝子発現及び分泌が活性であり、グルコース細胞取り込みの増加及びスフィンゴリピド代謝のアップレギュレーションが存在した。産生される巨大分子は、ホスホエタノールアミン及びセラミドであった。
【００５７】
ビンキュリン発現の低下は、細胞結合の低下及び細胞移動の調節の変化を強調した(Critchley, D.R., Cytoskeletal proteins talin and vinculin in integrin-mediated adhesion. Biochemical Society Transactions, 2004. 32: p. 831-836)。一方、プロフィリン1の中程度の増加は、細胞質アクチンフィラメントの消失を促進し、可能性としては結果として厚い皮質辺縁において、これらフィラメントの細胞外縁における蓄積に至る(Roy, P. and K. Jacobson, Overexpression of profilin reduces the migration of invasive breast cancer cells. Cell Motility and the Cytoskeleton, 2004. 57(2): p. 84-95)。CDH1はダウンレギュレートされ、全般的なβ-カテニン発現及びフィブロネクチン発現のわずかな増加が認識された(図９)。
【００５８】
アップレギュレートされたラミニン及びコラーゲン関連遺伝子のリスト：
(1) ラミニンα-1：小脳発生及び上皮内胚葉発生の間におけるラミニンα1鎖の機能的な役割(Kaestner, K., Development, Differentiation, and Disease of the Luminal Gastrointestinal Tract. 2010)；
(2) ラミニン,α4：LAMA4は、おそらくシンデカン4を介してMMP3の発現(rota-ADSCクラスターにおいて高度にアップレギュレートされた)を調節する(Fuerst, F.C., et al., Matrix metalloproteinase 3 is regulated by the laminin LAMA4 in human osteoarthritis. 2011. p. A14)；
(3)ラミニンγ1；
(4) Col2a1：骨及び軟骨の分化に関与；
(5) Col3a1：脈管構造及び腸発生；
(6) Col5a3；
(7) Col15a1；
(8) Col22a1：組織結合においてのみ存在する細胞外マトリクスタンパク質(Koch, M., et al., A Novel Marker of Tissue Junctions, Collagen XXII. 2004. p. 22514-22521)。
【００５９】
以下の表１は、ナイーブADSCと比較したrota-ADSCの分析を強調した25種の生物学的プロセスを示す。使用したプログラムは、Analysis Wizard of DAVID Bioinformatics Resources 6.7であった(Huang, D.W., B.T. Sherman, and R.A. Lempicki, Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protocols, 2008. 4(1): p. 44-57；Huang, D.W., B.T. Sherman, and R.A. Lempicki, Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. 2009. p. 1-13)。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
また、図１１は、当該25種の生物学的プロセスに関与する包括的な全ての主要な遺伝子を示す。x軸は、単一の遺伝子による特定のプロセスでの存在数を示す。
【００６２】
〔実施例２〕3つの胚葉への直接的分化による誘導されたrota-ADSC細胞の多能性の検証
1-1. 内胚葉系統方向へのrota-ADSC
＜肝細胞分化のための手順＞
(1) 実施例１に記載の方法に準じて、ADSC(P9)の懸濁/振動系により得られたrota-ADSCコロニー(P10)を、24ラミニンコーティングウェルプレートの6ウェルに播種した。1ウェル当たり約70000個の細胞を播種し、以下の前分化培地を、1ウェル当たり400μl添加し、15日間培養した：4％FBS、2 mMのグルタミン(Gln)、100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン、250 ng/mlのアンフォテリシンB、250 nMのデキサメタゾン(Dex)、CC-4182 HCM SingleQuots Kit(Lonza)(当該キットは、アスコルビン酸、BSA-FAF、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒト上皮成長因子(rhEGF)及びGA-1000を含有する；製造業者の説明書に準じた用量を使用)及び150 ng/mlの組換えマウス肝細胞増殖因子(rmHGF)を含有するDMEM培地。
(2) 培地交換を、0、1、4及び11日目に行った。
(3) qRT-PCR分析のために、細胞からのRNAサンプルを、0、11及び14(又は15)日目に抽出した。
(4) 分析した遺伝子を図１２及び１３に示す。
【００６３】
当該分化プロセスは、アルブミンの発現を誘導した(14/15日目；図１２及び１３)。また、上述の操作を、対照としてナイーブADSCを用いて実施し、遺伝子発現レベルをチェックし、rota-ADSCから産生された肝細胞様細胞と比較した(図１４)。ナイーブADSCからは、TAT及びTDO2発現の上昇がみられたが、アルブミン発現細胞が得られなかった。
【００６４】
1-2. 中胚葉系統方向へのrota-ADSC
＜脂肪細胞分化のための手順＞
(1) 実施例１に記載の方法に準じて、ADSC(P9)の懸濁/振動系により得られたrota-ADSCコロニー(P10)を、1ウェル当たり約70000個の細胞の濃度で播種した(3ウェル；100％コンフルエント；24ウェルプレート)。次いで、rota-ADSCを、以下の培地を含有する培養皿で8日間維持した：10％FBS、100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン硫酸塩、2 mMのグルタミン(Gln)、100xのadipogenic supplement(ハイドロコルチゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシンを含有する)(Mouse Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit, R&D Systems, Inc.)を含有するα-MEM培地。
(2) 培地交換を、2〜3日毎に行い、qRT-PCR分析のために、細胞からのRNAサンプルを3日目(ナイーブADSC)、0日目(rota-ADSC)及び8日目に抽出した。
(3) qRT-PCRを使用して、発現が脂肪細胞系列に制限される複数の遺伝子(PPARg2及びTfap2a)からの発現転写産物を増幅した。
【００６５】
分化した細胞において、Pparg及びTfap2aが開始rota-ADSC細胞又はナイーブADSCよりも20〜30倍高く発現していた。8日後の分化形態はqRT-PCR結果を確認するものであった(図１５及び１６)。
【００６６】
＜骨細胞分化のための手順＞
(1) 実施例１に記載の方法に準じて、ADSC(P9)の懸濁/振動系により得られたrota-ADSCコロニー(P10)を、1ウェル当たり約25000個の細胞の濃度で播種した(50％コンフルエント；24ウェルラミニンコーティングプレートの3ウェル)。ナイーブADSC(P11)(rota-ADSC誘導に使用した同じバッチのADSC)を、同じ手順の対照として使用した。
(2) rota-ADSC及びナイーブADSCを、それぞれ以下の培地を含有するラミニンコーティング皿で21日間維持した：10％FBS、100 units/mlのペニシリン、100 microgram/mlのストレプトマイシン硫酸塩、2 mMのグルタミン(Gln)、及び20xのmOsteogenic supplement(ascorbate-phosphate、β-glycerolphosphate、組換BMP-2を含有する)(Mouse Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit, R&D Systems, Inc.)を含有するαMEM培地。
(3) 培地交換を、2〜3日毎に行い、qRT-PCR分析のために、RNAサンプルを、ナイーブADSC及びrota-ADSCのそれぞれから0及び21日目に抽出した。
【００６７】
RT-PCRにより、骨細胞分化が確認された。具体的には、分化のためにチェックされた4つの遺伝子全てが、処理から21日後にアップレギュレートされた(図１７)。調査された2つの集団の分化能において相違がなく、ナイーブADSC及びrota-ADSCは、この特定の手順においては同じ能力を有した。
【００６８】
1-3. 外胚葉系統方向へのrota-ADSC
＜神経分化のための手順＞
(1) 実施例１に記載の方法に準じて、5x105個のナイーブADSC(P9)を、rota-ADSCコロニー(P10)の産生に使用した。得られたrota-ADSCコロニー(P10)全てを10cmペトリ皿に播種し(第1ステップ)、以下の培地で9日間維持した：50xのB-27 supplement(cat#17504044、Life Technologies社)、100 microgram/mlのカナマイシン、2 mMのグルタミン(Gln)、30 ng/mlのマウス塩基性線維芽細胞増殖因子(mbFGF)及び30 ng/mlのマウス上皮成長因子(mEGF)を含有するNeurobasal medium。
(2) 細胞を、ラミニンコーティング皿に継代し、培地を以下の培地：2％FBS、25 ng/mlのmbFGF及び25 ng/mlの脳由来神経栄養因子(BDNF)を含有するα-MEM培地に交換した(第2ステップ)。この第2ステップは、10日間と長かった。
(3) 各培地の交換を2〜3日毎に行い、qRT-PCR分析のために、細胞からのRNAサンプルを0及び19日目に抽出した。
【００６９】
使用した培地は、Kuroda et al 2013(Kuroda, Y., et al., Isolation, culture and evaluation of multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells. Nat. Protocols, 2013. 8(7): p. 1391-1415)のプロトコルに基づくが、Kuroda et al 2013のプロトコルで使用されるヒト成長因子の全てをマウス成長因子に変更した。
【００７０】
2ステップ分化後に、ニューロゲニン-2が運動ニューロン前駆体及び運動ニューロンと同様に発現された。Gfap発現は、通常アストロサイトにおいて見出されるグリア線維酸性タンパク質の形成を示す。このように、rota-ADSCはニューロン様細胞に分化した(図１８)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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