(57)【要約】【課題】  超並列高速シークエンサーから得られるリード配列から迅速かつ高精度にＨＬＡアリルを判定することのできるＨＬＡ遺伝子タイピング方法を提供する。【解決手段】  超並列高速シークエンサーから出力されるリード配列とＨＬＡアリルの塩基配列データベースの塩基配列との類似性解析を各座位（ローカス）のエクソン毎に実施し、各エクソンについて一致するあるいは高い類似性を示すＨＬＡアリルを抽出し、次いで当該座位の全エクソンに共通して一致するあるいは高い類似性を示すＨＬＡアリルを抽出してマッピングのための候補アリルとする工程、候補アリルの塩基配列をリファレンス配列としてリード配列をマッピングする工程を含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法、及び当該方法のデータ解析に使用するコンピュータプログラム。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
超並列高速シークエンサーから出力されるリード配列とＨＬＡアリルの塩基配列データベースとの類似性解析を各座位（ローカス）のエクソン毎に実施し、各エクソンについて一致するあるいは高い類似性を示すアリルを記録し、次いで当該座位の全エクソンに共通して高い類似性を示すＨＬＡアリルを抽出して、これをマッピングのための候補アリルとする工程を含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法。
【請求項２】
超並列高速シークエンサーから出力されるリード配列を他の形式に変換する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
超並列高速シークエンサーから出力されるリード配列をＨＬＡアリルの塩基配列データベースの塩基配列とエクソン毎に比較し、所定値以上のマッチング率を示すＨＬＡアリルを抽出して当該アリル名を記録するステップ、
エクソン毎に記録されるＨＬＡアリル名を比較して、全てのエクソンに共通して記録されているＨＬＡアリル名を抽出して、それを候補アリルとして記録するステップ、及び
記録された候補アリルの塩基配列をリファレンス配列としてリード配列をマッピングするステップを含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングのためのデータ解析用コンピュータプログラム。
【請求項４】
超並列高速シークエンサーから出力されたリードの配列をデータ解析に適した形式に変換するステップをさらに含む、請求項３に記載のコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超並列高速シークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子タイピング方法に関する。より詳細には、超並列高速シークエンサーから得られるリード配列から迅速かつ高精度にＨＬＡアリルを判定することのできるＤＮＡタイピング方法、及びその方法で使用するデータ解析用のコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっている。主なものとして６種類の抗原が知られており、ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ）が含まれる。
【０００３】
ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である。
【０００４】
例えば骨髄移植の際、移植希望者とドナーとのＨＬＡ型が４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度のＧＶＨＤ頻度が低下すると言われている。その一方、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＤＮＡタイピングに基づくアリル判定を正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
【０００５】
ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）−Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
これら従前のＤＮＡタイピング方法は、多数のＤＮＡ検体を迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を一義的に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＤＮＡタイピングが難しい場合があった。
【０００６】
ＨＬＡ遺伝子のアリル判定における多義性を低下させる方法として、特許文献１にはＳＳＯ法とＳＢＴ法の両方を使用し、両者で共通して判定されたアリルを特定する方法が記載されている。しかし、これらの方法の併用では、同一のＤＮＡ検体に対してＳＳＯ法及びＳＢＴ法の両方を実施する必要があり、操作が煩雑になるとともに少量のＤＮＡ検体しか入手できない場合には使用できない。
本発明者等は、ＰＣＲに使用するプライマーを工夫することにより、超並列高速シークエンサーを用いて、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排し、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルも検出できるＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法を開発した（特許文献２）。
【０００７】
「超並列高速シークエンサー」、「次世代シークエンサー（シーケンサー）」あるいは「新型シークエンサー」などの呼称は、従来のサンガー法（ジデオキシ法）に基づくゲル式シークエンサーやマイクロキャピラリー式シークエンサーとの対比において用いられている。超並列高速シークエンサーと呼ばれるＤＮＡシークエンサーは、少量のＤＮＡ検体に基づいて、高速で大量のＤＮＡ断片を自動的に解析するという点では一致するが、採用されているシークエンシング手法は機種によって異なっている。
【０００８】
現在汎用されている次世代シークエンサーは機種により手法が異なるが、Ｒｏｃｈｅ社製の４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒの場合「パイロシークエンシング（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」であり、４種類の核酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を一定の順序で加え、添加した核酸がポリメラーゼによりＤＮＡ配列へ取り込まれた際に生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応により検出し、そのシグナル強度を基に塩基配列が決定される。
実際に行われる工程は、（１）生体試料からＤＮＡを抽出し、（２）そのＤＮＡを超並列高速シークエンサーに適するように断片化してＤＮＡライブラリーを作製し、（３）ライブラリーのＤＮＡ断片を超並列高速シークエンサーに供して塩基配列を解読することを含む。ここで各ＤＮＡ断片の塩基配列の単位を「リード配列」と呼ぶことがある。次いで、（４）既存のＨＬＡアリルの塩基配列データベース（ＩＭＧＴ  ＨＬＡ）等に登録されているＨＬＡアリルの塩基配列をリファレンス配列として、これに前記リード配列をマッピングすることによりＨＬＡアリルの判定（タイピング）がなされる。
【０００９】
ここで、前記（４）のＤＮＡタイピング工程は、（ｉ）ＩＭＧＴ  ＨＬＡ等から公開されているＨＬＡアリルの塩基配列とリード配列との間で類似性解析を行って、類似性の高い候補アリルを抽出する工程と、（ｉｉ）抽出した候補アリルをリファレンス配列としてリード配列をマッピングする工程を含む。これらの工程を自動的に実行するコンピュータプログラムも存在しており、（ｉ）類似性解析については「ＢＬＡＴ（無償ソフト）」、（ｉｉ）マッピングについては「Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ：ＢＷＡ（無償ソフト）」、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ（商品名）」等が知られている。
【００１０】
しかしながら、ＩＭＧＴ  ＨＬＡ等に登録されている膨大な数のＨＬＡアリルの塩基配列と超並列高速シークエンサーから出力される多数のリード配列との類似性解析で抽出される候補アリルの数も極めて多く、それら多数の候補アリルにリード配列をマッピングするのに膨大な時間を要する。例えば、１検体の１座位についてのＤＮＡタイピング工程に約３週間を費やすというデータもある。
特許文献３には、ＩＭＧＴ  ＨＬＡ等に登録されているＨＬＡアリルの塩基配列から予測される全ＨＬＡアリルの組み合わせを記載したデータベースを予め作製することにより、タイピング結果の信頼性を向上させる方法が開示されている。しかしながら、この方法では予測される全ＨＬＡアリルの組み合わせを記載したデータベースを作製するという作業に膨大な時間を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１０−５０６５９５号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１３／０１１７３４号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−１０２５９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
よって本発明は、上記のような従来技術の欠点を克服し、超並列高速シークエンサーから得られるリード配列から迅速かつ高精度にＨＬＡアリルを判定することのできるＨＬＡ遺伝子タイピング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、ＨＬＡアリルの塩基配列データベースとリード配列との類似性解析を各ＨＬＡ座位（ローカス）に含まれるエクソン毎に実施し、全てのエクソンに共通に抽出されたＨＬＡアリルを当該座位における候補アリルに抽出する。この候補アリルをリファレンス配列としてリード配列とのマッピングを行うことで、マッピングの精度を維持したままマッピングに要する時間を大幅に短縮できることを見出し、本発明を完成した。本発明のソフトウェアを「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳｅａＢａｓｓ）」と命名する。
【００１４】
即ち本発明は、超並列高速シークエンサーから出力されるリード配列とＨＬＡアリルの塩基配列とをエクソン毎に類似性解析を実施し、各エクソンについて一致するあるいは高い類似性を示すＨＬＡアリルを座位ごとに抽出し、そのＨＬＡアリルの塩基配列をマッピングのための候補アリルとする工程を含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法では、エクソン毎にＨＬＡアリルの塩基配列とリード配列との類似性解析を実施するので、ＨＬＡアリル全体との類似性解析を実施する場合と比較して、解析に要する時間が大幅に短縮される。さらに、リード配列のマッピングの際にリファレンス配列とする候補アリルが、全エクソンが一致するあるいは高い類似性を示すＨＬＡアリルに絞り込まれているため、その後のマッピング作業が簡易化され、それに要する時間も短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】超並列高速シークエンサーを用いた超高解像度ＤＮＡタイピング法（Ｓｕｐｅｒ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ；ＳＳ−ＳＢＴ法）の概略を示す図である。
【図２】本発明の方法及びプログラムにおけるデータ処理工程の概略を示すブロック図である。
【図３】本発明の方法（実施例）で抽出された各エクソンに一致するＨＬＡアリル名を列挙した表である。
【図４】実施例におけるマッピング工程でリファレンス配列と１００％一致した場合のマッピング結果を表示する画面の例である。
【図５】実施例におけるマッピング工程でリファレンス配列と１００％一致しなかった場合のマッピング結果を表示する画面の例である。
【図６】ＨＬＡ−Ａ遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図７】ＨＬＡ−Ｂ遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図８】ＨＬＡ−Ｃ遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図９】ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図１０】ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図１１】ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図１２】ＨＬＡ−ＤＲＢ３４５遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図１３】ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【図１４】ＨＬＡ−ＤＰＡ１遺伝子について本発明の方法（実施例）でタイピングされたＨＬＡアリル及び他のコンピュータプログラムを用いて得られたＤＮＡタイピングの結果を比較する表である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のＨＬＡ遺伝子ＤＮＡタイピング方法では、超並列高速シークエンサーを用いて得られるリード配列が用いられる。
超並列高速シークエンサーからのリード配列の取得方法については、例えば、前記の特許文献２等を参照されたい。
要するに検体から得たＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物から超並列高速シークエンサー用のライブラリーを作製し、エマルジョンＰＣＲを経て得られる産物を超並列高速シークエンサーに供して塩基配列を解読することによりリード配列を取得する。
【００１８】
本発明で使用する超並列高速シークエンサーは特に限定されない。
現在普及している超並列高速シークエンサーは、リード配列がｆａｓｔｑ形式等で出力されるものが多いが、本発明の方法は、得られたリード配列を、その後の工程に適合するデータ形式（例えばｆａｓｔａ形式）に変換する工程（工程０）をさらに備えていてもよい。
【００１９】
次に、前記リード配列を好ましくはＩＭＧＴ  ＨＬＡに登録されているＨＬＡアリルの塩基配列を基に独自で作製したデータベース（ＳｅａＢａｓｓ用データベース）と比較する。
本発明の方法は、この段階で、塩基配列の比較をエクソン毎に実施することに特徴を有する。
目的とする領域に含まれる少なくとも２つ、好ましくは全てのエクソンについてリード配列とＳｅａＢａｓｓ用データベース中のＨＬＡアリルの塩基配列とを比較し、リード配列と一致する配列を含むＨＬＡアリルを抽出して、そのアリルの番号を記録する（工程１）。
【００２０】
ここで、ＳｅａＢａｓｓ用データベースとは、ＩＭＧＴ  ＨＬＡに登録されているＨＬＡアリルの塩基配列を基に、エクソン毎に分割したＨＬＡアリル配列をマルチｆａｓｔａ形式で保存したファイルの集合を意味する。
本発明では、ＩＭＧＴ  ＨＬＡ等のデータベースをそのまま使用してもよいが、上記のようなデータベースを予め作製しておき、その独自のデータベースを用いることにより、塩基配列の比較及び一致するアリルの抽出に要する時間が更に短縮できる。
なお、ＳｅａＢａｓｓ用データベースは一度作製すれば、複数の検体に対して繰り返し使用することができるが、新たに発見されたアリルの情報を追加する等の更新を定期的に実施するのが好ましい。
【００２１】
例えば、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子には７個のエクソン（エクソン１〜エクソン７）が存在することが知られている。
まず、エクソン１について、ＩＭＧＴ  ＨＬＡ等に登録されているＨＬＡ−Ｂ座位のＨＬＡ−Ｂアリルの塩基配列と前記リード配列とを比較して両者の塩基配列が一致するあるいは類似性の高いＨＬＡ−Ｂアリルを抽出し、例えば抽出されたアリルのＩＭＧＴ  ＨＬＡ登録名（例えば、ＨＬＡ＿ＨＬＡ００００１等）を記録する。
【００２２】
ＳｅａＢａｓｓ用データベースとリード配列との比較はコンピュータにより自動的に実施することができる。
例えば、ＵＣＳＵ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）から無償で提供されている「ｂｌａｔ」というプログラムを用いることができる。
このプログラムでは、ＳｅａＢａｓｓ用データベースにおけるＨＬＡアリルの塩基配列とリード配列とのマッチング率を予め設定しておくことにより、当該マッチング率以上のマッチングを示したＨＬＡアリルを抽出することができる。
マッチング率を１００％（ミスマッチ率：０％）に設定することにより、リード配列と完全に一致するエクソン１のＨＬＡアリルが抽出される。
【００２３】
マッチング率１００％の設定で抽出されるＨＬＡアリルが存在しない場合又はアリル数が極端に少ない場合には、マッチング率を（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、・・・等の１％刻み）に下げて、十分な数のＨＬＡアリルを抽出することも可能である。
全てのリード配列についてＨＬＡアリルの塩基配列と比較し、各マッチング率で抽出されたＨＬＡアリルの名称を記録する。
【００２４】
エクソン２〜７についても同様の操作を実施する。
本発明の方法では、エクソンという限られた領域（最長でも２７０ｂｐ程度）での塩基配列のマッチングを行うので、ＳｅａＢａｓｓ用データベースに登録されているＨＬＡアリルの全長との類似性検索を実施するより比較的短時間で完了する。
将来的にイントロン領域におけるＨＬＡ遺伝子のアリル配列情報が充実してくれば、同様の方法によりイントロン領域についても応用できる。
なお、各エクソンについて、上記の各マッチング率で抽出されるＨＬＡアリル名をマッチング率毎と対応させて記録しておき、次の工程２で全エクソンに共通するＨＬＡアリルが存在しない場合、別のマッチング率で抽出されるアリル名を抽出して再度比較するようにしてもよい。
【００２５】
エクソン１〜エクソン７の各々について抽出されるＨＬＡアリルを比較して、全てのエクソンに共通して抽出されるＨＬＡアリルを「候補アリル」とする（工程２）。
好ましくは、マッチング率１００％で抽出されたＨＬＡアリルの中に、全てのエクソンに共通するＨＬＡアリルが存在する場合は当該アリルを候補アリルとする。
マッチング率１００％で抽出されたＨＬＡアリルの中に全てのエクソンに共通するＨＬＡアリルが存在しない場合は、上記のようにマッチング率を下げた類似性解析から抽出されるＨＬＡアリルを候補アリルとしてもよく、あるいは、全てのエクソンではないが幾つかのエクソンについて一致するあるいは類似性の高いＨＬＡアリルを候補アリルとして抽出してもよい。
【００２６】
次に、前記工程２で抽出される候補アリルをリファレンス配列としてリード配列をマッピングする（工程３）。
リード配列のマッピングは、Ｂｕｒｒｏｗｓ?Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ：ＢＷＡ（無償ソフト）、ＧＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ（商品名）等の市販のコンピュータプログラムを用いて実施してもよい。
【００２７】
最後に、リード配列が完全にマッピングされた候補アリルを当該検体のＨＬＡアリルとする。
リード配列の一部が候補アリル配列と一致（マッピング）しない場合、一致率の最も高い候補アリル配列をリファレンス配列としたマッピングの結果から、予測される欠失、挿入、置換（ＳＮＰ）を加えたリファレンス配列を新たに作成する。
この新しいリファレンス配列を用いたマッピングを再度試みることにより、リード配列と新しいリファレンス配列が完全に一致させる処理を行い、それを最終的に新規アリルとする。
【００２８】
本発明は、上記したデータ解析の工程０〜工程３を、コンピュータを介して実施させるコンピュータプログラムも提供する。
図２は、本発明に係るコンピュータプログラムで実施させる工程を示すブロック図である。
【００２９】
本発明のプログラムは、超並列高速シークエンサーから出力されるリード配列を本発明のプログラムを備えたコンピュータに入力し、当該リード配列をデータ解析に適した形式（例えばｆａｓｔａ形式）に変換するステップ、ＳｅａＢａｓｓ用データベースとリード配列とをエクソン毎に比較し、所定値以上のマッチング率を示すＨＬＡアリルを抽出して当該塩基配列のアリル名（番号）を記録（記憶）するステップ、エクソン毎に記録されたＨＬＡアリル名を比較して、全てのエクソンに共通して記録されているアリル名（番号）を抽出して、候補アリルとして記録（記憶）するステップ、記録（記憶）された候補アリルの塩基配列をリファレンス配列としてリード配列をマッピングするステップを含む。
【００３０】
前記のマッピングステップにおいて、リード配列がリファレンス配列に１００％のマッチング率でマッピングされる場合、リファレンス配列を当該検体のＨＬＡアリルとして出力する。
１００％のマッチング率でマッチングするＨＬＡアリルがＳｅａＢａｓｓ用データベースに存在しない場合、最も高いマッチング率を示したリファレンス配列とリード配列とのマッピングにおいて、１個又は数個の変異が存在することを前提として、リファレンス配列に予測される欠失、挿入、又は置換（ＳＮＰ）を施すことによりリード配列と完全に一致するリファレンス配列（コンセンサス配列）を新たに作成し、当該コンセンサス配列をその検体のＨＬＡアリルとする。
【００３１】
前記のプログラムを用いてＤＮＡタイピングを実施することにより、３検体におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１座位のマッピングが約１５〜５０分間で完了した。これは、従来のマニュアル操作によるマッピングでは１検体、１座位に約３時間を要していたのと比較して格段の時間短縮が達成されたことを示している。
【実施例】
【００３２】
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
ＤＮＡ検体を用いて、超並列高速シークエンサーを使用して、通常の手法に従ってリード配列を得た。超並列高速シークエンサーとしてＲｏｃｈｅ社製の４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒを使用した。
【００３４】
得られたリード配列（ｆａｓｔａ形式）を、ソフトウェア「ｂｌａｔ」に入力し、ＩＭＧＴ  ＨＬＡ等に登録されているＨＬＡアリルの塩基配列と、エクソン毎の類似性解析を行った。パラメータは、リード長を２７０ｂｐ、マッチング率を１００％とした。
ＨＬＡ−Ａ遺伝子の場合、エクソン１〜エクソン７の各々について類似性解析を実施して、各エクソンについて１００％マッチングした塩基配列のＳｅａＢａｓｓ用データベースにおける名称を記録した。その結果を図３の表に示す。
【００３５】
図３の表において、エクソン１〜エクソン７の全てに共通して抽出されたＨＬＡアリルの名称が最右欄に掲げられている。これらのＨＬＡアリルを当該検体についての候補アリルとして絞り込んだ。
【００３６】
図３の最右欄に掲げた９個のアリル名で特定される塩基配列をリファレンス配列として、ソフトウェア「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ」を用いてリード配列のマッピングを行った。
【００３７】
マッピングの際にコンピュータ画面上に表示される例を図４及び図５に示す。
リード配列を１００％のマッチング率でマッチングした場合、リード配列がリファレンス配列に完全にマッピングされた（図５）。このリード配列から構成されるリファレンス配列（コンセンサス配列）を当該検体のＨＬＡアリルとした。
【００３８】
一方、リード配列とリファレンス配列とが完全に一致しない場合、両者が相違する箇所（変異部分）においてリード配列のマッピングにずれが生じた（図６）。当該変異部分に対して、例えば、欠失（−）を挿入して構成されたコンセンサス配列は、その欠失箇所以外はリファレンス配列と完全に一致していた。したがって、このコンセンサス配列は当該検体の新規アリルであると判定した。
【００３９】
上記のようにしてタイピングされたアリル情報を、座位毎に図６〜図１４にまとめて示す。比較のため、現在市販されているＨＬＡアリル判定ソフトウェア（Ａ社およびＢ社）で得られた結果も併記する。（ソフトウェア−Ａはマッピングによりアリル判定する市販ソフトであるが、その解析アルゴリズムの詳細は公表されておらず、本発明のようなエクソン毎のアリルの絞り込みは行われていないと予測される。ソフトウェア−Ｂは変異の組み合わせによりアリル判定する市販ソフトである。）
本発明（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  ＡｓｓｉｇｎｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅ  （ＳｅａＢａｓｓ））に従うと、誤ってタイピングされた遺伝子型は殆ど無く、市販のソフトを用いた場合に比較して正確性及び処理時間が格段に改善された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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