(57)【要約】【課題】合成試薬に対する膨潤が小さくて合成カラムに多く充填でき、その結果、合成カラムあたりの目的物収量を向上させることができる多孔質樹脂ビーズを提供すること。【解決手段】モノビニル単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる共重合体であり、且つ脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する多孔質樹脂ビーズであって、架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中１８．５〜５５ｍｏｌ％であり、多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、６０〜３００ｎｍであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノビニル単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる共重合体であり、且つ脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する多孔質樹脂ビーズであって、
架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中１８．５〜５５ｍｏｌ％であり、
多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、６０〜３００ｎｍであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
【請求項２】
モノビニル単量体が、スチレン系単量体を含む請求項１に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項３】
脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基が、アミノ基および／またはヒドロキシ基である請求項１または２に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性リンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得ることを特徴とする核酸の製造方法。
【請求項５】
４０ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドを得る請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質樹脂ビーズに関する。本発明の多孔質樹脂ビーズは、核酸（特に４０ｍｅｒ以上のポリヌクレオチド）の製造に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド或いはＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドといった核酸の化学合成に、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。この方法は、例えば、先ず合成する核酸の３’末端になるヌクレオシドを、スクシニル基等の開裂性リンカーを介して固相合成用担体にあらかじめ担持させ、この担体を合成カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。以降は核酸自動合成装置により反応カラム中に合成用試薬が流され、例えば以下のような合成プログラムが行われる：
（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液またはジクロロ酢酸／トルエン溶液等による、ヌクレオシド５’−ＯＨ基の脱保護。
（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）／アセトニトリル溶液、および、活性化剤（テトラゾール等）／アセトニトリル溶液による５’−ＯＨ基ヘのアミダイトのカップリング反応。
（３）無水酢酸／ピリジン／メチルイミダゾール／ＴＨＦ等による未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング。
（４）ヨウ素／水／ピリジン等によるホスファイトの酸化。
【０００３】
上述のような合成プログラムのサイクルを繰り返し、目的の配列を持った核酸が合成される。最終的に合成された核酸は、アンモニアやメチルアミン等により開裂性リンカーを加水分解させることによって、固相合成用担体から切り出される（非特許文献１参照）。
【０００４】
核酸の合成に使用される固相合成用担体としては、これまでＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）やシリカゲルのような無機粒子が用いられてきたが、近年、安価に、かつ大量に合成するために、固相合成用担体重量当りの核酸合成量を多くすることができる樹脂ビーズが用いられるようになってきた。このような樹脂ビーズとしては、低架橋かつ膨潤性の高い多孔質ポリスチレンビーズが知られている（特許文献１参照）。低架橋かつ膨潤性の高い樹脂ビーズは、核酸合成の起点となるリンカーを多く結合できるという特徴があるが、各合成試薬に対して膨潤が大きいため、核酸合成の際に用いるカラムあたりに充填できる樹脂ビーズ量が少なくなる。
【０００５】
また、アクリロニトリルを使用して種々の有機溶媒中における多孔質樹脂ビーズの膨潤率の変動を抑えることで、核酸の合成能を改善することが試みられている（特許文献２参照）。しかし、この文献における多孔質樹脂ビーズは、種々の有機溶媒中における多孔質樹脂ビーズの膨潤率の変動は小さいものの、核酸の合成能についてはさらなる改善が求められている。
【０００６】
一般的に、合成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの鎖長が長くなるほど、合成能（合成純度および合成量）が低下するという問題があり、これを解決するには固相合成用担体の合成の起点となるヌクレオシドリンカーの結合量を少なくする必要がある。例えば、２０ｍｅｒのＤＮＡオリゴヌクレオチドを高純度で合成するには市販の固相合成用多孔質樹脂ビーズ担体のヌクレオシドリンカー結合量は、２００μｍｏｌ／ｇ程度であるが、４０ｍｅｒ以上のＤＮＡポリヌクレオチドの場合は８０μｍｏｌ／ｇ以下である。このため、低架橋かつ膨潤性の高い樹脂ビーズの特徴である、核酸合成の起点となるリンカーを多く結合できるという特徴が生かせず、核酸合成の際に用いるカラムあたりに充填できる樹脂ビーズ量が少なくなるため、１合成あたりの核酸合成量が少なくなり、生産効率が低下する。なお本明細書において、オリゴヌクレオチドとは、２０ｍｅｒ以下のヌクレオチド重合体を意味し、ポリヌクレオチドとは、２０ｍｅｒを超えるヌクレオチド重合体を意味する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３２５２７２号公報
【特許文献２】特開２００８−０７４９７９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000) 3.6.1-3.6.13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、合成試薬に対する膨潤が小さくて合成カラムに多く充填でき、その結果、合成カラムあたりの目的物収量を向上させることができる多孔質樹脂ビーズを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、中架橋且つ細孔径の大きい多孔質樹脂ビーズを用いれば、上記目的を達成し得ることを見出した。この知見に基づく本発明は以下の通りである。
［１］  モノビニル単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる共重合体であり、且つ脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する多孔質樹脂ビーズであって、
架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中１８．５〜５５ｍｏｌ％であり、
多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、６０〜３００ｎｍであることを特徴とする、多孔質樹脂ビーズ。
【００１１】
［２］  架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中１８．５〜４５ｍｏｌ％である前記［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ。
［３］  架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中１８．５〜４０ｍｏｌ％である前記［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ。
［４］  架橋性ビニル単量体の量が、全単量体中１８．５〜３０ｍｏｌ％である前記［１］に記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１２】
［５］  多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、６５〜２５０ｎｍである前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［６］  多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径が、７０〜２００ｎｍである前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１３】
［７］  モノビニル単量体が、芳香族系ビニル単量体を含む前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［８］  モノビニル単量体が、スチレン系単量体を含む前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［９］  モノビニル単量体が、スチレン系単量体である前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［１０］  モノビニル単量体が、スチレンおよびｐ−ヒドロキシスチレンである前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１４】
［１１］  架橋性ビニル単量体が、多価ビニル芳香族化合物を含む前記［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［１２］  架橋性ビニル単量体が、ジビニルベンゼンを含む前記［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［１３］  架橋性ビニル単量体が、ｐ−ジビニルベンゼンおよびｍ−ジビニルベンゼンである前記［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１５】
［１４］  脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基が、アミノ基および／またはヒドロキシ基である前記［１］〜［１３］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［１５］  脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基が、ヒドロキシ基である前記［１］〜［１３］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１６】
［１６］  多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのカルボキシ基と結合し得る基の量が、１〜１０００μｍｏｌ／ｇである前記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［１７］  多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのカルボキシ基と結合し得る基の量が、５〜５００μｍｏｌ／ｇである前記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１７】
［１８］  多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径が、１〜１０００μｍである前記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［１９］  多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径が、１０〜５００μｍである前記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
［２０］  多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径が、２０〜３００μｍである前記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズ。
【００１８】
［２１］  前記［１］〜［２０］のいずれか一つに記載の多孔質樹脂ビーズに対して開裂性リンカーを介しヌクレオシドまたはヌクレオチドを順次結合させてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを得ることを特徴とする核酸の製造方法。
【００１９】
［２２］  多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりの開裂性リンカー結合量が、１〜８０μｍｏｌ／ｇである前記［２１］に記載の製造方法。
［２３］  多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりの開裂性リンカー結合量が、５〜８０μｍｏｌ／ｇである前記［２１］に記載の製造方法。
［２４］  多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりの開裂性リンカー結合量が、１０〜８０μｍｏｌ／ｇである前記［２１］に記載の製造方法。
【００２０】
［２５］  ４０ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドを得る前記［２１］〜［２４］のいずれか一つに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、合成試薬に対する膨潤が小さく、合成カラムあたりの充填量が多いため、合成カラムあたりの目的物収量を向上させることができる。そのため、本発明の多孔質樹脂ビーズを用いれば、核酸（特に、塩基配列が長いＤＮＡポリヌクレオチド）の合成を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、モノビニル単量体単位および架橋性ビニル単量体単位からなる共重合体である。モノビニル単量体は、１個のビニル基を有する単量体であれば、特に限定されない。モノビニル単量体としては、例えば、芳香族系ビニル単量体、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、酢酸ビニル、（メタ）アクリロニトリル、ビニルピリジン、ビニルピロリドン等が挙げられる。モノビニル単量体はいずれも、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。モノビニル単量体として、芳香族系ビニル単量体、（メタ）アクリル酸アルキルエステルが好ましく、芳香族系ビニル単量体がより好ましい。
【００２３】
芳香族系ビニル単量体としては、１個のビニル基を有する、環構成原子として窒素原子等のヘテロ原子を含有していてもよい環員数５〜６の芳香環化合物が挙げられる。該芳香環は、メチル基、アセトキシ基等の１個以上の置換基を有していてもよい。芳香族系ビニル単量体としては、スチレン系単量体が好ましい。
【００２４】
スチレン系単量体としては、例えば、スチレン；エチルスチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、ブチルスチレン等のアルキルスチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、フルオロスチレン、ペンタフルオロスチレン、ブロモスチレン等のハロゲン化スチレン；クロロメチルスチレン、フルオロメチルスチレン等のハロゲン化アルキルスチレン；アミノスチレン；シアノスチレン；メトキシスチレン、エトキシスチレン、ブトキシスチレン等のアルコキシスチレン；アセトキシスチレン等のアシルオキシスチレン；ニトロスチレン；等が挙げられる。置換基（例：アルキル基）を有するスチレン（例：アルキルスチレン）において、置換基の位置は、オルト位、メタ位、パラ位のいずれでもよく、パラ位が好ましい。
【００２５】
（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、例えば、アルキル基の炭素数が１〜１０個の直鎖または分岐鎖状の１価アルコールと（メタ）アクリル酸とから得られるエステル等が挙げられる。その具体例としては、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸メトキシエチル、アクリル酸メトキシエチレングリコール、アクリル酸メトキシポリエチレングリコール、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸メトキシエチレングリコール、メタクリル酸メトキシポリエチレングリコール、メタクリル酸ポリエチレングリコール、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸トリフルオロエチル、メタクリル酸オクタフルオロペンチル等が挙げられる。
【００２６】
架橋性ビニル単量体は、架橋剤として使用されるものであり、２個以上のビニル基を有する化合物であれば特に限定されない。架橋性ビニル単量体中のビニル基の数は、好ましくは２〜３である。架橋性ビニル単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン（ｏ−ジビニルベンゼン、ｍ−ジビニルベンゼン、ｐ−ジビニルベンゼン）、トリビニルベンゼン（例：１，３，５−トリビニルベンゼン）等の多価ビニル芳香族化合物；トリビニルシクロヘキサン；エチレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、ジプロピレンエチレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、ブタンジオール  ジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオール  ジ（メタ）アクリレート、ノナンジオール  ジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート系化合物；等が挙げられる。架橋性ビニル単量体はいずれも、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。架橋性ビニル単量体としては、多価ビニル芳香族化合物が好ましく、ジビニルベンゼンがより好ましく、ｐ−ジビニルベンゼン、ｍ−ジビニルベンゼン、並びにｐ−ジビニルベンゼンおよびｍ−ジビニルベンゼンの混合物がさらに好ましい。
【００２７】
本発明の多孔質樹脂ビーズは、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する。核酸を合成する場合、ヌクレオシドを多孔質樹脂ビーズと連結させるが、その際リンカーにカルボキシ基があると、リンカーのカルボキシ基と多孔質樹脂ビーズとを容易に結合させることができる。カルボキシ基と結合し得る基としては、アミノ基（１級アミノ基、２級アミノ基）、ヒドロキシ基が挙げられ、ヒドロキシ基が好ましい。
【００２８】
本発明の多孔質樹脂ビーズに、カルボキシ基と結合し得る基を導入する方法に特に限定は無い。例えば、カルボキシ基と結合し得る基がヒドロキシ基である場合は、例えば、モノビニル単量体として、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸４−ヒドロキシブチル、メタクリル酸４−ヒドロキシブチル、ヒドロキシスチレン等を共重合すればよい。また、カルボキシ基と結合し得る基がアミノ基である場合は、例えば、モノビニル単量体として、アミノスチレン、アミノメチルスチレン等を共重合すればよい。
【００２９】
脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有する多孔質樹脂ビーズは、一旦、別の官能基を有する多孔質樹脂ビーズを製造した後、該官能基をカルボキシ基と結合し得る基に変換することによって製造してもよい。
【００３０】
別の官能基を有する多孔質樹脂ビーズは、例えば、モノビニル単量体として、アセチルアミノスチレン等のアシルアミノスチレン；アセトキシスチレン、エタノイルオキシスチレン、ベンゾイルオキシスチレン等のアシルオキシスチレン；クロロメチルスチレン等のハロアルキルスチレンを共重合することによって製造することができる。
【００３１】
別の官能基としてアシルオキシ基、アシルアミノ基を有する多孔質樹脂ビーズは、加水分解によって、ヒドロキシ基、アミノ基を有する多孔質樹脂ビーズに変換することができる。また、別の官能基としてハロアルキル基を有する多孔質樹脂ビーズは、フタルイミドおよびヒドラジン、アンモニアまたは水酸化ナトリウム等との反応によって、アミノ基、ヒドロキシ基を有する多孔質樹脂ビーズに変換することができる。
【００３２】
多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのカルボキシ基と結合し得る基の量は、好ましくは１〜１０００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは５〜５００μｍｏｌ／ｇである。この量が１μｍｏｌ／ｇ未満では、固相合成用担体として用いたときに、合成の起点となる開裂性リンカーの結合量が少なくなるために核酸の合成量が低くなる。逆に、この量が１０００μｍｏｌ／ｇを超えると、多孔質樹脂ビーズ中での開裂性リンカーの結合に偏りが生じ、隣接する開裂性リンカー間の距離が不十分な場合、隣り合って起こる化学反応を互いに阻害し、固相合成用担体として用いたときに得られる核酸の純度が低くなる傾向がある。
【００３３】
本発明の多孔質樹脂ビーズにおいて、架橋性ビニル単量体の量は、全単量体中１８．５〜５５ｍｏｌ％、好ましくは１８．５〜４５ｍｏｌ％、より好ましくは１８．５〜４０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１８．５〜３０ｍｏｌ％である。この量が１８．５ｍｏｌ％未満では、得られるビーズの合成試薬に対する膨潤が大きくなる。逆にこの量が５５ｍｏｌ％を超えると、開裂性リンカーの結合効率が低下し、その結合量が少なくなるために核酸の合成量が低くなる。
【００３４】
本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径は、６０〜３００ｎｍ、好ましくは６５〜２５０ｎｍ、より好ましくは７０〜２００ｎｍである。このメジアン細孔径が６０ｎｍ未満では、核酸の純度が低くなる傾向にある。逆にこのメジアン細孔径が３００ｎｍを超えると、多孔質樹脂ビーズの空隙率が高くなり、乾燥体積が大きくなることから、合成の際に用いるカラムへのビーズの充填量が少なくなり、１合成あたりの核酸合成量が少なくなり、生産効率が低下する。このメジアン細孔径は、水銀圧入法の測定値である。具体的には、０．２ｇの多孔質樹脂ビーズを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ社製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により、メジアン細孔径を測定することができる。
【００３５】
本発明の多孔質樹脂ビーズの形状は、必ずしも厳密な球状を呈する必要は無く、少なくとも粒状であれば良い。しかしながら、固相合成用反応カラムヘの充填効率を高くでき、また、破損し難いという点から、本発明の多孔質樹脂ビーズは球状であることが好ましい。
【００３６】
本発明の多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは１０〜５００μｍ、さらに好ましくは２０〜３００μｍである。このメジアン粒子径は、レーザー回折散乱法による測定値である。具体的には、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を分散媒に用いて、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置ＬＡ−９５０（堀場製作所製）により、メジアン粒子径を測定することができる。
【００３７】
多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径は、多孔質樹脂ビーズを懸濁重合で製造する場合、重合開始前の撹拌条件や分散安定剤の濃度を調整することで、望ましい範囲に調整することが可能である。
【００３８】
本発明の多孔質樹脂ビーズの製造方法は特に限定されず、例えば、
（１）分散安定剤を分散または溶解した水中で、モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を有するビニル単量体、多孔質化剤および重合開始剤を撹拌し、懸濁共重合させて、多孔質樹脂ビーズを製造する方法、
（２）分散安定剤を分散または溶解した水中で、モノビニル単量体、架橋性ビニル単量体、別の官能基を有するビニル単量体、多孔質化剤および重合開始剤を撹拌し、懸濁共重合させて、別の官能基を有する多孔質樹脂ビーズを製造した後、加水分解等によって、別の官能基を、脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基に変換する方法、
等が挙げられる。
【００３９】
脱水縮合反応によりカルボキシ基と結合し得る基を含有するビニル単量体、または上述の別の官能基を有するビニル単量体量は、全単量体中、好ましくは１〜１５ｍｏｌ％であり、より好ましくは１〜１０ｍｏｌ％である。
【００４０】
懸濁共重合は、上述の各単量体、多孔質化剤、および重合開始剤との混合溶解物を、分散安定剤を分散または溶解した水中で撹拌乳化することにより行われる。
【００４１】
上述の多孔質化剤とは、懸濁共重合系における水以外の溶媒を意味し、炭化水素およびアルコールが好ましい。炭化水素としては、例えば、脂肪族の飽和または不飽和炭化水素あるいは芳香族炭化水素のいずれでもよく、好ましくは炭素数５〜１２の脂肪族炭化水素であり、より好ましくはｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、イソオクタン、ウンデカン、ドデカン等である。得られる多孔質樹脂ビーズの多孔質度を増すために、炭化水素およびアルコールを併用することが望ましい。アルコールとしては、例えば脂肪族アルコールを挙げることができ、その炭素数は、好ましくは５〜９である。このようなアルコールの具体例としては、２−エチルヘキサノール、ｔ−アミルアルコール、ノニルアルコール、２−オクタノール、シクロヘキサノール等が挙げられる。
【００４２】
多孔質化剤として用いられる炭化水素とアルコールの重量比は、炭化水素およびアルコールの具体的な組合せによって適宜変更され、それにより得られる固相合成用担体の比表面積を大きくすることができる。炭化水素とアルコールの好ましい重量比は１：９〜６：４である。
【００４３】
懸濁共重合の際の多孔質化剤の重量は、上記各単量体の総重量に対して、好ましくは０．５〜２．５倍であり、より好ましくは０．８〜２．３倍であり、さらに好ましくは１．０〜２．２倍である。この重量が０．５〜２．５倍の範囲外であると、得られる多孔質樹脂ビーズの細孔径や比表面積が小さくなり、化学反応による合成反応物の量が少なくなる。
【００４４】
懸濁共重合する際の方法には特に限定は無く、公知の方法を使用することができる。
【００４５】
分散安定剤としては特に限定されず、公知のポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ゼラチン、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の親水性保護コロイド剤；炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、りん酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、ベントナイト等の難溶性粉末；等が用いられる。分散安定剤の添加量は特に限定されないが、懸濁重合系の水１００重量部に対して、好ましくは０．０１〜１０重量部である。分散安定剤の量が少ない場合は、懸濁重合の分散安定性が損なわれて多量の凝集物が生成する。逆に、分散安定剤の量が多い場合は、微小ビーズが多数生成する。
【００４６】
重合開始剤としては特に限定されず、公知のジベンゾイルパーオキサイド、ジラウロイルパーオキサイド、ジステアロイルパーオキサイド、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）−２−メチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ヘキシルペルオキシ）シクロヘキサン、１，１−ジ（ｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、ジ−ｔ−ヘキシルパーオキサイド、ｔ−ブチルクミルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、１，１，３，３−テトラメチルブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ヘキシルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシイソプロピルモノカルボネート等の過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物；が用いられる。重合開始剤の添加量は特に限定されず、当業者であれば適切な量を選択することが可能である。
【００４７】
懸濁共重合の際の反応条件は、適宜に設定することができる。懸濁共重合の温度は、例えば６０〜９０℃であり、その時間は、例えば３０分間〜４８時間である。懸濁共重合は、通常、攪拌しながら行われる。その撹拌速度は、例えば１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは２００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍである。
【００４８】
懸濁共重合によって得られた多孔質樹脂ビーズは適宜、洗浄、乾燥、分級等の処理を施してもよい。
【００４９】
以上のような処理を経て、本発明の多孔質樹脂ビーズを得ることができる。この多孔質樹脂ビーズは、化学合成用の固相担体として利用することができる。本発明の多孔質樹脂ビーズは、特に、核酸合成用の固相担体として効果的に使用することができる。
【００５０】
本発明の多孔質樹脂ビーズを用いる核酸合成には、従来から知られている方法を適用することができる。例えば、本発明の多孔質樹脂ビーズ（固相担体）に、開裂性リンカーとして、下記のヌクレオシドスクシニルリンカーを結合する。
【００５１】
【化１】
2015129268.tif 000002
【００５２】
ヌクレオシドスクシニルリンカーは、上記のもののほかに、ＲＮＡ、修飾ヌクレオチドに対応したリンカー、ユニバーサルリンカー等が挙げられる。
【００５３】
次に、ヌクレオシドの５’末端から所定の塩基配列となるように、ヌクレオシドホスホロアミダイトを一段ずつ結合する。この合成反応は自動合成装置を用いて行うことができる。例えば、ヌクレオシドスクシニルリンカーを結合した多孔質樹脂ビーズを充填した装置の反応カラムに、５’−ＯＨ脱保護剤溶液、ヌクレオシドホスホロアミダイト溶液、アミダイト活性化剤溶液、酸化剤溶液、キャッピング剤溶液、洗浄溶液としてのアセトニトリル等が順次送られ、反応が繰り返される。最終的には、スクシニルリンカー部分をアルカリ溶液で加水分解するなどして切断し、目的の核酸を得ることができる。
【００５４】
本発明の核酸の製造方法では、多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりの開裂性リンカー結合量は、好ましくは１〜８０μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは５〜８０μｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは１０〜８０μｍｏｌ／ｇである。この開裂性リンカー結合量が１μｍｏｌ／ｇ未満では、合成できる核酸量が低下する。逆に、この開裂性リンカー結合量が８０μｍｏｌ／ｇを超えると、多孔質樹脂ビーズ中での開裂性リンカーの結合に偏りが生じ、隣接する開裂性リンカー間の距離が不十分な場合、隣り合って起こる化学反応を互いに阻害し、固相合成用担体として用いたときに得られる核酸の純度が低くなる傾向がある。
【００５５】
本発明の多孔質樹脂ビーズを用いる核酸の製造方法は、特に、４０ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドを合成するために有用である。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例および比較例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００５７】
実施例１
（１）多孔質樹脂ビーズの製造
冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた５００ｍＬセパラブルフラスコを恒温水槽に設置し、ポリビニルアルコール（クラレ製）２．６ｇ、蒸留水２６０ｇを入れ、３００ｒｐｍで撹拌してポリビニルアルコールを溶解した。ここに、スチレン（和光純薬製）３４．３６ｇ（全単量体中７１．６ｍｏｌ％）、ｐ−アセトキシスチレン（アルドリッチ製）３．８２ｇ（全単量体中５．１ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（ｍ−ジビニルベンゼンおよびｐ−ジビニルベンゼンの混合物、含有量５５重量％、和光純薬製）２５．４５ｇ（全単量体中２３．３ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール（和光純薬製）５３．４５ｇ、イソオクタン（和光純薬製）２２．９１ｇおよびベンゾイルパーオキサイド（２５重量％含水、日油製）１．２７ｇを混合して得られた溶液を添加して、窒素気流下、室温にて撹拌（５００ｒｐｍ）した後、８０℃に昇温して、１０時間懸濁共重合を行った。
【００５８】
重合生成物を、蒸留水およびアセトン（和光純薬製）を用いて濾過洗浄した後、全量約１Ｌになるようにアセトン中に分散させた。この分散液を、液を傾けても沈澱が乱れない程度になるまで放置した後、上清のアセトンを廃棄した。この沈澱に再びアセトンを加えて全量を約１Ｌにして、静置、アセトン廃棄の操作を繰り返すことにより分級した。この分散液を濾過し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−アセトキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た。
【００５９】
次いで冷却機、撹拌機および窒素導入管を付けた５００ｍＬフラスコに、上記の多孔質樹脂ビーズ２０ｇ、エタノール８０ｇ、蒸留水２０ｇおよび水酸化ナトリウム０．８ｇを仕込み、撹拌しながら８０．５℃で５時間反応させた。この分散液を塩酸で中和後、蒸留水およびアセトンを用いて濾過洗浄し、減圧乾燥することにより、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た（単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのヒドロキシ基の量：４５９μｍｏｌ／ｇ）。
【００６０】
（２）メジアン細孔径の測定
得られた多孔質樹脂ビーズ０．２ｇを水銀ポロシメーターＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ６０−ＧＴ（ＱｕａｎｔａＣｈｒｏｍｅ製）に投入し、水銀接触角１４０°、水銀表面張力４８０ｄｙｎ／ｃｍの条件における水銀圧入法により、多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径を測定した。結果を表１に示す。
【００６１】
（３）メジアン粒子径の測定
得られた多孔質樹脂ビーズを５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液中で超音波分散した。この分散液をサンプルとし、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液を分散媒として用いたレーザー回折／散乱式粒度分布装置ＬＡ−９２０（堀場製作所製）で、多孔質樹脂ビーズのメジアン粒子径を測定した。結果を表１に示す。
【００６２】
（４）トルエンに対する膨潤体積の測定
得られた多孔質樹脂ビーズ１ｇを秤量し、１０ｍＬメスシリンダーへ投入した。その後、トルエンを添加し、一晩静置した後、メスシリンダーの目盛より、膨潤体積を読み取った。膨潤体積およびこれから算出される０．２ｍＬカラムでの最大ビーズ充填量を表１に示す。
【００６３】
（５）多孔質樹脂ビーズへのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合
表２に示す配合で、実施例１で得られた多孔質樹脂ビーズ、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＯＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、アルドリッチ製）、アセトニトリル（和光純薬製）を混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させた。次いで、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、得られた多孔質樹脂ビーズを減圧乾燥した。
【００６４】
減圧乾燥した多孔質樹脂ビーズに、ＣａｐＡ（２０重量％無水酢酸／８０重量％アセトニトリル）１１２．５ｍＬ、ＣａｐＢ（２０重量％Ｎ−メチルイミダゾール／３０重量％ピリジン／５０重量％アセトニトリル）１２．５ｍＬ、４−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチ製）６３ｍｇ、アセトニトリル１２．５ｍＬを混合し、撹拌しながら室温で１２時間反応させ、アセトニトリルを用いて濾過洗浄した後、減圧乾燥して、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズを得た。多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅの結合量は、ｐ−トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて脱保護したＤＭＴ基の吸光度測定（４１２ｎｍ）から求めた。該結合量を表２に示す。
【００６５】
（６）６０ｍｅｒ  ＤＮＡポリヌクレオチドの合成
得られたＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズを合成スケール１μｍｏｌになるように合成カラム（容積０．２ｍＬ）に入れ、ＡＢＩ３４００
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製）にセットして、ヌクレオシドホスホロアミダイト濃度４ｅｑ／合成スケール、ＤＭＴ−ｏｎの条件にて６０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡポリヌクレオチドを合成した。合成後、乾燥させた多孔質樹脂ビーズからのＤＮＡポリヌクレオチドの切り出しおよび塩基アミノ基の脱保護を行った。フィルター濾過により多孔質樹脂ビーズを分離した濾液のＵＶ吸光度測定（測定波長：２６０ｎｍ）から核酸のＯＤ収量（核酸合成量に相当）を求めた。次に、濾液をＨＰＬＣ測定（ウォーターズ製のＨＰＬＣ装置を使用）して、合成純度（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ（面積％）、目的の配列長をもつＤＮＡポリヌクレオチドの割合）を求めた。結果を表３に示す。
【００６６】
実施例２
スチレン２０．１６ｇ（全単量体中４４．８ｍｏｌ％）、ｐ−アセトキシスチレン３．８２ｇ（全単量体中５．５ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５重量％）５０．９ｇ（全単量体中４９．８ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール５５．３９ｇ、イソオクタン２３．７４ｇ、ベンゾイルパーオキサイド１．２２ｇを用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た（単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのヒドロキシ基の量：４６６μｍｏｌ／ｇ）。
【００６７】
実施例１と同様にして測定および算出した多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径、メジアン粒子径、トルエンに対する膨潤体積および０．２ｍＬカラムでの最大ビーズ充填量を表１に示す。
【００６８】
表２に示す配合で実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズを製造し、さらに多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ結合量を測定した。該結合量を表２に示す。
【００６９】
実施例１と同様にして、６０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡポリヌクレオチドを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ（面積％）を求めた。結果を表３に示す。
【００７０】
比較例１
スチレン４５．０２ｇ（全単量体中８５．４ｍｏｌ％）、ｐ−アセトキシスチレン３．６５ｇ（全単量体中４．４ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５重量％）１２．２ｇ（全単量体中１０．２ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール５５．３９ｇ、イソオクタン２３．７４ｇ、ベンゾイルパーオキサイド１．２２ｇを用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た（単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのヒドロキシ基の量：４０９μｍｏｌ／ｇ）。
【００７１】
実施例１と同様にして測定および算出した多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径、メジアン粒子径、トルエンに対する膨潤体積および０．２ｍＬカラムでの最大ビーズ充填量を表１に示す。
【００７２】
表２に示す配合で実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズを製造し、さらに多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ結合量を測定した。該結合量を表２に示す。
【００７３】
実施例１と同様にして、６０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡポリヌクレオチドを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ（面積％）を求めた。結果を表３に示す。
【００７４】
比較例２
ｐ−アセトキシスチレン３．２ｇ（全単量体中８．４ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５重量％）５０．６２ｇ（全単量体中９１．６ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール６０．３１ｇ、イソオクタン２５．８５ｇを用いた以外は実施例１と同様にして、ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た（単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのヒドロキシ基の量：６４９μｍｏｌ／ｇ）。
【００７５】
実施例１と同様にして測定および算出した多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径、メジアン粒子径、トルエンに対する膨潤体積および０．２ｍＬカラムでの最大ビーズ充填量を表１に示す。
【００７６】
表２に示す配合で実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズを製造し、さらに多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ結合量を測定した。該結合量を表２に示す。
【００７７】
実施例１と同様にして、６０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡポリヌクレオチドを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ（面積％）を求めた。結果を表３に示す。
【００７８】
比較例３
スチレン３２．２７ｇ（全単量体中６１．５ｍｏｌ％）、ｐ−アセトキシスチレン３．９ｇ（全単量体中４．８ｍｏｌ％）、ジビニルベンゼン（含有量５５重量％）１１．１ｇ（全単量体中９．３ｍｏｌ％）、メタクリロニトリル８．２４ｇ（全単量体中２４．４ｍｏｌ％）、２−エチルヘキサノール５９．５７ｇ、イソオクタン２５．５３ｇ、ベンゾイルパーオキサイド１．１０ｇを用いた以外は実施例１と同様にして、スチレン−ジビニルベンゼン−ｐ−ヒドロキシスチレン−メタクリロニトリル共重合体である多孔質樹脂ビーズを得た（単量体の量から計算した多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのヒドロキシ基の量：４８８μｍｏｌ／ｇ）。
【００７９】
実施例１と同様にして測定および算出した多孔質樹脂ビーズのメジアン細孔径、メジアン粒子径、トルエンに対する膨潤体積および０．２ｍＬカラムでの最大ビーズ充填量を表１に示す。
【００８０】
表２に示す配合で実施例１と同様にして、ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した多孔質樹脂ビーズを製造し、さらに多孔質樹脂ビーズ１ｇあたりのＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ結合量を測定した。該結合量を表２に示す。
【００８１】
実施例１と同様にして、６０ｍｅｒ混合配列のＤＮＡポリヌクレオチドを合成し、核酸のＯＤ収量およびＦｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ（面積％）を求めた。結果を表３に示す。
【００８２】
【表１】
2015129268.tif 000003
【００８３】
【表２】
2015129268.tif 000004
【００８４】
【表３】
2015129268.tif 000005
【００８５】
表３には、０．２ｍＬカラムでの最大核酸合成スケールの計算値（＝カラム容積（０．２ｍＬ）×ＤＭＴ−ｄＴ−３’ｓｕｃｃｉｎａｔｅ結合量（μｍｏｌ／ｇ）／トルエンに対する膨潤体積（ｍＬ／ｇ））、および該計算値を用いて算出した０．２ｍＬカラムあたりの目的物収量の計算値（＝０．２ｍＬカラムでの最大核酸合成スケール（μｍｏｌ）×ＯＤ収量（ＯＤ／μｍｏｌ）×Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ（面積％）／１００）も記載する。表３に示すように、本発明の架橋単量体量およびメジアン細孔径の要件を満たす実施例１および２（特に、実施例１）の多孔質樹脂ビーズは、本発明の要件を満たさない比較例１〜３の多孔質樹脂ビーズよりも、０．２ｍＬカラムあたりの目的物収量の計算値が大きい。この結果から、本発明の多孔質樹脂ビーズを使用することで核酸（特に、塩基配列が長いＤＮＡポリヌクレオチド）の合成を効率的に行い得ることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明は、核酸合成の固相合成用担体として有用な多孔質樹脂ビーズを提供する。本発明の多孔質樹脂ビーズは、核酸（特に、塩基配列が長いＤＮＡポリヌクレオチド）の合成を効率的に行うことができる。
【００８７】
本願は、特願２０１３−２５１０２２号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。